RS57023B1 - Derivati hinazolina za tretman viralnih infekcija i drugih bolesti - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na derivate hinazolina, procese za njihovu pripremu, farmaceutske kompozicije, i na njihovu upotrebu u terapiji.

[0002] Ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu derivata hinazolina u tretmanu viralnih infekcija, imuno ili upalnih poremećaja u koje je uključena modulacija, ili agonizam, toll-like-receptora (TLR). Toll-like receptori su primarno trans-membranske belančevine karakterizovane sa izvan-ćelijskim domenom koji je bogat sa leucinom i citoplazmatskim produženjem koje sadrži konzervisani region. Urođeni imuno-sistem može da prepozna molekularne obrasce u vezi sa patogenom uz pomoć pomenutih TLR koji se eksprimiraju na ćelijskoj površini određenih tipova imuno-ćelija. Prepoznavanje stranih patogena aktiviše proizvodnju citokina i pozitivnu regulaciju ko-stimulacionih molekula na fagocitima. Ovo dovodi do modulacije ponašanja T-ćelija.

[0003] Procenjeno je da najveći broj sisara ima između deset i petnaest tipova Toll-like receptora. Kod ljudi i miševa je identifikovano trinaest TLR (jednostavno označeni od TLR1 do TLR13), a podjednake forme mnogih od njih su pronađene u ostalim vrstama sisara. Međutim, ekvivalenti određenih TLR, koji se nalaze kod ljudi, nisu pronađeni kod svih sisara. Na primer, gen koji kodira za belančevinu koja je analogna TLR10 kod ljudi je prisutan i kod miševa, ali se čini da je u prošlosti bio oštećen sa retrovirusom. Sa druge strane, miševi eksprimiraju TLR 11, 12, i 13, od kojih niti jedan nije prisutan kod ljudi. Drugi sisari mogu da eksprimiraju TLR koji se ne nalaze kod ljudi. Druge vrste koje nisu sisari mogu da sadrže TLR koji se razlikuju od onih od sisara, kao šta je TLR14, koji može da se nađe kod fuga (ribe iz roda Takifugu). Ovo može da komplikuje proces korišćenja eksperimentalnih životinja kao modele za ljudsku urođeni imunost.

[0004] Za detaljan pregled o toll-like receptorima treba pogledati sledeće članke: Hoffmann, J.A., Nature, 426, str. 33-38, 2003; Akira, S., Takeda, K., & Kaisho, T., Annual Rev. Immunology, 21, str.335-376, 2003; Ulevitch, R. J., Nature Reviews: Immunology, 4, str.512-520, 2004.

[0005] Jedinjenja koja pokazuju aktivnost prema Toll-like receptorima su opisana prethodno, poput derivata purina u dokumentu WO 2006117670, derivata adenina u dokumentima WO 98/01448 i WO 99/28321, i pirimidina u dokumentu WO 2009/067081.

[0006] Međutim, još uvek postoji snažna potreba za novim modulatorima Toll-like receptora koji poseduju preferiranu selektivnost, veću potenciju, veću metaboličku stabilnost, i imaju poboljšani profil bezbednosti u odnosu na jedinjenja iz prijašnjeg stanja tehnike.

[0007] Kod tretmana određenih viralnih infekcija mogu da se administriraju regularne injekcije interferona (IFNα), kao u slučaju virusa hepatitisa C (HCV), (Fried et. al. Peginterferon-alfa plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection, N Engl J Med 2002; 347: 975-82). Oralno dostupni mali molekuli IFN-induceri donose potencijalne prednosti smanjene imunogenosti i lakoće administriranja. Tako, novi IFN-induceri su potencijalno efektivna nova klasa lekova za tretiranje virusnih infekcija. Kao primer iz literature za malog molekula IFN-inducera, koji ima antiviralni efekt, vidi De Clercq, E.; Descamps, J.; De Somer, P. Science 1978, 200, 563-565.

[0008] IFNα se takođe daje zajedno sa drugim lekovima u tretmanu određenih tipova raka (vidi Eur. J. Cancer 46, 2849-57, i Cancer Res. 1992, 52, 1056, na primer). TLR 7/8 agonisti su takođe od interesa kao dodaci vakcinama zbog njihove sposobnosti da indukuju izraziti Th1 odgovor. Stanje tehnike dalje uključuje i dokument WO 2005/007672. Ova referenca se odnosi na postupke i kompozicije koje su korisne za moduliranje signaliziranja uz pomoć Toll-like receptora. Jedinjenja koja se tamo koriste imaju osnovnu strukturu koja sadrži najmanje dva prstena, pri čemu se tipično radi o 4-primarna amino-hinolina.

[0009] Druga osnovna referenca je dokument WO 2009.067081, koji se odnosi na derivate pirimidina za medicinsku upotrebu uključujući i tretman viralnih infekcija poput HCV.

[0010] U skladu sa ovim pronalaskom, obezbeđeno je jedinjenje sa formulom (I)

ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf, pri čemu

R1je C4-8alkil supstituisan sa hidroksilom,

R2je vodonik, halogen, hidroksil, amin, C1-7alkil, C1-7alkilamino, C1-6alkoksi, (C1-

4)alkoksi-(C1-4)alkil, C3-6cikloalkil, C4-7heterocikl, aromatski, biciklički heterocikl, arilalkil, heteroaril, heteroarilalkil, karboksilni amid, karboksilni ester od kojih je svaki opciono supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno izabranih iz halogena, hidroksila, amino, C1-6alkila, di-(C1-6)alkil-amino, C1-6alkilamino, C1-6alkila, C1-

6alkoksi, C3-6cikloalkila, karboksilne kiseline, karboksilnog estera, karboksilnog amida, heterocikla, arila, alkenila, alkinila, arilalkila, heteroarila, heteroarilalkila, ili nitrila, R3je vodonik, halogen, hidroksil, amin, C1-7alkil, C1-7alkenil, C1-7alkinil, C1-

7alkilamino, C1-6alkoksi, (C1-4)alkoksi-(C1-4)alkil, C3-6cikloalkil, C4-7heterocikl, aromatski, biciklički heterocikl, arilalkil, heteroaril, heteroarilalkil, ariloksi, heteroariloksi, keton, nitril od kojih je svaki opciono supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno izabranih iz halogena, hidroksila, amino, C1-6alkila, di-(C1-

6)alkilamino, C1-6alkilamino, C1-6alkila, C1-6alkoksi, C3-6cikloalkila, karboksilne kiseline, karboksilnog estera, karboksilnog amida, heterocikla, arila, alkenila, alkinila, arilalkila, heteroarila, heteroarilalkila, ili nitrila.

R4je vodonik, halogen, hidroksil, amin, C1-7alkil, C1-7alkilamino, C1-6alkoksi, (C1-

4)alkoksi-(C1-4)alkil, C3-6cikloalkil, C4-7heterocikl, biciklički heterocikl, arilalkil, heteroarilalkil, ariloksi, heteroariloksi od koji je svaki opciono supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno izabranih iz halogena, hidroksila, amino, C1-6alkila, di-(C1-6)alkilamino, C1-6alkilamino, C1-6alkila, C1-6alkoksi, C3-6cikloalkila, karboksilne kiseline, karboksilnog estera, karboksilnog amida, heterocikla, arila, alkenila, alkinila, arilalkila, heteroarila, heteroarilalkila, ili nitrila, i

R5je vodonik, fluor, hlor ili metil pod uslovom da R2, R3, R4, i R5ne mogu svi da budu H.

[0011] Jedna izvedba se odnosi na jedinjenja sa formulom (I) u kojoj R1je jedan od sledećih:

[0012] U drugoj izvedbi, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenja sa formulom (I) u kojoj R5je preferirano vodonik ili fluor, a R1, R2, R3, i R4su kao šta je opisano iznad.

[0013] Jedinjenja sa formulom (I) i njihova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf poseduju aktivnost kao farmaceutici, a naročito kao modulatori aktivnosti Toll-like receptora (posebno TLR7 i/ili TLR8).

[0014] Tako, u daljnjem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje sa formulom (I) ili neku njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, razređivača ili nosioca.

[0015] Nadalje, jedinjenje sa formulom (I) ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf u skladu sa ovim pronalaskom, ili neka farmaceutska kompozicija koja sadrži pomenuto jedinjenje sa formulom (I) ili neku njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf može da se koristi kao lek.

[0016] Drugi aspekt ovoga pronalaska, prema tome, je taj da jedinjenje sa formulom (I) ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf, ili pomenuta farmaceutska kompozicija koja sadrži pomenuto jedinjenje sa formulom (I) ili neku njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf može da se koristi u tretmanu poremećaja kod kojeg je uključena modulacija TLR7 i/ili TLR8.

[0017] Termin "alkil" se odnosi na ravnolančani ili razgranati zasićeni alifatski ugljovodonik koji sadrži specifikovani broj atoma ugljenika.

[0018] Termin "halogen" se odnosi na fluor, hlor, brom ili jod.

[0019] Termin "alkenil" se odnosi na alki, kao šta je definisano iznad, koji sadrži najmanje dva atoma ugljenika i najmanje jednu ugljenik-ugljenik dvostruku vezu.

[0020] Termin "alkinil" se odnosi na alkil, kao šta je definisano iznad, koji sadrži najmanje dva atoma ugljenika i najmanje jednu ugljenik-ugljenik trostruku vezu.

[0021] Termin "cikloalkil" se odnosi na karbociklički prsten koji sadrži specifikovani broj atoma ugljenika.

[0022] Termin "alkoksi" se odnosi na alkil (ugljovodonički lanac) koji je vezan na kiseonik uz pomoć jednostruke veze, na primer metoksi grupa ili etoksi grupa.

[0023] Termin "aril" označava aromatsku prstensku strukturu koja opciono sadrži jedan ili dva heteroatoma izabranih iz N, O i S, a naročito iz N i O. Pomenuta aromatska prstenska struktura može da sadrži 5, 6 ili 7 atoma u prstenu. Naročito, pomenuta aromatska prstenska struktura može da poseduje 5 ili 6 atoma u prstenu.

[0024] Termin "ariloksi" se odnosi na aromatsku prstensku strukturu. Pomenuta aromatska grupa je vezana na kiseonik uz pomoć jednostruke veze, poput na primer fenola.

[0025] Termin "heteroariloksi" se odnosi na aromatsku prstensku struktura koja opciono sadrži jedan ili dva heteroatoma izabrana iz N, O i S. Pomenuta aromatska grupa, koja sadrži 5 do 7 atoma u prstenu, od kojih je jedan vezan na kiseonik uz pomoć jednostruke veze, na primer hidroksipiridin.

[0026] Termin "biciklički heterocikl" označava aromatsku prstensku strukturu, kao šta je definisano kod termina "aril" koji se sastoji od dva fuzionisana aromatska prstena. Svaki prsten je opciono sastavljen od heteroatoma izabranih iz N, O i S, a naročito iz N i O.

[0027] Termin "arilalkil" označava aromatsku prstensku strukturu, kao šta je definisano kod termina "aril" opciono supstituisan sa alkilnom grupom.

[0028] Termin "heteroarilalkil" označava aromatsku prstensku strukturu, kao šta je definisano kod termina "heteroaril" opciono supstituisan sa alkilnom grupom.

[0029] Heterocikl se odnosi na molekule koji su zasićeni ili delomično zasićeni i uključuje etiloksid, tetrahidrofuran, dioksan i druge cikličke etare. Heterocikli koji sadrže azot uključuju, na primer azetidin, morfolin, piperidin, piperazin, pirolidin, i slično. Drugi heterocikli uključuju, na primer, tiomorfolin, dioksolinil, i ciklički sulfon.

[0030] Heteroarilne grupe su heterocikličke grupe koje su aromatske po prirodi. Pomenute su monocikličke, bicikličke, ili policikličke i sadrže jedan ili više heteroatoma izabranih iz N, O ili S. Heteroarilne grupe mogu da budu, na primer, imidazolil, izoksazolil, furil, oksazolil, pirolil, piridonil, piridil, piridazinil, pirazinil,

[0031] Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja sa formulom (I) uključuju kisele adicione i bazne soli. Prikladne kisele adicione soli nastaju iz kiselina koje mogu da formiraju ne-toksične soli. Prikladne bazne soli nastaju iz baza koje daju ne-toksične soli.

[0032] Jedinjenja iz ovoga pronalaska takođe mogu da postoje kao solvati. Termin "solvat" ovde se koristi sa ciljem da se opiše molekularni kompleks koji sadrži jedinjenje iz ovoga pronalaska i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih molekula rastvarača, na primer, etanola.

[0033] Termin "polimorf" se odnosi na sposobnost jedinjenja iz ovoga pronalaska da postoji u više od jedne forme ili kristalne strukture.

[0034] Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se administriraju kao kristalni i amorfni produkti. Mogu da se dobiju, na primer, u formi čvrstih pločica, prahova, ili filmova primenom postupaka poput precipitacije, kristalizovanja, smrzavanja-sušenja, raspršivanja-sušenja, ili uz pomoć sušenja isparavanjem. Pomenuta mogu da se administriraju sama za sebe ili zajedno sa jednim ili više drugih jedinjenja iz ovoga pronalaska ili kombinovano sa jednim ili više drugih lekova. Uopšteno, pomenuta mogu da se administriraju kao formulacija zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. Termin "ekscipijent" ovde se koristi sa ciljem da se opiše bilo koji sastojak koji je različit od jedinjenje(a) iz ovoga pronalaska. Izbor ekscipijenta zavisi uglavnom o faktorima poput korišćenog modusa administracije, efekta ekscipijenta na rastvorljivost i stabilnost, i o prirodi dozne forme.

[0035] Jedinjenja iz ovoga pronalaska ili bilo koja njihova podgrupa mogu da se formuliraju u brojne farmaceutske forme sa ciljem administriranja. Kao odgovarajuće kompozicije mogu da se pomenu sve kompozicije koje se uobičajeno koriste kod sistemskog administriranja lekova. Sa ciljem pripreme farmaceutskih kompozicija iz ovoga pronalaska, efektivna količina određenog jedinjenja, opciono u formi adicione soli, kao aktivan sastojak se kombinuje u smešu sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosiocem, pri čemu pomenuti nosilac može da bude raznolik u zavisnosti o formi preparata koji je poželjan za administriranje. Pomenute farmaceutske kompozicije poželjno dolaze kao unitarna dozna forma koja je prikladna za, na primer, oralno, rektalno, ili perkutano administriranje. Na primer, kod pripreme kompozicija kao oralna dozna forma, može da se koristi bilo koji uobičajeni farmaceutski medijum poput, na primer, vode, raznih glikola, ulja, alkohola i slično u slučaju oralnih tečnih preparata poput suspenzija, sirupa, eliksira, emulzija, i rastvora; ili čvrstih nosioca poput raznih tipova skroba, šećera, kaolina, razređivača, lubrikanata, veznika, agenasa za raspadanje i slično u slučaju prahova, pilula, kapsula, i tableta. Zbog jednostavnosti administriranja, tablete i kapsule predstavljaju najnaprednije oralne dozne unitarne forme, pri čemu se uobičajeno koriste čvrsti farmaceutski nosioci. Takođe, uključeni su i čvrsti preparati koji mogu da se konvertuju, neposredno pre upotrebe, u tečne forme. U kompozicijama koje su prikladne za perkutano administriranje, nosilac opciono obuhvata neki agens za poboljšanje penetracije i/ili neki prikladni agens za vlaženje, opciono kombinovan sa prikladnim aditivima, bilo kojeg tipa, u manjoj količini, pri čemu pomenuti aditivi ne utiču značajno štetno na kožu. Pomenuti aditivi mogu da ubrzaju administriranje u kožu i/ili mogu da budu korisni kod pripreme željenih kompozicija. Pomenute kompozicije mogu da se administriraju na razne načine, na primer, kao transdermalna nalepnica, spot-on, i kao mast. Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu takođe da se administriraju uz pomoć inhalacije ili insuflacije primenom postupaka i formulacija koji su poznati stanju tehnike. Tako, opšte uzeto, jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se administriraju u pluća u formi rastvora, suspenzije ili suvog praha.

[0036] Veoma je korisno da se malopre pomenute farmaceutske kompozicije formulišu kao unitarna dozna forma radi jednostavnosti administriranja i uniformnosti doziranja. Unitarna dozna forma, kao šta se ovde koristi, se odnosi na fizički diskretne jedinice koje su prikladne za unitarno doziranje, pri čemu svaka jedinica sadrži predodređenu količinu aktivnog sastojka za koju se zna da dovodi do željenog terapeutskog efekta zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosiocem. Primeri takvih unitarnih doznih forma su tablete (uključujući prekrivene ili omotane tablete), kapsule, pilule, paketići sa prahom, vafle, čepići, rastvori ili suspenzije za injektiranje i slično, i njihove višestruke forme.

[0037] Stručnjaci za infektivne bolesti mogu da odrede efektivnu količinu na osnovu rezultata testova koji su ovde predstavljeni. Generalno, smatra se da se efektivna dnevna količina kreće u rasponu od 0.01 mg/kg do 50 mg/kg telesne težine, bolje od 0.1 mg/kg do 10 mg/kg telesne težine. Može da bude poželjno da se željena doza administrira kao dve, tri, četiri ili više poddoza u odgovarajućim intervalima tokom dana. Pomenute pod-doze mogu da se formulišu kao unitarne dozne forme, na primer, takve koje sadrže od 1 do 1000 mg, a naročito od 5 do 200 mg aktivnog sastojka po unitarnoj doznoj formi.

[0038] Tačna doza i frekvencija administriranja zavisi o korišćenom jedinjenju sa formulom (I), o stanju koje se tretira, ozbiljnosti stanja koje se tretira, dobi, težini i opštega fizičkog stanja tretiranog pacijenta kao i o drugim lekovima koje osoba može da uzima istovremeno, koje je veoma dobro poznato stručnjacima. Nadalje, evidentno je da efektivna količina može da se smanji ili poveća u zavisnosti o odgovoru tretiranog subjekta i/ili u zavisnosti o evaluaciji lekara koji prepisuje jedinjenja iz ovoga instant-pronalaska. Rasponi efektivne količine, koji su pomenuti iznad, su prema tome samo smernice i ne ograničavaju okvire ili primenu ovoga pronalaska.

Priprema jedinjenja

[0039] Jedinjenja sa formulom (I) su pripremljena u skladu sa shemom 1.2,4-dihlorohinazolini mogu da budu reagovani, u odvojenim koracima, sa ciljem da se dobiju 2,4-diaminohinazolini sa prinosom koji je prihvatljiv. U prvom koraku, 2,4-dihloro-hinazolin je pomešan ili grejan sa aminom u prisutnosti ili bez katalizatora od prelaznog metala sa ciljem da se dobije 2-hloro-4-aminohinazolin. Nakon dorade sirovog 2-hloro-4-aminohinazolina, intermedijar je grejan u posudi pod pritiskom uz izvor amonijaka (na primer, amonijak u metanolu) i opciono uz CuO. Shema prikazuje referentno jedinjenje mimo pronalaska, u kojem R1je butil.

[0040] Jedinjenja sa formulom (I) takođe mogu da se pripreme u skladu sa shemom 2. Supstituisani antranilni esteri (IV) su grejani u kiselim uslovima u prisutnosti viška cijanamida, uz korišćenje alkoholnog rastvarača (na primer, etanola) ili diglima u skladu sa postupkom koji je opisan u literaturi (O'Hara et. al. JOC (1991) 56, p776). Naknadna aminska supstitucija 2-amino-4-hidroksihinazolina (V) može da se provede uz pomoć nekoliko različitih puteva. U jednom primeru, intermedijari V mogu da se greju u prisutnosti fosfornog oksihlorida (POCl3) sa ili bez rastvarača. Nakon odstranjivanja rastvarača, može da se doda čist amin, ili u prisutnosti polarnog rastvarača (na primer, acetonitril) kako bi se dobio VI, na sobnoj temperaturi ili uz grejanje. Drugi pristup je da intermedijari V reaguju sa agensom za kuplovanje poput BOP ili PyBOP u prisutnosti DBU i amina. Reakcija se događa u polarnom rastvaraču (na primer, DMF). Treći postupak je da se zaštiti 2-amino grupa u intermedijarima V uz pomoć acilne grupe. Intermedijar V je reagovan sa anhidridom (na primer, sirćetni anhidrid), tipično na temperaturi refluksa tokom nekoliko časova. Rastvarači mogu da se odstrane pod smanjenim pritiskom, a sirovi materijal može da se podvrgne naknadnoj reakciji sa POCl3, kao šta je opisano iznad. Jednostavno odstranjivanje zaštitne acilne grupe se provodi uz pomoć reakcije u baznom rastvaraču (na primer, natrijum metoksid u metanolu). R2u Shemi 2 je R1, kao šta je definisano iznad.

Eksperimentalni deo

Priprema intermedijara A

[0041]

[0042] U smešu 2,4-dihloro-6,7-dimetoksihinazolina (500 mg, 1.9 mmol), diizopropiletilamina (0.73 mL, 4.2 mmol), i acetonitrila (0.1 mL) je dodan rastvor n-butilamina (0.19 mL, 1.9 mmol) u acetonitrilu (5 mL), kap po kap uz mešanje. Smeša je ostavljena da se meša tokom jednog dana na ambijentalnoj temperaturi. Dodan je etil acetat, a organski sloj je ispran sa zas. vodenim amonijum hloridom. Organski sloj je odstranjen, osušen preko magnezijum sulfata. Čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije kako bi se dobio sirovi A, koji je korišćen u sledećem koraku.

Priprema Jedinjenja 1 (referentno jedinjenje)

[0043]

[0044] Intermedijar A (0.5 g, 1.7 mmol) je stavljen u posudu od 20 mL pod pritiskom u kojoj je bio 7 N amonijak u metanolu (15 mL), a tada je dodan CuO (242 mg, 1.7 mmol). Posuda je zatvorena, a smeša je grejana do 130° C uz mešanje tokom 18 h. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature. Čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su odstranjeni pod smanjenim pritiskom. Sirovi materijal je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije reverzene faze (Vydac Denali; kolona C18, 10 µm, 250 g, 5 cm). Mobilna faza (0.25% rastvor NH4HCO3u vodi, CH3CN).

Priprema 9 (referentno jedinjenje)

[0045]

[0046] Korak 1. U bocu sa okruglim dnom od 500 mL, koja je bila opremljena sa magnetnom mešalicom, su stavljeni metil 2-amino-6-metoksibenzoat (25 g, 149.6 mmol), etanol (200 mL), cijanamid (9.43 g, 224 mmol), i koncentrovana HCl (6 mL). Smeša je ostavljena da se meša na temperaturi refluksa tokom 6 h. U intervalima od jednog časa je dodavana koncentrovana HCl (0.5 mL). Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, a čvrsta materija, V-1, je izolovana uz pomoć filtracije pa je isprana sa etanolom.

LC-MS m/z = 192(M+H).

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.88 (s, 3 H), 6.96 (dd, J=8.2, 3.1 Hz, 2 H), 7.69 (t, J=8.3 Hz, 1 H), 8.28 (br. s., 2 H), 12.67 (br. s., 1 H)

Korak 2

[0047]

[0048] U bocu od 50 mL su stavljeni V-1 (250 mg, 1.24 mmol), bezvodni DMF (5 mL), DBU (0.6 g, 3.73 mmol), i BOP (659 mg, 1.49 mmol). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 h, dodan je n-butilamin (287 mg, 3.73 mmol), a reakciona smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 15 h. Smanjen je volumen rastvarača, a talog je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije (silika) uz primenu dihlorometana – 10% metanola u gradijentu dihlorometana. Najbolje frakcije su sakupljene, rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom koje daje 9.

[0049] Sledeći intermedijari su pripremljeni u skladu sa postupkom za pripremu V-1.

LC-MS m/z = 240/242

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.09 - 3.55 (m, 2 H), 7.09 (br. s., 1 H), 7.26 (dd, J=7.9, 1.3 Hz, 1 H), 7.37 - 7.48 (m, 2H)

LC-MS m/z = 196(M+H)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.00 (br. s., 2 H) 7.13 (d, J=7.78 Hz, 1 H) 7.18 (d, J=8.28 Hz, 1 H) 7.50 (t, J=8.03 Hz, 1 H), proton fenola nije primećen.

LC-MS m/z = 176(M+H)

LC-MS m/z = 180(M+H)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 6.98 (dd, J=11.0, 8.3 Hz, 1 H), 7.13 (d, J=8.3 Hz, 1 H), 7.51 (br. s., 2 H), 7.64 (td, J=8.3, 5.8 Hz, 1 H), 12.30 (br. s, 1 H)

LC-MS m/z = 180(M+H)

LC-MS m/z = 239/241 (M+H)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.32 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 7.49 (s, 2 H), 7.71 (br. s., 1 H), 7.81 (dd, J=8.6, 2.4 Hz, 1 H), 8.00 (d, J=2.4 Hz, 1 H)

LC-MS m/z = 192(M+H)

LC-MS m/z = 176(M+H)

LC-MS m/z = 180(M+H)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.01 - 7.16 (m, 2 H), 7.56 (br. s., 2 H), 7.99 (t, J=7.7 Hz, 1 H), 10.38 - 13.48 (m, 1 H)

LC-MS m/z = 196(M+H)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.41 (dd, J=8.5, 2.0 Hz, 1 H), 7.55 (d, J=2.0 Hz, 1 H), 7.98 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 8.49 (br. s., 2 H), 10.79 - 13.69 (m, 1 H)

LC-MS m/z = 176(M+H)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.43 (s, 3 H), 7.22 (d, J=1.0 Hz, 1 H), 7.24 (s, 1 H), 7.89 (d, J=8.0 Hz, 1 H), 8.29 (br. s., 2 H), 12.65 (br. s, 1 H)

LC-MS m/z = 192(M+H)

LC-MS m/z = 220(M+H)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.87 - 3.95 (m, 3 H), 7.12 - 7.47 (m, 1 H), 7.83 (dd, J=8.3, 1.4 Hz, 1 H), 7.99 (d, J=1.3 Hz, 1 H), 8.07 - 8.13 (m, 1 H), 8.43 (br. s., 2 H)

LC-MS m/z = 198(M+H)

LC-MS m/z = 298(M+H)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3.85 (s, 3 H), 5.10 (s, 2 H), 6.17 (br. s., 2 H), 6.70 (s, 1 H), 7.30 - 7.36 (m, 2 H), 7.40 (t, J=7.4 Hz, 2 H), 7.44 - 7.48 (m, 2 H), 10.82 (br. s., 1 H)

LC-MS m/z = 180(M+H)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 6.51-6.67 (m, 2H), 7.00-7.08(m, 1H), 7.42(ddd, J =11.2, 7.9 1.3Hz, 1H), 7.69 (dd, J=7.9, 0.6Hz, 1H), 11.08 (br. s., 1H)

LC-MS m/z = 196 (M+H)

LC-MS m/z = 176 (M+H)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.41 (s, 3 H), 7.15 (t, J=7.5 Hz, 1 H), 7.43 (br. s., 2 H), 7.55 (d, J=7.0 Hz, 1 H), 7.80 (d, J=7.8 Hz, 1 H), 11.17 - 12.49 (m, 1 H)

Priprema 10

[0050]

[0051] Korak 1. Priprema V-6. U bocu od 50 mL, koja je opremljena sa magnetnom mešalicom, su stavljeni V-3 (500 mg, 2.16 mmol), fenilboronska kiselina (342 mg, 2.8 mmol), kalijum karbonat (1.19 g, 8.62 mmol), dioksan (5.5 mL), voda (1.8 mL), i tetrakis(trifenilfosfin)paladijum (249 mg, 0.215 mmol). Gasoviti azot (mehurići) je proveden kroz reakcionu smešu tokom 10 min. Boca je zatvorena i grejana do 130° C. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature, a rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom. Sirovi materijal je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije reverzene faze (RP Vydac Denali C18 - 10 µm, 200 g, 5 cm. Mobilna faza: 0.25% rastvor NH4HCO3u vodi, CH3CN) koje daje V-6.

LC-MS m/z = 238 (M+H)

[0052] Korak 2. U bocu od 50 mL, opremljenu sa magnetnom mešalicom, su stavljeni V-6 (148 mg, 0.624 mmol), bezvodni DMF (3.5 mL), DBU (0.373 mL, 2.5 mmol), BOP (345 mg, 0.78 mmol), i (S)-2-aminopentanol (322 mg, 3.12 mmol). Reakciona smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 3 dana. Isparljive materije su odstranjene pod smanjenim pritiskom, a sirova materija je podeljena između vode i etil acetata. Organski slojevi su pomešani, osušeni (magnezijum sulfat), čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su odstranjeni pod smanjenim pritiskom. Sirova materija je prečišćena uz pomoć kolonske hromatografije reverzene faze (RP SunFire Prep C18 OBD-10 µm, 30 x 150 mm). Mobilna faza (0.25% rastvor NH4HCO3u vodi, CH3CN) koje daje 10.

Priprema 11 (referentno jedinjenje)

[0053]

[0054] Korak 1. U bocu sa okruglim dnom od 1 L, opremljenu sa magnetnom mešalicom, su stavljeni V-1 (8.8 g, 46.03 mmol) i sirćetni anhidrid (150 mL). Boca je opremljena sa reflukskondenzatorom, a smeša je grejana do refluksa uz mešanje tokom 15 h. Precipitat je izolovan uz pomoć filtracije pa je ispran sa diizopropiletrom, a tada je osušen in vacuo koje daje belu čvrstu materiju, V-9.

LC-MS m/z = 234 (M+H)

[0055] Korak 2. U bocu sa okruglim dnom od 250 mL, opremljenu sa magnetnom mešalicom, su dodani V-9 (4.5 g, 19.3 mmol), i acetonitril (100 mL). Dodan je POCl3(5.56 mL, 59.8 mmol), kap po kap tokom 30 min, a nakon toga i DIPEA (10.3 mL, 59.8 mmol). Reakciona smeša postaje smeđi rastvor koji je mešan tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je izlivena u 1 M NaOH (100 mL) pa je ekstrahovana sa etil acetatom (2 x 100 mL). Pomešani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a filtrat je korišćen kao takav u sledećem koraku.

[0056] Korak 3. Filtrat-rastvor iz koraka 2 u etil acetatu je tretiran sa DIPEA (9.2 mL, 53.6 mmol) i n-butilaminom (3.5 mL, 35.8 mmol). Reakciona smeša je mešana tokom 16 h na ambijentalnoj temperaturi. Rastvarač je odstranjen pod smanjenim pritiskom, a sirove materije su obnovljene u dihlorometanu i isprane sa vodom. Organski sloj je osušen (MgSO4), čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su ispareni do suvoće koje daje narandžastu čvrstu materiju, V-11.

LC-MS m/z = 289 (M+H)

[0057] Korak 4. U bocu od 30 mL pod pritiskom su stavljeni V-11 (2.8 g, 9.71 mmol), piridin hidrohlorid (6.73 g, 58.26 mmol), i piridin (50 mL), a smeša je grejana do 120° C tokom 16 h. Piridin je odstranjen pod smanjenim pritiskom. Sirove materije su rastvorene u smeši dihlorometan/metanol : 95/5 i isprane sa 1 N rastvorom HCl i vodom. Organski sloj je osušen (MgSO4), čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su odstranjeni pod smanjenim pritiskom koje daje VI-1. LC-MS m/z = 231 (M-H)

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.92 (t, J=7.37 Hz, 3 H) 1.33 - 1.43 (m, 2 H) 1.50 - 1.59 (m, 2 H) 3.41 - 3.49 (m, 2 H) 5.79 - 5.88 (m, 1 H) 6.02 (d, J=8.14 Hz, 1 H) 6.91 (br. s., 2 H) 6.99 - 7.04 (m, 1 H) 10.78 (br. s., 1 H) 13.35 (br. s., 1 H)

[0058] Korak 5. U bocu od 100 mL su stavljeni VI-1 (175 mg, 0.753 mmol), cezijum karbonat (0.74 g, 2.26 mmol) i DMF (15 mL). Smeša je mešana na ambijentalnoj temperaturi tokom 30 min. Dodan je 2-bromoetil metil etar (0.089 mL, 0.94 mmol), a smeša je mešana tokom 16 h na sobnoj temperaturi. Rastvarač je odstranjen pod smanjenim pritiskom, a sirovi talog je prečišćen uz pomoć HPLC (RP Vydac Denali C18 - 10 µm, 250 g, 5 cm; mobilna faza: 0.25% rastvor NH4HCO3u vodi, metanol), najbolje frakcije su sakupljene, a rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom koje daje 11 u formi čvrste materije.

Priprema 12 (referentno jedinjenje)

[0059]

[0060] Korak 1. V-2 je rastvoren u DMF (15 mL) i očišćen sa N2u uljanoj banji na 80° C tokom 10 min. Tada su dodani bi(trifenilfosfin)paladijum(II) dihlorid (69 mg, 0.098 mmol), trifenilfosfin (57.6 mg, 0.22 mmol) i bakar jodid (42.5 mg, 0.22 mmol). Nakon 5 min čišćenja sa N2, dodan je dietilamin (3.15 mL, 30.31 mmol), a tada i 2-piridiletin (168 mg, 1.63 mmol). Posuda je zatvorena, a reakciona smeša je mešana na 80° C tokom 16 h. Reakciona smeša je izlivena u ledenu vodu, a precipitat je izolovan uz pomoć filtracije, ispran sa vodom i osušen u vakuumu. Produkt je mešan u dihlorometanu tokom 30 min. Precipitat je izolovan uz pomoć filtracije, ispran sa dihlorometanom i diizopropil etrom pa je osušen u vakuumu na 50° C koje daje V-12.

LC-MS m/z = 263 (M-H)

[0061] Korak 2. U rastvor V-12 (300 mg, 1.15 mmol) u THF (50 mL) je stavljen 10% Pd/C (100 mg) u atmosferi N2(gas). Reakciona smeša je mešana tokom 16 h na sobnoj temperaturi, a tada je filtrirana kroz upakovani dekalit. Rastvarač iz filtrata je odstranjen pod smanjenim pritiskom koje daje sirovi V-13, koji je korišćen u sledećem koraku.

LC-MS m/z = 267 (M-H)

[0062] Korak 3. Primer 12 je pripremljen u skladu sa postupkom za pripremu 9.

Priprema 14 (referentno jedinjenje)

[0063]

[0064] Korak 1. Intermedijari VI-2 i VI-3 su pripremljeni u skladu sa postupkom za pripremu VI-1. VI-3 je izolovan nakon mešanja sa diizopropiletrom na sobnoj temperaturi.

VI-2 : LC-MS m/z = 337 (M+H)

VI-3 : LC-MS m/z = 379 (M+H)

[0065] Korak 2. Jedinjenje 14 je pripremljeno u skladu sa postupkom za pripremu intermedijara V-12.

Priprema 15 (referentno jedinjenje)

[0066]

[0067] Korak 1. U bocu sa okruglim dnom od 500 mL, opremljenu sa magnetnom mešalicom, su stavljeni hidrohlorid 3-aminoftalne kiseline (25 g, 115 mmol), etanol (250 mL), cijanamid (7.25 g, 172 mmol), i koncentrovana HCl (6 mL). Boca je opremljena sa reflukskondenzatorom, a smeša je ostavljena da se meša na temperaturi refluksa tokom 6 h. Kroz jednočasovne intervale je dodavana koncentrovana HCl (0.5 mL), uz pomoć staklene pipete. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom koje daje žuto ulje. Sirove materije su osušene preko silika-gela, a tada su delomično prečišćene uz pomoć kolonske hromatografije (silika-gel) uz korišćenje dihlorometana – 10% metanola u gradijentu od dihlorometana. Sirove materije, žuta čvrsta materija, V-14, su korišćene kao takve u sledećem koraku.

LC-MS m/z = 234 (M+H).

[0068] Korak 2. U bocu sa okruglim dnom od 100 mL, opremljenu sa magnetnom mešalicom, su stavljeni V-14 (1.7 g, 7.29 mmol), bezvodni DMF (25 mL), DBU (3.3 g, 21.87 mmol), i PyBOP (4.55 g, 8.75 mmol). Reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Tada je dodan n-butilamin (2.1 g, 29.2 mmol), a smeša je ostavljena da se meša tokom 15 h na sobnoj temperaturi. Rastvarač je odstranjen pod smanjenim pritiskom, a sirova materija je filtrirana kroz silika-gel uz korišćenje 20% metanola u dihlorometanu. Rastvarači iz filtrata su odstranjeni pod smanjenim pritiskom, a sirovo ulje (15,4 g) je prečišćeno uz pomoć kolonske hromatografije reverzene faze (RP Vydac Denali C18 - 10 µm, 200 g, 5 cm). Mobilna faza (0.25% rastvor NH4HCO3u vodi, CH3CN).

Priprema 16 (referentno jedinjenje)

[0069]

[0070] U suspenziju 10% Pd/C u metanolu (25 mL) u atmosferi N2je dodano jedinjenje 14 (111 mg, 0.39 mmol). Azotna atmosfera je odstranjena i zamenjena sa gasovitim vodonikom. Smeša je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi sve dok se ne konzumira 2 ekvivalenta gasovitog vodonika. Reakciona smeša je filtrirana kroz upakovani dekalit. Rastvarač iz filtrata je odstranjen pod smanjenim pritiskom. Sirova materija je prečišćena uz pomoć kolonske hromatografije (silika-gel) uz korišćenje dihlorometana – 10% metanola u gradijentu dihlorometana koje daje 16.

Priprema 18

[0071]

[0072] 17 (625 mg, 2.28 mmol) je rastvoren u bezvodnom THF (10 mL). Dodan je LAH (1 M u THF, 3.42 mL, 3.42 mmol), kap po kap, a reakciona smeša je mešana tokom 3 h na sobnoj temperaturi. LC-MS je pokazala kompletnu konverziju željenog produkta. Reakciona smeša je ugašena sa zas. vod. NH4Cl, čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su odstranjeni pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen uz pomoć prep. HPLC koje daje produkt u formi bele čvrste materije.

Priprema 19 (referentno jedinjenje)

[0073]

[0074] Smeša VI-2 (500 mg, 1.48 mmol), tetrakis(trifenilfosfin)paladijuma (86 mg, 0.074 mmol), i cink cijanida (106 mg, 0.89 mmol) u DMF (5 mL) u tubi od 10 mL je obrađena uz pomoć mikrotalasnog zračenja na 160° C tokom 10 min. Smeša je ohlađena do sobne temperature pa je koncentrovana in vacuo. Talog je podeljen između vode i dihlorometana. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), rastvarači su odstranjeni uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su koncentrovani in vacuo. Produkt je smrvljen u CH3CN, čvrsta materija je izolovana uz pomoć filtracije. Otklanjanje zaštite sa acila je ostvareno nakon tretmana sa natrijum metoksidom u metanolu na 60° C tokom jednog časa. Smeša je ohlađena, a produkt je precipitiran. Bela čvrsta materija, 19, je izolovana uz pomoć filtracije pa je osušena u vakuumu.

Priprema 20 (referentno jedinjenje)

[0075]

[0076] U bocu od 50 mL, opremljenu sa magnetnom mešalicom i poprskanu sa gasovitim azotom, su stavljeni VI-3 (300 mg, 0.79 mmol), ester boronske kiseline (198 mg, 0.95 mmol), voda (3 mL, degazirana) i DME (6 mL, degaziran), tada su dodani natrijum bikarbonat (199 mg, 2.37 mmol) i PdCl2(PPh3)2(55 mg, 0.079 mmol), a smeša je grejana do 90° C tokom 1 h. Smeša je ohlađena pa je dodan etil acetat. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su odstranjeni in vacuo. Talog je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije (silika-gel) u gradijentu dihlorometana – 10% metanola u dihlorometanu (koji sadrži amonijak). Frakcije sa produktom su sakupljene i koncentrovane in vacuo. Otklanjanje zaštite sa acila je ostvareno nakon tretmana sa natrijum metoksidom u metanolu na 60° C tokom jednog časa. Rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom, a talog je podeljen između vode i dihlorometana. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), rastvarači su odstranjeni uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su odstranjeni in vacuo. Produkt je kristalizovan iz CH3CN, izolovan uz pomoć filtracije i osušen in vacuo kako bi se dobila bela čvrsta materija, 20.

Priprema 21 (referentno jedinjenje)

[0077]

[0078] U prvu posudu, opremljenu sa magnetnom mešalicom i preklopnim poklopcem, rastvor Pd2(dba)3(6 mg, 0.007 mmol) i 2-di-tert-butilfosfino-3,4,5,6-tetrametil-2',4',6'-triizopropil-1,1'-bifenila (6 mg, 0.013 mmol) u toluenu (0.5 mL) je ispran sa gasovitim N2nakon čega je sve mešano na 120° C tokom 3 min. Druga boca, opremljena sa magnetnom mešalicom i preklopnim poklopcem, je nabijena sa 2-metilimidazolom (104 mg, 1.26 mmol) i K3PO4(224 mg, 1.05 mmol), a tada je dodan i VI-3 (200 mg, 0.53 mmol) i sve je takođe isprano sa N2(gas). Nakon toga je u drugu bocu dodan prethodno pripremljeni rastvor katalizatora, a tada uz pomoć šprica su dodani i bezvodni toluen (0.5 mL) i t-butanol (1.0 mL) (ukupno 2 mL toluena : t-BuOH – 1:1). Reakciona smeša je grejana do 120° C tokom 12 h.

[0079] Smeša je ohlađena pa je dodan natrijum metoksid (30% u metanolu). Smeša je grejana na 60° C tokom 1 h. Smeša je ohlađena do sobne temperature pa je koncentrovana in vacuo.

Talog je podeljen između vode i dihlorometana. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su koncentrovani in vacuo. Sirova materija je prečišćena uz pomoć prep. HPLC (RP SunFire Prep C18 OBD-10 µm, 30 x 150 mm). Mobilna faza (0.25% rastvor NH4HCO3u vodi, CH3CN). Frakcije sa produktom su sakupljene i koncentrovane in vacuo kako bi se dobilo jedinjenje 21.

Priprema 22 (referentno jedinjenje)

[0080]

[0081] Smeša VI-2 (500 mg, 1.48 mmol), tributil(1-etoksivinil)tin (0.626 mL, 1.85 mmol), PdCl2(PPh3)2(220 mg, 0.31 mmol) u DMF (10 mL) je grejan do 80° C tokom 16 h. Reakciona smeša je ohlađena pa je dodana HCl (1 N, 2 mL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 h, tada je izlivena u zas. vod. NaHCO3(100 mL), a precipitat je izolovan uz pomoć filtracije, obnovljen u dihlorometanu, osušen (MgSO4), čvrste materije su odstranjen uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su koncentrovani in vacuo. Produkt je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije (silika-gel) u gradijentu dihlorometana – 5% metanola u dihlorometanu, frakcije sa produktom su sakupljene i koncentrovane in vacuo. Produkt je smrvljen u DIPE, filtriran i osušen u vakuumu koje daje bledo žutu čvrstu materiju.

[0082] U smešu su dodani metanol (6 mL) i natrijum metoksid (0.716 mL) i sve je mešano na 60° C tokom 1 h. Smeša je ohlađena i koncentrovana in vacuo. Talog je podeljen između vode i dihlorometana. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su koncentrovani in vacuo. Produkt je smrvljen u DIPE, izolovan uz pomoć filtracije pa je osušen u vakuumu koje daje žutu čvrstu materiju, 22.

Priprema 23 (referentno jedinjenje)

[0083]

[0084] 22 (59 mg, 0.23 mmol) je suspendovan u metanolu (2 mL), a tada je dodan natrijum borohidrid (9 mg, 0.23 mmol). Smeša je mešana u atmosferi N2(gas) na sobnoj temperaturi tokom dva časa. Smeša je razređena sa dihlorometanom (5 mL), a tada je dodan zas. vod. NH4Cl (0.5 mL) pa još i NaHCO3. Organski sloj je osušen (MgSO4), čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su koncentrovani in vacuo. Produkt je smrvljen u DIPE, izolovan uz pomoć filtracije pa je osušen u vakuumu koje daje bledo žutu čvrstu materiju, 23.

Priprema 24 (referentno jedinjenje)

[0085]

[0086] Korak 1. Autoklav volumena 75 mL od nerđajućeg čelika je nabijen (u atmosferi azota) sa VI-2 (626 mg, 1.87 mmol), Pd(OAc)2(8 mg, 0.037 mmol), 1,3-bi(difenilfosfino)propanom (31 mg, 0.074 mmol), kalijum acetatom (364 mg, 3.71 mmol), THF (20 mL), i metanolom (20 mL). Autoklav je zatvoren, a pritisak je povećan do 30 bara CO (gas). Reakciona smeša je mešana tokom 16 h na 120° C. Reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, a tada je koncentrovana in vacuo. Talog je rastvoren u vodi pa je ekstrahovan sa dihlorometanom. Organski sloj je osušen (MgSO4), čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarač iz filtrata je koncentrovan in vacuo. Produkt je prečišćen na koloni od silike uz korišćenje dihlorometana – 5% metanola u gradijentu dihlorometana. Frakcije sa produktom su sakupljene i koncentrovane in vacuo kako bi se dobila prljavo-bela čvrsta materija, VI-4.

[0087] Korak 2. U rastvor VI-4 (190 mg, 0.69 mmol) u bezvodnom THF (20 mL) je dodan LAH (1 M u THF, 1.04 mL, 1.04 mmol) na -75° C u atmosferi azota. Reakciona smeša je ostavljena da se meša tokom dva časa uz polako grejanje do 0° C. Tada je smeša ohlađena u banji sa smešom led-etanol pa je pažljivo ugašena uz pomoć dodavanja 15 mL etil acetata, a tada i Na2SO410H2O (2 g). Smeša je mešana tokom jednog časa, a tada je osušena preko MgSO4, čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarač iz filtrata je odstranjen pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen uz pomoć prep. HPLC (RP Vydac Denali C18 -10 µm, 200 g, 5 cm). Mobilna faza (0.25% rastvor NH4HCO3u vodi, CH3CN), a tada i uz pomoć SFC-prečišćavanja (Chiralpak Diacel AD 30 x 250 mm). Mobilna faza (CO2, metanol sa 0.2% izopropilaminom), željene frakcije su sakupljene, a rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom koje daje 24.

Priprema 25

[0088]

[0089] Korak 1. V-14 je reagovan sa trimetilacetilenom u skladu sa postupkom za pripremu jedinjenja 14, koje daje V-15.

LC-MS m/z = 258 (M+H)

[0090] Korak 2. VI-5 je pripremljeni u skladu sa postupkom za pripremu jedinjenja 9. Otklanjanje zaštite sa TMS-grupe je provedeno u NaHCO3, vodi, i smeši metanola.

LC-MS m/z = 357(

[0091] Korak 3. Hidrogenacija je provedena u skladu sa postupkom za pripremu 16.

Priprema 26

[0092]

[0093] Korak 1. Karbonilacija 2-bromo-4-izopropilanilina katalizovana paladijumom je provedena u skladu sa procedurom za pripremu VI-4 osim šta je reakcija provedena na 110° C koje daje 2-amino-5-izopropilbenzojevu kiselinu.

LC-MS m/z = 180 (M+H)

[0094] Korak 2. V-16 je pripremljeni u skladu sa postupkom za pripremu V-1.

LC-MS m/z = 204(M+H)

[0095] Korak 3. Primer 26 je pripremljeni u skladu sa postupkom za pripremu 15.

Priprema 27

[0096]

[0097] Korak 1. Cijanamid je rastvoren u etru, a smeša je mešana u atmosferi gasovitog azota. U reakcionu smešu je dodana HCl (2 M u etru), kap po kap na ambijentalnoj temperaturi, a mešanje je nastavljeno tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Precipitat, A-2, je izolovan uz pomoć filtracije pa je osušen in vacuo na 50° C.

[0098] Korak 2. SO2(CH3)2(20.4 g, 217 mmol) je grejan do topljenja. Dodan je A-2 (3.3 g, 29 mmol), a nastala smeša je mešana i grejana do 120° C kako bi se potpuno rastvorila. U reakcionu smešu je dodan metil 5-(2-hloro-4-trifluorometilfenoksi)-antranilat (5 g, 14.5 mmol), u jednoj porciji. Mešanje je nastavljeno tokom 30 min. Reakciona smeša je tretirana sa vodom (10 mL) pa je mešana tokom 10 min. Precipitat, V-17, bela čvrsta materija, je izolovan uz pomoć filtracije pa je osušen u vakuum-pećnici.

LC-MS m/z = 356 (M+H)

[0099] Korak 3. Jedinjenje 27 je pripremljeno u skladu sa postupkom za pripremu 15.

Priprema 28 (referentno jedinjenje)

[0100]

[0101] Korak 1. A-3 (101 g, 0.44 mol) je rastvoren u sumpornoj kiselini (850 mL). Ovaj rastvor je ohlađen do 0° C. Dodana je HNO3(18.3 mL, 0.44 mol) u sumpornoj kiselini (200 mL), kap po kap tokom 2 h. Reakciona smeša je mešana tokom 45 min na -10° C, a tada je izlivena u smešu led-voda (6 L). Rastvarači su dekantirani, a talog je rastvoren u dihlorometanu (1.5 L). Vodeni sloj je ekstrahovan sa dihlorometanom (1 L). Pomešani organski slojevi su osušeni (MgSO4), čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarač je odstranjen pod smanjenim pritiskom koje daje A-4, a nus-produkt, izomer A-5, je odvojen uz pomoć kolonske hromatografije (silika-gela) uz korišćenje gradijenta heptan – etil acetat.

[0102] Korak 2. U Erlenmeyer-ovu bocu od 500 mL, opremljenu u sa magnetnom mešalicom i poprskanu sa gasovitim azotom, su stavljeni metanol (100 mL, koji sadrži 2% tiofen) i 5% Pt/C (2 g, 0.513 mmol), a tada je cela smeša ostavljena u atmosferi vodonika. Reakciona smeša je mešana tokom 16 h na sobnoj temperaturi. Katalizator je odstranjen uz pomoć filtracije, a isparljive materije iz filtrata su odstranjene pod smanjenim pritiskom. Talog je prečišćen na silici uz korišćenje gradijenta dihlorometan – dihlorometan : metanol (9:1) koje daje žuto ulje, IV-2.

LC-MS m/z = 244 (M+H)

[0103] Korak 3. Intermedijar V-18 je pripremljeni u skladu sa postupkom za pripremu V-17. LC-MS m/z = 254 (M+H)

[0104] Korak 4. Za sintezu 28 iz V-18 je primenjena procedura za pripremu jedinjenja 9.

Priprema jedinjenja 29

[0105]

[0106] Korak 1. Primer 29 je pripremljen nakon katalitičke hidrogenacije 27, u skladu sa postupkom koji je opisan kod pripreme 25.

Priprema 90 (referentno jedinjenje)

[0107]

[0108] Korak 1.17 (12.515 g, 45.62 mmol) je rastvoren u THF (100 mL). Dodan je LiOH (3.83 g, 91.2 mmol), rastvoren u vodi (20 mL), a tada i metanol (50 mL). Reakciona smeša je mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Isparljive materije su odstranjene pod smanjenim pritiskom, čvrsta materija je isprana sa vodom pa je smrvljena sa DIPE koje daje VI-6 u formi prljavobele čvrste materije.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.95 (t, J=7.4 Hz, 3 H), 1.40 (dq, J=14.9, 7.3 Hz, 2 H), 1.68 (kvint., J=7.3 Hz, 2 H), 3.54 - 3.65 (m, 2 H), 7.89 - 8.05 (m, 2 H), 8.14 - 8.31 (m, 2 H), 9.11 (br. s., 1 H), 11.10 (br. s., 1 H), 16.37 (br. s., 1 H)

[0109] Korak 2. U posudu od 50 mL su stavljeni VI-6 (200 mg, 0.768 mmol), DMF (10 mL), trietilamin (0.641 mL, 4.61 mmol), 3-aminopiridin (181 mg, 1.92 mmol) i dietil cijanofosfonat (0.233 mL, 1.54 mmol). Reakcija je ostavljena da se meša tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Rastvarač je odstranjen pod smanjenim pritiskom, a sirova materija je prečišćena uz pomoć kolonske hromatografije reverzene faze (Sunfire Prep C18, OBD 10 µm, 30 x 150 mm. Mobilna faza (0.25% rastvor NH4HCO3u vodi, metanol) koje daje 90.

Shema sinteze AA-9

[0110]

Sinteza intermedijara AA-3

[0111]

[0112] U rastvor valeraldehida (43 g, 500 mmol) u THF (1 L) je dodan AA-2 (200 g, 532 mmol), a reakciona smeša je mešana tokom 16 h na sobnoj temperaturi. Rastvarači su ispareni, a talog je razređen u petroleum etru pa je filtriran. Rastvarači iz filtrata su odstranjeni pod smanjenim pritiskom, a talog je prečišćen uz pomoć hromatografije na silika-gelu uz korišćenje gradijenta petroleum etar – 3% etil acetat koje daje AA-3 (90 g) u formi bezbojnog ulja.

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 6.81-6.77 (m, 1H), 5.68-5.64 (td, J=1.2Hz, 15.6 Hz, 1H), 2.11-2.09 (m, 2H), 1.406 (s, 9H), 1.38-1.26(m, 4H), 0.85-0.81 (t, J=7.2Hz, 3H).

Sinteza jedinjenja AA-5

[0113]

[0114] n-butil litijum (290 mL, 725 mmol, 1.5 vod.) je dodan u mešani rastvor AA-4 (165 g, 781 mmol) u THF (800 mL) na -78° C. Reakciona smeša je mešana tokom 30 min, tada je dodan AA-3 (90 g, 488.4 mmol) u THF (400 mL), a reakciona smeša je mešana tokom 2 h na -78° C. Smeša je ugašena sa zas. vod. rastvorom NH4Cl pa je grejana do sobne temperature. Produkt je podeljen između etil acetata i vode. Organska faza je isprana sa slanicom, osušena i isparena. Talog je prečišćen uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa 5% etil acetatom u petroleum etrom koje daje bezbojno ulje, AA-5 (132 g).

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 7.36-7.16 (m, 10H), 3.75-3.70 (m, 2H), 3.43-3.39 (d, J=15.2Hz, 1H), 3.33-3.15 (m, 1H), 1.86-1.80 (m, 2H), 1.47-1.37 (m, 2H), 1.32 (s, 9H), 1.26-1.17 (m, 7H), 0.83-0.79 (t, J=7.2Hz, 3H).

Sinteza AA-6

[0115]

[0116] AA-5 (130 g, 328 mmol) je rastvoren u THF (1.5 L), a tada je dodan LAH (20 g, 526 mmol) na 0° C u malim porcijama. Nastala smeša je mešana na istoj temperaturi tokom 2 h, a tada je ostavljena da se ugreje do sobne temperature. Smeša je ugašena sa zas. vod. rastvorom NH4Cl. Produkt je podeljen između etil acetata i vode. Organska faza je isprana sa slanicom, osušena i isparena. Pomešani organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije pa su koncentrovane koje daje sirovi AA-6 (100 g), koji je korišćen u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 7.33-7.14 (m, 10H), 3.91-3.86 (m, 1H), 3.80-3.77 (d, J=13.6Hz, 1H), 3.63-3.60 (d, J=13.6Hz, 1H), 3.43-3.42 (m, 1 H), 3.15-3.10 (m, 1H), 2.70-2.63 (m, 2H), 1.65-1.28 (m, 10H), 0.89-0.81 (m, 3H).

Sinteza AA-9

[0117]

[0118] Rastvor AA-6 (38 g, 116.75 mmol) i 10% Pd/C u metanolu (200 mL) je hidrogeniran pod pritiskom od 50 psi u atmosferi vodonika na 50° C tokom 24 h. Reakciona smeša je filtrirana, a rastvarač je isparen koje daje sirovi produkt AA-7 (17 g).

[0119] Sirovi produkt je rastvoren u dihlorometanu (200 mL), dodani su trietilamin (26.17 g, 259.1 mmol) i di-tert-butil dikarbonat (84.7 g, 194.4 mmol) na 0° C. Nastala smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Smeša je podeljena između dihlorometana i vode. Organska faza je isprana sa slanicom, osušena i isparena. Talog je prečišćen uz pomoć hromatografije na silika-gelu uz eluciju sa 20% etil acetatom u petroleum etru koje daje AA-8 (13 g) u formi bezbojnog ulja.

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): δ ppm 4.08-4.03 (br, 1H), 3.68 (m, 1H), 3.58-3.55 (m, 2H), 3.20-2.90(br, 1H), 1.80-1.73 (m, 1H), 1.42-1.17 (m, 15 H), 0.85-0.82(t, J=6.8Hz, 3H).

[0120] AA-8 (42 g, 0.182 mol) je rastvoren u dioksanu (200 mL), a tada je dodana smeša dioksan/HCl (4 M, 200 mL) na 0° C. Nastala smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Rastvarač je isparen kako bi se dobio sirovi produkt. U ovaj sirovi produkt je dodana smeša dihlorometan/petroleum etar (50 mL, 1:1, v/v), a supernatant je dekantiran. Ova procedure je ponovljena dva puta sa ciljem da se dobije ulje, AA-9 (26.6 g).

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ ppm 8.04 (s, 3H), 3.60-3.49 (m, 2H), 3.16-3.15 (m, 1H), 1.71-1.67 (m, 2H), 1.60-1.55(m, 2H), 1.33-1.26 (m, 4H), 0.90-0.87 (t, J=6.8Hz, 3H).

Priprema AA-10

[0121]

[0122] AA-10 je pripremljen u skladu sa postupkom iz pripreme AA-9, uz korišćenje butiraldehida umesto valeraldehida.

<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ ppm 8.07 (s, 3H), 4.85 (br, 1H), 3.57-3.45 (m, 2H), 3.14-3.12 (m, 1H), 1.70-1.64 (m, 2H), 1.56-1.49 (m, 2H), 1.38-1.30 (m, 2H), 0.90-0.80 (t, J=6.8Hz, 3H).

Tabela 1. Jedinjenja formule (I).

Analitički postupci

[0123] Sva jedinjenja su karakterizovana uz pomoć LC-MS. Korišćeni su sledeći LC-MS postupci:

Postupak A. UPLC reverzne faze (tečna hromatografija ultra-performansi) je provedena na C18 koloni sa premošćenim hibridom etilsiloksan/silika (BEH) (1.7 µm, 2.1 x 50 mm; Waters Acquity) kod stope protoka od 0.8 mL/min. Korišćene su dve mobilne faze (10 mM amonijum acetat u smeši H2O/acetonitril 95/5; mobilna faza B: acetonitril) sa ciljem da se uspostave uslovi gradijenta od 95% A i 5% B do 5% A i 95% B tokom 1.3 min uz zadržavanje od 0.7 min. Korišćen je injekcijski volumen od 0.75 µl. Voltaža konusa je bila 30 V za modus pozitivne jonizacije i 30 V za modus negative jonizacije.

Postupak B. HPLC reverzne faze je provedena na koloni Xterra MS C18 (3.5 µm, 4.6 x 100 mm) uz stopu protoka od 1.6 mL/min. Tri mobilne faze (mobilna faza A: 95% 25 mM amonijumacetat 5% acetonitril; mobilna faza B: acetonitril; mobilna faza C: metanol) su korišćene sa ciljem da se uspostave uslovi gradijenta od 100% A do 50% B i 50% C tokom 6.5 min, do 100% B tokom 0.5 min, 100% B tokom 1 min uz ponovno uravnoteženje sa 100% A tokom 1.5 min. Korišćen je injekcijski volumen od 10 µl.

Postupak C. UPLC reverzne faza (tečna hromatografija ultra-performansi) je provedena na C18 koloni od hibrida etilsiloksan/silika (BEH) (1.7 µm, 2.1 x 50 mm; Waters Acquity) kod stope protoka od 0.8 mL/min. Korišćene su dve mobilne faze (mobilna faza A: 10 mM amonijum acetat u smeši H2O/acetonitril 95/5; mobilna faza B: acetonitril) sa ciljem da se uspostave uslovi gradijenta od 95% A i 5% B do 5% A i 95% B tokom 1.3 min uz zadržavanje od 0.2 min. Korišćen je injekcijski volumen od 0.5 µl.

Biološka aktivnost jedinjenja sa formulom (I)

Opis bioloških ogleda

Procena aktivnosti TLR7 i TLR8

[0124] Sposobnost jedinjenja da aktivišu humani TLR7 i/ili TLR8 je procenjena primenom ćelijskog reporter-ogleda uz korišćenje HEK293 ćelija koje su bile privremeno transfektovane sa vektorom za ekspresiju TLR7 ili TLR8 i NFκB-luc reporter-konstruktom. U jednom primeru, konstrukt za ekspresiju TLR eksprimira odgovarajuću sekvencu divljeg-tipa ili mutiranu sekvencu koja sadrži deleciju drugog ponavljanja bogatog sa leucinom iz TLR. Za takve mutirane TLR-belančevine je ranije pokazano da su podložnije na aktivisanje uz pomoć agonista (US 7498409).

[0125] Ukratko, HEK293 ćelije su rasle u medijumu (DMEM obogaćen sa 10% FCS i 2 mM glutaminom). Sa ciljem da se ćelije u posudama od 10 cm transfektuju, pomenute su odvojene uz pomoć tripsin-EDTA, transfektovane sa smešom CMV-TLR7 ili sa TLR8 plazmidom (750 ng), NFκB-luc plazmidom (375 ng) u prisustvu reagensa za transfektovanje pa su inkubirane tokom 24 h na 37° C u vlažnoj atmosferi (5% CO2). Transfektovane ćelije su tada odvojene uz pomoć tripsin-EDTA, isprane sa PBS i resuspendovane u medijumu gustine 1.67 x 10<5>ćelija/mL. Trideset mikrolitara ćelija je dodano u svaku komoricu na pločicama sa 384-komorica, u koje je prethodno dodano 10 µL jedinjenja u 4% DMSO. Nakon 6 h inkubacije na 37° C uz 5% CO2, luciferazna aktivnost je određena uz pomoć dodavanja 15 µl supstrata Steady Lite Plus (Perkin Elmer) u svaku komoricu, a očitanje je provedeno na aparatu za čitanje mikropločica ViewLux ultraHTS (Perkin Elmer). Krive odgovora na dozu su generisane na osnovu merenja koja su ponovljena četiri puta. Vrednosti najnižih efektivnih koncentracija (LEC), definisano kao koncentracija koja indukuje efekt koji je barem dva puta iznad standardne devijacije ogleda, su određene za svako jedinjenje.

[0126] Toksičnost jedinjenja je paralelno određena uz korišćenje sličnih serija razblaženja jedinjenja uz 30 µL ćelija po komorici transfektovanih samo sa konstruktom CMV-TLR7 (1.67 x 10<5>ćelija/mL), u pločicama sa 384-komorica. Vijabilnost ćelija je izmerena nakon 6 h inkubacije na 37° C uz 5% CO2, uz pomoć dodavanja 15 µL ATP lite (Perkin Elmer) po komorici i očitanje na aparatu za čitanje mikropločica ViewLux ultraHTS (Perkin Elmer). Podaci su prikazani kao CC50.

Supresija replikacije HCV-replikona

[0127] Aktivisanje humanog TLR7 rezultuje robusnom proizvodnjom interferona od strane plazmacitoidnih dendritičnih ćelija prisutnih u ljudskoj krvi. Potencijal jedinjenja da indukuju interferon je procenjen na osnovu provere antiviralne aktivnosti u sistemu sa HCV-replikonom nakon inkubacije u kondicioniranom medijumu iz mononuklearnih ćelija iz periferne krvi (PBMC). Ogled sa HCV-replikonom se bazira na bicistronskom ekspresionom konstruktu, kao šta je opisano kod autora Lohmann et al. (Science (1999) 285: 110-113; Journal of Virology (2003) 77: 3007-153019) uz modifikacije od autora Krieger et al. (Journal of Virology (2001) 75: 4614-4624). Ogled primenjuje stabilno transfektovanu ćelijsku liniju Huh-7 luc/neo koja sadrži RNA koja kodira konstrukt za bicistronsku ekspresiju koji sadrži NS3-NS5B regione iz divljeg tipa HCV (tip 1b) koji se translatiraju sa internog ribozomskog ulaznog mesta (Internal Ribosome Entry Site – IRES) iz virusa encefalomiokarditisa (EMCV), ispred kojeg se nalazi reporter-gen (luciferaza iz svitca) i selektivan gen marker (neoR, neomicin fosfotransferaza). Konstrukt je okružen sa 5' i 3' NTR (ne-translatirani regioni) iz HCV (tip 1b). Kontinuirana kultura ćelija sa replikonom u prisutnosti G418 (neoR) je zavisna o replikaciji HCV RNA. Stabilno transfektovane replikon-ćelije koje repliciraju HCV RNA autonomno i u visokim nivoima, koja kodiraju inter alia luciferazu, su korišćene za profiliranje medijuma kondicioniranih ćelijskih kultura.

[0128] Ukratko, PBMC su pripremljeni iz frakcija antikoagulisanog uzorka krvi koje sadrže bela krvna zrnca i trombocite od najmanje dva donora uz korišćenje standardnog Ficollprotokola za centrifugovanje. Izolovani PBMC su resuspendovani u RPMI medijumu koji je bio obogaćen sa 10% humanim AB serumom, a 2 x 10<5>ćelija/komorici je dodano u pločice sa 384-komorica koje su sadržavale jedinjenja (70 µL totalni volumen). Nakon preko-noćne inkubacije, 10 µL of supernatanta je preneseno u pločice sa 384-komorica koje sadrže 2.2 x 10<3>replikon-ćelija/komorici u 30 µL (kultiviranih dan ranije). Sledećih 24 h inkubacije, replikacija je izmerena uz pomoć praćenja luciferazne aktivnosti primenom 40 µL supstrata Steady Lite Plus (Perkin Elmer) po komorici mereći sa aparatom za očitanje mikropločica ViewLux ultraHTS (Perkin Elmer). Inhibitorna aktivnost svakog jedinjenja prema Huh7-luc/neo ćelijama je prikazana u formi EC50vrednosti, definisano kao koncentracija jedinjenja koja je primenjena na PBMC i koja uzrokuje 50% redukciju luciferazne aktivnosti koje sa svoje strane pokazuje stepen replikacije replikon-RNA nakon prenosa definisane količine medijuma iz PBMC-kulture. Rekombinantni interferon α-2a (Roferon-A) je korišćen kao standardno kontrolno jedinjenje.

[0129] Biološka aktivnost jedinjenja sa formulom (I). Sva jedinjenja su pokazala CC50od >24 µM u ogledu HEK 293 TOX koji je opisan iznad.

Aktivisanje elemenata ISRE promotora

[0130] Potencijal jedinjenja da indukuju IFN-I je takođe procenjen uz merenje aktivnosti interferon-stimulisanih responsivnih elemenata (ISRE) uz pomoć kondicioniranog medijuma iz PBMC. ISRE-element sa sekvencom GAAACTGAAACT je veoma responsivan na transkripcioni faktor STAT1-STAT2-IRF9, aktivisan nakon vezanja IFN-I na njihov receptor IFNAR (Clontech, PT3372-5W). Plazmid pISRE-Luc od Clontech-a (ref. 631913) sadrži 5 kopija ovog ISRE-elementa, nakon čega se nalazi ORF od luciferaze. HEK293 ćelijska-linija koja je stabilno transfektovana sa pISRE-Luc (HEK-ISREluc) je uspostavljena sa ciljem da se profilira kondicionirani medijum iz kulture PBMC ćelija.

[0131] Ukratko, PBMC su pripremljeni iz frakcija antikoagulisanog uzorka krvi koje sadrže bela krvna zrnca i trombocite od najmanje dva donora uz korišćenje standardnog protokola Ficoll-centrifugovanja. Izolovani PBMC su resuspendovani u RPMI medijumu koji je bio obogaćen sa 10% humanim AB serumom, a 2 x 10<5>ćelija/komorica je dodano u pločicu sa 384-komorica koje sadrže jedinjenja (70 µL totalni volumen). Nakon preko-noćne inkubacije, 10 µL supernatanta je preneseno u pločice sa 384-komorica koje sadrže 5 x 10<3>HEK-ISREluc ćelija po komorici u 30 µL (kultiviranih prethodni dan). Sledećih 24 h inkubacije, aktivisanje ISRE-elemenata je izmereno uz pomoć određivanja aktivnosti luciferaze primenom 40 µL supstrata Steady Lite Plus (Perkin Elmer) po komorici mereći sa aparatom za očitanje mikropločica ViewLux ultraHTS (Perkin Elmer). Stimulaciona aktivnost svakog jedinjenja prema HEK-ISREluc ćelijama je prikazana kao LEC vrednost, definisano kao koncentracija jedinjenja primenjena na PBMC koja povećava luciferaznu aktivnost najmanje dva puta iznad standardne devijacije ogleda. LEC sa svoje strane pokazuje stepen aktivisanja ISRE nakon prenosa definisane količine medijuma iz PBMC kulture. Rekombinantni interferon α-2a (Roferon-A) je korišćen kao standardno kontrolno jedinjenje.

[0132] Za određeno jedinjenje, LEC vrednost dobivena iz ogleda se nalazi u istom rasponu kao i EC50vrednosti dobivene iz ogleda "supresije HCV replikacije". Tako, moguće je da se uporedi potencijal jedinjenja da indukuju IFN-I uz pomoć PBMC, mereno uz pomoć bilo kojeg od oba opisana ogleda.

* Analiza traje 48 sati

Claims (7)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje, naznačeno time, što ima formulu (I)
2. ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf, pri čemu R1je C4-8alkil supstituisan sa hidroksilom, R2je vodonik, halogen, hidroksil, amin, C1-7alkil, C1-7alkilamino, C1-6alkoksi, (C1-4)alkoksi-(C1-4)alkil, C3-6cikloalkil, C4-7heterocikl, aromatski biciklički heterocikl, arilalkil, heteroaril, heteroarilalkil, karboksilni amid, karboksilni ester od kojih svaki je opciono supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno izabranih iz halogena, hidroksila, amino, C1-6alkil, di-(C1- 6)alkilamino, C1-6alkilamino, C1-6alkila, C1-6alkoksi, C3-6cikloalkila, karboksilne kiseline, karboksilnog estera, karboksilnog amida, heterocikla, arila, alkenila, alkinila, arilalkila, heteroarila, heteroarilalkila ili nitrila, R3je vodonik, halogen, hidroksil, amin, C1-7alkil, C1-7alkenil, C1-7alkinil, C1-7alkilamino, C1-6alkoksi, (C1-4)alkoksi-(C1-4)alkil, C3-6cikloalkil, C4-7heterocikl, aromatski biciklički heterocikl, arilalkil, heteroaril, heteroarilalkil, ariloksi, heteroariloksi, keton, nitril od kojih je svaki opciono supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno izabranih iz halogena, hidroksila, amino, C1-6alkila, di-(C1-6)alkilamino, C1-6alkilamino, C1-6alkila, C1-6alkoksi, C3-6cikloalkila, karboksilne kiseline, karboksilnog estera, karboksilnog amida, heterocikla, arila, alkenila, alkinila, arilalkila, heteroarila, heteroarilalkila ili nitrila. R4je vodonik, halogen, hidroksil, amin, C1-7alkil, C1-7alkilamino, C1-6alkoksi, (C1-4)alkoksi-(C1-4)alkil, C3-6cikloalkil, C4-7heterocikl, biciklički heterocikl, arilalkil, heteroarilalkil, ariloksi, heteroariloksi od kojih je svaki opciono supstituisan sa jednim ili više supstituenata nezavisno izabranih iz halogena, hidroksila, amino, C1-6alkila, di-(C1-6)alkilamino, C1-6alkilamino, C1-6alkila, C1-6alkoksi, C3-6cikloalkila, karboksilne kiseline, karboksilnog estera, karboksilnog amida, heterocikla, arila, alkenila, alkinila, arilalkila, heteroarila, heteroarilalkila ili nitrila, a R5je vodonik, fluor, hlor ili metil pod uslovom da R2, R3, R4, i R5ne mogu svi da budu H. 2. Jedinjenje sa formulom (I) u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time, što R1je jedan od sledećih:
3. 3. Jedinjenje sa formulom (I) u skladu sa zahtevom 1 ili 2, naznačeno time, što R5je vodonik ili fluor.
4. 4. Jedinjenje sa formulom (I) u skladu sa zahtevima 1-3, naznačeno time, što ima strukturu
5. 5. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži jedinjenje sa formulom (I) ili neku njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf u skladu sa jednim ili više od zahteva od 1-4 zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, razređivača ili nosioca.
6. 6. Jedinjenje sa formulom (I) ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf u skladu sa jednim od zahteva od 1-4 ili neka farmaceutska kompozicija u skladu sa zahtevom 5, naznačeni time, što se koriste kao lek.
7. 7. Jedinjenje sa formulom (I) ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf u skladu sa jednim od zahteva od 1-4, ili neka farmaceutska kompozicija u skladu sa zahtevom 5, naznačeni time, što se koriste za tretman poremećaja u kojem je uključena modulacija TLR7 i/ili TLR8. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5