ES2274823T3 - Agentes cototoxicos que comprenden doxorrubicinas y daunorrubicinas y su utilizacion terapeutica. - Google Patents

Abstract

Compuesto que comprende un grupo de enlace R o R'' representado por la fórmula (I): en la que, X es H u OH; Y es O o NR2, en el que R2 es alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono; R es un grupo de enlace, H, o alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono; y R'' es un grupo de enlace, H, u -OR1, en el que R1 es alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono; en el que el grupo de enlace es una fracción que contiene tiol o disulfuro, o en un éter de morfolino es un grupo amino libre para unirse a un agente aglutinante de células mediante un enlace ácido lábil o fotolábil o para condensar con un péptido y enlazar con un agente aglutinante de células mediante un enlace lábil de peptidasa, o es un grupo hidroxi succinilado para unirse a un agente aglutinante de células mediante un enlace lábil de esterasa intracelular; con la condición de que R y R'' no sean grupos de enlace al mismo tiempo.

Description

Agentes citotóxicos que comprenden doxorrubicinas y daunorrubicinas y su utilización terapéutica.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos agentes citotóxicos y a su utilización terapéutica. Más específicamente, la invención se refiere a nuevos agentes citotóxicos que comprenden doxorrubicinas/daunorrubicinas modificadas y a su utilización terapéutica. Estos nuevos agentes citotóxicos tienen utilización terapéutica como resultado de la liberación de las doxorrubicinas/daunorrubicinas modificadas en una población específica de células de manera dirigida acoplando químicamente la doxorrubicina/daunorrubicina a un agente aglutinante a la célula.

Antecedentes de la invención

Han aparecido muchos informes sobre el direccionamiento específico ensayado de células tumorales con conjugados anticuerpo-fármaco monoclonales (Sela et al., en Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al., en Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al., en Antibody mediated delivery systems 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz et al., en Antibody mediated delivery systems 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988); Burnol et al., en Antibody mediated delivery systems 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988). Los fármacos citotóxicos tales como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalán, mitomicina C y clorambucilo se han conjugado con una variedad de anticuerpos monoclonales murinos. En algunos casos, las moléculas de fármaco se acoplaron con moléculas de anticuerpo mediante una molécula transportadora intermedia tal como la albúmina de suero (Garnett et al., 46 Cancer Res. 2407-2412 (1986); Ohkawa et al., 23 Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1986); Endo et al., 47 Cancer Res. 1076-1080 (1980)), dextrano (Hurwitz et al., 2 Appl. Biochem. 25-35 (1980); Manabi et al., 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985); Dillman et al., 46 Cancer Res. 4886-4891 (1986); Shoval et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci. 8276-8280 (1988)), o ácido poliglutámico (Tsukada et al., 73 J. Natl. Canc. Inst. 721-729 (1984); Kato et al., 27 J. Med. Chem. 1602-1607 (1984); Tsukada et al., 52 Br. J. Cancer 111-116
(1985)).

Se ha empleado un sistema de tecnologías de acoplamiento para la preparación de dichos inmunoconjugados y se han investigados enlazadores tanto escindibles como no escindibles. En la mayoría de los casos, pudo observarse solamente el potencial citotóxico completo de los fármacos, sin embargo, si las moléculas del fármaco podían liberarse de los conjugados en forma no modificada en la zona diana.

Uno de los enlazadores escindibles que ha sido empleado para la preparación de conjugados anticuerpo-fármaco es un enlazador ácido lábil basado en el ácido cis-aconítico que se aprovecha del medio ácido de diferentes compartimentos intracelulares tales como los endosomas encontrados durante la endocitosis mediada por el receptor y los liposomas. Shen y Ryser introdujeron este procedimiento para la preparación de conjugados de daunorrubicina con transportadores moleculares (102 Biochem. Biophys. Res. Commun. 1048-1054 (1981)). Yang y Reisfeld utilizaron la misma técnica para conjugar daunorrubicina con un anticuerpo anti-melanoma (80 J. Natl. Canc. Inst. 1154-1159 (1988)). Dillman et al. también utilizaron un enlazador ácido lábil de modo similar para preparar conjugados de daunorrubicina con un anticuerpo anti-linfocito T (48 Cancer Res. 6097-6102 (1988)).

Un método alternativo, explorado por Trouet et al., implicaba el acoplamiento de daunorrubicina a un anticuerpo mediante un ramal de espaciador peptídico (79 Proc. Natl. Acad. Sci. 626-629 (1982)). Esto se realizó bajo la premisa de que el fármaco libre podría liberarse de dicho conjugado mediante la acción de peptidasas lisosómicas.

Las pruebas de citotoxicidad in vitro, sin embargo, han puesto de manifiesto que los conjugados anticuerpo-fármaco raras veces consiguieron la misma potencia citotóxica que los fármacos libres, no conjugados. Esto sugirió que los mecanismos mediante los cuales se liberan las moléculas de fármaco de los anticuerpos son muy ineficaces. En el área de las inmunotoxinas, los conjugados formados mediante puentes disulfuro entre los anticuerpos monoclonales y las toxinas con proteína químicamente activa demostraron que eran más citotóxicas que los conjugados que contienen otros enlazadores. (Véase, Lambert et al., 260 J. Biol. Chem. 12035-12041 (1985); Lambert et al., en Immunotoxins 175-209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetie et al., 48 Cancer Res. 2610-2617 (1988)). Esto se atribuyó a la elevada concentración intracelular de glutatión que contribuye a la escisión eficaz del enlace disulfuro entre una molécula de anticuerpo y una toxina. A pesar de esto, existen solamente unos pocos ejemplos publicados de la utilización de puentes disulfuro para la utilización de conjugados entre fármacos y macromoléculas. Shen et al. (260 J. Biol. Chem. 10905-10908 (1985)) describieron la conversión de metotrexano en un derivado de mercaptoetilamida seguida de conjugación con poli-D-lisina mediante un puente disulfuro. Otro informe describió la preparación de un conjugado de caliqueamicina fármaco tóxico que contiene trisulfuro con un anticuerpo (Hinman et al., 53 Cancer Res. 3336-3342 (1993)).

Una razón de la falta de conjugados anticuerpo-fármaco unidos por disulfuro es la indisponibilidad de fármacos citotóxicos que posean una fracción que contiene un átomo de azufre que pueda utilizarse fácilmente para unir el fármaco a un anticuerpo mediante un puente disulfuro. Además, la modificación química de los fármacos existentes es difícil sin disminuir su potencial citotóxico.

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Otro inconveniente principal con los conjugados anticuerpo-fármaco existentes es su indisponibilidad para administrar una concentración suficiente de fármaco en el punto diana debido al número limitado de antígenos dirigidos y a la citotoxicidad relativamente moderada de fármacos cancerostáticos como metotrexano, doxorrubicina, daunorrubicina y vincristina. A fin de conseguir citotoxicidad significativa, se hace necesaria la unión de un gran número de moléculas de fármaco bien directamente al anticuerpo o mediante una molécula transportadora polimérica. Sin embargo dichos anticuerpos muy modificados con frecuencia presentan unión alterada al antígeno diana y eliminación rápida in vivo del torrente circulatorio.

A pesar de la dificultades descritas anteriormente, se han publicado los agentes citotóxicos útiles que comprenden grupos de unión celular y los grupos de fármacos citotóxicos conocidos como maytansinoides (USP nº 5.208.020; USP nº 5.416.064; y R. V. J. Chari, 31 Advanced Drug Delivery Reviews 89-104 (1998)). Asimismo, se han publicado también agentes citotóxicos útiles que comprenden grupos de unión celular y análogos y derivados del potente antibiótico antitumoral CC-1065 (USP nº 5.475.092 y USP nº 5.585.499).

La doxorrubicina (Adriamicina) y la daunorrubicina (Daunomicina) son productos citotóxicos naturales que se utilizan ampliamente en el tratamiento del cáncer. Estos compuestos pertenecen a la familia de compuestos denominados antraciclinas. Las antraciclinas son agentes que interactúan con el ADN que se intercalan en el ADN e interfieren con su función de plantilla produciendo la muerte celular.

El documento US-A-4672057 da a conocer glucósidos de antraciclina que incluyen análogos de doxorrubicina y daunorrubicinas que se diferencian en la presencia de un metano cetónico o un grupo metanol, que se caracterizan por un grupo morfolino que está sustituido en alfa en el morfolino O por sustituyentes hidrógeno o metilo por una parte y metoxi por otra parte. Estos compuestos se describen como agentes citotóxicos útiles para destruir poblaciones celulares seleccionadas y pueden presentarse en forma de composición farmacéutica.

El documento EP-A-0434960 describe asimismo glucósidos de antraciclina en forma de doxorrubicinas que comprenden un grupo metanol cetónico. En este caso los compuestos incluyen el grupo morfolino y éste está monosustituido en alfa con el morfolino O mediante un grupo etoxi de O alquilo C_{1}-C_{6}. Los compuestos se describen como agentes citotóxicos útiles para destruir poblaciones celulares seleccionadas y pueden presentarse en forma de composición farmacéutica.

Aunque la doxorrubicina y la daunorrubicina son agentes útiles en el tratamiento del cáncer, su actividad antitumoral está limitada debido a su toxicidad no específica para con las células normales.

Además, los compuestos como las propias doxorrubicina y daunorrubicina no son suficientemente potentes para ser utilizados en los conjugados de los agentes de unión celular. Varios ensayos para unir estos compuestos con anticuerpos han producido conjugados con baja potencia y poca selectividad para la diana (R. S. Greenfield et al., 50 Cancer Res. 6600-6607 (1990); R. S. Greenfield et al., 50 Cancer Res. 6608-6614 (1990); R. V. J. Chari, 31 Advanced Drug Delivery Revs. 89-104 (1998)). De este modo, estos conjugados se han demostrado ineficaces en pruebas clínicas humanas (A. W. Tolcher et al., 17 J. Clin. Oncol. 478-484 (1999)). Unos pocos análogos de morfolino con mayor potencia que la daunorrubicina o la doxorrubicina se han descrito (E. M. Acton et al., 27 J. Med. Chem. 638-645 (1984); E. M. Acton et al., 29 J. Med. Chem., 1225-1230 (1985); E. M. Acton et al., 29 J. Med. Chem. 2074-2079 (1986); patentes US nº 4.464.529, nº 4.672.057, nº 5.304.687 (Fig. 1); y recientemente, se ha descrito una pirrolinodoxorrubicina ((5) en la Figura 1) (A. Nagy et al., 93 Proc. Natl. Acad. Sci., 2464-2469 (1996); patente US nº 5.843.903). Sin embargo, estos compuestos carecen de una funcionalidad que permite la unión mediante un enlace escindible a los agentes de unión celular. Asimismo, un intento para unir la morfolinodoxorrubicina con un anticuerpo mediante un enlazador ácido lábil condujo a un conjugado inestable que era inactivo (B. M. Mueller et al., 1 BioConjugate Chem. 325-330 (1990)).

Por consiguiente, se necesita en gran medida un procedimiento de tratamiento de enfermedades con doxorrubicinas/daunorrubicinas en el que sus efectos secundarios estén reducidos sin comprometer su citotoxicidad.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar doxorrubicinas/daunorrubicinas modificadas que son muy tóxicas y que pueden utilizarse todavía de manera eficaz en el tratamiento de muchas enfermedades.

Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar nuevas doxorrubicinas/daunorrubicinas modificadas.

Estos y otros objetivos se han conseguido proporcionando un agente citotóxico que comprende una o más doxorrubicinas o daunorrubicinas modificadas unidas a un agente aglutinante celular. En una segunda forma de realización, la presente invención proporciona una composición terapéutica que comprende:

(A)

una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más doxorrubicinas o daunorrubicinas modificadas unidas a un agente aglutinante celular, y

(B)

un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una tercera forma de realización, la presente invención proporciona un procedimiento de destrucción de poblaciones de células seleccionadas que comprende poner en contacto células o tejido que contiene células diana con una cantidad eficaz de un agente citotóxico que comprende una o más doxorrubicinas o daunorrubicinas modificadas unidas a un agente aglutinante celular.

En una cuarta forma de realización, la presente invención proporciona doxorrubicinas o daunorrubicinas modificadas que comprenden un grupo de unión capaz de unir dichas doxorrubicinas o daunorrubicinas modificadas a una fracción química.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 presenta la estructura de varios análogos potentes de doxorrubicina y daunorrubicina (E. M. Acton et al. (1984, 1985 y 1986), supra).

La Figura 2 es una fórmula química que representa estructuras de algunas de las doxorrubicinas/daunorrubicinas que contienen disulfuro según la presente invención. Los sustituyentes R_{1}, R_{2} y Z son como se han definido en la presente memoria.

La Figura 3 presenta la síntesis de metilditiomorfolino doxorrubicina a partir de ribitol y doxorrubicina.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en la síntesis de nuevas doxorrubicinas/daunorrubicinas modificadas que presentan aumento de citotoxicidad y que pueden unirse de manera eficaz a los agentes aglutinantes de células. La técnica pone de manifiesto que es sumamente difícil modificar los fármacos existentes sin disminuir su potencial citotóxico. Sin embargo, se ha mostrado anteriormente que los fármacos muy citotóxicos pueden modificarse de manera que conduzcan a nuevos fármacos que tengan potencia equivalente o similar que el fármaco precursor. Además, estos fármacos muy citotóxicos pueden unirse a agentes aglutinantes de células utilizando un enlace escindible, tal como un enlace disulfuro, asegurando la liberación del fármaco totalmente activo en el interior de la célula. Dichos conjugados con citotóxicos de manera específica para el antígeno (R. V. J. Chari et al., 52 Cancer Res. 127-131 (1992); USP nº 5.475.092; y USP nº 5.416.064). La invención dada a conocer aplica esta tecnología a las doxorrubicinas y daunorrubicinas, que están modificadas con grupos químicos, y especialmente las que contienen grupos tiol o disulfuro, a las que pueden unirse agentes aglutinantes de células apropiados. Como resultado, las nuevas doxorrubicinas/daunorrubicinas modificadas dadas a conocer conservan y en algunos casos podrían aumentar incluso la potencia citotóxica de las doxorrubicinas y daunorrubicinas conocidas. Los complejos agente aglutinante celular-doxorrubicina/daunorrubicina permiten la medición completa de la acción citotóxica de las doxorrubicinas/daunorrubicinas que debe aplicarse de modo dirigido contra las células no deseables únicamente evitando, por consiguiente, los efectos secundarios debidos al daño a las células sanas no objetivo. La presente invención permite que las doxorrubicinas/daunorrubicinas se dirijan al punto diana y sean todavía eficaces. Por lo tanto la invención proporciona agentes útiles para la eliminación de células enfermas o anormales que deben destruirse o lisarse, tales como las células tumorales (particularmente las células de tumor sólido), las células infectadas por virus, las células infectadas por microorganismos, las células infectadas por parásitos, autoinmunocitos (células que producen autoanticuerpos), las células activadas (las implicadas en el rechazo del trasplante o en la enfermedad trasplante contra huésped) o cualquier otro tipo de células enfermas o anormales, mientras presenten un mínimo de efectos secunda-
rios.

El agente citotóxico según la presente invención comprende una o más doxorrubicinas/daunorrubicinas modificadas unidas a un agente aglutinante de células mediante un grupo de enlace. El grupo de enlace es parte de una fracción química que está unida por enlace covalente a una doxorrubicina/daunorrubicina modificada por procedimientos convencionales. Aunque el fármaco puede estar unido a agentes aglutinantes de células por enlaces escindibles tal como enlaces ácidos lábiles, de estearasa lábiles y de peptidasa lábiles, el modo de enlace preferido es mediante enlaces disulfuro.

Las doxorrubicinas/daunorrubicinas modificadas útiles en la presente invención presentan la fórmula (I) mostrada a continuación:

1

en la que,

X es H u OH;

Y es O o NR_{2}, en el que R_{2} es alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono;

R es un grupo de enlace, H, o alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono; y

R' es un grupo de enlace, H, u -OR_{1}, en el que R_{1} es alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono;

con la condición de que R y R' no sean grupos de enlace al mismo tiempo.

Ejemplos de alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 5 átomos de carbono, representados por R, R_{1} y R_{2}, incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo y pentilo, en cualquiera de sus ocho disposiciones isoméricas.

R_{1} y R_{2} son preferentemente metilo.

Los grupos de enlace adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos ácido lábiles, grupos fotolábiles, grupos de peptidasa lábiles y grupos de esterasa lábiles. Se prefieren los grupos tioéter y los grupos disulfuro. Las posiciones preferidas para la introducción de un grupo tiol o disulfuro están en R y R'.

Cuando el grupo de enlace es un grupo que contiene tiol o disulfuro, la cadena lateral que lleva el grupo tiol o disulfuro puede ser lineal o ramificada, aromática o heterocíclica. Un experto en la materia puede identificar fácilmente cadenas laterales adecuadas. Ejemplos específicos de sustituyentes que contienen tiol o disulfuro incluyen -(CH_{2})_{n}SZ, -O(CH_{2})_{n}SZ, -(CH_{2})_{n}CH(CH_{3})SZ, -O(CH_{2})_{n}CH(CH_{3})SZ, -(CH_{2})_{n}C(CH_{3})_{2}SZ u -O(CH_{2})_{n}C(CH_{3})_{2}SZ, en las que

Z es H o SR_{3}, en la que R_{3} es alquilo, lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, o arilo sencillo o sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o heterocíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, y

n es un número entero de 1 a 10.

Los ejemplos de alquilos lineales incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo y hexilo.

Los ejemplos de alquilos ramificados incluyen isopropilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, isopentilo y 1-etil-propilo.

Ejemplos de alquilos cíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.

Ejemplos de arilos sencillos incluyen fenilo y naftilo.

Ejemplos de arilos sustituidos incluyen arilos tales como los descritos anteriormente sustituidos con grupos alquilo, con halógenos, tales como Cl, Br, F, grupos nitro, grupos amino, grupos de ácido sulfónico, grupos de ácido carboxílico, grupos hidroxi y grupos alcoxi.

Ejemplos de heterocíclicos son los compuestos en los que los heteroátomos se seleccionan de entre O, N y S, e incluyen pirrolilo, piridilo, furilo y tiofeno.

Las doxorrubicinas/daunorrubicinas modificadas de la presente invención, que tienen un sustituyente que contiene tiol o disulfuro son en sí mismas nuevas. Los ejemplos de algunas doxorrubicinas y daunorrubicinas que contienen tiol o disulfuro preferidas según la presente invención se presentan en la Figura 2.

Las doxorrubicinas/daunorrubicinas modificadas pueden sintetizarse según procedimientos conocidos. El material de partida para la síntesis es la doxorrubicina o daunorrubicina disponible en el mercado. En primer lugar, se sintetiza un compuesto de anhidrorribitol que contiene el disulfuro apropiado. En la Fig. 3 se proporciona un ejemplo. El ribitol se oxida a continuación con peryodato sódico, tal como fue descrito anteriormente por E. M. Acton et al., supra. La reacción del dialdehído resultante con doxorrubicina seguido de reducción con cianoborohidruro sódico proporciona la morfolino doxorrubicina que contiene disulfuro (Fig. 3). El sustituyente que contiene disulfuro o tiol puede introducirse como un sustituyente de éter en R' por conversión del alcohol en R' en un éter por procedimientos químicos normalizados. Por ejemplo, el grupo hidroxilo primario de un anhidrorribitol protegido de forma apropiada (tal como la protección del diol por un grupo de isopropilideno), se hace reaccionar con un exceso de un compuesto dihalo, tal como 1,3-dibromobutano, para dar un halo éter. El desplazamiento del halógeno con un tiol por reacción con tioacetato de potasio, seguido de tratamiento con una base débil o hidroxilamina proporciona el ribitol que contiene tiol. El grupo tiol puede convertirse en un disulfuro de metilo o piridilo por reacción con sulfonato de metil metanotiol o ditiodipiridina respectivamente. Este procedimiento se describe en el documento USP nº 5.416.064, que está incorporado expresamente en la presente memoria:

``La síntesis de derivados maytansinoides puede describirse con relación a las Figs. 1, 2, 3, 4(A) y 4(B), en las que los ésteres maytansinoides que contienen disulfuro se preparan condensando maytansinol 1b con derivados de N-metil-L-alanina o N-metil-L-cisteína recién preparados que contienen un grupo disulfuro.

Los ácido omega-mercapto-carboxílicos de longitudes de cadena variables se convierten en sus respectivos metil-ditio, p. ej. 3a a 3d (donde n=1-10, incluyendo los alifáticos ramificados y cíclicos) o aril-ditio, p. ej. 4a a 4b, derivados haciéndoles reaccionar con metantiolsulfonato de metilo o disulfuros de arilo, tales como los disulfuros de difenilo y los disulfuros de difenilo sustituidos en el anillo y los disulfuros heterocíclicos tales como 2,2'-ditiopiridina. Los ácidos carboxílicos se activan y a continuación se hacen reaccionar con N-metil-L-alanina para formar los compuestos de ácido carboxílico, p. ej. 5a a 5f para la condensación con maytansinol 1b.

La esterificacion de maytansinol 1b o de un análogo con los ácidos carboxílicos 5a a 5f proporciona los maytansinoides 6a a 6f que contienen disulfuro. La escisión del grupo disulfuro en 6a a 6f con ditiotreitol proporciona los maytasinoides 7a a 7c que contienen tiol, que se unen fácilmente mediante enlaces disulfuro o tioéter a los agentes aglutinantes de células''.

La separación del grupo protector de isopropilideno con ácido, seguida por oxidación con peryodato y reacción del dialdehído resultante con doxorrubicina o daunorrubicina proporcionará la morfolino doxorrubicina o daunorrubicina deseada que contiene disulfuro. Cuando R o R' no es un grupo de enlace, el sustituyente en esta posición puede variarse hasta que se obtenga un compuesto de la toxicidad deseada. Toxicidad elevada se define como la que presenta una IC_{50} para con las células de cáncer cultivadas en el intervalo comprendido entre 1\times10-12 y 1\times10-9 M, durante un tiempo de exposición de 72 horas. Ejemplos representativos de sustituyentes son H, alquilo y O-alquilo, como se describió anteriormente. Un experto en la materia puede determinar la fracción química apropiada para R y R' utilizando exclusivamente experimentación de rutina.

Por ejemplo es de esperar que los sustituyentes metil y metoxi aumenten la potencia citotóxica, mientras que un hidrógeno no es de esperar que aumente la potencia en comparación con la doxorrubicina o daunorrubicina precursora. Típicamente unas pocas doxorrubicinas o daunorrubicinas representativas modificadas con sustituyentes en diferentes posiciones se prepararán inicialmente y se evaluará su citotoxicidad in vitro.

En los fármacos con doxorrubicina/daunorrubicina que contienen disulfuro y que contienen tiol de la invención puede evaluarse su capacidad para suprimir la proliferación de varias líneas celular no deseadas in vitro. Por ejemplo, las líneas celulares tal como la línea KH de carcinoma epidermoide humano, la línea SKBR3 de tumor de mama humano y la línea Namalwa de linfoma de Burkitt pueden utilizarse fácilmente para la evaluación de la citotoxicidad de estos compuestos. Las células que deben evaluarse pueden exponerse a los compuestos durante 72 horas y las fracciones supervivientes de las células medirse en ensayos directos por procedimientos conocidos. Los valores de IC_{50} pueden calcularse a continuación a partir de los resultados de los ensayos.

La eficacia de los compuestos de la invención como agentes terapéuticos depende de la selección cuidadosa de un agente aglutinante de células apropiado. Los agentes aglutinantes de células incluyen péptidos y no péptidos. Generalmente, estos pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales), linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas, moléculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina) o cualquier otra molécula o sustancia aglutinante de células.

Los ejemplos más específicos de agentes aglutinantes de células que pueden utilizarse incluyen:

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fragmentos de anticuerpos tales como sFv, Fab, Fab' y F(ab')_{2} (Parham, 131 J. Immunol. 2895-2902 (1983); Spring et al., 113 J. Immunol. 470-478 (1974); Nisonoff et al., 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244 (1960));

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interferones (p. ej. \alpha, \beta, \gamma);

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linfocinas tales como IL-2, IL-3, IL-4 e IL-6;

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hormonas tales como insulina, TRH (hormonas de liberación de tirotropina), MSH (hormona estimulante de melanocitos), hormonas esteroides, tales como andrógenos y estrógenos;

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vitaminas tales como ácido fólico

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factores de crecimiento y factores estimulantes de colonias tales como EGF, TGF-\alpha, G-CSF, M-CSF y GM-CSF (Burgess, 5 Immunology Today 155-158 (1984)); y

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transferrina (O'Keefe et al., 260 J. Biol. Chem. 932-937 (1985)).

Las técnicas de anticuerpos monoclonales permiten la producción de agentes aglutinantes de células sumamente específicos en forma de anticuerpos monoclonales específicos. Son particularmente bien conocidas en la materia las técnicas para crear anticuerpos monoclonales producidos inmunizando ratones, ratas, hámsteres o cualquier otro mamífero con el antígeno de interés tal como la célula diana intacta, antígenos aislados de la célula diana, virus completos, virus completos atenuados y proteínas víricas tales como las proteínas víricas del recubrimiento. Pueden utilizarse también células humanas sensibilizadas. Otro procedimiento de creación de anticuerpos monoclonales consiste en la utilización de bancos de fagos de sFv (zona variable de una sola cadena), específicamente sFv humana. (Véase p. ej. Griffiths et al., USP nº 5.885.793; McCafferty et al., documento WO 92/01047; Liming et al., documento WO 99/06587).

La selección del agente aglutinante de células apropiado es materia de selección que depende de la población celular en concreto a la que debe dirigirse, pero en general se prefieren anticuerpos monoclonales, si está disponible uno apropiado.

Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal J5 es un anticuerpo IgG_{2a} murino que es específico para Antígeno de Leucemia Linfoblástico Agudo Común (CALLA, de las iniciales en inglés) (Ritz et al., 283 Nature 583-585 (1980)) y pueden utilizarse si las células diana expresan CALLA tal como en la enfermedad de la leucemia linfoblástica aguda. Asimismo, el anticuerpo anti-B4 monoclonal es una IgG_{1} murina, que se une al antígeno CD19 en los linfocitos B (Nadler et al., 131 J. Immunol. 244-250 (1983)) y puede utilizarse si las células diana son linfocitos B o células enfermas que expresan a este antígeno tal como en el linfoma no hodgkiniano o la leucemia linfoblástica crónica.

Además, GM-CSF que se une a las células mieloides, puede utilizarse como agente aglutinante de células para las células enfermas de la leucemia mielógena aguda. IL-2, que se une a los linfocitos T activados, puede utilizarse para la prevención del rechazo del trasplante, para la terapia y prevención de la enfermedad trasplante contra huésped y para el tratamiento de la leucemia aguda de linfocitos T. MSH, que se une a melanocitos, puede utilizarse para el tratamiento de melanoma. El ácido fólico, que dirige el receptor de folato expresado en el ovario y en otros cánceres es también un agente aglutinante de células adecuado. Los cánceres de mama y de testículos pueden dirigirse con éxito con estrógeno (o análogos de estrógeno) o andrógeno (o análogos de andrógeno) respectivamente como agentes aglutinantes de células.

Los conjugados de doxorrubicinas/daunorrubicinas modificados de la invención y un agente aglutinante de células pueden formarse utilizando técnicas actualmente conocidas o desarrolladas más adelante. Numerosos procedimientos de conjugación se dan a conocer en la USP nº 5.416.064. Los éteres de morfolino pueden sintetizarse para dar un grupo amino libre y a continuación unirse a un anticuerpo o a otro agente aglutinante de células mediante un enlazador ácido lábil o un enlazador fotolábil. El morfolino (doxorrubicina/daunorrubicina) que contiene un grupo amino libre puede condensarse con un péptido y unirse posteriormente a un agente aglutinante de células para producir un enlazador de peptidasa lábil. El morfolino (doxorrubicina/daunorrubicina) que contiene el grupo hidroxilo libre puede sintetizarse a partir de doxorrubicina/daunorrubicina y ribitol y a continuación succinilarse y unirse a un agente aglutinante de células para producir un conjugado que puede ser escindido por esteraras intracelulares para liberar el fármaco libre. Más preferentemente, los éteres de doxorrubicina/daunorrubicina se tratan para crear un grupo tiol libre o protegido, y a continuación el disulfuro (o tiol) que contiene las doxorrubicinas/daunorrubicinas se unen al agente aglutinante de células mediante enlaces disulfuro.

Los conjugados representativos de la invención son doxorrubicina/daunorrubicina modificada por anticuerpos, doxorrubicina/daunorrubicina modificada por el factor de crecimiento epidérmico (EGF) de doxorrubicina/daunorrubi-
cina modificada por el fragmento de anticuerpos, doxorrubicina/daunorrubicina modificada por la hormona estimulante de melanocitos (MSH), doxorrubicina/daunorrubicina modificada por la hormona estimulante del tiroides (TSH), doxorrubicina/daunorrubicina modificada por estrógenos, doxorrubicina/daunorrubicina modificada por análogos de estrógeno, doxorrubicina/daunorrubicina modificada por andrógenos, doxorrubicina/daunorrubicina modificada por análogos de andrógenos y doxorrubicina/daunorrubicina modificada por folato.

Los conjugados con doxorrubicina/daunorrubicina modificados por anticuerpos, los fragmentos de anticuerpo, hormonas de proteínas o péptidos, factores de crecimiento de proteínas o péptidos y otras proteínas se preparan de la misma manera por procedimientos conocidos. Por ejemplo, los péptidos y anticuerpos pueden modificarse con reactivos de reticulación tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo, 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP), 4-succinimidil-oxicarbonil-\alpha-metil-\alpha-(2-piridil-ditio)-tolueno (SMPT), butirato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SDPB), 2-iminotiolano o anhídrido S-acetilsuccínico por procedimientos conocidos. Véase, Carlsson et al., 173 Biochem. J. 723-737 (1978); Blattler et al., 24 Biochem. 1517-1524 (1985); Lambert et al., 22 Biochem. 3913-3920 (1983); Klotz et al., 98 Arch. Biochem. Biophys. 805 (1982); y Liu et al., 18 Biochem. 690 (1979), Blakey y Thorpe, 1 Antibody, Immunoconjugates & Radiopharmaceuticals, 1-16 (1988), Worrell et al. 1 Anti-Cancer Drug Design 179-184 (1986). El agente aglutinante de células que contiene tiol protegido o libre derivado de este modo se hace reaccionar con una doxorrubicina/daunorrubicina que contienen tiol para producir conjugados. Los conjugados pueden purificarse por HPLC o por filtración en gel.

Asimismo, por ejemplo, los agentes aglutinantes de células con estrógeno y andrógeno tales como estradiol y androstenediol pueden esterificarse en el grupo hidroxi C-17 con un disulfuro apropiado que contiene ácido carboxílico utilizando, por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida como agente de condensación. Ejemplos de dichos ácidos carboxílicos que pueden emplearse son el ácido 3-(2-piridilditio)propanoico, ácido 3-metilditiopropanoico, ácido 4-(2-piridilditio)pentanoico y el ácido 3-fenilditiopropanoico. La esterificación del grupo C-17 puede también conseguirse por reacción con un grupo tiol protegido de manera apropiada que contiene cloruro de ácido carboxílico tal como el cloruro de 3-S-acetilpropanoilo. Pueden emplearse también otros procedimientos de esterificación como los descritos en la bibliografía (Haslam, 36 Tetrahedron 2409-2433 (1980)). El andrógeno o estrógeno protegido o que contiene tiol libre puede hacerse reaccionar a continuación con una doxorrubicina/daunorrubicina que contiene disulfuro o tiol para producir conjugados. Los conjugados pueden purificarse por cromatografía en columna en gel de sílice o por HPLC. El ácido fólico puede condensarse con una hidrazida adecuada tal como la hidrazida del ácido 4-(2-piridilditio)pentanoico en presencia de un agente de condensación tal como la diciclohexil carbodiimida para dar la hidrazona que contiene un disulfuro activo. El folato que contiene el disulfuro puede hacerse reaccionar a continuación con doxorrubicina/daunorrubicina que contiene tiol para producir un conjugado que puede purificarse por cromatografía en columna sobre gel de sílice o por HPLC.

Preferentemente los conjugados anticuerpo monoclonal- o agente aglutinante de células-doxorrubicina/daunorrubi-
cina son los que están unidos mediante un puente disulfuro, como se expuso anteriormente, que son capaces de liberar moléculas de doxorrubicina/daunorrubicina. Dichos conjugados aglutinantes de células se preparan por procedimientos conocidos tales como modificando anticuerpos monoclonales con ditiopropionato de succinimidilo piridilo (SPDP) (Carlsson et al., 173 Biochem. J. 723-737 (1978)). El grupo tiopiridilo resultante se desplaza a continuación por tratamiento con doxorrubicinas/daunorrubicinas que contienen tiol para producir conjugados unidos por disulfuro. Alternativamente, en el caso de las arilditio-doxorrubicinas/daunorrubicinas, la formación del conjugado aglutinante de células se efectúa por desplazamiento directo del aril-tiol de la doxorrubicina/daunorrubicina con grupos sulfhidrilo introducidos previamente en las moléculas de anticuerpo. Los conjugados que contienen de 1 a 10 fármacos con doxorrubicina/daunorrubicina unidos por un puente disulfuro se preparan fácilmente por ambos procedimientos.

Más específicamente, una solución del anticuerpo modificado con ditiopiridilo a una concentración de 1 mg/ml en tampón de fosfato potásico 0,1 M, a pH 6,5 que contiene EDTA 1 mM se trata con doxorrubicina/daunorrubicina que contiene tiol (equivalente molar 1,25/grupo ditiopiridilo). La liberación de tiopiridina del anticuerpo modificado se controla por espectrofotometría a 343 nm y es completa en aproximadamente 20 horas. El conjugado de doxorrubicina/daunorrubicina modificado con anticuerpo se purifica y se libera del fármaco sin reaccionar y de otro material de bajo peso molecular por filtración en gel a través de una columna de Sephadex G-25 o Sephacryl S300. El número de grupos modificados de doxorrubicina/daunorrubicina unidos por una molécula de anticuerpo puede determinarse midiendo la relación de la absorbancia a 280 nm y 490 nm. Una media de 1 a 10 moléculas de doxorrubicina/daunorrubicina modificadas/moléculas de anticuerpo puede unirse mediante enlaces disulfuro por este procedimiento.

Pueden prepararse también conjugados de doxorrubicina/daunorrubicina modificados por anticuerpos con enlaces no escindibles. El anticuerpo puede modificarse con agentes de reticulación tales como 4-(maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), sulfo-SMCC, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), sulfo-MBS o yodoacetato de succinimidilo, como se describe en la bibliografía, para introducir 1 a 10 grupos reactivos. Véase, Yoshitake et al., 101 Eur. J. Biochem. 395-399 (1979); Hashida et al., J. Applied Biochem. 56-63 (1984); y Liu et al., 18 Biochem. 690-697 (1979). El anticuerpo modificado se hace reaccionar a continuación con derivado de doxorrubicina/daunorrubicina que contiene tiol para producir un conjugado. El conjugado puede purificarse por filtración en gel a través de una columna Sephadex G-25.

Los anticuerpos modificados se tratan con las doxorrubicinas/daunorrubicinas que contienen tiol (1,25 equivalentes molares de grupo maleimido). Las mezclas se incuban durante la noche a aproximadamente 4ºC. Los conjugados de doxorrubicina/daunorrubicina modificados con anticuerpos se purifican por filtración en gel a través de una columna Sephadex G-25. Típicamente, se unen una media de 1 a 10 moléculas de doxorrubicina/daunorrubicina modificadas.

Un procedimiento preferido consiste en modificar anticuerpos con 4-(maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) para introducir los grupos maleimido seguido por reacción del anticuerpo modificado con las doxorrubicinas/daunorrubicinas que contienen tiol para dar el conjugado unido al tioéter. De nuevo resultan los conjugados que tienen 1 a 10 moléculas de fármaco por molécula de anticuerpo.

La citotoxicidad de las doxorrubicinas/daunorrubicinas modificada y sus conjugados de anticuerpo para las líneas celulares no adhesivas tales como Namalwa y HL-60 pueden medirse por retroextrapolación y las curvas de proliferación celular como las descritas en Goldmacher et al., 135 Immunol. 3648-3651 (1985). La citotoxicidad de estos compuestos para las líneas celulares adhesivas tales como SKBR3 y KB pueden determinarse mediante ensayos clonógenos como los descritos en Goldmacher et al., 102 J. Cell Biol. 1312-1319 (1986).

La presente invención proporciona también una composición terapéutica que comprende:

(A)

una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más doxorrubicinas/daunorrubicinas como las definidas anteriormente unidas a un agente aglutinante celular, y

(B)

un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El agente citotóxico se prepara como se describió anteriormente.

En los conjugados pueden evaluarse in vitro la potencia y la especificidad por los procedimientos descritos anteriormente (véase R. V. J. Chari et al., 55 Cancer Res. 4079-4084 (1995)). La actividad antitumoral puede evaluarse en modelos de xenotrasplante de tumor humano en ratones por los procedimientos descritos anteriormente (véase C. Liu et al., 93 Proc. Natl. Acad. Sci. 8618-8623 (1996)).

Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos y pueden ser determinados por los expertos en la materia como garantías de la situación clínica. Tal como se utiliza en la presente memoria, los vehículos incluyen diluyentes y excipientes.

Ejemplos de vehículos adecuados, diluyentes y/o excipientes incluyen: (1) solución salina tamponada por fosfato de Dulbecco, pH aproximadamente 7,4, que contiene o no aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml de albúmina de suero humano, (2) solución salina al 0,9% (NaCl al 0,9% p/v) y (3) dextrosa al 5% (p/v); y puede contener también un antioxidante tal como triptamina y un agente estabilizante tal como Tween 20.

Ejemplos de afecciones que pueden tratarse utilizando el compuesto o composición de la invención incluyen las enfermedades malignas de cualquier tipo incluyendo, por ejemplo, cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, riñón, páncreas, ovario y órganos linfáticos; enfermedades autoinmunitarias, tales como lupus generalizado, artritis reumatoide y esclerosis múltiple; rechazos de trasplante, tal como el rechazo de trasplante renal, rechazo de trasplante hepático, rechazo de trasplante pulmonar, rechazo de trasplante cardíaco y rechazo de trasplante de médula ósea; enfermedad injerto contra huésped; infecciones víricas, tales como la infección por mV, infección por VIH, SIDA, etc.; e infecciones por parásitos, tales como giardiosis, amebosis, esquistosomosis y otras determinadas por experto en la
materia.

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Ejemplos

La invención se ilustrará a continuación con relación a ejemplos no limitativos. A menos que se indique de otro modo, todos los porcentajes, relaciones, partes, etc. se expresan en peso.

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Ejemplo 1

Síntesis de morfolinodoxorrubicina que contiene disulfuro

En la Figura 3 se presenta esquemáticamente la síntesis de una morfolinodoxorrubicina representativa que contiene disulfuro. El ribitol (7), que está disponible en el mercado, se transforma en anhidrorribitol (8) por deshidratación catalizada por ácido. La protección del diol en (8) por transformación en el isopropilideno (9), seguida de la reacción del grupo hidroxilo libre con cloruro de metansulfonilo proporcionó el mesilato (10). La reacción de (10) con tioacetato de potasio proporcionó (11). La hidrólisis del tioéster con una base, seguida por intercambio del disulfuro del tiol en (12) con disulfuro de metilo proporcionó el metilditio, compuesto (13). El grupo protector isopropilideno se separó a continuación por hidrólisis ácida para dar 5-metilditio-(1,4-anhidro)ribitol (14). La oxidación con peryodato del diol proporcionó el dialdehído (15), que se trató in situ con doxorrubicina en presencia de cianoborohidruro de sodio para dar la metilditiomorfolinodoxorrubicina (16).

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Ejemplo 2

Ensayos de citotoxicidad in vitro

En los fármacos doxorrubicina/daunorrubicina de la invención que contienen sulfuro, disulfuro y sulfhidrilo puede evaluarse su capacidad para suprimir la proliferación de varias líneas celulares tumorales humanas in vitro. Se utilizan dos líneas celulares adherentes KB (carcinoma epidermoide humano) y SKBR3 (tumor de mama humano) y la línea celular no adherente, Namalwa (linfoma de Burkitt) para la evaluación de la citotoxicidad de estos compuestos. Se exponen las células a los compuestos durante 72 horas y se miden las fracciones de células supervivientes en ensayos directos. (Se ensaya la eficacia en cultivo de placa de petri de KB y SKBR3 (Goldmacher et al., 102 J. Cell. Biol. 1312-1319 (1986) y Namalwa se analizan mediante retroextrapolación del crecimiento (Goldmacher et al., 135 J. Immunol. 3648-3651 (1985)). Se calculan a continuación los valores IC_{50} a partir de estos datos.

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Ejemplo 3

Conjugación con anticuerpos Conjugación de doxorrubicinas/daunorrubicinas que contienen tiol con anticuerpos

Enlaces disulfuro: La conjugación de doxorrubicinas/daunorrubicinas que contienen tiol con anticuerpos mediante enlaces disulfuro se realiza en dos etapas. En la primera etapa se introducen grupos ditiopiridilo en los anticuerpos utilizando piridilditiopropionato de succinimidilo (SPDP) tal como describe Carlsson et al. Los grupos tiopiridilo se desplazan a continuación por reacción con la doxorrubicina/daunorrubicina que contiene tiol para producir un conjugado.

Preparación de conjugados de anticuerpo-SS-doxorrubicina/daunorrubicina. Los anticuerpos anti-B4, anti-T9 y N901 se modifican con SPDP o SPP como se describe en la bibliografía. Se introducen entre 1 y 10 grupos ditiopiridilo de promedio por molécula de anticuerpo.

Una solución del anticuerpo modificado con ditiopiridilo a una concentración de 1 mg/ml en tampón de fosfato potásico 0,1 M pH 6,5 que contiene EDTA 1 mM a 25ºC se trata con una doxorrubicina/daunorrubicina que contiene tiol (1,25 equivalentes molares/grupo ditiopiridilo). La liberación de tiopiridina del anticuerpo modificado se controla por espectrofotometría a 343 nm y se observa que es completa en aproximadamente 20 horas. El conjugado de doxorrubicina/daunorrubicina modificado por anticuerpos se purifica y se libera del fármaco sin reaccionar y de otro material de bajo peso molecular por filtración en gel a través de una columna de Sephadex G-25. El número de moléculas de doxorrubicina/daunorrubicina modificadas unidas por la molécula de anticuerpo se determina midiendo la relación entre las absorbancias a 280 nm y 490 nm. Un promedio de 1 a 10 moléculas de doxorrubicina/daunorrubicina modificadas por molécula de anticuerpo puede unirse mediante enlaces disulfuros por este procedimiento.

Conjugación de doxorrubicina/daunorrubicina modificada que contiene tiol a

Anticuerpos mediante un enlace tioéter no escindible: La conjugación de una doxorrubicina/daunorrubicina que contiene tiol se realiza en dos etapas. El anticuerpo se hace reaccionar en primer lugar con carboxilato de succinimidil maleimidometilciclohexano (SMCC) para introducir los grupos maleimido. El anticuerpo modificado se hace reaccionar a continuación con doxorrubicina/daunorrubicina que contiene tiol que forma enlaces tioéter.

Preparación de conjugados de doxorrubicina/daunorrobicina modificados con anticuerpos (no escindibles). Los anticuerpos anti-B4, anti-T9 y N901 se modifican con SMCC tal como se describe en la bibliografía.

Los anticuerpos modificados se tratan con doxorrubicina/daunorrubicina que contiene tiol (1,25 equivalentes molares/grupo maleimido). Se incuban las mezclas durante la noche a 4ºC. Los conjugados de doxorrubicina/daunorrubicina modificados con anticuerpos se purifican tal como se describió anteriormente. Típicamente se unen un promedio de 1 a 10 moléculas de doxorrubicina/daunorrubicina modificadas por molécula de anticuerpo.

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Ejemplo 4

Otros procedimientos de enlace de doxorrubicinas/daunorrubicinas Enlazadores ácidos lábiles

Las morfolino doxorrubicinas/daunorrubicinas que contienen un sustituyente amino pueden sintetizarse por métodos normalizados descritos en la bibliografía química. Estas doxorrubicinas/daunorrubicinas que contienen el grupo amino pueden unirse a anticuerpos y a otros agentes aglutinantes de células mediante un enlazador ácido lábil como se describió anteriormente (Blättler et al., 24 Biochemistry, 1517-1524 (1985), patentes US nº 4.542.225, nº 4.569.789 y nº 4.764.368).

Enlazador fotolábil

El derivado de doxorrubicina/daunorrubicina que contiene el grupo amino descrito anteriormente puede unirse a agentes aglutinantes de células mediante un enlazador fotolábil como se describió anteriormente. (Senter et al., 42 Photochemistry and Photobiology, 231-237 (1985), patente US nº 4.625.014).

Enlazador lábil de peptidasa

La doxorrubicina/daunorrubicina que contiene el grupo amino descrita anteriormente puede unirse también a agentes aglutinantes de células mediante enlazadores espaciadores de péptido. Se ha demostrado anteriormente que los espaciadores de péptidos cortos entre los fármacos y los vehículos de proteínas macromoleculares son estables en el suero pero son hidrolizados fácilmente por las peptidasas lisosómicas intracelulares (Trouet et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci., 626-629 (1982)). La doxorrubicina/daunorrubicina que contiene el grupo amino puede condensarse con péptidos tales como Ala-Leu, Leu-Ala-Leu y Ala-Leu-Ala-Leu utilizando agentes de condensación tal como 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etil carbodiimida-HCl para dar un derivado peptídico de doxorrubicina/daunorrubicina que puede unirse a continuación a los agentes aglutinantes de células.

Enlazador lábil de esterasa

Las morfolino doxorrubicinas/daunorrubicinas pueden esterificarse mediante la reacción del grupo hidroxilo con anhídrido succínico y a continuación unirse a un agente aglutinante de células para producir un conjugado que puede escindirse mediante esterasas intracelulares para liberar el fármaco libre. (Para ejemplos véase: Aboud-Pirak et al., 38 Biochem. Pharmacol. 641-648 (1989), Laguzza et al., 32 J. Med. Chem. 549-555 (1989)).

Ejemplo 5

Cultivos celulares y ensayos de citotoxicidad in vitro

Células de la línea celular de leucemia promielocítica humana, HL-60 (ATCC CCL 240) y de la línea celular Namalwa del linfoma de Burkitt (ATCC CRL 1432) se cultivan como cultivos en suspensión en medio de cultivo RPMI-1640 enriquecido con suero de ternero fetal al 10% y L-glutamina 2 mM. Todas las demás líneas celulares descritas a continuación se cultivan como cultivos adherentes. La línea celular de carcinoma epidermoide humano, KB (ATCC CCL 17), la línea celular A498 de carcinoma renal humano (ATCC HTB 44), las líneas celulares SW620 (ATCC CCL 227) y HT-29 (ATCC HTB 38) de adenocarcinoma de colon humano se cultivan en medio RPMI 1640 enriquecido con suero de ternero fetal al 10% y L-glutamina 2 mM. Las células SKBR3 de carcinoma de mama humano (ATCC HTB 30) se cultivan en DMEM enriquecido con suero de ternero fetal al 15% que contiene glutamina 2 mM y la línea celular OVCAR3 (ATCC HTB 161) de adenocarcinoma de ovario humano se cultiva en medio RPMI-1640 enriquecido con suero de ternero fetal al 10% que contiene 10 \mug/ml de insulina y L-glutamina 2 mM.

Se utilizan tres anticuerpos diferentes para la conjugación mediante enlaces disulfuro con doxorrubicinas/daunorru-
bicinas que contienen tiol. Se preparan conjugados con los anticuerpos anti-B4, que está contra el antígeno CD19 de linfocitos B; anti-T9 (5E9) que es un anticuerpo receptor de transferrina anti-humano, y N901, que es un anticuerpo de cáncer pulmonar microcítico anti-humano.

Se realizan ensayos de citotoxicidad en los medios respectivos descritos anteriormente. La citotoxicidad de las doxorrubicinas/daunorrubicinas modificada y sus conjugados de anticuerpo para las células HL-60 y de Namalwa se miden por retroextrapolación de las curvas de proliferación celular. La citotoxicidad de estos compuestos para el resto de las líneas celulares se determina mediante ensayo clonogénico como se describió anteriormente.

Se evalúa la citotoxicidad in vitro de los conjugados y de determinan los valores de IC_{50} para las líneas celulares.

Ejemplo 6

Determinación de la afinidad específica de los conjugados de doxorrubicina/daunorrubicina modificados por anticuerpos

Las afinidades específicas de los conjugados de doxorrubicina/daunorrubicina modificados con N901 unidos a disulfuro se analizan mediante ensayos de unión competitiva. La competición de la unión del anticuerpo marcado con FITC con células NCI N417 y NCI H69 por conjugados de doxorrubicina/daunorrubicina modificados con anticuerpo no marcado y anticuerpo se determinan por inmunofluorescencia directa en un FACS de Becton-Dickinson. Se cultivan las dos líneas celulares como células adherentes en matraces de grado de cultivo tisular que contienen medio esencial mínimo modificado por Dulbecco con suero de ternero bovino fetal al 15%. A continuación se tripsimizan las células y se incuban en suspensión, a 37ºC, durante 30 minutos en el mismo medio en matraces de grado de cultivo no tisular para impedir la adherencia de las células al plástico. Las células se transfieren a continuación a pocillos de placas de 96 pocillos y se vuelven a poner en suspensión en medio esencial mínimo que contiene suero humano mezclado al 25%. Se incuban suspensiones de células (0,2 ml de suspensión que contiene 100.000 células/pocillo) se incuban con anticuerpo N901 marcado con FITC 6 nM, a concentraciones variables de anticuerpo no marcado o conjugados de doxorrubicina/daunorrubicina modificados durante 1 hora a 0ºC. Las células se lavan a continuación una vez con tampón y se fijan con formaldehído al 1% en solución salina tamponada con fosfato. Se mide la fluorescencia celular media en un FACS.

Claims (16)

1. Compuesto que comprende un grupo de enlace R o R' representado por la fórmula (I):

2

en la que,

X es H u OH;

Y es O o NR_{2}, en el que R_{2} es alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono;

R es un grupo de enlace, H, o alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono; y

R' es un grupo de enlace, H, u -OR^{1}, en el que R^{1} es alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono;

en el que el grupo de enlace es una fracción que contiene tiol o disulfuro, o en un éter de morfolino es un grupo amino libre para unirse a un agente aglutinante de células mediante un enlace ácido lábil o fotolábil o para condensar con un péptido y enlazar con un agente aglutinante de células mediante un enlace lábil de peptidasa, o es un grupo hidroxi succinilado para unirse a un agente aglutinante de células mediante un enlace lábil de esterasa intracelular;

con la condición de que R y R' no sean grupos de enlace al mismo tiempo.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que X es H.

3. Compuesto según la reivindicación 1, en el que X es OH.

4. Compuesto según la reivindicación 1, en el que el grupo de enlace es una fracción que contiene tiol o disulfuro.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cadena lateral que lleva el grupo tiol o disulfuro es lineal o ramificada, aromática o heterocíclica.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 ó 5, en el que el grupo de unión es -(CH_{2})_{n}SZ, -O(CH_{2})_{n}SZ, -(CH_{2})_{n}CH(CH_{3})SZ, -O(CH_{2})_{n}CH(CH_{3})SZ, -(CH_{2})_{n}C(CH_{3})_{2}SZ u -O(CH_{2})_{n}C(CH_{3})_{2}SZ, en las que

Z es H o SR_{3}, en la que R_{3} es alquilo, lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, o arilo sencillo o sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o heterocíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, y

n es un número entero de 1 a 10.

7. Compuesto según la reivindicación 1, en el que NR^{2} es NCH_{3}.

8. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R' es -OCH_{3}.

9. Compuesto según la reivindicación 1, en el que R es H o alquilo, R^{1} es -OCH_{2}CH_{2}CH(Me)SH u -OCH_{2}CH_{2}CH(Me)SZ, o en el que cuando R es CH_{2}SH o CH_{2}CH(Me)SH o (CH_{2})_{n}SZ o CH_{2}CH(Me)SZ, R' es H u OR^{1}.

10. Compuesto de la reivindicación 1, en el que R, R^{1} o R^{2} se seleccionan de entre metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n, iso, sec o terc-butilo o pentilo.

11. Uno o más compuestos unidos por enlaces covalentes a un agente aglutinante celular mediante un grupo de enlace, para su utilización como agente citotóxico en el que por lo menos uno de dichos compuestos es un compuesto que comprende un grupo de enlace R o R´ y está representado por la fórmula (I):

3

en la que,

X es H u OH;

Y es O o NR_{2}, en el que R_{2} es alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono;

R es un grupo de enlace, H, o alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono; y

R' es un grupo de enlace, H, u -OR^{1}, en el que R^{1} es alquilo lineal o ramificado que tiene 1 a 5 átomos de carbono;

en el que el grupo de enlace es una fracción que contiene tiol o disulfuro, o en un éter de morfolino es un grupo amino libre para unirse a un agente aglutinante de células mediante un enlace ácido lábil o fotolábil o para condensar con un péptido y enlazar con un agente aglutinante de células mediante un enlace lábil de peptidasa, o es un grupo hidroxi succinilado para unirse a un agente aglutinante de células mediante un enlace lábil de esterasa intracelular;

con la condición de que R y R' no sean grupos de enlace al mismo tiempo.

12. Uno o más compuestos unidos por enlace covalente a un agente aglutinante de células mediante un grupo de unión según la reivindicación 11, en el que uno o más compuestos que presenta(n) la fórmula (I) es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10.

13. Uno o más compuestos unidos por enlace covalente a un agente aglutinante de células mediante un grupo de unión según la reivindicación 10, en el que un agente aglutinante de células se selecciona de entre no péptidos, preferentemente anticuerpos, linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas y moléculas transportadoras de nutrientes.

14. Composición para su utilización como agente terapéutico, que comprende:

(A)

una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más compuestos unidos por enlace covalente a un agente aglutinante de células mediante un grupo de unión para su utilización como agente citotóxico según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13; y

(B)

un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Procedimiento de destrucción de poblaciones seleccionadas de células in vitro o ex vivo en modelos para evaluar la potencia o especificidad que comprende poner en contacto las células diana o el tejido que contienen células diana con una cantidad eficaz de uno o más compuestos unidos por enlace covalente a un agente aglutinante celular mediante un grupo de unión para su utilización como agente citotóxico según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

16. Utilización de una cantidad eficaz de uno o más compuestos unidos por enlace covalente a un agente aglutinante celular mediante un grupo de unión para su utilización como agente citotóxico según la reivindicación 11 como ingrediente activo para la preparación de una composición destinada a la destrucción de poblaciones celulares seleccionadas en células diana o tejidos que contienen células diana.