RS57060B1 - Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe - Google Patents

Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS57060B1
RS57060B1 RS20180381A RSP20180381A RS57060B1 RS 57060 B1 RS57060 B1 RS 57060B1 RS 20180381 A RS20180381 A RS 20180381A RS P20180381 A RSP20180381 A RS P20180381A RS 57060 B1 RS57060 B1 RS 57060B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
antibodies
cells
binding
residues
Prior art date
Application number
RS20180381A
Other languages
English (en)
Inventor
Ercole Rao
Vincent Mikol
Danxi Li
Jochen Kruip
Matthew Davison
Original Assignee
Sanofi Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39313041&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57060(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sanofi Sa filed Critical Sanofi Sa
Publication of RS57060B1 publication Critical patent/RS57060B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/247—IL-4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
POLJE PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na nova bispecifična antitela protiv IL-4/IL-13 i na njihovu upotrebu kod ublažavanja, tretmana ili sprečavanja bolesti ili poremećaja kod sisara, uključujući i ljude, koji su posledica nepravilne aktivnosti IL-4 i/ili IL-13 ili metabolizma. Antitelo od interesa može da blokira angažman i/ili signaliziranje nekog liganda, poput IL-4 ili IL-13, sa nekim receptorom ili receptorskim kompleksom, poput IL-4Rα, IL-13Rα1 i IL-13Rα2. Razotkrivene su profilaktičke, imunoterapeutske i dijagnostičke kompozicije koje sadrže pomenuta antitela od interesa i njihova upotreba u postupcima za sprečavanje ili tretman bolesti kod sisara, uključujući i ljude, uzrokovanih nepravilnim metabolizmom i/ili delovanjem limfoidnih i nelimfoidnih ćelija, uključujući monocite, fibroblaste i endotelijalne ćelije. Takve bolesti uključuju autoimune deficijencije i bolesti uzrokovane zapaljenjem ili karakterizovane zapaljenjem, poput alergijske astme i dermatitisa.
POZADINA PRONALASKA
Interleukin-4 (IL-4) je pleotropen citokin koji ima široki spektar bioloških efekata na limfoidnim B- i T-ćelijama, i na mnogim ne-limfoidnim ćelijama uključujući monocite, endotelijalne ćelije i fibroblaste. Na primer, IL-4 stimuliše proliferaciju nekoliko ćelijskih linija koje zavise od IL-2 i IL-3, uključujući ekspresiju glavnih molekula histokompatabilnog kompleksa iz klase II na pasivnim B-ćelijama, i pojačava sekreciju IgG4 i IgE u humanim B-ćelijama. IL-4 je povezan sa imuno odgovorom tipa Th2, stvara se u ćelijama Th2 i potiče diferencijaciju istih. IL-4 se pominje kod mnogih poremećaja, poput alergija i astme.
IL-13 je otkriven nedavno (Minty, A. et al., Nature, 1993, 362, 248-250, i McKenzie, A. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1993, 90, 3735-3739), a predstavlja citokin od 112 aminokiselina koji se izlučuje u aktivisanim T-limfocitima, B-limfocitima i mastocitima nakon aktivisanja.
Uz pomoć njegovih brojnih bioloških karakteristika koje deli sa IL-4, pomenuti IL-13 je opisan kao citokim koji je sličan sa IL-4. Njegove aktivnosti su stvarno slične onima kod IL-4 na B-ćelijama (Defrance, T. et al., J. Exp. Med., 1994, 179, 135-143, Punnonen, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, 90, 3730-3734, Fior, R. et al., Eur. Citokin Network, 1994, 5, 593-600), monocitima (Muzio, M. R. F. et al., Blood, 1994, 83, 1738-1743, De Waal Malefyt, R. et al., J. Immunol, 1993, 151, 6370-6381, Doyle, A. et al., Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1441-1445, Montaner, L. J. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 743-747, Sozzani, P. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 5084-5088) i drugim ne-hematopoetskim ćelijama (Herbert, J. M. et al., Febs Lett., 1993, 328, 268-270, i Derocq, J. M. et al., Febs Lett. 1994, 343, 32-36). Sa druge strane, suprotno od IL-4, pomenuti ne stvara specifičan efekat na pasivnim ili aktivnim T-ćelijama (Zurawuki, G. et al., Immunol. Today, 1994, 15, 19-26).
Brojne biološke aktivnosti IL-13 na monocitima/makrofagima, B-limfocitima i određenim hematopoetskim prekursorima su opisane detaljno od strane A. J. Minty kao i u preglednim člancima o IL-13. Nekoliko podataka pokazuje, dodatno, da ovaj citokin ima pleotropni efekat na drugim tipovima ćelija. Ove ne-hematopoetske ćelije koje su direktno pod delovanjem IL-13 su endotelijalne i mikroglijalne ćelije, keratinociti i karcinomi bubrega i debelog creva.
Jedna od faza analize signala koji se prenosi uz pomoć biološkog molekula unutar ćelije se sastoji u identifikovanju njenog membranskog receptora. Istraživanja koja su do sada provedena na IL-13 receptoru su pokazala da IL-13 i IL-4 imaju zajednički receptor, ili barem iste komponente nekog zajedničkog receptorskog kompleksa, kao i zajedničke signalnoprenosne elemente (Zurawski S. M. et al., Embo Journal, 1993, 12, 2663-2670, Aversa, G. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 2213-2218, Vita, N. et al., Biol. Chem., 1995, 270, 3512-3517, Lefort, S. et al., Febs Lett., 1995, 366, 122-126). Ovaj receptor je prisutan na površini brojnih tipova ćelija u varijabilnom broju u zavisnosti o tipu ćelije. Komparativna distribucija IL-13 i IL-4 receptora je provedena od autora A. J. Minty (Interleukin-13 for Citokins in Health and Disease. Eds D. G. Remick & J. S. Frie, Marcel Decker, N.Y.1996).
Receptori i receptorski kompleksi na površini ćelija vežu IL-4 i/ili IL-13 sa različitim afinitetima. Osnovne komponente receptora i receptorskih kompleksa koji vežu IL-4 i/ili IL-13 su IL-4Ra, IL-13Rα1 i IL-13Rα2. Ovi lanci se eksprimiraju na površini ćelija kao monomeri ili heterodimeri IL- 4Rα/IL-13Rα1 (Tip II IL-4R) ili IL-4Rα/γc (Tip I IL-4R). IL-4Rα monomer i IL-4Rα/γc heterodimer veže IL-4, ali ne IL-13. IL-13Rα1 i IL-13Rα2 monomeri vežu IL-13, ali ne IL-4. IL-4Rα/IL-13Rα1 heterodimer veže IL-4 i IL-13 (Murata et al., Int. J. Hematol., 1999, 69, 13-20).
Imuno-odgovori tipa Th2 potiču stvaranje antitela i humoralni imunitet, pa se smatra da se bore protiv izvan-ćelijskih patogena. Th2 ćelije su medijatori proizvodnje Ig (humoralna imunost) i stvaraju IL-4, IL-5, IL-6, IL- 9, IL-10 i IL-13 (Tanaka, et, al., Citokin Regulation of Humoral Immunity, 251- 272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, New York (1996)). Imuno-odgovori tipa Th2 su karakterizovani stvaranjem određenih citokina (na primer, IL-4, IL-13) i specifičnih tipova antitela (IgE, IgG4) pa su tipični za alergijske reakcije, koje mogu da dovedu do poremećaja prekomernog suzenja i astmatskih simptoma, poput zapaljenja dišnih puteva i kontrakcije mišićnih ćelija iz dišnih puteva u plućima.
IL-4 i IL-13 su terapeutski važni citokini na osnovu njihovih bioloških funkcija i imaju kritične uloge u mnogim bolestima, uključujući astmu (Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005, Vo.5, 161-166). Za IL-4 je pokazano da je sposoban da inhibira autoimunu bolest, a za IL-4 i IL-13 da imaju potencijal da pojačaju anti-tumorske imuno odgovore. Budući da su oba citokina uključena u patogenezi alergijskih bolesti, inhibitori pomenutih citokina mogu da obezbede terapeutske koristi.
Prema tome, postoji potreba za poboljšanim agensima koji inhibiraju IL-4, inhibiraju IL-13, i za pojedinačnim agensima koji inhibiraju IL-4 i IL-13. WO 2007/085815 A2 otkriva bispecifična anti-IL-13/IL-4 antitela.
SUŠTINA PRONALASKA
Obim predmetnog pronalaska je definisan sa priloženim patentnim zahtevima. Ovaj pronalazak obezbeđuje nova humanizovana bispecifična antitela koja se specifično vezuju za IL-4 i IL-13, kao što je definisano u zahtevima 1 do 4. Neka od anti-IL-4 i IL-13 bispecifičnih antitela mogu se izmeniti kako bi se sprečilo formiranje disulfidnih veza među lancima koje rezultira sa molekulom koji je stabilan kroz proizvodnju i upotrebu in vivo. Pomenuta antitela iz ovoga pronalaska neutralizuju delovanje IL-4 i/ili IL-13 u biološkim testovima koji su ovde opisani.
Pronalazak takođe uključuje molekule nukleinske kiseline kako je definisano u patentnom zahtevu 6.
Druga realizacija predmetnog pronalaska obuhvata ćelije domaćina i vektore kako je definisano u zahtevima 7 i 8.
Naredna realizacija predmetnog pronalaska su antitela za upotrebu u lečenju bolesti i poremećaja kao što su definisani u zahtevima 10 ili 11.
Dodatne karakteristike i prednosti koje su ovde opisane će biti vidljive iz opisa u sledećem delu koji detaljno prikazuje ovaj pronalazak i iz slika.
KRATKI OPIS SLIKA SL 1 je šematski crtež molekula bispecifičnog antitela protiv IL-4/IL-13 koje sadrži četiri polipeptidna lanca. Dva laka lanca se sastoje od N-VLhB-B13-linker-VLh8D4-8-CL-C (CL, konstantni region lakog lanca), dva teška lanca se sastoje od N-VHhB-B13-linker-VHh8D4-8-CH1-CH2-CH3-C. Sekvenca linkera (G4S)2je GGGGSGGGGS (SEQ ID BR: 6).
SL 2 ilustruje amino-kiselinske sekvence humanizovanih varijabilnih domena B-B13 antitela protiv IL-13 (SEQ ID BR: 1 i 2) i humanizovanih varijabilnih domena 8D4-8 antitela protiv IL-4 (SEQ ID BR: 3, 4 i 5). Podcrtano označava uvedene promene u amino-kiselinama. Masna slova označavaju CDR.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Obim predmetnog pronalaska je definisan sa priloženim patentnim zahtevima.. Osim ako je drugačije navedeno, svi tehnički i naučni termini i bilo koji akronim koji se ovde koriste imaju ista značenja kao šta je uobičajeno i poznato stručnjaku u polju iz kojeg je ovaj pronalazak. Svi ovde pomenuti patenti i publikacije imaju za cilj da opisuju i otkriju proteine, enzime, vektore, ćelije domaćine i metodologije koje su ovde opisane koje mogu biti korišćene u ovom pronalasku. Međutim, ništa ovde ne treba tumačiti kao priznanje da pronalazak nema pravo da dozvoljava takvo otkrivanje na osnovu prethodnog pronalaska.
Pre opisa proizvodnje i upotrebe IL-4 i/ili IL-13, sličnih postupaka i produkata od interesa, ovde su obezbeđene sledeće ne-ograničavajuće definicije nekih termina i fraza sa ciljem da navode stručnjaka.
"Interleukin-4" (IL-4) se odnosi na prirodne, ili endogene IL-4 belančevine iz sisara i na belančevine koje imaju amino-kiselinske sekvence koje su iste kao i kod prirodnog ili odgovarajuće endogene belančevine IL-4 iz sisara (na primer, rekombinantne belančevine, sintetske belančevine (na primer, proizvedene uz pomoć postupaka sintetske organske hemije)). Prema tome, kao šta je ovde definisano, termin uključuje zrelu belančevinu IL-4, polimorfne ili alelne varijante, i druge izoforme IL-4 i modifikovane ili nemodifikovane forme već pomenutih (na primer, lipidovane, glikozilovane). Prirodni ili endogeni IL-4 uključuje belančevine divljeg tipa poput zrelog IL-4, polimorfnih ili alelnih varijanti i njihove izoforme i mutantne forme koje se prirodno pojavljuju kod sisara (na primer, kod ljudi, ne-humanih primata). Takve belančevine mogu da se obnove i izoluju iz izvora koji prirodno proizvodi IL-4, na primer. Ove belančevine i belančevine koje imaju istu amino-kiselinsku sekvencu kao i one koje se prirodno pojavljuju ili su odgovarajući endogeni IL-4, ovde su označeni istim imenom kao i odgovarajući sisar. Na primer, kada je odgovarajući sisar čovek, belančevina je označena kao humani IL-4. Nekoliko mutantnih IL-4 belančevina je poznato stanju tehnike, poput onih koje su razotkrivene u dokumentu WO 03/038041.
"Interleukin-13" (IL-13) se odnosi na prirodne ili endogene IL-13 belančevine iz sisara i na belančevine koje imaju amino-kiselinsku sekvencu koja je ista kao i ona kod prirodne ili odgovarajuće endogene belančevine IL-13 kod sisara (na primer, rekombinantne belančevine, sintetske belančevine (na primer, proizvedenih uz pomoć postupaka sintetske organske hemije)). Prema tome, kao šta je ovde definisano, termin uključuje zrelu IL-13 belančevinu, polimorfne ili alelne varijante, i druge izoforme IL-13 (na primer, stvorenih uz pomoć alternativnog splajsovanja il drugih ćelijskih procesa), i modifikovane ili nemodifikovane forme već pomenutih (na primer, lipidovane, glikozilovane). Prirodni ili endogeni IL-13 uključuje belančevine divljeg tipa poput zrelog IL-13, polimorfnih ili alelnih varijanti i druge izoforme i mutantne forme koje se javljaju prirodno kod sisara (na primer, kod ljudi, ne-humani primati). Na primer, kao šta se ovde koristi, IL-13 obuhvata ljudsku IL-13 varijantu u kojoj Arg na poziciji 110 u zrelom humanom IL-13 je zamenjen sa Gin (pozicija 110 zrelog IL-13 odgovara poziciji 130 kod prekursorske belančevine) koji je povezan sa astmom (atopna i neatopna astma) i drugim varijantama IL-13. (Heinzmann et al, Hum Mol Genet. 9:549-559 (2000).). Takve belančevine mogu da se obnove ili izoluju iz izvora koji prirodno stvara IL-13, na primer. Ove belančevine i belančevine koje imaju istu amino-kiselinsku sekvencu kao i prirodni ili odgovarajući endogeni IL-13 su označene sa imenom odgovarajućeg sisara. Na primer, kada je odgovarajući sisar čovek, belančevina je označena kao humani IL-13. Nekoliko mutantnih IL-13 belančevina je poznato stanju tehnike, poput onih razotkrivenih u dokumentu WO 03/035847.
Fraza "značajno identičan" u odnosu na polipeptidnu sekvencu iz lanca antitela može da se interpretuje kao lanac antitela koji pokazuje najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili više identičnosti u uporedbi sa referentnom polipeptidnom sekvencom. Termin u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline može da se interpretuje kao sekvenca nukleotida koja ima najmanje oko 85%, 90%, 95% ili 97% ili više identičnosti sa referentnom nukleinskom sekvencom.
Termini "identičnost" ili "homologija" mogu da označavaju procenat nukleotidnih baza ili amino-kiselina u sekvenci kandidatu koje su identične sa odgovarajućom sekvencom s kojom se upoređuju, nakon poravnavanja pomenutih sekvenci i uvođenja jazova, ako je potrebno, sa ciljem da se postigne maksimalan procenat identičnosti za celu sekvencu, i bez da se uzimaju u obzir bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvenci. N-terminalne ili C-terminalne ekstenzije i insercije ne treba da se interpretuju kao elementi koji smanjuju identičnost ili homologiju. Postupci i računarni programi za poravnavanje su dostupni i dobro poznati stanju tehnike. Identičnost sekvenci može da se meri uz pomoć programa za analizu sekvenci.
Fraze i termini "funkcionalni fragment, varijanta, derivat ili analog" i slično, kao i njihove forme, nekog antitela ili antigena se odnose na jedinjenje ili molekul koji ima kvalitativno biološko delovanje koje je zajedničko sa antitelom ili antigenom pune-dužine od interesa. Na primer, funkcionalan fragment ili analog nekog antitela protiv IL-4 je onaj koji može da veže molekul IL-4 ili onaj koji može da spreči ili značajno smanji sposobnost liganda, ili nekog agonističkog ili antagonističkog antitela, da veže IL-4.
"Supstitucijske" varijante su one koje imaju najmanje jednu amino-kiselinu u nativnoj sekvenci odstranjenu ili zamenjenu sa različitom amino-kiselinom koja je uvedena umesto nje na istu poziciju. Supstitucije mogu da budu pojedinačne, gde je samo jedna amino-kiselina u molekulu supstituisana, ili mogu da budu multiple, gde su dve ili više amino-kiseline supstituisane u istom molekulu. Višestruke supstitucije mogu da budu na konsekutivnim mestima. Takođe, jedna amino-kiselina može da bude zamenjena sa više ostataka, u kojem slučaju takva varijanta obuhvata supstituciju i inserciju. "Insercijske" varijante su one sa jednom ili više aminokiselina uvedenih odmah do neke amino-kiseline na određenom položaju u nativnoj sekvenci. Odmah do neke amino-kiseline označava da je spojeno na α-karboksilne ili α-amino funkcionalne grupe amino-kiseline. "Deletirane" varijante su one koje imaju jednu ili više amino-kiselina odstranjenih iz u nativne amino-kiselinske sekvence. Obično, delecijske varijante imaju jednu ili dve deletirane amino-kiseline u nekom posebnom regionu molekula.
Termin "antitelo" se koristi u širokom smislu, i specifično pokriva monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (na primer, bispecifična antitela), fragmente antitela ili sintetske polipeptide koji nose jedan ili više CDR ili više sekvenci izvedenih iz CDR ili pod uslovom da pomenuti polipeptidi pokazuju željenu biološku aktivnost. Antitela (Ab) i imunoglobulini (Ig) su glikobelančevine koje imaju iste strukturne karakteristike. Opšte uzeto, antitela se smatraju Ig sa definisanom ili prepoznatom specifičnosti. Tako, dok antitela pokazuju veznu specifičnost prema specifičnoj meti, imunoglobulini uključuju i antitela i druge molekule slične antitelu koje nemaju specifičnost za određenu metu. Antitela iz ovoga pronalaska mogu da budu iz bilo koje klase (na primer, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA itd.), ili potklase (na primer, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2itd.) ("tip" i "klasa", i "podtip" i ""podklasa" se ovde koriste tako da se mogu međusobno menjati). Nativni ili divlji tip antitela i imunoglobulini, odnosno, koji su dobiveni iz člana populacije koji nije veštački manipulisan, su uobičajeno heterotetramerne glikobelančevine od oko 150,000 Daltona, sastavljena od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH) nakon kojeg sledi određeni broj konstantnih domena. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i jedan konstantni domen na drugom kraju. Pod "ne-veštački manipulisani" treba da se podrazumeva onaj koji nije tretiran tako da sadrži ili eksprimira strani molekul koji može da veže antigen. Divlji tip može da se odnosi na najčešćeg alela ili na vrste koje se nalaze u populaciji ili na antitelo koje je dobiveno iz ne-manipulisane životinje, upoređeno sa nekim alelom ili polimorfizmom, ili varijanta ili derivat koji je dobiven uz pomoć neke manipulacije, poput mutageneze, upotrebe rekombinantnih postupaka itd. sa ciljem da se promeni neka amino-kiselina iz molekula koji veže antigen.
Kao šta se ovde koristi, "antitelo protiv IL-4" označava neko antitelo ili polipeptid izveden iz njega (derivat) koji se specifično veže na IL-4 kao šta je definisano ovde, uključujući, ali bez ograničenja, molekule koji inhibiraju ili značajno smanjuju vezanje IL-4 na njegov receptor ili inhibiraju delovanje IL-4.
Kao šta se ovde koristi, "antitelo protiv IL-13" označava neko antitelo ili polipeptid izveden iz pomenutog (derivat) koje se specifično veže na IL-13 kao šta je ovde definisano, uključujući, ali bez ograničenja, molekule koji inhibiraju ili značajno smanjuju vezanje IL-13 na njegov receptor ili inhibiraju delovanje IL-13.
Termin "varijabilan" u kontekstu varijabilnog domena antitela se odnosi na neke delove pomenutog molekula koji se razlikuju ekstenzivno u sekvenci međusobno i između antitela i se koristi kod specifičnog prepoznavanja i vezanja određenog antitela za njegovu određenu metu. Međutim, varijabilnost nije podjednako distribuirana kroz varijabilne domene antitela. Varijabilnost je koncentrisana u tri segmenta koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR; poput, CDR1, CDR2 i CDR3) takođe poznati kao hipervarijabilni regioni, u varijabilnim domenima lakog lanca i teškog lanca. Više konzervisani delovi varijabilnih domena se nazivaju okvirni (FR) regioni ili sekvence. Varijabilni domeni nativnih teških i lakih lanaca obuhvataju četiri FR regiona, dobro adaptiranih u konfiguraciji β-plohe, koji su spojeni na tri CDR, koji formiraju omče koje spajaju, i u nekim slučajevima formiraju deo, strukturu β-plohe. CDR u svakom lancu se drže zajedno često u blizini preko FR regiona i, zajedno sa CDR formiraju drugi lanac, doprinose formiranju veznog mesta antitela koje prepoznaje metu (epitop ili determinanta) (vidi Kabat et al. Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)). Kao šta se ovde koristi, numerisanje imunoglobulinskih amino-kiselinskih ostataka se provodi u skladu sa sistemom numerisanja imunoglobulinskih amino-kiselinskih ostataka prema Kabat et al., osim ako je drugačije navedeno. Jedan CDR može da ima sposobnost da se veže specifično na srodni epitop.
Termin "drška" ili "region drške", kao šta se ovde koristi se odnosi na fleksibilni polipeptid koji obuhvata amino-kiseline između prvog i drugog konstantnog domena antitela.
Termin "fragment antitela" se odnosi na deo intaktnog lanca ili lanca pune dužine ili na antitelo, opšte uzeto, region koji veže metu ili varijabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali bez ograničenja, Fab, Fab', F(ab')2i Fvfragmente. "Funkcionalni fragment" ili "analog antitela protiv IL-4 i/ili IL-13" je onaj koji može da spreči ili značajno smanji sposobnost receptora da veže ligand ili na inicira signaliziranje. Kao šta se ovde koristi, funkcionalan fragment, opšte uzeto, je sinonim za " fragment antitela" i šta se tiče antitela, može da se odnosi na fragmente, poput Fv, Fab, F(ab')2itd. koji mogu da spreče ili značajno smanje sposobnost receptora da veže ligand ili da inicira signaliziranje. "Fv" fragment se sastoji od dimera varijabilnih domena iz jednog teškog i jednog lakog lanca koji su ne-kovalentno spajani (VH-VLdimer). U takvoj konfiguraciji, tri CDR svakog varijabilnog domena interagiraju tako da definišu vezno mesto koje prepoznaje metu na površini VH-VLdimera, kao i kod intaktnog antitela. Kolektivno, šest CDR zajedno stvaraju specifično vezno mesto na intaktnom antitelu koje može da prepozna određenu metu. Međutim, čak i pojedinačan varijabilni domen (ili pola Fvkoje obuhvata samo tri CDR koji su specifični za metu) može da ima sposobnost da prepozna i da veže metu.
"Fvsa pojedinačnim lancem" "sFv" ili "scAb" fragmenti antitela obuhvataju VHi VLdomene nekog antitela, gde su pomenute domene prisutne u jednom polipeptidnom lancu. Opšte uzeto, Fvpolipeptid dodatno obuhvata polipeptidni linker, često fleksibilan molekul, između VHi VLdomena, koji omogućava sFv da formira željenu strukturu za vezanje mete.
Termin "dijatela" se odnosi na fragmente antitela sa dva mesta koja prepoznaju antigen, a koji fragmenti mogu da obuhvataju varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je spojen na varijabilni domen (VL) lakog lanca u istom polipeptidnom lancu. Uz pomoć korišćenja linkera koji je prekratak da dozvoli sparivanje između dva pomenuta varijabilna domena u istom lancu, pomenuti domeni iz dijatela su prisiljeni da se sparuju sa veznim domenima iz drugog lanca sa ciljem da se stvore dva vezna mesta koja prepoznaju antigen.
Fabfragment sadrži varijabilne i konstantne domene lakog lanca i varijabilan i prvi konstantan domen (CH1) iz teškog lanca. Fab'fragmenti se razlikuju od Fabfragmenata usled dodatka od nekoliko ostataka na karboksilnom terminusu u CH1domenu sa ciljem da se doda jedan ili više
1
cisteina iz regiona drške u antitelu. Fab'fragmenti mogu da se stvore uz pomoć rezanja disulfidnih veza na cisteinima iz drške iz F(ab')2produkta koji nastaje nakon digestije sa pepsinom. Dodatni encimski i hemijski tretmani antitela mogu da stvore druge funkcionalne fragmente od interesa.
Termin "linearni Fab" se odnosi na tetravalentno antitelo kao šta je opisano u Miller et al. (2003), J Immunol. 170: 4854-4861. "Linearni Fab" se sastoji od tandema istog CH1-VH domena, koji je sparen sa identičnim lakim lancem na svakoj CH1-VH poziciji. Ovi molekuli su bili razvijeni sa ciljem da se poveća valencija antitela kao bi se pojačao njegov funkcionalni afinitet preko povećanja efekta jačeg spajanja, pri čemu pomenuti molekuli ostaju monospecifični.
Termin "bispecifična antitela (BsAb)" se odnosi na molekule koji kombinuju vezna mesta koja prepoznaju antigen iz dva antitela u jedan molekul. Tako, bispecifično antitelo je sposobno da veže dva različita antigena istovremeno. Osim primene u dijagnostici, BsAb su otvorili put novim terapeutskim aplikacijama uz pomoć smanjivanja potentnih efektorskih sistema na željene areale ili uz pomoć povećanja aktivnosti neutralizovanja ili stimulisanja antitela.
Početni pokušaji da se spoje vezne specifičnosti dvaju celih antitela protiv različitih ciljnih antigena u terapeutske svrhe su koristili hemijski fuzionisane heterokonjugatne molekule (Staerz et al. (1985), Nature 314: 628-631).
Bispecifična antitela su proizvedena iz hibridnih hibridoma uz pomoć tehnika heterohibridoma i in vitro pokazuju karakteristike koje su slične onima koje su primećene kod heterokonjugata (Milstein & Cuello (1983) Nature 305:537-540).
Unatoč obećavajućim rezultatima koji su dobiveni korišćenjem heterokonjugata ili bispecifičnih antitela koja su proizvedena iz ćelijskih fuzija kao šta je malopre citirano, nekoliko faktora ih čine nepraktičnima za terapeutske aplikacije na velikoj skali. Takvi faktori uključuju: brz nestanak velikih heterokonjugata in vivo, veoma zahtevne tehnike koje su potrebne za stvaranje oba tipa molekula, potreba za ekstenzivnim prečišćavanjem heterokonjugata iz homokonjugata ili mono-specifičnih antitela i opšti niski prinosi.
Genetički inženjering se sve više i više koristi sa ciljem da se dizajniraju, modifikuju i stvore antitela ili derivati antitela sa željenim setom veznih karakteristika i efektorskih funkcija.
Brojni rekombinantni postupci su razvijeni za efikasnu proizvodnju BsAb, na primer fragmenata antitela (Carter et al. (1995), J. Hematotherapy 4: 463-470; Pluckthun et al. (1997) Immunotechology 3: 83-105; Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods 248: 47-66) i IgG formata punih dužina (Carter (2001) J. Immunol. Methods 248: 7-15).
Spajanje dva različita scFv rezultuje u BsAb formate sa minimalnim molarnim masama, koji se nazivaju sc-BsAb ili Ta-scFv (Mack et al.(1995), Proc. Acad. Sci. USA. 92: 7021-7025; Mallender et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 199-206). BsAb su bili konstruisani uz pomoć genetičkog spajanja dva scFv preko dimerizacije funkcionalnosti poput leucinskog zatvarača (Kostelny et al. (1992) J. Immunol.148: 1547-53; de Kruif et al. (1996) J. Biol. Chem.271: 7630-4).
Kao šta je malopre pomenuto, dijatela su mali bivalentni i bispecifični fragmenti antitela. Ovi fragmenti obuhvataju VH koji je spojen preko VL na isti polipeptidni lanac, uz pomoć linkera koji je toliko kratak (manje od 12 amino-kiselina) da omogući sparivanje između dva domena na istom lancu. Pomenuti domeni su prisiljeni da se spare intermolekularno sa komplementarnim domenima drugog lanca i tako formiraju dva mesta za vezanje antigena. Ovakvi fragmenti dimernog antitela, ili "dijatela," su bivalentni i bispecifični. (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448). Dijatela su slična po veličini sa fragmentom Fab. Polipeptidni lanci VH i VL domena spojeni sa linkerom između 3. i 12. amino-kiseline i formiraju predominantno dimere (dijatela), dok sa linkerom između 0 i 2. amino-kiselinskog ostatka, trimere (trijatela), a tetrameri (tetratela) su favorizovani. Osim dužina linkera, tačan obrazac oligomerizacije se čini da je zavisan o kompoziciji kao i o orijentaciji V-domena (Hudson et al. (1999), J Immunol Methods 231: 177-189). Predvidljivost finalne strukture molekula dijatela je veoma slaba.
Mada sc-BsAb i konstrukti koji se baziraju na dijatela pokazuju interesantni klinički potencijal, bilo je pokazano da takvi ne-kovalentno spojeni molekuli nisu dovoljno stabilni u fiziološkim uslovima. Celokupna stabilnost scFv fragmenta zavisi o urođenoj stabilnosti VL i VH domena kao i o stabilnosti domenskog interfejsa. Nedovoljna stabilnost VH-VL interfejsa scFv fragmenata je često sugerisana kao glavni uzrok ireverzibilnog scFv inaktivisanja, budući da privremeno otvaranje interfejsa, šta bi bilo dozvoljeno sa peptidnim linkerom, izlaže hidrofobne delove koji favorizuju agregaciju i prema tome nestabilnost i slabi proizvodni prinos (Wörn & Plückthun (2001), J. Mol. Biol.305: 989-1010).
Alternativan postupak proizvodnje bispecifičnih bivalentnih belančevina koje vežu antigen iz VH i VL domena je razotkriven u dokumentu US 5,989,830. Takvi dvoglavi fragmenti antitela su dobiveni uz pomoć eksprimiranja dicistronskog vektora koji kodira dva polipeptidna lanca, gde jedan polipeptidni lanac sadrži VH dva puta u serijama sa peptidnim linkerom (VH1-linker-VH2), a drugi polipeptidni lanac sadrži komplementarne VL domene koje su spojene u serijama sa peptidnim linkerom (VL1-linker-VL2). U dokumentu US 5,989,830 je opisano da svaki linker treba da sadrži najmanje 10 amino-kiselinskih ostataka.
Polivalentni kompleksi belančevina (PPC) sa povećanom valencijom su opisni u dokumentu US 2005/0003403 A1. PPC obuhvata dva polipeptidna lanca koji su, opšte uzeto, aranžirani lateralno jedan na drugoga. Svaki polipeptidni lanac tipično obuhvata 3 ili 4 "v-regiona", koji sadrže amino-kiselinsku sekvencu koja može da formira vezno mesto za antigen kada se spoji sa odgovarajućim v-regionom na suprotnom polipeptidnom lancu. Najviše 6 "v-regiona" može da se koristi u svakom polipeptidnom lancu. Pomenuti v-regioni iz svakog polipeptidnog lanca su spojeni linearno jedan na drugoga i mogu da budu spojeni preko spojnih regiona. Kada su aranžirani u formi PPC, pomenuti v-regioni na svakom polipeptidnom lancu formiraju pojedinačna vezna mesta za antigen. Pomenuti kompleks može da sadrži jednu ili nekoliko veznih specifičnosti.
Međutim, upotreba takvih molekula pokazuje agregaciju, nestabilnost i slabi ekspresijski prinos (Wu et al. (2001) Prot. Eng.14: 1025-1033). Ovo su tipični problemi sa stabilnosti koji mogu da se jave kada se eksprimiraju antitela bazirana na pojedinačnom lancu. (Worn & Plückthun (2001), J. Mol. Biol.305: 989-1010).
Tako, predmet ovoga pronalaska je da obezbedi bispecifično polivalentno antitelo kod kojeg neće dolaziti do nastanka agregata. Dodatno, treba da ima stabilnost koja će ga činiti prikladnim za upotrebu u terapeutici.
1
Termin "monoklonsko antitelo", kao šta se ovde koristi, se odnosi na antitelo koje je dobiveno iz populacije značajno homogenih antitela, na primer, pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim u odnosu na neke prirodne mutacije koje mogu da budu prisutne u manjim količinama.
Monoklonska antitela, koja su ovde specifikovana uključuju "himerna" antitela kod kojih je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa odgovarajućim sekvencama kod antitela koja su dobivena iz pojedinačnih vrsta ili koja pripadaju nekoj posebnoj klasi ili podklasi antitela (tip ili podtip), pri čemu je ostatak lanca(lanaca) identičan sa ili homologan sa odgovarajućim sekvencama kod antitela koja su dobivena iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i sa fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju poželjnu biološku aktivnost vezanja na IL-4 i/ili IL-13 ili uticaja na delovanje IL-4 i/ili IL-13 ili metabolizma (U.S. Pat. Br.4,816,567; i Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)). Tako, CDR iz neke klase antitela može da se presadi u FR nekog antitela iz različite klase ili podklase.
Monoklonska antitela su visoko specifična, jer su usmerena na pojedinačnu metu, epitop ili determinantu. Dodatno, suprotno od konvencionalnih preparata (poliklonskih) antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanta (epitopa) nekog antigena, svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv pojedinačnog determinanta u meti. Osim zbog njihove specifičnosti, monoklonska antitela su napredna jer mogu da se sintetišu u ćeliji domaćina, koja nije kontaminirana sa drugim imunoglobulinima, a ovde je još moguće da se klonira relevantan gen i mRNK koja kodira antitela preko njegovih lanaca. Izraz "monoklonsko" navodi karakter pomenutog antitela koje je dobiveno iz značajno homogene populacije antitela, i nije konstruisano tako da je za to potrebna proizvodnja antitela preko bilo kojeg određenog postupka. Na primer, monoklonska antitela mogu da se izoluju iz fagbiblioteka antitela uz pomoć dobro poznatih tehnika ili mogu da se prečiste iz poliklonskih preparata. Matična monoklonska antitela mogu da se proizvedu uz pomoć postupka hibridoma koji je opisan od Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ili mogu da se načine preko rekombinantnih postupaka koji su dobro poznati stanju tehnike.
Termin "polivalentno antitelo", kao šta se ovde koristi se odnosi na antitelo koje sadrži dva ili više mesta za vezanje antigena, pa je tako sposobno da veže dva ili više antigena, koji mogu da imaju istu ili različitu strukturu, istovremeno. Termin "bivalentno" označava da pomenuto antitelo sadrži dva vezna mesta za antigen. Termin "tetravalentno" označava da pomenuto antitelo sadrži četiri vezna mesta za antigen.
Termin "vezno mesto za antigen", kao šta se ovde koristi se odnosi na deo antitela koji obuhvata areal koji se specifično veže na ili je komplementaran na deo ili na celi antigen. Kada je neki antigen velik, antitelo može da se jedino veže na određeni deo samog antigena, a taj deo je označen sa terminom epitop. Domen koji veže antigen može da se obezbedi preko jednog ili više varijabilnih domena iz antitela. Preferirano, domen koji veže antigen je načinjen spajanjem varijabilnog domena (VL) iz lakog lanca antitela i varijabilnog domena (VH) iz teškog lanca antitela.
Termin "antigen", kao šta se ovde koristi se odnosi na molekul ili deo molekula koji je sposoban da bude vezan od strane antitela iz ovoga pronalaska. Antigen može da ima jedan ili više epitopa. Primeri antigena koje prepoznaju ovde opisana antitela uključuju, ali bez ograničenja, serumske belančevine, na primer citokine poput IL-4, IL5, IL9 i IL-13, bioaktivne peptide, molekule sa površine ćelija, na primer receptore, transportere, jonske-kanale, viralne i bakterijske belančevine.
Termin "monospecifično", kao šta se ovde koristi označava da pomenuto ovde opisano polivalentno antitelo prepoznaje samo jedan antigen, a sva su mesta koja vežu antigen identična.
Temin "bispecifično", kao šta se ovde koristi označava da pomenuto polivalentno antitelo iz ovoga pronalaska prepoznaje dva različita epitopa na istom ili na dva različita antigena.
Termin "multispecifično", kao šta se koristi u ovom pronalasku označava da pomenuto ovde opisano polivalentno antitelo prepoznaje više različitih epitopa na istom ili na više različitih antigena.
Termin "linker", kao šta se ovde koristi se odnosi na peptid koji je adaptiran da spaja varijabilne domene u konstruktima za ovde opisano antitelo. Pomenuti peptidni linker može da sadrži bilo koje amino-kiseline, pri čemu su amino-kiseline glicin (G) i serin (S) preferirane. Pomenuti
1
linkeri mogu ponekad da budu isti ili različiti jedan od drugoga između i unutar polipeptida teškog lanca i polipeptida lakog lanca. Dodatno, pomenuti linker može da ima dužinu od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 amino-kiselina. Preferirana peptidna linkerska jedinica za domene teških lanaca kao i za domene lakih lanaca je GGGGS. Broj linkerskih jedinica u teškom lancu i u lakom lancu može da bude jednak (simetričan red) ili različit (asimetričan red).
Peptidni linker je preferirano dovoljno dugačak da obezbedi adekvatan stepen fleksibilnosti koji sprečava ostatke antitela da si međusobno smetaju u delovanju, na primer preko steričke prepreke, da omogući pravilno savijanje belančevine i, ako je potrebno, da omogući molekulima antitela da reaguju sa dva ili više, moguće na većem razmaku, receptora u istoj ćeliji; ali je preferirano dovoljno kratak da omogući ostatke antitela da ostanu stabilni u ćeliji.
Prema tome, dužina, kompozicija i/ili konformacija peptidnih linkera može da se lako izabere od strane stručnjaka sa ciljem da se optimizuju željene karakteristike polivalentnog antitela.
"Humanizovane" forme ne-humanih (na primer, mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput, Fv, Fab, Fab', F(ab')2ili drugih podsekvenca antitela koje mogu da vežu metu) koji sadrže sekvence izvedene iz ne-humanog imunoglobulina, kada ih se uporedi sa humanim antitelom. Opšte uzeto, humanizovano antitelo će sadržavati gotovo sve od jednog, a tipično dva, varijabilna domena, gde svi ili gotovo svi CDR regioni odgovaraju onima iz ne-humanog imunoglobulina i svi ili gotovo svi FR regioni su oni iz sekvence humanog imunoglobulinskog kalupa. Humanizovano antitelo može takođe da sadrži najmanje jedan deo nekog imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), tipično onog iz humanog imunoglobulinskog kalupa. Opšte uzeto, cilj je da se stvori molekul antitela koji je minimalno imunogen kod ljudi. Tako, moguće je da jedna ili više amino-kiselina u jednom ili više CDR takođe može da bude izmenjena sa nekom koja je manje imunogena za ljudskog domaćina, bez značajnog minimiziranja funkcije specifičnog vezanja jednog ili više CDR na IL-4 i/ili IL-13. Alternativno, pomenuti FR može da bude ne-human, ali one amino-kiseline koje su najviše imunogene su zamenjene sa nekima koje su manje imunogene. Ipak, CDR presađivanje, kao šta je malopre diskutovano, nije jedini način da se dobije humanizovano antitelo. Na primer, modifikovanje samo CDR regiona može da bude nedovoljno jer nije retko da ostaci iz okvira imaju ulogu u određivanju tri-dimenzionalne strukture CDR omči i
1
celokupnog afiniteta antitela za njegov ligand. Tako, sva sredstva mogu da se praktikuju sa ciljem da se molekul ne-humanog matičnog antitela modifikuje u takav koji je manje imunogen za ljude, a ukupna identičnost sekvence sa humanim antitelom nije uvek neophodna. Prema tome, humanizovanje takođe može da se postigne, na primer, uz pomoć blage supstitucije od samo nekoliko ostataka, posebno onih koji su izloženi na površini molekula antitela i nisu skriveni unutar molekula, pa zbog toga nisu lako dostupni imuno sistemu domaćina. Takav postupak se ovde razmatra kada se govori o zameni "mobilnog" ili "fleksibilnog" ostatak na molekulu antitela, a cilj je smanjivanje ili ukidanje imunogenosti nastalog molekula bez narušavanja specifičnosti pomenutog antitela za njegov epitop ili determinantu. Vidi, na primer, Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et al., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993), WO 2006/042333 i U.S. Pat. Br.5,869,619.
Postupak humanizovanja od interesa se bazira na uticaj na molekularnu fleksibilnost samog antitela tokom i kod imuno prepoznavanja. Fleksibilnost belančevine je povezana sa molekularnom pokretljivošću molekula belančevine. Fleksibilnost belančevine je sposobnost cele belančevine, dela belančevine ili pojedinačnog amino-kiselinskog ostatka da može da zauzme više konformacija koje se značajno razlikuju jedna od druge. Informacije o fleksibilnosti belančevina mogu da se dobiju preko eksperimenata kristalografije sa X-zrakama (vidi, na primer, Kundu et al. 2002, Biophys J 83:723-732.), eksperimenata nuklearne magnetne rezonancije (vidi, na primer, Freedberg et al., J Am Chem Soc 1998, 120(31):7916-7923) ili uz pomoć izvođenja simulacija molekularne dinamike (MD). MD simulacija belančevine se izvodi u računaru i omogućava određivanje kretanje svih atoma belančevine tokom vremenskog perioda uz pomoć izračuna fizičkih interakcija između pomenutih atoma. Rezultat MD simulacije je putanja analizirane belančevine tokom vremenskog perioda same simulacije. Putanja je skup konformacija belančevine, takođe nazvana brzi snimci, koji su periodički sakupljeni tokom vremenskog perioda simulacije, na primer, svake 1 pikosekunde (ps). Preko analize skupa brzih snimaka stručnjak može da kvantifikuje fleksibilnost aminokiselinskih ostataka u belančevini. Tako, fleksibilan ostatak je onaj koji zauzima skup različitih konformacija u kontekstu polipeptida u kojem se pomenuti ostatak nalazi. MD postupci su poznati stanju tehnike, vidi, na primer, Brooks et al. "Proteins: A Theoretical Perspective of Dynamics, Structure and Thermodynamics" (Wiley, New York, 1988). Nekoliko softvera
1
omogućava MD simulacije, poput Amber (vidi Case et al. (2005) J Comp Chem 26:1668-1688), Charmm (vidi Brooks et al. (1983) J Comp Chem 4:187-217; i MacKerell et al. (1998) u "The Encyclopedia of Computational Chemistry" vol. 1:271-177, Schleyer et al., ur. Chichester: John Wiley & Sons) ili Impact (vidi Rizzo et al. J Am Chem Soc; 2000; 122(51):12898-12900.).
Najveći deo kompleksa belančevina deli relativno veliku i planarnu skrivenu površinu pa je pokazano da fleksibilnost veznih partnera obezbeđuje njenu plastičnost, šta im omogućava da se konformacijski adaptiraju jedan na drugi (Structure (2000) 8, R137-R142). Kao takvi, primeri "indukovanog podešavanja" se zna da imaju dominantu ulogu u interfejsima belančevina-belančevina. Dodatno, povećava se znanje o tome da belančevine u stvari vežu ligande različitih veličina i kompozicija (Protein Science (2002) 11:184-187) i da se konformacijska raznolikost javlja kao esencijalni deo sposobnosti prepoznavanja različitih partnera (Science (2003) 299, 1362-1367). Fleksibilni ostaci su uključeni u vezanju partnera belančevina-belančevina (Structure (2006) 14, 683-693).
Fleksibilni ostaci mogu da zauzmu brojne konformacije koji obezbeđuju celi skup areala za interakcije koji lako mogu da budu prepoznati od strane memorijskih B-ćelija i mogu da potaknu imuno-odgovor. Tako, antitelo može da se humanizuje uz pomoć modifikovanja brojnih ostataka iz okvira tako da skup konformacija i areala za prepoznavanje koji su izloženi na modifikovanog antitelu čim više sliči onima koje može da zauzme neko humano antitelo.
To može da se postigne uz pomoć modifikovanja ograničenog broja ostataka preko: (1) izgradnje modela homologije matičnog mAb i preko izvođenja MD simulacije; (2) analiziranja fleksibilnih ostataka i identifikovanja najfleksibilnijih ostataka u molekulu ne-humanog antitela, kao i preko identifikovanja ostataka ili motiva za koje je verojatno da mogu da postanu izvor heterogenosti ili reakcija degradacije; (3) identifikovanja humanog antitela koje ima najsličniji skup areala za prepoznavanje kao i matično antitelo; (4) određivanja fleksibilnih ostataka koji mogu da se mutiraju, ostataka ili motiva koji su verojatan izvor heterogenosti i degradacije koji takođe mogu da se mutiraju; i (5) provere prisutnosti poznatih epitopa T-ćelija i B-ćelija. Fleksibilni ostaci mogu da se pronađu uz pomoć korišćenja MD izračuna kao šta je malopre objašnjeno koristeći implicitan rastvarač-model, koji broji interakcije vodenog rastvarača sa atomima belančevine tokom perioda simulacije. Jednom kada se identifikuje
1
grupa fleksibilnih ostataka unutar varijabilnih delova lakih i teških lanaca, identifikovani su varijabilni regioni okvira iz humanih teških i lakih lanaca koji su najsličniji sa onim iz antitela od interesa. To može da se postigne, na primer, uz pomoć blast-pretrage na grupi fleksibilnih ostataka iz baze podataka za sekvence humanih antitela iz germinalne linije. Takođe može da se provede uz pomoć uporedbe dinamike matičnog mAb sa dinamikom iz biblioteke kanonskih struktura iz germinalne linije. CDR ostaci i susedni ostaci su isključeni iz pretrage sa ciljem da se očuva visok afinitet za antigen.
Fleksibilni ostaci se tada zamene. Kada nekoliko humanih ostataka pokazuje slične homologije, selekcija se provodi takođe uz pomoć prirode samih ostataka za koje se veruje da mogu da deluju na ponašanje humanizovanog antitela u rastvoru. Na primer, polarni ostaci će preferirano da se nalaze u izloženim fleksibilnim omčama za razliku od hidrofobnih ostataka. Ostaci koji su potencijalan izvor nestabilnosti i heterogenosti se takođe mutiraju čak i ako se nalaze u CDR. To uključuje izložene metionine jer sulfoksidna formacija može da rezultuje iz radikala sa kiseonikom, proteolitičkog cepanja slabo kiselih veza poput onih u dipeptidu Asp-Pro (Drug Dev Res (2004) 61:137-154), mesta deamidacije koji se nalaze u izloženim ostacima asparagina nakon čega sledi neka mala amino-kiselina, poput Gly, Ser, Ala, His, Asn ili Cys (J Chromatog (2006) 837:35-43) i mesta N-glikozilacije, poput mesta Asn-X-Ser/Thr. Tipično, izloženi metionini će biti zamenjeni sa Leu, izloženi asparagini će biti zamenjeni sa glutaminom ili sa aspartatom, ili će biti zamenjen sledeći ostatak. Kod mesta glikozilacije (Asn-X-Ser/Thr), zamenjen će biti Asn ili Ser/Thr ostatak.
Nastala sastavljena sekvenca se proverava na prisutnost poznatih epitopa iz B-ćelija ili linearnih T-ćelija. Potraga se provodi, na primer, sa javno dostupnim IEDB. Ako se pronađe poznati epitop unutar sastavljene sekvence, druga grupa humanih sekvenca se poziva i zamenjuje.
Za razlike od postupka promene površine iz dokumenta US Pat. Br. 5,639,641, B-ćelijskiprovođeni i T-ćelijski-provođeni imunogeni odgovori su obuhvaćeni pomenutim postupkom. Ovaj postupak takođe izbegava problem gubitka aktivnosti koji se ponekad primećuje kod CDR presađivanja (US Pat. Br. 5,530,101). Dodatno, problemi stabilnosti i rastvorljivosti takođe su uzeti u obzir u procesima inženjeringa i izbora, šta daje antitelo koje je optimizovano na nisku imunogenost, visoki afinitet za antigenom i poboljšanim biofizičkim karakteristikama.
1
Strategije i postupci za antitela sa promenjenom površinom, i drugi postupci za smanjivanje imunogenosti antitela u različitim domaćinima, su razotkriveni u, na primer, U.S. Pat. Br.
5,639,641. Ukratko, u poželjnom postupku, (1) grupa varijabilnih regiona iz teških i lakih lanaca antitela je poravnata i proizvedena sa ciljem da se dobiju izložene površinske pozicije u okviru varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, pri čemu su pozicije poravnavanja za sve varijabilne regione najmanje oko 98% identične; (2) definisana je grupa površinski izloženih amino-kiselinskih ostataka iz okvira varijabilnih regiona teškog i lakog lanca kod ne-humanog, poput antitela nekog glodara (ili njegov fragment); (3) identifikovana je grupa identičnih površinski izloženih amino-kiselinskih ostataka iz okvira varijabilnih regiona teškog i lakog lanca koja je identična kod one iz glodara; i (4) pomenuta grupa površinski izloženih aminokiselinskih ostataka iz okvira varijabilnih regiona teškog i lakog lanca definisanih u koraku (2) je zamenjena sa grupom površinski izloženih amino-kiselinskih ostataka iz okvira varijabilnog regiona iz teškog i lakog lanca identifikovanih u koraku (3), ali to ne vredi za one aminokiselinske ostatke koji se nalaze unutar 5Å bilo kojeg atoma iz bilo kojeg ostatka iz CDR u antitelu glodara, a sve sa ciljem da se dobije humanizovano, poput antitela glodara koje zadržava veznu specifičnost.
Antitela mogu da budu humanizovana pomoću brojnih drugih tehnika uključujući CDR presađivanja (EPO 0 239 400; WO 91/09967; i U.S. Pat. Br. 5,530,101 i 5,585,089), dvostrukog-sloja ili promene površine (EPO 0592 106; EPO 0519 596; Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6):805-814; i Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) i izmene lanca (U.S. Pat. Br. 5,565,332). Humana antitela mogu da se proizvedu uz pomoć brojnih postupaka poznatih stanju tehnike uključujući, ali bez ograničenja, postupke izlaganja faga, vidi U.S. Pat. Br. 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806 i 5,814,318; i dokumente WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 i WO 91/10741, koristeći transgene životinje, poput glodara, koristeći himerne ćelije i slično.
"Homolog antitela" ili "homolog" se odnosi na bilo koji molekul koji specifično veže IL-4 i/ili IL-13 kao šta je ovde navedeno. Tako, homolog antitela uključuje nativno ili rekombinantno antitelo, modifikovano ili ne, delove antitela koji zadržavaju biološke karakteristike od interesa, poput vezanja IL-4 ili IL-13, poput Fabili Fvmolekula, antitelo s jednim lancem,
2
polipeptid koji sadrži jedan ili više CDR regiona i slično. Amino-kiselinska sekvenca homologa ne treba da bude identična onoj prirodnog antitela, ali može da se promeni ili modifikuje sa ciljem da sadrži zamenjene amino-kiseline, uvedene amino-kiseline, deletirane amino-kiseline, amino-kiseline koje su različite od onih dvadeset koji se uobičajeno nalaze u belančevinama itd. sa ciljem da se dobije polipeptid sa pojačanim ili korisnim karakteristikama.
Antitela sa homolognom sekvencom su ona antitela sa amino-kiselinskom sekvencom koja imaju homologiju sa amino-kiselinskom sekvencom antitela protiv ovde opisanog IL-4, IL-13 ili bispecifičnog antitela protiv IL-4/IL-13. Preferirano, homologija se odnosi na aminokiselinsku sekvencu iz varijabilnih regiona ovde opisanog antitela. "Homologija sekvence" koja se primenjuje na amino-kiselinsku sekvencu ovde je definisana kao sekvenca od najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ili više homologije, a bolje od najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% homologije u odnosu na drugu amino-kiselinsku sekvencu, kao šta je definisano, na primer, preko postupka FASTA pretraga u skladu sa Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85, 2444-2448 (1988).
Himerno antitelo je ono koje ima različite delove nekog antitela koje je izvedeno iz različitih izvora, poput različitih antitela, različitih klasa antitela, različitih životinjskih vrsta, na primer, antitela koje ima varijabilni region koji je izveden iz mišjeg monoklonskog antitela koje je spareno sa konstantnim regionom humanog imunoglobulina itd. Tako, humanizovano antitelo je jedna vrsta himernog antitela. Postupci za proizvodnju himernih antitela su poznati stanju tehnike, vidi, na primer, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125:191-202; i U.S. Pat. Br. 5,807,715, 4,816,567 i 4,816,397.
Veštačka antitela uključuju scFv fragmente, himerna antitela, dijatela, trijatela, tetratela i mru (vidi Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293-299; i Hudson, 1999, Curr Opin Imm 11:548-557), a svako od njih poseduje sposobnost vezanja antigena ili epitopa. U Fvfragmentu sa jednim lancem (scFv), VHi VLdomeni antitela su spojeni uz pomoć fleksibilnog peptida. Tipično, pomenuti linker je peptid od oko 15 amino-kiselina. Ako je linker značajno manji, na primer, 5 amino-kiselina, nastaju dijatela. Najmanja vezna jedinica nekog antitela je CDR, tipično CDR2 iz teškog lanca koji poseduje dovoljno sposobnosti specifičnog prepoznavanja i kapacitet vezanja. Takav fragment se naziva molekularna jedinica prepoznavanja ili mru.
Nekoliko takvih mru mogu da se povežu sa kratkim linker peptidima, čine se formira veštačka vezna belančevina sa većom sposobnosti vezanja nego pojedinačni mru.
Ovde su takođe otkriveni funkcionalni ekvivalenti nekog antitela od interesa. Termin "funkcionalni ekvivalenti" uključuju antitela sa homolognom sekvencom, homologe antitela, himerna antitela, veštačka antitela i modifikovana antitela, na primer, gde svaki funkcionalni ekvivalent je definisan preko njegove sposobnosti da veže IL-4 i/ili IL-13, inhibira IL-4 i/ili IL-13 signalnu sposobnost ili funkciju, ili da inhibira vezanje IL-4 i/ili IL-13 na njegov receptor. Iskusan stručnjak razume da postoji preklapanje u grupi molekula nazvanih "fragmenti antitela" i grupe nazvane "funkcionalni ekvivalenti". Postupci stvaranja funkcionalnih ekvivalenata koji zadržavaju sposobnost vezivanja IL-4 i/ili IL-13 poznati su stručnjacima iz oblasti tehnike i otkriveni su, na primer, u WO 93/21319, EPO ser. br.239,400, WO 89/09622, EPO ser. br.338,745 i EPO ser. br.332,424.
Pomenuti funkcionalni ekvivalenti iz ove aplikacije takođe uključuju modifikovana antitela, na primer, antitela modifikovana uz pomoć kovalentnog spajanja bilo kojeg tipa molekula na pomenuto antitelo. Na primer, modifikovana antitela uključuju antitela koja su bila modifikovana, na primer, preko glikozilacije, acetilacije, pegilacije, deamidacije, fosforilacije, amidacije, derivatizacije uz pomoć poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog cepanja, spajanja na ćelijski ligand, spajanja na toksinski ili citotoksinski ostatak ili na drugu belančevinu itd. Kovalentno spajanje ne mora da proizvede antitelo koje ne može da stvori anti-idiotipski odgovor. Modifikacije mogu da se postignu uz pomoć poznatih tehnika, uključujući, ali bez ograničenja, specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu itd. Dodatno, modifikovana antitela mogu da sadrže jednu ili više neklasičnih amino-kiselina.
Brojne tehnike su dostupne stručnjaku u polju koje omogućavaju optimizovanje vezne sposobnosti. Tipično, ove tehnike uključuju zamenu brojnih amino-kiselinskih ostatka na mestu od interesa, a nakon toga sledi pretraga kako bi se analizirala vezna sposobnost mutiranog polipeptida za srodni antigen ili epitop.
Jednom kada je antitelo identifikovano i izolovano, često je korisno da se stvori varijanta antitela ili mutant, ili mutein, u kojem je jedan ili više amino-kiselinskih ostataka izmenjeno, na primer, u jednom ili više hipervarijabilnih regiona pomenutog antitela. Alternativno, ili dodatno, jedna ili više izmena (na primer, supstitucija) ostataka iz okvira može da se uvede u pomenuto antitelo kada pomenuta promena rezultuje poboljšanjem vezne sposobnosti antitela mutanta prema IL-4 i/ili IL-13. Primeri ostataka iz regiona okvira koji mogu da se modifikuju uključuju one koji ne-kovalentno, direktno vežu antigen (Amit et al., Science 233:747-753 (1986)); interagiraju sa/deluju na konformaciju CDR (Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)); i/ili sudeluju u VL-VHinterfejsu (EP 239400). U nekim izvedbama, modifikovanje jednog ili više takvih ostataka iz regiona okvira rezultuje u pojačanju vezne sposobnosti antitela za srodni antigen. Na primer, od oko jedan do pet ostataka iz okvira može da bude promenjen. Ponekad, ovo može da bude dovoljno da stvori mutirano antitelo koje je prikladno za upotrebu u pre-kliničkim ispitivanjima, čak i kada nije promenjen niti jedan od ostataka iz hipervarijabilnog regiona. Normalno, međutim, pomenuto antitelo-mutant može da sadrži jednu ili više promena u hipervarijabilnom regionu. Konstantni regioni takođe mogu da se promene sa ciljem da se dobiju željene ili više preferirane karakteristike efektora.
Ostaci iz hipervarijabilnog regiona koji su promenjeni mogu da budu promenjeni nasumično, posebno kada je početni vezani afinitet matičnog antitela takav da nasumično-stvorena antitela-mutanti mogu lako da se pretraže zbog promenjenog veznog afiniteta u nekom od testova ovde pomenutih.
Jedna procedura za dobivanje antitela-mutanata, poput CDR mutanata, je "alaninska skenirajuća mutageneza" (Cunningham & Wells, Science 244:1081-1085 (1989); i Cunningham & Wells, Proc Nat Acad Sci USA 84:6434-6437 (1991)). Jedan ili više ostataka iz hipervarijabilnog regiona se menja sa ostacima alanina ili polialanina. Oni ostaci iz hipervarijabilnog regiona koji pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije su tada podešeni uz pomoć uvođenja dodatnih i drugih mutacija u mesta ili za mesta pomenute supstitucije. Tako, dok je mesto za uvođenje varijacije u amino-kiselinskoj sekvenci unapred određeno, priroda mutacije per se se ne može uvek predvideti. Slične supstitucije mogu da se provedu i sa drugim amino-kiselinama, u zavisnosti o željenoj karakteristici skeniranih ostataka.
Bolji sistematski postupak za identifikovanje ostataka amino-kiselina sa ciljem da se modifikuju obuhvata identifikovanje ostataka iz hipervarijabilnog regiona koji su uključeni u
2
vezanju IL-4 i/ili IL-13 i onih ostataka iz hipervarijabilnog regiona koji malo ili nimalo učestvuju u vezanju IL-4 i/ili IL-13. Provodi se alaninsko skeniranje ne-veznih ostataka iz hipervarijabilnog regiona, pri čemu se svi ala-mutanti testiraju na pojačano vezanje za IL-4 i/ili IL-13. U drugoj izvedbi, oni ostaci koji su značajno uključeni u vezanje IL-4 i/ili IL-13 se biraju da se modifikuju. Modifikovanje može da uključuje deleciju ostatka ili inserciju jednog ili više ostataka u susedstvu ostatka od interesa. Međutim, normalno modifikovanje uključuje supstituciju ostatka sa drugom amino-kiselinom. Konzervativna supstitucija može da bude prva supstitucija. Ako takva supstitucija rezultuje u promenu biološke aktivnosti (na primer, utiče na vezni afinitet), tada se uvodi druga konzervativna supstitucija sa ciljem da se odredi dali je nastala značajnija promena.
Čak značajnija modifikacija raspona i prezentacije bioloških karakteristika nekog antitela može da se postigne uz pomoć selektiranja amino-kiseline koja se razlikuje značajnije u svojim karakteristikama no uobičajeni ostatak na mestu zamene. Tako, takva supstitucija može da se načini uz održavanje: (a) strukture polipeptidne okosnice u arealu supstitucije, na primer, kao ploha ili helikalna konformacija; (b) promene hidrofobnosti molekula na ciljanom mestu, ili (c) obima bočnog lanca.
Na primer, prirodne amino-kiseline mogu da se podele u grupe koje se baziraju na zajedničkim karakteristikama bočnih lanaca:
(1) hidrofobne: metionin (M ili met), alanin (A ili ala), valin (V ili val), leucin (L ili leu) i izoleucin (I ili ile);
(2) neutralne, hidrofilne: cistein (C ili cys), serin (S ili ser), treonin (T ili thr), asparagin (N ili asn) i glutamin (Q ili gln);
(3) kisele: asparaginska kiselina (D ili asp) i glutaminska kiselina (E ili glu);
(4) bazne: histidin (H ili his), lizin (K ili lys) i arginin (R ili arg);
(5) ostatke koji deluju na orijentaciju lanca: glicin (G ili gly) i prolin (P ili pro), i
(6) aromatske: triptofan (W ili trp), tirozin (Y ili tyr) i fenilalanin (F ili phe).
Ne-konzervativne supstitucije mogu da uzrokuju izmenu neke amino-kiseline sa aminokiselinom iz neke druge grupe. Konzervativne supstitucije mogu da uzrokuju izmenu neke amino-kiseline sa drugom iz iste grupe.
Preferirane amino-kiselinske supstitucije uključuju one koje: (1) smanjuju prijemčivost proteolizi, (2) smanjuju prijemčivost oksidaciji, (3) menjaju vezni afinitet i (4) stvaraju ili modifikuju druge fizičko-hemijske funkcionalne karakteristike takvih analoga. Analozi mogu da uključuju brojne mutein-sekvence koja su različite od onih kod prirodnog polipeptida. Na primer, supstitucije jedne ili više amino-kiselina (preferirano konzervativne supstitucije aminokiselina) mogu da se provedu na prirodnoj sekvenci (preferirano u delu polipeptida koji je spolja od domena koji stvaraju intermolekularne kontakte. Konzervativna amino-kiselinska supstitucija ne sme značajno da promeni strukturne karakteristike matične sekvence (na primer, uvedena amino-kiselina ne sme da pokazuje tendenciju da razori heliks koji se pojavljuje kod matične sekvence, ili da razori druge tipove sekundarnih struktura koji karakterizuju matičnu sekvencu) osim promena opsega ili konformacije R grupe ili bočnog lanca, Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, ur., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (Branden & Tooze, ur., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); i Thornton et al. Nature 354:105 (1991).
Uobičajeno, antitelo-mutant sa poboljšanim biološkim karakteristikama će sadržavati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična ili slična sa amino-kiselinskom sekvencom varijabilnog domena teškog ili lakom iz matičnog anti-humanog IL-4 i/ili IL-13 antitela, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% i često najmanje 95% identična. Identičnost ili sličnost u odnosu na sekvencu matičnog antitela je ovde definisana kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci-kandidatu koji su identični (na primer, isti ostatak) ili slični (na primer, amino-kiselinski ostatak iz iste grupe bazirano na zajedničkim karakteristikama bočnog lanca, supra) sa ostacima iz matičnog antitela, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja razmaka, ako je potrebno, sa ciljem da se postigne maksimalni procenat identičnosti sekvence.
Alternativno, antitela-mutanti mogu da se stvore uz pomoć sistemske mutacije FR i CDR regiona iz teških i lakih lanaca, ili Fcregion iz anti-IL-4, anti-IL-13 ili bispecifičnog IL-4/IL-13 antitela. Druge procedure za stvaranje antitela-mutanata uključuju upotrebu postupka sazrevanja afiniteta uz pomoć izlaganja faga (Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992) i Lowman et al., Biochemistry 30(45):10832-10838(1991)). Fuzije sa belančevinom omotača bakteriofaga (Smith, Science 228:1315 (1985); Scott & Smith, Science 249:386 (1990); Cwirla et al. Proc Natl Acad Sci USA 8:309 (1990); Devlin et al. Science 249:404 (1990); Wells &
2
Lowman, Curr Opin Struct Biol 2:597 (1992); i U.S. Pat. Br.5,223,409) su poznati kao korisne za povezivanje fenotipa izloženih belančevina ili peptida sa genotipom čestica bakteriofaga koji ih kodiraju. Fabdomeni iz antitela su takođe bili izloženi na fagu (McCafferty et al., Nature 348: 552 (1990); Barbas et al. Proc Natl Acad Sci USA 88:7978 (1991); i Garrard et al. Biotechnol 9:1373 (1991)).
Monovalentno izlaganje faga se sastoji od izlaganja grupe varijanti belančevina kao fuzije belančevine omotača bakteriofaga na česticama faga (Bass et al., Proteins 8:309 (1990). Sazrevanje afiniteta, ili poboljšavanje ili ravnoteža veznih afiniteta različitih belančevina, se pre postizalo preko postupne primene mutageneze, monovalentnog izlaganja faga i funkcionalne analize (Lowman & Wells, J Mol Biol 234:564 578 (1993); i U.S. Pat. Br.
5,534,617), na primer, uz pomoć fokusiranja na CDR regione iz antitela (Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:3809 (1994); i Yang et al., J Mol Biol 254:392 (1995)).
Biblioteke brojnih (na primer, 10<6>ili više) varijanti belančevina, koji se razlikuju na definisanim pozicijama sekvence, mogu da se konstruišu na česticama bakteriofaga, od kojih svaka sadrži DNK koja kodira tačno određenu varijantu belančevine. Nakon ciklusa afinitetnog prečišćavanja, uz pomoć imobiliziranog antigena, izoluju se pojedinačni klonovi bakteriofaga, a amino-kiselinska sekvenca izložene belančevine je otkrivena preko DNK.
Nakon stvaranja antitela-mutanta, može da se odredi biološka aktivnost pomenutog molekula u odnosu na matično antitelo kao šta je već ovde objašnjeno. Kao šta je navedeno pre, to može da uključuje određivanje veznog afiniteta i/ili drugih bioloških aktivnosti ili fizičkih karakteristika pomenutog antitela. U preferiranoj izvedbi ovoga pronalaska, priprema se panel sa antitelima-mutantima kojima se ispituje vezni afinitet za antigen. Jedno ili više antitelamutanata je izabrano iz ovakve pretrage koji se uobičajeno podvrgavaju jednoj ili više dodatnih testova biološke aktivnosti sa ciljem da se potvrdi da takva antitela-mutanti poseduju nove ili poboljšane karakteristike. U preferiranim izvedbama, antitelo-mutant zadržava sposobnost na veže IL-4 i/ili IL-13 sa veznim afinitetom koji je sličan ili bolji/veći od onog kod matičnog antitela.
Pomenuta antitela-mutanti koji su tako bili selektirani mogu da se podvrgnu drugim modifikacijama, često u zavisnosti o predviđenoj primeni antitela. Takve modifikacije mogu
2
da uključuju dodatne promene amino-kiselinske sekvence, fuziju na heterologni polipeptid(e) i/ili kovalentne modifikacije. Na primer, cisteinski ostatak koji nije uključen u održavanju odgovarajuće konformacije antitela-mutanta može da se zameni, opšte uzeto sa serinom, sa ciljem da se poboljša oksidativna stabilnost molekula i da se spreči aberantno unakrsnospajanje. Suprotno, cistein može da se doda u antitelo sa ciljem da se poboljša stabilnost (posebno klada je pomenuto antitelo fragment nekog antitela poput Fvfragmenta).
Drugi tip antitela-mutanta ima promenjeni glikozilacijski obrazac. To može da se postigne uz pomoć deletiranja jednog ili više karbohidratnih ostataka koji se nalaze u antitelu i/ili uz pomoć dodavanja jednog ili više glikozilacijskih mesta koja nisu prisutna na antitelu. Glikozilacija antitela je tipično N-spojena na Asn ili O-spojena na Ser ili Thr. Tripeptidne sekvence, asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde X je bilo koja amino-kiselina osim prolina, su uobičajene sekvence prepoznavanja za encimsko spajanje karbohidratnog ostatka na bočni lanac asparagina. N-acetilgalaktozamin, galaktoza, fukoza ili ksiloza, na primer, su spojeni na hidroksiamino kiselinu, a najčešće na serin ili treonin, mada 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin može takođe da se koristi. Dodavanje ili supstitucija jednog ili više ostataka serina ili treonina u sekvencu originalnog antitela može da pojača verovatnost O-spojene glikozilacije.
Može da bude poželjno da se modifikuje antitelo iz ovoga pronalaska u odnosu na efektorsku funkciju, tako da se pojača efikasnost antitela. Na primer, cisteinski ostatak ili ostaci mogu da se uvedu u Fcregion, šta omogućava nastanak inter-lančane disulfidne veze u tom regionu. Tako nastalo homodimerno antitelo može da ima poboljšani kapacitet internalizacije i/ili povećanu sposobnost ubijanja ćelija koje se provodi preko komplementa u ćelijsku toksičnost koja zavisi o antitelu (ADCC), vidi Caron et al., J Exp Med 176:1191-1195 (1992) i Shopes, Immunol 148:2918-2922 (1993). Alternativno, antitelo može da se konstruira tako da poseduje dvojne Fcregione i može prema tome da pokazuje pojačanu lizu komplementa i ADCC sposobnosti, vidi Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219230 (1989).
Kovalentne modifikacije antitela su uključene u okvirima ovoga pronalaska. Pomenute mogu da se načine uz pomoć hemijske sinteze ili uz pomoć encimskog ili hemijskog cepanja antitela, ako mogu da se primene. Drugi tipovi kovalentnih modifikacija antitela se uvode u molekul uz pomoć reagovanja ciljanih amino-kiselinskih ostataka iz antitela sa nekim organskim agensom
2
za derivatizovanje koji je sposoban da reaguje sa izdvojenim bočnim lancem ili sa N-terminalnim ili C-terminalnim ostatkom.
Cisteinski ostaci mogu da reaguju sa α-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), poput hlorosirćetne kiseline ili hloroacetamida, sa ciljem da se dobiju derivati karboksilmetila ili karboksiamidometila. Cisteiniski ostaci takođe mogu da se derivatizuju uz pomoć reakcije sa bromotrifluoroacetonom, α-bromo-β-(5-imidozoil) propionskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, phloromerkuribenzoatpom, 2-hloromerkura-4-nitrofenolom ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom, na primer.
Histidilski ostaci mogu da se derivatizuju uz pomoć reakcije sa dietilpirokarbonatom na pH 5.5-7.0. p-bromofenacil bromid takođe može da se koristi, a reakcija se preferirano provodi u 0.1 M natrijum kakodilatom na pH 6.0.
Lizinil i α-terminalni ostaci mogu da reaguju sa sukcinskim ili drugim karboksilnim kiselim anhidridima sa ciljem da se obrne naboj ostataka. Drugi prikladni reagensi za derivatizovanje ostataka koji sadrže α-amino uključuje imidoestere, poput metil pikolinimidata, piridoksal fosfata, piridoksala, hloroborohidrida, trinitrobenzensulfonske kiseline, O-metilizouree i 2,4-pentandiona, a amino-kiselina može da bude transaminaza-katalizovana sa glioksilatom.
Arginilni ostaci mogu da se modifikuju uz pomoć reakcije sa jednim ili više konvencionalnih reagenasa, poput fenilglioksala, 2,3-butandiona, 1,2-cikloheksandiona i ninhidrina. Derivatizacija argininskih ostataka često zahteva uslove za alkalnu reakciju. Nadalje, pomenuti reagensi mogu da reaguju sa lizinom kao i sa ε-amino grupom iz arginina.
Specifična modifikacija tirozilskih ostataka može da se provede sa aromatskim dijazonijumskim jedinjenjima ili sa tetranitrometanom. Na primer, N-acetilimidizol i tetranitrometan se koriste sa ciljem da se dobiju O-acetil tirozilne vrste i 3-nitro derivati. Tirozilni ostaci mogu da se jonizuju koristeći<125>I ili<131>I sa ciljem da se pravilno označe belančevine za upotrebu u radioimuno-testovima.
2
Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) mogu da se modifikuju uz pomoć reakcije sa karbodiimidima (R-N=C=C-R'), gde R i R' mogu da budu različite alkilne grupe, poput 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil)karbodiimida ili 1-etil-3-(4-azonija-4,4-dimetilpentil)karbodiimida. Nadalje, aspartilni i glutamilni ostaci mogu da se konvertuju u asparaginilne i glutaminilne ostatke uz pomoć reakcije sa amonijumskim jonima.
Glutaminilni i asparaginilni ostaci se frekventno deaminuju u odgovarajuće glutamilne i aspartilne ostatke u neutralnim ili alkalnim uslovima. Deaminovana forma ovih ostataka spada u okvire ovoga pronalaska.
Druge modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa iz serinilnih ili treonilnih ostataka, metilaciju the α-amino grupa iz bočnih lanaca lizina, arginina i histidina (Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, str. 79-86 (1983)), acetilaciju N-terminalnog amina i amidaciju bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.
Drugi tip kovalentnih modifikacija uključuje hemijsko i encimsko spajanje glikozida na antitelo. Ove procedure ne zahtevaju stvaranje antitela u nekoj drugoj ćeliji koja ima sposobnosti N-spojene ili O-spojene glikolizacije. U zavisnosti o modusu spajanja koji se koristi, šećer(i) mogu da se nadodaju na: (a) arginin i histidin; (b) na slobodne karboksilne grupe; (c) na slobodne sulfhidrilne grupe, poput onih iz cisteina; (d) na slobodne hidroksilne grupe, poput onih iz serina, treonina ili hidroksiprolina; (e) na aromatske ostatke poput onih iz fenilalanina, tirozina ili triptofana; ili (f) na amidnu grupu iz glutamina. Takvi postupci su opisani u dokumentu WO 87/05330 i u Aplin & Wriston, CRC Crit Rev Biochem, str.259-306 (1981).
Odstranjivanje bilo kojeg karbohidratnog ostatka koji se nalazi na antitelu može da se postigne hemijski ili encimski. Hemijska deglikozilacija, na primer, može da zahteva izlaganje antitela jedinjenju, trifluorometansulfonskoj kiselini, ili nekom ekvivalentnom jedinjenju, šta rezultuje cepanjem najvećeg dela ili svih šećera osim veznog šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), istovremeno ostavljajući samo antitelo intaktnim. Hemijska deglikozilacija je opisana, na primer, u Hakimuddin et al. Arch Biochem Biophys 259:52 (1987) i u Edge et al., Anal Biochem 118:131 (1981). Encimsko cepanje karbohidratnih
2
ostataka na antitelu može da se postigne uz pomoć bilo koje od brojnih endoglikozidaza i eksoglikozidaza kao šta je opisano u, na primer, Thotakura et al., Meth Enzymol 138:350(1987).
Drugi tip kovalentne modifikacije antitela obuhvata spajanje samog antitela na nekog od brojnih ne-proteinskih polimera, na primer, polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksilalkileni, na način koji je objašnjen u U.S. Pat. Br. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337.
Druga tehnika koja je preferirana za dobivanje mutanata ili muteina je afinitetno sazrevanje uz pomoć izlaganja faga (Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992); i Lowman et al., Biochemistry 30(45):10832-10838 (1991)). Ukratko, nekoliko mesta u hipervarijabilnom regionu (na primer, 6-7 mesta) je mutirano sa ciljem da se stvore sve moguće amino-kiselinske supstitucije na svakom mestu. Pomenuta antitela-mutanti koji su tako stvoreni se sada izlažu na monovalentan način na česticama faga kao fuzije na belančevinu koja se nalazi na česticama. Fag koji eksprimira različite mutante može da se provede kroz nekoliko runda selekcije na vezanje, a nakon toga sledi izolacija i sekvenciranje onih mutanata koji pokazuju najveći afinitet.
Postupak za selekciju novih veznih polipeptida može da koristi biblioteku strukturno sličnih polipeptida. Ovakva biblioteka strukturno sličnih polipeptida, na primer, fuzionisanih na belančevinu omotača faga, se proizvodi uz pomoć mutageneze, pa se izlaže na površini čestice. Čestice se tada dovode u kontakt sa molekulom metom i one čestice koje pokazuju najveći afinitet za metu se odvajaju od onih sa nižim afinitetom. Vezni molekuli s najvećim afinitetom se tada umnožavaju infekcijom odgovarajućeg bakterijskog domaćina, a nakon toga se korak kompetitivnog vezanja ponavlja. Ovaj proces se ponavlja dok se ne dobiju polipeptidi s željenim afinitetom.
Alternativno, multivalentni fag (McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; i Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628) takođe može da se koristi za ekspresiju nasumičnih točkastih mutacija (na primer, stvorenih uz pomoć upotrebe DNK polimeraze koja dozvoljava pogreške) sa ciljem da se stvori biblioteka faga sa fragmentima antitela koji tada mogu da se ispitaju na afinitet za IL-4 i/ili IL-13, Hawkins et al., (1992) J Mol Biol 254:889-896.
Preferirano, tokom procesa afinitetnog sazrevanja, replikativni ekspresijski vektor pod tesnom kontrolom transkripcijskog regulacionog elementa, pri čemu su uslovi kulture podešeni tako da količina ili broj čestica koji izlažu više od jedne kopije fuzione belančevine bude manji od oko 1%. Takođe preferirano, količina čestica koje izlažu više od jedne kopije fuzione belančevine je manji od 10% od količine čestica koje izlažu smo jednu kopiju fuzione belančevine. Preferirano, pomenuta količina je manja od 20%.
Funkcionalni ekvivalenti mogu da se stvore uz pomoć međusobnog izmenjivanja različitih CDR iz različitih lanaca antitela unutar okvira ili kompozitnog FR koji je izveden iz više antitela. Tako, na primer, različite klase antitela su moguće za određenu grupu CDR uz pomoć supstitucije različitih teških lanaca, na primer, IgG1-4, IgM, IgA1-2ili IgD, sa ciljem da se dobiju različiti tipovi ili izotipovi za IL-4 i/ili IL-13. Slično, veštačka antitela mogu da se stvore uz pomoć uvođenja određene grupe CDR u potpuno sintetički okvir.
Ovde otkriveni fragmenti antitela i funkcionalni ekvivalenti obuhvataju one molekule sa detektabilnom stepenom specifičnog vezivanja za IL-4 i/ili IL-13. Detektabilan stepen vezanja uključuje sve vrednosti u rasponu of najmanje 10-100%, preferirano od najmanje 50%, 60% ili 70%, još bolje od najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% vezne sposobnosti nekog antitela od interesa. Takođe su uključeni i ekvivalenti sa afinitetom većim od 100% antitela od interesa.
CDR, opšte uzeto, su važni za prepoznavanje epitopa i vezanje antitela. Međutim, promene mogu da se uvedu u ostatke koji stvaraju CDR bez da se utiče na sposobnost antitela da prepozna i da veže svoj epitop. Na primer, mogu da se načine promene koje ne utiču na prepoznavanje epitopa, a povećavaju veznu sposobnost antitela za epitop. Nekoliko studija je ispitivalo efekte uvođenja promena na jednoj ili više amino-kiselina na različitim pozicijama u sekvenci antitela, na osnovu znanja sekvence primarnog antitela, na njegove karakteristike, poput vezanja i nivoa ekspresije (Yang et al., 1995, J Mol Biol 254:392-403; Rader et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-8915; i Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539).
1
Tako, ekvivalenti antitela od interesa mogu da se stvore uz pomoć menjanja sekvence gena za teški i laki lanac u delu sa CDR1, CDR2 ili CDR3, ili u okvirnim regionima, koristeći postupke poput mesto-usmerene mutageneze potpomognute sa oligonukleotidima, mutageneze sa kasetama, PCR koji uvodi pogreške, mešanjem DNK ili uz pomoć mutator-sojeva bakterije E. coli (Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16:535-539; i Adey et al., 1996, Chap.16, str.277-291, u Phage Display of Peptides and Proteins, ur. Kay et al., Academic Press). Postupci menjanja sekvence nukleinske kiseline primarnog antitela mogu da rezultuju sa antitelima koja imaju poboljšani afinitet (Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370; i Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628).
Ponovljeni ciklusi "selekcije polipeptida" mogu da se koriste za viši i visoki afinitet vezanja uz pomoć, na primer, selekcije višestrukih amino-kiselinskih promena koje su izabrane nakon više ciklusa selekcije. Nakon prve runde selekcije, koja uključuje prvi region selekcije aminokiselina u polipeptidu liganda ili antitela, provode se dodatne runde selekcije u drugim regionima ili na drugim amino-kiselinama u ligandu. Ovakvi ciklusi selekcije se ponavljaju sve do postizanja željenih karakteristika za vezni afinitet.
Poboljšana antitela takođe uključuju ona antitela koja imaju poboljšane karakteristike koje su stvorene uz pomoć standardnih tehnika životinjske imunizacije, formiranju hibridoma i selekcijom antitela sa specifičnim karakteristikama.
"Antagonist" se odnosi na molekul koji je sposoban da inhibira jednu ili više bioloških aktivnosti ciljanog molekula, poput signaliziranja sa IL-4 i/ili IL-13. Antagonisti mogu da reaguju sa procesom vezanja receptora na ligand i vice versa, sa procesom onesposobljavanja ili ubijanja ćelija koje su aktivisane uz pomoć liganda, i/ili sa procesima aktivisanja receptora ili liganda (na primer, aktivisanje tirozin kinaze) ili sa prenosom signala nakon vezanja liganda na receptor. Pomenuti antagonist može potpuno da blokira interakcije receptor-ligand ili može značajno da smanji takve interakcije.
"Agonist" se odnosi na jedinjenje, uključujući belančevinu, polipeptid, peptid, antitelo, fragment antitela, konjugat, veliki molekul, mali molekul, koji aktivišu jednu ili više bioloških
2
aktivnosti IL-4 i/ili IL-13. Agonisti mogu da reaguju sa procesom vezanja receptora na ligand i vice versa, mogu da deluju kao mitogen u ćelija koje su aktivisane uz pomoć liganda, i/ili mogu da deluju na proces ćelijskog inaktivisanja ili na inhibicije prenosa signala nakon vezanja liganda na receptor. Sve takve tačke intervenisanja sa agonistom se smatraju ekvivalentima za ciljeve ovoga sadašnjeg otkrivanja.
Termini "ćelija", "ćelijska linija" i "ćelijska kultura" uključuju i njihove potomke. Treba da se takođe razume da svi potomci ne moraju da budu identični, poput na primer u sadržaju DNK, zbog namerene ili nehotične mutacije. Varijante potomaka koje imaju istu funkciju ili biološke karakteristike od interesa, kao šta je to slučaj sa početnim ćelijama, su uključene.
Termin "vektor" označava konstrukta nukleinske kiseline, nosioca, koji sadrži nukleinsku kiselinu, transgena, stranog gena ili gena od interesa, koji može da bude operativno spojen na odgovarajuću kontrolnu sekvencu za ekspresiju pomenutog transgena u nekom prikladnom domaćinu. Takva kontrolna sekvenca uključuje, na primer, promoter koji omogućava transkripciju, ponekad sekvencu operatora sa ciljem kontrole pomenute transkripcije, sekvencu koja kodira prikladna vezna mesta na mRNK za ribozom i sekvence koje kontrolišu terminaciju transkripcije i translacije. Vektor može da bude plazmid, čestica faga ili samo potencijalni genomski insert. Jednom kada je transformiran u odgovarajući domaćin, ovaj vektor može da se replicira i da funkcioniše nezavisno od genoma domaćina, ili može ponekad da se ugradi u genom ćelije domaćina. U ovoj specifikaciji, "plazmid" i "vektor" se koriste kao sinonimi, jer je plazmid uobičajena forma vektora. Međutim, ovaj pronalazak ima za nameru da uključi pomenute druge forme vektora koje imaju ekvivalentne funkcije nosioca, koji su ili postaju poznati stanju tehnike, poput virusa, sintetskih molekula koji nose nukleinske kiseline, liposome i slično.
"Sisar", za ciljeve tretmana, se odnosi na bilo koju životinju koja je klasifikovana kao sisar, uključujući i čoveka, domaće životinje i životinje sa farmi, ne-humanih primata i životinja iz zooloških vrtova, sportskih životinja i kućnih ljubimaca, poput pasa, konja, mačaka, krava i slično.
Antitela od interesa mogu da se pretraže ili mogu da se koriste u nekom testu kao šta je ovde opisano ili kao šta je poznato stanju tehnike. Često, takvi testovi zahtevaju reagensa koji može da se detektuje, odnosno, na primer, da se označi. Reč "oznaka", kada se ovde koristi, se odnosi na jedinjenje koje može da se detektuje ili na kompoziciju koja može da se direktno ili indirektno konjuguje na molekul ili belančevinu, na primer, neko antitelo. Oznaka može da bude detektabilna sama za sebe (na primer, oznake sa radioizotopima, oznake sa fluorescentnim česticama) ili, u slučaju encimske oznake, može da katalizuje hemijsku promenu nekog jedinjenja supstrata ili može da bude detektabilna kompozicija.
Kao šta se ovde koristi, "kruta faza" označava ne-vodeni matriks na kojeg može da se doda (adherira) neki entitet ili molekul, poput antitela iz ovoga sadašnjeg pronalaska. Primer krutih faza, koji je ovde obuhvaćen, uključuje one koji su načinjeni delomično ili potpuno od stakla (na primer, staklo sa porama poznate veličine), polisaharida (na primer, agaroza), poliakrilamida, polistirena, polivinil alkohola i silikona. U nekim izvedbama, zavisno o kontekstu, kruta faza može da obuhvata rupice testne pločice; u drugima može da se koristi u koloni za prečišćavanje (na primer, afinitetna hromatografska kolona). Tako, kruta faza može da bude hartija, kuglica, plastika, čip itd., a može da bude načinjena od brojnih materijala, poput nitroceluloze, agaroze, polistirena, polipropilena, silikona itd., u može da se nalazi u brojnim konfiguracijama.
Gen ili cDNK koja kodira IL-4 i IL-13, koji su poznati stanju tehnike, može da se klonira u neki plazmid ili neki drugi ekspresijski vektor i može da se eksprimira u brojnim ekspresijskim sistemima u skladu sa postupcima koji su dobro poznati stručnjacima u polju, ali vidi ispod, na primer.
Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju mutiranu amino-kiselinsku sekvencu mogu da se pripreme uz pomoć brojnih postupaka poznatih stanju tehnike. Ovi postupci uključuju, ali bez ograničenja, mutagenezu potpomognutu oligonukleotidima (ili mesto-usmerenu), PCR-mutagenezu i kasetnu mutagenezu nekog od pre pripremljenog mutanta ili ne-mutirane verzije molekula od interesa, (vidi, na primer, Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82:488 (1985)).
Rekombinantna ekspresija antitela iz pronalaska uključuje konstrukciju ekspresionog vektora koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo. Jednom kada se dobije polinukleotid koji kodira molekul antitela, vektor za proizvodnju pomenutog antitela može da se proizvede uz pomoć tehnologije rekombinantne DNK kao šta je već poznato stanju tehnike. Konstruira se
4
ekspresijski vektor koji sadrži antitelo koje kodira sekvence i odgovarajuće transkripcijske i translacijske kontrolne signale. Postupci uključuju, na primer, in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetske tehnike i in vivo genetičku rekombinaciju.
Ekspresioni vektor se prenosi u ćeliju domaćina pomoću konvencionalnih tehnika, a transfektovane ćelije se zatim kultivišu sa konvencionalnim tehnikama da bi se proizvelo antitelo iz pronalaska. U jednom aspektu ovoga pronalaska, vektori koji kodiraju teške i lake lance mogu da budu ko-ekspirimirani u ćeliji domaćina za ekspresiju celog imunoglobulinskog molekula, kao šta je ovde opisano.
Mogu da se koriste brojni domaćin/ekspresijski sistemi sa ciljem da se eksprimiraju molekuli antitela iz ovoga pronalaska. Takvi ekspresijski sistemi predstavljaju prenosioci uz pomoć kojih kodirajuća sekvenca od interesa može da bude proizvedena i naknadno prečišćena, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu da, kada su transformirane ili transfektirane sa odgovarajućom nukleotidnom kodirajućom sekvencom, eksprimiraju molekul antitela iz ovoga pronalaska in situ. Bakterijske ćelije, poput E. coli, i eukariotske ćelije se uobičajeno koriste za ekspresiju molekula rekombinantnog antitela, posebno za ekspresiju celog molekula rekombinantnog antitela. Na primer, ćelije sisara poput CHO-ćelija, zajedno sa vektorom, poput nekog koji sadrži element sa promotorom glavnog intermedijarnog ranog gena iz humanog citomegalovirusa, su efektivni ekspresijski sistem za antitela (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); i Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)). Biljke i ćelije iz biljne kulture, ćelije insekta itd. takođe mogu da se koriste da se proizvode belančevine od interesa, kao šta je već poznato stanju tehnike.
Dodatno, ćelija domaćina je izabrana tako da pomaže ekspresiju uvedene sekvence, ili modifikuje i procesira genski produkt na željeni način. Takve modifikacije (na primer, glikozilacija) i procesiranje (na primer, cepanje) proteinskih produkata mogu da budu važne za funkciju same belančevine. Različite ćelije-domaćini poseduju karakteristične i specifične mehanizme za post-translacijsko procesiranje i modifikovanje belančevina i genskih produkata. Odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi-domaćini mogu da se izaberu sa ciljem da se obezbedi tačna modifikacija i procesiranje eksprimiranog antitela od interesa. Tako, eukariotske ćelije-domaćini koji poseduju ćelijsku mašineriju za tačno procesiranje primarnog transkripta, glikozilaciju i fosforilaciju genskog produkta mogu da se koriste. Takve ćelijedomaćini iz sisara uključuju, ali bez ograničenja, CHO, COS, 293, 3T3 ili ćelije mijeloma.
Za dugotrajnu proizvodnju sa visokim prinosom rekombinantnih belančevina se preferira stabilna ekspresija. Na primer, mogu da se pripreme ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju molekule antitela. Umesto da se koriste ekspresijski vektori koji sadrže viralne početke replikacije, ćelije-domaćina mogu da se transformiraju sa DNK koja pod kontrolom odgovarajućih elemenata koji kontrolišu ekspresiju (na primer, promotor, sekvenca pojačivača, transkripcijskih terminatora, mesta za poliadenilaciju itd.) i marker koji može da se selekcionira. Nakon uvođenja strane DNK, konstruirane ćelije mogu da se ostave da rastu tokom jednog ili dva dana u nekom obogaćenom medijumu, a tada se premeštaju na selektivni medijum. Selektivni marker u rekombinantnom plazmidu poseduje rezistenciju na uspostavljenu selekciju i omogućava ćelijama da stabilno integriraju pomenuti plazmid u hromozom i da se razmnože u ćelijsku liniju. Takve ćelijske linije ne samo da su korisne za proizvodnju antitela, već su i korisne tokom pretrage i evaluacije jedinjenja koja reaguju direktno ili indirektno sa molekulom antitela.
Brojni selekcijski sistemi mogu da se koriste, uključujući, ali bez ograničenja, selekciju na timidin kinazu iz Herpes simplex virusa (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoksantin-gvanin fosforiboziltransferazu (Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992)), glutamat sintazu u prisutnosti metionin sulfoksimida (Adv Drug Del Rev 58, 671, 2006 i vidi Internet stranicu ili literaturu iz Lonza Group Ltd.) i gene za adenin fosforiboziltransferazu (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) u tk-, hgprt- ili aprt-ćelijama. Takođe, rezistencija na anti-metabolite može da se koristi kao baza za selekciju za sledeće gene: dhfr, koji stvara rezistenciju na metotreksat (Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:1527 (1981)); gpt, koji stvara rezistenciju na mikofenolnu kiselinu (Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:2072 (1981)); neo, koji stvara rezistenciju na aminoglikozid, G-418 (Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991)); i hygro, koji stvara rezistenciju na higromicin (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Postupci rekombinantne DNK tehnologije, koji su poznati stanju tehnike, mogu rutinski da se primene s ciljem selektiranja željenog rekombinantnog klona, a takvi postupci su opisani, na primer, kod Ausubel et al., ur., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press (1990); Dracopoli et al., ur., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994); i Colberre-Garapin et al., J Mol Biol 150:1 (1981).
Nivoi ekspresije molekula antitela mogu da se povećaju uz pomoć amplifikacije vektora (na primer, vidi Bebbington et al., u DNA Cloning, Vol. 3. Academic Press (1987)). Kada se amplificira marker u vektorskom sistemu koji eksprimira antitelo, povećanje nivoa inhibitora koji je prisutan u kulturi će povećati broj kopija marker-gena. Budući je amplifikovani region povezan sa genom antitela, proizvodnja samog antitela će se takođe povećati (Crouse et al., Mol Cell Biol 3:257 (1983)).
Ćelije-domaćini mogu da se ko-transfektuju sa dva ili više ekspresijskih vektora iz ovoga pronalaska, na primer, prvi vektor kodira polipeptid koji je izveden iz teškog lanca, a drugi vektor kodira polipeptid koji je izveden iz lakog lanca. Oba vektora mogu da sadrže identične selektivne markere koji omogućavaju podjednaku ekspresiju polipeptida sa teškim i lakim lancem. Alternativno, može da se koristi pojedinačan vektor koji kodira, i je sposoban da eksprimira, oba polipeptida, iz teškog i lakog lanca. U takvim situacijama, laki lanac treba da se postavi pre teškog lanca sa ciljem da se izbegne višak toksičnog slobodnog teškog lanca (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); i Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980)). Kodirajuće sekvence za teški i laki lanac obuhvataju cDNK ili genomsku DNK.
Jednom kada se proizvede molekul antitela iz ovoga pronalaska preko neke životinje, hemijski sintetizuje ili rekombinantno eksprimira, treba da ga se pročisti uz pomoć bilo kojeg postupka koji je poznat stanju tehnike, a koji se koristi za prečišćavanje nekog molekula imunoglobulina, na primer, uz pomoć hromatografije (na primer, izmena jona, afinititetna, posebno koja pokazuje afinitet za IL-4 i/ili IL-13 nakon hromatografije sa Belančevinom A i hromatografije bazirane na veličini itd.), centrifugovanja, diferencijalne rastvorljivosti ili preko bilo koje druge standardne tehnike za prečišćavanje belančevina. Pored toga, antitela iz ovog pronalaska mogu se kondenzovati sa heterolognim polipeptidnim sekvencama koje su ovde opisane ili su drugačije poznate u stanju tehnike, kako bi se olakšalo prečišćavanje.
Antitela iz ovoga pronalaska mogu da se stvore uz pomoć bilo kojeg prikladnog postupka koji je poznat stanju tehnike. Antitela koja su ovde otkrivena obuhvataju poliklonska antitela, mada su, zbog njihovog modifikovanja sa ciljam da se optimizuje njihova upotreba kod ljudi, kao i da se optimizuje upotreba antitela per se, monoklonska antitela preferirana usled lakoće njihove proizvodnje i manipulacije određenih belančevina. Postupci za pripremu poliklonskih antitela su poznati stručnjacima (Harlow et al., Antitela: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd. (1988)).
Antitela koja su ovde otkrivena preferirano obuhvataju monoklonska antitela. Monoklonska antitela mogu da se pripreme uz pomoć tehnologije hibridoma, kao šta je opisano kod Kohler et al., Nature 256:495 (1975); u dokumentu U.S. Pat. Br.4,376,110; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd. (1988) i kod Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier (1981), postupcima rekombinantne DNK, na primer, stvaranjem i korišćenjem transfektoma, ili pomoću drugih postupaka koji su poznati stručnjacima. Drugi primeri postupaka koji mogu da se koriste za proizvodnju monoklonskih antitela uključuju, ali bez ograničenja, tehnike humanih B-ćelijskih hibridoma (Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); i Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)), i tehnika EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, str. 77-96, Alan R. Liss (1985)). Takva antitela mogu da budu iz bilo koje imunoglobulinske klase uključujući IgG, IgM, IgE, IgA i IgD, i bilo koje njihove potklase. Hibridomi koje stvaraju ovde otkrivena mAb mogu da se kultiviraju in vitro ili in vivo.
U hibridom-modelu, domaćin poput miša, humanizovanog miša, transgeničnog miša sa genima humanog imuno-sistema, hrčka, zeca, pacova, kamile ili bilo koji drugi odgovarajući životinjski domaćin, se imunizuje sa ciljem da se dobiju limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja specifično vežu IL-4 ili IL-13. Alternativno, limfociti mogu da budu imunizovani in vitro. Limfociti se tada fuzionišu sa ćelijama mijeloma koristeći prikladni agens za fuziju, poput polietilen glikola, sa ciljem da se dobije hibridom-ćelija (Goding, Monoclonal Antitela: Principles and Practice, Academic Press, str.59-103 (1986)).
Opšte uzeto, tokom stvaranja hibridoma koji proizvode antitelo, koriste se limfociti iz periferne krvi ("PBL") ako su poželjne ćelije iz ljudskog izvora, ili ćelije slezine ili limfnih čvorova ako su poželjni izvori ne-humanih sisara. Imortalizovane ćelijske linije su uobičajeno transformirane ćelije sisara, posebno ćelije mijeloma iz glodara, goveda ili ljudi. Tipično se koriste mijelom-ćelijske linije iz miša ili pacova. Hibridom ćelije mogu da se kultiviraju u prikladnom medijumu za kulturu koji preferirano sadrži jednu ili više supstancija koje inhibiraju rast ili preživljavanje ne-fuzionisanih, imortalizovanih ćelija. Na primer, ako parentalnim ćelijama nedostaje encim hipoksantin gvanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), medijum za hibridom tipično će sadržavati hipoksantin, aminopterin i timidin ("HAT medijum"), supstancije koje sprečavaju rast HGPRT-deficijentnih ćelija.
Preferirane imortalizovane ćelijske linije i one koje se efikasno fuzionišu, podržavaju stabilnu proizvodnju antitela u velikim količinama preko selektiranih ćelija koje stvaraju antitelo, i su osetljive na medijum poput HAT medijuma. Među ovim mijelom-ćelijskim linijama su i mijelom linije iz miša, poput onih koje su izvedene iz MOPC-21 i MPC-11 mišjih tumora koji su dostupni preko Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. i SP2/0, FO ili X63-Ag8-653 ćelije koje mogu da se nabave iz American Type Culture Collection, Manassas, VA.
Ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma takođe su opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984); i Brodeur et al., Monoclonal Antitelo Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, str.
51-63 (1987)). Mišja mijelom-ćelijska linija NSO može takođe da se koristi (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, UK).
Druga alternativa je da se koristi električna fuzija radije no hemijska fuzija sa ciljem da se formira hibridom. Osim fuzije, B-ćelije mogu da se imortalizuju uz pomoć, na primer, Epstein Barr Virusa ili drugih gena za transformaciju, vidi, na primer, Zurawaki et al. u Monoclonal Antitela, ur., Kennett et al., Plenum Press, str.19-33. (1980). Transgenični miš koji eksprimira imunoglobuline u nekoliko kombinovanih imunodeficijentnih (SCID) miševa transplantiranih sa humanim B limfocitima takođe mogu da se koriste.
Medijum za kulturu u kojem hibridom-ćelije rastu je naveden za proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih protiv IL-4 i/ili IL-13. Vezna specifičnost monoklonskih antitela proizvedenih preko hibridom-ćelija može da se odredi uz pomoć imunoprecipitacije ili preko in vitro veznog testa, poput radioimuno-testa (RIA), fluorocitometrijske analize (FACS) ili encim-spojenog imunosorbent testa (ELISA). Takve tehnike su poznate stanju tehnike i ulaze u uobičajene sposobnosti stručnjaka. Vezni afinitet monoklonskog antitela prema IL-4 i/ili IL-13 može ad se odredi, na primer, uz pomoć Scatchard-ove analize (Munson et al., Anal Biochem 107:220 (1980)).
Nakon šta su hibridom-ćelije identifikovane da stvaraju antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili delovanja, klonovi mogu da se supkloniraju uz pomoć procedura krajnjeg razređenja i da se uzgoje pomoću standardnih postupaka (Goding, Monoclonal Antitela: Principles and Practice, Academic Press, str. 59-103 (1986)). Prikladni medijumi za kulturu uključuju, na primer, Dulbecco-ov modifikovani Eagle-ov medijum (D-MEM) ili RPMI-1640 medijum. Dodatno, hibridom-ćelije mogu da rastu in vivo kao ascitni tumori u nekoj životinji.
Monoklonska antitela koja se luče iz supklonova se prikladno odvajaju ili izoluju iz medijuma kulture, ascitne tečnosti ili seruma uz pomoć konvencionalnih procedura za prečišćavanjeimunoglobulina poput, na primer, hromatografije sa belančevinom A-Sefarozom, sa belančevinom G-Sefarozom, sa hidroksilapatitom, gel-ekskluzijskom hromatografijom, gelelektroforezom, dijalizom ili afinitetnom hromatografijom.
Stanju tehnike su poznati brojni postupci za proizvodnju monoklonskih antitela pa tako, ovo otkrivanje nije ograničeno na njihovu proizvodnju samo u hibridomama. Na primer, monoklonska antitela mogu da se proizvedu uz pomoć postupaka rekombinantne DNK, poput onih opisanih u U.S. Pat. Br.4,816,567. U tom kontekstu, termin "monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo koje je izvedeno iz pojedinačnog eukariotskog klona, faga ili prokariotskog klona.
DNK koje kodiraju ovde opisana monoklonska antitela se lako izoluju i sekvencioniraju uz pomoć konvencionalnih procedura (na primer, uz pomoć korišćenja oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu na gene koji kodiraju teške i lake lance iz mišjih antitela, ili istih lanaca iz čoveka, humanizovanih ili drugih izvora) (Innis et al. u PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990), i Sanger et al., Proc Natl Acad Sci 74:5463 (1977)). Hibridom-ćelije služe kao izvor takve DNK. Jednom izolovani, DNK molekuli mogu da se smeste u ekspresijske vektore, koje se tada transfektuju u ćelije-domaćine poput ćelija E. coli, ćelija NS0, ćelija COS, ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelija mijeloma koje inače ne proizvode imunoglobulinske belančevine, sa ciljem da se postigne sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama-domaćina. DNK takođe može da se modifikuje, na primer, uz pomoć supstituisanja kodirajuće sekvence za konstantne domene iz humanog teškog i lakog lanca sa homolognom mišjom sekvencom (U.S. Pat. Br.4,816,567; i
4
Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)) ili uz pomoć kovalentnog spajanja sekvence koja kodira imunoglobulin (sve ili deo kodirajuće sekvence) za ne-imunoglobulinski polipeptid. Takav ne-imunoglobulinski polipeptid može da se zameni za konstantne domene nekog ovde opisanog antitela, ili može da se zameni za varijabilne domene iz IL-4 ili IL-13 uz kombinovanje mesta iz ovde opisanog antitela sa ciljem da se stvori himerno bivalentno antitelo.
Pomenuta antitela mogu da budu monovalentna antitela. Postupci za pripremu monovalentnih antitela su dobro poznati stanju tehnike. Na primer, jedan postupak uključuje rekombinantnu ekspresiju imunoglobulinskog lakog lanca i modifikovanog teškog lanca. Teški lanac se skraćuje, opšte uzeto, na bilo kojoj tački u Fcregionu sa ciljem da se spreči unakrsno-spajanje teškog lanca. Alternativno, relevantni cisteinski ostaci se menjaju sa drugim amino-kiselinskim ostatkom ili se deletiraju sa ciljem da se spreči unakrsno-spajanje.
Fragmenti antitela koji prepoznaju specifične epitope mogu da se stvore uz pomoć poznatih tehnika. Tradicionalno, ovi fragmenti se izvode pomoću proteolitičke digestije intaktnog antitela (vidi, na primer, Morimoto et al., J Biochem Biophys Methods 24:107 (1992); i Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Na primer, Fabi F(ab')2fragmenti mogu da se stvore uz pomoć proteolitičkog cepanja imunoglobulinskih molekula, koristeći encime poput papaina (sa ciljem da se stvore Fabfragmenti) ili pepsina (za stvaranje F(ab')2fragmenata). F(ab')2fragmenti sadrže varijabilni region, konstantan region iz lakog lanca i CH1domen iz teškog lanca. Međutim, ovi fragmenti mogu da se proizvedu direktno uz pomoć rekombinantnih ćelijadomaćina. Na primer, fragmenti antitela mogu da se izoluju iz biblioteke faga sa antitelima. Alternativno, F(ab')2-SH fragmenti mogu da se direktno obnove iz E. coli i hemijski spoje sa ciljem da se formiraju F(ab')2fragmenti (Carter et al., Bio/Technology 10:163 (1992). Prema drugom pristupu, F(ab')2fragmenti mogu da se izoluju direktno iz kulture rekombinantnih ćelijadomaćina. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela će biti vidljive stručnjaku u polju. U drugim izvedbama, izabrano antitelo je jedno-lančani Fvfragment (Fv) (WO 93/16185).
Za neke primene, uključujući in vivo upotrebu antitela u ljudi i in vitro testova detekcije, može da bude poželjno da se koriste himerna, humanizovana ili humana antitela. Postupci za stvaranje himernih antitela su poznati stanju tehnike, vidi na primer, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J Immunol Methods 125:191 (1989); i U.S. Pat. Br.5,807,715; 4,816,567; i 4,816397.
Humanizovana antitela se izvode iz molekula antitela koje su stvorene u ne-humanim vrstama i koja mogu da vežu IL-4 i/ili IL-13 kada je jedan ili više njihovih CDR insertiran u FR regione iz humanog imunoglobulinskog molekula. Antitela mogu da se humanizuju koristeći brojne tehnike koje su poznate stanju tehnike uključujući, na primer, CDR presađivanje (EPO 239,400; WO 91/09967; i U.S. Pat. Br. 5,225,539; 5,530,101; i 5,585,089), dvostruki sloj ili promenu površine (EPO 592,106; EPO 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); i Roguska et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994)), i mešanje lanaca (U.S. Pat. Br.5,565,332).
Humanizovano antitelo ima jedan ili više amino-kiselinskih ostataka iz izvora koji nije ljudski. Ne-humani amino-kiselinski ostaci se često označavaju sa terminom "uvezeni" ostaci, a koji su tipično uzeti iz nekog "uvezenog" varijabilnog domena. Humanizovanje može da se esencijalno provede uz pomoć postupaka po Winteru i saradnicima (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); i Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), uz pomoć zamene ne-humanih CDR ili delova CDR sekvenci za odgovarajuće sekvence iz humanog antitela. Prema tome, takva "humanizovana" antitela su himerna antitela (U.S. Pat. Br.4,816,567), gde značajno manji deo iz intaktnog humanog varijabilnog domena je zamenjen sa odgovarajućom sekvencom iz ne-humanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima neki CDR ostaci i moguće neki FR ostaci su zamenjeni sa odgovarajućima iz analognih mesta u antitelima glodara. Konstanti region iz teškog lanca i region drške mogu da formiraju bilo koju klasu ili podklasu sa ciljem da se postigne željeni efekat, poput određene funkcije efektora.
Često, ostaci iz okvira u humanim okvirnim regionima mogu da se zamene sa odgovarajućim ostatkom iz CDR-a donorskog antitela sa ciljem menjanja, i moguće poboljšanja, vezanja antigena. Supstitucije u okviru se identifikuju uz pomoć postupaka koji su poznati stanju tehnike, na primer, uz pomoć modeliranja interakcija ostataka iz CDR i okvira kako bi se identifikovali ostaci iz okvira koji su važni za vezanje antigena, i uz pomoć uporedbe sekvenci kako bi se identifikovali uobičajeni ostaci okvira na određenim pozicijama, vidi, na primer, U.S. Pat. Br.5,585,089; i Riechmann et al., Nature 332:323 (1988).
Dodatno je preferirano da humanizovana antitela zadrže visoki afinitet za IL-4 i/ili IL-13, i da zadrže ili steknu druge korisne biološke karakteristike. Tako, humanizovana antitela se pripremaju preko procesa analize parentalne sekvence i brojnih konceptualnih humanizovanih produkata koristeći tri-dimenzionalne modele parentalne i humanizovane sekvence. Tridimenzionalni imunoglobulinski modeli su uobičajeno dostupni i poznati stručnjacima u polju. Postoje računarni programi koji ilustruju i prikazuju verojatne tri-dimenzionalne konformacijske strukture izabrane imunoglobulinske sekvence. Provera prikaza omogućava analizu verojatne uloge određenih ostatka u funkcioniranju određene imunoglobulinske sekvence, na primer, analiza ostataka koji utiču na sposobnost pomenutog imunoglobulina da veže IL-4 i/ili IL-13. Na taj način, ostaci iz FR mogu da se selekcioniraju i kombinuju iz recipientne i uvezene sekvence sa ciljem da se željene karakteristike antitela, poput povećanog afiniteta za ciljani antigen, maksimizuju, mada samo CDR ostaci direktno i najznačajnije utiču na vezanje IL-4 ili IL-13. CDR regioni takođe mogu da se modifikuju tako da sadrže jednu ili više amino-kiselina koje variraju u odnosu na one iz parentnog antitela iz kojeg su CDR dobiveni, a sa ciljem da se stvore pojačane ili različite karakteristike od interesa, poput vezanje sa većim afinitetom ili većom silinom, na primer.
Određene karakteristike konstantnih regiona antitela mogu da se manipulišu i promene sa ciljem da se dobiju antitela-homolozi, derivati, fragment i sl. sa karakteristikama koje se razlikuju od ili su bolje u odnosu na one koje postoje u matičnom antitelu. Tako, na primer, brojna IgG4 antitela formiraju unutrašnji-lanac sa disulfidnim vezama blizu regiona drške. Ova veza unutar lanca može da destabilizuje matični bivalentni molekul tako šta stvara monovalentne molekule koje sadrže težak lanac sa spojenim lakim lancem. Takvi molekuli mogu ponovo da asociraju, ali nasumično.
Bilo je primećeno da modifikujuće amino-kiseline u regionu drške iz IgG4 molekula mogu da smanje verovatnost nastanka veze unutar lanca, stabilizujući IgG4 molekul, šta minimizuje verovatnost nastanka bispecifičnih molekula. Ovakva modifikacija može da bude korisna ako je terapeutsko antitelo IgG4 molekul zbog toga šta će pojačana stabilnost da minimizuje verovatnost disocijacije molekula tokom nastanka i proizvodnje, kao i in vivo. Monovalentno antitelo ne mora da ima istu efikasnost kao i bivalentni matični molekul. Na primer, kada se bivalentni IgG4 administrira pacijentu, procenat bivalentnog IgG4 opada na oko 30% tokom
4
perioda od dve sedmice. Supstitucija amino-kiseline na poziciji 228 pojačava stabilnost IgG4. Serin koji se nalazi na poziciji 228 može da se zameni sa drugom amino-kiselinom, poput bilo koje od preostalih 19 amino-kiselina. Takva promena može da se provede posebno u rekombinantnim antitelima kada kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline može da se mutira sa ciljem da se ostvari zamena amino-kiseline na poziciji 228. Na primer, S može da se zameni sa prolinom.
Druga grupa amino-kiselina koje su prikladne za modifikovanje uključuju amino-kiseline u delu sa drškom, a koje utiču na vezanje molekula koji sadrži teški lanac koji može da se veže na Fcreceptor i da internalizuje vezano antitelo. Takve amino-kiseline uključuju, kod IgG1 molekula, ostatke od oko 233 do oko 237 (Glu-Leu-Leu-Gly-Gly); (SEQ ID BR:49) od oko 252 do oko 256 (Met-Ile-Ser-Arg-Thr) (SEQ ID BR:50) i od oko 318 (Glu) do oko 331 (Pro), uključujući, na primer, Lys320, Lys322i Pro329.
Kompletno humana antitela su posebno poželjna za terapeutski tretman ljudi. Humana antitela mogu da se stvore uz pomoć brojnih postupaka koji su poznati stanju tehnike uključujući postupke izlaganja faga koji su već ovde opisani koristeći biblioteke antitela dobivenih iz humanih imunoglobulinskih sekvenca, vidi, U.S. Pat. Br.4,444,887 i 4,716,111; i dokumente WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 i WO 91/10741. Tehnike autora Cole et al. i Boerder et al. su takođe dostupne za pripremu humanih monoklonskih antitela (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985); i Boerner et al., J Immunol 147:86 (1991)).
Humana antitela mogu takođe da se proizvedu uz pomoć transgeničnih miševa koji su sposobni da eksprimiraju funkcionalne endogene imunoglobuline, ali koji takođe eksprimiraju određene humane imunoglobulinske gene. Na primer, kompleksi humanih imunoglobulinskih gena za teški i laki lanac mogu da se uvedu nasumično ili uz pomoć homologne rekombinacije u mišje embrionske matične ćelije. Alternativno, humani varijabilni region, konstantni region i različiti region mogu da se uvedu u mišje embrionske matične ćelije, zajedno sa humanim genima teškog i lakog lanca. Mišji imunoglobulinski geni za teški i laki lanac mogu da postanu nefunkcionalni odvojeni ili simultano sa uvođenjem humanih imunoglobulinskih lokusa uz pomoć homologne rekombinacije. Posebno, homozigotna delecija JH regiona sprečava proizvodnju endogenog antitela. Modifikovane embrionske matične ćelije se umnožavaju i mikroinjektiraju u blastocistu sa ciljem da se stvore himerni miševi. Himerni miševi se tada uzgajaju sa ciljem da se dobiju homozigotni potomci koji eksprimiraju humana antitela, vidi, na primer, Jakobovitis et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993); Jakobovitis et al., Nature 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol 7:33 (1993); i Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)).
Transgenični miševi se imunizuju na uobičajen način uz pomoć IL-4 ili IL-13 citokina, na primer, sva ili deo IL-4 ili IL-13 monoklonskih antitela usmerenih protiv IL-4 i IL-13 mogu da se dobiju iz imunizovanih, transgeničnih miševa koristeći konvencionalnu hibridomtehnologiju. Humani imunoglobulinski transgeni koji se nalaze u transgeničnim miševima se rearanžiraju tokom diferencijacije B-ćelija, a nakon toga prolaze proces promene klasa i somatsku mutaciju. Tako, uz pomoć ove tehnike, moguće je da se stvore terapeutski korisna IgG, IgA, IgM i IgE antitela. Za pregledne radove vidi Lonberg et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995). Za diskusiju o proizvodnji humanih antitela i humanih monoklonskih antitela i protokola za proizvodnju takvih antitela, vidi, na primer, dokumente WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; i WO 96/33735; EPO Br. 0 598 877; i U.S. Pat. Br. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; i 5,939,598. Dodatno, kompanije poput Amgen (Fremont, CA), Genpharm (San Jose, CA) i Medarex, Inc. (Princeton, NJ) mogu da se iznajme za proizvodnju humanih antitela usmerenih protiv IL-4 i/ili IL-13 koristeći tehnologiju koja je slična onoj koja je opisana malopre.
Takođe, humana mAb mogu da se stvore uz pomoć imunizovanja miševa u koje su bili transplantirani humani leukociti iz periferne krvi, ćelije slezine i koštana srž (na primer, tehnika trioma od XTL Biopharmaceuticals, Izrael). Kompletno humana antitela koja prepoznaju izabrani epitop mogu da se stvore uz pomoć tehnika koje su poznate kao "navođena selekcija". U tom pristupu, selektirano ne-humano monoklonsko antitelo, na primer, mišje antitelo se koristi sa ciljem da se navodi selekcija kompletnog humanog antitela koje prepoznaje isti epitop (Jespers et al., Bio/technology 12:899 (1988)).
Kada se koriste rekombinantne tehnike, varijante antitela mogu da se proizvedu intra-ćelijski, u periplazmatskom prostoru, ili da se direktno izlučuju u medijum. Ako je pomenuta varijanta antitela nastala intra-ćelijski, tokom prvog koraka, poseban ostatak (debri), ćelije- domaćini ili lizirani fragmenti, mogu da se odstrane, na primer, uz pomoć centrifugovanja ili ultrafiltracije.
4
Autori Carter et al., Bio/Technology 10:163 (1992) opisuju proceduru za izolovanje antitela koja se izlučuju u periplazmatski prostor bakterije E. coli. Ukratko, ćelijska pasta je izložena natrijum acetatu (pH 3.5) i EDTA. Ćelijski ostatak može da se odstrani uz pomoć centrifugovanja. Kada se varijanta antitela izlučuje u medijum, supernatant iz takvog ekspresijskog sistema se prvo, opšte uzeto, koncentriše uz pomoć komercijalno dostupnog koncentracionog filtera za belančevine, na primer, ultrafiltracijska jedinica iz Amicon ili Millipore Pellicon. Inhibitor proteaze poput PMSF može da se uključi sa ciljem da inhibira proteolizu, a antibiotici mogu da se koriste sa ciljem da spreče rast naprednih kontaminanata.
Kompozicija antitela koja se priprema iz pomenutih ćelija može da se prečisti uz pomoć, na primer, hromatografije sa hidroksilapatitom, gel-elektroforeze, dijalize i afinitetne hromatografije. Prikladnost belančevine A ili belančevine G kao afinitetnog liganda zavisi o vrstama i izotipu bilo kojeg imunoglobulinskog Fcdomena koji je prisutan u varijanti antitela. Belančevina A može da se koristi sa ciljem da se prečiste antitela koja se baziraju na humanim IgG1, IgG2 ili IgG4 teškim lancima (Lindmark et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)). Belančevina G može da se koristi za mišje izotipove i za humani IgG3 (Guss et al., EMBO J 5:1567 (1986)). Matriks na kojeg je afinitetni ligand spojen najčešće je agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice, poput stakla sa porama poznate veličine ili poli(stirendivinil)benzena, dozvoljavaju brže rate protoka i kraće procesno vreme koje se uobičajeno postiže sa agarozom. Kada varijanta antitela sadrži CH3domen, ostatak Bakerbond ABXTM (JT Baker; Phillipsburg, NJ) je koristan za prečišćavanje. Druge tehnike za prečišćavanjebelančevina, poput frakcioniranja na koloni za jonsku izmenu, precipitacije sa etanolom, HPLC reverzne faze, hromatografije na silici, hromatografije na heparin agarozi i na ostatku za izmenu anjona ili katjona (poput kolone sa poliaspartičnom kiselinom), hromatofokusiranja, SDS-PAGE i precipitacija sa amonijum sulfatom su takođe dostupne, u zavisnosti u varijanti antitela koja treba da se obnovi.
Nakon bilo kojeg preliminarnog koraka prečišćavanja, mešavina koja sadrži antitelo ili varijantu od interesa i kontaminante može da se podvrgne hidrofobnoj interakcijskoj hromatografiji niskoga pH uz pomoć elucijskog pufera sa pH između 2.5-4.5, koja se preferirano provodi kod niskih koncentracija soli (na primer, od oko 0-0.25 M soli).
4
Antitela iz ovoga pronalaska su bispecifična antitela kako je definisano u priloženim zahtevima.
Postupci za stvaranje bispecifičnog antitela su dobro poznati. Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnog antitela se bazira na ko-ekspresiji parova imunoglobulinskih teških/lakih lanaca, gde oba teška lanca imaju različite specifičnosti (Milstein et al., Nature 305:537 (1983)). Zbog nasumičnog asortimana imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu mešavinu deset različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima tačnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanjetačnog molekula se uobičajeno postiže uz pomoć koraka afinitetne hromatografije. Slične procedure su razotkrivene u dokumentu WO 93/08829 i u Traunecker et al., EMBO J 10:3655 (1991). Drugi postupci za stvaranje bispecifičnog antitela su obezbeđeni kod, na primer, Kufer et al., Trends Biotech 22:238-244, 2004.
Varijabilne domene antitela sa željenim veznim specifičnostima mogu da se fuzionišu na sekvence konstantnih imunoglobulinskih domena. Preferira se fuzija sa konstantnim domenom iz teškog lanca nekog imunoglobulina, koji sadrži barem jedan deo ručke, CH2, i CH3regione. Može da sadrži prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto koje je neophodno za vezanje lakog lanca koji je prisutan najmanje u jednoj od pomenutih fuzija. DNK koje kodiraju fuzije imunoglobulinskog teškog lanca, ako je poželjno, imunoglobulinski laki lanac, se ugrađuju u odvojene ekspresijske vektore, pa se ko-transformiraju u neki prikladni organizam domaćin. Za daljnje detalje o stvaranju bispecifičnih antitela vidi, na primer Suresh et al., Meth Enzym 121:210 (1986).
Heterokonjugatna antitela se takođe razmatraju u ovom otkrivanju. Heterokonjugatna antitela se sastoje od dva kovalentno vezana antitela. Takva antitela su, na primer, bila predviđena da ciljaju neželjene ćelije imuno sistema (U.S. Pat. Br. 4,676,980). Predviđeno je da pomenuta antitela mogu da se pripreme in vitro koristeći poznate postupke iz sintetske hemije belančevina, uključujući i one postupke koje uključuju agense koji stvaraju unakrsnu povezanost. Na primer, imunotoksini mogu da se konstruiraju uz pomoć reakcije disulfidne izmene ili uz pomoć formiranja tioesterske veze. Primeri prikladnih reagenasa za tu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat, i one koji su razotkriveni u, na primer, U.S. Pat. Br.4,676,980.
4
Dodatno, mogu da se stvore i antitela sa jednim lancem usmerena protiv IL-4 i/ili IL-13. Primeri takve tehnologije su razotkriveni u dokumentu WO9425591 gde se govori o antitelima sa teškim lancem iz Ig iz roda Camelidae (kamile), kao i u dokumentu US20030130496 koji opisuje izolovanje potpuno humanog antitela sa jednim lancem iz biblioteka faga.
Alternativno, tehnike koje su opisane za proizvodnju antitela sa jednim lancem (U.S. Pat. Br.
4,946,778; Bird, Science 242:423 (1988); Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879 (1988); i Ward, et al., Nature 334:544 (1989)) mogu da se adaptiraju da stvaraju antitela sa jednim lancem. Antitela sa jednim lancem se formiraju uz pomoć spajanja fragmenata iz Fvregiona iz teškog i lakog lanca preko formiranja amino-kiselinskog mosta, šta rezultuje u jednolančani polipeptid. Tehnike za sklapanje funkcionalnih Fvfragmenata u bakteriji E. coli takođe mogu da se koriste (Skerra et al., Science 242:1038 (1988)).
Ovaj sadašnji pronalazak obuhvata antitela koja su rekombinantno spojena ili hemijski konjugovana (uključujući kovalentne i ne-kovalentne konjugate) na neki polipeptid. Fuzionisana ili konjugovana antitela iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za jednostavno prečišćavanje, vidi, na primer, dokument WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol Lett 39:91 (1994); U.S. Pat. Br. 5,474,981; Gillies et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1428 (1992); i Fell et al., J Immunol 146:2446 (1991). Amino-kiselinska sekvenca marker može da bude heksahistidinski peptid, poput priveska koji je obezbeđen u pQE vektoru (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA), među drugima, mnogi od njih su komercijalno dostupni, Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989). Drugi peptidni privesci korisni za prečišćavanjeuključuju, ali bez ograničenja, "HA" privesak, koji odgovara nekom epitopu koji je izveden iz belančevine hemaglutinin iz virusa influence (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) i "flag" privesak.
Mogu da se stvore vezni molekuli sa jednim polipetidinim lancem u kojima su Fvregioni iz teških i lakih lanaca spojeni. Antitela sa jednim lancem ("scFv") i postupak njihove konstrukcije su opisani u, na primer, U.S. Pat. Br. 4,946,778. Alternativno, Fabmože da se konstruiše i eksprimira na sličan način. Sva potpuna ili delomična humana antitela mogu da budu manje imunogena u uporedbi sa mišjim monoklonskim antitelima, a fragmenti i antitela sa jednim lancem mogu takođe da budu manje imunogena.
4
Antitela ili fragmenti antitela mogu da se izoluju iz biblioteka antitela u fagima koje su stvorene uz pomoć tehnika koje su opisane kod McCafferty et al., Nature 348:552 (1990). Clarkson et al., Nature 352:624 (1991), a Marks et al., J Mol Biol 222:581 (1991) opisuju izolovanje mišjih i humanih antitela koristeći biblioteke faga. Kasnije publikacije opisuju proizvodnju humanih antitela visokog afiniteta (nM raspon) uz pomoć mešanja lanca (Marks et al., Bio/Technology 10:779 (1992)), kao i kombinatorna infekcija i in vivo rekombinacija kao strategija za stvaranje veoma velikih biblioteka faga (Waterhouse et al., Nucl Acids Res 21:2265 (1993)). Tako, opisane tehnike su vredna alternativa tradicionalnim hibridom-tehnikama monoklonskih antitela koje se koriste za izolovanje monoklonskih antitela.
Antitela kandidati protiv IL-4 i/ili IL-13 se testiraju uz pomoć encim-spojenog imunosorbentnog testa (ELISA), FACS, Western-imunoblotinga ili drugih imunohemijskih tehnika koje su poznate stanju tehnike.
Sa ciljem da se odredi dali pojedino antitelo-homolog veže humani IL-4 i/ili IL-13 može da se koristi bilo koji konvencionalni test vezanja. Korisni IL-4 i IL-13 vezni testovi uključuju FACS analizu, ELISA testove, Površinsku plazmon-rezonanciju (Biacore), radioimuno-testove i slično, koji detektiraju vezanje antitela, i funkcije koje iz toga proizlaze, na humani IL-4 i/ili IL-13. Humani IL-4 i IL-13 pune dužine i rastvorljive forme, koje se ovde razmatraju su korisne u takvim testovima. Vezanje antitela ili homologa na IL-4 i/ili IL-13, ili na njihove odgovarajući rastvorljive fragmente, mogu uobičajeno da se odrede preko upotrebe drugog antitela koje je specifično za imunoglobuline iz vrsta iz kojih je pomenuto antitelo ili homolog dobiven.
Sa ciljem da se odredi dali pojedino antitelo ili homolog značajno blokira ili ne vezanje IL-4 i/ili IL-13, može da se koristi bilo koji prikladni kompeticijski test. Uobičajeni testovi uključuju, na primer, ELISA testove, FACS testove, radioimuno-testove i slično koji kvantifikuju sposobnost antitela ili homologa da se takmiči za IL-4 i/ili IL-13. Preferirano se meri sposobnost liganda da blokira vezanje označenog humanog IL-4 i/ili IL-13 na imobilizirano antitelo ili homolog.
4
Ovde opisana antitela mogu da se opišu ili specifikuju u odnosu na epitop(e) ili deo(delove) IL-4 i/ili IL-13 koje antitelo prepoznaje ili na koje se veže specifično. Epitop(i) ili polipeptidni deo(delovi) mogu da se specifikuju kao šta je ovde opisano, na primer, uz pomoć N-terminalnih i C-terminalnih pozicija, po veličini graničnih amino-kiselinskih ostataka, konformacijskih epitopa i slično.
Ovde opisana antitela mogu takođe da se opišu ili specifikuju u odnosu na unakrsnureaktivnost. Antitela koja vežu IL-4 i/ili IL-13 polipeptide, koji imaju najmanje 95%, najmanje 90%, najmanje 85%, najmanje 80%, najmanje 75%, najmanje 70%, najmanje 65%, najmanje 60%, najmanje 55% i najmanje 50% identičnosti (kao šta je izračunato uz pomoć postupaka koji su poznati stanju tehnike i ovde opisani) sa IL-4 i/ili IL-13 su takođe ovde opisana.
Ovde opisana antitela takođe mogu da se opišu ili specifikuju u odnosu na vezni afinitet za IL-4 i/ili IL-13. Antitela protiv IL-4 i/ili protiv IL-13 mogu da se vežu sa KDmanjom od oko 10<-7>M, manjom od oko 10<-6>M ili manjom od oko 10<-5>M. Veći vezni afiniteti u nekom antitelu od interesa mogu da budu korisni, poput onih sa ravnotežnom disocijaciskom konstantom ili KDod oko 10<-8>do oko 10<-15>M, od oko 10<-8>do oko 10<-12>M, od oko 10<-9>do oko 10<-11>M, ili od oko 10<-8>do oko 10<-10>M. Predmeto razotkrivanje takođe obezbeđuje antitela koja kompletno inhibiraju vezanje antitela na neki ovde razotkrivani epitop kao šta je određeno uz pomoć bilo kojeg postupka poznatog stanju tehnike za određivanje kompetitivnog vezanja, na primer, imuno-testova koji su opisani ovde. U preferiranim izvedbama, pomenuto antitelo kompetetivno inhibira vezanje epitopa za najmanje 95%, najmanje 90%, najmanje 85%, najmanje 80%, najmanje 75%, najmanje 70%, najmanje 60% ili najmanje 50%.
Ovo sadašnje otkrivanje takođe uključuje konjugate koji sadrže neko antitelo od interesa. Pomenuti konjugati obuhvataju dve primarne komponente, antitelo od interesa i drugu komponentu, koja može da bude agens za vezanje na ćeliju, citotoksični agens itd.
Kao šta se ovde koristi, termin "agens koji se veže na ćeliju" se odnosi na agens koji specifično prepoznaje i veže neki molekul na površini ćelije. Tako, agens koji se veže na ćeliju može da bude CD antigen, antigen patogena, poput virusnog antigena, diferencijacijskog antigena, antigena raka, ćelijsko specifičnog antigena, tkivno specifičnog antigena, Ig ili Ig-sličan molekul itd.
Agensi koji se vežu na ćeliju mogu da budu bilo kojeg tipa kao šta je već poznato, ili postaje poznato, i uključuju peptide, ne-peptide, saharide, nukleinske kiseline, ligande, receptore itd. ili njihove kombinacije. Agens za vezanje na površinu ćelije može da bude bilo koje jedinjenje koje može da se veže na ćeliju, na specifičan ili ne-specifičan način. Opšte uzeto, agens može da bude antitelo (posebno monoklonska antitela), limfokini, hormoni, faktori rasta, vitamini, molekuli koji transportuju nutrient (poput transferina), ili bilo koji drugi molekul ili supstancija koja može da se veže na ćeliju.
Drugi primeri agenasa koji mogu da se vežu na ćeliju koji mogu da se koriste uključuju: poliklonska antitela; monoklonska antitela; i fragmente antitela poput Fab, Fab', F(ab')2i Fv(Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al., J. Immunol.113:470-478 (1974); i Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960)).
Druga komponenta takođe može da bude citotoksični agens. Termin "citotoksični agens", kao šta se ovde koristi, se odnosi na supstanciju koja smanjuje ili blokira funkciju, ili rast, ćelija i/ili uzrokuje razaranje ćelija. Tako, citotoksični agens može da bude taksol, maitansinoid, poput DM1 ili DM4, CC-1065 ili analog CC-1065, ricin, mitomicin C itd. U nekim izvedbama, citotoksični agens, kao i svaki drugi vezni agens iz konjugata iz ovog sadašnjeg otkrivanja je kovalentno vezan, direktno ili preko linkera koji može da se pocepa ili može da bude takav koji ne može da se pocepa, na neko antitelo od interesa.
Primeri prikladnih maitansinoida uključuju maitansinol i analoge maitansinola. Maitansinoidi inhibiraju nastanak mikrotubula i su veoma toksični za ćelije sisara.
Primeri prikladnih analoga maitansinola uključuju one koje imaju modifikovani aromatski prsten i one koje imaju modifikacije na drugim pozicijama. Takvi prikladni maitansinoidi su razotkriveni u U.S. Patent Br. 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; i 5,846,545.
Primeri prikladnih analoga maitansinola koji imaju modifikovani aromatski prsten uključuju: (1) C-19-dehloro (U.S. Pat. Br.4,256,746) (pripremljen, na primer, uz pomoć LAH redukcije
1
ansamitocina P2); (2) C-20-hidroksi (ili C-20-demetil) /- C-19-dehloro (U.S. Pat. Br.
4,361,650 i 4,307,016) (pripremljen, na primer, uz pomoć demetilacije koristeći rodove Streptomyces ili Actinomyces ili dehlorinaciju uz pomoć litijum aluminijum hidrida (LAH)); i (3) C-20-demetoksi, C-20-aciloksi (-OCOR), /-dehloro (U.S. Pat. Br.4,294,757) (pripremljen uz pomoć acilacije preko acil hlorida).
Primeri prikladnih analoga maitansinola koji imaju modifikacije koje se nalaze na drugačijim pozicijama uključuju: (1) C-9-SH (U.S. Pat. Br. 4,424,219) (pripremljen uz pomoć reakcije maitansinola sa H2S ili P2S5); (2) C-14-alkoksimetil (demetoksi/CH2OR) (U.S. Pat. Br.
4,331,598); (3) C-14-hidroksimetil ili aciloksimetil (CH2OH ili CH2OAc) (U.S. Pat. Br.
4,450,254) (pripremljen iz roda Nocardia); (4) C-15-hidroksi/aciloksi (U.S. Pat. Br.4,364,866) (pripremljen uz pomoć konverzije maitansinola uz pomoć roda Streptomyces); (5) C-15-metoksi (U.S. Pat. Br.4,313,946 i 4,315,929) (izolovan iz biljke Trewia nudiflora); (6) C-18-N-demetil (U.S. Pat. Br. 4,362,663 i 4,322,348) (pripremljen uz pomoć demetilacije maitansinola pomoću roda Streptomyces); i (7) 4,5-deoksi (U.S. Pat. Br. 4,371,533) (pripremljen uz pomoć redukcije maitansinola sa titanijum trihloridom/LAH).
Pomenuti citotoksični konjugati mogu da se pripreme uz pomoć postupaka in vitro. Sa ciljem da se neki citotoksični agens, lek ili pro-lek veže na neko antitelo, uobičajeno se koristi vezna grupa. Prikladne vezne grupe su poznate stanju tehnike i uključuju disulfidne grupe, grupe tioetra, kisele nestabilne grupe, foto-nestabilne grupe, nestabilne grupe za peptidazu i nestabilne grupe za esterazu. Na primer, konjugati mogu da se konstruiraju uz pomoć reakcije izmene disulfida ili uz pomoć nastanka tioetarske veze između antitela od interesa i pomenutog leka ili pro-leka.
Kao što je gore navedeno, u ovom pronalasku su izolovane sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju antitelo iz predmetnog pronalaska, vektorski konstrukti koji sadrže nukleotidnu sekvencu iz predmetnog pronalaska, ćelije domaćina koje sadrže takav vektor i rekombinantne tehnike za proizvodnju polipeptida.
Vektor normalno sadrži komponente koje su poznate stanju tehnike i, opšte uzeto, uključuju, ali bez ograničenja, jedno ili više od sledećih: pojedinačnu sekvencu, početak replikacije, jedan ili više markera ili gena za selekciju, sekvence koje potpomažu i/ili pojačavaju translaciju,
2
element pojačivač itd. Tako, ekspresijski vektori uključuju nukleotidnu sekvencu koja je operativno spojena na takvu prikladnu nukleotidnu sekvencu koja reguliše transkripciju ili translaciju poput onih koje su izvedene iz sisara, mikroorganizama, virusa ili gena od interesa. Primeri dodatnih regulatornih sekvenca uključuju operatore, ribosomska vezna mesta za mRNK, i/ili druge odgovarajuće sekvence koje kontrolišu transkripciju i translaciju, poput njenog početka ili terminacije. Nukleotidne sekvence su "operativno vezane" kada je regulatorna sekvenca funkcionalno spojena na nukleotidnu sekvencu odgovarajućeg polipeptida. Tako, promotor nukleotidne sekvence je operativno spojen, na primer, na sekvencu teškog lanca iz antitela kada nukleotidna sekvenca pomenutog promotora kontroliše transkripciju pomenute nukleotidne sekvence.
Dodatno, sekvence koje kodiraju odgovarajuće signalne peptide koji nisu prirodno povezani sa sekvencama teškog i/ili lakog lanca antitela mogu da se ugrade u ekspresijske vektore. Na primer, nukleotidna sekvenca za signalni peptid (omogućava sekreciju) može da se fuzioniše u okviru polipeptidne sekvence na takav način da omogućava antitelu da se izlučuje u periplazmički prostor ili u medijum. Signalni peptid koji je funkcionalan u korišćenim ćelijama-domaćinima pojačava ekstra-ćelijsku sekreciju odgovarajućeg antitela ili njegovog dela. Signalni peptid može da se pocepa iz polipeptida tokom sekrecije antitela iz ćelije. Primeri takvih sekretornih signala su dobro poznati i uključuju, na primer, one koji su opisani u U.S. Pat. Br.5,698,435; 5,698,417; i 6,204,023.
Pomenuti vektor može da bude plazmid, jedno-lančani ili dvo-lančani viralni vektor, jednolančana ili dvo-lančana RNK ili DNK vektora iz faga, fagemd, kozmid ili bilo koji drugi nosilac nekog transgena od interesa. Takvi vektori mogu da se uvedu u ćelije kao polinukleotidi uz pomoć dobro poznatih tehnika za uvođenje DNK i RNK u ćelije. Vektori, u slučaju faga i viralnih vektora takođe mogu da se uvedu u ćelije kao pakovani ili sklopljeni virus uz pomoć poznatih tehnika za infekciju i transdukciju. Viralni vektori mogu biti sposobni za replikaciju ili nesposobni za pomenutu. U drugom slučaju, razmnožavanje virusa, opšte uzeto, se javlja jedino u komplementarnim ćelijama-domaćinima i uz pomoć korišćenja višestrukih vektora koji sadrže brojne virusne komponente koje su neophodne za nastanak čestica. Bez-ćelijski translacijski sistemi mogu takođe da se koriste za stvaranje belančevina koristeći RNK molekule koje su dobivene iz sadašnjih DNK konstrukata (vidi, na primer, dokumente WO 86/05807 i WO 89/01036; i U.S. Pat. Br.5,122,464).
Antitela iz ovoga pronalaska mogu da se eksprimiraju iz bilo koje prikladne ćelije-domačin. Primeri ćelija-domaćina u ovom sadašnjem pronalasku uključuju prokariotske, kvaščeve ćelije ili ćelije viših eukariota i uključuju, ali bez ograničenja, mikroorganizme poput bakterije (na primer, E. coli, B. subtilis, rodovi Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, i Shigella, kao i rodove Pseudomonas i Streptomyces i klasu Bacilli,) transformirane sa rekombinantnom DNK bakteriofaga, plazmidnom DNK ili kozmidnom DNK, a sve su ekspresijski vektori koji sadrže kodirajući sekvencu antitela od interesa; kvasca (na primer, rodovi Saccharomyces, Pichia, Actinomycetes, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Candida, Trichoderma, Neurospora, i filamentozne gljive, poput rodova Neurospora, Penicillium, Tolypocladium i Aspergillus) transformirani sa rekombinantnim kvaščevim ekspresijskim vektorima koji sadrže kodirajuću sekvencu za antitelo; sistema sa ćelijama insekata koje su inficirane sa rekombinantnim virusnim ekspresijskim vektorima (na primer, Baculovirus) koji sadrže kodirajući sekvencu antitela; sistema sa biljnim ćelijama inficiranima sa rekombinantnim virusnim ekspresijskim vektorima (na primer, virusa mozaika karfiola, CaMV; ili virusa mozaika duvana, TMV) ili transformirani sa rekombinantnom plazmidnim ekspresijskim vektorima (na primer, Ti-plazmid) koji sadrže kodirajući sekvencu antitela; ili sistema sa ćelijama sisara (na primer, COS, CHO, BHK, 293 ili 3T3 ćelije) koje sadrže rekombinantne ekspresijske konstrukte koji imaju promotore izvedene iz genoma sisara (na primer, metalotioneinski promotor) ili iz virusa sisara (na primer, kasni promotor iz adenovirusa; ili 7.5K promotor iz vakcinija virusa).
Ekspresijski vektori za upotrebu u prokariotskim ćelijama-domaćinima, opšte uzeto, obuhvataju jedan ili više fenotipski selektivnih gena markera. Fenotipski selektivni gen marker je, na primer, gen koji kodira belančevinu koja omogućava antibiotsku rezistenciju ili koja stvara neku autotrofnu potrebu. Primeri korisnih ekspresijskih vektora za prokariotske ćelijedomaćini uključuju one koji su izvedeni iz komercijalno dostupnih plazmida, poput pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Švedska), pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI), pET (Novagen, Madison, WI) i pRSET (Invitrogen, Carlsbad, CA) serija vektora (Studier, J Mol Biol 219:37 (1991); i Schoepfer, Gene 124:83 (1993)). Sekvence promotora koje se uobičajeno koriste za rekombinantne ekspresijske vektore u prokariotskim ćelijamadomaćinima uključuju T7, (Rosenberg et al., Gene 56:125 (1987)), β-laktamaza (penicilinaza), laktoza-promotorski sistem (Chang et al., Nature 275:615 (1978); i Goeddel et al., Nature
4
281:544 (1979)), triptofan (trp) promotorski sistem (Goeddel et al., Nucl Acids Res 8:4057 (1980)), i tac-promotor (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. izd., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)).
Kvaščevi vektori često sadrže sekvencu za početak replikacije, poput one iz 2µ kvaščevog plazmida, autonomno replicirajuću sekvencu (ARS), promotorski region, sekvence za poliadenilaciju, sekvence za terminaciju transkripcije i selektivni gen marker. Prikladne sekvence za promotore kod kvaščevih vektora uključuju, između ostalog, promotore za metalotionein, 3-fosfoglicerat kinazu (Hitzeman et al., J Biol Chem 255:2073 (1980)) ili drugih glikolitičkih encima (Holland et al., Biochem 17:4900 (1978)) poput enolaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze, heksokinaze, piruvat dekarboksilaze, fosfofruktokinaze, glukoza-6-fosfat izomeraze, 3-fosfoglicerat mutaze, piruvat kinaze, triosefosfat izomeraze, fosfoglukoze izomeraze i glukokinaze. Drugi prikladni vektori i promotori za upotrebu u kvaščevoj ekspresiju su dodatno opisani kod Fleer et al., Gene 107:285 (1991). Drugi prikladni promotori i vektori za kvasac i kvaščeve transformacijske protokole su dobro poznati stanju tehnike. Kvaščevi transformacijski protokoli su dobro poznati. Jedan takav protokol je opisan kod Hinnen et al., Proc Natl Acad Sci 75:1929 (1978), a odnosi se na Trp<+>transformante u selektivnom medijumu.
Bilo koja kultura eukariotskih ćelija je prikladna, bez razlike dali dolazi iz kičmenjaka ili beskičmenjaka. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju biljne ćelije i ćelije insekata (Luckow et al., Bio/Technology 6:47 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., ur., vol.8, str. 277-9, Plenum Publishing (1986); i Maeda et al., Nature 315:592 (1985)). Na primer, Baculovirus-sistemi mogu da se koriste ua proizvodnju heterolognih belančevina. U sistemu sa ćelijama insekata može da se koristi nuklearni poliedrozni virus (AcNPV) iz leptira Autographa californica kao vektor sa ciljem da eksprimira strane gene. Ovaj virus raste u ćelijama leptira Spodoptera frugiperda. Sekvenca koja kodira antitelo može da se klonira pod kontrolom AcNPV promotora (na primer, poliedrin promotor). Drugi domaćini koji su bili identifikovani uključuju komarce iz roda Aedes, Drosophila melanogaster i Bombyx mori. Brojni viralni sojevi za transfekciju su posebno dostupni, na primer, L-1 varijanta AcNPV i Bm-5 soj vrste Bombyx mori NPV. Štaviše, biljne kulture pamuka, kukuruza, krumpira, soje, petunije, paradajza i duvana takođe mogu da se koriste kao domaćini koji su poznati stanju tehnike.
Ćelije kičmenjaka i njihovo razmnožavanje u kulturi (kultura tkiva) može da bude rutinska procedura, mada postoje ćelijske linije koje su teške za održavanje i zahtevaju, na primer, specijalizovan medijum sa jedinstvenim faktorima, ćelijama hraniteljicama itd., vidi Tissue Culture, Kruse et al., ud., Academic Press (1973). Primeri korisnih ćelija-domaćina iz sisara su ćelije majmuna; humana linija embrionskih ćelija iz bubrega; ćelije bubrega mladunaca hrčka; ćelije jajnika Kineskih hrčaka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:4216 (1980)); mišje sertolijeve ćelije; ćelije humanog karcinoma vrata materice (na primer, HeLa); ćelije bubrega iz pasa; ćelije humanih pluća; ćelije humane jetre; mišje ćelije tumora dojki; i NS0 ćelije.
Ćelije-domaćini se transformiraju sa vektorima za stvaranje antitela pa se uzgajaju u kulturi na konvencionalnom hranjivom medijumu koji sadrži faktore rasta, vitamine, minerale itd., kao i inducere koji su prikladni za korišćene ćelije i vektore. Uobičajeno korišćena sekvenca promotora i sekvenca pojačivača se izvode iz polioma virusa, Adenovirusa 2, Simian virusa 40 (SV40) i humanog citomegalovirusa (CMV). DNK sekvence koje su izvedene iz genoma virusa SV40 mogu da se koriste sa ciljem da obezbede druge genetičke elemente za ekspresiju sekvence strukturnog gena u ćelijama-domaćina koji je sisar, na primer, SV40 početak, rani i kasni promotor, pojačivač, mesta splajsovanja i poliadenilacije. Viralni rani i kasni promotori su posebno korisni zbog toga šta ih je lako izvesti iz viralnog genoma kao fragment koji takođe može da sadrži viralni početak replikacije. Primeri ekspresijskih vektora za upotrebu u ćelijama-domaćinima iz sisara su komercijalno dostupni.
Komercijalno dostupan medijum poput Ham-ov F10, Minimalni esencijalni medijum (MEM), RPMI-1640 i Dulbecco-ov modifikovani Eagle-ov medijum (DMEM) su prikladni za kulturu ćelija-domaćina. Dodatno, bilo koji medijum koji je opisan kod Ham et al., Meth Enzymol 58:44 (1979) i Barnes et al., Anal Biochem 102:255 (1980), i u U.S. Pat. Br. 4,767,704; 4,657,866; 4,560,655; 5,122,469; 5,712,163; ili 6,048,728 može da se koristi kao medijum za kulturu ćelija-domaćina. Bilo koji od ovih medijuma može da se neophodno dopuni sa hormonima i/ili drugim faktorima rasta (poput insulina, transferina ili epidermalnog faktora rasta), solima (poput hlorida, kao natrijum, kalcijum ili magnezijm hlorid; i fosfatima), puferima (poput HEPES), nukleotidima (poput adenozina i timidina), antibioticima, elementima u tragovima (definisanim anorganskim jedinjenjima koja su uobičajeno prisutna u finalnim koncentracijama u mikromolarnom rasponu) i glikozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Bilo koji drugi neophodni dodatak može da se uključi u odgovarajućoj koncentraciji, po izboru. Uslovi kulture, poput temperature, pH itd., su poznati stanju tehnike u odnosu na odgovarajuću ćeliju i tako da omogućavaju željenu ekspresiju pomenutog transgena.
Mogu da se dobiju polinukleotidi od interesa i nukleotidna sekvenca određenih polinukleotida uz pomoć postupaka koji su poznati stanju tehnike. Na primer, ako je nukleotidna sekvenca antitela poznata, polinukleotid koji kodira pomenuto antitelo može da se sklopi iz hemijski sintetizovanih oligonukleotida (na primer, kao šta je opisano kod Kutmeier et al., Bio/Techniques 17:242 (1994)), a nakon toga se amplifikuju ligirani oligonukleotidi, na primer, uz pomoć PCR.
Alternativno, polinukleotid koji kodira antitelo može da se generiše iz nukleinske kiseline iz ćelije koja ju eksprimira. Ako klon koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira određeno antitelo nije dostupan, ali je sekvenca molekula antitela poznata, nukleinska kiselina koja kodira imunoglobulin može da se dobije iz odgovarajućeg izvora, poput biblioteke, koji može da bude specifičan za ćeliju koja strava antitelo, poput hibridom-ćelije koje su izabrane sa ciljem da eksprimiraju antitelo iz ovoga pronalaska. Prikladni primeri mogu da budu konfigurisani za PCR amplifikaciju. Amplifikovane nukleinske kiseline stvorene uz pomoć PCR mogu tada da se kloniraju u replikativni vektor za kloniranje koristeći bilo koji postupak koji je poznat stanju tehnike.
Jednom kada se odredi nukleotidna sekvenca i odgovarajuća amino-kiselinska sekvenca za antitelo, pomenuta nukleotidna sekvenca pomenutog antitela može da se manipuliše sa ciljem da se dobiju ekvivalenti od interesa koji su ovde opisani uz pomoć postupaka koji su poznati stanju tehnike, a koji se koriste za manipulisanje nukleotidnih sekvenca, na primer, tehnike rekombinantne DNK, mesto-usmerene mutageneze, PCR itd. (vidi, na primer, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2, izd., Cold Spring Harbor Laboratory (1990); i Ausubel et al., ur., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998) sa ciljem da se stvore antitela koja imaju različitu amino-kiselinsku sekvencu, na primer, sa ciljem da se stvore amino-kiselinske supstitucije, delecije i/ili insercije.
Amino-kiselinska sekvenca varijabilnog domena iz teškog i/ili lakog lanca može da se proveri sa ciljem identifikovanja sekvence CDR-a uz pomoć već poznatih postupaka, na primer, uporedbom sa poznatim amino-kiselinskim sekvencama varijabilnih regiona iz drugih teških i lakih lanaca sa ciljem da se odrede regioni hipervarijabilnosti sekvence. Koristeći rutinske tehnike rekombinantne DNK, jedan ili više CDR mogu da budu uvedeni u regione okvira, na primer, u humane regione okvira sa ciljem humanizovanja ne-humanog antitela, kao šta je opisano u supra. Polinukleotid od interesa koji je generisan uz pomoć kombinovanja regiona okvira i jednog ili više CDR kodira antitelo koje specifično veže IL-4 i/ili IL-13, ili najmanje njegov ED domen. Na primer, takvi postupci mogu da se koriste sa ciljem da se stvore aminokiselinske supstitucije ili delecije jednog ili više cisteinskih ostataka iz varijabilnog regiona koji učestvuju u intra-lančanoj disulfidnoj vezi sa ciljem da se dobiju molekuli antitela kojima nedostaje jedna ili više intra-lančanih disulfidnih veza.
Antitela iz ovog pronalaska mogu se koristiti za otkrivanje IL-4 i/ili IL-13, a time i ćelija koje eksprimiraju IL-4 i/ili IL-13, u biološkom uzorku in vitro ili in vivo. U jednoj izvedbi, antitelo protiv IL-4 i IL-13 iz ovoga pronalaska se koristi da se odredi nivo IL-4 i/ili IL-13 u tkivu ili u ćelijama koje su izvedene iz pomenutog tkiva. Nivoi IL-4 i/ili IL-13 u tkivu ili biopsiji mogu se odrediti, na primer, u imunološkom testiranju sa antitelima iz ovog pronalaska. Tkivo ili njegova biopsija mogu da se zamrznu ili fiksiraju. Isti ili drugačiji postupci mogu da se koriste sa ciljem da se odrede druge karakteristike IL-4 i/ili IL-13, poput njihovih nivoa, ćelijskog lokalizovanja, nivoa mRNK, njihove mutacije itd.
Malopre opisani postupci mogu da se koriste, na primer, sa ciljem da se dijagnosticira rak u subjektu za kojeg se zna da je podložan pojavi raka, kada se nivoi IL-4 i/ili IL-13 izmereni u pomenutom pacijentu uporede sa onima kod normalnog subjekta ili standarda. Test od interesa takođe može da se koristi sa ciljem da se dijagnosticira artritis ili druge autoimune bolesti karakterizovane sa infiltracijom i koncentrisanjem B-ćelija, zajedno sa razvojem diferencijalnog limfoidnog tkiva.
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje humanizovana antitela kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima koja su dalje obeležena za upotrebu u istraživačkim ili dijagnostičkim primenama. U nekim izvedbama, oznaka je radio-oznaka, fluorofor, a hromofor, imidžingagens i metalni jon.
Takođe je obezbeđen postupak za dijagnozu u kojoj se pomenuta obeležena antitela daju subjektu za kojeg se sumnja da ima kancer, artritis, autoimune bolesti ili drugo IL-4 i/ili IL-13 posredovano oboljenje, i distribucija oznake unutar tela subjekta se meri ili prati.
Antitelo iz ovog pronalaska može se koristiti kao afinitetni agensi za prečišćavanje. U tom procesu, antitela se imobiliziraju na krutoj fazi, poput ostatka dekstrana ili agaroze ili na filterhartiji, koristeći postupke koji su poznati stanju tehnike. Imobilizirano antitelo je kontaktirano sa primerkom koji sadrži IL-4 i/ili IL-13 ili sa ćelijama koje nose pomenute sa ciljem da ih se pročisti, a nakon toga podloga (ostatak) se plakni sa odgovarajućim rastvaračem koji će odstraniti približno sav materijal u primerku osim IL-4 i/ili IL-13 ili ćelije koje treba da se prečiste, koje su vezane na imobilizirano antitelo od interesa. Konačno, podloga se plakne sa drugim odgovarajućim rastvaračem, poput glicinskog pufera, pH 5.0, koji će da oslobodi IL-4 i/ili IL-13 ili ćelije sa antitela od interesa.
Kod dijagnostičkih aplikacija, pomenuto antitelo od interesa tipično će biti označeno sa ostatkom koji može da se detektuje. Brojne oznake su dostupne, a opšte uzeto, mogu da se grupišu u sledeće kategorije: (a) radio-izotopi, poput<36>S,<14>C,<125>I,<3>H i<131>I (antitelo može da bude označeno sa radio-izotopom uz pomoć tehnika koje su opisane u Current Protocols in Immunology, vol. 12, Coligen et al., ur., Wiley-Interscience, New York (1991), na primer, a radioaktivnost može da se izmeri uz pomoć scincilacijskog brojanja); (b) fluorescentne oznake, poput retkih zemnih helata (helati od evropijuma), fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, danzil, lizamin, pikoeritrin i Teksas crveno, a fluorescentne oznake mogu da se konjugiraju na antitelo koristeći tehnike koje su razotkrivene u Current Protocols in Immunology, supra, na primer, gde fluorescencija može da se kvantifikuje uz pomoć fluorimetra; i (c) brojne oznake sa encimskim supstratima su dostupne (U.S. Pat. Br.4,275,149 obezbeđuje pregled), gde encim, opšte uzeto, katalizuje hemijsku promenu hromogenog supstrata šta može da se izmeri uz pomoć brojnih tehnika, na primer, encim može da katalizuje promenu boje u nekom supstratu, šta može da se izmeri spektrofotometrijski, ili encim može da promeni fluorescenciju ili hemiluminescenciju supstrata. Tehnike za kvantifikovanje promena u fluorescenciji su poznati, na primer, može da se koristi luminometar, ili oznaka donira energiju fluorescentnom akceptoru. Primeri encimskih oznaka uključuju luciferaze (na primer, luciferaza iz svetleće bube i bakterijska luciferaza; U.S. Pat. Br.4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, malat dehidrogenaza, ureaza, peroksidaza, poput peroksidaze iz hrena (HRPO), alkalne fosfataze, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze (na primer, glikoza oksidaza, galaktoza oksidaza, i glikoza-6-fosfat dehidrogenaza), heterocikličke oksidaze (poput urikaze i ksantin oksidaze), laktoperoksidaze, mikroperoksidaze itd. Tehnike za konjugovanje encima na antitela su opisane u O'Sullivan et al., Meth Enz, ur. Langone & Van Vunakis, Academic Press, New York, 73 (1981).
Kada se koriste takve oznake, dostupni su prikladni supstrati, poput: (i) kod peroksidaza iz hrena kao supstrat se koristi hidrogen peroksidaza, pri čemu hidrogen peroksidaza oksidira obojeni prekursor (na primer, ortofenilen diamin (OPD) ili 3,3',5,5'-tetrametil benzidin hidrohlorid (TMB)); (ii) kod alkalne fosfataze (AP) kao hromogeni supstrat se koristi pnitrofenil fosfat; i (iii) β-D-galaktozidaza (β-D-Gal) sa hromogenim supstratom (na primer, pnitrofenil-β-D-galaktozidaza) ili fluorogeni supstrat poput 4-metilumbeliferil-β-D-galaktozidaze.
Druge encim-supstrat kombinacije su dostupne stručnjacima u polju. Za opšti pregled, vidi U.S. Pat. Br.4,275,149 i 4,318,980.
Ponekad, oznaka se indirektno konjugira na antitelo. Na primer, antitelo može da bude konjugirano sa biotinom i bilo kojim reporterom koji je već pomenut i može da bude konjugirano sa avidinom ili vice versa. Biotin se veže selektivno na avidin i tako, oznaka može da bude konjugirana sa antitelom na indirektan način. Alternativno, sa ciljem da se postigne indirektna konjugacija oznake, antitelo se konjugira sa malim haptenom (na primer, digoksin), a jedan od različitih tipova oznaka ili reportera koji su pomenuti ovde su konjugirani sa antitelom protiv digoksina. Tako, indirektna konjugacija oznake sa antitelom ili muteinom može da se postigne uz pomoć korišćenja drugog antitela.
U drugoj izvedbi prema pronalasku antitelo ne mora da bude označeno, a njegova prisutnost može da se detektuje uz pomoć korišćenja označenog antitela koje veže pomenutu antitelo, druga forma sekundarnog antitela.
Antitela iz ovoga pronalaska mogu da se koriste u bilo kom poznatom postupku testiranja, poput testa kompetitivnog vezanja, testova direktnih ili indirektnih sendviča, i testova imunoprecipitacije. Zola, Monoclonal Antitela: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc.
1987).
Testovi kompetitivnog vezanja se baziraju na sposobnost označenog standarda da se takmiči sa testnim primerkom za vezanje na ograničenu količinu antitela. Količina antigen u testnom primerku je obratno proporcionalna količini standarda koji se veže na antitela. Da se ubrza određivanje količina standarda koji se veže, antitela, opšte uzeto, se dovode u nerastvorljivo stanje pre ili nakon kompeticije. Kao rezultat, standardni i testni primerak koji su vezani za antitela mogu prikladno da se odvoje od standardnog i testnog primerka koji ostaje nevezan.
Sendvič testovi uključuju upotrebu dva antitela, od kojih je svako sposobno da se veže na različiti imunogeni deo, determinantu ili epitop iz mete koja se detektuje. U sendvič testu, testni primerak koji treba da se analizuje je vezan sa prvim antitelom koje je imobilizirano direktno ili indirektno na krutoj potpori, a nakon toga se sekundarno antitelo, koje je direktno ili indirektno označeno, veže na testni primerak, šta dovodi do nastanka nerastvorljivog kompleksa od tri dela, vidi na primer, U.S. Pat. Br. 4,376,110. Sekundarno antitelo može da bude označeno samo za sebe sa ostatkom koji može da se detektuje (direktan sendvič test) ili može da se izmeri uz pomoć antitela protiv imunoglobulina ili drugog prikladnog člana veznog para (antitelo/antigen, receptor/ligand, encim/supstrat, na primer) koji je označen sa markerom koji može da se detektuje (indirektan sendvič test). Na primer, jedan tip sendvič testova je ELISA-test, u kojem ostatak koji može da se detektuje je neki encim.
Ovaj sadašnji pronalazak uključuje komplete hemikalija, kako je definisano u priloženim zahtevima.. Instrukcije mogu da uključuju upute za upotrebu antitela, konjugata itd. in vitro, in vivo ili ex vivo. Antitelo može da bude u tečnoj formi ili kao kruta materija, opšte uzeto liofilizovana. Pomenuti komplet hemikalija sadrži odgovarajuće druge reagense, poput pufera, rastvor za rekonstituciju i druge neophodne sastojke za predviđenu namenu. Spakovana kombinacija reagenasa u količinama koje su unapred određene sa instrukcijama za njihovu upotrebu, poput terapeutske upotrebe za provođenje dijagnostičkog testa se takođe predviđa. Kada je antitelo označeno, na primer sa nekim encimom, komplet hemikalija može da sadrži supstrate i kofaktore koji su potrebni encimu (naprimer, supstratni prekursor koji obezbeđuje hromofor ili fluorofor koji može da se detektuje). Dodatno, drugi aditivi mogu da budu uključeni, poput agenasa za rastvaranje, pufera (na primer, pufer za blokiranje ili pufer za lizu)
1
itd. Relativne količine brojnih reagenasa mogu da variraju sa ciljem da se obezbede koncentrati rastvora nekog reagensa, šta omogućuje lakoću korišćenja, uštedu prostora, uštedu reagenasa itd. Pomenuti reagensi mogu da se obezbede kao suvi puderi, uobičajeno liofilizovani, uključujući ekscipijente, koji nakon rastvaranja daju rastvor reagensa koji ima odgovarajuću koncentraciju.
Antitela iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za tretman sisara. U jednoj izvedbi, antitelo ili ekvivalent od interesa se administrira ne-humanom sisaru u svrhu sakupljanja prekliničkih podataka, na primer. Primeri ne-humanih sisara koji mogu da se tretiraju uključuju ne-humane primate, pse, mačke, glodare i druge sisare kod kojih su provedene prekliničke studije. Takvi sisari mogu da pomognu da se uspostave animalni modeli za bolest koja će se tretirati sa pomenutim antitelom, ili mogu da se koriste sa ciljem studiranja toksičnosti antitela od interesa. U svakoj od pomenutih izvedba, studije eskalacije doze mogu da se provode na nekom sisaru.
Antitelo, sa ili bez drugih komponenata, poput terapeutskih ostataka koji su konjugirani na pomenuto, administrirani samo za sebe ili kombinovano sa citotoksičnim faktor(ima) mogu da se koriste kao terapeutik. Ovde su opisane terapije na bazi antitela koje uključuju administriranje antitela iz ovoga pronalaska nekoj životinji, sisaru ili čoveku sa ciljem tretiranja bolesti, poremećaja ili stanja koja su potpomognuta sa IL-4 i/ili IL-13.
Termin "tretman", kao šta se koristi u ovom pronalasku se odnosi na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Odnosi se na prevenciju, lečenje, okretanje, usporavanje, ublažavanje, minimiziranje, potiskivanje ili zaustavljanje štetnih efekata bolesnog stanja, napredovanja bolesti, agensa koji uzrokuje bolest (na primer, bakterije ili virusi) ili na neko drugo abnormalno stanje.
Tako, ovaj pronalazak takođe uključuje bispecifična antitela protiv IL-4/IL-13 kako je definisano u priloženim zahtevima, koji na sebe imaju spojene dijagnostički ili terapeutski funkcionalne efektorske molekule, atome ili druge vrste. Na primer, antitelo može da ima radioaktivnu dijagnostičku oznaku ili radioaktivni citotoksični atom ili metal ili citotoksičnu vrstu, na primer ricinski lanac, spojen na njega sa ciljem in vivo dijagnoze ili terapije raka.
2
Štaviše, antitela u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se koriste u imuno-testovima, u postupcima za prečišćavanjei u drugim postupcima u kojima se koriste njihovi imunoglobulini ili fragmenti. Takve upotrebe su dobro poznate stanju tehnike.
Shodno tome, pronalazak takođe sadrži kompozicije koje sadrže antitela prema pronalasku, pogodno u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijentom koji su konvencionalni u struci.
Termin "farmaceutska kompozicija", kako se koristi u ovom pronalasku se odnosi na formulacije brojnih preparata. Pomenute formulacije koje sadrže terapeutski efektivne količine polivalentnog antitela su sterilni tečni rastvori, tečne suspenzije ili liofilizovane verzije i ponekad sadrže stabilizatore ili ekscipijente.
Termin "poremećaj", kao šta se koristi u ovom pronalasku, se odnosi na bilo koje stanje koje će imati korist od tretmana sa antitelom iz ovoga pronalaska. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti uključujući ona patološka stanja koja prethode kod sisara, a posebno kod ljudi, poremećaju o kojem je reč. Ne-ograničeni primeri poremećaja koji mogu da se tretiraju ovde uključuju rak, zapaljenja, autoimune bolesti, infekcije, kardiovaskularne bolesti, respiratorne bolesti, neurološke bolesti i metaboličke bolesti.
Antitela iz ovoga pronalaska mogu da se koriste za tretman, potiskivanje ili sprečavanje bolesti, poput neke alergijske bolesti, Th2-potpomognute bolesti, IL-13-potpomognute bolesti, IL-4-potpomognute bolesti i/ili IL-4/IL-13-potpomognute bolesti. Primeri takvih bolesti uključuju, Hodgkin-ovu bolest, astmu, alergijsku astmu, atopni dermatitis, atopnu alergiju, ulcerativni kolitis, skleroderma, alergijski rinitis, COPD3, idiopatsku plućnu fibrozu, hronično odbacivanje transplantata, plućnu fibrozu indukovanu bleomicinom, plućnu fibrozu indukovanu zračenjem, plućni granulom, progresivnu sistemsku sklerozu, šistosomijazitis, hepatičku fibrozu, rak bubrega, Burkitt-ov limfom, Hodgkins-ovu bolest, ne-Hodgkins-ovu bolest, Sezary-ev sindrom, astmu, septički artritis, dermatitis herpetiformis, hroničnu idiopatsku urtikariju, ulcerozni kolitis, sklerodermiju, hipertrofni ožiljak, Whipple-ovu bolest, benignu hiperplaziju prostate, poremećaj pluća u kojem IL-4 receptor ima ulogu, stanje u kojem igra ulogu razaranje epitelijalne barijere preko receptora IL-4, poremećaj sistema za varanje u kojem IL-4 receptor ima ulogu, alergijska reakcija na neki lek, Kawasaki-eva bolest, srpasta anemija, Churg-Strauss-ov sindrom, Grave-ova bolest, pre-eklampsija, Sjogren-ov sindrom, auto-imuni limfoproliferativni sindrom, auto-imuna hemolitička anemija, Barrett-ov ezofagus, auto-imuni uveitis, tuberkuloza, cistička fibroza, alergijska bronhopulmonarna mikoza, hronična opstruktivna pulmonarna bolest, pneumopatija i fibroza indukovana bleomicinom, pulmonarna alveolarna proteinoza, sindrom respiratornog poremećaja kod odraslih, sarkoidoza, sindrom hiper IgE, idiopatski hipereozinofilni sindrom, auto-imuna bolest žuljeva, pemphigus vulgaris, bulozni pemfigus, myasthenia gravis, sindrom hroničnog umora, nefroza.
Termin "alergijska bolest" se odnosi na patološko stanje kod kojeg je pacijent hiper-osetljiv i razvija imunološku reakciju na supstanciju koja normalno nije imunogena. Alergijska bolest, se opšte uzeto, karakterizuje aktivisanjem mastocita uz pomoć IgE šta rezultuje zapaljenjem kao odgovor (na primer, lokalni odgovor, sistemski odgovor) koji može da rezultuje sa simptomima koji su benigni poput curenja nosa, pa sve do životno-opasnih anafilaktičkih šokova u smrti. Primeri alergijske bolesti uključuju, ali bez ograničenja, alergijski rinitis (na primer, polinoza), astmu (na primer alergijsku astmu), alergijski dermatitis (na primer, ekcem), kontaktni dermatitis, alergija na hranu i urtikariju (koprivnjača).
Kao šta se ovde koristi, "Th2-potpomognuta bolest" se odnosi na bolest u kojoj je patologija (delomično ili potpuno) posledica imuno odgovora (Th2-tip imuno odgovora) koji je regulisan sa CD4<+>Th2 T-limfocitima, koji karakteristično proizvode IL-4, IL-5, IL-9 i IL-13. Th2-tip imuno odgovora je povezan sa stvaranjem određenih citokina (na primer, IL-4, IL-13) i određenim klasama antitela (na primer, IgE), i je povezan sa humoralnim imunitetom. Th2-potpomognute bolesti su karakterizovane sa time da je vidljiv povećan nivo Th2 citokina (na primer, IL-4, IL-13) i/ili određenih klasa antitela (na primer, IgE) i uključuju, na primer, alergijsku bolest (na primer, alergijski rinitis, atopni dermatitis, astma (na primer, atopna astma), alergijsku bolest dišnih puteva (AAD), anafilaktički šok, konjunktivitis), auto-imuni poremećaji koji su povezani sa povećanim nivoima IL-4 i/ili IL-13 (na primer, reumatoidni artritis, domaćin-naspram-transplantat bolest, renalna bolest (na primer, nefritni sindrom, lupus nephritis)), i infekcije koje su povezane sa povećanim nivoima IL-4 i/ili IL-13 (na primer, viralna, parazitska, gljivična (na primer C. albicans) infekcija). Određeni tipovi raka su povezani sa povećanim nivoima IL-4 i/ili IL-13 ili su povezani sa IL-4-indukovanom i/ili IL-13-indukovanom proliferacijom ćelija raka (na primer, limfom B-ćelija, limfom T-ćelija,
4
multipli mijelom, rak glave i vrata, rak dojke i rak jajnika). Ovi tipovi raka mogu da se tretiraju, potisnu ili spreče uz pomoć liganda iz ovoga pronalaska.
Termin "rak", kao šta se ovde koristi, se odnosi na ili opisuje fiziološko stanje kod sisara, a posebno kod ljudi, koje se tipično karakterizuje uz pomoć neregulisanog rasta ćelija. Primeri raka uključuju, ali bez ograničenja, karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju.
Termin "auto-imuna bolest", kao šta se ovde koristi se odnosi na ne-malignu bolest ili poremećaj koji dolazi iz tkiva pacijenta i je usmeren protiv njega. Primeri auto-imunih bolesti ili poremećaja uključuju, ali bez ograničenja, zapaljenja poput bolest zapaljenja kože uključujući psorijazu i dermatitis; alergijska stanja poput ekcema i astme; druga stanja koja uključuju infiltraciju T-ćelija i hronična zapaljenja; aterosklerozu; diabetes mellitus (na primer, Tip I diabetes mellitus ili diabetes mellitus koji je zavisan od insulina); multiplu sklerozu i zapaljenja centralnog nervnog sistema (CNS).
Antitela iz ovoga pronalaska mogu da se koriste kao kompozicije za odvojeno administriranje ili zajedno sa drugim agensima. Antitela mogu da se koriste u kombinovanoj terapiji sa postojećim IL-13 terapeuticima (na primer, postojećim IL-13 agensima poput antitela umerenih protiv IL-13Rα1, IL-4/13 Trap i protiv IL-13) plus antitela protiv IL-4 i postojećih IL-4 agenasa (na primer, antitelo protiv IL-4R, IL-4 Mutein, IL-4/13 Trap) plus antitelo protiv IL-13 i IL-4 (na primer, dokumenti WO05/0076990 (CAT), WO03/092610 (Regeneron), WO00/64944 (Genetic Inst.) i WO2005/062967 (Tanox)).
Antitela iz ovoga pronalaska mogu da se administriraju i/ili formulišu zajedno sa jednim ili više dodatnih terapeutika ili aktivnih agenasa. Kada se administriraju sa nekim dodatnim terapeutskim agensom, pomenuti ligand može da se administrira pre, simultano sa ili supsekventno administraciji drugog agensa. Opšte uzeto, pomenuti ligand i dodatni agens se administriraju na način koji obezbeđuje preklapanje terapeutskih efekata. Dodatni agensi koji mogu da se administriraju ili formulišu sa pomenutim ligandom iz ovoga pronalaska uključuju, na primer, brojne imunoterapeutske lekove, poput coklosporina, metotreksata, adriamicina ili cisplatine, antibiotika, antimikotika, anti-viralnih agenasa i imunotoksina. Na primer, kada se administrira antagonist da se spreči, potisne ili tretira zapaljenje pluća ili respiratorna bolest (na primer, astma), može da se administrira u konjugaciji sa inhibitorima fosfodiesteraze (na primer, inhibitori fosfodiesteraze 4), bronhodilatorima (na primer, β2-agonisti, antiholinergici, teofilin), kratko-delujućim beta-agonistima (na primer, albuterol, salbuiamol, bambuterol, fenoter[sigma]1, izoeterin, izoproterenol, leva[jota]buterol, metaproterenol, pirbuterol, terbutalin i tornlat), dugo-delujućim beta-agonistima (na primer, formoterol i salmeterol), kratko-delujućim antiholinergicima (na primer, ipratropijum bromid i oksitropijum bromid), dugo-delujućim antiholinergicima (na primer, tiotropijum), teofilinom (na primer, kratkodelujuće formulacije, dugo-delujuće formulacije), steroidima za inhiranje (na primer, beklometazon, beklometazon, budezonid, flunizolid, flutikazon propionat i triamkinolon), oralnim steroidima (na primer, metilprednizolon, prednizolon, prednizolon i prednizon), kombinovanim kratko-delujućim beta-agonistima sa antiholinergicima (na primer, albuterol/salbutamol/ipratopijum i fenoterol/ipratopijum), kombinovanim dugo-delujućim beta-agonistima sa steroidima za inhaliranje (na primer, salmeterol/flutikazon i formolerol/budezonid) i mukolitičkim agensima (na primer, erdostein, acetilcistein, bromheksin, karbocislcin, gviafencsin i jodirani glicerol).
Drugi prikladni ko-terapeutski agensi koji mogu da se administriraju sa antitelom iz ovoga pronalaska sa ciljem da spreči, potisne ili tretira astma (na primer, alergijska astma), uključujući kortikosteroid (na primer, beklometazon, budezonid, flutikazon), kromoglikat, nedokromil, beta-agonist (na primer, salbutamol, terbutalin, bambuterol, fenoterol, reproterol, tolubuterol, salmeterol, fomtero), zafirlukast, salmeterol, prednizon, prednizolon, teofilin, zileutron, montelukast i leukotrienske modifikante. Ligandi iz ovoga pronalaska mogu da se ko-administriraju sa brojnim ko-terapeutskim agensima koji su prikladni za tretman bolesti (na primer, Th-2-potpomognuta bolest, YL-A-potpomognuta bolest, IL-13-potpomognuta bolest, IL-4-potpomognuta bolest i rak), uključujući citokine, analgetike/antipiretike, antiemetike i hemoterapeutike.
Antitela iz ovoga pronalaska mogu da budu obezbeđeni u farmaceutski prihvatljivim kompozicijama kao šta je poznato stanju tehnike ili ovde opisno. Termin "fiziološki prihvatljiv", "farmakološki prihvatljiv" itd. označava da je upotreba dozvoljena od strane regulacione agencije Federalne ili državne vlade ili izlistana u U.S. Pharmacopeia ili drugim opšte priznatim pharmacopeia za upotrebu na životinjama, a posebno na ljudima.
Anti-IL-4, anti-IL-13 i bispecifična antitela protiv IL-4/IL-13 mogu da se administriraju nekom sisaru, a posebno ljudima, na neki prihvatljiv način. Postupci uvođenja uključuju, ali bez ograničenja, parenteralnu, supkutanu, intraperitonealnu, intrapulmonarnu, intranazalnu, epiduralnu rutu i inhalaciju i oralnu rutu, a ako je poželjno za imunosupresivni tretman, koristi se i intralezionalna administracija. Parenteralne infuzije uključuju intramišićnu, intradermalnu, intravenoznu, intraarterijalnu ili intraperitonealnu administraciju. Antitela ili kompozicije mogu da se administriraju uz pomoć bilo koje prikladne rute, na primer, uz pomoć infuzije ili bolus-injekcije, uz pomoć apsorpcije kroz epitelijalnih ili mukokutanih obloga (na primer, oralna mukoza, rektalna i intestinalna mukoza itd.) i mogu da se administriraju zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Administracija može da bude sistemska ili lokala. Dodatno, može da bude poželjno da se terapeutska antitela ili kompozicije iz ovoga pronalaska uvedu u centralni nervni sistem preko bilo koje prikladne rute, uključujući intraventrikularnu i intratekalnu injekciju; intraventrikularna injekcija može da se ostvari preko intraventrikularnog katetera, na primer, spojenog na rezervoar, poput Ommaya-ovog rezervoara. Dodatno, antitelo se prikladno administrira preko pulsne infuzije, posebno sa opadajući dozama antitela. Preferirano, doziranje se provodi injekcijom, preferirano intravenozna ili supkutana injekcija, zavisno, delomično, o tome dali je administracija kratka ili hronična.
Brojni drugi sistemi za dostavu su poznati i mogu da se koriste sa ciljem da se administrira antitelo iz ovoga pronalaska, uključujući, na primer, enkapsulacija u liposomima, mikročesticama, mikrokapsulama (vidi Langer, Science 249:1527 (1990); Treat et al., u Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein et al., ur., str.
353-365 (1989); i Lopez-Berestein, ibid., str. 317-327) i rekombinantnim ćelijama koje su sposobne da eksprimiraju pomenuto jedinjenje; receptor-potpomognuta endocitoza (vidi, na primer, Wu et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)); konstrukcija nukleinske kiseline kao deo retroviralnog ili drugog vektora itd.
Aktivni sastojci mogu takođe da se zatvore u mikrokapsulu koja je pripremljena, na primer, uz pomoć tehnika koacervacije ili uz pomoć interfacijalne polimerizacije, na primer, kapsule od hidroksimetilceluloze ili želatinske-mikrokapsule i poli-(metilmetacilat)-mikrokapsule, u koloidnim sistemima za dostavu leka (na primer, liposomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su razotkrivene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, A. Osal, ur. (1980).
Pulmonarna administracija može takođe da se primeni, na primer, uz pomoć upotrebe inhalera ili nebulizera i formulacije sa agensom za stvaranje aerosoli. Antitelo može takođe da se administrira u pluća pacijenta u formi kompozicije suvog pudera, vidi na primer, U.S. Pat. Br.
6,514,496.
U jednoj specifičnoj izvedbi, može da bude poželjno da se administriraju terapeutska antitela ili kompozicije iz ovoga pronalaska lokalno u areal u potrebi za takvim tretmanom; to može da se postigne uz pomoć, na primer, ali bez ograničenja, lokalne infuzije, topikalne aplikacije, injekcije, uz pomoć katetera, uz pomoć čepića ili uz pomoć implanta, a pomenuti implant je od poroznog, ne-poroznog ili želatinoznog materijala, uključujući membrane, poput sijalastičkih membrana ili fibera. Preferirano, kada se antitelo iz ovoga pronalaska administrira, važno je da se koriste materijali na koje se belančevina ne apsorbira ili adsorbira.
U još jednoj izvedbi, antitelo može da se dostavi u nekom sistemu za kontrolisano otpuštanje. U jednoj izvedbi, može da se koristi pumpa (vidi Langer, Science 249:1527 (1990); Sefton, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); i Saudek et al., N Engl J Med 321:574 (1989)). U drugoj izvedbi, mogu da se koriste polimerni materijali (vidi Medical Applications of Controlled Release, Langer et al., ur., CRC Press (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen et al., ur., Wiley (1984); Ranger et al., J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23:61 (1983); takođe vidi Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann Neurol 25:351 (1989); i Howard et al., J Neurosurg 71:105 (1989)). U još jednoj izvedbi, sistem za kontrolisanu dostavu može da se smesti blizu terapeutske mete.
Terapeutske formulacije polipeptida ili antitela mogu da se pripreme za skladištenje u formi liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora uz pomoć mešanja polipeptida koji ima željeni stepen čistoće sa ponekad "farmaceutski prihvatljivim" nosačima, razređivačima, ekscipijentima ili stabilizatorima, koji se tipično koriste u stanju tehnike, kao na primer, agensi za puferovanje, agensi za stabilizovanje, konzervansi, agenasi za izotoničnost, ne-jonskih deterdženata, antioksidanasi i drugi manje važni aditivi, vidi Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izd., Osol, ur. (1980). Takvi aditivi su, opšte uzeto, netoksični za pacijente kod doza i koncentracija koje se koriste, pa prema tome, pomenuti ekscipijenti, razređivači, nosioci itd. su farmaceutski prihvatljivi.
"Izolovano" ili "prečišćeno" antitelo je značajno oslobođeno od ćelijskog materijala ili drugih kontaminirajućih belančevina iz ćelije ili tkiva ili medijuma iz kojeg je belančevina dobivena, ili značajno oslobođen od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada se sintetizuje hemijski. Izraz "značajno oslobođen od ćelijskog materijala" uključuje preparate antitela u kojima polipeptid/belančevina je odvojena od ćelijskih komponenti koji potiču iz ćelija iz kojih je pomenuta izolovana li rekombinantno dobivena. Tako, antitelo koje je značajno oslobođeno od ćelijskog materijala uključuje preparate antitela koje imaju manje od oko 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5% ili 1%, (na suvu težinu) kontaminirajuće belančevine. Kada je antitelo rekombinantno proizvedeno, takođe je preferirano značajno oslobođeno od medijuma kulture, kao na primer, medijum kulture predstavlja manje od oko 20%, 10%, 5%, 2.5% ili 1% volumena preparata sa belančevinom. Kada se antitelo proizvodi uz pomoć hemijske sinteze, preferirano je značajno oslobođeno od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija ili reagenasa, kao na primeri, antitelo od interesa je odvojeno od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija koje su uključene u sintezi belančevine. Prema tome, takvi preparati antitela imaju manje od oko 30%, 20%, 10%, 5% ili 1% (na suvu težinu) hemijskih prekursora ili jedinjenja koja su različita od antitela od interesa. U preferiranoj izvedbi, antitela se izoluju ili prečišćavaju.
Kao šta se ovde koristi, fraza "niski ili nedetektabilni nivoi agregacije" se odnosi na primerke koji sadrže ne više od 5%, ne više od 4%, ne više od 3%, ne više od 2%, ne više od 1% i često ne više od 0.5% agregacije, na težinu belančevine, kao šta je izmereno uz pomoć, na primer, hromatografije visoke performanse uz isključivanje čestica određenih veličina (HPSEC).
Kao šta se ovde koristi, termin "niski ili nedetektabilni nivoi fragmentacije" se odnosi na primerke koji sadrže jednako ili više od 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% totalne belančevine, na primer, u jednom vršku, kao šta je određeno uz pomoć HPSEC, ili u dva (2) vrška (teški lanaca i laki lanac) uz pomoć, na primer, redukovane kapilarne gel-elektroforeze (rCGE) i koji imaju druge pojedinačne vrške koji sadrže više od 5%, više od 4%, više od 3%, više od 2%, više od 1% ili više od 0.5% totalne belančevine, svaki. Pomenuta rCGE, kao šta se ovde koristi, se odnosi na kapilarnu gel-elektroforezu pod redukovanim uslovima koji su dovoljni da smanje broj disulfidnih veza u nekom antitelu ili tipu antitela ili izvedenog molekula.
Kako se ovde koriste, termini "stabilnost" i "stabilni" u kontekstu tečne formulacije koja sadrži IL-4 i IL-13 antitelo prema predmetnom pronalasku odnose se na otpor antitela u formulaciji na termičko i hemijsko odvijanje, agregaciju, degradaciju ili fragmentaciju u datim uslovima proizvodnje, pripreme, transporta i skladištenja. Pomenute "stabilne" formulacije prema pronalasku zadržavaju biološku aktivnost koja je jednaka ili je veća od 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 99.5% tokom proizvodnje, pripreme, transporta i skladištenja. Stabilnost pomenutog preparata sa antitelom može da se proceni preko stepena agregacije, degradacije ili fragmentacije uz pomoć postupaka koji su poznati stručnjacima u polju, uključujući, ali bez ograničenja, rCGE, natrijum dodecil sulfat poliakrilamid gel-elektroforezu (SDS-PAGE) i HPSEC, u odnosu na referencu.
Termin, "nosilac", se odnosi na razređivač, dodatak, ekscipijent ili prenosnik sa kojim se terapeutik administrira. Takvi fiziološki nosioci mogu da budu sterilne tečnosti, poput vode ili ulja, uključujući i one od petroleuma, životinjskog, biljnog ili sintetskog porekla, poput ulja od kikirikija, ulja od soje, mineralnog ulja, ulja od susama i slično. Voda je prikladan nosilac kada se pomenuta farmaceutska kompozicija administrira intravenozno. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola takođe mogu da se koriste kao tečni nosioci, delomično za rastvore koji se injektiraju. Prikladni farmaceutski ekscipijenti uključuju skrob, glikozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, osušeno obrano mleko, glicerol, propilen glikol, vodu, etanol i slično. Pomenuta kompozicija, ako je poželjno, može takođe da sadrži male količine agenasa za vlaženje ili za emulziju, ili agenasa za održavanje pH (puferi). Pomenute kompozicije mogu da budu u formi rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, pudera, formulacija za odloženo otpuštanje, depoa i slično. Pomenuta kompozicija može da bude formulisana kao čepić, sa tradicionalnim veznicima i nosiocima poput triglicerida. Oralne formulacije mogu da uključuju standardne nosioce poput manitola, laktoze, skroba, magnezijum stearata, natrijum saharina, celuloze, magnezijum karbonata (svi su sa farmakološkom čistoćom) itd. Primeri prikladnih nosioca su opisani u "Remington's Pharmaceutical Sciences," Martin. Takve kompozicije će sadržavati efektivnu količinu pomenutog antitela, preferirano u prečišćenom obliku, zajedno sa nekom prikladnom količinom nosioca sa ciljem da se obezbedi forma za odgovarajuću administraciju pacijentu. Kao šta je poznato stanju tehnike, formulacija će biti konstruirana za odgovarajući modus administracije.
Agensi za puferovanje pomažu da se održava pH u rasponu koji odgovara fiziološkim uslovima. Puferi su preferirano prisutni u koncentracionim rasponima od oko 2 mM do oko 50 mM. Prikladni agensi za puferovanje koji mogu da se koriste u ovom sadašnjem pronalasku uključuju organske i anorganske kiseline i njihove soli poput citratnih pufera (na primer, mononatrijum citrat-dinatrijum citratna mešavina, limuska kiselina-trinatrijum citratna mešavina, citrička kiselina-mononatrijum citratna mešavina itd.), sukcinatnih pufera (na primer, sukcinska kiselina-mononatrijum sukcinatna mešavina, sukcinska kiselina-natrijum hidroksidna mešavina, sukcinska kiselina-dinatrijum sukcinatna mešavina itd.), tartratnih pufera (na primer, tartarna kiselina-natrijum tartratna mešavina, tartarna kiselina-kalijum tartratna mešavina, tartarna kiselina-natrijum hidroksidna mešavina itd.), fumaratnih pufera (na primer, fumarna kiselina-mononatrijum fumaratna mešavina, fumarna kiselina-dinatrijum fumaratna mešavina, mononatrijum fumarat-dinatrijum fumaratna mešavina itd.), glukonatnih pufera (na primer, glukonska kiselina-natrijum glikonatna mešavina, glukonska kiselinanatrijum hidroksidna mešavina, glukonska kiselina-kalijum glukonatna mešavina itd.), okalatnih pufera (na primer, oksalna kiselina-natrijum oksalatna mešavina, oksalna kiselinanatrijum hidroksidna mešavina, oksalna kiselina-kalijum oksalatna mešavina itd.), laktatnih pufera (na primer, mlečna kiselina-natrijum laltatna mešavina, mlečna kiselina-natrijum hidroksidna mešavina, mlečna kiselina-kalijum laktatna mešavina itd.) i acetatnih pufera (na primer, sirćetna kiselina-natrijum acetatna mešavina, sirćetna kiselina-natrijum hidroksidna mešavina itd.). Fosfatni puferi, karbonatni puferi, histidinski puferi, trimetilaminske soli poput Tris, HEPES i drugi takvi poznati puferi mogu da se koriste takođe.
Konzervansi mogu da se dodaju sa ciljem da se uspori rast mikroorganizama, a mogu da se dodaju u količinama u rasponu od 0.2%-1% (w/v). Prikladni konzervansi za upotrebu sa ovim pronalaskom uključuju fenol, benzil alkohol, m-krezol, metil paraben, propil paraben, oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, benzijamonijum halide (na primer, hloridi, bromidi i jodidi), heksametonijum hlorid, alkilne parabene poput metil ili propil parabena, katehola, resorcinola, cikloheksanola i 3-pentanola.
1
Agensi za izotoničnost se dodaju sa ciljem da se obezbedi fiziološka izotoničnost tečnih kompozicija iz ovoga sadašnjeg pronalaska i uključuju polhidrične šećerne alkohole, preferirano trihidrične ili više šećerne alkohole, poput glicerina, eritritola, arabitola, ksilitola, sorbitola i manitola. Polihidrični alkoholi mogu da budu prisutni u količinama od između 0.1% do oko 25%, po težini, preferirano 1% do 5% uzimajući u obzir relativne količine drugih sastojaka.
Stabilizatori se odnose na širu kategoriju ekscipijenata koji mogu biti agensi za nadimanje pa sve do aditiva koji rastvaraju terapeutski agens ili pomažu da se spreči denaturisanje ili adherencija na zid od kontejnera. Tipični stabilizatore mogu da budu polihidrični šećerni alkoholi; amino-kiseline, poput arginina, lizina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, glutaminske kiseline, treonina itd., organski šećeri ili šećerni alkoholi, poput laktoze, trehaloze, stahioze, arabitola, eritritola, manitola, sorbitola, ksilitola, ribitola, mioinizitola, galaktitola, glicerola i slično, uključujući ciklitole poput inozitola; polietilen glikol; amino-kiselinskih polimera; agenasa za redukovanje koji sadrže sumpor, poput uree, glutationa, tioktinske kiseline, natrijum tioglikolata, tioglicerola, αmonotioglicerola i natrijum tiosulfata; polipeptida sa niskom molekularnom težinom (kao na primer, <10 ostataka); belančevina, poput albumina iz humanog seruma, albumina iz goveđeg seruma, želatina ili imunoglobulina; hidrofilnih polimera, poput polivinilpirolidona, saharida, monosaharida, poput ksiloze, manoze, fruktoze, glukoze; disaharida, poput laktoze, maltoze i saharoze; trisaharida poput rafinoze; polisaharida poput dekstrana itd. Stabilizatori su prisutni u rasponu od 0.1 do 10,000 w/w procenata aktivne belančevine.
Dodatni manje poznati ekscipijenti uključuju agense za nadimanje, (na primer, skrob), agense za heliranje (na primer, EDTA), antioksidanse (na primer, askorbinska kiselina, metionin ili vitamin E) i ko-rastvarače.
Ovde opisan formulacija takođe sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja šta je potrebno za određene indikacije koje se ovde tretiraju, preferirano one koja sa komplementarnim delovanjem koji istovremeno ne utiču negativno jedno na drugo. Na primer, može da bude poželjno da se dodatno obezbedi neki drugi imunosupresivni agens. Takvi molekuli prikladno su prisutni u kombinaciji sa količinama koje su efektivne za predviđenu namenu.
2
Kao šta se koristi ovde, termin "surfaktant" se odnosi na organske supstancije koje imaju amfipatičke strukture, naime, sastoje se od grupa sa suprotnim tendencijama rastvaranja, tipično ugljovodonički lanac rastvorljiv u ulju i jonska grupa rastvorljiva u vodi. Surfaktanti mogu da se klasifikuju, u zavisnosti o promeni ostataka koji je aktivan na površini, u anjonski, katjonski i nejonski surfaktanti. Surfaktanti često se koriste za vlaženje, za stvaranje emulzije, za rastvaranje i dispergovanje agenasa u brojnim farmaceutskim kompozicijama i preparatima biološkog materijala.
Ne-jonski surfaktanti ili deterdženti (takođe poznati kao "agensi za vlaženje") mogu da se dodaju sa ciljem da pomognu rastvaranje terapeutskog agensa, kao i sa ciljem da zaštite terapeutsku belančevinu od agregacije koja je potaknuta mešanjem, šta takođe dozvoljava da formulacija bude izložena tangencijalnom stresu bez da se uzrokuje denaturisanje belančevine. Prikladni ne-jonski surfaktanti uključuju polisorbate (20, 80 itd.), polioksamere (184, 188 itd.), Pluronske<®>poliole i polioksietilenske sorbitanske ostatke (TWEEN-20<®>, TWEEN-80<®>itd.). Ne-jonski surfaktanti mogu da budu prisutni u rasponu od oko 0.05 mg/ml do oko 1.0 mg/ml, preferirano od oko 0.07 mg/ml do oko 0.2 mg/ml.
Kao šta se ovde koristi, termin "anorganska so," se odnosi na bilo koje jedinjenje, koje ne sadrži ugljenik koji dolazi iz promene dela ili svih kiselih vodonika ili bilo koje kiseline uz pomoć metala ili grupe koja deluje poput metala, a često se koriste kao jedinjenja za podešavanje toniciteta u farmaceutskim kompozicijama i preparatima sa biološkim materijalima. Najčešće anorganske soli su NaCl, KCl, NaH2PO4itd.
Sadašnji pronalazak obuhvata tečne formulacije koje imaju stabilnost kod temperatura koje su uobičajene za komercijalne frižidere i hladnjake koji se nalaze u lekarskim ordinacijama ili laboratorijama, poput od oko -20° C do oko 5° C, a pomenuta stabilnost se procenjuje, na primer, uz pomoć hromatografije visoke performanse uz isključivanje čestica određenih veličina (HPSEC), u svrhu skladištenja, poput tokom oko 60 dana, tokom oko 120 dana, tokom oko 180 dana, tokom oko jedne godine, tokom oko 2 godine ili više. Tečne formulacije prema predmetnom pronalasku takođe pokazuju stabilnost, procenjenu, na primer, uz pomoć HSPEC, na sobnim temperaturama, za najmanje nekoliko časova, poput jednog časa, dva časa ili oko tri časa pre upotrebe.
Termin "mali molekuli" i analogni termini uključuju, ali bez ograničenja, peptide, peptidomimetike, amino-kiseline, amino-kiselinske analoge, polinukleotide, polinukleotidne analoge, nukleotide, nukleotidne analoge, organska ili anorganska jedinjenja (na primer, uključujući heterorganska i/ili organometalna jedinjenja) koja imaju molekularnu težinu od oko 10,000 grama po molu, organska ili anorganska jedinjenja koja imaju molekularnu težinu manju od oko 5,000 grama po molu, organska ili anorganska jedinjenja koja imaju molekularnu težinu manju od oko 1,000 grama po molu, organska ili anorganska jedinjenja koja imaju molekularnu težinu manju od oko 500 grama po molu, i soli, esteri, i druge farmaceutski prihvatljive forme pomenutih jedinjenja.
Tako, u slučaju raka, antitela iz ovoga pronalaska mogu da se administriraju sama za sebe ili u kombinaciji sa drugim tipovima tretmana za rak, uključujući konvencionalne hemoterapeutske agense (paklitaksel, karboplatina, cisplatina i doksorubicin), agense protiv EGFR (gefitinib, erlotinib i cetuksimab), agense protiv angiogeneze (bevacizumab i sunitinib), kao i imunomodulirajuće agense, poput interferona-α i talidomida.
Kao šta se ovde koriste, termini "terapeutski agens" i "terapeutski agensi" se odnose na bilo koji agens(agense) koji može da se koristi u tretmanu, obradi i ublažavanju neke bolesti, poremećaja, bolesnog stanja i slično koje je povezano sa IL-4 i/ili IL-13 metabolizmom i njihovom aktivnosti.
Dodatno, antitela iz ovoga sadašnjeg pronalaska mogu da se konjuguju na brojne efektorske molekule poput heterolognih polipeptida, lekova, radionukleotida ili toksina, vidi, na primer, dokumente WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. Pat. Br. 5,314,995; i EPO 396,387. Antitelo može biti konjugovano sa terapeutskim delom kao što je citotoksin (npr., citostatik ili citocidni agens), terapeutski agens ili radioaktivni metal jon (na primer, α-emiteri, poput, na primer, 213Bi). Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za ćeliju. Primeri uključuju paklitaksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracindion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihove analoge i homologe. Terapeutski agensi uključuju, ali bez ograničenja, antimetabolite (na primer, metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tiogvanin, citarabin, 5-fluorouracil i dekarbazin),
4
agense za alkilovanje (na primer, meloretamin, hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cisdihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatina), antracikline (na primer, daunorubicin, daunomicin i doksorubicin), antibiotike (na primer, daktinomicin, aktinomicin, bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC)), agense protiv mitoze (na primer, vinkristin i vinblastin).
Tehnike za konjugovanje takvih terapeutskih ostataka na antitela su dobro poznate, vidi, na primer, Arnon et al., u Monoclonal Antitela and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (ur.), str.243-56 Alan R. Liss (1985); Hellstrom et al., u Controlled Drug Delivery, 2. izd., Robinson et al., ur., str. 623-53, Marcel Dekker (1987); Thorpe, u Monoclonal Antitela '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., ur., str.475-506 (1985); Monoclonal Antitela For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al., ur., str. 303-16, Academic Press (1985); i Thorpe, et al., Immunol Rev 62:119 (1982). Alternativno, antitelo može da se konjuguje na sekundarno antitelo sa ciljem da se dobije heterokonjugat antitela, poput bifunkcionalnog antitela, vidi, na primer, U.S. Pat. Br.4,676,980.
Ovde opisani konjugati mogu da se koriste za modifikovanje određenog biološkog odgovora, a terapeutski agens ili ostaci lekova ne treba da se posmatraju kao ograničavajući u odnosu na klasične hemijske terapeutske agense. Na primer, ostaci lekova mogu da budu belančevina ili polipeptid koji poseduje željenu biološku aktivnost. Takve belančevine mogu da uključuju, na primer, toksin poput abrina, ricina A, egzotoksina iz roda Pseudomonas ili toksina difterije; belančevina poput faktora nekroze tumora, α-interferona, β-interferona, faktora rasta živaca, faktora rasta koji je dobiven iz krvnih pločica, tkvinog plazminogenskog aktivatora, apoptotičkog agensa, na primer, TNF-α, TNF-β, AIM I (WO 97/33899), AIM II (WO 97/34911), Fas-liganda (Takahashi et al., Int Immunol, 6:1567 (1994)), VEGF (WO 99/23105); trombotičkog agensa; agensa protiv angiogeneze, na primer, angiostatin ili endostatin; ili modifikatora biološkog odgovora poput, na primer, limfokina, interleukina-1 (IL-1), interleukina-2 (IL-2), interleukina-6 (IL-6), faktora koji stimuliše granulocitne kolonije makrofaga (GM-CSF), faktora koji stimuliše granulocitne kolonije (GCSF) ili drugih faktora.
Formulacije namenjene za korišćenje kao in vivo administracija moraju biti sterilne. To može da se postigne, na primer, uz pomoć filtracije preko sterilne membrane za filtriranje. Na primer, tečne formulacije iz ovoga pronalaska mogu da se steriliziraju uz pomoć filtriranja sa filtrom od 0.2 µm ili 0.22 µm.
Preparati za odloženo otpuštanje mogu takođe da se pripreme. Prikladni primeri preparata za odloženo otpuštanje uključuju polu-permeabilne matrice od krutih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, a koje matrice su u formi oblikovanih proizvoda, na primer, filmova ili matrica. Primeri matrica za zadržano otpuštanje uključuju poliestere, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietilmetakrilat), poli(vinilalkohol)), polilaktide (U.S. Pat. Br. 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamata, ne-raspadljivi etilene-vinil acetat, raspadljive kopolimere mlečne kiseline-glikolne kiseline (poput mikrosfera za injektiranje koje se sastoje od kopolimera mlečne kiseline-glikolne kiseline) i poli-D-(-)-3-hidroksibutirička kiselina. Dok polimeri poput etilen-vinil acetata i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju otpuštanje molekula tokom 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju belančevine tokom kraćeg perioda. Racionalne strategije mogu da se razviju za stabilizovanje u zavisnosti o delujućem mehanizmu. Na primer, ako je mehanizam agregacije formiranje intermolekularne S-S veze preko tio-disulfidne izmene, stabilizovanje može da se postigne uz pomoć modifikovanja sulfhidrilnih ostataka, liofilizovanja iz kiselih rastvora, kontrolisanja količine vlage, korišćenja odgovarajućih aditiva, amino-kiselinske supstitucije i razvijanjem specifičnih kompozicija od polimernog matriksa.
Kompozicija sa antitelom ili varijantom će biti formulisana, dozirana i administrirana na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori koji treba da se razgledaju u ovom kontekstu uključuju tačan poremećaj koji se tretira, koji se sisar ili čovek tretira, kliničko stanje individualnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto dostave agensa, postupak administracije, raspored administracija, i druge faktore koji su poznati medicinskim radnicima. Termin "terapeutski efektivna količina" antitela ili varijante koje će se administrirati će zavisiti o pomenutim uslovima, a može da bude minimalna količina koja je neophodna da spreči, ublaži ili tretira bolest, stanje ili poremećaj koji je potpomognut sa IL-4 i/ili IL-13.
Antitelo ili varijanta je ponekad formulisano sa jednim ili više agenasa koji se sada koriste za prevenciju ili tretman određenog poremećaja. Efektivna količina takvih drugih agenasa zavisi o količini antitela koje je prisutno u formulaciji, tipu poremećaja ili tretmanu i o drugim faktorima koji su ovde razmotreni. Pomenuti se, opšte uzeto, koriste u istim dozama i kroz rute za administraciju kao šta je opisano ovde ili od oko 1 do 99% do sada primenjenih doza.
Kao šta se ovde koristi, termin "efektivna količina" se odnosi na količinu terapije (na primer, profilaktički ili terapeutski agens), koja je dovoljna da smanji silinu i/ili trajanje bolesti koja je potpomognuta sa IL-4 i/ili IL-13, ublaži jedan ili više njenih simptoma, spreči napredovanje bolesti koja je potpomognuta sa IL-4 i/ili IL-13 ili da dovede do povlačenja pomenute bolesti, ili koja je dovoljna da dovede do sprečavanja pojave, ponavljanja, izbijanja ili napredovanja bolesti koja je potpomognuta sa IL-4 i/ili IL-13 ili jednog ili više njenih simptoma, ili da pojača ili poboljša profilaktičke i/ili terapeutske efekt(e) neke druge terapije (na primer, drugi terapeutski agens) koja je korisna za tretman bolesti koja je potpomognuta sa IL-4 i/ili IL-13.
Količina terapijskog antitela koja će biti efikasna u korišćenju ili lečenju određenog poremećaja ili stanja zavisiće od prirode poremećaja ili stanja i može se odrediti standardnim kliničkim tehnikama. Kada je moguće, kriva odgovora na dozu i farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska najpre treba da budu izvedene in vitro. Ako je dostupan neki prikladni životinjski model, opet kriva odgovora na dozu može da se koristi sa ciljem da se ekstrapolira odgovarajuća doza za ljude uz pomoć postupaka koji su poznati stanju tehnike. Međutim, na osnovu uobičajenog znanja iz stanja tehnike, farmaceutska kompozicija efektivna u provođenju ublažavanja nekog efekta zapaljenja, na primer, može da obezbedi koncentraciju lokalnog terapeutskog agensa od između 5 i 20 ng/ml, i, preferirano, između 10 i 20 ng/ml.
U poželjnoj realizaciji, vodeni rastvor terapeutskog antitela može se primeniti subkutanom injekcijom. Svaka doza može da bude u rasponu od oko 0.5 mg do oko 50 mg po kilogramu telesne težine, ili bolje, od oko 3 mg do oko 30 mg po kilogramu telesne težine. Doza može da se proceni empirijski za određenu bolest, populaciju pacijenata, načinu administracije itd., uz pomoć izvođenja farmaceutskih postupaka koji su poznati stanju tehnike.
Dozni režim (raspored) za supkutanu administraciju može da varira od jednom sedmično do dnevnog doziranja u zavisnosti o brojnosti kliničkih faktora, uključujući tip bolesti, silinu bolesti i osetljivosti subjekta na terapeutski agens.
Takođe su ovde prikazani postupci za pripremu tečnih formulacija antitela, pomenuti postupci sadrže koncentrovanje frakcije prečišćenog antitela do konačne koncentracije od oko 15 mg / ml, oko 20 mg / ml, oko 30 mg / ml, oko 40 mg / ml , oko 50 mg / ml, oko 60 mg / ml, oko 70 mg / ml, oko 80 mg / ml, oko 90 mg / ml, oko 100 mg / ml, oko 200 mg / ml, oko 250 mg / ml 300 mg / ml ili više, koristeći, na primer, polupropusnu membranu sa odgovarajućim prekidom molekulske mase (mw).
Dodatno, ovaj pronalazak takođe obuhvata prikladne tečne formulacije produkata od interesa koji imaju poboljšani polu-život in vivo. Tako, antitelo od interesa ima polu-život u subjektu, preferirano čoveku, veći od 3 dana, veći od 7 dana, veći od 10 dana, veći od 15 dana, veći od 25 dana, veći od 30 dana, veći od 35 dana, veći od 40 dana, veći od 45 dana, veći od 2 meseca, veći od 3 meseca, veći od 4 meseca, veći od 5 meseci i više.
Sa ciljem da se produži cirkulacija antitela u serumu in vivo, brojne tehnike mogu da se koriste. Na primer, inertni polimerni molekul, poput polietilen glikola (PEG) sa velikom molekularnom masom, može da se spoji na antitelo sa ili bez multifunkcionalnog linkera preko mestospecifične konjugacije PEG na N-terminus ili na C-terminus antitela ili preko ε amino-grupa koje su prisutne na lizinskim ostacima. Može da se koristi linearna ili razgranata polimerna derivatizacija koja rezultuje u minimalan gubitak biološke aktivnosti. Stepen konjugacije može da se neposredno posmatra uz pomoć SDS-PAGE i masene spektrometrije sa ciljem da se obezbedi ispravna konjugacija PEG molekula na antitela. Nereagovani PEG može da se odvoji sa konjugata antitelo-PEG uz pomoć eliminacije čestica na osnovu veličine ili preko hromatografije izmene jona. PEG-derivatizovana antitela mogu da se testiraju na njihovu veznu aktivnost kao i na in vivo efikasnosti koristeći postupke koji su poznati stručnjacima u polju, na primer, uz pomoć imuno-testova koji su ovde opisani.
Antitelo koje ima povećani polu-život in vivo može takođe da se stvori uz pomoć uvođenja jedne ili više amino-kiselinskih modifikacija (na primer, supstitucija, insercija ili delecija) u konstantni domen iz IgG, ili iz njegovog FcR veznog fragmenta (poput fragmenta Feili fragmenta sa domenom Feiz drške), vidi, na primer, dokumente WO 98/23289; WO 97/34631; i U.S. Pat. Br.6,277,375.
Dodatno, antitelo može da se konjuguje na albumin sa ciljem da se dobije antitelo koje je stabilnije in vivo ili ima duži polu-život in vivo. Tehnike su poznate stanju tehnike, vidi na primer, dokumente WO 93/15199, WO 93/15200 i WO 01/77137; i EPO 413, 622. Antitelo takođe može da bude modifikovano, na primer, uz pomoć glikozilacije, acetilacije, fosforilacije, amidacije, derivatizacije uz pomoć poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog cepanja, vezanja na ćelijski ligand ili belančevinu itd.
U jednoj izvedbi, pomenuta kompozicija se formuliše u skladu sa rutinskim procedurama kao farmaceutska kompozicija koja je adaptirana za intravenoznu administraciju u ljudska bića. Tipično, kompozicije za intravenoznu administraciju su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Kada je potrebno, pomenuta kompozicija može takođe da uključuje agens za solubilizovanje i lokalni anestetik poput lidokaina ili drugog "kainskog" anestetika sa ciljem smanjivanja boli na mestu injekcije. Opšte uzeto, pomenuti sastojci su pridodani odvojeno ili pomešani zajedno u jediničnoj doznoj formi, na primer, kao suvi liofilizovani puder ili bezvodni koncentrat u zatvorenom kontejneru, poput ampule ili sačeta koji pokazuje količinu aktivnog agensa. Kada se kompozicija administrira uz pomoć infuzije, može da bude istisnuta preko infuzijske boce koja sadrži sterilnu vodu ili slani rastvor farmaceutske kvalitete. Kada se kompozicija administrira injekcijom, može da bude obezbeđena ampula sa sterilnom vodom za injektiranje ili sa slanim rastvorom, na primer, u nekom kompletu hemikalija, tako da pomenuti sastojci mogu da se pomešanu pre administracije.
Pronalazak takođe obezbeđuje to da tečna formulacija prema predmetnom pronalasku može da se pakuje u zatvorenom kontejneru poput ampule ili kesice uz označavanje količine produkta od interesa. Tečne formulacije iz ovog pronalaska mogu biti u zaptivenoj posudi koja ukazuje na količinu i koncentraciju antitela. Tečna formulacija prema sadašnjem pronalasku može da se nalazi u zatvorenom kontejneru sa najmanje 15 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml ili 300 mg/ml antitela protiv IL-4 i/ili IL-13 u količini od 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml ili 20 ml, na primer.
Obezbeđeni su materijali koji sadrže pomenuti proizvod i koji su korisni za tretman poremećaja koji su ovde opisani. Proizvod obuhvata kontejner i nalepnicu. Prikladni kontejneri uključuju, na primer, boce, posude, šprice i test-tube. Pomenuti kontejneri mogu da se oblikuju od brojnih materijala poput stakla ili plastike. Kontejner sadrži kompoziciju koja je efektivna za dijagnozu, sprečavanje ili tretman stanja ili bolesti koja je potpomognuta sa L-4 i/ili IL-13 i može a ima sterilni ulaz (otvor) (na primer, kontejner može da bude vrećica za intravenozni rastvor ili posudica koja ima poklopac koji može da se probije sa hipodermičkom injekcijskom iglom). Nalepnica na kontejneru ili koja mu je namenjena pokazuje da se kompozicija koristi za tretman određenog stanja. Proizvod može dodatno da sadrži drugi kontejner koji obuhvata farmaceutski prihvatljiv pufer, poput slanog rastvora koji je puferovan sa fosfatom, Ringerovog rastvora ili rastvora dekstroze. Dodatno može da uključuje druge materijale koji su poželjni sa komercijalne gledne tačke i sa gledišta korisnika, uključujući pufere, razređivače, filtere, igle, šprice i dodatke sa instrukcijama za upotrebu.
Ovaj pronalazak će sada da bude dodatno predstavljen na korist stručnjaka uz pomoć sledećih primera koji ga ne ograničavaju i koji prikazuju neke od izvedba preko koji sam pronalazak može da se primenjuje.
PRIMERI PRIMER 1: SEKVENCIRANJE Fv DOMENA IZ MIŠJEG MONOKLONSKOG ANTITELA PROTIV HUMANOG IL-13, KLON B-B13
Reagens koji je korišćen u postupku ispod je mišje monoklonsko antitelo protiv IL-13, klon B-B13, koje je nabavljeno kod Cell Sciences, Inc. (Canton, MA, SAD). Cell Sciences je distributer Diaclone (Besançon, France) u SAD, koji proizvode antitelo B-B13.
Amino-kiselinska sekvenca klona B-B13 monoklonskog antitela protiv IL-13 je određena uz pomoć kombinovanja N-terminalnog sekvenciranja po Edman-u i masene spektrometrijske analize. Antitelo je podvrgnuto sledećim različitim pristupima sa ciljem da se stvori polipeptid ili njegovi fragmenti, a pomenuti su frakcionisani uz pomoć različitih pristupa sa ciljem da se pripreme primerci koji su naknadno podvrgnuti N-terminalnom sekvenciranju po Edman-u i analizi sa Tečnom hromatografijom/Masenom spektrometrijom/Masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) tako da je sekvenca upoređivana sa sličnim sekvencama belančevina iz peptidne baze podataka.
SDS-Page antitela, netretiranog ili tretiranog sa pirogluamino peptidazom, sa ciljem da se odvoje teški i laki lanci, a nakon toga blotiranje na membrani od poliviniliden fluorida (PVDF) i N-terminalno sekvenciranje vrpci po Edman-u.
Ograničena delomična proteoliza antitela sa specifičnim proteazama, a nakon toga SDS-Page i bloting na PVDF-membranu i N-terminalno sekvenciranje vrpci po Edman-u.
Ograničeno delomično hemijsko cepanje celog antitela, ili teškog i lakog lanca iz vrpci SDS-Page-gela, a nakon toga SDS-Page i bloting na PVDF-membrani i N-terminalno sekvenciranje vrpci po Edman-u.
Proteoliza celog antitela ili teškog i lakog lanca iz vrpci SDS-Page gela sa specifičnim proteazama i LC/MS/MS analiza.
Proteoliza teškog i lakog lanca iz vrpci SDS-Page gela sa specifičnim proteazama, a nakon toga frakcioniranje hromatografijom reverzne faze pod visokim pritiskom (RP-HPLC), i naknadno N-terminalno sekvenciranje po Edman-u i LC/MS/MS analiza frakcija.
Ograničena proteoliza antitela sa proteazom papain, frakcioniranje Fd (VH-CH1 fragment iz teškog lanca antitela) vrpce iz SDS-Page gela, proteoliza sa specifičnim proteazama, hromatografija reverzne faze pod visokom performansom (RP-HPLC), i naknadno N-terminalno sekvenciranje po Edman-u i LC/MS/MS analiza frakcija.
PRIMER 2: SEKVENCIRANJE Fv DOMENA MIŠJEG MONOKLONSKOG
ANTITELA PROTIV IL-4, KLON 8D4-8
Reagensno mišje monoklonsko antitelo protiv IL-4, klon 8D4-8 je nabavljeno kod Biozol diagnostica Vertrieb GmbH (Eching, Nemačka). Biozol je nemački distributer BioLegend (San Diego, CA, USA) koji proizvodi antitelo 8D4-8.
Amino-kiselinska sekvenca mišjeg monoklonskog antitela protiv IL-4 (klon 8D4-8) je određena uz pomoć kombinovanja sekvenciranja po Edman-u i masene spektrometrije (Pham et al., 2006, Anal. Biochem. 352: 77-86; Roberts et al., 2005, Anal. Chem. 67: 3613-25). Ukratko, pomenuto antitelo je najpre razdvojeno na laki i teški lanac, a tada je svaki lanac
1
pocepan sa proteazama specifičnim za sekvencu ili hemijski. Nastali peptidi su razdvojeni uz pomoć hormatografije reverzne faze i analizirani uz pomoć Matrix-potpomognuto lasersko razaranje/jonizacijske spektrometrije (MALDI) i/ili LC-MS/MS. Jedinstveni peptidi kao i intaktni teški i laki lanci su tada podvrgnuti sekvenciranju po Edman-u za nedvojbeno određivanje sekvence belančevine.
PRIMER 3: HUMANIZOVANJE Fv DOMENA MIŠJEG MONOKLONSKOG ANTITEPA PROTV IL-13, KLON B-B13
Korišćen je protokol za humanizovanje koji je ovde opisan i koji je bio korišćen za humanizovanje klona B-B13. Šest humanizovanih verzija je predloženo, a sadrže mutacije u CDR koji se tiču problematičnih ostataka (mesto za deaminaciju, metionin koji je izložen rastvaraču, pozicije koje su nestabilne u kiselom).
VL & VH sekvence B-B13 su blast-analizom upoređene sa verzijom Banke podataka za belančevine (PDB) od jula 2007 godine. Otkrivene su najsličnije amino-kiselinske sekvence teškog i lakog lanca. Najbliži homolog za varijabilan laki lanac je pronađen pod oznakom 1EGJ. Najbliži homolog teškog lanca je pronađen pod oznakom 1FNS. Strukture 1EGJ & 1FNS su korišćene da se izgradi homologni model varijabilnih domena koji su ubrzo energetski minimizovani uz pomoć standardne procedure koja je implementirana u Molecular Operating Environment (MOE). MOE je seriozan paket softvera za kompjuterizovano dizajniranje lekova koji se distribuira preko Chemical Computing grupe. Račun za molekularnu dinamiku (MD) 3D homolognog modela B-B13 je proveden naknadno za 1.7 nanosekunda u Generalized Born implicitnom rastvaraču. Nastalih 1,700 snimaka iz MD trajektorije je tada korišćeno da se izračuna, za svaku amino-kiselinu iz B-B13, distribucija korena srednjih kvadratnih devijacija (rmsd) u uporedbi sa referentnom reprezentativnom pozicijom. Konačno je upotrebljen statistički test, upoređujući rmsd-distribuciju svake amino-kiseline u odnosu na globalu rmsddistribuciju, sa ciljem da se detektuje dali je određena amino-kiselina dovoljno fleksibilna, kao šta se vidi iz MD, šta se smatra da je dovoljno da interagira sa receptorima B-ćelija i odgovorna za aktivisanje imuno odgovora. Fleksibilne pozicije mišjeg B-B13 varijabilnog regiona su upoređene sa odgovarajućim pozicijama u sekvenci humanog antitela iz baze podataka ImMunoGeneTics od januara 2007 koja je bila skinuta lokalno. Samo oni ostaci koji su pokazivali fleksibilnost veću od tri puta od srednje vrednosti i nekoliko bočnih ostataka koji čuvaju 3D strukture pomenutih fleksibilnih ostataka su preostali za pretragu. Varijabilni regioni
2
iz humanog antitela sa najviše identičnih fleksibilnih ostataka, pri čemu je posebna pažnja bila posvećena pozicijama koji se nalaze unutar 5.0 Å u CDR, su izabrani da zamene mišje fleksibilne ostatke iz varijabilnih regiona B-B13 antitela. Brojne mutacije u CDR su takođe uključene u predloženim verzijama sa ciljem da se izbegnu problematični ostaci. Sledeći motivi sekvence su bili razmatrani: Asp-Pro (veza koja je nestabilna u kiselom), Asn-X-Ser/Thr (glikozilacija), Asn-Gly/Ser/Thr (mesto deamidacije u izloženom delu), Met (oksidacija u izloženom delu). Nastale humanizovane sekvence su blast-analizirane na sličnost sa sekvencama iz baze podataka UniProtKB/Swiss-Prot pod pretpostavkom da je bila uspostavljena razumna polazna tačka. Bilo je pronađeno da sve sekvence pokazuju visoku sličnost brojnim humanim antitelima. Dodatno, niti jedna sekvenca nije sadržavala bilo koji poznati epitop iz B- ili T-ćelija koji su izlistani u bazi podataka Immune Epitop Database i bazi Analysis Resource (IEDB database).
Tri verzije za teški lanac (H1, H2, H3) i tri verzije za laki lanac (L1, L2, L3) su bile sugerisane. Pomenute tri verzije lakog lanca su izvedene iz CAA83271.1 (Genebank pristupni broj CAA83271). L1 verzija ima 4 mutacije. L2 verzija uključuje jednu dodatnu mutaciju koja otklanja jedno DP mesto (Pro99) u CDR3. L3 uključuje dve dodatne mutacije koje su locirane u CDR kada ih se uporedi sa L2 šta predstavljaju dva pretpostavljena mesta deamidacije (N34Q, N96A). H1, H2 i H3 verzije teškog lanca su izvedene iz CAC39364.1 (Genebank pristupni broj CAC39364). Ovaj kalup nije nabolji kalup, ali je onaj koji ima najviše bodova i koji ne sadrži sekvencu kija pokazuje visoku homologiju (> 70%) sa nekom poznatom imunogenom sekvencom. Verzija H1 sadrži 6 mutacija, a H2 sekvenca ugrađuje dve dodatne mutacije koja se tiču tri mesta deamidacije (N60A, N73T i N83T). Numerisanje amino-kiselina iz sekvence reflektuje njihov prirodni poredak u belančevini (N-terminus prema C-terminusu). H3 sadrži dve dodatne mutacije (Y100R & D106K) za koje se smatra da poboljšavaju potenciju. Šest kombinacija VL i VH varijanti su predložene za stvaranje humanizovanog antitela: VL1xVH1, VL2xVH2, VL1xVH3, VL3xVH1, VL3xVH2 i VL3xVH3. Kao šta je pokazano u Tabeli 1, amino-kiselinske promene su načinjene u humanizovanim VL i VH varijantama iz B-B13 uz pomoć tehnologije promene površine, koja je opisana u detalje u detaljnom opisu ove sadašnje prijave. Leva kolona pokazuje originalne amino-kiseline i njihove pozicije u mišjem B-B13 mAb.
Tabela 1
PRIMER 4: HUMANIZOVANJE Fv DOMENA MIŠJEG MONOKLONSKOG ANTITELA PROTIV HUMANOG IL-4, KLON 8D4-8
Tehnologija humanizovanja (promene površine) koja je ovde opisana je korišćena da se humanizuje klon 8D4-8. Pripremljene u dvije humanizovane verzije. Jedna verzija uključuje jednu mutaciju u CDR iz teškog lanca za koju se smatralo da se odnosi na problematični ostatak (izložene pozicije koje su osetljive na kiselo).
VL & VH sekvence iz 8D4-8 su blast-upoređene sa bazom podataka (PDB) verzije od jula 2007. Najsličnije amino-kiselinske sekvence lakog i teškog lanca su locirane. Najbliži homolog za varijabilni region iz lakog lanca je 1YDJ. Najbliži homolog za teški lanac je 1IQW. Strukture
4
1YDJ & 1IQW su bile korišćene da se izgradi model homologije varijabilnih domena koji je bio nakon toga energetski minimizovan uz pomoć standardne procedure koja je implementirana preko MOE. Nakon toga je proveden račun molekularne dinamike (MD) za 3D model homologije iz 8D4-8 za 1.7 nanosekunda u Generalized Born implicitnom rastvaraču. Snimljenih 1,700 snimaka iz MD trajektorije su tada korišćene da se izračuna, za svaku 8D4 amino-kiselinu, distribucija korena srednjih kvadratnih devijacija (rmsd) u uporedbi sa referentnom reprezentativnom pozicijom. Konačno je upotrebljen statistički test, koji je uporedio rmsd-distribuciju za svaku amino-kiselinu sa globalnom rmsd-distribucijom, a sve sa ciljem da se proceni dali je neka amino-kiselina dovoljno fleksibilna, kao šta se to vidi tokom MD, šta se koristi kasnije da se proceni dali pomenuta kože da reaguje sa receptorima na B-ćelijama i da na taj način bude odgovorna za aktivisanje imuno odgovora. Fleksibilne pozicije u varijabilnom regionu iz mišjeg 8D4-8 su upoređene sa odgovarajućim pozicijama u sekvenci humanog antitela iz verzije baze podataka ImMunoGeneTics od januara 2007 koja je snimljena lokalno. Samo su ostaci koji pokazuju fleksibilnost veću od tri puta od srednje vrednosti i nekoliko bočnih ostataka koji čuvaju 3D strukture pomenutih fleksibilnih ostataka uzeti u obzir za istraživanje. Varijabilni region iz humanog antitela sa najsličnijim fleksibilnim ostacima, sa posebnom pažnjom prema pozicijama koji dolaze na udaljenost od 5.0 Å u CDR, su izabrani da zamene varijabilni region mišjeg 8D4-8 antitela. Eventualno, neke dodatne mutacije su takođe načinjene da se izbegnu problematični ostaci. Sledeći motivi iz sekvence su bili razmatrani: Asp-Pro (veza labilna u kiselom), Asn-X-Ser/Thr (glikozilacija), Asn-Gly/Ser/Thr (mesto deamidacije u izloženom arealu), Met (oksidacija u izloženom arealu). Jedini problematični ostatak koji je pronađen je bilo DP-mesto u CDR2 iz teškog lanca. Nastale humanizovane sekvence su bile blast-upoređene na sličnost prema UniProtKB/Swiss-Prot bazi podataka koja daje pouzdane podatke da je uzeta razumna pretpostavka. Sve sekvence pokazale su visok stepen sličnosti sa većim brojem ljudskih antitela. Pored toga, nijedna od sekvenci ne sadrži bilo koji poznati B- ili T-ćelijski epitop naveden u IEDB bazi podataka.
Sugerisane su dve verzije za teški lanac (H1, H2) i jedna za laki lanac (L1). L1 verzija lakog lanca je izvedena iz BAC01676.1 (Genebank pristupni broj BAC01676). L1 verzija ima 3 mutacije. H1 i H2 verzije teškog lanca su izvedene iz BAC02418.1 (Genebank pristupni broj BAC02418). Verzija H1 sadrži 9 mutacije, a H2 verzija uključuje dodatnu mutaciju sa ciljem da se odstrani DP-mesto (Pro53) u CDR2. Dve kombinacije, VL1xVH1 i VL1xVH2, su pripremljene.
Tabela 2 prikazuje amino-kiselinske promene koje su načinjene u humanizovanim VL i VH varijantama iz 8D4-8 uz pomoć tehnologije humanizovanja (promena površine). Leva kolona prikazuje originalne amino-kiseline i njihove pozicije u mišjem 8D4-8 mAb.
Tabela 2
PRIMER 5: KLONIRANJE I STVARANJE HIMERNOG MONOKLONSKOG ANTITELA PROTIV IL-13, KLON B-B13, HIMERNOG MONOKLONSKOG ANTITELA PROTIV IL-4, KLON 8D4-8 I HUMANIZOVANE VARIJANTE Amino-kiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca iz anti-IL-13 klona B-B13 i anti-IL-4 klona 8D4-8 su prevedene u nukleotidne sekvence koje su stvorene uz pomoć modifikovanog protokola za PCR-preklopljene ekstenzije (OE-PCR) koja je opisana kod Young L. i Dong Q. (Nucl. Acids Res. (2004), 32(7), e59). PCR produkti su klonirani u pCR<®>4-TOPO uz pomoć kompleta hemikalija za kloniranje TOPO TA od Invitrogen (Kat # 45-0641) pa su sekvencirani uz pomoć prajmera M1-napred i M13-natrag. Varijabilni domeni su fuzionisani sa ciljem da se stvori težak (IGHG1, Genebank pristupni broj Q569F4) ili laki lanac (IGKC) Genebank pristupni broj Q502W4), koji su pocepani sa Nhe I i Hind III pa je svaki ligiran u Nhe I/Hind III mesta episomalnog ekspresijskog vektora pXL, analogon pTT vektora koji je opisan kod Durocher et al. (2002), Nucl. Acids Res.30(2), E9, šta je dovelo do stvaranja plazmida za ekspresiju (u sisara) himernih B-B13-teških i lakih lanaca i himernih 8D4-8 teških i lakih lanaca.
Ekspresijski kolonovi koji kodiraju humanizovane varijante anti-IL-13 klona B-B13 i anti-IL-4 klona 8D4-8 su takođe sintetički generisani uz pomoć PCR-preklapajuće ekstenzije (OE-PCR), na osnovu predloženih izmena amino-kiselina iz originalne sekvence.
Ekspresijski plazmidi koji kodiraju teški i laki lanac iz pomenutog antitela su umnoženi u E. coli DH5a. Plazmidi koji su korišćeni za transfekciju su pripremljeni iz E. coli koristeći komplet hemikalija Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kit.
Za transfekciju, ćelije HEK293FreeStyle (Invitrogen) su posejane u koncentraciji od 3 x 10<5>ćelija/mL u 100 mL medijuma FreeStyle bez seruma (Invitrogen) u bocama od 500 mL za inkubator. Ćelije su kultivirane na 37° C u inkubatoru sa vlažnom atmosferom od 8% CO2, na orbitalnoj platformi koja je rotirala na 110 rpm.
Tri dana nakon sadnje, određen je broj vijabilnih i totalnih ćelija uz pomoć CASY elektroničkog brojača ćelija (Schärfe System GmbH). Ćelije sa vijabilnosti većom od 90% su korišćene sa transfekciju kod ćelijske gustoće od 1-1.5 x 10<6>ćelija/mL.100 mL ćelija je bilo transfektovano u boci za inkubator od 500 mL uz pomoć mešavine ekspresijskih plazmida za teški i laki lanac (5x10<-7>µgDNK/ćeliji) koristeći FugeneHD (Roche) u omeru DNK:FugeneHD od 2:7, u uslovima koji su opisani od strane proizvođača. Transfektovane ćelije su kultivirane tokom 7 dana na 37° C u inkubatoru (8 % CO2) na orbitalnoj platformi koja rotira na 110 rpm.
Pločica tipa F96-MaxiSorp-Immuno od Nunc-a je prekrivena sa kozjim antitelom protiv humanog IgG (Fc specifično) [NatuTec A80-104A]. Antitelo je razređeno do 10 μg/ml u karbonatnom puferu (50 mM natrijum karbonat, pH 9.6) pa je dodano u koncentraciji od 50 μL po rupici. Pločica je bila začepljena sa adhezivnom nalepnicom i spremljena tokom noći na 4° C. Pločica je isprana 3 puta sa Wash-puferom (PBS pH 7.40.1% Tween20). Dodano je 150 μL rastvora za blokiranje (1% BSA/PBS) u svaku rupicu sa ciljem da se prekrije pločica. Nakon 1 h na ST pločica je bila isprana 3 puta sa puferom za ispiranje.100 μL primerka ili standarda (u rasponu od 1500 ng/ml do 120 ng/ml) je dodano pa su ostavljeni da stoje tokom 1 h na ST. Pločica je bila isprana 3 puta sa puferom za ispiranje.100 μL kozjeg antitela protiv konjugata humanog IgG-FC - HRP [NatuTec A80-104P-60] razređenog 1:10.000 je dodano uz pomoć inkubacionog rastvora (0.1% BSA, PBS pH 7.4, 0.05% Tween20). Nakon 1 h inkubacije na ST, pločica je isprana 3 puta sa puferom za ispiranje. 100 μL ABTS supstrata (10 mg ABTS tableta (Pierce 34026) u ml 0.1 M Na2HPO4, 0.05 M rastvora limunske kiseline, pH 5.0. uz dodavanje 10 μL 30% H2O2/ 10 ml suptratnog pufera pre upotrebe) je rastvoreno u svaku rupicu, sve je ostavljeno da stoji sa ciljem da se razvije boja. Nakon šta se boja razvila (približno 10 do 15 min), dodano je 50 μL 1% SDS rastvora sa ciljem da se zaustavi reakciju. Pločica je očitana kod A405.
Belančevine su prečišćene uz pomoć afinitetne hromatografije na Belančevini A (HiTrap™ Protein A HP Kolone, GE Life Sciences). Nakon elucije iz kolone uz pomoć 100 mM acetatnog pufera sa 100 mM NaCl pH 3.5, monoklonska antitela su formulisana u PBS pa su filtrirana kroz 0.22 µm filtar. Koncentracija belančevine je određena uz pomoć merenja apsorbancije kod 280 nm. Svaka šarža je analizirana uz pomoć kompleta hemikalija Protein 200 Plus LabChip na bioanalizeru tipa Agilent 2100 u uslovima redukcije i bez nje sa ciljem da se odredi čistoća i molekularna težina svake podjedinice iz monomera.
PRIMER 6: KARAKTERIZOVANJE VARIJANTI HUMANIZOVANOG ANTI-IL-13 KLONA B13 I VARIJANATA HUMANIZOVANOG ANTI-IL-4 KLONA 8D4-8 Rekombinantni humani IL-13 i IL-4 su bili nabavljeni kod Chemicon (USA). Biacore-kinetička analiza je bila provedena kako sledi.
Tehnologija površinske-plazmon rezonancije na Biacore 3000 (GE Healthcare) je korišćena za detaljno kinetičko karakterizovanje prečišćenih antitela. Korišćen je test za zarobljavanje uz pomoć antitela koje je specifično za vrstu (na primer, humani-Fc specifičan MAB 1302, Chemicon) za da se zarobe i orijentiraju istraživana antitela. Zarobljeno antitelo je imobilizirano preko primarnih amino-grupa (10000 RU) na čipu CM5 za istraživanje (GE Life Sciences) uz pomoć standardnih procedura. Analizirano antitelo je zarobljeno sa podešenom RU-vrednosti koja rezultuje u maksimalno vezanje 30 RU od strane analita kod rate protoka od 10 µl/min. Vezne kinetike su izmerene u odnosu na rekombinantni humani IL-4 i IL-13 kroz koncentracioni raspon od 0 do 50 nM u HBS EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % Surfaktant P20) kod rate protoka od 30 µL/min. Površine čipa su regenerisane sa 10 mM glicina kod pH 2.5. Kinetički parametri su analizirani i izračunati u programskom paketu BIAevaluation uz pomoć protoka ćelija bez zarobljenog antitela kao reference. Sa ciljem da se istraži aditivno vezanje oba antigena, bio je primenjen postupak koinjekcije uz pomoć stručnjaka pri čemu je jedan antigen bio injektiran odmah nakon antigenske mešavine IL-13/IL-4.
Antitela su određena na biološku aktivnost uz pomoć merenja inhibicije ćelijske proliferacije potpomognute sa IL-4 ili IL-13 u TF-1 ćelijama. Ukratko, aplikanti su koristili IL-4 ili IL-13 da stimulišu rast TF-1 ćelija. TF-1 je ćelijska linija kija je za rast zavisna o citokinima i reaguje na brojne citokine uključujući IL-4 i IL-13. Indukovani rast (u uporedbi sa osnovnim uslovima u odsustvu citokina) predstavlja biološku aktivnost IL-4 ili IL-13. Antitela protiv IL-4, IL-13 i bispecifično antitelo protiv IL-4/IL-13 su blokirala rast TF-1 ćelija indukovana sa IL-4 ili IL-13. Dodatno, bispecifično antitelo protiv IL-4/IL-13 je blokiralo proliferaciju TF-1 ćelija koja je indukovana kombinovanom stimulacijom sa IL-4 i IL-13. Efekat blokiranja je izmeren na dozno-zavisan način sa ciljem da se odredi IC50(koncentracija antitela kod inhibicije od 50%) kao neutralizujući potencijal antitela protiv svoje mete, na primer, IL-4 ili IL-13. Detalji korišćenih postupaka su bolje opisani ispod.
TF-1 ćelije (ATCC, CRL-2003) su održavane u kompletnom medijumu (DMEM sa visokom glikozom, 25 mM Hepes pufer i glutamin, 10% FBS, 1x P/S, 1 mM natrijum piruvat) koji sadrži sveže dodanog hGM-CSF finalne koncentracije 4 ng/ml 24 h pre tretmana sa IL-13 (15 ng/ml) ili IL-4 (1 ng/ml). Ćelije su posejane u pločice sa 96-rupica kod koncentracije od 0.05x10<6>/ml u kompletnom medijumu bez hGM-CSF. Serijska razređenja antitela sa odgovarajućim citokinom su pre-inkubirana tokom 30 min na 37° C pre dodavanja u ćelije. Ćelije su bile kultivirane tokom 72 h (37° C, 5% CO2). Dodan je MTS/PMS rastvor cellTiter 96 Aqueous. Ćelije su tada inkubirane tokom 3 h. Nakon tog perioda, zabeležena je apsorbancija kod 490 nm uz pomoć čitača pločica. Vrednosti IC50su izračunate uz pomoć programa Speed.
Vezne kinetike i aktivnost neutralizovanja humanizovanih B-B13 varijanti su prikazani u Tabeli 3. (nt, nije testirano).
Tabela 3
Jedna humanizovana varijanta B-B13, huB-B13 VL3xVH2, ima značajno veći afinitet kada ga se uporedi sa originalnim mišjim B-B13 (13 puta) i himernim B-B13 (6 puta). Poboljšani afinitet može da dovede do povećane potencije i efikasnosti kada se pomenuta humanizovana antitela protiv IL-13 koriste da se tretiraju pacijenti sa astmom. Dodatno, humanizovana antitela mogu da smanje imunogenost kada ih se uporedi sa mišjim antitelom ili sa himernim antitelom kada se koriste na čoveka.
Vezne kinetike i aktivnost neutralizovanja humanizovanih 8D4-8 varijanti su prikazane u Tabeli 4.
Tabela 4
Jedna humanizovana 8D4-8 varijanta, hu8D4-8 VL1xVH1 pokazuje značajno veći afinitet kada ga se uporedi sa originalnim mišjim 8D4-8 (11 puta) i himernim 8D4-8 (2 puta). Poboljšani afinitet može da dovede do povećane potencije i efikasnosti kada se ovo humanizovano antitelo protiv IL-4 koristi za tretman pacijenata sa astmom. Dodatno, humanizovano antitelo može da ima smanjenu imunogenost u uporedbi sa mišjim antitelom ili himernim antitelom kada se koristi na čoveka.
PRIMER 7: KLONIRANJE I STVARANJE HUMANIZOVANOG BISPECIFIČNOG ANTITELA PROTIV IL-4/IL-13
Format koji je korišćen za ekspresiju bispecifičnog antitela (BsAb) je IgG varijanta sa dvojnim domenom formata sa dvije glave koji je opisan u dokumentu US 5,989,830. U ovom formatu, IgG molekul je produžen na njegovom N-terminusu odgovarajućeg teškog i lakog lanca, uz pomoć dodatnog varijabilnog domena iz drugog antitela. Tako, nastao IgG molekul je heterotetramer koji se sastoji od dva teška i dva laka lanca. Teški lanci se sastoje od dva varijabilna teška domena (VH1-VH2) izvedena iz dva druga različita antitela spojena uz pomoć linkera koji se sastoji od deset amino-kiselina (G4S)2i fuzionisana na IgG4 konstantni domen. Laki lanci se sastoje od dva varijabilna laka domena (VL1-VL2) koji su izvedeni iz dva različita antitela spojena uz pomoć linkera koji se sastoji od deset amino-kiselina (G4S)2i fuzionisana na konstantni kapa-region.
Sekvence za varijabilne domene iz teškog i lakog lanca iz 8D4-8 varijanti su stvoreni PCR-om uz pomoć uvođenja restrikcijskog mesta BamH I (GGA TCC) na odgovarajućim 5'-krajevima dela koji kodira (G4S)2-(GGA TCC)-8D4-8. 3'-sekvenca iz VH iz 8D4-8 humanizovanih varijanti završava sa restrikcijskim mestom Apa I (koji kodira prve amino-kiseline iz CH1 domena) za kasniju fuziju IGHG4 sekvence (Q569F4, sa delecijom terminalnog Lys i dvostrukom mutacijom, S241P i L248E). 3'-kraj iz VL8D4-8 završava sa restrikcijskim mestom BsiW I kodirajući prve dve amino-kiseline iz konstantnog kapa-lanca za kasniju fuziju na IGKC (Pristupni broj Gene Bank je Q502W4).
Sekvence za varijabilne domene iz teškog i lakog lanca u B-B13 varijantama su stvorene sa PCR-om uvođenjem restrikcijskog mesta za BamH I na njihovim odgovarajućim 3'-krajevima koji kodiraju deo (G4S)2-(B-B13)-(GGA GGC GGA GGG TCC GGA GGC GGA GGA TCC (SEQ ID BR: 7)). Obe sekvence za VH i VL iz B-B13 varijanti su stvorene tako da poseduju restrikcijsko mesto za Nhe I na odgovarajućim 5'-krajevima, a nakon toga sledi ATG-startni kodon i sekvenca za vodeći peptid.
1
VH iz B-B13 i 8D4-8 su međusobno fuzionisani preko njihovih BamH I mesta u linkeru (G4S)2. VL iz B-B13 i 8D4-8 su fuzionisani jedan na drugi preko njihovih BamH I mesta u linkeru (G4S)2. Tako, stvoreni tandemi teških i lakih lanaca imaju sledeću kompoziciju.
Težak lanac iz bispecifičnog antitela: Nhe I - vodeći peptid - VH-B-B13 - (G4S)2- VH 8D4-8-Apa I.
Laki lanac iz bispecifičnog antitela: Nhe I - vodeći peptid - VL-B-B13 - (G4S)2- VL 8D4-8-BsiW I.
Svi intermedijarni PCR-fragmenti su klonirani u pCR<®>4-TOPO uz pomoć kompleta hemikalija Invitrogen TOPO TA (Kat #: 45-0641) pa su sekvencirani uz pomoć M13-napred i M13-nazad prajmera.
Nakon validovanja sekvence, tandemi sa teškim lancima su fuzionisani preko njihovih Apa I mesta u IGHG4 sekvenci, a tandemi varijabilnih lakih lanaca su fuzionisani sa IGKC preko njihovih BsiW I mesta. Stvoreni dvojni domeni teškog i lakog lanca su pocepani sa Nhe I i Hind III i svaki je ligiran u Nhe I / Hind III mesta episomalnog ekspresijskog vektora pXL, šta je stvorilo plazmide sa TBTI-teškim i lakim lancem za ekspresiju u ćelijama sisara.
Četiri humanizovana bispecifična konstrukta protiv IL-4/IL-13 su stvorena na osnovu sledećih kombinacija humanizovanih VH i VL verzija iz B13 i 8D4-8 kao šta je prikazano u Tabeli 5.
Tabela 5
PRIMER 8: KARAKTERIZOVANJE HUMANIZOVANOG BISPECIFIČNOG ANTITELA
Testovi za veznu aktivnost i aktivnost neutralizovanja su provedeni kao šta je opisano u prethodnim Primerima.
2
Tabela 6 prikazuje vezne kinetike ua četiri humanizovane varijante antitela protiv IL-4/IL-13. Sva četiri konstrukta bispecifičnog antitela vežu IL-4 i IL-13 sa visokim afinitetima.
Tabela 6
Aktivnost neutralizovanja humanizovanih varijanti bispecifičnog antitela protiv IL-4/IL-13 je prikazana u Tabeli 7. Obe varijante, TBTI3-1_1 i huTBTI3-2_1, kompletno neutrališu proliferaciju ćelija TF-1 poticanu sa IL-13 ili IL-4 sa konstantama IC50koje su prikazane ispod.
Tabela 7
Dobro je poznato da je mutirani alel IL-13 veoma često povezan sa pojavom astme (Heinzmann A. et al., 2000, Hum Mol Genet 9, 4, p549-559). Prema tome, studirane su vezne kinetike bispecifičnog antitela na mutiranu IL-13 belančevinu (humana IL-13 R112Q varijanta, PeproTech, Rocky Hill, NJ, SAD). Rezultati pokazuju da se huTBTI3-1_1 i huTBTI3-2_1 vežu na IL-13 varijantu slično klao i na IL-13 divljeg tipa.
Tabela 8 prikazuje vezne kinetike humanizovanih molekula protiv IL-4/IL-13 na mutantnu IL-13 belančevinu.
Tabela 8
4
PRIKAZ SEKVENCE
E
< < < < < <
< < <

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Humanizovano bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za IL-13 i IL-4, naznačeno time što je humanizovano bispecifično antitelo IgG molekul koji je izdužen na svom N-terminusu na odgovarajućim teškim i lakim lancima pomoću dodatnog varijabilnog domena drugog antitela, pri čemu je rezultujući IgG molekul heterotetramer sastavljen od dva teška i dva laka lanca,
pri čemu se teški lanci sastoje od dva varijabilna domena teškog lanca (VH1-VH2) koji potiču iz dva različita antitela spojena sa linkerom sastavljenim od deset aminokiselina (G4S)2i kondenzovanim sa konstantnim domenom IgG4,
pri čemu laki lanci sadrže dva varijabilna laka domena (VL1-VL2) koji potiču iz dva različita antitela međusobno spojena zajedno sa linkerom sastavljenim od deset aminokiselina (G4S)2i kondenzovanom sa konstantnom kappa regijom, te
pri čemu dva različita antitela su antitelo koje specifično vezuje IL-13 i antitelo koje specifično vezuje IL-4,
pri čemu antitelo koje specifično vezuje IL-4 sadrži varijabilni laki lanac koji obuhvata SEQ ID NO: 3 i varijabilni teški lanac koji obuhvata SEQ ID NO: 4 ili obuhvata varijabilni lak lanac koji sadrži SEQ ID NO: 3 i varijabilni teški lanac koji obuhvata SEQ ID NO: 5, te antitelo koje specifično vezuje IL-13 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži SEQ ID NO: 1 i sadrži varijabilni laki lanac koji sadrži SEQ ID NO: 2.
2. Humanizovano bispecifično antitelo prema zahtevu 1 koje dalje sadrži domene konstantnog regiona, pri čemu domeni konstantnog regiona poželjno sadrže CH1, CH2, CH3 i CL.
3. Humanizovano bispecifično antitelo prema zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što antitelo neutrališe aktivnost IL-4 i/ili IL-13.
4. Humanizovano bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3 naznačeno time što je dalje konjugovano sa efektorskim molekulom, pri čemu je efektorski molekul poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od heterolognih polipeptida, lekova, radionukleotida i toksina.
5. Farmaceutska kompozicija naznačena time što sadrži humanizovano bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
6. Molekul nukleinske kiseline naznačen time što kodira humanizovano bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3.
7. Vektor naznačen time što sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 6.
8. Ćelija domaćina naznačena time što sadrži vektor prema zahtevu 7.
9. Postupak za proizvodnju humanizovanog bispecifičnog antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3 naznačen time što obuhvata ekspresiju molekula nukleinske kiseline prema zahtevu 8 u pogodnoj ćeliji domaćina.
10. Humanizovano bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva od 1 do 4 naznačeno time što je za upotrebu u lečenju, suzbijanju ili prevenciji bolesti.
11. Humanizovano bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 10, naznačeno time što je bolest odabrana iz grupe koja se sastoji od alergijske bolesti, astme, kancera, autoimune bolesti, skleroderme i idiopatske plućne fibroze.
12. Upotreba humanizovanog bispecifičnog antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za istraživačke primene, naznačena time što navedeno antitelo sadrži oznaku kao što je radio-obeleživač, fluorofor, hromofor, sredstvo za snimanje ili metalni jon.
13. Komplet naznačen time što sadrži humanizovano bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4 i uputstva za upotrebu.
1
RS20180381A 2007-10-15 2008-10-14 Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe RS57060B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07291259A EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2007-10-15 Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US3712808P 2008-03-17 2008-03-17
EP12006797.0A EP2573119B1 (en) 2007-10-15 2008-10-14 Antibodies that bind IL-4 and/or IL-13 and their uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57060B1 true RS57060B1 (sr) 2018-05-31

Family

ID=39313041

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20171174A RS56553B1 (sr) 2007-10-15 2008-10-14 Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe
RS20140077A RS53175B (sr) 2007-10-15 2008-10-14 Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe
RS20180809A RS57396B1 (sr) 2007-10-15 2008-10-14 Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe
RS20180201A RS56914B1 (sr) 2007-10-15 2008-10-14 Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe
RS20180381A RS57060B1 (sr) 2007-10-15 2008-10-14 Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20171174A RS56553B1 (sr) 2007-10-15 2008-10-14 Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe
RS20140077A RS53175B (sr) 2007-10-15 2008-10-14 Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe
RS20180809A RS57396B1 (sr) 2007-10-15 2008-10-14 Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe
RS20180201A RS56914B1 (sr) 2007-10-15 2008-10-14 Antitela koja vežu il-4 i/ili il-13 i njihove upotrebe

Country Status (44)

Country Link
US (18) US8388965B2 (sr)
EP (12) EP2050764A1 (sr)
JP (5) JP5858616B2 (sr)
KR (5) KR101681909B1 (sr)
CN (3) CN113480647B (sr)
AR (3) AR068861A1 (sr)
AU (5) AU2008312655B2 (sr)
BR (1) BRPI0818677B8 (sr)
CA (3) CA3015470C (sr)
CL (4) CL2008003037A1 (sr)
CR (5) CR11337A (sr)
CY (5) CY1114987T1 (sr)
DK (5) DK2574629T3 (sr)
DO (3) DOP2010000109A (sr)
ES (5) ES2647872T3 (sr)
GT (1) GT201000067A (sr)
HN (1) HN2010000710A (sr)
HR (5) HRP20140150T1 (sr)
HU (4) HUE038556T2 (sr)
IL (2) IL205005A (sr)
LT (4) LT2574629T (sr)
MA (1) MA31838B1 (sr)
MX (6) MX363901B (sr)
MY (1) MY171214A (sr)
NI (7) NI201000401A (sr)
NO (2) NO2574629T3 (sr)
NZ (3) NZ584658A (sr)
PA (1) PA8799001A1 (sr)
PE (1) PE20091382A1 (sr)
PH (2) PH12013501032A1 (sr)
PL (5) PL2574629T3 (sr)
PT (5) PT2205640E (sr)
PY (1) PY08038498A (sr)
RS (5) RS56553B1 (sr)
RU (4) RU2488595C2 (sr)
SG (4) SG10201913838RA (sr)
SI (5) SI2574629T1 (sr)
TN (1) TN2010000126A1 (sr)
TR (2) TR201802225T4 (sr)
TW (4) TWI616206B (sr)
UA (2) UA104130C2 (sr)
UY (1) UY31394A1 (sr)
WO (1) WO2009052081A2 (sr)
ZA (1) ZA201002069B (sr)

Families Citing this family (201)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
JP5592792B2 (ja) 2007-09-26 2014-09-17 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 二重特異性抗体の融合体
EP2050764A1 (en) * 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
EP2641919A3 (en) * 2007-11-30 2014-05-07 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
AU2009282234A1 (en) * 2008-08-14 2010-02-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for purifying antibodies using protein a affinity chromatography
LT2334705T (lt) 2008-09-26 2017-03-27 Ucb Biopharma Sprl Biologiniai produktai
CN102369214B (zh) 2009-04-07 2019-04-12 罗氏格黎卡特股份公司 三价、双特异性抗体
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
ES2667258T3 (es) * 2009-09-10 2018-05-10 Ucb Biopharma Sprl Anticuerpos multivalentes
WO2011034605A2 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
GB201000467D0 (en) * 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
FR2958936A1 (fr) * 2010-04-14 2011-10-21 Sanofi Aventis Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
US20130115215A1 (en) * 2010-07-14 2013-05-09 Hongxing Zhou Domain insertion immunoglobulin
EP3960865A1 (en) 2010-08-02 2022-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
EP3252072A3 (en) 2010-08-03 2018-03-14 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
RU2013110876A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Рош Гликарт Аг Активируемые биспецифические антитела
RU2013110875A (ru) 2010-08-24 2014-09-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СОДЕРЖАЩИЕ СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ ДИСУЛЬФИДОМ ФРАГМЕНТ Fv
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
JP5764677B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-19 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗原結合タンパク質
CN102675460B (zh) * 2011-02-28 2015-08-19 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗肿瘤坏死因子α的人源化抗体
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
TWI719112B (zh) 2011-03-16 2021-02-21 賽諾菲公司 雙重ｖ區類抗體蛋白質之用途
TWI588156B (zh) * 2011-03-28 2017-06-21 賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
PH12018501305B1 (en) * 2011-03-28 2022-11-04 Sanofi Sa Dual variable region antibody-like binding proteins having cross-over binding region orientation
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
WO2012158818A2 (en) * 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
UY34105A (es) * 2011-06-03 2012-07-31 Lg Life Sciences Ltd Formulación líquida estable de etanercept
HRP20192255T1 (hr) 2011-08-05 2020-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi s univerzalnim lakim lancem
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
LT2782598T (lt) 2011-11-23 2020-07-27 In3Bio Ltd. Rekombinantiniai baltymai ir jų terapinis panaudojimas
WO2013103783A1 (en) * 2012-01-04 2013-07-11 Sanofi Us Murine il-13 antibodies
MX2014009565A (es) 2012-02-10 2014-11-10 Genentech Inc Anticuerpos monocatenarios y otros heteromultimeros.
CN104334744A (zh) * 2012-03-27 2015-02-04 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 预测、诊断和治疗特发性肺纤维化的方法
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9505833B2 (en) 2012-04-20 2016-11-29 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same
US9334319B2 (en) 2012-04-20 2016-05-10 Abbvie Inc. Low acidic species compositions
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
JP6203838B2 (ja) 2012-06-27 2017-09-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 少なくとも２つの異なる結合実体を含む、テーラーメイドの高度に選択的かつ多重特異的なターゲティング実体を選択および作製するための方法、ならびにその使用
RU2015100656A (ru) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
WO2014031610A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Sanofi Methods for treating or preventing asthma by administering an il-4r antagonist
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
SI2895513T1 (sl) 2012-09-12 2018-11-30 Genzyme Corporation Polipeptidi, ki vsebujejo FC, s spremenjeno glikozilacijo in zmanjšano efektorsko funkcijo
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
MY171664A (en) 2012-11-01 2019-10-22 Abbvie Inc Anti-dll4/vegf dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
AU2013337644A1 (en) 2012-11-01 2015-05-07 Abbvie Inc. Stable Dual Variable Domain Immunoglobulin protein formulations
SI2922875T1 (sl) 2012-11-20 2017-06-30 Sanofi Protitelesa anti-CEACAM5 in njihove uporabe
CN105007941B (zh) 2012-12-27 2019-01-25 赛诺菲 抗-lamp1抗体和抗体药物偶联物及其用途
IL289918B2 (en) 2013-03-11 2025-07-01 Genzyme Corp Site-specific antibody-drug conjugation through glycoengineering
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
EP2970484B2 (en) * 2013-03-15 2022-09-21 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
BR112015022978A8 (pt) 2013-03-15 2018-01-23 Memorial Sloan Kettering Cancer Center tecnologias de multimerização
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
WO2014165771A2 (en) * 2013-04-05 2014-10-09 Genentech, Inc. Anti-il-4 antibodies and bispecific antibodies and uses thereof
TWI679019B (zh) * 2013-04-29 2019-12-11 法商賽諾菲公司 抗ｉｌ－４／抗ｉｌ－１３之雙特異性抗體調配物
WO2015051293A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Abbvie, Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
BR112016006929A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-19 Hoffmann La Roche Anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de preparação de anticorpo, de tratamento de pacientes e de geração de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US20150118251A1 (en) 2013-10-31 2015-04-30 Sanofi Specific anti-cd38 antibodies for treating human cancers
US10584147B2 (en) 2013-11-08 2020-03-10 Biovertiv Therapeutics Inc. Procoagulant fusion compound
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
JP7325166B2 (ja) 2013-12-20 2023-08-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 二重特異性抗体
EP2893939A1 (en) 2014-01-10 2015-07-15 Netris Pharma Anti-netrin-1 antibody
TW201542226A (zh) * 2014-02-12 2015-11-16 Sanofi Sa 抗－ｉｌ－４／抗－ｉｌ－１３雙特異性抗體／聚麩胺酸配製物
CN106029693A (zh) * 2014-02-21 2016-10-12 豪夫迈·罗氏有限公司 抗il-13/il-17双特异性抗体及其用途
IL315136A (en) * 2014-02-21 2024-10-01 Sanofi Biotechnology Methods for treating or preventing asthma by administering an il-4rantagonist
US10995148B2 (en) 2014-03-19 2021-05-04 Genzyme Corporation Site-specific glycoengineering of targeting moieties
BR112016021679A2 (pt) 2014-03-21 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. proteína de ligação ao antígeno, métodos de produção de uma proteína de ligação ao antígeno e de identificação de uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno, hibridoma, ácido nucleico, célula, e, animal não humano geneticamente modificado.
SG10201808225TA (en) 2014-03-21 2018-10-30 Regeneron Pharma Non-human animals that make single domain binding proteins
TWI745962B (zh) * 2014-06-27 2021-11-11 法商賽諾菲公司 測定投予至人類個體之包括雙-v-區類抗體蛋白或其片段的劑量是否在人類個體中與il-4或il-13特異性結合之方法
IL296633A (en) 2014-07-11 2022-11-01 Genmab As Antibodies that bind axl
EP3194446B1 (en) 2014-09-18 2022-10-26 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for treating fibrosis
PT3204425T (pt) 2014-10-09 2020-12-18 Genzyme Corp Conjugados anticorpo fármaco glicomanipulados
US10066017B2 (en) 2014-11-14 2018-09-04 Sanofi Biotechnology Methods for treating chronic sinusitis with nasal polyps by administering an IL-4R antagonist
JP6686897B2 (ja) * 2014-11-21 2020-04-22 アステラス製薬株式会社 新規二重特異的抗体フォーマット
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
MY191964A (en) 2015-01-23 2022-07-21 Sanofi Sa Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
MA41414A (fr) 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
EP3067062A1 (en) 2015-03-13 2016-09-14 Ipsen Pharma S.A.S. Combination of tasquinimod or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a pd1 and/or pdl1 inhibitor, for use as a medicament
CA2977285A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of detecting and quantifying il-13 and uses in diagnosing and treating th2-associated diseases
HK1250038A1 (zh) 2015-03-19 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
CA2991805A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
MA43017A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Anticorps bispécifiques spécifiques d'un récepteur de co-stimulation du tnf
MX2018005048A (es) 2015-10-25 2018-09-06 Sanofi Sa Proteinas de union triespecificas y/o trivalantes para la prevencion o el tratamiento de la infeccion por vih.
AR106543A1 (es) 2015-11-02 2018-01-24 Netris Pharma Terapia de combinación de agente neutralizante de ntn1 con fármacos que inhiben el control epigenético
WO2017117384A1 (en) 2015-12-31 2017-07-06 Development Center For Biotechnology Anti-vegfr antibody and uses thereof
RU2766000C2 (ru) 2016-01-08 2022-02-07 АльтруБио Инк. Четырехвалентные антитела к psgl-1 и их применения
CN109476756B (zh) 2016-03-15 2022-05-31 埃泰美德(香港)有限公司 一种多特异性Fab融合蛋白及其用途
SI3443006T1 (sl) * 2016-04-13 2024-01-31 Sanofi Trispecifični in/ali trivalentni vezni proteini
BR112018070998A2 (pt) * 2016-04-13 2019-02-26 Sanofi proteínas de ligação triespecíficas e/ou trivalentes
EA037960B1 (ru) 2016-04-27 2021-06-15 Эббви Инк. Способ лечения эозинофильного эзофагита с применением антитела против il-13
TW201808336A (zh) 2016-05-11 2018-03-16 賽諾菲公司 用抗ｍｕｃ１類美登素免疫綴合物抗體治療腫瘤的治療方案
CA3030636A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 Genmab A/S Multispecific antibodies against cd40 and cd137
TWI790206B (zh) 2016-07-18 2023-01-21 法商賽諾菲公司 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白
JP7366742B2 (ja) 2016-08-26 2023-10-23 サノフイ 選択的な軽鎖対形成を容易にする多重特異性抗体
TWI778985B (zh) 2016-10-20 2022-10-01 法商賽諾菲公司 抗chikv抗體及其用途
WO2018083126A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
CA3046489A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
US12162932B2 (en) 2017-01-05 2024-12-10 Netris Pharma Combined treatment with Netrin-1 interfering drug and immune checkpoint inhibitors drugs
EP4659808A3 (en) 2017-02-17 2026-03-11 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
CA3053774A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
US10626169B2 (en) 2017-02-17 2020-04-21 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
KR101961871B1 (ko) * 2017-02-20 2019-07-17 주식회사 와이바이오로직스 신규 다중특이적 결합 단백질
WO2018183932A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a il-13 inhibitor
MX2019012171A (es) * 2017-04-13 2019-11-25 Regeneron Pharma Tratamiento e inhibicion de enfermedades pulmonares inflamatorias en pacientes que tienen alelos de riesgo en los genes que codifican la il33 e il1rl1.
MX2019014407A (es) 2017-06-07 2020-02-05 Genmab Bv Anticuerpos terapeuticos basados en hexameros de inmunoglobulina g (igg) mutados.
WO2019009879A1 (en) * 2017-07-03 2019-01-10 Development Center For Biotechnology ANTI-VEGFR ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019025545A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Genmab A/S BINDING AGENTS BINDING TO PD-L1 AND CD137 AND THEIR USE
WO2019028367A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING ESOPHAGITIS WITH ACTIVE EOSINOPHILES
WO2019051204A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services SYNERGISTIC COMBINATION OF IL4, INTERFERON GAMMA AND INTERFERON ALPHA RECEPTOR AGENTS FOR USE IN THE TREATMENT OF OVARIAN CANCER
CN120058938A (zh) 2017-10-10 2025-05-30 赛诺菲 抗cd38抗体及与抗cd3和抗cd28抗体的组合
CN109705217B (zh) * 2017-10-25 2020-09-11 北京智仁美博生物科技有限公司 抗il-13抗体及其用途
PL3703818T3 (pl) 2017-10-30 2024-03-25 Sanofi Biotechnology Antagonista IL-4R do zastosowania w sposobie leczenia lub zapobiegania astmie
WO2019140320A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Genzyme Corporation Methods for the quantitation of polypeptides
JP2021510740A (ja) 2018-01-24 2021-04-30 ゲンマブ ビー．ブイ． ポリペプチド変種およびそれらの用途
IL276286B2 (en) 2018-01-26 2025-07-01 Genzyme Corp FC variants with improved binding to FCRN and extended half-life
US20210024632A1 (en) * 2018-03-05 2021-01-28 Etablissement Francais Du Sang Recombinant single chain immunoglobulins
CA3093469A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Combination therapy for cardiovascular diseases
EP3788074A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
EP3574915A1 (en) 2018-05-29 2019-12-04 Neovacs Immunogenic product comprising il-4 and/or il-13 for treating disorders associated with aberrant il-4 and/or il 13 expression or activity
MA52951A (fr) 2018-06-22 2021-04-28 Genmab Holding B V Anticorps anti-cd37 et anticorps anti-cd20, compositions et méthodes d'utilisation de ceux-ci
CN120865412A (zh) 2018-07-13 2025-10-31 根马布股份公司 Cd38抗体变体及其用途
WO2020012038A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
US12460000B2 (en) 2018-09-07 2025-11-04 Itabmed (Hk) Limited Anti-CD19 and anti-CD3 bispecific antigen binding proteins and uses thereof
MX2021003756A (es) 2018-10-04 2021-08-11 Genmab Holding B V Composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos anti cumulo de diferenciacion 37 (cd37) biespecificos.
MX2021004147A (es) 2018-10-09 2021-09-08 Sanofi Sa Proteínas de unión triespecíficas anti-cd38, anti-cd28 y anti-cd3 y métodos de uso para tratar una infección viral.
EP3878868B1 (en) 2018-11-09 2024-10-09 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Human antibody having high affinity to human il-4 receptor alpha, and use thereof
CN116726361A (zh) 2018-11-19 2023-09-12 比奥拉治疗股份有限公司 用生物治疗剂治疗疾病的方法和装置
CA3124408A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Aim Immunotech Inc. Compositions and methods for cancer therapy
WO2020132810A1 (en) 2018-12-24 2020-07-02 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific antigen binding proteins capable of binding cd19 and cd3, and use thereof
CN111494625B (zh) * 2018-12-25 2022-06-21 江苏荃信生物医药股份有限公司 用于治疗il-4和/或il-13介导的信号转导相关的疾病的药物组合物
SG11202109003QA (en) 2019-03-06 2021-09-29 Regeneron Pharma Il-4/il-13 pathway inhibitors for enhanced efficacy in treating cancer
MA55372A (fr) 2019-03-21 2022-01-26 Regeneron Pharma Combinaison d'inhibiteurs de la voie il-4/il-13 et d'ablation de plasmocytes pour traiter une allergie
WO2020206063A1 (en) 2019-04-03 2020-10-08 Genzyme Corporation Anti-alpha beta tcr binding polypeptides with reduced fragmentation
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
US11827671B2 (en) 2019-05-24 2023-11-28 Sanofi Methods for treating systemic sclerosis
EP3753954A1 (en) 2019-06-21 2020-12-23 Université de Franche-Comté Anti-cd123 antibodies, anti-cd123 chimeric antigen receptors and anti-cd123 chimeric antigen receptors t cells
JP7592064B2 (ja) 2019-07-16 2024-11-29 サノフィ・バイオテクノロジー Ｉｌ－４ｒアンタゴニストを投与することにより喘息を治療するまたは予防するための方法
JP7685985B2 (ja) 2019-07-16 2025-05-30 サノフイ アルツハイマー病の処置のための中和抗アミロイドベータ抗体
TW202120539A (zh) 2019-07-25 2021-06-01 美商健臻公司 以FcRn拮抗劑治療抗體媒介之病症的方法
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
GB201919062D0 (en) * 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Antibody
EP4090365A1 (en) 2020-01-15 2022-11-23 Immatics Biotechnologies GmbH Antigen binding proteins specifically binding prame
US20230047809A1 (en) 2020-01-31 2023-02-16 Sanofi Pulmonary delivery of antibodies
US11879004B2 (en) 2020-02-28 2024-01-23 Genzyme Corporation Modified binding polypeptides for optimized drug conjugation
ES3032708T3 (en) 2020-03-03 2025-07-23 Active Biotech Ab Tasquinimod or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in combination therapy
TW202146463A (zh) 2020-03-05 2021-12-16 法商賽諾菲公司 蛋白酶加工的分子
CA3168613A1 (en) 2020-03-18 2021-09-23 Genmab A/S Antibodies binding to b7h4
WO2021214223A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates and folfox
MX2022013406A (es) 2020-04-24 2022-11-14 Sanofi Sa Combinaciones antitumorales que contienen productos conjugados de anticuerpos anti-ceacam5 y cetuximab.
KR20230005257A (ko) 2020-04-24 2023-01-09 사노피 항-ceacam5 항체 접합체 및 folfiri를 함유하는 항종양 병용물
MX2022013404A (es) 2020-04-24 2022-11-14 Sanofi Sa Combinaciones antitumorales que contienen productos conjugados de anticuerpos anti-ceacam5, trifluridina y tipirazilo.
CN111690066B (zh) * 2020-06-22 2022-07-22 南京融捷康生物科技有限公司 抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物
WO2021263075A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Methods of generating an activation inducible expression system in immune cells
WO2022018294A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Genmab B.V. A combination of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
CN116472060A (zh) 2020-09-02 2023-07-21 健玛保 抗体疗法
KR20230062600A (ko) 2020-09-04 2023-05-09 메르크 파텐트 게엠베하 항-ceacam5 항체 및 접합체 및 이의 용도
IL302731A (en) 2020-11-10 2023-07-01 Sanofi Sa Formulation of an antibody-drug conjugate for CEACAM5
EP4255926A1 (en) * 2020-12-07 2023-10-11 UCB Biopharma SRL Multi-specific antibodies and antibody combinations
WO2022184805A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding sars-cov-2 antigenic peptides in complex with a major histocompatibility complex protein
EP4334359A1 (en) 2021-05-07 2024-03-13 Genmab A/S Pharmaceutical compositions comprising bispecific antibodies binding to b7h4 and cd3
EP4347640A1 (en) 2021-05-27 2024-04-10 Sanofi Fc variant with enhanced affinity to fc receptors and improved thermal stability
KR20240029062A (ko) 2021-07-02 2024-03-05 메르크 파텐트 게엠베하 항-protac 항체 및 복합체
EP4372009A4 (en) * 2021-07-26 2025-06-11 Denka Company Limited REAGENT CONTAINING A HUMANIZED ANTIBODY
WO2023021195A1 (en) * 2021-08-20 2023-02-23 Neovacs mRNA VACCINES COMPRISING IL-4 AND/OR IL-13 RNA AND USES THEREOF
TW202333797A (zh) 2021-11-05 2023-09-01 法商賽諾菲公司 含有抗ceacam5抗體-藥物接合物及抗vegfr-2抗體之抗腫瘤組合
AU2022425608A1 (en) 2021-12-30 2024-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for attenuating atopic march by administering an il-4/il-13 antagonist
AU2023228391A1 (en) * 2022-03-03 2024-09-19 Pfizer Inc. Multispecific antibodies binding to il-4, il-13 and/or tslp and uses thereof
EP4489861A1 (en) 2022-03-09 2025-01-15 Merck Patent GmbH Methods and tools for conjugation to antibodies
EP4245772A1 (en) 2022-03-18 2023-09-20 Netris Pharma Anti-netrin-1 antibody to treat liver inflammation
EP4249509A1 (en) 2022-03-22 2023-09-27 Netris Pharma Anti-netrin-1 antibody against arthritis-associated pain
TW202413419A (zh) 2022-05-27 2024-04-01 法商賽諾菲公司 與ｎｋｐ４６和ｂｃｍａ變體結合之具有ｆｃ工程化的自然殺手（ｎｋ）細胞接合物
JP2025522482A (ja) 2022-06-17 2025-07-15 アポジー バイオロジクス， インコーポレイテッド インターロイキン１３に結合する抗体及び使用方法
EP4608859A1 (en) 2022-10-25 2025-09-03 Ablynx N.V. Glycoengineered fc variant polypeptides with enhanced effector function
JP2026503962A (ja) 2022-12-27 2026-02-03 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗ｐｒｏｔａｃ抗体および複合体
EP4413995A1 (en) 2023-02-07 2024-08-14 Université de Franche-Comté Anti-cd123 chimeric antigen receptors t cells for use in the treatement of autoimmune diseases
EP4673465A1 (en) 2023-02-27 2026-01-07 South Australian Health and Medical Research Institute Limited Anti-netrin-1 monoclonal antibody for treating endometriosis and associated pains
EP4673181A1 (en) 2023-03-01 2026-01-07 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating neuroendocrine cancers expressing ceacam5
EP4427763A1 (en) 2023-03-06 2024-09-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates, anti-vegfr-2 antibodies and anti-pd1/pd-l1 antibodies
CN120917154A (zh) 2023-03-23 2025-11-07 赛诺菲 用于癌症疗法中的患者选择的CEACAM5 mRNA测定
EP4434586A1 (en) 2023-03-23 2024-09-25 Xenothera Combination of antibodies, or antigen-binding fragments thereof, for the treatment of cancer and composition thereof
TW202509071A (zh) 2023-05-12 2025-03-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 能夠與ｏｘ４０結合之抗體、其變異體及其用途
WO2024238614A2 (en) * 2023-05-15 2024-11-21 Sthria Sciences Limited Liability Company A method of treating autoimmune disease
CN121443320A (zh) 2023-06-05 2026-01-30 赛诺菲 含有抗ceacam5抗体-药物缀合物、抗pd1/pd-l1抗体和抗ctla4抗体的抗肿瘤组合
WO2025049347A1 (en) * 2023-08-25 2025-03-06 Triveni Bio, Inc. Klk5/7 + il-4 targeting antibodies and uses thereof
WO2025049348A1 (en) * 2023-08-25 2025-03-06 Triveni Bio, Inc. Klk5/7 + il-13 targeting antibodies and uses thereof
AU2024333809A1 (en) * 2023-08-25 2026-02-26 Triveni Bio, Inc. Klk5/7 + th2 targeting antibodies and uses thereof
WO2025049345A1 (en) 2023-08-25 2025-03-06 Proteologix Us Inc. Anti-il-13 multispecific antibody constructs and uses thereof
JP2025036273A (ja) * 2023-08-30 2025-03-14 ファイザー・インク 多重特異性抗体およびその使用
WO2025073856A1 (en) 2023-10-04 2025-04-10 Xenothera Combination of antibodies, or antigen-binding fragments thereof, for the treatment of cancers
WO2025088546A1 (en) 2023-10-25 2025-05-01 Ablynx N.V. Fc domain variants with enhanced fc receptor binding
WO2025166138A1 (en) * 2024-02-02 2025-08-07 Triveni Bio, Inc. Klk5/7 + tslp targeting antibodies and uses thereof
WO2025166146A1 (en) * 2024-02-02 2025-08-07 Triveni Bio, Inc. Klk5/7 + ox40 targeting antibodies and uses thereof
WO2025242845A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Merck Patent Gmbh Colorectal cancer treatment
WO2026022712A1 (en) 2024-07-23 2026-01-29 Sanofi Cereblon ligase modulator and bcma nk cell engager combination therapy

Family Cites Families (144)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
DE3668186D1 (de) 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
IL89489A0 (en) 1988-03-09 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen
JPH02503867A (ja) 1988-04-15 1990-11-15 プロテイン　デザイン　ラブズ　インコーポレーテッド Ｉｌ‐２レセプター特異的キメラ抗体
ES2070172T3 (es) 1988-04-16 1995-06-01 Celltech Ltd Procedimiento para producir proteinas mediante adn recombinante.
EP0428534B1 (en) 1988-06-14 1995-03-29 Cetus Oncology Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US5534617A (en) 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
FI903489A0 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Ligander med en enda sektion, receptorer innehaollande naemnda ligander, foerfaranden foer deras framstaellning samt anvaendning av liganderna och receptorerna.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
IL94611A (en) 1989-06-05 1994-12-29 Organogenesis Inc Medium for cell cultures containing insulin or growth factor similar to insulin, transferrin or iron ion, triiodothyronine or thyroxine and method of use
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
EP0521985B1 (en) 1990-03-20 1997-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
ES2178635T3 (es) 1990-11-09 2003-01-01 Stephen D Gillies Inmunoconjugados de citoquinas.
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
DK0563475T3 (da) 1992-03-25 2000-09-18 Immunogen Inc Konjugater af cellebindende midler og derivater af CC-1065
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
ES2136664T3 (es) 1992-06-09 1999-12-01 Hoppe Ag Sistema de cierre y conjunto de cerradura.
WO1994004670A1 (en) 1992-08-26 1994-03-03 President And Fellows Of Harvard College Use of the cytokine ip-10 as an anti-tumor agent
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
ES2236693T3 (es) 1993-09-07 2005-07-16 Smithkline Beecham Corporation Anticuerpos recombinantes contra il4 utiles en el tratamiento de afecciones mediadas por il4.
US5928904A (en) * 1993-09-07 1999-07-27 Smithkline Beecham Corporation DNA encoding recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders
US20020193575A1 (en) 1993-09-07 2002-12-19 Smithkline Beecham P.L.C. Recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders
RU2162711C2 (ru) * 1993-09-07 2001-02-10 Смитклайн Бичам Корпорейшн Рекомбинантные il4-антитела, используемые для лечения нарушений, связанных с действием il4
WO1995009917A1 (en) * 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
US5597710A (en) 1994-03-10 1997-01-28 Schering Corporation Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
US5705154A (en) * 1995-03-08 1998-01-06 Schering Corporation Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
US6165463A (en) 1997-10-16 2000-12-26 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5989830A (en) 1995-10-16 1999-11-23 Unilever Patent Holdings Bv Bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6664227B1 (en) 1996-03-01 2003-12-16 Genetics Institute, Llc Treatment of fibrosis by antagonism of IL-13 and IL-13 receptor chains
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
EP0904278A4 (en) 1996-03-22 1999-09-15 Human Genome Sciences Inc MOLECULE II INDUCER OF APOPTOSIS
US6015884A (en) 1996-03-28 2000-01-18 The Johns Hopkins University Soluble divalent and multivalent heterodimeric analogs of proteins
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
GB9625899D0 (en) * 1996-12-13 1997-01-29 Glaxo Group Ltd Substances and their uses
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
SI0970126T1 (en) 1997-04-14 2001-08-31 Micromet Ag Novel method for the production of antihuman antigen receptors and uses thereof
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
DE69839060T2 (de) 1997-11-03 2009-01-15 Human Genome Sciences, Inc. Vegi, ein inhibitor der angiogenese und des tumorwachstums
ES2212638T3 (es) 1998-09-25 2004-07-16 Lindhofer, Horst, Dr. Utilizacion de celulas tumorales en tiempo escalonado en combinacion con anticuerpos intactos para la inmunizacion.
CA2796140A1 (en) * 1999-03-25 2000-09-28 Jochen Salfeld Human antibodies that bind human il-12 and methods for producing
ES2637801T3 (es) * 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
JP2003530838A (ja) 2000-04-12 2003-10-21 ヒューマン ゲノム サイエンシズ インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
JP2004511430A (ja) * 2000-05-24 2004-04-15 イムクローン　システムズ　インコーポレイティド 二重特異性免疫グロブリン様抗原結合蛋白および製造方法
ATE545703T1 (de) * 2000-07-25 2012-03-15 Immunomedics Inc Multivalentes zielbindendes protein
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
RU2430927C2 (ru) * 2000-10-20 2011-10-10 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Агонистическое соединение, способное специфически узнавать и поперечно сшивать молекулу клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу
US20040023338A1 (en) 2001-10-26 2004-02-05 Heavner George A. IL-4 mutein proteins, antibodies, compositions, methods and uses
EP1578912A4 (en) 2001-10-26 2007-12-26 Centocor Inc IL-13 MUTEIN PROTEINS, ANTIBODIES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
WO2003092610A2 (en) 2002-05-01 2003-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of using cytokine antagonists to treat hiv infection and aids
US20070104710A1 (en) * 2002-06-28 2007-05-10 Domants Limited Ligand that has binding specificity for IL-4 and/or IL-13
JP2006526408A (ja) 2003-04-22 2006-11-24 アイビーシー、ファーマシューティカルズ 多価タンパク質複合体
GB0407315D0 (en) 2003-07-15 2004-05-05 Cambridge Antibody Tech Human antibody molecules
GEP20104991B (en) * 2003-11-07 2010-05-25 Immunex Corp Antibodies that bind interleukin-4 receptor
DK2805728T3 (da) * 2003-12-23 2020-04-20 Genentech Inc Hidtil ukendte anti-IL13-antistoffer og anvendelser deraf
US7652146B2 (en) 2004-02-06 2010-01-26 Bristol-Myers Squibb Company Process for preparing 2-aminothiazole-5-carboxamides useful as kinase inhibitors
EP1729795B1 (en) 2004-02-09 2016-02-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1723428A2 (en) 2004-02-19 2006-11-22 Yale University Corporation Identification of cancer protein biomarkers using proteomic techniques
CA2554596A1 (en) 2004-02-27 2005-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il-4/il-13 specific polypetides and therapeutic uses thereof
GB0411186D0 (en) * 2004-05-19 2004-06-23 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2005116077A2 (en) * 2004-05-25 2005-12-08 Attenuon, Llc LIGANDS BINDING THE COMPLEX OF UROKINASE-TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR (uPA) AND ITS RECEPTOR (uPAR) THAT INHIBIT DOWNSTREAM uPAR INTERACTIONS: IDENTIFICATION AND USE IN DIAGNOSIS OR THERAPY
AR049390A1 (es) * 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
GB0414799D0 (en) * 2004-07-01 2004-08-04 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
US20060148009A1 (en) 2004-10-12 2006-07-06 Xencor, Inc. Prediction and assessment of immunogenicity
TW200902555A (en) * 2005-01-03 2009-01-16 Hoffmann La Roche Antibodies against IL-13 receptor alpha 1 and uses thereof
US20090041783A1 (en) * 2005-04-28 2009-02-12 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-platelet membrane glycoprotein vi monoclonal antibody
GB0514319D0 (en) * 2005-07-13 2006-06-14 Secr Defence Antibodies for anthrax
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007036745A2 (en) 2005-09-30 2007-04-05 Medimmune Limited Interleukin-13 antibody composition
MY144906A (en) * 2005-10-21 2011-11-30 Novartis Ag Human antibodies against il13 and therapeutic uses
GB0600488D0 (en) * 2006-01-11 2006-02-22 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
JP2009523460A (ja) * 2006-01-24 2009-06-25 ドマンティス リミテッド Ｉｌ−４および／またはｉｌ−１３に結合するリガンド
CA2646626A1 (en) 2006-03-22 2007-09-27 Apogenix Gmbh Antibody specific for human il-4 for the treatment of cancer
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
TWI719112B (zh) * 2011-03-16 2021-02-21 賽諾菲公司 雙重ｖ區類抗體蛋白質之用途
TWI679019B (zh) * 2013-04-29 2019-12-11 法商賽諾菲公司 抗ｉｌ－４／抗ｉｌ－１３之雙特異性抗體調配物
TWI745962B (zh) * 2014-06-27 2021-11-11 法商賽諾菲公司 測定投予至人類個體之包括雙-v-區類抗體蛋白或其片段的劑量是否在人類個體中與il-4或il-13特異性結合之方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR101681909B1 (ko) 2016-12-05
JP6126653B2 (ja) 2017-05-10
PA8799001A1 (es) 2009-07-23
HN2010000710A (es) 2013-07-22
GT201000067A (es) 2012-04-12
KR20140112574A (ko) 2014-09-23
US20130251717A1 (en) 2013-09-26
CL2013002040A1 (es) 2014-01-24
JP2015231382A (ja) 2015-12-24
NZ729148A (en) 2021-12-24
JP2018078907A (ja) 2018-05-24
US20130209469A1 (en) 2013-08-15
CL2008003037A1 (es) 2009-03-06
AU2013203328A1 (en) 2013-05-02
TW201536321A (zh) 2015-10-01
NO2573121T3 (sr) 2018-01-20
CY1114987T1 (el) 2016-12-14
TW201825117A (zh) 2018-07-16
IL249289A0 (en) 2017-01-31
JP2011501671A (ja) 2011-01-13
CN106986938B (zh) 2021-07-09
EP2574629A1 (en) 2013-04-03
TWI619508B (zh) 2018-04-01
SI2573119T1 (en) 2018-05-31
SI2574630T1 (en) 2018-08-31
TR201810005T4 (tr) 2018-08-27
DOP2013000302A (es) 2014-02-16
WO2009052081A2 (en) 2009-04-23
US20130236460A1 (en) 2013-09-12
JP5858616B2 (ja) 2016-02-10
NI201000404A (es) 2010-09-07
US8388965B2 (en) 2013-03-05
RU2721236C2 (ru) 2020-05-18
PH12013501032B1 (en) 2015-05-18
JP2016006086A (ja) 2016-01-14
CY1119875T1 (el) 2018-06-27
ZA201002069B (en) 2010-12-29
EP2573119A1 (en) 2013-03-27
PL2205640T3 (pl) 2014-05-30
US20130236461A1 (en) 2013-09-12
TW200932263A (en) 2009-08-01
CY1120887T1 (el) 2019-12-11
DK2205640T3 (en) 2014-02-24
RU2705551C2 (ru) 2019-11-07
EP2574630B1 (en) 2018-04-18
NI201000040A (es) 2010-09-07
NZ584658A (en) 2012-08-31
AU2013202389B9 (en) 2017-02-02
UA118949C2 (uk) 2019-04-10
RU2015141418A3 (sr) 2019-05-14
EP2574629B1 (en) 2017-11-22
RU2013120318A (ru) 2014-11-10
JP6280526B2 (ja) 2018-02-14
PT2573119T (pt) 2018-04-04
US20130251716A1 (en) 2013-09-26
PH12013501033A1 (en) 2015-05-25
MX354666B (es) 2018-03-15
DOP2013000301A (es) 2014-02-16
DK2573119T3 (en) 2018-04-16
DK2574630T3 (en) 2018-07-30
US20250313651A1 (en) 2025-10-09
RU2488595C2 (ru) 2013-07-27
NI201000402A (es) 2010-09-07
MX354150B (es) 2018-02-15
EP2573119B1 (en) 2018-01-03
RU2010119521A (ru) 2011-11-27
US20140023649A1 (en) 2014-01-23
AU2013202389A1 (en) 2013-05-02
RU2015141428A (ru) 2017-04-04
CA3015470C (en) 2022-01-18
IL205005A (en) 2016-11-30
RS56553B1 (sr) 2018-02-28
AU2013203328B2 (en) 2017-01-05
AU2008312655B2 (en) 2013-05-02
NO2574629T3 (sr) 2018-04-21
DK2574629T3 (en) 2018-02-26
WO2009052081A3 (en) 2009-06-04
US20130243776A1 (en) 2013-09-19
ES2647872T3 (es) 2017-12-27
LT2574630T (lt) 2018-07-25
JP2016006087A (ja) 2016-01-14
CN101827863B (zh) 2017-03-22
WO2009052081A4 (en) 2009-07-23
RU2015141418A (ru) 2017-04-04
US9732162B2 (en) 2017-08-15
CN101827863A (zh) 2010-09-08
HRP20180320T1 (hr) 2018-04-06
TWI616206B (zh) 2018-03-01
LT2574629T (lt) 2018-03-12
EP2574630A1 (en) 2013-04-03
US20210047437A1 (en) 2021-02-18
CY1120108T1 (el) 2018-12-12
NZ709353A (en) 2018-06-29
TN2010000126A1 (en) 2011-09-26
PY08038498A (es) 2014-08-01
MY171214A (en) 2019-10-02
JP6126652B2 (ja) 2017-05-10
CN113480647A (zh) 2021-10-08
CN113480647B (zh) 2025-03-28
AU2013203339B2 (en) 2017-01-05
CL2013002039A1 (es) 2014-03-07
PL2574630T3 (pl) 2018-09-28
KR20160142889A (ko) 2016-12-13
PH12013501032A1 (en) 2015-05-18
AU2013203324A1 (en) 2013-05-02
US10759871B2 (en) 2020-09-01
US20130251718A1 (en) 2013-09-26
SG10201602770UA (en) 2016-05-30
TWI616205B (zh) 2018-03-01
RS56914B1 (sr) 2018-05-31
US20230235088A1 (en) 2023-07-27
NI201000401A (es) 2010-09-07
TR201802225T4 (tr) 2018-03-21
AR122834A2 (es) 2022-10-12
BRPI0818677B1 (pt) 2019-11-12
CR11337A (es) 2010-04-21
AU2013203339B9 (en) 2017-02-02
EP2205640B1 (en) 2013-11-20
AR122833A2 (es) 2022-10-12
MX2010003290A (es) 2010-04-30
PE20091382A1 (es) 2009-10-14
CR20150102A (es) 2015-04-30
HUE038444T2 (hu) 2018-10-29
HUE036530T2 (hu) 2018-07-30
RS53175B (sr) 2014-06-30
AU2013203328B9 (en) 2017-02-02
PT2573121T (pt) 2017-11-21
US20130243777A1 (en) 2013-09-19
AU2013203324C1 (en) 2017-03-30
LT2573121T (lt) 2017-12-11
SI2573121T1 (en) 2018-01-31
PT2574629T (pt) 2018-02-23
MX363638B (es) 2019-03-28
RU2015141428A3 (sr) 2019-04-30
US20180030156A1 (en) 2018-02-01
CA3071750A1 (en) 2009-04-23
CN106986938A (zh) 2017-07-28
US20130236463A1 (en) 2013-09-12
EP2573118A1 (en) 2013-03-27
CL2012003196A1 (es) 2013-01-25
NI201000403A (es) 2010-09-07
US20130236462A1 (en) 2013-09-12
KR20100067669A (ko) 2010-06-21
HRP20180517T1 (hr) 2018-05-04
AU2013203339A1 (en) 2013-05-02
PL2574629T3 (pl) 2018-05-30
HUE038556T2 (hu) 2018-10-29
HRP20140150T1 (hr) 2014-03-28
CA3071750C (en) 2022-06-14
AU2013202389B2 (en) 2017-01-05
PL2573121T3 (pl) 2018-01-31
BRPI0818677A2 (pt) 2015-04-14
KR20190022928A (ko) 2019-03-06
ES2679281T3 (es) 2018-08-23
AU2013203324B2 (en) 2017-01-19
SG10201913836SA (en) 2020-03-30
PT2574630T (pt) 2018-07-17
SG185303A1 (en) 2012-11-29
PH12013501033B1 (en) 2018-12-14
KR101682373B1 (ko) 2016-12-06
EP2573121B1 (en) 2017-08-23
US11453727B2 (en) 2022-09-27
NI201000405A (es) 2010-09-07
UA104130C2 (uk) 2014-01-10
US20100226923A1 (en) 2010-09-09
EP2573115A1 (en) 2013-03-27
CA3015470A1 (en) 2009-04-23
SG10201913838RA (en) 2020-03-30
CA2702473C (en) 2018-10-09
ES2660152T3 (es) 2018-03-21
ES2664476T3 (es) 2018-04-19
EP3686220A1 (en) 2020-07-29
MX363634B (es) 2019-03-28
CR20150101A (es) 2015-04-14
AU2008312655A1 (en) 2009-04-23
PL2573119T3 (pl) 2018-07-31
RS57396B1 (sr) 2018-09-28
RU2580049C2 (ru) 2016-04-10
EP2574626A1 (en) 2013-04-03
ES2447915T3 (es) 2014-03-13
KR101823859B1 (ko) 2018-02-01
US9738728B2 (en) 2017-08-22
US20130259866A1 (en) 2013-10-03
SI2205640T1 (sl) 2014-04-30
HRP20171765T1 (hr) 2017-12-29
AR068861A1 (es) 2009-12-09
CR20150103A (es) 2015-04-14
CR20150654A (es) 2016-02-08
IL205005A0 (en) 2010-11-30
CY1120033T1 (el) 2018-12-12
MX363901B (es) 2019-04-08
EP2050764A1 (en) 2009-04-22
NI201000406A (es) 2010-09-07
DOP2010000109A (es) 2010-05-31
BRPI0818677B8 (pt) 2021-05-25
US20130243778A1 (en) 2013-09-19
HRP20181085T1 (hr) 2018-09-07
LT2573119T (lt) 2018-04-10
CA2702473A1 (en) 2009-04-23
EP2573117A1 (en) 2013-03-27
UY31394A1 (es) 2009-05-29
KR20180014189A (ko) 2018-02-07
EP2573116A1 (en) 2013-03-27
PT2205640E (pt) 2014-02-25
MA31838B1 (fr) 2010-11-01
NZ601342A (en) 2014-02-28
EP2205640A2 (en) 2010-07-14
EP2573121A1 (en) 2013-03-27
HUE037205T2 (hu) 2018-08-28
SI2574629T1 (en) 2018-03-30
DK2573121T3 (en) 2017-12-04
KR101954596B1 (ko) 2019-03-07
TW201536322A (zh) 2015-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250313651A1 (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
AU2019201718A1 (en) Antibodies that bind IL-4 and/or IL-13 and their uses
HK1183498B (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183884B (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183883B (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183879A (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183884A (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183879B (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183676A (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183883A (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183497A (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183495A (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183885A (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183675A (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses
HK1183498A (en) Antibodies that bind il-4 and/or il-13 and their uses