RS59738B1 - Anti-ox40 antitela i postupci primene - Google Patents

Description

OPIS

OBLAST PRONALASKA

Predmetni pronalazak se odnosi na anti-OX40 antitela i postupke za primenu istih. OSNOVA OX40 (poznat i kao CD34, TNFRSF4 i ACT35) je član superfamilije receptora faktora nekroze tumora. OX40 se konstitutivno ne eksprimira na naivnim T ćelijama, već se indukuje nakon angažovanja T ćelijskog receptora (TCR). Ligand za OX40, OX40L, pretežno je eksprimiran na ćelijama koje prezentuju antigene. OX40 snažno eksprimiraju aktivirane CD4+ T ćelije, aktivirane CD8+ T ćelije, memorijske T ćelije i regulatorne T ćelije. OX40 signalizacija može da obezbedi kostimulatorne signale CD4 i CD8 T ćelijama, što dovodi do pojačane ćelijske proliferacije, preživljavanja, efektorske funkcije i migracije. OX40 signalizacija takođe poboljšava razvoj i funkciju memorijskih T ćelija.

Regulatorne T ćelije (Treg) su visoko obogaćene u tumorima i drenažnim limfnim čvorovima dobijenim iz različitih indikacija kancera, uključujući melanom, nemikrocelularni karcinom pluća, renalni kancer, kancer jajnika, kolona, pankreasa, hepatocelularni kancer i kancer dojke. U podskupu ovih indikacija, povećana gustina intratumorskih T reg ćelija povezana je sa lošom prognozom za pacijenata, što sugeriše da ove ćelije imaju važnu ulogu u suzbijanju antitumorskog imuniteta. Opisani su limfociti koji se infiltriraju u tumor pozitivan na OX40.

WO 2009/079335 otkriva agonističko OX40 antitelo 11D4 koje se vezuje sa visokim afinitetom za ekstracelularni domen OX40R i za cele T ćelije. Dva agonistička antitela 1F7 i 2G2 opisana su u Xie i sar. Tissue Antigens 2006, 67(4), 307-317. Grupa agonističkih OX40 scFv može se naći u WO 03/106498. OX40 antitela 119-122 i 106-122 i njihova biološka aktivnost opisana su u Voo i sar, Journal of Immunology 2013, 191(7), 3641-3650.

Primena agonističkog OX40 antitela 9B12 kod pacijenata sa čvrstim malignitetima opisana je u Curti i sar. Cancer Research 2013, 73(24), 7189-7198, a primena agonističkog OX40 antitela u kombinaciji sa antagonistom PD-1 je objavljena u Guo i sar. PLOS ONE 2014, 9(2), e89350.

Jasno je da i dalje postoji potreba za agensima sa optimalnim kliničkim osobinama kako bi se razvijali kao terapeutski agensi. Ovde opisani pronalazak zadovoljava ovu potrebu i pruža druge koristi.

REZIME

U jednom aspektu, obezbeđena su izolovana antitela koja se vezuju za humani OX40 koji sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56, i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57.

U nekim otelotvorenjima, ova antitela iscrpljuju CD4+ efektorske T ćelije. U nekim otelotvorenjima, ova antitela iscrpljuju regulatorne T ćelije (Treg). U nekim otelotvorenjima, do iscrpljivanja dolazi putem ADCC i/ili fagocitoze. U nekim otelotvorenjima, do iscrpljivanja dolazi putem ADCC.

U drugom aspektu, obezbeđena su antihumana OX40 agonistička antitela koja vezuju humani OX40 sa afinitetom koji je manji ili je oko 0,45 nM kako je utvrđeno radioimunotestom. U nekim otelotvorenjima, antitelo vezuje OX40 čoveka i OX40 majmuna cinomolgus. U nekim otelotvorenjima, vezivanje za OX40 čoveka i majmuna cinomolgus je određeno pomoću FACS testa. U nekim otelotvorenjima, vezivanje za OX40 čoveka ima EC50 koji je manji ili jednak 0,3 µg/ml ili niži. U nekim otelotvorenjima, vezivanje za OX40 majmuna cinomolgus ima EC50 koji je manji ili jednak 1,5 µg/ml. U nekim otelotvorenjima, vezivanje za OX40 majmuna cinomolgus ima EC50 koji je manji ili jednak 1,4 µg/ml.

U drugom aspektu, obezbeđene su izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koja od ovde datih antihumanih OX40 antitela (npr. agonistička antitela).

U drugom aspektu, obezbeđene su ćelije domaćini koje sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje od ovde datih antihumanih OX40 antitela (npr. agonistička antitela).

U drugom aspektu, obezbeđeni su postupci za proizvodnju antitela, uključujući uzgajanje ćelije domaćina, tako da se proizvodi antitelo. U nekim otelotvorenjima, postupci dalje obuhvataju izolovanje antitela iz ćelije domaćina.

U drugom aspektu, obezbeđeni su imunokonjugati koji sadrže bilo koje od ovde datih antihumanih OX40 antitela (npr. agonistička antitela) i citotoksični agens.

U drugom aspektu, obezbeđene su farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde datih antihumanih OX40 antitela (npr. agonistička antitela) i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija sadrži (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela u koncentraciji između oko 10 mg/ml i oko 100 mg/ml, (b) polisorbat, pri čemu je koncentracija polisorbata oko 0,02% do oko 0,06%, (c) histidinski pufer pH oko 5,0 do oko 6,0 i (d) saharid, pri čemu je koncentracija saharida oko 120 mM do oko 320 mM.

U drugom aspektu, ovde navedena antihumana OX0 agonistička antitela su za upotrebu kao lek.

U drugom aspektu, ovde navedena antihumana OX0 agonistička antitela su za upotrebu u lečenju kancera.

U drugom aspektu, obezbeđeno je antihumano OX0 agonističko antitelo za upotrebu u postupcima lečenja pojedinca koji ima kancer, koji obuhvataju davanje pojedincu efikasne količine bilo kog od ovde datih antihumanih OX40 agonističkih antitela. U nekim otelotvorenjima, postupci dalje obuhvataju primenu dodatnog terapeutskog agensa. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens sadrži hemoterapeutski agens. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens sadrži antagonist vezivanja PD-1 ose.

KRATAK OPIS SLIKA SL. 1: Varijante humanizovanih OX40 antitela su analizirane pomoću FACS kako bi se procenilo vezivanje antitela za huOX40 eksprimiran na površini ćelija Hut78.

SL. 2: OX40 agonističko antitelo 1A7.gr.1 vezano sa visokim afinitetom za T ćelije čoveka i majmuna cinomolgusa.

SL. 3A i 3B: (SL. 3A) Mab 1A7.gr.1 nije imao efekta na proliferaciju T ćelija u nedostatku umrežavanja. Povećavanje koncentracije mab 1A7.gr.1 kostimulisalo je proliferaciju CD4+ memorijskih T ćelija kao odgovor na umrežavanje anti-CD3. Izračunata EC50 za kostimulišući efekat mab1A7.gr.1 bila je 9,96 ng/ml (n = 2). (SL. 3B)Povećavanje koncentracije mab 1A7.gr.1 kostimulisalo je proizvodnju interferona gama CD4+ memorijskih T ćelija kao odgovor na umrežavanje anti-CD3.

SL. 4A: U prisustvu anti-CD3 vezanog za ploču, kostimulisana proliferacija efektorskih T ćelija mab 1A7 vezanog za ploču. Suprotno tome, kostimulišuća aktivnost je ukinuta kada je mab 1A7 obezbeđen u rastvornom obliku u prisustvu anti-CD3 vezanog za ploču, na nivo sličan onome primećenom kod izotipa kontrolnog antitela vezanog za ploču u prisustvu anti-CD3 vezanog za ploču.

SL. 4B: MAb 1A7 gr.1 koji nosi mutaciju N297G nije uspeo da kostimuliše proliferaciju Teff ćelija. Suprotno tome, divlji tip (nemutirani) mab 1A7 gr.1 kostimuliše proliferaciju Teff ćelija indukovanu putem anti-CD3.

SL. 5: Tretman OX40 agonističkim antitelom inhibirao je Treg ćelijski posredovanu supresiju naivnih CD4+ T ćelija. Naivne CD4+ T ćelije (Tn), kada su uzgajane same, inhibirane su dodavanjem Treg ćelija i izotipskim kontrolnim antitelom. Treg ćelijski posredovana inhibicija proliferacije nativne CD4+ T ćelije je ukinuta u kulturama koje sadrže anti-OX40 antitelo, mab 1A7.gr1. Podaci su predstavljali prosek 3 nezavisna eksperimenta.

SL. 6: Tretman sa mab 1A7.gr.1 oslabio je supresivnu funkciju Treg ćelija.

SL. 7A i 7B: (SL. 7A) Tretman sa mab 1A7.gr.1 indukovao je ADCC T ćelija koje eksprimiraju OX40. (SL.7B) Tretman sa mab A7.gr1 (IgG1) indukovao je veću ADCC CD4+ T ćelija koje eksprimiraju OX40 u poređenju sa nivoom ADCC indukovanim od strane mab 1A7.gr1 (IgG4).

SL. 8A i 8B: BT474 transgeni klonovi humanog OX40 eksprimirali su različite nivoe humanog OX40. SL.8A, BT474 ćelije sa niskom ekspresijom OX40. SL.8A, BT474 ćelije sa visokom ekspresijom OX40.

SL. 9: Tretman sa OX40 agonističkim antitelom indukovao je ćelijski posredovanu fagocitozu zavisnu od antitela ćelijskih linija koje eksprimiraju humani OX40, a nivo ćelijski posredovane fagocitoze zavisne od antitela bio je osetljiv na nivo ekspresije OX40 u ciljnim ćelijama.

SL. 10: Tretman sa OX40 agonističkim antitelom 1A7.gr1 indukovao je ADCC u ćelijama koje eksprimiraju OX40.

SL. 11A-I: Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona anti-OX40 antitela. Označene su sekvence teškog lanca HVR - H1, −H2 i H3 i lakog lanca HVR −L1, −L2 i −L3. Položaji aminokiselina su numerisani prema Kabatovom sistemu numeracije, kao što je opisano ovde.

SL. 12A: Antihumani OX40 mab 1A7gr1 vezan za Hut78-hOX40 ćelije na način zavistan od doze, gde je 70% maksimalnog vezivanja uočeno na oko 200 ng/ml antitela (naznačeno tačkastim kvadratom).

SL. 12B: Oznaka OX40L pokazala je vezivanje za Hut78-hOX40 ćelije zavisno od doze.

SL. 12C: Vezivanje antihumanog OX40 mab 1A7.gr.1 za Hut78-hOX40 ćelije se smanjivalo sa povećanjem koncentracije oznake OX40L.

SL. 12D: Prisutnost kontrolne DR5-oznake nije uticala na vezanje mab 1A7.gr.1. SL. 13: Farmakokinetika (FK) 1A7.gr1 u dozi od 1 mg/kg ili 10 mg/kg kod SCID miševa.

SL. 14A i 14B: Primena 1A7.gr1 kod majmuna cinomolgus dovela je do minimalnog ili prolaznog povećanja c-reaktivnog proteina (CRP). (SL. 14A) Nivoi CRP tokom vremena zapaženi kod majmuna kojima su date doze od 0 mg/kg ili 0,01 mg/kg. (SL. 14B) Nivoi CRP tokom vremena zapaženi kod majmuna kojima su date doze od 0,3 mg/kg ili 10 mg/kg.

SL. 15A i 15B: Primena 1A7.gr1 kod majmuna cinomolgus dovela je do minimalnog ili prolaznog povećanja mešane podgrupe citokina. (SL.15A) Nivoi proinflamatornih citokina IL6 i MCP1 tokom vremena. (SL.15B) Nivoi antiinflamatornih citokina IL10 i IL1ra tokom vremena. Na SL.15A i 15B, pojedinačni majmuni u doznoj grupi od 10 mg/kg koji su pokazali prolazno povećanje nivoa citokina označeni su strelicama.

SL. 16A i 16B: Izloženost majmuna cinomolgus 1A7.gr1 potvrđena je serumskom FK i zauzetošću perifernih receptora. (SL. 16A) Serumska FK majmuna kojima je dato 0,01, 0,3 ili 10 mg/kg 1A7.gr1. (SL. 16B) Zauzetost OX40 receptora na perifernim CD4+ T ćelijama tokom vremena kod majmuna kojima je dato 0,01, 0,3 ili 10 mg/kg 1A7.gr1.

SL. 17: Farmakokinetika (FK) 1A7.gr1 u dozi od 0,5, 5 ili 30 mg/kg kod majmuna cinomolgus.

SL. 18: Zauzetost OX40 receptora tokom vremena kod majmuna kojima je dato 0, 0,5, 5 ili 30 mg/kg 1A7.gr1. Strelice označavaju dane u kojima su uzorci dobijeni.

SL. 19: Nivoi MCP-1 tokom vremena kod majmuna kojima je dato 0, 0,5, 5 ili 30 mg/kg 1A7.gr1.

SL. 20: Nije zapažena značajna aktivacija ili proliferacija perifernih T ćelija kod majmuna kojima je dato 0, 0,5, 5 ili 30 mg/kg 1A7.gr1.

DETALJAN OPIS OTELOTVORENJA PRONALASKA

I. DEFINICIJE

Termin "disfunkcija", u kontekstu imune disfunkcije, odnosi se na stanje smanjene imunske reakcije na antigensku stimulaciju.

Termin "disfunkcionalni", kako se ovde koristi, takođe znači refraktornost ili neresponzivnost na prepoznavanje antigena, posebno umanjenu sposobnost prevođenja prepoznavanja antigena u efektorske funkcije nishodnih T-ćelija, kao što je proliferacija, proizvodnja citokina (npr. gama interferon) i/ili ubijanje ciljnih ćelija.

"Poboljšanje funkcije T ćelije" znači indukovanje, uzrokovanje ili stimulisanje efektorske ili memorijske T ćeliju da ima obnovljenu, produženu ili pojačanu biološku funkciju. Primeri poboljšanja funkcije T ćelija uključuju: povećanu sekreciju γ-interferona iz CD8<+>efektorskih T ćelija, povećanu sekreciju γ-interferona iz CD4+ memorijskih i/ili efektorskih T ćelija, povećanu proliferaciju CD4+ efektorskih i/ili memorijskih T ćelija, povećanu proliferacija CD8+ efektorskih T ćelija, povećanu responzivnost na antigene (npr. klirens) u odnosu na takve nivoe pre intervencije. U jednom aspektu, nivo poboljšanja je barem 50%, alternativno 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. Postupak merenja ovog poboljšanja poznat je stručnjacima za ovu oblast.

"Imunitet tumora" odnosi se na postupak u kojem tumori izbegavaju imunsko prepoznavanje i klirens. Dakle, kao terapijski koncept, imunitet tumora se “leči” kada je takvo izbegavanje oslabljeno, a imunološki sistem prepoznaje i napada tumore. Primeri prepoznavanja tumora uključuju vezivanje tumora, skupljanje tumora i klirens tumora.

"Imunogenost" se odnosi na sposobnost određene supstance da izazove imunološki odgovor. Tumori su imunogeni i pojačavanje imunogenosti tumora pomaže u klirensu tumorskih ćelija imunološkim odgovorom.

"Akceptorski humani okvir" je za ove svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisan dole. Humani akceptorski okvir „dobijen od” okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može da sadrži iste aminokiselinske sekvence kao što su njihove, ili može da sadrži izmene u sekvenci aminokiselina. U nekim aspektima, broj izmena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim aspektima, VL akceptorski humani okvir je po sekvenci identičan sa sekvencom okvira VL humanog imunoglobulina ili sekvencom okvira humanog konsenzusa.

"Afinitet" se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, "afinitet vezivanja" se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema svom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifični aspekti dati kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.

"Agonističko antitelo", kako se ovde koristi, je antitelo koje aktivira biološku aktivnost antigena za koji se vezuje.

"Anti-angiogeni agens" odnosi se na jedinjenje koje blokira, ili u određenoj meri ometa, razvoj krvnih sudova. Anti-angiogeni agens može, na primer, biti mali molekul ili antitelo, koje se vezuje za faktor rasta ili receptor faktora rasta, koji je uključen u promociju angiogeneze. U jednom aspektu, anti-angiogeni agens je antitelo koje se vezuje za vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), poput bevacizumaba (AVASTIN).

„Citotoksičnost koja je zavisna od ćelija“ ili „ADCC“ odnosi se na oblik citotoksičnosti u kojoj sekretirani imunoglobulin povezan sa Fc receptorima (FcR) prisutnim na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) omogućavaju ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vezuju za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i potom ubiju ciljnu ćeliju sa citotoksinima. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII.

Sažeti prikaz ekspresije FcR na hematopoetskim ćelijama dat je u Tabeli 3 na strani 464 rada Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Da bi se procenila aktivnost ADCC molekula od interesa, in vitro ADCC test može se izvršiti kao što je opisano u US Patentu br.

5,500,362 ili 5,821,337 ili US Patentu br.6,737,056 (Presta). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju PBMC i NK ćelije. Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes i sar. PNAS (SAD) 95:652-656 (1998). Primer testa za procenu ADCC aktivnosti obezbeđen je u primerima datim ovde.

Izraz „anti-OX40 antitelo” i „antitelo koje se vezuje za OX40” odnosi se na antitelo koje je sposobno da veže OX40 sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje OX40. U jednom aspektu, obim vezivanja anti-OX40 antitela za nepovezan protein koji nije OX40 je manji od oko 10% od vezivanja antitela za OX40 kao što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U nekim aspektima, antitelo koje se vezuje za OX40 ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim aspektima, anti-OX40 antitelo se vezuje za epitop OX40 koji je konzerviran među OX40 različitih vrsta.

Kako se ovde koristi, pojam "vezuje", "specifično se vezuje za" ili je "specifičan za" odnosi se na merljive i reproduktivne interakcije, kao što je vezivanje između cilja i antitela, što je odlučujuće za prisustvo cilja u prisustvu heterogene populacije molekula uključujući biološke molekule. Na primer, antitelo koje se vezuje ili specifično vezuje za cilj (što može biti epitop) je antitelo koje vezuje ovaj cilj većim afinitetom, težnjom, spremnošću i/ili dužim trajanjem nego što se vezuje za druge ciljeve. U jednom aspektu, obim vezivanja antitela za nepovezan protein je manji od oko 10% od vezivanja antitela za cilj što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U određenim otelotvorenjima, antitelo koje se specifično vezuje za cilj ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤1 µM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ili ≤0,1 nM. U određenim aspektima, antitelo se specifično vezuje za epitop na proteinu koji je konzerviran među proteinima različitih vrsta. U drugom aspektu, specifično vezivanje može da uključi, ali ne zahteva isključivo vezivanje.

Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.

„Fragment antitela” ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab’-SH,F(ab')2; dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv) i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.

"Antitelo koje se vezuje za isti epitop" kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više. Ovde je dat primer kompetitivnog testa.

Izraz "vezujući domen" odnosi se na region polipeptida koji se vezuje za drugi molekul. U slučaju FcR, vezujući domen može da sadrži deo njegovog polipeptidnog lanca (npr. njegov alfa lanac) koji je odgovoran za vezivanje Fc regiona. Jedan korisni vezujući domen je ekstracelularni domen alfa lanca FcR.

Polipeptid sa varijantom IgG Fc sa "izmenjenom" aktivnošću FcR, ADCC ili fagocitoze je onaj koji ima ili pojačanu ili smanjenu aktivnost vezivanja FcR (npr. FcγR) i/ili aktivnost ADCC i/ili aktivnost fagocitoze u odnosu na matični polipeptid ili polipeptid koji sadrži Fc region nativne sekvence.

Termin „OX40”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni OX40 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađen, "kompletne dužine" OX40, kao i svaki oblik OX40 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante OX40, npr. splajsovane ili alelne varijante. Sekvenca aminokiselina primera humanog OX40 je prikazana u SEQ ID NO:1.

"OX40 aktivacija" se odnosi na aktivaciju OX40 receptora. Generalno, aktiviranje OX40 dovodi do transdukcije signala.

Termini „kancer“ i „kancerogeni“ odnose se na fiziološko stanje sisara koje se tipično karakteriše neregulisanim rastom ćelija, ili ga opisuju. Primeri za kancer uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom, i leukemiju ili limfoidne malignitete. Konkretniji primeri za takve kancere uključuju, ali nisu ograničeni na, kancer skvamoznih ćelija (npr. kancer epitelnih skvamoznih ćelija), kancer pluća, uključujući mikrocelularni karcinom pluća, nemikrocelularni karcinom pluća, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća, kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, rak želuca, uključujući gastrointestinalni kancer i gastrointestinalni stromalni kancer, rak gušterače, glioblastom, rak grlića materice, rak jajnika, rak jetre, kancer mokraćne bešike, kancer mokraćnih puteva, hepatom, rak dojke, kancer debelog creva, kancer rektuma, kolorektalni kancer, karcinom endometrijuma ili materice, karcinom pljuvačne žlezde, rak bubrega ili renalni kancer, rak prostate, rak vulve, kancer štitne žlezde, hepatični karcinom, analni karcinom, karcinom penisa, melanom, površinski šireći melanom, lentigo maligni melanom, akralni lentiginozni melanomi, nodularni melanomi, multipli mijelom i limfom B-ćelija; hronična limfocitna leukemija (CLL); akutna limfoblastna leukemija (ALL); leukemija vlasastih ćelija; hronična mijeloblastna leukemija; i posttransplantacioni limfoproliferativni poremećaj (PTLD), kao i abnormalna vaskularna proliferacija povezana sa fakomatozama, edem (poput onih povezanih sa tumorima mozga), Meigsov sindrom, kancer mozga, kao i glave i vrata, i povezane metastaze. U određenim aspektima, kanceri koji su podložni lečenju antitelima prema pronalasku uključuju kancer dojke, kolorektalni kancer, rektalni kancer, nemikrocelularni kancer pluća, glioblastom, ne-Hodžkinsov limfom (NHL), kancer bubrežne ćelije, kancer prostate, kancer jetre, kancer gušterače, sarkom mekog tkiva, Kapošijev sarkom, karcinoidni karcinom, kancer glave i vrata, kancer jajnika, mezoteliom i multipli mijelom. U nekim aspektima, kancer je odabran između: nemikrocelularnog kancera pluća, glioblastoma, neuroblastoma, melanoma, karcinoma dojke (npr. trostruko negativnog kancera dojke), kancera želuca, kolorektalnog kancera (CRC) i hepatocelularnog karcinoma. Ipak, u nekim aspektima, kancer je odabran od: nemikrocelularnog kancera pluća, kolorektalnog kancera, glioblastoma i karcinoma dojke (npr. trostruko negativnog kancera dojke), uključujući metastatske oblike tih kancera.

Izrazi „proliferativni poremećaj ćelije” i „proliferativni poremećaj” odnose se na poremećaje koji su u vezi sa određenim stepenom abnormalne proliferacije ćelija. U jednom aspektu, proliferativni poremećaj ćelije je kancer.

Termin "himerno" antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.

„Klasa” antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.

„Citotoksičnost zavisna od komplementa“ ili se odnosi na lizu ciljne ćelije u prisustvu komplementa. Aktivacija klasičnog puta komplementa započinje vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) za antitela (odgovarajuće potklase) koja su vezana za njihov srodni antigen. Za procenu aktivacije komplementa, može se sprovesti CDC test, npr.

1

kako su opisali Gazzano-Santoro i sar., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Polipeptidne varijante sa izmenjenim aminokiselinskim sekvencama Fc regiona (polipeptidi sa varijantama Fc regiona) i povećana ili smanjena sposobnost vezivanja C1q su opisani npr. u US Patentu br.

6.194.551 B1 i WO 1999/51642. Vidi takođe, npr. Idusogie i sar. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).

Termin "citostatički agens" odnosi se na jedinjenje ili kompoziciju koja zaustavlja rast ćelije bilo in vitro ili in vivo. Tako, citostatički agens može biti onaj koji značajno smanjuje procenat ćelija u S fazi. Dalji primeri citostatičkih agenasa uključuju agense koji blokiraju napredovanje ćelijskog ciklusa indukovanjem zaustavljanja G0/G1 ili zaustavljanja M-faze. Humanizovano anti-Her2 antitelo trastuzumab (HERCEPTIN®) je primer citostatičkog agensa koji indukuje zaustavljanje G0/G1. Klasični blokatori M-faze uključuju vinke (vinkristin i vinblastin), taksane i inhibitore topoizomeraze II, kao što su doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopozid i bleomicin. Određeni agensi koji zaustavljaju G1, isto tako, šire se na zastoj S-faze, na primer, DNK alkilujući agensi, kao što su tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil i ara-C. Dalje informacije mogu se videti u Mendelsohn i Israel, izd., The Molecular Basis of Cancer, Poglavlje 1, nazvano "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" čiji su autori Murakami i sar. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), npr. str. 13. Taksani (paklitaksel i docetaksel) su lekovi protiv raka koji su dobijeni od tise. Docetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), dobijen od evropske tise, je polusintetički analog paklitaksela (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paklitaksel i docetaksel promovišu sklapanje mikrotubula iz dimera tubulina i stabilizuju mikrotubule sprečavanjem depolimerizacije, što dovodi do inhibicije mitoze u ćelijama.

Izraz „citotoksični agens”, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva smrt ili uništenje ćelije. Citotoksični agensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malog molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante, kao i različite antitumorske ili antikancerogene agense koji su objavljeni dole.

"Iscrpljujuće anti-OX40 antitelo" je anti-OX40 antitelo koje ubija ili iscrpljuje ćelije koje eksprimiraju OX40. Iscrpljivanje ćelija koje eksprimiraju OX40 može se postići različitim mehanizmima, kao što su ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela i/ili fagocitoza. Iscrpljivanje ćelija koje eksprimiraju OX40 može se testirati in vitro, a ovde su dati primeri postupaka za in vitro testove ADCC i fagocitoze. U nekim otelotvorenjima, ćelija koja eksprimira OX40 je humana CD4+ efektorska T ćelija. U nekim otelotvorenjima, ćelija koja eksprimira OX40 je transgena BT474 ćelija koja eksprimira humani OX40.

Izraz „efektorske funkcije” ukazuje na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, koji varira prema izotipu antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: Vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; antitelo-zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.

"Efikasna količina" agensa, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.

„Fc receptor“ ili „FcR“ opisuje receptor koji se vezuje za Fc region antitela. U nekim otelotvorenjima, FcR je humani nativni FcR. U nekim aspektima, FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore potklasa FcγRI, FcγRII i FcγRIII, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane oblike ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA („aktivacioni receptor“) i FcγRIIB („inhibitorni receptor“), koji imaju slične aminokiselinske sekvence koje se prvenstveno razlikuju u njihovim citoplazmatskim domenima. Aktiviranje receptora FcγRIIA sadrži imunoreceptorski motiv za aktivaciju na bazi tirozina (ITAM) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibitorski receptor FcγRIIB sadrži imunoreceptorski motiv za inhibiciju na bazi tirozina (ITIM) u svom citoplazmatskom domenu (vidi, npr. Daëron, Annu. Rev. Immunol.15:203-234 (1997)). FcR su razmotreni, na primer, u Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel i sar., Immunomethods 4:25-34 (1994); i de Haas i sar., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Ostali FcR, uključujući i one koji će se identifikovati u budućnosti, ovde su obuhvaćeni izrazom „FcR“. Termin "Fc receptor" ili “FcR” takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus (Guyer i sar., J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim i sar., J. Immunol.

24:249 (1994)) i za regulaciju homeostaze imunoglobulina. Postupci merenja vezivanja na FcRn su poznate (vidi, npr. Ghetie i Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie i sar., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton i sar., J. Biol. Chem.279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton i sar.). Može se testirati vezivanje za ljudski FcRn in vivo i poluživot u serumu ljudskih FcRn polipeptida koji se vezuju sa visokim afinitetom, npr. kod transgenih miševa ili transficiranih humanih ćelijskih linija koje eksprimiraju humani FcRn, ili kod primata kod kojih se primenjuju polipeptidi sa varijantom Fc regiona. WO 2000/42072 (Presta) opisuje varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. Vidi takođe, npr. Shields i sar. J. Biol. Chem.9(2):6591-6604 (2001).

Izraz „Fc region” u ovom dokumentu se koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Izraz uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom aspektu, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, na C kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, označavanje aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

„Funkcionalni Fc region“ poseduje „efektorsku funkciju“ Fc regiona nativne sekvence. Primeri „efektorske funkcije“ uključuju C1q vezivanje, CDC, vezivanje Fc receptora, ADCC, fagocitozu, nishodnu regulaciju površinskih receptora ćelije (npr. receptor B ćelije, BCR) itd. Takve efektorske funkcije uopšteno zahtevaju da Fc region bude kombinovan sa domenom vezivanja (npr. varijabilni domen antitela) i mogu se proceniti pomoću različitih testova kao što je opisano, na primer, u definicijama ovde.

„Humane efektorske ćelije” odnose se na leukocite koji eksprimiraju jedan ili više FcR i izvršavaju efektorske funkcije. U određenim otelotvorenjima, ćelije eksprimiraju barem FcγRIII i vrše ADCC efektorsku funkciju (funkcije). Primeri za humane leukocite koji posreduju ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije i neutrofile. Efektorske ćelije mogu biti izolovane iz prirodnog izvora, npr. iz krvi.

„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Izrazi „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi za ukazivanje na antitelo koje ima suštinski sličnu strukturu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je u ovom dokumentu definisano.

Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelije domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući

1

potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji.

„Humano antitelo” je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija ili ono dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ne-humane antigen-vezujuće ostatke.

"Okvir humanog konsenzusa" je okvir koji predstavlja najčešće ostatke aminokiselina u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Generalno, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vol. 1-3. U jednom aspektu, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat i sar, gore. U jednom aspektu, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat i sar, gore.

„Humanizovano” antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od ne-humanih HVR i aminokiselinske ostatke od humanih FR. U određenim aspektima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR (npr. CDR), odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži barem deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik” antitela, npr. ne-humanog antitela, ukazuje na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.

Izraz „hipervarijabilni region” ili „HVR”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost” ili „CDR”) i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje”) i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom („antigen kontakti”). U suštini, antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U ovom dokumentu, primeri za HVR uključuju:

(a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3); (Chothia i Lesk, J. Mol.

Biol. 196:901-917 (1987));

(b) CDR koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(c) antigen kontakte koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3); (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)); i

(d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući aminokiselinske ostatke HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).

Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su numerisani prema radu Kabat i sar., gore.

U jednom aspektu, HVR ostaci sadrže one identifikovane na SL. 11A-I ili na drugom mestu u specifikaciji.

„Imunokonjugat” je antitelo konjugovano sa jednim heterologim molekulom ili sa više heterologih molekula, uključujući, bez ograničenja, citotoksični agens.

„Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U određenim aspektima, pojedinac ili ispitanik je čovek.

„Promocija rasta ili proliferacije ćelije” podrazumeva povećanje ćelijskog rasta ili proliferacije za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ili 100%.

„Izolovano” antitelo je ono koje je izdvojeno iz svog prirodnog okruženja. U nekim aspektima, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99% kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reversno faznim HPLC postupkom). Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, pogledajte npr. Flatman i sar., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

"Izolovana" nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.

1

„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-OX40 antitelo” ukazuje na jedan molekul ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj lokaciji ili više lokacija u ćeliji domaćinu.

Termin „monoklonsko antitelo”, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačnih antitela koja sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Tako, reč „monoklonsko” ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na postupak hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke koje koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.

"Golo antitelo" ukazuje na antitelo koje nije konjugovano sa heterologim delom (npr. citotoksičnim delom) ili radiološkom oznakom. Golo antitelo može da bude prisutno u farmaceutskoj formulaciji.

"Nativna antitela" ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N− do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N− do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena. „Fc region nativne sekvence“ sadrži aminokiselinsku sekvencu identičnu

1

sa aminokiselinskom sekvencom Fc regiona koja se nalazi u prirodi. Humani Fc regioni nativne sekvence uključuju humani Fc region nativne sekvence IgG1 (ne-A i A alotipi); humani Fc region nativne sekvence IgG2; humani Fc region nativne sekvence IgG3; i humani Fc region nativne sekvence IgG4, kao i njihove varijante koji se javljaju u prirodi.

Termin „uputstvo za upotrebu” koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.

„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence” u poređenju sa sekvencom referentnog polipeptida definisan je kao procenat onih aminokiselinskih ostataka u sekvencikandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, pri tom ne uzimajući u obzir bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.

U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što drugačije može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:

1

100 puta količnik X/Y

gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću ALIGN-2 kompjuterskog programa.

Termin „farmaceutska formulacija” odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.

"Farmaceutski prihvatljiv nosač" upućuje na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.

U smislu ovog dokumenta, „lečenje” (i njegovi gramatički oblici, kao što je „lečiti”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, a može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim aspektima, antitela iz ovog pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.

Izraz „tumor” odnosi se na rast i proliferaciju svih neoplastičnih ćelija, bilo malignih ili benignih, svih prekancerogenih i kancerogenih ćelija i tkiva. Izrazi „kancer”, „kancerogeni”, „proliferativni poremećaj ćelija”, „proliferativni poremećaj” i „tumor” međusobno se ne isključuju prilikom pominjanja u ovom dokumentu.

Izraz „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH i VL, datim redosledom) nativnog antitela u suštini imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (vidite, npr., Kindt i sar. Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman i Co., strana 91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen-vezujuće

1

specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen, za pregledanje biblioteke komplementarnih VH, odnosno VL domena. Videti, npr. Portolano i sar., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson i sar., Nature 352:624-628 (1991).

„Varijanta Fc regiona” sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one u sklopu nativne sekvence Fc regiona u pogledu najmanje jedne modifikacije aminokiseline, poželjno jedne ili više supstitucija aminokiseline. Poželjno je da varijanta Fc regiona ima najmanje jednu supstituciju aminokiselina u poređenju sa Fc regionom prirodne sekvence ili Fc regionom matičnog polipeptida, npr. od oko jedan do deset aminokiselinskih supstitucija, i poželjno od oko jedan do pet aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu u prirodnoj sekvenci ili u Fc regionu matičnog polipeptida. Varijanta Fc regiona ovde će poželjno imati najmanje oko 80% homologije sa nativnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom matičnog polipeptida, a najpoželjnije najmanje oko 90% homologije sa njom, poželjnije najmanje oko 95% homologije sa njom.

Izraz „vektor”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji ima sposobnost propagacije druge nukleinske kiseline za koju je vezan. Termin uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. U ovom dokumentu, takvi vektori se pominju kao „ekspresioni vektori”.

"Okvir konsenzusa VH podgrupe III" sadrži sekvencu konsenzusa dobijenu iz aminokiselinskih sekvenci u varijabilnoj teškoj podgrupi III iz rada Kabata i sar. U jednom otelotvorenju, okvir konsenzusa VH podgrupe III aminokiselinske sekvence sadrži barem neke ili sve naredne sekvence: (SEQ ID NO:185)-H1-

"Okvir konsenzusa VL podgrupe I" sadrži sekvencu konsenzusa dobijenu iz aminokiselinskih sekvenci u varijabilnoj lakoj kapa podgrupi I iz rada Kabata i sar. U jednom otelotvorenju, okvir konsenzusa VH podgrupe I aminokiselinske sekvence sadrži barem neke ili sve naredne sekvence:

1

Izraz „citotoksični agens”, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva smrt ili uništenje ćelije. Citotoksični agensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, radioaktivne izotope (npr. At211, I131, I125, Y90, Rel86, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 i radioaktivne izotope Lu), hemoterapeutske agense, agense za inhibiciju rasta, enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi i toksine, kao što su toksini malog molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante. Primeri za citotoksične agense mogu se odabrati od anti-mikrotubularnih agenasa, koordinacionih kompleksa platine, alkilujućih agenasa, antibiotskih agenasa, inhibitora topoizomeraze II, antimetabolita, inhibitora topoizomeraze I, hormona i hormonskih analoga, inhibitora puteva transdukcije signala, inhibitora angiogeneze nereceptorske tirozin kinaze, imunoterapeutskih agenasa, proapoptotskih agenasa, inhibitora LDH-A, inhibitora biosinteze masnih kiselina, inhibitora signalizacije ćelijskog ciklusa, HDAC inhibitora, inhibitora proteazoma i inhibitora metabolizma kancera.

U jednom aspektu, citotoksični agensi mogu se odabrati od anti-mikrotubularnih agenasa, koordinacionih kompleksa platine, alkilujućih agenasa, antibiotskih agenasa, inhibitora topoizomeraze II, antimetabolita, inhibitora topoizomeraze I, hormona i hormonskih analoga, inhibitora puteva transdukcije signala, inhibitora angiogeneze nereceptorske tirozin kinaze, imunoterapeutskih agenasa, proapoptotskih agenasa, inhibitora LDH-A, inhibitora biosinteze masnih kiselina, inhibitora signalizacije ćelijskog ciklusa, HDAC inhibitora, inhibitora proteazoma i inhibitora metabolizma kancera. U jednom aspektu, citotoksični agens je taksan. U jednom aspektu, taksan je paklitaksel ili docetaksel. U jednom aspektu, citotoksični agens je agens platine. U jednom aspektu, citotoksični agens je antagonist EGFR. U jednom aspektu, antagonist EGFR je N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoksietoksi)hinazolin-4-amin (npr. erlotinib). U jednom aspektu, citotoksični agens je RAF inhibitor. U jednom aspektu, RAF inhibitor je BRAF i/ili CRAF inhibitor. U jednom aspektu, RAF inhibitor je vemurafenib. U jednom aspektu, citotoksični agens je PI3K inhibitor.

„Hemoterapeutski agens“” obuhvata hemijska jedinjenja koja su od koristi u lečenju kancera. Primeri za hemoterapeutske agense uključuju erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), disulfiram, epigalokatehin galat, salinosporamid A, karfilzomib, 17-AAG (geldanamicin), radicikol, laktat dehidrogenazu A (LDH-A), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), sunitib (SUTENT®, Pfizer/Sugen), letrozol (FEMARA®, Novartis), imatinib mezilat (GLEEVEC®, Novartis), finasunat (VATALANIB®, Novartis), oksaliplatin (ELOXATIN®, Sanofi), 5-FU (5-

2

fluoruracil), leukovorin, rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), Lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafamib (SCH 66336), sorafenib (NEXAVAR®, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, alkilujuće agense kao što su tiotepa i CYTOXAN® ciklosfosfamid; alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbohon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilomelamin; acetogenine (naročito bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući topotekan i irinotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); kriptoficine (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); adrenokortikosteroide (uključujući prednizon i prednizolon); ciproteron acetat; 5α-reduktaze uključujući finasterid i dutasterid); vorinostat, romidepsin, panobinostat, valproinsku kiselinu, mocetinostat dolastatin; aldesleukin, talk duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlomafazin, hlorfosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozoureje kao što su karmustin, hlorzotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotike kao što su enedinski antibiotici (npr. kaliheamicin, naročito kaliheamicin γ1I i kaliheamicin ω1I (Angew Chem. Inti. izd. Engl,1994 33:183-186)); dinemicin, uključujući dinemicin A; bifosfonate, kao klodronat; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i povezane hromofore hromoproteina endiinskih antibiotika), aklacinomisine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicine, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMYCIN® (doksorubicin), morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine kao što je mitomicin C, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, porfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što je metotreksat i 5-fluoruracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge kao što je fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinske analoge kao što je ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što je kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenaline kao što je aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljač folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elfornitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidainin; majtanzinoide kao što je majtanzin i ansamitocine; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; lozoksantron; podofilinsku kiselinu; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoksan; rizoksin; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikvon; 2,2’,2”-trihlortrietilamin; trihotecene (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid (“Ara-C”); tiotepa; taksoide, npr. TAXOL (paklitaksel, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE® (bez kremofora), nanočestičnu formulaciju paklitaksela dizajniranu pomoću albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) i TAXOTERE® (docetaksel, doksetaksel; Sanofi-Aventis); hloranbucil; GEMZAR® (gemcitabin); 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; platinske analoge kao što je cisplatin i karboplatin; vinblastin; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; NAVELBINE® (vinorelbin); novantron; tenipozid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kapecitabin (XELODA®); ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluormetilornitin (DMFO); retinoide kao što je retinolna kiselina; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate svega gore nabrojanog.

Hemoterapeutsko sredstvo takođe uključuje i (i) antihormonske agense koji deluju na reguaciju ili inhibiranje delovanja hormona na tumore poput antiestrogena i selektivnih modulatora receptora estrogena (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX®; tamoksifen citrat), raloksifen, droloksifen, jodoksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston, i FARESTON® (toremifin citrat); (ii) inhibitore aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnoj žlezdi, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® (megestrol acetat), AROMASIN® (eksemestan; Pfizer), formestan, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis) i ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) anti-androgene poput flutamida, nilutamida, bikalutamida, leuprolida i goserelina; buserelin, tripterelin, medroksiprogesteron acetat, dietilstilbestrol, premarin, fluoksimesteron, sve trans retinolnu kiselinu, fenretinid, kao i troksacitabin (1,3-dioksolanski nukleozidni analog citozina); (iv) inhibitore protein kinaze; (v) inhibitore lipidne kinaze; (vi) antisens oligonukleotide, posebno one koji inhibiraju ekspresiju gena u signalnim putevima koji su uključeni u aberantnu proliferaciju ćelija, kao što su, na primer, PKC-alfa, Ralf i H-Ras; (vii) ribozime kao što su inhibitori ekspresije VEGF (npr. ANGIOZYME®) i inhibitori ekspresije HER2; (viii) vakcine, poput vakcina za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® i VAXID®; PROLEUKIN®, rIL-2; inhibitor topoizomeraze 1, kao što su LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; i (ix) farmaceutski prihvatljive soli, kiseline i derivate bilo kojeg od gore navedenog.

Hemoterapeutsko sredstvo takođe uključuje i antitela kao što su alemtuzumab (Campath), bevacizumab (AVASTIN®, Genentech); cetuksimab (ERBITUX®, Imclone); panitumumab (VECTIBIX®, Amgen), rituksimab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumab (OMNITARG®, 2C4, Genentech), trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomab (Bexxar, Corixia), i konjugat antitelo lek, gemtuzumab ozogamicin (MYLOTARG®, Wyeth). Dodatna humanizovana monoklonska antitela sa terapeutskim potencijalom kao agensi u kombinaciji sa jedinjenjima iz ovog pronalaska uključuju: apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bivatuzumab mertansin, kantuzumab mertansin, cedelizumab, certolizumab pegol, cidfusituzumab, cidtuzumab, daklizumab, ekulizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamicin, inotuzumab ozogamicin, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, okrelizumab, omalizumab, palivizumab, paskolizumab, pekfuzituzumab, pektuzumab, pekselizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resivizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, takatuzumab tetraksetan, tadocizumab, talizumab, tefibazumab, tocilizumab, toralizumab, tukotuzumab celmoleukin, tukuzituzumab, umavizumab, urtoksazumab, ustekinumab, visilizumab, i anti-interleukin-12 (ABT-874/J695, Wyeth Research ai Abbott Laboratories) koji je rekombinantno antitelo IgG1 λ kompletne dužine sa isključivo humanom sekvencom, genetski modifikovano da prepoznaje protein interleukin-12 p40.

Hemoterapeutsko sredstvo uključuje i "EGFR inhibitore", što se odnosi na jedinjenja koja se vezuju ili na drugi način direktno interaguju sa EGFR-om i sprečavaju ili smanjuju njegovu signalnu aktivnost, i alternativno se nazivaju "EGFR antagonisti." Primeri za takva sredstva uključuju antitela i male molekule koji se vezuju na EGFR. Primeri za antitela koja se vezuju za EGER uključuju MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (vidi US Patent br.

4,943, 533, Mendelsohn i sar.) i njihove varijante, poput himerizovanog 225 (C225 ili cetuksimab; ERBUTIX®) i preoblikovanog humanog 225 (H225) (vidi WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, potpuno humano, EGFR-ciljano antitelo (Imclone); antitela koja vezuju mutantni EGFR tip II (US Patent br.5,212,290); humanizovana i himerna antitela

2

koja vezuju EGFR kako je opisano u US Patentu br.5,891,996; i humana antitela koja vezuju EGFR, poput ABX-EGF ili panitumumaba (vidi WO98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto i sar. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (matuzumab) humanizovano EGFR antitelo usmereno protiv EGFR koje se takmiči sa EGF i TGF-alfa u vezivanju EGFR (EMD/Merck); humano EGFR antitelo, HuMax-EGFR (GenMab); potpuno humana antitela poznata kao E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6. 3 i E7.6. 3 i opisana u US 6,235,883; MDX-447 (Medarex Inc); i mAb 806 ili humanizovano mAb 806 (Johns i sar., J. Biol. Chem.

279(29):30375-30384 (2004)). Anti-EGFR antitelo se može konjugovati sa citotoksičnim agensom, stvarajući tako imunokonjugat (vidi, npr. EP659,439A2, Merck Patent GmbH). EGFR antagonisti uključuju male molekule poput jedinjenja opisanih u US Patentima br: 5,616,582, 5,457,105, 5,475,001, 5,654,307, 5,679,683, 6,084,095, 6,265,410, 6,455,534, 6,521,620, 6,596,726, 6,713,484, 5,770,599, 6,140,332, 5,866,572, 6,399,602, 6,344,459, 6,602,863, 6,391,874, 6,344,455, 5,760,041, 6,002,008 i 5,747,498, kao i u sledećim PCT publikacijama: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016 i WO99/24037. Konkretni mali molekuli EGFR antagonista uključuju OSI-774 (CP-358774, erlotinib, TARCEVA® Genentech/OSI Pharmaceuticals); PD 183805 (CI 1033, 2-propenamid, N-[4-[(3-hlor-4-fluorfenil)amino]-7-[3-(4-morfolinil)propoksi]-6-hinazolinil]−, dihidrohlorid, Pfizer Inc.); ZD1839, gefitinib (IRESSA®) 4-(3’-hlor-4’-fluoranilino)-7-metoksi-6-(3-morfolinopropoksi)hinazolin, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-amino-4-(3-metilfenil-amino)-hinazolin, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-hlor-4-fluor-fenil)-N2-(1-metil-piperidin-4-il)-pirimido[5,4−d]pirimidin-2,8-diamin, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-feniletil)amino]-1H-pirolo[2,3−d]pirimidin-6-il]-fenol); (R)-6-(4-hidroksifenil)-4-[(1-feniletil)amino]-7H-pirolo[2,3−d]pirimidin); CL-387785 (N-[4-[(3-bromfenil)amino]-6-hinazolinil]-2-butinamid); EKB-569 (N-[4-[(3-hlor-4-fluorfenil)amino]-3-cijano-7-etoksi-6-hinolinil]-4-(dimetilamino)-2-butenamid) (Wyeth); AG1478 (Pfizer); AG1571 (SU 5271; Pfizer); dvojne EGFR/HER2 inhibitore tirozin kinaze kao što je lapatinib (TYKERB®, GSK572016 ili N-[3-hlor-4-[(3 fluorfenil)metoksi]fenil]-6[5[[[2metilsulfonil)etil]amino]metil]-2-furanil]-4-hinazolinamin).

Hemoterapeutski agensi takođe uključuju “inhibitore tirozin kinaze”, uključujući EGFR-ciljane lekove navedene u prethodnom paragrafu; male molekule HER2 inhibitore tirozin kinaze kao što je TAK165 dostupan od Takeda; CP-724,714, oralni selektivni inhibitor ErbB2 receptorske tirozin kinaze (Pfizer i OSI); dvojne HER inhibitore kao što je EKB-569 (dostupne od kompanije Wyeth) koji preferencijalno vezuju EGER ali inhibiraju i HER2 i ćelije koje prekomerno eksprimiraju EGFR; lapatinib (GSK572016; dostupan od kompanije GlaxoSmithKline), oralni HER2 i EGFR inhibitor tirozin kinaze; PKI-166 (dostupan od kompanije Novartis); pan-HER inhibitore kao što je kanertinib (CI-1033; Pharmacia); Raf-1 inhibitore kao što je antisens agens ISIS-5132 dostupan od ISIS Pharmaceuticals koji inhibira Raf-1 signalizaciju; ne-HER ciljane TK inhibitore kao što je imatinib mezilat (GLEEVEC®, dostupan od kompanije Glaxo SmithKline); multi-ciljane inhibitore tirozin kinaze kao što je sunitinib (SUTENT®, dostupan od kompanije Pfizer); VEGF inhibitore receptorske tirozin kinaze kao što je vatalanib (PTK787/ZK222584, dostupan od kompanije Novartis/Schering AG); MAPK ekstracelularno regulisani inhibitor kinaze I CI-1040 (dostupan od kompanije Pharmacia); hinazoline, kao što je PD 153035,4-(3-hloranilino) hinazolin; piridopirimidine; pirimidopirimidine; pirolopirimidine, kao što je CGP 59326, CGP 60261 i CGP 62706; pirazolopirimidine, 4-(fenilamino)-7H-pirolo[2,3−d] pirimidine; kurkumin (diferuloil metan, 4,5-bis (4-fluoranilino)ftalimid); tirfostine koji sadrže ostatke nitrotiofena; PD-0183805 (Warner-Lamber); antisens molekule (npr. one koji se vezuju za HER-kodirajuću nukleinsku kiselinu); hinoksaline (US Patent br.5,804,396); trifostine (US Patent br.5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); pan-HER inhibitore kao što je CI-1033 (Pfizer); afinitak (ISIS 3521; Isis/Lilly); imatinib mezilat (GLEEVEC®); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); semaksinib (Pfizer); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone), rapamicin (sirolimus, RAPAMUNE®); ili kao što je opisano u bilo kojoj od sledećih patentnih publikacija: US Patent br. 5,804,396; WO 1999/09016 (American Cyanamid); WO 1998/43960 (American Cyanamid); WO 1997/38983 (Warner Lambert); WO 1999/06378 (Warner Lambert); WO 1999/06396 (Warner Lambert); WO 1996/30347 (Pfizer, Inc); WO 1996/33978 (Zeneca); WO 1996/3397 (Zeneca) i WO 1996/33980 (Zeneca).

Hemoterapeutski agensi takođe uključuju deksametazon, interferone, kolhicin, metoprin, ciklosporin, amfotericin, metronidazol, alemtuzumab, alitretinoin, alopurinol, amifostin, arsen trioksid, asparaginazu, BCG živu vakcinu, bevacuzimab, beksaroten, kladribin, klofarabin, darbepoetin alfa, denileukin, deksrazoksan, epoetin alfa, elotinib, filgrastim, histrelin acetat, ibritumomab, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, lenalidomid, levamisol, mesna, metksalen, nandrolon, nelarabin, nofetumomab, oprelvekin, palifermin, pamidronat, pegademas, pegaspargazu, pegfilgrastim, pemetreksed dinatrijum, plikamicin, porfimer natrijum, hinakrin, rasburikazu, sargramostim, temozolomid, VM-26, 6-TG, toremifen, tretinoin, ATRA, valrubicin, zoledronat i zoledronsku kiselinu, i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

Hemoterapeutski agensi takođe uključuju hidrokortizon, hidrokortizon acetat, kortizon

2

acetat, tiksokortol pivalat, triamcinolon acetonid, triamcinolon alkohol, mometazon, amcinonid, budesonid, desonid, fluocinonid, fluocinolon acetonid, betametazon, betametazon natrijum fosfat, deksametazon, deksametazon natrijum fosfat, fluokortolon, hidrokortizon-17-butirat, hidrokortizon-17-valerat, aklometazon dipropionat, betametazon valerat, betametazon dipropionat, prednikarbat, klobetazon-17-butirat, klobetazol-17-propionat, fluokortolon kaproat, fluokortolon pivalat i flupredniden acetat; imunoselektivne anti-inflamatorne peptide (ImSAID) kao što je fenilalanin-glutamin-glicin (FEG) i njegov D-izomerni oblik (feG) (IMULAN BioTherapeutics, LLC); anti-reumatske lekove kao što je azatioprin, ciklosporin (ciklosporin A), D-penicilamin, soli zlata, hidroksihlorhin, leflunomidminociklin, sulfasalazin, blokatore faktora nekroze tumora-alfa (TNFα) kao što je etanercept (enbrel), infliksimab (remikade), adalimumab (humira), certolizumab pegol (cimzia), golimumab (simponi), blokatore Interleukina 1 (IL-1) kao što je anakinra (kineret), blokatore kostimulacije T ćelija kao što je abatacept (orencia), blokatore Interleukina 6 (IL-6) kao što je tocilizumab (ACTEMERA®); blokatore Interleukina 13 (IL-13) kao što je lebrikizumab; blokatore Interferona alfa (IFN) kao što je rontalizumab; blokatore Beta 7 integrina kao što je rhuMAb Beta7; blokatore IgE puta kao što je Anti-M1 prime; sekretovani homotrimerni LTa3 i blokere membranski vezanog heterotrimera LTa1/β2 kao što je antilimfotoksin alfa (LTa); radioaktivne izotope (npr. At211,I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 i radioaktivne izotope Lu); razne ispitivane agense kao što je tioplatin, PS-341, fenilbutirat, ET-18- OCH3, ili inhibitori farnezil transferaze (L-739749, L-744832); polifenole kao što je kvercetin, resveratrol, piceatanol, epigalokatehin galat, teaflavini, flavanoli, procijanidini, betulinska kiselina i njeni derivati; inhibitore autofagije kao što je hlorohin; delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapahon; lapahol; kolhicine; betulinsku kiselinu; acetilkamptotecin, skopolektin, i 9-aminokamptotecin); podofilotoksin; tegafur (UFTORAL®); beksaroten (TARGRETIN®); bisfosfonate kao što je klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), etidronat (DIDROCAL®), NE-58095, zoledronska kiselina/zoledronat (ZOMETA®), alendronat (FOSAMAX®), pamidronat (AREDIA®), tiludronat (SKELID®), ili risedronat (ACTONEL®); i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R); vakcine kao što je THERATOPE® vakcina; perifosin, inhibitor COX-2 (npr. celekoksib ili etorikoksib), inhibitor proteozoma (npr. PS341); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibitor Bcl-2 kao što je oblimersen natrijum (GENASENSE®); piksantron; inhibitore farneziltransferaze kao što je lonafarnib (SCH 6636, SARASARTM); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo čega od gore navedenog; kao i kombinacije dva ili više od prethodno navedenog kao što je CHOP, skraćenica za kombinovanu

2

terapiju ciklofosfamidom, doksorubicinom, vinkristinom i prednizolonom; i FOLFOX, skraćenica za režim lečenja oksaliplatinom (ELOXATINTM) u kombinaciji sa 5-FU i leukovorinom.

Hemoterapeutski agensi takođe uključuju nesteroidne antiinflamatorne lekove sa analgetskim, antipiretskim i antiinflamatornim dejstvom. NSAIL uključuju neselektivne inhibitore enzima ciklooksigenaze. Konkretni primeri NSAIL uključuju aspirin, derivate propionske kiseline kao što je ibuprofen, fenoprofen, ketoprofen, flurbiprofen, oksaprozin i naproksen, derivate sirćetne kiseline kao što je indometacin, sulindak, etodolak, diklofenak, derivate enolne kiseline kao što je piroksikam, meloksikam, tenoksikam, droksikam, lornoksikam i izoksikam, derivate fenaminske kiseline kao što je mefenaminska kiselina, meklofenaminska kiselina, flufenaminska kiselina, tolfenaminska kiselina, i inhibitore COX-2 kao što je celekoksib, etorikoksib, lumirakoksib, parekoksib, rofekoksib, rofekoksib i valdekoksib. NSAIL mogu biti naznačeni za simptomatsko ublažavanje stanja kao što je reumatoidni artritis, osteoartritis, inflamatorne artropatije, ankilozirajući spondilitis, psorijatski artritis, Rajterov sindrom, akutni giht, dismenoreja, metastatski bol u kostima, glavobolja i migrena, postoperativni bol, blagi do umereni bol usled inflamacije i povrede tkiva, pireksija, ileus i bubrežna kolika.

Termin "citokin" je generički naziv za proteine koje oslobađa jedna ćelijska populacija, a koji na drugoj ćeliji deluju kao intercelularni medijatori. Primeri takvih citokina su limfokini, monokini; interleukini (IL) kao što je IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; faktor nekroze tumora kao što je TNF-α ili TNF-β; i drugi faktori polipeptida, uključujući LIF i kit ligand (KL) i gama interferon. Kako se ovde koristi, termin citokin uključuje proteine iz prirodnih izvora ili iz rekombinantne ćelijske kulture i biološki aktivne ekvivalente citokina nativne sekvence, uključujući sintetički proizvedene male molekule i njihove farmaceutski prihvatljive derivate i soli.

Termin „antagonist koji vezuje PD-1 osovinu” odnosi se na molekul koji inhibira interakciju partnera koji vezuje PD-1 osovinu sa jednim partnerom ili više njegovih partnera za vezivanje, kako bi se uklonila disfunkcija T-ćelije koja je rezultat signalizacije na PD-1 signalnoj osovini, a rezultat je obnavljanje ili poboljšanje funkcije T-ćelija (npr. proliferacija, proizvodnja citokina, uništavanje ciljanih ćelija). U smislu ovog dokumenta, antagonist koji vezuje PD-1 osovinu uključuje antagonist koji vezuje PD-1, antagonist koji vezuje PD-L1 i antagonist koji vezuje PD-L2.

Termin „antagonisti koji vezuju PD-1” odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa jednim

2

partnerom ili više partnera za vezivanje, kao što su PD-L1, PD-L2. U nekim aspektima, antagonist koji vezuje PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 inhibira vezivanje PD-1 za PD-L1 i/ili PD-L2. Na primer, antagonisti koji vezuju PD-1 uključuju anti-PD-1 antitela, njihove fragmente koji vezuju antigen, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-1 sa PD-L1 i/ili PD-L2. U jednom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan putem ili preko proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-1 tako da se disfunkcionalna T-ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim aspektima,antagonist koji vezuje PD-1 je anti-PD-1 antitelo. U specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 je MDX− 1106, opisan u ovom dokumentu. U drugom specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 je Merck 3745, opisan u ovom dokumentu. U sledećem specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-1 je CT-011, opisan u ovom dokumentu.

Termin „antagonisti koji vezuju PD-L1” odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira, inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim partnerom ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što su PD-1, B7-1. U nekim aspektima, antagonist koji vezuje PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-L1 inhibira vezivanje PD-L1 za PD-1 i/ili B7-1. U nekim aspektima, antagonisti koji vezuju PD-L1 sadrže anti-PD-L1 antitela, njihove fragmente koji vezuju antigen, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L1 sa jednim partnerom ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je PD-1, B7− 1. U jednom aspektu, antagonist koji vezuje PD-L1 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan putem ili preko proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-L1 tako da se disfunkcionalna T-ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima,antagonist koji vezuje PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo. U specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je YW243.55.S70, opisano u ovom dokumentu. U drugom specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MDX− 1 105, opisano u ovom dokumentu. U još jednom specifičnom aspektu, anti-PD-L1 antitelo je MPDL3280A, opisano u ovom dokumentu.

Termin „antagonisti koji vezuju PD-L2” odnosi se na molekul koji smanjuje, blokira,

2

inhibira, ukida ili ometa transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim partnerom ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je PD-1. U nekim aspektima, antagonist koji vezuje PD-L2 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L2 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, antagonist koji vezuje PD-L2 inhibira vezivanje PD-L2 za PD-1. U nekim aspektima, antagonisti PD-L2 uključuju anti-PD-L2 antitela, njihove fragmente koji vezuju antigen, imunoadhezine, fuzione proteine, oligopeptide i druge molekule koji smanjuju, blokiraju, inhibiraju, ukidaju ili ometaju transdukciju signala koji nastaje usled interakcije PD-L2 sa jednim partnerom ili više njegovih partnera za vezivanje, kao što je PD-1. U jednom aspektu, antagonist koji vezuje PD-L2 smanjuje negativni kostimulativni signal posredovan putem ili preko proteina na ćelijskoj površini eksprimiranih na T-limfocitima koji posreduju u signalizaciji putem PD-L2 tako da se disfunkcionalna T-ćelija učini manje disfunkcionalnom (npr. poboljšanje efektorskih odgovora na prepoznavanje antigena). U nekim otelotvorenjima,antagonist koji vezuje PD-L2 je imunoadhezin.

Termin "fagocitoza" označava internalizaciju ćelija ili čestica u ćelijama. U nekim otelotvorenjima, fagocitne ćelije ili fagociti su makrofagi ili neutrofili. U nekim aspektima, ćelije su ćelije koje eksprimiraju humani OX40. Postupci testiranja fagocitoze su poznate u struci i uključuju upotrebu mikroskopije za otkrivanje prisutnosti ćelija internalizovanih u drugim ćelijama. U drugim aspektima, fagocitoza se otkriva pomoću FACS, npr., otkrivanjem prisustva primetno označene ćelije u drugoj ćeliji (koja može biti primetno označena, npr. drugačijom oznakom od prve ćelije).

Termin "ne poseduje značajnu aktivnost" ili "suštinski nema aktivnosti" u odnosu na antitelo, kao što se ovde koristi, znači da antitelo ne pokazuje aktivnost koja je iznad osnovnog nivoa (u nekim otelotvorenjima, to je iznad osnovnog nivoa koji je statistički značajan). Termin"mala ili nepostojeća aktivnost" u odnosu na antitelo, kako se ovde koristi, znači da antitelo ne pokazuje biološki značajnu količinu funkcije. Funkcija se može meriti ili detektovati u skladu sa bilo kojim testom ili tehnikom poznatom u struci, uključujući, npr. one koje su ovde opisane. U nekim aspektima, funkcija antitela je stimulacija proliferacije efektorskih T ćelija i/ili izlučivanja citokina.

Termin "biomarker" ili "marker", kako se ovde koristi, uopšteno se odnosi na molekul, uključujući gen, iRNK, protein, ugljenohidratnu strukturu ili glikolipid, čija se ekspresija u ili na tkivu ili ćeliji ili kada je izlučen može otkriti poznatim postupcima (ili ovde opisanim postupcima), i predviđa, ili se može koristiti za predviđanje (ili pomoći u predviđanju) odgovora ćelije, tkiva ili pacijenta na režime lečenja.

Pod "pacijentovim uzorkom" podrazumeva se skup ćelija ili tećnosti dobijenih od

2

pacijenta sa kancerom. Izvor uzorka tkiva ili ćelije može biti čvrsto tkivo poput onog iz svežeg, zamrznutog i/ili sačuvanog uzorka organa ili tkiva ili biopsije ili aspirata, krv ili bilo koji sastojak krvi, telesne tečnosti kao što su cerebrospinalna tečnost, amnionska tečnost, peritonealna tečnost ili intersticijalna tečnost, ćelije iz bilo kog trenutka gestacije ili razvoja subjekta. Uzorak tkiva može da sadrži jedinjenja koja nisu prirodno mešana sa tkivom u prirodi, kao što su konzervansi, antikoagulansi, puferi, fiksatori, nutrijenti, antibiotici ili slično. Primeri uzoraka tumora ovde obuhvataju, ali nisu ograničeni na, biopsiju tumora, aspirat prikupljen tankom iglom, bronhiolarni ispirak, pleuralnu tečnost, sputum, urin, hirurški uzorak, cirkulišuće tumorske ćelije, serum, plazmu, cirkulišuće proteine plazme, ascitnu tečnost, primarne ćelijske kulture ili ćelijske linije izvedene iz tumora ili koje pokazuju svojstva nalik tumoru, kao i sačuvani uzorci tumora, kao što su uzorci tumora fiksirani u formalinu, ubačeni u parafin, ili zamrznuti uzorci tumora.

Termin "zasnovan na ekspresiji" kada se ovde koristi, znači da su podaci o nivou ekspresije ili prisustvu ili odsustvu ekspresije (npr. prisustvo ili odsustvo ili prevalencija (npr. procenat ćelija koje prikazuju) jednog ili više ovde navedenih biomarkera (npr. prisustvo ili odsustvo ili količina ili prevalencija ćelija koje eksprimiraju FcR, ili npr. prisustvo ili odsustvo ili količina ili prevalencija humanih efektorskih ćelija) koristi se za donošenje informisane odluke o lečenju, informacije date u uputstvu za upotrebu ili za marketinške/promotivne smernice itd.

Kancer ili biološki uzorak koji "ima humane efektorske ćelije" je onaj koji u dijagnostičkom testu sadrži humane efektorske ćelije prisutne u uzorku (npr. infiltrirajuće humane efektorske ćelije).

Kancer ili biološki uzorak koji "ima FcR eksprimirajuće ćelije" je onaj koji u dijagnostičkom testu ima FcR ekspresiju prisutnu u uzorku (npr. infiltrirajuće FcR eksprimirajuće ćelije). U nekim otelotvorenjima, FcR je FcγR. U nekim otelotvorenjima, FcR je aktivirajući FcγR.

Termin "preporučiti lečenje", kako se ovde koristi, odnosi se na korišćenje dobijenih informacija ili podataka koji se odnose na nivo ili prisustvo c-meta u uzorku pacijenta, kako bi se pacijent odredio kao prikladan za lečenje ili neprikladan za lečenje terapijom. U nekim aspektima, terapija može da sadrži c-met antitelo (npr. onartuzumab). U nekim aspektima, terapija može da sadrži antagonist VEGF (npr. bevacizumab). U nekim aspektima, terapija može da sadrži antihumano OX40 agonističko antitelo. Informacije ili podaci mogu biti u bilo kom obliku, pisani, usmeni ili elektronski. U nekim aspektima, upotreba dobijenih informacija ili podataka uključuje komuniciranje, predstavljanje, izveštavanje, skladištenje, slanje, prenos, snabdevanje, prenošenje, isporuku, izdavanje ili kombinacije gore navedenog. U nekim aspektima, komuniciranje, predstavljanje, izveštavanje, skladištenje, slanje, prenos, snabdevanje, prenošenje, isporuku, izdavanje ili kombinacije gore navedenog obavlja računarski uređaj, analizator ili njihova kombinacija. U nekim daljim aspektima, komuniciranje, predstavljanje, izveštavanje, skladištenje, slanje, prenos, snabdevanje, prenošenje, izdavanje ili kombinacije gore navedenog obavlja pojedinac (npr. laboratorijski ili zdravstveni stručnjak). U nekim aspektima, informacije ili podaci uključuju poređenje količine ili prevalencije FcR eksprimirajućih ćelija do referentnog nivoa. U nekim aspektima, informacije ili podaci uključuju poređenje količine ili prevalencije humanih efektorskih ćelija do referentnog nivoa. U nekim aspektima, informacije ili podaci uključuju indikaciju da su humane efektorske ćelije ili FcR eksprimirajuće ćelije prisutne ili odsutne u uzorku. U nekim aspektima, informacije ili podaci uključuju indikaciju da su FcR eksprimirajuće ćelije i/ili humane efektorske ćelije prisutne u određenom procentu ćelija (npr. velika prevalencija). U nekim aspektima, informacije ili podaci uključuju indikaciju da je pacijent pogodan za lečenje ili nepogodan za lečenje terapijom koja sadrži antihumano OX40 agonističko antitelo.

II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI

U jednom aspektu, otkriće se zasniva delimično na identifikovanju različitih OX40 vezujućih agenasa. U određenim aspektima, obezbeđena su antitela (npr. agonistička antitela) koja se vezuju za humani OX40. Antitela iz ovog otkrića su korisna, npr. za dijagnozu ili lečenje kancera i drugih poremećaja povezanih sa ekspresijom i/ili aktivnošću OX40.

A. Primeri za anti-OX40 antitela

U jednom aspektu, obezbeđena su izolovana antitela koja se vezuju za humani OX40. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo vezuje humani OX40 sa afinitetom koji je manji ili je oko 0,45 nM. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo vezuje humani OX40 sa afinitetom koji je manji ili je oko 0,4 nM. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo vezuje OX40 sa afinitetom koji je manji ili je oko 0,5 nM. U nekim aspektima, afinitet vezivanja se određuje radioimunotestom.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo vezuje OX40 čoveka i OX40 majmuna cinomolgusa. U nekim aspektima, vezivanje se određuje pomoću FACS testa. U nekim aspektima, vezivanje za OX40 čoveka ima EC50 od oko 0,2 µg/ml. U nekim aspektima, vezivanje za OX40 čoveka ima EC50 od oko 0,3 µg/ml ili niži. U nekim aspektima, vezivanje za OX40 majmuna cinomolgusa ima EC50 od oko 1,5 µg/ml. U nekim aspektima, vezivanje za OX40 majmuna cinomolgusa ima EC50 od oko 1,4 µg/ml.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo se ne vezuje za OX40

1

pacova ili OX40 miša.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo je iscrpljujuće antihumano OX40 antitelo (npr. iscrpljuje ćelije koje eksprimiraju humani OX40). U nekim aspektima, humane ćelije koje eksprimiraju OX40 su CD4+ efektorske T ćelije. U nekim aspektima, humane ćelije koje eksprimiraju OX40 su Treg ćelije. U nekim aspektima, do iscrpljivanja dolazi putem ADCC i/ili fagocitoze. U nekim aspektima, antitelo posreduje ADCC vezivanjem FcγR koji eksprimira humana efektorska ćelija i aktiviranjem funkcije humane efektorske ćelije. U nekim aspektima, antitelo posreduje u fagocitozi vezivanjem FcγR koji eksprimira humana efektorska ćelija i aktiviranjem funkcije humane efektorske ćelije. Primeri za ljudske efektorske ćelije uključuju, npr. makrofage, ćelije prirodne ubice (NK), monocite, neutrofile. U nekim otelotvorenjima, humana efektorska ćelija je makrofag. U nekim aspektima, humana efektorska ćelija je NK ćelija. U nekim aspektima, do iscrpljivanja ne dolazi apoptozom.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo ima funkcionalni Fc region. U nekim aspektima, efektorska funkcija funkcionalnog Fc regiona je ADCC. U nekim aspektima, efektorska funkcija funkcionalnog Fc regiona je fagocitoza. U nekim aspektima, efektorska funkcija funkcionalnog Fc regiona je ADCC i fagocitoza. U nekim aspektima, Fc region je humani IgG1. U nekim aspektima, Fc region je humani IgG4.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo ne indukuje apoptozu u OX40 eksprimirajućim ćelijama (npr. Treg). U nekim aspektima, apoptoza se testira upotrebom koncentracije antitela od 30 µg/ml, npr. utvrđivanjem da li je došlo do apoptoze upotrebom aneksina V i Treg obojenih proprodijum jodidom.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo pojačava funkciju CD4+ efektorske T ćelije, na primer, putem povećavanja proliferacije CD4+ efektorske T ćelije i/ili povećavanjem proizvodnje gama interferona od strane CD4+ efektorske T ćelije (na primer, u poređenju sa proliferacijom i/ili proizvodnjom citokina pre lečenja antihumanim OX40 agonističkim antitelom). U nekim aspektima, citokin je gama interferon. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo povećava broj intratumorskih (infiltrirajućih) CD4+ efektorskih T ćelija (npr. ukupan broj CD4+ efektorskih T ćelija, ili npr. procenat CD4+ ćelija u CD45+ ćelijama), npr. u poređenju sa brojem intratumorskih (infiltrirajućih) CD4+ T ćelija pre lečenja antihumanim OX40 agonističkim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo povećava broj intratumorskih (infiltrirajućih) CD4+ efektorskih T ćelija koje eksprimiraju gama interferon (npr. ukupan broj CD4+ ćelija koje eksprimiraju gama interferon, ili npr. procenat CD4+ ćelija koje eksprimiraju gama interferon u ukupnim CD4+ ćelijama), npr. u poređenju sa brojem intratumorskih (infiltrirajućih) CD4+ T ćelija koje

2

eksprimiraju gama interferon pre lečenja sa antihumanim OX40 agonističkim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo povećava broj intratumorskih (infiltrirajućih) CD8+ efektorskih T ćelija (npr. ukupan broj CD8+ efektorskih T ćelija, ili npr. procenat CD8+ u CD45+ ćelijama), npr. u poređenju sa brojem intratumorskih (infiltrirajućih) CD8+ T efektorskih ćelija pre lečenja antihumanim OX40 agonističkim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo povećava broj intratumorskih (infiltrirajućih) CD8+ efektorskih T ćelija koje eksprimiraju gama interferon (npr. procenat CD8+ ćelija koje eksprimiraju gama interferon u ukupnim CD8+ ćelijama), npr. u poređenju sa brojem intratumorskih (infiltrirajućih) CD8+ T ćelija koje eksprimiraju gama interferon pre lečenja antihumanim OX40 agonističkim antitelom.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo pojačava funkciju memorijskih T ćelija, na primer povećavanjem proliferacije memorijskih T ćelija i/ili povećavanjem proizvodnje citokina od strane memorijske ćelije. U nekim aspektima, citokin je gama interferon.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo inhibira funkciju Treg, na primer, smanjivanjem Treg supresije funkcije efektorskih T ćelija (npr. proliferacije efektorskih T ćelija i/ili sekrecije citokina efektorskih T ćelija). U nekim aspektima, efektorska T ćelija je CD4+ efektorska T ćelija. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo smanjuje broj intratumorskih (infiltrirajućih) Treg (npr. ukupan broj Treg ili npr. procenat Fox3p+ ćelija u CD4+ ćelijama).

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo je projektovano da poveća efektorsku funkciju (npr. u poređenju sa efektorskom funkcijom u IgG1 divljeg tipa). U nekim aspektima, antitelo ima povećano vezivanje za Fcγ receptor. U nekim aspektima, antitelo nema fukozu vezanu (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. U nekim aspektima, Fc region sadrži bisektovane oligosaharide, npr. one kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektovan pomoću GlcNAc. U nekim aspektima, antitelo sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo povećava transdukciju signala OX40 u ciljnoj ćeliji koja eksprimira OX40. U nekim aspektima, transdukcija signala OX40 detektuje se nadziranjem nishodne signalizacije NFkB.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo je stabilno nakon tretiranja na 40C tokom dve nedelje.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo vezuje humane efektorske ćelije, npr. vezuje FcγR (npr. aktivirajući FcγR) eksprimiran humanim efektorskim ćelijama. U nekim aspektima, humana efektorska ćelija obavlja (sposobna je da obavlja) efektorsku funkciju ADCC. U nekim aspektima, humana efektorska ćelija obavlja (sposobna je da obavlja) efektorsku funkciju fagocitoze.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži IgG1 varijantu Fc polipeptida koji sadrži mutaciju koja eliminiše vezivanje za humane efektorske ćelije (npr. DANA mutacija) ima umanjenu aktivnost (npr. funkciju CD4+ efektorskih T ćelija, npr. proliferaciju), u odnosu na antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži nativnu sekvencu Fc dela IgG1. U nekim otelotvorenjima, antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži IgG1 varijantu Fc polipeptida koji sadrži mutaciju koja eliminiše vezivanje za humane efektorske ćelije (npr. DANA mutacija) nema značajnu aktivnost (npr. funkciju CD4+ efektorskih T ćelija, npr. proliferaciju).

U nekim aspektima, potrebno je umrežavanje antitela za funkciju antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima, funkcija je stimulacija proliferacije CD4+ efektorskih T ćelija. U nekim aspektima, umrežavanje antitela je utvrđeno tako što se obezbedi antihumano OX40 agonističko antitelo koje prianja na čvrstu površinu (npr. ploča sa ćelijskom kulturom). U nekim aspektima, umrežavanje antitela se utvrđuje uvođenjem mutacije u Fc deo IgG1 antitela (npr. DANA mutacija) i testiranjem funkcije mutantnog antitela.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo se sa OX40L takmiči za vezivanje humanog OX40. U nekim aspektima, dodavanje OX40L ne pojačava funkciju antihumanih OX40 antitela u in vitro testu.

Prema drugom otelotvorenju, antihumana OX40 agonistička antitela uključuju bilo koje, bilo koju kombinaciju, ili sva sledeća svojstva: (1) vezuje humani OX40 sa afinitetom koji je manji ili jednak oko 0,45 nM, u nekim aspektima, vezuje humani OX40 sa afinitetom koji je manji ili jednak oko 0,4 nM, u nekim aspektima, vezuje humani OX40 sa afinitetom koji je manji ili jednak oko 0,5 nM, u nekim aspektima, afinitet vezivanja se određuje radioimunotestom; (2) vezuje humani OX40 i OX40 majmuna cinomolgusa, u nekim aspektima, vezivanje se određuje pomoću FACS testa, (3) vezuje humani OX40 sa EC50 od oko 0,2 ug/ml, u nekim aspektima, vezuje humani OX40 sa EC50 od oko 0,3 ug/ml ili manje, u nekim aspektima, vezuje OX40 majmuna cinomolgusa sa EC50 od oko 1,5 ug/ml, u nekim aspektima, vezuje OX40 majmuna cinomolgusa sa EC50 od oko 1,4 ug/ml, (4) ne vezuje se značajno za OX40 pacova ili OX40 miša, (6) predstavlja iscrpljujuće antihumano OX40 antitelo (npr. iscrpljuje ćelije koje eksprimiraju humani OX40), u nekim aspektima, ćelije su

4

CD4+ efektorske T ćelije i/ili Treg ćelije, (7) pojačava funkciju CD4+ efektorskih T ćelija, na primer, povećavanjem proliferacije CD4+ efektorskih T ćelija i/ili povećavanjem proizvodnje gama interferona od strane CD4+ efektorskih T ćelija (na primer, u poređenju sa proliferacijom i/ili proizvodnjom citokina pre lečenja antihumanim OX40 agonističkim antitelom), (8) pojačava funkciju memorijske T ćelije, na primer povećavanjem proliferacije memorijske T ćelije i/ili povećavanjem proizvodnje citokina od strane memorijske ćelije, (9) inhibira funkciju Treg, na primer, smanjivanjem Treg supresije funkcije efektorskih T ćelija (npr. proliferacije efektorskih T ćelija/ili sekrecije citokina efektorskih T ćelija). U nekim aspektima, efektorska T ćelija je CD4+ efektorska T ćelija, (10) povećava transdukciju signala OX40 u ciljanoj ćeliji koja eksprimira OX40 (u nekim aspektima, transdukcija signala OX40 se utvrđuje praćenjem nishodne signalizacije NFkB), (11) stabilno je nakon tretiranja na 40C tokom dve nedelje, (12) vezuje humane efektorske ćelije, npr. vezuje FcγR eksprimiran humanim efektorskim ćelijama, (13) antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži IgG1 varijantu Fc polipeptida koji sadrži mutaciju koja eliminiše vezivanje za humane efektorske ćelije (npr. N297G) ima umanjenu aktivnost (npr. funkcija CD4+ efektorske T ćelije, npr. proliferacija), u odnosu na antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži nativnu sekvencu Fc dela IgG1, u nekim otelotvorenjima, antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži IgG1 varijantu Fc polipeptida koji sadrži mutaciju koja eliminiše vezivanje za humane efektorske ćelije (npr. N297G) nema značajnu aktivnost (npr. funkcija CD4+ efektorske T ćelije, npr. proliferacija), (14) umrežavanje antitela (npr. vezivanjem Fc receptora) je potrebno za funkciju antihumanog OX40 agonističkog antitela.

U jednom aspektu, otkriveno je antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7.

U jednom aspektu, obezbeđeno je antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4. U drugom otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, i HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3. U daljem aspektu, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4.

U drugom aspektu, obezbeđeno je antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve ili sve tri VL HVR sekvence izabrane od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7.

U drugom aspektu, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:4, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7.

U drugom aspektu, otkriveno je antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:7.

U jednom aspektu, otkriveno je antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26.

U drugom aspektu pronalaska, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26, i HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3.

U drugom aspektu, antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:4, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26.

U drugom aspektu, otkriveno je antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:26.

U jednom aspektu, otkriveno je antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27.

U drugom aspektu, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27. U daljem otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27, i HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3.

U drugom aspektu, ovde prikazano antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:4, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27.

U drugom aspektu, otkriveno je antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:27.

U jednom aspektu, otkriveno je antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, 8 ili 9; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, 10, 11, 12, 13 ili 14; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, 15, ili 19; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28.

U jednom aspektu, prikazano je antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, 8 ili 9; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, 10, 11, 12, 13 ili 14; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, 15, ili 19. U jednom aspektu, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, 15 ili 19. U drugom otelotvorenju, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, 15 ili 19 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28. U daljem aspektu, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, 15 ili 19, HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ili 28, i HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, 10, 11, 12, 13 ili 14. U daljem aspektu, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, 8 ili 9, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, 10, 11, 12, 13 ili 14, i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, 15 ili 19.

U drugom aspektu, prikazano je antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28. U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28.

U drugom aspektu, antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, 8 ili 9; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, 10, 11, 12, 13 ili 14, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:4, 15 ili 19, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28.

U drugom aspektu, otkriveno je antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, 8 ili 9; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, 10, 11, 12, 13 ili 14; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4, 15 ili 19; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:7, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28.

U jednom aspektu, otkriveno je antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:172; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:173; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:174; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:175. U nekim aspektima, HVR-H2 nije (SEQ ID NO:193). U nekim aspektima, HVR-H3 nije (SEQ ID NO:194). U nekim aspektima, HVR-L3 nije (SEQ ID NO:195).

U jednom aspektu, prikazano je antitelo koje sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:172; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:173; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:174. U jednom aspektu, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:174. U drugom aspektu, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:174 i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:175. U daljem aspektu, antitelo sadrži HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:174, HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:175, i HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:173.

U daljem aspektu, antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:172; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:173; i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:174. U nekim aspektima, HVR-H2 nije

ID NO:194). U nekim aspektima, HVR-L3 nije

U drugom aspektu, prikazano je antitelo koje sadrži (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:175. U nekim aspektima, HVR-L3 nije

U drugom aspektu, antitelo kako je ovde prikazano sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:172; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:173, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:174, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:175.

U drugom aspektu, otkriveno je antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:172; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:173; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:174; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:175. U nekim aspektima, HVR-H2 nije

ID NO:194). U nekim aspektima, HVR-L3 nije (SEQ ID NO:195).

Sve moguće kombinacije prethodnih supstitucija su obuhvaćene sekvencama konsenzusa SEQ ID NO:172, 173, 174 i 175.

U svim gorepomenutim aspektima, anti-OX40 agonističko antitelo je humanizovano. U jednom aspektu, anti-OX40 antitelo sadrži HVR, kao i u bilo kom od prethodnih aspekata ili za bilo koji aspekt na SL. 11A-I, i dodatno uključuje humani akceptorski okvir, npr. okvir humanog imunoglobulina ili okvir humanog konsenzusa. U drugom aspektu, anti-OX40 antitelo sadrži HVR kao i u bilo kom od prethodnih aspekata, i dalje sadrži VH i/ili VL koji sadrže FR sekvencu prikazanu na SL. 11A-I.

U drugom aspektu, antihumano OX40 agonističko antitelo kako je ovde prikazano

4

sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 108, 114, 116, 183, ili 184. U nekim aspektima, VH sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, ubačeno i/ili izbačeno u SEQ ID NO:56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 108, 114, 116, 183, ili 184. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO:SEQ ID NO:56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 108, 114, 116, 183, ili 184, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom aspektu, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4.

U drugom aspektu, prikazano je antihumano OX40 agonističko antitelo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 109, 115 ili 117. U nekim aspektima, VL sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, ubačeno i/ili izbačeno u SEQ ID NO:57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 109, 115 ili 117. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO:57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 109, 115 ili 117, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom aspektu, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7.

U drugom aspektu, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:56. U nekim aspektima, VH sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:56. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO:56, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom otelotvorenju, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4.

U drugom aspektu, obezbeđeno je antihumano OX40 agonističko antitelo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:57. U nekim aspektima, VL sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:57. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO:57, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom aspektu, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7.

U drugom aspektu, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:180. U nekim aspektima, VH sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:180. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO:180, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom aspektu, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4.

U drugom aspektu, obezbeđeno je antihumano OX40 agonističko antitelo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:179. U nekim aspektima, VL sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:179. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO:179, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom otelotvorenju, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7.

U drugom aspektu, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:94. U nekim aspektima, VH sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:94. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO:94, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom aspektu, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, (b) HVR-

4

H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4.

U drugom aspektu, prikazano je antihumano OX40 agonističko antitelo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:95. U nekim aspektima, VL sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:95. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO:95, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom otelotvorenju, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26.

U drugom aspektu, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:96. U nekim aspektima, VH sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:96. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO:96, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom otelotvorenju, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4.

U drugom aspektu, prikazano je antihumano OX40 agonističko antitelo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:97. U nekim aspektima, VL sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:97. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO:97, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom aspektu, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:27.

U drugom aspektu, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148. U nekim aspektima, VH sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, ubačeno i/ili izbačeno u SEQ ID NO:118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO:SEQ ID NO:118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom otelotvorenju, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33.

U drugom aspektu, prikazano je antihumano OX40 agonističko antitelo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149. U nekim aspektima, VL sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu

4

sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, ukupno 1 do 10 aminokiselina je supstituisano, ubačeno i/ili izbačeno u SEQ ID NO:119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO:119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom aspektu, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42.

U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:56, odnosno SEQ ID NO:57, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:58, odnosno SEQ ID NO:59, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:60, odnosno SEQ ID NO:61, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:62, odnosno SEQ ID NO:63, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:64, odnosno SEQ ID NO:65, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:66, odnosno SEQ ID NO:67, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:68, odnosno SEQ ID NO:69, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:70, odnosno SEQ ID NO:71, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:72, odnosno SEQ ID NO:73, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:74, odnosno SEQ ID NO:75, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:76, odnosno SEQ ID NO:77, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:78, odnosno SEQ ID NO:79, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:80, odnosno SEQ ID NO:81, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:82, odnosno SEQ ID NO:83, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:84, odnosno SEQ ID NO:85, uključujući posttranslacione modifikacije

4

tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:86, odnosno SEQ ID NO:87, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:88, odnosno SEQ ID NO:89, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:90, odnosno SEQ ID NO:91, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:92, odnosno SEQ ID NO:93, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:94, odnosno SEQ ID NO:95, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:96, odnosno SEQ ID NO:97, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:98, odnosno SEQ ID NO:99, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:100, odnosno SEQ ID NO:101, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:108, odnosno SEQ ID NO:109, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:114, odnosno SEQ ID NO:115, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:116, odnosno SEQ ID NO:117, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:183, odnosno SEQ ID NO:65, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci. U jednom aspektu, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO:184, odnosno SEQ ID NO:69, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci.

U drugom aspektu, obezbeđeno je antihumano OX40 agonističko antitelo, pri čemu antitelo sadrži VH kao u bilo kom od prethodnih aspekata, i VL kao u bilo kom od prethodnih aspekata.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao antihumano OX40 antitelo iz ovog dokumenta. U nekim aspektima, antitelo je antihumano OX40 agonističko antitelo.

U daljem aspektu, anti-OX40 antitelo prema bilo kom od prethodnih aspekata je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednom aspektu, anti-OX40 antitelo je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo, ili F(ab’)2fragment. U drugom aspektu, antitelo je antitelo kompletne dužine, npr. netaknuto IgG1 antitelo ili druga klasa ili izotip antitela kao što je ovde definisano. U nekim aspektima, antitelo

4

je netaknuto IgG4 antitelo kompletne dužine.

U daljem aspektu, anti-OX40 antitelo prema bilo kom od prethodnih aspekata može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u Odeljcima 1-7 u nastavku:

1. Afinitet antitela

U nekim aspektima, ovde dato antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).

U jednom aspektu, Kd se određuje testom vezivanja radioaktivno označenog antigena (RIA). U jednom aspektu, RIA se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja Fab u rastvoru za antigen određen je uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog pomoću (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (pogledajte npr. Chen i sar., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Radi postavljanja uslova za test, MICROTITER<®>ploče sa većim brojem bunarčića (Thermo Scientific) preko noći su obložene rastvorom 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6), a zatim blokirane pomoću 2% (m/V) albumina goveđeg seruma u PBS-u, tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23°C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br. 269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena je pomešano sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, Presta i sar., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Željeni Fab se onda inkubira tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na ploču za hvatanje i inkubiraju se na sobnoj temperaturi (npr. jedan sat). Rastvor se zatim uklanja, a ploča se ispira osam puta pomoću 0,1% polisorbata 20 (TWEEN-20<®>) u PBS-u. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 μl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20™; Packard), pa se ploče mere na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja izabrane su za primenu u analizama kompetitivnog vezivanja.

Prema drugom aspektu, Kd se meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance BIACORE<®>. Na primer, analiza pomoću uređaja BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) obavljena je na 25°C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom aspektu, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-

4

etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen pomoću 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 μg/ml (~0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/min da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektovan je 1 M etanolamin da blokira neproreagovale grupe. Za kinetička merenja, dve serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) su injektovane u PBS-u sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25°C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) je izračunata kao odnos koff/kon. Vidi, npr. Chen i sar., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije prevazilazi 106 M-1 s-1 prema testu površinske plazmonske rezonance datom gore, tada brzina asocijacije može da se odredi korišćenjem tehnike fluorescentnog prigušivanja koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C iz 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, kako je izmereno u spektrometru, kao što je spektrofometar sa zaustavljanjem protoka (Aviv Instruments) ili SLM-Aminco™ spektrofotometar serije 8000 (ThermoSpectronic) koji ima kivetu sa mešanjem.

2. Fragmenti antitela

U određenim aspektima, antitelo iz ovog dokumenta je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, bez ograničenja, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, kao i druge fragmente opisane u nastavku. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson i sar. Nat. Med.9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite, npr. u: Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg i Moore izd., (Springer-Verlag, New York), str.269-315 (1994); pogledajte takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br.5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.

5,869,046.

Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti bivalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson i sar., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u radu Hudson i sar. Nat. Med.9:129-134 (2003).

Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela

4

ili njegov deo. U pojedinim aspektima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent br.6,248,516 B1).

Fragmenti antitela mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.

3. Himerna i humanizovana antitela

U pojedinim aspektima, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela opisuje, npr. U.S. Patent br. 4,816,567; kao i Morrison i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo „sa zamenjenom klasom”, kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.

U određenim aspektima, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim aspektima, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.

Pregled humanizovanih antitela i postupaka za njihovu pripremu daju, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008), a dalje ih opisuju, npr. Riechmann i sar. Nature 332:323-329 (1988); Queen i sar. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US Patent br. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri i sar., Methods 36:25-34 (2005) (opisuju graftovanje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, Mol. Immunol.

28:489-498 (1991) (opisuje “preuređivanje površine”); Dall’Acqua i sar. Methods 36:43-60 (2005) (opisuje “mešanje FR”); i Osbourn i sar. Methods 36:61-68 (2005) i Klimka i sar. Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (opisuje pristup “vođene selekcije” kod mešanja FR).

Regioni humanog okvira koji se mogu upotrebiti za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: regione okvira izabrane pomoću postupka "najboljeg slaganja" (vidite, npr. Sims i sar. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regione okvira dobijene iz sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (vidite, npr. Carter i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta i sar. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) regione okvira ili humane germinativne regione okvira (vidite, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008)); i regione okvira dobijene skriningom biblioteka FR (vidite, npr. Baca i sar. J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) i Rosok i sar. J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).

4. Humana antitela

U određenim aspektima, antitelo je humano antitelo. Humana antitela mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su uopšteno opisali van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) i Lonberg, Curr. Opin. Immunol.

20:450-459 (2008).

Humana antitela se mogu dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su generalno inaktivirani. Pogledajte pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u: Lonberg, Nat. Biotech.23:1117-1125 (2005). Pogledajte takođe, npr. U.S. Patent br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju tehnologiju XENOMOUSE™; U.S. Patent br.5,770,429 koji opisuje tehnologiju HUMAB®; U.S. Patent br. 7,041,870 koji opisuje tehnologiju K-M MOUSE®, i Publikaciju U.S. Patentne prijave br. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju VELOCIMOUSE®). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koja stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.

Humana antitela mogu se takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Vidite, npr., Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur i sar., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela i njihova primena), str.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boemer i sar., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humane B-ćelije takođe su opisali Li i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni,

1

Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje humano-humane hibridome). Tehnologiju humanih hibridoma (Trioma tehnologija) su takođe opisali Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.

5. Antitela dobijena iz biblioteke

Antitela iz predmetnog pronalaska mogu da se izoluju pretraživanjem kombinatornih biblioteka u potrazi za antitelima sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, veliki broj postupaka je poznat u struci za stvaranje biblioteka displeja faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih postupaka dali su, npr. Hoogenboom i sar. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien i sar., izd., Human Press, Totowa, NJ, 2001) a dalje su ih opisali, npr., McCafferty i sar., Nature 348:552-554; Clackson i sar., Nature 352: 624-628 (1991); Marks i sar., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks i Bradbury, u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, izd., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu i sar., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee i sar., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee i sar., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

Kod pojedinih postupaka displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR), i nasumično rekombinovani u biblioteke faga, koje zatim mogu da se pretražuju za antigen-vezujuće fage, kao što opisuju Winter i sar. Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao Fv (scFv) fragmenti s jednim lancem ili kao Fab fragmenti. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths i sar., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona, i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela uključuju, na primer: US Patent br. 5,750,373, i US Patent Publication br.

2

2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.

Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.

6. Multispecifična antitela

U pojedinim aspektima, antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim aspektima, jedna od specifičnosti vezivanja je za OX40, a druga je za bilo koji drugi antigen. U određenim aspektima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa OX40. Bispecifična antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimiraju OX40. Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.

Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac − laki lanac sa različitim specifičnostima (vidite Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker i sar., EMBO J. 10: 3655 (1991)), i “knob-in-hole” inženjerstvo (vidite, npr., U.S. Patent br.

5,731,168). Multi-specifična antitela mogu se takođe dobiti dizajniranjem pomoću efekata elektrostatičkog upravljanja, za dobijanje antitela Fc-heterodimernih molekula (WO 2009/089004A1); biokonjugacijom dva ili više antitela ili fragmenata (vidite, npr., US Patent br. 4,676,980, i Brennan i sar., Science, 229: 81 (1985)); primenom leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (vidite, npr., Kostelny i sar., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); primenom tehnologije "dijatela" za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela (vidite, npr., Hollinger i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i primenom jednolančanih Fv (sFv) dimera (vidite, npr. Gruber i sar., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela kao što opisuju, npr., Tutt i sar. J. Immunol.147: 60 (1991).

Dizajnirana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući "antitela hobotnice", ovde su takođe obuhvaćena (pogledajte, npr. US 2006/0025576A1).

Ovde antitelo ili fragment takođe uključuje "dvojno delujuće FAb" ili "DAF", koje sadrži mesto vezivanja antigena koji se vezuje za OX40, kao i za drugi, različit antigen (pogledajte, na primer US 2008/0069820).

7. Varijante antitela

U pojedinim aspektima, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanja, i/ili umetanja, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Svaka kombinacija izbacivanja, ubacivanja i supstitucije može se načiniti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen-vezujuće.

a) Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja

U pojedinim aspektima, prikazane su varijante antitela koja imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli A pod naslovom „poželjne supstitucije”. Konkretnije izmene su date u Tabeli A pod naslovom „primeri supstitucija” i, kako je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvodi ispitani na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.

TABELA A

4

Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog niza:

(1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) kisele: Asp, Glu;

(4) bazne: His, Lys, Arg;

(5) ostaci koji utiču na orijentaciju niza: Gly, Pro;

(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.

Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultujuće varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka je mutiran, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).

Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu se napraviti na "žarištima" HVR, tj. ostacima kodiranim kodonima, koji trpe mutaciju sa visokom učestalošću tokom procesa somatskog sazrevanja (vidite, npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)), i/ili ostacima koji ostvaruju kontakt sa antigenom, pri čemu se dobijene varijante VH ili VL ispituju na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka opisano je, npr., u Hoogenboom i sar. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien i sar. izd., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) U nekim aspektima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo koje od raznovrsnih postupaka (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze alaninom ili modelovanja. Posebno su često cilj CDR-H3 i CDR-L3.

U pojedinim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja mogu se desiti u jednom ili više HVR-ova, dokle god takve izmene znatno ne smanje sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje ne smanjuju znatno afinitet vezivanja mogu se načiniti u HVR-ima. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U pojedinim aspektima varijanti VH i VL sekvenci datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.

Korisni postupak za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu zove se „ciljana mutageneza sa alaninom”, a opisana je u radu Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamene neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Umesto toga, ili pored toga, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Mogu se pregledati varijante da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.

Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci uključuju fuzije amino- i/ili karboksi-kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ostataka ili više, kao i ubacivanja u sekvencu jednog ostatka aminokiselina, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante ubacivanja kod molekula antitela uključuju fuziju sa N− ili C− krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.

b) Varijante glikozilacije

U određenim aspektima, antitelo iz ovog dokumenta izmenjeno je da bi se povećao ili smanjio stepen do kog je antitelo glikozilovano. Adicija ili uklanjanje mesta glikozilacije antitela može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da jedno ili više mesta glikozilacije nastane ili se ukloni.

Kada antitelo sadrži Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je obično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Pogledajte, npr. Wright i sar. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharidi mogu da uključuju različite ugljovodonike, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u "osnovi" biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim aspektima, modifikacije oligosaharida u antitelu iz pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.

U jednom aspektu, date su varijante antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Na primer, količina fukoze u tom antitelu može biti od 1% do 80%, od 1% do 65%, od 5% do 65% ili od 20% do 40%. Količina fukoze se određuje izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn297 (npr. kompleksne, hibridne ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline ushodno ili nishodno od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Pogledajte, npr. US Patent Publication br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija vezanih za "defukozilovane" ili "sa manjkom fukoze" varijante antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki i sar. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki i sar. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Primeri za ćelijske linije sposobne za proizvodnju defukozilovanih antitela uključuju Lec 13 CHO ćelije sa manjkom fukozilacije proteina (Ripka i sar. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); US Pat Appl br. US 2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams i sar., naročito u Primeru 11), i nokaut ćelijske linije, kao što je gen alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (vidi, npr. Yamane-Ohnuki i sar. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. i sar. Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).

Varijante antitela su dalje prikazane sa bisektovanim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektovan pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u WO 2003/011878 (Jean-Mairet i sar.); US Patent br.6,602,684 (Umana i sar.); i US 2005/0123546 (Umana i sar.). Varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region takođe su obezbeđene. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO 1997/30087 (Patel i sar.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).

c) Varijante Fc regiona

U određenim aspektima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region antitela iz ovog dokumenta, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više aminokiselinskih položaja.

U određenim aspektima, pronalazak razmatra varijantu antitela koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, dok su pojedine efektorske funkcije (kao što su komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu se sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema FcγR vezivanje (stoga, verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fc(RIII, dok monociti eksprimiraju Fc(RI, Fc(RII i Fc(RIII. Sažeti prikaz ekspresije FcR na hematopoetskim ćelijama dat je u Tabeli 3 na strani 464 rada Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za procenu ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. Patent br. 5,500,362 (vidi, npr. Hellstrom, I. i sar. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I i sar. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (vidi Bruggemann, M. i sar. J. Exp. Med.166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu biti korišćeni neradioaktivni postupci analize (videti, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK).

Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes i sar. Proc. Nat’l Acad. Sci. SAD 95:652-656 (1998). C1q vezujući testovi mogu takođe da se izvedu kako bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i da, stoga, nema CDC aktivnost. Pogledajte, npr. C1q i C3c vezujući ELISA test u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se odredila aktivacija komplementa, može da se obavi CDC test (pogledajte, na primer, Gazzano-Santoro i sar. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. i sar. Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. i M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Vezivanje FcRn i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova, S.B. i sar. Int’l. Immunol.18(12): 1759-1769 (2006)).

Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br. 6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).

Opisane su pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,737,056; WO 2004/056312, i Shields i sar. J. Biol. Chem.

9(2): 6591-6604 (2001).)

U pojedinim aspektima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).

U nekim aspektima, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US Patent br.6,194,551, WO 99/51642, i Idusogie i sar. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG majke na fetus (Guyer i sar. J. Immunol.

117:587 (1976) i Kim i sar. J. Immunol. 24:249 (1994)), opisana su u US2005/0014934A1 (Hinton i sar.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom supstitucijom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ostatku ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br.7,371,826).

Pogledajte takođe Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. Patent br.

5,648,260; U.S. Patent br.5,624,821; i WO 94/29351 koji se tiču drugih primera za varijante Fc regiona.

d) Varijante antitela projektovane sa cisteinom

U pojedinim aspektima, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. "tioMAb", kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjeno ostacima cisteina. U naročitim aspektima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linkerlek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je u nastavku opisano. U pojedinim aspektima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antitela projektovana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u U.S. Patentu br.7,521,541.

e) Derivati antitela

U pojedinim aspektima, antitelo se može dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i dostupni su. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, hidrosolubilne polimere. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, kopolimere polipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.

U drugom aspektu, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom otelotvorenju, neproteinski ostatak je nanocevčica ugljenika (Kamet i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)).

Radijacija može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, bez ograničenja, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski funkcionalni ostatak na temperaturu na kojoj stradaju ćelije u blizini neproteinskog funkcionalnog ostatka antitela.

B. Rekombinantni postupci i smeše

Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i smeša, npr., kako je opisano u U.S. Patentu br. 4,816,567. U jednom otelotvorenju, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-OX40 antitelo iz ovog dokumenta. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. lake i/ili teške lance antitela). U daljem aspektu, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr. ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljem aspektu, obezbeđena je ćelija domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom aspektu, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr. Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-OX40 antitela, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).

Za rekombinantnu proizvodnju anti-OX40 antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr. kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje mogu selektivno da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).

Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakteriji, pogledajte, npr. U.S. Patente br.

5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523. (Vidite takođe Charlton, Methods in Molecular Biology, Tom 248 (B.K.C. Lo, izd. Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str. 245-254, koja opisuje ekspresiju fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste

1

bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.

Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do proizvodnje antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Videti Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), i Li i sar. Nat. Biotech.24:210-215 (2006).

Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela, isto tako, izvedene su od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Pogledajte, npr. US Patente br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju tehnologiju PLANTIBODIES™ za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).

Ćelije kičmenjaka se, isto tako, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere korisnih ćelijskih linija domaćina sisara predstavljaju CV1 linije iz bubrega majmuna transformisane pomoću SV40 (COS-7); humane embrionske linije iz bubrega (293 ili ćelije 293, kao što je opisano npr. u Graham i sar. J. Gen Virol. 36:59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), sertolijeve ćelije miša (TM4 ćelije kao što je opisano npr. u Mather, Biol. Reprod.

23:243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije burega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije, kao što je opisano u npr. Mather i sar. Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne linije ćelija domaćina sisara uključuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, poput Y0, NS0 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela,pogledajte, npr. Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Tom 248 (B.K.C. Lo, izd. Humana Press, Totowa, NJ), str.255-268 (2003).

C. Testovi

Anti-OX40 antitela iz ovog dokumenta mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim svojstvima i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.

1. Testovi vezivanja i drugi testovi

2

U jednom aspektu, antitelo iz ovog pronalaska se testira na svoju antigen vezujuću aktivnost, npr. poznatim postupcima kao što je ELISA, Western blot, itd. Vezivanje OX40 može se odrediti korišćenjem metoda poznatih u struci, i primeri metoda su prikazani ovde. U jednom otelotvorenju, vezivanje se meri pomoću radioimunotesta. Primer radioimunotesta je izložen u Primerima. OX40 antitelo je jodovano i pripremljene su konkurentske reakcione smeše koje sadrže fiksnu koncentraciju jodovanog antitela i opadajuće koncentracije serijski razblaženog, neobeleženog OZX40 antitela. Ćelije koje eksprimiraju OX40 (npr. BT474 ćelije stabilno transficirane humanim OX40) dodaju se u reakcionu smešu. Nakon inkubacije, ćelije su isprane da bi se odvojilo slobodno jodovano OX40 antitelo od OX40 antitela vezanog za ćelije. Nivo vezanog jodovanog OX40 antitela se određuje, npr. brojanjem radioaktivnosti povezane sa ćelijama i afinitetom vezivanja određenim standardnim postupcima. U drugom aspektu, sposobnost OX40 antitela da se vezuje za površinski eksprimirani OX40 (npr. na podskupove T ćelija) procenjuje se protočnom citometrijom. Dobijaju se periferna bela krvna zrnca (npr. čoveka, majmuna cinomolgusa, pacova ili miša) i ćelije se blokiraju serumom. Označeno OX40 antitelo se dodaje u serijskim razblaženjima, a T ćelije su takođe obojene radi identifikovanja podskupova T ćelija (korišćenjem metoda poznatih u struci). Nakon inkubacije uzoraka i ispiranja, ćelije se razvrstavaju pomoću protočnog citometra, a podaci su analizirani korišćenjem metoda dobro poznatih u struci. U drugom aspektu, vezivanje OX40 može da se analizira pomoću površinske plazmonske rezonance. Primer metode površinske plazmonske rezonance je izložen u Primerima.

U drugom aspektu, mogu se koristiti kompetitivni testovi za identifikovanje antitela koje se takmiči sa bilo kojim od anti-OX40 antitela prikazanih ovde u pogledu vezivanja za OX40. U određenim aspektima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezuje bilo koje od ovde prikazanih anti-OX40 antitela. Detaljne primere postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo daje Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology tom 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Kompetitivni test je izložen u Primerima.

U primeru za kompetitivni test, imobilisani OX40 je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, koje se vezuje za OX40 (npr. mab 1A7.gr.1, mab 3C8.gr5), i drugo neobeleženo antitelo, čija sposobnost da se takmiči sa prvim antitelom oko vezivanja za OX40 se ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani OX40 je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo, obeleženo antitelo, ali ne i drugo, neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije, u uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za OX40, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisano OX40. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani OX40 u ispitivanom uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za OX40. Pogledajte Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

2. Testovi za merenje aktivnosti

U jednom aspektu, dati su testovi za identifikaciju ovih anti-OX40 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može da obuhvata, npr. vezivanje OX40 (npr. vezivanje OX40 čoveka i/ili majmuna cinomolgusa), pojačavanje OX40-posredovane transdukcije signala (npr. pojačavanje NFkB-posredovane transkripcije), iscrpljivanje ćelija koje eksprimiraju humani OX40 (npr., T ćelije), iscrpljivanje ćelija koje eksprimiraju humani OX40 putem ADCC i/ili fagocitoze, poboljšavanje funkcije T efektorske ćelije (npr. CD4+ efektorska T ćelija), npr. povećavanjem proliferacije efektorske T ćelije i/ili pojačavanjem proizvodnje citokina (npr. gama interferona) od strane efektorskih T ćelija, poboljšavanje funkcije memorijske T ćelije (npr. CD4+ memorijske T ćelije), npr. povećavanjem proliferacije memorijske T ćelije i/ili povećavanjem proizvodnje citokina od strane memorijskih T ćelija (npr. gama interferona), inhibiranje funkcije regulatorne T ćelije (npr. smanjivanjem Treg supresije funkcije efektorske T ćelije (npr. funkcije CD4+ efektorske T ćelije), vezivanje humanih efektorskih ćelija. Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su obezbeđena.

U pojedinim aspektima, antitelo iz pronalaska je ispitano na takvu biološku aktivnost. Kostimulacija T ćelija može se testirati pomoću metoda poznatih u struci, a ovde su prikazani primeri metoda. Na primer, T ćelije (npr. memorijske ili efektorske T ćelije) mogu se dobiti iz perifernih belih krvnih zrnaca (npr. izolovanjem iz pune krvi čoveka pomoću gradijentnog centrifugiranja sa fikolom). Memorijske T ćelije (npr. CD4+ memorijske T ćelije) ili efektorske T ćelije (npr. CD4+ Teff ćelije) mogu se izolovati iz PBMC korišćenjem metoda poznatih u struci. Na primer, može se koristiti komplet kompanije Miltenyi za izolaciju CD4+ memorijske T ćelije ili komplet kompanije Miltenyi za izolaciju naivne CD4+ T ćelije. Izolovane T ćelije se uzgajaju u prisustvu ćelija koje prezentuju antigen (npr. ozračene L ćelije koje eksprimiraju CD32 i CD80) i aktiviraju se dodatkom anti-CD3 antitela u prisustvu ili odsustvu OX40 agonističkog antitela. Dejstvo agonističkog OX40 antitela na proliferaciju T ćelija može se meriti metodama dobro poznatim u struci. Na primer, može da se koristi komplet CellTiter Glo (Promega), a rezultati se očitavaju na čitaču Multilabel (Perkin Elmer). Dejstvo agonističkog OX40 antitela na funkciju T ćelija takođe može da se odredi analizom citokina

4

koje proizvodi T ćelija. U jednom otelotvorenju, proizvodnja interferona gama od strane CD4+ T ćelija se utvrđuje, npr. merenjem interferona gama u supernatantu ćelijske kulture. Metode za merenje interferona gama su dobro poznate u struci.

Funkcija Treg ćelija može se testirati pomoću metoda poznatih u struci, a ovde su prikazani primeri metoda. U jednom primeru, testira se sposobnost Treg da suzbija proliferaciju efektorskih T ćelija. T ćelije su izolovane iz pune ljudske krvi korišćenjem metoda poznatih u struci (npr. izolovanje memorijskih T ćelija ili naivnih T ćelija). Prečišćene CD4+ naivne T ćelije su označene (npr. pomoću CFSE), a prečišćene Treg ćelije su označene različitim reagensom. Ozračene ćelije koje prezentuju antigen (npr. L ćelije koje eksprimiraju CD32 i CD80) uzgajaju se zajedno sa označenim prečišćenim naivnim CD4+ T ćelijama i prečišćenim Treg. Kokulture se aktiviraju upotrebom anti-CD3 antitela i testiraju se u prisustvu ili odsustvu agonističkog OX40 antitela. Nakon odgovarajućeg vremena (npr. 6 dana zajedničkog uzgajanja), nivo proliferacije CD4+ naivnih T ćelija se prati razblaživanjem boje u smanjenom obojenju oznake (npr. redukovano obojenje oznake CFSE) pomoću FACS analize.

OX40 signalizacija se može testirati pomoću metoda poznatih u struci, a ovde su prikazani primeri metoda. U jednom aspektu, generisane su transgene ćelije koje eksprimiraju humani OX40 i reporter gen koji sadrži NFkB promoter fuzionisan sa reporter genom (npr. beta luciferaza). Dodavanje OX40 agonističkog antitela u ćelije dovodi do povećane transkripcije NFkB, što se otkriva upotrebom testa za reporter gen.

Fagocitoza se može testirati, npr. korišćenjem makrofaga izvedenih iz monocita ili U937 ćelija (ćelijska linija humanog histiocitnog limfoma sa morfologijom i karakteristikama zrelih makrofaga). Ćelije koje eksprimiraju OX40 se dodaju u makrofage izvedene od monocita ili U937 ćelija u prisustvu ili odsustvu anti-OX40 agonističkog antitela. Nakon uzgajanja ćelija tokom odgovarajućeg perioda, procenat fagocitoze se određuje ispitivanjem procenta ćelija koje su dvostruko obojene za markere 1) makrofaga ili U937 ćelije i 2) ćelije koja eksprimira OX40, i deljenjem toga sa ukupnim brojem ćelija koje pokazuju markere ćelije koja eksprimira OX40 (npr. GFP). Analiza se može obaviti protočnom citometrijom. U drugom aspektu, analiza se može obaviti i fluorescentnom mikroskopskom analizom.

ADCC se može testirati, npr. korišćenjem metoda dobro poznatih u struci. Primeri metoda su opisani u odeljku sa definicijama i primer testa je prikazan u Primerima. U nekim aspektima, nivo OX40 je okarakterisan na ćeliji koja eksprimira OX40 koja se koristi za testiranje u testu ADCC. Ćelija se može obojiti detektabilno označenim anti-OX40 antitelom (npr. PE označenim), zatim se nivo fluorescencije određuje protočnom citometrijom, a rezultati se predstavljaju kao medijana intenziteta fluorescencije (MFI). U drugom aspektu, ADCC može da se analizira kompletom za ispitivanje CellTiter Glo, a ćelijska vijabilnost/citotoksičnost se može odrediti hemioluminescencijom.

Afiniteti vezivanja različitih antitela za FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB i dva alotipa FcγRIIIA (F158 i V158) mogu se meriti u testovima vezivanja liganda na bazi ELISA primenom odgovarajućih rekombinantnih Fcγ receptora. Prečišćeni humani Fcγ receptori su eksprimirani kao fuzioni proteini koji sadrže ekstracelularni domen γ lanca receptora povezan sa Gly/6xHis/glutation-S-transferazom (GST) polipeptidnom oznakom na C-terminusu. Afiniteti vezivanja antitela za te humane Fcγ receptore određuju se na sledeći način. Za receptore malog afiniteta, tj. FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B) i dva alotipa FcγRIIIA (CD16), F-158 i V-158, antitela se mogu testirati kao multimeri umrežavanjem sa F(ab')2 fragmentom kozjeg antihumanog kapa lanca (ICN Biomedical; Irvine, CA) u približnom molarnom odnosu 1:3 antitelo:F(ab')2za umrežavanje. Ploče su prevučene anti-GST antitelom (Genentech) i blokirane albuminom goveđeg seruma (BSA). Nakon ispiranja fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) koji sadrži 0,05% Tween-20 sa ELx405™ pločom za ispiranje (Biotek Instruments; Winooski, VT), Fcγ receptori se dodaju na ploču kao 25 ng/bunarčiću i inkubiraju na sobnoj temperaturi 1 sat. Nakon što su ploče isprane, dodata su serijska razblaženja ispitivanih antitela kao multimerni kompleksi, i ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Nakon ispiranja ploče radi uklanjanja nevezanih antitela, antitela vezana za Fcγ receptor su detektovana peroksidazom rena (HRP) konjugovanom sa F(ab')2fragmentom kozjeg antihumanog F(ab')2(Jackson Immuno Research Laboratories; West Grove, PA) nakon čega je dodat supstrat, tetrametilbenzidin (TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories; Gaithersburg, MD). Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi 5-20 minuta, u zavisnosti od testiranih Fcγ receptora, kako bi se omogućio razvoj boje. Reakcija je prekinuta sa 1 M H3PO4i apsorbanca na 450 nm je merena čitačem mikroploča (SpectraMax<®>190, Molecular Devices; Sunnyvale, CA). Krive vezivanja doza-odgovor nastaju predstavljanjem srednjih vrednosti apsorbance duplih uzoraka razblaženja antitela u odnosu na koncentracije antitela. Vrednosti za efikasnu koncentraciju antitela pri kojoj je otkriveno 50% maksimalnog odgovora na vezivanje za Fcγ receptor (EC50) utvrđene su nakon postavljanja krive vezivanja pomoću jednačine sa četiri parametra korišćenjem SoftMax Pro (Molecular Devices).

Da bi se odabrala antitela koja indukuju ćelijsku smrt, gubitak integriteta membrane kako je naznačeno, npr. potrošnjom propidijum jodida (PI), tripan plavog ili 7AAD, može se odrediti u odnosu na kontrolu. Test potrošnje PI može se izvesti u odsustvu komplementa i imunskih efektorskih ćelija. Ćelije koje eksprimiraju OX40 su inkubirane samo sa medijumom ili sa medijumom koji sadrži odgovarajuće monoklonsko antitelo sa npr. oko 10 μg/ml. Ćelije se inkubiraju tokom određenog vremena (npr. 1 ili 3 dana). Nakon svakog tretmana ćelije se ispiraju i uzima se alikvot. U nekim aspektima, ćelijski alikvot je stavljan u epruvete 12 mm x 75 mm od 35 mm sa poklopcem (1 ml po epruveti, 3 epruvete po grupi tretmana) za uklanjanje ćelijskih agregata. Epruvete zatim dobijaju PI (10 μg/ml). Uzorci se mogu analizirati pomoću protočnog citometra FACSCAN™ i CellQuest softvera FACSCONVERT™ (Becton Dickinson).

Ćelije za upotrebu u bilo kom od gore navedenih in vitro testova uključuju ćelije ili ćelijske linije koje prirodno eksprimiraju OX40 ili koje su konstruisane da eksprimiraju OX40. Takve ćelije uključuju aktivirane T ćelije, Treg ćelije i aktivirane memorijske T ćelije koje prirodno eksprimiraju OX40. Takve ćelije takođe uključuju i ćelijske linije koje eksprimiraju OX40 i ćelijske linije koje obično ne eksprimiraju OX40, ali su transficirane nukleinskom kiselinom koja kodira OX40. Ovde dati primeri ćelijskih linija za upotrebu u bilo kom od gore navedenih in vitro testova uključuju transgene BT474 ćelije (ćelijsku liniju humanog raka dojke) koje eksprimiraju ljudski OX40.

Podrazumeva se da bilo koji od gorenavedenih testova može biti izveden uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto anti-OX40 antitela ili kao njegovog dodatka.

Podrazumeva se da se bilo koji od gorenavedenih testova može izvesti korišćenjem anti-OX40 antitela i dodatnog terapeutskog agensa.

D. Imunokonjugati

Pronalazak takođe daje imunokonjugate, uključujući anti-OX40 antitelo ovde konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.

U jednom aspektu, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo konjugovano za jedan ili više lekova, uključujući, ali se ne ograničavajući na majtanzinoid (pogledajte U.S. patente br. 5.208.020, 5.416.064 i evropski patent EP 0 425 235 B1); auristatin, kao što su funkcionalni ostaci leka monometilauristatina DE i DF (MMAE i MMAF) (pogledajte U.S. patente br. 5.635.483 i 5.780.588 i 7.498.298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (pogledajte U.S. patente br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman i sar. Cancer Res.53:3336-3342 (1993); i Lode i sar. Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); antraciklin, kao što je daunomicin ili doksorubicin (pogledajte Kratz i sar. Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey i sar. Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov i sar.Bioconj. Chem. 16:717721 (2005); Nagy i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik i sar. Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King i sar. J. Med. Chem.45:4336-4343 (2002); i U.S. Patent br. 6,630,579); metotreksat; vindesin; taksan kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.

U drugom aspektu, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano za enzimski aktivan toksin ili njegov fragment, uključujući, ali se ne ograničavajući na A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, diantin proteine, proteine vinobojke (Phytolaca americana) (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje (momordica charantia), kursin, krotin, inhibitor iz sapunjače (sapaonaria officinalis), gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.

U drugom aspektu, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano za radioaktivni atom, dajući radiokonjugat. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili I123, ili obeležavanje spinova za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznata kao magnetna rezonanca, MR), kao što je jod-123, ponovo jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.

Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina može se dobiti na način opisan u radu Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) primer je helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida za antitelo. Pogledajte WO94/11026. Linker može biti „raskidivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može se koristiti kiselo labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari i sar. Cancer Res.52:127131 (1992); U.S. Patent br.5,208,020).

Imunokonjugati ADC-a koji su ovde izričito razmatrani, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za biokonjugaciju koji uključuju, ali nisu ograničeni na BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL.,SAD).

E. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje

U pojedinim aspektima, svako od anti-OX40 antitela koja su ovde data korisno je za detektovanje OX40 u biološkim uzorcima. Termin "detekcija" kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U pojedinim aspektima, biološki uzorak sadrži ćeliju ili tkivo, kao što je uzorak tumora (npr. tumor nemikrocelularnog karcinoma pluća ili dojke).

U jednom aspektu, dato je anti-OX40 antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U sledećem aspektu, obezbeđen je postupak za detekciju prisustva OX40 u biološkom uzorku. U pojedinim aspektima, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa anti-OX40 antitelom kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-OX40 antitela sa OX40, i detektovanje nastajanja kompleksa između anti-OX40 antitela i OX40. Takva metoda može biti in vitro ili in vivo metoda. U jednom aspektu, anti-OX40 antitelo je upotrebljeno da se izabere ispitanik podoban za terapiju anti-OX40 antitelom, npr. kada je OX40 biomarker za izbor pacijenata.

U nekim aspektima, anti-OX40 antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju je antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7. U nekim aspektima, anti-OX40 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:4, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7. U nekim aspektima, OX40 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:7. U nekim aspektima, antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:180. U nekim aspektima, VH sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:180. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO:180, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom aspektu, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4. U nekim aspektima, antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (VL) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:179. U nekim aspektima, VL sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:179. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO:179, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom aspektu, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7.

U nekim aspektim, anti-OX40 antitelo korišćeno u postupku za dijagnozu ili detekciju je antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42. U nekim aspektima, anti-OX40 antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:31, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42. U nekim aspektima, anti-OX40 antitelo sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:42. U nekim otelotvorenjima, anti-OX40 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja ima najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnost sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:182. U nekim aspektima, VH sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:182. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO:182, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom aspektu, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31. U nekim aspektima, anti-OX40 antitelo sadrži sekvencu varijabilnog domena lakog lanca (VL) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:181. U nekim aspektima, VL sekvenca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), ubacivanja ili

1

izbacivanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali antihumano OX40 agonističko anititelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za OX40. U nekim aspektima, supstutisano je, ubačeno i/ili izbačeno ukupno od 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO:181. U nekim aspektima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Opciono, antihumano OX40 agonističko antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO:181, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom otelotvorenju, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42.

U nekim aspektima, anti-OX40 antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:180. U nekim aspektima, anti-OX40 antitelo sadrži VL sekvencu SEQ ID NO:179. U nekim aspektima, anti-OX40 antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:180 i VL sekvencu SEQ ID NO:179. U nekim aspektima, anti-OX40 antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:182. U nekim aspektima, anti-OX40 antitelo sadrži VL sekvencu SEQ ID NO:181. U nekim aspektima, anti-OX40 antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:182 i VL sekvencu SEQ ID NO:181.

Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostikovati korišćenjem antitela iz ovog pronalaska uključuju kancer.

U pojedinim aspektima, data su obeležena anti-OX40 antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,

<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofagi, stabilni slobodni radikali, i slično.

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje dijagnostičke metode, npr. za identifikovanje pacijenta obolelog od raka koji će verovatno imati odgovor na lečenje antihumanim OX40 agonističkim antitelom.

U nekim aspektima, obezbeđene su metode za identifikovanje pacijenata za koje je

2

verovatno da će imati odgovor na lečenje antihumanim OX40 agonističkim antitelom, pri čemu metode uključuju (i) određivanje prisustva ili odsustva ili količine (npr. broja za datu veličinu uzorka) ćelija koje eksprimiraju FcR u uzorku kancera pacijenta i (ii) određivanje da je za pacijenta verovatno da će imati odgovor ako uzorak sadrži ćelije koje eksprimiraju FcR (npr. veliki broj ćelija koje eksprimiraju FcR). Metode za otkrivanje ćelija koje eksprimiraju FcR dobro su poznate u struci, uključujući, npr. IHC. U nekim aspektima, FcR je FcγR. U nekim aspektima, FcR je aktivirajući FcγR. U nekim aspektima, kancer je bilo koji ovde opisan kancer. U nekim aspektima, kancer je nemikrocelularni kancer pluća (NSCLC), glioblastom, neuroblastom, melanom, karcinom dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke), kancer želuca, kolorektalni kancer (CRC) ili hepatocelularni karcinom. U nekim aspektima, metoda je in vitro metoda. U nekim aspektima, metode dalje sadrže (iii) preporuku lečenja antihumanim OX40 agonističkim antitelom (npr. bilo kojim od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela). U nekim aspektima, metode dalje sadrže (iv) lečenje pacijenta antihumanim OX40 agonističkim antitelom.

U nekim aspektima, obezbeđene su metode za identifikovanje pacijenata za koje je verovatno da će imati odgovor na lečenje antihumanim OX40 agonističkim antitelom, pri čemu metode uključuju (i) određivanje prisustva ili odsustva ili količine (npr. broja za datu veličinu uzorka) humanih efektorskih ćelija (npr. infiltrirajućih efektorskih ćelija) u uzorku kancera pacijenta i (ii) određivanje da je za pacijenta verovatno da će imati odgovor ako uzorak sadrži efektorske ćelije (npr. veliki broj efektorskih ćelija). Metode za otkrivanje infiltrirajućih humanih efektorskih ćelija dobro su poznate u struci, uključujući, npr. IHC. U nekim aspektima, humane efektorske ćelije su jedna ili više ćelija NK, makrofaga, monocita. U nekim aspektima, efektorske ćelije eksprimiraju aktivirajući FcγR. U nekim aspektima, metoda je in vitro metoda. U nekim aspektima, kancer je bilo koji ovde opisan kancer. U nekim aspektima, kancer je nemikrocelularni kancer pluća (NSCLC), glioblastom, neuroblastom, melanom, karcinom dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke), kancer želuca, kolorektalni kancer (CRC) ili hepatocelularni karcinom. U nekim aspektima, metode dalje sadrže (iii) preporuku lečenja antihumanim OX40 agonističkim antitelom (npr. bilo kojim od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela). U nekim aspektima, metode dalje sadrže (iv) lečenje pacijenta antihumanim OX40 agonističkim antitelom.

Obezbeđene su metode postavljanja dijagnoze kancera koje uključuju: (i) merenje ćelija koje eksprimiraju FcR (npr. nivo ili prisustvo ili odsustvo ili prevalencija (npr. procenat ćelija koje eksprimiraju FcR, npr. putem IHC) FcR) u uzorku pacijenta; (ii) postavljanje dijagnoze za pacijenta da ima kancer koji sadrži FcR biomarker (npr. povišen FcR biomarker) kada uzorak ima ekspresiju FcR biomarkera. U nekim aspektima, metoda dalje uključuje (iii) odabir terapije koja sadrži (a) antihumano OX40 agonističko antitelo ili (b) preporuku terapije za pacijenta koja sadrži antihumano OX40 agonističko antitelo. U nekim aspektima, metoda je in vitro metoda.

Obezbeđene su metode postavljanja dijagnoze kancera koje uključuju: (i) merenje humanih efektorskih ćelija (npr. nivo ili prisustvo ili odsustvo ili prevalencija (npr. procenat humanih efektorskih ćelija) humanih efektorskih ćelija) u uzorku pacijenta; (ii) postavljanje dijagnoze za pacijenta da ima kancer koji sadrži humane efektorske ćelije (npr. povišene humane efektorske ćelije) kada uzorak ima biomarker humanih efektorskih ćelija. U nekim aspektima, metoda dalje uključuje (iii) odabir terapije koja sadrži (a) antihumano OX40 agonističko antitelo ili (b) preporuku terapije za pacijenta koja sadrži antihumano OX40 agonističko antitelo. U nekim aspektima, metoda je in vitro metoda.

Obezbeđene su metode za preporuku lečenja pacijentu obolelom od kancera koje uključuju: (i) merenje ćelija koje eksprimiraju FcR (npr. nivo ili prisustvo ili odsustvo ili prevalencija (npr. procenat ćelija koje eksprimiraju FcR) FcR) u uzorku pacijenta; (ii) preporučivanje lečenja antihumanim OX40 agonističkim antitelom kada uzorak ima ćelije koje eksprimiraju FcR (u nekim aspektima, ćelije sa velikom ekspresijom FcR). U nekim aspektima, metoda dalje uključuje (iii) odabir terapije koja sadrži antihumano OX40 agonističko antitelo za pacijenta. U nekim aspektima, metoda je in vitro metoda.

Obezbeđene su metode za preporuku lečenja pacijentu obolelom od kancera koje uključuju: (i) merenje humanih efektorskih ćelija (npr. nivo ili prisustvo ili odsustvo ili prevalencija (npr. procenat humanih efektorskih ćelija) humanih efektorskih ćelija) u uzorku pacijenta; (ii) preporučivanje lečenja antihumanim OX40 agonističkim antitelom kada uzorak ima humane efektorske ćelije (u nekim aspektima, povišene humane efektorske ćelije). U nekim aspektima, metoda dalje uključuje (iii) odabir terapije koja sadrži antihumano OX40 agonističko antitelo za pacijenta. U nekim aspektima, metoda je in vitro metoda.

U nekim aspektima bilo kog od ovde datih pronalazaka, uzorak se pribavlja pre lečenja antihumanim OX40 agonističkim antitelom. U nekim aspektima, uzorak se pribavlja pre lečenja lekom protiv kancera. U nekim aspektima, uzorak se pribavlja nakon što je kancer metastazirao. U nekim aspektima, uzorak je fiksiran formalinom i ubačen u parafin (FFPE). U nekim aspektima, uzorak je iz biopsije (npr. biopsija jezgra), hirurški uzorak (npr. uzorak iz hirurške resekcije) ili aspirat prikupljen tankom iglom.

F. Farmaceutske formulacije

Farmaceutske formulacije anti-OX40 antitela, prema opisu iz ovog dokumenta,

4

pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili više takvih opcionih nosača. (Remington's Pharmaceutical Sciences 16t. izdanje, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. komplekse Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača, iz ovog dokumenta, dalje uključuju sredstva za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedini primeri za sHASEGP i postupci primene, uključujući rHuPH20, opisani su u US Patent Publication br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.

U nekim aspektima, "histidinski pufer" je pufer koji sadrži jone histidina. Primeri za histidinske pufere uključuju histidin hlorid, histidin acetat, histidin fosfat, histidin sulfat. Utvrđeno je da je poželjni histidinski pufer, utvrđen u ovim primerima, histidin acetat. U poželjnom aspektu, pufer histidin acetat se priprema titracijom L-histidina (slobodna baza, čvrsta supstanca) sirćetnom kiselinom (tečnost). U nekim aspektima, histidinski pufer ili pufer histidin acetat ima pH od 5,0 do 6,0, u nekim aspektima, pH 5,3 do 5,8.

U nekim aspektima, "saharid" dat ovde uključuje opšti sastav (CH2O)n i njegove derivate, uključujući monosaharide, disaharide, trisaharide, polisaharide, šećerne alkohole, redukujuće šećere, neredukujuće šećere itd. Primeri za saharide ovde uključuju glukozu, saharozu, trehalozu, laktozu, fruktozu, maltozu, dekstran, glicerin, dekstran, eritritol, glicerol, arabitol, silitol, sorbitol, manitol, melibiozu, melezitozu, rafinozu, manotriozu, stahiozu, maltozu, laktulozu, maltulozu, glucitol, maltitol, laktitol, izo-maltulozu, itd. U nekim aspektima, saharid je neredukujući disaharid, poput trehaloze ili saharoze.

U nekim aspektima datim ovde, "surfaktant" se odnosi na površinski aktivno sredstvo, poželjno nejonski surfaktant. Primeri za surfaktante ovde uključuju polisorbat (na primer, polisorbat 20 i polisorbat 80); poloksamer (npr. poloksamer 188); Triton; natrijum dodecil sulfat (SDS); natrijum lauril sulfat; natrijum oktil glikozid; lauril−, miristil−, linoleil−, ili stearil-sulfobetain; lauril−, miristil−, linoleil- ili stearil-sarkozin; linoleil−, miristil−, ili cetilbetain; lauroamidopropil−, kokamidopropil−, linoleamidopropil−, miristamidopropil−, palmidopropil−, ili izostearamidopropil-betain (npr. lauroamidopropil); miristamidopropil−, palmidopropil−, ili izostearamidopropil-dimetilamin; natrijum metil kokoil−, ili dinatrijum metil oleil-taurat; i seriju MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, New Jersey); polietil glikol, polipropil glikol, i kopolimere etilen i propilen glikola (npr. Pluronics, PF68 itd.); etc. U nekim aspektima, surfaktant je polisorbat 20. U nekim aspektima, surfaktant je polisorbat 80.

Primeri liofilizovanih formulacija antitela opisani su u US Patentu br. 6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US Patentu br. 6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.

Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno dalje obezbediti dodatni lek (primeri za to su dati ovde). Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.

Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u radu Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980).

Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. filmovi ili mikrokapsule.

Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.

U nekim aspektima, ovde su date farmaceutske formulacije koje sadrže: (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela; (b) histidinski pufer sa pH 5,0-6,0. U nekim aspektima, ovde su date farmaceutske formulacije koje sadrže: (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela; (b) histidinski pufer sa pH 5,0-6,0; (c) saharid i (d) surfaktant.

U nekim aspektima bilo koje formulacije, antihumano OX40 agonističko antitelo je prisutno u koncentraciji između oko 10 mg/ml i oko 100 mg/ml (npr. oko 15 mg/ml, 18 mg/ml, 20 mg/ml, 60 mg/ml i 75 mg/ml). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo je prisutno u koncentraciji od oko 20 mg/ml. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo je prisutno u koncentraciji od oko 50 mg/ml. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo je prisutno u koncentraciji od oko 60 mg/ml. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo je prisutno u koncentraciji od oko 70 mg/ml.

U nekim aspektima bilo koje formulacije, saharid je prisutan u koncentraciji od oko 75 mM do oko 360 mM (npr. oko 100 mM, oko 120 mM, oko 240 mM, oko 320 mM do oko 360 mM). U nekim aspektima, saharid je prisutan u koncentraciji od oko 120 mM. U nekim aspektima, saharid je prisutan u koncentraciji od oko 240 mM. U nekim aspektima, saharid je prisutan u koncentraciji od oko 320 mM. U nekim aspektima, saharid je disaharid. U nekim aspektima, disaharid je trehaloza. U nekim aspektima, disaharid je saharoza.

U nekim aspektima bilo koje formulacije, histidinski pufer je u koncentraciji od oko 1 mM do oko 50 mM (npr. oko 1 mM do oko 25 mM). U nekim aspektima, histidinski pufer je u koncentraciji od oko 10 mM. U nekim aspektima, histidinski pufer je u koncentraciji od oko 20 mM. U nekim aspektima, histidinski pufer je u koncentraciji od oko 30 mM. U nekim aspektima, histidinski pufer je histidin acetat.

U nekim aspektima bilo koje formulacije, surfaktant je polisorbat (npr. polisorbat 20 ili polisorbat 40), poloksamer (npr. poloksamer 188); Triton; natrijum dodecil sulfat (SDS); natrijum lauril sulfat; ili natrijum oktil glikozid.

U nekim aspektima bilo koje formulacije, surfaktant je polisorbat. U nekim aspektima, polisorbat je prisutan u koncentraciji od oko 0,005% do oko 0,1%. U nekim aspektima, polisorbat je prisutan u koncentraciji od oko 0,005%. U nekim aspektima, polisorbat je prisutan u koncentraciji od oko 0,02%. U nekim aspektima, polisorbat je prisutan u koncentraciji od oko 0,04%. U nekim aspektima, polisorbat je prisutan u koncentraciji od oko 0,06%. U nekim aspektima, polisorbat je polisorbat 20. U nekim aspektima, polisorbat je polisorbat 80.

U nekim aspektima bilo koje formulacije, formulacija je razblažena razblaživačem(npr.

0,9% NaCl). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo je prisutno u koncentraciji od oko 1 mg/ml.

Naročito, ovde su date farmaceutske formulacije koje sadrže (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela, (b) polisorbat, pri čemu koncentracija polisorbata iznosi oko 0,005% do oko 0,1%; i (c) histidinski pufer (npr. histidinski pufer sa pH između 5,0 i 6,0).

U nekim aspektima, farmaceutska formulacija sadrži (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela (npr. u koncentraciji između oko 10 mg/ml i oko 100 mg/ml), (b) polisorbat, pri čemu je koncentracija polisorbata oko 0,02% do oko 0,06%, (c) histidinski pufer (npr. histidinski pufer sa pH između 5,0 i 6,0) i saharid, pri čemu je koncentracija saharida oko 120 mM do oko 320 mM. U nekim aspektima, saharid je saharoza.

U nekim aspektima, farmaceutska formulacija sadrži (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela u koncentraciji između oko 10 mg/ml i oko 100 mg/ml, (b) polisorbat, pri čemu je koncentracija polisorbata oko 0,02% do oko 0,06%, pri čemu je polisorbat polisorbat 20 ili polisorbat 40; (c) histidinski acetatni pufer sa pH između 5,0 do 6,0 i saharid (npr. saharozu), u koncentraciji oko 120 mM do oko 320 mM.

U nekim aspektima, farmaceutska formulacija sadrži (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela, (b) polisorbat 20, pri čemu je koncentracija polisorbata oko 0,02% do oko 0,06%, (c) histidinski acetatni pufer (npr. histidinski acetatni pufer sa pH 5,0 do 6,0) i (d) saharozu, pri čemu je koncentracija saharoze oko 120 mM do oko 320 mM.

U nekim aspektima, farmaceutska formulacija sadrži (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela, (b) polisorbat 40, pri čemu je koncentracija polisorbata oko 0,02% do oko 0,06%, (c) histidinski acetatni pufer (npr. histidinski acetatni pufer sa pH između 5,0 i 6,0) i saharozu, pri čemu je koncentracija saharoze oko 120 mM do oko 320 mM.

U nekim aspektima, farmaceutska formulacija sadrži (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela, (b) polisorbat 20, pri čemu je koncentracija polisorbata oko 0,02%, (c) histidinski acetatni pufer sa pH 6,0 i (d) saharozu, pri čemu je koncentracija saharoze oko 320 mM.

U nekim aspektima, farmaceutska formulacija sadrži (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela, (b) polisorbat 20, pri čemu je koncentracija polisorbata oko 0,02%, (c) histidinski acetatni pufer sa pH 5,5 i (d) saharozu, pri čemu je koncentracija saharoze oko 240 mM.

U nekim aspektima, farmaceutska formulacija sadrži (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela, (b) polisorbat 20, pri čemu je koncentracija polisorbata oko 0,04%, (c) histidinski acetatni pufer sa pH 6,0 i (d) saharozu, pri čemu je koncentracija saharoze oko 120 mM.

U nekim aspektima, farmaceutska formulacija sadrži (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela, (b) polisorbat 40, pri čemu je koncentracija polisorbata oko 0,04%, (c) histidinski acetatni pufer sa pH 5,0 i (d) saharozu, pri čemu je koncentracija saharoze oko 240 mM.

U nekim aspektima, farmaceutska formulacija sadrži (a) bilo koje od ovde opisanih antihumanih OX40 agonističkih antitela, (b) polisorbat 40, pri čemu je koncentracija polisorbata oko 0,04%, (c) histidinski acetatni pufer sa pH 6,0 i (d) saharozu, pri čemu je koncentracija saharoze oko 120 mM.

U nekim aspektima, farmaceutska formulacija je tečna farmaceutska formulacija. U nekim aspektima, farmaceutska formulacija je stabilna farmaceutska formulacija. U nekim aspektima, farmaceutska formulacija je stabilna tečna farmaceutska formulacija.

U nekim aspektima bilo koje od ovde opisanih farmaceutskih formulacija, antihumano OX40 agonističko antitelo iz farmaceutske formulacije je prisutno u koncentraciji između oko 10 mg/ml i oko 100 mg/ml. U nekim aspektima, koncentracija humanog OX40 agonističkog antitela je između oko 10 mg/ml do 50 mg/ml, 10 mg/ml do 75 mg/ml, 25 mg/ml do 75 mg/ml, 50 mg/ml do 100 mg/ml, 50 mg/ml do 75 mg/ml i/ili 75 mg/ml do 100 mg/ml. U nekim aspektima, koncentracija humanog OX40 agonističkog antitela je veća od oko 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml ili 100 mg/ml.

Farmaceutska formulacija poželjno sadrži polisorbat. Polisorbat je obično uključen u količinu koja smanjuje nastajanje agregata (poput onog do kojeg dolazi prilikom trešenja ili otpremanja). Primeri za polisorbate uključuju, ali nisu ograničeni na, polisorbat 20 (polioksietilen (20) sorbitan monolaurat), polisorbat 40 (polioksietilen (20) sorbitan monopalmitat), polisorbat 60 (polioksietilen (20) sorbitan monostearat) i/ili polisorbat 80 (polioksietilen (20) sorbitan monooleat). U nekim aspektima, polisorbat je polisorbat 20 (polioksietilen (20) sorbitan monolaurat). U nekim aspektima bilo koje od ovde opisanih farmaceutskih formulacija, koncentracija polisorbata je dovoljna da minimizuje agregaciju i/ili održi stabilnost nakon dugotrajnog skladištenja i/ili tokom primene (npr. nakon razblaživanja u kesi za intravensku infuziju). U nekim aspektima, koncentracija polisorbata je oko 0,005% m/V, oko 0,02% m/V, oko 0,04% m/V i manja od oko 0,1% m/V. U nekim aspektima, koncentracija polisorbata je veća od 0,01 m/V i manja od oko 0,1 m/V. U nekim aspektima, koncentracija polisorbata je oko 0,005% m/V, oko 0,02% m/V, 0,03% m/V, 0,04 m/V ili 0,05% m/V. U nekim aspektima, polisorbat je prisutan u koncentraciji od oko 0,04% m/V. U nekim aspektima, polisorbat je prisutan u koncentraciji od oko 0,02% m/V.

Farmaceutska formulacija poželjno sadrži saharid. Saharidi uključuju monosaharide, disaharide, trisaharide, polisaharide, šećerne alkohole, redukujuće šećere, neredukujuće šećere itd. Dalji primeri za saharide uključuju, ali nisu ograničeni na, glukozu, saharozu, trehalozu, laktozu, fruktozu, maltozu, dekstran, glicerin, dekstran, eritritol, glicerol, arabitol, silitol, sorbitol, manitol, melibiozu, melezitozu, rafinozu, manotriozu, stahiozu, maltozu, laktulozu, maltulozu, glucitol, maltitol, laktitol, izo-maltulozu, itd. U nekim aspektima, saharid je disaharid. U nekim aspektima, saharid je neredukujući disaharid. U nekim aspektima, saharid je trehaloza.

Saharid je uglavnom uključen u količini koja smanjuje nastajanje agregata. U nekim aspektima bilo koje od ovde opisanih farmaceutskih formulacija, saharid je prisutan u koncentraciji između oko 50 mM do 250 mM, 75 mM do 200 mM, 75 mM do 150 mM, 100 mM do 150 mM ili 110 mM do 130 mM ili 100mM do 320 mM ili 240 mM do 320 mM ili 240 mM do 400 mM. U nekim aspektima, saharid je prisutan u koncentraciji većoj od oko 50 mM, 75 mM, 100 mM, 110 mM ili 115 mM. U nekim aspektima, saharid je prisutan u koncentraciji od oko 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM ili 140 mM. U nekim aspektima, saharid je prisutan u koncentraciji od oko 120 mM. U nekim aspektima bilo koje formulacije, saharid je prisutan u koncentraciji od oko 75 mM do oko 360 mM (npr. oko 100 mM, oko 120 mM, oko 240 mM, oko 320 mM do oko 360 mM). U nekim aspektima, saharid je prisutan u koncentraciji od oko 240 mM. U nekim aspektima, saharid je prisutan u koncentraciji od oko 320 mM.

Farmaceutska formulacija poželjno sadrži histidinski pufer. Primeri za histidinski pufer uključuju, ali nisu ograničeni na, histidin hlorid, histidin sukcinat, histidin acetat, histidin fosfat, histidin sulfat. U nekim aspektima, histidinski pufer je histidin acetat. U nekim aspektima bilo koje od ovde opisanih farmaceutskih formulacija, koncentracija histidinskog pufera je između oko 1 mM do 50 mM, 1 mM do 35 mM, 1 mM do 25 mM, 1 mM do 20 mM, 7,5 mM do 12,5 mM, ili 5 mM do 15 mM, 20 mM do 30 mM, 25 mM do 35 mM. U nekim aspektima, koncentracija histidinskog pufera je oko 5 mM, 7,5 mM, 10 mM, 12,5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM ili 40 mM. U nekim aspektima, koncentracija histidinskog pufera je oko 10 mM. U nekim aspektima, koncentracija histidinskog pufera je oko 20 mM. U nekim aspektima, koncentracija histidinskog pufera je oko 30 mM. U nekim aspektima, koncentracija histidinskog pufera je oko 40 mM. U nekim aspektima bilo koje od ovde opisanih farmaceutskih formulacija, histidinski pufer ima pH između pH 5,0 i 6,0, na primer, oko pH 5,0, pH 5,1, pH 5,2, pH 5,3, pH 5,4, pH 5,5, pH 5,6, pH 5,7, pH 5,8, pH 5,9 ili pH 6,0. U nekim aspektima, pH je između pH 4,9 i pH 6,3.

Farmaceutska formulacija ovde takođe može da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.

Nadalje, ovde su obezbeđene bočice i postupci za punjenje bočice koja sadrži ovde opisanu farmaceutsku formulaciju. U nekim aspektima, farmaceutska formulacija je obezbeđena u bočici sa čepom koji se može probiti špricem, poželjno u vodenom obliku. Poželjno je da se bočica čuva na oko 2-8°C kao i do 30°C tokom 24 sata pre davanja ispitaniku kome je to potrebno. Bočica može na primer biti bočica od 15 cm3 (na primer, za dozu od 200 mg).

Farmaceutska formulacija za primenu je poželjno tečna formulacija (nije liofilizovana) i nije podvrgnuta prethodnoj liofilizaciji. Iako farmaceutska formulacija može biti liofilizovana, poželjno je da ne bude. U nekim aspektima bilo koje od farmaceutskih formulacija, farmaceutska formulacija, farmaceutska formulacija je liofilizovana farmaceutska formulacija. U nekim aspektima, farmaceutska formulacija je tečna formulacija. U nekim aspektima, farmaceutska formulacija ne sadrži tonifikujuću količinu soli poput natrijum hlorida. U nekim aspektima bilo koje od farmaceutskih formulacija, farmaceutska formulacija je razblažena.

G. Postupci lečenja i kompozicije

Svako od antihumanih OX40 antitela koja su ovde data može biti upotrebljeno u postupcima lečenja.

U jednom aspektu, dato je antihumano OX40 agonističko antitelo da se koristi kao lek. U daljim aspektima, dato je antihumano OX40 agonističko antitelo da se koristi u lečenju kancera. U pojedinim aspektima, dato je antihumano OX40 agonističko antitelo za upotrebu u postupku lečenja. U pojedinim aspektima, pronalazak daje antihumano OX40 agonističko antitelo za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima kancer, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine antihumanog agonističkog OX40 antitela. U jednom takvom aspektu, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je dole opisano.

U jednom aspektu, prikazano je antihumano OX40 agonističko antitelo za upotrebu u poboljšavanju imunske funkcije (npr. regulisanjem ćelijski posredovanih imunskih odgovora) pojedinca koji ima kancer, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine antihumanog agonističkog OX40 antitela. U jednom aspektu, prikazano je antihumano OX40 agonističko antitelo za upotrebu u poboljšavanju funkcije T ćelija pojedinca koji ima kancer, obuhvatajući

1

davanje pojedincu efikasne količine antihumanog agonističkog OX40 antitela. U jednom aspektu, prikazano je antihumano OX40 agonističko antitelo za upotrebu u iscrpljivanju humanih OX40-eksprimirajućih ćelija (npr. OX40-eksprimirajućih T ćelija, npr. OX40-eksprimirajuće Treg), obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine antihumanog agonističkog OX40 antitela. U nekim aspektima, do iscrpljivanja dolazi putem ADCC. U nekim aspektima, do iscrpljivanja dolazi putem fagocitoze. Prikazano je antihumano OX40 agonističko antitelo za lečenje pojedinca koji ima imunitet tumora.

U daljim aspektima, prikazano je antihumano OX40 agonističko antitelo za upotrebu u lečenju infekcije (npr. uzrokovane bakterijom ili virusom ili drugim patogenom). U pojedinim aspektima, prikazano je antihumano OX40 agonističko antitelo za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima infekciju, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine antihumanog agonističkog OX40 antitela. U nekim aspektima, infekcija je virusna i/ili bakterijska. U nekim aspektima, infekcija je izazvana patogenom.

U daljem aspektu, prikazana je upotreba anti-OX40 antitela u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom aspektu, lek je za lečenje kancera. U daljem aspektu, lek je za upotrebu u postupku za lečenje kancera, koja uključuje davanje efikasne količine leka pojedincu koji ima kancer. U jednom takvom aspektu, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je dole opisano.

U jednom aspektu, lek je za upotrebu u poboljšavanju imunske funkcije (npr. regulisanjem ćelijski posredovanih imunskih odgovora) pojedinca koji ima kancer, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine leka. U jednom aspektu, lek je za upotrebu u poboljšavanju funkcije T ćelija pojedinca koji ima kancer, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine leka. U nekim aspektima, disfunkcionalni poremećaj T ćelije je kancer. U jednom aspektu, lek je za upotrebu u iscrpljivanju humanih ćelija koje eksprimiraju OX40 (npr. ćelije koje eksprimiraju visoki OX40, npr. T ćelije koje eksprimiraju OX40), obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine leka. U nekim aspektima, do iscrpljivanja dolazi putem ADCC. U nekim aspektima, do iscrpljivanja dolazi putem fagocitoze. U jednom aspektu, lek je za lečenje pojedinca koji ima imunitet tumora.

U daljim aspektima, lek je za upotrebu u lečenju infekcije (npr. uzrokovane bakterijom ili virusom ili drugim patogenom). U određenom aspektu, lek je za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima infekciju, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine leka. U nekim aspektima, infekcija je virusna i/ili bakterijska. U nekim aspektima, infekcija je izazvana patogenom.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje kancera. U jednom

2

aspektu, postupak uključuje davanje pojedincu koji ima takav kancer efikasne količine anti-OX40 antitela. U jednom takvom aspektu, postupak dalje uključuje davanje pojedincu efikasne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, kao što je dole opisano. "Pojedinac" prema bilo kom od gornjih aspekata može biti čovek.

U jednom aspektu, prikazan je postupak za poboljšanje imunske funkcije (npr. povećanjem regulacije ćelijski posredovanih imunskih odgovora) pojedinca koji ima kancer, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine antihumanog agonističkog OX40 antitela. U jednom aspektu, prikazan je postupak za poboljšanje funkcije T ćelija pojedinca koji ima kancer, obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine antihumanog agonističkog OX40 antitela. U jednom aspektu, prikazan je postupak za iscrpljivanje humanih ćelija koje eksprimiraju OX40 (npr. ćelije koje eksprimiraju visok nivo OX40, npr. T ćelije koje eksprimiraju OX40), obuhvatajući davanje pojedincu efikasne količine antihumanog agonističkog OX40 antitela. U nekim aspektima, do iscrpljivanja dolazi putem ADCC. U nekim aspektima, do iscrpljivanja dolazi putem fagocitoze.

U nekim aspektima, primeri za kancer dalje uključuju, ali nisu ograničeni na, limfom B-ćelija (uključujući niskostepeni/folikularni ne-Hodžkinov limfom (NHL); mali limfocitni (SL) NHL; srednjestepeni/folikularni NHL; srednjestepeni difuzni NHL; visokostepeni imunoblastni NHL; visokostepeni limfoblastni NHL; visokostepeni NHL malih neotcepljenih ćelija; voluminoznu bolest NHL; limfom ćelija plašta; limfom povezan sa AIDS-om; i Valdenstromovu makroglobulinemiju); hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL); akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL); leukemiju vlasastih ćelija; hroničnu mijeloblastnu leukemiju; i posttransplantacioni limfoproliferativni poremećaj (PTLD), kao i abnormalnu vaskularnu proliferaciju povezanu sa fakomatozama, edem (poput onih povezanih sa tumorima mozga), poremećaje proliferacije B-ćelija i Meigsov sindrom. Specifičniji primeri uključuju, bez ograničenja, relapsni ili refraktorni NHL, NHL niskog stepena linije fronta, NHL stadijuma III/IV, NHL otporan na hemoterapiju, prekursor B-limfoblastne leukemije i/ili limfom, mali limfocitni limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju B ćelija i/ili prolimfocitnu leukemiju i/ili mali limfocitni limfom, prolimfocitni limfom B-ćelija, imunocitom i/ili limfoplazmacitski limfom, limfom B ćelija marginalne zone, limfom rubne zone slezine, ekstranodalni limfom marginalne zone - MALT, nodalni limfom marginalne zone, leukemiju vlasastih ćelija, plazmacitom i/ili mijelom ćelija plazme, niskostepeni/folikularni limfom, srednjestepeni/folikularni NHL, limfom ćelija plašta, limfom folikularnog centra (folikularni), difuzni NHL srednjeg stepena, difuzni limfom velikih B ćelija, agresivni NHL (uključujući agresivni frontalni NHL i agresivni relapsni NHL), NHL relapsni posle, ili refraktorni na autolognu transplantaciju matičnih ćelija, primarni medijastinalni limfom velikih B ćelija, limfom primarne efuzije, visokostepeni imunoblastni NHL, visokostepeni limfoblastni NHL, visokostepeni NHL malih nerascepljenih ćelija, voluminoznu bolest NHL, Burkitov limfom, prekursorsku (perifernu) veliku granularnu limfocitnu leukemiju, mycosis fungoides i/ili Sezarijev sindrom, kožne (kutane) limfome, anaplastični limfom velikih ćelija, angiocentrični limfom.

U nekim aspektima, primeri za kancer dalje uključuju, ali nisu ograničeni na, poremećaje proliferacije B-ćelija, koji nadalje uključuju, ali nisu ograničeni na, limfome (npr. ne-Hodžkinove limfome (NHL) B ćelija) i limfocitne leukemije. Takvi limfomi i limfocitne leukemije uključuju npr: a) folikularne limfome, b) limfome malih neotcepljenih ćelija/Burkitov limfom (uključujući endemski Burkitov limfom, sporadični Burkitov limfom i ne-Burkitov limfom), c) limfome marginalne zone (uključujući B-ćelijski limfom ekstranodalne marginalne zone (limfomi limfatičnog tkiva povezanog sa mukozom, MALT), B-ćelijski limfom nodalne marginalne zone i limfom slezinske marginalne zone), d) limfom ćelija plašta (MCL), e) limfom džinovskih ćelija (uključujući B-ćelijski difuzni limfom džinovskih ćelija (DLCL), difuzni limfom mešanih ćelija, imunoblastni limfom, primarni medijastinalni limfom B-ćelija, angiocentrični limfom-plućni limfom B-ćelija), f) leukemiju vlasastih ćelija, g) limfocitni limfom, Valdenstromovu makroglobulinemiju, h) akutnu limfocitnu leukemiju (ALL), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL)/limfom malih limfocita (SLL), B-ćelijsku prolimfocitnu leukemiju, i) neoplazme plazmatskih ćelija, mijelom plazma ćelija, multipli mijelom, plazmacitom,i/ili j) Hodžkinovu bolest.

U nekim aspektima bilo koje od metoda, kancer je poremećaj proliferacije B-ćelija. U nekim aspektima, poremećaj proliferacije B-ćelija može biti limfom, ne-Hodžkinov limfom (NHL), agresivni NHL, relapsni agresivni NHL, relapsni indolentni NHL, refraktorni NHL, refraktorni indolentni NHL, hronična limfocitna leukemija (CLL), mali limfocitni limfom, leukemija, leukemija vlasastih ćelija (HCL), akutna limfocitna leukemija (ALL) ili limfom ćelija plašta. U nekim aspektima, poremećaj proliferacije B-ćelija je NHL, kao što je indolentni NHL i/ili agresivni NHL. U nekim aspektima, poremećaj proliferacije B-ćelija je indolentni folikularni limfom ili difuzni veliki limfom B-ćelija.

U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske formulacije koje sadrže ovde data anti-OX40 antitela, npr. za upotrebu u bilo kom od gornjih terapeutskih postupaka. U jednom aspektu, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-OX40 antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom aspektu, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-OX40 antitela, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što

4

je dole opisano.

U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, antihumana OX40 agonistička antitela inhibiraju imunitet tumora inhibiranjem funkcije Treg (npr. inhibiranjem supresivne funkcije Treg), ubijanjem ćelija koje eksprimiraju OX40 (npr. ćelije koje eksprimiraju visoke nivoe OX40), povećavanjem funkcije efektorskih T ćelija i/ili povećavanjem funkcije memorijskih T ćelija. U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, antihumana OX40 agonistička antitela leče kancer inhibiranjem funkcije Treg (npr. inhibiranjem supresivne funkcije Treg), ubijanjem ćelija koje eksprimiraju OX40 (npr. ćelije koje eksprimiraju visoke nivoe OX40), povećavanjem funkcije efektorskih T ćelija i/ili povećavanjem funkcije memorijskih T ćelija. U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, antihumana OX40 agonistička antitela poboljšavaju imunsku funkciju inhibiranjem funkcije Treg (npr. inhibiranjem supresivne funkcije Treg), ubijanjem ćelija koje eksprimiraju OX40 (npr. ćelije koje eksprimiraju visoke nivoe OX40), povećavanjem funkcije efektorskih T ćelija i/ili povećavanjem funkcije memorijskih T ćelija. U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, antihumana OX40 agonistička antitela poboljšavaju funkciju T ćelija inhibiranjem funkcije Treg (npr. inhibiranjem supresivne funkcije Treg), ubijanjem ćelija koje eksprimiraju OX40 (npr. ćelije koje eksprimiraju visoke nivoe OX40), povećavanjem funkcije efektorskih T ćelija i/ili povećavanjem funkcije memorijskih T ćelija.

U nekim aspektima bilo koje od metoda, antihumano OX40 agonističko antitelo je iscrpljuće antihumano agonističko antitelo. U nekim aspektima, lečenje antihumanim OX40 agonističkim antitelom dovodi do iscrpljivanja ćelija (npr. iscrpljivanje ćelija koje eksprimiraju OX40, npr. iscrpljivanje ćelija koje eksprimiraju visoke nivoe OX40). U nekim aspektima, do iscrpljivanja dolazi putem ADCC. U nekim aspektima, do iscrpljivanja dolazi putem fagocitoze.

U nekim aspektima bilo koje od metoda, antihumano OX40 agonističko antitelo inhibira funkciju Treg, npr. inhibiranjem Treg supresije funkcije efektorskih i/ili memorijskih T ćelija (u nekim aspektima, proliferacija efektorskih i/ili memorijskih T ćelija i/ili sekrecija citokina), u odnosu na Treg funkciju pre davanja OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima bilo koje od metoda, antihumano OX40 agonističko antitelo povećava proliferaciju efektorskih T ćelija, u odnosu na proliferaciju efektorskih T ćelija pre davanja OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima bilo koje od metoda, antihumano OX40 agonističko antitelo povećava proliferaciju memorijskih T ćelija, u odnosu na proliferaciju memorijskih T ćelija pre davanja OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima bilo koje od metoda, antihumano OX40 agonističko antitelo povećava proizvodnju citokina efektorskih T ćelija (npr. proizvodnju gama interferona), u odnosu na proizvodnju citokina efektorskih T ćelija pre davanja OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima bilo koje od metoda, antihumano OX40 agonističko antitelo povećava proizvodnju citokina memorijskih T ćelija (npr. proizvodnju gama interferona), u odnosu na proizvodnju citokina memorijskih T ćelija pre davanja OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima bilo koje od metoda, antihumano OX40 agonističko antitelo povećava proliferaciju CD4+ efektorskih T ćelija i/ili proliferaciju CD8+ efektorskih T ćelija, u odnosu na proliferaciju CD4+ efektorskih T ćelija i/ili proliferaciju CD8+ efektorskih T ćelija pre davanja OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima bilo koje od metoda, antihumano OX40 agonističko antitelo povećava proliferaciju memorijskih T ćelija (npr. proliferaciju CD4+ memorijskih T ćelija), u odnosu na proliferaciju memorijskih T ćelija pre davanja OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima, CD4+ efektorske T ćelije kod pojedinca imaju povećanu proliferaciju, lučenje citokina i/ili citolitičku aktivnost u odnosu na proliferaciju, lučenje citokina i/ili citolitičku aktivnost pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela.

U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, broj CD4+ efektorskih T ćelija je povišen u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima, sekrecija citokina CD4+ efektorske T ćelije je povišena u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima bilo koje od metoda, CD8+ efektorske T ćelije kod pojedinca imaju povećanu proliferaciju, lučenje citokina i/ili citolitičku aktivnost u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima, broj CD8+ efektorskih T ćelija je povišen u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima, sekrecija citokina CD8+ efektorske T ćelije je povišena u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela.

U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, antihumano OX40 agonističko antitelo vezuje humane efektorske ćelije, npr. vezuje FcγR eksprimiran humanim efektorskim ćelijama. U nekim aspektima, humana efektorska ćelija obavlja efektorsku funkciju ADCC. U nekim aspektima, humana efektorska ćelija obavlja efektorsku funkciju fagocitoze.

U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži IgG1 varijantu Fc polipeptida koji sadrži mutaciju koja eliminiše vezivanje za humane efektorske ćelije (npr. DANA ili N297G mutacija) ima umanjenu aktivnost (npr. funkciju CD4+ efektorskih T ćelija, npr. proliferaciju), u odnosu na antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži nativnu sekvencu Fc dela IgG1. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo koje sadrži IgG1 varijantu Fc polipeptida koji sadrži mutaciju koja eliminiše vezivanje za humane efektorske ćelije (npr. DANA ili N297G mutacija) nema značajnu aktivnost (npr. funkciju CD4+ efektorskih T ćelija, npr. proliferaciju).

U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, potrebno je umrežavanje antitela za funkciju antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima, funkcija je stimulacija proliferacije CD4+ efektorskih T ćelija. U nekim aspektima, umrežavanje antitela je utvrđeno tako što se obezbedi antihumano OX40 agonističko antitelo koje prianja na čvrstu površinu (npr. ploča sa ćelijskom kulturom). U nekim aspektima, umrežavanje antitela se utvrđuje uvođenjem mutacije u Fc deo IgG1 antitela (npr. DANA ili N297S mutacija) i testiranjem funkcije mutantnog antitela.

U nekim aspektima bilo koje od metoda, memorijske T ćelije kod pojedinca imaju povećanu proliferaciju i/ili lučenje citokina u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima, broj memorijskih T ćelija je povišen u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima, sekrecija citokina memorijske T ćelije (nivo) je povišena u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima bilo koje od metoda, Treg kod pojedinca ima umanjenu inhibiciju funkcije efektorskih T ćelija (npr. proliferacije i/ili lučenja citokina) u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima, broj efektorskih T ćelija je povišen u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima, sekrecija citokina efektorske T ćelije (nivo) je povišena u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela.

U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, broj intratumorskih (infiltrirajućih) CD4+ efektorskih T ćelija (npr. ukupan broj CD4+ efektorskih T ćelija, ili npr. procenat CD4+ ćelija u CD45+ ćelijama) je povišen u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, broj intratumorskih (infiltrirajućih) CD4+ efektorskih T ćelija koje eksprimiraju gama interferon (npr. ukupan broj CD4+ ćelija koje eksprimiraju gama interferon, ili npr. procenat CD4+ ćelija koje eksprimiraju gama interferon u ukupnim CD4+ ćelijama) je povišen u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela.

U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, broj intratumorskih (infiltrirajućih) CD8+ efektorskih T ćelija (npr. ukupan broj CD8+ efektorskih T ćelija, ili npr. procenat CD8+ u CD45+ ćelijama) je povišen u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela. U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, broj intratumorskih (infiltrirajućih) CD8+ efektorskih T ćelija koje eksprimiraju gama interferon (npr. procenat CD8+ ćelija koje eksprimiraju gama interferon u ukupnim CD8+ ćelijama) je povišen u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela.

U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, broj intratumorskih (infiltrirajućih) Treg (npr. ukupan broj Treg, ili npr. procenat Fox3p+ ćelija u CD4+ ćelijama) je smanjen u odnosu na period pre davanja antihumanog OX40 agonističkog antitela.

U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, primena antihumanog OX40 agonističkog antitela je u kombinaciji sa primenom tumorskog antigena. U nekim aspektima, tumorski antigen sadrži protein. U nekim aspektima, tumorski antigen sadrži nukleinsku kiselinu. U nekim aspektima, tumorski antigen je ćelija tumora.

U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, kancer prikazuje humane efektorske ćelije (npr. infiltriran je humanim efektorskim ćelijama). Metode za otkrivanje humanih efektorskih ćelija dobro su poznate u struci, uključujući, npr. IHC. U nekim aspektima, kancer prikazuje visoke nivoe humanih efektorskih ćelija. U nekim aspektima, humane efektorske ćelije su jedna ili više ćelija NK, makrofaga, monocita. U nekim aspektima, kancer je bilo koji ovde opisan kancer. U nekim aspektima, kancer je nemikrocelularni kancer pluća (NSCLC), glioblastom, neuroblastom, melanom, karcinom dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke), kancer želuca, kolorektalni kancer (CRC) ili hepatocelularni karcinom.

U nekim aspektima bilo koje od metoda ovog pronalaska, kancer prikazuje ćelije koje eksprimiraju FcR (npr. infiltriran je ćelijama koje eksprimiraju FcR). Metode za otkrivanje FcR dobro su poznate u struci, uključujući, npr. IHC. U nekim aspektima, kancer prikazuje visoke nivoe ćelija koje eksprimiraju FcR. U nekim aspektima, FcR je FcγR. U nekim aspektima, FcR je aktivirajući FcγR. U nekim aspektima, kancer je nemikrocelularni kancer pluća (NSCLC), glioblastom, neuroblastom, melanom, karcinom dojke (npr. trostruko negativni kancer dojke), kancer želuca, kolorektalni kancer (CRC) ili hepatocelularni karcinom.

"Pojedinac" prema svakom od gornjih aspekata je poželjno čovek.

Antitela iz pronalaska se mogu koristiti ili sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, antitelo iz pronalaska može biti primenjeno uz barem jedan dodatni terapeutski agens.

Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela iz pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili agenasa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. U jednom otelotvorenju, primena anti-OX40 antitela i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge. Antitela iz pronalaska mogu se takođe upotrebiti u kombinaciji sa radijacionom terapijom.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa hemoterapijom ili hemoterapeutskim agensom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa radioterapijom ili radioterapeutskim agensom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ciljanom terapijom ili ciljanim terapeutskim agensom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa imunoterapijom ili imunoterapeutskim agensom, na primer monoklonskim antitelom.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom PARP (npr. olaparanib, rukaparib, niraparib, cediranib, BMN673, veliparib), trabektedinom, nab-paklitakselom (albuminom vezani paklitaksel, ABRAXANE), trebananibom, pazopanibom, cediranibom, palbociklibom, everolimusom, fluorpirimidinom (npr. FOLFOX, FOLFIRI), IFL-om, regorafenibom, reolizinom, alimtaom, zikadijom, sutentom, toriselom (temsirolimus), inlitom (aksitinib, Pfizer), afinitorom (everolimus, Novartis), neksavarom (sorafenib, Onyx / Bayer), votrientom, pazopanibom, aksitinibom, IMA-901, AGS-003, kabozantinibom, vinfluninom, inhibitorom Hsp90 (npr. apatorsin), Ad-GM-CSF (CT-0070), temazolomidom, IL-2, IFNa, vinblastinom, talomidom, dakarbazinom, ciklofosfamidom, lenalidomidom, azacitidinom, lenalidomidom, bortezomidom (VELCADE), amrubicinom, karfilzomibom, pralatreksatom i/ili enzastaurinom.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antagonistom koji vezuje PD-1 osovinu. Antagonist koji vezuje PD-1 osovinu uključuje, ali nije ograničen na, antagonist koji vezuje PD-1, antagonist koji vezuje PD-L1 i antagonist koji vezuje PD-L2. Alternativni nazivi za "PD-1" uključuju CD279 i SLEB2. Alternativni nazivi za "PD-L1" uključuju B7-H1, B7-4, CD274 i B7-H. Alternativni nazivi za "PD-L2" uključuju B7-DC, Btdc i CD273. U nekim aspektima, PD-1, PD-L1 i PD-L2 su humani PD-1, PD-L1 i PD-L2. U nekim aspektima, antagonist koji vezuje PD-1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-1 za njegove partnere za vezivanje liganda. U specifičnom aspektu, partneri PD-1 za vezivanje liganda su PD-L1 i/ili PD-L2. U drugom otelotvorenju, antagonist koji vezuje PD-L1 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L1 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, partneri PD-L1 za vezivanje su PD-1 i/ili B7− 1. U drugom otelotvorenju, antagonist koji vezuje PD-L2 je molekul koji inhibira vezivanje PD-L2 za njegove partnere za vezivanje. U specifičnom aspektu, partner PD-L2 za vezivanje je PD-1. Antagonist može biti antitelo, njegov fragment koji vezuje antigen, imunoadhezin, fuzioni protein ili oligopeptid. U nekim aspektima, antagonist koji vezuje PD-1 je anti-PD-1 antitelo (npr. humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo). U nekim aspektima, anti-PD-1 antitelo je odabrano iz grupe koja se sastoji od MDX-1106 (nivolumab, OPDIVO), Merck 3475 (MK-3475, pembrolizumab, KEYTRUDA) i CT-011 (pidilizumab). U nekim aspektima, antagonist koji vezuje PD-1 je imunoadhezin (npr. imunoadhezin koji sadrži ekstracelularni ili PD-1 vezujući deo PD-L1 ili PD-L2 fuzionisan sa konstantnim regionom (npr. Fc region imunoglobulinske sekvence). U nekim aspektima, antagonist koji vezuje PD-1 je AMP-224. U nekim aspektima, antagonist koji vezuje PD-L1 je anti-PD-L1 antitelo. U nekim aspektima, antagonist koji vezuje anti-PD-L1 je odabran iz grupe koja se sastoji od YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI4736 i MDX-1105. MDX-1105, poznat i kao BMS-936559, je anti-PD-L1 antitelo opisano u WO2007/005874. Antitelo YW243.55.S70 (sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca prikazane u SEQ ID NO:20, odnosno 21) je anti-PD-L1 opisan u WO 2010/077634 A1. MDX-1106, poznat i kao MDX-1106-04, ONO-4538, BMS-936558 ili nivolumab, je anti-PD-1 antitelo opisano u WO2006/121168. Merck 3475, poznat i kao MK-3475, SCH-900475 ili pembrolizumab, je anti-PD-1 antitelo opisano u WO2009/114335. CT-011, poznat i kao hBAT, hBAT-1 ili pidilizumab, je anti-PD-1 antitelo opisano u WO2009/101611. AMP-224, poznat i kao B7-DCIg, je PD-L2-Fc fuzioni rastvorljivi receptor opisan u WO2010/027827 i WO201 1/066342. U nekim aspektima, anti-PD-1 antitelo je MDX− 1106. Alternativni nazivi za "MDX-1106" uključuju MDX-1 106-04, ONO-4538, BMS-936558 ili nivolumab. U nekim aspektima, anti-PD-1 antitelo je nivolumab (CAS registarski broj: 946414-94-4).

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agonistom usmerenim protiv aktivirajućeg kostimulišućeg molekula. U nekim aspektima, aktivirajući kostimulišući molekul može uključivati CD40, CD226, CD28, GITR, CD137, CD27, HVEM ili CD127. U nekim aspektima, agonist usmeren protiv aktivirajućeg kostimulišućeg molekula je agonističko antitelo koje se vezuje za CD40, CD226, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM ili CD127. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antagonistom usmerenim protiv inhibitorskog kostimulišućeg molekula. U nekim aspektima, inhibitorski kostimulišući molekul može uključivati CTLA-4 (poznat i kao CD152), PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO, TIGIT, MICA/B ili arginazu. U nekim aspektima, antagonist usmeren protiv inhibitorskog kostimulišućeg molekula je antagonističko antitelo koje se vezuje za CTLA-4, PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3 (npr. fuzioni protein LAG-3-IgG (IMP321)), B7-H3, B7-H4, IDO, TIGIT, MICA/B ili arginazu.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antagonistom usmerenim protiv CTLA-4 (poznat i kao CD152), npr. blokirajuće antitelo. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ipilimumabom (poznat i kao MDX-010, MDX-101 ili Yervoy®). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa tremelimumabom (poznat i kao ticilimumab ili CP-675,206). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antagonistom usmerenim protiv B7-H3 (poznat i kao CD276), npr. blokirajućim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa MGA271. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antagonistom usmerenim protiv TGF beta, npr. metelimumabom (poznat i kao CAT-192), fresolimumabom (poznat i kao GC1008) ili LY2157299.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa lečenjem koje uključuje adoptivni transfer T ćelije (npr. citotoksične T ćelije ili CTL) koja eksprimira himerni receptor antigena (CAR). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa UCART19. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa WT128z. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa KTE-C19 (Kite). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa CTL019 (Novartis). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa lečenjem koje uključuje adoptivni transfer T ćelije koja sadrži dominantno negativan TGF beta receptor, npr. dominantno negativan TGL beta receptor tip II. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa lečenjem koje uključuje protokol HERCREEM (vidi, npr. ClinicalTrials.gov identifikator NCT00889954).

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antagonistom usmerenim protiv CD19. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa MOR00208. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antagonistom usmerenim protiv CD38. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa daratumumabom.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agonistom usmerenim protiv CD137 (poznat i kao TNFRSF9, 4-1BB ili ILA), npr. aktivirajućim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se

1

primeniti zajedno sa urelumabom (poznat i kao BMS-663513). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agonistom usmerenim protiv CD40, npr. aktivirajućim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa CP-870893. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agonistom usmerenim protiv OX40 (poznat i kao CD134), npr. aktivirajućim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa drugim anti-OX40 antitelom (npr. AgonOX). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agonistom usmerenim protiv CD27, npr. aktivirajućim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa CDX-1127. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antagonistom usmerenim protiv indolamin-2,3-dioksigenaze (IDO). U nekim aspektima, antagonist IDO je 1-metil-D-triptofan (poznat i kao 1-D-MT).

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agonistom usmerenim protiv CD137 (poznat i kao TNFRSF9, 4-1BB ili ILA), npr. aktivirajućim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa urelumabom (poznat i kao BMS-663513). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agonistom usmerenim protiv CD40, npr. aktivirajućim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa CP-870893 ili RO7009789. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agonistom usmerenim protiv OX40 (poznat i kao CD134), npr. aktivirajućim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agonistom usmerenim protiv CD27, npr. aktivirajućim antitelom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa CDX-1127 (poznat i kao varlilumab). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antagonistom usmerenim protiv indolamin-2,3-dioksigenaze (IDO). U nekim aspektima, antagonist IDO je 1-metil-D-triptofan (poznat i kao 1-D-MT). U nekim aspektima, antagonist IDO je antagonist IDO prikazan u WO2010/005958 (čiji je sadržaj ovde izričito uključen u zapise). U nekim aspektima, antagonist IDO je 4-({2-[(aminosulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-brom-4-fluorfenil)-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamid (npr. kao što je opisano u Primeru 23 WO2010/005958). U nekim aspektima, antagonist IDO je

2

U nekim aspektima, antagonist IDO je INCB24360. U nekim aspektima, antagonist IDO je indoksimod (D izomer 1-metil-triptofana). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa konjugatom antitelo-lek. U nekim aspektima, konjugat antitelo-lek sadrži mertansin ili monometil auristatin E (MMAE). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa konjugatom anti-NaPi2b antitelo-MMAE (poznat i kao DNIB0600A, RG7599 ili lifastuzumab vedotin). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa trastuzumab emtansinom (poznat i kao T-DM1, ado-trastuzumab emtansin, ili KADCYLA®, Genentech). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa konjugatom anti-MUC16 antitelo-MMAE, DMUC5754A. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa konjugatom anti-MUC16 antitelo-MMAE, DMUC4064A. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa konjugatom antitelo-lek koji cilja endotelinski receptor tip B (EDNBR), npr. antitelo usmereno protiv EDNBR konjugovanog sa MMAE. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa konjugatom antitelo-lek koji cilja kompleks limfocit antigen 6, lokusom E (Ly6E), npr. antitelo usmereno protiv Ly6E konjugovano sa MMAE (poznato i kao DLYE5953A). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa polatuzumab vedotinom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa konjugatom antitelo-lek koji cilja CD30. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ADCETRIS (poznat i kao brentuksimab vedotin). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa polatuzumab vedotinom.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom angiogeneze. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antitelom usmerenim protiv VEGF, npr. VEGF-A. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa bevacizumabom (poznat i kao AVASTIN®, Genentech). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antitelom usmerenim protiv angiopoetina 2 (poznat i kao Ang2). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa MEDI3617. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antitelom usmerenim protiv VEGFR2. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ramucirumabom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa fuzionim proteinom VEGF receptora. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa afliberceptom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ziv-afliberceptom (poznat i kao VEGF Trap ili Zaltrap®). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa bispecifičnim antitelom usmerenim protiv VEGF i Ang2. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa RG7221 (poznat i kao vanucizumab). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom angiogeneze i zajedno sa antagonistom koji vezuje PD-1 osovinu (npr. antagonist koji vezuje PD-1 kao što je anti-PD-1 antitelo, antagonist koji vezuje PD-L1 kao što je anti-PD-L1 antitelo i antagonist koji vezuje PD-L2 kao što je anti-PD-L2 antitelo). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa bevacizumabom i zajedno sa antagonistom koji vezuje PD-1 osovinu (npr. antagonist koji vezuje PD-1 kao što je anti-PD-1 antitelo, antagonist koji vezuje PD-L1 kao što je anti-PD-L1 antitelo i antagonist koji vezuje PD-L2 kao što je anti-PD-L2 antitelo). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa bevacizumabom i MDX-1106 (nivolumab, OPDIVO). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa bevacizumabom i Merck 3475 (MK-3475, pembrolizumab, KEYTRUDA). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa bevacizumabom i CT− 011 (pidilizumab). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa bevacizumabom i YW243.55.S70. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa bevacizumabom i MPDL3280A. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa bevacizumabom i MEDI4736. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa bevacizumabom i MDX-1105.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antineoplastičnim agensom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agensom koji cilja CSF-1R (poznat i kao M-CSFR ili CD115). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa anti-CSF-1R antitelom (poznato i kao IMC-CS4 ili LY3022855). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa anti-CSF-1R antitelom, RG7155 (poznato i kao RO5509554 ili emactuzumab). U nekim aspektima, antihumano OX40

4

agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa interferonom, na primer interferonom alfa ili interferonom gama. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa roferonom-A (poznat i kao rekombinantni interferon alfa-2a). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa GM-CSF (poznat i kao rekombinantni faktor stimulisanja kolonije humanih granulocita i makrofaga, rhu GM-CSF, sargramostim ili Leukine®). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa IL-2 (poznat i kao aldesleukin ili Proleukin®). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa IL-12. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa IL27. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa IL-15. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ALT-803. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antitelom koje cilja CD20. U nekim aspektima, antitelo koje cilja CD20 je obinutuzumab (poznat i kao GA101 ili Gazyva®) ili rituksimab. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antitelom koje cilja GITR. U nekim aspektima, antitelo koje cilja GITR je TRX518. U nekim aspektima, antitelo koje cilja GITR je MK04166 (Merck).

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom Brutonove tirozin kinaze (BTK). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ibrutinibom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom izocitrat dehidrogenaze 1 (IDH1) i/ili izocitrat dehidrogenaze 2 (IDH2). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa AG-120 (Agios).

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa obinutuzumabom i antagonistom koji vezuje PD-1 osovinu (npr. antagonist koji vezuje PD-1 kao što je anti-PD-1 antitelo, antagonist koji vezuje PD-L1 kao što je anti-PD-L1 antitelo i antagonist koji vezuje PD-L2 kao što je anti-PD-L2 antitelo).

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa vakcinom za kancer. U nekim aspektima, vakcina za kancer je peptidna vakcina za kancer, koja je u nekim aspektima personalizovana peptidna vakcina. U nekim aspektima, peptidna vakcina za kancer je vakcina sa multivalentnim dugačkim peptidom, multipeptidom, koktelom peptida, hibridnim peptidom ili peptidom pulsiranim dendritskim ćelijama (vidi, npr. Yamada i sar. Cancer Sci, 104:14-21, 2013). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa adjuvansom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa lečenjem koje sadrži TLR agonist, npr. Poly-ICLC (poznat i kao Hiltonol®), LPS, MPL ili CpG ODN. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa faktorom nekroze tumora (TNF) alfa. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa IL-1. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa HMGB1. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa IL-10 antagonistom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa IL-4 antagonistom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa IL-13 antagonistom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa IL-17 antagonistom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa HVEM antagonistom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ICOS agonistom, npr. primenom ICOS-L, ili agonističkog antitela usmerenog protiv ICOS. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa lečenjem koje cilja CX3CL1. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa lečenjem koje cilja CXCL9. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa lečenjem koje cilja CXCL10. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa lečenjem koje cilja CCL5. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa LFA-1 ili ICAM1 agonistom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agonistom selektina.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom B-Raf. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa vemurafenibom (poznat i kao Zelboraf®). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa dabrafenibom (poznat i kao Tafinlar®). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa enkorafenibom (LGX818).

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom EGFR. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa erlotinibom (poznat i kao Tarceva®). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom EGFR-T790M. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa gefitinibom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa afatinibom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa cetuksimabom (poznat i kao Erbitux®). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa panitumumabom (poznat i kao Vectibix®). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa rociletinibom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa AZD9291. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom MEK, kao što je MEK1 (poznat i kao MAP2K1) i/ili MEK2 (poznat i kao MAP2K2). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa kobimetinibom (poznat i kao GDC-0973 ili XL-518). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa trametinibom (poznat i kao Mekinist®). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa binimetinibom.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom B-Raf (npr. vemurafenibom ili dabrafenibom) i inhibitorom MEK (npr. MEK1 i/ili MEK2 (npr. kobimetinib ili trametinib). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom ERK (npr. ERK1/2). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa GDC-0994). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom B-Raf, inhibitorom MEK i inhibitorom ERK1/2. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom EGFR, inhibitorom MEK i inhibitorom ERK1/2. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa jednim ili više inhibitora puta MAP kinaze. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa CK127. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom K-Ras.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom c-Met. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa onartuzumabom (poznat i kao MetMAb). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom anaplastične limfom kinaze (ALK). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa AF802 (poznat i kao CH5424802 ili alektinib). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa krizotinibom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ceritinibom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa buparlisibom (BKM-120). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa piktilisibom (poznat i kao GDC-0941). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa buparlisibom (poznat i kao BKM-120). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa perifozinom (poznat i kao KRX-0401). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa deltaselektivnim inhibitorom fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa idelalisibom (poznat i kao GS-1101 ili CAL-101). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa taselisibom (poznat i kao GDC-0032). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa BYL-719. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom Akt. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa MK2206. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa GSK690693. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ipatasertibom (poznat i kao GDC-0068). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom mTOR. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa sirolimusom (poznat i kao rapamicin). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa temsirolimusom (poznat i kao CCI-779 ili Torisel®). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa everolimusom (poznat i kao RAD001). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ridaforolimusom (poznat i kao AP-23573, MK-8669 ili deforolimus). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa OSI-027. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa AZD8055. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa INK128. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa dvojnim inhibitorom PI3K/mTOR. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa XL765. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa GDC-0980. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa BEZ235 (poznat i kao NVP-BEZ235). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa BGT226. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa GSK2126458. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa PF-04691502. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa PF-05212384 (poznat i kao PKI-587).

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agensom koji selektivno razlaže estrogenski receptor. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa GDC-0927. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom HER3. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa duligotuzumabom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom LSD1. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom MDM2. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom BCL2. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa venetoklaksom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom CHK1. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa GDC-0575. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa inhibitorom aktiviranog signalnog puta Hedgehog (jež). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ERIVEDGE.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa radioterapijom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa gemcitabinom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa nab-paklitakselom (ABRAXANE). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa trastuzumabom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa TVEC. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa IL27. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa ciklofosfamidom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa agensom koji regrutuje T ćelije u tumor. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa lirilumabom (IPH2102/BMS-986015). U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa idelalisibom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antitelom koje cilja CD3 i CD20. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa REGN1979. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa antitelom koje cilja CD3 i CD19. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa blinatumomabom.

U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa onkolitičkim virusom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa karboplatinom i nab-paklitakselom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa karboplatinom i paklitakselom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa cisplatinom i pemetreksedom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa cisplatinom i gemcitabinom. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa FOLFOX-om. U nekim aspektima, antihumano OX40 agonističko antitelo može se primeniti zajedno sa FOLFIRI.

Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela iz pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. Antitela iz pronalaska mogu se takođe upotrebiti u kombinaciji sa radijacionom terapijom.

Antitelo kao što je ovde prikazano (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

Antitela kao što je ovde prikazano bi bila formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i ostale faktore poznate lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko

1

1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.

Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela kako je ovde prikazano (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitela, i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 40 mg/kg antitela može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza može biti u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Takve doze mogu se primenjivati u intervalima, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent dobije od oko dve do oko dvadeset, ili, npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.

Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto anti-OX40 antitela ili kao njegovog dodatka.

III. PROIZVODI I KOMPLETI

U drugom aspektu, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje goreopisanih poremećaja. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju, na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo iz pronalaska. Oznaka ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens.

1 1

Proizvod može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje specifičnog stanja. Umesto toga, ili pored toga, proizvod može dalje da sadrži drugu (ili treću) ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

U nekim aspektima, prikazan je komplet koji sadrži lek koji sadrži antihumano OX40 agonističko antitelo opisano u ovom tekstu i opcioni farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim aspektima, komplet dalje sadrži uputstvo za primenu leka za lečenje kancera.

Podrazumeva se da svaki od gorepomenutih proizvoda može da sadrži imunokonjugat iz pronalaska umesto ili pored anti-OX40 antitela.

Sekvence

1 2

1

14

1

1

1

1

1

11

11

11

11

11

11

11

12

12

PRIMERI MATERIJALI I POSTUPCI

Površinska plazmonska rezonanca: Kinetika vezivanja anti-OX40 antitela izmerena je korišćenjem površinske plazmonske rezonance (SPR) na instrumentu Biacore 3000 (GE Healthcare). Antihumani Fc (GE Healthcare) je imobilisan na CM5 senzorskom čipu pomoću kuplovanja na bazi amina koristeći protokol obezbeđen od strane proizvođača. Anti-OX40 antitelo je uhvaćeno na nivou od 300-400 rezonantnih jedinica (RU). Vezivanje antitela je izmereno za humani OX40 (Sino Biological Inc). Za eksperimente su korišćene dvostruke serije koncentracija huOX40 u rasponu od 18,75 do 300 nM ili 6,25 do 200 nM. Senzorgrami za vezivanje OX40 zabeleženi su primenom vremena injektovanja od 2 minuta sa protokom od 30 µl/min, na temperaturi od 25°C, i sa radnim puferom od 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, i 0,005% Tween 20. Nakon injektovanja, disocijacija liganda iz antitela je praćena tokom 600 sekundi u radnom puferu. Površina je regenerisana između ciklusa vezivanja injektovanjem 40 µl 3 M magnezijum hlorida. Nakon oduzimanja slepe probe koja sadrži samo radni pufer, senzorgrami primećeni za vezivanje OX40 za anti-OX40 antitela su analizirani pomoću Lengmirovog modela vezivanja 1:1 putem softvera koji je obezbedio proizvođač radi izračunavanja kinetike i konstanti vezivanja.

12

Unakrsno blokiranje: Eksperimenti unakrsnog blokiranja su izvedeni korišćenjem površinske plazmonske rezonance (SPR) na instrumentu Biacore 3000 (GE Healthcare) kao što je gore opisano. Za analizu su korišćena dva formata. Za prvi, matična antitela dobijena od hibridomom 1A7, 3C8 i 1D2 su uhvaćena pomoću antimišjeg Fc (GE Healthcare) na različitim protočnim ćelijama. Humani OX40 (Sino Biological Inc) je zatim propuštan kroz antitela tokom 2 minuta, dopuštajući mu da se veže. Nakon toga je usledilo 2,5-minutno injektovanje klonova anti-OX40 antitela 1A7.gr.1, 3C8.gr.5 i 1D2.chimera. Porast rezonantnih jedinica (RU) ukazuje na to da nema unakrsnog blokiranja, a izostanak promene RU ukazuje na takmičenje. Za drugi format, format antitela je obrnut i humanizovane varijante su uhvaćene korišćenjem antihumanog Fc (GE Healthcare). Nakon toga je usledilo 2-minutno njektovanje huOX40, a zatim mišja antitela. Svaki od klonova je bio u stanju da se veže u prisustvu ostala dva klona, i bio je konkurent u vezivanju jedino samom sebi.

Generisanje varijanti antitela: Variante klonova humanizovanog anti-OX40 agonističkog antitela 1A7, 3C8 i 1D2 su generisane korišćenjem Kunkelove mutageneze. Varijante antitela su prolazno eksprimirane u 293 ćelijama, a zatim testirane na vezivanje i funkciju.

FACS analiza: Humana linija T ćelija Hut78 je stabilno transficirana humanim OX40, i humanizovani klonovi anti-OX40 antitela testirani su putem FACS pomoću Hut78-OX40 ćelija da bi se procenilo da li varijante zadržavaju vezivanje OX40 eksprimiranih na ćelijskoj površini. Nakon blokiranja FACS blokirajućim puferom (1X PBS, 0,5% BSA, 0,05% Na azida), ćelije su tokom 30 minuta bojene na ledu sa 0,1, 1,0 ili 10,0 µg/ml antitela. Nakon bojenja, ćelije su isprane 2x hladnim FACS puferom (1X PBS, 0,5% BSA, 0,05% Na azida). Ćelije su zatim obojene antihuFc fikoeritrinom (PE) ili Anti-muFc PE tokom 30 minuta na ledu. Obojene ćelije su isprane 3x hladnim FACS puferom pre očitavanja na uređaju FACSCalibur, a zatim analizane pomoću softvera Flowjo.

Ispitivanje stabilnosti: anti-OX40 agonistička antitela su podvrgnuta analizi stabilnosti, uključujući testiranje toplotnim stresom i testiranje hemijskim stresom. Za toplotno ispitivanje, uzorci formulisanog antitela su tretirani na 40°C tokom dve nedelje, a zatim podvrgnuti analizi, npr. na prisustvo izomerizovanih ili deaminiranih aminokiselinskih ostataka u CDR ostacima kako je određeno pomoću tripsinskog mapiranja pomoću LC-MS/MS. Za hemijsko ispitivanje, uzorci formulisanog antitela su podvrgnuti uslovima oksidacije (npr. korišćenjem AAPH kao oksidacionog agensa), zatim analizirani na prisustvo oksidisanih ostataka (npr. M ili W) u CDR-ima pomoću tripsinskog mapiranje koristeći LC-MS/MS.

12

Analiza ravnotežnog vezivanja OX40 agonističkog antitela 1A7.gr.1 za rekombinantni humani OX40 protein eksprimiran na transficiranim ćelijama BT-474: Mab 1A7.gr.1 je jodovan pomoću jodogenske metode (Fraker i Speck 1978). Radioaktivno označeni mab 1A7.gr.1 je prečišćen od slobodnog<125>I-Na pomoću gel filtracije koristeći kolonu NAP-5; prečišćeno antitelo ima specifičnu aktivnost od 24,3 µCi/µg. Smeše za kompetitivnu reakciju zapremine 50 µl sa konstantnom koncentracijom jodovanog mab 1A7.gr.1 i opadajućim koncentracijama serijski razblaženih neobeleženih mab 1A7.gr.1 stavljene su na ploče sa 96 bunarčića. Stabilno transficirane BT-474 ćelije koje eksprimiraju humani OX40 su uzgajane na 37°C u 5% CO2. Ćelije su odvojene iz boce pomoću rastvora za ćelijsku disocijaciju (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) i isprane puferom za vezivanje (DMEM sa 2% FBS, 50 mM HEPES, pH 7,2, 2 mM natrijum azid). Isprane ćelije su dodate u približnoj gustini od 5 x 104 ćelija u 0,2 ml vezujućeg pufera na ploče sa 96 bunarčića koje sadrže 50 µl smeše za kompetitivnu reakciju. Konačna koncentracija jodovanog antitela u svakoj kompetitivnoj reakciji sa ćelijama iznosila je oko 100 pM (oko 16,0 × 104 cpm po 0,25 ml), a krajnja koncentracija neobeleženih antitela u kompetitivnoj reakciji sa ćelijama je varirala, počevši od 500 nM i smanjujući se trostrukim koracima za 10 koncentracija, nakon čega sledi korak bez dodavanja sa neobeleženim antitelom, korišćenjem samo pufera za vezivanje. Kompetitivne reakcije sa ćelijama su inkubirane 2 sata na sobnoj temperaturi. Kompetitivna reakcija sa ćelijama za svaku koncentraciju neoznačenog antitela ponovljena je po tri puta. Nakon 2 sata inkubacije, kompetitivne reakcije su prenete na Millipore Multiscreen® filter ploču (Millipore; Billerica, MA) i isprane četiri puta vezujućim puferom da bi se razdvojila slobodna od vezanih jodovanih antitela. Filteri su prebrojani na Wallac Wizard 1470 gama brojaču (PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.; Wellesley, MA). Podaci o vezivanju su ocenjeni pomoću softvera NewLigand (Genentech), koji koristi prikladan algoritam Munsona i Rodbarda za određivanje afiniteta vezivanja antitela (Munson i Rodbard 1980).

Vezivanje OX40 agonističkog antitela 1A7.gr.1 za površinski eksprimiran OX40 T na ćelijama čoveka, majmuna cinomolgusa, pacova i miša protočnom citometrijom: Periferna bela krvna zrnca (PBMC) su dobijena iz pune krvi čoveka, majmuna cinomolgusa sa Mauricijusa, pacova ili miša lizom crvenih krvnih zrnaca pomoću pufera za lizu eritrocita (BD Bioscience; San Jose, CA). Ćelije su blokirane 10% serumom čoveka, majmuna cinomolgusa, pacova, odnosno miša u PBS-u tokom 15 minuta na 4°C i zasejane su na ploču sa 96 bunarčića u ekvivalentu od 100 µl pune krvi po reakciji.

Mab 1A7.gr.1 označen sa Alexa Fluor<®>647 (ili kontrolno antitelo trastuzumab označeno sa Alexa Fluor<®>647) titrisan je i vezan za ćelije počevši od 9 µg/ml u trostrukim

12

serijskim razblaženjima za uzorke čoveka, pacova i miša, i 8 µg/ml u dvostrukim serijskim razblaženjima za uzorke majmuna cinomolgusa sa Mauricijusa. PBMC su zajedno obojeni tokom 30 minuta u mraku na 4°C da bi se identifikovali podskupovi populacija T ćelija na sledeći način: Čovek, anti-CD3-PE-Cy7, anti-PerCDP-Cy5.5, anti-CD8-BV510 (BD Biosciences); majmun cinomolgus, anti-CD3-PE-Cy7, anti-CD4-PerCP-Cy5.5, anti-CD8-APC-H7 (BD Biosciences); pacov, anti-CD3-PE, anti-CD4-FITC (BD Biosciences); miš, anti-CD3-FITC, anti-CD4-PE (eBioscience, San Diego, CA).

Ćelije su zatim dvaput isprane FACS puferom za bojenje (BD Bioscience) i fiksirane 1% paraformaldehidom (EMS) u PBS-u pre dobijanja uzorka na protočnom citometru.

Svi uzorci su urađeni na BD Biosciences FACSCanto II. Bojenje pozadine iz kontrolnog antitela trastuzumaba na T ćelijama je korišćeno za postavljanje granice analize i normalizaciju mab 1A7.gr.1 −Alexa 647 bojenja. Pribavljeni podaci su analizirani pomoću softvera BD FACSDiva.

Kostimulacija efektorskih T ćelija posredovana anti-OX40 agonističkim antitelom 1A7.gr.1: Periferna bela krvna zrnca (PB MC) su izdvojena iz pune ljudske krvi pomoću uređaja za aferezu Trima Accel, i dodatno obogaćena fikol-hipak gradijentnim centrifugiranjem. (GE healthcare). CD4+ memorijske T ćelije su izolovane iz PBMC koristeći Miltenyi komplet za izolovanje CD4+ memorijskih T ćelija (Miltenyi) prema uputstvu proizvođača. L ćelije koje eksprimiraju CD32 i CD80 su ozračene na 5000 Rad i korišćene kao ćelije koje prezentuju antigen.

Ozračene CD32+ CD80+ L ćelije (5000 ćelija/bunarčiću) su pomešane sa CD4+ memorijskim T ćelijama (50.000 ćelija/bunarčiću) i uzgajane na 37°C u 5% CO2na ploči sa 96 bunarčića. Medijum za uzgajanje se sastojao od RPMI 1640 sa 10% FBS, Gluta-MAX, natrijum piruvata, penicilina/streptomicina, neesencijalnih aminokiselina i beta merkaptoetanola.

CD4+ memorijske T ćelije su aktivirane u ćelijskim kokulturama CD32+ CD80+ L dodavanjem 40 ng/ml anti-CD3 (klon SP34) i (BD Biosciences) i promenljivih količina mab 1A7.gr.1 ili kontrole izotipa (anti-HSV glikoprotein D, anti-gD) (serijski razblažen dva puta od 320 ng/ml do 0,16 ng/ml). Nivoi IFN-gama u supernatantu su procenjeni pomoću sistema Luminex (Bio-Rad) 5. dana uzgajanja, a proliferacija T ćelija je izmerena Titer-Glo luminescencijom ćelije (Promega) i očitavana na En Vision Multilabel čitaču (Perkin Elmer) 7. dana uzgajanja.

REZULTATI:

OX40 agonistička antitela vezuju humani OX40 sa sub-nanomolarnim afinitetom.

12

Analiza površinske plazmonske rezonance je korišćena za merenje kinetike vezivanja anti-OX40 antitela koja se vezuju za humani OX40. Varijante humanizovanog antitela 1A7 pokazale su visok afinitet vezivanja za humani OX40 kako je izmereno pomoću sistema Biacore. Rezultati ove analize prikazani su u Tabeli 2.

Tabela 2: Kinetičke konstante za varijante humanizovanog anti-OX40 antitela 1A7 koje se vezuju za humani OX40

Varijante humanizovanog antitela 3C8 pokazale su visok afinitet prema huOX40. Rezultati ove analize prikazani su u Tabeli 3.

Tabela 3: Kinetičke konstante za varijante humanizovanog anti-OX40 antitela 3C8 koje se vezuju za humani OX40

12

Humanizovane varijante antitela 1D2 pokazale su smanjeno vezivanje za huOX40 u poređenju sa antitelom matičnog hibridoma. Rezultati ove analize prikazani su u Tabeli 4.

Tabela 4: Kinetičke konstante za varijante humanizovanog anti-OX40 antitela 1D2 koje se vezuju za humani OX40

FACS analiza: Varijante humanizovanih OX40 antitela su analizirane pomoću FACS kako bi se procenilo vezivanje antitela za huOX40 eksprimiran na površini ćelija FIut78. Rezultati ove analize prikazani su na SL. 1. Humanizovana anti-OX40 agonistička antitela 1A7.gr.1, 1A7.gr.2, 1A7.gr.3, 3C8.gr.1, 3C8.gr.2 i 3C8.gr.3 dobro se vezuju za humani OX40 eksprmiran na ćelijskoj površini.

Eksperimenti unakrsnog blokiranja: Svaki od klonova antitela mogao je da se veže u prisustvu druga dva klona, i jedino sa samim sobom se takmičio za vezivanje za humani OX40, što sugeriše da se antitela 1A7, 3C8 i 1D2 ne takmiče međusobno oko vezivanja za humani OX40.

Nastanak i karakterizacija varijanti OX40 antitela: Varijante anti-OX40 klonova 1A7.gr.1 i 3C8.gr.5 nastale su Kunkelovom mutagenezom kako bi mutirali motive ostataka CDR koji su bili potencijalno labilni (npr. u uslovima toplotnog stresa). Za antitelo 1A7.gr1,

1

sekvence DS (D je u CDRH1; DS je potencijalno podložan povećanoj izomerizaciji) i NGDS (u CDR H2; NG je potencijalno podložan povećanoj izomerizaciji) su identifikovane kao potencijalno nestabilni ostaci, i mutirani su na način prikazan u Tabeli 5. Varijante su testirane putem sistema Biacore kako je gore opisano radi procene kinetike vezivanja, a u testovima kostimulacije radi određivanje biološke aktivnosti.

Tabela 5: Mutacije uvedene u varijante mab 1A7.gr.1

Mutacija ostataka DS (D je u CDR H1) u DA ili ES nije značajno izmenila afinitet vezivanja za huOX40 (Tabela 6). Mutacija ostataka NGDS u CDR H2 u NADS, NADA, NGDA i NGSS takođe nije značajno izmenila afinitet vezivanja za humani OX40. Mutacija NGDS (u CDR H2) u SGDS dovela je do dvostrukog gubitka afiniteta vezivanja (Tabela 6). Varijante antitela su analizirane korišćenjem testa kostimulacije T ćelija, i nivo kostimulacije T efektorskih ćelija nije značajno izmenjen u varijantama u poređenju sa 1A7.gr1 antitelom (podaci nisu prikazani).

Tabela 6: Kinetičke konstante za Anti-OX40 1A7 varijante koje se vezuju za humani OX40

1 1

Za antitelo 3C8.gr5, sekvence DT (u CDRH2) i DG (u CDR L2) (obe potencijalna mesta izomerizacije) identifikovane su kao potencijalno nestabilni ostaci u antitelu 3C8.gr.5. Mutacije su napravljene u svakoj od ovih sekvenci, kao što je prikazano u Tabeli 7.

Tabela 7: Mutacije uvedene u varijante mab 3C8.gr.5

1 2

Mutacija ostataka DT u CDR H2 u DA ili DQ dovela je do gubitka afiniteta prema humanom OX40 (u odnosu na afinitet matičnog antitela) (Tabela 8). Mutacija ostataka DG u CDR L2 u EG, QG, ili SG nije značajno izmenila afinitet vezivanja (Tabela 8).

Tabela 8: Kinetičke konstante za Anti-OX40 3C8 stabilne varijante koje se vezuju za humani OX40

Testiranje stabilnosti: Antitelo 1A7.gr.1 je podvrgnuto testiranju stabilnosti kao što je gore opisano, a sekvence DS (D je u CDRH1) i NGDS (u CDR H2) su bile stabilne u uslovima testiranja toplotnim stresom. Pored toga, ostaci M i W (u CDR-H1, −H2 i −H3) nisu pokazali neprihvatljive nivoe oksidacije tokom testiranja hemijskim stresom.

Antitelo 3C8.gr.5 je takođe podvrgnuto testiranju stabilnosti. Iako su ostaci DT bili stabilni u uslovima termičkog testiranja, ostaci DG (CDR-L2) nisu bili stabilni u uslovima termičkog testiranja.

Generisanje i karakterizacija mutanata za skeniranje alanina antitela OX40:

Mutanti za skeniranje alanina 1A7.gr.1 i 3C8.gr.5 su generisani, npr. za ispitivanje uticaja mutacija na afinitet vezivanja. Pored toga, utvrđen je uticaj afiniteta vezivanja na aktivnost antitela. Mutanti su generisani pomoću Kunkelove mutageneze za promenu aminokiselinskih ostataka u trećem CDR-u lakog lanca i teškog lanca. Varijante antitela su prolazno eksprimirane u 293 ćelija, i testirane pomoću sistema Biacore 3000 na vezivanje za humani OX40.

Rezultati ovog eksperimenta prikazani su u Tabeli 9. Supstitucije alanina u CDR 3 teškog lanca na pozicijama 96 (1A7.Ala.14), 97 (1A7.Ala.11), 98 (1A7.Ala.13), 99 (1A7.Ala.10) i 100 (1 A7.Ala.9) pokazale su smanjeno vezivanje za huOX40. Ovi rezultati sugerišu da ostaci na poziciji 96, 97, 98, 99 i 100 mogu biti važni za vezivanje antitela za OX40. Funkcionalna karakterizacija mutanata za skeniranje Ala 1A7.Ala9, 1A7.Ala10, 1A7.Alall, 1A7.Alal3 i 1A7.Alal4 u in vitro testu kostimulacije T ćelija pokazala je da je smanjeni afinitet

1

OX40 antitela u korelaciji sa smanjenom sposobnošću antitela da kostimulišu aktivnost proliferacije T ćelija.

Tabela 9: Kinetičke konstante za Anti-OX40 1A7.gr.1 varijante za skeniranje alanina koja se vezuju za humani OX40 (supstituisani alanin je podvučen)

1 4

Analiza varijanti antitela 3C8.gr5 za skeniranje alanina prikazana je u Tabeli 10. Varijante antitela koje sadrže alaninske supstitucije u CDR 3 lakog lanca i teškog lanca na pozicijama 91, 93, 94 i 95 pokazale su značajno smanjeno vezivanje za huOX40. Sve tri pozicije (95, 96 i 97) u CDR3 teškog lanca kada su mutirane u alanin pokazale su smanjeno vezivanje za huOX40.

Tabela 10: Kinetičke konstante za Anti-OX40 3C8.gr.5 varijante za skeniranje alanina koje se vezuju za humani OX40 (supstitucija alanina je podvučena)

1

Mab 1A7.gr.1 vezan sa velikim afinitetom za humani OX40, analiziran pomoću radioimunotesta: Studije ravnotežnog vezivanja izvedene su kako je opisano radi određivanja afiniteta mab 1A7.gr.1 prema humanom OX40 eksprimiranom na transficiranim ćelijama BT-474. Vrednosti Kd su rezimirane u Tabeli 11. Prosečni izmereni afinitet vezivanja bio je 0,45 nM (n=3, pojedinačne vrednosti 0,43, 0,44, 0,49).

Tabela 11 Analiza ravnotežnog vezivanja mab 1A7.gr.1 za ćelije BT-474 koje eksprimiraju rekombinantni humani OX40

Mab 1A7.gr.1 vezan sa velikim afinitetom za OX40 eksprimiran na T-ćelijama čoveka, majmuna cinomolgusa, pacova i miša: Vezivanje mab 1A7.gr.1 za OX40 eksprimiran na T-ćelijama čoveka, majmuna cinomolgusa, pacova i miša procenjeno je u testu na bazi protočne citometrije. Prosečne vrednosti EC50 za vezivanje mab 1A7.gr.1 za T ćelije čoveka i majmuna cinomolgusa sažete su u Tabeli 12, a krive vezivanja su prikazane na SL.2. Rezultati pokazuju da se mab1A7.gr.1 vezuje za T ćelije čoveka i majmuna cinomolgusa sa

1

sličnim velikim afinitetom, sa vrednostima EC50 od 0,220 ± 0,026 (1,47 nM) i 0,142 ± 0,0001 µg/ml (0,946 nM) za T ćelije čoveka, odnosno majmuna cinomolgusa. Nije otkriveno merljivo vezivanje mab1A7.gr.1 za T ćelije pacova ili miša.

Tabela 12: Vezivanje mab 1A7.gr.1 za T ćelije čoveka i majmuna cinomolgusa

Tretman agonističkim antitelom za OX40 mab1A7.gr.1 kostimulisao je proliferaciju T efektorskih ćelija i proizvodnju gama interferona nakon uključivanja receptora T ćelija na način zavistan od doze: CD4 memorijske T ćelije su stimulisane fiksnom koncentracijom anti-CD3 i varijabilnom koncentracijom anti-OX40 ili kontrolnih antitela kako je opisano. U nedostatku umrežavanja anti-CD3, mab 1A7.gr.1 nije imao uticaja na proliferaciju T ćelija (SL. 3A). Povećavanje koncentracije mab 1A7.gr.1 kostimulisalo je proliferaciju CD4+ memorijskih T ćelija kao odgovor na umrežavanje anti-CD3. Izračunata EC50 za kostimulišući efekat mab1A7.gr.1 bila je 9,96 ng/ml (n = 2, SL. 3A). Povećavanje koncentracije mab1A7.gr.1 kostimulisalo je proizvodnju interferona gama CD4+ memorijskih T ćelija kao odgovor na umrežavanje anti-CD3 (SL. 3B). Ovi rezultati pokazuju da agonist OX40 mab1A7.gr.1 kostimuliše proliferaciju CD4+ memorijskih T ćelija i proizvodnju gama interferona.

MATERIJALI I POSTUPCI II

1. Antitela: Prečišćeno antihumano OX40 (PE) (klon ACT35), mišji IgG1 (PE), antihumano CD3 (klon SP34), antihumano CD4 (FITC), antihumano CD25 (PE), antihumano CD45RA (APC), antihumano CD3-APC i prečišćeno mišje antihumano CD11b antitelo kupljeni su od BD biosciences. Alemtuzumab (kampat) je kupljen od kompanije Genzyme. Antihumani CD52 (APC) kupljen je od kompanije Sigma. Kozji antimišji IgG Alexa Fluor 647 je kupljen od kompanije Invitrogen. Antihumani CD127 (eFluor 450) i pacovski antimišji OX40 (PE, klon OX86) kupljeni su od eBiosciences. Antihumano OX40 antitelo IA7gr1, rituksimab (himerni anti-CD20, IgG1) i anti-HSV glikoprotein D (anti-gD antitelo, humani

1

IgG1) generisani su u kompaniji Genentech. Antihumani IgG (PE) kupljen je od kompanije BD Biosciences. Komplet II za izolaciju humanog CD4 je iz kompanije Miltenyi Biotech. Komplet za izolaciju humanih NK kupljen je od kompanije Stern Cell Technology.

2. Ćelije i medijumi

a, Ćelijske linije: BT474 (ćelijska linija humanog raka dojke) nabavljen je od ATCC; amfotropna ćelijska linija na bazi 293 nabavljena je od Life Technology. BT474 i amfotropne ćelije su uzgajane i održavane u DMEM medijumu uz dodatak 10% FBS/pen/strep, u inkubatoru na 37C/5%CO2. L ćelije koje eksprimiraju CD32a i CD80 su uzgajane i održavane u kompletnom RPMI medijumu (RPMI-1640, uz dodatak 10% FBS (toplotno inaktiviran)/pen/strep/glutamin/neesencijalne aminokiseline/55 µM βME), u inkubatoru na 37C/5%CO2. U937 (humana monocitna ćelijska linija) je uzgajen i održavan u kompletnom RPMI medijumu u inkubatoru na 37C/5%CO2.

b, Generisanje humanih BT474 klonova koji eksprimiraju OX40: Da bi se stvorio humani OX40-MSCV (hOX40-MSCV) plazmid, humana OX40 kDNK je klonirana kao fuzioni protein sa 5' HSV glikoprotein D (gD) oznakom u MSCV IRES GFP retrovirusni vektor (Clontech). Amfotropne ćelije za pakovanje Phoenix transficirane su sa hOX40-MSCV plazmidom putem Fugene HD (Roche). BT474 ćelije su naknadno zaražene virusnim supernatantima iz transficiranih amfotropnih ćelija. Spojene BT474 ćelije koje eksprimiraju OX40 su obogaćene sortiranjem površinskih gD+ i GFP+ ćelija. Klonovi koji eksprimiraju OX40 su nastali ograničavanjem analize razblaživanja klonova koji eksprimiraju OX40. Klonovi koji eksprimiraju visoke i niske nivoe OX40 su izabrani na osnovu površinske ekspresije gD oznake i nivoa ekspresije OX40 protočnom citometrijom. Da bi se odredili nivoi ekspresije humanog OX40 na BT474 klonovima, ćelije koje eksprimiraju OX40 su obojene antihumanim OX40-PE (klon ACT35, BD Biosciences), a ćelijska fluorescencija je izmerena na FACS Canto II (BD Bioscience) i analizirana pomoću softvera Flowjo (TreeStar).

c, Izolovanje normalnih mononuklearnih ćelija humane periferne krvi (PBMC), T ćelija, monocita i NK ćelija: Uzorke normalne humane periferne krvi donirali su registrovani zaposleni kompanije Genentech, a obezbedila ih je Služba zdravstvenih usluga zaposlenih. Normalna humana frakcija leukocita i trombocita nabavljena je od banke krvi u San Francisku preko odeljenja zdravstvene službe za zaposlene u kompaniji Genentech. Periferna bela krvna zrnca (PBMC) su izdvojena iz pune ljudske krvi pomoću uređaja za aferezu Trima Accel i dodatno obogaćena fikol-hipak gradijentnim centrifugiranjem (GE Healthcare).

CD4<+>T ćelije su izolovane iz PBMC korišćenjem Miltenyi kompleta za izolovanje

1

CD4<+>T ćelija. CD4+ naivne T ćelije su obojene sa CD4-FITC, CD25-PE i CD127-e450 (eBiosciences) radi sortiranja CD4+CD25-CD127+ ćelija i CD4<+>CD25<+>CD127<−>ćelija. Treg ćelije su sortirane od istog donora pomoću uređaja FACS Aria (BD Biosciences). Čistoća sortiranih ćelija je potvrđena protočnom citometrijskom analizom odmah nakon sortiranja.

PBMC uzoraka pune krvi izolovana pomoću fikol-pak gradijentnog centrifugiranja korišćena su za izolovanje monocita. Monociti su izolovani iz PBMC korišćenjem kompleta za izolovanje humanih monocita (Miltenyi). Izolovani monociti su uzgajani 7 do 14 dana sa kompletnim RPMI medijumom u prisustvu 20 ng/ml GM-CSF za stvaranje makrofaga izvedenih iz monocita (MDM).

Normalne humane NK ćelije su izolovane iz PBMC frakcije leukocita i trombocita upotrebom kompleta za obogaćivanje humanih NK ćelija (Stern Cell Technology) prema uputstvu proizvođača, i ćelije su odmah korišćene za ADCC test.

3. Reagensi za označavanje ćelija: Prečišćene CD4+ naivne T ćelije su označene sa CFSE pomoću CellTrace CFSE kompleta za ćelijsku proliferaciju (Life Technology), a prečišćene Treg ćelije su označene sa PKH26 kompletom sa crvenim fluorescentnim ćelijskim linkerom (Sigma). Oba kompleta su korišćena prema uputstvu proizvođača.

4. Test supresije Treg: L ćelije koje eksprimiraju CD32 i CD80 su ozračene sa 5000 rad i korišćene su kao ćelije koje prezentuju antigen za test supresije ćelija CD4+CD25+CD127.

Ozračene CD32+ CD80+ L ćelije (5000 RAD, 10.000 ćelija/bunarčiću) zasejane su na ploču za kulture tkiva sa 96 bunarčića i držane su preko noći u inkubatoru na 37C/5%CO2. Sledećeg dana procenjena je proliferacija CD4+ naivnih T ćelija u prisustvu ili odsustvu sortiranih Treg ćelija u sledećem testu supresije T ćelija CD4+CD25+CD127.

Za praćenje proliferacije naivnih CD4+ T ćelija, 100.000 CFSE (5um) označenih naïvnih CD4+ T ćelija je dodato u svaki bunarčić ploče za testiranje, koja već sadrži L ćelije zasejane prethodnog dana. Radi testiranja supresivne funkcije Treg ćelija, 200.000 PKH26 (2um)-označenih Treg ćelija je dodato u svaki bunarčić koji sadrži CFSE označene CD4+ naivne T ćelije. Radi testiranja aktivnosti anti-OX40 antitela 1A7.gr1, 1A7.gr1 ili antitela za kontrolu izotipa anti-CD20 antitelo (rituksimab) (svako sa 200 ng/ml) je dodato u kokulturu naivnih CD4+ T ćelija, Treg ćelija i ozračenih CD32<+>CD80<+>L ćelija. Rastvorljivi anti-CD3 je dodat ćelijama u krajnjoj koncentraciji od 2,5 ng/ml. Ploča za testiranje je održavana u inkubatoru na 37C/5%CO2tokom 6 dana pre prikupljanja podataka. Šestog dana, proliferacija naivnih CD4 T ćelija je praćena CFSE razblaživanjem bojama i ćelijska fluorescencija je izmerena pomoću uređaja FACS Canto II (BD Bioscience) i analizirana pomoću softvera FlowJo (Treestar).

1

5. Test ćelijski posredovane fagocitoze zavisne od antitela (ADCP): U937 ćelije su korišćene kao fagocitne efektorske ćelije u testu ADCP.50.000 U937 ćelija označenih pomoću PKH26 (2um) je zasejano na ploču za kulturu tkiva sa 96 bunarčića. Promenljive količine anti-OX40, 1A7.gr1 ili anti-HER2 (kontrola izotipa trastizumab) antitela (dvostruka serijska razblaženja od 1000 do 7,8 ng/ml) dodate su ćelijama U937. BT474 klonovi sa visokom ili niskom ekspresijom OX40 korišćeni su kao ciljne ćelije u ADCP testu. 5.000 OX40+ BT474 ćelija dodato je U937 ćelijama na ploči za testiranje. Ploča za testiranje je inkubirana u inkubatoru na 37C/5%CO2tokom 4 sata. Ćelije su zatim sakupljene radi merenja ćelijske fluorescencije na uređaju FACS Canto II (BD Bioscience) i analizirane pomoću softvera FlowJo (Treestar). Procenat fagocitoze je izračunat deljenjem događaja GFP+ PKH26+ (tj. izmerene U937 ćelije koje su progutale BT474 ćelije) svim događajima GFP+ (sve BT474 ćelije).

6. Test ćelijski posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC): Kako bi pokazali da 1A7.gr1 indukuje ADCC OX40 eksprimirajućih T ćelija, primarne NK ćelije su uzgajane zajedno sa aktiviranim primarnim CD4+ T ćelijama. CD4+ T ćelije i NK ćelije su izolovane od istog donora PBMC pomoću kompleta za izolovanje humane CD4 T ćelije (Miltenyi komplet), odnosno kompleta za obogaćivanje NK ćelija (Stern Cell Technology). Ekspresija OX40 na izolovanim CD4+ T ćelijama indukovana je aktiviranjem T ćelija sa PHA (5 ug/ml) tokom 48 sati u kompletnom RPMI-1640 medijumu. Alemtuzumab (anti-CD52 mAb) je korišćen kao pozitivna kontrola, a anti-gD je korišćen kao negativna kontrola za ADCC test. Aktivirane CD4+ ćelije (5000 po bunarčiću) inkubirane su sa promenljivom količinom 1A7.gr1 ili kontrolnim antitelima (trostruka serijska razblaživanja od 10.000 do 0,01 g/ml) tokom 30 minuta na ploči za testiranje sa kulturom tkiva sa 96 bunarčića. Nakon toga, ADCC test je započet dodavanjem NK ćelija (50.000 ćelija) u svaki bunarčić. Ploča za testiranje je zatim inkubirana još 20 sati u inkubatoru na 37C/5%CO2. Kokulture su zatim obojene antihumanim CD4-FITC i 7AAD (BD Biosciences). Nakon ispiranja pomoću PBS, podaci su prikupljeni protočnom citometrijom (BD FACScaliber) i analizirani programom Flowjo (TreeStar). Učestalost ubijanja (ADCC) CD4 T ćelija koje eksprimiraju OX40 je definisana procentom CD4<+>7AAD<+>ćelija u odnosu na ukupne CD4 T ćelije.

Radi demonstriranja ADCC osetljive na OX40 indukovane pomoću 1A7gr1, BT474 (ćelijska linija humanog raka dojke) klonovi su zasejani (5000 po bunaru) na ploču za testiranje sa kulturom tkiva sa crnim zidovima sa 96 bunarčića kako bi se omogućilo vezivanje, i držani su 24 sata u inkubatoru na 37C/5%CO2. Zatim su anti-CD20 (kontrola izotipa) ili anti-OX40 agonističko antitelo 1A7.gr1 dodati ćelijama BT474. Primarne humane NK ćelije zdravih

14

donora izolovane su iz PBMC-a frakcije leukocita i trombocita pomoću kompleta za obogaćivanje humanih NK ćelija (Stern Cell Technology), i 50.000 prečišćenih NK ćelija je dodato u bunarčiće koji sadrže klonove BT474 u prisustvu anti-CD20 (kontrola izotipa za rituksimab) ili 1A7.gr1. Ploča za testiranje je inkubirana 24 sata pre nego što je dodat reagens CellTiterGlo za hvatanje hemiluminescentnog signala. Procenat ćelija podvrgnutih anti-OX40 posredovanom ADCC izračunat je deljenjem signala ćelija tretiranih antitelom signalom netretiranih ćelija. Signal pojedinačne kulture NK je oduzet kako bi se neutralizovao osnovni signal iz NK ćelija.

REZULTATI II

Treg supresija CD4+ naivnih T ćelija inhibirana pomoću Mab 1A7.gr.1: Testirali smo da li će umrežavanje OX40 vezivanjem OX40 agonističkog antitela za Treg ćelije inhibirati njihovu sposobnost inhibiranja proliferacije naivnih T ćelija. Proliferacija naivnih CD4<+>T ćelija je indukovana anti-CD3 umrežavanjem u odsustvu 1A7.gr1. Dodavanje Treg ćelija u naivne T ćelijske kulture je suzbilo proliferaciju naivnih T ćelija indukovanu putem anti-CD3. Tretman pomoću mAb 1A7.gr.1 inhibira supresivnu funkciju regulatornih T ćelija (n=3, SL.6). Proliferacija naivnih T ćelija je izmerena praćenjem niske populacije CFSE putem protočne citometrijske analize. Ovaj rezultat je pokazao da mAb 1A7.gr.1 inhibira supresivnu funkciju Treg ćelija.

BT474-hOX40 transgeni klonovi eksprimirali su različite nivoe hOX40: Nivo ekspresije humanog OX40 je okarakterisan u transgenim klonovima BT474 ćelija pomoću hOX40 površinskog bojenja i srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) putem protočne citometrijske analize. BT474 klon sa visokim humanim OX40 eksprimirao je više od 5 puta veći OX40 nego BT474 klon sa niskim humanim OX40, pri čemu klon sa visokim OX40 ima MFI od 5243 (SL.8B), a klon sa niskim OX40 ima MFI od 994 (SL.8A). Antitelo za kontrolu izotipa, trastuzumab, imalo je MFI 10 (podaci nisu prikazani).

Tretiranje OX40 agonističkim antitelom indukovalo je ćelijski posredovanu fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP) zavisnu od OX40: Da bi se utvrdilo da li su antihumani OX40 mab 1A7.gr.1, posredovani ADCP, mijeloidne ćelije U937 su uzgajane sa ciljanim ćelijama koje eksprimiraju OX40, BT474 klonovima koji su eksprimirali visoke ili niske nivoe OX40. Tretiranje OX40 agonističkim antitelom 1A7 indukovalo je fagocitozu klonova BT474-hOX40 koji eksprimiraju niske i visoke nivoe hOX40, na način zavisan od doze, kao što je testirano pomoću FACS (SL. 9). Pored toga, primećen je viši nivo fagocitoze upotrebom BT474-hOX40-visokog klona nego kod BT474-hOX4-niskog klona, što ukazuje da je ćelijski posredovana fagocitoza posredovana antitelom na OX40 zavisna od nivoa ekspresije OX40 na ciljanim ćelijama (SL. 9). Nasuprot tome, trastuzumab (koji se takođe naziva herceptin), antitelo za kontrolu izotipa, samo je posredovalo 10% fagocitoze kao što je prikazano sa klonom BT474-hOX40-visok. Ovi podaci pokazali su da mab 1A7.gr.1 indukuje fagocitozu OX40 eksprimirajućih ciljanih ćelija i da su nivoi ćelijski posredovane fagocitoze zavisne od antitela korelisani sa nivoima OX40.

Tretiranje agonističkim OX40 antitelom 1A7.gr1 indukovalo je ADCC u BT474 klonovima koji eksprimiraju humani OX40, i nivo ADCC je bio značajno viši u ćelijama koje eksprimiraju visoke nivoe OX40 u odnosu na nivo ADCC u ćelijama koje eksprimiraju nizak nivo OX40: Tretiranje OX40 agonističkim antitelom 1A7.gr1 indukovalo je ADCC u ćelijama koje eksprimiraju OX40 (SL.10). Da bi se detektovao ADCC, izveden je CellTiterGlo test. Tretiranje anti-OX40 agonističkim antitelom 1A7.gr1 pri 0,1 ug/ml izazvalo je značajan ADCC hOX40-BT474-niskih ćelija, što je dokazano smanjenom vijabillnošću ciljnih ćelija. Tretiranje OX40 agonističkim antitelom 1A7.gr1 pri 0,1 ug/ml dovelo je do još obimnijeg ADCC visokih ćelija hOX40-BT474. Razlika ADCC između hOX40-BT474-niskog i -visokog klona bila je statistički značajna (p = 0,0077). Suprotno tome, tretman rituksimabom (kontrola) nije promenio vijabilnost klonova BT474 sa visokom i niskom ekspresijom OX40. Ovi podaci pokazuju da je OX40 agonističko antitelo 1A7.gr1 bilo sposobno da posreduje u ubijanju ćelija koje eksprimiraju OX40 in vitro. Pored toga, nivo ADCC bio je značajno viši u ćelijama koje eksprimiraju visok nivo OX40 u odnosu na ADCC u ćelijama koje eksprimiraju nizak nivo OX40. OX40 je visoko eksprimiran u intratumorskim T ćelijama, i humane intratumorske Treg ćelije eksprimiraju visoke nivoe humanog OX40.

Aktivnost agonističkih antitela OX40 bila je zavisna od umrežavanja i zahtevala je Fc efektorsku funkciju za kostimulaciju efektorskih T ćelija: Da bi se utvrdilo da li mab 1A7 zavisi od umrežavanja antitela za kostimulaciju proliferacije efektorskih T ćelija, u kulturu je dodat mab 1A7.gr.1 u obliku vezanom za ploču ili u solubilnom obliku. Rezultati ove analize prikazani su na SL.4A. U prisustvu anti-CD3 vezanog za ploču, mab 1A7.gr.1 vezan za ploču je kostimulisao proliferaciju CD4+ efektorskih T ćelija. Nasuprot tome, kostimulišuća aktivnost je ukinuta kada je 1A7 obezbeđen u rastvornom obliku u prisustvu anti-CD3 vezanog za ploču, na nivo sličan onome primećenom kod antitela za kontrolu izotipa vezanog za ploču u prisustvu anti-CD3 vezanog za ploču. Ovi rezultati sugerišu da umrežavanje (npr. obezbeđeno prianjanjem mab 1A7.gr.1 za ploču) može biti potrebno za kostimulaciju efektorskih T ćelija putem mab 1A7.

Da bi se dodatno ispitalo da li je za aktivnost mab 1A7.gr.1 potrebno umrežavanje, stvoreno je mutirano antitelo da bi se kreiralo antitelo koje ne može da se vezuje za Fc gama receptor prezentovan na ćelijama. Ukratko, Fc ostatak asparagin 297, mesto za N-vezanu glikozilaciju potrebnu za vezivanje za Fc gama receptore, mutiran je u glicin (N297G) da spreči vezivanje Fc antitela za Fc receptore. Rezultati ove analize prikazani su na SL.4B. MAb 1A7 gr.1 (IgG1) koji nosi mutaciju N297G nije uspeo da kostimuliše proliferaciju Teff ćelija. Nasuprot tome, divlji tip (nemutirani) mab 1A7 gr.1 kostimuliše proliferaciju Teff ćelija indukovanu putem anti-CD3. Zajedno sa rezultatima prikazanim na Sl. 4A, ovi rezultati pokazuju da aktivnost OX40 agonista mab 1A7 gr.1 zavisi od umrežavanja, zahtevajući efektorsku funkciju Fc da kostimuliše efektorske T ćelije.

Mab 1A7 gr.1 IgG.1 je imao snažniju aktivnost umrežavanja od mab 1A7.gr.1 IgG4. Izotipovi antitela imaju različito vezivanje za Fc gama receptore. Da bi se identifikovao izotip koji omogućava najsnažniju kostimulaciju efektorskih T ćelija, aktivnost mab 1A7.gr.1 koja ima Fc humanog IgG1 je upoređena sa aktivnošću mab 1A7 gr.1 na skeletu humanog IgG4. Rezultati ove analize prikazani su na SL. 5. Mab 1A7 gr.1-IgG1 kostimulisao je proliferaciju efektorskih T ćelija indukovanu od strane anti-CD3 snažnije nego mab 1A7 gr.1 −IgG4. Ovaj rezultat pokazuje da mab1A7 gr.1 koji sadrži Fc humanog IgG1 poseduje snažniju aktivnost umrežavanja nego mab 1A7.gr1 koji sadrži Fc humanog IgG4.

Tretman pomoću mab 1A7.gr.1 indukovao je ADCC T ćelija koje eksprimiraju OX40. Antitela koja prepoznaju ćelijske površinske antigene mogu posredovati u iscrpljivanju ciljne ćelije putem ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC). Da bi se utvrdilo da li mab1A7.gr1 indukuje ADCC, ciljne ćelije koje eksprimiraju visok nivo OX40 generisane su stimulacijom CD4+ T ćelija periferne krvi putem PHA, i dovedene su u kontakt sa mab 1A7.gr.1 u prisustvu humanih efektorskih ćelija. Rezultati ove analize prikazani su na SL.7A. Tretman sa mab 1A7.gr.1 indukovao je ADCC T ćelija koje eksprimiraju OX40 kada su NK ćelije uzgajane sa stimulisanim CD4+ T ćelijama (u odnosu od 10 NK ćelija: 1 aktivirana T ćelija). Ovaj rezultat je pokazao da 1A7.gr1 indukuje ADCC na T ćelijama koje eksprimiraju visoke nivoe OX40. Iscrpljivanje izazvano od strane mab.1A7.gr.1 je bilo manje obimno od onog indukovanog tretmanom pozitivnim kontrolnim antitelom, alemtuzumabom (anti-CD52 mab). Nasuprot tome, lečenje negativnim kontrolnim mab anti-gD (kontrola izotipa) nije dovelo do indukcije ADCC.

Da bi se utvrdilo da li mab 1A7.gr.1 antitela sa različitim izotipovima Fc pokazuju diferencijalnu aktivnost ADCC in vitro, aktivnost mab 1A7.gr1 sa izotipom IgG1 je upoređena sa aktivnošću mab 1A7.gr1 sa izotipom IgG4. Rezultati ovog eksperimenta prikazani su na SL.

7B. Tretiranje pomoću mab A7.gr1 (IgG1) indukovalo je veću ADCC CD4+ T ćelija koje eksprimiraju OX40 u poređenju sa nivoom ADCC indukovanim od strane mab 1A7.gr1 (IgG4).

14

MATERIJALI I POSTUPCI III

Test kompetitivnog vezivanja OX40L i anti-OX40. Antihumano OX40 antitelo 1A7gr1 je konjugovano sa Alexa Fluor647. Proteini humane OX40L-oznake i humane DR5-oznake generisani su u kompaniji Genentech. Antitelo protiv oznake konjugovano na Alexa Fluor 555 kupljeno je od Cell Signaling (kat. br.3768). Transgene ćelije Hut78-hOX40 (Hut78-hOX40, humana T ćelijska linija, transdukovana retrovirusom za ekspresiju humanog OX40) uzgajane su i održavane u kompletnom RPMI medijumu (RPMI-1640, uz dodatak 10% FBS (toplotno inaktiviran)/pen/strep/glutamin/neesencijalne aminokiseline/55 µM βME), u inkubatoru na 37C/5%CO2.

Prvo je izvršena titracija vezivanja mab 1A7gr1 na OX40. Korišćene su Hut78-hOX40 ćelije 1x10<6>, i koncentracija mab1A7gr1 je titrisana dvostruko naniže, počevši od 10 ug/ml. Nakon 30 minuta inkubacije na 4C, ćelije su isprane dva puta u puferu za ispiranje (PBS/0,5% FBS/2mM EDTA), nakon čega je usledilo prikupljanje podataka na protočnom citometru FACSCantoII (BD). Podaci su zatim analizirani programom Flowjo (TreeStar) i zabeležen je srednji intenzitet fluorescencije (MFI). Količina mab 1A7.gr.1 (200 ng/ml) koja generiše oko 70% maksimalnog MFI odabrana je za upotrebu u kompetitivnom testu. Titracija vezivanja OX40L-oznake izvedena je na sličan način, osim što je OX40L-oznaka titrisana 3 puta naniže, počevši od 10 ug/ml.

Test kompetitivnog vezivanja OX40L i anti-OX40 mab izveden je na sledeći način: OX40L-oznaka ili kontrolna DR5-oznaka dodata je u koncentracijama od 10 ng/ml do 1x10<6>Hut78-hOX40 ćelija. Nakon 30 minuta inkubacije na 4C, ćelije su isprane dva puta u puferu za ispiranje, a zatim je dodato 10 ug/ml anti-oznake-Alexa Fluor 555 i 200 ng/ml mab 1A7.gr.1-AlexaFluor647 da bi se ispitala konkurencija između OX40L i anti-hOX40 mab 1A7.gr.1. Nakon 30 minuta inkubacije na 4C, ćelije su isprane dva puta u puferu za ispiranje, nakon čega su prikupljeni podaci na protočnom citometru FACSCantoII (BD). Podaci su zatim analizirani programom Flowjo (TreeStar) da se odredi MFI za 1A7gr1 vezivanje.

REZULTATI III

Eksperiment sa titracijom je pokazao da antihumani OX40 mab 1A7gr1 vezuje Hut78-hOX40 ćelije na način zavisan od doze, i 70% maksimalnog vezivanja je uočeno na oko 200 ng/ml antitela (SL. 12A). Ova koncentracija odabrana je za kompetitivne eksperimente. OX40L-oznaka pokazala je vezivanje za Hut78-hOX40 ćelije zavisno od doze (SL.12B).

U kompetitivnom testu, vezivanje antihumanog OX40 mab 1A7.gr.1 za Hut78-hOX40 ćelije se smanjivalo sa povećanjem koncentracije OX40L-oznake (SL.12C). Nasuprot tome, prisustvo kontrolne DR5-oznake nije imalo uticaja na vezivanje mab 1A7.gr.1 (SL.12D), što ukazuje da je vezivanje OX40L za ćelije Hut78-OX40 specifično. Ovi podaci pokazali su da se OX40L takmiči sa antihumanim OX40 mab 1A7gr1 za vezivanje za hOX40 na ćelijama Hut78-OX40. U sličnim eksperimentima, zapaženo je i da se 3C8.gr5 nadmeće za vezivanje sa OX40L.

MATERIJALI I POSTUPCI IV

Farmakokinetička (FK) procena anti-OX40 kod miševa. Ženkama B6.CB17-Prkdc<scid>/SzJ miševa (n=12 životinja/grupi) data je pojedinačna i.v. injekcija 1A7.gr1 IgG1 (MOXR0916) od 1 mg/kg ili 10 mg/kg 0. dana. Svakom mišu je dat dozni volumen od 5 ml/kg (doza od 1 mg/kg bila je u koncentraciji od 0,2 mg/ml; doza od 10 mg/kg bila je u koncentraciji od 2 mg/ml). Uzorci krvi (125-150 µl) prikupljeni su od svake životinje srčanom punkcijom (3 termina po životinji; 3 životinje po terminu) nakon 5 minuta; 1, 3, 8 i 24 sata; i 2, 4, 7, 10, 14, 21 i 28 dana nakon doze. Za istraživanje nisu prikupljeni uzorci pre doze. Uzorci su prikupljeni u epruvete koje sadrže epruvete za odvajanje seruma, i obrađeni su na način opisan u nastavku.

Uzorci su ostavljeni da se zgrušavaju na sobnoj temperaturi najmanje 20 minuta pre centrifugiranja. Centrifugiranje je počelo u roku od 1 sata od sakupljanja, pri relativnoj centrifugalnoj sili od 11.000 obrtaja u minutu tokom 5 minuta u centrifugi sa održavanjem temperature na 2°C-8°C. Serum izdvojen iz krvi prebačen je u prethodno označene, epruvete od 0,5 ml sa poklopcima. Uzorci su čuvani u zamrzivaču sa održavanjem temperature na -80°C do analize.

1A7.gr1 IgG1 analiziran je generičkim ELISA testom upotrebom ovčjeg antihumanog IgG kao reagensa za hvatanje i kozjeg antihumanog IgG peroksidaze rena (HRP) kao reagensa za detekciju. Efektivna granica detekcije (LOD) za ovaj test bila je 0,08 µg/ml.

Koncentracija seruma u odnosu na vremenske podatke za svaku životinju analizirana je korišćenjem ulaznog modela i.v. bolusa i retkog uzorkovanja (Model 201), WinNonlin Pro, verzija 5.2.1, (Pharsight Corporation; Mountain View, CA). Sve FK analize su se zasnivale na podacima o naivnoj grupi pojedinačnih životinja. Za procenu specifičnih FK parametara korišćeni su sledeći postupci: Cmax (maksimalna koncentracija), AUClast(površina ispod krive koncentracije u serumu u odnosu na vreme, od vremena = 0 do posljednje merljive koncentracije izračunata je korišćenjem linearnog trapezoidnog pravila), AUCinf(površina ispod krive koncentracije u serumu u odnosu na vreme ekstrapolirana na beskonačnost), Cmax/D (dozno normalizovana Cmax), AUCinf/D (dozno normalizovana AUCinf), CL (klirens; doza/AUCinf), Vss (volumen raspodele u stabilnom stanju), i t1/2, λz(terminalno poluvreme života).

REZULTATI IV

14

Nakon primene 1 i 10 mg/kg, primećeno je da je FK proporcionalna dozi za 1A7.gr1 IgG1 (SL.13). FK parametri su sažeti ispod u Tabeli 13.

Tabela 13: FK parametri

Primećena je linearna FK proporcionalna dozi za 1A7.gr1 kod SCID miševa koji nemaju tumor. Ovi podaci sugerišu da je farmakokinetika 1A7.gr1 IgG1 u ispitivanim doznim nivoima bila u skladu sa očekivanjima za humano IgG1 monoklonsko antitelo kod miševa koje nije unakrsno reaktivno, i slična onoj za tipična IgG1 monoklonska antitela.

MATERIJALI I POSTUPCI V

4-nedeljna pilot studija toksičnosti kod majmuna cinomolgusa. Vehikulum (10 mM histidin acetat, 6% saharoze, 0,02% Tween 20, pH 5,8) ili 1A7.gr1 IgG1, davan je intravenski sa 0,01, 0,3 ili 10 mg/kg/dozi mužjacima majmuna cinomolgusa. Dozni režim je bio jednom na svake 2 nedelje za tri doze (date 1, 15. i 29. dana). Terminalna nekropsija je obavljena tri dana nakon poslednje doze. Bezbednosne krajnje tačke uključuju: klinička i dnevna zapažanja, kliničku patologiju, koagulaciju, analizu urina, makroskopsku i mikroskopsku analizu, toksikokinetiku (TK) i titar antiterapeutskih antitela (ATA). Farmakodinamička analiza (FD) uključuje serumske citokine, aktivaciju/proliferaciju/iscrpljivanje T ćelija i zauzetost OX40 receptora.

Krv je prikupljena venepunkcijom. Pribavljani su dodatni uzorci krvi (npr. zbog zgrušavanja neserumskih uzoraka) kada nije prekoračena dozvoljena učestalost uzorkovanja i količina krvi. Kada su drugi tipovi uzoraka prikupljani istovremeno sa FACS i FD uzorcima, ti uzorci su prikupljeni prvo nakon venepunkcije, nakon čega slede FACS i FD uzorci. Urin je skupljen drenažom iz posebnih kaveza od nerđajućeg čelika. Nakon prikupljanja, uzorci su prebačeni u odgovarajuću laboratoriju na obradu. Uzorci krvi su obrađeni za serum, i serum je analiziran na različite kliničke hemijske parametre.

Pojedinačne vrednosti kliničke hemije su analizirane pomoću analizatora OLYMPUS® au640e. C-reaktivni protein (CRP) je izmeren imunoturbidimetrijom.

Uzorci krvi sa antikoagulansom K2-EDTA su prikupljeni za analizu citokina u

14

naznačenim terminima. Nakon centrifugiranja, plazma je sakupljena i čuvana na -80°C do analize. Nivoi citokina su utvrđeni korišćenjem LUMINEX® xMAP® tehnologije za testiranje (Luminex, Austin, TX), tehnologije multipleksiranja na bazi perlica koja omogućava istovremenu kvantifikaciju više citokina. Uzorci su analizirani korišćenjem MILLIPLEX® MAP kompleta za citokine nehumanih primata na bazi magnetnih perlica (EMD Millipore, Billerica, MA) u skladu sa protokolom proizvođača. Standard je sadržao smešu rekombinantnog GCSF, GMCSF, IFNγ, IL1beta, IL1ra, IL2, IL4, IL5, IL6, IL8, IL10, IL12 / 23p40, IL13, IL15, IL17A, IL18, MCP1, MIP1alfa, MIP1beta, sCD40, TGFalfa, TNFalfa i VEGF. Standardni rasponi krive bili su 4,6-3000 pg/ml za IL4; 11,6-7500 pg/ml za IL10 i IL18; i 2,3-1500 pg/ml za sve ostale citokine. Uzorci plazme razblaženi su 1:3, a zatim su napravljena tri serijska razblaženja 1:2 na pločama sa 96 bunarčića, pa je dodat koktel fluorescentnih perlica povezanih sa antelom specifičnih za svaki citokin. Ploče su inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega je sledila noćna inkubacija na 4°C. Sledećeg dana u uzorke je dodata smeša biotinilovanih antitela za detekciju, i ploče su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega je sledila 30-minutna inkubacija sa streptavidin-fikoeritrinom. Fluorescentni signali su zatim procenjeni pomoću instrumenta LUMINEX® FLEXMAP 3D®, sa intenzitetom fikoetrinskog signala koji odgovara količini prisutnog citokina. Koncentracije citokina u serumu određene su iz odgovarajućih standardnih krivih postavljenih na osnovu pet parametara za svaki protein.

Koncentracija 1A7.gr1 IgG1 u majmunskom serumu analizirana je korišćenjem generičkog ELISA testa. Ovčji antihumani IgG (H L) (majmun apsorbovan) korišćen je kao reagens za hvatanje, a kozji antihumani IgG (H L) (majmun apsorbovan) konjugiran na peroksidaza renu (HRP) korišćen je kao reagens za otkrivanje.

Uzorci krvi prikupljeni su tokom studije za analize zauzetosti receptora pomoću protočne citometrije. Za ispitivanje obojenih površinskih markera protočnom citometrijom (npr. OX40 receptor), pripremljeni su kokteli antitela za svaku analizu bojenja tokom svakog dana ispitivanja. Odgovarajući alikvot koktela je raspoređen u predviđene bunarčiće na ploči sa 96 bunarčića. Za svaku životinju preneto je 100 µl uzorka pune krvi i pomešano je u odgovarajućim bunarčićima koji sadrže koktel za bojenje. Obojena krv je inkubirana u mraku na ambientalnoj temperaturi najmanje 30 minuta. Crvena krvna zrnca su lizirana sa 1,8 ml 1X BD FACS Lyse (BD Biosciences) najmanje 6 minuta na sobnoj temperaturi. Uzorci su centrifugirani, i supernatant je usisan i odbačen. Ćelijski peleti su isprani dva puta sa 1,8 ml HBSS. Nakon drugog ispiranja, svaki uzorak je suspendovan u 300 µl 1% paraformaldehida. Svaki uzorak (200 µl) je prebačen u odgovarajuće bunarčiće na ploči sa 96 bunarčića sa

14

udubljenim dnom, radi prikupljanja podataka na protočnom citometru BD FACS Canto II. Analiza podataka izvršena je korišćenjem softvera FACS Diva (BD Biosciences). Limfociti su identifikovani na osnovu njihovog FSC/SSC profila, i T ćelije su gejtovane kao CD3+/SSC

<niske>. Naknadno hijerarhijsko gejtovanje CD3+ T ćelija korišćeno je za identifikovanje i nabrajanje svakog podskupa T ćelija. Zauzetost OX40 na CD3+CD4+CD8-Th limfocitima određena je pomoću fluorescentno označenog uzorka za ispitivanje (anti-OX40 antitelo) koji se ne vezuje za OX40 u prisustvu primenjenog ispitivanog uzorka. Nepovezano humanizovano IgG1 antitelo korišćeno je kao kontrola izotipa za 1A7.gr1. Frakcija Th ćelija koja je bila pozitivna iznad izotipskog gejta je klasifikovana kao % OX40+ ćelija.

Dizajn studije je sažet u Tabeli 14 u nastavku.

Tabela 14: Dizajn pilot studije toksičnosti.

Studija toksičnosti prema dobroj laboratorijskoj praksi (GLP). Vehikulum (20 mM histidin acetat, 240 mM saharoza, 0,02% polisorbata 20, pH 5,5) ili 1A7.gr1 IgG1 je davan intravenskim bolusom pri 0,5, 5 ili 30 mg/kg/dozi mužjacima i ženkama majmuna cinomolgusa (pet mužjaka i pet ženki po grupi). Dozni režim je bio jednom na svake 2 nedelje tokom šest nedelja, za ukupno četiri doze (date 1, 15, 29. i 43. dana). Životinje iz glavne studije su određene za terminalnu nekropsiju 45. dana. Životinje predviđene za nekropsiju posle oporavka oporavljale su se 6 nedelja nakon poslednje doze i podvrgnute nekropsiji 85. dana. Bezbednosne krajnje tačke uključuju: klinička i dnevna zapažanja, kliničku patologiju, koagulaciju, analizu urina, makroskopsku i mikroskopsku analizu, toksikokinetiku (TK), titar antiterapeutskih antitela (ATA), kardiovaskularnu bezbednosnu farmakologiju i neurološke procene. Farmakodinamička analiza (FD) uključuje citokine iz seruma,

14

aktivaciju/proliferaciju/iscrpljivanje T ćelija i zauzetost OX40 receptora (periferno i tkivo). Krv je prikupljena venepunkcijom. Urin je sakupljen iz/putem drenaže iz posebnih poslužavnika u kavezima od nerđajućeg čelika preko noći na mokrom ledu pre prikupljanja krvi. Nakon prikupljanja, uzorci su prebačeni u odgovarajuću laboratoriju na obradu. Životinje su izgladnjivane pre uzimanja uzoraka za kliničku biohemiju.

Koncentracija 1A7.gr1 IgG1 u majmunskom serumu analizirana je korišćenjem generičkog ELISA testa.

Zauzetost receptora je određena ocenjivanjem vezivanja AF647-označenog 1A7.gr1 na CD3+CD4+ T-pomoćnim limfocitima protočnom citometrijom. Ukratko, 100 µl pune krvi ili suspenzije pojedinačnih ćelija dodato je u odgovarajuće bunarčiće od 2,2 ml/bunarčiću/ploči sa 96 bunarčića zajedno sa 1,8 ml sveže pripremljenog Pharm Lyse. Uzorci su dobro izmešani i inkubirani tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon liziranja, uzorci su centrifugirani, supernatant je odbačen, a uzorci su jednom isprani sa 1,8 ml HBSS. Nakon pranja, ćelije su blokirane u 100 µl 10% seruma majmuna cinomolgusa i inkubirane najmanje 15 minuta u mraku u frižideru da se temperatura održi na 2-8°C. Nakon koraka blokiranja, dodate su odgovarajuće zapremine koktela antitela u odgovarajuće bunarčiće na ploči, ploča je promešana, a zatim inkubirana najmanje 30 minuta u mraku u frižideru da se temperatura održi na 2-8°C. Nakon inkubacije, ploča je isprana dva puta sa po 1,8 ml HBSS, i uzorci su ponovo suspendovani u 300 µl 1% parafolrmaldehida i inkubirani 10-15 minuta u mraku u frižideru da se temperatura održi na 2-8°C. Nakon inkubacije, 200 µl svakog uzorka je prebačeno na ploču sa 96 bunarčića sa dnom u obliku slova V, i analizirano na citometru. Instrument za protočnu citometriju dao je podatke o relativnoj zastupljenosti različitih tipova ćelija sa antigenima markerima. Uzorci su analizirani upotrebom protočnog citometra FACSCanto™ II i softvera DIVA® 6.0. Podaci generisani za svaku životinju u svakom terminu nakon doziranja upoređivani su sa odgovarajućom vrednošću pre studije, kao i sa rasponom kontrolnih vrednosti. Veličina povećanja ili smanjenja procenjivana je sekundarno da bi se utvrdio potencijalni biološki značaj bilo koje primećene promene.

Nivoi MCP-1 izmereni su validiranim metodama na bazi LUMINEX®. Sendvič multipleks imunotest na bazi perlica je test proteina u čvrstoj fazi u kome se koriste spektralno kodirane perlice konjugovane sa specifičnim antitelima za hvatanje analita kao čvrstim nosačem. Standardi i uzorci su dodati u bunarčiće, i analit (citokin) koji je prisutan vezuje specifično antitelo za hvatanje konjugovano sa perlicama kodiranim bojom (svaka boja perlice je specifična za 1 citokin). Sistem za detekciju u testu bio je streptavidin konjugovan sa fluorescentnim proteinom, R-fikoeritrinom ili streptavidin-fikoeritrinom (streptavidin-RPE)

14

pomešan sa biotinilovanim antitelima za detekciju specifičnim za analit. Sadržaj svakog bunarčića mikroploče izvučen je instrumentom Luminex. Praćenjem spektralnih svojstava perlica i količine povezane RPE fluorescencije, koncentracije nekoliko analita određivane su istovremeno. Uzorci su centrifugirani do raspadanja peleta. Bunarčići filter ploče sa 96 bunarčića multiscreen isprane su sa 200 µl pufera za ispiranje. Standardi, uzorci za kontrolu kvaliteta (QC) i uzorci su zatim prebačeni (25 µl) u odgovarajuće bunarčiće koje sadrže 25 µl test pufera, nakon čega je dodato 25 µl odgovarajućeg radnog rastvora perlica antitela. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi na tresilici za ploče postavljenoj na snažno mućkanje tokom 2 sata (± 5 minuta), zatim je dvaput isprana sa 200 µl pufera za ispiranje, a zatim je dodato po 25 µl detekcionih antitela u svaki bunarčić. Ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi tokom 1 sata (± 2 minuta) na tresilici za ploče postavljenoj na snažno mućkanje. Zatim je dodato po 25 µl radnog rastvora streptavidin-RPE u svaki bunarčić, i ploča je inkubirana u mraku na sobnoj temperaturi, tokom 30 minuta (± 1 minut), na tresilici za ploče postavljenoj na snažno mućkanje. Nakon što je ploča dva puta isprana sa 200 µl pufera za ispiranje, dodato je 150 µl tečnosti za protočni citometar u svaki bunarčić, i ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi najmanje 5 minuta u mraku, na tresilici za ploče postavljenoj na snažno mućkanje. Ploča je očitana na sistemu Luminex. Standardi majmunskog MCP-1 pripremljeni su u test razblaživaču u rasponu koncentracija od 37,500 do 6000 pg/ml. LLOQ i ULOQ testa su bili od 75,00 do 6000 pg/ml. Uzorci za QC majmunskog MCP-1 pripremljeni su u test razblaživaču u teoretskim koncentracijama od 200, 1000 i 3200 pg/ml. Pored toga, uzorak za endogenu kontrolu kvaliteta (EQC) je sam postavljen na ploču, i nalazio se u rasponu krive.

Dizajn studije je sažet u Tabeli 15 u nastavku.

Tabela 15: Dizajn GLP studije toksičnosti.

REZULTATI V

Pilot studija toksičnosti

1

Cilj ove studije je bio procena toksičnost, toksikokinetičkog profila i farmakodinamike anti-OX40 (1A7.gr1 IgG1) kada se daje intravenskom injekcijom majmunima cinomolgus jednom na svake 2 nedelje(1, 15. i 29. dana) za ukupno 3 doze.

Intravenska primena 1A7.gr1 IgG1 je dobro podnošena kod majmuna cinomolgus do 10 mg/kg jednom na svake 2 nedelje tokom 4 nedelje, i sve životinje su preživele do zakazane nekropsije. Primećeno je minimalno povećanje c-reaktivnog proteina (CRP) (SL.14A i B), pri čemu je prolazno povećanje CRP ograničeno na tri ATA+ majmuna, primarno u grupi sa visokom dozom (10 mg/kg). Slično tome, prolazno povećanje u mešanom podskupu citokina (SL. 15A i B) bilo je ograničeno na tri ATA+ majmuna prvenstveno u grupi sa visokom dozom (10 mg/kg). Nisu primećene promene kliničke patologije niti povećanje citokina kod preostalih ATA+ ili ATA- životinja. Nije primećeno povećanje IFNγ, kao što je očekivano u nedostatku izazova antigena.

Izloženost je potvrđena kod svih životinja merenjem FK u serumu (SL. 16A) i zauzetosti perifernih receptora (SL. 16B). Cmaxdoza prvog ciklusa bila je proporcionalna za sve tri grupe. FK je u skladu sa očekivanjima za IgG1 antitelo na bazi AUC0−14pri 10 mg/kg. Primećena je velika učestalost ATA: 3 od 4 životinje u grupama sa 0,01 i 0,3 mg/kg; i 2 od 4 životinje u grupi sa 10 mg/kg. Uticaj je smanjena koncentracija u serumu i zauzetost receptora. Ovi rezultati pokazuju da je i.v. primena 1A7.gr1 dobro podnošljiva kod majmuna cinomolgusa pri navedenom rasporedu doziranja.

GLP studija toksičnosti

Cilj GLP studije toksičnosti bio je da se utvrdi toksičnost 1A7.gr1 kod majmuna cinomolgusa pri intravenskim dozama od 0, 0,5, 5 i 30 mg/kg/dozi 1, 15, 29. i 43. dana studije, praćenim sa 42 dana bez doziranja (period oporavka).

Intravenska primena 1A7.gr1 IgG1 je dobro podnošena kod majmuna cinomolgusa do 30 mg/kg jednom na svake 2 nedelje tokom 6 nedelja, i sve životinje su preživele do zakazane nekropsije u terminima 45. i 85. dana. Primećena je očekivana FK proporcionalna dozi za IgG1 antitelo (SL.17). Izloženost i zauzetost receptora održavani su na nivou doze od 30 mg/kg (SL.

18). Detektovani su ATA kod svih životinja na doznim nivoima od 0,5 i 5 mg/kg, ali ne i na doznom nivou od 30 mg/kg, uz gubitak izloženosti i zauzetost receptora. Primećeno je prolazno povišenje MCP-1 kod životinja sa srednjim dozama (SL.19). Nije opažena značajna aktivacija ili proliferacija perifernih T ćelija (SL.20), niti je primećeno značajno smanjenje primećenog apsolutnog broja perifernih T ćelija.

Ukratko, nisu primećena klinička opažanja ili promene parametara kliničke patologije nakon prve doze. Primećene su akutne reakcije posle doze i prolazni porast proteina i citokina

1 1

u akutnoj fazi počevši od 2. doze, potencijalno usled ATA (konzistentno u obe studije). Nisu zabeležene promene težine organa povezane sa lekovima, makroskopski ili mikroskopski nalazi. Detektovani su ATA kod svih životinja u doznim grupama sa 0,5 mg/kg i 5 mg/kg (ali ne i za 30 mg/kg) uz gubitak izloženosti i zauzetost receptora. Otkriveno je da 1A7.gr1 vezuje humani OX40 sa velikim afinitetom (~ 0,45 nM), a FK je očekivana za tipičan IgG1 i proporcionalna dozi. Ovo projektovano na humani CL = 2,5 ml/d/kg i t1/2~ 3 nedelje. Nisu primećeni značajni FD efekti na broj T ćelija ili status aktivacije u tkivima ili na periferiji. Nedostatak značajne aktivacije ili proliferacije perifernih T ćelija i nedostatak značajnih promena u apsolutnom broju perifernih T ćelija nije iznenađujući, jer je OX40 prolazno eksprimiran samo na aktiviranim T ćelijama, a zdravi cinomolgusi će imati zanemarljive aktivirane T ćelije.

1 2

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

21

21

21

21

21

21

21

22

22

22

22

22

22

22

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

Claims (20)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Antihumano OX40 agonističko antitelo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:56, i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57.

2. Antihumano OX40 agonističko antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo iscrpljuje ćelije koje eksprimiraju humani OX40 in vitro i vezuje humani OX40 sa afinitetom koji je jednak oko 0,45 nM, kako je određeno radioimunotestom.

3. Antihumano OX40 agonističko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, pri čemu antitelo iscrpljuje CD4+ efektorske T ćelije ili regulatorne T ćelije (Treg).

4. Antihumano OX40 agonističko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu je iscrpljivanje putem ADCC i/ili fagocitoze.

5. Antihumano OX40 agonističko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu antitelo vezuje humani OX40 i OX40 majmuna cinomolgusa.

6. Antihumano OX40 agonističko antitelo prema zahtevu 5, pri čemu se vezivanje za OX40 eksprimiran na ćelijskoj površini T ćelija čoveka i majmuna cinomolgusa označenog OX40 antitela utvrđuje pomoću FACS testa i vezivanje za humani OX40 ima EC50 koji je manji od ili jednak 0,3 µg/ml, i vezivanje za OX40 majmuna cinomolgusa ima EC50 koji je manji od ili jednak 1,5 µg/ml.

7. Antihumano OX40 agonističko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu je potrebno umrežavanje antitela za funkciju antihumanog OX40 agonističkog antitela.

8. Antihumano OX40 agonističko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu je antitelo IgG1 humano antitelo kompletne dužine.

9. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 8.

10. Ćelija domaćin koja obuhvata nukleinsku kiselinu iz zahteva 9.

11. Postupak za proizvodnju antitela, uključujući uzgajanje ćelije domaćina iz zahteva 10, tako da se proizvodi antitelo.

12. Postupak iz zahteva 11, koji dalje uključuje izolovanje antitela iz ćelije domaćina.

13. Imunokonjugat koji sadrži antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 8 i citotoksični agens.

14. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 8 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

15. Farmaceutska formulacija iz zahteva 14 koja sadrži (a) antitelo iz bilo kog od

24

zahteva 1 do 8 u koncentraciji od oko 10 mg/ml do oko 100 mg/ml, (b) polisorbat, pri čemu je koncentracija polisorbata oko 0,02% m/V do oko 0,06% m/V, (c) histidinski pufer pH 5,0 do 6,0 i (d) saharid, pri čemu je koncentracija saharida oko 120 mM do oko 320 mM.

16. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 8 za upotrebu kao lek.

17. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 8 za upotrebu u lečenju kancera.

18. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 8 za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima kancer, i koji uključuje davanje pojedincu efikasne količine antitela iz bilo kog od zahteva 1 do 8 i dodatnog terapeutskog agensa.

19. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 8 za upotrebu u postupku iz zahteva 18, pri čemu dodatni terapeutski agens obuhvata hemoterapeutski agens.

20. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 8 za upotrebu u postupku iz zahteva 18, pri čemu dodatni terapeutski agens sadrži antagonist koji vezuje PD-1 osovinu.