UA116191C2

UA116191C2 - Біспецифічний злитий білок, інгібітор т-клітинної активації

Info

Publication number: UA116191C2
Application number: UAA201400833A
Authority: UA
Inventors: Юнсян ЧЖУ; Йожеф КАРМАН; Ронні Вей; Цаньвень Цзян; Сен Чен
Original assignee: Джензім Корпорейшн
Priority date: 2011-06-30
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2018-02-26
Also published as: EP2726101B1; ES2810424T3; MX2013015384A; US11028170B2; EP2726101A1; ZA201309532B; CN103796681A; SG10201604715VA; JP2014522846A; JP6826154B2; JP2021073216A; CA2839462A1; EP3357511B1; US20210380686A1; PE20141469A1; MX354922B; ES2694749T3; AU2017261541B2; PL3357511T3; CN107988156B

Abstract

Винахід стосується біспецифічного злитого білка, інгітора Т-клітинної активації, де біспецифічний злитий білок містить ліганд, специфічний до CTLA-4, і ліганд, специфічний до комплексу рМНС, розділені за допомогою лінкера.

Description

(56) А Візресійс Ргоїєїп Сарабіє ої Епдадіпд СТІ А-4 апа МНОИЇІ Ргоїесі5 Моп-Орезе Оіабеїіс Місе їтот

Ашоіттипе Оіабеїез / Нопдітеї 2пао, дог5еї

Каплан, І-І еі Лапа еї аї. // Ріоз опе. - 2013. - Мої. 8. - по. 5. - Р. е63530 05 2011015892 АТ, 23.06.2011 05 20070148162 АТ, 26.06.2008

МО 2004078928 Аг, 16.09.2004

Спагасієгілайоп ої Ше таїйог пізіосотраїй Бійу соптріех сіазз ІІ ріпаїпду зйе оп ГАС-3 ргоївіп /

Вепгапа Ниага, НКепайо Мазігапоеїї, РА рре

Ргідепі еї а). // Ргос. паї). асай. всі. - ОБА. - 1997. -

Мої. 94. - Р. 5744 - 5749

Ідепійсайоп ої Кезідцез іп Те М ботаїп ої СО8О (8В7-1) Ітріїсаїей іп Рипсіопаї! Іпіегасіопв м

СО28 апа СТІ А4 / Спгізііпе А. Рагдеаз, АІетзедей

Тгипен, Мапіша Недау еї аї. // 9. ехр. тей. - 1995. - Моі. 182. - Р. 667 - 675 (54) БІСПЕЦИФІЧНИЙ ЗЛИТИЙ БІЛОК, ІНГІБІТОР Т-КЛІТИННОЇ АКТИВАЦІЇ (57) Реферат:

Винахід стосується біспецифічного злитого білка, інгітора Т-клітинної активації, де біспецифічний злитий білок містить ліганд, специфічний до СТІ А-4, і ліганд, специфічний до комплексу рРМНС, розділені за допомогою лінкера. 14000 снення ня 2000 оз ї тк з І З 10000- х т КЕ ке

ЕЕ вооо- -- - ВО0О- З 4000. З пише в Оу 2000 З ж ненні ВЖК п-- ше ке КЕ я --е

Фо с

Го. Бе й -к Ка й К ії в Фо жо стЕ СЕ в й ее

Чнг. 2

Перехресне посилання на споріднену заявку

За даною заявкою вимагається пріоритет наступної попередньої заявки США Мо 61/503282, що подана 30 червня 2011 року, повний зміст якої включений в даний документ за допомогою посилання.

Передумови винаходу

Клітинна терапія з використанням свіжовиділених, розмножених ех мімо або іп мйго індукованих Т-регуляторних клітин у моделях аутоїмунних захворювань або трансплантатів органів, показала, що адаптивне перенесення Т-регуляторних клітин може відновлювати баланс

Т-регуляторних клітин відносно ефекторних Т-клітин, тим самим керуючи аутоіїмунною реакцією, асоційованою з цими захворюваннями (АїЇап еї аї. (2008), Іттипої. Кем. 223:391-421; Лапа еї аї.,

Ехреп гемієм/ ої сііпіса! іттипоіоду 2:387-392; Віїєу вї аї. (2009), Іттипйцу, 30:656-665; Тапо еї аї. (2012), Чоигпаї ої тоїесшіаг сеї! Біоіоду, 4211-21). Однак використання адаптивного перенесення як терапевтичної стратегії представляє деякі проблеми, пов'язані з перенесенням у клініку.

Число аутологічних Т-регуляторних клітин, які можна виділяти з периферичної крові людського суб'єкта, є обмеженим, а екстенсивне розмноження ех мімо Т-регуляторних клітин може змінювати їх функціональність і/або чистоту. Оскільки виділені Т-регуляторні клітини є поліклональними, вони можуть виявляти функцію пригнічення всього імунітету, що діє на нецільові ефекторні Т-клітини. Важливо, що пластичність Т-регуляторних клітин представляє значну проблему (Віцезіопе еї аї. (2009), Маї. Кеу. Іттипої. 9:811-816; 7Нои еї а!. (2009а), Ситт

Оріп Іттипої. 21:281-285), оскільки адаптивно перенесені Т-регуляторні клітини можуть втрачати експресію Еохр3 і повторно диференціюватися в клітини ТП17 (Коепеп еї аї. (2008),

Віосад, 112:2340-2352) або патогенні Т-клітини пам'яті (2пои еї аї. (20095), Маї. Іттипої. 10:1000- 1007), що підвищує ризик збільшення аутоімунної реакції або запалення.

Терапевтичні засоби, що індукують утворення Т-регуляторних клітин антигенспецифічним чином іп 5йи, будуть мати переваги над клітинною терапією адаптивними Т-регуляторними клітинами. Асоційований з цитотоксичними Т-лімфоцитами антиген-4 (СТІ А-4; СО152) являє собою точно встановлений негативний регулятор Т-клітинної відповіді і важливий для підтримання Т-клітинного гомеостазу й аутотолератності. СТІ А-4 гомологічний костимуляторній молекулі СО28 і має ті ж ліганди, СО8О (87.1) і 2086 (87.2), що експресуються на поверхні

Зо антигенпредставляючих клітин (АРС). Однак неоднакове зв'язування СО80/СО086 на АРС з ср28 і СТІ А-4 на ефекторних Т-клітинах веде до протилежних результатів, причому С028 переключає Т-клітинну активацію, і СТІ А-4 викликає Т-клітинне інгібування.

Оскільки експресія СО28 на Т-клітинах носить конститутивний характер, і індукція експресії

СТІ А-4 відбувається тільки після Т-клітинної активації, з піком через 2-3 доби (дадо еї аї. (2004),

Сіїпіса! 5 Ехрегітепіа! Іттипоіоау, 136: 463-471), екстенсивна Т-клітинна активація виникає до залучення СТІ А-4. Таким чином, основна роль СТІ А-4 полягає в тому, щоб діяти як обмеження екстенсивної Т-клітинної відповіді замість того, щоб інгібувати Т-клітинну активацію. Однак раннє залучення СТІ А-4 за допомогою його ліганду і наступне його з'єднання з Т-клітинним рецептором (ТОК) може передчасно гальмувати передачу сигналу ТСК, що викликає інгібування і гіпореактивність Т-клітин або анергію. Ця концепція підтверджена експериментально з використанням різних способів, включаючи наступні: (ї) зшивання активуючих Т-клітини антитіл (анти-СОЗ/анти-СО28) з використанням агоністичних антитіл проти

СТІ А-4 за допомогою спільної іммобілізації на бусах або за допомогою вторинного антитіла (Віаїг єї а. (1998), 9. Іттипої. 160: 12-15; Ки"иттеї апа АїЇїзоп (1996), 9. Ехр. Мед. 183:2533-2540;

Маішпаз еї аї. (1996), У. Ехр. Мед. 183:2541-2550); (ії) молекулярне конструювання зв'язаного з поверхнею агоністичного 5сЕм проти СТІ А-4 на АРС (Біїе еї аї. (2006), 9. Сііп. Іпмеві. 116(8):2252- 61; Стійіп еї аї. (2001), 9У. Іттипої. Меїйоавз. 248(1-2):77-90; Стійіп еї аї. (2000), 9. Іттипо). 164(9):4433-42); і (ії) хімічне зшивання антитіл, які розпізнають специфічні антигени на АРС, з агоністичним антитілом проти СТІ А-4 (Ії еї аї. (2007), у. Іттипої. 179(8):5191-203; Нао 6ї аї. (2001), Сііп. Іттипої. 101(2): 136-45; Мази єї а. (2004), 9. Іттипої. 173(4):2866-76).

Відновлення балансу Т-регуляторних клітин відносно ефекторних Т-клітин являє собою багатообіцяючий засіб лікування аутоїмунних захворювань. Однак клітинна терапія, що включає перенесення Т-регуляторних клітин, має певні обмеження. Відповідно, вкрай необхідні терапевтичні засоби, що індукують утворення Т-регуляторних клітин (наприклад, СТІ А-4) антигенспецифічним чином, для лікування аутоїмунного захворювання.

Суть винаходу

Даний винахід стосується лігандів, які зшивають залучений лігандом антиген-4 цитотоксичних Т-лімфоцитів (СТІ А-4) з Т-клітинним рецептором (ТСК) під час ранньої фази Т- клітинної активації і тим самим ослабляють передачу сигналу ТСК, що веде до Т-клітинного 60 інгібування. Для розробки засобу, який може інгібувати Т-клітинну активацію, створили біспецифічний злитий білок, що містить фрагменти, які вибірково зв'язують і активують СТІ А-4 і при цьому зв'язуються з ТСЕ. На відміну від підходів відомого рівня техніки біспецифічний злитий білок конструювали для того, щоб зшивати МНС з СТІ А-4; потім обидва зв'язуються з

Те, утворюючи тримолекулярний комплекс СТІ А-4/МНСПП/ТСК в імунних синапсах.

Зшивання залученого лігандом антигену-4 цитотоксичних Т-лімфоцитів (СТІ А-4) з ТОК з використанням біспецифічного злитого білка (858), що містить мутантний СО8О миші й антиген-

З активації лімфоцитів, в алогенному МІК атенуйованому ТОК передає сигнал і направляє диференціацію Т-клітин у напрямку ЕРохр3"Т-регуляторних клітин. Як описано в даному документі, антигенспецифічні Т-регуляторні клітини також можна індукувати в антигенспецифічному оточенні. Лікування мишей з діабетом, що не страждають ожирінням (МОБ), коротким курсом В5В помірно затримувало початок аутоїмунного діабету 1 типу (Т10) при тимчасовому підвищенні Т-регуляторних клітин у крові. Однак більш тривалий курс лікування МОЮО-тварин з використанням В5В значно затримував початок захворювання, а також знижував захворюваність тварин, схильних до діабету. Гістопатологічний аналіз підшлункової залози мишей, яких лікували В5В, у яких не розвивався діабет, виявив присутність Т- регуляторних клітин, що були змішані з іншими СОЗ3-Т-клітинами і не-Т-клітинними лейкоцитами біля острівців. Цей періїнсуліт асоціювали з мінімальним інвазивним інсулітом без значного руйнування інсулінпродукуючих ДВ-клітин. Таким чином, біфункціональні білки, здатні залучати

СТІА-4 і МНС і опосередковано спільно зв'язувати їх з ТСК, можуть індукувати антигенспецифічні Т-регуляторні клітини іп мімо для того, щоб захищати мишей від Т1О0 або інших аутоімунних захворювань.

Зокрема, винахід описує біспецифічні злиті білки, які зшивають СТІ А-4 з комплексом рРМНСЇЇ. Наприклад, описаний біспецифічний злитий білок, що містить мутантний СО80О миші (СО8Ом/88а) і антиген-3 активації лімфоцитів ((АС-3), який конструюють для того, щоб паралельно залучати СТІ А-4 і зшивати його з ТСК через рМНСЇЇ. У першому аспекті, отже, наданий біспецифічний біологічний засіб, що містить ліганд, специфічний до СТІ А-4, і ліганд, специфічний до комплексу РМНО.

В одному з аспектів винахід стосується біспецифічного біологічного засобу, який містить ліганд, специфічний до СТІ А-4, і ліганд, специфічний до комплексу РМНСО. Біспецифічний біологічний засіб відповідно до винаходу здатний зшивати СТІ А-4, що є присутнім на Т- клітинах, з комплексом пептид-МНО (рмнНсо) на антигенпредставляючих клітинах (АРС).

Комплекс пептид-МНе зв'язує когнатний Т-клітинний рецептор (ТСЕК) на Т-клітинах, що означає, що біспецифічний біологічний засіб відповідно до винаходу дає початок потрійному комплексу

СТІ А-А/МНС/ТСВ.

У різних варіантах здійснення аспектів, позначених у даному документі, ліганд, специфічний до СТІ А-4, вибирають з антитіла, специфічного до СТІ А-4, і СОв80 (87-11) або СО86 (8В7-2). У конкретному варіанті здійснення антитіло, специфічне до СТІ А-4, і СО80 (87-1) або СО86 (В7-2) являє собою агоністичне антитіло. Антитіла, специфічні до СТІ А-4, можна конструювати, і СО80 і 2086 являють собою природні ліганди для СТІ А-4. В одному з аспектів використовують СО8О або його мутант, оскільки СО80О переважно зв'язується з СТІ А-4 відносно СО28 і, таким чином, сприяє Т-клітинній інактивації, на противагу активації.

У різних варіантах здійснення аспектів, позначених у даному документі, ліганд, специфічний до комплексу РМНС, можна вибирати з анти-МНС антитіла і ГАС-3. Поліпептид ГАС-3 являє собою природний ліганд для білка МНОЇЇ. В одному з варіантів здійснення МНС являє собою

МНС, який взаємодіє з СО4-Т-клітинами. В іншому варіанті здійснення МНС являє собою

МНеЇ, що взаємодіє з СО8-Т-клітинами.

У біспецифічному біологічному засобі відповідно до винаходу, ліганд, специфічний до СТІ А- 4, і ліганд, специфічний до комплексу РМНС, переважно розділені за допомогою лінкера. Лінкер може приймати форму одного або декількох з поліамінокислотної послідовності і Ес-домену антитіла. Придатна поліамінокислотна послідовність являє собою 9 (С1у-9).

У різних варіантах здійснення аспектів, позначених у даному документі, ліганд, специфічний до СТІ А-4, являє собою СО80 або його мутант, у який вводять мутації для підвищення специфічності до СТІ А-4 відносно СО28. В одному з варіантів здійснення СО8О, що мутував, містить одну або декілька мутацій, вибраних з МУВ8ВА, К75О, К75М, 511206, МК1265, 1260, 01271, 5193А і 5204А, використовуючи нумерацію послідовності в попереднику СО80О миші, або їх аналоги СО8О людини (МУВ4А, К716, К71М, 51096, К1235, К1230, 1241, 5190А їі 5201А) і додатково КЄЗА, М81А, МО7А, Е196А.

В одному з варіантів здійснення біспецифічний біологічний засіб містить СО80, що містить мутацію МУ84А (людина) або М/88А (миша).

У конкретному варіанті здійснення ліганд, специфічний до комплексу МНОЇЇ, являє собою

ГАС-3. Переважно, у ГАС-3 вводять мутації для підвищення специфічності до рМНнеЇЇ.

Наприклад, ГАС-3 містить одну або декілька мутацій, вибраних з К7ЗЕ, К75А, К75Е і К7бЕ (Ниага єї аї. (1997), Ргос. Май. Асад. Осі. ОБА. 94(11): 5744-5749). В одному з варіантів здійснення І АС-3 містить мутацію К75Е.

Переважне зв'язування біспецифічного злитого білка з СТІ А-4 відносно СО28 досягали з використанням мутантного СО80 (СО8Ом/88а), що містить аланін замість триптофану в амінокислоті 88 (нумерація по СО8О миші), як ліганду. СОвОм/вва зв'язує СТІ А-4, але виявляє мінімальну афінність до СО28 (Ми еї а. (1997), 9. Ехр. Мей. 185:1327-1335).

Ген-3 активації лімфоцитів (АС-3), природний ліганд МНСЇЇ, був вибраний як інший зв'язувальний компонент біспецифічного злитого білка (Ваїхегах еї аї. (1992), У. Ехр. Мед. 176:327-337; Ппіебеї еї аї. (1990), У. Ехр. Мед. 171:1393-1405). Автори даного винаходу показали, що злитий білок з такою подвійною функціональністю ефективно інгібує Т-клітинну активацію і стимулює продукцію протизапальних цитокінів ІЇ-10 і ТОв-ВД. Що більш важливо, цей біспецифічний злитий білок також направляє диференціацію Т-клітин у високо супресорні

Еохр3"Т-регуляторні клітини. Цього не відбувається, коли на заміну використовували точно встановлений костимуляторний інгібітор СТІ А-419у (ВіІсевіопе еї а!. (2006), Іттипйу, 24:233-238;

МІпвіву апа Мадіег (2009), Іттипої. Неху. 229:307-321). Отже, раннє залучення СТІ А-4 і зшивання

СТІ А-4 з ТСЕ під час Т-клітинної активації може впливати на диференціацію Т-клітин. Такі біспецифічні злиті білки можуть, таким чином, представляти новий клас біологічних засобів, які можна використовувати для керування надмірними Т-клітинними відповідями при аутоїмунних захворюваннях.

В другому аспекті винаходу надане застосування біспецифічного біологічного засобу, що містить ліганд, специфічний до СТІ А-4, і ліганд, специфічний до комплексу РМНС, відповідно до першого аспекту винаходу, для толеризації Т-клітини за допомогою приведення зазначених Т- клітин у контакт з антигенпредставляючими клітинами, що представляють пептид, одержаний із зазначеного антигену, у комплексі з молекулою МНС і зазначеним біспецифічним біологічним засобом.

У третьому аспекті надане застосування біспецифічного біологічного засобу, що містить ліганд, специфічний до СТІ А-4, і ліганд, специфічний до комплексу РМНС, відповідно до першого аспекту винаходу, у лікуванні захворювання, вибраного з аутоїмунного захворювання і відторгнення трансплантата.

Наприклад, аутоїмунне захворювання являє собою діабет 1 типу (Т10), системний червоний вовчак (ЗЕ), ревматоїдний артрит (КА) і запальне захворювання кишечнику (ІВО) (включаючи виразковий коліт (ШС) і хворобу Крона (СО)), розсіяний склероз (М5), склеродермію й інші захворювання і порушення, такі як РМ (пухирчатка звичайна), псоріаз, атопічний дерматит, глютенова хвороба, хронічне обструктивне захворювання легень, тиреоїдит Хашимото, базедова хвороба, синдром Шегрена, синдром Гійєна-Барре, синдром Гудпасчера, хвороба

Аддісона, гранулематоз Вегенера, первинний склероз жовчних шляхів, склерозуючий холангіт, аутоїмунний гепатит, ревматична поліміалгії, феномен Рейно, скроневий артеріїт, гігантоклітинний артеріїт, аутоїмунна гемолітична анемія, перніціозна анемія, вузликовий поліартеріїт, хвороба Бехчета, первинний біліарний цироз, увеїт, міокардит, ревматична пропасниця, анкілозуючий спондиліт, гломерулонефрит, саркоїдоз, дерматоміозит, міастенія гравіс, поліміозит, осередкова алопеція і вітиліго.

У четвертому аспекті наданий спосіб толеризації Т-клітин до антигену, який включає приведення зазначених Т-клітин у контакт з антигенпредставляючими клітинами, що представляють пептид, одержаний із зазначеного антигену, у комплексі з молекулою МНЕ і біспецифічним біологічним засобом, відповідно до першого аспекту винаходу.

У п'ятому аспекті наданий спосіб лікування суб'єкта, що страждає від стану, вибраного з аутоїмунного захворювання і відторгнення трансплантата, який включає стадії введення потребуючому цього суб'єкту біспецифічного біологічного засобу, що містить ліганд, специфічний до СТІ А-4, і ліганд, специфічний до комплексу РМНС, відповідно до першого аспекту винаходу.

Наприклад, аутоїмунне захворювання являє собою діабет 1 типу (Т10).

Опис креслень

Фіг. 1. Конструкції В5В і В5ВА. (А) Схематичні зображення злитих білків В5В (біспецифічні біологічні засоби) і В5В4. (В) Схематичне зображення рМНеЇІЇ, ТОК і костимуляторних молекул в імунному синапсі, а також запропонована схема для В5В-опосередкованого зшивання СТІ А-4 з

ТОК через тримолекулярний комплекс СТІ А-4/МНСЇ/ТС. Злитий білок залучає СТІА-4 і бо опосередковано лігує ТОК через зв'язування з МНЄеЇІЇ в імунному синапсі. Дві суцільні сторони трикутника позначають зшивання МНС і СТІ А-4, а також МНС ї ТОК; штрихова сторона позначає лігування СТІ А-4 з ТСК. Пунктирна лінія позначає інгібування передачі сигналу ТСК за допомогою В5В-залученого СТІ А-4. (С). Схематичне зображення, яке показує, що дія В5ВА схожа з такою В5В, за винятком того, що він нестабільно лігує ТСЕ.

Фіг. 2. Інгібування алогенної Т-клітинної активації за допомогою В5В у реакції змішаної культури лімфоцитів. Наївні Т-клітини мишей С57ВІ /6 і оброблені І Р5 і опромінені АРС ВАГ В/с змішували з тестовими конструкціями протягом 2 діб. Потім середовища для культивування збирали й аналізували на 1-2. Тільки В5В і СТІ А-4Ід інгібували Т-клітинну активацію, на що вказує знижена кількість ІІ-2 у середовищах. Фігура представляє більше п'яти незалежних, але схожих досліджень.

Фіг. 3. Індукція Гохр3-"Т-регуляторних клітин і утворення 1-10 ї ТОБ-В за допомогою В5В. (А)

Алогенні реакції змішаних культур лімфоцитів встановлювали, як описано в легенді до фіг. 2, з використанням наївних С04-С0О621І "СО25-СЕР" клітин, що виділяли у мишей із введеним Рохр3-

ЕСЕР у присутності тестових конструкцій. Через п'ять діб після активації СО4-Т-клітини аналізували на експресію СЕР за допомогою проточної цитометрії. Т-регуляторні клітини відбирали як СЕР" ії СО257 клітини. Тільки обробка В5В вела до експресії СЕР, що вказує на індукцію Еохр3"Т-регуляторних клітин (середній лівий графік). Середовища для культивування збирали для аналізу цитокінів (праві графіки), який виявляв підвищені рівні П/-10 ї ТОаБ-В у присутності В5В. Дані репрезентативно відображують множину незалежних, але схожих досліджень. (В) Необхідність аутокринного ТОЕ-ВД для індукції Т-регуляторних клітин показана за допомогою повного блокування індукції Т-регуляторних клітин у присутності блокуючого антитіла до ТОБЕ-ВД, тоді як контрольне АБ не здійснювало помітного впливу на індукцію Т- регуляторних клітин.

Фіг. 4. В5В-опосередкована індукція антигенспецифічних Т-регуляторних клітин іп міїго. (А)

Індукція Омагзз-ззя-СПецифічних Т-регуляторних клітин іп міго. Наївні Т-клітини ОТ-ЇЇ змішували з активованими ГІ РЗ5 і опроміненими сингенними АРС у присутності 0,5 мкг/мл пептиду Омагзз-239.

Потім контрольний тідсега, В5В і В5В плюс антитіло проти ТОБЕ-В (атав-рВ) додавали і проводили тестування, як показано (ліві графіки). Клітини культивували протягом 5 діб і потім мітили антитілами проти СО25 і проти ЕБохр3 перед аналізом за допомогою проточної

Зо цитометрії. Рівні І/-2, 11-10 ї ТЯБ-В у середовищах для культивування аналізували за допомогою ЕГІЗА (праві графіки). (В) Моніторинг проліферації індукованих Т-регуляторних клітин. Дослідження проводили, як у А, за винятком того, що наївні Т-клітини ОТ-ІЇ попередньо мітили СЕБЕ перед змішуванням з АРС. Клітини сортували по флуоресцентних каналах Еохр3 і

СЕ5Е.

Фіг. 5. Функція пригнічення В5В-індукованих Т-регуляторних клітин. (А) В5В- або Таг-р- індуковані Т-регуляторні клітини очищали за допомогою проточної цитометрії і змішували з міченими СЕБЕ наївними реактивними Т-клітинами, одержаними від мишей С57ВІ/6 у зазначених співвідношеннях у трансвелах (залиті стовпці) або звичайних культуральних ямках (заштриховані стовпці). Оброблені І Р5 алогенні АРС від ВАЇ В/с додавали для стимуляції Т- клітинної активації. Результати (середнє ж стандартне відхилення) відображують процентну частку проліферуючих реактивних Т-клітин (реактивні Т-клітини), грунтуючись на розведенні

СЕЗЕ без Т-регуляторних клітин (тільки реактивні Т-клітини ї- АРС), прийнятому за 100 9». (В)

Антитіла проти ІЇ/-10 ї проти ТШБ-В додавали в клітини в звичайні культуральні ямки при співвідношенні реактивних Т-клітин і Т-регуляторних клітин 1:1 для визначення внеску цитокінів у Т-клітинну проліферацію. Антитіла проти Таг-ВД частково інгібували функцію пригнічення ТаЕ-

В-індукованих Т-регуляторних клітин (лівий графік), але не впливали на В5В-індуковані Т- регуляторні клітини (правий графік). Фігура представляє більше трьох незалежних, але схожих досліджень.

Фіг. 6. Понижуюча регуляція фосфорилування АКТ і ттТОКк за допомогою В5В. Наївні Т- клітини культивували в круглодонних 96-ямкових планшетах, спільно покритих антитілами проти

СО3, проти СО28 і В58, да (тідс) миші або РО-І 1 (тРО-І1) миші протягом 18 год. Клітини, які вважали неактивованими, культивували в ямках, покритих тільки ІДС. Потім здійснювали моніторинг стану фосфорилування АКТ і тТОКк за допомогою проточної цитометрії після забарвлення флуоресцентно міченими антитілами до фосфорилованих АКТ і тт. МРЇ позначає середню інтенсивність флуоресценції. На цій фігурі представлений один із трьох незалежних експериментів.

Фіг. 7. Постійна експресія Бохр3 у Т-регуляторних клітинах у відповідь на безупинну стимуляцію з використанням В5В. Круглодонні 96б-ямкові планшети спільно покривали антитілами проти СОЗ, проти СО28 і В5В або Іда миші. Наївні Т-клітини від мишей із введеним бо Еохр3-ЕСЕР культивували протягом 5 діб для того, щоб індукувати Т-регуляторні клітини (ліві графіки), які потім очищали від оброблених В5В клітин (червоний квадрат) і повторно стимулювали в іншому раунді культивування в спільно покритих ямках, як зазначено вище, протягом 5 діб, до аналізу СЕР" клітин за допомогою проточної цитометрії. Повторне культивування очищених Т-регуляторних клітин з використанням контрольного ІдСї миші протягом 5 діб вело до втрати експресії Еохр3: у -60 95 клітин (правий верхній квадрант верхнього правого графіка), тоді як менше ніж 795 Т-регуляторних клітин, які повторно культивували з В5В, втратили експресію Рохр3" (верхній правий квадрант нижнього правого графіка). На цій фігурі представлений один із трьох незалежних експериментів.

Фіг. 8. Фармакокінетика В5В іп мімо і біохімічний аналіз. (А) Фармакокінетичний профіль В5В у мишей. Нормальним мишам С57В//6 (п-:5) дозували інтраперитонеально 20 мг/кг В5В. Зразки крові збирали в різні зазначені моменти часу, і рівні В5В8 визначали з використанням ЕГІЗА. (В)

Порівняння зв'язування В5В і Ї(дс2а миші з ЕсКп. ЕсКп іммобілізували на чипі Віасоге. В5В або контрольне ІдСега миші завантажували на чип у різних концентраціях і потім реєстрували сигнали.

Фіг. 9. Аналіз аспарагінзв'язаного глікозилування на В5В. Амінокислотну послідовність В5В відправляли на сервер МеїМаШус 1.0 для прогнозування Азп-зв'язаних ділянок глікозилування.

Прогнозували всього 10 Азп-зв'язаних ділянок глікозилування (позначені М); інші амінокислоти представлені точками. Також одержували моносахаридну композицію В5В для визначення композиції гліканів фукози (Рис), М-ацетилглюкозаміну (СсІсСМАс), галактози (Саї), манози (Мап), сіалової кислоти (М-ацетилнейрамінова кислота). Відношення сіалової кислоти до галактози, що дорівнює 0,68, указує на те, що приблизно третина залишків галактози доступна для зв'язування з асіалоглікопротеїновим рецептором.

Фіг. 10. Лікування мишей, що не страждають діабетом (МОБ), з використанням В5В затримувало початок діабету 1 типу (Т1О0) у рамках парадигми пізнього профілактичного лікування. (А) Рівні Еохр3-Т-регуляторних клітин у крові оброблених В5В МОЮ (суцільні кола, п-15) і оброблених фізіологічним розчином контрольних МОЮ мишей (суцільні трикутники, п-14). Мало місце помірне, але значиме підвищення числа Т-регуляторних клітин у оброблених

В5В тварин відносно того, що відзначали у контрольних тварин. (В) Кумулятивні захворюваності маніфестним діабетом у МОЮО-тварин, яких лікували з використанням В5В (заповнені кола) або

Зо фізіологічним розчином (заповнені трикутники).

Фіг. 11. Лікування МОЮО-мишей з використанням В5В затримувало початок Т10 у рамках парадигми раннього профілактичного лікування. (А) Рівні Гохр3-Т-регуляторних клітин у крові мишей, яких лікували з використанням В5В (суцільні кола, п-10), фізіологічним розчином (суцільні трикутники, п-10), СТІ А-41Ід (суцільні квадрати, п-10) і ї(дЯс2а миші (порожні квадрати, п--10). Не виявляли підвищення числа Рохр3-Т-регуляторних клітин після двох тижнів лікування з використанням В5В у порівнянні з контрольними тваринами, яких лікували фізіологічним розчином або тідсега. Однак лікування з використанням СТІ А-4Їд вело до статистично значимого зниження числа Рохр3"Т-регуляторних клітин у крові. (В) Кумулятивні захворюваності маніфестного діабету у тварин, яких лікували з використанням В5В, або контрольних тварин.

Лікування з використанням В5В вело до значної затримки початку Т1О0 у порівнянні з контрольними групами, які лікували фізіологічним розчином або Ідсега миші, до віку 24 тижні (р-0,04). Однак не відзначали значної різниці між групами наприкінці дослідження. Дані представляють одне з двох окремих досліджень зі схожими результатами, де в кожній групі було присутньо всього 26 МОЮ-мишей.

Фіг. 12. Тривале лікування МОО-мишей з використанням В5В значно затримувало початок

Т1О0 у МОЮО-мишей. (А) Кумулятивні захворюваності маніфестним діабетом у мишей, які одержували лікування з використанням В5В (п-16) і не одержували лікування (п-16). Лікування з використанням В5В значно знижувало захворюваність Т1О0 у порівнянні з тими, котрих лікували фізіологічним розчином (р«е0,01). (В) Гістопатологічний аналіз тканин підшлункової залози від тварин, яких лікували фізіологічним розчином або В5В. Зображення а-с представляють зрізи від мишей, яких лікували фізіологічним розчином, що залишалися не страждаючими діабетом, з використанням НеЕ, антитіла до інсуліну або антитіла проти СОЗ і боксу РогКпеай РЗ (Рохр3), відповідно. Схожі спостереження відзначали у МОЮ-мишей, яких лікували з використанням В5В, що залишалися не захворілими. На будь-якому зі зрізів не відзначали свідчення інфільтрації або інсуліту; може бути присутня деяка кількість Еохр3-Т- регуляторних клітин (стрілки на зображенні с). Зображення а-ї представляють зрізи підшлункової залози від МОЮ-тварин з діабетом. Інвазивний інсуліт був ясно видний, а інсулінпродукуючі В-клітини були повністю зруйновані (є). Також виявляли деякі СЮОЗ-Т-клітинні інфільтрації, поряд з деякими Т-регуляторними клітинами і множиною не-Т-клітинних лейкоцитів бо з блакитними ядрами (1). На зображеннях 9д-і показані острівці, що демонструють характерний періїнсуліт, у тварин, яких лікували з використанням В5В і які залишилися не страждаючими діабетом. Лейкоцитарні інфільтрації відзначали, але вони були обмежені периферією острівців.

Крім того, помітні руйнування інсулінпродукуючих ДВ-клітин були відсутні. Більшість лейкоцитів на периферії не були Т-клітинами (блакитні ядра). Збільшена вкладка (зображення і, що представляє червоний квадрат на ї) показує, що Рохр3-Т-регуляторні клітини (стрілка з жовтим кінчиком) були змішані з іншими СОЗ3-Т-клітинами і не-Т-клітинними лейкоцитами (блакитні ядра) на периферії острівців. Зображення одержували з використанням об'єктива 40х; вкладку одержували з використанням об'єктива боОх, яку потім додатково збільшували Зх цифровим способом.

Докладний опис винаходу

Якщо не зазначене інше, усі технічні і наукові терміни, використовувані в даному документі, мають те ж значення, у якому їх звичайно розуміє фахівець у галузі, до якої належить цей винахід. Які-небудь способи і матеріали з функцією, подібною або еквівалентною тій, котра описана в даному документі, можна використовувати при практичному здійсненні або тестуванні даного винаходу. Далі описані способи, пристрої і матеріали, придатні для такого використання.

Усі публікації, цитовані в даному документі, включені в даний документ за допомогою посилання в повному обсязі з метою опису і розкриття технологій, реактивів і інструментів, про які повідомляється в публікаціях і які можна використовувати застосовно до винаходу.

Способи за даною заявкою загалом здійснюють відповідно до стандартних способів, добре відомих фахівцям у даній галузі, і як описано в різних загальних і більш специфічних джерелах, які цитовані і розкриті на всьому протязі даного опису, якщо не зазначене інше. Такі способи повністю описані в літературі. Див., наприклад, Сеппаго А.К. ей. (1990), Кетіпдюп'5

Рпаптасешііса! бсієпсез5, 18-е видання, Маск Рибіїєпіпд Со.; Нагатап .).05., Гітбіга С.Е. апа

Сіїтап А.С, ед5. (2001), Те Рпаптасоїіодіса! Вавів ої Тпегарешіїсв, 10-е видання, МеОгам/-НІЇЇ

Со.; Соіом/іск 5. еї а!., едв., Меїйоавз Іп Епгутоіоду, Асадетіс Ргезв, Іпс.; М/єїг О.М. апа ВіаскмуеїЇ

С.С, еав5. (1986), Напабосок ої Ехрегітепіа! Іттипоїіоду, томи І-ІМ, ВіаскуєїЇ Зсієпійіс Рибріісайопв;

Мапіаїі5 Т. еї а!., ед5. (1989), МоіІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиаї, 2па еайоп, томи І-Ш, Соїа

Зргіпд Наїбог Іарогаїогу Рге55; А!йвире! Р.М. еї аї., едв. (1999), Зпоп Ргоїосоїв іп Моїесшаг

Віоіоду, 4-е видання, дхопп УмМіеу 5 5оп5; Кеат еї аї., еавз. (1998), МоїІесшаг Віоіоду Тесппідиев:

Зо Ап Іпіепвіме І абогаюгту Сошгзе, Асадетіс Ргез5; Меулоп С.В. апа Станат А., єдв». (1997), РСВ (Іпігодисійоп (о Віоїесппіднев Зегієв), 2-е видання, Зргіпдег-Мепад.

Термін "антитіло", якщо не зазначене інше, використовують, щоб відіслати до цілих антитіл, а також антигензв'язувальних фрагментів таких антитіл. Наприклад, термін охоплює чотириланцюжкові молекули да, а також фрагменти антитіл.

Як використовується в даному документі, термін "фрагменти антитіл" стосується частин інтактного повнорозмірного антитіла, таких як антигензв'язувальна або варіабельна область інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіл включають фрагменти Раб, Раб", К(абр)» і Ем; діатіла; лінійні антитіла; молекули одноланцюжкових антитіл (наприклад, 5сЕм); фрагменти поліспецифічних антитіл, таких як біспецифічні, триспецифічні і поліспецифічні антитіла (наприклад, діатіла, триатіла, тетратіла); злиті білки імуноглобулінів зі зв'язувальними доменами; камелізовані антитіла; міні-антитіла; хелатуючі рекомбінантні антитіла; тріотіла або діатіла; інтраантитіла; нанотіла; імунофармацевтичні засоби на основі модульних білків малого розміру (ЗМІР), що антитіла, що містять Мнн; і які-небудь інші поліпептиди, сформовані з фрагментів антитіл, наприклад, як додатково описано нижче.

Антитіла можуть належати до будь-якого класу, наприклад, да, ІА або Ідм; і до будь-якого підкласу, наприклад, ІДС або Ідс4. Різні класи і підкласи імуноглобулінів мають різні властивості, що можуть бути корисні в різних застосуваннях.

Специфічність у контексті даного винаходу вимагає того, щоб заявлене антитіло було здатне вибірково зв'язувати свій визначений когнатний антиген, що являє собою або СТІ А-4, або комплекс РМНС.

Імуноглобуліни, що зустрічаються в природі, мають звичайну корову структуру, у якій два ідентичні легкі ланцюги (приблизно 24 кдДа) і два ідентичні важкі ланцюги (приблизно 55 або 70 кДа) утворюють тетрамер. Амінокінцева частина кожного ланцюга відома як варіабельна (М) область, і її можна відрізняти від більш консервативних константних (С) областей іншої частини кожного ланцюга. У варіабельній області легкого ланцюга (також називаній доменом Мі) присутня С-кінцева частина, відома як у9У-область. У варіабельній області важкого ланцюга (також називаній доменом Мн) присутня Ю-область на доповнення до .-області. Більшість варіацій амінокислотних послідовностей в імуноглобулінах обмежена трьома окремими місцями розташування в М-областях, відомими як гіперваріабельні області або області, що визначають бо комплементарність (СОК), які безпосередньо беруть участь у зв'язуванні антигену. Якщо йти від амінокінця, ці області позначають СОКІ, СОК2 і СОКЗ, відповідно. СОК залишаються на місці за рахунок більш консервативних каркасних областей (ЕК). Якщо йти від амінокінця, ці області позначають ЕК, ЕК2, ЕКЗ і ЕКА4, відповідно. Місця розташування областей СОК і ЕК і система нумерації визначені авторами КаБбаї еї аї. (Кабраї Е.А. еї аї., (1991), Зедиепсе5 ої Ргоїеїп5 ої

Іпптипоїодіса! Іпіегеб5ії, п'яте видання, 0.5. ЮОерагтепі ої Неакт апа Нитап 5егмісе5, ЦШ.5.

Сомегтптепі Ргіпііпуд Ойісе), і більш нові версії публікації можна знайти в мережі.

Гуманізоване моноклональне антитіло, як позначають у даному документі, являє собою антитіло, що складається з каркаса антитіла людини, у який вбудовані СОЕК. з антитіла, що не належить людині. Процедури для конструювання й одержання гуманізованих антитіл добре відомі в даній галузі й описані, наприклад, у Саву еї а!., патенті США Мо 4816567; Саршу еї аї., європейській патентній заявці 0125023; Во55 еї аіЇ., патенті США Мо 4816397; Во55 еї аї., європейській патентній заявці 0120694; Меибрегдег М.5. еї аІ., МО 86/01533; Меибрегдег М.5. еї а!., європейській патентній заявці 0194276 В1; МуУіпіег, патенті США Мо 5225539; Ум/іпівг, європейській патентній заявці 0239400; Радіап Е.А. еї аї., європейській патентній заявці 0519596. Додаткові подробиці про антитіла, гуманізовані антитіла, сконструйовані антитіла людини і способи їх одержання можна знайти в Копіегтапп К. апа Сіібеї! 5. єдв. (2001, 2010),

Апіїроду Епдіпеегіпа, 2-е видання, зргіпдег-Мепад, Мем Моїк, МУ, 2001.

Константні області можна витягати з будь-яких константних областей антитіл людини.

Типово, гени варіабельної області клонують у експресуючі вектори зі збереженням рамки зчитування генів константної області, щоб експресувати важкі і легкі ланцюги імуноглобулінів.

Такі експресуючі вектори можна переносити в антитілопродукуючі клітини-хазяїни для синтезу антитіл.

Необхідні варіабельні і константні області антитіл можна одержувати з баз даних про послідовності. Наприклад, послідовності імуноглобулінів доступні в базі даних ІМСОТЛІСМ (Сіцаісейі ей оаі). (2006), МисіІвїс Асідв Аевз. 34(5!ррі. 1):0781-0784) або МВазе (мбазе.тгссре.сат.ас.ик). "Нуклеїнові кислоти", як позначають у даному документі, типово включають молекули ДНК, що кодують антитіла за винаходом. Переважними є експресуючі вектори, які придатні для експресії генів антитіл у клітині-хазяїні. Експресуючі вектори і клітини-хазяїни для експресії генів антитіл відомі в даній галузі; див., наприклад, Моггоум/ К.). (2008), Сепеїїс Епдіпеегпд 5

Віотесппоїоду Мем/5. (дипе 15, 2008) 28(12); і ВасКіймаї! с. еї аІ. (2008), Мисієїс Асіаз Кез. 36(15): е96-е96. "СО80", як використовується в даному документі, стосується антигену ссавця СОВ80О, а також його мутантів, що мають підвищену авідність або специфічність зв'язування з СТІ А-4. Див.

Мивієу єї аї. (1994), Іттипйу, 1:793-801, і Ми еї аї. (1997), У. Ехр. Мей. 185(7):1327-1335, що включені в даний документ за допомогою посилання. СО8О ссавців можна вибирати з СО8О гризунів, таких як миша, або людини. "СО86", як використовується в даному документі, стосується антигену СО86 ссавця, а також його мутантів, що мають підвищену авідність або специфічність зв'язування з СТІ А-4. Див.

Миб5ієу єї аї. (1994), Іттипйу, 1:793-801, що включена в даний документ за допомогою посилання. СО86б ссавця можна вибирати з СО86 гризунів, таких як миша, або людини. "СТІ А-4"7 як використовується в даному документі, стосується асоційованого з цитотоксичними лімфоцитами антигену-4 ссавця (СТІ А-4). Послідовність СТІ А-4 людини можна знайти в сСепВапкК, номер доступу ААН74893.1, 1:49904741. СТІ А-4 ссавця можна вибирати з

СТІ А-4 гризунів, таких як миша, або людини. "ГАСІ-3", як використовується в даному документі, стосується антигену-3 активації лімфоцитів ссавців ((АС-3). Послідовність Г(АС-3 людини можна знайти в Ниага еї аї. (1997),

Ргос. Маї!. Асад. осі, ОБА, 94:5744-5749, включеній в даний документ за допомогою посилання.

ГАС-3 ссавця можна вибирати з І АО-3 гризунів, таких як миша, або людини. "МН" являє собою комплекс, залучений у представлення пептидів, одержаних з антигенів, за допомогою антигенпредставляючих клітин, який розпізнається за допомогою ТСК. У визначеному аспекті, МНС являє собою МНОСЇІ, що представляє антиген СО4-Т-хелперним клітинам. Див., наприклад, УмМиспегрієппід еї аІ., С5Н Регзресі. ВіоїІ. 2(4): аб05140, електронна публікація 17 березня 2010 року.

Біспецифічний біологічний засіб, який можна позначати як біспецифічний ліганд, являє собою ліганд, що здатний зв'язувати або бути зв'язаним двома мішенями одночасно.

Біспецифічні антитіла відомі в даній галузі і додатково описані нижче. У контексті даного винаходу дві мішені являють собою молекулу СТІ А-4 на Т-клітині і комплекс пептид-МНС на

АРС. Біспецифічний біологічний засіб відповідно до винаходу може зшивати дві мішеней; за бо допомогою зв'язування рРМНС з ТОК в імунному синапсі, відповідним чином, зшиває молекулу

СТІ А-4 з ТОК. "Біологічний засіб", загалом, являє собою біологічний терапевтичний засіб або засіб, який можна використовувати, іпіег аїйа, для терапевтичних, діагностичних і/або дослідницьких цілей.

Лінкер являє собою яку-небудь амінокислотну послідовність, що з'єднує і розділяє два поліпептидних домени в білку. У контексті біспецифічного ліганду за винаходом, лінкер являє собою послідовність, що з'єднує ліганд СТІ А-4 з лігандом МНС. Зразкові лінкери являють собою послідовності амінокислот, такі як полігліцин, наприклад Сіу-9. Альтернативний лінкер являє собою Ес-область антитіла. Такий лінкер розносить два домени лігандів приблизно на 120А.

Ліганд відповідно до винаходу може включати антитіло і неантитільні ліганди в якій-небудь комбінації. Наприклад, ліганд СТІ А-4 може являти собою антитіло проти СТІ А-4, і ліганд МНС може являти собою ІГАс-3. Альтернативно, СО8О можна використовувати як ліганд СТІ А-4, у комбінації з ГАС-3 або антитілом проти МНС. Обидва ліганди можуть являти собою антитіла або обидва можуть являти собою природні ліганди, СОВ8О і | АС-3.

Асоційований з цитотоксичними лімфоцитами антиген-4 (СТІ А-4)

Асоційований з цитотоксичними Т-лімфоцитами антиген-4 (СТІ А-4), також відомий як

СО0152, являє собою негативний регулятор Т-клітинної відповіді, що відіграє важливу роль у підтриманні Т-клітинного гомеостазу й в індукції аутотолератності (КагапаїКаг еї аї. (1996), 9.

Ехр. Мед. 184:783-788; Кг"иттеї! апа АЇїЇївзоп (1995), У. Ехр. Мед. 182:459-465; І іпзІєу апа Соївівіп (1996), Ситт. Вісі. 6:398-400; УМаїшпаз апа Віпевіопе (1998), У. Іттипої. 160:3855-3860; УМаішпав еї а. (1994), У. Іттипої. 160:3855-3860). Миші з дефіцитом по СТІ А-4 розвивають поліорганні аутоїмунні захворювання і типово не витримують хвороби у віці 4 тижнів (Тімої еї аї. (1995),

Іттипйу, 3:541-547; Маїегоизе єї аї. (1995), Зсієпсе, 270:985-988). Молекулярні механізми, через які СТГ А-4 модулює Т-клітинну активність, є багатогранними, і вважають, що вони виникають або характерним чином на стандартних Т-клітинах, або під впливом зовнішніх факторів за допомогою Т-регуляторних клітин (Т-регуляторні клітини) (Ізе еї аїЇ. (2010), Маї.

Ітітипої. 11:129-135; Уаїп еї аї. (2010), Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА, 107:1524-1528; Раїегоп апа зЗпагре (2010), Маї. Іттипої. 11:109-111).

Ці механізми включають конкуренцію з СО28 за зв'язування ліганду (І іпв5іІєу еї аї. (1994),

Зо Іттипйу, 1:793-801), що ініціює утворення толерогенного ферменту індоламін-2,3З-діоксигенази в АРС (Сгоптапп еї аї. (2002), Маї. Іттипої. 3:1097-1101; Оподега еї аї. (2009), 9. Іттипої. 183:5608-5614), і витіснення СО28 з імунологічного синапсу (Репіспема-Ноапод еї аї. (2004),

Іттипйу, 21:401-413). СТІ А-4 гомологічний костимуляторній молекулі СО28 і має ті ж ліганди, сово (87.1) і 6086 (87.2), що експресуються на поверхні антигенпредставляючих клітин (АРС).

Однак, диференціальне зв'язування СО80/СО86 на АРС з СО28 і СТІ А-4 на ефекторних Т- клітинах веде до протилежних результатів, причому СО28 запускає Т-клітинну активацію, і

СТІ А-4 викликає Т-клітинне інгібування. Залучення СТІ А-4 за допомогою його лігандів (СО80/86) на АРС також стимулює рекрутування фосфатаз ЗНР-1 (Сипіептапп апа АІехапаег (2002), 9. Іттипої. 168:4420-4429) і РР2А (Вагоїа еї а. (2002), 9. Іттипої. 168:5070-5078; Спцапд еї а). (2000), Іттипйу, 13:313-322) поблизу ТОК на Т-клітинах, що піддаються активації.

Наступне дефосфорилування ключових молекул передачі сигналу, асоційованих з ТСЕ, веде до термінації Т-клітинної активації (Сзгійїп еї аІ. (2000), У. Іттипої. 164:4433-4442). Крім того, втручання, що сприяють ранньому залученню СТІ А-4 з його лігандами і зшиванню з ТОК, ведуть до передчасного ослаблення ключових сигнатур передачі сигналу і наступного інгібування Т-клітинної активації, що веде до гіпореактивності Т-клітин або анергії (Віаїг еї аї. (1998), Іттипої. 160:12-15; Сиійіп еї аї. (2000), 9. Іттипої. 164:4433-4442; Киттвеї! апа АїЇЇївоп (1996), 9. Ехр. Мед. 182:459-465; МаІшпаз еї аї. (1996), У. Ехр. Мед. 183:2541-2550).

Щоб сприяти зшиванню СТІ А-4 з ТС під час ранньої фази Т-клітинної активації, створювали біспецифічний злитий білок (позначуваний як "В5В"), що містить мутантний СЮО8О (сО80мвва) і ген-3 активації лімфоцитів (ГАС-3). В5В конструювали для того, щоб паралельно залучати СТІ А-4 і МНЄОЇЇ в імунному синапсі і тим самим опосередковано зшивати його з ТСК через когнатне утворення пари МНЄСЇІЇ з ТСЕК (Кагтап еї аї. (2012), 9. ВіоІ!. Спет. Ериб. 2012 Бер. 15). Показано, що В5В ефективний в алогенній МІ К при інгібуванні Т-клітинної активації. До подиву, В5В також індукував утворення І//-10 ї ТОЯБ-В ії сприяв диференціації Т-клітин, що піддаються активації, у Т-регуляторні клітини. Ї-10 може виявляти широкі імуносупресорні властивості за рахунок своєї здатності керувати активацією макрофагів і дендритних клітин (ОС), а також забезпечувати саморегуляцію клітин ТИ1 (ОПаїа еї аї. (2007), Апйгйі5 Кпеит, 56:2947-2956). ТаБ-В може діяти як інгібітор диференціації Т-клітин (Кенйгі еї аїІ. (1986), 9. Ехр.

Мед. 163:1037-1050), активації макрофагів (Тзипаумакі єї а. (1988), Маїиге, 334:260-262; Ман! єї 60 аім. (1990), Апп. М.М. Асай. сі. 593:188-196) і дозрівання дендритних клітин (5іеіптап еї аї.

(2003), Аппи. Немум. Іттипої. 21:685-711). На доповнення до їх протизапальних функцій, 1І-10 і такг-Вв також передбачувано можуть впливати на функцію Т-регуляторних клітин. Наприклад, показано, що 1-10 ініціює продукуючі І--10 клітини ТА1 (Копсагоїо еї аї. (2006), Іттипої. Кем. 212:28-50) і діє на Рохр3"Т-регуляторні клітини, підтримуючи експресію Рохр3 і тим самим поширюючи їх функцію пригнічення (Мигаі еї а). (2009), Маї Іттипої. 10:1178-1184).

Аналогічним чином, повідомлялося, що ТОЕ-В необхідний для індукції Т-регуляторних клітин (Спеп евї аї. (2003), У. Ехр. Мед. 198:1875-1886; 7пепо вї а). (2002), 9. Іттипої. 169:4183-4189) і в підтриманні їх функції пригнічення за допомогою сприяння експресії Еохр3 (Магіє еї аї. (2005), 3.

Ехр. Мед. 201:1061-1067).

Т-регуляторні клітини

Т-регуляторні клітини являють собою функціонально відмінну субпопуляцію Т-клітин, здатних контролювати імунну відповідь на свої і чужі антигени. Дефіцит Т-регуляторних клітин веде до підвищеної імунної відповіді і появи аутоїмунних захворювань (Закадистпі еї аї. (1995), у).

Ітітипої. 155:1151-1164). Екстенсивні дослідження встановили роль цих спеціалізованих Т- клітин у керуванні всіма аспектами імунної відповіді, зокрема у виникненні аутотолератності. Не обмежуючись конкретною теорією, ці знахідки вказують на те, що засоби, здатні стимулювати утворення Т-регуляторних клітин іп 5йи або адаптивне перенесення Т-регуляторних клітин, можна використовувати для лікування аутоїмунних захворювань. У дійсності, показана ефективність клітинної терапії Т-регуляторними клітинами з використанням свіжовиділених або розмножених ех мімо Т-регуляторних клітин при лікуванні діабету 1 типу на тваринних моделях (Т10) (Тапо еї аї. (2004), 9. Ехр. Мед. 199:1455-1465; Таїбеї єї а!. (2007), У. Ехр. Мей. 204:191- 201) і реакції "трансплантат проти хазяїна" (Апаегзоп еї аї. (2004); Тауог єї а!. (2002), Віоса, 99:3493-3499; 7пао еї аї. (2008), Віоса, 112:2129-2138). Замість виділення і розмноження

Еохру-СрАабр25:Т-регуляторних клітин (часто позначуваних як природні Т-регуляторні клітини або пТгед) з периферичної крові або лімфатичних вузлів, Т-регуляторні клітини можна індукувати з наївних СО4-С025- Т-клітин у контексті ТСК-активації і при супутній присутності тТакг-в. Ці Т-регуляторні клітини часто позначають як адаптивні Т-регуляторні клітини або індуковані Т-регуляторні клітини (індуковані Т-регуляторні клітини). Також вони є Еохр3: і передбачувано виявляють рівною мірою потентні функції пригнічення, як природні Т-регуляторні

Зо клітини (Спеп еї аї. (2003), У. Ехр. Мей. 198:1875-1886; Матадіжша єї аї. (2001), 9. Іттипої. 166:7282-7289; 27пепду еї аїЇ. (2002), 9У. Іттипої. 169:4183-4189). Показано, що адаптивні перенесення адаптивних Т-регуляторних клітин або індукованих Т-регуляторних клітин ефективно дають захист проти аутоїмунного захворювання індукованого колагеном артриту у тваринній моделі (оплаІе7-НКеу єї аї. (2006), АйНійіїв. ВНейт. 54:864-876). Однак стає більш очевидним, що антигенспецифічні Т-регуляторні клітини мають властивість значно більш сильного терапевтичного засобу, ніж поліклональні Т-регуляторні клітини, з репертуаром, що охоплює всі ТОК (МазіейПег еї аї. (2005), 9. Іттипої. 175:3053-3059; Тапд еї аї. (2004), 9. Ехр.

Мей. 199:1455-1465; Татбеї! еї аІ. (2007), У. Ехр. Мей. 204:191-201), при менших побічних ефектах, що діють на пригнічення всього імунітету. З цієї причини, автори даного винаходу вирішили оцінювати відносну якість В5В стосовно утворення антигенспецифічних Т- регуляторних клітин в антигенспецифічній обстановці Т-клітинної активації іп міо. Крім того, автори даного винаходу тестували його потенціал для лікування аутоіїмунного діабету у мишей з діабетом, що не страждають ожирінням (МОБ).

Діабет 1 типу

Діабет 1 типу (Т1О0) являє собою аутоїмунне захворювання, обумовлене тканиноспецифічним руйнуванням інсулінпродукуючих В-клітин підшлункової залози з наступним розвитком гіперглікемії. Миші з діабетом, що не страждають ожирінням (МОБ) (зокрема, самки мишей), мимовільно розвивають аутореактивні Т-клітини в напрямку власних специфічних антигенів острівців (наприклад, інсулін і декарбоксилаза глутамінової кислоти 65).

Узгоджено з іншими лімфоцитами, ці аутореактивні Т-клітини ініціюють розвиток періїнсуліту між

З і 4 тижнями від народження з наступним інвазивним інсулітом через 9 тижнів і мимовільним маніфестним діабетом між 12 і 35 тижнями (Апдегзоп апа Вісезіюпе (2005), Аппи. Веу. Іттипо). 23:447-485). Миші МОО мають багато подібностей із захворюванням у людських суб'єктів, такі як утворення специфічних до підшлункової залози аутоантитіл і активація аутореактивних СО: і

СОр8:Т-клітин. На сприйнятливість цих мишей до аутоімунних реакцій, як у людини, впливають гени головного комплексу гістосумісності (МНС), СТІ А-4 і ГАО-3. Миші МОО несуть унікальний гаплотип головного комплексу гістосумісності (МНС) (Н-297), який, як повідомляють, має найвищий ризик сприйнятливості до захворювання (МеоОемій еї а. (1996), Ногтопе апа тегїароїїс гезеагсі, 28:287-288; УМісКег еї а. (1995), Аппи. Неу. Іттипої. 13:179-200). У мишей МОО (Оєда 60 еї аІ. (2003), Маїшгте, 423:506-511) і у людини (Ои еї а. (2009), Сепез5 апа іттипйу 10 Зиррі.

1:527-32) також відзначали поліморфізм СТІ А-4, а дефіцит ГАС-3 на фоні МОЮ прискорює початок Т10 з 100 95 пенетрантністю (Вейіпі еї аї. (2011), 9. Іттипої. 187:3493-3498). Оскільки

В5В залучає всі ці мішені, терапевтичну якість В5В тестували на цій мишачій моделі 110.

Антитіла

Даний винахід стосується антигензв'язувальних фрагментів антитіл, розкритих у формулі винаходу. Як використовується в даному документі, термін "фрагменти" стосується частин інтактного повнорозмірного антитіла, таких як область зв'язування антигену або варіабельна область інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіл розкриті вище.

Термін "фрагменти", як використовується в даному документі, стосується фрагментів, здатних зв'язувати точно визначені мішені, молекулу СТІ А-4 або комплекс рРМНОС. У цих фрагментів може бути відсутній Ес-фрагмент інтактного антитіла, вони можуть швидше виводитися з циркуляції і можуть мати менше неспецифічне зв'язування із тканинами, ніж інтактне антитіло. Ці фрагменти можна одержувати з інтактних антитіл з використанням добре відомих способів, наприклад за допомогою протеолітичного розщеплення ферментами, такими як папаїн (для одержання фрагментів Раб) або пепсин (для одержання фрагментів Е(абр)г), або експресії таких фрагментів за допомогою рекомбінантної технології.

Антитіла і фрагменти також охоплюють одноланцюжкові фрагменти антитіл (5СЕмМ), що зв'язуються з молекулою СТІ А-4 або комплексом рРМНС. 5сЕм містить варіабельну область важкого ланцюга (Мн) антитіла, функціонально зв'язану з варіабельною областю легкого ланцюга (Мі) антитіла, де варіабельна область важкого ланцюга і варіабельна область легкого ланцюга, разом або окремо, утворюють сайт зв'язування, що зв'язує молекулу СТІ А-4 або комплекс РМНО. 5сЕм може містити область Мн на амінокінці й область Мі на карбоксикінці.

Альтернативно, зсЕм може містити область Мі на амінокінці й область Мн на карбоксикінці. Крім того, незважаючи на те, що два домени фрагмента Ем, Мі і Мн, кодують окремі гени, їх можна з'єднувати, використовуючи рекомбінантні способи, за допомогою синтетичного лінкера, що дозволяє одержувати їх у вигляді одного білкового ланцюга, у якому області Мі і Мн утворюють пари для того, щоб формувати одновалентні молекули (відомі як одноланцюжкові Ем (5зсігм)). 5сЕм може необов'язково додатково містити поліпептидний лінкер між варіабельною областю важкого ланцюга і варіабельною областю легкого ланцюга.

Зо Антитіла і фрагменти також охоплюють фрагменти доменних антитіл (дАБ), як описано в

Мага Е.5. евї а!. (1989), Майиге, 341:544-546, що складаються з домену Мн.

Антитіла і фрагменти також охоплюють антитіла з важких ланцюгів (НСАБ). Ці антитіла можуть явно формувати антигензв'язувальні області з використанням тільки варіабельної області важкого ланцюга в тому відношенні, що ці функціональні антитіла являють собою димери тільки важких ланцюгів (називані як "антитіла з важких ланцюгів" або "НСАБ").

Відповідно, антитіла і фрагменти можуть являти собою антитіла з важких ланцюгів (НСАБ), що специфічно зв'язуються з мішенями СТІ А-4 або рРМНе.

Антитіла і фрагменти також охоплюють антитіла, що являють собою ЗМІР або злиті білки імуноглобулінів зі зв'язувальними доменами зі специфічністю до мішеней СТІ А-4 або рМНе. Ці конструкції являють собою одноланцюжкові поліпептиди, що містять антигензв'язувальні домени, злиті з доменами імуноглобулінів, необхідними для здійснення ефекторних функцій антитіла (див. ММО 2005/017148).

Антитіла і фрагменти також охоплюють діатіла. Вони являють собою двовалентні антитіла, домени Мн і Мі яких експресують на одному поліпептидному ланцюзі, але з використанням лінкера, що занадто короткий для того, щоб зробити можливим утворення пари між двома доменами одного і того ж ланцюга. Це змушує домени утворювати пари з комплементарними доменами іншого ланцюга і тим самим створює дві ділянки зв'язування антигену (див., наприклад, УМО 93/11161). Діатіла можуть бути біспецифічними або моноспецифічними.

Антитіла або фрагменти цих антитіл відповідно до винаходу не мають перехресну

БО реактивність з якою-небудь мішенню, відмінною від передбачуваних мішеней СТІ А-4 або рМНО.

Самі антитіла і їх фрагменти можуть бути біспецифічними. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть бути схожими на прості антитіла (або фрагменти антитіл), але мати дві різних антигензв'язувальних ділянки (варіабельні області). Біспецифічні антитіла можна одержувати за допомогою різних способів, таких як хімічні способи, способи "роімудота" або способи рекомбінантної ДНК. Біспецифічні антитіла можуть мати специфічності зв'язування для щонайменше двох різних епітопів, наприклад по одному епітопу на кожній з мішеней СТІ А-4 і рМНО.

Біспецифічні антитіла, що містять комплементарні пари областей Мн і М, відомі в даній 60 галузі. Ці біспецифічні антитіла містять дві пари Мн і Мі, кожна пара Мнмі зв'язується з одним антигеном або епітопом. Такі біспецифічні антитіла включають міжвидові гібридоми (Міївбієїп С. апа Сицеїйо А.С. (1983), Маїште, 305 (5934): 537-400), міні-антитіла (Ни еї аї. (1996), Сапсег Кев. 56:3055-3061), діатіла (Ноїїїдег еї аІ. (1993), Ргос. Май). Асад. Зсі. ОА, 90:6444-6448; МО 94/13804), хелатуючі рекомбінантні антитіла (СКАБ) (Мегі еї а. (1995), 9. Мої. Віої. 246,367-373), біспецифічні 5сЕм (наприклад, АїУмеї! еї аЇ. (1996), Мої. Іттипої. 33:1301-1312), стабілізовані антитіла "виступи в западини" (Сагег еї аї. (1997), Ргоївіп Зсі. 6:781-788). У кожному випадку кожен вид антитіла містить дві ділянки зв'язування антигену, кожній підходить комплементарна пара доменів Мн і М. Кожне антитіло тим самим здатне зв'язувати два різних антигени або епітопи одночасно, при цьому зв'язування з кожним антигеном або епітопом опосередковане доменом Мн і комплементарним йому доменом Мі.

Описано природні аутоантитіла, що мають поліреактивність (Сазаїї апа МоїКіп5 (1989), Апп.

Вем. ІттипоїЇ. 7: 515-531), які реагують щонайменше з двома (звичайно більше) різними антигенами або епітопами, які структурно не зв'язані. Також показано, що відбір з випадкового репертуару пептидів з використанням технології фагового дисплея на моноклональному антитілі дозволяє ідентифікувати спектр пептидних послідовностей, що мають антигензв'язувальну ділянку. Деякі послідовності є близькоспорідненими і мають консенсусну послідовність, тоді як інші дуже сильно відрізняються і називаються мімеотопами (Гапе апа зерпеп (1993), Сшцтепі Оріпіоп іп Іттипоіоду, 5:268-271). Отже, ясно, що сайт зв'язування антитіла, яке містить асоційовані і комплементарні домени Мн і Мі, має потенціал зв'язуватися з багатьма різними антигенами з величезного спектра відомих антигенів.

У УМО 03/002609 (ЮБотапііїзх) описане одержання антитіл з подвійною специфічністю, де кожна пара МУнмі має подвійну специфічність, тобто здатна зв'язувати два епітопи на одному й тому ж або різних антигенах. Конформація може бути відкритою або закритою; у відкритій конформації, два епітопи можуть бути зв'язані одночасно, а в закритій конформації зв'язування з першим епітопом попереджує або обмежує зв'язування з другим.

Неімуноглобулінові білки з множиною специфічностей зв'язування відомі в природі; наприклад, багато факторів транскрипції зв'язуються як з ДНК, так і з іншими білковими молекулами. Однак способи відбору зв'язувальних пептидів відомого рівня техніки дозволяють відбирати тільки пептиди з однією, а не подвійною або множинною специфічністю.

Раніше різні команди дослідників прив'язували поліпептиди залишками цистеїну до синтетичних молекулярних структур (Кетр 0.5. апа МоМатага Р.Е. (1985), У. Огд. Спет.

Тіттептанп, Р. еї аї. (2005), СпетВіоСпет. 6(5):821-4). Меїоеп і співробітники використовували трис(бромметил)бензол і споріднені молекули для швидкого і кількісного закільцьовування множини пептидних петель на синтетичних каркасах для структурної мімікрії поверхонь білків (Тіттептап Р. еї аї. (2005), ірбід). Способи створення сполук можливих лікарських засобів, де зазначені сполуки створюють за допомогою зв'язування поліпептидів з молекулярним каркасом, що містять цистеїн, наприклад, такі як трис(бромметил)бензол, розкриті в УМО 2004/077062 і УМО 2006/078161. Відбір таких молекул з використанням технології дисплеїв описаний у УМО 2009/098450. Варіанти здійснення з подвійною специфічністю додатково описані в УМО 2010/089117.

Ліганд, такий як антитіло або його фрагмент, можна модифікувати для підвищення його часу напівжиття в сироватці, наприклад, за допомогою додавання молекул, таких як РЕС або інші водорозчинні полімери, включаючи полісахаридні полімери, щоб підвищувати час напівжиття. В одному з варіантів здійснення Ес-область антитіла можна додавати до біспецифічного лінкера відповідно до винаходу, щоб підвищувати час напівжиття в циркуляції.

Одержання антитіл

Одержання антитіл можна здійснювати за допомогою якого-небудь способу, відомого в даній галузі, включаючи трансгенні організми, такі як козячий (див. РоїосК еї аїЇ. (1999), 5.

Іттипої. Меїпод5 231:147-157), курячий (див. Могтом/ К.У.9У. (2000), Сепеї. Епуд. Мему5, 20:1-55), мишачий (див. РоїоскК еї аї. ірід) або рослинний (див. Богап Р.М. (2000), Сигг. Оріпіоп Віоїтесппо!). 11:199-204; Ма .К.-6. (1998) Маї.Меа. 4:601-606; Ває? .. єї а. (2000), ВіоРпагтт. 13:50-54; Біодег

Е. еї аї. (2000), Ріапі Мої. ВіоІ. 42:583-590). Антитіла також можна одержувати за допомогою хімічного синтезу; однак експресія генів, що кодують антитіла, у клітинах-хазяїнах є переважною.

Полінуклеотид, що кодує антитіло, виділяють і вставляють у репліковану конструкцію або вектор, такий як плазміда, для подальшого розмноження або експресії в клітині-хазяїні. У даній галузі доступні конструкції або вектори (наприклад, експресуючі вектори), придатні для експресії гуманізованого імуноглобуліну відповідно до винаходу. Доступні різні вектори, включаючи вектори, які містяться в одній копії або в множині копій у клітині-хазяїні або які вбудовуються в бо хромосому(и) клітини-хазяїна. Конструкції або вектори можна вводити в придатну клітину-

хазяїна, і клітини, що експресують гуманізований імуноглобулін, можна одержувати і підтримувати в культурі. Один вектор або множину векторів можна використовувати для експресії гуманізованого імуноглобуліну.

Полінуклеотиди, що кодують антитіла, легко виділяти і секвенувати з використанням стандартних процедур (наприклад, олігонуклеотидних зондів). Вектори, які можна використовувати, включають плазміду, вірус, фаг, транспозони, міні-хромосоми, серед яких плазміди являють собою типовий варіант здійснення. Загалом такі вектори додатково включають сигнальну послідовність, ділянку початку реплікації, один або декілька маркерних генів, енхансерний елемент, промотор і послідовності термінації транскрипції, функціонально зв'язані з полінуклеотидом легкого і/або важкого ланцюга для того, щоб сприяти експресії.

Полінуклеотиди, що кодують легкий і важкий ланцюги, можна вставляти в окремі вектори і вводити (наприклад, за допомогою трансформації, трансфекції, електропорації або трансдукції) в одну і ту ж клітину-хазяїна паралельно або послідовно, або, якщо бажано, як важкий ланцюг, так і легкий ланцюг можна вставляти в один і той же вектор перед таким введенням.

Промотор може бути передбачений для експресії в придатній клітині-хазяїні. Промотори можуть бути конститутивними або індуцибельними. Наприклад, промотор може бути так функціонально зв'язаний з нуклеїновою кислотою, що кодує гуманізований імуноглобулін або ланцюг імуноглобуліну, що він направляє експресію кодованого поліпептиду. Доступна множина придатних промоторів для прокаріотичних і еукаріотичних організмів-хазяїнів. Прокаріотичні промотори включають промотори Іас, їас, Т3, Т7 для Е. соїї; 3-фосфогліцераткінази або інших гліколітичних ферментів, наприклад енолази, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази, гексокінази, піруватдекарбоксилази, фосфофруктокінази, глюкозо-6-фосфатізомерази, 3- фосфогліцератмутази і глюкокінази. Еукаріотичні промотори включають індуцибельні промотори дріжджів, наприклад алкогольдегідрогенази-2, ізоцитохрому С, кислої фосфатази, металотіонетну і ферментів, що відповідають за метаболізм азоту або використання мальтози/галактози; промотори РНК полімерази ІІ, включаючи вірусні промотори, наприклад вірусу поліоми, вірусу віспи курей і аденовірусів (наприклад, аденовірусу 2), вірусу папіломи великої рогатої худоби, вірусу саркоми птахів, цитомегаловірусу (зокрема, передранній промотор гена), ретровірусу, вірусу гепатиту В, актину, промотор вірусу саркоми Рауса (К5МУ) і

Зо ранній або пізній промотор вірусу мавп 40 ії невірусні промотори, такі як ЕБР-1 (Мі2ивпіта апа

Мадага (1990), Мисієїс. Асійб5. Кев5. 18(17):5322). Фахівці в даній галузі здатні вибирати придатний промотор для експресії гуманізованого антитіла або його частини за винаходом.

Де це застосовно, наприклад, для експресії в клітинах вищих еукаріотів, додаткові енхансерні елементи можуть міститися замість тих, котрі знайдені в промоторах, описаних вище, або разом з ними. Придатні енхансерні послідовності ссавців включають енхансерні елементи з глобіну, еластази, альбуміну, фетопротеїну, металотіонеїну й інсуліну.

Альтернативно, можна використовувати енхансерний елемент із вірусу еукаріотичних клітин, такий як енхансер 540, енхансер раннього промотору цитомегаловірусу, енхансер вірусу поліоми, енхансер бакуловірусу або локус ІдДсга миші (див. УМО 04/009823). Хоча такі енхансери типово розташовані у векторі, у сайті вище у напрямку зчитування відносно промотору, вони також можуть розташовуватися в іншому місці, наприклад усередині нетрансльованої області або нижче у напрямку зчитування відносно сигналу поліаденілювання. Вибір і розташування енхансера можуть бути основані на сумісності з клітиною-хазяїном, використовуваною для експресії.

Крім того, вектори (наприклад, експресуючі вектори) типово містять селективний маркер для відбору клітин-хазяїнів, що несуть вектор і, у випадку реплікованого вектора, ділянку початку реплікації. Гени, що кодують продукти, які надають стійкість до антибіотиків або лікарських засобів, являють собою звичайні селективні маркери, і їх можна використовувати в прокаріотичних (наприклад, ген В-лактамази (стійкість до ампіциліну), ген Теї (стійкість до тетрацикліну)) і еукаріотичних клітинах (наприклад, гени стійкості до неоміцину (5418 або генетицин), дрі (мікофенолова кислота), ампіциліну або гігроміцину). Маркерні гени дигідрофолатредуктази роблять можливим відбір з використанням метотрексату в різних організмах-хазяїнах. Гени, що кодують продукти генів ауксотрофних маркерів організму-хазяїна (наприклад, І ЕШО2, ОКАЗ, НІЗЗ), часто використовують як селективні маркери в дріжджах. Також передбачене використання вірусних (наприклад, бакуловірусних) або фагових векторів і векторів, що здатні вбудовуватися в геном клітини-хазяїна, таких як ретровірусні вектори.

У еукаріотичних системах сигнали поліаденілювання і термінації функціонально зв'язані з полінуклеотидом, що кодує антитіло за даним винаходом. Такі сигнали типово розташовані ближче до 3'-кінця від відкритої рамки зчитування. У системах ссавців необмежувальні бо приклади сигналів поліаденілювання/термінації включають ті, що одержані з гормонів росту,

генів фактора елонгації-1 а і вірусних (наприклад, 5М40) генів або ретровірусних довгих кінцевих повторів. У дріжджових системах необмежувальні приклади сигналів поліаденілювання/гермінації включають ті, що одержують з генів фосфогліцераткінази (РОК) і алкогольдегідрогенази-1 (АОН). У прокаріотичних системах сигнали поліаденілювання типово не потрібні, і в них замість цього використовують більш короткі і більш визначені термінаторні послідовності. Вибір послідовностей поліаденілювання/термінації може бути оснований на сумісності з клітиною-хазяїном, використовуваною для експресії. На доповнення до викладеного вище, інші ознаки, які можна використовувати для збільшення виходу, включають хроматинремоделюючі елементи, інтрони і модифікації кодонів, специфічні для клітини-хазяїна.

Використання кодонів антитіла за даним винаходом можна модифікувати для того, щоб зробити використання кодонів клітиною-хазяїном більш ефективним для збільшення транскрипції і/або виходу продукту (наприклад, НоеКета А. еї аї. (1987), Мої. СеїІ. Віої. 7(8):2914-24). Вибір кодонів може бути оснований на сумісності з клітиною-хазяїном, використовуваною для експресії.

Винахід, таким чином, стосується виділених молекул нуклеїнової кислоти, що кодують гуманізовані імуноглобуліни за даним винаходом або їх важкі або легкі ланцюги. Винахід також стосується виділених молекул нуклеїнової кислоти, що кодують антигензв'язувальні частини імуноглобулінів і їх ланцюги.

Антитіла відповідно до даного винаходу можна одержувати, наприклад, за допомогою експресії однієї або декількох рекомбінантних нуклеїнових кислот, що кодують антитіла, у придатній клітині-хазяїні. Клітину-хазяїна можна одержувати з використанням будь-яких придатних способів. Наприклад, експресійні конструкції (наприклад, один або декілька векторів, наприклад експресуючий вектор клітини ссавця), описані в даному документі, можна вводити в придатну клітину-хазяїна, і одержувану клітину можна підтримувати (наприклад, у культурі, у тварині, у рослині) в умовах, придатних для експресії конструкції(й) або вектора(ів). Придатні клітини-хазяїни можуть являти собою прокаріотичні, включаючи бактеріальні клітини, такі як Е. соїї (наприклад, штам ОНба "м (Іпмігодеп, Сагізрай, СА), клітини РегСб (Стисеї|, І еідеп, М), В.

З,иБій5 і/або інші придатні бактерії; еукаріотичні клітини, такі як грибкові або дріжджові клітини (наприклад, Ріспіа равіогіз5, Аврегодійи5 в5р., засспаготусе5 сегемівіає, Зспігозасспаготусев5 ротбе, Меигозрога сгазза), або інші клітини нижчих еукаріотів, і клітини вищих еукаріотів, такі як

Зо клітини комах (наприклад, клітини 52 Огозорпйа 5сппієдег, клітини комах 519 (МО 94/126087 (ОбСоппог)), клітини комах ТМ5ВІ-4 (НІСН РІМЕ "М) (Іпмігодеп), ссавців (наприклад, клітини СО5, такі як СО5-І (Ме доступу АТС СКІ-1650) і СбО5-7 (Мо доступу АТСС СКІ-1651), СНО (наприклад, Ме доступу АТСС СКІ -9096), СНО рада (паць а. апа СнНавіп І А. (1980), Ргос. Маї).

Асас. осі. ОБА, 77(7):4216-4220), 293 (Мо доступу АТСС СКІ -1573), Неї а (Мо доступу АТСС СС - 2), СМІ (Мо доступу АТСС ССІ -70), МОР (Паїеу Г. єї аї. (1985), 9. Мікої., 54:739-749), 33, 2937 (Реаг М/.5. єї аі. (1993), Ргос. Майї). Асад. осі. ОБА. 90:8392-8396), клітини МО, клітини ЗР2/О, клітини Нит 78 і т. п., або рослин (наприклад, тютюну, ряски і водоростей). Див., наприклад,

А!йзибеї! Е.М. еї аї. єдв. Сштепі Ргоїосоїів іп МоІесціаг Віоіоду, Стеєпе Рибіїзпіпуд Авззосіаїез апа доп УУПеу б Боп5 Іпс. (1993). У деяких варіантах здійснення клітина-хазяїн не являє собою частину багатоклітинного організму (наприклад, рослини або тварини), наприклад вона являє собою виділену клітину-хазяїна або частину клітинної культури.

Клітини-хазяїни можна культивувати в обертових колбах, струшуваних колбах, обертових флаконах, хвильових біореакторах (наприклад, бузієт 1000 з мамебіоїесп.сот) або системах порожніх волокон, але переважним для одержання у великому масштабі є використання біореакторів у перемішуваних баках або біореакторів у вигляді мішків (наприклад, Умаме Віотесй, бБотегзеї, Мем/ Уегзеу БА), зокрема, для суспензійних культур. Типово біореактори в переміщуваних баках адаптують для аерації з використанням, наприклад, барботерів, дефлекторів або імпелерів з низьким зсувовим зусиллям. Для барботажних колонок і аерліфтних біореакторів можна використовувати пряму аерацію бульбашками повітря або кисню. Коли клітини-хазяїни культивують у середовищі для культивування без сироватки, у середовище можна додавати засіб, що захищає клітини, такий як плюронік Е-68, щоб допомагати запобігати ушкодженню клітин у результаті процесу аерації. Залежно від характеристик клітини-хазяїна, можна використовувати мікроносії як субстрати для росту для залежних від закріплення клітинних ліній, або клітини можна адаптувати до суспензійної культури. При культивуванні клітин-хазяїнів, зокрема клітини-хазяїнів хребетних, можна використовувати різні режими роботи, такі як порційний, порційний з підживленням, повторний порційний спосіб (див. Огареаи еї а! (1994), СуюїесппоїЇоду, 15:103-109), розширений порційний спосіб або перфузійна культура. Незважаючи на те, що рекомбінантно трансформовані клітини- хазяїни ссавців можна культивувати в середовищах, що містять сироватку, такі середовища бо містять ембріональну телячу сироватку (ЕС5), переважно такі клітини-хазяїни культивувати в середовищі без сироватки, наприклад, розкритому в Кееп еї аї. (1995), Суюїесппоїіоду, 17:153- 163, або комерційно доступних середовищах, таких як РГОСНО-СОМ або Шітасно м (Сатьгех

МУ, ОСОБА), за необхідності, з додаванням джерела енергії, такого як глюкоза, і синтетичних факторів росту, таких як рекомбінантний інсулін. Безсироваткове культивування клітин-хазяїнів може вимагати того, щоб ці клітини адаптувати до росту в умовах без сироватки. Один підхід до адаптації полягає в культивуванні таких клітин-хазяїнів в середовищах, що містять сироватку, і повторно заміняти 80 95 середовища для культивування на безсироваткові середовища з тим, щоб навчати клітини-хазяїни для того, щоб адаптувати до умов без сироватки (див. наприклад,

Зспапепбрегу К. еї аї. (1995), іп Апіта! Се!! Тесппоіоду ЮОемеіортепів Тоуагаз Ше 215ї Сепішгу (Веимегу Б.С. еї а! ед5), рр. 619-623, Кіимег Асадетіс рибіївпегв).

Антитіла відповідно до винаходу можна секретувати у середовище і збирати й очищати від нього з використанням різних способів, щоб забезпечити міру очищення, придатну для передбачуваного використання. Наприклад, використання терапевтичних антитіл за винаходом для лікування пацієнтів-людей типово призначає щонайменше 95 95 чистоту, як визначають за допомогою відновного 505-РАСЕ, більш типово 9895 або 9995 чистоту, у порівнянні із середовищами для культивування, що містять терапевтичні антитіла. У першому випадку клітинний детрит із середовища для культивування типово видаляють з використанням центрифугування з наступною стадією прояснення супернатанту з використанням, наприклад, мікрофільтрування, ультрафільтрування і/або глибокого фільтрування. Альтернативно, антитіло можна збирати за допомогою мікрофільтрування, ультрафільтрування або глибокого фільтрування без попереднього центрифугування. Доступні різні інші способи, такі як діаліз і електрофорез у гелі, і хроматографічні способи, такі як гідроксіапатитна (НА), афінна хроматографія (необов'язково містить систему афінного мічення, таку як полігістидин) і/або хроматографія гідрофобної взаємодії (НІС) (див. О5 5429746). В одному з варіантів здійснення антитіла за винаходом після різних стадій прояснення захоплюють з використанням білка А або афінної хроматографії на білку С з наступними додатковими стадіями хроматографії, такими як іонообмінна і/або НА хроматографія, аніонообмінна або катіонообмінна, ексклюзійна хроматографія і преципітація сульфатом амонію. Типово, також використовують різні стадії видалення вірусів (наприклад, нанофільтрування з використанням, наприклад, фільтра ЮМ-20).

Зо Після цих різних стадій надають очищений препарат, що містить щонайменше 100 мг/мл або більше, наприклад 100 мг/мл або більше, антитіла за винаходом, і, отже, формують варіант здійснення винаходу. Концентрацію до 100 мг/мл або більше можна створювати за допомогою ультрацентрифугування. Такі препарати по суті не містять агреговані форми антитіл за винаходом.

Бактеріальні системи особливо придатні для експресії фрагментів антитіл. Такі фрагменти локалізовані внутрішньоклітинно або усередині периплазми. Нерозчинні периплазматичні білки можна екстрагувати і повторно укладати для того, щоб формувати активні білки відповідно до способів, відомих фахівцям у даній галузі, див. Запсне? єї аї. (1999), У. ВіоїесНнпої. 72:13-20;

Сирії Р.М. єї а). (1999), І ей. Аррі. Містобріої!. 29:273-277.

Даний винахід також стосується клітин, що містять нуклеїнову кислоту, наприклад вектор, за винаходом (наприклад, експресуючий вектор). Наприклад, нуклеїнову кислоту (тобто одну або декілька нуклеїнових кислот), що кодує важкі і легкі ланцюги гуманізованого імуноглобуліну відповідно до винаходу, або конструкцію (тобто одну або декілька конструкцій, наприклад один або декілька векторів), що містить таку нуклеїнову кислоту(и), можна вводити в придатну клітину-хазяїна за допомогою способу, придатного для вибраної клітини-хазяїна (наприклад, трансформація, трансфекція, електропорація, інфекція), при цьому нуклеїнова кислота(и) є або стає функціонально зв'язаною з одним або декількома елементами, що керують експресією (наприклад, у векторі, у конструкції, створюваній за допомогою процесів у клітині, вбудованій в геном клітини-хазяїна). Клітини-хазяїни можна підтримувати в умовах, придатних для експресії (наприклад, у присутності індуктора, придатних середовищ з додаванням придатних солей, факторів росту, антибіотиків, харчових добавок і т. д.), за допомогою чого одержують кодований поліпептид(и). При бажанні, кодоване гуманізоване антитіло можна виділяти, наприклад, з клітин-хазяїнів, середовища для культивування або молока. Цей процес охоплює експресію в клітині-хазяїні (наприклад, клітині молочної залози) трансгенної тварини або рослини (наприклад, тютюну) (див. наприклад, УМО 92/03918).

Ліганди СО8О

Розробка і конструювання лігандів СО80О спрямовані на максимізацію специфічності ліганду до СТІ А-4 у порівнянні з СО28. Послідовність СОВ8О, відома в даній галузі, наведена, наприклад, у УМи еї аї., 1997. СО80 містить позаклітинний домен ІдД-М, схожий на варіабельний, і бо внутрішньоклітинний домен ІДС, схожий на константний. У переважному варіанті здійснення позаклітинний домен СО80О використовують як ліганд. Наприклад, див. зЕО ІЮ МО:15, зокрема залишки 1-241.

Мутації можна виконувати в СО80 людини для того, щоб підвищувати афінність зв'язування, і для того, щоб підвищувати вибірковість до СТІ А4 у порівнянні з СО28. Див., наприклад, УмМи еї а!., 1997.

Можна створювати мутанти, відмінні від МУ84А, включаючи К71с, К71М, 51092, 81235,

В1230, (1241, 5190А, 5201А, ВАбЗА, М81А, М97А, ЕТ96А. Див. Реасп еї аї., УВС, 1995. 279(6):21181-21187. Оцінку афінності зв'язування мутантів як з СТІ А-4, так і з СО28, можна здійснювати за допомогою сайт-направленого мутагенезу з наступною експресією мутантних поліпептидів і визначенням Ка за допомогою поверхневого плазмонного резонансу з використанням чипів СТІ А-4 і СО28 Віасоге. Див., наприклад. сио еї аї. (1995), У. Ехр. Меа. 181:1345-55.

Можна вибирати мутанти, що мають сприятливі профілі зв'язування і вибірковості, і потім оцінювати в аналізах на основі клітин. Наприклад, проточну цитометрію можна використовувати для оцінки ефекту дикого типу або мутантного СО80, яким трансфікують клітини.

Ліганди І АО-3

У даній галузі описаний ІГАС-3, і охарактеризований сайт зв'язування з протеїном МНЄеІЇ.

Див. Ниага еї аїЇ. (1997), Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 94(11): 5744-9. | АД-3 має чотири позаклітинних Ід-подібних домени, і в ці домени можна вводити мутації для оптимізування зв'язування з МН.

Ефективність мутацій можна аналізувати, як описано вище відносно лігандів СО80О.

В одному з аспектів ліганд відповідно до винаходу використовує тільки домени 1 і 2 (01 і 02) з чотирьох Ід-подібних доменів ГАС-3. Вважають, що ці домени відповідають за взаємодію з білком МНЄОЇІЇ.

Конструкції біспецифічних лігандів

Конструкція біспецифічного ліганду повторює загальну формулу "ліганд-лінкер-ліганд".

Біспецифічні антитіла відомі в даній галузі й описані вище.

Конструювання біспецифічних лігандів переважно включає конструювання й експресію придатного гена, що кодує бажаний поліпептид. Інші способи конструювання включають

Зо змішування двох поліпептидів в умовах, що роблять можливим утворення ковалентних, іонних або гідрофобних зв'язків. У переважних варіантах здійснення вони включають ковалентне зв'язування поліпептидів. Коли конструюють біспецифічну молекулу, що містить три компоненти, такі як ліганд СТІ А-4, лінкер і ліганд МНС, два з трьох можна комбінувати, зв'язувати разом, а третій поліпептид надалі додавати до продукту злиття і зв'язувати для того, щоб створювати продукт злиття, що містить усі три поліпептиди.

Поліпептиди відповідно до даного винаходу можна одержувати за допомогою будь-якого бажаного способу, включаючи хімічний синтез, виділення з біологічних зразків і експресію нуклеїнової кислоти, що кодує такий поліпептид. Нуклеїнові кислоти, у свою чергу, можна синтезувати або виділяти з біологічних джерел і, при бажанні, модифікувати за допомогою сайт- специфічного мутагенезу.

Винахід, таким чином, стосується векторів, що кодують біспецифічний ліганд відповідно до винаходу або його фрагмент. Вектор може являти собою, наприклад, фаг, плазміду, вірусний або ретровірусний вектор.

Нуклеїнові кислоти відповідно до винаходу можуть являти собою частину вектора, що містить селективний маркер для розмноження в організмі-хазяїні. У цілому, плазмідний вектор вводять у преципітаті, такому як преципітат фосфату кальцію, або в комплексі з зарядженим ліпідом.

Якщо вектор являє собою вірус, його можна упаковувати іп міго з використанням придатної пакувальної клітинної лінії і потім трансдукувати у клітини-хазяїни.

Вставку нуклеїнової кислоти функціонально зв'язують із придатним промотором, таким як промотор фага лямбда РІ, промотори ас Е. соїї, ігр, рпо і ас, ранній і пізній промотори 5М40 і промотори ретровірусних ГТК. Інші придатні промотори відомі фахівцям у даній галузі.

Експресійні конструкції додатково містять сайти ініціації транскрипції, термінації і, у транскрибованій області, ділянку зв'язування рибосоми для трансляції. Кодуюча частина транскриптів, експресованих за допомогою конструкцій, переважно містить ініціюючий трансляцію кодон на початку і термінуючий кодон (ШАА, ОСА або ШОАО), відповідним чином розташований на кінці поліпептиду, що підлягає трансляції.

Як показано, експресуючі вектори переважно містять щонайменше один селективний маркер. Такі маркери включають дигідрофолатредуктазу, 5418 або стійкість до неоміцину для бо культури еукаріотичних клітин і гени стійкості до тетрацикліну, канаміцину або ампіциліну для культивування в Е. соїї і інших бактеріях. Репрезентативні приклади придатних організмів- хазяїнів включають, але не обмежуючись цим, бактеріальні клітини, такі як клітини Е. соїї, зігеріотусев і ЗаіІтопеїа їурпітигішт; грибкові клітини, такі як дріжджові клітини (наприклад,

Засспаготусев сегемівзіає або Ріспіа разіогі5); клітини комах, такі як клітини 52 ЮОгозорпійа і 519 зродоріега; клітини тварин, такі як клітини СНО, СО5, НЕК293 і клітини меланоми Боуеса; і рослинні клітини.

Придатні середовища для культивування й умови для описаних вище клітин-хазяїнів відомі в даній галузі і доступні на комерційній основі.

Вектори, переважні для використання в бактеріях, серед іншого, включають РОЕ7О, рОЕбО і рОЕ-9, доступні від ОІАСЕМ, Іпс.; вектори рВішйезсгірі, вектори Ріадезсгірі, РМНВА, рМНІва, рІЧНІВА, рМНабА, доступні в 5ігаїадепе Сіопіпд Зузієтв, Іпс.; і рігс9За, ркКк2233, ркк233-3, ронБаю, рВІТ5, доступні від Ріагтасіа Віоїтесі, Іпс. Серед переважних еукаріотичних векторів рУУІ МЕО, роМм2САТ, роа44, рХТіІ і рба, доступні від бігаїадепе; і ремкК3З, рвРУ, рмМзо і ремі, доступні від Рпаптасіа. Вектори, переважні для використання в експресії в клітинах ссавця, серед іншого включають вектор раб, роМУ-5РОВТб6, рсОМА, рСЕР4, рВЕРА, реї, рої і

РВІСЕР-СММУ. Переважні експресуючі вектори для використання в дріжджових системах включають, але не обмежуючись цим, рУЕ52, рУбіІ, рТЕРИео, рУЕ52/с25, рРІСЯ, раАРАІ, раАРЛаїри, рРІСО, рРІСЗ.5, рНІГО2, рНІ-51, рРІСЗ.5ОК, рРІСОК ї РАОВ815 (усі доступні від

Іпмйгодеп, Сагізраєд, СА).

Введення конструкції в клітину-хазяїна можна здійснювати за допомогою трансфекції з фосфатом кальцію, опосередкованої ОЕБЕАЕ-декстраном трансфекції, опосередкованої катіонними ліпідами трансфекції, електропорації, трансдукції, інфекції або інших способів. Такі способи описані в багатьох стандартних лабораторних керівництвах, таких як Затьгоок еї аї., що згадане вище. Поліпептид відповідно до винаходу можна витягати й очищати від культури рекомбінантних клітин за допомогою загальновідомих способів, включаючи преципітацію сульфатом амонію або етанолом, екстрагування кислотою, аніоно- або катіонообмінну хроматографію, хроматографію на фосфоцелюлозі, хроматографію гідрофобної взаємодії, афінну хроматографію, хроматографію на гідроксіапатиті і лектинову хроматографію. Найбільш переважно для очищення використовують високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ).

Поліпептиди відповідно до даного винаходу також можна витягати з біологічних джерел, включаючи текучі середовища організму, тканини і клітини, зокрема клітини, одержані з пухлинної тканини або передбачуваних пухлинних тканин суб'єкта.

Крім того, поліпептиди відповідно до винаходу можна синтезувати хімічно з застосуванням відомих у даній галузі способів (наприклад, див. Стгеідпйіоп, 1983, Ргоїеіп5: БЗігисіиге5 апа

Моїесшіаг Ргіпсіріеєє М.Н. Егеетап 5 Со. М.У., ї НипКаріїег еї аї. (1984), Маїшге, 310:105-111).

Наприклад, поліпептид, що містить весь біспецифічний ліганд відповідно до винаходу або його частину, можна синтезувати з використанням пептидного синтезатора.

Біспецифічні ліганди відповідно до винаходу описані в деталях у 5ЕО ІОЮ, прикладених до нього. «ЕО ІЮ МО:1 і 2 надають замінну послідовність ДНК і послідовність білка миші для біспецифічних лігандів, у яких ліганд СТІ А-4 СОв80жм/вва утворює пари з лігандом МНС ГАС-3, відділеним Ес-областю ІСтга і послідовністю (Іу-9 (59). Послідовність кінцевої гістидинової мітки (Нб) передбачена на С-кінції ЗЕО ІЮ МО:З3 і 4 надають замінну послідовність ДНК і послідовність білка миші для тих же конструкцій, що і ЗЕО ІЮ МО:1 і 2, за винятком того, що Ес- область ІдДс2а розміщена ближче до С-кінця відносно поліпептиду ГАС-3, так що пептиди СО8О і ГАО-3 відділяє тільки 59. Два розташування, з Ес-областю між лігандами або ближче до С- кінця відносно них, позначають як конструкції гена 1 і гена 2, відповідно.

ЗЕО ІЮ МО:5 і 6 надають послідовності ДНК і білка людини, у яких збережена послідовність дикого типу. Не вводили ніяких мутацій, ні в СО8О, ні в ГАС-3.

У 5БЕО ІО МО:7 і 8 у СЮО80 людини введена мутація УУ84А (еквівалент УУВВА у мишії) і в ГАО-3 введена мутація К75Е. Інші БЕО ІЮ МО (7-14) описують інші мутації в послідовностях СО8О і

Гда-3.

Терапевтичні застосування

Супресія Т-клітинної активності є бажаною в багатьох ситуаціях, у яких імуносупресія обгрунтована і/або виникає аутоїмунний стан. Відповідно, націлений вплив на взаємодію

СТІ АЗ/МНС показаний при лікуванні захворювань, у яких має місце непридатна або небажана імунна відповідь, таких як запалення, аутоїмунна реакція і стани, у які залучені такі механізми. В одному з варіантів здійснення таке захворювання або порушення є аутоіїмунним і/або запальним захворюванням. Приклади таких аутоімунних і/або запальних захворювань викладені вище.

В одному з варіантів здійснення таке захворювання або порушення являє собою діабет 1 типу (Т10).

В іншому варіанті здійснення ліганди відповідно до винаходу використовують для того, щоб сприяти трансплантації за допомогою імуносупресії суб'єкта. Таке використання полегшує реакцію "трансплантат проти хазяїна". Для опису існуючого лікування для реакції ""трансплантат проти хазяїна" див. 5меппіїзоп (2005), Вопе Магтом/ Тгап5ріапіацоп, 35:565-557, і цитовані в там посилання. Переважно, антитіла за винаходом можна використовувати в комбінації з іншим доступним лікуванням.

Відносно лікування аутоїмунних захворювань, комбіноване лікування може включати введення ліганду за даним винаходом разом з лікарським засобом, який разом з лігандом містить ефективну кількість для запобігання або лікування таких аутоїмунних захворювань. Там, де зазначеним аутоїмунним захворюванням є діабет 1 типу, комбіноване лікування може охоплювати один або декілька з засобів, які сприяють росту р-клітин підшлункової залози або поліпшують трансплантацію ДВ-клітин, такі як фактори росту або виживаності ДВ-клітин або імуномодулюючі антитіла. Коли зазначене аутоіїмунне захворювання являє собою ревматоїдний артрит, зазначене комбіноване лікування може охоплювати одне або декілька з метотрексату, антитіла проти ТМЕ-а, злитого білка ТМЕ-с« рецептор-Ід, антитіла проти 1-6, проти 117, проти

І/-15 або проти 1-21, нестероїдного протизапального засобу (МАЇС) або модифікуючого захворювання протиревматичного лікарського засобу (ОМАКО). Наприклад, додатковий засіб може являти собою біологічний засіб, такий як засіб проти ТМЕ (наприклад, ЕнбрелФф), інфліксимаб (РемікейдФф)) і адалімумаб (Хуміраф) або ритуксимаб (РитуксанФ). Коли зазначене аутоїмунне захворювання являє собою відторгнення гематопоетичного трансплантата, можна вводити гематопоетичний фактор(и) росту (такий як еритропоетин, 5-С5Е, СМ-С5Е, 1 -3, 1-11, тромбопоетин і т. д.) або протимікробний засіб(оби) (такий як антибіотик, противірусні, протигрибкові лікарські засоби). Коли зазначене аутоїмунне захворювання являє собою псоріаз, додатковий засіб може являти собою одне або декілька з дьогтю і його похідних, терапії, кортикостероїдів, циклоспорину А, аналогів вітаміну ОО, метотрексату, інгібіторів рзв мітогенактивованої протеїнкінази (МАРК), а також біологічні засоби, такі як засоби проти ТМЕ-а і

РитуксанФ. Коли зазначене аутоїмунне захворювання являє собою запальне захворювання

Ко) кишечнику (ІВО), таке як, наприклад, хвороба Крона або виразковий коліт, додатковий засіб може являти собою один або декілька з аміносаліцилатів, кортикостероїдів, імуномодуляторів, антибіотиків або біологічних засобів, таких як РемікейдФ і Хуміраф).

Комбіноване лікування можна здійснювати будь-яким чином, який визнає необхідним або зручним фахівець у даній галузі, і з метою цього опису не передбачені обмеження відносно порядку, кількості, повторення або відносної кількості сполук, що підлягають використанню в комбінації. Відповідно, антитіла відповідно до даного винаходу для використання в терапії можна складати у фармацевтичні композиції. Даний винахід також пов'язаний з фармацевтичними композиціями, які містять пептиди відповідно до даного винаходу.

Фармацевтичні композиції

У переважному варіанті здійснення передбачена фармацевтична композиція, яка містить біспецифічний ліганд відповідно до винаходу або ліганд або ліганди, які можна ідентифікувати за допомогою способу аналізу, як визначено в попередньому аспекті винаходу. Ліганди можуть являти собою імуноглобуліни, пептиди, нуклеїнові кислоти або низькомолекулярні сполуки, як розглянуто в даному документі. Їх позначають в подальшому описі як "сполуки".

Фармацевтична композиція відповідно до винаходу являє собою композицію речовин, що містить сполуку або сполуки, здатні модулювати Т-клітинну активність, як активний інгредієнт.

Типово, сполука представлена у формі будь-якої фармацевтично прийнятної солі або, наприклад, де це застосовно, аналога, у формі вільної основи, таутомеру, рацемічної суміші енантіомерів або їх комбінації. Передбачено, що активні інгредієнти фармацевтичної композиції, які містять активний інгредієнт відповідно до винаходу, виявляють чудову терапевтичну активність, наприклад, при лікуванні реакції ""рансплантат проти хазяїна", коли їх вводять у кількості, яка залежить від конкретного випадку.

В іншому варіанті здійснення одну або декілька сполук за винаходом можна використовувати в комбінації з будь-якою прийнятою у даній галузі сполукою, про яку відомо, що вона придатна для лікування конкретного показання при лікуванні якого-небудь із зазначених вище станів. Відповідно, одну або декілька сполук за винаходом можна комбінувати з однією або декількома прийнятими в даній галузі сполуками, про які відомо, що вони придатні для лікування наведених вище показань, таким чином, що зручну єдину композицію можна вводити суб'єкту. Схему дозування можна коректувати для забезпечення оптимальної 60 терапевтичної відповіді.

Наприклад, декілька розділених доз можна вводити кожну добу або дозу можна пропорційно зменшувати, як того вимагають запити терапевтичної ситуації.

Активний інгредієнт можна вводити зручним чином, наприклад, за допомогою перорального, внутрішньовенного (у випадку розчинності у воді), внутрішньом'язового, підшкірного, інтраназального, внутрішньошкірного або супозиторного шляху або імплантації (наприклад, з використанням молекул з повільним вивільненням).

Залежно від шляху введення може бути необхідно покривати активний інгредієнт матеріалом для захисту зазначених інгредієнтів від дії ферментів, кислот і інших природних умов, що можуть інактивувати зазначений інгредієнт.

Для введення активного інгредієнта за допомогою введення, відмінного від парентерального, його потрібно покривати або вводити з матеріалом для запобігання його інактивації. Наприклад, активний інгредієнт можна вводити в ад'юванті, що вводиться спільно з інгібіторами ферментів або у ліпосомах. Ад'ювант використовують у його найбільш широкому розумінні, і він включає будь-яку імуностимулюючу сполуку, таку як інтерферон. Ад'юванти, розглянуті в даному документі, включають резорцини, неіонні поверхнево-активні засоби, такі як поліоксіегиленолеїловий ефір і н-гексадецилполіетиленовий ефір. Інгібітори ферментів включають трипсин підшлункової залози.

Ліпосоми включають СОог-емульсії вода-в-маслі-в-воді, а також стандартні ліпосоми.

Активний інгредієнт також можна вводити парентерально або інтраперитонеально.

Дисперсії також можна одержувати в гліцерині, рідких поліетиленгліколях і їх сумішах, а також в оліях. При звичайних умовах зберігання і використання ці препарати містять консервант для запобігання росту мікроорганізмів.

Фармацевтичні форми, придатні для ін'єкційного використання, включають стерильні водні розчини (у випадку розчинності у воді) або дисперсії і стерильні порошки для одержання ін'єктованих стерильних розчинів або дисперсій для негайного введення. В усіх випадках форма повинна бути стерильною і повинна бути текучою до такої міри, щоб легко проходити через голку. Вона повинна бути стабільна в умовах виготовлення і збереження, і її варто захищати від контамінуючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії і гриби. Носій може являти собою розчинник або дисперсійне середовище, що містить, наприклад, воду, етанол, багатоатомний спирт

Зо (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь і т. п.), їх придатні суміші і рослинні олії. Належну плинність можна підтримувати, наприклад, за допомогою покриття, такого як лецитин, за допомогою підтримання необхідного розміру частинки у випадку дисперсії і за допомогою поверхнево-активних речовин.

Запобігання дії мікроорганізмів можна здійснювати за допомогою різних антибактеріальних і протигрибкових засобів, наприклад парабенів, хлорбутанолу, фенолу, сорбінової кислоти, тимеросалу і т. п. У визначених випадках переважно можуть містити ізотонічні засоби, наприклад цукри або хлорид натрію. Пролонговану абсорбцію ін'єктованих композицій можна здійснювати за допомогою використання в композиціях засобів, що затримують абсорбцію, наприклад моностеарат алюмінію і желатин.

Стерильні ін'єктовані розчини одержують за допомогою введення активного інгредієнта в необхідній кількості в придатний розчинник з множиною інших інгредієнтів, перерахованих вище, за необхідності, з наступною стерилізацією фільтруванням. Загалом, дисперсії одержують за допомогою введення стерилізованого активного інгредієнта в стерильний наповнювач, що містить основне середовище дисперсії і необхідні інгредієнти, відмінні від перерахованих вище.

У випадку стерильних порошків для одержання стерильних ін'єктованих розчинів, переважні способи одержання являють собою вакуумне сушіння і спосіб ліофілізації, який дає порошок активного інгредієнта плюс будь-якого додаткового бажаного інгредієнта з його попередньо стерилізованого фільтруванням розчину.

Як використовується в даному документі, "фармацевтично прийнятний носій і/або розріджувач" включає будь-який і всі розчинники, середовища дисперсій, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, ізотонічні і затримуючі абсорбцію засоби і т. п.

Використання таких середовищ і засобів для фармацевтично активних речовин добре відоме в даній галузі. За винятком випадків, коли які-небудь стандартні середовища або засоби несумісні з активним інгредієнтом, передбачене їх використання в терапевтичних композиціях. Додаткові активні інгредієнти також можна вбудовувати в композиції.

Зокрема, сприятливо складати парентеральні композиції в одиничній дозованій формі для простоти введення й однорідності дози. Одинична дозована форма, як використовується в даному документі, належить до фізично роздільних одиниць, призначених як одиничні дози для суб'єктів ссавців, що підлягають лікуванню; кожна одиниця містить попередньо визначувану бо кількість активного матеріалу, обчислювану для того, щоб викликати бажаний терапевтичний ефект, у сполученні з необхідним фармацевтичним носієм. Опис нових одиничних дозованих форм за винаходом продиктований і безпосередньо залежить від (а) унікальних характеристик активного матеріалу і конкретного терапевтичного ефекту, що має бути досягнутий, і (Б) обмежень, що накладаються областю компаундування, наприклад активним матеріалом для лікування захворювання у живих суб'єктів, що мають патологічний стан, у якому здоров'я організму ослаблене.

Найважливіші активні інгредієнти компаундують для зручного й ефективного введення в ефективній кількості з використанням придатного фармацевтично прийнятного носія в одиничній дозованій формі. У випадку композицій, що містять додаткові активні інгредієнти, дози визначають, виходячи зі звичайної дози і способу введення зазначених інгредієнтів.

Для сприяння доставці пептидних сполук, включаючи антитіла, у клітини, пептиди можна модифікувати для підвищення їх здатності долати клітинну мембрану. Наприклад, у 05 5149782 розкрите використання фузогенних пептидів, пептидів, що утворюють іонні канали, мембранних пептидів, довголанцюжкових жирних кислот і інших засобів, що змішуються з мембранами, для підвищення перенесення білка через клітинну мембрану. Ці й інші способи також описані в МО 97/37016 ії 05 5108921, що включені в даний документ за допомогою посилання.

У додатковому аспекті передбачений активний інгредієнт за винаходом, як визначено раніше в даному документі, для застосування в лікуванні захворювання або окремо, або в комбінації з прийнятими в даній галузі сполуками, про які відомо, що вони придатні для лікування конкретного показання. Отже, передбачене застосування активного інгредієнта за винаходом для виготовлення лікарського засобу для лікування захворювання, асоційованого з аберантною імунною відповіддю.

Крім того, передбачений спосіб лікування стану, асоційованого з аберантною імунною відповіддю, який включає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості ліганду, ідентифікованого з використанням способу аналізу, як описано вище.

Винахід додатково описаний, лише в ілюстративних цілях, у наступних прикладах.

Приклади

Приклад 1

Розробка біспецифічного злитого білка, що залучає СТІ А-4 і зшиває його з ТСЕ через МНЄОЇІЇ

Зо Для того, щоб генерувати біспецифічний злитий білок, що вибірково й агоністично залучає

СТІ А-4 і одночасно зв'язує його з ТОК, мутантний СО80 (СО8Ом/88а, називаний далі як

СОвОула), що зв'язує СТІ А-4, але має мінімальну афінність до СО28 (УМи еї аї., 1997), зливали з

Г АС-3, природним лігандом МНЄеІЇ (Ваїхегаєх еї аї., 1992; Тгіебеї еї аї., 1990). СОвОула з'єднували з ГАС-3 з використанням лінкера, що складається з дев'яти гліцинів, які у свою чергу прикріплювали до Ес-частини ІдДс2а миші, щоб передбачувано підвищувати його час напівжиття в циркуляції (фіг. 1А). У відповідь на ліганд цієї конфігурації, очікували, що залучення СТІ А-4 і лігування з ТСК буде відбуватися опосередковано, через формування тримолекулярного комплексу (СТІ А-4/МНСП/ТТСБЕ) в імунних синапсах під час ранньої Т-клітинної активації (фіг. 18). У принципі, поза контекстом імунного синапсу, зв'язування біспецифічного злитого білка або з СТІ А-4, або з МНСОСЇЇ або окремо з обома СТІ А-4 і МНСЇЇ не повинно приводити до інгібування Т-клітинної активності. Залучення СТІ А-4 за допомогою СОвОула розробляли для того, щоб запускати передачу сигналу СТІ А-4 через рекрутування фосфатаз до цитоплазматичного хвоста СТІ А-4. Проте, зв'язування (Г АС-3 з МНС призначали для того, щоб наблизити СТІ А-4 до когнатного ТСЕК, що зв'язує комплекс рМНеСЇІЇ в імунному синапсі (фіг. 18).

Очікували, що комбінація цих двох подій зв'язування буде доставляти інгібуючий сигнал у ТОК.

Також конструювали контрольний злитий білок, що містить СО8Оучга і Ес ага (фіг. 1А), який не повинен бути здатним зшивати СТІ А-4 з ТС (фіг. 1С), оскільки в нього відсутній ГГ АС-3.

Тестові і контрольні злиті білки експресували в клітинах яєчника китайського хом'ячка й очищали афінною хроматографією на колонці з білком б. Агрегати видаляли з використанням ексклюзійної хроматографії. Тестовий біспецифічний злитий білок (СО8була-І АС-3-Ес) позначають як В5В (нуклеотидна послідовність: зЕО ІЮ МО:3; амінокислотна послідовність: ХЕ

ІО МО:4), і контрольна конструкція (СОвОула-Ес) відома як В5ВА (нуклеотидна послідовність:

ЗЕО ІЮ МО:16; амінокислотна послідовність: «ФЕО ІЮ МО:17). Як очікували, обидва злитих білки виглядали як димери на невідновних гелях 50О5-РАСЕ (В5В, 200 кДа; В5ВА 140 кДа) і як мономери (858, 100 кДа; В5ВА 70 кДа) на відновних гелях 505-РАСЕ. Їх ідентичність додатково підтверджували за допомогою Вестерн-блотингу з використанням антитіл проти ГАО-3 і СО80.

Приклад 2

В5В інгібує Т-клітинну активацію в алогенній реакції змішаної культури лімфоцитів

Відносну здатність В5В і В5ВА інгібувати Т-клітинну активацію оцінювали в алогенній реакції бо змішаної культури лімфоцитів за допомогою вимірювання утворення 1-2. Наївні 040025:

Собі пор адом Т-клітини, які виділяли у мишей ВАЇ В/с, змішували з АРС, виділеними у мишей

С57ВІ/6, у присутності або за відсутності В6В або В5ВА. Мишачі ІдСга і СТІ А-41д, інгібітор костимуляції, який зв'язується з СО80/86 і блокує їх зв'язування з СО28, включали у вигляді негативного і позитивного контролів, відповідно. Включення В5В, але не В5ВА, у реакцію змішаної культури лімфоцитів інгібувало утворення 1-2, хоча і не в тій же мірі, у якій цього досягали за допомогою СТІ А-41І9 (фіг. 2). Ця відмінність була ймовірним результатом В5В- опосередкованого Т-клітинного інгібування, що виникає пізніше, ніж СТІ А-4Ід-опосередковане інгібування. Більш конкретно, для В5В, інгібування виникало тільки після підвищення регуляції

СТІ А-4 після Т-клітинної активації. Нездатність В5ВА знижувати утворення 1-2, переконливо говорить про те, що залучення тільки СТІ А-4 є недостатнім для запобігання Т-клітинній активації, оскільки необхідне конкурентне зшивання з ТОК. Для виключення можливості того, що ГАС-3-частина В5В відіграє роль у Т-клітинному інгібуванні, у цьому аналізі тестували Г Ас-

ЗІд, і верифікували нездатність інгібувати Т-клітинну активацію.

Приклад З

В5В направляє диференціацію Т-клітин у Т-регуляторні клітини

Показано, що рання термінація передачі сигналу ТСК за допомогою усунення антигенної стимуляції, інгібування передачі сигналу ттТОК, субоптимальної стимуляції ТСК через низькоафінний антиген або слабка костимуляція під час Т-клітинної активації ініціює експресію

Еохр3" і відхилення диференціації Т-клітин у напрямку фенотипу Т-регуляторних клітин (ОєЇдопйе еї аї. (2009), Іттипйцу, 30:832-844; Нахпіпавіо єї аї. (2008), 9. Ехр. Мед. 205:565-574; зЗацег еї аІ. (2008), Рус. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 105:7797-7802). Оскільки В5В підсилює раннє залучення ТСК за допомогою індукованого активацією СТІ А-4 з наступним ослабленням передачі сигналу ТОК, також оцінювали його здатність утворювати Бохр3-Т-регуляторні клітини.

Наївні С04-СО621 попідзЕрР" Т-клітини, одержувані від мишей із введеним Рохр3-ЕСЕР (Нагівбнаї єї аім. (2007), 9У. Іттипої. 178:2961-2972), змішували з обробленими І Р5 алогенними АРС у присутності В5В або В5ВА. Аналіз проточної цитометрії клітин після п'яти діб культивування виявляв велике число СО4-С0р25:СЕР-Т-клітин серед оброблених В5В клітин (фіг. ЗА, середній лівий графік), але не серед клітин, які обробляли з використанням ІдСсга миші (фіг. ЗА, верхній лівий графік) або В5ВА контролю (фіг. ЗА, нижній лівий графію), що вказує на те, що ці

Зо брабр2гбнагРТ-клітини являли собою Еохр3"Т-регуляторні клітини. Для того, щоб підтверджувати цю знахідку, середовища клітинних культур збирали й аналізували на характерні цитокіни Т-регуляторних клітин, І/-10 ї ТОаБ-В (Соо!5 єї а). (2008), У. СеїЇ Мої. Мед. 12:690-700). Великі кількості І/-10 ії ТЕО-ВД виявляли в середовищах оброблених В5В клітин (фіг.

ЗА, ліві графіки), але не в середовищах клітин, оброблених з використанням В5ВА або тідсга.

До подиву, СТІ А-41д не ініціює утворення СЕР-"Т-регуляторних клітин або утворення ІІ -10 і ТОгЕ-

В. Не обмежуючись конкретною теорією, механізм, за допомогою якого СТІ А-4ІЇд зменшує Т- клітинну відповідь, відрізняється від такого у В5еВ. І АС-3Ід окремо або в комбінації з ВВА також був не здатний індукувати утворення СЕР-"Т-регуляторних клітин, вказуючи на те, що В5В- опосередковане зшивання СТІ А-4 з ТСЕК було необхідне для індукції Т-регуляторних клітин.

Приклад 4

Індукція Т-регуляторних клітин за допомогою В5В вимагає самостійно стимульованого ТОБ-

В

Конкурентне виявлення підвищених рівнів 1-10 ії ТОБ-ДВ після обробки з використанням В5В підвищувало імовірність того, що цитокіни, зокрема ТОЕ-ВД, відіграють роль у полегшенні утворення Т-регуляторних клітин (фіг. ЗА) Щоб розібратися з цим, середовища для культивування збирали протягом періоду в п'ять діб і аналізували на вміст цитокінів і Гохр3-Т- регуляторних клітин. Підвищені рівні Ї/-10 ії ТОЕ-В виявляли вже на 2 добу після обробки, і

Еохр3"Т-регуляторні клітини виявляли після З доби. Не обмежуючись конкретною теорією, ендогенне утворення ТОЕ-Д, яке передбачувано стимулювали за допомогою В5В, бере участь у диференціації Т-регуляторних клітин. Додавання антитіла проти ТОБЕ-В (клон 1011), але не ізотипічного контрольного ДС: (клон 13С4), в аналіз індукції Т-регуляторних клітин повністю блокувало появу Рохр3"Т-регуляторних клітин (фіг. ЗВ). Не обмежуючись конкретною теорією, раннє залучення СТІ А-4 і його наступне зшивання з ТОК за допомогою В5В стимулювало утворення ендогенного ТИЕ-ВД, який у свою чергу сприяв диференціації Т-регуляторних клітин.

Попередньо повідомлялося про те, що зшивання СТІ А-4 і ТОК ініціює утворення Таг-Вр (Снеп еї а!. (1998), У. Ехр. Мед. 188:1849-1857), незважаючи на те, що диференціацію Т-регуляторних клітин не оцінювали в цьому дослідженні.

Т-регуляторні клітини показували суттєвий терапевтичний потенціал при модулюванні маніфестації захворювання в декількох тваринних моделях аутоїмунних захворювань. Однак бо підкреслена важливість специфічності індукованих Т-регуляторних клітин проти значимих антигенів. Неантигенспецифічні Т-регуляторні клітини, що не будуть активовані проти конкретних аутоантигенів у контексті аутоантигенспецифічних реактивних Т-клітин, передбачувано не є функціонально імуносупресорними. Таким чином, підходи, які полегшують утворення великих кількостей антигенспецифічних Т-регуляторних клітин вкрай бажані для лікування цих захворювань. Крім того, стратегії які полегшують де помо індукцію антигенспецифічних Т-регуляторних клітин іп 5йи (наприклад, в острівцях підшлункової залози для Т10 або у власній пластинці для виразкового коліту або хвороби Крона), є переважними в порівнянні з використанням адаптивного перенесення диференційованих або розмножених іп міо Т-регуляторних клітин.

Приклад 5

В5В-індуковані Т-регуляторні клітини є функціонально супресорними залежним від міжклітинного контакту чином

Для того, щоб оцінити, чи є В5В-індуковані Т-регуляторні клітини функціонально супресорними, В5В-індуковані Т-регуляторні клітини і Таг-Вр-індуковані Т-регуляторні клітини, що служили як контроль, очищали з використанням активованого флуоресценцією сортування клітин (ЕАС5) і змішували з міченими СЕБЕ сингенними реактивними Т-клітинами в різних співвідношеннях і алогенними АРС. Клітини спільно культивували протягом трьох діб або в трансвелах, або в звичайних культуральних ямках, після чого проліферацію реактивних Т-клітин аналізували з використанням проточної цитометрії. Як резюмовано на фіг. 5А, як В5В- індуковані, так і ТОавБ-В-індуковані Т-регуляторні клітини, які культивували в звичайних культуральних ямках, майже повністю інгібували проліферацію реактивних Т-клітин. Сила супресорної активності В5В-індукованих Т-регуляторних клітин порівнянна з такою ТОавБ-р- індукованих Т-регуляторних клітин. На відміну від цього, Т-регуляторні клітини, утворені за допомогою або В5В, або Таг-рД, незначно інгібували проліферацію реактивних Т-клітин, коли Т- клітини відділяли від Т-регуляторних клітин у трансвелі. Не обмежуючись конкретною теорією, супресорна активність Т-регуляторних клітин залежала від міжклітинного контакту і не була опосередкована секретованими цитокінами або іншими факторами. На підтримання цієї точки зору, включення антитіла до 1-10 (клон УЕ55-2А5) у звичайну культуральну ямку не впливало на супресорну активність або В5В-індукованих, або ТОЕ-р-індукованих Т-регуляторних клітин

Зо (фіг. 58). Додавання антитіла до ТОЕ-В81011 також не здійснювало впливу на супресорну активність В5В-індукованих Т-регуляторних клітин, незважаючи на те, що воно частково знижувало супресію ТОЕ-В-індукованими Т-регуляторними клітинами (фіг. 58).

Приклад 6

В5В направляє диференціацію Т-клітин ОТ-ІІ в антигенспецифічні Т-регуляторні клітини

Оскільки виявлено, що біфункціональний злитий білок, що містить СОв8Ома і | Ас-3 (858), який зшиває СТІ А-4 з ТОК (через МНСЇІЇ), може індукувати утворення Еохр3-Т-регуляторних клітин в алогенній МІК, досліджували потенціал В5В викликати утворення антигенспецифічних

Т-регуляторних клітин. Щоб досліджувати це припущення, наївні Т-клітини ОТ-ІЇ виділяли у трансгенних мишей, що несуть трансгени, які кодують ТОК (а- і ВД-субодиниці), специфічний до пептиду овальбуміну курки (323-339) (Вагпаеп еї аї., 1998), і змішували із сингенними АРС у присутності Омазгз-зз3. Після 5 діб культивування, значно більш високі кількості ЕРохр3-Т- регуляторних клітин виявляли в Т-клітинах ОТ-ІЇЇ, які обробляли з використанням В5В (фіг. 4А, середній лівий графію), ніж з використанням контролю тідс (фіг. 4А, верхній лівий графік) або за допомогою СТІ А-41Ід (дані не представлені). Цю індукцію Т-регуляторних клітин інгібували за допомогою включення антитіла проти ТОЕ-В у культури (фіг. 4А, нижній лівий графію). Не обмежуючись конкретною теорією, диференціацію опосередковував ендогенно продукований тТанв-В аутокринним або паракринним чином. Відбувалося зниження рівнів 1-2, і при цьому відбувалося підвищення рівнів І -10 ії ТОЕ-В у середовищах оброблених В5В клітин (фіг. 4А, праві графіки).

Для здійснення моніторингу проліферативної активності індукованих Т-регуляторних клітин, клітини ОТ-ІЇ попередньо навантажували флуоресцентною міткою, СЕБЕ. Як показано на фіг. 48, В5В-індуковані Рохр3"Т-регуляторні клітини визначали як проліферативні, якщо на це вказувало ослаблення сигналу СЕБЕ. Як очікували, додавання СТІ А-4Ід, костимуляторного інгібітору, знижувало Т-клітинну проліферацію. Таким чином, В5В здатний інгібувати Т-клітинну активацію і індукувати утворення Т-регуляторних клітин як в алогенній МІК, так ії в антигенспецифічному оточенні.

Приклад 7

Індукція Т-регуляторних клітин з використанням В5В може викликати ослаблення шляху передачі сигналу АКТ/ПТОК

У нещодавніх повідомленнях зазначено, що шляхи передачі сигналу АКТ і ттТоОК грають важливі ролі у визначенні долі Т-клітини. Присутність конститутивно активного АКТ у Т-клітинах ослабляє диференціацію Т-регуляторних клітин залежним від рапаміцину чином (Нахйіпавіо еї а!., 2008), вказуючи на те, що шляхи передачі сигналу АКТ і тТОК перетинаються для того, щоб впливати на долю Т-регуляторної клітини. Крім того, Т-клітини з дефіцитом по тток, диференціюються в Т-регуляторні клітини легше, ніж нормальні контрольні Т-клітини (ОєІдоНе еї аі. (2009), Іттипйу, 30:832-844). Також повідомляли про обов'язкову роль коінгібіторних молекул РО-1/РО-Ї1 у контролі розвитку адаптивних Т-регуляторних клітин за допомогою антагоністичної дії на АКТ/ПТОК (Егапсівсо еї аї. (2009), 9. Ехр. Мей. 206:3015-3029). Для того, щоб визначити, чи залучені ці шляхи також у В5В-опосередковану індукцію Т-регуляторних клітин, антитіла проти СОЗ і проти СО28 іммобілізували разом з В5В, тідс;і або РО-11 на 96- ямкових планшетах, у яких висівали наївні Т-клітини. Через вісімнадцять годин після активації клітини забарвлювали флуоресцентно міченими антитілами проти фосфорилованих АКТ і тТОоК і аналізували за допомогою проточної цитометрії. Фосфорилування як АКТ, так і ттОокК ослабляли за допомогою спільної іммобілізації ВеВ і РО-Ї1 (фіг. 6) Не обмежуючись конкретною теорією, події передачі сигналу, опосередковані СТІ А-4 і інгібіторними молекулами

РО-Ї71, можуть сходитися в деякій точці на шляху передачі сигналу АКТ/тптТОК під час Т- клітинної активації для регулювання диференціації Т-регуляторних клітин.

Приклад 8

Вплив 858 підтримує експресію Рохр3: в індукованих Т-регуляторних клітинах.

Індуковані іп міго Т-регуляторні клітини, на відміну від повністю комітованих природних Т- регуляторних клітин, за повідомленнями, менш стабільні і можуть втрачати експресію Бохр3- після продовження культивування за відсутності початкового індуктора (наприклад, ТОЕ-ДВ або ретиноєва кислота) (ЗеїЇмагаї апа Сеїдег (2007), 9. Іттипої. 178:7667-7677). У даному дослідженні, В5В-індуковані Т-регуляторні клітини показували схожу нестабільність, причому деякі клітини втрачали експресію Рохр3 після повторення культивування (фіг. 7). Для того, щоб тестувати, чи може повторна стимуляція за допомогою В5В продовжувати експресію Еохр3, Т- регуляторні клітини спочатку індукували за допомогою покривання 96б-ямкових планшетів антитілами проти СОЗ/проти СО28 і В5В. Потім очищені Т-регуляторні клітини піддавали

Зо додатковому раунду культивування в присутності або за відсутності В5В. Повторна стимуляція очищених Т-регуляторних клітин з використанням В5В робила можливим підтримання великої популяції (193 95 від усіх Т-регуляторних клітин) Бохр3"Т-регуляторних клітин (фіг. 7, нижній правий графік), у порівнянні з «40 95 експресією Еохр3 у відповідь на контрольне да (фіг. 7, верхній правий графік).

Приклад 9

Фармакокінетика В5В у мишей

Перед тестуванням терапевтичної корисності В5В у тваринних моделях аутоіїмунних захворювань, визначали його фармакокінетичний профіль, щоб допомогти розробити режим дозування іп мімо. Інтраперитонеальна ін'єкція В5В мишам С57ВІ/б вела до росту, що піддається вимірюванню, циркулюючих рівнів з наступним швидким кліренсом і оціненим часом напівжиття в плазмі (М|/2) 12 год. (фіг. А). Цей профіль не очікували, оскільки фармакокінетика

Ес-вмісних злитих білків або антитіл типово є більш пролонгованою. Оскільки зв'язування антитіл з неонатальним Ес-рецептором (ЕсКп) у першу чергу відповідає за пролонговані часи напівжиття (Коорепіап апа Акіїезп, 2007), порівнювали відносні здатності В5В і контрольного

Ідсі2а миші зв'язуватися з ЕсКп. На фіг. 88 показано, що характеристики зв'язування обох білків з БсКп є дуже схожими, що вказує на те, що дефект зв'язування В5В з ЕсКп малоймовірно є причиною його швидкого кліренсу з циркуляції.

Інше можливе пояснення швидкого кліренсу В5В може полягати в його накопиченні не на клітинах-мішенях за рахунок вуглеводних рецепторів. Приклади таких рецепторів включають асіалоглікопротеїновий рецептор (АБОРК) на гепатоцитах (Ууеїде!, 1994) ії манозний рецептор на макрофагах і клітинах ендотелію ретикулоендотеліальної системи (Ропіоу; еї аї., 1992).

Аналіз В5В з використанням сервера МеїМОїус дозволяє передбачати, що він має потенціал нести аж до 10 аспарагінзв'язаних олігосахаридних бічних ланцюгів на одному мономері (фіг. 9).

Аналіз моносахаридного складу показав, що В5В містив приблизно 37 залишків манози, і всі прогнозовані аспарагінзв'язані ділянки глікозилування могли бути використані, оскільки кожний з цих аспарагінзв'язаних олігосахаридних гліканів містить структуру кор-маноза з трьома залишками манози (всього 30 залишків манози). Крім того, також може існувати невелика кількість олігосахаридів з високим вмістом манози для того, щоб врахувати додаткові залишки манози. У дійсності, значні кількості недосіалованих три- і тетра-антенних аспарагінзв'язаних, а також деякі олігосахариди з високим вмістом манози ідентифікували за допомогою мас- спектрометрії перметильованих гліканів, звільнених з білка.

Це передбачення також знаходиться у відповідності з молекулярною масою В5В 100 кДа, як показано за допомогою аналізу 5ЗО5-РАСЕ, на противагу обчисленій масі В5В 80 кДа.

Додаткова присутність олігосахаридів додавала внесок у різницю (20 кДа) у молекулярній мавсі.

Крім того, В5В демонстрував відношення сіалових кислот до галактози, що дорівнює 0,68 (фіг. 9), указуючи на те, що глікани сіаловані не повністю. Не обмежуючись конкретною теорією, вуглевод-опосередкований кліренс В5В за допомогою АБОРК додавав внесок у його швидкий кліренс із циркуляції.

Приклад 10

Короткий курс лікування з використанням В5В затримував початок аутоїмунного діабету у

МОЮО-мишей

Оскільки ЕСзо В5В 5 для індукції Т-регуляторних клітин іп міго оцінювали рівним приблизно 100 нМ, а його час напівжиття в циркуляції був коротким (Її «12 год.), В56В тестували у МОЮ- мишей у рамках парадигми пізньої профілактики. МОЮО-мишам вводили В5В через короткі інтервали (через день протягом 4 тижнів), коли вони були у віці між 9 і 12 тижнями. У цьому віці, аутореактивні Т-клітини і інсуліт уже помітні, але миші ще не розвили маніфестний діабет. Як показано на фіг. 10А, МОЮО-миші, яких лікували протягом 2 тижнів з використанням В5В, демонстрували помірне, але статистично значиме підвищення (2595) числа РЕохр3-Т- регуляторних клітин у крові в порівнянні з контролями, яких лікували фізіологічним розчином.

Однак це підвищення Т-регуляторних клітин було тимчасовим, оскільки різницю в числі Т- регуляторних клітин після 4 тижнів лікування або в більш пізні моменти часу знайти було не можливо. Схоже тимчасове збільшення Т-регуляторних клітин у лімфоїдних органах відзначали раніше після лікування МОЮ-мишей антитілом проти СОЗ (Мівпіо еї аї., 2010). Не обмежуючись конкретною теорією, В5зВ-індуковані Т-регуляторні клітини можуть повертатися в стан Рохр3-Т- клітин після припинення лікування. Також може відбуватися їх рекрутування конкретними тканинами-мішенями (наприклад, підшлунковою залозою) для того, щоб виконувати свою функцію. У будь-якому випадку, цей короткий курс лікування з використанням В5В у рамках парадигми пізнього профілактичного лікування, схоже, помірно затримував початок

Зо захворювання і знижував число мишей, що демонструють явний Т10 (фіг. 108).

Відзначена помірна відповідь може бути обумовлена присутністю активного інсуліту у МОЮ- мишей у віці У тижнів перед початком терапії. Показано, що запальне оточення сприяє перетворенню активуючих Т-клітин у ТП17-клітини і пригнічує їх перетворення в Т-регуляторні клітини. Також показано, що запальні цитокіни, такі як 1-6 або ІІ-4, інгібують перетворення Т- регуляторних клітин і сприяють втраті експресії охр3" у Т-регуляторних клітинах (Сагено еї аї., 2010; Кабзіпег еї аї., 2010; Коепеп еї аї., 2008). Для того, щоб обійти ці проблеми, МОО-мишей лікували, починаючи з більш раннього віку (вік 4 тижні) перед явною індукцією аутореактивних

Т-клітин і інсуліту. СТІ А-4Ід також включали як позитивний контроль у цьому дослідженні, оскільки Вісевіопе і колеги (І епзспом еї аіІ., 1995) продемонстрували ефекти від використання цього засобу в цій моделі; тідс2а використовували як негативний контроль на доповнення до фізіологічного розчину. На відміну від результатів на більш дорослих мишах (фіг. 10А), число

Еохр3"Т-регуляторних клітин у периферичній крові більш молодих МОЮ-мишей, яких лікували протягом 2 тижнів з використанням В5В, не зростало в порівнянні введеним фізіологічним розчином або тіда (фіг. 11А). Не обмежуючись конкретною теорією, це може бути обумовлене тим, що число аутореактивних Т-клітин у МОО-мишей у віці 4 тижнів (на відміну від мишей у віці 9-12 тижнів, яких використовували в більш ранньому дослідженні) було дуже низьким. Число індукованих антигенспецифічних Т-регуляторних клітин, імовірно, занадто мале, щоб реєструвати за межами базальних рівнів, присутніх у тварин. Значно більш низьку захворюваність Т1О відзначали у МОЮО-мишей, яким вводили В5В, у порівнянні з контролями, яких лікували фізіологічним розчином, до віку в 24 тижні (фіг. 118). Однак цей ефект зменшувався в більш пізні моменти часу.

Відповідно до повідомлення про МОО-мишей, яким вводили СТІ А-419д (Заіотоп еї а!., 2000), рівні Т-регуляторних клітин у крові (фіг. 11А) значно знижувалися, передбачувано через ефекти

СТІ А-41д, що діють на передачу сигналу СО28/87 (Тапо еї а!., 2003). Лікування з використанням

СТІ А-4Ід також підсилювало захворювання, причому миші демонстрували більш ранній початок захворювання (фіг. 118) і більш високу пенетрантність захворювання в порівнянні з контролями, яких лікували фізіологічним розчином і тідсі (фіг. 118). Причина невідповідності між цим знахідками і тим, про що повідомляли Вінезіопе і колеги (І еп5спомуу еї аї., 1995), не ясна, але може бути обумовлена відмінностями у використовуваних СТІ А-4Ід або застосовуваному 60 режимі дозування. У даних дослідженнях використовували дозу СТІ А-4Їд людини 10 мг/кг

(Огепсіа) замість СТІ А-4Ід. миші 2,5 мг/кг, яку використовували Віцпевіопе і колеги. Крім того, лікування з використанням В5В не продовжували більше 7 тижнів. Не обмежуючись конкретною теорією, використання більш високої дози СТІ А-44 давало більш повне блокування костимуляторного сигналу, необхідного для гомеостазу Т-регуляторних клітин.

Приклад 11

Більш тривалий курс лікування з використанням В58В значно затримував початок і знижував захворюваність аутоїмунним діабетом у МОО-мишей

Можливі причини спостережуваного помірного ефекту В58В при звертанні до захворювання у

МОЮ-мишей у більш ранніх дослідженнях включають проведення відносно короткого курсу лікування, помірну здатність В5В індукувати утворення Т-регуляторних клітин (ЕС5о»100 НМ) і короткий час напівжиття в циркуляції В5В, що могло обмежувати його експозицію. Оскільки здатність В5В і час напівжиття в циркуляції властиві молекулі і, отже, не піддані швидкій зміні, тестували більш тривалий курс лікування. З цією метою МОЮО-мишей лікували з використанням

В5В протягом 10 тижнів замість 4 тижнів, починаючи, коли миші були у віці 4 тижнів. Як показано на фіг. 12А, МОЮО-миші, яких лікували протягом 10 тижнів з використанням В5В, виявляли значне затримання початку Т10. Важливо, що у віці 35 тижнів тільки «13 95 МОЮО-мишей, яких лікували з використанням В5В, розвивали Т10 у порівнянні з більше ніж 70 95 у контролях, яких лікували фізіологічним розчином. Таким чином, тривале лікування МОЮО-мишей з використанням В5В, схоже, захищало тварин від розвитку аутоїмунного діабету.

У завершенні дослідження (коли миші були у віці 35 тижнів), тварин умертвляли, і їх підшлункові залози брали для гістопатологічного аналізу. Суміжні серійні зрізи забарвлювали

НаУЕ для загальної оцінки острівців, вивчали з використанням антитіла проти інсуліну для виявлення присутності інсуліну в В-клітинах, і виконували подвійне забарвлення антитілами проти СОЗ і проти Еохр3 для визначення місця розташування Т-клітин і Т-регуляторних клітин.

Через генетичну гетерогенність МОЮО-мишей невелике число тварин, яких не лікували, не розвивало захворювання у віці 35 тижнів. Аналіз острівців цих тварин без діабету (з групи, яку лікували фізіологічним розчином) показав, що р-клітини були інтактними без очевидних свідчень лімфоцитарної інфільтрації або інсуліту (фіг. 128, зображення а-с). Декілька Еохр3-Т- регуляторних клітин були присутні в острівцях цих мишей (стрілки на зображенні с). На відміну

Зо від цього, острівці від МОЮ-мишей з діабетом (з групи, яку лікували фізіологічним розчином) виявляли присутність інвазивного інсуліту (фіг. 128, зображення 4) і повне руйнування ВД-клітин (зображення е). На доповнення до СОЗ-Т-клітин і Гохр3"Т-регуляторних клітин, також видно велике число не-Т-клітинних лімфоцитів (фіг. 128, зображення й). Схожі гістопатологічні знахідки відзначали у відповідних мишей, яких лікували В5В, які залишалися не хворими наприкінці дослідження або які розвивали Т10 під час дослідження. Цікаво, що в «50 95 острівців МОЮ- мишей, яких лікували з використанням В5В, які залишалися без діабету, відзначали свідчення періїнсуліту (фіг. 128, зображення 9); однак, В-клітини були добре збережені (фіг. 128, зображення ПІ). Забарвлення антитілами вказувало, що клітини на периферії острівців містять у першу чергу СОЗ3-Т-клітини і Т-регуляторні клітини (фіг. 128, зображення і). Збільшення фрагмента зображення (червоний квадрат на фіг. 128, зображення Її) ясно показує присутність множини Еохр3-Т-регуляторних клітин (жовті стрілки на фіг. 12В, зображення |), які перемішані з не Рохр3", але СОЗ3-Т-клітинами (стрілки з чорними наконечниками на фіг. 12В, зображення |), а також не-Т-клітинних моноцитів (блакитні ядра). Розвиток періїнсуліту відзначали у молодих (вік 4-10 тижнів) МОЮ-мишей (Апдегзоп апа Віцебзіопе, 2005) і у більш дорослих мишей, яких лікували іншими ефективними терапевтичними засобами, які затримували або звертали новий початок Т1О у МОО-мишей (Спагепоцоа еї а!., 1994; Вапієї! еї аї!., 2011; бітоп еї а!., 2008; Мегдапі еї а, 2010). Таким чином, більш тривалий курс лікування МОЮО-мишей з використанням В5В захищав тварин від розвитку інвазивного інсуліту і явного Т1О0. Не обмежуючись конкретною теорією, це опосередковано, щонайменше частково, де помо і можливо іп 5йи індукцією специфічних до антигенів острівців Т-регуляторних клітин.

Зшивання СТІ А-4 і ТСК через МНЄОЇІЇ з використанням нового біспецифічного злитого білка (8583 ефективно індукували утворення антигенспецифічних Т-регуляторних клітин, а також протизапальних цитокінів, І/-10 ї ТавБ-В. Попередні дослідження показували, що Т-регуляторні клітини мають ключове значення для формування імунологічної толерантності і що антигенспецифічні Т-регуляторні клітини більш ефективні у тваринних моделях аутоімунних захворювань. В5В додатково оцінювали у тваринних моделях аутоіїмунних захворювань, таких як Т1О0. Не обмежуючись конкретною теорією, передбачали, що, якщо В5В сприяв індукції антигенспецифічних Т-регуляторних клітин під час ранньої фази активації аутореактивних Т- клітин у МОО-мишей, він може затримувати початок або зупиняти прогресування захворювання за допомогою перетворення аутореактивних Т-клітин, що піддаються активації, у Т-регуляторні клітини.

Незважаючи на те, що В5В виявляє помірну силу (через його помірну афінність до МНС! і

ТС) і короткий час напівжиття в циркуляції (який обмежував його експозицію), короткий курс лікування відтворювано затримував початок Т1О0 у МОО-мишей, яких лікували в ранньому віці (у віці 4-6 тижнів) і коли вони були старше (вік 9-12 тижнів). Однак, спостережувані ефекти були помірними і непостійними. Більш тривалий курс лікування (10 тижнів) МОО-мишей (У віці між 4 і 13 тижнями) з використанням В5В значно затримував початок захворювання і захворюваність тварин, що розвивають Т10. Не обмежуючись конкретною теорією, цей ефект забезпечувало утворення індукованих Т-регуляторних клітин де помо, що або утворювалися локально (наприклад, у підшлунковій залозі або дренуючих підшлункову залозу лімфатичних вузлах), або віддалено, які потім піддавалися рекрутуванню в підшлунковій залозі для захисту острівців від руйнування за допомогою аутореактивних Т-клітин і інших не-Т-клітинних лейкоцитів.

Імуногістохімічне забарвлення зрізів тканин підшлункової залози мишей у віці 35 тижнів, яких лікували з використанням В5В і які залишалися без діабету, ясно вказувало на підвищення числа Еохр3"Т-регуляторних клітин на периферії острівців. Візуально вони виглядали як такі, що запобігають входженню СОЗ3-Т-клітин і не-Т-клітинних лімфоцитів в острівці. Цей феномен спостерігали в --50 95 острівців МОЮ-мишей, яких лікували з використанням В5В і які залишалися без діабету наприкінці дослідження, і в жодному з острівців тварин з діабетом у контрольній групі. Острівці декількох мишей без діабету в контрольній групі залишалися без лімфоцитарної інфільтрації і без інсуліту. Відомо, що через генетичну гетерогенність МОЮ- мишей, деякі тварини в групі цього розміру ніколи не розвивали діабет у межах цього часового інтервалу. У інших «50 95 тварин без діабету в групі, яку лікували з використанням В5В, острівці також не мали лімфоцитарної інфільтрації і інсуліту. Можливості для нехворого стану цих мишей включають лікування з використанням В58В і генетичні передумови.

Відповідно до гістопатологічних знахідок, невелике, але статистично значиме підвищення числа Бохр3"Т-регуляторних клітин виявляли в крові тварин, яких лікували з використанням В5В (лікували у віці 9-12 тижнів), у порівнянні з контролями, яких не лікували. Це збільшення не виражене у мишей, яких починали лікувати в більш ранньому віці (у віці 4 тижнів). Не

Зо обмежуючись конкретною теорією, це може бути обумовлене тим, що більше аутореактивних Т- клітин піддавалося активації у віці 9 тижнів, ніж у віці 4 тижнів. Низькі рівні аутореактивних Т- клітин у мишей у віці 4 тижнів могли перешкоджати виявленню індукованих Т-регуляторних клітин після цього в існуючому середовищі Т-регуляторних клітин. У природі підвищення Т- регуляторних клітин також носить тимчасовий характер. Як схоже спостереження у тварин, яких піддавали терапії антитілами проти СОЗ (Мібпіо еї аїЇ., 2010), відзначено, що, можливо, індуковані Т-регуляторні клітини були нестабільні і втрачали експресію Рохр3. Більш імовірно, що відбувався рекрутинг Т-регуляторних клітин з циркуляції в уражені тканини-мішені. На відміну від цього, МОЮ-миші, яких лікували з використанням СТІ А-4Ід, виявляли значне зниження числа циркулюючих Т-регуляторних клітин. Лікування також погіршувало захворювання, про що свідчить прискорений початок захворювання і більш висока захворюваність тварин, які демонструють явне захворювання. Це відповідає попереднім повідомленням, у яких показано, що костимуляторний шлях залучений у гомеостаз Т- регуляторних клітин і що відсутність костимуляції знижує утворення Т-регуляторних клітин.

Блокування або нокаут СО8О або СО86 у МОЮО-мишей також веде до більш раннього початку

Т10 (Заіотоп єї аї., 2000; Тапа єї аї., 2003).

Виникнення періїнсуліту типово спостерігають у підшлунковій залозі МОЮО-мишей у віці між 4 і 9 тижнями. Без контролю виникає інвазивний інсуліт, що веде до повного руйнування ВД-клітин і розвитку маніфестного діабету у віці між 12 і 35 тижнями. Підшлункові залози МОЮО-мишей без діабету, яких лікували протягом 10 тижнів з використанням В5В і аналізували у віці 35 тижнів, демонстрували свідчення періїнсуліту, що здавався припиненим у своєму розвитку. Не відзначали ніяких указань на інвазивний інсуліт або надмірне руйнування інсулінпродукуючих |В- клітин. Мають місце інші повідомлення про різні терапевтичні втручання, які аналогічним чином затримували або запобігали захворюванню у МОЮО-мишей (Зпода еї аї., 2005). Тут результати найбільш близькі до тих, про які повідомляли Іі ее еї аї. (2010), які показали, що перенесення діабетогенних СО4-С0258002.5 Т-клітин, збіднених СО4-С025:Т-регуляторними клітинами, самкам МОБ/5СІЮ-мишей прискорював розвиток інвазивного інсуліту в порівнянні з мишами, яким вводили всі СО4-Т-клітини, що містять СО4-С0025-Т-регуляторні клітини. При інвазивному інсуліті головним чином переважає інфільтрація дендритних клітин (ОС), а не ВОС2.5 Т-клітин рег зе. На основі свого дослідження автори передбачали, що Т-регуляторні клітини регулювали бо інвазивність ОС в острівці за допомогою модулювання, щонайменше частково, хемотаксису ОС у відповідь на хемокіни ССІ 19 ї ССІ 21, секретовані острівцями. Патерни імуногістохімічного забарвлення для Рохр3"Т-регуляторних клітин, СОЗ-Т-клітин і не-Т-клітинних лейкоцитів, відзначені в зрізах підшлункової залози МОЮ-мишей без діабету, яких лікували з використанням

В5В, знаходяться у відповідності з їх знахідками (фіг. 128). Не обмежуючись конкретною теорією, Т-регуляторні клітини, утворені МОО-мишами у відповідь на В5В, ймовірно сприяють зупиненню міграції аутореактивних Т-клітин і не-Г-клітинних лімфоцитів в острівці. Більш тривалий курс лікування з використанням В5В більш ефективний, оскільки це створює більш надійну і постійну індукцію Т-регуляторних клітин. Ця безупинна стимуляція індукованих Т- регуляторних клітин з використанням В58В у клітинних культурах, що продовжувала експресію

Еохр3: у Т-регуляторних клітинах, підтримує цю точку зору (Каптап еї а!., 2012).

Клітинна терапія з використанням свіжовиділених, розмножених ех мімо або індукованих іп міо Т-регуляторних клітин у тваринних моделях аутоїмунних захворювань або трансплантатів органів показала, що адаптивне перенесення Т-регуляторних клітин може відновлювати баланс

Т-регуляторних клітин відносно ефекторних Т-клітин, тим самим контролюючи бурхливу аутоїмунну реакцію, асоційовану з цими захворюваннями (АїЇап еї аї., 2008; Лапод еї а!., 2006;

Кіеу еї аїЇ, 2009; Тапд еї аїЇ.,, 2012). Однак використання адаптивного перенесення як терапевтичної стратегії представляє деякі складності, пов'язані з перенесенням у клініку. По- перше, число аутологічних Т-регуляторних клітин, які можна виділяти з периферичної крові суб'єкта-людини, обмежене. Таким чином, часто необхідне екстенсивне розмноження Т- регуляторних клітин ех мімо, що може змінювати їх функціональність і чистоту. По-друге, оскільки виділені Т-регуляторні клітини є поліклональними, вони можуть виявляти функцію пригнічення всього імунітету на нецільових ефекторних Т-клітинах. По-третє, що найбільш важливо, пластичність Т-регуляторних клітин являє собою значну проблему (Вісевіопе еї аї., 2009; 7пои еї аїІ.,, 2009а). Показано, що адаптивно переносимі Т-регуляторні клітини можуть втрачати експресію Рохр3 і повторно диференціюватися в клітини ТА17 (Коепеп еї а!., 2008) або патогенні Т-клітини пам'яті (2пои еї аїЇ., 20095), що підвищує ризик погіршення аутоімунної реакції або запалення. Отже, терапевтичний засіб, що ініціює утворення Т-регуляторних клітин антигенспецифічним чином іп 5йи, є більш сприятливим, ніж адаптивна клітинна терапія Т- регуляторними клітинами. Результати, представлені в даному документі, демонструють

Зо корисність і ефективність такого засобу (858), що зшиває СТІ А-4 з МНЄСЇЇ у контексті моделі

Т10 на мишах. Комбінована демонстрація утворення ІЇ/-10, ТаБР-В ї Т-регуляторних клітин у відповідь на лікування з використанням В5В, а також ефективність у моделі Т1О на МОО-мишах, має потенціал надати нову терапевтичну концепцію. В5В також пропонує додаткові переваги в порівнянні з іншими імуномодуляторами в тому відношенні, що він не впливає на спочиваючі Т- клітини або інші лімфоцити. Кількості і процентні частки СО4-Т-клітини і СО19-В-клітин на периферії залишаються тими ж у всіх дослідженнях МОЮ, які проводили автори даного винаходу. Не обмежуючись конкретною теорією, цей підхід ефективний для затримання або зупинення прогресування захворювання. Розробка варіантів В5В, які більш ефективні і які мають більш сприятливий фармакокінетичний профіль, повинна підтвердити ці дослідження.

Таким чином, цю концепцію також можна застосовувати відносно керування іншими імунно- опосередкованими захворюваннями.

Результати, наведені в даному документі, одержували з використанням наступних способів і матеріалів, якщо не зазначене інше.

Тварини. Самок дикого типу С57ВІ/6 (Н-25), ВАЇ В/с: (Н-29), трансгенних мишей ОТ-Ї, експресуючих а-ланцюг і В-ланцюг Т-клітинного рецептора миші, специфічного до овальбуміну курки 323-339(Омазгз-зз93 на генетичному фоні С57ВІ/6, і самок не страждаючим ожирінням (МОЛІ) мишей з діабетом придбавали в Те Часкбзоп І арогаїогу. Тварин утримували на об'єкті, що не містить патогенів, а дослідження проводили відповідно до посібників, випущених

ЦО.5. Оераптепі ої Неайй апа Нитап зЗегмісе5 (публікація МІН Мо 86-23) і Сеплуте"5 Іпзійшіопаї!

Апітаї! Саге апа Обе соттіНев.

Антитіла і реактиви. Антитіла проти СОЗ миші функціональної марки або флуоресцентно мічені (клон 145-2С11), СО25, інсулін і антитіла БГохр3- придбавали в еВіозсіеєпсе або ВО

Віозсіеєпсе5. СТІ А-4-Рс миші і СТІ А-4Іуд людини (Огепсіа) придбавали в КУО Зузіетв, Іпс. і

ВгізіоІ-Муег5 5ацірь, відповідно. Ізотипічний контроль (дСб2а миші одержували в Віохсеїї Іпс.

СЕЗЕ, ембріональну телячу сироватку з ультранизьким вмістом Ід (ЕВ5) і інші середовища для клітинних культур одержували з Іпмігодеп. Пептид Омазгз-зза курки одержували з Мем/ Епдіапа

Рерійде.

Конструювання й одержання біспецифічного злитого білка В5В. Конструювання й експресія біспецифічного злитого білка (858), що містить позаклітинні домени СОв8Ом вва і І АС-3, а також 60 Ес Ідага миші (СОвОма-І АС-3-Ес, В5В), були описані раніше (Кагтагп еї аї., 2012).

Аналізи Віасоге і аналіз моносахаридного складу. Віасоге використовували для порівняння зв'язування В5В і тідс2а з неонатальним Ес-рецептором миші (РсоКп). У короткому викладі, на чипі СМ5 іммобілізували «1430 КО ЕсКп-НРСЯ4 миші з використанням хімічної реакції з амінами.

Кожен зразок серійно розводили 1:2 до кінцевих концентрацій від 200 до 6,25 нМ у РВ5Р (РВЗ з 0,005 95 поверхнево-активною речовиною Р-20), рН 6,0, і впорскували на З хв. двічі, з подальшим промиванням протягом З хв. у буфері для дисоціації. Поверхню регенерували 10

ММ боратом натрію і 1М Масі, рН 8,5. Моносахаридний склад вуглеводів В5В аналізували відповідно до протоколу, описаного авторами 2пои еї аї. (2пои еї аї., 2011).

Виділення наївних Т-клітин. Наївні Т-клітини із селезінки і лімфатичних вузлів старих самок

ВАЇ В/с або мишей ОТ-Ї у віці 8-12 тижнів очищали за допомогою магнітного розділення з наступним активованим флуоресценцією сортуванням клітин. Спочатку проводили негативний відбір клітин за допомогою магнітного розділення клітин (Мікепуї Віоїтесі) і потім сортували як срасбр2гб5 сова "СОддіом клітини до чистоти більше 98 95.

Аналіз антигенспецифічної індукції Т-регуляторних клітин. Аналіз в оточенні алогенної МІК здійснювали, як попередньо повідомлялося (Кагтап еї аї!., 2012). Для антигенспецифічної Т- клітинної активації 105 наївних Т-клітин ОТ-ІІ змішували в круглодонних 96-ямкових планшетах з 105 опромінених сингенних АРС у присутності Омазгз-зго з концентрацією розчинного антитіла проти СО28 0,5 мкг/мл і 1 мкг/мл (клон 37.51, еВіозсіепсе). Тестові конструкції, |Ідс2а миші або

СТІ А-4Ід миші додавали в культивовані клітини в насичувальній концентрації 100 мкг/мл.

Клітини культивували протягом 5 діб для індукування утворення Т-регуляторних клітин і аналізували за допомогою проточної цитометрії. Середовища збирали для аналізу ІІ -2, 1-10 і

ТаБР-В з використанням наборів ЕГІБА по інструкціях виробників. Для оцінки Т-клітинної проліферації очищені наївні Т-клітини ОТ-ЇЇ мітили 5 мкМ СЕ5Е протягом 5 хв. при 372С. Потім їх промивали для видалення незв'язаного СЕЗЕ, і використовували в аналізах індукції Т- регуляторних клітин, як описано вище. Клітини культивували протягом 5 діб для того, щоб дозволити їм ділитися перед аналізом за допомогою проточної цитометрії. Для виявлення

Еохр3:" у Т-клітинах забарвлювали поверхневі маркери клітин, як описано вище, з наступною пермеабілізацією з використанням буфера Ріх/Регт (еВіозсіепсе) і забарвлення РЕ-Су?7, кон'югованим з антитілом проти Рохр3 (клон БУК-165, еВіозсієепсе).

Зо Фармакокінетичні вимірювання В5В у мишей. Фармакокінетику В5В визначали у мишей

С57ВИ/6 у віці 8 тижнів. 20 мг/кг В56В вводили мишам за допомогою інтраперитонеальної ін'єкції.

Кров брали за допомогою кровопускання з підшкірної вени через 1, 5, 24, 48 і 72 год. після введення. Рівні В5В у кожен момент часу вимірювали з використанням аналізу ЕГІ5ЗА. У короткому викладі, 96-ямкові планшети покривали 100 мкл (1 мкг/мл) антитіла проти СО80О миші в РВ5 і інкубували протягом ночі при 4 "С. Планшети блокували 5 95 ембріональною телячою сироваткою протягом 1 год., після чого їх промивали 4 рази в РВ5. Потім 100 мкл зразків крові в різних розведеннях додавали в ямки. Планшети інкубували протягом 2 год. при м'якому струшуванні при кімнатній температурі і промивали 4 рази в РВ5. Біотинільоване антитіло проти

ІГАС-3 миші (1 мкг/мл) додавали і інкубували протягом 2 год. Планшети промивали 4 рази в

РВ5, після чого додавали стрептавідин-НЕР. Після 30 хв. планшети промивали 6 разів у РВ5 і проявляли для колориметричного вимірювання. Очищений В58, розведений у розріджувачі для аналізу в різних концентраціях, використовували як стандарти.

Лікування МОЮ мишей з використанням В5В. У короткому курсі лікування самок МОЮО-мишей у віці 4 тижнів лікували фізіологічним розчином, 20 мг/кг В5В, 20 мг/кг Їдс2а миші або 10 мг/кг

СТІ А-4Ід людини (Огепсіа) три рази на тиждень за допомогою інтраперитонеальних ін'єкцій протягом періоду 2,5 тижнів. Для моделі пізньої профілактики МОЮО-мишей у віці 9-12 тижнів лікували фізіологічним розчином або 20 мг/кг В5В, як зазначено вище, протягом 4 тижнів. Для більш тривалого курсу лікування МОЮО-мишей лікували з використанням В5В або фізіологічного розчину, як зазначено вище, протягом 10 тижнів у віці від 4 тижнів до 13 тижнів. Здійснювали моніторинг неголодувальних рівнів глюкози в крові щотижня, починаючи з віку в 8 тижнів.

Мишей вважали хворими з діабетом, коли їх показання глюкози перевищували 300 мг/дл для трьох послідовних показань. Еохр3-Т-регуляторні клітини в периферичній крові досліджували після двох тижнів лікування за допомогою проточної цитометрії. У короткому викладі, 50 мкл цільної крові блокували неміченими антитілами проти ЕсукіІр ії ЕсукІ (клон 93, еВіозсіепсе) протягом 20 хв. Надалі клітини забарвлювали флуоресцентно міченим антитілом проти СО4 протягом 30 хв. і потім промивали. Червоні клітини крові лізували з використанням ЕАСЗ Гузіпа

БоЇшіоп (ВО Віозсіепсе5) протягом 5 хв. Після промивання клітини фіксували, пермеабілізували й забарвлювали ЕРІТС-міченим антитілом проти Рохр3 протягом 30 хв., як описано вище.

Підшлункові залози розрізали навпіл, причому одну половину фіксували в нейтральному буфері бо з формаліном, а іншу поміщали в сполуку ОСТ і потім заморожували на сухому льоду.

Статистичний аналіз. Кумулятивні захворюваності МОЮО-мишей, що демонструють 110 і гіперглікемію після лікування з використанням В5В, або контролів порівнювали з використанням логарифмічного рангового критерію (Кокса-Мантела) у Ргізт 5 (Сгарпрад, місто і штат).

Значення р«е0,05 вважали статистично значимим.

Гістопатологічний аналіз. Підшлункові залози, фіксовані в нейтральному буфері з формаліном, забарвлювали на СО3, ЕРохр3" клітини з використанням автоматизованого процесора. Тканинні зрізи депарафінізували з використанням ксилолу-етанолу, антигени витягали за допомогою інкубації протягом 25 хв. у цитратному буфері і потім блокували сироваткою. Зрізи інкубували з антитілом проти СОЗ протягом 45 хв., за чим йшло антитіло кози проти полімеру кролячої пероксидази хрону протягом 20 хв. Візуалізацію хромогену СОЗ одержували за допомогою інкубації з 3,3'-діамінобензидинтетрагідрохлоридом протягом 2-4 хв.

Для виявлення Еохр3", зрізи повторно блокували сироваткою, з наступною експозицією антитілом проти Бохр3 протягом 45 хв. Потім зрізи інкубували з антитілом кролика проти ІдС щура протягом 30 хв., за чим йшло антитіло кози проти полімеру лужної фосфатази кролика.

Візуалізацію хромогену здійснювали з використанням швидкого червоного (Равзі Кеа) протягом 10 хв. Здійснювали контрастне забарвлення тканинних зрізів з використанням гематоксиліну протягом 2 хв. і промивання З рази в 0,05 95 Тмеєп-20/Ітіз буферному фізіологічному розчині між стадіями. Суміжні серійні зрізи забарвлювали з використанням антитіла проти інсуліну, як описано вище. Фотографії робили за допомогою флуоресцентного мікроскопа Мікоп Есіїрзе

Е800 із прикріпленою цифровою камерою з Оіадповіїс Іпс., і зображення одержували з використанням програмного забезпечення 5рої Адмапсеад.

Послідовності

Позначення

СОвОомвва - ліганд СТІ А-4,

Ідсга-Рс-область Ідсг, с9-спу-9,

Ї ад-3 - ліганд МНС, нб-Нів-6.

ЗЕО ІЮ МО-1:

Зо СТІ А-4 В5В (Сепеї) - СО8Ом8ва миші (а.о.1-235)-ІдДсга(а.о.241-474)-59-Ї аа-З(а.о.25-260)- нб

Нуклеотидна послідовність замінної конструкції миші (Ген 1):

АтТаССсТТаСААТТатсАатТаАТОСАСааАТтТАСАССАСТОСТСААСТТТОСАТОТО

СААДОСОССТСАТТСТТСТСОТІТаТаСсТастаАТТСатсСтТТтсСАСААатаТсСтТТСАаА тат аАТОААСААСТаТССААатСАаТаАААаАТААсаТтАТТаСсТтассттасса

ТТАСААСТСТОСТСАТаАДАСАТОАИТСТаААвАССОААТСТАСТОССАААААСАТ

САСАДАСТОСТО,СсТатТотТатсАТтТасСставОАААСТААААСаТасС,СоСалдатАТ

ААСААССасАСТТТАТАТаАСААСАСТАССТАСТСОТСТТАТСАТСОСТОСОССтТОС

ТОСТТТСАВАССОССВОСаСАСАТАСАССТататСатЕСААААСААасАААСАааАдА

СатАТОААДаИаТТАААСАСТТОаастТтТАСТАААатТатоСАТСАААаСтТалдсттсто

ТАСССССААСАТААСТОДаТСТОСАААСССАТСТаСАСАСАСТААААССАТТАС стесттастРоСсовацзі тоССАААаСсСстТастстсттаттавпААААТОС

ААСАСААТТАССТааСАТСААТАСОАСААТТТСССАСОАТОСТОААТСТОААТТО

ТАСАССАТТАСТАВССААСТАСАТТТСААТАСОАСТСИСААССАСАССАТТААСТ

СТОТСАТРАААТАТаСАаАТОСТоАСИЯататсАаАсаАСТТСАССТООСАОСССА вАаааСССАСААТСААаСССТаТатосСтТоСАТаСАААТаСССАССАССТААССТОТ тасатааАССАТССИТСТТСАТСТТОССТОСАААСАТСААСОСАТаТАСТСАТаА тотобСтТаласСсССАТтТааТСАСАТОТО ТаСТОСТОасСАТтТатадаСсАсОАТОаАС

СсСАаАтТатТоСАвАТСАССТОИ,ТТСИаТтадАСААСатавААатАСТСАСАаСТСАа

АСАСАААСССАТАСАСАСОАТТАСААСАСТАСТСОТОССОЯСОТОвИТСА,сТасСосто

СССАТССАВСАССАСаАСтТасвАтТаАатаасСААдааАаТТСАААТасСсААДаСтТСАА

СААСААДАаСССстТоССАасСассСАТОВАСАСААССАТСТСААААСССАААСССТ

СсАИТААДВДаСТоСАСАССИТАТАТОаТСТТаССТтоСАССАСААД,ААСАСАТОАСТА

АСААДАСАСаТатсАСТСТадссСстТасСсАТОСТСАСАСАСТТСАТаССТадАСАСАТТТ

Ас,7тасАдатавАССААСААСОацвААААСАСАаСтТАААСТАСААСААСАСТОаДА

ССАСаТоСТаОАСТСТаАТаСТТСТТАСТТСАТаТАСАаСАдасСтадаАатасаАА

ААСААСААСстТасатавАААСАААтТАастАстСста|астсА,а тат СсСАСадаса

ТСТасСсАСААТСАССАСАСОАСТААСАа,аСТ ТоТоССааАСТОСОаСОаТАААСасСо атасссасса,азвсАасссаватассатасасСстаааАААсвАаастссСса,атаатат сапасССА,аадсасАасСТоССатТСсСАТСТТСССТасСсАасСсСтТСАААТСССССААС

СстТасАТСОССТААСТТТСТАСВАдАДадОоаА,аасаТтТАТСТаССААСАТСААССАСАС атаасСсСААСССАСТОССАТОССОИаСССТТОАССТТСАССАсСаасАТасСосто аСсСтТАВАСААСССаСАСССасатСасСстТАСАССЬЯТаеаСстТадасатавасСтТоСАсваА сеостаСсасдассасАа,ваСАасссСТасСАТоСССсАСОВЯСТасластасАсадИас ссасстосад,аСсаСсссоааАстотттататсСсасссАастотасСасСАС

СбоАТаССОаОаСаАСТАССАСОаССсАСсСсОЯОтаСасстоССаААсСса,аСа7ассстостос таслаттосасстассассатбааСсСАсСассСтоаАТОАТтТа|астАаатосСсСтТСАса

АСВТОоСТСААдастТ|атстаАат,асатСссСтТттаААСТаСТоСТТСсАаССаТатосСтТад ссаСССАстототаТатаСсАСстТаа г ССАаааССАСЧААССа,вАатассСстТатсСтТАСА

АСТСАССОаСОаТСАТТТТТТАОСТаАААСТТТОСТаТтТАСТаССССААаТтСАаСос сставАСТОТООСОСАССсТеасаастататССтТоАССТАСАЧАСАТаасСтТТСААТОа

ТСТССАТСАСОСТАСААССТСААСИЯтТоТаса7атставАаСССатТАасСССАССАТС

АССАТСАТСАСТаОаА

ЗЕО ІЮ МО2:

СТІ А-4 858 (Ген 1) - СО80м/88а миші (а.о.1-235)-ІДС2а(а.о.241-474)-459-ІЇ ад-3(а.о.25-260)-Нб6

Трансльована білкова послідовність замінної конструкції миші (Ген 1):

МАСМСОЇ МООТРІ ІКЕРСРАСІС ЕМІТІВІ 560ОУ5БОМОЕОЇ 5КЗУКОКМІ І РСВУМ

ЗРНЕОЕБЕОВІММ/ОКНОКУМІ 5МІДОКІ КМАРЕУКМАТІ МОМ ПОЇ МІ ОВО

ТУ5СУМОККЕВО,ТУЕМКНІ АГ МУКІ БІКАОЄ5ТРМІТЕБаМРОЗАОЮТКАІТСЕАБаСЕРК

РВАЕБУ/Л ЕМОВЕЇ РЕІМТТІЗООРЕБЕЇ УТІЗБОЇ ОЕМ АМНТІКСІ ІКМарАНМУЗЕЮО

ЕТМ/ЕРВОРТІКРСОРРСКСРАРМІ ЯССРОМЕТЕРРКІКОМІ МІБ 5ХРМУТСУУУОМУ5Е

ВОРОМОІ5БМ/ЕММММЕМТАОТОТНАЕОММ5ТІ АВУМ5АГ РІОНОВСВУУМ5аТКкКЕРКСКМ

МУКАЇ РАРІЕВТІЗКРКаЗУВАРОМУМІ РРРЕЕЕМТККОМТІ ТСММТОРМРЕОІММЕ

М ТЯІМаКТЕСМУКМТЕРМ О50С5УЕМУ5КІАМЕККМУМУМЕНМЗУЗСЗУУНЕС,І НМ ннТткК5Е5АтТРОаКООВСИВСаааваРИЕКЕЇ РУММ/АОЕСАРУНІ РОБІ КОРМІ ОРМЕ

ГАВаСМІМОнНОРОБООРТРІРАГОСНОСМРУРВОРАРОВУТМІ БМАРОІ Ба

ОРІГНРНМОГЕЕНОГ ОВС, ЕБІЛМУІ АРАЇ АТОАСЕМУНАТМУВІ РМВАЇ 5С5І ВІ МСО

АБМІАБРБОаМІ КІ БОММ І МО5Е5АРОВРУБМНУ ЄОСОМАУРУУМ5РАНЕЇГАЕТЕ

ГР РОМ5Р ОЗСаТтУУасМу Тиврагмивіг МКМ агЕРМАНННННН

ЗЕО ІЮ МОЗ:

СТІ А-4 858 (Ген 2) - СО80му88а миші (а.о.1-235)-59-І ад-3 (а.о.25-260)-Ога (а.о.241-474)

Нуклеотидна послідовність замінної конструкції миші (Ген 2):

Зо

АТО,СТТаСААТТаТСАСТТОАТаСАОсСАТАСАССАСТОСТСААСТТТОСАТОТО

СААСОСТСАТТСТТСТСТТТатастастоАТТСатсТТтсСАСААатТатстТСАСА

ТаттаАТОДАСААСТаТтоСААДаТСАаТОАДААСАТААСИТАТТОСТОССТТаССа

ТТАСААСТСТОСТСАТОДАВАТОаДаИтСстТадАаАСсСОААТСТАСТОаСАААААСАТ вАСАДАСТОИаТастатотатосАаттаставаАААСТААААХ,атаа,сСсасссСсадатАт

ААСААССОаСАСТТТАТАТаАСААСАСТАССТАСТСОТСТТАТСАТОСТОСИаССТОС тТеСТТТсАвдоСОоваасСАСАТАСАасСТа|ататСатТСААААаААасАААаАаСсАА

СсатАТОаААатТтАААСАСТТОаОаСТТтТАСТАААаТттТа|атссСАТСАААастаАсттТстТо

ТАСССССААСАТААСТОДаИтСТапсьЬААСССАТСТОСАСАСАСТААААСОАТТАС стастттастссаоООатТТоССААдасстСОасСтТстСстТОаТТОаААААТОС

ААСАСААТТАССТОССАТСААТАСОАСААТТТСССАСОАТССТаААТСТОААТТО

ТАСАССАТТАаТАаССААСТАСАТТТСААТАСАСТСОСААССАСАССАТТААДСТ

СТСТСАТТАААТАТаВАСАТаСТСАСООТаТтсАсАавАСТТСАССТООСОаСОстТО асассоссао,восатаасоатавассСтаваАААсАаастоосСса,атоататоса ссСАасдаавАдастосСатосСАТСТТСССТаслаСсСтТСАААТСССССААССТОа

САТССТААСТТТСТАСОАдадОапАааОаТтТАТСТООСААСАТСААССАСАСАСТ

СОССААСССАСТОССАТСССОСЯСССТТОАССТТСАССАССавАТОСССТСОаСС

ТАСАСААСССОСАСССОСТСОаСТАСАССЯСЯТОАСТОАОССОЧТОаССТоСАасАСаС стТасаСсАаСОпаАпОсСАОССССтТасСсАТССССАСОСТасСсА,аСстаспдавАасСИасСа есстТоСАассоеСа,вОасАСТІСТСОТСТОатТаваттасСасссАастостасСсасСАССОАТ ссасасСсапАдаТАССАСассАасСса,атасассСстосСаААССасСассстстТосСтТасСА атотосасстаса,7асатовасССсАсассСтоОАтТадттастаатоссСстосАаасаато

СстТСсААда,астатстаАтта,ааватсстТтТаААСстТастосттса,ассатостадссас ссАдатотстатасАстаайТ САС ОасССАвААССаАатасстатсСтТАСААСТО

АССОСОаТСАТТТТТТАОСТОАААСТТТОСТОаТТАСТОССССААДСТСАОаСССССТ вОАстТотТапсАоСствавастТататссСтТСАССТАСАСАСАТОССТТСААТОИаТСТ

ССАТСАСИТАСААССТСААОССТ ТСТОСОЯатсТОосСАасСсСОстТАаСССССАалосо

СССАСААТСААаСССТОаТССТоОСАТаСАААТИаСССАаСАССТААССТСТТОСИТ

СОАССАТССОаТТСТТСАТСТТСССТОСАААСАТСААОСАТатАСТОСАТИаАТСТОС

СстТаАаССССАТааТСАСАТаТОТОИА ТОСТапАТатТОАдаСаАасСАТаАСССАСА татосАОАтсАастаатСОаТаААСААСОсТацвААДатАСТСАСАастоАСаАСАСА

ААСССАТАВАСАСОаАТтТАСААСАатТАСТОТОСЯИк сТаатсАатассстосСсСсСАТ

СсСАаСАССАаапАСтТавАтТалдатаасСААСОАаТ ТсСАААТаСААСатСААСААСА

ААВСССТоССАаСассСсСАТСОАСАСААССАТСТСААААСССАДДасваТтсСАаТтА

АПВА,СТОСАСАСаТАТАТаТСТТаССТоСАССАСААСААСАСАТаАСТААИААА

САВИаТСАСТСТаАССТасСАТаСТСАСАСАСТТСАТаССТаААСАСАТТТАСИатТта

САатТапАССААСААСайаААААСАСАасСТАААСТАСААИААСАСТОААССАИТ

СсСТаОАСТСТОАТОааТТСТТАСТТСАТатТАСАаСАДОаСтТадаАдаТайпААААсСАА вААДАСТОСОаТтТаспйАААвАААтТАасСтТАСТоСсТастоа,а тав сСАС,вАасваатстас

АСААТСАССАСАСОАСТААДОСА,СТТСТоСС,аАСТоСОасатАААТОА

ЗЕО ІЮ МОУ:

СТІ А-4 858 (Ген 2) - СО80м/88а миші (а.о.1-235)-59-ІЇ ад-З(а.о.25-260)-ІДс2а(а.о.241-474)

Трансльована білкова послідовність замінної конструкції миші (Ген 2):

МАСМСОЇ МООТРІКЕРСРАСІС ЕМВ 5ОМ550МОЕОЇ 5К5УКОКМІЇ РОВУ М

ЗРНЕОЕБЕОВІММОКНОКУМІ БМІДОКІ КМАРЕУКМАТІ МОМ ПО МІ ОВО

ТУ5БСММОККЕРОТУЕЄМКНІ АГ УКІ БІКАОЕЗТРМІТЕБОМРУОАОТКАІТСЕАБОСЕРК

РАЕБУ/Л'ЕМОРЕЇГ РОЇМТТІЗООРЕБЕЇ УТІЗБОЇ ОЕМ ТАМНТІКСІКМОАНМУ5ЕЮ гмуусаавасасвайаРОКЕЇ РУММ/АОЕСАРУНІ РОБІ КОРМІ ОРМЕГ АВасатимМо

НОРОБООРТРІРАГОЇ НОСМРОРАВОРАРОВУТМІ БМАРОСІ АБОаРОРІ НРНМОЇ Е

ЕВаГОВарЕ5І МІ АРАЇ ВТОАСЕМНАТУВІ РМВАЇ 5С5І ВІ ВМООАЗМІАБРБЗОаМІ.

КГ5ОМ/М І МС5ЕЗАРОВРУБУНМ РОСОМАМРУУМ5РАНЕГАЕТЕС І РОМ5РІ 05 атуасмМ ТтУвВрагмМм5ІГУМІ КМ агЕРМАРВОРТІКРОРРСКСРАРМІ ЇЇ СОРОМ

ЕРРКІКОМІ МІ ЗРМУТСУУМОУ5ЕВОРОМОЇ ЗМ ЕММММЕМ ТАОТОТНАЕОУМ5Т

ГАММА РІОНОЮУУМ5аКЕРКСКУММКАЇ РАРІЕВТІЗКРКа5УВАРОМУМІ РРРЕЕ

ЕМТККОМТІ ТОМУТОЕМРЕВІУМЕМ ТМЯММОаКТЕМУКМТЕРМІ О5БОСОЗМЕМУ5КІ В

МЕККММ МЕНМЗУ СУМНЕ НЯМННТТК5ЕЗАТРОК

ЗЕО ІЮ МОБ:

Конструкція з нуклеотидною послідовністю дикого типу СТІ А-4 В5В людини - (СО80 людини (а.0.1-234)-29-ІЇ ад-З(а.0.27-262)-ІДс1а(а.о.240-471)

АтапасССАСАСАСавАааСАсавзААСАТСАССАТССААаТатСсСАТАССТСАА тт сот тСАестотоатастаастаатсттсСтсСАСТтотТа|атсСАсвататтТАТС

САСИИТОАССАДССАдатаАААваААд,атааСААдСс,астТа|атостатаа Т САСААТатТ

ТСТатТОАдАпАаСТааСАСАААСТСаСАТСТАСТОССААААааАСААОсААААТ саетастаАСТАТаАТОТСТаСОасСАСАТаААТАТАТОВСССО,АСТАСААВААСС

,ОАССАТСТТТОАТАТСАСТААТААССТСТОСАТТаТОАТОСТООССТСТОСОСОоС

АтТотТадСбадоасйасСАСАТАССЬКТатТаттаттСтаддатТАТЗАААААСЧАСаТсттт

САДИСОССААСАССТОааСТаААаТаАСОТТАТСА,ТСАААаСТОаАСТТСССТАС

АССТАСТАТАТСТаАСТТТОАДААТТСОСААСТТСТААТАТТАСААСОАТААТТТОаСТ

СААССТСТОСАСОИтТТТтТоСАадасстоАсстстосСтоатТТаапААААтТОаАСАда

ААТТАААТаССАТСААСАСААСАаТатТ ТСССААСАТОСТаАААСТОИАДОСТСТАТИС тТаттАаСАССАААСТОСаСАТТТСААТАТОАСААССААССАСАаСсттсАТИаТИТСТОо

АТСААСТАТОСАСАТТТААСАСТаААТСАСАССТТСААСТОСААТАСААССОИС сатвосс,асосаХ,аоссатавссаттосовАаастоАсатоссастоотоатас асссдасдссасвастост|асссСсАасСтсСстТасАасссСсСАСААТОССССТОС

АСОАТСТСАОаССТТСТаСаААаАасСАСаСаТТСАСТТОааСАаСАТСАаССАСАС датоасссассса,астассоссссСаОасССсАТССССТООСССССасассстсАСС сассассаеасостостостовасасссалса7ассссассастАсАСссвсатастала сатаватосссагаасстасасасСс,асаааастасссстаСсАасССсосаТсот ссАдаставАТОДаСсОосооосов,;сАа,асасацвасвАсттстсастАтаастасиас сслдассссесаеасеСс,сАдсоессссасосалстаоса7асессасаватасСсАсстсАсаа слосасоеассстотостасса7асстосатстасасставассСсАвасстосАТОА стассассссссАапАТСТСТСАСАасСсСтТосСадстацсатСсАТТТТаААСТОСТ ссттсАд,ассассстахсасссСа,асстотатасАТтТаатттсовадАСсСсвавас

САсСсоесосссАаатоостатТоСаааАатоссССсСсСАТСАССАСТТАОСООАААасСТТ

ССТСТТоСТасСсСсССААДЯТСАОССССАТаСАСТСТОСОСССТООСВасСтТасАТСС

ТСАССТАСАВАаАТаВСТТСААСатстоСАТСАТаТтТАТААССТСАСТОаТТОтТас атотастаатасосссваоастоСаАасСССАААТСТТИаТОаАСААААСТСАСАСА тасссдоссатасссСсАасСАССтТадлдстостаасвасАсСаТтсАатсттостотт

ССССССААААСССААОСАСАСССТСАТОАТСТОССООАССССтТаАаОТсСАСАТ сота ТООАСОТОАОсССАСОСААаАСсСсСтТОАватСсААОаТТСААСТОСТАС атовдс,аосСсатовАаатТОСАТААТОССААСАСАААаСсСа,аСа,аалааАасАат

АСААСсАаСАСОЯатТАССОТатастоааСа|атостСАССатоСтТасСсАссСАсалстаа

СТадАТОССААСИаДатАСААаТасААайТСстТоСААСАААаСССтТоССАОСССС

САТСОАСААААССАТСТОСАААДОаССАДАасасАасссспАСААССАСАастТат

АСАСССтТаСССССАТСТООСОавАТаАастаАССААВААССАсатсАасстадсс тасстааТсАААаОСТТСтТАТСССАОСОАСАТСОССОЯТОСА,ТОСОАаАССАА тавасАдаССООпАСААСААСТАСААаАССАсасстосса7атастааАСтоСадса аСсТоСТ СТ оСТАТАСАССААасСТСАССатасвйАСААлаАааСА,атааСАасСАС ваСпААСатсТСсТсАТастоСатаАтТасСсАТаАаастстасСАСААССАСТАСАСО

САВААСАС,ССТоТоССТаТатстоСаасасТАААТОаА

ЗЕО ІЮ МО:6:

Трансльована білкова послідовність конструкції з СТІ А-4 В5В людини дикого типу - (СО80 людини (а.0.1-234)-49-Ї ад-З(а.о.27-262)-ІДСсТа(а.о.240-471)

МантАптОатТ5РБКСРУЇ МЕРОМ Аа 5НЕС5амМІНУТКЕМКЕМАТІ БСОЯНМУ5М

ЕЕГАОТАММОКЕККММУІ ТММЗИаОмММІМ/ РЕМКМАТІРОВІТММІ5ІМІГАСАРБЗОЕСТУ

ЕСУМ КУЕКОАРКВЕНІ АЕМТІ 5МКАОЕРТРБІБОРЕІРТОМІАНІСЗТОаСЕРЕРНІ.

ЗУ ЕМСЕЕЇ МАІМТ ТМ5ООРЕТЕЇ МАУ55КІ ОЕММТ ТМНЗЕМСГІКМОа НІ ВММОТЕ

МмучттасасасасвавадЕМРУУМАОЕСАРАОІ РОБРТІР ОБ БІ ВВА,

НОРОБОРРАДАРОНРІ АРаРНРААРБЗБЗМСРАРАНУТМІ БМОаРОСІ В5ОВІ РІГ ОР

ВМОГОЕНОаВКОРаОЕ5І МІ АРАННАВАСЕМУВААМНІ БОГА СВІ ВІ ВІ СОА5МТ

АБРРОБІ ВАБОУМУМІ МСЗЕ5АРОВРАБУНУ РАМА СОСАМРУВЕЗ5РНННІ АЕ5РЇ..

ЕСРОМБРМОБаРУ/СаСІ ТУАОСЕММ5ІМУМСТМ СІ ГМРАОБЕРКЗСОКТНТСРРО

РАРЕГ ССРБЗМЕГ ЕРРКРКОТІ МІЗАВТРЕУТСУММОУЗНЕОРЕУКЕМУМ УМО МЕМН

МАКТКРЕЕЕОУМОТУ ВМ ТМІ НОБУУЛ МаКЕУКСКУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКО

ОРЕЕРОМУТІ РРОВОЄТКМОМ5І ТСІ МКОЕУРБОІАМЕМЕЗБМООРЕМММКТТРРМУ

ГОБООБЕР М5КІ ТМОК5АМОСаММЕЗСЗУМНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І РОК

ЗЕО ІО МО:7:

Нуклеотидна послідовність варіанта 1 конструкції СТІ А-4 В5В людини - (СОВОМУВ4А/5190А людини (а.0.1-234)-29-І ад-38316/75Е(а.о.27-262)-ІДс1ам596/297О(а.0.240-471)

АТаОСОаССАСАСАССОСЯВАИЧИаСАаОспААСАТСАССАТССААСТИаТССАТАССТСАА тптсттсдасттесаста,астаастаа ст ТсТсАСТТСТаттсАсатТаттТАТС

САСИТОАССААДССААДИ,ТаАААаААа ТасСААСсастатостатайТСАСААТОаТ теотТаттаААдадаСТаСАСАААСТСасСАТСТАСТОССААААасАсСААсСААдААТ сеатасСстаАСТАТаАТИаИТСТОсСОСОсСАСАТОААТАТАаСССССаАСТАСААСААСС

СОАССАТСТТТаАТАТСАСТААТААССТСОТОСАТТИТаАТОСТООССТОТОСОСОС

АТСстТОАСадОаСасСАСАТАССЯДОаТатТаттатСсТтаААатАТаАААААаАСа,асттт

СААДССООасСААСАССТаастТаААатаАСатТАТСА,ТСАААДасСтТаАСТТСССТАС

АССТАСТАТАТСТОаАСТТТаАААТТССААСТТСТААТАТТАСААССАТААТТТОаСТ

СААССТСТИаСАССИТ ПТ ТоСАаАасСсСстТСАССТоТОСТОааЙТТайпААААТасСАСАДаИ

ААТТАААТаССАТСААСАСААСАИатТасСССААаАТССТОАААСТаласСтсСтТАТОаС тТаттАасСАаСАААСТасАТТТСААТАТЗАСААССААССАСАаСтТТСАТа,ататсто

АТСААДСТАТаСАСАТТ ТААДОДатаААТСАСАССТТСААСТасСААТАСААССОИаС сагосссассавАасассосатасссеоСссалд,астасатоссаоатаавтата ассСбАдасАасссасстстассСАастсссСтТасСАаССССАСААТОССССТОС

АапАТСТСАСССтТтОтТасСсаААсАаСА,асасТСсАСТТОСАаСАТСАаССАаАС датессссосссоеастассассооСаасССАТОСССТООСССССОаасСсСсСтТСАСС ссессесесостостостававасСсСсАсасСсССсАаСасСтТАСАСватастадоа сетосотосСсасвасасста7асаСсАд,аСсвсазАасастассосстасаа,ассосСса,сСат

СсСсАсСстТапвАТаАлаСОЯСвасСсасоАа,аСса7аСсавасвАстстастАТасста7асас ссАсоссс,аСсоСса,ассаАса,аСсСссаСаАа,атАссосСсассасраваТасСАССТСАССИ слсаеасассстотостасс,асстос,атстеса,7асставассСАаассСстСаАТИаА

СсТасСссАаССССССАССАТСТОТСАа,адасстоСагстаааТ САТ ТТОаААСТОаСсСтТ сстсАдасса,ассСтАсСаСССА,ассттатасСАТТООттсаСААсСавасас

САссассалатсостатСаваАаТССССССАТСАССАСТТАаСОСААдАдастт сстотоСстТасССсСсСААдатсАаСсСсССАТасАСТтьтава;!асосєтааваастасСсАТОС

ТСАССТАСАСАВАТОаСТ ТСААСаТтсТоСАТСАТаТтТАТААССТСАСТОТТСТОС аттастостасссС,асаасСТоСаАаСССАААТСТТатТаАСААААСТСАСАСА

АаСССАССаАаСССАсаСАССТаААСТОСТОСООСОЗАТОСТСАатст остео

ССССССААААСССААСОАСАСССТСАТаАТоТОоССасАсоСсСтТаАааТСАСАТ ссатестоастасдсатаАасССАССОСААаАСССтТаАдайТСсААСТТСААСтаатАс атасздсса,7сстасАс,атТасСАТААТаССААСАСААдАДасСсаса,впсосАасадасАат

АСсСАСАсСсАСсатассататааСАасСатСсТАССатсСстТаСАССАСаАСтТає

СТОААТИССАдОаСАСтТАСААДатасСсААаИаТСТоСААСАААассстоССАасСосс

САТССАСААААССАТСТОСААДАаССАААсСОааСАасссСаАаААССАСАСССИЯТаТт

АСАСССТаСССССАТСТСОВСВАТаАдаСтТаАССААСААССАсаТатсАаасстаАсс тасстТайаТСАААаастстТАТСССАаСОаАСАТСЯССОЯСТОСА,ВТасаАсСАССАА тасвасдасСсапАсСААСААСТАСААЧАССАСс,асстоссатаставАСТоСОаАСО аСсТосСТ СТ оСТАТАСАВСААДаСТСАССИатасАСААдаласСА,аатоаСАасСАс вапААСсатсТСсТсАТаСтТоСатаАТаСАТаАСастоТаСАСААССАСТАСАСО

САВААСАС,ССТоТоССтТаТатстоСацсиаТАААТОаА

ЗЕО ІЮ МО:8:

Трансльована білкова послідовність варіанта 1 конструкції СТІ А-4 В5В людини - й дрмвевтвоА людини (а.о.1-234)-29-І ад-38316/75Е(а.0.27-262)-ІДс1амМм596/297Ф(а.0.240-

МантАВОатТеРБКСОРУЇ МЕРОГ І МАСІ ЗНЕСБОаТМІНУТКЕМКЕМАТІ БСО)ЯНМУМ

ЕЕГАОТВІММОКЕККММУ ТММ5ИаОММІАРЕУКМАТІЕОЇТММІ 5ІМІСАСА!АРБОЕСТУ

ЕСУМІ КУЕКОАРКАВЕНІ АЕМТІ БМКАОЕРТРБІБОБРЕІРТОМІВВИІС5ТЗааЕРЕРНІ.

ЗУМЕМСОЕЕЇ МАІМТ ТМАООРЕТЕЇ МАМ55КІ ОЄММТТУНЗЕМСГІКМОаНІ АУМОТЕ муУчттасаваавававадаЕУРУУМАОЕСАРАОІ РО5РТІРІ О0І БІГ АВАСМТМ

ОНОРОБОРРАДАРОНРІ АРаРНРААРЗБУСРАРЕВУТМІ БМОРОІ ВБаВІ РІО

РЕМОГОЕВНаВОВарЕБІ МІ АВРАВРЕАВАСЕМУВААМНІ КОВБАСНІ ВІ НГ аОАБМ

ТАБРРОБІ ВАБОМ/ МІ МОСЗЕЗАРОВРАБУНМ РАМА СОСАМРУВЕ5РНННІ АЕ5РЇ.

ЕСРОУ5БРМОБОаРУСІТУВОСЕМУ5ІМУМСТМІ СГ МРА,ЗЕРКЗСОКТНТОРРБ5

РАРЕ Яа5З5УБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕУТСМУМОУ5НЕОРЕУКЕМУМУ УМВаМЕМН

МАКТКРАЕЕОМОЗТУВУМ5М ТМ НОМ МаКЕУКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКОИ

ОРВЕРОММУТІ РРОВОЄСТКМОМБІ ТС УКОЕМРБОІАМЕМЕЗБМООРЕММУКТТРРМУ

ГОБООаБЕР МК ТМОКОАМООСМУЕ5СО5УМНЕАІ НМНУТОКОБІ 5І РОК

ЗЕО ІЮ МО:9:

Нуклеотидна послідовність варіанта 2 конструкції СТІА-4 В5В людини - (СО80М/84А/5190А5201А людини (а.о.1-234)-29-І ад-38316/75Е(а.о.27-262)-

Іс 1ам596/297О(а.0.240-471)

АТаОСОаССАСАСАССОЯСАСасСсАаавААСАТСАССАТССААаТатССАТАССТСАА тлсттсАдастт,7аатаста,астаТ ст стТсАСТСтТаТаттсАааТтатТТАТС

САССТОАССААДССААаТаАААаААда ТтасСсАдсастатстатааТСАСААТИаТ тсетаттаААаАаСТайсСАСАААСТСасСАТСТАСТаССААДААасАсААсСААААТ сеатасСстаАСТАТаАТИТСТасСОасСАСАТаААТАТАИСССССОСАатТАСААаААСС ваАССАТСТТТаАТАТСАСТААТААССТСТОСАТТаТОАТОСТОО,ВСТОТОСОаСоС

АТСстТОАСадОаСасСАСАТАССЯДОИаТаТтатТатІСТаААатАТаАААААаАСаТсттто

ААДС;СО,аааААСАССТОаасСтТаААаТаАСИТТАТСАИТСАААДасСстТаАСТТОССТАСА

ССТАСТАТАТСТОАСТТТОАААТТОСААСТТСТААТАТТАСААССАТААТТТОаСТОо

ААсСсСТОТООСАсСатТтттоСАаАасстоАССтотСТааТТОпААААТОпАСпАдОА

АТТАААТаССАТСААСАСААСАСТТаСССААДСаАТССТОаАААСтТаласСтТСтТАТаСТтТ аТТасССАСаСАААСТОасСАТТТСААТАТаАСААССААССАСАО,СТТСАТататстсСА

ТСАДИТАТОСАСАТТ ТААСАаТаААТСАСАССТТСААСТаСААТАСААССОССС автеасссаСссеасасассатсссвсатсСаеавАХастадастоссаствататаса

СссСА,садссовастСсТасССАасСТСССТаСАасССССАСААТСССССТОСА авАТСТСАаССТІотТасСаААдсАаасСсАаааватСАСсттааСАаСАТСА,аССАСАСА астеасоссе7сссеастасса,7асосССбаасССАТОСССТООСССсСсСсСа,аасссСтСАССС ссаоссаса,асосстостостасовСв,аСссССсАсассСссАа,аса,астАсАссата,астадиас ставатоссосаадсасстасаСсад,ассавАаа,ае7стасссстасял,;соссса,асатс

САаСстТааАтТалсса,асвсассвасАа,аоасСасавАСстстасСстТАТОССТаСсаТсс

САд,ассСс,7саосСсасрссаАасаСсСсоаосзАа,атАссоссасс,аСааТасСАССТоСАС,ИС дсса,7аса7асостотостассаеасстосаттас,асставассСдавссСстоаАТОаАСТ

Зб

ВсСАаССССССАСОАТСТСТСАсАасстоСаАСТацаТ САТ ТТОААСтТасто

СсТсА,7сСсассстАсСассСАассттатасСсАТт,ааттСавААССасвасс д7асаесссаатоостатсвавАатсСССССАТСАССАСТТАаСОааАААИаСТТо стоТоСтТасСсСсСсСААдаТсАаССССАТОСАСТСТОСООоССТОСОСвастТасСАТОСТ

САССТАСАВАСАТОССТТСААСаТтСсТоСАТСАТаТАТААССТСАСТИАТТСоТаас тотастаатасссссавасСсТССОАасСССАААТСТТатаАСААААСТСАСАСАА

ВСсССАССОСДаСССАаСАССТОААСТОСТООИСООсаАТОСТоАатсттосСтетТто

СССССАДААСССААСОСАСАСССТСАТОАТСТОССасвАССССтТаАсаатСАСАТИ сетеатастааАСатТаАасССАСПААСАСССТаАсаТСААаТТСААСТаатТАСО тавАСсса,асатааАдсатасСАТААТасССААаАСАдАдассаС,аавсаАсадаСАаТтА

СсСАСАаСАСОСТАСССЯТИаИтТастА,аТтссСстТСАСсСатосСтТасСАССАСсСОаАСТасс

ТОААТаССААДСИаАИТАСААСТаСААДСааТСТОСААСААДассСстоССсАассссс

АТСОАСААААССАТСТССАААаССАААС,ааСАаССсССаАвААССАСАаИТаТтА

САСССТаСССССАТСТОСОсАТадастаАССААаААССАасСатСАасстаАССТ аоСстТаатТСАААСааСТТСТАТСССАаСОаАСАТоОвССсСатасваа гавсАаАасСААТ сааСА5саСССацАаААСААСТАСААаАССАСса,асстссСатаставАСТоСаАСО аСсТосСТ СТ оСТАТАСАВСААДаСТСАССИатасАСААдалаСАасатаасСАасСАС вапААСаТСТСсТсАТАСТОСаТОАТасСАТаАДОасто тасСАСААССАСТАСАСО

САВААСАС,ССТоТоССтТаТатстоСацсиаТАААТОаА

ЗЕО ІЮ МО:10:

Трансльована білкова послідовність варіанта 2 конструкції СТІ А-4 В5В людини - (СО80ОМУ84А/5190А5201А людини (а.о.1-234)-29-І ад-38316/75Е(а.о.27-262)-

Ідс1ам596/297О(а.0.240-471)

МантАптОатТ5РБКСРУЇ МЕРОМ Аа 5НЕС5амМІНУТКЕУКЕМАТІ БСОИаНМУБМ

ЕЕГАОТАЇММОКЕККММІ ТММЗаОММІАРЕМКМАТІРОІТММІ 5ІМІ АГ АРЗОБИаТУ

ЕСУМ КУЕКОАРКВЕНІ АЕМТІ 5МКАОЕРТРБІБОРЕІРТОМІАВІСЗТ5ОаСЕРЕРНІ.

ЗМ ЕМСЕЕЇ МАІМТ ТМАСОРЕТЕЇ МАМАБКІ ОЕММТ ТМНОЗЕМС С КМаніАМоОТЕ мучттасасасасвавадЕУРУММАОЕСАРАОІ РОБРТІРГОВІ БІ АвАСМУТМ

ОНОРОБаРРАААРСОНРІ АРОРНРААРБЗЗУ/ЛЯРАРЕВУТМІ БМЕРИОСІ АБОВІ РО

РВМОГОЕНОаНКОРОаОг5І МІ АРАННАОСАСЕМУВААМНІ НОВА 5СВІ ВІ ВІ ОМ

ТАБРРабБІ ВАБОМ/МІ МО5ЕЗАРОВРАБУНМЕАЕМНИаОССІВУМРУВЕЗРНННІ АЕ5РЕЇГ.

ЕГРОМ5РМОБаРУ/,аСІ ТУАОСЕММ5ІМУМСТМ СГ МРАОЗЕРКЗСОКТНТОРРО

РАРЕ СС255МЕГ ЕРРКРКОТІ МІЗАВТРЕУТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕМУУМВОаМЕМН

МАКТКРАЕЕЕОМОВБТУАУУБМІ ТМ НОБУ/ЛІ МаКЕУКСКУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКО

ОРАВЕРОММУТІ РРОВОЄТКМОМ5І ТС МКОЕМРЗОІАМЕМЕЗМСОСОРЕММУКТТРРУ

ГОБООБЕР КІ ТОК ОООММУЕЗСЗУМНЕАЇ НМНУТОКБІ 5І РОК

ЗЕО ІЮ МО 11:

Нуклеотидна послідовність варіанта З конструкції СТІ А-4 В5В людини - (СО8ОЕТ96А/5190А людини (а.0.1-234)-29-І ад-38316/75Е(а.о.27-262)-ІДс1ам596/297О(а.0.240-471)

АтТапасССАСАСАСОСАдааСАСОавААСАТСАССАТССААСТатоСАТАССТОСАА тот сАестоттоатеастоаста СТ СстТСАСТТСТаТаттсАСатТаттТАТС

САСИаТОАССААДОааААаТаАААаАА,атТавСсААсасСттоСтатайТСАСААТатТ тотТаттОАдАадастаайСАСАААСТОСОСАТСТАСТИайСААААсОАСААСААААТ сатастоАСТАТОАТаИтТСТОсСОаАСАТаААТАТАТОССССИаАатТАСААСААСС ваАССАТСТТТаАТАТСАСТААТААССТОТОСАТТатаАТОСТОССТОТОСОСССО

АтотТадссАссасСАСАТАСССЯСХСТО,аТаттатСстТадАСТАТЯАААААаАСа,ТстттТ

САДОССОССААСАССТаасСТаААатаАСсТТАТСАИТСАААаСТОАСТТСССТАС

АССТАСТАТАТСТОАСТТТаАААТТССААСТТСТААТАТТАСААССАТААТТТОаСТ

СсААССТСОТаСАСИТТТТОоСАалдассСстсАССТоТОоСтТОасСтТтапйААААтТасАадАс

ААТТААДАТаССАТСААСАСААСАСТТаСССААаАТССТаАААСТОаСССТСТАТОС таттАасСАВСАААСТОаСАТТТСААТАТОАСААССААССАСАССТТСАТОТОТСТО

АТСААСТАТаСАСАТТТААСАаТОаААТСАСАССТТСААСТОавААТАСААССОаИас сатаассасосАасассатасссаттоСсавалеастадсатоссоатаа,татай есосСАдавада,вавастСТассСАаСсТооСсТасАасСсСССАСААТСССССТОС

АоеаАТСТСАсаСсСсттотТасаААвАасАассааТСАСттааСАССАТСАассСАаАС датассссоеосса,астассасооССвОаССАТОСССТОСоССсССОасссСтТСАСС сассасосеосостостстовосаСССАсеасоСадасасСтТАСАСсатТастоада сатесстосСавзвавесстасасядаСса,асоАасаестасосстасА,сссСасСат

ССАвостТавАТаАЛаСОСовассвасАХсс,асоевавАСТтСтасСтТАТООССТОСОС

СсСбАавосссасасеСсавАсессвасвАатАссес,ассараатасСАССТОСАСО сАссесесостотостассвостосатотасасстваВССАаасСсСтоаАТОА стТаСсСАаССССССАСОАтТоТоТсАа,аА,асстоСаАСтасцаТ САТТТТОадАСТОСТ сСстТсАсоСсассСстАсСсассСсАаасстотаТатаСАТТОСИТТтТоОвААСсСавОаОс

СсАассаеассваатостатСсаваАаТоСССССАТСАССАСТТАаасСссаАААастт сстотоСстТасрссСсСААСТСАаССССАТООСАСТОТОСЬСОССТООСОасСстасСАТОС

ТСАССТАСА,АСАТОССТТСААСаТтстТоСАТСАТОТАТААССТСАСТОТТСТОаа стстестасвтасосСвоеаасСсТоСпАаСССАААТСТТатТаАСААААСТСАСАСА

АаССсСАССсдассСАасСАССТОААСТОСТОСОаваАТССТСАаТСТТОоСТОТТ

ССССССААДАдАСССААаСАСАСССТСАТаАТСТОССО,ааАССССТОАсатТСАСАТ ссстоатастааАсатТаАаССАСААЧАСССтТаАаатТСААСТТСААСТаатТАС атавдСс,ассатасдастасСАТААТаССААаАСААА,аССаСаса,А,сАдасАат

АСсСАаА2аСсАСсатассататааСАаСаТтсСсТСсАССИаТССтТаСАССАСИаАСТОСс

СТОААТааСАдДСаСАСТАСААаТасСсААаИТСТоСААСААдАлассстССАассосс

САТССАСААААССАТСТССАААаССАААасИТсАасСссССалдаААССАСАСаИТтат

АСАСССТаСССССАТСТООСОаСАТаАДасСТаАССААЧААССАааТатсАассСстТаАСс тасстааТСАААСОаСТТСТАТСССАасСссаАСсАТтасс,атасАа,атаваАсАаСАА тасасдасССопАпААСААСТАСААСАССАСсасСстосСсатаставАСтоСаАсСа аСсТоСТ СТ оСтТАТАСАССААДасСТСАССатаайАСААс,АасСсасатавСАасСАс ааспААсатсТстТсАТастоСатТаАТасСАТаАСасСстСтТасСАСААССАСТАСАСИ

САВААСАССССТоТоССТаТатстоСаасТАААТИаА

ЗЕО ІЮ МО 12:

Трансльована білкова послідовність варіанта З конструкції СТІ А-4 В5В людини - (СО8ОЕ196А/5190А людини (а.о.1-234)-29-Ї ад-38316/75Е(а.0.27-262)-ІДс1амМм596/297Ф(а.0.240- і 77 ОМОНТАВОСТеРОКСРМІ МЕРОМ МАСІ ЗНЕСЗОМІНУТКЕУКЕМАТІ ЗСОНМУВУ

ЗУ ЕМСЕЕЇ МАІМТ ТМАСОРЕТАЇ МАУ55КІ ОЕММТ ТМНЗЕМСГІКМОа НІ ВММОТЕ

МмучттасасасасвавадЕУРУММАОЕСАРАОІ РО5БРТІРГ О0І БІ ААУ

ОНОРОБаРРАААРСОНРІ АРОРНРААРБЗУ/ЛЯРАРЕВУТМІ БМОРОСІ ВБОВІ РІО

РВМОГОЕНОаНКОРОаОГ5І МІ АРАННАВСАСЕМУВРААМНІ КОВАЇ СВІ ВІ ВІ СОД5М

ТАБРРОаБІ ВАБОУУМІ МС5ЕЗАРОВРАБУНУМЕВМАВОСАУРУВЕБРНННІ АЕ5Е

ГРСРОМ5РМОБаРУУВСІТУАРИаРЄММ5ІМУМСТМ СГ І МРВОЗЕРКЗСОКТНТ5РР

ЗРАРЕ сс55МЕГ ЕРРКРКОТІ МІЗЕТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕУМКЕММ УМО СМЕМ

НМАКТКРАЕЕОМОЗТУВУМ5МІ ТМ НОСОМ МаКЕМКСКМУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАК

СОРРЕРОМУТІ РРОВОЕЇТКМОМ5БІ ТС МКОЕМРБОІАМЕМЕЗБМООРЕММУКТТРР

МГО5ОО5ЕРІ У5КІТУОКВАМОСО,аММЕ5С5УМНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І РОК

ЗЕО ІО МО:13:

Нуклеотидна послідовність варіанта 4 конструкції СТІА-4 В5В людини - (СО8ОЕ196А/5190А5201А людини (а.о.1-234)-29-І ад-3А8316/75Е(а.о.27-262)-

Ідс1ам596/297О(а.0.240-471)

АТОСОССАСАСАСОСОСВАДаССАвОавААСАТСАССАТССААСТаТоСАТАССТСАА тот САестотастаставастаатсТсСТсАСТТСТатТтСАсСататтТАТС

САСатТаАССААСИаААаТаАААаААс,тТаасААсастатстатаайТСАСААТОТ

ТТСТОУРСААСАВСТОССАСАААСТСОСАТСТАСТаайСААААасАСААСААААТ савтасСстадсСстТАТаАТтатставааАСАТОААТАТАТааСССОАсСТАСАА,ААСС

СОАССАТСТТТОАТАТСАСТААТААССТСОТССАТТОТаАТОСТОССТОТОСО,СОС

АТСсТОАСОдаайаСАСАТАССЯДОТаТаттаттСстТаААСаТАТаАААААаАСаТсттт

СсАдасСссасвААСАССта,всСстаААаТаАСаТатТАТСАИТСАААасСстаАСТТСССТАС

АССТАСТАТАТСТОАСТТТаАААТТССААСТТСТААТАТТАВААССАТААТТТОаСТ

СААССТСОТООаАСаттттоСАСАаССТСАССТоТоСтТааТТаСААААТасАсААДСОИ

ААТТАААТаССАТСААСАСААСАИТТассСААСАТОСТОАААСТасссСтТСтТАТОС тат асССАаСАААСТасСАТТТСААТАТЕАСААССААССАСАССТ ТАТИ ТИатосто

АТСАДаТАТаСАСАТТТААСАСТаААТСАВАССТТСААСТасААТАСААССОИАС сатасссасесвАадссссатаасссасСессАаесталсатссссата,та7атась ассСсАса,алдссавастоста|ассСсАаСсТСССТасСАасссССАСААТСССССТОС

АдеаАТсТоАДасСстТтстТаСОААсАаСАсаватСАСттаСАасСАТСАаССАаАС датзеасссоесссестасс,7асссСсСсаасСсАТОСССТОИаСССсССвасСсСсСтТсАСС ссессоесесостостостассааооСАсассСсвАа,аСасСстТАСАСсвата,астада сатасатоссосаАхсвесстасаСсАаасаевАасеастасосстасаасссСса7сат

ССбадаствАТОДОСОСОСооСс,аеСАсоеососавАСсттотастАтаастаСОас сслассссовсасеСссаАса,асса,асосАхатасс,асаосасрааТаСАССТСАОС схьесаеас,ассстотостассасстосаетотасасСставасСсАвасСсСтовАТОаА

СсТасСсСАВССССССАВОАТСТСТСАсАаССстоСадстаааТСАТТТТаААСТаст ссттолассасссталссасссласстотатасатоаттосадасС,асвас

САсасосахлатосстатоСаваАаТССССССАТСАССАСТТА,СасСАААОСТТ состоТоСТаССССААСТСАаССССАТавАСТСТОССЯСОССТОИ,СОаСТасСАТОС

ТСАССТАСАСАСАТОССТТСААСИаТСТоСАТСАТОТАТААССТоАСТО,аТТСТОаСс аттастестасссСс,асаасТоСадассССАААТСТТОТаАСААААСТСАСАСА даСССАССОАаСССАасСАССТаААСТОСТООВасваАТСоСТСАаТсТосСтотТт

ССССССААДАСССААДасСАСАСССТСАТОАТоТОССОаАССССТОАСаТтсСАСАТ ссатоеатзатадСсатадаССАСаААаАСССтТадватСААатТСААСТОатАС стазваосасатасАваТасСАТААТаССААСАСААА,аССЯвСавал,аслаесАа|ат

АССАБАССАСОатТАССОЯТатаатояа,сСса|атсосСстАССатссСстаСАССАСОАСтТОаа

СТОААТИаССААСОАСТАСААСТаСААсаТСТоСААСААА,аСоСстоССАаТссос

САТССАСААААССАТСТОСАААДасССААдАсСОс;АаССССаАаААССАСАСса,атат

АСАСССТОаСССССАТСТООСОСАТтОАа,СтТадгсССААВААССАса7атсАассталдсс тассСстОТСАААвасСТТСстТАТСССАаСОАСАТСОЯССОЯТтОСАИаТасОсАСАССАА тасасСсАдаСсСацйАспААСААСТАСААаАССАСсасстссатаставАСТоСаАСа аСсТоСТ СТ оСтТАТАСАССААДасСТСАССатаайАСААс,АасСсасатавСАасСАс ааспААсатсТстТсАТастоСатТаАТасСАТаАСасСстСтТасСАСААССАСТАСАСИ

САВААСАССССТоТоССТаТатстоСаасТАААТИаА

ЗЕО ІЮ МО:14:

Трансльована білкова послідовність варіанта 4 конструкції СТІ А-4 В5В людини - (СО8ОЕ196А/5190АБ2О1А людини (а.о.1-234)-29-ІЇ ад-38316/75Е(а.о.27-262)- 4дстам596/297О(а.0.240-471)

МОаНнтТАНОСТОРОКСРУЇ МЕРОІ МІ АС ЗНЕСЗОМІНУТКЕМКЕМАТІ БСОЯНМУБМ

ЕЕГАОТВІУМОКЕККМУ ТІММ5ИаОМмММІМ/ РЕМКМАТІЕОІТММІ 5ІМІСАСА!АРОрЕеаТУ

ЕСУМІ КУЕКОАРКРЕНІ АЕМТІ 5МКАОЕРТРБОІБОРЕІРТОМІВВІИІСЗТ5ОаСЕРЕРНІ.

ЗМ ЕМОЕЕЇ МАІМТ ТМАООРЕТАЇ МАМАБКІ ОЄММТТМНОЗЕМС ІКНІ ВММОТЕ мучттасаввасааавалдаЕУРУМУММ/АОСЕСАРАОІ РОБРТІРІ ОБІ БІГ ВРЕАСМТІМ

ОНОРОБОаРРАААРОНРІ АРаРНРААРБЗБЗУСОРАРЕВУТМІ БМОаРОІ АБаВІ РІО

РАЕМОГ ОЕВаРОНООЕ5І МІ ВРАВВАРАСЕУВААМНІ НОВАЇ 5СВІ ВІ ВІ ОА5М

ТАБРРабБІ ВАБОМ/МІ МС5ЕЗАРОВРАБУНУМ ЕЕМНИаСС,ВУРУВЕЗ5РНННІ АЕ5РЕЇ.

ЕГРОМ5РМОБаРУСІ ТУВОСЕМУ5ІМУМСТМІ СІ І МРАО5БЕРКЗСОКТНТОРРБ5

РАРЕ! Яа55УБГІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕУТСУУМОУЗНЕОРЕУКЕМУ УУрамМЕМУН

МАКТКРАЕЕОМОВТУАУМ5МІ ТМІ НОБУ/ЛІМЕКЕУКСКУ5МКАЇ РАРІЕКТІЗКАКО

ОРВЕРОМУТІ РРОВОЕЇТКМОМ5І ТС УКОЕМРЗОІАМЕМ ЕЗЄМООРЕММУМКТТРРУ

ГОБОСО5БЕБР ЗК ТУОКОВУМОСОСС ММЕ5С5УМНЕАЇІ НМНУТОКОІ 5І РОК

ЗЕО ІЮ МО:15:

СО80 людини

МантввоОстТ5 РОКСРУЇ МЕРЕ ОГІ МІ ДаїЇ 5Н ЕС5ОМІНМТК ЕУКЕМАТІ 50

СНММ5МЕЕЇГ А ОТВІММОКЕК КМУ ТММ5О0О ММІМ/РЕМКМА ТІБОЇТММІ 5

ІМІРАГАРБОО ЕСТУЕСУМІ К МЕКОАЕКВЕН ГАЕМТІ 5УКА ОЕРТРБІБОЄ

ЕІРТОМІВВІ ІС5Т5СОСЕРЕ РНІ 5БУУГЕМОЕ ЕІМАІЇМТТУ5 ОЮОРЕТЕЇ МАМ

З5КІГОЕММТТ МНЗЕМСГІКМ СНІ АУМОТЕМ УУМТТКОЕНЕР ОМ РБУУАЇТ

ГІ5УМаї!РМІ СС ТУСЕАРА СВЕВНАМЕНВІ АВЕБМАРМУ

ЗЕО ІЮ МО:16:

ДНК В5ВА (СО80мжа-Ес) - СО8Ом вва миші (а.о.1-235)-Ідс2а(а.о.241-474)

Нуклеотидна послідовність замінної конструкції миші (В5ВА; СОвОуа-Ес):

АТОВСТТаСААТТатсСАаТтТаАТаСАсСсАТАСАССАСТОСТСААОТТТССАТОаТО

СААСпаСТСАТТСТТоТСТТТатТаСтТасСТОАТТСОаТСТТТСАСААаТаТатсСТТСАСА тат АТААСААСТатоСААатСАатаАААаАтТААвататастассттссса

ТТАСААСТОТОСТСАТОААСАТОАЛатСстТаААаАССВААТСТАСТас!сСАААААСАТ вАСААДАСТТОСЯТаИСТатТотТатоАТТасСстасаАААСТАААдАХато,;СассСсаАдатАТ

ААСААдССОааАСТТТАТАТЯАСААСАСТАССТАСТСОТСТТАТСАТСОСТОСИССТО,И тост ТсАаАсСо,аайсСАСАТАСА,СТататСИаТТСААДААОААасСААДАДадОаСАА

СатАТаААСТТАААСАСТТаССТТ ТАаТАААСТТатТоСАТСАААДаСтТОаАСТТСТО

ТАСССССААСАТААСТаАаИТтСстТасАААСССАТСТаСАваАСАСТАААА,САТТАС стасттасттоСесасват тоССАААСССТСОЯСТТСтоттасТтТаапААААТаС

ААСАСПААТТАССТасССАТСААТАСВАСААТТ ТОСССАСОАТОСТаААТСТОААТТО

ТАСАССАТТАСТАаССААСТАСАТТ ТСААТАСОАСТСОаСААССАСАССАТТААИТ атстТСАТТАААТАТаСАСвАТИСТСАСОататсАсАасАСТТСАССстаавАасСсСсСА вАООаСССАСААТСААасСсСсСтТатоссСтССАТОСАААТаСССАасСАССТААССТСОТ таватасАССАТССаТтсСТТСсАТСТТСОССТОСАААСАТСААС,САТОТАСТСАТОА тотобСстТаАаССССАтТааТСсАСАТататаатаатавАтатадаСадавАТОаАС

ССАПАТаТССАСАТСАССТОИ ТТ СОТ ОААСААСИатасААСТАСТСАСА,СТСАС

АСАСАДАСССАТАСАСАСОСАТТАСААСАСаТАСТСОТОСОВЗИатаатсАяа,атасссто

СССАТССАаСАССАСОАСТОВаАтТалдиатаасСААааАаТ ТсСАААТасСсААаатсСАА

СААСАААДаСССТоССАаСОаСССАТСВА,АВААССАТСТСААААСССАААСССИТ

САСТААВАЛДаСТССАСАСаТатАТАТаИТСТТаССтТоСАССАСААСАдДаАаАТаАСТА

АСААдАСАватСАСТотТадсстасАТааТСАСАСАСТТСАТасСсСтТОаААсСАСАТТТ

АдсатавАдаТасАССААСААСасаААААСАпАаСтТАААСТАСААВААСАСТОаАДА

СсСАатостТааАСТСТОАТаатТсСТТАСТТСАТаТтТАСАаСАДИаСТаАдаАаТОааАА

ААвпАддаАдАСстТасчатавАААаАААтАастАстостастодатаватссСАСосАаса

ТСТасСсАСААТСАССАСАСВАСТААСаАОаСТТотоССосадстоСа,аааТААА,васа атесссаСсазвАасоасоатссоатасасСстасаАААсАа,асСтава стос

ССаТАаСССАССАТСАССАТСАТСАСТИаА

ЗЕО ІО МО:17

Білок В5ВА (СОвОма-Ес) - СО80м/в8ва миші (а.о.1-235)-Ідс2а(а.о.241-474)

Трансльована білкова послідовність замінної конструкції миші (В5ВА; СОвОа- Ес):

МАСМСОЇ МООТРІГ ЕКЕРСРАСІС ЕМ СПІВ 5ОМ5БОМОЕОЇ 5К5УКОКМІ РСВУМ

ЗРНЕОСЕБЕОВІМУМОКНОКУМІ 5БМІДОКІ КМАРЕУКМАТІ МОМТТУБІ ПС МІ ОВО

ТУБСУМОККЕНОТУЕМКНІ АГ УКІ БІКАОЄЗТРМІТЕЗБИаМРЗАОТКАІТСЕАБОСЕРК

РАЕБУМ ЕМОВЕГ РОЇМТТІЗООРЕБЕЇ МТІ55ОЇ ОРМТТАМНТІКСГ ІКМар6АнмУЕО

ЕТМЕРВОРТІКРСОРРСКСРАРМІ І СОРОМ ЕЇІЕРРКІКОМІ МІ БРМУТСУММОМ5Е

РОРОМОІЇ5БУМ/ЕУМММЕМСТАОТОТНАЕОУМ5ТІ ВУУМ5АГРІОНОСУМ5аКкКЕРКСКМ

ММКАЇ РАРІЕВТІЗКРКаЗУВАРОМУМІ РРРЕЕЕМТККОМТІ ТОМУТОЕМРЕВІММЕ

М/ТММактЕЇ МУКМТЕРМІ О5Ва5ЗУЕМУ5КІ АМЕККМУ МЕВМЗУЗСВУМУНЕСІ НМ ннТткКЗЕ5АТРОКОСИСССЯ,СИ,ааСаСРОКЕЇ агЕРМАНННННН

Інші варіанти здійснення

З наведеного вище опису очевидно, що варіації і модифікації можна створювати у винаході, описаному в даному документі, щоб адаптувати його до різних використань і умов. Такі варіанти здійснення також входять в обсяг наступної формули винаходу.

Перерахування списку елементів у якому-небудь визначенні перемінної в даному документі включає визначення цієї перемінної як якого-небудь одного елемента або комбінації (або підкомбінації) перерахованих елементів. Перерахування варіанта здійснення в даному документі включає цей варіант здійснення як який-небудь один варіант здійснення або в комбінації з якими-небудь іншими варіантами здійснення або їх частинами.

Усі патенти і публікації, згадані в цьому описі, включені в даний документ за допомогою посилання в тій же мірі, як якби було конкретно і окремо зазначено, що кожен незалежний патент і публікація включені по посиланню.

Джерела інформації:

У даному документі цитуються наступні документи:

АЦап, 5.Е., К. Вгоаду, 5. СОтерогі, М.Е. Нітте!, М. ГосКе, М.О. Копсагоіо, К. Вассбена, апа М.К. І ехіпрв. 2008. С4-- Т-гершасогу се! І8: (ожуага фегару Тог Питап дізеавев.

Іпттипо)і Кеу 223:391-421.

Апаегзоп, В.Е., Т.М. Мем, С. Маце, І. Афапавіадів, М.О. зПіотеіК, апа М./, 5ЗШотевіКк. 2004. Кесірієпі СІ4-- Т сеІІ5 Фаї вигуіїуе птадіаноп гершац(е спгопіс ягай- уегви8-Пові дізеазе. Віоод 104:1565-1573.

Апаегзоп, М.5., апа Л.А. ВІпевіопе. 2005. Те МОЮ тоиве: а тодеї ої іттипе дувзгершайоп. Аппи Кеу типо! 23:447-485.

Вагпадеп, М./., У. АШвоп, М.К. Неаф, апа Е.К. Сагропе. 1998. Оеїесиуе ТСК ехргеввіоп іп шапврепіс тісе сопзітисіей ивіпе СІЮМА-бравеай аїрва- апа Бега-сваїп репев5 ипдег Фе сопігої

ОЇ ПегегоЇІогоив гершагу еіетепів. Іттипої Сеї) Вісі! 70:34-40.

Вагоїа, М.1І.., 1. МізауаКті5пап, Е. Вецеш, Р.). Рагіпре(оп, Т.А. Свай, У. Ііпея, М. СоШпв,

В.М. Сатепо, /. Майгепав, апа У.К. Кисбгоо. 2002. ТоВібшоп ої СТІ.А-4 Тапсцоп Бу Фе тершагогу зирипії ої вегіпе/Пгеопіпе рпозрпагазе 2А. / Пптипої! 168:5070-5078.

Вешпі, М., А.І. 57утслак-МЖМогКтап, К. Рогбев, А.Н. СавіеЦаху, М. 5еїБу, Х. Рап, С.О.

Огаке, А.). Когтап, апа П.А. Мірпаїї. 2011. Спр» едре: ассеІегаєед ашопитипе аіабесев іп Ше абзепсе ої ГАС-3. / Пптипої! 1857:3493-3498.

Віаїг, Р.)., Л.І. КПеу, В.1І.. І ехуіпе, К.Р. І.ее, М. СтаіяВеай, Т. Егапсотапо, 5./. Репецо,

Сб.5. Отау, В.М. Саттепо, апа С.Н. Ліпе. 1998. СТІ.А-4 Прайоп деНуегв а ипідне вірпа! тевйпея Пштпап СІЯ Т се!І5 Фах іпрібі(в5 іп(епеийКіп-2 весгейоп Бис аПохув ВсІ-Х(І) іпдисйоп. /Тттипої! 160:12-15.

ВІшевіопе, У.А., С.К. МаскКау, 7). О'5Бпеа, апа В. ЖМосКіпрег. 2009. Те ГТипснопаї ріависцу

ОЇ Т сеї) зирвеїв8. Маг Кеу Пптипої 9:811-816.

Сагецо, І, 5.0. Каглтап, А.У. МШагіпо, Е. баЦо, апа А.К. АбБбав. 2010. Сишпе едре: Ше

ТНІ гевзропве іппібії5 Фе репегайоп ої регірпега! геришаюгу Т се!І5. / Пппипої! 184:30-34.,

СВагепопоа, І.., Е. Трегуеї, ). Ргіто, апа У.Е. Васі. 1994, Апи-СІЗ3 апибоду іпайсев Іопе- їегт гетіввіоп ої оуегі ашоїттипку іп попобеве діабейс тісе. Ргос Май Асад 5еі ОО 5 А 91:123-127.

Свеп, М., М. Ли, М. Нагдереп, К./. І еі, 1.. 11, М. Магіпов, б. МеОтаду, апа 5.М. Макві. 2003. Сопуегвіоп ої регірбегаї СІ4-СО25- паїхе Т се!5 то СЯ-СІ25-- тершагу Т сеПв

Бу ТОЕ-Бега іпдисноп ої гапзстірноп Тасіог Рохр3. / Ехр Меа 198:1875-1880.

Свпапе, Е., Т.5. Еі5бег, КЛУ. Могеап, М.Ю. Коббіпв, У.М. Юпетт, М.С. Мападег Неїаеп, /.Р.

Сагапег, У.Е. Натбог, М.). Мехец, апа С.В. Тротрзвоп. 2000. Те СІ28 апа СТІ. А-4 тесеріог» авзвосіасге мВ Ше взегіпе//йгеопіпе рро5ріагавзе РР2А. Ітптипіу 13:313-322.

Рапіє), С., В. Меіртапп, К. Вгопвоп, апа Н. уоп Воепйтег. 2011. Ргеуепноп ої їуре 1 діабегев іп тісе Бу (оІегорепіс уассіпайоп ж а зігопе аропіві іпеиШп тітес(оре. / Ехр

Мей 208:1501-1510.

Епне, В.Т., М.О. Ото, А.К. Аббах», К.М. ГоскКеІеу, апа Т.А. ВІпевіопе. 2006. ТІЛіБбшоп ої

Т сеІ асиуайоп апа ашопттипе аіабегев ивіпе а В се!) зштТасе-НоКей СТІ.А-4 аропіві. /

СпПп Іпуеві 116:2252-2261.

Сопла!е?-Кеу, Е., А. Регпапде7-Магйп, А. Спогпу, апа М. РеїІгадо. 2006. Мавоасіуе іпісвй па! реріїде іпдисе5 СІ4-А,СТ225-- Т тегшагу сс1І8 Ул (Впстарсийс сессії іп соПарсп- іпацсейд агфбив5. Агбгій5 Кейт 54:864-870.

Стій, М.0., О.К. Нопе, Р.О. НоІтпап, К.М. Гее, М.). Увіцегв, 5.М. О'Нетпіп, Р.

ЕвшШапіпо, М. СоШпв, О.М. 5ера), Т.Е. Са|ем Кі, О.М. Кгапли, апа Л.А. ВіІпевіопе. 2000.

ВіосКаде ої Т се!І асйиуайоп ивіпе а звштасе-НоКей віпе1е-спаіп апаібоду 0 СТІА-4 (СП152). У Тттипої! 164:4433-4442.

СтгоПтапп, 0., С. Огабопа, Г. ГаЦатгіпо, С. Масса, Г. СаЇІсіпаго, А. Гаіюогпі, Р. Сапае!Їого,

М.І. ВеЦадоппа, К. Віапсії, М.С. Ніогеці, апа Р. Риссецш. 2002. СТІ.А-4-Іе герміасев (гуріорбап сагабо!вт іп міо. Ма Плтипої 3:1097-1101.

Сипегтапп, С., апа О.К. АІехапдег. 2002. СТІА-4 вирргеввев ргохіта! ТСК вірпаїле іп тевіпе' Витап СІ4С) Т се!І5 Бу іпбібійпе 7АР-70 Туг(319) рпозрбогуїІайоп: а рогтепна! тоїе Тог СГуговіпе рпо5рВагавев. / Плтипо! 168:4420-4429.

Іве, М., М. Копбуата, К.М. Миїзсі, П.М. І.єе, А. 5ші, Б.К. Опапие, Т.І. Мигрву, апа К.М.

Мигрву. 2010. СТІ.А-4 вирргеввев5 Ше рафорепісісу ої зе!ї апиреп-зресіс Т се! Бу сеП- іпшіпвіс апа сеП-ехпіпвіс теспапізптв. Мас Питпипої 11:129-135.

Лаіп, М., Н. Мецйуеп, С. Спатрегв, апа ). Капе. 2010. ша! Типсйоп ої СТІЛ-4 іп гершагу

Т сеїП5 апа сопуепіопа)! Т сеїІ8 (о ргеуепі тийотрап ашоіїттипісу. Ргос Май Асай 5сі 0 5

А 107:1524-1528.

Лапе, 5., К.І. І есПпіег, апа б. Готватгаї. 2006. СІ4-С1525-- териІасгу Т-се)І фФегару.

Ехреп гемієхм ої сІпіса! іпппипоЇову 2:387-392.

КагапаїіКаг, М.)., С.І. Мапдегінйеії, Т.І. Маїшйпав, 5.0). МІШег, апа У. А. ВІпевіопе. 1996.

СТІА-4: а перайхме герміаог ої ашойттипе аїівеазе. / Ехр Мей 184:783-788.

Кагтап, /У., Л.І. Лапе, М. Ситіаху, Н. 7/Вао, Ї. Сатров5-Кіхега, /). 5апсно, У. 7Вапе, С. Папе, 5.1. Сбпепер, апа У. /Пи. 2012. Ілраноп ої суто(охіс Т Іутрросусге апиреп-4 то фе ГСК іпПібі(5 Т се!) аснуайоп апа дігесіз ФШегепнайоп ішо ЕОХРІ-- терціа(гу Т сев. У Вісі!

Спет

Кавіпег, І.., Ю. Юхууег, апа Е.Х. Оіп. 2010. 5упегоівОс еНесі ої П.-6б апа П.-4 1п дгіхіпе Тасе гехівіоп ої пашга! Рохр3-- гершацсогу Т се!І5. / Пптипої! 185:5778-5786.

Кепгі, /.Н., Г.М. МакКепеї!1а, А.В. Корбетпгів, 5. /"аКомем, М. АЇІуаге7-Моп, К. ЮОегупскК, М.В.

Зрот, апа А.5. Райсі. 1980. Ргодисцоп ої (гапатогтіпе, ягоуій Тасіог бега Бу питап Т

Іутріосуїев апа ії5 рогепнаї гоЇе іп фе гершацоп ої Т се!) ягомій. / Ехр Мей 163:1037-

Коепеп, Н.)., К.І.. 5тееїв, Р.М. Міпк, Е. уап Кі)звеп, А.М. Вооїв, апа І. /оовіеп. 2008.

Питап СО25Пі»пЕохраірозв гтерціагу Т сей5 ашШегепнагсе іпіо ЦП .-17-ргодисіпе, се!І5. Віоод 112:2340-2352.

Киішпте), М.Е., апа ).Р. АШвоп. 1995. С028 апа СТІ.А-4 рауе орровіпе еПесів оп Ше тевропве ої Т се!І5 0 вйптиацноп. / Гхр Меа 182:459-465.

Кіпптеї!, М.Е., апа У.Р. АШвоп. 1996. СТІ.А-4 епраретенпі іппіби5 П.-2 ассипишайоп апа се)! сусіе ргоргеввіоп проп асйуацоп ої гезіпе Т се/І5. / Ехр Мей 1853:2533-2540.

І епвспом, І).)., 5.С. Но, Н. 5ацакг, І. Кбеє, С. Огау, М. Мабамхі, К.С. Негоїй, апа А.

ВІшевіопе. 1995. ПіПТетепца! еПесів ої апі-В7-1 апа апі-В7-2 штопосіопа! апібоду шеаннпепі оп Фе деуеІортепі ої аїіабегев іп фе попобевзе «іабейс тоиве. / Ехр Мей 181:1145-1155.

ІіпвіІеу, Р.5., апа Р. Соїв(свїіп. 1996. І утрвросуге асйуайоп: Т-се!Ї геешайоп Бу СТІ.А-4,

Сигг Вісі! 6:398-400.

І1пв8Іеу, Р.5., 7.1. Отеєпе, М. Вгаду, У. Ва|огаф, 7. А. ІедбБецег, апа К. Реасіх. 1994. Нитап

В7-1 (СО80) апа В7-2 (СОВ86) Біпа хлів вітіаг ахідібе5 Би: дізипсі Кіпейсв о СО28 апа

СТІ А-4 гесеріогвь. пипісу 1:793-801.

Магіє, 7.С., 7.7. Т.ецнетіо, М. Сауіп, апі А.У. Кидеп5Ку. 2005. ТО Е-рега! таїіпіаїпь зирргеввог Пппсцоп апа Рохр3 ехргеввіоп іп С4-СІ25-4- герша(огу Т се1І8. / Ехр Мей 201:1061-1067.

Мавіепег, Б.І.., М.К. Магтег, О. Тапре, К.М. Тагреїї, Н. МеПеуй, апа Т.А. ВІпевіопе. 2005.

Ехрапзвіоп ої ПТипсйопа! епдорепои5 апіреп-5ресійс СІЯ--СІ25-- гершагсгу Т сеПв їтот попореве аіабейс тісе. / Птипо! 175:3053-3059.

Мереуш, Н., 5. 5іпрег, апа К. Тівсв. 1990. ТнНе гоїЇє ої МНС сіавв П репевз іп вивсерйбішу апа гевівмгапсе (0 їуре І діарбегте5 теПиив іп фе МОЮ тоийве. Ногтопе апа тегабоїіс гевеагсл - Ноппоп- ипа (ої меспвеПогеспипе - Ноптопев еї тегароїйвте 28:2857-258.

Мигаї, М., ОО. ТигоузКауа, С. Кип, К. Мадап, С... Кагр, Н. Сбегоцшнге, апі М. Кгопепбегр. 2009. ПепгецйкКіп 10 асів оп гершагогу Т сеП5 (о таіпіаіп ехргеввіоп ої Ше (гапзстірйоп

Тасіог Рохр3 апа 5ирргеввіхе Типспоп іп тісе УУцП соцПи5. Мас Плтпипо! 10:1178-1184,

Міо, /., М. Репегег, ). Мопе, Ю. Мафів, апа С. Вепоїві. 2010. Апи-СІ3 (Фегару регті(8 терміаюгу Т се 15 (о виттоцтпі Т сеї! тесеріог-5ресіїеай ретірветаї! піспе сопвігаїпів. / хр

Меа 207:1879-1889.

Опапга, ., Т. Мішга, Т.А. /оппвоп, 5. Ногі, 5.Г. /1ерІег, апа Н. КовзакКа. 2007. Спрапсей еПісасу ої гершайгу Т сеї) пгапвТег араіпві іпсгеавіпе гевівіапсе, Бу еіеуагей Гохр3 ехргеввіоп іпдисей іп агійгйс тигіпе повів. Агійгй5 Кпейт 56:2947-2956.

Оподега, Т., М.Н. )апе, 7. Смо, М. Уатавакі, Т. Нігагса, 7. Ваї, М.М. Т5щі, Ю. МавгаКибо,

О. ХовНВіє, 5. 5аКарисйві, О. ТакіКамжла, апа М. МіуавакКа. 2009. Сопеіши»уе ехргеввіоп ої 10О Бу депагійс се!І5 ої тевепетгтіс Іутрії подев: Типспопа)ї іпуоЇухетепі ої Ше СТІ. А-4/87 апа ССІ.22/ССКА іпшегасйопвь. У Шипипої! 183:5608-5614.

Рагегвзоп, А.М., апа А.Н. 5Багре. 2010. Татіпе (55йе-зресійс Т сеПв: СТІ.А-4 геїпв іп веН- теасиуе Т се». Маг Іттипої 11:109-111.

Репісбеуа-Поапе, Т., Л.О. Ереп, К. Мо|поопвкКі, апа ).Р. АШвоп. 2004. В7-1 апа В7-2 зсІссіусіу тес СТІ А-4 апа СО28 0 бе ітптипоіІоріса! зупарвсе. Птозипну 21:401-413.

Ропіоху, 5.Е., У. Кегу, апа Р.О). гав). 1992. Маппозве гесеріог. Іі Ксу Су! 1378:221-244,

Оиє, Н.О., У.Г. Вгаанеїа4, 5.Г. Отапі, Н. НаКопагзоп, апа С. РоЇІусігопаКов. 2009. Кетарріпе»

Ше ї(уре І аіабегев азвосіайоп ої Ше СТІ ЛА Іосив. Сепев апі ітпипіу 10 5иррі 1:527-32.

КПеу, 7.1.., С.Н. Ліпе, апа В.К. Віалаг. 2009. Нитап Т гершагсогу се!) Фегару: гаКе а БіШоп ог во апа са! те іп фе тогпіпр. Ппипіу 30:056-065.

Копсаго!о, М.О., 5. Стерогі, М. Вапйарвна, К. Васспеца, К. НіІеі5сПпрапег, апа М.К. І ехіпев. 2006. ІепеиКіп-10-5естейпе (уре 1 гершаогу Т се1І5 іп годепі5 апа Вшпапь. Плипипої Кеу 212:28-50.

Коорепіап, І.С., апа 5. АКПевв. 2007. РеКи: Ше пеопага! Ес тесеріог сотев ої аре. Маї Кеу

Іттипоі 7:715-725.

ЗаКаргисні, 5., М. ЗаКарисні, М. Авапо, М. ГО, апа М. Тода. 1995. Іпптпипоюріс веН- ю1егапсе таїіпіаіпейд Бу асихагей Т се!5 ехргеввіпе П.-2 гесеріог аЇрба-сваіпьв (СО25).

ВгсаКдохуп ої а віпріс тесвапівзт ої зе/-(0Ісгапсе сайвзев уагіоив ашо ттипе адівсавев.

Пітипо! 155:1151-1164. 5аіотоп, В., 0./. Гепвспоху, І. Кпеє, М. Лврошгіап, В. 5іпер, Л. 5Багре, апа Л.Л.

ВіІпевіопе. 2000. В7/СО28 собшпшацоп 15 еввепіа! Тог фе пПотеовіавів ої Ше СІЯ--СІ25-- ітптипогершіа(гу Т сеП5 Фаї сопігої ашоіїйттипе діаресге5. Плтипіну 12:431-440. 5пода, І.К., 0.1. Уоипе, 5. Катапціап, С.С. МВійпе, М.А. АіКіпзоп, Л.А. ВІпйев(опе, С.5.

Еївепратів, 1. Маів, А.А. Коввіпі, 5.Е. Сатррбеї!, К. Капп, апа Н.Т. Ктецмеї. 2005. А сотргевепвіхе геуієх/ ОЇ ішегуепноп5 іп Ше МОЮ) тойве апа поріїсаноп» Тог (гапб1айоп.

Іптипну 23:115-126.

Зітоп, б., М. РагКег, У. Каптіуа, С. Маввепа), У. Ниапе, І). Вгеввоп, К.Е. 5сіхуаня, М.

СатрреП-Тротрзоп, І.. Тепасе, Т. Вгив5Ко, 5. Хпе, А. 5сагіа, М. І ліКавоп, 5. Еізепреів, /.

УМіШатв, М. СІаго-б5а171Іст, ОХ. 5срафй, В. Каріап, М. Моп Неїтаф, К. Уотетг, апа М.А.

ЛІКіпвоп. 2008. Мигіпе апйфутосуге гІобиіп (пегару ацегв дівеавзе ргоетеввіоп іп МОЮ тісе Бу а Шпе-дерепдепі іпдисцоп ої іттипогеєшШайоп. Ріабеїе5 57:405-414, зісіптап, К.М., Ю. Намірег, апа М.С. Миввепгуеїр. 2003. ГоІегорепіс депагійс сеПв.

Аппи Кеху Іптипої 21:685-711.

Тапе, О., У. А. ВіІнпевіопе, апа 5.М. Капр. 2012. СЮА(-)Рохрі(т) герміасогу Т се!) Вегару іп щшапзріапайоп. )оцгпа! ої тоІесміак се!) БіоІову 4:11-21.

Тапе, О., К.). НеппіКвеп, М. Ві, Е.В. Еіпрег, ОС. 5701, /. Те, Е.І. МавіеЦег, Н. Мереуш, М.

Вопупваді, апа Л.А. ВІпевіопе. 2004. Ів уйптго-ехрапдей апіреп-5ресійс тегшасгу Т сеЦь зирргезв аоїпипипе (Фіабегев. / Ехр Мей 199:1455-1465,

Тапе, О., К.). НепгіКвсп, Е.К. Водсп, А./. Тооїсу, Ї/. Ус, 5.К. 5ибиаві, Х.Х. /репе, Т.В. 5попт, апа /.лЛ. Віпев(опе. 2003. Сишпе едее: СЮ28 сопігоі!5 регірпега! пПотеовгавів ої

СрансСр254- теєеша(огу Т се!8. / Питипої 171:3348-3352.

Тагреї), К.У., 1. Рені, Х. /по, ГР. Тоу, Х. Іо, А. Мдааті, Н. УХапе, М. 5йщбапфігап, 5.

Мо)/зоу, апа К.М. 5іеіптап. 2007. Репагійс сеП-ехрапаеа, івіес-5ресійс СІ4--А СП254-

СОб21 -- геєешасогу Т се! І5 гемоге погторіусетіа іп діабейс МОР пісе. / Ехр Мей 204:191-201.

Тауог, Р.А., С.У. Гесв, апа В.К. ВіІагак. 2002. Тре 1п/Ги810п ої сх міхо асимагса апа ехрапдеяа СО4(СНСО25() іттипе геєешШагсогу се!І5 іппібив егай-уегвив5-пові дізеаве

Іешашу. Віоой 99:3493-3499,

Тіхої, Е.А., Е. ВопіеЦо, А.М. 5спууейтег, М.Р. Гупсі, Л.А. ВІпевіопе, апа А.Н. 5Вагре. 1995. Го8585 ої СТІА-4 вад» (о таввіхе ІУутрпоргоШеганоп апа Гага! тиНогеап И58це девігисноп, геуеайпе а спйса! пегайхе герціа(огу гоїє ої СТІ.А-4, Патипісу 3:541-547,

Твипахжакі, 5., М. 5рогп, А. Піпе, апа С. Мафап. 1988. Оеасиуайоп ої тасгоріаревз Бу щтапвіоттіпе, ртоій Тасіог-рега. Машге 334:260-202.

Оеда, Н., Т.М. Нохзоп, 1. Евровісо, ). Нежага, Н. 5поокК, Сб. Спатрбегіаїп, О.В. Каіпрохм,

К.М. Нишег, А.М. бл, б. Рі бепоха, М.Н. Негт, І. РабІтап, Е. Раупе, Ю). 5туф, С.

Гоже, К.С. Гууев, 5. Ноулен, В. Неаїу, 5. МиШапа, Н.І. Капсе, М. І/уегей, І..). 5тіпк,

А.С. Пат, Н.У. Согає!), М.М. УаїКег, С. Вогани, ). Ниппе, С. Мого, Е. Сисса, У.Е. Незвв,

М.1.. МесКег, /. Корегв, 5. Отерогу, А. АЦарабадіа, К. Міфіуапапфап, Е. ТоопіШево-

Мой, ). ТнопшШено, Р. Віпря|Іеу, К.М. СШевріє, Ю.Е. Опацеп, К.5. Коппіпреп, С. Спціа, С.

Іопезси-Іігеомхівіє, О.А. затуаре, А.Р. Махуе)І, Ю.). Сатгвоп, С.С. Рацетгвоп, Л.А. ЕгапКІуп,

Р.О. СІауп, І.В. Регегвоп, І..5. УісКег, /.А. Тода, апа 5.С. Соцйрі. 2003. Ав5осіайоп ої

Ше Т-се)) геєеша(гу репе СТІ.А4 ж визсерцбі шу (о ашоіпипипе дізеазе. Майте 423:506-511.

Меграпі, А., Е. П'Адйдіо, М. Лигежісл, А. Регец, Т. Магапабе, К. Іли, К. Гах, С. 5себпеїя,

М. СагмчецЦо, Е. Огвепіро, 5. ЮОепер, 5.). Кодів, ).М. Апзвагі, С. є(ацйдасвег, К. Аа, /.

УіШаптв, /. МагКтапи, М. АїКіпвоп, М.Н. 5ауерії, апа Р. Ніогіпа. 2010. А похеі сПлісаПу теіІеуапі вітагеру (о абговра(ге ашоїттипісу апа гершасе айоіттипнцу іп МОЮ пісе. Оіаре(е5 59:2253-2264.

Умані, 5.М., М. МеСаптпеу-Ргапсів, /.В. АЦеп, Б.В. Роперегу, апа 5.Е. МопеВепу. 1990.

Масгорваве ргодисйоп ої ТОЕ-реїга апа гершайоп Бу ТОЕ-рега. Апп М У Асай 5сі 593:188-196,.

Уаїшйпах, Т.І.., С.У. ВаККег, апа /.А. ВІпевіопе. 1996. СТІ.А-4 Пеапйоп Біоск СЮ28- дерепдепі І сеЦ аспуацйоп. ) Ехр Мей 1853:2541-2550.

Уаїшйпав, Т.1І.., апа У. А. ВІпевсопе. 1998. СТІ .А-4 гтершацсев (оЇІегапсе іпдисйоп апа Т сей ашегепнацоп іп хіхо. / Пптипо! 160:3855-38600.

Уаїшйпав», Т.1.., Ю.Л. Гепзспом, С.У. ВаккКег, Р.5. Ііпвіву, С.). Егеєтап, /.М. Стееп, С.В.

Тротрзоп, апа Т.А, ВіІпевіопе. 1994, СТІ. А-4 сап ГТипспоп ав а перайхе герціацог ої Т сей асоуапоп. Іпипипцу 1:405-413.

Уагегвоивзве, Р., /.М. Реппіпрег, Е. Тітт», А. МакКеврат, А. 5Вапвіпіап, К.Р. Гее, С.В.

Твротрвоп, Н. Отіеввег, апа ТЛ. Мак. 1995, Г.утрпоргоШегайме дібвогаеть мУцВ еапу

Ісфашу іп тісс дейсіспі іп СОа-4. 5сіспсе 270:985-988.

Уеїреї, Р.Н. 1994, СаіІасіову! апа М-асесуІвсаЇастоватіпу! пПотеовіавів: а Типсйоп Їог таттацнап авіа!овіусоргоїеїп гесеріогв8. ВіоР8в8аув : пехув апа геуієху5 іп тоІесціаг, сеЦшаг апа деуеІортепіа! бБіо!ову 16:519-524.

УлсКег, 1..5., /.А. Тода, апа І.В. Регегвоп. 1995. Сепейс сопіго!Ї ої ашопттипе Фабегсев іп

Ше МОЮ тоивс. Аппи Кеу Плтипої 13:179-200.

Уатавіхма, 5., 7.0. Отау, 5. Назпітосо, апа П.А. Ногулі. 2001. А гоїе Тог ТОЕ-Бега іп бе репегайоп апа ехрапвіоп ої СІЗ4-СІ)25-- гегшасогу Т сеЦв тот Пшпап регірвега! Біоод. /

Плтипоїі 166:7282-7289. 7 Вас, І., С. /БВапе, Т. Х1, С.І, Іл1п, І. Тодогоу, Е. Капаее), 5. Гогтап, апа І). /епе. 2008.

Ів міхо-асихаїса С1О3--С04-- тегшасогу Т се!) атеГогасс опроїпе сбгопіс ягапй-устгвив-

Бові дізеаве. Віосй 112:2129-2138. 7 Пепер, 5.0, У.О. Отау, К. ОБізикКа, 5. Уатаріхма, апа Ю.А. Ногуця. 2002. бепегайоп ех хуіхо ої ТОЕ-рега-ргодисіпе герца(огу Т се!8 Пот СЯ-СО25- ргесигвогв8. 7 Плтипої 169:41853-41859.

7/Вои, Х., 5. Вайеу-ВисКігоці, 1..Т. )еКег, апа Л.А. ВІпевіопе. 2009а. Ріависцу ої СІ)

ЕохРЗ() Т сеЦв. Сшт Оріп Пптипоі 21:281-285. 7ои, Х., 5.1. Вайеу-ВисКк(ігои, 1..Т. )еКег, С. Репагапда, М. Магипе;-ПогаеЦа, М. АвпБу,

М. МаКауата, М. Козепіва), апа /.А. ВІпйевіопе. 20095. Іпвтабішу ої Ше папесгірноп Тасіог

Еохр3 Ієад» (о Ше репегайоп ої рафорепіс тетогу Т се/І5 іп міхо. Маг типо! 10:1000-

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Біспецифічний злитий білок, який містить ліганд, специфічний до СТІА-4, і ліганд, специфічний до комплексу РМНС, розділені за допомогою лінкера, де ліганд, специфічний до СТІ А-4, вибирають з СОВ80О (87-1) або СО86 (87-2) і антитіла, специфічного до СТІ А-4, і ліганд, специфічний до комплексу РМНС, вибирають з анти-МНС антитіла і | АС-3.

2. Біспецифічний злитий білок за п. 1, де лінкер являє собою одне або декілька з поліамінокислотної послідовності і Ес-домену антитіла.

3. Біспецифічний злитий білок за п. 2, де поліамінокислотна послідовність являє собою С9 (С1у-

9).

4. Біспецифічний злитий білок за п. 1, де ліганд, специфічний до СТІ А-4, являє собою СОВ80.

5. Біспецифічний злитий білок за п. 4, де СО80О мутований для підвищення специфічності до СТІ А-4.

6. Біспецифічний злитий білок за п. 5, де СО80О являє собою СО80 людини, що містить щонайменше одну з мутацій М/84А, КУТ, К7ТМ, 51090, В1235, 1230, с1241, 5190А, 5201А, ВбЗА, М81А, МО7А і Е196А.

7. Біспецифічний злитий білок за п. 6, де СОВ8О містить мутацію МУ84А або Е196А СОВ80 людини.

8. Біспецифічний злитий білок за п. 1, де ліганд, специфічний до комплексу РМНС являє собою І да-3.

9. Біспецифічний злитий білок за п. 8, де | АС-3 мутований для підвищення специфічності до рРМНеСЇІ.

10. Біспецифічний злитий білок за п. 9, де | АС-3 являє собою | АС-3 людини, що містить щонайменше одну з мутацій А7ЗЕ, Н75БА, А7Б5Е і Н7бЕ.

11. Біспецифічний злитий білок за п. 10, де І АС-3 містить мутацію В75А або В75Е.

А вав веВА В Мне с ее ро шо 5) ой ровиця зики ГГ зняв теки М он ПАНЕ ЛЗ СН ХСВАКСЮЬ : Таз ххх зе чяЕ ТАЛАН «ВМ о 5 УА о соку еше СЕК ся Кк, ть ТТ |. ножу які.

ПАОЛО Є ОИСТО оо ЛНИНЮ тевсоЮЗ Ге іг :

414000-5 шк Щ 12000 3 з 10000 З Я воро- С і Е - -ВОпО З ще 4009 З Шосе 2000. З БЕ ЗИ: й пор вон. ВНУ згілн, а Ка Кей ш 5 І й Гай ше ге Га ку є и и и Не я З ?

Фіг. 2

А в ; - ОО че в ваваж сзяаж|І т ; ІЗ Я я, ре У в. т і я ія, ОО о : Я ще Б є - їоесі в УК еннх г у м і т й; Воді 7 ех; З 1 ї і; І, - ЗНО Її х о о , 3 ; кі 4 ; «Вова п ве Кени, св тв 00003 М ТоклевВ О осях Ж ЕМ р, З що Я ОО ЗЧИ ж 00 ще Гі сек Е дя - де Си КК, Є і ще п 400 гі вв вв - ; сс.

мем. 0 .Бде 8-3 Я І сит існізню 1600 - : 163 - Ще ча -Е жк я ОХ 120 Я он її пи" Ко ; С т кВ - 80 ке ат шо, що айі|: о о К 9 ба ах д Я не Б ще ДО0оЗвБевезжі ому о ЗИ ДЯ ка Я я і пиши Й Й Ї Е З вою? о щж шва . | в Б В В іш КОХ у Е Е Ж В т В5В з контрольне ТЕО В5-нантитіле проти ТО-В з ше ня ше чо вел де : їв 7 НАШ Ка о и о Ї С Но з ку шо ! ча вк: Птн ОА щи й і а о хо. ! т ру: і т? ее жо г Н ше В М. і мно ек ав Е їе хе. і з й оо : ше нив і с нан У АЕКЄ вирішив шані шир; и и Ве Ми ни ше е- с Б - Що х вс ї З а обо а? ше ше ши Не Гохр3

Фіг. 3

А ко Кі в Та: З ож я дон : п-у ВО0Ю а Ж: : 5 | - шою ож : ее шо Я що : Ж. Воов- ; Шия : ш І; А СИ ї І іно дя НН : ой да -я ши ше су ою іх ШИН. ! - 2000 З ЗА жа ! І и а В . У «т зво. ЩЕ х йде х. ще : ле ОО : шо ОВ. т ще Я З ' З дк ж БЕК осади я т ох - За х НЕ ІВ : - п | бо їю Ж Но АННІ : --4 ж т : - дв

1. дже пе: щі зтйпуежритут с Ку ед ЧІ й ї и зеритлинних що р у, | о янав я уки і З Ав. люкс - 7: се око З М І и НН В і - т 1 Е зоо - й в я Нв -- и : Я рою 2 ОО | но ЛА осжож ще : Е їй що | - О0ю ! й ЗЕ : ПЛКЕ й Же щит, ПК х й т т ї та її Ко ! ! ! ' - с не Ж є р Е ж ж 50. ск т тк СЯ як се: - ке ячеб ВВ СТАНЬ НЕ Же : ї ня Нр : : та в'я ! : ЖІ Ії т. Ка Н й. ТЕ. ро Я ї дя Я : не ее : НЕО . : : оси сожажще роя для Я ее ЗЕ Се Ше як : ся КЕ пк ЕЕ жене Пи нн Еш за ох в. пе а жо ОВ : так Бе прое ях М ОК ОО ек ПЕ ше ши Мер ТВ

7. яса жо п щи ще: пе ше я СЕБЕ

Фіг. 4

АХ ТОВ Ве Т-регуляторні клітини 0 Т-регуляторні клітини се ШИ що ко 00» звання ж ж : Ж х. Й реч яса. В их яко Б0- се В і ! ! Тл тона се В Ї я ; і ЩЕ 40 й й як д : ще в г й хль х - 7 НЯ г г Ї К К то жо. -- ВШ й і яв Как їз 7 - я 1 М Б ШЕ Со жд М ий Ку й Б т. й вищі; их її З й - а Мей І Маші М Я ДА я ШНМ кі «8 х Ж -щшОо Ол водо вах г А БЕ БО БЕ Я оч що шо шо БЕ Б КЕ ще ВО БОШ шо що ка мош - дО ох ї- та сво ВЕ СВош о стшов ях о-ви Жов во шо вк щ ж не я ШИЯ хх Б Ж Б в вк З Кс с ни се В мож БЖ б я В шо Ж св ИН ех ши ши ши нн о В ТОовБВЛ ВВ рей Терегуляторні клітини Терегуляторні клітини ро т що шк ром о Й о БО А вв КІ в ж ВО й ВЕ ще ой ПИ п що Ж Б і Го ше 8-3 г. о що йо Кт. ща Ж и Не БЕ я т й на лоно ще ож ее о вк ве їй си Я нн оо МТ ВИ В в Гери ми рен не Б те ге това ша й ше ВО ня ія І нем З | 7 Ї Її ї кв - а БЕ -о їх що я товщ ж 0 оз пи в и Не Киів! На - Яя- МЕ г я Е Не к3 гля що ВО ях жо : Бо Ж шк Ж й Б ше й 8 5 ЕЕ 8 Б 5 5 В й д'Є Б З 5 ВЕ а СІШШННеХ ях х Ж 7 ще м нн НЕ ІН НН и НН С УМ осв б 85 Об ско 8 в В Б Ж 5 Я Б я НН НН НИ ех НЕ п НН В 5 ОЕ «й Б Е ЩО Ж ш жо в тк ва шко є

Фіг. 5 ши ше БАКТООО вто шия Чег73 з й я ; і | - ! а й ме І ік і М ! З Ж од. | г ! з р з ве ще І у шо зр ня за ЗВ в Ї А нії. . ГЕС ї ! Х. Я що а / їх й С сера з пава ле зер я іса шк б; неон т фею тус й не ою по ой ЗМО пд УВО стр ттннннн З с- АКТ ї - ВОК, 400 -4 рова 73 | зо0о-3 о ке ї ше п З 300: мА 2УЮ п оре я о Ше З жо а - Е й щ еЕ Гсй Ж й. З ї Е й 5 8 ке о кайщі мі

Фіг. 6

Ф Індукція І- шо т регуляторних клітин Повторна стимуляція фс) с що й пенеттстттннтя пил ще Сов ТЯ пики я ЗБ тіж. й ЗК ЗО шик Пе Й аа ск а З БУ З ту Ж, пз в в. зо В щі щу де Е й яку Б З в'я поза Я і З : не Бл се ву й 24 ВеЗЬ п Йо Е ав ла пох зе х ВН МАК НИ е З знай об 4 пови? зу З поза ю що шип у в 5 ББЖ Ти ВБИТІ баян Ге ШК Де! В вола Шоу У а яАшки ре ши ши ши Ше Й вот я Е о С З У нон Й ун і ке Ед ! Ну Ії ча? Е; "З пи 1 до ох 2 В ! - З де : сл, мл лах зв і й З тин важ пер ж і и те вва МАК ШЕ сті 3 -ї й 7 ; к шин - поїв шо о Ба по шо Бохрі

Фіг. 7 ре -- 0000 Я ВОбо0- Ж т7о0000- х го - : Ге тк п бБ0О0О Ж оч т 50000 у ї- 300005 200004 ; ч-) ж 10000 е ще ща 1 Е Ї З 4 че та Часі(тодо В Зв'язування В5В'з Бек п ре нак че , що | жен ОО НМ й рол Ки Й І зе ЗО НМ Ж оо й таня осн БО НМ що ве й Давня ее В НМ З ії і я ран пом ненн т І й й Вина ВЕН ТО ЗЕКЕТЕЛЕДА ДАНЕ КАЛ А КВ КН д ля ДБ лася нтнероновнняистннои етикетка б Бо лб0 бо боб обо Об зво же Час (тед.) щщ Зв'язування пцвО з Бека цих - О зейтч -- ДО0й М я і и их нн ек ном ВІ шо з дра ; ; З Га щи дра" ЕМ И ВИМИ, Хек 625 М Ж В ; Я Ж рання ій венхо з о ораоровььох; 0 50 00 я5а бе жа 300 Зб6 Не Час (год)

Фіг. 5 пеіжакучсуєуМ за Мікоігчазліюттих сутичка іти вузах ятькотт утіх Мі чи Мт сикчраєеазадута таять М ік хз ній фі Ма Мис тазі іх ника яні ти об ж юю Кв я я ж в вся ж я вояк в в фо Є Ж я яю я жо тя ж ЖЖ ож йо Жов жк во кою ковтя йо яву к я жов «еВ лих же ява ва ювжютитютх т жати ка я яз жчоюжж ються глюсюоасю «Му яю хто освтя жжохткоя вок ки нн А ЧЕ м М А а че о и а Є Р а МР и Я о чи Р М и м и г о и че вич пи и а и в чи и м и с ин м ше вч м с о с о с М В и РН чн яки «Мусл юки кві вт й вати вт» ее чуєчекююит иа же вив жжеиуюкди шт вжити юка жалю шини ш и ша ж шви и ж шлю шт и шир м чл а шити рю чи ша ча нич ши о шен Цукри/В5В шк Маноза Сіалова | Відношення Фукоза 1 СЗІСМАЄ | Галакгоза і кислота сіалової кислота ши до галактози Мольлясль | 8-0 ТЕ За | лено | 93 0.68

Фіг. 9

Но Е

Е х.0 во ес ве ан и Ж -д 4.8 е к . й » й що 8 В шк: св а вешЩю ЗЕ у к Й й жа ак їв ве Що о Кк Е ш 57.0 Б де х я о с, ша ще Вев Фізюлогічний розчин В о сонне Зо ни Фізіологічний розчин віки 6О0- -- 8658 а вні т 50 і и оо п - 4 сдроооффнносвь їй Гм Од в й в-во - . я о 12 14 16 15 20 22 24 26 28 30 Вік (тижні)

Фіг. 10 бо

А ВИ в 186 В ях шо Ка а 2 дк пе Е 8 й - 6ЛЯ в ш- не 8 збе ж ЕН ї- | іш й Шжіж ни ; 4- ак їв й ; їх й за Як що ча З їх ДЕН " ! пиши зм і й МУв «Фізіологічний СТА ТЕ ївода мин розчин В 90 не пе сення -й- Фізіологічний розчин . 0-3 ще | я-їй - Я я ІнСтда миші дв -- ВІВ Ши с-й з дО не спас ж т 50 ; и і щі росу | Г ; Ко й : З а що че т 20-34 ну ча юд ге -- 9 ЛЬ 3 ї5 ї7 19 91 25 95 29 Вік Стижні)

Фіг. 11

НК ; се - че З еще "ті ткі й я як чек Фізіологічний розчин г | по - 76- -фнн БА чи бом : Ка 34 А ле він ї-8нН й ха З ' - Я що м чи З їж ОО 15 Я хо зро ох 77 7531 зх Вік стижні) В екв нас Інсулін свій охо Б и ІК З Ов М НИ МОЯ с С 5: є Ку Ж хв А ВО НН ВВ ЛИН НН о яв ОНИ о о Я у вет я З о - ви в и ше ща и о БИ о и НЕ НН ННІ о НЕ ще 00 Ота ше 0 а ИН - шо - шннне ак 5 З ВИН НЕ ой Е о і. ще е ї; ОКО ВК ВН З НК Он ж. М се ДВ й З с її ще С шт б» ФО лю п. й зе ЕЕ. ОК и о о ж у дай тн 0 Я В о сао що с; г: 000 с а. ОО у М о он НН ен В ОБ УК: ХА о. ХХ Ко се В НЯ Ху ЖЖ ЕД ЕНН Те, В КН Б я о є о ВЕОКОКй ко ОН НИ БУ З 8. КО ЗОН а СНИ зх пи Й я Я нако ле Же е Ес. 5 ще ЕК м ВИ М Й зок МО ОО ДИКУ З й і арех ка 00 ин, її.

0. о її. на 0. й о 000 Еш ть . с СС Й : єть ОО КО Ж си: ША ке о о ен и дез

Фів. 12