RS57996B1

RS57996B1 - Inhibitori aktivacije t-ćelija

Info

Publication number: RS57996B1
Application number: RS20181350A
Authority: RS
Inventors: Yunxiang Zhu; Jozsef Karman; Ronnie Wei; Canwen Jiang; Seng Cheng
Original assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2019-01-31
Also published as: EP2726101B1; ES2810424T3; MX2013015384A; US11028170B2; EP2726101A1; ZA201309532B; CN103796681A; SG10201604715VA; JP2014522846A; JP6826154B2; JP2021073216A; CA2839462A1; EP3357511B1; US20210380686A1; PE20141469A1; MX354922B; ES2694749T3; AU2017261541B2; PL3357511T3; CN107988156B

Description

Opis

Stanje tehnike

[0001] Ćelijska terapija koja koristi sveže izolovane, ex vivo proširene ili in vitro indukovane Tregove u modelima autoimunih bolesti ili transplantacija organa pokazali su da adoptivni transfer Tregova može da obnovi ravnotežu Tregova protiv efektorskih T ćelija, čime kontroliše autoimunost povezanu sa ovim bolestima (Allan i dr., (2008) Immunol. Rev.

223:391-421; Jiang i dr., (2006) Expert review of clinical immunology 2:387-392; Riley i dr., (2009) Immunity 30:656-665 ; Tang i dr., (2012) Journal of molecular cell biology 4:11-21). Međutim, upotreba adoptivnog transfera kao terapeutske strategije predstavlja nekoliko izazova pre nego što bude spremna za kliničku primenu. Broj autolognih Tregova koji se mogu izolovati iz periferne krvi ljudskog pacijenta je ograničavajući, i ex vivo proširenje Tregova može promeniti njihovu funkcionalnost i/ili čistoću. Kako su izolovani Tregovi poliklonski, oni mogu vršiti pan-imuno supresivnu funkciju na T-ćelijama koje nisu ciljane. Od značaja je da plastičnost Tregova predstavlja značajan izazov (Bluestone i dr., (2009) Nat Rev Immunol 9:811-816; Zhou i dr., (2009a) Curr Opin Immunol 21:281-285), poput toga što adoptivno transferovan Treg može izgubiti eksprimiranje Foxp3 i redifencirati u Th17 ćelije (Koenen i dr., (2008) Blood 112:2340-2352.) ili patogene memorijske T ćelije (Zhou i dr., (2009b) Nat Immunol 10:1000-1007) što povećava rizik od pooštravanja autoimunosti ili upale.

[0002] Terapeutik koji indukuje generisanje Tregova na specifičan antigen-specifičan način in situ bi imao prednosti u odnosu na adoptivnu Treg ćelijsku terapiju. Antigen-4 (CTLA-4, CD 152) povezan sa citotoksičnim T limfocitima koji je dobro uspostavljen negativni regulator T ćelijskog odgovora, važan je za održavanje homeostaze T ćelija i samotolerancije. CTLA-4 je homologan ko-stimulativnom molekulu CD28 i deli iste ligande, CD80 (B7.1) i CD86 (B7.2), koji su eksprimirani na površini ćelija koje daju antigene (APC). Međutim, diferencijalno vezivanje CD80/CD86 na APC za CD28 i CTLA-4 na efektorskim T ćelijama dovodi do različitih ishoda, uz CD28 pokretanje T ćelijske aktivacije i CTLA-4 koji izaziva inhibiciju T ćelija.

[0003] Pošto je CD28 konstitutivno eksprimiran u T ćelijama i eksprimiranje CTLA-4 se indukuje samo nakon aktivacije T ćelija, dostižući vrh 2-3 dana kasnije (Jago i dr., (2004) Clinical & Experimental Immunology, 136: 463-471), ekstenzivna T ćelijska aktivacija bi se desila pre uključivanja CTLA-4. Stoga, glavna uloga CTLA-4 je da deluje kao zaštita od prekomernog T ćelijskog odgovora umesto da inhibira aktivaciju T ćelija. Međutim, rano uključivanje CTLA-4 pomoću njegovog liganda i njegovog kasnijeg ukrštanja sa T ćelijskim receptorom (TCR) može prevremeno otežati TCR signalizaciju, uzrokujući T ćelijsku inhibiciju i hiporesponsivnost, ili anergiju. Ovaj koncept je eksperimentalno potvrđen korišćenjem različitih postupaka, uključujući sledeće: (i) ukrštanje antitela koja aktivira T ćelije (anti-CD3/antiCD28) koristeći agonistička anti-CTLA-4 antitela ko-imobilizacijom na perlama ili preko sekundarnog antitela (Blair i dr., (1998) J. Immunol.160: 12-15; Krummel and Allison, (1996) J Exp Med 183:2533-2540; Walunas i dr., (1996) J. Exp. Med.183:2541-2550); (ii) molekularni inženjering agonističkog scFv na površinu vezan za CTLA-4 na APC (Fife i dr., (2006) J. Clin. Invest.116(8):2252- 61; Griffin i dr., (2001) J. Immunol. Methods.

248(1-2):77-90; Griffin i dr., (2000) J. Immunol. 164(9):4433-42); i (iii) hemijsku supstancu koja prepoznaje specifične antigene na APC za agonističko anti-CTLA-4 antitelo (Li i dr., (2007). J. Immunol. 179(8):5191-203; Rao i dr., (2001) Clin. Immunol.101(2):136-45; Vasu i dr., (2004) J. Immunol.173(4):2866- 76). Fife i dr. (2006) J. Clin. Invest.116(8):2252-2261 opisuje transgenogi (Tg) miša koji eksprimira jednolančani, membransko-vezani anti-CTLA-4 Ab (scFv) na B ćelijama. Navodi se da su B ćelije od scFv Tg+ miševa (scaCTLA4 ) sprečile proliferaciju T ćelija i proizvodnju citokina u mešovitim reakcijama limfocita.

[0004] Vraćanje ravnoteže Tregova u odnosu na efektorske T ćelije je obećavajući način za tretiranje autoimunih bolesti. Međutim, ćelijska terapija koja uključuje transfer Tregova ima određena ograničenja. Shodno tome, što pre su potrebni terapeutici koji mogu izazvati generisanje Tregova (npr., CTLA-4) na antigen-specifičan način, za tretiranje autoimunih bolesti.

Suština pronalaska

[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na ligande koji ukrštaju ligand-uključeni citotoksični T limfocitni antigen-4 (CTLA-4) u T ćelijski receptor (TCR) tokom rane faze aktivacije T ćelija i na taj način oslabljuju TCR signalizaciju, što dovodi do inhibicije T ćelija. Kako bi se razvio agens koji može inhibirati aktivaciju T ćelija, generiše se bispecifični fuzioni protein koji sadrži delove koji selektivno vezuju i aktiviraju CTLA-4 i ko-ligiraju ga do generisanog TCR. Za razliku od pristupa stanja tehnike, bispecifični fuzioni protein je dizajniran da ukršta MHC uzaCTLA-4; oba se zatim vuku do TCR, generišući tri-molekularni kompleks CTLA-4/MHCII/TCR u okviru imunih sinapsi.

[0006] Ukrštanje ligand-uključenog citotoksičnog T-limfocitnog antigena-4 (CTLA-4) za TCR sa bispecifičnim fuzionim proteinom (BsB) koji sadrži mutantni CD80 i antigen-3 za aktiviranje limfocita u alogenim MLR oslabljuje TCR signalizaciju i direktnu T ćelijsku diferencijaciju prema Foxp3<+>regulatornim T ćelijama (Treg). Kao što je ovde opisano, antigen-specifični Tregovi mogu takođe biti indukovani u antigen-specifičnom okruženju. Tretman ne-gojaznih dijabetičkih (NOD) miševa sa kratkim tokom BsB umereno je odložio pojavu autoimunog dijabetesa tipa 1 (T1D) sa prolaznim povećanjem Tregova u krvi.

Međutim, duži tok tretmana NOD životinja sa BsB značajno je odložio početak bolesti, kao što je i smanjio pojavu životinja koje su imale dijabetes. Histopatološka analiza pankreasa miševa tretiranih sa BsB koji su ostali ne-dijabetički otkrila je prisustvo Tregova koji su se mešali sa drugim CD3<+>T ćelijama i ne-T ćelijskim leukocitima oko ostrva. Ovaj peri-insulitis je povezan sa minimalnim invazivnim insulitisom, i nema značajnog uništenja ćelija koje proizvode insulin. Tako, bifunkcionalni proteini sposobni za uključivanje CTLA-4 i MHCII i indirektno ko-ligiranje na TCR mogu indukovati antigen-specifične Tregove in vivo za zaštitu miševa od T1D ili drugih autoimunih bolesti.

[0007] Konkretno, obelodanjenje opisuje bispecifične fuzione proteine koji unakrsno povezuju CTLA-4 sa pMHCII kompleksom. Na primer, opisan je bispecifični fuzioni protein koji sadrži mutantni CD80 (CD80w88a) i antigen-3 aktivacije limfocita (LAG-3) koji je dizajniran da istovremeno uključi CTLA-4 i unakrsno ga povezuje sa TCR preko pMHCII. U prvom aspektu, prema tome, pružena je bispecifični biološki lek koji sadrži ligand specifičan za CTLA-4 i ligand specifičan za pMHC kompleks.

[0008] U jednom aspektu, obelodanjenje pruža bispecifični biološki lek koji sadrži ligand specifičan za CTLA-4 i ligand specifičan za pMHC kompleks. Bispecifičnog biološkog leka prema obelodanjenju su sposobne za ukrštanje CTLA-4, prisutnog na T-ćelijama, sa kompleksom MHC peptida (pMHC) na antigen prezentujućim ćelijama (APC). Kompleks MHC peptida vezuje srodni T-ćelijski receptor (TCR) na T-ćelijama, što znači da bispecifičnog biološkog leka prema obelodanjenju dovode do tripartitnog CTLA-4/MHC/TCR kompleksa.

U prvom aspektu pronalaska, pružen je bispecifični fuzioni protein koji sadrži ligand specifičan za CTLA-4 i ligand specifičan za pMHC kompleks, gde su ligand specifični za CTLA-4 i ligand specifičan za pMHC kompleks raspoređeni pored veznika. Dalja otelotvorenja predmetnog pronalaska su navedena u priloženim patentnim zahtevima.

Kad se ovde koristi, izraz „otelotvorenje“ odnosi se na otelotvorenja pronalaska i/ili na obelodanjenja, kako je odgovarajuće.

U različitim otelotvorenjima aspekata izloženih ovde, ligand specifičan za CTLA-4 je izabran od antitela specifičnog za CTLA-4, i CD80 (B7-1) ili CD86 (B7-2). U konkretnom otelotvorenju, antitelo specifično za CTLA-4 i CD80 (B7-1) ili CD86 (B7-2) je agonistično antitelo. Antitela specifična za CTLA-4 mogu biti dizajnirana, a CD80 i CD86 su prirodni ligandi za CTLA-4. U jednom aspektu koristi se CD80 ili njegov mutant, s obzirom da se CD80 poželjno vezuje za CTLA-4 preko CD28 i na taj način promoviše inaktivaciju T-ćelija za razliku od aktivacije.

[0009] U različitim otelotvorenjima aspekata izloženim ovde, ligand specifičan za pMHC kompleks može se izabrati od anti-MHC antitela i LAG-3. LAG-3 polipeptid je prirodni ligand za MHCII protein. U jednom otelotvorenju, MHC je MHC-II (koji interakuje sa CD4<+>T-ćelijama). U još jednom otelotvorenju MHC je MHC-I, koji je u interakciji sa CD8<+>T-ćelijama.

[0010] U bispecifičnom biološkom leku prema obelodanjenju, ligand specifičan za CTLA-4 i ligand specifičan za pMHC kompleks su poželjno razmaknuti veznikom. Veznik može imati oblik jedne ili više poliaminokiselinske sekvence i Fc domena antitela. Pogodna sekvenca poliaminokiseline je G9 (Gly-9).

[0011] U različitim otelotvorenjima aspekata izloženih ovde, ligand specifičan za CTLA-4 je CD80 ili njegov mutant koji je mutiran da poveća specifičnost za CTLA-4 preko CD28. U jednom otelotvorenju, mutirani CD80 sadrži jednu ili više mutacija izabranih od W88A, K75G. K75V, S112G, R126S, R126D, G127L, S193A, i S204A, koristeći numerisanje sekvence po CD80 prekursora miša ili njihovih ljudskih CD80 pandana (W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, i S201A) i dodatno R63A, M81A, N97A, E196A.

[0012] U jednom otelotvorenju, bispecifični biološki lek sadrži CD80, koji obuhvata mutaciju W84A (čovek) ili W88A (miš).

[0013] U određenom otelotvorenju, ligand specifičan za MHCII kompleks je LAG-3.

Pogodno, LAG-3 je mutiran da poveća specifičnost za pMHCII. Na primer, LAG-3 sadrži jednu ili više mutacija izabranih od R73E, R75A, R75E i R76E (Huard i dr., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.94(11): 5744-5749. U jednom otelotvorenju, LAG-3 sadrži R75E mutaciju.

[0014] Poželjno vezivanje bispecifičnog fuzionog proteina u CTLA-4 preko CD28 postignuto je korišćenjem mutantnog CD80 (CD80w88a), koji sadrži alanin umesto triptofana kod aminokiseline 88 (numerisan po mišjem CD80) kao ligand. CD80w88a vezuje CTLA-4, ali pokazuje minimalni afinitet za CD28 (Wu i dr., (1997), J. Exp. Med.185:1327-1335).

[0015] Gen-3 aktivacije limfocita (LAG-3), prirodni ligand MHCII, izabran je kao druga komponenta vezivanja bispecifičnog fuzionog proteina (Baixeras i dr., (1992) J. Exp. Med.

176:327- 337; Triebel i dr., (1990) J. Exp. Med.171:1393-1405). Pokazujemo da fuzioni protein sa takvom bi-funkcionalnošću efikasno inhibira aktivaciju T ćelija i stimuliše proizvodnju protivupalnih citokina IL-10 i TGF-β. Još važnije, ovaj bispecifični fuzioni protein takođe je usmerio T ćelijsku diferencijaciju u visoko supresivne Foxp3<+>Tregove. Ovo se nije dogodilo kada je umesto njega korišćen dobro poznati ko-stimulatorni inhibitor CTLA-4Ig (Bluestone i dr., (2006) Immunity 24:233-238; Linsley and Nadler (2009) Immunol. Rev. 229:307-32). Stoga, rano uključivanje CTLA-4 i ukrštanje CTLA-4 sa TCR tokom aktivacije T ćelija može aktivno uticati na T-ćelijsku diferencijaciju. Takvi bispecifični fuzioni proteini mogu na taj način predstavljati novu klasu biološkog leka koja bi se mogla koristiti za kontrolu prekomernih T ćelijskih odgovora u autoimunim bolestima.

[0016] U dodatnom aspektu obelodanjenja, pružena je upotreba bispecifičnog biološkog leka koja sadrži ligand specifičan za CTLA-4 i ligand specifičan za pMHC kompleks u skladu sa prvim aspektom pronalaska, za toleranciju T-ćelija dovođenjem u dodir pomenute T ćelije sa antigen prezentujućom ćelijom, koja prezentuje peptid izveden iz pomenutog antigena složenog sa molekulom MHC i navedenom bispecifičnim biološkim lekom.

[0017] U dodatnom aspektu obelodanjenja, pružena je upotreba bispecifičnog biološkog leka koji sadrži ligand specifičan za CTLA-4 i ligand specifičan za pMHC kompleks u skladu sa prvim aspektom pronalaska, u tretiranju bolesti izabrane od autoimunog oboljenja i odbacivanja transplanata.

[0018] Na primer, autoimuno oboljenje je dijabetes tipa 1 (T1D, Sistemski lupus eritematosus (SLE), reumatoidni artritis (RA) i upalna bolest creva (IBD) (uključujući ulcerativni kolitis (UC) i Kronovu bolest (CD)), multipla skleroza (MS) skleroderma i druge bolesti i poremećaji, kao što su PV (pemphigus vulgaris), psorijaza, atopijski dermatitis, celijačna bolest, hronična opstruktivna bolest pluća, Hašimotov tiroiditis, Grejvs-Bazedovljeva bolest (tiroidna žlezda), Sjogrenov sindrom, Gijen-Bareov sindrom, Gudpasterov sindrom, Edisonova bolest, Vegenerova granulomatoza, primarna bilijarna skleroza, sklerozni holangitis, autoimuni hepatitis, polimialgija reumatika, Rejnoov fenomen, temporalni arteritis, arteritis gigantskih ćelija, autoimuna hemolitička anemija, perniozna anemija, nodoza poliarteritisa, Behčetova bolest, primarna bilijarna ciroza, uveitis, miokarditis, reumatska groznica, ankilozni spondilitis, glomerulonefritis, sarkoidoza, dermatomiozitis, mijastenija gravis, polimiozitis, alopecia areata, i vitiligo.

[0019] U sledećem aspektu obelodanjenja, pružen je postupak tolerisanja T ćelije na antigen, koji obuhvata dovođenje u dodir pomenute T ćelije sa antigen prezentujućom ćelijom koja prezentuje peptid izveden iz pomenutog antigena složenog sa molekulom MHC i bispecifičnog biološkog leka prema prvom aspektu pronalaska.

[0020] U sledećem aspektu obelodanjenja, pružen je postupak za tretiranje pacijenta koji pati od stanja koje je izabrano od autoimune bolesti i odbacivanja transplanata, koji obuhvata korake davanja pacijentu kom je to potrebno bispecifičnog biološkog leka koji sadrži ligand specifičan za CTLA-4 i ligand specifičan za pMHC kompleks prema prvom aspektu pronalaska.

[0021] Na primer, autoimuna bolest je dijabetes tipa 1 (T1D).

Opis slika

[0022]

Slika 1. Dizajn BsB i BSBΔ. (A) Šematski crteži BsB (bispecifični biološki lekovi) i BsBΔ fuzionih proteina. (B) Šematski crtež pMHCII, TCR i ko-stimulatornih molekula u imuno sinapsi, kao i predložena shema za ukrštanje CTLA-4 sa TCR posredstvom TCB preko CTLA-4/MHC 11/TCR tri-molekularnog kompleksa.

Fuzioni protein uključi CTLA-4 i indirektno ligira TCR putem vezivanja na MHCII u imuno-sinapsi. Dve pune strane trougla označavaju ukrštanje MHCII i CTLA-4, kao i MHCII i TCR; isprekidana strana prikazuje ligiranje CTLA-4 na TCR. Tačkasta linija ukazuje na inhibiciju TCR signalizacije pomoću BsB-uključenog CTLA-4. C.

Šematski crtež koji pokazuje da je akcija BsBΔ slična onoj iz BsB osim što nije u stanju da ligira TCR.

Slika 2. Inhibicija alogene T ćelijske aktivacije pomoću BsB u mešovitoj reakciji limfocita. Naivne T ćelije iz C57BL/6 i miševa tretirane sa LPS i ozračene sa BALB/c APC su pomešane sa test konstruktima u trajanju od 2 dana. Medijumi kulture su zatim sakupljeni i analizirani za IL-2. Samo BsB i CTLA-4Ig inhibiraju aktivaciju T ćelija, što ukazuje smanjena količina IL-2 u medijumu. Slika je reprezentativna za više od pet nezavisnih, ali sličnih studija.

Slika 3. Indukcija Foxp3<+>Tregova i proizvodnja IL-10 i TGF-β od strane BsB.

(A) Alogene mešovite reakcije limfocita su postavljene kao što je opisano u legendi na Slici 2, koristeći naivni CD4<+>CD62L<hi>CD25-GFP " ćelije koje su bile izolovane iz Foxp3-EGFP knock miševa u prisustvu test konstrukta. Pet dana nakon aktivacije, CD4<+>T ćelije su analizirane za GFP eksprimiranje protočnom citometrijom. Tregovi su zatvoreni kao GFP+ i CD25+ ćelije. Tretman sa samim BsB doveo je do GFP eksprimiranja, što ukazuje na indukciju Foxp3<+>Tregova (srednji levi panel).

Medijumi kulture su sakupljeni za analizu citokina (desni paneli), koji su otkrili povišene nivoe IL-10 i TGF-β u prisustvu BsB. Podaci su reprezentativni za brojne nezavisne, ali slične studije. (B) Potreba autokrina TGF-β za Treg indukciju je indikovana kompletnom blokadom Treg indukcije u prisustvu blokirajućeg antitela na TGF-β, gde kontrolno antitelo nije primetno uticalo na Treg indukciju.

Slika 4. BsB-posredovana indukcija antigen-specifičnih Tregova in vitro. (A) In vitro indukcija Ova233-339-specifičnih Tregova. Naivne OT-II T ćelije su pomešane sa LPS-aktiviranim i ozračenim sinegetskim APC u prisustvu 0,5 μg/ml Ova233-339peptida. Kontrole mIGg2a, BsB i BsB plus anti-TGF-β antitelo (αTGF-β) su zatim dodate i testirane kako je naznačeno (levi paneli). Ćelije su kultivisane tokom 5 dana, i zatim su označene sa anti-CD25 i anti-Foxp3 antitelima pre nego što se analiziraju protočnom citometrijom. IL-2, IL-10 i TGF-β nivoi u kulturi su analizirani pomoću ELISA (desni paneli). (B) Praćenje indukovane proliferacije Tregova. Istraživanja su sprovedena kao u A, izuzev što su naivne OT-II T ćelije prethodno obeležene sa CFSE pre nego što su se mešale sa APC. Ćelije su postavljene na Foxp3 i CFSE fluorescentnim kanalima.

Slika 5. Supresivna funkcija BsB-indukovanih Tregova. (A) BsB- ili TGF-βindukovani Tregovi su prečišćeni protočnom citometrijom i pomešani sa CFSE-označenim T-ćelijama naivnih respondera pripremljenim od C57BL/6 miševa pri naznačenim odnosima u transkomoricama (ispunjene kolone) ili redovnim komoricama za kulturu (otvorene kolone). LPS tretirani alogeni BALB/c APC su dodati da stimulišu aktivaciju T ćelija. Rezultati (srednja vrednost standardna devijacija) ukazuju na procenat proliferacionih responder T-ćelija (Tresp), na osnovu razređivanja CFSE bez Tregova (samo Tresp APC) na 100%. (B) Anti-IL-10 i anti-TGF-β antitela su dodata u ćelije u redovnim komoricama za kulturu pri odnosu Tresp:Treg od 1:1 kako bi se utvrdio doprinos citokina u proliferaciji T ćelija. Anti-TGF-β antitelo je delimično inhibiralo supresivnu funkciju TGF-β-indukovanih Tregova (levi panel), ali nije uticalo BsB-indukovane Trege (desni panel). Slika je reprezentativna za više od tri nezavisna, ali slična istraživanja.

Slika 6. Regulacija na dole AKT i mTOR fosforilacije od strane BsB. Naivne T ćelije su kultivisane u pločama sa 96 komorica sa okruglim dnom ko-obloženim sa anti-CD3, anti-CD28 i BsB, mišjim IgG (mIgG) ili mišjim PD-L1 (mPD-L1) tokom 18 sati. Ćelije za koje se smatra da nisu aktivirane bile su kultivisane u komoricama obloženim samo sa IgG. Status fosforilacije AKT i mTOR je zatim nadgledan protočnom citometrijom nakon bojenja sa fluorescentno označenim antitelima na fosforilovanom AKT i mTOR. MFI označava srednji intenzitet fluorescencije. Ova brojka predstavlja jedan od tri nezavisna eksperimenta.

Slika 7. Održana eksprimiranje Foxp3 u Tregovima kao odgovor na kontinuiranu stimulaciju sa BsB. Okrugle ploče sa okruglim dnom su bile obložene anti-CD3, anti-CD28 i BsB ili IgG miša. Naivne T ćelije iz Foxp3-EGFP udarnih miševa su se kultivisale 5 dana da indukuju Tregove (levi paneli), koji su zatim prečišćeni iz ćelija tretiranih sa BsB (crveni kvadrat) i ponovo stimulisani u drugom krugu kulture u ko- premazane komorice, kao što je gore navedeno, tokom 5 dana, pre analize pomoću protočne citometrije za GFP+ ćelije. Ponovno kultivisanje prečišćenih Tregova sa kontrolom IgG miša tokom 5 dana rezultovalo je gubitkom Foxp3+ eksprimiranje u ~ 60% ćelija (gornjem desnom kvadrantu gornjem desnom panelu), dok je manje od 7% Tregova koje su ponovo kultivisane sa BsB izgubile Foxp3+ izraz (gornji desni kvadrant donjeg desnog panela). Ova brojka predstavlja jedan od tri nezavisna eksperimenta.

Slika 8. Farmakokinetika BsB in vivo i biohemijska analiza. (A) Farmakokinetički profil BsB kod miševa. Normalni C57BL/6 miševi (n=5) su dozirani intraperitonealno sa 20 mg/kg BsB. Uzorci krvi su sakupljeni na različitim vremenskim tačkama i BsB nivoi su određeni koristeći ELISA. (B) Upoređivanje vezivanja BsB i mišjeg IgG2a za FcRn. FcRn su imobilisani na Biacore čipu. BsB ili kontrolni mišji IgG2a je stavljen na čip u različitim koncentracijama i signali su zatim snimljeni.

Slika 9. Analiza glikozilacije povezane sa asparaginom na BsB. Serija aminokiselina iz BsB je poslata do NetNGlyc 1.0 Servera za predviđanje Asnpovezanih mesta glikozilacije. Predviđeno je ukupno 10 Asn-povezanih mesta glikozilacije (označeno N); ostale aminokiseline su predstavljene kao tačke.

Monosaharidni sastav BsB takođe je izveden kako bi se odredio sastav glikan fukoze (Fuc), N-acetilglukozamina (GlcNAc), galaktoze (Gal), manoze (Man), sijalinske kiseline (N-acetilneuramska kiselina). Odnos sijalinske kiselina:galaktoza od 0,68 pokazuje da je oko trećine ostataka galaktoze dostupno za vezivanje za receptor azijaloglikoproteina.

Slika 10. Tretman ne-dijabetičkih (NOD) miševa sa BsB odložio je početak dijabetesa tipa 1 (T1D) u paradigmi kasne prevencije. (A) Nivoi Foxp3<+>Tregova u krvi BsB-tretiranih NOD (zatvoreni krugovi, n=15) i kontrolnim fiziološkim rastvorom tretiranih NOD miševa (zatvoreni trouglovi, n=14). Postojalo je umereno, ali značajno povećanje broja Tregova u životinjama tretiranim od sa BsB u odnosu na onaj koji je zabeležen kod kontrolnih životinja. (B) Kumulativne učestalosti otvorenog dijabetesa kod NOD životinja tretiranih sa BsB (ispunjeni krugovi) ili fiziološkim rastvorom (ispunjeni trouglovi).

Slika 11. tretiranje NOD miševa sa BsB odložilo je početak T1D u paradigmi rane prevencije. (A) Nivoi Foxp3<+>Tregovi u krvi miševa tretiranih sa BsB (zatvoreni krugovi, n=10), fiziološkim rastvorom (zatvoreni trouglovi, n=10), CTLA-4Ig (zatvoreni kvadrati, n=10) i mišjim IgG2a (otvoreni kvadrati, n=10). Nije detektovano povećanje broja Foxp3<+>Tregova nakon dve nedelje tretmana sa BsB u poređenju sa kontrolama tretiranim sa fiziološkim rastvorom ili mGgG2a. Međutim, tretman sa CTLA-4Ig rezultovao je statistički značajnim smanjenjem broja Foxp3<+>Tregova u krvi. (B) Kumulativne učestalosti otvorenog dijabetesa kod životinja tretiranih sa BsB ili kontrolama. BsB tretman rezultovao je značajnim zakašnjenjem u pojavi T1D u poređenju sa kontrolnim grupama tretiranim fiziološkim rastvorom ili mišjim IgG2a pre 24 nedelje starosti (p=0,04). Međutim, na kraju studije nije zabeležena značajna razlika između grupa. Podaci predstavljaju jednu od dve odvojene studije sa sličnim rezultatima, sa ukupno 26 NOD miševa u svakoj grupi.

Slika 12. Dugotrajni tretman NOD miševa sa BsB značajno je odložio početak T1D kod NOD miševa. (A) Kumulativne učestalosti otvorenog dijabetesa kod miševa tretiranih sa BsB (n=16) i netretiranih miševa (n=16). BsB tretman značajno je smanjio učestalost T1D u poređenju sa onima tretiranim sa fiziološkim rastvorom (p<0,01). (B) Histopatološka analiza tkiva pankreasa od životinja tretiranih

1

fiziološkim rastvorom ili BsB. Paneli a-c predstavljaju sekcije od miševa tretiranih fiziološkim rastvorom koji su ostali ne-dijabetički sa H i E, antitelom za insulin ili anti-CD3 i forkhead box P3 (Foxp3). Slična opažanja su zabeležena kod NOD miševa tretiranih sa BsB koji su ostali bez bolesti. U bilo kom od sekcija nisu zabeleženi nikakvi dokazi o infiltraciji ili insulitisu; nekoliko Foxp3+Tregova mogu biti prisutni (strelice na panelu c). Paneli d-f predstavljaju pankreasne sekcije od dijabetičkih NOD životinja. Invazivni insulitis je bio očigledan, i β-ćelije koje proizvode insulin su potpuno uništene (e). Neke infiltracije CD3<+>T ćelija su takođe detektovane, zajedno sa nekoliko Tregova i mnogih leukocita koji nisu T ćelije sa plavim jedrima (f). Paneli g pokazuju ostrvca životinja koje su tretirane sa BsB, koje su ostali nedijabetičke, koja pokazuju karakteristični peri-insulitis. Zabeležene su infiltracije leukocita, ali koje su bile ograničene na periferiju ostrvaca. Štaviše, nije bilo značajnog uništavanje ćelija koje proizvode insulin. Većina leukocita na periferiji bili su ne-T ćelije (plava jedra). Uvećano ostrvce (panel j, predstavlja crveni kvadrat u i) indikovano na Foxp3<+>Tregovima (žuta strelica) je mešano sa drugim CD3<+>T ćelijama i ne-T ćelijskim leukocitima (plava jedra) na periferiji ostrvaca. Slike su dobijene sa 40x objektivom; početak je dobijen sa 60x objektivom, koji je zatim uvećan 3x digitalno.

Detaljan opis pronalaska

[0023] Ukoliko nije drugačije naznačeno, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je obično poznato od strane stručnjaka u oblasti kojoj pripada predmetni pronalazak.

[0024] Sada su opisani postupci, uređaji i materijali pogodni za takvu upotrebu. Sve publikacije citirane ovde su date u svrhu opisivanja i obelodanjenja metodologija, reagensa i alata prijavljenih u publikacijama koje se mogu koristiti u vezi sa pronalaskom.

[0025] Postupci i tehnike predmetne prijave generalno se izvode u skladu sa konvencionalnim postupcima koji su dobro poznate stručnjacima u oblasti, i kako su opisani u raznim opštim i specifičnim referencama koje se citiraju i razmatraju u celoj ovoj specifikaciji, osim ako nije drugačije naznačeno. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Pogledati, npr., Gennaro, A. R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Hardman, J. G., Limbird, L. E., and Gilman, A. G., eds.

(2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill Co.; Colowick, S.

i dr., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, D. M. , and Blackwell, C. C., eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. i dr., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. i dr., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream i dr., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C. R., i Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed., Springer-Verlag.

[0026] Izraz „antitelo“, osim ako nije drugačije naznačeno, koristi se za celokupna antitela, kao i antigen-vezujuće fragmente takvih antitela. Na primer, izraz obuhvata četiri lanca IgG molekula, kao i fragmente antitela.

[0027] Kad se ovde koristi, izraz „fragmenti antitela“ odnosi se na delove netaknutog antitela pune dužine - kao što je antigen vezujući ili varijabilni region netaknutog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente; diatela; linearna antitela; molekule jednolančanog antitela (npr., scFv); multispecifične fragmente antitela, kao što su bispecifična, trispecifična i multispecifična antitela (npr. diatela, triatela, tetratela); imunoglobulinski fuzioni proteini vezujućeg domena; kamelizovana antitela; mini tela; helirajuća rekombinantna antitela; tritela ili bitela; intratela; nanotela; mali modularni imunofarmaceutici (SMIP), VHHkoji sadrže antitela; i bilo koji drugi polipeptidi formirani od fragmenata antitela, na primer kako je dalje opisano u nastavku.

[0028] Antitela mogu biti bilo koje klase, kao što su IgG, IgA ili IgM; i bilo koje podklase, kao što su IgG1 ili IgG4. Različite klase i podklase imunoglobulina imaju različita svojstva, koja mogu biti korisna u različitim primenama.

[0029] Specifičnost, u kontekstu ovog pronalaska, zahteva da navedeno antitelo bude sposobno za selektivno vezivanje njegovog definisanog kognatnog antigena, koji je ili CTLA-4 ili pMHC kompleks.

[0030] Prirodni imunoglobulini imaju zajedničku strukturu jezgra u kojoj dva identična laka lanca (oko 24 kD) i dva identična teška lanca (oko 55 ili 70 kD) formiraju tetramer. Aminoterminalni deo svakog lanca poznat je kao varijabilni (V) region i može se razlikovati od više konzerviranih konstantnih (C) regiona ostatka svakog lanca. U varijabilnom regionu lakog lanca (takođe nazvan VLdomen) je C-terminalni deo poznat kao J region. U okviru varijabilnog regiona teškog lanca (takođe nazvan VHdomen), pored J regiona postoji i D region. Većina varijacija aminokiselinske sekvence u imunoglobulinima ograničena je na tri odvojena mesta u V regionima poznatim kao hipervarijabilni regioni ili regioni koji određuju komplementarnost (CDR) koji su direktno uključeni u vezivanje antigena. Proistekli iz amino-terminusa, ovi regioni su označeni kao CDR1, CDR2 i CDR3, respektivno. CDR se održavaju od strane više konzerviranih okvirnih regiona (FR). Polazeći od amino-terminusa, ovi regioni su označeni FR1, FR2, FR3 i FR4, respektivno. Lokacije CDR i FR regiona i sistem numeracije su definisani od strane Kabat i dr. (Kabat, E.A., i dr., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office) i ažuriranja istih koji se mogu naći na Internetu.

[0031] Humanizovano monoklonsko antitelo, kako je ovde pomenuto, je antitelo koje se sastoji od okvira ljudskog antitela, u koji su graftovani CDR iz ne-ljudskog antitela. Postupci za dizajniranje i proizvodnju humanizovanih antitela su dobro poznati u struci i opisani su, na primer, kod Cabilly i dr., US Patent br.4,816,567; Cabilly i dr., Evropska prijava patenta 0 125 023; Boss i dr., US Patent br.4,816,397; Boss i dr., Evropska prijava patenta 0120 694; Neuberger, M.S. i dr., WO 86/01533; Neuberger, M.S. i dr., Evropska prijava patenta 0194 276 B1; Winter, US Patent br.5,225,539; Winter, Evropska prijava patenta 0239 400;

Padlan, E.A. i dr., Evropska prijava patenta 0519 596. Više detalja o antitelima, humanizovanim antitelima, antitelima napravljenim od strane ljudske ruke, i postupcima za njihovu pripremu možete naći kod Kontermann, R. and Dübel, S. eds. (2001, 2010) Antibody Engineering, 2nd ed., Springer-Verlag, New York, NY, 2001.

[0032] Konstantni regioni mogu biti izvedeni iz konstantnih regiona ljudskih antitela.

Tipično, geni varijabilnog regiona su klonirani u vektore eksprimiranja u okviru sa genima konstantnih regiona kako bi eksprimirali teške i lake lance imunoglobulina. Takvi vektori eksprimiranja mogu se, zarad sinteze antitela, transfektovati u ćelije domaćine koji proizvode antitela.

[0033] Potrebna varijabilni i konstantni regioni antitela mogu biti izvedeni iz baza podataka sekvenci. Na primer, imunoglobulinske sekvence dostupne su u bazi podataka IMGT/LIGM (Giudicelli i dr., (2006) Nucleic Acids Res. 34:(suppl. 1):D781-D784) ili VBase (vbase.mrccpe.cam.ac.uk).

1

[0034] „Nukleinske kiseline“ kad se ovde pominju obično uključuju DNK molekule koji kodiraju antitela predmetnog pronalaska. Poželjni su vektori eksprimiranja koji su pogodni za eksprimiranje gena antitela u ćeliji domaćina. Vektori eksprimiranja i ćelije domaćina za eksprimiranje gena antitela su poznati u struci; pogledati, na primer, Morrow, K.J. (2008) Genetic Engineering & Biotechnology News. (June 15, 2008) 28(12), and Backliwal, G., i dr. (2008) Nucleic Acids Res. 36(15): e96-e96.

[0035] „CD80“, kad se ovde koristi, odnosi se na sisarski CD80 antigen kao i na njegove mutante koji imaju povećan aviditet vezivanja ili specifičnost za CTLA-4. Pogledati Linsley i dr., (1994) Immunity 1:793-801, and Wu i dr., (1997) J. Exp. Med.185(7):1327-1335.

Sisarski CD80 se može izabrati od glodara, kao što je miš, ili ljudskog CD80.

[0036] „CD86“, kad se ovde koristi, odnosi se na sisarski CD86 antigen, kao i na njegove mutante koji imaju povećanu aviditet vezivanja ili specifičnost za CTLA-4. Pogledati Linsley i dr., (1994) Immunity 1:793-801. Sisarski CD86 se može odabrati od glodara, kao što je miš ili ljudskog CD86.

[0037] „CTLA-4“, kad se ovde koristi, odnosi se na sisarski citotoksični limfocit-povezan antigen-4 (CTLA-4). Sekvenca ljudskog CTLA-4 može se naći u GenBank, pristupni broj AAH74893.1, GI: 49904741. Sisarski CTLA-4 se može odabrati od glodara, kao što je miš ili ljudskog CTLA-4.

[0038] „LAG-3“, kad se ovde koristi, odnosi se na sisarski antigen 3 aktivacije limfocita (LAG-3). Sekvenca za ljudski LAG-3 se može naći kod Huard i dr., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 94:5744-5749. Sisarski LAG-3 se može odabrati od glodara, kao što je miš, ili ljudskog LAG-3.

[0039] „MHC“ je kompleks koji je uključen u prezentovanje peptida izvedenih iz antigena, od strane antigen prezentujućih ćelija, što je prepoznato od strane TCR. U određenom aspektu, MHC je MHCII, koji prezentuje antigen CD4<+>pomoćne T-ćelije. Pogledati, na primer, Wucherpfennig i dr., CSH Perspect. Biol.2(4): a005140, epub 2010 Mar 17.

[0040] Bispecifični biološki lek, koji se može nazvati bispecifičnim ligandom, je ligand koji je sposoban da istovremeno vezuje, ili da je vezan, za dva cilja. Bispecifična antitela su poznata u struci i dalje su opisana u nastavku. U kontekstu predmetnog obelodanjenja, uključujući predmetni pronalazak, dva cilja su molekul CTLA-4 na T-ćeliji i kompleks MHC peptida na APC. Bispecifični biološki lek u skladu sa obelodanjenjem može ukrstiti dva cilja; zahvaljujući vezivanju pMHC na TCR u imuno-sinapsi, stoga ukršta molekul CTLA-4 sa TCR. „Biološki lek“ je, uopšteno govoreći, biološki terapeutik ili agens, koji može biti koristan za, između ostalog, terapeutske, dijagnostičke i/ili istraživačke svrhe.

[0041] Veznik je bilo koja aminokiselinska sekvenca koja se povezuje i odvaja dva polipeptidna domena u proteinu. U kontekstu bispecifičnog liganda prema pronalasku, veznik je sekvenca koja pridružuje CTLA-4 ligand sa MHC ligandom. Primerni veznici su sekvence aminokiseline, kao što je poliglicin, na primer Gly-9. Alternativni veznik je Fc region antitela. Takav veznik se prostire duž dva domena liganda za oko 120Å.

[0042] Ligand prema pronalasku može sadržati ligande antitela i ne-antitela u bilo kojoj kombinaciji. Na primer, CTLA-4 ligand može biti anti-CTLA-4 antitelo, i MHC ligand može biti LAG-3. Alternativno, CD80 se može koristiti kao CTLA-4 ligand, u kombinaciji sa LAG-3 ili anti-MHC antitelom. Oba liganda mogu biti antitela, ili oba mogu biti prirodni ligandi, CD80 i LAG-3.

Citotoksični antigen-4 povezan sa limfocitima (CTLA-4)

[0043] Citotoksični antigen-4 povezan sa limfocitima (CTLA-4), poznat i kao CD152, je negativni regulator T ćelijskog odgovora, koji igra važnu ulogu u održavanju homeostaze T ćelija i indukciji samo-tolerancije (Karandikar i dr., (1996) J Exp Med 184:783-788;

Krummel and Allison, (1995) J Exp Med 182:459-465; Linsley and Golstein, (1996) Curr Biol 6:398-400; Walunas and Bluestone, (1998) J Immunol 160:3855-3860; Walunas i dr., (1994) J Immunol 160:3855-3860). Miševi deficijentni sa CTLA-4 razvijaju multi-organske autoimune bolesti i obično podležu bolesti do 4 nedelje starosti (Tivol i dr., (1995) Immunity 3:541-547; Waterhouse i dr., (1995) Science 270:985-988). Molekularni mehanizmi pomoću kojih CTLA-4 moduliše T ćelijsku aktivnost su višestruki i smatra se da se javljaju ili intrinsički na konvencionalnim T ćelijama ili ekstrinsički kroz regulatorne T ćelije (Treg) (Ise i dr., (2010) Nat Immunol 11:129-135; Jain i dr., (2010) Proc Natl Acad Sci U S A 107:1524-1528; Paterson and Sharpe, (2010) Nat Immunol 11:109-111).

[0044] Ovi mehanizmi uključuju nadmetanje sa CD28 za vezivanje liganda (Linsley i dr., (1994) Immunity 1:793-801), indukujući proizvodnju tolerogene enzim indoleamin 2,3

1

diokigenaze u APC (Grohmann i dr., (2002) Nat Immunol 3:1097-1101; Onodera i dr., (2009) J Immunol 183:5608-5614), i pomeranje CD28 iz imunološke sinapsa (Pentcheva-Hoang i dr., (2004) Immunity 21:401-413). CTLA-4 je homologan ko-stimulacionom molekulu CD28 i deli iste ligande, CD80 (B7.1) i CD86 (B7.2), koji su eksprimirani na površini antigen prezentujućih ćelija (APC). Međutim, diferencijalno vezivanje CD80/CD86 za APC na CD28 i CTLA-4 na efektorskim T ćelijama dovodi do suprotstavljenih ishoda, gde CD28 pokreće T ćelijsku aktivaciju i CTLA-4 izaziva inhibiciju T ćelija. Uključivanje CTLA-4 pomoću njegovih liganda (CD80/86) na APC takođe stimuliše regrutovanje SHP-1 fosfataza (Guntermann and Alexander, (2002) J Immunol 168:4420-4429) i PP2A (Baroja i dr., (2002) J 168:5070-5078; Chuang i dr., (2000) Immunity 13:313-322) u okolinu TCR T ćelija koje su pod aktivacijom. Posledična defosforilacija ključnih signalnih molekula povezanih sa TCR rezultuje u završetku aktivacije T ćelija (Griffin i dr., (2000) J Immunol 164:4433-4442). Štaviše, intervencije koje promovišu rano uključivanje CTLA-4 sa svojim ligandima i ukrštanje sa TCR rezultuju u prevremenom opadanju ključnih signalnih signatura i posledičnoj inhibiciji aktivacije T ćelija, što dovodi do hipotermibilnosti ili anergije T ćelija (Blair i dr., (1998) Immunol 160:12-15; Griffin i dr., (2000) J Immunol 164:4433-4442; Krummel and Allison, (1996) J Exp Med 182:459-465; Walunas i dr., (1996) J Exp Med 183:2541-2550).

[0045] Za promovisanje ukrštanja CTLA-4 sa TCR tokom rane faze aktivacije T ćelija generisan je bispecifični fuzioni protein (označen kao „BsB“) koji sadrži mutant CD80 (CD80w88a) i gena-3 aktivacije limfocita (LAG-3). BsB je dizajniran da istovremeno uključi CTLA-4 i MHCII u imuno sinapse i samim tim ih indirektno ukršta za TCR preko kognatnog uparivanja MHCII sa TCR (Karman i dr., (2012) J Biol Chem epub 2012 Feb 15). U alogenom MLR, pokazalo se da je BsB efikasan kod inhibicije aktivacije T ćelija.

Iznenađujuće, BsB je takođe indukovao proizvodnju IL-10 i TGF-β i promovisao diferencijaciju T ćelija koje su pod aktivacijom za Treg. IL-10 može vršiti široka imuno supresivna svojstva kroz svoju sposobnost da kontroliše aktivaciju makrofaga i dendritskih ćelija (DC), kao i samo-regulišućih Th1 ćelija (Ohata i dr., (2007) Arthritis Rheum 56:2947-2956). TGF-β može delovati kao inhibitor diferencijacije T ćelija (Kehrl i dr., (1986) J Exp Med 163:1037-1050), aktivacije makrofaga (Tsunawaki i dr., (1988) Nature 334:260-262; Wahl i dr., (1990) Ann N YAcad Sci 593:188-196) i sazrevanja dendritskih ćelija (Steinman i dr., (2003) Annu Rev Immunol 21:685-711). Pored svojih protivupalnih funkcija, IL-10 i TGF-β takođe mogu navodno uticati na Treg funkciju. Na primer, pokazalo se da IL-10 indukuje IL-10 koji proizvodi Tr1 ćelije (Roncarolo i dr., (2006) Immunol Rev 212:28-50) i

1

deluje na Foxp3<+>Tregove kako bi održavao eksprimiranje Foxp3 i na taj način propagirao njihovu supresivnu funkciju (Murai i dr., (2009) Nat Immunol 10:1178-1184). Slično tome, prijavljeno je da je TGF-β neophodan za indukciju Tregova (Chen i dr., (2003) J Exp Med 198:1875-1886; Zheng i dr., (2002) J Immunol 169:4183-4189) i održavanje njihove supresivne funkcije promovisanjem Foxp3 eksprimiranja (Marie i dr., (2005) J Exp Med 201:1061-1067).

Regulatorne T ćelije (Treg)

[0046] Tregovi su funkcionalno različita subpopulacija T ćelija sposobna za kontrolu imunog odgovora na sopstvene i ne-sopstvene antigene. Nedostatak Tregova dovodi do pojačanog imunog odgovora i prezentovanja autoimunih bolesti (Sakaguchi i dr., (1995) JImmunol 155:1151-1164). Obimna istraživanja uspostavila su ulogu ovih specijalizovanih T ćelija u kontroli svih aspekata imunih odgovora, posebno u stvaranju samo-tolerancije. Bez vezivanja za određenu teoriju, ovi nalazi ukazuju na to da agensi koji su sposobni da povećaju in-situ proizvodnju Tregova ili adoptivni transfer Tregova mogu biti upotrebljeni za tretiranje autoimunih bolesti. Zaista, terapije bazirane na Treg ćelijama koje koriste sveže izolovane ili ex vivo proširene Tregove pokazale su se efikasnim u tretiranju životinjskih modela dijabetesa tipa 1 (T1D) (Tang i dr., (2004) J Exp Med 199:1455-1465; Tarbell i dr., (2007) J Exp Med 204:191-201) i graft-protiv-domaćina bolesti (Anderson i dr., (2004) ; Taylor i dr., (2002) Blood 99:3493-3499; Zhao i dr., (2008) Blood 112:2129-2138). Umesto izolacije i širenja Foxp3<+>CD4<+>CD25<+>Tregova (često označeni kao prirodni Treg ili nTreg) iz periferne krvi ili limfnih čvorova, Tregovi se mogu indukovati iz naivnih D4<+>CD25-T ćelija u kontekstu TCR aktivacije i istovremenom prisustvu TGF-β.

[0047] Ovi Tregovi se često nazivaju adaptivni Tregovi (aTreg) ili indukovani Tregovi (iTreg). Oni su takođe Foxp3<+>i navodno pokazuju jednako moćne supresivne funkcije kao nTregovi (Chen i dr., (2003) J Exp Med 198:1875-1886; Yamagiwa i dr., (2001) J Immunol 166:7282-7289; Zheng i dr., (2002) J Immunol 169:4183-4189). Pokazalo se da su adoptivni transferi aTregova ili iTregova efikasni u davanju zaštite od autoimunih bolesti u životinjskom modelu artritisa izazvanog kolagenom (Gonzalez-Rey i dr., (2006) Arthritis Rheum 54:864-876). Međutim, postaje sve očiglednije da antigen-specifični Tregovi nude značajno veći terapeutski količnik nego poliklonski Treg sa pan-TCR repertoarom (Masteller i dr., (2005) J Immunol 175:3053-3059; Tang i dr., (2004) J Exp Med 199:1455-1465;

Tarbell i dr., (2007) J Exp Med 204:191-201), sa manje potencijalnog neželjenog efekta na pan-imuno supresiju. Iz tog razloga, nastojali smo da procenimo relativne zasluge BsB pri

1

proizvodnji antigen-specifičnih Tregova u antigen-specifičnoj postavci aktivacije T ćelija in vitro. Štaviše, testirali smo njegov potencijal u tretiranju autoimunog dijabetesa kod negojaznih dijabetičkih (NOD) miševa.

Tip 1 dijabetesa

[0048] Tip 1 dijabetesa (T1D) je autoimuna bolest izazvana tkivno-specifičnim uništavanjem β-ćelija pankreasa koje proizvode insulin, sa posledičnim razvojem hiperglikemije. Negojazni dijabetički (NOD) miševi (naročito ženke miševa) spontano razvijaju autoreaktivne T ćelije prema ostrvce-specifičnim samo-antigenima (na primer, insulin i dekarboksilaza 65 glutaminske kiseline). U saradnji sa drugim limfocitima, ove autoreaktivne T ćelije započinju razvoj peri-insulitisa između 3 i 4 nedelje starosti, nakon čega sledi invazivni insulitis u pri 9 nedelja i spontani otvoreni dijabetes između 12 i 35 nedelja (Anderson i Bluestone, (2005) Annu Rev Immunol 23:447-485). NOD miševi dele mnoge sličnosti sa bolestima kod ljudskih pacijenata, kao što su proizvodnja autoantitela specifičnih za pankreas i aktivacija autoreaktivnih CD4<+>i CD8<+>T ćelija. Podložnost ovih miševa za autoimunost, kao kod ljudi, pod uticajem je gena za glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC), CTLA-4 i LAG-3. NOD miševi imaju jedinstveni haplotip velikog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) (H-2<g7>), koji navodno daje najveći rizik za podložnost bolesti (McDevitt i dr., (1996) Hormone and metabolic research 28:287-288; Wicker i dr., (1995) Annu Rev Immunol 13:179-200). Polimorfizam CTLA-4 takođe je primećen kod NOD miševa (Ueda i dr., (2003) Nature 423:506-511 i kod ljudi (Qu i dr., (2009) Genes and immunity 10 Suppl 1:S27-32) i nedostatak LAG-3 na NOD pozadini ubrzava T1D početak sa 100% penetracije (Bettini i dr., (2011) J Immunol 187:3493-3498) Budući da BsB utiče na sve ove ciljeve, terapeutske zasluge BsB su testirane u ovom mišjem modelu T1D.

Antitela

[0049] Predmetni pronalazak obuhvata antigen-vezujuće fragmente antitela prikazanih u patentnim zahtevima. Kad se ovde koristi, izraz „fragmenti“ se odnosi na delove netaknutog antitela pune dužine - kao što je vezivanje antigena ili varijabilni region netaknutog antitela. Primeri fragmenata antitela su navedeni iznad.

[0050] Izraz „fragmenti“ kad se ovde koristi odnosi se na fragmente sposobne za vezivanje određenih ciljeva, CTLA-4 molekula ili pMHC kompleksa. Ovim fragmentima može nedostajati Fc fragment netaknutog antitela, mogu se brzo čistiti iz cirkulacije i mogu imati manje nespecifičnog vezivanja tkiva nego netaknuto antitelo. Ovi fragmenti mogu se

1

proizvoditi iz netaknutih antitela koristeći dobro poznate postupke, na primer proteolitičko cepanje sa enzimima kao što je papain (za proizvodnju Fab fragmenata) ili pepsin (za proizvodnju F(ab')2fragmenata) ili eksprimiranje takvih fragmenata rekombinantnom tehnologijom.

[0051] Antitela i fragmenti takođe obuhvataju jednolančane fragmente antitela (scFv) koji se vezuju za molekul CTLA-4 ili pMHC kompleks. ScFv sadrži varijabilni region teškog lanca antitela (VH) operativno povezan sa varijabilnim regionom lakog lanca antitela (VL) gde varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, zajedno ili pojedinačno, formiraju vezujuće mesto koje vezuje molekul CTLA-4 ili pMHC kompleks. ScFv može sadržati VHregion na terminalu amino terminala i VLregion na karboksi-terminalu.

Alternativno, scFv može sadržati VLregion na kraju amino-terminala i VHregion na kraju karboksi-terminala. Pored toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirani sa odvojenim genom, mogu se povezati, koristeći rekombinantne postupke, sintetičkim veznikom koji im omogućava da budu napravljeni kao pojedinačni proteinski lanac u kome se VLi VHregioni uparuju za formiranje monovalentnih molekula (poznatih kao jednolančani Fv (scFv)). ScFv može opciono dalje da sadrži polipeptidni veznik između varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca.

[0052] Antitela i fragmenti takođe obuhvataju fragmente domena antitela (dAb) kako je opisano kod Ward, E.S. i dr. (1989) Nature 341:544-546, koje se sastoje od VHdomena.

[0053] Antitela i fragmenti takođe obuhvataju antitela teških lanaca (HCAb). Ova antitela izgleda mogu da oblikuju regione koji se vezuju za antigen koristeći samo varijabilni region teškog lanca, jer su ova funkcionalna antitela dimeri samo teških lanaca (poznati kao „antitela teškog lanca“ ili „HCAbs“). Prema tome, antitela i fragmenti mogu biti antitela teškog lanca (HCAb) koja se specifično vezuju za CTLA-4 ili pMHC ciljeve.

[0054] Antitela i fragmenti takođe obuhvataju antitela koja su SMIP ili fuzioni proteini imunoglobulina vezujućeg domena specifični za CTLA-4 ili pMHC mete. Ovi konstrukti su jednolančani polipeptidi koji sadrže antigen vezujuće domene fuzionisane na domene imunoglobulina neophodne za izvršavanje efektorskih funkcija antitela (pogledati WO 2005/017148).

[0055] Antitela i fragmenti takođe obuhvataju dijatela. Ovo su bivalentna antitela u kojima su

1

VHi VLdomeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali koristeći veznik koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu. Ovo usmerava domene da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca, i time stvaraju dva mesta za vezivanje antigena (pogledati, na primer, WO 93/11161). Dijatela može biti bispecifična ili monospecifična.

[0056] Antitelo ili njegov fragment antitela prema pronalasku nema reakciju ukrštanja sa bilo kojim ciljem osim nameravanih CTLA-4 ili pMHC ciljeva.

[0057] Antitela i fragmenti mogu sami po sebi biti bispecifični. Na primer, bispecifična antitela mogu da liče na pojedinačna antitela (ili fragmente antitela), ali da imaju dva različita mesta za vezivanje antigena (varijabilni regioni). Bispecifična antitela mogu se proizvoditi različitim postupcima - kao što su hemijske tehnike, tehnike „polidoma“ ili tehnike rekombinantne DNK. Bispecifična antitela mogu imati vezivne specifičnosti za najmanje dva različita epitopa, na primer jedan epitop na svakom od CTLA-4 i pMHC ciljeva.

[0058] Bispecifična antitela koja sadrže komplementarne parove VHi VLregiona su poznata u struci. Ova bispecifična antitela sadrže dva para VHi VL, svaki VHVLpar vezivanja na jedan antigen ili epitop. Takva bispecifična antitela uključuju hibridne hibridome (Milstein, C. and Cuello, A.C., (1983) Nature 305 (5934): 537-40), minitela (Hu i dr., (1996) Cancer Res. 56:.3055-3061)), diatela (Holliger i dr., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; WO 94/13804), helirajuća rekombinantna antitela (CRAb) (Neri i dr., (1995) J. Mol. Biol. 246,367- 373), biscFv (npr., Atwell i dr., (1996) Mol. lmmunol.33:1301-1312), „knobs in holes“ stabilizovana antitela (Carter i dr., (1997) Protein Sci.6:781-788). U svakom slučaju svaka vrsta antitela sadrži dva antigen vezujuća mesta, od kojih je svaki oblikovan komplementarnim parom VHi VLdomena. Svako antitelo je time u stanju da se vezuje za dva različita antigena ili epitopa u isto vreme, sa vezivanjem za svaki antigen ili epitop, posredovan sa VHi njegovim komplementarnim VLdomenom.

[0059] Opisana su prirodna autoantitela koja su poliaktivna (Casali and Notkins (1989) Ann. Rev. Immunol. 7: 515-531), reagujući sa najmanje dva (obično više) različitih antigena ili epitopa koji nisu strukturno povezani. Takođe je pokazano da će selekcije nasumičnih peptidnih repertoara koristeći tehnologiju prikaza faga na monoklonskom antitelu identifikovati niz peptidnih sekvenci koje se uklapaju u mesto vezivanja antigena. Neke od ovih sekvenci su veoma povezane, prilagođavajući konsenzusnu sekvencu, dok su druge

2

veoma različite i nazivaju se mimotopima (Lane and Stephen (1993) Current Opinion in Immunology 5:268-271). Stoga je jasno da mesto vezivanja antitela, koje sadrži pridruženi i komplementarne VHi VLdomene, ima potencijal da se vezuje za mnoge različite antigene iz velikog univerzuma poznatih antigena.

[0060] WO 03/002609 (Domantis) opisuje proizvodnju dvojnih specifičnih antitela u kojima svaki VHVLpar poseduje dvostruku specifičnost, tj. sposobnost vezivanja dva epitopa na istim ili različitim antigenima. Konformacija može biti otvorena ili zatvorena; u otvorenoj konformaciji, dva epitopa mogu biti vezana istovremeno, ali u zatvorenoj konformaciji vezivanje za prvi epitop sprečava ili obeshrabruje vezivanje za drugi.

[0061] Proteini bez imunoglobulina sa višestrukim vezivnim specifičnostima poznati su u prirodi; na primer, određeni broj transkripcionih faktora vezuje i DNK i druge proteinske molekule. Međutim, postupci za odabir vezujućih peptida u stanju tehnike samo biraju peptide sa pojedinačnim, ne dvojnim ili višestrukim specifičnostima.

[0062] Različiti istraživački timovi su prethodno vezali polipeptide sa ostacima cisteina za sintetičke molekulske strukture (Kemp, D. S. and McNamara, P. E., (1985) J. Org. Chem. Timmerman, P. i dr., (2005) ChemBioChem. 6(5):821-4). Meloen i saradnici su koristili tris(bromometil)benzen i srodne molekule za brzu i kvantitativnu ciklizaciju višestrukih peptidnih petlji na sintetičke skele za strukturnu mimikriju proteinskih površina ((Timmerman, P. i dr., (2005) ibid). Postupci za generisanje kandidat jedinjenja leka u kojima se navedena jedinjenja generišu povezivanjem polipeptida koji sadrže cistein za molekulsku skelu kao na primer tris(bromometil)benzen, obelodanjeni su u WO 2004/077062 i WO 2006/078161. Izbor takvih molekula korišćenjem tehnologije prikaza opisan je u WO 2009/098450. Dvostruka specifična otelotvorenja su dalje opisana u WO 2010/089117.

[0063] Ligand, kao što je antitelo ili njegov fragment, može biti modifikovan kako bi se povećao njegov poluživot u serumu, na primer, dodavanjem molekula - kao što su PEG ili drugi polimeri rastvorljivi u vodi, uključujući polimorfne polimere za povećanje poluživota. U jednom otelotvorenju, Fc region antitela se može dodati bispecifičnom vezniku prema pronalasku, kako bi se povećao poluživot u cirkulaciji.

Proizvodnja antitela

[0064] Proizvodnja antitela mo e se izvesti bilo kojom tehnikom poznatom u struci, uključujući transgene organizme kao što su koze (pogledati Pollock i dr. (1999) J. Immunol. Methods 231:147- 157), kokoške (pogledati Morrow, KJJ (2000) Genet. Eng. News 20:1 -55), miševi (pogledati Pollock i dr. ibid) ili biljke (pogledati Doran PM (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11:199-204; Ma, JK-C (1998) Nat.Med.4:601-606; Baez, J. i dr. (2000)

[0065] BioPharm.13:50-54; Stoger, E. i dr. (2000) Plant Mol. Biol.42:583-590). Antitela takođe mogu biti proizvedena hemijskom sintezom; međutim, poželjno je eksprimiranje gena koji kodiraju antitela u ćelijama domaćina.

[0066] Polinukleotid koji kodira antitelo se izoluje i ubacuje u konstrukte ili vektore koji se mogu replicirati, kao što je plazmid za, dalje širenje ili eksprimiranje u ćeliji domaćinu. Konstrukti ili vektori (npr. vektori eksprimiranja) pogodni za eksprimiranje humanizovanog imunoglobulina prema pronalasku su dostupni u struci. Na raspolaganju su različiti vektori, uključujući vektore koji se održavaju u jednoj kopiji ili više kopija u ćeliji domaćina ili koji se integrišu u hromozom ćelija domaćina. Konstrukti ili vektori mogu se uvesti u pogodnu ćeliju domaćina, i ćelije koje eksprimiraju humanizovani imunoglobulin mogu se proizvoditi i održavati u kulturi. Jedan vektor ili višestruki vektori mogu se koristiti za eksprimiranje humanizovanog imunoglobulina.

[0067] Polinukleotidi koji kodiraju antitelo se lako izoluju i sekvenciraju koristeći konvencionalne procedure (npr., oligonukleotidne sonde). Vektori koji se mogu koristiti obuhvataju plazmid, virus, fag, transposone, minihromzome od kojih su plazmidi tipičan oblik. Generalno, takvi vektori dalje uključuju signalnu sekvencu, poreklo replikacije, jedan ili više markerskih gena, element poboljšivača, promoter i sekvence završetka transkripcije operativno povezane sa polinukleotidom lakog i/ili teškog lanca kako bi se olakšalo eksprimiranje. Polinukleotidi koji kodiraju lake i teške lance mogu se ubaciti u odvojene vektore i uvesti (npr. transformacijom, transfekcijom, elektroporacijom ili transdukcijom) istovremeno ili sekvencijalno u istu ćeliju domaćina ili, ako je poželjno, i teški lanac i laki lanac mogu biti ubačeni u isti vektor pre takvog uvođenja.

[0068] Promoter može biti pružen za eksprimiranje u pogodnoj ćeliji domaćinu. Promoteri mogu biti konstitutivni ili inducibilni. Na primer, promoter može biti operativno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira humanizovani imunoglobulin ili lanac imunoglobulina, tako da usmerava eksprimiranje kodiranog polipeptida. Na raspolaganju su različiti pogodni promoteri za prokariotske i eukariotske domaćine. Prokariotski promoteri uključuju lac, tac, T3. T7 promoteri za E. coli; 3- fosfogliceratna kinaza ili drugi glikolitički enzimi npr. enolaza, gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza 6 fosfat izomeraza, 3-fosfogliceratna mutaza i glukokinaza.

Eukariotski promoteri uključuju inducibilne promotere kvasca kao što su alkohol dehidrogenaza 2, izocitokrom C, kisela fosfataza, metalotionein i enzimi odgovorni za metabolizam azota ili upotrebu maltoze/galaktoze; promoteri RNK polimeraze II uključujući virusne promotere kao što su polioma, fowlpox i adenovirusi (npr. Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, ptičji sarkom virus, citomegalovirus (posebno neposredni promoter ranog gena), retrovirus, hepatitis B virus, aktin, rous sarkoma virusa (RSV) i rani ili kasni Simian virus 40 i ne-virusni promoteri kao što je EF-1 alfa (Mizushima and Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17):5322). Stručnjaci u oblasti biće u stanju da izaberu odgovarajući promoter za eksprimiranje humanizovanog antitela pronalaska, ili njegovog dela.

[0069] Tamo gde je prikladno, npr., za eksprimiranje u ćelijama viših eukroita, mogu se uključiti i dodatni elementi poboljšanja umesto, ili kao i oni koji se nalaze u promoterima opisanim iznad. Pogodne sisarske sekvence poboljšanja uključuju elemente poboljšanja iz globina, elastaze, albumina, fetoproteina, metalotionina i insulina. Alternativno, može se koristiti element poboljšanja iz virusa eukriotskih ćelija kao što je SV40 poboljšivač, poboljšivač ranog promotera citomegalovirusa, poboljšivač polioma, bakulovirusni poboljšivač ili mišji IgG2a lokus (pogledati WO 04/009823). Dok se takvi poboljšivači obično nalaze na vektoru na mestu uzvodno od promotera, oni se takođe mogu naći na drugim mestima, npr., u neprevedenom regionu ili nizvodno od signala poliadenilacije. Izbor i pozicioniranje pojačivača mogu se zasnivati na kompatibilnosti sa ćelijom domaćina koja se koristi za eksprimiranje.

[0070] Osim toga, vektori (npr. vektori eksprimiranja) obično sadrže selektivni marker za selekciju ćelija domaćina koje nose vektor i, u slučaju vektora koji se može replicirati, poreklo replikacije. Geni koji kodiraju proizvode koji pružaju antibiotsku ili lekovitu rezistenciju su obični selektivni markeri i mogu se koristiti kod prokariotskim (npr. gena βlaktamaze (otpornost na ampicilin), Tet gene (otpornost na tetraciklin) i eukariotskim ćelijama (npr. neomicin (G418 ili geneticin) gpt (mikofenolna kiselina), ampicilin ili geni otpornosti na higromicin). Marker geni dihidrofolat reduktaze dozvoljavaju selekciju sa metotreksatom u različitim domaćinima. Geni koji kodiraju genski proizvod auksotrofnih markera domaćina (npr. LEU2, URA3, HIS3) se često koriste kao selektivni markeri u

2

kvascu. Korišćeni su i virusni (npr., bakulovirus) ili fagni vektori i vektori koji su sposobni da se integrišu u genom ćelije domaćina, kao što su retrovirusni vektori.

[0071] U eukariotskim sistemima, poliadenilacijski i terminacioni signali operativno su vezani za polinukleotid koji kodira antitelo ovog pronalaska. Takvi signali se tipično postavljaju 3' od otvorenog okvira čitanja. U sisarskim sistemima, neograničavajući primeri signala poliadenilacije/završetka uključuju one koji se dobijaju iz hormona rasta, faktora-1 alfa elongacije i virusnih (npr., SV40) gena ili retroviralnih dugih terminalnih ponavljanja. U sistemima kvasca, neograničavajući primeri signala polidenilacije/terminacije uključuju one izvedene iz fosfogliceratne kinaze (PGK) i gena alkohol dehidrogenaze 1 (ADH). U prokariotskim sistemima obično nisu potrebni poliadenilacijski signali, i umesto njih uobičajeno je koristiti kraće i više definisane terminatorske sekvence. Izbor sekvenci poliadenilacije/terminacije može biti zasnovan na kompatibilnosti sa ćelijom domaćina koja se koristi za eksprimiranje. Pored gore navedenog, druge karakteristike koje mogu biti korišćene za povećanje prinosa uključuju elemente za preuređivanje hromatina, introne i modifikaciju kodona specifičnu za ćeliju domaćina. Kodonska upotreba antitela ovog pronalaska može se modifikovati kako bi se prilagodila pristrasnosti kodona ćelije domaćina, kako bi se povećao transkript i/ili prinos proizvoda (npr. Hoekema, A. i dr. (1987) Mol Cell Biol. 7(8):2914-24). Izbor kodona može biti zasnovan na kompatibilnosti sa ćelijom domaćina koja se koristi za eksprimiranje.

[0072] Pronalazak se stoga odnosi na izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju humanizovane imunoglobuline, ili njihove teške ili lake lance, predmetnog pronalaska.

Pronalazak se takođe odnosi na izolovane molekule nukleinske kiseline koje kodiraju antigen vezujući deo imunoglobulina i njihove lance.

[0073] Antitela prema ovom pronalasku mogu se proizvoditi, na primer, eksprimiranjem jedne ili više rekombinantnih nukleinskih kiselina koje kodiraju antitelo u pogodnoj ćeliji domaćina. Ćelija domaćina se može proizvesti pomoću bilo kog odgovarajućeg postupka. Na primer, konstrukti eksprimiranja (npr. jedan ili više vektora, npr. vektor eksprimiranja ćelija sisara) koji su ovde opisani, mogu se uvesti u pogodnu ćeliju domaćina, i rezultujuća ćelija može da se održava (npr. u kulturi, u životinji, u biljci) pod uslovima pogodnim za eksprimiranje konstrukata ili vektora. Odgovarajuće ćelije domaćina mogu biti prokariotske, uključujući bakterijske ćelije kao što su E. coli (npr., soj DH5a™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), PerC6 ćelije (Crucell, Leiden, NL), B. subtilis i/ili druge pogodne bakterije; eukariotske ćelije, kao što su gljivične ili ćelije kvasca (npr., Pichia pastoris, Aspergillus sp., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa), ili druge niže eukariotske ćelije, i ćelije viših eukariota kao što su one od insekata (npr. Drosophila Schnieder S2 ćelije, Sf9 ćelije insekata (WO 94/126087 (O'Connor), TN5BI-4 (HIGH FIVE™) ćelije insekata (Invitrogen), sisaraske (npr. COS ćelije, kao što su COS-I (ATCC Accession No. CRL-1650) i COS-7 (ATCC Accession No. CRL-1651), CHO (npr., ATCC Accession No. CRL-9096), CHO DG44 (Urlaub, G. and Chasin, LA., (1980) Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 77(7):4216-4220), 293 (ATCC Accession No. CRL- 1573), HeLa (ATCC Accession No. CCL-2), CVI (ATCC Accession No. CCL-70), WOP (Dailey, L., i dr., (1985) J. Virol., 54:739-749), 3T3, 293T (Pear, W. S., i dr., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:8392-8396), NSO ćelije, SP2/0 ćelije, HuT 78 ćelije i slično, ili biljne (npr. duvan, lemna (sočivica) i alge). Pogledati, na primer, Ausubel, F.M. i dr., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc. (1993). U nekim otelotvorenjama ćelija domaćin nije deo višećelijskog organizma (npr. biljke ili životinje), na primer, ona je izolovana ćelija domaćina, ili je deo ćelijske kulture.

[0074] Ćelije domaćini mogu se kultivisati u bočicama za obrtanje, bočicama za mešanje, bočicama za kotrljanje, talasnim bioreaktorima (npr. Sistem 1000 od wavebiotech.com) ili sistemima od šupljih vlakana, ali je za proizvodnju velike količine poželjno da se koriste bioreaktori sa rezervoarom za mešanje ili vrećasti bioreaktori (npr. Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA), posebno za kulture suspenzije. Tipično, bioreaktori sa rezervoarom su prilagođeni za ateraciju koristeći, na primer, prskalice, odbojnike ili rotore sa niskim smicanjem. Za mehurne kolone i vazdušne bioreaktore, možda se koristi direktna aeracija sa mehurićima vazduha ili kiseonika. Kada se ćelije domaćina kultivišu u medijumu bez kulture u serumu, medijum se može dopuniti zaštitnim agensom za ćelije, kao što je pluronski F-68, kako bi se sprečilo oštećenje ćelija kao rezultat procesa aeracije. U zavisnosti od karakteristika ćelija domaćina, mikronosači se možda koriste kao supstrati rasta za ćelijske linije zavisne od sidrenja, ili su ćelije možda prilagođene kulturi suspenzije. Za gajenje ćelija domaćina, posebno ćelija domaćina kičmenjaka, mogu se koristiti različiti režimi rada, kao što su serije, pothranjene serije, ponovljena serijska obrada (pogledati Drapeau i dr (1994) Cytotechnology 15: 103-109), proširen serijski proces ili kultura perfuzije. Iako se rekombinantno transformisane ćelije domaćina sisara mogu kultivisati u medijumima koji sadrže serum, kao što su medijumi koji sadrže fetalni teleći serum (FCS), poželjno je da se takve ćelije domaćina kultivišu u medijumima bez seruma kao što je obelodanjeno kod Keen i dr (1995) Cytotechnology 17:153-163, ili u komercijalno dostupnim medijumima kao što su

2

ProCHO-CDM ili UltraCHO™ (Cambrex NJ, USA), koji su po potrebi dopunjeni sa izvorima energije kao što su glukoza i sintetički faktori rasta kao što je rekombinantni insulin. Kultivacija ćelija domaćina bez seruma može se zahtevati da se te ćelije prilagođavaju da rastu u uslovima bez seruma. Jedan adaptivni pristup je kultivisanje takve ćelije domaćina u medijumima koji sadrže serum, uz više puta zamene 80% medijuma za kulturu sa medijumom bez seruma, tako da ćelije domaćina nauče da se prilagođavaju uslovima bez seruma (pogledati npr. Scharfenberg K .i dr (1995) in Animal Cell Technology Developments Towards the 21st Century (Beuvery E.C. i dr eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers).

[0075] Antitela prema pronalasku mogu se izlučiti u medijum i iz njega se obnavljati i prečišćavati koristeći različite tehnike kako bi se postigao stepen prečišćavanja pogodan za nameravanu upotrebu. Na primer, upotreba terapeutskih antitela prema pronalasku za tretiranje pacijenata kod ljudi obično zahteva najmanje 95% čistoće kako je određeno redukovanem SDS-PAGE, tipičnije 98% ili 99% čistoće, u poređenju sa medijumom za kulturu koji sadrži terapeutska antitela. U prvoj instanci, ćelijski ostaci iz medijuma za kulturu obično se uklanjaju korišćenjem centrifugiranja, praćenom korakom pročišćavanja supernatanta koristeći npr. mikrofiltraciju, ultrafiltraciju i/ili dubinsku filtraciju. Alternativno, antitelo se može sakupljati mikrofiltracijom, ultrafiltracijom ili filtracijom dubine, bez prethodnog centrifugiranja. Dostupne su različite druge tehnike, kao što su dijaliza i elektroforeza gel, i hromatografske tehnike kao što je hidroksiapatit (HA), afinitetna hromatografija (opcionalno uključuje sistem označavanja afiniteta kao što je polihistidin) i/ili hromatografija hidrofobne interakcije (HIC) (pogledati US 5,429,746). U jednom otelotvorenju, antitela predmetnog pronalaska, nakon različitih koraka pročišćavanja, uzimaju se korišćenjem hromatografije afiniteta proteina A ili G, praćene dodatnim hromatografskim koracima kao što su jonska razmena i/ili HA hromatografija, anjonska ili katjonska razmena, hromatografija isključivanja veličine, i amonijum sulfat taloženje. Tipično, korišćeni su i različiti koraci uklanjanja virusa (npr. nanofiltracija pomoću, na primer, DV-20 filtera).

Nakon ovih različitih koraka, pružen je prečišćeni sastav koji sadrži najmanje 10 mg/ml ili više, npr., 100 mg/ml ili više antitela predmetnog pronalaska, i stoga predstavlja oblik otelotvorenja pronalaska. Koncentracija do 100 mg/ml ili više može se generisati ultracentrifugiranjem. Takvi sastavi su u suštini bez agregiranih oblika antitela pronalaska.

[0076] Bakterijski sistemi su posebno pogodni za eksprimiranje fragmenata antitela. Takvi fragmenti su lokalizovani intracelularno ili unutar periplazme. Nerastvoreni periplazmatični

2

proteini mogu se ekstrakovati i ponovo obraditi kako bi se formirali aktivni proteini prema postupcima poznatim strucnjacima u oblasti, pogledati Sanchez i dr. (1999) J. Biotechnol. 72:13-20; Cupit, PM i dr. (1999) Lett. Appl. Microbiol.29:273-277.

[0077] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćelije koje sadrže nukleinsku kiselinu obelodanjenja, npr., vektor (npr., vektor eksprimiranja). Na primer, nukleinska kiselina (tj. jedna ili više nukleinskih kiselina) koja kodira teške i lake lance humanizovanog imunoglobulina prema obelodanjenju, ili konstrukt (tj. jedan ili više konstrukata, npr. jedan ili više vektora) koje sadrže takvu nukleinsku kiselinu, mogu se uneti u pogodnu ćeliju domaćina postupkom koji odgovara izabranoj ćeliji domaćinu (npr. transformacija, transfekcija, elektroporacija, infekcija), gde nukleinska kiselina jeste, ili postaje, operativno povezana sa jednim ili više elemenata kontrole eksprimiranja (npr. u vektoru, u konstruktu stvorenom procesima u ćeliji, integrisana u genom ćelije domaćina). Ćelije domaćini mogu se održavati pod uslovima pogodnim za eksprimiranje (npr. u prisustvu induktora, odgovarajućem medijumu dopunjenom odgovarajućim solima, faktora rasta, antibiotika, prehrambenih suplemenata, itd.), gde se proizvode kodirani polipeptidi. Po želji, kodirano humanizovano antitelo može biti izolovano, na primer, iz ćelija domaćina, medijuma za kulturu ili mleka. Ovaj postupak obuhvata eksprimiranje u ćeliji domaćinu (npr. ćeliji mlečne žlezde) transgene životinje ili biljke (npr. duvan) (pogledati npr. WO 92/03918).

CD80 Ligandi

[0078] Dizajn i konstrukcija CD80 liganda namenjen je maksimiziranju specifičnosti liganda za CTLA-4 preko CD28. Sekvenca CD80 je poznata u struci, poput primera navedenog u Wu i dr., 1997. CD80 sadrži ekstracelularni Ig-V varijabilni domen i intracelularni IgC konstantni domen. U poželjnom otelotvorenju, ekstracelularni domen CD80 se koristi kao ligand. Na primer, pogledati SEQ ID NO: 15, naročito ostatke 1-241.

[0079] Može se napraviti mutacija kod ljudskog CD80 radi poboljšanja afiniteta vezivanja i poboljšanja selektivnosti za CTLA4 preko CD28. Pogledati, na primer, Wu i dr., 1997.

[0080] Mogu biti napravljeni i drugi mutanti osim W84A, uključujući K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A, E196A. Pogledati Peach i dr., JBC 1995.270(6): 21181-21187. Procena afiniteta vezivanja mutanata za CTLA-4 i CD28 može se izvršiti putem usmerene mutageneze praćene eksprimiranjem mutantnih polipeptida i

2

određivanjem Kd površinskom plazmonskom rezonancom koristeći CTLA-4 i CD28 Biacore čipove. Pogledati, na primer, Guo i dr., (1995) J. Exp. Med.181:1345-55.

[0081] Mutanti koji imaju povoljne profile vezivanja i selektivnosti mogu se odabrati i dalje proceniti u ćelijskim testovima. Na primer, protočna citometrija se može koristiti za ispitivanje efekta CD80 divljeg tipa ili mutanta transfektovanog u ćelije.

LAG-3 ligandi

[0082] LAG-3 je opisan u stanju tehnike, i mesto vezivanja za protein MHCII se karakteriše. Pogledati Huard i dr., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(11):5744-9. LAG-3 ima četiri ekstracelularna domena slična 1g, i mutacije se mogu uvesti u ove domene kako bi se optimizovalo vezivanje za MHCII.

[0083] Efikasnost mutacija se može analizirati kako je gore opisano u odnosu na CD80 ligande.

[0084] U jednom aspektu, u ligandu prema pronalasku se koriste samo domeni 1 i 2 (D1 i D2) od četiri domena LAG-3 slična 1g. Veruje se da su ovi domeni odgovorni za interakciju sa MHCII proteinom.

Bispecifični ligand konstrukti

[0085] Konstrukcija bispecifičnog liganda prati opštu formulu „ligand-veznik-ligand“.

Bispecifična antitela su poznata u struci i opisana su iznad.

[0086] Izgradnja bispecifičnih liganda poželjno uključuje konstrukciju i eksprimiranje odgovarajućeg gena koji kodira željeni polipeptid. Ostali postupci konstrukcije su mešanjem dva polipeptida pod uslovima koji dozvoljavaju kovalentno, jonsko ili hidrofobno vezivanje. U poželjnim varijantama, sadrži kovalentno vezivanje polipeptida. Kada je konstruisan bispecifični molekul koji sadrži tri komponente, kao što su CTLA-4 ligand, veznik i MHC ligand, dve od tri mogu biti kombinovane, vezane zajedno, i treći polipeptid se naknadno dodaje fuzionom proizvodu, i vezan je kako bi stvorio fuzioni proizvod koji sadrži sva tri polipeptida.

[0087] Polipeptidi u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se proizvesti bilo kojom željenom tehnikom, uključujući hemijsku sintezu, izolaciju iz bioloških uzoraka i

2

eksprimiranje nukleinske kiseline koja kodira takav polipeptid. Nukleinske kiseline, s druge strane, mogu biti sintetisane ili izolovane iz bioloških izvora i modifikovane usmerenom mutagenezom, ako se to želi.

[0088] Pronalazak se tako odnosi na vektore koji kodiraju bispecifični ligand prema pronalasku, ili njegov fragment. Vektor može biti, na primer, fag, plazmid, virusni ili retrovirusni vektor.

[0089] Nukleinske kiseline prema obelodanjenju mogu biti deo vektora koji sadrži selektivni marker za razmnožavanje u domaćinu. Generalno, plazmidni vektor se unosi u precipitat, kao što je precipitat kalcijum fosfata, ili u kompleks sa naelektrisanim lipidom.

[0090] Ako je vektor virus, može se pakovati in vitro koristeći odgovarajuću liniju pakovanja i potom transdukciju u ćelije domaćina.

[0091] Umetak nukleinske kiseline je operativno povezan sa odgovarajućim promoterom, kao što je fag lambda PL promoter, E. coli lac, trp, phoA i tac promoteri, SV40 rani i kasni promoteri, i promoteri retrovirusnih LTR. Ostali pogodni promoteri su poznati stručnjacima. Konstrukti eksprimiranja dalje sadrže mesta za iniciranje transkripcije, terminaciju i, u transkribiranom regionu, mesto za vezivanje ribozoma za translaciju. Kodirani deo transkripta koji su eksprimirani od strane konstrukata po mogućstvu uključuje inicijalni kodon za translaciju na početku, i terminacioni kodon (UAA, UGA ili UAG) koji se na odgovarajući način pozicionira na kraju polipeptida koji se prevodi.

[0092] Kao što je navedeno, vektori eksprimiranja poželjno uključuju bar jedan selektivni marker. Takvi markeri uključuju dihidrofolat reduktazu, G418 ili otpornost na neomicin za kulturu eukariotskih ćelija i gene otpornosti na tetraciklin, kanamicin ili ampicilin za kultivaciju u E. coli i drugim bakterijama. Reprezentativni primeri odgovarajućih domaćina uključuju, ali nisu ograničeni na, bakterijske ćelije, kao što su E. coli, Streptomyces i Salmonella typhimurium ćelije; gljivične ćelije, kao što su ćelije kvasca (npr., Saccharomyces cerevisiae ili Pichia pastoris); ćelije insekata kao što su Drosophila S2 i Spodoptera Sf9 ćelije; životinjske ćelije kao što su CHO, COS, HEK293 i Bowes melanoma ćelije; i biljne ćelije.

2

[0093] Odgovarajući medijumi za kulturu i uslovi za gore opisane ćelije domaćina su poznati u struci i dostupni su komercijalno.

[0094] Vektori koje su poželjne za upotrebu u bakterijama uključuju pQE70, pQE60 i pQE-9, dostupni od QIAGEN, Inc.; pBluescript vektori, Phagescript vektori, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, dostupni od Stratagene Cloning Systems, Inc.; i ptrc99a, pKK2233, pKK233-3, pDR540, pRIT5 dostupni od Pharmacia Biotech, Inc. Među poželjnim eukariotskim vektorima su pWLNEO, pSV2CAT, p0G44, pXTI i pSG dostupni od Stratagene; i pSVK3, pBPV, pMSG i pSVL dostupni od Pharmacia. Vektori poželjni za •

primenu u eksprimiranju sisarskih ćelija uključuju pSG5 vektor, pCMV SPORT6, pcDNA, pCEP4, pREP4, pCI, pSI i pBICEP-CMV. Poželjni vektori eksprimiranja za primenu u sistemima kvasca uključuju, ali nisu ograničeni na pYES2, pYDI, pTEFI/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3.5, pHILD2, pHIL-SI, pPIC3.5K, pPIC9K, i PA0815 (svi su dostupni od Invitrogen, Carlsbad, CA).

[0095] Uvođenje konstrukta u ćeliju domaćina može se izvršiti transfekcijom kalcijum fosfata. Transfekcija posredovana sa DEAE-dekstranom, transfekcijom posredovanom katjonskim lipidom, elektroporacijom, transdukcijom, infekcijom ili drugim postupcima. Takvi postupci su opisane u mnogim standardnim Laboratorijskim priručnicima, kao što su Sambrook i dr., navedeni iznad. Polipeptid prema pronalasku može se poznatim postupcima obraditi i prečistiti od rekombinantnih ćelijskih kultura, uključujući precipitaciju amonijum sulfata ili etanola, ekstrakciju kiseline, anjonsku ili katjonsku hromatografiju, fosfoceluloznu hromatografiju, hromatografiju hidrofobne interakcije, afinitetnu hromatografiju, hidroksilapatitsku hromatografiju i lektinsku hromatografiju. Najpoželjnije, za prečišćavanje se koristi tečna hromatografija visokih performansi („HPLC“).

[0096] Polipeptidi prema predmetnom pronalasku mogu se takođe dobiti iz bioloških izvora, uključujući telesne tečnosti, tkiva i ćelije, posebno ćelije izvedene iz tumorskog tkiva pacijenta ili iz tkiva za koje se sumnja da je tumorsko.

[0097] Pored toga, polipeptidi prema pronalasku mogu biti hemijski sintetisani korišćenjem tehnika poznatih u struci (na primer, pogledati Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co. , N. Y. , and Hunkapiller i dr., (1984) Nature, 310:105-111). Na primer, polipeptid koji sadrži sve ili deo bispecifičnog liganda prema pronalasku može se sintetisati upotrebom sintetizatora peptida.

[0098] Bispecifični ligandi u skladu sa pronalaskom su detaljno opisani u ovde priloženim SEQ ID. SEQ ID NO: 1 i 2 pružaju surogatne DNK i proteinske sekvence bispecifičnih liganda u kojima je CTLA-4 ligand CD80w88a uparen sa MHC ligandom LAG-3, razdvojen regionom IGg2a Fc i Gly-9 (G9) sekvencom. Terminalna His oznaka (H6) se nalazi na C-terminusu. SEQ ID NO: 3 i 4 pružaju mišje surogatne DNK i proteinske sekvence za iste konstrukte kao SEQ ID NO: 1 i 2, osim što je IgG2a Fc region postavljen C-terminalno u LAG-3 polipeptid, tako da su CD80 i LAG-3 peptidi su odvojeni sa samim G9. Dva rasporeda, sa Fc regionom između liganda ili njegovog C-terminala, označavaju se kao konstrukti gena 1 i gena 2, respektivno.

[0099] SEQ ID NO: 5 i 6 pružaju sekvence ljudskih DNK i proteina u kojima je sačuvana sekvenca divljih vrsta. Nema mutacija ni za CD80 niti za LAG-3.

[0100] U SEQ ID NO: 7 i 8, W84A mutacija je napravljena na ljudskom CD80 (ekvivalent W88A kod miševa) i R75E mutacija je napravljena u LAG-3. Preostale SEQ ID (NO: 7- 14) opisuju druge mutacije u CD80 i LAG-3 sekvencama.

Terapeutske primene

[0101] Suzbijanje aktivnosti T ćelija je poželjno u brojnim situacijama u kojima je opravdana imunosupresija, i/ili se javlja autoimuno stanje. Shodno tome, ciljanje CTLA4/MHC interakcije je indikovano u tretiranju bolesti koje uključuju neadekvatan ili neželjeni imuni odgovor, kao što su upala, autoimunost i stanja koja uključuju takve mehanizme. U jednom aspektu, takva bolest ili poremećaj prezentuje autoimuno i/ili upalno oboljenje. Primeri takvih autoimunih i/ili upalnih bolesti su navedeni iznad.

[0102] U jednom aspektu, takva bolest ili poremećaj je dijabetes tipa 1 (T1D).

[0103] U još jednom otelotvorenju, ligandi prema pronalasku se koriste kako bi se imunosupresijom pacijenta pomogla transplantacija. Takva upotreba olakšava graft-protivdomaćina bolest. Za opis postojećih tretmana za graft-protiv-domaćina bolest, pogledati Svennilson, (2005) Bone Marrow Transplanation 35:S65-S67, i tamo navedene reference.

1

Pogodno, antitela pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim dostupnim terapijama.

[0104] Kada se radi o tretiranju autoimunih bolesti, kombinovana terapija može obuhvatiti davanje liganda predmetnog pronalaska zajedno sa medikamentom, koji zajedno sa ligandom sadrži efikasnu količinu za sprečavanje ili tretiranje takvih autoimunih bolesti. Kad je pomenuto autoimuno oboljenje dijabetes tipa 1, kombinovana terapija može obuhvatiti jedan ili više agenasa koji promovišu rast beta ćelija pankreasa ili poboljšava transplantaciju beta ćelija, kao što su rast beta ćelija ili faktori preživljavanja ili imunomodulatorna antitela. Kada je pomenuto autoimuno oboljenje reumatoidni artritis, pomenuta kombinovana terapija može obuhvatiti jedan ili više od metotreksata, anti-TNF-a antitela, TNF-α receptor-Ig fuzionog proteina, anti-IL-6 ili anti-IL17 ili anti-IL-15 ili anti-IL-21 antitela, nesteroidnog protivupalnog leka (NSAID), ili anti-reumatskog leka koji modifikuje bolest (DMARD). Na primer, dodatni agens može biti biološki agens, kao što je anti-TNF agnes (npr., Enbrel®, infliksimab (Remicade®) i adalimumab (Humira®) ili rituksimab (Rituxan®)). Kad je navedena autoimuna bolest odbacivanje hematopoetskog transplanata, mogu se primenjivati hematopoetski faktor rasta (kao što su eritropoetin, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-11, trombopoetin, itd.) ili antimikrobiotici (kao što su antibiotici, antivirusni, antifungalni lekovi). Kad je pomenuto autoimuno oboljenje psorijaza, dodatni agens može biti jedan ili više od katrana i njegovih derivata, fototerapija, kortikosteroida, Ciklosporina A, analoga vitamina D, metotreksata, inhibitora p38 mitogen-aktiviranih proteinskih kinaza (MAPK), kao i bioloških agenasa kao što su anti-TNF-α agensi i Rituxan®. Kad je navedena autoimuna bolest upalna bolest creva (IBD), kao što je, na primer, Kronova bolest ili ulcerativni kolitis, dodatni agens može biti jedan ili više od aminosalicilata, kortikosteroida, imunomodulatora, antibiotika ili bioloških agenasa kao što su Remicade® i Humira®.

[0105] Kombinovani tretman može se izvršiti na bilo koji način koji smatra potrebnim ili pogodnim za stručnjake i za potrebe ove specifikacije, bez ograničenja u pogledu redosleda, količine, ponavljanja ili relativne količine jedinjenja koje će se koristiti u kombinaciji se razmatranim. Shodno tome, antitela prema predmetnom pronalasku za upotrebu u terapiji mogu se formulisati u farmaceutske sastave. predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske sastave koje sadrže peptide prema predmetnom pronalasku.

Farmaceutski sastavi

2

[0106] U poželjnom otelotvorenju, pružen je farmaceutski sastav koji sadrži bispecifični ligand prema pronalasku, ili ligand ili ligande koji se mogu identifikovati postupkom analize kao što je definisano u prethodnom aspektu obelodanjenja. Ligandi mogu biti imunoglobulini, peptidi, nukleinske kiseline ili mali molekuli, kao što je ovde diskutovano. U diskusiji koja sledi, navode se kao „jedinjenja“.

[0107] Farmaceutski sastav prema pronalasku je sastav materije koji kao aktivni sastojak sadrži jedinjenje ili jedinjenja koja mogu da modulišu T-ćelijsku aktivnost. Tipično, jedinjenje je u obliku bilo koje farmaceutski prihvatljive soli, ili, na primer, gde je pogodno, analog, oblik slobodne baze, tautomer, enantiomer racemat ili njihove kombinacije. Aktivni sastojci farmaceutskog sastava koji sadrže aktivni sastojak prema pronalasku su razmatrani kako bi pokazali izvrsnu terapeutsku aktivnost, na primer, u tretiranju graft-protiv-domaćina bolesti, kada se primenjuju u količini koja zavisi od konkretnog slučaja.

[0108] U još jednom otelotvorenju, jedno ili više jedinjenja prema pronalasku mogu se koristiti u kombinaciji sa bilo kojim jedinjenjem priznatim u struci, za koje je poznato da je pogodno za tretiranje određene indikacije u tretiranju bilo kog od gore pomenutih stanja. Shodno tome, jedno ili više jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se kombinovati sa jednim ili više jedinjenja priznatih u struci, za koja je poznato da su pogodna za tretiranje prethodnih indikacija, tako da se može primeniti pogodan, jedinstveni sastav pacijentu. Režim doziranja može se prilagoditi kako bi se obezbedio optimalni terapijski odgovor.

[0109] Na primer, nekoliko podeljenih doza može se davati dnevno, ili se doza može proporcionalno smanjiti, kao što je pokazano potrebama terapeutske situacije.

[0110] Aktivni sastojak se može primenjivati na odgovarajući način, kao što je oralno, intravenozno (rastvorljiv je u vodi), intramuskularno, subkutano, intranazalno, intradermalno ili supozitornim putevima ili implantacijama (npr., koristeći molekule sa sporim oslobađanjem).

[0111] U zavisnosti od načina primene, može biti potrebno da aktivni sastojak bude obložen materijalom za zaštitu navedenih sastojaka od dejstva enzima, kiselina i drugih prirodnih stanja koje mogu deaktivirati navedeni sastojak.

[0112] Kako bi se aktivni sastojak primenjivao drugom primenom osim parenteralne, on će biti premazana ili primenjena sa materijalom koji sprečava njegovu inaktivaciju. Na primer, aktivni sastojak se može primenjivati u adjuvantu, koji se primenjuje sa inhibitorima enzima ili u lipozomima. Adjuvant se koristi u najširem smislu i uključuje bilo koje imuno stimulišuće jedinjenje kao što je interferon. Adjuvanti obuhvaćeni ovde uključuju rezorcinole, nejonske surfaktante kao što su polioksietilen oleil eter i n-heksadecil polietilen eter.

Enzimski inhibitori uključuju pankreasni tripsin.

[0113] Lipozomi uključuju voda-u-ulju CGF emulzije i uobičajene lipozome.

[0114] Aktivni sastojak se takođe može davati parenteralno ili intraperitonealno.

[0115] Disperzije se takođe mogu pripremiti u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama i uljima. Pod običnim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi sastavi sadrže konzervans za sprečavanje rasta mikroorganizama.

[0116] Farmaceutski oblici pogodni za injektibilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (rastvorljiv je u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za izvanredno pripremanje sterilnih injektibilnih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima oblik mora biti sterilan i mora biti fluidan u meri u kojoj postoji lako korišćenje u špricu. Mora biti stabilan u uslovima proizvodnje i skladištenja, i mora se očuvati od kontaminacije mikroorganizama kao što su bakterije i gljivice. Nosilac može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilenglikol, i slično), njihove pogodne smeše i biljna ulja. Odgovarajuća fluidnost može se održati, na primer, upotrebom prevlake kao što je lekitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i korišćenjem surfaktanata.

[0117] Sprečavanje delovanja mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim agensima, kao što su, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, sorbinska kiselina, trimerozal i slično. U određenim slučajevima, možda je poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektibilnih sastava može se postići upotrebom u sastavima agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0118] Sterilni injektabilni rastvori se pripremaju inkorporiranjem aktivnog sastojka u potrebnu količinu u odgovarajućem rastvaraču sa različitim drugim sastojcima navedenim

4

gore, po potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije se pripremaju uvođenjem sterilizovanog aktivnog sastojka u sterilni nosač koje sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke osim onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i tehnika sušenja sa zamrzavanjem koja daje prah aktivnog sastojka plus dodatni željeni sastojak iz ranije sterilnog filtriranog rastvora.

[0119] Kad se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili razblaživač“ uključuje bilo koje rastvarače, disperzione medijume, prevlake, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične i apsorpcione agense za odlaganje i slično. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u struci. Osim u slučaju kad neki konvencionalni medijum ili agens nije kompatibilan sa aktivnim sastojkom, razmatra se njegova upotreba u terapijskim sastavima. Dodatni aktivni sastojci se takođe mogu inkorporirati u sastave.

[0120] Posebno je pogodno formulisati parenteralne sastave u obliku dozne jedinice za lakšu primenu i uniformnost doziranja. Oblik dozne jedinice koji se ovde koristi odnosi se na fizički diskretne jedinice koje su pogodne za jedinične doze za sisarske pacijente koje treba tretirati; svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog materijala izračunatog kako bi se proizveo željeni terapeutski efekat u vezi sa zahtevanim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za nove oblike doznih jedinica prema pronalasku diktiraju i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog materijala i određenog terapeutskog efekta koji treba postići, i (b) ograničenja koja su inherentna u struci sastavljanja takvih aktivnih materijala za tretiranje bolesti kod živih pacijenata koji imaju bolesno stanje u kome je telesno zdravlje oštećeno.

[0121] Glavni aktivni sastojci se kombinuju za praktičnu i delotvornu primenu u efektivnim količinama sa pogodnim farmaceutski prihvatljivim nosačem u obliku dozne jedinice. U slučaju sastava koji sadrže dodatne aktivne sastojke, doze se određuju upućivanjem na uobičajenu dozu i način primene navedenih sastojaka.

[0122] Kako bi olakšali isporuku peptidnih jedinjenja, uključujući antitela, do ćelija, peptidi se mogu modifikovati kako bi se poboljšala njihova sposobnost da pređu ćelijsku membranu. Na primer, US 5,149,782 obelodanjuje upotrebu fuzogenih peptida, peptida koji formiraju jonske kanale, membranskih peptida, masnih kiselina dugih lanaca i drugih agenasa za stapanje membrana kako bi se povećao transport proteina duž ćelijske membrane. Ovi i drugi postupci su takođe opisane u WO 97/37016 i US 5,108,921.

[0123] U sledećem aspektu pružen je aktivni sastojak pronalaska kao što je prethodno definisano za upotrebu u tretiranju bolesti, bilo sam ili u kombinaciji sa jedinjenjima priznatim u struci, za koje je poznato da su pogodna za tretiranje određene indikacije. Shodno tome, pružena je upotreba aktivnog sastojka pronalaska za proizvodnju leka za tretiranje bolesti povezane sa abnormalnim imunim odgovorom.

[0124] Štaviše, pružen je postupak za tretiranje stanja koje je povezano sa abnormalnim imunim odgovorom, koji obuhvata davanje pacijentu terapeutski efikasne količine liganda koji se može identifikovati korišćenjem postupaka ispitivanja koji su opisani iznad.

[0125] Predmetni pronalazak je dalje opisan, samo u svrhu ilustracije, u sledećim primerima.

Primeri

Primer 1

Dizajn bispecifičnog fuzionog proteina koji se aktivira oko CTLA-4 i povezuje ga sa TCR preko MHC 11.

[0126] Za generisanje bispecifičnog fuzionog proteina koji se selektivno i agonistički aktivira oko CTLA-4 i istovremeno ligira na TCR, mutant CD80 (CD80w88a, u daljem tekstu CD80wa) koji vezuje CTLA-4 ali ima minimalni afinitet za CD28 (Wu i dr., 1997) fuzionisan je sa LAG-3, prirodnim ligandom MHCII (Baixeras i dr., 1992; Triebel i dr., 1990). CD80wa je spojen sa LAG-3 koristeći veznik sastavljen od devet glicina, koji je zauzvrat bio povezan sa Fc delom mišjeg IgG2a kako bi se navodno povećao poluživot u cirkulaciji (Slika 1A). Kao odgovor na ligand ove konfiguracije, očekivano je da indirektno dođe do CTLA-4 uključivanja i ligacije TCR putem formiranja tro-molekulskog kompleksa (CTLA-4/MHCII/TCR) u imunim sinapsama tokom rane T ćelijske aktivacije (Slika 1B).

Konceptualno, van konteksta imunih sinapsi, vezivanje bispecifičnog fuzionog proteina bilo za sam CTLA-4 ili sam MHCII, ili i CTLA-4 i MHCII, ne bi trebalo da dovede do inhibicije aktivnosti T ćelija. Aktiviranje oko CTLA-4 pomoću CD80wa bilo je dizajnirano da pokrene CTLA-4 signalizaciju putem regrutacije fosfataza na citoplazmatičnom rep CTLA-4. U međuvremenu, vezivanje LAG-3 za MHCII trebalo je da dovede CTLA-4 u blizinu srodnog TCR, koji vezuje kompleks pMHCII u imuno sinapsi (Slika 1B). Očekuje se da će kombinacija ova dva vezuju a događaja isporu iti inhibitorni signal do TCR. Takođe je izgrađen kontrolni fuzioni protein koji sadrži CD80wa i IgG2a Fc (Slika 1A), koji ne bi trebalo da bude sposoban za ukrštanje CTLA-4 sa TCR (Slika 1C) jer nema LAG-3.

[0127] Testirani i kontrolni fuzioni proteini su eksprimirani u ćelijama jajnika kineskog hrčka i prečišćeni sa afinitetnom hromatografijom na koloni proteina G. Agregati su uklonjeni korišćenjem hromatografije za isključivanje veličine. Testirnai bispecifični fuzioni protein (CD80wa-LAG-3-Fc) se naziva BsB (nukleotidna sekvenca: SEQ ID NO: 3, aminokiselinska sekvenca: SEQ ID NO: 4), i kontrolni konstrukt (CD80wa-Fc) je poznato kao BsBΔ (nukleotidna sekvenca: SEQ ID NO: 16; aminokiselinska sekvenca: SEQ ID NO: 17). Kao što se očekivalo, oba fuziona proteina su se pojavila kao dimeri na ne-redukujućim SDS-PAGE gelovima (BsB, 200 kDa, BsBΔ 140 kDa) i kao monomeri (BsB, 100 kDa, BsBΔ 70 kDa) na redukujućim SDS-PAGE gelovia. Njihovi identiteti su dalje potvrđeni Western blotovanjem, koristeći antitela protiv LAG-3 i CD80.

Primer 2

BsB inhibira aktivaciju T ćelija u reakciji alogenih mešovitih limfocita.

[0128] Relativna sposobnost BsB i BsBΔ za inhibiranje aktivacije T ćelije procenjena je kod reakciji alogenih mešovitih limfocitni merenjem proizvodnje IL-2. Naivne CD4<+>CD25-CD62L<high>CD44<low>T ćelije koje su prečišćene od BALB/c miševa su pomešane sa APC izolovanim od C57BL/6 miševa u prisustvu ili odsustvu BsB ili BSBΔ. Mišji IgG2a i CTLA-4Ig, inhibitor ko-stimulacije koji se vezuju za CD80/86 i blokira njihovo vezivanje za CD28, uključen je kao negativna i pozitivna kontrole, respektivno. Uključivanje BsB, ali ne BsBΔ, u reakciju mešovitih limfocita inhibiralo je proizvodnju IL-2, ali ne u istoj meri koja je postignuta sa CTLA-4Ig (Slika 2). Ova razlika je verovatno bila posledica inhibicije T-ćelija posredovane sa BsB koja se dešava posle inhibicije posredovane sa CTLA-4Ig. Preciznije, za BsB, inhibicija se dogodila samo nakon što je CTLA-4 regulisana nakon aktivacije T ćelija. Nemogućnost BsBΔ da smanji proizvodnju IL-2 snažno ukazuje na to da uključivanje samog CTLA-4 nije dovoljno za sprečavanje aktivacije T ćelija, jer je potrebno istovremeno ukrštanje sa TCR. Kako bi se isključila mogućnost da LAG-3 deo od BsB igra ulogu u inhibiciji T ćelija, LAG-3Ig je testiran u ovom testu i verifikovano je da ne inhibira aktivaciju T ćelija.

Primer 3

BsB usmerava T ćelijsku diferencijaciju u Tregovima.

[0129] Za ranu terminaciju TCR signalizacije povlačenjem stimulacije antigena, inhibiciju mTOR signalizacije, suboptimalnu TCR stimulaciju usled antigena sa niskim afinitetom, ili slabu ko-stimulaciju tokom aktivacije T ćelija pokazalo se da indukuju Foxp3<+>eksprimiranje i menjaju T ćelijsku diferencijacije prema Treg fenotipu (Delgoffe i dr., (2009) Immunity 30:832-844; Haxhinasto i dr., (2008) J. Exp. Med.205:565-574; Sauer i dr., (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:7797-7802). Pošto BsB izaziva rano uključivanje TCR putem CTLA-4 indukovane aktivacijom sa posledičnim slabljenjem TCR signala, takođe je procenjena njegova sposobnost da generiše Foxp3<+>Treg. Naivne CD4<+>CD62L<high>GFP" T ćelije pripremljene od Foxp3-EGFP knock-in miševa (Haribhai i dr., (2007) J. Immunol 178:2961-2972) su mešane sa alogenim APC tretiranim sa LPS u prisustvu BsB ili BSBΔ. Analiza ćelija protočnom citometrijom nakon pet dana kultivisanja otkrila je veliki broj CD4<+>CD25<+>GFP<+>T ćelija među ćelijama tretiranim sa BsB (Slika 3A, srednji levi panel), ali ne i kod ćelija tretiranih sa mišjim IgG2a (Slika 3A, gornji levi panel) ili kontrolnim BsBΔ (Slika 3A, donji levi panel), što ukazuje da su ove CD4<+>CD25<+>GFP<+>T ćelije bile Foxp3<+>Treg. Kako bi potvrdili ovaj nalaz, medijum ćelijske kulture je sakupljen i analiziran za potpis Treg citokina, IL-10 i TGF-β (Cools i dr., (2008) J. Cell Mol. Med.12:690-700). Velike količine IL-10 i TFG-β su detektovane u medijumima ćelija tretiranih sa BsB (Slika 3A, levi paneli), ali ne u medijumima ćelija tretiranih sa BsBΔ ili mIgG2a. Iznenađujuće, CTLA-4Ig nije indukovao generisanje GFP<+>Tregova ili IL-10 i proizvodnju TGF-β. Bez vezivanja za određenu teoriju, mehanizam pomoću koga CTLA-41g smanjuje T-ćelijski odgovor je različit od onog kod BsB. LAG-3Ig, sam ili u kombinaciji sa BsBΔ, takođe nije uspeo da generiše GFP<+>Treg, sugerišući da je za indukciju Tregova potrebno BsB-posredovano ukrštanje CTB-4 sa TCR.

Primer 4

Indukciji Tregova pomoću BsB potreban je samo-stimulisan TGF-β

[0130] Istovremeno detektovanje povišenih nivoa IL-10 i TGF-β nakon tretmana sa BsB povećalo je mogućnost da su citokini, naročito TGF-β, imali ulogu u olakšavanju stvaranja Tregova (Slika 3A). Kako bi se ovo rešilo, medijumi za kulturu su sakupljani tokom perioda od pet dana i analizirani za sadržaj citokina i Foxp3<+>Tregova. Povećani nivoi IL-10 i TGF-β su otkriveni već u toku 2 dana posle tretmana, i Foxp3<+>Tregovi su otkriveni nakon dana 3. Bez vezivanja za određenu teoriju, endogena proizvodnja TGF-β koja je verovatno stimulisana od strane BsB, uključena je u Treg diferencijaciju. Dodavanje anti-TGF-β antitela (klon 1D11), ali ne izotipskog kontrolnog IgG (klon 13C4), u Treg indukcioni test potpuno je blokirao pojavu Foxp3<+>Tregova (Slika 3B). Bez vezivanja za određenu teoriju, rano uključivanje CTLA-4 i njegova naknadna ukrštanja sa TCR pomoću BsB stimulisali su endogenu proizvodnju TGF-β, što je, zauzvrat, podstaklo diferencijaciju Tregova. Prethodno je prijavljeno da ukrštanje CTLA-4 i TCR indukuje TGF-β proizvodnju (Chen i dr., (1998) J. Exp. Med.188:1849-1857), iako diferencijacija Tregova nije procenjena u ovoj studiji.

[0131] Tregovi su pokazali značajan terapeutski potencijal u modulaciji manifestacija bolesti u nekoliko životinjskih modela autoimunih bolesti. Međutim, naglašen je značaj specifičnosti indukovanih Tregova protiv relevantnih antigena. Tregovi koji nisu specifični za antigen, koji se neće aktivirati protiv određenih autoantigena u kontekstu reaktivnih T ćelija specifičnih za autoantigene, verovatno nisu funkcionalno imunosupresivni. Prema tome, pristupi koji olakšavaju stvaranje velikog broja Tregova koji su specifični za antigen su veoma poželjni za tretiranje ovih bolesti. Štaviše, strategije koje olakšavaju de novo indukciju Tregova koji su specifični za antigen in situ (na primer, u ostrvcima pankreasa za T1D ili u lamina propria za ulcerozni kolitis ili Kronovu bolest) poželjne su u odnosu na upotrebu usvojenog transfera in vitro diferenciranih ili proširenih Tregova.

Primer 5

Tregovi indukovani sa BsB su funkcionalno supresivni na način koji zavisi od ćelijaćelija dodira.

[0132] Kako bi se procenili da li su BsB-indukovani Treg funkcionalno supresivni, BsB-indukovani Tregovi i TGF-indukovani Tregovi, koji su služili kao kontrola, su prečišćeni korišćenjem fluorescencijski aktiviranog sortiranja ćelija (FACS) i pomešani su sa CFSE-označenim sinergetskim responderom T ćelije pri različitim odnosima i alogenim APC. Ćelije su ko-kultivisane tri dana, bilo u transkomoricama ili u regularnim komoricama za kulturu, nakon čega je proliferacija respiratornih T ćelija analizirana pomoću protočne citometrije. Kao što je rezimirano na Slici 5A, u BsB- i TGF- β-indukovani Tregovi kultivisani u komoricama za regularnu kulturu su u potpunosti inhibirali proliferaciju responder T-ćelija. Potencija supresivnih aktivnosti BsB-indukovanih Tregova bila je uporediva sa onom od TGF- β-indukovanih Tregova. Nasuprot tome, Tregovi koje su generisali BsB ili TGF-β nisu značajno inhibirali proliferaciju responder T-ćelija kada su T ćelije bile odvojene od Tregova u transkomorici. Bez vezivanja za određenu teoriju, Treg supresivna aktivnost zavisila je od ćelija-ćelija dodira i nije bila posredovana izlučenim citokina ili drugim faktorima. Kao podrška ovoj tvrdnji, uključivanje antitela za IL-10 (klon JES5-2A5) u komorice za regularnu kulturu nije uticalo na supresivnu aktivnost bilo BsB- ili TGF-β-indukovanih Tregova (Slika 5B). Dodavanje antitela do TGF-β1D11 takođe nije uticalo na supresivnu aktivnost BsBindukovanih Tregova, iako je delimično smanjena supresija TGF-β-indukovanih Tregova (Slika 5B).

Primer 6

BsB usmerava diferencijaciju OT-II T ćelija u antigen-specifične Tregove.

[0133] Kao što je otkriveno da bifunkcionalni fuzioni protein koji sadrži CD80wa i LAG3 (BsB) koji ukršta CTLA-4 sa TCR (preko MHCII) može indukovati proizvodnju Foxp3<+>Tregova u alogenom MLR, ispitan je potencijal BsB u lučenju proizvodnje antigenspecifičnih Tregova. Kako bi istražili ovu perspektivu, naivne OT-II T ćelije su prečišćene od transgenih miševa koji poseduju transgene koji kodiraju TCR (α- i β- podjedinice) specifičan za kokošiji ovalbumin peptid (323-339) (Barnden i dr., 1998) i mešane su sa sinergetskim APC u prisustvu Ova323-339. Nakon 5 dana kulture, znatno veće količine Foxp3<+>Tregova su detektovane u OT-II T ćelijama koje su tretirane sa BsB (Slika 4A, srednji levi panel) nego sa mIgG kontrolom(Slika 4A, gornji levi panel) ili sa CTLA-4Ig (podaci nisu prikazani). Ova indukcija Tregova inhibirana je uključivanjem anti-TGF-β antitela u kulture (Slika 4A, donji levi panel). Bez vezivanja za određenu teoriju, diferencijaciju je posredovana endogeno proizvedenim TGF-β na autokrinski ili parakrinski način. Nivoi IL-2 su smanjeni, dok su se vrednosti IL-10 i TGF-β povećale u medijumima ćelija tretiranih sa BsB (Slika 4A, desni paneli).

[0134] Kako bi se pratila proliferativna aktivnost indukovanih Tregova, OT-II ćelije su prethodno opterećene sa fluorescentnim tragačem, CFSE. Kao što je prikazano na Slici 4B, za BsB-indukovane Foxp3<+>Tregove je utvrđeno da proliferiraju, kao što je indikovano razblaživanjem CFSE signala. Kao što je očekivano, dodatak CTLA-4Ig, ko-stimulatorni bloker, smanjio je proliferaciju T ćelija. Zbog toga, BsB je bio sposoban da inhibira aktivaciju T ćelija i indukuje proizvodnju Tregova, i u postavci alogenog MLR, i u antigenspecifičnoj postavci.

Primer 7

Indukcija Tregova od strane BsB može uključivati slabljenje AKT/mTOR signalnog puta.

[0135] Nedavni izveštaji ukazuju na to da AKT i mTOR signalni putevi igraju važne uloge u određivanju sudbine T ćelija. Prisustvo konstitutivno aktivnog AKT u T ćelijama smanjuje Treg diferencijaciju na način koji je osetljiv na rapamicin (Haxhinasto i dr., 2008), ukazujući na to da se signalni putevi AKT i mTOR ukrštaju kako bi uticali na sudbinu Tregova. Štaviše,

4

T ćelije kojima nedostaje mTOR diferenciraju do Tregova lakše nego normalne kontrolne T ćelije (Delgoffe i dr., (2009) Immunity 30:832-844). Prijavljena je obavezna uloga za koinhibitorne molekule PD-1/PD-L1 u kontrolisanju adaptivnog Treg razvoja antagonizacijom AKT/mTOR (Francisco i dr., (2009) J. Exp. Med.206:3015-3029). Kako bi se utvrdilo da li su ovi putevi takođe uključeni u BsB-posredovanu indukciju Tregova, anti-CD3 i anti-CD28 antitela su ko-imobilisana sa BsB, mIgG ili PD-L1 na pločama sa 96 komorica, u koje su posejane naivne T ćelije. Osamnaest časova posle aktivacije, ćelije su obojene fluorescentnooznačenim antitelima protiv fosforilisanog AKT i mTOR i analizirane protočnom citometrijom. Fosforilacija i AKT i mTOR je umanjena sa BsB i PD-L1 ko-imobilizacijom (Slika 6). Bez vezivanja za određenu teoriju, signalizacija događaja posredovanih sa CTLA-4 i PD-L1 inhibitornim molekulima može se u određenoj meri konvergovati duž AKT/mTOR signalnog puta tokom aktivacije T ćelija radi regulacije Treg diferencijacije.

Primer 8

Izloženost BsB-u održava Foxp3<+>eksprimiranje u indukovanim Tregovima.

[0136] In vitro-indukovani Tregovi, za razliku od potpuno posvećenih prirodnih Tregova, navodno su manje stabilni i mogu izgubiti Foxp3<+>eksprimiranje nakon produženog kultivisanja u odsustvu inicijalnog induktora (npr., TGF-β ili retinoinska kiselina) (Selvaraj and Geiger, (2007) J. Immunol. 178:7667-7677). U trenutnoj studiji, BsB-indukovani Tregovi pokazali su sličnu nestabilnost, gde su neke ćelije izgubile eksprimiranje Foxp3 nakon ponovljenog kultivisanja (Slika 7). Kako bi se testiralo da li re-stimulacija pomoću BsB može produžiti Foxp3 eksprimiranje, Treg je prvi put indukovan premazom 96-komoričnih ploča sa anti-CD3/anti-CD28 antitelima i BsB. Prečišćeni Tregovi su zatim podvrgnuti dodatnoj rundi kultivisanja prisustvu ili odsustvu BsB. Re-stimulacija prečišćenih Tregova sa BsB omogućila je za održavanje velike populacije (-93% ukupnih Trega) pd Foxp3<+>Tregova (Slika 7, donji desni panel), u poređenju sa -40% eksprimiranjem Foxp3 kao odgovor na IgG kontrolu (Slika 7, gornjem desnom panelu).

Primer 9

Farmakokinetika BsB kod miševa.

[0137] Pre testiranja terapijske upotrebe BsB u životinjskim modelima autoimunih bolesti utvrđeno je da je njegov farmakokinetički profil pomogao u izradi režima doziranja in vivo. Intraperitonealna injekcija BsB kod C57BL/6 miševa rezultovala je merljivim porastom nivoa u cirkulaciji, praćeno brzim klirensom sa procenjenim poluživotom u plazmi (t1/2) od -12 sati (Slika 8A). Ovaj profil je bio neočekivani, jer je farmakokinetika fuzionih proteina ili antitela koji sadrže Fc tipično više produžena. Pošto je vezivanje antitela na neonatalni Fc receptor (FcRn) prvenstveno odgovorno za njegov produženi poluživot (Roopenian i Akilesh, 2007), upoređene su relativne sposobnosti BsB i kontrolnog mišjeg IgG2a da se vezuju FcRn. Slika 8B pokazuje da su karakteristike vezivanja oba proteina na FcRn veoma slične, što ukazuje na to da defekt vezivanja BsB na FcRn verovatno nije bio uzrok njegovog brzog čišćenja iz cirkulacije.

[0138] Još jedno potencijalno objašnjenje brzog čišćenja BsB može biti zbog njegovog uzimanja od strane receptora ugljenih hidrata na ćelijama koje nisu ciljane. Primeri takvih receptora uključuju receptor azijaloglikoproteina (ASGPR) na hepatocitima (Weigel, 1994) i receptora manoze na makrofagima i endotelnim ćelijama retikuloendotelskog sistema (Pontow i dr., 1992). Analiza BsB korišćenjem NetNGlyc servera ukazuje na to da ima potencijal da prikupi do 10 asparagina-povezanih bočnih lanaca oligosaharida po monomeru (Slika 9). Analiza monosaharidnih sastava pokazala je da BsB sadrži približno 37 manoznih ostataka, i mogla su se koristiti sva predviđena mesta glikozilacije povezane sa asparaginom, jer svaki od ovih oligosaharid glikana povezanih sa asparaginom sadrži jezgro-manoza strukturu sa tri ostataka manoze (ukupno 30 ostataka manoze). Pored toga, mogu postojati i male količine tipa oligosaharida visoke manoze, kako bi se uzeli u obzir ekstra ostaci manoze. Zaista, značajne količine pod-sijalilovanih tri- i tetra-antenara povezanih sa asparaginom, kao i nekih tipova oligosaharida visoke manoze, identifikovane su masenom spektrometrijom permetiliranih glikana oslobođenih iz proteina.

[0139] Ova projekcija je takođe u skladu sa BsB molekulskom težinom od 100 kDa, što je pokazano SDS-PAGE analizom, za razliku od izračunate težine BsB od 80 kDa. Dodato prisustvo oligosaharida doprinelo je razlici (20 kDa) u molekulskoj težini. Štaviše, BsB je pokazao odnos sijaličnih kiselina i galaktoze od 0,68 (Slika 9), što ukazuje da su glikani nepotpuno sijalilirani. Bez vezivanja za određenu teoriju, ugljovodonično-posredovano čišćenje BsB od strane ASGPR doprinelo je njegovom brzom uklanjanju iz cirkulacije.

Primer 10

Kratak terapijski tretman sa BsB odložio je početak autoimunog dijabetesa kod NOD miševa.

[0140] Pošto je EC50od BsB za indukovanje Tregova in vitro procenjen da je oko 100 nM, i njegov poluživot u cirkulaciji je kratak (t1/2na ~12h), BsB je testiran na NOD miševima u paradigmi kasne prevencije. NOD miševima su dati BsB u kratkom intervalu (svaki drugi dan u trajanju od 4 nedelje), kada su bili između 9 i 12 nedelja starosti. U ovom dobu, autoreaktivne T ćelije i insulitis su već očigledni, ali miševi tek treba da razviju otvoreni dijabetes. Kao što je prikazano na Slici 10A, NOD miševi tretirani tokom 2 nedelje sa BsB pokazali su skromno, ali statistički značajno povećanje (25%) u broju Foxp3<+>Tregova u krvi u poređenju sa kontrolama tretiranim sa fiziološkim rastvorom. Međutim, taj porast Tregova je bio prolazan kao razlika u broju Tregova nakon 4 nedelje tretmana, ili u kasnijim vremenskim tačkama nisu mogao da se detektuje. Slično prolazno povećanje Tregova u limfoidnim organima prethodno je zabeleženo nakon tretmana NOD miševa sa anti-CD3 antitelom (Nishio i dr., 2010). Bez vezivanja za određenu teoriju, BsB-indukovani Tregovi su se možda vratili na Foxp3<->T ćelije nakon prestanka tretmana. Oni su takođe mogli biti regrutovani od strane specifičnih ciljnih tkiva (npr. pankreasa) da bi izvršili svoju funkciju. Bez obzira na to, izgleda da ova kratka terapija tretmana sa BsB u paradigmi kasne preventivne terapije skromno odlaže početak bolesti, i smanjuje broj miševa koji imaju otvoreni T1D (Slika 10B).

[0141] Skroman odgovor je mogao biti zbog prisustva aktivnog insulitisa kod 9 nedelja starih NOD miševa pre početka terapije. Pokazalo se da je upalni milje pogodan za konverziju aktivirajućih T ćelija u Th17 ćelije, i potiskivanje njihove konverziju u Treg. Upalni citokini kao što su IL-6 ili IL-4 takođe su pokazali da inhibiraju Treg konverziju, i promovišu gubitak Foxp3<+>eksprimiranja u Tregovima (Caretto i dr., 2010; Kastner i dr., 2010; Koenen i dr., 2008). Kako bi se zaobišli ovi izazovi, NOD miševi su tretirani počevši od ranijeg doba (4 nedelje starosti) pre otvorene indukcije auto-reaktivnih T ćelija i insulitisa. CTLA-4Ig je takođe uključen kao pozitivna kontrola u ovoj studiji, s obzirom da su Bluestone i kolege (Lenschow i dr., 1995) pokazali koristi od tog agensa u ovom modelu; mIgG2a je korišćen kao dodatna negativna kontrola za fiziološki rastvor. Za razliku od rezultata kod starijih miševa (Slika 10A), broj Foxp3<+>Tregova u perifernoj krvi mlađih NOD miševa tretirani tokom 2 nedelje sa BsB nije povećan iznad onih kod kojih su primenjivani fiziološki rastvor ili mIGg (Slika 11A). Bez vezivanja za određenu teoriju, to može biti zato što je broj autoreaktivnih T ćelija kod 4 nedelje starih NOD miševa (za razliku od miševa starih od 9-12 nedelja korišćenih u ranijoj studiji) bio veoma nizak. Broj indukovanih antigen-specifičnih Tregova je verovatno premali da bi se registrovao izvan bazalnih nivoa prisutnih u životinjama. Značajno niža učestalost T1D je zabeležena kod NOD miševa kojima je dat BsB, u poređenju sa kontrolama tretiranim fiziološkim rastvorom pre 24 nedelje starosti (Slika 11B). Međutim, ova korist je smanjena na kasnijim tačkama.

4

[0142] U skladu sa izveštajem NOD miševa kojima je primenjivan CTLA-4Ig (Salomon i dr., 2000), nivoi Tregova u krvi (Slika 11A) su značajno smanjeni, verovatno zbog efekata CTLA-4Ig na CD28/B7 signalizaciju (Tang i dr., 2003). Tretman sa CTLA-4Ig takođe je pogoršao bolest kod miševa koji su imali raniji početak bolesti (Slika 11B) i veću penetraciju bolesti u poređenju sa kontrolama tretiranim sa slanim rastvorima i mIgG (Slika 11B). Razlog neslaganja između ovih nalaza, i onih koje su prijavili Bluestone i kolege (Lenschow i dr., 1995) je nejasan, ali može biti zbog razlika u korišćenju CTLA-4Ig ili režima doziranja. U predmetnim studijama, umesto 2,5 mg/kg mišjeg CTLA-4Ig od strane Bluestone i kolega, korišćena je doza od 10 mg/kg ljudskog CTLA-4Ig (Orencia). Štaviše, BsB tretman nije produžen nakon sedam nedelja. Bez vezivanja za određenu teoriju, upotreba veće doze CTLA-4Ig omogućila je potpuniju blokadu ko-stimulativnog signala potrebnog za homeostazu Tregova.

Primer 11

Duži tok tretmana sa BsB značajno je odložio početak i smanjio učestalost autoimunog dijabetesa kod NOD miševa.

[0143] Potencijalni razlozi za opažene skromne koristi od BsB pri tretmanu bolesti kod NOD miševa u ranijim studijama uključuju primenu relativno kratkog toka tretmana, umerenu jačinu BsB na indukovanje proizvodnje Tregova (EC50na > 100 nM), i kratki poluživot u cirkulaciji u odnosu na BsB koji je možda ograničio njegovu izloženost. Kako su potentnost i poluživot u cirkulaciji BsB inherentni za molekul i zbog toga nisu podložni lakoj promeni, testiran je duži tok tretmana. U tom cilju, NOD miševi su tretirani sa BsB tokom 10 nedelja umesto 4 nedelje, počevši od kada su miševi bili stari 4 nedelje. Kao što je prikazano na Slici 12A, NOD miševi tretirani 10 nedelja sa BsB pokazuju značajno kašnjenje u pojavi T1D. Značajno, do 35 nedelja starosti, samo ~13% NOD miševa koji su tretirani sa BsB su razvili T1D u poređenju sa preko 70% u kontrolisanim tretmanima fiziološkim rastvorom. Prema tome, produženi tretman NOD miševa sa BsB izgleda štiti životinje od razvoja autoimunog dijabetesa.

[0144] Na kraju studije (kada su miševi bili stari 35 nedelja), životinje su žrtvovane i njihovi pankreasi su sakupljeni za histopatološku analizu. Susedne serijske sekcije su obojene sa H&E za opštu procenu ostrvaca, sondirane antitelom protiv insulina radi detektovanja prisustva insulina u β-ćelijama, i dvostrukom obojeni sa anti-CD3 i anti-Foxp3 antitelima za lociranje T ćelija i Tregova.

[0145] Zbog genetske heterogenosti NOD miševa, mali broj netretiranih životinja nije razvio bolesti do 35 nedelja života. Analiza ostrvaca ovih ne-dijabetičkih životinja (iz kohorte tretirane fiziološkim rastvorom) pokazala je da su β-ćelije netaknute bez očiglednih dokaza o limfocitnoj infiltraciji ili insulitisu, (Slika 12B, paneli a-c). Nekoliko Foxp3<+>Treg ćelija su bile prisutne u ostrvcima ovih miševa (strelice u panelu c). Nasuprot tome, ostrvca iz dijabetičkih NOD miševa (iz kohorta tretirane fiziološkim rastvorom) otkrila su prisustvo invazivnog insulitisa (Slika 12B, panel d) i kompletno uništavanje β-ćelija (panel e). Pored CD3<+>T ćelija i Foxp3<+>Tregova, takođe je bio evidentan veliki broj ne-T ćelijskih limfocita (Slika 12B, panel f). Slični histopatološki nalazi su primećeni u odgovarajućim miševima koji su bili tretirani sa BsB, koji su ostali bez bolesti na kraju studije, ili su razvili T1D tokom studije. Zanimljivo je da su u ~50% ostrvaca NOD miševa, koji su tretirani sa BsB ostali nedijabetički, evidentirani dokazi peri-insulitisa (Slika 12B, panel g); međutim, β-ćelije su dobro očuvane (Slika 12B, panel h). Bojenje antitela pokazalo je da ćelije na periferiji ostrvaca sadrže prvenstveno CD3<+>T ćelije i Tregove. (Slika 12B, panel i). Povećanje dela slike (crveni kvadrat na Slici 12B, panel i) jasno otkriva prisustvo brojnih Foxp3<+>Tregova (žute strelice na slici 12B, panel j) koji su bili razdvojeni ne sa Foxp3<+>, već sa CD3+ T ćelijama (crne strele sa strelicama na Slici 12B, panel j), kao i ne-T ćelijski mononukleotidi (plava jedra). Razvoj peri-insulitisa zabeležen je kod mladih (4-10 nedelja stari) NOD miševa (Anderson i Bluestone, 2005), i kod starijih miševa tretiranih drugim efikasnim terapijskim agensima koji su odložili ili promenili početak T1D kod NOD miševa (Chatenoud i dr., 1994; Daniel i dr., 2011; Simon i dr., 2008; Vergani i dr., 2010). Stoga, duži tok tretmana NOD miševa sa BsB zaštitio je životinje od razvoja invazivnog insulitisa i otvorenog T1D. Bez vezivanja za određenu teoriju, ovo je bilo posredovano, barem delimično, de novo i eventualno in situ indukcijom ostrvaca antigen-specifičnih Tregova.

[0146] Ukrštanje CTLA-4 i TCR preko MHCII koristeći novi bispecifični fuzioni protein (BsB) efikasno je indukovalo proizvodnju antigen-specifičnih Tregova, kao i anti-upalne citokine, IL-10 i TGF-β. Prethodne studije pokazale su da su Treg kritični za davanje imunološke tolerancije i da su antigeni specifični Treg efikasniji u životinjskim modelima autoimunih bolesti. BsB je dalje procenjen kod životinjskih modela autoimunih bolesti, kao što je T1D. Bez vezivanja za određenu teoriju, hipoteza je bila da ako je BsB promovisala indukciju antigen-specifičnih Tregova tokom rane faze aktivacije autoreaktivnih T ćelija kod NOD miševa, ona može odložiti početak ili zaustaviti progresiju bolesti pretvaranjem autoreaktivnih T ćelija koje se aktiviraju za Treg.

4

[0147] Uprkos tome što BsB ispoljava skromnu potentnost (zbog svog umerenog afiniteta za MHC-II i TCR) i kratkotrajan poluživot u cirkulaciji (koji je ograničio njegovu izloženost), kratki tok tretmana je reproducibilno odložio početak T1D kod NOD miševa koji su tretirani mladi (između 4-6 nedelja starosti) i kada su bili stariji (između 9-12 nedelja starosti).

Međutim, posmatrane prednosti su bile skromne i neodržive. Duži tok tretmana (10 nedelja) NOD miševa (između 4 i 13 nedelja starosti) sa BsB značajno je odložio pojavu bolesti i učestalost životinja koje razvijaju T1D. Bez vezivanja za određenu teoriju, ovu korist je dala de novo generacija indukovanih Tregova koji su ili lokalno proizvedeni (npr. u pankreasima ili limfnim čvorovima pankreasa) ili distalno, koji su zatim regrutovani u pankreas kako bi zaštitili ostrvca od uništavanja od strane autoreaktivnih T ćelija i drugih ne-T ćelijskih leukocita. Imunohistohemijsko bojenje delova tkiva pankreasa 35 nedelja starih miševa koji su ostali ne-dijabetički jasno pokazuje povećanje broja Foxp3<+>Tregova na periferiji ostrvaca. Vizuelno, čini se da sprečavaju CD3<+>T ćelije i ne-T ćelijske limfocite od ulaska u ostrvca. Ova pojava je primećena kod ~50% ostrvaca NOD miševa koji su tretirani sa BsB koji su ostali ne-dijabetički na kraju studije, ali ni u jednom od ostrvaca dijabetičkih životinja u kontrolnoj grupi. Ostrvca nekoliko ne-dijabetičkih miševa u kontrolnoj grupi ostala su bez limfocitnih infiltracija i bez insulitisa. Poznato je da zbog genetske heterogenosti NOD miševa, nekoliko životinja u grupi ove veličine nikad ne razvija dijabetes u ovom vremenskom okviru. Kod preostalih, ~ 50% ne-dijabetičkih životinja u grupi koja je tretirana sa BsB, ostrvca su takođe bili bez limfocitnih infiltracija i bez insulitisa. Mogućnosti za statusa bez bolesti ovih miševa uključuju BsB tretman i genetsku osnovu.

[0148] U skladu sa histopatološkim nalazima, mali, ali statistički značajan porast broja Foxp3<+>Tregova je otkriven u krvi životinja tretiranih sa BsB (tretiranih od 9-12 nedelja starosti) u poređenju sa netretiranim kontrolama. Ovo povećanje nije bilo očigledno kod miševa koji su započeli tretiranje u mlađem dobu (4 nedelje). Bez vezivanja za određenu teoriju, to može biti zbog toga što se više autoreaktivnih T ćelija aktivira u kod 9 nedelja starih nego kod 4 nedelje starih miševa. Nizak nivo autoreaktivnih T ćelija kod 4 nedelje starih miševa mogao je onemogućiti detektovanje indukovanih Tregova izvan toga u postojećem miljeu Tregova. Povećanje Tregova takođe je prolazne prirode. Pošto je slično posmatranje zabeleženo kod životinja podvrgnutih anti-CD3 terapiji (Nishio i dr., 2010), moguće je da su indukovani Tregovi nestabilni i izgubili eksprimiranje Foxp3. Veća je verovatnoća da su Tregovi regrutovani iz cirkulacije u ciljana tkiva. Nasuprot tome, NOD miševi tretirani CTLA-4Ig pokazali su značajno smanjenje broja Tregova u cirkulaciji.

4

Tretman je takođe pogoršao bolest, što je dokazano brzim pojavom bolesti i većom učestalošću životinja koje pokazuju otvorenu bolest. Ovo je u skladu sa prethodnim izveštajima koji pokazuju da je ko-stimulatorni put uključen u homeostazu Tregova, i da nedostatak ko-stimulacije smanjuje proizvodnju Tregova. Blokiranje ili knock-out CD80 ili CD86 kod NOD miševa takođe rezultuje ranijim početkom T1D (Salomon i dr., 2000; Tang i dr., 2003).

[0149] Pojava peri-insulitisa obično se posmatra u pankreasu NOD miševa između 4 i 9 nedelja starosti. Ako nije kontrolisana, dolazi do invazivnog insulitisa koji dovodi do potpunog uništavanja β-ćelija i razvoja otvorenog dijabetesa između 12 i 35 nedelja starosti. Pankreasi ne-dijabetičkih NOD miševa koji su tretirani 10 nedelja sa BsB i analizirani u 35-ogodišnjem uzrastu pokazala je dokaze o peri-insulitisu kojima je izgleda zaustavljena progresija. Nije bilo indikacija invazivnog insulitisa ili prekomernog uništenja ćelija za proizvodnju insulina. Postoje i drugi izveštaji o različitim terapijskim intervencijama sličnog odlaganja ili prevencije bolesti kod NOD miševa (Shoda i dr., 2005). Rezultati su najčešće srodni onima koje je izveo Lee i dr. (2010), koji su pokazali da transfer dijabetogenih CD4<+>CD25-BDC2.5 T ćelija, kojima su iscrpljeni CD4<+>CD25<+>Tregovi, u ženske NOD/SCID miševe ubrzava razvoj invazivnog insulitisa u poređenju sa miševima kojima su primenjivane ukupne CD4<+>T ćelije koje sadrže CD4<+>CD25<+>Tregove. Invazivnim insulitisom u velikoj meri dominira infiltracija dendritskih ćelija (DC) umesto BDC2.5 T ćelija per se. Autori su pretpostavili iz svoje studije da su Tregovi regulisali invazivnost DC u ostrvca tako što su modulisali, barem delimično, hemotaksu DC u odgovoru na hemokine CCL19 i CCL21 koji su izlučeni iz ostrvaca. Imunohistohemijski obrasci bojenja za Foxp3<+>Tregove, CD3<+>T ćelije i ne-T ćelijske leukociti primećeni u pankreasnim sekcijama NOD miševa tretiranih sa BsB su u skladu sa njihovim nalazima (Slika 12B). Bez vezivanja za određenu teoriju, Tregovi proizvedeni u NOD miševima kao odgovor na BsB verovatno su delovali da zaustave migraciju autoreaktivnih T ćelija i ne-T ćelijskih limfocita u ostrvca. Daliji tok tretmana sa BsB bio je efikasniji, jer je to izazvalo jaču i održivu indukciju Tregova. Ta kontinuirana stimulacija indukovanih Tregova sa BsB u ćelijskim kulturama produžila je eksprimiranje Foxp3<+>u Tregovima podržava ove navode (Karman i dr., 2012).

[0150] Ćelijska terapija koja koristi sveže izolovan, ex vivo proširen ili in vitro indukovani Tregovi u životinjskim modelima autoimunih bolesti ili transplantaciji organa pokazala je da usvojeni prenos Tregova može da obnovi ravnotežu Tregova protiv efektorskih T ćelija, čime kontroliše visoku autoimunost povezanu sa ovim bolestima (Allan i dr., 2008; Jiang i dr.,

4

2006; Riley i dr., 2009; Tang i dr., 2012). Međutim, upotreba adoptivnog transfera kao terapeutske strategije predstavlja nekoliko izazova pre nego što bude spremna za kliničku primenu. Prvo, broj autolognih Tregova koji se mogu izolovati od periferne krvi ljudskog pacijenta je ograničen. Zbog toga je često neophodna ex vivo ekspanzija Tregova, što može promeniti njihovu funkcionalnost i čistoću. Drugo, pošto su izolovani Tregovi poliklonski, oni mogu vršiti pan-imuno supresivnu funkciju na T-ćelijama koje nisu ciljane. Treće, i najvažnije, plastičnost Tregova predstavlja značajan izazov (Bluestone i dr., 2009; Zhou i dr., 2009a). Pokazano je da adoptivni transferi Tregova mogu izgubiti eksprimiranje Foxp3 i rediferencirati u Th17 ćelije (Koenen i dr., 2008) ili patogene memorijske T-ćelije (Zhou i dr., 2009b), što podiže rizik od pogoršanja autoimunosti ili upale. Shodno tome, terapeutik koji indukuje generisanje Tregova na antigen-specifičan način in situ je povoljniji u odnosu na ćelijsku terapiju adoptivnog Tregova. Prikazani rezultati pokazuju korisnost i efikasnost takvog agensa (BsB) koji ukršta CTLA-4 u MHCII u kontekstu mišjeg modela T1D.

Kombinovana demonstracija proizvodnje IL-10, TGF-β i Tregova kao odgovor na tretman sa BsB kao i efikasnost u NOD mišem modelu T1D ima potencijal da obezbedi nov terapijski koncept. BsB takođe nudi dodatne prednosti u odnosu na druge imunološke modulatore u tome što ne utiče na neaktivne T ćelije ili druge limfocite. Brojevi i procenti CD4<+>T ćelije i CD19<+>B ćelije na periferiji ostali su isti u svim našim NOD studijama. Bez vezivanja za određenu teoriju, ovaj pristup je efikasan u odlaganju ili zaustavljanju progresije bolesti. Razvijanje varijanti BsB koje su snažnije i koje imaju povoljniji farmakokinetički profil bi trebalo da potvrde studije. Dakle, ovaj koncept se takođe može primeniti na upravljanje drugim imunološki posredovanim bolestima.

[0151] Rezultati koji su objavljeni ovde su dobijeni korišćenjem sledećih postupaka i materijala, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0152] Životinje. Ženke divljeg tipa C57BL/6 (H-2<b>), BALB/c(H-2<d>), transgeni OT-II miševi koji eksprimiraju α-lanac α i β-lančani receptor T ćelija specifičan za kokošiji ovalbumin 323-339 (Ova323-339) u C57BL/6 genetičkoj pozadini, i ženke ne-gojaznih dijabetičkih (NOD/LtJ) miševa nabavljene su od The Jackson Laboratory. Životinje su održavane u postrojenju bez patogena, i studije su sprovedene u skladu sa smernicama koje su izdali U.S. Department of Health and Human Services (NIH Publication No 86-23) i Genzyme's Institutional Animal Care and Use komitet.

[0153] Antitela i reagensi. Funkcionalni razred ili fluorescentno-označena anti-mišja CD3

4

(klon 145-2C11), CD25, insulin i Foxp3<+>antitela su kupljena od eBioscience ili BD Biosciences. Mišji CTLA-4-Fc i ljudski CTLA-4Ig (Orencia) su kupljeni od R&D Systems, Inc. i Bristol-Myers Squibb, respektivno. Kontrolni mišji IgG2a izotip dobijen je od BioXCell Inc. CFSE, ultraniski Ig fetalni goveđi serum (FBS), i drugi medijumi za kulturu ćelija su bili od Invitrogena. Kokošiji Ova323-339peptid je dobijen od New England Peptida.

[0154] Izgradnja i proizvodnja bispecifičnog fuzionog proteina BsB. Konstrukcija i eksprimiranje bispecifičnog fuzionog proteina (BsB) koji sadrži ekstracelularne domene CD80w88a i LAG-3, kao i Fc mišjeg IgG2a (CD80wa-LAG-3-Fc, BsB), su opisani prethodno (Karman i dr., 2012 ).

[0155] Biacore testovi i analiza sastava monosaharida. Biacore je korišćen za upoređivanje vezivanja BsB i mIgG2a na mišji neonatalni Fc receptor (FcRn). Ukratko, CM5 čip je imobilisan sa -1430 RU mišjeg FcRn-HPC4 koristeći aminsku hemiju. Svaki uzorak je serijski razređen 1:2 do konačnih koncentracija između 200 i 6,25 nM u PBSP (PBS sa 0,005% Surfaktant P-20), pH 6,0 i ubrizgava se 3 minuta u duplikat, nakon čega sledi 3 minuta pranja sa puferom za disocijaciju. Površina je regenerisana sa 10mM natrijum borata i 1M NaCl, pH 8,5. Uzorak ugljenih hidrata monosaharida iz BsB analiziran je prema protokolu koji su opisali Zhou i dr. (Zhou i dr., 2011).

[0156] Izolacija naivnih T ćelija. Naivne T ćelije iz slezine i limfnih čvorova od 8-12 nedelja starih ženki BALB/c ili ženki OT-II miševa prečišćene su magnetnim odvajanjem, nakon čega sledi fluorescencijski-aktivirano sortiranje ćelija. Ćelije su prvo negativno odabrane magnetnim separacijama ćelija (Miltenyi Biotech), i potom sortirane kao CD4<+>CD25-CD62L<hi>CD44<low>ćelije čistoće veće od 98%.

[0157] Test indukcije antigen-specifičnih Tregova. Analize u postavci alogenog MLR su obavljene kao što je prethodno prijavljeno (Karman i dr., 2012). Za antigen-specifičnu T ćelijsku aktivaciju, 10<5>naivnih OT-II T ćelija je pomešane u 96-komoričnim pločama sa okruglim dnom, sa 10<5>ozračenim sinergetskim APC u prisustvu Ova323-329na 0,5 μg/ml i 1 μg/ml rastvorljivog anti-CD28 (klon 37,51, eBioscience). Ispitivani konstrukti, mišji IgG2a ili mišji CTLA-4Ig dodati su kultivisaime ćelije sa zasićenom koncentracijom od 100 μg/ml. Ćelije su kultivisane tokom 5 dana kako bi se indukovala proizvodnja Tregova, i analizirane su protočnom citometrijom. Medijumi su sakupljeni za analizu IL-2, IL-10 i TGF-β pomoću ELISA kompleta prema instrukcijama proizvođača. Za procenu proliferacije T ćelija,

4

prečišćene naivne OT-II T ćelije su označene sa 5 μM CFSE tokom 5 min na 37°C. Zatim su isprane kako bi se uklonio nevezani CFSE i korišćene su u testovima indukcije Tregova, kao što je gore opisano. Ćelije su kultivisane tokom 5 dana kako bi im se omogućilo da se dele pre nego što su analizirane protočnom citometrijom. Kako bi se detektovao Foxp3<+>u T ćelijama, ćelije su obojene za površinske markere kao što je gore opisano, praćeno permeabilizacijom sa Fix/Perm puferom (eBioscience) i bojenjem sa PE-Ci7 konjugovanim anti-Foxp3 antitelima (klon FJK-16s, eBioscience).

[0158] Farmakokinetička merenja BsB kod miševa. Farmakokinetika BsB je utvrđena kod 8 nedelja starih C57BL/6 miševa.20 mg/kg BsB je dato miševima intraperitonealnom injekcijom. Krv se sakuplja iz potkožne vene na 1 sat, 5 sati, 24 sata, 48 sati i 72 sata nakon primene. Nivoi BsB u svakoj vremenskoj tački su mereni pomoću ELISA testa. Ukratko, 100 μl (1 μg/ml) anti-mišjeg CD80 antitela u PBS je premazano na 96-komoričnnim ploča, i inkubirano je preko noći na 4°C. Ploče su blokirane sa 5% fetalnog goveđeg seruma u trajanju od 1 sata, nakon čega su 4 puta prane sa PBS. U komorice je zatim dodato 100 μl uzoraka krvi u različitim razblaženjima. Ploče su inkubirane 2 sata uz nežno mešanje na sobnoj temperaturi i isprane 4 puta sa PBS. Dodato je biotinilovano anti-mišje LAG-3 antitelo (1 μg/ml) i inkubirano 2 sata. Ploče su isprane 4 puta sa PBS nakon čega je dodat streptavidin-HRP. Nakon 30 min, ploče su isprane 6 puta sa PBS i razvijene za kolorimetrijsko merenje. Prečišćeni BsB razblaženi u razblaživaču u različitim koncentracijama su korišćeni kao standardi.

[0159] Tretiranje NOD miševa sa BsB. U tretiranju kratkog kursa, 4 nedelje stari ženski NOD miševi su tretirani sa fiziološkim rastvorom, 20 mg/kg BsB, 20 mg/kg mišjeg IgG2a ili 10 mg/kg ljudskog CTLA-4Ig (Orencia) tri puta nedeljno intraperitonealnom injekcijom tokom perioda od 2,5 nedelje. Za model kasne prevencije, NOD miševi starosti od 9 do 12 nedelja tretirani su fiziološkim rastvorom ili 20 mg/kg BsB kao što je gore navedeno u trajanju od 4 nedelje. Za duži tok tretmana, NOD miševi su tretirani sa BsB ili fiziološkim rastvorom, kao što je navedeno iznad, tokom 10 nedelja od starosti 4 nedelje do 13 nedelja. Nivoi glukoze u krvi praćeni su nedeljno, počevši od 8 nedelja starosti. Miševi su procenjeni kao dijabetički kada su njihova očitavanja glukoze veća od 300 mg/dL na tri uzastopna čitanja. Foxp3<+>Tregovi u perifernoj krvi ispitani su nakon dve nedelje tretmana pomoću protočne citometrije.

[0160] Ukratko, 50 ul čitave krvi je blokirano neobeleženim anti-FcyRIIb i FcgRIII (klon 93, eBioscience) tokom 20 minuta. elije su naknadno obojene sa anti-CD4 antitelom označenim sa fluorescencijom tokom 30 min, i zatim isprane. Crvene krvne ćelije su lizirane pomoću FACS Lysing rastvora (BD Biosciences) tokom 5 minuta. Nakon pranja, ćelije su fiksirane, permeabilizovane i obojene FITC-označenim anti-Foxp3 antitelom u trajanju od 30 minuta, kako je gore opisano. Pankreasi su se disecirani na pola, gde je jedna polovina fiksirana u neutralnom puferskom formalinu, a druga je postavljena u OCT jedinjenje, i zatim zamrznuta na suvom ledu.

[0161] Statistička analiza. Kumulativne učestalosti NOD miševa koji su imali T1D i hiperglikemiju nakon tretmana sa BsB ili kontrolama upoređene su korišćenjem log-rank (Cox-Mantel) testa u Prism 5 (Graphpad, city and state). Vrednost od p<0,05 se smatra statistički značajnom.

[0162] Histopatološka analiza. Neutralni pankreasi fiksirani u puferskom formalinu su obojeni za CD3, Foxp3<+>ćelije koristeći automatizovani procesor. Odeljci tkiva razdvojeni su pomoću ksilen-etanola, antigena dobijenih inkubiranjem 25 minuta u citratnom puferu, i zatim blokirani serumom. Slajdovi su inkubirani sa anti-CD3 antitelom u trajanju od 45 minuta, nakon čega sledi polimer kozje anti-zečje peroksidaze rena tokom 20 min.

Hromogena vizuelizacija CD3 dobijena je inkubiranjem sa 3,3'-diaminobenzidin tetrahidrohloridom 2-4 min. Kako bi se detektovao Foxp3<+>, sekcije su ponovo blokirane serumom, praćeno izlaganjem anti-Foxp3 antitelu tokom 45 minuta. Slajdovi su potom inkubirani sa zečjim anti-pacovskim IgG antitelom u trajanju od 30 minuta, nakon čega sledi polimer kozjeg anti-zečje alkalne fosfataze. Vizuelizacija hromogena je postignuta korišćenjem Fast Red tokom 10 min. Sekcije tkiva su kontraobojene korišćenjem hematoksilina tokom 2 min i oprane 3 puta sa 0,05% Tween-20/Tris puferisanim fiziološkim rastvorom između koraka. Susedne serijske sekcije su obojene korišćenjem anti-insulinskih antitela kako je opisano iznad. Slike su snimljene pomoću fluorescentnog mikroskopa Nikon Eclipse E800 sa priloženim digitalnim fotoaparatom kompanije Diagnostic Inc. i slikama stečenim pomoću Spot Advanced softvera.

Sekvence

Legenda

[0163] CD80w88a = CTLA-4 ligand

IgG2a = IgG2 Fc region

G9 = Gly 9

1

Lag-3 = MHC ligand

H6 = His 6

SEQ ID NO.1:

CTLA-4 BsB (Gen1) = mišji CD80w88a(aa1-235)-IgG2a(aa241-474)-G9-Lag-3(aa25-260)-H6

Nukleotidna sekvenca mišjeg surogat konstrukta (Gen1):

2

SEQ ID NO.3:

CTLA-4 BsB (Gen2) = mišji CD80w88a(aa1-235)-G9-Lag-3(aa25-260)-IgG2a(aa241-474)

Nukleotidna sekvenca mišjeg surogat konstrukta (Gene 2):

SEQ ID NO.4:

4

Prevedena proteinska sekvenca mišjeg surogat konstrukta (Gene 2):

SEQ ID NO.5:

CTLA-4 BsB ljudski konstrukt divljeg tipa nukleotidne sekvence = (ljudski

SEQ ID NO.6:

CTLA-4 BsB ljudski konstrukt divljeg tipa prevedene proteinske sekvence = (ljudski CD80(aa1-234)-G9-Lag-3(aa27-262-IgGla(aa240-471)

SEQ ID NO.8:

CTLA-4 BsB ljudski konstrukt varijante prevedene proteinske sekvence 1 = (ljudski CD80W84A/S190A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-

SEQ ID NO.11:

CTLA-4 BsB ljudski konstrukt varijante nukleotidne sekvence 3 = (ljudski CD80E196A/5190A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1aN596/297Q(aa240-471)

SEQ ID NO.12:

1

CTLA-4 BsB ljudski konstrukt varijante prevedene proteinske sekvence 3 = (ljudski CD80E196A/S190A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1

SEQ ID NO.13:

CTLA-4 BsB ljudski konstrukt varijante nukleotidne sekvence 4 = (ljudski CD80E196A/S190AS201A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-IgG1a N596/297Q(aa240-471)

2

SEQ ID NO.14:

CTLA-4 BsB ljudski konstrukt varijante prevedene proteinske sekvence 4 = (ljudski CD80E196A/S190AS201A(aa1-234)-G9-Lag-3R316/75E(aa27-262-

SEQ ID NO.16

BSBΔ (CD80wa-Fc) DNA = mišji CD80w88a(aa1-235)-IgG2a(aa241-474) Nukleotidna sekvenca mišjeg surogat konstrukta (BSBΔ; CD80wa-Fc):

4

SEQ ID NO.17

BSBΔ (CD80wa-Fc) Protein = mišji CD80w88a(aa1-235)-IgG2a(aa241-474) Prevedena proteinska sekvenca mišjeg surogat konstrukta (BSBΔ; CD80wa-Fc):

Druga otelotvorenja

[0164] Iz prethodnog opisa, biće očigledno da se varijacije i modifikacije mogu učiniti pronalasku koji je ovde opisan, kako bi se prilagodio za različite primene i uslove.

[0165] Navođenje spiska elemenata u bilo kojoj definiciji promenljivih ovde uključuje definicije te promenljive kao bilo kog pojedinačnog elementa ili kombinacije (ili potkombinacije) navedenih elemenata. Navođenje otelotvorenja ovde uključuje to otelotvorenje kao bilo koje pojedinačno otelotvorenje, ili u kombinaciji sa bilo kojim drugim otelotvorenjem ili njegovim delovima.

Claims

Patentni zahtevi

1. Bispecifični fuzioni protein koji sadrži ligand specifičan za CTLA-4 i ligand specifičan za pMHC kompleks, gde su ligand specifičan za CTLA-4 i ligand specifičan za pMHC kompleks razdvojeni od strane veznika.

2. Bispecifični fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1, gde je ligand specifičan za CTLA-4 odabran od CD80 (B7-1) ili CD86 (B7-2), ili antitela specifičnog za CTLA-4.

3. Bispecifični fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je ligand specifičan za pMHC kompleks odabran od anti-MHC antitela i LAG-3.

4. Bispecifični fuzioni protein prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je veznik jedan ili više od poliaminokiseline i Fc domena antitela.

5. Bispecifični fuzioni protein prema patentnom zahtevu 4, gde sekvenca poliaminokiseline jeste G9 (Gly-9).

6. Bispecifični fuzioni protein prema patentnom zahtevu 2, gde ligand specifičan za CTLA-4 jeste CD80, poželjno CD80 mutiran kako bi se povećala specifičnost za CTLA-4.

7. Bispecifični fuzioni protein prema patentnom zahtevu 6, gde je CD80 ljudski CD80 koji sadrži najmanje jednu od mutacija W84A, K71G, K71V, S109G, R123S, R123D, G124L, S190A, S201A, R63A, M81A, N97A i E196A, poželjno W84A ili E196A.

8. Bispecifični fuzioni protein prema patentnom zahtevu 3, gde ligand specifičan za pMHC kompleks jeste LAG-3, poželjno mutiran kako bi se povećala specifičnost za pMHCII.

9. Bispecifični fuzioni protein prema patentnom zahtevu 8, gde je LAG-3 ljudski LAG-3 koji sadrži najmanje jednu od mutacija R73E, R75A, R75E i R76E, poželjno R75A ili R75E.

10. Bispecifični fuzioni protein prema bilo kom od patentnih patentnih zahteva 1-9, gde fuzioni protein sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 14.

11. Bispecifični fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, za upotrebu pri tolerisanju T ćelija, kada je T-ćelija dovedena u dodir sa antigen prezentujućom ćelijom koja prezentuje antigen preko MHC molekula i bispecifičnog fuzionog proteina.

12. Bispecifični fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, za upotrebu u tretmanu bolesti odabrane od autoimune bolesti i odbacivanja transplanata.

13. Bispecifični fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, gde se bispecifični fuzioni protein daje u kombinaciji sa imunim supresorom ili modulatorom.

14. Bispecifični fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 12 ili 13, gde je autoimuna bolest odabrana od dijabetesa tipa 1 (T1D), sistemskog lupus eritematozusa (SLE), reumatoidnog artritisa (RA), upalne bolesti creva (IBD), ulcerativnog kolitisa (UC), Kronove bolesti (CD), multiple skleroze (MS), skleroderma, pemfigus vulgarisa (PV), psorijaze, atopijskog dermatitisa, celijačna bolest, hronične opstruktivne bolesti pluća, Hashimotovog tiroiditisa, Grejvs-Bazedovljeve bolesti (tiroidna žlezda), Sjogrenovog sindroma, Gijen-Bareovog sindroma, Gudpasterovog sindroma, Edisonove bolesti, Vegenerove granulomatoze, primarne bilijarne skleroze, skleroznog holangitisa, autoimunog hepatitisa, polimialgija reumatika, Rejnoovog fenomena, temporalnog arteritisa, arteritisa gigantskih ćelija, autoimune hemolitičke anemije, pernikusne anemije, poliarteritis nodoze, Behčetove bolesti, primarne bilijarne ciroze, uveitisa, miokarditisa, reumatske groznice, ankiloznog spondilitisa, glomerulonefritisa, sarkoidoze, dermatomiozitisa, mijastenije gravis, polimiozitisa, alopecia areate i vitiliga.

15. Bispecifični fuzioni protein za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, gde je autoimuna bolest dijabetes tipa 1 (T1D).