RS59129B1 - Kompozicije koje sadrže bakterijske sojeve - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST

[0001] Ovaj pronalazak je iz oblasti kompozicija koje sadrže bakterijske sojeve izolovane iz digestivnog trakta sisara i upotreba takvih kompozicija u lečenju bolesti, kao što je definisano u patentim zahtevima.

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0002] Humano crevo se smatra da je sterilno in utero, ali je izloženo velikom broju majčinih i okolnih mikroba odmah nakon rođenja. Posle toga, dešava se mikrobna kolonizacija i sukcesija, koji je pod uticajem faktora kao što je vrsta porođaja, okruženje, ishrana i genotip domaćina, od kojih svi utiču na kompoziciju mikrobiota creva, naročito u toku ranog života. Nakon toga, mikrobiot se stabilizuje i postaje sličan kod adulta [1]. Mikrobiot humanog creva obuhvata više od 1500 različitih filotipova pri čemu u nivoima zastupljenosti dominiraju dva glavna bakterijska razdela (phyla), Bacteroidetes i Firmicutes [2]. Uspešne simbiotske veze koje nastaju iz bakterijske kolonizacije humanog creva su doprinele širokoj raznovrsnosti metaboličkih, strukturnih, zaštitnih i drugih korisnih funkcija. Poboljšane metaboličke aktivnosti kolonizovanog creva obezbeđuju da hranljive komponente koje inače ne mogu da se svare budu degradirane uz oslobađanje sporednih proizvoda koji obezbeđuju značajan izvor nutrijenta za domaćina i dodatne zdravstvene koristi. Slično tome, imunološki značaj mikrobiota creva je dobro prepoznat i predstavljen je primerima kod životinja koje su oslobođene klica koje imaju narušen imunski sistem koji se funkcionalno rekonstituiše nakon uvođenja komensalnih bakterija [3-5].

[0003] Dokumentovane su dramatične promene u mikrobiotskom sastavu u gastointestinalnim poremećajima kao što je zapaljenska bolest creva (IBD). Na primer, nivoi Clostridium cluster XIVa su redukovani kod IBD pacijenata dok su brojevi E. coli povećani, što sugeriše na promenu u ravnoteži simbionata i patobionata prisutnih u crevu [6-9, 18].

[0004] U prepoznavanju potencijalnog pozitivnog efekta koji određeni bakterijski sojevi mogu da imaju na životinjsko crevo, različiti sojevi su predloženi za upotrebu u lečenju različitih bolesti (videti, na primer, [10-13]). Brojni sojevi, uključujući uglavnom Lactobacillus i Bifidobacterium sojeve, su predloženi za upotrebu u lečenju različitih poremećaja creva (videti [14] za pregled i videti [15]). Referenca [16] predlaže upotrebu sojeva roda Blautia za upotrebu u podešavanju ravnoteže u digestivnom ekosistemu. U kontekstu reference 16, izmena se odnosi na pospešivanje aktivnosti acetogene bakterisjke flore na štetu metanogenih bakterija i bakterija koje redukuju sumpor. Ovaj dokument prema tome govori samo o povećanju acetogenih bakterija. Ne postoji diskusija koja je u vezi sa raznovrsnošću vrsta koje pripadaju različitim taksonima. Referenca [17] diskutuje o upotrebi Blautia za poboljšanje preživljavanja kod pacijenata koji imaju bolest graft naspram domaćina (graft versus host disease -GVDH). Ona pominje da porast bakterisjkog diverziteta je u vezi sa smanjenom smrtnošću usled GVDH i da povećana količina bakterija roda – Blautia je u vezi sa smanjenjem GVDH. Međutim, ne postoje sugestije da davanje Blautia pacijentu dovodi do povećanja raznovrnosti mikrobiota i/ili indukuje stabilnost mikrobiota kod subjekta.

[0005] Odnos između različitih bakterijskih sojeva i različitih bolesti, precizni uticaji posebnih bakterijskih sojeva na creva i sistemski nivo i na posebne tipove bolesti, su slabo karakterisani i rezultati su danas promenjivi i postavlja se viša pitanja nego što ima odgovora [18].

[0006] Oznaka mnogo humanih bolesti povezanih sa promenama mikrobiota je gubitak diverziteta mikrobita. Za razliku od takozvane disbioze koja je jednostavno izmenjeni sastav mikrobiota u poređenju sa tipičnim nakupinama mikrobiota kod zdravih subjektata, gubitak diverziteta mikrobima može biti kvalifikovan merljivom redukcijom u broju bakterijske klasifikacije zanovane na sekvencama ili operacionim taksonomskim jedinicama (Operational Taxonomic Units- OTUs) u uzorku, tipično određene sa postupcima sekvenciranja amlikona 16S rRNK. Gubitak diverziteta je takođe meren smanjenjem Šenonovog indeksa diverziteta (engl.Shannon Diversity Index), ili Chao-og indeksa. Smanjeni diverzitet mikrobiota je zabeležen u skorim ispitivanjima gojaznosti, inflamatorne bolesti creva (IBD), sindroma nervoznog creva (IBS), dijabetesa tipa 2 i slabih starijih ljudi [20]. Ponovno ustanovljavanje zdravog mikrobima može biti teško jer su bakterije u crevu rezistentne na kolonizaciju. Ovo predstavlja izazov kada pokušava da se leči mikrobiota subjekata koji nisu zdravi povećavanjem diverziteta mikrobiota [19]. Prateći gubitak metaboličke fukcije mikroba se smatra da je faktor koji doprinosi simptomima ovih patofiziologija. Nasuprot zdravih pojedinaca kod kojih je mikrobiota stabilna, mikrobiota pojedinaca koji nisu zdravi kao što su oni koji pate od IBD, IBS i slabih starijih ljudi je nestabilna[18, 20].

[0007] Postoji potreba za karakterisanjem potencijalnih efekata crevnih bakterija tako da mogu biti razvijene nove terapije u kojima se koriste crevne bakterije.

SUŠTINA PRONALASKA

[0008] Pronalazači su razvili nove terapije za lečenje i sprečavanje bolesti i poremećaja povećavanjem ili održavanjem intestialnog diverziteta mikrobiota kod subjekta. Posebno, poronalači su identitifkovali da bakterijski sojvi iz roda Blautia mogu biti efikasni u povećavanju ili održavanju broja i/ili ravnomernosti različitih tipova bakterija u distalnom crevu subjekta. Kao što je opisano u primerima, oralno davanje kompozicija koje sadrže Blautia hydrogenotrophica povećava diverzitet mikrobiona u stolici. Ovaj porast diverziteta je viđen kod zdravih i IBS subjekata. Međutim, IBS subjekti koji primaju placebo su imaji statistički značajno smanjene u diverzitetu mikrobioma u toku ispitivanja. Dodatno, primeri pokazuju za lečenje sa kompozicijama koje sadrže Blautia hydrogenotrophica, ali ne placebo, povećavaju stabilnost u mikrobiote kod IBS subjekata u toku ispitivanja. Stabilnost mikrobiota kod subjekata koji primaju kompoziciju koja sadrži Blautia hydrogenotrophica je bila uporediva sa onom zdravih kontrolnih subjekata.

[0009] Prema tome, u prvom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj vrste Blautia hydrogenotrophica, za upotrebu u lečenju ili prevenciji sindroma nervoznih creva gde lečenje i prevencija obuhvataju povećanje diverziteta mikrobiota kod subjekta.

[0010] Izraz "povećavanje ili održavanje diverziteta mikrobiota" je ovde korišćeno da označi povećavanje ili održavanje broja različitih tipova bakterija i/ili ravnomernost različitih tipova bakterija u mikrobiotu subjekta. Diverzitet mikrobiota je povećan. U nekim izvođenjima, broj različitih rodova bakterija u mikrobioti je povećan . U nekim izvođenjima, broj različitih vrsta bakterija u mikrobioti je povećan. U nekim izvođenjima, broj različitih sojeva bakterija u mikrobioti je povećan. U nekim izvođenjima, diverzitet mikrobiota je održan. U nekim izvođenjima, broj raličitih rodova bakterija u mikrobioti je održan. U nekim izvođenjima, broj različitih vrsta bakterija u mikrobioti je održan. U nekim izvođenjima, broj različitih sojeva bakterija u mikrobioti je održan. U nekim izvođenjima, broj rodova, vrsta i sojeva u mikrobioti je povećan ili održan.

[0011] Povećanje diverziteta mikrobiota može biti za neacetogene bakterije. Takođe može biti za obe acetogene i neacetogene bakterije. Takve bakterije su dobro poznate u stanju tehnike. Ukratko, acetogene bakterije proizvode acetat kao krajnji proizvod anaerobene respiracije ili fermentacije.

[0012] U nekim izvođenjima, gubitak, porast ili održavanje diverziteta mikrobiota može biti kvantifikovano merljivim smanjenjem, povećanjem ili održavanjem, respektivno , kao broj klasifikacije bakterija na osnovu sekvence ili operacionih taksonomskih jedinica (OTUs) u uzorku, tipično određenih sa postupcima sekvenciranja amplikona 16S rRNK. U nekim izvođenjima, gubitak diverziteta može biti meren smanjenjem Šenonovog indeksa diverziteta, ili Chao-vog indeksg. Posledično, u nekim izvođenjima, porast diverziteta može biti meren porastom Šenonovog indkesa diverziteta ili Chao-vog indeksa. Slično, u nekim izvođenjima, održavanje diverziteta može biti mereno istim rezultatima Šenonovog indeksa diverziteta ili Chao-vog indeksa.

[0013] U nekim izvođenjima, povećana je ravnomernost različitih tipova bakterija. U nekim izvođenjima, relativna zastupljenost različitih tipova bakterija u mikrobiotu postaje ujednačenija posle lečenja ili prevencije sa kompozicijom prema pronalasku.

[0014] Pronalazači su takođe razvili nove terapije za lečenje i prevenciju bolesti izazivanjem stabilnosti intestinalnog mikrobiota. Posebno, pronalazači su identifikovali da bakterijski sojevi roda Blautia izazivaju stabilnost intestinalnog mikrobiota. Pod "izazivaju stabilnost" se misli da diverzitet mikrobiota ostaje stabilan i takođe relativan broj različitih rodova u mikrobiotu ostaje stabilan. Ovo je važno jer brojne bolesti i poremećaji, uključujući IBS i IBD, su karakterisani sa smanjenom stabilošću mikrobiota. Kao što je opisano u primerima, oralno davanje kompozicija koje sadrže Blautia hydrogenotrophica izazivaju stabilnost mikrobiota u stolici. Prema tome, u drugim izvođenjima, opis obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj roda Blautia, za upotrebu u postupku izazivanja stabilnosti mikrobiota kod subjekta. Slično, takođe je obezbeđen postupak za izazivanje stabilnosti mikrobiota kod subjekta koji obuhvata upotrebu bakterijskog soja roda Blautia.

[0015] U nekim izvođenjima opisa, relativni brojevi različitih bakterijskih vrsta u mikrobiotu subjekta postaju stabilnije posle lečenja ili prevencije sa kompozicijom prema opisu, na primer kod subjekta kod koga je dijagnozirana bolest ili poremećaj karakterisan smanjenjem diverziteta mikrobiota. U nekim izvođenjima opisa, relativan broj različitih bakterijskih rodova u mikrobiotu subjekta postaje stabilniji posle tretmana i prevencije sa kompozicijom prema opisu, na primer kod subjekta kod koga je dijagnozirana bolest ili poremećaj karakterisan smanjenjem diverziteta mikrobiota. Stabilnost mikrobiota subjekta može biti procenjivan upoređivanjem mikrobioma subjekta u dve različite vremenske tačke.Ukoliko postoji razlika u mikrobioti, ovo može biti indikacija za bolest ili poremećaj koji je prisustan . U nekim izvođenjima, dve različite vremenske tačke su bar tri dana razdvojene (npr. bar 1 nedelja, 2 nedelje, 1 mesec, 3 meseca, 6 meseci, 1 godina, 2 godine razmaka). U nekim izvođenjima, dve različite tačke su razdvojene 3-7 dana, 1-2 nedelja, 2-4 nedelja, 4-8 nedelja, 8-24 nedelja, 24-40 nedelja, 40-52 nedelja ili više od 52 nedelja. U nekim izvođenjima, više od dve vremenske tačke su korišćene, npr. tri, četiri, pet ili više od pet vremenskih tačaka. Pogodni intervali su izabrani u različitim vremenskim tačkama, na primer kao što je ovde navedeno.

[0016] Bakterijski soj je Blautia hydrogenotrophica i poželjno je bakterija koja je depenovnana pod pristupnim brojem DSM 10507/14294.

[0017] U nekim izvođenjima, diverzitet mikrobiota se odnosi na diverzitet mikrobiota u stolici subjekta. U nekim izvođenjima, diverzitet mikrobiota odnosi se na diverzitet mikrobiota u uzorku stolice subjekta. U nekim izvođenjima, diverzitet mikrobiota se odnosi na diverzitet mikrobiota u distalnom crevu subjekta. U nekim izvođenjima, diverzitet mikrobiota se odnosi na diverzitet mikrobiota u gastrointestinalnom traktu subjekta. U nekim izvođenjima, diverzitet mikrobiota prema diverzitetu mikrobiona u cekumu. U nekim izvođenjima, diverzitet mikrobiota se odnosi na diverzitet mikrobiota debelom crevu.

[0018] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj vrste Blautia hydrogenotrophica, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije sindorma nervoznih creva gde lečenje ili prevencija obuhvataju povećanje diverzitea mikrobiota. U nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija pomoću kompozicije prema pronalasku dovodi do diverziteta mikrobiota do nivoa prisutnog u zdravom subjektu. U nekim izvođenjima, lečenje ili sprečavanje pomoću kompozicije prema pronalasku dovodi do diverziteta mikrobiota koji se povećva do nivoa viših od onih prisutnih kod nekih zdravih pojedinaca. U nekim izvođenjima, zdrav pojedinac je istog/sličnih godina kao subjekt i/ili slične/iste rase kao subjekt. Slično, pronalazak takođe obezbeđuje postupak lečenje ili prevencije bolesti ili poremećaja u vezi sa nivom diverziteta mikrobiota koji je smanjen u odnosu na diverzitet mikrobiota zdravog subjekta u kome postupak obuhvata davanje kompozicije koja sadrži bakterijski soj roda Blautia. Primeri bolesti ili poremećaja u vezi sa smanjenim nivoom diverziteta mikrobiota uključuju ali bez ograničenja samo na njih: IBS, IBD [21], gojaznost [22], dijabetes tipa 2, infektivne bolesti, alergijske bolesti. Autoimune bolesti i metaboličke bolesti/poremećaji. Lečenje ilii prevencija ovih bolesi i poremmećaja je obuhvaćena pronalaskom. U nekim izvođenjima, bolest ili poremećaj je IBS.

[0019] U nekim izvođenjima, subjekt je beba ili dete sa smanjenim diverzitetom mikrobiota u poređenju sa zdravom bebom ili detetom, respektivno. Primećeno je da neka deca koja su razvila alergijsku bolest kasnije u životu su imala smanjeni diverztitet fekalnog mikrobiota kao odojčad stara 1 nedelju [23]. Prema tome, u nekim izvođenjima, odojče je staro manje od 1 nedelje, manje od 2 nedelje, manje od jednog meseca, i manje od dva meseca ili manje od četiri meseca. U nekim izvođenjima, subjekt je odojče koje nije došlo na svet vaginalnim porođajem. Na primer, u nekim izvođenjima, subjekt je odojče koje je došlo na svet carskim rezom. Smanjeni diverzitet mikrobiota je takođe zabeležen kod slabih starijih subjekata. U nekim izvođenjima, prema tome, subjekt je stariji subjekt, na primer slabiji stariji subjekt. U nekim izvođenjima, subjekt ima 65 ili više godina (npr.70 ili više, 75 ili više, 80 ili više, 85 ili više ili 90 ili više godina) [20].

[0020] Procenjeno je da pojedinačni humani pojedinac ima približno 101 različitih bakterijskih vrsta i 195 različitih sojeva u njegovoj mikrobioti [24]. Prema tome, u nekim izvođenjima, kompozicija za upotrebu u lečenju subjekta ima manje od 101 različite bakterijske vrste (npr. manje od 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 ili 70 bakterijskih vrsta) i/ili manje od 195 različitih vrsta (npr. manje od 194, 193, 192, 191, 190, 189, 188, 187, 186, 185, 183, 180, 175, 170, 165, 160, 150, 140 bakterijskih vrsta) u njegovoj mikrobioti. U nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovodi do povećanja diverziteta mikrobiota na više od 80 bakterijskih vrsta (npr. više od 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100 bakterijskih vrsta) ili do 101 bakterijskih vrsta. Na primer, u nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovodi do povećanja diverziteta mikrobiota do više od 90 bakterijski vrsta. Na primer, u nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovodi do povećanja diverziteta mikrobiota na više od 95 bakterijskih vrsta. Na primer, u nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovodi do povećanja diverziteta mikrobiota na više od 97 bakterijskih vrsta. Na primer, u nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovodi do povećanja diverziteta mikrobiota na više od 99 bakterijskih vrsta. U nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovodi do povećanja diverziteta mikrobiota do više od 160 bakterijskih vrsta (npr. više od 165, 170, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193 ili 194 bakterijskih vrsta) ili do 195 bakterijskih vrsta. Na primer, u nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovodi do povećanja diverziteta mikrobiota na više od 175 bakterijskih sojeva. Na primer, u nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovode do porasta diverziteta mikrobiota na više od 185 bakterijskih vrsta. Na primer, u nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovodi do povećanja diverziteta mikrobiota na više od 190 bakterijskih vrsta.

[0021] U nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovodi do povećanja diverziteta mikrobiota za bar jedan bakterijski rod (npr. za bar dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset bakterijskih rodova). U nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovodi do povećanja diverziteta mikrobiota za bar jednu bakterijsku vrstu (npr. za bar dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, 12, 15, 17 ili 20 bakterijskih vrsta). U nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija dovodi do povećanja diverziteta mikrobiota za bar jedan bakterijski soj (npr. za bar dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, 12, 15, 17, 20 ili 25 bakterijskih sojeva).

[0022] U nekim izvođenjima, opis obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj roda Blautia, za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja bolesti ili poremećaja u vezi sa smanjenom stabilošću mikrobiota u poređenju sa stabilnošću mikrobiota zdravih subjekata (ili u poređenju sa populacijom zdravih subjekata). Pod "smanjenom stabilnošću mikrobiota " se smatra da diverzitet mikrobiota ne ostaje stabilan i takođe da relativan broj različitih rododva u mikrbiomu ne ostaje stabilan kao stabilnost primećena kod zdravih subjekata ili u populaciji zdravih subjekata . U nekim izvođenjima, izazivajući stabilnost mikrobiota dovodi do stabilnosti koja je izazvana do sličinh nivoa koji su prisustni u zdravim subjektima, ili u populaciji zdravih subjekata. U nekim izvođenjima, izazivanje stabilnosti mikrobiota dovodi do stabilnosti koja je izazvana na istom nivou kao kod zdravih subjekata, ili na populaciji zdravih subjekata. Slično, opis obezbeđuje postupak lečenja ili sprečavanja bolesti ili stanja u vezi sa smanjenom stabilnošću mikrobiota gde postupak obuhvata davanje kompozicije koja sadrži bakterijski soj roda Blautia. Na primer, patogeneza nekih bolesti ili poremećaja je karakterisana smanjenom stabilnošću mikrobiota. Primeri takve bolesti i poremećaji su IBS, IBD, dijabetes (npr. dijabetes tipa 2), alergijske bolesti, autoimune bolesti i metaboličke bolesti/poremećaji. Prema tome, u nekim izvođenjima, opis obezbeđuje kompoziciju koja se sastoji od bakterijskog soja roda Blautia, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije poremećaja u vezi sa smanjenom stabilošću mikrobiota, gde lečenje ili prevencija obuhvata izazivanje stabilnosti mikrobiota. U nekim izvođenjima, bolest ili poremećaj je izabran iz IBS, IBD, dijabetesa (npr dijabetesa tipa 2), alergijskih bolesti, autoimunih bolesti i metaboličkih bolesti/poremećaja . U nekim izvođenjima, bolest ili poremećaj je IBS ili IBD. U nekim izvođenjima, bolest ili poremećaj je IBS. Prema tome, u nekim izvođenjima, opis obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj roda Blautia, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju IBS ili IBD, gde poremećaj ili prevencija obuhvataju izazivanje stabilnosti mikrobiota.

[0023] U nekim izvođenjima,pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj vrste Blautia hydrogenotrophica, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju sindroma nervoznih creva gde lečenje ili prevencija obuhvataju povećanje diverziteta mikrobiota kod subjekta, dalje obuhvata dijagnoziranje subjekta koji ima smanjeni nivo diverziteta mikrobiota i zatim ukoliko je nađen smanjen nivo diverziteta, davanje kompozicije koja sadrži bakterijski soj roda Blautia subjektu

[0024] U nekim izvođenjima, opis obezbeđuje postupak lečenja ili prevencije bolesti ili poremećaja u vezi sa smanjenom stabilnošću mikrobiota u odnosu na stabilnu mikrobiotu kod zdravog subjekta gde postupak obuhvata dijagnoziranje subjekta koji ima smanjenu stabilnost mikrobiota i zatim ukoliko je nađena smanjena stabilnost, davanje kompozicije koja sadrži bakterijski soj roda Blautia subjektu.

[0025] Bakterijski soj u kompoziciji je Blautia hydrogenotrophica. Blisko povezani sojevi imaju 16s rRNK sekvencu koja je bar 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sa 16s rRNK sekvencom bakterijskog soja Blautia hydrogenotrophica. Bakterijski soj može imati 16s rRNK sekvencu koja je bar 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sa SEQ ID NO:5. Poželjno, bakterijski soj ima 16s rRNK sekvencu SEQ ID NO:5. Najpoželjnije, bakterijski soj u kompoziciji je Blautia hydrogenotrophica soj koji je deponovan pod pristupnim brojem DSM 10507/14294.

[0026] U izvesnim brojevima, kompozicija prema pronalasku je za oralno davanje. Oralno davanje sojeva prema pronalasku može biti efikasno za povećanje diverziteta mikrobiota i/ili izazivanja stabilnosti mikrobiota. Takođe, oralno davanje je konvencionalno za subjekte i one koji primenjuju pronalazak, i omogućava davanje i/ili parcijalnu ili potpunu kolonizaciju creva.

[0027] U izvesnim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosača.

[0028] U izvesnim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku obuhvata bakterijski soj koji je bio liofiliziran. Liofilizacija je efikasna i konvencionalna tehnika za dobijanje stabilne kompozicije koja dozvoljava davanje bakterija i pokazano je da obezbeđuje efikasne kompozicije u primerima.

[0029] U izvesnim izvođenjima,pronalazak obezbeđuje proizvod za ishranu koji obuhvata kompoziciju koja je definisana u patentim zahtevima.

[0030] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju vakcine koja sadrži kompoziciju koja je definisana u patenim zahtevima.

KRATAK OPIS NACRTA

[0031]

Slika 1: Upoređivanje mikrobiota kod zdravih i IBS pacijenata.

Slika 2: Upoređivanje diverziteta mikrobiota između dana 16 i dana 1 za zdrave i IBS pacijente posle lečenja sa BlautiX ili placebom.

Slika 3: A) Međusobna povezanost mikrobiota kod zdravih pacijenata dana 1, dana 16 i na kraju ispitivanja posle lečenja sa BlautiX, B) Međusobna povezanost mikrobiota kod IBS pacijenata dana 1, dana 16 i na kraju ispitivanja posle tretmana sa BlautiX. Rezultati međusobne povezanosti viđeni dana 1, dana 16 i na kraju ispitivanja zdravih pojeinaca koji su prikazani na slici 3A su takođe prikazani na slikama 3A1, 3A2 i 3A3, respektivno. Rezultati međusobne povezanosti viđeni dana 1, dana 16 i na kraju ispitvinja za IBS pacijente koji su prikazani na slici Slika 3B su takođe prikazani na slikama 3B1, 3B2 i 3B3, respektivno.

Slika 4: Upoređivanje nestabilnosti profila mikrobiota kod zdravih i IBS pacijenata posle lečenja sa BlautiX ili placebom A) dana 16 i dana 1, B) na kraju ispitivanja i dana 1 i C) na kraju ispitivanja i dana 16.

Slika 5: Upoređivanje diverziteta mikrobioma u različitim vremenskim tačkama za zdrave i IBS pacijente posle tretmana sa BlautiX.

Slika 6: A) Višestruka ekskluziona mreža zdravih pacijenata dana 1, dana 16 i na kraju ispitivanja posle tretmana sa BlautiX, B) Zajednička ekskluziona mreža kod IBS pacijenata dana 1, dana 16 i na kraju ispitivanja posle tretmana sa BlautiX. Zajednički eksluzioni rezultati viđeni dana 1, dana 16 i na kraju ispitivanja za zadrave pojedince koji su prikazani slici 6A su takođe prikazani na slikama 6A1, 6A2 i 6A3, respektivno. Višestruki eksluzioni rezultati su viđeni dana 1, dana 16 i na kraju ispitivanja za IBS pacijente koji su prikazani na slici 6B su takođe prikazani na slikama 6B1, 6B2 i 6B3, respektivno.

Slika 7: Hijerarhijsko grupisanje mikrobiota.

Slika 8: Upoređivanje profila mikrobiota pre (D14) i posle (D32) tretmana sa Blautix na osnovu Bray-Curtis-ovih različitosti.

Slika 9: (A) Vizuelizacija profila mikrobiota različitih grupa D-14 pomoću PCoA zasnovanog na Bray-Curtis-ovim različitostima. (B) Vizuelizacija profila mikrobiota grupa D14 pomoću PCoA zasnovanom na Bray-Curtis-ovim različitostima. (C) Značajne razlike (p-vrednosti=0.002) u profilima mikrobitoa za grupuBlautix su viđene duž vremenskih tački.

Slika 10: Upoređivanje profila mikrobiota za tretman sa Blautix u ispitivanim tačkama (D-14, D-1, D34) na osnovu Bray-Curtis-ovih različitosti.

OPIS PRONALASKA

Bakterijski sojevi

[0032] Kompozicije za upotrebu prema pronalasku sadrže bakterijski soj roda Blautia hydrogenotrophica. Primeri pokazuju da bakterija ove vrste su korisne za povećanje diverziteta mikrobiota i/ili izazivanje stabilnosti mikrobiota. Najpoželjnija je bakterija deponovana pod pristupnim brojem DSM 10507/14294.

[0033] Vrstwe Blautia su gram-reakcija-pozitivne, nepokretne bakterije koje mogu biti ili kokoidne ili ovalne i sve su obavezno anarobne koje proizvode sirćetnu kiselinu kao glavni krajnji proizvod glukozne fermentacije [25]. Blautia može biti izolovana iz humanog creva, mada je B. producta je izolovana iz uzorka septikemije.

[0034] Blautia hydrogenotrophica (ranije poznata kao Ruminococcus hydrogenotrophicus) je izolovana iz creva sisara, je striktno anaerobna i metaboliše H2/CO2do acetata, koji može biti važan za humanu ishranu u zdravlje. Tip soja Blautia hydrogenotrophica je S5a33 = DSM 10507 = JCM 14656. Pristupni broj GenBank za 16S rRNK gensku sekvencu Blautia hydrogenotrophica soja S5a36 je X95624.1 (opisana ovde kao SEQ ID NO:5). Ovaj primer Blautia hydrogenotrophica soja je opisan u [25] i [26]. S5a33 soj i S5a36 soj odgovara dva subklona acetogenog soja izovlovanog iz fekalnog uzorka zdravog subjekta. One pokazuju identičnu morfologiju, fiziologiju i metabolizam i imaju identične 16S rRNK sekvence. Prema tome, u nekim izvođenjima, Blautia hydrogenotrophica za upotrebu u pronalasku ima 16S rRNA sekvencu SEQIDNO:5.

[0035] Blautia hydrogenotrophica bakterija je deponovana pod pristupnim brojem DSM 10507 i takođe pod pristupnim brojem DSM 14294 je testirana u primerima i takođe se na nju poziva kao na soj BH. Soj BH je deponovan pod Deutsche Sammlung von Mikroorganismen [German Microorganism Collection] (Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany) 10. maja 2001 kao "Ruminococcus hydrogenotrophicus" pod pristupnim brojem DSM 10507 i takođe pod pristupnim brojem DSM 14294. Deponent je bio INRA Laboratoire de Microbiologie CR de Clermont-Ferrand/Theix 63122 Saint Genes Champanelle, France. Vlasništno nad bakterijom deponovanom kao DSM 10507 i DSM 14294 je preneto prenosom na 4D Pharma Plc.

[0036] Bakterijski sojvi blisko povezani sa testiranim sojem u primerima takođe jeočekivano da budu efikasni u povećanju diverziteta mikrobiota i/ili izazivanja stabilnosti mikrobiota. U izvesnim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sa 16s rRNK sekvencom bakterijskoj soja Blautia hydrogenotrophica. Poželjno, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sa SEQ ID NO:5. Poželjno, bakterijski soj za upotrebu prema pronalasku ima 16s rRNK sekvencu koja ima sekvencu SEQ ID NO:5.

[0037] Blautia hydrogenotrophica sojevi koji su biotipovi bakterije deponovane pod pristrupnim brojem DSM 10507/14294 se takođe očekuje da su efikasni za povećanje diverziteta mikrobiota i/ili izazivanje stabilnosti mikrobiota. Biotip je blisko u vezi sa sojem koji ima iste ili veoma slične fiziološke ili biohemijske karakteristike.

[0038] Sojevi koji su biotipovi bakterije koja je deponovana pod pristupnim brojem DSM 10507/14294 i koji su pogodni za upotrebu prema pronalasku mogu biti identifikovani sekvenciranjem druge nukleotidne sekvence za bakteriju deponovanu pod pristupnim brojem DSM 10507/14294. Na primer, suštinski ceo genom može biti sekvenciran i soj biotipa za upotrebu prema pronalasku može imati bar 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identičnost sekvence duž bar 80% celog njegovog genoma (npr. duž bar 85%, 90%, 95% ili 99%, ili duž njegovog celog genoma). Na primer, u nekim izvođenjima, soj biotipa ima bar 98% identičnu sekvencu duž bar 98% njegovog genoma ili bar 99% identiču sekvencu duž 99% njegovog genoma. Druge pogodne sekvence za upotrebu u identifikovanju soja biotipa mogu uključivati hsp60 ili repetativne sekvence kao što su BOX, ERIC, (GTG)5, ili REP ili [28]. Sojevi biotipova mogu imati sekvence sa bar 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identitičnosti sekvence sa odgovarajućom sekvencom bakterije deponovane pod pristupnim brojem quence DSM 10507/14294. U nekim izvođenjima, soj biotipa ima sekvencu koja je bar 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identičnosti sekvence sa odgovarajućom sekvencom soja Blautia hydrogenotrophica soja deponovanom pod pristupnim brojem DSM 10507/14294 i sadrži 16S rRNK sekvencu koja je bar 99% identična (npr. bar 99.5% ili bar 99.9% identična) sa SEQ ID NO:5. U nekim izvođenjima, soj biotipa ima sekvencu koja sa bar 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identičnošću sekvence sa odgovarajućom sekvencom Blautia hydrogenotrophica soja deponovanom pod pristupnim brojem DSM 10507/14294 i ima 16S rRNK sekvencu SEQ ID NO:5.

[0039] Alternativno, sojevi koji su biotipovi bakterije deponovane pod pristupnim brojem DSM 10507/14294 i koji su podgodni za upotrebu u pronalasku mogu biti identifikovani korišćenjem pristupnog broja DSM 10507/14294 deponovanog i analiza restrikcionih fragmenata i/ili PCR analize, na primer korišćenjem polimorfizma dužine fluorescentnih pojačanih fragmenata (fluorescent amplified fragment length polymorphism - FAFLP) i repetativnih DNK elemenata (rep)-PCR otisak prsta, ili proteinska potvrda, ili parcijalno 16S ili 23s rDNK sekvencioniranje. U poželjnim izvođenjima, takve tehnike mogu biti korišćene da se identifikuju drugi sojevi Blautia hydrogenotrophica.

[0040] U izvesnim izvođenjima, sojevi koji su biotipovi bakterije deponovane pod pristupnim brojem DSM 10507/14294 i koje su pogodne za upotrebu u pronalasku su sojevi koji obezbeđuju isti uzorak kao bakterija deponovana pod pristupnim brojem DSM 10507/14294 kada je anaizirana povećavanjem ribozomalne DNK restrikcione analize (ARDRA), na primer kada se koriste Sau3AI restrikcioni enzimi (na primer postupci i uputstvo videti, na primer [29]). Alternativno, sojevi biotipa su identifikovani kao sojevi koji imaju istu uzorak fermentacije ugljenihidrata kao bakterije deponovane pod pristupnim brojem DSM 10507/14294.

[0041] Ostali Blautia hydrogenotrophica sojevi koji su korisni u kompozicijama i postupcima prema pronalasku, kao što su biotipovi bakterije deponovane pod pristupnim brojem DSM 10507/14294, mogu biti identifikovani korišćenjem odgovarajućeg postupka ili strategije, uključujući testove opisane u primerima. Na primer, sojevi za upotrebu pronalaska mogu biti identifikovani kultivisanjem bakterije i davanjem pacovima da bi se testirali u testu distenzije. Posebno, bakterijski sojevi imaju sličnan uzorak rasta, metabolički tip i/ili površinu antigena onima bakterija deponovanim pod pristupnim brojem DSM 10507/14294 koji mogu biti korisni u pronalasku. Korisan soj će imati uporediv sa izmenjenom aktivnošću mikrobiota prema DSM 10507/14294 strain. Posebno, soj biotipa će izazivati uporedive efekte na mikrobiotu efektima prikazanim u primerima, koji mogu biti identifikovani korišćenjem protokola kultivisanja i davanja opisanih u primerima .

[0042] Naročito poželjan soj prema pronalasku je Blautia hydrogenotrophica soj deponovanom pod pristupnim brojem DSM 10507/14294. Ovo je kao primer BH soj testiran u primerima i prikazan kao efikasan za povećavanje diverziteta mikrobiota i/ili izazivanjem stabilnosti mikrobiota. Prema tome, pronalazak obezbeđuje ćeliju, kao što je izolovana ćelija Blautia hydrogenotrophica soja deponovana pod pristupnim brojem DSM 10507/14294, ili njegog derivata za upotrebu u terapiji, naročito za ovde opisane bolesti i poremećaje .

[0043] Derivat soja deponovanog pod pristupnim brojem DSM 10507/14294 može biti soj ćerka (potomstvo) ili kultivisani soj (subkloniran) iz originalnog. Derivat soja prema pronalasku može biti modifikovan, na primer na genetičkom nivou bez uništavanja biološke aktivnosti. Posebno, izvedeni soj prema pronalasku je terapeutski aktivan. Derivat soja će imati uporedivu aktivnost modulacije mikrobiota u odnosu na originalni DSM 10507/14294 soj. Posebno, derivat soja će izazvati uporedive efekte na mikrobiotu pokazane u primerima, koji mogu biti identifikovani korišćenjem protokola kultivisanja i davanja opisanim u primerima. Derivat DSM 10507/14294 soja će generalno biti biotip DSM 10507/14294 soja.

[0044] Reference na ćelije Blautia hydrogenotrophica soja deponovanog pod pristupnim brojem DSM 10507/14294 obuhvata bilo koje ćelije koje imaju iste karakteristike sigurnosti i terepautske efikasnosti pod pristupnim brojem DSM 10507/14294, ali takve ćelije obuhvataju pronalazak.

[0045] U poželjnim izvođenjima, bakterijski sojevi u kompozicijama prema pronalasku su živi i u stanju da parcijalno ili potpuno kolonizuju creva.

Teraputske upotrebe

[0046] Kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u povećanju diverziteta mikrobiota kao što je definisano u patentim zahtevima. Smanjeni diverzitet mikrobiota je u vezi sa brojnim patološkim bolestima i poremećajima, i primeri prikazuju da kompozicije prema pronalasku mogu biti efikasne za povećavanje diverziteta mikrobiota. Prema tome, bolest ili poremećaj koji su lečeni ili sprečeni pomoću kompozicije prema pronalasku su poželjno bolest i poremećaj u vezi sa nivoom diverziteta mikrobita koji je smanjen u odnosi na diverzitet mikrobiota zdravog subjekta kao što je definisano u patentim zahtevima. Prema tome, u nekim izvođenjima, bolest ili poremećaj koji mogu biti u vezi sa nivoom diverziteta mikrobiota koji je smanjen u odnosu na diverzitet mikrobiota zdravog subjekta i takođe će biti u vezi sa smanjenom stabilnošću mikrobiota.

[0047] Kompozicije prema pronalasku su korisne u lečenju ili prevenciji IBS. Lečenje ili prevencija obuhvataju povećanje diverziteta mikrobioata ili izazivanje stabilnosti mikrobiota kod subjekta.

[0048] U poželjnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku sadrže bakteriju deponovanu pod pristupnim brojem DSM 10507/14294 i za upotrebu u povećanju diverziteta mikrobiota subjekta u toku lečenja IBS.

[0049] U izvesnim izvođenjima, kompozicije su za upotrebu kod subjekta koji pokazuje, ili se očekuje da pokazuje, smanjene nivoe diverziteta mikrobiota, na primer, u poređenju sa zdravim subjektom, ili populacije zdravog subjekta. Na primer, u nekim izvođenjima, kompozicija za upotrebu u lečenju subjekta koji ima manje od 101 različitih bakterisjkih vrsta (npr. manje od 100, 99, 98, 97, 96, 95, 93, 90, 85, 80, 75 ili 70 bakterijskih vrsta) i/ili manje od 195 različitih sojeva (npr. manje od 193, 190, 187, 185, 183, 180, 175, 170, 165, 160, 150, 140 bakterijskih sojeva) u njihovim mikrobiotama. Na primer, u nekim izvođenjima, kompozicija je za upotrebu u lečenju subjekta koji ima bar jedan bakterijski rod (npr. bar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 bakterijskih rodova) ređih u njihovim intestinalnim mikrobiotama u poređenju sa zdravim subjektom ili u poređenju sa zdravim subjektima. U nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija obuhvata korak dijagnoziranja kod subjekta koji ima smanjeni nivo diverziteta mikrobiota i zatim ukoliko je smanjen nivo diverziteta mikrobiota nađen kao prisutan, subjekat je zatim tretiran sa kompozicijom prema pronalasku.

[0050] U izvesnim izvođenjima, subjekt je odojče. U izvesnim izvođenjima, subjekat je dete. U izvesnim izvođenjim asubjekt je odrasla jedinka.

[0051] U izvesnim izvođenjima, subjekat je zdrav subjekat . Na primer , u nekim izvođenjima u kojima je kompozicija korišćena za sprečavanje bolesti ili poremećaja, subjekt je zdrav subjekt, opciono onaj identifikovan da je u riziku od razvijanja bolesti ili poremećaja karakterisanog redukcijom diverziteta mikrobiota .

[0052] U izvesnim izvođenjima, subjekt je ranije primio, prima ili će primiti antibiotski tretman. Prema tome, i nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija obuhvataju davanje kompozicije prema pronalasku posle, zajedno sa ili pre antibiotskog tretmana. Kompozicija prema pronalasku i jedan ili više antibiotika mogu biti za odvojeno, simultano ili sekvencionalno davani.

[0053] U nekim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku je za upotrebu u postupku povećavanja diverziteta mikrobiota kod subjekta koji ima povećani nivo vodonika u njegovom dahu u odnosu na

1

zdravog subjekta. U nekim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku je za upotrebu u smanjenju nivoa vodonika u dahu subjekta koji pokazuje ili za koga se očekuje da pokazuje snižene nivoe diverziteta njegovog mikrobiota. Subjekat je poželjno subjekat kod koga je kod subjekta dijagnozirano da ima IBS. Lečenje sa kompozicijom prema pronalasku smanjuje nivo vodonika detektovanog u testru vodonika u dahu. Prema tome, nivoi vodonika su poželjno procenjivani pomoću testa vodonika u dahu. Test vodonika u dahu je dobro poznat u stanju tehnike i takozvana osoba iz struke će znati kako da izvede takav test. U nekim izvođenjima, subjektu se daje laktuloza kao supstrat za test.

[0054] Test vodonika u dahu je takođe koristan alat za praćenje efikasnosti ili verovatne efikasnosti povećavanje diverztiteta mikrobita i lečenje ili prevenciju korišćenjem kompozicije pema pronalasku. Na primer, smanjeni nivo vodonika detektovanog u dahu subjekta posle lečenja sa kompozicijom prema pronalasku može ukazati da lečenje ima povećanu, stabilišući, terapeutski ili prevntivan efekat. Prema tome, u nekim izvođenjima upotrebe prema pronalasku dalje sadrže praćenje nivoa vodonika u subjektovom dahu u toku i/ili posle sledećih tretmana sa kompozicijom prema pronalasku i na taj način procenjivanje efikasnosti ili verovatnosti efikasnosti povećanja, stabilizacije, lečenja ili prevencije. Na primer, nivoi vodonika mogu biti praćeni jedan ili više (npr. 1, 2, 3, 4 ili više od 4) puta, na primer, uključujući pre lečenja, na početku lečenja, u toku lečenja, na kraju lečenja i/ili posle lečenja, ako je poželjno. U nekim izvođenjima, nivo vodonika u dahu subjekta na kraju i/ili posle perioda doziranja (u toku kog je kompozicija davana subjektu) je poređen sa nivoom na početku i/ili pre perioda doziranja i smanjenje u novoima ukazuju na efikasnost ili verovatnu efikasnost u povećanju, stabilizaciji, lečenju ili prevenciji. Na primer, u izvođenjima u kojima je period doziranja 16 dana, može biti poželjno uzeti merenja dana 1 i dana 16, ili na primer dana 1, dana 2, dana 15 i dana 16. U nekim izvođenjima, mogu biti uzeta višestruka merenja i dobijena srednja vredednost ovih h merenja (na primer, srednja vrednost dana 1 i dana 2 i srednja vrednost dana 15 i dana 16). U nekim izvođenjima, redukcija u bar 40 ppm nivoa vodonika Cmax ukazuje da povećanje, stabilizacija, tretman ili prevencija je efikasna ili da je verovatno efikasna. U nekim izvođenjima, nivo vodonika u dahu subjekta je meren samo jednom, na primer, na kraju ili posle tretmana i nalaženjem da je nivo na ili blizu prethodno određene vrednosti je indikativno da je povećana stabilizaciju, tretman ili prevencija verovano da bila efikasna. Test vodonika u dahu je standardni test i tako prethodno određeni nivoi su poznati u stanju tehnike.

[0055] Tretiranje ili prevencija mogu se odnositi na, na primer, na ublažavanje jačine simptoma ili smanjenje u učestalost egzacerebracije ili opsega ili pokretača koji su problem za subjekta.

[0056] Bakterije u mikrobioti mogu biti detektovane u fecesu subjekta, korišćenjem standarnih tehnika, kao što su qPCR tehnike korišćene u primerima.

Načini davanja

[0057] Poželjno, kompozicije iz pronalaska su namenjene za davanje u gastrontestinalnom traktu da bi se omogućilo davanje u i / ili parcijalna ili ukupna kolonizacija creva sa bakterijskim sojem iz pronalaska, kako je definisano u zahtevima. Generalno, kompozicije iz pronalaska su za oralno ordiniranje, ali mogu da se ordiniraju rektalno, intranazalno, ili bukalnim ili podjezičnim načinima za davanja.

[0058] U određenim izvođenjima, kompozicije iz pronalaska mogu da se daju u obliku pene, kao sprej ili gel.

[0059] U određenim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku mogu da se daju kao supozitorije, kao rektalna supozitorija, na primer u obliku teobrom ulja (kakao butera), sintetičkih čvrstih masti (npr. suppocire, witepsol), glicero-želatina, polietilen glikola, ili kompozicija glicerinskog sapuna.

[0060] U određenim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku je davana u gatroinestinalni trakt preko cevi, kao što je nazogastrična cev, orogastrična cev, gastrična cev, jejunostomska cev (J cev), perkutana endoskopska gastrostomija (PEG), ili port, kao što je port kroz grudni zid koji omogućava pristup stomaku, jejunumu i drugi odgovarajući pristupni portovi.

[0061] Kompozicije preama pronalasku mogu jednom da se daju, ili mogu sekvencijalno da se daju kao deo režima lečenja. U određenim izvođenjima, kompozicije su namenjene za dnevno davanje. Primeri pokazuju da dnevno davanje obezbeđuje uspešno davanje i kliničke prednosti.

[0062] U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su davanje regularno, kao što je dnevno, svaka dva dana, ili nedeljno u produženim vremenskim periodima, kao što je bar jedna nedelja, dve nedelje, jedan mesec, dva meseca, šest meseci ili jedna godina. Primeri pokazuju da davanje B. hydrogenotrophica ne mora dovesti do trajne kolonizacije creva, tako da redovno davanje produženim vremenskim periodima mogu obezbediti veće terpautske i/ili profilaktičke koristi.

[0063] U određenim izvođenjima, lečenje prema pronalasku prati procena mikrobiote u crevima kod subjekta. Tretman može da se ponovi ukoliko davanje i / ili parcijalna ili ukupna kolonizacija sa sojem iz pronalaska nije postignuta tako da se efikasnost ne može uočiti, ili tretman može da se prekine ukoliko davanje i / ili parcijalna ili ukupna kolonizacija je uspešna i efikasnost može da se uoči.

[0064] U određenim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku može da se daje gravidnoj životinji, na primer sisaru kao što je čovek da bi se sprečilo razvijanje smanjenih nivoa diverziteta mikrobiota i/ili redukovane stabilnosti mikrobiota razvijene kod njenog deteta in utero i / ili posle njegovog rođenja.

[0065] Kompozicije prema pronalasku mogu biti davne subjektu kod koga je dijagnoziran smanjeni diverzitet mikrobiota u odnosu na zdravog subjekta i/ili redukovana stabilnost mikrobiota ili bolesti ili poremećaji u vezi sa smanjenim diverzitetom mikrobiota u odnosu na zdravog subjekta i/ili smanjenu stabilnost mikrobiota ili bolesti ili poremećaja u vezi sa zdravim subjektom i/ili smanjenom stabilošću mikrobiota, ili koji je identifikovan da je u riziku od smanejnog diverziteta mikrobiota u odnosu na zdravog subjekta i/ili smanjene stabilnosti mikrobiota. Kompozicije mogu biti takođe davane kao profilaktička mera da se spreči razvijanje smanjenog diverziteta mikrobiota Tu odnosu na zdravog subjekta i/ili smanjene stabilnosti mikrobiota zdravog subjekta .

[0066] Kompozicije prema pronalasku mogu biti davane subjektu kod koga je identifikovano da imaju abnormalnu mikrobiotu u crevu. Na primer, subjekt koji može imati smanjeni ili nepostojeću kolonizaciju Blautia, i posebno Blautia hydrogenotrophica, Blautia stercoris ili Blautia wexlerae.

[0067] Kompozicije prema pronalasku mogu biti davane kao proizvod za hranu, kao što dijetetski suplement .

[0068] Generalno, kompozicije prema pronalasku su za lečenje ljudi, mada one mogu biti korišćene za lečenje kod životinja uključujući monogastrične sisare kao što su živina, svinje, mačke, psi, konji ili zečevi. Kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne za poboljšanje rasta i osobina životinja, pri čemu može biti korišćena oralna gavaža.

Kompozicije

[0069] Generalno, kompozicija prema pronalasku sadrži bakteriju, kako je definisano u patentim zahtevima. U poželjnim izvođenjima pronalaska, kompozicija je formulisana za oblik sušen smrzavanjem. Na primer, kompozicija prema pronalasku može sadržati granule ili želatinske kapsule, na primer tvrde želatinske kapsule, koje sadrže bakterijski soj prema pronalasku.

[0070] Poželjno, kompozicija iz pronalaska obuhvata liofilizovane bakterije. Liofilizacija bakterija je dobro uspostavljeni postupak i relevantne smernice su dostupne u, na primer, referencama [30-32]. Primeri pokazuju da su naročito efikasne liofilizirane kompozicije .

[0071] Alternativno, kompozicija iz pronalaska može da obuhvati živu, aktivnu bakterijsku kulturu.

[0072] U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompoziciji prema pronalasku nije inaktiviran, na primer, nije dezaktiviran toplotom. U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompoziciji prema pronalasku nije ubijen, na primer nije ubijen toplotom. U nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompoziciji prema pronalasku nije umrtvljen, na primer, nije bio umrtvljen toplotom . Na primer, u nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompoziciji prema pronalasku nije ubijen, inaktiviran i/ili umrtvljen . Na primer , u nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompoziciji prema pronalasku je živ . Na primer, u nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompoziciji prema pronalasku je u stanju ili parcijalno ili totalno da kolonizuje creva. Na primer, u nekim izvođenjima, bakterijski soj u kompoziciji prema pronalasku je živ i u stanju da parcijalno ili potpuno kolonizuje creva.

[0073] U nekim izvođenjima, kompozicije sadrže smežu živih bakterijskih sojeva koji su ubijeni.

[0074] U poželjnim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku je inkapsulirana da omogući davanje bakterijskog soja u crevo . Inkapsulacija štiti kompoziciju od degradacije do davanja na ciljano mesto preko, na primer, pucanja sa hemijskim i fizičkim stimulansima kao što je pritisak, enzimska aktivnost ili fizička dezintegracija, koje mogu biti izazvani promenama u pH. Bilo koji odgovarajući postupci inkapsulacije mogu biti korišćeni. Primeri tehnika inkapsulacije uključuju zarobljavanje u porozni matriks, vezivanje ili adsorpciju na površinu čvrstog nosača, samo-agregaciju flokulacijom ili sredstvima za umrežavanje , i mehaničko zadržavanje iza mikroporozne membrane ili mikrokapsula. Smernice pri inkapsulaciji koji mogu biti korisne za pripremanje kompozicija prema pronalasku dostupne su, na primer, referencama [33] i [34].

[0075] Kompozicije mogu biti davane oralno i mogu biti u obliku tablete, kapsule ili praha. Inkapsulirani proizvodi su poželjni jer su Blautia anarobni. Drugi sastojci (kao što su vitamin C, na primer), mogu biti uključeni kao hvatači kiseonika i prebiotski supstrati da bi se poboljšalo davanje i/ili parcijalna ili ukupna kolonizacija i preživljavanje in vivo. Alternativno, probiotska kompozicija prema pronalasku može biti davana oralno kao hrana ili nutricioni proizvod, kao što je mleko ili fermentisani mlečni proizvodi na bazi surutke ili farmaceutski proizvod .

[0076]Kompozicija može biti formulisana kao probiotik.

[0077] Kompozicija prema pronalasku uključuje terapeutski efikasnu količinu bakterijskog soja prema pronalasku, kao što je definisano u patentim zahtevima. Terapeutski efikasna količina bakterijskog soja je dovoljna da pokazuje korisne efekte kod subjekta. Terapeutski efikasna količina bakterijskog soja može biti dovoljna da dovedeo do davanja i/ili parcijalne ili potpune kolonizacije creva subjekta.

[0078] Pogodna dnevna doza bakterije, na primer za odraslog čoveka, može biti oko 1 x 10<3>do oko 1 x 10<11>jedinica koje obrazuju kolonije (colony forming units - CFU); na primer, od oko 1 x 10<7>do oko 1 x 10<10>CFU; u drugom primeru od oko i 1 x 10<7>do oko 1 x 10<11>CFU; u još jednom primeru od oko 1 x 10<8>do oko 1 x 10<10>CFU; u još jednom primeru od oko i 1 x 10<8>do oko 1 x 10<11>CFU; u još jednom primeru od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<10>CFU.

[0079] U izvesnim izvođenjima, doza bakterije je bar t 10<9>ćelija po danu, kao što je bar 10<10>, bar 10<11>, ili bar 10<12>ćelija po danu .

[0080] U izvesnim izvođenjima, kompozicija koja sadrži bakterijski soj u količini od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<11>CFU/g, u odnosu na masu kompozicije ; na primer, od oko 1 x 10<8>do oko 1 x 10<10>CFU/g. Doza moeže biti, na primer , 1 g, 3g, 5g, i 10g.

[0081] Tipično, probiotik, kao što je kompozicija prema pronalasku, je opciono kombinovna sa bar jednim jedinjenjem. Prebiotsko jedinjenje je uglavnom nedigestibilni ugljeni hidrat kao što je oligo- ili polisaharid, ili šećerni alkohol, koji nije degradiran ili apsorobvan u gornjem digestivnom traktu. Poznati prebitotici ukljujuju komercijalne proizvode kao što su inulin i transgalakto-oligosaharidi.

[0082] U izvesnim izvođenjima, probiotska kompozcija prema prikazanom pronalasku obuhvata prebiotsko jedinjenje u količini od oko 1 do oko 30% u odnosu na masu, u odnosu na ukupnu masu

1

kompozicije, (npr. od 5 do 20% u odnosu na masu). Ugljenihidrati mogu biti izabrani iz grupe koju čine: frukto-oligosaharidi (ili FOS), frukto-oligosaharidi kratkog lanca, inulin, izomalt-oligosaharidi, pektini, ksilo-oligosaharidi (ili XOS), hitosan-oligosaharidi (ili COS), beta-glukani, modifikovane obradive gume i rezistentni skrobovi , polidekstroze, D-tagatoze, vlakna akacije, karob, ovas, i vlakna citrusa.U jednom aspektu, prebiotici su kratko lančani frukto-oligosaharidi (radi jednostavnosti ovde prikazane kao FOSsc.c); pomenuti FOSs-c.c. nisu digestibilni ugljenihidrati, generalno dobijeni konverzijom šećera od šećerne repe i uključujućo molekul saharoze za koji su vezana tri glukozna molekula .

[0083] Kompozicije prema pronalasku mogu sadržati farmaceutski prihvatljive ekscipijente ili nosače. Primeri takvih pogodnih ekscipijenata mogu se naći u referenci [35]. Prihvatljivi nosači ili razblaživači za terapeutsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj struci i opisani su, na primer u referenci [36]. Primeri pogodnih nosača uključuju laktozu, skrob, glukozu, metil celulozu, magnezijum stearat, manitol, sorbitol i slično. Primeri pogodnih sredstava za razblaživanja uključuju etanol, glicerol i vodu. Izbor farmaceutkog nosača, ekscipijenata ili razblaživača može biti izabran u odnosu na nameravani način davanja i standardnu farmaceutsku praksu. Farmaceutske kompozicije mogu sadržati, ili dodatno pored, nosača, ekscipijenta ili razblaživača bilo koje pogodno vezujuće sredstvo(a), lubricans(e), sredstvo(a) za suspendovanje, sredstvo(a) za oblaganje, sredstvo(a) za pospešivanje rastvorljivosti. Primeri pogodnih vezujućih sredstava uključuju skrob, želatin, prirodne šećere kao što je glukoza, anhidrovana laktoza, laktoza slobodnog protoka, beta-laktoza, kukuruzni zaslađivači, prirodne i sintetičke gume, kao što je akacija, tragakant ili natrijum alginat, karboksimetil celuloza i polietilen glikol. Primeri pogodnih lubrikanasa obuhvataju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid i slično. Sredstva za održavanje, stabilizatore, boje i čak sredstva za davanje ukusa mogu biti dodata u farmaceutsku kompoziciji. Primeri sredstava za održavanje uključuju natrijum benzoat, sobinsku kiselinu, cisten i estre p-hidroksibenzojeve kiseline. Antioksidansi i sredstva za suspendovanje mogu takođe biti korišćena. Dalji primer pogodnog nosača je saharoza . Drugi primer sredstva za odrežavanje je cistein.

[0084] Kompozicije prema pronalasku mogu biti formulisane kao prehrambeni proizvod. Na primer, prehrambeni proizvod može obezbeđivati nutricionu korist pored terapeutskog efekta prema pronalasku, kao što je nutriciona suplementacija . Slično, prehrambeni proizvod može biti formulisan da unapredi ukus kompozicije prema pronalasku ili da napravi kompoziciju atraktivnijom za konzumiranje tako što je sličnija uobičajenim prehrambenim proizvodima, pre nego farmaceutskoj kompoziciji. U izvesnim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku može biti formulisana kao proizvod zasnovan na mleku. Izraz "proizvod na bazi mleka" označava bilo koji tečni ili polu-čvrst proizvod zasnovan na mleku ili surutci koji ima promenjiv sadržaj masti. Proizvod na bazi mleka može biti , npr., kravlje mleko, kozje mleko, ovčije mleko,obrano mleko, punomasno mleko, mleko dobijeno iz mleka u prahu i surutke bez bilo kakve obrade ili obrađeni proizvod, kao što je jogurt, zgrušano mleko, vurda, kiselo mleko, kiselo punomasno mleko, maslac od mleka i drugi proizvodi kiselog mleka. Još jedna važna grupa uključuje napitke od mleka, kao što je napitak od surutke, fermentisana melka, mleka za odojčad i bebe; mleka sa ukusima, sladoled; hrana koja sadrži mleko kao što su zaslađivači .

[0085] U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku sadrže pojedinačni bakterijski soj ili vrstu i ne sadrže bilo koje druge bakterijske sojeve ili vrste . Takve kompozicije mogu sadržati samo de minimis ili biološki irelevantne količine drugih bakterijskih sojeva ili vrsta. Takve kompozcije mogu biti kultura ili liofilizat koji je suštinski bez organizama drugih vrsta.

[0086] U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku sadrže jedan ili više bakterijskih sojeva roda Blautia, i ne sadrže bilo koji drugi bakterijski rod, ili koji sadrže samo de minimis ili biološki irelevantne količine bakterije drugoga roda. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku sadrže specifične vrste Blautia hydrogenotrophica, i ne sadrže bilo koju drugu bakterijsu vrstu, ili sadrže samo de minimis ili biološki irelevantne količine bakterije iz drugih vrsta. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku sadrže pojedinačni soj Blautia hydrogenotrophica, i ne sadrže bilo koje druge bakterijske sojeve ili vrste, ili sadrže samo de minimis ili biološki irelevantne količine bakterije iz drugog soja ili vrste .

[0087] U nekim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku sadrže više od jednog bakterijskog soja ili vrste. Na primer, u nekim izvođenjima, kompozicije prema pronalsku sadrže više od jednog soja u okviru istih vrsta (npr. više od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili 45 sojeva), i, opciono, ne sadrže bakteriju iz bilo kojih drugih vrsta . U nekim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku sadrže manje od 50 sojeva između istih vrsta (npr. manje od 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ili 3 sojeva), i opciono, ne sadrži bakteriju od bilo koje od drugih vrsta. U nekim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku sadrže t 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25, ili 31-50 sojeva između istih vrsta i opciono ne sadrže bakteriju iz bilo kojih drugih vrsta . U nekim izvođenjima, kompozicije prema pronalsku sadrže više od jedne vrste u okviru istog roda i (npr, više od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 23, 25, 30, 35 ili 40 vrsta), i opciono, ne sadrže bakteriju iz bilo kog drugog roda . U nekim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku sadrže manje od 50 vrsta u okviru istog roda (npr. manje od 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4 ili 3 vrste), i opciono, do ne sadrže bakteriju iz bilo kog drugog roda. U nekim izvođenjima, kompozicije prema pronalsku sadrže 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25, ili 31-50 vrsta iz istog roda i opciono, ne sadrže bakteriju iz bilo kog drugog roda . Pronalazak sadrži bilo koju kombinaciju gore navedenog .

[0088] U nekim izvođenjima, kompozicija sadrži bakterijski soj Blautia hydrogenotrophica kao deo mikrobnog konzorcijuma. Na primer, u nekim izvođenjima, bakterijski so Blautia je prisutan u kombinaciji sa jednim ili više (npr. bar 2, 3, 4, 5, 10, 15 ili 20) drugih bakterijskih sojeva drugog reda sa kojima može živeti simbiotski in vivo u crevu. Na primer, u nekim izvođenjima, kompozicije sadrže bakterijski soj Blautia hydrogenotrophica u kombinaciji sa bakterijskim sojem iz različitih rodova . U nekim izvođenjima, mikrobni konzorcijum sadrži dva ili više bakterijskih sojeva dobijenih iz uzorka fecesa pojedinačnog organizma , npr. čoveka. U nekim izvođenjima, mikrobni konzorcijum se ne nalazi zajedno u prirodi . Na primer, u nekim izvođenjima, mikrobni konzorcijum sadrži bakterijske sojeve dobijene iz fecesa uzorka od bar dva različita organizma. U nekim izvođenjima, dva različita organizma su iz istih vrsta, npr. dva različita čoveka. U nekim izvođenjima, dva različita organizma su odojčad ljudi i odrasli ljudi. U nekim izvođenjima, dva različita organizma su humani i nehumani sisari.

[0089] U nekim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku dodatno sadrži bakterijski soj koji ima iste sigurnostne karakteristike i karakteristike teapeutske efikasnosti kao soj Blautia hydrogenotrophica deponovanom pod pristupnim brojem DSM 10507/14294, ali koji nije soj Blautia hydrogenotrophica deponovanom pod pristupnim brojem DSM 10507/14294, ili koji nije Blautia hydrogenotrophica ili koji nije Blautia.

[0090] U nekim izvođenjima u kojima kompozicija prema pronalasku sadrži viiše od jednog bakterijskog soja, vrste ili roda, pojedinačni bakterijski sojevi, vrste ili rodovi mogu biti za odvojeno, simultano ili sekvencionalno davanje. Na primer, kompozicija može sadržati sve više od jednog bakterijskog soja, vrste ili rodova, ili bakterijske sojeve, vrste ili rodovi mogu biti čuvani odvojeno i davani odvojeno, simultano ili sekvencionalno . U nekim izvođenjima, više od jenog bakterijskog soja, vrsta ili rodova je čuvano odvojeno, ali je pomešano zajedno pre upotrebe .

[0091] U nekim izvođenjima, bakterijski soj za upotrebu prema pronalasku je dobijem iz fecesa odraslog čoveka. U nekim izvođenjima, u kojima kompozicija prema pronalasku sadrži više od jednog bakterijskog soja, sve bakterije su dobijene iz fecesa odraslog čoveka ili ako su drugi bakterijski sojevi prisutni oni su prisutni samo u de minimis količinama. U nekim izvođenjima, bakterija može biti kultivisana naknadno posle dobijanja iz fecesa odraslog čoveka i korišćena je u kompoziciji prema pronalasku.

[0092] U nekim izvođenjima, jedan ili više bakterijskih sojeva Blautia je/su jedino(a) terapeutsko(a)

1

sredstvo(a) u kompoziciji prema pronalasku. U nekim izvođenjima, bakterijski soj(evi) u kompoziciji je/su jedino(a) terapeutski(a) aktivno sredstvo u kompoziciji prema pronalasku.

[0093] Kompozicije za upotrebu prema pronalasku mogu ili ne moraju zahtevati dozvolu za stavljanje u promet.

[0094] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, u kojoj pomenuti bakterijski soj je liofilizovan. U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, u kojoj pomenuti bakterijski soj je sušen raspršivanjem. U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, u kojoj je bakterijski soj liofilizovan ili sušen raspršivanjem i gde je živ . U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, gde je bakterijski soj liofilizovan ili sušen raspršivanjem i gde je živ. U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, u kojoj bakterijski soj je liofilizovan ili sušen sprejom i gde je u stanju da se parcijalno ili totalno kolonizuje crevo. U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, u kojoj bakterijski soj je liofilizovan ili sušen raspršivanjem i gde je živ i sposoban da parcijalno ili potpuno kolonizuje crevo.

[0095] U nekim slučajevima, bakterijski soj koji je liofilizovan ili sušen raspršivanjem je rekonstruisan pre davanja. U nekim slučajevima, rekonstrukcija je upotrebom ovde opisanograzblaživača .

[0096] Kompozicije prema pronalasku mogu sadržati farmaceutski prihvatljive ekscipijente, razblaživače ili nosače .

[0097] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj kako je korišćen u pronalasku; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent ili razblaživač ; gde je bakterijski soj u količini dovoljnoj da poveća diverzitet mikrobiota kod subjekta i/ili izazove stabilnost mikrobiota i/ili lečenje poremećaja u vezi sa smanjenim diverzitetom mikrobiota i/ili smanjenom stabilnošću mikrobiota kada se daje subjektu kome je to potrebno, diverzitet mikrobiota, na primer, bolest ili poremećaj kao što je IBS, IBD, gojaznost, dijabetes tipa 2 , jedna ili više infektivnih bolesti, jedna ili više alergijskih bolesti, jedna ili više autoimunih bolesti ili jedna ili više metaboličkih bolesti /poremećaja.

[0098] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, u kojoj količina bakterijskog soja je od oko 1 x 10<3>do oko 1 x 10<11>jedinica koje obrazuju kolonije po gramu u odnosu na masu kompozicije.

[0099] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutski kompoziciju, u kojoj je kompozicija davana u dozi od 1 g, 3 g, 5 g ili 10 g.

[0100] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, gde je kompozcija davana postupcima izabranim iz grupe koju čine oralni, rektalni, subkutanozni, nazalni, bukalni, i sub-lingualni.

[0101] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompozciju, koja sadrži nosač izabran iz grupe koju čine laktoza, skrob, glukoza, metil celuloza, magenzijum stearat, manitol i sorbitol .

[0102] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži razblaživač izabran iz grupe koju čine etanol, glicerol i voda.

[0103] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži ekscipijent koji je izabran iz grupe koja sadrži skrob, želatin, glukoza, anhidrovana laktoza, slobodno protočna laktoza, beta laktoza, kukuruzni zaslađivač, akacija, tragakant, natrijum alginat, karboksimetil celuloza, polietilen glikol, natrijum oelat, natrijum stearat, magnezijum stearat , natrijum benzoat,

1

natrijum acetat i natrijum hlorid.

[0104] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutski kompoziciju, koja dalje sadrži bar jedno sredstvo za održavanje, antioksidans i stabilizator .

[0105] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži sredstvo za održavanje izabrano iz grupe koju čine natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu i estre phidroksibenzoeva kiselina .

[0106] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, u kojoj je pomenuti bakterijski soj liofilizovan .

[0107] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, pri čemu kada je kompozcija skladištena u zatopljenom kontejneru na oko 4°C ili oko 25°C i kontejner je smešten u atmosferu koja ima 50% relativne vlažnosti, bar 80% bakterijskog soja merenog kao jedinice koje obrazuju kolonje, ostaje posle perioda od oko: 1 mesec, 3 mesec, 6 meseci, 1 godina, 1.5 godina, 2 godine, 2.5 godine ili 3 godine.

[0108] U nekim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku je obezbeđena u zatopljenom kontejneru koji sadrži kompoziciju koja je ovde opisana . U nekim izvođenjima, zatopljeni kontejner je kesica ili flašica. U nekim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku je obezbeđena kao špric koji sadrži kompoziciju kako je ovde opisano.

[0109] Kompozicija prema prikazanom pronalasku može, u nekim izvođenjima, biti obezbeđena kao farmaceutska formulacija . Na primer, kompozicija može biti obezbeđena kao tableta ili kapsula . U nekim izvođenjima, kapsula je želatinska kaspula ("gel-kap").

[0110] U nekim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su davane oralno. Oralno davanje može uključivati gutanje, tako da jedinjenje ulazi u gastrointestinalni trakt, i/ili bukalno, lingualno ili sublingualno davanje kojim jedinjenje ulazi u krvotok direktno preko usta.

[0111] Farmaceutske formulacije su pogodne za oralno davanje uključuju čvrste oblike, čvrste mikročestice, polu-čvrste i tečne (uključujući višestruke faze ili disperzone sisteme) kao što su tablete; čvrste ili tvrde kapsule koje sadrže multi-ili nano-čestice, tečnosti (npr. vodene rastvore), emulzije ili prahove; lozenge (uključujući tečna punjenja); žvake; gelove; brze disperzione dozne oblike ; filmove; ovule; sprejeve; i bukalne/mukoadhezivne flastere .

[0112] U nekim izvođenjima farmaceutska formulacija je entero formulacija , tj. gastro-rezistentna formulacija (na primer, rezistentna za želudačni pH) koja je pogodna za davanje kompozicije prema pronalasku u creva oralnim davanjem. Entero formulacije moraju biti naročito korisne kada bakteriija ili druge komponenete prema kompoziciji su osetljive na kiseilnu , npr. sklone degradaciji u uslovima želudca .

[0113] U nekim izvođenjima, entero formulacija sadrži entero oblogu. U nekim izvođenjima, formulacija je entero-obloženi dozni oblik . Na primer, formulacija može biti entero-obložena tableta ili entero-obložena kapsula ili slično. Entero obloga može biti konvencionalna entero obloga, na primer, konvencionalna obloga za tabletu, kapsulu ili slično za oralno davanje . Formulacija može sadržati film oblogu, na primer tanak sloj filma entero polimera, npr. polimera nerastvoronog u kiselini .

[0114] U nekim izvođenjima, entero formulacija je suštinski entero, na primer, gastro-rezistentna bez potrebe za entero oblogom. Prema tome, u nekim izvođenjima, formulacija je entero formulacija koja ne sadrži entero prevlaku. U nekim izvođenjima, formulacija je kapsula napravljena od termogelirajućeg materijala. U nekim izvođenjima, termogelirajući materijal je celulozni materijal kao što je metilceluloza, hidroksimetilceluloza ili hidroksipropilmetilceluloza (HPMC). U nekim izvođenjima,

1

kapsula sadrži ljusku koja ne sadrži bilo koji polimer koji obrazuje film. U nekim izvođenjima, kapsula sadrži ljusku i ljuska se sastoji od hidroksipropilmetilceluloze i ne sadrži bilo koji polimer koji obrazuje film (npr. videti [37]). U nekim izvođenjima, formulacija je suštinski entero kapsula (na primer, Vcaps® iz Capsugel).

[0115] U nekim izvođenjima, formulacija je meka kaspula. Meke kapsule su kapsule koje mogu, usled dodavanja omekšivača, kao što su, na primer , glicerol, sorbitol, maltitol i polietilen glikola, prisutnih u ljusci kapsule , imati izvesnu elatičnost i mekoću . Meke kapsule mogu biti dobijene, na primer, na bazi želatina ili skroba. Mekane kapsule na bazi želatina su komercijalno dostupne kapsule od različitih proizvođača. U zavisnosti od postupka davanja, kao što je na primer oralno ili rektalno, meke kapsule mogu imati različite oblike, one mogu biti, na primer okrugle, ovalne, duguljastog oblika ili u obliku torpeda. Meke kapsule mogu biti proizvedene konvencionalnim postupcima, kao što su na primer Šererov postupak , Accogel postupak ili postupak u kapima ili brizganjem.

Postupci kultivisanja

[0116] Bakterijski sojevi za upotrebu prema prikazanom pronalasku mogu biti kultivisani pomoću standarnih mikrobioloških tehnika detaljno opisanih, na primer u referencama [38-40].

[0117] Čvrsti ili tečni medijum korišćen za kulture može biti YCFA agar ili YCFA medijum. YCFA medijum može uključivati (na 100ml, približne vrednosti): Casitone (1.0 g), ekstrakt kvasca (0.25 g), NaHCO3(0.4 g), cistein (0.1 g), K2HP04(0.045 g), KH2PO4(0.045 g), NaCl (0.09 g), (NH4)2SO4(0.09 g), MgSO4·7H2O (0.009 g), CaCl2(0.009 g), resazurin (0.1 mg), hemin (1 mg), biotin (1 mg), kobalamin (1 mg), paminobenzoeva kiselina (3 mg), folna kiselina (5 mg), i piridoksamin (15 mg).

Bakterijski sojvi za upotrebu u kompozicijama vakcine

[0118] Pronalazači su identifikovali da bakterijski sojevi prema pronalasku su korisni za lečenje ili sprečavanje bolesti ili poremećaja u vezi sa nivoom diverziteta mikrobiota koji je smanjen u odnosu na diverzitet mikrobiota zdravog subjekta (ili relativno prema diverzitetu mikrobiota populacije zdravih subjekata ) i/ili bolesti ili poremećaja koji su u vezi sa smanjenom stabilnošću mikrobiota u poređenju sa zdravim subjektom (ili u poređenju sa populacijom zdravih subjekata). Ovo je verovatno rezultat efekta bakterijskih sojeva prema pronalasku koji imaju na imuni sistem domaćina. Prema tome, kompozicije prema pronalasku mogu biti takođe korisne za sprečavanje takvih bolesti ili poremećaja kada se daju vakcine kompozicije. U izvesnim izvođenjima, bakterijski sojevi prema pronalasku su živi . U izvesnim takvim izvođenjima, bakterijski sojevi prema pronalasku su u stanju da parcijalno ili potpuno kolonizuju crevo. U izvesnim takvim izvođenjima, bakterijski sojevi prema pronalasku su živi i u stanju da parcijalno ili postpino kolonizuju crevo. U izvesnim takvim izvođenjima, bakterijski sojvi prema pronalasku mogu biti umrtvljeni, inaktivirani ili oslabljeni. U izvesnim izvođenjima, kompozicije su za davanje pomoću injekcije, kao što je pomoću subkutanozne injekcije.

1

Opšte

[0119] Praksa prema prikazanom pronalsku će se korisiti, ako nije drugačije navedeno, konvencionalni postupci hemije, biohemije, molekularne biologije, imunologije i farmakologije, u okviru stanja tehnike. Takve tehnike su potpuno objašnejne u literaturi . Videti npr., reference [41] i [42-48], itd.

[0120] Izraz "sadrži" obuhvata "uključuje" kao i "sastoji se" npr, kompozicija "sadrži" X može se sastojati isljučivo od X ili može ponekad uključivati i dodatne npr. X Y.

[0121] Izraz "oko" u vezi sa numeričkom vrednošću x je opciono i srednja vrednost, na primer, x±10%.

[0122] Izraz "suštinski"ne obuhvata "potpuno" npr. kompoziciju koja je "suštinski bez" Y može biti potpuno bez Y. Kad je neophodno, reč "suštinski" može biti izostavljena iz definicije pronalaska.

[0123] Pozivanje na procentnu identičnost sekvence između dve nukelotidne sekvence znači da kada su poravnate, da jeprocenat nukleotida isti u upoređivanju dve sekvence. Ovo poravnanje i procenat homologije ili identičnosti sekvence može biti određen korišćenjem softverskih programa poznatih u stanju tehnike, na primer onih opisanih u odeljku 7.7.18 ref. [49]. Poželjno poravnanje je određeno sa Smith-Waterman-ovim algoritmom traženja homologije pomoču ‚affine gap search‘ sa ‚gap open penalty‘ od 12 i ‚gap extension penalty‘ od 2, BLOSUM matrix od 62. Smith-Waterman-ov algoritam traženja homologije je opisan u ref. [50].

[0124] Osim ukoliko nije specifično navedeno, proces ili postupak koji se sastoji od više koraka može sadržati dodatne korake na početku ili kraju postupka, ili može sadržati dodatne interventne korake. Takođe, koraci mogu biti kombinovani, izostavljeni ili izvedeni alternativnim redom ukoliko je pogodno .

[0125] Različita izvođenja prema pronalasku su ovde opisana . Znaće se da karakteristike navedene u svakom izvođenju mogu biti kombinovane sa ostalim navedenim karakteristikama, da bi se obezbedila dalja izvođenja. Posebno, ovde istaknutaizvođenja kao pogodna, tipična ili poželjna mogu biti kombinovana jedna sa drugim (osim kada su međusobno isključiva).

NAČINI IZVOĐENJA PRONALASKA

Primer 1 -Izmene kod mikrobiota pacijenata posle lečenja sa Blautia hydrogenotrophica Suština

[0126] Efekat Blautia hydrogenotrophica na diverzitet i stabilnost pacijentovog mikrobiota je testiran kod zdravih i IBS pacijenata.

Metodologija

Nacrt ispitivanja

[0127] Faza I kliničkog ispitivanja je izvedena u kojoj Blautia hydrogenotrophica ("Blautix", soj deponovan pod pristupnim brojem DSM 10507 i takođe pod pristupnim brojem DSM 14294) je davan humanim pacijentima koji imaju IBS ili zdravim humanim pacijentima. Pacijentima je davan Blautix u toku perioda doziranja (dani 1-16) sa periodom ispiranja danima 19-23. Fekalni uzorci su sakupljeni od IBS & zdravih subjekata, tretiranih placebom ili Blautix-om , u toku: osnovne linije, dana 1 (D1) pre tretiranja; na kraju tretiranja dana 16 (D-16); i na kraju ispitivanja (EOS), što je bilo 2-4 nedelje (ispiranje) posle lečenja.

Sekvenciranje 16S Amplikona

[0128] Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit je korišćen prema uputstvu proizvođača, da bi se

1

ekstrahovala mikrobna DNK iz 0.2g zamrznutih fekalnih uzoraka od IBS & zdravih subjekata, tretiranih placebom ili Blautix-om, u toku: osnovne linije, dana 1 (D1) pre lečenja; na kraju lečenja dana 16 (D-16); i na kraju ispitivanja (EOS), što je bilo 2-4 nedelje (ispiranje ) posle lečenja.

[0129] Pripremanje i sekvenciniranje 16S rRNK genskog amplikona je bilo izvedeno pomoću 16S Sequencing Library Preparation Nextera protokola razvijenog od strane Illumina (San Diego, California, USA). 50 ng svakog od DNK fekalnih ekstrakta je pojačano pomoću PCR i prajmeri su ciljali V3/V4 varjabilni region 16S rRNK gena. Proizvodi su prečišćeni napred i nazad barkodovi du vezani u drugom krugu adapter PCR. Dobijeni PCR proizvodi su prečišćeni, kvantifikovani i ekvimolarne količine svakog amplikona su zatim sakupljene pre nego što su poslate na sekvencioniranje za komercijalnim Supplier GATC Gmbh., ili MiSeq (2x250 bp chemija) ili HiSeq (2 x 300 bp hemija) platformama.

Analiza podataka (Post-sekvencioniranje)

[0130] Podaci sirove sekvence su spojeni trimovanjem korišćenjem fleš metodologije Sirovi podaci sekvenci su spojeni trimovanjem korišćenjem fleš metodologije. Ovo je izdvojilo dosta kvalitetnih očitavanja. USEARCH metodologija cevovoda (verzija 8.1.1861_i86_linux64) je korišćena da identifikuje unikate (engl. singletons) i sakrije ih od OTU (Operational Taxonomic Unit) koraka stvaranja. UPARSE algoritam je korišćen da grupiše sekvence u OTUs. Himerne sekvence stvorene u koraku amplifikacije su uklonjene pomoću UCHIME algoritma uklanjanja himera sa Chimeraslayer referentnom bazom podataka (preuzeto: 9th September 2016). USEARCH globalno poravnanje je zatim korišćeno da se mapiraju sva očitavanja, uključujući unikate u preostale OTU sekvence. Skripti iz kuće su korišćeni da se zatim grupišu sekvence u OTUs kako je klasifikovano USEARCH algoritmom globalnog poravnanja. Pojedinačne sekvence su grupisane u IOTUs da bi se dobila informacija o sastavu mikrobioma (količin i diverzitet).

Analiza podataka na visokom nivou

[0131] Bray-Curtis-ov matriks različitosti je stvoren za svaki uzork sparivanjem pomoću Vegan biblioteke u R 3.3.1. Set podataka je vizuelizovan korišćenjem analize osnovnih koordinata (engl. Principal Coordinate analysis) sa Bray-Curtis-ovim matriksom različitosti .

[0132] Toplotni grafik R funkcije iz kuće je korišćen da se stvori vizuelizacija toplotne mape sa hijerahijskim grupisanjem zasnovanim na Bray-Curtis-ovom različitošću i vardovoj vezi.

[0133] Šenonovi i Simpsonovi indeksi diverziteta su stvarani korišćenjem ‚phyloseq‘ biblioteke u R.

[0134] DESeq2 metodologija je korišćena da se identifikuju taksonomske promenji koje su bile značajene za izabrana upoređivanja.

[0135] Izvedena je permutaciona MANOVA na matriks različitosti korišćenjem Adonis-ove funkcije u R. Rezultati

[0136] Uzorci iz svi vremenskih tačaka su grafički prikazani za obe grupe (71 IBS pacijenta i 67 zdravih kontrola za obe grupe tretirane sa Blautix i placebo). Analiza je izvedena pomoću stvorenih merenja rastojanja na punom setu podataka punog mikrobita. Slika 1 beleži da mikrobiota IBS subjekata je značajno različita od one zdravih subjekata .

[0137] Analiza diverziteta je izvedena korišćenjem primećenog broja predviđenog taksoma (Observed number of predicted Taxa OTUs), Šenonovog indeksa diverziteta i Simpsonovog indeksa diverziteta. Obe tretirane grupe pokazuju porast u diverzitetu dana 16 vremenske tačke koja je bila značajna za primećeni OTUs i prikazuje kretanje za Simpson (sirova P-vrednost: < 0.1) (Slika 2). Ovaj porast

2

različitosti nije primećen kod pacijenata tretiranih sa placebom. Značajan pad u diverzitetu mikrobiota je primećen kod netretirane IBS placebo grupe između kraja ispitivanja i dana 1.

[0138] Slika 3 beleži da lečenje sa Blautix-om povećava mrežnu povezanost mikrobiota izvesnim taksomima u vezi sa zdravljem. Kod zdravih pacijenata suštinski porast u međumikrobnoj povezanosti je primećen od dana 1 do dana 16 (posle lečenja Blautix-om), što sugeriše porast u povezivanju i strukturi mikrobiota (Slika 3A). Povezivanje je u korelaciji sa diverzitetom i stabilnošću. Posle perioda ispiranja struktura merže se vratila na mrežu koja je sliča onoj primećenoj dana 1. Lečenje sa Blautixom je , prema tome, u stanju da poveća interkonektivnost kod zdravih pacijenata, ali je efekat izgubljen posle spiranja. Kod IBS pacijenata merža je ostala slična u smislu povezivanja između dana 1 i dana 16, ali porast u povezivanju je primećen do kraja ispitivanja koji sugeriše povećanu strukturu mikrobiota pose perioda spiranja kod IBS pacijenata lečenih sa Blautix-om (Slika 3B). Efekat Blautix-a na povezanost mikrobioma je bio, prema tome, odložen kod IBS pacijenata u poređenju sa zdravim pacijentima .

[0139] Nestabilnost/promena u profilima mikrobiota su prikazani Bray Curtis-ovim distancama između vremenskih tačaka istog subjekta. Bray-Curtis pokazuje različitost između profila rasprostranjenosti vrsta ograničenu između 0-1 (0 = ista; 1 = ne deli bio koje vrste). Lečenje IBS pacijenata sa Blautix-om smanjuje magnitudu promena mikrobiota u toku lečenja (Slika.4A) i posle lečenja (Slike 4B-4C). Ovo pokazuje da Blautix povećava stabilnost mikrobiota kod IBS pacijenata i da se promena nastavlja posle intervencije. Ova povećana stabilnost nije primećena kada je IBS pacijentima davan placebo (Slike 4 A-C).

[0140] Slika 5 beleži da nije bilo značajnog porasta u diverzitetu mikrobiota na nivou roda za IBS pacijente tretirane Dana 16 u poređenju sa danom 1. Analiza diverziteta je izvedena korišćenjem Šenonovog indeksa diverziteta primenjenog na nivou roda (sirove p-vrednosti:0.04, dan 1 naspram dana 16).

[0141] Slika 6A i Slika 6B pokazuju izmene u zajedničkim ekskluzionim mrežama kod zdravih i IBS pacijenata posle lečenja sa Blautix-om. Kod zdravih pojedinaca zajedničke ekskluzine mereže postaju gušće i međusobno povezane dana 16, što je sugestivno za porast kompeticije i inhibicije. Ovaj efekat je izgubljen, međutim do kraja ispitivanja, meržna struktura vraćena na početnu vremensku tačku u toku procesa spiranja (Slika 6A). Kod IBS pacijenata efekat Blautix-a na zajedničku ekskluzionu povezanost je bio povećanje prečnika mreže u toku vremena lečenja i perioda spiranja. Ovo je bilo suprotno efektu viđenom kod zdravih pojedinaca kada je mreža postala gušća. U toku faze spiranja za IBS pacijente, višestruke nezavisne interakcije su primećene koje nisu ranije viđene. Višestruke nezavisne interakcije odgovaraju parovima taksona koji međusobno regauju na način da su nezavisni od ostatka mreže, tj. oni nemaju bilo koje interakcije na ostatak mreže .

[0142] Vizualizacija mikrobiota pokazuje da posle lečenja sa Blautix-om postoji poravećana mrežna povezanost za izvesne taksone u vezi sa zdravljem (Slika 7). Takosni u vezi sa zdravljem uključuju Clostridium grupu IV, Bifidobacterium i Prevotella. Oscillibacter je takođe potencijalni rod u vezi sa zdravljem . Ovi taksoni u vezi sa zdravljem uključeni su u odgovor na lečenje .

Primer 2 -Zaštitni efekti na modele neurorazvojnih poremećaja

BTBR mišji model

[0143] BTBR mišji model koristi oplemenjene, genetski modifikovane miševe koji pokazuju robusni fenotip sličan autističnom. Deficiti u socijalnom ponašanju, povećano repetitivno ponašanje i povećana ponašanja u vezi sa uznemirenošću su zabeleženi u ovom soju [51]. Usled ovog robustnog bihejvioralnog fenotipa, BTBR miš je idealan životinjski model za procenjivanje efikasnosti novih terapeutskih sredstava za lečenje poremećaja u vezi sa autističnošću. Ublažvanje takvih simtoma sa živim bioterapeutikom može takođe biti indikativno za efikasnost bioterapeutika u lečenju psihijatrijskih ili neuroloških bolesti .

Miševi

[0144] Muški BTBR miševi su pareni u kući. Životinje su smeštene u sobe sa kontrolisanom temperaturom i vlažnošću sa ciklusom 12h mraka (svetlo od 7:00-19:00 h). Svi eksperimenti su izvedeni prema Evropskoj direktivi 2010/63/EEC, zahtevi S.I. No 543 od 2012, i odobreni od strane Animal Experimentation Ethics Committee iz University College Cork.

Soj

[0145] Blautia hydrogenotrophica bakterija je deponovana pod pristupnim brojem DSM 10507 i takođe pod pristupnim brojem DSM 14294.

[0146] Bioterapeutik je obezbeđen u glicerinskom štoku. Živi bioterapeutici su gajeni u objektu u anearobnim uslovima .

Davanje živog bioterapeutika

[0147] Doziranje sa Blautia hydrogenotrophica započeto je kad je miš bio star 8 nedelja. Ovi miševi su tretirani jednom dnevno u toku 3 nedelje pomoću oralne gavaže .

Raspored davanja

[0148] Nosač za oralno davanje je PBS. Dnevno oralno davanje se javlja pomoću oralne gavaže . Fekalna kolekcija

[0149] Sveži fekalni uzorci su sakupljeni od pojedinačnih miševa pre i posle davanja Blautia hydrogenotrophica. Bar 20 mg svežeg fecesa je smešteno u epruvetu za mikrocentirfugu, smeštenu na led i zatim čuvanu u na -80°C.

Rezultati

[0150] Efekat lečenja Blautix-om na mikrobiotu između vremenskih tačaka (D14, D32) je prikazan na slici 8. Značajna vremenska varijacija u profilima mikrobiota je primećene (p-vrednost = 0.001) između vremenskih tačaka ispitivanja pre lečenja (D14) i posle lečenja (D32) .

[0151] Diferencijalne analize pomoću DESeq2 daju 25 značajno (prilagođenih p-vrednosti < 0.05) diferencijalno rasprostranjenih taksona za lečenje sa Blautix-om, između D14 i D32 vremenskih tačaka istitivanja autizma . Taksoni su izlistani dole u tabeli 1.

Tabela 1. Značajno diferencijalno zastupljeni taksoni između vremenskih tačaka D14 i D32 u ispitivanju autizma. Pozitivne promene su interpretirane kao povećanje u D32 kada se porede sa D14.

Suština

[0152] U modelu autizma miša u kom je životinjama davan Blautix, primećena je značajna varijacija na njihov mikrobiom, uključujući sušinski porast mreže u bakterijskom diverzitetu .

Primer 3 -Uticaj na modele cerebralne ishemije

Suština

[0153] Zaštitni efekti Blautia hydrogenotrophica su testirani na modelima miša cerebralne ishemije. Do kraja testirane su tri grupe od 5-17 miševa. Samo životinje koje su se normalno ponašale su ukjučene u ispitivanje. Prvi dan doziranja je bio dan -14. Jedna grupa je primila dnevno bakteriju osušenu smrzavanje od prvog dana doziranja do završetka. Kontrolne grupe su primale ili sredstvo ili liopufer.

[0154] Dana 1, svi miševi su anestezirani. Srednji rez je napravljen na ventralnoj strani vrata da bi se izložile desne i leve obične karotidne arterije. Zatim je indukovan model cerebralne ishemijereperfuzije I/R sa bilateralnim okulzijama običnih karotidnih arterija (engl.bilateral common carotid artery occlusion-BCCAO) pomoću vaskularnih štipaljki u toku 15 minuta. Na kraju svake okulzije, štipaljke su uklonjene .

Soj

[0155] Blautia hydrogenotrophica bakterija je deponovana pod pristupnim brojem DSM 10507 i takođe pod pristupnim brojem DSM 14294.

2

Raspored davanja

[0156]

Nacrt ispitivanja

[0157] Dani -14 do 14:Dnevna doza PBS kontrole (liopufer), kontrolni prah sušen zamrzavanjem (nosač) ili bakterija sušena smrzavanjem (Blautix).

[0158] Dan 1: Cerebralna ishemija-reperfuzija I/R model indukovan hiruški .

[0159] Dan 14: Polovina miševa u svakoj grupi je završila.

[0160] Dan 14 do 28: Dnevna doza PBS kontrole (liopufer), kontrolni prah sušen smrzavanjem (nosač) ili bakterija sušena smrzavanjem (Blautix) za preostale miševe u svakoj grupi.

[0161] Dan 28: Završetak za ostale miševe.

[0162] Fekalne pelete su sakupljene u tri vremenske tačke : Dan -14, Dan 14 i Dan 28. Svako uzimanje je izvedeno u sterilnoj okolini (potpuno aseptičnoj = očićenoj između životinja ), sa svakim mišem koji je uzet iz kaveza i smešten odvojeno u sterilnu novu kutiju za pojedinačno sakupljane peleta. Sakupljeno je što je bilo moguće više peleta u cilju dostizanja minimalno 80mg i poželjno 100mg materijala po mišu.

Rezultati

[0163] Ne postoji značajnih razlika u profilma mikrobita između grupa tretiranih sa Blautix-om, Nosačem i Liopuferom detektovanim na D-14 (p-vrednost= 0.177) pre davanja Blautix (videti Sliku 9A). Međutim, primećene su značajne razlike u profilima mikrobita između različito tretiranih grupa dana 14 (videti Sliku 9B) sa primećenom p-vrednošću 0.011. Pronalazači su dalje procenjivali trenutrne varijacije u mikrobioti grupe tretirane sa Blautix-om i našli značajnu razliku (videti Sliku 9C) sa primećenom p-vrednošću 0.002.

[0164] Diferencijalna analiza pomoću DESeq2 dala je značano (prilagođena p-vrednost <0.05) različito rasprostranjene taksone za tretrianje sa sredstvom, liofilnim puferom i različito raspoređenim taksonom za tretiranja sa nosačem, liopuferom i Blautix-om u vremenskim tačkama u ispitivanju moždanog udara, kao što je prikazano u tabeli 2, koja pokazuje dugotrajni uticaj na bakterijski diverzitet koji ima Blautix. Taksomi za tretman sa Blautix-om su dati u tabli 3, tabeli 4 i tabeli 5.

Tabela 2. Značajno različito rasprostranjeni taksomi u ispitivanju moždanog udara .

Tabela 3. Značajno različito rasprostranjeni taksoni između vremenskih tačaka D-14 i D14 za tretman sa Blautix-om u ispitivanju moždanog udara . Pozitivna promena je izražena kao povećanje D14 kada se koristi sa D-14.

Tabela 4. Značajno različito rasprostranjeni takson između vremenskih tačaka D14 i D28 za lečenje u ispitivanju moždanog udata. Pozitivna promena je interpretirana kao povećanje za D28 kada se poredi sa D14.

2

Tabela 5. Značajno različita rasprostranjenost taksoma između vremenskih tačaka D-14 i D28 za tretman sa Blautix-om u ispitivanju moždanog udara. Pozitivna promena je interpretirana kao porast za D28 kada se oredi sa D-14.

[0165] Različite analize pomoću DESeq2 dale su zanačajno (prilagođena p-vrednost <0.05) različito rasprostranjene taksonom za tretiranje sa Blautix naspram nosača kao i tretiranje sa Blautix-om naspram Liopufera za vremenske tačke ispitivanja moždanog udara, kao što je prikazano u tabeli 6. Taksom je izlistan u tabeli 7, tabeli 8 i tabeli 9.

Tabela 6. Značajno različito rasprostranjeni taksom za tretman sa Blautix-om kod ispitivanja moždanog udara .

Tabela 7. Značajno različito rasprostranjeni taksom za lečenje sa Blautix-om vs. nosač za D14 u ispitivanju moždanog udara.

2

Tabela 8. Značajno različito rasprostranjeni taksom za tretiranje sa Blautix-om naspram liopufera za D-14 u is itivanu moždano udara

Tabela 9. Značajno različito rasprostranjem taksom za tretman sa Blautix-om naspram liopufera za D14 iu ispitivanju moždanog udara

Kratak prikaz

[0166] Blautix utiče na značajan porast diverziteta mikrobiote u toku perioda ispitivanja na modelu moždanog udara kod miša, kada se predi sa liopuferom ili kontrolom nosača .

Primer 4 -Zaštitni efekti na modelima neuroinflamatornih uslova

[0167] Eksperimentalni autominumi encefalomijelitis (EAE) je mišji model inflamacije CNS koji oslikava mnogo aspekata humane bolesti MS i EAE i najčešće se koristi kao eksperimentalni model za humanu MS. EAE je takođe korišćen generalno kao model za CNS-specifične autoinume poremećaje [52] i za druge specifične uslove, uključujući akutni rasprostranjeni encefalomijelitis. EAE je indukovan korišćenjem imunizacije sa mijelisnkim peptidima i pomoćnim sredstvima da bi se izazvao imuno i inflamatorni koji je u bliskoj relaciji sa mehanizmima istaknutim u mnogo autoimunih i inflamatornih poremećaja CNS, i posebno MS. Mnogo terapija koje pokazuju efikasnost u EAE takođe je pokazano efikasnost u tretmanu MS kod humanih pacijenata [52]. Najvažnije, EAE reprodukuje ključne karakteristike MS, uključujući inflamaciju, demijelinaciju, gubitak aksona i gliozu. Efekti demijelinizacije su uglavnom organičeni na kičmenu moždinu kod EAE, sa malim razlikama moždanog stabla i malog mozga. Kod EAE CD4+ T ćelije su populacija dominantnih ćelija nađna u CNS.

2

Metodologija

[0168] Blautia hydrogenotrophica ("Blautix", soj deponovanom pod pristupnim brojem DSM 10507 i takođe pod pristupnim brojem DSM 14294) je korišćen kao prah sušen smrzavanjem i rekonstruisan kada je potrebno . Korišćeno je 12 odraslih ženki C57BL/6J miševa .

[0169] Dana 0 i dana 7, životinjama je davana emulzija koja sadrži MOG35-55 i potpuni Freund-ov adjuvant (CFA) obogaćen sa Mycobacterium Tuberculosis H37Ra subkutanoznom injekcijom u gasnoj anesteziji (izofluran) . Dana 0, dve subkutanozne injekcije su date u bokove; jedna u svaki od donjih kvadranata leđa . Dana 7, dve subkutanozne injekcije su date u bokove, jedna u svaki od gornjih kvadranata leđa .

[0170] Dana 0 i dana 2, životinje su primile pertuzijski toksin (PTx) u fosfatnom puferisanu rastvoru soli (PBS) intra-peritonealnom injekcijom. Dana 0, PTx davanje je izvedeno posle MOG injekcija.

[0171] Tretmani sa Blautix-om ili kontrolama su davani dana -14 prema sledećem rasporedu :

Dan 0: MOG/CFA, jednom, SC

Dan 0: PTx, jednom, IP

Dan 2, PTx, jednom, IP

Dan 7: MOG/CFA, jednom, SC

[0172] Tretmani su davani u toku 15 minuta posle njihovih pripremanja. Blautix je davan u dozi od 2 x 10<8>; 100µl/mišu.

[0173] Od dana 0 do kraja eksperimenta, životinje su procenjivane dnevno na kliničke znake EAE, uključujući parezu i paralizu repa i/ili udova .

[0174] Dana -14, Dana -1 i dana 34, sakupljane su fekalne pelete od svake životinje, odmah brzo zamrznute i čuvane na -80°C.

Rezultati

[0175] Uticaj tretiranja sa Blautix-om na mikrobiotu u vremenskim tačkama između (D-14, D-1, D34) za MS model je prikazan na slici 10. Značajna vremenska varijacija profila mikrobiote je primećena (pvrednost =0.001 ) za ispitivanja vremenskih tačaka.

[0176] Diferencijalne analize pomoću DESeq2 dale su značajno (podešena p-vrednost < 0.05) različito rasprostranjem taksonom za tretman sa Blautix-om između ispitivanih vremenskih tačaka, kao što je prikazano u tabeli 10. Taksom je izlistan u tabeli Tabeli 11, Tabeli 12 i Tabeli 13.

Tabela 10.Značajno različito rasprostranjeni taksom izvmeđu vremenskih tačaka u MS ispitivanju.

2

Tabela 11. Značajno različito rasprostranjeni taksom između vremsnkih tačaka D-14 i D-1 u MS ispitivanju. Pozitivna promena je izražena kao porast u D-1 kada se poredi sa D-14.

2

Tabela 12. Značajno različito rasprostranjen taksom između vremenskih tačaka D-1 i D34 tu ispitivanju MS . Pozitivna promena je izražena kao povećanje u D34 kada se poredi sa D-1.

Tabela 13. Značajno drugačije rasprostranjen taksom između vremenskih tačaka D-14 i D34 u ispitivanju MS . Pozitivna promena je izražena kao povećanje u D34 kada se poredi D-14. )

1

Suština

[0177] Blautix utiče značajno na diverzitet mikrobiote i dovodi do značajnog porasta u diverzitetu mikrobiote i dovodi do značajne vremenske varijacije u toku tretmana na životinjskom modelu za multipla sklerozu .

Sekvence

[0178]

SEQ ID NO:1 (ribozomalni RNK gen Blautia stercoris soja GAM6-1 16S , parcijalna sekvenca -HM626177)

2

SEQ ID NO:2 (ribozomalni RNK gen Blautia wexlerae soja WAL 14507 16S , parcijalna sekvenca -EF036467)

SEQ ID NO:4 (konsezusna 16S rRNK sekvenca za Blautia wexlerae soj MRX008)

SEQ ID NO:5 (ribozomalni RNK gen Blautia Hydrogenotropica soja S5a3616S , parcijalna sekvenca X95624.1

4

REFERENCE

[0179]

[1] Spor et al. (2011) Nat Rev Microbiol.9(4):279-90.

[2] Tap et al. (2009), Environ Microbiol, 11(10):2574-84

[3] Macpherson et al. (2001) Microbes Infect.3(12):1021-35

[4] Macpherson et al. (2002) Cell Mol Life Sci.59(12):2088-96.

[5] Mazmanian et al. (2005) Cell 15;122(1):107-18.

[6] Frank et al. (2007) PNAS 104(34):13780-5.

[7] Scanlan et al. (2006) J Clin Microbiol.44(11):3980-8.

[8] Kang et al. (2010) Inflamm Bowel Dis.16(12):2034-42.

[9] Machiels et al. (2013) Gut.63(8):1275-83.

[10] WO 2013/050792

[11] WO 03/046580

[12] WO 2013/008039

[13] WO 2014/167338

[14] Lee and Lee (2014) World J Gastroenterol.20(27): 8886-8897.

[15] Xie et al. (2016) Journal Dairy Sci.99:6913-6921

[16] WO 01/85187

[17] WO2016/086161

[18] YQ et al. (2016), J. Dig. Dis., "Therapeutic Modulation of the Gut Microbiota in IBD -More Questions to Be Answered", Oct 15, 1751-2980, 12422, Epub ahead of print.

[19] Lozupone (2012). Nature.2012 September 13; 489 (7415): 220-230

[20] Claesson, et al. (2012) Nature, 488, 178-184.

[21] Hansen, et al., (2010), Curr. Opin. Gastroenterol., 26(6): 564-571.

[22] Turnbaugh et al. Nature, 457(7228): 480-484.

[23] Wang et al. (2009) ISME J.3(8): 944-954.

[24] Faith et al. (2013), Science, 341(6141): 1237439

[25] Liu et al. (2008) Int J Syst Evol Microbiol 58, 1896-1902.

[26] Bernalier et al. (1996) Arch. Microbiol.166 (3), 176-183.

[28] Masco et al. (2003) Systematic and Applied Microbiology, 26:557-563.

[29] Srutková et al. (2011) J Microbiol. Methods, 87(1):10-6.

[30] Miyamoto-Shinohara et al. (2008) J Gen. Appl. Microbiol., 54, 9-24.

[31] Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, ed. by Day and McLellan, Humana Press.

[32] Leslie et al. (1995) Appl. Environ. Microbiol.61, 3592-3597.

[33] Mitropoulou et al. (2013) J Nutr Metab. (2013) 716861.

[34] Kailasapathy et al. (2002) Curr Issues Intest Microbiol.3(2):39-48.

[35] Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller [36] Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit.1985)

[37] US 2016/0067188

[38] Handbook of Microbiological Media, Fourth Edition (2010) Ronald Atlas, CRC Press.

[39] Maintaining Cultures for Biotechnology and Industry (1996) Jennie C. Hunter-Cevera, Academic Press

[40] Strobel (2009) Methods Mol Biol.581:247-61.

[41] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.

[42] Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press).

[43] Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)

[44] Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications)

[45] Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[46] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997)

[47] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).

[48] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)

[49] Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30

[50] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math.2: 482-489.

[51] Meyza and Blanchard (2017) Neurosci Biobehav Rev.;76(Pt A):99-110

[52] Constantinescu et al. (2011) Br J Pharmacol.164(4):1079-1106

4

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija koja sadrži bakterijski soj vrsta Blautia hydrogenotrophica, za upotrebu u lečenju ili prevenciji sindroma nervoznog creva, gde lečenje ili prevencija obuhvata povećanje diverziteta mikrobiote kod subjekta .

2. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, gde subjekt ima manje od 99 različitih bakterijskih vrsta i/ili manje od 190 različitih bakterijskih vrsta u njegovom miktobiotu.

3. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde porast u diverzitetu mirkobiota je za neacetogene bakterije ili za i acetogene i neacetogene bakterije.

4. Kompozcija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde :

(a) subjekat je slab stariji subjekt ili

(b) subjekat je odojče koje je rođeno carskim rezom.

5. Kompozcija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je diverzitet mikrobiote povećan u crevu i/ili u distalnom crevu subjekta.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-5, gde je soj bakterije bakterija Blautia hydrogenotrophica deponovan pod pristupnim brojem DSM 10507 i takođe pod pristupnim brojem DSM 14294.

7. Kompozcija za upotrebu prema kom od prethodnih zahteva, gde:

(a) kompozicija je za oralno davanje; i/ili

(b) kompozicija sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosača; i/ili (c) bakterijski soj je liofilizovan ; i/ili

(d) bakterijski soj je živ; i/ili

(e) bakterijski soj je u stanju da parcijalno ili potpuno kolonizuje crevo.

8. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji obuhvata jedan soj Blautia hydrogenotrophica.

9. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde kompozicija sadrži Blautia hydrogenotrophica i ne sadrži bakteriju bilo kog drugog roda ili sadrži takve druge bakterije samo u de minimis količinama.

10. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde kompozicija sadrži Blautia hydrogenotrophica i ne sadrži bakteriju bilo koje druge vrste ili sadrži takve bakterije samo u de minimis količinama.

11. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-7, koja sadrži Blautia hydrogenotrophica kao deo mikrobialnog konzorcijuma.

12. Prehrambeni proizvod koji sadrži kompoziciju prema bilo kom od prethodnih zahteva, za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva .

13. Kompozicija vakcine koja sadrži kompoziciju prema bilo kom od zahteva 1-11, za upotrebu u bilo kom od zahteva 1-11.

4