RS57675B1 - Upotreba biljnog ekstrakta za prevenciju i lečenje gubitka kose - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu biljnog ekstrakta za prevenciju i lečenje gubitka kose.

[0002] Predmetni pronalazak potiče iz oblasti trihologije i prehrambenih ili dijetetskih proizvoda.

[0003] Konkretno, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu biljnog ekstrakta za stimulaciju fiziološkog rasta kose u oblastima zahvaćenim proređivanjem kose i/ili ćelavošću.

Poznato stanje tehnike

[0004] Dlaka ima zaštitnu ulogu i smatra se dodatkom koži, zajedno sa lojnim žlezdama, znojnim žlezdama i noktima. Dlaka poseduje jedinstveno i karakteristično svojstvo: cikličnost.

[0005] Životni ciklus bulbusa dlake suštinski predstavljaju tri uzastopne faze: anagena (rast), katagena (involucija) i telogena (faza mirovanja).

[0006] Period rasta dlake praćen je fazom regresije, tokom kojeg najdublji deo folikula podleže programiranoj ćelijskoj smrti.

[0007] Na kraju ove faze, ciklus počinje iz početka. Biološke faze ovog fenomena zasnivaju se na sposobnosti matičnih ćelija bulbusa da napuste, naizmeničnim koracima, stanje mirovanja. Tokom faze rasta bulbusa i proizvodnje dlake preovlađuju aktivnosti proliferacije, diferencijacije i preživljavanja, koje su regulisane faktorima rasta. Faza regresije se, naprotiv, odlikuje aktivacijom molekularnih puteva koji indukuju apoptozu u ćelijama bulbusa.

[0008] Ako se uloga kose posmatra u društvenim odnosima, suočavanje sa gubitkom kose može da bude teško za mnoge ljude.

[0009] U anagenoj fazi, dermalna papila stvara hemijske signale koji aktiviraju i usmeravaju matične ćelije pupoljka koje migriranjem u bazni deo folikula obrazuju matriks dlake. Ovom "migracijom" matične ćelije pupoljka stvaraju "obrazac" ćelija koje će dati spoljašnju ovojnicu korena dlake ili ORS.

[0010] Kao odgovor na dodatne signale dermalne papile, ćelije matriksa, koje potiču od matičnih ćelija, proliferišu i započinju proces diferencijacije, ushodnim pomeranjem, kako bi se formirala stabljika i unutrašnja ovojnica folikula dlake.

[0011] Početak katagene faze odlikuje se završetkom ćelijske proliferacije i apoptozom ćelija matriksa. Tokom katagene faze dermalna papila migrira prema najnižem delu pupoljka. Smatra se da je ovaj blizak položaj papile i pupoljka od suštinskog značaja za započinjanje još jednog ciklusa proizvodnje dlake. Ovo omogućava interakciju/aktivaciju ćelija pupoljka u mirovanju i novi ciklus rasta dlake.

[0012] Po prelasku iz katagene u telogenu fazu, neke ćelije pupoljka migriraju prema papili, stvarajući zametak dlake.

[0013] Dlaka u telogenoj fazi sadrži populaciju ćelija u svojoj osnovi, što se u stvari naziva zametkom dlake, smeštenu veoma blizu dermalne papile. Proliferacija zametka dlake se aktivira prema kraju telogene faze, čak pre pupoljka, da bi se obrazovao, okruživanjem papile, matriks novog bulbusa.

[0014] Različiti faktori, među kojima stres, nedostatak nutritijenata i starenje, negativno utiču na životni ciklus bulbusa dlake, uzrokujući smanjenje broja dlaka i njihovo proređivanje.

[0015] Kod osoba koje pate od androgene alopecije (AGA), tokom vremena folikuli, koji se ponovo formiraju na početku nove anagene faze, postaju manji, što vodi formiranju dlake manjeg prečnika u poređenju sa početnim prečnikom. Kao posledica, dolazi do nastajanja mikroskopske kose. Zapaženo je da, iako folikuli kože glave atrofiraju, i dalje postoji izvor matičnih ćelija koje se pretvaraju u progenitorske ćelije, iako u manjoj meri u odnosu na kožu glave u fiziološkim uslovima.

[0016] Većina preparata za kosu dostupnih na tržištu ciljno deluje na bulbuse dlake i deluje na metabolizam, ishranu, oksigenaciju i mikrocirkulaciju kože glave poboljšavajući uslove koji doprinose fiziološkom rastu dlake.

[0017] Različiti proizvodi i preparati su dostupni na tržištu za lečenje i prevenciju gubitka kose. Međutim, upotreba ovih proizvoda koji su se do danas pokazali posebno efikasnim u lečenju gubitka kose, kao što je minoksidil ili neki antisteroidni lekovi sintetskog porekla, nije bez nedostataka. Konkretno, topikalna upotreba minoksidila može da izazove pojavu sporednih dejstava u određenom stepenu, kao što su kožni osipi, lokalna zapaljenja, glavobolja, dok oralna primena lekova kao što je finasterid može da izazove pojavu hormonalnih disfunkcija sa potencijalnim negativnim dejstvima na seksualni život.

[0018] Drugi proizvodi koji se trenutno koriste u oblasti trihologije, uprkos tome što se zasnivaju na proizvodima prirodnog porekla, imaju taj nedostatak da se prave složenim proizvodnim postupcima, zbog čega su posebno skupi. WO 2006/100101 A1 opisuje biljni ekstrakt biljke Ajuga reptans koja pripada porodici Laminaceae za upotrebu u lečenju gubitka kose ili alopecije, koji sadrži izoflavone.

[0019] Publikacija autora Oto N. "Hair papilla cell growth promoter useful as hair restorer, contains plant extracts chosen from Thymus serphyllum extract, rosemary extract, turmeric extract, white birch extract and black tea extract" WPI/Thomson, 24, avgust 2006, opisuje biljni ekstrakt za podsticanje rasta ćelija papile dlake od biljke iz porodice Laminaceae tj. Thymus serphyllum. Biljni ekstrakt je za upotrebu u lečenju alopecije i gubitka kose u obliku kreme, šampona ili praška.

[0020] Publikacija autora Sendula M. sa naslovom "Cosmetic plant extract product for hair and skin regeneration" vol. 2000, no. 36, 28. maj 2000, opisuje biljni ekstrakt koprive koja pripada porodici Lamiaceae za upotrebu u lečenju gubitka kose.

[0021] Stoga, trenutno postoji potreba za obezbeđivanjem proizvoda koji sadrže supstance koje su aktivne u stimulaciji fiziološkog procesa rasta kose i čija upotreba ne dovodi do značajnih sporednih dejstava.

[0022] Jedan od ciljeva pronalaska je obezbeđivanje kompozicije ili preparata koji sadrži aktivna sredstva -sintetskog porekla koja su pogodna za stimulaciju fiziološkog rasta kose kod subjekata koji pate od gubitka ili proređivanja kose, i čija upotreba je gotovo bez značajnih sporednih dejstava.

[0023] Još jedan cilj pronalaska je obezbeđivanje kompozicije za trihološku upotrebu koja može da se nanese lokalno ili da se primeni oralno, čija su aktivna sredstva biljnog porekla i mogu da se dobiju jednostavnim postupcima.

Kratak opis pronalaska

[0024] U tehničkoj oblasti pronalaska, podnosilac prijave je našao da biljni ekstrakt dobijen iz odabrane zeljaste biljke stimuliše fiziološki proces rasta kose, kada se primeni lokalno na kožu glave, ili kada se primeni oralno.

[0025] Konkretno, podnosilac prijave je neočekivano našao da biljka Galeopsis segetum Necker sadrži jedan ili više aktivnih sastojaka koji stimulišu aktivnost bulbusa dlake i doprinose obnavljanju fizioloških stanja rasta kose.

[0026] Prema prvom aspektu pronalaska, stoga, obezbeđena je neterapijska upotreba biljnog ekstrakta Galeopsis segetum Necker u lečenju ili prevenciji gubitka kose.

[0027] Prema drugom aspektu, predmetni opis obezbeđuje biljni ekstrakt Galeopsis segetum Necker za upotrebu u lečenju ili prevenciji gubitka kose.

[0028] Iznenađujuće je zapaženo da biljni ekstrakt Galeopsis segetum Necker primenjen topikalno ili oralno kod subjekta koji pati od proređivanja kose, uzrokuje progresivno zgušnjavanje kose u oblastima kože glave sa proređenom kosom.

[0029] U skladu sa trećim aspektom, predmetni opis obezbeđuje upotrebu kompozicije koja sadrži biljni ekstrakt Galeopsis segetum Necker i fiziološki prihvatljiv nosač za stimulaciju fiziološkog rasta kose.

[0030] U skladu sa četvrtim aspektom, obezbeđena je kompozicija koja sadrži biljni ekstrakt Galeopsis segetum Necker i fiziološki prihvatljiv nosač za upotrebu u lečenju ili prevenciji androgene alopecije ili opadanja kose.

[0031] Tipično, kompozicija prema pronalasku sadrži trihološki aktivnu količinu jednog ili više aktivnih sastojaka prisutnih u ekstraktu Galeopsis segetum Necker.

Kratak opis slika

[0032] Svojstva i prednosti predmetnog pronalaska će postati očiglednije iz priloženih crteža, na kojima:

Slika 1 prikazuje stubičasti grafikon koji se odnosi na podatke o citotoksičnosti dobijene u MTT testu u primeru 8 na uzorcima: biljne biomase, hidroalkoholnog ekstrakta Galeopsis segetum, etil-acetatnog ekstrakta Galeopsis segetum, ekstrakta u nadkritičnom CO2Galeopsis segetum, u doznom opsegu 2-200 µg/ml za 24, 48 i 72 časova;

Slika 2 prikazuje stubičasti grafikon koji pokazuje rezultate MTT testa sa indukovanim oksidativnim stresom dobijene na uzorcima α-tokoferola, biljne biomase, hidroalkoholnog ekstrakta, etil-acetatnog ekstrakta i ekstrakta sa nadkritičnim CO2Galeopsis segetum, kao što je dato u tabeli 1 primera 8;

Slika 3 prikazuje stubičasti grafikon koji predstavlja podatke o proizvodnji intracelularnih ROS u testu iz primera 8 uzoraka predstavljenih α-tokoferolom, biljnom biomasom i hidroalkoholnim ekstraktom, etil-acetatnim ekstraktom i ekstraktom sa nadkritičnin CO2iz Galeopsis segetum;

Slika 4 prikazuje stubičasti grafikon koji predstavlja dejstva uzoraka α-tokoferola, biljne biomase i hidroalkoholnog ekstrakta, etil-acetatnog ekstrakta i ekstrakta sa nadkritičnim CO2Galeopsis segetum, na aktivnost izoforme 2 enzima 5-alfareduktaze, kao što je prikazano u primeru 8.

Slika 5 prikazuje stubičasti grafikon koji predstavlja dejstva na ekspresiju citokeratina 6A dve koncentracije po svakom od uzoraka biljne biomase, hidroalkoholnog ekstrakta Galeopsis segetum, etil-acetatnog ekstrakta Galeopsis segetum, ekstrakta u nadkritičnom CO2Galeopsis segetum, kao što je prikazano u primeru 8.

Slika 6 prikazuje stubičasti grafikon koji se odnosi na MTT test nakon 24 časa koji pokazuje procenat ćelijske aktivnosti u poređenju sa kontrolom, određene tretmanom sa biljnim ekstraktima koji sadrže rastuće količine Galeopsis segetum Necker, u skladu sa primerom 7.

Slika 7 prikazuje podatke o karakterizaciji tri ekstrakta Galeopsis segetum opisana u primeru 9 pomoću TLC hromatografije sa visoko-polarnim eluentom;

Slika 8 prikazuje podatke o karakterizaciji tri ekstrakta Galeopsis segetum opisana u primeru 9 pomoću TLC hromatografije sa visoko-polarnim eluentom;

Slika 9 prikazuje grafik sa FT-IR spektrom hidroalkoholnog ekstrakta Galeopsis segetum iz primera 9;

Slika 10 prikazuje grafik sa FT-IR spektrom etil-acetatnog ekstrakta Galeopsis segetum iz primera 9;

Slika 11 prikazuje grafik sa FT-IR spektrom ekstrakta sa nadkritičnim CO2Galeopsis segetum iz primera 9;

Detaljan opis pronalaska

[0033] Podnosilac prijave je našao da biljni ekstrakt Galeopsis segetum Necker, kada se primeni lokalno ili preko kože, postiže stimulativno dejstvo na ćelije folikula, ponovno aktivirajući životni ciklus folikula dlake.

[0034] Osim toga, iznenađujuće je nađeno da se trihološka aktivnost ekstrakta Galeopsis segetum Necker takođe ispoljava na bulbuse dlake kože glave koji su u stanju mirovanja, tipično prisutne u onim oblastima kože glave u kojima je nađeno proređivanje kose.

[0035] U skladu sa prvim aspektom pronalaska, prema tome, obezbeđena je neterapijska upotreba biljnog ekstrakta biljke Galeopsis segetum Necker u lečenju ili prevenciji gubitka kose.

[0036] U skladu sa drugim aspektom, predmetni opis obezbeđuje biljni ekstrakt biljke Galeopsis segetum Necker za upotrebu u stimulaciji fiziološkog rasta kose.

[0037] Biljka iz koje biljni ekstrakt u osnovi pronalaska potiče je Galeopsis segetum Necker (G. ochroleuca Lam., G. dubia Leers, G. villosa Huds, takođe poznata kao smrdljiva kopriva), zeljasta uspravna vrsta sa tipičnim cvetom usnatica, koja pripada porodici Lamiaceae.

[0038] Biljni ekstrakt za ovde opisane upotrebe može da se dobije iz korena, lišća, plodova ili cvetova biljke Galeopsis segetum Necker ili iz dva ili više ovih delova biljke.

[0039] U nekim primerima izvođenja, biljni ekstrakt je dobijen iz nadzemnog dela biljke Galeopsis segetum Necker.

[0040] Prema nekim primerima izvođenja, biljni ekstrakt prema pronalasku dobijen je ekstrakcijom dela biljke, naročito nadzemnih delova biljke ili njenog biljnog tkiva, uz korišćenje fiziološki prihvatljivog ili jestivog rastvarača kao sredstva za ekstrakciju. Izraz jestiv označava fiziološki prihvatljiv rastvarač koji ljudsko telo može da apsorbuje.

[0041] Pogodni rastvarač za dobijanje biljnog ekstrakta je fiziološki prihvatljiva i/ili jestiva tečnost u kojoj su biološki aktivne komponente rastvorljive i u kojoj ne podležu promenama koje ih lišavaju njihove aktivnosti.

[0042] U nekim primerima izvođenja rastvarač je hidrofilan i odabran je od vode, etil acetata, etanola ili njihovih smeša.

[0043] U cilju dobijanja biljnog ekstrakta biljke Galeopsis segetum Necker, mogu da se upotrebe tehnike ekstrakcije koje koriste nadkritični CO2ili tehnike čvrsto-tečne ekstrakcije pogodne za separaciju/ekstrakciju jedne ili više biološki aktivnih komponenata za ponovno uspostavljanje fizioloških stanja aktivnosti bulbusa dlake iz biljnih tkiva biljke.

[0044] U određenim primerima izvođenja, ekstrakcija jedne ili više biološki aktivnih komponenata obavlja se maceracijom biljnog dela ili matriksa Galeopsis segetum Necker u pogodnom rastvaraču, na primer hidroalkoholnoj smeši.

[0045] Na primer, biljni deo ili matriks, tipično nadzemni delovi biljke Galeopsis segetum Necker potapaju se u pogodni rastvarač, na primer smešu voda-etanol, tokom vremena pogodnog za obogaćivanje rastvarača sa jednom ili više biološki aktivnih komponenata. U ovim uslovima, ekstrakcija u rastvaraču biološki aktivnih komponenata prisutnih u biljnim tkivima biljke odvija se putem difuzije i osmoze.

[0046] Tipično se tokom maceracije matriks biljke Galeopsis segetum Necker dovodi u kontakt sa rastvaračem tokom različitog vremena da bi se postigla ekstrakcija efikasne količine biološki aktivne komponente. U određenim primerima izvođenja vreme maceracije može da varira od 1 do 48 časova.

[0047] U određenim primerima izvođenja biljni ekstrakt Galeopsis segetum Necker se primenjuje u koncentraciji od 0.01 do 100 mg/ml.

[0048] Prema određenim primerima izvođenja priprema pogodnog ekstrakta Galeopsis segetum Necker obuhvata sledeće korake:

- usitnjavanje dela biljke, na primer nadzemnih delova biljke,

- dodavanje rastvarača za ekstrakciju, na primer da bi se dobio težinski odnos lek/hidroalkoholni rastvarač sadržan između oko 1:10 i oko 1:50,

- maceraciju,

- ekstrakciju,

- filtriranje,

- koncentrovanje filtrata, na primer na sniženom pritisku evaporacijom rastvarača,

- opciono nastavljanje evaporacije do uklanjanja rastvarača

- opciono sušenje ekstrakta.

[0049] U određenim primerima izvođenja, korak ekstrakcije može da bude ponovljen dva ili tri puta, do iscrpljivanja materijala za ekstrakciju.

[0050] U završnom koraku uklanjanja rastvarača evaporacijom, opciono može da se doda čvrsti nosač, kao što su, kao neograničavajući primer, skrobovi ili maltodekstrini, za dobijanje ekstrakta u obliku suvog praha.

[0051] Prema još jednom primeru izvođenja, metod ekstrakcije iz Galeopsis segetum Necker obuhvata sledeće korake:

- usitnjavanje, na primer nadzemnih delova biljke

- prenošenje dobijenog praha u pogodni perkolator

- perkolaciju, na primer sa količinom rastvarača za ekstrakciju takvom da se dobije težinski odnos lek/rastvarač od oko 1:20 do oko 1:100

- recirkulaciju dela perkolata do iscrpljivanja materijala za ekstrakciju

- presovanje ekstrahovanog biljnog sloja da bi se izdvojio sav rastvarač za ekstrakciju

- filtraciju perkolata

- koncentrovanje filtrata na primer na sniženom pritisku evaporacijom rastvarača

- opciono nastavljanje evaporacije do uklanjanja rastvarača

- opciono sušenje ekstrakta.

[0052] Prema nekim primerima izvođenja, u završnom koraku uklanjanja rastvarača evaporacijom, dodaje se čvrsti nosač, na primer skrob ili maltodekstrini, da bi se dobio ekstrakt u obliku suvog praha.

[0053] Tipično, dobijeni ekstrakt može da bude fluidan, mek ili suv. Na primer, u fluidnom ekstraktu, 1 ml ekstrakta sadrži biološki aktivne komponente rastvorljive u 1 g biljnog leka, u mekom ekstraktu, rastvarač se delimično evaporiše, konkretno sve dok ekstrakt kvasi filter papir, u suvom ekstraktu rastvarač se evaporiše gotovo u potpunosti da bi se dobio prah.

[0054] Moguće je pripremiti ekstrakte Galeopsis segetum koji imaju različitu polarnost. Na primer, moguće je dobiti visoko polarni ekstrakt upotrebom polarnog rastvarača kao što je hidroalkoholni rastvor, srednje polarnog ekstrakta upotrebom manje polarnog rastvarača, kao što je etil-acetat, ili nepolarnog ekstrakta upotrebom nadkritičnog CO2. Poželjne tehnike ekstrakcije su one sa visoko polarnim rastvaračem i one sa nadkritičnim CO2. Konkretno, upotrebom ovih tehnika, efikasno se ekstrahuje frakcija fitokompleksa koja ispoljava inhibitornu aktivnost prema enzimu 5-alfa-reduktazi, koji ima značajnu ulogu u androgenoj alopeciji i koji je ciljno mesto delovanja finasterida, jedinjenja za koje je poznato da ima antiandrogenu aktivnost, efikasna u stimulaciji rasta kose i u ponovnoj aktivaciji fiziološkog ciklusa folikula kose.

[0055] U određenim primerima izvođenja, ekstrakcija se izvodi korišćenjem težinskog odnosa između rastvarača i biljnog matriksa sadržanog između 1:10 i 10:1.

[0056] Dalji postupci za dobijanje biljnog ekstrakta pronalaska uključuju tehnike ekstrakcije digestijom, infuzijom, ceđenjem, dekokcijom, perkolacijom, protivstrujnom ekstrakcijom, sokslet-ekstrakcijom, ekstrakcijom sa nadkritičnim gasovima ili ultrazvukom.

[0057] U nekim primerima izvođenja, biološki aktivna komponenta sadržana u ekstraktu Galeopsis segetum Necker sadrži najmanje jedan flavonoid, konkretno, izabran iz grupe koja sadrži monoacetilovani hipolaetin 4’-metil etar 7-(2"-alozil) glukozid, diacetilovani hipolaetin 4’-metil etar 7-(2"-alozil) glukozid, monoacetilovani izoskutelarein 7-(2"-alozil) glukozid, hipolaetin 4’-metil etar 7-(2"- alozil) glukozid, monoacetilovani hipolaetin 7-(2"- alozil) glukozid, izoskutelarein 7-(2"- alozil) glukozid i diacetilovani hipolaetin 7-(2"- alozil) glukozid.

[0058] Podnosilac prijave je našao da su flavonoidi koji su posebno aktivni u stimulaciji aktivnosti bulbusa dlake monoacetilovani hipolaetin 4’-metil etar 7-(2"-alozil)glukozid i/ili diacetilovani hipolaetin 4’-metil etar 7-(2"-alozil)glukozid.

[0059] U nekim primerima izvođenja, kompozicije pronalaska imaju sadržaj biljnog ekstrakta Galeopsis segetum Necker sadržan između 0.01 i 10% tež./tež., na primer 3% tež./tež.

[0060] Biološki aktivne komponente sadržane u biljnom ekstraktu prema pronalasku ponovno aktiviraju životni ciklus folikula dlake, čak i u mirovanju, kože glave u oblastima proređene kose i/ili oblastima pogođenim ćelavošću. Ovo dejstvo se prevodi u ponovni rast kose i u oblastima kože glave gde je kosa proređena. U skladu sa trećim aspektom, predmetni opis obezbeđuje upotrebu kompozicije koja sadrži biljni ekstrakt Galeopsis segetum Necker i fiziološki prihvatljiv nosač u lečenju i/ili prevenciji gubitka kose ili za stimulaciju fiziološkog rasta kose.

[0061] U skladu sa četvrtim aspektom, obezbeđena je kompozicija koja sadrži biljni ekstrakt Galeopsis segetum Necker i fiziološki prihvatljiv nosač za upotrebu u lečenju ili prevenciji androgene alopecije ili opadanja kose.

[0062] Konkretno, kompozicija prema pronalasku sadrži aktivnu količinu jedne ili više biološki aktivnih komponenata ekstrahovanih iz biljke Galeopsis segetum Necker.

[0063] Tipično, kompozicija prema pronalasku je medicinsko sredstvo, farmaceutska formulacija, dijetetski ili nutritivni dodatak, ili kozmetičko sredstvo.

[0064] Kompozicija prema pronalasku, kada se primeni lokalno ili sistemski, povećava vijabilnost ćelija folikula u anagenoj fazi, kao i u fazi umanjivanja, i ponovo aktivira ćelije kože glave u fazi mirovanja regeneracijom folikula i stimulacijom rasta nove kose.

[0065] U nekim primerima izvođenja, kompozicija prema pronalasku sadrži fiziološki i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0066] Tipično, fiziološki prihvatljiv nosač u kompoziciji prema pronalasku je ekscipijens, nosač ili razblaživač pogodan za topikalnu primenu i/ili oralnu primenu.

[0067] U okviru obima ovog dokumenta, pojam "nosač" se odnosi na ekscipijens, nosač, razblaživač ili adjuvans koji može da bude prisutan u kompoziciji prema pronalasku. Bilo koji nosač i/ili ekscipijens pogodan za oblik preparata poželjan za primenu obuhvaćen je upotrebama biljnog ekstrakta ili ovde opisanih aktivnih sastojaka prisutnih u njemu.

[0068] Tipično, kompozicija prema pronalasku koristi komponente biljnog porekla koje su biološki aktivne i suštinski bez sporednih dejstava, kada se primene oralno ili lokalno.

[0069] U nekim primerima izvođenja, kompozicija prema pronalasku primenjuje se oralno. U drugim primerima izvođenja, kompozicija se nanosi na kožu, i konkretno na kožu glave.

[0070] Fiziološki i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens mogu da budu odabrani na osnovu puta primene za koji je rezultujuća farmaceutska kompozicija namenjena.

[0071] U nekim primerima izvođenja, put primene kompozicije prema pronalasku je topikalni. U ovim slučajevima, kompozicija prema pronalasku može da se nanese, u efikasnoj količini, neposredno na kožu glave.

[0072] Na primer, u lečenju androgene alopecije kozmetički aktivna količina kompozicije prema pronalasku može da se nanese neposredno na kožu glave jednom ili više puta dnevno pogodno u ciklusima koji traju 2-3 meseca, naizmenično sa periodima odmora.

[0073] Prema još jednom aspektu pronalaska, obezbeđen je postupak za kozmetički tretman koji obuhvata primenu na kožu glave efikasne količine kompozicije prethodno opisanog tipa.

[0074] Kompozicija za topikalnu primenu može da bude u čvrstom, polu-čvrstom ili fluidnom obliku. Pogodne formulacije u čvrstom obliku uključuju kreme, gelove, paste, masti.

[0075] U drugim primerima izvođenja formulacija za lokalnu primenu je u fluidnom obliku, na primer u obliku losiona, gelova, šampona, suspenzija, emulzija.

[0076] U slučaju formulacija u fluidnom ili polu-fluidnom obliku, biljni ekstrakt može da se razblaži u nosaču u fiziološki prihvatljivom tečnom obliku kao što je voda, alkohol, hidroalkoholni ili glicerinski rastvor, ili da se pomeša sa drugim tečnostima pogodnim za lokalnu primenu.

[0077] Kao primer, kompozicije prema pronalasku u tečnom obliku mogu da se pripreme rastvaranjem biološki aktivnih komponenata ekstrakta u vodi i/ili alkoholu. Tečna kompozicija može da bude puferisana da bi se postigao pH opseg pogodno odabran između 5 i 7 tako da odgovara pH vrednosti kože glave, a zatim filtrirana i pakovana u pogodne kontejnere kao što su bočice ili ampule.

[0078] U nekim primerima izvođenja, kompozicije prema pronalasku mogu da sadrže ekscipijense koji se uobičajeno koriste u formulaciji kozmetičkih ili farmaceutskih preparata, za lokalnu upotrebu, kao što su konzervansi, baktericidna sredstva, stabilizatori, emulgatori, puferi, sredstva za kvašenje, sredstva za bojenje i drugi ekscipijensi koji se uobičajeno koriste u kozmetičkim/farmaceutskim preparativnim tehnikama.

[0079] U jednom primeru izvođenja, formulacija za lokalnu primenu je u obliku emulzije koja sadrži ekstrakt sa pogodnim ekscipijensom kao nosačem.

[0080] U smislu primera, pogodni ekscipijensi su derivati celuloze kao hidroksimetil celuloza, hidroksipropil metilceluloza, metilceluloza, hidroksipropil celuloza, hidroksietil celuloza, karboksietil celuloza, etilhidroksietil celuloza, celuloza-acetat butirat, celuloza-acetat ftalat, i njihove smeše.

[0081] Sledeći primeri pogodnih ekscipijenasa obuhvataju polimere koji pripadaju familiji laktama, kao pirolidon i njegovi derivati, na primer polivinilpirolidon, polivinilpolipirolidon i njihove smeše, neorganske soli kao kalcijum ili dikalcijum fosfat, sredstva za podmazivanje kao na primer magnezijum stearat, triacilgliceroli i njihove smeše.

[0082] U nekim primerima izvođenja, kompozicija za topikalnu primenu sadrži ekscipijens tipa hidroksimetil celuloze i/ili gelirajuća sredstva sa HLB, pogodna za formulaciju i supstance.

[0083] Prema drugim primerima izvođenja, primena kompozicije prema pronalasku obavlja se oralnim putem.

[0084] Kompozicije za oralnu primenu mogu da budu u čvrstom ili tečnom obliku. Tipične kompozicije u čvrstom obliku obuhvataju tablete, kapsule, prahove, granule, pilule. Tipične kompozicije u tečnom obliku obuhvataju rastvore, emulzije, suspenzije, sirupe. Sve kompozicije takođe obuhvataju oblike sa kontrolisanim oslobađanjem istih.

[0085] Tablete uopšteno sadrže pogodan nosač ili ekscipijens u kome je biljni ekstrakt dispergovan, tipično u suvom obliku.

[0086] Biološki aktivne komponente kompozicije prema pronalasku mogu da budu prisutne u različitim količinama, na primer sadržanim između 0.0001% po težini i 10% po težini, tipično između 00.1 i 5% po težini.

[0087] U skladu sa određenim primerima izvođenja, kompozicija prema pronalasku dalje sadrži jednu ili više aktivnih supstanci, kao što su vitamini, minerali, mikronutrijenti i druge supstance aktivne u stimulaciji aktivnosti folikula dlake.

[0088] Prema nekim primerima izvođenja, kompozicija za oralnu primenu je funkcionalna hrana, nutraceutska kompozicija, dijetetski proizvod, dodatak ishrani ili nutritivni proizvod ili medicinsko sredstvo.

[0089] Funkcionalna hrana označava bilo koju modifikovanu hranu ili sastojak hrane koji može da pruži korist ili zaštitu od nedostatka ili fiziološkog stanja, pored tradicionalnih nutrijenata koje sadrži.

[0090] Nutraceutski proizvod označava proizvod izdvojen ili prečišćen iz jestivih supstanci. Nutraceutski proizvod je takav, kada pokazuje da ima fiziološku prednost ili pruža zaštitu od nedostatka ili fiziološkog poremećaja.

[0091] Dijetetski dodatak ili dodatak ishrani označava proizvod koji sadrži vitamin, mineral, biljni ekstrakt, aminokiselinu, metabolit, ekstrakt, koncentrat ili smeše ovih sastojaka.

[0092] Primenjena količina i učestalost primene kompozicije zavisiće od tipa i ozbiljnosti trihološkog stanja koje treba da se leči. Kompozicija prema pronalasku je efikasna u prevenciji i/ili lečenju oblika ćelavosti ili proređivanja kose, kao što su opadanje kose i androgena alopecija.

[0093] Predmetni pronalazak će u nastavku biti opisan uz pozivanje na sledeće primere koji su dati u svrhu ilustracije i nisu namenjeni ograničavanju obima ovog pronalaska.

PRIMER 1

[0094] Tableta za oralnu upotrebu

Galeopsis segetum suvi ekstrakt 100 -300 mg Mikrokristalna celuloza 80 -340 mg

Kalcijum fosfat dibazni dihidrat 50 -100 mg

Koloidni silicijum dioksid 2.5 -10 mg

Magnezijum stearat 2.5 -10 mg

PEG-4000 0.5 -2.5 mg

Umrežena natrijum karboksimetil celuloza 0.25 -0.5 mg Natrijum alginat 0.25 -0.5 mg Hidroksi-propil-metilceluloza 0.25 -0.5 mg

PRIMER 2

[0095] Proizvod u granulama za oralnu upotrebu

Eritritol 20-40% tež./tež. Galeopsis segetum suvi ekstrakt 0.5-4% tež./tež. Manitol 10-30% tež./tež. Sredstvo za davanje arome 5-10% p/p Sukraloza 0.1-0.3% p/p Skrob do 100

PRIMER 3

[0096] Tableta za oralnu upotrebu

Rafinisana saharoza 50-90 mg Galeopsis segetum meki ekstrakt 50-100 mg Talk 10-20 mg Kukuruzni skrob 5-25 mg Šećer u prahu 5-15 mg 70% nekristalizirajući sorbitol 5-10 mg Magnezijum stearat 1-3 mg Guma arabika 2-3 mg Titanijum dioksid 1-2.5 mg Želatin 1-3 mg Kopolimer tipa A metakrilne kiseline 1-2.5 mg Laki magnezijum karbonat 0.5-1 mg Polietilen glikol 6000 0.1-0.3 mg Dibutil ftalat 0.1-0.25 mg Metil paraoksibenzoat 0.01-0.03 mg Mikrokristalna celuloza do 300 mg PRIMER 4

[0097] Losion za primenu na kosi i koži glave

Denaturisani etil alkohol tip C 500-1500 mg Galeopsis segetum fluidni ekstrakt 50-300 mg Polioksietilenirano hidrogenizovano ricinusovo ulje 12.2-48.8 mg Sredstvo za davanje mirisa 3-12 mg Dinatrijum EDTA dihidrat 1.5-6 mg Voda do 5 ml

PRIMER 5

[0098] Tretmanski šampon

Zetesol MGS 30-50% tež./zapr. Protelan LS 9011 5-15% tež./zapr. Mirasheen CP 820/G 2-6% tež./zapr.

Rewoderm LI S 80 2-4% tež./zapr.

BC 2262 0.5-1.5% tež./zapr. Kokamid MIPA 0.5-1.5% tež./zapr. Protelan AG 11 0.5-1.5% tež./zapr. Limunska kiselina 0.5-1.5% tež./zapr. Sredstvo za davanje mirisa 0.5-1.5% tež./zapr. Natrijum hidroksimetilglicinat 0.5-1.5% tež./zapr. Betain 0.25-0.75% tež./zapr. Lauril metil glucet-10 hidroksipropil-dimonijum hlorid 0.25-0.75% tež./zapr. Polikvaternijum-10 0.2-0.6% tež./zapr. Tetranatrijum EDTA 0.1-0.3% tež./zapr. Pantenol 0.1-0.3% tež./zapr. Galeopsis segetum fluidni ekstrakt 0.05-1.0% tež./zapr. Butil hidroksianizol (BHA) 0.005-0.02% p/zapr. Voda do 100 ml

PRIMER 6

[0099] Emulzija za kožu

Propilen glikol 6-8 g

Gliceril stearat palmitat 3-5 g

Kokosovo ulje 2-4 g

Cetostearil alkohol (25) OE 1-3 g

Vosak za emulgovanje 1-3 g

Benzil alkohol 0.5-1.5 g

Galeopsis segetum meki ekstrakt 0.5-1.5 g

Cetil alkohol (6) OE 0.25-1.0 g

Voda do 100 g

PRIMER 7

[0100] Proliferativna dejstva ekstrakta Galeopsis segetum ispitivana su na ćelijama HFDPC-c (PromoCell®) održavanim u kulturi u prisustvu medijuma za rast dermalne papile folikula, i prema uputstvima proizvođača (PromoCell®).

[0101] Proliferativna aktivnost je procenjena pomoću testa MTT.

[0102] Test MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum) je kolorimetrijski test koji se koristi za in vitro procenu ćelijske proliferacije [Mosmann T, 1983], budući da omogućava merenje ćelijske proliferacije i vijabilnosti procenom aktivnosti mitohondrija. Ovaj postupak je veoma koristan za merenje ćelijskog rasta posle tretmana mitogenima, antigenim stimulansima, faktorima rasta i za ispitivanja citotoksičnosti.

[0103] Test predviđa upotrebu hromogenog oksidativnog sredstva, MTT, koje se sastoji od policikličnog sistema (C18H16BrN5S) sa tetrazolinskim prstenom koji može lako da se redukuje mitohondrijalnim dehidrogenazama ili drugim sistemima za transport elektrona, obrazujući, otvaranjem tetrazolinskog prstena, azotno hromogeno jedinjenje označeno kao formazan. Taj formazan obrazuje nerastvorljive kristale u intracelularnom okruženju, za koje su membrane suštinski nepropustljive: ulazak molekula u ćeliju je prema tome omogućen, ali izlazak proizvoda nije, ukoliko je bio pravilno metabolizovan, odnosno ako su lanci za transport elektrona i dalje metabolički aktivni.

[0104] Kristali formazana se zatim rastvaraju u dimetilsulfoksidu (DMSO), čime se boja rastvora menja iz žute u tamno plavo-ljubičastu.

[0105] Ćelije HFDPC-c su zasejane pri gustini od 5*10<4>ćelija/bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića. Posle 24 časa, kada je postignuta konfluentnost od oko 80%, ćelije su tretirane sa 6 rastućih koncentracija ekstrakta Galeopsis segetum N.: 0.01; 0.05; 0.1; 0.5; 1 i 2 mg/mL u potpunom medijumu. Kontrolne ćelije, sa druge strane, održavane su u kulturi u potpunom medijumu.

[0106] Ploče su inkubirane na 37°C, sa 5% CO2tokom 24 časa, na kraju ovog perioda medijum za kulturu zamenjen je sa 100 µL rastvora MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) 0.5 mg/mL u potpunom medijumu za kulturu.

[0107] Posle 3 časa inkubacije na 37°C, medijum je sakupljen i kristali formazana su rastvoreni sa 100 µL po bunarčiću DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Ploča, obložena aluminijumskom folijom, smeštena je na mehaničku mešalicu (Arhos 160 - PBI International, Milan, Italija) na 120 rpm, 15 minuta na sobnoj temperaturi.

[0108] Apsorbanca obojenog rastvora izmerena je pomoću spektrofotometrijskog čitača mikroploča (BioTek Instruments Inc., Bad Frieddrichshall, Nemačka) na talasnoj dužini od 570 nm (referentna talasna dužina 630 nm).

[0109] Podaci su izraženi kao procenat ćelijske vijabilnosti u poređenju sa kontrolnim ćelijama (kont.), prema sledećoj formuli:

% ćelijske vijabilnosti / kont. = (Aps. uzorka / Aps. kont.)*100

[0110] Svi testovi su izvedeni u duplikatu.

[0111] Rezultati testa pokazuju dozno-zavisno povećanje ćelijske proliferacije ukazujući na stimulaciju ćelijskog rasta ćelija folikula.

[0112] Matične ćelije folikula dlake imaju važnu ulogu u ciklusu dlake, ali poznato je da sa starenjem dolazi do gubitka istih i sposobnosti da se obnovi regeneracija dlake. Iz matičnih ćelija obrazuju se ćelije matriksa, čiji rast i diferencijacija su pod uticajem supstanci koje proizvode ćelije dermalne papile. Sekretorna aktivnost dermalne papile je pod kontrolom supstanci koje proizvode ćelije spinoznog sloja spoljašnje ovojnice korena ili hormona. U stvari, ćelije spinoznog sloja proizvode peptide veće od 3000 Daltona sposobne da izazovu dvostruko do petostruko povećanje broja mitoza ćelija papile. Nedavno je nađeno da faktor rasta fibroblasta (bFGF) i faktor rasta poreklom iz trombocita (PDGF) pojačavaju rast ćelija dermalne papile. Naročito, ovi proteini povećavaju sintezu stromelizina (enzima metaloproteinaze) delujući na ćelije papile i ubrzavajući njihov rast. Ćelije dermalne papile proizvode brojne citokine koji deluju na proliferaciju ćelija matriksa kose. Prema tome, dejstvo, kao ono koje ispoljava ekstrakt biljke Galeopsis, stimulišući rast ovih ćelija, predstavlja prednost u podsticanju rasta kose.

PRIMER 8

CILJ EKSPERIMENTALNOG RADA

[0113] Eksperimentalni postupak prikazan u nastavku teksta ima za cilj ispitivanje in vitro aktivnosti različitih uzoraka Galeopsis segetum, podvrgnutih različitim postupcima za ekstrakciju, da bi se okarakterisala njihova antioksidativna aktivnost i aktivnost stimulacije rasta kose.

MATERIJALI

Ispitivani uzorci

[0115] Svi ekstrakti su razblaženi do 100 mg/ml u DMSO i filtrirani u sterilnim uslovima. Štok-rastvori su skladišteni na -20°C.

Korišćeni reagensi i oprema

[0116]

Biološki modeli korišćeni u testovima

Kulture mišjih embrionskih fibroblasta

[0117] Imortalizovana linija mišjih embrionskih fibroblasta BALB/c3T3, klon A31 (ATCC, Manassas, VA, SAD), dobijena je od Nacionalnog instituta za istraživanje kancera (Genova, Italija).

[0118] Ćelije su održavane u kulturi u sterilnim bocama od 25cm<3>i inkubirane na 37°C u vlažnoj atmosferi na 5% CO2. Kao medijum za kulturu korišćen je DMEM (Dulbekov modifikovani Iglov medijum, ATCC, Manassas, VA, SAD) uz dodatak 10% fetalnog telećeg seruma (FCS), 1% neesencijalnih aminokiselina (NEAA), 1% smeše penicilina i streptomicina (Pen-Strep Mix). Ovi drugi reagensi su svi nabavljeni od proizvođača Lonza, Inc. (Barcelona, Španija)

[0119] Tokom koraka kultivacije, razređivanje ćelija u odnosu 1:3 je izvođeno na svaka 2 dana, nakon dostizanja konfluentnosti od 80%, pranjem sa 1X PBS (Lonza, Barcelona, Španija) i odvajanjem ćelija od podloge pomoću rastvora tripsin-EDTA (Lonza, Barcelona, Španija) na 37°C tokom 2 minuta.

Ćelijske kulture humanih ćelija spoljašnje ovojnice korena folikula dlake

[0120] Humane ćelije spoljašnje ovojnice korena folikula dlake (HHFORSC) nabavljene kod Innoprot izolovane su od strane Scien Cell Research Labs iz spoljašnje ovojnice korena dlake. Ćelijska linija je kultivisana u medijumu za mezenhimske matične ćelije (MSCM): 500 ml osnovnog medijuma, 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), 1% dodatka za rast mezenhimskih matičnih ćelija (MSCGS), 1% rastvora penicilina/streptomicina (P/S rastvor) i održavane u bocama za kulturu od 25 cm2 na 37°C i pod 5% CO2. Pre zasejavanja ćelija, boca je morala da bude obložena poli-L-lizinom (2 µg/cm<2>).

[0121] Svaka dva dana konfluentne kulture su bile podeljene u odnosu 1:3-1:6, posle pranja sa DPBS (Dulbekov fosfatno puferisani fiziološki rastvor), upotrebom rastvora T/E (tripsin/EDTA rastvor) i TNS (rastvor za neutralizaciju tripsina) i zasejavane pri gustini od 2-5x104 ćelija/cm<2>, 37°C, 5% CO2.

Kontrole

TEST MTT (BALB3T3)

[0122] POZITIVNA KONTROLA: Netretirane ćelije u DMEM medijumu (Dulbekov modifikovani Iglov medijum, ATCC, Manassas, VA, SAD) dodatom u 10% fetalnog goveđeg seruma (FCS), 1% neesencijalnih aminokiselina (NEAA), 1% smeše penicilina i streptomicina (Pen-Strep Mix), i održavane u pločama za kulturu od 25 cm<2>(96 bunarčića) na 37°C i pod 5% CO2.

TEST DCFH-DA i TEST MTT-INDUKOVANI OKSIDATIVNI STRES (BALB3T3)

[0123] NEGATIVNA KONTROLA: Netretirane ćelije u DMEM medijumu (Dulbekov modifikovani Iglov medijum, ATCC, Manassas, VA, SAD) dodatom u 2.5% fetalnog goveđeg seruma (FCS), 1% neesencijalnih aminokiselina (NEAA), 1% smeše penicilina i streptomicina (Pen-Strep Mix), i održavane u pločama za kulturu od 25 cm<2>(96 bunarčića) na 37°C i pod 5% CO2.

[0124] POZITIVNA KONTROLA: Ćelije tretirane 2 časa sa 1mM vodonik peroksida u DMEM medijumu (Dulbekov modifikovani Iglov medijum, ATCC, Manassas, VA, SAD) dodatom u 2.5% fetalnog goveđeg seruma (FCS), 1% neesencijalnih aminokiselina (NEAA), 1% smeše penicilina i streptomicina (Pen-Strep Mix), i održavane u pločama za kulturu od 25 cm2 (96 bunarčića) na 37°C i pod 5% CO2(u mraku).

ISPITIVANJE AKTIVNOSTI INDUKCIJE 5-ALFA REDUKTAZE (BALB3T3)

[0125] NEGATIVNA KONTROLA: Netretirane ćelije u DMEM medijumu (Dulbekov modifikovani Iglov medijum, ATCC, Manassas, VA, SAD) dodatom u 10% fetalnog goveđeg seruma (FCS), 1% neesencijalnih aminokiselina (NEAA), 1% smeše penicilina i streptomicina (Pen-Strep Mix) i 10 ng/mL testosterona, i održavane u pločama za kulturu od 25 cm2 (12 bunarčića) na 37°C i pod 5% CO2.

[0126] POZITIVNA KONTROLA: Ćelije tretirane 24 časa sa finasteridom (0.05 mg/mL) u DMEM medijumu (Dulbekov modifikovani Iglov medijum, ATCC, Manassas, VA, SAD) dodatom u 10% fetalnog goveđeg seruma (FCS), 1% neesencijalnih aminokiselina (NEAA), 1% smeše penicilina i streptomicina (Pen-Strep Mix) i 10 ng/mL testosterona, i održavane u pločama za kulturu od 25 cm<2>(12 bunarčića) na 37°C i pod 5% CO2.

ISPITIVANJE EKSPRESIJE KERATINA 6A (ORS)

[0127] NEGATIVNA KONTROLA: Netretirane ćelije u MSCM, 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), 1% dodatka za rast mezenhimskih matičnih ćelija (MSCGS), 1% rastvora penicilin/streptomicin (P/S rastvor) i održavane u pločama za kulturu od 25 cm<2>(12 bunarčića) na 37°C i pod 5% CO2.

[0128] Pre zasejavanja ćelija, boca je morala da bude obložena poli-L-lizinom (2 µg/cm<2>).

METODE

- Preliminarni test citotoksičnosti (MTT test)-BALB3T3

Princip metode

[0129] Test MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum) je kolorimetrijski test koji se koristi za procenu in vitro ćelijske proliferacije, budući da omogućava merenje ćelijske proliferacije i vijabilnosti procenom aktivnosti mitohondrija. Ovaj postupak je veoma koristan za merenje ćelijskog rasta posle tretmana mitogenima, antigenim stimulansima, faktorima rasta i za ispitivanja citotoksičnosti.

[0130] Test obezbeđuje upotrebu hromogenog oksidativnog sredstva, MTT, koje se sastoji od policikličnog sistema (C18H16BrN5S) sa tetrazolinskim prstenom koji može lako da se redukuje mitohondrijalnim dehidrogenazama ili drugim sistemima za transport elektrona, obrazujući, otvaranjem tetrazolinskog prstena, azotno hromogeno jedinjenje označeno kao formazan. Formazan obrazuje nerastvorljive kristale u intracelularnom okruženju, za koje su membrane suštinski nepropustljive: ulazak molekula u ćeliju je prema tome omogućen, ali izlazak proizvoda nije, ukoliko je bio pravilno metabolizovan, odnosno ako su lanci za transport elektrona i dalje metabolički aktivni.

[0131] Kristali formazana se zatim rastvaraju u dimetilsulfoksidu (DMSO), čime se boja rastvora menja iz žute u tamno plavo-ljubičastu.

Eksperimentalni postupak

[0132] Test je izveden metodom koju je opisao Mosmann (1983), sa nekim malim modifikacijama. Ćelije BALB3T3 su zasejane pri gustini od 5*10<4>ćelija/bunarčiću u ploče sa 96 bunarčića. Posle 24 časa, kada je postignuta konfluentnost od oko 80%, ćelije su tretirane sa 6 različitih rastućih koncentracija ekstrakata Galeopsis segetum (biljna biomasa; suvi hidroalkoholni uzorak; uzorak u etil-acetatu; ekstrakt u CO2) 2-10-20-50-100-200 mg/mL u kompletnom medijumu. Kontrolne ćelije, sa druge strane, održavane su u kulturi u kompletnom medijumu.

[0133] Ploče su inkubirane na 37°C, pod 5% CO2tokom 24, 48 i 72 časa. Na kraju svih tretmana, medijum je sakupljen i zamenjen sa 100 µL rastvora 0.5 mg/mL MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) u kompletnom medijumu za kulturu.

[0134] Posle 3 časa inkubacije na 37°C, medijum je sakupljen i kristali formazana su rastvoreni sa 100 µL po bunarčiću DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Ploča, obložena aluminijumskom folijom, smeštena je na mehaničku mešalicu (Arhos 160 - PBI International, Milan, Italija) na 120 rpm, 15 minuta na sobnoj temperaturi.

[0135] Apsorbanca obojenog rastvora izmerena je pomoću spektrofotometrijskog čitača mikroploča (BioTek Instruments Inc., Bad Frieddrichshall, Nemačka) na talasnoj dužini od 570 nm (referentna talasna dužina 630 nm).

[0136] Podaci su izraženi kao procenat ćelijske vijabilnosti u poređenju sa kontrolnim ćelijama (kont.), prema sledećoj formuli:

% ćelijske vijabilnosti / kont. = (Aps. uzorka / Aps. kont.)*100

[0137] Svi testovi su izvedeni najmanje dva puta u duplikatu.

MTT sa indukovanim oksidativnim stresom-BALB3T3

Princip metode

[0138] Mišji fibroblasti BALB3T3 predstavljaju jedan od modela koji su validirani za ispitivanje oksidativnog stresa in vitro (Subiradeet al., 1995; Kutuk et al., 2004).

[0139] Ispitivanja koja su 2005. godine sproveli Rajapakse i kolege (2005) ukazala su na mogućnost primene široko korišćene i prilagodljive metode kao što je MTT test za in vitro ispitivanje antioksidativne aktivnosti aktivnih jedinjenja. Specifično, ovom metodom je moguće ispitivati zaštitna dejstva takvih jedinjenja na ćelije naknadno podvrgnute oksidativnom stresu. Indukcija oksidativnog stresa se sprovodi pomoću inkubacije sa vodonik peroksidom, indukcionim sredstvom koje proizvodi oksidativno oštećenje u ćelijama obrazovanjem ROS. Moguća zaštitna dejstva mogu da se odrede procenom ćelijske vijabilnosti posle oksidativnog stresa kod ćelija koje su prethodno tretirane/prethodno izložene aktivnim jedinjenjima koja se ispituju, u poređenju sa ćelijama izloženih istom oksidativnom stresu.

Veća vijabilnost ćelija će odgovarati zaštitnom dejstvu ispitivanih jedinjenja.

Eksperimentalni postupak

[0140] Test je izveden prema metodi koju su opisali Coda i kolege (Coda et al., 2012), sa nekim modifikacijama.

[0141] Mišji fibroblasti BALB3T3 su zasejani u ploču sa 96 bunarčića pri gustini od 5*10<4>ćelija/bunarčiću i inkubirani na 37°C, pod 5% CO2, do postizanja oko 80% konfluentnosti.

[0142] Zatim, ćelije su inkubirane 16 časova sa ekstraktima Galeopsis segetum (biljna biomasa; suvi hidroalkoholni uzorak; uzorak u etil-acetatu; ekstrakt u CO2) u sledećim koncentracijama: 20-50 i 100 µg/mL.

[0143] Razblaženja su pripremljena polazeći od 1000X štok-rastvora u DMSO, filtrirana u sterilnim uslovima i upotrebom DMEM medijuma dodatog u 2.5% fetalnog telećeg seruma (FCS), 1% neesencijalnih aminokiselina (NEAA), 1% smeše penicilina i streptomicina (Pen-Strep Mix).

[0144] Ćelije tretirane sa 1 mM H2O2korišćene su kao pozitivna kontrola; ćelije održavane samo u medijumu za kulturu (DMEM 2.5% FCS), sa druge strane, korišćene su kao negativna kontrola.

[0145] Na kraju predtretmana od 16 časova, ćelije su oprane sa 1X PBS i inkubirane 90 minuta sa 1 mM rastvorom H2O2(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) u medijumu bez seruma, u mraku, na 37°C i 5% CO2.

[0146] Kada je korak indukcije oksidativnog stresa završen, procena vijabilnosti ćelija izvedena je na različitim uzorcima, prema metodi opisanoj u odeljku 4.1.2 (MTT test).

[0147] Podaci su izraženi kao procenat ćelijske vijabilnosti u poređenju sa kontrolnim ćelijama (kont.) koje nisu izložene stresu, prema sledećoj formuli:

% ćelijske vijabilnosti / kont. = (Aps. uzorka / Aps. kont.)*100

[0148] Svi testovi su izvedeni najmanje dvaput u duplikatu.

Ispitivanje dejstava ekstrakata Galeopsis segetum na proizvodnju ROS pomoću testa DCFH-DA na BALB3T3

Princip metode

[0149] Proizvodnja ROS u ćelijskoj liniji mišjih fibroblasta BALB3T3 određena je spektrofluorimetrijom pomoću testa sa 2,7-dihlorofluorescin-diacetatom (DCFH-DA), kao što je opisano kod autora Tobi i kolege (Tobi et al., 2000). DCFH-DA je jedinjenje koje nije fluorescentno u svom lipofilnom obliku, sposobno da difunduje kroz ćelijsku membranu. Kada dospe u ćeliju, ono se deacetiluje intracelularnim esterazama u redukovani 2,7-dihlorofluorescin (DCFH), koji takođe nije fluorescentan. DCFH, koji ne može ponovo da prođe kroz ćelijsku membranu, zbog toga se nakuplja u ćelijama (Curtin et al., 2002). Reakcija sa intracelularnim ROS vodi oksidaciji DCFH u 2,7-dihorofluorescin (DCF), visoko fluorescentno jedinjenje. Intenzitet te fluorescencije može da se detektuje fluorimetrom, omogućavajući procenu količine ROS koja je proizvedena u ćelijama.

Eksperimentalni postupak

[0150] Protokol koji je korišćen u ovom eksperimentu predstavlja modifikovanu verziju one koja je opisana u radu autora Tobi i kolege (Tobi et al., 2000).

[0151] Mišji fibroblasti BALB3T3 su zasejani u ploče sa 96 bunarčića pri gustini od 5*10<4>ćelija/bunarčiću i inkubirani do dostizanja oko 80% konfluentnosti. Zatim, ćelije su inkubirane 16 časova sa ekstraktima Galeopsis segetum (biljna biomasa; suvi hidroalkoholni uzorak; uzorak u etil-acetatu; ekstrakt u CO2) u sledećim koncentracijama: 20-50 i 100 µg/mL.

[0152] Razblaženja su pripremljena polazeći od 1000X štok-rastvora u DMSO, filtrirana u sterilnim uslovima i upotrebom DMEM medijuma dodatog u 2.5% fetalnog telećeg seruma (FCS), 1% neesencijalnih aminokiselina (NEAA), 1% smeše penicilina i streptomicina (Pen-Strep Mix).

[0153] Ćelije tretirane sa 1 mM H2O2korišćene su kao pozitivna kontrola; ćelije održavane samo u medijumu za kulturu (DMEM 2.5% FCS), sa druge strane, korišćene su kao negativna kontrola.

[0154] α-Tokoferol, ispitivan u koncentraciji od 25-50-250-500 µM;

Na kraju inkubacije, izvedena je indukcija oksidativnog stresa tretmanom tokom 90 minuta sa 4 mM rastvorom H2O2, u mraku, na 37°C i 5% CO2. Kada je tretman završen, ćelije su oprane dvaput sa 1X PBS i lizirane pomoću pufera za liziranje CelLytic™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) prema protokolu snabdevača.

[0155] Nakon toga, lizati su preneti u crnu ploču sa 96 bunarčića i DCF fluorescencija je spektrofluorometrijski očitana upotrebom fluorescentnog čitača mikroploča FluoroskanAscent FL (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD), sa talasnim dužinama ekscitacije i emisije od 485 odnosno 538 nm. Vrednosti emisije (RFU) dobijene za svaki uzorak, povezane sa intracelularnom proizvodnjom ROS, upoređene su sa vrednošću emisije dobijenom za negativnu kontrolu (kont., ćelije tretirane sa 1 mM H2O2) i izražene kao procenat proizvedenih ROS prema sledećoj jednačini:

% proizvedenih ROS / kont. = (Aps538nm uzorka / Aps538nm kont.)*100

[0156] Svi testovi su izvedeni najmanje dvaput u duplikatu.

Ispitivanje dejstava ekstrakata Galeopsis segetum na aktivnost 5 alfa-reduktaze (izoforma 2)-BALB3T3

Eksperimentalni postupak

[0157] Ekspresija gena za izoformu 2 enzima 5 alfa-reduktaze (SRD5A2) u ćelijama BALB3T3 procenjena je kvantitativnom RT-PCR (kvantitativna lančana reakcija polimeraze sa reverznom transkripcijom - qRT-PCR).

[0158] Ova analiza je imala 3 uzastopna koraka:

• ekstrakcija ukupne RNK;

• reverzna transkripcija u cDNK;

qRT-PCR.

[0159] Mišji fibroblasti BALB3T3 su zasejani u ploče sa 12 bunarčića pri gustini od 0.5*10<6>ćelija/bunarčiću i inkubirani do postizanja oko 80% konfluentnosti. Zatim, ćelije su inkubirane 24 časa sa ekstraktima Galeopsis segetum (biljna biomasa; suvi hidroalkoholni uzorak; uzorak u etil-acetatu; ekstrakt u CO2) u sledećim koncentracijama: 20-50 i 100 µg/mL.

[0160] Razblaženja su pripremljena polazeći od 1000X štok-rastvora u DMSO, filtrirana u sterilnim uslovima i upotrebom DMEM medijuma dodatog u 10% fetalnog telećeg seruma (FCS), 1% neesencijalnih aminokiselina (NEAA), 1% smeše penicilina i streptomicina (Pen-Strep Mix).

[0161] Ćelije održavane samo u medijumu za kulturu (DMEM 2.5% FCS), sa druge strane, korišćene su kao negativna kontrola.

[0162] Finasterid, selektivni inhibitor izoforme 2 (SRD5A2) enzima 5 alfa-reduktaze, ispitivan je u koncentraciji od 0.05 mg/mL.

[0163] Na kraju inkubacije, izvedena je ekstrakcija RNK. Ukupna RNK je ekstrahovana iz ćelija BALB3T3 upotrebom komercijalnog kita RibospinTM (Gene All Biotechnology Co., LTD)

[0164] Na kraju inkubacije sa aktivnim jedinjenjima od interesa, ćelije su oprane sa PBS (1X) i najzad podvrgnute postupku za ekstrakciju RNK. Na kraju ekstrakcije, upotrebom spektrofotometra (Jenway UV/VIS MOD: 6715, BS-6715B0), koncentracije su izračunate u µg/mL ukupne ekstrahovane RNK, na talasnoj dužini od 260 nm.

[0165] Najzad, integritet RNK (2 µg/mL) procenjen je elektroforezom na 1% agaroznom gelu.

[0166] Ukupna RNK je pretvorena u cDNK (komplementarnu DNK), pomoću enzima sposobnog da sintetiše DNK molekul koristeći lanac RNK kao šablon; ovaj RNK-zavisni DNK polimerazni enzim naziva se reverzna transkriptaza.

[0167] On se vezuje za 3’ kraj pojedinačnog RNK lanca i pomoću nasumičnih prajmera i deoksinukleotid trifosfata (DNTP) sintetiše lanac cDNK.

[0168] U tom cilju, korišćen je kit "PrimeScript™ RT Reagent Kit (perfect Real Time)" (TakaraBiolnc., Japan) koji sadrži 5X PrimeScript pufer (za PCR u realnom vremenu); PrimeScript RT enzimsku mešavinu 1; OligodTPrimer; nasumične heksamere; dH2O bez RNaze.

[0169] RNK koja je ekstrahovana i kvantitativno određena, razblažena je do koncentracije od 2 µg/mL i reverzno transkribovana u cDNK. Pripremljeno je 10 µL reagensa Master Mix (koji sadrži 5X PrimeScript pufer (za PCR u realnom vremenu); PrimeScript RT enzimsku mešavinu 1; OligodTPrimer 50 µM; nasumične heksamere 100 µM) u koji je dodato 10 µL RNK (2 µg/mL).

[0170] Uzorci su stavljeni u uređaj za PCR (Stratagene Mx3000P Real Time PCR System, Agilent Technologies Italia S.p.A., Milan, Italija) i podvrgnuti reverznoj transkripciji pod sledećim uslovima:

37°C tokom 15 minuta;

85°C tokom 5 sekundi;

4°C zadržavanje.

[0171] Na kraju reverzne transkripcije uzorcima je dodato 30 µL DEPC vode da bi se dobila finalna koncentracija cDNK od 40 ng/µL.

[0172] qRT-PCR je metoda za amplifikaciju i kvantitativno određivanje u realnom vremenu proizvoda amplifikacije praćenjem fluorescencije koja se emituje tokom reakcije.

[0173] Za RT-PCR amplifikaciju korišćen je sistem TaqMan® proba (Applied Biosystems). Korišćene su sledeće TaqMan probe: Mm00446421ml (SDR5A2) i Mm00466519ml (βaktin). Kao kontrolni gen (konstitutivni) upotrebljen je β-aktin.

[0174] Taqman proba je tip probe koji omogućava razvoj fluorescencije sa napredovanjem amplifikacije. Na njenom 5’ kraju vezan je reporter (fluorofor FAM™), dok se na 3’ kraju nalazi kvenčer. Blizina reportera i kvenčera ne dozvoljava emisiju fluorescentnog signala. Pomoću 5’ egzonukleazne aktivnosti termički stabilne DNK polimeraze (Taq polimeraza) detektuje se fluorescencija, i nakupljanje proizvoda amplifikacije može da se proceni povećanjem fluorescencije reportera koja se povećava u svakom ciklusu.

[0175] Za qRT-PCR Master Mix je pripremljen kao što sledi:

• 10 µL "2X Premix Ex Taq" ;

• 1 µL "203 TaqMan Gene ExpressionAssays" (koji sadrži 2 prajmera i fluoroforom FAM™-obeleženu fluorescentnu probu);

• 0,4 µL pasivna referenca Rox II;

• 5 µL DEPC vode.

[0176] Master Mix je obogaćen sa 4 µL cDNK za ciljni gen i 1 µL cDNK za konstitutivni gen.

[0177] Amplifikacija je izvedena pod sledećim uslovima za 40 ciklusa:

• 95°C, 30 sek. (Amplitaq aktivacija);

• 95°C, 5 sek. (Denaturacija);

• 60°C, 20 sek. (Hibridizacija - izduživanje);

[0178] Svaka analiza je izvedena u duplikatu.

[0179] Dobijeni podaci su analizirani metodom 2-ΔΔCt, i na tj način je bilo moguće izračunati vrednosti u vezi sa ekspresijom gena od interesa, normalizovane u odnosu na konstitutivni gen i kalibrisane na kontrolnom uzorku (netretirane ćelije):

ΔΔCt = ΔCtciljni-konstitutivni gen(kontrola) - ΔCtciljni-konstitutivni gen(tretirane ćelije)

[0180] Podrazumevajući efikasnost amplifikacije od 100%, izračunata je vrednost 2<-ΔΔCt>.

Ispitivanja dejstava ekstrakata Galeopsis segetum na ekspresiju citokeratina 6A-ORS

Eksperimentalni postupak

[0181] Za ispitivanje ekspresije citokeratina 6A u ORS ćelijama korišćen je komercijalni kit: Humani keratin, tip II citoskeletni 6A(KRT6A) ELISA kit 96T (CSB).

Dan 1:

Kada su ćelije (HHFORSC) dostigle oko 80% konfluentnosti, odvojene su od podloge smešom tripsin/EDTA i zasejane pri gustini od 1x10<6>ćelija/ml u ploče sa 12 bunarčića i zatim inkubirane na 37°C, 5% CO2(24 časa).

Dan 2:

Kada su ćelije dostigle oko 80% konfluentnosti, izložene su aktivnim jedinjenjima koja treba da se ispitaju: uzorku biljne biomase; suvom hidroalkoholnom uzorku; uzorku u etil-acetatu; ekstraktu u CO2, u sledećim koncentracijama: 20-50 i 100 µg/mL.

Razblaženja su pripremljena počevši od 1000X štok-rastvora u DMSO, filtrirana u sterilnim uslovima i upotrebom medijuma za mezenhimske matične ćelije.

Dan 3:

Na kraju inkubacije ćelije su lizirane upotrebom pufera za liziranje Cell Lytic™ obogaćenog do 1% sa koktelom inhibitora proteaze i lizati su upotrebljeni za ELISA test.

[0182] Kako bi se normalizovala ekspresija proteina prema ukupnom sadržaju proteina u uzorku, količina ukupnog proteina u svakom uzorku procenjena je testom prema Bradfordu (Bradford, 1976).

REZULTATI

[0183] Eksperimentalno dobijeni podaci su prikazani na priloženim slikama 1-5 koje pokazuju sledeće:

5.1 Preliminarni test citotoksičnosti (MTT test)-BALB3T3

[0184] Slika 1 prikazuje podatke dobijene testom MTT (srednja vrednost ±SD). U testu su ispitivani sledeći ekstrakti Galeopsis segetum: suvi ekstrakt (biljna biomasa), hidroalkoholni ekstrakt (suvi hidroalkoholni uzorak), ekstrakt u etil-acetatu (uzorak u etil-acetatu) i ekstrakt u CO2(ekstrakt u CO2) u doznom opsegu 2-200 µg/ml tokom 24, 48 i 72 časa. Rezultati pokazuju da nijedno od ispitivanih jedinjenja nije citotoksično.

5.2 MTT sa indukovanim oksidativnim stresom-BALB3T3

[0185] Slika 2 prikazuje rezultate MTT eksperimenata sa oksidativnim stresom indukovanim na uzorcima datim u tabeli 1 koja sledi.

[0186] Konkretno, slika 2 prikazuje antioksidativnu aktivnost biljne biomase, hidroalkoholnog ekstrakta, etil-acetatnog ekstrakta, ekstrakta u CO2, dok tabela 2 prikazuje podatke o aktivnosti hvatanja slobodnih radikala.

[0187] Rezultati pokazuju da ekstrakti ispoljavaju antioksidativnu aktivnost. Pokazano je da postupci za ekstrakciju određuju poboljšanje takve aktivnosti, posebno ekstrakcija u etilacetatu i CO2. Ako se razmatra aktivnost hvatanja radikala biljne biomase (22.14), ona je poboljšana posle hidroalkoholne ekstrakcije (37.64; 70%) i povećava se etil-acetatnom i CO2ekstrakcijom (50.13 odnosno 48.58; u proseku 123%).

5.3 Ispitivanja dejstava ekstrakata Galeopsis segetum na proizvodnju ROS pomoću testa DCFH-DA na BALB3T3

[0188] Podaci o zaštitnoj aktivnosti ćelije prema oksidativnom stresu indukovanom sa H2O2prikazani su na sl.3.

[0189] Indukovani oksidativni stres dovodi do patnje ćelija koja vodi značajnom gubitku u ćelijskoj populaciji. Tretman jedinjenjima (biljna biomasa, hidroalkoholni ekstrakt, etilacetatni ekstrakt, ekstrakt u CO2) pokazuje zaštitnu sposobnost u odnosu na apoptotski proces indukovan oksidativnim stresom. Takva aktivnost je u skladu sa onim što je zapaženo za antioksidativnu aktivnost i relevantna je za etil-acetatne i CO2ekstrakte.

5.4 Ispitivanja dejstava ekstrakata Galeopsis segetum na aktivnost 5 alfa-reduktaze (izoforma 2)-BALB3T3

[0190] Sl. 4 prikazuje podatke o ekspresiji gena za izoformu 2 enzima 5 alfa-reduktaze, ciljnog molekula za delovanje finasterida.

[0191] Galeopsis segetum (biljna biomasa) pokazuje inhibitornu aktivnost prema 5 alfareduktazi tipa 2. Takođe i hidroalkoholni i CO2ekstrakti (50 i 100 µg/ml) pokazuju takvu aktivnost, dok je ona manje očigledna kod etil-acetatne ekstrakcije.

5.5 Ispitivanja dejstava ekstrakata Galeopsis segetum na ekspresiju citokeratina 6A-ORS

[0192] Slika 5 pokazuje vrednosti koje se odnose na citokeratin 6A, dobro poznati marker matičnih ćelija folikula gde ima važnu ulogu u homeostazi i rastu kose.

[0193] Dobijeni podaci pokazuju da biljna biomasa nije sposobna da stimuliše taj keratin, dok uzorci koji su dobijeni hidroalkoholnom i etil-acetatnom ekstrakcijom (u obe ispitivane doze) i ekstrakcijom u CO2(samo veća doza) mogu da ga stimulišu.

[0194] Stepen stimulacije takvog keratina etil-acetatnim uzorkom je značajan.

Zaključak

[0195] Sprovedeni testovi su pokazali sledeće:

- odsustvo citotoksičnosti svih ispitivanih uzoraka u opsegu 2-200 mikrogr./ml do 72 časa tretmana ćelija (fibroblasti) (MTT test),

- dobra antioksidativna aktivnost svih jedinjenja, treba zapaziti da ekstrakcije poboljšavaju antioksidativnu aktivnost. U poređenju sa biljnom biomasom, hidroalkoholna ekstrakcija poboljšava takvu aktivnost za 70%, dok je etil-acetatna i CO2ekstrakcija povećavaju za 123% (diholorofluorescinski test),

- takva aktivnost se takođe odražava u zaštiti ćelija nakon indukovanog oksidativnog stresa (test na fibroblastima),

- test stimulacije sinteze citokeratina 6A u ORS (ćelije spoljašnje ovojnice korena folikula) pokazuje da biljna biomasa ne može da stimuliše njegovu sintezu, dok hidroalkoholni, etilacetatni i CO2ekstrakti (u ovom slučaju samo u većoj ispitivanoj dozi) indukuju sintezu takvog keratina.

PRIMER 9

Uvod

[0196] Ovaj primer se odnosi na pripremu tri ekstrakta koji imaju različitu polarnost dobijena iz nadzemnih delova biljke Galeopsis segetum. Najpolarniji je pripremljen ekstrakcijom vodenim rastvorom etanola. Na početku je urađen skrining rastvarača, kako bi se identifikovao najpogodniju alkoholni sadržaj.

[0197] Upotrebom nadkritičnog CO2pripremljen je nepolarni ekstrakt.

[0198] Ekstrakt koji ima srednju polarnost pripremljen je ekstrakcijom manje polarnih komponenti hidroetanolskog ekstrakta etil acetatom.

[0199] Ovi ekstrakti upotrebljeni su za skrining aktivnosti.

1. Cilj testova

[0200] Priprema tri ekstrakta koji imaju različitu polarnost dobijena iz nadzemnih delova biljke Galeopsis segetum, i njihova karakterizacija.

[0201] Pripremljeni su sledeći ekstrakti:

� Suvi hidroalkoholni ekstrakt Galeopsis segetum - IDN6764

� Suvi ekstrakt sa etil acetatom Galeopsis segetum - IDN 6765

� Ekstrakt sa CO2Galeopsis segetum - IDN 6766

2. Eksperimentalni korak

2.1 Biomasa

[0202] Sav rad naveden u ovom dokumentu obavljen je na nadzemnim delovima Galeopsis segetum CoA 1054/9394.

2.2 Hidroalkoholni ekstrakt: Skrining sadržaja etanola

[0203] Da bi se pronašao najbolji rastvarač za ekstrakciju u smislu prinosa, svojstava i tipa sekundarnih metabolita primenom metode TLC, izveden je skrining sa različitim sadržajem etanola, naime 20%, 40% i 70%. Za svaki test, 20 g biomase medijuma je suspendovano u 400 ml rastvarača na 50°C, uz mešanje tokom 4 časa. Suspenzije su filtrirane i rastvori su koncentrovani do suva.

[0204] Svaki ekstrakt je ocenjen u odnosu na prinos ekstrakcije, svojstva i ispitivanje metodom TLC. Rezultati su prikazani u tabeli 1

Tabela 1

[0205] Prema TLC, najbolji rastvarač za ekstrakciju je 40% i 70% EtOH. Sa druge strane, ovaj drugi ekstrakt sadrži više hlorofila što dovodi do toga de je ekstrakt zelenkast i lepljiv. Iz ovog razloga, kao rastvarač za ekstrakciju u § odabran je 40% EtOH.

2.3 Priprema suvog hidroalkoholnog ekstrakta Galeopsis segetum - IDN6764 (ref. test 921/30/D)

a) 100 g usitnjenih nadzemnih delova Galeopsis segetum, CofA 1054/9394, sipano je u perkolator, pokriveno sa 0.54 l 40% etanola, zagrevano do 50°C i ostavljeno u statičnim uslovima 4 časa.

Nakon pražnjenja, urađene su još tri ekstrakcije (3 x 0.3 l), upotrebom iste temperature i istog kontaktnog vremena.

b) Perkolati su sakupljeni i koncentrovani pod vakuumom u cilju dobijanja suspenzije od oko 0.15 l i 10% suvog ostatka.

c) Suspenzija je centrifugirana da bi se izdvojio nerastvorljivi ostatak i bistri rastvor je koncentrovan pod vakuumom dok nije postao suv.

[0207] Ostatak je osušen na 50°C pod vakuumom tokom 24 časa.

Prinos: 14.79 g suvog hidroalkoholnog ekstrakta Galeopsis segetum - IDN6764, serija 921/30/D, CofA 14/0605/LRE

prinos tež./tež.: 14.79%

2.4 Priprema suvog ekstrakta sa etil acetatom Galeopsis segetum - IDN6765 (ref. test 921/30/G)

[0208]

a) 850 g usitnjenih nadzemnih delova Galeopsis segetum, CofA 1054/9394, sipano je u perkolator, pokriveno sa 4.6 l 40% etil alkohola, zagrevano do 50°C i ostavljeno u statičnim uslovima 4 časa.

Nakon pražnjenja, urađene su još tri ekstrakcije (4 x 2.5 l), uz održavanje iste temperature i istog kontaktnog vremena.

b) Perkolati su sakupljeni i koncentrovani pod vakuumom u cilju dobijanja suspenzije od oko 1.4 l i 10% suvog ostatka.

c) Suspenzija je centrifugirana da bi se izdvojio nerastvorljivi ostatak i bistri rastvor je podvrgnut ekstrakciji etil acetatom (3 x 0.35 l).

d) Organske faze su spojene i koncentrovane do dobijanja meke mase. Dodata je voda (10 ml) i suspenzija je ponovo koncentrovana do dobijanja meke mase. Ovaj tretman je ponovljen da bi se uklonio sav zaostali etil acetat.

[0209] Najzad, ostatak je osušen na 50°C pod vakuumom tokom 24 časa.

Prinos: 2.85 g suvog ekstrakta sa etil acetatom Galeopsis segetum - IDN6765, serija 921/30/G, CofA 14/0606/LRE

prinos tež./tež.: 0.34%

2.5 Priprema ekstrakta Galeopsis segetum sa CO2- IDN6766

[0210]

a) 5 kg usitnjenih nadzemnih delova Galeopsis segetum, CofA 1054/9394, sipano je u kontejner ekstraktora. Ekstrakcija je izvedena pod sledećim uslovima:

- Temperatura, 55°C

- Pritisak, 270 - 280 bar

- Protok CO2, 70 kg/h

- Vreme ekstrakcije, 4,5 časova

b) Ekstrakcijom je dobijena emulzija (94 g). Emulzija je osušena na 60°C pod vakuumom tokom 4 časa.

Prinos: 74 g ekstrakta Galeopsis segetum sa CO2- IDN6766, serija 522/14/23A, CofA 14/0604/LRE.

prinos tež./tež.: 1.48%

3. Rezultati

[0211] Ekstrakti su okarakterisani izvođenjem sledećih ispitivanja:

- Izgled

- Identifikacija pomoću TLC, kao što je prikazano na priloženim sl.7 i 8

- Identifikacija pomoću FT-IR, kao što je prikazano na priloženim sl. 9-11

[0212] Rezultati su prikazani u tabeli 2

Tabela 2

4. Zaključak

[0213] Iz nadzemnih delova Galeopsis segetum pripremljena su i okarakterisana tri ekstrakta koja imaju različitu polarnost.

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Neterapijska upotreba biljnog ekstrakta iz Galeopsis segetum Necker u lečenju ili prevenciji gubitka kose.

2. Upotreba prema patentnom zahtevu 1, gde je navedeni biljni ekstrakt dobijen ekstrakcijom dela ili tkiva biljke Galeopsis segetum Necker sa fiziološki prihvatljivim rastvaračem poželjno odabranim od vode, etil alkohola i njihovih smeša ili ugljen dioksida u nadkritičnoj fazi.

3. Neterapijska upotreba prema patentnom zahtevu 1 gde je biljni ekstrakt iz Galeopsis segetum Necker uključen u kompoziciju koja sadrži fiziološki prihvatljiv nosač.

4. Upotreba prema patentnom zahtevu 3, naznačena time što biljni ekstrakt sadrži flavonoid odabran iz grupe koja sadrži monoacetilovani hipolaetin 4’-metil etar 7-(2"-alozil) glukozid, diacetilovani hipolaetin 4’-metil etar 7-(2"-alozil) glukozid, monoacetilovani izoskutelarein 7-(2"-alozil) glukozid, hipolaetin 4’-metil etar 7-(2"- alozil) glukozid, monoacetilovani hipolaetin 7-(2"- alozil) glukozid, izoskutelarein 7-(2"- alozil) glukozid i diacetilovani hipolaetin 7-(2"- alozil) glukozid, ili njihove smeše.

5. Upotreba prema patentnom zahtevu 4, gde je navedeni flavonoid monoacetilovani hipolaetin 4’-metil etar 7-(2"-alozil) glukozid, diacetilovani hipolaetin 4’-metil etar 7-(2"-alozil) glukozid, ili njihove smeše.

6. Upotreba prema patentnom zahtevu 3, naznačena time što je kompozicija u obliku za oralnu primenu ili topikalnu primenu.

7. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 3-6, naznačena time što je kompozicija u obliku za topikalnu primenu odabranom od losiona, emulzije, šampona, kreme ili masti.

8. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 3-6, naznačena time što je kompozicija u obliku za oralnu primenu odabranom od tablete, pilule ili granulisanog praha.

9. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 3-6, gde kompozicija dodatno sadrži jedan ili više sastojaka odabranih od vitamina, minerala, mikronutrijenata i njihovih smeša.

10. Upotreba prema bilo kom od patentnih zahteva 3-9, naznačena time što je kompozicija nutraceutska kompozicija, funkcionalna hrana, dijetetski dodatak, dodatak ishrani, farmaceutski proizvod ili kozmetički proizvod.

11. Kompozicija koja sadrži biljni ekstrakt iz Galeopsis segetum Necker i fiziološki prihvatljiv nosač za upotrebu u lečenju ili prevenciji androgene alopecije ili opadanja kose.

12. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 za oralnu primenu ili topikalnu primenu.