RS57928B1 - Antitela koja vezuju humani cd3 - Google Patents

Antitela koja vezuju humani cd3

Info

Publication number
RS57928B1
RS57928B1 RS20181314A RSP20181314A RS57928B1 RS 57928 B1 RS57928 B1 RS 57928B1 RS 20181314 A RS20181314 A RS 20181314A RS P20181314 A RSP20181314 A RS P20181314A RS 57928 B1 RS57928 B1 RS 57928B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
light chain
antibody
amino acid
variable region
binding
Prior art date
Application number
RS20181314A
Other languages
English (en)
Inventor
Alexander Berthold Hendrik Bakker
Loo Pieter Fokko Van
Original Assignee
Merus Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merus Nv filed Critical Merus Nv
Publication of RS57928B1 publication Critical patent/RS57928B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[0001] Pronalazak se odnosi na oblast antitela, posebno na oblast terapeutskih antitela. Antitela mogu biti korišćena u lečenju ljudi. Posebno, pronalazak se odnosi na antitela i poželjno, bispecifična antitela za lečenje tumora.
[0002] Monoklonska antitela koja se vezuju za humani CD3 su bila među prvim antitelima razvijenim za terapijsku primenu kod ljudi. Monoklonska CD3 vezujuća antitela se tipično koriste zbog njihovih imunosupresivnih kvaliteta, na primer u odbacivanju transplantata. Antitela koja su bispecifična za CD3 na T ćelijama i za površinski ciljni antigen na kancerogenim ćelijama, sposobna su za povezivanje bilo koje vrste T ćelije sa ćelijom raka, nezavisno od specifičnosti T-ćelijskog receptora, kostimulacije ili prezentacije peptidnog antigena. Takva bispecifična antitela koja angažuju T-ćelije pokazuju veliko obećanje u lečenju različitih vrsta raka i neoplastičnih izraslina.
[0003] WO2014/051433 opisuje CD3 mAt-a koja su pogodni kandidati da služe kao gradivni blok u generaciji bispecifičnih antitela, a koja deluju kao molekule koje angažuju T-ćelije. Ova CD3 mAt-a su označena 3056 i 3896; VH i VL sekvence ovih mAt-a su prikazane na slici 22. I 3056 i 3896 CD3 mAt-a imaju dobre osobine u pogledu funkcionalne aktivnosti. Ona se vezuju za ćelijsku površinu izraženog CD3/TCR-a na humanim T ćelijskim linijama sa afinitetom (KD) koji je značajno manji od afiniteta dobro poznatog mišjeg anti-CD3 antitela mOKT3, što rezultira nižim srednjim intenzitetom fluorescencije u protočnoj citometrijskoj analizi na CD3<POS>ćelijama. Slično, kada su imobilisana na pločama kulture tkiva, ona indukuju proliferaciju T ćelija u manjoj meri u poređenju sa mOKT3.
[0004] Bez teorijskog ograničenja veruje se da je CD3 afinitet koji je značajno manji od afiniteta mOKT3 poželjan u bispecifičnom obliku T-ćelijskog angažmana. Poželjno je da se bispecifično antitelo vezuje za CD3 sa afinitetom koji je manji od afiniteta vezivanja za tumorski antigen. Bez vezivanja za teoriju veruje se da ova razlika u afinitetu dozvoljava preferencijalnu opsonizaciju tumorskih ćelija pomoću bispecifičnog antitela, otuda ih označava za uništavanje pomoću imuno efektornih ćelija, uključujući NK i/ili T ćelije prisutne u blizini.
[0005] Pronalazači su zapazili da rezultati dobijeni sa antitelom 3056 pokazuju varijaciju od šarže do šarže. Ovo je iznenadilo pronalazače, jer varijabilnost nije bila problem sa antitelom 15C3, koje ima istu VH-sekvencu kao antitelo 3056, ali različiti laki lanac (opisan u WO2005/118635).
[0006] Cilj pronalaska je da obezbedi varijantu antitela 3056 sa suštinski istim svojstvima vezivanja CD3 u vrsti, ne nužno u količini, sa poboljšanim karakteristikama.
SUŠTINA PRONALASKA
[0007] Pronalazak obezbeđuje antitelo koje vezuje humani CD3, antitelo koje sadrži teški lanac i laki lanac, pri čemu pomenuti teški lanac sadrži varijabilni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE WVAAI
WYX1X2R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC TRGTG
YNWFD PWGQG TLVTV SS
sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja drugačijih od položaja koji je naznačen pomoću X1X2; i drugačijih od CDR regiona;
gde
X1= N i X2= A;
X1= N i X2= T;
X1= H i X2= G;
X1= D i X2= G; ili
X1= H i X2= A; i pomenuti laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca O12/IgVK1-39 iz slika 23A sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija.
[0008] Opisan je molekul nukleinske kiseline koji kodira aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE WVAAI
WYX1X2R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC TRGTG
YNWFD PWGQG TLVTV SS
sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih umetanja, delecija, supstitucija, adicija ili njihove kombinacije na jednom ili više položaja drugačijih od položaja označenog pomoću X1X2; pri čemu
X1= N i X2= A;
X1= N i X2= T;
X1= S i X2= G;
X1= H i X2= G;
X1= D i X2= G; ili
X1= H i X2= A.
[0009] Kombinacija X1i X2u antitelo, kako je ovde opisano je poželjno X1= N i X2= A.
[0010] Dalje opisana je ćelija koja eksprimira antitelo i / ili sadrži molekul nukleinske kiseline.
[0011] Antitelo prema pronalasku je, ukoliko specifično nije drugačije specificirano, poželjno bispecifično antitelo. Bispecifično antitelo poželjno, vezuje najmanje humani CD3. Pored toga, bispecifično antitelo poželjno, vezuje najmanje jedan površinski molekul koji je preferencijalno izražen na humanim tumorskim ćelijama. U poželjnoj realizaciji, bispecifično antitelo se vezuje za BCMA, CD19, CD20, CD30, CD33, CD38, CD44, CD123, CD138, CEA, CLEC12A, CS-1, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, DLL3, LGR5, MSLN, FOLRl , FOLR3, HER2, HM1.24, MCSP ili PSMA. U poželjnijoj realizaciji, bispecifično antitelo se vezuje za CLEC12A.
[0012] Dalje je opisan farmaceutski preparat koji sadrži antitelo prema pronalasku.
[0013] Dalje opisano je antitelo prema pronalasku koje dalje sadrži oznaku, poželjno oznaku za in vivo snimanje.
[0014] Takođe je opisan postupak za lečenje subjekta koji ima tumor ili je pod rizikom od nastanka tumora, a koji sadrži primenu bispecifičnog antitela kod subjekta prema pronalasku. Takođe, opisano je bispecifično antitelo prema pronalasku za upotrebu u lečenju subjekta koji ima tumor ili je pod rizikom od tumora. Dalje opisana je upotreba antitela prema pronalasku za pripremu leka za lečenje subjekta koji ima tumor ili je pod rizikom od nastanka tumora. U poželjnom izvođenju, tumor je CLEC12A pozitivni tumor.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
[0015] Antitelo prema pronalasku je poželjno bispecifično antitelo. Bispecifično antitelo vezuje najmanje humani CD3. Pored toga, bispecifično antitelo poželjno, vezuje najmanje jedan površinski molekul koji je eksprimiran na humanim tumorskim ćelijama. U poželjnoj realizaciji bispecifično antitelo se vezuje za BCMA, CD19, CD20, CD30, CD33, CD38, CD44, CD123, CD138, CEA, CLEC12A, CS-1, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, DLL3, LGR5, MSLN, FOLR1, FOLR3, HER2, HM1.24, MCSP ili PSMA. U posebno poželjnoj realizaciji, bispecifično antitelo se vezuje za CLEC12A.
[0016] BCMA se takođe naziva član 17, superfamilije receptora faktora tumorske nekroze (TNFRSF17); TNFRSF13A2; Antigen sazrevanja B ćelija; BCM; Faktor sazrevanja B-ćelija; protein B-ćelijskog sazrevanja; CD269 ili CD269 antigen. Ids: HGNC: 11913; Entrez Gene: 608; Ensembl: ENSG00000048462; OMIM: 109545; UniProtKB: Q02223.
[0017] CD19 se takođe naziva CD19 molekul; T-ćelijski površinski antigen Leu-12; CD 19 Antigen; CVID3; Diferencijacijski antigen CD19; B4; B-limfocitni površinski antigen B4; B-limfocitni antigen CD 19. Ids: HGNC: 1633; Entrez Gene: 930; Ensembl: ENSG00000177455; OMIM: 107265; UniProtKB: P15391.
[0018] CD20 se takođe naziva član 1, Podfamilije A, membransko-obuhvatajući 4-domena, (MS4A1); MS4A2; CD20; S7; Leukocitni površinski antigen Leu-16; B-limfocitni antigen CD20; Bp35; B-limfocitni ćelijski površinski antigen B1; CD20 Antigen; CD20 receptor; CVID5; B-limfocitni površinski antigen B1; B1; Membransko-obuhvatni 4-domena Podfamilije A član 1; LEU- 16. Ids: HGNC: 7315; Entrez Gene: 931; Ensembl: ENSG00000156738; OMIM: 112210; UniProtKB: PI 1836.
[0019] CD30 se takođe naziva član 8, superfamilije receptora faktora tumorske nekroze, (TNFRSF8); Ki-1 antigen; CD30; Ki-1; D1S166E; Citokinski receptor CD30; Limfocitni aktivacijski antigen CD30; član 8 superfamilije receptora faktora nekroze tumora; CD30L receptor; CD30 Antigen. Ids: HGNC: 11923; Entrez Gene: 943; Ensembl: ENSG00000120949; OMIM: 153243; UniProtKB: P28908.
[0020] CD33 se takođe naziva molekula CD33; SIGLEC-3; CD33 antigen (Gp67); Mijeloidni ćelijski površinski antigen CD33; Lektin 3 nalik Ig-u za vezivanje sijalinske kiseline; Siglec-3; SIGLEC3; CD33 antigen i gp67. Ids: HGNC: 1659; Entrez Gene: 945; Ensembl: ENSG00000105383; OMIM: 159590; UniProtKB: P20138.
[0021] CD38 se takođe naziva molekula CD38; T10; CD38 antigen (P45); CADPr Hidrolaza 1; ADP-Ribozil Ciklaza 1; ADP-Ribozil Ciklaza/ciklična ADP-Riboza hidrolaza; NAD (+) nukleozidaza; EC 3.2.2.5; Ciklična ADP-Riboza hidrolaza 1; CD38 Antigen. Ids: HGNC: 1667; Entrez Gene: 952; Ensembl: ENSG00000004468; OMIM: 107270; UniProtKB: P28907.
[0022] CD44 se takođe naziva CD44 molekula (Indijska krvna grupa); IN; MDU2; CD44 antigen (Homing funkcija i sistem indijske krvne grupe); MDU3; CDW44; MIC4; CSPG8; Hondroitin sulfat proteoglikan 8; HCELL; hematopoetske ćelije E- i L-Selektin ligand; MC56; Receptor III ekstracelularnog matriksa; Pgp1; Heparan sulfat proteoglikan; Ćelijski površinski glikoprotein CD44; Hijaluronatni receptor; epican; Fagocitni glikoprotein 1; Homing Funkcija i Indijski sistem krvnih grupa; ECMR-III; CDw44; HUTCH-I; Epican; LHR; PGP-1; CD44 Antigen; PGP-I; CP90 limfocitni homing /adhezioni receptor; Fagocitni glikoprotein I; Hermes antigen. Ids: HGNC: 1681; Entrez Gene: 960; Ensembl: ENSG00000026508; OMIM: 107269; UniProtKB: P16070.
[0023] CD123 se takođe naziva kao ciklus ćelijske deobe 123; Homolog ciklusa ćelijske deobe 123; C10orf7; Homolog proteina 123 ciklusa ćelijske deobe; D123; Protein D123; HT-1080; CCEP123; PZ32; CEP89; Homolog ciklusa ćelijske deobe 123 (S. Cerevisiae); FLJ14640; Hromozom 10 Otvoreni okvir za čitanje 7. Ids: HGNC: 16827; Entrez Gene: 8872; Ensembl: ENSG00000151465; OMIM: 615470; UniProtKB: 075794.
[0024] CD138 se takođe naziva Sindekan 1 (SCD1); CD138; SDC; Heparan sulfat Proteoglikan Fibroblastni receptor faktora rasta; Sindekan Proteoglikan 1; sindekan; SYND1; sindekan-1; CD138 Antigen. Ids: HGNC: 10658; Entrez Gene: 6382; Ensembl: ENSG00000115884; OMIM: 186355; UniProtKB: P18827.
[0025] CEA se takođe naziva Karcinoembrionski ćelijski adhezioni molekul 5 koji se odnosi na antigen (CEACAM5); Meconium Antigen 100; CD66e; Karcinoembrionski Antigen; CD66e Antigen. Ids: HGNC: 1817; Entrez Gene: 1048; Ensembl: ENSG00000105388; OMIM: 114890; UniProtKB: P06731.
[0026] CLEC12A se takođe naziva Član A, C-tipa domena lektina Familije 12; Lektinski protein C-tipa CLL-1; MICL; Lektin 2 povezan sa dendritskim ćelijama; C-tip superfamilije lektina; Mijeloidni inhibitorni receptor poput lektina C-tipa; Molekula 1 C-Tipa poput lektina; CLL-1; DCAL2; CLL1; Molekula 1 C-Tipa poput lektina; DCAL-2; Ćelija ubice nalik lektinu podfamilije receptora L, član 1 (KLRL1); CD371 (Bakker A. i sar. Cancer Res.2004, 64, p8843 50; GenBankTM pristupni br: AY547296; Zhang V. i sar. GenBankTM pristupni br: AF247788; A.S. Marshall, i sar. J Biol Chem 2004, 279, p 14792-802, GenBankTM pristupni br: AY498550; Y.Han i sar., Blood 2004, 104, p285866, H.Floyd, i sar., GenBankTM pristupni br: AY426759, C.H.Chen, i sar. Blood 2006, 107, p145967). Ids: HGNC: 31713; Entrez Gene: 160364; Ensembl: ENSG00000172322; OMIM: 612088; UniProtKB: Q5QGZ9. CLEC12A je antigen koji je eksprimiran na leukemijskim ćelijama blasta i na leukemijskim matičnim ćelijama kod akutne mijeloidne leukemije (AML), uključujući, CD34 negativne ili CD34 nisko eksprimirajuće leukemijske matične ćelije (sporedna populacija) (AB Bakker i sar., Cancer Res 2004, 64, p844350, Van Rhenen i sar., 2007, Blood 110: 2659; Moshaver i sar. 2008, Stem Cells 26: 3059). Ekspresija CLEC12A je inače smatrana da bude ograničena na hematopoetsku liniju, naročito na mijeloidne ćelije u perifernoj krvi i koštanoj srži, tj. granulocitima, monocitima i prekursorima dendritskih ćelija. Još važnije, CLEC12A je odsutan na hematopoetskim matičnim ćelijama. Ovaj ekspresioni profil čini CLEC12A posebno pogodnim ciljem u AML-u. Oblik pune dužine CLEC12A sadrži 275 aminokiselinskih ostataka, uključujući dodatni intracelularni deo od 10 aminokiselina koji je odsutan kod većine drugih izoformi i pokazuje izraziti profil mijeloidne ekspresije (površinska ekspresija i nivo mRNK). Izraz 'CLEC12A ili njegov funkcionalni ekvivalent podrazumeva sve varijante (kao što su spoj i mutacija) koje su gore pomenute i njihove izoforme koje zadržavaju strogi profil mijeloidne ekspresije (kako na površinskom nivou ekspresije, tako i na nivou mRNK), kao što je opisano od strane Bakker i sar. Cancer Res 2004, 64, p8443-50 i Marshall 2004 - J Biol Chem 279 (15), str. 14792-802. CLEC12A vezivno antitelo prema pronalasku vezuje humani CLEC12A. Kada se ovde poziva na CLEC12A, poziva se na humani CLEC12A, osim ukoliko nije drugačije naznačeno.
[0027] CD3 (klaster diferencijacije 3) T-ćelijski ko-receptor je kompleks proteina i sastoji se od četiri različita lanca. Kod sisara, kompleks sadrži CD3γ lanac, CD3δ lanac i dva CD3ε lanca. Ovi lanci se udružuju sa molekulima poznatim kao T-ćelijski receptor (TCR) i ζ-lancem za generisanje aktivacionog signala u T limfocitima. TCRα, TCRβ, ζ-lanac i CD3 molekuli zajedno sadrže TCR kompleks. CD3 je izražen na T ćelijama. Antitelo koje vezuje CD3 može da vezuje CD3γ lanac, CD3δ lanac, CD3ε lanac ili kombinaciju CD3δ/CD3ε ili CD3γ/CD3ε. Antitelo za vezivanje CD3 iz sadašnjeg pronalaska vezuje CD3ε lanac. CD3ε je poznat pod različitim pseudonimima od kojih su neki: "CD3e molekula, Epsilon (CD3-TCR kompleks)"; "CD3e Antigen, Epsilon Polipeptid (TiT3 kompleks)"; T-ćelijski površinski antigen T3/Leu-4 Epsilon lanac; T3E; Antigen receptorski kompleks T-ćelija, podjedinica Epsilon iz T3; CD3e Antigen; CD3-Epsilon 3; IMD18; TCRE. Identifikatori za CD3E gene su HGNC: 1674; Entrez Gene: 916; Ensembl: ENSG00000198851; OMIM: 186830 i UniProtKB: P07766. Pokazano je da su bispecifična CD3 vezujuća antitela koja ciljaju lanac CD3ε efikasna u regrutovanju T ćelija ka abnormalnim ćelijama. Stoga, (bispecifično) antitelo prema sadašnjem pronalasku poželjno, sadrži jednu kombinaciju teškog/lakog lanca koja vezuje CD3ε. CD3 vezujuće antitelo prema pronalasku vezuje humani CD3. Gde se ovde upućuje na CD3, referenca je na humani CD3, osim ukoliko nije drugačije naznačeno.
[0028] CS-1 se takođe naziva kao Citrat sintaza; EC 2.3.3.1; Citrat sintaza, mitohondrijalna; EC 2.3.3. Ids: HGNC: 2422; Entrez Gene: 1431 Ensembl: ENSG00000062485; OMIM: 118950; UniProtKB: O75390.
[0029] EGFR se takođe naziva receptorom epidermalnog faktora rasta; onkogenim homologom (ptičje) Eritroblastične Virusne Leukemije (V-Erb-B); ERBB1; PIG61; Proto-onkogenom C-ErbB-1; Onkogenim homologom ptičje Eritroblastične Virusne Leukemije (V-Erb-B); Receptorom Tirozin-Proteinske Kinaze ErbB-1; Proteinom 40 koji inhibira rast ćelija; Proteinom 61 koji indukuje proliferaciju ćelija; HER1; mENA; EC 2.7.10.1; EC 2.7.10; Receptorom epidermalnog faktora rasta (Onkogeni Homolog ptičje Eritroblastne virusne leukemije (V-Erb-B). Ids: HGNC: 3236; Entrez Gene: 1956; Ensembl: ENSG00000146648; OMIM: 131550; UniProtKB: P00533.
[0030] EGFRvIII je uobičajena varijanta EGFR (Oncogene. 23. Maj 2013; 32 (21): 2670-81. doi: 10.1038/onc.2012.280. Epub 16 Jul 2012).
[0031] Delta nalik 3 (DLL3) se takođe naziva Delta-Like 3); Drosophila Delta Homolog 3; Delta3; Delta (Drosophila)-nalik 3; SCDO1. Identifikatori za DLL3 su: HGNC: 2909; Entrez Gene: 10683; Ensembl: ENSG00000090932; OMIM: 602768 i UniProtKB: Q9NYJ7.
[0032] LGR5 je ponavljanje bogato leucinom koje sadrži G protein-vezani receptor 5. Alternativna imena za gen ili protein su Leucin-bogato ponavljanje koje sadrži G-proteinvezani receptor 5; Leucin-bogato ponavljanje - koje sadrži G-protein-vezani receptor 5; G-Protein kuplovani receptor HG38; G-Protein vezani receptor 49; G-Protein vezani receptor 67; GPR67; GPR49; Orphan G Protein-kuplovani Receptor HG38; G Protein-vezani receptor 49; GPR49; HG38 i FEX. Protein ili antitelo prema pronalasku koje vezuje LGR5, vezuje humani LGR5. LGR5 vezujući protein ili antitelo iz pronalaska može, zbog sekvence i tercijarne strukture sličnosti između čoveka i drugih ortologa sisara, takođe vezati takav ortolog, ali ne i nužno tako. Brojevi pristupnih baza podataka za humani protein LGR5 i gen koji ga kodira su (NC_000012.12; NT_029419.13; NC_018923.2; NP_001264155.1; NP_001264156.1; NP_003658.1).
[0033] MSLN ili mezotelin se takođe naziva Mezotelin; Pre-Pro-Megakariocitni-Potencirajući Faktor; CAK1 Antigen; MPF; Rastvorljivi MPF Mezotelin srodni protein; Faktor potenciranja megakariocita i SMRP. Identifikatori za MSLN su: HGNC: 7371; Entrez Gene: 10232; Ensembl: ENSG00000102854; OMIM: 601051; UniProtKB: Q13421.
[0034] Folatni receptor 1 se takođe naziva FOLR1; Folatni receptor 1 Folatni receptor 1; Antigen Mov18 povezan sa tumorom jajnika; protein za vezivanje folata odraslih; Folatni receptor, Odrasli; KB ćelije FBP; FR-Alfa; FOLR; FBP; Folatni vezujući protein; i Folatni Receptor 1. Identifikatori za FOLR1 su HGNC: 3791; Entrez Gene: 2348; Ensembl: ENSG00000110195; OMIM: 136430; UniProtKB: P 15328
[0035] Folatni receptor 3 se takođe naziva FOLR3; Folatni receptor 3 (Gama); FR-Gama; Folatni receptor 3; Gama-HFR; i FR-G. Identifikatori za FOLR3 su HGNC: 3795; Entrez Gene: 2352; Ensembl: ENSG00000110203; OMIM: 602469; i UniProtKB: P41439.
[0036] EPCAM se takođe naziva molekulom adhezije epitelijalnih ćelija; EGP40; M4S1; ESA; MIC18; KS1/4; Pretvarač 1 kalcijumovog signala povezanog sa tumorom; MK-1; TACSTD1; Humani epitelijalni glikoprotein-2; TROP1; Membranska komponenta, hromozom 4, površinski marker (35kD Glikoprotein); Adenokarcinomski povezani antigen; EGP; Ćelijski površinski glikoprotein Trop-1; Ep-CAM; Epitelijalni glikoprotein 314; GA733-2; Glavni gastrointestinalni protein povezan sa tumorom GA733-2; M1S2; EGP314;
CD326 Antigen; KSA; Epitelijalni ćelijski površinski antigen; DIAR5; Epitelijalni glikoprotein; HNPCC8; hEGP314; Antigen identifikovan monoklonskim antitelom AUA1; KS 1/4 Antigen; EGP-2; ACSTD1. Ids: HGNC: 11529; Entrez Gene: 4072; Ensembl: ENSG00000119888; OMIM: 185535; UniProtKB: P16422.
[0037] HER2 se takođe naziva V-Erb-B2 Virusni Onkogeni Homolog 2 ptičje Eritroblastične Leukemije; ERBB2; CD340; NGL; HER-2; HER-2/neu2; NEU2; TKR1; Onkogeni homolog izveden od neuro/glioblastoma; C-Erb B2/Neu Protein; Protein metastatskog limfnog čvora gena 19; herstatin; Proto-onkogen C-ErbB-2; Onkogeni homolog dobijen od neuro/glioblastoma; Proto-onkogen Neu; Receptor Tirozin-Protein Kinaze ErbB-2; Receptor HER2 na površini ćelija tipa tirozin kinaze; V-Erb-B2 Eritroblastični leukemijski virusni onkogeni homolog 2, Onkogeni homolog dobijen od neuro/glioblastoma; MLN 19; MLN19; p185erbB2; CD340 Antigen; EC 2.7.10.1; EC 2.7.10; V-Erb-B2 ptičji Eritroblastični leukemijski virusni onkogeni homolog 2 (onkogeni homolog dobijen iz neuro/glioblastoma). Ids: HGNC: 3430; Entrez Gene: 2064; Ensembl: ENSG00000141736; OMIM: 164870; UniProtKB: P04626.
[0038] HM1.24 se takođe naziva BST2; Antigen 2 stromalne ćelije koštane srži; TETHERIN; BST-2; Stromalni antigen 2 koštane srži; HM1.24 Antigen; Tetherin; CD317; CD317 Antigen; NPC-A-7. Ids: HGNC: 1119; Entrez Gene: 684; Ensembl: ENSG00000130303; OMIM: 600534; UniProtKB: Q10589.
[0039] MCSP se takođe naziva Spermalni mitohondrijalno-povezani protein bogat cisteinom (SMCP); MCSP; MCS; Selenoprotein mitohondrijalne kapsule; HSMCSGEN1; Spermalni mitohondrijalno-povezani protein bogat cisteinom. Ids: HGNC: 6962; Entrez Gene: 4184; Ensembl: ENSG00000163206; OMIM: 601148; UniProtKB: P49901.
[0040] PSMA se takođe naziva folatna hidrolaza (Membranski antigen specifičan za prostatu) 1; FOLH1; NAALAD1; FOLH; mGCP; Glutamat Karboksipeptidaza II; N-acetilovana-alfavezana kiselinska dipeptidaza I; PSM; NAALADaza I; PSMA; EC 3.4.17.21; Glutamat karboksilaza II; GCP2; Protein gena 27 koji inhibira rast ćelija; NAALAdaza; Folilpoli-gamaglutamat karboksipeptidaza; Glutamat karboksipeptidaza 2; Membranska glutamat karboksipeptidaza; N-acetilovana alfa-vezana kiselinska dipeptidaza 1; Pteroilpoli-gamaglutamat karboksipeptidaza; Varijanta F membranskog antigena specifičnog za prostatu; FGCP; Folatna hidrolaza 1; GCPII; Membranski antigen specifičan za prostatu. Ids: HGNC: 3788; Entrez Gene: 2346; Ensembl: ENSG00000086205; OMIM: 600934; UniProtKB: Q04609.
[0041] PSMA se ne sme mešati sa Proteazom (Prosome, Macropain) podjedinicom, Alfa tipa, 1 koji je takođe poznat pod drugim imenom PSMA1.
[0042] Pristupni brojevi se prvenstveno daju da obezbede dalji postupak identifikacije cilja, aktuelna sekvenca vezanog proteina može varirati, na primer zbog mutacije u kodirajućem genu, poput onih koji se javljaju kod nekih karcinoma ili slično. Mesto vezivanja antigena vezuje antigen i različite njegove varijante, kao što su one koje su eksprimirane od strane nekih antigen pozitivnih imunih ili tumorskih ćelija.
[0043] Kada se ovde upućuje na gen, protein, referenca je poželjno na humani oblik gena ili proteina. Kada se ovde upućuje na gen ili protein, referenca je na prirodni gen ili protein i varijantne oblike gena ili proteina koji se mogu otkriti u tumorima, karcinomima i slično, poželjno, kao što se može otkriti kod humanih tumora, raka i slično.
[0044] Bispecifično antitelo prema pronalasku, poželjno se vezuje za humani BCMA, CD19, CD20, CD30, CD33, CD38, CD44, CD123, CD138, CEA, CLEC12A, CS-1, EGFR, EGFRvIII, EPCAM, DLL3, LGR5, MSLN, FOLR1, FOLR3, HER2, HM1.24, MCSP, PSMA protein ili njegovu varijantu. Nepotrebno je reći da kombinacija teškog/lakog lanca za vezivanje antigena poželjno, vezuje ekstracelularni deo antigena. Bispecifično antitelo prema pronalasku, poželjno se vezuje za humani CLEC12A ili njegovu varijantu. Poželjno, bispecifično antitelo prema pronalasku se vezuje za humani CD3 i humani CLEC12A ili njegovu varijantu.
[0045] HGNC označava Komitet za nomenklaturu HUGO gena. Broj koji sledi skraćenicu je pristupni broj s kojim informacije o genu i proteinu kodiranom od strane gena, mogu biti preuzete iz HGNC baze podataka. Entrez Gene obezbeđuje pristupni broj ili ID gena sa kojim informacije o genu ili proteinu kodiranom od strane gena, mogu biti preuzete iz NCBI baze podataka (Nacionalni centar za biotehnološke Informacije). Ensemble obezbeđuje pristupni broj sa kojim informacije o genu ili proteinu kodiranom od strane gena, mogu biti dobijene iz baze podataka Ensemble. Ensembl je zajednički projekat između EMBL-EBI i Wellcome Trust
1
Sanger Instituta za razvoj softverskog sistema koji proizvodi i održava automatsku napomenu o odabranim eukariotskim genomima.
[0046] Pronalazak obezbeđuje antitelo koje vezuje humani CD3, antitelo koje sadrži teški lanac i laki lanac, gde pomenuti teški lanac sadrži varijabilni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE WVAAI
WYX1X2R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC TRGTG
YNWFD PWGQG TLVTV SS
sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja drugačijih od položaja koji je naznačen pomoću X1X2; i drugačijih od CDR regiona;
gde
X1= N i X2= A;
X1= N i X2= T;
X1= H i X2= G;
X1= D i X2= G; ili
X1= H i X2= A; i pomenuti laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca O12/IgVκ 1-39 iz slike 23A sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija.
Takođe je opisan laki lanac koji obuhvata varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu genskog segmenta O12 / IgVκ1-39*01, kao što je prikazano na slici 23A sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih ubacivanja, delecija, zamena, adicija ili njihove kombinacije. Fraza "O12 laki lanac" biće korišćena u čitavoj specifikaciji kao skraćenica za "laki lanac koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu genskog segmenta O12 / IgVκ1-39*01, kao što je prikazano na slici 23A sa 0- 10, poželjno 0-5 aminokiselinskih ubacivanja, delecija, supstitucija, dodataka ili njihove kombinacije. IgVκ1-39 je skraćenica za imunoglobulinski varijabilni kappa 1-39 gen. Gen je takođe poznat i kao Imunoglobulin Kappa Varijabilni 1-39; IGKV139; IGKV1-39; O12a ili O12. Spoljni Identifikatori za gen su HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371. Poželjna aminokiselinska sekvenca za IgVκ1-39 je data na slici 23A. Ovo navodi sekvencu Vregiona. V-region može biti kombinovan sa jednim od pet J-regiona. Slika 23B i 23C opisuju dve poželjne sekvence za IgVκ1-39 u kombinaciji sa J-regionom. Povezane sekvence su označene kao IGKV1-39/jk1 i IGKV1-39/jk5; alternativna imena su IgVκ1-39*01/IGJκ1* 01 ili IgVκ1-39* 01/IGJκ5*01 (nomenklatura prema bazama podataka IMGT širom sveta na web adresi imgt.org).
Poželjno je da je O12 / IgVκ1-39*01 koji sadrži varijabilni region lakog lanca, sekvenca germinalne linije. Dalje je poželjno da je IGJκ1*01 ili / IGJκ5*01 koji sadrži varijabilni region lakog lanca, sekvenca germinalne linije. U poželjnoj realizaciji, varijabilni regioni lakog lanca IGKV1-39/jk1 ili IGKV1-39/jk5 su sekvence germinalne linije.
U poželjnom izvođenju, varijabilni region lakog lanca sadrži germinalnu liniju O12 / IgVκ1-39*01. U poželjnom izvođenju, varijabilni region lakog lanca sadrži kappa lakog lanca IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ili IgVκ1-39*01/IGJκ5*01. U poželjnom izvođenju IgVκ1-39*01/ IGJκ1*01. Varijabilni region lakog lanca poželjno, sadrži germinalnu liniju kappa lakog lanca IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ili germinalnu liniju kappa lakog lanca IgVκ1-39*01/IGJκ5*01, poželjno germinalnu liniju IgVκ1-39*01/IGJκ1*01.
[0047] Zrele B-ćelije koje proizvode antitelo sa lakim lancem O12 često proizvode laki lanac koji je prošao jednu ili više mutacija u odnosu na sekvencu germinalne linije, tj. normalnu sekvencu u ne-limfoidnim ćelijama organizma. Proces koji je odgovoran za ove mutacije se često naziva somatska (hiper) mutacija. Dobijeni laki lanac se naziva afinitetno zrelim lakim lancem. Takvi laki lanci, kada su izvedeni iz sekvence O12 germinalne linije, su O12-izvedeni laki lanci. U ovoj specifikaciji, fraza "O12 laki lanci" će uključivati O12-izvedene lake lance, mutacije koje su uvedene somatskom hipermutacijom, naravno, mogu se uvesti veštački u laboratoriji. U laboratoriji se takođe mogu uvesti i druge mutacije, bez uticaja na osobine lakog lanca u vrsti, ne nužno u količini. Laki lanac je najmanje jedan laki lanac O12 ako on sadrži sekvencu, kao što je prikazano na slici 23A, slici 23B ili slici 23C sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih umetaka, delecija, zamena, dodavanja ili njihove kombinacije.
U poželjnom izvođenju laki lanac O12 je laki lanac koji sadrži sekvencu, kao što je prikazano na slici 23A, slici 23B ili slici 23C sa 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4 aminokiselinskih ubacivanja, brisanja, zamena, dodavanja ili njihove kombinacije. U poželjnom izvođenju laki lanac O12 je laki lanac koji sadrži sekvencu, kao što je prikazano na slici 23A, slici 23B ili slici 23C sa 0-5, poželjno 0-4, poželjnije 0-3 aminokiselinskih ubacivanja, delecija, zamena, dodavanja ili njihove kombinacije. U poželjnom izvođenju laki lanac O12 je laki lanac koji sadrži sekvencu, kao što je prikazano na slici 23A, slici 23B ili slici 23C sa 0-2, poželjnije 0-1, najpoželjnije 0 aminokiselinskih ubacivanja, delecija, supstitucija, dodataka ili njihovu kombinaciju. U poželjnom izvođenju laki lanac O12 je laki lanac koji sadrži sekvencu, kao što je prikazano na slici 23A ili na slici 23B sa navedenim aminokiselinskim insertima, delecijama, supstitucijama, dodavanjima ili njihovom kombinacijom. U poželjnom izvođenju laki lanac sadrži sekvencu na slici 23B.
[0048] Antitelo je poželjno bispecifično antitelo. Bispecifično antitelo poželjno, ima jednu kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca/varijabilnog regiona lakog lanca (VH / VL) koja vezuje CD3 i drugu VH / VL kombinaciju koja vezuje antigen koji je drugačiji od antigena na CD3. U poželjnom izvođenju antigen je tumorski antigen. U poželjnom izvođenju VL u pomenutoj prvoj VH / VL kombinaciji je sličan VL-u u pomenutoj drugoj VH / VL kombinaciji. U poželjnijem obliku, VL lanci u prvoj i drugoj VH / VL kombinaciji su identični. U poželjnom izvođenju, bispecifično antitelo je antitelo u punoj dužini koje ima jednu kombinaciju teškog/lakog (H / L) lanca koja vezuje CD3 i jednu kombinaciju H / L lanca koja vezuje drugi antigen, poželjno tumorski antigen. U poželjnom izvođenju laki lanac u pomenutoj prvoj kombinaciji lanca H / L je sličan lakom lancu u pomenutoj drugoj kombinaciji H / L lanca. U poželjnijem izvođenju, laki lanci u prvoj i drugoj kombinaciji lanca H / L su identični, tj. sličan ili identičan humani laki lanac je takozvani "zajednički laki lanac", koji je laki lanac koji se može kombinovati sa različitim teškim lancima za formiranje antitela sa funkcionalnim antigen vezujućim domenima. U poželjnom izvođenju, laki lanac u pomenutoj prvoj kombinaciji lanca H / L sadrži varijabilni region lakog lanca koji je sličan varijabilnom regionu lakog lanca u pomenutoj drugoj kombinaciji lanca H / L. U poželjnijem izvođenju, varijabilni regioni lakog lanca u prvoj i drugoj kombinaciji lanca H / L su identični, tj. sličan ili identičan varijabilni region humanog lakog lanca je takozvani "zajednički varijabilni region lakog lanca", koji je varijabilni region lakog lanca koji može da se kombinuje sa različitim varijabilnim regionima teškog lanca za formiranje antitela sa funkcionalnim domenima za vezivanje antigena. Laki lanac koji sadrži zajednički varijabilni region lakog lanca je poželjno zajednički laki lanac. Laki lanac poželjno, sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu segmenta gena O12 / IgVκ1-39*01, kao što je prikazano na slici 23A sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija, kao što je dalje definisano na drugom mestu ovde. Poželjno, zajednički laki lanac ima sekvencu germinalne linije. Poželjna sekvenca germinalne linije je varijabilni region lakog lanca koji se često koristi u humanom repertoaru i ima dobru termodinamička stabilnost, prinos i rastvorljivost. Poželjni laki lanac germinalne linije je O12, kao što je ovde prethodno navedeno. Poželjna sekvenca za O12 / IgVκ1-39 je data na slici 23A. Ova navodi sekvencu V-regiona. Slike 23B i 23C opisuju dve poželjne sekvence za IgVκ1-39 u kombinaciji sa J-
1
regionom. Povezane sekvence su označene kao IGKV1-39 / jk1 i IGKV1-39 / jk5; alternativna imena su IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ili IgVκ 1-39*01/IGJκ5*01.
Poželjno je da je laki varijabilni region O12 / IgVκ1-39*01 sekvenca germinalne linije. Poželjno je da je O12 / IgVκ1-39*01 koji sadrži varijabilni region lakog lanca sekvenca germinalne linije. Dalje je poželjno da je IGJκ1*01 ili / IGJκ5*01 koji sadrži varijabilni region lakog lanca, sekvenca germinalne linije. U poželjnom izvođenju, varijabilni regioni lakog lanca IGKV1-39 / jk1 ili IGKV1-39 / jk5 su sekvence germinalne linije. Laki lanac O12 bispecificnog antitela je poželjno laki lanac O12, kao što je gore ovde navedeno.
[0049] Tumorski antigen je definisan šablonom njegove ekspresije. Tumor specifični antigen, je tipično prisutan samo na ćelijama tumora, a ne na bilo kojoj drugoj ćeliji u postnatalnom, poželjno odraslom ljudskom telu. Antigen povezan sa tumorom je tipično prisutan na ćelijama tumora, a takođe i na nekim normalnim ćelijama u postnatalnom, poželjno odraslom ljudskom telu. Tumorski antigen, kako se ovde koristi, tipično je specifičan za tumor ili antigen povezan sa tumorom. Tumorski antigeni, mogu biti uključeni u onkogenom procesu ili ne. Mogu se razlikovati od "normalnog" proteina kod zdravih osoba ili ne. Treba napomenuti da su različiti antigeni specifični za tumore kasnije pokazali da su izraženi i na nekim drugim ne-tumorogenim ćelijama. Poželjni tumorski antigeni su tumorski-antigeni koji su izraženi na površini ćelije i koji imaju ekstra-ćelijski deo. Antitelo se tipično vezuje za ekstra-ćelijski deo antigena.
[0050] Izraz "antitelo", kao što se ovde koristi, označava proteinski molekul koji pripada imunoglobulinskoj klasi proteina, koji sadrže jedan ili više domena koji se vezuju za epitop na antigenu, gde su takvi domeni izvedeni od ili dele homologiju sekvence sa varijabilnim regionom antitela. Antitela su tipično izrađena od osnovnih strukturnih jedinica - svaka sa dva teška lanca i dva laka lanca. Antitela za terapijsku upotrebu su poželjno, onoliko bliska prirodnim antitelima subjekta koji će biti tretiran koliko je moguće (na primer, humana antitela za humane osobe). Vezivanje antitela, može biti izraženo u smislu specifičnosti i afiniteta. Specifičnost određuje koji antigen ili njegov epitop je specifično vezan od strane domena vezivanja. Afinitet je merilo jačine vezivanja za određeni antigen ili epitop. Vezivanje ili "specifično prepoznavanje" je definisano kao vezivanje sa afinitetima (KD) od najmanje 1x10e-6 M, 1x10e-7 M, 1x10e-8 M, ili najmanje 1x10e-9 M. Antitela za terapijsku primenu, mogu imati afinitete od 1x10e-10 M ili čak više. Antitela iz sadašnjeg pronalaska su tipično, bispecifična antitela i humane IgG podklase. Poželjno, antitela iz sadašnjeg pronalaska su humana IgG1 podklase. Najpoželjnije, antitela iz sadašnjeg pronalaska su molekuli IgG-a pune dužine. Pronalazak takođe, obezbeđuje derivat i / ili analog antitela prema pronalasku. Takav derivat i / ili analog ima VH / VL domene antitela prema pronalasku, poželjno, uključujući zajednički varijabilni region lakog lanca, kako je ovde na drugom mestu definisano. Pogodni derivati su Fv-fragmenti sa pojedinačnim lancem, monotela, VHH i Fab-fragmenti. Derivati mogu biti spojeni sa domenima CH2 i CH3 teškog lanca antitela. Derivat poželjno, dalje sadrži CH1 domen teškog lanca antitela i CLdomen lakog lanca antitela. Derivat takođe može biti u multivalentnom obliku, poželjno u bispecificnom obliku, gde jedan od domena VH / VL antitela sadrži kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca / varijabilnog regiona lakog lanca (VH / VL) koja vezuje CD3 iz pronalaska i najmanje jedan drugi VH / VL domen antitela koji vezuje antigen koji nije CD3 antigen. Najmanje jedan drugi VH / VL domen antitela poželjno, vezuje tumorski antigen, poželjno CLEC12A. Multivalentni oblici se lako proizvode, na primer, proizvodnjom derivata kao fuzionog proteina sa ili bez odgovarajućeg i / ili konvencionalnog peptidnog linkera ili razdvajivača između VH / VL domena.
[0051] "Bispecifično antitelo" je antitelo, kao što je ovde iznad opisano, koje obuhvata jednu kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca / varijabilnog regiona lakog lanca (VH / VL) koja vezuje CD3 i drugu VH / VL kombinaciju koja vezuje antigen koji nije CD3, poželjno tumorski antigen. U poželjnom izvođenju VL u pomenutoj prvoj VH / VL kombinaciji je sličan sa VL-om u pomenutoj drugoj VH / VL kombinaciji. U poželjnijem izvođenju, VL-i u prvim i drugim VH / VL kombinacijama su identični. U poželjnom izvođenju, bispecifično antitelo je antitelo u punoj dužini koje sadrži jednu kombinaciju teškog / lakog lanca koja vezuje CD3 i jednu kombinaciju teškog / lakog lanca koja vezuje drugi antigen, poželjno tumorski antigen. Vezivanje kombinacije teškog / lakog lanca sa antigenom se postiže preko mesta za vezivanje antigena u varijabilnom regionu od kombinacije teškog / lakog lanca.
[0052] Pronalazak takođe obezbeđuje alternativne bispecifične oblike, kao što su oni opisani u Spiess, C, i sar., (Alternativni molekularni oblici i terapeutske primene za bispecifična antitela. Mol. Immunol. (2015) http: //dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003). Oblici bispecifičnih antitela koji nisu klasična antitela sa dve H / L kombinacije, imaju najmanje varijabilni domen koji sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca prema pronalasku. Ovaj varijabilni domen može biti povezan sa Fv-fragmentom sa jednim lancem, monotelom, VHH i Fab-fragmentom koji obezbeđuju drugu aktivnost vezivanja.
Izraz bispecifično antitelo, može biti zamenjen širim pojmom "bispecifični vezivni protein koji sadrži imunoglobulinski varijabilni domen koji vezuje CD3, koji ima varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca prema pronalasku; i antigen vezujući (poli) peptid koji vezuje drugi antigen. U ovom izvođenju vezujući (poli) peptid je poželjno (poli) peptid kako je navedeno od strane Spiess i sar. (supra).
1
U bispecifičnom antitelu prema pronalasku laki lanac u kombinaciji H / L lanca za vezivanje CD3 je poželjno sličan lakom lancu u kombinaciji H / L lanca koji može vezati antigen koji je drugačiji od CD3, poželjno tumorski antigen. U poželjnijem izvođenju, laki lanac u obe kombinacije lanca H / L je identičan, tj. pomenuti humani laki lanac je takozvani "zajednički laki lanac", koji je laki lanac koji se može kombinovati sa različitim teškim lancima za obrazovanje antitela sa funkcionalnim antigen vezujućim domenima. Poželjno, uobičajeni laki lanac ima sekvencu germinalne linije. Poželjna sekvenca germinalne linije je varijabilni region lakog lanca koji se često koristi u humanom repertoaru i ima dobru termodinamičku stabilnost, prinos i rastvorljivost. Poželjni laki lanac germinalne linije je 012, poželjno je
preuređeni germinalne linije humani kappa laki lanac IgVκ1-39*01 / IGJκ1*01 ili fragment ili funkcionalni ekvivalent (tj. isti segment gena IGVκ1-39, ali različiti segment gena IGJκ) (nomenklatura prema bazama podataka IMGT širom sveta na web adresi imgt.org).
Izraz "zajednički laki lanac", kako se ovde koristi, odnosi se na dva laka lanca (ili njegov VL deo) u bispecifičnom antitelu. Dva laka lanca (ili njegov VL deo), mogu biti identična ili imaju neke razlike u aminokiselinskoj sekvenci, dok specifičnost vezivanja antitela u punoj dužini nije pogođena. To je na primer, unutar okvira definicije zajedničkih lakih lanaca kao što je ovde korišćeno, za pripremu ili nalaženje lakih lanaca koji nisu identični, ali ipak funkcionalno ekvivalentnih, npr. uvođenjem i testiranjem konzervativnih aminokiselinskih promena, promena aminokiselina u regionima koji ne ili samo delimično doprinose specifičnosti vezivanja kada su upareni sa teškim lancem i slično. Izrazi "zajednički laki lanac", "zajednički VL", "pojedinačni laki lanac", "pojedinačni VL", sa ili bez dodatka izraza "preuređeni" su ovde svi korišćeni naizmenično.
Poželjno, zajednički laki lanac ima sekvencu germinalne linije. Poželjna sekvenca germinalne linije je varijabilni region lakog lanca koji se često koristi u humanom repertoaru. Poželjni laki lanac germinalne linije je O12, poželjno je preuređeni germinalne linije humani kappa laki lanac IgVκ1-39*01 / IGJκ1*01 ili fragment ili njegov funkcionalni ekvivalent (tj. isti segment gena IGVκ1-39, ali različiti segment gena IGJκ) (nomenklatura prema bazi podataka IMGT širom sveta na web adresi imgt.org ). Izrazi preuređeni germinalne linije humani kappa laki lanac IgVκ1-39*01 / IGJκ1*01, IGKV1-39 / IGKJ1, huVκ1-39 laki lanac ili skraćeno huVκ1-39 su korišćeni naizmenično kroz čitavu prijavu. Očigledno, stručnjaci u tehnici će prepoznati da se "zajednički" odnosi i na funkcionalne ekvivalente lakog lanca čija aminokiselinska sekvenca nije identična. Mnoge varijante pomenutog lakog lanca postoje kada su prisutne mutacije (delecije, zamene, umetci i / ili dodaci) koje ne utiču na stvaranje funkcionalnih regiona za vezivanje. Laki lanac prema sadašnjem pronalasku, može takođe biti laki lanac, kao što je ovde
1
gore specificirano, koji ima 0-5 aminokiselinskih supstitucija. [0053] Antitelo prema pronalasku je poželjno IgG antitelo, poželjno IgG1 antitelo. Izraz "IgG pune dužine" prema pronalasku je definisan kao koji sadrži suštinski kompletan IgG, koji međutim ne mora nužno imati sve funkcije intaktnog IgG-a. Radi izbegavanja sumnje, IgG u punoj dužini sadrži dva teška i dva laka lanca. Svaki lanac sadrži konstantne (C) i varijabilne (V) regione, koji se mogu razvrstati u domene označene CH1, CH2, CH3, VH i CL, VL. IgG antitelo se vezuje za antigen preko domena varijabilnih regiona sadržanih u Fab delu, a nakon vezivanja može da intereaguje sa molekulima i ćelijama imunog sistema preko konstantnih domena, većinom kroz Fc deo. Antitela u punoj dužini prema pronalasku obuhvataju IgG molekule u kojima mogu biti prisutne mutacije koje obezbeđuju željene karakteristike. IgG u punoj dužini ne bi trebao da ima delecije značajnih delova bilo kojih regiona. Međutim, molekuli IgG u kojima su jedan ili više aminokiselinskih ostataka obrisani, bez suštinskog menjanja karakteristika vezivanja rezultujućeg IgG molekula, obuhvaćeni su u okviru izraza "IgG pune dužine". Na primer, takvi molekuli IgG, mogu imati deleciju između 1 i 10 aminokiselinskih ostataka, poželjno u ne-CDR regionima, pri čemu izbrisane aminokiseline nisu esencijalne za vezujuću specifičnost IgG-a.
[0054] IgG antitela pune dužine se koriste zbog njihovog pogodnog polu-života i želje da ostanu što bliže potpuno autolognim (humanim) molekulima zbog imunogenosti. IgG1 je omiljen na osnovu njegovog dugog cirkulatornog polu-života kod čoveka. Da bi se sprečila ili izbegla imunogenost kod ljudi, poželjno je da bispecifično IgG antitelo pune dužine prema pronalasku predstavlja humani IgG1. Izraz "bispecifičan" označava da se jedna kombinacija teškog i lakog lanca (kombinacija H / L) ili deo antitela vezuje za prvi antigen, dok se druga kombinacija H / L ili drugi deo vezuje za drugi antigen, pri čemu pomenuti prvi i drugi antigeni nisu identični. Antigen je tipično molekul koji služi kao meta za antitelo. U sadašnjem pronalasku poželjno je da je antigen protein eksprimiran na membrani ćelije pojedinca. Prema sadašnjem pronalasku, pomenuti prvi i drugi antigeni su na dva različita molekula koji su poželjno locirani na dva različita tipa ćelija. Izraz 'jedan deo [antitela]' poželjno označava kombinaciju teškog lanca / lakog lanca koja sadrži jedan deo Fab-a od IgG antitela pune dužine. Bispecifična antitela koja posreduju citotoksičnost privlačenjem i aktiviranjem endogenih imunih ćelija su nova klasa sledeće generacije terapeutskih antitela. Ovo se može postići kombinovanjem specifičnosti vezivanja antigena za ciljne ćelije (tj. tumorske ćelije) i efektorne ćelije (tj. T ćelije, NK ćelije i makrofage) u jednom molekulu (Cui i sar. JBC 2012 (287) 2820628214; Kontermann, MABS 2012 (4) 182 197; Chames i Baty, MABS 2009 (1) 539547; Moore i sar. Blood 2011 (117) 4542 4551; Loffler i sar., 2000 Blood 95: 2098; Zeidler i sar. 1999 J. Immunol. 163: 1246). Prema pronalasku, obezbeđena su bispecifična antitela, gde jedna kombinacija teškog / lakog
1
lanca vezuje antigen CLEC12A na abnormalnim (tumorskim) ćelijama, dok druga kombinacija teškog / lakog lanca vezuje CD3 na imunskim efektornim ćelijama.
[0055] Pronalazak obezbeđuje bispecifična IgG antitela, gde jedna kombinacija teškog / lakog lanca specifično prepoznaje CLEC12A ili njegov funkcionalni ekvivalent, uključujući i one funkcionalne ekvivalente CLEC12A kojima nedostaju gore pomenuti dodatni intracelularni deo od 10 aminokiselina. Bispecifično IgG antitelo, gde jedna kombinacija teškog / lakog lanca vezuje oblik celokupne dužine CLEC12A je poželjna. Nepotrebno je reći da kombinacija teškog / lakog lanca za vezivanje tumorskog antigena vezuje ekstracelularni deo tumorskog antigena.
[0056] Izrazi 'domen varijabilnog regiona', 'varijabilni region', 'varijabilni domen', 'VH / VL par', 'VH / VL', 'VH', 'VL', 'Fab deo', 'Fab krak', 'Fab' ili 'deo' se ovde koriste naizmenično.
[0057] Vezivanje antigena od strane antitela je tipično posredovano kroz komplementarnost regiona antitela i specifične trodimenzionalne strukture i antigena i varijabilnog domena omogućavajući ovim dvema strukturama da se vezuju zajedno sa preciznošću (interakcija slična bravi i ključu), za razliku od slučajnog, nespecifičnog lepljenja antitela. Kako antitelo tipično prepoznaje epitop antigena, i kao takav epitop može biti prisutan i u drugim proteinima, antitela prema sadašnjem pronalasku koja vezuju CD3 ili CLEC12A, mogu prepoznati i druge proteine, ako takvi drugi proteini sadrže isti epitop. Stoga, izraz "vezivanje" ne isključuje vezivanje antitela za drugi protein ili protein(e) koji sadrže isti epitop. Kombinacija teškog / lakog lanca koja vezuje CD3 u antitelu prema pronalasku se ne vezuje za druge proteine na membrani ćelija u postnatalnom, poželjno odraslom čoveku. Kombinacija teškog / lakog lanca koja vezuje CLEC12A prema pronalaska ne vezuje druge proteine na membrani ćelija u postnatalnom, poželjno odraslom čoveku.
[0058] Bispecifično antitelo prema sadašnjem pronalasku koje vezuje CD3 i tumorski antigen, vezuje se za CD3 (poželjno CD3 na efektornim ćelijama) sa afinitetom vezivanja od najmanje 1x10e-6 M, kao što je detaljnije opisano u nastavku. U poželjnom izvođenju, afinitet za vezivanje CD3 je 1x10e-6 M - 1x10e-10 M, poželjno 1x10e-7 M - 1x10e-9 M.
[0059] Bispecifično antitelo prema predmetnom pronalasku koje vezuje CD3 i tumorski antigen, vezuje se za tumorski antigen poželjno sa afinitetom vezivanja koji je veći od afiniteta sa kojim ono vezuje CD3. U poželjnom izvođenju, afinitet vezivanja tumorskog antigena na tumorskim ćelijama je najmanje 2 puta, poželjnije 4 puta, poželjnije 6 puta ili 10 puta veći od afiniteta vezivanja za CD3. U poželjnoj realizaciji, afinitet vezivanja tumorskog antigena je 1x10e-6 M - 1x10e-10 M, poželjno 1x10e-7 M - 1x10e-10 M, poželjnije najmanje 1x10e-8, poželjno najmanje 1x10e-9. Poželjno u kombinaciji sa afinitetom za CD3 koji je najmanje 2 puta, poželjnije 4 puta, poželjnije 6 puta ili 10 puta niži od naznačenog afiniteta vezivanja za
1
tumorski antigen. U poželjnom izvođenju, afinitet vezivanja tumorskog antigena je 1x10e-8-1x10e-10.
[0060] Izraz 'abnormalne ćelije', kao što se ovde koristi, uključuje tumorske ćelije, specifičnije tumorske ćelije hematološkog porekla, uključujući i pre-leukemijske ćelije, kao što su ćelije koje izazivaju mijelodisplastične sindrome (MDS) i leukemijske ćelije, kao što su tumorske ćelije akutne mijeloidne leukemije (AML) ili ćelije hronične mijelogene leukemije (CML).
[0061] Izraz "imunske efektorne ćelije" ili "efektorne ćelije" kako se ovde koristi odnosi se na ćeliju unutar prirodnog repertoara ćelija u imunskom sistemu sisara koji se može aktivirati da utiče na održivost ciljne ćelije. Imunske efektorne ćelije uključuju, ćelije limfoidne linije kao što su ćelije prirodne ubice (NK), T ćelije, uključujući citotoksične T ćelije, ili B ćelije, ali i ćelije mijeloidne loze se mogu smatrati imunskim efektornim ćelijama, kao što su monociti ili makrofage, dendritske ćelije i neutrofilni granulociti. Stoga, pomenuta efektorna ćelija je poželjno NK ćelija, T ćelija, B ćelija, monocit, makrofag, dendritska ćelija ili neutrofilni granulocit. Prema pronalasku, angažovanje efektornih ćelija do abnormalnih ćelija znači da su imuno efektorne ćelije dovedene u neposrednu blizinu abnormalnih ciljnih ćelija, tako da efektorne ćelije mogu direktno ubiti ili indirektno iniciraju ubijanje abnormalnih ćelija na koje su angažovane. Poželjno je da CD3 vezivno antitelo vezuje CD3 na površini efektornih ćelija.
[0062] Antitelo koje vezuje humani CD3 prema pronalasku, obuhvata varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE WVAAI
WYX1X2R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC TRGTG
YNWFD PWGQG TLVTV SS
sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja drugačijih od položaja koji je naznačen pomoću X1X2; i drugačijih od CDR regiona;
gde
X1= N i X2= A;
X1= N i X2= T;
X1= H i X2= G;
X1= D i X2= G; ili
1
X1= H i X2= A.
[0063] Varijabilni region teškog lanca, može da ima 0-5 aminokiselinskih supstitucija u odnosu na naznačenu aminokiselinsku sekvencu. Aminokiselinske supstitucije u odnosu na naznačenu sekvencu, su naravno samo na položajima različitim od položaja označenih pomoću X1X2i različitim od CDR regiona. Na položajima označenim pomoću X1X2dozvoljene su samo označene aminokiseline. U poželjnom izvođenju, varijabilni region teškog lanca sadrži 0-4, poželjno 0-3, poželjno 0-2, poželjno 0-1 i poželjno 0 aminokiselinskih supstitucija u odnosu na naznačenu aminokiselinsku sekvencu, na položajima drugačijim od položaja koje označava X1X2i drugačijim od CDR regiona. Kombinacija umetanja, dodavanja, brisanja ili zamene je kombinacija ako se poravnate sekvence ne razlikuju više od 10, poželjno ne više od 5 položaja. Praznina u jednoj od poravnanih sekvenci broji za onoliko aminokiselina koliko je preskočeno u drugoj sekvenci.
[0064] Aminokiselinska umetanja, delecije, zamene, dodaci ili njihova kombinacija poželjno nisu u CDR3 regionu varijabilnog regiona teškog lanca, poželjno ne u CDR1 i / ili CDR2 regionu varijabilnog regiona teškog lanca. U poželjnom izvođenju, varijabilni region teškog lanca ne sadrži brisanje, dodavanje ili umetanje u odnosu na naznačenu sekvencu. U ovom izvođenju, varijabilni region teškog lanca, može imati 0-5 aminokiselinskih supstitucija u odnosu na naznačenu aminokiselinsku sekvencu. Aminokiselinska supstitucija je poželjno konzervativna aminokiselinska supstitucija.
[0065] Antitelo koje vezuje humani CD3 prema pronalasku koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE WVAAI
WYX1X2R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC TRGTG
YNWFD PWGQG TLVTV SS
sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja drugačijih od položaja koji je naznačen pomoću X1X2; i drugačijih od CDR regiona;
gde
X1= N i X2= A;
2
X1= N i X2= T;
X1= H i X2= G;
X1= D i X2= G; ili
X1= H i X2= A, je poželjno antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina identifikovanu brojevima 5192; 5193; 5196; 5197; 5351; 5354; 5356; 5603; 5616; 5626; 5630; 5648; 5661; ili 5694, kao što je prikazano na slikama 12, 25 i 28. Varijabilni region teškog lanca poželjno, sadrži aminokiselinsku sekvencu identifikovanu brojevima 5196; 5197; 5603; 5616; 5626; 5630; 5648; 5661; ili 5694, kao što je prikazano na slikama 12 i 25. Varijabilni region teškog lanca antitela poželjno, sadrži aminokiselinsku sekvencu identifikovanu brojem 5196, kao što je prikazano na slikama 12.
[0066] Pronalazak dalje obezbeđuje bispecifično antitelo koje vezuje humani CD3 prema pronalasku koje sadrži teški lanac i laki lanac, gde varijabilni region teškog lanca pomenutog teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE WVAAI
WYX1X2R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC TRGTG
YNWFD PWGQG TLVTV SS
sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja drugačijih od položaja koji je naznačen pomoću X1X2; i drugačijih od CDR regiona;
gde
X1= N i X2= A;
X1= N i X2= T;
X1= H i X2= G;
X1= D i X2= G; ili
X1= H i X2= A.
Laki lanac je zajednički laki lanac, kao što je ovde definisano na drugom mestu. Bispecifično antitelo dalje sadrži kombinaciju teškog lanca i lakog lanca koja vezuje drugi antigen, poželjno tumorski antigen. Laki lanac od kombinacije teškog lanca i lakog lanca koja vezuje drugi antigen je poželjno zajednički laki lanac, kao što je ovde definisano na drugom mestu. Teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE WVAAI
WYX1X2R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC TRGTG
YNWFD PWGQG TLVTV SS
sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja drugačijih od položaja koji je označen pomoću X1X2; i drugačijih od CDR regiona;
gde
X1= N i X2= A;
X1= N i X2= T;
X1= H i X2= G;
X1= D i X2= G; ili
X1= H i X2= A, poželjno je teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu identifikovanu pomoću brojeva 5192; 5193; 5196; 5197; 5351; 5354; 5356; 5603; 5616; 5626; 5630; 5648; 5661; ili 5694, kao što je prikazano na slikama 12, 25 i 28. Varijabilni region teškog lanca bispecifičnog antitela, poželjno, sadrži aminokiselinsku sekvencu identifikovanu pomoću brojeva 5196; 5197; 5603; 5616; 5626; 5630; 5648; 5661; ili 5694, kao što je prikazano na slikama 12 i 25. Varijabilni region teškog lanca bispecifičnog antitela, poželjno, sadrži aminokiselinsku sekvencu identifikovanu brojem 5196, kao što je prikazano na slici 12.
[0067] Bispecifično antitelo prema pronalasku koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVASG FTFSS YGMHW VRQAP GKGLE WVAAI
WYX1X2R KQDYA DSVKG RFTIS RDNSK NTLYL QMNSL RAEDT AVYYC TRGTG
YNWFD PWGQG TLVTV SS
sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja drugačijih od položaja koji je označen pomoću X1X2; i drugačijih od CDR regiona;
gde
X1= N i X2= A;
X1= N i X2= T;
X1= H i X2= G;
X1= D i X2= G; ili
X1= H i X2= A
poželjno, dalje sadrži kombinaciju teškog / lakog lanca koja vezuje humani CLEC12A. U poželjnom izvođenju, teški lanac od kombinacije teškog / lakog lanca koji vezuje humani CLEC12A sadrži varijabilni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGAE VKKPG ASVKV SCKAS GYTFT SYYMH WVRQA PGQGL EWMGI
INPSG GSTSY AQKFQ GRVTM TRDTS TSTVY MELSS LRSED TAVYY CAKGT
TGDWF DYWGQ GTLVT VSS;
EVQLV QSGAE VKKPG ASVKV SCKAS GYTFT SYYMH WVRQA PGQGL EWMGI
INPSG GSTSY AQKFQ GRVTM TRDTS TSTVY MELSS LRSED TAVYY CARGN
YGDEF DYWGQ GTLVT VSS; ili
QVQLV QSGAE VKKPG ASVKV SCKAS GYTFT GYYMH WVRQA PGQGL EWMGW
INPNS GGTNY AQKFQ GRVTM TRDTS ISTAY MELSR LRSDD TAVYY CARDG
YFADA FDYWG QGTLV TVSS;
2
sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih umetanja, delecija, supstitucija, dodataka ili njihove kombinacije.
[0068] Varijabilni region teškog lanca od kombinacije teškog / lakog lanca koji vezuje humani CLEC12A, može imati 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih umetanja, delecija, supstitucija, dodavanja u odnosu na naznačenu aminokiselinsku sekvencu, ili njihovu kombinaciju. U poželjnom izvođenju, varijabilni region teškog lanca sadrži 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4, poželjno 0-3, poželjno 0-2, poželjno 0-1 i poželjno 0 aminokiselinskih umetanja, delecija, zamena, dodavanja u odnosu na naznačenu aminokiselinsku sekvencu, ili njihovu kombinaciju. Kombinacija umetanja, brisanja, dodavanja ili zamene je kombinacija, kao što se zahteva ako se poravnate sekvence ne razlikuju na više od 5 položaja. Praznina u jednoj od poravnanih sekvenci broji za toliko aminokiselina koliko je preskočeno u drugoj sekvenci.
[0069] Umetanje aminokiselina, brisanje, zamena, dodavanje ili njihova kombinacija u varijabilnom regionu CD3 teškog lanca, kao što je ovde opisano, poželjno ostavlja H35, A61, Y102, N103 i W104 i položaje u CDR3 VH nepromenjene. Ako je A50 modifikovan, poželjno je supstituisan sa S, Y, M ili Q. Ako je D59 modifikovan, poželjno je da bude supstituisan sa Y ili E. Međutim zamena D59 sa L, I, V, F, R, A, N, H, S, T je takođe moguća. Ako je A61 supstituisan, poželjno je da bude supstituisan sa N, I, H, Q, L, R, Y, E, S, T, D, K, V. Ako je F105 modifikovan, poželjno je supstituisan sa Y ili M. Za CD3 VH prema pronalasku smatra se da su ostaci H35, Y102, N103 i W104 relevantni za vezivanje CD3. Druge specifične zamene na položajima A50, D59, A61 i F105 su takođe relevantne, ali ne moraju uticati na vezivanje CD3. Tabela 2 navodi supstituciju aminokiselina uvedenu u kolonu 2. One koje su takođe obnovljene su spomenute u koloni 3. Smatra se da supstitucije aminokiselina koje su uvedene, ali nisu oporavljene, utiču na antitelo i nisu poželjne. Na primer, mutacija A50I nije poželjna. Tolerantne supstitucije aminokiselina se lako mogu naći korišćenjem metode opisane u primeru 5A zajedno sa CIEX-HPLC nakon skladištenja.
[0070] Poželjno je da aminokiselinsko umetanje, brisanje, zamena, dodavanje ili njihova kombinacija nije izvršena u vezujućoj interfazi teškog i lakog lanca.
[0071] Ako je aminokiselina promenjena u interfazi interakcije H / L lanca, poželjno je da se odgovarajuće aminokiseline u drugom lancu menjaju da bi se prilagodile promeni. Umetanje ili dodavanje aminokiseline poželjno ne iziskuje umetanje ili dodavanje prolina.
[0072] Dodavanje aminokiseline se u principu može smatrati istim kao umetanje. Dodavanje aminokiseline na jedan od krajeva polipeptidnog lanca se ponekad ne smatra umetanjem, već kao strogo dodavanje (produženje). Za predmetni pronalazak i dodavanje u lancu ili na jedan od krajeva smatra se umetanjem.
[0073] Aminokiselinska umetanja, delecije, supstitucije, dodavanja ili njihova kombinacija poželjno nisu u CDR3 regionu varijabilnog regiona teškog lanca, poželjno ne u CDR1 ili CDR2 regionu varijabilnog regiona teškog lanca. U poželjnom izvođenju, varijabilni region teškog lanca ne sadrži brisanje, dodavanje ili umetanje u odnosu na naznačenu sekvencu. U ovom izvođenju, varijabilni region teškog lanca može imati 0-5 aminokiselinskih supstitucija u odnosu na naznačenu aminokiselinsku sekvencu. Aminokiselinska supstitucija je poželjno konzervativna aminokiselinska supstitucija. CDR1, CDR2 i CDR3 VH za vezivanje CD3 prema pronalasku, poželjno, sadrže respektivno aminokiselinsku sekvencu GFTFSSYG za CDR1 (prema IMGT), IWYNARKQ za CDR2 i GTGYNWFDP za CDR3. CDR1, CDR2 i CDR3 od VH za vezivanje CLEC12A prema pronalasku, poželjno, sadrže respektivno aminokiselinsku sekvencu GYTFTSYY za CDR1, INPSGGST za CDR2 i GTTGDWFDY za CDR3.
[0074] Varijabilni region lakog lanca sadrži poželjno, V-segment varijabilnog regiona 012 germinalne linije. U poželjnom izvođenju, varijabilni region lakog lanca sadrži V-segment kappa lakog lanca IgVκ1-39*01. U posebno poželjnom izvođenju, varijabilni region lakog lanca sadrži kappa lakog lanca IgVκ1-39*01 / IGJκ1*01 ili IgVκ1-39*01 / IGJκ1*05. U najpoželjnijem izvođenju, varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu germinalne linije kappa lakog lanca IgVκ1-39*01 / IGJκ1*01.
[0075] U bispecifičnom antitelu prema pronalasku, poželjno je da je laki lanac isti za obe kombinacije teškog lanca / lakog lanca. Takav laki lanac se takođe naziva kao "zajednički laki lanac". Izraz "zajednički laki lanac" prema pronalasku se odnosi na lake lance koje mogu biti identični ili imaju neke razlike aminokiselinske sekvence, dok zadržavaju vezivnu specifičnost antitela. Na primer, moguće je u okviru definicije zajedničkih lakih lanaca kao što je ovde korišćeno, da se pripreme ili nađu laki lanci koji nisu identični, ali ipak funkcionalno ekvivalentni, npr. uvođenjem i testiranjem konzervativnih aminokiselinskih promena, promena aminokiselina u regionima koji ne doprinose ili samo delimično doprinose specifičnosti vezivanja kada su upareni sa teškim lancem i slično. Izrazi "zajednički laki lanac", "zajednički VL", "pojedinačni laki lanac", "pojedinačni VL", sa ili bez dodavanja izraza "preuređeni" su svi ovde korišćeni naizmenično. Jedan od aspekata sadašnjeg pronalaska je da se kao zajednički laki lanac koristi humani laki lanac koji se može kombinovati sa različitim teškim lancima da bi se formirala antitela sa funkcionalnim domenima za vezivanje antigena (WO2004/009618, WO2009/157771, Merchant i sar., 1998, Nissim i sar. 1994). Poželjno, zajednički laki lanac
2
ima sekvencu germinalne linije. Poželjna sekvenca germinalne linije je varijabilni region lakog lanca koji se često koristi u humanom repertoaru i ima superiornu sposobnost da se upari sa mnogim različitim regionima VH i ima dobru termodinamičku stabilnost, prinos i rastvorljivost. U poželjnom izvođenju, zajednički laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži germinalnu liniju O12 / IgVκ1-39*01. U poželjnom izvođenju, varijabilni region lakog lanca sadrži laki lanac kappa IgVκ1-39*01 / IGJκ1*01 ili IgVκ1-39*01 / IGJκ5*01. U poželjnom izvođenju jedan IgVκ1-39*01 / IGJκ1*01. Varijabilni region lakog lanca, poželjno, sadrži kappa laki lanac IgVκ1-39*01 / IGJκ1*01 germinalne linije ili kappa laki lanac IgVκ1-39*01 / IGJκ5*01 germinalne linije. U poželjnom izvođenju germinalne linije IgVκ1-39*01 / IGJκ1*01. Očigledno, stručnjaci u tehnici će prepoznati da se "zajednički" odnosi i na funkcionalne ekvivalente lakog lanca čija aminokiselinska sekvenca nije identična. Mnoge varijante pomenutog lakog lanca postoje gde su prisutne mutacije (brisanja, supstitucije, dodavanja) koje ne utiču na stvaranje funkcionalnih vezujućih regiona.
U poželjnom izvođenju, varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK ili DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija. U poželjnom izvođenju, varijabilni region lakog lanca sadrži 0-4, poželjno 0-3, poželjno 0-2, poželjno 0-1 i poželjno 0 aminokiselinkih supstitucija u odnosu prema naznačenoj aminokiselinskoj sekvenci. Kombinacija umetanja, brisanja, dodavanja ili zamene je kombinacija koja se zahteva ako se poravnate sekvence ne razlikuju na više od 5 položaja. Praznina u jednoj od poravnanih sekvenci broji za toliko aminokiselina koliko je preskočeno u drugoj sekvenci. U poželjnom izvođenju, varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK ili DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK. U poželjnom izvođenju, varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK. U drugom poželjnom izvođenju varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP
2
GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK.
[0076] Aminokiselinska umetanja, delecije, zamene, dodavanja ili njihova kombinacija poželjno nisu u CDR3 regionu varijabilnog regiona lakog lanca, poželjno nisu u CDR1 ili CDR2 regionu varijabilnog regiona teškog lanca. U poželjnom izvođenju, varijabilni region teškog lanca ne sadrži brisanje, dodavanje ili umetanje u odnosu na naznačenu sekvencu. U ovom izvođenju, varijabilni region teškog lanca, može imati 0-5 aminokiselinskih supstitucija u odnosu na naznačenu aminokiselinsku sekvencu. Zamena aminokiselina je poželjno konzervativna supstitucija aminokiselina. CDR1, CDR2 i CDR3 iz lakog lanca antitela prema pronalasku, poželjno, sadrže respektivno aminokiselinsku sekvencu CDR1 - QSISSY, CDR2 -AAS, CDR3 - QQSYSTP, tj. CDR-ove od IGKV1-39 (prema IMGT).
[0077] Kao što je ovde gore pomenuto, poželjno je da je antitelo iz pronalaska bispecifično antitelo. U poželjnom izvođenju, bispecifično antitelo sadrži kombinaciju teškog / lakog lanca za vezivanje CD3, kao što je ovde prikazano i kombinaciju teškog / lakog lanca koja vezuje tumorski antigen. U poželjnom izvođenju, kombinacija teškog i lakog lanca za vezivanje tumorskog antigena vezuje CLEC12A.
[0078] Konstantni region (bispecifičnog) antitela prema predmetnom pronalasku je poželjno humani konstantni region. Konstantni region, može sadržati jedan ili više, poželjno ne više od 10, poželjno ne više od 5 aminokiselinskih razlika sa konstantnim regionom prirodnog humanog antitela. Različiti varijabilni domeni antitela ovde proizvedeni su izvedeni iz biblioteke varijabilnih domena humanih antitela. Kao takvi, ovi varijabilni domeni su humani. Jedinstveni CDR regioni, mogu biti izvedeni od ljudi, biti sintetički ili izvedeni iz drugog organizma. Antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku je poželjno humano ili humanizovano antitelo.
[0079] U tehnici postoje različite metode za proizvodnju antitela. Antitela su obično proizvodena od strane ćelije koja izražava nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo. Pogodne ćelije za proizvodnju antitela su ćelija hibridoma, ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO), NS0 ćelija ili PER-C6 ćelija. U posebno poželjnom izvođenju, pomenuta ćelija je CHO ćelija.
[0080] Različite institucije i kompanije razvile su ćelijske linije za proizvodnju antitela u velikim razmerama, na primer za kliničku upotrebu. Neograničavajući primeri takvih ćelijskih linija su CHO ćelije, NS0 ćelije ili PER.C6 ćelije. Ove ćelije se takođe koriste u druge svrhe, kao što je proizvodnja proteina. Razvijena ćelijska linija za industrijsku proizvodnju proteina i antitela dalje se ovde nazivaju kao industrijske ćelijske linije. Takođe je opisana industrijska ćelijska linija koja proizvodi i antitelo iz pronalaska.
2
[0081] Takođe je opisana ćelija koja sadrži antitelo prema pronalasku i / ili nukleinsku kiselinu, kao što je ovde opisano. Pomenuta ćelija je poželjno životinjska ćelija, poželjnije ćelija sisara, poželjnije ćelija primata, najpoželjnije humana ćelija. U svrhu pronalaska pogodna ćelija je bilo koja ćelija koja može da sadrži i poželjno proizvede antitelo prema pronalasku i / ili nukleinsku kiselinu, kao što je opisano.
[0082] Takođe je opisana ćelija koja sadrži antitelo prema pronalasku. Poželjno, navedena ćelija (obično in vitro, izolovana ili rekombinantna ćelija) proizvodi navedeno antitelo. U poželjnom izvođenju, pomenuta ćelija je ćelija hibridoma, ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelija NS0 ili ćelija PER.C6. U posebno poželjnom izvođenju, pomenuta ćelija je CHO ćelija. Dalje je obezbeđena ćelijska kultura koja sadrži ćeliju prema pronalasku, kao što je opisano. Različite institucije i kompanije razvile su ćelijske linije za proizvodnju velikih razmera antitela, na primer za kliničku upotrebu. Neograničavajući primeri takvih ćelijskih linija su CHO ćelije, NS0 ćelije ili PER.C6 ćelije. Ove ćelije se takođe koriste u druge svrhe, kao što je proizvodnja proteina. Razvijena ćelijska linija za proizvodnju proteina industrijskih razmera i antitela dalje se ovde nazivaju industrijske ćelijske linije. Stoga, takođe je opisana upotreba ćelijske linije razvijene za proizvodnju velikih razmera antitela, za proizvodnju antitela iz pronalaska. Takođe je opisana ćelija za proizvodnju antitela koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira VH, VL i / ili teški i laki lanac antitela, kao što se zahteva. Poželjno navedeni molekul nukleinske kiseline kodira VH identifikovan brojem 5196 na slici 12, molekul nukleinske kiseline koji kodira VH, kao što je identifikovano brojem 4327 na slici 24 ili njihovu kombinaciju.
[0083] Takođe je opisan postupak za proizvodnju antitela koji obuhvata kultivisanje ćelije, kao što je ovde opisano i sakupljanje navedenog antitela iz navedene kulture. Poželjno, navedena ćelija je kultivisana u medijumu bez seruma. Poželjno je pomenuta ćelija prilagođena rastu suspenzije. Dalje je opisano antitelo koje se dobija metodom za proizvodnju antitela prema pronalasku. Antitelo je poželjno prečišćeno iz medijuma kulture. Poželjno je pomenuto antitelo afinitetno prečišćeno.
[0084] Ćelija, kao što je opisano je na primer, ćelijska linija hibridoma, ćelija CHO, ćelija 293F, ćelija NS0 ili drugi tip ćelija poznat po svojoj pogodnosti za proizvodnju antitela za kliničke svrhe. U posebno poželjnom izvođenju, pomenuta ćelija je humana ćelija. Poželjno ćelija koja se transformiše pomoću regiona adenovirusa E1 ili njegovog funkcionalnog ekvivalenta. Poželjan primer takve ćelijske linije je PER.C6 ćelijska linija ili njen ekvivalent. U posebno poželjnom izvođenju, pomenuta ćelija je CHO ćelija ili njena varijanta. Poželjna je varijanta koja koristi vektorski sistem Glutamin sintetaze (GS) za ekspresiju antitela.
2
[0085] Takođe je opisan postupak za proizvodnju antitela koji obuhvata kultivisanje ćelije, kao što je opisano i sakupljanje navedenog antitela iz navedene kulture. Poželjno, navedena ćelija se kultiviše u medijumu bez seruma. Poželjno je pomenuta ćelija prilagođena rastu suspenzije. Dalje opisano je antitelo koje se dobija metodom za proizvodnju antitela prema pronalasku. Antitelo je poželjno prečišćeno iz medijuma kulture. Poželjno je pomenuto antitelo afinitetno prečišćeno.
[0086] Bispecifična antitela su tipično takođe, proizvedena od strane ćelija koje eksprimiraju nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo. U ovom slučaju ćelija izražava različite lake i teške lance koje čine bispecifično antitelo. U tom cilju ćelija izražava dva različita teška lanca i najmanje jedan laki lanac. Kako se nemodifikovani teški lanci mogu upariti jedni sa drugima kako bi se formirali dimeri, takve ćelije obično proizvode dva monoklonska antitela (homodimeri), pored bispecifičnog antitela (heterodimer). Broj mogućih kombinacija teškog / lakog lanca u proizvedenim antitelima se povećava kada ćelija izražava dva ili više laka lanca. Da bi se smanjio broj različitih vrsta antitela (kombinacija različitih teških i lakih lanaca) poželjan je proizvedeni gore pomenuti "zajednički laki lanac".
[0087] Ćelija za proizvodnju antitela koja izražava zajednički laki lanac i jednake količine dva teška lanca obično proizvodi 50% bispecifičnog antitela i 25% od svakog od monospecifičnih antitela (tj. koja imaju identične kombinacije teškog lakog lanca). Nekoliko metoda je objavljeno da bi favorizovalo proizvodnju bispecifičnog antitela ili obrnuto, monospecifičnih antitela. U sadašnjem pronalasku je poželjno da ćelija favorizuje proizvodnju bispecifičnog antitela više od proizvodnje odgovarajućih monospecifičnih antitela. Takav tip se obično postiže modifikovanjem konstantnog regiona teških lanaca tako da oni favorizuju heterodimerizaciju (tj. dimerizacija sa teškim lancem druge kombinacije teškog / lakog lanca) nad homodimerizacijom. U poželjnom izvođenju, bispecifično antitelo prema pronalasku sadrži dva različita teška lanca imunoglobulina sa kompatibilnim domenima heterodimerizacije. Različiti kompatibilni domeni heterodimerizacije su opisani u tehnici (videti npr. Gunasekaran i sar. JBC 2010 (285) 19637-19646). Kompatibilni domeni heterodimerizacije su poželjno kompatibilni imunoglobulinski CH3 heterodimerizacijski domeni teškog lanca. U tehnici su opisani različiti načini u kojima se može postići takva heterodimerizacija teških lanaca. Jedan od načina je stvaranje bispecifičnih antitela "čvor u rupi". Videti Američku patentnu prijavu 20030078385 (Arathoon i sar. - Genentech).
[0088] U US 9,248,181, US 9,358,286 i PCT/NL2013/050294 (objavljen kao WO2013/ 157954) otkrivene su metode i sredstva za proizvodnju bispecifičnih antitela, korišćenjem kompatibilnih domena heterodimerizacije. Ova sredstva i postupci takođe, mogu biti pogodno
2
korišćeni u sadašnjem pronalasku. Specifično, poželjne mutacije za proizvodnju u suštini samo bispecifičnih IgG molekula pune dužine su aminokiselinske supstitucije L351K i T366K (numerisanje prema Kabatu) u prvom CH3 domenu (teški lanac "KK-varijanta") i aminokiselinske supstitucije L351D i L368E u drugom domenu (teški lanac "DE-varijanta"), ili obrnuto. Prethodno je prikazano u našim US 9,248,181 i US 9,358,286 patentima, kao i WO2013/157954 PCT prijavi da se DE-varijanta i KK-varijanta preferentno uparuju da obrazuju heterodimere (tzv. "DEKK" bispecifične molekule). Homodimizacija DE-varijantnih teških lanaca (DEDE homodimera) ili teških lanaca KK-varijante (homodimeri KKKK) se teško javlja zbog jakog odbijanja između naelektisanih ostataka na CH3-CH3 međupovršini između identičnih teških lanaca. U jednoj realizaciji, kombinacija teškog lanca / lakog lanca koja sadrži varijabilni domen koji vezuje CD3, sadrži KK varijantu teškog lanca. U ovom izvođenju, kombinacija teškog lanca / lakog lanca koja sadrži varijabilni domen koji vezuje antigen koji nije CD3 sadrži DE varijantu teškog lanca. U poželjnom izvođenju, antigen koji nije CD3 je CLEC12A. U poželjnom izvođenju, VH varijabilnog domena koji vezuje CLEC12A je MF4327_VH, kao što je prikazano na slici 24.
[0089] Neka antitela su modifikovana u CH2 / donjem spojnom regionu, na primer za smanjenje interakcije Fc-receptora ili smanjenje vezivanja C1q. U nekim realizacijama, antitelo prema pronalasku je IgG antitelo sa mutiranim CH2 i / ili donjim domenom šarke tako da je interakcija bispecifičnog IgG antitela za Fc-gama receptor smanjena. Takav mutantni CH2 i / ili donji spojni domen, poželjno, sadrži amino supstituciju na položaju 235 i / ili 236 (Kabat numerisanje), poželjno L235G i / ili G236R supstituciju.
[0090] Pronalazak dalje opisuje, postupak lečenja raka ili rizika od karcinoma kod subjekta koji obuhvata primenu bispecifičnog antitela kod subjekta kome je to potrebno, koje vezuje humani CD3, antitelo koje sadrži teški lanac i laki lanac u kojem navedeni teški lanac sadrži varijabilni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVAS GFTFS SYGMH WVRQA PGKGL EWVAA
IWYX1X2RKQDY ADSVK GRFTI SRDNS KNTLY LQMNS LRAED TAVYY CTRGT
GYNWF DPWGQ GTLVT VSS
sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih umetanja, delecija, supstitucija, adicija ili njihove kombinacije na jednom ili više položaja drugačijih od položaja naznačenog pomoću X1X2; gde
X1= N i X2= A;
X1= N i X2= T;
X1= S i X2= G;
X1= H i X2= G;
X1= D i X2= G; ili
X1= H i X2= A; i
kombinacija teškog lanca - lakog lanca (H / L) koja vezuje tumorski antigen.
[0091] Laki lanac poželjno, sadrži zajednički varijabilni region lakog lanca. Pomenuti zajednički varijabilni region lakog lanca poželjno, sadrži varijabilni region lakog lanca O12 / IgVκ 1-39. Pomenuti varijabilni region lakog lanca je poželjno, varijabilni region germinalne linije O12 / IgVκ 1-39*01. Pomenuti varijabilni region lakog lanca poželjno, sadrži kappa laki lanac IgVκ1-39*01 / IGJκ1*01 ili IgVκ1-39*01 / IGJκ5*01. Varijabilni region lakog lanca poželjno, sadrži laki lanac kappa germinalne linije IgVκ1-39*01 / IGJκ1*01 ili IgVκ1-39*01 / IGJκ5*01. Navedeni varijabilni region lakog lanca poželjno, sadrži aminokiselinsku sekvencu. DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK ili DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK sa 0-5 aminokiselinskih umetanja, delecija, zamena, dodavanja ili njihove kombinacije. Poželjno, kombinacija lanca teškog lanca / lakog lanca (H / L) koja vezuje tumorski antigen vezuje CLEC12A.
Antitelo je poželjno humano ili humanizovano antitelo. Poželjno, antitelo sadrži dva različita teška lanca imunoglobulina sa kompatibilnim domenima heterodimerizacije. Navedeni kompatibilni domeni heterodimerizacije su poželjno, kompatibilni domeni heterodimerizacije CH3 teškog lanca imunoglobulina. Navedeno bispecifično antitelo je poželjno, IgG antitelo sa mutiranim CH2 i / ili donjim spojnim domenom, tako da je interakcija bispecifičnog IgG antitela za Fc-gama receptor smanjena. Mutantni CH2 i / ili donji spojni domen poželjno, sadrži amino supstituciju na položaju 235 i / ili 236 (Kabat numerisanje), poželjno, supstituciju L235G i / ili G236R. Antitelo poželjno, sadrži zajednički laki lanac.
1
[0092] Takođe je obezbeđeno bispecifično antitelo koje vezuje humani CD3, antitelo koje sadrži teški lanac i laki lanac u kome navedeni teški lanac sadrži varijabilni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVAS GFTFS SYGMH WVRQA PGKGL EWVAA
IWYX1X2RKQDY ADSVK GRFTI SRDNS KNTLY LQMNS LRAED TAVYY CTRGT
GYNWF DPWGQ GTLVT VSS
sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja drugačijih od položaja koji je označen pomoću X1X2; i drugačijih od CDR regiona;
gde
X1= N i X2= A;
X1= N i X2= T;
X1= H i X2= G;
X1= D i X2= G; ili
X1= H i X2= A; i pomenuti laki lanac sadrži varijabilni region O12 / IgVK1-39 lakog lanca na slici 23 A sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija i teški lanac i laki lanac koji vezuju tumorski antigen.
[0093] Dalje opisano je antitelo prema pronalasku ili njegov derivat ili farmaceutski preparat prema pronalasku, za upotrebu u lečenju subjekta kome je to potrebno. Za lečenje subjekta koji ima ili je pod rizikom od nastanka tumora, poželjno je da je antitelo bispecifično antitelo prema pronalasku. Poželjno, pri čemu CD3 vezujuće antitelo sadrži kombinaciju teškog / lakog lanca koja vezuje tumorski antigen. Bispecifično antitelo je poželjno, antitelo za vezivanje CD3 / CLEC12A.
[0094] Opisana su bispecifična antitela za CD3 / tumorski antigen i farmaceutski preparati koji sadrže takva bispecifična antitela za upotrebu u lečenju čvrstih ili hematoloških tumora. Preferencijalni čvrsti tumori su epitelijalnog porekla; ginekološki rak, kao što su tumori jajnika i endometrijuma; rak prostate, rak mozga ili bilo koji drugi solidni tumor.
[0095] Takođe je opisano CD3 / tumorski antigen bispecifično antitelo iz pronalaska ili njegov derivat ili farmaceutski preparati koji sadrže takvo bispecifično antitelo ili njegov derivat, za
2
upotrebu u lečenju različitih leukemija i pred-leukemijskih oboljenja mijeloidnog porekla, ali i B ćelijskih limfoma. Bolesti koje mogu biti tretirane uključuju, mijeloidne leukemije ili predleukemijske bolesti, kao što su akutna mijeloidna leukemija (AML), mijelodisplastični sindrom (MDS) i hronična mijelogena leukemija (CML) i Hočkinovi limfomi i većina ne-Hočkinovih limfoma. Takođe B-ALL; T-ALL, limfom mantle ćelija su takođe preferencijalni ciljevi za lečenje antitelom prema pronalasku. Stoga, takođe je opisano bispecifično IgG antitelo pune dužine prema pronalasku, za upotrebu kao farmaceutski lek u lečenju mijelodisplastičnog sindroma (MDS), hronične mijelogene leukemije (CML), multiplog mijeloma (MM) ili poželjno akutne mijeloidne leukemije (AML). Takođe je opisana upotreba bispecifičnog IgG antitela prema pronalasku u pripremi leka za lečenje ili prevenciju MDS, CML, MM ili poželjno AML. Preferencijalno je da je tumorski antigen CLEC12A.
[0096] Količina antitela prema pronalasku koja će biti primenjena kod pacijenta je tipično u terapeutskom okviru, što znači da je korišćena dovoljna količina za postizanje terapeutskog efekta, dok količina ne prelazi graničnu vrednost koji dovodi do neprihvatljivog stepena neželjenih efekata. Što je niža količina antitela potrebna za postizanje željenog terapeutskog efekta, obično će biti veći terapeutski okvir. Stoga je preferencijalno antitelo prema pronalasku koje ispoljava terapeutske efekte pri niskim dozama.
[0097] Svake godine dijagnostikuje se oko 30,000 pacijenata sa AML-om u Evropi i Americi. Većina ovih pacijenata ima 60 godina ili više. Starije godište je glavna negativna determinanta ishoda u AML-u i dugotrajno preživljavanje (u 5 godina) intenzivno lečenih starijih pacijenata AML-a je oko 10%. Kod skoro svih pacijenata koji su postigli remisiju nakon induktivne hemioterapije, progresija bolesti je primećena u roku od 3 godine. Tekući post remisioni tretman je pokazao ograničenu, ukoliko postoji, vrednost kod starijih pacijenata sa AML-om. Stoga, ostaje značajno opterećenje rezidualne rezistentne leukemije, a preživela subpopulacija leukemijskih ćelija otpornih na lekove brzo generiše povratak. Potrebne su nove vrste lekova sa potpuno različitim načinima delovanja za ciljanje ovih AML tumorskih ćelija koje ne odgovaraju na hemioterapiju u pokušajima za indukovanje i održavanje potpunih remisija. Iako se kompletna remisija (CR) može postići s brojnim intenzivnim kombinacijama hemioterapije kod više od 50% starijih pacijenata sa AML-om i oko 80% kod mlađih pacijenata, napredovanje odgovara ili preživljavanje je ostalo glavni istraživački izazov. U nedavno objavljenoj mrežnoj meta-analizi 65 randomizovanih kliničkih ispitivanja (15,110 pacijenata) kod starijih pacijenata sa AML-om većina izmenjenih istraživačkih indukcijskih režima ima slične ili još lošije profile efikasnosti u poređenju sa konvencionalnim 3 7 indukcijskim režimom sa daunorubicinom i citarabinom. Ovaj standardni tretman AML-a je povezan sa visokim morbiditetom i čak smrtnošću. Većina pacijenata u CR relapsu usled preostalih leukemijskih matičnih ćelija nakon hemioterapije. Dalji intenzitet doziranja je ograničen zbog neprihvatljive toksičnosti. Zbog toga je hitna potreba za novim modalitetima lečenja, preferencijalno sa manjom toksičnošću, naročito kod starijih pacijenata sa AML-om.
[0098] Tretman AMT-a koji ne reaguje na hemioterapiju se može postići preusmeravanjem T ćelija iz sopstvenog imunološkog sistema pacijenta u AML tumorske ćelije i naknadne tumorski ciljane-specifične aktivacije T ćelija, korišćenjem bispecifičnog antitela. Ovaj proces je poznat i kao takozvani "pristup za angažovanje T-ćelija". Na taj način, imunološki sistem pacijenata je ojačan i retargetovan da napada i eliminiše AML tumorske ćelije. Sadašnji pronalazak obezbeđuje CD3xCLEC12A bispecifična IgG antitela koja efikasno preusmeravaju T ćelije prema tumorskim ćelijama AML-a, čime se indukuje liza tumorskih ćelija AML-a. CD3xCLEC12A bispecifična antitela, stoga su ciljana terapija sa manje neželjenih efekata, koja specifično iskorenjuju AML blaste i leukemijske matične ćelije kako bi poboljšala prognozu pacijenata sa AML-om. Pošto je CLEC12A izražen na leukemijskim matičnim ćelijama (LSC), a ne na normalnim hematopoetskim matičnim ćelijama, očekuje se da terapija usmerena protiv ovog antigena iskoreni LSC, dok štedi normalnu matičnu ćeliju. Ova bispecifična antitela IgG pune dužine su klinički procenjena kod pacijenata sa povratnim i / ili refraktornim AML-om. Klinička efikasnost je analizirana korišćenjem smanjenja blasta AML u koštanoj srži, kao objektivni kriterijum odgovora. Efikasan bispecifični IgG za AML obezbeđuje novu terapeutsku opciju za veliki segment pacijenata za koji trenutno nije dostupan tretman. Pored obezbeđivanja sredstava za postizanje trajnih remisija, ova opcija tretmana takođe ima kurativni potencijal za AML kada se primenjuje tokom remisije. Najverovatnije će imati najveći uticaj na situacije Minimalne rezidualne bolesti (MRD). Očekuje se da će procenat relapsa pasti usled iskorenjivanja MRD-a. Dakle, uticaj ovog novog načina lečenja za AML pacijenta bi bio manje toksičan tretman sa manjim procentom recidiva, a koji rezultira u poboljšanju ishoda povezanih sa boljim kvalitetom života.
[0099] Antitela 15C3 i 3056, opisana u stanju tehnike dele isti varijabilni region teškog lanca, ali se razlikuju u varijabilnom regionu lakog lanca. Varijacije od šarže do šarže u vezivnom potencijalu antitela je primećena u serijama antitela 3056. Ovo nije zabeleženo za antitela 15C3. Kako se antitela razlikuju u lakom lancu, razlog za razliku u ponašanju bi bio različiti laki lanac. SDS-page je otkrila je da je 3056 antitelo bilo nepromenjeno i u serijama sa manje aktivnim antitelima. 3D-modeliranje varijabilnih domena antitela je pokazalo izvesne promene u uvijanju VH / VL domena između dva antitela. Kako ove promene mogu objasniti različito ponašanje antitela, eksperimenti su dizajnirani da učine presavijanje VH / VL domena antitela 3056
4
srodnije 15C3. Nažalost, ovo nije objasnilo razlike između antitela 15C3 i 3056. Izoelektrično fokusiranje (IEF) je otkrilo samo neznatne razlike između 15C3 (3055) i 3056 vezane za glavnu traku pri visokoj iso-električnoj tački antitela. Naknadna analiza korišćenjem CIEX-HPLC, hromatografske tehnike koja omogućava odvajanje naelektrisanih varijanti, pokazala je, u zavisnosti od serije vrlo složeni retencioni spektar sa širokim profilom elucije za antitelo 3056, ovo je u suprotnosti sa profilom koji je primećen za 15C3 (3055). Štaviše, otkriveno je da se model 3056 značajno promenio tokom vremena, ukazujući na to da je 3056 antitelo inherentno nestabilno.
Samo kada su dizajnirane varijante u kojima je lanac 3056_VH promenjen pri jednom ili dva specifična položaja ponašanje je promenjeno. Ponašanje se razlikovalo između nestabilne, bez ikakvih aktivnosti vezivanja do vezivanja bez značajnih varijabilnosti serije do serije.
[0100] Teški lanac 3056 sadrži NG motiv za deamidaciju u svom regionu CDR2, WYNGRKQ, koji bi mogao biti umešan u posmatranoj heterogenosti naboja antitela 3056. U siliko modelovanju 15C3 i 3056 Fab-ovi nisu otkrili značajnu razliku u presavijanju motiva NG deamidacije u regionu HCDR2. Ovo se protivilo protiv umešanosti ovog motiva u posmatranoj nestabilnosti antitela 3056. Međutim, iznenađujuće, promene, kao što je naznačeno u patentnim zahtevima značajno su smanjile posmatranu varijaciju od serije do serije antitela iz pronalaska.
[0101] Pronalazak dalje obetbeđuje, antitelo koje sadrži varijabilni domen koji vezuje CD3 i varijabilni domen koji vezuje CLEC12A, pri čemu varijabilni domen koji vezuje CLEC12A ima VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu identifikovanu brojevima 4327 sa slike 24 sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih umetaka, delecija, zamena, dodataka ili njihove kombinacije i varijabilni domen koji vezuje CD3 ima VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu identifikovanu brojevima 5192, 5193; 5196; 5197; 5351; 5354; 5356; 5603; 5616; 5626; 5630; 5648; 5661; ili 5694 kao što je prikazano na slikama 12, 25 i 28 sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja različitih od položaja 54 i 55 i različitih od CDR regiona. Laki lanac poželjno sadrži varijabilni domen sa aminokiselinom, kao što je prikazano na slici 23, poželjno 23B.
Pronalazak dalje obezbeđuje, antitelo koje sadrži varijabilni domen koji vezuje CD3 i varijabilni domen koji vezuje CLEC12A, pri čemu varijabilni domen koji vezuje CLEC12A ima VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu identifikovanu brojevima 4327 sa slike 24 sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih umetaka, delecija, zamena, dodataka ili njihove kombinacije, a varijabilni domen koji vezuje CD3 ima VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu identifikovanu brojem 5196, kao što je prikazano na slici 12 sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja, drugačijih od položaja 54 i 55 i drugačijih od CDR regiona.
Teški lanac varijabilnog domena koji vezuje CD3, poželjno ima sekvencu aminokiselina identifikovanu brojevima 5196; 5197; 5603; 5616; 5626; 5630; 5648; 5661; ili 5694, kao što je prikazano na slikama 12 i 25 sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja različitih od položaja 54 i 55 i različitih od CDR regiona. Varijabilni domen koji vezuje CD3, poželjno ima sekvencu aminokiselina identifikovanu brojem 5196, kao što je prikazano na slikama 12 sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja različitih od položaja 54 i 55 i različitih od CDR regiona; U poželjnom izvođenju, varijabilni region teškog lanca sadrži 0-4, poželjno 0-3, poželjno 0-2, poželjno 0-1 i poželjno 0 aminokiselinskih supstitucija u odnosu na naznačenu aminokiselinsku sekvencu. Za teški lanac CD3 naznačene supstitucije aminokiselina su na položajima različitim od položaja 54 i 55 i različitim od CDR regiona. Kombinacija umetanja, dodavanja, brisanja ili zamene je kombinacija ako se poravnate sekvence ne razlikuju više od 10, poželjno ne više od 5 položaja. Praznina u jednoj od poravnanih sekvenci broji za onoliko aminokiselina koliko je preskočeno u drugoj sekvenci.
[0102] Pronalazak dalje obezbeđuje, antitelo koje sadrži varijabilni domen koji vezuje CD3 i varijabilni domen koji vezuje CLEC12A, pri čemu varijabilni domen koji vezuje CLEC12A ima VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu identifikovanu brojevima 4327 na slici 24 i varijabilni domen koji vezuje CD3 ima VH koji sadrži aminokiselinsku sekvencu identifikovanu brojevima 5192, 5193; 5196; 5197; 5351; 5354; 5356; 5603; 5616; 5626; 5630; 5648; 5661; ili 5694, kao što je prikazano na slikama 12, 25 i 28. Teški lanac varijabilnog domena koji vezuje CD3, poželjno ima sekvencu aminokiselina identifikovanu brojevima 5196; 5197; 5603; 5616; 5626; 5630; 5648; 5661; ili 5694, kao što je prikazano na slikama 12 i 25. Varijabilni domen koji vezuje CD3, poželjno ima aminokiselinsku sekvencu identifikovanu brojem 5196, kao što je prikazano na slici 12.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0103]
Slika 1. IEF PG3055 i PG3056
Slika 2. CEX-HPLC analiza PG3055 i PG3056
Slika 3. Varijabilnost šarže do šarže i stabilnost PG3055 i PG3056 analizirana pomoću CEX-HPLC analize. Levo šarže 3055 tokom vremena, desno 3056 šarže tokom vremena, sa uzorcima na vrhu skladištenim na -80 ° C, uzorcima na dnu koji se čuvaju na 2-8 ° C za > 3 meseca.
Slika 4. Analiza protočne citometrije za vezivanje PG3055 i PG3056 za CD3 na prečišćenim humanim T ćelijama, nakon inkubacije u medijumu IMDM 10% FBS na 2-8 ° C ili 37 ° C tokom 7 dana. PG3055 i PG3056: inkubirani u medijumu IMDM 10% FBS na 2-8 ° C tokom 7 dana. PG305537 ° C i PG305637 ° C: PG3055 i PG3056 inkubirani u IMDM 10% FBS medijumu na 37 ° C tokom 7 dana.
Slika 5. Levo: Homologni model PG3056 Fab zumiran na varijabilnim domenima, VL u svetlo sivoj, VH u crnoj, HCDR1-3 petlje u svetlo sivoj. Označeni su ostaci Asn54 i Gli55 koji formiraju motiv deamidacije u HCDR2. Desno: Preklapanje homolognih modela PG3055 (svetlo siva) i PG3056 (tamno siva) Fab-ova.
Slika 6. Poravnanje VH MF3056 (od MF3056_VH) nasuprot sekvence VH3-33 germinalne linije.
Slika 7. Poravnanje VH MF3056 nasuprot VH MF3872, MF3873 i MF3905.
Slika 8. Protočna citometrijska analiza za vezivanje za CD3 na HPB-ALL ćelijama od varijanti PG3872, PG3873 i PG3905, PG3056 je uključena kao referentna kontrola.
Slika 9. Poravnanje VH od MF3056 nasuprot VH od MF3874, MF3878, MF3883, MF3886 i MF3891.
Slika 10. Analiza protočne citometrije za vezivanje za CD3 na HPB-ALL ćelijama varijanti PG3874, PG3878, PG3883, PG3886 i PG3891, PG3056 je uključena kao referentna kontrola.
Slika 11. CEX-HPLC analiza PG3891.
Slika 12. Poravnanje VH od MF3056 nasuprot VH od MF5192-5197 VH
Slika 13. Analiza protočne citometrije za vezivanje za CD3 na HPB-ALL ćelijama varijanti PG5192-5197, PG3056 je uključena kao referentna kontrola.
Slika 14. IEF analiza PG5196p06.
Slika 15. CEX-HPLC hromatogram PG5196.
Slika 16. Vezivanje 5196x4327 DM-Fc bsAt-a za membranski eksprimiran CD3 (HPB-ALL) i CLEC12A (HL-60).
Slika 17.5196x4327 DM-Fc bsAt zadržava CLEC12A-specifičnu aktivaciju CD4 i CD8 T ćelija, reflektovanu pomoću ushodne regulacije ranog aktivacionog markera CD69. BsAt i kontrolni IgG su testirani pri 1000 ng / mL. Podaci protočne citometrije za aktivaciju T ćelija su izraženi kao procenat CD69-pozitivnih ćelija unutar CD4 ili CD8+ T-ćelijskih populacija. HD1 i HD2 odražavaju dva različita eksperimenta korišćenjem T ćelija, dobijenih iz različitih zdravih donora.
Slika 18.5196x4327 indukovana liza ciljanih ćelija posredovana antigenom.
Slika 19. Senzorgrami koji pokazuju zavisne i nezavisne odnose CD3δε-Fc (A) i CLEC12A proteina (B) na imobilisanom 5196x4327 DM-Fc bsAt-u. Senzorgrami pokazuju odgovor (količina proteina vezanog za čip, u veštačkim jedinicama) kao funkcija vremena (u sekundama). Oba panela prikazuju senzorgrame dobijene korišćenjem koncentracijskog raspona antigena (u boji) i odgovarajuće krive podešavanja izvršene korišćenjem softvera BIAevaluacije (u crnom).
Slika 20. Primarni uzorak AML pacijenata je fenotipizovan za CLEC12A ekspresiju i frakciju T ćelija i AML blaste pomoću analize protočne citometrije na početku (dan = 0) ko-kulture. Nakon 7 dana ko-kulture sa 5196x4327 DM-Fc bsAt-om ili izotipskom kontrolom, frakcija i ukupan broj T ćelija i AML blasta su kvantifikovani pomoću analize protočne citometrije.
Slika 21. DSC analiza kao što je opisano u primeru 9.
Slika 22. Varijabilna sekvenca teškog lanca (VH) antitela 15C3 opisana u WO2005/ 118635. Patentna publikacija opisuje dve varijante antitela 15C3. Obe varijante imaju isti varijabilni domen teškog lanca, ali je ovaj varijabilni domen teškog lanca kombinovan sa dva različita varijabilna domena lakog lanca. Kada se ovde upućuje na antitelo 15C3, upućuje se na antitelo koje ima varijabilni domen teškog lanca, kao što je prikazano na ovoj slici u kombinaciji sa varijabilnim domenom L2 lakog lanca, kao što je označeno na ovoj slici. Fab proizvod iz 15C3 VH plus L2 laki lanac se ovde dalje naziva MF3055. Antitelo PG3056 ima VH, kao što je ovde prikazano u kombinaciji sa varijabilnim regionom lakog lanca IGKV1-39, kao što je prikazano na ovoj slici. Fab proizvod od 15C3 VH plus IGKV1-39 lakog lanca se dalje naziva MF3056.
Slika 23. Antitelo prema pronalasku poželjno ima zajednički laki lanac. A) Opšti laki lanac poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao sekvenca IGKV1-39 na ovoj slici. B) U poželjnom izvođenju, zajednički laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao IGKV1-39 / jk1 ili IGKV1-39 / jk5. U posebno poželjnom izvođenju, zajednički laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu IGKV1-39 / jkl, kao što je prikazano na ovoj slici.
Slika 24. Aminokiselinska sekvenca VH regiona anti-CLEC12A vezujućeg Fab-a antitela (MF4327) i aminokiselinska sekvenca VH regiona anti-tetanusnog toksoid (TT) vezujućeg Fab-a (MF1337). Zajedno sa aminokiselinskom sekvencom zajedničkog lakog lanca prikazanog na slici 23, ovi VH formiraju varijabilne domene Fab-ova MF4327 i MF1337 koji vezuju CLEC12A i tetanusni toksoid, respektivno.
Slika 25. Primeri varijanti za vezivanje CD3 od MF5196 su MF5603, MF5616, MF5626, MF5630, MF5648, MF5661 i MF5694, koji svi sadrže preuređeni humani IGKV1-39 / IGKJ1 VL region. Označena je aminokiselinska sekvenca VH Fab-ova.
Slika 26. Vezivanje antitela koja sadrže MF5196 VH; MF5603 VH; MF5616 VH;
MF5626 VH; MF5630 VH; MF5648 VH; MF5661 VH i MF5694 VH i zajednički laki Lanac, kao što je prikazano na slici 23B, za membranski izraženi CD3 na HPB-ALL ćelijama, kao što je analizirano protočnom citometrijom.
Slika 27. PG5661 CIEX-HPLC hromatogram.
Slika 28 CD3 vezivni Fab-ovi MF5351, MF5354 i MF5356, sastavljeni od preuređenog humanog IGKV1-39 / IGKJ1 VL regiona imaju odgovarajući VH, kao što je prikazano.
Slika 29 Vezivanje PG oblika za membranski-izraženi CD3 na HPB-ALL ćelijama, svi ovi primeri se vezuju za CD3.
PRIMERI
[0104] Kao što je ovde korišćeno "MFXXXX", gde je X nezavisno broj 0-9, odnosi se na Fab koji sadrži varijabilni domen, gde VH ima aminokiselinsku sekvencu identifikovanu pomoću 4 broja. Osim ako nije drugačije naznačeno, varijabilni region lakog lanca varijabilnog domena tipično ima sekvencu na slici 23, tipično 23B. "MFXXXX VH" se odnosi na aminokiselinsku sekvencu VH identifikovanu pomoću 4 broja. MF dalje sadrži konstantni region lakog lanca i konstantni region teškog lanca koji normalno stupa u interakciju sa konstantnim regionom lakog lanca. PG se odnosi na monospecifično antitelo koje sadrži identične teške i lake lance. PB se odnosi na bispecifično antitelo sa dva različita teška lanca. Varijabilni region teških lanaca se razlikuje i tipično takođe, region CH3, pri čemu jedan od teških lanaca ima KK mutaciju njegovog CH3 domena, a drugi ima DE-mutaciju koja dopunjuje njegov CH3 domen (videti za referencu PCT/NL2013/050294 (objavljen kao WO2013/157954).
Primer 1: Heterogenost naelektrisanja 3055 i 3056 mAt-a
[0105] Izo-električno fokusiranje (IEF) je korišćeno za određivanje pI i heterogenosti naelektrisanja PG3056, celokupnog IgG1 monoklonskog antitela koje sadrži MF3056 VH uparen sa zajedničkim lakim lancem IGVK1-39 / JK1 i PG3055, celokupne dužine IgG1 monoklonskog antitela koje sadrži isti VH uparen sa lakim lancem 15C3 VL2 - IGKV1-13. Za ovu svrhu FocusGel sa pI opsegom 6-11 (Webscientific, kat# 1006-03) je propuštan na GE Healthcare Multiphor II elektroforeznoj jedinici opremljenoj sa rashladnom pločom koja je ohlađena na 10 ° C.10 μg netretiranog uzorka je napunjeno u otvor za uzorak pored markera visokog pI opsega (GE Healthcare, kat# 17047301V). Program elektroforeze se sastojao od tri faze; inicijalno fokusiranje tokom 10 minuta na 500 V, praćeno 90 minuta na 1,500 V i na kraju faza fokusiranja na 2,000 V tokom 10 minuta. Shodno tome, gel je bio fiksiran i obojen korišćenjem koloidne boje Coomassie (Pierce, kat# 24590).
4
IEF analiza PG3056 i PG3055 je rezultirala gelom prikazanim na slici 1. Za PG3055 glavna traka je primećena na visokom pI (~ 9) sa satelitskom trakom uz nešto veću pI vrednost. PG3056 je pokazao sličan IEF obrazac, međutim kod finih viših pI vrednosti i sa malo većim difuznim glavnim opsegom.
[0106] Oba IgG-a su analizirana korišćenjem katjonske izmenjivačke hromatografije HPLC (CEX-HPLC) za analizu njihovog heterogenog naelektrisanja, korišćenjem ortogonalne metode. CEX-HPLC je izveden pri temperaturi okoline na Dionex HPLC sistemu opremljenim sa kolonom SP STAT 7 μm i UV / Vis detektorom. Injektovano je 10 μg uzorka; gradijent od 25 mM fosfatnog pufera pH 6,0 sa povećanjem koncentracije NaCl je korišćen za razdvajanje varijanti naelektrisanja antitela. Podaci su analizirani korišćenjem Chromeleon softvera.
[0107] CEX-HPLC hromatogrami PG3055 i PG3056 su prikazani na slici 2. PG3055 pokazuje glavni pik na 18,8 minuta, okružen malim pikovima koji predstavljaju kisele i bazne izoforme IgG-a. Iznenađujuće, hromatogram PG3056 sadrži višestruke pikove tokom velikog vremenskog intervala; dva široka glavna pika su vidljiva na 18,4 i 20,4 minuta. Hromatogrami pokazuju značajno povećanu heterogenost naboja IGVK1-39 / JK1 zajedničkog lakog lanca anti-CD3 antitela (PG3056) kada se porede sa IgG-om sa 15C3 VL2 - IGKV1- 13 lakim lancem (PG3055).
[0108] CEX-HPLC je takođe korišćena za procenu serijske varijabilnosti i stabilnosti anti-CD3 antitela. Oba antitela su analizirana nakon što su bila skladištena na 2-8 ° C više od 3 meseca i nakon dugotrajnog skladištenja na -80 ° C. Preklapanje uzoraka PG3055 (Slika 3, levo) pokazuje da je između uzoraka primećena mala razlika; relativne površine pikova manjih pikova pri 17,1 minuta i 19,8 minuta se blago menjaju prilikom skladištenja na 2-8 ° C u dužem vremenskom periodu. Razlike koje su posmatrane između uzoraka PG3056 (Slika 3 desno) su mnogo značajnije. Pik na 20,4 minuta se značajno smanjuje pri skladištenju na 2-8 ° C, dok se pik na 18,4 minuta povećava do opsega koji postaje glavni pik uzorka. Ostali pikovi koji se rano eluiraju koji predstavljaju druge kiselinske izoforme IgG pokazuju i relativno povećanje površine pika, npr. pik na 16,4 minuta. Posmatrane promene u CEX-HPLC hromatogramima nakon dugotrajnog skladištenja na 2-8 ° C, ukazuju na to da anti-CD3 antitelo koje sadrži zajednički laki lanac IGVK1-39 / JK1 nije stabilno dok se skladišti pod ovim uslovima, dok antitelo PG3055 koje sadrži 15C3 VL2-IGKV1- 13 laki lanac je mnogo stabilnije.
Primer 2: Uticaj varijacije šarže do šarže antitela PG3056 na vezivanje antigena
[0109] Da bi se procenila stabilnost anti-CD3 antitela u prisustvu seruma, antitela PG3055 i PG3056 su razblažena do 10 μg / mL u IMDM-u (Invitrogen, Kat # 21980-065) dopunjavanog 10% FBS-om (PAA, Kat # A15-101 ), a zatim inkubirana na 37 ° C tokom sedam dana. U ovoj analizi je uključen izotipski kontrolni IgG (PG1207). Nakon sedam dana vezivanje IgG-a za CD3 je procenjeno analizom protočne citometrije na dobijenim od zdravih donora, MACS prečišćenim T ćelijama. Za upoređivanje PG3055 i PG30566 koji su čuvani u istom medijumu tokom sedam dana na 2-8 ° C, uključeni su u analizu protočne citometrije. CD3 vezivanje od svih antitela je testirano u koncentracijama 10, 1, 0,1 i 0,01 μg / mL, razblaženih u IMDM 10% FBS-u. Vezana antitela su vizualizovana sa kozjim-anti-humanim Fc antitelom (Southern Biotech, 2043-02), prema proceduri FACS, kao što je ranije opisano u WO2014/051433 sa odstupanjem da je izvršeno bojenje IMDM 10% FBS. Podaci pokazuju (Slika 4) da su PG3055 i PG3056 pokazali slično vezivanje za T ćelije kada su inkubirani na 2-8 ° C u prisustvu seruma. Dok na vezivanje PG3055 nije uticala sedmodnevna inkubacija na 37 ° C u IMDM 10% FBS-u (PG3055 vs PG305537 ° C), vezivanje PG3056 za CD3 na T ćelijama je značajno smanjeno (PG3056 vs PG305637 ° C).
[0110] U zaključku PG3056, anti-CD3 antitelo koje sadrži IGVK1-39/ JK1 zajednički laki lanac, pokazuje jako redukovano vezivanje za CD3 nakon serumske inkubacije na 37 ° C tokom 7 dana. Suprotno, antitelo PG3055 je zadržalo kompletno vezivanje za CD3, pod istim uslovima.
Primer 3: Koja je razlika između PG3055 i PG3056 antitela?
[0111] Antitela PG3055 i PG3056 imaju identične sekvence, ali za varijabilni region lakog lanca. Izgleda da zajednički laki lanac ne funkcioniše dobro u kontekstu drugih aminokiselinskih sekvenci antitela, a posebno sa varijabilnim regionom teškog lanca sa kojim je u bliskom kontaktu. Najočigledniji način da se pokuša i ispravi nedostatak antitela 3056 bi bio da se vidi da li se zajednički laki lanac može na bilo koji način izmeniti, kako bi se učinio sličniji lakom lancu u antitelu 3055. Pored toga, laki lanac antitela PG3056 nije izabran da bude deo antigen vezujućeg mesta koji vezuje molekul CD3. Za tu svrhu izabran je varijabilni region teškog lanca. Ovo je još jedan razlog da vidimo da li se zajednički laki lanac može učiniti sličnijim lakom lancu u roditeljskom antitelu PG3055.
[0112] Da bi se saznalo gde su se razlikovali varijabilni regioni PG3055 i PG3056 kao rezultat različitog lakog lanca, njihovi regioni Fab su modelirani. Homologni model Fab regiona PG3056 i PG3055 je izgrađen korišćenjem MODELLER-a (Sali i sar., 1993: J. Mol.
Biol. 234, 779-815). Od generisanog ansambla struktura odabrana je struktura modela sa optimalnim skorom energije. Optimizacija bočnih lanaca i algoritmi za minimiziranje energije su korišćeni za zamenu templejta bočnih lanaca, gde su se oni razlikovali od ciljane sekvence. Modeli sličnosti 3055 i 3056 Fab-ova su vizuelno pregledani korišćenjem Yasara (http://www.yasara.org). Preklapanje modela za PG3055 i PG3056 (Slika 5, desna slika) pokazuje da razlike u sekvencama u lakom lancu izazivaju samo nekoliko strukturnih promena; orijentacija nekih delova lakog lanca u odnosu na teški lanac je promenjena do izvesnog stepena između dva IgG-a. Promenjeni delovi mogu suštinski biti manje stabilni i biti glavni uzrok za posmatrane razlike u stabilnosti. Alternativno, izmenjeni delovi mogu biti manje ili više podložni različitim procesima koji izazivaju heterogenost. Razni procesi, poznati i nepoznati, mogu biti uzrok posmatranih karakteristika za antitelo PG3056. Enzimske i ne-enzimske modifikacije uključuju, formiranje disulfidnih veza, glikozilaciju, N-terminalnu glutaminsku ciklizaciju, C-terminalnu lizinsku obradu, deamidaciju, oksidaciju, glikaciju i cepanje peptidne veze su među procesima koji mogu izazvati heterogenost (Liu i sar., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 97, 2426- 2447 (2008)). U zavisnosti od vrste modifikacije, heterogenost monoklonskih antitela, može biti uvedena intracelularnim procesima, ekstracelularnim procesima koji se, na primer, odvijaju u serumu, ascitesu i / ili medijumu ćelijske kulture. Heterogenost se takođe, može uvesti inkubacijom sa puferima tokom procesa prečišćavanja, skladištenja, pod različitim stresnim uslovima, kao što je povišena temperatura ili izlaganje intenzivnoj svetlosti.
[0113] Modeliranje nije odredilo određenu aminokiselinu ili region da fokusira postizanje mutacije varijabilnog regiona kod PG3056. Uočene razlike između homolognih modela PG3055 i PG3056 su bile manje.
[0114] U sadašnjem pronalasku je utvrđeno da nema potrebe za promenom aminokiselinske sekvence lakog lanca antitela PG3056. Adaptacija teškog lanca, može da proizvede antitelo sa dobrim vezivnim svojstvima, dobrom stabilnošću i dobrom uniformnošću, čak i kada je teški lanac prisutan u varijabilnom regionu sa zajedničkim lakim lancem. Kao što će ovde biti detaljnije prikazano u nastavku, iznenadjujuće je otkriveno da su specifične promene u CDR2 regionu teškog lanca tolerisane u odnosu na vezivanje i obezbeđuju antitelo sa željenom stabilnošću i uniformnošću.
[0115] Promene rezultiraju promenom motiva NG deaminacije u CDR2 regionu teškog lanca. Region HCDR2 oba PG3055 i PG3056 sadrži ostatke Asn54 i Gli55. Ostaci su površinski izloženi u oba antitela, kao što je prikazano na slici 5. Strukturni položaj i izlaganje na površini su veoma slični u oba molekula, sa nešto drugačijom orijentacijom za bočni lanac asparagina.
4
S obzirom na to da je motiv površinski izložen u oba antitela i na taj način lako dostupan za okolinu i da izgleda da nema značajne razlike u presavijanju HCDR2 NG motiva u PG3055 nasuprot P3056, smatraće se malo verovatno da bi poboljšana deamidacija Asn54 u PG3056 bila glavni uzrok posmatrane varijacije vezivanja različitih serija PG3056.
Primer 4: Generisanje i karakterizacija varijanti PG3056
[0116] Analitička karakterizacija PG3056 pomoću CIEX-HPLC je pokazala da je IgG veoma heterogen. Kako ova heterogenost može ometati prečišćavanje na bazi CIEX-HPLC od CD3xCLEC12A bispecifičnog IgG, ciljali smo na poboljšanje CIEX-HPLC profila MF3056 Fab-a. Varijabilni region teškog lanca MF3056 sadrži nekoliko ostataka i / ili motiva koji mogu doprineti heterogenosti PG3056. Ovo su ostaci C-terminalnog lizina, motiv za deamidaciju NG asparagina u HCDR2 i kiselinski labilni DP motiv u HCDR3 (videti sliku 6 za poravnanje MF3056_VH nasuprot VH 3-33 sekvence germinalne).
[0117] Iako se u silikonskom modeliranju uopšte ne uočava motiv HCDR2 NG kao verovatni uzrok za posmatranu heterogenost, pokušano je identifikovati varijante VH MF3056 kojima nedostaje ovaj post-translacioni modifikacijski motiv, a koji paralelno može prikazati poboljšan CIEX-HPLC retencioni profil, kao i poboljšanu stabilnost. U tom cilju su generisane i testirane sledeće varijante VH od MF3056: MF3872, MF3873 i MF3905 (slika 7).
[0118] Ovi Fab-ovi koji sadrže ove VH varijante i zajednički laki lanac (MF3872, MF3873 i MF3905) su izraženi kao monoklonski IgG pune dužine (PG3872, PG3873 i PG3905) i testirani za vezivanje za memranski-eksprimiran CD3 na HPB-ALL ćelijama, pomoću protočne citometrije (prema proceduri FACS-a, kao što je prethodno opisano u WO2014/ 051433). Dobijeni su sledeći rezultati (slika 8):
Ovi rezultati pokazuju da su varijante PG3873 i PG3905 u potpunosti izgubile vezivanje CD3, dok je vrlo nisko vezivanje za CD3 zadržano za varijantu PG3872.
[0119] Kao alternativni pristup za dobijanje poboljšanih varijanti sa smanjenom heterogenošću i smanjenom imunogenošću, VH MF3056 je bio germinalne linije prema VH3-33 sekvenci u nekoliko ostataka, pravljenjem pojedinačnih ili kombinovanih supstitucija aminokiselina. Sledeće varijante MF3056_VH su generisane: MF3874_VH, MF3878_VH, MF3883_VH, MF3886_VH i MF3891_VH (slika 9).
[0120] Ponovo, Fab-ovi koji sadrže ove VH varijante i zajednički laki lanac (MF3874_VH, MF3878_VH, MF3883_VH, MF3886_VH i MF3891_VH) su izraženi kao monoklonski IgG pune dužine (PG3874, PG3878, PG3883, PG3886 i PG3891) i testirani za vezivanje CD3, kao što je gore opisano. Dobijeni su sledeći rezultati (slika 10):
Kao što je prikazano na slici 10, sve pojedinačne (PG3874 (Q6E), PG3878 (V23A), PG3883 (A50V), PG3886 (T97A)) i kombinovane (PG3891 (Q6E/V23A/T97A)) varijante germinalne linije su zadržale pun kapacitet vezivanja CD3. Nakon toga, PG3891 je analiziran pomoću CIEX-HPLC (kako je opisano u primeru 1) da bi se procenilo da li je germlining rezultirao u smanjenoj heterogenosti.
[0121] Kao što je prikazano na slici 11, CIEX-HPLC profil PG3891 je još uvek pokazivao značajnu heterogenost naboja. Slični CIEX-HPLC profili su dobijeni za pojedinačne varijante germlininga (podaci nisu prikazani).
[0122] U sledećem pokušaju za redukovanje heterogenosti punjenja PG3056, generisane su varijante MF3056_VH kojima nedostaje HCDR2 NG motiv (Slika 12).
[0123] Fab-ovi koji sadrže ove VH varijante i zajednički laki lanac (MF5192-5197_VH) su generisani i izraženi kao monoklonski IgG u punoj dužini (PG brojevi) i testirani za vezivanje za membranski-eksprimiran CD3 na HPB-ALL ćelijama, pomoću protočne citometrije, kao što je gore opisano. Ova analiza (Slika 13) je pokazala da PG5196 (N54G55u supstituciju N54A55) zadržava CD3 vezivanje uporedivo sa PG3056, dok su sve druge ispitivane varijante MF3056 pokazale značajno smanjeno (PG5192, PG5193 ili PG5197) ili nema vezivanja CD3 (PG5194 i PG5195).
[0124] Za procenu heterogenosti naelektrisanja PG5196 mAt-a izvršeno je izoelektrično fokusiranje, kao što je opisano u primeru 1. Nakon bojenja gela, uska traka pri visokom pI je primećena za PG5196 sa manjom satelitskom trakom sa nešto većom vrednošću pI (videti sliku 14).
[0125] Za detaljnije procenjivanje heterogenosti naelektrisanja PG5196, CIEX-HPLC je izveden prema postupku opisanom u primeru 1, rezultujući hromatogram je prikazan na slici 15. Hromatogram pokazuje glavni pik sa retencionim vremenom od 19 minuta, a prethodi mu mali pik na 16,9 minuta. Iznenađujuće, ovi podaci pokazuju da PG5196 pokazuje značajno poboljšani profil heterogenosti naelektrisanja u poređenju sa PG3056.
Primer 5: Generisanje dodatnih varijanti PG5196 korišćenjem odabira displeja faga
[0126] Na osnovu MF5196 VH, dizajnirane su biblioteke prikaza faga sa ciljem da se dobiju dodatni CD3 vezujući Fab-ovi sa slično redukovanim heterogenim naelektrisanjem. Generisane su biblioteke prikaza faga koje su sadržale preuređeni humani IGKV1-39 / IGKJ1 VL region
4
(De Kruif i sar. Biotechnol Bioeng.2010 (106) 741-50) i kolekciju VH regiona zasnovanih na MF5196 koji uključuju aminokiselinske supstitucije koje potencijalno mogu da poboljšaju međuvezu VH / VL. U tabeli 1. su naznačene specifične supstitucije i dozvoljene alternativne aminokiseline na položaju. Na mutiranom položaju sve naznačene supstitucije, kao i originalna aminokiselina su uvedene u jednakom odnosu.
4
Tabela 1
[0127] Bakteriofagi iz ovih biblioteka prikaza faga su odabrani u jednom ili dva kruga, korišćenjem HBP-ALL ćelija i / ili rekombinantnog humanog CD3δε-Fc proteina, korišćenjem procedura koje su poznate prosečnom stručnjaku. Vezujući fagi su hemijski eluirani i korišćeni za ponovnu infekciju bakterija. Nakon izbora velikog broja preživelih bakterijskih kolonija, fagi su spašeni i prikazani su za vezivanje na površinu ćelija izraženih CD3 / TCR kompleksa protočnom citometrijom. PCR kolonija je izveden za sve fage koji su pokazali vezivanje CD3 za amplifikaciju i sekvencu VH regiona.
[0128] Analiza VH gena je otkrila koje supstitucione varijante zadržavaju CD3 vezivanje. Izabrane MF5196_VH varijante su imale sledeće supstitucije: A50 u QSYL, D59 u LIVFRANEHST, A61 u NIHQLRYESTDKV i / ili F105 u MY (Tabela 2). Suprotno, u tabeli 1 navedene supstitucije na H35, Y102, N103 i W104 nisu bile dozvoljene, jer sve odabrane varijante vezivanja CD3 su zadržale originalnu aminokiselinu na položajima 35, 102, 103 i 104. Ovo pokazuje da su ostaci H35, Y102, N103 i W104 kritične aminokiseline za vezivanje CD3.
[0129] Primeri CD3 vezujućih varijanti MF5196_VH su MF5603_VH, MF5616_VH, MF5626_VH, MF5630_VH, MF5648_VH, MF5661_VH i MF5694_VH, sve u kombinaciji sa preuređenim humanim IGKV1-39 / IGKJ1 VL regionom. VH sekvence ovih MF-a su navedene na slici 25. Testiranje ovih MF varijanti u monospecifičnom IgG obliku za vezivanje za membranski-eksprimiran CD3 na HPB-ALL ćelijama, protočnom citometrijom kao što je gore opisano, pokazalo je da su svi ovi primeri vezani za CD3 (Slika 26). Kao primer njihove inherentne stabilnosti, PG5661 je analiziran pomoću CIEX-HPLC-a izveden prema postupku
4
opisanom u primeru 1, rezultujući hromatogram je prikazan na Slici 27. Hromatogram prikazuje glavni pik sa retencionim vremenom od ~ 20 minuta, slično profilu koji je prikazan za PG5196.
Tabela 2
Primer 5B
[0130] Na osnovu MF5196 VH, dizajnirane su biblioteke prikaza faga sa ciljem dobijanja dodatnih stabilnih Fab-ova za vezivanje CD3. Generisane su biblioteke prikaza faga koje su sadržale preuređeni humani IGKV1-39/IGKJ1 VL region (De Kruif i sar. Biotechnol Bioeng.
2010 (106) 741-50) i kolekciju VH3-33 varijanti za koje je fuzionisan teški lanac CDR3 regiona MF5196.
[0131] Bakteriofagi iz ovih biblioteka prikaza faga su odabrani u jednom ili dva kruga, korišćenjem HBP-ALL ćelija i / ili rekombinantnog humanog CD3δε-Fc proteina, korišćenjem procedura koje su poznate stručnjaku. Vezujući fagi su hemijski eluirani i korišćeni za ponovnu infekciju bakterije. Nakon izbora velikog broja preživelih bakterijskih kolonija, fagi su spašeni i prikazani su za vezivanje za ćelijsku površinu eksprimiranih CD3 / TCR kompleksa protočnom citometrijom. PCR kolonija je izveden za sve fage koji su pokazali vezivanje CD3 za amplifikaciju i sekvencu VH regiona.
[0132] Primeri dobijenih dodatnih CD3 vezujućih varijanti MF5196_VH su MF5351_VH, MF5354_VH i MF5356_VH (navedeni na slici 28), svi u kombinaciji sa preuređenim humanim IGKV1-39 / IGKJ1 VL regionom.
[0133] Testiranje ovih MF varijanti u monospecifičnom IgG obliku za vezivanje za membranski-izražen CD3 na HPB-ALL ćelijama, pomoću protočne citometrije, kao što je gore opisano, je pokazalo da su svi ovi primeri vezani za CD3 (Slika 29).
4
Primer 6: Funkcionalna karakterizacija MF5196 Fab-a u bispecifičnom IgG obliku CD3xCLEC12A
[0134] Za ispitivanje funkcionalne aktivnosti MF5196 Fab-a, ovaj CD3 Fab i MF3056 CD3 Fab su izraženi zajedno sa CLEC12A Fab-om MF4327 kao pričvršćenim delom. Bispecifični IgG-ovi CD3xCLEC12A su izraženi u bispecificnom IgG obliku u punoj dužini, kao što je opisano u WO2014/051433, uključujući i donje spojno / CH2 konstruisanje na položajima 235-236 (označen kao DM-Fc, CH2 dvostruka mutacija u regionu Fc). Poput MF3056 i MF5196, MF4327 Fab koristi laki lanac humanog IGKV1-39 / IGKJ1. MF4327 Fab sekvenca je data u patentnoj prijavi WO2014/051433. Prvo, vezivanje 5196x4327 DM-Fc bsAt-a za CD3 i CLEC12A je pokazano protočnom citometrijom korišćenjem CD3+ HPB-ALL ćelija i CLEC12A+ HL-60 ćelija (prema procedurama, kao što je ranije opisano u WO2014/051433).
3056x4327 DM-Fc bsAt je uključen kao referenca i referentna kontrola izotipa IgG1, PG1337, je uključena kao kontrola (slika 16). Oba CD3xCLEC12A DM-Fc bsAt-a vezuju membranski eksprimiran CD3 i HPB-ALL sa nešto poboljšanim vezivanjem za 5196x4327 DM-Fc bsAt.
[0135] Sledeće, ispitivana je funkcionalna aktivnost 5196x4327 CD3xCLEC12A DM-Fc bsAta. Prvo, stimulativni kapacitet T-ćelija je ispitivan sa T-ćelijama u mirovanju od zdravog donora. Prečišćene T ćelije u mirovanju su dobijene prema postupku opisanom u patentu WO2014/051433. Prečišćene T-ćelije u mirovanju su naknadno inkubirane sa ćelijama iz izvedene leukemijske HL-60 ćelijske linije u 10% humanom serumu (HS), pri odnosu efektora : ciljne ćelije od 5: 1 tokom dva dana, kao što je opisano u WO2014/051433. Kao referenca je uključeno 3056x4327 DM-Fc bsAt. Kao negativni kontrolni referentni IgG-ovi uključeni su izotipski kontrolni IgG (kontrolni IgG) i 5196x1337 DM-Fc bsAt. 5196x1337 DM-Fc bsAt vezuje CD3 sa jednim delom (MF5196) i vezuje tetanusni toksoid (TT) sa drugim delom (MF1337) i uključeno je da ispita potencijalnu aktivnost izazvanu ne-ciljanjem od strane MF5196. BsAt i kontrolni IgG-ovi su testirani pri 1,000 ng/mL. Podaci o aktivaciji T ćelija su izraženi kao procenat CD69-pozitivnih ćelija unutar CD4-pozitivne ili CD8-pozitivne T-ćelijske populacije (Slika 17).5196x4327 DM-Fc bsAt indukuje aktivaciju CD4 i CD8 T ćelija, što se ogleda u ushodnoj regulaciji CD69 markera rane aktivacije. Takođe, 3056x4327 DM-Fc bsAt je indukovalo ushodnu regulaciju CD69 na CD4 i CD8 T ćelijama, međutim u manjoj meri u poređenju sa 5196x4327 DM-Fc bsAt. Posmatrana ushodna regulacija CD69 na obe T ćelijske podgrupe je bila specifična za antigen CLEC12A, kao što 5196x1337 DM-Fc bsAt nije indukovalo ushodnu regulaciju CD69.
4
[0136] Ova analiza je pokazala da 5196x4327 DM-Fc bsAt ima kapacitet da indukuje antigen specifičnu aktivaciju CD4 i CD8 T ćelija, nešto bolje od 3056x4327 DM-Fc bsAt (Slika 17). Indukovana T ćelijska aktivacija sa 5196x4327 DM-Fc bsAt-om je bila CLEC12A specifična, dok kontrolno 5196x1337 DM-Fc bsAt ne indukuje aktivaciju T ćelija. Uzeto zajedno, ovo pokazuje da aminokiselinska supstitucija HCDR2 N u A, koja rezultira u CD3 vezujućem MF5196 Fab-u, u potpunosti zadržava aktivaciju T ćelija specifičnih za CLEC 12A.
[0137] Za istraživanje da li je stepen aktivacije T-ćelija od strane 5196x4327 nasuprot 3056x4327 CD3xCLEC12A DM-Fc bsAt-a bio dovoljan da indukuje lizu ciljne ćelije, ćelije HL-60 su obeležene sa sukcimidil estrom karboksifluorescein diacetata (CFSE) i zajedno kultivisane sa T-ćelijama od zdravog donora, pri odnosu efektora : ciljne ćelije od 5 : 1 u prisustvu 10% HS-a.5196x1337 CD3xTT DM-Fc bispecifično antitelo je uključeno da ispita potencijalnu ne-ciljanu lizu. Bispecifični IgG-ovi su testirani u četvorostrukom opsegu razblaženja počevši od 1,000 ng / ml. Nakon dva dana, preživele CFSE-pozitivne HL-60 ćelije su kvantifikovane protočnom citometrijom. Rezultati su izraženi kao procenat specifične lize povezane sa uslovima kontrole PBS (slika 18).
[0138] Ova analiza je pokazala da je 5196x4327 DM-Fc bsAt u potpunosti zadržalo kapacitet da indukuje CLEC12A antigen specifičnu lizu ciljnih ćelija. Iznenađujuće, jačina 5196x4327 DM-Fc je bila značajno bolja od 3056x4327 DM-Fc bsAt-a.
[0139] U zaključku, ovaj primer je pokazao da je MF5196 Fab funkcionalan kao 5196x4327 CD3xCLEC12A DM-Fc bsAt-om efikasno indukovana CLEC12A antigen specifična T ćelijska aktivacija i liza CLEC12A HL-60 ćelija. Štaviše, ovaj primer je pokazao da 5196x4327 DM-Fc bsAt ima poboljšanu jačinu kada se poredi sa 3056x4327 DM-Fc bsAt.
Primer 7
Afinitet anti-CD3 i anti-CLEC12A delova od 5196x4327 DM-Fc bsAt-a
[0140] Afiniteti MF5196 CD3 i MF4327 CLEC12A Fab-ova za njihove ciljeve su izmereni pomoću tehnologije površinske plazmonske rezonance (SPR) korišćenjem BIAcore T100. Anti-humano IgG mišje monoklonsko antitelo (Becton i Dickinson, kat. Br. 555784) je kuplovano za površine CM5 senzorskog čipa korišćenjem slobodne hemije amina (NHS / EDC). Zatim je 5196x4327 DM-Fc bispecifično antitelo apsorbovano na ovu površinu senzora. Nakon toga, rekombinantni prečišćeni antigeni humanog CLEC12A (Sino Biological Inc, kat. Br. 11896-H07H) i humanog CD3δε-Fc proteina su propuštani preko površine senzora u opsegu koncentracija kako bi se merili vezani i slobodni odnosi. Nakon svakog ciklusa, površina senzora je regenerisana impulsom HCl i 5196x4327 DM-Fc bsAt je ponovo apsorbovano. Od dobijenih senzorskih programa, vezani i slobodni odnosi su određeni korišćenjem softvera BIAevaluacije.
[0141] Ovi podaci (Slika 19) su pokazali da 5196x4327 DM-Fc bsAt ima afinitet od 3 nM za humani CLEC12A i afinitet od 177 nM za CD3. Ovo je pokazalo da je afinitet CLEC12A dela bio ~ 60 puta veći od afiniteta humanog CD3 vezujućeg dela u 5196x4327 DM-Fc bsAt-u.
Tabela 3: Odnosi on- i off- i vrednosti afiniteta za vezivanje za humani CD3 i humani CLEC12A. Vrednost je prosek od tri merenja. KD: konstanta afiniteta (ravnotežna disocijacija).
Primer 8 Efikasnost 5196x4327 DM-Fc bsAt-a za indukciju lize AML blasta u primarnim uzorcima AML pacijenta
[0142] U primeru 6 je pokazano da 5196x4327 DM-Fc bsAt potencijalno izaziva lizu ciljnih ćelija HL-60, pomoću T ćelija dobijenih od zdravih donora. U patentu WO2014/051433 pronalazači su pokazali da je CD3xCLEC12A DM-Fc bsAt imalo sposobnost da indukuje lizu AML blasta autolognim izvedenim T ćelijama od AML pacijenta, pri odnosu efektora prema cilju od 5: 1. Ovde je ispitivana efikasnost CD3xCLEC12A DM-Fc bsAt-a, specifičnije od 5196x4327 CD3xCLEC12A DM-Fc bsAt-a, da bi se indukovala liza AML blasta u primarnim AML uzorcima sa niskim odnosima efektora prema cilju, T ćelije prema AML blastu.
[0143] Uzorci pacijenta sa AML-om uzeti pri dijagnozi (od AML FAB klasifikacija M1, M2, M4, M4 / M5, Tabela 4) su odmrznuti i okarakterisani za frakciju T ćelija i AML blasta protočnom citometrijskom analizom za CD4, CD8, CD14, CD33, CD34, CD45 i 7AAD. Analizirani uzorci AML-a su imali odnos efektora prema cilju u rasponu od 1: 7- 1:40.
[0144] Nakon toga, uzorci koštane srži primarnog AML pacijenta su bili kultivisani u IMDM medijumu dopunjenom sa 10% normalnog HS plus 20 ng / mL IL-15 (Miltenyi, # 130-095-766), 2,5 ng / mL GM-CSF (Immunotools, # 11343125), 12,5 ng / mL G-CSF (opisanog od
1
strane Norde i sar., 2009), 6,25 ng / mL IL-3 (Imunotools, # 11340035), 3,0 ng / mL SCF (Immunotools, # 11343325) i 2,5 ng / mL Flt3L (Imunotools, # 311340035). Testirani uslovi su uključivali PBS, kontrolu izotipa At WT-Fc, 5196x4327 DM-Fc bsAt, 5196x1337 DM-Fc bsAt i pozitivnu kontrolu CD3 WT-Fc At (sva antitela pri 1,000 ng / mL). Nakon sedam dana kulture, širenje T ćelija i uništavanje AML blasta je određeno protočnom citometrijskom analizom, korišćenjem istih markera kao što su korišćeni u 0 danu. Rezultati su izraženi kao broj puta ekspanzije T-ćelija ili učestalost lize AML blasta u odnosu na stanje PBS.
[0145] Ovi podaci su pokazali (Tabela 4 i Slika 20) da 5196x4327 DM-Fc bsAt efikasno indukuje ekspanziju T ćelija (5-30-puta T ćelijska ekspanzija) nakon 7 dana. Što je još važnije, ovi podaci su pokazali da 5196x4327 DM-Fc bsAt efikasno indukuje lizu (26-88%) AML tumorskih ćelija pacijenta kod 5/5 testiranih primarnih AML uzoraka pacijenata, čak i u AML uzorcima sa vrlo niskim odnosima efektora prema cilju.
Tabela 4
[0146] Efikasnost 5196x4327 DM-Fc bsAt-a da indukuje T ćelijsku proliferaciju i lizu AML blasta je analizirana u dodatnim uzorcima AML pacijenata uzetih pri dijagnozi.
[0147] Uzorci AML pacijenta uzeti pri dijagnozi (od AML FAB klasifikacija M1, M2, M4, M4/M5, Tabela 5) su odmrznuti i okarakterisani za frakciju T ćelija i AML blasta pomoću protočne citometrijske analize za CD4, CD8, CD14, CD33, CD34, CD45 i 7AAD. Analizirani uzorci AML-a imaju odnos efektora prema cilju u rasponu od 1: 3 - 1:97. Nakon toga, primarni uzorci AML pacijenata su kultivisani, kao što je gore opisano u primeru 8. Testirani uslovi su uključivali PBS, izotipsko kontrolno antitelo WT-Fc, 5196x4327 DM-Fc bsAt, 5196x1337 DM-Fc bsAt i pozitivnu kontrolu CD3 WT-Fc At (sva antitela pri 200 ng / mL). Nakon sedam
2
i deset dana od ekspanzije T ćelijske kulture i ubijanja AML blasta utvrđeno je pomoću protočne citometrijske analize korišćenjem istih markera kao što je korišćeno u 0 danu. Rezultati su izraženi kao ekspanzija T-ćelija ili frekvencija lize blasta AML-a u odnosu na stanje PBS.
[0148] Ovi podaci su pokazali (Tabela 5) da 5196x4327 DM-Fc bsAt efikasno indukuje ekspanziju T ćelija (7-226-struku T ćelijsku ekspanziju) nakon 10 dana. Što je još važnije, ovi podaci pokazuju da 5196x4327 DM-Fc bsAt efikasno indukuje lizu (38-99%) pacijentovih AML tumorskih ćelija kod 6/8 testiranih primarnih uzoraka AML pacijenata, čak i u AML uzorcima sa vrlo niskim odnosima efektora prema cilju od 1 : 45 - 1: 97.
Tabela 5
Primer 9
[0149] Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) je korišćena za merenje termostabilnosti domena, ovde opisanih IgG-a. DSC eksperimenti su izvedeni na MicroCal VP-DSC, korišćenjem Origin v7.0 (VPViewer i VP Analyzer) softvera. Antitela su prva dijalizovana protiv 10 mM fosfata, 150 mM NaCl pufera na pH 6.5. Uzorci IgG-a su analizirani pri koncentraciji proteina od 0,25 mg / mL, kako je određeno UV absorpcijom, dijalizni pufer je korišćen kao referentni uzorak. Skeniranje je trajalo od 50 ° C do 95 ° C sa brzinom skeniranja od 1 ° C / min i analizirana su korišćenjem programa GraphPad Prism 5 i Microsoft Excel 2010 softvera.
[0150] DSC analiza divljeg tipa (WT) IgG1 je rezultirala u dva pika, kao što je prikazano na Slici 21 (naznačeno kao WT | WT za CH2 | CH3). Tm1 na 70,9 ° C odgovara topljenju CH2 domena, dok pik na 85,0 ° C (Tm2) predstavlja topljenje Fab i CH3 domena. DSC grafikon IgG1 sa identičnim Fab-ovima koji sadrže dve mutacije (L235G, G236R) u domenu CH2 (DM | WT) pokazuje veoma sličan pik Tm2 na 85,0 ° C. Međutim, Tml pik se pomerio na 73,5 ° C, što ukazuje da ove mutacije značajno povećavaju stabilnost CH2 domena. S obzirom da domen CH2 nije samo najslabiji domen WT IgG1, već i CH3-konstruisanog bispecifičnog IgG1, može se zaključiti da L235G, G236R konstruisani CH2 domen, takođe daje dodatnu stabilnost CD3xCLEC12A bispecifičnim IgG antitelima koja nose ove CH2 mutacije.
4

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Antitelo koje vezuje humani CD3, antitelo koje sadrži teški lanac i laki lanac, naznačeno time, da pomenuti teški lanac sadrži varijabilni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu:
QVQLV QSGGG VVQPG RSLRL SCVAS GFTFS SYGMH WVRQA PGKGL
EWVAA IWYX1X2RKQDY ADSVK GRFTI SRDNS KNTLY LQMNS LRAED
TAVYY CTRGT GYNWF DPWGQ GTLVT VSS
sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija na jednom ili više položaja drugačijih od položaja koji je naznačen pomoću X1X2; i drugačijih od CDR regiona;
gde
X1= N i X2= A;
X1= N i X2= T;
X1= H i X2= G;
X1= D i X2= G; ili
X1= H i X2= A; i pomenuti laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca O12/IgVκ 1-39 iz slike 23A sa 0-5 aminokiselinskih supstitucija.
2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, da je pomenuti varijabilni region lakog lanca varijabilni region germinalne linije O12/IgVκ 1-39*01.
3. Antitelo prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time, da varijabilni region lakog lanca sadrži kappa laki lanac IgVκ 1-39*01/IGJκ1*01 ili IgVκ 1-39*01/IGJκ5*01.
4. Antitelo prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time, da varijabilni region lakog lanca sadrži kappa laki lanac IgVκ 1-39*01/IGJκ1*01 ili IgVκ 1-39*01/IGJκ5*01 germinalne linije.
5. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, da pomenuti varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu.
DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA
ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ
GTKVE IK ili DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP
GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ
SYSTP PITFG QGTRL EIK sa 0-5 aminokiselinskih umetanja, delecija, supstitucija, dodavanja ili njihove kombinacije.
6. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, koje je bispecifično antitelo.
7. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 6, koje sadrži kombinaciju H/L lanca iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-5 i kombinaciju H/L lanca koja vezuje tumorski antigen.
8. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time, da pomenuta kombinacija H/L lanca koja vezuje tumorski antigen vezuje CLEC12A.
9. Antitelo ili bispecifično antitelo prema patentnim zahtevima 1-8, koje sadrži humani konstantni region i humane varijabilne domene.
10. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 6-9, koje sadrži dva različita imunoglobulinska teška lanca sa kompatibilnim domenima heterodimerizacije.
11. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 10, naznačeno time, da su pomenuti kompatibilni domeni heterodimerizacije kompatibilni domeni heterodimerizacije CH3 teškog lanca imunoglobulina.
12. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 6-11, naznačeno time da je pomenuto bispecifično antitelo IgG antitelo sa mutiranim CH2 i / ili donjim spojnim domenom tako da je interakcija bispecifičnog IgG antitela za Fc-gama receptor smanjena.
13. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 12, naznačeno time, da mutirani CH2 i / ili donji spojni domen sadrži amino supstituciju na položaju 235 i / ili 236 (Kabat numerisanje), poželjno supstituciju L235G i / ili G236R.
14. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 6-12, koje sadrži varijabilni region O12/IgVκ 1-39 lakog lanca iz slike 23A sa 0-5 aminokiselinskih umetanja, delecija, supstitucija, dodavanja ili njihove kombinacije.
15. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14, za upotrebu u lečenju subjekta kome je to potrebno.
RS20181314A 2015-07-10 2016-07-08 Antitela koja vezuju humani cd3 RS57928B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15176355 2015-07-10
EP16178648.8A EP3115376B1 (en) 2015-07-10 2016-07-08 Human cd3 binding antibody

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57928B1 true RS57928B1 (sr) 2019-01-31

Family

ID=53673007

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181314A RS57928B1 (sr) 2015-07-10 2016-07-08 Antitela koja vezuju humani cd3

Country Status (23)

Country Link
US (4) US9914777B2 (sr)
EP (3) EP3115376B1 (sr)
JP (4) JP7010811B2 (sr)
KR (1) KR102709815B1 (sr)
CN (1) CN108026174B (sr)
AU (1) AU2016293942B2 (sr)
CA (1) CA2991880C (sr)
CY (1) CY1120849T1 (sr)
DK (1) DK3115376T3 (sr)
EA (1) EA201890028A1 (sr)
ES (2) ES2812303T3 (sr)
HR (1) HRP20181802T1 (sr)
HU (1) HUE042039T2 (sr)
IL (2) IL321912A (sr)
LT (1) LT3115376T (sr)
MX (2) MX2018000344A (sr)
PL (1) PL3115376T3 (sr)
PT (1) PT3115376T (sr)
RS (1) RS57928B1 (sr)
SI (1) SI3115376T1 (sr)
SM (1) SMT201800562T1 (sr)
TR (1) TR201816055T4 (sr)
WO (1) WO2017010874A1 (sr)

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9248181B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Merus B.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
HUE042040T2 (hu) 2012-09-27 2019-06-28 Merus Nv Bispecifikus IGG antitestek mint T-sejt kapcsolók
JP6771385B2 (ja) 2014-02-28 2020-10-21 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ 二重特異性抗体および医薬組成物
US9708412B2 (en) 2015-05-21 2017-07-18 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
US9914777B2 (en) 2015-07-10 2018-03-13 Merus N.V. Human CD3 binding antibody
SMT202100230T1 (it) 2015-10-23 2021-07-12 Fundacio Inst De Recerca Biomedica Irb Barcelona Molecole di legame che inibiscono la crescita tumorale
EP3493844A4 (en) 2016-05-20 2021-03-24 Harpoon Therapeutics Inc. SINGLE DOMAIN SERUM ALBUMIN BINDING PROTEIN
RU2769282C2 (ru) 2016-06-20 2022-03-30 Кимаб Лимитед Анти-PD-L1 и IL-2 цитокины
WO2018106945A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
WO2018183929A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
IL269656B2 (en) 2017-03-31 2024-06-01 Merus Nv Bispecific antibodies that bind ERBB-2 and ERBB3 for use in the treatment of cells with NRG1 fusion gene
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
JP7296891B2 (ja) 2017-05-17 2023-06-23 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ 乳癌のためのＥｒｂＢ－２／ＥｒｂＢ－３二重特異性抗体と内分泌療法との組み合わせ
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
AR112257A1 (es) 2017-06-21 2019-10-09 Gilead Sciences Inc Anticuerpos multiespecíficos dirigidos al vih-1 gp120 y cd3 humana, composiciones que los comprende, ácido nucleico, vector y célula huésped relacionados, método para producirlos, método para detectar células que expresan gp120 y cd3, kit de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo que se une a gp120 y método para producirlos
WO2019000223A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
KR102794369B1 (ko) 2017-08-01 2025-04-15 에이비 테라퓨틱스 인코퍼레이티드 이중특이 항체 및 그의 용도
SG11202001050PA (en) 2017-08-09 2020-03-30 Merus Nv Antibodies that bind egfr and cmet
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
MX2020003915A (es) 2017-10-13 2020-10-08 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas trispecificas y metodos de uso.
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
AU2018351050B2 (en) 2017-10-18 2025-09-18 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
CN111787938A (zh) 2017-11-15 2020-10-16 诺华股份有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体、靶向cd19的嵌合抗原受体及组合疗法
US20200371091A1 (en) 2017-11-30 2020-11-26 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
WO2019108065A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Merus N.V. Use of bispecific antibody and il-15 for combination therapy
JP7314146B2 (ja) * 2017-12-28 2023-07-25 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
US12539308B2 (en) 2018-01-08 2026-02-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Immune-enhancing RNAs for combination with chimeric antigen receptor therapy
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
AU2019215031C1 (en) 2018-01-31 2026-02-26 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
TWI890481B (zh) * 2018-02-09 2025-07-11 日商小野藥品工業股份有限公司 雙特異性抗體
US20200399383A1 (en) 2018-02-13 2020-12-24 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
EP3765517A1 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
MA52212A (fr) * 2018-03-30 2021-02-17 Merus Nv Anticorps multivalent
KR102602329B1 (ko) * 2018-05-23 2023-11-16 화이자 인코포레이티드 Cd3에 특이적인 항체 및 이의 용도
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
WO2019246312A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
EP4635978A2 (en) 2018-08-31 2025-10-22 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3844265A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
US10815311B2 (en) 2018-09-25 2020-10-27 Harpoon Therapeutics, Inc. DLL3 binding proteins and methods of use
CN111116753A (zh) * 2018-10-30 2020-05-08 上海泰因生物技术有限公司 一种双特异性抗体的制备方法
EP3883635A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
US11873338B2 (en) 2018-12-20 2024-01-16 Merus N.V. CLEC12AxCD3 bispecific antibodies and methods for the treatment of disease
US12463463B2 (en) 2019-01-28 2025-11-04 Ab Therapeutics, Inc. Bispecific antibodies and uses thereof
GB2599228B (en) 2019-02-21 2024-02-07 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
CN119039441A (zh) 2019-02-21 2024-11-29 马伦戈治疗公司 与nkp30结合的抗体分子及其用途
US20220152150A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
EP3942025A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novartis AG Car-t cell therapies with enhanced efficacy
TW202546002A (zh) * 2019-03-29 2025-12-01 荷蘭商美勒斯公司 Cd3結合分子
CN114605546A (zh) * 2019-03-29 2022-06-10 美勒斯公司 Cd3结合分子
EP3953455A1 (en) 2019-04-12 2022-02-16 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
JP6881658B2 (ja) * 2019-07-05 2021-06-02 小野薬品工業株式会社 Ｐｄ−１／ｃｄ３二重特異性タンパク質による血液がん治療
CN114423787B (zh) 2019-07-19 2025-01-24 昂科里斯庞斯公司 免疫调节性抗体及其使用方法
TW202118790A (zh) * 2019-07-30 2021-05-16 日商小野藥品工業股份有限公司 雙特異性抗體
JP7536085B2 (ja) 2019-08-19 2024-08-19 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ Ｌｇｒ５及びｅｇｆｒに結合する抗体とトポイソメラーゼｉ阻害剤との組合せを用いる癌の治療
AU2020346886A1 (en) * 2019-09-13 2022-04-14 Memorial Hospital For Cancer And Allied Diseases Anti-CD371 antibodies and uses thereof
IL293215A (en) 2019-11-26 2022-07-01 Novartis Ag Chimeric antigen receptors that bind bcma and cd19 and their uses
CN115666704B (zh) 2019-12-13 2025-09-26 比特比德科有限责任公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
AU2020416273A1 (en) 2020-01-03 2022-07-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
EP4110376A2 (en) 2020-02-27 2023-01-04 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CN115397460A (zh) 2020-02-27 2022-11-25 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
CR20220541A (es) 2020-03-31 2022-11-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Moléculas de unión al antígeno multiespecíficas dirigidas a ligando de tipo delta 3 (dll3) y sus usos
TW202206460A (zh) 2020-04-24 2022-02-16 荷蘭商美勒斯公司 使用結合lgr5及egfr之抗體的癌症治療
JP2023529211A (ja) 2020-06-11 2023-07-07 ノバルティス アーゲー Ｚｂｔｂ３２阻害剤及びその使用
MX2023002107A (es) 2020-08-21 2023-03-15 Novartis Ag Composiciones y metodos para la generacion in vivo de celulas que expresan car.
CN117624324A (zh) 2020-12-15 2024-03-01 美勒斯公司 利用结合lgr5和egfr的抗体治疗癌症
WO2022216993A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
WO2022229853A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Novartis Ag Viral vector production system
US20250084158A1 (en) * 2021-07-20 2025-03-13 Abl Bio Inc. Anti-cll-1 antibodies and uses thereof
EP4388000A1 (en) 2021-08-20 2024-06-26 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor?expressing cells
US20240425604A1 (en) 2021-10-06 2024-12-26 Merus N.V. Treatment of immune checkpoint inhibitor-treated cancers with high egfr expression using an antibody that binds at least egfr
WO2024088987A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for the treatment of cancer
AU2023369684A1 (en) 2022-10-26 2025-04-17 Novartis Ag Lentiviral formulations
TW202434635A (zh) * 2022-11-03 2024-09-01 美商翰森生物有限責任公司 多特異性抗體及其醫藥用途
AU2023408531A1 (en) 2022-12-23 2025-07-17 Merus B.V. Combination treatment of cancers using an antibody that binds at least egfr and an immune checkpoint inhibitor
TW202432606A (zh) 2022-12-28 2024-08-16 荷蘭商美勒斯公司 使用結合egfr的抗體及細胞毒性藥物的組合之癌症治療
WO2025097015A1 (en) * 2023-11-01 2025-05-08 Fred Hutchinson Cancer Center Clec2a-binding therapeutics
WO2025109119A1 (en) 2023-11-22 2025-05-30 Priothera Sas Methods of treatment with multispecific antigen-binding proteins in combination with s1p receptor modulators
WO2026050572A2 (en) 2024-08-29 2026-03-05 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4801687A (en) 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
FI884924L (fi) 1987-10-28 1989-04-29 Oncogen Humanimmuglobulin som producerats med hybrid-dna-teknik.
US5151504A (en) 1989-11-17 1992-09-29 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method for purification of monoclonal antibodies
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
EP0523949B1 (en) 1991-07-15 2003-06-25 The Wellcome Foundation Limited Production of antibodies
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
ATE299938T1 (de) 1997-05-02 2005-08-15 Genentech Inc Ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
HK1048138B (zh) 1999-04-15 2009-06-12 荷兰克鲁塞尔公司 用编码腺病毒e1蛋白的序列在人体细胞中生产重组蛋白
PT1600510E (pt) 2001-07-04 2007-06-25 Chromagenics Bv Sequências de adn com actividade anti-repressora.
WO2003107218A1 (ja) 2002-05-31 2003-12-24 セレスター・レキシコ・サイエンシズ株式会社 相互作用予測装置
DK2314629T4 (da) 2002-07-18 2023-02-06 Merus Nv Rekombinant produktion af blandinger af antistoffer
SI1583830T1 (sl) 2003-01-07 2006-12-31 Symphogen As Postopek za pripravo rekombinantnih poliklonskih proteinov
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
EP2322547A1 (en) 2003-06-25 2011-05-18 Crucell Holland B.V. Myeloid cell-specific lectin
CN1984931B (zh) * 2004-06-03 2012-11-28 诺维莫尼公司 抗-cd3抗体及其使用方法
CA2569509C (en) 2004-06-03 2014-08-12 Novimmune S.A. Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof
WO2006028936A2 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
US20060171929A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 The University Of Washington Regulation of dendritic cell functions by the DCAL-2 receptor
WO2006105338A2 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
CN101309703A (zh) * 2005-09-12 2008-11-19 诺维莫尼公司 抗cd3抗体组合物
PT1999154E (pt) 2006-03-24 2013-01-24 Merck Patent Gmbh Domínios proteicos heterodiméricos modificados
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
US8290739B2 (en) 2006-10-20 2012-10-16 Amfit, Inc. Method for determining relative mobility of regions of an object
ES2593484T3 (es) 2007-03-29 2016-12-09 Genmab A/S Anticuerpos biespecíficos y métodos de producción de los mismos
JP2010536341A (ja) 2007-08-15 2010-12-02 アムニクス， インコーポレイテッド 生物学的に活性なポリペプチドの特性を改変するための組成物および方法
US8536310B2 (en) 2007-10-17 2013-09-17 Arca Biopharma, Inc. Antibodies to CLL-1
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
AU2009211148B2 (en) 2008-02-05 2014-08-28 Zymeworks Inc. Methods for determining correlated residues in a protein or other biopolymer using molecular dynamics
EP2147594B1 (en) 2008-06-27 2013-11-13 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
CN104262483A (zh) 2009-01-26 2015-01-07 根马布股份公司 用于生成抗体混合物的方法
MY152068A (en) 2009-03-20 2014-08-15 Genentech Inc Bispecific anti-her antibodies
WO2010129304A2 (en) 2009-04-27 2010-11-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
MY192182A (en) 2009-06-26 2022-08-04 Regeneron Pharma Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SMT202600080T1 (it) 2010-02-08 2026-03-09 Regeneron Pharma Topo con catena leggera comune
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
JP2013537416A (ja) 2010-08-13 2013-10-03 メディミューン リミテッド 変異型Ｆｃ領域を含むモノマーポリペプチド及び使用方法
CN103261220B (zh) 2010-08-16 2016-06-15 诺夫免疫股份有限公司 用于生成多特异性和多价抗体的方法
ES2758994T3 (es) 2010-11-05 2020-05-07 Zymeworks Inc Diseño anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc
BR112013023918A2 (pt) 2011-03-25 2016-12-13 Glenmark Pharmaceuticals Sa imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para produzir uma imunoglobulina hetero-dimérica ou fragmento hetero-dimérico da mesma, método para construir uma interface proteína-proteína de um domínio de uma proteína de múltiplos domínios e uso de um domínio doador de um primeiro e de um segundo membro de uma super-família de imunoglobulina de ocorrência natural
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
US9248181B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Merus B.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
HUE042040T2 (hu) 2012-09-27 2019-06-28 Merus Nv Bispecifikus IGG antitestek mint T-sejt kapcsolók
JP6003513B2 (ja) * 2012-10-15 2016-10-05 株式会社Ihi 高温処理炉及び強化繊維の継ぎ方法
JP6771385B2 (ja) 2014-02-28 2020-10-21 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ 二重特異性抗体および医薬組成物
WO2015130173A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Merus B.V. Antibody that binds erbb-2 and erbb-3
US9914777B2 (en) 2015-07-10 2018-03-13 Merus N.V. Human CD3 binding antibody

Also Published As

Publication number Publication date
LT3115376T (lt) 2018-11-12
CA2991880C (en) 2025-02-04
KR20180030856A (ko) 2018-03-26
CY1120849T1 (el) 2019-12-11
SI3115376T1 (sl) 2018-12-31
US20190211100A1 (en) 2019-07-11
CN108026174A (zh) 2018-05-11
CN108026174B (zh) 2023-02-17
JP7010811B2 (ja) 2022-02-10
JP7772759B2 (ja) 2025-11-18
SMT201800562T1 (it) 2018-11-09
US11739148B2 (en) 2023-08-29
AU2016293942B2 (en) 2022-06-16
ES2812303T3 (es) 2021-03-16
EP3345928B1 (en) 2020-06-24
KR102709815B1 (ko) 2024-09-24
MX2018000344A (es) 2018-03-14
JP2018520169A (ja) 2018-07-26
HK1254029A1 (zh) 2019-07-12
US20160368988A1 (en) 2016-12-22
HRP20181802T1 (hr) 2018-12-28
IL256760B1 (en) 2026-04-01
IL321912A (en) 2025-09-01
US9914777B2 (en) 2018-03-13
EP3115376B1 (en) 2018-09-05
PL3115376T3 (pl) 2019-01-31
DK3115376T3 (en) 2018-11-26
JP2023181462A (ja) 2023-12-21
JP2022023228A (ja) 2022-02-07
IL256760A (en) 2018-03-29
JP7379446B2 (ja) 2023-11-14
US10266593B2 (en) 2019-04-23
EP3757129A1 (en) 2020-12-30
AU2016293942A1 (en) 2018-02-01
PT3115376T (pt) 2018-11-15
HUE042039T2 (hu) 2019-06-28
MX2022008124A (es) 2022-08-08
WO2017010874A1 (en) 2017-01-19
JP2026026089A (ja) 2026-02-16
TR201816055T4 (tr) 2018-11-21
CA2991880A1 (en) 2017-01-19
US20180237523A1 (en) 2018-08-23
NZ739165A (en) 2020-11-27
EP3345928A1 (en) 2018-07-11
EA201890028A1 (ru) 2018-08-31
ES2693596T3 (es) 2018-12-12
US20240109966A1 (en) 2024-04-04
EP3115376A1 (en) 2017-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7379446B2 (ja) ヒトｃｄ３結合抗体
JP7401538B2 (ja) 抗ｃｌｄｎ１８．２抗体およびその使用
JP7397882B2 (ja) 二重特異性抗体及びその調製方法、使用
CN104093841A (zh) 基于IL-15和IL-15Rα SUSHI结构域的免疫细胞因子
US20230374132A1 (en) Anti-cd3 antibody and uses thereof
JP2023179541A (ja) Ｃｄ３結合分子
HK40043437A (en) Human cd3 binding antibody
NZ739165B2 (en) Human cd3 binding antibody
EA046108B1 (ru) Антитело, связывающее cd3 человека
HK1254029B (en) Human cd3 binding antibody