RS59307B1

RS59307B1 - Kompozicije koje sadrže bakterijske sojeve

Info

Publication number: RS59307B1
Authority: RS
Inventors: George Grant; Angela Margaret Patterson; Imke Mulder; Seanin Mccluskey; Emma Raftis
Original assignee: 4D Pharma Res Ltd
Priority date: 2015-06-15
Filing date: 2016-06-15
Publication date: 2019-10-31
Also published as: CO2017013446A2; CN108271355A; CL2017003192A1; US10780134B2; AU2021290210A1; JP2017537871A; SMT201900540T1; MA51455A; CY1122148T1; US20220008486A1; EP3204024A1; US10391130B2; PT3204024T; JP6375051B2; US20170319634A1; IL255794B; HUE046681T2; IL276798A; US20200384038A1; CN112156114A

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Ovaj pronalazak je iz oblasti koja se odnosi na kompozicije koje sadrže bakterijske sojeve izolovane iz digestivnog trakta i korišćene takvih kompozicija za lečenje bolesti .

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0002] Smatra se da je humano crevo sterilno in utero, ali je odmah nakon rođenja izloženo velikom broju majčinih i mikrobima iz spoljašnje sredine. Nakon toga, dešava se dinamičan period mikrobne kolonizacije i sukcesije, koji je pod uticajem faktora kao što su vrsta porođaja, okruženje, ishrana i genotip domaćina, od kojih svi imaju uticaj na kompoziciju mikrobioma iz creva, posebno ranom tokom života. Zatim, mikrobiom se stabilizuje i postaje sličan adultnom [1]. Mikrobiom iz humanog creva sadrži više od 500-1000 različitih filotipova koji u suštini pripadaju dva velika razdela, Bacteroidetes i Firmicutes [2]. Uspešni simbiotski odnosi koji proizilaze iz bakterijske kolonizacije humanog creva su doveli do široke raznolikosti metaboličkih, strukturnih, zaštitnih i drugih korisnih funkcija. Pojačane metaboličke aktivnosti kolonizovanog creva osiguravaju da na drugi način nesvarljive komponente hrane mogu da se degradiraju sa oslobađanjem sporednih proizvoda koji obezbeđuju važan izvor nutrijenta za domaćina. Slično tome, imunološki značaj mikrobiota iz creva je dobro prepoznat i predstavljen je primerima kod životinja koje se gaje u sterilnom okruženju koje imaju narušeni imunski sistem koji se funkcionalno rekonstituiše nakon uvođenja komensalnih bakterija [3-5].

[0003] Dramatične promene u kompoziciji mikrobiote su dokumentovane u gastrointestinalnim poremećajima kao što je zapaljenska bolest creva (IBD). Na primer, nivoi Clostridium klastera XIVa bakterija su redukovani kod IBD pacijenata dok su brojevi E. coli povećani, što ukazuje na pomak u ravnoteži patobionata u crevima [6-9]. Zanimljivo, ova mikrobna disbioza je takođe povezana sa neravnotežom u populacijama T efektorskih ćelja.

[0004] U prepozavanju potencijalnog pozitivnog efekta koji određeni bakterijski sojevi mogu da imaju na životinjsko crevo, predloženi su različiti sojevi za upotrebu u lečenju raznih bolesti (videti, na primer, [10-13]). Takođe, određeni sojevi, uključujući uglavnom Lactobacillus i Bifidobacterium sojeve, su predloženi za upotrebu u različitih inflamatornih i autoimunskih bolesti koje nisu direktno povezane sa crevima (videti [14] i [15] kao pregled). Međutim, veza između različitih bolesti i različitih bakterijskih sojeva, i tačni efekti određenih bakterijskih sojeva na crevo i na sistemski nivo i na bilo koje određene tipove bolesti, su slabo okarakterisani.

[0005] U oblasti tehnike postoji potreba za novim postupcima za lečenje inflamatornih i autoimunskih bolesti. Takođe postoji potreba za karakterizacijom potencijalnih efekata bakterija iz creva kako bi mogle da se razviju nove terapije upotrebom bakterija iz creva.

[0006] WO 2011/153226 opisuje farmaceutske proizvode u kojima se koriste ćelijski sastojci različitih vrsta Bacteroides.

[0007] US 2014/335131, CN 104546935, CN 103156888 i CN 104546942 opisuju upotrebu u terapiji Bacteroides fragilis, thetaiotaomicron, vulgatus i dorei.

[0008] US 9011834 opisuje dobijanje populacije bakterijskih spora tretiranih etanolom.

SUŠTINA PRONALASKA

[0009] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj roda Bacteroides koji ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 98% identična sa SEQ ID NO:4, za upotrebu u postupcima lečenja ili prevencije inflamatornih ili autoimunih bolesti.

[0010] Pronalazači su razvili nove terapije za lečenje i sprečavanje inflamatornih i autoimunih bolesti. Posebno, pronalazači su razvili nove terapije za lečenje ili sprečavanje inflamatornih i autoimunih bolesti. Posebno, pronalazači su razvili nove terapije za lečenje i prevenciju bolesti i stanja posredovanih sa IL-17 ili Th17 putem. Posebno, pronalazači su identifikovali da bakterijski sojevi iz roda Bacteroides modu biti efikasni u smanjenju Th17 inflamatornog odgovora. Kao što je opisano u primerima, oralno davanje kompozicija koje sadrže Bacteroides coprocola mogu smanjivati intenzitet inflamatornog odgovora, uključujući Th17 inflamatorni odgovor, na modelima astme, reumatoidnog artritisa i multiple skleroze na mišu.

[0011] Pronalazači su identifikovali da lečenje sa bakterijskim sojevima ovoga roda može smanjiti nivoe citokina koji su deo Th17 puta, uključujući IL-17, mogu ublažiti Th17 inflamatorni odgovor i mogu obezbediti kliničku korist na modelima miša inflamatornih i autoimunih bolesti posredovanih sa IL-17 i Th17 putem.

[0012] U posebnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj roda Bacteroides koji ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 98% identična sa SEQ ID NO:4, za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja bolesti ili stanja izabranog iz grupe koju čine : multipla skleroza; artritis, kao što je reumatoidni artritis, osteoartritis, psorijatički artritis, ili juvenilni idiopatski artritis ; neuromijelitis optika (Devicova bolest); ankilozni spondilitis; spondiloartritis; psorijaza; sistemski eritemski lupus; inflamatorna bolest creva, kao što je Kronova bolest ili ulcerozni kolitis; celijakija; astma, kao što je alergijska astma ili neutrofilna astma; hronična opstruktivna bolest pluća (engl. hronična opstruktivne bolest pluća-COPD); uveitis; skleritis; vaskulitis; Behčetova bolest; ateroskleroza; atopijiski dermatitis; emfizem; periodontitis; alergijski rinitis; i odbacivanje alografta. Efekat pokazan za bakterijske sojeve iz roda Bacteroides na Th17 inflamatorni odgovor mogu obezbeđivati terapeutsku korist za bolesti i stanja posredovana sa IL-17 i Th17 put, kao što su one gore navedene

[0013] U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj roda Bacteroides koji ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 98% identična sa SEQ ID NO:4, za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja astme, kao što je neutrofilna astma ili alergijska astma. Pronalazači su identifikovali da lečenje sa sojevima Bacteroides mogu smanjiti regrutovanje neutrofila i eozinofila u plućima, koje može pomoćui lečenju ili prevenciji astme. Pored toga, pronalazali su testirali i pokazali efikasnost sojeva Bacteroides na mišjim modelima astme. U izvesnim izvođenjima, kompozicija je za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja neutrofilne astme ili eozinofilne astme. Efekat pokazan na kompozicijama prema pronalasku na neutrofile i eozinofile označava da mogu biti naročito efikasni u lečenju ili prevenciji neutofilne astme i eozinofilne astme. Zaista, u izvesnim izvođenjima, kompozicija za upotrebu u postupku smanjenja neutrofilnog inflamatornog odgovora u lečenju astme, ili kompozicija je za upotrebu u postupku smanjenja eozinofilnog inflamatornog odgovora u lečenju ili prevenciji astme. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj vrste ies Bacteroides coprocola, za upotrebu u lečenju astme, i posebno neutofilne astme.

[0014] U drugim poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj roda Bacteroides koji ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 98% identična sa SEQ ID NO:4, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije rheumatoidnog artritisa. Pronalazači su identifikovali da lečenje sa Bacteroides sojevima mogu obezbediti kliničke koristi na modlu reumatoidnog artritisa miša i mogu smanjiti naticanje zglobova. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj vrste Bacteroides coprocola, za upotrebu u čišćenju reumatoidnog artritisa. Kompozicije u kojima se koristi Bacteroides coprocola mogu biti naročito efikasne za lečenje reumatoidnog artritisa.

[0015] U drugim poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj roda Bacteroides koji ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 98% identična sa SEQ ID NO:4, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije multiple skleroze. Pronalazači su identifikovali da lečenje sa sojevima Bacteroides može smanjiti učestalost i intenzitet bolesti na modelu multiple skleroze kod miša. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj vrsta Bacteroides coprocola, za upotrebu u lečenju multiple skleroze. Kompozicije u kojima se koristi Bacteroides coprocola mogu biti naročito efikasni za lečenje multiple skleroze.

[0016] U drugim poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj roda Bacteroides koji ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 98% identična sa SEQ ID NO:4, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije uveitisa, kao što je zadnji uveitis. U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj vrsta Bacteroides coprocola, za upotrebu u lečenju uveitis.

[0017] U izvesnim izvođenjima, kompozicije ovde opisane su za upotrebu u postupku smanjenja proizvodnje IL-17 ili smanjenja diferencijacije Th17 ćelija u lečenju ili prevenciji bolesti ili stanja u kojima posreduje IL-17 ili Th17 put. Posebno, ovde opisane kompozicije mogu biti korišćene za smanjenje proizvodnje IL-17 ili smanjenje diferencijacije Th17 ćelija u lečenju ili prevenciji astme, reumatoidnog artritisa ili multiple skleroze. Poželjno, opis obezbeđuje kompozicije koje sadrže bakterijski soje vrsta Bacteroides coprocola, za upotrebu u smanjenju proizvodnje IL-17 ili smanjenju diferencijacije Th17 ćelija u lečenju ili prevenciji astme, reumatoidnog artritisa ili multiple skleroze ili astme, reumatoidnoog artritisa, multiple skleroze, uveitisa ili kancera. U izvesnim izvođenjima, kompozicija je za upotrebu kod pacijenata sa povećanim nivoima IL-17 ili Th17 ćelijama. Efekat na Th17 inflamatorni odgovor pokazan za soj Bacteroides može biti naročito koristan za takve pacijente.

[0018] U poželjnim izvođenjima pronalaska, bakterijski soj u kompoziciji je Bacteroides coprocola. Poželjno, bakterijski soj ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 99%, 99.5% ili 99.9% identična sa SEQ ID NO:4. Poželjno, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima 16s rRNK sekvencu koja je predstavljena kao SEQ ID NO:4.

[0019] U drugim poželjnim izvođenjima opisa, bakterijski soj u kompoziciji je Bacteroides thetaiotaomicron. Blisko povezani sojevi mogu takođe biti korišćeni, kao što su bakterijski sojevi koji imaju 16s rRNK sekvencu koja je bar 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sa 16s rRNK sekvencom bakterijskog soja Bacteroides thetaiotaomicron. Poželjno, bakterijski soj ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili99.9% identična sa SEQ ID NO:5. Poželjno, ovde opisan bakterijski soj ima 16s rRNK sekvencu koja je prikazana sa SEQ ID NO:5.

[0020] U drugim ovde opisanim poželjnim izvođenjima, bakterijski soj u kompoziciji je Bacteroides fragilis. Blisko povezani sojevi mogu takođe biti korišćeni, kao što su bakterijski sojevi koji imaju genom sa identičnostu sekvence CR626927.1.

[0021] U izvesnim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku je za oralno davanje. Oralno davanje sojeva prema pronalasku može biti efikasno za lečenje bolesti i stanja posredovanih IL-17- ili Th17 putem. Takođe,oralno davanje je pogodno za pacijente i osobe koje primenjuju pronalazak i omogućava dostavljanje u i/ili parcijalu ili potpuno kolonizaciju creva.

[0022] U izvesnim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa ili nosača.

[0023] U izvesnim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku sadrži bakerijski soj koji je bio liofilizovan. Liofilizacija je efikasna i konvencionalna tehnika za dobijanje stabilnih kompozicija koje omogućavaju davanje bakterija.

[0024] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje prehrambeni proizvod koji sadrži kompoziciju koja je gore opisana.

[0025] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju vakcine koja sadrži kompoziciju koja je gore opisana.

[0026] U razvijanju gornjeg pronalaska, pronalazači su identifikovani i karakterisani bakterijski soj koji je naročito korisan za lečenje. Soj prema pronalasku se pokazao da je efikasn za lečenje ovde opisanih bolesti, kao što je artritis, astma i multiple skleroza. Prema tome, u još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje ćeliju soja koja je deponovan pod prijemnim brojem NCIMB 42408. Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije koje sadrže takve ćelije, ili biološki čiste kulture takvih ćelija. Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju soja deponovnog pod prijemnim brojem NCIMB 42408 za upotrebu u terapiji, posebno za ovde opisane bolesti.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0027]

Slika 1: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Ukupni broj ćelija u BAL tečnosti.

Slika 2: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Ukupni broj eozinofila u BALF.

Slika 3: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Proporcija eozinofila u BALF.

Slika 4: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Ukupan broj makrofaga u BALF.

Slika 5: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Proporcija makrofaga u BALF.

Slika 6: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Ukupan broj neutrofila u BALF.

Slika 7: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Proporcija neutrofila u BALF.

Slika 8: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Ukupan broj limfocita u BALF.

Slika 9: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Proporcija limfocita u BALF.

Slika 10: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Ukupan broj ćelija u BAL tečnosti.

Slika 11: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Ukupan broj eozionofila u BALF.

Slika 12: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Proporcija eozinofila u BALF.

Slika 13: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Ukupan broj makrofaga u BALF.

Slika 14: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Proporcija makrofaga u BALF.

Slika 15: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Ukupan broj neutrofila u BALF.

Slika 16: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Proporcija neutrofila BALF.

Slika 17: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Ukupan broj limfocita u BALF.

Slika 18: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Proporcija limfocita u BALF.

Slika 19: Model reumatoidnog artritisa na mišu – Telesne mase, dani -14 do 0. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM procenat početne (Dan -14) telesne mase. Statistična značajnost

p < 0.0001 kada se poredi sa grupom tretiranom sa nosačem.

Slika 20: Model reumatoidnog artritisa na mišu – Telesna masa, dani 0 do 42. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM procenat početne (Dan 0) telesne mase. ♦ p < 0.05,

0.001, •••• p < 0.0001 kada se poredi sa grupom tretiranom sa nosačem.

Slika 21: Model reumatoidnog artritisa na mišu – Klinički rezultati. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM. * p < 0.0001 kada se porede sa danom 21 grupe tretirane sa nosačem. ♦,O p < 0.05 kada se poredi sa grupom tretiranom sa nosačem datog dana. ;;Slika 22: Model reumatoidnog artritisa na mišu – Proliferativni odgovor spelnocita na kolagen II. Oduzeta pozadina medijuma [CII-stimulisani – pozadina medijuma] broj u minuti na osnovu 3H-TdR inkorporacije. Svi podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM. ;;Slika 23: Model reumatoidnog artritisa na mišu - Nivoi IFN γ u supernatantima kulture tkiva iz grupe tretirane nosačem. Linije predstavljaju vrednost medijane za grupu. ;;Slika 24: Model reumatoidnog artritisa na mišu - Nivoi IL-17A u supernatantima kulture tkiva iz grupe tretirane nosačem Linije predstavljaju vrednost medijane za grupu. ;Slika 25: Model reumatoidnog artritisa na mišu - Nivoi IL-10 u supernatantima kulture tkiva iz grupe tretirane nosačem. Linije predstavljaju vrednost medijane za grupu. ;;Slika 26: Model reumatoidnog artritisa na mišu - Nivoi IL-6 u supernatantima kulture tkiva iz grupe tretirane nosačem. Linije predstavljaju vrednost medijane za grupu. ;;Slika 27: Model reumatoidnog artritisa na mišu - Nivoi citokina u supernatantima kultura tkiva iz grupe tretirane sa bioterapeutikom #675 (Grupa 4). Linije predstavljaju vrednost medijane za grupu. ;;Slika 28: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - Ukupan IgE u serumu ;;Slika 29: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - HDM specifičnog IgG1 u serumu ;Slika 30: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - Ukupni IgE u BALF ;;Slika 31: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - HDM specifični IgG1 u BALF ;Slika 32: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Histološke analize – Srednja vrednost rezultata peribronhijalne infiltracije. ;;Slika 33: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Histološke analiza – Srednja vrednost rezultata perivaskularne infiltracije. ;;Slika 34: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Histološke analize – Srednja vrednost rezultata inflamacije (srednja vrednost rezultata peribronhiolarne i perifaskularne infiltracije) ;Slika 35: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu – Histološka analiza – Rezultat mukusa ;;Slika 36: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - IL-9 nivo u tkivu pluća ;;Slika 37: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - IL-1a nivo u tkivu pluća ;;Slika 38: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - IFN γ nivo u tkivu pluća ;;Slika 39: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - IL-17A nivo u tkivu pluća ;Slika 40: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - IL-4 nivo u tkivu pluća ;;Slika 41: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - IL-5 nivo u tkivu pluća ;;Slika 42: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - IL-1b nivo u tkivu pluća ;;Slika 43: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - RANTES nivo u tkivu pluća ;Slika 44: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - MIP-1a nivo u tkivu pluća ;Slika 45: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - KC nivo u tkivu pluća ;;Slika 46: Model astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu - MIP-2 nivo u tkivu pluća ;Slika 47: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - HDM specifični IgG1 u serumu ;Slika 48: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - HDM specifični IgG2a u serumu ;Slika 49: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - HDM specifični IgG1 u BALF ;;Slika 50: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - HDM specifčni IgG2a u BALF ;;Slika 51: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Histološka analize – Srednja vrednost rezultata peribronihijalne infiltracije ;;Slika 52: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Histološka analize – Srednja vrednost rezultata perivaskularne infiltracije ;;Slika 53: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu – Histološke analize – Srednja vrednost rezultata inflamacije (srednja vrednost rezultata i peribronhijalne i perivaskularne infiltracije) ;;Slika 54: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - TNF α nivo u tkivu pluća ;;Slika 55: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - IL-1a nivo u tkivu pluća ;;Slika 56: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - IFN γ nivo u tkivu pluća ;;Slika 57: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - IL-17F nivo u tkivu pluća ;;Slika 58: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - IL-1b nivo u tkivu pluća ;;Slika 59: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - RANTES nivo u tkivu pluća ;;Slika 60: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - MIP-2 nivo u tkivu pluća ;;Slika 61: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - KC nivo u tkivu pluća ;;Slika 62: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - IL-17A nivo u tkivu pluća ;;Slika 63: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu -MIP-1a nivo u tkivu pluća ;;Slika 64: Model ozbiljne neutrofilne astme na mišu - IL-33 nivo u tkivu pluća ;;Slika 65: Model reumatoidnog artritisa na mišu – Vizualni obrzac za bodovanje histopatologije. Reprezentativne slike pokazuju kombinovane rezultate mišjih tarzalnih zglobova u ispitivanju artritisa izazvanom kolagenom. ;;Slika 66: Model reumatoidnog artritisa na mišu - Histopatologija: Rezultati inflamacije. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM. * p < 0.01 kada se poredi sa grupom tretiranom sa nosačem.

Slika 67: Model reumatoidnog artritisa na mišu - Histopatologija: Rezultati hrskavice grupe tretirane nosačem. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 68: Model reumatoidnog artritisa na mišu - Histopatologija: Rezultati kostiju. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 69: Model reumatoidnog artritisa na mišu - Histopatologija: Ukupni rezultati. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 70: Model reumatoidnog artritisa na mišu - Histopatologija: soj #675. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 71: Model reumatoidnog artritisa na mišu - Histopatologija: Reprezentativne slike. ID životinje (#n.n) i ud (R za desno, L za levo) su naznačeni u zagradama. Gornja leva slika (nosač): intenzivno raspadanje zgloba i kosti sa inflamacijom i fibrozom sa proširenjem na peri-artikularna meka tkiva. Donja slika (soj #675): sinovitis i burzitis koji se proširuju fokalno na peri-artikularna tkiva, blaga zglobna oštećena hrskavice i intrazglobni oštećenje, neoštećena koštana struktura.

Slika 72: Model multiple skelroze na mišu – klinički rezultat.

Slika 73: Model multiple skleroze na mišu – učestalost javljanja bolesti.

OPIS PRONALASKA

Bakterijski sojevi

[0028] Kompozicije prema pronalasku sadrže bakterijski soj roda Bacteroides koji ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 98% identična sa SEQ ID NO:4. Primeri pokazuju da bakterija ovog roda je korisna za lečenje ili prevenciju bolesti i stanja u kojima posreduje IL-17 ili Th17 put. Poželjni bakterijski sojevi su vrste Bacteroides coprocola.

[0029] Primeri ovde opisanih Bacteroides vrsta uključuju Bacteroides massiliensis, Bacteroides coprocola, Bacteroides thetaiotaomicron i Bacteroides caccae. Drugi primer ovde opisanih vrsta Bacteroides je Bacteroides fragilis. Bacteroides je rod gram-negativnih, obavezno anaerobih bakterija. Vrste Bacteroides su bacili koji ne obrazu endospore, i mogu biti ili pokretne ili nepokrektne, u zavisnosti od vrste. Vrste Bacteroides čine značajan deo gastrointestinalne flore sisara i ključni su obrađivanje složenijih molekula.

[0030] Ćelije Bacteroides coprocola su kultivisanae na pločama EG krvnog agara stiktno anaerobe, koje ne obrazuju spore, nepokretne gram negativne . Kratke štapićaste ili štapićaste ćelije su širine oko 0-8µm i promenjive dužine, generalno u opsegu 1-4 µm. Primeri sojeva vrste Bacteroides coprocola su opisani u [16]. Tip soja, M16T(=JCM 12979<T>=DSM 17136<T>), je izolovan iz fecesa zdravog čoveka. Dva dodatna soja [M11 (=JCM 12980) i M156 (=JCM 12981)] su uključena u ovu vrstu. GenBank/EMBL/DDBJ pristupni brojevi za 16S rRNK sekvencu gena ovih Bacteroides coprocola sojeva su AB200223, AB200224 i AB200225 (opisani ovde kao SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:3).

[0031] Bakterija deponovana pod prijemnim brojem NCIMB 42408 je testirana u primerima i takođe je ovde nazivana soj 675.16S rRNK sekvenca za 675 soj koji je testiran je obezbeđena u SEQ ID NO:4. Soj 675 je deponovan kod inetracionalnim autoritetom za deponovanje NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB219YA, Scotland) od strane 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB252ZS, Scotland) 13-tog maja 2015 kao "Bacteroidales 675" i dodeljen joj je prijavni broj NCIMB 42408.

[0032] Genom soja 675 sadrži hromozom i plazmid. Obezbeđena je sekvenca hromozoma za soj 675 u SEQ ID NO:6 u listi sekvenci objavljenoj sa WO 2016/203217. Obezbeđena je sekvenca plazmida za soj 675 u SEQ ID NO:7 u listi sekvenci objavljenoj sa WO 2016/203217. Ove sekvence su nastale korišćenjem PacBio RS II platforme.

[0033] Bakterijski sojevi blisko povezani sa testiranim sojem u primerima se takođe očekuje da su efikasni za lečenje ili prevenciju boelsti i stanja u kojima posreduje IL-17 ili Th17 put. Poželjno, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 99%, 99.5% ili 99.9% identična sa SEQ ID NO:4. Poželjno, bakterijski soj za upotrebu prema pronalasku ima 16s rRNK sekvencu koja je prikazana sa SEQ ID NO:4.

[0034] Drugi bakterijski soj ovde opisan je soj Bacteroides thetaiotaomicron deponovan pod prijemnim brojem NCIMB 42341. Soj je deponovan kod međunarodne ustanove za deponovanje NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB219YA, Scotland) 3 Decembra 2014.

[0035] Drugo poželjni ovde opisani sojevi Bacteroides thetaiotaomicron su soj tipa ATCC 29148 = CCUG 10774 = CIP 104206 = DSM 2079 = JCM 5827 = NCTC 10582 = VPI 5482 i soj WAL 2926 = ATCC 29741. Drugi poželjan ovde opisani soj Bacteroides thetaiotaomicron je soj opisan u EP1448995. Pristupni broj za 16S rRNK sekvencu gena soja Bacteroides thetaiotaomicron WAL 2926 je M58763 (ovde opisan kao SEQ ID NO:5).

[0036] U izvesnim slučajevima, ovde opisani bakterijski soj ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sa 16s rRNK sekvencom bakterijskog soja Bacteroides thetaiotaomicron. Poželjno, ovde opisani bakterijski soj ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,99.5% ili 99.9% identična sa SEQ ID NO:5. Poželjno, bakterijski soj za upotrebu u pronalasku ima 16s rRNK sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO:5.

[0037] Poželjni ovde opisan soj Bacteroides fragilis je tip soja ATCC 25285 = CCUG 4856 = CIP 77.16 = DSM 2151 = JCM 11019 = LMG 10263 = NCTC 9343. Prijavni broj Bacteroides fragilis soja NCTC 9343 kompletnog genoma CR626927.1 (verzija: CR626927.1 GI:60491031).

[0038] U izvesnim slučajevima, ovde opisani bakterijski soj ima genom sa identičnom sekvencom sa CR626927.1. U poželjnim izvođenjima, ovde opisani bakterijski soj ima genom sa bar 90% identičnom skevencom (npr. bar 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnom sekvencom) sa CR626927.1 duž bar 60% (npr. bar 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%) CR626927.1. Na primer, ovde opisani bakterijski soj može imati genom sa bar 90% identičnom sekvencom sa CR626927.1 duž 70% CR626927.1, ili bar 90% identičnom sekvencom sa CR626927.1 duž 80% CR626927.1, ili bar 90% identičnom sekvencom sa CR626927.1 duž 90% CR626927.1, ili bar 90% identičnom sekvencom sa CR626927.1 duž 100% CR626927.1, ili bar 95% identičnom sekvencom sa CR626927.1duž 70% CR626927.1, ili bar 95% identičnom sekvencom sa CR626927.1 duž 80% CR626927.1, ili bar 95% identičnom sekvencom sa CR626927.1 duž 90% CR626927.1, ili bar 95% identičnom sekvencom sa CR626927.1 duž 100% CR626927.1, ili bar 98% identičnom sekvencom sa CR626927.1 duž 70% CR626927.1, ili bar 98% identičnom sekvencom sa CR626927.1 duž 80% CR626927.1, ili bar 98% identičnom sekvencom sa CR626927.1 duž 90% CR626927.1, ili bar 98% identičnom sekvencom sa CR626927.1 duž 100% CR626927.1.

[0039] U izvesnim slučajevima, bakterijski soj za upotrebu prema pronalasku ima hromozom sa identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217. U poželjnim slučajevima, bakterijski soj za upotrebu prema pronalasku ima hromozom sa bar 90% identičnom sekvencom (npr. bar 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnom sekvencom) sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž bar 60% (npr. bar 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%) SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217. Na primer, bakterijski soj za upotrebu prema pronalasku može imati hromozom sa bar 90% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 70% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 , ili bar 90% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 80% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 , ili bar 90% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 90% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 , ili bar 90% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 100% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 , ili bar 95% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 70% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217, ili bar 95% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 80% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217, ili bar 95% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 90% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217, ili bar 95% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 100% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217, ili bar 98% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 70% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217, ili bar 98% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 80% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217, ili bar 98% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 90% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217, ili bar 98% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 duž 100% SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217.

[0040] U izvesnim slučajevima, bakterijski soj za upotrebu prema pronalasku ima plazmid sa identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217. U poželjnim slučajevima, bakterijski soj za upotrebu prema pronalasku ima plazmid sa bar 90% identičnom sekvencom (npr. bar 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnom sekvencom) sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž bar 60% (npr. bar 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%) SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217. Na primer, bakterijski soj za upotrebu prema pronalasku može imati plazmid sa bar 90% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 70% SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217, ili bar 90% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 80% SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217, ili bar 90% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 90% SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217, ili bar 90% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 100% SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217, ili bar 95% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 70% SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217, ili bar 95% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 80% SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217, ili bar 95% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 90% SEQ ID NO:7 WO 2016/203217, ili bar 95% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 100% SEQ ID NO:7 izWO 2016/203217, ili bar 98% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 70% SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217, ili bar 98% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 80% SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217, ili bar 98% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 90% SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217, ili bar 98% identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217 duž 100% SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217.

[0041] U izvesnim slučajevima, bakterijski soj za upotrebu prema pronalasku ima hromozom sa identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:6 iz WO 2016/203217 i plazmid sa identičnom sekvencom sa SEQ ID NO:7 iz WO 2016/203217.

[0042] Bakterijski sojevi koji su biotipovi bakterije deponovane pod prijemnim brojem 42408 se takođe smatra da su efikasne u lečenju ili prevenciji bolesti i stanja u kojima posreduje IL-17 ili Thl7 put. Bakterijski sojevi koji su biotipovi bakterije deponovane pod prijemnim brojem NCIMB 42341, ATCC 29148 ili ATCC 29741 se takođe očekuje da su efikasni za lečenje ili sprečavanje bolesti i stanja posredovanih sa IL-17 ili Th17 putem. Biotip je blisko povezani soj koji ima iste ili veoma slične fiziološke i biohemijske karakteristike.

[0043] Sojevi koji su biotipovi bakterije deponovane pod prijemnim brojem NCIMB 42408 i koji su pogodni za upotrebu u pronalasku mogu biti identifikovanu sekvencioniranjem drugih nukleotidnih sekvenci za bakteriju deponovanu pod prijemnim brojem NCIMB 42408. Na primer, suštinski ceo genom može biti sekvencioniran i soj biotipa za upotrebu prema pronalasku može imati bar 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% sekvence identiče bar 80% njegovog celog genoma (npr. duž bar 85%, 90%, 95% ili 99%, ili duž njegovog celog genoma). Druge pogodne sekvence za upotrebu u identifikovanu sojeva biotipa mogu obuhvatati hsp60 ili repetitivne sekvence kao što su BOX, ERIC, (GTG)5, ili REP ili [17]. Sojevi biotopa mogu imati sekvence sa bar 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identičnom sekvencom sa odgovarajućom sekvencom bakterije deponovane pod prijemnim brojem NCIMB 42408.

[0044] Alternativno, sojevi koji su biotipovi bakterija deponovnih pod prijemnim brojem NCIMB 42408 i koji su pogodni za upotrebu u pronalasku mogu biti identifikovani pomoću depozita pod prijavnim brojom NCIMB 42408 i analize restrikcionih fragmenata i/ili PCR analize, na primer korišćenjem polimorfizma dužine fluorescentno pojačanih fragmenata (engl. fluorescent amplified fragment length polymorphism - FAFLP) i repetitivnim-PCR ’otisakom prsta’ repetativnih DNK elemenata (engl.repetitive DNA element (rep)-PCR fingerprinting), ili profilisanjem proteina, ili parcijalnim 16S ili 23s rDNK sekvencioniranjem.

[0045] U izvesnim izvođenjima, sojevi koji su biotipovi bakterije deponovane pod prijemnim brojem NCIMB 42408 i koji su pogodni za upotrebu prema pronalasku su sojevi koji obezbeđuju isti uzorak kao bakterija deponovana pod prijemnim brojem NCIMB 42408 kada se analizira sa restrikcionom analizom pojačane ribozomalne DNK (engl. amplified ribosomal DNK restriction analysis -ARDRA), na primer kada se korisi restrikcioni enzim Sau3AI (kao postupke za primer i smernice pogledati, na primer,[18]). Alternativno, sojevi biotipa su identifikovani kao sojevi koji imaju iste uzorke fermentacije ugljenih hidrata kao bakterija deponovana pod prijemnim brojem NCIMB 42408.

[0046] Drugi sojevi Bacteroides koji su korisni u kompozicijama i postupcima prema pronalasku, kao što su biotipovi bakterije deponovane pod prijemnim brojem NCIMB 42408, mogu biti identifikovani korišćenjem bilo kog odgovarajućeg postupka ili strategija, uključujući opisane testove u primerima. Na primer, sojevi za upotrebu u pronalasku mogu biti identifikovani kultivisanjem anaerobnih YCFA i/ili davanjem bakterije u modelu artitisa izazvanog tipom II kolagena kod miša i zatim procenom nivoa citokina. Posebno, bakterijski sojevi koji imaju slične uzorke rasta, metabolički tip i/ili površinske antigene bakterijama deponovnim pod prijemnim brojem NCIMB 42408 i mogu biti korisni u pronalasku. Koristan soj će imati uporedivu imunomodulatorsku aktivnost sa NCIMB 42408 sojem. Posebno, soj biotipa će izazvati uporedive efekte na modelima astme, artritisa i multiple skleroze na nivoe citokina prema efektima prikazanim u primerima, koji mogu biti identifikovani korišćenjem kultivisanjem i davanjem protokola opisanih u primerima.

[0047] Naročito poželjan soj prema pronalasku je soj deponovan pod prijemnim brojem NCIMB 42408. Ovo je soj 675 dat kao primer i testiran u primerima i pokazano da je efikasan za lečenje bolesti . Prema tome, pronalazak obezbeđuje ćeliju, kao što je izolovana ćelija, soja deponovanog pod prijeminim brojem NCIMB 42408. Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži ćeliju soja deponovanog pod prijemnim brojem NCIMB 42408. Pronalazak takođe obezbeđuje biološki čistu kulturu soja deponovanog pod prijemnim brojem NCIMB 42408. Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju deponovanu pod prijemnim brojem NCIMB 42408, za upotrebu u terapiji, posebno za ovde opisane bolesti.

[0048] Derivat soja deponovanog pod prijemnim brojem NCIMB 42408 može biti soj ćerka (potomstvo) ili kultivisani soj (subkloniran) iz originala. Derivat soja prema pronalasku može biti modifikovan, na primer na genetičkom nivou, bez smanjenja biološke aktivnosti. Posebno, derivat soja prema pronalasku je terapeutski aktivan. Derivat soja će imati uporedivu imunomodulatorsku aktivnost sa originalnim NCIMB 42408 sojem. Posebno, derivat soja će izazvati uporedne efekte na modilima astme, artritisa i multiple skleroze i uporedne efekte na nivoe citokina efektima pokazanim u primerima, koji mogu biti identifikovani korišćenjem i davanjem protokola opisanih u primerima. Derivat NCIMB 42408 soja će generalno biti biotip NCIMB 42408 soja. Derivat NCIMB 42341 će generalno biti biotip NCIMB 42341 soja.

[0049] Pozivanje na ćelije soja deponovanog pod prijemnim brojem NCIMB 42408 obuhvataju bilo koje ćelije koje imaju istu sigurnost i karakteristike terapeutske efikasnosti kao sojevi deponovani pod prijemnim brojem NCIMB 42408, i takve ćelije su obuhvaćene pronalaskom. Pozivanje na ćelije soja Bacteroides thetaiotaomicron deponovanog pod prijemnim brojevima NCIMB 42341, ATCC 29148 ili ATCC 29741 obuhvataju bilo koje ćelije koje imaju istu sigurnost i karakteristike terapeutske efikasnosti kao sojevi deponovani pod prijemnim brojem NCIMB 42341, ATCC 29148 ili ATCC 29741.

[0050] U poželjnim izvođenjima, bakterijski sojvevi u kompozicijea prema pronalasku su žive i u stanju da parcijalno ili potpuno kolonizuju crevo.

Terapeutske upotrebe

[0051] Kao što je prikazano u primerima, bakterijske kompozicije prema pronalasku su efikasne za smanjenje Th17 inflamatornog odgovora. Naročito, tretman sa kompozicijama prema pronalasku postiže smanjenje nivoa IL-17A i drugih Th17 puteva citokina, i klinička poboljšanja na modelima na životinjama stanja u kojima posreduju IL-17 i put Th17 . Prema tome, kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne za lečenje ili prevenciju inflamatornih i autoimunih bolesti i naročito bolesti ili stanja posredovnih sa IL-17. Posebno, komozicije prema pronalasku mogu biti korisne za smanjenju ili prevenciju povećanja IL-17 inflamatornog odgovora.

[0052] Th17 ćelije su podset od T pomoćničkih ćelija koje proizvode, na primer, IL-17A, IL17-F, IL-21 i IL-22. Diferencijacija Th17 ćelija i IL-17 ekspresije može biti vođena sa IL-23. Ovi citokini i odstali oblici važnih delova Th17 puta, koji je dobro ustanovljeni inflamatorni put signalizacije koji doprinosi i leži u osnovi brojni inmflamatornih i autoimunih bolesti (kako je ovde opisano, na primer, [19-24]). Bolesti u kojima je Th17 put aktiviran su bolesti u kojima posreduje Th17 put. Bolesti posredovane Th17 putem mogu biti poboljšane ili ublažene represijom Th17 puta, koja može biti preko redukcije u diferencijaciji Th17 ćelija ili redukciji u njihovoj aktivnosti ili redukcije u nivou citokina Th17 puta. Bolesti posredovane Th17 putem mogu biti karakterisane sa povećanim nivoima citokima proizvedenih od Th17 ćelija, kao što su IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26, IL- 9 (pregled dat u [25]). Bolesti posredovane Th17 putem mogu biti karakterisane sa povećanom ekspresijom gena u vezi sa Th-17, kao što su Stat3 ili IL-23R. Bolesti posredovane Th17 putem mogu biti u vezi sa povećanim nivoima Th17 ćelija.

[0053] IL-17 je pro-inflamatorni citokin koji doprinosi patogenezi nekoliko inflamatornih i autoimunih bolesti i stanja . IL-17 koji je ovde korišćen može da se odnosi na bilo koji član IL-17 familije, uključujući IL-17A, IL- 17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, i IL-17F. Bolesti posredovane IL-17 i stanja su karakterisane sa visokom ekspresijom IL-17 i/ili akupmulacijom ili prisustvom IL-17-pozitivnih ćelija u tkivu koje je napadnuto bolešću ili stanjem. Slično, bolesti i stanja posredovani IL-17- su bolesti i stanja koji su pogoršani sa visokim nivoima IL-17 ili porastom nivoa IL-17 i ublažena su niskim IL-17 nivoima ili smanjenjem IL-17 nivoa. IL-17 inflamatorni odgovor može biti lokalni ili sistemski.

[0054] Primeri bolesti i stanja koji mogu biti posredovani sa IL-17 ili Th17 putem obuhvataju multiple sklerozu; artritis, kao što je reumatoidni artritis, osteoartritis, psorijatički artritis, ili juvenilni idopatski artritis; neuromijelitis optika (Devicova bolest); ankilozni spondilitis; spondiloartritis; psorijaza; sistemski eritemski lupus; inflamatorna bolest creva, kao što je Kronova bolest ili ulcerozni kolitis; celijakija; astma, kao što je alergijska astma ili neutrofilna astma; hronična opstruktivna bolest pluća (COPD); uveitis; skleritis; vaskulitis; Behčetova bolest; ateroskleroza; atopijski dermatitis; emfizem; periodontitis; alergijski rinitis; i odbacivanje alografta. U poželjnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su korišćene za lečenje ili prevenciju jednog ili više stanja ili bolesti. U drugim poželjnim izvođenjima, ova stanja ili bolesti su posredovana sa IL-17 ili Th17 putem.

[0055] U izvesnim slučajevima, ovde opisane kompozicije su za upotrebu u postupku smanjenja IL-17 proizvodnje ili smanjenja ćelijske diferencijacije Th17 pri lečenju ili prevenciji bolesti ili stanja posredovanih sa IL-17 ili Th17 putem. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u lečnju ili prevenciji inflamatornih ili autoimunnih bolesti, gde pomenuto lečenje ili prevencija se postiže smanjenjem ili sprečavanje podizanja Th17 inflamatornog odgovora. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u lečenju pacijenata sa inflamatornom ili autoimunom bolesti, gde pacijent ima povišene nivoe IL-17 ili povećene Th17 ćelije ili pokazuje Th17 inflamatorni odgovor. U izvesnim izvođenjima, kod pacijenta može biti dijagnozirana hronična inflamatorna ili autoimuna bolest ili stanje, ili kompozcija prema pronalasku može biti korišćena za sprečavanje inflamatorne ili autoimune bolesti ili stanja koje se razvija u hroničnu inflamatornu ili autoimunu bolest ili stanje. U izvesnim izvođenjima, bolest ili stanje ne mora da regauje na lečenje sa TNF- α inhibitorima. Ove upotrebe prema pronalasku mogu biti primenjenje na bilo koju od specifičnih bolesti ili stanja navedenih u prethodnom pasusu.

[0056] IL-17 i Th17 put su često u vezi sa hroničnim inflamatornim i autoimunim bolestima, tako da kompozicije prema pronalasku mogu biti naročito korisne u lečenju ili sprečavanju hroničnih bolesti ili stanja koje su gore navedene. U izvesnim izvođenjima, kompozcije su za upotrebu kod pacijenata sa hroničnom bolešću. U izvesnim izvođenjima, kompozicije su za upotrebu u sprečavanju razvijanja hronične bolesti.

[0057] Ovde opisane kompozicije mogu biti korisne za lečenje bolesti i stanja posredovanih sa IL-17 ili Th17 putem i za uticanje na Th17 inflamatorni odgovor, tako da ovde opisane kompozicije mogu biti naročito korisne za lečenje ili sprečavanje hronične boelsti, lečenje ili prevenciju bolesti kod pacijenta koji nije reagovao na ostale terapije (kao što je lečenje sa TNF- α inhibitorima), i/ili lečenje i sprečavanje ošetećenja tkiva i simptoma u vezi sa IL-17 i Th17 ćelijama. Na primer, IL-17 je poznat da aktivno uništava matriks u hrskavici i koštanom tkivu i IL-17 ima inhibitorni efekat na proizvodnju matriksa u hondrocitama i oesteoblastima, tako da ovde opisane kompozicije mogu biti korisne u lečenju ili sprečavanju erozije kosti ili oštećenja hrskavice.

[0058] U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku obezbeđuje smanjenje ili sprečavanje u povećavanju IL-17 nivoa, posebno nivoa IL-17A . U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku obezbeđuje smanjenje ili sprečava povećavanje u nivoima IFN- γ, IL-1 β, RANTES, MIP-1 α, IL-8 ili IL-6. Tako smanjenje ili prevencija povećanih nivoa ovih citokina može biti korisna za lečenje ili sprečavanje inflamatornih ili autoimunih bolesti i stanja, posebno onih posredovanih IL-17 ili Th17 putem.

Astma

[0059] U poželjnim izvođenjima kompozicije prema pronalasku su korisne u lečenju ili sprečavanju astme. Primeri pokazuju da kompozicije prema pronalasku postižu smanjenje u angažovanju neutrofila i/ili eozinofila u disajnim putevima posle senzitizacije i izazivanja sa ekstraktom grinja kućne prašine i tako oni mogu biti korisni u lečenju ili prevenciji astme. Astma je hronična bolest karakterisana inflamacijom i restrikcijom disajenih puteva. Inflamacija u astmi može biti posredovana sa IL-17 i/ili Th17 ćelijama, i tako kompozicije prema pronalasku mogu biti naročito efikasne u prevenciji ili lečenju astme. Inflamacija u astmi može biti posredovana sa eozinofilima i/ili neutrofilima.

[0060] U izvesnim izvođenjima, astma je eozinofilna ili alergijska astma. Eozinofilna i alergijska astma su karakterisane porastom broja eozinofila u perifernoj krvi i u sekreciji vazdušnih puteva i u patološkoj su vezi sa zadebljavanjem zone bazalne membrane i farmakološki sa odgovorom na kortikosteroide [26]. Kompozicije koje smanjuju ili inhibiraju angažovanje eozinofila ili aktivaciju mogu biti korisne za lečenje ili sprečavanje eozinofilne i alergijske astme.

[0061] U dodatnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u lečenju ili prevenciji neutrofilne astme (ili neeozinofilne astme). Visoki broj neutrofila je u vezi sa ozbiljnom astmom koja može biti neosetljiva na lečenje kortikosteroidima. Kompozicije koje smanjuju ili inhibiraju angažovanje neutrofila ili aktivaciju mogu biti korisne u lečenju ili sprečavanju neutrofilne astme.

[0062] Eozinofilna i neutrofilna astma nisu međusobno isključivi uslovi i lečenja koji pomažu da se leče i eozinofilni i neutrofilni odgovori mogu biti generalno korisna u lečenju astme.

[0063] Povećani IL-17 nivoi i aktivacija Th17 puta su u vezi sa ozbiljnom astmom, tako da kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne u prevenciji razvijanja ozbiljne astme ili za lečenje ozbiljne astme.

[0064] U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u postupcima smanjenja eozinofilnog inflamatornog odgovora u lečenju ili prevenciji astme ili za upotrebu u postupcima za smanjenje neutrofilnog inflamatornog odgovora pri lečenji ili prevenciji astme. Kako je gore zabeleženo, visoki nivoi eozinofila u astmi su u vezi sa patološkim zadebljanjem zone bazalnih membrana, tako da smanjenje eozinofilnog odgovora u lečenju ili prevenciji astme može biti u stanju da specifično utiče na ovu karakteristiku bolesti. Takođe, povećani neutrofili, ili u kombinaciji sa povećanim eozinofilima ili u njihovom odsustvu, je u vezi sa ozbiljnom astmom i hroničnim suženjem disajnih puteva. Prema tome, smanjenje neutrofilnog inflamatornog odgovora može biti naročito korisno za uticanje na ozbiljnu astmu.

[0065] U izvesnim izvođenjima, kompozicije smanjuju peribronhijalnu infiltraciju kod alergijske astme, ili su za upotrebu u smanjenju peribronhijalne infiltracije u lečenju alergijske astme. U izvesnim izvođenjima, kompozicije smanjuju peribronhijalnu i/ili perivaskularnu infiltraciju kod neutrofilne astme, ili su za upotrebu u smanjenju peribronhijalne i/ili perivaskularne infiltracije u lečenju alergijske neutrofilne astme.

[0066] U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku obezbeđuje smanjenje ili prevenciju povećanja nivoa IL-1 β, IFN γ, RANTES, MIP-1 α ili IL-8.

[0067] U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u postupku lečenja astme koji dovodi do smanjenja eozinofilnog i/ili neutrofilnog inflamatornog odgovora. U izvesnim izvođenjima, pacijent koji se leči ima, ili je ranije identifikovan da ima, povećane nivoe neutrofila ili eozinofila, na primer kako je identifikovano kroz uzimanje krvi ili analizom ispljuvka. Kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne za sprečavanje razvijanja astme kod novorođenčeda kada se daje novorođenčetu ili trudnoj ženi. Kompozicije mogu biti korisne za spečavanje razvijanja astme kod dece. Kompozcije prema pronalasku mogu biti korisne za lečenje ili prevenciju početka astme kod odraslih. Kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne za kontrolisanje ili ublažavanje astme. Kompozicije prema pronalasku mogu biti naročito korisne za smanjenje simptoma u vezi sa astmom koji se pogoršavaju sa alergenima, kao što su grinje iz kućne prašine.

[0068] Lečenje ili prevencija astme mogu da se odnose na, na primer, ublažavanje intenziteta simptoma ili smanjenje učestalosti pogoršanja ili opsega izazivača koji su problem za pacijenta.

Artritis

[0069] U poželjnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u lečenju ili prevenciji reumatoidnog artritisa (RA). Primeri pokazuju da kompozicije prema pronalasku postižu smanjenje u kliničkim znacima RA na modelu miša, smanjenje oštećenja hrkavice i kosti, i smanjenje IL-17 inflamatornog odgovora i tako da mogu biti korisni u lečenju ili prevenciji RA. RA je sistemski inflamatorni poremećaj koji primarno napada zglobove . RA je u vezi sa inflamatornim odgovorom koji je rezultat nateklih zglobova, sinovijalne hiperplazije, i propadanja hrskavice i kosti . IL-17 i Th17 ćelije mogu imati ključnu ulogu u RA, na primer zbog toga što IL-17 inhibiraju proizvodnju matriksa u hondrocitama i oestobalstima i aktiviraju proizvodnju i funkcionisanje matričnih metaloprotinaza i zbog toga što aktivnost RA bolesti je u vezi sa IL-17 nivoima i brojem Th-17 ćelija [27,28], tako da kompozicije prema pronalasku mogu biti naročito efikasne u sprečavanju ili lečenju RA.

[0070] U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u snižavanju nivoa IL-17 ili sprečavanju povećanja IL-17 nivoa u lečenju ili prevenciji RA. U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku obezbeđuje smanjenje ili prevenciju povećanja IL-17, posebno nivoa IL-17A. U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku obezbeđuje smanjenje ili prevenciju povećanja nivoa IFN- γ ili IL-6.

[0071] U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku dvodi do smanjenja u naticanju zglobova. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrbeu kod pacijenata sa nateklim zglobovma ili pacijenata kood kojih je identifikovan rizik od oticanja zglobova. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u postupku smanjenja naticanja zglobova kod RA.

[0072] U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku će dovesti do smanjenja u ošećenju hrskavice i oštećenju kosti. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalsku su za upotrebu ili sprečavanje oštećenja hrskavice ili kosti u lečenju RA. U izvesnim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u lečenju pacijenta sa ozbiljnim RA koji su u riziku od ošećernja hrskavice ili kosti.

[0073] Povećani nivoi IL-17 i broja ćelija Th17 su u vezi sa razarajem hrkavice i kosti u RA [27,28]. IL-17 je takođe poznato da aktivira razaranje matriksa u hrskavici i koštanom tkivu i IL-17 ima inhibitorini efekat na proizvodnju matriksa u hondocitama i oesteobalastima. Prema tome, u izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u sprečavanju erozije kostiju ili oštećenju hrskavice u lečenju RA. U izvesnim izvođenjima, kompozicije su za upotrebu u lečenju pacijenata koji pokazuju eroziju kosti ili ošetećenje hrskavice ili pacijenti kod kojih je identifikovano da su u riziku od erozije kosti ili ošećenja hrskavice.

[0074] TNF- α je takođe u vezi sa RA, ali TNF- α nije uključen u patogenezu kasnijih stadijuma bolesti. Nasuprot tome, IL-17 ima ulogu u svim stadijumima hronične bolesti [29]. Prema tome, u izvesnim izvođenjima kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u lečenju hroničnog RA ili kasnijeg stadijuma RA, kao što su bolesti koji uključuju destrukciju zgloba i gubitak hrskavice. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su lečenje pacijenata koji su prethodno primili anti-TNF-a terapiju. U izvesnim izvođenjima, pacijenti koji se leče ne odgovaraju ili više ne odgovaraju na anti-TNF-α terapiju.

[0075] Kompozcije prema pronalasku mogu biti korisne u modulaciji pacijentovog imunog odgovora, tako da u izvesnim izvođenjima kompozicije prema pronalasku su korisne u sprečavanju RA kod pacijenta identifikovanog da je u riziku od RA, ili kod koga je dijagnosticiran rani stadijum RA. Kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne u sprečavanju RA.

[0076] Kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne u kontrolisanju ili ublažavanju RA. Kompozicije prema pronalasku mogu biti narčito korisne u smanjenju simptoma koji je u vezi sa oticanjem zglobova ili destrukcijom kosti. Lečnje ili prevencija RA mogu se odnositi na primer na, ublažavanje intenziteta i simptoma ili smanjenje učestalosti pogoršanja ili opsega izazivača koji su problem za pacijenta.

Multiple skleroza

[0077] U poželjnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u lečenju ili sprečavanju multiple skleroza. Primeri pokazuju da kompozicije prema pronalasku postižu smanjenje u javljanju bolesti i intenzitetu bolesti na mišjem modelu multiple skleroze (EAE modelu), i tako oni mogu biti korisni u lečenju ili prevenciji multiple skleroze. Multiple skleroza je inflamatroni poremećaj koji je u vezu sa oštećenjem mijelinskih omotača neurona, naročito u mozgu i kičmi. Multiple skleroza je hronična bolest koja je progresivno onesposobljavajuća i koja uključuje epizode. IL-17 i Th17 ćelije mogu imati klučnu ulogu u multiple sklerozi, na primer IL-17 nivoi mogu biti u korelaciji sa lezijama multiple skleroze, IL-17 može da poremeti čvrste spojeve endotelijalnih ćelija krvno-moždane barijere, i Th17 ćelije mogu migrirati u ćelijski nervni sistem i izazuvati gubitak neurona [30,31].Prema tome, kompozicije prema pronalasku mogu biti naročito efikasne za sprečavanje ili lečnjenje multiple skleroze.

[0078]U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku dovodi do smanjenja u javljanju bolesti ili intenzitetu bolesti. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku za upotrebu u smanjenju javljanja bolesti ili intenzitetu bolesti. U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku sprečava pad u motornim funkcijama ili dovodi do poboljšanja morotne fukcije. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su korisne u sprečavanju pada u motornoj funkciji ili za upotrebu u poboljšanju motorne funkcije. U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicija prema pronalasku sprečava razvijanje paralize. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su korisne u sprečavanju paralize u lečenju multiple skleroze.

[0079] Kompozcije prema pronalasku mogu biti korisne za modulaciju pacijentovog imunog sistema, tako da u izvesnim izvođenjima kompozicije prema pronalasku su korisne u sprečavanju multiple skleroze kod pacijenta identifikovanog da je u riziku od multiple skleroze, ili kod koga je dijagnoziran rani stadijum multiple skleroze ili "vraćanje - odlaganje" multiple skleroze. Kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne u sprečavanju razvijanja skleroze. Zaista, primeri pokazuju da davanje kompozicija prema pronalasku sprečava razvijanje bolesti kod mnogo miševa.

[0080] Kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne za kontrolisanje ili ublažavanje multiplaskleroze. Kompozicije prema pronalasku mogu biti naričito pogodne za smanjenje simptoma u vezi sa multiple sklerozom. Lečenje ili prevencija multiple skleroze može da se odnosi na primer, na ublažavanje intenziteta simptoma ili smanjenja u frekvenci ili opsegu izivačača koji su problem za pacijenta .

Uveitis

[0081] U drugim poželjnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u lečenju ili sprečavanju uveitisa. Kompozicije prema pronalasku mogu postići smanjenje u javljanju bolesti i intenziteta bolesti na životinjskom modelu uveitisa i tako mogu biti korisne u lečenju ili prevenciji uveitisa. Uveitis je zapaljenje uvee i može dovesti do uništenja tkive retine. Može se javiti u različitim anatomskim oblicima (anteriorni, intermedijarni, posteriorni ili difuzan) i javiti se usled različitih, ali povezanih, uzroka uključujući sistemske autoimune poremećaje. IL-17 i Th17 put su centralno uključeni u uveitis, tako da kompozicije prema pronalasku mogu biti naročito efikasne u sprečavanju ili lečenju uveitisa. Reference [38-45] opisuju povećne nivoe interleukina-17A u serumu kod pacijenata sa uveitisom, naročito u vezi sa IL17A genetičkim varijantama panuveitisa, uloga Th17-vezanih citokina u patogenezi eksperimentalnog autoimunog uveitisa, neravnoteže između Th17 ćelija i regulatornih T ćelija u toku monofaznog emperimentalnog autoimunog uveitisa, nadregulaciji IL-17A kod pacijenata sa uveitisom i aktivnim Adamantiades-Behçet-ovom i Vogt-Koyanagi-Harada-ov (VKH) bolestima, lečenje neinfektivnog uveitisa sa sekukinumabom (anti-IL-17A antitelom), i Th17 u očima sa uveitisom.

[0082] U izvesnim izvođenjima, uveitis je posteriorni uveitis. Posteriorni uveitis prikazuje primarno inflamacije retine i i horoida i kompozicije prema pronalasku mogu biti efikasne za smanjenje inflamacije retine i oštećenja.

[0083] U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku dovodi do smanjenja u ošećenju reine. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u smanjenju ili prevenciji oštećenja retine pri lečenju uveitisa. U izvesnim izvođenjima, kompozicije su za upotrebu u lečenju pacijenata sa ozbiljnim uveitisom koji su u riziku od oštećenja retine. U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku dovodi do smanjenja zapaljenja optičkog diska (glave očnog nerva). U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u smanjenju ili prevenciji inflamacije optičkog diska. U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku dovodi do smanjenja inflitracije tkiva retine inflamacionim ćelijama. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u smanjenju infiltracije tkiva retine inflamacionim ćelijama. U izvesnim izvođenjima, lečenje sa kompozicijama prema pronalasku dovodi do toga da se vid zadržava ili poboljšava. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su za upotrebu u održavanju ili poboljšanju vida.

[0084] U izvesnim izvođenjima, kompozicije su za upotrebu u lečenju ili sprečavanju uveitisa koji je u vezi sa neinfektivnom ili autoimunom bolešću. Kao što je Behčetova bolest, Kronova bolest, Fušov heterohromni iridociklitis, granulomatoza sa poliangitisom, uveitis u vezi sa HLA-B27, juvenilni idopatski artritis, sarkoidoza, spondiloartritis, simpateticčka oftalmija, tubulointerstitialni nefritis i sindrom uveitisa ili Vogt-Koyanagi-Harada-ov sindrom. IL-17A je pokazano da je uključen u, na primer, Behčetovu i Vogt-Koyanagi-Harada-ovu bolest.

[0085] Lečenje ili prevencija uveitisa može da se odnosi na primer, na ublažavanje intenziteta simptoma ili prevenciju vraćanja.

Načini davanja

[0086] Poželjno, kompozicije prema pronalasku se mogu davati preko gastrointestinalnog trakta u cilju osposobljavanja davanja i/ili parcijalne ili ukupne kolonizacije creva sa bakterijskim sojem prema pronalasku. Generalno, kompozicije prema pronalasku se daju oralno, ali one mogu biti davane rektalno, intranazalno ili bukalno ili sublingvalnim putem.

[0087] U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku se daju kao pena, sprej ili gel.

[0088] U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku mogu biti davane kao supozitorija, kao što je rektalna supozitorija, na primer u obliku ulja teobroma (kakao buter), sintetičke tvrde masti (npr. suppocire, witepsol), glicero-želatina, polietilen glikola , ili sapun-glicerinske kompozicije.

[0089] U izvesnim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku je davana u gastrointestinalni trakt pomoću cevi, kao što je nazogastrična cev, orogastrična cev, gastrična cev, jejunostomna cev (J cev), perckutanozna endoskopska gastrostomija (PEG), ili port, kao što je port kroz zid grudnog koša koji obezbeđuje pristup želucu, jejunumu i drugi pogodni pristupni portovi.

[0090] Kompozicije premra pronalasku mogu biti davane jednom ili mogu biti davane sekvencionalno kao deo režima tretiranja. U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku su davane dnevno.

[0091] U izvesnim izvođenjima pronalaska, lečenje prema pronalasku je praćeno procenom mikrobiote creva pacijenta. Lečenje može biti ponovljeno ukoliko davanje i/ili parcijalna ili potpuna kolonizacija sa sojem prema pronalasku nije postignuta tako da takva efikasnost nije primećena, ili lečenje može biti prekinuto ukoliko davanje i/ili parcijalna ili potpuna kolonizacija je uspešna i primećena je efikasnost.

[0092] U izvesnim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku može biti davana trudnoj životinji, na primer sisaru kao što je čovek u cilju sprečavanja razvijanja inflamatorne ili autoimune bolesti kod deteta in utero i / ili posle rođenja.

[0093] Kompozicije prema pronalasku mogu biti davane pacijentu kod koga je bila dijagnozirana bolest ili stanje u kome posreduje IL-17 ili Th17 put, ili je identifikovano da je u riziku od bolesti ili stanja u kojima posreduju IL-17 ili Th17 put. Kompozicije mogu biti davanje kao profilaktička mera za sprečavanje razvijanja bolesti ili stanja u kojoj posreduje IL-17 ili Th17 put kod zdravog pacijenta.

[0094] Kompozicije prema pronalasku mogu biti davane pacijentu kod koga je identifikovano da ima abnormalnu mikrobiotu creva. Na primer, pacijent može imati smanjenu ili biti bez kolonizacije Bacteroides, i naročito Bacteroides coprocola.

[0095] Kompozicije prema pronalasku mogu biti davane kao prehrambeni proizvod, kao što je dodatak ishrani .

[0096] Generalno, kompozicije prema pronalasku su za davanje ljudima, mada mogu biti korišćene z alečenje životinja uključujući monogastriče sisare kao što su živina, svinje, mačke, psi, konji ili zečevi. Kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne za poboljšavanje rasta i osobina životinja. Ukoliko su davani životinjama, može biti korišćena oralna gavaža.

Kompozicije

[0097] Generalno, kompozicija prema pronalasku sadrži bakteriju. U poželjnim izvođenjima pronalaska, kompozicija je formulisana u obliku sušenja smrzavanjem. Na primer, kompozicija prema pronalasku može sadržati granule ili želatinske kapsule, koje sadrže bakterijski soj prema pronalasku.

[0098] Poželjno, kompozicija prema pronalasku sadrži liofilizovanu bakteriju. Liofilizacija bakterije je dobro ustanovljeni postupak i relevantne smernice su dostupne u , na primer, referencama [46-48].

[0099] Alternativno, kompozicija prema pronalasku može sadržati živu, aktivnu bakterijsku kulturu.

[0100] U poželjnim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku je inkapsulirane da se omogući davanje bakterijskoj soja u crevo. Inkapsulacija štiti kompoziciju od degradacije dok ne stigne na željenu lokaciju, na primer, razlaganjem hemijskim ili fizičkim stimulansom kao što je pritisak, enzimska aktivnost ili fizička dezintegracija, koje mogu biti pokrenute promenama pH. Bilo koji odgovarajući postupak inkapsulacije može biti korišćen. Primeri tehnika inkapsulacije uključuju zarobljavanje u okviru poroznog materijala, vezivanje ili apsorpciju na površinu čvrstog nosača, samo-grupisanje flokulacijom ili sa sredstvima za vezivanje, i mehaničkim obuzdavanjem iza mikroporozne membrane ili mikrokapsula . Smernice za inkapsulaciju koje mogu biti korisne za dobijanje kompozicija prema pronalasku su dostupne u, na primer referencama [49] i [50].

[0101] Kompozicija može biti davana oralno i može biti u obliku tablete, kapsule ili praha. Inkapsulirani proizvodi su poželjni zbog toga što su Bacteroides anaerobne. Drugi sastojci (kao što je vitamin C, na primer), mogu biti uključeni kao hvatači kiseonika i prebiotski supstrati da bi se poboljšalo davanje i/ili parcijalna ili potpuna kolonizacija i preživljavanje in vivo. Alternativno, probiotska kompozicija prema pronalasku može biti davana oralno kao prehrambeni proizvod ili dodatak ishrani, kao što je mleko ili surutka kao fermentisani mlečni proizvod, ili kao farmaceutski proizvod.

[0102] Kompozicija može biti formulisana kao probiotik.

[0103] Kompozicija prema pronalasku obuhvata terapeutski efikasnu količinu bakterijskog soja prema pronalasku. Terapeutski efikasna količina bakterijskoj soja je dovoljna da pokaže koristan efekat na pacijenata. Terapeutski efikasna količina bakterijskog soja može biti dovoljna da dovede do davanja u i/ili parcijalne ili potpune kolonizacije creva pacijenta.

[0104] Pogodna dnevna doza bakterije, na primer za odraslog čoveka, može biti od oko 1 x 10<3>do oko 1 x 10<11>jedinica koje obrazuju kolonije (engl. colony forming units - CFU); na primer, od oko 1 x 10<7>do oko 1 x 10<10>CFU; u drugom primeru od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<10>CFU.

[0105] U izvesnim izvođenjima, kompozicija sadrži bakterijski soj u količini od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<11>CFU/g, u odnosu na masu kompozicije; na primer, od oko 1 x 10<8>do oko 1 x 10<10>CFU/g. Doza može biti, na primer 1 g, 3g, 5g, i 10g.

[0106] Tipično, probiotik, kao što je kompozicija prema pronalasku, je opciono kombinovan sa bar jednim pogodnim prebiotskim jedinjenjem. Prebiotsko jedinjenje je uglavnom nedigestivni ugljenihidrat kao što je oligo- ili polisaharid, ili šećerni alkohol, koji nije degradiran ili apsorbovan u gornjem digestivnom traktu. Poznati prebiotici uključuju komercijalne proizvode kao što je inulin i transgalakto-oligosaharide.

[0107] U izvesnim izvođenjima, probiotska kompozicija prema prikazanom pronalasku uključuje prebiotsko jedinjenjenje u količini od oko 1 do oko 30% masenih, u odnosu na ukupnu masu kompozicije, (npr. od 5 do 20% masenih). Ugljenihidrati mogu biti izabrani iz grupe koju čine: fruktooligosaharidi (ili FOS), frukto-oligosaharidi kratkog lanca, inulin, izomalt-oligosaharidi, pektini, ksilooligosaharidi (ili XOS), hitosan-oligosaharidi (ili COS), beta-glukani, modifikovana arable guma i otporni skrobovi, polidekstroza, D-tagatoza, vlakna akacije, karob, ovas, i citrusna vlakna. U jednom aspektu, prebiotici su frukto-oligosaharidi kratkog lanca (radi jednostavnosti dole prikazani kao FOSs-c.c); pomenti FOSs-c.c. nisu digestibilni ugljenihidrati, generalno dobijeni konverzijom šećera iz šećerne repe i uključujući molekul saharoze za koji cu vezana tri molekula glukoze.

[0108] Kompozicije prema pronalasku mogu sadržati farmaceutski prihvatljive ekscipijense ili nosače. Primeri takvih pogodnih ekscipijenasa mogu se nači u referenci [51]. Prihvatljivi nosači ili razblaživači za terapeutsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj oblasti i opisani su , na primer, u referenci [52]. Primeri pogodnih nosača uključuju laktozu, skrob, glukozu, metil celulozu, magnezijum stearat, manitol, sorbitol i slično. Primeri pogodnoih razblaživača uključuju etanol, glicerol i vodu. Izbor farmaceutskog nosala, ekscipijensa ili razblaživača može biti izabran u odnosu na nameravani put davanja i standardne farmaceutske prakse. Farmaceutske kompozicije mogu sadržati, ili dodatno nosaču, ekscipijensu ili razblaživaču bilo koje pogodno vezivno(a) sredstvo(a), lubricans(e), sredstvo(a) za suspendovanje, sredstvo(a) za oblaganje, sredstvo(a) za rastvaranje. Primeri pogodnih vezivnih sredstava uključuju skrob, želatin, prirodne šećere kao što je glukoza, anhidrovana laktoza, tečljiva laktoza , beta-laktoza, kukuruzni zaslađivači, prirodne i sintetičke gume, kao što je akacija, tragakant ili natrijum alginat, karboksimetil celuloza i polietilen glikol. Primeri pogodnih lubrikanasa uključuju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid i slično. Sredstva za održavanje, stabilizatori, boje i čak sredstva za davanje ukusa mogu biti obezbeđena u farmaceutskoj kompoziciji. Primeri sredstava za održavanje uključuju natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu i estre p-hidroksi benzoeve kiseline. Antioksidansi i sredstva za suspendovanje mogu takođe biti korišćeni.

[0109] Kompozicije prema pronalasku mogu biti formulisane kao prehrambeni proizvodi. Na primer, prehrambeni proizvod može obezbediti nutricionu korist pored terapeutskog efekata pronalaska, kao što je dodatak ishrani. Slično, prehrambeni proizvod može biti formulisan da unapredi ukus kompozicije prema pronalasku ili da se napravi kompozicija atraktivnijom za korišćenje tako što je sličnija uobičajenim prehrambenim proizvodima pre nego farmaceutskoj kompoziciji. U izvesnim izvođenjima, kompozicija prema pronalasku je formulisana kao proizvod na bazi mleka. Izraz "proizvod na bazi mleka" označava tečni ili polutečni mlečni proizvod ili proizvod od surutke koji ima varjabilan sadržaj masti. Proizvod na bazi mleka može biti npr, kravlje mleko, kozje mleko, ovčije mleko, obrano mleko, punomasno mleko, mleko dobijeno od mleka u prahu i surutke bez bilo kakve obrade, ili obrađeni proizvod, kao što je jogurt, kefir, kiselo mleko, punomasno kiselo mleko, buter i ostali mlečni proizvodi kišeljenja. Još jedna važna grupa uključuje mlečne napitke, kao što je napitak od surutke, fermentisana mleka, kondenzovana mleka, mleka za odojčad i bebe; mleka sa ukusom, sladoled; hrana koja sadrži mleko kao što su slatkiši.

[0110] U izvesnim izvođenjima, kompozicije prema pronalasku sadrže pogodni bakterijski soj ili vrste i ne sadrže bilo koje druge bakterijske sojeve ili vrste. Takve kompozicije mogu sadržati samo de minimis ili biološki irelevantne količine drugih bakterijskih vrsta ili sojeva. Takve kompozcicije mogu biti kulture koje su suštinski slobodne od ostalih vrsta organizama.

[0111] Kompozicije za upotrebu prema pronalasku mogu ili ne moraju zahtevati dozvolu za stavljanje u promet.

[0112] U nekim slučajevima, liofilizovani bakterijski soj je rekonstruisan pre davanja. U nekim slučajevima, ovde je opisana rekonstrukcija pomoću razblaživača.

[0113] Kompozicije prema pronalasku mogu sadžati farmaceutski prihvatljive ekscipijense, razblaživače ili nosače.

[0114] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bakterijski soj prema pronalasku; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosač ili razblaživač; gde bakterijski soj je u količini dovoljnoj za lečenje poremećaja kada se daje subjektu kome je potrebno; i gde je poremećej izabran iz grupe koju čine astma, alergijska astma, neutrofilna astma, osteoartritis, psoriatički artritis, juvenilni idiopatski artritis, neuromijelitis optika (Devicova bolest), ankilozni spondilitis, spondiloartritis, sistemski eritemski lupus, celijačna bolest, hronična obstruktivna bolest pluća (COPD), kancer, kancer grudi, kancer debelog creva, kancer pluća, kancer jajnika, uveitis, skleritis, vaskulitis, Behčetova bolest, ateroskleroza, atopijski dermatitis, emfizem, periodontitis, alergijski rinitis, i odbacivanje alografta.

[0115] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bakterijski soj prema pronalasku; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosač ili razblaživač; gde je bakterijski soj u količini dovoljnoj za lečenje ili sprečavanje bolesti posredovane sa IL-17 ili Th17 putem. U poželjnim izvođenjima, pomenuta bolest ili stanje je izabrano iz grupe koju čine reumatoidni artritis, multiple skleroza, psorijaza, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, celijakija, astma, alergijska astma, neutrofilna astma, osteoartritis, psorijatički artritis, juvenilni idiopatski artritis, neuromijelitis optika (Devicova bolest), ankilozni spondilitis, spondiloartritis, sistemski eritematozni lupus, hronična opstruktivna bolest pluća (COPD), kancer, kancer grudi, kancer debelog creva, kancer pluća, kancer jajnika, uveitis, skleritis, vaskulitis, Behčetova bolest, ateroskleroza, atopijski dermatitis, emfizem, periodontitis, alergijski rinitis, iodbacivanje alografta.

[0116] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju kompoziciju, gde količina bakterijskog soja je od oko 1 x 10<3>do oko 1 x 10<11>jedinica koje obrazuju koloniju po gramu u odnosu na masu kompozicije.

[0117] U izvesnim izvođenjima, pronalazak oobezbeđuje gornju farmaceutski kompoziciju, gde kompozicija je davana u dozi od 1 g, 3 g, 5 g ili 10 g.

[0118] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsu kompoziciju, gde kompozicija je davana postupkom izabranim iz grupe koju čine oralni, rektalni, subkutanozni, nazalni, bukalni, i sublingualni.

[0119] U izvesnim izvođenjima, pronalazk obezbeđuje gornju farmaceutski kompoziciju koja se sastoji od nosača izabranog iz grupe koju čine laktoza, skrob, glukoza, metil celuloza, magnezijum stearat, manitol i sorbitol.

[0120] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži razblaživač izabran iz grupe koju čine etanol, glicerol i voda.

[0121] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutski kompozicijukoja sadrži ekscipijens izabran iz grupe koju čine skrob, želatin, glukoza, anhidrovana laktoza, beta-laktoza, kukuruzni zaslađivač, akacija, tragakant, natrijum alginat, karboksimetil celuloza, polietilen glikol, natrijum oleat, natrijum steart, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat i natrijum hlorid.

[0122] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, dalje obuhvata bar jedno sredstvo za održavanje, antioskidans i stabilizator.

[0123] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži sredstvo za održavanje koje je izabrano iz grupe koju čine natrijum benzoat, sorbinska kiselina i estri phidroksibenzoeve kiseline.

[0124] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju, gde pomenuti bakterijski soj je liofilizovan.

[0125] U izvesnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gornju farmaceutsku kompoziciju gde kada je kompozicija čuvana u zatopljenom sudu na oko 4°C ili oko 25°C i nosač je smešten u atmosferu koja ima 50% relativne vlažnosti, bar 80% bakterijskog soja mereno u jedinicama koje obrazuju koloniju, je preostalo posle perioda od bar oko: 1 mesec, 3 meseca, 6 meseci, 1 godinu, 1.5 godinu, 2 godine, 2.5 godine ili 3 godine

Postupci za kultivisanje

[0126] Bakterijski sojevi za upotrebu u prikazanom pronalasku mogu biti kultivisani pomoću standardnih mikrobioloških tehnika detaljno prikazanih u , na primer, referencama [53-55].

[0127] Bakterijski sojevi roda Bacteroides mogu biti kultivisani korišćenjem postupka kao što je onaj dole neveden, koji može obezbediti dobar rast i pouzdanost. Ovaj postupak je naročito koristan za kultivisanje sojeva vrste Bacteroides coprocola.

[0128] Bakterijski sojevi roda Bacteroides, i posebno vrsta Bacteroides coprocola, mogu biti kultivisani pomoću tečnog štoka za inokulaciju ploče (ili veće tečne kulture), pre nego razmaza smrznutog štoka koji se generalno može koristiti (videti, na primer, referencu [56]). Ustanovljavanje zrelih kolonija je pouzdano i brzo ukoliko su zamrznuti štokovi sojeva Bacteroides otopljeni i korišćeni kao tečna kultura.

[0129] Postupak koji je pogodan za kultivisanje bakterijskog soja roda Bacteroides, može obuhvatati:

<(a)>obezbeđivanje smrznutog štoka bakterijskog soja;

<(b)>otapanje smrznutog štoka da bi se dobio tečni štok;

(c) dodavanje tečnog štoka u čvrst ili tečni medijum; i

(d) inkubiranje čvrstog ili tečnog medijuma da bi se dobila kultura bakterijskog soja.

[0130] Ovaj postupak je naročito koristan za kultivisanje bakterijskih sojeva Bacteroides coprocola.

[0131] Smrznuti štok može biti zamrznuti glicerolski štok. Čvrst ili tečni medijum može biti YCFA agar ili YCFA medijum. YCFA medijum može obuhvatati (na 100ml, približne vrednosti): Casitone (1.0 g), ekstrakt kvasca (0.25 g), NaHCO3(0.4 g), cistein (0.1 g), K2HPO4(0.045 g), KH2PO4(0.045 g), NaCl (0.09 g), (NH4)2SO4(0.09 g), MgSO4· 7H2O (0.009 g), CaCl2(0.009 g), resazurin (0.1 mg), hemin (1 mg), biotin (1 µg), kobalamin (1 µg), p-aminobenzoeva kiselina (3 µg), folna kiselina (5 µg), i piridoksamin (15 µg).

[0132] Inkubiranje u koraku (d) može biti izvedeo u toku bar 36 sati, kao što je 48 ili 72 sata. Inkubiranje u koraku (d) može biti izvedeno u anaerobnim uslovima kao što je anaerobna komora. Kultura obezbeđena u koraku (d) može biti korišćena kao subkultura veće kulture bakterijskog soja. Takvo subkultivisanje omogućava da bude pripremljena veća količina bakterije i može biti korisno za obezbeđivanje kompozicija prema pronalasku na komercijalnoj skali

[0133] Topljenje u koraku (b) može biti izvedeno na sobnoj temperaturi ili zagrevanjem rukom.

[0134] Količina tečnog štoka dodatog u koraku (c) može biti između 300µl i 5ml, kao što je 500µl. Štok može biti 20% štok glicerola.

[0135] Gornji postupak može biti korišćen za pripremanje farmaceutske kompozicije ili prehrambenog proizvoda, u kom slučaju postupak može obuhvatati dodatne korake izolovanja bakterijskog soja, opciono liofilizovanjem bakterijskog soja i kombinovanjem bakterijskog soja sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa ili nosača, ili jednom ili više prehrambenih supstanci. Ova farmaceutska kompozicija ili prehrambeni proizvod pripremljen postupkom može biti korišćen za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja u kojima posreduje IL-17 ili Th17 put.

[0136] Primer postupka kultivisanja bakterijskih sojeva roda Bacteroides, i posebno vrste Bacteroides coprocola, može obuhvatati:

<1.>500µl 20% štoka glicerola je zasejano na pločama na YCFA agaru.

<2.>Ploče su ostavljene u anaerobnoj komori u toku 48/72 sati da se stvore zrele kolonije.

3. Bakterija je kultivisana u zapremini od 10ml, bilo da je ovo oblik jedne kolonije ili 1% tečne subkulture.

4. Ploče sa kolonijama su samo korišćene u toku 2/3 dana pošto je postignuta morfologija zrele kolonije.

Bakterijski sojevi za upotrebu u kompozicijama vakcine

[0137] Pronalazači su identifikovali da su bakterijske sojevi prema pronalasku korisni za lečenje ili sprečavanje bolesti ili stanja u kojima posreduju IL-17 ili Th17 put. Ovo je verovatno rezultat efekta koji bakterijski sojevi prema pronalasku imaju na domaćinov imuni sistem. Prema tome, kompozicije prema pronalasku mogu takođe biti korisne u sprečavanju bolesti ili stanja u kojima posreduju IL-17 ili Th17 put, kada se daju kompozicije vakcine. U izvesnim takvim izvođenjima, bakterijski sojevi prema pronalasku mogu biti ubijeni, inaktivirani ili ublaženi. U izvesnim izvođenjima, kompozicije mogu sadržati adjuvant za vakcinu. U izvesnim izvođenjima, kompozicije su za davanje pomoću injekcije, kao što je subkutanozna injekcija.

Opšte

[0138] Praksa prikazanog pronalska će koristiti, osim ako nije drugačije navdeno, konvencionalne postupke hemije, biohemije, molelularne biologije, imunologije i farmakologije, u okviru stanja tehnike. Takve tehnike su potpuno objašnjene u literaturi. Videti, npr., reference [57] i [58-64], itd.

[0139] Izraz "čini" obuhvata "uključuje" kao i "sastoji se" npr. kompozicija koja " se sastoji " X može da sadrži samo X ili može uključivati nešto dodatno npr. X Y.

[0140] Izraz "oko" u vezi sa numeričkom vrednošću x je opcion i označava, na primer, x±10%.

[0141] Izraz "suštinski" ne isključuje "potpuno" npr. kompozicija koja je "suštinski bez" Y može biti potpuno bez Y. Kada je neophodno, reč "suštinski" može biti izostavljena iz definicije prema pronalasku.

[0142] Pozivanje na procenat identične sekvence između dve nukleotidne sekvence znači da, kada su poravnate, taj procenat nukleotida je isti pri poređenju dve sekvence. Ovo poravnanje i procenat homologije ili identičnost sekvence mogu biti određeni pomoću progrma softvera poznatih u stanju tehnike, na primer oni opisani u odeljku 7.7.18 ref. [65]. Poželjno poravnavanje je određeno pomoću Smith-Waterman-ovog algoritma za pretraživanje homologije pomoću pretraživanja ’affine gap’ sa ’gap open penalty’ od 12 i ’gap extension penalty’ od 2, BLOSUM matrks 62. The Smith- Waterman-ov algoritam za pretraživanje homologije je opisan u ref. [66].

[0143] Osim ukoliko nije specifično navedeno, postupak ili metod koji obuhvata više koraka može obuhvatati dodatne korake na početku ili kaju postupka ili može sadržati dodatne međukorake. Takođe, koraci mogu biti kombinovani, izostavljeni ili izvedeni alternativnim redosledom ukoliko je pogodno.

[0144] Ovde su opisana različita izvođenja. Zna se da karakteristike navedene u svakom izvođenju mogu biti kombinovane sa drugim navedenim karakteristikama, da bi se dalje obezbedila druga izvođenja. Posebno, izvođenja koja su ovde istaknuta kao pogodna, tipična ili poželjna mogu biti kombinovana jedan sa drugim (osim kada su međusobno isključiva).

PRIMERI

Primer 1 – Efikasnost bakterijskog inkuluma na Modelu astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu Kratak prikaz

[0145] Miševima su davane kompozicije koje sadrže bakterijske sojeva prema pronalasku i zatim su izazivani sa ekstraktom grinja iz kućne prašine (engl.house dust mite-HDM) da bi se izazvao alergijski inflamatorni odgovor. Inflamatorni odgovor na HDM uključujući eozinofilne i neutrofilne komponente, je posredovan sa IL-17 i Th17 putem, i model je za astmu. Magnituda i karakteristike ispoljenog inflamatornog odgovora miševa tretiranog sa kompozicijama prema pronalasku su poređeni sa kontrolnim grupama. Nađeno je da kompozicije prema pronalasku ublažavaju inflamatorni odgovor, i smanjuju angažovanje eozinofila i nutrofila, ukazujući da one mogu biti korisne u lečenju IL-17- i Th17-posredovanih stanja kao što su eozinofilija, neutrofilija i astma.

Soj

[0146] 675

Nacrt studije

[0147] Grupe:

<1.>Negativna kontrolna grupa. Tretiranje sa kontrolom nosača (oralno).

3. Tretiranje sa inokulumom terapeutske bakterije soja 675 (oralno).

<7.>Pozitivna kontrolna grupa. Tretiranje sa deksametazonom (i.p.).

<8.>Netretirna kontrolna grupa.

Broj miševa po grupi = 5

Dan -14 do dana 13: Dnevno davanje kontrolnog nosača oralno (Grupa 1).

Dan -14 do dana 13: Dnevno davanje inokuluma terapeutske bakterije oralno (Grupa 2-6).

Dan 0, 2, 4, 7, 9, 11 Davanje 15ug HDM (ekstrakta grinja kućne prašine – kataloški broj: XPB70D3A25, Broj serije: 231897, Greer Laboratories, Lenoir, NC, USA) u zapremini od 30ul PBS nazalno (Grupa 1-8). Dan 0, 2, 4, 7, 9, 11 Davanje deksametazona (i.p., 3mg/kg, Sigma-Aldrich, Kataloški broj D1159) (Grupa 7).

Dan 14 Žrtvovanje svih životinja za analizu.

Ukupan broj miševa = 40.

Krajnje tačke i analiza

[0148] Dana 14 životinje su žrtvovane letalnom intraperitonealnom injekcijom sa pentabarbitolom (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) neposredno zatim sa bronhoalveliolarnim ispiranjem (engl.bronchoalveolar lavage-BAL).

[0149] Izolovane su ćelije iz BAL (bronhoalveolarnog ispirane) tečnosti i izveden je diferencijalni broj ćelija (200 broj ćelija/ uzorcima).

Materijal i postupci

[0150] Miševi. Ženski BALB/c miševi stari 7 nedelja su nabavljeni od Charles River Laboratories i nasumično smešteni u kaveze sa ukupno 5 miševa po kavezu (Ventilirani kavezi nabavljeni od Indulab AG, Gams, Switzerland tip kaveza: "The SealsafeTM - IVC cage. Proizvod broja 1248L). Kavezi su obeleženi sa brojem ispitivanja, brojem grupe i datumom početka eksperimenta. Miševi su praćeni nedeljno i aklimatizovani na okruženje u toku 7 dana pre početka ispitivanja (Dan ispitivanja-14). Životinje su bile stare 8 nedelja na dan ispitivanja -14. Voda za piće i hrana su bili dostupni ad libitum. Kavezi su bili obogaćeni. Dnevna nega životinja je izvedena prema lokanom broju autorizovane licence 2283.1 (izdate i odobrene od strane : Service de la consommation et des affaires vétérinaires du Canton de Vaud). Pijaća voda i hrana su bili dostupne ad libitum i osvežavane jednom dnevno. Kavezi su bili obogaćeni. Propisi o dobrobiti životinja su praćeni kao što je nalagano od strane zvaničnih autoriteta Švajcarske prema propisu 455.163 od FVO (Federal Veterinary Office) o laboratoriskom uzgoju životinja, proizvodnji genetički modifikovanih životinja, i postupcima sprovođenja eksperimenata na životinjama.

[0151] Kultivisanje bakteriskog inokuluma. U okviru sterilne radne stanice, krio-fiola bakterije je otopljena zagrevanjem sa rukavicom na ruci i ~0.7 ml sadržaja je injektovano u Hungatovu epruvatu (kataloški broj, 1020471, Glasgerätebau Ochs, Bovenden-Lenglern, Germany), koja sadrži 8 ml anaerobnih YCFA. Dve epruvete po soju su uglavnom pripremljene. Hungatove epruvete su zatim inkubirane (statčno) na 37°C do 24-26 sata (za soj 675).

[0152] S obzirom da je ustanovljeno da je bakterijski ODs inokulum soja 675 varjabilan, 3 različita prilaza kultivisanja su izvedena svaki dan.2 fiole su kultivisane kao što je gore opisano i treći uzorak je kultivisan korišćenjem 400ul alikvora kulture prethodnog dana za zasejavanje. Dana 4. tretiranja korišćen je poslednji pristup, zbog sprog rasta iz zamrnutog štoka. Primetno, ovaj prilaz je doveo da intenzivnog rasta bakterijskog soja 675 u svim slučajevima.

[0153] Kultivisanje kontrole nosača. Hungatova epruveta koja sadrži 8 ml anaerobnog YCFA je inkubirana (statički) na 37°C u toku 16h.

[0154] Davanje bakterijskog inokuluma ili kontrole nosača.400ul kultivisanog bakterijskog inokulima ili kontrole nosača davano je po danu pomoću oralne gavaže.

[0155] Intranazalna senzitizacija. Miševi su anestezirani i.p. injekcijom sa 9.75 mg ksilazola i 48.75 mg ketazola por kg (Dr. E. Graeub AG, Bern, Switzerland) i dato je 15ug HDM (Kataloški broj: XPB70D3A25, Broj serije: 231897, Greer Laboratories, Lenoir, NC, USA) u zapremini od 30ul PBS nazalno.

[0156] Dobijanje i davanje pozitivnog kontrolnog jedinjenja deksametazona. Deksametazon 21-fosfatna dinatrijum so (Sigma-Aldrich, Kataloški broj D1159, partija N° SLBD.1030V) je rastvorena u H2O i davana životinjama u dozi od 3mg/kg u zapremini od 200ul oralno danima navedenim u gornjem protokolu ispitivanja.

[0157] Završna procedura. Dana 14 Životinje su žrtvovane letalnom injekcijom pentabarbitola (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) a zatim je odmah sledilo bronhoalveolarno ispiranje (BAL) u 500 ul rastvoru soli.

[0158] Merenje ćelsjkih infiltrata u BAL. Ćelije su izolovane iz BAL tečnosti i diferencijalni ćelijski broj je izveden na osnovu standarnih morfoloških i citoloških kriterijuma.

[0159] Grafici i statistička analiza. Svi grafici su stvoreni sa Graphpad Prism Version 6 i jednosmerna ANOVA je primenjena. Rezultati iz statisitčkih analiza su obezbeđeni sa pojedinačinm podacima u tabelama. Linija greške predstavlja standardnu grešku srednje vrednosti (SEM).

Rezultati i analiza

[0160] Rezultati eksperimenata su prikazani na slikama 1-9.

[0161] Morbiditet ili smrtnost nisu zabeleženi kod miševa tretiranih sa bakterijom ili nosačem. Dve kontrole, tretiranje nosačem (negativna kontrola) i tretiranje deksametazonom (pozitivna kontrola) su se ponašali kao što je očekivano, sa oslabljenom eozinofilijom i neutrofilijom zabeleženom posle tretmana sa deksametazonom.

[0162] Najvažniji rezultati eksperimenta su prikazani na slikama 6 i 7, koje beleže ukupni broj i procenat neutrofila detektovan u brohijalnom ispiranju posle izazivanja sa HDM. Soj 675 smanjuje ukupno neutofile i proprcijalno neutrofile u BAL u odnosu na samo kontrolu sa nosačem.

Primer 2 – Efikasnost bakterijskog inokuluma na modelu ozbiljne neutrofilne astme na mišu Kratak prikaz

[0163] Miševima su date kompozicije koje sadrže bakterijske sojeve prema pronalasku i zatim su senzitizirane subkutanoznim davanjem ekstrakta grinja iz kućne prašine (HDM) i izazivane sa intranazalnim davanjem HDM u cilju modeliranja inflamatornog odgovora ozbiljne neutrofilne astme. Magnituda i karakteristike inflamatornog odgovora pokazane od strane miševa tretiranih sa kompozicijama prema pronalasku su poređeni sa kontrolnim grupama. Kompozicije prema pronalasku je ustanovljeno da ublažavaju inflamatorni odgovor i posebno smanjuju angažovanje neutrofila, na način uporediv sa pozitivnom kontrolom koja obuhvata davanja anti-IL-17 antitela. Podaci, prema tome ukazuju da kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne za lečenje IL-17- i Th17-posredovnaih uslova kao što je neutrofilija i astma.

Sojevi

[0164] 675

Nacrt ispitivanja

[0165] Grupe:

<1.>Negativna kontrola grupa. Tretman sa kontrolnim nosačem (oralno).

3. Tretman sa terapeutskim bakterijskim inokulumom soja 675 (oralno).

<7.>Pozitivna kontrolna grupa. Treatmman sa anti-IL-17 (i.p.).

<8.>Netretirana kontrolna grupa.

9: Zdravi miševi (osnovna linija).

Broj miševa u grupi (Grupa 1-8) = 5

Dan -14 do dana 17: Dnevno davanje kontrole nosača oralno (Grupa 1).

Dan -14 do dana 17: Dnevno davanje inokuluma terapeutske bakterije oralno

Dan 0: Senzitizacija sa HDM u CFA (s.c.) (Grupa 1-8).

Dan 7: Senzitizacija sa HDM u CFA (s.c.) (Grupa 1-8).

Dan 13, 15, 17: Davanje anti IL-17 neutralizujućeg antitela i.p. (Grupa 7).

Dan 14, 15, 16, 17: Izazivanje sa HDM u 30ul PBS nazalno (Group 1-8).

Dan 18: Žrtvovanje svih životinja za analizu.

Krajnje tečke i analiza:

[0166] Dana 14 životinje su žrtvovane letalnom intraperitonealnom injekcijom sa pentabarbitolom (Streuli PharmaAG,Uznach, Cat: 1170139A) neposredno posle bronhoalveolarnog ispiranja (BAL). Ćelije su izolovane iz BAL tečnosti i izvedeni su diferencijalni brojevi ćelija (200 brojeva ćelija/ uzorcima).

Materijali i postupci

[0167] Miševi. Ženski C57BL/6 miševi stari 7 nedelja su nabavljeni kod Charles River Laboratories i nasumično smešteni u kaveze ukupno 5 miševa po kavezu (Ventilirani kavezi dobijeni od Indulab AG, Gams, Switzerland Kavez tipa: "The SealsafeTM - IVC cage. Broj proizvoda 1248L). Kavezi su obeleženi sa brojem ispitivanja, brojem grupe i danom početka eksperimenta. Miševi su praćeni nedeljno i aklimatizovani na smeštaj u toku 7 dana pre početka ispitivanja (Dan ispitivanja -14). Životinje su bile stare 8 nedelja na dan ispitivanja -14. Pijaća voda i hrana su bile dostupne ad libitum. Kavezi su bili obogaćeni. Dnevna briga o životinjama je izvedena prema lokalnim ovlašćenjima licence broj 2283.1 (izdate i odobrene od strane: Service de la consommation et des affaires vétérinaires du Canton de Vaud). Pijaća voda i hrana su bile dostupne ad libitum i osvežavane jednom dnevno. Dopunavanje kaveza je bilo prisutno. Propisi o dobrobiti životinja su praćeni kao što je nalagano od strane zvaničnih autoriteta Švajcarske prema propisu 455.163 od FVO (Federal Veterinary Office) o laboratoriskom uzgoju životinja, proizvodnji genetički modifikovanih životinja, i postupcima sprovođenja eksperimenata na životinjama.

[0168] Kultivisanje bakterijskog inokuluma. U okviru sterilne radne stancice, krio-fiola bakterije je otpoljenja zagrevanjem u ruci sa rukavicom i ~0.7 ml sadržaja je injektovano u Hungatovu epruvetu (kat. broj, 1020471, Glasgerätebau Ochs, Bovenden-Lenglern, Germany), koja je sadržala 8 ml anaerobnog YCFA. Dve epruvete po soju su uglavnom pripremljene. Hungatove epruvete su zatim inkubirane (statički) na 37°C do 24-26 sati (za soj 675).

[0169] S obzirom da je bakterijski ODs inokuluma soja 675 bio varjabilan, 3 različita kultivisanja su izvedena svakog dana. 2 fiole su kultivisane kao što je groe opsiano i treći urzorak je kultivisan korišćenjem 400ul alikvota iz kulture prethodnog dana za zasejavanje. 4 dana tretiranja korišćen je poslednji pristup, zbog slabog rasta iz stmrznutog štoka. Primetno, ovaj prilaz je doveo do intenzivnog rasta bakterijskog soja 675 u svim slučajevima.

[0170] Kultivisanje kontrole nosača. Hungatova epruveta koja sadrži 8 ml anaerobnog YCFA je inkubirana (statički) na 37°C u toku 16h.

[0171] Davanje bakterijskog inokuluma ili kontrole nosača.400ul kultivisanog bakterijskog inokuluma ili kontrole nosača je davano dnevno oralnom gavažom.

[0172] HDM sensitizacija. 50 µg HDM (Kataloški broj: XPB70D3A25, Broj partije: 231897, Greer Laboratories, Lenoir, NC, USA) u PBS je emulgovan u jednakoj zapremini kompetnog Freundovog adjuvanta (CFA Chondrex Inc. Washington, USA) i davan je subkutanozno u zapremini od 200 µl, dva puta u toku dve nedelje na suprotnim bokovima. Nedelju posle druge imunizacije, miševi su anestezirani i.p. injekcijom sa 9.75 mg ksilasola i 48.75 mg ketasola po kg (Dr. E. Graeub AG, Bern, Switzerland) i zatim je dato intranazalno izazivanje sa 15 µg HDM u zapremini od 30ul PBS 4 uzastopna dana. Analiza je izvedena jedan dan posle izazivanja.

[0173] Pripremanje i davanje anti mišjeg IL-17 antitela kao jedinjanja pozitivne kontrole. Anti-IL-17 neutralizjuće antitelo je poticalo od Bio X ćelije i čuvano je na 4°C (Klon 17F3, Cat. Number BE0173, Bio X 45 Cell) i davano i.p. pri dozi od 12.5 mg/kg danima naznačenim gore u protokolu ispitivanja.

[0174] Krajnji postupak. Dana 18 životinje su žrtvovane letalnom i.p. injekcijom pentabarbitola (Streuli Pharma AG, Uznach, Cat: 1170139A) a zatim je sledelo bronhoalveolarno ispiranje (BAL) u 500 ul rastvora soli.

[0175] Merenje ćelijskih infiltrata u BAL. Ćelije su izolovane iz BAL tečnosti i izveden je diferencijalni broj ćelija na osnovu standarnih morfoloških i citohemijskih kriterijuma.

[0176] Grafici i statistička analiza. Svi grafici su dobijeni sa Graphpad Prism Version 6 i primenjena je jednosmerna ANOVA. Rezultati iz statističke analize su obezbeđeni sa pojedinačnim podacima u tabelama . Stupci greške prestavljaju standardnu grešku srednje vrednosti (SEM).

Rezultati i analiza

[0177] Rezultati eksperimenta su prikazani na slikama 10-18.

[0178] Nije primećena ni morbidnost ni smrtnost kod miševa tretiranih sa bakterijom ili sa snosačem. Kao što je prikazano na slikama 15 i 16, soj 675 je pokazao jak efekat i smanjene ukupne brojeve neutrofila u odnosu na negativne kontrole. Pored toga, soj 675 je smanjio brojeve eozinofila u odnosu na kontrole, kao što je prikazano na slikama 11 i 12.

Primer 3 – Efikasnost bakterijskom inokuluma na lečenje artritisa na modelu artirtisa kod miša izazvanog kolagenom tipa II

Materijali i postupci

Soj

[0179] 675

Bakterijske kulture

[0180] Bakterijske kulture su gajene do davanja u anaerobnoj radnoj stanici (Don Whitley Scientific) prema donjoj šemi rasta.

- Pon/Sred/Pet: Transfer štoka glicerola u led i prošarane YCFA ploče iz štoka glicerola. Koristit ploču kao što sledi maskimalno 3 dana.

- DnevnoPM: Uzeti jednu koloniju svakog soja iz kulura sa ploča, preneti u hungatovu epruvetu od 8 ml koja sadrži YCFA u toku noći (ON1)

- AM: Subkultura 80 ul (1%) ON1 u svežoj epruveti od 8 ml (DC1). Upotreba ON1 kulture za AM oralnu gavažu.

- PM: Upotreba DC1 kulture za PM oralnu gavažu.

[0181] Bakterijski soj #675 je gajen pomoću štoka glicerola.

[0182] Glicerolni štokovi su čuvani -80°C. Tri puta nedeljeno, štokovi glicerola su otapani na sobnu temperaturi i prošarani na YCFA pločama. Novi glicerolni alikvot je korišten u svakoj prilici. Bakterija je omogućeno da raste na datoj poloči do 72 sata.

[0183] Rastvori koji se daju životinjama su pripremani dva puta dnevno u intervalimaod osam sati za jutarnje (AM) i popodnevne (PM) tretmane. Bakterijska kolonija je sakupljena sa prošaranih ploča i preneta u epruvetu koja sadrži YCFA medijum. Bakterijski soj #675 je omogućeno da raste u toku 16 sati pre AM davanja. Bakterije su subkulivisane pri 1% u YCFA medijumu u toku PM davanja. OD vrednosti su zabeležene za svaki soj posle pripremanja za jutarnji i poslepodnevni tretman.

Model artitisa na mišu izazvan kolagenom tipa II

[0184] Odrasli muški DBA/1 miševi su nasumično raspoređeni u eksperimentalne grupe i omogućena im je aklimatizacija u toku dve nedelje. Dana 0, životinjama je davana subkutanozna injekcija 100 mikrolitara emulzije koja sadrži 100 mikrograma kolagena tipa II (CII) u nekompletnom Freundovom adjuvantu obogaćenom sa 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Dana 21, životinje su primile subkutanoznu injekciju sa buster emulzijom koja sadrži 100 µg kolagena tipa II u nekompletnom Freundovom adjuvantu.

[0185] Tretmani su davani prema donjem rasporedu. Od dana -14 do kraja eksperimenta dana 45, životinje su izmerene tri puta nedeljno. Od dana 21 do kraja eksperimenta, životinje su bodovane tri puta nedeljno radi kliničkih znaka artritisa i uključivali su naticanje zadnjih i prednjih šapa, radokarpalne (zglobove prednjih šapa) zglobove i tibio-tarzalne (zglavake) zglobove.

[0186] Dana 45 miševi su usmrćeni i krajnji uzorci krvi su uzeti za analizu citokina.

[0187] Dana -14, Dana 0 i Dana 45, uzorci stolice su sakupljeni u toku mikrobioloških analiza, neposredno brzo zamrznuti i čuvani na -80°C.

[0188] Artritis izazvan kolagnom (CIA) na mišjem modelu je dobro ustanovljen mišji model reumatoidnog artritisa [67]. Imunizacija sa CII izaziva patogenezu koja uključuje nekoliko važnih patoloških karakterisitka reumatoidnog artritisa, uključujući sinovijalnu hiperplaziju, mononuklearnu ćelijsku infiltraciju i degradaciju hrskavice. Značajno, razvitak CIA je posredovan sa Th17 ćelijama kroz lučenje IL-17A [68]. Imuni odgovor koji je u osnovi modela artritisa obogaćenog sa upotrebom Freundovog adjuvanta obogaćenog sa Mycobacterium tuberculosis.

[0189] Dana 21, slezina je sakupljena iz tri satelistske životinje iz svake grupe. Ćelije su kultivisane u toku 72 sata u prisustvu ili odsustvu kolagena II. Citokini, uključujći TNF- α, IL-6, IFN- γ, IL-4, IL-10 i IL-17, su kvantifikovani u supernatantima kulture i u krajnjem serumu sa Luminex. Ćelijska proliferacija je kvantifikovana pomoću titracionog postupka inkorporacije timidina.

Grupe za tretiranje i doziranje

[0190] Sve grupe su bile n=15 (n=12 za glavnu grupu za ispitivanje i n=3 za satelitske grupe)

[0191] Korišćeni nosač za bioterapeutike je bio medijum Ekstrakta kvasca -Casitone-Masne kiseline (YCFA).

Telesne mase

[0192] Od Dana -14 do kraja eksperimenta, životinje su izmerene tri puta nedeljno. Podaci su grafički prikazani (Srednja vrednost ± SEM).

Nespecifilna klinička zapažanja

[0193] Od dana -14 do kraja eksperimenta, životinje su proveravane dnevno na nespecifične kliničke znake koji su uključivali abnormalan položaj do kraja eksperimenta, životinje su dnevno proveravane na nespecifične kliničke znake koji uključuju abnormalni stav (pogrbljen), abnormalno stanje krzna (piloerekcija) i abnormalane nivoe aktivnosti (smanjena ili povećana aktivnost).

Klinička zapažanja

[0194] Od dana 21 do kraja eksperimenta dana 45, životinje su bodovane tri puta nedeljno na kliničke znake artritisa koji uključuju naticanje zadnjih i prednjih šapa, radio-karpalni (zglobova prednjih šapa) zglobova i tibio-tarzalnih (zglavka) zglobova. Svaki ud je bodovan korišćenjem sledeće skale: (0) normalan, (1) blago natečen, (2) srednje naticanje, (3) umereno naticanje i (4) ozbiljno naticanje. Klinički rezultat je izračunat dodavanjem svakog rezultata za svaki ud. Makismalni mogući klinički rezultat za životinje je bio (16). Životinje sa rezultatom jednakim (12) za dva uzastopna slučaja i životinje sa rezultatom većim od (12) ili bilo kojim slučajem su usmrćene. Podaci su prikazani grafički (Srednja vrednost ± SEM).

Analiza ćelijske proliferacije

[0195] Dana 21, tri životinje sateliti po grupi su usmrćene i slezine su izvađenje. Ćelije slezine su kultivisane u toku 72sata u prisustvu ili odsustvu kolagena tipa II. Posle 72 sata, ćelije su pulsirane u toku noću u prisustvu titriranog timidina. Ćelijska proliferacija je kvantifikovana merenjem ugradnje timidina. Podaci su grafički prikazani (srednja vrednost ± SEM). Supernatanti su sakupljeni i testirani na prisustvo ključnih citokina.

Analiza citokina

[0196] Terminalni supernatanti iz kultura ćelija slezine su testiranu u cilju kvantifikacije TNF- α, IL-6, IFN- α, IL- 4, IL-10 i IL-17 Luminex-om. Podaci su grafični prikazani (Srednja vrednost ± SEM).

Mikrobiološka analiza

[0197] Dana -14, Dana 0 i Dana 45, uzorci stolice su sakupljeni iz svake životinje, momentalno brzo zamrznuti, i čuvani na -80°C. Caeca (uključujući sadržaj) su trenutno brzo zamrznuti i čuvani na -80°C. Izveden je dnevno test idnentifikacije bakterija zasejavanjem bakterija.

Histopatologija

[0198] Na kraju eksperimenta, zadnje šape su čuvane u fiksiru za tkivo. Uzorci su premešteni u dekalcifikacioni rastvor. Uzorci tkiva su obrađeni, sekcirani i obojeni sa hematoksilin & eozinom. Isečci su bodovani kvalitativnom histopatologijom, slepom na nacrt eksperimenta, na znake artitisa koji obuhvataju inflamaciju, oštećenja zglobne hrskavice i ošetećenja u osnovi metafizne kosti. Detaljni sitem bodovanja je korišćen (videti dole). Podaci su grafički prikazani (Srednja vrednost ± SEM). Sirovi i analizirani podaci su obezbeđeni kao i reprezentativne slike.

Rezultati i analiza

Preživljavanje i nespecifična klinička zapažanja

[0199] Neke životinje su usmrćene pre predviđenog kraja ispitivanja usled intenziteta kliničkih znakova artritisa ili usled intenziteta nespecifičnih kliničkih zapažanja.

[0200] Jedna životinja u grupi 1 je usmrćena (tretirana sa nosačem, životinja je došla od snabdevača sa slomljenom nogom).

[0201] Jedanaest životinja je usmrćeno zbog intenziteta kliničkih znaka artritisa: pet životinja u grupi 1 (tretiranih nosačem), i šest životinja iz grupe 4 (tretirane bioterapeutikom #675).

[0202] Pet životinja je usmrćeno usled intenziteta nespecifičnih kliničkih znaka uključujući abnormalni stav (pogrbljenost), abnormalno stanje krzna (piloerekcija), abnormalni nivoi aktivnosti (smanjena aktivnost): tri životinje u grupi 1 (tretirane nosačem) i dve životinje iz grupe 4 (tretirane bioterapeutikom #675).

Telesne mase

[0203] Podaci telesne mase su zabeleženi od dana -14 do dana 0 i izraženi kao procenat početnih (Dan -14) telesnih masa i analizirani su sa dvosmernom ANOVA praćenom sa Dunnettovim post-testom za višestruka ušpoređivanja Dana -14 zatim za višestruko upoređivanja sa grupom testiranom nosačem. Podaci su prikazani na slici 19. Podaci usmrćenih životinja pre predviđenog kraja eksperimenta su isključeni iz analize.

[0204] Kada se porede sa danom -14, davanje dva puta dnevno oralnom gvažom izaziva značajan gubitak telesne težine u grupi tretiranoj sa nosačem dana -9 i dana -7.

[0205] Telesne mase grupe 4 (netretirane do dana 0, a zatim tretirana sa bioterapeutikom #675) su značajno više od grupe tretirane sa nosačem od dana -11 do dana -1 (p < 0.0001 osim dana -4 gde p < 0.05).

[0206] Telesne mase merene između dana -14 i dana -1 u grupama teretiramim bioterapeutkom se ne razlikuju od telesne mase merene u grupi tretiranoj sa nosačen bilo kog dana.

[0207] Podaci telesne mase zabeleženi od dana 0 do dana 28 i izraženih kao procenat početne (Dan 0) telesne mase su analizirani dvosmernom ANOVA praćenom sa Dunetovim post-testom za višestruka upoređivanja sa danom 0 u grupi tretiranoj sa nosačem zatim za višestruko upoređivanje sa grupom tretiranom sa nosačem. Podaci su prikazani na slici 20. Podaci usmrćenih životinja pre predviđenog kraja eksperiment i od životinja satelita su isključeni iz analize. Podaci dana 28, dana 35 i dana 42 su dalje anlizirani sa jednosmernom ANOVA praćenom sa Dunetovim post-testom za višestruka upoređivanja sa grupom tretiranom sa nosačem.

[0208] Početak kliničkih zanakova artritisa u vezi sa značajnim gubitkom mase dana 26 i dana 28 (p < 0.0001) kada se poredi sa danom 0 grupe koja je tretirana nosačem.

[0209] Kada se poredi sa grupom tretiranom sa nosačem, telesne mase su bile značajno više u grupi 4 (tretiranoj bioterapeutikom #675-) dana 3, dana 5, dana 10 (p < 0.05) i dana 26 (p < 0.001).

[0210] Kada su analizirani podaci sa jednosmernom ANOVA, telesne mase su bile značajno više u grupi 4 (tretirane sa bioterapeutikom #675) kada se poredi sa grupom tretiranom sa nosačem dana 28 (p < 0.01). Nije bilo značajne razlike između eksperimentalnih grupa dana 35 ili dana 42.

Klinička zapažanja

[0211] Podaci kliničkih rezultata su analizirani sa dvosmernom ANOVA i zatim sa Dunetovim posttestom za višestruko upoređivanje između dana u grupi tretiranoj sa nosačem zatim za višestruko upoređivanje između eksperimentalnih grupa i grupe tretirane sa nosačem svaki dan. Podaci su prikazani na slici 21. Podaci zabeleženi od životinja usmrćenih pre kraja eksperimenta su isključeni iz analize. Kada su životinje usmrćene zbog težine kliničkih artritisa, poslednji zabeleženi rezultat je zabeležen za sledeće dane i korišćen u statističnoj analizi.

[0212] Značajan porast kliničkih rezultata je primećen u grupi tretiranoj sa nosačem od 28 do dana 45 (p < 0.0001) kada se poredi sa danom 21.

[0213] Bioterapeutik #675 nije smanjivao kliničke rezultate kada se poredi sa grupom tretiranom sa nosačem. Životinje u ovoj grupu su imunizirane u različito vreme kada se porede sa drugim eksperimentalnim grupama, koje mogu obajasniti primetno više kliničke rezultate.

Analiza ćelijske proliferacije

[0214] Da bi se validirali testovi, splenocite su kultivisane u prisustvu rastvornih anti-CD3 i anti-CD28 (anti- CD3/CD28) kao pozitivna kontrola stimulans da bi se potvrdio proliferativni potencijal ćelija.

[0215] Jaki proliferativni odgovori na anti-CD3/CD28 su viđeni u svim eksperimentalnim grupama pokazujući da su ćelije bile zdrave, žive i u stanju da odgovore na aktivacione signale.

[0216] Da bi se tesirao proliferativni odgovor u prisustvu kolagena II (CII), splenocite su kultivisane u prisustvu CII pri 50 µg/ml. Porliferativni odgovori splenocita na CII su analizirani sa dvosmernom ANOVA praćenom sa Sidakovim post- testom za višestruka upoređivanja između nestimulisanih i CII-stimulisanih splenocita i jednosmernom ANOVA praćenom sa Dunetovim post-testom za upoređivanje CII-stimulisanog odgovora u različitim eksperimentalnim grupama sa grupom tretiranom sa nosačem . Podaci su prikazani na slici 22.

[0217] CII izaziva visoko značajni porast inkorporacije 3H-timidina (cpm) kada se poredi sa nestimulisanim splenocitama u grupi tretiranoj s nosačem (p < 0.0001).

[0218] Proliferacija splenocita za grupu tretiranu sa bioterapeutikom #675 je bila podešena drugog dana, prema tome upoređivanje sa grupom koja je tretirana sa nosačem nije bilo izvršeno, mada je primećena značajna redukcija.

Nivoi citokina u supernatatima kulture tkiva

[0219] Nivoi svakog citokina su mereni u supernatantima tkiva kulture koji potiču od anti-CD3/CD28 stimulisanih kultura sa lumineks analizama. Ono pokazuje intenzivne odgovore na sve merene citokine (srednji nivoi u grupi nosača je bila kao što sledi: IL-4 = 6,406 pg/ml; IL-6 = 306 pg/ml; IL-10 = 10,987 pg/ml; IL-17A = 11,447 pg/ml; IFN- γ = 15,581 pg/ml; TNF- α = 76 pg/ml).

[0220] Sledeći odeljci ukratko prikazuju podatke dobijene iz kultura stimulisanim kolagenom II. Gde je primenjivo, statistička analiza razlika između nivoa citokina u supernatantima nestimulisanih i CII-stimulisanih splenocita su izvedeni pomoću dvosmerne ANOVA praćene sa Sidakovim post-testom za višestruko upoređivanje, dok jednosmerna ANOVA praćena sa Dunetovim post-testom je bila korišćena za upoređivanje CII-stimulisanog odgovora u grupama tretiranim bioherapeutikom sa grupom tretiranom nosačem. Nije bilo značajne razlike u nivoima citokina između grupa u oba slučaja. Ovo je verovatno usled male veličine korišćenog uzorka (n=3).

[0221] U cilju tačnijeg prikazivanja rasporeda podataka za citokine sa suštinskom raspoređenošću podataka, oni su prikazani kao rasuti na dijagramu.

[0222] Srednje vrednosti grupe IL-4 u supernatantima kulture tkiva posle stimulacije sa CII su bili <5pg/ml. Oni nisu smatrani biološki značajnim i nisu ovde uključeni. Srednje vrednosti grupe TNF- α u supernatantima kulture tkiva posle stimulacije sa kolagenom su ispod granice kvantifikacije.

Nivoi IFN- γ u supernatantu (Slika 23)

[0223] Zajedno sa IL-17, IFN- γ je glavni citokin koji pokreće bolest na CIA modelu. Rasuti dijagram na slici 23 pokazuje nivoe IFN- γ posle CII stimulacije, sa srednjom vrednošću grupe koja je viša za grupu tretiranu nosačem u poređenju sa bioterapeutikom (videti sliku 27).

Nivoi IL-17A u supernatantu (Slika 24)

[0224] Nivoi IL-17A su bili 50pg/ml u kulturama stimulisanim CII za grupu tretiranu nosačem. Nivoi ovih citokina izgleda da su niži u grupi bioterapeutika u poređenju sa grupom koja je tretirana sa nosačem (videti sliku 27).

Nivoi IL-10 u supernatantu (Slika 25)

[0225] Nivoi IL-10 u grupi tretiranoj sa nosačem su bili 13 pg/ml i 2.1 pg/ml za CII-stimulisane, i kontrolnom medijumu kultura, respektivno. Viši nivoi IL-10 (koji je anti-inflamatorni citokin) za grupu tretiranu nosačem može se očekivati zbog zapaljenja i indukcije proinflamatornih citokina može biti praćen sa anti-inflamatornim povratnim mehanizmom.

Nivoi IL-6 u supernatantu (Slika 26)

[0226] Inflamatorni citokini kao što su IL-6 i TNF- α nisu tipično proizvedeni u visokim nivoima u anti-CII kulturama. Međutim, njihovi nivoi mogu biti menjani kao rezultat imune modulacije. Nivoi IL-6 u CII-stimulisanim kulturama su bili skromi, dosežući 10pg/ml. Mada viši nego u kontrolim kulturama medijuma, ove razlike su bile suviše male da bi bile racionalne za izvođenje statističkih analiza.

Supernatanti kulture tkiva u grupi 4 - Bioterapeutik #675 (Slika 27)

[0227] Kulture splenocita za ovu grupu su podešene različitog dana i prema tome odvojene od grupe tretirane nosačem. Mada direktno poređenje može neće biti odgovarajuće, smatra se da je tretman sa bioterapeutom #675 bio efikasan u snižavanju IFN- γ, IL-17A i IL-6 nivoa.

Mikrobiolaoška analiza

[0228] Bakterijski rast je potvrđen merenjem optičke gustoće na 600 nm pomoću spektrofotometra. Bakterijski identitet je potvrđen upoređivanjem slika prošaranih ploča sa referentim pločama.

[0229] Praćenjem poboljšanog postupka pripremanja bakterija, konzistentne visoke doze bakterijskog soja su davane od dana -2 i dana -3 (osim za soj #675 od dana 0) na šta ukazuju izmerene visoke OD vrednosti.

[0230] Uzorci fecesa su sakupljeni i brzo zamrznuti dana -14, dana 0 i na kraju.

Histopatologija

[0231] Rezultati histopatologije su prikazani na slikama 66-71. Kao što je očekivano na ovom modelu, intra-individualna i inter-individualna varjabilnost je primećena u smislu prisustva/odsustva artritisa ili intenziteta prisutnih promena.

[0232] Priroda patologije je očekivana za ovaj model, sa intenzivnim pomešanim hroničnim-aktivnim inflamacijama sinovijuma i burse koji se protežu i uključuju perizglobna meka tkiva (mišiće, adipozno tkivo, dermalni kolagen). U najozbiljnije napadnutim zglobovima bila je degeneracija hrskavice u zglobu i gubitak sa intrazglobnim oštećenjem i inflamacija i urušeni zglob i koštana strukrura fibrozom i inflamacijom .

[0233] Učestalost histopatoloških promena je bila: nosač - 80% (16/20); Bioterapeutik #675 - 83% (20/24). Bioterapeutik #675 je bio efikasan u smanjenju histopatološkog oštećenja zglobova zadnjih udova i smanjenju rezultata inflamacije zglobova, rezultata oštećenja hrskavice, rezultata oštećenja kosti i ukupnih rezultata histopatologije (videti sliku 70), mada statističko upoređivanje sa grupom sa nosačem ne može biti izvrešeno.

Rezime

[0234] Povećani klinički rezultati su primećeni dana 28 posle prvog davanja kolagena tipa II, kao što se očekuje na modelu artritisa kod DBA/1 miševa. Biotherapeutik #675 je pokazano da je efikasan u lečenju artritisa na ovom modelu. Životinje tretirane sa bioterapeutikom #675 su imunizirane u različito vreme kada se porede sa grupom tretiranom sa nosačem, što može obajsniti primećene veće kliničke rezultate. Međutim, bioterapeutik #675 je bio efikasan u smanjenju patloške bolesti, kako je pokazano u histopatološkoj analizi.

[0235] Proliferativni upamćeni odgovori na kolagen II su viđeni u kulturama splenocita iz svih eksperimentalnih grupa. Statistika nije bili izvedena za kulture bioterapeutika #675, jer su one bile ustanovljene u različito vreme, ali je primećeno smanjenje u odgovorima specifičnim za kolegen u odnosu na kontrolu.

[0236] Većina testiranih T ćelija citokina je pokazala detaktabilni porast između grupa stimulisanih kolagenom i kontrolama sa medijumom u grupi tretiranoj sa nosačem. Ovi porasti nisu bili očigledni u grupi tretiranoj bioterapeutikom. Ovo široko podržava gore opisane proliferativne upamćene odgovore na kolagen II. Postojao je dokaz supersije ose Th1/Th17, što je patogeni odgovor na ovom modelu i na humanom RA. Korelacija smanjenih nivoa citokina sa smanjenom proliferacijom je sugestivna za imune modulacije. Nije postajao dokaz da ova modulacija rezultuje ili od povećanih nivoa Th2 u vezi sa IL-4 ili sa povećanjima citokina koji moduliše imuni sistem, IL-10.

Primer 4 – Dalje analize efekta bakterijske inokulacije na modelu astme izazvane grinjama iz kućne prašine na mišu

[0237] Miševi testiranu u primeru 1 su podvrgnuti daljim analizama da dalje karakterišu efekat kompozicije prema pronalasku na inflamtorni odgovor alergijske astme.

Materijali i postupci

[0238] Uzimanje krvi i pripremanje seruma dana 14. Uzorci krvi životinja su sakupljeni pomoću srčane punkcije. Serum je izolovan iz uzorka krvi centrifugiranjem u toku 5 min na 14000g i čuvan na -20 °C.

[0239] Uklanjanje organa dana 14. Sakupljanje levog plućna krila u formalini za naknadnu histopatlošku analizu. Sakupljanje desnog plućnog krila (sva preostala krila) i uklanjanje seruma za brzo smrzavanje i naknadnu analizu. Preostala BAL tečnost je brzo zamrznuta za naknadnu analizu.

Merenje nivoa antitela u serumu i BAL tečnosti

[0240] Proizvodnja ukupnih IgE i IgG1 antitela specifičnih na grinje iz kućne prašine (HDM) je merena u BAL i serumu sa ELISA testom.

Izolovanje pluća i histopatološka analiza

[0241] Leva plućna krila su fiksirana u formalinu što je praćeno stavljanjem u parafin, sekciranjem i bojenjem sa hematoksilinom i eozinom PAS. Naknadno histološko bodovanje je izvedeno na slepo kao što sledi: Pet nasumičnih vidnih polja po uzorku je bodovano na inflamaciju (peribronhijalna infiltracija i perivaskularna infiltracija) i proizvodnja mukusa. Inflamatorna infiltracija je bodovana sa sledećim sistemom ocenjivanja:

<0>- normalno

<1>– blagi inflamatorni infiltrati

<2>– umereni inflamatorni infiltrati

3 – značajni inflamatroni infiltrati

4 – ozbiljni inflamatorni infiltrati

5 – veoma ozbiljni inflamatorni infiltrati

[0242] U svakom vidnom polju, merena je veličina disajnih puteva i broj ćelija mukusa je kvantifikovan / um.

Merenje inflamatornih medijatora u tkivu pluća

[0243] Desna plućna krila (sva preostala krila) izolovana za kvantifikaciju inflamatornih medijatora su brzo zamrznuti za naknadna merenja CCL11, IFN-gama, IL-1 alfa, IL-1 beta, IL-4, IL-5, IL-9, IL-17A, CXCL1, CCL3, CXCL2 i CCL5 sa komercijalno dostupnim multipleks testom (Merck-Millipore). Analiza je izvedena prema uputstvu proizvođača.

Rezultati i analize

[0244] Rezultati eksperimenata su prikazani na slikama 28-46.

[0245] Kao podrška nalazima opisanim u primeru 1, analiza ćelijskih infiltrata u tkivu pluća miševa tretiranih sa sojem 675 je pokazala znatno i statistični značajno smanjenje u srednjoj vrednosti inflamacionih rezultata (videti slike 32 i 34).

[0246] Nivoi antitela u BAL tečnosti i serumu su analizirani (videti slike 28-31). Nije primećen jasan efekat bakterijskog tertmana na nivoe antitela seruma. Ovo može uticati na neuspeh eksperimenta, jer su podaci rašireni i linija greške za svaki tretman je velik, i pozitivne i negativne kontrole izgleda da se ne ponašaju onako kako bi se očekivalo. Takođe, nivoi antitela osnovne linije seruma mogli su da maskiraju bilo koje promene.

[0247] Slično, nije primećen jasan efekat bakterijskog tretmana na nivoe citokina u plućima (videti slike 36-46). Ponovo, ovo se može odraziti na neuspeh eksperimenta , zbog širenja podataka i linija greške za svaki tretman su veliki i pozitivna i negativna kontrola izgleda da se ne ponašaju onako kako bi se očekivalo. Takođe je moguće da uključen imehanizam dejstva utiče na ranije odgovore citokina koji nisu više detektovani dana 4 posle krajnjeg izazivanja disajnih puteva sa HDM. Trebalo bi biti oprezni u tumačenju podataka o citokinima u ovom ispitivanju, zbog promenjivosti u otkrivenim nivoima. Ova promenjivost delom može biti objašnjena činjenicom da je tkivo pluća odvojeno za različite analize, i prema tome jedno plućno krilo možda nije celo reprezentativno ili uporedivo sa istim krilom drugog miša usled distribucije parčića inflamacije.

Primer 5 – Dalje analize efekata bakterijskog inokuluma na model ozbiljne neutrofilne astme na mišu

[0248] Miševi testirani u primeru 2 su podvrgnuti daljim analizama da bi se dalje katakterisao efekat kompozicija prema pronalasku na neutofilni odgovor u vezi sa ozbiljnom astmom.

Materijali i postupci

[0249] Uklanjanje ograna dana 18. Sakupljanje levog plućna krila u formalinu za naknadnu histopatlošku analizu. Sakupljanje desnog plućnog krila (sva preostala krila) i uklanjanje seruma za brzo smrzavanja i naknadnu analizu. Preostala BAL tečnost je brzo zamrznuta za naknadnu analizu.

[0250] Merenje inflmatornih medijatora u tkivu pluća (naknadna analiza). Desna plućna krila (sva ostala krila) izolovana za kvantifikaciju inflamatornim medijatora su brzo zamrznuta za naknadna merenja IFN- gama, IL-1 alfa, IL-1 beta, CXCL1, CCL3, CXCL2, CCL5, IL-17A, TNF-alfa, IL-17F, IL-23 i IL-33 komercijalno dostupnim multipleks testom (Merck-Millipore). Analiza je izvedena prma uputstvu proizvođača.

[0251] Merenja nivoa antitela u serumu i BAL tečnosti (naknadna analiza). Proizvodnja IgG1 i IgG2a antitela specifičnih na grinje iz kućne prašine (HDM) je merena u BAL i serumu sa ELISA testom.

[0252] Izolovanje pluća i histološka analiza (naknadna analiza). Leva plućna krila su fiksirana u formalinu a zatim smeštena u parafin, sekcirana i bojena sa hematoksilinom i eozinom i PAS. Naknadno histološko bodovanje je izvedeno na slepo kao što sledi: Pet nasumičnih vidnih polja po uzorku je bodovano na inflamaciju (peribronhijalna infiltracija i perivaskularna infiltracija) i proizvodnju mukusa. Inflamatorna infiltracija je bodovana sa sledećim sistemom ocenjivanja:

<0>- normalno

<1>– blagi inflmatorni infiltrati

<2>– umerni inflamatorni infiltrati

3 – značajni inflamatorni infiltrati

4 – ozbiljni inflamatorni infiltrati

5 – veoma ozbilni inflamatorni infiltrati

Rezultati i analize

[0253] Rezultati eksperimata su prikazani na slikama 47-64.

[0254] Dalja analiza nivoa antitela je otkrila da efikasnost bakterijskog soja 675 se takođe odrazila na smanjenje nivoa HDM-specifičnih IgG1 u BAL tečnosti i serumu (videti slike 47 i 49). Čvrst zaključak u vezi sa efektom na nivoe IgG2a se ne može doneti. Sveukupno, podaci iz analize antitela sugerišu smanjenje u vezi sa celokupnim smanjenjem inflamatornog odgovora, nasuprot selektivnog efekata na prebacivanje izotipa antitela.

[0255] Histološka analiza podržana je diferencijalnim brojem ćelija iz BAL tečnosti, koja pokazuje smanjenu ćelijsku infiltraciju kod miševa tretiranih sa sojem 675 (videti slike 51-53).

[0256] U vezi sa nivoom citokina, za primer 4, širenje podataka i linija greške za svaki tretman je velika i pozitivna i negativna kontrole izgleda da se nisu ponašale onako kako bi se nužno očekivalno. Takođe je moguće da mehanizam dejstva uključuje uticanje na ranije odgovore citokina koji više nisu bili detektabilni dana 4 posle krajnjeg izazivanja disajnih puteva sa HDM. Trebalo bi biti oprezni u tumačenju podataka o citokinima u ovom ispitivanju, zbog promenjivosti u otkrivenim nivoima. Ova promenjivost delom može biti objašnjena činjenicom da tkivo pluća je odvojeno za različite analize, i prema tome jedno plućno krilo možda nije celo reprezentativno ili uporedivo sa istim krilom drugog miša usled distribucije parčića inflamacije.Uprkos ovoj različitosti, jasni antiinflamatorni efekti na nivoe citokina za soj 675 su pokazani, i pozitivna kontrola anti-IL-17 Ab se generalno ponašala kako je očekivano.

[0257] Sa gore navedenim upozorenjima, podaci na slikama 56, 58, 59, 61 i 63 sugerišu da tretman sa bakterijskim sojevima prema pronalasku može postići smanjenje u nivoima IL-1b, IFN γ, RANTES, MIP-1a i KC (mišji ortolog humanog IL-8), koji mogu biti indikativni za mehanizam dejstva u vezi sa uticanjem na oslobađanje hemokina (i prema tome aktiviranje ćelija) sa stromalnim ili urođenim imunim ćelijama. Ovi citokini su deo Th17 puta. Uzimajući zajedno ovaj set podataka, jasan zaključak se može postaviti da soj 675 je visoko efikasan u zaštiti miševa naspram inflamacija na ovom modelu ozbiljne neutrofilne astme na mišu.

Primer 6 – Efikasnost bakterijske inokulacije na modelu multiple skleroze na mišu

Kratki prikaz

[0258] Miševima su date kompozicije koje sadrže bakterijske sojeve prema pronalasku i miševi su naknadno imunizirani sa mijelinskim oligodendrocitnim glikoproteinom da bi se izazvao eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE). EAE je najuobičajenije korišćeni eksperimetalni model za humanu multiple sklerozu. Kompozicije prema pronalasku je nađeno da imaju upadljiv efekat na javljanje bolesti i intenzitet bolesti.

Soj

[0259] 675: bakterija deponovana pod prijemnim brojem NCIMB 42408

Plan ispitivanja

[0260] Grupe:

1. Negativna kontrolna grupa. Tretiranje sa nosačem kao kontrolom (oralno).

3. Tretiranje sa inokulumom soja 675 terapeutske bakterije (oralno).

<9.>Pozitivna kontrolna grupa. Lečenje sa deksametazonom (i.p.).

<10.>Netretirana kontrolna grupa.

Broj miševa u grupi = 10

Dani -14 do dana 27: Dnevno davanje kontrole sa nosačem oralno (Grupa 1).

Dani -14 do dana 27: Dnevno davanje inokuluma terapeutske bakterije oralno (Grupa 4). Dani 0-28: davanje deksametazona (i.p.) tri puta nedeljno (Grupa 9)

Dan 0: MOG35-55 (mijelinski oligodendrocitni glikoprotein - 2mg/ml) i CFA (2mg/ml MTB) su pomešani 1:1 dajući 1mg/ml rastvore.100µl smeše peptid-CFA je injektovano subkutanozno u svaku zadnju nogu . Davanje petrusis toksina intraperitonealno (300ng).

Dan 1: Davanje pertusis toksina intraperitonealno (300ng).

Dani 7-nadaljes: Merenje javljanja bolesti i merenje tri puta nedeljno.

Krajnja tačka i analiza

[0261] Miševi su analizirani na javljanje bolesti i intenzitet bolesti tri puta nedeljeno. Bodovanje je bilo izvedeno na slepo. Intenzitet bolesti je procenjivana pomoću kliničkog opsega bodovanja od 0 do 5, sa 5 koji ukazuje na mrtvog miša (videti dole klinički sistem bodovanja).

Praćenje

[0262] Navedenim danima miševi su mereni i posmatrani radi bodovanja u vezi sa aktivnošću bolesti i javljanja bolesti.

Posmatranje rezultata aktivnosti bolesti:

0 - Nema očigledne promene na motornim funkcijama u poređenju sa neimuniziranim miševima 0.5 - Vrh repa je opušten.

1.0 - Opušten rep.

1.5 - Kočenje opuštenog repa i zadnjih nogu.

2.0 - Opušteni rep i slabost zadnjih nogu.

ILI – Postoje očigledni zanaci naginjanja glave kada se posmatra hod. Slaba ravnoteža.

2.5 - Opušten rep i vučenje zadnjih nogu .

- ILI – Postoji jako naginjanje glave koje izaziva da miš povremeno pada.

3.0 - Opušten rep i potpuna paraliza zadnjih nogu.

3.5 - Opušten rep i potpuna paraliza zadnjih nogu.

Pored toga: Miš se kreće oko kaveza, ali kada se stavi na stranu nije u stanju da se ispravi. Zadnje noge su zajedno na jednoj strani tela.

4.0 - Opušteni rep, potpuna paraliza zadnjih nogu i parcijalna paraliza prednjih nogu.

- Miš se minimalno kreće oko kaveza ali izgleda budno i hranjeno

4.5 - Potpuna paraliza zadnjih i parcijalna paraliza prednjih nogu, bez kretanja oko kaveza.

Miš je momentalo eutanaziran i uklonjen iz kaveza.

5.0 Miš je eutaniziran usled ozbiljne paralize.

[0263] Kada životinja ima jednaku ili veću aktivnost bolesti bodovanu kao 1, smatra se da ima pozitivan rezultat javljanja bolesti.

Rezultati

[0264] Rezultati ispitivanja su prikazani na slikama 72 i 73.

[0265] Izazivanje bolesti u negativnim kontrolnim grupama je bilo uspešno sa visokim rezultatima pokazanim kontrolom sa nosačem i netretiranom kontrolom. Efekti tretmana sa sojem 675 je bio uočljiv i miševi tretirani sa sojem 675 su pokazivali značajno smanjeno javljanje bolesti i intenzitet bolesti. Zaista, smanjenje u javljanju bolesti i intenzitetu bolesti je bilo uporedivo sa pozitivnom kontrolnom grupom. Ovi podaci ukazuju da soj 675 može biti koristan za lečenje ili sprečavanje multiple skleroze.

Primer 7 – Testiranje stabilnosti

[0266] Ove opisana kompozicija koja sadrži bar jedan ovde opisani bakterijski soj je čuvana u zatopljenom sudu na 25°C ili 4°C i sud je smešten u atmosferu koja ima relativnu vlažnost 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ili 95%. Posle 1 mesec, 2 meseca, 3 meseca, 6 meseci, 1 godinu, 1.5 godinu, 2 godine, 2.5 godine ili 3 godine, bar 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% bakterijskoh soja treba da ostane kako je izmereno u jedinicama koje obrazuju kolonije određene standardnim protokolima.

Sekvence

[0267]

SEQ ID NO:1 (Bacteroides coprocola gen zar 16S rRNK, parcijalna sekvenca, soj: M11 - AB200223)

SEQ ID NO:2 (Bacteroides coprocola gen za 16S rRNK, parcijalna sekvenca, soj: M16 - AB200224)

SEQ ID NO:3 (Bacteroides coprocola gen za 16S rRNK, parcijalna sekvenca, soj: M158 - AB200225)

SEQ ID NO:4 (konsezusna 16S rRNK sekvenca za soj 675)

SEQ ID NO:5 (Bacteroides thetaiotaomicron gen za 16S rRNK, parcijalnu sekvencu - M58763) Ċ

SEQ ID NO:6 (soj 675 hromozomska sekvenca) – videti elektronsku listu sekvenci iz WO 2016/203217. SEQ ID NO:7 (soj 675 plazmidna sekvenca) - videti elektronsku listu sekvenci iz WO 2016/203217.

REFERENCE

[0268]

<[1]>Spor et al. (2011) Nat Rev Microbiol.9(4):279-90.

[2] Eckburg et al. (2005) Science.10;308(5728):1635-8.

[3] Macpherson et al. (2001) Microbes Infect.3(12):1021-35

[4] Macpherson et al. (2002) Cell Mol Life Sci. 59(12):2088-96. [5] Mazmanian et al. (2005) Cell 15;122(1):107-18.

[6] Frank et al. (2007) PNAS 104(34):13780-5.

<[7]>Scanlan et al. (2006) J Clin Microbiol.44(11):3980-8.

<[8]>Kang et al. (2010) Inflamm Bowel Dis.16(12):2034-42.

[9] Machiels et al. (2013) Gut.63(8):1275-83.

[10] WO 2013/050792

[11] WO 03/046580

[12] WO 2013/008039

[13] WO 2014/167338

[14] Goldin and Gorbach (2008) Clin Infect Dis. 46 Suppl 2:S96-100. [15] Azad et al. (2013) BMJ.

347:f6471.

[16] Kitahara et al. (2005) Int J Syst Evol Microbiol.55(Pt 5):2143-7.

[17] Masc °o et al. (2003) Systematic and Applied Microbiology, 26:557-563.

[18] Srutková et al. (2011) J Microbiol. Methods, 87(1):10-6. [19] Ye et al. (2015) PLoS One.

10(1):e0117704.

<[20]>Fabro et al. (2015) Immunobiology.220(1):124-35.

<[21]>Yin et al. (2014) Immunogenetics.66(3):215-8.

[22] Cheluvappa et al. (2014) Clin Exp Immunol.175(2):316-22.

<[23]>Schieck et al. (2014) J Allergy Clin Immunol.133(3):888-91.

<[24]>Balato et al. (2014) J Eur Acad Dermatol Venereol.28(8):1016-24.

<[25]>Monteleone et al. (2011) BMC Medicine.2011, 9:122.

<[26]>Fahy (2009) Proc Am Thorac Soc 6.256-259

[27] Miossec and Kolls (2012) Nat Rev Drug Discov.11(10):763-76.

[28] Yang et al. (2014) Trends Pharmacol Sci.35(10):493-500. [29] Koenders et al. (2006) J. Immunol.

176:6262-6269.

[30] Amedei et al. (2012) Int J Mol Sci.13(10):13438-60.

[31] Shabgah et al. (2014) Postepy. Dermatol. Alergol.31(4):256-61.

[38] Zhang (2015) Inflammation. Aug 23. [39] Sun et al. (2015) Cytokine.74(1):76-80.

<[40]>Mucientes et al. (2015) Br J Ophthalmol.99(4):566-70.

<[41]>Jawad et al. (2013) Ocul Immunol Inflamm.21(6):434-9.

<[42]>Maya et al. (2014) J Ophthalmology.310329

[43] Chi et al. (2007) J. Allergy and Clinical Immunology.119(5):1218-1224.

<[44]>Chi et al. (2008) Investigative Ophthalmology &Visual Science.49(7): 3058-3064.

<[45]>Luger and Caspi (2008) Semin. Immunopathol.30(2): 134-143.

<[46]>Miyamoto-Shinohara et al. (2008) J. Gen. Appl. Microbiol., 54, 9-24.

<[47]>Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, ed. by Dan and McLellan, Humana Press.

[48] Leslie et al. (1995) Appl. Environ. Microbiol.61, 3592-3597.

<[49]>Mitropoulou et al. (2013) J Nutr Metab. (2013) 716861.

<[50]>Kailasapathy et al. (2002) Curr Issues Intest Microbiol.3(2):39-48.

<[51]>Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller

<[52]>Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit.1985)

[53] Handbook of Microbiological Media, Fourth Edition (2010) Ronald Atlas, CRC Press.

[54] Maintaining Cultures for Biotechnology and Industry (1996) Jennie C. Hunter-Cevera, Academic Press

[55] Strobel (2009) Methods Mol Biol.581:247-61.

[56] "Creating Bacterial Glycerol Stocks for Long-term Storage of Plasmids" Addgene -https://www.ad- dgene.org/plasmid-protocols/create-glycerol-stock/

[57] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.

<[58]>Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press).

<[59]>Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)

<[60]>Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications)

[61] Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[62] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997)

[63] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).

[64] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)

[65] Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30<[66]>Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math.2: 482-489.

<[67]>Brand et al. (2007) Nature Protocols.2(5):1269-1275

<[68]>Jiao et al. (2014) Immunopathology and Infectious Diseases.184(4): 1085-93.

Claims

Patentni zahtevi

<1.>Kompozicija koja sadrži bakterijski soj roda Bacteroides koji ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 98% identična sa SEQ ID NO:4 , za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije inflamatorne ili autoimune bolesti.

<2.>Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, gde je kompozicija za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja bolesti ili stanja izabranog iz grupe koju čine astma, kao što je alergijska astma ili neutrofilna astma; artritis, kao što je reumatoidni artritis, osteoartritis, psorijatički artritis, ili juvenilni idiopatski artritis; multiple skleroza; neuromijelitis optika (Devicova bolest); ankilozni spondilitis; spondiloartritis; psorijaza; sistemski eritematozni lupus; inflamatorna bolest creva, kao što je Kronova bolest ili ulcerozni kolitis; celijakija; hronična opstruktivna bolest pluća (COPD); uveitis; skleritis; vaskulitis; Behčetova bolest; ateroskleroza; atopijski dermatitis; emfizem; periodontitis; alergijski rinitis; i odbacivanje alografta.

<3.>Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 2, gde je kompozicija za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije astme, kao što je neutrofilna astma ili alergijska astma, i gde kompozicija je za upotrebu u postupku smanjenja neutrofilije ili eozinofilije u lečenju astme.

<4.>Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 2, gde je kompozicija za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju reumatoidnog artritisa i gde kompozicija je za upotrebu u postupku smanjenja oticanja zglobova kod reumatoidnog artritisa.

<5.>Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 2, gde je kompozicija za upotrebu u postupku lečenja ili sprečavanja multiple skleroze, i gde je kompozicija za upotrebu u postupku smanjenja javljanja bolesti i intenziteta bolesti.

<6.>Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 2, gde je kompozicija za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije uveitisa, i gde je kompozicija za upotrebu u postupku smanjenja ili spečavanja oštećenja retine kod uveitisa.

<7.>Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je kompozicija za upotrebu u postupku smanjenja proizvodnje IL-17 ili smanjenja diferencijacije Th17 ćelija u lečenju ili prevenciji inflamatornih ili autoimunih bolesti.

<8.>Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahtava, gde je kompozicija upotrebu kod pacijenata sa povišenim nivoima IL-17 ili Th17 ćelijama.

<9.>Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde je bakterijski soj vrsta Bacteroides coprocola.

<10.>Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-9, gde bakterijski soj ima 16s rRNK sekvencu koja je bar 99%, 99.5% ili 99.9% identična sa SEQ ID NO:4, ili gde bakterijski soj ima 16s rRNK sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO:4.

<11.>Kompozcija za upotrebu prema bilo kom zahtevu, gde je kompozicija za oralno davanje, gde kompozicija sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa ili nosača, i/ili gde je bakterijski soj liofilizovan.

<12.>Prehrambeni proizvod ili kompozicija vakcine koji sadrži kompoziciju prema bilo kom od prethodnih zahteva, za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu.

<13.>Ćelija ili biološki čista kultura soja deponovanog pod prijemnim brojem NCIMB 42408.

<14.>Kompozicija koja sadrži ćeliju prema zahtevu 13, opciono sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

<15.>Ćelija soja deponovanog pod prijemnim brojem NCIMB 42408 za upotrebu u terapiji, opciono gde je ćelija za upotrebu u postupku definisanom u bilo kom od zahteva 1-8.