TR201908003T4 - TLR4 agonistleri içeren gelişmiş adjuvan formülasyonları ve bunların kullanım metotları. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş farmasötik ve aşı formülasyonları alanıyla ilgilidir. Daha spesifik olarak, burada tarif edilen uygulamalar farmasötik ve aşı formülasyonlarıyla, özellikle su içinde yağ emülsiyonlarıyla ilgili olup, içerisinde bileşimler bir TLR4 agonisti, örneğin glukopiranozil lipid adjuvan (GLA) içerir.

Description

TARIFNAME TLR4 AGONISTLERI IÇEREN GELISMIS ADJUVAN FORMÜLASYONLARI VE BUNLARIN KULLANIM METOTLARI BULUSUN ARKAPLANI Bulusun Alani Mevcut bulus farmasötik ve asi formülasyonlari alaniyla ilgilidir. Daha spesifik olarak, burada tarif edilen uygulamalar farmasötik ve asi formülasyonlariyla, özellikle su içinde yag emülsiyonlariyla ilgili olup, içerisinde bilesimler bir TLR4 agonisti, örnegin glukopiranozil Iipid adjuvan (GLA) içerir. Önceki Teknik Yüksek organizmalarin immün sistemi, yabanci ajanlarin (veya "kendinin olmayan" ajanlarin), bilinen veya "kendinin olan" bilesenlerinden ayirt edilmesi, böylece "kendi" bilesenleri göz ardi edilirken veya tolere edilirken yabanci ajanlarin immün tepkileri ortaya çikarmasiyla karakterize edilmistir. immün tepkiler geleneksel olarak, antijenlere özgü antikorlarin, plazma hücreleri olarak bilinen farklilastirilmis B lenfositleri tarafindan üretildigi hümoral tepkiler veya çesitli T lenfosit türlerinin, çesitli antijenleri çesitli mekanizmalar tarafindan ortadan kaldirmak için etki gösterdigi hücre aracili tepkiler olarak üretilir. Örnegin, spesifik antijenleri taniyabilen CD4+ yardimci T hücreleri, bir bagisiklik tepkisine katilmak üzere bagisiklik sisteminin ek hücrelerini almak için sitokinler gibi çözülebilir aracilari serbest birakarak yanit verebilir. Ayni zamanda, spesifik antijen tanima yetenegine sahip olan CD8+ sitotoksik T hücreleri, bir antijen tasiyan hücreye veya partiküle baglanarak veya bunlari tahrip ederek veya bunlara zarar vererek yanit verebilir. Immünoloji tekniklerinde, genellikle bir konakçida arzu edilen bir immün yanitin indüklenmesi amaciyla, çesitli formülasyonlara göre belirli asilarin saglanmasi bilinmektedir. Örnegin, tek veya çok fazli emülsiyon sistemleri dahil, adjuvan bilesimlerinin formüle edilmesine yönelik bazi emülsiyon sistemleri tarif edilmistir. Su içinde yag emülsiyonu adjuvanlarinin, adjuvan bilesimi olarak yararli oldugu ileri sürülmüs olup (EP O 399 8438), ayrica su içinde yag emülsiyonlari ve diger aktif ajanlarin kombinasyonlari Alving ve ark., tek basina stabilize edici madde olarak yeterli miktarda vezikülleri kullanan stabil bir su içinde yag emülsiyonu tarif etmekte olup, bu veziküller ayrica immünojenler veya terapötik maddeler de içerir (US Pat. No. 6,110,492). Leesman, metabolize edilebilir bir yag, yüzey aktif maddeler, bir antioksidan ve emülsiyonu izotonik hale getirmek için bir bilesen içeren stabil bir su içinde yag emülsiyonu olan bir adjuvan bilesimini tarif eder (US . Sentetik Yardimci bilesimlerin hazirlanmasina yönelik emülsiyon sistemlerinin üretilmesi için bilinen bu yöntemlere ragmen, mevcut emülsiyon yardimci bilesimlerinin hala birçok dezavantaji bulunmaktadir. Buna göre, TLR4 agonistlerini içeren su içinde yag emülsiyon formülasyonlari gibi daha da gelistirilmis emülsiyon adjuvan bilesimlerine ihtiyaç vardir. Burada tarif edildigi gibi, mevcut bulus bu ihtiyaçlari karsilar ve diger ilgili avantajlari sunar. BULUSUN KISA ÖZETI Bulus, ekteki istemlerde ortaya konmustur. Bir yönüne göre, mevcut bulus bir TLR4 agonisti ve metabolize edilebilen bir yag içeren bir su içinde yag emülsiyonu saglamakta olup, içerisinde metabolize edilebilen yag, su içinde yag emülsiyonu içinde yaklasik %001 ila %1 hacim/hacim veya tercihen yaklasik %001 ila %05 hacim/hacim konsantrasyonunda bulunur, içerisinde su içinde yag emülsiyonunun hidrofobikzlipofilik dengesi (HLB) yaklasik 9'dan büyük veya yaklasik 10'dan büyük veya yaklasik 9 ile 12 arasindadir, içerisinde TLR4 agonisti MPL, 3D-MPL ve sentetik glukopiranozil lipid adjuvandan (GLA) olusan grup içinden seçilir. Burada ayrica bir TLR4 agonisti, bir metabolize edilebilen yag ve bir yüzey aktif madde içeren bir su içinde yag emülsiyonu saglanmakta olup, içerisinde metabolize edilebilen yag, su içinde yag emülsiyonu içinde yaklasik %0.01 ila %1 hacim/hacim veya tercihen yaklasik %0.01-%0.5 hacim/hacim konsantrasyonunda bulunur. Bazi uygulamalarda, metabolize edilebilen yag konsantrasyonu %1 hacim/hacim düzeyinin altindadir. Bazi uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonunun hidrofobikzlipofilik dengesi (HLB) yaklasik 9'dan büyüktür veya yaklasik 10'dan büyüktür veya yaklasik 9 ile 12 arasindadir. Bulusun su içinde yag emülsiyonlarinda kullanilan TLR4 agonisti, MPL, 3D-MPL veya sentetik bir GLA adjuvanindan olusan gruptan TLR4 arasindan seçilebilir. Bazi uygulamalarda, sentetik GLA adjuvan asagidaki yapiya uygun: L7IL1 Iz Ya R17// L9 4 R6 OH veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu olup, özelligi; içerisinde: L1, L2, L3, L4, L5 ve La ifadelerinin ayni veya farkli olmasi ve bagimsiz olarak -O-, -NH- veya -(CH2)- olmasi; L7, L8, L9 ve L10 ifadelerinin ayni veya farkli olmasi ve bagimsiz olarak eksik olmasi veya -C(=O)- olmasi; Y1 ifadesinin bir asit fonksiyonel grup olmasi; Y2 ve Ys ifadelerinin ayni veya farkli olmasi ve bagimsiz olarak -OH, -SH olmasi veya bir asit fonksiyonel grubu olmasi; Y4 ifadesinin -OH veya -SH olmasi; R1, R3, R5 ve R6 ifadelerinin ayni veya farkli olmasi ve bagimsiz olarak 08-13 alkil olmasi; ve R2 ve R4 ifadelerinin ayni veya farkli olmasi ve bagimsiz olarak C6-11 alkil olmasidir. Sentetik GLA yapisinin bazi uygulamalarinda, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri C10 alkildir; ve R2 ve R4 ifadeleri Cs alkildir. Örnegin, daha spesifik bir uygulamada, su içinde yag emülsiyonu asagidaki yapiya sahip bir sentetik GLA adjuvan içerir: 11° @imge Yukaridaki GLA yapisinin belirli uygulamalarinda, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri C11-C20 alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri C12-Czo alkildir. Daha spesifik bir uygulamada, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri Ci1 alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri C13 alkildir. Bir baska daha spesifik uygulamada, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri Cio alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri Cs alkildir. alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri C9-C20 alkildir. Belirli uygulamalarda, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri Ci1 alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri 09 alkildir. Belirli uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonu asagidaki yapiya uygun bir sentetik lO GLA adjuvani içerir: Yukaridaki GLA yapisinin belirli uygulamalarinda, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri Cii-Czo alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri Cg-Czo alkildir. Belirli uygulamalarda, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri 011 alkil; ve R2 ve R4 Ifadeleri C9 alkildir. Belirli uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonu asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvani içerir: Yukaridaki GLA yapisinin belirli uygulamalarinda, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri C11-C20 alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri Cg-Czo alkildir. Belirli uygulamalarda, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri C11 alkil; ve R2 ve R4 Ifadeleri Cg alkildir. Belirli uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonu asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvani içerir: R4 0 i _ Yukaridaki GLA yapisinin belirli uygulamalarinda, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri C11-C20 alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri C9-C20 alkildir. Belirli uygulamalarda, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri C11 alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri Ce alkildir. Belirli uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonu asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvani içerir: ( 8 0 OH ( 10 Belirli uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonu asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvani içerir: 47/0 0 M 0? Belirli uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonu asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvani içerir: 3 ÖH ( "OH Bulusun emülsiyonlarinin, amaçlanan bir etki için gerekli veya istenen baska bilesenleri içerebilecegi anlasilmalidir. Örnegin, mevcut bulusun su içinde yag lO emülsiyonu, bazi uygulamalarda, ayrica içerir. Bazi uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonlarinin içindeki DMPC sentetiktir. Bazi uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonu 1-palmitoiI- içerir. Bazi uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonlarinin içindeki POPC sentetiktir. Bazi uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonu içerir. Bazi uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonlarinin içindeki DOPC sentetiktir. Diger uygulamalarda, emülsiyonlar ayrica bir yüzey aktif madde, örnegin pluronik F68 içerir. Yine diger uygulamalarda, emülsiyonlar ayrica bir antioksidan, örnegin E vitamini Bulusun emülsiyonlarinda kullanilan metabolize edilebilir yag, çesitli mevcut kaynaklardan herhangi biri arasindan seçilebilir. Belirli uygulamalarda, metabolize edilebilen yag skualen içerir. Baska uygulamalarda, metabolize edilebilen yag mayadan türetilen skualen içerir. Yine diger uygulamalarda, metabolize edilebilen yag, skualenden yapisal olarak farkli olan bir mayadan türetilen izoprenoid içerir. Elbette, emülsiyonlarin, antijene özgü immün tepkileri ortaya çikarmak için bir veya daha fazla antijen varliginda kullanilabilecegi anlasilmalidir. Alternatif olarak, emülsiyonlar, spesifik olmayan bir bagisiklik tepkisi ortaya çikarmak için antijen yoklugunda kullanilabilir. Baska bir yönünde bulus, MPL, 3D-MPL ve sentetik GLA adjuvani, metabolize edilebilir bir yag ve DMPC veya DOPC'den seçilen bir TLR4 agonisti içeren bir su içinde yag emülsiyonu saglar. Bazi uygulamalarda, metabolize edilebilen yagin, su içinde yag emülsiyonu içindeki konsantrasyonu yaklasik %0.01 - %20 (örn., yaklasik düzeyindedir. Bazi uygulamalarda, su içinde yag emülsiyonundaki DMPC veya DOPC konsantrasyonu yaklasik %0.002 - %2'dir. Bazi uygulamalarda, emülsiyonun HLB`si yaklasik 9 veya yaklasik 10'dan büyüktür. Bazi uygulamalarda, DMPC veya DOPC konsantrasyonu yaklasik %0.015 ila %0.25'tir. Bazi uygulamalarda, DMPC emülsiyondaki DOPC'dir ve sentetiktir. Mevcut bulusun spesifik bir uygulamasinda, bir sentetik GLA adjuvani, yaklasik %001 ila %1 hacim/hacim konsantrasyonunda metabolize edilebilen bir yag ve yaklasik saglanmakta olup, içerisinde emülsiyonun HLB degeri yaklasik 10'dan büyüktür. Bazi uygulamalarda, DMPC konsantrasyonu yaklasik %0.015 ila %0.25'tir. Mevcut bulusta ayrica, bir denekte bir immün tepkisini uyarmaya yönelik ve burada denege burada tarif edildigi gibi bir su içinde yag emülsiyonunun uygulanmasini ve böylece denekte bir immün yanitin uyarilmasini içeren yöntemler saglanmaktadir. Elbette, yöntemler spesifik olmayan bagisiklik tepkilerini ortaya çikarmak için kullanilabilmekte olup, burada emülsiyonlar antijen içermez. Daha tipik olarak, emülsiyonlar, bir veya daha fazla antijen içerecek olup, böylece bagisiklik tepkisi, antijene özgü bir bagisiklik tepkisi olacaktir. Mevcut bulusun bu ve diger yönleri, asagidaki detayli açiklamaya ve ekteki sekillere referansla açikça anlasilacaktir. Ek olarak, mevcut bulusun bazi yönlerini daha ayrintili olarak tarif eden çesitli referanslar burada verilmektedir. SEKILLERIN KlSA AÇIKLAMASI Sekil 1. HPLC-CAD ile ölçüldügü üzere GLA-AF gruplarinda zaman içinde GLA konsantrasyonu. Noktali çizgiler, HPLC yöntemi için üst ve alt spesifikasyon sinirlarini temsil eder. Sekil 2. 2. ve 3. immünizasyonlardan sonra ölçüldügü üzere emülsiyon dozlari ile asilarina antikor yanitlari. Üst panel, soldan saga dogru: (a-c) 2. immünizasyondan 3 hafta sonra ölçülen IgG, IgG1 ve IgGZa antikor uç nokta titreleri. Alt panel, soldan saga dogru: (d-f) 3. immünizasyondan 3 hafta sonra ölçülen IgG, lgG1 ve IgG2a antikor uç noktasi titreleri. (g) 3. immünizasyondan 3 hafta sonra tespit edilen kemik iligindeki uzun ömürlü antikor salgilayan hücreler. Sekil 3. 0.5. ve 3. immünizasyonlardan sonra ölçüldügü üzere emülsiyon dozlari ile asilarina antikor yanitlari. Üst panel, soldan saga dogru: (a-c) 2. immünizasyondan 3 hafta sonra ölçülen lgG, IgG1 ve IgG2a antikor uç nokta titreleri. Alt panel, soldan saga dogru: (d-f) 3. immünizasyondan 3 hafta sonra ölçülen IgG, lgG1 ve IgGZa antikor uç noktasi titreleri. (g) 3. immünizasyondan 3 hafta sonra tespit edilen kemik iligindeki uzun ömürlü antikor salgilayan hücreler. Sekil 4. 3. immünizasyondan 3 hafta sonra ELlSPOT testi ile saptanan antijene spesifik sitokin üreten hücreler. (a) IFN-y üreten hücreler, (b) IL-5 üreten hücreler. Sekil 5. 3. immünizasyondan 3 hafta sonra multipleks boncuk testi (Luminex®) ile tespit edilen antijene özgü sitokin üretimi. (a) IL-2 (b) IL-5 (c) IL-10 (d) IL-13 (e) IL-17 (f) lFN-v (g) TNF-oi. Sekil 6. Yardimci formülasyonlarin parçacik büyüklügü ve polidispersitesi. Sekil 7. Çesitli depolama sicakliklarinda emülsiyon parçacik büyüklügü kararliligi. (A) °C (sol üst grafik), (b) Oda sicakligi (sag üst grafik), (c) 37 °C (sol alt grafik) ve (d) 60 °C (sag alt grafik) kosullarinda saklamanin ardindan sonuçlar gösterilmektedir. Parçacik boyutu, Malvern Instruments APS kullanilarak ölçülmüs; hata çubuklari, her emülsiyonun bir grubundan üç ayri alikotun standart boyut sapmasini temsil eden hata çubuklari ile ölçülmüstür. Sekil 8. Lazer saçilma optik profil emülsiyon stabilitesinin analizi. Emülsiyon içeren 25 - 30 mm küvet bölgesinin tek parça iletim profilleri, 60 °C'de 4 saatten fazla ölçülmüstü r. Sekil 9. Emülsiyonlarin, rekombinant sitma antijeni ile immünizasyonla indüklenen antikor tepkileri üzerine etkisi. BALB/c fareleri, POPC, DOPC ve DMPC dahil olmak üzere yumurta PC veya sentetik PC içeren emülsiyonlarla formüle edilmis PbCSP antijeniyle iki kez immünize edilmistir. Antijene özgü lgG (a), lgG 1 (b) ve lgGZa (c), ELlSA ile belirlenmistir. Grup basina n = 5'tir ve veriler, bireysel farelerin (Logio) degerleri olarak gösterilmekte olup, çubuk ortalamayi temsil eder. * = p degeri < 0.05, tek basina protein ile immünizasyona karsi. Sekil 10. Adjuvan formülasyonunun, inaktive edilmis bölünmüs virüs influenza asisi (Fluzone) ile immünizasyonla indüklenen humoral immün yanitlarinda etkisi. BALB/c fareleri, POPC, DOPC ve DMPC dahil olmak üzere yumurta PC veya sentetik PC içeren emülsiyonlarla formüle edilmis Fluzone antijeniyle immünize edilmistir. Antijene özgü lgG (a), lgG 1 (b) ve lgGZa (c), ELlSA ile belirlenmistir. Fluzone'a karsi lgG salgilayan kemik iligi plazma hücreleri ELlS-POT (d) ile belirlenmistir. (a-c) için sonuçlar uç nokta titresi (Logio) olarak gösterilir, her nokta ayri ayri fareleri temsil eder ve çubuk ise ortalamayi temsil eder. (d) için sonuçlar ayrica her gruptaki bireysel fareleri temsil eder, çubuk ortalama ASPC/grubu temsil eder. * = p degeri <0.05, sadece asi ile immünizasyona karsi ve # = p degeri <0.05, DMPC emülsiyonunu içeren asi ile immünizasyona karsi. Sekil 11. HI titreleri, yumurta PC'si veya sentetik PC'ler ile formüle edilmis Fluzone ile immünizasyon ile gelistirilmistir. BALB/c fareleri, Fluzone ve çesitli emülsiyonlarla immünize edilmis, daha sonra serum HI titreleri, güçlendirmeden dört hafta sonra belirlenmis olup, (a) Fluzone'un A/Solomon Adalari/ bilesenine karsi Hl titreleri; (b) Fluzone'un ANVisconsin/ bilesenine karsi HI titreleridir. Veriler, her bir hayvan için (Log2) titresi olarak gösterilmekte olup, çubuk ortalamayi temsil eder. * = p degeri <0.05, sadece asi ile immünizasyona karsi ve # = p degeri <0.05, POPC emülsiyonu veya DMPC emülsiyonu içeren asi ile asilamaya karsi. Sekil 12. lL-5 üreten hücreler, emülsiyonlarla formüle edilmis Fluzone ile immünizasyondan sonra arttirilir. Fluzone ve çesitli emülsiyonlarla immünize edilen BALB/c farelerinden splenositler (a) 5 HAU etkisizlestirilmis A/Solomon Adalari/ ve ELISPOT ile belirlenen lL-5 üreten hücrelerle stimüle edilmistir. Veriler, bireysel fareler/grup için milyon splenosit basina leke olusturma birimi (SFU) sayisi olarak gösterilmekte olup; çubuk. ortalamayi temsil eder, grup basina n = 5'tir. * = p degeri <0.05, sadece asi ile immünizasyona karsi ve # = p degeri <0.05, DMPC emülsiyonunu içeren asi ile immünizasyona karsi. BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Mevcut bulus, birçok yönüyle, TLR4 agonistlerini, özellikle TLR4 agonistlerini içeren suda yag emülsiyonlarini içeren emülsiyon bilesimlerini ve bunlarin ekte verilen istemlerde belirtildigi gibi adjuvan ve immünostimülatör bilesimler olarak iliskin kullanim yöntemlerini saglar. Burada tartisildigi gibi, mevcut bulusun formülasyonlari genel olarak bir TLR4 agonisti ve bir metabolize edilebilen yag içeren bir su içinde yag emülsiyonu içermekte olup, içerisinde metabolize edilebilen yag, su içinde yag emülsiyonu içinde yaklasik %0.01 ila %1 hacim/hacim veya yaklasik %0.01 ila %05 hacim/hacim konsantrasyonunda bulunur ve içerisinde su içinde yag emülsiyonunun hidrofobikzlipofilik dengesi (HLB) yaklasik 9'dan büyük veya yaklasik 10'dan büyük veya yaklasik 9 ile 12 arasindadir. Bir emülsiyonun HLB'sini belirlemeye yönelik yöntemler teknikte bilinir. Bkz., örn., internette: firp.ula.ve/archivos/historicos/76_Book_HLB_ICI.pdf ve chemistscorner.com/hIb-the-easiest-way-to-create-an-emulsion/. Mevcut bulusta kullanim için yag emülsiyonu adjuvanlari dogal veya sentetik olabilir ve mineral veya organik olabilir. Mineral ve organik yaglarin örnekleri, teknikte uzman olan kimselerce kolayca anlasilacaktir. Belirli bir uygulamada, bulusun bir bilesimi, TLR4 agonistinin yag fazina dahil edildigi bir su içinde yag emülsiyonu içerir. Su bilesimindeki bir yagin insan uygulamasina uygun olmasi için emülsiyon sisteminin yag fazi tercihen metabolize edilebilir bir yag içerir. Metabolize edilebilir yag teriminin anlami teknikte iyi bilinmektedir. Metabolize edilebilirlik "metabolizma tarafindan dönüstürülebilme" olarak tanimlanabilir (Dorland's illustrated Medical Dictionary, W. B. Saunders Company, 25. basim (1974)). Yag, alici için toksik olmayan ve metabolizma tarafindan dönüstürülebilen herhangi bir bitki yagi, bitkisel yag, balik yagi, hayvansal yag veya sentetik yag olabilir. Fistik (örnegin yer fistigi), tohumlar ve tahillar bitkisel yaglarin ortak kaynaklaridir. Sentetik yaglar da kullanilabilir. Belirli örnekleyici uygulamalarda, mevcut bulusun formülasyonlari yaklasik %0.01-%1 hacim/hacim, yaklasik %0.01-%0.5 hacim/hacim, yaklasik %0.5 hacim/hacim veya yaklasik %0.2 hacim/hacim konsantrasyonunda bulunan bir metabolize edilebilen yag içerir. Bazi uygulamalarda, metabolize edilebilen yag, %1 hacim/hacim'in altindaki bir konsantrasyonda bulunur. Bu bulusa göre yararli olan örnek metabolize edilebilir yaglar, bunlarla sinirli olmamak üzere, skualen, soya fasulyesi yagi, susam yagi ve kaprilik/kaprik asit trigliseritlerini (MIGLYCOL 810 yagi) içerir. Tercih edilen bir uygulamada, metabolize edilebilir yag skualen içerir. Daha spesifik bir uygulamada, metabolize edilebilir yag, mayadan türetilmis skualen veya mayadan türetilmis ilgili izoprenoid yapisi gibi bir veya daha fazla maya türevi izoprenoit içerir. köpekbaligi karaciger yaginda yüksek miktarlarda bulunan ve zeytin yagi, bugday tohumu yagi, pirinç kepegi yagi ve mayada düsük miktarlarda bulunan bir doymamis yagdir ve mevcut bulusta kullanilmak üzere özellikle tercih edilen bir yagdir. Skualen, kolesterol biyosentezinde bir ara madde olmasi nedeniyle metabolize edilebilir bir yagdir (Merck endeksi, 10. Baski, giris no. 8619). Diger örnek uygulamalarda, bulusun bazi formülasyonlari bir antioksidan içerir. Mevcut bulusun emülsiyonunda faydali olan açiklayici antioksidanlar arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, bir tokoferol ve bir askorbik asit bulunmakta olup, bir tokoferol tercih edilir. Yine baska örnek uygulamalarda, bulusun bazi emülsiyonlari bir yüzey aktif madde içerir. Mevcut bulusa göre yararli olan yüzey aktif maddeler Pluronic F68, Tween 80, polisorbat 80 (CAPMUL POE-O düsük PV yüzey aktif madde, ABITEC Corp., Janesville, Wis.), polietilen 660 12-hidroksistearat (SOLUTOL HS15, BASF Corp., Chicago, lll.) ve poloksamer 188 (PLURONIC Q F68 blok ko-polimeri, BASF Corp., Chicago, Ill.), sodyum kolat, gliserodeoksi kolat, fosfatidil kolin olup, poloksamer 188 tercih edilir. Diger uygun yüzey aktif maddeler arasinda sfingomiyelinler, örnegin sfingomiyelin ve sfingozin ve fosfolipitler, örnegin yumurta fosfatidilkolin, 1,2-DimiristoiI-sn-gliser0-3-fosf0etanolamin, L-a-Fosfatidiletanolamin ve veya bunlarin karisimlari bulunur. DPPC, insanlarda kullanim için kabul edilebilir. Bazi uygulamalarda, yüzey aktif madde DMPC, DOPC ve/veya POPC'dir (örnegin sentetik DMPC, DOPC ve POPC). Bir veya daha fazla yüzey aktif madde kullanilabilir. Ek olarak, yine baska açiklayici uygulamalarda, bulusun bazi formülasyonlari, yaklasik 9'dan büyük veya yaklasik 10'dan büyük veya yaklasik 11'den büyük bir hidrofobikzlipofilik dengeye (HLB) sahiptir. Diger ilgili uygulamalarda, formülasyonlar HLB'ye sahiptir. Diger belirli örnek niteligindeki uygulamalarda, mevcut bulusun formülasyonlari fosfolipid , özellikle sentetik DMPC içerir. Ayrica, emülsiyonun DMPC içerdigi bazi uygulamalarda, emülsiyon bir antioksidan içermez. Yine ayrica, emülsiyonun DMPC içerdigi bazi uygulamalarda, formülasyonlarin HLB degeri yaklasik 9'dan büyüktür veya yaklasik 10'dan büyük veya yaklasik 11'den büyüktür veya yaklasik 9 ile 12 arasinda, yaklasik 10 ile 12 arasinda veya yaklasik 10 ile 11 arasinda bir HLB degeri bulunur. Formülasyonlarin DMPC içerdigi yerlerde, formülasyonlar genellikle yumurta fosfatidil kolin (PC) içermez. Adjuvani izotonik yapmak için söz konusu bulusun emülsiyonuna eklenebilen ajanlar arasinda dekstroz, gliserol, mannitol, sorbitol, PEG 300, PEG 400 ve polietilen glikol Örnek niteligindeki yag emülsiyonlari, su içinde yag emülsiyonlari ve özellikle su içinde skualen emülsiyonlaridir. Ek olarak, mevcut bulusun en çok tercih edilen yag emülsiyon adjuvanlari bir antioksidan içermekte olup, tercihen yag alfa-tokoferoldür (E ve/veya 3D-MPL (yukarida tartisilan) immünostimülanlarla formüle edilen, skualen, alfa-tokoferol ve TWEEN® 80 bazli emülsiyon adjuvanlarini açiklar. WO 99/12565, bu skualen emülsiyonlarinda yag fazina bir sterol ilavesi ile bir gelistirme açiklar. Ek trigliserit ilave edilebilir. Stabil su içinde yag emülsiyonu içinde bulunan yag damlaciklarinin boyutu, foton korelasyon spektroskopiyle ölçüldügü üzere tercihen 1 mikrondan az olup, büyük tercih edilen biçimde büyük ölçüde 150 ila 500 nm çapta olabilir ve özellikle yaklasik 150 nm çapta olabilir. Bu bakimdan, yag damlaciklarinin sayica %80'inin tercih edilen araliklar dahilinde, daha çok tercih edilen biçimde sayica %90'indan fazlasinin ve en çok tercih edilen biçimde %95'inden fazlasinin tanimli boyut araliklarinin dahilinde olmasi gerekir. Su emülsiyonlarinda yag üretme yöntemi, teknikte uzman kisilerce iyi bilinmektedir. Genellikle, yöntem, yag fazinin bir PBS/TWEEN80® çözeltisi gibi uygun bir yüzey aktif madde ile karistirilmasini, ardindan bir homojenlestirici kullanilarak homojenlestirilmesini içerir. Örnegin, karisimin bir siringa ignesinden bir kez, iki kez veya daha fazla kez geçirilmesini içeren bir yöntem, küçük hacimli sivilari homojenize etmek için uygun olacaktir. Ayni derecede, bir mikroakiskanlastirici (M11OS mikroakiskanlastirici makine, maksimum 50 geçis, 6 barlik maksimum basinç girisiyle 2 dakikalik bir süre boyunca (çikti basinci yaklasik 850 bar)) içindeki emülsifikasyon prosesi daha küçük veya daha büyük emülsiyon hacimleri üretmek üzere adapte edilebilir. Bu adaptasyon, istenen çaptaki yag damlaciklari ile bir preparasyon elde edilene kadar elde edilen emülsiyonun ölçümünü içeren rutin deneylerle saglanabilir. TLR4 Agonistleri Tercih edilen bazi uygulamalarda, bulusun formülasyonlarinda kullanilan bir TLR4 Örnegin, belirli uygulamalarda, TLR4 agonisti asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvanidir: R17/I LG R2 R /Lio R5 veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu olup, özelligi; içerisinde: L1, L2, L3, L4, L5 ve La ifadelerinin ayni veya farkli olmasi ve bagimsiz olarak -O-, -NH- veya -(CH2)- olmasi; L7, L8, L9 ve L10 ifadelerinin ayni veya farkli olmasi ve bagimsiz olarak eksik olmasi veya -C(=O)- olmasi; Y1 ifadesinin bir asit fonksiyonel grup olmasi; Y2 ve Y3 ifadelerinin ayni veya farkli olmasi ve bagimsiz olarak -OH, -SH olmasi veya bir asit fonksiyonel grubu olmasi; Y4 ifadesinin -OH veya -SH olmasi; R1, R3, R5 ve R6 ifadelerinin ayni veya farkli olmasi ve bagimsiz olarak 08-13 alkil olmasi; ve R2 ve R4 ifadelerinin ayni veya farkli olmasi ve bagimsiz olarak Css-11 alkil olmasidir. Sentetik GLA yapisinin bazi uygulamalarinda, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri C10 alkildir; ve R2 ve R4 ifadeleri Cs alkildir. Örnegin, belirli uygulamalarda, TLR4 agonisti asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvanidir: 012-020 alkildir. Bir baska spesifik uygulamada, GLA yukarida ortaya konuldugu gibi formüle sahip Bir baska spesifik uygulamada, GLA yukarida ortaya konuldugu gibi formüle sahip Bir baska spesifik uygulamada, GLA yukarida ortaya konuldugu gibi formüle sahip 09 alkildir. Belirli uygulamalarda, TLR4 agonisti asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvanidir: R4 O : Rt' ."OH ifadeleri C11 alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri C9 alkildir. Belirli uygulamalarda, TLR4 agonisti asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvanidir: alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri Cg-Czo alkildir. Belirli uygulamalarda, R1, R3, R5 ve Rif3 ifadeleri Cii alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri 09 alkildir. Belirli uygulamalarda, TLR4 agonisti asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvanidir: 1 NH HO R6 "'OH_Yukaridaki GLA yapisinin belirli uygulamalarinda, R1, R3, R5 ve R6 ifadeleri Cii-Czo alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri Cg-Czo alkildir. Belirli uygulamalarda, R1, R3, R5 ve R8 ifadeleri Cii alkil; ve R2 ve R4 ifadeleri Cg alkildir. Belirli uygulamalarda, TLR4 agonisti asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvanidir: Belirli uygulamalarda, TLR4 agonisti asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvanidir: Belirli uygulamalarda, TLR4 agonisti asagidaki yapiya uygun bir sentetik GLA adjuvanidir: 8 ÖH ( "'OH Bir baska uygulamada, zayiflatilmis bir lipit A türevi (ALD), söz konusu bulusa ait bilesimlere dahil edilir. ALD'Ier molekülün lipit A yan etkilerini daha az veya farkli bir biçimde gösterecegi sekilde degistirilmis veya insa edilmis olan Iipit A benzeri moleküllerdir. Bu yan etkiler arasinda pirojeniklik, lokal Shwarzman reaktivitesi ve tavuk embriyosu %50 ölümcül doz tahlilinde (CELD50) degerlendirildigi üzere toksisiteyi içerir. Mevcut bulusa göre kullanisli olan ALD'ler arasinda monofosforil Iipit A (MLA) ve 3-deasile monofosforil lipit A (BD-MLA) bulunur. MLA ve 3D-MLA bilinmektedir ve burada detayli olarak açiklanmasi gerekmemektedir. Örnegin, monofosforil lipit A ve bunun üretimini açiklayan Ribi lmmunoChem Research, Inc. bakiniz. ABD Patent No 4,912,094 ve yeniden degerlendirme sertifikasi B1 ABD Patent No 4,912,094, Myers ve ark., yine Ribi lmmunoChem Research, Inc. adina olup, 3-deasile monofosforil Iipit A ve bunun üretimine yönelik bir metodu kapsar. Bazi uygulamalarda, bulusun formülasyonlari ayrica bir veya daha fazla antijen içerecektir. Burada tarif edilen asi bilesimleri ve GLA kullanilan metotlarin belirli uygulamalarinda kullanima yönelik bir antijen, kendisine karsi bir hastada immünoreaktivitenin ortaya çikarilmasinin veya gelistirilmesinin istendigi herhangi bir hedef epitopu, molekül (örnegin bir biyomolekül), moleküler kompleks (örnegin biyomoleküller içeren moleküler kompleksler), hücreiçi düzenek, hücre veya doku olabilir. Siklikla, antijen terimi, ilgilenilen bir polipeptit antijenini belirtir. Bununla birlikte, burada kullanildigi gibi antijen, ilgilenilen bir polipeptit antijenini kodlayan bir rekombinant yapiyi da belirtebilir (örn., bir ifade yapisi). Belirli tercih edilen uygulamalarda, antijen bir enfeksiyöz patojen ve/veya enfeksiyon, kanser, otoimmün hastalik, alerji, astim veya bir antijene özgü bagisiklik yanitinin stimülasyonunun istendigi veya yararli oldugu herhangi bir baska rahatsizlikla iliskili bir epitop, biyomolekül, hücre veya doku olabilir veya bundan türetilebilir veya bununla immünolojik olarak çapraz reaktif olabilir. Tercihen ve belirli uygulamalarda, mevcut bulusun asi formülasyonlari bir insan veya bir baska memeli patojene karsi bir bagisiklik yaniti verebilen bir antijen veya antijenik bilesim içermekte olup, bu antijen veya antijenik bilesim bir virüsten, örnegin HlV-1 (örnegin tat, nef, gp120 veya gp160), insan herpes virüsleri, örnegin gD veya bunlarin türevleri veya Immediate Early protein, örnegin HSV1 veya HSV2'den lCP27, sitomegalovirüs ((özellikle insan) (örnegin 98 veya bunlarin türevleri), Rotavirüs (örnegin canli hafifletilmis virüsler), Epstein Barr virüsü (örnegin gp350 veya bunlarin türevleri), Varicella Zoster Virüsü (örnegin gpl, Il ve IE63) veya bir hepatit virüsünden, örnegin hepatit B virüsü (örnegin, Hepatit B yüzey antijeni veya bunun türevi), hepatit A virüsü, hepatit C virüsü ve hepatit E virüsü veya diger viral patojenlerden, örnegin paramiksovirüslerden: respiratuvar sinsitiyal virüsü (örnegin F ve G proteinleri veya bunlarin türevleri), parainfluenza virüsü, kizamik virüsü, kabakulak virüsü, insan papilom virüsleri (örnegin HPV6, 11, 16, 18, vb.), flavivirüsler (örn., sari ates virüs, dang hummasi virüsü, kene kökenli ensefalit virüsü, `Japon ensefalit virüsü) veya influenza virüsü (tam canli veya etkisizlestirilmis virüs, bölünmüs influenza virüsü, yumurtalarda veya MDCK hücrelerinde yetistirilen veya tam flu virozomlari (Gluck, rekombinant proteinler, örnegin HA, NP, NA veya M proteinleri veya bunlarin kombinasyonlari) içerebilir. Diger belirli tercih edilen uygulamalarda, mevcut bulusun asi formülasyonlari bir insan veya diger memeli patojene karsi bir bagisiklik yaniti ortaya koyabilen bir antijen veya antijenik bilesim içermekte olup, bu antijen veya antijenik bilesim bir veya daha fazla bakteriyel patojenlerden türetilen bir bilesimi içerebilir ve bunlarin arasinda örnegin: Neisseria spp, örnegin N. gonorrhea ve N. meningitidis (örnegin kapsüler polisakkaritler ve bunlarin konjügatlari, transferin baglayan proteinler, laktoferin baglanma proteinleri, PilC, adezinler); S. pyogenes (örnegin M proteinler ya da bunlarin parçaciklari, CSa proteaz, lipoteikoik asitler), S. aga/actiae, S. mutans: H. ducreyi'; Moraxella spp, örnegin M catarrhalis, ayrica Branhamella catarrhalis olarak da bilinir (örnegin yüksek ve düsük moleküler agirlikli adezinler ve invazinler): Bordetella spp, örnegin B. pertussis (örnegin pertaktin, bogmaca toksini veya bunlarin türevleri, filamentöz hemaglutinin, adenilat siklaz, fimbria), B. parapertussis ve B. bronchiseptica; Mycobacteri'um spp,, örnegin M. tuberculosis (örnegin ESATG, Antijen 85A, -B veya -C), M. bovi's, M. Ieprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; LegioneI/a spp, örnegin L. pneumophi/a; Escheri'chi'a spp, örnegin enterotoksik E. coli' (örnegin kolonizasyon faktörleri, isiya dayaniksiz toksin veya bunlarin türevleri, isiya dayanikli toksin veya bunlarin türevleri), enterohemorajik E. co/i, enteropatojenik E. 0011' (örnegin shiga toksini benzeri toksin veya bunlarin türevleri); Vibrio spp, örnegin V. cho/era (örnegin kolera toksin veya bunlarin türevleri); Shigel/a spp, örnegin 8. sonnei, S. dysenteri'ae, S. flexnerii; Yersinia spp, örnegin Y. enterocolitica (örnegin bir Yop proteini), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, örnegin C. jejuni (örnegin toksinler, adezinler ve invazinler) ve C. coli; Salmone/Ia spp, örnegin 8. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteri'tidi's; Listeria spp., örnegin L. monocytogenes; Helicobacter spp. örnegin H. pylori (örnegin üreaz, katalaz, bosluk olusturan toksin): Pseudomonas Spp, örnegin P. aerugi'nosa; Staphy/ococcus spp., örnegin 8. aureus, S. epidermi'di's; Enterococcus spp., örnegin E. faeca/is, E. faecium; Clostridium spp., örnegin C. tetani (örnegin tetanoz toksini ve bunun türevi), C. botulinum (örnegin botulinum toksini ve bunun türevi), C. difficile (örnegin klostridyum toksinleri A veya 8 ve bunlarin türevleri); Bacillus spp., örnegin B. anthracis (örnegin botulinum toksini ve bunun türevleri); Corynebacterium spp., örnegin C. diphtheriae (örnegin difteri toksini ve bunun türevleri); Borreli'a spp., örnegin B. burgdorferi (örnegin OspA, OspC, Dpr, DbpB), B. garini'i' (örnegin OspA, OspC, Dpr, DbpB), B. afzelii(örnegin OspA, OspC, Dpr, DbpB), B. andersoni'i (örnegin OspA, OspC, Dpr, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., örnegin E. equi' ve Insan Granülositik Ehrlikiyoz ajani; Rickettsia spp. örnegin R. rickettsii; Chlamydia spp. örnegin C. trachomatis (örnegin MOMP, heparin baglayici proteinler), C. pneumoniae (örnegin MOMP, heparin baglayici proteinler), C. psittaci; Leptospira spp., örnegin L. interrogans; Treponema spp., örnegin T. pallidum (örnegin nadir dis membran proteinleri), T. denticola, T. hyodysenteriae; veya diger bakteriyel patojenler bulunur. Diger belirli tercih edilen uygulamalarda, mevcut bulusun asi formülasyonlari bir insan veya diger memeli patojene karsi bir bagisiklik yaniti ortaya koyabilen bir antijen veya antijenik bilesim içermekte olup, bu antijen veya antijenik bilesim bir veya daha fazla parazitten türetilen bir bilesimi içerebilir (Bkz, örn., John, D.T. and Petri, W.A., Markell and Voge's Medical Parasitology-9th Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis' Parasitology for Veterinarians-Sth Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphia) ve bunlarin arasinda: Plasmodium spp., örnegin P. falciparum; Toxoplasma spp., örnegin T. gondii (örnegin SAG2, SAGS, T934); Entamoeba spp., örnegin E. histolytica; Babesia spp., örnegin B. microti; Tiypanosoma spp., örnegin T. cruzi; Giardia spp., örnegin G. Iamblia; Leshmani'a spp., örnegin L. major; Pneumocystis spp., örnegin P. carini'i'; Trichomonas spp., örnegin T. vagina/is; veya bir memeliyi enfekte edebilen bir helminth'ten, örnegin: (i) nematod enfeksiyonlari (örnegin, sinirlandirma olmaksizin, Enterobius vermicularis, Ascaris Iumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Wuchereria ban- crofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracariculus medinensis, Trichine/Ia spiralis ve Strongyloides stercora/is); (ii) trematod enfeksiyonlari (örnegin, sinirlandirma olmaksizin, Schistosoma mansoni', Schistosoma haematobium, Schistosoma japon/'cum, Schistosoma mekongi, Opisthorchis sinensis, Paragonimus sp, Fasci'o/a hepatica, Fasciola magna, Faso/'ola giganti'ca); ve (iii) sestod enfeksiyonlari (örnegin, sinirlandirma olmaksizin, Taenia saginata ve Taenia solium) bulunur.Belirli uygulamalar bu nedenle Schisostoma spp., Schistosoma mansoni'i, Schistosoma haematobium ve/veya Schistosoma japonicum'dan türetilen veya mayadan türetilen, örnegin Candida spp., örnegin C. albicans; Cryptococcus spp., örnegin C. neoformans içeren asi bilesimlerini ele almaktadir. M. tuberculosi's için diger tercih edilen spesifik antijenler, örnegin Th Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb. M. tüberküloz için proteinler ayrica füzyon proteinlerini ve bunlarin varyantlarini içermekte olup; burada en az iki, tercihen üç adet M. tüberküloz polipeptidi daha büyük bir proteine kaynasir. Tercih edilen füzyonlar arasinda Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14DPV-MTI-MSL-mTCCZ, Klamidya için en çok tercih edilen antijenler, örnegin, Yüksek Moleküler Agirlikli Proteini (HWMP) (WO ve varsayilan zar proteinlerini (Pmp) içerir. Asi formülasyonunun diger Klamidya antijenleri, WO 99128475'te açiklanan gruptan seçilebilir. Tercih edilen bakteriyel asilar Streptococcus spp, örnegin 8. pneumoniae (örnegin kapsüler polisakkaritler ve bunlarin konjügatlari, PsaA, PspA, streptolizin, kolin baglayici proteinler) ve protein antijeni Pnömolizin türetilen antijenleri içerir. Diger tercih edilen bakteriyel asilar Haemophilus spp.'den türetilen antijenleri, örnegin H. influenzae tip B (örnegin PRP ve bunlarin konjügatlari), türlenemeyen H. influenzae, örnegin OMP26, yüksek moleküler agirlikli adezinler, P5, P6, protein D ve Iipoprotein D ve fimbrin ve fimbrinden türetilen peptitler (ABD Pat. No. ,843,464) veya bunlarin çok kopyali varyantlari veya füzyon proteinlerini içerir. Hepatit B Yüzey antijeni türevleri, teknikte iyi bilinir ve digerleri arasinda EP-A414 374, ParsZ S antijenlerini içerir. Tercih edilen bir yönüyle, bulusa ait asi formülasyonu, özellikle CHO hücrelerinde ifade edildiginde, HIV-1 antijeni gp120'yi içerir. Baska bir uygulamada, bulusun asi formülasyonu yukarida tanimlandigi gibi gD2t içerir. Mevcut bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, istemlenen adjuvani içeren asilar genital sigillerden sorumlu oldugu düsünülen Insan Papilom Virüsünden (HPV) (HPV 6 veya HPV 11 ve digerleri) ve servikal kanserden sorumlu oldugu düsünülen HPV virüslerinden (HPV16, HPV18 ve digerleri) türetilen antijeni içerir. Özellikle tercih edilen genital sigil profilaktik veya terapötik asi formlari, L1 partiküllerini veya kapsomerlerini ve HPV 6 ve HPV 11 proteinleri E6, E7, L1 ve L2'den seçilen bir veya daha fazla antijen içeren füzyon proteinlerini içerir. Bazi tercih edilen füzyon proteini servikal enfeksiyon veya kanser, profilaksi veya terapötik asi, bilesim HPV 16 veya 18 antijenleri içerebilir. Örnegin, L1 veya L2 antijen monomerleri veya bir virüs benzeri parçacik (VLP) olarak sunulan L1 veya L2 antijenleri veya bir VLP veya kaposmer yapisi içinde sunulan tek basina L1 tek basina protein. Bu antijenler, virüs benzeri parçaciklar ve kapsomer basli basina bilinmektedir. Örnegin, bkz. W094/OO152, Ilave erken proteinler tek baslarina veya örnegin E7, E2 veya tercihen F5 gibi füzyon proteinleri olarak dahil edilebilmekte olup; özellikle tercih edilen uygulamalar, L1E7 füzyon proteinleri içeren bir VLP'yi (WO 96/11272) içerir. Özellikle tercih edilen HPV 16 antijenleri, HPV 16'dan Protein D-E6 veya E7 füzyonlari veya bunlarin kombinasyonlarini olusturmak için bir protein D tasiyici ile füzyon halinde erken içerir. Alternatif olarak, HPV 16 veya 18 erken proteinleri E6 ve E7, tek bir molekül içerisinde, tercihen bir Protein D-E6/E7 füzyonunda sunulabilir. Bu tür asilar istege bagli olarak HPV 18'den EG ve E7 proteinlerinden birini veya her ikisini birden, tercihen bir protein D-Eö veya protein D-E7 füzyon proteini veya protein D E6/E7 füzyon proteini formunda içerebilir. Mevcut bulusun asisi ayrica diger HPV suslarindan, tercihen HPV 31 veya 33 suslarindan antijenleri içerebilir. Mevcut bulusun asilari ayrica sitmaya neden olan parazitlerden türetilmis antijenleri içerir. Örnegin, Plasmodia falciparum'dan tercih edilen antijenler, RTS, S ve TRAP'i içerir. RTS, Hepatit B yüzey antijeninin preSZ kisminin dört amino asidiyle hepatit B virüsünün yüzey (S) antijenine bagli dört amino asit ile baglanmis P. falciparum'un circumsporozoite (CS) proteininin C-terminal kismini esas olarak içeren bir hibrid proteindir. Tam yapisi, 9,94390,7 numarali Ingiliz patent basvurusundan öncelikli olan Basvurusunda açiklanmistir. Mayada ifade edildiginde RTS, bir Iipoprotein partikülü olarak üretilir ve HBV'den S antijeni ile birlikte ifade edildiginde, RTS,S olarak bilinen karisik bir partikül üretir. Uluslararasi Patent Basvurusunda tarif edilmistir. Mevcut bulusun tercih edilen bir uygulamasi, antijenik preparasyonun RTS,S ve TRAP antijenlerinin bir kombinasyonunu içerdigi bir Sitma asisidir. Çok asamali bir sitma asisinin olasi bilesen adaylari olan diger plazmodiya antijenleri P. faciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, Plasmodium spp. içindeki analoglaridir. Buna göre, burada açiklanan belirli uygulamalar en az bir enfeksiyöz patojenden, örnegin bir bakteri, bir virüs veya bir mantardan, örnegin bir Aktinobakteriden, örnegin M. tuberculosis veya M. Ieprae veya bir baska mikobakteriden; bir bakteri, örnegin Salmonella, Nei'sseri'a, Borrelia, Chlamydia veya Bordete//a cinsinin bir üyesinden; bir virüs, örnegin bir herpes simpleks virüsü, bir insan bagisiklik yetmezligi virüsü (HlV), bir kedigil bagisiklik yetmezligi virüsü (FIV), sitomegalovirüs, Varicella Zoster virüsü. hepatit virüsü, Epstein Barr virüsü (EBV), solunumla ilgili sinsitiyal virüsü, insan papilom virüsü (HPV) ve bir sitomegalovirüs; HlV, örnegin HIV-1 veya HlV-2; bir mantar, örnegin Aspergil/us, Blastomyces, Coccidioi'des ve Pneumocysti veya bir maya, örnegin Candida türü, örnegin C. a/bi'cans, C. glabrata, C. krusei, C. Iusitaniae, C. tropicalis ve C. parapsilosis; bir parazit örnegin bir protozoa, örnegin, bir Plasmodium türü, örnegin P. falciparum, P. vivax, P. malariae ve P. ova/e; veya bir baska parazit, örnegin Acanthamoeba, Entamoeba histolyti'ca, Angiostrongy/us, Schi'stosoma mansoni'i, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Cryptosporidium, Ancy/ostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria bancrofti, Giardia, ve Leishmania'dan bir veya daha fazlasindan türetilen bir antijeni ele almaktadir. Örnegin, Borrelia sp.'den türetilen antijenler içeren GLA içeren asi uygulamalarinda, antijenler nükleik asit, patojenden türetilen antijen veya antijenik preparasyonlar, rekombinant olarak üretilen protein veya peptitler ve kimerik füzyon proteinleri içerebilir. Böyle bir antijen, OspA'dir. OspA, bir konakçi hücrede (Lipo-OspA) biyosentezi sayesinde Iipide edilmis bir biçimde tam olgun bir protein olabilir veya alternatif olarak Iipide edilmemis bir türev olabilir. Bu tür Iipitlenmis türevler, influenza virüsünün yapisal olmayan proteininin (N81) ilk 81 N-terminal amino asitleri olan lipitlenmemis NS1-OspA füzyon proteinini ve tam OspA proteinini ve bir baska protein olan, 3 ilave N-terminal amino asit tasiyan OspA'nin Iipitlenmemis bir formu olan MDP-OspA'yi içerir. Teknikte, burada tarif edildigi gibi bulasici bir patojen ile enfeksiyonu olan veya olma riski tasiyan süpheli bireyleri tanimlamak için bilesimler ve yöntemler bilinmektedir. Örnegin, bakteri Mycobacterium tuberculosis, tüberkülozu (TB) gösterir. Bakteriler genellikle akcigerlere saldirir, ancak böbrek, omurga ve beyine de saldirabilir. Düzgün tedavi edilmezse TB hastaligi ölümcül olabilir. Enfekte bir kisi hapsirdiginda veya öksürdügünde, hastalik havada bir kisiden digerine yayilir. 2003 yilinda ABD`de 14.000'den fazla TB vakasi rapor edilmistir. Her ne kadar tüberküloz genel olarak genisletilmis antibiyotik tedavisi kullanilarak kontrol edilebilse de, böyle bir tedavi hastaligin yayilmasini önlemek için yeterli degildir ve antibiyotige dirençli suslarin potansiyel seçimi ile ilgili endiseler mevcuttur. Enfekte olan bireyler bir süre asemptomatik fakat bulasici olabilirler. Ek olarak, tedavi rejimine uyum kritik olsa da, hasta davranisini izlemek zordur. Bazi hastalar tedavi sürecini tamamlamamakta olup, bu durum etkisiz tedaviye ve ilaç direncinin gelismesine yol açabilir (örnegin, ABD Patenti 7,087,713). Günümüzde, canli bakterilerle asilama, tüberküloza karsi koruyucu bagisikligin uyarilmasi için en etkili yöntemdir. Bu amaçla kullanilan en yaygin mikobakteri, bir Mycobacterium bovis susu olan Bacillus Calmette-Guerin'dir (BCG). Bununla birlikte, BCG'nin güvenligi ve etkinligi bir tartisma kaynagidir ve ABD gibi bazi ülkeler genel halki asilamamaktadir. Teshis genellikle tüberkülin PPD'ye (proteini saflastirilmis türev) intradermal maruz kalmayi içeren bir deri testi kullanilarak gerçeklestirilir. Antijene spesifik T hücresi tepkileri, enjeksiyon bölgesinde, enjeksiyondan 72 saat sonra ölçülebilir indürasyonla sonuçlanmakta olup, bu, mikobakteriyel antijenlere maruz kalmayi gösterir. Bununla birlikte, duyarlilik ve spesifiklik, bu testte bir sorun olmustur ve BCG ile asilanmis kisiler, enfekte olmus bireylerden ayirt edilememistir (örnegin, ABD Patenti 7,087,713). Makrofajlarin, M. tuberculosis bagisikliginin baslica etkileyicileri olarak etki ettigi gösterilmis olmasina ragmen, T hücreleri bu bagisikligin baskin indükleyicileridir. T hücrelerinin M. tuberculosis enfeksiyonuna karsi korunmasindaki asil rolü, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonuyla iliskili CD4 T hücrelerinin tükenmesinden dolayi, AIDS hastalarinda M. tuberculosis'in sik görülmesi ile gösterilmistir. Mikobakteriyle reaktif CD4 T hücrelerinin, farelerde makrofajlarin anti-mikobakteriyal etkilerini tetikledigi gösterilmis olan etkili gama interferon (IFN-gama) üreticileri oldugu gösterilmistir. IFN-gamanin insanlardaki rolünün netligi daha az olmakla birlikte, çalismalar 1,25-dihidr0ksi-D3 vitamininin, tek basina veya lFN-gama veya tümör nekröz faktörü alfa ile birlikte insan makrofajlarini aktiflestirerek M. tüberküloz enfeksiyonunu inhibe ettigini göstermistir. Ayrica, lFN-gamanin insan makrofajlarini 1,25-dihidr0ksi-vitamin D3 yapmaya tesvik ettigi bilinmektedir. Benzer sekilde, lL-12'nin M. tuberculosis enfeksiyonuna karsi direnci uyarmada rol oynadigi gösterilmistir. M. tuberculosis enfeksiyonunun immünolojisinin gözden geçirilmesi için bkz. Chan ve Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press. Washington, DC. (1994). Mevcut bilesikler ve tüberkülozu teshis etmek veya tüberküloza karsi koruyucu bagisiklik saglamak için yöntemler, bir veya daha fazla Mycobacterium proteininin en az bir immünojenik kismini içeren polipeptitlerin ve bu gibi polipeptitleri sifreleyen DNA moleküllerinin kullanimini içerir. Bu tür polipeptidleri veya DNA dizilerini ve uygun bir tespit reaktifini içeren teshis kitleri, hastalarda ve biyolojik numunelerde Mycobacterium enfeksiyonunun tespiti için kullanilabilir. Bu gibi polipeptitlere karsi yöneltilmis antikorlar da saglanir. Ek olarak, bu tür bilesikler Mycobacterium enfeksiyonuna karsi immünizasyon için asilar ve/veya farmasötik bilesimler halinde 1960'li yillarda dünyanin birçok yerinde sitma ortadan kalkti, ancak hastalik halen devam etmekte ve mevcut ilaçlara dirençli olan yeni hastalik türleri ortaya çikmaktadir. Sitma, 90'dan fazla ülkede önemli bir halk sagligi sorunudur. On sitma vakasindan dokuzu sahra alti Afrika'da meydana gelmektedir. Dünya nüfusunun üçte birinden fazlasi risk altindadir ve her yil 350 ila 500 milyon kisi sitma ile enfekte olmaktadir. Kirk bes milyon gebe, bu yil sitmaya yakalanma riski altindadir. Halihazirda enfekte olmus kisilerin arasinda, her yil enfekte olanlarin 1 milyondan fazlasi önlenebilir bir hastaliktan ölmektedir. Bu ölümlerin çogunlugu Afrikaldaki çocuklardir. Sitma, genellikle bir insan bir enfekte disi Anopheles sivrisinek tarafindan isirildigi zaman bulasir. Bulasma için, sivrisinegin halihazirda sitma ile enfekte olmus bir kisiden kan emerek enfekte olmus olmasi gerekir. Sitmaya parazit neden olur ve hastaligin klinik belirtileri arasinda titreme, bas agrisi, kas agrilari ve yorgunluk, ates ve grip benzeri hastaliklar bulunur. Bu semptomlara bulanti, kusma ve ishal eslik edebilir. Sitma ayrica kirmizi kan hücrelerinin kaybi nedeniyle anemiye ve sariliga neden olabilir. Tek tip sitma ile enfeksiyon, derhal tedavi edilmedigi takdirde, Plasmodium falciparum, böbrek yetmezligine, nöbetlere, zihinsel karisikliga, komaya ve ölüme neden olabilir. Bir bireyde sitma için bir in vitro tanilayici metot bilinmekte olup, bir bireyden alinan bir doku veya bir biyolojik sivinin bir molekül veya polipeptit bilesimiyle temas ettirilmesini içerir ve içerisinde bahsedilen molekül veya polipeptit bilesimi, bahsedilen bilesim ile doku veya biyolojik sivida bulunabilecek olan antikorlar arasinda bir in vitro immünolojik tepkimenin meydana gelmesine olanak taniyan kosullar altinda, P. falciparum enfeksiyöz aktivitesinden kaynaklanan proteinlerin bir veya daha fazla T epitoplarinin tamamini veya bir kismini tasiyan bir veya daha fazla peptit sekansi içerir ve olusturulan antijen-antikor komplekslerinin in vitro saptanmasini içerir (bkz. örn., ABD Patent 7,087,231). Bir rekombinant Plasmodium falciparum (3D7) AMA-1 ektodomain'in ifadesi ve saflastirilmasi tarif edilmistir. Önceki yöntemler, dogal molekülün katlanmasini ve disülfit köprüsünü koruyan oldukça saflastirilmis bir protein üretmistir. Rekombinant AMA-1, antikor üretiminde oldugu gibi bir teshis reaktifi olarak ve tek basina kullanim için bir protein olarak veya sitmayi önlemek için bir asinin bir parçasi olarak faydalidir (ABD Patent 7,029,685). Teknikte, bu antijenlere karsi yönlendirilmis monoklonal veya poliklonal antikorlar gibi, enfeksiyondan sonra duyarli bir memeli konakçinin plazmasina salgilanan proteinler veya protein parçalari olan türe özgü P. vivax malarial peptid antijenlerini kodlayan polinükleotitler tarif edilmistir. Peptit antijenleri, monoklonal antikorlar ve/veya poliklonal antikorlar, sitmayi teshis etmek için kullanilan testlerde ve Plasmodium vivax'in enfeksiyondan sorumlu tür olup olmadigini belirlemek için kullanilir (ABD Patenti 6,706,872). Bu antijenlere yönelik monoklonal veya poliklonal antikorlar oldugu gibi, enfeksiyondan sonra duyarli bir memeli konakçinin plazmasina salgilanan proteinler veya protein parçalari olan türlere özgü P. vivax malarial peptid antijenleri de rapor edilmistir. Peptit antijenleri, monoklonal antikorlar ve/veya poliklonal antikorlar, sitmayi teshis etmek için kullanilan testlerde ve Plasmodium vivax'in enfeksiyondan sorumlu tür olup olmadigini belirlemek için kullanilir (bkz, örn., US Patent 6,231,861). Bir rekombinant Plasmodium falciparum (3D7) AMA-1 ektodomain, dogal molekülün katlanmasini ve disülfür köprüsünü koruyan yüksek derecede saflastirilmis bir protein üreten bir yöntemle de ifade edilmistir. Rekombinant AMA-1, bir antikor belirleyici olarak, antikor üretiminde kullanim için ve bir asi olarak faydalidir (ABD Patenti 7,060,276). Benzer sekilde bilinen, dogal molekülün katlanmasini ve disülfür köprüsünü koruyan bir rekombinant Plasmodium falciparum (3D7) MSP-142'nin ifadesi ve saflastirilmasidir. Rekombinant MSP-142, antikor üretiminde kullanim için birteshis reaktifi olarak ve bir asi olarak faydalidir (ABD Patenti 6,855,322). Bir sitma bulasici patojeniyle enfekte olma riski tasiyan veya oldugundan süphelenilen bir hastayi tanimlamak için insan sitma enfeksiyonlarinin saptanmasina yönelik teshis yöntemleri bu nedenle bunlara ve ilgili açiklamalara göre bilinir. Spesifik olaraki örnegin, kan numuneleri, 3-asetil piridin adenin dinükleotidi (APAD), bir substrat (örnegin bir Iaktat tuzu veya Iaktik asit) ve bir tampon içeren bir reaktifle birlestirilir. Reaktif, sitma paraziti tarafindan üretilen benzersiz bir glikolitik enzimin varligini tespit etmek için tasarlanmistir. Bu enzim parazit laktik asit dehidrojenaz (PLDH) olarak bilinir. PLDH, yukarida tarif edilen reaktif kullanilarak, konak LDH'den kolayca ayirt edilebilir. Reaktifin parazitlenmis bir kan örnegi ile kombinasyonu APAD'nin azalmasina neden olur. Ancak, APAD, ana LDH tarafindan azaltilmaz. Azalan APAD, spektral, florimetrik, elektroforetik veya kolorimetrik analiz dahil olmak üzere çesitli tekniklerle tespit edilebilir. Azalan APAD'nin yukaridaki sekilde saptanmasi, sitma enfeksiyonunun pozitif bir göstergesini saglar (örnegin ABD Patenti 5,124,141). Sitmanin teshisi için baska bir metodolojide, Plasmodium falciparum antijeni GLURP'den türetilmis karakteristik bir amino asit dizisini içeren bir polipeptit, bir test örneginde polipeptide karsi veya reaktif olarak spesifik bir antikor tarafindan taninir (ABD Patenti 5,231,168). Laysmanyaz, Hindistan alt kitasi, Afrika ve Latin Amerika'da sik salginlar gösteren yaygin bir paraziter hastaliktir ve asi gelisimi için bir Dünya Saglik Örgütü tarafindan öncelikli olarak ele alinmaktadir. Farkli hastaliklardan olusan bir kompleks olan Laysmanya parazitleri, agir cilt hastaliklarinin yani sira iç organlarin ölümcül enfeksiyonlarina neden olur. Laysmanyazin en yikici biçimlerinden biri, burun ve agzin sekil bozucu bir enfeksiyonudur. Laysmanyaz vakalarinin sayisi artmaktadir ve birçok alanda kontrolden çikmistir. Laysmanyaz ayrica bazi gelismis ülkelerde, özellikle HlV enfeksiyonu sonucu olarak güney Avrupa'da da artmaktadir. Mevcut ilaçlar toksiktir, pahalidir ve günlük uzun süreli enjeksiyonlar gerektirir. Laysmanya, makrofajlarda veya immün sistemin beyaz kan hücrelerinde yasayan protozoan parazitlerdir. Parazitler, gezegenin çok genis bölgelerinde yasadiklari için kontrol edilmesi zor olan küçük kan emici böceklerin (kum sinekleri) isirmasiyla bulasir. Viseral Iaysmanyaz, hastaligin üç manifestasyonu arasindan en tehlikeli olanidir. Her yil yaklasik 500.000 yeni Viseral form vakasinin (kala-azar veya "ölüm hastaligi") oldugu tahmin edilmektedir. 200 milyondan fazla insanin Viseral Iaysmanyaz geçirme riski vardir. Viseral laysmanyaz vakalarinin yüzde 90'indan fazlasi Hindistan, Banglades, Sudan, Brezilya ve Nepal'de meydana gelmektedir. Ölümlerin çogu çocuklarda görülür. Kütanöz formlara sahip olanlar siklikla kalici olarak sekil degistirmeye birakilir. Laysmanya enfeksiyonlarinin teshis edilmesi güçtür ve tipik olarak doku biyopsi örneklerinin histopatolojik analizini içerir. Bununla birlikte, birkaç serolojik ve sartlandirilmis ortam üretmek için metabolik ürünleri kültür ortamina salgilarlar. Bu metabolik ürünler konaga immünojeniktir. Bkz. Schnur, L.F. ve ark., (1972) Isrl. J. Dünyadaki yaklasik 40 milyon insana AIDS'e neden olan virüs olan HIV bulasmaktadir. Her yil yaklasik 3 milyon insan hastaliktan ölmekte olup, bunlarin yüzde 95'i gelismekte olan dünyadadir. Her yil 5 milyona yakin insan HIV ile enfekte olmaktadir. Su anda, Sahra alti Afrika en yüksek hastalik yükünü tasimaktadir, ancak hastalik hizla Hindistan, Çin ve Rusya gibi diger ülkelere yayilmaktadir. Salgin, azinlik nüfuslari arasinda en hizli sekilde büyümektedir. Amerika Birlesik Devletleri'nde verimli yillarinda vurur. Kadinlar hem biyolojik hem de sosyal nedenlerden dolayi HIV/AIDS için artmis risk tasirlar. AIDS, vücudun bagisiklik sisteminin hücrelerini öldüren ve tahrip eden ve vücudun enfeksiyonlarla ve bazi kanserlerle savasma yetenegini kademeli olarak yok eden insan bagisiklik eksikligi virüsü (HIV) tarafindan kaynaklanir. HIV en çok, virüslü bir esle korunmasiz seks yaparak yayilir. Problemin en saglam çözümü virüsün yayilmasini önlemektir. Güvenli, etkili ve uygun maliyetli bir HIV asisi yapmak bu hedefe ulasmak için bir yoldur. Dünyada, HIV enfeksiyonu riski yüksek bes kisiden birinden daha azinin etkili bir sekilde korumaya erisimi vardir. Virüs kültürü, hasta örneklerinden tanimlanmis nükleik asit sekanslarinin PCR'si ve hasta serumlarinda anti-HIV antikorlarinin mevcudiyeti için antikor testleri de dahil olmak üzere HIV enfeksiyonlarinin teshisi için yöntemler bilinmektedir (bakiniz örnegin Burada açiklanan diger bazi uygulamalara göre, asi bilesimleri ve ilgili formülasyonlar ve kullanim yöntemleri, kanserlerin immünoterapötik tedavisi için faydali olabilecegi gibi, bir kanser hücresinden türetilmis bir antijen içerebilir. Örnegin, adjuvan formülasyonu, prostat, meme, kolorektal, akciger, pankreas, böbrek veya melanom kanserleri gibi tümör reddetme antijenleriyle fayda bulabilir. Örnek niteligindeki kanser veya kanser hücresinden türetilen antijenler arasinda MAGE 1, 3 ve MAGE 4 veya diger MAGE antijenleri, örnegin W099/40188, PRAME, BAGE, Lage (ayrica NY Eos 1 olarak da bilinir) SAGE ve HAGE (WO 99/53061) veya GAGE (Robbins and ark., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale ve ark. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, s. 293 belgelerinde tarif edilenler bulunur. Bu sinirlayici olmayan kanser antijen örnekleri, melanom, akciger karsinomu, sarkom ve mesane karsinomasi gibi çok çesitli tümör tiplerinde ifade edilir. Bakiniz, örnegin, ABD Patent No. 6,544,518. Diger tümöre özgü antijenler belirli mevcut olarak açiklanan uygulamalara göre GLA ile kullanima uygun olup, bunlarin arasinda sinirlandirma olmaksizin tümöre özgü veya tümörle iliskili gangliyozitler, örnegin GM2 ve GMs veya bunlarin tasiyici proteinlerle konjügatlari bulunur; veya bir anti-kanser bagisiklik yanitini saglamak veya gelistirmek için bir GLA asi bilesiminde kullanima yönelik bir antijen bir self peptit hormonu, örnegin tam boy gonadotropin hormonu salim hormonu (GnRH, WO 95/20600), birçok kanserin tedavisinde kullanisli olan bir kisa, 10 amino asit uzunlugunda peptit olabilir. Bir baska uygulamada, prostat antijenleri kullanilmakta olup, örnegin Prostata özgü antijen (PSA), PAP, PSCA (örn., Proc. Nat. Acad. Sci. 00/04149 olarak bilinen bir antijen kullanilir. Diger prostata özgü antijenler, WO Mevcut bulus baglaminda faydali baska tümörle iliskili antijenler sunlari içerir: Plu -1 (J Bioessays ve Criptin (ABD Pat. No. ,981,215). Ek olarak, kanser terapisindeki asilarla özellikle ilgili antijenler ayrica tirozinaz ve survivin içerir. Bir kanser antijeni içeren GLA içeren asi bilesimlerine iliskin burada açiklanan uygulamalar, HER-2/neu ifadesi veya diger kansere özgü veya kansere bagli antijenler gibi tümörle iliskili antijen ifadesi ile karakterize edilen herhangi bir kansere karsi yararli olacaktir. Kanser olan veya kanser riski oldugundan süphelenilen bir hastada kanserin teshisi teknikte kabul edilen çok çesitli metodolojilerle gerçeklestirilebilmekte olup, bunlar klinik sunum, kanserin ilerleme derecesi, kanser türü ve diger faktörleri içeren çesitli faktörlere bagli olarak degisiklik gösterebilir. Kanser teshisinin örnekleri arasinda, hasta numunelerinin histopatolojik, histositokimyasal, immünohistositokimyasal ve immünohistopatolojik incelenmesi (örn., kan, cilt biyopsi, diger doku biyopsi, cerrahi numuneler vb.), tanimli genetik isaretleyici (örn., nükleik asit) için PCR testleri, kanserle iliskili antijenlerin veya bu tür antijenleri tasiyan hücrelerin veya spesifikligi tanimli antikorlarin dolasimi için serolojik testler veya teknikte uzman kisilerin asina 211(7):18. Mevcut bulusun belirli uygulamalarina göre asi bilesimleri ve metotlari ayrica otoimmün hastaliklarin profilaksisinde veya terapisinde kullanilabilmekte olup, bunlarin arasinda, bir konagin veya hastanin bagisiklik sisteminin "self" dokularina, hücrelerine, biyomoleküllerine (örn., peptitler, polipeptitler, proteinler, glikoproteinler, lipoproteinler, proteolipitler, Iipitler, glikolipitler, nükleik asitler, örnegin RNA ve DNA, oligosakkaritler, polisakkaritler, proteoglikanlar, glikozaminoglikanlar veya benzerleri ve hastalarin hücreleri ve dokularinin diger moleküler bilesenleri) veya epitoplarina (örn., bir antikor degisken bölge tamamlayicilik belirleyici bölge (CDR) veya bir T hücre reseptörü CDR'si tarafindan tanimlananlar gibi spesifik immünolojik olarak tanimli tanima yapilari) karsi yöneltilmis bir bagisiklik yanitina zarar verici biçimde aracilik ettigi hastaliklar, rahatsizliklar veya bozukluklar bulunur. Bu nedenle, otoimmün hastaliklar, her iki durumda da normal otolog dokulara yöneltilmis olan hücreleri veya antikorlari içeren anormal bir bagisiklik tepkisi ile karakterize edilir. Memelilerdeki otoimmün hastaliklar genellikle iki farkli kategoriden birinde siniflandirilabilir: hücre aracili hastalik (yani T hücresi) veya antikor aracili bozukluklar. Hücre aracili otoimmün hastaliklarin sinirlayici olmayan örnekleri arasinda multipl skleroz, romatoid artrit, Hashimoto tiroiditi, tip I diabetes mellitus (Juvenil baslangiçli diyabet) ve otoimmün üvoretinit bulunur. Antikor aracili otoimmün bozukluklarin örnekleri arasinda, sinirlandirma olmaksizin, miyastenya gravis, sistemik lupus eritematoz (veya SLE), Graves hastaligi, otoimmün hemolitik anemi, otoimmün trombositopeni, otoimmün astim, kriyoglobülinemi, trombik trombositopenik purpura, birincil biliyer skleroz ve pernisiyöz anemi bulunur. Sistemik lupus eritematoz ile iliskili olan antijen veya antijenler küçük çekirdekli ribonükleik asit proteinleri (snRNP) olup; Graves hastaligi tirotropin reseptörü, tiroid epitelyal hücrelerin tiroglobülin ve diger bilesenleridir (Akamizu ve ark., 1996; Kellerman ve ark., 1995; Raju ve ark., 1997; ve Texier ve ark., 1992); pemfigus kaderin benzeri pemfigus antijenleri, örnegin desmoglein 3 ve diger adezyon molekülleridir (Memar ve ark., trombositopenik purpura trombosit antijenleridir (bkz, örn., US Patent 6,929,796; Gorski ve ark. (Eds.), Autoimmunity, 2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA; Radbruch and Lipsky, P.E. (Eds.) Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Otoimmünite, tip 1 diyabet, multipl skleroz, Iupus, romatoid artrit, skleroderma ve tiroid hastaliklari dahil olmak üzere 80'den fazla farkli hastalikta rol oynar. Otoimmün hastaliklarin çogu için kuvvetli nicel morbidite tahminleri eksiktir. 1990'Iarin sonlarinda yapilan son arastirmalar, otoimmün hastaliklarin, Amerika Birlesik Devletleri'nde en yaygin üçüncü büyük hastalik oldugunu ortaya koymaktadir; ve en yaygin otoimmün hastaliklar 8.5 milyondan fazla Amerikaliyi etkilemektedir. Hastalik prevalansina dair güncel tahminler, Birlesik Devletler nüfusunun yüzde 5 ila 8'i arasinda degismektedir. Otoimmün hastaliklarin çogu orantisiz olarak kadinlari etkiler. Kadinlarin otoimmün bir hastalik geçirmesi erkeklerden 2.7 kat daha olasidir. Kadinlar otoimmün hastaliklara karsi daha hassastir; erkeklerin kadinlardan daha yüksek düzeyde dogal öldürücü hücre aktivitesi oldugu görülmektedir (Jacobsen ve ark., Clinical Immunology and Otoimmün hastaliklar, bagisiklik sistemi kendi kendine dokulari özümsemedigi ve uygunsuz bir saldiri düzenledigi zaman meydana gelir. Vücut, örnegin bagirsak (Crohn hastaligi) ve beyin (multipl skleroz) dahil olmak üzere otoimmün hastaliklardan farkli sekillerde etkilenebilir. Bir otoantikorun, fonksiyonlarini zedelemek için kendi hücrelerine veya kendi dokularina saldirdigi ve bunun bir sonucu olarak otoimmün hastaliklara neden oldugu ve otoantikorun, bir otoimmün hastaligin gerçek olusumundan önce hastanin serumunda tespit edilebilecegi bilinmektedir (örnegin, görünüm klinik belirti ve bulgularin ortaya çikisi). Bir otoantikorun saptanmasi bu nedenle bir otoimmün hastaligin erken kesfedilmesine veya varliginin veya gelisme riskinin taninmasina olanak tanir. Bu bulgulara dayali olarak, otoantijenlere karsi çesitli otoantikorlar kesfedilmistir ve otoantijenlere karsi otoantikorlar klinik testlerde otoimmün teshisler iliskin bir metabolitin (örn., ABD Pat. No. 4,659,659) veya içerebilir. Bazi uygulamalarda, bulusun bilesimleri, böbrek diyalizindeki hastalar, kemoterapi ve/veya radyasyon terapisindeki hastalar, transplant alicilari ve benzerleri dahil olmak üzere, yasli ve/veya immün baskilanmis hastalarda özellikle uygulanabilir. Bu tür bireyler genellikle asilara karsi azalan bagisiklik tepkileri gösterir ve bu nedenle bulusa ait bilesimlerin kullanimi, bu hastalarda elde edilen bagisiklik tepkilerini artirabilir. Diger uygulamalarda, mevcut bulusun bilesimlerinde kullanilan antijen veya antijenler solunum hastaliklariyla iliskili antijenleri, örnegin bakteriyel enfeksiyondan kaynaklanan veya bunlarla siddetlenenleri (örn., pnömokokal), kronik obstrüktif akciger hastaligi (COPD) gibi rahatsizliklarin profilaksisi ve terapisi amaciyla içerir. COPD kronik bronsit ve/veya amfizemli hastalarda geri dönüsümsüz veya kismen geri dönüsümlü solunum yollari tikanikliginin bulunmasiyla fizyolojik olarak tanimlanir (Am genellikle bakteriyel (örn. pnömokokal) enfeksiyondan kaynaklanir (Clin Microbiol Burada tarif edildigi gibi, mevcut bulusun bazi uygulamalari, bir veya daha fazla TolI benzeri reseptör agonisti (TLR agonisti) içeren farmasötik bilesimler dahil olmak üzere asi bilesimlerini ve immünolojik adjuvan bilesimlerini ele alir. ToII-benzeri reseptörler (TLR), dogustan bagisiklik sisteminin, çok sayida enfeksiyöz patojende veya bunlarin üzerinde bulunabilecek olan çesitli korunumlu mikrobiyal moleküler yapilar için konak hücrelere erken faz tanima yetenegi saglayan hücre yüzeyi transmembran reseptörlerini içerir (örn., Armant ve ark., 2002 Genome Biol. Dogustan gelen bagisiklik sistemi yoluyla bagisiklik yanitlarinin baslatilmasini güçlendirmek için TLR aracili sinyal aktariminin uyarilmasi, hücre yüzeyi TLR'sini tutan TLR agonistleri tarafindan gerçeklestirilebilir. Örnegin, Iipopolisakkarit (LPS) TLR2 veya TLR4 vasitasiyla bir TLR agonisti olabilir (Tsan ve ark., 2004 J. Leuk. Biol. Shock 24:206); poli(inozin-sitidin) (poIiI:C) TLR3 vasitasiyla bir TLR agonisti olabilir sitozin-guanozin veya "CpG" dinükleotit motifleri içeren oligodeoksinükleotitler, örn., Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer ve ark. Expert Opinion on Biological peptidoglikanlar TLR2 ve/veya TLR6 agonistleri olabilir (Soboll ve ark., 2006 Biol. nol hidrat, Mol. Wt. 318 Da from 3M Pharmaceuticals, St. Paul, MN, bu da ayrica iliskin ve/veya bir TLR8 agonisti olabilir (Johansen 2005); flagellin bir TLR5 agonisti olabilir (Feuillet ve ark., ; ve hepatit C antijenleri TLR7 ve/veya TLR9 vasitasiyla TLR agonistleri olarak etki edebilir (Lee ve ark., 2006 Proc. mevcut tarif edilen uygulamalarin bazilarina göre kullanilabilir. Örnegin ve arkaplan vasitasiyla (bkz., örn., US Patent No. 6,544,518), metillesmemis CpG dinükleotitleri ("CpG") içeren immünostimülatör oligonükleotitler hem sistemik hem de mukozal yollarla uygulandiginda adjuvanlar olarak bilinirler (WO 96/02555, EP motiflerinin kisaltmasidir. CG motifinin immünostimülasyondaki merkezi rolü Krieg, sekans baglaminda olmasi gerektigini ve bu tür sekanslarin bakteriyel DNA'da yaygin oldugunu, ancak omurgali DNA'sinda nadir oldugunu göstermistir. Immünostimülatör sekans genellikle: Purin, Purin, C, G, pirimidin, pirimidin olup; Içerisinde dinükleotid CG motifi metillenmemistir, ancak diger metillenmemis CpG sekanslarinin immünostimülatör oldugu bilinmektedir ve mevcut bulusun bazi uygulamalarinda kullanilabilir. CpG, asilar halinde formüle edildiginde, serbest antijen ile birlikte serbest çözelti içinde uygulanabilir (WO 96102555; McCluskie ve Davis, supra) veya bir antijene kovalent olarak konjuge edilebilir (PCT Yayini No. WO 98/16247) veya alüminyum hidroksit gibi bir tasiyici ile formüle edilebilir (örnegin, Davis ve ark., supra, Mevcut bulusun adjuvanlarinda veya asilarinda kullanim için tercih edilen oligonükleotitler, tercihen en az üç, daha tercihen en az alti veya daha fazla nükleotit ile ayrilmis iki veya daha fazla dinükleotit CpG motifi içerir. Bu bulusun oligonükleotitleri tipik olarak deoksinükleotitlerdir. Tercih edilen bir uygulamada, oligonükleotid içindeki internükleotit, fosforodidiyoat veya daha fazla tercihen bir fosforotiyoat bagi olup, bununla birlikte, fosfodiester ve diger internükleotit baglari. karisik internükleotit baglantilarina sahip oligonükleotitler dahil olmak üzere, bulus kapsamindadir. Fosforotiyoat oligonükleotitlerin veya fosforoditiyoatin üretilmesi için edilmektedir. Tercih edilen oligonükleotitlerin örnekleri, asagidaki yayinlarda açiklanan sekanslara sahip olup; burada açiklanan bazi uygulamalar için sekanslar tercihen fosforotiyoat ile degistirilmis internükleotit baglantilarini içerir: CPG 7909: Cooper ve ark., "CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults." AIDS, 2005 Sep CpG 10101: Bayes ve ark., "Gateways to clinical trials." Methods Find. Exp. Clin. Vollmer J., "Progress in drug development of immunostimula-tory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9." Alternatif CpG oligonükleotitleri, yukarida belirtilen yayinlarda tarif edilen tercih edilen sekanslarin, bunlara esit olmayan nükleotit sekansi ornatimlari, eklemeleri, silinmeleri ve/veya ilavelerine sahip olmalari bakimindan farkli olan varyantlarini içerebilir. Bu bulusun bazi uygulamalarinda kullanilan CpG oligonükleotitleri, teknikte bilinen herhangi bir yöntemle sentezlenebilir (örnegin, EP 468520). Uygun olarak, bu oligonükleotitler, bir otomatiklestirilmis sentezleyici kullanilarak sentezlenebilir. Oligonükleotitler tipik olarak deoksinükleotitlerdir. Tercih edilen bir uygulamada, oligonükleotiddeki internükleotid bagi, fosforoditiyoat veya daha çok tercih edildigi haliyle fosforotiyoat bagi olup, bununla birlikte, fosfodiesterler, hali hazirda tasarlanan uygulamalarin kapsami dahilindedir. Farkli internükleotit baglari içeren Oligonükleotitler de düsünülmekte olup, örnegin, karisik fosforotiyoat fosfodiesterleri tasarlanir. Oligonükleotidi stabilize eden diger internükleotit baglari da kullanilabilir. Es-ad'iuvan Burada saglanan bazi uygulamalar arasinda, GLA'ya ek olarak, adjuvan aktivitesine sahip olan, ancak bu gibi bilesimlerin bir bilesenini gösteren, GLA disinda en az bir yardimci adjuvan içeren farmasötik bilesimler dahil asi bilesimleri ve immünolojik adjuvan bilesimleri bulunur. Bu tür adjuvan aktiviteye sahip bir ko-adjuvan, bir hastaya, örnegin bir insan (örn., bir insan hasta), bir insan disi primat, bir memeli veya bilinen bir bagisiklik sistemi olan bir baska yüksek ökaryotik organizmaya uygulandiginda bagisiklik yanitinin potansisini ve/veya uzun ömürlülügünü degistirebilir (yani, istatistiksel olarak anlamli bir sekilde arttirabilir veya azaltabilir ve belirli tercih edilen uygulamalarda, gelistirebilir veya arttirabilir) (bkz, örn., Powell and Newman, "Vaccine design - The Subunit and Adjuvant Approach", 1995, Plenum Press, New York). Burada açiklanan belirli uygulamalarda, GLA ve istenen bir antijen ve istege bagli olarak bir veya daha fazla ko-adjuvan böylece, GLA ile ayni anda uygulanabilecek olan veya uygulanma zamani ve/veya yeri (örn., farkli bir anatomik bölgede) bakimindan ayrilabilecek olan istenen antijene karsi yöneltilmis bir bagisiklik yanitini degistirebilir, örn. saglayabilir veya gelistirebilir; ancak mevcut bulusun belirli uygulamalarinin bununla sinirlandirilmamasi amaçlanmistir ve bu nedenle ayrica GLA'nin belirli bir antijeni içermeyen ancak bir TLR agonisti, bir ko-adjuvan, bir imidazokinolin bagisiklik yaniti modifiye edici ve bir çift köklü ilmek bagisiklik modifiye ediciden (dSLIM) birini içerebilecek olan bir bilesimde uygulanmasi da düsünülmüstür. Buna göre ve yukarida belirtildigi gibi, ko-adjuvanlar GLA'dan baska adjuvan etkileri olan, örnegin saponinler ve saponin mimetikleri, örnegin QS21 ve Q821 mimetikleri alkaloidleri, örnegin tomatin, deterjanlar, örnegin (sinirlandirma olmaksizin) saponin, polisorbat 80, Span85 ve stearil tirozin, bir veya daha fazla sitokin (örn., GM-CSF, edicisi ve bir çift kök ilmek bagisiklik modifiye edicisi (dSLIM, örn., Weer-atna ve ark., Saponinleri içeren deterjanlar, örn., US Patent 6,544,518; LacailIe-Dubois, M and ögretilmektedir. Quil A'nin (saponin) fraksiyonlarini içeren immün uyarici kompleksler (ISCOMS) olarak adlandirilan parçacikli yapilar hemolitiktir ve asilarin imalatinda kullanilagelmistir (Morein, B., EP O . Bu yapilarin adjuvan aktiviteye sahip QS17 (Quil A'nin HPLC ile saflastirilmis fraksiyonlari), güçlü sistemik adjuvanlar ABD Patentlerinde anlatilmistir. Bu referanslarda ayrica, sistemik asilar için güçlü bir adjuvan görevi gören QS7'nin (Quil-A'nin hemolitik olmayan bir fraksiyonu) kullanimi açiklanmaktadir. Q821'in kullanimi ayrica, Kensil ve ark. tarafindan tarif edilmektedir açiklanmaktadir. Sistemik asilama çalismalarinda kullanilan diger saponinler, Gypsophila ve Saponaria gibi diger bitki türlerinden elde edilenleri içerir (Bomford ve Escin, burada açiklanan uygulamalarin adjuvan bilesimlerinde kullanim için saponinlerle ilgili baska bir deterjandir. Escin, Merck indeksinde (12. Baski: giris 3737), Aesculus hippocastanum at kestanesi agacinin tohumunda olusan bir saponin karisimi olarak tanimlanmaktadir. Bunun izolasyonu kromatografi ve saflastirma (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) ve iyon degisimi reçineleriyle tarif edilmistir (Erbring ve ark., ABD Pat. No. 3,238,190). Escin fraksiyonlarinin (ayni zamanda aescin olarak da bilinir) saflastirilmis ve biyolojik olarak aktif olduklari gösterilmistir (Yoshikawa M, ve ark. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Agustos; 44(8): 3204) bir saponin olarak tarif edilmistir ve Digitalis purpurea tohumlarindan türetilir ve Gisvold ve ark., J. Am. Pharm.Assoc., 1934, 23, 664; ve Rubenstroth-Bauer, Physiol. Burada açiklanan bazi uygulamalara göre kullanim için es-adjuvan maddeler arasinda, ilgili teknikte bulunanlarin asina olacagi bir polimerik bilesikler sinifina atifta bulunan bir blok ko-polimer veya biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer bulunur. Bir GLA asi bilesimine veya bir GLA immünolojik adjuvanina dahil edilebilecek olan bir blok kopolimer veya biyolojik olarak parçalanabilen polimerin örnekleri arasinda Pluronic® L121 (BASF Corp., Mount Olive, NJ; bkz., örn., Yeh ve ark., 1996 Pharm. Canc. Res. , poli-(D,L-Iaktit-k0-glikolit) (PLG) ve poIiI:C bulunur (bkz., örn., Powell and Newman, Bazi uygulamalar, GLA asilarini ve bu gibi bazi uygulamalarda es-adjuvan aktiviteye katkida bulunabilecek bir yag içeren GLA immünolojik adjuvanlari ve ilave olarak veya alternatif olarak farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya eksipiyan saglayabilir. Herhangi bir sayida uygun yag bilinmektedir ve bu tarifnameye dayanarak asi bilesimlerine ve immünolojik adjuvan bilesimlerine dahil edilmek üzere seçilebilir. Bu yaglarin örnekleri, açiklama amaciyla ve sinirlama olmaksizin, skualen, skualan, mineral yag, zeytinyagi, kolesterol ve bir mannit monooleati içerir. Imidazokinolin immün yanit modifiye edicileri gibi immün yanit degistiricileri de teknikte bilinir ve hali hazirda tarif edilen bazi uygulamalarda yardimci adjuvanlar olarak dahil edilebilir. Belirli tercih edilen imidazokinolin bagisiklik yaniti modifiye edicileri arasinda, sinirlandirici olmayan örnekleme yoluyla, resikuimod (R848), imikuimod ve bunlar ve diger imidazokinolin bagisiklik yaniti modifiye edicileri, uygun kosullar altinda ayrica burada tarif edilen sekilde TLR agonist aktiviteye sahiptir. Diger immün yanit modifiye ediciler, nükleik asit bazli çift kök halkali immün modifiye edicilerdir (dSLIM). Hali hazirda açiklanan uygulamalarin bazilarinda kullanim için tasarlanan dSLIM'in spesifik örnekleri, Schmidt ve ark., 2006 Allergy 61:56; Weihrauch ve ark. (Editor). John Wiley & Sons, 6 Aralik , ve Mologen AG (Berlin, FRG: [internetten alinma tarihi: 8/18/06, adresi: http://www.moIo-gen.com/English/04.20-dSLlM.shtml] belgelerinde bulunabilir. Yukarida da belirtildigi gibi, burada tarif edilen sekilde GLA ile kullanim için bir tür es adjuvan, genellikle "alum" olarak adlandirilan alüminyum es adjuvanlari olabilir. Alum es adjuvanlari asagidakilere dayanir: alüminyum oksi-hidroksit; alüminyum hidroksifosfoat; veya çesitli propriyete tuzlar. Alum es adjuvanlari kullanan asilar, tetanoz suslari, HPV, hepatit A, etkisizlestirilmis çocuk felci virüsü ve burada tarif edilen diger antijenler için asilari içerebilir. Alum es adjuvanlari avantajlidir çünkü iyi bir güvenlik siciline sahiptir, antikor tepkilerini arttirir, antijenleri stabilize ederler ve büyük ölçekli üretim için nispeten basittirler (Edelman 2002 Mol. Biotechnol. Etkili bagisiklik uyarimi için GLA ile birlestirilebilecek diger yardimci maddeler arasinda, Q821 ve benzer etkileri veren ve burada Q821 mimetikleri olarak adlandirilan yapisal olarak ilgili bilesikler de dahil olmak üzere saponin ve saponin mimetikleri bulunur. Q821 tercih edilen bir yardimci madde olarak kabul edilmistir. Q821, Quillaja Saponaria Molina'nin kabugundan türetilmis bir HPLC ile saflastirilmis (Stockholm, Isveç) ve CSL Ltd.'den (Parkville, Victoria, Avustralya) alinabilecek olan Rekombinant Ifade Yapisi Burada açiklanan bazi uygulamalara göre, GLA asi bilesimi, bir antijeni kodlayan bir nükleik asit sekansina islevsel olarak baglanmis bir promotör içeren en az bir rekombinant ifade yapisi içerebilir. Bazi baska uygulamalarda, rekombinant ifade yapisi, bir adenovirüs, adeno-iliskili virüs, herpes virüsü, lentivirüs, poksvirüs veya retrovirüs vektörü gibi bir viral vektörde bulunur. Bu tür ifade yapilarini ve vektörleri yapmaya ve kullanmaya yönelik bilesimler ve metotlar teknikte, burada saglanan polipeptit antijenlerinin ifadesi için, örnegin Ausubel ve ark., (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 2006 John Wiley & Sons, NY belgesinde tarif edilen sekilde bilinmektedir. Rekombinant ifade yapilarinin sinirlandirici olmayan örnekleri genellikle olup, belirli mevcut olarak açiklanan uygulamalarda kullanilmak üzere burada saglanan polipeptit antijenlerinin ifadesine uyarlanabilecek ögretiler bulunur. Bagisiklik Yaniti Mevcut bulus bu nedenle bir bagisiklik yaniti saglayabilecek olan bir konakta bagisiklik yanitlarini degistirmeye (yani, teknikte uzman kisilerin asina olacagi sekilde uygun bir kontrole göre istatistiksel olarak anlamli bir sekilde arttirma veya azaltma) yönelik bilesimler saglar. Teknikte siradan uzmanliga sahip kisilerce bilinecegi gibi, bir immün yanit, konagin bagisiklik durumunun korunmasina ve/veya düzenlenmesine katilan bir veya daha fazla doku, organ, hücre veya molekülün yapisinda veya fonksiyonunda herhangi bir degisikligi içerebilen bir konagin immün durumunun herhangi bir aktif degisikligi olabilir. Tipik olarak, bagisiklik yanitlari çesitli iyi bilinen parametrelerden herhangi biriyle saptanabilecek olup, örnegin, sinirlandirma olmaksizin, çözünür immünoglobülinler veya antikorlar; çözünür mediyatörler, örnegin sitokinler, lenfokinler, kemokinler, hormonlar, büyüme faktörleri ve benzerleri ve ayni zamanda diger çözünür küçük peptit, karbohidrat, nükleotit ve/veya Iipit mediyatörleri; bagisiklik sistemi hücrelerinin fonksiyonel veya yapisal özelliklerinin degismesiyle, örnegin hücre proliferasyonu, degisen motilite, spesifik gen ifadesi veya sitolitik davranis gibi özel aktivitelerin indüklenmesi; bagisiklik sistemi hücreleri tarafindan hücresel farklilasma, örnegin degisen yüzey antijeni ifade profilleri veya apoptoz baslangici (programlanmis hücre ölümü); veya bir bagisiklik yanitinin mevcut oldugunun saptanabilecegi herhangi bir baska kriterin in vivo veya in vitro olarak belirlenmesini içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Immün yanitlar genellikle, örnegin, bir konakçinin bagisiklik sisteminin hücreleri ve dokulari tarafindan kendi kendine ve kendi kendine olmayan yapilar arasinda moleküler ve hücresel seviyelerde hücreler tarafindan yapilan ayrimcilik olarak kabul edilebilir, fakat bulus bununla sinirli olmamalidir. Örnegin, bagisiklik yanitlari ayrica bagisiklik sistemi bilesenlerinin tipik düzenlenmesi gibi çesitli sayida normal durumun birlikte görülebilecegi veya otoimmün ve dejeneratif hastaliklarda gözlenen uygun olmayan otoimmün yanitlar gibi patolojik rahatsizliklarda bulunabilecek olan self moleküllerin, hücrelerin veya dokularin bagisiklik tanimasindan kaynaklanan bagisiklik sistemi durumu degisikliklerini de içerebilir. Bir baska örnek olarak, belirli bagisiklik sistemi aktivitelerinin (örnegin, antikor ve/veya sitokin üretimi veya hücre aracili bagisiklik aktivasyonu) yukari regülasyonunun indüksiyonunun yani sira, bagisiklik yanitlari ayrica seçilen antijen, antijen uygulama yolu, spesifik tolerans indüksiyonu veya diger faktörlerin sonucu olabilecek olan saptanabilir bagisikligin baskilanmasi, hafifletilmesi veya herhangi bir baska asagi regülasyonunu da içerebilir. Mevcut bulusa ait asilar tarafindan bir immün yanitin uyarilmasinin belirlenmesi, teknikte siradan uzmanliga sahip kisilerin kolayca asina olacagi iyi bilinen bir dizi immünolojik tahlilden herhangi biri ile belirlenebilir. Bu tür deneyler örnegin, sinirlandirma olmaksizin, çözünür antikorlar; çözünür mediyatörler, örnegin sitokinler, lenfokinler, kemokinler, hormonlar, büyüme faktörleri ve benzerleri ve ayni zamanda diger çözünür küçük peptit, karbohidrat, nükleotit ve/veya lipit mediyatörleri; bagisiklik sistemi hücrelerinin fonksiyonel veya yapisal özelliklerinin degismesiyle, örnegin hücre proliferasyonu, degisen motilite, spesifik gen ifadesi veya sitolitik davranis gibi özel aktivitelerin indüklenmesi; bagisiklik sistemi hücreleri tarafindan hücresel farklilasma, örnegin degisen yüzey antijeni ifade profilleri veya apoptoz baslangicinin (programlanmis hücre ölümü) belirlenmesini içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Bu ve benzeri deneylerin gerçeklestirilmesi için prosedürler yaygin olarak bilinir ve örnegin Lefkovits'te bulunabilir (lmmunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998; bkz. ayrica, Current Protocols iri lmmunology; bkz. ayrica, örn., Weir, Handbook of Experimental lmmunology, 1986 Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular lmmunology, 1979 buralarda belirtilen referanslar). Antijen-reaktif T hücrelerinin çogalmasinin tespiti, bilinen çesitli tekniklerle gerçeklestirilebilir. Örnegin, T hücresi proliferasyonu DNA sentezinin ölçülmesiyle saptanabilir ve antijen spesifikligi, aday antijen-reaktif T hücrelerinin maruz birakildigi uyaricilarin (örnegin, spesifik bir istenen antijen- veya bir kontrol antijeniyle darbeli antijen sunan hücreler) kontrol edilmesiyle belirlenebilir. Çogalmasi için uyarilmis olan T hücreleri, artan bir DNA sentezi hizi sergiler. DNA sentezi hizini ölçmenin tipik bir yolu, örnegin, yeni sentezlenen DNA içine dahil edilmis bir nükleozit öncülü olan tritiye timidin ile T hücrelerinin puls etiketleme kültürleridir. Dahil edilen tritiye timidin miktari, bir sivi sintilasyon spektrofotometresi kullanilarak belirlenebilir. T hücre proliferasyonunu saptamanin diger yollari interlökin-2 (IL-2) üretimindeki, Ca2+ akisindaki veya boya alimindaki, örnegin 3-(4,5-dimetiltiyazoI-2-iI)-2,5-difeniI-tetrazolyum artislarinin ölçülmesini içerir. Alternatif olarak, Ienfokinlerin (interferon-gama gibi) sentezi ölçülebilir veya belirli bir antijene yanit verebilecek T hücrelerinin göreli sayisi ölçülebilir. Antijene özgü antikor üretiminin saptanmasi, örnegin, radyoimmün analiz (RlA), enzime bagli bagisiklik deneyi (ELISA), denge diyaliz veya kati faz immünolekeleme, örnegin Western blot gibi in vitro metodolojiler kullanilarak mevcut bulusa göre bir asiyla tedavi edilen bir konaktan bir numunenin (örn., bir immünoglobülin içeren numune, örnegin serum, plazma veya kan) deneye tabi tutulmasiyla gerçeklestirilebilir. Tercih edilen uygulamalarda ELlSA tahlilleri ayrica hedef antijenin antijen yakalayici immobilizasyonunu, örnegin tahlilin hassasiyetini arttirmak için antijene özgü bir kati faz monoklonal antikoru içerebilir. Çözünür mediyatörlerin (örn., sitokinler, kemokinler, lenfokinler, prostaglandinler vb.) ayrintilandirilmasi ayrica enzime bagli bagisiklik deneyi (ELISA) ile, örnegin ticari kaynaklardan (örn., Sigma, St. Louis, MO; bkz. ayrica R & D Systems 2006 Catalog, R & D Systems, Minneapolis, MN) kolaylikla alinabilecek olan metotlar, aparatlar ve ayiraçlar kullanilarak kolaylikla belirlenebilir. Herhangi bir sayida baska immünolojik parametre, teknik alanda iyi bilinen rutin deneyler kullanilarak izlenebilir. Bunlar örnegin antikora bagimli hücre aracili sitotoksisite (ADCC) deneylerini, ikincil in vitro antikor yanitlarini, iyi bilinen isaretleyici antijen sistemleri, immünohistokimya veya diger iliskin sistemler kullanilarak çesitli periferal kan veya lenfoid tek çekirdekli hücre alt popülasyonlarinin akis immünositofloi'imetrik analizini içerebilir. Bu ve diger tahliller, örnegin, Rose ve ark. (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunolog, 5th Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DC belgesinde bulunabilir. Buna göre, burada saglanan asi ve adjuvan bilesimlerinin bir konakta bir TH1 tipi T antikor yaniti, bir sitokin yaniti, bir Ienfokin yaniti, bir kemokin yaniti ve bir inflamatuvar yanit arasindan seçilen en az bir bagisiklik yanitini saglayabilecegi veya gelistirebilecegi düsünülmektedir. Belirli uygulamalarda, bagisiklik yaniti, içerisinde sitokinin interferon-gama (IFN-y), tümör nekröz faktörü-alfa (TNF-oi) arasindan seçildigi bir ya da çoklu sayida sitokinin üretimi, içerisinde interlökinin IL-1, IL-2, IL-3, çoklu sayida interlökinin üretimi, içerisinde kemokinin MIP-1a, MlP-1 p, RANTES, CCL4 ve CCL5 arasindan seçildigi bir ya da çoklu sayida kemokinin üretiminden en az birini ve bir bellek T hücresi yaniti, bir bellek B hücresi yaniti, bir efektör T hücresi yaniti, bir sitotoksik T hücresi yaniti ve bir efektör B hücresi yaniti arasindan seçilen bir Farmasötik Bilesimler Burada, burada tarif edilen su içinde yag emülsiyonlarini içeren bilesimler (farmasötik bilesimler dahil) saglanmaktadir. Bazi uygulamalarda, bilesim ayrica farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici, eksipiyan veya seyreltici içerir. Bazi uygulamalarda, farmasötik bilesim bir asi bilesimidir. Burada tarif edilen bilesimler, hastada bir immün yaniti (spesifik olmayan yanit ve antijene özgü yanit dahil) uyarmak için bir hastaya uygulanabilir. Bazi uygulamalarda, hasta bir memelidir (örn., çiftlik hayvanlari (inekler, domuzlar, keçiler, atlar vb.) ve evcil hayvanlar (kediler, köpekler vb.) veya bir insani içerir). Bazi uygulamalarda, hasta sicak kanli bir hayvandir. Farmasötik bilesimler genellikle GLA (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL'den alinabilir; ürün numarasi 699800) içerebilir ve ayrica burada saglanan sekilde antijen, TLR agonisti, ko-adjuvan (örnegin, istege bagli olarak bir sitokin, bir imidazokinolin bagisiklik yaniti modifiye edici ve/veya bir dSLIM) ve/veya bir rekombinant Ifade yapisini, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici, eksipiyan veya seyreltici ile kombinasyon halinde içerir. Bu nedenle, belirli yönlerde, mevcut bulus GLA "m0n0terapi"sine çekilmekte olup, içerisinde GLA, burada tarif edilen sekilde, büyük ölçüde diger antijenleri içermeyen bir emülsiyon halinde formüle edilir ve bir hastalik veya baska rahatsizligi, örnegin bir organizma ile enfeksiyonu tedavi etmek veya önlemek amaciyla bir bagisiklik yanitini, örnegin bir spesifik olmayan bagisiklik yanitini stimüle etmek üzere bir hastaya uygulanir. Bir uygulamada, örnegin, bulusun bilesimleri ve yöntemleri, bir denekte bir immün tepkisini uyarmak için monofosforile edilmis bir disakarit kullanir. Baska bir özel uygulamada, bilesimler ve yöntemler, bir denekte bir immün yaniti uyarmak için Lipit A'nin bir 2-mon0asil formunu kullanir. Bir baska özel uygulamada, GLA istege bagli olarak bir kit içinde saglanan bir sprey formundadir. GLA tercihen burada tarif edildigi gibi kararli bir emülsiyon halinde formüle edilebilir. Özel bir uygulamada, örnegin, büyük ölçüde diger antijenlerden yoksun olan kararli bir emülsiyon içinde bir lipit A türevini içeren bir bilesim saglanmaktadir. Bir baska özel uygulamada, 2-amin pozisyonunun bir tek asil zincirine sahip oldugu ve diger antijenlerden büyük ölçüde yoksun olan, memelilerde kullanilmaya uygun, 3-asillenmis monofosforile edilmis lipit A türevini içeren bir bilesim saglanmaktadir. Belirli baska uygulamalarda, farmasötik bilesim bir asi bilesimi olup, hem GLA hem de bir antijen içerir ve ayrica, burada saglanan sekilde TLR agonisti, ko-adjuvan (örnegin, bir sitokin, bir imidazokinolin bagisiklik yaniti modifiye edicisi ve/veya bir dSLlM) ve benzerleri ve/veya bir rekombinant ifade yapisi arasindan seçilen bir veya daha fazla bileseni, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici, eksipiyan veya seyreltici ile kombinasyon halinde içerebilir. Örnek tasiyicilar, alicilar için, kullanilan dozajlarda ve konsantrasyonlarda toksik olmayacaktir. GLA-arti-nükleik asit bazli asilar için veya GLA arti bir antijen içeren asilar için, yaklasik 0.01 mg/kg ila yaklasik 100 mg/kg vücut agirligi, tipik olarak intradermal, subkütan, intramüsküler veya intravenöz veya diger yollarla yolla uygulanir. Tercih edilen bir dozaj, yaklasik 1 mg/kg ila yaklasik 1 mg/kg olup, yaklasik 5 mg/kg ila yaklasik 200 mg/kg özellikle tercih edilir. Teknikte uzman kisilerce takdir edilecegi üzere, verilis sayisinin ve sikliginin konagin tepkisine bagli olacagi açiktir. Terapötik kullanim için "farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar" farmasötik tekniginde iyi bilinir ve örnegin Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985) belgesinde tarif edilmektedir. Örnegin, fizyolojik pH'ta steril salin ve fosfat tamponlu salin kullanilabilir. Koruyucular, stabilizörler, boyalar ve hatta lezzet verici ajanlar farmasötik bilesimde saglanabilir. Örnegin, sodyum benzoat, sorbik asit ve p-hidroksibenzoik asit esterleri koruyucu olarak eklenebilir. Id. 1449. Ek olarak, antioksidanlar ve süspanse edici ajanlar kullanilabilir. ld. inorganik asidin (asit ilaveli tuzlar) veya bir organik veya inorganik bazin (baz ilaveli tuzlar) kombinasyonundan türetilen, mevcut bulusa ait bilesiklerin tuzlarini belirtir. Bu bulusun bilesimleri, serbest baz veya tuz formlarinda kullanilabilmekte olup; her iki form da mevcut bulusun kapsami dahilindedir. Farmasötik bilesimler, bilesimin bir hastaya uygulanmasina izin veren herhangi bir biçimde olabilir. Örnegin, bilesim kati, sivi veya gaz seklinde (aerosol) olabilir. Tipik uygulama yollari arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, oral, topikal, parenteral (örnegin, dilalti veya bukal), dilalti, rektal, vajinal ve intranazal (örn., bir sprey olarak) bulunur. Parenteral terimi, burada kullanildigi sekliyle iyontoforetik (örn., US intravenöz, intramusküler, intrasternal, intrakavernöz, intratekal, intrameatal, intraüretral enjeksiyonu veya infüzyon tekniklerini içerir. Belirli bir uygulamada, burada tarif edilen bir bilesim (asi ve farmasötik bilesimler dahil), iyontoforez, mikro kavitasyon, sonoforez veya mikroignelerden seçilen bir teknikle intradermal olarak uygulanir. Farmasötik bilesim, içinde bulunan aktif bilesenlerin, bilesimin bir hastaya uygulanmasiyla birlikte biyolojik olarak kullanilabilir hale gelmesini saglayacak sekilde formüle edilir. Bir hastaya uygulanacak olan bilesimler bir ya da daha fazla dozaj birimi biçimini alabilmekte olup, içerisinde, örnegin, bir tablet bir tekli dozaj birimi olabilir ve mevcut bulusun bir veya daha fazla bilesiginin aerosol biçimindeki bir kabi çoklu sayida dozaj birimleri tasiyabilir. Agizdan uygulama için, bir yardimci madde ve/veya baglayici mevcut olabilir. Örnekler sükroz, kaolin, gliserin, nisasta dekstrinler, sodyum aljinat, karboksimetilselüloz ve etil selülozdur. Renklendirici ve/veya lezzet verici ajanlar mevcut olabilir. Bir kaplama kabugu kullanilabilir. Bilesim bir sivi, örnegin bir iksir, surup, çözelti, emülsiyon veya süspansiyon formunda olabilir. Sivi, örnek olarak oral uygulama için ya da enjeksiyon yoluyla dagitim için olabilir. Oral uygulama için tasarlandiginda, tercih edilen bilesimler bir veya daha fazla tatlandirici madde, koruyucu maddeler, boya/renklendirici ve lezzet arttirici içerir. Enjeksiyon yoluyla uygulanmasi amaçlanan bir bilesimde, bir ya da daha fazla yüzey aktif madde, koruyucu, islatici ajan, dispersan ajan, süspanse edici ajan, tampon, stabilizör ve izotonik ajan dahil edilebilir. Burada kullanilan, bir çözelti, süspansiyon veya baska bir formdaki sivi farmasötik bilesim, asagidaki tasiyicilar veya eksipiyanlardan bir veya daha fazlasini içerebilir: steril seyrelticiler, örnegin enjeksiyonluk su, salin çözeltisi, tercihen fizyolojik salin, Ringer çözeltisi, izotonik sodyum klorür, sabit yaglar, örnegin skualan, skualan, mineral yag, bir mannit monooleat, kolesterol ve/veya çözücü ya da süspanse edici ortam görevi görebilecek sentetik mono ya da digliseritler, polietilen glikoller, gliserin, propilen glikol ya da diger çözücüler; antibakteriyel ajanlar örnegin benzil alkol ya da metil paraben; antioksidanlar, örnegin askorbik asit ya da sodyum bisülfit; kiskaçlayici ajanlar, örnegin etilendiamintetraasetik asit; tamponlar, örnegin asetatlar, sitratlar ya da fosfatlar ve tonikligi ayarlayici ajanlar, örnegin sodyum klorür ya da dekstroz. Parenteral preparasyon ampüller, tek kullanimlik siringalar ya da cam ya da plastik çok dozlu viyaller içine konulabilir. Enjekte edilebilen bir farmasötik bilesim tercihen sterildir. Belirli bir uygulamada, mevcut bulusun bir farmasötik veya asi bilesimi 0.2 um'nin altinda bir stabil sulu süspansiyon içerir ve ayrica fosfolipitler, yag asitleri, yüzey aktif maddeler, deterjanlar, saponinler, florütlestirilmis Iipitler ve benzerlerinden olusan grup içinden seçilen en az bir bilesen içerir. Bir baska uygulamada, bulusun bir bilesimi, aerosol haline getirilebilecek bir sekilde formüle edilir. Bir asi veya farmasötik bilesim içinde, örnegin dagitim vehikülleri, örnegin, sinirlandirma olmaksizin alüminyum tuzlari, yag içinde su emülsiyonlari, biyolojik olarak parçalanabilen yag vehikülleri, su içinde yag emülsiyonlari, biyolojik olarak parçalanabilen mikrokapsüller ve Iipozomlari içeren ancak bunlarla sinirli olmayan dagitim vehiküllerini içermesi istenebilir. Bu tür vehiküllerde kullanima yönelik ilave immünostimülatör maddeler de ayrica yukarida tarif edilmektedir ve N-asetilmuramiI-L-alanin-D-iso-glutamin (MDP), glukan, lL-12, GM-CSF, gama interferon ve IL-12'yi içerebilir. Teknikte uzman olanlarin bildigi herhangi bir uygun tasiyici mevcut bulusun farmasötik bilesimlerinde kullanilabilmesine ragmen, tasiyici tipi, uygulama sekline ve sürekli saliverilmenin istenip istenmedigine bagli olarak degisecektir. Deri alti enjeksiyon gibi parenteral uygulama için, tasiyici tercihen su, salin, alkol, bir yag, bir balmumu veya bir tampon içerir. Oral uygulama için, yukaridaki tasiyicilarin herhangi biri veya manitol, Iaktoz, nisasta, magnezyum stearat, sodyum sakarin, talk, selüloz, glikoz, sukroz ve magnezyum karbonat gibi bir kati tasiyici kullanilabilir. Biyobozunur mikrokürecikler (örnegin polilaktik galaktit), mevcut bulusun farmasötik bilesimleri için tasiyicilar olarak da kullanilabilir. Uygun biyobozunur mikrokürecikler, örnegin ABD mikrokürenin yaklasik 25 mikrondan daha büyük olmasi tercih edilir. Farmasötik bilesimler (örnegin GLA asilari ve GLA immünolojik adjuvanlari) ayrica seyrelticiler, örnegin tamponlar, antioksidanlar, örnegin askorbik asit, düsük moleküler agirlikli (yaklasik 10 kalintinin altinda) polipeptitler, proteinler, amino asitler, karbohidratlar, örnegin glükoz, sukroz veya dekstrinler, kiskaçlayici ajanlar, örnegin EDTA, glutatyon ve diger stabilizörler ve eksipiyanlari içerebilir. Nötr tamponlu salin veya spesifik olmayan serum albümini ile karistirilmis salin örnek uygun seyrelticilerdir. Tercihen, ürün seyrelticiler olarak uygun eksipiyan çözeltileri (örnegin sukroz) kullanilarak Iiyofilizat olarak formüle edilebilir. Yukarida tarif edildigi gibi, belirli uygulamalarda, söz konusu bulus, istenen antijenleri kodlayan nükleik asit moleküllerini tasiyabilen bilesimler içerir. Bu tür bilesimler 89/01973)), bir polikatyonik molekülle kompleks olmus rekombinant ifade yapisi nükleik asit molekülleri (bkz. WO 93/03709) ve Iipozomlarla iliskilendirilen nükleik uygulamalarda, DNA öldürülmüs veya etkisizlestirilmis adenovirüs ile baglantili olabilir Dogrudan in vivo prosedürlere ek olarak, ex vivo prosedürler, hücrelerin bir konakçidan çikarildigi, modifiye edildigi ve ayni veya baska bir konakçi hayvana yerlestirildigi ex vivo prosedürler kullanilabilir. Antijen kodlayan nükleik asit moleküllerinin, ex vivo baglamda doku hücrelerine sokulmasi için yukarida belirtilen bilesimlerin herhangi birinin kullanilabilecegi açiktir. Viral, fiziksel ve kimyasal alim yöntemleri için protokoller teknikte iyi bilinmektedir. Buna göre mevcut bulus, bir konakçida, bir hastada veya hücre kültüründe bir immün tepkinin arttirilmasi veya ortaya çikarilmasi için faydalidir. Burada kullanilan "hasta" terimi, sicakkanli herhangi bir hayvani, tercihen bir insani belirtir. Bir hasta enfeksiyöz bir hastaliktan, meme kanseri gibi kanserden veya otoimmün bir hastaliktan muzdarip olabilir veya normal olabilir (yani, saptanabilir hastalik ve/veya enfeksiyonu olmayan). Bir "hücre kültürü", immünokompetan hücreleri veya immün sistemin izole edilmis hücrelerini (T hücreleri, makrofajlar, monositler, B hücreleri ve dendritik hücreler dahil, ancak bunlarla sinirli olmamak üzere) içeren herhangi bir preparasyondur. Bu tür hücreler, teknikte siradan uzmanliga sahip kisilerce iyi bilinen çesitli tekniklerden herhangi biriyle izole edilebilir (örn., Ficoll-hypaque yogunluk santrifüjlemesi). Hücreler kansere yakalanmis bir hastadan izole edilmis (ancak buna ihtiyaç duyulmamis) olabilir ve tedaviden sonra bir hastaya tekrar verilebilir. Bazi uygulamalarda, parenteral veya oral uygulama için amaçlanan bir sivi bilesiminin, uygun bir dozajin elde edilecegi bir miktar GLA asi bilesimi içermesi gerekir. Tipik olarak, bu miktar bilesimde agirlikça en az %0.01 olan bir antijendir. Oral uygulama amaçlandiginda, bu miktar, bilesimin agirliginin %0.1'i ile yaklasik %70'i arasinda degisir. Tercih edilen oral bilesimler yaklasik %4 ila yaklasik %50 oraninda antijen içerir. Tercih edilen bilesimler ve preparasyonlar, bir parenteral dozaj biriminin. agirlikça %0.01 ila 1 oraninda aktif bilesim içerecegi sekilde hazirlanir. Farmasötik bilesim topikal uygulama amaçli olabilir ve bu durumda, tasiyici uygun sekilde bir çözelti, emülsiyon, merhem ya da jel bazi içerebilir. Örnegin baz, asagidakilerden birini veya daha fazlasini içerebilir: vazelin, Ianolin, polietilen glikoller, balmumu, mineral yag, su ve alkol gibi seyrelticiler ve emülsiyonlastiricilar ve stabilizatörler. Kivamlastirici ajanlar, topikal uygulama için farmasötik bir bilesimde bulunabilir. Transdermal uygulama amaçli oldugunda, bilesim bir transdermal yama ya da iyontoforez aygiti içerebilir. Topikal formülasyonlar yaklasik %10 agirlik/hacim (birim hacim basina agirlik) konsantrasyonunda antijen (örn., GLA-antijeni asi bilesimi) veya GLA (örn., immünolojik adjuvan bilesimi; GLA Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL'den alinabilir; örn., ürün no. 699800) içerebilir. Bilesim, örnegin rektumda eritilecek ve ilaci serbest birakacak bir fitil formunda rektal uygulama için tasarlanabilir. Rektal uygulama için bilesim, tahris edici olmayan uygun bir eksipiyan olarak bir oleajinöz baz içerebilir. Bu gibi bazlar arasinda, sinirlandirma olmaksizin, lanolin, kakao yagi ve polietilen glikol bulunur. Bulusun yöntemlerinde, asi bilesimleri/adjuvanlari, uç(lar), boncuk(lar), zamana bagli salim formülasyonu/formülasyonlari, yama(lar) veya hizli salimli formülasyon(lar) kullanilarak uygulanabilir. Bazi uygulamalarda ayrica, burada açiklanan GLA asi bilesimlerini ve/veya bir veya daha fazla kapta saglanabilen GLA immünolojik adjuvan bilesimlerini içeren kitler de dahil edilir. Bir uygulamada, GLA asi bilesimlerinin ve/veya GLA immünolojik adjuvan bilesimlerinin tüm bilesenleri, tek bir kap içinde bir arada bulunur, ancak bulus uygulamalarinin bununla sinirli olmasi amaçlanmamistir ve ayni zamanda, örnegin GLA immünolojik adjuvan bilesimi, antijen bileseninden ayridir ve bunlarla temas halinde degildir. Teoriyle sinirli kalmaksizin, bazi durumlarda yalnizca GLA immünolojik adjuvan bilesiminin uygulanmasinin yararli bir sekilde gerçeklestirilebilecegi düsünülürken, diger durumlarda bu tür bir uygulama antijenin uygulanmasindan zamansal ve/veya mekansal olarak (örn., farkli bir anatomik bölgede) yararli biçimde ayrilabilir ve yine diger hastaya uygulama durumlarinda, burada tarif edilen sekilde bir GLA asi bilesimi hem antijeni hem de GLA'yi içerecek sekilde ve istege bagli olarak burada tarif edilen diger bilesenleri de içerek sekilde gerçeklestirilebilir. Bu tür kit uygulamalarina göre bir kap herhangi bir uygun kap, muhafaza, viyal, ampul, tüp, kupa, kutu, sise, deney tüpü, kavanoz, tabak, tek kuyucuklu veya çok kuyucuklu bir aparatin bir kuyucugu, rezervuar, tarik veya benzeri olabilir veya içerisine burada açiklanan bilesimlerin yerlestirilebilecegi, saklanabilecegi ve/veya tasinabilecegi ve içerigini çikarmak üzere erisilebilecegi baska cihaz olabilir. Tipik olarak bu tür bir kap, kullanim amacina uygun ve içerdigi içeriklerin geri kazaniminin kolayca elde edilebildigi bir malzemeden yapilabilir. Bu tür kaplarin tercih edilen örnekleri, bir septum veya bir igne ve siringa kullanilarak içerigin çekilmesi ile uyumlu olan baska bir sizdirmazlik araci içerenler de dahil olmak üzere cam ve/veya plastik sizdirmaz veya yeniden kapatilabilir tüpler ve ampulleri içerir. Bu tür kaplar, örnegin camdan veya kimyasal olarak uyumlu bir plastik veya reçineden yapilabilir ve kaptan malzemenin verimli bir sekilde çikarilmasina olanak taniyan ve/veya malzemeyi, örnegin ultraviyole isik veya asiri sicaklik gibi bozundurucu kosullardan veya mikrobiyal kirleticiler dahil olmak üzere istenmeyen kirleticilerin sunulmasindan koruyan bir malzemeyle kaplanabilir. Kaplar tercihen sterildir veya sterilize edilebilirdir ve herhangi bir tasiyici, eksipiyan, çözücü, vehikül veya benzeri ile uyumlu olabilmekte olup, örnegin burada tarif edilen asi bilesimlerini ve/veya immünolojik adjuvan bilesimlerini ve/veya antijenleri ve/veya rekombinant ifade yapilarini ve benzerlerini askiya almak veya çözündürmekte kullanilabilir. Asagidaki örnekler, sinirlama yoluyla degil, açiklama yoluyla sunulmaktadir. ÖRNEKLER EMÜLSIYON ADJUVAN DOZU TITRASYONU VE BIR REKOMBINANT siTMA AsisiNiN IMMÜNOJENIKLIGI ÜZERINE TLR4 AGONIST FORMÜLASYON ETKlERI Su içinde yag (o/w) emülsiyonlari modern asilarda yardimci maddeler olarak güvenli ve basarili bir sekilde kullanilmistir. En dikkat çekici o/w emülsiyonlari, sirasiyla Novartis ve GSK Biologicals tarafindan üretilen MF59® ve ASO3'tür. Bu adjuvanlarin her ikisi de, nihai asi formülasyonunda yaklasik %25 hacim/hacim oraninda skualen içerir [1]. Ancak, yakin zamana kadar bu skualen konsantrasyonunu seçme motivasyonuyla ilgili sadece birkaç rapor yayinlanmistir [2-4]. Ayrica, yeni bir çalisma MF59 seyreltisinin bir pandemik influenza asisi klinik çalismasinda immün tepkisini tehlikeye atmadigini göstermistir [5]. Eger adjuvan aktivite, skualen dozunun azalmasi ile korunabilirse, o/w emülsiyonlarinin lokal reaktojenitesi potansiyel olarak azaltilabilir. Ayrica, mevcut adjuvan arzi artarken, asi maliyeti azalabilir, böylece kaynak bakimindan fakir ülkelerde asi ve adjuvan üretimi daha kolay hale getirilebilir. Emülsiyon adjuvani (Montanide® ISA 720) ile birlestirilen rekombinant sitma antijeni PfCeITOS (PIasmodiumfa/ciparum hücre geçis proteini), heterolog bir yükleme modelinde farelerin %60'inda koruyucu etkinlik göstermistir [6]. PfCeITOS, sporozoit hareketliligini ve hepatosit infektivitesini inhibe eder ve yeni nesil sitma asilarinin önemli bir bileseni olabilir. Hem hücresel hem de humoral immün yanitlar, koruyucu etkinlik için önemlidir [6, 7]. Bu çalismada, PfCeITOS'a karsi hümoral ve hücresel immün yanitlar üzerindeki skualen bazli stabil emülsiyon (SE) adjuvan doz etkileri degerlendirilmektedir. Ayrica, asi formülasyonuna sentetik bir TLR4 agonisti, glikopiranozil lipid adjuvaninin (GLA) dahil edilmesinin etkisi arastirilmaktadir. GLA-SE'de %2 hacim/hacim'den az skualen konsantrasyonlarinin, %2 hacim/hacim skualen konsantrasyonuna esdeger adjuvan yanitlari indükleyebilecegi gösterilmektedir. Bulgu asi adjuvani üretimi ve dozlamasina yönelik önemli çikarimlara ve ayni zamanda yag konsantrasyonlarina daha duyarli olabilecek özgün uygulama yollarina (örnegin intradermal) sahiptir. Ayrica, GLA'nin varliginin, asi etkinligi için önemli olabilecek yüksek seviyelerde hücreleri ortaya çikaran Th1 tipi bir tepkiye yönelik bagisiklik aktivitesini sekillendirdigini gösterdik. Malzemeler ve Metotlar Asi formülasyonlari. Köpekbaligi karaciger skualeni (%98 saflikta) Sigma-Aldrich'den (St. Louis, MO) satin alinmistir. Gliserol ve ci-tokoferol Spectrum Chemical'dan (Gardena, CA) satin alinmistir. Poloxamer , BASF'den (Ludwigshafen, Almanya) veya Spectrum Chemical'dan elde edilmistir. Yumurta fosfatidilkolin (yumurta PC), ve glikopiranozil lipid adjuvani (GLA) Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) firmasindan elde edilmistir. Amonyum fosfat tampon bilesenleri de J. T. Baker'dan temin edilmistir. Emülsiyon formülasyonu, ayri sulu ve yag fazlari yapilarak hazirlanmistir. Poloxamer 188, gliserol ve tampon bilesenleri karistirilarak sulu fazda çözülmüs, yumurta fosfatidilkolin yag fazinda selenleme ve isitma ile çözülmüstür. Sulu ve yagli fazlar (%10 hacim/hacim yag) daha sonra bir Silverson Heavy Duty Laboratory Mixer Emulsifier (boru seklinde kare delikli yüksek kesme kuvvetli elek eklemesinde 3/4; East Longmeadow, MA) ile -7,000 RPM'de on dakika boyunca karistirilmis ve böylece islenmemis bir emülsiyon vermistir. Ham emülsiyon, - 12 geçis için bir Microfluidics M11OP (Newton, MA) yüksek basinçli homojenlestirici ile islenmistir. Sulu GLA süspansiyonu, organik çözücü içerisinde GLA ve DPPC'nin 4.2:1 mol oraninda önceden karistirilmasi, ardindan çözücünün buharlastirilmasi ve ultra saf su ile hidrasyon yapilmasi ile olusturulmustur. -70 °C'de su banyosu selenleme nanoparçacik sulu süspansiyon GLA-AF'yi olusturmustur. Formülasyonlar, asilama programi boyunca 5 °C`de boyut ve GLA konsantrasyonu bakimindan izlenmistir. Parçacik büyüklügü, daha önce tarif edildigi gibi dinamik isik saçilimi ile ölçülmüstür emülsiyon PBS ile belirtilen yag konsantrasyonlarina seyreltilmis ve antijen ve GLA-AF ile karistirilmistir (uygun oldugunda). Montanide® ISA 720, Seppic Inc.'den (Fairfield, NJ) satin alinmis ve immünizasyondan önce %30 hacim/hacim sulu faz ile karistirilarak hazirlanmistir. Hazirlama boyunca emülsiyon dozu, nihai asi formülasyonundaki %hacim/hacim yag olarak adlandirilir; yagin emülgatöre orani tüm dozlarda sabit tutulur. Kodon bakimindan harmonize edilmis rekombinant antijen PfCeITOS, Walter Reed Army lnstitute of Research tarafindan gelistirilip üretilmis ve biçimde saglanmistir. Immünoloji yöntemleri Uç noktasi titresi Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA) ve ardindan seyreltimde belirlenen degerlerin bir sigmoidal yerlestirmesi (degisken egim) kullanilarak belirlenmis olup, bir kesme degerine (C) karsilik gelen bir uç noktasi titresi önceden tarif edilen sekilde [10], C = X + SDf formülüne göre belirlenmis olup, burada X ifadesi ortalamadir ve SD negatif serum kontrol plakasinin standart sapmasidir ve f ifadesi düsükse, 0.1 OD'Iik bir kesme degeri atanmistir. Nadir durumlarda, münferit plaka kuyulari en yüksek seyreltimlerin yakininda anormal derecede yüksek bir okuma kaydetmistir. Bunlar, %99 güven seviyesinde söz konusu seyreltimi çevreleyen 4 seyreltime kiyasla, Grubb'un süpheli deger üzerinde yaptigi test kullanilarak sigmoidal uyum disinda birakilmistir [11]. Sonuçlar GLA-AF ve SE, stabil nanoparçacik formülasyonlaridir [12]. GLA-AF, GLA'nin ve fosfolipit partiküllerinin sulu bir nano süspansiyonudur. SE, tipik olarak immünizasyon için %2 hacim/hacim skualende kullanilan bir skualen bazli nanoemülsiyondur. GLA konsantrasyonunu sabit tutarken emülsiyon doz titrasyonunu kolaylastirmak için GLA-AF, GLA-SE etiketli deney gruplari için immünizasyondan hemen önce belirtilen SE konsantrasyonuna eklenmistir. Bu çalismada kullanilan formülasyon partilerinin ortalama partikül boyutlari 88 ila 98 nm arasindadir ve Tablo 1'de gösterilmektedir. Sekil 1'de, farkli GLA-AF gruplarinda zaman içinde GLA konsantrasyonu, asagida açiklanan in vivo çalismalarin süresi boyunca ve en az 6 ay boyunca TLR agonist konsantrasyonunun stabilitesi gösterilmektedir. Montanide® lSA 720, immünizasyon için tipik olarak %70 hacim/hacim skualende kullanilan ve daha önce bir sitma mücadelesi modelinde PfCelTOS ile anlamli steril koruma gösterdigi bir yag içinde su adjuvanidir [6]. Bu nedenle Montanide® ISA 720, asagida tarif edilen immünojeniklik çalismalari için pozitif bir kontrol olarak kullanilir. BALB/c fareleri, enjeksiyonlar arasinda 3 hafta olacak sekilde PfCeITOS asi bilesimleri ile 3 kez immünize edilmistir. Sekil 2, 2. ve 3. immünizasyonlarin ardindan toplam IgG, IgG1 ve IgG2a antikor uç noktasi titrelerini sunmaktadir. 3. immünizasyondan sonra (Sekil 2d-f), SE dozu titrasyonunun etkisi, %002 SE grubunun, %2 SE grubuna kiyasla azalan toplam IgG, IgGi ve IgG2a yanitlarinda belirgin olmustur. %01 ve %05 SE gruplari ayrica %2 SE grubundan daha düsük lgG2a yaniti göstermistir. Bununla birlikte, GLA ilavesinin bu SE dozu titrasyon etkisini etkisiz duruma getirdigi görülmüstür: emülsiyon dozundan bagimsiz olarak tüm GLA-SE gruplari esdeger lgG, IgG1 ve IgG2a yanitlarini ortaya koymustur. Aslinda, GLA-AF grubu (emülsiyon içermeyen), GLA-SE gruplarina kiyasla esdeger antikor yanitlari ortaya çikarmistir. Açikça, GLA'nin varligi (SE ya da AF), GLA içermeyen ayni asi bilesimine kiyasla daha güçlü bir IgGZa tepkisi ortaya çikarmaktadir. Montanide® grubu, %2 SE veya %05 GLA-SE grubuna kiyasla anlamli bir sekilde farkli olmasa da, en yüksek IgG1 yanitlarini göstermistir. 2. bagisiklik kazandirma isleminden sonra antikor yanitlari, genel titreler biraz daha düsük olmasina ragmen, yukarida tarif edilenlerle benzer örüntüler göstermistir (Sekil 2a-c). Ayrica, GLA-SE gruplarinin birçogu. GLA-AF'ye kiyasla anlamli olarak daha yüksek IgGZa ve IgGl yanitlari göstermistir. Son olarak, kemik iliginde daha fazla sayida antikor salgilayan plazma hücresi, sadece antijen grubuna kiyasla, GLA (SE veya AF), Montanide® veya antikor son nokta titrelerini yansitan tam %2 SE dozuna kiyasla azalmis antikor salgilayan plazma hücreleri seviyeleri göstermistir. Bir baska deneyde, daha dar bir aralikta SE doz titrasyonu uygulanmistir (%O.5 - %2) ve hücresel ve ayni zamanda hümoral yanitlar arastirilmistir. Sekil 3'te, 2. ve 3. immünizasyonlardan sonra ölçülen toplam IgG, IgG1 ve lgG2a antikor son nokta titreleri sunulmaktadir. 3. bagisiklik kazandirma isleminden sonra (Sekil 3d-f), adjuvanlanan tüm gruplar, yalnizca antijene kiyasla daha yüksek toplam IgG yaniti göstermistir. Bununla birlikte, %0.5'Iik SE dozu, yalnizca antijene kiyasla daha yüksek lgG1 antikorlari ortaya çikarmayi basaramamis ve tüm SE dozlari, sadece antijene kiyasla daha yüksek IgG2a tepkileri ortaya çikaramamistir. Buna karsilik, GLA içeren tüm gruplar, yalnizca antijene kiyasla daha yüksek IgG, lgG1 ve IgG2a tepkileri göstermistir. GLA, GLA içermeyen ayni bilesime kiyasla, tüm gruplarda IgG2a tepkilerini çarpici sekilde arttirmistir. Montanide® grubu diger tüm gruplara göre anlamli olarak daha yüksek IgG1 titreleri gösterirken, %0.5 ve %1 SE dozlarindaki GLA-SE gruplari, Montanide® grubuna kiyasla daha yüksek IgGZa tepkileri ortaya çikarmistir. 2. immünizasyondan sonra (Sekil 3a-c) benzer desenler belirgindir, ancak vermistir. Çesitli SE konsantrasyonlarinda herhangi bir doz titrasyonu etkisi bulunmamasina ragmen, GLA veya Montanide® içeren asilarla (Sekil Bg) daha yüksek sayida antikor salgilayan plazma hücreleri ortaya çikmistir. Hücresel tepkiler sitokin ELlSPOT tahlili ile arastirilmistir. Daha yüksek seviyelerde gruplarina kiyasla, %1 veya %2 SE dozlarinda GLA-SE gruplari tarafindan ortaya çikarilmistir (Sekil 43). Bunun tersine, GLA-SE gruplari gözardi edilebilir düzeylerde grubundan veya Montanide® grubundan daha yüksek düzeylerde IL-5 salgilayan hücreler saglamistir. Benzer bir egilim multipleks sitokin tanecik deneyi sonuçlarinda belirgin olup, burada Th1 sitokin IFN-Y üretimi GLA-SE gruplariyla uyarilirken, artan Th2 sitokinler, örnegin IL-5, IL-10 ve lL-13 ise GLA'yi içermeyen emülsiyon gruplariyla iliskilendirilir (Sekil 5). %2 SE dozu, en yüksek Th2 sitokin hücresel tepkilerini ortaya çikarmistir (örnegin, lL-5 ve IL-13). Tartisma Yukaridaki asi bilesimlerine GLA'nin dahil edilmesi, önemli ölçüde daha yüksek IgG2a antikorlari ve IFN-y üretimi ile gösterildigi gibi bir Th1 egilimine karsi immün tepkisini sekillendirir. Toplam antikor üretiminin daha önceki CeITOS çalismalarinda koruyucu etkinlik ile korele olmadigi bulunmasina ragmen, antikor izotip analizi yapilmamistir [6, 7]. Bu nedenle, daha yüksek IgGZa antikor üretiminin artan koruyucu potansiyel anlamina gelip gelmedigi açik degildir. Bununla birlikte, lFN-y üretimi asi etkinligi ile iliskili görünmektedir [6, 7]. Bu nedenle, GLA-SE adjuvanlari, CelTOS asilarinda koruyucu etkinlik olusturmak için iyi adaylar olabilir. Burada, emülsiyonun lFN-y üretimi (örnegin, GLA-SE gruplari) için gerekli göründügünü ve GLA-AF gruplari tarafindan ortaya çikan antikor titrelerinin, 3. bagisiklik kazandirma isleminden sonra GLA-SE gruplarina benzer oldugunu not ettik. Ilginç sekilde, emülsiyon dozunun azaltmamistir. Son olarak, GLA'nin dahil edilmesi, sadece antijene kiyasla, belirgin sekilde daha yüksek uzun ömürlü antikor salgilayan hücreleri de indüklemistir. Genel olarak, GLA, bir Th1 egilimine karsi bagisiklik tepkisini sekillendirir ve kemik iliginde daha fazla sayida antikor salgilayan plazma hücresi indükler, ancak bu etkiler için GLA içermeyen emülsiyon gruplarinda, azaltilmis adjuvan konsantrasyonunun etkileri daha belirgin olmustur. Böylece, IL-5 üreten hücrelerin seviyeleri %1 SE grubunda %2 SE grubuna kiyasla daha düsük olmustur ve sadece %2 SE grubu sadece antijene kiyasla daha yüksek miktarda IL-13 göstermistir. Emülsiyon dozu titrasyon etkisi antikor uç noktasi titrelerinde, özellikle en düsük emülsiyon konsantrasyon grubunda (% gösterilmis olup, bu, daha düsük IgG, lgG1 ve IgG2a saglamis ve ayni zamanda %2 SE grubuyla karsilastirildiginda daha düsük düzeylerde antikor salgilayan plazma hücreleri saglamistir. Bununla birlikte, %05 ve %1 SE konsantrasyonlari, tam %2 SE dozuna kiyasla benzer seviyelerde antikor salgilayan plazma hücrelerinin yani sira benzer seviyelerde lgG ve IgG1 antikor titreleri ortaya çikarmistir. Bununla birlikte, genel bagisiklik tepkisi düsük SE konsantrasyonlari ile, özellikle %0.02'Iik en yüksek seyreltimle birlikte biraz azalmis gibi görünmektedir. Asilarda emülsiyon konsantrasyonunun azaltilmasi, maliyet tasarrufu, lokal reaktojenite azalmasi, alternatif verilme yollari ve küçük çocuklarin immünizasyonunu kolaylastirmak gibi birden fazla uygulamaya sahip olabilir. Bir TLR4 agonisti varliginda daha düsük miktarlarda emülsiyon içeren adjuvanlarin, tam %2 yag emülsiyon dozuna esdeger immün yanitlari üretebilecegini gösterdik. Yakin zamanda yapilan klinik çalismalar önde gelen su içinde yag emülsiyon ürünleri MF59® ve A803'ü kullanarak adjuvan doz etkilerini degerlendirmis olup, her ikisi de Avrupa'da kullanim için onaylanmistir, ancak formüllerin hiçbiri bir TLR agonisti içermez. Bu nedenle, bir pandemik influenza asisi klinik arastirmasinda, MF59® adjuvaninin tipik% -2.3 yag dozunun, immünojeniklikten ödün vermeden ve yine de pandemik asi lisansi için Avrupa kriterlerini yerine getirerek yariya (ancak 4 katina kadar degil) düsürülebilecegi bulunmustur [5]. Ayrica, deneme katilimcilarinda enjeksiyon bölgesi agrisinda doza veya tam dozda mevsimsel influenza antijeni ve MF59® kullanilan bir çalismada, reaktojenite açisindan farkli adjuvan dozlari arasinda fark olmadigi bulunmustur [4]. Antikor yanitlari, adjuvan konsantrasyonuna göre bir doz yaniti izlemesine ragmen, tüm formülasyonlar, 2. asilamadan sonra Avrupa Insan Kullanimina Iliskin Tibbi Ürünler Komitesi (CHMP) kriterlerini karsilamistir. Iki farkli A803 dozu (%25 skualen ve %25 oi-tokoferol tam dozu içeren ASO3A ve buna karsilik yarim doz içeren ASOSB) bir baska influenza klinik denemesinde degerlendirilmis olup, burada iki farkli adjuvan dozuyla saglanan baslangiç bagisiklik yanitlari esdeger olmakla birlikte, asilamadan 182 gün sonra ölçülen yanit dayanikliligi daha yüksek adjuvan dozuyla birlikte bir miktar daha iyi olmustur [3]. Ayrica, 41-64 yas grubu, alt adjuvan dozunda anlamli sekilde azalmis antikor yanitlari göstermistir. Son olarak, düsük doz adjuvan dozunda, tam doza kiyasla daha az agri azalmasi kaydedilmistir. Birlikte ele alindiginda, MF59® ve A803 klinik deneyleri, adjuvan doz titrasyonunun etkisinin, her asi bilesimine ve amaçlanan alicilarina bagli olabilecegini göstermektedir. GLA-SE adjuvani içeren PfCelTOS asilari, BALB/c farelerinde güçlü Th1 tipi immün tepkileri ortaya çikarir (örnegin Montanide® lSA 720 içeren bir PfCeITOS asisindan daha yüksek IFNy üretimi). Emülsiyon dozu, GLA-SE adjuvan gruplarinda immünojeniklikten ödün vermeden %2'den % 1'e düsürülebilir. Genel olarak, SE gruplarindaki emülsiyon dozunun azaltilmasi (TLR4 agonisti GLA içermeyen), özellikle en düsük adjuvan doz seyreltmesinde (%002), bir miktar azalmis immünojeniklik göstermistir. GLA-SE adjuvani ile PfCeITOS kullanan koruma çalismalarinin sonuçlari daha sonra yayinlanmak üzere derlenmektedir ve 2012 için bir faz I klinik arastirmasi planlanmaktadir. Referanslar Nest G. MF59: design and evaluation of a safe and potent adjuvant for human vaccines. In: Powell MF, Newman MJ, editors. Vaccine Design: The Subunit and and cross-reactive immunogenicity of candidate ASOS-adjuvanted prepandemic H5N1 influenza vaccines: A randomized controlled phase 1/2 trial in adults. J lnfect Dis quadrivalent MF59-adjuvanated influenza vaccine in young children: A dose- and ranging of adjuvant and antigen in a cell culture H5N1 influenza vaccine: Safety and M, Ockenhouse C, ve ark. Immunization with pre-erythrocytic antigen CelTOS from Plasmodium falciparum elicits cross-Species protection against heterologous Cellular and humoral immune effector mechanisms required for sterile protection against sporozoite challenge induced with the novel malaria vaccine candidate and physical effects of oil composition in vaccine adjuvant emulsions. Vaccine ark. Physicochemical characterization and biological activity of synthetic TLR4 agonist University Press, 2006. Baldwin SL, ve ark. Development and characterization of synthetic glucopyranosyl Asi ADJUVAN EMÜLSIYONLARINDA FOSFOLIPIT BILESIMININ IMMÜNOMODÜLATÖR VE FIZIKSEL ETKILERI Metabolize edilebilen su içinde yag emülsiyonlarinin güvenli ve etkili asi adjuvanlari, besin takviyeleri ve ilaç dagitim vehikülleri oldugu gösterilmistir. Çesitli emülgatör bilesimleri mevcut olup, skualen asi adjuvan uygulamalari için tercih edilen metabolize edilebilir bir yagdir (1-3). Yaygin olarak kullanilan emülsiyonlastiricilar, Pluronics®, Tweens®, Spans® ve fosfolipidleri içerir. Emülgatör seçimi, emülsiyon stabilize etme kapasitesine ve/veya biyolojik aktiviteye dayanir, çünkü emülsiyonlastiricilarin tanim geregi membran aktif olduklari ve immün uyarima bagli çesitli biyolojik etkilere sahip olduklari gösterilmistir (4). Lesitin ve ana bileseni olan fosfatidilkolin (PC), güvenli ve etkili parenteral yolla verilen emülsiyonlarda emülsiyonlastiricilar olarak basariyla kullanilmistir. Belki de fosfolipid emülsiyonlastiricilarin en yaygin kullanimi, bir soya fasulyesi yagi/yumurta lesitin emülsiyonu olan Intralipid®'deki gibi intravenöz besin takviyesi uygulamasidir (5). Bununla birlikte, bir yumusatici olarak yumurta lesitini (veya yumurta PC) ile baglantili bazi dezavantajlar ve yumurtadan türetilmis fosfolipidlerin sentetik fosfolipidlerle ornatilmasinin avantajlari olabilir. Ilk olarak, yapinin önemli derecede heterojenligi vardir: yumurta PC'si en az 17 farkli PC türü (6) içerebilir, ancak çesitli sentetik PC'Ier bozunmaya yatkin olan çoklu tekli doymamis ve çoklu doymamis asil zincirlerinden olusurken, çesitli sentetik PC'Ier doymus asil zincirlerinden olusur ve bu nedenle kimyasal olarak daha stabildir (7). Üçüncü olarak, yumurta fosfolipidleri, sentetik olarak üretilmek yerine bir hayvan kaynagindan türetilir. Yumurta PC tarafindan stabilize edilen skualen emülsiyonlarinin fiziksel stabilite profilini daha önce yayinlamistik (8, 9). Dahasi, sentetik POPC'nin (yumurta PC'nin ana bileseni) yumurta PC'ye kiyasla bir skualen emülsiyonuna esdeger bir stabilite sagladigini gösterdik. Bununla birlikte, baska hiçbir sentetik PC degerlendirilmemistir. Sentetik, homojen fosfolipitler yaygin olarak bulunmaya baslanmistir ve simdi nispeten ucuzdur. Uygun sentetikfosfolipid seçimi ile emülgatörün kimyasal stabilitesi ve emülsiyonun fiziksel stabilitesi optimize edilebilir. Biyolojik esdegerligin de ele alinmasi gerekmekte olup; asi adjuvan emülsiyonlarindaki emülgatörlerlerin kaynagindaki veya safligindaki degisikliklerin daha önce asi potansiyelini büyük ölçüde etkiledigi gösterilmistir (10, 11).Mevcut açiklamada, 1) diger sentetik PC'leri (POPC'nin yani sira) içeren skualen emülsiyonlarinin fiziksel stabilitesini degerlendirerek geçmis çalismalarimizi gelistirmeyi ve 2) sentetik PC emülsiyonlarinin ve ayni zamanda bir yumurta PC emülsiyonunun biyolojik aktivitesini sitma ve influenza asisi formülasyonlari baglaminda degerlendirmeyi amaçlamaktayiz. Malzemeler ve Metotlar Adjuvan formülasyonlari. Köpekbaligi karaciger skualeni (%98 saflikta) Sigma-Aldrich'den (St. Louis, M0) satin alinmistir. Yumurta fosfatidilkolin (yumurta PC), 1-palmitoiI-2-ole0iI-sn-glisero-S-fosfokolin (POPC), ve 1,2-dilauroil-sn-glisero-3-fosf0k0lin (DLPC) bilesikleri Avanti Polar Lipids, Inc.'den %99 saflikta (Alabaster, AL) elde edilmistir. Tüm emülsiyon formülasyonlari, daha önce tarif edildigi gibi (8) yüksek hizli homojenizasyon yoluyla bir yag fazinin (skualen ve fosfolipid içeren) ve bir sulu fazin yüksek hizda karistirilmasiyla hazirlanmistir. Fosfolipidin son konsantrasyonu 25 mM olmustur. Formülasyonlar, 6 ay boyunca, 5 °C'de, oda sicakliginda (RT), 37 °C'de ve 60 °C'de stabilite açisindan izlenmistir. Parçacik büyüklügü, zeta potansiyeli, viskozite, hemoliz ve isik saçma optik profil ölçümleri daha önce tarif edildigi gibi yapilmistir (8). Kisaca, belirtilen zaman noktalarinda, her bir emülsiyonun 1:100'Iük bir bölümünün su ile seyreltilmesi ve saçilma yogunlugu egilimli boyut ortalamasinin (Z-avg) dinamik isik saçilmasi (Malvern Zetasizer APS) ile ölçülmesiyle, belirtilen zaman noktalarinda parçacik büyüklügü belirlenmistir. Zeta potansiyeli, emülsiyon üretiminden kisa bir süre sonra, her emülsiyonun bir bölümünün su içinde 1:20 kat seyreltilmesi ve zeta potansiyelinin mikroelektroforez (Malvern Zetasizer Nano-ZS) ile ölçülmesiyle ölçülmüstür. Her bir emülsiyonun 20 mL'Iik bir numunesi, 5 °C'de depodan çikarilmis ve dönel viskozimetre (Brookfield DV-E) ile viskoziteyi ölçmeden önce oda sicakligina gelmeye birakilmistir. Emülsiyon hemolitik aktivitesi, daha önce yayinlanmis bir teknigin degistirilmis bir versiyonunun ardindan analiz edilmis (12); bir insan gönüllüden alinan kirmizi kan hücrelerinin bir süspansiyonu, her bir emülsiyon ile yaklasik 20 dakika boyunca salin içinde karistirilmis, ardindan numune santrifüjlenmis, süpernatan bir etanolzHCI (39:1, hacimzhacim) karisimi içine seyreltilmis ve absorbans 398 nm'de ölçülmüstür. Lazer saçilma optik profil ölçümleri, her 8 dakikada bir, kullanilarak 60 °C'de seyreltilmemis emülsiyon numunelerinde 4 saat boyunca toplanmistir. Immünizasyon, serum toplanmasi ve immünolojik analizler. Alti-yedi haftalik disi, BALB/c fareleri (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), her bir arka kuadrisepste intramüsküler enjeksiyonla asilanmistir. Iki farkli antijen test edilmistir: 1) 2007-2008 Fluzon inaktive edilmis bölünmüs virüs asisi, temsili influenza suslari A/Solomon Adalari/ ve B/Malezya/2506/2004'ü içerir; ve 2) Walter Reed Army Institute of Research tarafindan gelistirilen kodon uyumlu yapi kullanilarak kendi bünyesinde üretilen rekombinant Plasmodium berghei cirpoumsporozoit proteini (PbCSP). influenza ve sitma asisi formülasyonlari, bagisiklik kazandirma rejimleri ve serum toplama, grip antijen dozunun 0.02 mg toplam HA olmasi disinda, daha önce tarif edildigi gibi olmustur (8). Tüm prosedürler spesifik patojen içermeyen kosullar altinda ve lDRl hayvan bakimi ve kullanimi komitesinin düzenlemeleri ve kilavuzlarina uygun olarak gerçeklestirilmistir. Antikor yanitlari. Fareler üç hafta arayla iki kez immünize edilmistir. Serumlar, antijene spesifik IgG, lgG1, IgG2a antikorlari ve hemaglutinasyon inhibisyonu (HI) antikor aktivitesi için, daha önce tarif edildigi gibi, rastgele anti-PbCSP birimleri standart bir egri ile karsilastirilarak atanirken, uç nokta titreleri influenza antikorlari için belirlenmistir (8). Fluzon artisini takiben dört hafta toplanan örneklerdeki asiya özgü uzun ömürlü antikor salgilayan plazma hücrelerinin indüklenmesini belirlemek için bir kemik iligi ELISPOT tahlili, daha önce küçük modifikasyonlarla (13) tarif edildigi gibi adjuvanla ve adjuvansiz asilamayi desteklemistir. Antijene özgü sitokin yanitlari. MultiScreen 96 kuyucuklu filtrasyon plakalari (Millipore, Bedford, MA) siçan anti-fare lL-5 yakalama Ab (eBioscience, San Diego, CA) ile kaplanmis ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edilmistir. Plakalar PBS ile yikanmis, oda sicakliginda en az 1 saat süreyle RPMI 1640 ve %10 FBS ile bloke edilmis ve sonra tekrar yikanmistir. Ikinci Fluzon enjeksiyonundan dört hafta sonra dalaklar toplanmistir. Tek hücre süspansiyonlari hazirlanmis ve kuyucuk basina 2 x 105 hücrede, her iki ortamda tek basina, konkanavilin A (0.75 Dg/ml), 5 hemaglutine edici birim (HAU) inaktive edilmis A/Solomon Adalari/ veya 2 HAU ile inaktive edilmistir. Plakalar daha sonra %0.1 PBS-Tween 20 ile yikanmis ve gece boyunca bir biyotin-konjuge siçan anti-fare lL-5 sekonder Ab (eBioscience) ile inkübe edilmistir. Filtreler, üreticinin protokolüne (Vector Laboratories) göre VectaStain ABC avidin peroksidaz konjugati ve Vectastain AEC substrat kitleri kullanilarak gelistirilmistir. Tepkime deiyonize su ile yikanmis, karanlikta kurutulmus plakalarla yikanmis ve lekeler bir otomatik ELlSPOT okuyucusu (C.T.L. Serie3A Analyzer, Cellular Technology Ltd.) kullanilarak sayilmistir. Veriler ImmunoSpot® yazilimi (CTL Analyzer LLC) kullanilarak analiz edilmistir. Istatistiksel analiz. Tüm fare deneyleri, her bir zaman noktasi basina grup basina bes ayri hayvani analiz etmistir. ELISPOT sayilari ve logio-dönüstürülmüs antikor titreleri, Tukey çoklu karsilastirma testi ile ANOVA kullanilarak karsilastirilmistir. HI titreleri, ANOVA ile Tukey'in l092 ile dönüstürülmüs HI titreleri kullanilarak yapilan çoklu karsilastirma testiyle karsilastirilmistir. Sonuçlar Emülsiyonlarin fiziksel kararliligi. Tablo 1, bu çalismada kullanilan emülgatörlerin bilesimini açiklar. Yumurta PC, çesitli asil zincir uzunluklari ve doygunluk derecelerine sahip heterojen bir fosfatidilkolin karisimidir, ancak ana bilesen POPC olarak tanimlanmistir (6, 14). Bunun tersine, Tablo 1'de gösterilen sentetik fosfolipitler yüksek düzeyde saftir (%99) ve Iipit düzenekleri olarak iyi tanimli ana faz geçis sicakliklarina (Tm) sahiptir. Her ikisi de tekli doymamis asil zincirleri içeren DOPC ve POPC, doymamis zincirlerin dayattigi paketleme bozuklugu nedeniyle düsük faz geçis sicakliklarina (<0 °C) sahiptir. Tekli doymamis ve çoklu doymamis asil Zincirlerini içeren yumurta PC'si ayrica düsük bir Tm'ye sahiptir. DLPC, doymus asil zincirlerinden olusur, ancak bunlar düsük bir Tm ile sonuçlanan sadece 12 karbon uzunlugundadir. DMPC, DPPC ve DSPC daha uzun doymus asil zincirlerine (sirasiyla 14, 16 ve 18 karbon) sahiptir ve faz geçis sicakliklari zincir uzunluguna göre artar. Örnegin, oda sicakliginda DPPC konfigürasyonu yüksek dereceli düzenlenmis jel fazi olup, bununla birlikte 41 °C'nin üstünde lipit, asil zincir konformasyonunda (15) sicakliga bagli degisiklikler nedeniyle daha fazla paketleme bozuklugu ile karakterize edilen bir sivi kristal faz olusturur. Tablo 2, emülsiyonlarin fiziksel ve hemo-uyumluluk özelliklerini üretiminden kisa bir süre sonra göstermektedir. Viskozite degerleri suyunkine (~1 cP) yakin olup, bu emülsiyonlarda düsük yag içerigini göstermektedir (Viskozite ölçüldügünde %10 hacim/hacim, ancak immünizasyon için %2 hacim/hacim'e seyreltilmistir). Zeta potansiyeli degerleri düsük Tm degerleri kullanilan emülsiyonlarda negatifken (örn., DOPC, DLPC), yüksek Tm'li fosfolipitli emülsiyonlarda pozitiftir (DSPC, DPPC). DLPC emülsiyonu digerlerinden biraz daha fazla hemolitik görünmesine ragmen emülsiyonlarin hiçbiri, bir RBC süspansiyonu ile inkübe edildiginde belirgin hemolitik aktivite göstermez. Yakin zamanda, 5 °C'de veya oda sicakliginda depolanan sentetik bir POPC-skualen emülsiyonunun partikül büyüklügü stabilitesinin, bir yumurta PC-skualen emülsiyonuna kiyasla esdeger veya gelistirilmis oldugunu rapor ettik (9). POPC'nin yani sira çesitli diger sentetik fosfolipitleri olan skualen emülsiyonlarini üreterek bu çalismayi gelistirmeyi amaçlamadik. Sekil 1'de farkli sicakliklarda saklanan emülsiyonlarin parçacik boyutu stabilitesi gösterilmektedir. POPC emülsiyonunun baslangiç büyüklügü daha önce rapor edilmis olup (9); burada, bu ayni partinin diger sentetik PC emülsiyonlari ile karsilastirmali olarak uzun vadeli stabilitesini izledik. Faz ayrilmasi gibi fiziksel görünümdeki bariz anomaliler görsel olarak kararsiz olan emülsiyonlar niteligindedir. Tüm sicakliklardan gelen veriler dikkate alindiginda, DMPC ve POPC emülsiyonlari, çalisilan diger emülsiyonlardan daha büyük parçacik büyüklügü stabilitesi göstermistir. Minimal partikül ebadi degisimi 5 °C`de belirgin olmus ve artan sicaklikta kademeli partikül ebadi degisimi görülmüstür (Sekil 1). Nispeten, DOPC emülsiyon damlacik ebadi degisimi, 5 °C'de minimumdur, fakat daha yüksek depolama sicakliklarinda fark edilir. DPPC emülsiyon stabilitesi yüksek derecede sicakliga bagli olmustur. DPPC Trn (41 °C) üzerinde depolandiginda, DPPC emülsiyonu diger emülsiyonlara kiyasla iyi bir stabilite göstermistir. Bununla birlikte, Tm'nin altindaki üç depolama sicakliginda, DPPC emülsiyonu görsel olarak kararsiz olmus veya daha kararli emülsiyonlardan daha fazla parçacik büyüklügü degisikligi göstermistir. Ilginç bir sekilde, en kisa doymus zincirli emülgatörü içeren DLPC emülsiyonu, dört saklama sicakliginda da erken zaman noktalarinda görsel olarak kararsiz olmustur. DSPC emülsiyonu, tüm depolama sicakliklarinda 6 aylik zaman noktasindan önce görsel olarak kararsiz hale gelmistir. Büyüklük polidispersite degerleri daha kararli emülsiyonlar arasinda benzer olmustur (Ek Sekil 1). Lazer saçilimi optik profil emülsiyon stabilitesi ile ilgili tamamlayici bilgi saglar. Yapisma, birlesme, vb. nedenlerden dolayi emülsiyondaki degisiklikler, emülsiyonun dikey profili boyunca isik geçirgenligindeki degisiklikler olarak algilanir (8). Emülsiyonlarin lazer saçilma optik profilleri, 60 °C'de 4 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir ölçülmüstür (Ek Sekil 2). Farkli emülsiyonlardan elde edilen verileri karsilastirmak için, numunenin dikey profilinde belirli bir bölge (25 ila 30 mm) arasindaki entegral iletim Sekil 2'de gösterilmektedir. Entegral iletimdeki bir düsüs, birlesme veya partikül boyutu büyümesinin göstergesidir, çünkü daha büyük partiküller daha fazla isik yaymakta olup, detektöre daha azinin iletilmesine izin verir. Entegral iletimdeki bir artis, genellikle kremaj veya faz ayrilmasinin temsilcisidir. DMPC emülsiyonu, POPC veya DOPC emülsiyonlarina kiyasla çok az degisiklik gösterir ve bu sicaklikta üstün stabilite gösterir. Bu optik profil verileri yukarida açiklanan parçacik boyutunu ve görsel stabilite gözlemlerini dogrular. DLPC, DPPC ve DSPC emülsiyonlari gösterilmemistir, çünkü bu emülsiyonlar, optik profil ölçümleri yapilmadan önce 5 °C`de görsel olarak kararsiz olarak siniflandirilmistir. Beraber alindiginda, fiziksel stabilite verileri, sentetik Iipidler DMPC, POPC ve daha az bir ölçüde DOPC'nin, skualen yaginin en etkili emülsiyonlastiricilari oldugunu göstermektedir. Emülsiyonlarin inaktive edilmis bir influenza asisi ile karistirilmasinin ardindan partikül büyüklügü ve SDS-PAGE analizi iyi bir uyumluluk göstermistir (veriler gösterilmemistir). Bu nedenle, yukaridaki stabil sentetik PC emülsiyonlari, bir yumurta PC emülsiyonu ile birlikte bir fare modelinde biyolojik aktivite açisindan degerlendirilmistir. Emülsiyonlar seçici olarak bir rekombinant sitma proteinine karsi antikor yanitlarini arttirmaktadir. Bir rekombinant sitma antijeni olan Plasmodium berghei Circumsporozoite proteinine (PbCSP) karsi antikor yanitlari, tek basina veya emülsiyon formülasyonlari ile birlestirilen protein ile ikinci bir immünizasyondan iki hafta sonra bireysel fare serumlarinda ölçülmüstür. Anti-PbCSP IgG antikor seviyeleri, emülsiyon varliginda enjekte edilen PbCSP ile immünize edilmis farelerde, sadece protein alan farelere kiyasla anlamli derecede yüksek olmustur (Sekil 3a, p-degerleri <0.05). IgG 1 antikorlari ayrica, yumurta PC, POPC ve DMPC emülsiyonlari ile PbCSP ile immünize edilmis farelerde, sadece protein ile immünize edilmis farelere kiyasla daha yüksek olmustur (Sekil 3b, p-degerleri <0.05). Buna karsilik, çesitli gruplar arasindaki farkliliklar, anti-PbCSP IgG2a antikor seviyelerinde saptanmamistir (Sekil 30, p-degerleri 0.05). Bu veriler, antijene özgü IgG1 antikorlarinin, antijene maruz kalma sirasindaki emülsiyonlari dahil ederek seçici olarak gelistirildigini göstermektedir. Emülsiyonlar, influenza proteinlerine karsi antikor yanitlarini arttirir. Yumurtadan türetilen PC (8, 13) içeren emülsiyonlarla formüle edilen Fluzon enjekte edilen hayvanlarda antikor yanitlarinin arttigini gözlemledik, ancak bu etkilerin sentetik lipitler dahil edildiginde gözlenip gözlenmedigini arastirmadik. Emülsiyonlarin dogal influenza proteinlerine karsi antikor tepkisini arttirip arttirmadigini belirlemek için, farelere, dogal veya sentetik fosfolipidleri içeren emülsiyon formülasyonunun varliginda veya yoklugunda düsük bir Fluzon asisi dozu verdik. Yalnizca Fluzon asisi ile asilama ile karsilastirildiginda, toplam lgG, IgG1 ve lgG2a antikor titreleri emülsiyon formülasyonlari ile Fluzon alan tüm gruplar için daha yüksek olmustur (Sekil Ayrica, emülsiyon formülasyonlarinin kemik iliginin içinde antijene özgü antikor salgilayan plazma hücrelerinin (ASPC) olusturulmasi üzerindeki etkisini de degerlendirdik, çünkü bu uzun ömürlü hücreler antijenik maruziyetin ardindan uzun süre boyunca antikor salgilamakta ve uzun vadeli koruma için bir temel saglayabilmektedir. Genel olarak, sonuçlarimiz çesitli emülsiyon formülasyon gruplari arasinda benzer sayida ASPC'nin üretildigini göstermektedir. Bununla birlikte DOPC emülsiyonu içeren asi tek basina, yalnizca Fluzone'dan önemli ölçüde daha yüksek sayida uzun ömürlü plazma hücrelerini uyarmistir (Sekil 4d). Hemaglutinasyon inhibisyon (HI) deneyi influenza asisi etkinliginin anlamli bir kestirimsel göstergesi olup, genellikle koruma saglamak için yeterli bir titre saglar (16). Emülsiyon formülasyonlarinin, Fluzon asisiyla saglanan korumayi gelistirebilen daha yüksek kaliteli antikorlar üretebilip üretemedigini belirlemek için, tek basina Fluzone ile veya çesitli emülsiyon formülasyonlariyla birlikte Fluzone ile asilanan farelerin Hl titrelerini karsilastirdik. Son immünizasyondan 4 hafta sonra ölçüldügünde, emülsiyon formülasyonunun eklenmesi hem A/Solomon Adalari/ hem de ANVisconsin/ asisina karsi tek basina Fluzon asi bilesenlerinden daha yüksek HI titrelerini indükler (Sekil 5). A/Solomon Adalari/ bilesenine karsi, emülsiyon içeren tüm asilar, sadece Fluzone'dan daha yüksek HI titrelerini indüklemistir. ANVisconsin/ bilesenine karsi, yumurta PC ve DOPC emülsiyonlari, yalnizca Fluzone'dan daha yüksek HI titrelerini indüklemistir. Ek deneyler, DMPC emülsiyonu haricinde, Fluzon arti emülsiyonlari ile immünize edilmis farelerden antijen spesifik T hücrelerinin sayisinin artmasinin, sadece Fluzon ile asilanan farelerden daha yüksek IL-5 seviyeleri salgiladigini göstermistir (Sekil 6, p degerleri <0.05). Birlikte, antikor ve sitokin salgilama verileri, arttirilmis bir Th2 tipi bagisiklik yanitinin, bu emülsiyonlari içeren asilar tarafindan ortaya çikarildigini gösterir. Tartisma Hem sitma hem de influenza asilariyla saglanan antikor yanitlari, emülgatör bilesenler olarak sentetik veya yumurtadan türetilen PC'den bagimsiz olarak esdeger bir sekilde gelistirilmistir. Bu bulgu, dogal bilesenler yerine sentetik esasli PC emülsifiye emülsiyonlarinin sürekli gelisimi için anlamlidir. Literatür, bu tür bilesen ornatiminin biyolojik esdegerliginin neden verilmemesi gerektigini göstermis olup; bir fosfolipid emülgatörün bir baskasi ile ornatilmasinin biyolojik aktivitede farkliliklara neden oldugu çesitli durumlar vardir. Örnegin, Yasuda ve ark. sentetik fosfatidilkolinlerden olusan Iipozomlarin, fareleri intraperitoneal olarak sentetik bir lipit bazli antijenle immünize etmede kullanildiginda, immünojeniklik (dalakta antikor salgilayan hücrelerin sayisiyla gösterildigi üzere) ve lipit faz geçis sicakligi arasinda dogrudan bir korelasyon göstermis olup; daha yüksek faz geçisinin artan immünojeniklikle dogrudan korele edildigi bulunmustur (17). Faz geçis sicakligi ve immünojeniklik arasindaki bu korelasyon mevcut çalismada belirgin olmamistir, ancak en yüksek faz geçis sicakliklarina sahip olan fosfolipitler (DPPC ve DSPC), zayif emülsiyon stabilitesi nedeniyle immünolojik olarak degerlendirilmemistir. Emülgatör kaynaginin önemine dair bir baska örnekte, yakin zamanda bir yag içinde su adjuvan emülsiyonu olan Montanide® ISA 51 ile yapilan klinik deneme sonuçlari, hayvan kaynakli emülgatörün bitki kaynakli malzemeyle degistirilmesinin in vivo etkinlikteki önemli ölçüdeki düsüsün nedeni olabilecegini ortaya çikarmistir (11).Mevcut çalismadaki immünolojik veriler, influenza ve sitmanin, farkli dogal veya sentetik fosfatidilkolinlerle yapilan emülsiyonlar ile adjuvanlanmis asilari benzer antikor tepkileri ortaya çikardigini göstermektedir. Ayrica, bu çalismada kullanilan emülsiyonlarin nitel immünojenikligi literatür raporlari ile uyumlu olup; örnegin, emülsiyonlarin (TLR agonistleri olmadan), sadece antijene kiyasla lgG2a tepkilerinde sadece mütevazi artislari indükledigi görülmektedir (18). influenza asisi ile yapilan deneylerde emülsiyonlar arasinda ince farkliliklar görülmüs olup; bu, Iipit emülgatörlerin biyolojik etkilerde biraz farkli olabilecegini göstermektedir. Bununla birlikte, genel olarak, yumurta PC'nin, basit bir rekombinant antijen sitma asisi veya daha kompleks bir inaktive edilmis bölünmüs virüs influenza asisi baglaminda biyolojik aktivite üzerinde zararli bir etkisi olmadan sentetik fosfolipidlerle degistirilebilecegi anlasilmaktadir. Biyolojik aktivitenin yani sira, emülsiyonlastirici asil zincir yapisina iliskin olarak fiziksel emülsiyon stabilitesini göz önünde bulundurmak önemlidir. Zaman zaman saflastirilmis PC moleküllerinin emülsiyonlari etkili bir sekilde stabilize etmedigi bildirilmistir (1 9). Örnegin, bir DOPC:DPPC:DPPE sentetik karisimi, perflorokarbonlari emülsifiye etmek için kullanildiginda yumurta lesitini ile gözlenen kadar stabil emülsiyonlar üretmemistir (20). Bununla birlikte, saf sentetik PC'Ierin etkili bir sekilde emülsifiye edilmedigi iddiasi, stabilitenin hem yagin hem de emülsiyon yapicinin (22) yapisina ve özelliklerine bagli oldugunu açikça gösteren diger raporlar (21) tarafindan kolayca çürütülür. Emülgatörlerin kendiliginden egriligi veya paketleme yapisi, bunlarin emülsiyonlari stabilize etmedeki etkinliklerini belirler (21). Emülgatör anlik kavisi veya paketlemesi a) fosfolipit faz davranisindan, b) lipit asil zincirlerinin doymamislik derecesinden ve c) yag içinde fosfolipit karisabilirliginden (21) etkilenir. Bu çalismada, Iipit faz geçisinin önemi, en yüksek faz geçis sicakliklarina (DPPC ve DSPC) sahip olan fosfolipidleri içeren emülsiyonlarin, büyüklük ve görsel görünüse bagli olarak çogu depolama sicakliklarinda kararli olmadigi için belirgindir. Ilginç sekilde, DPPC yalnizca ana faz geçis sicakliginin üzerinde depolandiginda kararli bir emülsiyon üretmistir. Bununla birlikte, faz geçis sicakligi fiziksel stabilitenin tek belirleyici faktörü olmamis olup; DMPC emülsiyonunun daha yüksek faz geçis sicakligina sahip olmasina karsin, DMPC'nin DLPC emülsiyonuna göre daha iyi stabilite (faz geçisinin üzerindeki ve altindaki sicakliklar dahil olmak üzere tüm saklama sicakliklarinda) gösterdigine dikkat edilmelidir. Bu nedenle, emülsiyonlastirici-yag etkilesimlerinin karmasikligi, bu çalismada tarif edilen emülsiyonlarin stabilitesinin yalnizca fosfolipid faz geçis sicakligi, asil zincir uzunlugu veya doygunluga dayanarak tahmin edilememesi gerçegiyle kanitlanmaktadir. Benzer sekilde, lipit faz geçis sicakliginin ve asil zincir yapisinin emülsiyon stabilitesi üzerindeki etkisinin, gliseril trioktanoat emülsiyonlari baglaminda tahmin edilmesi zor olmustur: DLPC, DMPC ve DPPC emülsiyonlari DSPC, 1,2-diIinoleoil-sn-glisero-3-fosfokolin ve DOPC emülsiyonlarindan daha kararli olmustur (23). Emülsiyon damlacik ebadi büyümesi iki mekanizma ile gerçeklesebilir: Ostwald olgunlasmasi (Laplace basinç farkliliklari, yag moleküllerinin daha küçük damlaciklardan daha büyük damlaciklara dogru dagilmasina neden olur) veya birlesme (ayri yag damlaciklari birlesip tek bir damlacik olusturur) (24). Skualen esas olarak suda çözünmez oldugu için, Ostwald olgunlasmasinin mevcut is emülsiyonlarindaki ebat büyümesinden sorumlu olmasi muhtemel degildir (25-28). Dolayisiyla, birlesme, burada bildirilen boyut büyümesi için olasi bir mekanizmadir. Birlesme oraninin, artan difüzyon ve damlacik etkilesimi olaylarindan dolayi daha yüksek sicakliklarla artmasi beklenmektedir ve burada sunulan boyut verileri bu beklenti ile tutarlidir. Iyi bir sekilde paketlenmis bir ara yüz tabakasi araciligiyla yag damlasina etkili bir sterik veya elektrostatik stabilizasyon saglamayan emülsiyonlastiricilar, artan birlesme oranlarindan sorumlu olabilir. Bulgularimiz, genel olarak, doymamis Iipit emülsiyonlastiricilarin, skualen emülsiyonlarinin stabilize edilmesinde doymus lipidlerden daha etkili oldugunu, sadece doymus asil Zincirlerini içermesine ragmen oldukça stabil bir emülsiyon üreten DMPC'nin bunun disinda kaldigini göstermektedir. Bu, yalnizca fosfolipid emülgatörlerin faz geçisi ve asil zincir yapisina dayanarak emülsiyon stabilitesini tahmin etmenin zor oldugunu vurgulamaktadir. Son olarak, bu yazida gösterilen çesitli fiziksel karakterizasyon verilerinin önceki literatür raporlari ile iyi korele oldugunu not ettik. Örnegin, sivi kristalli faz Iipitlere karsi jel faz lipitler için daha negatif zeta potansiyeli degerleri önceden belirtilmis olup; bu, sivi faz membranlarda bozukluk ve paketleme kusurlarinda artisla iliskilendirilmistir ve polar bas gruplarinin açikta kalmasina neden olur ve çözelti anyonlar için daha fazla kullanilabilir baglama bölgelerine olanak tanir (29, 30). Ayrica, DLPC emülsiyonunun hafifçe arttirilan hemolitik egilimi, literatürde DLPC ve diger kisa Zincirli fosfolipitlerin lipit faz ayrimi vasitasiyla lipit çift katmanlarda spesifik olmayan gözeneklerin olusturulmasi vasitasiyla hemolizi uyardigi ve böylece iyonlarin permeasyonuna olanak tanidigini bildiren bir baska rapora karsilik gelir (31). Bu çalismada, skualen yagi ve sentetik fosfolipid emülgatörler, yani DMPC veya POPC içeren asi adjuvan emülsiyonlarinin, çesitli sicakliklarda uzun vadeli partikül ebadi stabilitesi gösterdigi gösterilmistir. Genel olarak, yumurta PC ve sentetik PC emülsiyonlari, basit bir rekombinant sitma antijeni veya etkisizlestirilmis bir bölünmüs virüs influenza asisi ile kombinasyon halinde benzer bagisiklik tepkilerini indüklemistir. Bu nedenle, yumurta fosfatidilkolinin sentetik fosfatidilkolin ile ornatilmasi asi adjuvaninin biyolojik aktivitesinin kaybiyla sonuçlanmamistir. Laboratuvarimizda devam eden çalismalar, skualen-fosfolipid emülsiyonlarinin stabilitesini ve immünojenisitesini, diger fosfolipid olmayan yüzey aktif cisimleri yapilari, yani polisorbat 80 ve poloksamer 188 ile karsilastirmaktadir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR