RS58868B1

RS58868B1 - Poboljšane adjuvansne formulacije koje sadrže agoniste tlr4 i postupci upotrebe istih

Info

Publication number: RS58868B1
Application number: RS20190701A
Authority: RS
Inventors: Christopher Fox; Steven G Reed; Susan Baldwin; Thomas Vedvick
Original assignee: Infectious Disease Res Inst
Priority date: 2012-02-07
Filing date: 2013-02-07
Publication date: 2019-08-30
Also published as: SMT201900324T1; US20230116042A1; ZA201405890B; EP3563834A1; ZA201805284B; LT2811981T; US20150017191A1; EP2811981A4; PT2811981T; HRP20190960T1; SI2811981T1; CY1121666T1; US11510875B2; DK2811981T3; EP2811981A1; HUE044841T2; TR201908003T4; EP2811981B1; CN104363892A; CN110339160A

Description

Opis pronalaska

POZNATO STANJE TEHNIKE

Oblast tehnike na koju se pronalazak odnosi

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast farmaceutskih i formulacija vakcina. Određenije, primeri izvođenja koji su ovde opisani se odnose na farmaceutske i formulacije vakcina, posebno na emulzije ulja u vodi, pri čemu kompozicije sadrže agonistu TLR4, kao što je glukopiranozilni lipidni adjuvans (GLA).

Opis srodnog stanja tehnike

[0002] Imuni sistem viših organizama je okarakterisan kao sposoban da razlikuje strane agense (ili "agense koji nisu sopstveni") od poznatih ili "sopstvenih" komponenti, tako da strani agens izaziva imuni odgovor dok se "sopstvene" komponente ignorišu ili tolerišu. Imuni odgovori su tradicionalno okarakterisani bilo kao humoralni odgovori, u kojima se antitela specifična za antigene proizvode od strane diferenciranih B-limfocita poznatih kao plazma ćelije, ili odgovori posredovani ćelijama, u kojima različiti tipovi T-limfocita deluju na eliminaciju antigena brojnim mehanizmima. Na primer, CD4+ pomoćne T-ćelije koje su sposobne da prepoznaju specifične antigene, mogu odgovoriti oslobađanjem solubilnih medijatora, kao što su citokini, da bi se regrutovale dodatne ćelije imunog sistema da učestvuju u imunom odgovoru. Isto tako, CD8+ citotoksične T-ćelije, koje su takođe sposobne za specifično prepoznavanje antigena, mogu odgovarati vezivanjem i uništavanjem ili oštećivanjem ćelija ili čestica koje nose antigen. U oblasti imunologije je poznato obezbeđivanje određenih vakcina u vidu raznovrsnih formulacija, obično u svrhu izazivanja želјenog imunog odgovora kod domaćina.

[0003] Na primer, opisani su određeni emulzioni sistemi za formulisanje adjuvansnih kompozicija, uklјučujući emulzione sisteme sa jednom ili sa više faza. Predloženo je da su adjuvansne emulzija tipa ulja u vodi same po sebi korisne kao adjuvansna kompozicija (EP 0 399 843B), a opisane su takođe kombinacije emulzija ulja u vodi i drugih aktivnih agenasa kao adjuvani za vakcine (WO 95/17210; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241). Drugi uljani emulzioni adjuvansi su opisani, kao što su emulzije vode u ulјu (U.S. Pat. No. 5,422,109; EP 0480982 B2) i emulzije vode u ulјu u vodi (U.S. Pat. No.5.424,067; EP 0480981 B). Alving i saradnici opisuju kompoziciju koja sadrži stabilnu emulziju ulja u vodi i koristi vezikule kao jedini agens stabilizacije, dovoljnu količinu vezikula i dalje, koje vezikule dodatno sadrže imunogene ili terapijske supstance (U.S. Pat. Co. 6,110.492). Publikacija Leesman-a opisuje adjuvansnu kompoziciju koja je stabilna emulzija ulja u vodi i koja sadrži ulјe koje se može metabolisati, surfaktante, antioksidans i komponentu koja čini emulziju izotoničnom (U.S.

2003/0215497; PCT/US99/09978). Sintetski glukopiranozilni lipidni (GLA) adjuvansi su obezbeđeni u US 2010/0310602.

[0004] Uprkos ovim poznatim postupcima proizvodnje emulzionih sistema za pripremu adjuvansnih kompozicija, današnje emulzione adjuvansne kompozicije i dalјe imaju mnogih nedostataka. Shodno tome, postoji potreba za dodatnim, pobolјšanim emulzionim adjuvansnim kompozicijama, kao što su emulzione formulacije ulja u vodi koje sadrže TLR4 agoniste. Kao što je ovde opisano, predmetni pronalazak zadovolјava ove potrebe i nudi druge srodne prednosti.

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0005] Pronalazak je predstavljen u priloženim patentnim zahtevima. Prema jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje emulziju ulja u vodi koja sadrži agonistu TLR4 i ulјe koje se može metabolisati, pri čemu je ulјe koje se može metabolisati prisutno u emulziji tipa ulja u vodi u koncentraciji od oko 0,01%-1% v/v ili poželјno oko 0,01%-0,5% v/v, pri čemu je hidrofobno:lipofilna ravnoteža (HLB) emulzije ulja u vodi veća od oko 9 ili veća od oko 10 ili između oko 9-12 i gde je agonista TLR4 izabran iz grupe koja se sastoji od MPL, 3D-MPL i sintetskog glukopiranozilnog lipidnog adjuvansa (GLA).

[0006] Ovde je takođe obezbeđena emulzija ulja u vodi koja sadrži agonistu TLR4, ulјe koje se može metabolisati i surfaktant, pri čemu je ulјe koje se može metabolisati prisutno u emulziji ulja u vodi u koncentraciji od oko 0,01%-1% v/v ili poželјno oko 0,01%-0,5% v/v. U pojedinim primerima izvođenja, koncentracija ulјa koje se može metabolisati je ispod 1% v/v. U pojedinim primerima izvođenja, hidrofobno:lipofilna ravnoteža (HLB) emulzije ulja u vodi je veća od oko 9 ili veća od oko 10 ili između oko 9-12.

[0007] Agonista TLR4 koji se upotrebljava u emulzijama ulja u vodi pronalaska može biti izabran od TLR4 iz grupe koja se sastoji od MPL, 3D-MPL ili sintetskog GLA adjuvansa.

[0008] U pojedinim primerima izvođenja, sintetski GLA adjuvans ima sledeću strukturu:

ili njegova farmaceutski prihvatlјiva so, gde:

L1, L2, L3, L4, L5i L6su isti ili različiti i nezavisno -O-, -NH- ili -(CH2)-;

L7, L8, L9i L10su isti ili različiti i nezavisno su ili odsutni ili su -C(=O)-;

Y1je funkcionalna grupa kiseline;

Y2i Y3su isti ili različiti i nezavisno -OH, -SH ili funkcionalna grupa kiseline;

Y4je -OH ili -SH;

R1, R3, R5i R6su isti ili različiti i nezavisno C8-13alkil; i

R2i R4su isti ili različiti i nezavisno C6-11alkil.

[0009] U pojedinim primerima izvođenja sintetske GLA strukture, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C10alkil; i R<2>i R<4>su C8alkil.

[0010] Na primer, u specifičnijem primeru izvođenja, emulzija ulja u vodi sadrži sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0011] U određenim primerima izvođenja prethodno navedene GLA strukture, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; i R<2>i R<4>su C12-C20alkil. U specifičnijem primeru izvođenja, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; i R<2>i R<4>su C13alkil. U još jednom specifičnijem primeru izvođenja, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C10alkil; i R<2>i R<4>su C8alkil.

[0012] U određenim primerima izvođenja prethodno navedene GLA strukture, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; i R<2>i R<4>su C9-C20alkil. U određenim primerima izvođenja, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; a R<2>i R<4>su C9alkil.

[0013] U određenim primerima izvođenja, emulzija ulja u vodi sadrži sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0014] U određenim primerima izvođenja prethodno navedene GLA strukture, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; i R<2>i R<4>su C9-C20alkil. U određenim primerima izvođenja, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; a R<2>i R<4>su C9alkil.

[0015] U određenim primerima izvođenja, emulzija ulja u vodi sadrži sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0016] U određenim primerima izvođenja prethodno navedene GLA strukture, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; i R<2>i R<4>su C9-C20alkil. U određenim primerima izvođenja, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; a R<2>i R<4>su C9alkil.

[0017] U određenim primerima izvođenja, emulzija ulja u vodi sadrži sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0018] U određenim primerima izvođenja prethodno navedene GLA strukture, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; i R<2>i R<4>su C9-C20alkil. U određenim primerima izvođenja, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; a R<2>i R<4>su C9alkil.

[0019] U određenim primerima izvođenja, emulzija ulja u vodi sadrži sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0020] U određenim primerima izvođenja, emulzija ulja u vodi sadrži sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0021] U određenim primerima izvođenja, emulzija ulja u vodi sadrži sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0022] Podrazumeva se da emulzije pronalasku mogu uklјučivati druge komponente koje su neophodne ili poželјne za želјeni efekat. Na primer, emulzije ulja u vodi pronalaska u pojedinim primerima izvođenja dalјe sadrže 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DMPC). U pojedinim primerima izvođenja, DMPC u emulzijama ulja u vodi je sintetski. U pojedinim primerima izvođenja, emulzija ulja u vodi sadrži 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosholin (POPC). U pojedinim primerima izvođenja, POPC u emulzijama ulja u vodi je sintetski. U pojedinim primerima izvođenja, emulzija ulja u vodi sadrži 1,2-dioleoil-snglicero-3-fosfoholin (DOPC). U pojedinim primerima izvođenja, DOPC u emulzijama ulja u vodi je sintetski. U drugim primerima izvođenja, emulzije dalјe sadrže surfaktant, kao što je Pluronic F68. U još drugim primerima izvođenja, emulzije dodatno sadrže antioksidans, kao što je vitamin E.

[0023] Ulјe koje se može metabolisati i koje se koristi u emulzijama pronalaska, može biti izabrano iz bilo koje vrste raspoloživog izvora. U određenim primerima izvođenja, ulјe koje se može metabolisati sadrži skvalen. U drugim primerima izvođenja, ulјe koje se može metabolisati sadrži skvalen dobijen iz kvasca. U još nekim drugim primerima izvođenja, ulјe koje se može metabolisati sadrži izoprenoid iz kvasca koji je strukturno različit od skvalena.

[0024] Naravno, podrazumeva se da emulzije mogu biti upotrebljene u prisustvu jednog ili više antigena da bi se indukovali imuni odgovori specifični za antigen. Alternativno, emulzije mogu biti upotrebljene u odsustvu antigena da bi se izazvao nespecifičan imuni odgovor.

[0025] Prema drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje emulziju ulja u vodi koja sadrži agonistu TLR4 izabranog od MPL, 3D-MPL i sintetskog GLA adjuvansa, ulјe koje se može metabolisati i DMPC ili DOPC. U pojedinim primerima izvođenja, koncentracija ulјa koje se može metabolisati u emulziji ulja u vodi je oko 0,01%-20% (npr. oko 10%, oko 5%, oko 2%, oko 1%, oko 0,5%, oko 0,2%). U pojedinim primerima izvođenja, koncentracija DMPC ili DOPC u emulziji ulja u vodi je oko 0,002%-2%. U pojedinim primerima izvođenja, HLB emulzije je veći od oko 9 ili oko 10. U nekim primerima izvođenja, koncentracija DMPC ili DOPC je od oko 0,015% do 0,25%. U nekim primerima izvođenja, DMPC je DOPC u emulziji i sintetski je.

[0026] U jednom specifičnom primeru izvođenja pronalaska, obezbeđena je emulzija ulja u vodi koja sadrži sintetski GLA adjuvans, ulјe koje se može metabolisati u koncentraciji od oko 0,01%-1% v/v, kao i DMPC u koncentraciji od oko 0,002%-2% DMPC, pri čemu je HLB emulzije veći od oko 10. U pojedinim primerima izvođenja, koncentracija DMPC je od oko 0,015% do 0,25%.

[0027] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuju postupke za stimulaciju imunog odgovora kod subjekta koji podrazumevaju primenu ovde opisane emulzije ulja u vodi subjektu i time stimulaciju imunog odgovora kod subjekta. Naravno, postupci mogu biti upotrebljeni za izazivanje nespecifičnih imunih odgovora, pri čemu emulzije ne sadrže antigen. Uobičajenije je da će emulzije sadržavati jedan ili više antigena tako da je imuni odgovor tipa imunog odgovora specifičnog za antigen.

[0028] Navedeni i drugi aspekti predmetnog pronalaska će postati očigledni kroz detaljan opis i priložene slike koje slede. Pored toga, ovde se navode razne reference koje detalјnije opisuju određene aspekte ovog pronalaska.

KRATAK OPIS NEKOLIKO ASPEKATA NACRTA

[0029]

Slika 1. Koncentracija GLA tokom vremena u serijama GLA-AF, izmerena upotrebom HPLC-CAD. Isprekidane linije predstavlјaju gornje i donje granice specifičnosti za HPLC postupak.

Slika 2. Odgovori antitela na PfCelTOS vakcine koje sadrže razne adjuvansne formulacije sa dozama emulzije od 0,02% do 2% v/v ulјa, izmereni nakon 2. i 3. imunizacije. Gornji panel sa leva na desno: (a-c) krajnji titri IgG, IgG1 i IgG2a antitela, izmereni 3 nedelјe nakon 2. imunizacije. Donji panel sa leva na desno: (d-f) krajnji titri IgG, IgG1 i IgG2a antitela, izmereni 3 nedelјe nakon 3. imunizacije. (g) Dugoživeće ćelije kosne srži koje luče antitela, detektovane 3 nedelјe nakon 3. imunizacije.

Slika 3. Odgovori antitela na PfCelTOS vakcine koje sadrže razne adjuvansne formulacije sa dozama emulzije od 0,5% do 2% v/v ulјa, izmereni nakon 2. i 3. imunizacije. Gornji panel sa leva na desno: (ac) krajnji titri IgG, IgG1 i IgG2a antitela, izmereni 3 nedelјe nakon 2. imunizacije. Donji panel sa leva na desno: (d-f) krajnji titri IgG, IgG1 i IgG2a antitela, izmereni 3 nedelјe nakon 3. imunizacije. (g) Dugoživeće ćelije kosne srži koje luče antitela, detektovane 3 nedelјe nakon 3. imunizacije.

Slika 4. Antigen-specifične ćelije koje proizvode citokine, detektovane ELISPOT testom 3 nedelјe nakon 3. imunizacije. (a) ćelije koje proizvode IFN-γ, (b) ćelije koje proizvode IL-5.

Slika 5. Proizvodnja citokina specifičnih za antigen, detektovana 3 nedelјe nakon 3. imunizacije, testom sa multipleksnim zrncima (Luminex®). (a) IL-2 (b) IL-5 (c) IL-10 (d) IL-13 (e) IL-17 (f) IFN-γ (g) TNF-α.

Slika 6. Veličina čestica i polidisperznost adjuvansnih formulacija.

Slika 7. Stabilnost veličine čestica emulzije na različitim temperaturama skladištenja. Prikazani su rezultati nakon skladištenja na (a) 5°C (gornji levi grafik), (b) sobnoj temperaturi (gornji desni grafik), (c) 37°C (donji levi grafik) i (d) 60°C (donji desni grafik). Veličina čestica je merena upotrebom APS uređaja firme Malvern Instruments, a rezultati su prikazani sa greškama koje predstavljaju veličinu standardne devijacije za vrednosti koje su dobijene za tri zasebna alikvota iz jedne serije svake emulzije.

Slika 8. Analiza stabilnosti emulzije optičkim profilisanjem rasejanja laserske svetlosti. Integralni profili transmisije regiona od 25 - 30 mm za kivete koji sadrže emulziju, mereni tokom 4 sata na 60°C. Slika 9. Efekat emulzija na odgovore antitelima, indukovane imunizacijom rekombinantnim antigenom malarije. BALB/c miševi su imunizovani dva puta sa PbCSP antigenom formulisanim sa emulzijama koje su sadržavale PC jajeta ili sintetski PC, uklјučujući POPC, DOPC i DMPC. Antigenspecifični IgG (a), IgG1 (b) i IgG2a (c) su određeni ELISA testom. n = 5 po grupi, a podaci su prikazani kao vrednosti za pojedinačne miševe (Log10) u okviru stubića koji predstavlja srednju vrednost. * = pvrednost <0,05 u odnosu na imunizaciju samo sa proteinom.

Slika 10. Efekat adjuvansne formulacije na humoralne imune odgovore indukovane imunizacijom sa inaktiviranom split-vakcinom protiv gripa (Fluzone). BALB/c miševi su imunizovani sa Fluzone vakcinom formulisanom sa emulzijama koje sadrže PC jajeta ili sintetski PC, uklјučujući POPC, DOPC i DMPC. Antigen-specifični IgG (a), IgGl (b) i IgG2a (c) su određeni ELISA testom. Aktivacija plazma ćelija kosne srži koje luče IgG sa Fluzone vakcinom je određena upotrebom ELISPOT testa (d). Rezultati za (a-c) su prikazani kao krajnji titar (Log10), pri čemu svaka tačka predstavlјa vrednosti dobijene kod pojedinačnih miševa, dok stubići predstavlјaju srednje vrednosti. Rezultati za (d) su takođe predstavljeni za pojedinačne miševe u svakoj grupi, sa stubićem koja predstavlјa srednju vrednost ASPC po grupi. * = p-vrednost <0,05 u odnosu na imunizaciju samo sa vakcinom i # = pvrednost <0,05 u odnosu na imunizaciju sa vakcinom koja sadrži DMPC emulziju.

Slika 11. HI titri su pobolјšani imunizacijom sa Fluzone vakcinom formulisanom sa PC jajeta ili sintetskim PC. BALB/c miševi su imunizovani sa Fluzone vakcinom i različitim emulzijama, a zatim su serumski titri HI određivani četiri nedelјe nakon buster doze, (a) HI titri za A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1) komponentu Fluzone vakcine. (b) HI titri za A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) komponentu Fluzone vakcine. Podaci su prikazani kao (Log2) titar za svaku pojedinačnu životinju, sa stubićem koji predstavlјa srednju vrednost. * = p-vrednost <0,05 u odnosu na imunizaciju samo sa vakcinom i # = p-vrednost <0,05 u odnosu na imunizaciju vakcinom koja sadrži POPC emulziju ili DMPC emulziju. Slika 12. Ćelije koje proizvode IL-5 su povećane nakon imunizacije sa Fluzone vakcinom formulisanom sa emulzijama. Splenociti iz BALB/c miševa imunizovanih sa Fluzone vakcinom i raznim emulzijama su stimulisani bilo sa (a) 5 HAU inaktiviranih A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1) ili (b) 2 HAU inaktiviranih A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), pa su ćelije koje proizvode IL-5 detektovane ELISPOT testom. Podaci su predstavlјeni kao broj jedinica obrazovanja spotova (SFU) na milion splenocita i za pojedinačne miševe/grupu, sa stubićem koja predstavlјa srednju vrednost, n = 5 po grupi. * = pvrednost <0,05 u odnosu na imunizaciju samo sa vakcinom i # = p-vrednost <0,05 u odnosu na imunizaciju vakcinom koja sadrži DMPC emulziju.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0030] Predmetni pronalazak u mnogim svojim aspektima obezbeđuje emulzione kompozicije koje sadrže TLR4 agoniste, naročito emulzije ulja u vodi koje sadrže TLR4 agoniste, kao i i srodne postupke upotrebe istih kao adjuvanasa i imunostimulatornih kompozicija, kao što je navedeno u priloženim patentnim zahtevima.

[0031] Kao što je ovde diskutovano, formulacije pronalaska generalno sadrže emulziju ulja u vodi koja sadrži agonistu TLR4 i ulјe koje se može metabolisati, pri čemu je ulјe koje se može metabolisati prisutno u emulziji ulja u vodi u koncentraciji od oko 0,01%-1 % v/v ili oko 0,01%-0,5% v/v i pri čemu je hidrofobno:lipofilna ravnoteža (HLB) emulzije ulja u vodi veća od oko 9 ili veća od oko 10 ili između oko 9 -12.

[0032] Postupci za određivanje HLB emulzije su poznati u stanju tehnile. Pogledati, npr. internet adrese www.firp.ula.ve/archivos/historicos/76_Book_HLB_ICI.pdf i www.chemistscorner.com/hlb-the-easiestvai-create-an-emulsion/.

[0033] Adjuvansi uljanih emulzija za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu biti prirodni ili sintetski i mogu biti mineralni ili organski. Primeri mineralnih i organskih ulјa će biti očigledni za stručnjaka.

[0034] U posebnom primeru izvođenja, kompozicija pronalaska sadrži emulziju ulјa u vodi, gde je agonista TLR4 ugrađen u ulјanu fazu. Da bi kompozicija ulja u vodi bila pogodna za primenu ljudima, ulјana faza emulzionog sistema poželјno sadrži ulјe koje se može metabolisati. Značenje termina “ulјe koje se može metabolisati” je dobro poznato u stanju tehnike. “Koji se može metabolisati” se može definisati kao "sposoban da se transformiše metabolizmom” (Dorland’s illustrated Medical Dictionary, W. B. Saunders Company, 25. izdanje (1974)). Ulјe može biti bilo koje ulje iz biljaka, bilјno ulјe, riblјe ulјe, životinjsko ulјe ili sintetsko ulјe, koje nije toksično za recipijenta i koje se može transformisati metabolizmom. Ulja orašastih plodova (kao što je ulјe kikirikija), semenja i žitarica su uobičajeni izvori bilјnih ulјa. Sintetska ulјa se takođe mogu koristiti.

[0035] U određenim ilustrativnim primerima izvođenja, formulacije predmetnog pronalaska sadrže ulјe koje se može metabolisati tako da je prisutno u koncentraciji od oko 0,01%-1% v/v, oko 0,01%-0,5% v/v, oko 0,5% v/v ili oko 0,2% v/v. U nekim primerima izvođenja, ulјe koje se može metabolisati je prisutno u koncentraciji ispod 1% v/v. Ilustrativna ulјa koje se mogu metabolisati, i koja su prema predmetnom pronalasku korisna, uklјučuju, ali nisu ograničena na, skvalen, sojino ulјe, susamovo ulјe i trigliceride kaprilne/kaprinske kiseline (ulјe MIGLYCOL 810). U jednom poželjnom primeru izvođenja, ulјe koje se može metabolisati sadrži skvalen. U specifičnijem primeru izvođenja, ulјe koje se može metabolisati sadrži jedan ili više izoprenoida iz kvasca, kao što su skvalen iz kvasca ili srodna izoprenoidna struktura izvedena iz kvasca.

[0036] Skvalen (2,6,10,15,19,23-heksametil-2,6,10,14,18,22-tetrakozaheksen) je, na primer, nezasićeno ulјe koje se nalazi u velikim količinama u ulјu ajkule i u manjim količinama u maslinovom ulјu, ulju pšeničnih klica, ulјu piričanih mekinja i kvascu, a naročito je poželјno ulјe za upotrebu u ovom pronalasku. Skvalen je ulјe koje se može metabolisati zbog činjenice da je intermedijer u biosintezi holesterola (Merck index, 10. izdanje, unos br.8619).

[0037] U drugim ilustrativnim primerima izvođenja, određene formulacije pronalaska sadrže antioksidans. Ilustrativni antioksidansi koji su korisni u emulziji predmetnog pronalaska uklјučuju, ali nisu ograničeni na, tokoferol i askorbinsku kiselinu, pri čemu je tokoferol poželjniji.

[0038] U još drugim ilustrativnim primerima izvođenja, određene emulzije pronalaska sadrže surfaktant. Prema predmetnom pronalasku, korisni surfaktanti su Pluronic F68, Tween 80, polisorbat 80 (CAPMUL POE-O low PV surfactant, ABITEC Corp., Janesville, Wis.), polietilen 660 12-hidroksistearat (SOLUTOL HS15, BASF Corp., Chicago, III) i poloksamer 188 (PLURONIC Q F68 block co-polymer, BASF Corp., Chicago, Il.), natrijum holat, glicerodezoksil holat, fosfatidil holin, pri čemu je poloksamer 188 poželjniji. Drugi pogodni srufaktanti uključuju sfingolipide kao što su sfingomijelin i sfingozin, kao i fosfolipide kao što su fosfatidilholin jajeta, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin, L-α-fosfatidiletanolamin i 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DPPC) ili njihove smeše. DPPC je prihvatlјiv za upotrebu kod lјudi. U pojedinim primerima izvođenja, surfaktant je DMPC, DOPC i/ili POPC (uklјučujući sintetske DMPC, DOPC i POPC). Može biti upotrebljen jedan ili više surfaktanata.

[0039] Pored navedenog, u još nekim ilustrativnim primerima izvođenja, određene formulacije pronalaska imaju hidrofobno:lipofilnu ravnotežu (HLB) veću od oko 9 ili veću od oko 10 ili veću od oko 11. U drugim srodnim primerima izvođenja, formulacije imaju HLB između oko 9-12 ili između oko 10-12 ili između oko 10-11.

[0040] U određenim drugim ilustrativnim primerima izvođenja, formulacije pronalaska sadrže fosfolipid 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DMPC), naročito sintetski DMPC. Dalje, u pojedinim primerima izvođenja gde emulzija sadrži DMPC, emulzija ne sadrži antioksidans. Još dalјe, u pojedinim primerima izvođenja gde emulzija sadrži DMPC, formulacije imaju HLB veći od oko 9 ili veći od oko 10 ili veći od oko 11 ili imaju HLB između oko 9-12, oko 10-12 ili oko 10-11. Kada formulacije sadrže DMPC, formulacije generalno ne sadrže fosfatidil holin (PC) jajeta.

[0041] Agensi koji se mogu dodati u emulziju predmetnog pronalaska da bi se adjuvans učinio izotoničnim uklјučuju dekstrozu, glicerol, manitol, sorbitol, PEG 300, PEG 400 i polietilen glikol.

[0042] Ilustrativne uljane emulzije su emulzije ulјa u vodi, a naročito emulzije skvalena u vodi. Dodatno, najpoželјniji adjuvansi uljanih emulzija predmetnog pronalaska sadrže antioksidans, koji je poželјno ulјani alfa-tokoferol (vitamin E, EP 0 382 271 B1). WO 95/17210 i WO 99/11241 opisuju emulzione adjuvanse na bazi skvalena, alfa-tokoferola i TWEEN® 80, po izboru formulisane sa imunostimulansima QS21 i/ili 3D-MPL (o kojima se prethodno diskutovano). WO 99/12565 opisuje pobolјšanje ovih skvalenskih emulzija dodavanjem sterola u ulјanu fazu. Dodatno, triglicerid kao što je trikaprilin (C27H5006), može biti dodat u uljanu fazu u cilјu stabilizacije emulzije (WO 98/56414).

[0043] Veličina uljanih kaplјica koje se nalaze u stabilnoj emulziji ulja u vodi poželјno je manja od 1 mikrona, a može biti u opsegu od suštinski 30-600 nm, pri čemu je poželјno da je prečnik suštinski oko 30-500 nm, a najpoželјnije 150-500 nm i naročito da je prečnik oko 150 nm, što se određuje fotonskom korelacionom spektroskopijom. U tom pogledu, 80% broja uljanih kaplјica bi trebao da bude u okviru poželјnih opsega, poželјnije više od 90% i najpoželјnije više od 95% broja uljanih kaplјica je unutar definisanih opsega veličina.

[0044] Postupak proizvodnje emulzija ulja u vodi je dobro poznat stručnjaku. Postupak obično obuhvata mešanje ulјane faze sa pogodnim surfaktantom kao što je PBS/TWEEN80® rastvor, nakon čega sledi homogenizacija upotrebom homogenizera. Na primer, postupak koji obuhvata propuštanje smeše jednom, dva puta ili više puta kroz iglu šprica bi bio pogodan za homogenizaciju malih zapremina tečnosti. Isto tako, proces emulzifikacije u mikrofluidizeru (M110S mikrofluidna mašina, maksimalno 50 prolazaka, tokom perioda od 2 minuta i pri maksimalnom pritisku od 6 bara (izlazni pritisak od oko 850 bara)) može biti prilagođen za proizvodnju manjih ili većih zapremina emulzija. Navedeno prilagođavanje se može postići rutinskim eksperimentima koji uključuju merenja u rezultujućim emulzijama, dok se ne postigne preparat sa kaplјicama ulјa potrebnog prečnika.

Agonisti TLR4

[0045] U određenim poželјnim primerima izvođenja, agonista TLR4 koji se upotrebljava u formulacijama pronalaska sadrži glukopiranozilni lipidni adjuvans (GLA), kao što su oni opisani u U.S.

[0046] Patent Publication No. US2007/021017, US2009/045033, US2010/037466 i US 2010/0310602.

[0047] Na primer, u određenim primerima izvođenja, agonista TLR4 je sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

ili njegova farmaceutski prihvatlјiva so, gde:

L1, L2, L3, L4, L5i L6su isti ili različiti i nezavisno -O-, -NH- ili -(CH2)-;

Y1je funkcionalna grupa kiseline;

Y4je -OH ili -SH;

R1, R3, R5i R6su isti ili različiti i nezavisno C8-13alkil; i

R2i R4su isti ili različiti i nezavisno C6-11alkil.

[0048] U pojedinim primerima izvođenja sintetske GLA strukture, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C10alkil; i R<2>i R<4>su C8alkil.

[0049] Na primer, u određenim primerima izvođenja, agonista TLR4 je sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0050] U specifičnom primeru izvođenja, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; i R<2>i R<4>su C12-C20alkil.

[0051] U sledećem specifičnom primeru izvođenja, GLA ima formulu koja je prethodno navedena, u kojoj R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; a R<2>i R<4>su C13alkil.

[0052] U sledećem specifičnom primeru izvođenja, GLA ima formulu koja je prethodno navedena, u kojoj R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C10alkil; a R<2>i R<4>su C8alkil.

[0053] U sledećem specifičnom primeru izvođenja, GLA ima formulu koja je prethodno navedena, u kojoj R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; i R<2>i R<4>su C9-C20alkil. U određenim primerima izvođenja, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; a R<2>i R<4>su C9alkil.

[0054] U određenim primerima izvođenja, agonista TLR4 je sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0055] U određenim primerima izvođenja prethodno navedene GLA strukture, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; i R<2>i R<4>su C9-C20alkil. U određenim primerima izvođenja, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; a R<2>i R<4>su C9alkil.

[0056] U određenim primerima izvođenja, agonista TLR4 je sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0057] U određenim primerima izvođenja prethodno navedene GLA strukture, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; i R<2>i R<4>su C9-C20alkil. U određenim primerima izvođenja, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; a R<2>i R<4>su C9alkil.

[0058] U određenim primerima izvođenja, agonista TLR4 je sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0059] U određenim primerima izvođenja prethodno navedene GLA strukture, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; i R<2>i R<4>su C9-C20alkil. U određenim primerima izvođenja, R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; a R<2>i R<4>su C9alkil.

[0060] U određenim primerima izvođenja, agonista TLR4 je sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0061] U određenim primerima izvođenja, agonista TLR4 je sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0062] U određenim primerima izvođenja, agonista TLR4 je sintetski GLA adjuvans koji ima sledeću strukturu:

[0063] U još jednom primeru izvođenja, oslabljeni derivat lipida A (ALD) je ugrađen u kompozicije predmetnog pronalaska. ALD su molekuli nalik lipidu A, koji su izmenjeni ili konstruisani tako da molekul pokazuje manje ili različite štetne efekte od lipida A. Ovakvi neželјeni efekti uklјučuju pirogenost, lokalnu Švarcmanovu reaktivnost i toksičnost, što se određuje testom letalne doze od 50% na embrionima pileta (CELDso). ALD koji su korisni, prema predmetnom pronalasku uklјučuju monofosforilni lipid A (MLA) i 3-deacilovani monofosforil lipid A (3D-MLA). MLA i 3D-MLA su poznati i ne treba ih ovde detalјno opisivati. Pogledati na primer U.S. Pat. No. 4,436,727 izdat 13. marta 1984, dodelјen Ribi ImmunoChem Research, Inc., koji opisuje monofosforilni lipid A i njegovu proizvodnju. U.S. Pat. No.4,912,094 i sertifikat preispitivanja B1 U.S. Pat. No.4,912,094, Myers i saradnici, koji je takođe dodelјen Ribi ImmunoChem Research, Inc., opisuju 3-deacilovani monofosforilni lipid A i postupak za njegovu proizvodnju.

Antigen

[0064] U pojedinim primerima izvođenja, formulacije pronalaska će takođe sadržavati jedan ili više antigena.

[0065] Antigen, za upotrebu u određenim primerima izvođenja ovde opisanih kompozicija vakcina i postupaka u kojima se upotrebljava GLA, može biti bilo koji cilјni epitop, molekul (uklјučujući biomolekul), molekulski kompleks (uklјučujući molekulske komplekse koji sadrže biomolekule), subćelijski sklop, ćelija ili tkivo na koji je poželjno izazvati ili poboljšati imunreaktivnosti kod subjekta. Često se termin antigen odnosi na polipeptidni antigen od interesa. Međutim, antigen, kako se ovde koristi, se može takođe odnositi na rekombinantni konstrukt koji kodira polipeptidni antigen od interesa (npr. ekspresioni konstrukt). U određenim poželјnim primerima izvođenja, antigen može, ali ne mora, biti izveden iz ili može biti imunološki unakrsno reaktivan sa infektivnim patogenom i/ili epitopom, biomolekulom, ćelijom ili tkivom koji su u vezi sa infekcijom, kancerom, autoimunim oboljenjem, alergijom, astmom ili bilo kojim drugim stanjem gde bi stimulacija antigen-specifičnog imunog odgovora bila poželјna ili korisna.

[0066] Poželјno je, i u određenim primerima izvođenja jeste tako, da formulacije vakcina predmetnog pronalaska sadrže antigen ili antigensku kompoziciju sposobnu da izazove imuni odgovora na humani ili drugi patogen sisara, gde antigen ili antigenska kompozicija mogu uključivati kompoziciju izvedenu iz virusa kao što je HIV- 1 (npr. tat, nef, gp120 ili gp160), humanih herpes virus, npr. gD ili njegovi derivati ili neposredni rani proteini poput ICP27 iz HSV1 ili HSV2 i dalje, kao što su citomegalovirus ((naročito humani) (npr. gB ili njegovi derivati), Rotavirus (uklјučujući žive atenuirane viruse), Epštajn-Bar-ov virus (poput gp350 ili njegovih derivata), Varicella Zoster virus (kao što su gpl, II i IE63) ili virus hepatitisa kao što su virus hepatitisa B-(na primer, površinski antigen virusa hepatitisa B-ili njegov derivat), virus hepatitisa A, virus hepatitisa C i virus hepatitisa E ili drugi virusni patogeni, kao što su paramiksovirusi: respiratorni sincicijski virus (kao što su F i G proteini ili njihovi derivati), virus parainfluence, virus morbila, virus zauški, humani papiloma virus (na primer, HPV6, 11, 16, 18 itd.), flavivirusi (npr. virus žute groznice, virus denga groznice, virus krpeljnog encefalitisa, japanski virus encefalitisa) ili virus gripa (ceo, živ ili inaktivirani virus, split-virus gripa, gajen na jajetu ili u MDCK ćelijama ili virozomi pravog gripa (kao što je opisano u Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) ili njihovi prečišćeni ili rekombinantni proteini, kao što su HA, NP, NA ili M proteini ili njihove kombinacije).

[0067] U određenim drugim poželјnim primerima izvođenja, formulacije vakcine predmetnog pronalaska sadrže antigen ili antigensku kompoziciju koji su sposobni da izazovu imuni odgovora na humani ili drugi patogen sisara čiji antigen ili antigenska kompozicija može sadržavati kompost izveden iz jednog ili više bakterijskih patogena kao što su Neisseria spp, uklјučujući N. gonorrhea i N. meningitidis (na primer, kapsularni polisaharidi i njihovi konjugati, proteini za vezivanje transferina, proteini vezivanja laktoferina, PilC, adhezini); S. pyogenes (na primer, M proteini ili njihovi fragmenti, C5A proteaza, lipotehojske kiseline), S. agalactiae, S. mutans: H. ducreyi; Moraxella spp, uklјučujući M catarrhalis, poznat i kao Branhamella catarrhalis (na primer, adhezini visoke i niske molekulske težine i invazini); Bordetella spp, uklјučujući B. pertussis (na primer, pertaktin, toksin velikog kašlja ili njegovi derivati, filamentni hemaglutinin, adenilat ciklaza, fimbrija), B. parapertussis i B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., uklјučujući M. tuberculosis (na primer, ESAT6, Antigen 85A, -B ili -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, uklјučujući L. pneumophila; Escherichia spp, uklјučujući enterotoksičnu E. coli (npr. faktori kolonizacije, toksin koji je toplotno labilan ili njegovi derivati, toksin stabilan na toplotu ili njegovi derivati), enterohemoragičnu E. coli, enteropatogenu E. coli (na primer, toksin sličan šiga toksinu ili njegovi derivati); Vibrio spp, uklјučujući V. cholera (na primer, toksin kolere ili njegovi derivati); Shigella spp, uklјučujući S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, uklјučujući Y. enterocolitica (na primer, Yop protein), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, uklјučujući C. jejuni (na primer, toksini, adhezini i invazini) i C. coli; Salmonella spp, uklјučujući S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., uklјučujući L. monocitogenes; Helicobacter spp, uklјučujući H. pylori (na primer, ureaza, katalaza, vakuolacioni toksin); Pseudomonas spp, uklјučujući P. aeruginosa; Staphylococcus spp., uklјučujući S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., uklјučujući E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., uklјučujući C. tetani (na primer, toksin tetanusa i njegov derivat), C. botulinum (na primer, botulinski toksin i njegov derivat), C. difficile (na primer, klostridijumski toksini A ili B-i njihovi derivati); Bacillus spp., uklјučujući B. anthracis (na primer, botulinski toksin i njegovi derivati); Corynebacterium spp., uklјučujući C. diphtheriae (npr. difterijski toksin i njegovi derivati); Borrelia spp., uklјučujući B. burgdorferi (na primer, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (na primer, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (na primer, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (na primer, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., uklјučujući E. equi i agens humane granulocitne erlihioze; Rickettsia spp, uklјučujući R. rickettsii; Chlamydya spp. uklјučujući C. trachomatis (na primer, MOMP, heparin-vezujući proteini), C. pneumoniae (na primer, MOMP, heparin-vezujući proteini), C. psittaci; Leptospira spp., uklјučujući L. interrogans; Treponema spp., uklјučujući T. pallidum (na primer, retki proteini spolјašnje membrane), T. denticola, T. hyodysenteriae; ili drugi bakterijski patogeni.

[0068] U određenim drugim poželјnim primerima izvođenja, formulacije vakcine predmetnog pronalaska sadrže antigen ili antigensku kompoziciju koji su sposobni da izazovu imuni odgovor na humani ili drugi patogen sisara, čiji antigen ili antigenska kompozicija može uključivati kompost izveden iz jednog ili više parazita (pogledati, npr. John, D.T. i Petri, W.A., Markell i Voge's Medical Parasitology-9. izd., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis’ Parasitology for Veterinarians - 8. izdanje, 2002, WB Saunders, Philadelphia) kao što su Plasmodium spp., uklјučujući P. falciparum; Toxoplasma spp., uklјučujući T. gondii (na primer, SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., uklјučujući E. histolytica; Babesia spp., uklјučujući B. microti; Trypanosoma spp., uklјučujući T. cruzi; Giardia spp., uključujući G. lamblia; Leshmania spp., uklјučujući L. major; Pneumocystis spp., uklјučujući P. carinii; Trichomonas spp., uklјučujući T. vaginalis; ili iz helminata sposobnih da inficiraju sisare, kao što su: (i) infekcije nematodama (uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracanculus medinensis, Trichinella spiralis i Strongyloides stercoralis); (ii) trematodne infekcije (uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Opisthorchis sinensis, Paragonimus sp, Fasciola hepatica, Fasciola magna, Fasciola gigantica); i (iii) infekcije cestodama (uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, Taenia saginata i Taenia solium). Određeni primeri izvođenja mogu stoga razmatrati kompozicije vakcina koje sadrže antigen izveden iz Schisostoma spp., Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium i/ili Schistosoma japonicum ili pak izveden iz kvasca kao što je Candida spp., uklјučujući C. albicans; Cryptococcus spp., uklјučujući C. neoformans.

[0069] Drugi poželјni antigeni specifični za M. tuberculosis su na primer Th Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 i hTCC1 (WO 99/51748). Proteini za M. tuberculosis takođe uklјučuju fuzione proteine i njihove varijante gde su najmanje dva, poželјno tri polipeptida M. tuberculosis fuzionisana u veći protein. Poželјne fuzije uklјučuju Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99151748). Drugi antigeni koji mogu biti upotrebljeni, uklјučuju antigene, kombinaciju antigena i fuzione proteine opisane u US 2010/0129391 i WO 2008/124647.

[0070] Najpoželјniji antigeni iz hlamidije uklјučuju, na primer, proteine visoke molekulske težine (HWMP) (WO 99/17741), ORF3 (EP 366412) i putativne membranske proteine (Pmps). Drugi antigeni iz hlamidije za formulacije vakcine mogu biti izabrani iz grupe opisane u WO 99128475. Poželјne bakterijske vakcine sadrže antigene izvedene iz Streptococcus spp, uklјučujući S. pneumoniae (na primer, kapsularne polisaharide i njihove konjugate, PsaA, PspA, streptolizin, holin-vezujuće proteine), kao i proteinski antigen Pneumolizin (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins i saradnici, Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) i njegove mutantne detoksifikovane derivate (WO 90/06951; WO 99/03884). Druge poželјne bakterijske vakcine sadrže antigene izvedene iz Haemophilus spp., uklјučujući H. influenzae tipa B-(na primer, PRP i njegove konjugate), netipizovan H. influenzae, a kao što su na primer OMP26, adhezini visoke molekulske težine, P5, P6, protein D i lipoprotein D, kao i fimbrin i peptidi izvedeni iz fimbrina (U.S. Pat. No. 5,843,464) ili njihove varijante sa višestrukim kopijama ili njihovi fuzioni proteini.

[0071] Derivati površinskog antigena hepatitisa B-su dobro poznati u stanju tehnike i uklјučuju, između ostalog, one PreS1, Pars2 S antigene koji su opisani u Evropskim patentnim prijavama EP-A414374; EP-A-0304578 i EP 198474. Prema jednom poželјnom aspektu, formulacija vakcine pronalaska sadrži HIV-1 antigen, gp120, naročito kada je eksprimiran u CHO ćelijama. U sledećem primeru izvođenja, formulacija vakcine pronalaska sadrži gD2t, kao što je ovde prethodno definisano.

[0072] U poželјnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, vakcine koje sadrže adjuvans naveden u patentnim zahtevima, sadrže antigen izveden iz humanih papiloma virusa (HPV) za koje se smatra da su odgovorni za genitalne bradavice (HPV 6 ili HPV 11 i drugi) i HPV virusa odgovornih za rak grlića materice (HPV16, HPV18 i drugi). Posebno poželјni oblici profilaktičke ili terapijske vakcine za genitalne bradavice sadrže L1 čestice ili kapsomere, kao i fuzione proteine koji sadrže jedan ili više antigena izabranih od proteina E6, E7, L1 i L2 iz HPV 6 i HPV 11. Određeni poželјni oblici fuzionog proteina uklјučuju L2E7 koji je opisan u WO 96/26277, kao i proteinD(1/3)-E7 opisan u GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285). Poželјna kompozicija profilaktičke ili terapijske vakcine za HPV infekciju grlića materice ili kancer, može sadržavati antigene HPV 16 ili 18. Na primer, L1 ili L2 antigenske monomere ili L1 ili L2 antigene koji mogu biti zajedno prisutni u česticama sličnim virusima (VLP) ili L1 protein koji je samostalno prisutan u VLP ili strukturi kaposmere. Takvi antigeni, virusima slične čestice i kapsomeri su poznati sami po sebi. Pogledati, na primer, WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 i WO93/02184.

[0073] Dodatni rani proteini mogu biti uklјučeni samostalno, ili kao fuzioni proteini, a kao što su to E7, E2 ili poželјno F5, na primer; naročito poželјni primeri izvođenja uklјučuju VLP koje sadrže L1E7 fuzione proteine (WO 96/11272). Posebno poželјni antigeni HPV 16 obuhvataju rane proteine E6 ili F7 u fuziji sa nosačem tipa proteina D da bi se obrazovali fuzioni Proteini D-E6 ili E7 iz HPV 16, ili njihove kombinacije; ili kombinacije E6 ili E7 sa L2 (WO 96/26277). Alternativno, rani proteini HPV 16 ili 18, E6 i E7, mogu biti prisutni u jednom molekulu, poželјno fuzionom proteinu D-E6/E7. Ovakva vakcina može po izboru sadržavati bilo koji ili oba od E6 i E7 proteina ispred HPV 18, poželјno u obliku fuzionog proteina Protein D-E6 ili Protein D-E7 ili fuzionog proteina Protein D E6/E7. Vakcina predmetnog pronalaska može dodatno sadržavati antigene iz drugih HPV sojeva, poželјno iz sojeva HPV 31 ili 33.

[0074] Vakcine predmetnog pronalaska dalјe sadrže antigene izvedene iz parazita koji izazivaju malariju. Na primer, poželјni antigeni iz Plasmodia falciparum uklјučuju RTS,S i TRAP. RTS je hibridni protein koji suštinski sadrži ceo C-terminalni deo cirkumsporozoitnog (CS) proteina P.falciparum, povezanog preko četiri aminokiseline preS2 dela površinskog antigena virusa hepatitisa B-sa površinskim (S) antigenom virusa hepatitisa B. Nјegova puna struktura je opisana u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/EP92/02591, objavljenoj kao WO 93/10152 koja zahteva pravo prvenstva u odnosu na UK patentnu prijavu br.9124390.7. Kada se eksprimira u kvascu, RTS se proizvodi kao lipoproteinska čestica, a kada je koeksprimiran sa S antigenom iz HBV-a, proizvodi mešovitu česticu poznatu kao RTS,S.

[0075] TRAP antigeni su opisani u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/GB89/00895 objavlјenoj kao WO 90/01496. Poželјan primer izvođenja premetnog pronalaska je vakcina za malariju, pri čemu antigenski preparat sadrži kombinaciju RTS,S i TRAP antigena. Ostali antigeni plazmodijuma koji su verovatni kandidati da budu komponente višestepene vakcine za malariju su MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, sekvestrin, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 iz P. faciparum i njihovi analozi u Plasmodium spp.

[0076] Shodno navedenom, određeni primeri izvođenja koji su ovde navedeni, razmatraju antigen koji je izveden iz najmanje jednog infektivnog patogena kao što je bakterija, virus ili glјivica, uklјučujući Actinobacterium kao što je M. tuberculosis ili M. leprae ili druga mikobakterija; bakteriju kao što je neki od članova roda Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia ili Bordetella; virus kao što je virus herpes simpleks, virus humane imunodeficijencije (HIV), virus mačje imunodeficijencije (FIV), citomegalovirus, virus Varicella Zoster, virus hepatitisa, Epštajn-Barov virus (EBV), respiratorni sincicijalni virus, humani papiloma virus (HPV) i citomegalovirus; HIV kao što je HIV-1 ili HIV-2; glјivice kao što su Aspergillus, Blastomyces, Coccidioides i Pneumocysti ili kvasci, uklјučujući vrste Candida kao što su C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis i C. parapsilosis; parazit kao što je protozoa, na primer, vrsta Plasmodium uklјučujući P. falciparum, P. vivax, P. malariae i P. ovale; ili neki drugi parazit kao što je jedan ili više od Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Angiostrongylus, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Cryptosporidium, Ancylostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria bancrofti, Giardia i Leishmania.

[0077] Na primer, u primerima izvođenja vakcine koja sadrži GLA i antigene izvedene iz Borrelia sp., antigeni mogu uklјučivati nukleinsku kiselinu, antigen ili antigenske preparate izvedene iz patogena, rekombinantno proizvedeni protein ili peptide i himerne fuzione proteine. Jedan takav antigen je OspA. OspA može biti potpuno zreo protein u lipidovanom obliku, dobijen biosintezom u ćeliji domaćinu (Lipo-OspA) ili, alternativno, može biti derivat koji nije lipidovan. Ovakvi nelipidovani derivati uklјučuju nelipidovani NS1-OspA fuzioni protein koji ima prvih 81 N-terminalnih aminokiselina nestrukturnog proteina (NS1) virusa influence i kompletan OspA protein, dok je drugi, MDP-OspA nelipidovani oblik OspA onaj koji nosi 3 dodatne N-terminalne aminokiseline.

[0078] Kompozicije i postupci su poznati u stanju tehnike za identifikaciju subjekata koji imaju, ili za koje se sumnja da su pod rizikom da imaju, infekciju infektivnim patogenom koji je ovde opisan.

[0079] Na primer, bakterija Micobacterium tuberculosis prouzrokuje tuberkulozu (TB). Bakterije obično napadaju pluća, ali mogu napasti i bubrege, kičmu i mozak. Ukoliko se ne leči pravilno, TB obolјenje može biti fatalno. Bolest se prenosi sa jedne osobe na drugu vazduhom, kada zaražena osoba kine ili kašlјe. U 2003. godini, u Sjedinjenim Američkim Državama je prijavlјeno više od 14.000 slučajeva TB.

[0080] Iako se tuberkuloza generalno može kontrolisati upotrebom proširene antibiotske terapije, takav tretman nije dovolјan da spreči širenje bolesti i postoji zabrinutost u vezi moguće selekcije sojeva rezistentnih na antibiotike. Zaražene osobe mogu biti izvesno vreme bez simptoma ali zarazne. Pored toga, iako je usklađenost sa režimom lečenja kritična, ponašanje pacijenata je teško pratiti. Neki pacijenti ne završavaju tok lečenja, što može dovesti do neefikasnog lečenja i razvoja rezistencije na lekove (npr. U.S. Patent 7,087,713).

[0081] Trenutno je vakcinacija živim bakterijama najefikasniji postupak za indukciju imuniteta u cilju zaštite od tuberkuloze. Mikobakterija koja se najčešća koristi u ovu svrhu je Bacillus Calmette-Guerin (BCG), avirulentni soj Micobacterium bovis. Ipak, bezbednost i efikasnost BCG-a je izvor kontroverzi, a neke zemlјe, kao što su Sjedinjene Američke Države, ne vakcinišu opštu populaciju. Dijagnoza se obično postavlja upotrebom testa na koži koji uključuje intradermalno izlaganje tuberkulinu PPD (proteinprečišćeni derivat). Odgovori T-ćelija na specifičan antigen dovode do merlјivog otvrdnjavanja na mestu ubrizgavanja, 48-72 sata nakon injekcije, što ukazuje na reakciju na antigene mikobakterije. Osetlјivost i specifičnost su, međutim, bili problem sa ovim testom, pošto se osobe koje su vakcinisane sa BCG vakcinom ne mogu razlikovati od inficiranih oboba (npr. U.S. Patent 7,087,713)

[0082] Iako je pokazano da makrofagi deluju kao glavni efektori imunosti na M. tuberculosis, T-ćelije su dominantni u indukciji ovakvog imuniteta. Suštinska uloga T-ćelija u zaštiti od infekcije sa M. tuberculosis je ilustrovana čestom pojavom M. tuberculosis kod pacijenata sa sidom, usled deplecije CD4 T-ćelija koja prati infekciju virusom humane imunodeficijencije (HIV). Pokazano je da su CD4 T-ćelije koje su reaktivne na mikobakteriju, potentni proizvođači gama-interferona (IFN-gama), za koga je zauzvrat pokazano da aktivira anti-mikobakterijske efekte makrofaga kod miševa. Iako je uloga IFNgama kod lјudi manje jasna, studije su pokazale da 1,25-dihidroksi-vitamin D3, bilo samostalno ili u kombinaciji sa IFN-gama ili faktorom nekroze tumora-alfa, aktivira humane makrofage da inhibiraju M. tuberculosis infekciju. Štaviše, poznato je da IFN-gama stimuliše humane makrofage da prave 1,25-dihidroksi-vitamin D3. Slično tome, pokazano je da IL-12 ima ulogu u stimulaciji rezistencije na infekciju M. tuberculosis. Za pregled imunologije M. tuberculosis infekcije, pogledati Chan i Kaufmann, u Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (izd.), ASM Press. Washington, D.C. (1994).

[0083] Postojeća jedinjenja i postupci za dijagnostikovanje tuberkuloze ili za indukovanje zaštitnog imuniteta na tuberkulozu uklјučuju upotrebu polipeptida koji sadrže najmanje jedan imunogeni deo jednog ili više proteina Micobacterium-a, kao i molekule DNK koji kodiraju takve polipeptide. Dijagnostički kompleti koji sadrže takve polipeptide ili sekvence DNK i odgovarajući reagens za detekciju mogu biti upotrebljeni za detekciju infekcije mikobakterijom kod pacijenata i u biološkim uzorcima. Takođe su obezbeđena antitela koja su usmerena na navedene polipeptide. Pored toga, takva jedinjenja mogu biti formulisana u vakcine i/ili farmaceutske kompozicije za imunizaciju na infekcije Micobacterium-om. (U.S. Patent No.6,949,246 i 6,555,653).

[0084] Malarija je eliminisana u mnogim delovima sveta šezdesetih godina, ali bolest i dalјe postoji i pojavlјuju se nove vrste bolesti koje su otporne na postojeće lekove. Malarija je veliki javni zdravstveni problem u više od 90 zemalјa. Devet od deset slučajeva malarije se javlјa u podsaharskoj Africi. Više od jedne trećine svetske populacije je ugroženo, a između 350 i 500 miliona lјudi se zarazi malarijom svake godine. Četrdeset pet miliona trudnica je izloženo riziku od malarije ove godine. Od onih koji su već zaraženi, svake godine umire više od 1 miliona, od onoga što je bolest koja se može sprečiti. Većina smrtnih slučajeva se javlja kod dece u Africi.

[0085] Malarija se obično prenosi kada osobu ugrize zaražena ženka komaraca vrste Anopheles. Da bi prenosio, komarac mora biti zaražen izvlačenjem krvi iz osobe koja je već zaražena malarijom. Malariju prouzorkuje parazit, a klinički simptomi bolesti uklјučuju groznicu i bolest nalik gripu, praćenu jezom, glavoboljom, bolovima u mišićima i umorom. Ovi simptomi mogu biti praćeni mučninom, povraćanjem i dijarejom. Malarija takođe može prouzrokovati anemiju i žuticu zbog gubitka crvenih krvnih zrnaca. Infekcija sa jednom vrstom parazita malarije, Plasmodium falciparum, ukoliko se ne leči odmah, može prouzrokovati otkazivanje bubrega, epileptične napade, mentalnu konfuziju, komu i smrt.

[0086] Poznat je in vitro dijagnostički postupak za malariju kod osoba, koji se sastoji od postavlјanja tkiva ili biološke tečnosti uzete od osobe, u kontakt sa molekulom ili polipeptidom kompozicijom, pri čemu navedeni molekul ili polipeptidna kompozicija sadrže jednu ili više peptidnih sekvenci koje nose ceo ili deo jednog ili više T-epitopa proteina koji su rezultat infektivne aktivnosti P. falciparum, pod uslovima koji omogućavaju imunološku reakciju in vitro između navedene kompozicije i antitela koja mogu biti prisutna u tkivu ili biološkoj tečnosti, čime se obrazuju komleksi antigena i antitela za in vitro detektciju (pogledati, npr. U.S. Patent 7,087,231).

[0087] Opisani su ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog AMC-1 ektodomena Plasmodium falciparum-a (3D7). Ovi prethodno opisani postupci su proizveli visoko prečišćen protein koji zadržava sposobnost uvijanja i obrazovanja disulfidnih mostova nativnog molekula. Rekombinantni AMA-1 je koristan kao dijagnostički reagens i u proizvodnji antitela, ali i kao protein za samostalnu upotrebu ili upotrebu u vidu dela vakcine za prevenciju malarije (U.S. Patent 7,029,685).

[0088] U stanju tehnike su opisani polinukleotidi koji kodiraju peptidni antigen malarije specifičan za vrstu P. vivax, antigen koji predstavlja proteine ili fragmente proteina koji se nakon infekcije luče u plazmu domaćina sisara koji je inficiran, kao i monoklonska ili poliklonska antitela proizvedena na ove antigene. Peptidni antigeni, monoklonska antitela i/ili poliklonska antitela se koriste u testovima koji se upotrebljavaju u dijagnozi malarije, kao i za određivanje da li je Plasmodium vivax vrsta odgovorna za infekciju (U.S. Patent 6,706,872). Opisani su i peptidni antigeni malarije specifični za P. vivax koji predstavljaju proteine ili fragmente proteina koji se nakon infekcije luče u plazmu domaćina sisara koji je inficiran, kao i monoklonska ili poliklonska antitela dobijena na ove antigene. Peptidni antigeni, monoklonska antitela i/ili poliklonska antitela se koriste u testovima koji se upotrebljavaju u dijagnozi malarije, kao i za utvrđivanje da li je Plasmodium vivax vrsta odgovorna za infekciju (pogledati, npr. U.S. Patent 6,231,861).

[0089] Rekombinantni AMA-1 ektodomen iz Plasmodium falciparum-a (3D7) je takođe eksprimiran postupcima koji proizvode visoko prečišćeni protein koji zadržava sposobnosot uvijanja i obrazovanja disulfidnih veza unutar nativnog molekula. Rekombinantni AMA-1 je koristan kao dijagnostički reagens, za upotrebu u proizvodnji antitela i kao vakcina (U.S. Patent 7,060,276). Slično su poznati ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog MSP-142Plasmodium falciparum-a (3D7), koji zadržava sposobnosot uvijanja i obrazovanja disulfidnih veza unutar nativnog molekula. Rekombinantni MSP-142je koristan kao dijagnostički reagens, za upotrebu u proizvodnji antitela i kao vakcina (U.S. Patent 6,855,322).

[0090] U skladu sa navedenim, prema predmetnom i srodnim opisima, poznati su dijagnostički postupci za detekciju infekcija malarije kod lјudi, a da bi se identifikovao subjekt koji ima ili za koga se sumnja da je pod rizikom od infekcije sa infektivnim patogenom malarije. Preciznije, na primer, uzorci krvi se kombinuju sa reagensom koji sadrži 3-acetil piridin adeninski dinukleotid (APAD), supstrat (npr. so mlečne kiseline ili mlečnu kiselinu) i pufer. Reagens je dizajniran tako da detektuje prisustvo jedinstvenog glikolitičkog enzima koga proizvodi malarijski parazit. Ovaj enzim je poznat kao parazitska dehidrogenaza mlečne kiseline (PLDH). PLDH se lako razlikuje od LDH domaćina upotrebom prethodno opisanog reagensa. Kombinacija reagensa sa uzorkom krvi u kome ima parazita rezultuje u smanjenju APAD. Međutim, APAD se ne redukuje dejstvom LDH domaćina. Smanjeni APAD može zatim biti detektovan raznim tehnikama, uklјučujući spektralnu, fluorimetrijsku, elektroforetsku ili kolorimetrijsku analizu. Detekcija smanjenja APAD na prethodni način, obezbeđuje pozitivnu indikaciju malarijske infekcije (npr. U.S. Patent 5,124,141). U drugoj metodologiji za dijagnostikovanje malarije, polipeptid koji sadrži karakterističnu aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz antigena GLURP Plasmodium falciparum-a, prepoznaje se u ispitivanom uzorku upotrebom specifičnog antitela proizvedenog na ili koje je reaktivno sa polipeptidom (U.S. Patent 5,231,168).

[0091] Lajšmanioza je široko raširena parazitska bolest sa čestim epidemijama na Indijskom potkontinentu, u Africi i Latinskoj Americi i predstavlјa prioritet Svetske zdravstvene organizacije za razvoj vakcine. Javlja se kao kompleks različitih bolesti, pošto paraziti roda Leishmania izazivaju fatalne infekcije unutrašnjih organa, kao i ozbilјne kožne bolesti. Jedan od najrazornijih oblika lajšmanioze je izobličujuća infekcije nosa i usta. Broj slučajeva lajšmanioze se povećava i sada je van kontrole u mnogim oblastima. Lajšmanioza je takođe u porastu u nekim razvijenim zemlјama, posebno u južnoj Evropi kao rezultat HIV infekcija. Dostupni lekovi su toksični, skupi i zahtevaju dugotrajne dnevne injekcije.

[0092] Leishmania su protozoalni paraziti koji naselјavaju makrofage ili bela krvna zrnca imunog sistema. Paraziti se prenose ugrizom malih insekata koji sisaju krv (peščanih mušica), a koje je teško kontrolisati pošto naselјavaju ogromna područja planete.

[0093] Visceralna lajšmanioza je najopasnija od tri manifestacije bolesti. Procenjuje se da se svake godine javlja oko 500,000 novih slučajeva visceralnog oblika (kala-azar ili "ubijajuća bolest"). Više od 200 miliona lјudi je trenutno izloženo riziku od dobijanja visceralne lajšmanioze. Preko 90 procenata slučajeva visceralne lajšmanioze se javlјa u Indiji, Bangladešu, Sudanu, Brazilu i Nepalu. Većina smrtnih slučajeva se javlja kod dece. Osobe sa kožnim oblicima često ostaju trajno izobličene.

[0094] Infekcije sa Leishmania parazitom je teško dijagnostikovati i obično uklјučuju histopatološku analizu uzoraka biopsije tkiva. Razvijeno je, međutim, nekoliko seroloških i imunoloških dijagnostičkih testova (U.S. Patent 7,008,774; Senaldi i saradnici, (1996) J. Immunol. Methods 193:9 5; Zijlstra i saradnici, (1997) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 91:671 673; Badaro i saradnici, (1996) J. Inf. Dis.

173:758761; Choudhary S. i saradnici, (1992) J. Comm. Dis.24:3236; Badaro R. i saradnici, (1986) Am. J. Trop. Med. Hyg.35:7278; Choudhary A. i saradnici, (1990) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.84:363366; i Reed S.G. i saradnici, (1990) Am. J. Trop. Med. Hyg.43:632639). Promastigoti oslobađaju metaboličke produkte u medijum kulture da bi se proizveo kondicioniran medijum. Ovi metabolički produkti su imunogeni za domaćina. Pogledati Schnur L.F. i saradnici, (1972) lsrl. J. Med. Sci. 8:932942; Sergeiev V.P. i saradnici, (1969) Med. Parasitol. 38:208212; El-On J. i saradnici, (1979) Exper. Parasitol. 47:254 269; i Bray R.S. i saradnici, (1966) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 60:605609; U.S. Pat. No. 6,846,648, U.S. Patent 5,912,166; U.S. Patent 5,719,263; U.S. Patent 5,411,865).

[0095] Oko 40 miliona lјudi širom svijeta je zaraženo HIV-om, virusom koji prouzrokuje sidu. Oko 3 miliona lјudi umire od ove bolesti svake godine, a 95% njih u zemlјama u razvoju. Svake godine, blizu 5 miliona lјudi se zarazi HIV-om. Trenutno, ljudi iz podsaharske Afrike su pod navećim opterećenjem bolesti, ali se bolest brzo širi i na druge zemlјe kao što su Indija, Kina i Rusija. Epidemija najbrže raste među manjinskim populacijama. U Sjedinjenim Američkim Državama je prijavlјeno više od 950,000 slučajeva side od 1981. godine. Sida pogađa lјude tokom njihovih najproduktivnijih godina. Žene, iz bioloških i socijalnih razloga, imaju povećan rizik od HIV-a/side.

[0096] Sida je prouzrokovana virusom humane imunodeficijencije (HIV), koji ubija i oštećuje ćelije imunog sistema tela i progresivno uništava sposobnost organizma da se bori protiv infekcija i određenih vrsta kancera. HIV se najčešće širi nezaštićenim seksualnim odnosom sa zaraženim partnerom. Najrobusnije rešenje problema je sprečavanje širenja virusa. Stvaranje sigurne, efektivne i pristupačne HIV vakcine je jedan od načina da se postigne ovaj cilј. Širom sveta, manje od jednog od pet lјudi sa visokim rizikom za HIV infekciju ima pristup efektivnoj prevenciji.

[0097] Poznati su postupci za postavljanje dijagnoze HIV infekcija, uklјučujući virusnu kulturu, PCR određenih sekvenci nukleinskih kiselina iz uzoraka pacijenata, kao i testove sa antitelima na prisustvo anti-HIV antitela u serumima pacijenata (pogledati, npr. U.S. Patent No. 6,979,535, 6,544,728, 6,316,183, 6,261,762, 4,743,540,).

[0098] Prema određenim drugim primerima izvođenja koji su ovde opisani, kompozicije vakcina i srodne formulacije i postupci upotrebe mogu uklјučivati antigen koji je izveden iz ćelije kancera, a što može biti korisno za imunoterapijski tretman kancera. Na primer, adjuvansna formulacija može naći primenu ukoliko je sa antigenima odbacivanja tumora, kao što su oni za kancer prostate, dojke, debelog creva, pluća, pankreasa, bubrega i za melanome. Primeri antigena izvedenih iz kancera ili kancerskih ćelija uklјučuju MAGE 1, 3 i MAGE 4 ili druge MAGE antigene kao što su oni opisani u WO99/40188, PRAME, BAGE, Lage (poznat i kao NY Eos 1) SAGE i HAGE (WO 99/53061) ili GAGE (Robbins i Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, str. 628-636; Van den Eynde i saradnici, International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 i 1998)); Correale i saradnici (1997), Journal of National Cancer Institute 89, str.293). Ovi neograničavajući primeri antigena kancera se eksprimiraju u širokom opsegu tipova tumora kao što su melanom, karcinom pluća, sarkom i karcinom bešike. Pogledati, npr. U.S. Patent No.6,544,518.

[0099] Drugi antigeni specifični za tumore koji su pogodni za upotrebu sa GLA prema određenim primerima izvođenja koji su ovde opisani, uključuju, ali nisu ograničeni na, gangliozide specifične za tumore ili povezane sa tumorima, kao što su GM2i GM3ili njihovi konjugati za proteinske nosače; ili antigen za upotrebu u kompoziciji GLA vakcine za izazivanje ili pojačavanje imunološkog odgovora na kancer, može biti peptidni hormon samostalno, kao što je hormon oslobađanja gonadotropinskog hormona pune dužine (GnRH, WO 95/20600), kratak peptid od 10 aminokiselina, koji je koristan u lečenju mnogih vrsta kancera. U drugačijem primeru izvođenja, upotrebljavaju se antigeni iz prostate, kao što su antigen specifičan za prostatu (PSA), PAP, PSCA (npr. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95(4) 1735-1740 1998), PSMA ili, u poželјnom primeru izvođenja, antigen poznat kao Prostaza (npr. Nelson i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 1999. 96, 3114-3119; WO 98/12302; U.S. Pat. No. 5,955,306; WO 98/20117; U.S. Pat. Nos.

5,840,871 i 5,786,148; WO 00/04149. Ostali antigeni specifični za prostatu su poznati iz WO 98/137418 i WO/004149. Drugi je STEAP (PNAS 9614523145287-121999).

[0100] Drugi antigeni povezani sa tumorom koji su korisni u kontekstu predmetnog pronalaska uklјučuju: Plu -1 (J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon i saradnici, Bioessays 199, 21:61-70, U.S. Pat. No. 5,654,140) i Criptin (U.S. Pat. No. 5,981,215). Pored toga, antigeni koji su posebno relevantni za vakcine u terapiji kancera takođe obuhvataju tirozinazu i surivivin.

[0101] Ovde opisani primeri izvođenja koje se odnose na kompozicije vakcine koje sadrže GLA i koje dalje sadrže antigen kancera, biće korisni za bilo koji kancer koga karakteriše ekspresija antigena specifičnog za tumor, kao što je ekspresija HER-2/neu ili drugog antigena koji je specifičan ili povezan sa kancerom.

[0102] Dijagnoza kancera kod subjekta koji ima ili za koga se sumnja da sa rizikom da ima kancer, može se postići bilo kojim od širokog spektra metodologija koje su prihvaćene u stanju tehnike, a koje mogu varirati u zavisnosti od raznih faktora, uklјučujući kliničku sliku, stepen progresije kancer, vrstu kancera i druge faktore. Primeri dijagnostičkih postupaka za kancer uklјučuju histopatološki, histocitohemijski, imunohistocitohemijski i imunohistopatološki pregled uzoraka pacijenata (npr. krvi, biopsiju kože, biopsiju drugih tkiva, hirurških uzoraka itd.), PCR testove za definisane genetičke marker (npr. nukleinske kiseline), serološke testove za cirkulišuće antigena koji su povezani sa kancerom ili ćelija koje nose takve antigene ili za antitela definisane specifičnosti ili dalje, druge metodologije sa kojima će stručnjaci iz oblasti biti upoznati. Pogledati, npr. U.S. Patent No. 6,734,172; 6,770,445; 6,893,820; 6,979,730; 7,060,802; 7,030,232; 6,933,123; 6,682,901; 6,587,792; 6,512,102; 7,078,180; 7,070,931; JP5-328975; Waslylyk i saradnici, 1993 Eur. J Bioch.211 (7):18.

[0103] Kompozicije vakcina i postupci u skladu sa određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, mogu takođe biti upotrebljeni za profilaksu ili terapiju autoimunih oboljenja, koja uklјučuju bolesti, stanja ili poremećaje u kojima imuni sistem domaćina ili subjekta štetno posreduje u imunom odgovoru tako da ga usmerava protiv "sopstvenih" tkiva, ćelija, biomolekula (npr. peptida, polipeptida, proteina, glikoproteina, lipoproteina, proteolipida, lipida, glikolipida, nukleinskih kiselina kao što su RNK i DNK, oligosaharida, polisaharida, proteoglikana, glikozaminoglikana ili sličnih, kao i drugih molekulskih komponenti ćelija i tkiva) ili epitopa (npr. specifične imunološki definisane strukture za prepoznavanje, kao što su one koje prepoznaju regioni za određivanje komplementarnosti varijabilnog regiona antitela (CDR) ili CDR receptori T-ćelija.

[0104] Autoimune bolesti se stoga karakterišu abnormalnim imunim odgovorom koji uklјučuje bilo ćelije ili antitela, a koji su u oba slučaja usmereni protiv normalnih autolognih tkiva. Autoimune bolesti kod sisara mogu biti u principu klasifikovane u jednu od dve različite kategorije: bolesti posredovane ćelijama (tj. T-ćelijske) ili poremećaji posredovani antitelom. Neograničavajući primeri ćelijski posredovanih autoimunih bolesti uklјučuju multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, Hašimotov tireoiditis, dijabetes melitus tipa I (juvenilni dijabetes) i autoimuni uvoretinitis. Autoimuni poremećaji posredovani antitelima uklјučuju, ali nisu ograničeni na, mijasteniju gravis, sistemski eritematozni lupus (ili SLE), Gravesovu bolest, autoimunu hemolitičku anemiju, autoimunu trombocitopeniju, autoimunu astmu, krioglobulinemiju, trombocitopeničnu purpuru, primarnu bilijarnu sklerozu i pernicioznu anemiju. Antigen(i) povezan(i) sa: sistemskim eritematoznim lupusom su proteini malih jedarnih ribonukleinskih kiselina (snRNP); za Gravesovu bolest je receptor tirotropina, tiroglobulin i druge komponente epitelnih ćelija štitne žlezde (Akamizu i saradnici, 1996; Kellerman i saradnici, 1995; Raju i saradnici, 1997; i Texier i saradnici, 1992); za pemfigus je antigen pemfigusa sličan kadherinu, kao što su dezmoglein 3 i drugi adhezioni molekuli (Memar i saradnici, 1996: Stanley, 1995; Plott i saradnici, 1994; i Hashimoto, 1993); i trombični iz trombocitopenične purpure su antigeni trombocita. (pogledatni, npr. U.S. Patent 6,929,796; Gorski i saradnici (ur.), Autoimmunity, 2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA; Radbruch i Lipsky, P.E. (ur.) Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation (Curr. Top. Microbiol. and Immunol.) 2001, Springer, NY.)

[0105] Autoimunitet ima ulogu u više od 80 različitih bolesti, uklјučujući dijabetes tipa 1, multiplu sklerozu, lupus, reumatoidni artritis, sklerodermu i bolesti štitne žlezde. Za većinu autoimunih bolesti nedostaju precizne kvantitativne procene morbiditeta. Najnovije studije, urađene krajem 1990-ih, otkrivaju da su autoimune bolesti treća najčešća glavna bolest u Sjedinjenim Državama; autoimune bolesti najčešće pogađaju više od 8,5 miliona Amerikanaca. Trenutne procene prevalencije oboljenja se kreću od 5 do 8 procenata populacije Sjedinjenih Država. Većina autoimunih bolesti neproporcionalno pogađa žene. Žene su sa 2,7 puta većom verovatnoćom da dobiju autoimunu bolest od muškaraca. Žene su podložnije autoimunim bolestima; izgleda da muškarci imaju veći nivo aktivnosti ćelija prirodnih ubica nego žene. (Jacobsen i saradnici, Clinical Immunology and Immunopathology, 84:223-243, 1997.) [0106] Autoimune bolesti se javlјaju kada imunološki sistem pogrešno prepoznaje sopstveno od nesopstvenog tkiva i neodgovarajuće ga napadne. Telo može biti zahvaćeno autoimunim oboljenjima na različite načine, uklјučujući, na primer, creva (Kronova bolest) i mozak (multipla skleroza). Poznato je da autoantitela napadaju sopstvene ćelije ili sopstvena tkiva da bi oštetila njihovu funkciju i da je rezultat prouzrokovanje autoimune bolesti, kao i da se autoantitelo može detektovati u serumu pacijenta pre stvarne pojave autoimune bolesti (npr. pre pojave kliničkih znakova i simptoma). Detekcija autoantitela omogućava stoga rano otkrivanje ili prepoznavanje prisustva ili rizika za razvoj autoimune bolesti. Na osnovu ovih nalaza, otkriven je niz autoantitela koja su specifična za autoantigene, a autoantitela na autoantigene su merena i u kliničkim testovima (npr. U.S. Patent 6,919,210. 6,596,501, 7,012,134, 6,919,078) dok druge dijagnostičke procedure za autoimunost mogu podrazumevati detekciju relevantnog metabolita (npr. U.S. Pat. No. 4,659,659) ili imunološke reaktivnosti (npr. U.S. Pat. Nos.

4,614,722 i 5,147,785, 4,420,558, 5,298,396, 5,162,990, 4,420,461, 4,595,654, 5,846,758, 6,660,487).

[0107] U određenim primerima izvođenja, kompozicije pronalaska će biti posebno primenlјive u tretmanu starijih i/ili imunosuprimiranih, uklјučujući subjekte na dijalizi bubrega, subjekte na hemioterapiji i/ili radioterapiji, primaoce transplantata i slične. Ovakve osobe generalno pokazuju smanjen imuni odgovor na vakcine i stoga upotreba kompozicija pronalasku može pobolјšati imuni odgovor koji se postiže kod ovih subjekata.

[0108] U drugim primerima izvođenja, antigen ili antigeni koji se koriste u kompozicijama pronalaska, uklјučuju antigene koji se javljaju kod respiratornih oboljenja, kao što su ona izazvana ili pogoršana bakterijskom infekcijom (npr. pneumokoknom) za profilaksu i terapiju stanja kao što je hronična opstruktivna plućna bolest (HOBP). HOBP je fiziološki definisan prisustvom nepovratne ili delimično reverzibilne opstrukcije disajnih puteva kod pacijenata sa hroničnim bronhitisom i/ili emfizemom (Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov; 152 (5 Pt 2): S77-121). Pogoršanja HOBP su često prouzrokovana bakterijskom (npr. pneumokoknom) infekcijom (Clin Microbiol Rev.2001 Apr; 14 (2): 336-63).

TLR

[0109] Kao što je ovde opisano, određeni primeri predmetnog pronalaska razmatraju kompozicije vakcina i imunološke adjuvansne kompozicije, uklјučujući farmaceutske kompozicije, koje sadrže jedan ili više agonista receptora nalik proteinu Toll (TLR agonista). Toll-proteinu slični receptori (TLR) obuhvataju transmembranske receptore na površini ćelija urođenog imunog sistema koje obezbeđuju ćelijama domaćina sposobnost ranog prepoznavanja raznih evolutivno očuvanih mikrobnih molekulskih struktura kao što su one prisutne u ili na velikom broju infektivnih patogena (npr. Armant i saradnici, 2002 Genome Biol. 3(8): revijski članak, 3011.1-3011.6; Fearon i saradnici, 1996, Science 272:50; Medzhitov i saradnici, 1997 Curr. Opin. Immunol. 9:4; Luster 2002 Curr. Opin. Immunol.14:129; Lien i saradnici 2003 Nat. Immunol. 4:1162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol. 1:135; Takeda i saradnici, 2003 Ann Rev Immunol. 21:335; Takeda i saradnici 2005 Int. Immunol. 17:1; Kaisho i saradnici, 2004 Microbes Infect.6:1388; Datta i saradnici, 2003 J. Immunol.170:4102).

[0110] Na indukciju prenosa signala posredovanog sa TLR u ćeliji, zarad potenciranja inicijacije imunih odgovora putem urođenog imunog sistema, može se uticati TLR agonistima, koji aktiviraju TLR na površini ćelije. Na primer, lipopolisaharid (LPS) može biti TLR agonista preko TLR2 ili TLR4 (Tsan i saradnici, 2004 J. Leuk. Biol. 76:514; Tsan i saradnici, 2004 Am. J. Physiol. Cell Phsiol. 286:C739; Lin i saradnici, 2005 Shock 24:206); poli(inozin-citidin) (polil:C) može biti TLR agonista preko TLR3 (Salem i saradnici, 2006 Vaccine 24:5119); CpG sekvence (oligodezoksinukleotidi koji sadrže nemetilovane citozin-guanozine ili "CpG" dinukleotidne motive, npr. CpG 7909, Cooper i saradnici, 2005 AIDS 19:1473; CpG 10101 Bayes i saradnici, Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer i saradnici, Expert Opinion on Biological Therapy 5:673; Vollmer i saradnici, 2004 Antimicrob. Agents Chemother.48:2314; Deng i saradnici, 2004 J. Immunol.173:5148) mogu biti TLR agonisti preko TLR9 (Andaloussi i saradnici, 2006 Glia 54:526; Chen i saradnici, 2006 J. Immunol.177:2373); peptidoglikani mogu biti TLR2 i/ili TLR6 agonisti (Soboll i saradnici, 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao i saradnici, 2005 J. Immunol. 174:1566); 3M003 (4-amino-2-(etoksimetil)-α,α-dimetil-6,7,8,9-tetrahidro-1H-imidazo[4,5-c]hinolin-1-etanol hidrat, MW 318 Da firme 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, koja je takođe izvor srodnih jedinjenja 3M001 i 3M002; Gorden i saradnici, 2005 J. Immunol. 174:1259) može biti TLR7 agonista (Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35:1591) i/ili TLR8 agonista (Johansen 2005); flagelin može biti TLR5 agonista (Feuillet i saradnici, 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:12487); a antigeni hepatitisa C mogu delovati kao TLR agonisti preko TLR7 i/ili TLR9 (Lee i saradnici, 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1828; Horsmans i saradnici, 2005 Hepatol.42:724). Drugi TLR agonisti su poznati (npr. Schirmbeck i saradnici, 2003 J. Immunol. 171:5198) i mogu biti upotrebljeni u skladu sa određenim ovde opisanim primerima izvođenja.

[0111] Na primer, a i kao prikaz stanja tehnike (pogledati, npr. U.S. Patent No. 6,544,518), imunostimulatorni oligonukleotidi koji sadrže nemetilovane CpG dinukleotide ("CpG") su poznati kao adjuvansi prilikom kako sistemske, tako i primene preko sluzokože (WO 96/02555, EP 468520, Davis i saradnici, J. Immunol, 1998.160(2): 870-876; McCluskie i Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). CpG je skraćenica za citozin-guanozinske dinukleotidne motive prisutne u DNK. Centralna uloga CG motiva u imunostimulaciji je razjašnjena od strane Krieg, Nature 374, p5461995. Detalјna analiza je pokazala da CG motiv mora biti u određenom kontekstu sekvence i da su takve sekvence uobičajene u bakterijskoj DNK, ali i da su retke u DNK kičmenjaka. Imunostimulatorna sekvenca je često: purin, purin, C, G, pirimidin, pirimidin; gde dinukleotidni CG motiv nije metilovan, ali je poznato da su druge nemetilovane CpG sekvence imunostimulatorne tako da se mogu stoga koristiti u određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska. Kada je CpG formulisan u vakcine, može se primenjivati u slobodnom rastvoru zajedno sa slobodnim antigenom (WO 96/02555; McCluskie i Davis, navedeno iznad) ili kovalentno konjugovan za antigen (PCT Publication No. WO 98/16247) ili formulisan sa nosačem kao što je aluminijum hidroksid (npr. Davis i saradnici, navedeno iznad, Brazolot-Millan i saradnici, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8).

[0112] Poželјni oligonukleotidi za upotrebu u adjuvansima ili vakcinama predmetnog pronalaska poželјno sadrže dva ili više dinukleotidnih CpG motiva razdvojenih sa najmanje tri, još poželјnije najmanje šest ili više nukleotida. Oligonukleotidi predmetnog pronalaska su obično dezoksinukleotidi. U poželјnom primeru izvođenja, internukleotid u oligonukleotidu je fosforoditioat ili još poželјnije fosforotioatna veza, iako su i fosfodiesterske i druge internukleotidne veze unutar područja pronalaska, uklјučujući oligonukleotide sa mešovitim internukleotidnim vezama. Postupci za proizvodnju fosforotioatnih oligonukleotida ili fosforoditioata su opisani u U.S. Pat. No. 5,666,153, 5,278,302 i WO95/26204.

[0113] Primeri poželјnih oligonukleotida imaju sekvence koje su opisane u publikacijama koje slede; za određene primere izvođenja koji su ovde opisani, sekvence poželјno sadrže fosforotioatne modifikovane internukleotidne veze:

CPG 7909: Cooper i saradnici, "CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B-virus vaccine seroprotection in antiretroviraltreated HIV-infected adults". AIDS, 2005 Sep 23; 19(14): 1473-9.

CpG 10101: Bayes i saradnici, "Gateways to clinical trials", Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 27. april 2005. (3):193-219. Vollmer J., "Progress in drug development of immunostimula-tory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9." Expert Opinion on Biological Therapy. 2005 May; 5(5): 673-682

[0114] Alternativni CpG oligonukleotidi mogu sadržavati varijante poželјnih sekvenci koje su opisane u prethodno citiranim publikacijama, a koje se razlikuju po tome što imaju nekonzistentne supstitucije, insercije, delecije i/ili adicije u nukleotidnoj sekvenci. CpG oligonukleotidi koji se koriste u određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska mogu biti sintetisani bilo kojim postupkom koji je poznat u satnju tehnike (npr. EP 468520). Konvencionalno je da takvi oligonukleotidi mogu biti sintetisani upotrebom automatskog sintetizera. Oligonukleotidi su obično dezoksinukleotidi. U poželјnom primeru izvođenja, internukleotidna veza u oligonukleotidu je fosforoditioatna, ili poželјnije fosforotioatna veza, mada su fosfodiestri takođe u okviru područja primera izvođenja koji se ovde razmatraju. Oligonukleotidi koji sadrže različite internukleotidne veze se takođe razmatraju, npr. mešoviti fosforotioatni fosfodiestri. Mogu biti upotrebljene i druge internukleotidne veze koje stabilizuju oligonukleotid.

Koadjuvans

[0115] Određeni primeri izvođenja koji su ovde obezbeđeni, uključuju kompozicije vakcina i imunološke adjuvansne kompozicije, uklјučujući farmaceutske kompozicije koje sadrže, pored GLA, najmanje jedan koadjuvans, što se odnosi na komponentu takvih kompozicija koja ima adjuvansnu aktivnost, ali koja je drugačija od GLA. Koadjuvans koji ima takvu adjuvansnu aktivnost podrazumeva kompoziciju koja, kada se primeni subjektu kao što je čovek (npr. humani pacijent), primat koji nije čovek, sisar ili drugi viši eukariotski organizam koji ima prepoznatljiv imuni sistem, je sposobna da izmeni (tj. poveća ili smanji, na statistički značajan način i, u određenim poželјnim primerima izvođenja, pojača ili poveća) potenciju i/ili dugoročnost imunog odgovora. (pogledati, npr. Powell i Newman, "Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, Plenum Press, New York). U određenim primerima izvođenja koji su ovde opisani, pored GLA i želјenog antigena, po izboru može biti dodat i jedan ili više koadjuvanasa, i tako se može izmeniti, npr. izazvati ili pojačati imuni odgovor koji je usmeren na želјeni antigen, pri čemu koadjuvans može biti primenjen u isto vreme kada i GLA, ili primena može biti razdvojena u vremenu i/ili prostoru (npr. na anatomski različitom mestu); ipak, određeni primeri izvođenja pronalaska nisu predviđeni da budu tako ograničeni i stoga takođe razmatraju primenu GLA u kompoziciji koja ne sadrži specifični antigen, ali može sadržavati jedan ili više od agonista TLR-a, koadjuvansa, imidazohinlinskih modifikatora imunog odgovora i imunih modifikatora sa strukturom dvostruke petlјe (dSLIM).

[0116] Shodno tome, i kao što je prethodno navedeno, koadjuvansi uklјučuju kompozicije različite od GLA koje imaju adjuvansne efekte, kao što su saponini i mimetici saponina, uklјučujući QS21 i mimetike QS21 (pogledati, npr. U.S. Pat. No. 5,057,540; EP 0 362 279 B1; WO 95/17210), i dalje alumi, bilјni alkaloidi kao što je tomatin, deterdženti kao što su (ali bez ograničenja) saponin, polisorbat 80, Span 85 i stearil tirozin, jedan ili više citokina (npr. GM-CSF, IL-2, IL-7, IL -12, TNF-alfa, IFN-gama), imidazohinolinski modifikator imunog odgovora i imuni modifikator sa strukturom dvostruke petlјe (dSLIM, npr. Weeratna i saradnici, 2005 Vaccine 23:5263).

[0117] Deterdženti koji sadrže saponine su opisani u, npr. U.S. Patent 6,544,518; Lacaille-Dubois M i Wagner H. (1996 Phytomedicine 2: 363-386), U.S. Pat. No.5,057,540 , Kensil, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55 i EP 0 362 279 B1. Čestične strukture, nazvane imunostimulirajućim kompleksima (ISCOMS), koje sadrže frakcije Quil A (saponina) su hemolitičke i upotrebljavane su u proizvodnji vakcina (Morein, B., EP 0 109 942 B1). Prijavljeno je da ove strukture imaju adjuvansnu aktivnost (EP 0109942 B1; WO 96/11711). Hemolitički saponini QS21 i QS17 (prečišćene frakcije Quil A, HPLC postupkom) su opisani kao moćni sistemski adjuvansi, a postupak njihove proizvodnje je opisan u U.S. Pat. No. 5,057,540 i EP 0 362 279 B1. Takođe je u ovim referencama opisana upotreba QS7 (nehemolitičke frakcije Quil-A) koja deluje kao moćan adjuvans za sistemske vakcine. Upotreba QS21 je dalјe opisana u Kensil i saradnici (1991. J. Immunology 146: 431-437). Kombinacije QS21 i polisorbata ili ciklodekstrina su takođe poznate (WO 99/10008). Sistemi adjuvansa u vidu čestica koje sadrže frakcije QuilA, kao što su QS21 i QS7, su opisani u WO 96/33739 i WO 96/11711. Drugi saponini koji su korišćeni u istraživanjima sistemskih vakcinacija uključuju one izvedene iz drugih bilјnih vrsta, kao što su Gypsophila i Saponaria (Bomford i saradnici, Vaccine, 10(9):572-577, 1992).

[0118] Escin je drugi deterdžent srodan saponinima koji se može upotrebiti u adjuvansnim kompozicijama primera izvođenja koji su ovde opisani. Escin je opisan u Merkovoj listi (12. izd.: unos 3737) kao smeša saponina koja se javlja u semenu divlјeg kestena, Aesculus hippocastanum. Opisana je njegova izolacija hromatografijom i prečišćavanjem (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)), kao i upotrebom jonoizmenjivačkih smola (Erbring i saradnici, U.S. Pat. No. 3,238,190). Frakcije escina (poznate i kao aescini) su takođe prečišćene i pokazano je da su biološki aktivne (Yoshikawa M i saradnici (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 August; 44(8):1454-1464)). Digitonin je sledeći deterdžent, koji je takođe opisan u Merkovoj listi (12. izdanje, unos 3204) kao saponin, dobijen iz semena Digitalis purpurea, koji je prečišćen prema proceduri opisanoj u Gisvold i saradnici, J. Am. Pharm.Assoc., 1934, 23, 664; i Rubenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621.

[0119] Drugi koadjuvansi za upotrebu prema određenim, ovde opisanim, primerima izvođenja, uklјučuju blok kopolimer ili biorazgradivi polimer, što se odnosi na klasu polimernih jedinjenja sa kojima će stručnjaci u relevantnoj oblasti biti upoznati. Primeri blok polimera ili biorazgradivog polimera koji mogu biti uklјučeni u GLA kompoziciju vakcine ili GLA imunološki adjuvans, uklјučuju Pluronic® L121 (BASF Corp., Mount Olive, NJ; pogledati, npr. Yeh i saradnici, 1996 Pharm. Res.13:1693; U.S. Patent No.

5,565,209), CRL1005 (npr. Triozzi i saradnici, 1997 Clin Canc. Res. 3:2355) i polimere tipa (laktat-koglikolna kiselina) (PLGA), polimer mlečne kiseline (PLA), poli-(D,L-laktid-ko-glikolid) (PLG) i polil:C. (pogledati, npr. Powell i Newman, "Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, Plenum Press, New York)

[0120] Određeni primeri izvođenja razmatraju GLA vakcine i GLA imunološke adjuvanse koji uklјučuju ulјe, koje, u pojedinim takvim primerima izvođenja, može doprineti koadjuvansnoj aktivnosti, a u drugim takvim primerima izvođenja može dodatno ili alternativno obezbediti farmaceutski prihvatlјiv nosač ili ekscipijens. Veliki broj pogodnih ulјa je poznat i može biti izabran za uklјučivanje u kompoziciju vakcine i imunološke adjuvansne kompozicije na osnovu predmetnog opisa. Primeri takvih ulјa, kao ilustracije, a ne kao ograničenja, su skvalen, skvalan, mineralno ulјe, maslinovo ulјe, holesterol i manid monooleat.

[0121] Modifikatori imunog odgovora kao što su imidazohinolinski modifikatori imunog odgovora su takođe poznati u stanju tehnike i mogu takođe biti uklјučeni kao koadjuvansi u određenim ovde opisanim primerima izvođenja. Određeni poželјni imidazohinolinski modifikatori imunog odgovora uklјučuju, kao neograničavajuće primere, rezikvimod (R848), imikvimod i gardikvimod (Hemmi i saradnici, 2002 Nat. Immunol.3:196; Gibson i saradnici, 2002 Cell. Immunol.218:74; Gorden i saradnici, 2005 J. Immunol. 174:1259); ovi i drugi imidazohinolinski modifikatori imunog odgovora mogu, pod odgovarajućim uslovima, takođe imati aktivnost TLR agonista, kao što je ovde opisano. Drugi modifikatori imunog odgovora su imuni modifikatori sa strukturom dvostruke petlјe (dSLIM) zasnovani na nukleinskim kiselinama. Specifični primeri dSLIM-a koji su razmatrani za upotrebu u pojedinim primerima izvođenja koji su ovde opisani, mogu se naći u Schmidt i saradnici, 2006 Allergy 61:56; Weihrauch i saradnici 2005 Clin Cancer Res.11(16):5993-6001; Modern Biopharmaceuticals, J. Knablein (urednik). John Wiley & Sons, 6. decembar, 2005. (dSLIM su diskutovani na stranicama 183-200) i u Mologen AG (Berlin, FRG: [preuzeto 18.8.2006. sa http://www.mologen.com/English/04.20-dSLIM.shtml].

[0122] Kao što je prethodno takođe napomenuto, jedan tip koadjuvansa za upotrebu sa GLA, kao što je ovde opisano, mogu biti aluminijumski koadjuvansi, koji se generalno nazivaju "alumi". Alum koadjuvansi se zasnivaju na sledećem: aluminijum oksi-hidroksidu; aluminijum hidroksifosfatu; ili raznim odgovarajućim solima. Vakcine koje koriste koadjuvanse sa alumom mogu uklјučivati vakcine za sojeve tetanusa, HPV-a, virusa hepatitis A, inaktivirani polio virus i druge antigene, kako je ovde opisano. Koadjuvansi sa alumom su pogodni pošto imaju dobre podatke o bezbednosti, povećavaju odgovore antitela, stabilizuju antigene i relativno su jednostavni za proizvodnju velikog obima (Edelman 2002 Mol. Biotechnol.21: 129-148; Edelman, R.1980 Rev. Infect. Dis.2: 370-383.).

[0123] Drugi koadjuvansi koji se mogu kombinovati sa GLA zarad efektivne imunostimulacije, uklјučuju saponine i saponinske mimetike, uklјučujući QS21 i strukturno srodna jedinjenja koja obezbeđuju slične efekte i ovde se nazivaju QS21 mimeticima. QS21 je prepoznat kao poželјan koadjuvans. QS21 može sadržavati HPLC-om prečišćenu netoksičnu frakciju izvedenu iz kore Quillaja Saponaria Molina. Proizvodnja QS21 je opisana u U.S. Pat. No. 5,057,540, (pogledati takođe U.S. Patent No. 6,936,255, 7,029,678 i 6,932,972.)

[0124] U određenim primerima izvođenja, GLA može takođe biti u kombinaciji sa "imunostimulatornim kompleksima" poznatim kao ISCOMS (npr. U.S. Patent No.6,869,607, 6,846,489, 6,027,732, 4,981,684), uklјučujući ISCOMATRIX® proizveden od saponina, a koji je komercijalno dostupan, na primer, od firmi Iscotec (Stokholm, Švedska) i CSL Ltd. (Parkville, Victoria, Australija).

Rekombinantni ekspresioni konstrukt

[0125] Prema određenim primerima izvođenja koji su ovde opisani, kompozicija GLA vakcine može sadržavati najmanje jedan rekombinantni ekspresioni konstrukt koji sadrži promotor, operativno povezan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira antigen. U određenim dodatnim primerima izvođenja, rekombinantni ekspresioni konstrukt je prisutan u virusnom vektoru, kao što je adenovirusni, adeno-asocirani viralni, herpesvirusni, lentivirusni, poksvirusni ili retrovirusni vektor. Kompozicije i postupci pravljenja i upotrebe ovakvih ekspresionih konstrukata i vektora su poznati u stanju tehnike, za ekspresiju polipeptidnih antigena koji su ovde obezbeđeni, na primer, u Ausubel i saradnici (izd.), Current Protocols in Molecular Biology, 2006 John Wiley & Sons, NY. Neograničavajući primeri rekombinantnih ekspresionih konstrukata se u principu mogu naći, na primer, u U.S. Patent No.

6,844,192; 7,037,712; 7,052,904; 7,001,770; 6,106,824; 5,693,531; 6,613,892; 6,875,610; 7,067,310; 6,218,186; 6,783,981; 7,052,904; 6,783,981; 6,734,172; 6,713,068; 5,795,577 i 6,770,445 i drugde, sa opisima koji se mogu prilagoditi ekspresiji polipeptidnih antigena koji su ovde obezbeđeni i za upotrebu u određenim ovde opisanim primerima izvođenja.

Imuni odgovor

[0126] Pronalazak stoga obezbeđuje kompozicije za izmenu (tj. povećanje ili smanjenje, na statistički značajan način, na primer, u odnosu na odgovarajuću kontrolu koja će biti očigledna stručnjacima) imunog odgovora u domaćinu koji je sposoban da pokrene imuni odgovor. Kao što će biti poznato prosečno iskusnim stručnjacima, imuni odgovor može biti bilo koja aktivna izmena imunskog statusa domaćina koja može uklјučivati bilo koju izmenu u strukturi ili funkciji jednog ili više tkiva, organa, ćelije ili molekula koji učestvuju u održavanju i/ili regulaciji imunskog statusa domaćina. Imuni odgovori se obično mogu detektovati bilo kojim od niza dobro poznatih parametara, uklјučujući ali ne ograničavajući se na, in vivo ili in vitro određivanje: solubilnih imunoglobulina ili antitela; solubilnih medijatora kao što su citokini, limfokini, hemokini, hormoni, faktori rasta i slični, kao i drugih solubilnih malih peptidnih, ugljeni hidratnih, nukleotidnih i/ili lipidnih medijatora; promena stanja aktivacije ćelije, određivanjem izmena u fnkcionalnim ili strukturnim osobinama ćelija imunog sistema, na primer, u ćelijskoj proliferaciji, izmeni pokretlјivosti, indukciji specijalizovanih aktivnosti kao što je specifična ekspresija gena ili citolitičko ponašanje; ćelijskoj diferencijaciji dejstvom ćelija imunog sistema, uklјučujući izmenjene profile ekspresije površinskih antigena ili početak apoptoze (programirane ćelijske smrti);

[0127] Imuni odgovori se često mogu smatrati, na primer, razlikovanjima između sopstvenih i nesopstvenih struktura od strane ćelija i tkiva imunog sistema domaćina, na molekulskom i ćelijskom nivou, ali pronalazak ne bi trebalo da bude tako ograničen. Na primer, imuni odgovori mogu takođe uklјučivati promene stanja imunog sistema koje su rezultat imunskog prepoznavanja sopstvenih molekula, ćelija ili tkiva, što može pratiti bilo koji broj normalnih stanja poput uobičajene regulacije komponenti imunog sistema ili što može biti prisutno u patološkim stanjima, kao što su neodgovarajući autoimuni odgovori koji se mogu uočiti kod autoimunih i degenerativnih bolesti. Kao još jedan od primera, pored indukcije povećanja određenih aktivnosti imunog sistema (kao što su proizvodnja antitela i/ili citokina ili aktivacija ćelijski posredovanog imuniteta), imuni odgovori mogu takođe uklјučivati supresiju, atenuaciju ili bilo koju drugu negativnu regulaciju imuniteta koja se može detektovati i koja može biti posledica izabranog antigena, načina primene antigena, specifične indukcije tolerancije ili drugih faktora.

[0128] Određivanje indukcije imunog odgovora vakcinama predmetnog pronalaska može biti urađeno bilo kojim od brojnih dobro poznatih imunoloških testova koje će oni koji imaju uobičajeno znanje u ovoj oblasti lako prepoznati. Ovakvi testovi uklјučuju, ali ne moraju biti ograničeni na, na in vivo ili in vitro određivanje: solubilnih antitela; solubilnih medijatora kao što su citokini, limfokini, hemokini, hormoni, faktori rasta i slični, kao i drugih solubilnih malih peptidnih, ugljeni hidratnih, nukleotidnih i/ili lipidnih medijatora; promena stanja aktivacije ćelije, određivanjem izmena u fnkcionalnim ili strukturnim osobinama ćelija imunog sistema, na primer, u ćelijskoj proliferaciji, izmeni pokretlјivosti, indukciji specijalizovanih aktivnosti kao što je specifična ekspresija gena ili citolitičko ponašanje; ćelijskoj diferencijaciji dejstvom ćelija imunog sistema, uklјučujući izmenjene profile ekspresije površinskih antigena ili početak apoptoze (programirane ćelijske smrti). Procedure za izvođenje ovih i sličnih testova su široko poznate i mogu se naći, na primer, u Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998; pogledati takođe Current Protocols in Immunology; pogledati takođe, npr. Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986. Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell i Shigii (ur.) Selected Methods in Cellular Immunology, 1979 Freeman Publishing, San Francisco, CA; Green i Reed, 1998 Science 281:1309 i reference koje su u njima citirane.).

[0129] Detekcija proliferacije antigen-reaktivnih T-ćelija se može postići različitim poznatim tehnikama. Na primer, proliferacija T-ćelija može biti detektovana merenjem stope sinteze DNK, a specifičnost antigena se može odrediti kontrolisanjem stimulusa (kao što su, na primer, specifične želјene antigen- ili kontrolne antigen-prezentujuće ćelije koje su sa pulsno obeleženim antigenom) kojima se izlažu T-ćelije kandidati reaktivni na antigen. T-ćelije koje su stimulisane da proliferišu, pokazuju povećanu stopu sinteze DNK. Uobičajen način za merenje stope sinteze DNK je, na primer, pulsno obeležavanje kultura T-ćelija sa timidinom obeleženim tricijumom, nukleozidnim prekursorom koji se ugrađuje u novosintetisanu DNK. Količina ugrađenog timidina koji je obeležen tricijumom se može odrediti upotrebom scincilacionog spektrofotometra za tečnosti. Drugi načini za detekciju proliferacije T-ćelija uklјučuju merenja povećanja proizvodnje interleukina-2 (IL-2), fluksa Ca<2+>ili unosa boje kao što je 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolijum. Alternativno, može se meriti sinteza limfokina (kao što je interferon-gama) ili se može kvantifikovati relativan broj T-ćelija koje mogu da reaguju na određeni antigen.

[0130] Detekcija proizvodnje antitela specifičnih za antigen se može postići, na primer, analizom uzorka (npr. uzorka koji sadrži imunoglobulin, kao što su serum, plazma ili krv) iz domaćina tretiranog vakcinom prema predmetnom pronalasku, upotrebom in vitro metodologija kao što su radioimunoeseji (RIA), enzimski-povezani imunosorbentni testovi (ELISA), ravnotežna dijaliza ili imunoblotovanje na čvrstoj fazi, uklјučujući Western blot. U poželјnim primerima izvođenja ELISA testovi mogu dodatno uključivati imobilizaciju cilјnog antigena sa monoklonskim antitelom specifičnim za taj antigen na čvrstoj fazi, na primer, da bi se povećala osetlјivost testa. Proizvodnja solubilnih medijatora (npr. citokina, hemokina, limfokina, prostaglandina itd.) takođe se može lako odrediti upotrebom enzimski-povezanog imunosorbentnog testa (ELISA), na primer, upotrebom postupaka, aparata i reagenasa koji su lako dostupni iz komercijalnih izvora (npr. Sigma, St. Louis, MO; pogledati takođe R & D Systems, Katalog 2006., R & D Systems, Minneapolis, MN).

[0131] Brojni drugi imunološki parametri mogu takođe biti praćeni, upotrebom rutinskih testova koji su dobro poznati u stanju tehnike. Testovi mogu uklјučivati, na primer, testove citotoksičnosti prosredovane ćelijama koja je zavisna od antitela (ADCC), sekundarne in vitro odgovore antitela, analize raznih subpopulacija mononuklearnih ćelija periferne krvi ili limfoidnih mononuklearnih ćelija protočnom imunocitofluorimetrijom i upotrebom dobro uspostavlјenih markerskih antigenskih sistema, imunohistohemiju ili druge relevantne testove. Ovi i drugi testovi se mogu naći, na primer, u Rose i saradnici (izd.), Manual of Clinical Laboratory Immunolog, 5. izd., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DC.

[0132] Shodno navedenom, smatra se da će vakcine i adjuvansne kompozicije koje su ovde obezbeđene biti sposobne da u domaćinu izazovu ili pobolјšaju najmanje jedan imuni odgovor koji je izabran od T-limfocitnog odgovora tipa TH1, T-limfocitnog odgovora tipa TH2, odgovora citotoksičnih T-limfocita (CTL), odgovora antitela, citokinskog odgovora, limfokinskog odgovora, hemokinskog odgovora i inflamatornog odgovora. U određenim primerima izvođenja, imuni odgovor može podrazumevati najmanje jedno od: proizvodnje jednog ili mnoštva citokina, pri čemu je citokin izabran od interferonagama (IFN-γ), faktora nekroze tumora-alfa (TNF-α); proizvodnje jednog ili mnoštva interleukina, pri čemu je interleukin izabran od IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10. IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 i IL-23; proizvodnje jednog ili mnoštva hemokina, pri čemu je hemokin izabran od MIP-1α, MIP-1β, RANTES, CCL4 i CCL5 i odgovora limfocita koji je izabran od odgovora memorijskih T-ćelija, odgovora memorijskih B-ćelija, odgovora efektorskih T-ćelija, odgovora citotoksičnih T-ćelija i odgovora efektorskih B-ćelija. Pogledati, npr. WO 94/00153; WO 95/17209; WO 96/02555; U.S. 6,692,752; U.S. 7,084,256; U.S.

6,977,073; U.S. 6,749,856; U.S. 6,733,763; U.S. 6,797,276; U.S. 6,752,995; U.S. 6,057,427; U.S.

6,472,515; U.S. 6,309,847; U.S. 6,969,704; U.S. 6,120,769; U.S. 5,993,800; U.S. 5,595,888; Smith i saradnici, 1987 J Biol Chem.262:6951; Kriegler i saradnici, 1988 Cell 53:4553; Beutler i saradnici, 1986 Nature 320:584; U.S.6,991,791; U.S.6,654,462; U.S.6,375,944.

Farmaceutske kompozicije

[0133] Ovde su obezbeđene kompozicije (uklјučujući farmaceutske kompozicije) koje sadrže ovde opisane emulzije ulja u vodi. U pojedinim primerima izvođenja, kompozicija dalјe sadrži farmaceutski prihvatlјiv nosač, ekscipijens ili razblaživač. U pojedinim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je kompozicija vakcine. Kompozicije koje su ovde opisane mogu biti primenjene subjektu za stimulaciju imunog odgovora kod subjekta (uklјučujući nespecifičan odgovor i odgovor specifičan za antigen). U pojedinim primerima izvođenja, subjekat je sisar (npr. životinja, uključujući domaće životinje (krave, svinje, koze, konje itd.) i kućne lјubimce (mačke, pse itd.) ili ljude). U pojedinim primerima izvođenja, subjekt je toplokrvna životinja.

[0134] Farmaceutske kompozicije generalno sadrže GLA (dostupan od firme Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; broj proizvoda 699800) i mogu dalјe sadržavati jednu ili više komponenti koje su ovde obezbeđene i koje su izabrane od antigena, agoniste TLR-a, koadjuvansa (uklјučujući po izboru citokin, imidazohinolinski modifikator imunog odgovora i/ili dSLIM) i/ili rekombinantnog ekspresionog konstrukta, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatlјivim nosačem, ekscipijensom ili razblaživačem.

[0135] Shodno navedenom, u određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na GLA "monoterapiju" gde je GLA, kao što je ovde opisano, formulisan u emulziji koja je suštinski lišena drugih antigena i primenjuje se subjektu da bi se stimulisao imuni odgovor, npr. nespecifičan imuni odgovor, u svrhu lečenja ili prevencije bolesti ili drugog stanja, kao što je infekcija nekim organizmom. U jednom primeru izvođenja, na primer, kompozicije i postupci pronalaska koriste monofosforilisani disaharid za stimulaciju imunog odgovora kod subjekta. U sledećem posebnom primeru izvođenja, kompozicije i postupci koriste 2-monoacilni oblik Lipida A za stimulaciju imunog odgovora kod subjekta. U sledećem posebnom primeru izvođenja, GLA je u obliku spreja, opciono obezbeđen u okviru komercijalnog kompleta.

[0136] GLA može biti poželјno formulisan u stabilnoj emulziji, kao što je ovde opisano. U jednom posebnom primeru izvođenja, na primer, obezbeđena je kompozicija koja sadrži derivat lipida A u stabilnoj emulziji koja je suštinski lišena drugih antigena. U sledećem posebnom primeru izvođenja, obezbeđena je kompozicija koja sadrži derivat 3-acilovanog monofosforilisanog lipida A koji je pogodan za upotrebu kod sisara, gde amin na poziciji 2 ima jedan acilni lanac i pri čemu je kompozicija suštinski lišena drugih antigena.

[0137] U određenim drugim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je kompozicija vakcine koja sadrži i GLA i antigen, i koja dodatno može sadržavati jednu ili više ovde obezbeđenih komponenti koje su izabrane od agoniste TLR-a, koadjuvansa (uklјučujući, npr. citokin, imidazohinolinski modifikator imunog odgovora i/ili dSLIM) i sličnog i/ili pak rekombinantni ekspresioni konstrukt, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatlјivim nosačem, ekscipijensom ili razblaživačem.

[0138] Ilustrativni nosači će biti netoksični za primaoce u upotreblјenim dozama i koncentracijama. Vakcine na bazi “GLA plus nukleinska kiselina” ili vakcine koje sadrže “GLA plus antigen”, primenjuju se u koncentraciji od oko 0,01 µg/kg do oko 100 mg/kg telesne težine, obično intradermalnim, subkutanim, intramuskularnim ili intravenskim putem primene ili drugim načinima primene.

[0139] Poželјna doza je oko 1 µg/kg do oko 1 mg/kg, a naročito je poželjna doza od oko 5 µg/kg do oko 200 µg/kg. Stručnjacima iz oblasti će biti jasno da će broj i učestalost primene zavisiti od odgovora domaćina. "Farmaceutski prihvatlјivi nosači" za terapijsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj praksi i opisani su, na primer, u Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ur.1985). Na primer, može se koristiti sterilan fiziološki rastvor i fosfatani pufer, sa fiziološkim pH. U farmaceutskoj kompoziciji mogu biti obezbeđeni i konzervansi, stabilizatori, boje i čak sredstva za pobolјšanje ukusa. Na primer, natrijum benzoat, sorbinska kiselina i estri p-hidroksibenzoeve kiseline se mogu dodavati kao konzervansi. Id. na 1449. Pored toga, mogu se upotrebiti antioksidansi i agensi za resuspendovanje. Id.

[0140] "Farmaceutski prihvatlјiva so" se odnosi na soli jedinjenja predmetnog pronalaska izvedene iz kombinacije takvih jedinjenja i organske ili neorganske kiseline (kisele adicione soli) ili organske ili neorganske baze (bazne adicione soli). Kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljene bilo u obliku slobodne baze ili soli, pri čemu se za oba oblika smatra da su u okviru područja predmetnog pronalaska.

[0141] Farmaceutske kompozicije mogu biti u bilo kom obliku koji dozvoljava da se kompozicija primeni kod pacijenta. Na primer, kompozicija može biti u čvrstom, tečnom ili gasovitom obliku (aerosol). Putevi primene obično uklјučuju, bez ograničenja, oralnu, topikalnu, parenteralnu (npr. sublingvalnu ili bukalnu), sublingvalnu, rektalnu, vaginalnu i intranazalnu primenu (npr. u vidu spreja). Termin parenteralno, kako se ovde koristi, obuhvata jontoforetsku (npr. U.S.7,033,598; 7,018,345; 6,970,739), sonoforetsku (npr. U.S. 4,780,212; 4,767,402; 4,948,587; 5,618,275; 5,656,016; 5,722,397; 6,322,532; 6,018,678), termalnu (npr. U.S. 5,885,211; 6,685,699), pasivno transdermalnu primenu (npr. U.S.

3,598,122; 3,598,123; 4,286,592; 4,314,557; 4,379,454; 4,568,343; 5,464,387; UK Pat. Spec. No.

2232892; U.S.6,871,477; 6,974,588; 6,676,961), primenu mikroiglama (npr. U.S. 6,908,453; 5,457,041; 5,591,139; 6,033,928), kao i subkutane injekcije, intravenske, intramuskularne, intrasternalne, intrakaverozalne, intratekalne, intrakanalne, intraureteralne injekcije ili infuzione tehnike. U posebnom primeru izvođenja, kompozicija koja je ovde opisana (uklјučujući farmaceutske i kompozicije vakcina) primenjuje se intradermalno, tehnikom izabranom od jontoforeze, mikrokavitacije, sonoforeze ili primene mikroiglama.

[0142] Farmaceutska kompozicija je formulisana tako da dozvolјava da aktivni sastojci koji su u njoj sadržani, budu bioraspoloživi nakon primene kompozicije pacijentu. Kompozicije koje će se primenjivati pacijentu će biti u vidu jediničnih ili višestukih doznih jedinica, gde, na primer, tableta može biti jedna jedinična doza, a spremište sa jednim ili sa više jedinjenja pronalaska u aerosolnom obliku može sadržavati više doznih jedinica.

[0143] Za oralnu primenu, mogu biti prisutni ekscipijensi i/ili agensi povezivanja. Primeri su saharoza, kaolin, glicerin, dekstrini skroba, natrijum alginat, karboksimetilceluloza i etil celuloza. Mogu biti prisutni agensi za boju i/ili ukus. Može se koristiti i omotač za oblaganje.

[0144] Kompozicija može biti u obliku tečnosti, npr. kao eliksir, sirup, rastvor, emulzija ili suspenzija. Tečnost može biti za oralnu primenu ili primenu injekcijom, koji predstavljaju dva primera. Kada su namenjene za oralnu primenu, poželјne kompozicije sadrže jedan ili više zaslađivača, konzervanasa, boja/obojivača i pojačivača ukusa. U kompoziciju koja je namenjena za primenu injekcijom, može biti uklјučen jedan ili više surfaktanata, konzervanasa, agenasa za vlaženje, agenasa za dispergovanje, agenasa za resuspendovanje, pufera, stabilizatora i izotoničnih agenasa.

[0145] Tečna farmaceutska kompozicija, kako se ovde upotrebljava, bilo u obliku rastvora, suspenzije ili u drugom sličnom obliku, može uklјučivati jedan ili više od sledećih nosača ili ekscipijenasa: sterilne razblaživače kao što su voda za injekcije, rastvor soli, poželјno fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, izotonični natrijum hlorid, masna ulјa kao što su skvalen, skvalan, mineralno ulјe, manidni monooleat, holesterol i/ili sintetski mono ili digilceridi koji mogu da služe kao rastvarači ili resuspendujući medijumi, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol ili drugi rastvarači; antibakterijska sredstva kao što su benzil alkohol ili metil paraben; antioksidansi kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helatorna sredstva kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina; puferske supstance kao što su acetati, citrati ili fosfati i agensi za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. Parenteralni preparat se može upakovati u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili višedozne bočice napravlјene od stakla ili plastike. Farmaceutska kompozicija za injeciranje je poželјno sterilna.

[0146] U posebnom primeru izvođenja, farmaceutska ili kompozicija vakcine pronalaska sadrži stabilnu vodenu suspenziju sa česticama manjim od 0,2µm i dalјe sadrži najmanje jednu komponentu izabranu iz grupe koja se sastoji od fosfolipida, masnih kiselina, surfaktanata, deterdženata, saponina, fluorisanih lipida i sličnog.

[0147] U još jednom primeru izvođenju, kompozicija pronalaska je formulisana na način koji omogućava prevođenje u aerosol.

[0148] Takođe može biti poželјno da se u vakcinu ili farmaceutsku kompoziciju uklјuče i druge komponente, kao što su nosači za isporuku, uklјučujući, ali se ne ograničavajući na, soli aluminijuma, emulzije vode u ulјu, biorazgradiva ulјa, emulzije ulјa u vodi, biorazgradive mikrokapsule i lipozome. Primeri dodatnih imunostimulatornih supstanci (koadjuvanasa) za upotrebu u takvim nosačima su takođe prethodno opisani i mogu uključivati N-acetilmuramil-L-alanin-D-izoglutamin (MDP), glukan, IL-12, GM-CSF, gama interferon i IL-12.

[0149] Dok se u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska može koristiti bilo koji pogodan nosač poznat stručnjacima, tip nosača će varirati u zavisnosti od načina primene i da li je poželјno odloženo oslobađanje. Za parenteralnu primenu, kao što je subkutana injekcija, nosač poželјno sadrži vodu, fiziološki rastvor, alkohol, mast, vosak ili pufer. Za oralnu primenu se mogu koristiti bilo koji od prethodno navedenih nosača ili čvrsti nosači kao što su manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, talk, celuloza, glukoza, saharoza i magnezijum karbonat. Biorazgradive mikrosfere (npr. polilaktički galaktid) mogu takođe biti upotrebljene kao nosači za farmaceutske kompozicije ovog pronalaska. Pogodne biorazgradive mikrosfere su opisane, na primer, u U.S. Patent No. 4,897,268 i 5,075,109. U ovom pogledu, poželјno je da mikrosfera bude veća od približno 25 mikrona.

[0150] Farmaceutske kompozicije (uklјučujući GLA vakcine i GLA imunološke adjuvanse) mogu takođe sadržavati razblaživače poput pufera, antioksidanse kao što je askorbinska kiselina, polipeptide niske molekulske težine (manje od oko 10 ostataka), proteine, aminokiseline, uglјene hidrate uklјučujući glukozu, saharozu ili dekstrine, helatorna sredstva kao što je EDTA, glutation i druge stabilizatore i ekscipijense. Neutralni pufer ili fiziološki rastvor pomešan sa nespecifičnim serumskim albuminom, predstavljaju odgovarajuće razblaživače za primer. Poželјno je da se proizvod može formulisati kao liofilizirana supstanca, upotrebom odgovarajućih rastvora ekscipijensa (npr. saharoze) kao razblaživača.

[0151] Kako je prethodno opisano, u određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obuhvata kompozicije koje su sposobne da isporuče molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju želјene antigene. Takve kompozicije uklјučuju rekombinantne virusne vektore (npr. retrovirusne (pogledati WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 i WO 94/03622), adenovirusne (pogledati Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Li i saradnici, Hum. Gene Ther. 4:403-409, 1993; Vincent i saradnici, Nat. Genet.5:130-134, 1993; i Kolls i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 91:215-219, 1994), poks virusa (pogledati U.S. Patent No. 4,769,330; U.S. Patent No. 5,017,487; i WO 89/01973)), rekombinantne ekspresione konstrukte molekula nukleinskih kiselina u kompleksu sa polikatjonskim molekulom (pogledati WO 93/03709) i nukleinske kiseline vezane sa lipozomima (pogledati Wang i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851, 1987). U određenim primerima izvođenja, DNK može biti povezana sa ubijenim ili inaktiviranim adenovirusom (pogledati Curiel i saradnici, Hum. Gene Ther.

3:147-154, 1992; Cotton i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094, 1992). Druge pogodne kompozicije uklјučuju kombinacije DNK i liganda (pogledati Wu i saradnici, J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989) i kombinacije lipida i DNK (pogledati Feigner i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989).

[0152] Pored direktnih in vivo procedura, mogu biti upotrebljene i ex vivo procedure, u kojima se ćelije uklanjaju iz domaćina, modifikuju i smeštaju u istu ili drugu životinju domaćina. Biće očigledno da se može koristiti bilo koja od prethodno navedenih kompozicija za uvođenje molekula nukleinskih kiselina koji kodiraju antigen u ćelije tkiva u ex vivo kontekstu. Protokoli za virusne, fizičke i hemijske postupke preuzimanja su dobro poznati u stanju tehnike.

[0153] Shodno navedenom, predmetni pronalazak je koristan za pojačavanje ili izazivanje imunog odgovora kod domaćina, pacijenta ili u kulturi ćelija. Kako se ovde koristi, termin "pacijent" se odnosi na bilo koju toplokrvnu životinju, poželјno čoveka. Pacijent može biti oboleo od infektivne bolesti, kancera poput kancera dojke ili autoimune bolesti ili može biti normalan (tj. bez uočljivog oboljenja i/ili infekcije). "Kultura ćelija" je bilo koji preparat koji sadrži imunokompetentne ćelije ili izolovane ćelije imunog sistema (uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, T-ćelije, makrofage, monocite, B-ćelije i dendritične ćelije). Ovakve ćelije mogu biti izolovane bilo kojom od različitih tehnika koje su dobro poznate stručnjaku sa prosečnim iskustvom (npr. Ficoll-gradijent gustine, centrifugiranje). Ćelije mogu (ali ne moraju) biti izolovane iz pacijenta obolelog od kancera i mogu se ponovo uvesti u pacijenta nakon tretmana.

[0154] U određenim primerima izvođenja, tečna kompozicija namenjena za parenteralnu ili oralnu primenu bi trebala da sadrži količinu GLA kompozicije vakcine koja je pogodna za dobijanje odgovarajućih doza. Navedena količina obično iznosi najmanje 0,01 tež.% antigena u kompoziciji. Kada je namenjena za oralnu primenu, ova količina može varirati između 0,1 i oko 70 tež.% kompozicije.

Poželјne oralne kompozicije sadrže između oko 4% i oko 50% antigena. Poželјne kompozicije i preparati su pripremlјeni tako da parenteralna dozna jedinica sadrži između 0,01 i 1 tež.% aktivne kompozicije.

[0155] Farmaceutska kompozicija može biti namenjena za topikalnu primenu, a u tom slučaju, pogodno je da sadrži rastvor, emulziju, mast ili gel kao osnovu. Osnova, na primer, može sadržavati jedno ili više od sledećeg: vazelin, lanolin, polietilen glikol, pčelinji vosak, mineralno ulјe, razblaživače kao što su voda i alkohol i emulgatore i stabilizatore. Agensi za zgušnjavanje mogu biti prisutni u farmaceutskoj kompoziciji za topikalnu primenu. Ukoliko je namenjena za transdermalnu primenu, kompozicija može biti primenjea u okviru transdermalnog flastera ili uređaja za jontoforezu. Topikalne formulacije mogu sadržavati koncentraciju antigena (npr. GLA-antigen kompozicije vakcine) ili GLA (npr. imunološku adjuvansnu kompoziciju; GLA je dostupan od firme Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL; npr. kataloški broj 699800) od oko 0,1 do oko 10% (težina po jedinici zapremine).

[0156] Kompozicija može biti namenjena za rektalnu primenu, u obliku, npr. supozitorija koji će se rastopiti u rektumu i osloboditi lek. Kompozicija za rektalnu primenu može sadržavati ulјastu bazu kao pogodan ekscipijens koji ne izaziva iritaciju. Ovakve baze uklјučuju, bez ograničenja, lanolin, puter kakaa i polietilen glikol. U postupcima pronalaska, kompozicije/adjuvansi vakcine mogu biti primenjeni upotrebom inserta, kuglica, formulacije(a) sa vremenski regulisanim otpuštanjem, flastera ili formulacije(a) sa brzim oslobađanjem.

[0157] U pojedinim primerima izvođenja se takođe razmatraju komercijalni kompleti koji sadrže ovde opisane GLA kompozicije vakcina i/ili GLA imunološke adjuvansne kompozicije, koje mogu biti obezbeđene u jednom ili u više kontejnera. U jednom primeru izvođenja, sve komponente GLA kompozicija vakcine i/ili GLA imunološke adjuvansne kompozicije su prisutne zajedno u jednom kontejneru, ali primeri izvođenja pronalaska nisu predviđeni da budu tako ograničeni i takođe razmatraju dva ili više kontejnera u kojima je, na primer, GLA imunološka adjuvansna kompozicija odvojena od antigenske komponente i nije u kontaktu sa njom. Bez vezivanja za teoriju, veruje se da, u nekim slučajevima, može biti korisna primena samo GLA imunološke adjuvansne kompozicije, dok u drugim slučajevima takva primena može biti korisna samo ukoliko je vremenski i/ili prostorno (npr. na anatomski različitim mestima) odvojena od primene antigena, pri čemu je u drugim slučajevima, korisna primena subjektu samo ovde opisana GLA kompozicija vakcine koja je sadrži i antigen i GLA, a opciono i druge komponente koje su ovde opisane.

[0158] Prema navedenim primerima izvođenja, spremište kompleta može biti bilo koji odgovarajući kontejner, posuda, bočica, ampula, epruveta, čaša, kutija, boca, flask, tegla, pljosnata posuda (šolja), bunarić sa ploče sa jednim ili više bunarića, rezervoar, tank ili slično ili drugi uređaj u koji se ovde opisane kompozicije mogu staviti, uskladištiti i/ili kojim se mogu transportovati, a kojima se može pristupiti da bi se uklonio sadržaj. Navedena spremišta obično mogu biti napravljena od materijala koji je kompatibilan sa predviđenom upotrebom i sa koga se lako može postići preuzimanje sadržaja.

Poželјni primeri ovakvih kontejnera obuhvataju staklene i/ili plastične, zaptivene ili epruvete i ampule koje se mogu ponovo zatvoriti, uklјučujući one koje imaju gumenu pregradu ili drugi način zaptivanja kompatibilan sa povlačenjem sadržaja upotrebom igle i šprica. Navedeni kontejneri mogu, na primer, biti izrađeni od stakla ili hemijski kompatibilne plastike ili smole i, dalje, izrađeni od materijala ili biti presvučeni materijalom koji omogućava efikasno povlačenje materijala iz spremišta i/ili koji štiti materijal od, npr. uslova koji dovode do razlaganja, kao što su ultralјubičasta svetlost ili ekstremne temperature, ili pak od neželjene kontaminacije koja može uključivati i mikrobiološke zagađivače. Kontejneri su poželјno sterilni ili mogu biti sterilisani i napravlјeni od materijala koji će biti kompatibilni sa bilo kojim nosačem, ekscipijensom, rastvaračem, nosačem ili sličnim, tako da se mogu upotrebljavati za resuspednovanje ili rastvaranje ovde opisanih kompozicija vakcine i/ili imunoloških adjuvansnih kompozicija i/ili antigena i/ili rekombinantnih ekspresionih konstrukata itd.

[0159] Primeri koji slede su navedeni kao ilustracije, a ne kao ograničenje.

PRIMERI

PRIMER 1

UTICAJ TITRACIJE DOZE EMULZIONOG ADJUVANSA I FORMULACIJE AGONISTE TLR4 NA IMUNOGENOST REKOMBINANTNE VAKCINE ZA MALARIJU

Uvod

[0160] Emulzije ulja u vodi (u/v) su bezbedno i uspešno korišćene kao adjuvansi u modernim vakcinama. Najizapaženije u/v emulzije su MF59® i AS03®, koje proizvode firme Novartis i GSK Biologicals, tim redom. Oba navedena adjuvansa sadrže ~2,5% skvalena u finalnoj formulaciji vakcine [1]. Ipak, do skora je objavljeno samo nekoliko studija u pogledu motivacije za izbor ove koncentracije skvalena [2-4]. Štaviše, skorašnja studija je pokazala da razblaživanje MF59 nije ugrozilo imuni odgovor u kliničkom ispitivanju vakcine za pandemski grip [5]. Ukoliko se adjuvansna aktivnost može održati uz smanjenje doze skvalena, lokalna reaktivnost u/v emulzija može potencijalno biti smanjena. Pored toga, cena vakcine bi se mogla smanjiti uz povećanje snabdevenošću adjuvansom, čime bi se lakše mogla ostvariti proizvodnja vakcine i adjuvansa u siromašnim zemlјama.

[0161] Rekombinantni antigen malarije PfCelTOS (protein Plasmodiumfalciparum-a za prelazak u ćeliju, kod ookineta i sporozoita) u kombinaciji sa emulzionim adjuvansom (Montanide® ISA 720) pokazao je efikasnost zaštite kod 60% miševa u modelu heterolognog izlaganja [6]. PfCelTOS inhibira pokretlјivost sporozoita, kao i njihovu infektivnost ka hepatocitima, tako da može biti važna komponenta nove generacije vakcina za malariju. Za efikasnost zaštite su važni i ćelijski i humoralni imuni odgovori [6, 7].

[0162] U ovom radu, ispitali smo efekte stabilne adjuvansne emulzije na bazi skvalena (SE) i njeno dejstvo na humoralni i ćelijski imuni odgovor nakon primene PfCelTOS. Štaviše, istražili smo efekat uklјučivanja sintetskog agoniste TLR4 i glukopiranozilnog lipidnog adjuvansa (GLA) u formulaciju vakcine. Pokazali smo da koncentracije skvalena u GLA-SE koje su manje od 2% v/v mogu izazvati ekvivalentne adjuvansne odgovore kao i koncentracija skvalena od 2% v/v. Ovaj nalaz ima važne implikacije za proizvodnju i doziranje adjuvanasa za vakcine, kao i za nove načine primene (kao što je intradermalni), koji mogu biti osetlјiviji na koncentracije ulјa. Štaviše, pokazali smo da prisustvo GLA oblikuje imunološku aktivnost u pogledu Th1-tipa odgovora, izazivajući više nivoe titara IgG2a antitela, IFN-γ produkujućih ćelija i dugoživečih plazma ćelije koje luče antitela, što može biti važno za efikasnost vakcine.

Materijali i postupci

[0163] Formulacije vakcine. Skalen iz jetre ajkule (čistoće ≥98%) je nabavlјen od firme Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Glicerol i α-tokoferol su nabavlјeni od firme Spectrum Chemical (Gardena, CA). Poloksamer 188 (Pluronic® F68) je nabavlјen od firme BASF (Ludwigshafen, Nemačka) ili Spectrum Chemical. Fosfatidilholin iz jaja (PC jajeta), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DPPC) i glukopiranozilni lipidni adjuvans (GLA) su nabavljeni od firme Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL). Komponente amonijum fosfatnog pufera su takođe nabavljene od firme J. T. Baker. Elumziona formulacija je pripremlјena razdvojenom pripremom vodene i uljane faze. Poloksamer 188, glicerol i komponente pufera su rastvorene u vodenoj fazi uz mešanje, dok je fosfatidilholin jaja rastvoren u ulјanoj fazi sonikacijom i zagrevanjem. Vodene i uljane faze (10% v/v ulјa) su zatim pomešane upotrebom laboratorijskog emulgatorskog miksera tipa Silverson Heavi Duti (visoke moći mešanja sa cevastim priključkom i kvadratnim prozorom od 3/4 inča; East Longmeadow, MA) pri brzini od -7000 obrtaja/min, tokom 10 minuta, da bi se dobila sirova emulzija. Sirova emulzija je zatim obrađena upotrebom homogenizera sa visokim pritiskom tipa Microfluidics M110P (Newton, MA), sa 12 prolazaka na -207 MPa (-30,000 psi). Vodena suspenzija GLA je najpre dalje dopunjena mešanjem GLA sa DPPC u molarnom odnosu 4.2:1 u organskom rastvaraču, nakon čega je usledilo uparavanje rastvarača i hidratacija sa ultra čistom vodom. Sonikacijom u vodenom kupatilu na -70°C je obrazovana nanočestična vodena suspenzija GLA-AF. Formulacije su kontrolisane, u pogledu veličine i koncentracije GLA na 5°C, sve vreme tokom trajanja rasporeda imunizacije. Veličina čestica je merena dinamičkim rasejavanjem svetlosti kao što je prethodno opisano [8]. Koncentracija GLA je praćena HPLC-CAD analizama [9]. Na dan imunizacije, emulzija je razblažena sa PBS-om do naznačenih koncentracija ulјa i pomešana je sa antigenom i GLA-AF (gde je bilo primenlјivo). Montanide® ISA 720 je nabavlјen od firme Seppic Inc. (Fairfield, NJ) i pripremlјen je pre imunizacije mešanjem sa vodenom fazom do 30% v/v. U tekstu specifikacije, doza emulzije se označava u vidu % ulјa u finalnoj formulaciji vakcine; odnos ulјa i emulgatora je održavan konstatnim za sve doze. Rekombinantni antigen harmonizovanih kodona, PfCelTOS, je razvijen i proizveden u Walter Reed Army Institute of Research i dostavlјen na IDRI u vidu prečišene količine u fosfatnom puferu, zahvalјujući dr Evelini Angov.

Imunološki postupci ...

[0164] Titar u krajnjoj tački je određen upotrebom Prism programa (GraphPad Software, La Jolla, CA), sigmoidnom ekstrapolacijom (promenlјivog nagiba) vrednosti dobijenih za razblaženje i sa titrom u krajnjoj tački koji je odgovarao graničnoj vrednosti (C) koja je određena kao što je prethodno opisano [10], upotrebom C = X SDf, gde je X srednja vrednost, SD je standardna devijacija negativne serumske kontrolne ploče i f je umnožak nivoa pouzdanosti od 99,9%. Ukoliko je granična vrednost koja je prethodno određena iznosila manje od 0,1 OD, vrednost od 0,1 OD je definisana kao granična vrednost. U retkim prilikama, pojedinačni registrovani bunarići na ploči su pokazali abnormalno visoko očitavanje u blizini najvećih razblaženja. Ove vrednosti su isklјučene iz sigmoidne krive upotrebom Grubovog testa za sumnjive vrednosti, poređenjem sa 4 razblaženja koja okružuju razblaženje koje se posmatra, sa nivoom pouzdanosti od 99% [11].

Rezultati

[0165] GLA-AF i SE su stabilne formulacije nanočestica [12]. GLA-AF je vodena nanosuspenzija GLA i fosfolipidnih čestica. SE je nanoemulzija na bazi skvalena koja se za imunizaciju obično upotrebljava sa skvalenom u koncentraciji od 2% v/v. Da bi se olakšala titracija doze emulzije uz zadržavanje GLA koncentracije konstantnom, GLA-AF je dodat u naznačene koncentracije SE neposredno pre imunizacije eksperimentalne grupe označene kao GLA-SE. Prosečne veličine čestica serija formulacije koje su upotrebljavane u ovoj studiji su bile između 88 i 98 nm i prikazane su u Tabeli 1. Na Slici 1 je prikazana koncentracija GLA tokom vremena u različitim serijama GLA-AF, a koja ukazuje na stabilnost koncentracije agoniste TLR-a za vreme trajanja in vivo studija opisanih u nastavku teksta i najmanje 6 meseci. Montanide® ISA 720 je adjuvans tipa emulzije vode u ulјu koji se obično koristi sa 70% v/v skvalena za imunizaciju, a prethodno je pokazao značajnu sterilnu zaštitu sa PfCelTOS, u modelu izloženosti malariji [6]. Montanide® ISA 720 se stoga koristi kao pozitivna kontrola za studije imunogenosti koje su opisane u nastavku.

[0166] BALB/c miševi su imunizovani 3 puta sa PfCelTOS kompozicijama vakcine uz razmak između injekcija od 3 nedelјe. Slika 2 prikazuje ukupne krajnje titre IgG, IgGl i IgG2a antitela nakon 2. i 3. imunizacije. Nakon 3. imunizacije (Slika 2d-f), uticaj titracije SE doze je bio očigledan u vidu smanjenja ukupnih IgG, IgG1 i IgG2a odgovora kod 0,02% SE grupe u poređenju sa 2% SE grupom. SE grupe sa 0,1% i 0,5% su takođe pokazale manji IgG2a odgovor nego 2% SE grupa. Ipak, izgleda da dodavanje GLA poništava ovaj efekat titracije SE doze: sve GLA-SE grupe izazivaju ekvivalentne IgG, IgG1 i IgG2a odgovore bez obzira na dozu emulzije. U stvari, GLA-AF grupa (koja ne sadrži emulziju) je pokazala ekvivalentne odgovore antitela kao GLA-SE grupa. Jasno je da prisustvo GLA (bilo SE ili AF) izaziva jači IgG2a odgovor u odnosu na istu kompoziciju vakcine bez GLA. Montanide® grupa je pokazala najviši IgGl odgovor, iako on nije značajno različit u odnosu na 2% SE ili 0,5% GLA-SE grupe. Odgovori antitela nakon 2. imunizacije su pokazali slične obrasce kao što su prethodno opisani, iako su ukupni titri bili nešto niži (slika 2a-c). Štaviše, nekoliko GLA-SE grupa je pokazalo značajno veće IgG2a i IgG1 odgovore u odnosu na GLA-AF. Konačno, vakcine koje sadrže GLA (SE ili AF), Montanide® ili 2% SE su dovele do većeg broja plazma ćelija kosnoj srži koje izlučuju antitela u poređenju sa grupom koja je sadržavala samo antigen (Slika 2g). Zanimlјivo je da 0,02% SE grupa pokazala smanjene nivoe plazma ćelija koje izlučuju antitela u poređenju sa grupom kojoj je primenjena puna 2% SE doza, što odražava rezultate dobijene za krajnje titre IgG antitela.

[0167] U drugom eksperimentu, korišćen je uži raspon titracije SE doza (0,5%- 2%), a ispitivani su i ćelijski i humoralni odgovori. Na Slici 3 su prikazani ukupni krajnji titri IgG, IgG1 i IgG2a antitela određeni nakon 2. i 3. imunizacije. Nakon 3. imunizacije (Slika 3d-f), sve grupe sa adjuvansima su pokazale veće ukupne IgG odgovore u odnosu na sam antigen. Međutim, doza od 0,5% SE nije uspela da izazove više IgGl antitela u poređenju sa efektom samog antigena, kao što i sve doze SE nisu uspele da izazovu veće IgG2a odgovore u poređenju efektom samog antigena. Nasuprot tome, sve grupe koje su sadržavale GLA su pokazale veće IgG, IgG1 i IgG2a odgovore u odnosu na sam antigen. GLA dramatično povećava IgG2a odgovore u svim grupama u poređenju sa istom kompozicijom bez GLA. Dok je grupa Montanide® pokazala značajno veće titre IgG1 nakon poređenja sa svim drugim grupama, GLA-SE grupe sa dozama od 0,5% i 1% SE su izazvale veće IgG2a odgovore u odnosu na Montanide® grupu. Slični obrasci su bili očigledni i nakon 2. imunizacije (Slika 3a-c), mada je 0,5% SE doza izazvala visok IgGl odgovor, za razliku od rezultata dobijenih za 3. imunizaciju. Vakcine koje sadrže GLA ili Montanide® su izazvale veći broj plazma ćelija koje izlučuju antitela (Slika 3g), iako efekat titracije doze sa različitim koncentracijama SE nije uočen.

[0168] Ćelijski odgovori su ispitivani citokinskim ELISPOT testom. Viši nivoi ćelija koje produkuju IFN-γ su uočeni u GLA-SE grupama sa SE dozom od 1% ili 2%, u poređenju sa grupama tretiranim samim antigenom, GLA-AF, SE bez GLA ili sa Montanide® adjuvansom (Slika 4a). Nasuprot tome, GLA-SE grupe su pokazale zanemarlјive nivoe ćelija koje luče IL-5 (Slika 4b), dok je 2% SE grupa imala više nivoe ćelija koje luče IL-5 u odnosu na grupe koje su sadržavale samo antigen ili Montanide®. Sličan trend je očigledan i u rezultatima multipleks analize citokina sa zrncima, gde je proizvodnja Th1 citokina IFN-γ indukovana kod GLA-SE grupa, dok su povećani Th2 citokini kao što su IL-5, IL-10 i IL-13 bili udruženi sa primenom emulzija koje ne sadrže GLA (Slika 5). Doza SE od 2% je izazvala najviše Th2 citokinske ćelijske odgovore (npr. kroz IL-5 i IL-13).

Diskusija

[0169] Uklјučivanje GLA u prethodno navedene kompozicije vakcine oblikovalo je imuni odgovor dominantno prema Th1 što moglo uočiti u vidu značajno viših nivoa IgG2a antitela i proizvodnje IFN-γ. Iako nije utvrđeno da ukupna proizvodnja antitela koreliše sa efikasnošću zaštite u prethodnim CelTOS studijama, nije urađena analiza izotipova antitela [6, 7]. Prema tome, nije jasno da li veća proizvodnja IgG2a antitela predstavlja povećani zaštitni potencijal. Ipak, čini se da je proizvodnja IFN-γ povezana sa efikasnošću vakcine [6, 7]. Stoga, GLA-SE adjuvansi mogu biti dobri kandidati za generisanje efikasnosti zaštite u CelTOS vakcinama. Napominjemo da deluje da je emulzija neophodna za proizvodnju IFN-γ (tj. GLA-SE grupe), dok su titri antitela izazvani u GLA-AF grupama bili slični GLA-SE grupama nakon 3. imunizacije. Zanimlјivo je da smanjenje doze emulzije sa 2% na 1% nije umanjilo proizvodnju IFN-γ ili antitela u GLA-SE grupama. Konačno, uklјučivanje GLA takođe indukuje značajno više dugoživećiih ćelije koje luče antitela u poređenju sa efektom samog antigena. Uglavnom, GLA oblikuje imuni odgovor dominantno prema Th1 i indukuje veći broj plazma ćelija koje luče antitela u kosnoj srži, iako deluje da koncentracije emulzije manje od 2% mogu biti dovolјne za ove efekte.

[0170] U grupama tretiranim emulzijama koje ne sadrže GLA, efekti smanjenja koncentracije adjuvansa su bili očigledniji. Tako, nivoi ćelija koje proizvode IL-5 su bili niži u 1% SE grupi u poređenju sa 2% SE grupom i samo je 2% SE grupa pokazala veće količine IL-13 u poređenju sa dejstvom samog antigena. Efekat titracije doze emulzije je pokazan u vidu krajnjih titara antitela, posebno u grupi sa najnižom koncentracijom emulzije (0,02% SE) koja je izazvala niže IgG, IgG1 i IgG2a, kao i niže nivoe plazma ćelija koje luče antitela u poređenju sa 2% SE grupom. Međutim, izgleda da koncentracije SE od 0,5% i 1% izazivaju slične nivoe IgG i IgG1 titara antitela, kao i slične nivoe plazma ćelija koje luče antitela u poređenju sa punom dozom od 2% SE. Ipak, deluje i da je ukupan imuni odgovor donekle smanjen sa nižim koncentracijama SE, posebno sa najvećim razblaženjem do 0,02%.

[0171] Smanjenje koncentracije emulzije u vakcinama može imati višestruke primene, kao što su ušteda troškova, smanjenje lokalne reaktivnosti, alternativni putevi isporuke i olakšavanje imunizacije male dece. Pokazali smo da adjuvansi koji sadrže manje količine emulzije u prisustvu agoniste TLR4, mogu proizvesti ekvivalentne imune odgovore kao puna doza od 2% ulјane emulzije. Nedavne kliničke studije su procenjivale efekte adjuvansne doze upotrebom najpoznatijih emulzija ulja u vodi, MF59® i AS03, koje su obe odobrene za upotrebu u Evropi, iako nijedna od formulacija ne sadrži TLR agonist. Stoga, kliničko ispitivanje vakcine za pandemski grip je pokazalo da se uobičajena ulјana doza adjuvansa MF59 od -2,3% može smanjiti za pola (ali ne 4 puta) bez ugrožavanja imunogenosti i da još uvek ispunjava evropske kriterijume za izdavanje vakcina za pandemsku vakcinu [5]. Štaviše, kod učesnika kliničke studije je zabeleženo smanjenje bola na mestu injekcije koje je zavisilo do doze. Nasuprot tome, studija koja je koristila sezonski antigen gripa i MF59® u dozama od 0,125, 0,25, 0,5, ili u punoj dozi kod dece od 6 do 36 meseci, nije našla razliku u reaktivnosti između različitih doza adjuvansa [4]. Odgovori antitela su pratili odgovor na dozu shodno koncentraciji adjuvansa, iako su se sve formulacije zadovoljile kriterijumima Evropskog komiteta za medicinke proizvode za humanu upotrebu (CHMP) nakon 2. imunizacije.

[0172] Dve različite doze AS03 (AS03A koja sadrži punu dozu sa 2,5% skvalena i 2,5% α-tokoferola u odnosu na AS03B koja sadrži pola doze) ispitane su u drugom kliničkom ispitivanju za grip, gde je zaklјučeno da su početni imuni odgovori izazivani sa dve različite doze adjuvansa bili ekvivalentni, dok je dužina trajanja odgovora, izmerena 182 dana nakon vakcinacije, bila nešto bolјa sa višom dozom adjuvansa [3]. Pored toga, starosna grupa od 41-64 godine je pokazala značajno smanjene odgovore antitela na donju dozu adjuvansa. Konačno, uočena je skromna redukcija bola kod niže doze adjuvansa u odnosu na punu dozu. Posmatrano zajedno, klinička ispitivanja MF59® i AS03 pokazuju da efekat titracije doze adjuvansa može zavisiti od svake kompozicije vakcine i tipa primalaca koji se predviđa.

Zaklјučak

[0173] PfCelTOS vakcine koje sadrže GLA-SE adjuvans izazivaju jake imunološke odgovore tipa Th1 (uklјučujući veću proizvodnju IFN-γ u odnosu na PfCelTOS vakcinu koja sadrži Montanide® ISA 720) u BALB/c miševima. Doza emulzije se može smanjiti sa 2% na 1% bez ugrožavanja imunogenosti u grupama koje su primale GLA-SE adjuvans. U principu, smanjene doze emulzije u SE grupama (koje nisu sadržale GLA agonistu TLR4) su pokazale donekle smanjenu imunogenost, naročito u najnižem razblaženju doze adjuvansa (0,02%). Rezultati iz studija zaštite upotrebom PfCelTOS sa GLA-SE adjuvansom se obrađuju za narednu publikaciju, a klinička studija faze I je planirana za 2012. godinu.

Reference

[0174]

1] Fox CB. Squalene emulsions for parenteral vaccine and drug delivery. Molecules 2009;14:3286-312.

[2] Ott G, Barchfeld GL, Chernoff D, Radhakrishnan R, van Hoogevest P, Van Nest G. MF59: design and evaluation of a safe and potent adjuvant for human vaccines. In: Powell MF, Newman MJ, editors. Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach. New York: Plenum Press, 1995: 277-96.

[3] Langley JM, Frenette L, Ferguson L, Riff D, Sheldon E, Risi G, et al. Safety and cross-reactive immunogenicity of candidate AS03-adjuvanted prepandemic H5N1 influenza vaccines: A randomized controlled phase 1/2 trial in adults. J Infect Dis 2010;201:1644-53.

[4] Cioppa GD, Vesikari T, Sokal E, Lindert K, Nicolay U. Trivalent and quadrivalent MF59-adjuvanted influenza vaccine in young children: A dose- and schedule-finding study. Vaccine 2011;29:8696-704.

[5] Keitel W, Groth N, Lattanzi M, Praus M, Hilbert AK, Borkowski A, et al. Dose ranging of adjuvant and antigen in a cell culture H5N1 influenza vaccine: Safety and immunogenicity of a phase 1/2 clinical trial. Vaccine 2010;28:840-8.

[6] Bergmann-Leitner ES, Mease RM, De La Vega P, Savranskaya T, Polhemus M, Ockenhouse C, et al. Immunization with pre-erythrocytic antigen CelTOS from Plasmodium falciparum elicits cross-species protection against heterologous challenge with Plasmodium berghei. PLoS One 2010;5:e12294.

[7] Bergmann-Leitner ES, Legler PM, Savranskaya T, Ockenhouse C, Angov E. Cellular and humoral immune effector mechanisms required for sterile protection against sporozoite challenge induced with the novel malaria vaccine candidate CelTOS. Vaccine 2011;29:5940-9.

[8] Fox CB, Baldwin SL, Duthie MS, Reed SG, Vedvick TS. Immunomodulatory and physical effects of oil composition in vaccine adjuvant emulsions. Vaccine 2011;29:9563-72.

[9] Anderson RC, Fox CB, Dutill TS, Shaverdian N, Evers TL, Poshusta GR, et al. Physicochemical characterization and biological activity of synthetic TLR4 agonist formulations. Coll Surf B: Biointerfaces 2010;75:123-32.

[10] Frey A, Di Canzio J, Zurakowski D. A statistically defined endpoint titer determination method for immunoassays. J Immunologycal Methods 1998;221:35-41.

[11] Hibbert DB, Gooding JJ. Data Analysis for Chemistry. New York: Oxford University Press, 2006.

[12] Coler RN, Bertholet S, Moutaftsi M, Guderian JA, Plessner Windish H, Baldwin SL, et al. Development and characterization of synthetic glucopyranosyl lipid adjuvant system as a vaccine adjuvant. PLoS ONE 2011;6:e16333.

PRIMER 2

IMUNOMODULATORNI I FIZIČKI EFEKTI FOSFOLIPIDNE KOMPOZICIJE U ADJUVANTNIM EMULZIJAMA VAKCINA

Uvod

[0175] Pokazano je da emulzije ulja koje se može metabolisati u vodi, bezbedni i efikasni adjuvansi vakcina, dodataka ishrani i nosači za isporuku lekova. Postoje različite emulgatorske kompozicije, pri čemu skvalen predstavlјa poželјno ulјe koje se može metabolisati, za primenu u vidu adjuvansa vakcina (1-3). Često korišćeni emulgatori uklјučuju Pluronic®-e, Tween®-ove, Span®-ove i fosfolipide. Izbor emulgatora se zasniva na kapacitetu stabilizacije emulzije i/ili biološkoj aktivnosti, pošto su emulgatori po definiciji aktivni na membrani i pokazalo se da imaju razne biološke efekte u pogledu imunostimulacije (4).

[0176] Lecitin i njegova glavna komponenta, fosfatidilholin (PC), uspešno se koriste kao emulgatori u sigurnim i efikasnim emulzijama za parenteralnu isporuku. Možda je najšira upotreba fosfolipidnih emulgatora u primeni intravenskih dodataka ishrani (5), u vidu Intralipid®-a, emulzija sojinog ulјa i lecitina. Međutim, mogu postojati pojedini nedostaci povezani sa lecitinom jajeta (ili PC jajeta) kao emulgatorom, kao i prednosti zamene fosfolipida dobijenih iz jaja sa sintetskim fosfolipidima. Najpre, karakteriše ga znatna heterogenost strukture: PC jajeta može sadržavati najmanje 17 različitih vrsta PC (6), dok su razni sintetski PC-ovi komercijalno dostupni sa čistoćom od 99%. Drugo, lecitin jaja se sastoji od višestrukih mononezasićenih i polinezasićenih acilnih lanaca koji su skloni oksidativnoj degradaciji, dok se razni sintetski PC-ovi sastoje od zasićenih acil lanaca i stoga su hemijski stabilniji (7). Treće, fosfolipidi jaja se dobijaju iz životinjskog izvora umesto da budu proizvedeni sintetski.

[0177] Prethodno smo objavili profil fizičke stabilnosti skvalenskih emulzija, stabilizovanih sa PC jajeta (8, 9). Štaviše, pokazali smo da je sintetski POPC (glavna komponenta PC jajeta) obezbedila ekvivalentnu stabilnost skvalenske emulzije u poređenju sa PC jajeta. Međutim, nijedan drugi sintetski PC nije ispitivan. Sintetski, homogeni fosfolipidi su postali široko dostupni i sada su relativno jeftini. Odgovarajućom selekcijom sintetskog fosfolipida, može se optimizovati hemijska stabilnost emulgatora i fizička stabilnost emulzije. Biološka ekvivalentnost takođe mora biti istražena; za promene u izvoru ili čistoći emulgatora u adjuvansnim emulzijama vakcina je prethodno pokazano da dramatično utiču na potentnost vakcine (10.11). U predmetnoj specifikaciji, pokušavamo da 1) unapredimo naš dosadašnji rad procenjujući fizičku stabilnost skvalenskih emulzija koje sadrže druge sintetske PC (pored POPC) i 2) uporedimo biološku aktivnost sintetskih PC emulzija, kao i emulzija sa PC jajeta, u kontekstu formulacija vakcina za malariju i grip.

Materijali i postupci

[0178] Adjuvansne formulacije. Skalen iz jetre ajkule (čistoće ≥98%) je nabavlјen od firme Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Fosfatidilholin jaja (PC jajeta), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (POPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DOPC), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DPPC), 1,2-dimiristol-sn-glicero-3-fosfoholin (DMPC) i 1,2-dilauroilsn-glicero-3-fosfoholin (DLPC) su nabavljeni od firme Avanti Polar Lipids, Inc. i bili su čistoće do 99% (Alabaster, AL). Sve formulacije emulzije su pripremlјene brzim mešanjem uljane faze (koja sadrži skvalen i fosfolipid) i vodene faze, homogenizacijom pod visokim pritiskom, kao što je prethodno opisano (8). Konačna koncentracija fosfolipida je bila 25 mM. Stabilnost formulacija je praćena tokom 6 meseci na 5°C, sobnoj temperaturi (ST), 37°C i 60°C. Veličina čestica, zeta potencijal, viskoznost, hemoliza i merenja optičkog profila rasejanja laserske svetlosti su urađena kao što je prethodno opisano (8). Ukratko, veličina čestica je određena u naznačenim vremenskim tačkama, razređivanjem alikvota svake emulzije do 1:100 puta u vodi i merenjem prosečnog vektora rasipanja (Z-sr) prilikom dinamičkog rasipanja svetlosti (Malvern Zetasizer APS). Zeta potencijal je određivan ubrzo nakon proizvodnje emulzije, razblaživanjem alikvota svake emulzije 1:20 puta u vodi i merenjem zeta potencijala mikroelektroforezom (Malvern Zetasizer Nano-ZS). Uzorak od 20 mL svake emulzije je uklonjen iz količine koja je uskladištena na 5°C i ostavlјen je da se temperira do sobne temperature pre merenja viskoznosti upotrebom rotacionog viskozimetra (Brookfield DV-E). Hemolitička aktivnost emulzije je ispitana modifikovanom verzijom prethodno publikovane tehnike (12); suspenzija crvenih krvnih zrnaca dobijenih od humanog volontera je pomešana sa fiziološkim rastvorom kojji je sadržavao svaku emulziju, tokom -20 min, nakon čega je uzorak centrifugiran, supernatant je razblažen u smeši etanola i HCl (39:1, v:v) i izmerena je apsorbancija na 398 nm. Optički profili rasejanja laserske svetlosti su određivani na svakih 10 min tokom 4 sata, korišćenjem nerazblaženih uzoraka emulzije na 60°C, i upotrebom laserske svetlosti od 870 nm i CC detektora (LUMiReader).

[0179] Imunizacija, prikuplјanje seruma i imunološki testovi. Ženke BALB/c miševa stare šest do sedam nedelјa (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) su imunizovane intramuskularnom injekcijom u svaki kvadriceps zadnjih ekstremiteta. Ispitivana su dva različita antigena: 1) 2007-2008 Fluzone inaktivirana split-virusna vakcina, koja sadrži reprezentativne sojeve gripa A/Solomon Islands/2/2006 (H1N1), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) i B/Malaysia/2506/2004; i 2) rekombinantni cirkonasporozoitni protein Plasmodium berghei (PbCSP) proizveden u matičnom institute upotrebom konstukta harmonizovanih kodona razvijenog od strane Walter Reed Armi Institute of Research. Formulacije vakcine protiv gripa i malarije, režimi imunizacije i prikuplјanje seruma su opisani ranije (8), osim što je doza antigena virusa gripa iznosila 0,02 µg od ukupne HA. Sve procedure su izvedene u specifičnim uslovima bez patogena i u skladu sa propisima i smernicama odbora za negu i upotrebu životinja IDRI.

[0180] Odgovori antitela. Miševi su imunizovani dva puta, u razmacima od tri nedelјe. Serumi su analizirani na IgG, IgG1, IgG2a antitela specifična za antigene, kao i na aktivnost antitela na inhibiciju hemaglutinacije (HI), kao što je prethodno opisano, upotrebom proizvolјnih anti-PbCSP jedinica koje su određene poređenjem sa standardnom krivom, dok su titri krajnje tačke određeni za antitela na virus gripa (8). ELISPOT test kosne srži je upotrebljen da bi se odredila indukcija dugživećih plazma ćelija koje luče antitela specifična za vakcinu, u uzorcima prikuplјenim četiri nedelјe nakon bolusne imunizacije Fluzone vakcinom sa i bez adjuvansa, kao što je prethodno opisano, a uz manje modifikacije (13).

[0181] Odgovori citokina specifični za antigen. MultiScreen filtracione ploče sa 96 bunarića (Millipore, Bedford, MA) su obložene pacovskim anti-mišjim IL-5 antitelom (eBioscience, San Diego, CA) i inkubirane preko noći na 4°C. Ploče su zatim isprane sa PBS, blokirane sa RPMI 1640 i 10% FBS tokom najmanje 1 sata na ST, a zatim ponovo isprane. Slezine su izvađene četiri nedelјe nakon druge injekcije Fluzone vakcine. Suspenzije pojedinačnih ćelija su pripremlјene i zasejane u gustini od 2x10<5>ćelije po bunariću, u duplikatu, pa su pojedinačno dodati medijum, konkanavilin A (0,75 μg/ml), 5 hemaglutinirajućih jedinica (HAU) inaktiviranog A/Solomon Islands/2/2006 (H1N1) ili 2 HAU inaktiviranog A/Wisconsin/67/2005 ( H3N2) i inkubirani 48 sati na 37°C. Ploče su zatim isprane sa 0,1% PBS-Tween 20 i inkubirane preko noći sa biotin-konjugovanim pacovskim anti-mišjim IL-5 sekundarnim antitelom (eBioscience). Vezivanje je detektovano upotrebom VectaStain ABC kompleta sa konjugatom avidina obeleženim peroksidazom, kao i Vectastain AEC kompleta sa supstratom, prema protokolu proizvođača (Vector Laboratories). Reakcija je zaustavlјena ispiranjem ploča dejoniziranom vodom, nakon čega su ploče osušene u mraku, pa su obojene tačkaste strukture (spotovi) izbrojane upotrebom automatizovanog ELISPOT čitača (C.T.L. Serie3A Analyzer, Cellular Technology Ltd.). Podaci su analizirani uporebom ImmunoSpot® kompjuterskog programa (CTL Analyzer LLC).

[0182] Statistička analiza. Svi eksperimenti na miševima su analizirali pet pojedinačnih životinja po grupi, u svakoj vremenskoj tački. Podaci dobijeni ELISPOT analizom i transformisani titri antitela (Log10) su upoređeni upotrebom ANOVA analize sa Tukey-ovim testom za višestruka poređenja. HI titri su upoređeni ANOVA analizom sa Tukey-ovim testom za višestruka poređenja, upotrebom log2-transformisanih HI titara.

Rezultati

[0183] Fizička stabilnost emulzija. Tabela 1 opisuje sastav emulgatora upotreblјenih u ovoj studiji. PC jajeta je heterogena fosfatidilholinska smeša sa raznim dužinama acil lanca i stepenima zasićenja, iako je glavna komponenta identifikovana kao POPC (6, 14). Nasuprot tome, sintetski fosfolipidi prikazani u tabeli 1 su veoma čisti (≥99%) i kao lipidni kompleksi imaju dobro definisane temperature faznog prelaza (Tm). DOPC i POPC, koja oba sadrže mononezasićene acilne lance, imaju niske temperature faznog prelaza (<0°C) zbog poremećaja u pakovanju koji se nameće usled prisustva nezasićenih lanaca. PC jajeta, koji sadrži mononezasićene i polinezasićene acilne lance, takođe ima nizak Tm. DLPC se sastoji od zasićenih acilnih lanaca, ali ima samo 12 uglјenika u dužini, što rezultira niskim Tm. DMPC, DPPC i DSPC imaju duže zasićene acilne lance (14, 16 i 18 uglјenika, tim redom) i njihove temperature faznog prelaza se povećavaju u skladu sa dužinom lanca. Na primer, konfiguracija DPPC na sobnoj temperaturi je visoko uređena faza gela, dok iznad 41°C lipid formira tečnu kristalnu fazu koja se karakteriše većim poremećajem pakovanja usled promena u acilnom lancu koje su izazvane temperaturom (15).

[0184] Tabela 2 prikazuje fizičke i hemokompatibilne osobine emulzija ubrzo nakon njihove proizvodnje. Vrednosti viskoznosti su bliske vrednostima za vodu (~1 cP), što ukazuje na nizak sadržaj ulјa u ovim emulzijama (10% v/v kada se meri viskoznost, ali se razblažuje do 2% v/v za imunizaciju). Vrednosti zeta potencijala su negativne za emulzije koje koriste fosfolipide sa niskim Tmvrednostima (npr. DOPC, DLPC), dok su za emulzije sa višim Tmfosfolipida, vrednosti pozitivne (DSPC, DPPC). Nijedna od emulzija ne pokazuje značajnu hemolitičku aktivnost kada se inkubira sa suspenzijom eritrocita, iako se DLPC emulzija čini nešto više hemolitičkom od drugih.

[0185] Nedavno smo objavili da je stabilnost veličine čestica sintetske POPC-skvalen emulzije uskladištene na 5°C ili sobnoj temperaturi ekvivalentna ili pobolјšana u odnosu na emulziju sa PC jajeta i skvalenom (9). Nastojali smo da unapredimo ovo istraživanje, proizvodnjom skvalenskih emulzija sa raznim drugim sintetskim fosfolipidima pored POPC; Slika 1 prikazuje stabilnost veličine čestica emulzija uskladištenih na različitim temperaturama. Početna veličina POPC emulzije je prijavlјena ranije (9); ovde smo pratili dugoročnu stabilnost te iste serije zarad poređenja sa drugim sintetskim PC emulzijama. Očigledne anomalije u fizičkom izgledu, kao što je razdvajanje faza, kvalifikuju emulzije kao vizuelno nestabilne. Uzimajući u obzir podatke za sve temperature, DMPC i POPC emulzije su pokazale veću stabilnost veličine čestica od ostalih emulzija koje su ispitivane. Minimalna promena veličine čestica bila je očigledna na 5°C, a postepena promena veličine čestica je bila očigledna sa povećanjem temperature (Slika 1). Radi poređenja, promena veličine kapljica u DOPC emulziji je bila minimalna na 5°C i primetna na višim temperaturama skladištenja. Stabilnost DPPC emulzije je u velikoj meri zavisila od temperature. Prilikom skladištenja iznad DPPC Tm(41°C), DPPC emulzija je pokazala dobru stabilnost u odnosu na druge emulzije. Ipak, na tri temperature skladištenja ispod Tm, DPPC emulzija je bila ili vizuelno nestabilna ili je pokazala veću promenu veličine čestica od stabilnijih emulzija. Zanimlјivo je da je DLPC emulzija, koja sadrži najkraći zasićen lanac emulgatora, vizuelno bila nestabilna u ranim vremenskim tačkama na sve četiri temperature skladištenja. DSPC emulzija je takođe postala vizuelno nestabilna pre vremenske tačke od 6 meseci, na svim temperaturama skladištenja. Veličine polidisperznosti su bile slične među stabilnijim emulzijama (dodatna Slika 1).

[0186] Optičko profilisanje laserskog raspršivanja pruža komplementarne informacije o stabilnosti emulzije. Promene u emulziji usled stvaranja kremaste strukture, koalescencije itd., detektovane su kao promene u prenosu svetlosti kroz vertikalni profil emulzije (8). Optički profili laserskog raspršivanja emulzija su mereni svakih 10 minuta tokom perioda od 4 sata na 60°C (dodatna Slika 2). Da bi se uporedili podaci iz različitih emulzija, integrisana transmisija između specifičnog područja (25 do 30 mm) u vertikalnom profilu uzorka je grafički prikazana na Slici 2. Smanjenje integralne transmisije ukazuje na porast koalescencije ili veličine čestica pošto će veće čestice raspršiti više svetla, što će omogućiti da se manje iste prenese do detektora. Povećanje integralne transmisije je generalno reprezentativno za obrazovanje kremaste strukture ili razdvajanje faza. DMPC emulzija pokazuje malo promene u poređenju sa POPC ili DOPC emulzijama, što ukazuje na superiornu stabilnost na ovoj temperaturi. Ovi podaci o optičkom profilu potvrđuju prethodno opisana zapažanja o veličini čestica i vizuelnoj stabilnosti. DLPC, DPPC i DSPC emulzije nisu prikazane, pošto su ove emulzije već klasifikovane kao vizuelno nestabilne na 5°C, pre merenja optičkim profilisanjem.

[0187] Ukupno posmatrano, podaci o fizičkoj stabilnosti ukazuju da su među sintetskim lipidima, DMPC, POPC i u manjoj meri DOPC najefikasniji emulgatori skvalenskog ulјa. Veličina čestica i SDS-PAGE analiza nakon mešanja emulzija sa inaktiviranom vakcinom protiv gripa ukazala na dobru kompatibilnost (podaci nisu prikazani). Prema tome, prethodno navedene stabilne sintetske PC emulzije, zajedno sa emulzijom sa PC jajeta, naknadno su ispitane za biološku aktivnost u mišjem modelu.

[0188] Emulzije selektivno pojačavaju odgovore antitela na rekombinantni protein malarije. Odgovori antitela na rekombinantni antigen malarije, cirkumsporozoitni protein iz Plasmodium berghei (PbCSP), mereni su u serumina pojedinačnih miševa dve nedelјe nakon druge imunizacije sa samim proteinom ili sa proteinima u kombinaciji sa emulzionim formulacijama. Nivoi anti-PbCSP IgG antitela su bili značajno viši kod miševa imunizovanih sa PbCSP koji je injeciran u prisustvu emulzija nego kod miševa koji su primali samo protein (Sika 3a, p-vrednosti <0,05). IgG1 antitela su takođe bila viša kod miševa imunizovanih sa PbCSP i emulzijama sa PC jajeta, POPC i DMPC u poređenju sa miševima koji su imunizovani samo proteinom (Slika 3b, p-vrednosti <0,05). Nasuprot tome, razlike između različitih grupa nisu detektovane u nivoima anti-PbCSP IgG2a antitela (Slika 3c, p-vrednosti> 0,05). Ovi podaci ukazuju da su antigen-specifična IgGl antitela selektivno pojačana uklјučivanjem emulzija u izlaganja antigenu.

[0189] Emulzije pojačavaju odgovor antitela na proteine virusa influence. Već smo primetili povišene odgovore antitela kod životinja kojima je injecirana Fluzone vakcina formulisana sa emulzijama koje sadrže PC jajeta (8, 13), ali nije istraživano da li se ovi efekti primećuju kada se uklјuče sintetski lipidi. Da bi se odredilo da li emulzije podižu odgovor antitela na prirodne proteine gripa, imunizovali smo miševe sa niskom dozom Fluzone vakcine u prisustvu ili odsustvu emulzione formulacije koja sadrži prirodne ili sintetske fosfolipide. U poređenju sa vakcinacijom samo sa Fluzone vakcinom, ukupni IgG, IgG1 i IgG2a titri antitela su bili veći za sve grupe koje su primile Fluzone sa emulzionim formulacijama (Slika 4).

[0190] Takođe smo ispitali efekat emulzionih formulacija na proizvodnju antigen-specifičnih antitela koje luče plazma ćelije (ASPC) unutar kosne srži, pošto ove dugoživeće ćelije luče antitela u dužim vremenskim periodima nakon izloženosti antigenu i mogu biti osnova drugotrajne zaštite. Sveukupno, naši rezultati pokazuju da su slični brojevi ASPC proizvedeni među različitim grupama emulznih formulacija. Samo je vakcina koja je sadržavala DOPC emulziju, međutim, indukovala je značajno veći broj dugoživećih plazma ćelija u odnosu na efekat Fluzone vakcina samostalno (Slika 4d).

[0191] Test inhibicije hemaglutinacije (HI) je značajan prediktivni pokazatelј efikasnosti vakcine protiv gripa, sa titrom koji se generalno smatra dovolјnim da obezbedi zaštitu (16). Da bi se utvrdilo da li emulzione formulacije mogu da proizvedu antitela bolјeg kvaliteta koja mogu povećati zaštitu svojstvenu Fluzone vakcini, uporedili smo HI titre miševa vakcinisanih samo sa Fluzone vakcinom ili Fluzone vakcinom sa različitim emulzionim formulacijama. Merenjima 4 nedelјe nakon završne imunizacije, pokazano je da dodavanje emulzione formulacije izaziva veće HI titre za A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1) i A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) komponente vakcine u odnosu na samu Fluzone vakcinu (Slika 5). Za A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1) komponente, sve vakcine koje sadrže emulziju su indukovale veće HI titre nego sama Fluzone vakcina. Za A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) komponente, emulzije sa PC jajeta i DOPC su indukovali više HI titre nego sama Fluzone vakcina.

[0192] Dodatni eksperimenti su pokazali da, sa izuzetkom DMPC emulzije, povećan broj T-ćelija specifičnih za antigen kod miševa imunizovanih sa Fluzone vakcinom sa emulzijama, dovodi do lučenja viših nivoa IL-5 nego što je to slučaj sa ćelijama miševa imunizovanih samo sa Fluzone vakcinom (Slika 6, p-vrednosti <0,05). Zajedno, podaci za antitela i sekreciju citokina ukazuju na pojačani imuni odgovor tipa Th2 izazvan vakcinama koje sadrže navedene emulzije.

Diskusija

[0193] Odgovori antitela indukovani i vakcinama protiv malarije i protiv gripa su pobolјšani na jednak način bez obzira da li su upotrebljavani sintetski ili PC dobijeni iz jaja kao emulgatorske komponente. Ovaj nalaz je značajan za dalјi razvoj emulzija sa PC na bazi sintetskih umesto prirodnih komponenti. Literatura je pokazala zašto se biološka ekvivalentnost ove vrste supstitucije komponenti ne bi trebala uzeti zdravo za gotovo; postoji nekoliko slučajeva kada je supstitucija jednog fosfolipidnog emulgatora sa drugim rezultirala razlikama u biološkoj aktivnosti. Na primer, Yasuda i saradnici su pronašli da lipozomi sačinjeni od sintetskih fosfatidilholina pokazuju direktnu korelaciju između imunogenosti (naznačene brojem ćelija u slezini koje luče antitela) i temperature prelaza lipidne faze kada se za intraperitonealnu imunizaciju miševa koriste sintetski antigeni na bazi lipida; utvrđeno je da viša fazni prelaz direktno koreliše sa povećanom imunogenošću (17). Ova korelacija između temperature faznog prelaza i imunogenosti nije bila očigledna u sadašnjem radu, iako fosfolipidi sa najvišim temperaturama faznog prelaza (DPPC i DSPC) nisu bili imunološki ispitani zbog slabe stabilnosti emulzije. U drugom primeru važnosti izvora emulgatora, nedavni rezultati kliničkih ispitivanja sa adjuvansnom emulzijom voda u ulju vakcine, Montanide® ISA 51, otkrili su da je zamena emulgatora životinjskog porekla sa materijalom iz bilјnog izvora možda uzrok za značajno smanjenje in vivo efikasnost (11). Imunološki podaci u ovom radu pokazuju da vakcine protiv gripa i malarije sa adjuvansnim emulzijama pripremljenim sa različitim prirodnim ili sintetskim fosfatidilholinima izazivaju slične reakcije antitela. Štaviše, kvalitativna imunogenost emulzija korišćenih u ovom radu je u skladu sa izveštajima u literaturi; na primer, čini se da emulzije (bez agonista TLR) indukuju samo skromna povećanja IgG2a odgovora u poređenju sa samim antigenom (18). Očigledne su razlike između emulzija u eksperimentima sa vakcinom protiv gripa, što pokazuje da se lipidni emulgatori mogu blago razlikovati u biološkim efektima. Ipak, uopšteno posmatrajući, deluje da PC jajeta može biti zamenjen sintetskim fosfolipidima bez štetnog uticaja na biološku aktivnost u kontekstu jednostavne rekombinantne antigenske vakcine protiv malarije ili kompleksnije inaktivirane vaccine za virusa gripa.

[0194] Pored biološke aktivnosti, važno je uzeti u obzir fizičku stabilnost emulzije, pošto se ona odnosi na strukturu acilnog lanca emulgatora. Povremeno je prijavljivano da prečišćeni molekuli PC ne stabilizuju emulzije na efektivan način (19). Na primer, sintetska mešavina DOPC:DPPC:DPPE nije proizvela stabilne emulzije poput onih koje se pripremaju upotrebom lecitina iz jaja za emulgovanje perfluoruglјenika (20). Međutim, tvrdnja da čisti sintetski PC ne emulguju efikasno, lako se može opovrgnuti drugim publikacijama (21), koje jasno pokazuju da stabilnost zavisi od strukture i osobina i ulјa i emulgatora (22). Spontana zakrivlјenost ili struktura pakovanja emulgatora određuju njihovu efikasnost u stabilizaciji emulzija (21). Na spontanu zakrivlјenost ili pakovanje emulgatora utiču a) ponašanje fosfolipidne faze, b) stepen nezasićenosti lipidnih acilnih lanaca i c) stepen mešanja fosfolipida sa ulјem (21). U ovom radu, značaj lipidnog faznog prelaza je očigledan pošto emulzije koje sadrže fosfolipide sa najvišim temperaturama faznog prelaza (DPPC i DSPC) nisu bile stabilne na većini temperatura skladištenja po pitanju veličine i vizuelnog izgleda. Zanimlјivo je da DPPC proizvodi stabilnu emulziju samo kada se skladišti iznad svoje glavne temperature faznog prelaza. Ipak, temperatura faznog prelaza nije bila jedini odlučujući faktor za fizičku stabilnost; treba napomenuti da DMPC emulzija pokazuje dobru stabilnost (pri svim temperaturama skladištenja, uklјučujući temperature iznad i ispod faznog prelaza) u poređenju sa DLPC emulzijom, iako DMPC ima višu temperaturu faznog prelaza. Prema tome, kompleksnost interakcija emulgator-ulјe je pokazana činjenicom da se stabilnost emulzija opisanih u ovom radu ne može predvideti isklјučivo na osnovu temperature faznog prelaza fosfolipida, dužine acil lanca ili zasićenja. Slično tome, efekat temperature prelaza lipidne faze i strukture acil lanca na stabilnost emulzije je bilo teško predvideti u kontekstu emulzija gliceril trioktanoata: emulzije DLPC, DMPC i DPPC su bile stabilnije od DSPC, 1,2-dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoholinskih i DOPC emulzija (23).

[0195] Rast veličine kaplјica emulzije se može odvijati putem dva mehanizma: Ostvaldovo zrenje (Laplasove razlike u pritisku uzrokuju difuziju molekula ulјa iz manjih kaplјica u veće kaplјice) ili koalescenciju (odvojene kaplјice ulјa se stapaju i formiraju jednu kaplјicu) (24). Pošto je skvalen suštinski nerastvoran u vodi, malo je verovatno da je Ostvaldovo zrenje odgovorno za rast veličine kapljica u emulzijama iz ovog rada (25-28). Prema tome, koalescencija je verovatni mehanizam za rast veličine kapljica koji je ovde prijavljen. Očekuje se da će stopa koalescencije porasti na višim temperaturama zbog povećanih stopa difuzije i interakcija kaplјica, a podaci o veličini kapljica koji su prikazani ovde su u skladu sa ovim očekivanjima. Emulgatori koji ne obezbeđuju efikasnu steričnu ili elektrostatičku stabilizaciju uljane kaplјice preko dobro upakovanog međupovršinskog sloja, mogu biti odgovorni za povećane stope koalescencije. Naši nalazi ukazuju da su, u celini gledano, nezasićeni lipidni emulgatori bili efikasniji od zasićenih lipida u stabilizaciji skvalenskih emulzija, sa izuzetkom DMPC koji je proizveo veoma stabilnu emulziju iako sadrži samo zasićene acilne lance. Ovo ponovo naglašava da je teško predvideti stabilnost emulzije isklјučivo na osnovu faznog prelaza i strukture acilnih lanca fosfolipidnih emulgatora.

[0196] Konačno, napominjemo da različiti podaci o fizičkoj karakterizaciji koji su prikazani u ovom radu, dobro korelišu sa prethodno objavljenom literaturom. Na primer, odnos negativnijih vrednosti zeta potencijala za lipide u tečnoj kristalnoj fazi u odnosu na lipidne faze u vidu gela, prethodno je opisan; pripisuje se povećanim poremećajima i defektima pakovanja u membrane u tečnoj fazi, što dovodi do izloženosti polarnih grupa i omogućava da su dostupnija vezna mesta za anjone rastvora (29, 30). Osim toga, blago povišena hemolitička tendencija DLPC emulzije odgovara drugoj objavljenoj studiji da DLPC i drugi fosfolipidi kratkog lanca indukuju hemolizu putem stvaranja nespecifičnih pora u lipidnim dvoslojima preko razdvajanje lipidnih faza, dozvolјavajući tako prodiranje jona (31).

Zaklјučak

[0197] U ovom radu je pokazano da adjuvansne emulzije za vakcine koje sadrže skvalensko ulјe i sintetske fosfolipidne emulgatore, odnosno DMPC ili POPC, pokazuju dugotrajnu stabilnost veličine čestica na različitim temperaturama. Uopšteno posmatrajući, emulzije sa PC iz jajeta i sintetskim PC su izazvale slične imunološke odgovore u kombinaciji sa jednostavnim rekombinantnim antigenom malarije ili inaktiviranom vakcinom protiv virusa gripa. Tako, zamena fosfatidilholina jaja sa sintetskim fosfatidilholinom nije dovela do gubitka biološke aktivnosti adjuvansa vakcine. Trenutna istraživanja u našoj laboratoriji će uporediti stabilnost i imunogenost skvalen-fosfolipidnih emulzija sa drugim klasama nefosfolipidnih surfaktantnih struktura, odnosno sa polisorbatom 80 i poloksamerom 188.

Reference

[0198]

1. Fox CB. Squalene emulsions for parenteral vaccine and drug delivery. Molecules. 2009;14:3286-312.

2. Reddy LH, Couvreur P. Squalene: a natural triterpene for use in disease management and therapy. Adv Drug Del Rev.2009;61:1412-26.

3. Brito LA, Chan M, Baudner B, Gallorini S, Santos G, O'Hagan DT, et al. An alternative renewable source of squalene for use in emulsion adjuvants. Vaccine.2011;29:6262-8.

4. Yang YW, Wu CA, Morrow WJW. Cell death induced by vaccine adjuvants containing surfactants. Vaccine.2004;22:1524-36.

5. Forchielli ML, Bersani G, Tala S, Grossi G, Puggioli C, Masi M. The spectrum of plant and animal sterols in different oil-derived intravenous emulsions. Lipids.2010;45:63-71.

6. Vernooij EAAM, Kettens - van den Bosch JJ, Crommelin DJA. Rapid determination of acyl chain position in egg phosphatidylcholine by high performance liquid chromatography/electrospray mass spectrometry. Rapid Comm Mass Spec.1998;12:83-6.

7. deMan JM. Chemical and physical properties of fatty acids. In: Chow CK, editor. Fatty Acids in Foods and their Health Implications. Boca Raton, FL: CRC Press; 2008. p.17-46.

8. Fox CB, Baldwin SL, Duthie MS, Reed SG, Vedvick TS. Immunomodulatory and physical effects of oil composition in vaccine adjuvant emulsions. Vaccine.2011;29:9563-72.

9. Fox CB, Lin S, Sivananthan SJ, Dutill TS, Forseth KT, Reed SG, et al. Effects of emulsifier concentration, composition, and order of addition in squalene-phosphatidylcholine oil-in-water emulsions. Pharm Dev Technol.2011;16:511-9.

10. Hilleman MR. Personal historical chronicle of six decades of basic and applied research in virology, immunology, and vaccinology. Immunol Rev.1999;170:7-27.

11. Rosenberg SA, Yang JC, Kammula US, Hughes MS, Restifo NP, Schwarz SL, et al. Different adjuvanticity of incomplete Freund's adjuvant derived from beef or vegetable components in melanoma patients immunized with a peptide vaccine. J Immunother.2010;33:626-9.

12. Bock TK, Muller BW. A novel assay to determine the hemolytic activity of drugs incorporated in colloidal carrier systems. Pharm Res.1994;11:589-91.

13. Baldwin SL, Shaverdian N, Goto Y, Duthie MS, Raman VS, Evers T, et al. Enhanced humoral and Type 1 cellular immune responses with Fluzone adjuvanted with a synthetic TLR4 agonist formulated in an emulsion. Vaccine.2009;27:5956-63.

14. Vernooij EAAM, Brouwers JFHM, Kettenes-van den Bosch JJ, Crommelin DJA. RP-HPLC/ESI MS determination of acyl chain positions in phospholipids. J Sep Sci.2002;25:285-9.

15. Fox CB, Uibel RH, Harris JM. Detecting phase transitions in phosphatidylcholine vesicles by Raman microscopy and self-modeling curve resolution. J Phys Chem B.2007;111(39):11428-36.

16. Falsey AR. Half-dose influenza vaccine. Arch Intern Med.2008;168:2402-3.

17. Yasuda T, Dancey GF, Kinsky SC. Immunogenicity of liposomal model membranes in mice: Dependence on phospholipid composition. Proc Natl Acad Sci.1977;74:1234-6.

18. Baudner BC, Ronconi V, Casini D, Tortoli M, Kazzaz J, Singh M, et al. MF59 emulsion is an effective delivery system for a synthetic TLR4 agonist (E6020). Pharm Res.2009;26:1477-85.

19. Mikrut B. Case study: formulation of an intravenous fat emulsion. In: Burgess DJ, editor. Injectable Dispersed Systems: Formulation, Processing, and Performance. Boca Raton, FL: Taylor and Francis; 2005. p.415-25.

20. Yoon JK, Burgess DJ. Interfacial properties as stability predictors of lecithin-stabilized perfluorocarbon emulsions. Pharm Dev Tech.1996;1:333-41.

21. Kabalnov A, Tarara T, Arlauskas R, Weers J. Phospholipids as emulsion stabilizers: phase behavior versus emulsion stability. J Coll Inter Sci.1996;184:227-35.

22. Mollet H, Grubenmann A. Formulation Technology: Emulsions, Suspensions, Solid Forms. Verlag: Wiley-VCH; 2001.

23. Nii T, Ishii F. Properties of various phosphatidylcholines as emulsifiers or dispersing agents in microparticle preparations for drug carriers. Coll Surf B: Biointerfaces.2004;39(1-2):57-63.

24. Fox CB, Anderson RC, Dutill TS, Goto Y, Reed SG, Vedvick T. Monitoring the effects of component structure and source and formulation stability and adjuvant activity of oil-in-water emulsions. Coll Surf B: Biointerfaces.2008;65:98-105.

25. Bibette J, Morse DC, Witten TA, Weitz DA. Stability criteria for emulsions. Phys Rev Lett.

1992;69(16):2439.

26. Capek I. Degradation of kinetically-stable o/w emulsions. Adv Coll Inter Sci. 2004;107(2-3):125-55.

27. Dalgleish DG. Adsorption of protein and the stability of emulsions. Trends Food Sci Tech.

1997;8(1):1-6.

28. McClements DJ. Critical review of techniques and methodologies for characterization of emulsion stability. Crit Rev Food Sci Nutri.2007;47:611-49.

29. Tatulian SA. Binding of alkaline-earth metal cations and some anions to phosphatidylcholine liposomes. Eur J Biochem.1987;170:413-20.

30. Tatulian SA. Effect of lipid phase transition on the binding of anions to dimyristoylphosphatidylcholine liposomes. Biochim Biophys Acta.1983;736:189-95.

31. Tanaka Y, Mashino K, Inoue K, Nojima S. Mechanism of human erythrocyte hemolysis induced by short-chain phosphatidylcholines and lysophosphatidylcholine. J Biochem.1983;94:833-40.

Claims

Patentni zahtevi 1. Emulzija ulja u vodi koja sadrži agonistu TLR4 i ulјe koje se može metabolisati, pri čemu je ulјe koje se može metabolisati prisutno u emulziji ulja u vodi u koncentraciji od 0,01%-1% v/v i gde je hidrofobno:lipofilna ravnoteža (HLB) emulzije ulja u vodi veća od 9 ili veća od 10 ili između 9-12, pri čemu je agonista TLR4 izabran iz grupe koju čine monofosforilni lipid A (MPL), 3-O-deacilovani monofosforilni lipid A i sintetski glukopiranozilni lipidni adjuvans (GLA).
2. Emulzija ulja u vodi prema patentnom zahtevu 1, gde je ulјe koje se može metabolisati prisutno u emulziji ulja u vodi u koncentraciji od 0,01%-0,5% v/v.
3. Emulzija ulja u vodi prema patentnom zahtevu 1, gde emulzija dodatno sadrži 1,2-dimiristoil-snglicero-3-fosfoholin (DMPC), po izboru gde emulzija ne sadrži antioksidans.
4. Emulzija ulja u vodi prema patentnom zahtevu 1, gde agonista TLR4 sadrži sintetski GLA.
5. Emulzija ulja u vodi prema patentnom zahtevu 4, gde sintetski GLA ima sledeću strukturu: (i)

gde: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; i R<2>i R<4>su C12-C20alkil; ili gde sintetski GLA ima sledeću strukturu: (ii)

ili njegova farmaceutski prihvatlјiva so, gde: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-20alkil; i R<2>i R<4>su C9-20alkil; Ili gde sintetski GLA ima sledeću strukturu: (iii)

ili njegova farmaceutski prihvatlјiva so, gde: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; a R<2>i R<4>su C9-C20alkil; ili gde sintetski GLA ima sledeću strukturu: (iv)

ili njegova farmaceutski prihvatlјiva so.
6. Emulzija ulja u vodi prema patentnom zahtevu 5(i), gde R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; i R<2>i R<4>su C13alkil.
7. Emulzija ulja u vodi prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 6, pri čemu emulzija dodatno sadrži surfaktant, po izboru, gde je surfaktant pluronic F68.
8. Emulzija ulja u vodi prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7, gde ulјe koje se može metabolisati je skvalen.
9. Emulzija ulja u vodi prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8, gde emulzija dodatno sadrži antioksidans, po izboru, gde je antioksidans vitamin E.
10. Emulzija ulja u vodi prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 9, pri čemu emulzija dodatno sadrži najmanje jedan antigen.
11. Emulzija ulja u vodi prema patentnom zahtevu 1, gde agonista TLR4 je sintetski GLA, gde je HLB emulzije veći od oko 10 i gde emulzija dodatno sadrži DMPC u koncentraciji od oko 0,002%-2%.
12. Emulzija ulja u vodi prema patentnom zahtevu zahteva 11, gde sintetski GLA ima sledeću strukturu:

gde: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; a R<2>i R<4>su C12-C20alkil, po izboru, gde R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11alkil; a R<2>i R<4>su C13alkil; ili gde sintetski GLA ima sledeću strukturu:

ili njegova farmaceutski prihvatlјiva so, gde: L1, L2, L3, L4, L5i L6su isti ili različiti i nezavisno -O-, -NH- ili -(CH2)-; L7, L8, L9i L10su isti ili različiti i nezavisno su ili odsutni ili su -C(=O)-; Y1je funkcionalna grupa kiseline; Y2i Y3su isti ili različiti i nezavisno -OH, -SH ili funkcionalna grupa kiseline; Y4je -OH ili -SH; R1, R3, R5i R6su isti ili različiti i nezavisno C8-13alkil; i R2i R4su isti ili različiti i nezavisno C6-11alkil, po izboru, gde R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C10alkil; a R<2>i R<4>su C8alkil; ili gde sintetski GLA ima sledeću strukturu:

ili njegova farmaceutski prihvatlјiva so, gde: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-20alkil; a R<2>i R<4>su C9-20alkil; ili gde sintetski GLA ima sledeću strukturu:

ili njegova farmaceutski prihvatlјiva so, gde: R<1>, R<3>, R<5>i R<6>su C11-C20alkil; a R<2>i R<4>su C9-C20alkil; ili gde sintetski GLA ima sledeću strukturu:

ili njegova farmaceutski prihvatlјiva so.
13. Emulzija ulja u vodi prema bilo kom od patentnih zahteva od 1-12 za upotrebu u terapijskom postupku stimulacije imunog odgovora kod subjekta.
14. Emulzija ulja u vodi za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, gde je imuni odgovor nespecifičan imuni odgovor ili imuni odgovor specifičan za antigen.
15. Emulzija ulja u vodi za upotrebu prema patentnom zahtevu 13 ili patentnom zahtevu 14, pri čemu se emulzija ulja u vodi primenjuje intradermalno.