RS58857B1

RS58857B1 - Stabilne formulacije jedinstvenog varijabilnog domena imunoglobulina i njihove primene

Info

Publication number: RS58857B1
Application number: RS20190694A
Authority: RS
Inventors: Yves Meyvis; Brabandere Veronique De; Hans Ulrichts; Ann Brige; Filip Callewaert
Original assignee: Ablynx Nv
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2014-05-16
Publication date: 2019-07-31
Also published as: CN105339003A; WO2014184352A1; NL1040254C2; CN105339003B; MX387527B; CA2912670A1; MX2019005269A; AU2014267222A1; US20190010249A1; ES2731922T3; CN110063935A; EP3511018A1; PT3511018T; RU2671977C2; PH12015502591A1; TR201908663T4; JP6952019B2; HRP20190954T1; JP2016520075A; AU2019201307A1

Description

Opis

1. Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na stabilne formulacije polipeptida, npr. jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina, naročito jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina usmereni protiv von Vilebrandovog faktora (vWF), koji sadrži SEQ ID NO:1, tj. Nanotelo ALX-0081.

[0002] Pronalazak obezbeđuje formulacije koje su stabilne tokom skladištenja tokom dužeg vremenskog perioda i na širokom opsegu temperatura. Formulacije iz predmetnog pronalaska obezbeđuju visoku stabilnost polipeptida, dozvoljavajući višestruke cikluse zamrzavanja i odmrzavanja bez hemijskog ili fizičkog propadanja i obezbeđuju stabilnost u odnosu na mehanička naprezanja, kao što su potresi, smicanje ili naprezanja pri mešanju. Oni su pogodni za farmaceutske i dijagnostičke preparate i kompatibilni su sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačima, kao što su fiziološki rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor glukoze/dekstroze.

[0003] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupke dobijanja, postupke za skladištenje i upotrebu formulacija. Pronalazak se dalje odnosi na jedinične oblike doziranja, komplete i medicinsku upotrebu formulacija.

2. Pozadina pronalaska

[0004] Jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina, kao što su kamelizovani VHH domeni, kamelizirani VH domeni ili humanizovani VHH domeni, predstavljaju brzo rastuću klasu terapeutika antitela. Na primer, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni protiv vWF su opisani

u WO2004/015425, WO2004/062551, WO2006/074947, WO2006/122825, WO2009/115614 i WO2011/067160.

[0005] Proteini, kao što su jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina (ISVD), tipično se moraju čuvati i transportovati između početne proizvodnje i upotrebe, npr. davanja pacijentu. Procesi transporta, proizvodnje, skladištenja i isporuke mogu vršiti višestruka naprezanja na jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina, kao što su hemijska i fizička naprezanja. Tokom skladištenja mogu se pojaviti hemijske modifikacije kao što su, na primer, deamidacija, racemizacija, hidroliza, oksidacija, izomerizacija, beta-eliminacija ili disulfidna razmena. Fizička naprezanja mogu prouzrokovati denaturaciju i razvijanje, agregaciju, formiranje čestica, taloženje, opalescenciju ili adsorpciju.

[0006] Ostaje potreba za obezbeđivanjem formulacija za jedinstvene varijabilne domene imunoglobulina, npr. kao što je ovde definisano, koji poboljšavaju stabilnost, čuvaju aktivno sredstvo protiv hemijskog i/ili mehaničkog naprezanja i stoga dozvoljavaju skladištenje i temperaturne promene bez značajnog fizičkog ili hemijskog propadanja, ostaju stabilne tokom dužeg vremenskog perioda, i/ili su prijateljske prema pacijentu, npr. u kojima je aktivno sredstvo rastvorljivo u visokoj koncentraciji.

3. Rezime pronalaska

[0007] Poznato je da iznad pomenuta naprezanja mogu uticati na fizičko-hemijski integritet proteinskih terapeutika, npr. terapeutici antitela. Na primer, agregacija, deamidacija i oksidacija su opisani kao najčešći uzroci degradacije antitela (Cleland i dr., 1993, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 10, 307-377). Istovremeno je instrumentalno da se obezbede formulacije koje čuvaju hemijski i fizički integritet imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena. Za upotrebu kao npr. terapeutsko sredstvo i obično su takođe povezani sa biološkom aktivnošću. Iako se naše znanje o stabilnosti proteina povećava, optimizovanje uslova formulacije za potpuno suzbijanje ili minimiziranje ovih višestrukih naprezanja i obezbeđivanje produženog roka trajanja ostaje veliki izazov.

[0008] Malo je poznato o pogodnim formulacijama imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena. WO2010/077422 opisuje formulaciju TNF vezujućeg Nanotela koje sadrži lioprotektant, surfaktant i pufer izabran iz histidinskog pufera i Tris-HCI pufera na pH između 5.0 do 7.5.

[0009] Specifična vWF vezivna sredstva, a posebno jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina sa visokim afinitetom prema vWF kao što je ALX-0081 [INN: kaplacizumab], su ispitivani kao dodatna terapija za pacijente sa akutnim koronarnim sindromom (ACS) koji prolaze kroz perkutanu koronarnu intervenciju (PCI) i razvijeni su kao lečenje trombotične trombocitopenične purpure (TTP). Faza I kliničkih ispitivanja je uspešno završena i ispitivanje u fazi II ispitivanja je u toku. Do sada, ALX-0081 je predstavljen kao tečna formulacija na bazi fosfata koja sadrži 5 mg/mL aktivnog farmaceutskog sastojka (API) u D-PBS, 200 mM glicina i 0.02% Tween-80 (v/v). Callewaert i dr. (2012 Blood 17:3603-3610) navodi se procena efikasnosti i bezbednosti anti-vWF Nanotela ALX-0681 (kaplacizumab) u predkliničkom modelu babuna aTTP. Callewaert i dr. dalje opisuju da je kaplacizumab formulisan u PBS puferu.

[0010] Iako se ova formulacija pokazala efikasnom, ona se može poboljšati na nekoliko načina. Prvo, trenutna koncentracija bi verovatno zahtevala višestruke subkutane injekcije (pretpostavljajući da je zapremina po potkožnoj injekciji ograničena na oko 1 mL) i na taj način smanjuje prijatnost i pogodnost pacijenta. Drugo, stabilnost pri skladištenju i rok trajanja trenutne formulacije ALX-0081 (u daljem tekstu takođe označeni kao savremeni ALX-0081) može se poboljšati na povišenim temperaturama. Stabilnost u sadašnjoj formulaciji na visokim temperaturama se uglavnom određuje hemijskim modifikacijama na polipeptidu. Hemijske modifikacije mogu biti povezane sa gubitkom snage.

[0011] Iako se praktični rok upotrebe može postići skladištenjem proizvoda na -20°C, to se, međutim, ne smatra povoljnom opcijom za većinu praktičnih razloga.

[0012] Sušenje smrzavanjem je uobičajeno korišćena tehnika za očuvanje proteina koji služi za uklanjanje vode iz proteinskog preparata od interesa. Liofilizacija, ili liofilizacija, je proces kojim se materijal koji treba da se osuši prvo zamrzne i zatim se led ili zamrznuti rastvarač ukloni sublimacijom u vakuumskom okruženju. Ekscipijens može biti uključen u pre-liofilizovane formulacije da bi se povećala stabilnost tokom procesa sušenja smrzavanjem i/ili da se poboljša stabilnost liofilizovanog proizvoda nakon skladištenja (Arakawa i dr. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)).

[0013] Predmetni pronalazak daje sledeće:

1. [1] Formulacija koja sadrži sredstvo za vezivanje von Vilebrandovog faktora (vWF), citratni pufer, saharozu i Tween-80, gde:

(a) vWF sredstvo za vezivanje ima koncentraciju od 10 mg/mL do 40 mg/mL; (b) saharoza ima koncentraciju 7% (w/v);

(c) Tween-80 ima koncentraciju 0.01% (v/v); i

(d) citratni pufer ima koncentraciju od 20 mM, tako da je pH formulacije 6.5, i pri čemu pomenuto vWF sredstvo za vezivanje sadrži SEQ ID NO:1.

[2] Formulacija prema [1], gde je pomenuto vWF sredstvo za vezivanje SEQ ID NO:1.

[3] Formulacija prema [1] ili [2], gde

1. (a) vWF sredstvo za vezivanje ima koncentraciju od 10 mg/mL do 12.5 mg/mL;

[4] Formulacija prema bilo kom od [1]-[3], gde

2. (a) vWF sredstvo za vezivanje ima koncentraciju od 10 mg/mL ili 12.5 mg/mL;

[5] Formulacija prema bilo kom od [1]-[4], koja ima:

3. (i) manje od 5% vrsta visoke molekulske mase (HMW) nakon skladištenja najmanje 12 meseci na 5°C; i/ili

4. (i) manje od 5% vrsta niske molekulske mase (LMW) nakon skladištenja najmanje 12 meseci na 5°C.

[6] Formulacija prema bilo kom od [1]-[5], pri čemu vWF sredstvo za vezivanje u formulaciji zadržava najmanje oko 80% svoje stabilnosti nakon skladištenja najmanje 12 meseci na 5°C.

[7] Formulacija prema bilo kom od [1]-[6], pri čemu najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, poželjnije najmanje 95% ili čak najmanje 99% vWF sredstva za vezivanje zadržava svoju aktivnost vezivanja nakon skladištenja u poređenju sa aktivnošću vezivanja pre skladištenja, pomenuta aktivnost vezivanja merena pomoću ELISA i/ili Biacore.

[8] Formulacija prema bilo kom od [1]-[7], koja je tečna ili rekonstituisana liofilizovana formulacija koja sadrži:

(a) vWF sredstvo za vezivanje u koncentraciji od 10 mg/mL do 12.5 mg/mL, poželjno 12.5 mg/mL;

(b) saharoza u koncentraciji 7% (w/v);

(c) Tween-80 u koncentraciji 0.01% (v/v); i

(d) citratni pufer pri koncentraciji od 20 mM, tako da je pH formulacije 6.5. 2. [9] Formulacija prema bilo kom od [1]-[7], koja je grupno skladištena formulacija koja sadrži:

(b) saharoza u koncentraciji 7% (w/v);

(c) Tween-80 u koncentraciji 0.01% (v/v); i

(d) citratni pufer pri koncentraciji od 20 mM, tako da je pH formulacije 6.5; pri čemu se najmanje 100 litara formulacije skladišti u uslovima ispod temperature smrzavanja.

[10] Formulacija prema bilo kom od [1] do [9], koji je u tečnom, liofilizovanom, osušenom raspršivanjem, rekonstituisanom liofiliziranom ili smrznutom obliku.

[11] Postupak ili proces pripreme formulacije prema bilo kom od [1] do [10], pri čemu navedeni postupak ili proces obuhvata korake:

o ekspresiju vWF sredstva za vezivanje u kulturi ćelija;

o prečišćavanje vWF sredstva za vezivanje prolaskom vWF sredstva za vezivanje preko najmanje jednog koraka prečišćavanja hromatografijom i koraka ultrafiltracije/dijafiltracije;

o podešavanje koncentracije vWF sredstva za vezivanje na 10 do 40 mg/mL, poželjno 12.5 mg/mL, u formulaciji koja sadrži:

1. (i) saharoza u koncentraciji 7% (w/v);

2. (ii) Tween-80 u koncentraciji 0.01% (v/v); i

3. (ii) citratni pufer pri koncentraciji od 20 mM, tako da je pH formulacije 6.5.

[12] Postupak za pripremanje rekonstituisane formulacije prema bilo kom od [1] do [10], gde navedeni postupak obuhvata korake: (i) liofilizaciju smeše vWF sredstva za vezivanje, lioprotektanta, surfaktanta i pufera, čime se formira liofilizovana smeša; i (ii) rekonstituisanje liofilizovane smeše u razblaživaču, pri čemu se priprema formulacija, pri čemu rekonstituisana formulacija sadrži

(a) vWF sredstvo za vezivanje u koncentraciji od 10 mg/mL do 40 mg/mL, poželjno 12.5 mg/mL;

(b) saharoza u koncentraciji 7% (w/v);

(c) Tween-80 u koncentraciji 0.01% (v/v); i

(d) citratni pufer pri koncentraciji od 20 mM, tako da je pH formulacije 6.5.

[13] Komplet ili proizvodni artikl, koji sadrži kontejner koji sadrži formulaciju bilo kog od [1]-[10] i uputstva za upotrebu.

[14] Komplet ili proizvod iz [13], gde je formulacija prisutna u bočici ili injekcionom špricu.

[0014] Ovaj pronalazak se odnosi na formulaciju koja sadrži sredstvo za vezivanje von Vilebrandovog faktora (vWF) i citratni ili fosfatni pufer, poželjno citratni pufer, sa pH u opsegu od 5.0 do 7.5. Posebno, predmetno obelodanjivanje se odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, gde pomenuto vWF sredstvo za vezivanje sadrži najmanje jedan jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina vezan za SEQ ID NO:20.

[0015] Navedeni jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina sadrži ili suštinski sadrži, ali nije ograničen na, jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina koji je sekvenca varijabilnog domena teškog lanca, preciznije imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji je sekvenca varijabilnog domena teškog lanca koja je izvedena iz uobičajenog antitela sa četiri lanca ili sekvenca varijabilnog domena teškog lanca koja je izvedena iz antitela teškog lanca, ili Nanotela (uključujući ali ne ograničavajući se na VHH sekvencu), poželjno Nanotela.

[0016] Pored toga, predmetno obelodanjivanje se odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, gde pomenuto vWF sredstvo za vezivanje sadrži najmanje jednu od SEQ ID NO:s 1-19. Osim toga, predmetni pronalazak se odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, gde je pomenuto vWF sredstvo za vezivanje jednolančani polipeptid koji sadrži jedan ili više jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina, poželjno gde je pomenuto vWF sredstvo za vezivanje monovalentno ili multivalentno, pri čemu je navedeno vWF sredstvo za vezivanje monospecifično ili multispecifično i/ili gde jedan ili više jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina su CDR-kalemljeni, humanizovani, kamelizovani, de-imunizovani, i/ili in vitrogenerisani (npr. odabrani pomoću fagnog prikaza). Predmetni pronalazak se takođe odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, gde pomenuto vWF sredstvo za vezivanje sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična SEQ ID NO:1. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, gde pomenuto vWF sredstvo za vezivanje ima koncentraciju u opsegu od 0.1 do 80 mg/mL, i/ili gde navedeni pufer ima koncentraciju u opsegu od 5-200 mM.

[0017] Dodatno, predmetno obelodanjivanje se odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, koja dalje sadrži ekscipijens, poželjno je da pomenuti ekscipijens ima koncentraciju u opsegu od 10-500 mM, još poželjnije, gde je pomenuti ekscipijens izabran sa liste koja se sastoji iz saharoze, glicina, manitol, trehaloza i NaCl, još poželjnije, gde navedena saharoza ima koncentraciju u opsegu od 1-15%, poželjno 2-12%, poželjno 4-10%, npr.4, 5, 6, 7, 8 ili 9% (w/v), najpoželjnije 7%.

[0018] Predmetno obelodanjivanje se takođe odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, gde je pufer izabran iz citratnog pufera, poželjno je da citratni pufer ima pH između 6.0 i 7.0, poželjnije 6.5; i fosfatni pufer, poželjno je da navedeni fosfatni pufer ima pH u opsegu od 6.5 do 7.5, poželjno 7.1.

[0019] Pored toga, predmetno obelodanjivanje se odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, koja dalje sadrži ne-jonski deterdžent, kao što je Tween-80, poželjno u koncentraciji između 0.001 i 0.5% (v/v), poželjnije 0.01-0.02% (v/v).

[0020] Dalje, predmetno obelodanjivanje se odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, gde je navedeni pufer citratni pufer na pH 6.5 ±0.5, npr.6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7 ili 6.8, specifičnije 6.5, i gde navedena formulacija dalje sadrži saharozu sa koncentracijom u opsegu od 1-15%, poželjno 2-12%, poželjno 4-10%, npr. 4, 5, 6, 7, 8 ili 9% (w/v), najpoželjnije 7%, i poželjno dalje sadrži ne-jonski deterdžent kao što je Tween-80, poželjno u koncentraciji od 0.01% (v/v) .

[0021] Takođe, predmetno obelodanjivanje se odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, gde navedena formulacija ima osmolalnost u opsegu od 290 ± 60 mOsm/kg, poželjnije u opsegu od 290 ± 20 mOsm/kg.

[0022] Predmetno obelodanjivanje se dalje odnosi na formulaciju koja sadrži:

(a) vWF sredstvo za vezivanje u koncentraciji od oko 0.1 mg/mL do oko 80 mg/mL; (b) ekscipijens izabran između saharoze, glicina, manitola, trehaloze ili NaCl u koncentraciji od oko 1% do oko 15% (w/v);

(c) Tween-80 u koncentraciji od oko 0.001% do 0.5% (v/v); i

(d) pufer izabran iz citratnog pufera u koncentraciji od oko 5 mM do oko 200 mM, tako da je pH formulacije oko 6.0 do 7.0 i fosfatni pufer u koncentraciji od oko 10 mM do oko 50 mM, tako da pH formulacije je oko 6.5 do 7.5, pri čemu vWF sredstvo za vezivanje u formulaciji zadržava najmanje oko 80% svoje stabilnosti nakon skladištenja najmanje 12 meseci na 5°C ili čak 24 meseca na 5°C.

[0023] Obelodanjivanje se takođe odnosi na formulaciju koja ima manje od 5% vrsta visoke molekulske mase (HMW) nakon skladištenja najmanje 12 meseci na 5°C ili čak 24 meseca na 5°C; i/ili manje od 5% vrsta niske molekulske mase (LMW) nakon skladištenja najmanje 12 meseci na 5°C ili čak 24 meseca na 5°C.

[0024] Predmetno obelodanjivanje se dalje odnosi na formulaciju u kojoj najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, poželjnije najmanje 95% ili čak najmanje 99% vWF sredstva za vezivanje zadržava svoju aktivnost vezivanja nakon skladištenja u odnosu na aktivnost vezivanja pre skladištenja, navedena aktivnost vezivanja je merena pomoću ELISA i/ili Biacore.

[0025] Pored toga, obelodanjivanje se odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, gde je navedena formulacija u tečnom, liofilizovanom, osušenom raspršivanjem, rekonstituisanom liofiliziranom ili smrznutom obliku, tačnije odnosi se na tečnu ili rekonstituisanu liofilizovanu formulaciju koja sadrži:

(a) vWF sredstvo za vezivanje u koncentraciji od oko 0.1 mg/mL do oko 80 mg/mL; (b) saharoza u koncentraciji od oko 1% do oko 15% (w/v);

(c) Tween-80 u koncentraciji od oko 0.001% -0.5% (v/v); i

(d) citratni pufer u koncentraciji od oko 5 mM do oko 200 mM, tako da je pH formulacije oko 6.0 do 7.0.

[0026] Liofilizovana formulacija se zatim može rekonstituisati prema potrebi mešanjem liofilizovanog oblika sa pogodnim razblaživačem (npr. vodom) da bi se originalne formulacione komponente dovele do željene koncentracije.

[0027] Predmetno obelodanjivanje se takođe odnosi na formulaciju kao što je ovde opisana, gde je pomenuta formulacija formulacija za skladištenje u masi koja sadrži:

(a) vWF sredstvo za vezivanje u koncentraciji od oko 0.1 mg/mL do oko 80 mg/mL; (b) saharoza u koncentraciji od oko 1% do oko 15%;

(c) Tween-80 u koncentraciji od oko 0.001%-0.5% (w/v); i

(d) citratni pufer u koncentraciji od oko 5 mM do oko 200 mM, tako da je pH formulacije oko 6.0 do 7.0, pri čemu se najmanje 100 litara formulacije skladišti u uslovima ispod temperature zamrzavanja.

[0028] Dodatno, predmetno obelodanjivanje se odnosi na formulaciju, pri čemu je navedena formulacija pogodna za parenteralno davanje subjektu, npr., humanom subjektu (npr. pacijentu koji ima poremećaj povezan sa vWF). Formulacija se može dati subjektu injekcijom (npr. intravenozno, subkutano, intramuskularno ili intraperitonealno).

[0029] Takođe, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje formulaciju kao što je ovde opisana, za upotrebu u postupku lečenja humanog ili životinjskog subjekta, poželjno za upotrebu u lečenju poremećaja povezanih sa vWF, kao što je npr. akutni koronarni sindrom (ACS), prolazni cerebralni ishemijski napad, nestabilna ili stabilna angina pektoris, moždani udar, infarkt miokarda ili trombotična trombocitopenična purpura (TTP), najpoželjnije za upotrebu u lečenju TTP ili ACS. Štaviše, predmetno obelodanjivanje se odnosi na postupak ili proces za pripremu formulacije kao što je ovde opisano. Postupak ili proces uključuje ekspresiju vWF sredstva za vezivanje u kulturi ćelija; prečišćavanje vWF sredstva za vezivanje, npr., propuštanjem vWF sredstva za vezivanje preko najmanje jednog koraka prečišćavanja hromatografijom, koraka ultrafiltracije/dijafiltracije; podešavanje koncentracije vWF sredstva za vezivanje, npr. do oko 0.1 do 80 mg/mL u formulaciji koja sadrži lioprotektant, surfaktant i pufer kao što je ovde opisano, npr. saharoza u koncentraciji od oko 1% do oko 15%; Tween-80 u koncentraciji od oko 0.001% do oko 0.5% (w/v); i citratni pufer u koncentraciji od oko 5 mM do oko 200 mM, tako da je pH formulacije oko 6.0 do 7.0; po izboru, sadrži korak konfekcioniranja formulacije u obliku jedinične doze.

[0030] Obelodanjivanje takođe karakteriše postupak ili proces za pripremanje rekonstituisane formulacije koja sadrži vWF sredstvo za vezivanje, npr., ALX-0081 kao što je ovde opisano. Postupak obuhvata: liofilizaciju smeše vWF sredstva za vezivanje, lioprotektanta, surfaktanta i pufera, čime se formira liofilizovana smeša; i rekonstituisanje liofilizovane smeše u razblaživaču, pri čemu se dobija formulacija kao što je ovde opisana. Posebno, formulacija uključuje (a) vWF sredstvo za vezivanje, npr., ALX-0081 u koncentraciji od oko 0.1 do oko 80 mg/mL; (b) saharoza u koncentraciji od oko 1% do oko 15% (w/v); (c) Tween-80 u koncentraciji od oko 0.001% do 0.5% (v/v); i (d) citratni pufer u koncentraciji od oko 5 do oko 200 mM, tako da je pH formulacije oko 6 do 7.0; po izboru, sadrži korak konfekcioniranja formulacije u obliku jedinične doze.

[0031] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupak za stabilizaciju vWF sredstva za vezivanje, poželjno polipeptida koji sadrži najmanje jednu od SEQ ID NO:1-19 za skladištenje, koji obuhvata pripremanje formulacije kao što je ovde definisano.

1

[0032] Dodatno, obelodanjivanje se odnosi na postupak za čuvanje vWF sredstva za vezivanje, poželjno polipeptida koji sadrži najmanje jedan od SEQ ID NO:1-19, koji obuhvata pripremanje formulacije kao što je ovde definisano.

[0033] Takođe su obezbeđene farmaceutski ili dijagnostički sastavi koji sadrže bilo koju od formulacija koje su ovde opisane ili koji se mogu dobiti ovde opisanim postupcima.

[0034] Dalje, obelodanjivanje otkriva postupak za analizu proizvoda ili procesa, npr., proizvodni proces. Postupak uključuje obezbeđivanje formulacije vWF sredstva za vezivanje, npr., ALX-0081 kao što je ovde opisano i procenjivanje parametra formulacije, kao što je boja, bistrina, viskoznost ili količina jedne ili više HMW, LMW vrsta, kao što je ovde opisano. Evaluacija može uključivati procenu jednog ili više parametara, kao što je utvrđivanje da li parametar zadovoljava prethodno izabrani kriterijum, npr. određivanje da li je prisutan prethodno izabrani kriterijum ili je prisutan u unapred izabranom opsegu, čime se analizira proces. Na primer, procena postupka uključuje merenje stabilnosti formulacije vWF sredstva za vezivanje. Stabilnost formulacije ALX-0081 se može izmeriti, na primer, formiranjem agregata, koji se analizira, na primer, pomoću tečne hromatografije visokog pritiska (SE-HPLC), boje, bistrine ili viskoznosti kao što je ovde opisano.

[0035] Pored toga, postupak može dalje obuhvatiti upoređivanje dve ili više formulacija uzoraka u postupku praćenja ili kontrole varijacija serije u odnosu na seriju, upoređujući preparat sa referentnim standardom, klasifikujući, selektujući, prihvatajući ili odbacujući, oslobađajući ili zadržavajući, preradu u lek, transport, premeštanje na drugo mesto, formulisanje, obeležavanje ili pakovanje formulacije, na osnovu poređenja. Takođe, postupak može dalje da sadrži obezbeđivanje zapisa koji uključuje podatke koji se odnose na procenjeni parametar formulacije i opciono uključuje identifikator za serijske formulacije; podnošenje tog zapisa donosiocu odluke; opciono, primanje komunikacije od pomenutog donosioca odluka; opciono, odlučivanje o tome da li da oslobodi ili plasira grupu formulacija na osnovu komunikacije donosioca odluke.

[0036] Takođe su obezbeđeni kompleti ili artikli za proizvodnju koji sadrže formulaciju obelodanjivanja i uputstva za upotrebu, npr. od strane zdravstvenog radnika. Kompleti ili artikli za proizvodnju mogu uključivati bočicu ili špric koji sadrži formulaciju obelodanjivanja kao što je ovde opisano. Poželjno, bočica ili šprica je sastavljena od stakla, plastike ili polimernog materijala izabranog od cikličnog olefin polimera ili kopolimera. Pored toga, formulacija može takođe biti prisutna u injektabilnom uređaju (npr. Injekcioni špric, npr. prethodno napunjeni injekcioni špric).

[0037] Predmetno obelodanjivanje dalje obezbeđuje farmaceutske jedinične oblike doziranja koji sadrže stabilne formulacije opisa koji su pogodni za parenteralno davanje (npr., intradermalno, intramuskularno, intraperitonealno, intravenozno i subkutano) formulacije obelodanjivanja pacijentu.

[0038] Štaviše, formulacije iz obelodanjivanja mogu se koristiti za čuvanje vWF sredstva za vezivanje, poželjno polipeptida koji sadrži najmanje jednu od SEQ ID NO:s 1-19, kao što je ALX-0081 kao što je ovde opisano, pri čemu je navedeno skladištenje 1-36 meseci, kao što su 1, 1.5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ili 36 meseci, poželjno najmanje 12 meseci, npr. na temperaturi između -70°C i 40°C, kao što je -70°C, -20°C, 5°C, 25°C ili 40°C, poželjno na temperaturi između -70°C i 25°C.

[0039] Predmetno obelodanjivanje se takođe odnosi na postupak za lečenje ili prevenciju poremećaja povezanog sa vWF, kao što je npr. akutni koronarni sindrom (ACS), prolazni cerebralni ishemijski napad, nestabilna ili stabilna angina pektoris, moždani udar, infarkt miokarda ili trombotična trombocitopenična purpura (TTP); navedeni postupak se sastoji od davanja ispitaniku farmaceutskog sastava koja sadrži formulaciju obelodanjivanja, čime se redukuje jedan ili više simptoma povezanih sa navedenim poremećajem povezanim sa vWF. Naročito, navedeni poremećaj povezan sa vWF je TTP.

4. Kratak opis slika

[0040]

Slika 1

Dijagram toka koji predstavlja različite korake standardnog programa 65h-liofilizacije izvedenog za ALX-0081.

Slika 2A

Relevantni deo RP-HPLC hromatograma ALX-0081 posle 1 i 2 meseca čuvanja na -70°C, 5°C i 25°C; mAU: mili jedinica apsorpcije.

Slika 2B

Zumiranje relevantnog dela hromatograma RP-HPLC ALX-0081 nakon inkubacije 0, 4 i 8 nedelja na 37°C. Podela glavnog maksimuma RP-HPLC je uočena kao rezultat produžene inkubacije na 37°C (0, 4, 8n); mAU: mili jedinica apsorpcije.

Slika 3A

Prekrivanje SE-HPLC profila praznog citratnog pufera (bcb) i ALX-0081 u 20 mM citratu pH 7.0 na 55.9 mg/mL pre (a) i posle 10 ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja (FT) na -20°C (c) i -70°C (b) (λ = 280 nm). Manji maksimum citrata je primećen za uzorke koji su prethodno razblaženi u puferu za izvođenje; mAU: mili jedinica apsorpcije.

Slika 3B

Prekrivanje SE-HPLC profila praznog citratnog pufera (bcb) i ALX-0081 u 20 mM citratu pH 7.0 na 55.9 mg/mL nakon ±1 nedelje čuvanja na 4°C (λ = 280 nm). ALX-0081 je razložen u jedan glavni maksimum (97%) koji odgovara netaknutom, nemodifikovanom ALX-0081 i malim pre-maksimumima koji predstavljaju samo 3% ukupne površine. Manji maksimum citrata je primećen za ALX-0081 koji su prethodno razblaženi u puferu za izvođenje; mAU: mili jedinica apsorpcije.

Slika 4A

Intenzitet raspršivanja u mešanim uzorcima ALX-0081 u 50 mM citratu pH 6.0, 50 mM citrata pH 6.0 0.01% Tween-80 (v/v) i 50 mM citrata pH 6.0 0.02% Tween-80 (v/v) na 25°C. '+' predstavlja uzorke u 50 mM citratu pH 6.0 (y=0.0044x 3.5962, R<2>=0.9549); 'o' predstavljaju uzorke u 50 mM citratu pH 6.0 0.02% Tween-80 (v/v) (y=0.0002x 1.0447, R<2>=0.4673); 'x' predstavljaju uzorke u 50 mM citratu pH 6.0 0.01% Tween-80 (v/v) (y=0.0004x 0.5125, R<2>=0.6804);(x-osa= vreme u sekundama; y-osa= intenzitet raspršivanja).

Slika 4B

Intenzitet raspršivanja u mešanim uzorcima ALX-0081 u 50 mM citratu pH 6.5, 50 mM citrata pH 6.5 0.01% Tween-80 (v/v) i 50 mM citrata pH 6.5 0.02% Tween-80 (v/v) na 25°C. '+' predstavlja uzorke u 50 mM citratu pH 6.5 (y=0.0041x 4.7667, R<2>=0.9431); 'o' predstavljaju uzorke u 50 mM citratu pH 6.5 0.02% Tween-80 (v/v) (y=0.0004x - 0.0208, R<2>=0.9391); 'x' predstavljaju uzorke u 50 mM citratu pH 6.5 0.01% Tween-80 (v/v) (y=0.0001x - 1.8853, R<2>=0.0376); (x-osa = vreme u sekundama; y-osa= intenzitet raspršivanja).

Slika 5

1

Preklapanje profila clEF ALX-0081 pri 5 mg/mL u D-PBS 200 mM glicina 0.01% Tween-80 nakon jednog meseca skladištenja na 40°C (a) i -70°C (b); (λ = 280 nm). AU: jedinica apsorpcije; pxlpos: pozicijapiksela.

Slika 6

Slika liofilizovanih formulacija ALX-0081 (oblik 3 = citrat/saharoza pH 6.0; oblik 7 = citrat /saharoza pH 6.5; oblik 17 = D-PBS/glicin) pre (ploča A) i nakon rekonstrukcije sa Milli-Q vodom (ploča B).

Slika 7

Slika liofilizovanih formulacija baziranih na ALX-0081 citratu/saharozi.

Slika 8

Slike tečnih formulacija ALX-0081 od 28 mg/mL koje sadrže 15, 20, 25, 30, 40 i 50 mM citrata pH 6.5 nakon 4 dana čuvanja na 25°C (ploča A) ili 5°C (ploča B). Prazan citratni pufer (50 mM) je uključen kao referenca.

Slika 9

Slike tečnih formulacija ALX-0081 od 20 mg/mL koje sadrže 15 mM citrata pH 6.5 i različite količine saharoze i Tween-80 nakon 4 dana čuvanja na 25°C (ploča A) ili 5°C (ploča B). Prazan citratni pufer (50 mM) je uključen kao referenca.

Slika 10

Predviđanje procenta piroglutamata u liofilizovanom ALX-0081 leku kao funkcija vremena kada se čuva na 5°C.

Slika 11

Predviđanje procenta piroglutamata u liofilizovanom ALX-0081 leku kao funkcija vremena kada se čuva na 25°C.

5. Detaljni opis pronalaska

[0041] Ukoliko nije drugačije naznačeno, svi postupci, koraci, tehnike i manipulacije koji nisu posebno opisani detaljno mogu se izvesti i izvršeni su na način koji je poznat sam po sebi, što će biti jasno stručnjaku. Referenca je, na primer, ponovo napravljena na standardne priručnike i opštu pozadinu koja je ovde pomenuta i na dalje reference koje su tamo citirane; kao i na primer za sledeće preglede: Presta, Adv. Drug Deliv. Rev.2006, 58 (5-6): 640-56; Levin and Weiss, Mol. Biosyst.2006, 2(1): 49-57; Irving i dr., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz i dr., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales i dr., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31-43, koji opisuju tehnike za projektovanje proteina, kao što su sazrevanje afiniteta i druge tehnike za poboljšanje specifičnosti i drugih željenih svojstava proteina kao što su imunoglobulini.

[0042] Sada je iznenađujuće pronađeno da vWF sredstva za vezivanje, a posebno ALX-0081 (SEQ ID NO:1), može se primenjivati u posebnim režimima doziranja kod ljudi. Nađeno je da vWF sredstva za vezivanje, a posebno ALX-0081, proizvode farmakodinamički efekat, sa brzim početkom dejstva odmah na kraju doziranja i održavaju svoju efikasnost do oko 12-24 h. Dodatno, vWF sredstva za vezivanje, a posebno ALX-0081 (SEQ ID NO:1), pokazalo se da se dobro podnose i da su bezbedni kod zdravih muških volontera. Ovi rezultati ukazuju da vWF sredstva za vezivanje, a posebno ALX-0081 (SEQ ID NO:1) pogodni su za akutno lečenje kod pacijenata sa stabilnom anginom koja je podvrgnuta selektivnoj perkutanoj koronarnoj intervenciji (u daljem tekstu i "PCI") i lečenju kod pacijenata sa trombotičnom trombocitopeničnom purpurom (u daljem tekstu i "TTP").

[0043] Ipak, trenutne formulacije vWF sredstva za vezivanje i naročito ALX-0081 (SEQ ID NO:1) primenjeni humanim primaocima su bili podložni poboljšanju.

[0044] Pronalazak formulacije za vWF sredstvo za vezivanje, a posebno ALX-0081, koji je ovde opisan, daje novu formulaciju na bazi citrata/saharoze sa povećanom rastvorljivošću (do 80 mg/mL) i značajno poboljšanom stabilnošću skladištenja tečnosti (npr. manje oksidacije nastaje pri skladištenju nova formulacija u originalnu formulaciju u svom tečnom stanju). Takođe, u liofilizovanom obliku, u suštini nema oksidacije ili asp-izomerizacije nakon 12 meseci čuvanja na 40°C ili čak 24 meseca čuvanja na 40°C. Još uvek je primećena zaostala formacija malih količina piroglutamata. Dalja optimizacija koncentracije citrata i saharoze rezultirala je smanjenjem sadržaja vlage u liofiliziranom proizvodu, čime se minimizira brzina zaostale formacije piroglutamata.

[0045] Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje stabilne tečne i liofilizovane formulacije anti-vWF sredstava za vezivanje koja sadrže ALX-0081. Takođe su opisane njihove primene za lečenje ili prevenciju poremećaja povezanih sa vWF.

5.1 Polipeptid(i) upotrebljeni u pronalasku

[0046] VWF sredstva za vezivanje koja se koriste u ovom opisu su tipično proteini ili polipeptidi koji se vezuju za humani von Vilebrand faktor (vWF, SEQ ID NO:20). VWF sredstva za vezivanje su proteini ili polipeptidi koji sadrže ili se sastoje iz najmanje jedne

1

sekvence imunoglobulina, kao što je jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina (ISVD). VWF sredstva za vezivanje predmetnog pronalaska su proteini ili polipeptidi koji sadrže ili se sastoje iz SEQ ID NOs: 1-19 i najpoželjnije SEQ ID NO:1. VWF sredstva za vezivanje se mogu koristiti kao dopunska terapija za pacijente sa ACS koji se podvrgavaju PCI ili kao tretman trombotične trombocitopenične purpure (TTP). Termini "protein", "polipeptid" i "aminokiselinska sekvenca" se ovde koriste naizmenično. Stoga, aminokiselinska sekvenca obelodanjivanja je vWF sredstvo za vezivanje.

[0047] Tako, na primer, pogodna vWF sredstva za vezivanje za upotrebu u obelodanjivanju mogu uključiti jedinjenja u Tabeli A-1, npr. SEQ ID NO:1-19, ili jedinjenje koje ima 80% ili više, poželjnije 85% ili više, najpoželjnije 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više, identičnost aminokiselinske sekvence prema jedinjenju u Tabela A-1 (videti odeljak Definicija za "identitet sekvence").

[0048] Poželjno, vWF sredstva za vezivanje za upotrebu u opisu su jedinjenja slična 12A02H1. Za potrebe ovog opisa jedinjenje slično 12A02H1 je jedinjenje koje sadrži 12A02H1 (tj. SEQ ID NO:19) ili jedinjenje koje ima 80% ili više, poželjnije 85% ili više, najpoželjnije 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više, identičnost aminokiselinske sekvence (kao što je ovde dalje definisano) do 12A02H1 (SEQ ID NO:19). Posebno poželjno vWF sredstvo za vezivanje je ALX-0081 (SEQ ID NO:1).

[0049] Sva gore pomenuta vWF sredstva za vezivanje su dobro poznata iz literature. Ovo uključuje njihovu proizvodnju (videti naročito npr. WO2006/122825 ali takođe

i WO2004/062551). Na primer, ALX-0081 je pripremljen kao što je opisano npr.

u WO2006/122825 ili WO2009/115614.

[0050] Ukoliko nije drugačije naznačeno, termin "sekvenca imunoglobulina" - bilo da se ovde koristi da označi antitelo teškog lanca ili konvencionalno 4-lančano antitelo - koristi se kao opšti termin da se uključi i antitelo pune veličine, njegovi pojedinačni lanci, kao i sve delove, domene ili njihove fragmente (uključujući, ali ne ograničavajući se na domene ili fragmente koji vežu antigen, kao što su VHHdomeni, odnosno VH/VLdomeni). Termini antigen-vezujući molekul ili antigen-vezujući protein se koriste naizmenično sa imunoglobulinskom sekvencom i uključuju jedinstvene varijabilne domene imunoglobulina, kao što su Nanotela®.

1

[0051] Otelotvorenja pronalaska se odnose na imunoglobulinske sekvence koje su jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina, kao što su sekvence varijabilnog domena lakog lanca (npr. VL-sekvenca) ili sekvence varijabilnog domena teškog lanca (npr. VH-sekvenca); specifičnije, sekvence varijabilnog domena teškog lanca koje su izvedene iz konvencionalnih četiri lanca antitela ili sekvenci varijabilnog domena teškog lanca koje su izvedene iz antitela teškog lanca (npr. VHH-sekvenca).

[0052] Termin "jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina" definiše molekule u kojima je mesto za vezivanje antigena prisutno na, i formirano od strane jednog imunoglobulinskog domena ili njihovih pogodnih fragmenata. Ovo postavlja jedinstvene varijabilne domene imunoglobulina osim "konvencionalnih" imunoglobulina ili njihovih fragmenata, pri čemu dva domena imunoglobulina, posebno dva varijabilna domena interaguju i formiraju mesto za vezivanje antigena. Tipično, u konvencionalnim imunoglobulinima, varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL) interaguju i formiraju mesto za vezivanje antigena. U ovom slučaju, regioni koji određuju komplementarnost (CDR) i VHi VLdoprinose mestu vezivanja antigena, tj. ukupno 6 CDR će biti uključeno u formiranje mesta vezivanja antigena.

[0053] Nasuprot tome, mesto vezivanja antigena jedinstvenog varijabilnog domena imunoglobulina formirano je od strane jednog VHili VLdomena. Prema tome, mesto vezivanja antigena jedinstvenog varijabilnog domena imunoglobulina formirano je ne više od tri CDR-a, npr. jedan, dva ili tri CDR-a.

[0054] Termin "jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina" stoga ne sadrži konvencionalne imunoglobuline ili njihove fragmente koji zahtevaju interakciju najmanje dva varijabilna domena za formiranje mesta za vezivanje antigena. Ovo je takođe slučaj za varijante pronalaska koje "sastoje iz" ili "sadrže" jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina. U kontekstu predmetnog pronalaska, takva otelotvorenja isključuju konvencionalne imunoglobuline ili njihove fragmente. Prema tome, sastav koji "se sastoji iz" ili "sadrži" jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina može se odnositi na npr. konstrukte koji sadrže više od jednog jedinstvenog varijabilnog domena imunoglobulina. Alternativno, mogu postojati i drugi sastojci osim jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina, npr. pomoćna sredstva različitih vrsta, proteinske oznake, boje, farbe, itd. međutim, ovi termini

1

obuhvataju fragmente konvencionalnih imunoglobulina gde je mesto vezivanja antigena formirano od jedinstvenog varijabilnog domena.

[0055] Prema pronalasku, polipeptid koji se koristi u ovom pronalasku, specifičnije sekvence imunoglobulina, može da se sastoji od, ili da sadrži jedno ili više od sledećih: domenska antitela, ili aminokiselinske sekvence koje su pogodne za upotrebu kao antitela domena, antitela jedinstvenog domena, ili aminokiselinske sekvence koje su pogodne za upotrebu kao antitela jedinstvenog domena, "dAbs", ili sekvence aminokiselina koje su pogodne za upotrebu kao dAbs, ili Nanotela®, uključujući ali ne ograničavajući se na VHHsekvence, kao što su humanizovane VHHsekvence ili kamelizovane VHsekvence, a poželjno su Nanotela®.

[0056] Predmetno obelodanjivanje obuhvata pogodne fragmente jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina. "Pogodni fragmenti" jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina se odnose na polipeptide koji sadrže manje aminokiselina od izvornog imunoglobulina jedinstvenog varijabilnog domena, ali još uvek pokazuju aktivnost vezivanja antigena (koja će tada obično sadržati najmanje neke aminokiselinske ostatke koji formiraju najmanje jedan CDR-a, kao što je ovde dalje opisano). Takvi imunoglobulinski jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina i fragmenti najpoželjnije sadrže imunoglobulinski nabor ili su sposobni za formiranje, pod pogodnim uslovima, imunoglobulinskog nabora.

Specifičnije, jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina i njihovi fragmenti su takvi da su sposobni da se vežu za ciljni antigen. Kao takav, jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina može, na primer, sadržati sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (npr. VL-sekvencu) ili njegov odgovarajući fragment; ili sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (npr. VH-sekvenca ili VHH-sekvenca) ili njegov odgovarajući fragment; sve dok je sposoban da formira jedinstvenu jedinicu za vezivanje antigena (tj. funkcionalnu jedinicu za vezivanje antigena koja se u suštini sastoji iz jedinstvenog varijabilnog domena imunoglobulina, tako da pojedinačni domen za vezivanje antigena nije potreban za interakciju sa drugim varijabilnim domenom da formira funkcionalni domen za antigen jedinicu za vezivanje antigena, kao što je na primer slučaj za varijabilne domene koji su prisutni u, na primer, konvencionalnim antitelima i scFv fragmentima koji moraju da stupaju u interakciju sa drugim varijabilnim domenom-npr. preko VH/VLinterakcije - da formiraju funkcionalni domen za vezivanje antigena).

1

[0057] Sekvence imunoglobulina iz obelodanjivanja su poželjno u suštini izolovani oblici. Sekvence imunoglobulina iz obelodanjivanja mogu takođe da formiraju deo proteina ili polipeptida iz opisa (kao što je ovde definisano), koji mogu sadržati ili suštinski sadržati jednu ili više aminokiselinskih sekvenci iz obelodanjivanja i koje mogu opciono dalje sadržati jednu ili više daljnjih aminokiselinske sekvence (sve opciono povezane preko jednog ili više pogodnih veznika). Na primer, i bez ograničenja, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci iz obelodanjivanja mogu da se koriste kao jedinice za vezivanje u takvom proteinu ili polipeptidu, koji može opciono da sadrži jednu ili više daljnjih aminokiselinskih sekvenci koje mogu da služe kao jedinice za vezivanje, tako da se obezbedi monovalentni, multivalentni ili multispecifični polipeptid iz opisa, respektivno, sve kako je ovde opisano. Takav protein ili polipeptid može takođe biti u suštini izolovanom obliku.

[0058] Obelodanjivanje se odnosi na imunoglobulinske sekvence različitog porekla, koje sadrže mišje, pacovske, zečje, magareće, humane i kamelizovane imunoglobulinske sekvence. Obelodanjivanje takođe uključuje potpuno humane, humanizovane ili himerne imunoglobulinske sekvence. Na primer, Obelodanjivanje obuhvata sekvence kamelizovanih imunoglobulina i humanizovane sekvence imunoglobulina iz gmizavaca, ili antitela sa kamelizovanim domenom, npr. kamelizovani dAb kao što su opisali Ward i dr (videti na primer WO 94/04678 i Davies and Riechmann (1994 i 1996)). Štaviše, opis obuhvata fuzionisane imunoglobulinske sekvence, npr. formiranje multivalentnog i/ili multispecifičnog konstrukta (za multivalentne i multispecifične polipeptide koji sadrže jedan ili više VHHdomena i njihovo dobijanje, takođe se upućuje na Conrath i dr., J. Biol. Chem., Vol.276, 7346-7350, 2001, kao i na primer WO96/34103 i WO99/23221), i imunoglobulinske sekvence koje sadrže oznake ili druge funkcionalne grupe, npr. toksine, etikete, radiohemijske supstance, itd., koje se mogu izvesti iz imunoglobulinskih sekvenci iz ovog pronalaska. Jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina su takođe opisani u ajkulama (koji se takođe nazivaju "IgNAR", kao što je opisano npr. WO03/014161 ili Streltsov, 2005).

[0059] U posebnom otelotvorenju, jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina opisanog pronalaska su Nanotela®, naročito kamelizovani VHHdomeni, humanizovani VHHdomeni ili kamelizovani VHdomeni. Stručnjak je dobro upoznat sa humanizacijom VHHi/ili kamelizacijom VHdomena.

1

[0060] Aminokiselinska sekvenca i struktura imunoglobulinske sekvence, posebno Nanotela®, može se smatrati - bez ograničenja na njih - da se sastoji iz četiri okvirna regiona ili "FR", koji su u struci i ovde označeni kao "Okvirni region 1" ili "FR1"; kao "Okvirni region 2" ili "FR2"; kao "Okvirni region 3" ili "FR3"; i kao "Okvirni region 4" ili "FR4", respektivno; gde su okvirni regioni prekinuti sa tri komplementarna determinisana regiona ili "CDR-a", koji se u struci nazivaju "Region koji determiniše komplementarnost 1" ili "CDR1"; kao "Region koji determiniše komplementarnost 2" ili "CDR2"; i kao "Region koji determiniše komplementarnost 3" ili "CDR3", respektivno;

[0061] Ukupan broj aminokiselinskih ostataka u Nanotela® može biti u području od 110-120, poželjno je 112-115, a najpoželjnije je 113. Treba, međutim, primetiti da delovi, fragmenti, analozi ili derivati (kao što je ovde dalje opisano) Nanotela® nisu posebno ograničeni u pogledu njihove dužine i/ili veličine, sve dok takvi delovi, fragmenti, analozi ili derivati ispunjavaju dalje zahtevi koji su ovde opisani i takođe su pogodno pogodni za ovde opisane svrhe.

[0062] Tako, generalno, jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina će biti aminokiselinske sekvence koje se sastoje iz, ili suštinski, sastoje se iz 4 okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i 3 regiona koji determinišu komplementarnost (CDR1 do CDR3, redom). "Suštinski se sastoji" u ovom kontekstu znači da dodatni elementi kao što su npr. oznake koje se koriste za prečišćavanje ili obeležavanje mogu biti prisutne, ali takvi dodatni elementi su mali u poređenju sa imunoglobulinom pojedinačnog varijabilnog domena per se, i ne utiču na aktivnost vezivanja antigena jedinstvenog varijabilnog domena imunoglobulina.

[0063] Kako se ovde koristi, termin "imunoglobulinske sekvence" ili "jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina" odnosi se na sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid, i polipeptid sam po sebi. Svako ograničenje značenja će biti očigledno iz specifičnog konteksta.

[0064] Posebno, aminokiselinska sekvenca iz obelodanjivanja može biti Nanotelo® ili njegov odgovarajući fragment. Za detaljniji opis VHH-a i Nanotela, upućuje se na pregledni članak Muyldermans in Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001), 277-302; kao i na sledeće patentne prijave, koje se pominju kao opšta

pozadina: WO94/04678, WO95/04079 i WO96/34103 od Vrije Universiteit

2

Brussel; WO94/25591, WO99/37681, WO00/40968, WO00/43507, WO00/65057, WO01/40 310, WO01/44301, EP1134231 i WO02/48193 Unilever; WO97/49805, WO01/21817, WO0 3/035694, WO03/054016 and WO03/055527 Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO03/050531 Algonomics N.V. i Ablynx N.V.; WO 01/90190 National Research Council of Canada; WO03/025020 (= EP1433793) Institute of Antibodies; kao

i WO04/041867, WO04/041862, WO04/041865, WO04/041863, WO04/062551, WO05/044 858, WO06/40153, WO06/079372, WO06/122786, WO06/122787 i WO06/122825, od Ablynx N.V. i dalje objavljene prijave patenata od strane Ablynx N.V. Takođe se poziva na dalje stanje tehnike koje je pomenuto u ovim prijavama, a posebno na spisak referenci pomenutih na stranama 41-43 Međunarodne prijave WO06/040153. Kao što je opisano u ovim referencama, Nanotela (posebno VHHsekvence i delimično humanizovana Nanotela) mogu biti posebno karakterisana prisustvom jednog ili više "Hallmarkovih ostataka" u jednoj ili više sekvenci okvira. Dalji opis Nanotela, uključujući humanizaciju i/ili kamelizaciju Nanotela, kao i drugih modifikacija, delova ili fragmenata, derivata ili "fuzija Nanotela", multivalentnih konstrukata (uključujući neke neograničavajuće primere sekvenci veznika) i različitih modifikacija povećavaju polu-raspad Nanotela i mogu se naći njihovi preparati, npr u WO07/104529.

[0065] Jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina obezbeđeni opisom su poželjno u izolovanom obliku ili u suštini izolovanom obliku. Sekvence imunoglobulina iz obelodanjivanja mogu takođe da formiraju deo proteina ili polipeptida iz opisa, koji mogu sadržati ili suštinski sadržati jednu ili više jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina iz obelodanjivanja i koje mogu opciono dalje sadržati jednu ili više daljnjih aminokiselinske sekvence (sve opciono povezane preko jednog ili više pogodnih veznika). Na primer, i bez ograničenja, jedna ili više jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina iz obelodanjivanja mogu da se koriste kao jedinice za vezivanje u takvom proteinu ili polipeptidu, koji može opciono da sadrži jednu ili više daljnjih aminokiselinskih sekvenci koje mogu da služe kao jedinice za vezivanje, tako da se obezbedi monovalentni, multivalentni ili multispecifični polipeptid za upotrebu iz opisa, respektivno, sve kako je ovde opisano. Takav protein ili polipeptid može takođe biti u izolovanom ili u suštini izolovanom obliku. Prema tome, prema pronalasku, jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina sadrže konstrukte koji sadrže dva ili više antigen vezujućih jedinica u obliku pojedinačnih domena, kao što je iznad navedeno. Na primer, dva (ili više) jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina sa istom ili različitom antigenskom specifičnošću mogu biti povezani tako da formiraju npr. dvovalentni, trovalentni ili multivalentni konstrukt. Kombinovanjem jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina dve ili više specifičnosti, mogu se formirati bispecifični, trispecifični itd. konstrukti. Na primer, polipeptid prema pronalasku može da sadrži dva jedinstvena varijabilna domena imunoglobulina usmerena protiv ciljnog A, i jedan jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina protiv cilja B, čineći ga bivalentnim za A i monovalentnim za B. Takve konstrukte i njihove modifikacije, osoba može lako da predvidi, svi su obuhvaćeni ovim obelodanjivanjem. U određenim otelotvorenjima, pronalazak se odnosi na bi-paratopske konstrukte koji sadrže najmanje dva jedinstvena varijabilna domena imunoglobulina usmerena na različite epitope unutar istog ciljnog antigena.

[0066] Svi ovi molekuli se takođe navode kao "polipeptid iz obelodanjivanja", koji je sinonim za "imunoglobulinske sekvence" ili "jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina" obelodanjivanja.

[0067] Pored toga, termin "sekvenca" kako se ovde koristi (na primer u terminima kao "sekvenca imunoglobulina", "sekvenca antitela", "sekvenca varijabilnog domena", "VHH-sekvenca" ili "proteinska sekvenca"), treba generalno razumeti da uključuju i relevantnu aminokiselinsku sekvencu kao i sekvence nukleinskih kiselina ili nukleotidne sekvence koje kodiraju iste, osim ako kontekst ne zahteva više ograničeno tumačenje.

[0068] Prema jednom neograničavajućem otelotvorenju ovog pronalaska, imunoglobulinske sekvence, Nanotela® ili polipeptid iz opisa su glikozilovani. Prema jednim neograničavajućim otelotvorenjem ovog pronalaska, imunoglobulinske sekvence, Nanotela® ili polipeptid iz opisa su glikozilovani.

5.2 "Vezivanje" za antigen

[0069] Pronalazak se odnosi na imunoglobulinske sekvence koje se mogu vezati i/ili imati afinitet za antigen, što je von Vilebrandov faktor. U kontekstu predmetnog pronalaska, "vezivanje za i/ili afinitet za" određeni antigen ima uobičajeno značenje u struci, kao što je razumljivo npr. u kontekstu antitela i njihovih odgovarajućih antigena.

[0070] U određenim otelotvorenjima pronalaska, termin "vezuje se i/ili ima afinitet za" znači da imunoglobulinska sekvenca specifično interaguje sa antigenom, i koristi se naizmenično sa imunoglobulinskim sekvencama "protiv" navedenog antigena.

[0071] Termin "specifičnost" se odnosi na broj različitih tipova antigena ili antigenskih determinanti na koje određena sekvenca imunoglobulina, molekul koji vezuje antigen ili antigen-vezujući protein (kao što je imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen, Nanotelo® ili polipeptid obelodanjivanja) može da se veže. Specifičnost antigen-vezujućeg proteina može se odrediti na osnovu afiniteta i/ili aviditeta. Afinitet, predstavljen konstantom ravnoteže za disocijaciju antigena sa antigen-vezujućim proteinom (KD), je mera za snagu vezivanja između antigenske determinante i antigen-vezujućeg mesta na antigen-vezujućem proteinu: što je manja vrednost KD, jača je snaga vezivanja između antigenske determinante i molekula koji vezuje antigen (alternativno, afinitet se takođe može izraziti kao afinitetna konstanta (KA), koja je 1/KD). Kao što će biti jasno stručnjaku (na primer, na osnovu daljeg obelodanjivanja ovde), afinitet se može odrediti na način poznat sam po sebi, u zavisnosti od specifičnog antigena od interesa. Avidnost je mera jačine vezivanja između molekula koji vezuje antigen (kao što je jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina, Nanotelo® ili polipeptid iz obelodanjivanja) i odgovarajućeg antigena. Avidnost je povezana i sa afinitetom između antigenske determinante i njegovim antigen-vezujućim mestom na molekulu koji vezuje antigen i brojem relevantnih mesta vezivanja prisutnih na molekulu koji vezuje antigen.

[0072] Tipično, sekvence imunoglobulina iz ovog pronalaska (kao što su aminokiselinske sekvence, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni, Nanotela® i/ili polipeptidi iz obelodanjivanja) će se vezati za svoj antigen sa konstantom disocijacije (KD) 10<-5>do 10<-12>mol/l ili manje, i poželjno 10<-7>do 10<-12>mol/l ili manje, i poželjnije 10<-8>do 10<-12>mol/l (tj. sa konstantom asocijacije (KA) od 10<5>do 10<12>litara/mol ili više, i poželjno 10<7>do 10<12>litara/mol ili više, a poželjnije 108 do 10<12>litara/mol), i/ili se vezuju za njihov antigen kao što je ovde definisano sa kon-stopom između 10<2>M<-1>s<-1>do oko 10<7>M<-1>s<-1>, poželjno između 10<3>M<-1>s<-1>i 10<7>M<-1>s<-1>, poželjnije između 10<4>M<-1>s<-1>i 10<7>M<-1>s<-1>, kao što je između 10<5>M<-1>s<-1>i 10<7>M<-1>s<-1>; i/ili se vezuju za njihov antigen kao što je ovde definisano sa koff stopa između 1s<-1>(t1/2=0.69 s) i 10<-6>s<-1>(obezbeđivanje blizu ireverzibilnog kompleksa sa t1/2 višestrukih dana), poželjno između 10<-2>s<-1>i 10<-6>s<-1>, poželjnije između 10<-3>s<-1>i 10<-6>s<-1>, kao što je između 10<-4>s<-1>i 10<-6>s<-1>.

[0073] Svaka vrednost KD veća od 10-4M (ili bilo koja KA vrednost manja od 10<4>M<-1>) se generalno smatra da ukazuje na nespecifično vezivanje.

2

[0074] Poželjno, monovalentna sekvenca imunoglobulina iz obelodanjivanja će se vezati za željeni antigen sa afinitetom manjim od 500 nM, poželjno manjim od 200 nM, poželjnije manjim od 10 nM, kao što je manje od 500 pM.

[0075] Specifično vezivanje antigen-vezujućeg proteina za antigen ili antigensku determinantu može se odrediti na bilo koji pogodan način koji je poznat sam po sebi, uključujući, na primer, Scatchard analizu i/ili testove kompetetivnog vezivanja, kao što su radioimunološke metode (RIA), enzimske imunološke metode (EIA) i testovi kompetetivnosti sendviča, i njihove različite varijante poznate same po sebi u struci; kao i druge tehnike pomenute ovde.

[0076] Konstanta disocijacije (KD) može biti stvarna ili prividna konstanta disocijacije, što će biti jasno stručnjaku. Postupci za određivanje konstante disocijacije biće jasni stručnjaku, i na primer uključuju ovde pomenute tehnike. U tom smislu, takođe će biti jasno da nije moguće izmeriti konstante disocijacije veće od 10<-4>mola/litar ili 10<-3>mola/litru (npr., 10<-2>mola/l). Opciono, kao što će biti jasno stručnjaku, (stvarna ili prividna) konstanta disocijacije može se izračunati na osnovu (stvarne ili prividne) konstante asocijacije (KA), pomoću odnosa [KD = 1/KA].

[0077] Afinitet označava snagu ili stabilnost molekularne interakcije. Afinitet se obično daje kao KD, ili konstantom disocijacije, koja ima jedinice mol/l (ili M). Afinitet se takođe može izraziti kao konstanta asocijacije, KA, koja je jednaka 1/KD i ima jedinice (mol/l)<-1>(ili M<-1>). U predmetnoj specifikaciji, stabilnost interakcije između dva molekula (kao što je aminokiselinska sekvenca, imunoglobulinska sekvenca, jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina, Nanotelo® ili polipeptid iz obelodanjivanja i njegov ciljni cilj) će uglavnom biti izražena u smislu vrednost njihove interakcije; stručnjaku je jasno da, s obzirom na relaciju KA = 1/KD, određivanje jačine molekularne interakcije prema njenoj KD vrednosti može se takođe koristiti za izračunavanje odgovarajuće KA vrednosti. Vrednost KD karakteriše jačinu molekularne interakcije takođe u termodinamičkom smislu, jer se odnosi na slobodnu energiju (DG) vezivanja poznatim odnosom DG=RT.In (KD) (ekvivalentno DG=-RT.In(KA), gde je R jednako gasnoj konstanti, T je apsolutna temperatura i In označava prirodni logaritam.

[0078] KD za biološke interakcije, kao što je vezivanje sekvenci imunoglobulina iz obelodanjivanja do vWF kao što je ovde definisano, koje se smatraju značajnim (npr. specifičnim) su tipično u opsegu od 10<-10>M (0.1 nM) do 10<-5>M (10000 nM). Što je interakcija jača, to je niži njen KD.

[0079] KD se takođe može izraziti kao odnos konstante brzine disocijacije kompleksa, označen kao koff, prema brzini njegove asocijacije, označen kon(tako da KD=koff/koni KA = kon/koff). Koffima jedinice brzine otpuštanja s<-1>(gde je s oznaka SI jedinice sekunde). K<on>ima jedinice brzine vezivanja M<-1>s<-1>.

[0080] Što se tiče sekvenci imunoglobulina iz obelodanjivanja, brzina može varirati između 102 M<-l>s<-1>do oko 10<7>M<-l>s<-1>, približavajući se konstanti brzine asocijacije ograničene difuzijom za bimolekularne interakcije. Smanjenje brzine se odnosi na polu-raspad date molekularne interakcije odnosom t1/2=In(2)/koff. Smanjenje brzine sekvenci imunoglobulina iz obelodanjivanja može varirati između 10<-6>s<-1>(blizu ireverzibilnog kompleksa sa t12 višestrukih dana) do 1 s<-1>(t1/2=0.69 s).

[0081] Afinitet molekularne interakcije između dva molekula može se meriti različitim tehnikama poznatim samim po sebi, kao što je dobro poznata biosenzorska tehnika površinske plazmonske rezonance (SPR) (videti na primer Ober i dr., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001) gde je jedan molekul imobilizovan na biosenzorskom čipu i drugi molekul se prenosi preko imobilizovanog molekula pod uslovima protoka koji daju kon, koff merenja i stoga KD (ili KA) vrednosti. Ovo se može, na primer, izvesti korišćenjem dobro poznatih Biacore instrumenata.

[0082] Takođe će biti jasno stručnjaku da izmereni KD može odgovarati prividnom KD ako merni proces nekako utiče na svojstveni afinitet vezivanja impliciranih molekula, na primer artefaktima vezanim za oblaganje na biosenzoru jednog molekula. Takođe, očigledan KD može se meriti ako jedan molekul sadrži više od jednog mesta prepoznavanja za drugi molekul. U takvoj situaciji izmenjeni afinitet može biti pod uticajem aviditeta interakcije između dva molekula.

[0083] Drugi pristup koji se može koristiti za procenu afiniteta je postupak ELISA (enzimski povezani imunosorbentni test) u 2 koraka Friguet i dr. (J. Immunol. Methods, 77, 305-19,

2

1985). Ovaj postupak uspostavlja merenje ravnoteže faze rastvora i izbegava moguće artefakte koji se odnose na adsorpciju jednog od molekula na nosaču kao što je plastika.

[0084] Međutim, tačno merenje KD može biti prilično radno intenzivno i kao posledica toga, često su očigledne KD vrednosti određene za procenu jačine vezivanja dva molekula. Treba napomenuti da sve dok su sva merenja napravljena na konzistentan način (npr. zadržavanje uslova analize nepromenjena) očigledna KD merenja se mogu koristiti kao aproksimacija pravog KD i stoga u predmetnom dokumentu KD i očigledni KD treba tretirati sa podjednakim značajem.

[0085] Konačno, treba napomenuti da u mnogim situacijama iskusni naučnik može smatrati pogodnim odrediti afinitet vezivanja u odnosu na neku referentnu molekulu. Na primer, da bi se procenila snaga vezivanja između molekula A i B, može se npr. koriste referentni molekul C za koji se zna da se vezuje za B i koji je prikladno označen sa fluorofornom ili hromofornom grupom ili drugom hemijskom grupom, kao što je biotin za jednostavnu detekciju u ELISA ili FACS (fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija) ili u drugom formatu (fluorofora za detekciju fluorescencije, hromofora za detekciju apsorpcije svetlosti, biotin za ELISA detekciju posredovan streptavidinom). Obično, referentni molekul C se drži u fiksnoj koncentraciji i koncentracija A se menja za datu koncentraciju ili količinu B. Kao rezultat dobije se IC50 vrednost koja odgovara koncentraciji A na kojoj je signal izmeren za C u odsustvo A je prepolovljeno. Pod uslovom da je KD ref, KD referentnog molekula, poznat, kao i ukupni koncentracioni cref referentnog molekula, prividni KD za interakciju A-B može se dobiti iz sledeće formule: KD =IC50/(1+cref/ KD ref). Ne to ako cref << KD ref, KD ≈ IC50. Pod uslovom da se merenje IC50 vrši na konzistentan način (npr. držanje fiksiranog cref) za veziva koja se upoređuju, jačina ili stabilnost molekularne interakcije može se proceniti pomoću IC50 i ovo merenje se procenjuje kao ekvivalentno KD ili očigledno KD u ovom tekstu.

5.3 Ciljani antigen

[0086] Jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina predmetno obelodanjivanja vezuju se i/ili imaju afinitet za vWF. U kontekstu predmetnog pronalaska, "vWF" uključuje, ali nije ograničeno, na makaki rakojeda, babuna, svinju, zamorca, miša i/ili humani vWF i najpoželjniji humani vWF, tj. SEQ ID NO:20 ili GenBank unos: NP_000543.

5.4 Specifična otelotvorenja sekvenci imunoglobulina

2

[0087] Predmetni pronalazak se odnosi na jedinstvene varijabilne domene imunoglobulina opisane u postupcima koji su opisani u ili koje se mogu

dobiti WO2004/015425, WO2004/062551, WO2006/074947, WO2006/122825, WO2009/11 5614 ili WO2011/067160, sve na ime podnosioca prijave.

[0088] Pronalazak se takođe odnosi na optimizovane varijante ovih aminokiselinskih sekvenci. Generalno, "optimizovana varijanta" aminokiselinske sekvence prema opisu je varijanta koja sadrži jednu ili više korisnih supstitucija kao što su supstitucije koje povećavaju i) stepen "humanizacije", ii) hemijska stabilnost, i/ili iii ) nivo izražavanja; dok je potencija (izmerena npr. testom potencije kao što je opisano u eksperimentalnom

delu WO2006/122825 ostaje uporediv (tj. u odstupanju od 10%) od divljeg tipa 12A02 (kao što je definisano u WO2006/122825) ili uporediv sa varijantom 12A02H1 (SEQ ID NO:19), takođe definisano u WO2006/122825. Poželjno, u poređenju sa sekvencom divljeg tipa 12A02, aminokiselinska sekvenca iz opisa sadrži najmanje jednu takvu supstituciju, a poželjno najmanje dve takve supstitucije, a poželjno najmanje tri humanizujuće supstitucije i poželjno najmanje 10 takvih humanizovanih supstitucija.

[0089] U posebnom aspektu, aminokiselinske sekvence opisa sadrže ukupno između 1 i 15, poželjno između 2 i 14, kao što je između 9 i 13, npr.10, 11 ili 12 aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa sekvencom divljeg tipa 12A02. Kao što je pomenuto, ove razlike poželjno sadrže najmanje jednu, a poželjno najmanje dve, kao što su tri, četiri ili pet ili deset humanizovanih supstitucija, i mogu opciono da sadrže jednu ili više dodatnih supstitucija (kao što je bilo koja, ili bilo koja pogodna kombinacija bilo koje dve ili više od sledećih supstitucija (a) do (c) kao što je ovde pomenuto). Ponovo, na osnovu ovog pronalaska i opciono posle ograničenog stepena ispitivanja i greške, stručnjak će biti u stanju da izabere (pogodnu kombinaciju) jednog ili više takvih pogodnih humanizujućih i/ili daljih supstitucija.

[0090] Predmetno obelodanjivanje obuhvata polipeptidne sekvence koje su veoma slične bilo kom od specifičnih primera datih ovde, ili bilo koji od specifičnih primera definisanih u iznad navedenim referencama.

[0091] Veoma sličan znači identitet aminokiseline od najmanje 90%, npr.95, 97, 98 ili 99%. Veoma slične polipeptidne sekvence će imati istu funkciju kao i sekvenca iz koje su

2

izvedene, tj. one će se vezati za vWF, specifičnije vezati i inhibirati interakciju između vWF i trombocita.

[0092] U posebnom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na sekvence koje su veoma slične bilo kojoj od SEQ ID NOs: 1-19, posebno SEQ ID NO:1. Međutim, za svaku varijantnu sekvencu stabilnost u formulaciji kao što je ovde definisana mora se proceniti, tako da se pronalazak posebno odnosi na varijante ili visoko slične sekvence koje su stabilne u formulacijama kao što je ovde definisano.

[0093] Postupci za generisanje polipeptidnih sekvenci iz obelodanjivanja su široko poznati i uključuju npr. rekombinantna ekspresija ili sinteza. Stručnjak je dobro upoznat sa pogodnom tehnologijom ekspresije, npr. pogodni rekombinantni vektori i ćelije domaćini, npr. bakterijske ili ćelije domaćina kvasca. Stručnjak je takođe dobro upoznat sa pogodnim tehnikama prečišćavanja i protokolima.

5.5 Formulacije pronalaska

[0094] Predmetni pronalazak obezbeđuje formulacije polipeptida usmerenih protiv vWF, npr. jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina (ISVDs) ili polipeptidi koji sadrže najmanje jedan jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina, koji su stabilni, i pogodno pogodni za farmaceutske upotrebe, koji obuhvataju pripremu lekova.

[0095] Formulacija vWF sredstva za vezivanje, npr., ISVD, uključuje ISVD, jedinjenje koje može da služi kao krioprotektant i/ili lioprotektant i pufer. PH formulacije ovog pronalaska je generalno pH 5 - 7.5. U nekim otelotvorenjima, formulacija se čuva kao tečnost. U drugim otelotvorenjima, formulacija je pripremljena kao tečnost i zatim je osušena, npr., liofilizacijom ili sušenjem raspršivanjem, pre skladištenja. Osušena formulacija (tj. liofilizat) može da se koristi kao suvo jedinjenje, npr., kao aerosol ili prah, ili rekonstituisano u originalnu ili drugu koncentraciju, npr., koristeći vodu, pufer ili drugu odgovarajuću tečnost (razblaživač).

[0096] Postupak pročišćavanja vWF sredstva za vezivanje je dizajniran da omogući prenos vWF sredstva za vezivanje u formulaciju pogodnu za dugotrajno skladištenje, npr. kao smrznuta tečnost i/ili naknadno za sušenje smrzavanjem (npr., upotrebom formulacije citrata/saharoze). Formulacija se liofilizira sa proteinom, npr. vWF sredstvo za vezivanje u specifičnoj koncentraciji. Liofilizirana formulacija se zatim može rekonstituisati prema

2

potrebi sa pogodnim razblaživačem (npr., vodom) da bi se originalne formulacione komponente dovele do željene koncentracije, generalno iste ili više koncentracije u odnosu na koncentraciju pre liofilizacije. Liofilizirana formulacija može biti rekonstituisana da bi se dobila formulacija koja ima koncentraciju koja se razlikuje od originalne koncentracije (tj., pre liofilizacije), u zavisnosti od količine razblaživača dodatnog liofilizatu u odnosu na zapreminu tečnosti koja je prvobitno osušena zamrzavanjem. Pogodne formulacije se mogu identifikovati analizom jednog ili više parametara integriteta vWF sredstva za vezivanje. Ispitivani parametri su generalno procenat vrsta visokih molekularnih težina (HMV) ili procenat vrsta niske molekulske težine (LMV) pomoću HPLC sa isključivanjem veličine (SE-HPLC).

[0097] Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje formulacije karakterisane odgovarajućim stepenom čistoće i u pogodnim koncentracijama, kao što je potrebno, npr. za farmaceutske svrhe. Formulacije obezbeđuju polipeptide, npr. jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina ili polipeptidi koji sadrže najmanje jedan jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina kao što je ovde definisan u stabilnom obliku u velikom opsegu koncentracija i veliki opseg uslova čuvanja, npr. temperature, uključujući uslove naprezanja kao što su povišene temperature (npr. 25°C ili više), liofilizacija, protresanje ili drugi oblici fizičkog naprezanja.

[0098] Formulacija sadrži vodeni nosač. Vodeni nosač je naročito pufer.

[0099] Pronalazak, međutim, takođe obuhvata proizvode koji se mogu dobiti daljnjom obradom tečne formulacije, kao što je smrznuti, liofilizirani ili osušeni raspršivanjem proizvod. Nakon rekonstitucije, ovi čvrsti proizvodi mogu postati tečne formulacije kao što je ovde opisano (ali nisu ograničene samo na njih). U svom najširem smislu, termin "formulacija" obuhvata i tečne i čvrste formulacije. Međutim, čvrste formulacije se shvataju kao izvedive iz tečnih formulacija (npr. zamrzavanjem, sušenjem zamrzavanjem ili sušenjem raspršivanjem), te stoga imaju različite karakteristike koje su definisane karakteristikama koje su navedene za tečne formulacije ovde. Pronalazak ne isključuje rekonstituciju koja dovodi do sastava koji odstupa od originalnog sastava pre npr. sušenje zamrzavanjem ili raspršivanjem.

2

[0100] Formulacije iz opisa obuhvataju najmanje jedno vWF sredstvo za vezivanje, naročito jedinstvene varijabilne domene imunoglobulina ili polipeptid koji sadrži najmanje jedan jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina kako je ovde definisano. Posebno, formulacija sadrži jedan ili više polipeptida izabranih iz SEQ ID NOs: 1-19, poželjno SEQ ID NO:1. Polipeptidima mogu dodatno biti produženi polu-raspadi, npr. inkorporiranjem peptida koji vezuje serum-albumin ili vezujućeg domena, koji može biti bilo koji pogodan peptid koji vezuje serum-albumin ili vezujući domen sposoban da poveća polu-raspad konstrukta (u poređenju sa istim konstruktom bez peptida koji se vezuje za serum-albumin ili vezivanja domena), a naročito mogu biti peptidi koji vezuju serumski albumin kao što je opisano u WO2008/068280 od strane podnosioca (i posebno WO2009/127691 i WO2011/095545, i od strane podnosioca zahteva), ili serum-albumin vezujući jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina (kao što je serum-albumin vezujuće Nanotelo; na primer Alb-1 ili humanizovana verzija Alb-1, kao što je Alb-8, za koju se, na primer, upućuje

na WO06/122787). Alternativni načini za produženje polu-raspada koji su takođe obuhvaćeni ovim opisom uključuju npr. pegilaciju (PEG) kao što je široko poznato u struci, uključujući pegilaciju specifičnog mesta ili nasumičnu pegilaciju, poželjno pegilaciju specifičnog mesta. PEG se može koristiti sa molekulskom masom iznad 5000, npr. između 10.000 i 200.000, po mogućnosti u rasponu od 20.000 do 100.000. U bilo kom aspektu produženja poluživota, predviđeno je da aktivnost polipeptida kao što je ovde definisana nije ugrožena, npr. zadržava najmanje 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% aktivnosti istog polipeptida bez produženja poluraspada. Aktivnost se može odnositi na npr. vezivanje za ciljni antigen, i/ili potenciju u biološkom testu. Stručnjak će takođe utvrditi da je izabrana tehnologija produženja poluraspada pogodna po tome što ne povećava ili čak smanjuje imunogenost.

5.5.1 Pufer

[0101] Formulacija opisa sadrži pufer izabran od najmanje jednog citratnog ili fosfatnog pufera, poželjno citratnog pufera. U posebnom otelotvorenju, citratni pufer se dobija korišćenjem monohidrata limunske kiseline i tri-natrijum citrat dehidrata, npr.0.2154 g/L limunske kiseline monohidrata i 5.5805 g/L tri-natrijum citrat dehidrata. Kako je određeno merenjem temperature topljenja u neograničavajućem primeru, ovi puferi povećavaju stabilnost vWF sredstva za vezivanje, u poređenju sa drugim ispitivanim puferima.

[0102] Formulacija prema opisu sadrži citratni pufer u koncentraciji u opsegu od 5-200 mM, npr. 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ili 200 mM, poželjno 5-100 mM, poželjnije 7.5-80 mM, još poželjnije 10-50, npr.

10, 15, 20, 25 ili 30 mM, i najpoželjnije 20 mM, pri čemu se svaka vrednost podrazumeva da opciono obuhvata opseg ±5 mM. Formulacija prema opisu može sadržati fosfatni pufer u koncentraciji u opsegu od 5-200 mM, npr.5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ili 200 mM, poželjno 5-80 mM, poželjnije 7.5-60 mM, još poželjnije 10-40, npr.10, 15, 20, 25 ili 30 mM, i najpoželjnije 20 mM, pri čemu se svaka vrednost podrazumeva da opciono obuhvata opseg ±5 mM. Podrazumeva se da niža koncentracija pufera ima efekat na konačni osmolalitet, a odgovarajuće na dodatne rastvorne materije koje se mogu dodati.

[0103] PH formulacije ovog pronalaska je u opsegu od 5.0 do 7.5, pri čemu se svaka vrednost podrazumeva da obuhvata opseg od ±0.2. Specifični primeri poželjnih pH vrednosti za formulacije iz opisa mogu biti izabrani iz neograničavajuće liste koja sadrži pH od 5.0, 5.5, 5.8, 6.0, 6.2, 6.5, 6.7, 7.0, 7.1, 7.2 ili 7.5, poželjno 6.0 do 7.0, poželjnije 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8 ili 6.9, npr.6.5, pri čemu se svaka vrednost podrazumeva da opciono obuhvata opseg od ±0.2.

[0104] Neočekivano, citratni i fosfatni puferi imaju preklapajuće raspone pH sa npr. histidina i Tris-HCI pufera, a ipak favorizuju stabilnost.

[0105] Najpovoljniji pH će zavisiti od pufera koji se nalazi u formulaciji. Prema tome, obelodanjivanje se posebno odnosi na formulaciju koja sadrži fosfatni pufer, koji poželjno ima pH u opsegu od 6.5 do 7.5, poželjno 6.9, 7.0, 7.1, npr.7.1.

[0106] Pokazano je da je formulacija koja sadrži citratni pufer veoma pogodna za skladištenje i upotrebu. Međutim, za razliku od konvencionalnog shvatanja, tečne formulacije koje sadrže citratni pufer bile su najstabilnije sa pH od oko 6.0, dok su liofilizovane formulacije koje sadrže citratni pufer bile najstabilnije sa pH od oko 6.5. Prema tome, predmetno obelodanjivanje se odnosi na formulaciju koja sadrži citratni pufer, koji poželjno ima pH između 6.0 i 7.0, poželjnije 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8 ili 6.9, npr.6.5, gde se podrazumeva da svaka vrednost opciono obuhvata opseg od ± 0.2.

5.5.2 Koncentracija

[0107] Formulacije iz obelodanjivanja sadrže vWF sredstva za vezivanje kao što je ovde definisano, naročito jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina ili polipeptidi koji sadrže najmanje jedan jedinstveni varijabilni domen imunoglobulina u koncentraciji koja uključuje

1

koncentracije koje se koriste u osnovnim rastvorima za razblaživanje pre upotrebe na pacijentu. Pored poboljšane stabilizacije, formulacije iz opisa omogućavaju veće koncentracije vWF sredstva za vezivanje, npr. ISVD ili polipeptidi. Posebno, formulacije iz obelodanjivanja su ostale fizički stabilne, tj. odsustvo zamućenosti i/ili stvaranja malih čestica, što je potvrđeno vizuelnom inspekcijom, mikroskopijom, SE-HPLC i DLS. Čuvanje na povišenim temperaturama za produženo vreme i ponovljeni ciklusi zamrzavanja i odmrzavanja očigledno nisu uticali na fizičku stabilnost vWF sredstva za vezivanje u ovim formulacijama.

[0108] Tipične koncentracije aktivnog sredstva, npr. vWF sredstva za vezivanje ili polipeptida iz obelodanjivanja, u formulacijama iz obelodanjivanja sadrže neograničavajuće primere koncentracija u opsegu od 0.1 do 80 mg/mL, poželjno 1-70 mg/mL, 5-60 mg/mL, 7.5- 50 mg/mL, ili 10-40 mg/mL, kao što su 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili 60 mg/mL, poželjno 12.5 mg/ml ili 10 mg/mL, gde se svaka vrednost podrazumeva da opciono obuhvata opseg od ±20% (npr. vrednost od 10 opciono obuhvata opseg od 8 do 12 mg/mL).

5.5.3 Ekscipijensi

[0109] Formulacije prema pronalasku mogu takođe opciono sadržati jedan ili više ekscipijenasa. Termin "ekscipijens", kako se ovde koristi, odnosi se na inertnu supstancu koja se obično koristi kao razblaživač, nosač, konzervans, lioprotektant, vezivo ili sredstvo za stabilizaciju jedinjenja koja daju formulaciju korisnu fizičku osobinu. Stručnjak je upoznat sa ekscipijensima pogodnim za farmaceutske svrhe, koji mogu imati posebne funkcije u formulaciji, kao što su lioprotekcija, stabilizacija, konzervacija, itd. uobičajeno upotrebljeni stabilizatori i konzervansi su dobro poznati stručnjaku (videti npr. WO2010/077422).

Farmaceutski prihvatljivi nosači koji se mogu koristiti u ovim sastavima uključuju, ali nisu ograničeni na, jonske izmenjivače, aluminijum oksid, aluminijum stearat, lecitin, serumske proteine, kao što je humani serumski albumin, puferne supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, delimične smeše glicerida zasićenih biljnih masnih kiselina, vode, soli ili elektrolita, kao što su protamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, soli cinka, koloidni silicijum dioksid, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze, polietilen glikol, natrijum karboksimetilceluloza, poliakrilati, voskovi, polietilen polioksipropilen blok polimeri, polietilen glikol i masti od vune. U povoljnim aspektima obelodanjivanja, ekscipijens može

2

biti jedan ili više odabranih iz liste koja se sastoji od NaCl, trehaloze, saharoze, manitola ili glicina.

[0110] U proceni obelodanjivanja, stručnjak može lako da odredi pogodne koncentracije ekscipijenasa koje treba dodati formulacijama. U primerima otelotvorenja, NaCl ima koncentraciju u opsegu od 10-500 mM, kao što su 25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 250 ili 500 mM, poželjno 50-150 mM, npr.75 ili 140 mM, pri čemu se svaka vrednost podrazumeva da opciono obuhvata opseg od ±5 mM; i/ili manitol ima koncentraciju od 1-10%, poželjno 2-4%, npr.2, 3 ili 4% (w/w), pri čemu se svaka vrednost podrazumeva da obuhvata opciju od ±0.5%; i/ili saharoza ima koncentraciju od 1-15%, poželjno 2-12% ili 4-10%, npr.4, 5, 6, 7, 8 ili 9% (w/w), i najpoželjnije 7%, pri čemu se svaka vrednost podrazumeva da obuhvata opciju od ±0.5%; i/ili glicin ima koncentraciju u opsegu od 10-500 mM, kao što su 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 100, 150, 250 ili 500 mM, poželjno 50-400 mM, 75-300 mM, 100-250 mM, npr 140 ili 200 mM, pri čemu se svaka vrednost podrazumeva da opciono obuhvata opseg od ±5 mM; i/ili trehaloza ima koncentraciju u opsegu od 10-500 mM, kao što su 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 100, 150, 250 ili 500 mM, poželjno 100-300 mM, 150-280 mM, npr 160 mM ili 260 mM, pri čemu se podrazumeva da svaka vrednost opciono obuhvata opseg od ±5 mM.

[0111] U poželjnom otelotvorenju, formulacije prema bilo kom aspektu obelodanjivanja su izotonične u odnosu na ljudsku krv. Izotonični rastvori imaju isti osmotski pritisak kao krvna plazma, pa se mogu intravenski infundirati u ispitanika bez promene osmotskog pritiska krvne plazme ispitanika. Toničnost može biti izražena u smislu osmolalnosti, koja može biti teoretski osmolalnost ili poželjno eksperimentalno određena osmolalnost. Tipično, osmolalnost će biti u opsegu od 290 ± 60 mOsm/kg, poželjno 290 ± 20 mOsm/kg.

[0112] Tako, u selekciji ekscipijenasa (ako ih ima), stručnjak će uzeti u obzir koncentraciju pufera i koncentracije jednog ili više ekscipijenasa i poželjno doći do formulacije sa osmolalnošću u opsezima kao što je iznad navedeno. Stručnjak je upoznat sa proračunima za procenu osmolalnosti (videti npr. WO2010/077422). Ukoliko je potrebno, stručnjak može dodatno uključiti jedinjenje za podešavanje osmolalnosti formulacije. Primeri jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na gore pomenute ekscipijense, i/ili jedan ili više sorbitola, metionina, dekstroze, inozitola, arginina ili arginin hidrohlorida.

[0113] Pokazano je da je formulacija koja sadrži saharozu naročito pogodna za održavanje fizičke stabilnosti, tokom npr. skladištenje i zamrzavanje-odmrzavanje polipeptida. Shodno tome, predmetno obelodanjivanje se odnosi na formulacije koje sadrže oko 5-9%, poželjnije 6-8% i još poželjnije 7% saharoze, pri čemu se svaka vrednost podrazumeva da opciono obuhvata opseg od ±0.5%.

[0114] Formulacije iz obelodanjivanja mogu takođe sadržati jedinjenja koja su specifično korisna za zaštitu polipeptida iz obelodanjivanja tokom sušenja smrzavanjem. Takva jedinjenja su takođe poznata kao lioprotektanti i dobro su poznata stručnjaku. Specifični primeri uključuju, ali nisu ograničeni na šećere kao što su saharoza, sorbitol ili trehaloza; aminokiseline kao što je glutamat, posebno mononatrijum glutamat ili histidin; betain, magnezijum sulfat, šećerni alkoholi, propilen glikol, polietilen glikoli i njihove kombinacije. Shvativši obelodanjivanje, potrebna količina takvog jedinjenja koje treba dodati može lako da se odredi od strane stručnjaka u ovoj oblasti uzimajući u obzir stabilnost formulacije u tečnom obliku i kada se podvrgne liofilizaciji. Formulacije koje su naročito pogodne za sušenje smrzavanjem mogu nadalje da sadrže sredstva za punjenje. Pogodna sredstva su široko poznata stručnjaku. Pokazano je da formulacija koja sadrži saharozu nije samo posebno pogodna za održavanje fizičke stabilnosti, tokom npr. skladištenje i zamrzavanjeodmrzavanje vWF sredstava za vezivanje, ali i kao lioprotektant.

5.5.4 Deterdženti

[0115] U daljem aspektu obelodanjivanja, formulacija prema bilo kom aspektu obelodanjivanja može dalje sadržati deterdžent ili surfaktant. Pogodni deterdženti ili surfaktanti za upotrebu sa ovim pronalaskom uključuju, ali nisu ograničeni na estere polioksietilen sorbitan masnih kiselina, npr. polisorbat -20, -40, -60, -65, -80 ili -85 Uobičajeni nazivi brendova za polisorbate uključuju Alkest, Canarcel i Tween. Stručnjak zna dalje neograničavajuće primere deterdženata, kao što su oni navedeni npr. WO2010/077422. U poželjnom aspektu obelodanjivanja, deterdžent je nejonski deterdžent. Specifičnije, deterdžent je polisorbat-80, koji je takođe označen kao Tween-80 u daljem tekstu. Stručnjak može lako odrediti pogodnu koncentraciju deterdženta za formulaciju opisa. Tipično, koncentracija će biti što je moguće niža, uz održavanje korisnih efekata deterdženata, npr. stabilizirajući efekat pod uslovima naprezanja pri smicanju, npr. mešanje, što smanjuje agregaciju formulisanih vWF sredstava za vezivanje. U oglednim, neograničavajućim aspektima obelodanjivanja, koncentracija deterdženata može biti u opsegu od 0.001 do 0.5%, npr. 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%,

4

0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3% 0.4% ili 0.5%, poželjno u koncentraciji između 0.01 i 0.05%, poželjnije između 0.01 i 0.02%, npr.0.01% (v/v).

5.5.5 Kombinacije

[0116] Različita otelotvorenja kao što je iznad opisano u odeljcima 5.5.1 do 5.5.4 mogu se kombinovati u formulacijama opisa bez ograničenja. Na primer, rasponi vrednosti koji koriste kombinaciju bilo koje od iznad navedenih vrednosti kao gornje i/ili donje granice treba da budu uključeni. Međutim, poželjni neograničavajući primeri formulacija iz obelodanjivanja uključuju formulacije gde je pufer citratni pufer na oko pH 6.5, poželjno u koncentraciji od 20 mM, i formulacija dalje sadrži saharozu, poželjno u koncentraciji od oko 7% (w/v), i opciono dalje sadrži ne-jonski deterdžent kao što je Tveen-80, poželjno u koncentraciji od 0.01% (v/v).

5.6 Dalja obrada

[0117] Kao što je naglašeno, bilo koja od iznad navedenih formulacija može se dalje obrađivati npr. liofilizacijom, sušenjem raspršivanjem ili zamrzavanjem, npr. zapreminskim zamrzavanjem. Dobijeni prerađeni proizvod ima karakteristike izvedene iz tečne početne formulacije, kao što je iznad definisano. Kada je potrebno, dodatna sredstva mogu biti uključena za dalju obradu, kao što su, na primer, lioprotektanti, itd.

5.6.1 Zamrzavanje

[0118] U nekim slučajevima, formulacije koje sadrže vWF sredstva za vezivanje su zamrznute za skladištenje. Prema tome, poželjno je da formulacija bude relativno stabilna u takvim uslovima, kao što su ciklusi zamrzavanja i odmrzavanja (FT). Jedan postupak za određivanje pogodnosti formulacije je da se formulacija uzorka podvrgava najmanje dva, npr. tTri, četiri, pet, osam, deset ili više ciklusa zamrzavanja (na primer, na -20°C ili -70°C) i odmrzavanje (na primer brzim topljenjem u vodenom kupatilu od 25°C ili sporim odmrzavanjem na temperaturi od 2°C do 8°C), određivanje masenog oporavka originalnog proizvoda i prisustva i/ili količine LMW vrsta i/ili HMW vrste koje se akumuliraju nakon FT ciklusa i porede ga sa količinom LMW vrsta ili HMW vrsta prisutnih u uzorku pre FT procedure, npr. pomoću SE-HPLC. Povećanje LMW ili HMW vrsta ukazuje na smanjenu stabilnost.

5.6.2 Liofilizacija

[0119] Formulacije mogu biti skladištene nakon liofilizacije. Prema tome, ispitivanje formulacije za stabilnost polipeptidne komponente formulacije nakon liofilizacije je korisno za određivanje prikladnosti formulacije. Postupak je sličan onom iznad opisanom, za zamrzavanje, osim što je formulacija uzorka liofilizovana umesto zamrznuta, rekonstituisana do originalne zapremine i ispitivana na prisustvo LMW vrsta i/ili HMW vrsta. Formulacija liofilizovanog uzorka se upoređuje sa odgovarajućom formulacijom uzorka koja nije liofilizovana. Povećanje LMW ili HMW vrsta u liofiliziranom uzorku u odnosu na odgovarajući uzorak ukazuje na smanjenu stabilnost u liofiliziranom uzorku. Uopšteno, protokol liofilizacije uključuje punjenje uzorka u liofilizator ili sušilo za zamrzavanje, period pred-hlađenja, zamrzavanje, iniciranje vakuuma, pojačavanje temperature primarnog sušenja, primarno sušenje, pojačavanje temperature sekundarnog sušenja, sekundarno sušenje i zaustavljanje uzorka. Iako je proces sušenja zamrzavanjem dobro poznat u tehnici, različiti faktori određuju karakteristike sušenja zamrzavanjem uzorka, uključujući: temperatura staklastog prelaza (Tg') i temperatura kolapsa (Tc). Dodatni parametri koji se mogu izabrati za protokol liofilizacije uključuju vakuum (npr., u mikronama) i temperaturu kondenzatora.

[0120] Odgovarajuće stope povišenja temperature su između oko 0.1°C/min. do 2°C/min., na primer 0.1°C/min. do 1.0°C/min., 0.1°C/min. do 0.5°C/min., 0.2°C/min. do 0.5°C/min., 0.1°C/min., 0.2°C/min., 0.3°C/min., 0.4°C/min., 0.5°C/min., 0.6°C/min., 0.7°C/min., 0.8°C/min., 0.9°C/min. i 1.0°C/min. Prikladne temperature na polici tokom zamrzavanja za ciklus liofilizacije su uglavnom od oko -55°C do -5°C, -25°C do -5°C, -20°C do -5°C, -15°C do -5°C, -10 C do -5°C, -10°C, -11°C, -12°C, -13°C, -14°C, -15°C, -16°C, -17°C, -18°C, -19°C, -20°C, -21°C, -22°C, -23°C, -24°C ili -25°C. Temperatura na polici može biti različita za primarno sušenje i sekundarno sušenje, na primer, primarno sušenje se može izvesti na nižoj temperaturi od sekundarnog sušenja. U neograničavajućem primeru, primarno sušenje se može izvesti na 0°C ili alternativno na 5°C i sekundarno sušenje na 25°C. U nekim slučajevima, protokol za žarenje se koristi tokom zamrzavanja i pre iniciranja vakuuma. U takvim slučajevima mora se odabrati vreme žarenja i temperatura je generalno iznad temperature staklastog prelaza sastava. Generalno, vreme žarenja je oko 2 do 20 sati, oko 3 do 19 sati, oko 2 do 10 sati, oko 3 do 5 sati, oko 3 do 4 sata, oko 2 sata, oko 3 sata, oko 5 sati, oko 8 sati, oko 10 sati, oko 12 sati, oko 15 sati ili oko 19 sati.

[0121] Temperatura za žarenje je generalno od oko -35°C do oko -5°C, na primer od oko -25°C do oko -8°C, oko -20°C do oko -10°C, oko -25°C, oko -20°C, oko -15°C, oko 0°C, ili oko -5°C. U nekim slučajevima, temperatura žarenja je generalno od -35°C do 5°C, na primer od -25°C to -8°C, -20°C do -10°C, -25°C, -20°C, -15°C, 0°C, 5°C.

[0122] Stabilnost ovde opisanih formulacija može se testirati korišćenjem različitih parametara liofilizacije uključujući: primarna polica za sušenje temperature od -25°C do 30°C, a sekundarno sušenje od 2 sata do 33 sata na 0° do 30°C. Temperatura za sekundarno sušenje treba da bude što je više moguće, bez izazivanja degradacije aktivnog farmaceutskog sastojka.

[0123] Ekscipijens koji će se koristiti u formulaciji iz ovog pronalaska treba poželjno da zadovolji jedan ili više sledećih parametara: biti farmakološki inertan; biti kompatibilni sa zahtevima obrade; pacijent ga mora dobro podnositi; da ne oštećuje aktivni materijal; obezbedi rastvorljiv, apsorbujući proizvod; obezbedi proizvod stabilan na polici; i obezbedi komercijalno prihvatljiv proizvod.

[0124] U jednom otelotvorenju, formulacija predmetnog pronalaska se dobija liofilizacijom, na primer kao što je prikazano na Slici 1 ili Tabeli 14.

[0125] Pokazano je da liofilizacija formulacija na bazi citrata/saharoze značajno poboljšava stabilnost vWF sredstava za vezivanje. Konkretno, formulacije na bazi citrata/saharoze suštinski sprečavaju hemijske modifikacije koje se javljaju u tečnom obliku, ali sa izuzetkom malih količina piroglutamatne formacije. Neočekivano, snižavanje koncentracije citrata i istovremeno povećanje koncentracije saharoze poboljšalo je hemijsku stabilnost, npr. smanjena formacija piroglutamata. Pokazano je da je vWF sredstvo za vezivanje robusno nakon liofilizacije do ekstremnih temperatura proizvoda. Zaista, profil stabilnosti je bio identičan za materijal koji je pripremljen korišćenjem različitih ciklusa sušenja zamrzavanjem.

[0126] Uopšteno, ciklus liofilizacije može trajati od 10 sati do 100 sati, npr.20 sati do 80 sati, 30 sati do 70 sati, 40 sati do 60 sati, 45 sati do 50 sati, 50 sati do 66 sati.

[0127] U neograničavajućem primeru, formulacija od 20 mM citrata, 7% saharoze, 0.01% Tween-80, pH 6.5, u koncentraciji proteina od 12.5 mg/mL vWF sredstva za vezivanje formulisana je u rasutom stanju i liofilizovana.

[0128] Neograničavajući primeri temperaturnog opsega za čuvanje formulacije prema pronalasku su oko -20°C do oko 50°C, npr., Oko -15°C do oko 40°C, oko -15 °C do oko +30°C, oko -15°C do oko 20°C, oko 5°C do oko 25°C, oko 5 °C do oko 20°C, oko 5°C do oko 15°C, oko 2°C do oko 12°C, oko 2°C do oko 10°C, oko 2°C do oko 8°C, oko 2°C do oko 6°C, ili oko 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 10°C, 15°C, 25°C, 30°C ili 40°C. Bez obzira na temperature skladištenja, u određenim slučajevima, uzorci su stabilni pod temperaturnim promenama koje mogu prolazno da se dešavaju tokom uslova skladištenja i transporta koji se mogu predvideti za takve sastave.

[0129] Utvrđeno je da se radom sa formulacijama iz pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima, može dobiti dobijeni osušeni prah koji ima veličinu čestica pogodnu za udobno zadržavanje i brzo rastvaranje aktivnog materijala. Osušena formulacija prema pronalasku sadrži čestice koje ostaju stabilne i ravnomerne tokom obrade, finalne dorade, skladištenja i raspodele. Formulacija je stabilna na polici i slobodno teče, ne predstavlja nikakav problem kada se raspodeli u svoj konačni kontejner i jednostavno je primeniti od strane pacijenta.

5.6.3 Sušenja raspršivanjem

[0130] U nekim slučajevima, formulacije je osušena raspršivanjem i zatim skladištena.

Sušenje raspršivanjem se izvodi upotrebom postupaka poznatih u struci, i može se modifikovati tako da se koristi tečno ili smrznuto sušenje raspršivanjem (npr., upotrebom postupaka kao što su oni iz Niro Inc. (Madison, WI), Upperton Particle Technologies (Nottingham, England), ili patentne objave SAD. br.2003/0072718 i 2003/0082276), ili Buchi (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY).

5.6.4 Razblaživač

[0131] Liofilizovane formulacije, kao što je ovde opisano, mogu se rekonstituisati prema potrebi mešanjem liofilizovanog oblika sa pogodnim razblaživačem da bi se originalne formulacione komponente ponovo rastvorile do željene koncentracije. Termin "razblaživač", kako se ovde koristi, odnosi se na farmaceutski prihvatljiv (bezbedan i netoksičan za davanje humanom) rastvaraču za promenu ili postizanje odgovarajuće koncentracije kao što je ovde opisano. Primeri razređivača uključuju, ali nisu ograničeni na, sterilnu vodu (npr. WFI, Milli-Q voda), fiziološki rastvor, glukozu, dekstrozu, Ringerov i vodene puferske rastvore.

5.7 Farmaceutski sastavi

[0132] Formulacije predmetnog pronalaska su pogodno pogodne za upotrebu u postupcima terapije životinjskog ili ljudskog tela. Prema tome, pronalazak se odnosi na farmaceutske ili dijagnostičke sastave koji sadrže formulaciju polipeptida prema bilo kom aspektu pronalaska ili koji se mogu dobiti bilo kojim postupkom ili procesom iz ovog pronalaska.

[0133] Formulacije pronalaska su poželjno farmaceutske formulacije. Posebno, formulacije su pogodne za parenteralno davanje ljudima, npr. subkutano, intravenozno, intramuskularno, intradermalno ili intraperitonealno, poželjno intravensko ili subkutano davanje. Primena obuhvata bilo koji način primene tečne formulacije, posebno injekcije. Drugi oblici sistemske primene, npr. preko implantabilnih uređaja, pumpe za mikroinfuziju (opciono implantabilne), i/ili (implantabilne) formulacije sa produženim oslobađanjem, npr. naslage, gelovi, biorazgradive polimerne formulacije su takođe u okviru ovog pronalaska. Farmaceutski sastavi su sterilni i stabilni tokom proizvodnje i skladištenja, jer su derivati/proizvodi razgradnje vWF sredstava za vezivanje nepoželjni u kliničkom okruženju. Sastav će takođe biti visoke čistoće, npr. isključiti prisustvo bakterijskih proizvoda kao što je LPS. Formulacije se mogu sterilisati bilo kojim pogodnim sredstvom, npr. sterilna filtracija, zračenje i njihove kombinacije, itd. poželjno je da su farmaceutske kompozicije prilagođene parenteralnoj (posebno intravenskoj, intra-arterijskoj ili transdermalnoj) primeni. Smatra se da je intravenska primena od posebne važnosti. Poželjno je da je vWF sredstvo za vezivanje u obliku parenteralne forme, najpoželjnije intravenske i subkutane forme.

[0134] Da bi bila pogodna kao farmaceutska formulacija, formulacija pronalaska će tipično sadržati polipeptid iz obelodanjivanja (tj. aktivno sredstvo) u pogodnom odnosu prema zapremini. Na primer, za subkutanu injekciju koncentracija aktivnog sredstva može biti veća, da bi se omogućila primena potrebne farmaceutske doze u manjoj zapremini, u poređenju sa formulacijom za intravensku injekciju. Međutim, u nekim otelotvorenjima koncentracija aktivnog sredstva će biti identična za subkutanu ili intravensku injekciju, i može biti u primerima koji su ovde definisani.

[0135] U nekim otelotvorenjima, formulacije prema pronalasku mogu da sadrže dodatna sredstva, npr. dodatna aktivna sredstva, ekscipijensi, stabilizatori, konzervansi kao što su antimikrobna sredstva, itd.

[0136] Formulacije pronalaska su poželjno u dozi koja se primenjuje na pacijenta kome je to potrebno. Ipak, određeni način primene i doziranje mogu biti izabrani od strane lekara, uzimajući u obzir pojedinosti pacijenta, naročito starost, težinu, životni stil, nivo aktivnosti i opšte zdravstveno stanje. Specifičnije, ALX-0081 se primenjuje intravenski ili subkutano u intervalu doze od 24 h. Još poželjnije, ALX-0081 se daje intravenozno ili subkutano u 24časovnom intervalu doze nakon razmatranja aktivnosti agregacije, npr. mereno pomoću RIPA, agregacija trombocita indukovana ristocetinom - (Favaloro EJ. Clin Haematol 2001; 14: 299-319) i/ili Ristocetin Cofactor Platelet Agglutination Assay - (Howard MA, Firkin BG. Ristocetin - novo sredstvo u istraživanju agregacije trombocita. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica 1971; 26: 362-9). Na primer, ne primenjuje se dodatna doza ako se procenjuje da aktivnost agregacije ostaje ispod 10% mereno pomoću RIPA ili da ostane ispod 20% mereno sa RICO tokom sledećih 6 sati (Klinički relevantna inhibicija).

[0137] Međutim, generalno, doza vWF sredstva za vezivanje može zavisiti od različitih faktora, kao što su efektivnost i trajanje dejstva aktivnog sastojka, toplokrvne vrste i/ili pola, starosti, težine i individualnog stanja toplokrvne životinje.

[0138] Normalno doza je takva da se pojedinačna doza vWF sredstva za vezivanje, na primer, procenjuje na osnovu in vitro rezultata, ili na primer, na osnovu rezultata studije o povećanju doze da bi se testirala subhronična toksičnost kod cinomolgus majmuna. Na osnovu takvog predkliničkog skupa podataka, može se odrediti početna i sledeća doza za vWF sredstvo za vezivanje. Na primer, doza može biti od 0.5 - 50 mg, naročito 1-30 mg i primenjuje se na toplokrvnu životinju težine približno 75 (+/- 30) kg (ali može biti različita i prema ovoj normi). Ako se želi, ova doza se takođe može uzeti u nekoliko, opciono jednakih, delimičnih doza ("mg" označava mg lek na svakog sisara - uključujući i čoveka - da se tretira).

[0139] Iznad navedena doza - ili primenjena kao pojedinačna doza (koja je jedna realizacija) ili u nekoliko delimičnih doza - može se ponoviti, kao što je iznad pomenuto, na primer, jednom svakih šest sati, jednom svakih 12 sati ili jednom dnevno. Drugim rečima, farmaceutski sastavi se mogu primenjivati u režimima koji se kreću od kontinuirane 6-časovne terapije do terapije sa dužim intervalom doziranja.

[0140] Poželjno, vWF vezivna sredstva se daju u dozama koje su u istom redu veličine kao one koje se koriste u dopunskom lečenju kod pacijenata kojima je potrebna PCI, kao što je ovde predloženo za ALX-0081. Na primer, za poželjne 12V02H1 koja sadrže vWF sredstva za vezivanje, npr. ALX-0081 i njegove funkcionalne varijante, doze vWF sredstva za vezivanje u opsegu od oko 0.5 do oko 40 mg, poželjno od oko 1 do oko 35 mg, ili od oko 2 do oko 30 mg, još poželjnije od oko 3 do oko 25 mg. mg ili od oko 4 do oko 20 mg, ili od oko 5 do oko 17.5 mg, ili čak od oko 6 do oko 16 mg, ili od oko 7.5 do oko 15 mg, ili čak od

4

oko 10 do oko 14 mg, poželjnije oko 10, oko 12.5 ili oko 13.8 mg, može se koristiti za akutno lečenje kod ljudi.

[0141] Formulacije u obliku jedinične doze sadrže poželjno od oko 0.5 do oko 40 mg, poželjno od oko 1 do oko 35 mg, ili od oko 2 do oko 30 mg, još poželjnije od oko 3 do oko 25 mg ili od oko 4 do oko 20 mg, ili od oko 5 do oko 17.5 mg, ili čak od oko 6 do oko 16 mg, ili od oko 7.5 do oko 15 mg, ili čak od oko 10 do oko 14 mg, poželjnije oko 10, oko 12.5 ili oko 13.8 mg i formulacije koje nisu u obliku jedinične doze sadrže poželjno od oko 0.5 do oko 40 mg, poželjno od oko 1 do oko 35 mg, ili od oko 2 do oko 30 mg, još poželjnije od oko 3 do oko 25 mg ili od oko 4 do oko 20 mg, ili od oko 5 do oko 17.5 mg, ili čak od oko 6 do oko 16 mg, ili od oko 7.5 do oko 15 mg, ili čak od oko 10 do oko 14 mg, poželjnije oko 10, oko 12.5 ili oko 13.8 mg aktivnog sastojka.

[0142] Farmaceutski preparati za parenteralno davanje su, na primer, oni u jediničnim oblicima doziranja, kao što su ampule. Oni se pripremaju na način koji je poznat sam po sebi, na primer pomoću konvencionalnih postupaka mešanja, rastvaranja ili liofilizacije.

[0143] Parenteralne formulacije su naročito injekcione tečnosti koje su efikasne na različite načine, kao što je na mestu PCI, intra-arterijalno, intramuskularno, intraperitonealno, intranazalno, intradermalno, subkutano ili poželjno intravenozno. Takve tečnosti su poželjno izotonične vodene otopine ili suspenzije koje se mogu pripremiti pre upotrebe, na primer od liofilizovanih preparata ili koncentrata koji sadrže aktivni sastojak sam ili zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Farmaceutski preparati mogu da se sterilizuju i/ili sadrže dodatke, na primer konzervanse, stabilizatore, sredstva za vlaženje i/ili emulgatore, rastvarače, soli za regulaciju osmotskog pritiska i/ili pufere.

[0144] Pogodne formulacije za transdermalnu aplikaciju uključuju efikasnu količinu aktivnog sastojka sa nosačem. Povoljni nosači uključuju apsorbujuće farmakološki prihvatljive rastvarače koji pomažu prolazak kroz kožu domaćina. Karakteristično, transdermalni uređaji su u obliku zavoja koji sadrže potporni član, rezervoar koji sadrži jedinjenje opciono sa nosačima, opciono barijeru koja kontroliše brzinu za isporuku aktivnog sastojka u kožu domaćina na kontrolisano i prethodno određeno tokom dužeg vremenskog perioda, i sredstva za obezbeđivanje uređaja za kožu.

[0145] Sledeća tabela daje neke neograničavajuće primere formulacija baziranih na citratnom i fosfatnom puferu iz predmetnog obelodanjivanja. Sve formulacije se mogu podesiti na osmolalnost od 290 ± 60 mOsm/kg dodavanjem pogodnog ekscipijensa, ako se želi.

Formulacije mogu sadržati bilo koji jedan ili više polipeptida iz predmetnog obelodanjivanja, npr. SEQ ID NOs: 1-19, posebno SEQ ID NO:1.

[0146] Podrazumeva se da koncentracije pufera u ovoj tabeli opciono obuhvataju ±5 mM. Podrazumeva se da pH vrednosti opciono obuhvataju ±0.2. Svaki od iznad navedenih pufera može se kombinovati sa jednim ili više ekscipijenasa izabranih iz npr. NaCl u koncentraciji od npr.25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 250 ili 500 mM; manitol u koncentraciji od npr.2, 3 ili 4 % (w/v); glicin u koncentraciji od npr.25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 250 ili 500 mM; trehaloza u koncentraciji od npr.25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 250 ili 500 mM i saharoza u koncentraciji od npr.4, 5, 6, 7, 8 ili 9% (w/v), i/ili surfaktant, npr. Tween-80 u koncentraciji od 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.01%, 0.015%, 0.02%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% ili 0.5% (v/v).

5.8 Efekti pronalaska

[0147] Pronalazak obezbeđuje stabilne formulacije vWF sredstava za vezivanje, npr. jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina kao što je ovde definisano, npr. SEQ ID NOs: 1-19, posebno sadrži SEQ ID NO:1. "Stabilan" generalno znači da jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina ne trpe značajne fizičke ili hemijske promene tokom skladištenja tokom dužeg vremenskog perioda, npr.1 mesec do 36 meseci, čak i ako su izloženi jednom ili više hemijskih ili fizičkih naprezanja kao što su povišene temperature (jednake ili veće od 25°C), ili fizičko naprezanje kao što je protresanje ili mešanje. Posebno, "stabilan" znači da nakon skladištenja na duže periode (kao što je definisano) pod uslovima (kao što je definisano) postoji samo ograničena formacija (kao što je definisano) jednog ili više produkata razgradnje, npr. derivati niske molekulske mase (LMW) (fragmenti) polipeptida iz obelodanjivanja; i/ili hemijskih derivata ili modifikacija kao što su npr. varijante piroglutamata; i/ili derivati velike molekulske mase (HMW) (oligomeri ili polimeri) formirani npr. agregacijom.

[0148] Stručnjak je dobro upoznat sa tehnikama za procenu veličine proteina, npr. ekskluziona hromatografija-HPLC ili za procenu formiranja hemijskih derivata, npr. HPLC reverzne faze. Stručnjak je takođe upoznat sa uobičajenim uređajima i softverskim alatima za izvođenje takvih analiza. Na primer, stručnjak zna poznati softver za analizu hromatografskih ciklusa, npr. u odnosu na relativnu površinu vrha. Primeri uključuju (ali nisu ograničeni na) Agilent 1200 HPLC sistem opremljen ChemStation softverom (Agilent Technologies, Palo Alto, SAD, Rev B) ili Dionex Ultimate 3000 HPLC sistem opremljen sa Chromeleon softverom (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA, V6.8).

[0149] Opšte tehnike koje se mogu koristiti za procenu stabilnosti proteina, npr. jedinstvenog varijabilnog domena imunoglobulina uključuje statičko rasipanje svetlosti, tangencijalna filtracija protoka, Furijeova transformaciona infracrvena spektroskopija, cirkularni dikroizam, razvijanje proteina indukovanog ureom, intrinzična fluorescencija triptofana vezivanje i/ili 1-anilin-8-naftalensulfonske kiseline. Pored toga, formulacija pronalaska pokazuje mali ili nikakav gubitak potencije/biološke aktivnosti tokom skladištenja i/ili pod uticajem jednog ili

4

više naprezanja kao što je ovde definisano. Biološka aktivnost i/ili potencija se može odrediti npr. kao što je opisano u WO2006/122825.

5.8.1 Termička stabilnost

[0150] Formulacije ovog pronalaska su karakterisane obezbeđivanjem visoke termičke stabilnosti vWF sredstva za vezivanje, npr. jedinstvenog varijabilnog domena imunoglobulina kao što je ovde opisano. Termička stabilnost se može proceniti npr. određivanjem temperature topljenja (Tm). Pogodne tehnike za određivanje temperature taline su poznate i uključuju npr. test termičkog pomaka (TSA), npr. kao što je ovde opisano.

Specifičnije, formulacije predmetnog pronalaska dovode do povećanja Tm za jedinstvene varijabilne domene imunoglobulina kako je određeno TSA u poređenju sa drugim formulacijama. Ovaj efekat je prikazan u Tabeli 1 eksperimentalnog odeljka.

[0151] Kao što se može ustanoviti iz eksperimentalne sekcije, visoka termička stabilnost, tj. visoka Tm može se uzeti kao indikacija stabilnosti skladištenja.

[0152] Prema ovom pronalasku, formulacije iz ovog pronalaska imaju pozitivan uticaj na Tm u širokom opsegu pH vrednosti, npr. između 6.0 i 7.0 za citratni pufer, i 6.5 do 7.5 za fosfatni pufer. Najpovoljniji efekat na Tm može se posmatrati za citratni pufer na pH 6-7, a posebno za pH 6.5±0.2 i fosfatni pufer na pH 6.5 do 7.5, naročito pH 7.1±0.2.

[0153] Dodavanje ekscipijenasa može da ima pozitivan ili negativan efekat na Tm (Tabela 1). Na primer, trehaloza može povećati Tm (u kontekstu određenog pufera) npr. između 150 mM i 300 mM. Takođe manitol ili saharoza su imali jasan pozitivan efekat na Tm. Ovi ekscipijensi mogu naći upotrebu u određenim varijantama pronalaska, npr. formulacije gde je sredstvo za punjenje ili lioprotektanti povoljno. Ovi primeri otelotvorenja ne isključuju upotrebu drugih poznatih lioprotektanata ili sredstava za povećanje mase, bilo sam ili u kombinaciji sa manitolom ili saharozom.

[0154] Kao što se vidi iz eksperimentalnog dela ovog opisa, Tm kao što je određeno sa TSA služi kao vredan indikator stabilnosti vWF sredstva za vezivanje, npr. jedinstvenog varijabilnog domena imunoglobulina iz obelodanjivanja.

5.8.2 Stabilnost u pogledu mehaničkog naprezanja

[0155] Formulacije prema pronalasku su karakterisane visokom stabilnošću što se tiče mehaničkog naprezanja, kao što je mešanje, protresanje ili napon smicanja. Mogući test za procenu stabilnosti pod mehaničkim naprezanjem je praćenje signala rasipanja 500 nm u spektrofluorometru ili putem UV spektrofotometrije, npr. na 340 nm. Povećanje raspršenja ili UV apsorpcije odražava formiranje agregata. Kada se formiraju agregati (HMW), povećanje tokom vremena sledi linearnu krivu za koju se može odrediti nagib (intenzitet raspršivanja/vreme ili jedinice apsorpcije). Poželjno, formulacije ovog pronalaska su karakterisane nagibom manjim od 0.0006, npr. manje od 0.0005, npr. između 0 i 0.0004 (uporediti Slike 4A i B).

[0156] Formulacije koje sadrže citratne pufere su naročito poželjne i imaju pozitivan efekat na rekuperaciju proteina nakon npr. kao što je iznad definisano. Na primer, oporavak mase je najmanje 90%, 95%, 98% ili 100%. Oporavak proteina je određen u poređenju sa ukupnim sadržajem proteina pre naprezanja uzorka, npr. mešanjem. Formulacije koje sadrže fosfatne pufere imaju za rezultat rekuperaciju od najmanje 75%, 80%, 85% ili čak više nakon mešanja, kao što je iznad definisano.

[0157] U primernoj, neograničavajućoj koncentraciji od 5 mg/mL, formulacije iz opisa samo formiraju reverzibilne agregate kao odgovor na mešanje u odsustvu Tween-a. Prema tome, formulacije iz obelodanjivanja sprečavaju stvaranje nepovratnih agregata pod mehaničkim naprezanjem. Prema tome, u daljem aspektu obelodanjivanja, formulacije iz opisa mogu da sadrže ne-jonski deterdžent kao što je definisano iznad, npr. Tween-80, npr. u koncentraciji kako je iznad definisana, npr. između 0.01% i 0.02% (v/v). Dodavanje deterdženta može dalje poboljšati fizičku stabilnost formulacije. Na primer, pri neograničavajućoj primernoj koncentraciji od 5 mg/mL, dodavanje deterdženta može sprečiti formiranje agregata (reverzibilno i ireverzibilno) kako je određeno npr. praćenjem raspršenog signala od 500 nm u spektrofluorometru ili UV spektrofotometrijom (340 nm) (Slike 4A i B).

[0158] Fizička stabilnost formulacija iz predmetnog pronalaska može se takođe pokazati pomoću SE-HPLC. Različite neograničavajuće formulacije jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina predmetnog pronalaska mogu da izdrže mehaničko naprezanje, npr. naprezanje pri mešanju, bez stvaranja oligomera (HMW) ili produkata razgradnje (LMW). Formulacije predmetnog pronalaska ostaju stabilne bez degradacije ili oligomerizacije, kao što je određeno npr. posle 1.5 sati mešanja pomoću SE-HPLC analize.

4

[0159] U bilo kojoj od formulacija nije detektovana oligomerizacija ili degradacija (npr. kako je određeno pomoću RP-HPLC (samo degradacija) ili SE-HPLC profila). Prema tome, prema poželjnom otelotvorenju pronalaska, formulacije sadrže citratni pufer i pokazuju oporavak od najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili čak oko 100%, na primer pod iznad opisanim uslovima, pri čemu se regeneracija određuje npr. RP-HPLC ili SE-HPLC u poređenju sa uzorkom koji nije naprezan. Povoljno, ekscipijens u kontekstu citratnog pufera je saharoza, a regeneracija kao što je iznad definisano je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili čak oko 100%.

5.8.3 Ispitivanje stabilnosti tečnih formulacija

5.8.3.1 Stabilnost skladištenja

[0160] Tečne formulacije pronalaska obezbeđuju dobru stabilnost kada se skladište, npr. na temperaturi od -70°C, -20°C, 5°C, 25°C ili 40°C, npr. za 1-36 meseci, kao što su 1, 1.5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ili 36 meseci. Najpovoljniji rezultati mogu se dobiti formulacijama na bazi citratnog pufera, kao što je prikazano u Tabeli 5.

[0161] Stručnjak će dalje prepoznati da skladištenje na 25°C, a naročito 40°C, predstavlja uslove naglašenog skladištenja. Očekuje se da takvi uslovi povećaju i ubrzaju bilo koji znak nestabilnosti, npr. hemijska ili fizička nestabilnost. Dakle, relativno kratko čuvanje na npr. 25 ili 40°C daje dobru indikaciju za dugotrajnu stabilnost skladištenja u blažim uslovima (npr. 5°C ili zamrznuta).

5.8.3.2 Stabilnost skladištenja u smislu obnavljanja proteina

[0162] Na primer, formulacije iz predmetnog pronalaska obezbeđuju rekuperaciju proteina od najmanje 95%, npr. najmanje 96, 97, 98, 99 ili čak oko 100% nakon skladištenja na temperaturi između -70°C i 40°C. Oporavak proteina može se odrediti bilo kojim poznatim načinom kvantifikovanja proteina, npr. RP-HPLC ili SE-HPLC, kao što je prikazano u Tabeli 5, u poređenju sa referentnim uzorkom koji se čuva na -70°C. Ovi rezultati se mogu posmatrati npr. nakon skladištenja na naznačenu temperaturu od 1 meseca, 1.5 meseca, 3 meseca, 6 meseci, 9 meseci, 12 meseci, 18 meseci, 24 meseca, 30 meseci ili čak 36 meseci.

5.8.3.3 Stabilnost skladištenja u smislu hemijskih derivata/proizvoda razgradnje [0163] Pored toga, formulacije predmetnog pronalaska minimiziraju proizvodnju hemijskih derivata, npr. varijante piroglutamata, manje od 5.0% u vršnoj veličini, kao što je određeno npr. RP-HPLC (uporediti Tabelu 5). U ovoj vrsti analize, površina datog vrha se upoređuje sa ukupnom površinom hromatograma i relativna površina se dodeljuje svakom maksimumu.

4

Stručnjak poznaje pogodna sredstva za analizu, npr. odgovarajući softver, za analizu hromatograma (specifični, neograničavajući primeri uključuju Agilent 1200 HPLC sistem opremljen ChemStation softverom (Agilent Technologies, Palo Alto, SAD, Rev B) ili Dionex Ultimate 3000 HPLC sistem opremljen sa Chromeleon softverom (Dionex Corporation, Sunnyvale , CA, USA, V6.8). Tako, poželjno, varijanta piroglutamata doprinosi površini pika manjoj od 5%, poželjno manjoj od 4.6%, npr.4,5, 4,3, 4,2, 4,0 ili čak manje od 3.8%, što je određeno pomoću RP-HPLC pri čuvanju na temperaturama između -70°C i 40°C, npr.

+40°C, npr. nakon skladištenja u trajanju kao što je gore definisano, npr.1 mesec.

[0164] Formulacije iz predmetnog pronalaska takođe minimiziraju oksidaciju, kao što je formiranje oksidovanih proizvoda (kao što je određeno npr. RP-HPLC) tokom perioda čuvanja kao što je gore definisano, npr.1 mesec na temperaturi između -70°C i 40°C (uporediti Tabelu 5). Tako, formulacije iz predmetnog pronalaska dovode do varijanti oksidacije sa površinom pika manjim od 3%, poželjno manjim od 2.7%, poželjno manjim od 2.5%, npr. manje od 2.3%, 2.2%, npr.2.0, ili čak manje, kao što je 1.7% ili 1.5% pri skladištenju na temperaturama između -70°C i 40°C, npr. 40°C, npr. nakon skladištenja u trajanju kao što je iznad definisano, npr.1 mesec (kao što je određeno npr. RP-HPLC).

5.8.3.4 Stabilnost skladištenja u smislu oligomerizacije

[0165] Formulacije iz pronalaska takođe obezbeđuju stabilnost skladištenja, tako da se ne formira očigledno rastvorljiv oligomerni materijal (kao što je definisano npr. SE-HPLC) pri temperaturama skladištenja između -70°C i 40°C, nakon perioda čuvanja kao što je definisano iznad, na primer 1 mesec; ili manje od 1%, poželjno manje od 0.5%, npr. formira se 0.3% rastvorljivog oligomernog materijala (kao što je definisano npr. SE-HPLC) pri temperaturama skladištenja između -70°C i 40°C, npr. 40°C, nakon perioda skladištenja kako je iznad definisano, npr.1 mesec.

[0166] Ovaj pronalazak takođe ima efekat obezbeđivanja indeksa agregacije koji je određen vrednostima apsorbancije [(100xA340)/(A280-A340)] koji ostaje ispod 0.15, poželjno ispod 0.1 posle čuvanja na -70°C ili 40°C za skladištenje trajanja kao što je iznad definisano, npr 1 mesec.

5.8.3.5 Stabilnost skladištenja koja se ogleda u oporavku glavnog proizvoda

[0167] Formulacije ovog pronalaska imaju efekat da je površina maksimuma glavnog proizvoda, kao što je određeno npr. RP-HPLC (uporediti Tabelu 5) je oko 90% nakon skladištenja između -70°C i 40°C nakon perioda skladištenja kao što je iznad navedeno, npr.

4

1 mesec; ili maksimum glavnog proizvoda, kao što je određeno npr. RP-HPLC (videti Tabelu 5) je najmanje 85%, ili više, kao što je 86%, 87% ili 88%. Još poželjnije, glavni maksimum je 90%, 92% ili 95%, npr. najmanje 97%, poželjnije 100% nakon skladištenja između -70°C i 40°C, npr. 40°C nakon perioda skladištenja kao što je iznad navedeno, npr.1 mesec; ili maksimum glavnog proizvoda, kao što je određeno npr. pomoću SE-HPLC je najmanje 85%, najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, npr. najmanje 98% ili čak oko 100% nakon skladištenja između -70°C i 40°C, npr. 40°C, nakon perioda skladištenja kao što je iznad navedeno, npr. 1 mesec.

[0168] Formulacije prema predmetnom pronalasku takođe imaju efekat da je glavna površina maksimuma određena pomoću RP-HPLC nakon čuvanja npr. u koncentraciji do 20 mg/mL na -70°C i 25°C između 1 i 3 meseca ostaje nepromenjena u poređenju sa formulacijom pre skladištenja, i predstavlja najmanje 90%, poželjnije najmanje 95% od ukupnih maksimuma, pri čemu referentni uzorak ima glavni maksimum npr.95%. Nakon skladištenja na 40°C tokom jednog meseca, formulacija iz predmetnog pronalaska zadržava glavni maksimum koji je određen RP-HPLC od najmanje 80%, 85% ili 90%; nakon skladištenja 2 meseca najmanje 80%, ili 85%, a nakon skladištenja 3 meseca najmanje 75% ili 80%.

[0169] Štaviše, kako je određeno pomoću clEF, formulacija predmetnog pronalaska ima efekat obezbeđivanja oporavka glavnog proizvoda nakon skladištenja pri koncentraciji od npr. do 20 mg/mL između 1-3 meseca na temperaturi između -70°C i 40°C koja je uporediva sa referentnim uzorkom (formulacija bez čuvanja, glavni maksimum je najmanje 98%), npr. glavni maksimum je najmanje 85%, ili više, kao što je 86%, 87% ili 88%. Još poželjnije, glavni maksimum je 90%, 92% ili 95%, npr. najmanje 97%, poželjnije 100% nakon skladištenja između -70°C i 40°C.

5.8.3.6 Stabilnost u uslovima smrzavanja i odmrzavanja

[0170] Pored obezbeđivanja stabilnosti formulacija u uslovima skladištenja koje ostaju konstantne tokom vremena (npr. skladištenje na 5°C), ili uključuju jedan FT ciklus (npr. skladištenje na -20°C ili -70°C), dodatni efekat pronalaska je stabilnost u uslovima ponovljenih FT ciklusa. Svaki prelaz između zamrznutog i tečnog stanja i obrnuto nameće posebno uslove naprezanja na jedinstvene varijabilne domene imunoglobulina.

[0171] Formulacije prema pronalasku takođe imaju efekat obezbeđivanja dobre stabilnosti pod uslovima FT. Na primer, formulacije prema pronalasku mogu biti podvrgnute npr.10 FT

4

ciklusa između -70°C i sobne temperature (npr. 25°C), ili -20°C i sobne temperature.

Jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina sadržani u formulacijama će izdržati ova stanja bez značajnog pogoršanja, kako je utvrđeno npr. RP-HPLC ili SE-HPLC. Efekat ponavljajućih FT ciklusa na različita neograničavajuća otelotvorenja formulacija iz ovog pronalaska je procenjen, i otkriva da u svim slučajevima hemijski i fizički integritet vWF sredstva za vezivanje, npr. očuvani su jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina.

Ukupni oporavak je bio u opsegu između 95 i 100%, poželjno najmanje 95, 98 ili 99%.

Relativna proporcija različitih vrhova ostala je nepromenjena u poređenju sa kontrolom podvrgnutom samo jednom FT ciklusu.

[0172] Specifičnije, u koncentraciji između 5 mg/mL i 20 mg/mL, 10 FT ciklusa rezultiralo je oporavkom (kako je određeno na osnovu, na primer, ukupne površine pika, tj. SE-HPLC koji je najmanje 90%, 95%, 98% ili 100%; pri čemu je u posebnom otelotvorenju profil RP-HPLC ili SE-HPLC bio nepromenjen u odnosu na referentni uzorak (1 FT ciklus).

5.8.3.7 Stabilnost u smislu potencije

[0173] Stručnjak poznaje različite načine za određivanje potentnosti vWF sredstva za vezivanje, naročito jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina, specifičnije polipeptida u skladu sa bilo kojim od SEQ ID NO:1-19, npr. SEQ ID NO:1 (videti na primer, u eksperimentalnom odeljku WO2006/122825, npr. Primere 3-6, 18 i 19, ili u eksperimentalnom odeljku WO2009/115614).

[0174] U jednom otelotvorenju, potencija polipeptida iz predmetnog pronalaska može se odrediti vezivanjem za njegov antigen konvencionalnim testom, npr. ELISA, Biacore, RIA, FACS, itd.

[0175] Potentnost vWF sredstava za vezivanje je ostala prihvatljiva u formulacijama iz pronalaska kao što je ispitivano pod uslovima naprezanja, tj.4 nedelje čuvanja na 40°C.

5.8.3.8 Stabilnost u smislu kompatibilnosti

[0176] Formulacije predmetnog pronalaska su takođe kompatibilne sa nizom različitih razblaživača. Na primer, formulacije se mogu mešati/razblažiti sa takvim razblaživačima, bez uticaja na hemijsku i fizičku stabilnost jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina.

[0177] Prema tome, formulacije iz predmetnog pronalaska takođe obezbeđuju stabilnost u širokom opsegu koncentracija, kao što je ovde definisano.

4

5.8.3.9 Rezime efekata stabilizacije

[0178] Formulacije iz predmetnog pronalaska imaju efekat održavanja hemijskog i fizičkog integriteta polipeptida iz ovog pronalaska čak i posle produženog skladištenja, npr. za trajanja kao što je iznad definisano, na temperaturama između -70°C i 25°C.

[0179] Skladištenje jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina kao što je ovde definisano, posebno ALX-0081 na -70°C tokom 1 meseca, nije uticalo na njihove fizičkohemijske karakteristike za bilo koju od formulacija pronalaska, posebno neograničavajući primeri pufera ispitivanih u eksperimentalnom odeljku. Skladištenje nije imalo značajan uticaj na RP-HPLC, SE-HPLC ili clEF profile.

5.8.4 Ispitivanje stabilnosti liofilizovanih formulacija

[0180] Dodatno, pronalazak obezbeđuje stabilne formulacije vWF sredstava za vezivanje, npr. jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina kao što je ovde definisano, npr. SEQ ID NOs: 1-19, poželjno sadrži SEQ ID NO:1, koji su posebno korisni za liofilizaciju.

Formulacije pronalaska su rezultirale poboljšanom rastvorljivošću i poboljšanom stabilnošću skladištenja posle liofilizacije.

5.8.4.1 Stabilnost skladištenja

[0181] Formulacije pronalaska mogu obezbediti dobru stabilnost nakon liofilizacije kada se skladište, npr. na temperaturi od -70°C, -20°C, 5°C, 25°C ili 40°C, npr. za 1-36 meseci, kao što su 1, 1.5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ili 36 meseci. Najpovoljniji rezultati mogu se dobiti formulacijama na bazi citratnog pufera, npr. formulacije 3 i 7 kao što je prikazano u eksperimentalnom delu (npr. dobro formiranje kolača i bez vizuelnih znakova raspada, Slika 6). Stručnjak može prepoznati da u donjoj diskusiji poželjne vrednosti odražavaju sastave citratnog pufera, npr. kao što je prikazano u Tabeli 8.

[0182] Stručnjak će takođe prepoznati da skladištenje na 25°C, a naročito 40°C, predstavlja uslove naglašenog skladištenja. Očekuje se da takvi uslovi povećaju i ubrzaju bilo koji znak nestabilnosti, npr. hemijska ili fizička nestabilnost. Dakle, relativno kratko čuvanje na npr. 25°C ili 40°C daje dobru indikaciju za produženu stabilnost skladištenja u blažim uslovima (npr. 5°C ili zamrznuta).

5.8.4.2 Stabilnost skladištenja u smislu obnavljanja proteina

[0183] Na primer, formulacije iz predmetnog pronalaska obezbeđuju rekuperaciju proteina nakon liofilizacije od najmanje 95%, npr. najmanje 96, 97, 98, 99 ili čak oko 100% nakon skladištenja na temperaturi između -70°C i 40°C. Oporavak proteina može se odrediti bilo kojim poznatim načinom kvantifikovanja proteina, npr. prema sadržaju, RP-HPLC ili SE-HPLC. Ovi rezultati se mogu posmatrati npr. nakon čuvanja na ukazanoj temperaturi od 1-36 meseci, kao što su 1, 1.5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ili 36 meseci.

5.8.4.3 Stabilnost skladištenja u smislu hemijskih derivata/proizvoda razgradnje [0184] Štaviše, formulacije iz predmetnog pronalaska mogu sprečiti i minimizirati proizvodnju hemijskih derivata nakon liofilizacije, što je potvrđeno npr. pomoću SE-HPLC.

5.8.4.4 Stabilnost skladištenja u smislu oligomerizacije

[0185] Formulacije iz pronalaska mogu takođe obezbediti stabilnost skladištenja nakon liofilizacije, tako da se ne formira očigledno rastvorljiv oligomerni materijal (kao što je definisano npr. SE-HPLC) pri temperaturama skladištenja između -70°C i 40°C, nakon perioda čuvanja kao što je definisano iznad, na primer 1 mesec; ili manje od 1%, poželjno manje od 0.5%, npr. formira se 0.3% rastvorljivog oligomernog materijala (kao što je definisano npr. SE-HPLC) pri temperaturama skladištenja između -70°C i 40°C, npr.

+40°C, nakon perioda skladištenja kako je iznad definisano, npr.1-36 meseci, kao što je 1, 1.5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ili 36 meseci.

5.8.4.5 Stabilnost skladištenja koja se ogleda u oporavku glavnog proizvoda

[0186] Formulacije prema pronalasku mogu takođe imati efekat da nakon liofilizacije glavnog maksimuma proizvoda, kao što je određeno npr. pomoću SE-HPLC (videti tabelu 18 i tabele 27-29) je oko 100% nakon skladištenja između -70°C i 40°C nakon perioda skladištenja kao što je iznad navedeno, npr.1, 3, 6, 9, 12, 18 ili 24 meseca; ili maksimum glavnog proizvoda, kao što je određeno npr. pomoću SE-HPLC (videti tabelu 18 i tabele 27-29) je najmanje 85%, ili više, kao što je 86%, 87% ili 88%. Još poželjnije, glavni maksimum je 90%, 92% ili 95%, npr. najmanje 97%, poželjnije 100% nakon skladištenja između -70°C i 40°C, npr. 25°C nakon perioda skladištenja kao što je iznad navedeno, npr.1, 3, 6, 9, 12, 18 ili 24 meseci; ili maksimum glavnog proizvoda, kao što je određeno npr. pomoću SE-HPLC je najmanje 85%, najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, npr. najmanje 98% ili čak oko 100% nakon skladištenja između -70°C i 40°C, npr. 40°C, nakon perioda skladištenja kao što je iznad navedeno, npr.1, 3, 6, 9, 12, 18 ili 24 meseci.

[0187] Formulacije prema predmetnom pronalasku takođe imaju efekat nakon liofilizacije, da je glavna površina maksimuma određena pomoću RP-HPLC nakon čuvanja npr. u koncentraciji do 12,5 mg/mL na -70°C i 40°C između 1 i 12 meseca ostaje nepromenjena u poređenju sa formulacijom pre skladištenja, i predstavlja najmanje 90%, poželjnije najmanje 93% od ukupnih maksimuma, pri čemu referentni uzorak ima glavni maksimum npr.93%

1

(uporediti Tabelu 15). Tokom skladištenja nakon liofilizacije na 40°C tokom 12 meseci, formulacija iz predmetnog pronalaska zadržava glavni maksimum koji je određen RP-HPLC od najmanje 91%, 92% ili 93%.

[0188] Štaviše, kako je određeno pomoću clEF (uporediti Tabele 27-29), formulacije predmetnog pronalaska ima efekat obezbeđivanja nakon liofilizacije oporavka glavnog proizvoda nakon skladištenja pri koncentraciji od npr.12.7 mg/mL između 1-24 meseca na temperaturi između -70°C i 40°C koja je uporediva sa referentnim uzorkom (formulacija bez čuvanja, glavni maksimum je najmanje 96%), npr. glavni maksimum je najmanje 85%, ili više, kao što je 86%, 87% ili 88%. Još poželjnije, glavni maksimum je 90%, 92%, 93%, 94%, 95% ili 96%, npr. najmanje 97%, poželjnije 100% nakon skladištenja između -70°C i 40°C.

5.8.4.6 Stabilnost u uslovima smrzavanja i odmrzavanja

[0189] Formulacije prema pronalasku takođe imaju efekat obezbeđivanja dobre stabilnosti nakon liofilizacije pod uslovima FT. Na primer, formulacije prema pronalasku mogu biti podvrgnute npr. 5 FT ciklusa između -20°C i sobne temperature (npr. 25°C). Jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina sadržani u formulacijama će izdržati ova stanja bez značajnog pogoršanja, kako je utvrđeno npr. RP-HPLC ili SE-HPLC. U svim slučajevima hemijski i fizički integritet vWF sredstva za vezivanje, npr. jedinstveni varijabilni domeni imunoglobulina, je sačuvan. Ukupni oporavak je bio u opsegu između 95 i 100%, poželjno najmanje 95, 98 ili 99% u poređenju sa tečnim kontrolnim uzorkom skladištenim na -70°C.

[0190] Specifičnije, u koncentraciji i 16 mg/mL, 5 FT ciklusa rezultiralo je oporavkom (kako je određeno na osnovu, na primer, ukupne površine, tj. SE-HPLC koji je najmanje 90%, 95%, 98%, 99% ili 100%; pri čemu je u posebnom otelotvorenju RP-HPLC ili SE-HPLC profil nepromenjen u poređenju sa referentnim uzorkom (kontrolni uzorak tečnosti čuvan na -70°C) (uporediti Tabelu 12).

5.8.4.7 Stabilnost u smislu potencije

[0191] Stručnjak poznaje različite načine za određivanje potentnosti vWF sredstva za vezivanje, naročito jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina, specifičnije polipeptida u skladu sa bilo kojim od SEQ ID NO:1-19, npr. SEQ ID NO:1 (videti na primer, u eksperimentalnom odeljku WO2006/122825, npr. Primere 3-6, 18 i 19, ili u eksperimentalnom odeljku WO2009/115614). Potentnost vWF sredstva za vezivanje nakon liofilizacije nije bila zahvaćena nakon ponovljenih FT ciklusa u formulacijama. Naročito, jačina vWF sredstva za vezivanje je ostala stabilna u formulacijama pronalaska kao što je

2

ispitivano pod uslovima naprezanja, tj. do 12 meseci čuvanja na 40°C (Tabela 23) i čak do 24 meseca čuvanja na 40°C (Tabela 29). U jednom otelotvorenju, potencija polipeptida iz ovog obelodanjivanja nakon liofilizacije može se odrediti vezivanjem za njegov antigen konvencionalnim testom, npr. ELISA, Biacore, RIA, FACS, itd. konkretnije, u formulacijama ovog pronalaska najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, poželjnije najmanje 95% ili čak najmanje 99% vWF sredstva za vezivanje zadržava njegovo vezivanje. aktivnost nakon skladištenja pod iznad navedenim uslovima naprezanja u odnosu na aktivnost vezivanja pre skladištenja.

[0192] U daljem aspektu, formulacije iz predmetnog pronalaska pokazuju skoro nikakav gubitak biološke aktivnosti kada se upoređuje tečna formulacija ALX-0081 sa liofilizovanom formulacijom, kako je procenjeno različitim imunološkim testovima uključujući, ali ne ograničavajući se na Biacore test, enzimski vezan imunosorbentnim testom (ELISA), analizom ko-faktorske aktivnosti indukovane ristocetinom (RICO) i/ili analizom zasnovanom na Gyrolab-u (videti Odeljak 7.13 i Tabela 24).

5.8.4.8 Rezime efekata stabilizacije

[0193] Formulacije iz predmetnog pronalaska imaju efekat nakon liofilizacije održavanja hemijskog i fizičkog integriteta polipeptida iz predmetnog pronalaska, posebno ALX-0081, tj. čak i posle produženog skladištenja, npr. za trajanja kao što je iznad definisano, na temperaturama između -70°C i 40°C, profil čistoće/nečistoća proizvoda se u suštini ne menja. Na primer, produženo skladištenje nakon liofilizacije nije imalo značajan efekat na RP-HPLC, SE-HPLC ili clEF profile, kao što je podržano u eksperimentalnom delu.

5.9 Postupci pronalaska

[0194] VWF sredstva za vezivanje iz obelodanjivanja mogu se proizvesti bilo kojim uobičajeno upotrebljenim postupkom. Tipični primeri uključuju rekombinantnu ekspresiju u pogodnim sistemima domaćina, npr. bakterije ili kvasac. VWF sredstva za vezivanje će biti podvrgnuta pogodnom režimu prečišćavanja pre nego što budu formulisana u skladu sa ovim pronalaskom.

[0195] Predmetni pronalazak obuhvata postupke za dobijanje formulacija kao što je definisano u patentnim zahtevima.

[0196] Koraci pročišćavanja i formulacije mogu se podudarati, npr. kada su vWF sredstva za vezivanje iz pronalaska eluirana iz kolone korišćenjem pufera u skladu sa ovim pronalaskom.

Alternativno, formulacije prema pronalasku mogu biti pripremljene zamenom pufera bilo kojim pogodnim sredstvom, npr. sredstva koja se široko koriste u tehnici, kao što su dijaliziranje, ultrafiltracija itd.

[0197] U nekim otelotvorenjima, postupak proizvodnje formulacije prema pronalasku može se takođe odnositi na rekonstituciju liofilizovane ili osušene sprej formulacije, npr. dodavanjem vode ili odgovarajućeg pufera (koji može opciono da sadrži dodatne ekscipijense).

[0198] Postupci za pripremu formulacije prema predmetnom pronalasku mogu obuhvatiti dalje korake, kao što je punjenje u bočice pogodne za kliničku upotrebu, kao što su zapečaćene ambalaže i/ili konfekcioniranje u obliku jedinične doze. Postupci mogu takođe obuhvatiti dodatne korake kao što su sušenje raspršivanjem, liofilizacija ili zamrzavanje, npr. grupno zamrzavanje. Pronalazak takođe obuhvata ambalaže, jedinične oblike doziranja ili druge proizvode koji se mogu dobiti bilo kojim postupkom definisanim u patentnim zahtevima.

[0199] Formulacije ovog pronalaska se mogu koristiti za skladištenje vWF sredstva za vezivanje, npr. ISVD kao što je ovde definisano. Prema tome, obelodanjivanje obuhvata postupak čuvanja vWF sredstva za vezivanje, kako se ovde koristi, koji se karakteriše upotrebom formulacije kao što je ovde definisano. Još specifičnije, opis obuhvata postupke za stabilizaciju vWF sredstva za vezivanje, kao što je ovde definisano, za skladištenje, koji obuhvata npr. dobijanje formulacije kao što je ovde opisano. Skladištenje može biti 1-36 meseci, kao što su 1, 1.5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ili 36 meseci, npr. najmanje 12 ili čak 24 meseca, opciono na temperaturi između -70°C i 40°C, kao što je -70°C, -20°C, 5°C, 25°C ili 40°C, poželjno je temperatura između -70°C i 25°C, poželjnije na temperaturi između -20°C i 5°C. Prema tome, skladištenje može obuhvatiti zamrzavanje, sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) i/ili sušenje raspršivanjem. Postupci skladištenja mogu dalje obuhvatati procenu fizičkog i hemijskog integriteta vWF sredstava za vezivanje kao što je ovde definisano.

[0200] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupke za analizu formulacija koje sadrže najmanje jedno od vWF sredstava za vezivanje kao što je ovde definisano. Formulacije se mogu analizirati za bilo kakve znakove hemijske ili fizičke nestabilnosti vWF sredstva za

4

vezivanje kao što je ovde definisano. Na primer, formulacije se mogu proceniti za prisustvo proizvoda razgradnje, npr. derivati niske molekulske mase kao što su proteolitički fragmenti; i/ili za hemijske derivate, npr. varijante piroglutamata; i/ili za derivate visoke molekulske mase kao što su agregati, aglomerati, itd. formulacija se takođe može proceniti za ukupni sadržaj proteina i/ili potenciju. Svaki od različitih postupaka ispitivanja, kako je ovde pomenuta, može se koristiti u postupku analize ovog obelodanjivanja.

[0201] Prema tome, predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za praćenje i/ili procenu kvaliteta i/ili stabilnosti formulacije, npr. tokom jedne ili više proizvodnje, skladištenja i upotrebe. Obelodanjivanje se takođe odnosi na metod kontrole kvaliteta formulacije, npr. da proceni da formulacija zadovoljava specifikacije proizvoda kao što je ovde dalje opisano. Obelodanjivanje u bilo kojem od ovih aspekata obuhvata jedan ili više odabranih od poređenja sa jednim ili više referentnih uzoraka, analizom varijacija serije do serije i stalnim praćenjem procesa proizvodnje.

[0202] Predmetni pronalazak se odnosi na bilo koji proizvod koji je povezan sa formulacijama iz predmetnog pronalaska, npr. tako što će se sastojati iz njih ili biti neophodni za njihovu proizvodnju ili konfekcioniranje, bez ikakvih ograničenja.

[0203] Na primer, predmetni pronalazak se odnosi na proizvodni artikl, npr. zatvorenu ambalažu koji sadrži jednu ili više formulacija u skladu sa ovim pronalaskom. Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski jedinični oblik doziranja, npr. oblik doziranja pogodan za parenteralno davanje pacijentu, poželjno ljudskom pacijentu, koji sadrži jednu ili više formulacija u skladu sa bilo kojim otelotvorenjem koje je ovde opisano. Jedinične oblik doziranja može biti npr. u obliku napunjenog štrcaljke, ampule, patrone ili bočice. Štrcaljka, ampula, kertridž ili bočica mogu biti proizvedeni od bilo kojeg pogodnog materijala, kao što je staklo ili plastika i mogu uključivati gumene materijale, kao što su gumeni čepovi za bočice i gumeni klipovi i gumene zaptivke za špriceve i patrone. Pronalazak se takođe odnosi na komplet koji sadrži jednu ili više formulacija prema ovom pronalasku. Komplet može dalje sadržati uputstva za upotrebu i/ili lek za klinički paket.

[0204] U bilo kojom otelotvorenju proizvoda kao što je ovde definisano, predmetni pronalazak takođe obuhvata prisustvo materijala za pakovanje, uputstva za upotrebu i/ili lekova za klinički paket, npr. kako to zahtevaju regulatorni aspekti.

5.10 Definicije

5.10.1 Identitet

[0205] Za svrhe upoređivanja dve ili više aminokiselinskih sekvenci, procenat "identičnosti sekvence" između prve aminokiselinske sekvence i druge aminokiselinske sekvence (koji se ovde nazivaju i "aminokiselinski identitet") može se izračunati deljenjem [broj aminokiselinskih ostataka u prvoj aminokiselinskoj sekvenci koji su identični aminokiselinskim ostacima na odgovarajućim pozicijama u drugoj amino kiselinskoj sekvenci] sa [ukupnog broja aminokiselinskih ostataka u prvoj aminokiselinskoj sekvenci] i množenjem sa [100%], pri čemu se svaka delecija, ubacivanja, supstitucija ili dodavanje aminokiselinskog ostatka u drugoj aminokiselinskoj sekvenci - u poređenju sa prvom aminokiselinskom sekvencom - smatra kao razlika na jednom aminokiselinskom ostatku (poziciji), tj. kao "aminokiselinska razlika" kao što je ovde definisano.

[0206] Alternativno, stepen identičnosti sekvence između dve ili više aminokiselinskih sekvenci može se izračunati korišćenjem poznatog računarskog algoritma za poravnanje sekvenci kao što je NCBI Blast v2.0. koristeći standardne postavke.

[0207] Neke druge tehnike, kompjuterski algoritmi i podešavanja za određivanje stepena identičnosti sekvence su, na primer, opisani

u WO04/037999, EP0967284, EP1085089, WO00/55318, WO00/78972, WO98/49185 i GB2 357768-A.

[0208] Obično, u svrhu određivanja procenta "identičnosti sekvence" između dve aminokiselinske sekvence u skladu sa iznad navedenim postupkom izračunavanja, aminokiselinska sekvenca sa najvećim brojem aminokiselinskih ostataka će se uzeti kao "prva" aminokiselinska sekvenca, a druga aminokiselinska sekvenca će se uzeti kao "druga" aminokiselinska sekvenca.

[0209] Takođe, pri određivanju stepena identičnosti sekvence između dve aminokiselinske sekvence, stručnjak može uzeti u obzir takozvane "konzervativne" supstitucije aminokiselina, koje se generalno mogu opisati kao supstitucije aminokiselina u kojima je aminokiselinski ostatak zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom slične hemijske strukture i koji ima mali ili suštinski nikakav uticaj na funkciju, aktivnost ili druga biološka svojstva polipeptida.

Takve konzervativne aminokiselinske supstitucije su dobro poznate u tehnici, na primer iz WO04/037999, GB2357768-A, WO98/49185, WO00/46383 i WO01/09300; i (poželjni) tipovi i/ili kombinacije takvih supstitucija mogu biti izabrani na osnovu odgovarajućih učenja iz WO04/037999 kao i WO98/49185 i iz dalje citiranih referenci. Takve konzervativne supstitucije poželjno su supstitucije u kojima je jedna aminokiselina u okviru sledećih grupa (a) - (e) supstituisana sa drugim aminokiselinskim ostatkom unutar iste grupe: (a) mali alifatski, nepolarni ili blago polarni ostaci: Ala, Ser, Thr, Pro i Gly; (b) polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi (nenaelektrisani ) amidi: Asp, Asn, Glu i Gln; (c) polarni, pozitivno naelektrisani ostaci: His, Arg i Lys; (d) veliki alifatski, nepolarni ostaci: Met, Leu, Ile, Val i Cys; i (e) aromatični ostaci: Phe, Tyr i Trp. Naročito poželjne konzervativne supstitucije su sledeće: Ala u Gly ili u Ser; Arg u Lys; Asn u Gln i u His; Asp u Glu; Cys u Ser; Gln u Asn; Glu u Asp; Gly u Ala ili u Pro; His u Asn ili u Gln; Ile u Leu ili u Val; Leu u Ile ili u Val; Lys u Arg, u Gln ili u Glu; Met u Leu, u Tyr ili u Ile; Phe u Met, u Leu ili u Tyr; Ser u Thr; Thr u Ser; Trp u Tyr; Tyr u Trp; i/ili Phe u Val, u Ile ili u Leu. Bilo koja aminokiselinska supstitucija primenjena na ovde opisane polipeptide može takođe da se zasniva na analizi frekvencija aminokiselinskih varijacija između homolognih proteina različitih vrsta razvijenih iz Schulz i dr., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, na analizama potencijala za formiranje strukture Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 i Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978i na analizi obrazaca hidrofobnosti u proteinima Eisenberg i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol.157: 105-132, 1981, i Goldman i dr., Ann. Rev. Biophys. Chem.15: 321-353, 1986. Informacije o primarnoj, sekundarnoj i tercijarnoj strukturi Nanotela® su date u opisu u ovom tekstu i u opštoj prethodnoj literaturi. Takođe, za ovu svrhu, kristalna struktura VHHdomene iz lame je na primer data u Desmyter i dr., Nature Structural Biology, Vol.3, 9, 803 (1996); Spinelli i dr., Nature Structural Biology (1996); 3, 752-757; i Decanniere i dr., Structure, Vol.7, 4, 361 (1999). Dalje informacije o nekim od aminokiselinskih ostataka koje u konvencionalnim VHdomenima formiraju VH/VLinterfejs i potencijalne kamelizirane supstitucije na ovim pozicijama mogu se naći u prethodnom stanju tehnike.

6. Skraćenice

[0210]

API

Aktivni Farmaceutski Sastojak

clEF

Kapilarno izoelektrično fokusiranje

DLS

Dinamičko rasejanje svetlosti

DOE

Dizajn eksperimenata

DP

Lekoviti proizvod

DS

Lekovita supstanca

FT

Smrzavanje i odmrzavanje

HMW

Visoka molekulska masa

LMW

Niska molekulska masa

MALS

Rasejanje svetlosti iz više uglova

RH

Relativna vlažnost

RPC

Hromatografija reverzne faze

RP-HPLC

Tečna hromatografija visokih performansi reverzne faze SE-HPLC

Tečna hromatografija visokih performansi isključenja veličine SOP

Standardni operativni postupak

Tm

Temperatura topljenja (°C)

TSA

Test termalnog pomaka

vWF

von Vilebrandov faktor

WFI

Voda za injektiranje

[0211] Pronalazak će sada biti dalje opisan pomoću sledećih neograničavajućih poželjnih aspekata, primera i slika:

7. PRIMERI

[0212] Set eksperimenata je dizajniran da bi se dobio poboljšani formulacioni pufer, namenjen da zadovolji širok spektar različitih i na izgled neusaglašenih ciljeva. Posebno, ovde su dati primeri formulacija koje su sposobne da održavaju stabilnost, biološku aktivnost, čistoću i kvalitet drX-0081 i to tokom produženog vremenskog perioda, stabilne na različite naprezanja kao što su zamrzavanje, liofilizacija, zagrevanje i/ili rekonstituisanje.

[0213] Savremeni ALX-0081 DS je predstavljen kao tečna formulacija koja sadrži 5 mg/mL aktivnog farmaceutskog sastojka (API) u fosfatnom (D-PBS) puferu koji sadrži 200 mM glicina i 0.02% Tween-80 (v/v) ), pH 7.1 (DS). Iako je ova formulacija primenjena tokom početnih kliničkih ispitivanja, ona se može poboljšati na nekoliko načina. Prvo, relativno niska koncentracija bi verovatno zahtevala višestruke subkutane injekcije (pod pretpostavkom da je zapremina po potkožnoj injekciji ograničena na oko 1 mL) i na taj način se smanjuje upotrebljivost kod pacijenta. Drugo, stabilnost skladištenja pri 3-8°C ili sobnoj temperaturi trenutne formulacije ALX-0081 je ograničena. Ograničeni rok trajanja u ovoj formulaciji se uglavnom određuje hemijskom modifikacijom (videti odeljak 7.2). Hemijske modifikacije mogu biti povezane sa gubitkom snage. Iako se praktični rok upotrebe može postići skladištenjem proizvoda na -20°C, to se, međutim, ne smatra povoljnom opcijom za većinu praktičnih razloga.

7.1 Postupci

[0214] Uzorci su analizirani u suštini prema standardnim operativnim procedurama za procenu sadržaja, jačine i čistoće, taloženja, koncentracije, degradacije, agregacije i potencije. Pored toga, svi uzorci su vizuelno pregledani radi zamućenja ili prisustva proteinskih agregata ili taloženja. Sadržaj preostale vlage u specifičnim liofiliziranim uzorcima određen je pomoću Karl-Fišerove titracije.

[0215] U ovom ispitivanju su korišćena tri različita programa liofilizacije za zamrzavanjesušenje ALX-0081 - standardno 65 h pokretanje (Slika 1), skraćeno 37 h izvođenje i duži ciklus liofilizacije od 66 h optimizovan za smanjenje sadržaja preostale vlage kao što je opisano u Tabeli 14.

[0216] Ukratko, na početku skraćenog 37 h procesa liofilizacije temperatura na polici je bila 20°C i dovedena je do -50°C za 2 sata. Zatim je za 1 h stvoren vakuum od 0.04 mbar. Nakon dostizanja vakuuma od 0.04 mbar temperatura polica je održavana na -50°C tokom 4 h. Posle ovih 4 sata temperatura je postepeno povećavana do 0°C u 15 sati (tj. primarni korak sušenja, uklanjanje smrznute vode). Temperatura polica od 0°C je držana 7 sati, uz održavanje vakuuma od 0.04 mbar. Posle 7 sati temperatura je podignuta na 25°C u toku 3 sata i zatim održavana na 25°C tokom 5 sati (tj. sekundarni korak sušenja, uklanjanje nezagađene vode). Bočice su zatvorene pod vakuumom od ±0.400 mbar nakon čega je normalni pritisak obnovljen.

[0217] Isti postupak je primenjen za standardno 65 h pokretanje i razlikuje se samo u drugom koraku sušenja koji je produžen sa 28 h na 25°C pod vakuumom, što je rezultiralo ukupnim vremenom ciklusa od oko 65h. Šematski prikaz različitih koraka u standardnoj 65 h liofilizaciji prikazan je na slici 1. Tokom procesa liofilizacije, praćena je temperatura proizvoda od tri bočice u strateškim položajima. Konačno, standardno 65 h izvođenje je modifikovano tokom izvođenja u skladu sa očitavanjem temperaturnih sondi što je rezultiralo produženim ciklusima liofilizacije kao što je opisano u Tabeli 14.

7.2 Hemijska stabilnost suvremene formulacije ALX-0081

[0218] RP-HPLC je jedan od najinformativnijih postupaka za procenu hemijske stabilnosti lekovite supstance (DS).

[0219] RP-HPLC je rastvorio ALX-0081 DS u više različitih vrsta. Pored glavnog maksimuma, mogu se uočiti pre-maksimumi (supstance koje se eluiraju pre netaknutog nemodifikovanog materijala) i određeni broj post-maksimuma. U do sada proizvedenim serijama, pre-maksimumi i post-maksimum 1 konzistentno predstavljaju oko 2% i 3.6% respektivno, dok su ostali post-maksimumi činili manje od 1% DS.

[0220] Tokom skladištenja pod ubrzanim uslovima (+5°C) ili pod naprezanjem (+25°C i 37°C/+40°C), relativna zastupljenost određenih varijanti povezanih sa proizvodom se povećava sa vremenom i temperaturom, kao što je prikazano na slici 2A. Dodatno, glavni pik RP-HPLC izgleda da se podeli na nekoliko različitih vrsta pri produženoj inkubaciji, posebno na povišenim temperaturama (≥+25°C) (Slika 2B). Podaci pokazuju da se neke ranije eluirajuće nove molekularne vrste stvaraju tokom skladištenja.

[0221] Najvažnije izmene koje su bile prisutne u ALX-0081 DS u vreme proizvodnje ili koje su nastale tokom skladištenja su sledeće: (i) pre-maksimum 1 (oksidacija); (ii) postmaksimum 1 (varijanta nor-leu); (iii) post-maksimum 2 (formiranje piroglutamata) i (iv) razdvajanje glavnog maksimuma (izomerizacija). Modifikacije (i), (ii) i (iii) nisu značajno uticale na potenciju (podaci nisu prikazani). Nasuprot tome, izomerizacija ostataka asparaginske kiseline na poziciji 105 i 236 SEQ ID NO:1, koji su locirani u CDR3 regionu, pokazalo se da je dominantan molekularni mehanizam koji leži u osnovi potencijalnog gubitka potentnosti ALX-0081 (videti (iv) iznad).

[0222] Neke od varijanti ALX-0081 koje se odnose na proizvod, prisutne u vreme proizvodnje ili nastale tokom skladištenja, takođe mogu biti detektovane od strane clEF. Ovo je bio slučaj za modifikaciju piroglutamata koja se pojavila kao post-maksimum (videti (iii) iznad). Takođe, slično onome što je uočeno u RP-HPLC analizi, događaji izomerizacije na poziciji 105 u oba 12A02H1 domena rezultirali su širenjem glavnog maksimuma i eventualnim razdvajanjem glavnog clEF maksimuma (videti (iv) iznad).

7.3 Skrining pufera i ekscipijenasa

[0223] Da bi se dalje razvila formulacija vWF sredstava za vezivanje, dizajniran je složen skup eksperimenata koji razrađuju različite parametre koji utiču jedni na druge, uključujući (i) različite pufere, (ii) u različitim koncentracijama, (iii) svaki pufer na različitim pH; i (iv) svaka kombinovana sa različitim ekscipijensima.

[0224] Puferski sistemi bi trebalo da imaju što manji kapacitet puferisanja što je moguće, kako ne bi značajno poremetili sistem puferisanja tela kada se ubrizgava. Pored toga, tip pufera i koncentracija na aktivnost aktivnog farmaceutskog sastojka (API) moraju biti vrednovani veoma pažljivo.

[0225] Generalno, povećani nivo stabilnosti proteina pripisuje se visokim temperaturama topljenja. Prema tome, termička svojstva ALX-0081 su praćena u prisustvu različitih sastava. Posebno, TSA eksperiment je izveden u 192 različite izotonične formulacije, za koje su rezultati uneseni u dizajn eksperimenata (DOE) za procenu uticaja pufera, koncentracije, jonske snage, pH i ekscipijenasa na termičku stabilnost ALX-0081. Očitana je temperatura topljenja (Tm) ALX-0081 koja je indikativna za termičku stabilnost proteina u različitim ispitivanim sastavima.

1

[0226] Ukratko, upotrebljeni test termičkog pomaka (TSA) prati promene signala fluorescentne boje, kao što je Sypro Orange, dok se protein podvrgava termičkom odvijanju. Kada se Sypro Orange dodaje u pravilno presavijeni rastvor proteina, on se ne može vezati za bilo koju površinu proteina i njegov signal fluorescencije se gasi. Kada temperatura raste, protein se podvrgava termičkom odvijanju i izlaže svoje hidrofobno jezgro. Sypro Orange se onda veže za hidrofobne regione i neugašene, što dovodi do povećanja fluorescentnog signala. Test je izveden na rastvorima koji sadrže različite formulacije za ispitivanje, ALX-0081 na 0.2 mg/mL i 10x Sypro Orange. Program se sastojao iz sledećih koraka: zagrejte na 37°C pri brzini od 4.4°C/s i držite 10s; zagrevati na 90°C pri kontinuiranoj brzini od 0.02°C/s (20 akvizicija po °C); i ohladiti na 37°C pri brzini od 2.2°C/s i držati 10 s.

[0227] Sledeći set pufera sa različitim koncentracijama (10-200 mM), pH vrednosti i ekscipijensi su ovde istraženi:

[0228] Dobijene temperature topljenja (Tm) su uvezene u program stručnjaka za projektovanje za analizu eksperimenta faktorskog skrininga da bi se predvidelo 50 formulacija koje su rezultirale najvećom termičkom stabilnošću (videti Tabelu 1).

[0229] Najveće vrednosti Tm predviđene su za fosfat (pH 7.0-7.5) i citrat (pH 6.2-7.0) koji sadrži trehalozu, saharozu, manitol ili glicin. Potpuno neočekivano, rezultati ispitivanja sugerišu da puferi na bazi Tris-HCl (pH 7.8-8.0) i histidin-HCI (pH 6.5) baziraju na znatno

2

nižim temperaturama topljenja, iako su prethodno izabrani kao puferski sistem izbora za kontrolu pH rastvora jedinstvenih varijabilnih domena imunoglobulina kako je opisano u WO2010/077422.

[0230] Shodno tome, zaključeno je da se fosfatne i citratne formulacije koje sadrže trehalozu, saharozu, glicin ili manitol, izvode posebno dobro u stabilizovanju vWF sredstva za vezivanje, npr. ALX-0081.

7.4 Ispitivanje rastvorljivosti

[0231] Da bi se procenilo da li se rastvorljivost ALX-0081 može dodatno poboljšati, početni skrining je izveden u nekoliko formulacija. ALX-0081 je zamenjen puferom za formulaciju od interesa (isključujući Tween-80) i dalje koncentrisan u ćeliji za mešanje (npr. tip Amicon) opremljen sa 5 kDa odsečenim filterom. Čim je došlo do vidljivog taloženja ili zamućenja, uzorak je filtriran i izmerena je koncentracija proteina. Tabela 2 prikazuje rezime dobijenih rezultata.

[0232] Koncentracija u fosfatnim i histidinskim puferima rezultirala je zamućenosti uzorka i formiranjem precipitacije na relativno niskoj koncentraciji proteina (<10mg/mL). Nasuprot tome, ALX-0081 je ostao fizički stabilan u citratnom puferu, čak i nakon dostizanja koncentracije ∼56 mg/mL. Pored vizuelne inspekcije, odsustvo čestičnih materija ili HMV vrsta je potvrđeno fluorescentnom mikroskopijom (bojenje Nile Redom, SE-HPLC i DLS). Nadalje, podvrgavanje ∼56 mg/mL rastvor na 10 FT ciklusa na -20°C ili -70°C, ili skladištenje na 4°C oko 1 nedelju nije delovao kao da utiče na fizičku stabilnost molekula kao što je dokazano SE-HPLC analizom (videti slike 3A) i 3B).

[0233] Komparativno visoka rastvorljivost ALX-0081 u citratnom puferu potvrđena je PEG taloženjem (podaci nisu prikazani).

7.5 Tween-80

[0234] Da bi se odredilo da li je nejonski surfaktant polisorbat, takođe označen kao Tween, (polioksietilen (N) sorbitan monolaurat; gde je N=20, 40, 60, 65, 80 ili 85) potrebno u formulaciji ALX-0081, nekoliko eksperimenata za naprezanje mešanjem je izvedeno u 50 mM citratnom puferu pri pH 6.0 i 6.5. Efekat različitih koncentracija Tween-80 (bez Tween-80 u odnosu na 0.01% u odnosu na 0.02% (v/v)) na fizičku stabilnost ALX-0081 procenjen je na 5 mg/mL praćenjem 500 nm raspršenog signala u a spektrofluorometer.

[0235] Tween-80 je sprečio povećanje signala rasipanja u oba pufera, pokazujući njegov zaštitni efekat (Slike 4A i 4B). Nisu uočene značajne razlike između uzoraka koji sadrže 0.01% ili 0.02% Tween-80 (v/v). Pored toga, SE-HPLC profili uzoraka pre i posle mešanja nisu pokazali nikakve razlike: Postignuto je 95-100% oporavka i nije bilo moguće detektovati oligomerizaciju ili degradaciju.

[0236] Na osnovu ovih rezultata, odlučeno je da se uključi 0.01% Tween-80 (v/v) u formulaciji vWF sredstva za vezivanje, npr. ALX-0081.

7.6 Tween

[0237] Da bi se odredilo da li su ostali članovi u polisorbatu u rasponu, koji se razlikuju po dužini polioksietilenskog lanca i estru masne kiseline, npr. Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-65 i Tween-85 su potrebni u formulaciji anti-vWF sredstva za vezivanje, nekoliko eksperimenata za naprezanje mešanjem je izvedeno u 50 mM citratnom puferu pri pH 6.0 i 6.5, u suštini kao što je opisano u odeljku 7.5 iznad. Efekat različitih koncentracija različitih Tween-članova (nema Tween u odnosu na 0.01% prema 0.02% (v/v)) na fizičku stabilnost vWF sredstva za vezivanje je procenjen na 5 mg/mL praćenjem 500 nm raspršenog signala u spektrofluorometru.

[0238] Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-65 i Tween-85 dati suštinski isti koristan rezultat kao i Tween-80.

7.7 Ispitivanje stabilnosti tečnih formulacija

[0239] Sprovedeno je opsežnije ispitivanje za procenu stabilnosti ALX-0081 u različitim izotoničnim formulacijama na bazi citrata u koncentraciji od 20 mg/mL. Tabela 3 daje pregled različitih formulacija koje su ispitivane.

[0240] Glavni cilj je bio da se proceni uticaj pH (6.0-6.5-7.0) i tipa ekscipijensa (NaCl, manitol, saharoza ili glicin) na stabilnost tečnog proizvoda. Za potrebe kontrole i direktnog poređenja, studija je uključila i suvremene ALX-0081 formulisane u dozi od 5 mg/mL u D-PBS i glicinu (identičnom trenutnoj formulaciji, izuzev nižih koncentracija Tween-80) kao i prethodno pomenute različite citratne zasnovane na izotoničnim rastvorima ALX-0081, ali su formulisane u koncentraciji od 5 mg/mL umesto 20 mg/mL. Sve ovo je rezultiralo sa 17 različitih tečnih formulacija (formulacija br.1-17) koje su bile podvrgnute dubokim ispitivanjima stabilnosti. Da bi se isključio efekat razlika u koncentraciji Tween-a, sve formulacije su sadržale 0.01% Tween-80 (v/v).

4

7.7.1 Stabilnost pri smrzavanju-odmrzavanju

[0241] Procenjen je efekat ponavljajućih FT ciklusa na stabilnost ALX-0081 kao tečne formulacije. Alikvoti različitih formulacija (0.5 mL/epruveta) su podvrgnuti do 10 FT ciklusa na -70°C ili -20°C. Jedan ciklus je uključivao zamrzavanje ± 20 minuta, nakon čega je sledilo odmrzavanje tokom 5 minuta u vodenom kupatilu na 25°C. Nakon ovog tretmana, sve formulacije su ostale vidljivo bistre. RP-HPLC analize su pokazale dobar oporavak (95-100%) i nije bilo moguće utvrditi značajnu razliku u profilu što ukazuje na to da kvalitet vVF sredstva za vezivanje, npr. ALX-0081 nije pod uticajem ponovnog zamrzavanja-odmrzavanja u 17 različitih ispitivanih tečnih formulacija.

7.7.2 Stabilnost skladištenja

[0242] Stabilnost 17 različitih formulacija je takođe procenjena skladištenjem alikvota (0.5 mL/epruveta) u uslovima naprezanja, tj. 40°C; Dugotrajno stanje skladištenja od -70°C je uključeno kao referenca. Analize su fokusirane na RP-HPLC zato što je ovaj postupak opšte poznat kao posebno informativan postupak za otkrivanje hemijskih modifikacija koje se dešavaju tokom skladištenja (videti Tabelu 4). Ovaj odeljak daje pregled podataka dobijenih nakon 1 meseca skladištenja; rezultati potvrđuju nalaze u ranijim vremenskim tačkama, tj. nakon 1 nedelje i 2 nedelje.

(a) RP-HPLC

[0243] Kao što je prethodno navedeno u odeljku 7.2 gore, RP-HPLC analiza je rešila istovremenu ALX-0081 DS (D-PBS/glicin formulacija) u neke varijante i nečistoće vezane za proizvod. Ukratko, pod uslovima naprezanja (npr. 40°C), čistoća (% glavni maksimuma) se smanjuje istovremeno sa povećanjem nekih od postojećih pre/post-maksimuma, kao i sa formiranjem dodatnih.

[0244] Podaci RP-HPLC dobijeni u ovom ispitivanju su sumirani u tabeli 5.

[0245] Sveukupno, dobijeni rezultati su pokazali da su u osnovi iste modifikacije izvršene u različitim citratnim puferima, kao što je posmatrano u sadašnjem puferu za formulaciju (tj. D-PBS/glicin), mada se mogu uočiti neke razlike u relativnoj površini vrha. Konkretno, povećanje oblasti pre-maksimuma (oksidacija) je bilo sporije u citratnim formulacijama (posebno na pH 6.0) u poređenju sa formulacijom D-PBS/glicina. Što se tiče ovog povećanja pre-maksimuma, glicin se pokazao kao najmanje povoljan među različitim ekscipijensima. Profil različitih post-maksimuma nakon skladištenja tokom 1 meseca na 40°C bio je uporediv za sve formulacije, mada je drugi post-maksimum (tj. varijanta piroglutamata) izgledao izraženije pri pH 7.0 nego kod pH 6.0 - 6.5. Stepen širenja/razdvajanja glavnog maksimuma - rezultat izomerizacije asp - teško je kvantifikovati zbog slabe rezolucije; procenat površine maksimuma ramena nije mogao biti tačno procenjen i stoga je uključen u relativnu površinu prikazanu u Tabeli 5 za glavni maksimum. Ipak, odgovarajući RP-HPLC hromatogrami (podaci nisu prikazani) omogućili su da se izvrši kvalitativna procena; ovi podaci sugerišu da je obim izomerizacije prilično sličan u različitim formulacijama.

(b) cIEF

[0246] Slično kao i RP-HPLC, clEF postupak omogućava detekciju određenih varijanti proizvoda koje se dešavaju tokom skladištenja pod uslovima naprezanja (za detalje pogledajte odeljak 7.2). Ovo je ilustrovano na Slici 5, upoređujući elektroferograme istovremeno ALX-0081 nakon skladištenja tokom jednog meseca na -70°C i 40°C.

[0247] clEF podaci dobijeni u ovom ispitivanju (podaci nisu prikazani) u osnovi potvrđuju zaključke do kojih je došla RP-HPLC analiza, tj. Isti tip modifikacija se odvija u približno istoj meri u različitim citratnim puferima kao što je uočeno u predmetnom puferu formulacije koji su ovde predstavljeni formulacijom 17 kao što je prikazano na Slici 5 (tj. D-PBS/glicin). Međutim, uočene su neke razlike u relativnoj površini vrha. Posebno, post-maksimum (tj. varijanta piroglutamata) izgleda da je izraženiji pri pH 7.0 nego kod pH 6.0 - 6.5, što je u skladu sa nalazima RP-HPLC kao što je prethodno sumirano u Tabeli 5.

(c) SE-HPLC

[0248] SE-HPLC analiza je izvedena da bi se ispitala fizička stabilnost ALX-0081, tj. da bi se detektovale HMW vrste i/ili proizvodi razgradnje koji su se mogli formirati tokom skladištenja pod uslovima naprezanja. Za sve formulacije koje su ovde ispitivane, izgleda da ispitivanje naprezanje nema značajan uticaj na SE-HPLC hromatograme.

(d) Zaključak

[0249] Sažetak najvažnijih nalaza u vezi stabilnosti skladištenja različitih tečnih formulacija ALX-0081 prikazan je u tabeli 5. Navedeni su samo najinformativniji podaci zasnovani na RP-HPLC analizi. Ovi podaci ukazuju na veću hemijsku stabilnost u 50 mM citratu pri pH 6.0-6.5. Sa izuzetkom glicina, tip ekscipijensa nije imao značajan uticaj na stabilnost. Što se tiče fizičke stabilnosti, ne mogu se uočiti razlike između različitih formulacija. Ovo poslednje je dokazano sa ± 100% oporavkom opaženim za sve uzorke u različitim HPLC analizama, kao i pomoću SE-HPLC hromatograma koji pokazuju odsustvo agregacije/degradacije.

[0250] Na osnovu iznad navedenih rezultata, odlučeno je da se dalje istraži potencijal formulacija citrata/saharoze na pH 6.0-6.5.

7.8 Ispitivanje stabilnosti liofilizovanih formulacija

[0251] Efekat liofilizacije je procenjen poređenjem stabilnosti skladištenja ALX-0081 u tečnim i liofilizovanim formulacijama citrat/saharoza (20 mg/mL API pri pH 6.0-6.5).

Pregled ispitivanih formulacija dat je u Tabeli 6. Forma D-PBS/glicin zasnovana na stanju tehnike (5 mg/mL API) je uključena za poređenje. Tečnost (tj. pre liofilizacije) i liofilizovani ALX-0081 su držani zamrznuti (-70°C za tečne uzorke i -20°C za liofilizovane formulacije) kao i na 5°C, 25°C i 40°C i uzorci su analizirani nakon 2 nedelje i 1.5 meseci čuvanja.

[0252] Ploča A na Slici 6 prikazuje sliku bočica nakon procesa liofilizacije koristeći standardni rad od 65 sati, kao što je prikazano na Slici 1. Liofilizacija formulacija koje sadrže citrat/saharozu rezultirala je dobrim formiranjem kolača, dok uzorci formulisani u D-PBS/glicinu nisu proizveli standardan kolač. Svi uzorci se lako mogu rastvoriti sa Milli-Q vodom i rastvori su bistri i bezbojni (Slika 6, panel B).

7.8.1 Procena proizvoda pre i posle liofilizacije

[0253] Analiza RP-HPLC i SE-HPLC pokazala je da nema značajnih razlika u pogledu fizičko-hemijskih karakteristika između tečnog polaznog proizvoda (čuvanog na -70°C) i proizvoda nakon liofilizacije i rekonstitucije za bilo koju od ispitivanih formulacija. Osim toga, za sve formulacije je pokazano potpuno oporavak uzorka (Tabela 7).

7.8.2 Procena liofilizovanog proizvoda posle 1.5 meseca skladištenja

(a) Vizuelna inspekcija i sadržaj

[0254] Kolač liofilizovanih uzoraka nije pokazao vizualne znakove propadanja nakon skladištenja od 1.5 meseca na -20°C, 5°C, 25°C ili 40°C.

[0255] Uzorci su bili bistri i bezbojni nakon rekonstitucije sa Milli-Q vodom. Takođe, skladištenje nije imalo značajan uticaj na sadržaj, izmeren nakon rekonstitucije (Tabela 8).

(b) RP-HPLC

[0256] Profili 3 različite liofilizovane formulacije (br.3, 7 i 17) su upoređeni nakon 1.5 meseci čuvanja na -20°C, 5°C, 25°C, odnosno 40°C. Poređenje u najtežim uslovima (+40°C) najbolje otkriva uticaj liofilizacije na hemijsku stabilnost. Odgovarajući rezultati rezimirani su u Tabeli 8. Kao što se može videti, skladištenje u smrznutom obliku izgleda da ne utiče na ALX-0081 u bilo kojoj od formulacija ispitivanih u ovom ispitivanju.

[0257] Sveukupno, preovladavajući zaključak iz dobijenih podataka je da liofilizacija formulacije na bazi citrata/saharoze u suštini sprečava hemijske modifikacije koje se javljaju u tečnom obliku, sa izuzetkom nekih manjih količina modifikacije piroglutamata. U ovim liofilizovanim formulacijama nije bilo ni povećanja procenta površine pre-maksimuma niti znaka širenja/razdvajanja glavnog maksimuma. Nasuprot tome, liofilizacija formulacije na bazi D-PBS/glicina nije dovela do značajnog poboljšanja hemijske stabilnosti. Formiranje piroglutamata u liofilizovanoj formulaciji citrata/saharoze izgleda da je nešto izraženije pri pH 6.0 nego kod pH 6.5. Ovo je potvrđeno podacima na 25°C, pri čemu je temperatura formiranja piroglutamata manja, ali pokazuje istu pH zavisnost. Kao što se očekivalo, skladištenje do 1.5 meseca na -20°C ili 5°C nije izazvalo nikakvo detektabilno pogoršanje liofilizovanog ALX-0081 (podaci nisu prikazani).

[0258] Iznenađujuće, na 40°C dobijena je poboljšana stabilnost u formulacijama na bazi citrata/saharoze u poređenju sa formulacijom baziranom na D-PBS/glicin, koja pokazuje značajno veću osetljivost na hemijske modifikacije.

[0259] Za tečne formulacije skladištenje do 1.5 meseca na -70°C, 5°C i 25°C nije imalo značajan efekat na ALX-0081 (podaci nisu prikazani). Pogoršanje opaženo nakon 1.5 meseca skladištenja na 40°C, otprilike se slaže sa ranijim zapažanjima (videti Odeljak 7.7.2).

(c) cIEF

[0260] Rezultati dobijeni pomoću clEF analize su u saglasnosti sa rezultatima RP-HPLC. Najznačajnije, liofilizacija formulacije na bazi citrata/saharoze nije u stanju da potpuno spreči modifikaciju piroglutamata. Zaista, skladištenje liofilizovanog proizvoda na 40°C tokom 1.5 meseca dovelo je do povećanja post-maksimuma. Ponovo, brže formiranje piroglutamata primećeno je u citratu/saharozi na pH 6.0 nego na pH 6.5.

(d) SE-HPLC/MALS/DLS

[0261] Čuvanje do 1.5 meseca na -70°C/-20°C, 5°C i 25°C nije imalo uticaja na SE-HPLC profile liofilizovanih ili tečnih formulacija ALX-0081 (podaci nisu prikazani). Međutim, kod 40°C može se primetiti širenje i formiranje maksimuma ramena u svim tečnim formulacijama. MALS analiza je pokazala da ovi maksimumi ramena odgovaraju monomernom ALX-0081 (podaci nisu prikazani). Podaci ukazuju na konformacijsku promenu u pod-populaciji ALX-0081 kao rezultat skladištenja pod naprezanjem.

Iznenađujuće, SE-HPLC profil formulacija liofilizovanih citrata/saharoze nije bio pod uticajem ispitivanja naprezanjem 40°C koji ukazuje da ove liofilizovane formulacije takođe poboljšavaju fizičku stabilnost ALX-0081. Ovo, međutim, nije bio slučaj za liofilizovanu formulaciju D-PBS/glicin; naprezanje ove formulacije na 40°C ne samo da je rezultiralo maksimumom ramena, već očigledno i kod nekih vrsta više molekularne težine, vidljivih kao široki pred-maksimum (Tabela 8). DLS analiza nije otkrila nikakve velike oligomerne vrste u bilo kojoj od formulacija (podaci nisu prikazani).

(e) Zaključak

[0262] Sažetak najvažnijih nalaza u vezi stabilnosti skladištenja ispitivanih liofilizovanih ALX-0081 prikazan je u tabeli 8. Sve u svemu, uočene su samo ograničene razlike u stabilnosti između citratnih/saharoznih formulacija, mada se neočekivano pokazalo da je ALX-0081 manje sklon stvaranju piroglutamata pri pH 6.5 nego kod pH 6.0. Prema tome, daljnji rad na reformulaciji za ALX-0081 bio je fokusiran na formulacije na bazi citrata/saharoze pri pH 6.5.

7.9 Dalja optimizacija formulacije na bazi citrata/saharoze

[0263] Do sada prikupljeni podaci pokazuju da formulacija na bazi citrata/saharoze poboljšava rastvorljivost i da liofilizacija ove formulacije značajno poboljšava stabilnost skladištenja ALX-0081. Međutim, skladištenje liofilizovanog ALX-0081 na višim temperaturama, iako ograničeno i dalje dovodi do stvaranja piroglutamata. Razumno je pretpostaviti da ova modifikacija može ograničiti rok trajanja liofilizovanog proizvoda (čak i kada se čuva na 5°C). Ostaje da se razjasni zašto liofilizacija nije bila u stanju da spreči ovu modifikaciju.

[0264] Pretpostavljeno je da voda koja ostaje u proizvodu zamrznuto-sušenom igra ključnu ulogu.

[0265] Ako bi ta hipoteza bila istinita, onda bi preostala voda mogla biti minimizirana optimizacijom fizičkih parametara liofilizacije, kao što su vreme sušenja, temperature, vakuum itd., kao što je iznad navedeno, ali u isto vreme i drugi parametri vWF sredstava za vezivanje bi trebali ostati konstantni. Drugi pristup je modifikacija formulacije, ali opet u isto vreme i drugi parametri vWF sredstva za vezivanje bi trebali ostati konstantni. Pored toga, može se koristiti podešavanje fizičkih parametara liofilizacije u kombinaciji sa modifikovanjem formulacije.

7.9.1 Optimizacija liofilizirajućih parametara

[0266] Optimizacija parametara fizičke liofilizacije, uključujući (i) vreme sušenja, (ii) temperature različitih koraka, (iii), vakuum i kombinaciju (i) - (iii) nije bilo zadovoljavajuće, tj. sadržaj zaostale vlage ili utiče na parametre vWF sredstava za vezivanje.

7.9.2 Optimizacija formulacije za liofiliziranje

[0267] Uticaj sadržaja vlage na hemijsku stabilnost liofilizovanog proizvoda ispitan je podešavanjem koncentracija citratnog pufera i ekscipijensa saharoze. Pored toga, ispitivano je sekundarno vreme sušenja tokom programa liofilizacije.

7.10 Uticaj sadržaja vlage na stabilnost liofiliziranog proizvoda

[0268] Tri različite izotonične formulacije ALX-0081 sa različitim koncentracijama citrata i saharoze (sva tri na pH 6.5) su podvrgnute dvema različitim programima liofilizacije: standardno puštanje u rad od 65h s jedne strane i skraćeni 37h sa druge strane. Pregled ispitivanih formulacija dat je u Tabeli 9. Slika 7 prikazuje bočice dobijene posle liofilizacije. Liofilizacija je rezultirala formiranjem standardnog kolača za sve formulacije.

[0269] Liofilizirani uzorci ALX-0081 analizirani su nakon 2 i 4 nedelje čuvanja na -20°C i 40°C. U ovom eksperimentu, odlučeno je da se izvrši iscrpno ispitivanje kako bi se dalje potkrepila korisnost formulacija.

[0270] Prvo, tokom skladištenja na 40°C do 4 nedelje kolač liofilizovanih uzoraka ostao je netaknut i rekonstitucija je dala bistre rastvore. Čini se da ciklus liofilizacije nema značajnog uticaja na sadržaj (meren spektroskopski na 277 nm) ili osmolalnost. U skladu sa ranijim eksperimentima, 4 nedelje skladištenja na 40°C nije imalo efekta na fizičku stabilnost ALX-0081, na osnovu SE-HPLC, MALS i DLS analiza (podaci nisu prikazani). Dodatno, nađeno je da potentnost ALX-0081, kao što je određeno pomoću Biacore-baziranog testa, nije bila pod uticajem procesa liofilizacije i naknadnog skladištenja (podaci nisu prikazani). Međutim, RP-HPLC analize su pokazale da je skladištenje opet rezultiralo formiranjem -alko manje količine piroglutamatne varijante. Ovo je bilo nešto izraženije za formulaciju koja sadrži najveću koncentraciju citrata i najnižu koncentraciju saharoze (Tabela 10). Dodatno, za svaku liofilizovanu formulaciju, ukupni sadržaj vlage je određen pomoću Karl Fisher titracije. Rezime ovih podataka zajedno sa količinom piroglutamata detektovanom u odgovarajućim naprezanim uzorcima prikazan je u Tabeli 10. Iz podataka dobijenih za svaki program liofilizacije proizilazi da veći sadržaj vlage dovodi do veće osetljivosti na formiranje piroglutamata. Ovo ukazuje da zaostala voda prisutna u liofilizovanom proizvodu promoviše hemijske modifikacije.

[0271] U zaključku, rezultati ukazuju da smanjenje sadržaja vlage u liofilizovanim vWF sredstvima za vezivanje, npr. ALX-0081 je koristan za njegovu hemijsku stabilnost.

7.11 Učinak smanjenja čvrstoće pufera i povećanja sadržaja saharoze

[0272] Podaci dobijeni u prethodnom odeljku pokazuju da smanjenje koncentracije citrata dok se povećava koncentracija saharoze (čime se održava izotonični rastvor) povoljno utiče na stabilnost liofilizovanog proizvoda. U isto vreme, dobijeni su dokazi da ALX-0081 zahteva dovoljno visoku koncentraciju citrata da bi se dobila poboljšana rastvorljivost. Stoga je odlučeno da se proceni uticaj koncentracije citrata i saharoze na izgled rastvora tokom skladištenja na 5°C i 25°C, i da se ponovo proceni stabilnost zamrzavanja i odmrzavanja u prisustvu nižih koncentracija citrat.

7.11.1 Procena uticaja koncentracije citrata/saharoze

[0273] U prvom eksperimentu, 12 različitih formulacija ALX-0081 su čuvane na 5°C i 25°C do 4 dana. Uzorci su redovno pregledani za zamućenost ili prisustvo taloga. Slike uzete nakon 4 dana skladištenja prikazane su na slikama 8 i 9. Pregled različitih formulacija i odgovarajućih rezultata prikazan je u Tabeli 11. Nakon 4 dana skladištenja na 25°C svi uzorci su ostali bistri i bezbojni (slika 8, panel A). Nasuprot tome, kod 5°C većina citratnih formulacija bez ekscipijenasa je postala mutna (slika 8, panel B). Jasno je da je stepen zamućenosti obrnuto proporcionalan koncentraciji citrata, pri čemu formulacija citrata od 50 mM ostaje bistra. Takođe, uzorak za uzorak koji sadrži 15 mM citrata bio je 68% (na osnovu A277 nakon 20 h uskladištenja), dok su ostali oporavci varirali od 90 do 100% (podaci nisu prikazani). Dodavanje saharoze u 15 mM formulaciju citrata sprečilo je nejasnost uzorka, mada je pri najnižoj koncentraciji saharoze (tj.5%) detektovana neka manja zamućenost na 5°C (Slika 9, panel B).

[0274] Posmatranja potvrđuju značaj dovoljno visoke koncentracije citrata u održavanju rastvorljivog ALX-0081, naročito na niskoj temperaturi. Ipak, povećanje koncentracije citrata rezultiralo je povećanim sadržajem vlage. Neočekivano, smanjenje koncentracije citrata može se kompenzovati dodavanjem saharoze. Nije primećen efekat Tween-80 na rastvorljivost.

7.11.2 Procena FT stabilnosti

[0275] Kontrolni eksperiment se fokusirao na stabilnost FT nekoliko formulacija na bazi citrata/saharoze. Devet različitih formulacija ALX-0081 podvrgnuto je 5 uzastopnih FT ciklusa na -20°C. Pregled ispitivanih formulacija i odgovarajućih rezultata prikazan je u

1

Tabeli 12. Svi uzorci su ostali jasni i FT ciklusi nisu uticali na fizičku stabilnost vWF sredstava za vezivanje, npr. ALX-0081, na osnovu analize sadržaja i podataka SE-HPLC.

7.11.3 Optimizacija koncentracije saharoze i citrata u odnosu na izotoničnost [0276] Na osnovu gore pomenutih rezultata skladištenja i FT, optimalna koncentracija citratnog pufera je izabrana kao 20 mM. Završni eksperiment je izveden na tri formulacije koje se razlikuju u koncentraciji saharoze. Cilj ovog eksperimenta je bio da se utvrdi optimalna koncentracija saharoze za postizanje izotonične formule i da se potvrdi FT stabilnost ALX-0081 na 20 mg/mL. Pored 5 uzastopnih FT ciklusa, svaka formulacija je takođe bila podvrgnuta ciklusu od 1 FT praćenog 24-časovnim skladištenjem na 25°C i dodatnim FT ciklusom kako bi se oponašali koraci rukovanja tokom proizvodnje.

[0277] Rezime rezultata dat je u Tabeli 13. Sve ispitivane formulacije su bile jasne, a različiti postupci nisu imali uticaj na sadržaj/oporavak ili osmolalnost. Na osnovu vrednosti osmolalnosti izgleda da je koncentracija 7% saharoze optimalna za dobijanje izotoničnog rastvora.

7.12 Ispitivanje stabilnosti liofilizovanih formulacija ALX-0081 koje se čuvaju na različitim temperaturama do 12 meseci

[0278] ALX-0081 formulisan na 12.5 mg/mL u 20 mM citratnom puferu pH 6.5, 7% saharozi (w/v) i 0.01% Tween-80 (v/v) je liofilizovan u skladu sa uslovima datim u Tabeli 14. Uzorci su posle toga skladišteni na -20°C (±5°C), 5°C (±3°C), 25°C (±2°C/60±5% RH) i 40°C (±2°C/75±5% RH).

[0279] Stabilnost liofilizovanih formulacija je procenjivana u različitim vremenskim tačkama, tj. početni, 1 mesec, 3 meseca, 6 meseci, 9 meseci i 12 meseci, i procenjena je na čistoću, izgled, fizičko-hemijska svojstva i potenciju.

Detaljni podaci karakterizacije uzorka dati su u tabelama 15 do 23.

Čistoća uzoraka je procenjena pomoću RP-HPLC u kojoj je određen procenat srednje površine maksimuma, kao i procenat površina pre i posle maksimuma. Koncentracija proteina određena je UV apsorbancijom.

Dalje, liofilizirani uzorci su vizuelno pregledani, rekonstituisani i rekonstituisana formulacija je vizuelno pregledana. PH uzoraka nakon rekonstitucije je meren i sadržaj vlage u liofilizovanom prahu je određen kulometrijskom titracijom (Karl Fišer). Merenja broja čestica su vršena da bi se izračunale čestice ≥10 µm i ≥25 µm. Uzorci su dalje okarakterisani

2

za biološku funkciju korišćenjem testa zasnovanog na biacore-u. Potencija je izražena kao procenat relativne potentnosti referentnog materijala.

[0280] Dobijeni podaci o stabilnosti pokazuju da karakteristike liofilizovanog proizvoda ALX-0081 nisu značajno pogođene tokom 12 meseci čuvanja na -20°C ili 5°C. Nađeno je da su podaci prikupljeni tokom studije stabilnosti na tim temperaturama uporedivi sa onima generisanim u nultom vremenu.

[0281] Uočeno je nekoliko manjih promena za uzorke uskladištene na 25°C ili 40°C što se može pripisati ubrzanim ili naglašenim uslovima skladištenja. Glavna zapažanja su bila:

∘ Na 25°C i na 40°C uočeno je povećanje post-maksimuma 2 na RP-HPLC tokom skladištenja od 12 meseci, što odgovara formiranju varijante piroglutamata od 0.7% do 1.1% ili do 2.4% respektivno.

∘ Na 40°C povećanje sadržaj vlage od 0.7% do 2.1% (w/w) nakon 12 meseci zabeleženo je skladištenje. Ovo se potencijalno može pripisati unosu vlage iz skladišnog okruženja (tj.75% RH) od čepa, sa naknadnom postepenom difuzijom u proizvod.

[0282] Rezultati dobijeni u uslovima naprezanja ukazuju na korelaciju između sadržaja vlage i hemijske stabilnosti proizvoda; ovo odgovara podacima koji su prethodno prijavljeni u Odeljku 7.10.

Dakle, ovi podaci ukazuju na važnost kontrole sadržaja vlage DP proizvoda tokom skladištenja.

Imajući u vidu da se skladištenje 40°C može smatrati prediktivnim za dugoročnu stabilnost na 25°C, podaci o stabilnosti od 12 meseci koji su ovde uključeni pružaju dobru indikaciju za dugotrajnu stabilnost skladištenja na sobnoj temperaturi (kao što su 18, 24, 30 ili 36 meseci), pa čak i produžene stabilnosti kada se čuvaju u blažim uslovima (npr. 5°C ili zamrznuti).

7.13 In vitro ispitivanje o uporedivosti biološke aktivnosti tečne i liofilizovane formulacije leka anti-vWF Nanotela kaplacizumaba (ALX-0081)

7.13.1 Predmet

[0283] Brojni testovi su korišćeni za procenu in vitro kompatibilnosti istovremenog ALX-0081 DP [tečna formulacija koja sadrži 5 mg/mL aktivnog farmaceutskog sastojka (API) u fosfatnom (D-PBS) puferu koji sadrži 200 mM glicina i 0.02 % Tween-80 (v/v), pH 7.1] i liofilizirana formulacija ALX-0081 DP kao što je gore prikazano [formulisano na 12.5 mg/mL u 20 mM citratnom puferu pH 6.5, 7% saharoze (w/v) i 0.01% Tween-80 (v/v)] u odnosu na biološko aktivnost i vezivanje cilja:

a) Analiza potencije na bazi Biacora

b) Analiza potencije na bazi ELISA

c) Farmakodinamički biomarker za analizu kofaktorske aktivnosti indukovane Ristocetinom (RICO)

d) Određivanje afiniteta na bazi Gyrolaba

Ovi testovi su omogućili uporedno poređenje tečnog i liofilizovanog leka ALX-0081 (kaplacizumab). Za procenu uporedivosti za svaki test korišćeni su unapred definisani kriterijumi uporedivosti i navedeni su u Tabeli 24.

7.13.2 Postupci

[0284]

a) Biacore test se zasniva na tehnologiji površinske plazmonske rezonance (SPR) i meri avidno vezivanje ALX-0081 za humani vWF A1-domen imobilizovan na senzorskom čipu. Test je odabran za ispitivanje potencijala pri oslobađanju i stabilnosti.

b) Test jačine zasnovan na ELISA-i je ortogonalni postupak za ispitivanje potencijala ALX-0081 koja je razvijena za dalju karakterizaciju kapaciteta neutralizacije ciljne kaplacizumaba. Ovaj test meri inhibiciju vezivanja von Vilebrandovog faktora (vWF) izazvanog ristocetinom do vezanog trombocita pomoću kaplacizumaba.

c) RICO test se koristi kao farmakodinamički marker za farmakološku aktivnost kaplacizumaba. Analiza meri brzinu i stepen do koga humani liofilizovani trombociti formiraju agregate nakon dodavanja antibiotika ristocetina, koji imitira pomično indukovanu aktivaciju vWF.

d) Analiza zasnovana na Gyrolab-u analizira kinetičke interakcije kaplacizumaba sa njegovim multimernim ciljanim vWF i određuje konstantu afiniteta kaplacizumaba prema humanim multimernim vWF. Ukratko, određivanje afiniteta na platformi Gyrolaba je utvrđeno na sledeći način: Gyrolab Bioaffy 1000 CDs-ovi su upotrebljeni. Kao alat za hvatanje, 3000 nM postojeći biotinilovani prečišćeni vWF (prečišćeni HaemateP korišćenjem hromatografije sa isključenjem veličine) je primenjen na kolone koje su prethodno upakovane sa zrncima obloženim streptavidinom. Za razblaživanje alata za hvatanje korišćen je D-PBS koji sadrži 0.01% Tween-20 za filtriranje. Serija 1/3 razblaženja prečišćenog vWF HaemateP je prethodno inkubirana 24 sata na RT (+20°C) na ploči sa 96 udubljenja na rotoru na 600 rpm sa fiksnom koncentracijom kaplacizumaba

4

(5 pM) u AD1 puferu (Analizni pufer za razblaživanje za krivu doznog odgovora). Posle 24 sata, ploča je centrifugirana 1 minut na 200 g. 70 µL pre-inkubacione smeše, koja sadrži slobodne molekule kaplacizumaba, uneseno je u PCR ploču sa dubokim udubljenjem. Zatim je ova smeša proticala preko kolone tako da se slobodni kaplacizumab mogao vezati za biotinilovani vWF imobilizovan na koloni. Sistem Gyrolab automatski prenosi smešu u triplikatu na CD-ove. Slobodni kaplacizumab je detektovan sa 50 nM AlexaFluor647-obeleženim anti-kaplacizumab monoklonskim antitelom razblaženim u Rexxip F puferu (komercijalno dostupni pufer za detekciju). Izvršena su tri nezavisna eksperimenta da bi se odredio konačni KD. Fluorohromi su bili pobuđeni crvenim laserom tako da su fluorescentni signali dobijeni i pojačani fotomultiplikacionom cevi (PMT). Nivo amplifikacije ovog testa je bio 1% PMT. Za KD-određivanje kaplacizumaba korišćen je nepoznati model za analizu liganda. Analiza je izvedena sa softverom XL fit radne stanice Gyrolaba.

7.13.3 Rezultati

[0285]

a) Relativna potentnost tečnih i liofilizovanih ALX-0081 test uzoraka je merena u Biacore testu jačine, u odnosu na ALX-0081 referentni materijal koji je korišćen u testu jačine, takođe označen master referentni standard 2 (MRS-2). Relativna potentnost je bila 102.8% odnosno 102.9%, što ukazuje na potpunu uporedivost u odnosu na biološku potenciju određenu putem Biacore-a (videti tabelu 24).

b) Relativna potentnost tečnih i liofilizovanih ALX-0081 test uzoraka je određena u ELISA testu zasnovanom na potenciji, u odnosu na MRS-2. Relativne vrednosti potencije bile su 99.4% i 109.5%, respektivno, i prema tome u okviru kriterijuma uporedivosti (videti tabelu 24). Prema tome, ovi rezultati ukazuju da su obe formulacije uporedive u odnosu na potenciju određenu putem ELISA.

c) RICO-aktivnost tečnog i liofilizovanog ALX-0081 test uzorka je merena u uporednom poređenju, i određena je koncentracija za potpuno blokiranje RICO aktivnosti (<20%). Koncentracija koja potpuno blokira RICO aktivnost (<20%) bila je ≤ 0.4 µg/mL za obe formulacije. Ovi rezultati su u skladu sa kriterijumima uporedivosti (videti tabelu 24) i ukazuju na potpunu uporedivost u pogledu farmakodinamičke aktivnosti obe formulacije. d) Afinitetna konstanta (KD-vrednost) tečnih i liofilizovanih ALX-0081 test uzoraka je takođe određena u uporednom poređenju u testu na bazi Gyrolaba. KD-vrednosti su bile 6.84 pM i 4.46 pM, respektivno, sa preklapajućim intervalima pouzdanosti. Prema tome, ovi rezultati ukazuju na potpunu uporedivost obe formulacije u odnosu na afinitet za multimerni ciljni vWF (videti tabelu 24).

7.13.4 Zaključak

[0286] Cilj ove studije bio je da se proceni in vitro kompatibilnost tečnog i liofilizovanog leka ALX-0081 (kaplacizumab) pomoću četiri testa, sposobna da proceni in vitro biološkoj aktivnosti i ciljnom vezivanju:

a) Analiza potencije na bazi Biacora

b) Analiza potencije na bazi ELISA

d) Određivanje afiniteta na bazi Gyrolaba

[0287] Svi in vitro testovi ispunili su predefinisane kriterijume prihvatljivosti i pokazali da su obe formulacije ALX-0081 uporedive u smislu biološke aktivnosti i ciljnog vezivanja (videti Tabelu 24). Ispitivane tečne i liofilizovane formulacije ALX-0081 DP pokazale su:

• sličnu relativnu potenciju određenu putem Biacore i ELISA testa

• uporedivu farmakodinamičku aktivnost in vitro (ciljna neutralizacija) putem RICO testa

• uporediv ciljni afinitet preko Gyrolab testa.

7.14 Ubrzano i dugotrajno ispitivanje stabilnosti tečnih i liofilizovanih ALX-0081 formulacija.

[0288] Dodatno uz Primer 7.12, eksperimenti nezavisne stabilnosti su izvedeni upotrebom različite serije ALX-0081 iste formulacije [20 mM citratni pufer pH 6.5, 7% saharoze (w/v) i 0.01% Tween-80 (v/v)] .

Stabilnost i liofilizirane i tekuće formulacije je ispitivana na različitim temperaturama:

• Tečna formulacija 13.8 mg/mL ALX-0081 u 20 mM citratnom puferu pH 6.5, 7% saharoze (w/v) i 0.01% Tween-80 (v/v) je čuvana na temperaturama ≤ -60°C i 5°C (±3°C) i ispitivan na stabilnost u različitim vremenskim tačkama, tj. početni, 9 meseci, 12 meseci, 18 meseci i 24 meseca.

• Liofilizovana formulacija od 12.7 mg/mL ALX-0081 u 20 mM citratnom puferu pH 6.5, 7% saharoze (w/v) i 0.01% Tween-80 (v/v) je čuvana na 5°C (±3°C), 25°C (± 2°C/60±5% RH) i 40°C (±2°C/75±5% RH). Slično tekućoj formulaciji, stabilnost liofilizirane formulacije je određena na 0, 9, 12, 18 i 24 meseca.

[0289] U svakoj vremenskoj tački hemijska i fizička stabilnost uzoraka je praćena korišćenjem brojnih analitičkih tehnika, uključujući KLEF, RP-HPLC, SE-HPLC, vizuelni izgled, pH i UV apsorpciju. Sadržaj vlage u liofilizovanom prahu određen je kulometrijskom titracijom. Relativna jačina tečnog i liofilizovanog uzorka je merena u Biacoru u odnosu na interni referentni standard ALX-0081.

Detaljni podaci karakterizacije uzoraka za tečne i liofilizovane formulacije dati su u tabelama 25 do 26 i u tabelama 27 do 29. respektivno. Uzorci koji ispunjavaju kriterijume navedene u koloni 2 svake od iznad navedenih tabela smatraju se unutar specifikacija proizvoda.

[0290] Dobijeni podaci pokazuju da je izumljena formulacija veoma stabilna najmanje 24 meseca. Fizičko-hemijske karakteristike kao i biološka aktivnost liofilizovanog ALX-0081 nisu značajno pogođene 24-mesečnim skladištenjem na 5°C ili 25°C. Prilikom 24-mesečnog naprezanja ALX-0081 na 40°C primećeno je povećanje post-pik 2, što odgovara formiranju varijante piroglutamata od 1.1% u početnom materijalu do 2.8%, 3.2%, 4.2% i 6.2% posle 9, 12, 18 i 24 meseca.

Skladištenje tečnih formulacija ALX-0081 najmanje 24 meseca na temperaturama ≤ -60°C ili na 5°C nije značajno uticalo na njegovu fizičko-hemijsku stabilnost: vrednosti su bile stabilne, uzorci su ostali jasni i clEF, RP-HPLC i SE-HPLC profili početnog materijala su bili uporedivi sa onima u uzorcima stabilnosti.

[0291] Promene koje su prijavljene za liofilizovane uzorke uskladištene na 40°C mogu se pripisati uslovima naprezanja skladištenja i pružiti dobru indikaciju za dugoročnu stabilnost skladištenja u blažim uslovima.

Dugoročna predviđanja stabilnosti

[0292] Postojeće specifikacije lekova navode da je dozvoljeni procenat piroglutamata ≤ 4%. Na osnovu ove specifikacije i podataka o trenutnoj stabilnosti, korišćena je Arenijusova jednačina da se predvidi rok trajanja liofilizovanog leka na 5°C i 25°C. Arenijusova jednačina je tačna formula koja opisuje temperaturnu zavisnost brzina reakcije koja se obično koristi u farmaceutskoj industriji. Kao što je prikazano na slikama 10 i 11, očekuje se da će liofilizovani lek ostati unutar specifikacija najmanje 500 meseci kada se čuva na 5°C i najmanje 60 meseci kada se čuva na 25°C.

7.15 Opšti zaključak

[0293] Pronalazak za reformulaciju vWF sredstava za vezivanje, a posebno ALX-0081 koji je ovde opisan, daje novu formulaciju na bazi citrata/saharoze sa poboljšanom rastvorljivošću (do 80 mg/mL) i značajno poboljšanom stabilnošću skladištenja tečnosti (npr. manje oksidacije u odnosu na originalnu formulaciju). Takođe, u liofilizovanom obliku, u suštini nema oksidacije ili asp-izomerizacije nakon 12 ili čak 24 meseca čuvanja na 40°C. Dalja optimizacija koncentracije citrata i saharoze rezultirala je smanjenjem sadržaja vlage u liofiliziranom proizvodu, čime se minimizira brzina formacije piroglutamata. Pokazano je da su na svaku fizičko-hemijsku karakteristiku vWF sredstva za vezivanje različito uticali različiti sastojci, fizički i hemijski, formulacije, kao što je izbor pufera, pH, koncentracija, ekscipijent, itd. ili sprečavanje različitih hemijskih i/ili fizičkih naprezanja.

Dizajniran je jedan pufer za formulaciju koji je ispunio najviše kritične kriterijume: 20 mM citrat pH 6.5 7.0% saharoza (w/v) 0.01% Tween-80 (v/v). Koristeći ovu formulaciju, pokazano je da je ALX-0081 stabilan najmanje 12 ili čak 24 meseca na -20°C, 5°C, 25°C i 40°C. Ovi podaci jasno ukazuju na znatno duži rok upotrebe na 5°C od tekuće formulacije. Pored toga, pronalazači su u velikoj meri pokazali da je istovremena formulacija ALX-0081 koja je do sada korišćena u kliničkim studijama uporediva sa novo optimizovanom liofilizovanom formulacijom ALX-0081 koja je ovde prikazana u smislu in vitro biološke aktivnosti i ciljnog vezivanja.

Tabela A-1: Primeri vWF sredstva za vezivanje

Naziv SEQ Sekvenca

1

Tabela A-2

2 Naziv SEQ Sekvenca

Tabela 1. Pregled 50 različitih kombinacija pufera/ekscipijenasa predviđenih programom stručnjaka za dizajn da bi se postigle najviše temperature topljenja za ALX-0081.

Kombinacije pufera/ekscipijenasa se rangiraju prema Tm vrednosti. Različiti tipovi pufera prikazani su u različitim nijansama sive.

4

Tabela 2. Ispitivanje rastvorljivosti ALX-0081 u različitim formulacijama pufera.

Tabela 3. Pregled tečnih ALX-0081 formulacija procenjenih u skladištenju i stabilnosti FT, zajedno sa izmerenim vrednostima pH i osmolalnosti.

Tabela 4. Pregled studije stabilnosti skladištenja različitih ALX-0081 formulacija. Navedene su vremenske tačke, temperature skladištenja i metode.

Tabela 6. Pregled liofiliziranih/tečnih ALX-0081 formulacija procenjenih u probi stabilnosti skladištenja.

Tabela 7. Oporavak ALX-0081 u različitim formulacijama nakon liofilizacije i rekonstitucije na osnovu ukupnih površina prikazanih pomoću RP-HPLC i SE-HPLC.

Tabela 9. Pregled ALX-0081 formulacija procenjenih u probi stabilnosti skladištenja.

Tabela 10. Sadržaj vlage u liofilizovanim uzorcima ALX-0081 i relativne količine piroglutamata detektovane na RP-HPLC nakon 4 nedelje čuvanja na 40°C.

Tabela 11. Rezultati vizuelnog pregleda formulacije ALX-0081 tokom skladištenja na 5°C i 25°C. " " = bistro, "+/-" = malo zamućeno, "-" = mutno "h" = sat, "d" = dani.

Tabela 12. Rezultati vizuelne kontrole, sadržaja i SE-HPLC analize ALX-0081 formulacija nakon 5 uzastopnih FT ciklusa na -20°C (* u poređenju sa kontrolnim uzorkom tečnosti koji se čuva na ≤-70°C). ;;; ;;;; 1 ; ;; Tabela 13. Rezultati vizuelne inspekcije, oporavka i merenja osmolalnosti formulacija ALX-0081 nakon 5 uzastopnih FT ciklusa na -20°C ili nakon 1 FT ciklusa 24h skladištenja 1 FT ciklus (*u poređenju sa kontrolnim uzorkom tečnosti držanim na ≤-70°C).

Tabela 14. Parametri liofilizacije.

2

Tabela 15. RP-HPLC analiza glavnog maksimuma (čistoće) ALX-0081 formulacije [12.5 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (w/v) u 20 mM citratnom puferu pH 6.5].

Tabela 16. Analiza RPC pre en post vršne analize ALX-0081 formulacije [12.5 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (w/v) u 20 mM citratnom puferu pH 6.5].

4

Tabela 17. Koncentracija proteina dobijena UV za ALX-0081 formulaciju [12.5 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (w/v) u 20 mM citratnom puferu na pH 6.5].

Tabela 18. SE-HPLC analiza formulacije ALX-0081 [12.5 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (w/v) u 20 mM citratnom puferu pH 6.5].

Tabela 19. Rezultati fizičkih testova na liofilizovanom ALX-0081 čuvani su na -20°C [12.5 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (v/v) u 20 mM citratnom puferu pri pH

6.5].

Tabela 20. Rezultati fizičkih testova na liofilizovanom ALX-0081 čuvani su na 5°C [12.5 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (v/v) u 20 mM citratnom puferu pri pH

6.5].

Tabela 21. Rezultati fizičkih testova na liofilizovanom ALX-0081 čuvani su na 25°C/60% [12.5 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (w/v) u 20 mM citratnom puferu pri pH 6.5].

1

Tabela 22. Rezultati fizičkih testova na liofilizovanom ALX-0081 čuvani su na 40°C/75%RH [12.5 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (w/v) u 20 mM citratnom puferu pri pH 6.5].

1 1

Tabela 23. Potentnost rezultata ALX-0081 formulacije [12.5 mg/mL API, 0.01% Tween-80

(v/v) i 7% saharoze (w/v) u 20 mM citratnom puferu na pH 6.5].

1 2

1

Tabela 24. In vitro komparativnost rezultata kaplacizumaba.

1 4

Tabela 25. Stabilnost rezultata tečnog ALX-0081 čuvani su na ≤-60°C [13.8 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (v/v) u 20 mM citratnom puferu pri pH 6.5].

1

Tabela 26. Stabilnost rezultata tečnog ALX-0081 čuvani su na 5°C ±3°C [13.8 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (w/v) u 20 mM citratnom puferu pri pH 6.5].

1

Tabela 27. Stabilnost rezultata liofilizovanog ALX-0081 čuvanog na 5°C ±3°C [12.7 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (w/v) u 20 mM citratnom puferu pri pH

6.5].

1

1 Tabela 28. Stabilnost rezultata liofilizovanog ALX-0081 čuvanog na 25°C (±2°C/60±5% RH) [12.7 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (w/v) u 20 mM citratnom puferu pri pH 6.5].

11

Tabela 29. Stabilnost rezultata liofilizovanog ALX-0081 čuvanog na 40°C (±2°C/75±5% RH) [12.7 mg/mL API, 0.01% Tween-80 (v/v) i 7% saharoze (w/v) u 20 mM citratnom puferu pri pH 6.5].

Ekvivalenti

[0294] Smatra se da je iznad navedena pisana specifikacija dovoljna da omogući stručnjaku da praktikuje pronalazak. Predmetni pronalazak ne treba da bude ograničen obimom uz pomoć datih primera, pošto su primeri namenjeni kao jedna ilustracija jednog aspekta pronalaska.

11

12

1

11

12

1

��

1

�

��

�

Claims

Patentni zahtevi

1. Formulacija koja sadrži sredstvo za vezivanje von Vilebrandovog faktora (vWF), citratni pufer, saharozu i Tween-80, gde:

(a) vWF sredstvo za vezivanje ima koncentraciju od 10 mg/mL do 40 mg/mL;

(b) saharoza ima koncentraciju 7% (w/v);

(c) Tween-80 ima koncentraciju 0.01% (v/v); i

2. Formulacija prema patentnom zahtevu 1, gde je pomenuto vWF sredstvo za vezivanje SEQ ID NO:1.

3. Formulacija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde

(a) vWF sredstvo za vezivanje ima koncentraciju od 10 mg/mL do 12.5 mg/mL.

4. Formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde

(a) vWF sredstvo za vezivanje ima koncentraciju od 10 mg/mL ili 12.5 mg/mL.

5. Formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, koja ima:

(i) manje od 5% vrsta visoke molekulske mase (HMW) nakon skladištenja najmanje 12 meseci na 5°C; i/ili

(i) manje od 5% vrsta niske molekulske mase (LMW) nakon skladištenja najmanje 12 meseci na 5°C.

6. Formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu vWF sredstvo za vezivanje u formulaciji zadržava najmanje oko 80% svoje stabilnosti nakon skladištenja najmanje 12 meseci na 5°C.

7. Formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, pri čemu najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, poželjnije najmanje 95% ili čak najmanje 99% vWF sredstva za vezivanje zadržava svoju aktivnost vezivanja nakon skladištenja u poređenju sa aktivnošću vezivanja pre skladištenja, pomenuta aktivnost vezivanja merena je pomoću ELISA i/ili Biacore.

8. Formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, koja je tečna ili rekonstituisana liofilizovana formulacija koja sadrži:

(b) saharozu u koncentraciji 7% (w/v);

(c) Tween-80 u koncentraciji 0.01% (v/v); i

(d) citratni pufer u koncentraciji od 20 mM, tako da je pH formulacije 6.5.

9. Formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, koja je grupno skladištena formulacija koja sadrži:

(b) saharozu u koncentraciji 7% (w/v);

(c) Tween-80 u koncentraciji 0.01% (v/v); i

(d) citratni pufer u koncentraciji od 20 mM, tako da je pH formulacije 6.5;

pri čemu se najmanje 100 litara formulacije skladišti u uslovima ispod temperature smrzavanja.

10. Formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, koja je u tečnom, liofilizovanom, osušenom raspršivanjem, rekonstituisanom liofilizovanom ili smrznutom obliku.

11. Postupak ili proces za pripremu formulacije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, gde navedeni postupak ili proces obuhvata korake:

- ekspresiju vWF sredstva za vezivanje u kulturi ćelija;

- prečišćavanje vWF sredstva za vezivanje prolaskom vWF sredstva za vezivanje preko najmanje jednog koraka prečišćavanja hromatografijom i koraka ultrafiltracije/dijafiltracije;

- podešavanje koncentracije vWF sredstva za vezivanje na 10 do 40 mg/mL, poželjno 12.5 mg/mL, u formulaciji koja sadrži:

(i) saharozu u koncentraciji 7% (w/v);

(ii) Tween-80 u koncentraciji 0.01% (v/v); i

(ii) citratni pufer u koncentraciji od 20 mM, tako da je pH formulacije 6.5.

12. Postupak za pripremanje rekonstituisane formulacije prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, gde navedeni postupak obuhvata korake: (i) liofilizaciju smeše vWF sredstva za vezivanje, lioprotektanta, surfaktanta i pufera, čime se formira liofilizovana smeša; i (ii) rekonstituisanje liofilizovane smeše u razblaživaču, pri čemu se priprema formulacija, pri čemu rekonstituisana formulacija sadrži

(b) saharoza u koncentraciji 7% (w/v);

(c) Tween-80 u koncentraciji 0.01% (v/v); i

(d) citratni pufer pri koncentraciji od 20 mM, tako da je pH formulacije 6.5.

13. Komplet ili proizvodni artikl, koji sadrži kontejner koji sadrži formulaciju bilo kog od patentnih zahteva 1-10 i uputstva za upotrebu.

14. Komplet ili proizvod iz patentnog zahteva 13, gde je formulacija prisutna u bočici ili injekcionom špricu.

1