RS57813B1 - Formulacije sa smanjenom oksidacijom - Google Patents

Description

OPIS

OBLAST PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na tečne formulacije koje sadrže protein i dalje sadrže jedinjenje koje sprečava oksidaciju pomenutog proteina, metode za proizvodnju i primenu tečnih formulacija, kao i metodu za skrining jedinjenja koja sprečavaju oksidaciju proteina u kompozicijama proteina, pri čemu je protein antitelo.

OSNOVE PRONALASKA

Oksidativna degradacija aminokiselinskih ostataka je fenomen koji se često zapaža u farmaceutskim preparatima sa proteinima. Jedan deo aminokiselinskih ostataka je podložan oksidaciji, konkretno metionin (Met), cistein (Cys), histidin (His), triptofan (Trp) i tirozin (Tyr) (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)). Oksidacija se tipično zapaža kada je protein izložen vodonik peroksidu, svetlosti, metalnim jonima, ili njihovoj kombinaciji tokom različitih postupaka obrade (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)). Konkretno, proteini izloženi svetlosti (Wei, et al., Analytical Chemistry 79(7):2797-2805 (2007)), AAPH ili Fentonovim reagensima (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009)) imali su povećane nivoe oksidacije na ostacima triptofana, dok su oni izloženi vodonik peroksidu tipično imali samo oksidaciju metionina (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009)). Izlaganje svetlosti može dovesti do oksidacije proteina preko nastanka reaktivnih vrsta kiseonika (ROS), uključujući singletni kiseonik, vodonik peroksid i superoksid (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995); Wei, et al., Analytical Chemistry 79(7):2797-2805 (2007); Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Frokjaer et al., Nat Rev Drug Discov 4(4):298-306 (2005)), dok se oksidacija proteina tipično dešava preko hidroksil radikala u reakciji posredstvom Fentonovog reagensa (Prousek et al., Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338 (2007)) i preko alkoksil peroksida u reakciji posredstvom AAPH (Werber et al., J Pharm Sci 100(8):3307-15 (2011)). Oksidacija triptofana daje veliki broj oksidacionih proizvoda, uključujući hidroksitriptofan, kinurenin i N-formilkinurenin, i potencijalno može da utiče na bezbednost i efikasnost (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995); Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Frokjaer et al., Nat Rev Drug Discov 4(4):298306 (2005)). Objavljen je članak o oksidaciji konkretnog ostatka triptofana u regionu teškog lanca koji određuje komplementarnost (CDR) monoklonskog antitela, što je povezano sa gubitkom biološke funkcije (Wei, et al., Analytical Chemistry 79(7):2797-2805 (2007)). Oksidacija Trp posredovana metalnim jonom koordiniranim sa histidinom je nedavno objavljena za molekul Fab (Lam et al., Pharm Res 28(10):2543-55 (2011)). U istom članku je objavljena autooksidacija polisorbata 20 u formulaciji Fab, koja dovodi do stvaranja različitih peroksida. Nastajanje tih peroksida indukovano autooksidacijom takođe može dovesti do oksidacije metionina u proteinu tokom dugotrajnog čuvanja leka, jer je nagovešteno da Met ostaci u proteinima deluju kao interni antioksidansi (Levine et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(26):15036-15040 (1996)), i lako se oksidišu peroksidima. Oksidacija aminokiselinskih ostataka može uticati na biološku aktivnost proteina. To naročito može da važi za monoklonska antitela (mAb). Oksidacija metionina na Met254 i Met430 u IgG1 mAb potencijalno utiče na poluživot u serumu kod transgenih miševa (Wang et al., Molecular Immunology 48(6-7):860-866 (2011)), i takođe utiče na vezivanje humanog IgG1 za FcRn i Fc-gama receptore (Bertolotti-Ciarlet et al., Molecular Immunology 46(8-9)1878-82 (2009)).

Treba proceniti stabilnost proteina, posebno u tečnom stanju, tokom proizvodnje i čuvanja lekovitog proizvoda. U razvoj farmaceutske formulacije nekada je uključeno dodavanje antioksidanasa, da bi se sprečila oksidacija aktivnog sastojka. Dodatak L-metionina u formulacije je doveo do smanjenja oksidacije metioninskog ostatka kod proteina i peptida (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Lam et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 86(11):1250-1255 (1997)). Takođe, dokazano je da dodatak L-triptofana smanjuje oksidaciju triptofanskih ostataka (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Lam et al., Pharm Res 28(10):2543-55 (2011)). Međutim, L-Trp ima jaku apsorbancu u UV oblasti (260-290 nm), što ga čini primarnim ciljem tokom fotooksidacije (Creed, D., Photochemistry and Photobiology 39(4):537-562 (1984)). Pretpostavlja se da je Trp endogeni fotosenzibilizator koji povećava fotooksidaciju zavisnu od kiseonika, tirozina (Babu et al., Indian J Biochem Biophys 29(3):296-8 (1992)), kao i drugih aminokiselina (Bent et al., Journal of the American Chemical Society 97(10):2612-2619 (1975)). Dokazano je da L-Trp može da generiše vodonik peroksid kada se izloži svetlosti, i da L-Trp pod UV svetlom proizvodi vodonik peroksid preko superoksidnog anjona (McCormick et al., Science 191(4226):468-9 (1976); Wentworth et al., Science 293(5536):1806-11 (2001); McCormick et al., Journal of the American Chemical Society 100:312-313 (1978)). Pored toga, poznato je da triptofan proizvodi singletni kiseonik prilikom izlaganja svetlosti (Davies, M.J., Biochem Biophys Res Commun 305(3):761-70 (2003)). Slično oksidaciji proteina indukovanoj autooksidacijom polisorbata 20, moguće je da oksidacija proteina može da se desi nakon stvaranja ROS od strane drugih ekscipijenasa u formulaciji proteina (npr. L-Trp) pod normalnim uslovima rukovanja.

U EP 1260 230 A1 su objavljene stabilne formulacije proteina koje sadrže triptofan ili derivate triptofana, kao što je acetiltriptofan, koji deluju kao stabilizator. WO 2010/032220 A1 se odnosi na stabilne tečne formulacije antitela, pri čemu se trehaloza koristi kao tonirajući agens i stabilizator.

Iz nedavnih studija se vidi da dodatak standardnih ekscipijenasa, kao što je L-TRP i polisorbati, u proteinske kompozicije radi stabilizacije proteina može da dovede do neočekivanih i neželjenih posledica kao što je oksidacija proteina koju indukuju ROS. Zato i dalje postoji potreba za prepoznavanjem alternativnih ekscipijenasa za primenu u proteinskim kompozicijama, i za razvojem takvih kompozicija.

SAŽETAK PRONALASKA

Ovde su date formulacije koje sadrže protein i jedinjenje koje sprečava oksidaciju proteina u formulaciji, pri čemu je protein antitelo, metode za izradu formulacija, i metode skrininga jedinjenja koja sprečavaju oksidaciju proteina u proteinskoj kompoziciji, pri čemu je protein antitelo.

U jednom aspektu, ovde je data tečna formulacija koja sadrži protein i jedinjenje koje sprečava oksidaciju proteina u tečnoj formulaciji, pri čemu je jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od 5-hidroksi-triptofana, 5-hidroksi-indola, 7-hidroksi-indola, i serotonina, i pri čemu je protein antitelo.

U nekim otelotvorenjima, formulacija je vodena.

U nekim otelotvorenjima, jedinjenje koje sprečava oksidaciju proteina u formulaciji je od oko 0,3 mM do oko 10 mM, ili do najviše koncentracije u kojoj je jedinjenje rastvorno u formulaciji. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje koje sprečava oksidaciju proteina u formulaciji je od oko 0,3 mM do oko 9 mM, od oko 0,3 mM do oko 8 mM, od oko 0,3 mM do oko 7 mM, od oko 0,3 mM do oko 6 mM, od oko 0,3 mM do oko 5 mM, od oko 0,3 mM do oko 4 mM, od oko 0,3 mM do oko 3 mM, od oko 0,3 mM do oko 2 mM, od oko 0,5 mM do oko 2 mM, od oko 0,6 mM do oko 1,5 mM, ili od oko 0,8 mM do oko 1,25 mM. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje koje sprečava oksidaciju proteina u formulaciji je od oko 0,3 mM do oko 1 mM. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje koje sprečava oksidaciju proteina u formulaciji je od oko 0,3 mM do oko 5 mM. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje koje sprečava oksidaciju proteina u formulaciji je oko 1 mM. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje sprečava oksidaciju triptofana i/ili metionina u proteinu. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje sprečava oksidaciju proteina reaktivnim vrstama kiseonika. U nekim otelotvorenjima, reaktivna vrsta kiseonika je izabrana iz grupe koja sadrži singletni kiseonik, superoksid (O2-), vodonik peroksid, hidroksil radikal i alkil peroksid.

U nekim otelotvorenjima, protein u formulaciji je podložan oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, triptofan u proteinu je podložan oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, protein je poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, himerno antitelo ili fragment antitela. U nekim otelotvorenjima, koncentracija proteina u formulaciji je oko 1 mg/ml do oko 250 mg/ml.

U nekim otelotvorenjima, formulacija dalje sadrži jedan ili više ekscipijenasa izabranih iz grupe koja se sastoji od stabilizatora, pufera, surfaktanta i tonirajućeg agensa. U nekim otelotvorenjima, pH formulacije je od oko 4,5 do oko 7,0.

U drugom aspektu, ovde je data metoda za izradu tečne formulacije koja obuhvata dodavanje u tečnu formulaciju količine jedinjenja koje sprečava oksidaciju proteina, pri čemu je jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od 5-hidroksi-triptofana, 5-hidroksi-indola, 7-hidroksi-indola i serotonina. U drugom aspektu, ovde je dat postupak za sprečavanje oksidacije proteina u tečnoj formulaciji koja obuhvata dodavanje u tečnu formulaciju količine jedinjenja koje sprečava oksidaciju proteina, pri čemu je jedinjenje izabrano iz grupe koja se sastoji od 5-hidroksi-triptofana, 5-hidroksi-indola, 7-hidroksi-indola i serotonina.

U nekim otelotvorenjima ovde opisanih metoda, formulacija je farmaceutska formulacija pogodna za davanje ispitaniku. U nekim otelotvorenjima, formulacija je vodena.

U nekim otelotvorenjima ovde opisanih metoda, jedinjenje u formulaciji je od oko 0,3 mM do oko 10 mM, ili do najviše koncentracije u kojoj je jedinjenje rastvorno u formulaciji. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje u formulaciji je u koncentraciji od oko 0,3 mM do oko 9 mM, od oko 0,3 mM do oko 8 mM, od oko 0,3 mM do oko 7 mM, od oko 0,3 mM do oko 6 mM, od oko 0,3 mM do oko 5 mM, od oko 0,3 mM do oko 4 mM, od oko 0,3 mM do oko 3 mM, od oko 0,3 mM do oko 2 mM, od oko 0,5 mM do oko 2 mM, od oko 0,6 mM do oko 1,5 mM, ili od oko 0,8 mM do oko 1,25 mM. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje u formulaciji je od oko 0,3 mM do oko 1 mM. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje u formulaciji je od oko 0,3 mM do oko 5 mM. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje u formulaciji je od oko 1 mM. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje sprečava oksidaciju triptofana i/ili metionina u proteinu. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje sprečava oksidaciju proteina reaktivnim vrstama kiseonika. U nekim otelotvorenjima, reaktivna vrsta kiseonika je izabrana iz grupe koja sadrži singletni kiseonik, superoksid (O2-), vodonik peroksid, hidroksil radikal i alkil peroksid.

U nekim otelotvorenjima, protein je podložan oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, triptofan u proteinu je podložan oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, protein je poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, himerno antitelo ili fragment antitela. U nekim otelotvorenjima, koncentracija proteina u formulaciji je oko 1 mg/ml do oko 250 mg/ml.

U nekim otelotvorenjima, u formulaciju se dodaje jedan ili više ekscipijenasa, izabranih iz grupe koja se sastoji od stabilizatora, pufera, surfaktanta i tonirajućeg agensa. U nekim otelotvorenjima, pH formulacije je od oko 4,5 do oko 7,0.

U drugom aspektu, ovde je opisana metoda za skrining jedinjenja koje sprečava oksidaciju proteina u kompoziciji proteina, koja obuhvata odabir jedinjenja koje ima manji oksidacioni potencijal i manju fotosenzitivnost u poređenju sa L-triptofanom, i ispitivanje efekta izabranog jedinjenja na sprečavanje oksidacije proteina.

U nekim metodama, fotosenzitivnost se meri na osnovu količine H2O2 koju jedinjenje proizvodi prilikom izlaganja svetlosti. U nekim otelotvorenjima, odabrano je jedinjenje koje proizvodi manje od oko 20% količine H2O2 koju proizvodi L-triptofan. U nekim otelotvorenjima, oksidacioni potencijal se meri cikličnom voltametrijom. U nekim otelotvorenjima, ispituje se efekat izabranog jedinjenja na sprečavanje oksidacije proteina reaktivnim vrstama kiseonika koje su generisali 2,2'-azobis(2-amidinopropan) dihidrohlorid (AAPH), svetlost i/ili Fentonov reagens.

Podrazumeva se da jedna, neke ili sve osobine različitih ovde opisanih različitih otelotvorenja mogu da se kombinuju, dajući druga otelotvorenja predmetne aplikacije. One su dalje detaljno opisane u nastavku.

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1 je niz dijagrama koji pokazuju oksidaciju A) Fab u mAb1, i B) Fc u mAb1, nakon osam sati izlaganja svetlosti na 250 W/m<2>. mAb1 je bilo u koncentraciji 5 mg/ml u 20 mM histidin acetatu, 250 mM trehalozi, 0,02% polisorbatu 20. Sve bočice su bile stavljene u svetlosni orman, osim mAb1 Ref Mat. Bočice Folija kontr. su bile umotane u foliju pre stavljanja u svetlosni orman. Uzet je prosek od tri odvojene eksperimentalne bočice za svaki uzorak, osim "10mM Met, 1mM Trp" (*) koji je prosek od dve eksperimentalne bočice, a mAb1 Ref Mat je bila jedna eksperimentalna bočica sa tri nezavisna injektovanja na HPLC. Interval greške predstavlja jednu standardnu devijaciju. ;Slika 2 je dijagram koji predstavlja dozno zavisnu proizvodnju H2O2 od strane L-Trp. Rombovi prikazuju samo L-Trp, trouglovi prikazuju L-Trp SOD (superoksid dismutaza); kvadrati i krugovi prikazuju L-Trp NaN3 ± SOD. Sve studije su izvedene u 20mM L-His HCl, pH 5,5. ;Slika 3 je niz dijagrama koji prikazuju A) proizvodnju vodonik peroksida (H2O2) u 50 mg/ml mAb1 formulacijama koje sadrže 3,2 mM L-Trp, kada se izlože ambijentalnom svetlu tokom 1, 3 i 7 dana, i B) procenat (%) oksidacije Fab u formulacijama mAb1 koje sadrže 3,2 mM L-Trp nakon 10 dana izlaganja ambijentalnom svetlu. ;Slika 4 je niz dijagrama koji prikazuju stvaranje vodonik peroksida od strane derivata triptofana i derivata indola pod svetlosnim stresom tokom 4 sata na 250 W/m<2>. A) Skrining derivata triptofana (1 mM) na nastajanje vodonik peroksida (µM) u formulaciji 20 mM HisAc pH 5,5. B) Skrining derivata indola (1 mM) na nastajanje vodonik peroksida (µM) u formulaciji 20 mM HisAc pH 5,5. ;Slika 5 je dijagram koji prikazuje efekat NaN3 na proizvodnju H2O2 od strane različitih derivata Trp prilikom izlaganja svetlosti. Prikazani su podaci kao udeo u odnosu na peroksid generisan od strane L-Trp. ;Slika 6 je dijagram koji prikazuje korelaciju između oksidacionog potencijala i nastajanja peroksida indukovanog svetlošću. Uokvirena oblast prikazuje kandidate za antioksidativna jedinjenja. ;Slika 7 je niz dijagrama koji prikazuju oksidaciju A) Fab u mAb1, i B) Fc u mAb1 nakon inkubacije sa AAPH. Svi uzorci su inkubirani sa AAPH, osim mAb1 Ref Mat i Bez AAPH. Svi uzorci su inkubirani na 40°C, osim mAb1 Ref Mat. Prikazani podaci su prosečna vrednost tri eksperimentalna uzorka ± 1SD, osim mAb1 Ref Mat, koji je prosek od šest HPLC injektovanja bez intervala greške. ;Slika 8 je niz dijagrama koji prikazuju oksidaciju A) Fab u mAb1, i B) Fc u mAb1 nakon šesnaest sati izlaganja svetlu pri 250 W/m<2>. Sve bočice su bile stavljene u svetlosni orman, osim mAb1 Ref Mat. Bočice Folija kontr. su bile umotane u foliju pre stavljanja u svetlosni orman. Uzet je prosek od tri odvojene eksperimentalne bočice za svaki uzorak, osim za L-triptofanamid (*) koji je prosek od dve eksperimentalne bočice, a mAb1 Ref Mat je bila jedna bočica sa tri nezavisna injektovanja na HPLC. Interval greške predstavlja jednu standardnu devijaciju.

Slika 9 je niz dijagrama koji prikazuju oksidaciju A) Fab u 3 mg/ml mAb1, i B) Fc u 3 mg/ml mAb1 nakon Fentonove reakcije, koristeći 10 ppm H2O2 i 0,2 mM Fe(III). Reakcija je inkubirana 3 sata na 40°C, prekinuta dodatkom 100 mM L-Met i analizirana koristeći RP-HPLC nakon digestije papainom. Svi uzorci predstavljaju prosek od tri odvojene bočice, dok je mAb1 kontrolni uzorak (Ref Mat) bila jedna bočica sa pet nezavisnih injekcija na HPLC. Interval greške predstavlja jednu standardnu devijaciju.

Slika 10 je niz dijagrama koji prikazuju pretpostavljeni mehanizam ekscitacije A) L-Trp i B) 5-hidroksi-L-triptofana, i stvaranja i prekidanja<1>O2. k25C predstavlja konstantu brzine drugog reda za prekidanje<1>O2 (Dad et al., J Photochem Photobiol B, 78(3):245-51 (2005)), dok je EOX oksidacioni potencijal molekula u odnosu na Ag/AgCl.

DETALJNI OPIS

I. Definicije.

Pre detaljnog opisa pronalaska, podrazumeva se da ovaj pronalazak nije ograničen na konkretne kompozicije ili biološke sisteme, koji se, naravno, mogu razlikovati. Takođe se podrazumeva da ovde upotrebljena terminologija ne služi samo za opisivanje konkretnog otelotvorenja, i nije ograničavajuća.

Naziv "farmaceutska formulacija" odnosi se na preparat, koji je u takvom obliku da omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka bude delotvorna, i koji ne sadrži dodatne komponente, koje su neprihvatljivo toksične po ispitanika kome bi se formulacija davala. Takve formulacije su sterilne.

"Sterilna" formulacija je aseptična ili bez, ili suštinski bez prisustva svih živih mikroorganizama i njihovih spora.

"Stabilna" formulacija je ona u kojoj protein suštinski zadržava svoju fizičku stabilnost i/ili hemijsku stabilnost, i/ili biološku aktivnost nakon čuvanja. Poželjno, formulacija suštinski zadržava svoju fizičku i hemijsku stabilnost, kao i biološku aktivnost nakon čuvanja. Period čuvanja je uopšteno odabran na osnovu navedenog roka trajanja formulacije. Razne analitičke tehnike za merenje stabilnosti proteina raspoložive su u ovoj oblasti, a prikazane su, na primer, u Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee izd., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) i Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)Stabilnost se može meriti pri izlaganju odabranoj količini svetlosti i/ili temperaturi za izabrani period. Stabilnost se može odrediti kvalitativno i/ili kvantitativno na puno različitih načina, uključujući određivanje nastajanja agregata (na primer, pomoću hromatografije na molekulskim sitima, merenjem zamućenja i/ili vizuelnim pregledom); određivanje nastajanja ROS (na primer, koristeći test svetlosnog stresa ili stres pod uticajem 2,2'-azobis(2-amidinopropan) dihidrohlorida (AAPH)); oksidaciju specifičnih aminokiselinskih ostataka proteina (na primer, Trp ostatak i/ili Met ostatak monoklonskog antitela); procenom heterogenosti naelektrisanja pomoću katjonsko izmenjivačke hromatografije, snimanja kapilarnog izoelektričnog fokusiranja (icIEF) ili kapilarne zonske elektroforeze; analizu amino-terminalne ili karboksi-terminalne sekvence; masenu spektrometrijsku analizu; SDS-PAGE analizu radi poređenja smanjenog i netaknutog antitela; analizu peptidne mape (npr. tripsinska ili LYS-C); procenu biološke aktivnosti ili ciljne funkcije vezivanja proteina (npr., antigen vezujuće funkcije antitela); itd. Nestabilnost može da uključi bilo koju, ili više od sledećih stvari: agregacija, deamidacija (npr. Asn deamidacija), oksidacija (npr. oksidacija Met i/ili oksidacija Trp), izomerizacija (npr. izomerizacija Asp), cepanje/hidroliza/fragmentacija (npr. fragmentacija regiona šarke), nastajanje sukcinimida, nespareni cistein(i), ekstenzija N-terminusa, obrada C-terminusa, razlike u glikozilaciji itd.

Protein "zadržava svoju fizičku stabilnost" u farmaceutskoj formulaciji ako ne pokazuje, ili vrlo malo pokazuje znake agregacije, taloženja i/ili denaturacije pri vizuelnom pregledu boje i/ili bistrine, ili kako je izmereno rasipanjem UV svetlosti, ili hromatografijom na molekulskim sitima.

Protein "zadržava svoju hemijsku stabilnost" u farmaceutskoj formulaciji ako je njegova hemijska stabilnost u datom vremenu takva da se smatra da je protein zadržao svoju biološku aktivnost, kako je definisana u nastavku. Hemijska stabilnost se može odrediti detektovanjem i kvantifikovanjem hemijski izmenjenih oblika proteina. Hemijska izmena može uključiti oksidaciju proteina, koja može biti procenjena, na primer, pomoću tripsinskog peptidnog mapiranja, reversno-fazne tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) i tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC/MS). Ostale vrste hemijskih izmena uključuju izmenu naelektrisanja proteina, koja se može odrediti npr. pomoću jonoizmenjivačke hromatografije ili icIEF.

Protein "zadržava svoju biološku aktivnost" u farmaceutskoj formulaciji ako je biološka aktivnost proteina u datom vremenu u okviru oko 10% (u granicama greške testa) biološke aktivnosti pokazane u vreme pripreme farmaceutske formulacije, što je određeno, na primer, testom vezivanja antigena za monoklonsko antitelo.

Kao što se ovde koristi, "biološka aktivnost" proteina odnosi se na sposobnost proteina da veže svoj cilj, na primer, sposobnost monoklonskog antitela da veže antigen. Ona dalje može uključiti biološki odgovor, koji se može meriti in vitro ili in vivo. Takva aktivnost može biti antagonistička ili agonistička.

Protein koji je "podložan oksidaciji" je onaj koji sadrži jedan ili više ostataka za koje je utvrđeno da imaju sklonost ka oksidaciji, kao što je, bez ograničenja, metionin (Met), cistein (Cys), histidin (His), triptofan (Trp) i tirozin (Tyr). Na primer, aminokiselina triptofan u Fab delu monoklonskog antitela, ili aminokiselina metionin u Fc delu monoklonskog antitela, može biti podložna oksidaciji.

Pod pojmom "izotoničan" podrazumeva se da formulacija od značaja ima suštinski isti osmotski pritisak kao ljudska krv. Izotonične formulacije će generalno imati osmotski pritisak od oko 250 do oko 350 mOsm. Izotoničnost se može, na primer, meriti pomoću pritiska pare ili osmometra na bazi zamrzavanja.

Kao što se ovde koristi, "pufer" se odnosi na puferizovani rastvor koji se opire promeni pH dejstvom svojih komponenata kiselo-baznog konjugata. Pufer iz ovog pronalaska poželjno ima pH u opsegu od oko 4,5 do oko 8,0. Na primer, histidin acetat je primer pufera koji kontroliše pH u ovom opsegu.

"Konzervans" je jedinjenje koje može opciono biti uključeno u formulaciju, da suštinski smanji dejstvo bakterija u njoj, i tako olakša proizvodnju formulacije za višestruku primenu, na primer. Primeri za potencijalne konzervanse uključuju oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid (smeša alkilbenzildimetilamonijum hlorida kod kojih su alkil grupe jedinjenja dugog niza) i benzetonijum hlorid. Druge vrste konzervanasa uključuju aromatične alkohole, kao što je fenol, butil i benzil alkohol, alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol. U jednom otelotvorenju, konzervans je ovde benzil alkohol.

Kao što se ovde koristi, "surfaktant" se odnosi na površinski aktivan agens, poželjno nejonski surfaktant. Primeri za surfaktante ovde uključuju polisorbat (na primer, polisorbat 20 i polisorbat 80); poloksamer (npr. poloksamer 188); triton; natrijum dodecil sulfat (SDS); natrijum lauril sulfat; natrijum oktil glikozid; lauril-, miristil-, linoleil-, ili stearil-sulfobetain; lauril-, miristil-, linoleil-, ili stearil-sarkozin; linoleil-, miristil-, ili cetil-betain; lauroamidopropil-, kokamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, ili izostearamidopropil-betain (npr. lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, ili izostearamidopropil-dimetilamin; natrijum metil kokoil-, ili dinatrijum metil oleil-taurat; i MONAQUAT™ seriju (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); polietil glikol, polipropil glikol, i kopolimere etilen i propilen glikola (npr. Pluronics, PF68 itd.); itd. U jednom otelotvorenju, surfaktant je ovde polisorbat 20.

"Farmaceutski prihvatljivi" ekscipijensi ili nosači, kao što se ovde koristi, obuhvataju farmaceutski prihvatljive nosače, stabilizatore, pufere, kiseline, baze, šećere, konzervanse, surfaktante, tonirajuće agense, i slično, koji su dobro poznati u struci (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22. izd., Pharmaceutical Press, 2012). Primeri za farmaceutski prihvatljive ekscipijense uključuju pufere kao što je fosfatni, citratni, acetatni, i pufere drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući aksorbinsku kiselinu, L-triptofan i metionin; polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljovodonike, uključujući glukozu, manozu, ili dekstrine; metalne komplekse, kao što je kompleks Zn-protein; helirajuće agense, kao što je EDTA; šećerne alkohole, kao što je manitol ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; i/ili nejonske surfaktante, kao što je polisorbat, poloksamer, polietilen glikol (PEG), i PLURONICS™. "Farmaceutski prihvatljivi" ekscipijensi ili nosači su oni koji mogu razumno da se daju ispitaniku da bi se obezbedila efikasna doza primenjenog aktivnog sastojka, i koji su netoksični za ispitanika koji im je izložen u primenjenim dozama i koncentracijama.

Formulisani protein je poželjno suštinski čist, i poželjno suštinski homogen (npr. nema kontaminirajuće proteine, itd.). "Suštinski čist" protein označava smešu koja sadrži najmanje oko 90% težinski proteina (npr. monoklonsko antitelo), na osnovu ukupne težine smeše, poželjno najmanje oko 95% težinski. "Suštinski homogen" protein označava smešu koja sadrži najmanje oko 99% težinski proteina (npr. monoklonsko antitelo), na osnovu ukupne težine smeše.

Termini "protein", "polipeptid" i "peptid" se ovde koriste naizmenično da bi se ukazalo na aminokiselinske polimere bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili razgranat, može sadržati modifikovane aminokiseline, i može biti prekinut kiselinama koje nisu aminokiseline. Termini takođe obuhvataju aminokiselinski polimer koji je modifikovan prirodno ili putem intervencije, na primer, stvaranje disulfidne veze, glikozilacija, lipidacija, acetilovanje, fosforilacija, ili bilo koja druga manipulacija ili modifikacija, kao što je konjugacija sa komponentom za označavanje. Definicija takođe obuhvata, na primer, proteine koji sadrže jedan ili više analoga aminokiseline (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline, itd), kao i druge modifikacije poznate u struci. Primeri za proteine ovde obuhvaćene definicijom uključuju proteine sisara, kao što je, npr. renin; hormon rasta, uključujući humani hormon rasta i goveđi hormon rasta; hormon faktora rasta; paratiroidni hormon; tiroidni stimulišući hormon; lipoproteine; alfa-1-antitripsin; A-lanac insulina; B-lanac insulina; proinsulin; folikulostimulišući hormon; kalcitonin; luteinizujući hormon; glukagon; leptin; faktore zgrušavanja, kao što je faktor VIIIC, faktor IX, tkivni faktor, i fon Vilebrandov faktor; anti-koagulacione faktore, kao što je protein C; atrijalni natriuretski faktor; plućni surfaktant; plazminogenski aktivator, kao što je urokinaza ili humani plazminogenski aktivator urinskog ili tkivnog tipa (t-PA); bombezin; trombin; hemopoetski faktor rasta; faktor nekroze tumora-alfa i -beta; receptor faktora nekroze tumora, kao što je receptor smrti 5 i CD120; TNF-srodni apoptoza indukujući ligand (TRAIL); antigen sazrevanja B-ćelija (BCMA); stimulator B-limfocita (BLyS); A proliferacija indukujući ligand (APRIL); enkefalinaza; RANTES (regulisan nakon aktivacije eksprimiran u normalnoj T-ćeliji i izlučen); humani makrofagni inflamatorni protein (MIP-1-alfa); albumin iz seruma, kao što je humani albumin iz seruma; antimilerov hormon; A-lanac relaksina; B-lanac relaksina; prorelaksin; mišji gonadotropin-vezani peptid; mikrobni protein, kao što je beta-laktamaza; DNaza; IgE; antigen vezan sa citotoksičnim T-limfocitom (CTLA), kao što je CTLA-4; inhibin; aktivin; endotelni faktor ćelijskog rasta izveden iz trombocita (PD-ECGF); protein iz familije vaskularnih endotelnih faktora rasta (npr., VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, i P1GF); protein iz familije faktora rasta izvedenih iz trombocita (PDGF) (npr., PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, i njihovi dimeri); familija faktora rasta fibroblasta (FGF), kao što je aFGF, bFGF, FGF4, i FGF9; faktor rasta epiderma (EGF); receptori hormona ili faktora rasta, kao što je(su) VEGF receptor(i) (npr., VEGFR1, VEGFR2, i VEGFR3), receptor(i) epidermalnog faktora rasta (EGF) (npr., ErbB1, ErbB2, ErbB3, i ErbB4 receptor), receptor(i) faktora rasta izvedenih iz trombocita (PDGF) (npr., PDGFR-α i PDGFR-β), i receptor(i) faktora rasta fibroblasta; TIE ligandi (angiopoetini, ANGPT1, ANGPT2); angiopoetin receptor ,kao što je TIE1 i TIE2; protein A ili D; reumatoidni faktori; neurotrofni faktor, kao što je neurotrofni koštani faktor (BDNF), neurotrofin-3, -4, -5, ili -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ili NT-6), ili faktor rasta nerava, kao što je NGF-b; transformišući faktor rasta (TGF), kao što je TGF-alfa i TGF-beta, uključujući TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, ili TGF-β5; insulinu sličan faktor rasta-I i -II (IGF-I i IGF-II); des(1-3)-IGF-I (moždani IGF-I), vezujući proteini insulinu sličnog faktora rasta (IGFBP); CD proteini, kao što je CD3, CD4,CD8, CD19 i CD20; eritropoetin; osteoinduktivni faktori; imunotoksini; koštani morfogenetski protein (BMP); hemokin, kao što je CXCL12 i CXCR4; interferon, kao što je interferon-alfa, -beta, i -gama; faktori stimulacije kolonije (CSF), npr. M-CSF, GM-CSF, i G-CSF; citokin, kao što su interleukini (IL), npr. IL-1 do IL-10; midkin; superoksid dismutaza; receptori T-ćelija; proteini površinske membrane; faktor ubrzavanja raspadanja; virusni antigen, kao što je, na primer, deo omotača AIDS-a; transportni proteini; homing receptori; adresini; regulatorni proteini; integrini, kao što je CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 i VCAM; efrini; Bv8; delta-slični ligand 4 (DLL4); Del-1; BMP9; BMP10; folistatin; faktor rasta hepatocita (HGF)/faktor rasipanja(SF); Alk1; Robo4; ESM1; perlekan; EGF-sličan domen, višestruki 7 (EGFL7); CTGF i članovi njegove familije; trombospondini, kao što je trombospondin1 i trombospondin2; kolageni, kao što je kolagen IV i kolagen XVIII; neuropilini, kao što je NRP1 and NRP2; pleotrofin (PTN); progranulin; proliferin; Notch proteini, kao što je Notch1 i Notch4; semaforini, kao što je Sema3A, Sema3C, i Sema3F; tumor asocirani antigen, kao što je CA125 (antigen kancera jajnika); imunoadhezini; i fragmenti i/ili varijante bilo kog od gore navedenih proteina i antitela, uključujući fragmente antitela, vezivanje za jedan ili više proteina, uključujući, na primer, bilo koji od gore navedenih proteina.

Termin "antitelo" ovde je upotrebljen u najširem smislu, i konkretno obuhvata monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu biološku aktivnost.

„Izolovani" protein (npr. izolovano antitelo) je onaj koji je identifikovan i odvojen i/ili se izoluje iz komponente njegove prirodne sredine. Komponente zagađivači njegove prirodne sredine su materijali koji bi ometali istraživačku, dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu proteina, i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske supstance. Izolovani protein obuhvata protein in situ u rekombinantnim ćelijama, jer barem jedna komponenta prirodnog okruženja proteina neće biti prisutna. Međutim, izolovani protein će se obično pripremiti najmanje jednim korakom prečišćavanja.

"Nativna antitela" su obično heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je povezan sa teškim lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok broj disulfidnih veza varira kod teških lanaca razičitih izotipova imunoglobulina. Svaki teški i laki lanac takođe ima pravilno razmaknute intralančane disulfidne mostove. Svaki teški lanac na jednom kraju ima varijabilni domen (VH) za kojim sledi više konstantnih domena. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen na svom drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa varijabilnim domenom teškog lanca. Veruje se da određeni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog i teškog lanca.

Termin "konstantni domen" odnosi se na deo molekula imunoglobulina koji ima očuvanije aminokisleinske sekvence u odnosu na ostale delove imunoglobulina, varijabilni domen, koji sadrži antigen vezujuće mesto. Konstantni domen sadrži CH1, CH2 i CH3 domene (zajedno, CH) teškog lanca i CHL (ili CL) domen lakog lanca.

„Varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ antitela se odnosi na domene amino-krajeva teškog ili lakog lanca antitela. Varijabilni domen teškog lanca može se pominjati kao "VH." Varijabilni domen lakog lanca može se pominjati kao "VL." Ovi domeni su uglavnom najvarijabilniji delovi antitela i sadrže antigen-vezujuća mesta.

Termin "varijabilan" ukazuje na činjenicu da se izvesni delovi varijabilnih domena veoma razlikuju po sekvenci između različitih antitela, i koriste se za vezivanje i specifičnost svakog konkretnog antitela za taj konkretni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena kroz varijabilne domene antitela. Ona je koncentrisana u tri segmenta koji se zovu hipervarijabilni regioni (HVR), u varijabilnom domenu i lakog i teškog lanca. Više očuvani delovi varijabilnih domena se zovu regioni okvira (FR). Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca čine četiri FR regiona, koji u velikoj meri zauzimaju konfiguraciju β-ravni, povezanu sa tri HVR-a, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i formiraju, deo konfiguracije beta-ravni. HVR-i u svakom lancu drže se zajedno u neposrednoj blizini FR regionima, i sa HVR-ima iz drugog lanca doprinose stvaranju antigen-vezujućeg mesta antitela (pogledajte Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela.

"Laki lanac" antitela (imunoglobulina) od bilo koje vrste sisara može se dodeliti jednom od dva jasno izražena tipa, koja se zovu kapa ("κ") i lambda ("λ"), na bazi aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena.

Termin "izotip" ili "potklasa" IgG, kao šte se ovde koristi, označava svaku od potklasa imunoglobulina definisanu hemijskim ili antigenskim karakteristikama njihovih konstantnih regiona. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, antitela (imunoglobulini) se mogu svrstati u različite klase. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, γ, ε, γ, odnosno μ. Podjedinične strukture i trodimenzione konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate i generalno opisane, na primer, u knjizi Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4. izd., W.B. Saunders, Co., 2000. Antitelo može biti deo većeg fuzionog molekula, nastalog kovalentnim ili nekovalentnim povezivanjem antitela sa jednim ili više drugih proteina ili peptida.

Termini "antitelo pune dužine", "netaknuto antitelo" i "kompletno antitelo" se ovde naizmenično koriste da ukažu na antitelo u njegovom suštinski netaknutom obliku, a ne na fragmente antitela, kao što su definisani u nastavku. Termini se posebno odnose na antitelo sa teškim lancima koji sadrže Fc region.

"Fragmenti antitela" sadrže deo netaknutog antitela, poželjno koji sadrži njegov antigen vezujući region. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab’, F(ab’)2 i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela; i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.

Digestija antitela papainom dala je dva identična antigen-vezujuća fragmenta, pod nazivom "Fab" fragmenti, svaki sa jednim antigen-vezujućim mestom, a ostatak je "Fc" fragment, čije ime odražava sposobnost lake kristalizacije. Tretman pepsinom daje F(ab')2 fragment koji ima dva antigen-kombinujuća mesta, i dalje je sposoban za biokonjugaciju antigena. Fab fragment sadrži varijabilne domene teškog i lakog lanca, i takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata tako što imaju još nekoliko ostataka na karboksi terminusu CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona šarke antitela. Fab’-SH je ovde oznaka za Fab’ u kome ostatak cisteina konstantnih domena nosi slobodnu tiolsku grupu. F(ab’)2 fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab’ fragmenata koji imaju između sebe šarke cisteina. Takođe su poznati i drugi hemijski sklopovi fragmenata antitela.

„Fv“ je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno antigen-vezujuće mesto. U jednom otelotvorenju, dvolančana vrsta Fv se sastoji od dimera varijabilnog domena jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. U jednolančanoj vrsti Fv (scFv), varijabilni domen jednog teškog i jednog lakog lanca može biti kovalentno vezan sa fleksibilnim peptidnim linkerom, tako da se laki i teški lanac mogu povezati u „dimernu“ strukturu analognu onoj kod dvolančane vrste Fv. U ovoj konfiguraciji tri HVR-a svakog varijabilnog domena interaguju, definišući antigen-vezujuće mesto na površini dimera VH-VL. Zajedno, šest HVR daju antigen-vezujuću specifičnost antitelu. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri HVR-a specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, ali sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.

"Jednolančani Fv" ili "scFv" fragmenti antitela sadrže VH i VL domene antitela, pri čemu, ti domeni su prisutni u jednom lancu polipeptida. Generalno, scFv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFv, pogledajte, npr. Pluckthün, u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore izd., Springer-Verlag, New York, str.

269-315, 1994.

Termin „dijatela“ se odnosi na fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, čiji fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Primenom linkera koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena u istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i kreiraju dva antigen-vezujuća mesta. Dijatela mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Dijatela su detaljnije opisana, na primer, u EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u članku Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Termin "monoklonsko antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno od populacije suštinski homogenih antitela, npr. pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična, osim mogućih mutacija, na primer, prirodne mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Tako reč "monoklonsko" ukazuje na karakter antitela, koje nije smeša diskretnih antitela. U nekim otelotvorenjima, takvo monoklonsko antitelo tipično sadrži antitelo koje obuhvata polipeptidnu sekvencu koja vezuje cilj, pri čemu je sekvenca koja se vezuje za ciljni polipeptid dobijena postupkom koji uključuje odabir pojedinačne sekvence koja se vezuje za ciljni polipeptid od većeg broja polipeptidnih sekvenci. Na primer, postupak selekcije može biti selekcija jedinstvenog klona od većeg broja klonova, kao što je skup klonova hibridoma, klonovi faga, ili klonovi rekombinantne DNK. Podrazumeva se da odabrana sekvenca koja se vezuje za cilj može dalje da se menja, na primer, da bi se povećao afinitet prema cilju, da bi se humanizovala, da bi se poboljšala njena proizvodnja u ćelijskoj kulturi, da bi se smanjila njena imunogenost in vivo, da bi se dobilo multispecifično antitelo, itd, i da je antitelo koje sadrži izmenjenu sekvencu koja se vezuje za cilj takođe monoklonsko antitelo iz ovog pronalaska. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno prema pojedinačnoj determinanti na antigenu. Pored specifičnosti, prednost preparata monoklonskih antitela je što tipično nisu kontaminirana drugim imunoglobulinima.

Reč "monoklonska" ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba da se tumači tako da se zahteva proizvodnja antitela nekim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti prema pronalasku mogu biti dobijena najraznovrsnijim tehnikama, uključujući, na primer, metodu hibridoma (npr., Kohler i Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd.

1988); Hammerling et al., u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), metode rekombinacije DNK (vidite, npr. U.S. Pat. No. 4,816,567), tehnologije displeja faga (vidite, npr. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol.

Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), i tehnologije za proizvodnju humanih antitela, ili antitela sličnih humanim, u životinjama koje imaju delove ili cele lokuse humanog imunoglobulina ili gene koji kodiraju sekvence humanog imunoglobulina (vidite, npr. WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); i Lonberg i Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).

Monoklonska antitela ovde specifično uključuju „himerna“ antitela, kod kojih je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od konkretne vrste, ili pripada konkretnoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lan(a)ca identičan ili homolog sa odgovarajućim sekvencama antitela dobijenih od druge vrste, ili koje pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu biološku aktivnost (vidite, npr. U.S. Pat. No.4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Himerna antitela uključuju PRIMATTZED® antitela, pri čemu je antigen-vezujući region antitela dobijen od antitela proizvedenog npr. imunizacijom makaki majmuna željenim antigenom.

"Humanizovani" oblici ne-humanih (npr. mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalne sekvence dobijene od ne-humanog imunoglobulina. U jednom otelotvorenju, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (antitelo primalac) kod kojeg su ostaci HVR primaoca zamenjeni ostacima HVR ne-humane vrste (donorsko antitelo), kao što je miš, pacov, zec ili ne-humani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i/ili kapacitet. U nekim slučajevima, FR ostaci humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim ne-humanim ostacima. Nadalje, humanizovana antitela mogu da uključe ostatke koji nisu nađeni u antitelu primaocu ili u donorskom antitelu. Te modifikacije mogu biti načinjene kako bi se dodatno preradilo dejstvo antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili barem jedan, a obično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima iz ne-humanog imunoglobulina, a svi ili suštinski svi FR-i su oni iz sekvenci humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će opciono takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično humanog imunoglobulina. Za više detalja pogledajte, npr. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Takođe vidite, npr. Vaswani i Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle i Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); i U.S. Pat. br.6,982,321 i 7,087,409.

"Humano antitelo" je ono koje poseduje sekvencu aminokiselina koja odgovara onoj u antitelu proizvedenom od strane čoveka i/ili je napravljeno pomoću bilo koje tehnike za stvaranje humanih antitela, kako je ovde otkriveno. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ne-humane antigen-vezujuće ostatke. Humana antitela mogu se proizvoditi korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci, uključujući biblioteke displeja faga. Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Takođe dostupne za pripremu humanih monoklonskih antitela su metode opisane u Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Vidite takođe van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Humana antitela se mogu pripremiti davanjem antigena transgenoj životinji koja je modifikovana tako da proizvodi takva antitela u odgovoru na antigenski izazov, ali čiji su endogeni lokusi onemogućeni, npr. imunizovani ksenomiševi (pogledajte, npr. U.S. Pat. br. 6,075,181 i 6,150,584 za XENOMOUSE™ tehnologiju). Vidite takođe, na primer, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) u vezi sa humanim antitelima dobijenim putem tehnologije hibridoma humane B-ćelije.

Termin "hipervarijabilni region", "HVR" ili "HV", kada se ovde koristi, odnosi se na regione varijabilnih domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje. Generalno, antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U nativnim antitelima, H3 i L3 pokazuju najveću raznovrsnost od šest HVR-a, a za H3 se konkretno veruje da igra jedinstvenu ulogu u davanju specifičnosti antitelima. Vidite, npr. Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, u Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, izd., Human Press, Totowa, N.J., 2003). Zaista, prirodna kamilja antitela koja se sastoje samo od teškog lanca su funkcionalna i stabilna u odsustvu lakog lanca. Vidite, npr. Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol.3:733-736 (1996).

U upotrebi je određeni broj ograničenja HVR, koja su ovde obuhvaćena. Kabatovi regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) bazirani su na varijabilnosti sekvence, i najčešće se koriste (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Čotija umesto toga ukazuje na lokaciju strukturnih petlji (Chothia i Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). HVR-i AbM predstavljaju kompromis između HVR-a Kabatovih i Čotijinih strukturnih petlji, a koristi ih program za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. "Kontaktni" HVR su bazirani na analizi raspoloživih kompleksnih kristalnih struktura. Ostaci iz svakog od ovih HVR su navedeni u nastavku.

Petlja Kabat AbM Čotija Kontakt

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabatova numeracija)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Čotijina numeracija)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

HVR-i mogu sadržati "proširene HVR" kao što sledi: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 ili 89-96 (L3) u VL, i 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102 ili 95-102 (H3) u VH. Ostaci varijabilnog domena su numerisani prema Kabatu i sar., u tekstu iznad, za svaku od ovih definicija.

"Okvirni" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu HVR ostaci kao što su ovde definisani.

Termin "numerisanje ostataka varijabilnog domena kao u Kabatu" ili "numerisanje pozicije aminokiselina kao u Kabatu", i njegove varijacije, odnose se na sistem numeracije koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca kompilacije antitela u publikaciji Kabat et al., supra. Koristeći ovaj sistem numeracije, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržavati manji broj, ili dodatne aminokiseline, što odgovara skraćivanju ili unošenju u FR ili HVR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da uključuje jedan pojedinačni aminokiselinski unos (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 od H2 i ubačene ostatke (npr. ostaci 82a, 82b i 82c itd. prema Kabatu) nakon ostatka FR teškog lanca 82. Numeracija ostataka prema Kabatu može se odrediti za dato antitelo poravnanjem u oblastima homologije sekvence antitela sa "standardnom" numerisanom sekvencom Kabata.

Sistem numerisanja prema Kabatu se generalno koristi kada se govori o ostatku u varijabilnom domenu (otprilike ostaci 1-107 lakog lanca, i ostaci od 1-113 teškog lanca) (npr. Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "EU sistem numerisanja" ili "EU indeks" generalno se koristi kada se ukazuje na ostatak u konstantnom regionu teškog lanca imunoglobulina (npr. EU indeks koji su objavili Kabat et al., supra). "EU indeks kao u Kabatu" odnosi se na brojanje ostataka humanog IgG1 EU antitela.

Izraz "linearna antitela" odnosi se na antitela opisana u Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062). Ukratko, ta antitela sadrže par tandem Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji, zajedno sa komplementarnim peptidima lakih lanaca, čine par antigen vezujućih regiona. Linearna antitela mogu biti bispecifična ili monospecifična.

Termin "oko" kao što se ovde koristi, ukazuje na prihvatljiv opseg greške za odgovarajuću vrednost, kako je odredila osoba sa prosečnom veštinom u struci, što će delimično zavisiti od toga kako je veličina merena ili određena, tj. od ograničenja mernog sistema. Na primer, "oko" može značiti oko 1 ili manje od 1 standardne devijacije, prema uobičajenoj praksi. Ukazivanje na vrednosti ili parametre koji su "oko" ovde uključuje i opisuje otelotvorenja koja su per se usmerena ka toj vrednosti ili parametru. Na primer, opis koji se odnosi na "oko X" uključuje opis "X".

Kao što se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici jednine uključuju i množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, ukazivanje na "jedinjenje" opciono uključuje i kombinaciju dva ili više takvih jedinjenja, i slično.

Podrazumeva se da ovde opisani aspekti i otelotvorenja iz pronalaska uključuju aspekte i otelotvorenja koji"uključuju", "sastoje se od" i "suštinski se sastoje od".

II. Formulacije i priprema proteina

Pronalazak se ovde odnosi na tečne formulacije koje sadrže protein i jedinjenje koje sprečava oksidaciju proteina u tečnoj formulaciji, pri čemu je jedinjenje odabrano od grupe koja se sastoji od 5-hidroksi-triptofana, 5-hidroksi-indola, 7-hidroksi-indola, i serotonina, i pri čemu je protein antitelo. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje u formulaciji je od oko 0,3 mM do oko 10 mM, ili do najviše koncentracije u kojoj je jedinjenje rastvorno u formulaciji. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje u formulaciji je oko 1 mM. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje sprečava oksidaciju jedne ili više aminokiselina u proteinu odabranih iz grupe koja se sastoji od triptofana i metionina. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje sprečava oksidaciju proteina od strane reaktivnih vrsta kiseonika (ROS). U daljem otelotvorenju, reaktivna vrsta kiseonika je odabrana iz grupe koja se sastoji od singletnog kiseonika, superoksida (O2-), alkoksil radikala, peroksil radikala, vodonik peroksida (H2O2), divodonik trioksida (H2O3), hidrotrioksi radikala (HO3•), ozona (O3), hidroksil radikala, i alkil peroksida. U nekim otelotvorenjima, ovde opisani protein je podložan oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, metionin, cistein, histidin, triptofan, i/ili tirozin u proteinu je podložan oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, triptofan, i/ili metionin u proteinu je podložan oksidaciji. Na primer, aminokiselina triptofan u Fab delu monoklonskog antitela i/ili aminokiselina metionin u Fc delu monoklonskog antitela mogu biti podložni oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, protein je terapeutski protein. U nekim otelotvorenjima, antitelo je poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, himerno antitelo ili fragment antitela. U daljem otelotvorenju, jedinjenje sprečava oksidaciju jedne ili više aminokiselina u Fab delu antitela. U daljem otelotvorenju, jedinjenje sprečava oksidaciju jedne ili više aminokiselina u Fc delu antitela. U nekim otelotvorenjima, ovde data formulacija je farmaceutska formulacija pogodna za davanje ispitaniku. Kao što se ovde koristi, "ispitanik" ili "pojedinac" u svrhu lečenja ili primene odnosi se na svaku životinju iz klase sisara, uključujući čoveka, domaće i gajene životinje, i životinje iz zoološkog vrta, životinje za sport, ili kućne ljubimce, kao što su psi, konji, mačke, krave, itd. Poželjno, sisar je čovek. U nekim otelotvorenjima, formulacija je vodena. U nekim otelotvorenjima, ovde je koncentracija proteina (npr. antitela) u formulaciji oko 1 mg/ml do oko 250 mg/ml. U nekim otelotvorenjima, formulacija dalje sadrži jedan ili više ekscipijenasa odabranih iz grupe koja se sastoji od stabilizatora, pufera, surfaktanta i tonirajućeg agensa. Na primer, formulacija iz pronalaska može da uključi monoklonsko antitelo, ovde dato jedinjenje koje sprečaav oksidaciju proteina (npr. 5-hidroksi indol), i pufer koji održava pH formulacije na željenom nivou. U nekim otelotvorenjima, ovde data formulacija ima pH od oko 4,5 do oko 7,0.

Antitela u formulaciji se mogu dobiti metodama poznatim u struci. Antitelo (npr. antitelo pune dužine, fragmenti antitela i multispecifična antitela) u tečnoj formulaciji dobijeno je tehnikama dostupnim u struci, čije neograničavajuće metode su detaljnije opisane u sledećim odeljcima. Ovde date metode stručnjaci mogu prilagoditi za dobijanje formulacije koje uključuju druge proteine, kao što su inhibitori na bazi peptida. Vidite Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. izd., 2003); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., izd., J. Wiley and Sons, 2002); Current Protocols in Protein Science, (Horswill et al., 2006); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, izd., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6. izd., J. Wiley and Sons, 2010) za dobro proučene i uobičajeno korišćene tehnike i postupke za proizvodnju terapeutskih proteina, koji su svi ove uključeni putem reference ili u celosti.

A. Priprema antitela

Ovde dato antitelo u tečnim formulacijama usmereno je protiv željenog antigena. Poželjno, antigen je biološki važan polipeptid, i davanje antitela sisaru koji pati od poremećaja može doneti terapeutsku korist sisaru. Međutim, antitela usmerena protiv nepolipeptidnih antigena su takođe razmatrana.

Kada je antigen polipeptid, on može biti transmembranski molekul (npr. receptor) ili ligand, kao što je faktor rasta. Primeri za antigen uključuju molekule kao što je vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF); CD20; ox-LDL; ox-ApoB100; renin; hormon rasta, uključujući humani hormon rasta i goveđi hormon rasta; hormon faktora rasta; paratiroidni hormon; tiroidni stimulišući hormon; lipoproteine; alfa-1-antitripsin; A-lanac insulina; B-lanac insulina; proinsulin; folikulostimulišući hormon; kalcitonin; luteinizujući hormon; glukagon; faktore zgrušavanja, kao što je faktor VIIIC, faktor IX, tkivni faktor, i fon Vilebrandov faktor; antikoagulacione faktore, kao što je protein C; atrijalni natriuretski faktor; plućni surfaktant; plazminogenski aktivator, kao što je urokinaza ili humani plazminogenski aktivator urinskog ili tkivnog tipa (t-PA); bombezin; trombin; hemopoetski faktor rasta; receptor faktora nekroze tumora, kao što je receptor smrti 5 i CD120; faktor nekroze tumora alfa i beta; enkefalinaza; RANTES (regulisan nakon aktivacije eksprimiran u normalnoj T-ćeliji i izlučen); humani makrofagni inflamatorni protein (MIP-1-alfa); albumin iz seruma, kao što je humani albumin iz seruma; antimilerov hormon; A-lanac relaksina; B-lanac relaksina; prorelaksin; mišji gonadotropin-vezani peptid; mikrobni protein, kao što je beta-laktamaza; DNaza; IgE; antigen vezan sa citotoksičnim T-limfocitom (CTLA), kao što je CTLA-4; inhibin; aktivin; receptori hormona ili faktora rasta; protein A ili D; reumatoidni faktori; neurotrofni faktor, kao što je neurotrofni koštani faktor (BDNF), neurotrofin-3, -4, -5, ili -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ili NT-6), ili faktor rasta nerava, kao što je NGF-β; faktor rasta dobijen iz trombocita (PDGF); faktor rasta fibroblasta kao što je aFGF i bFGF; faktor rasta epiderma (EGF); transformišući faktor rasta (TGF) kao što je TGF-alfa i TGF-beta, uključujući TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, ili TGF-β5; insulinu sličan faktor rasta-I i -II (IGF-I i IGF-II); des (1-3)-IGF-I (moždani IGF-I), vezujući proteini insulinu sličnog faktora rasta; CD proteini kao što je CD3, CD4, CD8, CD19 i CD20; eritropoetin; osteoinduktivni faktori; imunotoksini; koštani morfogenetski protein (BMP); interferon kao što je interferon-alfa, -beta, i -gama; faktori stimulacije kolonije (CSF), npr. M-CSF, GM-CSF, i G-CSF; interleukini (IL), npr. IL-1 do IL-10; superoksid dismutaza; receptori T-ćelija; proteini površinske membrane; faktor ubrzavanja raspadanja; virusni antigen kao, na primer, deo omotača AIDS virusa; transportni proteini; homing receptori; adresini; regulatorni proteini; integrini kao što je CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 i VCAM; tumor asocirani antigen kao što je HER2, HER3 ili HER4 receptor; i fragmenti svih gorenavedenih polipeptida.

(i) Priprema antigena

Rastvorni antigeni ili njihovi fragmenti, opciono konjugovani sa drugim molekulima, mogu se koristiti kao imunogeni za generisanje antitela. Za transmembranske molekule, kao što su receptori, njihovi fragmenti (npr. ekstracelularni domen receptora) mogu se koristiti kao imunogen. Alternativno, ćelije koje eksprimiraju transmembranski molekul mogu se koristiti kao imunogen. Takve ćelije se mogu dobiti iz prirodnog izvora (npr. ćelijske linije kancera), ili mogu biti ćelije transformisane rekombinantnim tehnikama da bi se eksprimirao transmembranski molekul. Ostali antigeni i njihovi oblici korisni za pripremu antitela biće očigledni stručnjacima.

(ii) Neke metode na osnovu antitela

Poliklonska antitela se poželjno uzgajaju u životinjama, putem višestrukih supkutanih (sc) ili intraperitonealnih (ip) injekcija relevantnog antigena i adjuvansa. Može biti korisna konjugacija relevantnog antigena za protein koji je imunogen u vrsti koja se imunizuje, npr.

hemocijanin puža Megathura crenulata, albumin iz seruma, goveđi tiroglobulin, ili sojin tripsin inhibitor, koristeći bifunkcionalni agens ili agens za derivatizaciju, na primer, maleimidobenzoil sulfosukcinimid estar (konjugacija putem ostataka cisteina), N-hidroksisukcinimid (putem ostataka lizina), glutaraldehid, anhidrid sukcinske kiseline, SOCl2, ili R<1>N=C=NR, gde su R i R<1>različite alkil grupe.

Životinje se imunizuju protiv antigena, imunogenih konjugata ili derivata kombinovanjem, npr. 100 µg ili 5 µg proteina ili konjugata (za zečeve, odnosno miševe), sa 3 zapremine Frojndovog kompletnog adjuvansa, i injektovanjem rastvora intradermalno na više mesta. Mesec dana kasnije, životinjama se daje još 1/5 do 1/10 originalne količine peptida ili konjugata u Frojndovom kompletnom adjuvansu, supkutanom injekcijom na više mesta. Nakon sedam do 14 dana, životinjama se pusti krv, i serum se ispituje na titar antitela. Životinjama se dodaju nove doze dok titar ne dostigne vodoravnu liniju. Poželjno, životinji se daju nove doze konjugata istog antigena, koji je konjugovan sa različitim proteinom i/ili putem različitog reagensa za umrežavanje. Konjugati se takođe mogu napraviti u rekombinantnoj ćelijskoj kulturi kao fuzije proteina. Takođe, agregacioni agensi, kao što je stipsa, pogodno se koriste za povećanje imunog odgovora.

Željena monoklonska antitela se mogu napraviti pomoću metode hibridoma koju su prvi put opisali Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), a dalje je opisana, npr. u Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd.1988); Hammerling et al., u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) u vezi humano-humanih hibridoma. Dodatne metode uključuju one opisane, na primer, u U.S. Pat. br.7,189,826 u vezi sa proizvodnjom monoklonskih humanih prirodnih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma. Tehnologiju humanih hibridoma (trioma tehnologija) su takođe opisali Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Druge različite tehnike hibridoma vidite, npr. u US 2006/258841; US 2006/183887 (potpuno humana antitela), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; i U.S. Pat. br. 7,078,492 i 7,153,507. Primer protokola za proizvodnju monoklonskih antitela po metodi hibridoma opisan je u nastavku. U jednom otelotvorenju, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin, kao što je hrčak, imunizovana je, kako bi se izazvali limfociti koji proizvode, ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za protein koji se koristi za imunizaciju. Antitela su uzgajana u životinjama višestrukim supkutanim (sc) ili intraperitonealnim (ip) injekcijama željenih polipeptida ili njihovog fragmenta, i adjuvansa, kao što je monofosforil lipid A (MPL)/trehaloza dikrinomikolat (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.). Željeni polipeptid (npr. antigen) ili njegov fragment može se dobiti metodama dobro poznatim u struci, kao što su rekombinantne metode, od kojih su neke opisane ovde u nastavku. Serum od imunizovanih životinja je ispitan na antiantigen antitela, i opciono su date imunizacije za pojačavanje. Izolovani su limfociti životinja koje proizvode anti-antigen antitela. Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro.

Limfociti se onda spajaju sa ćelijama mijeloma pomoću prikladnog agensa za fuziju, kao što je polietilen glikol, dajući ćelije hibridoma. Vidite, npr. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 59-103 (Academic Press, 1986). Mogu se koristiti ćelije mijeloma koje mogu efikasno da se fuzionišu, da podrže stabilnu proizvodnju velike koncentracije antitela od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela, i osetljive su na medijum, kao što je HAT medijum. Primeri za ćelije mijeloma uključuju, ali se ne ograničavaju na linije mišjeg mijeloma, kao one dobijene od mišjih tumora MOPC-21 i MPC-11, koje se mogu nabaviti od Distribucionog centra za ćelije Salkovog instituta (Salk Institute Cell Distribution Center), San Diego, California SAD, i SP-2 ili X63-Ag8-653 ćelije koje se mogu nabaviti od American Type Culture Collection, Rockville, Md. SAD. Ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma takođe su opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

Tako pripremljene ćelije hibridoma se zasejavaju i uzgajaju u pogodnom medijumu za uzgajanje, npr. medijumu koji sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, matičnih ćelija mijeloma. Na primer, ako matične ćelije mijeloma nemaju enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferazu (HGPRT ili HPRT), medijum za uzgajanje hibridoma tipično će sadržati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medijum), jer te supstance sprečavaju rast HGPRT-deficijentnih ćelija. Poželjno, metode za uzgajanje ćelijske kulture hibridoma bez seruma se koriste da se smanji korišćenje seruma dobijenog od životinja, kao što je serum goveđeg fetusa, kao što su opisali, na primer, Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).

Oligopeptidi kao alat za poboljšanje produktivnosti ćelijskih kultura hibridoma opisani su u Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005). Specifično, standardni medijumi za uzgajanje su obogaćeni izvesnim aminokiselinama (alanin, serin, asparagin, prolin), ili frakcijama proteinskih hidrolizata, a apoptoza može biti znatno suzbijena sintetičkim oligopeptidima, koji se sastoje od tri do šest aminokiselinskih ostataka. Peptidi su prisutni u milimolarnim ili većim koncentracijama.

Medijum za uzgajanje u kome rastu ćelije hibridoma može se testirati na proizvodnju monoklonskih antitela koja se vezuju za ovde opisano antitelo. Specifičnost vezivanja monoklonskih antitela koje proizvode ćelije hibridoma određuje se imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunotest (RIA) ili test sa imunoadsorbentom vezanim za enzim (ELISA). Afinitet vezivanja monoklonskog antitela se može odrediti, na primer, Skačardovom analizom. Vidite, npr. Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Pošto se identifikuju ćelije hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta, i/ili aktivnosti, klonovi mogu biti potklonirani postupcima ograničavanja razblaženja, i uzgajeni standardnim metodama. Vidite, npr. Goding, supra. Pogodni medijumi za ćelijske kulture za ovu namenu uključuju, na primer, medijume D-MEM ili RPMI-1640. Pored toga, ćelije hibridoma mogu se uzgajati in vivo kao ascites tumori u životinji. Monoklonska antitela koja izlučuju potklonovi su pogodno odvojena od medijuma za uzgajanje, tečnosti ascitesa ili seruma klasičnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina, kao što je, na primer, protein A sefaroza, hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija. Jedan postupak za izolovanje proteina iz ćelija hibridoma opisan je u US 2005/176122 i U.S. Pat. br. 6,919,436. Metoda minimalno uključuje soli, kao što su liotropne soli, u postupku vezivanja, i poželjno takođe koristi male količine organskih rastvarača u postupku eluiranja.

(iii) Neke metode za skrining biblioteka

Antitela u formulacijama i ovde opisane kompozicije mogu se napraviti korišćenjem kombinatornih biblioteka za skrining antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, veliki broj postupaka je poznat u struci za stvaranje biblioteka displeja faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Takve metode su generalno opisane u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., izd., Human Press, Totowa, N.J., 2001). Na primer, jedna metoda za stvaranje željenih antitela je upotreba biblioteka antitela faga, kako je opisano u Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93.

U principu, sintetički klonovi antitela su izabrani skriningom biblioteka faga, koje sadrže fage koji izlažu različite fragmente varijabilnih regiona antitela (Fv) fuzionisane sa proteinom omotača faga. Takve biblioteke faga su isprane afinitetnom hromatografijom sa željenim antigenom. Klonovi koji eksprimiraju Fv fragmente sposobne da se vežu za željeni antigen su adsorbovani na antigen, i tako razdvojeni od nevezujućih klonova u biblioteci. Vezujući klonovi su zatim eluirani sa antigena, i mogu se dalje obogatiti dodatnim ciklusima adsorpcije /elucije antigena. Svako od antitela se može dobiti osmišljavanjem pogodnog postupka za skrining antigena, da bi se izabrao željeni klon faga, nakon čega se konstruiše klon antitela pune dužine pomoću Fv sekvenci željenog klona faga, i pogodnog konstantnog regiona (Fc) sekvenci opisanih u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vol.1-3.

U nekim otelotvorenjima, antigen-vezujući domen antitela se formira od dva varijabilna (V) regiona od oko 110 aminokiselina, po jedna iz lakog (VL) i teškog (VH) lanca, koja oba imaju tri hipervarijabilne petlje (HVR) ili regiona koji određuje komplementarnost (CDR). Varijabilni domeni se funkcionalno mogu izložiti na fagu, ili kao jednolančani fragmenti Fv (scFv), gde su VH i VL kovalentno vezani preko kratkog, elastičnog peptida, ili kao fragmenti Fab, gde je svaki fuzionisan sa konstantnim domenom i reaguje nekovalentno, kao što su opisali Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Kao što se ovde koristi, klonovi faga koji kodiraju scFv i klonovi faga koji kodiraju Fab jednim imenom se zovu "Fv klonovi faga", ili "Fv klonovi".

Repertoari VH i VL gena mogu odvojeno da se kloniraju putem lančane reakcije polimeraze (PCR), i nasumično rekombinuju u biblioteke faga, koje zatim mogu da se pretražuju za antigen-vezujuće klonove, kao što opisuju Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona, i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

U nekim otelotvorenjima, koristi se filamentni fag za izlaganje fragmenata antitela fuzijom sa manje bitnim proteinom nosača pIII. Fragmenti antitela se mogu izložiti kao jednolančani Fv fragmenti, kod kojih su VH i VL domeni povezani na istom polipeptidnom lancu preko elastičnog polipeptidnog spejsera, npr. kao što su opisali Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ili kao Fab fragmenti, kod kojih je jedan lanac fuzionisan za pIII, a drugi se izlučuje u periplazmu bakterijske ćelije domaćina, gde se udružuje sa proteinskom strukturom Fab omotača koja postaje izložena na površini faga, zamenjujući neke od proteina omotača divljeg tipa, npr. kao što su opisali Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991).

Generalno, nukleinske kiseline koje kodiraju fragmente gena antitela se dobijaju iz imunih ćelija sakupljenih od čoveka ili životinja. Ako se želi biblioteka koja favorizuje antiantigen klonove, ispitanik se imunizuje antigenom da bi se dobio antigenski odgovor, i ćelije slezine i/ili kružeće B-ćelije drugih limfocita periferne krvi (PBL) se izdvajaju za konstruisanje biblioteke. U jednom otelotvorenju, biblioteka fragmenata gena humanog antitela koja favorizuje anti-antigen klonove dobijena je izazivanjem odgovora anti-antigen antitela kod transgenih miševa koji nose funkcionalni genski niz humanog imunoglobulina (a nemaju funkcionalni sistem za proizvodnju endogenih antitela), tako da imunizacija antigena izaziva da B ćelije proizvode humana antitela protiv antigena. U nastavku je opisano stvaranje transgenih miševa koji proizvode humano antitelo.

Dodatno obogaćenje populacije anti-antigen reaktivnih ćelija može se postići primenom pogodnog postupka skrininga da se izoluju B ćelije koje eksprimiraju antigen-specifično antitelo vezano za membranu, npr. separacijom ćelija pomoću afinitetne hromatografije antigena, ili adsorpcijom ćelija za antigen obeležen fluorohromom i zatim sortiranjem ćelija aktiviranim protokom (FACS).

Alternativno, upotreba ćelija slezine i/ili B ćelija ili drugih PBL od neimunizovanog donora daje bolje predstavljanje mogućeg repertoara antitela, i takođe omogućava konstruisanje biblioteke antitela koristeći bilo koju životinjsku vrstu (humanu ili nehumanu) kod koje antigen nije antigenski. Da se dobiju biblioteke koje uključuju in vitro konstrukciju gena antitela, sakupljaju se matične ćelije ispitanika i dobijaju se nepreuređeni segmenti gena antitela koji kodiraju nukleinske kiseline. Željene imunske ćelije se mogu dobiti od velikog broja životinjskih vrsta, kao što je čovek, miš, pacov, vrste dvozubaca, vrste zečeva, pasa, mačaka, svinja, goveda, konja i ptica, itd.

Varijabilni segmenti gena antitela koje kodira nukleinsku kiselinu (uključujući VH i VL segmente) izdvajaju se iz željenih ćelija i umnožavaju. U slučaju biblioteka preuređenih VH i VL gena, željena DNK se može dobiti izolovanjem genomske DNK ili mRNK iz limfocita, a zatim lančanom reakcijom polimeraze (PCR) sa prajmerima koji odgovaraju 5' i 3' kraju preuređenih VH i VL gena, kako su opisali Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989), pri čemu se dobijaju raznovrsni repertoari V gena za ekspresiju. V geni se mogu umnožiti iz cDNK i genomske DNK, sa zadnjim prajmerima na 5' kraju eksona koji kodira zreli V-domen, i prednjim prajmerima koji se nalaze u sastavu J-segmenta, kako su opisali Orlandi et al. (1989) i Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989). Međutim, kod amplifikacije cDNK, zadnji prajmeri takođe mogu da se nalaze u vodećem eksonu, kako su opisali Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), a prednji prajmeri u konstantnom regionu, kako su opisali Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Da bi komplementarnost bila maksimalna, u prajmere može biti uključena degeneracija, kako su opisali Orlandi et al. (1989) ili Sastry et al. (1989). U nekim otelotvorenjima, raznovrsnost biblioteke je povećana na maksimum primenom PCR prajmera koji ciljaju na svaku familiju V-gena, da bi se amplifikovala sva VH i VL preuređivanja u uzorku nukleinske kiseline imunske ćelije, npr. kao metoda koju su opisaliMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ili kao što je opisano u metodi koju su dali Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Radi kloniranja umnožene DNK u ekspresione vektore, mogu se uvesti retka restrikciona mesta u PCR prajmer kao oznaka na jednom kraju, kako su opisali Orlandi et al. (1989), ili daljom amplifikacijom PCR pomoću obeleženog prajmera, kako su opisali Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

Repertoari sintetički preuređenih V gena mogu se dobiti in vitro od segmenata V gena. Većina segmenata humanog VH-gena je klonirana i sekvencirana (objavljeno u radu Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)), i mapirana (objavljeno u radu Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993); ovi klonirani segmenti (uključujući sve glavne konformacije H1 i H2 petlji) mogu se koristiti za stvaranje raznovrsnih repertoara VH gena sa PCR prajmerima koji kodiraju H3 petlje raznovrsne sekvence i dužine, kako su opisali Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). VH repertoari se takođe mogu napraviti kada se sva raznovrsnost sekvence fokusira u dugačku H3 petlju jedne dužine, kako su opisali Barbas et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992). Humani Yκ i Vλ segmenti su klonirani i sekvencirani (objavljeno u radu Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)), i mogu se koristiti za izradu repertoara sintetičkog lakog lanca. Repertoari sintetičkog V-gena, na bazi opsega savijanja VH i VL, i dužine L3 i H3, kodiraće antitela značajne strukturne raznovrsnosti. Nakon amplifikacije DNK koje kodiraju V-gene, segmenti V-gena germinativne linije mogu biti preuređeni in vitro prema metodama koje su dali Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

Repertoari fragmenata antitela se mogu konstruisati kombinovanjem VH i VL repertoara gena na više načina. Svaki repertoar se može napraviti u različitim vektorima, a vektori rekombinovani in vitro, npr. kako su opisali Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993), ili in vivo, kombinatornom infekcijom, npr. loxP sistem opisan u radu Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). Pristup vezan za in vivo rekombinaciju koristi dvolančanu prirodu Fab fragmenata da bi se prevazišla ograničenja veličine biblioteke koja nameće efikasnost transformacije E. coli. Naivni VH i VL repertoari se kloniraju odvojeno, jedan u fagemid a drugi u vektor faga. Dve biblioteke se zatim kombinuju putem infekcije fagom bakterije koja sadrži fagemid, tako da svaka ćelija sadrži različitu kombinaciju, i veličina biblioteke je ograničena samo brojem prisutnih ćelija (oko 10<12>klonova). Oba vektora sadrže in vivo rekombinacione signale, tako da se VH i VL geni rekombinuju u jedan replikon, i zajedno se pakuju u virione faga. Ove ogromne biblioteke daju veliki broj različitih antitela dobrog afiniteta (Kd<-1>od oko 10<-8>M).

Alternativno, repertoari se redom mogu klonirati u isti vektor, npr. kako su opisali Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), ili sastaviti pomoću PCR a zatim klonirati, npr. kako su opisali Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Sastavljanje pomoću PCR se takođe može koristiti da se DNK od VH i VL spoji sa DNK koja kodira elastični peptidni spejser, dajući repertoare jednolančanog Fv (scFv). U još jednoj tehnici, "PCR sklapanje u ćeliji" je korišćeno za kombinovanje VH i VL sa limfocitima pomoću PCR, a zatim kloniranje repertoara vezanih gena, kako su opisali Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).

Antitela dobijena pomoću naivnih biblioteka (prirodnih ili sintetičkih) mogu imati umereni afinitet (Kd<-1>od oko 10<6>do 10<7>M<-1>), ali afinitetno sazrevanje takođe može da se imitira in vitro konstruisanjem i reselektovanjem iz sekundarnih biblioteka, kako su opisali Winter et al.

(1994), supra. Na primer, mutacija se može uvesti nasumično in vitro primenom polimeraze sklone greškama (objavljeno u radu Leung et al., Technique 1: 11-15 (1989)) u metodi koju su dali Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992), ili u metodi koju su dali Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Pored toga, afinitetno sazrevanje se može izvesti nasumičnom mutacijom jednog ili više CDR-a, npr. upotrebom PCR sa prajmerima koji nose nasumične sekvence koje obuhvataju željeni CDR, u selektovanim pojedinačnim klonovima Fv, i pretraživanjem za klonove većeg afiniteta. WO 9607754 (objavljen 14. marta 1996.) opisuje metodu za indukovanje mutageneze u regionu koji određuje komplementarnost lakog lanca imunoglobulina, i kreiranje biblioteke gena lakog lanca. Još jedan delotvoran pristup je rekombinovanje VH ili VL domena odabranih displejem faga sa repertoarima varijanti prirodnih V domena dobijenih od neimunizovanih donora, i pretraženih za veći afinitet u nekoliko ciklusa ponovnog mešanja lanaca, kako su opisali Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Ova tehnika omogućava proizvodnju antitela i fragmenata antitela sa afinitetima od oko 10<-9>M, ili manje.

Pretraživanje biblioteka se može postići različitim tehnikama poznatim u struci. Na primer, antigen se može koristiti za premazivanje bunarčića adsorpcionih ploča, može biti eksprimiran na ćeliji domaćinu fiksiranoj za adsorpcione ploče, ili se može koristiti za sortiranje ćelija, ili biti konjugovan za biotin radi hvatanja perlicama premazanim streptavidinom, ili se može koristiti u bilo kojoj drugoj metodi za ispiranje biblioteka za displej faga.

Uzorci biblioteke faga se dovode u kontakt sa imobilisanim antigenom pod uslovima pogodnim za vezivanje barem jednog dela čestice faga sa adsorbensom. Normalno se biraju uslovi koji imitiraju fiziološke uslove, uključujući pH, jonsku jačinu, temperaturu, i slično. Fagi vezani za čvrstu fazu se ispiraju, a zatim eluiraju kiselinom, npr. kako su opisali Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991), ili alkalijom, npr. kako su opisali Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ili takmičenjem antigena, npr. u postupku sličnom metodi takmičenja antigena koju su dali Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991). Fagi mogu biti obogaćeni 20-1000 puta u jednom ciklusu selekcije. Pored toga, obogaćeni fagi se mogu uzgajati u bakterijskoj kulturi, i podvrći dodatnim ciklusima selekcije.

Efikasnost selekcije zavisi od mnogih činilaca, uključujući kinetiku disocijacije tokom ispiranja, i od toga da li se fragmenti višestrukih antitela na jednom fagu mogu istovremeno vezati za antigen. Antitela sa brzom kinetikom disocijacije (i malim afinitetom vezivanja) mogu se zadržati primenom kratkotrajnog ispiranja, displejom viševalentnog faga i velikom gustinom premaza antigena u čvrstoj fazi. Pored toga što stabilizuje fage putem viševalentnih interakcija, velika gustina favorizuje ponovno vezivanje faga koji je disociran. Selekcija antitela sa sporom kinetikom disocijacije (i dobrim afinitetima vezivanja) može se poboljšati upotrebom dugotrajnog ispiranja i displejom jednovalentnog faga, kako su opisali Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) i WO 92/09690, i malom gustinom premazivanja antigena, kako su opisali Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

Za antigen je moguća selekcija između antitela faga različitih afiniteta, čak i afiniteta koji se neznatno razlikuju. Međutim, nasumična mutacija odabranog antitela (npr. kako se radi u nekim tehnikama afinitetnog sazrevanja) verovatno će dovesti do velikog broja mutanata, od kojih će se većina vezivati za antigen, a neka će imati veći afinitet. Ako se ograniči antigen, retki fagi velikog afiniteta se mogu isključiti. Da bi se zadržali svi mutanti većeg afiniteta, fagi se mogu inkubirati sa viškom biotinilovanog antigena, ali sa biotinilovanim antigenom u koncentracijama manjeg molariteta od ciljne konstante molarnog afiniteta za antigen. Fagi sa velikim afinitetom se onda mogu uhvatiti na paramagnetnim perlicama premazanim streptavidinom. Takvo "ravnotežno hvatanje" omogućava da se antitela selektuju prema njihovim afinitetima vezivanja, sa osetljivošću koja omogućava izolovanje klonova mutanta sa svega dvostruko većim afinitetom iz velikog viška faga sa manjim afinitetom. Uslovi korišćeni za ispiranje faga vezanih za čvrstu fazu se takođe mogu prilagoditi u cilju odbacivanja na bazi kinetike disocijacije.

Anti-antigen klonovi mogu biti odabrani na osnovu aktivnosti. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-antigen antitela koja se vezuju za žive ćelije koje prirodno eksprimiraju antigen ili se vezuju za slobodni antigen, ili antigen vezan za druge ćelijske strukture. Fv klonovi koji odgovaraju takvim anti-antigen antitelima mogu se odabrati (1) izolovanjem anti-antigen klonova iz biblioteke faga, kako je gore opisano, i opciono amplifikacijom izolovane populacije klonova faga uzgajanjem populacije u pogodnoj bakteriji domaćinu; (2) selektovanjem antigena i drugog proteina protiv koga se želi blokirajuća, odnosno neblokirajuća aktivnost; (3) adsorbovanjem anti-antigen klonova faga na imobilisanom antigenu; (4) primenom viška drugog proteina za eluiranje svih neželjenih klonova koji prepoznaju antigen-vezujuće determinante koje se preklapaju ili se dele sa vezujućim determinantama drugog proteina; i (5) eluiranjem klonova koji ostaju adsorbovani nakon koraka (4). Opciono, klonovi sa željenim blokirajućim/neblokirajućim svojstvima se dalje mogu obogatiti ponavljanjem ovde opisanih postupaka selekcije jednom ili više puta.

Monoklonska antitela dobijena od hibridoma koja kodiraju DNK ili Fv klonovi displeja faga lako se izoluju i sekvenciraju klasičnim postupcima (npr. primenom oligonukleotidnih prajmera konstruisanih da specifično amplifikuju željene kodirajuće regione teškog i lakog lanca iz matrice hibridoma ili DNK faga). Kada se izoluje, DNK se može ubaciti u ekspresione vektore, koji se zatim transficiraju u ćeliju domaćina, kao što su ćelije E. coli, majmunske COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, da bi se postigla sinteza željenih monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. Revijalni članci o rekombinantnoj ekspresiji u bakterijama DNK koja kodira antitelo obuhvataju radove Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) i Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992).

DNK koja kodira Fv klonove može se kombinovati sa poznatim sekvencama DNK koje kodiraju konstantne regione teškog lanca i/ili lakog lanca (npr. odgovarajuće sekvence DNK se mogu dobiti iz Kabat et al., supra) dajući klonove koji kodiraju kompletni ili delimični teški i/ili laki lanac. Smatraće se da u ovu svrhu mogu da se koriste konstantni regioni svakog izotipa, uključujući konstantne regione IgG, IgM, IgA, IgD, i IgE, i da se takvi konstantni regioni mogu dobiti od svake čovečje ili životinjske vrste. Fv klon dobijen od DNK varijabilnog domena jedne životinjske vrste (kao što je čovek), a zatim fuzionisan sa DNK konstantnog domena druge životinjske vrste dajući kodirajuće sekvence za "hibrid", kompletan teški lanac i/ili laki lanac, uključen je u definiciju "himernog" i "hibridnog" antitela kako se ovde koristi. U nekim otelotvorenjima, Fv klon dobijen od humane varijabilne DNK je fuzionisan sa DNK humanog konstantnog regiona, dajući kodirajuću sekvencu(e) za kompletan ili delimični humani teški lanac i/ili laki lanac.

DNK koja kodira anti-antigen antitelo dobijena od hibridoma takođe se može modifikovati, na primer, supstitucijom kodirajuće sekvence humanog konstantnog domena teškog i lakog lanca na mesto homologih mišjih sekvenci dobijenih od klona hibridoma (npr. kao u metodi koju su dali Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). DNK koja kodira antitelo ili fragment dobijen od hibridoma ili Fv klona može se dalje modifikovati kovalentnim vezivanjem za sekvencu koja kodira imunoglobulin, cele sekvence ili dela kodirajuće sekvence za polipeptid koji nije imunoglobulin. Na taj način, dobijaju se "himerna" ili "hibridna" antitela koja imaju specifičnost vezivanja antitela dobijenih od Fv klona ili hibridoma. (iv) Humanizovana i humana antitela

Razne metode za humanizaciju antitela koja nisu humanog porekla su poznate u struci. Na primer, humanizovano antitelo ima jedan ili više ostataka aminokiseline uvedenih iz izvora koji nije humanog porekla. Ovi ostaci aminokiselina koje nisu humanog porekla često se nazivaju "uvezeni" ostaci, koji se obično uzimaju iz "uvezenog" varijabilnog domena. Humanizacija može u suštini da se obavi metodom Vintera i saradnika (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), supstitucijom CDR ili sekvenci CDR glodara odgovarajućim sekvencama humanog antitela. Prema tome, takva "humanizovana" antitela su himerna antitela (U.S. Patent br. 4,816,567), naznačena time što se znatno manje od netaknutog humanog varijabilnog domena zamenjuje odgovarajućom sekvencom vrsta koje nisu humanog porekla. Obično su humanizovana antitela humana antitela kod kojih su neki CDR ostaci i verovatno neki FR ostaci zamenjeni ostacima sa analognih mesta antitela glodara.

Izbor humanih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji će se koristiti za dobijanje humanizovanih antitela, veoma je važan za smanjivanje antigenosti. U skladu sa takozvanom metodom „najboljeg poklapanja“, sekvenca varijabilnog domena antitela glodara upoređuje se sa celom bibliotekom poznatih sekvenci humanih varijabilnih domena. Humana sekvenca najbliža sekvenci glodara se prihvata kao humani okvir (FR) za humanizovano antitelo (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Druga metoda koristi određeni okvir dobijen iz sekvence konsenzusa svih humanih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti okvir se može upotrebiti za više različitih humanizovanih antitela (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Nadalje, važno je da antitela budu humanizovana uz zadržavanje velikog afiniteta prema antigenu, i drugih povoljnih bioloških osobina. Da bi se to postiglo, prema jednom otelotvorenju metode, humanizovana antitela se pripremaju postupkom analize matičnih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda pomoću trodimenzionalnih modela matičnih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni imunoglobulinski modeli obično su dostupni, i poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Računarski programi dostupni su za ilustraciju i prikaz verovatnih trodimenzionalnih konformacionih struktura odabranih kandidata za imunoglobulinsku sekvencu. Pregled ovih izlaganja omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidata za imunoglobulinsku sekvencu, tj. analizu ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci se mogu odabrati i kombinovati od primaoca i uvezenih sekvenci, tako da željene karakteristike antitela, kao što je povećan afinitet prema ciljanom antigenu, budu ostvarene. Uopšteno, ostaci hipervarijabilnog regiona direktno i najneposrednije utiču na vezivanje antigena.

Humana antitela u ovde opisanim formulacijama i kompozicijama mogu se konstruisati kombinovanjem sekvence(i) varijabilnog domena Fv klona odabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla, sa poznatim sekvencama humanog konstantnog domena, kako je gore opisano. Alternativno, humana monoklonska antitela se mogu napraviti metodom hibridoma. Ćelijske linije humanog mijeloma i ćelijske linije mišje-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela opisali su, na primer, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

Moguće je proizvesti transgene životinje (npr. miševe) koje mogu, po imunizaciji, da proizvode pun repertoar humanih antitela u odsustvu endogene imunoglobulinske produkcije. Na primer, opisano je da homozigotno izbacivanje gena spojnog regiona teškog lanca antitela (JH) kod himernih miševa i miševa sa germinalnim mutacijama dovodi do potpune inhibicije endogene proizvodnje antitela. Transfer čipa humanog gena imunoglobulina germinalne linije u takve miševe sa germinalnim mutacijama dovešće do proizvodnje humanih antitela izazvane antigenom. Vidite, npr., Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); iDuchosal et al. Nature 355:258 (1992).

Takođe se može upotrebiti mešanje gena da se dobiju humana antitela iz nehumanih, npr. antitela glodara, gde humano antitelo ima slične afinitete i specifičnosti kao polazno nehumano antitelo. Prema ovoj metodi, koja se takođe zove "obeležavanje epitopa", varijabilni region teškog ili lakog lanca fragmenta nehumanog antitela dobijenog tehnikama displeja faga, kako je ovde opisano, zamenjuje se repertoarom gena humanog V domena, dajući populaciju scFv ili Fab himera nehumanog lanca/humanog lanca. Selekcija sa antigenom dovodi do izolovanja himernih scFv ili Fab nehumanog lanca/humanog lanca, pri čemu humani lanac obnavlja antigen-vezujuće mesto uništeno po uklanjanju odgovarajućeg nehumanog lanca u klonu primarnog displeja faga, tj. epitop upravlja (obeležava) izbor partnerskog humanog lanca. Kada se postupak ponavlja da bi se zamenio preostali nehumani lanac, dobija se humano antitelo (vidi PCT WO 93/06213, objavljen 1. aprila 1993.). Za razliku od tradicionalne humanizacije nehumanih antitela CDR graftingom, ova tehnika daje kompletno humana antitela, koja nemaju FR ili CDR ostatke nehumanog porekla.

(v) Fragmenti antitela

Fragmenti antitela se mogu generisati tradicionalnim sredstvima, kao što je enzimska digestija, ili rekombinantnim tehnikama. U nekim okolnostima, postoje prednosti kada se koriste fragmenti antitela umesto celih antitela. Manja veličina fragmenta omogućava brži klirens, i može dovesti do poboljšanog pristupa solidnim tumorima. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson et al. (2003) Nat. Med.9:129-134.

Razvijene su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti se dobijaju proteolitičkom digestijom netaknutih antitela (vidite, npr. Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); i Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Međutim, ti fragmenti sa sada mogu proizvesti direktno putem rekombinantnih ćelija domaćina. Fab, Fv i ScFv fragmenti antitela se svi mogu eksprimirati u ćeliji E. coli i iz nje izlučivati, tako omogućavajući laku proizvodnju velike količine tih fragmenata. Fragmenti antitela se mogu izolovati iz biblioteka faga antitela, o kojima je gore bilo reči. Alternativno, Fab'-SH fragmenti se mogu direktno izolovati iz E. coli i hemijski kuplovati, dajući F(ab')2 fragmente (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Prema drugom pristupu, F(ab')2 fragmenti se mogu direktno izolovati iz kulture rekombinantnih ćelija domaćina. Fab i F(ab')2 fragmenti sa produženim poluživotom in vivo, uključujući ostatke epitopa koji vezuju receptor spasa, opisani su u U.S. Pat. br. 5,869,046. Ostale tehnike za proizvodnju fragmenata antitela biće poznate iskusnom stručnjaku. U nekim otelotvorenjima, antitelo je jednolančani Fv fragment (scFv). Vidite WO 93/16185; U.S. Pat. br. 5,571,894; i 5,587,458. Fv i scFv su jedine vrste sa netaknutim kombinujućim mestima koje nemaju konstantne regione; oni tako mogu biti pogodni za smanjeno nespecifično vezivanje tokom primene in vivo. Mogu se konstruisati scFv fuzioni proteini, dajući fuziju efektorskog proteina na amino ili karboksilnom terminusu scFv. Vidite Antibody Engineering, izd. Borrebaeck, supra. Fragment antitela takođe može biti "linearno antitelo", npr., kako je opisano u U.S. Pat. br.5,641,870. Takvo linearno antitelo može biti monospecifično ili bispecifično.

(vi) Multispecifična antitela

Multispecifična antitela imaju specifičnost vezivanja za najmanje dva različita epitopa, a epitopi su obično od različitih antigena. Dok takvi molekuli obično normalno vezuju dva različita epitopa (tj. bispecifična antitela, BsAb), antitela sa dodatnim specifičnostima, kao što su trispecifična antitela, obuhvaćena su ovim izrazom kada se ovde koristi. Bispecifična antitela mogu se pripremiti kao kompletna antitela ili kao fragmenti antitela (npr. F(ab’)2 bispecifična antitela).

Metode za dobijanje bispecifičnih antitela su poznate u struci. Tradicionalna proizvodnja kompletnih bispecifičnih antitela je na bazi koekspresije dva para teški lanac - laki lanac imunoglobulina, gde dva lanca imaju različite specifičnosti (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Zbog nasumičnog rasporeda teških i lakih lanaca imunoglobulina, ti hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu smešu od 10 različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima pravilnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje ispravnog molekula, što se obično radi afinitetnom hromatografijom, prilično je teško, i prinosi proizvoda su mali. Slični postupci su objavljeni u WO 93/08829, i u Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Prema različitom pristupu, varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (mesta sa kombinacijom antitelo-antigen) fuzionišu se sa sekvencama konstantnog domena imunoglobulina. Fuzija je poželjno sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina, i sadrži bar jedan deo regiona šarke, CH2 i CH3 regione. Tipično postoji prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto potrebno za vezivanje lakog lanca prisutno u bar jednoj fuziji. DNK koje kodiraju fuzije teškog lanca imunoglobulina, i, po želji, lakog lanca imunoglobulina, ubacuju se u odvojene ekspresione vektore, i kotransficiraju se u pogodni organizam domaćina. To omogućava veliku fleksibilnost u podešavanju uzajamnih proporcija tri polipeptidna fragmenta u otelotvorenjima kada nejednaki udeli tri polipeptidna lanca upotrebljena za konstrukciju daju optimalne prinose. Međutim, moguće je ubaciti kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan ekspresioni vektor, kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u istim udelima dovodi do većeg prinosa, ili kada prinosi nisu naročito značajni.

U jednom otelotvorenju ovog pristupa, bispecifična antitela se sastoje od teškog lanca hibridnog imunoglobulina sa prvom specifičnošću vezivanja na jednom kraku, i para teški lanaclaki lanac hibridnog imunoglobulina (što obezbeđuje drugu specifičnost vezivanja ) na drugom kraku. Nađeno je da ova asimetrična struktura olakšava separaciju željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija lanca imunoglobulina, jer prisustvo lakog lanca imunoglobulina kod samo jedne polovine bispecifičnih molekula obezbeđuje lake načine separacije. Ovaj pristup je objavljen u WO 94/04690. Za više detalja za dobijanje bispecifičnih antitela vidite, na primer, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

Prema drugom pristupu koji opisuje WO96/27011, interfejs između para molekula antitela može se konstruisati radi dobijanja maksimalnog procenta heterodimera koji su izolovani iz rekombinantne ćelijske kulture. Jedan interfejs sadrži barem deo CH 3 domena konstantnog domena antitela. U ovoj metodi, jedan ili više malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog molekula antitela zamenjeni su dužim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzujuće “šupljine” iste ili slične veličine kao dugački bočni lanci stvaraju se na interfejsu drugog molekula antitela, zamenom dugačkih bočnih lanaca aminokiselina kraćima (npr., alanin ili treonin). To obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera u odnosu na druge neželjene krajnje proizvode, kao što su homodimeri.

Bispecifična antitela uključuju biokonjugovana antitela, ili "heterokonjugate". Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može biti kuplovano sa avidinom, a drugo sa biotinom. Za takva antitela je, na primer, predloženo da se koriste za ciljanje ćelija imunskog sistema ka neželjenim ćelijama (U.S. Pat. br. 4,676,980), i za lečenje HIV infekcije (WO 91/00360, WO 92/200373, i EP 03089). Antitela heterokonjugati mogu se napraviti pomoću pogodnih metoda biokonjugacije. Pogodni agensi za biokonjugaciju su dobro poznati u struci, i objavljeni su u US Patentu br.4,676,980, uz druge tehnike biokonjugacije.

Tehnike za stvaranje bispecifičnih antitela od fragmenata antitela takođe su opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antitela mogu se pripremiti primenom hemijskog vezivanja. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) opisuju postupak naznačen time što se netaknuta antitela proteolitički cepaju, dajući F(ab’)2 fragmente. Ti fragmenti se redukuju u prisustvu ditiolnog agensa za kompleksiranje natrijum arsenita za stabilizaciju vicinalnih ditiola i sprečavanje nastajanja intermolekularnog disulfida. Nastali Fab’ fragmenti se zatim prevode u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od derivata Fab'-TNB se zatim ponovo konvertuje u Fab'-tiol putem redukcije merkaptoetilaminom, i pomeša sa ekvimolarnom količinom drugog derivata Fab'-TNB, dajući bispecifično antitelo. Proizvedena bispecifična antitela mogu se primeniti kao agensi za selektivnu imobilizaciju enzima.

Najnovija dostignuća su olakšala direktnu izolaciju Fab'-SH fragmenata iz E. coli, koji mogu biti hemijski kuplovani, dajući bispecifična antitela. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) opisuje proizvodnju molekula kompletno humanizovanog bispecifičnog antitela F(ab')2. Svaki Fab’ fragment je odvojeno izlučen iz E. coli i podvrgnut direktnom hemijskom kuplovanju in vitro, da se dobije bispecifično antitelo.

Takođe su opisane različite tehnike za pripremu i izolovanje fragmenata bispecifičnih antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena primenom leucinskih zatvarača. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Peptidi leucinskog zatvarača iz Fos i Jun proteina vezani su za Fab' delove dva različita antitela putem fuzije gena. Homodimeri antitela su redukovani u regionu šarke, dajući monomere, i ponovo oksidisani, dajući heterodimere antitela. Ova metoda se takođe može koristiti za proizvodnju homodimera antitela. Tehnologija "dijatela" koju su opisali Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) daje alternativni mehanizam za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela. Fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) vezan za varijabilni domen lakog lanca (VL) preko linkera koji je prekratak da omogući sparivanje dva domena na istom lancu. Prema tome, VH i VL domeni jednog fragmenta su prisiljeni da se spare sa komplementarnim VL i VH domenima drugog fragmenta, tako formirajući dva antigenvezujuća mesta. Druga strategija za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera takođe je objavljena. Vidite Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994).

Razmatrana su antitela sa više od dve valence. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Tuft et al. J. Immunol.147: 60 (1991).

(vii) Antitela sa jednim domenom

U pojedinim otelotvorenjima, ovde opisano antitelo je humano antitelo sa jednim domenom. Antitelo sa jednim domenom je jedan polipeptidni lanac koji sadrži kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; vidite, npr., U.S. Pat. br.

6,248,516 B1). U jednom otelotvorenju, antitelo sa jednim domenom se sastoji od kompletnog varijabilnog domena teškog lanca antitela ili njegovog dela.

(viii) Varijante antitela

U nekim otelotvorenjima, razmatrane su modifikacije aminokiselinskih sekvenci ovde opisanih antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke osobine antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela mogu se dobiti uvođenjem odgovarajućih izmena u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, izbacivanja, i/ili ubacivanja, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Svaka kombinacija izbacivanja, ubacivanja i supstitucije može se načiniti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike. U aminokiselinsku sekvencu antitela ispitanika mogu se uvesti izmene aminokiselina u vreme nastajanja sekvence.

(ix) Derivati antitela

Antitela u formulacijama i kompozicijama iz pronalaska mogu se dalje modifikovati tako da sadrže dodatne neproteinske delove poznate u struci, koji su lako dostupni. U nekim otelotvorenjima, delovi sposobni za derivatizaciju antitela su polimeri rastvorni u vodi. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimere propropilen glikola, kopolimere prolipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, i može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira, i ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, ali se ne ograničavajući na naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.

(x) Vektori, ćelije domaćini i rekombinantne metode

Antitela se mogu dobiti i rekombinantnim metodama. Kod rekombinantne proizvodnje anti-antigen antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo je izolovana i ubačena u replikabilni vektor radi daljeg kloniranja (amplifikacije DNK) iili ekspresije. DNK koja kodira antitelo može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje mogu specifično da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Dostupni su mnogi vektori. Komponente vektora generalno uključuju, bez ograničenja, jedno ili više od sledećeg: signalna sekvenca, mesto početka replikacije, jedan ili više marker gena, element za pojačavanje, promoter, i terminalna sekvenca za transkripciju.

(a) Komponenta signalne sekvence

Antitelo u ovde opisanim formulacijama i kompozicijama može se rekombinantnim putem dobiti ne samo direktno, nego i kao fuzioni polipeptid sa heterologim polipeptidom, koji je poželjno signalna sekvenca, ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na N-kraju zrelog proteina ili polipeptida. Poželjno odabrana sekvenca heterologog signala je ona koju ćelija domaćin prepoznaje i obrađuje (npr. cepa se delovanjem signalne peptidaze). Kod prokariotskih ćelija domaćina koje ne prepoznaju i ne obrađuju signalnu sekvencu nativnog antitela, signalna sekvenca je zamenjena prokariotskom signalnom sekvencom odabranom, na primer, iz grupe koju čine alkalna fosfataza, penicilinaza, lpp, ili lideri toplotno stabilnog enterotoksina II. Kod sekrecije kvasaca, nativna signalna sekvenca može se supstitisati, npr. liderom invertaze kvasca, liderom faktora (uključujući lidere α-faktora kvasca Saccharomyces i Kluyveromyces ), ili liderom kisele fosfataze, liderom glikoamilaze C. albicans, ili signalom opisanim u WO 90/13646. Kod ekspresije ćelija sisara, dostupne su sekvence signala sisara kao i virusnih lidera sekrecije, na primer, gD signal virusa herpes simpleks.

(b) Mesto početka replikacije

I ekspresioni i klonirajući vektori sadrže sekvencu nukleinskih kiselina koja vektoru omogućava replikaciju u jednoj ili više odabranih ćelija domaćina. Generalno, kod klonirajućih vektora ova sekvenca omogućava replikaciju vektora nezavisno od hromozomske DNK domaćina, i uključuje mesto početka replikacije, ili samostalno replikujuće sekvence. Takve sekvence su dobro poznate za mnoge bakterije, kvasce i viruse. Mesto početka replikacije od plazmida pBR322 pogodno je za većinu gram-negativnih bakterija, mesto početka replikacije od plazmida 2µ je pogodno za kvasac, a razna virusna mesta početka replikacije (SV40, polioma, adenovirus, VSV ili BPV) su korisna za klonirajuće vektore u ćeliji sisara. Generalno, komponenta mesta početka replikacije nije potrebna za ekspresione vektore sisara (mesto početka replikacije SV40 može tipično da se upotrebi samo zato što sadrži rani promoter).

(c) Komponenta selekcije gena

Ekspresioni i klonirajući vektori mogu da sadrže selekcioni gen, takođe nazvan selektabilni marker. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) daju otpornost na antibiotike ili ostale toksine, npr, ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) dopunjavaju auksotrofne nedostatke, ili (c) obezbeđuju kritične nutrijente koji nisu raspoloživi iz kompleksnih medijuma, npr. D-alanin racemaza koja kodira gene za Bacilli.

U jednom primeru selekcione šeme, lek se koristi da se zaustavi rast ćelije domaćina. Te ćelije koje su uspešno transformisane sa heterologim genom proizvode protein koji daje otpornost na lek, i tako preživljavaju odabrani režim. Primeri za takvu dominantnu selekciju obuhvataju lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin.

Drugi primer za pogodne selektabilne markere za ćeliju sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija kompetentnih da preuzmu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kao što je DHFR, glutamin sintetaza (GS), timidin kinaza, metalotionein-I i -II, poželjno metalotioneinski geni primata, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza, itd.

Na primer, ćelije transformisane DHFR genom se identifikuju gajenjem transformanasa u medijumu za uzgajanje koji sadrži metotreksat (Mtx), koji je kompetitivni antagonist DHFR. Pod tim uslovima, gen DHFR je amplifikovan sa svakom drugom kotransformisanom nukleinskom kiselinom. Može se upotrebiti ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) sa nedostatkom DHFR aktivnosti (npr. ATCC CRL-9096).

Alternativno, ćelije transformisane GS genom se identifikuju gajenjem transformanasa u medijumu za uzgajanje koji sadrži L-metionin sulfoksimin (Msx), koji je inhibitor GS. Pod tim uslovima, GS gen je amplifikovan sa svakom drugom kotransformisanom nukleinskom kiselinom. Sistem za selekciju/amplifikaciju GS može se koristiti u kombinaciji sa gore opisanim sistemom za selekciju/amplifikaciju DHFR.

Alternativno, ćelije domaćini (konkretno domaćini divljeg tipa koji sadrže endogeni DHFR) transformisane ili kotransformisane DNK sekvencama koje kodiraju željeno antitelo, DHFR gen divljeg tipa i drugi selektabilni marker, kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH), mogu se odabrati putem ćelijskog rasta u medijumu koji sadrži selekcioni agens za selektabilni marker, kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr. kanamicin, neomicin ili G418. Vidite U.S. Pat. br.4,965,199.

Pogodni selekcioni gen za primenu kod kvasca je trp 1 gen prisutan u plazmidu kvasca YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). Trp1 gen obezbeđuje selekcioni marker za mutantni soj kvasca koji nema sposobnost rasta u triptofanu, na primer, ATCC br. 44076 ili PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). Prisustvo lezije trp1 u genomu ćelije domaćina kvasca onda obezbeđuje efikasno okruženje za detektovanje transformacije rastom u odsustvu triptofana. Slično tome, Leu2-deficijentni sojevi kvasaca (ATCC 20,622 ili 38,626) su dopunjeni poznatim plazmidima koji nose Leu2 gen.

Pored toga, vektori dobijeni od cirkularnog plazmida pKD1 od 1,6 µm mogu se upotrebiti za transformaciju kvasaca Kluyveromyces. Alternativno, ekspresioni sistem za proizvodnju u velikoj zapremini rekombinantnog telećeg himozina objavljen je za K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Takođe je objavljen članak o stabilnim ekspresionim vektorima za višestruko kopiranje, za sekreciju zrelih rekombinantnih humanih albumina iz seruma iz industrijskih sojeva Kluyveromyces . Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

(d) Promoterska komponenta

Ekspresioni i klonirajući vektori generalno sadrže promoter koji je prepoznat od strane organizma domaćina, i operativno je vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo. Promoteri pogodni da se upotrebe sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promoter, promoterske sisteme β-laktamaze i laktoze, promoter alkalne fosfataze, promoterski sistem triptofana (trp), i hibridne promotere, kao što je tac promoter. Međutim, pogodni su i drugi bakterijski promoteri. Promoteri za primenu u bakterijskim sistemima takođe će sadržati Šajn-Dalgarnovu (S.D.) sekvencu operativno vezanu za DNK koja kodira antitelo.

Poznate su promoterske sekvence za eukariote. Praktično svi eukariotski geni imaju region obogaćen sa AT, koji se nalazi oko 25 do 30 baza ushodno od mesta gde je započeta transkripcija. Druga sekvenca koja se nalazi 70 do 80 baza ushodno od mesta početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region, gde N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskih gena je AATAAA sekvenca, koja može biti signal za dodavanje poli A nastavka na 3' kraj kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence su pogodno ubačene u eukariotske ekspresione vektore.

Primeri za pogodne promoterske sekvence za primenu kod domaćina kvasaca uključuju promotere za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, kao što je enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triozafosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza, i glukokinaza.

Drugi promoteri kvasaca, koji su induktibilni promoteri koji imaju dodatnu prednost da je transkripcija kontrolisana uslovima rasta, jesu promoterski regioni za alkohol dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselu fosfatazu, degradativne enzime povezane sa metabolizmom azota, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu, i enzime odgovorne za korišćenje maltoze i galaktoze. Pogodni vektori i promoteri za primenu u ekspresiji kvasca su dalje opisani u EP 73,657. Povoljno je da se koriste pojačavači kvasca sa promoterima kvasca.

Transkripcija antitela sa vektora na ćeliju domaćina sisara može se kontrolisati, na primer, promoterima dobijenim iz genoma virusa, kao što je polioma virus, virus kokošjih boginja, adenovirus (kao što je adenovirus 2), goveđi papiloma virus, ptičji sarkoma virus, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa B, majmunski virus 40 (SV40), ili iz heterologih promotera sisara, npr. aktinski promoter ili imunoglobulinski promoter, od promotera toplotnog šoka, pod uslovom da su takvi promoteri kompatibilni sa sistemom ćelije domaćina.

Rani i kasni promoteri SV40 virusa se pogodno dobijaju kao restrikcioni fragment SV40 koji takođe sadrži mesto početka replikacije virusa SV40. Trenutni rani promoter humanog citomegalovirusa se pogodno dobija kao restrikcioni fragment HindIII E. Sistem za ekspresiju DNK u domaćinima sisarima koristeći goveđi papiloma virus kao vektor objavljen je u U.S. Pat. br. 4,419,446. Modifikacija ovog sistema je opisana u U.S. Pat. br. 4,601,978. Vidite takođe Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) o ekspresiji cDNK humanog β-interferona u mišjim ćelijama pod kontrolom promotera timidin kinaze iz virusa herpes simpleks. Alternativno, dugo terminalno ponavljanje (LTR) Rousovog sarkoma virusa (RSV) se može koristiti kao promoter.

(e) Komponenta elementa pojačivača

Transkripcija DNK koja kodira antitelo kod viših eukariota često se povećava ubacivanjem pojačivačke sekvence u vektor. Sada su poznate mnoge pojačivačke sekvence iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein i insulin). Međutim, tipično će se koristiti pojačivač iz virusa eukariotske ćelije. Primeri uključuju pojačivač SV40 na kasnoj strani od mesta početka replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, polioma pojačivač na kasnoj strani od mesta početka replikacije, i pojačivače adenovirusa. Vidite takođe Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) o elementima koji pojačavaju aktivaciju eukariotskih promotera. Pojačavač može biti splajsovan u vektor u položaju 5' ili 3' kodirajuće sekvence antitela, ali se poželjno nalazi na 5' mestu u odnosu na promoter.

(f) Komponenta za prekidanje transkripcije

Ekspresioni vektori upotrebljeni u eukariotskoj ćeliji domaćinu (ćelije kvasca, gljiva, insekata, biljaka, životinja, ljudi, ili drugih višećelijskih organizama) takođe će sadržati sekvence potrebne za prekidanje transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupne od 5' i, ponekad 3', netranslatovanih regiona eukariotske ili virusne DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilovani fragmenti u netranslatovanom delu mRNK koja kodira antitelo. Jedna korisna komponenta za prekidanje transkripcije je poliadenilovani region goveđeg hormona rasta. Vidite WO94/11026 i u njemu objavljene ekspresione vektore.

(g) Selekcija i transformacija ćelije domaćina

Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju DNK u vektorima ovde su prokariote, kvasci, ili više eukariotske ćelije koje su gore opisane. Pogodne prokariote za tu namenu uključuju eubakterije, kao što su gram-negativni ili gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae, kao Escherichia, npr., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr., Salmonella typhimurium, Serratia, npr., Serratia marcescans, i Shigella, kao i Bacilli, kao B. subtilis i B. licheniformis (npr., B. licheniformis41P otkriven u DD 266,710 objavljen 12. aprila 1989.), Pseudomonas, kao P. aeruginosa, i Streptomyces. Jedna poželjna E. coli kao domaćin za kloniranje je E. coli 294 (ATCC 31,446), mada su pogodni i drugi sojevi, kao E. coliB, E. coli X1776 (ATCC 31,537), i E. coli W3110 (ATCC 27,325). Ovi primeri su ilustrativni a ne ograničavajući.

U bakterijama se mogu proizvoditi antitela pune dužine, fuzioni proteini antitela i fragmenti antitela, konkretno kada nije potrebna glikozilacija i Fc efektorska funkcija, kao kada je antitelo za lečenje konjugovano sa citotoksičnim agensom (npr. toksinom) koji sam po sebi pokazuje efikasnost u uništavanju ćelija tumora. Antitela pune dužine imaju duži poluživot u krvotoku. Proizvodnja u E. coli je brža i ekonomičnija. Ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, vidite, npr. u U.S. Pat. br. 5,648,237 (Carter et. al.), U.S. Pat. br.

5,789,199 (Joly et al.), U.S. Pat. br. 5,840,523 (Simmons et al.), koji opisuje region početka translacije (TIR) i signalne sekvence za optimizaciju ekspresije i sekrecije. Vidite takođe Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), str.245-254, koja opisuje ekspresiju fragmenata antitela u E. coli. Nakon ekspresije, antitelo može biti izolovano iz paste ćelija E. coli u rastvornoj frakciji, i može se prečistiti, npr. na koloni sa proteinom A ili G, u zavisnosti od izotipa. Konačno prečišćavanje se može izvesti slično postupku za prečišćavanje antitela eksprimiranog npr. u CHO ćelijama.

Pored prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne plesni ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitela. Saccharomyces cerevisiae, ili pekarski kvasac, najčešće se koristi od nižih eukariotskih mikroorganizama domaćina. Međutim, dostupno je i korisno više rodova, vrsta i sojeva, kao Schizosaccharomyces pombe; domaćini Kluyveromyces, kao, npr, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, i K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis; i filamentozne plesni kao, npr., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium i domaćini Aspergillus, kao A. nidulans i A. niger. Pregled upotrebe kvasaca i filamentoznih plesni za proizvodnju terapeutskih proteina pogledajte, npr. u Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004).

Mogu biti odabrani pojedini sojevi plesni i kvasaca kod kojih su putevi glikozilacije "humanizovani", što dovodi do proizvodnje antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Vidite, npr., Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (opisuje humanizaciju puta glikozilacije kod Pichia pastoris); i Gerngross et al., supra.

Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela, isto tako, izvedene su od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi i varijante bakulovirusa i odgovarajuće dozvoljene ćelije domaćina insekata od domaćina kao što je Spodoptera frugiperda(gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (voćna mušica), i Bombyx mori. Slobodno su dostupni raznovrsni sojevi virusa za transfekciju, npr. L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, i takvi virusi mogu se koristiti kao ovde upotrebljen virus prema pronalasku, konkretno za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

Kao domaćini se mogu koristiti i biljne ćelijske kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, sočivice (Leninaceae), lucerke (M. truncatula) i duvana. Vidite, npr., U.S. Pat. br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).

Ćelije kičmenjaka se mogu koristiti kao domaćin, i propagacija ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinski postupak. Primeri za korisne ćelijske linije sisara domaćina je ćelijska linija bubrega majmuna CV1 transformisana od strane SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija bubrega humanog embriona (293 ili 293 ćelije potklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK, ATCC CCL 10); mišje Sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije humanog karcinoma cerviksa (HELA, ATCC CCL 2); ćelije psećeg bubrega (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75); humane ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija humanog hepatoma (Hep G2). Ostale korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što je NS0 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, vidite, npr., Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), str. 255-268.

Ćelije domaćini se transformišu gore opisanim ekspresionim ili klonirajućim vektorima radi proizvodnje antitela, i uzgajaju se u klasičnim hranljivim medijima modifikovanim po potrebi za indukovanje promotera, selekciju transformanasa, ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence.

(h) Uzgajanje ćelija domaćina

Ćelije domaćini koje se koriste za proizvodnju antitela mogu se uzgajati u različitim medijumima. Za uzgajanje ćelija domaćina pogodni su komercijalno dostupni medijumi, kao što je Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), i Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma). Pored toga, svaki od medijuma koji su opisali Ham et al., Meth. Enz.58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980), U.S. Pat. br. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili U.S. Pat. Re. 30,985 može se koristiti kao medijum za uzgajanje ćelija domaćina. Svaki od ovih medijuma može po potrebi biti dopunjen hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što je insulin, transferin, ili faktor rasta epiderma), solima (kao što je natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum, i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što je adenozin i timidin), antibioticima (kao što je lek GENTAMYCIN™), mikroelementima (definisanim kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u konačnim koncentracijama u mikromolskim količinama), i glukozom, ili ekvivalentnim izvorom energije. Svi ostali potrebni suplementi mogu takođe biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama koje su poznate stručnjacima. Uslovi uzgajanja, kao što je temperatura, pH, i slično, su kao prethodno upotrebljeni kod ćelije domaćina odabrane za ekspresiju, i biće očigledni prosečno veštom stručnjaku.

(xi) Prečišćavanje antitela

Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvoditi intracelularno, u periplazmatskom prostoru, ili se može direktno izlučivati u medijum. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, u prvom koraku se uklanjaju otpaci čestica, ili ćelija domaćina ili lizirani fragmenti, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) opisuju postupak za izolovanje antitela koja se izlučuju u periplazmatski prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta se otapa u prisustvu natrijum acetata (pH 3,5), EDTA, i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) otprilike preko 30 min. Ćelijski otpad se može ukloniti centrifugiranjem. Kada se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se generalno prvo koncentruju pomoću komercijalno dostupnog filtera za koncentrovanje proteina, na primer Amicon ili Millipore Pellicon uređaj za ultrafiltraciju. Inhibitor proteaze, kao što je PMSF, može biti uključen u bilo koji od gorepomenutih koraka da bi se sprečila proteoliza, i mogu biti uključeni antibiotici da se spreči rast slučajnih kontaminanata.

Kompozicija antitela dobijena iz ćelija može se prečistiti primenom, na primer, hidroksilapatitne hromatografije, hromatografije hidrofobnih interakcija, gel elektroforezom, dijalizom i afinitetnom hromatografijom, pri čemu afinitetna hromatografija spada u tipično poželjne korake prečišćavanja. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa svakog domena imunoglobulina Fc koji je prisutan u antitelu. Protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela na bazi teških lanaca humanog γ1, γ2, ili γ4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)). Protein G se preporučuje za sve mišje izotipove, i za humani γ3 (Guss et al., EMBO J.5:15671575 (1986)). Matrica za koju je vezan afinitetni ligand je najčešće agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice, kao što je staklo sa kontrolisanim porama ili poli(stirendivinil)benzen, omogućavaju brži protok i kraće vreme obrade nego što se može postići primenom agaroze. Kada antitelo sadrži CH3 domen, za prečišćavanje je korisna smola Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.). Takođe su dostupne druge tehnike za prečišćavanje proteina, kao što je frakcionisanje na jonoizmenjivačkoj koloni, taloženje etanolom, reversno fazna HPLC hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparin SEPHAROSE™, hromatografija na anjonskoj ili katjonskoj izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona sa poliasparaginskom kiselinom), hromatofokusiranje, SDS-PAGE, i taloženje amonijum sulfatom, u zavisnosti od antitela koje se izdvaja.

Generalno, u struci postoje različite metodologije za pripremu antitela za primenu u istraživanju, ispitivanju i klinici, koje su u skladu sa gore opisanim metodologijama i/ili prema proceni stručnjaka za konkretno antitelo.

B.Odabir biološki aktivnih antitela

Antitela proizvedena kako je gore opisano mogu se podvrći jednom ili više testova "biološke aktivnosti", kako bi se odabralo antitelo sa korisnim osobinama sa stanovišta lečenja. Antitelo se može ispitati prema sposobnosti da veže antigen protiv koga treba da deluje. Na primer, kod anti-DR5 antitela (npr., drozitumab), antigen-vezujuća svojstva antitela se mogu odrediti u testu koji detektuje sposobnost vezivanja za detektor smrti 5 (DR5).

U drugom otelotvorenju, afinitet antitela se može odrediti saturacionim vezivanjem, ELISA testom ili kompetitivnim testovima (npr. RIA).

Takođe, antitelo se može podvrgnuti drugim testovima za određivanje biološke aktivnosti, npr. da bi se procenila njegova efikasnost kao terapeutskog sredstva. Takvi testovi su poznati u struci, i zavise od ciljnog antigena i namenjene primene antitela.

Da bi se pretražila antitela koja se vezuju za konkretni epitop na željenom antigenu, može se izvesti rutinski test unakrsnog blokiranja, kao onaj opisan u Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow i David Lane (1988). Alternativno se može izvršiti mapiranje epitopa, npr. kako je opisano u Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995), kako bi se odredilo da li antitelo vezuje željeni epitop.

C. Priprema formulacija

Ovde su date metode za pripremu tečnih formulacija koje sadrže protein i jedinjenje koje sprečava oksidaciju proteina u tečnoj formulaciji, pri čemu je protein antitelo. Tečna formulacija se može pripremiti mešanjem proteina željenog stepena čistoće sa jedinjenjem koje sprečava oksidaciju proteina u tečnoj formulaciji. U nekim otelotvorenjima, protein koji se formuliše nije prethodno podvrgnut liofilizaciji, a željena formulacija je ovde vodena formulacija. U nekim otelotvorenjima, protein je terapeutski protein. U daljim otelotvorenjima,antitelo je poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, himerno antitelo ili fragment antitela. U nekim otelotvorenjima, antitelo je kompletno antitelo. U jednom otelotvorenju, antitelo u formulaciji je fragment antitela, kao što je F(ab')2, i u tom slučaju problemi koji se možda neće pojaviti za kompletno antitelo (kao što je isecanje antitela do Fab) moraju da se rešavaju. Terapeutski efikasna količina proteina prisutna u formulaciji određuje se uzimajući u obzir, na primer, željene dozne zapremine i način(e) primene. Primeri za koncentraciju proteina u formulaciji su od oko 1 mg/ml do oko 250 mg/ml, od oko 10 mg/ml do oko 250 mg/ml, od oko 15 mg/ml do oko 225 mg/ml, od oko 20 mg/ml do oko 200 mg/ml, od oko 25 mg/ml do oko 175 mg/ml, od oko 25 mg/ml do oko 150 mg/ml, od oko 25 mg/ml do oko 100 mg/ml, od oko 30 mg/ml do oko 100 mg/ml, ili od oko 45 mg/ml do oko 55 mg/ml. U nekim otelotvorenjima, ovde opisani protein je podložan oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više aminokiselina odabranih iz grupe koja se sastoji od metionina, cisteina, histidina, triptofana i tirozina podložna je oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, triptofan u proteinu je podložan oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, metionin u proteinu je podložan oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je podložno oksidaciji u Fab delu i/ili Fc delu antitela. U nekim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je podložno oksidaciji na aminokiselini triptofanu u Fab delu antitela. U daljem otelotvorenju, aminokiselina triptofan podložna oksidaciji je u CDR antitela. U nekim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je podložno oksidaciji na aminokiselini metioninu u Fc delu antitela.

Tečne formulacije koje pronalazak ovde obezbeđuje sadrže protein i jedinjenje koje sprečava oksidaciju proteina u tečnoj formulaciji, pri čemu je jedinjenje odabrano iz grupe koju čine 5-hidroksi-triptofan, 5-hidroksi-indol, 7-hidroksi-indol i serotonin, i pri čemu je protein antitelo. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje u formulaciji je u koncentraciji od oko 0,3 mM do oko 10 mM, ili do najviše koncentracije u kojoj je jedinjenje rastvorno u formulaciji. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje u formulaciji je u koncentraciji od oko 0,3 mM do oko 9 mM, od oko 0,3 mM do oko 8 mM, od oko 0,3 mM do oko 7 mM, od oko 0,3 mM do oko 6 mM, od oko 0,3 mM do oko 5 mM, od oko 0,3 mM do oko 4 mM, od oko 0,3 mM do oko 3 mM, od oko 0,3 mM do oko 2 mM, od oko 0,5 mM do oko 2 mM, od oko 0,6 mM do oko 1,5 mM, ili od oko 0,8 mM do oko 1,25 mM. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje u formulaciji je oko 1 mM. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje sprečava oksidaciju jedne ili više aminokiselina u proteinu. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje sprečava oksidaciju jedne ili više aminokiselina u proteinu odabranom iz grupe koja se sastoji od triptofana, metionina, tirozina, histidina i/ili cisteina. U nekim otelotvorenjima, jedinjenje sprečava oksidaciju proteina od strane reaktivnih vrsta kiseonika (ROS). U daljem otelotvorenju, reaktivna vrsta kiseonika je odabrana iz grupe koja se sastoji od singletnog kiseonika, superoksida (O2-), alkoksil radikala, peroksil radikala, vodonik peroksida (H2O2), divodonik trioksida (H2O3), hidrotrioksi radikala (HO3•), ozona (O3), hidroksil radikala, i alkil peroksida. U daljem otelotvorenju, jedinjenje sprečava oksidaciju na jednoj ili više aminokiselina u Fab delu antitela. U daljem otelotvorenju, jedinjenje sprečava oksidaciju jedne ili više aminokiselina u Fc delu antitela.

U nekim otelotvorenjima, tečna formulacija dalje sadrži jedan ili više ekscipijenasa odabranih iz grupe koja se sastoji od stabilizatora, pufera, surfaktanta i tonirajućeg agensa. Tečna formulacija iz pronalaska je pripremljena u pH puferovanom rastvoru. Pufer iz ovog pronalaska ima pH u opsegu od oko 4,5 do oko 7,0. U nekim otelotvorenjima, pH je u opsegu od pH 4,5 do 6,5, u opsegu od pH 4,5 do 6,0, u opsegu od pH 4,5 do 5,5, u opsegu od pH 4,5 do 5,0, u opsegu od pH 5,0 do 7,0, u opsegu od pH 5,5 do 7,0, u opsegu od pH 5,7 do 6,8, u opsegu od pH 5,8 do 6,5, u opsegu od pH 5,9 do 6,5, u opsegu od pH 6,0 do 6,5, ili u opsegu od pH 6,2 do 6,5. U nekim otelotvorenjima pronalaska, tečna formulacija ima pH 6,2 ili oko 6,2. U nekim otelotvorenjima pronalaska, tečna formulacija ima pH 6,0 ili oko 6,0. Primeri pufera koji kontrolišu pH u ovom opsegu uključuju organske i neorganske kiseline i njihove soli. Na primer, acetat (npr. histidin acetat, arginin acetat, natrijum acetat), sukcinat (npr., histidin sukcinat, arginin sukcinat, natrijum sukcinat), glukonat, fosfat, fumarat, oksalat, laktat, citrat, i njihove kombinacije. Koncentracija pufera može biti od oko 1 mM do oko 600 mM, u zavisnosti, na primer, od pufera i željene izotoničnosti formulacije. U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži histidinski pufer (npr. u koncentraciji od oko 5 mM do 100 mM). Primeri za histidinske pufere uključuju histidin hlorid, histidin acetat, histidin fosfat, histidin sulfat, histidin sukcinat, itd. U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži histidin i arginin (npr., histidin hlorid-arginin hlorid, histidin acetat-arginin acetat, histidin fosfat-arginin fosfat, histidin sulfat-arginin sulfat, histidin sukcinat-arginin sukcinat, itd.). U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži histidin u koncentraciji od oko 5 mM do 100 mM, i arginin je koncentraciji od oko 50 mM do 500 mM. U jednom otelotvorenju, formulacija sadrži histidin acetat (npr. oko 20 mM)-arginin acetat (npr. oko 150 mM). U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži histidin sukcinat (npr. oko 20 mM)-arginin sukcinat (npr. oko 150 mM). U nekim otelotvorenjima, histidin u formulaciji je od oko 10 mM do oko 35 mM, oko 10 mM do oko 30 mM, oko 10 mM do oko 25 mM, oko 10 mM do oko 20 mM, oko 10 mM do oko 15 mM, oko 15 mM do oko 35 mM, oko 20 mM do oko 35 mM, oko 20 mM do oko 30 mM, ili oko 20 mM do oko 25 mM. U daljim otelotvorenjima, arginin u formulaciji je od oko 50 mM do oko 500 mM (npr. oko 100 mM, oko 150 mM, ili oko 200 mM).

Tečna formulacija iz pronalaska može dalje da sadrži saharid, kao što je disaharid (npr. trehaloza ili saharoza). "Saharid", kako se ovde koristi, uključuje opšte jedinjenje (CH2O)n i njegove derivate, uključujući monosaharide, disaharide, trisaharide, polisaharide, šećerne alkohole, redukujuće šećere, neredukujuće šećere, itd. Primeri za saharide ovde uključuju glukozu, saharozu, trehalozu, laktozu, fruktozu, maltozu, dekstran, glicerin, eritritol, glicerol, arabitol, silitol, sorbitol, manitol, melibiozu, melezitozu, rafinozu, manotriozu, stahiozu, laktulozu, maltulozu, glucitol, maltitol, laktitol, izo-maltulozu, itd.

Surfaktant se opciono može dodati u tečnu formulaciju. Primeri za surfaktante uključuju nejonske surfaktante, kao što su polisorbati (npr. polisorbati 20, 80, itd.) ili poloksamere (npr. poloksamer 188, itd.). Količina dodatog surfaktanta je takva da smanjuje agregaciju formulisanog antitela i/ili minimizuje nastajanje čestica u formulaciji i/ili smanjuje adsorpciju. Na primer, surfaktant može biti prisutan u formulaciji u količini od oko 0,001% do oko 0,5%, od oko 0,005% do oko 0,2%, od oko 0,01% do oko 0,1%, od oko 0,02% do oko 0,06%, ili oko 0,03% do oko 0,05%. U nekim otelotvorenjima, surfaktant je prisutan u formulaciji u količini od 0,04% ili oko 0,04%. U nekim otelotvorenjima, surfaktant je prisutan u formulaciji u količini od 0,02% ili oko 0,02%. U jednom otelotvorenju, formulacija ne sadrži surfaktant.

U jednom otelotvorenju, formulacija sadrži gore navedene agense (npr. antitelo, pufer, saharid i/ili surfaktant), i suštinski ne sadrži jedan ili više konzervanasa, kao što je benzil alkohol, fenol, m-krezol, hlorobutanol i benzetonijum Cl. U drugom otelotvorenju, u formulaciju može biti uključen konzervans, naročito kada je formulacija multidozna formulacija. Koncentracija konzervansa može biti u opsegu od oko 0,1% do oko 2%, poželjno od oko 0,5% do oko 1%. Jedan ili više drugih farmaceutski prihvatljivih nosača, ekscipijenasa ili stabilizatora, kao što su oni opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. izd. (1980) mogu biti uključeni u formulaciju, pod uslovom da nemaju suprotno dejstvo na željene karakteristike formulacije. Primeri farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa ovde dalje uključuju sredstva za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Pojedine primere sHASEGP i metode primene, uključujući rHuPH20, opisuje US Patent Publication br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.

Formulacija može dalje da sadrži helatore metalnih jona. Helatori metalnih jona su dobro poznati stručnjacima, i uključuju, ali nisu neophodno ograničeni na aminopolikarboksilate, EDTA (etilendiamintetrasirćetna kiselina), EGTA (etilen glikol-bis(beta-aminoetil etar)-N,N,N',N'-tetrasirćetna kiselina), NTA (nitrilotrisirćetna kiselina), EDDS (etilen diamin disukcinat), PDTA (1,3-propilendiamintetrasirćetna kiselina), DTPA (dietilentriaminpentasirćetna kiselina), ADA (beta-alanindisirćetna kiselina), MGCA (metilglicindisirćetna kiselina), itd. Pored toga, neka otelotvorenja ovde uključuju helatore fosfonate/fosfonsku kiselinu.

Tonirajući agensi su prisutni da bi podesili ili održali toničnost tečnosti u kompoziciji. Kada se koriste sa velikim, naelektrisanim biomolekulima kao što su proteini i antitela, oni takođe mogu da služe kao "stabilizatori", jer mogu da interaguju sa naelektrisanim grupama bočnih lanaca aminokiselina, i da tako smanjuju potencijal za inter- i intramolekulske interakcije. Tonirajući agensi mogu biti prisutni u bilo kojoj količini između 0,1% do 25% težinski, ili poželjnije između 1% do 5% težinski, uzimajući u obzir relativne količine ostalih sastojaka. Poželjni tonirajući agensi uključuju polihidroksi šećerne alkohole, poželjno trihidroksilne ili više šećerne alkohole, kao što je glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol.

Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog proteina ili malog molekula leka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno na drugi protein. Na primer, kada je antitelo anti-DR5 (npr., drozitumab), ono se može kombinovati sa drugim agensom (npr., hemoterapeutskim agensom, i antineoplastičnim agensom).

U nekim otelotvorenjima, formulacija je za in vivo primenu. U nekim otelotvorenjima, formulacija je sterilna. Formulacija se može učiniti sterilnom putem filtracije kroz membrane za sterilnu filtraciju. Terapeutska formulacija je ovde generalno stavljena u sud sa sterilnim pristupnim ulazom, na primer, u kesu za intravenski rastvor ili bočicu sa čepom koji se može probušiti iglom za potkožnu injekciju. Način primene je u skladu sa poznatim i prihvaćenim metodama, kao što je pojedinačni ili višestruki bolus ili infuzija tokom dugog perioda na pogodan način, npr. injekcija ili infuzija supkutanim, intravenskim, intraperitonealnim, intramuskularnim, intraarterijskim, intralezionim ili intraartikularnim putem, topikalna primena, inhalacija, ili pomoću sredstva za odloženo ili produženo oslobađanje.

Tečna formulacija iz pronalaska može biti stabilna pri čuvanju. U nekim otelotvorenjima, protein u tečnoj formulaciji je stabilan pri čuvanju na oko 0 do 5°C tokom najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci, najmanje oko 21 mesec, ili najmanje oko 24 meseca (ili najmanje oko 52 nedelje). U nekim otelotvorenjima, protein u tečnoj formulaciji je stabilan pri čuvanju na oko -20°C tokom najmanje oko 12 meseci, najmanje oko 18 meseci, najmanje oko 21 mesec, ili najmanje oko 24 meseca (ili najmanje oko 52 nedelje). U nekim otelotvorenjima, protein u tečnoj formulaciji je stabilan tokom izrade formulacije. U nekim otelotvorenjima, protein u tečnoj formulaciji je stabilan kada se čuva u posudi od metalne legure (npr. posuda od nerđajućeg čelika). U nekim otelotvorenjima, protein u tečnoj formulaciji je stabilan kada se čuva u staklenoj bočici. U nekim otelotvorenjima, protein u tečnoj formulaciji je stabilan kada se čuva u plastičnoj posudi. U nekim otelotvorenjima, određuje se ili meri fizička stabilnost, hemijska stabilnost, ili biološka aktivnost proteina u tečnoj formulaciji. Sve metode poznate u struci mogu se koristiti za ocenu stabilnosti i biološke aktivnosti. U nekim otelotvorenjima, stabilnost se meri oksidacijom proteina u tečnoj formulaciji nakon čuvanja. Stabilnost se može ispitati određivanjem fizičke stabilnosti, hemijske stabilnosti, i/ili biološke aktivnosti antitela u formulaciji oko vremena formulacije, kao i nakon čuvanja. Fizička i/ili hemijska stabilnost se može odrediti kvalitativno i/ili kvantitativno na mnogo različitih načina, uključujući određivanje stvaranja agregata (na primer, primenom hromatografije na molekulskim sitima, merenjem zamućenja i/ili vizuelnim pregledom); procenom heterogenosti naelektrisanja pomoću katjonsko izmenjivačke hromatografije ili kapilarne zonske elektroforeze; amino-terminalnom ili karboksiterminalnom analizom sekvence; masenom spektrometrijom; SDS-PAGE analizom da se uporedi smanjeno i netaknuto antitelo; analizom peptidne mape (na primer, tripsinska ili LYS-C); određivanjem biološke aktivnosti antigen vezujuće funkcije antitela, itd. Nestabilnost može dovesti do agregacije, deamidacije (npr. Asn deamidacija), oksidacije (npr. oksidacija Trp), izomerizacije (npr. izomerizacija Asp), isecanja/hidrolize/fragmentacije (npr. fragmentacija regiona šarke), nastajanja sukcinimida, nesparenih cisteina, N-terminalne ekstenzije, C-terminalne obrade, razlika u glikozilaciji, itd. U nekim otelotvorenjima, oksidacija proteina je određena putem jedne ili više RP-HPLC, LC/MS analiza, ili tripsinskog mapiranja peptida. U nekim otelotvorenjima, oksidacija antitela je određena kao procenat, putem jedne ili više RPHPLC, LC/MS analiza, ili tripsinskog mapiranja peptida, i formule:

Formulacije za primenu in vivo moraju biti sterilne. To se lako postiže filtracijom kroz membrane za sterilnu filtraciju, pre ili posle pripreme formulacije.

Ovde su takođe date metode za izradu tečne formulacije ili sprečavanje oksidacije proteina u tečnoj formulaciji, koje obuhvataju dodavanje količine jedinjenja koja sprečava oksidaciju proteina u tečnu formulaciju, pri čemu je jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od 5-hidroksi-triptofana, 5-hidroksi-indola, 7-hidroksi-indola, i serotonina, i pri čemu je protein antitelo. Pronalazak ovde takođe obezbeđuje metodu za sprečavanje oksidacije proteina u tečnoj formulaciji koja obuhvata dodavanje količine jedinjenja koja sprečava oksidaciju proteina u tečnu formulaciju, pri čemu je jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od 5-hidroksitriptofana, 5-hidroksi-indola, 7-hidroksi-indola, i serotonina, i pri čemu je protein antitelo. Količina jedinjenja koja sprečava oksidaciju proteina, kao što je ovde dato, iznosi od oko 0,3 mM do oko 10 mM, ili bilo koja ovde objavljena količina.

III. Primena proteinskih formulacija

Tečna formulacija se daje sisaru kome je potrebno lečenje antitelom, poželjno čoveku, prema poznatim metodama, kao što je intravenska primena kao bolus ili kontinualnom infuzijom u vremenskom periodu, intramuskularnim, intraperitonealnim, intracerebrospinalnim, supkutanim, intraartikularnim, intrasinovijalnim, intratekalnim, oralnim, topikalnim ili inhalacionim putem. U jednom otelotvorenju, tečna formulacija se daje sisaru intravenskom primenom. U te svrhe, formulacija može biti injektovana pomoću šprica ili preko IV linije, na primer. U jednom otelotvorenju, tečna formulacija se daje sisaru supkutanom primenom.

Odgovarajuća doze ("terapeutski efikasna količina") proteina zavisiće, na primer, od stanja koje se leči, ozbiljnosti i toka stanja, bilo da se protein primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na protein, vrste upotrebljenog proteina, i izbora lekara. Protein se pogodno daje pacijentu jednokratno ili u seriji terapija, i može se davati pacijentu u bilo kom trenutku nakon dijagnoze. Protein se može davati kao jedino lečenje, ili zajedno sa drugim lekovima ili terapijama korisnim za lečenje konkretnog stanja. Kao što se ovde koristi, "tretman" se odnosi i na terapeutski tretman, i na profilaktičke ili preventivne mere. Oni kojima je lečenje neophodno obuhvataju one koji već imaju poremećaj, kao i one kod kojih poremećaj treba sprečiti. Kao što se ovde koristi, "poremećaj" je svako stanje kod koga bi postojala korist od lečenja, uključujući, ali se ne ograničavajući na, hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja zbog kojih sisar ima predispoziciju za dotični poremećaj.

U farmakološkom smislu, u kontekstu pronalaska, "terapeutski efikasna količina" proteina (npr. antitela) odnosi se na količinu efikasnu u sprečavanju ili lečenju poremećaja za čije lečenje je antitelo efikasno. Generalno, terapeutski efikasna količina datog proteina će biti u opsegu od oko 0,1 do oko 50 mg/kg telesne težine pacijenta, bilo kod jedne ili više primena, gde je tipični opseg proteina koji se koristi oko 0,3 do oko 20 mg/kg, poželjno oko 0,3 do oko 15 mg/kg dato dnevno, kao primer. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Na primer, protein se može davati u dozi od oko 100 ili 400 mg svakih 1, 2, 3, ili 4 nedelje, ili se daje u dozi od oko 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 15,0, ili 20,0 mg/kg svake 1, 2, 3, ili 4 nedelje. Doza se može primeniti kao pojedinačna doza, ili kao višestruke doze (npr.2 ili 3 doze), kao što su infuzije. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama.

IV. Metode za skrining jedinjenja za prevenciju oksidacije proteina

Ovde su takođe date metode za skrining jedinjenja za prevenciju oksidacije proteina u kompoziciji proteina, pri čemu je protein antitelo. U nekim otelotvorenjima, metoda obuhvata selekciju jedinjenja koje ima niži oksidacioni potencijal i manju fotosenzitivnost u poređenju sa L-triptofanom, i ispitivanje efekta odabranog jedinjenja na sprečavanje oksidacije proteina. U nekim otelotvorenjima, fotosenzitivnost se meri na osnovu količine H2O2 koju jedinjenje proizvodi prilikom izlaganja svetlosti. Na primer, tečna kompozicija koja sadrži jedinjenje se može izložiti svetlosti od 250 W/m<2>tokom izvesnog perioda, i nastali H2O2 se kvantifikuje. Jedinjenje sa manjom fotosenzitivnošću proizvodi manje H2O2 prilikom izlaganja izvesnoj količini svetlosti od jedinjenja sa većom fotosenzitivnošću prilikom izlaganja istoj količini svetlosti. U nekim otelotvorenjima, odabrano je jedinjenje koje proizvodi manje od oko 15%, manje od oko 20% ili manje od oko 25% količine H2O2. H2O2 se može proizvoditi oksidacijom aminokiselinskih ostataka u proteinu koji su podložni oksidaciji. U nekim otelotvorenjima, oksidacioni potencijal se meri cikličnom voltametrijom.

U nekim otelotvorenjima, ispituje se efekat izabranog jedinjenja na sprečavanje oksidacije proteina reaktivnim vrstama kiseonika koje su generisali 2,2'-azobis(2-amidinopropan) dihidrohlorid (AAPH), svetlost i/ili Fentonov reagens. U svakom od ovde datih otelotvorenja, metoda opisana u primerima (npr. Primeri 2 i 3) može se koristiti za skrining jedinjenja koje sprečava oksidaciju proteina u proteinskoj kompoziciji.

H. Predmeti proizvodnje

U drugom otelotvorenju pronalaska, obezbeđuje se predmet proizvodnje, koji je sadržan u posudi koja sadrži tečnu formulaciju pronalaska, i opciono obezbeđuje uputstva za njegovu upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice i špriceve. Posuda može biti od različitih materijala, kao što je staklo, metalna legura (kao nerđajući čelik) ili plastika. Primer za posudu je posuda od 300 cm3 od metalne legure (npr. za čuvanje na -20°C). Primer za posudu je staklena bočica za jednokratnu upotrebu od 3-20 cm3. Alternativno, za multidoznu formulaciju, posuda može biti staklena bočica od 3-100 cm3. U posudi se čuva formulacija i ona je obeležena, ili ima pridodatu oznaku; posuda može imati uputstvo za upotrebu. Predmet proizvodnje može dalje obuhvatiti druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve i uloške u pakovanju sa uputstvom za upotrebu.

Smatra se da je specifikacija dovoljna da stručnjak primeni pronalazak.

PRIMERI

Pronalazak će se u potpunosti bolje shvatiti kroz Primere koji slede.

Primer 1: Antioksidans L-Trp proizvodi ROS koji oksidišu monoklonska antitela u proteinskim formulacijama.

Dokazano je da monoklonska antitela proizvode ROS kroz put oksidacije vode koji antitela katalizuju (antibody catalyzed water oxidation pathway, ACWOP), pri čemu antitela potencijalno katalizuju reakciju između vode i singletnog kiseonika, gradeći vodonik peroksid (Wentworth et al., Science 293(5536): 1806-11 (2001); Wentworth et al., Proc Natl Acad Sci U S A 97(20):10930-5 (2000)). U ACWOP, na putu ka proizvodnji vodonik peroksida, stvaraju se raznovrsne ROS, uključujući superoksidni anjon, divodonik trioksid, ozon, pa čak i hidrotrioksi radikal (Zhu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101(8):2247-52 (2004)). Pokazalo se da površinski izloženi molekuli triptofana u monoklonskom anti-DR5 antitelu, drozitumabu (CAS broj 912628-39-8), koji se ovde pominje i kao mAb1, deluju na nastajanje (<1>O2 i O2-) u supstratu, što olakšava ACWOP čak i pri uslovima slabog svetla, na način koji zavisi od vremena i koncentracije (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). Pokazalo se da je mAb1 posebno podložno oksidaciji tokom čuvanja pod farmaceutski relevantnim uslovima (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). Pokazalo se da je oksidacija specifična prema mestu, i lokalizovana na Trp53 (W53) na CDR teškog lanca (Fab), kao što je određeno tripsinskim mapiranjem peptida. Pored toga, korišćena je reversno fazna HPLC analiza da se izmeri ukupna oksidacija u HC Fab i Fc regionima mAb1, pomoću digestije papainom, DTT redukcije i reversno fazne separacije. RP-HPLC pikovi su identifikovani pomoću LC/MS, i pokazali su jaku korelaciju sa rezultatima tripsinske peptidne mape, što ukazuje da RP metoda može da se koristi kao zamena za detekciju W53 (tj. % Fab) oksidacije (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). U RP metodi digestije papainom, oksidacioni pikovi Fab i Fc su eluirani pre odgovarajućih glavnih pikova, što omogućava kvantifikaciju % Fab i % oksidacije Fc u odnosu na njihove ukupne površine pika. Studija je dalje pokazala da vodonik peroksid može biti zamena za veći broj ROS, uključujući superoksid i singletni kiseonik.

Da bi se odredilo da li ograničeno (tj. kontrolisano) izlaganje svetlu može da se koristi kao model ubrzanog stresa za ispitivanje oksidacije proteina, upotrebljeno je isto humano monoklonsko IgG1 antitelo (mAb1) za skrining i procenu potencijalnih antioksidanasa. Nedavno je dokazano da je antioksidans koji se upotrebljava u proteinskim formulacijama, L-triptofan (L-Trp), fotosenzitivan (Igarashi et al., Anal Sci 23(8):943-8 (2007)) i da može da proizvede H2O2 prilikom izlaganja svetlosti. Određena je osetljivost mAb1 na L-Trp prilikom svetlosnog stresa, sa dodatkom ili bez dodatka L-metionina (L-Met) kao potencijalnog antioksidansa. mAb1 je eksprimirano u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO), i prečišćeno nizom hromatografskih metoda, uključujući afinitetno prečišćavanje protein A hromatografijom i jonoizmenjivačkom hromatografijom. mAb1 je pripremljeno u koncentraciji od 5 mg/ml, u formulaciji 20 mM histidin acetat, 250 mM trehaloza i 0,02% polisorbat 20 u staklenoj bočici, i sa 1mM L-Trp i različitim koncentracijama L-Met, u opsegu od 10 mM do 100 mM, i tokom osam sati izloženo svetlosti od 250 W/m<2>u instrumentu Atlas SunTest CPS+ Xenon Test (Chicago, IL). Kontrolne bočice su umotane u aluminijumsku foliju i tretirane na sličan način. Nakon izlaganja svetlosti, pripremljeni su rastvori za analizu reversno faznom HPLC. Za RP-HPLC, pripremljen je rastvor mAb1 iz stres studije, sa 1,1 mg/ml u 0,1 M tris, 4,4 mM EDTA, i 1,1 mM cisteinu. 150 µl 0,1 mg/ml papaina je dodato u 1,35 ml rastvora mAb1, koji je zatim inkubiran dva sata na 37°C. Nakon inkubacije, 900 µl rastvora je spojeno sa 100 µl 1 M ditiotreitola (DTT), i inkubirano još trideset minuta na 37°C. Uzorci su onda propušteni kroz HPLC sistem Agilent, Inc. 1100/1200 (Santa Clara, CA) sa UV detekcijom na 280 nm, povezan sa difenil kolonom Varian, Inc. Pursuit 3 µm, 2 mm ID x 250 mm (Palo Alto, CA). Mobilna faza A je bila 0,1% TFA u vodi. Mobilna faza B je bila 0,1% TFA u acetonitrilu. Gradijent mobilne faze se linearno povećavao od 34% B u 0 minuta do 43% B u 50,0 minuta, a zatim na 95% B u 50,1 minuta. Gradijent je ostao 95% B do 60,1 minuta, a zatim se linearno smanjivao od 95% B do 34% B između 60,1 i 60,2 minuta. Gradijent je ostao 34% B do kraja ciklusa u 80,2 minuta. Temperatura kolone je bila 65°C, ukupni protok 0,2 ml/min, a injekciona zapremina svakog uzorka je bila 6 µl. Hromatogrami su zatim integrisani radi kvantifikacije oksidacije.

Pored toga nađeno je da je mAb1 stabilno u puferu na bazi L-His na pH 6,0. Analiza efekta izlaganja L-Trp i L-Met svetlosti na oksidaciju Fab mAb1 pokazala je da referentni materijal mAb1 (bez izlaganja svetlosti) i kontrolni uzorak u foliji imaju oko 2% oksidacije Fab (Sl. 1A). Pošto su kontrolni uzorak u foliji i referentni materijal imali isti nivo oksidacije Fab, nije bilo verovatno da samo toplota izaziva oksidaciju Fab. Kada je mAb1 izloženo svetlosti, (uzorak "bez ekscipijensa") oksidacija Fab se udvostručila na 4%. Uz dodavanje 1 mM L-Trp, oksidacija Fab se povećala gotovo do 9%, nagoveštavajući da slobodni L-Trp stvara ROS prilikom izlaganja svetlosti, što može dovesti do oksidacije W53 na Fab. Dalje dodavanje 10, 25, 50, i 100mM L-Met u formulaciju koja sadrži 1 mM L-Trp je izgleda neznatno smanjilo oksidaciju Fab, ali čak i 100 molarni višak L-Met nije smanjio oksidaciju Fab do nivoa kontrolnog uzorka u foliji (Sl.1A).

Pokazalo se da se oksidacija u Fc regionu mAb1 pretežno dešava na Met ostacima Met 254 i Met 430 (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). Analiza efekata izlaganja L-Trp i L-Met svetlosti na oksidaciju Fc mAb1 pokazala je da referentni materijal mAb1 i kontrolni uzorak u foliji imaju oko 8% oksidacije Fc čak i pre izlaganja svetlosti (Sl. 1B). Izlaganje svetlosti je dovelo samo do manjeg povećanja oksidacije Fc ("bez ekscipijensa") kod mAb1 i puferu za formulaciju. Međutim, inkubacija sa 1mM L-Trp dovela je do preko 20% oksidacije na tim mestima Met u Fc regionu, kako je određeno RP-HPLC testom. Dodavanje različitih koncentracija L-Met (10, 25, 50 i 100 mM) u formulacije koje sadrže 1mM L-Trp smanjilo je količinu oksidacije Fc, mada čak ni 100 mM L-Met nije smanjio oksidaciju Fc do nivoa kontrolnih uzoraka (Sl.1B).

Prethodno je objavljeno da L-Trp proizvodi H2O2 preko superoksidnog jona u odnosu manjem od stehiometrijskog, dok antitela pod sličnim uslovima proizvode katalitičke količine (Wentworth et al., Science 293(5536):1806-11 (2001); McCormick et al., Journal of the American Chemical Society 100:312-313 (1978)). Kako bi se ispitala podložnost slobodnog L-Trp pod farmaceutski relevantnim uslovima, kao što su ICH uslovi i uslovi pod ambijentalnim svetlom, formulacije koje sadrže 0,32 mM do 7,5 mM L-Trp (L-Trp je rastvoren u natrijum fosfatnom puferu na pH 7,1) izložene su tokom 3 sata UV svetlu od 250W/m<2>, i oko 150.000 luksa vidljive svetlosti. Uzorci su uzeti i odmah analizirani pomoću Amplex testa, kako bi se detektovala količina H2O2 nastalog pri ovim uslovima. Slobodni L-Trp je nagradio veliku količinu H2O2 prilikom izlaganja svetlosti na način koji zavisi od koncentracije (Sl. 2). Ovo nastajanje H2O2 je znatno smanjeno u prisustvu 50 mM natrijum azida, koji je poznat po tome što gasi singletni kiseonik (Sl.2). Kada je L-Trp inkubiran sa kombinacijom 50 mM NaN3 i 150 U superoksid dismutaze (SOD) ili samo SOD, i dalje su detektovane značajne količine H2O2 u uzorcima koji ne sadrže NaN3. To ukazuje da, pored singletnog kiseonika, superoksidni jon takođe nastaje prilikom svetlosnog ozračivanja, kada se prevodi u H2O2 pomoću SOD.

Dok je fotoosetljivost slobodnog L-Trp pod ICH uslovima osvetljenja potvrđena, proučavan je efekat ambijentalnog svetla tipičnog za laboratorije. Merenja pomoću digitalnog svetlomera DLM1 u različitim laboratorijama pokazala su prosečno 300 luksa na laboratorijskoj površini (sa belim fluorescentnim svetlom), prosečno 3000 luksa u laminarnoj kapeli (sa belim fluorescentnim svetlom), i oko 10.000 luksa na prozoru izloženom suncu jugoistočno. Pod tim uslovima, L-Trp u puferima za formulaciju sa 50 mg/ml mAb1 proizvodio je vodonik peroksid u mikromolarnom opsegu, kako je detektovano pomoću Amplex Ultra Red testa (Sl. 3A). Proizvodnja peroksida se povećala sa osvetljenošću (300, 3000, i 10.000 luksa) i vremenom (1, 3, i 7 dana). Uzorci proteina su dalje analizirani pomoću mAb1 specifične RP-HPLC analize, i pokazali su povećanu oksidaciju teškog lanca Fab koja odgovara oksidaciji kod W53 sa povećanom osvetljenošću (Sl. 3B). Istovremeno se % oksidacije Fc u mAb1 pod tim uslovima povećao od 5 do 40% između 300, odnosno 10.000 luksa. Ti nivoi izloženosti svetlosti i vremena određeni su kao farmaceutski relevantni za lekovitu supstancu kojom se rukuje pod ambijentalnim svetlom i temperaturom pre operacija punjenja/finalizacije, i potencijalno prilikom pregleda bočica sa lekovitim proizvodom. Ti rezultati podržavaju činjenicu da je L-Trp fotoosetljiv, i da proizvodi nekoliko reaktivnih vrsta kiseonika, uključujući singletni kiseonik, superoksid i H2O2, koji mogu štetno delovati na kvalitet proizvoda mAb, pa treba preduzeti mere prilikom rukovanja puferima koji sadrže L-Trp.

Primer 2: Skrining jedinjenja kandidata za antioksidanse.

Triptofan (Trp) je aminokiselina bogata elektronima, koja prolazi kroz oksidativne reakcije i reakcije elektrofilne adicije u prisustvu ROS, kao što su hidroksil radikali i singletni kiseonik. Svaki potencijalni antioksidans koji štiti Trp u proteinima od oksidacije treba da ima sličnu, ako ne i bolju reaktivnost prema tim ROS. Procenjen je niz jedinjenja koja su ili na bazi strukture L-Trp, ili je objavljeno da imaju svojstvo antioksidansa. Jedinjenja ispitana na antioksidativnu sposobnost u ovoj studiji uključuju derivate triptofana, indola, aromatične kiseline, kao što je salicilna kiselina, i neke vitamine. Hemijske strukture upotrebljenih različitih jedinjenja se zasnivaju na (A) derivatima triptofana (B) kinureninu (C) derivatima indola i (D) derivatima aromatičnih kiselina:

(A) Derivati triptofana

(B) Kinurenin

(D) Derivati aromatičnih kiselina

Naziv Z1Z2

Jedinjenja kandidati za antioksidanse dobijena testom ispitivanja fotoosetljivosti.

Mada L-Trp može biti efikasan antioksidans pod nekim uslovima, njegova fotosenzitivnost može ograničiti njegovu korisnost tokom normalne obrade bez posebnih mera predostrožnosti. Zato je ispitivana fotosenzitivnost gorepomenutih molekula, i molekuli su ocenjeni prema svojoj sposobnosti da stvaraju H2O2 vezano za L-Trp. Radi ispitivanja, kandidati za antioksidanse su izloženi svetlosti tokom četiri sata na 250 W/m<2>, i dobijeni H2O2 je kvantifikovan Amplex Ultra Red testom. Konkretno, antioksidansi su napravljeni kao 1 mM u 20 mM histidin acetatnom puferu na pH 5,5. Alikvoti 1 mM rastvora antioksidansa su preneti u staklene bočice (2 ml/staklenoj bočici) i izloženi četiri sata svetlosti na 250 W/m<2>na instrumentu Atlas SunTest CPS+ Xenon Test (Chicago, IL). Ukupna UV doza je bila 90 vat časova/kvadratnom metru, a ukupna vidljiva doza je bila 0,22 miliona luks časova tokom 4-časovnog perioda. Kontrolne bočice su umotane u aluminijumsku foliju i tretirane na sličan način. Količina vodonik peroksida nastala nakon izlaganja svetlosti merena je Amplex® Ultra Red testom (Invitrogen, Carlsbad, CA), prema postupku koji je preporučio proizvođač. Po dodatku peroksidaze rena (HRP), boja je reagovala 1:1 stehiometrijski sa H2O2, dovodeći do proizvodnje fluorescentnog oksidacionog proizvoda rezorufina. U ovoj studiji, očitavanja fluorescencije su dobijena pomoću čitača mikropločica Spectra Max M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), sa ekscitacijom i emisijom podešenom na 560 nm, odnosno 590 nm. Konačne koncentracije H2O2 određene su pomoću standardne krive opsega od 0 µm do 20 µm.

Analiza nastajanja vodonik peroksida (H2O2) koji daju derivati triptofana prilikom izlaganja svetlosti pokazala je da je, pod sličnim uslovima osvetljenosti (koji odgovaraju 0,22 miliona luks časova u 4-časovnom periodu) i pufera (20mM L-His-acetat, pH 5,5), 5-hidroksi-L-triptofan (5-HT) proizveo oko jedne desetine H2O2, dok je kinurenin proizveo oko jedne petine H2O2, u poređenju sa L-Trp (Sl. 4A). Drugi derivati triptofana su proizveli između 30% i 105% H2O2 koji je proizveo L-Trp. U poređenju sa L-Trp, troloks (derivat E vitamina rastvoran u vodi) proizveo je 123 puta više H2O2, a piridoksin (vitamin B6) je proizveo 5 puta više H2O2 (Tabela 1). Indol, sa osnovnom strukturom sličnijoj strukturi L-Trp, ponašao se slično kao L-Trp, ali je indol-3-sirćetna kiselina proizvela dvostruko više H2O2 (Sl. 4B). Hidroksi derivati indola su se ponašali kao 5-HT, proizvodeći zanemarljive količine H2O2 prilikom izlaganja svetlosti. Takođe je ispitano nekoliko biohemijski relevantnih derivata L-Trp, a to su triptamin, serotonin i melatonin. Triptamin je proizveo oko polovine H2O2 u odnosu na L-Trp (Tabela 1). Zanimljivo je da se serotonin (5-hidroksitriptamin) ponašao veoma slično 5-OH derivatima indola i triptofana, proizvodeći veoma malo H2O2 prilikom izlaganja svetlosti, dok je melatonin (N-acetil-5-metoksitriptamin) proizvodio manje od trećine H2O2 u odnosu na L-Trp (Tabela 1).

Tabela 1: Odnos proizvodnje vodonik peroksida od strane ispitivanih jedinjenja u odnosu na L-Trp

Da bi se razumele ROS nastale tokom fotoozračivanja, nekoliko derivata Trp je ispitano pri izlaganju svetlosti kao što je gore opisano, u prisustvu 50 mM NaN3, koji je poznato sredstvo za gašenje singletnog kiseonika. Sve ispitane komponente su pokazale značajno smanjenje količine vodonik peroksida nastalog pod tim uslovima, ukazujući da je singletni kiseonik glavna ROS nastala fotoozračivanjem Trp i njegovih derivata (Sl.5).

Druga aromatična jedinjenja, kao što je salicilna kiselina i njeni derivati, takođe su ispitani prema prijavljenim antioksidativnim osobinama (Baltazar et al., Curr Med Chem 18(21):3252-64 (2011)). Salicilna kiselina je proizvela veoma malo H2O2 prilikom izlaganja svetlosti, dok su se njeni 5-OH derivati ponašali kao L-Trp (Tabela 1). Sa druge strane, antranilna kiselina je proizvela dvostruko više H2O2 u odnosu na L-Trp, ali je 5-OH-antranilna kiselina proizvela upola manje H2O2 u odnosu na L-Trp (Tabela 1).

Jedinjenja kandidati za antioksidanse dobijeni iz testa CV skrininga.

Na osnovu rezultata skrininga fotosenzitivnosti,čini se da jedinjenja sa supstitucijama u aromatičnom prstenu imaju uticaja na količinu nastalog vodonik peroksida. Pošto je cilj poželjno oksidacija ekscipijensa a ne proteinskog leka, ekscipijensi sa malim oksidacionim potencijalom su mogli da posluže kao efikasni antioksidansi. Ispitane su oksidacione/redukcione karakteristike jedinjenja. Neka jedinjenja, uključujući L-Trp i njegove derivate, procenjena su za zaštitu od oksidacije Trp proteina pomoću ciklične voltametrije (CV) i određen im je redosled na osnovu njihovog oksidacionog potencijala (Tabela 2). Konkretno, kandidati za antioksidanse su rastvoreni u dejonizovanoj vodi, a zatim dodati u 0,2 M rastvor elektrolita litijum perhlorata. Rastvori su okarakterisani pomoću polarografa/voltametra EG&G Princeton Applied Research Model 264A sa ugljeničnom elektrodom model 616 RDE Glassy kao radnom elektrodom. Rastvori su ispitani od -0,10 V do 1,50 V pri brzini skeniranja ili 100 ili 500 mV/s. Analitička ćelija je pročišćena četiri minuta azotom pre skeniranja svakog antioksidativnog rastvora. Ulaz je linearno skeniranje potencijala radne elektrode, a izlaz je merenje dobijene struje. Tokom skeniranja potencijala (linearnog povećavanja ili smanjivanja), elektrohemijski aktivne čestice u CV ćeliji su podlegale reakcijama oksidacije i redukcije na površini radne elektrode, dovodeći do struje koja je kontinualno merena. Redoks reakcije su okarakterisane oštrim povećanjem ili smanjenjem struje (pikovi). Potencijal na kome se dešavala reakcija oksidacije se pominje kao potencijal anodnog pika (ili oksidacioni potencijal), a potencijal na kome se dešava redukcija pominje se kao potencijal katodnog pika (ili redukcioni potencijal).

Oksidacioni potencijali ekscipijenasa u ovoj studiji su bili između 0,410 do 1,080 V u odnosu na Ag/AgCl (Tabela 2). Pod tim uslovima, L-Trp je imao potencijal ireverzibilne oksidacije od 0,938 V u odnosu na Ag/AgCl. Nađeno je da devet jedinjenja ima manji oksidacioni potencijal od L-Trp, uključujući sva 5-OH jedinjenja sa oksidacionim potencijalom između 0,535 i 0,600 V u odnosu na Ag/AgCl. Od svih ispitanih jedinjenja, 5-amino-DL-triptofan je imao najmanji oksidacioni potencijal od 0,410 V, dok su N-acetil jedinjenja (0,730-0,880 V), i 5-metoksi-DL-triptofan (0,890 V) takođe ispod L-Trp. Sedam jedinjenja je imalo veći oksidacioni potencijal od L-Trp (Tabela 2). To su indol-3-sirćetna kiselina, 5-fluor-L-triptofan, triptamin, L-triptofanamid, L-kinurenin, 5-nitro-DL-triptofan, i salicilna kiselina. Salicilna kiselina ima najveći oksidacioni potencijal u ovoj studiji (1,080 V u odnosu na Ag/AgCl). Sva ispitana jedinjenja su pokazala nereverzibilni CV, što ukazuje da kada se jednom oksidiše, čestica ne teži da prima elektrone, i možda neće moći da učestvuje u daljim elektrohemijskim reakcijama.

Tabela 2: Oksidacioni potencijali ekscipijenasa

Oksidacioni potencijali (anodni pik) mereni su pomoću ciklične voltametrije sa staklenom ugljeničnom radnom elektrodom u 0,2 M litijum perhloratu.

Određena je korelacija između oksidacionog potencijala i stvaranja H2O2 indukovanog svetlošću za 16 jedinjenja koja su imala oksidacione potencijale iznad i ispod oksidacionog potencijala L-Trp, i proizvodnju H2O2 manju i veću od L-Trp (Sl.6). Pošto su se indol i triptofan ponašali slično u pogledu proizvodnje H2O2 prilikom izlaganja svetlosti, moguće je da supstitucije u C3 položaju 5-članog prstena nisu uticale na ovo svojstvo. Međutim, triptamin sa -CH2CH2NH2 supstitucijom i indol-3-sirćetna kiselina sa -CH2COOH supstitucijom u C3 položaju proizvodili su dva puta manje, odnosno dva puta više H2O2 nego L-Trp. Ti podaci su ukazali da C3 supstitucije imaju važnu ulogu u fotoaktivaciji i stvaranju peroksida. C3 supstitucije nisu uticale na oksidacione potencijale molekula, dok je indol per se imao znatno niži oksidacioni potencijal nego L-Trp pod tim eksperimentalnim uslovima. Supstitucije na C5 6-članog aromatičnog prstena su se ponašale sasvim predvidljivo. Generalno, jedinjenja sa elektron donorskim grupama, kao što je -NH2 i -OH, imala su niže oksidacione potencijale od svojih matičnih jedinjenja, i takođe su proizvodila male količine H2O2 prilikom fotoaktivacije (npr. 5-amino-DL-triptofan, 5-hidroksiindol-3-sirćetna kiselina, 5-hidroksi-L-triptofan, 5-hidroksiindol, serotonin). Slično tome, jedinjenja sa visokim oksidacionim potencijalom su proizvodila više H2O2 (5-metoksi-DL-triptofan, L-Trp, indol-3-sirćetna kiselina, 5-fluor-L-triptofan) pod ovim uslovima. Bilo je odstupanja od ove korelacije; neka jedinjenja su imala visok oksidacioni potencijal, ali nisu proizvodila mnogo H2O2 (npr. salicilna kiselina i L-kinurenin), što ukazuje da potencijalno postoje drugi mehanizmi koji igraju značajnu ulogu kod ovih šestočlanih aromatičnih jedinjenja, koji nisu primećeni kod jedinjenja koja sadrže kostur indola L-Trp. Oblast od interesa je kvadrant koji sadrži jedinjenja sa nižim oksidacionim potencijalom i manjom proizvodnjom H2O2 prilikom izlaganja svetlosti od L-Trp (Sl.6, uokvireno isprekidanim linijama). Jedinjenja sa ovim dvema osobinama se smatraju novim kandidatima za antioksidanse, jer mogu da (1) oksidišu brže od Trp na proteinu i (2) proizvode veoma malo H2O2 tokom dugotrajnog čuvanja i/ili obrade u ambijentalnim uslovima tokom proizvodnje leka, i zato mogu da zaštite protein od dalje oksidacije pod tim uslovima.

Primer 3: Jedinjenja kandidati za antioksidanse smanjila su oksidaciju formulacija monoklonskih antitela.

Jedinjenja koja su, u poređenju sa L-Trp, proizvodila manje H2O2 prilikom izlaganja svetlosti, kao i ona sa manjim oksidacionim potencijalima od L-Trp, odabrana su za procenu mogućih antioksidantskih osobina pomoću AAPH, svetlosti i Fentonove reakcije kao modela oksidativnog stresa (Tabela 3). mAb1 su korišćena kao model protein za određivanje efikasnosti odabranih kandidata za antioksidanse radi zaštite od oksidacije Trp u različitim modelima stresa. Svaki model stresa je proizvodio oksidaciju putem različitih mehanizama, i stoga je svaki bio vredan za procenu biofarmaceutske stabilnosti. AAPH, ili 2,2'-azobis(2-amidinopropan) dihidrohlorid, korišćen je kao model za stres, koji imitira alkil perokside potencijalno nastale od ekscipijenasa formulacije, kao što je degradirani polisorbat. Razlaganjem AAPH nastaju alkil, alkoksil, i alkil peroksil radikali za koje je dokazano da oksidišu aminokiselinske ostatke u proteinima, uključujući ostatke metionina, tirozina, i triptofana (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009); Chao et al., Proc Natl Acad Sci U S A 94(7):2969-74 (1997)). Slično tome, kao model stresa se može koristiti kontrolisana svetlost koja imitira izlaganje ambijentalnoj svetlosti kojoj lekovi mogu biti izloženi tokom obrade i skladištenja. Pokazalo se da se svetlošću indukovana oksidacija biofarmaceutika nastavlja preko mehanizma singletnog kiseonika (<1>O2) i/ili superoksidnog anjona (O2-) (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). Fentonova reakcija se takođe uobičajeno koristi kao model antioksidativnog stresa. Ova smeša H2O2 i Fe jona izaziva oksidaciju mehanizmom hidroksil radikala katalizovanim metalom (Prousek et al., Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338 (2007)), i koristi se za modelovanje ostataka metala sa površina od nerđajućeg čelika koje se koriste u proizvodnji i čuvanju lekova.

Tabela 3: Modeli oksidativnog stresa

Oksidacija triptofana (W53) na mAb1 je prethodno detaljno okarakterisana pomoću RP-HPLC i LC-MS metode (Sreedhara et al., Mol. Pharmaceutics (2013)). Ukratko, mAb1 je digestirano sa papainom, dajući Fab teškog lanca (HC), HC FC i fragmente lakog lanca. Fragmenti su redukovani pomoću DTT, razdvojeni i identifikovani pomoću tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Nađeno je da se oksidisane verzije HC Fab i HC Fc eluiraju pre svojih nativnih parnjaka. Poređenje integrisane površine ispod oksidisanih i nativnih pikova korišćeno je za kvantifikaciju oksidacije HC Fab i Fc. Pored toga, LC-MS/MS peptidne mape (dobijene tripsinskom digestijom i Lys-C digestijom) pokazale su da je oksidacija HC Fab bila prvenstveno na ostatku Trp, W53, dok je oksidacija HC Fc prvenstveno pripisana oksidaciji dva Met ostatka, M254 i M430. Korišćenjem RP-HPLC metode sa digestijom papainom, u predmetnoj studiji je bilo moguće istražiti oksidaciju ostataka Trp kvantifikovanjem oksidacije HC Fab, a Met ostataka kvantifikovanjem oksidacije HC Fc.

% oksidacije Fab i % oksidacije Fc izračunati su na sledeći način (zapazite da svaki molekul antitela ima dva Fab; tako dobijeni % oksidacije Fab ne odražava % oksidisanih netaknutih antitela koja sadrže oksidaciju Fab):

Za studiju mAb1 sa svetlosnim stresom, pripremljeno je mAb1 sa 5 mg/ml u formulaciji 20 mM histidin acetat pH 6,0, 250 mM trehaloza, i 0,02% polisorbat 20. Antioksidansi su dodati u koncentraciji od 1 mM (finalna koncentracija) polazeći od 10 mM stok rastvora dobijenih u 20 mM histidin acetatu pH 6,0, 250 mM trehalozi, i 0,02% polisorbatu 20. Izuzetak je bio L-Met, koji je dodat u finalnoj koncentraciji od 1, 10, 25, 50, i 100 mM, od stok rastvora od 200 mM L-Met u istom puferu (tj.20 mM histidin acetat pH 6,0, 250 mM trehaloza, i 0,02% polisorbat 20). Staklene bočice sa ovim formulacijama su izložene svetlosti od 250 W/m<2>u instrumentu Atlas SunTest CPS+ Xenon Test (Chicago, IL) na ambijentalnoj temperaturi. Kontrolne bočice su umotane u aluminijumsku foliju i tretirane na sličan način. Nakon izlaganja svetlosti, pripremljeni su rastvori za analizu reversno-faznom hromatografijom, kao što je gore opisano.

Za stres studiju mAb1 sa AAPH, pripremljeno je mAb1 sa 4 mg/ml u formulaciji 20 mM histidin acetat pH 6,0, 250 mM trehaloza, i 0,02% polisorbat 20. Antioksidansi su dodati u koncentraciji od 1 mM (finalna koncentracija) polazeći od 10 mM stok rastvora dobijenih u 20 mM histidin acetatu pH 6,0, 250 mM trehalozi, i 0,02% polisorbatu 20. 200 µl 10 mM AAPH dodato je u 2 ml svakog rastvora mAb1, a zatim inkubirano na 40°C tokom 24 sata. Nakon inkubacije, svakom rastvoru je zamenjen pufer formulacionim puferom (20 mM histidin acetat pH 6,0, 250 mM trehaloza, i 0,02% polisorbat 20) pomoću kolone PD-10, tako da je finalna koncentracija mAb1 iznosila 2,3 mg/ml. Nakon zamene pufera, svaki rastvor je pripremljen za analizu reversno faznom HPLC, kao što je gore opisano.

Za studiju mAb1 sa stresom pod uticajem Fentonovog reagensa, pripremljeno je mAb1 sa 3 mg/ml u formulaciji 20 mM histidin hidrohlorid pH 6,0. Antioksidansi su dodati u finalnoj koncentraciji od 1 mM polazeći od 10 mM stok rastvora pripremljenih u 20 mM histidin hidrohloridu. Finalna koncentracija od 0,2 mM FeCl3 i 10 ppm H2O2 dodata je u svaki rastvor mAb1, i inkubirana na 40°C tokom 3 sata. Nakon inkubacije, svaka reakcija je prekinuta dodatkom 100 mM L-Met (pripremljen od stok rastvora od 200 mM L-Met u 20 mM histidin hidrohloridu) i zatim pripremljena za analizu reversno faznom HPLC, kao što je gore opisano.

Određeno je da inkubacija mAb1 sa AAPH tokom 24 sata na 40°C dovodi do 27% oksidacije Fab (Trp ostatak) (Sl. 7A) i 47% oksidacije Fc (Met ostatak) (Sl. 7B). Sedam ekscipijenasa koji su prethodno ispitani pomoću svetlosnog stresa i ciklične voltametrije inkubirani su sa mAb1 pod uslovima sa AAPH, da bi se procenile antioksidativne sposobnosti. Nađeno je da šest od sedam jedinjenja značajno smanjuje oksidaciju Fab koju indukuje AAPH (Sl. 7A). Svih šest jedinjenja ima kostur indola. Štaviše, svi ispitani hidroksi derivati (5-hidroksi-L-Trp, 5-hidroksi-indol, 7-hidroksi-indol, i serotonin) smanjuju oksidaciju Fab gotovo na nivo kontrolnih uzoraka (oko 2%). Pri tome, salicilna kiselina gotovo uopšte nema efekta na oksidaciju Fab pod AAPH stresom. Izgleda da nijedan od ekscipijenasa ne utiče na nivo oksidacije Fc koju indukuje AAPH (Sl.7B).

Kod studije sa svetlosnim stresom, mAb1 je bilo izloženo svetlosti od 250 W/m<2>tokom 16 sati, prilikom ispitivanja sedam prethodno pomenutih ekscipijenasa (Sl. 8). Izlaganje mAb1 svetlosti ("bez ekscipiensa") povećalo je oksidaciju Fab 3,5 puta iznad nivoa kontrolnog uzorka ("mAb1 Ref Mat", Sl.8A). Prethodno je pokazano da L-Trp može da pruži zaštitu od oksidacije Trp, na model proteinu paratiroidnom hormonu (PTH) (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009)). Međutim, u ovoj studiji je nađeno da dodatak 1 mM L-Trp u mAb1 povećava oksidaciju Fab preko 11 puta, verovatno putem proizvodnje ROS, kao što je singletni kiseonik, od strane L-Trp izloženog svetlosti (Sl.2). Dodatak hidroksi jedinjenja (5-hidroksi-L-Trp, 5-hidroksi-indola, 7-hidroksi-indola, i serotonina) pruža zaštitu od oksidacije Fab indukovane svetlošću, smanjujući oksidaciju Fab na vrednost blisku kontrolnim uzorcima (Sl. 8A). Sa druge strane, salicilna kiselina je delovala slično L-triptofanamidu, povećavajući oksidaciju Fab 8 puta u odnosu na kontrolu. Slični rezultati su dobijeni za oksidaciju Fc pod svetlosnim stresom (Sl. 8B). Izlaganje mAb1 svetlosti dovelo je do 40% povećanja oksidacije Fc iznad kontrolnog nivoa, dok je dodatak L-Trp povećao oksidaciju Fc 7 puta u odnosu na kontrolni nivo. U poređenju sa kontrolom (bez ekscipijensa), L-triptofanamid i salicilna kiselina su takođe doveli do veće oksidacije Fc. Hidroksi jedinjenja su dala sličnu oksidaciju Fc kao kontrola bez ekscipijensa, verovatno zato što oni proizvode mnogo manje ROS nego L-Trp prilikom izlaganja svetlosti. Rezultati svetlosnog skrininga i studije sa NaN3 u Primeru 2 pokazali su dobru korelaciju između količine H2O2 koju stvara ekscipijens i oksidacije Fc Met mAb1.

Fentonova reakcija, koristeći smešu H2O2 i Fe jona, proizvodi oksidaciju putem reakcije sa hidroksil radikalima katalizovane metalom (Prousek et al., Pure and Applied Chemistry 79(12):2325-2338 (2007)). Ta reakcija je dala oksidaciju Fab, tj, triptofana, u mAb1. Reakcija je takođe izvedena u prisustvu odabranih antioksidanasa koji su bili korisni protiv oksidacije pod uticajem AAPH i svetlosti, kako je gore objavljeno. Podaci povezani sa osobinama antioksidanasa koje deluju protiv Fentonove reakcije analizirani su pomoću RP HPLC analize, kao što je gore opisano (Sl. 9). Pod ispitivanim uslovima, Fentonova reakcija je dala oko četiri puta veću oksidaciju u Fab regionu mAb1 od kontrole. Većina ispitanih antioksidanasa, osim salicilne kiseline, pokazali su slične osobine gašenja hidroksil radikala prema L-Trp, pružajući zaštitu od oksidacije Fab za oko 25% u odnosu na slučaj bez ekscipijenasa (Sl. 9A). U vezi sa zaštitom od oksidacije Fc, ispitani ekscipijensi (osim salicilne kiseline) delovali su neznatno bolje od L-Trp (Sl.9B).

Supstitucije sa doniranjem elektrona na aromatičnom prstenu mogu da olakšaju nastajanje katjona indolil radikala, i potencijalno bržu reaktivnost sa radikalima. Hidroksilne grupe vezane za aromatične prstenove su donori elektrona, jer atom kiseonika ima usamljen elektronski par koji može biti uključen u rezonantnu strukturu, dovodeći do manjih oksidacionih potencijala i potencijalno veće podložnosti elektrofilnom napadu. Kao što se vidi iz Tabele 2, hidroksilne supstitucije dovode do značajno manjih oksidacionih potencijala, što ukazuje da ta jedinjenja mogu biti bolji antioksidansi nego L-Trp i/ili indol. Hidroksil supstituisani derivati indola i Trp takođe su proizveli najmanju količinu vodonik peroksida prilikom izlaganja svetlosti (Tabela 1).

To je možda posledica male kvantne efikasnosti tih molekula prilikom prenošenja svetlosne energije na molekulski kiseonik, povezane sa velikim konstantama gašenja, kako je pokazano za 5-hidroksi-L-triptofan (Dad et al., J Photochem Photobiol B, 78(3):245-51 (2005)). Kao što je prikazano na Sl. 7 i Sl. 8, hidroksil supstituisani derivati indola i triptofana pružali su značajnu zaštitu od AAPH, svetlosti i Fentonove oksidacije za W53 u Fab regionu mAb1. Međutim, nijedno od ovih jedinjenja nije pružilo značajnu antioksidacionu zaštitu od oksidacije Met u Fc regionu mAb1 prilikom degradacije koju indukuje AAPH. Nasuprot tome, derivati indola i triptofana su se ponašali na očekivani način kod oksidacije posredstvom svetlosti. Molekuli koji su proizveli veće količine peroksida prilikom fotoaktivacije (npr. L-Trp i Trp-amid) takođe su dali veću oksidaciju Met u Fc regionu mAb1, dok su -OH derivati dali manje H2O2, i najmanju količinu oksidacije Met u Fc regionu u uslovima fotooksidacije. Metionin je lako oksidisan u metionin sulfoksid pomoću H2O2 i alkil peroksida, reakcijom nukleofilne supstitucije (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)). Fotooksidacija metionina u metionin sulfoksid dešava se preko singletnog kiseonika, mada se ova reakcija dešava preko različitog intermedijera (Li et al., Biotechnology and Bioengineering 48:490-500 (1995)). AAPH se razlaže pod toplotnim stresom, dajući i alkil perokside i alkoksil radikale sa različitom reaktivnošću prema Met, odnosno Trp (Werber et al., J Pharm Sci 100(8):3307-15 (2011)). Prethodne studije su pokazale da L-Trp može da spreči oksidaciju Trp u PTH indukovanu putem AAPH, i da L-Trp ne sprečava oksidaciju Met u PTH pod istim uslovima (Ji et al., J Pharm Sci 98(12):4485-500 (2009)). Slično tome, L-Met štiti PTH od oksidacije indukovane od strane AAPH, ali ne od Trp oksidacije. Ova zapažanja su u skladu sa reakcionim mehanizmima, pri čemu se oksidacija Met pretežno odigrava preko reakcija nukleofilne supstitucije, dok se oksidacija Trp odigrava pretežno putem mehanizma slobodnih radikala.

Pretpostavljeni mehanizam fotoaktivacije L-Trp koja dovodi do singletnog kiseonika i na kraju do H2O2, i nastajanja i gašenja singletnog kiseonika od strane 5-HT prikazan je na Sl.10.

Claims (14)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Tečna formulacija koja sadrži protein i jedinjenje koje sprečava oksidaciju proteina u tečnoj formulaciji, pri čemu je jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od 5-hidroksi-triptofana, 5-hidroksi-indola, 7-hidroksi-indola, i serotonina, i pri čemu je protein antitelo.

2. Formulacija prema zahtevu 1 koja je vodena.

3. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-2, pri čemu je jedinjenje u formulaciji od 0,3 mM do 5 mM.

4. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu je jedinjenje u formulaciji 1 mM.

5. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu jedinjenje sprečava oksidaciju triptofana i/ili metionina u proteinu.

6. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu jedinjenje sprečava oksidaciju proteina reaktivnim vrstama kiseonika.

7. Formulacija prema zahtevu 6, pri čemu reaktivna vrsta kiseonika je odabrana iz grupe koja se sastoji od singletnog kiseonika, superoksida (O2-), vodonik peroksida, hidroksil radikala i alkil peroksida.

8. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu je protein podložan oksidaciji.

9. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu je triptofan u proteinu podložan oksidaciji.

10. Formulacija prema zahtevu 1, pri čemu je antitelo poliklonsko antitelo, monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, himerno antitelo ili fragment antitela.

11. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-10, pri čemu je koncentracija proteina u formulaciji od 1 mg/ml do 250 mg/ml.

12. Formulacija prema bilo kom od zahteva 1-11, koja dalje sadrži jedan ili više ekscipijenasa odabranih iz grupe koja se sastoji od stabilizatora, pufera, surfaktanta i tonirajućeg agensa.

13. Formulacija prema bilo kom od zahteva 3-12, pri čemu formulacija ima pH od 4,5 do 7,0.

14. Postupak za sprečavanje oksidacije proteina u tečnoj formulaciji koja obuhvata dodavanje količine jedinjenja koje sprečava oksidaciju proteina u tečnu formulaciju, pri čemu je jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od 5-hidroksi-triptofana, 5-hidroksi-indola, 7-hidroksi-indola, i serotonina, i pri čemu je protein antitelo.