RS57225B1

RS57225B1 - Derivati pirolo[3,2-d]pirimidina za tretman viralnih infekcija i drugih bolesti

Info

Publication number: RS57225B1
Application number: RS20180577A
Authority: RS
Inventors: Gowan David Craig Mc; Stefaan Julien Last; Serge Maria Aloysius Pieters; Werner EMBRECHTS; Tim Hugo Maria Jonckers; Pierre Jean-Marie Bernard Raboisson
Original assignee: Janssen Sciences Ireland Uc
Priority date: 2012-10-10
Filing date: 2013-10-09
Publication date: 2018-07-31
Also published as: BR112015007586B1; CA2884478A1; HRP20180771T1; US20190330217A1; DK2906563T3; EA201590663A1; HK1209412A1; HUE037064T2; MX2015004517A; PL2906563T3; CL2015000898A1; BR112015007586A2; ZA201502383B; EP2906563A1; KR102280595B1; EA202090662A3; US20150239892A1; MX386924B; AU2013328732A1; US11220504B2

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na derivate pirolo[3,2-d]pirimidina, procese za njihovu pripremu, farmaceutske kompozicije.

[0002] Ovaj pronalazak se odnosi na derivate pirolo-pirimidina, a naročito na derivate pirolo[3,2-d]pirimidina koji mogu da se koriste u tretmanu viralnih infekcija, imuno ili upalnih poremećaja u kojima je uključena modulacija, ili agonizam, toll-like-receptora (razni TLR). Toll-like receptori su primarne transmembranske belančevine koje karakterizuje izvanćelijski domen bogat sa leucinom i citoplazmatsko produženje koje sadrži konzervisani region. Urođeni imuno-sistem može da prepozna molekularne obrasce povezane sa patogenom uz pomoć pomenutih TLR receptora koji se eksprimiraju na površini nekih tipova imuno-ćelija. Prepoznavanje stranih patogena aktiviše proizvodnju citokina i pozitivno reguliše kostimulacione molekule na fagocitima. Ovo dovodi do modulacije ponašanja T-ćelija.

[0003] Većina vrsta sisara poseduje između deset i petnaest tipova toll-like receptora. Trinaest TLR (jednostavno označenih TLR1 do TLR13) je identifikovano kod ljudi i miševa (zajedno), a ekvivalentne forme mnogih od ovih su pronađene i kod drugih vrsta sisara. Međutim, ekvivalenti nekih TLR, pronađenih kod ljudi, nisu otkriveni u ostalim sisarima. Na primer, gen koji kodira za belančevinu koja je analogna TLR10 u ljudi je prisutan i kod miševa, ali se čini da je bio promenjen tokom evolucije delovanjem retrovirusa. Sa druge strane, miševi eksprimiraju TLR 11, 12, i 13, od koji niti jedan nije prisutan kod ljudi. Drugi sisari mogu da eksprimiraju TLR koji ne mogu da se pronađu kod ljudi. Druge vrste ne-sisara mogu da poseduju TLR koji su različiti od onih od sisara, kao šta je TLR14, koji se nalazi kod fuga (ribe iz roda Takifugu). Ovo može da komplikuje proces korišćenja eksperimentalnih životinja kao modele za ljudski urođeni imunitet.

[0004] O toll-like receptorima vidi sledeće naučne tekstove: Hoffmann, J.A., Nature, 426, str.

33-38, 2003; Akira, S., Takeda, K., & Kaisho, T., Annual Rev. Immunology, 21, str.335-376, 2003; Ulevitch, R. J., Nature Reviews: Immunology, 4, str.512-520, 2004.

[0005] Jedinjenja koja pokazuju aktivnost prema toll-like receptorima su već opisana, poput heterocikličkih derivata iz dokumenta WO2000006577, adeninskih derivata iz dokumenata WO 98/01448 i WO 99/28321, i pirimidina iz dokumenta WO 2009/067081.

[0006] Kod tretmana nekih viralnih infekcija mogu da se administriraju regularne injekcije interferona (IFN-alfa), kao u slučaju hepatitisa C (HCV) (Fried et. al. Peginterferon-alfa plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection, N Engl J Med 2002; 347: 975-82). Oralno dostupni IFN induceri (mali molekuli) nude potencijalne prednosti zbog smanjene imunogenosti i jednostavnog administriranja. Tako, novi IFN induceri su potencijalno efektivna nova klasa lekova za tretman virusnih infekcija. Kao primer (iz literature) za IFN (inducer melog molekula) koji ima antiviralni efekt vidi De Clercq, E.; Descamps, J.; De Somer, P. Science 1978, 200, 563-565.

[0007] Interferon alfa se takođe daje pacijentima zajedno sa drugim lekovima kod tretmana nekih tipova raka (Eur. J. Cancer (46) str.2849-57, i Cancer Res.1992 (52) str.1056). Agonisti TLR 7/8 su takođe interesantni kao dodaci vakcinama zbog njihove sposobnosti da indukuju izraženi Th1 odgovor (Hum.Vaccines, 2009 (5), 381•394).

[0008] Međutim, još uvek postoji izražena potreba da se razviju novi modulatori toll-like receptora koji poseduju preferiranu selektivnost, i poboljšani bezbednosni profil u odnosu na jedinjenja iz sadašnjeg stanja tehnike.

[0009] U skladu sa ovim pronalaskom, obezbeđeno je jedinjenje sa formulom (I)

i njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat, ili polimorf, gde

R1je H, fluor ili metil;

R2je H, halogen ili C1-3alkil;

R3je C1-6alkil opciono supstituisan sa arilom koji je opciono dalje supstituisan sa jednim ili više suptituenata nezavisno izabranih iz ariloksi, halogena, arila, alkilamino, dialkilamino, heterocikloalkila, C1-6cikloalkila, C1-6alkila, karboksilne kiseline, karboksilnog estera, karboksilnog amida, nitrila, ili C1-6alkoksi; ili

R3je C1-6alkil opciono supstituisan sa C1-6alkenom, C3-7cikloalkilom ili C3-7heterocikloalkilom; ili

R3je C1-6alkil opciono supstituisan sa C1-6alkoksi koji je opciono dalje supstituisan sa arilom;

R4je C1-8alkil opciono supstituisan sa jednim ili više suptituenata nezavisno izabranih iz hidroksila, C1-6alkoksi, C1-6alkila, C3-7cikloalkila, C2-6alkenila, arila, heteroarila koji je opciono dalje supstituisan sa C1-6alkilom, i C3-7cikloalkila koji je opciono dalje supstituisan sa C1-6alkilom;

pod uslovom da je 2-amino-4-(N-butilamino)-5-(alfametilbenzil)pirolo[3,2-d] pirimidin isključen.

[0010] Preferirana jedinjenja su ona sa formulom (I) u kojoj R3je C1-3alkilna grupa supstituisana sa arilom (supstituisan ili ne), a R1, R2, i R4su opisani iznad.

[0011] U drugoj izvedba se nalaze jedinjenja sa formulom (I) u kojoj R3i R4su C1-3alkil supstituisan sa arilom, koji je opciono dalje supstituisan kao šta je opisano iznad.

[0012] U dodatnim izvedbama se nalaze ona jedinjenja sa formulom (I) u kojoj R1je vodonik, R2je fluor, a R3i R4su opisani iznad.

[0013] Druge preferirane izvedbe su one sa formulom (I) u kojoj R1je fluor, R2je vodonik, a R3i R4su opisani iznad.

[0014] Jedinjenja navedena u Tabelama I i II, koja imaju sledeće brojeve # 89, 94, 101, 144, 154, 156, 175, 192, 209, 213 i 215, su od posebnog interesa zbog njihovih karakteristika u skladu sa ovde opisanim pronalaskom.

[0015] Jedinjenja sa formulom (I) i njihove farmaceutski prihvatljive soli, solvati ili polimorfi poseduju aktivnost farmaceutska, a naročito aktivnost modulatora toll-like receptora (posebno TLR7 i/ili TLR8).

[0016] U dodatnom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje sa formulom (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, razređivača ili nosioca.

[0017] Nadalje, jedinjenje sa formulom (I) ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf u skladu sa ovim pronalaskom, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži pomenuto jedinjenje sa formulom (I) ili neku njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf može da se koristi kao lek.

[0018] Jedinjenje sa formulom (I) ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf, ili pomenuta farmaceutska kompozicija koja sadrži pomenuto jedinjenje sa formulom (I) ili neku njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf može da se koristi u skladu sa tretmanom bilo kojeg poremećaja u kojem je uključena modulacija TLR7 i/ili TLR8.

[0019] Termin "alkil" se odnosi na ravnolančani ili razgranati zasićeni alifatski ugljovodonik koji sadrži određeni broj atoma ugljenika.

[0020] Termin "halogen" se odnosi na fluor, hlor, brom ili jod.

[0021] Termin "alkenil" se odnosi na alkil, kao šta je opisano iznad, koji se sastoji od najmanje dva atoma ugljenika i najmanje jedne dvostruke veze ugljenik-ugljenik.

[0022] Termin "cikloalkil" se odnosi na karbociklički prsten koji sadrži specifikovan broj atoma ugljenika.

[0023] Termin "alkoksi" se odnosi na alkil (lanac ugljenika i vodonika) koji je jednostruko vezan na kiseonik poput na primer metoksi ili etoksi grupe.

[0024] Termin "aril" označava aromatsku prstensku strukturu koja opciono sadrži jedan ili dva heteroatoma izabranih iz N, O, i S, a naročito iz N i O. Pomenuta aromatska prstenska struktura može da sadrži 5, 6, ili 7 atoma u prstenu. Naročito, pomenuta aromatska prstenska struktura može da sadrži 5 ili 6 atoma u prstenu. Pomenuta aromatska prstenska struktura može takođe da bude fuzionisana na drugi arilni prsten koje daje bicikličku strukturu (primeri uključuju, ali bez ograničenja: hinolin, izohinolin, hinazolin, benzoksazol).

[0025] Termin "ariloksi" se odnosi na aromatsku prstensku strukturu. Pomenuta aromatska grupa je jednostruko vezana na kiseonik (na primer, fenoksi).

[0026] Termin "alken" se odnosi na nezasićeni ugljovodonični lanac koji sadrži specifikovani broj atoma ugljenika i najmanje jednu dvostruku vezu ugljenik-ugljenik.

[0027] Termin "heterocikl" se odnosi na molekule koji su zasićeni ili delomično zasićeni i uključuju tetrahidrofuran, dioksan i druge cikličke etare. Heterocikli koji sadrže azot uključuju, na primer azetidin, morfolin, piperidin, piperazin, pirolidin, i slično. Drugi heterocikli uključuju, na primer, tiomorfolin, dioksolinil, i cikličke sulfone.

[0028] Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja sa formulom (I) uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Prikladne kisele adicione soli nastaju iz kiselina koje formiraju netoksične soli. Prikladne bazne soli nastaju iz baza koje formiraju ne-toksične soli.

[0029] Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da postoje u solvatizovanim i nesolvatizovanim formama. Termin "solvat" ovde se koristi sa ciljem da se opiše molekulski kompleks koji sadrži jedinjenje iz ovog pronalaska i jednog ili više farmaceutski prihvatljivih molekula rastvarača, na primer, etanola.

[0030] Termin "polimorf" se odnosi na sposobnost jedinjenja iz ovoga pronalaska da postoji u više od jedne forme ili kristalne strukture.

[0031] Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se administriraju kao kristalni ili amorfni produkti. Pomenuta mogu da se dobiju u formi, na primer, čvrstih čepova, prahova, ili filmova primenom postupaka poput precipitacije, kristalizacije, smrzavanja-sušenja, raspršivanjasušenja, ili sušenja uz pomoć isparavanja. Pomenuta mogu da se administriraju samo za sebe ili zajedno sa jednim ili više drugih jedinjenja iz ovoga pronalaska ili kombinovano sa jednim ili više drugih lekova. Uopšteno, pomenuta su namenjena da se administriraju kao formulacija zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. Termin "ekscipijent" se ovde koristi sa ciljem da se opiše bilo koji sastojak koji nije jedinjenje (ili više njih) iz ovoga pronalaska. Izbor ekscipijenta zavisi uglavnom o faktorima poput izabranog modusa za administriranje, efekta samog ekscipijenta na rastvorljivost i stabilnost, i o prirodi dozne forme.

[0032] Jedinjenja iz ovoga pronalaska ili bilo koja njihova pod-grupa mogu da se formulišu u različite farmaceutske forme sa ciljem administriranja. Kao prikladne kompozicije mogu da se navedu sve kompozicije koje se uobičajeno koriste za sistemsko administriranje lekova. Sa ciljem da se pripreme farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska, efektivna količina određenog jedinjenja, opciono u formi adicione soli, kao aktivni sastojak se kombinuje u finu smešu sa nekim farmaceutski prihvatljivim nosiocem, pri čemu pomenuti nosilac može da bude u raznim formama u zavisnosti o formi preparata koji je poželjan za administriranje. Pomenute farmaceutske kompozicije su poželjno unitarne dozne forme, na primer, za oralno, rektalno, ili perkutano administriranje. Na primer, kod pripreme kompozicija u formi oralnih doza može da se koristi bilo koji uobičajeni farmaceutski medijum poput, na primer, vode, raznih glikola, ulja, alkohola i slično kada se govori o oralnim tečnim preparatima poput raznih suspenzija, sirupa, eliksira, emulzija, i rastvora; ili mogu da se koriste i čvrsti nosioci poput raznih tipova skroba, šećera, kaolina, razređivača, lubrikanata, veznika, agenasa za dezintegraciju i slično kada se govori o raznim prahovima, pilulama, kapsulama, i tabletama. Zbog jednostavnosti primene tokom administriranja, tabele i kapsule predstavljaju najnaprednije oralne unitarne dozne forme, pri čemu se uobičajeno koriste čvrsti farmaceutski nosioci. Takođe su uključeni i čvrsti preparati koji mogu da se konvertuju, neposredno pre upotrebe, u tečne forme. U kompozicijama koje su prikladne za perkutano administriranje, nosilac opciono sadrži agens za pojačavanje penetracije i/ili neki prikladni agens za vlaženje, opciono kombinovan sa raznim prikladnim aditivima u manjim količinama, pri čemu pomenuti aditivi ne smeju da deluju štetno za kožu. Pomenuti aditivi mogu da ubrzaju administriranje u kožu i/ili mogu da posluže kod pripreme željenih kompozicija. Ove kompozicije mogu da se administriraju na brojne načine, na primer, kao transdermalna nalepnica, kao spot-on, ili kao mast. Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu takođe da se administriraju uz pomoć inhalacije ili insuflacije uz pomoć postupaka i formulacija koje su poznate stanju tehnike. Tako, opšte uzeto, jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se administriraju u pluća u formi rastvora, suspenzije ili suvog praha.

[0033] Posebno je korisno da se malopre pomenute farmaceutske kompozicije formulišu kao unitarne dozne forme radi jednostavnog administriranja i postizanja uniformnog doziranja. Unitarna dozna forma, kao šta se ovde koristi, se odnosi na fizički diskretne jedinice koje su prikladne za unitarno doziranje, pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka za koju se zna da može da postigne željeni terapeutski efekt zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosiocem. Primeri za takve unitarne dozne forme su tablete (uključujući tablete koje su pogodne za lomljenje ili prekrivene tablete), kapsule, pilule, pakovanja sa prahom, razni vafli, čepići, rastvori ili suspenzije za injektiranje i slično, i njihovu odvojeni višekratnici.

[0034] Stručnjaci za tretiranje infektivnih bolesti obučeni su da odrede efektivnu količinu na osnovu test-rezultata koji su opisani ispod. Uopšteno, smatra se da se efektivna dnevna količina kreće od 0.01 mg/kg do 50 mg/kg telesne težine, bolje od 0.1 mg/kg do 10 mg/kg telesne težine. Može biti prikladno da se poželjna doza administrira uz pomoć dve, tri, četiri ili više pod-doza tokom odgovarajućih intervala kroz ceo dan. Pomenute pod-doze mogu da se formulišu kao unitarne dozne forme, na primer, koje sadrže 1 do 1000 mg, a naročito 5 do 200 mg aktivnog sastojka po unitarnoj doznoj formi.

[0035] Tačna doza i frekvencija administriranja zavisi o korišćenom jedinjenju sa formulom (I), stanju koje se tretira, ozbiljnosti stanja koje se tretira, dobi, težini i opšteg fizičkog stanja tretiranog pacijenta kao i o drugim lekovima koje osoba može da istovremeno uzima, kao šta je već poznato stručnjacima. Nadalje, jasno je da efektivna količina može da se smanji ili poveća u zavisnosti o odgovoru tretiranog subjekta i/ili u zavisnosti o proceni lekara koji prepisuje jedinjenja iz ovoga instant pronalaska. Iznad pomenuti rasponi efektivne količine su, prema tome, samo smernice i ne ograničavaju okvire i primenu pronalaska na bilom koji način.

Eksperimentalni deo

[0036]

[0037] Jedinjenja tipa A u shemi 1 mogu da budu alkilovana primenom benzil bromida uz korišćenje polarnog aprotičkog rastvarača, na primer DMF. Reagovanje alkil halida sa intermedijarom A zahteva jaču bazu (na primer, cezijum karbonat) i moguće duže reakciono vreme i/ili povećanu temperaturu. Zamena hlora u intermedijaru B sa aminom sa ciljem da se formiraju jedinjenja tipa C može da zahteva dodatno grejanje ili produženo reakciono vreme kao šta je primećeno sa aminoalkoholima (za pripremu aminoalkohola vidi dokumente WO2009067081 i WO2008147697). Zamena hlora u intermedijaru B sa aminom može takođe da se provede na sobnoj temperaturi u nekom polarnom rastvaraču (na primer, DMF ili acetonitril). Brojne baze mogu da se koriste sa ciljem da se omogući reakcija koja vodi od B u C uključujući, ali bez ograničenja, sledeće: trietilamin, diizopropilamin, cezijum karbonat, kalijum karbonat, ili natrijum hidrid. Redukcija azido-grupe u jedinjenjima koja su predstavljena sa intermedijarom D iznad može takođe da se provede preko Pd/C u atmosferi vodonika. Intermedijari B, C, i D koji sadrže fluor mogu da budu supstituisani primenom istih protokola kao i kod nesupstituisanih analoga, pa tako reakcione sheme vrede za oba tipa jedinjenja.

Priprema intermedijara B

[0038]

[0039] U posudu od 50 mL su stavljeni 2,4-dihlor-5H-pirolo[3,2-d]pirimidin [CAS 63200-54-4] (1 g, 5.319 mmol), DMF (10 mL), DIPEA (2.75 mL, 16 mmol) i benzil bromid (0.7 mL, 5.85 mmol). Posuda je zatvorena i potresana tokom 16 h na sobnoj temperaturi. Rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom. Sirovi materijal je prečišćen primenom kolonske hromatografije (silika-gel) u gradijentu heptan-acetat. Najbolje frakcije su spojene, a rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom koje daje B.

LC-MS (M+H) m/z = 278

Priprema intermedijara B2

[0040]

[0041] U posudu od 50 mL, koja je bila opremljena sa magnetnom mešalicom, su stavljeni A (50 mg, 0.27 mmol), bezvodni DMF (1 mL), cezijum karbonat (0.259 g, 0.8 mmol), a tada i 2-bromoetil metil etar (0.03 mL, 0.29 mmol). Boca je zatvorena, a reakciona smeša je ostavljena da se meša na 70° C tokom 2 h. Rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom. Sirovi materijal je prečišćen primenom kolonske hromatografije (silika-gel) u gradijentu heptanacetat. Najbolje frakcije su spojene, a rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom koje daje B2.

LC-MS (M+H) m/z = 246

Priprema intermedijara C

[0042]

[0043] U bocu od 50 mL sa okruglim dnom, koja je bila opremljena sa magnetnom mešalicom, su stavljeni B (1.4 g, 5.03 mmol), n-butilamin (0.59 mL, 6.04 mmol), i 1,4-dioksan (5 mL). Boca je bila opremljena sa refluksnim kondenzatorom pa je ostavljena da se greje uz mešanje na 100° C tokom 16 h. Nakon hlađenja do sobne temperature, rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom. Sirovi materijal je prečišćen primenom kolonske hromatografije (silikagel) u gradijentu heptan-acetat. Najbolje frakcije su spojene, a rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom koje daje C.

LC-MS (M+H) m/z = 315

1

Priprema intermedijara D

[0044]

[0045] U staklenu posudu koja je bila opremljena sa magnetnom mešalicom su stavljeni C (1 g, 3.18 mmol), natrijum azid (0.62 g, 9.53 mmol), i smeša NMP:voda (9:1, 4 mL). Staklena posuda je zatvorena, a smeša je grejana uz mešanje do 170° C tokom 5 h. Nakon hlađenja do sobne temperature, smeša je razređena sa etil acetatom (20 mL) i isprana sa vodom (5 x 15 mL). Organski sloj je osušen preko magnezijum sulfata, čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarači iz filtrata su odstranjeni pod smanjenim pritiskom. Sirovi materijal je prečišćen primenom kolonske hromatografije (silika-gel) u gradijentu heptan-etil acetat. Najbolje frakcije su spojene, a rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom koje daje D.

LC-MS (M+H) m/z = 322

Priprema of 1

[0046]

[0047] U staklenu posuda koja je bila opremljena sa magnetnom mešalicom su stavljeni D (100 mg, 0.311 mmol), 1,4-dioksan (4 mL), voda (1 mL), i trifenilfosfin (245 mg, 0.93 mmol). Staklena posuda je zatvorena, a smeša je grejana uz mešanje do 120° C tokom 48 h. Nakon hlađenja do sobne temperature, rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom. Sirovi materijal je prečišćen primenom kolonske hromatografije (silika-gel) u gradijentu dihlormetan – 10% metanol u dihlormetanu. Najbolje frakcije su spojene, a rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom koje daje 1.

LC-MS (M+H) m/z = 296

Priprema of 86

[0048]

[0049] U staklenu posuda koja je bila opremljena sa magnetnom mešalicom su stavljeni 1 (110 mg, 0.372 mmol), nitrometan (1.5 mL), i selektfluor (198 mg, 0.56 mmol). Staklena posuda je zatvorena, a smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom. Sirovi materijal je prečišćen primenom hromatografije reverzne faze. Najbolje frakcije su spojene, a rastvarači su odstranjeni pod smanjenim pritiskom koje daje 86.

Priprema intermedijara E

[0050]

[0051] U staklenu posuda koja je bila opremljena sa magnetnom mešalicom su stavljeni A (600 mg, 3.19 mmol), nitrometan (10 mL), i selektfluor (5.67 g, 16 mmol). Staklena posuda je zatvorena, a smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 48 h. Dodan je NaHCO3(zas. vod., 10 mL), a sve je ekstrahovano sa etil acetatom (3 x 15 mL). Organski slojevi su spojeni, osušeni preko magnezijum sulfata, čvrste materije su odstranjene uz pomoć filtracije, a rastvarač iz filtrata je odstranjen pod smanjenim pritiskom koje daje sirovi materijal E, koji je korišćen kao takav u sledećem kraku.

LC-MS (M+H) m/z = 206

Priprema intermedijara G

[0052]

Korak 1.

[0053] Intermedijar F je pripremljen u skladu sa postupkom koji je korišćen kod pripreme jedinjenja 9 u shemi 3 na strani 44 dokumenta WO2010006025. Acetilna grupa je korišćena umesto trimetilacetilne grupe.

Korak 2. Priprema intermedijara G

[0054] U staklenu posudu od 50 mL, koja je bila opremljena sa magnetnom mešalicom, su stavljeni F (200 mg, 0.97 mmol), bezvodni DMF (5 mL), DBU (0.435 mL, 2.91 mmol), i BOP (536 mg, 1.2 mmol). Reakciona smeša postaje rastvor nakon mešanja tokom nekoliko minuta, tada je dodan n-butilamin (0.48 mL, 4.85 mmol), a mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi tokom 16 h. Rastvarač je odstranjen pod smanjenim pritiskom, a sirovi materijal je prečišćen primenom hromatografije reverzne faze.

LC-MS (M+H) m/z = 262

[0055] Opšta procedura. Jedinjenja tipa X u shemi 2 mogu da budu funkcionalizovana uz pomoć alkohola primenom Mitsunobu-ovih uslova u nekom polarnom aprotičkom rastvaraču, na primer THF. Cepanje metil karbamata je provedeno u baznim uslovima u 1,4-dioksanu koje daje intermedijar Z. Zamena hlora u intermedijaru Z je provedena uz pomoć amina i baze (na primer, NaH) u polarnom rastvaraču (na primer, NMP) koje daje jedinjenja sa formulom (I).

1

Priprema intermedijara X

[0056]

[0057] 3-amino-2-etoksikarbonilpirol hidrohlorid (25.8 g, 135.3 mmol) je podeljen između dihlormetana i zas. NaHCO3, osušen preko MgSO4, filtriran i isparen do suvoće. Talog je rastvoren u metanolu (500 mL) zajedno sa 1,3-bi(metoksikarbonil)-2-metil-2-tiopseudoureom (32.1 g, 156 mmol) i sirćetnom kiselinom (39 mL, 677 mmol), a sve je mešano tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Pojavljuje se precipitat nakon čega je mešanje nastavljeno preko noći. Dodan je natrijum metoksid (73.1 g, 1353 mmol). Primećena je egzoterma, a reakciona smeša je mešana preko noći. Reakciona smeša je dovedena u područje pH 5 uz pomoć dodavanja sirćetne kiseline, a precipitat je odstranjen filtriranjem, smrvljen sa vodom (2 x 350 mL), acetonitrilom (1 x 350 mL) i diizopropiletrom (1 x 350 mL). Dobiveni metil N-(4-hidroksi-5H-pirolo[3,2-d]pirimidin-2-il)karbamat je osušen u pećnici.

[0058] Metil N-(4-hidroksi-5H-pirolo[3,2-d]pirimidin-2-il)karbamat (25 g, 120 mmol) je dodan u acetonitril (350 mL) u boci od 500 mL sa više grla na sobnoj temperaturi. Dodan je POCl3(22.1 mL, 238.2 mmol), a reakciona smeša je grejana do 70° C uz mešanje primenom preklopne mehaničke mešalice (300 rpm). Dodana je Hunig-ova baza (41.4 mL, 240.2 mmol), kap po kap, uz pomoć pumpe sa špricom kod stope protoka od 0.2 mL/min. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature pa je izlivena u mešani rastvor natrijum acetata (78.8 g, 961 mmol) u vodi (500 mL) na 45° C. Organski ostaci su ispareni, a preostala tečnost je mešana i ohlađena u ledenoj banji. Nastala čvrsta materija je izolovana uz pomoć filtracije, isprana sa acetonitrilom i smrvljena sa diizopropiletrom koje daje intermedijar X u formi čvrste materije koja je bila osušena u vakuumu.

Priprema intermedijara Y

[0059]

[0060] U suspenziju intermedijara X (5 g, 22 mmol), 2-piridinmetanola (2.6 mL, 26.5 mmol) i trifenilfosfina vezanog na polistiren (18.4 g, 55.2 mmol) u bezvodnom THF (153 mL) je dodan DIAD (6.9 mL, 33 mmol) na sobnoj temperaturi, a reakciona smeša je mešana tokom 30 min pa je koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Produkt je prečišćen primenom kolonske hromatografije (silika-gel) u gradijentu dihlormetan:metanol (100:0 do 90:10). Frakcije sa produktom su sakupljene i koncentrovane pod smanjenim pritiskom. Produkt je ponovo kristalizovan u acetonitrilu, izolovan uz pomoć filtracije pa je osušen u vakuumu koje daje Y u formi bele čvrste materije.

Priprema intermedijara Z

[0061]

[0062] Y (4.5 g, 14.2 mmol) je rastvoren u 1,4-dioksanu (68 mL) u boci od 100 mL sa okruglim dnom pa je dodan 1 N NaOH (34 mL). Smeša je grejana do 60° C tokom 5 h. Smeša je ohlađena i koncentrovana pod smanjenim pritiskom. Talog je tretiran sa vodom, a precipitat je izolovan uz pomoć filtracije pa je osušen koje daje Z. Produkt je korišćen kao takav u sledećem koraku.

1

[0063] Z (175 mg, 0.67 mmol), izoksazol-3-il-metilamin hidrohlorid (136 mg, 1.0 mmol), i diizopropiletilamin (173 mg, 1.3 mmol) su rastvoreni u NMP (2.4 mL) u staklenoj posudi od 7 mL. Smeša je mešana na 100° C tokom 2 h, a tada je ohlađena i koncentrovana in vacuo. Sve je prečišćeno uz pomoć prep. HPLC (stacionarna faza: RP Vydac Denali C18 - 10 µm, 200 g, 5 cm, mobilna faza: 0.25% rastvor NH4OAc u vodi, metanol), željene frakcije su sakupljene i koncentrovane in vacuo. Produkt je smrvljen u acetonitrilu, izolovan uz pomoć filtracije pa je osušen u vakuumu koje daje 155 u formi bele čvrste materije.

Tabela 1. Jedinjenja formule (I) i odgovarajući analitički podaci.

1

2

1

2

4

1

2

4

1

2

4

Analitički postupci

[0064] Sva jedinjenja su bila karakterizovana uz pomoć LC-MS u skladu sa sledećim LC-MS postupcima.

[0065] Postupak A. Korišćena je kolona Phenomenex Kinetex (XB-C18, 50 x 4.6 mm I.D.

2.6µm) na 35° C. MS detekcija: API-ES pozitivan jonizacijski modus, maseni raspon 100-1200. PDA detekcija (λ=190-400 nm). Sledeći gradijent je korišćen uz injekciju od 2 µL:

[0066] Postupak B. UPLC reverzne faze (tečna hromatografija ultra performanse) je provedena na koloni C18 od premošćenog etilsiloksan/silika-hibrida (BEH) (1.7 µm, 2.1 x 50

1

mm; Waters Acquity) uz stopu protoka od 0.8 ml/min. Korišćene su dve mobilne faze (10 mM amonijum acetat u H2O/acetonitrilu – 95/5; mobilna faza B: acetonitril) sa ciljem da se ostvari gradijent od 95% A i 5% B do 5% A i 95% B tokom 1.3 min uz zadržavanje tokom 0.7 min. Korišćena je injekcija volumena 0.75 µl. Voltaža konusa je bila 30 V za pozitivni jonizacijski modus i 30 V za negativni jonizacijski modus.

[0067] Postupak C. Analize su provedene na koloni Waters XTerra C18 (100 x 4.6 mm I.D.

3.5 µm čestice) na 40° C uz stopu protoka od 1.6 mL/min. Elucija u gradijentu je provedena kako sledi: od 100% rastvora amonijum acetata (25 mM) u smeši voda/acetonitril (90:10) pa do smeše acetonitril/metanol (50:50) tokom 7.5 min; od dobivene kompozicije pa do 100% acetonitrila tokom 1.0 min; 100% acetonitril tokom 1.5 min; od 100% acetonitrila do 100% do 100% rastvora amonijum acetata (25 mM) u smeši voda/acetonitril (90:10; 25 mM) tokom 3.0 min. Standardni volumen injekcije je iznosio 3 µL. Akvizicijski rasponi su bili podešeni na 200-400 nm za UV svetlo.

[0068] Postupak D. LC merenje je bilo provedeno primenom sistema Acquity UPLC (Waters) koji sadrži binarnu pumpu, organizator primerka, grejač kolone (podešen na 55° C), i detektor diodnog polja (DAD) na koloni kao šta je specifikovano u odgovarajućim postupcima ispod. Protok iz kolone je podeljen na MS-spektrometru. MS-detektor je bio konfigurisan uz pomoć jonizacijskog izvora elektrospreja. Maseni spektari su dobiveni uz pomoć skeniranja od 100 do 1000 tokom 0.18 s uz vreme zadržavanja od 0.02 s. Voltaža kapilarne igle je iznosila 3.5 kV, a temperatura izvora je održavana na 140° C. Azot je korišćen kao nebulizer (gas). UPLC reverzne faze (tečna hromatografija ultra performanse) je provedena na koloni C18 od premošćenog etilsiloksan/silika-hibrida (BEH) (1.7 µm, 2.1 x 50 mm; Waters Acquity) uz stopu protoka od 0.8 mL/min. Korišćene su dve mobilne faze (10 mM amonijum acetat u smeši H2O/acetonitril – 95/5; mobilna faza B: acetonitril) sa ciljem da se uspostavi gradijent od 95% A i 5% B pa do 5% A id 95% B tokom 1.3 min uz zadržavanje tokom 0.3 min. Volumen injekcije je iznosio 0.5 µl. Voltaža konusa je iznosila 10 V za pozitivni jonizacijski modus i 20 V za negativni jonizacijski modus.

2

Postupak E [0069]

Postupak F

[0070]

Biološka aktivnost jedinjenja sa formulom (I)

Opis bioloških ogleda

Procena aktivnosti TLR7 i TLR8

[0071] Sposobnost jedinjenja da aktivišu ljudski TLR7 i/ili TLR8 je procenjena primenom ćelijskog reporterskog ogleda koji koristi HEK293 ćelije koje su prolazno transfektovane sa vektorom koji eksprimira TLR7 ili TLR8 i konstruktom NFκB-luc reporter.

[0072] Ukratko, HEK293 ćelije su uzgajane u medijumu za kulturu tkiva (DMEM, obogaćen sa 10% FCS i 2 mM glutamina). Za potrebe postupka transfekcije ćelija u posudama od 10 cm, ćelije su odvojene uz pomoć tripsin-EDTA, transfektovane uz pomoć smeše CMV-TLR7 ili TLR8 plazmida (750 ng), NFκB-luc plazmida (375 ng) i reagensa za transfektovanje nakon čega su inkubirane preko noći na 37° C u vlažnoj atmosferi uz 5% CO2. Transfektovane ćelije su tada odvojene uz pomoć tripsin-EDTA, isprane sa PBS i ponovo suspendovane u medijumu do gustine od 1.67 x 10<5>ćelija/mL. Trideset μm ćelija je tada dodano u svaku komoricu pločica sa 384-komorica, u kojima je 10 µL jedinjenja u 4% DMSO već bilo prisutno. Nakon 6 h inkubacije na 37° C, uz 5% CO2, aktivnost luciferaze je određena uz pomoć dodavanja 15 µL supstrata Steady Lite Plus (Perkin Elmer) u svaku komoricu, a očitanje je provedeno na aparatu ViewLux ultraHTS microplate imager (Perkin Elmer). Krive sa odgovorom na dozu su generisane na osnovu provedenih merenja uz četvorostruko ponavljanje ogleda. Za svako jedinjenje su određene vrednosti za najniže efektivne koncentracije (LEC), definisane kao one koncentracije koje potiču efekt koji je barem dva puta iznad standardne devijacije ogleda.

[0073] Toksičnost jedinjenja je određena paralelno uz korišćenje sličnih serija razblaživanja jedinjenja uz 30 µL (po komorici) ćelija transfektovanih samo sa konstruktom CMV-TLR7 (1.67 x 10<5>ćelija/mL), na pločicama sa 384-komorica. Vijabilnost ćelija je izmerena nakon inkubacije od 6 h na 37° C, uz 5% CO2, uz pomoć dodavanja 15 µL ATPlite (Perkin Elmer) po komorici i očitanje na aparatu ViewLux ultraHTS microplate imager (Perkin Elmer). Podaci su prikazani kao CC50.

[0074] Istovremeno su korišćene slične serije razblaživanja jedinjenja (10 µL jedinjenja u 4% DMSO) uz 30 µL (po komorici) ćelija transfektovanih samo sa konstruktom NFκB-luc reporter (1.67 x 10<5>ćelija/mL). Pet časova nakon inkubacije na 37° C, uz 5% CO2, aktivnost luciferaze je određena uz pomoć dodavanja 15 µl supstrata Steady Lite Plus (Perkin Elmer) u svaku

4

komoricu uz očitanje na aparatu ViewLux ultraHTS microplate imager (Perkin Elmer). Podaci su prikazani kao LEC.

Aktivisanje elemenata ISRE promotora

[0075] Potencijal jedinjenja da indukuju IFN-I je takođe procenjen uz pomoć merenja aktivisanja interferon-stimulisanih responsivnih elemenata (ISRE) uz pomoć kondicioniranog medijuma od PBMC. ISRE-element sa sekvencom GAAACTGAAACT je veoma responsivan na transkripcijski faktor STAT1-STAT2-IRF9, koji se aktiviše nakon vezanja IFN-I na njegov receptor IFNAR (Clontech, PT3372-5W). Plazmid pISRE-Luc od Clontech (ref. 631913) sadrži 5 kopija pomenutog ISRE-elementa, nakon čega sledi ORF luciferaze od svica. Ćelijska linija HEK293 koja je stabilno transfektovana sa pISRE-Luc (HEK-ISREluc) je uspostavljena sa ciljem da se profilira medijum kondicionirane PBMC ćelijske kulture.

[0076] Ukratko, PBMC-i su pripremljeni iz leukocitno-trombocitnog sloja cele krvi najmanje dva donora uz korišćenje standardnog protokola Ficoll-centrifugovanja. Izolovani PBMC-i su ponovo suspendovani u RPMI-medijumu koji je bio obogaćen sa 10% humanim AB serumom, a nakon toga je dodano 2 x 10<5>ćelija/po komorici u pločicu sa 384-komorica koje su već sadržavale jedinjenja (ukupan volumen: 70 µL). Nakon preko-noćne inkubacije, 10 µL supernatanta je preneseno u pločice sa 384-komorica koje su sadržavale 5 x 10<3>HEK-ISREluc ćelija/po komorici u volumenu od 30 µL (uzgojene prethodni dan). Nakon inkubacije tokom 24 h, aktivisanje ISRE-elemenata je izmereno praćenjem luciferazne aktivnosti uz pomoć supstrata Steady Lite Plus (40 µL/po komorici; Perkin Elmer) uz merenje na aparatu ViewLux ultraHTS microplate imager (Perkin Elmer). Stimulaciona aktivnost svakog jedinjenja u HEK-ISREluc ćelijama je prikazana kao LEC vrednost, a definisana je kao koncentracija jedinjenja koja je dodana u PBMC-e i koja potiče luciferaznu aktivnost koja je veća barem dva puta od standardne devijacije ogleda. LEC sa svoje strane pokazuje stepen aktivisanja ISRE nakon prenosa definisane količine medijuma iz PBMC-kulture. Rekombinantni interferon α-2a (Roferon-A) je korišćen kao standardno kontrolno jedinjenje.

Tabela 2. Aktivnost jedinjenja formule (I). Sva jedinjenja nisu pokazala nikakvu aktivnost (LEC >25 µM) u test HEK 293 NF-kB opisanom gore.

1

2

4

1

2

4

1

11

12

1

14

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje, naznačeno time, što ima formulu (I)

i njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf, pri čemu R1je H, fluor ili metil; R2je H, halogen ili C1-3alkil; R3je C1-6alkil opciono supstituisan sa arilom koji je opciono dalje supstituisan sa jednim ili više suptituenata nezavisno izabranih iz ariloksi, halogena, arila, alkilamino, dialkilamino, C1-6alkila, karboksilne kiseline, karboksilnog estera, karboksilnog amida, nitrila, ili C1-6alkoksi; ili R3je C1-6alkil opciono supstituisan sa C1-6alkenom, C3-7cikloalkilom ili C3-7heterocikloalkilom; ili R3je C1-6alkil opciono supstituisan sa C1-6alkoksi koji je opciono dalje supstituisan sa arilom; R4je C1-8alkil opciono supstituisan sa jednim ili više suptituenata nezavisno izabranih iz hidroksila, C1-6alkoksi, C1-6alkila, C3-7cikloalkila, C2-6alkenila, arila, heteroarila koji je opciono dalje supstituisan sa C1-6alkilom, i C3-7cikloalkila koji je opciono dalje supstituisan sa C1-6alkilom; pod uslovom da je 2-amino, 4-(N-butilamino)-5-(alfametilbenzil)pirolo[3,2-d] pirimidin isključen.
2. Jedinjenje sa formulom (I) u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time, što R3je metilna grupa koja je supstituisana sa arilom (supstituisan ili ne), a R1, R2, i R4su opisani u zahtevu 1.
3. Jedinjenje sa formulom (I) u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time, što R3i R4su C1- 3alkil koji je supstituisan sa arilom, koji je opciono dalje supstituisan kao šta je opisano u zahtevu 1.
4. Jedinjenje sa formulom (I) u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time, što R1je fluor, R2je vodonik, a R3i R4su opisani u zahtevu 1.
5. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži jedinjenje sa formulom (I) ili neku njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf u skladu sa zahtevom 1 zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, razređivača ili nosioca.
6. Jedinjenje sa formulom (I) ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf u skladu sa zahtevom 1, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži pomenuto jedinjenje sa formulom (I) ili neku njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili polimorf u skladu sa zahtevom 5, naznačeni time, što se koriste kao lek. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 1