RS58347B1

RS58347B1 - Inhibitor aurora a kinaze

Info

Publication number: RS58347B1
Application number: RS20190161A
Authority: RS
Inventors: James Robert Henry
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2019-03-29
Also published as: CO2017004784A2; EP3218366A1; ECSP17029203A; CA2963473A1; EP3473619B1; SV2017005418A; AU2015347043A1; SG11201703394RA; PT3473619T; AU2015347043B2; EP3473619B8; ME03325B; HUE043759T2; PL3218366T3; ES2826448T3; CR20170158A; KR20170066623A; WO2016077161A1; DK3473619T3; HRP20201681T1

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje aminopiridina, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, koje inhibira Aurora A i može da bude korisno za lečenje kancera.

[0002] Aurora kinaze su familija serin/treonin kinaza i predstavljaju ključne regulatore mitoze. Postoje tri humana homologa Aurora kinaza, A, B i C, od kojih je Aurora A uključena u kancere različitog histološkog porekla i može da poseduje onkogenične osobine u slučaju prekomerne ekspresije.

[0003] Aneuploidije ili genomička nestabilnost je jedna od najrasprostranjenijih odlika kancera. Još preciznije, inhibicija Aurore B indukovana endo-reduplikacijom a zatim poliploidijom je jedan od glavnih puteva za genomičku nestabilnost. Osim toga, DNK endoreduplikacija/poliploidija fenotipa može da bude perzistentna za višestruke ćelijske deobe bez potpunog ubijanja ćelija kancera. Alternativno, selektivna inhibicija Aurore A dovodi do zaustavljanja mitoze u brojnim ćelijama kancera. Zaustavljanje mitoze često dalje dovodi do progresije apoptoze ili smrti ćelija kancera, što je mnogo poželjnija odlika za medikament za kancer nego DNK endo-reduplikacija/poliploidija sa inhibitorima Aurore B ili dvostrukim inhibitorima Aurora A/B. Pored toga, u nekim kliničkim ispitivanjima je zabeleženo da pojedini inhibitori Aurore B i dvostruki inhibitori Aurore A/B dovode do pojave neutropenije i citotoksičnosti koštane srži kod pacijenata dok neki relativno selektivni inhibitori Aurore A u kliničkom ispitivanju nisu pokazali ove poremećaje. Prema tome, poželjno je da se selektivno inhibira Aurora A a smanji ili izbegne inhibicija Aurore B ili dvostruka inhibicija Aurore A/B. Zbog toga, selektivna inhibicija Aurore A može da bude korisna u terapiji kancera.

[0004] Inhibitori Aurore A su poznati u tehnici. WO 2008/026768, EP 2062887 i WO2009/104802 otkrivaju neka jedinjenja aminopiridina koja imaju delovanje selektivnog inhibitora Aurore A. WO 2013/129443 otkriva neka jedinjenja piperidina koja imaju aktivnost selektivnog inhibitora Aurore A.

[0005] Postoji potreba da se obezbede alternativni inhibitori Aurore A za tretman kancera. Takođe, postoji potreba da se obezbede selektivni inhibitori Aurore A koji smanjuju ili eliminišu inhibiciju Aurore B ili dvostruku inhibiciju Aurore A/B. U skladu sa tim, ovaj pronalazak obezbeđuje neke inhibitore Aurore A koji mogu da budu korisni za lečenje kancera. Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje neke selektivne inhibitore Aurore A koji mogu da smanje inhibiciju Aurore B ili dvostruku inhibiciju Aurore A/B.

[0006] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje izabrano iz grupe koja sadrži (2S,4S)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilnu kiselinu:

i (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilnu kiselinu:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0007] Još poželjnije, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metilpiperidin-4-karboksilna kiselina:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0008] Kao posebno otelotvorenje, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje je (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilna kiselina.

[0009] Kao posebno otelotvorenje, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje koje je (2S,4S)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilna kiselina.

[0010] Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilnu kiselinu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent. Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilnu kiselinu i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.

[0011] Ovaj pronalazak obezbeđuje (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilnu kiselinu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u terapiji. Ovaj pronalazak obezbeđuje (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilnu kiselinu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, za upaotrebu u tretmanu kancera. Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu farmaceutska kompozicija uključuje (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilnu kiselinu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so.

[0012] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilnu kiselinu za upotrebu u terapiji. Ovaj pronalazak obezbeđuje (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilnu kiselinu za upotrebu u tretmanu kancera. Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu farmaceutska kompozicija uključuje (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilnu kiselinu.

[0013] Ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilne kiseline, ili njene farmaceutski prihvatljive soli, u proizvodnji medikamenta za tretman kancera. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilne kiseline u proizvodnji medikamenta za tretman kancera.

[0014] Ovaj pronalazak obezbeđuje terc-butilamino so (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-4-[[3fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilne kiseline u kristalnom obliku. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje tercbutilamino so (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-4-[[3-fluoro6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilne kiseline u kristalnom obliku koji se karakteriše oblikom difrakcije X-zraka praškastog uzorka koji ima karakteristične pikove, u 2θ ± 0.2°, dobijene na 17.0° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 11.5°, 23.2° i 15.0°.

[0015] Ovaj pronalazak obezbeđuje amonijumovu so (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-4-[[3-fluoro6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilne kiseline u kristalnom obliku. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje amonijumovu so (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilne kiseline u kristalnom obliku koji se karakteriše oblikom difrakcije X-zraka praškastog uzorka koji ima karakteristične pikove, u 2θ ± 0.2°, dobijene na 4.6° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 13.8°, 17.2° i 15.9°.

[0016] Osim toga, ovaj pronalazak obezbeđuje preferirana otelotvorenja postupaka i upotrebe koji su ovde opisani, u kojima je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera malih ćelija pluća, kolorektalnog kancera, kancera želuca, kancera prostate, kancera dojke, trostruko negativnog kancera dojke, kancera grlića materice, kancera glave i vrata, kancera jednjaka, kancera jajnika, kancera ne-malih ćelija pluća i ne-Hočkinove limfome. Preferirani kanceri su kancer malih ćelija pluća, kancer prostate, trostruko-negativni kancer dojke, kancer grlića materice i kancer glave i vrata.

[0017] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilnu kiselinu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u istovremenoj, odvojenoj ili po redu primeni u kombinaciji sa jednim ili više hemoterapeutskih sredstava u tretmanu kancera.

[0018] Kako su prethodno korišćeni i kako se koriste kroz ceo opis pronalaska, treba znati da sledeći nazivi, ukoliko nije drugačije navedeno, imaju sledeća značenja:

"farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent" je medijum generalno prihvaćen u tehnici za oslobađanje biološki aktivnih sredstava na sisarima, na primer ljudima.

[0019] "Farmaceutski prihvatljive soli" ili "farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na relativno ne-toksičnu, neorgansku ili organsku so ili soli jedinjenja iz ovog pronalaska.

[0020] "Efektivna količina" označava količinu jedinjenja, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, iz ovog pronalaska ili farmaceutske kompozicije koja sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvaltjivu so iz ovog pronalaska, koja će da izazove biološki ili medicinski odgovor ili željeni terapeutski efekat na tkivu, sistemu, životinji, sisaru ili ljudima koje zahteva istraživač, veterinar, lekar ili drugi kliničar.

[0021] Nazivi "treatman," "lečenje," "tretiranje," i slično, treba da uključe usporavanje ili zaustavljanje progresije poremećaja. Ovi nazivi takođe obuhvataju usporavanje, poboljšanje, zaustavljanje, eliminaciju ili redukciju jednog ili više simptoma poremećaja ili stanja, čak i kada poremećaj ili stanje nije potpuno eliminisano i čak ukoliko progresija poremećaja ili stanja nije sama po sebi usporena ili zaustavljena.

[0022] Jedinjenje iz ovog pronalaska je sposobno da reaguje, na primer, sa brojnim neorganskim i organskim kiselinama i bazama da formira farmaceutski prihvatljive soli. Ovakve farmaceutski prihvatljive soli i uobičajena metodologija za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. Videti, na primer, P. Stahl, i saradnici, HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, i saradnici, "Pharmaceutical Salts, " Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No.1, January 1977.

[0023] Jedinjenje iz ovog pronalaska je preferirano formulisano kao farmaceutska kompozicija koja koristi farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent i primenjuje se različitim načinima. Preferirano, ove kompozcije su za oralnu primenu. Ove farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici. Videti, na primer, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, i saradnici, eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005).

[0024] Količinu jedinjenja iz ovog pronalaska koja se primenjuje će pod relevantnim okolnostima da odredi lekar, uključujući stanje koje se tretira, izabrani način primene, određeno jedinjenje iz ovog pronalaska koje se primenjuje, starost, telesnu težinu i odgovor pojedinačnog pacijenta i težine simptoma pacijenta. Dnevne doze su normalno u rasponu od približno 1 do približno 1000 mg. U nekim slučajevima, vrednosti doze ispod donjeg limita prethodno pomenutog opsega mogu da budu više nego adekvatne, dok u drugim slučajevima mogu da se primene čak i veće doze. Vrednosti doze može da odredi stručnjak sa iskustvom u tehnici.

[0025] Jedinjenje iz ovog pronalaska, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, mogu da se izrade po različitim procedurama poznatim u tehnici kao i po procedurama niže opisanim u Izradama i Primerima. Specifične faze sinteze za svaki opisani postupak mogu da se kombinuju na različite načine kako bi se izradila jedinjenja iz pronalaska ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0026] Reagensi i početni materijali su generalno lako raspoloživi za stručnjaka sa uobičajenim iskustvom u tehnici. Drugi mogu da se izrade standardnim tehnikama organske i heterociklične hemije, tehnikama koje su poznate stručnjaku sa uobičajenim iskustvom u tehnici i procedurama opisanim u Primerima koji slede, uključujući neke nove procedure. Niže date Izrade i Primeri dalje ilustruju pronalazak. Ukoliko nije drugačije navedeno, ovde ilustrovana jedinjenja su imenovana i označena koristeći Accelrys Draw 4.1.

[0027] Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici može da odvoji ili razdvoji pojedinačne izomere, enantiomere ili diastereomere u bilo kojoj odgovarajućoj tački sinteze jedinjenja postupcima kao što su tehnike selektivne kristalizacije ili asimetrična hromatografija (videti, na primer, Enantiomers, Racemates i Resolutions (J. Jacques, i saradnici, John Wiley and Sons, Inc., 1981)).

[0028] Stručnjak sa iskustvom će shvatiti da jedinjenje iz ovog pronalaska sadrži najmanje jedan asimetrični centar. Još preciznije, jedinjenje iz ovog pronalaska sadrži dva asimetrična centra. Ovaj pronalazak obuhvata sve pojedinačne enantiomere ili diastereomere, kao i smeše enantiomera i diastereomera ovih jedinjenja, uključujući racemate. Poželjno je da jedinjenje iz ovog pronalaska egzistira kao pojedinačni enantiomer ili diastereomer. Pojedinačni enantiomer ili diastereomer može da se izradi počevši sa asimetričnim reagensima ili tehnikama stereoselektivne ili stereospecifične sinteze. Alternativno, pojedinačni enantiomer ili diastereomer mogu da se izoluju iz smeša tehnikama standardne asimetrične hromatografije ili kristalizacijom.

[0029] Stručnjak sa iskustvom u tehnici takođe zna da jedinjenje sa pirazolil prstenom može da egzistira kao par tautomera u kojima vodonik može da se kreće između dva azota na pirazolil prstenu.

[0030] Jedinjenje iz ovog pronalaska može da se izradi u skladu sa postupcima sinteze dobro poznatim i prihvaćenim u tehnici. Odgovarajući uslovi reakcije za faze u ovim reakcijama su dobro poznati u tehnici a odgovarajuće supstitucije rastvarača i ko-reagenasa su u okviru iskustva u tehnici. Isto tako, stručnjak sa iskustvom u tehnici će shvatiti da međuproizvodi sinteze mogu da se izoluju i/ili prečiste različitim dobro poznatim tehnikama, ukoliko je to potrebno ili poželjno i da će često biti moguće da se različiti međuproizvodi koriste direktno u narednim fazama sinteze sa malo ili bez prečišćavanja. Osim toga, stručnjak sa iskustvom će znati da u nekim okolnostima redosled po kome se uvode radikali nije kritičan. Tačan redosled faza potreban za izradu jedinjenja iz ovog pronalaska zavisi od određenog jedinjenja koje se sintetiše, početnog jedinjenja i relativne osetljivosti supstituisanih radikala, što je dobro poznato hemičaru sa iskustvom. Svi supstituenti, ukoliko nije drugačije navedeno, su kako je prethodno definisano a svi reagensi su dobro poznati i prihvaćeni u tehnici.

[0031] Kako se ovde koristi, sledeći nazivi imaju navedena značenja: "ADP" se odnosi na adenozin 5’-difosfat; "ATP" se odnosi na adenozin 5’-trifosfat; "BSA" se odnosi na albumin seruma govečeta; "DNK" se odnosi na deoksiribonukleinsku kiselinu; "DMSO" se odnosi na dimetil sulfoksid; "DTT" se odnosi na ditiotreitol; "EDTA" se odnosi na etilendiamintetrasirćetnu kiselinu; "EGTA" se odnosi na etilen glikol tetrasirćetnu kiselinu; "FBS" se odnosi serum fetusa govečeta; "IVTI" se odnosi na in vivo ciljanu inhibiciju;

"HEPES" se odnosi na 4-(2-hidroksietil)piperazin-1-etansulfonsku kiselinu; "MEM" se odnosi na minimum esencijalnog medijuma; "MS" se odnosi na masenu spektroskopiju; "NMR" se odnosi na nuklearnu magnetnu rezonancu; "PBS" se odnosi na pufer fosfatnih soli; "MSR" se odnosi na minimalni značajan odnos; "PMSF" se odnosi na fenilmetilsulfonil fluorid; "PNPP" se odnosi na dinatrijumovu so 4-nitrofenil fosfat heksahidrata; "psi" se odnosi na funte po inču na kvadrat; "SCLC" se odnosi na kancer malih ćelija pluća; "TAME" se odnosi na N-alfa-4-tosil-L-arginin metil estar hidrohlorid; "TED" se odnosi na prag efektivne doze; "TPCK" se odnosi na tosil fenilalanil hlormetil keton.

Izrada 1

Metil 2-metilpiperidin-4-karboksilat hidrohlorid

[0033] U reaktivnu posudu se sipa PtO2(11.5 g). Nakon toga se sadržaj reaktivne posude prečisti sa N2i ovlaži sa sirćetnom kiselinom (225 ml). U žitku masu se dodaju metil 2-hlor-6-metil-piridin-4-karboksilat (125 g) i sirćetna kiselina (1000 ml). Reaktivna posuda se zatvori, sadržaj prečisti sa N2a nakon toga prečisti sa H2i podvrgne pritisku sa H2. Reaktivna smeša se zagreva 7 sati na 60 °C pod pritiskom vodonika od 60 psi. Vrše se dve odvojene reakcije u istoj razmeri i pod istim uslovima. Reaktivna smeša svake reakcije se filtrira i filtrati se kombinuju. Filtrati se koncentruju pod vakuumom da se dobije gusto ulje koje sadrži malo sirćetne kiseline. U gusto ulje se doda metil terc-butil etar (2 L) i meša na sobnoj temperaturi. Dobijene čvrste supstance se sakupe, isperu sa metil terc-butil etrom (2x 1000 mL) i suše pod vakuumom na 35 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (400 g).<1>H NMR (CDCl3) δ 1.55 (d, J=6.3 Hz, 3H); 1.85 (etar, J=12.3 Hz, 1H); 2.23-1.98 (m, 3H); 2.59-2.46 (m, 1H); 2.85 (dt, J=13.0, 3.5 Hz, 1H); 3.20-3.06 (m, 1H); 3.53 (br d, J=12.6 Hz, 1H); 3.69 (s, 3H); 9.7 (br s, 1H)

Izrada 2

Metil 1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilat

[0034]

[0035] U okruglu bocu sa tri grla zapremine (1 L) se dodaju metil 2-metilpiperidin-4-karboksilat hidrohlorid (205.4 g, 1.06 mol), 1-(bromometil)-3-hlor-2-fluoro-benzen (261 g, 1.17 mol), acetonitril (2050 mL) i kalijum karbonat (293 g, 2.12 mol). Reaktivna smeša se meša 18 sati pod refluksom. Nakon toga se prekine zagrevanje, čvrste supstance filtriraju a nakon toga čvrste supstance isperu sa acetonitrilom (2x 250 mL). Filtrat se koncentruje pod vakuumom da se dobije zeleni sirovi produkt. Produkt se rastvori u metil terc-butil etru (2500 ml), doda se CELITE®, meša a nakon toga filtrira. Filtrat se ispere sa vodom. Organski deo se ekstrahuje sa 1.25N vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (2000 ml), nakon toga sa 1M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (1000 ml). Vodeni ekstrakti se kombinuju i zaalkališu do pH ∼ 12 sa 48% vodenim rastvorom natrijum hidroksida (250 g). Ekstrahuje se sa metil terc-butil etrom (3L). Organski deo se suši preko magnezijum sulfata, filtrira i koncentruje da se dobije naslovljeno jedinjenje kao braon ulje (272.8 g). MS (m/z): 300 (M+1).

Izrada 3

Metil (2R, 4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilat

[0036]

[0037] Enantiomeri metil 1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-2-metilpiperidin-4-karboksilata (272.8 g) se razdvoje koristeći superkritičnu tečnu asimetričnu hromatografiju. Stacionarna faza: Chiralpak IC, mobilna faza: 3% izopropil alkohol i 0.2% dimetiletilamin. Collection se prvi eluirani enantiomer (RT = 1.73 min). Collection se drugi eluirani enantiomer kao naslovljeno jedinjenje (158 g, 49.7% prinos; RT = 2.19 min; MS (m/z): 300 (M+1).).

Analitički uslovi: Stacionarna faza: Chiralpak IC, mobilna faza: 5% izopropil alkohol / 0.2% izopropil amin, protok 3 mL/min, temperatura: 35°C.

Izrada 4

Metil (2R,4R)-2-metilpiperidin-4-karboksilat hidrohlorid

[0038]

[0039] U bocu sa tri grla zapremine 4000 ml se dodaju metil (2R, 4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilat (250g, 0.834 mol), 1,2-dihloretan (1200 ml) i 1-hloretil hloroformat (112 ml, 1.04 mol). Meša se 72 sata na 70°C pomoću mehaničke mešalice. Doda se 1-hloretil hloroformat (30 ml, 0.227 mol) i meša 6 sati pod refluksom. Smeša se ostavi da se ohladi na 60°C i pomoću levka za dodavanje se dodaje metanol (250 ml) u toku 30-45 min. Meša se 18 sati na 60-65°C. Doda se metanol (400 ml) i meša 5 sati na 65-68°C. Smeša se ostavi da se ohladi na temperaturu sredine i meša u toku noći. Koncentruje se pod vakuumom do žitke mase. Žitka masa se razblaži sa etil acetatom (1500 ml) i meša 30 min na 0°C. Čvrste supstance se sakupe i isperu sa etil acetatom (1000 ml) da se dobije naslovljeno jedinjenje kao siva čvrsta supstanca (136.5 g, 84.5% prinos). H<1>NMR (399.81 MHz, d6-DMSO): δ 1.22 (d, J= 6.5 Hz, 3H), 1.53-1.43 (m, 1H), 1.73-1.62 (m, 1H), 1.99-1.91 (m, 2H), 2.71-2.63 (m, 1H), 2.89-2.83 (m, 1H), 3.15-3.12 (m, 1H), 3.23-3.20 (m, 1H), 3.59 (s, 3H), 9.03 (br, s, 1H), 9.44 (br, s, 1H).

Izrada 5

O1-terc-butil O4-metil (2R,4R)-2-metilpiperidin-1,4-dikarboksilat

[0041] U bocu okruglog dna sa tri grla zapremine 4L opremljenu sa stubnom mešalicom se dodaju metil (2R,4R)-2-metilpiperidin-4-karboksilat hidrohlorid (136 g, 0.702 mol) i dihlormetan (1500 ml). Doda se diizopropiletilamin (250 ml) i meša na sobnoj temperaturi nekoliko minuta. Doda se 4-piridinamin-N,N-dimetil (9.0 g, 0.74 mol). Ohladi se u kupatilu sa ledenom vodom. Polako se u toku 30 minuta dodaje rastvor di-terc-butildikarbonata (192 g, 0.88 mol) u dihlormetanu (300 ml) održavajući temperaturu između 5-10 °C. Smeša se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu i meša u toku noći. Doda se rastvor 10% oksalne kiseline (2L) i meša 45 min na sobnoj temperaturi. Slojevi se razdvoje. Organski sloj se ispere sa 5 % oksalnom kiselinom (1L). Organski slojevi se isperu sa vodom, nakon toga sa zasićenim rastvorom NaCl, suše preko natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod vakuumom. Ostatak se rastvori se u dihlormetanu (250 ml). Rastvor se nanese na ploču silika gela (250 g) ovlaženu sa dihlormetanom. Eluira se sa dihlormetanom (3L). Filtrat se koncentruje pod vakuumom i ostavi pod vakuumom nekoliko sati da se dobije naslovljeno jedinjenje (146 g, 80.8% prinos) kao bledo žuto ulje. H<1>NMR (399.80 MHz, CDCl3): δ 1.05 (d, J= 6.8 Hz, 3H), 1.42 (s, 9H), 1.76-1.66 (m, 1H), 1.99-1.94 (m, 3H), 2.55 (kvintet, J= 5.8 Hz, 1H), 3.10-3.02 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.85-3.78 (m, 1H), 4.18-4.10 (m, 1H).

Izrada 6

6-Bromo-2-(bromometil)-3-fluoro-piridin

[0042]

[0043] U bocu okruglog dna sa tri grla zapremine 1000 ml opremljenu sa povratnim kondenzatorom i ulazom za azot se dodaju 6-bromo-3-fluoro-2-metil-piridin (50 g, 0.263 mol), N-bromosukcinimid (100 g, 0.562 mol) i ugljenik tetrahlorid (500 ml). Uz mešanje na sobnoj temperaturi u porcijama se doda 2,2’-azobis(izobutironitril). Reakcija se meša 72 sata na 78 °C. Smeša se ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu i filtrira da se izdvoje čvrste supstance. Čvrste supstance se isperu sa toluenom (2 X 100 ml). Filtrat se koncentruje do ∼ 250 ml, razblaži sa tetrahidrofuranom (300 ml) i ohladi na 0-5 °C. U atmosferi azota se polako, u toku 30 min, dodaje rastvor dietil fosfita (37 ml, 0.288 mol) i trietilamina (40 ml, 0.287 mol) u tetrahidrofuranu (100 ml). Smeša se ostavi 1 sat da se polako zagreje na sobnu temperaturu. Koncentruje se pod vakuumom. Doda se ledeno hladna voda i meša dok je smeša na sobnoj temperaturi. Čvrste supstance se sakupe i isperu sa vodom (2 X 200 ml). Čvrste supstance se suše pod vakuumom. Rastvore se u dihlormetanu (500 ml) i filtriraju kroz ploču silika gela. Ploča se ispere sa dihlormetanom (250 ml). Filtrat se koncentruje pod vakuumom, razblaži sa heksanima (500 ml) i koncentruje pod vakuumom do ∼100 ml. Čvrste supstance se sakupe i isperu sa heksanima (100 ml) da se dobije naslovljeno jedinjenje (48.0 g, 67.8% prinos) kao bela čvrsta supstanca. Čvrste supstance se sakupe iz osnovnog rastvora i suše pod vakuumom da se dobije naslovljeno jedinjenje (5.2 g, 7.35% prinos) kao bela čvrsta supstanca. H<1>NMR (399.80 MHz, CDCl3): δ 4.51 (d, J= 2.1 Hz, 2H), 7.31-7.25 (m, 1H), 7.42 (dd, J= 3.5, 8.6 Hz, 1H).

Izrada 7

O1-terc-butil O4-metil (2R,4R)-4-[(6-bromo-3-fluoro-2-piridil)metil]-2-metilpiperidin-1,4-dikarboksilat

[0045] U bocu okruglog dna sa tri grla zapremine 3 L se doda O1-terc-butil-O4-metil (2R, 4R)-2-metilpiperidin-1,4-dikarboksilat (48.1 g, 0.187 mol) u tetrahidrofuranu (470 ml) i smeša ohladi na -78 °C. U kapima se u toku 30 min dodaje litijum diizopropilamid (10% težinski) u heksanima (112.2 ml, 0.224 mol) održavajući unutrašnju temperaturu ispod -71°C. Meša se 1.5 sat na -78 °C. U kapima se u toku 1 sat doda rastvor 6-bromo-2-(bromometil)-3-fluoro-piridina (60.4 g, 0.225 mol) u tetrahidrofuranu (470 ml) održavajući unutrašnju temperaturu ispod -71°C. Meša se 1 sat na -78°C. Reakcija se neutrališe dodavanjem zasićenog vodenog rastvora amonijum hlorida (150 ml). Dobijene čvrste supstance se sakupe, rastvore u vodi (500 ml) i ekstrahuju sa etil acetatom (1000 ml). Ekstrakti se kombinuju, suše preko natrijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod vakuumom. Ova reakcija se ponovi sa 57.22 g O1-terc-butil-O4-metil (2R, 4R)-2-metilpiperidin-1,4-dikarboksilata pod istim uslovima reakcije i dobijeni materijali se kombinuju za prečišćavanje. Kombinovani materijal se prečisti hromatografijom na silika gelu (5-15% gradijent heksani / etil acetat) da se dobije naslovljeno jedinjenje (168.2 g) kao svetlo žuto ulje. H<1>NMR (399.80 MHz, CDCl3): δ 0.98 (d, J= 7.1 Hz, 3H), 1.43 (s, 9H), 1.76 (dd, J= 6.0, 13.8 Hz, 1H), 2.02 (s, 2H), 2.23 (dt, J= 13.9, 2.1 Hz, 1H), 3.09-2.98 (m, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.90-3.87 (m, 1H), 4.40-4.37 (m, 1H), 7.19 (t, J= 8.5 Hz, 1H), 7.29 (dd, J= 3.4, 8.6 Hz, 1H).

Izrada 8

Metil (2R,4R)-4-[(6-bromo-3-fluoro-2-piridil)metil]-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-2-metilpiperidin-4-karboksilat

[0046]

[0047] U bocu okruglog dna sa tri grla zapremine 4 L se doda O1-terc-butil-O4-metil (2R, 4R)-4-[(6-bromo-3-fluoro-2-piridil)metil]-2-metil-piperidin-1,4-dikarboksilat (168.2 g, 0.378 mol) u 1,4-dioksanu (945 ml). Polako se u toku 20 minuta dodaje hlorovodonična kiselina (4 M rastvor u 475 mL 1,4-dioksana, 1.9 mol). Meša se 21 sat na sobnoj temperaturi a nakon toga 4 sata na 50°C. Čvrste supstance se sakupe i suše pod vakuumom 1 sat na 45°C. Filtrat se koncentruje do čvrstog stanja i potpuno osuši. U bocu okruglog dna sa tri grla zapremine 3 L se dodaju kombinovani čvrsti produkti, kalijum karbonat (105 g, 0.76 mol) i acetonitril (1200 ml). Meša se 20 minuta na sobnoj temperaturi a nakon toga se doda 3-hlor-2-fluorobenzil bromid (101.3 g, 0.453 mol). Meša se 3 dana na sobnoj temperaturi. Smeša se filtrira kroz CELITE®. Filtrat se koncentruje do žutog ulja. Ulje se prečisti hromatografijom na silika gelu (gradijent 100 % dihlormetan do 7 % metil-terc-butiletar u dihlormetanu u toku 70 minuta) da se dobije naslovljeno jedinjenje (153 g, 0.314 mol) kao žuto ulje. MS (m/z): 489 (M+1).

Izrada 9

Metil (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[(3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]2-metilpiperidin-4-karboksilat

[0048]

[0049] U mikrotalasnu reaktivnu posudu se doda terc-butil alkohol (9.4 ml) i odstrani kiseonik ubacivanjem azota u toku 5 minuta. Dodaju se paladijum(ll) acetat (0.044 g, 0.196 mmol) i 2-di-terc-butilfosfino-2’,4’,6’-triizopropilbifenil (0.251 g, 0.58 mol). Doda se voda (0.014 ml) ispod površine rastvora. Smeša se zagreva 2 minuta na 100 °C koristeći inicijator mikrotalasa. Ovaj rastvor katalizatora se špricem doda u sledeću smešu.

[0050] U bocu okruglog dna sa tri grla zapremine 3 L se dodaju metil (2R,4R)-4-[(6-bromo-3-fluoro-2-piridil)metil]-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilat (9.4 g, 0.019 mol), 5-metil-1H-pirazol-3-amin (2.07 g, 0.021 mol) i terc-butil alkohol (65 ml). Smeša se zagreje na 40-45 °C i isprska sa azotom u toku 10 minuta. U smešu se dodaju cezijum karbonat (14.5 g, 0.045 mol) i prethodno dobijen rastvor katalizatora. Meša se 3.5 sata na 40-45 °C. Reakcija nije završena. Izradi se nova smeša paladijum(ll) acetata (0.0088 g, 0.039 mmol), 2-di-terc-butilfosfino-2’,4’,6’-triizopropilbifenila (0.050 g, 0.103 mmol), vode (2.8 mL) i terc-butil alkohola (2 ml). Smeša se zagreva 2 min na 100 °C koristeći inicijator mikrotalasa a nakon toga se doda u prethodno nezavršenu reaktivnu smešu. Reaktivna smeša se meša 2 sata na 40-45 °C. Smeša se razblaži sa etil acetatom (100 mL), filtrira kroz CELITE® ploču i ploča ispere sa etil acetatom (100 mL). Koncentruje se pod vakuumom. Reakcija se ponovi sa 129.35 g metil (2R,4R)-4-[(6-bromo-3-fluoro-2-piridil)metil]-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilata pod istim uslovima reakcije kako je prethodno opisano i sirovi materijali kombinuju za prečišćavanje.

[0051] Dva sirova produkta reakcije se izmešaju. Materijal se prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa 30% etil acetata u smeši 1:1 dihlormetan/heksani do 100% etil acetat da se dobije 95 g ružičaste čvrste supstance. U bocu zapremine 4 L se dodaju čvrst SILIAMETS® THIOL (120 g) i dihlormetan (2 L). Meša na sobnoj temperaturi u toku noći. Smeša se filtrira kroz CELITE®. Filtrat se koncentruje do sušenja da se dobije naslovljeno jedinjenje (93.3 g) kao bela pena. MS (m/z): 504 (M+1).

Primer 1

(2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilna kiselina

[0052]

[0053] U bocu okruglog dna sa tri grla zapremine 1 L se dodaju metil (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[(3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metilpiperidin-4-karboksilat (19.95 g, 0.040 mol), hlorovodonična kiselina (36.5% težinski) i voda (140 ml, 1.63 mol). Meša se 17 sati na 93-96 °C. Ohladi se na sobnu temperaturu i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se rastvori u vodi (1000 ml) i ohladi u ledenom kupatilu. pH se podesi na 6.5 sa 5N rastvorom natrijum hidroksida. Dobijene čvrste supstance se sakupe i isperu sa vodom. Vodeni filtrat se ekstrahuje sa smešom 10 % izopropanol/dihlormetan (3 x 500 ml). Suši se i koncentruje do čvrstog stanja. Čvrste supstance se kombinuju i rastvore u etanolu (200 ml). Razblaže se sa etil acetatom (1500 ml) i mešaju na sobnoj temperaturi u toku noći. Filtriraju i koncentruju pod vakuumom do čvrste supstance. Čvrste supstance se rastvore u smeši 5 % metanol/dihlormetan, razblaže sa etil acetatom (500 ml) i koncentruju do 300 ml. Čvrste supstance se izdvoje filtriranjem. Reakcija se ponovi sa 61.9 g metil (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[(3-fluoro-6-[(5-metil-<1>H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metilpiperidin-4-karboksilata pod istim uslovima reakcije kako je prethodno opisano. Filtrati iz obe reakcije se kombinuju. Kombinovani filtrati se koncentruju do ∼ 600 ml i razblaže sa heksanima (600 ml). Čvrste supstance se sakupe i suše pod vakuumom na 50 °C u toku noći. Osnovni rastvori se koncentruju pod vakuumom do sušenja a čvrste supstance suše pod vakuumom na 50 °C u toku noći. Čvrste supstance se kombinuju da se dobije naslovljeno jedinjenje (63.44 g). MS (m/z): 490 (M+1). [α]<20>D<+>17.3° (c 1.00, EtOH).

Primer 2

terc-butilamin so (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilne kiseline

[0054]

[0055] U 4 mL acetona se doda (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilna kiselina (580 mg). Čvrsta supstanca se rastvori da formira bistar žuti rastvor uz mešanje na 60°C (temperatura ploče)/1000 opm. U rastvor se doda terc-butilamin (150 µL, 1.20 ekvivalenata, 99.5%) i uočava se precipitacija. Smeša se prevede u žitku masu na 60°C u toku narednih 10 minuta a nakon toga ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu. Čvrsta supstanca se filtrira vakuum filtracijom i čvrsta supstanca suši u vakuumskoj pećnici na 60 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (635 mg, 95.26% prinos).

Primer 3

Amonijumova so (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilne kiseline

[0056]

[0057] U 2 mL acetona se doda (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilna kiselina (154 mg). Čvrsta supstanca se rastvori u bistar žuti rastvor uz mešanje na 60°C (temperatura ploče)/1000 opm. U rastvor se doda amonijum hidroksid (29.8%, 50 µL, 1.22 ekvivalenta) i uočava se precipitacija. Smeša se prevede u žitku masu na 60°C u toku naredna dva sata i nakon toga ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu. Uočava se gusta žitka masa sjajne bele čvrste supstance. Čvrsta supstanca se filtrira vakuum filtracijom i čvrsta supstanca suši u vakuumskoj pećnici na 60 °C da se dobije naslovljeno jedinjenje (145 mg, 90.81% prinos).

Difrakcija X-zraka praška iz Primera 2 i 3

[0058] XRD modeli kristala čvrstih supstanci su dobijeni na Bruker D4 Endeavor difraktometru X-zraka praška, opremljenom sa izvorom CuKa λ = 1.54060 Å) i Vantec detektorom, koji radi na 35 kV i 50 mA. Uzorak se skenira između 4 i 40° u 2θ, sa veličinom faze od 0.009° u 2θ i brzinom skeniranja od 0.5 sekundi/faza i sa 0.6 mm divergencije, 5.28 fiksnim anti-skaterom i 9.5 mm detektorom proreza. Suvi prašak se pakuje na kvarcnom držaču uzorka a ravna površina se dobija pomoću staklene ljuspice. Modeli difrakcije kristalnog oblika se sakupljaju na temperaturi sredine i pri relativnoj vlažnosti. U tehnici kristalografije je dobro poznato da, za bilo koji dat kristalni oblik, relativni intenziteti pikova difrakcije mogu da variraju zbog preferirane orijentacije koja je rezultat faktora kao što su morfologija i osobine kristala. Kada su prisutni efekti preferirane orijentacije, intenziteti pikova su izmenjeni, ali su pozicije karakterističnih pikova polimorfa nepromenjene. Videti, na primer, The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, strane 1843-1844, 1995. Osim toga, u tehnici kristalografije je takođe dobro poznato da za bilo koji dati kristalni oblik pozicije ugaonih pikova mogu blago da variraju. Na primer, pozicije pika mogu da se menjaju zbog promena u temperaturi ili vlažnosti na kojima se uzorak analizira, zbog pomeranja uzorka ili zbog prisustva ili odsustva unutrašnjeg standarda. U ovom slučaju, promenljivost položaja pika od ± 0.2 u 2θ će uzeti u obzir ove potencijalne varijacije bez ometanja jasne identifikacije navedenog kristalnog oblika. Potvrda kristalnog oblika može da se izvede na osnovu bilo koje jedinstvene kombinacije različitih pikova (u jedinicama od ° 2θ), obično više istaknutih pikova. Modeli difrakcije kristalnog oblika, sakupljeni na temperaturi sredine i pri relativnoj vlažnosti, su podešeni na osnovu NIST 675 standardnih pikova za 8.853 i 26.774 stepeni 2-teta.

[0059] Pripremljeni uzorak iz Primera 2 se karakteriše XRD modelom koristeći CuKa zračenje koji ima pikove difrakcije (2-teta vrednosti) kako je opisano u niže datoj Tabeli 1 a preciznije, koji ima pikove za 17.0° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 11.5°, 23.2° i 15.0°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

Tabela 1: pikovi difrakcije X-zraka praška za Primer 2

[0060] Pripremljeni uzorak iz Primera 3 se karakteriše XRD modelom koristeći CuKa zračenje koji ima pikove difrakcije (2-teta vrednosti) kako je opisano u niže datoj Tabeli 2 a preciznije, koji ima pikove za 13.8°, 17.2° i 15.9°; sa tolerancijom za uglove difrakcije od 0.2 stepena

Tabela 2: pikovi difrakcije X-zraka praška za Primer 3

Struktura kristala Aurora A kinaze određena X-zracima koristeći Primer 3

[0061] Katalitički domen Aurora A kinaze (ostaci 125-391 sekvence NP_003591) je ekspresovan u Sf9 ćelijama insekta sa TEV proteazom raskidivim N-terminalom poli-histidin repića. Ekspresovani protein je izolovan vezivanjem za kolonu helatnog nikla. Nakon cepanja histidin repića, protein je dalje prečišćen propuštanjem kroz hromatografsku kolonu sa odvajanjem po veličini (16/600 S200; GE Lifesciences) uravnoteženu u puferu koji sadrži 50mM natrijum fosfat pH 7.0, 250mM NaCl, 1mM EDTA, 5mM DTT i 0.1mM sa β,γimidoadenozin 5’-trifosfat (AMP-PNP). Prečišćeni Aurora A kinaza protein u koncentraciji od 8.3 mg/ml je obogaćen sa dodatnom količinom AMP-PNP do finalne koncentracije od 2 mM i kristalizovan na 21°C difuzijom pare. Kristalizacija se izvodi mešanjem 0.8 µL proteina sa 0.8 µL osnovnog rastvora koji sadrži 100mM MES pH 4.6, 23% PEG 3350 i 150mM amonijum sulfata i ponovnim uravnoteženjem istog osnovnog rastvora u paletama sedeće kapi. Pojedinačni kristal Aurora A kinaze u kompleksu sa AMP-PNP se potopi u toku noći u rastvoru koji sadrži 2 mM Primera 3 i prenese u rastvor koji sadrži 20% polietilen glikola 400 i brzo zamrzne u tečnom azotu. Rezultat difrakcije X-zraka za 1.96 Å je dobijen od zamrznutog kristala na Lilly Research Laboratories Collaborative Access Team Beam-Line (LRL-CAT APS 31ID) na Advanced Photon Source, Argonne, IL. X-zraci talasne dužine od 0.9793 Å su korišćeni za dobijanje 180 slika u oscilacijama od 1°, sa detektorom razdaljine od 185 mm. Struktura Aurora A kinaze korišćenjem Primera 3 je određena molekularnim premeštanjem i prečišćena za R-faktor od 20.6% i bez R od 25.6%. Rezultat je sa Primerom 3 i obezbeđuje stereohemiju. Takođe su obezbeđene stereohemije za Primere 1 i 2 zbog toga što je Primer 1 korišćen kao početni materijal za izradu Primera 2 i 3.

Tabela 3: koordinate atoma liganda u kompleksu nastalom nakon tretmana kristala Aurora A sa Primerom 3

(nastavlja se)

[0062] Rezultati narednih analiza pokazuju da je jedinjenje iz Primera 1 ovog pronalaska inhibitor Aurore A. Pored toga, rezultati narednih analiza pokazuju da je jedinjenje iz Primera 1 selektivni inhibitor Aurore A koji može da smanji inhibiciju Aurore B ili dvostruku inhibiciju Aurore A/B. Takođe, rezultati narednih analiza pokazuju da jedinjenje iz Primera 1 indukuje zaustavljanje mitoze ćelijskog ciklusa inhibicijom aktivnosti Aurora A kinaze. pored toga, jedinjenje iz Primera 1 in vivo ispoljava ciljanu inhibiciju Aurore A, ne Aurore B, sa uzorcima ksenograft tumora, kao i značajnu efikasnost u zaustavljanju rasta tumora kod kancera malih ćelija pluća na modelu NCI-H446 golih eksperimentalnih miševa.

Ispitivanje Aurora A kinaze

[0063] Ovim ispitivanjem se meri sposobnost testiranih jedinjenja da inhibiraju aktivnost Aurora A kinaze in vitro merenjem TRAN-SCREENER ®ADP-fluorescentne polarizacije u formatu ploča sa 96 crnih udubljenja (CORNING® COSTAR® 3694). Izradi se rastvor kinaza pufera [50mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonske kiseline (HEPES) pH 7.4, 4 mM MgCl2, 0.01% TRITON™ X-100 i 2 mM ditiotreitola (DTT)] sa adenozin trifosfatom (ATP) i petljom aktivacije Aurora A kinaze (ENOGEN®, #326861) u finalnim koncentracijama od 20 µM ATP i 150 µM petlje aktivacije Aurora A kinaze, tim redom. U ovaj rastvor se doda Aurora A enzim u finalnoj koncentraciji od 0.096 ng/µL. Testirana jedinjenja se serijski razblaže 1:3 u 20% dimetil sulfoksidu (DMSO) da se dobije kriva od 10 tačaka odgovora na dozu pri finalnim koncentracijama počevši od 20 µM. Sam DMSO pufer bez testiranog jedinjenja se koristi kao pozitivna kontrola (potpuna aktivnost Aurora A bez inhibitora). Negativna kontrola je potpuna reaktivna smeša plus 100 nM etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA) da se odredi nivo adenozin 5’-difosfata (ADP) podloge. Izrađeni rastvor Aurora A enzima se doda u ploče koje sadrže test jedinjenja, a takođe pozitivne i negativne kontrole, i inkubiraju 30 minuta na 22 °C. Reakcija se započinje dodavanjem ATP i rastvora petlje aktivacije Aurora A kinaze i ostavi 30 minuta na 22 °C. Nakon toga se reakcija zaustavlja dodavanjem 25 µL (1:1 v:v) smeše za detekciju ADP koja sadrži ADP „far red“ tragač, ADP antitelo i pufer za zaustavljanje i detekciju (Bellbrook Labs cat # 3003-10K). Ploče se ostave najmanje 2 sata zaštićeno od svetlosti da se omogući premeštanje ADP Alexa633 tragača (vezan za ADP2 antitelo) sa ADP produkovanim u reakciji kinaze i odredi se smanjenje polarizacije fluorescencije (Ultra384, Tecan). Standardna kriva ADP/ATP u prethodnom kinaza puferu se koristi za određivanje konverzije ADP za test jedinjenje.

[0064] Razlika između srednje vrednosti pozitivnih i negativnih kontrola se uzima kao 100% aktivnosti. Logaritamska kriva dobijena od četiri parametra se koristi za generisanje IC50vrednosti pomoću ActivityBase™ softvera (IDBS, Alameda CA). Analiza pokazuje minimalni značajni odnos (MSR) od ≤ 3.

[0065] Jedinjenje iz okvira pronalaska je ispitivano ovom analizom tačno kako je prethodno opisano. Za jedinjenje iz Primera 1 je određeno da ima IC50od 1.12 ± 0.15 nM (n=4).

Biohemijska analiza Aurore A omogućava analizu donje granice detekcije tako da zabeležena IC50ne mora da odražava apsolutnu potenciju inhibicije jedinjenja in vitro; međutim, sama analiza je statistički validna tako da ove vrednosti obezbeđuju IC50rezultat jedinjenja pokazan u analizi. Prema tome, rezultati pokazuju da Primer 1 inhibira aktivnost Aurora A kinaze in vitro.

Ispitivanje Aurora B kinaze

[0066] Ovim ispitivanjem se meri sposobnost testiranih jedinjenja da inhibiraju aktivnost Aurora B kinaze in vitro merenjem TRAN-SCREENER®ADP-fluorescentne polarizacije u formatu ploča sa 96 crnih udubljenja (CORNING® COSTAR® 3694). Izradi se rastvor Aurora B enzima u puferu kinaze (37.5 mM HEPES pH 7.4, 6.25 mM MgCl2, 0.0075% TRITON™ X-100 i 2.5 mM DTT) sa Aurora B enzimom (finalne koncentracije od 0.39 ng/µL), 0.1µM INCEP peptida (GenScript, #92480_1, finalne koncentracije 0.1 µM), ATP (finalne koncentracije 10 µM) i Histon H3 (Anaspec, #KLH08-4, finalne koncentracije 5 µM). Testirana jedinjenja se serijski razblaže 1:3 u DMSO da se dobije kriva od 10 tačaka odgovora na dozu pri finalnim koncentracijama počevši od 20 µM. Sam DMSO pufer bez jedinjenja se koristi kao pozitivna kontrola (potpuna aktivnost Aurora B bez inhibitora). Negativna kontrola je potpuna reaktivna smeša plus 100 nM EDTA da se odredi nivo ADP podloge. Izrađeni rastvor Aurora B enzima se doda u ploče koje sadrže test jedinjenja a takođe pozitivne i negativne kontrole. Smeša se pre-inkubira 30 minuta na 22 °C. Reakcija se započinje dodavanjem prethodno izrađenog rastvora ATP i Histona H3 i ploče se inkubiraju 45 minuta na 22 °C. Reakcija se zaustavlja dodavanjem 25 µL (1:1 v:v) smeše za detekciju ADP koja sadrži ADP „far red“ tragač, ADP antitelo i pufer za zaustavljanje i detekciju (Bellbrook Labs cat # 3003-10K). Ploče se ostave najmanje 2 sata zaštićeno od svetlosti da se omogući premeštanje ADP Alexa633 tragača (vezan za ADP2 antitelo) sa ADP produkovanim u reakciji kinaze i odredi se smanjenje polarizacije fluorescencije (Ultra384, Tecan). Standardna kriva ADP/ATP u prethodnom kinaza puferu se koristi za određivanje konverzije ADP za test jedinjenje.

[0067] Razlika između srednje vrednosti pozitivnih i negativnih kontrola se uzima kao 100% aktivnosti. Logaritamska kriva dobijena od četiri parametra se koristi za generisanje IC50vrednosti pomoću ActivityBase™ softvera (IDBS, Alameda CA). Analiza pokazuje minimalni značajni odnos (MSR) od ≤ 3.

[0068] Jedinjenje iz okvira pronalaska je ispitivano ovom analizom tačno kako je prethodno opisano. Određeno je da jedinjenje 1 ima IC50od 1510 ± 668 nM (n=5). Rezultati pokazuju da Primer 1 inhibira aktivnost Aurora B kinaze in vitro manje nego što inhibira aktivnosti Aurora A kinaze in vitro.

Histon H3 fosfo-SerlO i DNK sadržaj ćelije na bazi višestrukih fenotipnih analiza

[0069] Analizom se meri inhibicija Aurora A indukovana zaustavljanjem mitoze. Inhibicija Aurore A indukovana zaustavljanjem mitoze se meri povećanjem histon H3 fosfo-SerlO markera mitoze, povećanjem sadržaja 4N (G2/M) DNK i inhibicijom proliferacije ćelija fenotipova tretmanom jedinjenjem u toku 24 sata korišćenjem Acumen Explorer™ (Laserskenirajući fluorescentni mikropločni citometar (TTP LabTech LTD, UK)). Hela ćelije od American Type Culture Collection (ATCC) se nanesu u količini od 5000 ćelija/udubljenje u BD BIOCOAT™ poli-D lizin ploče sa 96 udubljenja (Becton Dickinson, katalog # 356640) i inkubiraju 24 sata na 37 °C uz 5 % CO2u Minimum Essential Media (MEM) (na primer Gibco, katalog # 31095) sa 10% seruma fetusa govečeta (FBS) (na primer Gibco, katalog #16000), 1% neesencijalnih amino kiselina (na primer Gibco, katalog #11140), 1% natrijum piruvijata (na primer Gibco katalog #11360) i 1% penicilini-streptomicin (na primer Gibco, katalog #15140). Ćelije se tretiraju dodavanjem test jedinjenja u medijum, doziranjem u 10 tačaka 1:3 serijskih razblaženja u rasponu od 20 µM do 0.001 µM i sa finalnom koncentracijom DMSO od 0.25%. Nakon 24 sata izlaganja jedinjenjima, ćelije se fiksiraju sa PREFER™ (Anatech LTD., katalog # 414) 30 minuta na sobnoj temperaturi, jedanput isperu sa puferom fosfatnih soli (PBS) i permeabiluju sa 0.1% TRITON® X100 u PBS rastvoru u toku 15 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije se dva puta isperu sa PBS i blokiraju sa 1% serumom albumina govečeta (BSA) u PBS (na primer Sigma, katalog # A7030) 30 minuta na sobnoj temperaturi. U ćelije se doda primarno anti-histon H3 fosfo-SerlO zečje poliklonalno antitelo (Millipore, katalog # 06-570) u količini od 1:1000 u PBS sa 1% BSA i inkubira na 4°C u toku noći. Nakon dva ispiranja sa PBS, ćelije se inkubiraju 1 sat sa kozjim anti-zečjim IgG Alexa 488 obeleženim sekundarnim antitelom 1:1000 u PBS (Invitrogen cat # A11008) na sobnoj temperaturi. Nakon još dva ispiranja sa PBS, doda se rastvor koji sadrži 10 µg/mL propidijum jodida (Invitrogen katalog # P3566) i 50 µg/mL ribonukleaze A (Sigma katalog # R-6513) u PBS da se oboji nukleus. Fluorescentne ploče se skeniraju sa ACUMEN EXPLORER™ [Laser-skenirajući fluorescentni mikropločni citomer (koji uključuje ekscitaciju lasera argon jonom na 488 nm i detekciju višestruke fotomultiplikatorske kivete, proizvođača TTP LabTech Ltd.) za merenje sadržaja histon H3 fosfo-SerlO i DNK. Analiza slike je zasnovana na fluorescentnim ćelijskim signalima za identifikaciju ćelija u različitim subpopulacijama. Rezultati analiza su procenat inhibicije proliferacije ćelija, procenat ćelija sa pozitivnim histon H3 fosfo-SerlO, procenat 2N (G1 ćelijski ciklus ili sadržaj diploidne DNK gde se N odnosi na signal komplementa hromozoma, sadržaj haploidne DNK) i procenat 4N plus >4N (G2/M ćelijski ciklusi i iznad) profila DNK histograma. IC50i EC50vrednosti su određene logaritamskom krivom dobijenom od četiri parametra za svaki rezultat korišćenjem ACTIVITY BASE™.

[0070] Jedinjenje iz okvira pronalaska je ispitivano ovom analizom tačno kako je prethodno opisano. Jedinjenje iz Primera 1 pokazuje zaustavljanje mitoze sa EC50od 108±15 nM (n=4) za povećanje Histon H3 P- SerlO, EC50od 108±27 nM (n=4) za povećanje sadržaja 4N-DNK i IC50od 52.9±27 nM (n=4) za inhibiciju proliferacije ćelija, tim redom.

Analiza inhibicije Aurora B ćelija na bazi histon H3 fosfo-SerlO

[0071] Analizom se meri inhibicija Aurora B indukovana smanjenjem histon H3 fosfo-SerlO tretmanom testiranim jedinjenjem u toku jedan sat. NCI-H446 ćelije iz American Type Culture Collection (ATCC) se nanesu na BD BIOCOAT™ poli-D-lizin ploče sa 96 udubljenja (Becton Dickinson, katalog # 356640) u kocentraciji od 12000 ćelija/udubljenje i inkubiraju 24 sata na 37 °C uz 5% CO2u Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medijumu (na primer Gibco, katalog # 52400) uz dodatak 10% FBS (na primer Gibco, katalog #16000) i 1% penicilin-streptomicin (na primer Gibco, katalog #15140). Ćelije se tretiraju dodavanjem test jedinjenja u medijum, doziranjem na 10 tačaka 1:3 serijskih razblaženja u rasponu od 40 µM do 0.002 µM, sa finalnom koncentracijom DMSO od 0.2%. Nakon jedan sat izlaganja test jedinjenjima, ćelije se fiksiraju sa 16% formaldehidom u PBS (finalna koncentracija 4% od osnovnog rastvora formaldehida od 37%, Sigma katalog # F1635) 45 minuta na sobnoj temperaturi, jedanput isperu sa PBS i permeabiluju sa hladnim metanolom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga se ćelije jedanput isperu sa 0.1% TRITON® X100 u PBS rastvoru, dva puta sa PBS i blokiraju sa 3 % Skim Milk u PBS (Difco, katalog # 232100) 30 minuta na sobnoj temperaturi. U ćelije se doda primarno anti-histon H3 fosfo-SerlO zečje poliklonalno antitelo (Millipore, katalog # 06-570) u količini od 1:1000 u 3% Skim Milk u PBS i inkubira na 4°C u toku noći. Nakon jednog ispiranja sa 0.1% TRITON® X100 u PBS rastvoru i dva puta sa PBS, ćelije se inkubiraju sa kozjim anti zečjim IgG Alexa 488 obeleženim sekundarnim antitelom u količini 1:1000 u PBS (Invitrogen cat # A11008) jedan sat na sobnoj temperaturi. Nakon još dva ispiranja sa PBS, doda se rastvor koji sadrži 10 µg/mL propidijum jodida (Invitrogen katalog # P3566) i 50 µg/mL ribonukleaze A (Sigma katalog # R-6513) u PBS da se oboji nukleus. Fluorescentne ploče se skeniraju sa ACUMEN EXPLORER™ [Laser-skenirajući fluorescentni mikropločni citomer (koji uključuje ekscitaciju lasera argon jonom na 488 nm i detekciju višestruke fotomultiplikatorske kivete, proizvođača TTP LabTech Ltd.) za merenje fosforilacije histon H3 proteina i sadržaja DNK. Analiza slike se zasniva na fluorescentnim signalima ćelija za identifikaciju ćelija u različitim subpopulacijama. Rezultat analize se izražava kao procenat Histon H3 fosfo-SerlO pozitivnih ćelija. IC50vrednosti su određene pomoću logaritamske krive dobijene od četiri parametra za svaki rezultat korišćenjem Genedata Screener®.

[0072] Jedinjenje iz okvira pronalaska je ispitivano ovom analizom tačno kako je prethodno opisano. Jedinjenje iz Primera 1 pokazuje IC50inhibicije Aurora B od 1467 ± 456 nM (n=4). Uzeto zajedno sa rezultatima analize na bazi Aurora A fosfor-Thr288 MSD ćelija, koji su niže dati, Primer 1 pokazuje selektivnost za Aurora A u odnosu na Aurora B.

Izrada lizata ćelija i ekstrakcija histona

[0073] Ovo je protokol za izradu lizata ćelija supernatanta koji se koristi za narednu ELISA Meso Scale Discovery (MSD) analizu inhibicije fosforilacijeAurora A. Lizat H446 ćelija kancera malih ćelija pluća (SCLC) se izradi u skladu sa specifikacijama proizvođača MSD (http://www.mesoscale.com/CatalogSystemWeb/Documents/Phospho_Aurora_A_Thr288_WCL.pdf) korišćenjem pufera za liziranje (Tris 25 mM, pH 7.5; Leupeptin 10 µg/mL; tripsinhimotripsin 10 µg/mL; tosil fenilalanil hlormetil keton (TPCK) 10 µg/mL; Aprotinin 10 µg /mL; β-glicerofosfat 60 mM; Triton X-1001%; natrijum pirofosfat (Na2H2P2O7) 2.5 mM; NaCl 150 mM; EDTA 15 mM; etilen glikol tetrasirćetna kiselina (EGTA) 5 mM; Nalfa-4-tosil-L-arginin metil estar hidrohlorid (TAME) 2 mM; 4-nitrofenil fosfat dinatrijum so heksahidrat (PNPP) 15 mM; benzamidin 5 mM; natrijum vanadat 1 mM; natrijum fluorid 10 mM; fenilmetansulfonilfluorid (PMSF) 50 µg/mL; DTT 1 mM; okadainska kiselina 1 µM; mikrocistin 1 µM). Koncentracija proteina supernatanta se meri pomoću Biorad DC-Protein analize (#500-0111, BioRad) a 25µL od 1 mg/mL lizata ćelija se koristi za Aurora A fosfor-Thr288 MSD analizu.

Analiza Aurora A na bazi fosfor-Thr288 MSD ćelija

[0074] Cilj analize je da se izmeri aktivnost inhibicije Aurora A kinaze u ćelijskoj kulturi. Analiza se izvodi u ELISA Meso Scale Discovery (MSD) pločama sa 96 udubljenja (#K150 JCD Whole Cell Lysate Kit, Meso Scale 40 Discovery, MD).

[0075] MULTI-SPOT® Phospho-Aurora A Singleplex ploča se blokira sa 150 µL/udubljenje blokirajućeg rastvora A (finalna koncentracija 3% BSA). Ploča se mućka 1 sat na sobnoj temperaturi i ispere tri puta sa MSD TrisWash puferom. 25 µL od 1 mg/mL lizata ćelija se nanese u MULTI-SPOT® Phospho-Aurora MSD ploču. Smeša se inkubira dodatna 3 sata na sobnoj temperaturi i ispere tri puta sa MSD TrisWash puferom. Antitelo za detekciju (SULFO-TAGTM anti-Aurora A Phospho-T288) se razblaži 50x u 1% BSA puferu za razblaživanje antitela (1 deo 3% BSA sa 2 dela MSD pufera za ispiranje; 0.02% blokera D-R) i 25 µl/otvor se doda u ploču uz mućkanje 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploča se ispere 3 puta sa MSD TrisWash puferom a nakon toga se u ploču doda 150 µL/otvor 2X MSD Read Buffer T i ploča se očitava na MSD SECTORTM Imager 6000 instrumentu. Procenat inhibicije se definiše kao [(100-(MSD vrednost-MSD vrednost maksimalne inhibicije)/(MSD vrednost minimalne inhibicije-MSD vrednost maksimalne inhibicije)]*100. "Maksimum" i "minimum" se definišu pomoću 2 µM pozitivne kontrole jedinjenja alisertib prema negativnoj kontroli samog DMSO.

[0076] Jedinjenje iz okvira pronalaska je ispitivano ovom analizom tačno kako je prethodno opisano. Jedinjenje iz Primera 1 pokazuje inhibiciju Aurora A tretmanom jedinjenjem u toku 1 sat u ćeliji sa IC50od 1.4 ± 1.1 nM (n=2). Rezultati pokazuju da Primer 1 ispoljava inhibiciju aktivnosti Aurora A kinaze u ćelijskoj kulturi.

Izrada lizata tumor proteina i ekstrakcija histona

[0077] Ovo je protokol za izradu lizata ksenograft tumora i ekstrakta histona korišćenih u narednim in vivo analizama ciljane inhibicije (IVTI). Uzorci tumora su zaleđeni u tečnom azotu i stavljeni na list folije, preneti u tarionik sa tučkom na kontejneru suvog leda. Uzorci tkiva tumora se usitne sa tučkom i usitnjena tkiva tumora se prenesu u kivetu koja sadrži Lysing Maxtrix D perlice (#6913-500; Biomedicals MP Lysing Maxtrix D) i 0.6mL pufera za lizu (Tris 25 mM, pH 7.5; Leupeptin 10 µg/mL; tripsin-himotripsin 10 µg/mL; TPCK 10 µg/mL; Aprotinin 10 µg/mL; β-glicerofosfat 60 mM; Triton X-1001%; natrijum pirofosfat (Na2H2P2O7) 2.5 mM; NaCl 150 mM; EDTA 15 mM; EGTA 5 mM; Nalfa-4-tosil-L-arginin metil estar hidrohlorid (TAME) 2 mM; PNPP 15 mM; benzamidin 5 mM; natrijum vanadat 1 mM; natrijum fluorid 10 mM; PMSF 50 µg/mL; DTT 1 mM; okadainska kiselina 1 µM; mikrocistin 1 µM) plus komplet tableta bez EDTA (#1873580; Roche). Kivete se intenzivno mućkaju 30 sekundi brzinom od 6.0 u Bio101 fastPrep (#Bio 101; Thermo Seweant). Lizat tumora je izrađen u skladu sa specifikacijom MSD proizvođača (http://www.mesoscale.com/CatalogSystemWeb/Documents/Phospho_Aurora_A_Thr288WCL.pdf).

Koncentracija proteina u supernatantu je određena Biorad DC-Protein analizom (#500-0111).

[0078] Kit za ekstrakciju ukupnog histona (#OP-0006; EpiQuik) se koristi za ekstrakciju ukupnog histona iz pelete tkiva tumora iz prethodne faze centrifugiranja u skladu sa specifikacijom proizvođača (http://www.epigentek.com/docs/OP-0006.pdf). Koncentracija proteina se meri pomoću Biorad DC-Protein analize (#500-0111; BioRad) a 25 µM od 0.25 mg/mL proteina ekstrahovanog histona se koristi za IVTI histon H3 fosfo-SerlO analize.

In vivo MSD analiza ciljane inhibicije Aurora A (IVTI) na bazi fosfor-Thr288

[0079] Cilj analize je da se izmeri inhibicija Aurora A kinaze in vivo sa uzorcima ksenograft tumora. Analiza se izvodi na ELISA Meso Scale Discovery (MSD) formatu ploča sa 96 udubljenja. MULTI-SPOT® Phospho-Aurora A Singleplex ploča (K150 JCD Whole Cell Lysate Kit; Meso Scale Discovery, MD) se napuni sa 150 µM/udubljenje rastvora A za blokiranje (finalna koncentracija 3% BSA). Ploča se mućka 1 sat na sobnoj temperaturi i ispere tri puta sa TrisWash puferom. Lizati tumora su izrađeni po prethodno datom protokolu za lizat tumora za 1 mg/mL i 25 ml/udubljenje i preneti u MULTI-SPOT® Phospho-Aurora MSD ploču. Smeša se inkubira dodatna 3 sata na sobnoj temperaturi i ispere 3 puta sa TrisWash puferom za ispiranje. Detektovano SULFO-TAGTM anti-Aurora A Phospho-T288 antitelo u 1% BSA puferu za razblaženje antitela (antitelo razblaženo 50x u puferu sa 1 delom 3% BSA plus 2 dela pufera za ispiranje; 0.02% blokera D-R) u količini od 25 µL/udubljenje se doda u ploču i ploča mućka 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploča se ispere 3 puta sa TrisWash puferom, doda se 150 µL/udubljenje 2X Read pufer T a nakon toga se odmah očitava na MSD SECTORTM Imager 6000 instrumentu. Procenat inhibicije se definiše kao [100-(očitana srednja MSD vrednost grupe tretirane jedinjenjem/očitana srednja MSD grupe sa vehikulumom)]*100.

[0080] Jedinjenje iz okvira pronalaska je ispitivano ovom analizom tačno kako je prethodno opisano. Jedinjenje iz Primera 1 pokazuje TED50od 2.13 mg/kg na modelu H446 ksenografta golih miševa (Najmanja efektivna doza) u studiji odgovora na dozu 3 sata nakon doziranja. Rezultati pokazuju da Primer 1 ispoljava inhibiciju Aurora A kinaze in vivo na uzorcima ksenograft tumora za navedenu TED.

In vivo analiza MSD ciljane inhibicije Aurora B (IVTI) na bazi histon H3 fosfo-SerlO

[0081] Cilj analize je da se izmeri inhibicija aktivnosti Aurora B kinaze in vivo sa uzorcima ksenograft tumora određivanjem inhibicije histon H3 fosfo-SerlO kada je izložen opadajućem nivou Aurora B u substratu. Analiza se izvodi na ELISA Meso Scale Discovery (MSD) formatu ploča sa 96 udubljenja. Rastvor A za blokiranje (finalna koncentracija 3% BSA) se doda u MULTI-SPOT® Histone H34-Spot ploču (Cat# K150 EWD-3 JCD Whole Cell Lysate Kit, Meso Scale Discovery, MD) u količini od 150 mL/udubljenje i ploča mućka 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon 3 ispiranja sa MSD TrisWash puferom, ekstrakt histona izrađen u količini od 0.25 mg/mL po prethodnom protokolu za lizat tumora se nanese na MSD ploču u količini od 25 µL/udubljenje. Smeša se inkubira još 3 sata na sobnoj temperaturi i ispere 3 puta sa MSD TrisWash puferom. Detektovano SULFO-TAG anti-histon H3 fosfo-SerlO antitelo se razblaži 50x u 3 mL 1% BSA puferu za razblaženje antitela (1ml 3% BSA sa 2 mL MSD pufera za ispiranje; 0.01% blokera D-M), u količini od 25 µL/udubljenje se doda u ploču i ploča mućka 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon toga se ploča ispere 3 puta sa MSD TrisWash puferom. U ploču se doda 150 µL/udubljenje 2X MSD Read pufera T. Ploča se odmah očita sa MSD SECTORTM Imager 6000 instrumentom. Procenat inhibicije se definiše kao [100-(očitana srednja MSD vrednost grupe tretirane jedinjenjem/očitana srednja MSD grupe sa vehikulumom)]*100.

[0082] Jedinjenje iz okvira pronalaska je ispitivano ovom analizom tačno kako je prethodno opisano. Jedinjenje iz Primera 1 ne obezbeđuje preko 50% inhibicije analizom histon H3 fosfo-SerlO u studiji odgovora na dozu od 30 mg/kg 3 sata nakon doziranja i u studiji zavisnosti od vremena pri koncentraciji od 50 mg/kg 1 sat nakon doziranja. Rezultati pokazuju da Primer 1 ne inhbira Aurora B in vivo sa uzorcima ksenograft tumora pri navedenim dozama.

Porast anti-tumorne efikasnosti na SCLC NCI-H446 ksenograft modelu golih miševa

[0083] Analiza se izvodi zbog merenja inhibicije rasta tumora in vivo u ksenograft modelima SCLC NCI-H446 i SCLC NCI-H69 golih miševa. Sve in vivo studije su izvedene u skladu sa Institutional Animal Care i Use Protocols. Za ksenograft modele, NCI-H446 ćelije kancera malih ćelija pluća ljudi i NCI-H69 ćelije kancera malih ćelija pluća ljudi su održavane po preporuci dobavljača. Ćelije su sakupljene, isprane i reususpendovane u smeši 1:1 medijuma bez seruma i matrigela (354234, Becton Dickinson). Ćelije su nakon toga implantirane subkutano u zadnju slabinu ženke atimičnih golih miševa (Harlan Laboratories) u količini od 5 x 106 ćelija/miš. Zapremina tumora se procenjuje po formuli: v=l x w<2>x 0.536 gde je l = veći izmereni prečnik a w = manji vertikalni prečnik. Rezultat je analiziran sa SAS softverom (SAS Institutes Inc, Cary, NC).

[0084] Kada je prosečna zapremina tumora kod golih miševa dostigla 150 mm<3>, životinje se podele po veličini tumora i primenjuje se formulacija testiranog jedinjenja koristeći kao vehikulum 20% hidroksipropil beta ciklodekstrin (HPB-CD)/25mM fosfatnog pufera pH 8, sa finalnim pH podešenim na pH 9 sa 1N NaOH. Po deset životinja je korišćeno za vehikulum i za tretirane grupe. Za svaku uzetu vremensku tačku, tretirane grupe su upoređivane sa kontrolnom vehikulum grupom. Za svaku tretiranu grupu su zapremine tumora date kao prosek zajedno sa standardnim greškama.

[0085] Jedinjenje iz okvira pronalaska je ispitivano ovom analizom tačno kako je prethodno opisano. Jedinjenje iz Primera 1 pokazuje značajnu efikasnost u sprečavanju rasta tumora u modelu ksenograft kancera NCI-H446 malih ćelija pluća golih miševa i modelu NCI-H69 ksenograft kancera malih ćelija pluća golih miševa.

Tabela 4: inhibicija rasta ksenograft tumora in vivo SCLC H446 uz tretman Primerom 1

Tabela 5: Inhibicija rasta SCLC H69 ksenograft tumora in vivo uz tretman Primerom 1

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje naznačeno time što je izabrano iz grupe koja se sastoji od: (2S,4S)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilne kiseline:

i (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluoro-fenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metil-piperidin-4-karboksilne kiseline:

ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metilpiperidin-4-karboksilna kiselina:

ili njena farmaceutski prihvatljiva so.
3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačeno time što je to (2R,4R)-1-[(3-hlor-2-fluorofenil)metil]-4-[[3-fluoro-6-[(5-metil-1H-pirazol-3-il)amino]-2-piridil]metil]-2-metilpiperidin-4-karboksilna kiselina:
4. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje ili so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3 i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijent.
5. Jedinjenje ili so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
6. Jedinjenje ili so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time što je za upotrebu u tretmanu kancera.
7. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačeno time što je kancer izabran iz grupe koja sadrži kancer malih ćelija pluća, kancer kolorektuma, kancer želuca, kancer prostate, kancer dojke, trostruko negativni kancer dojke, kancer grlića materice, kancer glave ili vrata, kancer jednjaka, kancer jajnika, kancer ne-malih ćelija pluća i ne-Hočkin limfomu.
8. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 7, naznačeno time što je to kancer malih ćelija pluća.
9. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 7, naznačeno time što je to kancer prostate.
10. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 7, naznačeno time što je kancer trostruko negativni kancer dojke.
11. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 7, naznačeno time što je to kancer grlića materice.
12. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 7, naznačeno time što je to kancer glave i vrata. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5