RS57762B1 - Jedinjenja za zaštitu ćelija - Google Patents

Description

Opis pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje za zaštitu ćelija, a naročito kultivisanih ćelija, krvnih ćelija i ćelija tkiva i krvnih pločica, ili trombocita. On se dalje odnosi na jedinjenje za primenu kao lek ili u lekovima. Dalje, pronalazak se odnosi na metod za zaštitu ćelija, a naročito na metod za zaštitu ćelija tokom čuvanja.

[0002] Jedinjenja koja štite ćelije i koja se primenjuju kao lek za zaštitu ćelija, na primer, od oštećenja ćelija indukovanog oksidativnim stresom su poznata iz odgovarajuće oblasti. Na primer, derivati tropolona ispoljavaju neuroprotektivnu aktivnost, što je opisano u Koufaki et al. (Eur J Med Chem.2010 mar; 45(3):1107-12). Oksidativni stres u ćelijama i oštećenje ćelija su često povezani sa starenjem i bolestima povezanim sa starenjem. Nedavne studije su otkrile da jedinjenja kao što su nitroni mogu da se primene u lečenju ishemijskog moždanog udara i kao antikancerski agensi (pregled dat u Floyd et al. Free Radic Biol Med.2011 sep 1;51(5):931-41). Jacobsen et al. Medicinal Chemistry 199235(23): 4464-4472 opisuju 2-(aminometil)hromane koji štite centralni nervni sistem od traume i ishemije.

[0003] Drugi primeri jedinjenja koja imaju svojstva zaštite ćelija, a naročito neuroprotektivnu aktivnost, su hibridi hromana i kateholskih radikala, što je opisano u Koufaki et al. (Bioorg Med Chem.2010 Jun 1;18(11):3898-909; Bioorg Med Chem. 2009 sep 1;17(17):6432-41), i izoksazolima supstituisani hromani (Bioorg Med Chem.

2011 avg 15; 19 (16) : 4841-50) .

[0004] Zaštita ćelija je takođe potrebna tokom čuvanja ćelija. Ovo je posebno slučaj kada se ćelije hlade npr. na 4°C ili -80°C, i ponovo se zagrevaju radi upotrebe u ćelijskim testovima ili kliničkim primenama.

[0005] Krvne pločice su tip ćelija koje je veoma teško čuvati. Sada se krvne pločice čuvaju uz konstantno mešanje na 20-24 °C. Čuvanje na sobnoj temperaturi obezbeđuje okruženje u kome se bilo kakve bakterije, kožna flora ili drugi mikroorganizmi iz krvi ili sa kože koje budu uvedene u krvnu komponentu u toku procesa sakupljanja mogu razmnožavati, pošto rast na ovim temperaturama nije ograničen. Ove kontaminirane krvne pločice se više ne mogu koristiti za transfuziju. Iz ovog razloga, čuvanje ne može biti duže od pet dana, što rezultuje činjenicom da za više od 15% sakupljenih krvnih pločica istekne rok trajanja, pre nego što mogu da budu upotrebljene (mogu ili bi mogle). Čuvanje na niskoj temperaturi bi sprečilo razmnožavanje bakterija. Međutim, pločice odlikuje lezija pločica indukovana hladnoćom pri čuvanju (engl. platelet storage lesion, skr. PSL), [pošto se ova skraćenica upotrebljava kasnije] kada se ohlade, čak i na kratko na 4°C. Ove lezije pločica indukovane hladnoćom počinju da se pojavljuju čak i posle kratkog izlaganja temperaturama manjim od 20°C i uočene su čak i kod pacijenata koji su podvrgnuti hirurškoj intervenciji tokom koje se temperatura celog tela ili delova tela smanjuje na manje od 20°C. Izlaganje pločica temperaturama manjim od 20°C rezultuje strukturnim oštećenjem i funkcionalnom aktivacijom normalnih pločica. Ključne karakteristike lezije pločica indukovane hladnoćom su (1) reverzibilna do nereverzibilna morfološka promena od diskoidne ćelije u spekulativne sfere sa štrčećim filipodijama, u zavisnosti od trajanja izlaganja temperaturama manjim od 20°C i (2) nepovratno imuno nezavisno mikroslepljivanje pločica usled povećane interakcije ćelija-ćelija, (3) membransko nakupljanje glikoproteina GPIb na površini pločica, koje je signal za mikrofage da uklone te pločice iz krvotoka; i (4) sledstveno prepoznavanje i fagocitoza transfuzionisanih pločica od strane makrofaga posle transfuzije primaocu. Proučeno je nekoliko jedinjenja i njihov efekat na čuvanje pločica. Na primer, patent US 7,964,339 opisuje upotrebu polietilen glikola i derivata za modifikaciju pločica koja ima efekat na hladno čuvanje. Dalje, Amorini (Blood Transfus. 2007 jan;5(1):24-32) je pokazao da glukozni rastvor može imati pozitivan efekat na čuvanje krvnih pločica. US patent br.6,833,236 i EP patent br.1 221 835 B1 opisuju upotrebu trehaloze za zaštitu trombocita kada se liofilizuju ili suše u FTS sušaču, radi čuvanja krvnih pločica.

[0006] Uprkos ovom poznavanju jedinjenja koja imaju efekat na čuvanje krvnih pločica, još uvek postoji potreba za novim jedinjenjima koja imaju pozitivan efekat na čuvanje krvnih pločica. Pored toga, dalje je potrebno da se otkriju nova jedinjenja koja štite ćelije od oštećenja ćelija in vitro i in vivo, pri čemu, između ostalog, oštećenje ćelija može biti izazvano oksidativnim stresom.

[0007] Cilj ovog pronalaska je da se realizuju jedinjenja koja se mogu primeniti za zaštitu ćelija, kao što su sisarske ćelije, od povrede ćelija.

[0008] Sledeći cilj je da se realizuju jedinjenja koja se mogu primeniti za zaštitu krvnih pločica od lezije pri čuvanju na hladnom.

[0009] Sledeći cilj je da se realizuju jedinjenja koja obezbeđuju zaštitu ćelija od oštećenja izazvanih nekim medicinskim indikacijama, kao što su indikacije u koje su uključene bolesti starenja, indikacije u koje je uključen oksidativni stres, i/ili indikacije u koje je uključeno formiranje krvnog ugruška.

[0010] Ovi ciljevi i drugi ciljevi su rešeni delimično, ako ne u potpunosti, jedinjenjem koje je opisano u priloženom zahtevu 1.

[0011] Opisana su jedinjenja sa strukturnom formulom (I)

pri čemu,

R1 i R2 su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od C1-C6alkila, a prvenstveno metil, etil, propil ili izopropil;

R3 je izabran iz grupe koja se sastoji od CH2NHR9, C(=O)YR10, -CH2OH,

gde * označava tačku vezivanja R3za ostatak molekula;

R4, R5, R6, R7, R8su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od H, -OH, alkila, supstituisanog alkila, a prvenstveno hidroksialkila, arila, supstituisanog arila, halogena, kiseonika, heteroarila, supstituisanog heteroarila; a R7prvenstveno nije aril,

X je izabran iz grupe koja se sastoji od H, =O, =S;

Y je izabran iz grupe koja se sastoji od O, NH, S;

R9je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkila, supstituisanog alkila, a prvenstveno hidroksialkila, alkenila, arila, heteroarila;

R10je izabran iz grupe koja se sastoji od alkila, supstituisanog alkila, a prvenstveno hidroksialkila ili cijanoalkila, arila, OH;

R11i R12zajedno sa atomom N za koji su vezani obrazuju zasićeni ili nezasićeni 3, 4, 5, 6, 7 ili 8-člani prsten, koji sadrži jedan ili više dodatnih, kao što su jedan, dva ili tri N, O, ili S atoma;

R13i R14zajedno sa atomom N za koji su vezani obrazuju zasićeni ili nezasićeni 3, 4, 5, 6, 7 ili 8-člani prsten, opciono supstituisan sa alkilalkoholom, i u slučaju da R3jeste CH2NHR9, C(=O)YR10, -CHOH ili

R1i R2su izopropil.

[0012] Opisana su jedinjenja gde R7ili R10nije OH ako Y jeste O.

[0013] Opisano je jedinjenje koje nije 5-[4-[N-[(2RS)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-ilmetil]-(2S)-pirolidin-2-metoksi]fenil metilen]tiazolidin-2,4-dion.

[0014] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na aktuelno jedinjenje za primenu kao lek.

[0015] Prema jednom aspektu, pronalazak se dalje odnosi na primenu (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanona u lečenju ili profilaksi ishemijskog moždanog udara, cerebralne paralize, tromboze, embolije, hemoragije, kardiovaskularne bolesti, artritisa, dijabetesa, kancera, a naročito kancera poovezan sa starenjem, ateroskleroze, srčane insuficijencije, infarkta miokarda, šizofrenije, bipolarnog poremećaja, sindroma krhkog X hromozoma, bolesti srpastih ćelija, i sindroma hroničnog umora, hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), neurodegenerativne bolesti, kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, Lu Gerigova bolest, Hantingtonova bolest, hipotermije/reperfuzione povrede, hemoragijskog šoka, starenja, hipertenzije, bubrežne insuficijencije usled različitih bubrežnih bolesti, astme, zapaljenske bolesti creva, hepatitisa i ciroze jetre, migrene, hiper-homocisteinemije, infektivnih bolesti uključenih u napad na trombocite, kao što je hemoragijska groznica, a naročito ebola i Čagas.

[0016] Pronalazači su kao iznenađujuće otkrili da jedinjenja koja imaju gore opisanu formulu štite ćelije od oštećenja ćelija. Pronalazači su razvili nekoliko novih jedinjenja koja su opisana gore, i otkrili su da ona mogu da zaštite ćelije od oštećenja ćelija. Oštećenje ćelija može imati nekoliko uzroka i pojavljuje se pod stresnim uslovima. Oštećenje ćelija može konačno dovesti do nekroze ili apoptoze ćelija. Pronalazači su izveli testove na nekoliko tipova ćelija i kao iznenađujuće su otkrili da gornja jedinjenja imaju efekat na ćelije i da štite ćeliju od oštećenja ćelija ili povrede ćelija pod stresnim uslovima. Pod stresnim uslovima se podrazumeva nedostatak kiseonika (hipoksija i ishemija); pojava fizičkih agenasa (kao što su mehanička trauma, ekstremne temperature, opekotine i promrzline, iznenadne promene atmosferskog pritiska, zračenja, električni šok); pojava hemijskih agenasa i droga; pojava infektivnih agenasa, imunološke reakcije; genetske bolesti; nutritivni disbalansi, kao što su povreda, infekcija, kancer, infarkt, otrovi, pojava ROS (reaktivne vrste kiseonika), i zapaljenje. Jedinjenje prema pronalasku se može primeniti kao lek za zaštitu ćelija od gore navedenih uzroka povrede ćelija.

[0017] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon za primenu u lečenju oksidativnog stresa, zapaljenja, poremećaja proteostaze, oštećenja DNK (npr. usled zračenja), preopterećenja kalcijumom, otrovnih/toksičnih agenasa, poremećaja ili grešaka u metabolizmu indukovanih oštećenjem ćelija.

[0018] U sledećem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon za primenu u lečenju ili profilaksi bolesti koje su povezane sa starenjem, neurodegenerativnim bolestima, infekcijama, dijabetesom i drugim indikacijama u koje je uključeno oštećenje ćelija.

[0019] U sledećem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon za lečenje ili profilaksu stanja povezanih sa starenjem ili oksidativnim stresom, a naročito ishemijskog moždanog udara, cerebralne paralize, tromboze, embolije, hemoragije, kardiovaskularne bolesti, artritisa, dijabetesa, kancera, a naročito kancera povezanog sa starenjem, ateroskleroze, srčane insuficijencije, infarkta miokarda, šizofrenije, bipolarnog poremećaja, sindroma krhkog X hromozoma, bolesti srpastih ćelija, sindroma hroničnog umora, hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD) i neurodegenerativnih bolesti, kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, Lu Gerigova bolest i Hantingtonova bolest, oštećenja tkiva posredovanog virusnom ili bakterijskom infekcijom.

[0020] U sledećem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon za primenu u lečenju ishemije/reperfuzione povrede.

[0021] U sledećem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon za primenu u lečenju indikacija uključenih u oštećenje ćelija indukovano oksidativnim stresom.

[0022] Prema jednom aspektu, pronalazači su takođe otkrili da (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon štiti krvne pločice i sprečava krvne pločice da se lepe ili slepljuju, i sprečava da budu podvrgnute promeni oblika.

[0023] U sledećem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon za primenu u lečenju ili profilaksi poremećaja koji dovode do disfunkcije pločica ili su izazvani njom, kao što su arterijska tromboza, arterijska fibrilacija, plućna embolija (PE), tromboza dubokih vena (DVT), ili venska tromboembolija (VTE), kongestivna srčana insuficijencija, moždani udar, infarkt miokarda, genetska ili stečena hiperkoagulabilnost, ili defekti pločica izazvani hemoragijskim groznicama, kao što su ebola, Marburg hemoragijska groznica i Čagas.

[0024] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na rastvor koji sadrži (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon i ćelije. Pronalazači su otkrili da (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon štiti ćelije od povrede ćelija, koja eventualno može dovesti do smrti ćelija usled nekroze ili apoptoze. (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon obezbeđuje zaštitu od povrede ćelija. Zaštita se može obezbediti tokom čuvanja. Ćelije koje se čuvaju sa jedinjenjima prema pronalasku imaju smanjenje smrti ćelija u poređenju sa ćelijama koje se čuvaju bez jedinjenja.

[0025] U jednom primeru izvođenja, (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon štiti sisarske ćelije, kao što su kultivisane ćelijske linije (npr. humanog porekla), matične ćelije, primarne ćelije, krvne pločice, krvne ćelije i ćelije tkiva. Ćelijske linije se mogu staviti u kulturu radi proizvodnje virusnih vakcina, bioloških proizvoda proizvedenih tehnologijom rekombinantne DNK u ćelijskim kulturama, kao što su proteini, hormoni, enzimi, antitela itd.

[0026] U sledećem primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na medijum koji sadrži (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon, u kome se ćelije gaje da bi formirale dvo- ili trodimenzionalnu ćelijsku kulturu. Pored toga, jedinjenja se mogu koristiti za zaštitu ćelija koje se upotrebljavaju za inženjering tkiva.

[0027] Iz sledeće tabele 1, samo je (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon deo pronalaska.

Tabela 1:

[0028] Poželjni primer izvođenja pronalaska je medijum koji sadrži krvne pločice i (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon.

[0029] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na metod za zaštitu ćelija koji sadrži dodavanje (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanona ćeliji. Prvenstveno je aktuelni metod ex vivo metod. Shodno tome, jedinjenje se može upotrebiti za zaštitu ćelija tokom čuvanja. Čuvanje se može vršiti na temperaturi koja je podesna za čuvanje specifične ćelije i

1

može biti na i ispod 37°C, a prvenstveno između -80 i 37°C, kao što je između 10-25°C; 0-10°C, oko 4°C; između -20 i 0°C i između -80 i -20°C, na sobnoj temperaturi, - 80°C itd. Pronalazači su otkrili da (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon štiti ćelije od oštećenja ćelija tokom hlađenja i posle njega, a naročito od oštećenja tokom zagrevanja nazad na funkcionalnu temperaturu. Što više ćelija preživi ove stresne uslove, to se, shodno tome, više povećava mogućnost čuvanja kada se ćelije čuvaju zajedno sa (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanonom, u poređenju sa ćelijama koje se čuvaju bez dodavanja (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanona.

[0030] U jednom primeru izvođenja medijum, koji može biti tipični pufer ili aditivni rastvor za čuvanje pločica, sadrži (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon koji ima koncentraciju između 1.10<-3>- 1.10<-10>M, a prvenstveno oko 1.10<-6>, 1.10<-7>, 1.10<-8>, 1.10<-9>, 1.10<-10>M.

[0031] Prema sledećem aspektu, pronalazak se odnosi na metod za čuvanje ćelija, pri čemu su ćelije krvne pločice, koji sadrži dodavanje (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanona krvnim pločicama. Kao što je gore opisano, krvne pločice se čuvaju na sobnoj temperaturi, pre nego što se mogu upotrebiti za transfuziju. Čuvanje krvnih pločica na 4°C rezultuje brzim gubitkom vijabilnosti i funkcije pločica. Pronalazači su otkrili da kada se krvne pločice čuvaju na temperaturi ispod 20°C, npr. na 4°C sa (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanonom, mogućnost čuvanja je mnogo veća i zato se mogu čuvati duže u poređenju sa krvnim pločicama koje se čuvaju bez (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanona. Shodno tome, (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon može da se upotrebi za dobijanje povećane mogućnosti čuvanja krvnih pločica tokom čuvanja na hladnom. Pored toga, kada se (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon doda krvnim pločicama, smanjuju se slepljivanje i adhezija krvnih pločica. Pored toga, pločice koje se čuvaju sa (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanonom mogu još uvek ispoljiti reakciju slepljivanja posle stimulacije sa ADP ili epinefrinom. (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon pomaže održavanje funkcionalnosti pločica.

[0032] Opisan je metod za zaštitu krvnih pločica od lezija pločica pri čuvanju. Ovo znači da je jedinjenje prema pronalasku uključeno u proces koji utiče na morfološke promene pločica kada se one čuvaju na hladnom. Jedinjenje prema pronalasku obezbeđuje redukovanu promenu oblika, smanjenje koagulacije i efekat na oslobađanje sadržaja granula, egzocitozu citozolnih proteina ili na glikoproteinsko ponašanje pločica. Jedinjenje prema pronalasku ima uticaj na mehanizam aktivacije pločica, i obezbeđuje smanjenje PSL (PSL pločica = lezije pločica pri čuvanju), ili smanjenu količinu aktiviranih pločica, što sledstveno dovodi do smanjenja apoptoze. Gornje jedinjenje čuva funkciju krvnih pločica posle čuvanja u hladnom okruženju.

[0033] (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon bolje održava sposobnost pločica da se slepljuju ili da prianjaju posle stimulacije, čak i ako su bile čuvane na 4°C

[0034] Opisane su pločice koje se čuvaju sa jedinjenjem prema pronalasku za primenu kao transfuzija pločica.

[0035] Krvne pločice se mogu dobiti iz plazme bogate pločicama (engl. platelet-rich plasma, skr. PRP). Pločice se mogu dobiti iz trombocitno-leukocitnog međusloja (engl. buffy coat, skr. BC) ili metodom afereze. Pločice za transfuziju se mogu pripremiti pomoću tri različita metoda: (a) metod sa plazmom bogatom pločicama (PRP) metod; (b) metod sa trombocitno-leukocitnim međuslojem (BC); i (c) metod afereze. Studije sa upoređivanjem PRP i BC pločica su pokazale da nema razlike u in vitro kvalitetu takvih koncentrata pločica kada se one čuvaju do 5 dana na sobnoj temperaturi. Kod afereze pločica ili fereze pločica pločice potiču od jednog specifičnog donora. Tri metode su dobro opisane i poznate su stručnjaku iz odgovarajuće oblasti.

[0036] Opisan je Sul 109 za povećanje hladne ishemijske tolerancije transplantiranih organa, a prvenstveno srca. Drugim rečima, takođe je opisana primena Sul 109 za čuvanje organa za transplantaciju, kao što su srca.

[0037] Tehnički efekti i prednosti različitih primera izvođenja i aspekti metoda prema pronalasku odgovaraju mutatis mutandis onima koji su opisani za proizvode prema pronalasku i obratno.

[0038] Ovo onda generalno opisuje pronalazak, da bi pomoglo njegovom razumevanju, a sada se vrši poziv na priložene slike nacrta i neograničavajuće primere i slike.

Opis slika nacrta:

[0039]

Slika 1: šematski pregled testa sa indukovanom hipotermijom/reperfuzionom povredom gde je jedinjenje prvo dodato ćelijama na 37°C, pa je inkubirano 1h, a zatim je hlađeno na 4°C tokom 24h, te je ponovo zagrejano i testirano je na 37°C.

Slika 2: Apsorpcioni test sa tripan plavim. NOD je upotrebljen kao pozitivna kontrola. Sul 112 ((6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) ((S)-2-(hidroksimetil)pirolidin-1-il)metanon), Sul 121 ((6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(piperazin-1-il)metanon) Sul 127 (metil 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilat), Sul 136 (2-(4-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)sirćetna kiselina), Sul 89 (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), Sul 85 (((R)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina), Sul 141 ((S)-2-(4-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)sirćetna kiselina), Sul 142 ((R)-2-(4-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)sirćetna kiselina). Sul 136 je racemska smeša. Sul 141 i Sul 142 su, respektivno, S i R izomer.

Jedinjenja su bila dodata SMAC ćelijama u različitim koncentracijama.

Apsorpcioni test je bio izvršen posle ponovnog zagrevanja na 37° C.4° C znači da su ćelije bile prvo ohlađene na 4° C. C37°C i C4°C su testovi SMAC ćelija, pri čemu se ćelije održavaju na 37° C, pa se prvo ohlade na 4° C, a zatim se ponovo zagreju na 37° C, respektivno, bez prisustva jedinjenja.

[0040] U sledećim primerima samo je (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon deo pronalaska.

Primer 1: Čuvanje HEK ćelija

Materijal i metod:

[0041] Humane embrionske bubrežne (HEK) 293 ćelije su bile kultivisane u DMEM medijumu za kultivaciju ćelija (Life Technologies, 41965-052), kome su bili dodati fetusni teleći serum, penicilin i streptomicin. Ćelije su bile zasejane sa gustinom od

1

0.8 - 1.2E6 mL-1 u polistirenske balone od 25 cm2, pa su stavljene u inkubator sa regulisanim CO2 i ovlaživanjem na 37°C i ostavljeno je da proliferišu 24 sata pre početka eksperimenata. Bila su testirana jedinjenja SUL-090 (N,6-dihidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-091 (N-butil-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-092 (6-hidroksi-N-izopropil-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-093 ((E)-N-(3,7-dimetilokta-2,6-dien-1-il)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-095 ((6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(morfolino)metanon), SUL-097 (N-(4-fluorobenzil)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-098 (6-hidroksi-N-((S)-2-hidroksi-1-feniletil)-2, 5, 7, 8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-100 (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametil-N-(2-(metilamino)etil)hroman-2-karboksamid), SUL-101 (6-hidroksi-N,2,5,7,8-pentametil-N-(2-(metilamino)etil)hroman-2-karboksamid), SUL-102 (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametil-N-(3-(piperidin-1-il)propil)hroman-2-karboksamid), SUL-104 (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametil-N-(3-nitrofenil)hroman-2-karboksamid), SUL-106 (N-(4-fluorofenil)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-107 (metil 4-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamido)benzoat), SUL-108 ((4-butilpiperazin-1-il) (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)metanon), SUL-109 ((6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon), SUL-111 (N-((R)-2-amino-2-okso-1-feniletil)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-112 ((6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) ((S)-2-(hidroksimetil)pirolidin-1-il)metanon), SUL-114 (N-(2-bromoetil)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-117 (2-((butilamino)metil)-2,5,7,8-tetrametilhroman-6-ol), SUL-118 (6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karboksilna kiselina), SUL-120 (6-hidroksi-N-((R)-1-hidroksipropan-2-il)-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-121 ((6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (piperazin-1-il)metanon), SUL-122 ((6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-(2-hidroksietoksi)etil)piperazin-1-il)metanon), SUL-123 (N-(2-cijanoetil)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-124 (6-hidroksi-N-(2-((2-hidroksietil)(metil)amino)etil)-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-125 ((R)-N,6-dihidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid), SUL-126 ((S)-N,6-dihidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksamid, SUL-128 (2-(((S)-2-(hidroksimetil)pirolidin-1-il)metil)-2,5,7,8-tetrametilhroman-6-ol), SUL-129 (2-((((S)-2-hidroksi-1-feniletil)amino)metil)-2,5,7,8-tetrametilhroman-6-ol), SUL-130 (2,5,7,8-tetrametil-2-(piperidin-1-ilmetil)hroman-6-ol), SUL-131 (N,6-dihidroksi-5,7-diizopropil-2,8dimetilhroman-2-karboksamid), SUL-132 ((6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon), SUL-134 (2-(((S)-2-(hidroksimetil)pirolidin-1-il)metil)-2,5,7,8-tetrametilhroman-6-ol), SUL-135 (2-(((S)-2-(hidroksimetil)pirolidin-1-il)metil)-2,5,7,8-tetrametilhroman-6-ol), SUL-136 (2-(4-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)sirćetna kiselina), SUL-137 ((6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-il)(piperazin-1-il)metanon), SUL 138 ((6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon), SUL-139 (2-(4-(6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)sirćetna kiselina), SUL-140 (etil 2-(4-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)acetat), SUL-141 ((S)-2-(4-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)sirćetna kiselina), SUL-142 ((R)-2-(4-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)sirćetna kiselina), SUL-143 ((2S)-1-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)pirolidin-2-karboksilna kiselina), SUL-144 ((2S)-1-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)pirolidin-2-karboksilna kiselina), SUL-145 ((2S)-1-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)pirolidin-2-karboksilna kiselina.

[0042] Jedinjenja su bila rastvorena u dimetil sulfoksidu (DMSO) do nekoliko koncentracija. Pre početka eksperimenata, ovaj pripremljeni rastvor je bio rastvoren u prethodno zagrejanom DMEM i onda je dalje razređen da bi se dobio opseg koncentracija od 10nM - 1 mM. Bio je upotrebljen protokol hipotermijskih povreda sa zagrevanjem kao što sledi, a pregled je dat na slici 1. Medijum za kultivaciju ćelija je onda bio zamenjen ovim razređivanjima, pa su ćelije bile inkubirane 1 sat u prisustvu jedinjenja. Posle inkubacije, poklopci su čvrsto zatvoreni, a zatim su baloni bili stavljeni u sobu na 4°C, te su hlađeni 24 sata. Posle ovog perioda hlađenja, ćelije su bile stavljene nazad na 37°C u inkubator sa zatvorenim poklopcima i ostavljene su još sledeća 24 sata da se ponovo zagreju.

Određivanje vijabilnosti

[0043] Posle ovog perioda ponovnog zagrevanja, bile su snimljene mikroskopske slike da bi se odredila morfologija ćelija (Nikon D5100, Nikon Diaphot-TMD). Medijum za ćelijske kulture je bio sakupljen i centrifugiran (4 minuta, 2000 rpm). Supernatant je bio sakupljen, pa je odmah bio izmeren pH da bi se sprečilo uravnoteženje pH karbonatnim puferom u medijumu, dok su peletirane ćelije bile resuspendovane u 5

1

mL PBS. Ćelije koje su ostale u balonu su bile isprane dva puta sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS) sve dok ispirani proizvod nije bio odstranjen. Posle toga, ćelije su bile tripsinizovane dodavanjem 0,5 mL tripsina, pa su prikupljene resuspendovanom peletom. Ova ćelijska suspenzija je onda bila obojena sa finalnom koncentracijom od 0,2% tripan plavog (Sigma, T8154), što je bilo praćeno ručnim određivanjem vijabilnosti i broja ćelija na Bürker-Türk hemocitometru. Da bi se okončao test, bili su izmereni nivoi glukoze medijuma za ćelijske kulture (Roche Accutrend Plus) kao indikacija metaboličke aktivnosti. Svi ovi koraci su bili pažljivo izvedeni da bi se sprečilo da mehanički stres utiče na vijabilnost ćelija posle hlađenja ili je izmeni.

Rezultati

[0044] Tabela 2 prikazuje rezultate količine ćelija koja je preživela proces hlađenja i ponovnog zagrevanja uz dodatak jedinjenja prema pronalasku u različitim koncentracijama. Količina predstavlja % ćelija koje su preživele. Broj jedinjenja odgovara jedinjenju koje je opisano u tabeli 1. Kod kontrole je bila primenjena ista procedura na dve kolonije HEK ćelija. Medijum nije sadržao jedinjenje prema pronalasku. Količina ćelija koje su preživele zavisi od upotrebljene koncentracije i tipa jedinjenja.

Tabela 2

1

1

Primer 2: Čuvanje SMAC ćelija

[0045] Pacovske ćelije glatkih mišića aorte (engl. smooth muscle aortic cells (SMAC) ćelije) su bile kultivisane u DMEM medijumu za kultivaciju ćelija (Life Technologies, 41965-052) kome su bili dodati fetusni teleći serum, penicilin i streptomicin. Ćelije su stavljene u inkubator sa regulisanim CO2 i ovlaživanjem na 37°C i ostavljeno je da proliferišu 24 sata pre početka eksperimenata. Jedinjenja Sul 84, Sul 85, Sul 89, Sul 112, Sul 121, Sul 127, i Sul 136 su bila rastvorena u DMSO do finalne koncentracije od 100mM. Ovaj rastvor je onda bio rastvoren u DMEM medijumu za kultivaciju ćelija, pa je zatim dodat ćelijama u različitim koncentracijama, te je prethodno inkubiran 1 sat na 37° C, a onda je ohlađen na 4° C i držan je na 4° C tokom 24h. Ćelije su bile ponovo zagrevane 1h sve do 37° C i onda su bile testirane. Bio je izveden test sa tripan plavim, kao što je gore opisano za HEK ćelije. Pored ovog ekskluzionog testa sa tripan plavim, bio je izveden apsorpcioni test. Apsorpcija tripan plavog je bila upotrebljena kao mera indikacije broja nevijabilnih ćelija. Tripan plavo je bilo dodato u ploče sa 6 bunarčića do finalne koncentracije od 0,05%, pa su ćelije bile inkubirane na 37°C tokom 5 minuta. Posle toga je bio odstranjen višak boje

1

pažljivim ispiranjem bunarčića tri puta sa hladnim PBS. Posle ispiranja, bilo je dodato 150 pL 1% SDS u bunarčiće da bi se ćelije lizirale i da bi se oslobodilo tripan plavo iz nevijabilnih ćelija. Lizati ćelija su bili centrifugirani, a supernatant je posle toga bio prenet u ploču sa 96 bunarčića. 1% SDS je bio upotrebljen kao kontrola, a apsorpcija je bila merena na 595 nm. Smrt ćelija je bila izražena kao procenat netretiranih kontrola na 4°C (100%).

[0046] Slika 2 prikazuje rezultate apsorpcionog testa sa tripan plavim za ocenjivanje količine ćelija koje su preživele hipotermiju i proces ponovnog zagrevanja. Vijabilnost SMAC ćelija je bila do 90%. Sul 136 je racemska smeša. Sul 141 i Sul 142 su R i S izomer, respektivno. S enantiomer je imao bolji efekat od R enantiomera ili racemske smeše, čak i u manjoj koncentraciji.

Primer 3: Čuvanje krvnih pločica

Sakupljanje pomoću PRP

[0047] PRP pločice su bile sakupljene, pa je 2.1 ml bio suspendovan u polipropilenskim epruvetama od 5 ml, zatvorenim čepom.

[0048] Nekoliko jedinjenja prema pronalasku je bilo dodato krvnim pločicama direktno posle pripreme PRP plazme, pa je inkubirano 10 minuta na 37°C ili 30 minuta na sobnoj temperaturi. Onda su krvne pločice sa jedinjenjem bile čuvane na 4°C.

[0049] Kontrola je bila čuvana pod uslovima mućkanja na sobnoj temperaturi.

Sledeća kontrola je bila čuvana na 4°C bez dodavanja jedinjenja. Jedinjenja koja su bila dodata su ona navedena u tabeli 3.

[0050] Bio je uzet uzorak iz svake epruvete 264 sati posle dodavanja jedinjenja i testiran je kao što sledi:

• Boja i svojstva koagulacije su bili vizuelno analizirani.

• Trombocitne ćelije koje su preživele su bile izbrojane i bilo je utvrđeno da li su trombociti bili slepljeni.

• Bilo je utvrđeno da li su trombociti još uvek mogli da funkcionišu posle stimulacije dodavanjem ADP ili pod uticajem kolagena u ploči sa 96 bunarčića.

1

• Bila je određena adhezija, odnosno sposobnost pločica da vezuju kolagen u ploči sa 6 bunarčića prethodno inkubiranoj sa kolagenom.

• Pomoću ELISA testa je bilo utvrđeno da li je iz pločica bio izlučivan tromboksan.

Tromboksan olakšava slepljivanje i proizvode ga aktivirane krvne pločice.

[0051] Tabela 3 daje pregled rezultata dodavanja jedinjenja krvnim pločicama i određivanja slepljivanja trombocita posle dodavanja jedinjenja prema pronalasku i hlađenja na 4°C.

Tabela 3

2

Sakupljanje metodom afereze i PRP

[0052] Pločice su bile dobijene standardnim procedurama fereze pločica bilo na Haemonetics (donor 2611811 i donor 2611855) ili na Cobe instrumentu (donor 2611770). Prema protokolu sve jedinice bi bile dobijene procedurom fereze pločica sa Cobe instrumentom, ali tri donacije nisu prošle kriterijume kontrole kvaliteta banke krvi. Ipak, sve donacije pločica su imale sličnu koncentraciju i sličan kvalitet pločica. Ni u jednom od koncentrata pločica nisu bili pronađeni ugrušci.

[0053] Sveže sakupljene pločice su bile izmerene na vagi, a za uzorkovanje koncentrata pločica mala PVC kesa je bila spojena šavom sa glavnom kesom za koncentrat pločica. Standardna homogenizacija koncentrata pločica pre uzorkovanja je morala da bude izvršena pomoću valjka.

[0054] 300 μM suspenzije Sul 136 je bilo dodato procedurom kojom je sadržaj kese ostao sterilan, pa je Sul 136 držan u suspenziji čestim vrtloženjem i čuvan je na 37°C pre nego što je dodat sveže sakupljenim pločicama. Suspenzija Sul 136 je bila dodata u tri kese sa pločicama direktno iz kese. Posle dodavanja, sadržaj kese sa pločicama je bio nežno mešan. Posle 2 sata izvučen je prvi uzorak sa šavom spojene kese za uzorke. Kesa za uzorke je bila razdvojena zavarivanjem, a iz ove kese za uzorke su bili uzeti uzorci za hematološku analizu, testove sa agregometrom i testove sa protočnom citometrijom. Vrtloženje u kesi je bilo prijavljeno na osnovu iskustva laboratorijskog saradnika u standardnom formatu. Pločice bez Sul 136 koje su stavljene na šejker sa ravnom pločom i čuvane na sobnoj temperaturi su bile upotrebljene kao kontrola. Sledeća kontrola je čuvana na 4°C. Uzorci pločica u koje je bio dodat Sul 136 su čuvani bez mućkanja u frižideru na 4°C.

[0055] Uzorci su bili uzeti posle 2, 24, 48, 96, 168, 216, 264 sata, pa su čuvani 7 nedelja.

[0056] Uzorci su bili izmereni kao što sledi:

Aneksin V test:

[0057] Na Beckman Coulter FC 500 protočnom citometru uz korišćenje Roche Aneksin-V FLUOS kita za bojenje

Procedura:

[0058] Bila je napravljena smeša 20 μl Aneksin-V fluoresceina iz Roche kita u 1 ml pufera za inkubaciju, pa je bilo dodato 20 μl rastvora propidijum jodida.2 ml koncentrata pločica je bilo centrifugirano na standardnoj Eppendorf centrifugi, a supernatant je bio odbačen.

[0059] Bio je dodat 1 ml PBS pufera, pa je provereno da li je koncentracija ćelija bila oko 1.000.000. Ovo je bilo razređeno 100 puta sa pripremljenom smešom Aneksin-V fluoresceina i propidijum jodida, pa je inkubirano 15 minuta. Bilo je dodato 500 μl pufera za inkubaciju iz kita, pa je izvršena analiza ćelija u protočnom citometru.

Aktivacija pločica sa ADP i TRAP

[0060] Aktivacija pločica je bila izvedena na Beckman Coulter FC 500 protočnom citometru uz korišćenje CD 41 PE, CD 62p FITC, IgG1 FITC/IgG1 PE antitela iz Beckman Coulter kita.

Testna epruveta 1:

[0061] 40 μl pufera za razređivanje je bilo stavljeno na oko 15 minuta na 37°C; a onda je bilo dodato 10 μl CD41 PE 5 μl CD62 FITC, pa je mešano sa Vortex-om, te je inkubirano tokom 5 min. na sobnoj temperaturi; bilo je dodato 1000 μl hladnog HBSS pufera; bilo je izvršeno merenje u protočnom citometru.

Testna epruveta 2:

[0062] 40 μl pufera za razređivanje je bilo stavljeno na oko 15 minuta na 37°C; a onda je bilo dodato 10 μl CD41 PE 5 μl CD62 FITC, pa je mešano sa Vortex-om, te je inkubirano tokom 5 min. na sobnoj temperaturi; bilo je dodato 1000 μl hladnog HBSS pufera; bilo je izvršeno merenje u protočnom citometru.

Testna epruveta 3:

[0063] 36 μl pufera za razređivanje 4 μl ADP je bilo stavljeno na oko 15 minuta na 37°C; a onda je bilo dodato 10 μl CD41 PE 5 μl CD62 FITC, pa je mešano sa Vortex-om, te je inkubirano tokom 5 min. na sobnoj temperaturi; bilo je dodato 1000 μl hladnog HBSS pufera; bilo je izvršeno merenje u protočnom citometru.

Testna epruveta 4:

[0064] 36 μl pufera za razređivanje 4 μl TRAP je bilo stavljeno na oko 15 minuta na 37° C; a onda je bilo dodato 10 μl CD41 PE 5 μl CD62 FITC, pa je mešano sa Vortex-om, te je inkubirano tokom 5 min. na sobnoj temperaturi; bilo je dodato 1000 μl hladnog HBSS pufera; bilo je izvršeno merenje u protočnom citometru.

[0065] Slepljivanje pločica je bilo mereno prema Platelet Aggregation Profiler PAP 8 (Mölab) uz korišćenje svih reagenasa firme Mölab.

Priprema uzorka:

[0066] 3 ml koncentrata pločica je bilo centrifugirano na 3000 RPM da bi se dobio PPP. Bilo je pomešano 1800 μl PPP i 600 μl PRP.

Test:

[0067] 225 μl PRP je bilo stavljeno u testnu epruvetu sa magnetnim mešačem.225 μl PPP 25 μl aquadesta je bilo stavljeno u testnu epruvetu bez magnetnog mešača. PPP je bio upotrebljen za osnovu. PRP je bio stavljen na valjak tokom 2 min na 37°C. Merenje sa PRP u agregometru je počelo posle 30 sekundi sa 25 μl induktora. Merenje je bilo vršeno tokom 6 min.

[0068] Vizuelno određivanje vrtloženja je bilo izvedeno u skladu sa Bertolini, F. i Murphy, S. (1994) (A multicenter evaluation of reproducibility of swirling in platelet concentrates, Transfusion 34, 796-801.)

Rezultati testova sa PRP sakupljenim pločicama

[0069] PRP pločice su bile testirane sa dodavanjem Sul 136. Tabela 4 prikazuje rezultate broja ćelija koje su preživele 24, 48, 72, i 216 sati posle čuvanja na 4°C.

2

Broj ćelija je dat u % u odnosu na broj ćelija u trenutku 0.66% pločica čuvanih na sobnoj temperaturi je preživelo posle 216 sati. Samo 42.3% ćelija čuvanih na 4 °C je preživelo posle 216 sati. Dodavanje Sul 136 je rezultovalo time da je znatno više pločica preživelo posle čuvanja od 72 i 216 sati na 4°C.

Tabela 4

[0070] Tabela 5 prikazuje mogućnost slepljivanja pločica sakupljenih sa PRP i gde je bio dodat Sul 136, posle stimulacije sa ADP. Kada je bilo dodato 10 mM Sul 136, pločice su pokazivale još aktivnosti posle stimulacije sa ADP. (+ znači da ćelije pokazuju slepljivanje i da, shodno tome, mogu biti aktivirane posle stimulacije, - znači da nema slepljivanja posle stimulacije).

Tabela 5

[0071] Tabela 6 prikazuje mogućnost slepljivanja PRP pločica sa Sul 136 posle stimulacije sa kolagenom. Kada je bilo dodato 10 mM Sul 136, pločice su pokazivale još aktivnosti posle stimulacije sa kolagenom. (+ znači da ćelije pokazuju slepljivanje, + znači jako slepljivanje, ove pločice, shodno tome, mogu biti aktivirane posle stimulacije, - znači da nema slepljivanja posle stimulacije).

Tabela 6

Rezultati sa pločicama sakupljenim aferezom

2

[0072] Tabela 7 prikazuje rezultate testa čuvanih afereznih krvnih pločica donora 1 (2611770) koje su čuvane na sobnoj temperaturi na šejkeru sa ravnom pločom bez Sul 136. pH na dan 12 je bio 6.3. pH na dan 19 je bio 5.7

[0073] Tabela 8 prikazuje rezultate testa čuvanih afereznih krvnih pločica donora 1, koje su čuvane na 4 °C sa dodatkom Sul 136. pH na dan 12 je bio 6.2, pH na dan 19 je bio 5.9.

Tabela 7

Tabela 8

[0074] Testovi protočne citometrije su bili slični za pločice čuvane na sobnoj temperaturi i za pločice čuvane na 4 °C sa jedinjenjem Sul 136. Pored toga, slepljivanje pločica posle stimulacije sa kolagenom i ADP je bilo ponovo uspostavljeno na dan 12 i dan 19 za pločice čuvane sa jedinjenjem Sul 136. Ovaj rezultat je uporediv sa pločicama čuvanim na sobnoj temperaturi na dan 1 - 3.

2

[0075] Tabela 9 i 10 prikazuje rezultate testa izvedenog sa pločicama Donora 2. Pločice iz tabele 9 su bile čuvane na 4 °C bez Sul 136. Pločice iz tabele 10 su bile čuvane na 4 °C sa Sul 136.

Tabela 9

Tabela 10

[0076] Tabela 11 i 12 prikazuje rezultate testa izvedenog sa pločicama Donora 3. Pločice iz tabele 9 su bile čuvane na sobnoj temperaturi bez Sul 136. Pločice iz tabele 10 su bile čuvane na 4 °C sa Sul 136.

Tabela 11

2

Tabela 12

Test vrtloženja

[0077] Bilo je uočeno vrtloženje kod pločica čuvanih sa jedinjenjima na 4 °C i posle 7 nedelja.

[0078] Vrtloženje nije bilo uočeno kod pločica bez dodatih jedinjenja čuvanih na 4 °C, mereno posle 24 sata.

Primer 4: Sinteza jedinjenja

[0079] Jedinjenja prema pronalasku su sintetizovana prema standardnim metodama sinteze koje su dobro poznate stručnjaku iz odgovarajuće oblasti.

[0080] SUL-0083, SUL-0084 i SUL-0085 su komercijalno raspoloživi.

Sinteza SUL 089-112, 114-117, 120-126, 128-130, 132, 134-135, 138, i 140.

2

[0081] Amidacija troloksa je bila izvršena reakcijom sa podesnim aminom u prisustvu standardnih reagenasa za kuplovanje radi formiranja amida, npr. HATU i CDI.

Odgovarajući amini su bili pripremljeni redukcijom amida formiranih sa BH3Derivati hidroksaminske kiseline su bili pripremljeni reakcijom sa hidroksilaminom/CDI. Sinteza karbohidrazidnih analoga troloksa je bila izvršena reakcijom sa (supstituisanim) hidrazinima. Enantiomerna/dijastereomerna jedinjenja su bila pripremljena polazeći od enantiomerno čistog (R)- ili (S)-troloksa ili hiralnom hromatografijom.

Sinteza SUL-118, SUL-119 i SUL-146

[0082] Oksidacijom komercijalno raspoloživog propofola sa salkominom, koordinatnim kompleksom salenskog liganda sa kobaltom, praćenom redukcijom sa NaBH4je dobijen 2,6-diizopropilbenzen-1,4-diol. Sledstvenom metilacijom sa HCO/SnCl2/HCl i reakcijom sa metil metakrilatom je dobijen SUL-146 (metil 6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karboksilat). Hidrolizom sa LiOH je dobijena karboksilna kiselina SUL-118 (6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8- dimetilhroman-

2

2-karboksilna kiselina). Alkohol SUL-119 (2-(hidroksimetil)-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-6-ol) je bio dobijen redukcijom SUL-146 sa LiAlH4.

Sinteza SUL-131, SUL-133, SUL 137 i SUL-146

[0083] Polazeći od karboksilne kiseline SUL-118 (6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karboksilna kiselina), hidroksilamin je bio dobijen reakcijom sa hidroksilaminom uz korišćenje CDI kao reagensa za kuplovanje. Jedinjenja SUL 133 ((6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-il) (4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon) i SUL 137 ((6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-il) (piperazin-1-il)metanon) su dobijena reakcijom SUL-118 sa odgovarajućim piperazinskim derivatom. Oba reagensa za kuplovanje HATU i CDI su dovela do zadovoljavajućih prinosa. SUL 139 (2-(4-(6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)sirćetna kiselina) je bio pripremljen reduktivnom aminacijom SUL 137 ((6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-il) (piperazin-1-il)metanon) sa glioksalnom kiselinom.

Sinteza SUL-136, SUL-141 i SUL-142.

[0084] Hidrolizom SUL-140 (etil 2-(4-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)acetat) pod N2atmosferom je dobijen SUL-136 (2-(4-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)sirćetna kiselina) sa visokim prinosom. Enantiomeri SUL-141 i SUL-142 su bili pripremljeni u skladu sa gore opisanim uslovima.

Sinteza SUL 143, 144 i 145

[0085] Amidacijom troloksa sa (S)-metil pirolidin-2-karboksilatom (L-prolin metil estar) su dobijena, posle kolonske hromatografije, dva dijastereoizomera. Pratećom

1

hidrolizom pojedinačnih dijastereoizomera su dobijeni SUL-144 ((2S)-1-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)pirolidin-2-karboksilna kiselina, dijastereomer 1) i SUL-145 ((2S)-1-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)pirolidin-2-karboksilna kiselina, dijastereomer 2). Racemski analog SUL-143 ((2S)-1-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)pirolidin-2-karboksilna kiselina) je bio dobijen mešanjem estara pojedinačnih dijastereoizomera praćenom hidrolizom estarske grupe uz korišćenje LiOH.

Amidacija troloksa (opšti primer)

[0086] SUL-108 ((4-butilpiperazin-1-il) (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)metanon). HCl. Troloks (11 g, 0.044 mol, 1 ekv.) je bio suspendovan u acetonitrilu (100-150 ml). CDI (8.6 g, 0.053 mol, 1.2 ekv.) je bio dodat u šaržama. Reakciona smeša je bila mešana 0.5-1 sat na sobnoj temperaturi. Posle dodavanja 1-butilpiperazina (6.9 g, 0.048 mol, 1.1 ekv.) reakciona smeša je bila mešana na 25-30ºC preko vikenda. Reakciona smeša je bila koncentrovana, pa je bila dodata H2O (200 ml), a vodeni sloj je bio ekstrahovan sa EtOAc (4X). Sjedinjeni organski slojevi su bili osušeni, pa su isfiltrirani i koncentrovani. Dobijeni sirovi proizvod je bio prečišćen kolonskom hromatografijom (DCM/10% MeOH), čime je dobijeno željeno jedinjenje (9 g proizvoda, 82% čistoće). Kristalizacijom iz EtOAc/heptana dobijen je SUL-108 (6 g, 0.016 mol, 36 % prinos, 90% čistoće) u vidu bele čvrste materije. Dobijeni materijal je bio rastvoren u DCM (50-100 ml). Dodata je HCl (4 M u dioksanu, 8.8 ml, 0.0035 mol, 2.2 ekv.), pa je reakciona smeša bila mešana na sobnoj temperaturi preko vikenda. Smeša je bila isfiltrirana, pa je isprana sa DCM, i osušena je da bi se dobila HCl so SUL-108 (6.3 g, 97-98% čistoće) u vidu bele čvrste materije.

2

<1>H-NMR (CDCl3, u ppm) : 0.93 (t, 3H), 1.38 (m, 2H), 1.58 (s, 3H), 1.67 (m, 2H), 2.09 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.15 (s, 3H), 2.50-3.20 (m, 14H). M<+>= 375.3

Redukcija troloks amida (opšti primer)

[0087] SUL-128. (2-(((S)-2-(hidroksimetil)pirolidin-1-il)metil)-2,5,7,8-tetrametilhroman-6-ol).HCl. BH3.THF u THF (16 ml, 0.0156 mol, 2 ekv.) je bio ohlađen na T = 0ºC. Rastvor SUL-112 ((6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)((S)-2-(hidroksimetil)pirolidin-1-il)metanon; 2.6 g, 0.0078 mol, 1 ekv.) u THF (50 ml) je bio ukapan, pa je reakciona smeša refluksovala 1 sat i zatim je preko noći ohlađena na sobnu temperaturu. Reakciona smeša je ohlađena na ledenom kupatilu, a onda je bila ukapana HCl (6 M, 25 ml). Bio je dodat DCM (100 ml), pa su slojevi razdvojeni. Vodeni sloj je bio ekstrahovan sa DCM (3X). Sjedinjeni org. slojevi su bili sušeni preko K2CO3sve dok se više nije moglo uočiti formiranje gasa. Organska faza je bila isfiltrirana i koncentrovana. Sirovi proizvod je bio ohlađen na ledenom kupatilu, a zatim je ukapan NaOH (6M, 50 ml). Posle dodavanja reakciona smeša je bila mešana 1 sat, te je ekstrahovana sa DCM (4X). Sjedinjeni DCM slojevi su bili osušeni, pa su isfiltrirani i koncentrovani da bi se dobilo 1.6 g sirovog proizvoda (20-40% čistoće). Materijal je bio prečišćen kolonskom hromatografijom, čime je dobijen SUL-128 (300 mg, 0.94 mmol, 12 % prinos, 90 % čistoće) . On je rastvoren u DCM (10 ml), pa je ohlađen na T =0 °C (ledeno kupatilo). Dodata je HCl (4M u dioksanu, 0.3 ml, 0.94 mmol, 1.2 ekv.), pa je reakciona smeša bila mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Nastala čvrsta materija je bila isfiltrirana, pa je isprana sa Et2O i osušena je da bi se dobila HCl so SUL-128 (300 mg, 90 % čistoće) u vidu bele čvrste materije (smeša dijastereomera).

<1>H-NMR (CDCl3, u ppm) : 1.20-1.90 (m, 7H), 2.12 (s, 6H), 2.17 (s, 3H), 2.20-2.90 (m, 9H), 3.4-3.65 (m, 2H). M<+>= 320.1

Sinteza SUL-118 (6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karboksilna kiselina).

Sinteza 2,6-diizopropilcikloheksa-2,5-dien-1,4-diona.

[0088]

[0089] Propofol 100 g, 561 mmol) je bio rastvoren u DMF (250 mL). Rastvor je bio ohlađen na 0 °C uz mešanje. Bio je dodat salkomin (16.6 g, 51 mmol; 9 mol%), a rezultujuća reakciona smeša je bila mešana 112 h preko noći dok je zagrevana na sobnu temperaturu. Reakciona smeša je bila izlivena u vodu (7 L). Rezultujuća suspenzija je bila ekstrahovana sa heptanima (5 x 1 L). Sjedinjeni organski ekstrakti su bili osušeni sa Na2SO4. Koncentracijom rastvora pod vakuumom je dobijen sirovi 2,6-diizopropilcikloheksa-2,5-dien-1,4-dion (62.5 g; 325 mmol; 58% prinos) u vidu ulja. Proizvod je bio upotrebljen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Sinteza 2,6-diizopropilbenzen-1,4-diola.

[0090]

[0091] Sirovi 2,6-diizopropilcikloheksa-2,5-dien-1,4-dion (62.5 g, 325 mmol) je bio rastvoren u dihlorometanu (300 mL) i metanolu (100 mL). Rastvor je bio ohlađen na 0 °C sa ledenim kupatilom. Natrijum borohidrid (4.5 g, 182 mmol) je bio dodat u šaržama. Pošto je dodavanje bilo završeno, reakciona smeša je bila mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Aceton (150 mL) je bio dodat da bi se neutralizovao višak natrijum borohidrida. Posle 30 minuta mešanja bilo je dodato 2N aq. HCl (200 mL). Posle mešanja tokom 45 minuta smeša je bila ekstrahovana sa etil acetatom (4 x 400 mL). Sjedinjeni organski slojevi su bili osušeni sa Na2SO4. Koncentracijom rastvora pod vakuumom dobijen je sirovi 2,6-diizopropilbenzen-1,4-diol (64 g, 330 mmol) u vidu crvenog ulja u kvantitativnom prinosu. Proizvod je bio upotrebljen u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

4

Sinteza 3,5-diizopropil-2-metilbenzen-1,4-diola

[0092]

[0093] Smeša 2,6-diizopropilbenzen-1,4-diola (64 g, 0.33 mol), paraformaldehida (9.8 g, 0.327 mol), SnCl2(217.9 g, 1.15 mol), koncentrovane aq.37% HCl (0.6 L) i diizopropil etra (2.5 L) je bila zagrevana tako da refluksuje tokom 4 sata. Posle hlađenja na sobnu temperaturu preko noći bila je izdvojena dvofazna smeša. Vodeni sloj je bio ekstrahovan sa TBME (2000 mL). Sjedinjene organske frakcije su bile isprane sa 1N aq. HCl (1000 mL), vodom (1000 mL) i slanim rastvorom (1000 mL). Organske frakcije su bile osušene sa Na2SO4i koncentrovane su pod vakuumom da bi se dobila 50 : 35 smeša 3,5-diizopropil-2-metilbenzen-1,4-diola i 2,6-diizopropil-3,5-dimetilbenzen-1,4-diola (61 g ulja) prema GCMS analizi. Prečišćavanjem hromatografijom na silika gelu (1200 mL) eluiranjem sa etil acetatom/heptanima = 97.5:2.5 (4000 mL), 95:5 (4000 mL) dobijen je 3,5-diizopropil-2-metilbenzen-1,4-diol 6 (16.6 g, 79.8 mmol; 24%: 83% čistoće) u vidu ulja.

Sinteza metil 6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karboksilata.

[0094]

[0095] 3,5-diizopropil-2-metilbenzen-1,4-diol (10.6 g, 50.9 mmol; 83% čistoće) je bio rastvoren u metil metakrilatu (20 mL, 186 mmol). Rastvor je bio prenet u teflonsku epruvetu u Berghof reaktoru. Bio je dodat vodeni formaldehid (10 mL; 37% tež. rastvor, stabilizovan sa 10-15% MeOH), pa je reakciona smeša bila zagrevana na 180 °C (interna temperatura) u zatvorenom reaktoru tokom 5 sati uz mešanje. Posle hlađenja na pribl.40 °C. Reakciona smeša je bila izlivena u MeOH (200 mL), pa je smeša bila koncentrovana pod vakuumom. Prečišćavanjem hromatografijom na silika gelu (600 mL) eluiranjem sa etil acetatom/heptanima = 95:5 (5000 mL; TLC: Rf ~ 0.2; tačkasto obojen sa parom joda) dobijen je željeni čisti proizvod metil 6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karboksilat (10.0 g, 31.3 mmol, 61%).

Sinteza 6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karboksilne kiseline (SUL-118).

[0096]

[0097] Smeša prečišćenog metil 6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karboksilata (8.3 g, 25.9 mmol) i litijum hidroksid monohidrata (4.3 g, 102.5 mmol; 4 ekv.) u MeOH (100 mL), THF (100 mL) i vodi (25 mL) je bila zagrevana 30 minuta na ambijentalnom pritisku uz obrtanje rotacionim uparivačem u toplom vodenom kupatilu na 60 °C. Organski rastvarači su bili upareni pod vakuumom. Ostatku je bila dodata voda (150 mL), što je bilo praćeno sirćetnom kiselinom (10 mL). Bila je dobijena svetlo narandžasta smeša. Ekstrakcijom sa etil acetatom (3 x 100 mL), sušenjem sjedinjenih organskih frakcija sa Na2SO4i koncentracijom pod vakuumom dobijen je sirovi proizvod u vidu narandžaste čvrste materije. Čvrste materije su bile mešane sa tBME (150 mL). Bež čvrsta materija se istaložila i dobijen je narandžasti rastvor. Bio je dodat heptan (250 mL), pa je smeša bila mešana 15 minuta. Smeša je bila isfiltrirana preko staklenog filtera. Rezidualne čvrste materije su bile isprane sa heptanima (2 x 50 mL) na filteru uz isisavanje. Sušenjem čvrstih materija pod vakuumom na 60 °C dobijena je čista 6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karboksilna kiselina (SUL-118) u vidu beličaste čvrste materije (3.1 g, 10.13 mmol; 39%, 100% čistoće).<1>H-NMR (CDCl3, u ppm) : 1.38 (t, 12 H), 1.52 (s, 3H), 1.87 (m, 1H), 2.20 (s, 3H), 2.30 (m, 1H), 3.20 (m, 1H), 3.38 (m, 1H). M<+>= 307.10

[0098] Primer 5. Sinteza SUL 119 (2-(hidroksimetil)-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-6-ol). Rastvor metil 6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karboksilata (500 mg, 1.56 mmol) u THF (12 mL) je dodavan 5 minuta pomoću šprica sa gumenim septumom u LiAlH4(238 mg, 6.26 mmol; 4 ekv.), koji je prethodno odmeren u suvi 3-grli balon sa okruglim dnom od 100 mL pod inertnom atmosferom azota uz mešanje na sobnoj temperaturi. Egzotermno dodavanje estra je bilo praćeno razvijanjem gasa. Pošto je dodavanje bilo završeno, rezultujuća siva suspenzija je bila zagrevana da bi refluksovala. Posle 3 sata zagrevanje je prekinuto, pa je reakcija ugašena ukapavanjem EtOAc (6 mL; egzotermno). Bila je dodata voda (5 mL) u malim šaržama, što je bilo praćeno sa 2N HCl (2 mL), praćenim sa EtOAc (25 mL). Smeša je bila izlivena na Na2SO4(ca.50 g), a blago žuti organski sloj je bio izdvojen iz dvofazne smeše. Vodena faza je bila isprana sa EtOAc (50 mL), a sjedinjene organske frakcije su bile koncentrisane pod vakuumom da bi se dobio sirovi alkohol (530 mg) u vidu bistrog ulja. Bio je dodat heptan (100 mL) i posle koncentracije pod vakuumom 2-(hidroksimetil)-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-6-ol (248 mg, 0.85 mmol, 54%, LCMS: 95.5 % čistoće).

M<+>= 293.2

[0099] Primer 6. Sinteza SUL 139 (2-(4-(6-hidroksi-5,7-diizopropil-2,8-dimetilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)sirćetna kiselina). SUL-137 (440 mg, 1.17 mmol, 1 ekv.) je bio rastvoren u MeOH (50 ml), pa je bila dodata glioksalna kiselina (216 mg, 2.35 mmol, 2 ekv.). Rezultujuća smeša je bila mešana 1 sat na sobnoj temperaturi i sukcesivno je bio dodat NaBH3CN (183 mg, 2.94 mmol, 2.5 ekv.). Reakciona smeša je bila mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Bila je dodata sirćetna kiselina (nekoliko ml), a posle mešanja na sobnoj temperaturi od 0.5-1 sat, reakciona smeša je bila koncentrovana. Dobijeni ostatak je bio rastvoren u EtOAc, pa je ispran sa H2O (2X), a zatim je osušen, isfiltriran i koncentrisan da bi se dobio SUL 139 (500 mg, 1.16 mmol, 98%, 91-92 % čistoće) u vidu bledo žute čvrste materije.

<1>H-NMR (CD3OD, u ppm): 1.33 (dd, 12H), 1.59 (s, 3H), 1.62 (m, 1H), 2.09 (s, 3H), 2-5-3.0 (m, 7H), 3.1-3.6 (m, 4H), 3.81 (bs, 2H), 4.28 (bs, 2H). M<+>= 433.2.

[0100] Primer 7. Sinteza SUL 136 (2-(4-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)piperazin-1-il)sirćetna kiselina). U balon sa tri grla od 250 ml opremljen sa dva septuma (levi i desni) i slavinom su bili stavljeni SUL-136 (15.5 g, 38.4 mmol) i THF/voda (240 ml THF 80 ml vode). Bistri rastvor je bio mešan i degaziran je najmanje 30 minuta barbotiranjem argona uz korišćenje ulazne cevi opremljene dugačkom iglom za špric kroz levi septum; desni septum je bio opremljen kratkom iglom i funkcionisao je kao izlaz. Degazirani rastvor (koji je bio održavan pod argonom) je bio ohlađen na 0°C u ledenom kupatilu, pa je bio dodat čvrsti anhidrovani LiOH (2.3 g,96 mmol, 2.5 ekv.) u jednoj šarži. Rezultujuća reakciona smeša je bila mešana 2 sata na 0°C, posle čega je bila neutralizovana dodavanjem MeOH/vode (3/1, v/v) mulja Dowex-50WX8-200 jonoizmenjivačke smole; finalni pH je bio pribl.6. Dowex smola je bila isfiltrirana usisavanjem, pa je isprana sa 3 dela MeOH/vode (3/1, v/v). Filtrat je bio redukovan in vacuo, a mokrom proizvodu je bilo dodato pribl. 100 ml vode. Rezultujuća bela vodena suspenzija je bila liofilizovana preko noći da bi se dobio SUL-136 (13.48 g, 93%. LCMS: 99.6%) u vidu bele čvrste materije.

1H-NMR (CD3OD, u ppm)): 1.60 (s, 3H), 1.65 (m, 1H), 2.05 (s, 3H), 2.10 (s, 6H), 2.55 (m, 2H), 2.62 (m, 1H), 3.0, (bs, 4H), 3.40 (bs, 2H), 3.65 (bs, 2H), 4.25 (bs, 2H). M<+>= 377.1

[0101] Primer 8. Sinteza SUL 144 ((2S)-1-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)pirolidin-2-karboksilna kiselina). (2S)-metil 1-(6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karbonil)pirolidin-2-karboksilat (dijastereomer 1, 3.5 g, 9.7 mmol) je bio rastvoren u THF/H2O (60/20 mL). N2je bio barbotiran kroz rastvor 1 h. Smeša je bila ohlađena u ledenom kupatilu, a zatim je bio dodat LiOH.H2O (1.01 g, 24.2 mmol, 2.5 ekv.). Reakciona smeša je bila mešana pod N2na ST preko noći. Dowex-50WX8-200 (isprana 4x sa MeOH/H2O 3:1) je bila dodavana kao mulj u MeOH/H2O (3:1) sve do pH=6. Smeša je bila isfiltrirana, pa je isprana sa MeOH/H2O (3:1) i koncentrisana in vacuo. Demi H2O (50 mL) je bila dodata koncentratu, pa je rastvor bio liofilizovan, čime je dobijen SUL-144 (3.4 g, 9.7 mmol, kvant, 99.7% čistoće) u vidu beličaste pene.

1H-NMR (CDCl3): 1.60 (s, 3H), 1.65-2.30 (m, 14H), 2.60 (m, 2H), 2.81 (m, 1H), 3.49 (m, 1H), 4.01 (t, 1H), 4.50 (d, 1H). M<+>= 348.1

Primer 9: SUL 109 za hladnu ishemijsku toleranciju svinjskih srca

[0102] Ovi primeri studija SUL 109 kao aditiva standardnim protokolima transplantacije srca će pomoći produžavanju maksimalne ishemijske zaštite svinjskih srca na hladnom. Za dugotrajno zaustavljanje, na primer, u slučaju transplantacije, obično se upotrebljava rastvor CUSTODIOL®. Sa CUSTODIOL® rastvorom moguće je držati srce u hladnom ishemijskom stanju do šest sati pre nego što bude neophodna reperfuzija sa toplom oksigenovanom krvi.

Materijal i metode

[0103] Dva srca su bila uzeta od svinja iz klanice, pa su tretirana kao što sledi. Svinje su bile omamljene elektrošokom u glavu, pa su iskrvarile presecanjem gornje šuplje vene. Posle iskrvavljenja brzo je otvorena grudna kost, pa su srce i pluća bili odstranjeni kao celina. Srce je bilo odmah stavljeno u ledeno kupatilo, a aorta je bila presečena u blizini brahocefalne strane ogranaka. Kanula od 19 mm je bila umetnuta u aortu, pa je privezana. Kanula iz koje je bio pažljivo odstranjen vazduh je bila upotrebljena za retrogradnu administraciju hladnog kardioplegičnog rastvora. Prvom srcu je bilo dato 2 litra standardnog CUSTODIOL® sa 5000IU/l dodatog heparina. Drugom srcu je bilo dato 2 litra CUSTODIOL® sa 5000IU/l heparina i 10ml/l SUL 109 u 0,9%NaCl sa 75μM. Oba srca su bila čuvana u plastičnim kesama napunjenim sa istim rastvorima, pa su zatim transportovana u laboratoriju na ledu na približno 4°C. Pre pripreme srca su bila čuvana na 4°C 24 sata. Sledećeg dana oba srca su bila pripremljena za montažu na PhysioHeart platformu, kao što je opisano u DeHart et al 2011. Posle odstranjivanja vazduha iz srca, započela je retrogradna reperfuzija aorte sa toplom oksigenovanom krvi na 38°C. Oba protoka krvi i pritiska na korenu aorte su bila registrovana tokom eksperimenta.

Rezultati i nalazi

[0104] Prvo je sa krvlju bilo reperfuzionisano srce koje nije bilo tretirano sa SUL109. Ovo srce je ispoljilo visoku vaskularnu rezistenciju na reperfuziju, što je rezultovalo ukupnim koronarnim protokom krvi od 0,5 litara u minuti za zadati pritisak u aorti od 80mmHg. Jedva da je bila vidljiva bilo kakva kontraktilna aktivnost srčanog mišića posle 5 minuta, samo blago pomeranje tkiva nalik fibrilaciji. Posle izvesne defibrilacije elektrošokom i asistencije srcu pejsmejkerom bila je vidljiva slaba kontrakcija bočne i prednje leve komore.

[0105] Drugo srce, koje je bilo tretirano sa SUL109, takođe je bilo reperfuzionisano sa krvlju. Neposredno posle početka reperfuzije, dogodila se prva značajna razlika u odnosu na netretirano srce. Mišićno tkivo tretiranog srca je inicijalno bilo tvrdo i kruto kao i kod netretiranog srca, ali je pri reperfuziji i zagrevanju srce postepeno postalo manje tvrdo i kruto i skoro nalik normalnom srcu pri reperfuziji u roku od 6 sati. Ovo je rezultovalo manjom vaskularnom rezistencijom, što je bilo uočeno koronarnim protokom od 11pm pri pritisku perfuzije od 80 mmHg. Tretirano srce je odmah ispoljilo veću kontraktilnu aktivnost u poređenju se netretiranim, a posle nekoliko defibrilacionih šokova bila je uočena slaba kontraktilna nepravilna aktivnost.

Diskusija

[0106] U normalnoj proceduri uzimanja za PhysioHeart eksperimente, srca su bila zaustavljena u hladnom kardioplegičnom rastvoru, pa su transportovana u LifeTec Group laboratorije radi dalje pripreme i hirurške intervencije. Pripreme mogu zahtevati do 4 sata, posle čega se srce reaktivira reperfuzijom sa toplom oksigenovanom krvlju. Da bi se povećalo pripremno vreme ili da bi se omogućilo duže vreme putovanja pre reperfuzije, bilo bi veoma korisno da se tkiva miokarda zaštite tokom ishemijskog vremena na hladnom. Ovaj primer pokazuje veoma jasnu razliku koja je uočena između srca tretiranog sa SUL109 i srca koje nije tretirano, pošto je prvo od njih ispoljilo poboljšanu regularnu kontraktivnu aktivnost tkiva miokarda. Shodno tome, korišćenje SUL 109 kao aditiva standardnim protokolima transplantacije srca produžava ishemijsku zaštitu na hladnom.

4

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon u svom racemskom ili enantiomernom obliku.

2. (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon u svom racemskom ili enantiomernom obliku za primenu kao lek.

3. (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon u svom racemskom ili enantiomernom obliku za primenu u lečenju ili profilaksi ishemijskog moždanog udara, cerebralne paralize, tromboze, embolije, hemoragije, kardiovaskularne bolesti, artritisa, dijabetesa, kancera, a naročito kancera povezanog sa starenjem, ateroskleroze, srčane insuficijencije, infarkta miokarda, šizofrenije, bipolarnog poremećaja, sindroma krhkog X hromozoma, bolesti srpastih ćelija, i sindroma hroničnog umora, hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), neurodegenerativne bolesti, kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, Lu Gerigova bolest, Hantingtonova bolest, hipotermije/reperfuzije, hemoragijskog šoka, infektivnih bolesti uključenih u napad na trombocite ili njihovu povećanu razgradnju, kao što je hemoragijska groznica, a naročito ebola, Marburg hemoragijska groznica i Čagas.

4. (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon u svom racemskom ili enantiomernom obliku za primenu u lečenju ili profilaksi ishemije/reperfuzione povrede.

5. (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon u svom racemskom ili enantiomernom obliku za primenu u lečenju ili profilaksi indikacija uključenih u oštećenje ćelija indukovano oksidativnim stresom.

6. (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon u svom racemskom ili enantiomernom obliku za primenu u sprečavanju slepljivanja pločica pri lečenju ili profilaksi arterijske tromboze, arterijske fibrilacije, plućne embolije (PE), tromboze dubokih vena (DVT), ili venske tromboembolije (VTE), kongestivne srčane insuficijencije, moždanog udara, infarkta miokarda, genetske ili stečene hiperkoagulabilnosti, ateroskleroze, koronarne arterijske bolesti, cerebrovaskularne bolesti, cerebrovaskularnog napada, periferne arterijske okluzivne bolesti (PAOD).

7. Medijum koji sadrži (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon u njegovom racemskom ili enantiomernom obliku i ćelije.

8. Medijum prema zahtevu 7, pri čemu su ćelije krvne pločice, sisarske kultivisane ćelije ili sisarske primarne ćelije.

9. Medijum koji sadrži (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanon u njegovom racemskom ili enantiomernom obliku i tkivo.

10. Postupak za in vitro zaštitu ćelija koji sadrži dodavanje ćeliji (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanona u njegovom racemskom ili enantiomernom obliku.

11. Postupak prema zahtevu 10, pri čemu se zaštita ćelija odvija tokom čuvanja.

12. Postupak prema zahtevu 11, pri čemu se čuvanje odvija na temperaturi ispod 37°C, a naročito na sobnoj temperaturi, na 4°C, na -20°C ili na -80°C.

13. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 do 12, gde se dodavanje (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanona u njegovom racemskom ili enantiomernom obliku izvodi pre hlađenja ćelija.

14. Postupak prema zahtevima 11-13, pri čemu su ćelije sisarske kultivisane ćelije, sisarske primarne ćelije ili krvne pločice.

15. Upotreba (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-il)(4-(2-hidroksietil)piperazin-1-il)metanona u njegovom racemskom ili enantiomernom obliku za in vitro čuvanje ćelija na temperaturi ispod 37°C, a naročito na 4°C, sobnoj temperaturi, -20°C ili -80°C.

4