RS57704B1 - Bispecifična anti-vegf/anti-ang-2 antitela i njihova primena u lečenju vaskularnih bolesti oka - Google Patents

Description

Opis

Predmetni pronalazak se odnosi na metodu za smanjenje viskoziteta antitela (uključujući bispecifično antitelo) potklase humanog IgG1 ili humanog IgG4, bispecifičnih antitela protiv humanog vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF/VEGF-A) i protiv humanog angiopoetina-2 (ANG-2), metode za njihovu proizvodnju, farmaceutske kompozicije koje sadrže pomenuta antitela, i njihovu primenu.

Osnove pronalaska

Angiogeneza je uključena u patogenezu raznovrsnih poremećaja koji uključuju solidne tumore, intraokularne neovaskularne sindrome, kao što su proliferativne retinopatije ili starosna degeneracija makule (AMD), reumatoidni artritis i psorijaza (Folkman, J., et al, J. Biol. Chem.

267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; i Garner, A., Vascular diseases (Vaskularne bolesti), u: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, (Patobiologija očne bolesti, dinamički pristup) Garner, A., i Klintworth, G. K. (izd.), 2. izdanje, Marcel Dekker, New York (1994), str.1625-1710).

Ranibizumab (trgovačko ime Lucentis®) je fragment monoklonskog antitela dobijen iz istog matičnog mišjeg antitela kao bevacizumab (Avastin). Međutim, on je afinitetno sazreo da se obezbedi jače vezivanje za VEGF-A (WO 98/45331). Poznato je da blokiranje VEGF-A može biti povezano sa nekim sistemskim toksičnostima, zato ranibizumab nema Fc deo da se smanji poluživot u serumu, a time i sistemska toksičnost. To je anti-angiogeni agens koji je odobren za lečenje "vlažnog" tipa starosne degeneracije makule (ARMD), uobičajenog oblika gubitka vida vezanog za starost.

Testovi angiogeneze rožnjače su pokazali da i ANG-1 i ANG-2 imaju slično dejstvo, delujući sinergijski sa VEGF u podsticanju rasta novih krvnih sudova. Asahara, T., et al., Circ. Res.83 (1998) 233-40. Mogućnost da postoji dozno-zavisni endotelni odgovor pojavila se kada je primećeno da u velikim koncentracijama in vitro, ANG-2 može biti i pro-angiogen (Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52). U velikim koncentracijama, ANG-2 deluje kao faktor za preživljavanje apoptoze za endotelne ćelije tokom apoptoze u osiromašenom serumu putem aktivacije Tie2 preko PI-3 kinaze i Akt puta (Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52).

WO 2010/040508 A9 i WO 2011/117329 se odnose na bispecifična anti-VEGF/anti-ANG-2 antitela. WO 2008/132568 se odnosi na fuzione proteine koji se vezuju za faktore rasta. WO 2009/136352 se odnosi na anti-angiogena jedinjenja. WO 2009/080253 i WO 2011/117330 se odnose na bispecifični dvovalentni format antitela. WO 2010/069532 se odnosi na Ang2 antitela.

Vaskularne bolesti oka, kao što je starosna degeneracija makule (ARMD) i dijabetička retinopatija (DR) posledica su nenormalne horoidne, odnosno retinalne neovaskularizacije. One su vodeći uzrok gubitka vida u industrijskim zemljama. Pošto se retina sastoji od dobro definisanih slojeva neuronskih, glijalnih i vaskularnih elemenata, relativno mali poremećaji, kao oni kod vaskularne proliferacije ili edema, mogu dovesti do značajnog gubitka funkcije vida. Nasledne degeneracije retine, kao što je Retinitis Pigmentosa (RP), takođe su povezane sa vaskularnim abnormalnostima, kao što je sužavanje arteriola i vaskularna atrofija. One pogađaju čak 1 od 3500 osoba, i karakterišu se progresivnim noćnim slepilom, gubitkom vidnog polja, atrofijom očnog živca, slabljenjem arteriola i centralnim gubitkom vida koji često napreduje do potpunog slepila.

Ishemijske retinopatije se odlikuju gubitkom ili disfunkcijomretinalne vaskulature, što dovodi do smanjenja protoka krvi i hipoksije. Retina odgovara na hipoksiju dajući signale za rast novih krvnih sudova, ali ti novi sudovi su obično krhki i neorganizovani. Taj rast nenormalnih novih krvnih sudova predstavlja najveću smetnju vidu, jer oni mogu da cure, krvare ili stvaraju ožiljke, što može dovesti do odvajanja retine. Sadašnje terapije za ishemijske retinopatije žele da zaustave rast patoloških krvnih sudova, ali se ne bave osnovnom ishemijom koja izaziva njihov rast. Nadalje, standardno lečenje za dijabetičku retinopatiju, ishemijsku retinopatiju koja pogađa milione ljudi, uključuju uništavanje dela retine laserom u pokušaju da se zaustavi rast novih krvnih sudova i očuva centralni vid. Primenjene su strategije za blokiranje funkcije vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF), koji je glavni promoter rasta krvnih sudova. Anti-VEGF terapija kratkoročno može da poboljša vid, ali se ne bavi osnovnom ishemijom, pa u stvari može da pogorša stanje, jer inhibira svaki rast krvnih sudova, uključujući i korisne sporedne krvne sudove. Takođe, postoji ozbiljna zabrinutost oko sistemskog izlaganja tim lekovima starijih pacijenata, odnosno dijabetičara, gde rast novih krvnih sudova može biti potreban u slučaju ishemije mozga, srca ili ekstremiteta.

Tipično za očne bolesti, putem intravitrealne primene se često koriste manji fragmenti antitela, kao što je Fab ili Fab(2), jer imaju mali poluživot u serumu, a rizik od sistemskih toksičnosti je niži. Međutim, manji fragmenti tipično imaju takođe manji intravitrealni poluživot (npr. usled brže difuzije u serum), i tipično moraju češće da se doziraju.

Kim et al, Molecular Vision, 15 (2009) 2803-2812 odnosi se na antitela kompletne dužine primenjena intravitrealno u oko, pri čemu je IgG sa vezivanjem FcRn eliminisan u krv miševa divljeg tipa, dok IgY bez vezivanja FcRn nije eliminisan u krvotok. Nadalje, IgG sa vezivanjem FcRn nije eliminisan u krvotok kod FcRn nokdaun miševa. Kim, J.-K.- et al., Eur. J. Immunol.

29 (1999) 2819-2825 odnosi se na mapiranje mesta na humanom IgG za vezivanje receptora FcRn vezanog za klasu I MHC. Publikacija Kuo, T. et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789 odnosi se na neonatalni Fc receptor FcRn, a Qiao, S.-W. et al., PNAS 105 (2008) 9337-9342 se odnosi na zavisnost antitelom posredovane prezentacije antigena na FcRn. U struci postoji potreba za boljim sredstvima za lečenje i prevenciju različitih vaskularnih bolesti oka, kao što su ishemijske retinopatije.

Sažetak pronalaska

Jedan aspekt pronalaska je metoda za smanjenje viskoziteta antitela, pri čemu antitelo sadrži konstantni region teškog lanca potklase humanog IgG1, pri čemu metoda obuhvata modifikaciju konstantnog regiona teškog lanca antitela potklase humanog IgG1 mutacijama I253A, H310A, i H435A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), pri čemu je antitelo bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, pri čemu,

i) pomenuto prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za VEGF sadrži u varijabilnom domenu teškog lanca CDR3H region SEQ ID NO.: 1, CDR2H region SEQ ID NO.: 2, i CDR1H region SEQ ID NO.: 3, i u varijabilnom domenu lakog lanca CDR3L region SEQ ID NO.: 4, CDR2L region SEQ ID NO.: 5, i CDR1L region SEQ ID NO.: 6, i

ii) pomenuto drugo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za ANG-2 sadrži u varijabilnom domenu teškog lanca CDR3H region SEQ ID NO.: 9, CDR2H region SEQ ID NO.: 10, i CDR1H region SEQ ID NO.: 11, i u varijabilnom domenu lakog lanca CDR3L region SEQ ID NO.: 12, CDR2L region SEQ ID NO.: 13, i CDR1L region SEQ ID NO.: 14.

U jednom otelotvorenju pronalaska, takva metoda je naznačena time što je pomenuto, gore opisano bispecifično antitelo dalje modifikovano mutacijama L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

Pronalazak je dalje usmeren na bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigenvezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, pri čemu,

i) pomenuto prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za VEGF sadrži u varijabilnom domenu teškog lanca CDR3H region SEQ ID NO.: 1, CDR2H region SEQ ID NO.: 2, i CDR1H region SEQ ID NO.: 3, i u varijabilnom domenu lakog lanca CDR3L region SEQ ID NO.: 4, CDR2L region SEQ ID NO.: 5, i CDR1L region SEQ ID NO.: 6, i

ii) pomenuto drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za ANG-2 sadrži u varijabilnom domenu teškog lanca CDR3H region SEQ ID NO.: 9, CDR2H region SEQ ID NO.: 10, i CDR1H region SEQ ID NO.: 11, i u varijabilnom domenu lakog lanca CDR3L region SEQ ID NO.: 12, CDR2L region SEQ ID NO.: 13, i CDR1L region SEQ ID NO.: 14,

i pri čemu,

iii) bispecifično antitelo sadrži konstantni region teškog lanca potklase humanog IgG1 koji sadrži mutacije I253A, H310A, i H435A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu)

U jednom otelotvorenju, pomenuto bispecifično antitelo je naznačeno time što

i) pomenuto prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za VEGF sadrži kao varijabilni domen teškog lanca VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 7, i kao varijabilni domen lakog lanca VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 8, i ii) pomenuto drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za ANG-2 sadrži kao varijabilni domen teškog lanca VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 15, i kao varijabilni domen lakog lanca VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 16.

U jednom otelotvorenju, pomenuto bispecifično antitelo potklase IgG1 je naznačeno time što konstantni region teškog lanca potklase IgG1 dalje sadrži mutacije L234A , L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu)

Nadalje, aspekti pronalaska su farmaceutske kompozicije koje sadrže pomenuto bispecifično antitelo, pri čemu su pomenute farmaceutske kompozicije za primenu u lečenju vaskularnih bolesti oka. U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži pomenuto bispecifično antitelo daje se intravitrealno.

Dalji aspekt pronalaska je molekul nukleinske kiseline koji kodira teški, odnosno laki lanac bispecifičnog antitela prema pronalasku.

Pronalazak dalje daje ekspresione vektore koji sadrže pomenutu nukleinsku kiselinu prema pronalasku, koji mogu da eksprimiraju pomenutu nukleinsku kiselinu u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu, i ćelije domaćine koje sadrže takve vektore za rekombinantnu proizvodnju bispecifičnog antitela prema pronalasku.

Pronalazak dalje obuhvata prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina koja sadrži vektor prema pronalasku.

Pronalazak dalje obuhvata metodu za proizvodnju bispecifičnog antitela prema pronalasku, naznačenog time što eksprimira nukleinsku kiselinu prema pronalasku u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu, i izolovanje pomenutog bispecifičnog antitela iz pomenute ćelije ili supernatanta ćelijske kulture. Jedno otelotvorenje je metoda za dobijanje bispecifičnog antitela prema pronalasku, koja sadrži sledeće korake

a) transformisanje ćelije domaćina vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju pomenuto antitelo;

b) uzgajanje ćelije domaćina pod uslovima koji omogućavaju sintezu pomenutog molekula antitela; i

c) izolovanje pomenutog molekula antitela iz pomenute kulture

U skladu sa tim, jedno otelotvorenje pronalaska je bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 21, SEQ ID NO.: 22, SEQ ID NO.: 23 i SEQ ID NO.: 24.

U skladu sa tim, jedno otelotvorenje pronalaska je bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 25, SEQ ID NO.: 26, SEQ ID NO.: 27 i SEQ ID NO.: 28.

Antitela prema pronalasku imaju veoma vredna svojstva usled specifičnih modifikacija u Fc delu/konstantnom regionu koja donose korist pacijentu koji pati od vaskularnih bolesti oka. Ona pokazuju veliku stabilnost u intravitrealnom okruženju, i sporu difuziju iz oka (u poređenju sa manjim fragmentima antitela bez konstantnog regiona teškog lanca), gde je konkretna bolest locirana i gde se leči (pa raspored lečenja može da se poboljša u poređenju sa antitelima koja ne liče na IgG, kao npr Fab i (Fab)2 fragmenti). Neočekivano, u poređenju sa neizmenjenim IgG antitelima, poluživot u oku nakon intravitrealne primene antitela sa mutacijama I253A, H310A, i H435A u konstantnom regionu (gde više nema vezivanja FcRn) bio je sličan (neznatno smanjen) (Tabele 17a i 18a, i Slike 7D i 7E), pri čemu je difuzija iz oka u krvni serum bila slična (Tabela 15 i Sl.7B). To je veoma vredno, jer je za lečenje vaskularnih bolesti oka vezanih za ANG2, odnosno VEGF poželjno eliminisati VEGF i Ang2 iz oka (npr. putem transporta u krvni serum kao kompleks anti-ANG2/ANG2 antitelo ili kompleks anti-VEGF/VEGF antitelo). Antitela prema pronalasku se, sa druge strane, veoma lako uklanjaju iz seruma u poređenju sa neizmenjenim IgG antitelima (što je veoma poželjno kako bi se smanjila moguća neželjena dejstva nastala od sistemskog izlaganja).

Neočekivano, ona su takođe imala manji viskozitet (v. Sliku 2) (u poređenju sa verzijama bez mutacija I253A, H310A, i H435A u konstantnom regionu) i stoga su posebno korisna za intravitrealnu primenu putem tankih igala tokom lečenja očnih bolesti (za tu primenu se koriste tipične tanke igle, pa veliki viskozitet otežava odgovarajuću primenu). Manji viskozitet takođe omogućava formulacije sa višim koncentracijama.

Takođe neočekivano, antitela prema pronalasku pokazuju manju težnju ka agregaciji (Sl. 4) tokom čuvanja (u poređenju sa verzijama bez mutacija I253A, H310A, i H435A u Fc delu), što je kritično za intravitrealnu primenu u oko (pošto agregacija u oku može dovesti do komplikacija tokom takvog lečenja). Bispecifična antitela prema pronalasku pokazuju dobru efikasnost u inhibiranju vaskularnih bolesti.

U nekim otelotvorenjima, bispecifična antitela prema pronalasku, zbog specifičnih modifikacija u konstantnom regionu (npr. P329G LALA) pokazuju vredna svojstva, kao to što ne vezuju Fcgama receptore, što smanjuje rizik od neželjenih dejstava kao što je tromboza, odnosno neželjena ćelijska smrt (npr. usled ADCC).

Opis slika

Slika 1 Šema koncepta i prednosti <VEGF-ANG-2> IgG1 ili IgG4 antitela sa AAA mutacijama (mutacije I253A, H310A, i H435A - numeracija prema Kabatovom EU indeksu)

Slika 2 Merenje viskoziteta u maloj zapremini, na bazi DLS Ekstrapolisani viskozitet na 150 mg/mL u 200 mM rastvoru arginin/sukcinat, pH 5,5 (poređenje <VEGF-ANG-2> antitela prema pronalasku VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijama) u poređenju sa VEGFang2-0015 (bez takvih AAA mutacija)

Slika 3 DLS agregacija u zavisnosti od temperature ( uključujući početnu temperaturu DLS agregacije) u 20 mM His, 140 mM NaCl, pH 6,0 5 (poređenje <VEGF-ANG-2> antitela prema pronalasku VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijama) u poređenju sa VEGFang2-0015 (bez takvih AAA mutacija)

Slika 4 Čuvanje 7 dana na 40°C na 100 mg/ml (smanjenje osnovne i velike molekulske mase /VMM) povećanje) (poređenje <VEGF-ANG-2> antitela prema pronalasku VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijama) koja su pokazala manju agregaciju u poređenju sa VEGFang2-0015 (bez takvih AAA mutacija)

Slika 5A Afinitet prema FcRn u stabilnom stanju za VEGFang2-0015 (bez AAA mutacija): preklapanje Biacore senzorgrama pri različitim koncentracijama pokazuje vezivanje zavisno od koncentracije VEGFang2-0015 (bez AAA mutacija) za FcRn

Slika 5B Afinitet prema FcRn u stabilnom stanju za A: VEGFang2-0015 (bez AAA mutacija): kriva odgovora koncentraciono zavisnog vezivanja VEGFang2-0015 (bez AAA mutacija) pokazuje vezivanje za FcRn

Slika 5C Afinitet prema FcRn u stabilnom stanju za VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijama): preklapanje Biacore senzorgrama pri različitim koncentracijama ne pokazuje vezivanje za FcRn ni kod jedne koncentracije

Slika 5D Afinitet prema FcRn u stabilnom stanju za VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijama): kriva odgovora koncentraciono zavisnog vezivanja VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijama) ne pokazuje vezivanje za FcRn

Slika 5E Afinitet prema FcRn u stabilnom stanju za VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijama): kriva odgovora koncentraciono zavisnog vezivanja VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijama) ne pokazuje vezivanje za FcRn (opseg odgovora od -0,6 do 0,2 RU/ koncentracione skale u opsegu od 0 do 0,35 M)

Slika 6 Merenje FcgamaRIIIa interakcije VEGFang2-0015 bez AAA mutacija i VEGFang2-0016 sa AAA mutacijama (oba su potklase IgG1 sa P329G LALA mutacijama; za kontrolu je korišćen Anti-Dig iz potklase IgG1 i antitelo na bazi IgG4)

Slika 7A Šematski prikaz principa Pk-ELISA testa za određivanje koncentracije <VEGF/Ang2> bispecifičnih antitela u serumu i lizatu celog oka

Slika 7B Koncentracije u serumu nakon intravenske primene: Poređenje jedinjenja -VEGFang2-0015 bez AAA mutacija i VEGFang2-0016 sa AAA mutacijama

Slika 7C Koncentracije u serumu nakon intravitrealne primene: Poređenje jedinjenja -VEGFang2-0015 bez AAA mutacija i VEGFang2-0016 sa AAA mutacijama

Slika 7D Koncenracije u lizatu oka VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijom) u desnom i levom oku (nakon intravitrealne primene samo u desno oko u poređenju sa intravenskom primenom): Nakon intravitrealne primene, značajne koncentracije mogu se detektovati samo u desnom oku. Nakon intravenske primene, ne mogu se detektovati koncentracije u lizatima oka zbog malog poluživota VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijom) u serumu

Slika 7E Koncentracije u lizatima oka VEGFang2-0015 (bez AAA mutacije) u desnom i levom oku (nakon intravitrealne primene samo u desno oko u poređenju sa intravenskom primenom): U desnom oku (i u izvesnoj meri u levom oku) mogle su se detektovati koncentracije VEGFang2-0015 nakon intravitrealne primene. To ukazuje na difuziju iz desnog oka u serum, a odatle u levo oko, što se može objasniti dugim poluživotom VEGFang2-0015 (bez AAA mutacije). Nakon intravenske primene, takođe su detektovane značajne koncentracije u lizatima oba oka usled difuzije u oči VEGFang2-0015 (bez AAA mutacije), stabilnog u serumu.

Detaljan opis pronalaska

U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo prema pronalasku je dvovalentno.

U jednom aspektu pronalaska, takvo bispecifično, dvovalentno antitelo prema pronalasku je naznačeno time što sadrži

a) teški lanac i laki lanac prvog antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za VEGF;

b) modifikovani teški lanac i modifikovani laki lanac drugog antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za ANG-2, pri čemu su konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim.

Format bispecifičnog, dvovalentnog antitela za bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za humani vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) i humani angiopoetin-2 (ANG-2) opisan je u WO 2009/080253 (uključujući modifikovane CH3 domene "dugme u rupici"). Antitela na osnovu ovog formata bispecifičnog, dvovalentnog antitela nazivaju se CrossMab.

U jednom otelotvorenju, takvo bispecifično, dvovalentno antitelo je naznačeno time što sadrži

1

a) kao teški lanac prvog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 25, i kao laki lanac prvog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 27, i

b) kao modifikovani teški lanac drugog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 26, i kao modifikovani laki lanac drugog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 28.

U jednom otelotvorenju, takvo bispecifično, dvovalentno antitelo je naznačeno time što sadrži

a) kao teški lanac prvog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 21, i kao laki lanac prvog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 23, i

b) kao modifikovani teški lanac drugog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 22, i kao modifikovani laki lanac drugog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 24.

U jednom otkriću, takvo bispecifično, dvovalentno antitelo je naznačeno time što sadrži

a) kao teški lanac prvog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 29, i kao laki lanac prvog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 31, i

b) kao modifikovani teški lanac drugog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 30, i kao modifikovani laki lanac drugog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 32.

U skladu sa tim, jedno otelotvorenje pronalaska je bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 25, SEQ ID NO.: 26, SEQ ID NO.: 27 i SEQ ID NO.: 28.

U skladu sa tim, jedno otelotvorenje pronalaska je bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 21, SEQ ID NO.: 22, SEQ ID NO.: 23 i SEQ ID NO.: 24.

Jedno otkriće je bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 29, SEQ ID NO.: 30, SEQ ID NO.: 31 i SEQ ID NO.: 32.

U drugom aspektu pronalaska, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time što sadrži

a) teški lanac i laki lanac prvog antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za VEGF;

b) teški lanac i laki lanac drugog antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za ANG-2, pri čemu je N-terminus teškog lanca povezan sa C-terminusom lakog lanca preko peptidnog linkera.

Ovaj format bispecifičnog, dvovalentnog antitela za bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za humani vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) i humani angiopoetin-2 (ANG-2) opisan je u WO 2011/117330, uključujući modifikovane CH3 domene "dugme u rupici". Antitela na osnovu formata bispecifičnog, dvovalentnog antitela se nazivaju OAscFab.

U jednom otelotvorenju, takvo bispecifično, dvovalentno antitelo je naznačeno time što sadrži

a) kao teški lanac prvog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 33, i kao laki lanac prvog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 35, i

b) kao teški lanac drugog antitela kompletne dužine povezan sa lakim lancem drugog antitela kompletne dužine preko peptidnog linkera, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 34.

U jednom otkriću, takvo bispecifično, dvovalentno antitelo je naznačeno time što sadrži

a) kao teški lanac prvog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 36, i kao laki lanac prvog antitela kompletne dužine, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 38, i

b) kao teški lanac drugog antitela kompletne dužine povezan sa lakim lancem drugog antitela kompletne dužine preko peptidnog linkera, aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 37.

U jednom otelotvorenju, varijabilni domen teškog lanca antitela (VH) i varijabilni domen lakog lanca antitela (VL) teškog i lakog lanca drugog antitela kompletne dužine su stabilizovani disulfidom putem uvođenja disulfidne veze između sledećih položaja: varijabilni domen teškog lanca položaj 44 i varijabilni domen lakog lanca položaj 100 (numeracija je uvek prema Kabatovom EU indeksu (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Takva dalja stabilizacija disulfidom je postignuta uvođenjem disulfidne veze između varijabilnih domena teškog i lakog lanca VH i VL drugog antitela kompletne dužine. Tehnike za uvođenje neprirodnih disulfidnih mostova radi stabilizacije opisane su npr. u WO 94/029350, Rajagopal, V., et al, Prot. Engin. 10 (1997) 1453-59; Kobayashi et al., Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393; ili Schmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721.

U skladu sa tim, jedno otelotvorenje pronalaska je bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 33, SEQ ID NO.: 34, SEQ ID NO.: 35.

Jedno otkriće je bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 36, SEQ ID NO.: 37, SEQ ID NO.: 38.

U jednom otelotvorenju, CH3 domeni bispecifičnog, dvovalentnog antitela prema pronalasku su izmenjeni tehnologijom "dugme u rupici", koja je detaljno opisana sa nekoliko primera npr. u WO 96/027011, Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; i Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681. U ovoj metodi, površine interakcije dva CH3 domena su izmenjene da se poveća heterodimerizacija oba teška lanca koji sadrže ta dva CH3 domena. Svaki od ova dva CH3 domena (dva teška lanca) može biti "dugme", dok je drugi "rupica". Uvođenjem disulfidnog mosta se stabilizuju heterodimeri (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol.270 (1997) 26-35) i povećava prinos.

U poželjnom aspektu pronalaska, sva bispecifična antitela prema pronalasku su naznačena time što

CH3 domen jednog teškog lanca i CH3 domen drugog teškog lanca se sreću na međupovršini koja sadrži originalnu međupovršinu između CH3 domena antitela;

1

pri čemu je pomenuta međupovršina izmenjena da podstakne formiranje bispecifičnog antitela, pri čemu je izmena naznačena time što:

a) CH3 domen jednog teškog lanca je izmenjen,

tako da u okviru originalne međupovršine, CH3 domen jednog teškog lanca koji se sreće sa originalnom međupovršinom CH3 domena drugog teškog lanca unutar bispecifičnog antitela,

aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima voluminozniji bočni niz, i pri tome stvara ispupčenje na međupovršini CH3 domena jednog teškog lanca koje može da se postavi u šupljinu na međupovršini CH3 domena drugog teškog lanca

i

b) CH3 domen drugog teškog lanca je izmenjen,

tako da, u originalnoj međupovršini drugog CH3 domena, koja se sreće sa originalnom međupovršinom CH3 domena unutar bispecifičnog antitela,

aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manje voluminozan bočni niz, i pri tome stvara šupljinu na međupovršini drugog CH3 domena drugog teškog lanca, gde može da se postavi ispupčenje na međupovršini prvog CH3 domena.

Tako, antitelo prema pronalasku je poželjno naznačeno time što

CH3 domen teškog lanca antitela kompletne dužine a) i CH3 domen teškog lanca antitela kompletne dužine b) se sreću na međupovršini koja sadrži izmenu originalne međupovršine između CH3 domena antitela;

pri čemu, i) u CH3 domenu jednog teškog lanca

aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima voluminozniji bočni niz, i pri tome stvara ispupčenje na međupovršini CH3 domena jednog teškog lanca koje može da se postavi u šupljinu na međupovršini CH3 domena drugog teškog lanca

i pri čemu,

ii) u CH3 domenu drugog teškog lanca

aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manje voluminozan bočni niz, i pri tome stvara šupljinu na međupovršini drugog CH3 domena drugog teškog lanca, gde može da se postavi ispupčenje na međupovršini prvog CH3 domena.

Poželjno, pomenuti aminokiselinski ostatak sa voluminoznijim bočnim nizom je izabran iz grupe koja se sastoji od arginina (R), fenilalanina (F), tirozina (Y), triptofana (W).

Poželjno, pomenuti aminokiselinski ostatak sa manje voluminoznim bočnim nizom je izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).

U jednom aspektu pronalaska, oba CH3 domena su dalje izmenjena uvođenjem cisteina (C) kao aminokiseline u odgovarajućem položaju svakog CH3 domena, tako da može da se formira disulfidni most između oba CH3 domena.

U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži T366W mutaciju u CH3 domenu "lanca sa dugmetom", i T366S, L368A, Y407V mutacije u CH3 domenu "lanca sa rupicom". Dodatni međulančani disulfidni most između CH3 domena takođe može da se koristi (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681), npr. uvođenjem Y349C mutacije u CH3 domen "lanca sa dugmetom", i E356C mutacije ili S354C mutacije u CH3 domen "lanca sa rupicom".

U drugom otelotvorenju, bispecifično antitelo prema pronalasku sadrži Y349C, T366W mutacije u jednom od dva CH3 domena, i E356C, T366S, L368A, Y407V mutacije u drugom od dva CH3 domena. U drugom poželjnom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži Y349C, T366W mutacije u jednom od dva CH3 domena, i S354C, T366S, L368A, Y407V mutacije u drugom od dva CH3 domena (dodatna Y349C mutacija u jednom CH3 domenu, i dodatna E356C ili S354C mutacija u drugom CH3 domenu koje formiraju međulančani disulfidni most) (numeracija je uvek prema Kabatovom EU indeksu (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Takođe, alternativno ili dodatno se mogu koristiti druge tehnologije "dugme u rupici" koje opisuje EP 1870459 A1. Tako, drugi primer za bispecifično antitelo su R409D; K370E mutacije u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i D399K; E357K mutacije u CH3 domenu "lanca sa rupicom" (numeracija je uvek prema Kabatovom EU indeksu (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

1

U drugom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži T366W mutaciju u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i T366S, L368A, Y407V mutacije u CH3 domenu "lanca sa rupicom", i dodatno R409D; K370E mutacije u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i D399K; E357K mutacije u CH3 domenu "lanca sa rupicom".

U drugom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži Y349C, T366W mutacije u jednom od dva CH3 domena, i S354C, T366S, L368A, Y407V mutacije u drugom od dva CH3 domena, ili pomenuto trovalentno, bispecifično antitelo sadrži Y349C, T366W mutacije u jednom od dva CH3 domena, i S354C, T366S, L368A, Y407V mutacije u drugom od dva CH3 domena, i dodatno R409D; K370E mutacije u CH3 domenu "lanca sa dugmetom" i D399K; E357K mutacije u CH3 domenu "lanca sa rupicom".

U jednom otelotvorenju pronalaska, bispecifično antitelo prema pronalasku je naznačeno time što ima jedno ili više od sledećih svojstava (određenih u testovima kao što je opisano u Primeru 6

- pokazuje niže koncentracije u serumu u poređenju sa odgovarajućim bispecifičnim antitelom bez mutacija opisanih pod iii) (96 sati nakon intravitrealne primene kod miševa, koji su miševi sa nedostatkom FcRn, ali hemizigotni transgeni za humani FcRn);

- pokazuje slične (faktor 0,8 do 1,2) koncentracije u lizatima celog desnog oka u poređenju sa odgovarajućim bispecifičnim antitelom bez mutacija opisanih pod iii) (kod miševa, koji su miševi sa nedostatkom FcRn, ali hemizigotni transgeni za humani FcRn, 96 sati nakon intravitrealne primene u desno oko).

U jednom otelotvorenju, bispecifično, dvovalentno antitelo je naznačeno time što sadrži

prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigenvezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što

i) pomenuto prvo antigen-vezujuće mesto sadrži kao varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO.: 7, a kao varijabilni domen lakog lanca (VL) SEQ ID NO.: 8, i

ii) pomenuto drugo antigen-vezujuće mesto sadrži kao varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO.: 15, a kao varijabilni domen lakog lanca (VL) SEQ ID NO.: 16, i

1

iii) bispecifično antitelo sadrži konstantni region teškog lanca IgG1 (humanog porekla) koji sadrži mutacije I253A, H310A, i H435A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu)

i koji ima jedno ili više od sledećih svojstava (određenih u testovima kao što je opisano u Primeru 6

- pokazuje niže koncentracije u serumu u poređenju sa odgovarajućim bispecifičnim antitelom bez mutacija opisanih pod iii) (96 sati nakon intravitrealne primene kod miševa, koji su miševi sa nedostatkom FcRn, ali hemizigotni transgeni za humani FcRn);

- pokazuje slične (faktor 0,8 do 1,2) koncentracije u lizatima celog desnog oka u poređenju sa odgovarajućim bispecifičnim antitelom bez mutacija opisanih pod iii) (kod miševa, koji su miševi sa nedostatkom FcRn, ali hemizigotni transgeni za humani FcRn, 96 sati nakon intravitrealne primene u desno oko).

U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo je naznačeno time što sadrži

prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigenvezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što

i) pomenuto prvo antigen-vezujuće mesto sadrži kao varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO.: 7 sa supstitucijom 1, 2 ili 3 aminokiselinska ostatka, a kao varijabilni domen lakog lanca (VL) SEQ ID NO.: 8 sa supstitucijom 1, 2 ili 3 aminokiselinska ostatka, i

ii) pomenuto drugo antigen-vezujuće mesto sadrži kao varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO.: 15 sa supstitucijom 1, 2 ili 3 aminokiselinska ostatka, a kao varijabilni domen lakog lanca (VL) SEQ ID NO.: sa supstitucijom 1, 2 ili 3 aminokiselinska ostatka, i

iii) bispecifično antitelo sadrži konstantni region teškog lanca IgG1 (humanog porekla) koji sadrži mutacije I253A, H310A, i H435A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu)

i koji ima jedno ili više od sledećih svojstava (određenih u testovima kao što je opisano u Primeru 6

1

- pokazuje niže koncentracije u serumu u poređenju sa odgovarajućim bispecifičnim antitelom bez mutacija opisanih pod iii) (96 sati nakon intravitrealne primene kod miševa, koji su miševi sa nedostatkom FcRn, ali hemizigotni transgeni za humani FcRn);

- pokazuje slične (faktor 0,8 do 1,2) koncentracije u lizatima celog desnog oka u poređenju sa odgovarajućim bispecifičnim antitelom bez mutacija opisanih pod iii) (kod miševa, koji su miševi sa nedostatkom FcRn, ali hemizigotni transgeni za humani FcRn, 96 sati nakon intravitrealne primene u desno oko).

Kao što se ovde koristi, "antitelo" se odnosi na vezujući protein koji sadrži antigen-vezujuća mesta. Kao što se ovde koriste, termini "vezujuća mesta" ili "antigen-vezujuća mesta" označavaju region(e) molekula antitela za koje se ligand zapravo vezuje. Termin "antigenvezujuće mesto" obuhvata varijabilne domene teškog lanca antitela (VH) i varijabilne domene lakog lanca antitela (VL) (par VH/VL).

Specifičnost antitela se odnosi na selektivno prepoznavanje antitela za konkretni epitop antigena. Na primer, prirodna antitela su monospecifična.

"Bispecifična antitela" prema pronalasku su antitela koja imaju dve različite antigen-vezujuće specifičnosti. Antitela iz predmetnog pronalaska su specifična za dva različita antigena VEGF kao prvi antigen, i ANG-2 kao drugi antigen.

Termin "monospecifično" antitelo, kao što se ovde koristi, označava antitelo koje ima jedno ili više vezujućih mesta, od kojih se svako vezuje za isti epitop istog antigena.

Termin "valentni", kao što se koristi u tekućoj primeni, označava prisustvo naznačenog broja vezujućih mesta u molekulu antitela. Kao takvi, termini "dvovalentni", "četvorovalentni" i "šestovalentni" označavaju prisustvo dva vezujuća mesta, četiri vezujuća mesta, odnosno šest vezujućih mesta, u molekulu antitela. Bispecifična antitela prema pronalasku su poželjno "dvovalentna".

Termin "VEGF", kao što se ovde koristi, odnosi se na humani vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF/VEGF-A), humani vaskularni endotelni faktor ćelijskog rasta sa 165 aminokiselina (aminokiseline 27-191 sekvence prekursora humanog VEGF165: SEQ ID NO.: 17, gde aminokiseline 1-26 predstavljaju signalni peptid), i povezani izooblici 121, 189 i 206 vaskularniog endotelnog faktora ćelijskog rasta, kao što je opisao Leung, D.W., et al., Science

1

246 (1989) 1306-9; Houck et al., Mol. Endocrin.5 (1991) 1806-1814; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12 i Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24; zajedno sa prirodnim alelnim i obrađenim oblicima tih faktora rasta. VEGF učestvuje u regulaciji normalne i abnormalne angiogeneze i neovaskularizacije vezane sa tumorima i intraokularnim poremećajima (Ferrara, N., et al., Endocr. Rev.18 (1997) 4-25; Berkman, R.A.,et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol.26 (1995) 86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res.53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer.73 (1996) 931-934; i Dvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF je homodimerni glikoprotein koji je izolovan iz nekoliko izvora, i uključuje nekoliko izooblika. VEGF pokazuje visoko specifičnu mitogenu aktivnost za endotelne ćelije.

Termin "ANG-2", kao što se ovde koristi,, odnosi se na humani angiopoetin-2 (ANG-2) (alternativna skraćenica ANGPT2 ili ANG2) (SEQ ID NO.: 18) koji su npr. opisali Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60 i Cheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91. Angiopoetini-1 (SEQ ID NO.: 19) i -2 su otkriveni kao ligandi za Tie, familiju tirozin kinaza koja je selektivno eksprimirana u vaskularnom endotelu (Yancopoulos, G.D., et al, Nature 407 (2000) 242-48). Sada postoje četiri definitivna člana familije angiopoetina. Angiopoetin-3 i -4 (Ang-3 i Ang-4) mogu predstavljati veoma razdvojene ekvivalente istog lokusa gena kod miša i čoveka (Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28). ANG-1 i ANG-2 su prvobitno identifikovani u eksperimentima sa uzgajanjem tkiva, kao agonist, odnosno antagonist (za ANG-1 vidite: Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; a za ANG-2: Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60). Svi poznati angiopoetini se vezuju primarno za Tie2 (SEQ ID NO.:20), a i Ang-1 i -2 se vezuju za Tie2 sa afinitetom od 3 nM (Kd) (Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60).

Antigen-vezujuća mesta bispecifičnog antitela prema pronalasku sadrže šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR) koji u različitom stepenu doprinose afinitetu vezujućeg mesta prema antigenu. Postoje tri CDR varijabilnog domena teškog lanca (CDRH1, CDRH2 i CDRH3) i tri CDR varijabilnog domena lakog lanca (CDRL1, CDRL2 i CDRL3). Obim CDR i regiona okvira (FR) određuje se poređenjem sa sakupljenom bazom podataka aminokiselinskih sekvenci u kojima su ovi regioni definisani prema varijabilnosti između sekvenci.

1

Antitela iz pronalaska obuhvataju konstantne regione imunoglobulina humanog porekla, jedne ili više klasa imunoglobulina, pri čemu takve klase imunoglobulina uključuju klase IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, a u klasi IgG i IgA, njihove potklase, naročito IgG1 i IgG4.

Termini "monoklonsko antitelo" ili "kompozicija monoklonskih antitela", kako su ovde korišćeni, odnose se na pripremu molekula antitela sa jedinstvenim aminokiselinskim sastavom.

Izraz "himerno antitelo" se odnosi na antitelo koje sadrži varijabilni region, tj., vezujući region, iz jednog izvora ili vrste, i najmanje deo konstantnog regiona poreklom iz različitog izvora ili vrste, koje je obično proizvedeno tehnikama rekombinantne DNK. Poželjna su himerna antitela koja sadrže mišji varijabilni region i humani konstantni region. Drugi poželjni oblici "himernih antitela" koji su obuhvaćeni ovim pronalaskom su oni u kojima je konstantni region modifikovan ili izmenjen u odnosu na originalno antitelo, da bi se generisala svojstva prema pronalasku, posebno u pogledu C1q vezivanja i/ili vezivanja Fc receptora (FcR). Takva "himerna" antitela se, takođe, označavaju kao "antitela sa promenjenom klasom". Himerna antitela su proizvod eksprimiranih imunoglobulinskih gena koji sadrže DNK segmente koji kodiraju imunoglobulinske varijabilne regione, i DNK segmente koji kodiraju imunoglobulinske konstantne regione. Postupci proizvodnje himernih antitela obuhvataju konvencionalne tehnike rekombinantne DNK i tehnike genske transfekcije, koje su dobro poznate u praksi. Vidi, npr., Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 i US 5,204,244.

Termin "humanizovano antitelo" se odnosi na antitela u kojima su okvir ili "regioni koji određuju komplementarnost" (CDR) modifikovani tako da sadrže CDR imunoglobulina različite specifičnosti u poređenju sa onim kod matičnog imunoglobulina. U poželjnom otelotvorenju, mišji CDR se kalemi u region okvira humanog antitela kako bi se proizvelo "humanizovano antitelo." Vidi npr. Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; i Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Naročito poželjni CDR odgovaraju onima koji predstavljaju sekvence koje prepoznaju antigene koji su gore navedeni za himerna antitela. Drugi oblici "humanizovanih antitela" obuhvaćeni ovim pronalaskom su oni u kojima je konstantni region dodatno modifikovan ili izmenjen od onog u originalnom antitelu da bi se generisala svojstva prema pronalasku, posebno u pogledu C1q vezivanja i/ili vezivanja Fc receptora (FcR).

2

Izraz "humano antitelo", kako je ovde korišćen, treba da obuhvati antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene od sekvenci imunoglobulina humanih germinativnih linija. Humana antitela su dobro poznata u struci (van Dijk M.A. i van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Humana antitela mogu, isto tako, da se proizvedu u transgenim životinjama (npr. miševima) koje mogu, po imunizaciji, da proizvode pun repertoar ili izbor humanih antitela u odsustvu endogene imunoglobulinske produkcije. Transfer niza gena imunoglobulina humane germinativne linije u takve mutantne miševe germinativne linije dovešće do proizvodnje humanih antitela nakon antigenskog izazova (vidi, npr., Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M., et al., Year Immunol.7 (1993) 33-40). Humana antitela se takođe mogu proizvoditi u bibliotekama displeja faga (Hoogenboom, H.R., i Winter, G., J. Mol. Biol.227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol.222 (1991) 581-597). Takođe, dostupne su i tehnike koje su dali A. Cole i saradnici, i P. Boerner i saradnici, za izradu humanih monoklonskih antitela Cole, A., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A.L., str. 77 (1985); i Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Kao što je već rečeno za himerna i humanizovana antitela prema pronalasku, termin "humano antitelo", kako je ovde korišćen, obuhvata takva antitela koja su modifikovana u konstantnom regionu da bi se stvorila svojstva prema pronalasku, posebno u pogledu C1q vezivanja i/ili FcR vezivanja, npr. "zamenom klasa" tj. promenom ili mutiranjem delova Fc (npr. od IgG1 do IgG4 i/ili IgG1/IgG4 mutacija.).

Termin "rekombinantno antitelo", koji se ovde koristi, utvrđen je kako bi obuhvatio sva humana antitela, koja se pripremaju, eksprimiraju, kreiraju ili izoluju na rekombinantne načine, kao što su antitela izolovana iz ćelije domaćina, kao što je NS0 ili CHO ćelija, ili iz životinje (npr. miš), koja je transgena za humane imunoglobulinske gene, ili antitela, koja se eksprimiraju korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora, transficiranog u ćeliju domaćina. Takva rekombinantna antitela imaju varijabilne i konstantne regione u preuređenom obliku. Rekombinantna antitela prema pronalasku bila su podvrgnuta in vivo somatskoj hipermutaciji. Prema tome, aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, budući da su dobijene iz VH i VL sekvenci humane germinativne linije i srodne su sa njima, ne mogu prirodno postojati in vivo u okviru repertoara humanih antitela germinativne linije.

"Varijabilni domen" (varijabilni domen lakog lanca (VL), varijabilni domen teškog lanca (VH)), kako je ovde korišćeno, označava svaki od parova lakog i teškog lanca koji su direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen. Domeni varijabilnih regiona humanih lakih i teških lanaca imaju istu opštu strukturu, a svaki domen sadrži četiri okvirna (FR) regiona, čije su sekvence u velikoj meri konzervirane, a povezane su pomoću tri "hipervarijabilna regiona" (ili regiona koji određuju komplementarnost, CDR). Regioni okvira poprimaju tzv. “"-βpresavijenu" konformaciju, a CDR-i mogu formirati petlje koje povezuju "β-presavijenu" strukturu. CDR-i u svakom lancu se održavaju u svojoj trodimenzionalnoj strukturi pomoću regiona okvira i formiraju, zajedno sa CDR-ima iz drugog lanca, antigen vezujuće mesto. Regioni CDR3 teškog i lakog lanca antitela igraju posebno značajnu ulogu u specifičnosti/afinitetu vezivanja antitela u skladu sa pronalaskom i, sledstveno tome, obezbeđuju dalji cilj pronalaska.

Termini "hipervarijabilni region" ili "antigen-vezujući deo antitela", kako se ovde koristi, odnose se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz "regiona koji određuju komplementarnost" ili "CDR-a". Regioni "okvira" ili "FR" regioni su oni regioni varijabilnog domena, koji se razlikuju od ostataka hipervarijabilnog regiona kako su ovde definisani. Prema tome, laki i teški lanci antitela od N- do C-kraja sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. CDR-i na svakom lancu su razdvojeni takvim okvirnim aminokiselinama. Posebno, CDR3 teškog lanca je region koji najviše doprinosi vezivanju antigena. CDR i FR regioni su određeni prema standardnoj definiciji u: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Kao što je ovde upotrebljen, termin "vezujući" ili "specifično vezujući" odnosi se na vezivanje antitela za epitop antigena (humani VEGF ili humani ANG-2) u in vitro testu, poželjno u testu plazmonske rezonance (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) sa prečišćenim antigenom divljeg tipa. Afinitet vezivanja je definisan preko termina ka (konstanta asocijacije antitela iz kompleksa antitelo/antigen), kD (konstanta disocijacije), i KD (kD/ka). U jednom otelotvorenju, vezivanje ili specifično vezivanje znači afinitet vezivanja (KD) od 10<-8>mol/l ili manje, u jednom otelotvorenju 10<-9>M do 10<-13>mol/l.

Izraz "epitop" obuhvata ma koju polipeptidnu determinantu koja može da se specifično veže za antitelo. U izvesnim otelotvorenjima, epitop determinanta obuhvata hemijski aktivne površinske grupacije molekula, kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil, i, u izvesnim otelotvorenjima, mogu imati specifične karakteristike trodimenzionalne strukture, i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop je region antigena preko kojeg se veže antitelo.

U nekim otelotvorenjima, kaže se da antitelo specifično vezuje antigen kada poželjno prepoznaje svoj ciljni antigen u kompleksnoj smeši proteina i/ili makromolekula.

Termin "antitelo kompletne dužine" označava antitelo koje se sastoji od dva "teška lanca antitela kompletne dužine" i dva "laka lanca antitela kompletne dužine". "Teški lanac antitela kompletne dužine" je polipeptid koji se sastoji, u smeru od N-kraja do C-kraja, od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena teškog lanca 1 antitela (CH1), regiona šarke antitela (HR), konstantnog domena teškog lanca 2 antitela (CH2), i konstantnog domena teškog lanca 3 antitela (CH3), skraćeno VH-CH1-HR-CH2-CH3; i opciono konstantnog domena teškog lanca 4 antitela (CH4), u slučaju antitela potklase IgE. Poželjno, "teški lanac antitela kompletne dužine" je polipeptid koji se sastoji, u smeru od N-kraja do C-kraja, od VH, CH1, HR, CH2 i CH3. "Laki lanac antitela kompletne dužine" je polipeptid koji se sastoji, u smeru od N-kraja do C-kraja, od varijabilnog domena lakog lanca antitela (VL), i konstantnog domena lakog lanca antitela (CL), skraćeno VL-CL. Konstantni domen lakog lanca antitela (CL) može biti κ (kapa) ili λ (lambda). Dva lanca antitela kompletne dužine su zajedno povezana preko među-polipeptidnih disulfidnih veza između CL domena i CH1 domena, i između regiona šarke teških lanaca antitela kompletne dužine. Primeri za tipična antitela kompletne dužine su prirodna antitela, kao IgG (npr. IgG1 i IgG2), IgM, IgA, IgD i IgE. Antitela kompletne dužine prema pronalasku mogu biti od jedne vrste npr. čoveka, ili mogu biti himerna ili humanizovana antitela. Antitela kompletne dužine prema pronalasku sadrže dva antigen-vezujuća mesta koja čini par VH i VL, i koja se specifično vezuju za isti antigen. C-kraj teškog ili lakog lanca pomenutog antitela kompletne dužine označava poslednju aminokiselinu na C-terminusu pomenutog teškog ili lakog lanca. N-kraj teškog ili lakog lanca pomenutog antitela kompletne dužine označava poslednju aminokiselinu na N-terminusu pomenutog teškog ili lakog lanca.

Termin "peptidni linker", kako se koristi u pronalasku, označava peptid sa aminokiselinskim sekvencama, koji je poželjno sintetičkog porekla. Ti peptidi prema pronalasku se koriste za povezivanje C-kraja lakog lanca za N-kraj teškog lanca drugog antitela kompletne dužine (koje se specifično vezuje za drugi antigen) preko peptidnog linkera. Peptidni linker u teškom ili

2

lakom lancu drugog antitela kompletne dužine je peptid sa aminokiselinskim sekvencama dužine najmanje 30 aminokiselina, poželjno dužine 32 do 50 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, linker je peptid sa aminokiselinskom sekvencom dužine 32 do 40 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, pomenuti linker je (GxS)n, gde je G = glicin, S = serin, (x = 3, n = 8, 9 ili 10, i m = 0, 1, 2 ili 3) ili (x = 4 i n = 6, 7 ili 8, i m = 0, 1, 2 ili 3), poželjno x = 4, n = 6 ili 7 i m= 0, 1, 2 ili 3, poželjnije x = 4, n = 7 i m = 2. U jednom otelotvorenju, pomenuti linker je (G4S)6G2.

Termin "konstantni region", kao što se koristi u tekućoj primeni, označava zbir domena antitela osim varijabilnog regiona. Konstantni region nije neposredno uključen u vezivanje antigena, ali pokazuje različite efektorske funkcije. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog regiona njihovih teških lanaca, antitela su podeljena na klase: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu biti dalje podeljene na potklase, kao što su IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni regioni teških lanaca koji odgovaraju različitim klasama antitela zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ. Konstantni regioni lakih lanaca koji se nalaze u svih pet klasa antitela nazivaju se κ (kapa) i λ (lambda).

Termini "konstantni region humanog porekla" ili "humani konstantni region", kao što se koristi u tekućoj primeni, označava konstantni region teškog lanca humanog antitela potklase IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4, i/ili kapa ili lambda konstantni region lakog lanca. Takvi konstantni regioni su dobro poznati u struci, i npr. opisali su ih Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) (vidite takođe npr. Johnson, G., i Wu, T.T., Nucleic Acids Res.28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788). U ovoj aplikaciji, korišćeno je numerisanje položaja i mutacija prema EU sistemu numeracije (EU indeks) koji su dali Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), i pominje se kao "numeracija prema Kabatovom EU indeksu".

U jednom otelotvorenju, bispecifična antitela prema pronalasku imaju konstantni region humane potklase IgG1 (dobijen od humane potklase IgG1).

U jednom otkriću, bispecifična antitela prema pronalasku imaju konstantni region humane potklase IgG4 (dobijen od humane potklase IgG1).

U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo prema pronalasku je humane potklase IgG1 sa mutacijama L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) i P329G (Pro329Gly). Takvo antitelo ima smanjeno vezivanje FcR (naročito ako više ne pokazuju vezivanje za FcRgamaI, FcRgamaII i FcRgamaIII). To je posebno korisno za smanjenje mogućih neželjenih dejstava kao što je npr. tromboza (Meyer, T., et al., J. Thromb. Haemost. 7 (2009) 171-81). U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo prema pronalasku je humane potklase IgG4 sa mutacijama S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) i P329G (Pro329Gly). Takvo antitelo ima smanjeno vezivanje FcR, kao što je gore navedeno. Dok mutacija Pro329Ala, koja je već opisana, uklanja samo dve trećine FcgamaRIIIa sendvič interakcije, Pro329Gly u antitelima prema pronalasku u potpunosti omogućava vezivanje dela Fc za FcgamaRIII. To je posebno korisno, jer je vezivanje FcgamaRIII uključeno u ADCC (ćelijsku toksičnost zavisnu od antitela) koja dovodi do ćelijske smrti, koja može biti korisna u lečenju kancera, ali može izazvati ozbiljna neželjena dejstva u lečenju na bazi antitela drugih vaskularnih ili imunoloških bolesti. Tako su antitela prema pronalasku potklase IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G i objavljena antutela potklase IgG4 sa mutacijama S228P, L235E i P329G posebno korisna, jer oba pokazuju osobinu da se više ne vezuju za FcRgamaI, FcRgamaII i FcRgamaIII.

Termin "sa mutacijama AAA" kao što se ovde koristi odnosi se na mutacije I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) i H435A (His435Ala) u konstantnom regionu teškog lanca IgG1 ili IgG4, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu.

Termin "sa mutacijama P329G LALA" kao što se ovde koristi odnosi se na mutacije L234A (Leu234Ala, L235A (Leu235Ala) i P329G (Pro329Gly) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG1, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu. Termin "sa mutacijama SPLE" kao što se ovde koristi odnosi se na mutacije S228P (Ser228Pro) i L235E (Leu235Glu) konstantnog regiona teškog lanca potklase IgH4, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu. Termin "sa mutacijama SPLE i P239G" kao što se ovde koristi odnosi se na mutacije S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) i P329G (Pro329Gly) konstantnog regiona teškog lanca potklase IgG4, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu.

Antitelo prema pronalasku se dobija rekombinacijom. Tako, jedan aspekt tekućeg pronalaska je nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema pronalasku, i dalji aspekt je ćelija koja sadrži pomenutu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo prema pronalasku. Metode za rekombinantnu proizvodnju su opšte poznate u struci, i sadrže ekspresiju proteina u prokariotskoj i eukariotskoj ćeliji, uz naknadnu izolaciju antitela, a obično i prečišćavanje do

2

farmaceutski prihvatljive čistoće. Za ekspresiju antitela, kao što je pomenuto u ćeliji domaćinu, nukleinska kiselina koja kodira odgovarajuće lake i teške lance ubacuje se u ekspresione vektore standardnim metodama. Ekspresija se izvodi u odgovarajućoj prokariotskoj i eukariotskoj ćeliji kao što su CHO ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, HER293 ćelije, COS ćelije, PER.C6 ćelije, kvasac, ili ćelije E.coli, i antitelo se izdvaja iz ćelija (supernatanta ili ćelija nakon lize). Opšte metode za rekombinantnu proizvodnju antitela su dobro poznate u struci, i opisao ih je , na primer, u revijalnim člancima Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res.48 (1998) 870-880.

Prema tome, jedno otelotvorenje pronalaska je metoda za dobijanje bispecifičnog antitela prema pronalasku, koja sadrži sledeće korake:

a) transformisanje ćelije domaćina vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju pomenuto antitelo;

b) uzgajanje ćelije domaćina pod uslovima koji omogućavaju sintezu pomenutog molekula antitela; i

c) izdvajanje pomenutog molekula antitela iz pomenute kulture.

U jednom otelotvorenju, korak izdvajanja pod c uključuje upotrebu reagensa za hvatanje specifičnog za konstantni domen lakog lanca (koji je npr. specifičan za kapa ili lambda konstantni laki lanac, u zavisnosti od toga da li je korišćen kapa ili lambda laki lanac u bispecifičnom antitelu prema pronalasku). U jednom otelotvorenju, ovaj reagens za hvatanje specifičan za laki lanac koristi se u režimu veži-i-eluiraj). Primeri za takav reagens za hvatanje specifičan za konstantni domen lakog lanca su npr. KappaSelect™ i LambdaFabSelectTM proizvođača GE Healthcare/BAC, koji se zasnivaju na veoma čvrstoj matrici na bazi agaroze, koja omogućava veliki protok i mali protivpritisak za velike zapremine. Oni imaju ligand koji se vezuje za konstantni region kapa, odnosno lambda lakog lanca (tj. fragmenti koji nemaju konstantni region lakog lanca neće se vezati; Sl. 1). Oba su takođe sposobna da vežu druge ciljne molekule koji sadrže konstantni region lakog lanca, na primer, IgG, IgA i IgM. Ligandi su vezani za matricu preko dugog hidrofilnog spejsera, kako bi bili lako dostupni za vezivanje za ciljni molekul. Oni se zasnivaju na jednolančanom fragmentu antitela pregledanom na humani Ig kapa ili lambda.

2

Bispecifična antitela su pogodno odvojena od medijuma za uzgajanje klasičnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina, kao što je, na primer, protein A sefaroza, hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija. DNK i RNK koje kodiraju monoklonska antitela se lako izoluju i sekvenciraju klasičnim postupcima. Ćelije hibridoma mogu biti izvor takve DNK i RNK Kada se izoluje, DNK se može ubaciti u ekspresione vektore, koji se zatim transficiraju u ćeliju domaćina, kao što su HEK 293 ćelije, CHO ćelije, ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, da bi se dobila sinteza rekombinantnih monoklonskih antitela u ćelijama domaćina.

Varijante aminokiselinskih sekvenci (ili mutanti) bispecifičnog antitela se dobijaju uvođenjem odgovarajućih izmena nukleotida u DNK antitela ili sintezom nukleotida. Takve modifikacije se mogu izvesti samo u veoma ograničenom obimu. Na primer, modifikacije ne menjaju karakteristike gorepomenutog antitela, kao što je potklasa IgG i vezivanje antigena, ali mogu poboljšati prinos rekombinantne proizvodnje, stabilnost proteina, ili olakšati prečišćavanje.

Termin "ćelija domaćin" kao što se koristi u ovoj aplikaciji, označava svaku vrstu ćelijskog sistema koji se može dizajnirati da stvara antitela prema tekućem pronalasku. U jednom otelotvorenju, HEK293 ćelije i CHO ćelije se koriste kao ćelije domaćini. Kao što se ovde koristi, izraz "ćelije", "ćelijska linija" i "ćelijska kultura" se koriste naizmenično, i sve te odrednice uključuju potomstvo. Tako, reči "transformanti" i "transformisane ćelije" uključuju primarne ćelije subjekta i kulture dobijene od njih, bez obzira na broj prenošenja. Takođe se podrazumeva da svo potomstvo ne mora biti potpuno identično po sadržaju DNK, usled namernih ili slučajnih mutacija. Ovde se uključuje varijantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano u originalno transformisanoj ćeliji.

Ekspresiju u NS0 ćelijama opisali su npr. Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Tranzijentnu ekspresiju su opisali npr Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res.30 (2002) E9. Kloniranje varijabilnih domena su opisali Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; i Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Poželjni sistem za tranzijentnu ekspresiju (HEK 293) opisali su Schlaeger, E.-J., i Christensen, K., u Cytotechnology 30 (1999) 71-83, i Schlaeger, E.-J., u J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

2

Kontrolne sekvence pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotera, opciono operatorsku sekvencu, i mesto vezivanja ribozoma. Zna se da eukariotske ćelije koriste promotere, pojačivače i signale za poliadenilaciju.

Nukleinska kiselina je "operativno vezana" kada je postavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za predsekvencu ili sekretorni lider je operativno vezan za DNK za polipeptid, ako je eksprimirana kao pretprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno vezan za kodirajuću sekvencu ako utiče na transkripciju sekvence; ili je vezujuće mesto ribozoma operativno vezano za kodirajuću sekvencu ako je postavljeno tako da olakšava translaciju. Generalno, "operativno vezan" znači da su vezane sekvence DNK susedne, a, u slučaju sekretornog lidera, susedne i u okviru za čitanje. Međutim, pojačavači ne moraju da budu susedni. Vezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički adapteri ili linkeri oligonukleotida, prema uobičajenoj praksi.

Prečišćavanje antitela se izvodi da bi se uklonile ćelijske komponente ili drugi kontaminanti, npr. druge ćelijske nukleinske kiseline ili proteini, standardnim tehnikama, uključujući tretman alkalijama/SDS, separacija traka pomoću CsCl, hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu, i druge metode poznate u struci. Vidite Ausubel, F., et al., izd. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Različite metode su u upotrebi i rasprostranjene za prečišćavanje proteina, kao što je afinitetna hromatografija sa mikrobnim proteinima (npr. afinitetna hromatografija sa proteinom A ili proteinom G), jonoizmenjivačka hromatografija (npr. katjonska izmena (karboksimetil smole), anjonska izmena (aminoetil smole) i mešana izmena), tiofilna adsorpcija (npr. sa betamerkaptoetanolom i drugim SH ligandima), hidrofobna interakcija ili aromatična adsorpciona hromatografija (npr. sa fenil sefarozom, aza-arenofilne smole, ili n-aminofenil boronska kiselina), metalna helatna afinitetna hromatografija (npr. sa Ni(II)- i Cu(II)-afinitetnom supstancom), hromatografija na molekulskim sitima i elektroforetske metode (kao što je gel elektroforeza, kapilarna elektroforeza) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

Bispecifična, dvovalentna antitela prema pronalasku pokazuju da su korisna za ljudske pacijente kojima treba terapija koja cilja na VEGF i ANG-2.

2

Dvovalentno bispecifično antihumano VEGF i humano ANG-2 prema ovom pronalasku mogu imati vredan profil efikasnosti/bezbednosti, i mogu obezbediti korist za pacijente kojima treba anti-VEGF i anti-ANG-2 terapija.

Jedan aspekt pronalaska je korišćenje farmaceutske kompozicije koja obuhvata antitelo prema pronalasku. Drugi aspekt pronalaska je korišćenje antitela prema pronalasku za proizvodnju farmaceutske kompozicije. Dalji aspekt pronalaska je metoda za proizvodnju farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo prema pronalasku. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju, npr. farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži antitelo prema predmetnom pronalasku, formulisanu zajedno sa farmaceutskim nosačem.

Kao što se ovde koristi, "farmaceutski nosač" uključuje svaki rastvarač, disperzioni medijum, premaz, antibakterijski i antifungalni agens, izotonični agens i agens za odlaganje apsorpcije, i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Poželjno, nosač je pogodan za primenu, i daje se ispitaniku lokalnim putem. Na primer, antitelo ili njegova kompozicija mogu se dati ispitaniku putem intraokularne primene, npr. intraokularne injekcije, kao što je intravitrealna injekcija. To se može uraditi prema standardnim postupcima poznatim u struci. Pogledajte npr. Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-76; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206; i Wray et al., Arch. Neurol.33 (1976) 183-5.

Kompozicija iz predmetnog pronalaska može se primeniti pomoću velikog broja metoda poznatih u struci. Kao što će vešt stručnjak proceniti, način i/ili režim primene će se razlikovati u zavisnosti od željenih rezultata. Da bi se jedinjenje iz pronalaska primenilo određenim načinom primene, može biti potrebno da se jedinjenje prevuče, ili istovremeno primeni sa materijalom koji sprečava njegovu inaktivaciju. Na primer, jedinjenje se može dati ispitaniku na odgovarajućem nosaču, na primer, lipozomima, ili u razblaživaču. Farmaceutski prihvatljivi razblaživači uključuju slane rastvore i vodene puferske rastvore. Farmaceutski nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije, i sterilne praškove za neplaniranu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Korišćenje takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance poznato je u struci.

Mnogi mogući režimi isporuke se mogu upotrebiti, uklučujući, ali se ne ograničavajući na, intraokularnu ili topikalnu primenu. U jednom otelotvorenju, primena je intraokularna, i uključuje, ali nije ograničena na supkonjuktivalnu injekciju, intrakameralnu injekciju, injekciju u prednju komoru preko temporalnog limbusa, intrastromalnu injekciju, intrakornealnu

2

injekciju, subretinalnu injekciju, injekciju u očnu vodicu, subtenonsku injekciju ili uređaj sa odloženim oslobađanjem, intravitrealnu injekciju (npr. prednja, središnja ili zadnja vitrealna injekcija). U jednom otelotvorenju, primena je topikalna, i uključuje, ali nije ograničena na kapi za oči u rožnjaču.

U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku primenjuju se putem intravitrealne primene, npr. intravitrealnom injekcijom. To se može uraditi prema standardnim postupcima poznatim u struci. Pogledajte npr. Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-76; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206; i Wray et al., Arch. Neurol.33 (1976) 183-5.

U nekim otelotvorenjima, terapeutski kompleti iz pronalaska mogu da sadrže jednu ili više doza bispecifičnog antitela prisutnog u ovde opisanoj farmaceutskoj kompoziciji, pogodni uređaj za intravitrealnu injekciju farmaceutske kompozicije, i uputstvo koje detaljno opisuje pogodne ispitanike i protokole za davanje injekcije. U tim otelotvorenjima, kompozicije se tipično daju ispitaniku kome je potrebno lečenje intravitrealnom injekcijom. To se može uraditi prema standardnim postupcima poznatim u struci. Pogledajte npr. Ritter et al., J. Clin. Invest.

116 (2006) 3266-76; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol.25 (1999) 196-206; i Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-5.

Kompozicija može takođe da sadrži adjuvanse kao što su konzervansi, kvašljivci, emulgatori i disperzivi. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se obezbediti i sterilizacionim postupcima, kao gore, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorbutanola, fenola, sorbinske kiseline i slično. Takođe može biti poželjno uključiti u kompoziciju izotonične agense, kao što su šećeri, natrijum hlorid i slično. Pored toga, produžena apsorpcija injektabilnih farmaceutskih oblika može se postići uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju, kao što je aluminjium monostearat i želatin.

Nezavisno od izabranog načina primene, jedinjenja iz predmetnog pronalaska, koja se mogu koristiti u pogodnom hidratisanom obliku, i/ili farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska, formulisani su u farmaceutski prihvatljive dozne oblike klasičnim metodama poznatim stručnjacima.

Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama iz predmetnog pronalaska mogu biti različiti, da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna tako da se dobije željeni terapeutski odgovor za konkretnog pacijenta, kompoziciju, i način primene, bez toksičnosti po pacijenta. Izabrani dozni nivo zavisiće od velikog broja farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost konkretnih upotrebljenih kompozicija iz predmetnog pronalaska, način primene, vreme primene, brzinu ekskrecije konkretnog upotrebljenog jedinjenja, trajanje lečenja, druge lekove, jedinjenja i/ili materijale upotrebljene u kombinaciji sa konkretnim upotrebljenim jedinjenjem, starost, pol, težinu, stanje, opšte zdravlje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji se leči, i slične činioce dobro poznate u medicini.

Kompozicija mora biti sterilna i tečna u toj meri da se kompozicija može isporučiti putem šprica. Pored vode, nosač je poželjno izotonični puferski rastvor soli.

Odgovarajuća fluidnost se može održati, na primer, primenom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije, i primenom surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželjno je u kompoziciju uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole, kao što je manitol ili sorbitol, i natrijum hlorid.

Kompozicija može da sadrži oftalmičku depo formulaciju koja sadrži aktivni agens za subkonjuktivnu primenu. Oftalmička depo formulacija sadrži mikročestice suštinski čistog aktivnog agensa, npr. bispecifičnog antitela prema pronalasku. Mikročestice koje sadrže bispecifično antitelo prema pronalasku mogu biti ugrađene u biokompatibilni farmaceutski prihvatljivi polimer ili lipidni agens za enkapsulaciju. Depo formulacije mogu se prilagoditi da otpuste sve, ili suštinski sve aktivne materije tokom produženog vremenskog perioda. Polimer ili lipidna matrica, ako su prisutni, mogu se prilagoditi da se dovoljno razgrade kako bi se transportovali sa mesta primene nakon oslobađanja svog, ili suštinski svog aktivnog agensa. Depo formulacija može biti tečna formulacija, koja sadrži farmaceutski prihvatljiv polimer, i rastvoreni ili dispergovani aktivni agens. Nakon injektovanja, polimer stvara depo na mestu injektovanja, npr. formiranjem gela ili taloženjem.

Drugi aspekt pronalaska je bispecifično antitelo prema pronalasku za primenu u lečenju vaskularnih bolesti oka.

Jedno otelotvorenje pronalaska je bispecifično antitelo prema pronalasku za primenu u lečenju vaskularnih bolesti oka.

Drugi aspekt pronalaska je pomenuta farmaceutska kompozicija za primenu u lečenju vaskularnih bolesti oka.

1

Drugi aspekt pronalaska je primena antitela prema pronalasku za proizvodnju leka za lečenje vaskularne bolesti oka.

Termini "očna vaskularna bolest" i "vaskularna bolest oka" se ovde koriste naizmenično i uključuju, ali nisu ograničeni na intraokularne neovaskularne sindrome, kao što je dijabetička retinopatija, dijabetički makularni edem, retinopatija nedonoščadi, neovaskularni glaukom, okluzije retinalne vene, okluzije centralne retinalne vene, degeneracija makule, starosna degeneracija makule, retinitis pigmentosa, retinalna angiomatska proliferacija, makularna teleangiektazija, ishemijska retinopatija, neovaskularizacija irisa, intraokularna neovaskularizacija, neovaskularizacija rožnjače, neovaskularizacija retine, horoidalna neovaskularizacija i degeneracija retine. (Garner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., i Klintworth, G.K., (izd.), 2. izdanje, Marcel Dekker, New York (1994), str.1625-1710). Kao što se ovde koristi, vaskularni poremećaj oka ukazuje na svako patološko stanje okarakterisano izmenjenom ili neregulisanom proliferacijom i invazijom novih krvnih sudova u strukturu očnog tkiva, kao što je mrežnjača ili rožnjača. U jednom otelotvorenju, vaskularna bolest oka je izabrana iz grupe koja se sastoji od vlažne forme starosne makularne degeneracije (vlažna AMD), suve forme starosne makularne degeneracije (suva AMD), dijabetičkog makularnog edema (DME), cistoidnog makularnog edema (CME), neproliferativne dijabetičke retinopatije (NPDR), proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR), cistoidnog makularnog edema, vaskulitisa (npr. okluzije centralne retinalne vene), papiloedema, retinitisa, konjuktivitisa, uveitisa, horoiditisa, multifokalnog horoiditisa, okularne histoplazmoze, blefaritisa, suvog oka (Šegrenova bolest) i drugih očnih bolesti, pri čemu je bolest ili poremećaj oka vezan za okularnu neovaskularizaciju, vaskularno curenje i/ili edem retine. Tako su bispecifična antitela prema pronalasku korisna u prevenciji i lečenju vlažne AMD, suve AMD, CME, DME, NPDR, PDR, blefaritisa, suvog oka i uveitisa, takođe poželjno vlažne AMD, suve AMD, blefaritisa, i suvog oka, takođe poželjno CME, DME, NPDR i PDR, takođe poželjno blefaritisa i suvog oka, konkretno vlažne AMD i suve AMD, i takođe konkretno vlažne AMD. U nekim otelotvorenjima, bolest oka je izabrana iz grupe koja se sastoji od vlažne forme starosne makularne degeneracije (vlažna AMD), makularnog edema, okluzije retinalne vene, retinopatije nedonoščadi i dijabetičke retinopatije.

Druge bolesti vezane za neovaskularizaciju rožnjače uključuju, ali nisu ograničene na, epidemijski keratokonjuktivitis, nedostatak vitamina A, preterano nošenje kontaktnih sočiva, atopijski keratitis, superiorni limbični keratitis, pterygium keratitis sicca, Šegrenov sindrom,

2

akne rosacea, phylectenulosis, sifilis, infekcije mikobakterijom, lipidnu degeneraciju, hemijske opekotine, bakterijske čireve, gljivične čireve, infekcije virusom Herpes simplex, infekcije virusom Herpes zoster, infekcije protozoama, Kapošijev sarkom, Morenov ulkus, Terinovu marginalnu degeneraciju, marginalnu keratolizu, reumatoidni artritis, sistemski lupus, poliarteritis, traumu, vegenerovu sarkoidozu, skleritis, Stivens Džonsonovu bolest, perifigoidnu radijalnu keratotomiju i odbacivanje rožnjače.

Bolesti povezane sa retinalnom/horoidalnom neovaskularizacijom uključuju, ali se ne ograničavaju na dijabetičku retinopatiju, makularnu degeneraciju, srpastu anemiju, sarkoid, sifilis, pseudoxanthoma elasticum, Pedžetovu bolest, okluziju vene, okluziju arterije, karotidnu opstruktivnu bolest, hronični uveitis/vitritis, infekcije mikobakterijama, Lajmsku bolest, sistemski eritemski lupus, retinopatiju nedonoščadi, retinitis pigmentosa, edem retine (uključujući makularni edem), Ilsovu bolest, Bečetovu bolest, infekcije koje izazivaju retinitis ili horoiditis, pretpostavljenu histoplazmozu oka, Bestovu bolest, kratkovidost, oštećenje očnog živca, Stargartovu bolest, pars planitis, hroničnu ablaciju retine, sindrome hiperviskoznosti, toksoplazmozu, traumu i post-laserske komplikacije. Ostale bolesti uključuju, ali se ne ograničavaju na bolesti povezane sa rubeozom (neovaskularizacija ugla) i bolesti izazvane abnormalnom proliferacijom fibrovaskularnog ili fibroznog tkiva, uključujući sve oblike proliferativne vitreoretinopatije.

Retinopatija nedonoščadi (ROP) je bolest oka koja pogađa prerano rođene bebe. Misli se da je izazvana neorganizovanim rastom krvnih sudova retine, što može dovesti do ožiljaka i ablacije retine. ROP može biti slaba i može se spontano razrešiti, ali u ozbiljnim slučajevima može dovesti do slepila. Kao takve, sve prerano rođene bebe imaju rizik od ROP, a veoma mala težina pri rođenju je dodatni faktor rizika. Kiseonična toksičnost i relativna hipoksija mogu doprineti razvoju ROP.

Makularna degeneracija je medicinsko stanje koje se pretežno sreće kod starijih osoba, kod kojih se centar unutrašnje ivice oka, poznate kao žuta mrlja mrežnjače, tanji, atrofira, i u nekim slučajevima krvari. To može dovesti do gubitka centralnog vida, što uključuje nemogućnost da se vide sitni detalji, da se čita ili da se prepoznaju lica. Prema Američkoj akademiji za oftalmologiju, to je danas vodeći uzrok gubitka centralnog vida (slepila) u Sjedinjenim Državama za osobe starije od pedeset godina. Mada se pojedine distrofije makule koje pogađaju mlađe osobe ponekad nazivaju makularnom degeneracijom, termin se uopšteno odnosi na starosnu makularnu degeneraciju (AMD ili ARMD).

Starosna makularna degeneracija počinje sa karakterističnim žutim naslagama u žutoj mrlji (centralnoj oblasti mrežnjače koja obezbeđuje detaljni centralni vid, zvanom fovea) zvanim druze, između epitela pigmenta retine i horoida ispod. Većina ljudi sa tim ranim promenama (koje se zovu starosna makulopatija) imaju dobar vid. Ljudi sa druzama mogu da razviju uznapredovalu AMD. Rizik je znatno veći kada su druze velike i brojne, i povezane sa poremećajem pigmentiranog sloja ćelija ispod mrežnjače. Velike i meke druze su vezane za povećane naslage holestrola, i mogu da reaguju na agense za snižavanje holesterola, ili na reo postupak.

Uznapredovala AMD, koja je odgovorna za dubinski gubitak vida, ima dva oblika: suvi i vlažni. Centralna geografska atrofija, suvi oblik uznapredovale AMD, rezultat je atrofije sloja epitela pigmenta retine ispod retine, koji izaziva gubitak vida putem gubitka fotoreceptora (štapića i čepića) u centralnom delu oka. Mada ne postoji lečenje za ovo stanje, Nacionalni institut za oko i drugi su dokazali da vitaminski suplementi sa velikim dozama antioksidanasa, luteina i zeaksantina, usporavaju napredovanje suve makularne degeneracije, a kod nekih pacijenata poboljšavaju oštrinu vida.

Retinitis pigmentosa (RP) je grupa genetskih stanja oka. U napredovanju simptoma RP, noćno slepilo prethodi tunelskom vidu za više godina, ili čak decenija. Mnoge osobe sa RP ne postaju zapravo slepe do 40-ih ili 50-ih godina, i celog života delimično zadrže vid. Drugi sasvim oslepe usled RP, u nekim slučajevima već u detinjstvu. Napredovanje RP je u svakom slučaju drugačije. RP je vrsta nasledne distrofije retine, grupe naslednih poremećaja kod kojih abnormalnosti fotoreceptora (štapića i čepića) ili epitelijuma pigmenta retine (RPE) dovodi do progresivnog gubitka vida. Pogođene osobe prvo iskuse neodgovarajuće prilagođavanje na mrak, ili niktalopiju (noćno slepilo), praćeno smanjenjem polja perifernog vida (poznato kao tunelski vid) i ponekad gubitkom centralnog vida u kasnijem toku bolesti.

Makularni edem se dešava kada se fluid i naslage proteina sakupljaju na, ili ispod makule oka, žutog centralnog dela mrežnjače, izazivajući njihovo zadebljanje i oticanje. Oticanje može da izobliči centralni vid, jer je makula blizu centra mrežnjače na zadnjoj strani očne jabučice. Ova oblast sadrži gusto pakovane čepiće koji obezbeđuju oštar, jasan centralni vid koji omogućava osobi da vidi oblik, boju, i detalje koji su direktno na vidnoj liniji. Cistoidni makularni edem je vrsta makularnog edema koji uključuje nastajanje ciste.

4

Kombinovane terapije: U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku primenjuju se samostalno (bez dodatnog terapijskog agensa) za lečenje jedne ili više ovde opisanih vaskularnih bolesti oka.

U drugim otelotvorenjima, bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku primenjuju se u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa ili metoda za lečenje jedne ili više ovde opisanih vaskularnih bolesti oka.

U drugim otelotvorenjima, bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku formulisani su u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa, i primenjeni za lečenje jedne ili više ovde opisanih vaskularnih bolesti oka.

U nekim otelotvorenjima, ovde dato kombinovano lečenje uključuje primenu bispecifičnog antitela ili farmaceutske kompozicije prema pronalasku, i primenjuje se redno, sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa za lečenje jedne ili više ovde opisanih vaskularnih bolesti oka.

Dodatni terapeutski agensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, triptofanil-tRNK sintetazu (TrpRS), EyeOO1 (Anti-VEGF pegilovani aptamer), skvalamin, RETAANE(TM) (anekortav acetat za depo suspenziju; Alcon, Inc.), kombretastatin A4 prolek (CA4P), MACUGEN(TM), MIFEPREX(TM) (mifepriston-ru486), subtenon triamcinolon acetonid, intravitrealni kristalni triamcinolon acetonid, prinomastat (AG3340- inhibitor metaloproteinaza sa sintetičkom matricom, Pfizer), fluocinolon acetonid (uključujući fluocinolon intraokularni implant, Bausch & Lomb/Control Delivery Systems), VEGFR inhibitore (Sugen), VEGF-Trap (Regeneron/Aventis), VEGF receptor inhibitora tirozin kinaze, kao što je 4-(4-brom-2-fluoranilino)-6-metoksi-7-(1-metilpiperidin-4-ilmetoksi)hinazolin (ZD6474), 4-(4-fluor-2-metilindol-5-iloksi)-6-metoksi-7-(3-pirolidin-1-ilpropoksi)hinazolin (AZD2171), vatalanib (PTK787) i SU11248 (sunitinib), linomid, i inhibitore integrin v.beta.3 funkcije i angiostatin.

Ostale farmaceutske terapije koje mogu biti primenjene u kombinaciji sa bispecifičnim antitelom ili farmaceutskom kompozicijom prema pronalasku uključuju, ali se ne ograničavaju na, VISUDYNE(TM) sa primenom netermalnog lasera, PKC 412, endovion (NeuroSearch A/S), neurotrofne faktore, uključujući kao primer glijalni neurotrofni faktor i cilijarni neurotrofni faktor, diatazem, dorzolamid, fototrop, 9-cis-retinal, lekove za oko (uključujući eho terapiju) uključujući fosfolin jodid ili ehotiofat ili inhibitore karbonske anhidraze, AE-941 (AEterna Laboratories, Inc.), sirna-027 (Sima Therapeutics, Inc.), pegaptanib (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), neurotrofine (uključujući, samo kao primer, NT-4/5, Genentech), cand5 (Acuity Pharmaceuticals), INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals), antagoniste integrina (uključujući one proizvođača Jerini AG i Abbott Laboratories), EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd.), BDM-E (BioDiem Ltd.), talidomid (kao što ga koristi, na primer, EntreMed, Inc.), kardiotrofin-1 (Genentech), 2-metoksiestradiol (Allergan/Oculex), DL-8234 (Toray Industries), NTC-200 (Neurotech), tetratiomolibdat (University of Michigan), LYN-002 (Lynkeus Biotech), jedinjenje iz mikroalgi (Aquasearch/ Albany, Mera Pharmaceuticals), D-9120 (Celltech Group pic), ATX-S10 (Hamamatsu Photonics), TGF-beta 2 (Genzyme/Celtrix), inhibitore tirozin kinaze (Allergan, SUGEN, Pfizer), NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), Opt-24 (OPTIS France SA), neuroprotektante retinalne ganglijske ćelije (Cogent Neurosciences), derivate N- nitropirazola (Texas A&M University System), KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals), ciklosporin A, "limitiranu translokaciju mrežnjače", fotodinamičku terapiju, (uključujući, samo kao primer, receptor-ciljani PDT, Bristol-Myers Squibb, Co.; porfimer natrijum za injekciju sa PDT-om; verteporfin, QLT Inc.; rostaporfin sa PDT-om Miravent Medical Technologies; talaporfin natrijum sa PDT-om, Nippon Petroleum; moteksafin lutecijum, Pharmacyclics, Inc.), antisens oligonukleotide (uključujući, kao primer, proizvode koje su ispitali Novagali Pharma SA i ISIS-13650, Isis Pharmaceuticals), lasersku fotokoagulaciju, laser druza, operaciju makularne rupe, operaciju makularne translokacije, implantabilne minijaturne teleskope, fluorescentne angiografije (poznata i kao mikro-laserska terapija i lečenje dovodnog krvnog suda), terapiju protonskim zrakom, mikrostimulacionu terapiju, odvajanje retine i operaciju staklastog tela, skleralnu kopču, submakularnu hirurgiju, transpupilarnu termoterapiju, fotosistem I terapiju, primenu RNK interferencije (RNKi), ekstrakorporeanu reoferezu (poznatu i kao membranska diferencijalna filtracija i reoterapija), implantaciju mikročipa, terapiju matičnim ćelijama, terapiju zamene gena, ribozimsku gensku terapiju (uključujući gensku terapiju za element odgovora na hipoksiju, Oxford Biomedica; Lentipak, Genetix; PDEF gensku terapiju, GenVec), transplantaciju fotoreceptora/retinalnih ćelija (uključujući transplantabilne retinalne epitelne ćelije, Diacrin, Inc.; transplant ćelija retine. Cell Genesys, Inc.), i akupunkturu.

Svaki anti-angiogeni agens može se primeniti u kombinaciji sa bispecifičnim antitelom ili farmaceutskom kompozicijom prema pronalasku, uključujući, ali se ne ograničavajući na, one koje su naveli Carmeliet i Jain, 2000, Nature 407:249-257. U nekim otelotvorenjima, antiangiogeni agens je drugi VEGF antagonist ili antagonist VEGF receptora, kao što su varijante VEGF, rastvorljivi fragmenti VEGF receptora, aptameri sposobni da blokiraju VEGF ili VEGFR neutrališuća anti-VEGFR antitela, inhibitore VEGFR tirozin kinaze male molekulske mase, i svaku njihovu kombinaciju, i one uključuju anti-VEGF aptamere (npr. pegaptanib), rastvorne rekombinantne receptore mamce (npr. klopka za VEGF). U nekim otelotvorenjima, anti-angiogeni agens uključuje kortikosteroide, angiostatske steroide, anekortav acetat, angiostatin, endostatin, malu interferentnu RNK koja smanjuje ekspresiju VEGFR ili VEGF liganda, post-VEGFR blokade sa inhibitorima tirozin kinaze, MMP inhibitore, IGEBP3, SDE-1 blokatore, PEDF, gama-sekretazu, delta-sličan ligand 4, integrinske antagoniste, HIF-1 alfa blokadu, blokadu protein kinaze CK2, i inhibiciju matičnih ćelija (tj. endotelnih progenitorskih ćelija) usmerene prema mestu neovaskularizacije pomoću vaskularnog endotelnog kadherina (CD-144) i antitela stromalnog izvedenog faktora (SDF)-I. Mogu se koristiti i mali molekuli RTK inhibitora koji ciljaju VEGF receptore, uključujući PTK787. Agensi koji imaju aktivnost protiv neovaskularizacije, koji nisu neophodno anti-VEGF jedinjenja, takođe se mogu koristiti, i uključuju anti-inflamatorne lekove, m-Tor inhibitore, rapamicin, everolimus, temsirolimus, ciklosporin, anti-TNF agense, anti-komplementne agense, i nesteroidne antiinflamatorne agense. Takođe se mogu koristiti agensi koji su neuroprotektivi i potencijalno mogu da smanje napredovanje suve degeneracije makule, kao što je klasa lekova zvana "neurosteroidi". Oni uključuju lekove kao što je dehidroepiandrosteron (DHEA) (imena brenda: prastera(R) i fidelin(R)), dehidroepiandrosteron sulfat i pregnenolon sulfat. Može se koristiti svaki agens za terapiju AMD (starosna makularna degeneracija) u kombinaciji sa bispecifičnim antitelom ili farmaceutskom kompozicijom prema pronalasku, uključujući, ali se ne ograničavajući na, verteporfin u kombinaciji sa PDT-om, natrijum pegaptanib, cink, ili antioksidans(e), same ili u kombinaciji.

Termini "ispitanik" i "pacijent" koriste se naizmenično, i odnose se na sisare, kao što su humani pacijenti i nehumani primati, kao i eksperimentalne životinje, kao što su zečevi, pacovi i miševi, i druge životinje. Životinje uključuju sve kičmenjake, npr. sisare i one koje nisu sisari, kao što su psi, mačke, ovce, krave, svinje, zečevi, pilići, itd. Poželjni ispitanici za primenu terapeutskih metoda iz predmetnog pronalaska su ljudi. Ispitanici kojima treba lečenje uključuju pacijente koji su već oboleli od vaskularne bolesti oka ili poremećaja, kao i one sklone razvoju poremećaja.

Kao što se ovde koristi, izrazi "ćelija, "ćelijska linija" i "ćelijska kultura" se koriste naizmenično, i svi ti izrazi uključuju potomstvo. Tako, reči "transformanti" i "transformisane ćelije" uključuju primarne ćelije ispitanika i kulture dobijene od njih, bez obzira na broj presejavanja. Takođe se podrazumeva da svo potomstvo ne mora biti potpuno identično po sadržaju DNK, usled namernih ili slučajnih mutacija. Ovde se uključuje varijantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano u originalno transformisanoj ćeliji. Tamo gde se namerava da se posebno označi, to će biti jasno iz konteksta.

Termin "transformacija", kao što se ovde koristi, odnosi se na postupke transfera vektora/nukleinske kiseline u ćeliju domaćina. Ako se ćelije bez ogromne barijere ćelijskog zida koriste kao ćelije domaćini, transfekcija se izvodi npr. metodom taloženja kalcijum fosfatom, kao što je opisao Graham, F.L., van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 546-467. Međutim, druge metode za uvođenje DNK u ćeliju, kao što je injekcija nukleusa ili fuzija protoplasta, takođe se mogu primeniti. Ako se koriste prokariotske ćelije ili ćelije koje sadrže znatne konstrukcije ćelijskog zida, npr. jedna metoda transfekcije je tretman kalcijumom pomoću kalcijum hlorida, kao što je opisao Cohen, S.N., et al., PNAS.69 (1972) 2110-2114.

Kao što se ovde koristi, "ekspresija" se odnosi na postupak pomoću koga se nukleinska kiselina transkribuje u mRNK i/ili na postupak pomoću koga se transkribovana mRNK (takođe pomenuta kao transkript) zatim prevodi u peptide, polipeptide ili proteine. Transkripti i kodirani polipeptidi se kolektivno pominju kao genski proizvod. Ako je polinukleotid dobijen iz genomske DNK, ekspresija u eukariotskoj ćeliji može uključiti splajsovanje mRNK.

"Vektor" je molekul nukleinske kiseline, konkretno samoreplicirajući, koji prenosi ubačeni molekul nukleinske kiseline u i/ili između ćelija domaćina. Termin uključuje vektore koji funkcionišu prvenstveno za ubacivanje DNK ili RNK u ćeliju (npr. hromozomska integracija), replikaciju vektora koji funkcionišu prvenstveno za replikaciju DNK ili RNK, i ekspresiju vektora koji funkcionišu za transkripciju i/ili translaciju DNK ili RNK. Takođe su uključeni vektori koji daju više od jedne opisane funkcije.

"Ekspresioni vektor" je polinukleotid koji, kada se uvede u odgovarajuću ćeliju domaćina, može biti transkribovan i preveden u polipeptid. "Ekspresioni sistem" se obično odnosi na pogodnu ćeliju domaćina koja se sastoji od ekspresionog vektora koji može da funkcioniše tako da da željeni ekspresioni proizvod.

Sledeći primeri, liste sekvenci i slike su date da pomognu u razumevanju predmetnog pronalaska.

Opis liste sekvenci (aminokiselinske sekvence)

4

U nastavku su navedena otelotvorenja pronalaska:

1. Bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2,

pri čemu,

i) pomenuto prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za VEGF sadrži u varijabilnom domenu teškog lanca CDR3H region SEQ ID NO.: 1, CDR2H region SEQ ID NO.: 2, i CDR1H region SEQ ID NO.: 3, i u varijabilnom domenu lakog lanca CDR3L region SEQ ID NO.: 4, CDR2L region SEQ ID NO.: 5, i CDR1L region SEQ ID NO.: 6, i

ii) pomenuto drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za ANG-2 sadrži u varijabilnom domenu teškog lanca CDR3H region SEQ ID NO.: 9, CDR2H region SEQ ID NO.: 10, i CDR1H region SEQ ID NO.: 11, i u varijabilnom domenu lakog lanca CDR3L region SEQ ID NO.: 12, CDR2L region SEQ ID NO.: 13, i CDR1L region SEQ ID NO.: 14, i pri čemu,

iii) bispecifično antitelo sadrži konstantni region teškog lanca humane IgG1 potklase (humanog porekla) koji sadrži mutacije I253A, H310A, i H435A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu)

Bispecifično antitelo prema otelotvorenju 1, pri čemu,

i) pomenuto prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za VEGF sadrži kao varijabilni domen teškog lanca VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 7, i kao varijabilni domen lakog lanca VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 8, i

ii) pomenuto drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za ANG-2 sadrži kao varijabilni domen teškog lanca VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 15, i kao varijabilni domen lakog lanca VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 16.

Bispecifično antitelo prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 2, pri čemu je konstantni region teškog lanca pod iii) potklase IgG1

Bispecifično antitelo prema otelotvorenju 3, pri čemu konstantni region teškog lanca potklase IgG1 dalje sadrži mutacije L234A, 235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu)

Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 4.

Bispecifično antitelo prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 4, za primenu u lečenju vaskularnih bolesti oka.

Primena bispecifičnog antitela prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 4 za proizvodnju leka za lečenje vaskularnih bolesti oka.

Bispecifično antitelo prema bilo kom od otelotvorenja 96 ili 7, pri čemu se antitelo daje intravitrealnom primenom.

Nukleinska kiselina koja kodira bispecifično antitelo prema bilo kom od otelotvorenja 1 do 4.

10. Ekspresioni vektor koji sadrži pomenutu nukleinsku kiselinu prema otelotvorenju 9, sposoban da eksprimira pomenutu nukleinsku kiselinu u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu.

11. Prokariotska ili eukariotska ćelija domaćin koja sadrži vektor prema otelotvorenju 10.

12. Metoda za pripremu bispecifičnog antitela prema otelotvorenjima 1 do 4

koja sadrži sledeće korake

a) transformisanje ćelije domaćina vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju pomenuto antitelo;

b) uzgajanje ćelije domaćina pod uslovima koji omogućavaju sintezu pomenutog molekula antitela; i

c) izdvajanje pomenutog molekula antitela iz pomenute kulture.

13. Bispecifično antitelo dobijeno metodom iz otelotvorenja 12.

14. Bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 25, SEQ ID NO.: 26, SEQ ID NO.: 27, i SEQ ID NO.: 28.

15. Bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 21, SEQ ID NO.: 22, SEQ ID NO.: 23, i SEQ ID NO.: 24.

Eksperimentalni postupci

Tabela 1: Bispecifična antitela i njihove odgovarajuće sekvence

4

Obratite pažnju da se termin "sa AAA mutacijama", kao što se ovde koristi, odnosi na mutacije I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) i H435A (His435Ala) konstantnog regiona teškog lanca IgG1 ili IgG4 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), termin "sa mutacijama P329G LALA" kao što se ovde koristi, odnosi se na mutacije L234A (Leu234Ala), L235A ((Leu235Ala) i P329G (Pro329Gly) konstantnog regiona teškog lanca potklase IgG1 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), a termin "sa SPLE mutacijama" kao što se ovde koristi, odnosi se na mutacije S228P (Ser228Pro) i L235E (Leu235Glu) konstantnog regiona teškog lanca potklase IgG4 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

Primeri

Materijali i opšte metode

Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Aminokiseline lanca antitela su numerisane i navedene prema EU numeraciji (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

Tehnologija rekombinantne DNK

Korišćene su standardne metode za rukovanje sa DNK, kao što su opisali Sambrook, J. et al, Molecular Cloning: A laboratory manual (Molekulsko kloniranje: Laboratorijski priručnik); Cold Springs Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača.

Sinteza gena

Željeni segmenti gena su poručeni prema datim specifikacijama od kompanije Geneart (Regensburg, Germany).

Određivanje sekvence DNK

DNK sekvence su određene sekvenciranjem dvojne spirale obavljenim u MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany) ili Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany).

Analiza sekvenci DNK i proteina i upravljanje podacima o sekvencama

Za kreiranje sekvenci, mapiranje, analizu, anotaciju i ilustraciju korišćen je softverski paket GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) verzija 10.2 i Infomax Vector NT1 Advance suite verzija 8.0.

Ekspresioni vektori

Za ekspresiju opisanih antitela, primenjene su varijante ekspresionih plazmida za tranzijentnu ekspresiju (npr. u HEK293-F) ćelija na bazi organizacije cDNK sa CMV-Intron A promoterom ili bez njega, ili na bazi organizacije sa CMV promoterom.

Pored ekspresione kasete antitela, vektori su sadržali:

4

- mesto porekla replikacije koje omogućava replikaciju ovog plazmida u E. coli, - gen ß-lactamaze koji daje otpornost na ampicilin kod E. coli., i

- gen dihidrofolat reduktaze iz Mus musculus kao selekcioni marker kod eukariotskih ćelija

- Transkripciona jedinica gena antitela sastojala se od sledećih elemenata:

- jedinstveno restrikciono mesto(a) na 5’ kraju

- trenutni rani pojačivač i promotere iz humanog citomegalovirusa,

- praćen sekvencom Introna A u slučaju organizacije cDNK,

- 5'-netranslatovani region gena humanog antitela,

- signalnu sekvencu teškog lanca imunoglobulina,

- lanac humanog antitela (divljeg tipa ili sa izmenom domena) kao cDNK ili kao genomska organizacija sa imunoglobulinskom ekson-intron organizacijom

- 3’ netranslatovani region sa signalnom sekvencom poliadenilacije, i

- jedinstveno restrikciono mesto(a) na 3’ kraju.

Fuzioni geni koji sadrže lance antitela kao što je dole opisano nastali su putem PCR i/ili sinteze gena, i sklopljeni poznatnim rekombinantnim metodama i tehnikama, povezivanjem usaglašenih segmenata nukleinske kiseline, npr. koriščenjem jedinstvenih restrikcionih mesta u odgovarajućim vektorima. Potklonirane sekvence nukleinske kiseline su proverene sekvenciranjem DNK. Za tranzijentne transfekcije su pripremljene veće količine plazmida, putem dobijanja plazmida iz transformisanih kultura E. coli (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Tehnike uzgajanja ćelija

Korišćene su standardne tehnike uzgajanja ćelija, kao što opisuje Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. i Yamada, K.M. (izdav.), John Wiley & Sons, Inc.

Bispecifična antitela su eksprimirana tranzijentnom kotransfekcijom odgovarajućih ekspresionih plazmida u HEK29-F ćelijama koje rastu u suspenziji kao što je dole opisano.

Primer 1

Ekspresija i prečišćavanje

4

Tranzijentna transfekcija u sistemu HEK293-F

Bispecifična antitela su dobijena tranzijentnom transfekcijom sa odgovarajućim plazmidima (npr. kodiranjem teškog i modifikovanog teškog lanca, kao i odgovarajućeg lakog i modifikovanog lakog lanca) korišćenjem sistema HEK293-F (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, HEK293-F ćelije (Invitrogen) uzgajane u suspenziji ili u bočici koja se mućka ili u fermentoru uz mešanje, u FreeStyle<TM>293 ekspresionom medijumu bez seruma (Invitrogen) transficirane su mešavinom četiri ekspresiona plazmida i 293fektina<TM>ili fektina (Invitrogen). Za bocu za mućkanje od 2 l (Coming), HEK293-F ćelije su zasejane sa gustinom od 1,0E*6 ćelija/ml u 600 ml, i inkubirane na120 o/min, 8% CO2. Dan nakon što su ćelije transficirane sa gustinom ćelija od 1,5E*6 ćelija/ml sa oko 42 ml smeše A) 20 ml Opti-MEM (Invitrogen) sa 600 µg DNK totalnog plazmida (1 µg/ml) koji kodira teški, odnosno modifikovani teški lanac, i odgovarajući laki lanac u ekvimolarnom odnosu i B) 20 ml Opti-MEM 1,2 mL 293 fektina ili fektina (2 µl/ml). Prema potrošnji glukoze, dodavan je glukozni rastvor tokom fermentacije. Supernatant koji je sadržao sekretovano antitelo sakupljen je nakon 5-10 dana, i antitela su ili direktno prečišćena iz supernatanta, ili je supernatant zamrznut i sačuvan.

Prečišćavanje

Bispecifična antitela su prečišćena iz supernatanta ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom pomoću MabSelectSure-Sepharose<TM>(za mutante bez AAA mutacije) (GE Healthcare, Švedska) ili kapaSelect-Agarose (za AAA mutante) (GE Healthcare, Švedska), hromatografije hidrofobnih interakctija koristeći butil-sefarozu (GE Healthcare, Švedska) i Superdex 200 ekskluzionu hromatografiju (GE Healthcare, Švedska).

Ukratko, sterilni filtrirani supernatanti ćelijske kulture su uhvaćeni na MabSelect SuRe smoli ekvilibrisanoj sa PBS puferom (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl i 2,7 mM KCl, pH 7,4), isprani ekvilibracionim puferom i eluirani sa 25 mM natrijum citratom na pH 3,0. AAA mutanti su uhvaćeni na kapaSelect smoli ekvilibrisanoj sa 25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7,2, isprani ekvilibracionim puferom i eluirani sa 25 mM natrijum citratom na pH 2,9. Eluirane proteinske frakcije su spojene i neutralisane pomoću 2M Tris, pH 9,0. Rezerve antitela za hromatografiju sa hidrofobnim interakcijama su pripremljene dodatkom 1,6 M rastvora amonijum sulfata do krajnje koncentracije od 0,8 M amonijum sulfata, i pH je podešen na pH 5,0 pomoću sirćetne kiseline. Nakon ekvilibracije smole butil-sefaroze pomoću 35 mM

4

natrijum acetata, 0,8 M amonijum sulfata, pH 5,0, antitela su naneta na smolu, isprana ekvilibracionim puferom i eluirana pomoću linearnog gradijenta do 35 mM natrijum acetata pH 5,0. Frakcije koje su sadržale bispecifična antitela su spojene i dalje prečišćene hromatografijom na molekulskim sitima, koristeći Superdex 20026/60 GL (GE Healthcare, Švedska) kolonu ekvilibrisanu pomoću 20 mM histidina, 140 mM NaCl, pH 6,0. Frakcije koje su sadržale bispecifična antitela su spojene, koncentrovane do potrebne koncentracije pomoću ultrafiltracionih uređaja Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech S.A., France) i čuvane na -80°C.

Tabela 2: Prinos bispecifičnih antitela <VEGF-ANG-2>

Čistoća i integritet antitela su analizirani nakon svakog koraka prečišćavanja pomoću CE-SDS koristeći tehnologiju Microfluidic Labchip (Caliper Life Science, SAD). Za CE-SDS analizu je pripremljeno 5 µl proteinskog rastvora pomoću HT proteinskog ekspres reagensa prema uputstvu proizvođača, i analiziran je na sistemu LabChip GXII koristeći HT Protein Express Chip. Podaci su analizirani pomoću softvera LabChip GX.

Tabela 3: Uklanjanje tipičnih sporednih proizvoda različitim koracima sekvencijalnog prečišćavanja određenim preko CE-SDS.

4

Sadržaj agregata u uzorcima antitela analiziran je SEC tehnikom visokih performansi koristeći Superdex 200 analitičku kolonu za hromatografiju na molekulskim sitima (GE Healthcare, Švedska) u 2xPBS (20 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 274 mM NaCl i 5,4 mM KCl, pH 7,4) pufer propuštan na 25°C.25 µg proteina je injektovano na kolonu pri protoku od 0,75 ml/min, i eluirano izokratski tokom 50 minuta.

Analogno tome, <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela VEGFang2-0012 i VEGFang2-0201 dobijena su i prečišćena u sledećim prinosima:

Takođe, <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG4 sa AAA mutacijama i sa SPLE mutacijama (SEQ ID NO.: 29, SEQ ID NO.: 30, SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32), <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG1 sa AAA mutacijama (SEQ ID NO.: 33, SEQ ID NO.: 34, SEQ ID NO.: 35) i <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG4 sa AAA mutacijama i sa SPLE mutacijama (SEQ ID NO.: 36, SEQ ID NO.: 37, SEQ ID NO.: 38) se mogu dobiti i prečistiti na isti način.

4

Primer 2

Analitika i mogućnost razvoja

Merenje viskoziteta u maloj zapremini na bazi DLS.

Merenje viskoziteta je suštinski obavljeno kao što opisuje (He, F. et al., Analytical Biochemistry 399 (2009) 141-3). Ukratko, uzorci su koncentrovani do različitih koncentracija proteina u 200 mM arginin sukcinata, pH 5,5, pre dodavanja polistirenskih lateks perlica (prečnik 300 nm) i polisorbata 20 (0,02% V/V). Uzorci su preneti na optičku ploču sa 384 bunarčića putem centrifugiranja kroz filter ploču od 0,4 µm, i pokriveni parafinskim uljem. Ugaoni prečnik perlica od lateksa određen je pomoću dinamičkog rasipanja svetla na 25 °C. Viskozitet rastvora se može izračunati kao η = η0(rh/rh,0) ( η: viskozitet; η0: viskozitet vode; rh: ugaoni hidrodinamički poluprečnik perlica od lateksa; rh,0: hidrodinamički poluprečnik perlica od lateksa u vodi.

Da bi se omogućilo poređenje različitih uzoraka u istoj koncentraciji, podaci o viskozitetu u zavisnosti od koncentracije su uvedeni u Munijevu jednačinu (Jednačina 1) (Mooney, Colloid Sci, 1951; Monkos, Biochem. Biophys. Acta 1997), i podaci su na odgovarajući način interpolisani.

(S: parametar hidrodinamičke interakcije proteina; K: parametar samonagomilavanja; Φ: zapreminska frakcija rastvorenog proteina)

Rezultati su prikazani na Slici 2: VEGFang2-0016 sa AAA mutacijama u Fc delu pokazuje manji viskozitet na svim merenim temperaturama u poređenju sa VEGFang2-0015 bez AAA mutacija u Fc delu.

Temperatura početka DLS agregacije

Uzorci su pripremljeni u koncentraciji od 1 mg/ml u 20 mM histidin/histidin hloridu, 140 mM NaCl, pH 6,0, preneti u optičku ploču sa 384 bunarčića centrifugiranjem kroz filter ploču od 0,4 µm, i prekriveni parafinskim uljem. Hidrodinamički poluprečnik je više puta meren dinamičkim rasipanjem svetla, dok su uzorci zagrevani brzinom od 0,05°C/min od 25°C do 80°C. Temperatura početka agregacije je definisana kao temperatura na kojoj hidrodinamički poluprečnik počinje da se povećava. Rezultati su prikazani na Slici 3. Na slici 3, prikazana je agregacija VEGFang2-0015 bez AAA mutacija u odnosu na VEGFang2-0016 sa AAA mutacijama u Fc delu. VEGFang2-0016 je imao temperaturu početka agregacije 61°C, dok je VEGFang2-0015 bez AAA mutacija pokazao temperaturu početka agregacije 60°C.

Vremenski tok DLS

Pripremljeni su uzorci u koncentraciji od 1 mg/ml u 20 mM histidin/histidin hloridu, 140 mM NaCl, pH 6,0, preneti na optičku ploču sa 384 bunarčića centrifugiranjem kroz filter ploču od 0,4 µm, i prekriveni parafinskim uljem. Hidrodinamički poluprečnik je više puta meren dinamičkim rasipanjem svetla, dok su uzorci držani na konstantnoj temperaturi od 50°C do 145 sati. U ovom eksperimentu, težnja ka agregaciji nativnog, razmotanog proteina na povišenoj temperaturi bi dovela do povećanja prosečnog prečnika čestice tokom vremena. Ovaj metod na bazi DLS je veoma osetljiv na agregate, jer oni više nego proporcionalno doprinose intenzitetu rasutog svetla. Čak i nakon 145 sati na 50°C (temperatura bliska temperaturi početka agregacije, vidi iznad), nađeno je da je prosečno povećanje prečnika čestice samo manje od 0,5 nm, i za VEGFang2-0015 i za VEGFang2-0016.

7-dnevno čuvanje na 40°C pri 100 mg/ml (povećanje VMM)

Uzorci su koncentrovani do konačne koncentracije od 100 mg/ml u 200 mM arginin sukcinatu, pH 5,5, sterilno filtrirani, i u stanju mirovanja čuvani 7 dana na 40°C. Pre i posle čuvanja, određen je sadržaj vrsta sa velikom i malom molekulskom masom (VMM, odnosno MMM) putem hromatografije sa molekulskim sitima. Razlika u sadržaju VMM i MMM između čuvanog uzorka i uzorka merenog odmah nakon pripreme prijavljena je kao "povećanje VMM", odnosno "povećanje MMM". Rezultati su prikazani u Tabeli 4 i na Slici 4, koje pokazuju da VEGFang2-0015 (bez AAA mutacije) pokazuje veće smanjenje glavnog pika i veće povećanje VMM u poređenju sa VEGF Ang2-0016 (sa AAA mutacijom). Neočekivano, VEGF Ang2-0016 (sa AAA mutacijom) pokazao je manju težnju ka agregaciji u poređenju saVEGFang2-0015 (bez AAA mutacije).

Tabela 4: Delta glavni, VMM i MMM pikovi nakon 7d na 40°C

1

Funkcionalna analiza anti-VEGF i anti-Ang2 bispecifičnih antitela je procenjena pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR) koristeći BIAcore® Tl00 ili T200 instrument (GE Healthcare) na 25°C. Sistem BIAcore® je dobro proveren za proučavanje molekulskih interakcija. SPR tehnologija se zasniva na merenju indeksa prelamanja blizu površine zlatom prevučenog biosenzorskog čipa. Promene indeksa prelamanja ukazuju na promene mase na površini izazvane interakcijom imobilisanog liganda sa analitom injektovanim u rastvor. Masa se povećava ako molekul vezuje imobilisane ligande na površini, i obrnuto, masa se smanjuje u slučaju disocijacije analita sa imobilisanog liganda (disocijacija reflektujućeg kompleksa). SPR omogućava kontinualno blagovremeno praćenje vezivanja ligand/analit, i time određivanje konstante brzine asocijacije (ka), konstante brzine disocijacije (kd) i konstante ravnoteže (KD).

Primer 3

Vezivanje za VEGF, Ang2, FcgammaR i FcRn

Kinetički afinitet izooblika VEGF, uključujući procenu unakrsnog reagovanja među vrstama

Oko 12000 rezonantnih jedinica (RU) sistema za hvatanje (10 µg/ml kozjeg anti humanog F(ab)’2; Šifra za poručivanje: 28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Švedska) kuplovano je na CM5 čip (GE Healthcare BR-1005-30) na pH 5,0 koristeći komplet za kuplovanje amina nabavljen od GE Healthcare. Pufer za uzorak i sistem je bio PBS-T (10 mM rastvor soli sa fosfatnim puferom i sa 0,05% Tween20) pH 7,4. Protočna ćelija je podešena na 25°C a blok za uzorak na 12°C, i dva puta je prajmovan propuštanjem pufera. Bispecifično antitelo je uhvaćeno injektovanjem 50 nM rastvora tokom 30 s pri protoku od 5 µl/min. Asocijacija je merena injektovanjem humanog hVEGF121, mišjeg mVEGF120 ili pacovskog rVEGF164 u različitim koncentracijama u rastvoru tokom 300 s, pri protoku od 30 µl/min, počevši od 300 nM, sa razblaženjima 1:3. Faza disocijacije je praćena do 1200 s, i aktivirana prebacivanjem sa rastvora uzorka na propuštanje pufera. Površina je regenerisana ispiranjem od 60 s rastvorom

2

glicina pH 2,1 pri protoku od 30 µl/min. Razlike u indeksu prelamanja masivnih uzoraka su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog od površine kozjeg anti humanog F(ab')2. Takođe su oduzimane blanko injekcije (=dvostruka referenca). Za izračunavanje prividne KD i ostalih kinetičkih parametara, korišćen je Lengmirov model 1:1. Rezultati su prikazani u Tabeli 5.

Afinitet rastvora Ang2, uključujući procenu unakrsnog reagovanja među vrstama

Afinitet rastvora je mera afiniteta interakcije, određivanjem koncentracije slobodnih partnera u interakciji u ravnotežnoj smeši. Test afiniteta rastvora uključuje mešanje <VEGF-ANG-2> bispecifičnog antitela držanog na konstantnoj koncentraciji, sa ligandom (= Ang2) u promenljivim koncentracijama. Maksimalne moguće rezonantne jedinice (npr. 17.000 rezonantnih jedinica (RU)) antitela je imobilisano na površini CM5 čipa (GE Healthcare BR-1005-30) na pH 5,0 pomoću kompleta za kuplovanje amina nabavljenog od GE Healthcare. Pufer za uzorak i sistem je bio HBS-P pH 7,4. Protočna ćelija je podešena na 25°C a blok za uzorak na 12°C, i dva puta je prajmovan propuštanjem pufera. Da bi se dobila kalibraciona kriva, injektovane su rastuće koncentracije Ang2 u protočnu ćeliju BIAcore koja je sadržala imobilisano bispecifično antitelo VEGF-ANG-2>. Količina vezanog Ang2 određena je kao rezonantne jedinice (RU), i predstavljena je njena zavisnost od koncentracije. Rastvori svakog liganda (11 koncentracija od 0 do 200 nM za bispecifično antitelo VEGF-ANG-2>) inkubirani su sa 10 nM Ang2 i pušteni da postignu ravnotežu na sobnoj temperaturi. Koncentracije slobodnog Ang2 su određene iz kalibracione krive dobijene pre i posle merenja odgovora rastvora sa poznatim količinama Ang2. Postavljeno je podešavanje 4 parametra pomoću XLfit4 (IDBS softver) pomoću modela 201, koristeći koncentracije slobodnog Ang2 i primenjenu koncentraciju antitela za inhibiciju kao x-osu. Afinitet je izračunat određivanjem pregibne tačke ove krive. Površina je regenerisana jednokratnim ispiranjem od 30 s pomoću 0,85% rastvora H3PO4 pri protoku od 30 µl/min. Razlike u indeksu prelamanja masivnih uzoraka su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog od površine kuplovane sa blankom. Rezultati su prikazani u Tabeli 6.

Afinitet FcRn u stabilnom stanju

Za merenja FcRn, korišćen je afinitet u stabilnom stanju za međusobno poređenje bispecifičnih antitela. Humani FcRn razblažen je u puferu za kuplovanje (10 µg/ml, Na-acetat pH 5,0) i imobilisan na C1-čipu (GE Healthcare BR-1005-35) postupkom ciljane imobilizacije pomoću BIAcore čarobnjaka, do konačnog odgovora od 200 RU. Protočna ćelija je podešena na 25°C a blok za uzorak na 12°C, i dva puta je prajmovan propuštanjem pufera. Uzorak i sistemski pufer je bio PBS-T (10 mM rastvor soli sa fosfatnim puferom i sa 0,05% Tween20) pH 6,0. Da bi se ocenile različite koncentracije IgG za svako antitelo, pripremljene su koncentracije od 62,5 nM, 125 nM i 250 nM, 500 nM. Protok je podešen na 30 µl/min, i zaredom su injektovani različiti uzorci na površinu čipa, izborom 180 s kao vremena asocijacije. Površina je regenerisana injektovanjem PBS-T pH 8 tokom 60 s, pri protoku od 30 µl/min. Razlike u indeksu prelamanja masivnih uzoraka su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog od blanko površine. Takođe su oduzete injekcije pufera (= dvostruka referenca). Za izračunavanje afiniteta u stabilnom stanju korišćena je metoda Bia-Evaluation softvera. Ukratko, vrednosti RU (RU max) su predstavljene u odnosu na analizirane koncentracije, dajući krivu dozaodgovor. Na osnovu podešavanja 2 parametra, izračunata je gornja asimptota, omogućavajući određivanje polu-maksimalne vrednosti RU i afiniteta. Rezultati su prikazani na Slici 5 i u Tabeli 7. Analogno se mogu odrediti vrednosti za FcRn cyno majmuna, miša i zeca.

Merenje FcgamaRIIIa

Za merenje FcgamaRIIIa je korišćen test direktnog vezivanja. Oko 3000 rezonantnih jedinica (RU) sistema za hvatanje (1 µg/ml Penta-His; Quiagen) kuplovano je na CM5 čip (GE Healthcare BR-1005-30) na pH 5,0 koristeći komplet za kuplovanje amina nabavljen od GE Healthcare. Pufer za uzorak i sistem je bio HBS-P+ pH 7,4. Protočna ćelija je podešena na 25°C a blok za uzorak na 12°C, i dva puta je prajmovan propuštanjem pufera. FcgamaRIIIa -His-receptor je uhvaćen injektovanjem 100 nM rastvora tokom 60 s, pri protoku od 5 µl/min. Vezivanje je mereno pri injektovanju 100 nM bispecifičnog antitela ili monospecifičnih kontrolnih antitela (anti-Dig za IgG1 potklasu i IgG4 potklasu antitela) tokom 180 s, pri protoku od 30 µl/. Površina je regenerisana tokom 120 s ispiranjem rastvorom glicina pH 2,5 pri protoku od 30 µl/min. Pošto se FcgamaRIIIa vezivanje razlikuje od Lengmirovog 1:1 modela, ovim testom se određuje samo vezivanje/nevezivanje. Na sličan način može da se odredi FcgamaRIa i FcgamaRIIa vezivanje. Rezultati su prikazani na Slici 6, odakle sledi da uvođenjem mutacija P329G LALA više ne može biti detektovano vezivanje za FcgamaRIIIa.

Procena nezavisnog vezivanja VEGF- i Ang2 za <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela

Oko 3500 rezonantnih jedinica (RU) sistema za hvatanje (10 µg/ml kozji anti humani IgG; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Švedska) kuplovano je na CM4 čip (GE Healthcare BR-1005-

4

34) na pH 5,0 pomoću kompleta za kuplovanje amina nabavljenog od GE Healthcare. Pufer za uzorak i sistem je bio PBS-T (10 mM rastvor soli sa fosfatnim puferom i sa 0,05% Tween20) pH 7,4. Temperatura protočne ćelije je podešena na 25°C a blok za uzorak na 12°C. Pre hvatanja, protočna ćelija je dva puta prajmovana propuštanjem pufera.

Bispecifično antitelo je uhvaćeno injektovanjem 10 nM rastvora tokom 60 s, pri protoku od 5 µl/min. Nezavisno vezivanje svakog liganda za bispecifično antitelo je analizirano određivanjem kapaciteta aktivnog vezivanja za svaki ligand, bilo da su dodati zaredom ili istovremeno (protok 30 µl/min):

1. Injektovanje humanog VEGF sa koncentracijom od 200 nM za 180 s (identifikuje se pojedinačno vezivanje antigena).

2. Injektovanje humanog Ang2 sa koncentracijom od 100 nM za 180 s (identifikuje se pojedinačno vezivanje antigena).

3. Injektovanje humanog VEGF sa koncentracijom od 200 nM za 180 s a zatim dodatno injektovanje humanog Ang2 sa koncentracijom od 100 nM za 180 s (identifikuje se vezivanje Ang2 u prisustvu VEGF).

4. Injektovanje humanog Ang2 sa koncentracijom od 100 nM za 180 s, a zatim dodatno injektovanje humanog VEGF sa koncentracijom od 200 nM (identifikuje se vezivanje VEGF u prisustvu Ang2).

5. Istovremeno injektovanje humanog VEGF sa koncentracijom od 200 nM i humanog Ang2 sa koncentracijom od 100 nM za 180 s (identifikuje se istovremeno vezivanje VEGF i Ang2).

Površina je regenerisana ispiranjem tokom 60 s sa 3 mM rastvorom MgCl2 pri protoku od 30 µl/min. Razlike u indeksu prelamanja masivnih uzoraka su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog od površine kozjeg anti humanog IgG.

Bispecifično antitelo može da veže oba antigena nezavisno ako je rezultujući finalni signal iz pristupa 3, 4 i 5 jednak ili približan zbiru pojedinačnih finalnih signala iz pristupa 1 i 2. Rezultati su prikazani u Tabeli 9, gde je prikazano da oba antitela VEGFang2-0016, VEGFang2-0012 mogu uzajamno nezavisno da se vežu za VEGF i ANG2.

Procena istovremenog vezivanja VEGF i Ang2 za <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela Prvo je oko 1600 rezonantnih jedinica (RU) VEGF (20µg/ml) kuplovano na CM4 čip (GE Healthcare BR-1005-34) na pH 5,0 pomoću kompleta za kuplovanje amina nabavljenog od GE Healthcare. Pufer za uzorak i sistem je bio PBS-T (10 mM rastvor soli sa fosfatnim puferom i sa 0,05% Tween 20) pH 7,4. Protočna ćelija je podešena na 25°C a blok za uzorak na 12°C, i dva puta je prajmovan propuštanjem pufera. Kao drugo, 50 nM rastvora bispecifičnog antitela je injektovano tokom 180 s pri protoku od 30 μl/min. Kao treće, hAng-2 je injektovan tokom 180 s, pri protoku od 30 µl/min. Odgovor vezivanja hAng-2 zavisi od količine bispecifičnog antitela vezanog za VEGF, i pokazuje simultano vezivanje. Površina je regenerisana ispiranjem 60 s sa 0,85% rastvorom H3PO4 pri protoku od 30 µl/min. Simultano vezivanje je dokazano dodatnim signalom specifičnog vezivanja hAng2 za bispecifična antitela <VEGF-ANG-2> prethodno vezana za VEGF. Za oba bispecifična antitela, VEGFang2-0015 i VEGFang2-0016, detektovano je simultano vezivanje VEGF i Ang2 za <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela (podaci nisu prikazani).

Tabela 5: Rezultati: Kinetički afiniteti izooblika VEGF iz različitih vrsta

Tabela 6: Rezultati: Afiniteti rastvora prema Ang2

Tabela 7: Rezultati: Afinitet prema FcRn <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela

Tabela 8: Rezultati vezivanja za FcgamaRI - IlIa

Tabela 9: Rezultati: Nezavisno vezivanje VEGF i Ang2 za <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela

Primer 4

Masena spektrometrija

Ovaj odeljak opisuje karakterizaciju <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela sa naglaskom na pravilnu strukturu. Očekivane primarne strukture su potvrđene masenom spektrometrijom sa elektrosprej jonizacijom (ESI-MS) deglikozilovanih i netaknutih, ili digestiranih pomoću IdeS (enzim S. pyogenes koji razgrađuje IgG) <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela. Digestija pomoću IdeS je obavljena sa 100 μg prečišćenog antitela inkubiranog sa 2 μg IdeS proteaze (Roche) u 100 mmol/l NaH2PO4 / Na2HPO4, pH 7,1 na 37°C tokom 5 h. Antitela su zatim deglukozilovana pomoću N-glikozidaze F, neuraminidaze i O-glikozidaze (Roche) u 100 mmol/l NaH2PO4 / Na2HPO4, pH 7,1 na 37°C tokom najviše 16 h pri koncentraciji proteina od 1 mg/ml, i zatim desalinizovana primenom HPLC tehnike na koloni Sephadex G25 (GE Healthcare). Ukupna masa je određena putem ESI-MS na maXis 4G UHR-QTOF MS sistemu (Bruker Daltonik) opremljenom TriVersa NanoMate izvorom (Advion).

Mase dobijene za molekule digestovane pomoću IdeS, deglikozilovane (Tabela 10) ili netaknute, deglikozilovane (Tabela 11) odgovaraju predviđenim masama dobijenim iz aminokiselinske sekvence za <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela koja se sastoje od dva različita laka lanca LCAng2 i LCLucentis, i dva različita teška lanca HCAng2 i HCLucentis.

Tabela 10: Mase deglikozilovanih, pomoću IdeS digestovanih bispecifičnih <VEGF/ANG2> antitela VEGFang2-0201 (bez AAA mutacije) i VEGFang2-0012 (sa AAA mutacijom)

Tabela 11: Mase deglikozilovanih <VEGF/ANG2> antitela VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijom) i VEGFang2-0015 (bez AAA mutacije)

Primer 5

Fc-Rn hromatografija

Kuplovanje za streptavidin sefarozu:

Jedan gram streptavidin sefaroze (GE Healthcare) dodat je u biotinilovani i dijalizirani receptor, i inkubiran 2 sata uz mućkanje. Sefaroza derivatizovana receptorom je napunjena u XK kolonu od 1 ml (GE Healthcare).

Hromatografija pomoću afinitetne FcRn kolone:

Uslovi:

dimenzije kolone: 50 mm x 5 mm

visina sloja: 5 cm

nanošenje: 50 µg uzorka

pufer za ekvilibraciju: 20 mM MES, sa 150 mM NaCl, podešen na pH 5,5

pufer za eluiranje: 20 mM Tris/HCl, sa 150 mM NaCl, podešen na pH 8,8

eluiranje: 7,5 zapremina kolone (CV) pufera za ekvilibraciju, u 30 CV do 100% pufera za eluiranje, 10 CV pufera za eluiranje

Afinitetna hromatografija na koloni sa hu FcRn

U sledećoj tabeli su data retenciona vremena <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela na afinitetnoj koloni koja sadrži humani FcRn. Podaci su dobijeni pri gore navedenim uslovima. U sledećoj tabeli su data retenciona vremena <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela na humanim FcRn.

Tabela 12: Rezultati: retenciona vremena <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela

Primer 6

Farmakokinetičke (FK) osobine

FK podaci sa Fc-Rn miševima transgenim za humani FcRn

U fazi života

Studija ja obuhvatila ženke miša C57BL/6J (osnova); miševe bez FcRn ali hemizigotno transgene za humani FcRn (hu-FcRn, linija 276 -/tg)

Deo 1

Svim miševima je jednom intravitrealno u desno oko injektovano 2 μL/životinji odgovarajućeg rastvora (tj. 21 μg jedinjenja/životinji (VEGFAng2-0015 (bez AAA mutacija) ili 23,6 µg jedinjenja/životinji (VEGFAng2-0016 (sa AAA mutacijama).

Miševi su podeljeni u 2 grupe sa po 6 životinja. Uzeti su uzorci krvi iz 1. grupe nakon 2 sata, 24 sata i 96 sati, a od 2. grupe 7, 48 i 168 sati nakon doziranja.

Injekcija u staklasto telo desnog oka miša izvedena je pomoću sistema mikrošprica NanoFil za nanolitarske injekcije, proizvođača World Precision Instruments, Inc., Berlin, Germany. Miševi su anestezirani sa 2,5% izoflurana, a za posmatranje mišjeg oka je korišćen mikroskop Leica MZFL 3 sa uvećanjem 40 puta, i svetlosni prsten sa svetlom Leica KL 2500 LCD. Nakon toga, 2 μL jedinjenja je injektovano kroz iglu od 35 gejdža.

Krv je uzeta preko retrobulbarnog venskog spleta suprotnog oka svake životinje za određivanje nivoa jedinjenja u serumu.

Uzorci seruma od najmanje 50 μl dobijeni su iz krvi nakon 1 sata na sobnoj temperaturi, centrifugiranjem (9300xg) na 4°C tokom 3 min. Uzorci seruma su zamrznuti odmah nakon centrifugiranja, i čuvani u zamrznutom stanju na -80°C do analize. Tretirane oči životinja su izolovane u 1. grupi 96 sati nakon tretmana, a životinja iz 2. grupe 168 sati nakon tretmana. Uzorci su čuvani u zamrznutom stanju na -80°C do analize.

Deo 2

Svim miševima je jednom intravenski putem repne vene injektovano 200 μL/životinji odgovarajućeg rastvora (tj.21 µg jedinjenja/životinji (VEGFAng2-0015 (bez AAA mutacije) ili 23,6 µg jedinjenja/životinji (VEGFAng2-0016 (sa AAA mutacijom).

Miševi su podeljeni u 2 grupe sa po 5 životinja. Uzeti su uzorci krvi iz 1. grupe nakon 1 sata, 24 sata i 96 sati, a od druge grupe nakon 7, 48 i 168 sati nakon doziranja. Krv je uzeta preko retrobulbarnog venskog spleta svake životinje za određivanje nivoa jedinjenja u serumu.

Uzorci seruma od najmanje 50 μl dobijeni su iz krvi nakon 1 sata na sobnoj temperaturi, centrifugiranjem (9300xg) na 4°C tokom 3 min. Uzorci seruma su zamrznuti odmah nakon centrifugiranja, i čuvani u zamrznutom stanju na -80°C do analize.

Priprema lizata celog oka (miševi)

Lizati oka su dobijeni fizičko-hemijskom dezintergacijom celog oka laboratorijskih životinja. Radi mehaničkog tretmana, svako oko je preneto u mikrobočicu od 1,5 ml sa konusnim dnom. Nakon zamrzavanja i otapanja, oči su jednom isprane sa 1 ml pufera za ispiranje ćelija (Bio-Rad, Bio-Plex komplet za lizu ćelija, kat. br.171-304011). U sledećem koraku, dodato je 500 ul sveže pripremljenog pufera za lizu ćelija, i oči su usitnjene pomoću tučka od 1,5 ml za usitnjavanje tkiva (Kimble Chase, tučak od 1,5ml, art. br. 749521 - -1500). Smeša je zatim zamrznuta i otopljena pet puta, i ponovo usitnjena. Da bi se lizat odvojio od preostalog tkiva, uzorci su centrifugirani 4 min na 4500 g. Posle centrifugiranja, sakupljen je supernatant i čuvan na -20°C do dalje analize ELISA kvantifikacijom.

Analiza

Koncentracije <VEGF/ANG2> antitela u serumu i lizatima oka miševa određene su pomoću testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA).

Za kvantifikaciju <VEGF/ANG2> antitela u serumu i lizatima oka miševa, prilikom hvatanja i detektovanja antitela korišćen je standardni serijski sendvič test u čvrstoj fazi sa biotinilovanim i digoksigenovanim monoklonskim antitelima. Da bi se proverio integritet bispecifičnosti analita, biotinilovano uhvaćeno antitelo prepoznaje anti-VEGF vezujuće mesto, dok će se digoksigenovano detekciono antitelo vezati za anti-Ang2 vezujuće mesto analita. Vezani imuni kompleks uhvaćenog antitela, analita i detekcionog antitela na čvrstoj fazi

1

mikrotitarske ploče pokrivene streptavidinom (SA-MTP) je onda detektovan pomoću peroksidaze rena kuplovane za anti-digoksigenin antitelo. Nakon ispiranja nevezanog materijala sa SA-MTP i dodatka ABTS supstrata, dobijeni signal je srazmeran količini analita vezanog za čvrstu fazu SA-MTP. Kvantifikacija je izvršena konvertovanjem izmerenih signala uzoraka u koncentracije poređenjem sa paralelno analiziranim kalibratorima.

U prvom koraku, SA-MTP je prevučen sa 100µL/bunarčiću biotinilovanog rastvora za hvatanje antitela (mAb<Id<VEGF>>M-2.45.51-IgG-Bi(DDS)) sa koncentracijom od 1µg/ml tokom jednog sata, na 500 o/min na MTP šejkeru. U međuvremenu su pripremljeni kalibratori, uzorci za kontrolu kvaliteta (KK) i uzorci. Kalibratori i KK uzorci su razblaženi do 2% matrice seruma; uzorci su razblaživani dok signali nisu dospeli u linearni opseg kalibratora.

Nakon prevlačenja SA-MTP antitelom za hvatanje, ploča je tri puta isprana puferom za ispiranje i 300 µl/bunarčiću. Zatim je 100 µl/bunarčiću kalibratora, KK uzoraka i uzoraka pipetirano na SA-MTP i inkubirano ponovo jedan sat na 500 o/min. Analit je sada vezan svojim anti-VEGF vezujućim mestom preko antitela za hvatanje za čvrstu fazu SA-MTP. Posle inkubacije i uklanjanja nevezanog analita ispiranjem ploče, 100µL/bunarčiću prvog detekcionog antitela (mAb<Id-<Ang2>>M-2.6.81-IgG-Dig(XOSu)) sa koncentracijom od 250 ng/ml dodato je u SA-MTP. Ploča je ponovo inkubirana jedan sat na 500 o/min na šejkeru. Posle ispiranja, 100µL/bunarčiću drugog detekcionog antitela (pAb<digoksigenin>S-Fab-POD (poli)) sa koncentracijom od 50 mU/ml dodato je u bunarčiće SA-MTP, i ploča je ponovo inkubirana jedan sat na 500 o/min. Nakon krajnjeg koraka ispiranja radi uklanjanja viška detekcionog antitela, dodato je 100 µl/bunarčiću supstrata (ABTS). Konjugat antitelo-enzim katalizuje bojenu reakciju ABTS® supstrata. Signal je zatim meren ELISA čitačem na 405 nm (referentna talasna dužina: 490 nm ([405/490] nm)).

Farmakokinetička procena

Farmakokinetički parametri su izračunati nekompartmentalnom analizom, pomoću programa za farmakokinetičku evaluaciju WinNonlinTM (Pharsight), verzija 5.2.1.

Rezultati: A) Koncentracije u serumu

Rezultati za koncentracije u serumu prikazani su u Tabelama 13 do 16, i na Sl.7B do 7C

2

Tabela 13: VEGFAng2-0015 (bez AAA mutacije): Poređenje koncentracija u serumu posle intravitrealne i intravenske primene

Tabela 14: VEGFAng2-0016 (sa AAA mutacijom): Poređenje koncentracija u serumu posle intravitrealne i intravenske primene

Tabela 15: VEGFang2-0015 (bez AAA mutacije) i VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijom): Poređenje koncentracija u serumu posle intravitrealne primene

Tabela 16: VEGFang2-0015 (bez AAA mutacije) i VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijom): Poređenje koncentracija u serumu posle intravenske primene

Rezultati: B) Koncentracije u lizatu levog i desnog oka

Rezultati koncentracija u lizatu oka prikazani su u Tabelama 17 do 18, i na Slikama 7D do 7E

4

Tabela 17a Koncentracije VEGFang2-0015 (bez AAA mutacije) u lizatima oka nakon intravitrealne primene u desno oko

Tabela 17b: Koncentracije VEGFang2-0015 (bez AAA mutacije) u lizatima oka nakon intravenske primene

Tabela 18a Koncentracije VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijom) u lizatima oka nakon intravitrealne primene u desno oko

Tabela 18b: Koncentracije VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijom) u lizatima oka nakon intravenske primene

Sažetak rezultata:

Nakon intravitrealne primene, bispecifično <VEGF/ANG2> antitelo prema pronalasku VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijom) pokazuje slične koncentracije (nakon 96 i 168 sati) u lizatima oka u poređenju sa bispecifičnim <VEGF/ANG2> antitelom bez AAA mutacije VEGFang2-0015.

Takođe, nakon intravitrealne primene, bispecifično <VEGF/ANG2> antitelo prema pronalasku VEGFang2-0016 (sa AAA mutacijom) pokazuje pored toga brži klirens i kraći poluživot u serumu u poređenju sa bispecifičnim <VEGF/ANG2> antitelom bez AAA mutacije VEGFang2-0015.

Primer 7

Test mikrodžepova sa angiogenezom u rožnjači miša

Da bi se ispitao anti-angiogeni efekat bispecifičnog <VEGF/ANG2> antitela sa odgovarajućim anti-VEGF VH i VL SEQ ID NO.: 7 i 8, i anti-ANG2 VH i VL SEQ ID NO.: 15 i 16 na VEGF-indukovanu angiogenezu in vivo, uradili smo test angiogeneze na rožnjači miša. U tom testu, Nylaflo disk natopljen sa VEGF implantiran je u džep avaskularne rožnjače na fiksnom rastojanju od limbalnih krvnih sudova. Krvni sudovi odmah urastaju u rožnjaču prema gradijentu VEGF.8 do 10 nedelja stare ženke Balb/c miševa su nabavljene od Charles River, Sulzfeld, Germany. Protokol je izmenjen prema metodi koju je opisao Rogers, M.S., et al., Nat. Protoc. 2 (2007) 2545-2550. Ukratko, mikrodžepovi širine oko 500 μm su pripremljeni pod mikroskopom na oko 1 mm od limbusa do vrha rožnjače pomoću skalpela i oštre pincete u anesteziranom mišu. Disk (Nylaflo®, Pall Corporation, Michigan) prečnika 0,6 mm je implantiran, i površina implantirane površine je poravnata. Diskovi su inkubirani u odgovarajućem faktoru rasta ili vehikulumu tokom najmanje 30 min. Nakon 3, 5 i 7 dana (ili alternativno samo nakon 3, 5 ili 7 dana) oči su fotografisane, i izmeren je vaskularni odgovor. Test je kvantifikovan izračunavanjem procenta površine novih krvnih sudova po ukupnoj površini rožnjače.

Na diskove je naneto 300 ng VEGF ili PBS kao kontrola, i implantirani su na 7 dana. Prorastanje krvnih sudova iz limbusa do diska praćeno je tokom vremena 3, 5. i 7. dana. Jedan dan pre implantacije diska, antitela su data intravenski u dozi od 10 mg/kg (zbog intravenske primene, VEGFang2-0015 stabilna u serumu (bez AAA mutacije) koja se razlikuju od VEGFang2-0016 samo po AAA mutaciji, i imaju iste VEGF i anti-ANG2 VH i VL za posredovanje u efikasnosti, korišćena su kao zamena) za ispitivanje anti-angiogenog efekta na VEGF-indukovanu angiogenezu in vivo. Životinje u kontrolnoj grupi primaju vehikulum. Aplikaciona zapremina je 10 ml/kg.

LISTA SEKVENCI

1

2

4

�

2

�

1

�

4

�

11

12

1

14

1

�

1

�

�

11

11

11

11

11

11

11

12

��

12

��

��

12

12

1

11

��

1

��

�

1

1

1

1

��

��

14

14

14

14

��

1

11

��

�

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Postupak za smanjenje viskoziteta antitela, pri čemu antitelo sadrži konstantni region teškog lanca humane potklase IgG1, pri čemu postupak obuhvata

modifikaciju konstantnog regiona teškog lanca antitela humane potklase IgG1 mutacijama I253A, H310A i H435A, numeracija prema Kabatovom EU indeksu;

i pri čemu je antitelo bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF, i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, pri čemu,

i) pomenuto prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF sadrži u varijabilnom domenu teškog lanca CDR3H region SEQ ID NO.: 1, CDR2H region SEQ ID NO.: 2, i CDR1H region SEQ ID NO.: 3, i u varijabilnom domenu lakog lanca CDR3L region SEQ ID NO.: 4, CDR2L region SEQ ID NO.: 5, i CDR1L region SEQ ID NO.: 6; i

ii) pomenuto drugo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za ANG-2 sadrži u varijabilnom domenu teškog lanca CDR3H region SEQ ID NO.: 9, CDR2H region SEQ ID NO.: 10, i CDR1H region SEQ ID NO.: 11, i u varijabilnom domenu lakog lanca CDR3L region SEQ ID NO.: 12, CDR2L region SEQ ID NO.: 13, i CDR1L region SEQ ID NO.: 14.

2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu, bispecifično antitelo je dalje modifikovano mutacijama L234A, L235A i P329G, numeracija prema Kabatovom EU indeksu.

3. Bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2,

pri čemu,

i) pomenuto prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za VEGF sadrži u varijabilnom domenu teškog lanca CDR3H region SEQ ID NO.: 1, CDR2H region SEQ ID NO.: 2, i CDR1H region SEQ ID NO.: 3, i u varijabilnom domenu lakog lanca CDR3L region SEQ ID NO.: 4, CDR2L region SEQ ID NO.: 5, i CDR1L region SEQ ID NO.: 6, i

ii) pomenuto drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za ANG-2 sadrži u varijabilnom domenu teškog lanca CDR3H region SEQ ID NO.: 9, CDR2H region SEQ ID NO.: 10, i CDR1H region SEQ ID NO.: 11, i u varijabilnom domenu lakog lanca CDR3L region SEQ ID NO.: 12, CDR2L region SEQ ID NO.: 13, i CDR1L region SEQ ID NO.: 14, i pri čemu,

iii) bispecifično antitelo sadrži konstantni region teškog lanca humane potklase IgG1 koji sadrži mutacije I253A, H310A, i H435A, numeracija prema Kabatovom EU indeksu.

4. Bispecifično antitelo prema zahtevu 3, pri čemu

i) pomenuto prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za VEGF sadrži kao varijabilni domen teškog lanca VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 7, i kao varijabilni domen lakog lanca VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 8, i

ii) pomenuto drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za ANG-2 sadrži kao varijabilni domen teškog lanca VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 15, i kao varijabilni domen lakog lanca VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 16.

5. Bispecifično antitelo prema zahtevu 3, pri čemu, konstantni region teškog lanca potklase IgG1 dalje sadrži mutacije L234A, L235A i P329G, numeracija prema Kabatovom EU indeksu.

6. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 3 do 5.

7. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 3 do 5, za primenu u lečenju vaskularnih bolesti oka.

8. Bispecifično antitelo za primenu prema zahtevu 7, pri čemu, antitelo se daje putem intravitrealne primene.

9. Nukleinska kiselina koja kodira bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 3 do 5.

1

10. Ekspresioni vektor koji sadrži pomenutu nukleinsku kiselinu prema zahtevu 9, sposoban da eksprimira pomenutu nukleinsku kiselinu u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji domaćinu.

11. Prokariotska ili eukariotska ćelija domaćin koja sadrži vektor prema zahtevu 10.

12. Metodu za dobijanje bispecifičnog antitela prema bilo kom od zahteva 3 do 5

koja sadrži sledeće korake

a) transformisanje ćelije domaćina vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju pomenuto antitelo;

b) uzgajanje ćelije domaćina pod uslovima koji omogućavaju sintezu pomenutog molekula antitela; i

c) izdvajanje pomenutog molekula antitela iz pomenute kulture.

13. Bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 25, SEQ ID NO.: 26, SEQ ID NO.: 27, i SEQ ID NO.: 28.

14. Bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF i drugo antigen-vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, naznačeno time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO.: 21, SEQ ID NO.: 22, SEQ ID NO.: 23, i SEQ ID NO.: 24.

15. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 13 do 14, za primenu u lečenju vaskularnih bolesti oka.

16. Bispecifično antitelo za primenu prema zahtevu 16, pri čemu, antitelo se daje putem intravitrealne primene.

1