RS58219B1 - Rekombinantna bakterijska ćelija domaćina za ekspresiju proteina - Google Patents

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na rekombinantni bakterijski soj domaćina, posebno na E. coli. Pronalazak se takođe odnosi na postupak za proizvodnju proteina od interesa u takvoj ćeliji.

Pozadina pronalaska

[0002] Bakterijske ćelije, kao što je E. coli, se obično koriste za proizvodnju rekombinantnih proteina. Postoje mnoge prednosti korišćenja ćelija bakterija, kao što je E. coli, za proizvodnju rekombinantnih proteina naročito zbog svestrane prirode bakterijskih ćelija kao ćelija domaćina koje dozvoljavaju inserciju gena preko plazmida. E. coli se koristi za proizvodnju mnogih rekombinantnih proteina, uključujući i humani insulin.

[0003] Uprkos mnogim prednostima korišćenja bakterijskih ćelija za proizvodnju rekombinantnih proteina, još uvek postoje značajna ograničenja uključujući teškoće proizvodnje proteina osetljivih na proteaze. Proteaze igraju važnu ulogu u razgradnji starih, oštećenih ili nepravilno savijenih proteina u periplazmi i citoplazmi E. coli. Proteaze bakterija degradiraju rekombinantne proteine od interesa, čime često značajno smanjuju prinos aktivnog proteina.

[0004] Identifikovane su brojne bakterijske proteaze. Identifikovane su E. coli proteaze uključujući Proteazu III (ptr), DegP, OmpT, Tsp, prlC, ptrA, ptrB, pepA-T, tsh, espc, eatA, clpP i Ion.

[0005] Tsp (takođe poznat kao Prc) je 60kDa periplazmička proteaza. Prvi poznati supstrat Tsp-a je bio Penicilin-vezujući protein-3 (PBP3) (Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli; Nagasawa H, Sakagami Y, Suzuki A, Suzuki H, Hara H, Hirota Y. J Bacteriol. 1989 Nov;171(11):5890-3 i Cloning, mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3; Hara H, Yamamoto Y, Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y. J Bacteriol. 1991 Aug;173 (15):4799-813) ali je kasnije otkriveno da je Tsp takođe u stanju da cepa proteine na repu faga i zato je preimenovan u proteazu specifičnu za rep (Tsp) (Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:295-299 (1992)). Silber sa saradnicima (Delecija prc(tsp) gena) je dao dokaze za dodatnu proteolitičku aktivnost specifičnu za rep u Escherichia coli K-12; Silber, KR, Sauer, RT; Mol Gen Genet 1994242: 237-240) opisuje soj sa prc delecijom (KS1000) u kojem je mutacija stvorena zamenom segmenta prc gena sa fragmentom koji sadrži Kan<r>marker.

[0006] Smanjenje Tsp (prc) aktivnosti je poželjno za smanjenje proteolize proteina od interesa. Međutim, utvrđeno je dać elije kojima nedostaju prc proteaze pokazuju termosenzitivni rast pri niskoj osmolarnosti. Hara i saradnici su izolovali termorezistentne revertante koji sadrže ekstragenske supresorske (spr) mutacije (Hara i saradnici, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)). Spr je 18kDa periplazmička proteaza vezana za membranu a supstrati spr-a su Tsp i peptidoglikani u spoljnoj membrani uključeni u hidrolizu ćelijskog zida tokom ćelijske deobe. Spr gen se označava sa UniProtKB/Swissprot P0AFV4 (SPR_ECOLI).

[0007] Poboljšani sojevi deficijentni u proteazi koji sadrže mutirani spr gen su ranije opisani. Chen et al. opisuju konstrukciju sojeva E. Coli koji nose različite kombinacije mutacija u prc (Tsp) i drugoj proteazi, DegP, stvorene amplifikovanjem uzvodnih i nizvodnih regiona gena i njihovom ligacijom za vektor koji sadrži markere za selekciju i sprW174R mutaciju (High-level accumulation of a recombinant antibody fragment in the periplasm of Escherichia coli requires a triple-mutant (ΔDegP Δprc sprW174R) host strain (Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. Biotechnol Bioeng. 2004 Mar 5;85(5):463-74). Otkriveno je da kombinacija ΔDegP, Δprc i sprW174R mutacije obezbeđuju najviše nivoe lakog lanca antitela, teškog lanca antitela i F(ab')2-LZ. EP1341899 opisuje soj E. coli deficijentan u hromozomskim DegP i prc koji kodiraju DegP i Prc proteaze, i sadrže mutirani spr gen koji kodira protein koji potiskuje razvoj fenotipova koje ispoljavaju sojevi koji nose prc mutante.

[0008] Drugi poboljšani sojevi deficijentni u proteazi koji sadrže mutacije i u Tsp i u spr su opisani u WO2011/086136 i WO2012/013930.

[0009] Sojevi opisani u WO02/48376 su lac<->i ne mogu rasti u kulturama u kojima se kao izvor ugljenika koriste timidin, fukoza ili maltoza. Ovo može biti ozbiljan nedostatak sojeva namenjenih za upotrebu u komercijalnim razmerama. Mogu postojati dodatni nedostatci povezani sa tim sojevima, na primer nedostatak proizvodnje alkalne fosfataze. Ovo poslednje je periplazmički protein uključen u upotrebu fosfata za medijume kultura.

[0010] Određeni proteini pokazuju aktivnost peptidil-prolil izomeraza i/ili aktivnost izomeraza i/ili aktivnost šaperona i utvrđeno je da obezbeđuju povoljne karakteristike kada se koriste u ćelijskim linijama namenjenim za ekspresiju rekombinantnih proteina.

[0011] Ovaj pronalazak obezbeđuje nove bakterije koje nose i Tsp, i spr mutacije i najmanje jedan gen koji kodira protein ili proteine sposobne da olakšaju savijanje proteina čime se obezbeđuju povoljna sredstva za proizvodnju rekombinantnih proteina.

Rezime pronalaska

[0012] Ovde je otkrivena rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija koja sadrži:

a. mutirani spr gen koji kodira spr protein koji ima mutaciju na jednoj ili više amino kiselina odabranih od D133, H145, H157, N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, V135, L136, G140, R144 i G147 i

b. gen ili gene sposobne za ekspresiju ili prekomernu ekspresiju jednog ili više proteina sposobnih da olakšaju savijanje proteina, poput FkpA, Skp, SurA, PPiA a PPID

pri čemu se smanjuje ćelijska aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg tipa.

[0013] Zatim je otkrivena rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija koja kodira:

a. mutirani spr gen koji kodira spr protein koji ima mutaciju na jednoj ili više amino kiselina odabranih od D133, H145, H157, N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, V135, L136, G140, R144 i G147,

b. gen ili gene sposobne za ekspresiju ili prekomernu ekspresiju jednog ili više proteina koji mogu da olakšaju savijanje proteina, poput FkpA, Skp, SurA, PPiA i PPiD,

c. gen sposoban da eksprimira protein od interesa, na primer antitelo ili njegov vezujući fragment

pri čemu ćelija ima smanjenu aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg tipa a ostatak genomske DNK ćelije je izogen sa divljim tipom ćelije iz koje je izvedena rekombinantna ćelija.

[0014] U jednom slučaju, genom ćelije je izogen sa bakterijskom ćelijom divljeg tipa osim mutiranog spr gena, čija modifikacija je potrebna za smanjenje aktivnosti Tsp proteina u odnosu na ćeliju divljeg tipa i gena koji eksprimiraju protein koji može da olakša savijanje proteina.

[0015] Ovde je zatim, otkrivena rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija koja ima smanjenu aktivnosti Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg tipa i sadrži mutirani spr gen koji kodira spr protein, pri čemu je genom ćelije izogen sa bakterijskom ćelijom divljeg tipa izuzev modifikacije potrebne za smanjenje aktivnosti Tsp proteina u poređenju sa divljim tipom ćelije, mutiranog spr gena i gena uvedenih za ekspresiju proteina sposobnog da olakša savijanje proteina.

[0016] Ćelije koji su ovde otkrivene pokazuju povoljan rast i povoljne fenotipove proizvodne proteina.

[0017] Dodatno je ovde otkriven postupak za proizvodnju proteina od interesa koji obuhvata ekspresiju proteina od interesa u rekombinantnoj gram-negativnoj bakterijskoj ćeliji kako je gore definisano.

Kratak opis crteža

[0018]

Slika 1 prikazuje rezultate fermentacija za količinu od 5L izvedenih sa različitim kombinacijama ćelija domaćina i "šaperona". W3110 je soj divljeg-tipa E. coli. Različite kombinacije su: divlji tip bez šaperona; divlji tip sa FkpA i Skp; MXE016 mutirani spr i Δ Tsp kako je objavljeno u WO2011/086136; MXE016 i FkpA; MXE016 i Skp; MXE016 i Skp; MXE016 i FkpA i Skp; MXE017 objavljeno u WO2011/086136; MXE017 i FkpA i Skp

Slika 2 prikazuje eksperimentalne rezultate varijacije brzine hranjenja za post indukcione brzine hranjenja od 5.4, 6.0 i 7.0 g/h, za MXE016 većina dodatnog Fab' dobijenog pri većim brzinama hranjenja je izgubljena u supernatantu.

Slike 3A, B prikazuju vijabilnost ćelija (3A) i Fab' titre (3B) za MXE016 /- FkpA.

Slika 4 prikazuje podatke primarne regeneracije pri proizvodnji probne količine od 20L.

Slika 5 prikazuje primarnu regeneraciju na SDS-PAGE bojenom gelu u neredukujućim uslovima proizvodnje probne količine od 20L. Osim traka za FkpA, proteinski profili dva soja izgledaju veoma slično.

Slika 6 prikazuje His-tag western blot u neredukujućim uslovima za proces proizvodnje probne količine od 20L. Detektovan je FkpA pune dužine i odgovara traci ~30kDa i kako je očekivano, nije detektovan signal u samom MXE016.

Slika 7A-C prikazuje razne mutacije u raznim genima

Slika 7D je grafički prikaz kreacije vektora koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela (LC), teški lanac antitela (HC), a FkpA polinukleotidnu sekvencu i/ili Skp polinukleotid

Slika 8 prikazuje razne polinukleotide i aminokiselinske sekvence

Kratak opis sekvenci

Detaljan opis poželjnih aspekata pronalaska

[0020] Ovi pronalazači obezbeđuju bolje rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije pogodne za ekspresiju rekombinantnog proteina od interesa.

[0021] U jednoj realizaciji protein je antitelo ili vezujući fragment, a naročito terapeutsko antitelo.

[0022] Posebno, ovi pronalazači su obezbedili poboljšane rekombinantne gram-negativne bakterijske ćelije pogodne za ekspresiju rekombinantnog proteina od interesa inkorporiranjem jednog ili više gena koji kodiraju protein za olakšavanje savijanja proteina, u gram-negativne bakterijske ćelije koje nose mutirani Tsp gen i mutirani spr gen

[0023] U jednoj realizaciji gen ili geni, koji kodiraju protein za olakšavanje savijanja proteina, su integrisani u ćelijski genom, na primer, da obezbede stabilnu ćelijsku liniju. U jednoj realizaciji rekombinantni protein za ekspresiju (kao što je terapeutski protein) se transfektuje u stabilnu ćelijsku liniju da obezbedi ekspresiju željenog rekombinantnog proteina.

[0024] U jednoj realizaciji gen ili geni, koji kodiraju protein za olakšavanje savijanja proteina, se obezbeđuju na jednom ili više plazmida, na primer plazmidi se privremeno transfektuju u ćeliju da se obezbedi ćelijska linija iz ovog otkrića.

[0025] U jednoj realizaciji gen ili geni, koji kodiraju protein za olakšavanje savijanja proteina, se obezbeđuju na plazmidu koji takođe sadrži kodirajuću sekvencu za rekombinantni protein od interesa.

[0026] U jednoj realizaciji gen ili geni, koji kodiraju protein za olakšavanje savijanja proteina, se obezbeđuju na plazmidu koji ne sadrži kodirajuću sekvencu za rekombinantni protein od interesa.

[0027] U jednoj varijanti pronalazak obezbeđuje nove sojeve koji imaju poboljšan fenotip rasta ćelija u poređenju sa divljim tipom bakterijskih ćelija i ćelija koje nose samo mutirani Tsp gen ili mutirani Tsp gen i mutirani spr gen.

[0028] Ćelije iz ovog pronalaska poseduju mnoge prednosti. Pronalazači su neočekivano otkrili da ćelije prema predstavljenom opisu mogu pokazivati povećanu vijabilnost ćelija u poređenju sa divljim tipom ćelije ili ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen i mutirani spr gen.

[0029] Ćelijska vijabilnost je od posebnog značaja u praktičnom smislu, pošto su nevijabilne ćelije sklone ćelijskoj lizi i stvaranju DNK fagmenata u kulturi. Ovi DNK fragmenti povećavaju, teškoće, cenu i trošak za prečišćavanje željenog proteina. Zbog toga minimiziranje DNK fragmenata iz liziranih nevijabilnih ćelija predstavlja značajno pitanje za efikasnu proizvodnju rekombinantnih proteina, videti na primer US 6.258.560.

[0030] Ćelijska vijabilnost se može meriti bilo kojom od brojnih rutinskih tehnika, na primer upotrebom fluorescentne boje i FACS analize ili slično.

[0031] Konkretno, ćelije prema predmetnom pronalasku uopšteno pokazuju smanjen fenotip ćelijske lize u poređenju sa ćelijama koje nose mutirani Tsp gen i mutirani spr gen.

[0032] Štaviše, novi sojevi mogu smanjiti “curenje” proteina iz ćelija i omogućiti produženu periplazmičku akumulaciju u poređenju sa ćelijama koje nose mutirani Tsp gen i mutirani spr gen. To je posebno važno pošto, na primer, kada su ukupni nivoi ekspresije ciljanog proteina slični ali se više proteina akumulira u periplazmi ili se manje proteina akumulira u supernatantu pošto taj soj manje curi nego kod ćelija koje imaju slabije izraženo svojstvo manjeg curenja, generalno će biti pogodniji za proizvodnju u industrijskim razmerama pošto olakšava regeneraciju proteina.

[0033] Zatim, ćelije prema predstavljenom opisu mogu pokazivati povećani prinos proteina od interesa u odnosu na bakterijske ćelije divljeg tipa ili ćelije koje sadrže mutirani Tsp gen i mutirani spr gen u odsustvu gena koji kodiraju protein kao što je FkpA. Poboljšan prinos proteina može biti periplazmički prinos proteina i/ili prinos proteina u supernatantu. U jednoj realizaciji ćelije iz predmetnog pronalaska pokazuju povećan prinos periplazmičkih proteina u poređenju sa ćelijom koja nosi mutirani Tsp gen i mutirani spr gen zbog smanjenog curenja iz ćelije.

[0034] Rekombinantne bakterijske ćelije mogu biti sposobne da brže proizvode protein od interesa i, stoga, ista količina proteina od interesa može biti proizvedena za kraće vreme u poređenju sa bakterijskom ćelijom divljeg tipa ili ćelijom koja sadrži mutirani Tsp gen i mutirani spr gen. Brža proizvodnja proteina od interesa može biti posebno značajna tokom početnog perioda rasta ćelije, na primer tokom prvih 5, 10, 20 ili 30 sati nakon indukcije proteinske ekspresije.

[0035] Ćelije prema prikazanom pronalasku poželjno eksprimiraju maksimalni prinos u periplazmi i/ili medijimu od oko 1.0g/L, 1.5g/L, 1.8g/L, 2.0g/L, 2.4g/L, 2.5 g/L, 3.0 g/l, 3.5g/L ili 4.0g/L proteina od interesa.

[0036] Psim toga, ekspresija proteina ili proteina koji olakšavaju savijanje dodatno optimizira ekpresiju maksimiziranjem proteina dobijenih pravilnim savijanjem. Stručnjaku je dobro poznato da je odgovarajuće savijanje od suštinskog značaja za biološku funkciju, pa je tako i izolacija proteina sa željenim savijanjem od vitalnog značaja. Ovo je posebno važno kada je protein eksprimiran u gram-negativnoj ćeliji pošto eksprimirani protein neće biti prirodan za ćeliju i stoga ćelija možda neće automatski eksprimirati protein sa odgovarajućim savijanjem. Neodgovarajuće savijanje se može eksprimirati kao agregacija ili druge nečistoće. Izolacija željenog proteina može zahtevati obimno prečišćavanje koje ima uticaj na troškove i može da dovede do niskog prinosa željenog proteina. Maksimiziranje količine pravilno savijenog proteina koji se eksprimira minimizira količinu neophodnog prečišćavanja i može optimizirati iskoristiv prinos i stoga je povoljno.

[0037] Prednosti povezane sa ekspresijom proteina koji olakšava savijanje uključuje jedno ili više od sledećeg: Povećan titar (npr. povećan na oko 1.05g/L u odnosu na divlji tip 0.5g/L); Veću vijabilnost pri žetvi (npr> 95%); Povećan titar sa povećanjem brzine hranjenja (bolji izgledi za razvoj procesa); Povećan titar u komercijalnim razmerama proizvodnje kao što je količina od 20L i veća vijabilnost pri žetvi; i lakše bistrenje ekstrakta, naročito za količinu od 20L.

[0038] Ćelije koje su obezbeđene predmetnim pronalaskom imaju smanjenu aktivnosti proteaze Tsp u poređenju sa ćelijama divljeg tipa, što može smanjiti proteolizu proteina od interesa, posebno proteina od interesa koje su proteolitički senzitivni na Tsp. Prema tome ćelije koji su obezbeđene predmetnim pronalaskom mogu da obezbede veći prinos intaktnih proteina, poželjno proteina od interesa i niži prinos, ili po mogućnosti bez proteolitičkih fragmenata proteina, poželjno proteina od interesa, u odnosu na bakterijsku ćeliju divljeg tipa.

[0039] Ovde su opisane ćelije koje nose samo minimalne mutacije genoma potrebne da se uvedu modifikacije prema predmetnom opisu. Bakterijska ćelija se može razlikovati od bakterijske ćelije divljeg tipa samo po jednoj ili više mutacija u spr genu i modifikaciji potrebnoj da se smanji aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg tipa kako bi npr. gen ili geni koji kodira(ju) protein za lakše savijanje proteina, mogli privremeno biti uvedeni u ćeliju, npr na plazmidu. Ćelije koje su ovde otkrivene ne nose nikakve druge mutacije koje mogu imati štetan uticaj na ćelijski rast i/ili sposobnost eksprimiranja proteina od interesa.

[0040] Prema tome, jedna ili više rekombinantnih ćelija domaćina koje su ovde opisane mogu pokazati poboljšanu ekspresiju proteina i/ili poboljšane karakteristike rasta u poređenju sa ćelijama koje sadrže dalje genetskim inženjeringom izvršene mutacije genomske sekvence. Ćelije koje su ovde opisane su pogodnije za upotrebu za proizvodnju terapeutskih proteina u poređenju sa ćelijama koje sadrže dodatne disrupcije u ćelijskom genomu.

[0041] Stručnjak će lako moći da testira kandidata - ćelijskog klona da vidi da li ima željeni prinos proteina od interesovanja pomoću metoda dobro poznatih u tehnici uključujući metodu fermentacije, ELISA i protein G HPLC. Pogodni postupci fermentacije su opisani u Humphreys D P, et al. (1997). Formation of dimeric Fabs in E. coli: effect of hinge size and isotype, presence of interchain disulphide bond, Fab’ expression levels, tail piece sequences and growth conditions. J. IMMUNOL. METH.

209: 193-202; Backlund E. Reeks D. Markland K. Weir N. Bowering L. Larsson G. Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov’t Journal of Biotechnology. 135(4):358-65, 2008 Jul 31; Champion KM. Nishihara JC. Joly JC. Arnott D. Similarity of the Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceutical fermentation processes. [Journal Article] Proteomics. 1(9):1133-48, 2001 Sep; and Horn U. Strittmatter W. Krebber A. Knupfer U. Kujau M. Wenderoth R. Muller K. Matzku S. Pluckthun A. Riesenberg D. High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli, using an optimized expression vector and high-cell-density fermentation under non-limited growth conditions, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov’t Applied Microbiology & Biotechnology.

46(5-6):524-32, 1996 Dec. Stručnjak bi takođe lako mogao da testira izlučeni protein da vidi da li je protein pravilno savijen pomoću metoda poznatih u tehnici, kao što su HPLC proteina G, cirkularni dihroizam, NMR, Rendgenska kristalografija i metoda merenja afiniteta epitopa.

[0042] Predmetni pronalazak će sada biti opisan detaljnije.

[0043] Termini "protein" i "polipeptid" se koriste naizmenično, osim ukoliko kontekst ne nalaže drugačije. "Peptid" se odnosi na 10 ili manje aminokiselina.

[0044] Termin "polinukleotid" obuhvata gen, DNK, cDNK, RNK, mRNK itd osim ako kontekst ne nalaže drugačije.

[0045] “Smanjena aktivnost" kako je ovde korišćeno se odnosi na "niže nivoe enzimske aktivnosti, poput Tsp enzimske aktivnosti u poređenju sa odgovarajućom enzimskom aktivnošću soja divljeg tipa, mereno u pogodnom testu pod sličnim uslovima. U jednoj realizaciji smanjena aktivnost je 50% ili manje, 40% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje, ili 5% ili manje od enzimske aktivnosti divljeg tipa komparatora. U jednoj realizaciji analize za određivanje nivoa enzimske aktivnosti se izvode istovremeno kada rezultati za direktno poređenje treba da se koriste.

[0046] Direktno poređenje kako se ovde koristi se odnosi na poređenje brojnih vrednosti dva ili više rezultata u svrhu procene smanjene aktivnosti kao što je ovde definisano ili rangiranja rezultata aktivnosti dobijenih iz eseja.

[0047] Kako se ovde koristi, termin "obuhvata" u kontekstu ove specifikacije treba tumačiti kao "uključuje".

[0048] Ćelija divljeg tipa kako se ovde koristi, se koristi naizmenično sa nemutirana ćelija ili ćelija kontrole.

[0049] Nemutirana ćelija ili ćelija kontrole u kontekstu predmetnog pronalaska označava ćeliju istog tipa kao i rekombinantna gram-negativna ćelija iz pronalaska pri čemu ćelija nije modifikovana da nosi gornji Tsp protein smanjene aktivnosti i da nosi mutirani spr gen. Na primer, nemutirana ćelija može biti ćelija divljeg tipa i može biti izvedena iz iste populacije ćelija domaćina kao ćelije iz pronalaska pre modifikacije za uvođenje neke mutacije.

[0050] Izrazi "ćelija", "ćelijska linija", "ćelijska kultura" i "soj" se koriste naizmenično.

[0051] Izraz "fenotip ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen" u kontekstu ovog pronalaska, znači fenotip koji ispoljava ćelija koja ima mutirani Tsp gen. Tipično ćelije koje sadrže mutant Tsp gena mogu da liziraju, naročito pri visokim gustinama ćelija. Liza ovih ćelija dovodi do toga da neki rekombinantni protein curi u supernatant. Ćelije koje nose mutirani Tsp gen takođe mogu da pokazuju termosenzitivni rast pri niskoj osmolarnosti. Na primer, ćelije ne pokazuju ili imaju smanjene brzine rasta ili ćelijsku smrt u hipotoničnom medijumu na visokoj temperaturi, kao što je na 40 °C ili više.

[0052] Termin "izogen" u kontekstu ovog pronalaska, znači da genom ćelije iz predmetnog pronalaska ima suštinski istu ili istu genomsku sekvencu u poređenju sa divljim tipom ćelije iz koje je ćelija izvedena osim mutiranog spr gena i modifikacije potrebne za redukciju aktivnosti Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg tipa. U ovoj realizaciji genom ćelije ne sadrži druge veštačke ili genetskim inženjeringom dobijene mutacije. U jednoj realizaciji, ćelija prema predmetnom pronalasku može imati suštinski istu genomsku sekvencu u poređenju sa ćelijom divljeg tipa osim mutiranog spr gena i modifikacije potrebne da se smanji aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg tipa uzimajući u obzir sve prirodne mutacije koje se mogu javiti. U jednoj realizaciji, ćelija prema predmetnom pronalasku može imati potpuno istu genomsku sekvencu u poređenju sa ćelijom divljeg tipa osim mutiranog spr gena i modifikacije potrebne da se smanji aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg tipa.

[0053] Izraz "divlji tip" u kontekstu predstavljenog pronalaska označava soj gram-negativnih bakterijskih ćelija kakav se može javiti u prirodi ili se može izolovati iz prirodnog okruženja, koji ne nosi nikakve genetski modifikovane mutacije. Primer soja divljeg tipa E. coli je V3110, poput V3110 K-12 soja.

[0054] Bilo koja pogodna gram-negativna bakterija se može koristiti kao roditeljska ćelija za proizvodnju rekombinantne ćelije iz predmetnog pronalaska. Pogodna gram-negativna bakterija uključuje Salmonella tiphimurium, Pseudomonas fluorescens, Ervinia carotovora, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii i E. coli. Poželjno roditeljska ćelija je E. coli. Bilo koji pogodan soj E. coli se može koristiti u ovom pronalasku, ali se poželjno koristi soj W3110 divlji tip, poput K-12 W3110.

[0055] Nedostatak povezan sa bakterijskim sojevima deficijentnim u proteazi koji su prethodno kreirani i korišćeni za ekspresuju rekombinantnih proteina je što oni sadrže dodatne mutacije gena uključenih u ćelijski metabolizam i replikaciju DNK kao što je, na primer phoA, fhuA, lac, rec, gal, ara, arg, thi i pro u sojevima E. coli. Ove mutacije mogu imati mnogo štetnih uticaja na ćelije domaćina, uključujući uticaj na rast ćelija, stabilnost, prinos ekspresije rekombinantnog proteina i toksičnost. Sojevi koji imaju jednu ili više od ovih genomskih mutacija, posebno sojeva koji imaju veliki broj ovih mutacija, mogu pokazivati gubitak kondicije koja smanjuje bakterijsku stopu rasta do nivoa koji nije pogodan za industrijsku proteina. dalje, neki od gore navedenih genomske mutacije mogu uticati na druge gene u cis i/ili trans na nepredvidive štetne načine menjajući tako fenotip, fizičko stanje i proteinski profil soja. Zatim, upotreba jako mutiranih ćelija generalno nije pogodna za proizvodnju rekombinantnih proteina za komercijalnu upotrebu, naročito za terapiju, jer takvi sojevi obično imaju defektne metaboličke puteve i stoga slabo ili uopšte ne rastu u minimalnim ili hemijski definisanim medijumima.

[0056] U jednoj realizaciji ćelija prema predmetnom pronalasku je izogena bakterijskoj ćeliji divljeg tipa osim mutiranog spr gena i modifikacije potrebne da se smanji aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg tipa. Samo minimalne mutacije su napravljene u ćelijskom genomu za uvođenje ovih mutacija. Ćelije ne nose nikakve druge mutacije koje mogu imati štetne efekte na ćelijski rast i/ili sposobnost ekspresije proteina od interesa. Shodno tome, jedna ili više rekombinantnih ćelija domaćina prema predmetnom pronalasku mogu pokazati poboljšanu ekspresiju proteina i/ili poboljšane karakteristike rasta u poređenju sa ćelijama koje sadrže dodatno genetskim inženjeringom izvedene mutacije genomske sekvence. Ćelije koji su obezbeđene predmetnim pronalaskom su takođe pogodnije za primenu u proizvodnji terapeutskih proteina u odnosu na ćelije koje sadrže dodatne disrupcije u genomu ćelije.

[0057] U poželjnom rešenju, ćelija je izogena ćeliji divljeg tipa E. coli, kao što je soj W3110, izuzev mutiranog spr gena i modifikacije potrebne da se smanji aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg tipa.

[0058] Ćelija prema predmetnom pronalasku može dalje razlikuje od divljeg tipa ćeliji po tome što sadrži polinukleotid koji kodira protein od interesa. Sekvenca polinukleotida koja kodira protein od interesa može biti egzogena ili endogena. Polinukleotid koji kodira protein od interesa može biti sadržan u pogodnom ekspresionom vektoru transformisanom u ćeliji i/ili integrisanom u genom ćelije domaćina. U primeru realizacije u kojem je polinukleotid koji kodira protein od interesa umetnut u genom domaćina, ćelija iz ovog pronalaska će se takođe razlikovati od ćelije divljeg tipa usled ubačene polinukleotidne sekvence koja kodira protein od interesa. Poželjno polinukleotid je u ekspresionom vektoru u ćeliji stvarajući tako minimalnu disrupciju genoma ćelije domaćina.

[0059] Spr protein je membranski vezana periplazmička proteaza E. coli.

[0060] Aminokiselinska sekvenca divljeg tipa spr proteina je prikazana u SEK ID BR: 21 sa signalnom sekvencom na N-terminusu i u SEK ID BR: 22 bez signalne sekvence od 26 aminokiselina (prema UniProt pristupnom Broju P0AFV4). Numeracija aminokiselina spr proteinske sekvence u predmetnom pronalasku uključuje signalnu sekvencu. Shodno tome, amino kiselina 1 spr proteina je prva amino kiselina (Met) prikazana u SEK ID BR: 21.

[0061] Mutirani spr gen je ćelijski hromozomalni spr gen.

[0062] Mutirani spr gen kodira spr protein sposoban za suzbijanje fenotipa ćelija koji dalje sadrži mutirane Tsp gene. Ćelije koje nose mutirani Tsp gen mogu imati dobru brzinu rasta ćelija, ali jedno ograničenje ovih ćelija je njihova sklonost ka lizi, posebno pri velikim gustinama ćelija. Shodno tome fenotip ćelija koje sadrže mutirani Tsp gen je tendencija ka lizi, posebno kod velike gustine ćelija. Ćelije koje nose mutirani Tsp gen takođe pokazuju termosenzitivni rast kod niske osmolarnosti. Međutim, spr mutacije koje nose ćelije iz predmetnog pronalaska, kada se uvedu u ćeliju koja ima smanjenu Tsp aktivnost vrše supresiju Tsp fenotipa i prema tome, te ćelije pokazuju smanjenu lizu, naročito kod velike gustine ćelija. Stručnjak može lako izmeriti fenotip rasta ćelija tokom mućkanja flaska ili tehnikom fermentacije ćelija velike gustine. Supresija fenotipa ćelijske lize se može videti iz poboljšane brzine rasta i/ili produkcije rekombinantnog proteina, posebno u periplazmi, koju izlaže ćelija koja nosi spr mutant i koja ima smanjenu Tsp aktivnost u poređenju sa ćelijom koja nosi Tsp mutant i spr divljeg tipa.

[0063] Ćelije prema ovom pronalasku sadrže mutirani spr gen koji kodira spr protein koji ima mutaciju na jednoj ili više amino kiselina odabranih od N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 i H157, poželjno mutaciju na jednoj ili više amino kiselina odabranih od C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 i H157. U ovom izvođenju, spr protein poželjno nema drugih mutacija.

[0064] Mutacija jedne ili više od gore navedenih amino kiselina može biti bilo koja pogodna misens mutacija na jednom, dva ili tri nukleotida koji kodiraju amino kiselinu. Mutacija menja aminokiselinsku reziduu bilo koje pogodne aminokiseline što rezultira u mutiranom spr proteinu koji ima sposobnost supresije fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen. Misens mutacija (pogresna mutacija) može promeniti tu aminokiselinu u aminokiselinu različite veličine i/ili drugačijih hemijskih osobina u poređenju sa divljim tipom aminokiseline.

[0065] U jednoj realizaciji mutirani spr gen kodira spr protein koji ima jednu ili više mutacija izabranih od C94A, S95F, V98E, YY115F, D133A, V135D ili G, H145A, G147C i H157A.

[0066] U jednoj realizaciji mutacija na jednoj, dve ili tri od katalitičkih trijada aminokiselinskih ostataka C94, H145 i H157 (Solution NMR Structure of the NlpC/P60 Domain of Lipoprotein Spr from Escherichia coli Structural Evidence for a Novel Cysteine Peptidase Catalytic Triad, Biochemistry, 2008, 47, 9715-9717). Shodno tome, mutirani spr gen može da sadrži: mutaciju na C94; ili mutaciju na H145; ili mutaciju na H157; ili mutaciju na C94 i H145; ili mutaciju na C94 i H157; ili mutaciju na H145 i H157; ili mutaciju na C94, H145 i H157.

[0067] U ovom primeru izvođenja, spr protein poželjno nema više mutacija.

[0068] Jedna, dve ili tri od C94, H145 i H157 mogu biti mutirane na bilo kojoj pogodnoj aminokiselini što rezultira u spr proteinu koji ima sposobnost supresije fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen. Na primer, jedna, dve ili tri od C94, H145 i H157 mogu biti mutirane na malim amino kiselinama kao što je Gly ili Ala. Prema tome, spr protein može imati jednu, dve ili tri od mutacija C94A, H145A i H157A. U jednoj realizaciji, spr gen sadrži misens mutaciju C94A, za koju je nađeno da proizvodi spr protein sposoban za supresiju fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen. U drugoj realizaciji, spr gen sadrži misens mutaciju H145A, za koju je pronađeno da proizvodi spr protein sposoban za supresiju fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen.

[0069] Oznaka za mutacije supstitucije se ovde sastoji od slova praćenog brojem praćenog slovom. Prvo slovo označava amino kiselinu u proteinu divljeg tipa. Broj se odnosi na položaj aminokiseline, na kom se vrši supstitucija amino kiseline, a drugo slovo označava amino kiselinu koja se koristi za zamenu aminokiseline divljeg tipa. U jednoj realizaciji mutirani spr protein sadrži mutaciju na jednoj ili više amino kiselina odabranu od N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 i G147, poželjno mutaciju na jednoj ili više aminokiselina izabranu od S95, V98, Y115, D133, V135 i G147. U ovoj realizaciji, spr protein poželjno nema druge mutacije. Shodno tome, mutirani spr gen može da sadrži: mutaciju N31; ili mutaciju R62; ili mutaciju 170; ili mutaciju Q73; ili mutaciju S95; ili mutaciju V98; ili mutaciju Q99; ili mutaciju R100; ili mutaciju L108; ili mutaciju Y115; ili mutaciju D133; ili mutaciju V135; ili mutaciju L136; ili mutaciju G140; ili mutaciju R144; ili mutaciju G147.

U jednoj realizaciji mutirani spr protein sadrži višestruke mutacije aminokiselina: S95 i Y115; ili N31, Q73, R100 i G140; ili Q73, R100 i G140; ili R100 and G140; ili Q73 i G140; ili Q73 i R100; ili R62, Q99 i R144; ili Q99 i R144.

[0070] Jedna ili više amino kiselina N31, R62,170, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 i G147 mogu biti mutirane na bilo kojoj pogodnoj amino kiselini što rezultuje u spr proteinu koji ima sposobnost supresije fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen. Na primer, jedna ili više od N31, R62, 170, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140 i R144 može biti mutirana na maloj amino kiselini kao što je Gly ili Ala.

[0071] U jednoj realizaciji spr protein sadrži jednu ili više od sledećih mutacija: N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D ili V135G, L136P, G140C, R144C i G147C. U jednoj realizaciji SPR protein sadrži jednu ili više od sledećih mutacija: S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D ili V135G i G147C. U ovoj realizaciji, spr protein poželjno nema više mutacija.

[0072] U jednoj realizaciji spr protein ima jednu mutaciju odabranu od N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D ili V135G, L136P, G140C, R144C i G147C. U ovoj realizaciji, spr protein poželjno nema više mutacija. U sledećem primeru realizacije spr protein ima višestruke mutacije odabrane od: S95F i Y115F; N31Y, Q73R, R100G i G140C; Q73R, R100G i G140C; R100G i G140C; Q73R i G140C; Q73R i R100G; R62C, Q99P i R144C; ili Q99P i R144C.

[0073] U jednoj realizaciji mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju C94A.

[0074] U jednoj realizaciji mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju V103E.

[0075] U jednoj realizaciji mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju D133A.

[0076] U jednoj realizaciji mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju V135D.

[0077] U jednoj realizaciji mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju V135A.

[0078] U jednoj realizaciji mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju H145A.

[0079] U jednoj realizaciji mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju G147C.

[0080] U jednoj realizaciji mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju H157A.

[0081] U jednoj realizaciji mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju odabranu od H145A, H157A i D133A.

[0082] U jednoj realizaciji predstavljenog pronalaska, bilo koja pogodna mutacija ili mutacije mogu biti napravljene na spr genu što rezultuje u spr proteinu koji ima sposobnost supresije fenotipa ćelije koja sadrži mutirani Tsp gen. Poželjno, spr protein može imati jednu ili više od sledećih mutacija: N31Y, R62C, I70T, Q73R, C94A, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D, V135G, L136P, G140C, R144C, H145A, G147C, H157A i V174R. U jednoj realizaciji spr protein ne sadrži mutaciju V174R. Poželjno, spr gen sadrži jednu ili više mutacija koje su razmatrane gore u tekstu.

[0083] Ćelije prema predstavljenom pronalasku imaju smanjenu aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg tipa. Izraz "smanjena aktivnost Tsp proteina u poređenju sa ćelijom divljeg tipa" znači da je Tsp aktivnost ćelije smanjena u odnosu Tsp aktivnost ćelije divljeg tipa. Ćelija može biti modifikovana na bilo koji pogodan način da se smanji Tsp aktivnost.

[0084] U jednoj realizaciji smanjenu Tsp aktivnost potiče od modifikacije endogenog polinukleotida koji kodira Tsp i/ili povezanih sekvenci koje regulišu ekspresiju. Modifikacija može smanjiti ili zaustaviti transkripciju i translaciju Tsp gena ili može obezbediti ekspresiju Tsp proteina koji ima smanjenu proteaznu aktivnost u odnosu na Tsp protein divljeg tipa.

[0085] U jednoj realizaciji asocirana sekvenca za regulaciju ekspresije je modifikovana da smanji ekspresiju Tsp. Na primer, promoter Tsp gena može biti mutiran radi sprečavanja ekspresije gena.

[0086] U poželjnoj realizaciji, ćelije prema predstavljenom pronalasku nose mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein koji ima smanjenu proteaznu aktivnost ili mutirani Tsp nokaut gen.

[0087] Poželjno je mutiran hromozomalni Tsp gen.

[0088] Kaкo je ovde korišćeno, "Tsp gen" označava gen koji kodira proteazu Tsp (takođe poznatu kao Prc) koja je periplazmička proteaza sposobna da deluje na Penicilin-vezujući protein-3 (PBP3) i proteine repa faga. Sekvenca Tsp gena divljeg tipa je prikazana u SEK ID BR: 1, a sekvenca Tsp proteina divljeg tipa je prikazana u SEK ID BR: 2.

[0089] Oznaka mutiranog Tsp gena ili mutiranog Tsp gena koji kodira Tsp, se odnosi ili na mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein koji ima smanjenu proteaznu aktivnost ili na mutirani nokaut Tsp gen, ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0090] Izraz "mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein koji ima smanjenu proteaznu aktivnost" u kontekstu ovog pronalaska, znači da mutirani Tsp gen nema punu proteaznu aktivnost u poređenju sa nemutiranim divljim tipom Tsp gena.

[0091] Poželjno, mutirani Tsp gen kodira Tsp protein koji ima 50% ili manje, 40% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje, ili 5% ili manje od aktivnosti proteaze nemutiranog Tsp proteina divljeg tipa. Poželjnije, mutirani Tsp gen kodira protein Tsp koje nema proteaznu aktivnost. U ovoj realizaciji, ćelija nije deficijentna u hromozomskom Tsp t.j. sekvenca Tsp gena nije izbrisana ili mutirana da spreči ekspresiju bilo kog oblika Tsp proteina.

[0092] Bilo koja pogodna mutacija može biti uvedena u Tsp gen da bi se proizveo protein koji ima smanjenu proteaznu aktivnost. Proteazna aktivnost Tsp proteina eksprimirana od gram-negativne bakterije se može lako testirati od strane stručnjaka u tehnici bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u struci, kao što je postupak opisan u Keiler et al (Identification of Active Sites Residues of the Tsp Protease* THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.270, No. 48, Izdanje decembar 1, str.

28864-28868, 1995 Kenneth C. Keiler i Robert T. Sauer) kojim je testirana proteazna aktivnost Tsp.

[0093] Keiler sa saradnicima je (supra) je prijavio da Tsp ima aktivno mesto koje sadrži rezdue S430, D441 i K455 i rezidue G375, G376, E433 i T452 koje su važne za održavanje strukture Tsp. Keiler i saradnici (supra) su pronašli da mutirani Tsp geni S430A, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A i T452A imaju nedetektabilnu proteaznu aktivnost. Zatim su izvestili da mutirani gen Tsp S430C pokazuje oko 5-10% aktivnosti divljeg tipa. Prema tome, Tsp mutacija za proizvodnju proteina koji ima smanjenu proteaznu aktivnost može sadržati mutaciju, kao što je misens mutacija na jednoj ili više rezidua S430, D441, K455, G375, G376, E433 i T452. Poželjno Tsp mutacija da se proizvede protein koji ima smanjenu aktivnosti proteaze može da sadrži mutaciju, kao što je misens mutacija na jednom, dva ili sva tri aktivna mesta rezidua S430, D441 i K455.

[0094] Prema tome, mutirani Tsp gen može da sadrži: mutaciju na S430; ili mutaciju na D441; ili mutaciju na K455; ili mutaciju na S430 i D441; ili mutaciju na S430 i K455; ili mutaciju na D441 i K455; ili mutaciju na S430, D441 i K455.

[0095] Jedna ili više od S430, D441, K455, G375, G376, E433 i T452 može biti mutirana na bilo kojoj pogodnoj aminokiselini što rezultira u proteinu koji ima smanjenu proteaznu aktivnost. Primeri pogodnih mutacija su S430A, S430C, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A i T452A. Mutirani Tsp gen može da sadrži jednu, dve ili tri mutacije na aktivnim mestima rezidua, na primer gen može da sadrži: S430A ili S430C; i/ili D441A; i/ili K455A ili K455H ili K455R.

[0096] Poželjno, Tsp gen ima tačkastu mutaciju S430A ili S430C.

[0097] Izraz "nokaut mutirani Tsp gen" u kontekstu ovog pronalaska, znači da gen sadrži jednu ili više mutacija koje onemogućavaju ekspresiju Tsp proteina kodiranog genom divljeg tipa da se obezbedi ćelija sa deficitom Tsp proteina. Nokaut gen može biti delimično ili potpuno transkribovan ali ne transliran u kodirani protein. Mutirani nokaut Tsp gen može mutirati na bilo koji pogodan način, na primer, sa jednom ili više delecija, insercija, tačaka, misens, nonsens i mutacija sa pomeranjem okvira čitanja, da ne izazove ekspresiju proteina. Na primer, gen može biti isključen (nokautiran) umetanjem strane DNK sekvence, kao što je marker rezistentan na antibiotik, u kodirajuće sekvence gena.

[0098] U poželjnoj realizaciji Tsp gen nije mutiran umetanjem sekvence strane DNK, kao što je marker rezistentan na antibiotik, u kodirajuću sekvencu gena. U ovoj realizaciji Tsp gen može sadržati mutaciju na početnom kodonu gena i/ili na jednom ili više zaustavnih kodona pozicioniranih nizvodno od početnog kodona gena i uzvodno od zaustavnog kodona gena sprečavajući ekspresiju Tsp proteina. Mutacija na početnom kodonu može biti misens mutacija jednog, dva ili sva tri nukleotida početnog kodona. Alternativno ili dodatno početni kodon može biti mutiran insercijom ili delecijom mutacije pomeranja okvira. Tsp gen se sastoji od dva ATG kodona na kraju 5' kodirajuće sekvence, jedan ili oba ATG kodona mogu biti mutirani pomoću misens mutacije. Tsp gen može biti mutiran na drugom ATG kodonu (kodon 3) do TCG. Tsp gen može alternativno ili dodatno da sadrži jedan ili više zaustavnih kodona postavljenih nizvodno od početnog kodona gena i uzvodno od zaustavnih kodona gena. Poželjno mutirani nokaut Tsp gen sadrži i misens mutacije na početnom kodonu i jedan ili više umetnutih zaustavnih kodona. U poželjnom rešenju Tsp gen je mutiran da se izbriše "T" iz petog kodona čime se izaziva da pomeranje okvira rezultuje u zaustavnim kodonima na kodonima 11 i 16. U poželjnom rešenju Tsp gen se mutira za inserciju Ase I restrikcionog mesta za kreiranje trećeg in-frame zaustavnog kodona u kodonu 21.

[0099] U poželjnoj realizaciji mutirani nokaut Tsp gen ima DNK sekvencu SEK ID BR: 3, koja sadrži 6 nukleotida ATGAAT uzvodno od početnog kodona. U jednoj realizaciji mutirani Tsp gen ima DNK sekvencu nukleotida 7 do 2048 iz SEK ID BR: 3.

[0100] U ovom pronalasku ćelije takođe nose jedan ili više gena sposobnih za ekspresiju ili prekomernu ekspresiju jednog ili više proteina koji su u stanju da olakšaju savijanje proteina. Primeri uključuju proteine poput FkpA, Skp, Sura, PPiA i PPiD.

[0101] U jednoj realizaciji protein za olakšavanje savijanja proteina je FkpA, Skp ili njihova kombinacija.

[0102] U jednoj realizaciji protein za olakšavanje savijanja proteina je izabran od FkpA ili kombinacije FkpA i Skp.

[0103] FkpA je peptidil-prolil cis-trans izomeraza sa Swiss-Prot brojem P45523.

[0104] Skp je šaperon protein sa Swiss-Prot brojem P0AEU7.

[0105] Protein za olakšavanje savijanja proteine može biti kodiran pomoću gena u genom ćelija ili tranzijentno transfektovan u njemu, na primer na plazmidu ili njihovoj kombinaciji, po potrebi.

[0106] Rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija iz pronalaska ne sadrži rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC.

[0107] U jednoj realizaciji iz predstavljenog pronalaska, rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija dalje sadrži mutirani DegP gen koji kodira DegP protein koji ima aktivnost šaperona i smanjenu proteaznu aktivnost i/ili mutirani ptr gen, pri čemu mutirani ptr gen kodira protein Proteaza III koji ima smanjenu proteaznu aktivnost ili je mutirani nokaut ptr gen i/ili mutirani OmpT gen, pri čemu mutirani OmpT gen kodira OmpT protein koja ima smanjenu proteaznu aktivnost ili je pak mutirani nokaut OmpT gen.

[0108] U ovom aspektu ćelijski genom je izogen bakterijskoj ćeliji divljeg tipa osim za gore navedene mutacije.

[0109] Kako je ovde korišćeno, "DegP" označava gen koji kodira protein DegP (takođe poznat i kao HtrA), koji ima dvojnu funkciju kao šaperon i proteaza (Families of serine peptidases, Rawlings ND, Barrett AJ. Methods Enzymol 1994; 244:19-61). Sekvenca nemutiranog gena DegP je prikazana u SEK ID BR: 7, a sekvenca nemutiranog proteina DegP je prikazana u SEK ID BR: 8.

[0110] Pri niskim temperaturama DegP funkcioniše kao šaperon, a na visokim temperaturama DegP ima sklonost da funkcioniše kao proteaza (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Schock Protein. Cell, Tom 97, Izdanje 3, Strane 339 - 347. Spiess C, Beil a Ehrmann M) i The proteolitic activity HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658)

[0111] U izvođenjima u kojima ćelija sadrži DegP mutaciju ta DegP mutacija u ćeliji obezbeđuje mutirani DegP gen koji kodira protein DegP koji ima aktivnost šaperona, ali ne i punu aktivnost proteaze.

[0112] Izraz "ima aktivnost šaperona" u kontekstu ovog pronalaska, znači da mutirani DegP protein ima istu ili suštinski istu aktivnost šaperona u poređenju sa nemutiranim DegP proteinom divljeg tipa. Poželjno, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji ima 50% ili više, 60% ili više, 70% ili više, 80% ili više, 90% ili više, ili 95% ili više aktivnosti šaperona divljeg tipa nemutiranog DegP proteina. Poželjnije, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji ima istu aktivnost šaperona u poređenju sa divljim tipom DegP.

[0113] Izraz "ima smanjenu proteaznu aktivnost" u kontekstu ovog pronalaska, znači da mutirani DegP protein nema punu aktivnosti proteaze u poređenju sa nemutiranim DegP proteinom divljeg tipa. Poželjno, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji ima 50% ili manje, 40% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje, ili 5% ili manje od proteazne aktivnosti nemutiranog DegP proteina divljeg tipa. Poželjnije, mutirani DegP gen kodira DegP protein koji nema proteaznu aktivnost. Ćelija nije deficijentna u hromozomalnom DegP odnosno DegP genske sekvence nisu izbrisane ili mutirane da spreče ekspresiju bilo kog oblika DegP proteina.

[0114] Bilo koja pogodna mutacija može biti uvedena u DegP gen da se proizvede protein koji ima aktivnost šaperona i smanjenu proteaznu aktivnost. Proteazna i aktivnost šaperona DegP proteina eksprimiranog od gram negativne bakterije lako može biti testirana od strane stručnjaka u ovoj oblasti bilo kojim pogodnim postupkom, kao što je postupak opisan u Spiess et al u kojem su proteazna i aktivnost šaperona DegP testirane na Mals, prirodnom supstratu DegP (Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in widely Conserved Heat Schock Protein. Cell, Volume 97, Izdanje 3, Strane 339 - 347. Spiess C, Beil A Ehrmann M) kao i metod opisan u The Proteolitic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658.

[0115] DegP je serin proteaza i ima aktivni centar koji se sastoji od katalitičke trijade aminokiselinskih rezidua His105, Asp135 i Ser210 (Famillies of serine peptidases, Methods Enzymol, 1994, 244: 19-61 Ravlings N and Barrett A). Mutacija DegP za proizvodnju proteina koji ima aktivnost šaperona i smanjenu proteaznu aktivnost može sadržati mutaciju, kao što je misens mutacija na jednoj, dve ili tri od His105, Asp135 i Ser210.

[0116] Prema tome, mutirani DegP gen može da sadrži: mutaciju na His105; ili mutaciju na Asp135; ili mutaciju na Ser210; ili mutaciju na His105 i Asp135; ili mutaciju na His105 i Ser210; ili mutaciju na Asp135 i Ser210; ili mutaciju na His105, Asp135 i Ser210.

[0117] Jedan, dva ili tri od His105, Asp135 i Ser210 mogu biti mutirani na bilo kojoj pogodnoj aminokiselini što rezultira u proteinu koji ima aktivnost šaperona i smanjenu proteaznu aktivnost. Na primer, jedan, dva ili tri od His105, Asp135 i Ser210 mogu biti mutirani u malim amino kiselinama kao što je Gly ili Ala. Sledeća prikladna mutacija je da se jedna, dve ili tri od His105, Asp135 i Ser 210 promeni u aminokiselinu koja ima suprotne osobine kao što je Asp135 mutirana u Lis ili Arg, polarna His105 mutirana u nepolarnu amino kiselinu kao što je Gly, Ala, Val ili Leu i mala hidrofilna Ser210 mutirana u veliku ili hidrofobnu reziduu kao što je Val, Leu, Phe ili Tir. Poželjno, DegP gen sadrži tačkastu mutaciju S210A, kao što je prikazano na Slici 11c, za koji je ustanovljeno da proizvodi protein koji ima aktivnost šaperona, ali ne i aktivnost proteaze (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Tom 97, Izdanje 3, Strane 339 -347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).

[0118] DegP ima dva PDZ domena, PDZ1 (rezidue 260-358) i PDZ2 (rezidue 359-448), koji posreduju interakciju protein-protein (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Tom 97, Izdanje 3, Strane 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M). U jednoj realizaciji ovog pronalaska DegP gen se mutira za deleciju PDZ1 domena i/ili PDZ2 domena. Delecija PDZ1 i PDZ2 dovodi do potpunog gubitka proteazne aktivnosti DegP proteina i smanjene aktivnosti šaperona u odnosu na divlji tip DegP proteina dok delecija bilo PDZ1 ili PDZ2 dovodi do 5% proteazne aktivnosti i slične aktivnosti šaperona u odnosu na divlji tip DegP proteina (A Temperature-Dependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Tom 97, Izdanje 3, Strane 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).

[0119] Mutirani DegP gen takođe može sadržati tiho restrikciono mesto koje se ne javlja uprirodi, kao što je Ase I kako bi se pomoglo u metodama identifikacije i skrininga, na primer kao što je prikazano na Slici 7C.

[0120] Poželjna sekvenca mutiranog DegP gena koja sadrži tačkastu mutaciju S210A i restrikciono označeno mesto Ase I je obezbeđeno u SEK ID BR: 9, i kodirana sekvenca proteina je prikazana u SEK ID BR: 10.

[0121] U realizacijama predstavljenog pronalaska u kojima ćelija sadrži mutirani DegP gen koji kodira DegP protein koji ima aktivnost šaperona i smanjenu proteaznu aktivnost, jedna ili više ćelija obezbeđenih ovim pronalaskom može da obezbedi povećan prinos pravilno savijenih proteina iz ćelije u odnosu na mutirane ćelije u kojima je DegP gen mutiran do nokaut DegP sprečavajući ekspresiju DegP, kao što je hromozomalno deficijentan DegP. U ćeliji koja sadrži mutirani nokaut DegP gen koji sprečava ekspresiju DegP, aktivnost šaperona DegP se potpuno gubi a u ćeliji prema predmetnom pronalasku aktivnost šaperona kod DegP se zadržava dok se gubi puna proteazna aktivnost. U ovim realizacijama, jedna ili više ćelija prema predstavljenom pronalasku imaju nižu proteaznu aktivnost za sprečavanje proteolize proteina, dok se istovremeno održava aktivnost šaperona da se dozvoli pravilno savijanje i transport proteina u ćeliju domaćina.

[0122] U ovim realizacijama, jedna ili više ćelija prema predstavljenom pronalasku mogu imati poboljšan rast ćelija u poređenju sa ćelijama koje nose mutirani nokaut DegP gen koji sprečava ekspresiju DegP. Bez želje da budemo vezani za teoriju poboljšan rast ćelija može biti ispoljen zbog toga što DegP proteaza zadržava aktivnost šaperona koja može povećati kapacitet ćelije da obradi sve proteine koji zahtevaju aktivnost šaperona. Shodno tome, proizvodnja pravilno savijenih proteina neophodnih za rast i razmnožavanje ćelija može da se poveća u jednoj ili više ćelija iz ovog pronalaska u poređenju sa ćelijama koje nose nokaut mutaciju DegP unapređujući tako ćelijske puteve koji regulišu rast. Zatim, poznati sojevi deficijentni u DegP proteazama su generalno osetljivi na temperaturu i obično se ne raszvijaju na temperaturama višim od oko 28 °C. Međutim, ćelije prema predmetnom pronalasku nisu osetljive na temperaturu i mogu da se gaje na temperaturama od 28 °C ili više, uključujući temperature od oko 30 °C do približno 37 °C, koje se obično koriste za proizvodnju proteina iz bakterija u industrijskim razmerama.

[0123] U jednoj varijanti predstavljenog pronalaska ćelije nose mutirani ptr gen. Kako je ovde korišćeno, "ptr gen" označava gen koji kodira proteazu Proteaza III, koja degradira belančevine visoke molekulske težine. Sekvenca nemutiranog ptr gena je prikazana u SEK ID BR: 4, a sekvenca nemutiranog proteina Proteaza III je prikazana u SEK ID BR: 5.

[0124] Pozivanje na mutirani ptr gen ili mutirani ptr gen koji kodira Proteazu III, se odnosi na mutirani ptr gen koji kodira protein Proteaza III koji ima smanjenu proteaznu aktivnost ili na nokaut mutirani ptr gen, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0125] Izraz "mutirani ptr gen koji kodira Proteaza III protein koji ima smanjenu proteaznu aktivnost" u kontekstu ovog pronalaska znači da mutirani ptr gen nema punu proteaznu aktivnost u poređenju sa nemutiranim divljim tipom ptr gena.

[0126] Poželjno, mutirani ptr gen kodira Proteazu III koja ima 50% ili manje, 40% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje ili 5% ili manje od proteazne aktivnosti divljeg tipa nemutiranog proteina Proteaza III. Još poželjnije, mutirani ptr gen kodira protein Proteaza III koji nema proteaznu aktivnost. U ovom izvođenju ć elija nije deficijentna u hromozomalnim ptr tj. sekvenca ptr gena nije izbrisana ili mutirana da se spreči ekspresija bilo kog oblika proteina Proteaza III.

[0127] Bilo koja pogodna mutacija može biti uvedena u ptr gen da se proizvede protein Proteaza III koji ima smanjenu proteaznu aktivnost. Proteaznu aktivnost proteina Proteaza III eksprimiranog od gram-negativne bakterije lako može testirati stručnjak u ovoj oblasti bilo kojim pogodnim postupkom iz ove oblasti.

[0128] Izraz " mutirani nokaut ptr gen" u kontekstu ovog pronalaska, znači da gen sadrži jednu ili više mutacija takvih da ne izazivaju ekspresiju proteina kodiranog od strane gena da se obezbedi ćelija deficijentna u proteinima kodiranim pomoću mutiranog nokaut gena. Nokaut gen može biti delimično ili potpuno transkribovan ali ne transliran u kodirani protein. Mutirani nokaut ptr gen može biti mutiran na bilo koji pogodan način, na primer, sa jednom ili više dalecija, insercija, tačkastih, misens, nonsens i mutacija pomeranja okvira, za sprečavanje ekspresije proteina. Na primer, gen može biti isključen (nokautiran) insercijom sekvence strane DNK, kao što je marker rezistentan na antibiotik, u kodirajuće genske sekvence.

[0129] U poželjnom rešenju gen nije mutiran umetanjem sekvence strane DNK, kao što je marker rezistentan na antibiotik, u sekvence koje kodiraju gen. Poželjno gen Proteaza III sadrži mutaciju na početnom kodonu gena i/ili jednom ili više zaustavnih kodona postavljenih nizvodno od početnog kodona gena i uzvodno od zaustavnog kodona gena sprečavajući ekspresiju proteina Proteaza III.

[0130] Mutacija na ciljanom početnom kodonu nokaut gena dovodi do gubitka funkcije početnog kodona i time osigurava da ciljni gen ne sadrži pogodan početni kodon na početku kodirajuće sekvence. Mutacija na početnom kodonu može biti misens mutacija jednog, dva ili sva tri nukleotida početnog kodona. Alternativno ili dodatno početni kodon može mutirati pomoću insercije ili delecije mutacije pomeranja okvira čitanja.

[0131] U poželjnoj realizaciji ptr gen se mutira da se promeni ATG početni kodon u ATT.

[0132] Nokaut mutirani ptr gen može alternativno ili dodatno da sadrži jedan ili više zaustavnih kodona pozicioniranih nizvodno od početnog kodona gena i uzvodno od zaustavnog kodona gena. Poželjno nokaut mutirani ptr gen sadrži i misens mutacije na početnom kodonu i jedan ili više umetnutih zaustavnih kodona.

[0133] Jedan ili više umetnutih zaustavnih kodona su poželjno in-frame zaustavni kodoni. Međutim jedan ili više umetnutih zaustavnih kodona mogu alternativno ili dodatno biti out-of-frame zaustavni kodoni. Jedan ili više out-of-frame zaustavnih kodona mogu biti potrebni za prekidanje translacije kada se neki out-of-frame početni kodon promeni u in-frame početni kodon insercijom ili delecijom mutacije pomeranja okvira čitanja. Jedan ili više zaustavnih kodona se može uvesti bilo kojom pogodnom mutacijom uključujući nonsens tačkaste mutacije i mutacije pomeranja okvira čitanja. Jedan ili više zaustavnih kodona se poželjno uvodi pomoću mutacija pomeranja okvira čitanja i/ili umetanja mutacija, poželjno zamenom segmenta genske sekvence sa sekvencom koja sadrži zaustavni kodon. Na primer može biti ubačeno restrikciono mesto Ase I, koje sadrži zaustavni kodon TAA.

[0134] U poželjnoj realizaciji ptr gen se mutira za ubacivanje in-frame zaustavnih kodona umetanjem restrikcionog mesta Ase I, kao što je prikazano na Slici 7A. U poželjnoj realizaciji mutirani nokaut ptr gen ima DNK sekvencu SEK ID BR: 6.

[0135] Gore opisane nokaut mutacije su pogodne zbog toga što izazivaju minimalnu ili ne izazivaju disrupciju hromozomske DNK uzvodno ili nizvodno od mesta ciljnog nokaut gena i ne zahtevaju inserciju i retenciju strane DNK, kao što su markeri rezistencije na antibiotike, koji bi mogli uticati na podobnost ćelija za ekspresiju proteina od interesa, posebno terapeutskih proteina. Prema tome, jedna ili više ćelija u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu pokazati poboljšane karakteristike rasta i/ili ekspresije proteina u poređenju sa ćelijama u kojima je gen proteaze nokautiran umetanjem strane DNK u kodirajuće sekvence gena.

[0136] U jednoj realizaciji, ćelije prema predstavljenom pronalasku nose mutirani OmpT gen. Kako je ovde korišćeno, "OmpT gen" označava gen koji kodira proteazu OmpT (spoljna membranska proteaza T) koja je spoljna membranska proteaza. Sekvenca nemutiranog OmpT gena divljeg tipa je SWISS-PROT P09169.

[0137] Pozivanje na mutirani OmpT gen ili mutirani OmpT gen koji kodira OmpT se odnosi bilo na mutirani OmpT gen koji kodira OmpT protein, koji ima smanjenu proteaznu aktivnost ili na mutirani OmpT nokaut gen, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0138] Izraz "mutirani OmpT gen koji kodira OmpT protein koji ima smanjenu proteaznu aktivnost" u kontekstu ovog pronalaska znači da mutirani OmpT gen nema punu proteaznu aktivnost u poređenju sa divljim tipom nemutiranog OmpT gena. Mutirani OmpT gen može da kodira OmpT protein koji ima 50% ili manje, 40% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, 10% ili manje ili 5% ili manje proteazne aktivnosti od divljeg tipa ne-mutiranog OmpT proteina. Mutirani OmpT gen može kodirati OmpT protein koji nema proteaznu aktivnost. U ovom izvođenju ć elija nije deficijentna u hromozomskom OmpT, tj. sekvenca OmpT gena nije izbrisana ili mutirana da bi se sprečila ekspresija bilo kog oblika OmpT proteina.

[0139] Bilo koja pogodna mutacija može biti uvedena u OmpT gen da se proizvede protein koji ima smanjenu proteaznu aktivnost. Proteazna aktivnost OmpT proteina eksprimiranog iz gram-negativne bakterije može biti lako testirana od strane stručnjaka u ovom području tehnike bilo kojim pogodnim postupkom u tehnici, kao što je postupak opisan u Kramer et al. 505 (2001) 426-430) i Dekker et al (Substrate Specitificity of the Integral Membrane Protease OmpT Determined by Spatially Addressed Peptide Libraries, Biochemistry 2001, 40, 1694-1701).

[0140] OmpT koji je prijavljen u Kramer et al (Identification of active site serine and histidine residues in Escherichia coli outer membrane protease OmpT FEBS Letters 2000468, 220-224)) opisuje da supstitucija serina, histidina i kiselih rezidua alaninima rezultuje u ~10-ostruko smanjenoj aktivnosti za Glu27, Asp97, Asp208 ili His101, ~500-struko smanjenu aktivnost za Ser99 i ~10000 puta smanjenu aktivnost za Asp83, Asp85, Asp210 ili His212. Vandeputte-Rutten et al (Crystal Structure of the Outer Membrane Protease OmpT from Escherichia coli suggests a novel catalytic site, The EMBO Journal 2001, Vol 20 No 185033-5039) kao aktivno mesto sadrži par Asp83-Asp85 i par His212-Asp210. Dalje Kramer et al (Lipopolysaccharide regions involved in the activation of Escherichia coli outer membrane protease OmpT, Eur. J. Biochem. FEBS 2002, 269, 1746-1752) opisuje da sve mutacije D208A, D210A, H212A, H212N, H212K, G216K/K217G, K217T i R218L u petlji L4 rezultuju u delimičnom ili gotovo potpunom gubitku enzimske aktivnosti.

[0141] Prema tome, OmpT mutacija za proizvodnju proteina koji ima smanjenu proteaznu aktivnost može da sadrži mutaciju, kao što je misens mutacija na jednoj ili više rezidua E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218 & E250.

[0142] Jedna ili više od E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218 i E250 mogu biti mutirane na bilo kojoj pogodnoj aminokiselini koja rezultuje u proteinu koji ima smanjenu proteaznu aktivnost. Na primer, jedna ili više od E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218 & E250 može biti mutirana na alaninu. Primeri pogodnih mutacija E27A, D43A, D83A, D85A, D97A, S99A, H101A E111A, E136A, E193A, D206A, D208A, D210A, H212A, H212N, H212Q, G216K, K217G, K217T, R218L & E250A. U jednoj realizaciji mutirani OmpT gen sadrži mutacije D210A i H212A. Pogodno mutirana OmpT sekvenca koja obuhvata mutacije D210A i H212A je prikazana u SEK ID BR: 23.

[0143] Izraz " mutirani OmpT nokaut gen" u kontekstu ovog pronalaska, znači da gen sadrži jednu ili više mutacija kojima se ne izaziva ekspresija proteina kodiranog tim genom da se obezdedi ćelija deficijentna u proteinu kodirana mutiranim nokaut genom. Nokaut gen može biti delimično ili potpuno transkribovan ali ne transliran u kodirani protein. Mutirani OmpT nokaut gen može mutirati na bilo koji prigodan način, na primer, sa jednom ili više delecija, insercija, tačkastih, misens, nonsens i mutacija sa pomeranjem okvira čitanja, da se ne izazaove ekspresija proteina. Na primer, gen može biti isključen umetanjem sekvence strane DNK, kao što je marker antibiotske rezistencije, u sekvencu koja kodira gen.

[0144] U jednoj realizaciji, OmpT gen sadrži mutaciju na početnom kodonu gena i/ili jednom ili više zaustavnih kodona postavljenih nizvodno od početnog kodona gena i uzvodno od zaustavnog kodona gena sprečavajući ekspresiju OmpT proteina. Mutacija na početnom kodonu može biti misens mutacija jednog, dva ili sva tri nukleotida početnog kodona. Pogodna mutirana nokaut OmpT sekvenca je prikazana u SEK ID BR: 24. Alternativno, ili dodatno početni kodon može biti mutiran insercijom ili delecijom mutacije pomeranja okvira čitanja.

[0145] U jednoj realizaciji bakterijska gram-negativna ćelija prema predmetnom pronalasku ne nosi mutirani OmpT nokaut gen, kao što je onaj deficijentan u hromozomalnom OmpT.

[0146] U jednoj realizaciji, bakterijski gram-negativna ćelija prema predmetnom pronalasku ne nosi mutirani DegP nokaut gen, kao što je onaj deficijentan u hromozomalnom DegP. U jednoj realizaciji, gram-negativna bakterijska ćelija prema predmetnom pronalasku ne nosi mutirani gen DegP.

[0147] U jednoj realizaciji, gram-negativna bakterijska ćelija prema predmetnom pronalasku ne nosi mutirani ptr nokaut gen, kao što je onaj deficijentan u hromozomalnom ptr.

[0148] Mnoge mutacije izvedene genetskim inženjeringom uključujući nokaut mutaciju podrazumevaju upotrebu markera antibiotske rezistencije koji omogućavaju izbor i identifikaciju uspešno mutiranih ćelija. Međutim, kao što je diskutovano gore, postoji niz nedostataka korišćenja markera antibiotske rezistencije.

[0149] Sledeća realizacija predmetnog pronalaska je da ćelija ne sadrži marker antibiotske rezistencije i prevazilazi navedene nedostatke korišćenja markera antibiotske rezistencije u kojem se, mutirani Tsp gen, mutirani spr gen i eventualno mutirani DegP gen i/ili mutirani ptr gen i/ili mutirani OmpT gen, mutiraju da sadrže jedno ili više označenih restrikcionih mesta. Restrikciona mesta su dobijena genetskim inženjeringom gena i ne javljaju se prirodno. Označena restrikciona mesta su pogodna zbog toga što omogućavaju prikazivanje i identifikaciju pravilno modifikovanih ćelija koje sadrže zahtevane hromozomske mutacije. Ćelije koje su modifikovane da nose jedan ili više mutiranih gena proteaze mogu biti analizirani pomoću PCR genomske DNK iz ćelijskog lizata pomoću oligonukleotidnih parova dizajniranih da amplifikuju region genomske DNK koja sadrži označena restrikciona mesta koja se prirodn ne javljaju. Amplifikovana DNK može zatim biti analizirana elektroforezom na agaroznom gelu pre i posle inkubacije sa pogodnim restrikcionim enzimom sposobnim za digestiju DNK na neprirodnom označenom restrikcionom mestu. Prisustvo fragmenata DNK nakon inkubacije sa restrikcionim enzimom potvrđuje da su ćelije uspešno modifikovane da nose jedan ili više mutiranih gena.

[0150] U primeru izvođenja u kojem ćelija nosi mutirani ptr nokaut gen koji ima DNK sekvencu SEK ID BR: 6, oligonukleotidne sekvence prajmera prikazane u SEK ID BR: 17 i SEK ID BR: 18 se mogu koristiti za amplifikaciju regiona DNK koji sadrži neprirodno restrikciono mesto Ase I iz genomske DNK transformisanih ćelija. Amplifikovana genomska DNK zatim može da se inkubira sa Ase I restrikcionim enzimom i analizira gel elektroforezom da se potvrdi prisustvo mutiranog ptr gena u genomskoj DNK.

[0151] U primeru izvođenja u kojem ćelija sadrži mutirani Tsp nokaut gen koji ima DNK sekvencu SEK ID BR: 3 ili nukleotide 7 do 2048 iz SEK ID BR: 3, oligonukleotidne sekvence prajmera prikazane u SEK ID BR: 15 i SEK ID BR: 16 se mogu koristiti za amplifikaciju regiona DNK koji sadrži ne-prirodno restrikciono mesto Ase I iz genomske DNK transformisanih ćelija. Amplifikovana genomska DNK zatim može da se inkubira sa Ase I restrikcionim enzimom i analizira gel elektroforezom da se potvrdi prisustvo mutiranog Tsp gena u genomskoj DNK.

[0152] U primeru izvođenja u kojem ćelija sadrži mutirani DegP gen koji ima DNK sekvencu SEK ID BR: 9, oligonukleotidne sekvence prajmera prikazane u SEK ID BR: 19 i SEK ID BR: 20 se mogu koristiti za amplifikaciju regiona DNK koji sadrži neprirodno restrikciono mesto Ase I iz genomske DNK transformisanih ćelija. Amplifikovana genomska DNK zatim može da se inkubira sa Ase I restrikcionim enzimom i analizira pomoću gel elektroforeze da se potvrdi prisustvo mutiranog DegP gena u genomskoj DNK.

[0153] Jedno ili više restrikcionih mesta može biti uvedeno bilo kojom pogodnom mutacijom uključujući sa jednom ili više delecija, insercija, tačkastih, misens, nonsens i mutacija pomeranja okvira čitanja. Restrikciono mesto može biti uvedeno mutacijom početnog kodona i/ili mutacijom da se uvede jedan ili više zaustavnih kodona, kao što je gore opisano. Ova varijanta je pogodna pošto je obeleženo restrikciono mesto direktna i jedinstvena oznaka uvedenih nokaut mutacija.

[0154] Može biti umetnuto obeleženo restrikciono mesto koje sadrži unutar okvira in-frame početni kodon, kao što je restrikciono mesto Ase I. To je naročito pogodno pošto umetnuto restrikciono mesto služi i kao označeno restrikciono mesto i kao zaustavni kodon za sprečavanje pune transkripcije kodirajuće sekvence gena. Na primer, u realizaciji u kojoj je zaustavni kodon uveden za ptr gen uvođenjem jednog Ase I mesta, to takođe stvara restrikciono mesto, kao što je prikazano na Slici 7A. Na primer, u izvođenju u kojem je zaustavni kodon uveden u Tsp gen na kodonu 21 uvođenjem Ase I mesta, to takođe kreira restrikciono mesto, kao što je prikazano na Slici 7B.

[0155] Označeno restrikciono mesto može biti umetnuto pomoću mutacije početnog kodona i opciono jedne ili više dodatnih tačkastih mutacija. U ovom izvođenju označeno restrikciono mesto je poželjno restrikciono mesto EcoR I. Ovo je naročito pogodno pošto mutacija na početnom kodonu takođe stvara označeno restrikciono mesto. Na primer, u izvođenju u kojem je početni kodon ptr gena promenjen u ATT, to stvara označeno mesto EcoR I, kao što je prikazano na Slici 11a. Na primer, u izvođenju u kojem se početni kodon (kodon 3) Tsp gena menja iz ATG u TCG, kao što je prikazano na Slici 1b, dalja tačkasta mutacija kodona 2 iz AAC u AAT i mutacija kodona 3 ATG u TCG stvara označeno restrikciono mesto EcoR I, kao što je prikazano na Slici 7B.

[0156] U izvođenju iz predmetnog pronalaska u kojem ćelija nosi mutirani OmpT gen, jedno ili više restrikcionih mesta može biti uvedeno bilo kojom pogodnom mutacijom uključujući sa jednom ili više delecija, insercija, tačkastih, misens, nonsens i mutacija pomeranja okvira čitanja. Na primer, u izvođenju u kojem OmpT gen sadrži mutacije D210A i H212A, ove mutacije uvode tiho Hindlll restrikciono mesto koje se može koristiti kao selekcioni marker.

[0157] U DegP genu ili spr genu, označeno restrikciono mesto može biti uvedeno korišćenjem tihih promena kodona. Na primer, mesto Ase I se može koristiti kao tiho označeno restrikciono mesto, pri čemu TAA zaustavni kodon je out-of-frame, kao što je prikazano na Slici 7C za mutirani DegP gen.

[0158] U izvođenjima iz ovog pronalaska, u kojim se ptr gen i/ili Tsp gen mutiraju za kodiranje Proteaze III ili Tsp koje imaju smanjenu proteaznu aktivnost, jedno ili više označenih restrikcionih mesta može biti uvedeno korišćenjem tihih promena kodona.

[0159] Rekombinantna gram-negativna bakterijska ćelija prema predmetnom pronalasku se može proizvesti na bilo koji pogodan način. Stručnjak zna pogodne tehnike koje se mogu koristiti za zamenu sekvence hromozomalnog gena sa mutiranom genskom sekvencom. Mogu se koristiti pogodni vektori koji omogućavaju integraciju u hromozom domaćina pomoću homologne rekombinacije.

[0160] Pogodne metode zamene gena su opisane, na primer, u Hamilton et al (New Method for Generating Deletions and Gene Replacements in Escherichia coli, Hamilton C. M. et al., Journal of Bacteriology Sept. 1989, Vol. 171, No. 9 p 4617-4622), Skorupski et al (Positive selection vectors for allelic exchange, Skorupski K and Taylor R. K., Gene, 1996, 169, 47-52), Kiel et al (A general method for the construction of Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmid segregation, Kiel J.A.K.W. et al, Mol Gen Genet 1987, 207:294-301), Blomfield et al (Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature sensitive pSC101 replicon, Blomfield I. C. et al., Molecular Microbiology 1991, 5(6), 1447-1457) i Ried et al. (An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis, Ried J. L. and Collmer A., Gene 57 (1987) 239-246). Pogodan plazmid koji omogućava homolognu rekombinaciju/zamenu je plazmid pKO3 (Link et al., 1997, Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237).

[0161] Uspešno mutirani sojevi mogu biti identifikovani korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u tehnici, uključujući PCR sekvenciranje kolonija DNK i PCR mapiranje restrikcionih enzima kolonija.

[0162] U primeru izvođenja u kojem ćelija sadrži dva ili više mutiranih hromozomalnih gena, mutirani geni mogu biti uvedeni u gram-negativne bakterije na iste ili različite vektore.

[0163] U jednoj realizaciji gram-negativna bakterijska ćelija prema predmetnom pronalasku ne nosi mutirani OmpT nokaut gen, kao što je onaj deficijentan u hromozomalnoj OmpT.

[0164] U jednoj realizaciji ćelije prema predstavljenom otkriću sadrže samo tri karakterišuće mutacije mutiranog spr, smanjeni Tsp i eksprimiran FkpA, Skp ili kombinaciju FkpA i Skp.

[0165] U jednoj realizaciji ćelijska linija prema ovom otkriću se sastoji od mutiranog Tsp gena i mutiranog spr gena, i FkpA gena.

[0166] U jednoj realizaciji ćelijska linija prema ovom otkriću se sastoji od mutiranog Tsp gena i mutiranog spr gena i Skp gena.

[0167] U jednoj realizaciji ćelijska linija prema ovom otkriću se sastoji od mutiranog Tsp gena i mutiranog spr gena, FkpA gena i Skp gena.

[0168] U jednoj realizaciji gen ili geni sposobni za ekspresiju ili prekomernu ekspresiju jednog ili više proteina koji mogu da olakšaju svijanje proteina, poput FkpA i Skp, su tranzijentno transformisani u ćeliji, na primer u ekspresionom vektoru koji opciono sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili njegov vezujući fragment.

[0169] U jednoj realizaciji polinukleotidna sekvenca koja kodira antitelo i polinukleotid koji kodira FkpA i/ili Skp se umeću u odvojene ekspresione vektore.

[0170] Za proizvodnju proizvoda koji sadrže i teške i lake lance, ćelijska linija može biti transformisana sa dva vektora, prvim vektorom koji kodira polipeptid lakog lanca i drugi vektor koji kodira polipeptid teškog lanca. Alternativno može da se koristi jedan vektor, jedan vektor koji uključuje sekvence koje kodiraju polipeptide lakog lanca i teškog lanca.

[0171] Alternativno, polinukleotidna sekvenca koja kodira antitela i polinukleotid koji kodira FkpA i/ili Skp se umeću u jedan vektor. Poželjno vektor sadrži sekvence koje kodiraju polipeptide lakog i teškog lanca antitela.

[0172] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ekspresioni vektor koji sadrži rekombinantni polinukleotid koji kodira FkpA i/ili Skp i antitelo ili njegov antigen vezujući fragment specifičan za humani FcRn. Ekspresioni vektor je multicistronski vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira sekvencu FkpA i/ili Skp i polinukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo.

[0173] Multicistronski vektor može biti proizveden povoljnom metodom kloniranja koja omogućava ponavljajuće sekvencijalno kloniranje sekvenci polinukleotida u vektor. Metoda koristi kompatibilne kohezivne krajeve para restrikcionih mesta, kao što su "AT" krajevi Ase I i Nde I restrikcionih mesta. Sekvenca polinukleotida koja sadrži kodirajuću sekvencu i ima kompatibilne kohezivne krajeve, kao što je Asel-Ndel fragment, može da se klonira u restrikciona mesta u vektoru, kao što je Ndel. Umetanje polinukleotidne sekvence uništava 5' restrikciono mesto ali kreira novo 3' restrikciono mesto, kao što je Ndel, koje se zatim može koristiti za umetanje dodatnih polinukleotidnih sekvenci koje sadrže kompatibilne kohezivne krajeve. Postupak se zatim može ponoviti za umetanje dodatnih sekvenci. Svaka polinukleotidna sekvenca umetnuta u vektor uključuje nekodirajuću sekvencu 3' za zaustavni kodon koja može sadržati Ssp I mesto za skrining, Shine Dalgarno vezujuću sekvencu ribozoma, A rich spejser i Ndel mesto koje kodira početni kodon.

[0174] Šematski prikaz kreiranja vektora koji sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela (LC), teški lanac antitela (HC), FkpA polinukleotidne sekvence i sledeće polinukleotidne sekvence je prikazan na Slici 7d.

[0175] Ćelija prema predmetnom pronalasku poželjno sadrži ekspresioni vektor kako je prethodno definisano. U nastavku će biti opisan primer u kojem ćelija eksprimira jedan ili više dodatnih proteina kako sledi: jedan ili više proteina koji mogu da olakšaju savijanje proteina, kao što su skp, surA, PPiA i PPiD; i opciono jedan ili više proteina koji mogu da olakšaju sekreciju ili translokaciju proteina, kao što je SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY i Lep; jedan ili više drugih proteina mogu biti eksprimirani od jednog ili više polinukleotida umetnutih u isti vektor kao polinukleotid koji kodira FkpA i/ili polinukleotidna sekvenca koja kodira antitelo. Alternativno jedan ili više polinukleotida mogu biti umetnuti u odvojene vektore.

[0176] Ekspresioni vektor može biti proizveden umetanjem jedne ili više ekspresionih kaseta, kao što je gore definisano, u pogodan vektor. Alternativno, regulatorne ekspresione sekvence za usmeravanje ekspresije polinukleotidne sekvence mogu biti sadržane u ekspresionom vektoru i na taj način može biti potreban samo kodirajući region polinukleotida da se kompletira ekspresioni vektor.

[0177] Polinukleotid koji kodira FkpA i/ili Skp i/ili polinukleotid koji kodira antitelo je pogodno umetnut u replikabilni vektor, obično autonomno replikujući ekspresioni vektor za ekspresiju u ćeliji pod kontrolom pogodnog promotera za ćeliju. Mnogi vektori za ovu namenu su poznati u tehnici i izbor odgovarajućeg vektora može zavisiti od veličine nukleinskih kiselina i posebno od tipa ćelije.

[0178] Primeri ekspresionih vektora koji se mogu koristiti za transformisanje ćelije domaćina sa polinukleotidima prema ovom pronalasku obuhvataju:

• plazmid, kao što je pBR322 ili pACYC184, i/ili

• viralni vektor poput bakterijskog faga

• transpozabilni genetski element kao što je transposon

[0179] Takvi ekspresioni vektori obično sadrže plazmidni početak replikacije DNK, antibiotski selektabilni marker, promoter i terminator transkripcije odvojene mestom višestrukog kloniranja (ekspresiona kaseta) i sekvencu DNK koja kodira mesto vezivanja ribozoma.

[0180] Promoteri koji se koriste u predmetnom pronalasku mogu biti povezani sa relevantnim polinukleotidom direktno ili alternativno mogu biti locirani u odgovarajućoj poziciji, na primer u vektoru tako da kada se relevantni polipeptid umetne relevantni promoter može da deluje na njega. U jednom rešenju promoter se nalazi pre kodirajućeg dela polinukleotida na koji on deluje, na primer relevantni promoter pre svakog kodirajućeg dela polinukleotida. "Pre", kako je ovde korišćeno treba da implicira da se promoter nalazi na 5 prim kraju u odnosu na kodirajući deo polinukleotida.

[0181] Promoteri mogu biti endogeni ili egzogeni za ćelije domaćina. Pogodni promoteri uključuju lac, tac, trp, PhoA, Ipp, Arab, tet i T7.

[0182] Jedan ili više korišćenih promotera mogu biti inducibilni promoteri. U primeru izvođenja u kojem se polinukleotid koji kodira FkpA i/ili Skp i polinukleotid koji kodira antitelo umeću u jedan vektor, nukleotidne sekvence koje kodiraju FkpA i antitelo mogu biti pod kontrolom jednog promotera ili odvojenih promotera. U izvođenju u kojem su nukleotidne sekvence koje kodiraju FkpA i/ili Skp i antitelo pod kontrolom odvojenih promotera, promoteri mogu biti nezavisni inducibilni promoteri.

[0183] Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima takođe generalno sadrže Shine-Dalgamo (S.D.) sekvencu operativno povezanu za DNK koja kodira polipeptid od interesa. Promoter može biti uklonjen iz bakterijskog izvora DNK digestijom pomoću slobodnih restrikcionih enzima i umetnut u vektor koji sadrži željenu DNK.

[0184] Ekspresioni vektor poželjno sadrži i dicistronsku poruku za proizvodnju antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta kao što je opisano u WO03/048208 ili WO2007/039714 (čiji je sadržaj ovde uključen referencom). Poželjno uzvodni cistron sadrži DNK koja kodira laki lanac antitela, a nizvodni cistron sadrži DNK koja kodira odgovarajući teški lanac, dicistronsku intergensku sekvencu (IGS) koja poželjno sadrži sekvencu izabranu od IGS1 (SEK ID BR: 23), IGS2 (SEK ID BR: 24), IGS3 (SEK ID BR: 25) i IGS4 (SEK ID BR: 26).

[0185] Terminatori mogu biti endogeni ili egzogeni za ćelije domaćina. Pogodan terminator je rrnB.

[0186] Dalji pogodni transkripcioni regulatori uključujući promotere i terminatore i metoda ciljanja proteina se mogu naći u "Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli" Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, Sept 1996, p 512-538.

[0187] FkpA polinukleotid umetnut u ekspresioni vektor poželjno obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira FkpA signalne sekvence i FkpA kodirajuće sekvence. Vektor poželjno sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava vektoru replikaciju u jednoj ili više selektovanih ćelija domaćina, po mogućnosti replikaciju nezavisnu od hromozoma domaćina. Takve sekvence su dobro poznate za razne vrste bakterija.

[0188] U jednoj realizaciji FkpA i/ili Skp i/ili protein od interesa sadrži histidinski-tag na N-terminusu i/ili C-terminusu.

[0189] Molekul antitela može biti izlučen iz ćelije ili ciljan u periplazmu pomoću odgovarajućih signalnih sekvenci. Alternativno, molekuli antitela se mogu akumulirati u citoplazmi ćelije. Poželjno je da se molekul antitela cilja u periplazmu.

[0190] Polinukleotid koji kodira antitelo može biti eksrimiran kao fuzija sa drugim polipeptidom, poželjno signalnom sekvencom ili drugim polipeptidom koji ima specifično mesto cepanja na N-terminusu zrelog polipeptida. Odabrana heterologna signalna sekvenca mora biti ona koja je prepoznata i obrađena od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne obrađuju nativnu ili eukariotsku signalnu sekvencu polipeptida, signalna sekvenca se supstituiše prokariotskom signalnom sekvencom. Pogodne signalne sekvence obuhvataju OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA i DsbC. U jednom primeru izvođenja u kojem ćelija sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira teški lanac antitela i polinukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela, svaki polinukleotid može da sadrži signalnu sekvencu, kao što je OmpA.

[0191] Konstrukcija pogodnih vektora koji sadrže jednu ili više gore navedenih komponenata koristi standardne tehnike ligacije. Izdvojeni plazmidi ili fragmenti DNK se cepaju, prilagođavaju i ponovo spajaju u željeni oblik za dobijanje potrebnih plazmida. Opšte metode pomoću kojih mogu biti konstruisani vektori, metode transfekcije i metode kultivisanja su dobro poznate stručnjacima. U tom smislu, pozivamo se na "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, FM Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York i Maniatis Manual izdanje Cold Spring Harbor Publishing.

[0192] Za pripremu DNK sekvenci koje kodiraju antitela se mogu koristiti standardne tehnike molekularne biologije. Željene DNK sekvence mogu da se sintetišu u potpunosti ili delimično, korišćenjem tehnika sinteze oligonukleotida. Po potrebi se mogu koristiti tehnike mutageneze usmerene na mesto i lančana reakcija polimeraze (PCR).

[0193] Realizacije ovog pronalaska koje su ovde opisane u vezi sa polinukleotidima se primenjuju podjednako na alternativne realizacije pronalaska, na primer vektore, ekspresione kasete i/ili ćelije domaćina koje sadrže upotrebljene komponente, sve dok je relevantni aspekt primenljiv.

[0194] Ćelija prema predmetnom pronalasku može dalje da sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein od interesa. Sekvenca polinukleotida koja kodira protein od interesa može biti egzogena ili endogena. Sekvenca polinukleotida koja kodira protein od interesa može biti integrisana u hromozom domaćina ili može biti neintegrisana u vektor, obično plazmid.

[0195] U jednom aspektu ćelija prema predmetnom pronalsku eksprimira protein od interesa. "Protein od interesa" u kontekstu ove specifikacije treba da se odnosi na polipeptid za ekspresiju, obično rekombinantni polipeptid. Međutim, protein od interesa može biti endogeni protein eksprimiran od endogenog gena u ćeliji domaćina.

[0196] Kako je ovde korišćeno, "rekombinantni polipeptid" se odnosi na protein koji je konstruisan ili proizveden korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK. Protein od interesa može biti egzogena sekvenca identična endogenom proteinu ili njena mutirana verzija, na primer sa oslabljenom biološkom aktivnošću, ili njen fragment, eksprimiran od egzogenog vektora. Alternativno, protein od interesa može biti heterologni protein, koji se normalno ne eksprimira u ćeliji domaćina.

[0197] Protein od interesa može biti bilo koji pogodan protein uključujući terapeutske, profilaktičke ili dijagnostičke proteine.

[0198] Stručnjak će, lako moći da testira da li je izlučeni protein pravilno savijen pomoću metoda koje su poznate u tehnici, kao što je HPLC proteina G, cirkularni dihroizam, NMR, Rendgenska kristalografija i metode merenja afiniteta epitopa.

[0199] U jednoj realizaciji protein od interesa je koristan u lečenju bolesti ili poremećaja, uključujući imunološke poremećaje i/ili autoimune bolesti.

[0200] U jednoj realizaciji, autoimuna bolest je izabrana od sledećeg: akutni diseminisani encefalomijelitis (ADEM), akutni nekrotizirajuć i hemoragijski leukoencefalitis, Adisonova bolest, agamaglobulinemija, alopecija areata, amiloidoza, vaskulitis povezan sa ANCA, ankilozantni spondilitis, anti-GBM/anti-TBM nefritis, antifosfolipidni sindrom (APS), autoimuni angioedem, autoimuni hepatitis, autoimuna hiperlipidemija, autoimuna imunodeficijencija, autoimuna bolest unutrašnjeg uha (AIED), autoimuni miokarditis, autoimuni pankreatitis, autoimuna retinopatija, autoimuna trombocitopenična purpura (ATP), autoimune bolesti štitnjače, autoimune urtikarijalne, aksonalne i neuronske neuropatije, kardiomiopatija, Castlemanova bolest, celijakija, Šagasova bolest, sindrom hroničnog umora, hronična inflamatorna demijelinacijska polineuropatija (CIDP), hronični rekurentni multifokalni ostomijelitis (CRMO), Churg-Straussov sindrom, cikatricijalni pemfigoid/ benigni pemfigoid mukoze, bolest hladnog aglutinina, kongenitalni srčani blok, miokarditis koksaki, CREST bolest, esencijalna mešana krioglobulinemija, demijelinizacione neuropatije, dermatitis herpetiformis, dermatomiozitis, Devicova bolest (neuromielitis optica), dilatirana kardiomiopatija, diskoidni lupus, Dreslerov sindrom, endometrioza, eozinofilna angiocentrična fibroza, eozinofilni fasciitis, nodozni eritem, eksperimentalni alergijski encefalitis, arteritis džinovskih ć elija (temporalni arteritis), glomerulonefritis, Gudpasterov sindrom, granulomatoza sa polangiitisom (GPA) vidi Wegenerova granulomatoza, Graveova bolest, Guillain-Barreov sindrom, Hashimotov encefalitis, Hashimotov tiroiditis, hemolitička anemija, Henoch-Schonlein purpura, herpes gestationis, hipogamaglobulinemija, idiopatski hipokomplementemični tubulointesticijalni nefritis, idiopatska trombocitopenična purpura (ITP), IgA nefropatija, bolest povezana sa IgG4, sklerozirajući kolangitis povezan sa IgG4, imunoregulatorni lipoproteini, inflamatorna aneurizma aorte, inflamatorni pseudotumor, miozitis inkluzionih tela, insulinzavisni dijabetes (tip1), intersticijalni cistitis, juvenilni artritis, juvenilni dijabetes, Kavasaki sindrom, Kutner tumor, Lambert-Eatonov sindrom, leukocitoklastični vaskulitis, lichen planus, lichen sclerosis, lignozni konjunktivitis, linearna IgA bolest (LAD), Lupus (SLE), Lajmska bolest, hronična, medijastinalna fibroza, Menijerova bolest, mikroskopski polangiitis, Mikulićev sindrom, mešovita bolest vezivnog tkiva (MCTD), Morenov čir, Mucha-Habermannova bolest, multifokalna fibroskleroza, multipla skleroza, miastenija gravis, miozitis, narkolepsija, neuromijelitis optica (Devic's), neutropenija, očni cikatricijalni pemfigoid, optički neuritis, Ormond bolest (retroperitonealna fibroza), palindromski reumatizam, PANDAS (pedijatrijski autoimuni neuropsihijatrijski poremeć aji povezani sa Streptokokom), paraneoplastična cerebelarna degeneracija, paraproteinemijske polineuropatije, paroksizmalna noć na hemoglobinurija (PNH), Rombergov sindrom, Parsonnage-Turner-ov sindrom, pars planitis (periferni uveitis), pemfigus vulgaris, periaortitis, periarteritis, periferna neuropatija, perivenski encefalomijelitis, perniciozna anemija, POEMS sindrom, nodozni poliarteritis, autoimuni poliglandularni sindromi tip I, II i III, reumatska polimialgija, sindrom postmiokardijalnog infarkta, postperikardiotomni sindrom, progesteronski dermatitis, primarna bilijarna ciroza, primarni sklerozni holangitis, psorijaza, psorijatični artritis, idiopatska pulmonarna fibroza, gangrenozna piodermija, čista aplazija crvenih ć elija, Raynaudov fenomen, refleksna simpatička distrofija, Reiterov sindrom, povratni polikondritis, sindrom nemirnih nogu, retroperitonealna fibroza, reumatska groznica, reumatoidni artritis, Riedelov tireoiditis, sarkoidoza, Schmidtov sindrom, skleritis, skleroderma, Sjogrenov sindrom, autoimunitet spermija i testisa, sindrom ukočene osobe, subakutni bakterijski endokarditis (SBE), Susacov sindrom, simpatička oftalmija, Takajasu arteritis, temporalni arteritis/arteritis gigantskih ć elija, trombotična, trombocitopenična purpura (TTP), Tolosa-Huntov sindrom, transverzalni mijelitis, ulcerativni kolitis, nediferencirana bolest vezivnog tkiva (UCTD), uveitis, vaskulitis, vezikulobulozna dermatoza, vitiligo, Waldenstrom makroglobulinemija, topla idiopatska hemolitička anemija i Wegenerova granulomatoza (sada se naziva granulomatoza sa polangiitisom (GPA).

[0201] U jednoj realizaciji neurološki poremećaj je odabran od sledećeg: hronična inflamatorna demijalinizaciona polineuropatija (CIDP), Guillain-Barreov sindrom, paraproteinemijske polineuropatije, Devicova bolest i miastenija gravis.

[0202] U jednoj realizaciji imunološki hematološki poremećaj je odabran od sledećeg: idiopatska trombocitopenična purpura (ITP), trombotična trombocitopenična purpura (TTP), topla idiopatska hemolitička anemija, Gudpasterov sindrom i neusklađenost donora transplantacije zbog anti-HLA antitela.

[0203] U jednoj realizaciji bolest je odabrana od sledećeg: miastenia gravis, neuromijelitis optika, CIDP, Guillain-Barreov sindrom, paraproteinemična polineuropatija, refraktorna epilepsija, ITP/TTP, hemolitička anemija, Gudpasterov sindrom, ABO neusklađenost, lupus nefritis, bubrežni vaskulitis, skleroderma, fibrozni alveolitis, dilatativna kardiomiopatija, Graveova bolest, dijabetes tipa 1, autoimuni dijabetes, pemfigus, skleroderma, lupus, ANCA vaskulitis, dermatomiozitis, Sjogrenova bolest i reumatoidni artritis.

[0204] U jednoj realizaciji dermatološki poremećaj je odabran od sledećeg: bulozni pemfigoid, pemphigus vulgaris, vaskulitis povezan sa ANCA i dilatirana kardiomiopatija.

[0205] U jednoj varijanti, antitela ili fragmenti prema predstavljenom opisu mogu biti upotrebljeni u profilaksi ili lečenju aloimunih bolesti povezanih sa alogenim organom ili transplantacijom tkiva ili određenim neonatalnim stanjima.

[0206] Protein može biti proteolitički senzitivan polipeptid, t.j. proteini koji su skloni da budu cepani, podložni cepanju ili cepani pomoću jedne ili više gram-negativnih bakterijskih proteaza, kao što su proteaze E. coli, bilo u nativnom stanju ili tokom sekrecije. U jednoj realizaciji protein od interesa je proteolitički-senzitivan na proteazu odabranu od DegP, Proteaza III i Tsp. U jednoj realizaciji protein od interesa je proteolitički-senzitivan na proteazu Tsp. U jednoj varijanti protein od interesa je proteolitički-senzitivan na proteaze DegP i Proteaza III. U jednoj varijanti protein od interesa je proteolitički senzitivan na proteaze DegP i Tsp. U jednoj varijanti protein od interesa je proteolitički- senzitivan na proteaze Tsp i Proteazu III. U jednoj varijanti protein od interesa je proteolitički osetljiv na proteaze DegP, Proteaza III i Tsp.

[0207] Poželjno protein je eukariotski polipeptid.

[0208] Protein od interesa eksprimiran pomoću ćelija prema ovom pronalasku može, npr. da bude imunogen, fuzioni protein koji sadrži dva heterologna proteina ili antitelo. Antitela za upotrebu kao proteini od interesa uključuju monoklonska, multivalentna, multi-specifična, humanizovana, kompletno humana ili himerna antitela. Antitelo može biti bilo koje vrste, ali je poželjno izvedeno iz monoklonskog antitela, humanog antitela, ili humanizovanog fragmenta. Antitelo može biti izvedeno iz bilo koje klase (npr. IgG, IgE, IgM, IgD ili IgA) ili podklase imunoglobulinskih molekula i može se dobiti iz bilo koje vrste, uključujući na primer miša, pacova, ajkulu, zeca, svinju, hrčka, kamilu, lamu, kozu ili čoveka. Delovi fragmenta antitela se mogu dobiti od više vrsta, na primer fragmenti antitela mogu biti himerni. U jednom primeru konstantni regioni su od jedne vrste, a varijabilni regioni od druge.

[0209] Antitelo može biti kompletan molekul antitela koji ima punu dužinu teškog i lakog lanca ili njihov fragment, npr. VH, VL, VHH, Fab, modifikovani Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv fragment, ili dualno specifično antitelo, kao što je Fab-dAb ili Fab-Fv, kako je opisano u WO2009/040562 i WO2010/ 035012.

[0210] U jednoj realizaciji protein je Fab'.

[0211] Antitelo može biti specifično za bilo koji ciljani antigen. Antigen može biti ćelijski asocirani protein, na primer, ćelijski površinski protein na ćelijama poput bakterijskih ćelija, ćelija kvasca, T-ćelija, endotelnih ćelija ili ćelija tumora, ili može biti rastvorljivi protein. Antigen od interesa takođe može biti bilo koji medicinski relevantan protein kao što su proteini koji su ushodno regulisani tokom bolesti ili infekcije, na primer receptori i/ili njihovi odgovarajući ligandi. Posebni primeri ćelijskih površinskih proteina uključuju adhezione molekule, na primer integrine kao što su β1 integrini npr. VLA-4, E-selektin, P selektin ili L selektin, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19 , CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDV52, CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, CSF1 ili CSF1-Receptor, DPCR1, DPCR1, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, nektinu-sličan2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, karcinoembrionski antigen (CEA), human milk fat globulin (HMFG1 i 2), MHC Klasa I i MHC Klasa II antigena, KDR i VEGF, i po potrebi, njihovi receptori.

[0212] Rastvorljivi antigeni uključuju interleukine kao što su IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL -16 ili IL-17, kao što je IL17A i/ili IL17F, viralni antigeni npr. respiratorni sincicijalni virus ili antigeni citomegalovirusa, imunoglobulini, kao što je IgE, interferoni kao što su interferon α, interferon ß ili interferon γ, faktor nekroze tumora TNF (ranije poznat kao faktor nekroze tumora-α), faktor nekroze tumora-ß, faktori stimulacije kolonija kao što je G-CSF ili GM-CSF, i faktori rasta poreklom iz trombocita, kao što su PDGF-α, i PDGF-β i kada je to odgovarajuće njihovi receptori. Drugi antigeni uključuju površinske antigene bakterijskih ćelija, bakterijske toksine, viruse kao što je grip, EBV, HepA, B i C, bioterorističke agense, radionuklide i teške metale, i otrove i toksine zmija i pauka.

[0213] U jednom obliku antigen je FcRn.

[0214] Antitela za upotrebu u predstavljenom opisu mogu biti dobijena korišćenjem bilo kog pogodnog postupka koji je poznat u struci. Za proizvodnju antitela koja specifično prepoznaju FcRn mogu da se koriste FcRn polipeptid/protein uključujući fuzione proteine i njihove mutante, uključujući ćelije (rekombinantne ili prirodne) koje eksprimiraju polipeptide (kao što su aktivirane T ćelije). Polipeptid može biti "zreli" polipeptid ili biološki aktivni fragment ili njegov derivat. Ljudski protein je registrovan u Swiss-Prot pod brojem P55899. U jednoj realizaciji imunogen je FcRn alfa lanac ili njegov fragment.

[0215] Polipeptidi za upotrebu za imunizaciju domaćina, mogu biti pripremljeni postupcima dobro poznatim u struci od genetski modifikovanih ćelija domaćina koje sadrže ekspresione sisteme ili mogu biti regenerisane iz prirodnih bioloških izvora. U predmetnoj prijavi, izraz "polipeptidi" uključuje peptide, polipeptide i proteine. Oni se koriste naizmenično ukoliko nije drugačije specificirano. FcRn polipeptid može u nekim slučajevima biti deo većeg proteina kao što je fuzioni protein, na primer fuzionisan sa afinitetnim tagom.

[0216] Antitela generisana protiv FcRn polipeptida mogu biti dobijena, kada je neophodna imunizacija životinje, administriranjem polipeptida životinji, poželjno ne-humanoj životinji, korišćenjem dobro poznatih i rutinskih protokola, vidi na primer Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Mnoge toplokrvne životinje, kao što su zečevi, miševi, pacovi, ovce, krave, kamile i svinje mogu biti imunizovane. Međutim, generalno su najpogodniji miševi, zečevi, svinje i pacovi.

[0217] U jednoj realizaciji, se antitelo može koristiti za funkcionalno menjanje aktivnosti antigena od interesa. Na primer, antitelo može da neutrališe, antagonizuje ili agonizuje aktivnost pomenutog antigena, direktno ili indirektno ili jednostavno da blokira vezivanje normalnog liganda za njega.

[0218] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje rekombinantnu gram-negativnu bakterijsku ćeliju koja sadrži mutirani Tsp gen, pri čemu mutirani Tsp gen kodira Tsp protein koja ima smanjenu proteaznu aktivnost ili je mutirani nokaut tsp gen, mutirani spr gen koji kodira mutirani spr, gen koji može da eksprimira ili prekomerno eksprimira jedan ili više proteina koji mogu da olakšaju savijanje proteina i polinukleotidna sekvenca koja kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment specifičan za FcRn.

[0219] Različita anti-FcRn antitela i fragmenti su prikazani u sekvencama 36 do 74.

[0220] U jednoj realizaciji teški lanac sadrži 1, 2 ili 3 CDR-a nezavisno odabrana od SEK ID BR: 36, 37 i 38.

[0221] U jednoj realizaciji laki lanac sadrži 1, 2 ili 3 CDR-a nezavisno odabrana od SEK ID BR: 39, 40 i 41.

[0222] U jednoj realizaciji teski lanac antitela sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 36 za CDR-H1, sekvencu datu u SEK ID BR: 37 za CDR-H2 i sekvencu datu u SEK ID BR: 38 za CDRH3.

[0223] U jednoj realizaciji laki lanac antitela sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 39 za CDR-L1, sekvencu datu u SEK ID BR: 40 za CDR-L2 i sekvencu datu u SEK ID BR: 41 za CDRL3.

[0224] U jednoj realizaciji teški lanac antitela sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 36 za CDR-H1, sekvencu datu u SEK ID BR: 37 za CDR-H2, sekvencu datu u SEK ID BR: 38 za CDRH3, sekvencu datu u SEK ID BR: 39 za CDR-L1, sekvence date u SEK ID BR: 40 za CDR-L2 i sekvencu datu u SEK ID BR: 41 za CDRL3.

[0225] U jednoj realizaciji ćelija eksprimira molekul antitela sa ovde opisanom sekvencom.

[0226] Molekuli antitela uključuju antitela i njihove vezujuće fragmente.

[0227] Pogodno, humanizovano antitelo prema predmetnom pronalasku ima varijabilni domen koji sadrži okvirne regione humanog akceptora kao i jedan ili više CDR-a posebno obezbeđenih u ovom dokumentu. Tako je u jednoj realizaciji predviđeno humanizovano antitelo koje vezuje humani FcRn pri čemu varijabilni domeni obuhvataju okvirne regione humanog akceptora i CDR-e ne-humanog donora. U jednom primeru varijabilni domen lakog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 50 i varijabilni domen teškog lanca sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 58. U jednom primeru laki lanac sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 54, a teski lanac sadrži sekvencu datu u SEK ID BR: 62.

[0228] Nakon ekspresije, fragmenti antitela mogu biti dalje procesirani, na primer konjugacijom za drugi entitet kao što je efektorski molekul.

[0229] Termin efektorski molekul kako se ovde koristi uključuje, na primer, antineoplastične agense, lekove, toksine (kao što su enzimski aktivni toksini bakterijskog ili biljnog porekla i njihove fragmente npr. ricin i njegovi fragmenti) biološki aktivne proteine, na primer enzime, druga antitela ili fragmente antitela, sintetičke ili prirodne polimere, nukleinske kiseline i njihove fragmente npr. DNK, RNK i njihove fragmente, radionuklide, posebno radio-jodide, radioaktivne izotope, helatirane metale, nanočestice i reporter grupe kao što su fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koja se mogu detektovati NMR ili ERS spektroskopijom. Efektorski molekul može biti vezan za antitelo ili njegov fragment pomoću bilo kojeg pogodnog postupka, na primer fragment antitela može biti modifikovan za pričvršćivanje najmanje jednog efektorskog molekula kao što je opisano u WO05/003171 ili WO05/ 003170 (čiji sadržaji su ovde uključeni referencom). WO05/003171 ili WO05/003170 takođe opisuju odgovarajuće efektorske molekule.

[0230] U jednoj realizaciji antitelo ili njegov fragment, kao što je Fab, se PEGiluje da se dobije produkt sa potrebnim osobinama, npr. sličan celim antitelima, ako je potrebno. Na primer, antitelo može biti PEGilovani anti-TNF-α Fab', kako je opisano u WO01/094585, koji je poželjno vezan za jednu od cisteinskih rezidua na C-terminalnom kraju teškog lanca lizilmaleimid-izvedene grupe u kojoj je svaka od dve amino grupe lizil rezidue ima kovalentno vezanu za sebe metoksipoli (etilenglikol) reziduu koja ima molekulsku masu od oko 20,000Da, tako da je ukupna prosečna molekulska masa metoksipoli (etilenglikol) rezidue oko 40,000Da, još poželjnije lizil-maleimid-izvedena grupa je [1-[[[2-[[3-(2,5-diokso-1-pirolidinil)-1-oksopropil]amino]etil]amino]-karbonil]-1,5-pentandiil]bis (iminokarbonil).

[0231] U jednoj realizaciji Fab ili Fab' prema ovom otkriću se konjuguje za molekul albumina humanog seruma ili molekul skroba.

[0232] Ćelija takođe može sadržati dodatne polinukleotidne sekvence koje kodiraju jedan ili više drugih proteina od interesa.

[0233] Dodatno, ovde su opisane ćelije u kojima je jedan ili više proteina domaćina E. coli izabrano za genetsku modifikaciju za čiji divlji tip je poznato da se prečišćava zajedno sa rekombinantnim proteinom od interesa tokom prečišćavanja, kako je opisano u Humphreys et al. "Engineering of Escherichia coli to improve the purification of periplasmic Fab’ fragments: changing the pl of the chromosomally encoded PhoS/PstS protein", Protein Expression and Purification 37 (2004) 109-118 i WO04/035792 (čiji sadržaj je ovde uključen referencom). Upotreba takvih modifikovanih proteina domać ina poboljšava proces prečiš ć avanja proteina od interesa, posebno antitela, proizvedenih u E. coli menjanjem fizičkih svojstava odabranih proteina E. coli, tako da se oni više ne prečiš ć avaju zajedno sa rekombinantnim antitelom. Poželjno protein E. coli koji se menja, se bira od jednog ili više od sledećeg: protein koji vezuje Fosfat (PhoS/PstS), protein koji vezuje dipeptid (DppA), protein koji vezuje maltozu (MBP) i Tioredoksin.

[0234] U jednom primeru fizičko svojstvo kontaminirajućeg proteina domaćina se menja dodavanjem aminokiselinskog taga na C-terminus ili N-terminus. U poželjnoj realizaciji fizičko svojstvo koje se menja je izoelektrična tačka, i aminokiselinski tag je tag poli-asparaginske kiseline vezan za C-terminus. U jednoj realizaciji E. coli proteini izmenjeni dodavanjem pomenutog taga su Dipeptidni vezujući protein (DppA) Maltozni vezujući protein (MBP), tioredoksin i Fosfat vezujući protein (PHOS/PstS). U jednoj specifičnoj varijanti pI od E. coli Fosfat vezujućeg proteina (Phos/PstS) se smanjuje sa 7.2 na 5.1 dodavanjem taga poliasparaginske kiseline (poliD), koji na C-terminusu sadrži 6 rezidua asparaginske kiseline.

[0235] Takođe je opisana modifikacija specifičnih rezidua kontaminirajućeg proteina E. coli da se promene njegova fizička svojstva, samih ili u kombinaciji sa dodatkom N ili C terminalnih tagova. Takve promene mogu uključivati insercije ili delecije da se izmeni veličina proteina ili zamene amino kiseline da se promeni pI, ili hidrofobnost. Ove rezidue mogu biti locirane na površini proteina. U konkretnom primeru realizacije površinske rezidue Phos proteina se menjaju u nameri da se smanji pI proteina. Rezidue koje se smatraju bitnim za vezivanje fosfata (Bass, US5,304,472) se izbegavaju kako bi Phos protein zadržao funkcionalnost. Poželjno se ciljaju rezidue lizina koje se pružaju daleko od površine proteina ili su u ili blizu velikih grupa baznih rezidua. U jednom primeru, Phos protein ima tag heksa poli-asparaginske kiseline vezan za C-terminus dok su površinske rezidue na suprotnom kraju molekula meta za supstituciju. Poželjno odabrani ostaci lizina se zamenjuju glutaminskom kiselinom ili asparaginskom kiselinom da ispolje veći potencijal promene pI nego kada se neutralne rezidue zamene kiselim. Označavanje supstitucijskih mutanata se ovde sastoji od slova koje prati broj koji prati slovo. Prvo slovo označava amino kiselinu u divljem tipu proteina. Broj se odnosi na položaj aminokiseline, na kojem se vrši supstitucija amino kiseline, a drugo slovo označava amino kiselinu koja se koristi da zameni aminokiselinu divljeg tipa. U poželjnim mutacijama Phos-a u predmetnom pronalasku lizinske rezidue (K) 275, 107, 109, 110, 262, 265, 266, 309, 313 se supstituišu glutaminskom kiselinom (E) ili glutaminom (Q), kao pojedinačne ili kombinovane mutacije, osim toga lizin (K) 318 može biti zamenjen asparaginskom kiselinom (D) kao pojedinačna ili kombinovana mutacija. Poželjne pojedinačne mutacije su K262E, K265E i K266E. Poželjne kombinovane mutacije su K265/266E i K110/265/266E. Još poželjnije, sve mutacije se kombinuju sa tagom poliasparaginske kiseline (poliD) na C-terminusu, a opciono i substitucijom K318D. U sledećem primeru mutacije dovode do smanjenja pI od najmanje 2 jedinice. Poželjno mutacije smanjuju pI, kod Phos od 7.2 do između oko 4 i oko 5.5. U jednom primeru pI kod Phos proteina E. coli je smanjen sa 7.2 na oko 4.9, oko 4.8 i oko 4.5 korišćenjem mutacije poliD K318D, poliD K265/266E i poliD K110/265/266E respektivno.

[0236] Polinukleotid koji kodira protein od interesa može biti eksprimiran kao fuzioni sa drugim polipeptidom, poželjno signalnom sekvencom ili drugim polipeptidom koji ima specifično mesto cepanja na N-terminusu zrelog polipeptida. Heterologna signalna sekvenca koja je odabrana mora biti ona koja je prepoznata i obrađena od ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne stvaraju nativnu ili eukariotsku signalnu sekvencu polipeptida, signalna sekvenca se supstituiše prokariotskom signalnom sekvencom. Pogodne signalne sekvence obuhvataju OmpA, PhoA, LamB, pelB, DsbA i DsbC.

[0237] Konstrukcija pogodnih vektora koji sadrže jednu ili više od gore navedenih komponenata koristi standardne tehnike ligacije. Izolovani plazmidi ili fragmenti DNK se cepaju, prilagođavaju, i ponovo spajaju u oblik poželjan za generisanje potrebnog plazmida.

[0238] U jednom aspektu ekspresiona kaseta se u predmetnom pronalasku koristi da nosi polinukleotid koji kodira protein od interesa koji obično sadrži jedan ili više proteina kodirajuće sekvence koji kodiraju jedan ili više proteina od interesa i jednu ili više sekvenci za regulaciju ekspresije. Jedna ili više sekvenci za regulaciju ekspresije mogu da sadrže promoter. Jedna ili više sekvenci za regulaciju ekspresije može takođe uključivati 3’ netranslirani region, kao što je terminaciona sekvenca. Pogodni promoteri su detaljnije diskutovani dalje u tekstu.

[0239] U jednom aspektu, ćelija prema predmetnom pronalasku sadrži vektor, kao što je plazmid. Vektor prvenstveno sadrži jednu ili više ekspresionih kaseta kako je gore definisano.

[0240] U primeru izvođenja u kojem protein od interesa predstavlja antitelo koje sadrži i teške i lake lance, ćelijska linija može biti transfektovana sa dva vektora, prvim vektorom koji kodira polipeptid lakog lanca i drugim vektorom koji kodira polipeptid teškog lanca. Alternativno, može da se koristi jedan vektor, vektor koji sadrži sekvence koje kodiraju polipeptide lakog lanca i teškog lanca.

[0241] Vektor za upotrebu u predmetnom pronalasku može biti proizveden umetanjem ekspresione kasete u pogodan vektor kao što je gore definisano. Alternativno, regulatorne sekvence za usmeravanje ekspresije polinukleotidne sekvence koja kodira protein od interesa mogu biti sadržane u vektoru i na taj način mogu biti potreban samo kodirajući region polinukleotida da se vektor kompletira.

Primeri vektora koji se mogu koristiti za transformaciju ćelije domaćina sa polinukleotidom prema ovom pronalasku uključuju: plazmid, kao što je pBR322 ili pACYC184, i/ili viralni vektor poput bakterijskog faga, transpozabilni genetički element kao što je transpozon.

[0242] Mnogi oblici ekspresionog vektora su dostupni. Takvi vektori obično sadrže plazmidni početak replikacije DNK, selektivni antibiotski marker, promoter i terminator transkripcije odvojene mestom višestrukog kloniranja (ekspresiona kaseta) i sekvencu DNK koja kodira mesto vezivanja ribozoma.

[0243] Promoteri koji se koriste u predmetnom pronalasku mogu biti spojeni sa relevantnim polinukleotidom direktno ili alternativno mogu da se nalaze u odgovarajućpj poziciji, na primer u vektoru tako da kada se ubaci relevantni polipeptid relevantni promoter može da deluje na njega. U jednom rešenju promoter se nalazi pre kodirajućeg dela polinukleotida na koji deluje, na primer relevantni promoter pre svakog kodirajućeg dela polinukleotida. "Pre", kako je ovde korišćeno treba da implicira da se promoter nalazi na 5 prim kraju u odnosu na kodirajući deo polinukleotida.

[0244] Promoteri mogu biti endogeni ili egzogeni za ćelije domaćina. Pogodni prometori uključuju lac, tac, trp, PhoA, IPP, Arab, Tet i T7.

[0245] Jedan ili više promotera koji se koriste mogu biti inducibilni promoteri.

[0246] Ekspresione jedinice za upotrebu u bakterijskim sistemima takođe generalno sadrže Shine-Dalgarno (SD) ribozomske sekvence operativno povezane sa DNK koja kodira polipeptid od interesa.

[0247] Ekspresioni vektor poželjno sadrži i dicistronsku poruku za proizvodnju antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta kao što je opisano u WO 03/048208 ili WO2007/039714 (čiji sadržaji su ovde uključeni referencom). Poželjno uzvodni cistron sadrži DNK koja kodira laki lanac antitela, a nizvodni cistron sadrži DNK koja kodira odgovarajući teški lanac, a dicistronska intergena sekvenca (IGS) poželjno sadrži sekvencu izabranu od IGS1 (SEK ID BR: 38), IGS2 (SEK ID BR: 39), IGS3 (SEK ID BR: 40) i IGS4 (SEK ID BR: 41).

[0248] Terminatori mogu biti endogeni ili egzogeni za ćelije domaćina. Pogodan terminator je rrnB.

[0249] Dalji pogodni transkripcioni regulatori uključujući promotere i terminatore i metode ciljanja proteina koji se mogu naći u "Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli" Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, Sept 1996, p 512-538.

[0252] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju rekombinantnog proteina od interesa koji obuhvata ekspresiju rekombinantnog proteina od interesa u rekombinantnoj gram-negativnoj bakterijskoj ćeliji kao što je opisano u ovom pronalasku.

[0253] Gram negativna bakterijska ćelija i protein od interesa koji se prvenstveno koriste u postupku iz ovog pronalaska su detaljnije opisani u prethodnom tekstu.

[0254] Kada je polinukleotid koji kodira protein od interesa egzogen taj polinukleotid može biti inkorporiran u ćeliju domaćina pomoću bilo kojih pogodnih sredstava poznatih u struci. Tipično, polinukleotid se inkorporira kao deo ekspresionog vektora koji se transformiše u ćeliji. Prema tome, u jednom aspektu ćelija prema predmetnom pronalasku sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotid koji kodira protein od interesa.

[0255] Sekvenca polinukleotida se može transformisati u ćeliji korišćenjem standardnih tehnika, na primer korišćenjem rubidijum hlorida, PEG ili elektroporacije.

[0256] Kako je dalje ovde opisano postupak takođe može da koristi sistem za selekciju kako bi se olakšala selekcija stabilnih ćelija koje su uspešno transformisane polinukleotidom koji kodira protein od interesa. Sistem za selekciju obično koristi zajedničku transformaciju sekvence polinukleotida koja kodira selekcioni marker. U jednom primeru, svaki polinukleotid transformisan u ćeliji dodatno sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više selekcionih markera. Prema tome, transformacija polinukleotida koji kodira protein od interesa i jednog ili više polinukleotida koji kodiraju marker se javljaju zajedno i sistem za selekciju se može upotrebiti da se odaberu one ćelije koje proizvode željene proteine.

[0257] Ćelije sposobne za ekspresiju jednog ili više markera mogu da prežive/rastu/razmnožavaju se u izvesnim veštački zadatim uslovima, na primer, dodavanje toksina ili antibiotika, zbog svojstava koje pruža polipeptid/gen ili polipeptidna komponenta sistema za selekciju koja je u njega uneta (npr. antibiotska rezistencija). Ćelije koje ne mogu da eksprimiraju jedan ili više markera nisu u mogućnosti da prežive/rastu/razmnožavaju se u veštački zadatim uslovima. Veštački zadati uslovi mogu biti izabrani tako da budu više ili manje pogodni za rast, po potrebi.

[0258] U predmetnom pronalasku može da se koristi bilo koji pogodan sistem selekcije. Izbor sistema obično može biti zasnovan na uključivanju u vektor jednog ili više gena koji obezbeđuju otpornost na poznate antibiotike, na primer gena rezistentnih na tetraciklin, hloramfenikol, kanamicin ili ampicilin. Ćelije koje rastu u prisustvu relevantnih antibiotika mogu biti izabrane pošto eksprimiraju i gen koji daje antibiotsku rezistenciju i željeni protein.

[0259] U jednom izvođenju, postupak prema prikazanom pronalasku dalje obuhvata korak kultivisanja transformisane ćelije u medijumu da se na taj način eksprimira protein od interesa.

[0260] Otkriven je inducibilni sistem za ekspresiju ili konstitutivni promoter koji mogu da se koriste za eksprimiranje proteina od interesa. Pogodni inducibilni ekspresioni sistemi i konstitutivni promoteri su dobro poznati u tehnici.

[0261] Bilo koji pogodan medijum može da se koristi za kultivisanje transformisane ćelije. Medijum se može prilagoditi za određeni sistem selekcije, na primer medijum može fa sadrži antibiotik, da omogući samo one ćelije koje su uspešno transformisane da rastu u medijumu.

[0262] Ćelije dobijene iz medijuma po potrebi mogu biti podvrgnute daljem skriningu i/ili prečišćavanju. Postupak po potrebi može da sadrži i jedan ili više koraka za ekstrakciju i prečišćavanje proteina od interesa.

[0263] Ovaj polipeptid može biti regenerisan iz soja, uključujući iz citoplazme, periplazme ili supernatanta.

[0264] U jednoj realizaciji antitelo je izolovano iz periplazme.

[0265] U jednoj realizaciji, post indukciona brzina hranjenja je u rasponu od 5 do 7.5g/h, kao što je oko 7g/h.

[0266] Specifična metoda(e) koja se koristi za prečišćavanje proteina zavisi od vrste proteina. Pogodni postupci uključuju frakcionaciju na imuno-afinitetnim ili jonoizmenjiva

kim kolonama; precipitaciju etanolom; reverzno-faznu HPLC; hromatografiju hidrofobnih interakcija; hromatografiju na silikagelu; hromatografiju na jonoizmenjivačkim smolama, kao što je S-SEPHAROSE i DEAE; hromatofokusiranje; amonijumsulfatnu precipitaciju; i gel filtraciju.

[0267] Antitela se mogu pogodno odvojiti od medijuma za gajenje i/ili ekstrakta citoplazme i/ili ekstrakta periplazme konvencionalnim procedurama prečišćavanja antitela kao što je, na primer, protein A-Sepharose, protein G hromatografija, protein L hromatografija, tiofilna, multi modalna hromatografija, His-tag, FLAGTag, hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza, afinitetna hromatografija, Amonijum sulfat, etanol ili PEG frakcionacija/precipitacija, jonoizmenjivačke membrane, adsorpciona hromatografija na (EBA) ili simulirana pokretno-stacionarno fazna hromatografija.

[0268] Postupak takođe može uključivati dalji korak merenja količine ekspresije proteina od interesa i selekcije ćelija koje imaju visoke nivoe ekspresije proteina od interesa.

[0269] Postupak može takođe uključivati jedan ili više daljih nizvodnih koraka u postupku kao što je pegilacija proteina od interesa, kao što je antitelo ili fragment antitela.

[0270] Jedan ili više koraka postupka koji je ovde opisan mogu biti izvedeni u kombinaciji u odgovarajućem kontejneru kao što je bioreaktor.

Antitela i fragmenti prema predstavljenom opisu mogu biti korišćeni u lečenju ili profilaksi gde se tehnički odgovarajuće realizacije ovog pronalaska mogu kombinovati. Realizacije su ovde opisane tako da obuhvataju određene karakteristike/elemente. Ovaj pronalazak se takođe odnosi i na zasebne realizacije koje se sastoje ili se suštinski sastoje od pomenutih karakteristika/elemenata. Tehničke reference navedene u tekstu, kao što su patenti & aplikacije su ovde inkorporirani referencama.

Predmetni pronalazak je dalje opisan, samo kao ilustracija, u sledećim primerima, koji se odnose na priložene Slike.

PRIMERI

Primer 1: Generisanje ćelijskih linija

[0271] Generisanje MXE016 i MXE017 je dato u WO2011/086136.

[0272] Generisanje plazmida za anti-FcRn Fab' ekspresiju i za ekspesiju anti-FcRn Fab' sa FkpA, anti-FcRn Fab' sa skp i za ekspresiju anti-FcRn Fab i sa FkpA i sa Skp

[0273] Plazmid je bio konstruisan da sadrži sekvence teškog i lakog lanca iz anti-FcRn Fab (SEK ID BRs: 63 i 55, respektivno. Plazmid pTTOD 1519.g57 Fab', je bio konstruisan korišćenjem konvencionalnih metodologija restrikcionog kloniranja koje se mogu naći u Sambrook et al 1989, Molecular Cloning: Laboratorijski Priručnik. CSHL press, N.Y. Plazmid pTTOD 1519.g57 Fab' je sadržao sledeće karakteristike; snažan tac promoter i operator lac sekvence. Plazmid je sadržao jedinstveno restrikciono mesto EcoRI posle kodirajućeg regiona teškog lanca u Fab', praćeno nekodirajućom sekvencom sa mestom snažnog vezivanja ribozoma a zatim i jedinstveno restrikciono mesto Ndel.

[0274] Fab-a lakog lanca, geni teškog lanca su transkribovani kao pojedinačna policistronska poruka. DNK koja kodira signalni peptid iz E. coli proteina OmpA je fuzionisana na 5' kraju lakih i teških lanaca genskih sekvenci koje usmeravaju translokaciju polipeptida u periplazmu E. coli. Transkripcija je prekinuta pomoću dvojnog terminatora transkripcije rrnB t1t2. Gen laclq je kodirao konstitutivno eksprimiran represorski protein Lac I. Ovo je represiralo transkripciju od tac promotera dok prisustvom alolaktoze ili IPTG nije indukovana derepresija. Kao početak replikacije je korišćen p15A, koji je održavao mali broj kopija. Plazmid je sadržao gen tetraciklinske rezistencije za antibiotsku selekciju.

[0275] Plazmid pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA, ekspresioni vektor za anti-FcRn Fab i FkpA (periplazmički polipeptid), je bio konstruisan ligacijom FkpA na 3'kraj Fab' sekvence iz pTTOD 1519.g57 Fab' korišćenjem mesta EcoRI i Ndel (Vidi Sliku 7D). FkpA (SEK ID BR: 30) je sintetički konstruisan da se uklone 2 Puv II mesta, mesto Sful, BamHI i mesto EcoRI, tako da se novi konstrukt kodiran za 5' EcoRI mesto praćeno mestom snažnog vezivanja ribozoma, praćeno nativnim početnim kodonom, signalnom sekvencom i zrelom sekvencom FkpA, završava C-terminalnim His-tagom i na kraju mestom snažnog vezivanja ribozoma praćenim nekodirajućim mestom Ndel. Restrikcioni fragment EcoRI-Ndel je presečen i spojen u ekspresioni vektor tako da su sva tri polipeptida: laki lanac Fab', teški lanac Fab' i FkpA kodirani na jednoj policistronskoj iRNK.

[0276] Plazmid pTTOD 1519.g57 Fab' Skp, ekspresioni vektor za anti-FcRn Fab i Skp (periplazmički polipeptid), je konstruisan ligacijom Skp na 3'kraj Fab’ sekvence plazmida pTTOD 1519.g57 Fab' korišćenjem EcoRI i Ndel mesta. Skp (SEK ID BR: 34) je sintetički konstruisan da se ukloni 4 Pst I mesta i mesto EcoRV, tako da se novi konstrukt kodiran za 5' EcoRI mesto praćeno mestom snažnog vezivanja ribozoma, praćeno nativnim početnim kodonom, signalnom sekvencom i zrelom sekvencom Skp, završava C-terminalnim His-tagom i na kraju snažnim mestom vezivanja ribozoma praćeno nekodirajućim mestom Ndel. EcoRI-Ndel restrikcioni fragment je presečen i spojen u ekspresioni vektor tako da su sva tri polipeptida: laki lanac Fab', teški lanac Fab' i Skp kodirani na jednoj policistronskoj iRNK.

[0277] Plazmid pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA Skp ekspresioni vektor za anti-FcRn Fab, FkpA i Skp (oba periplazmički polipeptidi), je konstruisan ligacijom Skp u plazmid pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA, na 3'kraj sekvence FkpA korišćenjem mesta Ndel. Skp (SEK ID BR: 34) je sintetički konstruisana da se uklone 4 Pst I mesta i jedno EcoRV mesto, tako da se konstrukt kodiran za 5' Ase I mesto uključujući nativni početni kodon, signalnu sekvencu i zrelu sekvencu Skp, završava C-terminalnim His-tagom i konačno nekodirajućim mestom Ndel. Restrikcioni fragment AseI-NdeI je presečen i spojen u ekspresioni vektor tako da su sva četiri polipeptida: laki lanac Fab', teški lanac Fab', FkpA i Skp kodirani na jednoj policistronskoj iRNK.

[0278] Fermentacija pTTOD 1519.g57 Fab', pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA, pTTOD 1519.g57 Fab' Skp i pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA skp u E. coli V3110, MXE012 (E. coli V3110 spr H145A), MXE016 (E. MXE012 coli V3110 ΔTsp, spr C94A) i MXE017 (E. coli V3110 ΔTsp, spr H145A). Sojevi E. coli V3110, MXE016 i MXE017 su transformisani sa plazmidima pTTOD 1519. g57 Fab', pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA, pTTOD 1519.g57 Fab' Skp i pTTOD 1519.g57 Fab' FkpA Skp generisanim u Primeru 1. Transformacija sojeva je izvedena metodom nađenom kod Chung C.T. i saradnika Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86:2172-2175 (1989). Ovi transformisani sojevi su testirani za ekspresiju pomoću fermentacije.

[0279] Primer 2: Uticaj šaperona na ekspresiju Fab': Sojevi prikazani na Slici 1 su testirani u 1L i 2.5L fermentacionim eksperimentima poređenjem ekspresija Fab':

Medijum za rast, inokulum i koraci fermentacije. Proces fermentacije je iniciran pripremom inokuluma iz viala iz banke ćelija i amplifikovan kroz nekoliko faza prethodnog kultivisanja (flask i reaktori) pre zasejavanja proizvodnog fermentora. U produkcionom fermentoru, ćelije su gajene u definisanim medijumima velike gustine u šaržnom i prihranjivanom šaržnom “fedbatch” načinu rada. Kada je postignuta željena gustina ćelija indukovana je ekspresija Fab' dodavanjem IPTG. Fab' ekspresija je ciljana u periplazmički prostor E. coli gde se akumulirao Fab' tokom trajanja faze indukcije. Hranjenje izvorom ugljenika je primenjeno tokom faze indukcije za kontrolu ekspresije i rasta ćelija. Temperatura, rastvoreni kiseonik (pO2) i pH su kontrolisani za održavanje kulture u optimalnim uslovima.

[0280] Merenje koncentracije biomase i brzine rasta. Koncentracija biomase je određena merenjem optičke gustine kultura na 600 nm.

[0281] Periplazmatska Ektrakcija. Ćelije su sakupljene iz uzoraka kulture centrifugiranjem. Supernatant frakcija je zadržana (na -20 °C) za dalju analizu. Ćelijski pelet je resuspendovan do početne zapremine kulture u puferu za ekstrakciju (100 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA; pH 7.4). Nakon inkubacije na 60 °C tokom otprilike 10 do 12 časova ekstrakt je izbistren centrifugiranjem, a supernatant je upotrebljen svež ili je čuvan (na -20 °C) za analizu.

[0282] Kvantifikacija Fab'. Koncentracije Fab' u periplazmičkim ekstraktima i supernatantima kultura su određene korišćenjem HPLC Proteina G. HiTrap Protein-G HP 1ml kolona (GE-Healthcare ili ekvivalenta) je napunjena analitom (približno neutralan pH, 30 °C, 0.2µm filtriran) pri 2ml/min, kolona je isprana sa 20 mM fosfata, 50 mM NaCl pH 7.4 a zatim je Fab' eluiran korišćenjem injekcije od 50mM Glicin/HCl pH 2.7. Eluirani Fab' je meren pomoću A280 na Agilent 1100 ili 1200 HPLC sistemu i kvantifikovan u odnosu na standardnu krivu prečišćenog Fab' proteina poznate koncentracije.

[0283] Slika 1 prikazuje rezultate 46 fermentacija na količini od 5L izvedenih sa različitim kombinacijama ćelija domaćina i "šaperona". W3110 je divlji-tip E. coli soja. Različite kombinacije su bile: divlji tip bez šaperona, divlji tip sa FkpA i Skp, MXE016 mutant spr i ΔTsp opisan u WO2011 /086136, MXE016 i FkpA, MXE016 i Skp, MXE016 i FkpA i Skp, MXE017 opisan u WO2011/ 086136, MXE017 i FkpA i Skp.

[0284] Rezultati pokazuju da su MXE016, MXE016 i FkpA, MXE016 i FkpA i Skp, i MXE017 i FkpA i Skp pokazali najbolje nivoe ekspresije.

Primer 3: Uticaj post-indukcione brzine hranjenja

[0285] Uticaj tri različite post-indukcione brzine hranjenja 5.4, 6.0 i 7.0g/h je testiran na MXE016 i MXE016 FkpA.

[0286] Medijum za rast, inokulum i koraci fermentacije. Proces fermentacije je iniciran pripremom inokuluma iz viala iz banke ćelija i amplifikovan kroz nekoliko faza prethodnog kultivisanja (flask i reaktori) pre zasejavanja proizvodnog fermentora. U proizvodnom fermentoru, ćelije su gajene u definisanim medijumima visoke gustine u šaržnom i prihranjivanom šaržnom “fed-batch” načinu rada. Kada je željena gustina ćelija postignuta indukovana je ekspresija Fab ' dodavanjem IPTG. Fab' ekspresija je ciljana u periplazmički prostor E. coli gde se akumulirao Fab' tokom trajanja faze indukcije. “Hranjenje” izvorom ugljenika je primenjeno tokom faze indukcije za kontrolu ekspresije i rasta ćelija, u ovom eksperimentu brzina hranjenja je podešena na tri zasebne radne tačke (prikazano na slici). Temperatura, rastvoreni kiseonik (pO2) i pH su kontrolisani za održavanje kulture u optimalnim uslovima.

[0287] Slika 2 prikazuje soj MXE016 transformisan sa plazmidima koji ne eksprimiraju ni šaperone ni FkpA. Slika prikazuje uticaj povećanja post-indukcione brzine hranjenja na proizvodnju Fab' i retenciju u periplazmi sa i bez FkpA. Podaci pokazuju da kada se brzina hranjenja poveća bez FkpA ekspresije dodatno proizveden Fab' se gubi u supernatantu. To nije slučaj sa ekspresijom FkpA kada se dodatni Fab ' proizveden pri većim brzinama hranjenja, zadržava u periplazmi indukujući viši titar.

Primer 4: Analiza prinosa i ćelijske vijabilnosti

[0288] Slike 3A i B prikazuju uticaj na ćelijsku vijabilnost i Fab' titаr u MXE016 transformisanim sa plazmidima koji ne eksprimiraju ni šaperone ni FkpA u šarži od 20L. Slika 3A prikazuje da je vijabilnost ćelija niža kada nije prisutan FkpA. 3B prikazuje da su Fab' titri bili viši i manje varirali za MXE016 FkpA.

[0289] Slika 4 prikazuje da viši titar sa MXE016 FkpA rezultuje u 30% više Fab' nakon primarne regeneracije Fab proizvoda.

[0290] Slike 5 i 6 prikazuju SDS-PAGE i anti-His-tag Western blot-ove uzoraka iz primarne regeneracije MXE016 bez šaperona i MXE016 sa FkpA ekspresijom.

[0291] Uzorci su punjeni naneti na osnovu koncentracije Fab' sa 1µg nanetog Fab' po traci. Gelovi su bili 4-20% i pokretani su u ne-redukujućim uslovima na 125V tokom 2 sata. Gelovi su bojeni Sypro Ruby bojom i snimljeni. Western blotovi su prebačeni na PVDF membranu pomoću Invitrogen iBlot sistema, a zatim blokirani sa 1% rastvorom kazeina. Membrane su zatim ispitane sa anti-His HRP konjugovanim antitelom (Novagen). Blotovi su zatim razvijeni rastvorom ECL i snimljeni pomoću Amersham Life Sciences HyperProcesser.

LISTA SEKVENCI

š čk k

Claims (20)

Patentni Zahtevi

1. Rekombinantna gram-negativna bakterijska ć elija koja sadrži:

a. mutirani spr gen koji kodira spr protein koji ima mutaciju na jednoj ili više amino kiselina izabrano od D133, H145, H157, N31, R62, 170, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, V135, L136, G140, R144 i G147 i

b. ekspresioni vektor koji sadrži gen koji eksprimira ili prekomerno eksprimira jedan ili više proteina koji mogu da olakšaju savijanje proteina, odabrano od FkpA, Skp ili kombinacije FkpA i Skp,

pri čemu ć elija ima smanjenu Tsp proteinsku aktivnost u poređenju sa ć elijom divljeg tipa i pri čemu ć elija ne sadrži rekombinantni polinukleotid koji kodira DsbC i pri čemu je bakterijska ć elija izogena sa divljim tipom E. coli ć elije osim mutiranog spr gena i modifikacije potrebne da se smanji aktivnost Tsp proteina u poređenju sa divljim tipom ć elije.

2. Ć elija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu mutirani spr gen kodira spr protein koji ima jednu ili više mutacija izabrano od D133A, H145A, H157A, N31Y, R62C, I70T, Q73R, C94A, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, V135D, V135G, L136P, G140C, R144C i G147C.

3. Ć elija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutacije C94 i H145A.

4. Ć elija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju izabranu od D133A, H145A i H157A.

5. Ć elija prema patentnom zahtevu 1, pri čemu mutirani spr gen kodira spr protein koji ima mutaciju izabranu od C94A.

6. Ć elija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je mutirani spr gen integrisan u genom ć elije.

7. Ć elija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je gen koji kodira protein podoban da olakša savijanje proteina, tranzijentno transfektovan u ć eliju.

8. Ć elija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu protein podoban da olakša savijanje proteina jeste FkpA.

9. Ć elija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu ć elija dalje sadrži jedan ili više od slede ć ih mutiranih gena:

a. mutirani DegP gen koji kodira DegP protein koji ima aktivnost šaperona i smanjenu aktivnost proteaze;

b. mutirani ptr gen, pri čemu mutirani ptr gen kodira Proteaza III protein koji ima smanjenu proteaznu aktivnost ili je nokaut mutirani ptr gen; i

c. mutirani gen OmpT, pri čemu mutirani OmpT gen kodira OmpT protein sa smanjenom aktivnosti proteaze ili je nokaut mutirani OmpT gen.

10. Ć elija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu ć elija sadrži mutirani Tsp gen koji kodira Tsp protein koji ima smanjenu proteaznu aktivnost ili je nokaut mutirani Tsp gen.

11. Ć elija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu ć elija ima mutirani Tsp nokaut gen koji sadrži mutaciju u početnom kodonu gena i/ili jedan ili više zaustavnih kodona pozicioniranih nizvodno od početnog kodona gena i uzvodno od zaustavnog kodona.

12. Ć elija prema patentnom zahtevu 11, pri čemu mutirani Tsp nokaut gen sadrži restrikciono označeno mesto koje je misens mutacijom uvedeno u početni kodon gena i opciono sadržavajući jednu ili više daljih tačkastih mutacija.

13. Ć elija prema patentnom zahtevu 12, pri čemu mutirani Tsp nokaut gen sadrži SEK ID BR: 3.

14. Ć elija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je ć elija E. coli.

15. Ć elija prema patentnom zahtevu 14, pri čemu je E coli sojeva K12 ili V3110.

16. Ć elija prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu ć elija sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira protein od interesa odabran od antitela ili njegovog antigen vezuju ć eg fragmenta.

17. Ć elija prema patentnom zahtevu 16, pri čemu je antitelo ili njegov antigen-vezuju ć i fragment specifičan za FcRn.

18. Postupak za proizvodnju proteina od interesa koji obuhvata kultivisanje rekombinantne gram negativne bakterijske ć elije kako je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 17 u medijumu kulture, pod uslovima koji su efikasni za eksprimiranje rekombinantnog proteina od interesa i regeneraciju rekombinantnog proteina od interesa iz periplazme rekombinantne gram-negativne bakterijske ć elije i/ili medijuma kulture.

19. Postupak prema patentnom zahtevu 18, pri čemu postupak dalje obuhvata regeneraciju proteina od interesa iz ć elije.

20. Postupak prema patentnom zahtevu 19, pri čemu je protein od interesa regenerisan iz periplazme i/ili supernatanta.