RS62509B1

RS62509B1 - Bispecifična anti-vegf/anti-ang-2 antitela i njihova upotreba u lečenju očnih vaskularnih bolesti

Info

Publication number: RS62509B1
Application number: RS20211296A
Authority: RS
Inventors: Harald Duerr; Frank Herting; Christian Klein; Joerg Thomas Regula; Matthias Rueth; Kay-Gunnar Stubenrauch
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2012-07-13
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2021-11-30
Also published as: US10683345B2; FIC20230011I1; CR20140542A; SI2872534T1; CY1124681T1; LTPA2023507I1; EA201500132A1; FR23C1010I1; JP2021036888A; CN104428315B; ES2896493T3; JP2017140038A; CY2023005I1; JP2015527064A; HRP20181595T1; NL301218I1; JP2020062036A; TWI506036B; CL2017002146A1; US9695233B2

Description

OPIS

Predmetni pronalazak se odnosi na metodu za smanjenje viskoziteta antitela (uključujući bispecifično antitelo) potklase humanog IgG1 ili humanog IgG4, na bispecifična antitela na humani vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF/VEGF-A) i na humani angiopoetin-2 (ANG-2), metode za njihovu proizvodnju, farmaceutske kompozicije koje sadrže navedena antitela, i njihovu primenu.

Osnova pronalaska

Angiogeneza je uključena u patogenezu različitih poremećaja koji uključuju solidne tumore, intraokularne neovaskularne sindrome, kao što su proliferativne retinopatije ili starosna degeneracija makule (AMD), reumatoidni artritis i psorijazu (Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934; Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239; i Garner, A., Vascular diseases, u: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., i Klintworth, G. K. (eds.), 2. izdanje, Marcel Dekker, New York (1994), str.1625-1710).

Ranibizumab (trgovački naziv Lucentis®) je fragment monoklonskog antitela dobijen od istog matičnog mišjeg antitela kao bevacizumab (Avastin). Međutim, afinitetno je sazreo kako bi se obezbedilo jače vezivanje za VEGF-A (WO 98/45331). Poznato je da blokiranje VEGF-A može biti povezano sa nekim sistemskim toksičnostima, te stoga ranibizumabu nedostaje Fc deo kako bi se smanjio poluživot u serumu i posledično sistemske toksičnosti. On je antiangiogeni agens koji je odobren za lečenje „vlažnog” oblika starosne degeneracije makule (ARMD), što je uobičajeni oblik starosnog gubitka vida.

Testovi angiogeneze rožnjače pokazuju da i ANG-1 i ANG-2 imaju slično dejstvo i deluju sinergijski sa VEGF u promovisanju rasta novih krvnih sudova. Asahara, T., et al., Circ. Res. 83 (1998) 233-40. Na mogućnost postojanja endotelnog odgovora zavisnog od doze ukazuje zapažanje da pri velikim koncentracijama in vitro ANG-2 takođe može biti proangiogen (Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52). U velikoj koncentraciji, ANG-2 deluje kao faktor preživljavanja apoptoze za endotelne ćelije tokom apoptoze kod lišavanja seruma aktivacijom Tie2 putem PI-3 kinaze i Akt puta (Kim, I., et al., Oncogene 19 (2000) 4549-52).

WO 2010/040508 A9 i WO 2011/117329 se odnose na bispecifična anti-VEGF/anti-ANG-2 antitela. WO 2008/132568 se odnosi na fuzione proteine koji se vezuju za faktore rasta. WO 2009/136352 se odnosi na antiangiogena jedinjenja. WO 2009/080253 i WO 2011/117330 se odnose na formate bispecifičnih dvovalentnih antitela. WO 2010/069532 se odnosi na Ang2 antitela.

Očne vaskularne bolesti, poput senilne degeneracije makule (ARMD) i dijabetičke retinopatije (DR), uzrokovane su abnormalnom neovaskularizacijom sudnjače, odnosno mrežnjače. One su glavni uzroci gubitka vida u industrijalizovanim zemljama. Budući da se mrežnjača sastoji od dobro definisanih slojeva neuronskih, glijalnih i vaskularnih elemenata, relativno mali poremećaji, kao što su oni uočeni kod vaskularne proliferacije ili edema, mogu dovesti do značajnog gubitka funkcije vida. Nasledne degeneracije mrežnjače, kao što je retinitis pigmentoza (RP), takođe su povezane sa vaskularnim abnormalnostima, kao što je sužavanje arteriola i vaskularna atrofija. Javljaju se čak kod 1 od 3500 osoba i karakteriše ih progresivno noćno slepilo, gubitak vidnog polja, atrofija optičkog nerva, arteriolarno slabljenje i centralni gubitak vida koji često napreduje do potpunog slepila.

Ishemijske retinopatije karakteriše gubitak ili disfunkcija vaskulature mrežnjače, što dovodi do smanjenog protoka krvi i hipoksije. Mrežnjača reaguje na hipoksiju stvaranjem signala za rast novih krvnih sudova, ali ti novi krvni sudovi su obično krhki i neorganizovani. Rast ovih abnormalnih novih krvnih sudova predstavlja najveću pretnju po vid pošto oni mogu da procure, krvare ili dovedu do stvaranja ožiljačnog tkiva, što može dovesti do ablacije mrežnjače. Postojeća lečenja za ishemijske retinopatije pokušavaju da zaustave rast patoloških krvnih sudova, ali se ne bave postojećom ishemijom koja pokreće njihov rast. Nadalje, standardno lečenje za dijabetičku retinopatiju, ishemijsku retinopatiju koja se javlja kod miliona ljudi, uključuje uništavanje dela mrežnjače laserom u pokušaju da se spreči rast novih krvnih sudova i očuva centralni vid. Različite strategije su korišćene da se blokira funkcija vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF), koji je značajan promoter rasta krvnih sudova. Kratkoročno, anti-VEGF terapija može da poboljša vid, ali ne otklanja postojeću ishemiju i zapravo može da pogorša ovo stanje jer inhibira rast svih krvnih sudova, uključujući korisne kolateralne. Postoji i ozbiljna zabrinutost zbog sistemske izloženosti ovim lekovima kod starijih osoba i/ili dijabetičara, gde rast novih krvnih sudova može biti potreban kod ishemijskog mozga, srca ili udova.

Za očne bolesti se tipično koriste mali fragmenti antitela poput Fab ili Fab(2) putem intravitrealne primene pošto imaju kratak poluživot u serumu, a rizik od sistemskih toksičnosti je manji. Međutim, ovi manji fragmenti tipično imaju i kraći intravitrealni poluživot (npr. zbog brže difuzije u serum) i tipično moraju češće da se doziraju.

Kim et al, Molecular Vision, 15 (2009) 2803-2812 odnosi se na antitela kompletne dužine koja se intravitrealno primenjuju na oko, pri čemu je IgG sa vezivanjem FcRn eliminisan u krvi miševa divljeg tipa, dok IgY bez FcRn vezivanja nije eliminisan u krvnom sistemu. Nadalje, IgG sa vezivanjem FcRn nije eliminisan u krvnom sistemu miševa sa izbačenim FcRn.

U struci postoji potreba za boljim sredstvima za lečenje i prevenciju različitih očnih vaskularnih bolesti, poput ishemijskih retinopatija.

Rezime pronalaska

Pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo za upotrebu u lečenju očne vaskularne bolesti, pri čemu je očna vaskularna bolest dijabetička retinopatija, dijabetički edem makule, starosna degeneracija makule,

pri čemu bispecifično antitelo sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za VEGF i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za ANG-2, pri čemu

i) navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za VEGF u varijabilnom domenu teškog lanca sadrži region CDR3H SEQ ID NO: 1, region CDR2H SEQ ID NO: 2, i region CDR1H SEQ ID NO:3, i u varijabilnom domenu lakog lanca region CDR3L SEQ ID NO: 4, region CDR2L SEQ ID NO:5, i region CDR1L SEQ ID NO:6; i ii) navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za ANG-2 u varijabilnom domenu teškog lanca sadrži region CDR3H SEQ ID NO: 9, region CDR2H SEQ ID NO: 10, i region CDR1H SEQ ID NO: 11, i u varijabilnom domenu lakog lanca region CDR3L SEQ ID NO: 12, region CDR2L SEQ ID NO: 13, i region CDR1L SEQ ID NO: 14, i pri čemu

iii) bispecifično antitelo sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG1 humanog porekla koji sadrži mutacije I253A, H310A i H435A, numeracija prema Kabatovom EU indeksu.

U jednom otelotvorenju, navedeno bispecifično antitelo je okarakterisano time što je konstantni region teškog lanca pod iii) humane potklase IgG1. U jednom otelotvorenju, navedeno bispecifično antitelo potklase IgG1 je okarakterisano time što konstantni region teškog lanca potklase IgG1 dalje sadrži mutacije L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu)

U jednom otelotvorenju pronalaska, bispecifično antitelo je dvovalentno i sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 i SEQ ID NO: 28.

Dalji aspekt pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži navedeno bispecifično antitelo za upotrebu u lečenju očnih vaskularnih bolesti, pri čemu su očne vaskularne bolesti dijabetička retinopatija, dijabetički edem makule ili starosna degeneracija makule.

U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži navedeno bispecifično antitelo se daje putem intravitrealne primene.

Antitela za upotrebu prema pronalasku imaju veoma korisna svojstva zbog svojih specifičnih modifikacija u Fc delu / konstantnom regionu, što dovodi do koristi za pacijenta koji boluje od vaskularne bolesti oka. Ona pokazuju veliku stabilnost u intravitrealnom okruženju i usporavaju difuziju iz oka (u poređenju sa manjim fragmentima antitela bez konstantnog regiona teškog lanca), gde se aktuelna bolest nalazi i leči (tako da se raspored lečenja potencijalno može poboljšati u odnosu na antitela koja nisu IgG, poput npr. Fab i (Fab)2 fragmenata). Poluživot u oku nakon intravitrealne primene antitela sa mutacijama I253A, H310A i H435A u konstantnom regionu (bez vezivanja FcRn) iznenađujuće je bio sličan (samo malo kraći) u poređenju sa nemodifikovanim IgG antitelima (tabele 17a i 18a i slike 7D i 7E), dok je difuzija iz oka u krvni serum bila slična (Tabela 15 i Sl. 7B). To je izuzetno značajno pošto je za lečenje vaskularnih bolest oka povezanih sa ANG2 i/ili VEGF poželjno da se VEGF i Ang2 eliminišu iz oka (npr. putem transporta u krvni serum kao kompleks anti-ANG2/ANG2 antitelo ili kompleks anti-VEGF/VEGF antitelo). Sa druge strane, antitela prema pronalasku se veoma brzo uklanjaju iz seruma u poređenju sa nemodifikovanim IgG antitelima (što je veoma poželjno, da bi se smanjila potencijalna neželjena dejstva koja nastaju usled sistemskog izlaganja).

Iznenađujuće, ona takođe pokazuju manji viskozitet (vidite Sliku 2) (u poređenju sa verzijama bez mutacija I253A, H310A i H435A u konstantnom regionu) i stoga su posebno korisna za intravitrealnu primenu kroz tanke igle tokom lečenja bolesti oka (za takvu primenu koriste se tipično tanke igle i visok viskozitet otežava odgovarajuću primenu). Manji viskozitet takođe omogućava veće koncentracije formulacija.

Takođe je iznenađujuće da antitela za upotrebu prema pronalasku pokazuju manju sklonost ka agregaciji (Sl. 4) tokom skladištenja (u poređenju sa verzijama bez mutacija I253A, H310A i H435A u Fc delu) koja je kritična za intravitrealnu primenu u oku (jer agregacija u oku može da dovede do komplikacija tokom takvog lečenja). Bispecifična antitela prema pronalasku pokazuju dobru efikasnost u inhibiciji vaskularnih bolesti.

U određenim otelotvorenjima, bispecifična antitela za upotrebu prema pronalasku zbog svojih specifičnih modifikacija u konstantnom regionu (npr. P329G LALA) pokazuju vredna svojstva, kao što je nepostojanje vezivanja za receptore Fcgama, što smanjuje rizik od neželjenih dejstava kao što su tromboza i/ili neželjena ćelijska smrt (npr., usled ADCC) Opis slika

Slika 1 Šema koncepta i prednosti <VEGF-ANG-2> IgG1 ili IgG4 antitela sa mutacijama AAA (mutacije I253A, H310A i H435A – numeracija prema Kabatovom EU indeksu)

Slika 2 Merenje viskoziteta na bazi malog obima DLS Ekstrapolirani viskozitet na 150 mg/ml u 200 mM argininu/sukcinatu, pH 5,5 (poređenje <VEGF-ANG-2> antitela prema pronalasku VEGFang2-0016 (sa mutacijama AAA) sa referentnim VEGFang2-0015 (bez takvih mutacija AAA)

Slika 3 Agregacija DLS u zavisnosti od temperature (uključujući početnu temperaturu agregacije DLS) u 20 mM His, 140 mM NaCl, pH 6,05 (poređenje <VEGF-ANG-2> antitela prema pronalasku VEGFang2-0016 (sa mutacijama AAA) sa referentnim VEGFang2-0015 (bez takvih mutacija AAA)

Slika 47-dnevno skladištenje na 40 °C pri 100 mg/ml (smanjenje glavne i velike molekulske mase / HMW) povećanje) (poređenje <VEGF-ANG-2> antitela prema pronalasku VEGFang2-0016 (sa mutacijama AAA) koja pokazuju manju agregaciju sa referentnim VEGFang2-0015 (bez takvih mutacija AAA))

Slika 5A Afinitet stanja mirovanja FcRn prema VEGFang2-0015 (bez mutacija AAA): preklapanje Biacore senzorgrama pri različitim koncentracijama pokazuje vezivanje VEGFang2-0015 zavisno od koncentracije (bez mutacija AAA) za FcRn

Slika 5B Afinitet stanja mirovanja FcRn A: VEGFang2-0015 (bez mutacija AAA): kriva odgovora na vezivanje zavisno od doze VEGFang2-0015 (bez AAA mutacija) pokazuje vezivanje za FcRn

Slika 5C Afinitet stanja mirovanja FcRn VEGFang2-0016 (sa mutacijama AAA): preklapanje Biacore senzorgrama pri različitim koncentracijama ne pokazuje vezivanje za FcRn pri svim koncentracijama

Slika 5D Afinitet stanja mirovanja FcRn VEGFang2-0016 (sa mutacijama AAA): kriva odgovora na vezivanje zavisno od doze VEGFang2-0016 (sa mutacijama AAA) ne pokazuje vezivanje za FcRn

Slika 5E Afinitet stanja mirovanja FcRn VEGFang2-0016 (sa mutacijama AAA): kriva odgovora na vezivanje zavisno od doze VEGFang2-0016 (sa mutacijama AAA) ne pokazuje vezivanje za FcRn (raspon odgovora od -0,6 do 0,2 RU/skala koncentracije u rasponu od 0 do 0,35 M)

Slika 6 Merenje FcgamaRIIIa interakcija VEGFang2-0015 bez mutacija AAA i VEGFang2-0016 sa mutacijama AAA (oba su potklase IgG1 sa mutacijama P329G LALA; kao kontrole su korišćeni Anti-Dig potklase IgG1 i antitelo na bazi IgG4)

Slika 7A Šema principa Pk-ELISA testa za određivanje koncentracija <VEGF/Ang2> bispecifičnih antitela u serumu i celim lizatima oka

Slika 7B Koncentracija u serumu nakon intravenske primene: Poređenje jedinjenja –VEGFang2-0015 bez mutacija AAA i VEGFang2-0016 sa mutacijama AAA Slika 7C Koncentracija u serumu nakon intravitrealne primene: Poređenje jedinjenja –VEGFang2-0015 bez mutacija AAA i VEGFang2-0016 sa mutacijama AAA Slika 7D Koncentracija VEGFang2-0016 (sa mutacijom AAA) u lizatima oka, u desnom i levom oku (nakon intravitrealne primene samo u desno oko u poređenju sa intravenskom primenom): Značajne koncentracije su otkrivene samo u desnom oku nakon intravitrealne primene. Nakon intravenske primene, nisu mogle da se otkriju koncentracije u lizatima oka usled malog poluživota VEGFang2-0016 (sa mutacijom AAA) u serumu Slika 7E Koncentracija VEGFang2-0015 (bez mutacije AAA) u lizatima oka, u desnom i levom oku (nakon intravitrealne primene samo u desno oko u poređenju sa intravenskom primenom): U desnom oku (i donekle u levom oku) nakon intravitrealne primene mogu se otkriti koncentracije VEGFang2-0015. To ukazuje na difuziju iz desnog oka u serum i odatle u levo oko, što može da se objasni dugačkim poluživotom VEGFang2-0015 (bez mutacije AAA). Nakon intravenske primene, takođe mogu da se otkriju značajne koncentracije u lizatima oba oka usled difuzije VEGFang2-0015 stabilnog u serumu u oči (bez mutacije AAA)

Detaljan opis pronalaska

U jednom otelotvorenju pronalaska, bispecifično antitelo prema pronalasku je dvovalentno.

U jednom aspektu pronalaska, takvo bispecifično, dvovalentno antitelo prema pronalasku je okarakterisano time što sadrži

a) teški lanac i laki lanac prvog antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za VEGF;

b) modifikovani teški lanac i modifikovani laki lanac drugog antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za ANG-2, pri čemu su konstantni domeni CL i CH1 međusobno zamenjeni.

Ovaj format bipecifičnog, dvovalentnog antitela za bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za humani vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) i humani angiopoetin-2 (ANG-2) opisan je u WO 2009/080253 (uključujući CH3 domene sa modifikacijama dugme u rupici). Antitela na bazi ovog formata bispecifičnog, dvovalentnog antitela se nazivaju CrossMab.

U jednom otelotvorenju, takvo bispecifično, dvovalentno antitelo je okarakterisano time što sadrži

a) kao teški lanac prvog antitela kompletne dužine aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i kao laki lanac prvog antitela kompletne dužine aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27, i

b) kao modifikovani teški lanac drugog antitela kompletne dužine aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, i kao modifikovani laki lanac drugog antitela kompletne dužine aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28.

Prema jednom otelotvorenju pronalaska je bispecifično, dvovalentno antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, okarakterisano time što sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 i SEQ ID NO: 28.

U jednom otelotvorenju, CH3 domeni bispecifičnog, dvovalentnog antitela prema pronalasku su izmenjeni tehnologijom „dugme u rupici” koja je detaljno opisana sa nekoliko primera, npr. u WO 96/027011, Ridgway J.B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; i Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681. U ovoj metodi, površine interakcije dva CH3 domena su izmenjene kako bi se povećala heterodimerizacija oba teška lanca koji sadrže ova dva CH3 domena. Svaki od dva CH3 domena (iz dva teška lanca) može biti „dugme”, dok je drugi „rupica”. Uvođenje disulfidnog mosta stabilizuje heterodimere (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol.270 (1997) 26–35) i povećava prinos.

U poželjnom aspektu pronalaska, sva bispecifična antitela prema pronalasku su okarakterisana time što

se CH3 domen jednog teškog lanca i CH3 domen drugog teškog lanca susreću na međupovršini koja sadrži originalnu međupovršinu između CH3 domena antitela;

pri čemu je navedena međupovršina izmenjena tako da podstiče formiranje bispecifičnog antitela, pri čemu je promena okarakterisana time što:

a) CH3 domen jednog teškog lanca je izmenjen,

tako da, unutar originalne međupovršine CH3 domena jednog teškog lanca koji se susreće sa originalnom međupovršinom CH3 domena drugog teškog lanca unutar bispecifičnog antitela,

aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veću zapreminu bočnog lanca, usled čega nastaje izbočina u međupovršini CH3 domena jednog teškog lanca koja se može pozicionirati u šupljinu u međupovršini CH3 domena drugog teškog lanca

i

b) CH3 domen drugog teškog lanca je izmenjen,

tako da unutar originalne međupovršine drugog CH3 domena koji se susreće sa originalnom međupovršinom CH3 domena unutar bispecifičnog antitela

aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manju zapreminu bočnog lanca, čime se generiše šupljina u međupovršini drugog CH3 domena u koju se može pozicionirati izbočina u međupovršini prvog CH3 domena.

Prema tome, antitelo prema pronalasku je poželjno okarakterisano time što

CH3 domen teškog lanca antitela kompletne dužine a) i CH3 domen teškog lanca antitela kompletne dužine b) se susreću na međupovršini koja sadrži izmenu u originalnoj međupovršini između CH3 domena antitela;

pri čemu i) u CH3 domenu jednog teškog lanca

i pri čemu

ii) u CH3 domenu drugog teškog lanca

Poželjno je da navedeni aminokiselinski ostatak koji ima veću zapreminu bočnog lanca bude izabran iz grupe koja se sastoji od arginina (R), fenilalanina (F), tirozina (Y), triptofana (W).

Poželjno je da navedeni aminokiselinski ostatak koji ima manju zapreminu bočnog lanca bude izabran iz grupe koja se sastoji od alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).

U jednom aspektu ovog pronalaska, oba CH3 domena su dalje izmenjena uvođenjem cisteina (C) kao aminokiseline u odgovarajuće položaje svakog CH3 domena, tako da se može formirati disulfidni most između oba CH3 domena.

U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži mutaciju T366W u CH3 domenu „lanca sa dugmetom” i mutacije T366S, L368A, Y407V u CH3 domenu „lanca sa rupicom”.

Takođe može da se koristi dodatni međulančani disulfidni most između CH3 domena (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681), npr. uvođenjem mutacije Y349C u CH3 domen „lanca sa dugmetom” i mutacije E356C ili mutacije S354C u CH3 domen „lanca sa rupicom”.

U drugom otelotvorenju, bispecifično antitelo prema pronalasku sadrži mutacije Y349C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije E356C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva CH3 domena. U drugom poželjnom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži mutacije Y349C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva CH3 domena (dodatna mutacija Y349C u jednom CH3 domenu i dodatna mutacija E356C ili S354C u drugom CH3 domenu koji formira međulančani disulfidni most) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Takođe, alternativno ili dodatno se mogu koristiti i druge tehnologije „dugme u rupici” kao što su opisane u EP 1 870 459 A1. Tako, još jedan primer za bispecifično antitelo su mutacije R409D, K370E u CH3 domenu „lanca sa dugmetom“ i mutacije D399K, E357K u CH3 domenu „lanca sa rupicom” (numeracija uvek prema Kabatovom EU indeksu (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

U drugom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži mutaciju T366W u CH3 domenu „lanca sa dugmetom” i T366S, L368A i Y407V mutacije u CH3 domenu „lanca sa rupicom” i dodatno mutacije R409D, K370E u CH3 domenu „lanca sa dugmetom” i mutacije D399K, E357K u CH3 domenu „lanca sa rupicom”.

U drugom otelotvorenju, bispecifično antitelo sadrži mutacije Y349C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva CH3 domena, ili navedeno trovalentno, bispecifično antitelo sadrži mutacije Y349C, T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C, T366S, L368A, Y407V u drugom od dva CH3 domena i dodatno mutacije R409D, K370E u CH3 domenu „lanca sa dugmetom” i mutacije D399K, E357K u CH3 domenu „lanca sa rupicom”.

U jednom otelotvorenju pronalaska, bispecifično antitelo prema pronalasku je okarakterisano time što ima jedno ili više od sledećih svojstava (određeno u testovima kako je opisano u Primeru 6

- pokazuje nižu koncentraciju u serumu u poređenju sa bispecifičnim antitelom bez mutacija opisanim pod iii) (96 sati nakon intravitrealne primene na miševima, pri čemu su miševi sa nedostatkom FcRn, ali hemizigotno transgeni za humani FcRn);

1

- pokazuje sličnu (faktor 0,8 do 1,2) koncentraciju u lizatima celog desnog oka u poređenju sa odgovarajućim bispecifičnim antitelom bez mutacija opisanih pod iii) (kod miševa, pri čemu su miševi sa nedostatkom FcRn, ali hemizigotno transgeni za humani FcRn, 96 sati nakon intravitrealne primene u desno oko).

U jednom otelotvorenju, bispecifično, dvovalentno antitelo je okarakterisano time što sadrži

prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, okarakterisano time što i) navedeno prvo antigen vezujuće mesto sadrži kao varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 7 i varijabilni domen lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 8; i

ii) navedeno drugo antigen vezujuće mesto sadrži kao varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 15 i kao varijabilni domen lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 16; i iii) bispecifično antitelo sadrži konstantni region teškog lanca potklase IgG1 ili IgG4 (humanog porekla i) koji sadrži mutacije I253A, H310A i H435A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu)

i koje ima jedno ili više od sledećih svojstava (određeno u testovima kako je opisano u Primeru 6

- pokazuje nižu koncentraciju u serumu u poređenju sa odgovarajućim bispecifičnim antitelom bez mutacija opisanih pod iii) (96 sati nakon intravitrealne primene na miševima, pri čemu su miševi sa nedostatkom FcRn, ali hemizigotno transgeni za humani FcRn);

U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo je okarakterisano time što sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani VEGF i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za humani ANG-2, okarakterisano time što

i) navedeno prvo antigen vezujuće mesto sadrži kao varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 7 sa 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskih ostataka, i kao varijabilni domen lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 8 sa 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskih ostataka; i ii) navedeno drugo antigen vezujuće mesto sadrži kao varijabilni domen teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 15 sa 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskih ostataka, i kao varijabilni domen lakog lanca (VL) SEQ ID NO: sa 1, 2 ili 3 supstitucije aminokiselinskih ostataka; i

iii) bispecifično antitelo sadrži konstantni region teškog lanca potklase IgG1 ili IgG4 (humanog porekla i) koji sadrži mutacije I253A, H310A i H435A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu)

Kako se ovde koristi, „antitelo” se odnosi na vezujući protein koji sadrži antigen vezujuća mesta. Termini „mesto vezivanja” ili „antigen vezujuće mesto”, kako se ovde koriste, označavaju regione molekula antitela za koje se ligand zapravo vezuje. Termin „antigen vezujuće mesto” obuhvata varijabilne domene teškog lanca antitela (VH) i varijabilne domene lakog lanca antitela (VL) (par VH/VL).

Specifičnost antitela odnosi se na selektivno prepoznavanje antitela za određeni epitop antigena. Prirodna antitela su, na primer, monospecifična.

„Bispecifična antitela” su antitela koja imaju dve različite specifičnosti vezivanja antigena. Antitela iz predmetnog pronalaska su specifična za dva različita antigena, VEGF kao prvi antigen i ANG-2 kao drugi antigen.

Termin „monospecifično” antitelo, kako se ovde koristi, označava antitelo koje ima jedno ili više vezujućih mesta od kojih se svako vezuje za isti epitop istog antigena.

Termin „valentno” kako se koristi u okviru trenutne primene označava prisustvo određenog broja mesta vezivanja u molekulu antitela. Kao takvi, termini „dvovalentni”, „četvorovalentni” i „šestovalentni” označavaju prisustvo dva, odnosno četiri, odnosno šest mesta za vezivanje u molekulu antitela. Bispecifična antitela prema pronalasku su poželjno „dvovalentna”.

Termin „VEGF”, kako se ovde koristi, odnosi se na humani vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF/VEGF-A), humani vaskularni endotelni ćelijski faktor rasta sa 165 aminokiselina (aminokiseline 27-191 prekursorske sekvence humanog VEGF165: SEQ ID NO: 17; aminokiseline 1-26 predstavljaju signalni peptid), i srodne izooblike vaskularnog endotelnog ćelijskog faktora rasta 121, 189 i 206, kako su opisali Leung, D.W., et al., Science 246 (1989) 1306-9; Houck et al., Mol. Endocrin. 5 (1991) 1806-1814; Keck, P.J., et al., Science 246 (1989) 1309-12 i Connolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-24; zajedno sa prirodnim alelnim i prerađenim oblicima tih faktora rasta. VEGF je uključen u regulaciju normalne i abnormalne angiogeneze i neovaskularizacije povezane sa tumorima i intraokularnim poremećajima (Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A.,et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; i Dvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF je homodimerni glikoprotein koji je izolovan iz nekoliko izvora i uključuje nekoliko izooblika. VEGF pokazuje visoko specifičnu mitogenu aktivnost za endotelne ćelije.

Termin „ANG-2”, kako se ovde koristi, odnosi se na humani angiopoetin-2 (ANG-2) (alternativno skraćeno kao ANGPT2 ili ANG2) (SEQ ID NO: 18) koji opisuju npr. Maisonpierre, P.C., et al, Science 277 (1997) 55-60 i Cheung, A.H., et al., Genomics 48 (1998) 389-91. Angiopoetini-1 (SEQ ID NO: 19) i -2 otkriveni su kao ligandi za Ties, porodicu tirozin kinaza koja se selektivno eksprimira unutar vaskularnog endotela (Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407 (2000) 242-48). Sada postoje četiri definitivna člana porodice angiopoetina. Angiopoetin-3 i -4 (Ang-3 i Ang-4) mogu predstavljati obimno različite pandane istog genskog lokusa kod miša i čoveka (Kim, I., et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274 (1999) 26523-28). ANG-1 i ANG-2 su prvobitno identifikovani u eksperimentima sa kulturom tkiva kao agonist, odnosno antagonist (vidite za ANG-1: Davis, S., et al., Cell 87 (1996) 1161-69; i za ANG-2: Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60). Svi poznati angiopoietini se vezuju prvenstveno za Tie2 (SEQ ID NO: 20), i Ang-1 i -2 se vezuju za Tie2 sa afinitetom od 3 nM (Kd) (Maisonpierre, P.C., et al., Science 277 (1997) 55-60).

Antigen vezujuća mesta bispecifičnog antitela iz pronalaska sadrže šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR) koji u različitom stepenu doprinose afinitetu mesta vezivanja prema antigenu. Postoje tri CDR-a varijabilnog domena teškog lanca (CDRH1, CDRH2 i CDRH3) i tri CDR-a varijabilnog domena lakog lanca (CDRL1, CDRL2 i CDRL3). Obim CDR-a i regiona okvira (FRs) se određuje upoređivanjem sa prikupljenom bazom podataka aminokiselinskih sekvenci u kojoj su ti regioni definisani prema varijabilnosti među sekvencama.

Antitela iz pronalaska sadrže konstantne regione imunoglobulina humanog porekla iz

1

jedne ili više klasa imunoglobulina, pri čemu takve klase imunoglobulina uključuju klase IgG, IgM, IgA, IgD i IgE i, u slučaju IgG i IgA, njihove potklase, naročito IgG1 i IgG4.

Termini „monoklonsko antitelo” ili „kompozicija monoklonskih antitela”, kako je ovde korišćeno, odnose se na pripremu molekula antitela sa jednim aminokiselinskim sastavom.

Termin „himerno antitelo” odnosi se na antitelo koje sadrži varijabilni region, tj. vezujući region, iz jednog izvora ili vrste, i najmanje deo konstantnog regiona koji je dobijen iz različitog izvora ili vrste, a koje se uglavnom priprema tehnikama rekombinacije DNK. Himerna antitela koja sadrže mišji varijabilni region i humani konstantni region su poželjna. Drugi poželjni oblici „himernih antitela” obuhvaćenih predmetnim pronalaskom su oni u kojima je konstantni region modifikovan ili promenjen od onog u originalnom antitelu da bi se stvorila svojstva u skladu sa ovim pronalaskom, posebno u pogledu vezivanja C1q i/ili vezivanja Fc receptora (FcR). Takva himerna antitela se takođe označavaju kao „antitela sa promenjenom klasom”. Himerna antitela su proizvod eksprimiranih imunoglobulinskih gena koji sadrže segmente DNK koji kodiraju varijabilne regione imunoglobulina i segmente DNK koji kodiraju konstantne regione imunoglobulina. Metode za proizvodnju himernih antitela obuhvataju klasične tehnike rekombinantne DNK i genske transfekcije, koje su dobro poznate u struci. Vidi, npr., Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 i US 5,204,244.

Termin „humanizovano antitelo” se odnosi na antitela u kojima su okvir ili „regioni koji određuju komplementarnost” (CDR) modifikovani tako da sadrže CDR imunoglobulina različite specifičnosti u poređenju sa onim kod matičnog imunoglobulina. U poželjnom otelotvorenju, mišji CDR se kalemi u region okvira humanog antitela kako bi se proizvelo „humanizovano antitelo”. Vidite, npr. Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; i Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Posebno poželjni CDR odgovaraju onima koji predstavljaju sekvence koje prepoznaju antigene, koji su gore naznačeni za himerna antitela. Drugi oblici „humanizovanih antitela” obuhvaćenih predmetnim pronalaskom su oni u kojima je konstantni region dodatno modifikovan ili promenjen u odnosu na konstantni region originalnog antitela da bi se dobile karakteristike u skladu sa pronalaskom, posebno u pogledu vezivanja C1q i/ili vezivanja Fc receptora (FcR).

Termin „humano antitelo”, kako se ovde koristi, treba da obuhvati antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene od sekvenci imunoglobulina humanih germinativnih linija. Humana antitela su dobro poznata u struci (van Dijk M.A. i van de Winkel J.G. Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Humana antitela se takođe mogu proizvesti u transgenim životinjama (npr. miševima) koje mogu, nakon imunizacije, da proizvode pun repertoar ili izbor humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Transfer sklopa humanog gena germinativne linije imunoglobulina u takve miševe mutantne germinativne linije dovešće do proizvodnje humanih antitela nakon antigenskog izazova (vidite, npr., Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama displeja faga (Hoogenboom, H.R., i Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). Takođe, dostupne su tehnike čiji su autori Cole, A., et al. i Boemer, P., et al., za pripremu humanih monoklonskih antitela (Cole, A., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A.L., str. 77 (1985); i Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Kao što je već rečeno za himerna i humanizovana antitela prema pronalasku, termin „humano antitelo”, kako je ovde korišćen, takođe obuhvata takva antitela koja su modifikovana u konstantnom regionu da bi se stvorila svojstva prema pronalasku, posebno u pogledu vezivanja C1q i/ili vezivanja FcR, npr. „zamenjivanjem klase” tj. promenom ili mutiranjem delova Fc (npr. mutacija od IgG1 u IgG4 i/ili IgG1/IgG4).

Termin „rekombinantno antitelo”, kako se ovde koristi, treba da obuhvata sva humana antitela, koja se pripremaju, eksprimiraju, kreiraju ili izoluju na rekombinantni način, kao što su antitela izolovana iz ćelije domaćina, kao što je NSO ili CHO ćelija, ili iz životinje (npr. miš), koja je transgena za gene humanog imunoglobulina, ili antitela koja se eksprimiraju korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora, transficiranog u ćeliju domaćina. Takva rekombinantna antitela imaju varijabilne i konstantne regione u preuređenom obliku. Rekombinantna antitela prema pronalasku bila su podvrgnuta in vivo somatskoj hipermutaciji. Prema tome, aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, budući da su dobijene iz VH i VL sekvenci humane germinativne linije i srodne su sa njima, ne mogu prirodno postojati in vivo u okviru repertoara antitela humane germinativne linije.

„Varijabilni domen” (varijabilni domen lakog lanca (VL), varijabilni domen teškog lanca (VH), kako se ovde koristi, označava svaki par lakog i teškog lanca koji je direktno uključen u vezivanje antitela za antigen. Domeni varijabilnih humanih lakih i teških lanaca imaju istu opštu strukturu, a svaki domen sadrži četiri okvirna (FR) regiona, čije su sekvence u velikoj meri konzervirane, a povezane su pomoću tri „hipervarijabilna regiona” (ili regiona koji određuju komplementarnost, CDR). Regioni okvira poprimaju tzv. „β-presavijenu” konformaciju, a CDR mogu da formiraju petlje koje povezuju „β-presavijenu” strukturu.

1

CDR u svakom lancu se održavaju u svojoj trodimenzionalnoj strukturi pomoću regiona okvira i formiraju, zajedno sa CDR-ima iz drugog lanca, antigen vezujuće mesto. CDR3 regioni teškog i lakog lanca antitela imaju posebno značajnu ulogu u specifičnosti/afinitetu vezivanja antitela prema pronalasku i stoga predstavljaju sledeći predmet pronalaska.

Termini „hipervarijabilni region” ili „antigen-vezujući deo antitela”, kako se ovde koristi, odnose se na aminokiselinske ostatke antitela, koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz „regiona koji određuju komplementarnost” ili „CDR-e”. „Okvirni” ili „FR” regioni su oni regioni varijabilnog domena koji se razlikuju od ostataka hipervarijabilnog regiona kako je ovde definisano. Prema tome, laki i teški lanci antitela od N- do C-kraja sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. CDR na svakom lancu su razdvojeni takvim aminokiselinama okvira. Posebno, CDR3 teškog lanca je region koji najviše doprinosi vezivanju antigena. CDR i FR regioni su određeni prema standardnoj definiciji u Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Kao što je ovde upotrebljen, termin „vezivanje” ili „specifično vezivanje” odnosi se na vezivanje antitela za epitop antigena (humani VEGF ili humani ANG-2) u in vitro testu, poželjno u testu plazmonske rezonance (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Švedska sa prečišćenim antigenom divljeg tipa. Afinitet vezivanja je definisan pojmovima ka (konstanta brzine za asocijaciju antitela iz kompleksa antitelo/antigen), kD(konstanta disocijacije) i KD(kD/ka). U jednom otelotvorenju, vezivanje ili specifično vezivanje znači afinitet vezivanja (KD) od 10<-8>mol/l ili manje, u jednom otelotvorenju 10<-9>M do 10<-13>mol/l.

Termin „epitop” uključuje bilo koju determinantu polipeptida koja je sposobna za specifično vezivanje za antitelo. U određenim otelotvorenjima, determinanta epitopa obuhvata hemijski aktivna površinska grupisanja molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil i, u određenim otelotvorenjima, mogu da imaju posebne trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili posebne karakteristike naelektrisanja. Epitop je oblast antigena koja je vezana antitelom.

U određenim otelotvorenjima, kaže se da se antitelo specifično vezuje za antigen kada preferencijalno prepoznaje svoj ciljni antigen u složenoj smeši proteina i/ili makromolekula.

Termin „antitelo kompletne dužine” označava antitelo koje se sastoji od dva „teška lanca antitela kompletne dužine” i dva „laka lanca antitela kompletne dužine”. „Teški lanac antitela kompletne dužine” je polipeptid koji se u smeru od N-terminusa do C-terminusa sastoji od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena 1 teškog

1

lanca antitela (CH1), regiona šarke antitela (HR), konstantnog domena 2 teškog lanca antitela (CH2) i konstantnog domena 3 teškog lanca antitela (CH3), skraćeno VH-CH1-HR-CH2-CH3, i opciono konstantnog domena 4 teškog lanca antitela (CH4) u slučaju antitela potklase IgE. „Teški lanac antitela kompletne dužine” je poželjno polipeptid koji se u smeru od N-terminusa do C-terminusa sastoji od VH, CH1, HR, CH2 i CH3. „Laki lanac antitela kompletne dužine” je polipeptid koji se u smeru od N-terminusa do C-terminusa sastoji od varijabilnog domena lakog lanca antitela (VL) i konstantnog domena lakog lanca antitela (CL), skraćeno VL-CL. Konstantni domen lakog lanca antitela (CL) može biti κ (kapa) ili λ (lambda). Dva lanca antitela kompletne dužine su povezana putem inter-polipeptidnih disulfidnih veza između CL domena i CH1 domena i između regiona šarke teških lanaca antitela kompletne dužine. Primeri za tipična antitela kompletne dužine su prirodna antitela poput IgG (npr. IgG1 i IgG2), IgM, IgA, IgD i IgE. Antitela kompletne dužine prema pronalasku mogu biti od jedne vrste, npr. čoveka, ili mogu biti himerna ili humanizovana antitela. Antitela kompletne dužine prema pronalasku sadrže dva antigen vezujuća mesta koja su nastala od para VH i VL, pri čemu se oba specifično vezuju za isti antigen. C-terminus teškog ili lakog lanca navedenog antitela kompletne dužine označava poslednju aminokiselinu na C-kraju navedenog teškog ili lakog lanca. N-terminus teškog ili lakog lanca navedenog antitela kompletne dužine označava poslednju aminokiselinu na N-terminusu navedenog teškog ili lakog lanca.

Termin „peptidni linker”, kako se koristi u pronalasku, označava peptid sa aminokiselinskim sekvencama, koji je poželjno sintetičkog porekla. Ovi peptidi prema pronalasku koriste se za povezivanje C-terminusa lakog lanca sa N-terminusom teškog lanca drugog antitela kompletne dužine (koje se specifično vezuje za drugi antigen) putem peptidnog linkera. Peptidni linker u teškom i lakom lancu drugog antitela kompletne dužine je peptid sa aminokiselinskom sekvencom čija je dužina najmanje 30 aminokiselina, uz poželjnu dužinu od 32 do 50 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, peptidni linker je peptid sa aminokiselinskom sekvencom dužine od 32 do 40 aminokiselina. U jednom slučaju navedeni linker je (GxS)n sa G = glicin, S = serin, (x = 3, n = 8, 9 ili 10, i m = 0, 1, 2 ili 3) ili (x = 4 i n = 6, 7 ili 8, i m = 0, 1, 2 ili 3), poželjno x = 4, n = 6 ili 7 i m = 0, 1, 2 ili 3, poželjnije x = 4, n = 7 i m = 2. U jednom otelotvorenju, navedeni linker je (G4S)6G2.

Termin „konstantni region” kako se koristi u trenutnoj primeni označava zbir domena antitela osim varijabilnog regiona. Konstantni region nije direktno uključen u vezivanje antigena, ali ispoljava različite efektorske funkcije. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog regiona njihovih teških lanaca, antitela se mogu svrstati u klase: IgA, IgD, IgE,

1

IgG i IgM, a neke od njih mogu biti dalje podeljene na potklase, poput IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni regioni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ. Konstantni regioni lakog lanca koji se mogu naći u svih pet klasa antitela nazivaju se κ (kapa) i λ (lambda).

Termin „konstantni region humanog porekla” ili „humani konstantni region”, kako se koristi u predmetnoj prijavi, označava konstantni region teškog lanca humanog antitela potklase IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 i/ili konstantni kapa ili lambda region lakog lanca. Takvi konstantni regioni su dobro poznati u struci, i npr. opisuju ih Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) (vidite takođe, npr., Johnson, G., i Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788). U prijavi se za numeraciju pozicija i mutacija koristi EU sistem numeracije (EU indeks) prema radu Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) i naziva se „numeracija prema Kabatovom EU indeksu”.

U jednom otelotvorenju, bispecifična antitela prema pronalasku imaju konstantni region potklase humanog IgG1 (dobijen od potklase humanog IgG1).

U jednom otelotvorenju, bispecifična antitela prema pronalasku imaju konstantni region potklase humanog IgG4 (dobijen od potklase humanog IgG1).

U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo prema pronalasku je potklase humanog IgG1 sa mutacijama L234A (Leu235Ala), L235A (Leu234Ala) i P329G (Pro329Gly). Takvo antitelo ima smanjeno vezivanje FcR (naročito više ne pokazuje vezivanje za FcRgamaI, FcRgamaII i FcRgamaIII). To je posebno korisno za smanjenje potencijalnih neželjenih dejstava, npr. poput tromboze (Meyer, T., et al., J. Thromb. Haemost. 7 (2009) 171-81). U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo prema pronalasku je potklase humanog IgG4 sa mutacijama S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) i P329G (Pro329Gly). Takvo antitelo pokazuje smanjeno vezivanje FcR, kako je prethodno naznačeno. Dok prethodno opisana mutacija Pro329Ala uklanja samo dve trećine sendvič interakcije FcgamaRIIIa, Pro329Gly u antitelima prema pronalasku u potpunosti prenosi vezivanje dela Fc za FcgamaRIII. To je naročito korisno pošto je vezivanje za FcgamaRIII uključeno u ADCC (ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela) koja dovodi do ćelijske smrti, što može biti korisno u lečenju kancera, ali može izazvati ozbiljna neželjena dejstva u lečenju na bazi antitela za druge vaskularne ili imunološke bolesti. Dakle, naročito su korisna antitela prema pronalasku potklase IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G i potklase IgG4 sa mutacijama S228P,

1

L235E i P329G pošto pokazuju prestanak vezivanja za FcRgamaI, FcRgamaII i FcRgamaIII. Termin „sa mutacijama AAA”, kako se ovde koristi, odnosi se na mutacije I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) i H435A (His435Ala) u konstantnom regionu teškog lanca IgG1 ili IgG4, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu.

Termin „sa mutacijama P329G LALA”, kako se ovde koristi, odnosi se na mutacije L234A (Leu235Ala), L235A (Leu234Ala) i P329G (Pro329Gly) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG1, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu. Termin „sa mutacijama SPLE”, kako se ovde koristi, odnosi se na S228P (Ser228Pro) i L235E (Leu235Glu) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG4, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu. Termin „sa mutacijama SPLE i P239G”, kako se ovde koristi, odnosi se na S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) i P329G (Pro329Gly) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG4, pri čemu je numeracija prema Kabatovom EU indeksu.

Antitela za upotrebu prema pronalasku su proizvedena rekombinantnim sredstvima. Tako, jedan aspekt tekućeg pronalaska je nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema pronalasku, a sledeći aspekt je ćelija koja sadrži navedenu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo prema pronalasku. Metode za rekombinantnu proizvodnju su opštepoznate u struci i obuhvataju ekspresiju proteina u prokariotskim i eukariotskim ćelijama uz naknadnu izolaciju antitela, i obično prečišćavanje do farmaceutski prihvatljive čistoće. Za ekspresiju gore pomenutih antitela u ćeliji domaćinu, nukleinske kiseline koje kodiraju odgovarajuće modifikovane lake i teške lance se ubacuju u ekspresione vektore standardnim metodama. Ekspresija se vrši u odgovarajućim prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćinima, kao što su CHO ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, HEK293 ćelije, COS ćelije, PER.C6 ćelije, ćelije kvasca ili E. coli, a antitelo se izdvaja iz ćelija (supernatant ili ćelije nakon lize). Opšti postupci za rekombinantnu proizvodnju antitela su dobro poznati u struci, i opisani su, na primer, u revijalnim člancima čiji su autori Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res.48 (1998) 870-880.

Ovde je otkriven postupak za pripremu bispecifičnog antitela prema pronalasku, koji obuhvata korake

a) transformisanja ćelije domaćina vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju navedeno antitelo;

b) uzgajanje ćelije domaćina u uslovima koji omogućavaju sintezu pomenutog molekula antitela; i

c) dobijanje pomenutog molekula antitela iz navedene kulture.

1

Korak izolovanja pod c uključuje upotrebu reagensa za specifično hvatanje konstantnog domena lakog lanca (koji je npr. specifičan za kapa ili lambda konstantni laki lanac, u zavisnosti od toga da li je kapa ili lambda laki lanac u bispecifičnom antitelu prema pronalasku). Ovaj reagens za specifično hvatanje lakog lanca koristi se u režimu vezivanja i eluiranja). Primeri za takve reagense za specifično hvatanje konstantnog domena lakog lanca su npr. KappaSelect™ i LambdaFabSelectTM kompanije GE Healthcare/BAC, koji se temelje na vrlo krutoj agaroznoj baznoj matrici koja omogućava veliki protok i nizak povratni pritisak u industrijskim razmerama. Oni sadrže ligand koji se vezuje za konstantni region kapa, odnosno lambda lakog lanca (tj. fragmenti kojima nedostaje konstantni region lakog lanca neće se vezati; Sl.1). Oba su stoga sposobna da vežu druge ciljne molekule koji sadrže konstantni region lakog lanca, na primer, IgG, IgA i IgM. Ligandi su vezani za matricu pomoću dugačkog hidrofilnog kraka spejsera, kako bi bili lako dostupni za vezivanje za ciljni molekul. Oni se zasnivaju na jednolančanom fragmentu antitela koji je testiran na humani Ig kapa ili lambda.

Bispecifična antitela se pogodno odvajaju od medijuma za uzgajanje klasičnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina, kao što je, na primer, protein A sefaroza, hidroksiapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija. DNK i RNK koje kodiraju monoklonska antitela se lako izoluju i sekvenciraju pomoću konvencionalnih postupaka. Ćelije hibridoma mogu poslužiti kao izvor takve DNK i RNK. Kada se izoluje, DNK se može ubaciti u ekspresione vektore, koji se zatim transficiraju u ćelije domaćina, kao što su ćelije HEK 293, CHO ćelije ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, da bi se dobila sinteza rekombinantnih monoklonskih antitela u ćelijama domaćina.

Varijante (ili mutanti) aminokiselinske sekvence bispecifičnog antitela pripremaju se uvođenjem odgovarajućih promena nukleotida u DNK antitela ili sintezom nukleotida. Takve modifikacije se, međutim, mogu izvršiti samo u vrlo ograničenom opsegu. Na primer, modifikacije ne menjaju gorenavedene karakteristike antitela kao što su potklasa IgG i vezivanje antigena, ali mogu poboljšati prinos rekombinantne proizvodnje, stabilnost proteina ili olakšati prečišćavanje.

Termin „ćelija domaćin"”, kako se koristi u sadašnjoj prijavi, označava bilo koji tip ćelijskog sistema koji se može konstruisati da generiše antitela prema tekućem pronalasku. U jednom otelotvorenju, HEK293 ćelije i CHO ćelije se koriste kao ćelije domaćini. Kako se ovde koriste, izrazi „ćelija”, „ćelijska linija” i „ćelijska kultura” se koriste kao sinonimi i sve takve oznake uključuju potomstvo. Tako, reči „transformanti” i „transformisane ćelije”

2

uključuju primarnu ćeliju ispitanika i kulture koje su od nje izvedene, bez obzira na broj prenosa. Takođe se podrazumeva da svako potomstvo možda nije precizno identično po sadržaju DNK, usled namernih ili nenamernih mutacija. Ovde se uključuju varijante potomstva koje imaju istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano u originalno transformisanoj ćeliji.

Ekspresiju u NS0 ćelijama su opisali npr. Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Prolaznu ekspresiju opisuju, npr. Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Kloniranje varijabilnih domena opisuju Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; i Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Poželjni sistem prolazne ekspresije (HEK 293) opisali su Schlaeger, E.-T, i Christensen, K., u Cytotechnology 30 (1999) 71-83 i Schlaeger, E.-J., u J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promoter, opciono operatorsku sekvencu i mesto vezivanja ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotere, pojačivače i poliadenilacione signale.

Nukleinska kiselina je „operativno povezana” kada se stavi u funkcionalnu vezu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za predsekvencu ili sekretorni lider su operativno povezani sa DNK za polipeptid ako se eksprimiraju kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakšava translaciju. Uopšteno, „operativno povezan” znači da su sekvence DNK koje su povezane susedne i, u slučaju sekretornog lidera, susedne i u okviru čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susedni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri u skladu sa konvencionalnom praksom.

Prečišćavanje antitela se vrši kako bi se eliminisale ćelijske komponente ili drugi kontaminanti, npr. druge ćelijske nukleinske kiseline ili proteini, standardnim tehnikama, uključujući alkalni/SDS tretman, vezivanje CsCl, hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu i druge tehnike dobro poznate u struci. Vidi Ausubel, F., i sar., izd. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing i Wiley Interscience, New York (1987). Za prečišćavanje proteina su dobro utvrđene i široko rasprostranjene različite metode, kao što je afinitetna hromatografija sa mikrobnim proteinom (npr. afinitetna hromatografija sa proteinom A ili proteinom G), jonoizmenjivačka hromatografija (npr. katjonska izmena (karboksimetil smole), anjonska izmena (amino etil smole) i izmena u mešovitom režimu), tiofilna adsorpcija (npr. sa beta-merkaptoetanolom i drugim SH ligandima), hidrofobna interakcija ili aromatična adsorpciona hromatografija (npr. sa fenil-sefarozom, azaarenofilnim smolama ili m-aminofenilboronskom kiselinom), afinitetna hromatografija sa metalnim helatima (npr. sa Ni(II)- i Cu(II) afinitetnim materijalom), gel hromatografija i elektroforetske metode (kao što je gel elektroforeza, kapilarna elektroforeza) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech.75 (1998) 93-102).

Bipecifična, dvovalentna antitela za upotrebu prema pronalasku pokazuju koristi za humane pacijente kojima je potrebna terapija koja cilja VEGF i ANG-2.

Dvovalentno bispecifično antitelo na humani VEGF i humani ANG-2 prema predmetnom pronalasku može imati vredan profil efikasnosti/bezbednosti i može pružati koristi pacijentu kome je potrebna anti-VEGF i anti-ANG-2 terapija.

Jedan aspekt pronalaska je farmaceutska kompozicija za upotrebu koja sadrži antitelo prema pronalasku. U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za upotrebu, koja sadrži antitelo prema predmetnom pronalasku, formulisano zajedno sa farmaceutskim nosačem.

Kako se ovde koristi, „farmaceutski nosač” uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična sredstva i sredstva koja odlažu apsorpciju, i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Nosač je poželjno pogodan za primenu na ispitaniku lokalnim putem. Na primer, antitelo ili njegova kompozicija mogu da se primene na ispitaniku putem intraokularne primene, npr. intraokularnom injekcijom, kao što je intravitrealna injekcija. To se može izvesti u skladu sa standardnim postupcima poznatim u struci. Vidite, npr. Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-76; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206; i Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-5.

Kompozicija iz predmetnog pronalaska može se primeniti različitim metodama poznatim u struci. Kao što će stručnjak shvatiti, put i/ili način primene će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Da bi se jedinjenje iz pronalaska dalo određenim načinom primene, može biti neophodno da se jedinjenje obloži ili da se jedinjenje istovremeno daje sa supstancom koja sprečava njegovu inaktivaciju. Na primer, jedinjenje se može dati ispitaniku u odgovarajućem nosaču, na primer, lipozomima, ili razblaživaču. Farmaceutski prihvatljivi razblaživači uključuju slane i vodene puferske rastvore. Farmaceutski nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporanu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u struci.

Mogu se koristiti mnogi mogući načini isporuke, uključujući, ali se ne ograničavajući na intraokularnu primenu ili topikalnu primenu. U jednom otelotvorenju, primena je intraokularna i uključuje, ali nije ograničena na, subkonjunktivnu injekciju, intrakameralnu injekciju, injekciju u prednju komoru putem termporalnog limbusa, intrastromalnu injekciju, intrakornealnu injekciju, subretinalnu injekciju, vodenu injekciju u telesnu tečnost, subtenonsku injekciju ili sredstvoj za produženu isporuku, intravitrealnu injekciju (npr. prednja, srednja ili zadnja vitrealna injekcija). U jednom otelotvorenju, primena je topikalna i uključuje, ali nije ograničena na, kapi za oči u rožnjaču.

U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku primenjuje se intravitrealno, npr. putem intravitrealne injekcije. To se može izvesti u skladu sa standardnim postupcima poznatim u struci. Vidite, npr. Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-76; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol.

25 (1999) 196-206; i Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-5.

U nekim otelotvorenjima, terapeutski kompleti iz pronalaska mogu sadržati jednu ili više doza bispecifičnog antitela za upotrebu prisutnog u farmaceutskoj kompoziciji kao što je ovde opisano, pogodno sredstvo za intravitrealnu injekciju farmaceutske kompozicije i uputstvo koje detaljno opisuje odgovarajuće ispitanike i protokole za davanje injekcije. U ovim otelotvorenjima, kompozicije se tipično daju ispitaniku kome je potrebno lečenje intravitrealnom injekcijom. To se može izvesti u skladu sa standardnim postupcima poznatim u struci. Vidite, npr. Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-76; Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol.25 (1999) 196-206; i Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-5.

Kompozicije mogu takođe da sadrže adjuvanse, kao što su konzervansi, kvašljivci, emulgatori i disperzioni agensi. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se osigurati i postupcima sterilizacije, gore, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorbutanola, fenola, sorbinske kiseline i slično. Takođe, može biti poželjno da se u kompozicije uključe izotonični agensi, kao što su šećeri, natrijum hlorid i slično. Pored toga, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može se postići uključivanjem agenasa koja odlažu apsorpciju, kao što je aluminijum monostearat i želatin.

Bez obzira na odabrani put primene, jedinjenja iz ovog pronalaska, koja se mogu koristiti u pogodnoj hidratisanoj formi, i/ili farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska, formulišu se u farmaceutski prihvatljive dozne oblike konvencionalnim

2

metodama poznatim stručnjacima.

Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama iz predmetnog pronalaska mogu biti različiti, tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je efikasna za postizanje željenog terapeutskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju i način primene, a da nije toksična za pacijenta. Izabrani dozni nivo će zavisiti od različitih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost određenih kompozicija iz predmetnog pronalaska koje se koriste, put primene, vreme primene, brzinu izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanje lečenja, druge lekove, jedinjenja i/ili supstance koji se koriste u kombinaciji sa određenim upotrebljenim kompozicijama, starost, pol, težinu, stanje, opšte zdravlje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji se leči, i slične faktore dobro poznate u medicinskoj struci.

Kompozicija mora biti sterilna i tečna do te mere da se kompozicija može isporučiti špricem. Pored vode, nosač je poželjno izotonični puferovani slani rastvor.

Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželjno je u kompoziciju uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što je manitol ili sorbitol, i natrijum hlorid.

Kompozicija može da sadrži oftalmičku depo formulaciju koja sadrži aktivni agens za subkonjunktivnu primenu. Oftalmička depo formulacija sadrži mikročestice suštinski čistog aktivnog agensa, npr. bispecifičnog antitela prema pronalasku. Mikročestice koje sadrže bispecifično antitelo prema pronalasku mogu biti ugrađene u biokompatibilni farmaceutski prihvatljiv polimer ili agens za enkapsulaciju lipida. Depo formulacije se mogu prilagoditi tako da se oslobađaju svi suštinski aktivni materijali tokom dužeg vremenskog perioda. Polimerna ili lipidna matrica, ako je prisutna, može se prilagoditi da se dovoljno razgradi da bi se transportovala sa mesta primene nakon oslobađanja svog ili suštinski svog aktivnog agensa. Depo formulacija može biti tečna formulacija, koja sadrži farmaceutski prihvatljiv polimer i rastvoreni ili dispergovani aktivni agens. Nakon injektovanja, polimer formira depo na mestu injekcije, npr. nastajanjem gela ili precipitacijom.

Termini „očna vaskularna bolest” i „vaskularna bolest oka” ovde se koriste naizmenično i uključuju dijabetičku retinopatiju, dijabetički edem makule i starosnu degeneraciju makule.

Degeneracija makule je medicinsko stanje koje se pretežno može naći kod starijih osoba, u kome se centar unutrašnjeg sloja oka, poznat kao oblast makule mrežnjače, istanjuje, atrofira i, u nekim slučajevima, krvari. To može dovesti do gubitka centralnog vida, što podrazumeva nemogućnost da se vide fini detalji, da se čita ili da se prepoznaju lica. Prema Američkoj oftalmološkoj akademiji, to je danas vodeći uzrok gubitka centralnog vida (slepila) u Sjedinjenim Američkim Državama kod osoba starijih od pedeset godina. Iako se neke distrofije makule koje pogađaju mlađe osobe ponekad nazivaju degeneracijom makule, termin se generalno koristi za starosnu degeneraciju makule (AMD ili ARMD).

Starosna degeneracija makule počinje karakterističnim žutim naslagama u makuli (centralna oblast mrežnjače koja obezbeđuje detaljan centralni vid, koja se naziva fovea) koje se nazivaju druzama, između epitela pigmenta retine i sudovnjače koja se nalazi ispod. Većina ljudi sa ovim ranim promenama (koje se nazivaju senilna makulopatija) ima dobar vid. Ljudi sa druzama mogu kasnije razviti uznapredovalu AMD. Rizik je znatno veći ako su druze velike i brojne i povezane sa poremećajem sloja pigmentnih ćelija ispod makule. Velike i meke druze su povezane sa povišenim naslagama holesterola i mogu da reaguju na agense za snižavanje holesterola ili na postupak reofereze.

Uznapredovala AMD, koja je odgovorna za težak gubitak vida, ima dva oblika: suvi i vlažni. Centralna geografska atrofija, koja je suvi oblik uznapredovale AMD, rezultat je atrofije sloja epitela pigmenta retine ispod retine, što izaziva gubitak vida usled gubitka fotoreceptora (štapića i čepića) u centralnom delu oka. Iako nema dostupnog lečenja za ovo stanje, Nacionalni zavod za oči i drugi su pokazali da vitaminski suplementi sa visokim dozama antioksidanasa, luteina i zeaksantina, usporavaju progresiju suve degeneracije makule i kod nekih pacijenata povećavaju oštrinu vida.

Edem makule nastaje kada se tečnost ili naslage proteina skupljaju na makuli oka, žutoj centralnoj oblasti mrežnjače, ili ispod nje, što uzrokuje njeno zadebljanje i oticanje. Oticanje može da poremeti centralni vid osobe pošto je makula blizu centra mrežnjače sa zadnje strane očne jabučice. Ovo područje sadrži gusto zbijene čepiće koji obezbeđuju oštar, čist centralni vid kako bi osoba mogla da vidi oblik, boju i detalje koji su neposredno u vidnom polju. Cistoidni edem makule je vrsta edema makule koja uključuje nastanak ciste.

Termini „ispitanik” i „pacijent” se koriste naizmenično i odnose se na sisare kao što su ljudski pacijenti i nehumani primati, kao i na eksperimentalne životinje kao što su zečevi, pacovi i miševi, i na druge životinje. Životinje uključuju sve kičmenjake, npr. sisare i kičmenjake koji nisu sisari, kao što su psi, mačke, ovce, krave, svinje, zečevi, kokoške itd. Poželjni ispitanici za praktikovanje terapeutskih postupaka iz predmetnog pronalaska su ljudi. Ispitanici kojima je potrebno lečenje uključuju pacijente koji već boluju od vaskularne bolesti ili poremećaja oka, kao i one koji imaju sklonost ka nastanku poremećaja.

Kako se ovde koriste, izrazi „ćelija”, „ćelijska linija” i „ćelijska kultura” se koriste

2

kao sinonimi i sve takve oznake uključuju potomstvo. Tako, reči „transformanti” i „transformisane ćelije” uključuju primarnu ćeliju ispitanika i kulture koje su od nje izvedene, bez obzira na broj prenosa. Takođe se podrazumeva da svako potomstvo možda nije precizno identično po sadržaju DNK, usled namernih ili nenamernih mutacija. Ovde se uključuju varijante potomstva koje imaju istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano u originalno transformisanoj ćeliji. Tamo gde su nameravane različite oznake, to će biti jasno iz konteksta.

Termin „transformacija”, kako se ovde koristi, odnosi se na proces prenosa vektora / nukleinske kiseline u ćeliju domaćina. Ako se kao ćelije domaćini koriste ćelije koje nemaju znatne prepreke ćelijskog zida, transfekcija se vrši npr. metodom taloženja kalcijum fosfata, kako su opisali Graham, F.L., van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 546-467. Međutim, mogu se koristiti i druge metode uvođenja DNK u ćelije, kao što je injektovanje u jedro ili fuzija protoplasta. Ako se koriste prokariotske ćelije ili ćelije koje sadrže značajne konstrukcije ćelijskog zida, npr. jedna metoda transfekcije je tretman kalcijumom pomoću kalcijum hlorida, kao što su opisali Cohen, S.N., et al., PNAS.69 (1972) 2110-2114.

Kako se ovde koristi, „ekspresija” se odnosi na proces kojim se nukleinska kiselina transkribuje u iRNK i/ili na proces kojim se transkribovana iRNK (koja se takođe naziva i transkript) naknadno prevodi u peptide, polipeptide ili proteine. Transkripti i kodirani polipeptidi se zajednički nazivaju genskim proizvodom. Ako je polinukleotid dobijen od genomske DNK, ekspresija u eukariotskoj ćeliji može uključivati splajsovanje iRNK.

„Vektor” je molekul nukleinske kiseline, posebno samoreplikujući, koji prenosi umetnuti molekul nukleinske kiseline u i/ili između ćelija domaćina. Termin obuhvata vektore koji služe prvenstveno za umetanje DNK ili RNK u ćeliju (npr. hromozomska integracija), replikaciju vektora koji služe prvenstveno za replikaciju DNK ili RNK, te ekspresione vektore koji služe za transkripciju i/ili translaciju DNK ili RNK. Takođe su uključeni vektori koji pružaju više od jedne funkcije kao što je opisano.

„Ekspresioni vektor” je polinukleotid koji se, kada se uvede u odgovarajuću ćeliju domaćina, može transkribovati i prevesti u polipeptid. „Ekspresioni sistem” se obično odnosi na pogodnu ćeliju domaćina koja se sastoji od ekspresionog vektora koji može služiti za dobijanje željenog proizvoda ekspresije.

Sledeći primeri, spisak sekvenci i slike su dati radi lakšeg razumevanja predmetnog pronalaska.

Opis spiska sekvenci (aminokiselinske sekvence)

2

Eksperimentalni postupci

Tabela 1: Bispecifična antitela i njihove odgovarajuće sekvence

2

Imajte u vidu da se termin „sa mutacijama AAA”, kako se ovde koristi, odnosi na mutacije I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) i H435A (His435Ala) u konstantnom regionu teškog lanca IgG1 ili IgG4 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), termin „sa mutacijama P329G LALA”, kako se ovde koristi, odnosi se na mutacije L234A (Leu235Ala), L235A (Leu234Ala) i P329G (Pro329Gly) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG1 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), a termin „sa SPLE mutacijama”, kako se ovde koristi, odnosi se na S228P (Ser228Pro) i L235E (Leu235Glu) u konstantnom regionu teškog lanca potklase IgG4 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

Primeri

Materijali i opšti postupci

Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Aminokiseline lanaca antitela su numerisane i označene prema EU numeraciji (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

Tehnike rekombinantne DNK

Standardne metode su korišćene za manipulaciju DNK kako je opisano u Sambrook, J. i sar. Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača.

Genska sinteza

Željeni segmenti gena su naručeni u skladu sa datim specifikacijama od Geneart (Regensburg, Nemačka).

Određivanje sekvence DNK

Sekvence DNK su određene dvolančanim sekvenciranjem izvršenim u kompaniji MediGenomix GmbH (Martinsried, Nemačka) ili Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Nemačka).

Analiza DNK i sekvenci proteina i upravljanje podacima o sekvenci Softverski paket GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) verzija 10.2 i Infomax Vector NT1 Advance suite verzija 8.0 korišćeni su za kreiranje sekvenci, mapiranje, analizu, označavanje i ilustraciju.

Ekspresioni vektori

Za ekspresiju opisanih antitela, primenjene su varijante ekspresionih plazmida za prolaznu ekspresiju (npr. u HEK293-F) ćelija na bazi organizacije kDNK sa CMV-Intron A promoterom ili bez njega, ili genomske organizacije sa CMV promoterom.

Pored kasete za ekspresiju antitela, vektori su sadržali:

- mesto početka replikacije koje omogućava replikaciju tog plazmida u E. coli, - ß-laktamazni gen koji daje otpormost na ampicilin u E. coli, i

- gen dihidrofolat reduktaze iz Mus musculus kao selektabilni marker u eukariotskim ćelijama

- Jedinica transkripcije gena antitela sastoji se od sledećih elemenata:

- jedinstvenog restrikcionog mesta (jednog ili više) na 5' kraju

- trenutnog ranog pojačivača i promotera iz humanog citomegalovirusa, - praćenog sekvencom Intron A u slučaju organizacije kDNK,

- 5'-netranslatovanog regiona gena humanog antitela,

- signalnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca,

- lanca humanog antitela (divljeg tipa ili sa razmenom domena) bilo kao kDNK ili kao genomska organizacija sa organizacijom imunoglobulina ekson-intron

1

- 3' netranslatovanog regiona sa poliadenilacionom signalnom sekvencom, i - jedinstvenog restrikcionog mesta na 3' kraju.

Fuzioni geni koji sadrže lance antitela, kao što je opisano u nastavku, generisani su pomoću PCR i/ili sinteze gena i sastavljeni poznatim rekombinantnim postupcima i tehnikama, povezivanjem odgovarajućih segmenata nukleinske kiseline, npr. upotrebom jedinstvenih restrikcionih mesta u odgovarajućim vektorima. Sekvence subklonirane nukleinske kiseline verifikovane su sekvenciranjem DNK. Za prolazne transfekcije su pripremljene veće količine plazmida putem pripreme plazmida iz transformisanih kultura E. coli (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Tehnike gajenja ćelija

Standardne tehnike gajenja ćelija su korišćene kako je opisano u Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. i Yamada, K.M. (izdav.), John Wiley & Sons, Inc.

Bispecifična antitela su eksprimirana tranzijentnom kotransfekcijom odgovarajućih ekspresionih plazmida u HEK29-F ćelijama koje rastu u suspenziji kao što je opisano u nastavku.

Primer 1

Ekspresija i prečišćavanje

Prolazne transfekcije u HEK293-F sistemu

Bispecifična antitela su generisana tranzijentnom transfekcijom sa odgovarajućim plazmidima (npr. kodiranje teškog i modifikovanog teškog lanca, kao i odgovarajućeg lakog i modifikovanog lakog lanca) korišćenjem HEK293-F sistema (Invitrogen) prema uputstvu proizvođača. Ukratko, HEK293-F ćelije (Invitrogen) koje rastu u suspenziji bilo u boci za tresenje ili u fermentoru sa mešanjem u ekspresionom medijumu bez seruma FreeStyle™ 293 (Invitrogen) transficirane su smešom četiri ekspresiona plazmida i 293fectin™ ili fektina (Invitrogen). Za boce za tresenje od 2 l (Corning), HEK293-F ćelije su zasejane pri gustini od 1,0E*6 ćelija/ml u 600 ml i inkubirane pri 120 o/min, 8% CO2. Dan nakon što su ćelije transficirane pri gustini ćelija od oko 1,5E*6 ćelija/ml sa oko 42 ml smeše A) 20 ml Opti-MEM (Invitrogen) sa 600 µg ukupne plazmidne DNK (1 µg/ml) koja kodira teški odnosno modifikovani teški lanac i odgovarajući laki lanac u ekvimolarnom odnosu i B) 20 ml Opti-MEM 1,2 ml 293 fektina ili fektina (2 µl/ml). U skladu sa potrošnjom glukoze, dodat je rastvor glukoze tokom fermentacije. Supernatant koji sadrži izlučeno antitelo je sakupljen nakon 5-10 dana i antitela su direktno prečišćena iz supernatanta ili je supernatant zamrznut i uskladišten.

2

Prečišćavanje

Bispecifična antitela su prečišćena iz supernatanta ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, koristeći MabSelectSure-Sepharose™ (za mutante bez AAA) (GE Healthcare, Švedska) ili kappaSelect-Agarose (za mutante sa AAA) (GE Healthcare, Švedska), hromatografiju hidrofobnih interakcija koristeći butil sefarozu (GE Healthcare, Švedska) i gel hromatografiju na Superdex 200 (GE Healthcare, Švedska).

Ukratko, sterilno filtrirani supernatanti ćelijskih kultura su uhvaćeni na MabSelect SuRe smoli ekvilibrisanoj PBS puferom (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl i 2,7 mM KCl, pH 7,4), isprani puferom za ekvilibraciju i eluirani 25 mM natrijum citratom na pH 3,0. AAA mutanti su uhvaćeni na kappaSelect smoli ekvilibrisanoj sa 25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7,2, isprani puferom za ekvilibraciju i eluirani 25 mM natrijum citratom pH 2,9. Eluirane frakcije proteina su spojene i neutralisane pomoću 2 M Tris, pH 9,0. Spojena antitela su pripremljena za hromatografiju hidrofobnih interakcija dodavanjem 1,6 M rastvora amonijum sulfata do konačne koncentracije od 0,8 M amonijum sulfata i pH je podešen na pH 5,0 pomoću sirćetne kiseline. Nakon ekvilibracije smole butil sefaroze 35 mM natrijum acetatom, 0,8 M amonijum sulfatom, pH 5,0, antitela su naneta na smolu, isprana puferom za ekvilibraciju i eluirana linearnim gradijentom do 35 mM natrijum acetata pH 5,0. Frakcije koje sadrže bispecifično antitelo su spojene i dalje prečišćene gel hromatografijom koristeći kolonu Superdex 20026/60 GL (GE Healthcare, Švedska) ekvilibrisanu 20 mM histidinom, 140 mM NaCl, pH 6,0. Frakcije koje sadrže bispecifično antitelo su sakupljene, koncentrovane do potrebne koncentracije koristeći Vivaspin ultrafiltracione uređaje (Sartorius Stedim Biotech SA, Francuska) i čuvane na -80 °C.

Tabela 2: Prinosi bispecifičnih <VEGF-ANG-2> antitela

istoća i integritet antitela su analizirani nakon svakog koraka prečišćavanja pomoću CE-SDS koristeći mikrofluidnu Labchip tehnologiju (Caliper Life Science, SAD). Za analizu CE-SDS pripremljeno je 5 µl rastvora proteina pomoću kompleta reagensa HT Protein Express prema uputstvu proizvođača, i analizirani su na sistemu LabChip GXII koristeći HT Protein Express Chip. Podaci su analizirani pomoću softvera LabChip GX.

Tabela 3: Uklanjanje tipičnih sporednih proizvoda različitim sekvencijalnim koracima prečišćavanja određenim pomoću CE-SDS.

Sadržaj agregata u uzorcima antitela analiziran je gel hromatografijom visokih performansi koristeći analitičku kolonu za gel hromatografiju Superdex 200 (GE Healthcare, Švedska) u 2xPBS (20 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 274 mM NaCl i 5,4 mM KCl, pH 7,4) radni pufer na 25 °C. 25 µg proteina je injektovano na kolonu pri protoku od 0,75 ml/min i eluirano izokratski tokom 50 minuta.

Analogno, <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela VEGFang2-0012 i VEGFang2-0201 pripremljena su i prečišćena sa sledećim prinosima:

4

Takođe <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG4 sa mutacijama AAA i sa SPLE mutacijama (SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32), <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG1 sa mutacijama AAA (SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35) i <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG4 sa mutacijama AAA i sa SPLE mutacijama (SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38) analogno mogu da se pripreme i prečiste.

Primer 2

Analitički podaci i mogućnost razvoja

Merenje viskoziteta na bazi DLS u malom obimu.

Merenje viskoziteta je suštinski obavljeno kako je opisano u (He, F. et al., Analytical Biochemistry 399 (2009) 141-3). Ukratko, uzorci su koncentrovani do različitih koncentracija proteina u 200 mM arginin sukcinatu, pH 5,5, pre dodavanja perlica od polistirenskog lateksa (prečnika 300 nm) i polisorbata 20 (0,02% V/V). Uzorci su prebačeni na optičku ploču sa 384 bunarčića centrifugiranjem kroz filter ploču od 0,4 µm i premazani parafinskim uljem. Prividni prečnik lateks perlica je određen dinamičkim rasipanjem svetlosti na 25 °C. Viskozitet rastvora može da se izračuna kao η = η0(rh/rh,0) (η: viskozitet; η0: viskozitet vode; rh: vidljivi hidrodinamički radijus lateks perlica; rh,0: hidrodinamički radijus lateks perlica u vodi.

Da bi se omogućilo poređenje različitih uzoraka pri istoj koncentraciji, podaci o viskozitetu-koncentraciji uneti su u Munijevu jednačinu (jednačina 1) (Mooney, Colloid Sci, 1951; Monkos, Biochem. Biophys. Acta 1997) i podaci su interpolirani u skladu sa tim.

<SФ>

<η = η>0<exp>(1 - KФ)Jednačina 1

(S: parametar hidrodinamičke interakcije proteina; K: faktor samozgrušavanja; Ф: frakcija zapremine rastvorenog proteina)

Rezultati su prikazani na Slici 2: VEGFang2-0016 sa mutacijama AAA u Fc delu pokazuje manji viskozitet na svim izmerenim temperaturama u poređenju sa VEGFang2-0015 bez mutacija AAA u Fc delu.

Temperatura početka agregacije DLS

Uzorci su pripremljeni u koncentraciji od 1 mg/ml u 20 mM histidin/histidin hloridu, 140 mM NaCl, pH 6,0, preneti na optičku ploču sa 384 bunarčića centrifugiranjem kroz filter ploču od 0,4 μm i premazani parafinskim uljem. Hidrodinamički radijus je više puta izmeren dinamičkim rasipanjem svetlosti dok su uzorci zagrevani brzinom od 0,05 °C/min od 25 °C do 80 °C. Temperatura početka agregacije je definisana kao temperatura na kojoj hidrodinamički radijus počinje da se povećava. Rezultati su prikazani na Slici 3. Na Slici 3 je prikazana agregacija VEGFang2-0015 bez mutacija AAA u odnosu na VEGFang2-0016 sa mutacijama AAA. VEGFang2-0016 pokazuje temperaturu početka agregacije od 61 °C, dok VEGFang2-0015 bez mutacija AAA pokazuje početnu temperaturu od 60 °C.

Vremenski tok DLS

Uzorci su pripremljeni u koncentraciji od 1 mg/ml u 20 mM histidin/histidin hloridu, 140 mM NaCl, pH 6,0, preneti na optičku ploču sa 384 bunarčića centrifugiranjem kroz filter ploču od 0,4 μm i premazani parafinskim uljem. Hidrodinamički radijus je više puta izmeren dinamičkim rasipanjem svetlosti dok su uzorci držani na konstantnoj temperaturi od 50 °C do 145 sati. U ovom eksperimentu, tendencije agregacije prirodnog, nerazmotanog proteina na povišenoj temperaturi dovele bi do povećanja prosečnog prečnika čestica tokom vremena. Ovaj postupak na bazi DLS je veoma osetljiv za agregate pošto oni nesrazmerno doprinose intenzitetu rasute svetlosti. Čak i nakon 145 sati na 50 °C (temperatura blizu temperature početka agregacije, vidite gore), utvrđeno je prosečno povećanje prečnika čestica samo manje od 0,5 nm za VEGFang2-0015 i VEGFang2-0016

7-dnevno skladištenje na 40 °C pri 100 mg/ml (povećanje HMW)

Uzorci su koncentrisani do finalne koncentracije od 100 mg/ml u 200 mM arginin sukcinatu, pH 5,5, sterilno filtrirani i skladišteni u mirovanju na 40 °C tokom 7 dana. Pre i posle skladištenja, sadržaj vrsta sa velikom i malom molekulskom masom (HMW odnosno LMW) određen je hromatografijom na molekulskim sitima. Razlika u sadržaju HMW i LMW između uskladištenog uzorka i uzorka koji je meren odmah nakon pripreme objavljen je kao „porast HMW” odnosno „porast LMW”. Rezultati su prikazani u Tabeli 4 i na Slici 4, gde je prikazano da VEGFang2-0015 (bez mutacije AAA) pokazuje veće smanjenje glavnog pika i veće povećanje HMW u poređenju sa VEGF Ang2-0016 (sa mutacijom AAA). Iznenađujuće, VEGF Ang2-0016 (sa mutacijom AAA) pokazuje manju sklonost ka agregaciji u poređenju sa VEGFang2-0015 (bez mutacije AAA).

Tabela 4: Delta glavni, HMW i LMW pik nakon 7d na 40 °C

Funkcionalna analiza anti-VEGF i anti-Ang2 bispecifičnih antitela obavljena je putem površinske plazmonske rezonance (SPR) koristeći instrument BIAcore® T100 ili T200 (GE Healthcare) na 25 °C. BIAcore® sistem je dobro poznat za ispitivanje interakcija molekula. SPR tehnologija se zasniva na merenju indeksa prelamanja blizu površine zlatom premazanog biosenzorskog čipa. Promene indeksa prelamanja ukazuju na masene promene na površini uzrokovane interakcijom imobilisanog liganda i analita injektovanog u rastvor. Masa se povećava ako molekuli vezuju imobilisane ligande na površini, i obrnuto, masa se smanjuje u slučaju disocijacije analita sa imobilisanog liganda (što odražava disocijaciju kompleksa). SPR omogućava kontinuirano praćenje vezivanja liganda/analita u realnom vremenu, a time i određivanje konstante brzine asocijacije (ka), konstante brzine disocijacije (kd) i konstante ravnoteže (KD).

Primer 3

Vezivanje za VEGF, Ang2, FcgamaR i FcRn

Kinetički afinitet izooblika VEGF, uključujući procenu unakrsne reaktivnosti vrsta

Oko 12.000 rezonantnih jedinica (RU) sistema za hvatanje (10 µg/ml kozjeg antihumanog F(ab)'2; šifra narudžbine: 28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Švedska) kuplovano je na čip CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) na pH 5,0 pomoću kompleta za kuplovanje amina kompanije GE Healthcare. Pufer za uzorak i sistemski pufer bio je PBS-T (10 mM fiziološki rastvor puferovan fosfatom, uključujući 0,05% Tween20) pri pH 7,4. Protočna ćelija je podešena na 25 °C, a blok uzorka je postavljen na 12 °C i dva puta kondicioniran radnim puferom. Bispecifično antitelo je uhvaćeno injektovanjem 50 nM rastvora tokom 30 s pri protoku od 5 µl/min. Asocijacija je merena injektovanjem humanog hVEGF121, mišjeg mVEGF120 ili pacovskog rVEGF164 u različitim koncentracijama u rastvor tokom 300 s pri protoku od 30 µl/min, počevši sa 300 nM u serijskim razblaženjima 1:3. Faza disocijacije je praćena do 1200 sekundi i aktivirana prebacivanjem sa uzorka rastvora na radni pufer. Površina je regenerisana tako što je 60 s ispirana rastvorom glicina pH 2,1 pri protoku od 30 µl/min. Razlike u indeksu refrakcije u rasutom stanju su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog od površine kozjeg anti humanog F(ab’)2. Blanko injektovanja se takođe oduzimaju (= dvostruka referenca). Za izračunavanje prividnog KDi drugih kinetičkih parametara korišćen je Lengmirov model 1:1. Rezultati su prikazani u Tabeli 5.

Afinitet rastvora Ang2, uključujući procenu unakrsne reaktivnosti vrsta Afinitet rastvora meri afinitet interakcije određivanjem koncentracije slobodnih partnera za interakciju u ravnotežnoj smeši. Test afiniteta rastvora uključuje mešanje <VEGF-ANG-2> bispecifičnog antitela, koje je održavano u konstantnoj koncentraciji, sa ligandom (= Ang2) u različitim koncentracijama. Maksimalni mogući broj rezonantnih jedinica (npr. 17.000 rezonantnih jedinica (RU)) antitela imobilisan je na površini CM5 čipa (GE Healthcare BR-1005-30) pri pH 5,0 koristeći komplet za kuplovanje amina nabavljen od GE Healthcare. Pufer za uzorak i sistemski pufer bio je HBS-P pH 7,4. Protočna ćelija je postavljena na 25 °C, a blok uzorka na 12 °C i dva puta kondicioniran radnim puferom. Radi dobijanja kalibracione krive, rastuće koncentracije Ang2 su injektovane u protočnu ćeliju BIAcore sa imobilisanim VEGF-ANG-2> bispecifičnim antitelom. Količina vezanog Ang2 je određena kao rezonantne jedinice (RU) i uneta u odnosu na koncentraciju. Rastvori svakog liganda (11 koncentracija od 0 do 200 nM za VEGF-ANG-2> bispecifično antitelo) inkubirani su sa 10 nM Ang2 i ostavljeni da dostignu ravnotežu na sobnoj temperaturi. Koncentracije slobodnog Ang2 određene su sa kalibracione krive koja je napravljena pre i posle merenja odgovora rastvora sa poznatim količinama Ang2. Podešavanje sa 4 parametra je postavljeno pomoću XLfit4 (IDBS Software) koristeći Model 201, gde je koncentracija slobodnog Ang2 korišćena kao y-osa, a koncentracija antitela za inhibiciju je korišćena kao x-osa. Afinitet je izračunat određivanjem tačke pregiba ove krive. Površina je regenerisana tako što je jednokratno ispirana 300,85%-tnim rastvorom H3PO4pri protoku od 30 µl/min. Razlike u indeksu refrakcije u rasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog od površine kuplovane sa slepom probom. Rezultati su prikazani u Tabeli 6.

Afinitet FcRn u stanju mirovanja

Za merenje FcRn, afinitet u stabilnom stanju korišćen je za međusobno poređenje bispecifičnih antitela. Humani FcRn je razblažen u puferu za kuplovanje (10 µg/ml, Na acetat pH 5,0) i imobilisan na C1 čipu (GE Healthcare BR-1005-35) postupkom za ciljnu imobilizaciju koristeći BIAcore wizard do finalnog odgovora od 200 RU. Protočna ćelija je postavljena na 25 °C, a blok uzorka na 12 °C i dva puta kondicioniran radnim puferom. Pufer za uzorak i sistemski pufer bio je PBS-T (10 mM fiziološki rastvor puferovan fosfatom, uključujući 0,05% Tween20) pri pH 6,0. Za procenu različitih koncentracija IgG za svako antitelo, pripremljena je koncentracija od 62,5 nM, 125 nM i 250 nM, 500 nM. Protok je podešen na 30 µl/min, a različiti uzorci su redom injektovani na površinu čipa odabirom vremena asocijacije od 180 s. Površina je regenerisana injektovanjem PBS-T pH 8 tokom 60 s pri protoku od 30 µl/min. Razlike u indeksu refrakcije u rasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog od prazne površine. injektovanja pufera se takođe oduzimaju (= dvostruka referenca). Za izračunavanje afiniteta u stabilnom stanju korišćen je postupak iz Bia-Evaluation softvera. Ukratko, vrednosti RU (RU max) prikazane su u odnosu na analizirane koncentracije, dajući krivu doza-odgovor. Na osnovu unosa 2 parametra, izračunata je gornja asimptota, što omogućava određivanje polovine maksimalne vrednosti RU, te tako i afiniteta. Rezultati su prikazani na Slici 5 i u Tabeli 7. Analogno se može odrediti afinitet prema cinomolgusovom, mišjem i zečjem FcRn.

Merenje FcgamaRIIIa

Za merenje FcgamaRIIIa korišćen je test direktnog vezivanja. Oko 3000 rezonantnih jedinica (RU) sistema za hvatanje (1 µg/ml Penta-His; Quiagen) kuplovano je na čip CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) na pH 5,0 pomoću kompleta za kuplovanje amina koji je obezbedio GE Healthcare. Pufer za uzorak i sistemski pufer bio je HBS-P+ pH 7,4. Protočna ćelija je podešena na 25 °C, a blok uzorka na 12 °C i dva puta kondicioniran radnim puferom. FcgamaRIIIa −His-receptor je uhvaćen injektovanjem 100 nM rastvora tokom 60 s pri protoku od 5 µl/min. Vezivanje je mereno injektovanjem 100 nM bispecifičnog antitela ili monospecifičnih kontrolnih antitela (anti-Dig za antitelo potklase IgG1 i potklase IgG4) tokom 180 s pri protoku od 30 µl/. Površina je regenerisana tako što je 120 s ispirana rastvorom glicina pH 2,5 pri protoku od 30 µl/min. Budući da se vezivanje FcgamaRIIIa razlikuje od Lengmirovog modela 1:1, ovim testom se utvrđuje samo vezivanje / odsustvo vezivanja. Na sličan način može da se utvrdi vezivanje FcgamaRIa i FcgamaRIIa. Rezultati su prikazani na Slici 6, odakle sledi da se uvođenjem mutacija P329G LALA više ne može detektovati vezivanje za FcgamaRIIIa.

Procena nezavisnog vezivanja VEGF i Ang2 za <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela

Oko 3500 rezonantnih jedinica (RU) sistema za hvatanje (10 µg/ml kozjeg antihumanog IgG; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Švedska) kuplovano je na čip CM4 (GE Healthcare BR-1005-34) na pH 5,0 pomoću kompleta za kuplovanje amina koji je dostavio GE Healthcare. Pufer za uzorak i sistemski pufer bio je PBS-T (10 mM fiziološki rastvor puferovan fosfatom, uključujući 0,05% Tween20) pri pH 7,4. Temperatura protočne ćelije je postavljena na 25 °C, a blok uzorka na 12 °C. Pre hvatanja, protočna ćelija je dva puta kondicionirana radnim puferom.

Bispecifično antitelo je uhvaćeno injektovanjem 10 nM rastvora tokom 60 s pri protoku od 5 µl/min. Nezavisno vezivanje svakog liganda za bispecifično antitelo je analizirano određivanjem kapaciteta aktivnog vezivanja za svaki ligand, bilo da je dodat redno ili istovremeno (protok 30 µl/min):

1. Injektovanje humanog VEGF u koncentraciji od 200 nM tokom 180 s (identifikuje se pojedinačno vezivanje antigena).

2. Injektovanje humanog Ang2 u koncentraciji od 100 nM tokom 180 s (identifikuje se pojedinačno vezivanje antigena).

3. Injektovanje humanog VEGF u koncentraciji od 200 nM tokom 180 sekundi, praćeno dodatnim injektovanjem humanog Ang2 u koncentraciji od 100 nM tokom 180 s (identifikuje se vezivanje Ang2 u prisustvu VEGF).

4. Injektovanje humanog Ang2 u koncentraciji od 100 nM tokom 180 s, praćeno dodatnim injektovanjem humanog VEGF u koncentraciji od 200 nM (identifikuje se vezivanje VEGF u prisustvu Ang2).

5. Zajedničko injektovanje humanog VEGF u koncentraciji od 200 nM i humanog Ang2 u koncentraciji od 100 nM tokom 180 s (identifikuje se vezivanje VEGF i Ang2 u isto vreme).

Površina je regenerisana tako što je 60 s ispirana rastvorom 3m MgCl2 pri protoku od 30 µl/min. Razlike u indeksu refrakcije u rasutom stanju su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog od površine kozjeg antihumanog IgG.

Bispecifično antitelo je moglo da se vezuje za oba antigena međusobno nezavisno ako je dobijeni finalni signal iz pristupa 3, 4 i 5 jednak ili je sličan zbiru pojedinačnih finalnih signala iz pristupa 1 i 2. Rezultati su prikazani u Tabeli 9, gde je pokazano da se oba antitela VEGFang2-0016, VEGFang2-0012 međusobno nezavisno vezuju za VEGF i ANG2

Procena istovremenog vezivanja VEGF i Ang2 za <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela

Prvo, oko 1600 rezonantnih jedinica (RU) VEGF (20 µg/ml) kuplovano je na CM4 čip (GE Healthcare BR-1005-34) na pH 5,0 koristeći komplet za kuplovanje amina kompanije GE Healthcare. Pufer za uzorak i sistemski pufer bio je PBS-T (10 mM fiziološki rastvor puferovan fosfatom, uključujući 0,05% Tween 20) pri pH 7,4. Protočna ćelija je postavljena na 25 °C, a blok uzorka na 12 °C i dva puta kondicioniran radnim puferom. Drugo, 50 nM rastvor bispecifičnog antitela je injektovan tokom 180 s pri protoku od 30 µl/min. Treće, hAng-2 je injektovan tokom 180 s pri protoku od 30 µl/min. Odgovor

4

vezivanja hAng-2 zavisi od količine bispecifičnog antitela vezanog za VEGF i pokazuje istovremeno vezivanje. Površina je regenerisana tako što je 60 s ispirana 0,85%-tnim rastvorom H3PO4 pri protoku od 30 µl/min. Istovremeno vezivanje je prikazano dodatnim signalom specifičnog vezivanja hAng2 za prethodna <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela vezana za VEGF. Za oba bispecifična antitela, VEGFang2-0015 i VEGFang2-0016, moglo je da se detektuje istovremeno vezivanje VEGF i Ang2 za <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela (podaci nisu prikazani).

Tabela 5: Rezultati: Kinetički afiniteti prema VEGF izooblicima različitih vrsta

Tabela 6: Rezultati: Afiniteti rastvora prema Ang2

Tabela 7: Rezultati: Afinitet prema FcRn <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela

Tabela 8: Rezultati vezivanja za FcgamaRI - IIIa

Tabela 9: Rezultati: Nezavisno vezivanje VEGF i Ang2 za <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela

Primer 4

Masena spektrometrija

Ovaj odeljak opisuje karakterizaciju <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela sa naglaskom na pravilno sastavljanje. Očekivane primarne strukture su potvrđene masenom spektrometrijom sa elektrosprej jonizacijom (ESI-MS) deglikozilovanih i netaknutih ili digestovanih pomoću IdeS (enzim S. Pyogenes koji razgrađuje IgG) <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela. Digestija pomoću IdeS izvedena je sa 100 µg prečišćenog antitela inkubiranog sa 2 µg IdeS proteaze (Roche) u 100 mmol/l NaH2PO4/ Na2HPO4, pH 7,1 na 37 °C tokom 5 h. Nakon toga, antitela su deglikozilovana N-glikozidazom F, neuraminidazom i O-glikozidazom (Roche) u 100 mmol/l NaH2PO4/ Na2HPO4, pH 7,1 na 37 °C do 16 h pri koncentraciji proteina od 1 mg/ml, a zatim su desalinizovana pomoću HPLC na koloni Sephadex G25 (GE Healthcare). Ukupna masa je određena preko ESI-MS na sistemu maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik) opremljenom TriVersa NanoMate izvorom (Advion).

Dobijene mase za deglikozilovane (Tabela 10) ili netaknute, deglikozilovane (Tabela

4

11) molekule digestovane pomoću IdeS odgovaraju predviđenim masama dobijenim iz aminokiselinskih sekvenci za <VEGF-ANG-2> bispecifična antitela koja se sastoje od dva različita laka lanca LCAng2i LCLucentis, i dva različita teška lanca HCAng2i HCLucentis.

Tabela 10: Mase deglikozilovanih i bispecifičnih <VEGF/ANG2> antitela VEGFang2-0201 (bez AAA mutacije) i VEGFang2-0012 (sa AAA mutacijom) digestovanih pomoću IdeS

Tabela 11: Mase deglikozilovanih <VEGF/ANG2> antitela VEGFang2-0016 (bez mutacije AAA) i VEGFang2-0015 (sa mutacijom AAA)

Primer 5

Fc-Rn hromatografija

Vezivanje za streptavidin sefarozu:

Jedan gram streptavidin sefaroze (GE Healthcare) dodat je u biotinilovani i dijalizovani receptor i inkubiran je dva sata uz tresenje. Sefaroza derivatizovana receptorom je napunjena u XK kolonu od 1 ml (GE Healthcare).

Hromatografija pomoću FcRn afinitetne kolone:

Uslovi:

dimenzije kolone: 50 mm x 5 mm

visina sloja: 5 cm

punjenje: 50 µg uzorka

pufer za ekvilibraciju: 20 mM MES, sa 150 mM NaCl, podešen na pH 5,5

pufer za eluiranje: 20 mM Tris/HCl, sa 150 mM NaCl, podešen na pH 8,8 eluiranje: 7,5 zapremina kolone pufera za ekvilibraciju, u 30 zapremina kolone do 100% pufera za eluiranje, 10 zapremina kolone pufera za eluiranje

Hu FcRn afinitetna hromatografija na koloni

U sledećoj tabeli su data retenciona vremena <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela na afinitetnim kolonama koje sadrže humani FcRn. Podaci su dobijeni primenom gore navedenih uslova. U sledećoj tabeli su data retenciona vremena <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela na humanom FcRn.

Tabela 12: Rezultati: retenciona vremena <VEGF-ANG-2> bispecifičnih antitela

Primer 6

Farmakokinetička (PK) svojstva

PK podaci sa Fc-Rn miševima transgenim za humani FcRn

Životna faza

Studija je obuhvatala ženke C57BL/6J miševa (osnova); miševe sa nedostatkom FcRn, ali hemizigotno transgene za humani FcRn (huFcRn, linija 276 -/tg)

Deo 1

Svim miševima je jednom u desno oko intravitrealno injektovano 2 µl/životinji

4

odgovarajućeg rastvora (tj.21 µg jedinjenja/životinji (VEGFAng2-0015 (bez mutacije AAA) ili 23,6 µg jedinjenja/životinji (VEGFAng2-0016 (sa mutacijom AAA).

Miševi su raspoređeni u 2 grupe sa po 6 životinja. Uzorci krvi su uzeti iz 1. grupe 2, 24 i 96 sati, a iz 2. grupe 7, 48 i 168 sati nakon doziranja.

Injekcija u staklasto telo desnog oka miša je izvedena koristeći NanoFil mikrošpric za nanolitarsku injekciju kompanije World Precision Instruments, Inc., Berlin, Nemačka. Miševi su anestezirani 2,5%-tnim izofluranom, a za vizuelizaciju oka miša korišćen je Leica MZFL 3 mikroskop sa uvećanjem 40 puta i prstenastim svetlom sa Leica KL 2500 LCD osvetljenjem. Nakon toga, 2 µl jedinjenja je injektovano koristeći iglu od 35 G.

Krv je prikupljena putem retrobulbarnog venskog pleksusa kontralateralnog oka od svake životinje radi određivanja nivoa jedinjenja u serumu.

Uzorci seruma od najmanje 50 µl su uzeti iz krvi nakon 1 sata na sobnoj temperaturi centrifugiranjem (9300xg) na 4 °C tokom 3 min. Uzorci seruma su zamrznuti neposredno nakon centrifugiranja i skladišteni zamrznuti na -80 °C do analize. Tretirane oči životinja iz 1. grupe su izolovane 96 sati nakon tretmana, a životinja iz 2. grupe 168 sati nakon tretmana. Uzorci su do analize čuvani zamrznuti na -80 °C.

Deo 2

Svim miševima je jednom preko repne vene intravenski injektovano 200 µl/životinji odgovarajućeg rastvora (tj.21 µg jedinjenja/životinji (VEGFAng2-0015 (bez mutacije AAA) ili 23,6 µg jedinjenja/životinji (VEGFAng2-0016 (sa mutacijom AAA).

Miševi su raspoređeni u 2 grupe sa po 5 životinja. Uzorci krvi su uzeti iz 1. grupe 1, 24 i 96 sati, a iz 2. grupe 7, 48 i 168 sati nakon doziranja. Krv je od svake životinje prikupljena putem retrobulbarnog venskog pleksusa radi određivanja nivoa jedinjenja u serumu.

Uzorci seruma od najmanje 50 µl su uzeti iz krvi nakon 1 sata na sobnoj temperaturi centrifugiranjem (9300xg) na 4 °C tokom 3 min. Uzorci seruma su zamrznuti neposredno nakon centrifugiranja i skladišteni zamrznuti na -80 °C do analize.

Priprema lizata celog oka (miševi)

Lizati oka su dobijeni fizičko-hemijskom dezintegracijom celog oka laboratorijskih životinja. Radi mehaničkog poremećaja, svako oko je prebačeno u mikrobočicu od 1,5 ml sa konusnim dnom. Nakon zamrzavanja i odmrzavanja, oči su isprane koristeći 1 ml pufera za ispiranje ćelija (Bio-Rad, Bio-Plex Cell Lysis Kit, kat. br.171-304011). U sledećem koraku, dodato je 500 µl sveže pripremljenog pufera za lizu ćelija, i oči su usitnjene pomoću tučka za mlevenje tkiva od 1,5 ml (Kimble Chase, tučak 1,5 ml, art. br.749521-1500). Smeša je zatim

4

pet puta zamrznuta i odmrznuta, te ponovo usitnjena. Za odvajanje lizata od preostalog tkiva, uzorci su centrifugirani 4 minuta na 4500 g. Nakon centrifugiranja, supernatant je sakupljen i čuvan na -20 °C do dalje analize putem kvantifikacionog ELISA testa.

Analiza

Koncentracije <VEGF/ANG2> antitela u mišjem serumu i lizatima oka određene su testom sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA)

Za kvantifikaciju <VEGF/ANG2> antitela u uzorcima mišjeg seruma i lizatima oka, obavljen je standardni serijski sendvič imunotest čvrste faze sa biotinilovanim i digoksigenovanim monoklonskim antitelima korišćenim kao antitela za hvatanje i detekciju. Da bi se potvrdio integritet bispecifičnosti analita, biotinilovano antitelo za hvatanje prepoznaje anti-VEGF-vezujuće mesto, dok se digoksigenovano antitelo za detekciju vezuje za anti-Ang2 vezujuće mesto analita. Vezani imunološki kompleks antitela za hvatanje, analita i antitela za detekciju na čvrstoj fazi mikrotitarske ploče premazane streptavidinom (SA-MTP) zatim je detektovan pomoću peroksidaze rena kuplovane sa anti-digoksigenin antitelom. Nakon ispiranja nevezanog materijala sa SA-MTP i dodatka ABTS-supstrata, dobijeni signal je proporcionalan količini vezanog analita vezanog za čvrstu fazu SA-MTP. Kvantifikacija se zatim vrši pretvaranjem izmerenih signala uzoraka u koncentracije koje se odnose na paralelno analizirane kalibratore.

U prvom koraku, SA-MTP je premazan sa 100 μl/bunarčiću rastvora biotinilovanog antitela za hvatanje (mAb<Id<VEGF»M-2.45.51-IgG-Bi(DDS)) u koncentraciji od 1 μg/ml tokom jednog sata na 500 o/min na tresilici za MTP. U međuvremenu su pripremljeni kalibratori, uzorci za QC i uzorci. Kalibratori i uzorci za QC su razblaženi do 2% serumske matrice; uzorci su razblaživani sve dok signali nisu bili u linearnom rasponu kalibratora.

Nakon oblaganja SA-MTP antitelom za hvatanje, ploča je isprana tri puta puferom za ispiranje i 300 µl/bunarčiću. Zatim je 100 µl/bunarčiću kalibratora, uzoraka za QC i uzoraka pipetirano na SA-MTP i ponovo inkubirano jedan sat na 500 o/min. Analit je sada vezan preko svog anti-VEGF mesta vezivanja putem antitela za hvatanje sa čvrstom fazom SA-MTP. Nakon inkubacije i uklanjanja nevezanog analita ispiranjem ploče, 100 µl/bunarčiću prvog antitela za detekciju (mAb<Id-<Ang2»M-2.6.81-IgG-Dig(XOSu)) u koncentraciji od 250 ng/ml dodato je u SA-MTP. Ploča je ponovo inkubirana jedan sat na 500 o/min na tresilici. Nakon ispiranja, u bunarčiće SA-MTP dodato je 100 µl/bunarčiću drugog antitela za detekciju (pAb<digoksigenin>S-Fab-POD (poly)) u koncentraciji od 50 mU/ml, i ploča je ponovo inkubirana jedan sat na 500 o/min. Nakon završnog koraka ispiranja radi uklanjanja viška antitela za detekciju, dodaje se 100 µl/bunarčiću supstrata (ABTS). Konjugat antitelo-

4

enzim katalizuje bojenu reakciju ABTS® supstrata. Signal je zatim izmeren ELISA čitačem na talasnoj dužini 405 nm (referentna talasna dužina: 490 nm ([405/490] nm)).

Farmakokinetička procena

Farmakokinetički parametri su izračunati nekompartmentalnom analizom, koristeći program za farmakokinetičku procenu WinNonlinTM (Pharsight), verzija 5.2.1.

Rezultati: A) Koncentracije u serumu

Rezultati koncentracija u serumu su prikazani u Tabelama 13 do 16 i na Sl.7B do 7C Tabela 13: VEGFAng2-0015 (bez mutacije AAA): Poređenje koncentracija u serumu nakon intravitrealne i intravenske primene

Tabela 14: VEGFAng2-0016 (sa mutacijom AAA): Poređenje koncentracija u serumu nakon intravitrealne i intravenske primene

4

Tabela 15: VEGFang2-0015 (bez mutacije AAA) i VEGFang2-0016 (sa mutacijom AAA): Poređenje koncentracija u serumu posle intravitrealne primene)

Tabela 16: VEGFang2-0015 (bez mutacije AAA) i VEGFang2-0016 (sa mutacijom AAA): Poređenje koncentracije u serumu nakon intravenske primene

Rezultati: B) Koncentracije u lizatima levog i desnog oka

Rezultati za koncentracije u lizatima oka prikazani su u Tabelama 17 do 18 i na Slikama 7D do 7E

Tabela 17a: Koncentracije VEGFang2-0015 (bez mutacije AAA) u lizatima oka nakon intravitrealne primene u desno oko

4

Tabela 17b: Koncentracije VEGFang2-0015 (bez mutacije AAA) u lizatima oka nakon intravenske primene

Tabela 18a: Koncentracije VEGFang2-0016 (sa mutacijom AAA) u lizatima oka nakon intravitrealne primene u desno oko

Tabela 18b: Koncentracije VEGFang2-0016 (sa mutacijom AAA) u lizatima oka nakon intravenske primene

Sažetak rezultata:

Nakon intravitrealne primene, bispecifično <VEGF/ANG2> antitelo prema pronalasku, VEGFang2-0016 (sa mutacijom AAA), pokazuje slične koncentracije (nakon 96 i 168 sati) u lizatima oka u poređenju sa bispecifičnim <VEGF/ANG2> antitelom bez mutacije AAA, VEGFang2-0015.

Takođe, nakon intravitrealne primene, bispecifično <VEGF/ANG2> antitelo prema pronalasku VEGFang2-0016 (sa mutacijom AAA), pokazuje još brži klirens i kraći poluživot u serumu u poređenju sa bispecifičnim <VEGF/ANG2> antitelom bez mutacije AAA, VEGFang2-0015.

Primer 7

Mikrodžep test angiogeneze rožnjače miša

Za ispitivanje antiangiogenog dejstva bispecifičnog <VEGF/ANG2> antitela sa odgovarajućim anti-VEGF VH i VL SEQ ID NO: 7 i 8 i anti-ANG2 VH i VL SEQ ID NO: 15 i 16 na VEGF-indukovanu angiogenezu in vivo, obavili smo test angiogeneze rožnjače miša. U ovom testu, Nylaflo disk natopljen sa VEGF implantiran je u džep avaskularne rožnjače na fiksnom rastojanju od limbalnih sudova. Sudovi odmah urastaju u rožnjaču ka razvoju gradijenta VEGF. Ženke Balb/c miševa stare 8 do 10 nedelja kupljene su od kompanije Charles River, Sulzfeld, Nemačka. Protokol je modifikovan prema postupku koji opisuju Rogers, M.S., et al., Nat. Protoc. 2 (2007) 2545-2550. Ukratko, mikrodžepovi širine oko 500 μm pripremljeni su pod mikroskopom na oko 1 mm od limbusa do vrha rožnjače koristeći hirurško sečivo i oštru pincetu na anesteziranom mišu. Implantiran je disk (Nylaflo®, Pall Corporation, Michigan) prečnika 0,6 mm i površina oblasti implantacije je poravnata. Diskovi su inkubirani u odgovarajućem faktoru rasta ili u vehikulumu najmanje 30 minuta. Nakon 3, 5 i 7 dana (ili alternativno, samo nakon 3, 5 ili 7 dana) oči su fotografisane i izmeren je vaskularni odgovor. Test je kvantifikovan izračunavanjem procenta površine novih krvnih sudova po ukupnoj oblasti rožnjače.

Diskovi su napunjeni sa 300 ng VEGF ili PBS-om kao kontrolom i implantirani na 7 dana. Rast krvnih sudova od limbusa do diska praćen je tokom vremena 3, 5. i/ili 7. dana. Jedan dan pre implantacije diska, antitela su primenjena intravenski u dozi od 10 mg/kg (usled intravenske primene, kao surogat se koristi VEGFang2-0015 (bez mutacije AAA) stabilan u serumu, koji se razlikuje od VEGFang2-0016 samo po mutaciji AAA i ima iste anti-VEGF i anti-ANG2 VH i VL za posredovanje efikasnosti) za testiranje antiangiogenog dejstva na VEGF-indukovanu angiogenezu in vivo. Životinje u kontrolnoj grupi su primile vehikulum. Zapremina primene je 10 ml/kg.

1

2

4

1

2

�

4

1

2

�

1

2

�

1

11

12

1

��

1

�

1

11

12

��

12

1

11

��

�

14

�

1

14

��

14

��

Claims

Patentni zahtevi

1. Bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži navedeno bispecifično antitelo za upotrebu u lečenju vaskularne bolesti oka,

pri čemu je vaskularna bolest oka dijabetička retinopatija, dijabetički edem makule ili starosna degeneracija makule,

2. Bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži navedeno bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu konstantni region teškog lanca potklase IgG1 dalje sadrži mutacije L234A, L235A i P329G, numeracija prema Kabatovom EU indeksu.

3. Bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je antitelo dvovalentno i sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 i SEQ ID NO: 28.

4. Bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži navedeno bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je antitelo za intravitrealnu primenu.

5. Bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži navedeno bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je vaskularna bolest oka dijabetička retinopatija.

6. Bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži navedeno bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je vaskularna bolest oka dijabetički edem makule.

7. Bispecifično antitelo ili farmaceutska kompozicija koja sadrži navedeno bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu je degeneracija makule starosna degeneracija makule (AMD).

14