ES2371083T3 - Anticuerpos dirigidos contra la angiopoyetina-2 y usos de los mismos. - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 81 y una cadena pesada variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 79.

Description

Anticuerpos dirigidos contra la angiopoyetina-2 y usos de los mismos
CAMPO
La invención se refiere a anticuerpos monoclonales contra la angiopoyetina-2 (Ang-2) y a usos de este tipo de
5 anticuerpos. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos monoclonales totalmente humanos dirigidos contra Ang-2 y a usos de estos anticuerpos. Aspectos de la invención se refieren también a hibridomas o a otras líneas celulares que expresan este tipo de anticuerpos. Los anticuerpos descritos son útiles como agentes de diagnóstico y para el tratamiento de enfermedades asociadas con la actividad y/o supraproducción de Ang-2.
ANTECEDENTES
10 La angiogénesis es el proceso de formar nuevos capilares a partir de vasos sanguíneos pre-existentes, y es un componente esencial de la embriogénesis, el desarrollo normal fisiológico, la reparación y expansión de tumores. A pesar de que una diversidad de factores pueden modular respuestas de células endoteliales (CE) in vitro y el crecimiento de vasos sanguíneos in vivo, se piensa que únicamente miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF – siglas en inglés) y las angiopoyetinas actúan casi exclusivamente sobre BCs vasculares.
15 Yancopoulos et al., Nature 407:242-48 (2000).
Las angiopoyetinas fueron descubiertas como ligandos para los Ties, una familia de tirosina quinasas que es expresada selectivamente dentro del endotelio vascular. Yancopoulos et al., Nature 407:242-48 (2000). Existen ahora cuatro miembros definitivos de la familia de las angiopoyetinas. Angiopoyetina-3 y -4 (Ang-3 y Ang-4) pueden representar homólogos ampliamente divergentes del mismo locus del gen en ratones y el hombre. Kim et al., FEBS 20 Let; 443:353-56 (1999); Kim et al., J. Biol. Chem 274:26523-28 (1999). Ang-1 y Ang-2 fueron originalmente identificados en experimentos de cultivo tisular como agonistas y antagonistas, respectivamente. Davis et al., Cell 87:1161-69 (1996); Maisonpierre et al., Science 277: 55-60 (1997). Todas las angiopoyetinas conocidas se unen principalmente a Tie2, y tanto Ang-1 como -2 se unen a Tie2 con una afinidad de 3 nM (Kd), Maisonpierre et al., Science 277: 55-60 (1997). Ang-1 demostró soportar la supervivencia de CE y fomentar la integridad del endotelio, 25 Davis et al., Cell 87: 1161-69 (1996); Kwak et al., FEBS Lett 448: 249-53 (1999); Suri et al., Science 282: 468-71 (1998); Thurston et al., Science 286: 2511-14 (1999); Thurston et al., Nat. Med. 6: 460-63 (2000), mientras que Ang2 tenía el efecto opuesto y fomentaba la desestabilización y regresión de los vasos sanguíneos en ausencia de los factores de supervivencia VEGF o del factor de crecimiento de fibroblastos básico. Maisonpierre et al., Science 277: 55-60 (1997). Sin embargo, muchos estudios de la función de Ang-2 han sugerido una situación más compleja. Ang30 2 podría ser un regulador complejo de la remodelación vascular que juega un papel tanto en el brote de los vasos como en la regresión de los vasos. Análisis de expresión que sustentan dichos papeles para Ang-2 revelan que Ang2 es rápidamente inducida, junto con VEGF, en estipulaciones adultas de brotes angiogénicos, mientras que Ang-2 es inducida en ausencia de VEGF en estipulaciones de regresión vascular. Holash et al., Science 284: 1994-98 (1999); Holash et al., Oncogene 18: 5356-62 (1999). Consistente con un papel dependiente del contexto, Ang-2 se
35 une al mismo receptor específico endotelial Tie-2, que es activado por Ang-1, pero que tiene efectos dependientes del contexto sobre su activación. Maisonpierre et al., Science 277: 55-60 (1997).
Ensayos de la angiogénesis de la córnea han demostrado que tanto Ang-1 como Ang-2 tenían efectos similares, actuando sinérgicamente con VGEF para fomentar el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Asahara et al., Circ. Res. 83: 233-40 (1998). La posibilidad de que existiera una respuesta endotelial dependiente de la dosis fue
40 planteada por la observación de que in vitro a elevada concentración, Ang-2 puede también ser pro-angiogénica. Kim et al., Oncogene 19: 4549-52 (2000). A una elevada concentración, Ang-2 actúa como un factor de la supervivencia de la apoptosis para células endoteliales durante la apoptosis por privación de suero a través de la activación de Tie2 a través de la vía de la quinasa PI-3 y Akt. Kim et al., Oncogene 19: 4549-52 (2000).
Otros experimentos in vitro sugirieron que durante exposición continua, los efectos de Ang-2 pueden cambiar
45 progresivamente desde los de un antagonista a un agonista de Tie2, y en instantes posteriores, pueden contribuir directamente a la formación del tubo vascular y a una estabilización neovascular. Teichert-Kuliszewska et al., Cardiovasc. Res. 49: 659-70 (2001). Además, si las CEs se cultivaban en gel de fibrina, también se observó una activación de Tie2 con Ang-2, sugiriendo quizás que la acción de Ang-2 podría depender del estado de diferenciación de CE. Teichert-Kuliszewska et al., Cardiovasc. Res. 49: 659-70 (2001). En CE microvasculares cultivadas en un gel
50 de colágeno tridimensional, Ang-2 puede también inducir la activación de Tie2 y fomentar la formación de estructuras similares a capilares. Mochizuki et al., J. Cell. Sci. 115: 175-83 (2002). El uso de un co-cultivo esferoidal en 3-D como un modelo in vitro de la maduración de los vasos demostró que el contacto directo entre CEs y células mesenquimales abroga la capacidad de respuesta a VEGF, mientras que la presencia de VEGF y Ang-2 inducía el brote. Korff et al., Faseb J. 15: 447-57 (2001). Etoh et al. demostraron que las CEs que expresan constitutivamente
55 Tie2, la expresión de MMP-1, -9 y u-PA fueron fuertemente suprarreguladas por parte de Ang-2 en presencia de VEGF. Etoh et al., Cancer Res. 61: 2145-53 (2001). Con un modelo de membrana pupilar in vivo, Lobov et al.,
demostraron que Ang-2, en presencia de VEGF endógeno, fomenta un aumento rápido en el diámetro capilar, remodelando la lámina basal, la proliferación y migración de células endoteliales y estimula el brote de nuevos vasos sanguíneos. Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 11205-10 (2002). En contraposición, Ang-2 fomenta la muerte de células endoteliales y la regresión de los vasos sin VEGF endógeno. Lobov et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11205-10 (2002). De manera similar, con un modelo de tumores in vivo Vajkoczy et al. demostraron que agregados multicelulares inician el crecimiento vascular mediante el brote angiogénico a través de la expresión simultánea de VEGFR-2 y Ang-2 por parte del hospedante y del endotelio del tumor. Vajkoczy et al., J. Clin. Invest.
109: 777-85 (2002). Este modelo ilustraba que la microvasculatura establecida de tumores en desarrollo se caracteriza por una remodelación continua, mediada supuestamente por la expresión de VEGF y Ang-2. Vajkoczy et al., J. Clin. Invest. 109: 777-85 (2002).
Estudios en ratones inactivados de Tie-2 y angiopoyetina-1 muestran fenotipos similares, y sugieren que la fosforilación de Tie-2 estimulada por angiopoyetina-1 media en la remodelación y estabilización de vasos en desarrollo, fomentando la maduración de vasos sanguíneos durante la angiogénesis y el mantenimiento de la adhesión de células sustentada por células endoteliales (Dumont et al., Genes & Development, 8: 1897-1909 (1994), Sato, Nature, 376:70-74 (1995); (Thurston, G. et al., 2000 Nature Medicine: 6, 460-63)). Se piensa que el papel de angiopoyetina-1 se conserva en el adulto, en donde se expresa ampliamente y de forma constitutiva (Hanahan, Science, 277: 48-50 (1997); Zagzag, et al., Exp Neurology, 159:391-400 (1999)). En contraposición, la expresión de angiopoyetina-2 está principalmente limitada a sitios de remodelación vascular en donde se piensa que bloquea la estabilización constitutiva o la función de maduración de angiopoyetina-1, permitiendo que se inviertan los vasos y que permanezcan en un estado plástico que pueda tener una mayor respuesta a señales de brote (Hanahan, 1997; Holash et al., Oncogene 18: 5356-62 (1999); Maisonpierre, 1997). Estudios de la expresión de la angiopoyetina-2 en angiogénesis patológica han encontrado que muchos tipos de tumores muestran una expresión vascular de angiopoyetina-2 (Maisonpierre et al., Science 277: 55-60 (1997)). Estudios funcionales sugieren que la angiopoyetina-2 está implicada en la angiogénesis de tumores y asocian la sobreexpresión de angiopoyetina-2 con un crecimiento incrementado del tumor en un modelo de xenoinjerto en ratones (Ahmad, et al., Cancer Res., 61: 1255-1259 (2001)). Otros estudios han asociado la sobreexpresión de angiopoyetina-2 con una hipervascularidad del tumor (Etoh et al., Cancer Res. 61: 2145-53 (2001); Tanaka et al., Cancer Res. 62 : 7124-29 (2002)).
En los últimos años, angiopoyetina-1, angiopoyetina-2 y/o Tie-2 han sido propuestos como posibles dianas terapéuticas anti-cancerígenas. Por ejemplo, los documentos US6166185, US5650490 y US5814464 describe cada uno anticuerpos de ligandos y receptor anti-Tie-2. Se ha informado que estudios que utilizan Tie-2 soluble disminuyen el número y tamaño de los tumores en roedores (Lin, 1997; Lin, 1998). Siemester et al., (1999) generaron líneas celulares de melanoma humano que expresan el dominio extracelular de Tie-2, inyectaron éstas en ratones desnudos e informaron que Tie-2 soluble daba como resultado una inhibición importante del crecimiento del tumor y de la angigénesis del tumor. Dado que angiopoyetina-1 y angiopoyetina-2 se unen a Tie-2, no resulta claro de estos estudios si la angiopoyetina-1, angiopoyetina-2 o Tie-2 serían una diana atractiva para la terapia anticancerígena. Sin embargo, se piensa que una terapia anti- angiopoyetina-2 eficaz sería de beneficio para tratar enfermedades tales como cáncer, en las que el progreso depende de una angiogénesis aberrante en que el bloqueo del proceso puede conducir a la prevención del avance de la enfermedad (Folkman, J. Nature Medicine. 1: 27-31 (1995). Además, algunos grupos han informado del uso de anticuerpos que se unen a angiopoyetina-2, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.166.185 y la solicitud de patente de EE.UU. nº de publicación 2003/0124129 A1. El estudio del efecto de la expresión focal de la angiopoyetina-2 ha demostrado que el antagonizar la señal de angiopoyetina-1/Tie-2 relaja la estrecha estructura vascular, exponiendo con ello las CEs a señales de activación procedentes de inductores de la angiogénesis, p. ej. VEGF (Hanahan, 1997). Este efecto pro-angiogénico, que resulta de la inhibición de angiopoyetina-1, indica que una terapia anti-angiopoyetina-1 no sería un tratamiento eficaz anticáncer.
Ang-2 se expresa durante el desarrollo en sitios en los que se está produciendo la remodelación de los vasos sanguíneos. Maisonpierre et al., Science 277: 55-60 (1997). En individuos adultos, la expresión de Ang-2 está limitada a sitios de la remodelación vascular así como en tumores muy vascularizados, incluido el glioma, Osada et al., Int. J. Oncol. 18: 305-09 (2001); Koga et al., Cancer Res. 61: 6248-54 (2001), carcinoma hepatocelular, Tanaka et al., J. Clin. Invest. 103: 341-45 (1999), carcinoma gástrico, Etoh et al., Cancer Res. 61: 2145-53 (2001); Lee et al, Int. J. Oncol. 18: 355-61 (2001), tumor del tiroides, Bunone et al., Am J Pathol 155: 1967-76 (1999), cáncer de pulmón de células no pequeñas, Wong et al., Lung Cancer 29: 11-22 (2000) y cáncer de colon, Ahmad et al., Cancer
92: 1138-43 (2001) y de próstata, Wurmbach et al., Anticancer Res. 20: 5217-20 (2000). Se encuentra que algunas células tumorales expresan Ang-2. Por ejemplo, Tanaka et al., J. Con. Invest. 103: 341-45 (1999) detectaron ARNm de Ang-2 en 10 de 12 muestras de carcinoma hepatocelular humano (HCC). El grupo de Ellis informó que Ang-2 se expresa de forma ubiqua en el epitelio tumoral. Ahmad et al., Cancer 92: 1138-43 (2001). Otros investigadores informaron de hallazgos similares. Chen et al., J. Tongji Med. Univ. 21: 228-30, 235 (2001). Al detectar niveles de ARNm de Ang-2 en muestras de cáncer de mama humano archivadas, Sfilogoi et al., Int. J. Cancer 103: 466-74 (2003) informaron que el ARNm de Ang-2 está significativamente asociado con una invasión del nódulo linfático auxiliar, un breve tiempo libre de enfermedades y una deficiente supervivencia general. Tanaka et al., Cancer Res.
62: 7124-29 (2002) revisaron un total de 236 pacientes de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) con fase I a IIIA patológicas, respectivamente. Utilizando la inmunohistoquímica, encontraron que el 16,9% de los pacientes con NSCLC eran Ang-2 positivos. La densidad de microvasos para tumores Ang-2 positivos es significativamente más elevada que para Ang-2 negativos. Un efecto angiogénico de este tipo de Ang-2 se observó solamente cuando la expresión de VEGF era elevada. Además de ello, la expresión positiva de Ang-2 era un factor significativo para predecir una deficiente supervivencia postoperatoria. Tanaka et al., Cancer Res. 62: 7124-29 (2002). Sin embargo, éstos no encontraron correlación significativa alguna entre la expresión de Ang-1 y la densidad de los microvasos. Tanaka et al., Cancer Res. 62: 7124-29 (2002). Estos resultados sugieren que Ang-2 es un indicador de un deficiente pronóstico de pacientes con varios tipos de cáncer.
Recientemente, utilizando un modelo de ratón inactivado con Ang-2, el grupo de Yancopoulos informó que Ang-2 es requerida para la angiogénesis postnatal. Gale et al., Dev. Cell 3: 411-23 (2002). Estos demostraron que la regresión programada en el desarrollo de la vasculatura hialoide en el ojo no se produce en los ratones Ang-2-/- y sus vasos sanguíneos de la retina no brotan de la arteria retinal central. Gale et al., Dev. Cell 3: 411-23 (2002). También encontraron que la deleción de Ang-2 tiene como resultado defectos profundos en el modelado y la función de la vasculatura linfática. Gale et al., Dev. Cell 3: 411-23 (2002). El rescate genético con Ang-1 corrige los defectos linfáticos, pero no los defectos de la angiogénesis. Gale et al., Dev. Cell 3: 411-23 (2002).
Peters y sus colegas informaron que Tie2 soluble, cuando se administra en forma de una proteína recombinante o en un vector de expresión viral, inhibía el crecimiento in vivo de carcinoma mamario murino y el melanoma en modelos de ratones. Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8829-34 (1998); Lin et al., J. Clin. Invest. 100 : 2072-78 (1997). Las densidades vasculares en los tejidos tumorales, así tratados, fueron grandemente reducidas. Además, Tie2 soluble bloqueaba la angiogénesis en la córnea de rata estimulada por los medios acondicionados de las células tumorales. Lin et al., J. Clin. Invest. 100: 2072-78 (1997). Además de ello, Isner y su equipo demostraron que la adición de Ang-2 a VEGF fomentaba significativamente la neovascularidad más prolongada y más circunferencial que VEGF sólo. Asahara et al., Circ. Res. 83: 233-40 (1998). El receptor Tie2 soluble en exceso excluía la modulación de la neovascularización inducida por VEGF por parte de Ang-2. Asahara et al., Circ. Res. 83: 333-40 (1998). Siemeister et al., Cancer Res. 59: 3185-91 (1999) demostraron con xenoinjertos de ratones desnudos que la sobreexpresión de los dominios de unión al ligando extracelulares de Flt-1 o Tie2 en los xenoinjertos resulta en una inhibición significativa de la vía no se podía compensar por parte del otro, sugiriendo que la vía del receptor de VEGF y la vía de Tie2 deberían considerarse como dos mediadores independientes, esenciales para el proceso de la angiogénesis in vivo. Siemeister et al., Cancer Res. 59: 3185-91 (1999). Esto se demuestra por una publicación más reciente de White et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5028-33 (2003). En su estudio, se demostró que un aptámero de ARN resistente a nucleasa que se une específicamente e inhibe Ang-2, inhibía significativamente la neovascularización inducida por bFGF en el modelo de angiogénesis del microbolsillo corneal en rata.
SUMARIO
Realizaciones de la invención se refieren a agentes de unión dirigidos que se unen específicamente a angiopoyetina2 y que en ella inhiben la angiogénesis del tumor y reducen el crecimiento del tumor. Mecanismos mediante los cuales se puede conseguir esto pueden incluir y no están limitados a la inhibición de la unión de Ang-2 a su receptor Tie2, la inhibición de la señalización de Tie2 inducida por Ang-2 o el aclaramiento incrementado de Ang-2, reduciendo en ella la concentración efectiva de Ang-2.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un fragmento de unión a anticuerpo o antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 en esta memoria.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un fragmento de unión a anticuerpo o antígeno aislado de acuerdo con la reivindicación 3 en esta memoria.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un fragmento de unión a anticuerpo o antígeno de acuerdo con la reivindicación 4 en esta memoria.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un fragmento de unión a anticuerpo o antígeno de acuerdo con la reivindicación 5 en esta memoria.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un fragmento de unión a anticuerpo o antígeno de acuerdo con la reivindicación 6 en esta memoria.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un uso de un fragmento de unión a anticuerpo
o antígeno de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor maligno.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un fragmento de unión a anticuerpo o antígeno de la invención para uso en el tratamiento de un tumor maligno.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo totalmente humano que une a Ang-2 y que presenta la unión de Ang-2 a Tie2. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal totalmente humano que se une a Ang-2 y Ang-1, y que también inhibe la fosforilación de Tie2 inducida por Ang-2. El anticuerpo puede unir Ang-2 con una Kd menor que 100 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM o 5 pM.
El anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos de cadena pesada con una región determinante de la complementaridad (CDR – siglas en inglés) con una de las secuencias mostradas en la Tabla 11. Se señala que los expertos ordinarios en la técnica pueden conseguir fácilmente determinaciones de la CDR. Véase, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, NIB Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols 1-3. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal totalmente humano.
El tumor maligno se puede seleccionar del grupo que consiste en melanoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma hepatocelular (del hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (del estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer pancreático y carcinoma epidermoide.
Realizaciones de la invención descritas en esta memoria se refieren a anticuerpos monoclonales que unen Ang-2 y que afectan a la función de Ang-2. Otras realizaciones se refieren a anticuerpos anti-Ang-2 totalmente humanos y a preparados de anticuerpos anti-Ang-2 que con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica, incluida la afinidad de unión a Ang-2, la capacidad de neutralizar Ang-2 in vitro e in vivo, y la capacidad de inhibir la angiogénesis inducida por Ang-2.
En una realización preferida, anticuerpos descritos en esta memoria se unen a Ang-2 con afinidades muy elevadas (Kd). Por ejemplo, un anticuerpo humano, de conejo, de ratón quimérico o humanizado, que es capaz de unir Ang-2 con una Kd menor que pero no limitada a 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-11, 10-12, 10-13 ó 10-14 M, o cualquier intervalo o valor dentro de ellos. La afinidad y/o las mediciones de la avidez pueden medirse mediante KinExA® y/o BIACORE®, según se describe en esta memoria.
Por consiguiente, una realización descrita en esta memoria incluye anticuerpos aislados o fragmentos de esos anticuerpos, que se unen a Ang-2. Tal como se conoce en la técnica, los anticuerpos pueden ser, ventajosamente, por ejemplo, anticuerpos policlonales oligoclonales, monoclonales, químericos humanizados y/o totalmente humanos.
En una realización de la invención, el anticuerpo se une a y neutraliza angiopoyetina-2 y también se une a y neutraliza angiopoyetina-1.
Se apreciará que las realizaciones de la invención no están limitadas a ninguna forma particular de un anticuerpo o método de generación o producción. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Ang-2 puede ser un anticuerpo de longitud completa (p. ej. que tiene una región Fc humana intacta) o un fragmento de anticuerpo (p. ej. Fab, Fab’ o F(ab’)2). Además, el anticuerpo se puede fabricar a partir de un hibridoma que segrega el anticuerpo o a partir de una célula producida de forma recombinante que ha sido transformada o transfectada con un gen o genes que codifican el anticuerpo.
La inhibición de la actividad biológica de Ang-2 puede presentar una angiogénesis inducida por Ang-2 y otros efectos deseados.
Ang-2 es un importante “interruptor de encendido” de la angiogénesis. Por consiguiente, se espera que al antagonizar esta molécula, ésta inhiba procesos patofisiológicos y, con ello, actúe como una potente terapia para diversas enfermedades dependientes de la angiogénesis. Además de tumores sólidos y sus metástasis, malignidades hematológicas tales como leucemias, linfomas y mieloma múltiple, son también dependientes de la angiogénesis. Un crecimiento vascular excesivo contribuye a numerosos trastornos no neoplásticos. Estas enfermedades dependientes de la angiogénesis no neoplástica incluyen: aterosclerosis, hemangioma, hemangioendotelioma, angiofibroma, malformaciones vasculares (p. ej. teleangiectasia hemorrágica hereditaria (HHT) o síndrome de Osler-Weber), verrugas, granulomas piógenos, crecimiento excesivo del cabello, sarcoma de Kaposis, cicatrices queloides, edema alérgico, psoriasis, hemorragia uterina disfuncional, cistes foliculares, hiperestimulación de los ovarios, endometriosis, distrés respiratorio, ascites, esclerosis peritoneal en pacientes de diálisis, formación de adherencias que resultan de una cirugía abdominal, obesidad, artritis reumatoide, sinovitis, osteomielitis, crecimiento del panus, osteofito, articulaciones hemófilas, procesos inflamatorios e infecciosos (p. ej. hepatitis, neumonía, glomerulonefritis), asma, pólipos nasales, regeneración del hígado, hipertensión pulmonar, retinopatía de premadurez, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, leucomalacia, glaucoma neovascular, neovascularización de injerto corneal, tracoma, tiroiditis, ampliación del tiroides y trastornos linfoproliferativos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es una transferencia Western que muestra que los anticuerpos monoclonales (mAbs) Ang-2 inhiben la fosforilación inducida por Ang-2 de Tie2 ectópicamente expresada en células HEK293F.
La Figura 2 es una gráfica lineal de la relación dosis-respuesta de anticuerpos monoclonales anti-Ang-2 sobre la inhibición de la fosforilación de Tie2 inducida por Ang-2.
La Figura 3 es una gráfica lineal que muestra la inhibición tanto de Ang-1 (gráfica superior) como de Ang-2 (gráfica inferior) que se une a Tie2 de una manera dependiente de la dosis utilizando el mAb 3.19.3 o Tie2/Fc.
La Figura 4 es una transferencia Western que muestra la inhibición de la fosforilación de Tie-2 estimulada por angiopoyetina-1 sobre células endoteliales Eahy 926 por parte del mAb.3.19.3. En este sistema se observa la inhibición de la fosforilación de Tie-2 inducida por angiopoyetina-1. Las concentraciones de anticuerpos se muestran en nM.
La Figura 5 es una gráfica lineal que muestra la inhibición de la fosforilación de Tie-2 estimulada por angiopoyetina-1 en células endoteliales Eahy 926 por parte del mAb.3.19.3. La CI50 = 99 nM. El eje x es la concentración del mAb.
3.19.3 y el eje y indica la respuesta.
La Figura 6 es un diagrama esquemático de la estructura de la proteína de Ang-2 y Ang-2443 humana. Los números superiores indican las secuencias de aminoácidos (diagrama tomado de Injune el at., (2000) JBC 275: 18550).
La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos de una molécula quimérica de ratón/ser humano (SEQ ID NO: 1). Los residuos humanos (clonados como fragmento StuI-Tfil) 310-400 están subrayados.
La Figura 8 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de proteínas Ang-1 humana (SEQ ID NO:2), Ang-2 humana (SEQ ID NO: 3) y Ang-2 de ratón (SEQ ID NO: 4). Los puntos de fusión de moléculas quiméricas de Ang-2 y las mutaciones puntuales están señaladas en negrillas.
La Figura 9 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de Ang-1 de ratón (SEQ ID NO: 5), Ang-1 humana (SEQ ID NO: 2), Ang-2 de ratón (SEQ ID NO: 4) y Ang-2 humana (SEQ ID NO: 3). La cabeza de la flecha muestra el sitio de escisión para las secuencias conductoras hidrófobas. Las flechas definen los límites de la espiral enrollada y dominios similares a fibrinógeno. Los círculos en negro muestran los residuos cisteína conservados (imagen tomada de Maisonpierre et. al., 1997, Science 277: 55).
La Figura 10 es una gráfica lineal que demuestra la reactividad cruzada en ratones en una relación dosis-respuesta. Se muestran clones de los anticuerpos monoclonales 5.2.1, 5.28.1, 3.19.3 y 3.31.2
La Figura 11 es una gráfica lineal que muestra la inhibición tanto de Ang-2 humana (triángulos en negro) como de ratón (cuadrados en negro) de unirse a Tie2 humana de una manera dependiente de la dosis utilizando el mAb
3.19.3.
La Figura 12 es un análisis del histograma del efecto de anticuerpos sobre la angiogénesis inducida por células MCF-7. La Figura 12A muestra el efecto de anticuerpos anti-Ang-2 sobre el número de extremos de vasos sanguíneos, en donde el eje x indica los grupos experimentales y el eje y indica el número medio de extremos de vasos (+ D.E.- desviación estandar). La Figura 12B demuestra el efecto de anticuerpos anti-Ang-2 sobre la longitud de los vasos sanguíneos, en que el eje x indica los grupos experimentales y el eje y indica la longitud media de los vasos (+ D.E.).
La Figura 13 es una gráfica lineal que muestra el efecto antitumoral del clon 3.19.3 del anticuerpo monoclonal antiAng-2 según se ensaya en un modelo de xenoinjerto en ratones de carcinoma epidermoide de piel humano utilizando la línea de células A431. El eje x indica el número de días después de la implantación de células tumorales y el eje y indica el volumen medio del tumor +/- EMT (error medio típico) en cm3. Los triángulos en negro representan las mediciones del volumen del tumor post-implante de ratones a los que se les inyectó el clon 3.19.3 del anticuerpo monoclonal anti-Ang-2; los círculos en negro representan las mediciones del volumen de tumor post-implante de ratones a los que se les inyectó un anticuerpo control del isotipo PK1631.
La Figura 14A es una gráfica lineal que muestra la prevención del crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto LoVo de adenocarcinoma de colon humano con un tamaño del tumor indicado para ratones creados con 0,5, 2 y 10 mg/kg o el control del isotipo indicado. El eje x indica el número de días del implante de células post-tumor y el eje y indica el volumen medio del tumor, +/-EMT en cm3. La Figura 14B es una gráfica lineal que muestra el efecto inhibidor del crecimiento del tumor del mAb en un modelo de xenoinjerto SW480 de adenocarcinoma de colon humano.
La Figura 15A es una gráfica lineal que muestra la prevención del crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto de HT29. El eje x indica el número de días del implante de células post-tumor y el eje y indica el volumen medio del tumor, +/- EMT en cm3. La Figura 15B es una gráfica que muestra la prevención del crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto Calu-6, con el tamaño del tumor indicado para ratones tratados con 10 mg/kg del clon 3.3.2 ó
3.19.3 del mAb o con un anticuerpo control del isotipo. La Figura 15C es un histograma que indica la densidad de la tinción con CD31+ en tumores procedentes de ratones portadores de tumores MDA-MB-231, tratados con control de IgG o 10 mg/kg del mAb 3.19.3. Se muestran los resultados de métodos de recuento del umbral como de la rejilla manuales.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Realizaciones de la invención descritas en esta memoria se refieren a anticuerpos monoclonales que unen a Ang-2. En algunas realizaciones, los anticuerpos se unen a Ang-2 e inhiben la unión de Ang-2 a su receptor, Tie2. Otras realizaciones de la invención incluyen anticuerpos anti-Ang-2 totalmente humanos, y preparados de anticuerpos que son terapéuticamente útiles. Preparados de anticuerpos anti-Ang-2 de este tipo tienen propiedades terapéuticas deseables, incluidas una fuerte afinidad de unión a Ang-2, la capacidad de neutralizar Ang-2 in vitro y la capacidad de inhibir la angiogénesis inducida por Ang-2 in vivo.
Realizaciones de la invención incluyen también fragmentos de unión aislados de anticuerpos anti-Ang-2. Preferiblemente, los fragmentos de unión se derivan de anticuerpos anti-Ang-2 totalmente humanos. Fragmentos a modo de ejemplo incluyen Fv, Fab’ u otros fragmentos de anticuerpos bien conocidos, según se describe con mayor detalle más abajo.
Células pueden expresar anticuerpos totalmente humanos contra Ang-2. Ejemplos de células incluyen hibridomas o células creadas de forma recombinante tales como células de ovarios de hámster chino (CHO), variantes de células de CHO (por ejemplo DG44) y células NS0 que producen anticuerpos contra Ang-2. Información adicional sobre variantes de células de CHO se puede encontrar en Andersen y Reilly (2004) Current Opinion in Biotechnology 15, 456-462.
Anticuerpos anti-Ang-2 son útiles para prevenir la transducción de señales de Tie2 mediada por Ang-2, inhibiendo con ello la angiogénesis. El mecanismo de acción de esta inhibición puede incluir la inhibición de Ang-2 de unirse a su receptor, Tie2, la inhibición de la señalización de Tie2 inducida por Ang-2 o el aclaramiento potenciado de Ang-2 en el mismo, reduciendo la concentración efectiva de Ang-2 para la unión a Tie-2. Enfermedades que se pueden tratar a través de este mecanismo de inhibición incluyen, pero no se limitan a enfermedades neoplásticas tales como melanoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (de hígado), glioblastoma, cánceres y tumores del tiroides, estómago, próstata, mama, ovarios, vejiga, pulmón, útero, riñón, colon y páncreas, glándula salivar y colorrectal.
En una realización preferida, la presente invención es particularmente adecuada para uso en antagonizar angiopoyetina-1 o angiopoyetina-2 en pacientes con un tumor que depende sólo, o en parte, de un receptor Tie-2.
Realizaciones adicionales, características y similares relacionadas con anticuerpos anti-Ang-2 se proporcionan con un detalle adicional más abajo.
Listado de secuencias
En la Tabla 1 que figura más abajo se listan anticuerpos anti-Ang-2 específicos. Esta tabla informa sobre el número de identificación de cada uno de los anticuerpos anti-Ang-2, junto con el número de SEQ ID de los correspondientes genes de la cadena pesada y de la cadena ligera.
A cada anticuerpo se le ha dado un número de identificación que incluye dos o tres números separados por uno o dos puntos decimales. Para la mayoría de los anticuerpos, solamente se listan dos números de identificación, separados por un punto decimal.
Sin embargo, en algunos casos, se prepararon varios clones de un anticuerpo. A pesar de que los clones tienen secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos idénticas a la secuencia parental, también pueden estar listados por separado, estando el número de clon indicado por el número a la derecha de un segundo punto decimal. Así, por ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del anticuerpo 5.35 son idénticas a las secuencias de los anticuerpos 5.35.1, 5.35.2 y 5.35.3.
Tabla 1
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
3.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 6
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
7
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
8
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
9
3.2
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 10
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
11
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
12
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
13
3.3
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 14
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
15
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
16
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
17
3.3.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 18
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
19
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
20
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
21
3.3.2
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 22
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
23
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
24
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
25
3.6
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 26
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
27
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
28
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
29
3.7
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 30
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
31
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
32
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
33
3.8
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 34
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
35
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
36
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
37
3.9
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 38
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
39
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
40
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
41
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
3.10
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 42
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
43
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
44
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
45
3.11
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 46
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
47
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
48
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
49
3.12
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 50
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
51
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
52
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
53
3.13
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 54
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
55
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
56
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
57
3.14
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 58
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
59
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
60
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
61
3.15
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 62
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
63
3.16
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 64
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
65
3.17
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 66
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
67
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
68
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
69
3.18
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 70
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
71
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
72
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
73
3.19.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 74
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
75
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
76
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
77
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
3.19.3
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 78
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
79
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
80
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
81
3.20
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 82
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
83
3.21
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 84
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
85
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
86
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
87
3.22
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 88
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
89
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
90
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
91
3.26
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 92
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
93
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
94
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
95
3.28.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 96
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
97
3.31.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 98
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
99
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
100
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
101
3.31.2
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 102
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
103
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
104
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
105
3.32
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 106
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
107
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
108
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
109
3.33
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 110
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
111
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
112
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
113
(continúa)
3.34
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 114
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
115
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
116
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
117
3.35
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 118
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
119
3.37
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 120
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
121
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
122
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
123
3.39
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 124
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
125
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
126
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
127
3.40
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 128
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
129
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
130
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
131
3.41
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 132
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
133
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
134
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
135
3.42
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 136
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
137
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
138
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
139
4.2
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 140
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
141
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
142
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
143
4.3
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 144
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
145
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
146
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
147
4.4
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 148
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
149
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
4.5
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 150
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
151
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
152
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
153
4.6
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 154
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
155
4.7
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 156
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
157
4.8
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 158
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
159
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
160
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
161
4.9
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 162
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
163
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
164
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
165
4.11
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 166
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
167
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
168
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
169
4.13
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 170
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
171
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
172
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
173
4.14
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 174
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
175
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
176
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
177
4.15
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 178
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
179
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
180
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
181
4.16
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 182
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
183
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
184
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
185
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
4.18
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Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
188
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
189
5.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 190
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
191
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
192
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
193
5.2
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 194
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
195
5.2.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 196
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada
197
5.3
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 198
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
199
5.4
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 200
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
201
5.5
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 202
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
203
5.6
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 204
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
205
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
206
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
207
5.7
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 208
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
209
5.8
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 210
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
211
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
212
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
213
5.9
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 214
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
215
5.10
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 216
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
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Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
218
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
219
(continúa)
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Secuencia SEQ ID NO:
5.11
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Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
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Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
223
5.12
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 224
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
225
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
226
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
227
5.13.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 228
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
229
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
230
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
231
5.14.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 232
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
233
5.15
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 234
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
235
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
236
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
237
5.16.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 238
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
239
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
240
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
241
5.17
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 242
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
243
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
244
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
245
5.18
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 246
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
247
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
248
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
249
5.19
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 250
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
251
5.20
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 252
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
253
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
5.21
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 254
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
255
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
256
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
257
5.22
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 258
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
259
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
260
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
261
5.23
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 262
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
263
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
264
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
265
5.24
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 266
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
267
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
268
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
269
5.25
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 270
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
271
5.26
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 272
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
273
5.27
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 274
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
275
5.28.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 276
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
277
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
278
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
279
5.29
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 280
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
281
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
282
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
283
5.30
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 284
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
285
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
286
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
287
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
5.31
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 288
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
289
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
290
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
291
5.33
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 292
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
293
5.34
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 294
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
295
5.35.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 296
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
297
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
298
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
299
5.36
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 300
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
301
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
302
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
303
5.37
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 304
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
305
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
306
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
307
5.38
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 308
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
309
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
310
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
311
5.39.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 312
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
313
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
314
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
315
5.40.2
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 316
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
317
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
318
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
319
5.41.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 320
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
321
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
322
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
323
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
5.43
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 324
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
325
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
326
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
327
5.44
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 328
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
329
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
330
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
331
5.45
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 332
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
333
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
334
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
335
5.46
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 336
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
337
5.47
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 338
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
339
5.48
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 340
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
341
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
342
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
343
5.51
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 344
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
345
5.52
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 346
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
347
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
348
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
349
5.52.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 350
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
351
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
352
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
353
5.53
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 354
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
355
5.54.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 356
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
357
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
358
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
359
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
5.55
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 360
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
361
5.56.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 362
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
363
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
364
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
365
5.58
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 366
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
367
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
368
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
369
5.59
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 370
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
371
5.60
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 372
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
373
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
374
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
375
5.61
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 376
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
377
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
378
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
379
5.62.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 380
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
381
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
382
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
383
5.64
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 384
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
385
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
386
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
387
5.66
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 388
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
389
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
390
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
391
5.67
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 392
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
393
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
394
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
395
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
5.68
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 396
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
397
5.70
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 398
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
399
5.71
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 400
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
401
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
402
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
403
5.72
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 404
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
405
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
406
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
407
5.73
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 408
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
409
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
410
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
411
5.74
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 412
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
413
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
414
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
415
5.75
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 416
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
417
5.76
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 418
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
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Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
420
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
421
5.77
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 422
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
423
5.78
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 424
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
425
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
426
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
427
5.78.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 428
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
429
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
430
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
431
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
5.79
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 432
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
433
5.80
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 434
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
435
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
436
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
437
5.81
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 438
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
439
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
440
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
441
5.82
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 442
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
443
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
444
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
445
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Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 446
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
447
5.83.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 448
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
449
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
450
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
451
5.86.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 452
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
453
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
454
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
455
5.87
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 456
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
457
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
458
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
459
5.88
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 460
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
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Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
462
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
463
5.88.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 464
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
465
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
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Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
467
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
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Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 468
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
469
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
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Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
471
5.89
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 472
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
473
5.90
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 474
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
475
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
476
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
477
5.91
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 478
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
479
5.92
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 480
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
481
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
482
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
483
5.93
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 484
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
485
5.94
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 486
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
487
5.95
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 488
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
489
5.97
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 490
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
491
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
492
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
493
5.99
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 494
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
495
5.101.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 496
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
497
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
498
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
499
5.102
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 500
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
501
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
5.103.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 502
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
503
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
504
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
505
5.104
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 506
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
507
5.106
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 508
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
509
5.107
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 510
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
511
5.108.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 512
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
513
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
514
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
515
5.109
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 516
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
517
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
518
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
519
5.111
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 520
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
521
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
522
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
523
5.112
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 524
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
525
5.114
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 526
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
527
5.115
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 528
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
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Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
530
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
531
6.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 532
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
533
6.2
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 534
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
535
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
536
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
537
(continúa)
mAb ID Nº:
Secuencia SEQ ID NO:
6.3.1
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 538
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
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Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
540
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
541
6.4
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 542
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
543
6.5
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Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
545
6.6
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 546
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
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Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera
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Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
549
6.7
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 550
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
551
6.8
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 552
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
553
6.9
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada 554
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena pesada
555
6.10
Secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera 556
Secuencia de aminoácidos que codifica la región variable de la cadena ligera
557
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, los términos y expresiones científicos y técnicos utilizados en esta memoria deben tener el significado que es comúnmente comprendido por los expertos ordinarios en la técnica. Además, a 5 menos que se requiera de otro modo por el contexto, los términos y expresiones en singular deben incluir plurales y términos y expresiones en plural deben incluir el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con y las técnicas de cultivo de células y tejidos, biología molecular y química de proteínas y de oligonucleótidos o polinucleótidos y la hibridación descritos en esta memoria son bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica.
Técnicas convencionales se utilizan para la síntesis de ADN recombinante, de oligonucleótidos y el cultivo y la
10 transformación de tejidos (p. ej. electroporación, lipofección). Reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se consigue comúnmente en la técnica o según se describen en esta memoria. Las técnicas y los procesos que anteceden se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y según se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, p.ej., Sambrook et al.,
15 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y (2001)).
Las nomenclaturas utilizadas con relación con, y los procesos y técnicas de laboratorio de la química analítica, química orgánica de síntesis y química médica y farmacéutica descritos en esta memoria son los bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Técnicas convencionales se utilizan para la síntesis química, los análisis
20 químicos, la preparación, formulación y administración farmacéutica, y el tratamiento de pacientes.
Según se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos y descripciones, a menos que se indique de otro modo, deben entenderse que tengan los significados siguientes:
Un antagonista puede ser un polipéptido, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípido, compuesto de bajo peso
molecular, un oligonucleótido, un oligopéptido, ARN de interferencia (ARNi), antisentido, una proteína recombinante, un anticuerpo o conjugados o proteínas de fusión de los mismos. Para una revisión de ARNi véase Milhavet O, Gary DS, Mattson MP, (Pharmacol Rev. 2003, dic.; 55 (4): 629-48, Revisión.) y antisentido, véase Opalinska JB, Gewirtz AM. (Sci STKE, 2003, oct. 28; 2003 (206): pe47).
La angiogénesis relacionada con la enfermedad puede ser cualquier angiogénesis anormal, indeseable o patológica, por ejemplo una angiogénesis relacionada con tumores. Enfermedades relacionadas con la angiogénesis incluyen, pero no se limitan a tumores no sólidos tales como leucemia, mieloma múltiple o linfoma o también a tumores sólidos tales como melanoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (de hígado), glioblastoma, carcinoma del tiroides, tumores del conducto biliar, de los huesos, gástrico, del cerebro/SNC, de cabeza y cuello, hepáticos, de estómago, de próstata, de mama, renales, testiculares, de ovarios, de la piel, cervicales, pulmonares, de la musculatura, neuronales, esofágicos, de la vejiga, pulmonares, uterinos, vulvales, endometriales, renales, colorrectales, pancreáticos, membranas pleurales/peritoneales, glándulas salivares y epidermoides.
Un compuesto se refiere a cualquier compuesto de bajo peso molecular con un peso molecular menor que aproximadamente 2000 dalton.
El término “Ang-2” se refiere a la molécula de angiopoyetina-2.
El término “neutralizar”, cuando se refiere a un anticuerpo, se refiere a la capacidad de un anticuerpo de eliminar o reducir significativamente la actividad de un antígeno diana. Por consiguiente, un anticuerpo anti-Ang-2 “neutralizante” es capaz de eliminar o reducir significativamente la actividad de Ang-2. Un anticuerpo Ang-2 neutralizante puede actuar, por ejemplo, bloqueando la unión de Ang-2 a su receptor Tie2. Al bloquear esta unión, la transducción de señales mediada por Tie2 se elimina significativamente o por completo. De manera ideal, un anticuerpo neutralizante contra Ang-2 inhibe la angiogénesis.
La expresión “polinucleótido aislado”, tal como se utiliza en esta memoria, debe dar a entender un polinucleótido que ha sido aislado de su entorno que se produce de forma natural. Polinucleótidos de este tipo pueden ser genómicos, ADNc o sintéticos. Polinucleótidos aislados no están preferiblemente asociados con la totalidad o una parte de los polinucleótidos con los que se asocian en la naturaleza. Los polinucleótidos aislados pueden estar operativamente enlazados a otro polinucleótido que no está enlazado en la naturaleza. Además, polinucleótidos aislados no se producen preferiblemente en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.
La expresión “proteína aislada”, a la que se alude en esta memoria, significa una proteína que ha sido aislada de su entorno que se produce de forma natural. Proteínas de este tipo pueden derivarse de ADN genómico, ADNc, ADN recombinante, ARN recombinante o pueden ser de origen sintético o alguna combinación de los mismos, que, en virtud de su origen o fuente de derivación, la “proteína aislada” (1) no está asociada con proteínas que se encuentran en la naturaleza, (2) está exenta de otras proteínas de la misma fuente, p. ej. está exenta de proteínas murinas, (3) es expresada por una célula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza.
El término “polipéptido” se utiliza en esta memoria como un término genérico para aludir a proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia de polipéptidos. Por lo tanto, proteína nativa, fragmentos y análogos son especies del género polipéptido. Polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana así como moléculas de anticuerpos formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera tal como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa o lambda, o viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas. Polipéptidos preferidos de acuerdo con la invención también pueden comprender únicamente las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana o fragmentos de las mismas.
La expresión “se produce en la naturaleza”, tal como se utiliza en esta memoria, según se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluidos virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada de manera intencionada por el hombre en el laboratorio o que aparece en la naturaleza de otra manera.
La expresión “enlazado de forma operativa”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a posiciones de componentes así descritos que están en una relación que les permite funcionar en su manera pretendida. Por ejemplo, una secuencia control “enlazada de forma operativa” a una secuencia codificadora está conectada de manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue bajo condiciones compatibles con las secuencias control.
La expresión “secuencia control”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a secuencias de polinucleótidos que
necesariamente han de efectuar o afectar a la expresión y al tratamiento de secuencias codificadoras a las que están conectadas. La naturaleza de secuencias control de este tipo difiere en función del organismo hospedante; en procariotas, secuencias control de este tipo incluyen, generalmente, promotor, sitio de unión al ribosoma y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente secuencias control de este tipo pueden incluir promotores, reforzadores, intrones, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias de la señal de poliadenilación y regiones no traducidas 5’ y 3’. La expresión “secuencias control” pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el tratamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo secuencias conductoras y secuencias de participantes en la fusión.
El término “polinucleótido”, según se alude en esta memoria, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, o heteroduplex de ARN-ADN. El término incluye formas de ADN de cadena sencilla y doble.
El término “oligonucleótido” al que se alude en esta memoria incluye nucleótidos que se producen de forma natural y modificados, enlazados entre sí mediante enlaces que aparecen de forma natural o enlaces que no aparecen de forma natural. Oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que comprenden, generalmente, una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente, los oligonucleótidos son de una longitud de 10 a 50 bases y, lo más preferiblemente, de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son habitualmente de cadena sencilla, p. ej. para sondas; a pesar de que los oligonucleótidos pueden ser de cadena doble, p. ej. para uso en la construcción de un mutante génico. Oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos sentido
o antisentido.
La expresión “nucleótidos que se producen en la naturaleza”, a la que se alude en esta memoria, incluyen desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. La expresión “nucleótidos modificados”, a la que se alude en esta memoria, incluye nucleótidos con grupos azúcares modificados o sustituidos y similares. La expresión “enlaces de oligonucleótidos”, a la que se alude en esta memoria, incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato y similares. Véase, p. ej., LaPlanche et al, Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106 :6077 (1984) ; Stein et al. Nucl. Acids Res. 16 :3209 (1988) ; Zon et al. Anti-Cancer Durg Design 6 :539 (1991) ; Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991)); Stec et al. patente de EE.UU. Nº 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990) incluyen una marca para la detección, si se desea.
La expresión “se hibrida de forma selectiva”, a la que se alude en esta memoria, significa unirse de forma detectable y específica. Polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos se hibridan de forma selectiva a cadenas de ácidos nucleicos bajo condiciones de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Se pueden utilizar condiciones de alta rigurosidad para conseguir condiciones de hibridación selectiva según es conocida, los polinucleótidos, oligonucleótidos o fragmentos de anticuerpos y una secuencia de ácido nucleico de interés tendrá al menos una homología del 80% y, más típicamente, con homologías preferiblemente crecientes de al menos 85%, 90%, 95%, 99% y 100%.
Dos secuencias de aminoácidos son “homólogas” si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias están alineadas para un emparejamiento máximo. Para maximizar el emparejamiento se permiten huecos (en cualquiera de las dos secuencias que están siendo emparejadas); se prefieren longitudes de los huecos de 5 o menos, siendo más preferidas de 2 o menos. Alternativa y preferiblemente, dos secuencias de proteínas (o secuencias de polipéptidos derivados de ellas de al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, según se utiliza este término en esta memoria, si tienen una puntuación de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) utilizando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización por huecos de 6 o mayor. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, págs. 101110 (volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y el suplemento 2 a este volumen, págs. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos tienen una identidad mayor que o igual a 50% cuando se alinean óptimamente utilizando el programa ALIGN. Debe apreciarse que pueden existir regiones de homología diferentes dentro de dos secuencias ortólogas. Por ejemplo, los sitios funcionales de ortólogos de ratón y seres humanos pueden tener un mayor grado de homología que las regiones no funcionales.
La expresión “corresponde a“ se utiliza en esta memoria para dar a entender que una secuencia de polinucleótidos es homóloga (es decir es idéntica, no estrictamente relacionada de forma evolutiva) a la totalidad o a una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia, o que una secuencia de polipéptidos es idéntica a una secuencia de polipéptidos de referencia.
En contradistinción, la expresión “complementaria a“ se utiliza en esta memoria para dar a entender que la secuencia
complementaria es homóloga a la totalidad o a una parte de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para fines ilustrativos, la secuencia de nucleótidos “TATAC” corresponde a una secuencia de referencia “TATAC” y es complementaria a una secuencia de referencia “GTATA”.
Los siguientes términos y expresiones se utilizan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más secuencias de polinucleótidos o de aminoácidos: “secuencia de referencia”, “ventana de comparación”, “identidad de la secuencia”,
“porcentaje de la identidad de las secuencias” e “identidad sustancial”. Una “secuencia de referencia” es una secuencia definida, utilizada como base para una comparación de la secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo en forma de un segmento de un ADNc de longitud completa o una secuencia génica dada en un listado de secuencias, o puede comprender un ADNc completo o una secuencia génica. Generalmente, una secuencia de referencia tiene una longitud de al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos, frecuentemente tiene una longitud de al menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos y, a menudo, una longitud de al menos 48 nucleóotidos o 16 aminoácidos. Dado que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos cada una puede (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia del polinucleótido o aminoácido completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) puede comprender, además, una secuencia que es divergente entre las dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas se realizan típicamente comparando secuencias de las dos moléculas a lo largo de una “ventana de comparación” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparación”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un segmento conceptual de al menos aproximadamente 18 posiciones de nucleótidos contiguas o aproximadamente 6 aminoácidos, en donde la secuencia de polinucleótidos o la secuencia de aminoácidos se compara con una secuencia de referencia de al menos 18 nucleótidos contiguos o 6 secuencias de aminoácidos, y en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede incluir adiciones, deleciones, sustituciones y similares (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. Un alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede realizar mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda de un método de similitud de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), paquetes de software GENEWORKS™ o MACVECTOR®) o mediante inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, el que resulta en el porcentaje de homología más elevado a lo largo de la ventana de comparación), generado por los diversos métodos.
La expresión “identidad de la secuencia” significa que dos secuencias de polinucleótidos o aminoácidos son idénticas (es decir sobre una base de nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) a lo largo de la ventana de comparación. La expresión “porcentaje de identidad de la secuencia” se calcula comparando dos secuencias óptimamente alineadas a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base del ácido nucleico idéntica (p. ej. A, T, C, G, U o I) o el residuo aminoácido se produce en las dos secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de la secuencia. La expresión “identidad sustancial”, tal como se utiliza en esta memoria, denota una característica de una secuencia de polinucleótido o de aminoácido, en donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene una identidad de la secuencia de al menos el 85 por ciento, de preferencia una identidad de la secuencia de al menos el 90 al 95 por ciento, más preferiblemente una identidad de la secuencia de al menos el 99 por ciento, en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótidos (6 aminoácidos), frecuentemente a lo largo de una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos), en donde el porcentaje de la identidad de la secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que totaliza el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor.
Tal como se utiliza en esta memoria, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen un uso convencional. Véase, Immunology- A Synthesis (2ª edición, E. S. Golub y D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Estereoisómeros (p. ej. D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a,a-disustituidos, N-alquil-aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser adecuados componentes para polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convenconales incluyen: 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, £-N,N,Ntrimetillisina, £-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, o-Nmetilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (p. ej. 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos
utilizada en esta memoria, la dirección del Método es la direccín Amino-terminal y la dirección de la derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con el uso y convención estándares.
De manera similar, a menos que se especifique de otro modo, el extremo de la izquierda de secuencias de polinucleótidos de cadena sencilla es el extremo 5’; a la dirección de la izquierda de secuencias de polinucleótidos de doble cadena se le alude como la dirección 5’. A la dirección de la adición 5’ a 3’ de transcritos de ARN naciente se le alude como la dirección de transcripción; regiones de la secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en posición 5’ con el extremo 5’ del transcrito de ARN se prefieren como “secuencias situadas más arriba”; regiones de secuencias en la cadena de ADN tienen la misma secuencia que el ARN y que están en posición 3’ con el extremo 3’ del transcrito de ARN se las alude como “secuencias situadas más abajo”.
Tal como se aplica a polipéptidos, la expresión “identidad sustancial” significa que dos secuencias de péptidos, cuando están óptimamente alineadas tal como por los programas GAP o BESTFIT utilizando pesos de huecos por defecto, comparten una identidad de la secuencia de al menos el 80 por ciento, preferiblemente una identidad de la secuencia de al menos el 90 por ciento, más preferiblemente una identidad de la secuencia de al menos el 95 por ciento y, lo más preferiblemente, una identidad de la secuencia de al menos el 99 por ciento. Preferiblemente, posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos. Sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la capacidad de intercambio de residuos con cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que contiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas-hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales con contenido en amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales de carácter básico es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales con contenido en azufre es cisteína y metionina. Grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido glutámico-aspártico y asparagina-glutamina.
Tal como se comenta en esta memoria, variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se contemplan como abarcadas por la presente invención, con la condición de que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan una identidad de la secuencia de al menos el 75%, más preferiblemente de al menos el 80%, 90%, 95% y, lo más preferiblemente, el 99% con los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina descritos en esta memoria. En particular, se contemplan sustituciones conservativas de aminoácidos. Sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que tienen cadenas laterales relacionadas. Aminoácidos genéticamente codificados se dividen generalmente en familias:
(1) de carácter ácido = aspartato, glutamato; (2) de carácter básico = lisina, arginina, histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Familias más preferidas son: serina y treonina son una familia alifática-hidroxi; asparagina y glutamina son una familia con contenido en amida; alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptófano y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina por una leucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina o una sustitución similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tenga un efecto mayor sobre la función de unión o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si la sustitución no implica un aminoácido dentro de un sitio del marco. El que un cambio de aminoácidos dé como resultado un péptido funcional puede fácilmente determinarse sometiendo a ensayo la actividad específica del derivado de polipéptido. En esta memoria se describen en detalle los ensayos. Fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se pueden preparar fácilmente por los expertos ordinarios en la técnica. Extremos amino y carboxi preferidos y fragmentos o análogos aparecen próximos a límites de dominios funcionales. Dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de la secuencia públicas o de propiedad. Preferiblemente, se utilizan métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencias o dominios de conformación de proteínas predichos que se producen en otra proteína de estructura y/o función conocida. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al. Science 253: 164 (1991). Así, los ejemplos que anteceden demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencias y conformaciones estructurales que pueden utilizarse para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con los anticuerpos descritos en esta memoria.
Sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que (1) reducen la susceptibilidad a la proteolisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión y (4) confieren o modifican otras propiedades físico-químicas o funcionales de análogos de este tipo. Análogos pueden incluir diversas muteinas de una secuencia distinta a la secuencia de péptidos que se produce de forma natural. Por ejemplo, múltiples sustituciones de aminoácidos (preferiblemente sustituciones conservativas de aminoácidos) se pueden realizar en la secuencia que se produce de forma natural (preferiblemente en la porción
del polipéptido fuera del o de los dominios que forman contactos intermoleculares. Una sustitución conservativa de aminoácidos no debería cambiar sustitutivamente las características estructurales de la secuencia parental (p. ej. un aminoácido de sustitución no debería eludir romper una hélice que se produce en la secuencia parental, o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracteriza a la secuencia parental). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, structure and Molecular principles (Creighton, Ed., W, H. Freeman amd Compañy, Nueva York (1934)); Introduction to protein structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N. Y. (1991)); y Thornton et al. Nature: 354:105 1991).
La expresión “fragmento de polipéptidos”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero en donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a la posición correspondiente en la secuencia que se produce de forma natural deducida, por ejemplo de una secuencia de ADNc de longitud completa. Típicamente, los fragmentos tienen una longitud de al menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos, preferiblemente una longitud de al menos 14 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de al menos 20 aminoácidos, habitualmente una longitud de al menos 50 aminoácidos e incluso más preferiblemente, una longitud de al menos 70 aminoácidos. El término “análogo”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a polipéptidos que están constituidos por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tienen una identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a una Ang-2 bajo condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad de bloquear la unión apropiada a Ang-2, (3) capacidad de inhibir la actividad de Ang-2. Típicamente, análogos de polipéptidos comprenden una sustitución (o adición o deleción) conservativa de aminoácidos con respecto a la secuencia que se produce de forma natural. Análogos tienen una longitud típicamente de al menos 20 aminoácidos, preferiblemente una longitud de al menos 50 aminoácidos o más, y, a menudo, pueden ser tan largas como un polipéptido de longitud completa que se produce en la naturaleza.
Análogos de péptidos se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica en calidad de fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan “miméticos peptídicos” o “peptidomiméticos” Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber y Freidinger TINS pág. 393 (1985) y Evans et al. J. Chem. 30:1229 (1987).
Compuestos de este tipo se desarrollan a menudo con ayuda de un modelado molecular computarizado. Miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles pueden utilizarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, péptidos miméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) tal como un anticuerpo humano, pero que tienen uno o más enlaces péptido opcionalmente reemplazaos por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CH2SO-, por métodos bien conocidos en la técnica. Se puede utilizar una sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (p. ej. D-lisina en lugar de L-lisina) para generar péptidos más estables. Además, péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de la secuencia consenso sustancialmente idéntica se pueden generar por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Glerasch Ann, Rev. Biochem. 61:87 (1992), por ejemplo añadiendo residuos cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclizan el péptido.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término “anticuerpo” se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que están constituidos por al menos un dominio de unión que se forma a partir del plegamiento de cadenas de polipéptidos que tienen espacios de unión tridimensionales con formas de superficie interna y distribuciones de la carga complementarias a los rasgos de un determinante antigénico de un antígeno. Un anticuerpo tiene típicamente una forma tetramérica, comprendiendo dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada uno de los pares una cadena “ligera” y una cadena “pesada”. Las regiones variables de cada uno de los pares de cadena ligera/pesada forman un sitio de unión del anticuerpo.
Tal como se utiliza en esta memoria, un “agente de unión fijado como objetivo” es un anticuerpo o fragmento de unión del mismo, que preferentemente se une a un sitio diana. En una realización, el agente de unión fijado como objetivo es específico para solamente un sitio diana. En otras realizaciones, el agente de unión fijado como objetivo es específico para más de un sitio diana. En una realización, el agente de unión fijado como objetivo puede ser un anticuerpo monoclonal, y el sitio diana puede ser un epítopo.
“Fragmentos de unión” de un anticuerpo se producen mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Fragmentos de unión incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv y anticuerpos de cadena sencilla. Se entiende que un anticuerpo distinto de un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” tenga cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo inhibe sustancialmente la adhesión de un receptor a un receptor antagonista cuando un exceso de anticuerpos reduce la cantidad de receptor unido al receptor antagonista en al menos aproximadamente un 20%, 40%, 60% u 80% y, de manera más usual, más de aproximadamente 85% (según se mide en un ensayo de unión competitivo in vitro).
Un anticuerpo puede ser oligoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado a CDR, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo catalítico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo totalmente humano, un anticuerpo anti-idiotípico y anticuerpos que se pueden marcar en forma soluble o ligada, así como fragmentos, variantes o derivados de los mismos, ya sea solos o en combinación con otras secuencias de aminoácidos proporcionadas por técnicas conocidas. Un anticuerpo puede proceder de cualquier especie. El término anticuerpo incluye también fragmentos de unión de los anticuerpos de la invención; fragmentos a modo de ejemplo incluyen Fv, Fab, Fab’, anticuerpo de cadena sencilla (svFC), región variable dimérica (diacuerpo) y región variable estabilizada con disulfuro (dsFv).
El término “epítopo” incluye cualquier determinante proteínico capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. Determinantes epitópicos consisten habitualmente en agrupaciones de superficie químicamente activa de las moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y puede, pero no siempre, tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es < 1 !M, preferiblemente < 100 nM y, lo más preferiblemente, < 10 nM.
El término “agente” se utiliza en esta memoria para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto preparado a partir de materiales biológicos.
“Activo” o “actividad” con respecto a un polipéptido de Ang-2 se refiere a una porción de un polipéptido de Ang-2 que tiene una actividad biológica o una actividad inmunológica de un polipéptido de Ang-2 nativo. “Biológico”, cuando se utiliza en esta memoria, se refiere a una función biológica que resulta de la actividad del polipéptido de Ang-2 nativo. Una actividad biológica de Ang-2 preferida incluye, por ejemplo, angiogénesis inducida por Ang-2.
“Mamífero”, cuando se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier animal que se considera un mamífero. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
La digestión de anticuerpos con la enzima papaína resulta en dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, conocidos también como fragmentos “Fab”, y un fragmento “Fc” que no tiene actividad de unión a antígeno, pero que tiene la capacidad de cristalizar. La digestión de anticuerpos con la enzima, pepsina, resulta en el fragmento F(ab’)2, en el que los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen enlazados y comprenden dos sitios de unión al antígeno. El fragmento F(ab’)2, tiene la capacidad de reticular antígeno.
“Fv”, cuando se utiliza en esta memoria, se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que conserva tanto sitios de reconocimiento del antígeno como de unión al antígeno.
“Fab”, cuando se utiliza en esta memoria, se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.
El término “mAb” se refiere a anticuerpo monoclonal.
“Liposoma”, cuando se utiliza en esta memoria, se refiere a una pequeña vesícula que puede ser útil para la administración de fármacos que pueden incluir el polipéptido de Ang-2 de la invención, o anticuerpos contra un polipéptido de Ang-2 de este tipo a un mamífero.
“Marca” o “marcado”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la adición de un resto detectable a un polipéptido, por ejemplo una radiomarca, marca fluorescente, marca enzimática, marcado de forma quimioluminiscente un grupo biotinilo. Radioisótopos o radionucleidos pueden incluir 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In,125I, 131I, marcas fluorescentes pueden incluir rodamina, lantánidos fósforo o FITC y marcas enzimáticas pueden incluir peroxidasa de rábano picante, �-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina.
La expresión “agente farmacéutico o fármaco”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente. Otros términos y expresiones químicos en esta memoria se utilizan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, según se ejemplifica por el diccionario McGraw-Hill de términos químicos (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
Tal como se utiliza en esta memoria, “esencialmente puro” significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una masa molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) y, preferiblemente, una fracción sustancialmente modificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos 50 por ciento sobre una base molar de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente más de aproximadamente 85%, 90%, 95% y 99%. Lo más preferiblemente, la especie objeto se purifica hasta una homogeneidad esencial (la especie contaminante no se puede detectar en la composición por métodos de detección
convencionales), en donde la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular.
El término “paciente” incluye sujetos humanos y veterinarios.
Anticuerpos humanos y humanización de anticuerpos
Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes de murinos o ratas. La presencia de proteínas derivadas de murinos o ratas de este tipo puede conducir al rápido aclaramiento de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por parte de un paciente. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos derivados de murinos o ratas, se pueden generar anticuerpos totalmente humanos a través de la introducción de loci de anticuerpos humanos funcionales en un roedor, otro mamífero o animal, de modo que el roedor, otro mamífero o animal produce anticuerpos totalmente humanos.
Un método para generar anticuerpos totalmente humanos es a través del uso de cepas XenoMouse® de ratones que han sido tratadas mediante ingeniería para que contengan hasta pero menos de 1000 fragmentos configurados de la línea geminal de un tamaño de 1000 kb del locus de cadena pesada humana y del locus de cadena ligera kappa, véase Mendez et a. Nature Genetics 15: 146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998). Las cepas XenoMouse® están disponibles de Abgenix, Inc. (Fremont, CA).
La producción de las cepas XenoMouse® de ratones se discute adicionalmente y se esboza en las publicaciones de patente US19970923138, US 6162963, US6075181, US 6673986, US 6158584, US 59339598, US 6657103, documento WO 9622380, US6075181, US 6114598, US2005076395, US 6075181, US6162693, US6150584, US 200370185, publicación de EE.UU. 2003/0093820, presentada el 30 de noviembre de 2001, y las patentes de EE.UU. nºs 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 y 5.939.598, y las patentes japonesas nºs 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 y 3 068 507 B2. Véase también la patente europea nº EP 0 463 151 B1, publicada la concesión el 12 de junio de 1996, la solicitud de patente internacional nº WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, la solicitud de patente internacional nº WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, WO 98/24393, publicada el 11 de junio de 1998, WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre del 2000.
En un enfoque alternativo, otros, incluido GenPharm International, Inc., han utilizado un enfoque de “minilocus”. En el enfoque de minilocus, un locus Ig exógeno es imitado a través de la inclusión de trozos (genes individuales) procedentes del locus Ig. Así, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu y, habitualmente, una segunda región constante (preferiblemente una región constante gamma) se forman en una construcción para la inserción en un animal. El enfoque se describe en la patente de EE.UU. nº 5.545.807, expedida a Surani et al., y en las patentes de EE.UU. nºs 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.798.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 y 6.255.458, cada una expedida a Lomberg y Kay, las patentes U.S. 5.591.669 y 6.023.010 expedida a Krimpenfort y Berns, las patentes de EE.UU. nºs 5.612.205,
5.721.367 y 5.789.215 expedidas a Berns et al., y la patente de EE.UU. nº 5.643.763 expedida a Choi y Dunn, y las publicaciones de patente de EE.UU. de GenPharm International nºs US 5569825, WO 9203919, US 5569825, US 5789650, US 5545806, US 5545806, US 5814318, WO 9425285, US 5770429.
Véase también la patente europea nº 0 546 073 B1, las solicitudes de patente internacionales nºs WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 y WO 98/24884 y la patente de EE.UU. nº 5.981.175.
Véase, además, Taylor et al., 1992, Chen et al.,1993, Taillon et al.,1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994) y Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996).
Kirin ha demostrado también la generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los que, a través de una fusión de microcélulas, se han introducido grandes trozos de cromosomas, o cromosomas enteros. Véanse las solicitudes de patente europea nºs 773 288 y 843 961, cuyas descripciones se incorporan con ello como referencia. Adicionalmente, se han generado ratones KM™ que son el resultado de una cruce de ratones Tc de Kirin con ratones de minilocus (Humab) de Medarex. Estos ratones poseen el transcromosoma IgH humano de los ratones Kirin y el transgen de la cadena kappa de los ratones de GenPharm (Ishida et al., Cloning Stern Cells, (2002) 4: 91-102).
Anticuerpos humanos también se pueden derivar por métodos in vitro. Ejemplos adecuados incluyen, pero no se limitan a exhibición del fago (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (antes Proliferon), Affimed), exhibición del ribosoma (CAT), exhibición de levaduras, y similares.
Preparación de anticuerpos
Anticuerpos, según se describe en esta memoria, se prepararon mediante la utilización de la tecnología XenoMouse®, según se describe más abajo. Ratones de este tipo son capaces, entonces, de producir moléculas de inmunoglobulina humana y anticuerpos humanos, y son deficientes en la producción de moléculas de
inmunoglobulina y anticuerpos murinos. Tecnologías utilizadas para conseguir las mismas se describen en las patentes, solicitudes y referencias descritas en la sección de Antecedentes de esta memoria. En particular, sin embargo, una realización preferida de la producción transgénica de ratones y anticuerpos de las mismas se describe en la publicación de patente de EE.UU. US 20030701805 y las solicitudes de patente internacional nºs WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. Véase también Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997).
A través del uso de una tecnología de este tipo, se han producido anticuerpos monoclonales totalmente humanos contra una diversidad de antígenos. En esencia, líneas de ratones XenoMouse® se inmunizan con un antígeno de interés (p. ej. Ang-2); células linfáticas (tales como células B) se recuperan de los ratones hiper-inmunizados, y los linfocitos recuperados se fusionan con una línea de células de tipo mieloide para preparar líneas de células de hibridoma inmortales. Estas líneas de células de hibridoma se rastrean y seleccionan para identificar líneas de células de hibridoma que producían anticuerpos específicos para el antígeno de interés. En esta memoria, se proporcionan métodos para la producción de líneas de células de hibridoma múltiples que producen anticuerpos específicos para Ang-1 y Ang-2. Además, en esta memoria se proporciona la caracterización de los anticuerpos producidos por parte de líneas de células de este tipo, incluidos análisis de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de este tipo.
Alternativamente, en lugar de ser fusionadas a células de mieloma para generar hibridomas, las células B se pueden analizar directamente. Por ejemplo, células B CD19+ se pueden aislar a partir de ratones XenoMouse® hiperinmunes y se puede dejar que proliferen y se diferencien en células de plasma secretoras de anticuerpos. Anticuerpos procedentes de los sobrenadantes de las células se rastrean entonces mediante ELISA en cuanto a la reactividad contra el inmunogen Ang-2. Los sobrenadantes podrían ser también rastreados en cuanto a la inmunorreactividad frente a fragmentos de Ang-2 para representar adicionalmente en mapa los diferentes anticuerpos para la unión a dominios de interés funcional en Ang-2. Los anticuerpos también se pueden rastrear frente a Ang-1, Ang-3 o Ang-4, otras quimioquinas humanas relacionadas y contra los ortólogos de Ang-2 de rata, ratón y primates no humanos tal como el mono Cynomolgus, estos últimos para determinar la reactividad cruzada entre especies. Células B procedentes de pocillos de Ang-2, éstas últimas para determinar la reactividad cruzada entre especies. Células B procedentes de pocillos que contienen anticuerpos de interés se pueden inmortalizar por diversos métodos, incluida la fusión para producir hibridomas a partir de pocillos individuales o a partir de pocillos agrupados, o mediante infección con BEV o transfección por parte de genes inmortalizantes conocidos y luego se pueden extender en placas en un medio adecuado. Alternativamente, células de plasma sencillas que segregan anticuerpos con las especificidades deseadas se aíslan después utilizando un ensayo de calva hemolítica específico para Ang-1 o Ang-2 (véase, por ejemplo, Babcook et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93: 7843-48 (1996)). Las células que fijan como objetivo la lisis son preferiblemente hematíes de oveja (SRBCs – siglas en inglés) revestidos con el antígeno Ang-2. En el rastreo por un anticuerpo también capaz de antagonizar angiopoyetina-1, los métodos anteriores pueden utilizarse igualmente sustituyendo angiopoyetina-1 por angiopoyetina-2.
En presencia de células de plasma que contienen un cultivo de células B, que secretan la inmunoglobulina de interés y el complemento, la formación de una calva indica la lisis específica mediada por Ang-1/Ang-2 de los hematíes de oveja que rodean a la célula de plasma de interés. Se puede aislar la única célula de plasma específica para el antígeno en el centro de la calva, y la información genética que codifica la especificidad del anticuerpo se aísla a partir de la célula de plasma única. Utilizando la transcripción inversa seguida de PCR (RT-PCR – siglas en inglés) se puede clonar el ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo. Después, el ADN clonado de esta forma se puede insertar adicionalmente en un vector de expresión adecuado, preferiblemente una casete de un vector tal como un ADNpc, más preferiblemente un vector de ADNpc que contiene los dominios constantes de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulinas. El vector generado se puede luego transfectar en células hospedantes, p. ej. células HEK293, células CHO y se puede cultivar en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir transformantes selectores de la transcripción o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.
En general, los anticuerpos producidos por los hibridomas fusionados eran cadenas pesadas de IgG2 humana con cadenas ligeras kappa o lambda totalmente humanas. Los anticuerpos descritos en esta memoria poseen cadenas pesadas de IgG4 humanas así como cadenas pesadas de IgG2. Los anticuerpos también pueden ser de otros isotipos humanos, incluida IgG1. Los anticuerpos poseían elevadas afinidades, poseyendo típicamente una Kd de aproximadamente 10-6 hasta aproximadamente 10-12 M o inferior, cuando se mide mediante técnicas en fase sólida y en fase de disolución. Se prefieren anticuerpos que posean una Kd de al menos 10-11 M para inhibir la actividad de Ang-1 y/o Ang-2.
Según se apreciará, los anticuerpos pueden expresarse en líneas celulares distintas de líneas de células de hibridoma. Secuencias que codifican anticuerpos particulares se pueden utilizar para transformar una célula hospedante de mamífero adecuada. La transformación puede hacerse por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedante, incluido, por ejemplo, el empaquetamiento de los polinucleótidos en un
virus (o en un vector viral) y la transducción de una célula hospedante con el virus (o vector) o mediante procesos de transfección conocidos en la técnica, según se ejemplifican por las patentes de EE.UU. nºs 4.399.216, 4.912.040,
4.740.461 y 4.959.455.
El proceso de transformación utilizado depende del hospedante a transformar. Métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos son bien conocidos en la técnica e incluyen la transfección mediada por dextrano, la precipitación con fosfato de calcio, la transfección mediada por polibreno, la fusión de protoplantas, la electroporación, encapsulación del o de los polinucleótidos en liposomas y la microinyección directa del ADN en los núcleos.
Líneas de células de mamíferos disponibles como hospedantes para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) que incluyen, pero no se limitan a células de ovarios de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej. Hep G2), células de riñón epitelial humano 293 y un cierto número de otras líneas de células. Líneas de células de particular preferencia se seleccionan a través de la determinación de las líneas de células que tengan elevados niveles de expresión y produzcan anticuerpos con propiedades de unión a Ang-2 constitutivas.
Basado en la capacidad de los mAbs de neutralizar significativamente la actividad de angiopoyetina-1 y angiopoyetina-2 (según se demuestra en los Ejemplos que figuran más abajo) estos anticuerpos tendrán efectos terapéuticos en el tratamiento de síntomas y estados que resulten de la expresión de angiopoyetina-1 y/o angiopoyetina-2. En realizaciones específicas, los anticuerpos y métodos en esta memoria se refieren al tratamiento de síntomas que resultan de la angiogénesis inducida por angiopoyetina-1 y/o angiopoyetina-2.
Los anticuerpos anti-Ang-2 son útiles en la detección de Ang-2 en muestras de pacientes y, por consiguiente, son útiles como agentes de diagnóstico para estados patológicos según se describen en esta memoria. Además, basado en su capacidad de neutralizar significativamente la actividad de Ang-2 (según se demuestra en los Ejemplos que figuran más abajo), anticuerpos anti-Ang-2 tienen efectos terapéuticos en el tratamiento de síntomas y estados que resultan de la expresión de Ang-2.
Administración y formulaciones terapéuticas
Formulaciones farmacéuticas estériles de anticuerpos anti-Ang-2 o anticuerpos que se unen tanto a Ang-1 como a Ang-2 son útiles como tratamiento de enfermedades. Formulaciones de este tipo inhibirían la unión de Ang-2 o Ang-1 y Ang-2 a su receptor Tie2, tratando con ello de manera eficaz los estados patológicos en que, por ejemplo, Ang-1 y/o Ang-2 de suero o tejido está anormalmente elevada. Anticuerpos anti-Ang-2 poseen preferiblemente una afinidad adecuada para neutralizar potentemente Ang-2 y, preferiblemente, tienen una duración de acción adecuada para permitir la dosificación infrecuente en seres humanos. Anticuerpos anti-Ang-1/Ang-2 poseen preferiblemente una afinidad adecuada para neutralizar potentemente Ang-1 y Ang-2 y, preferiblemente, tienen una duración de acción adecuada para permitir una dosificación infrecuente en seres humanos. Una duración de acción prolongada permitirá programas de dosificación menos frecuentes y más convenientes por vías parentales alternativas tales como la inyección subcutánea o intramuscular.
Formulaciones estériles se pueden crear, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estéril antes o después de la liofilización y reconstitución del anticuerpo. Ordinariamente, el anticuerpo se almacenará en forma liofilizada o en disolución. Composiciones de anticuerpos terapéuticas se colocan generalmente en un recipiente que tiene una entrada de acceso estéril, por ejemplo una bolsa o vial para disolución intravenosa con un adaptador que permite la retirada de la formulación, tal como un tapón que puede ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica.
La vía de las administraciones de anticuerpos está de acuerdo con métodos conocidos, p. ej. inyección o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intratecal, por inhalación o intralesional, o por sistemas de liberación retardada tal como se señala más abajo. El anticuerpo se administra preferiblemente de forma continua por infusión o mediante inyección en bolo.
Una cantidad eficaz de anticuerpo a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, de la vía de administración y del estado del paciente. Por consiguiente, se prefiere que el terapeuta valore la dosificación y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente, el médico administrará anticuerpos hasta que se haya alcanzado una dosificación que consiga el efecto deseado. El progreso de esta terapia se vigila fácilmente por ensayos convencionales o por los ensayos descritos en esta memoria.
Anticuerpos, según se describen en esta memoria, se pueden preparar en una mezcla con un soporte farmacéuticamente aceptable. Esta composición terapéutica se puede administrar por vía intravenosa o a través de
la nariz o pulmones, preferiblemente en forma de un aerosol líquido o en polvo (liofilizado). La composición también se puede administrar por vía parenteral o subcutánea, según se desee. Cuando se administra de forma sistémica, la composición terapéutica debería ser estéril, apirógena y en una disolución parenteralmente aceptable que tenga debidamente en cuenta el pH, la isotonicidad y la estabilidad. Estas condiciones son conocidas por los expertos en la técnica. En síntesis, formulaciones de dosificación de los compuestos descritos en esta memoria se preparan para el almacenamiento o la administración mezclando el compuesto que tenga el grado deseado de pureza con soportes, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables. Materiales de este tipo son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como TRIS HCl, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menores que aproximadamente diez residuos) tales como poliarginina, proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, incluida celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcar-alcoholes tales como manitol o sorbitol; iones conjugados tales como sodio y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol.
Composiciones estériles para inyección se pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional según se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20ª ed, Lippincott Williams &amp; Wilkens Publishers (2003)). Por ejemplo, se puede desear la disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo tal como agua o aceite vegetal que se produce de forma natural, tal como aceite de sésamo, cacahuete o semilla de algodón, o un vehículo graso sintético tal como oleato de etilo o similar. Tampones, conservantes, antioxidantes y similares se pueden incorporar de acuerdo con la práctica farmacéutica aceptada.
Ejemplos adecuados de preparados de liberación retardada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación retardada incluyen poliésteres, hidrogeles (p. ej. poli(metacrilato de 1-hidroxietilo) según se describe por Langer et al., J. Biomed. Mater, Res., (1981) 15:167-277 y Langer Chem. Tech., (1982) 12:98-105 o poli(alcohol vinílico), polilactidas (patente de EE.UU. nº 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de gamma-etilo (Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22: 547-556), etileno-acetato de vinilo no degradable (Langer et al., supra), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido lácticoácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988).
Mientras que polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante largo tiempo, pueden desnaturalizarse
o agregarse como resultado de exposición a la humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden concebir estrategias racionales para la estabilización de proteínas en función del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de un enlace S-S intermolecular a través de intercambio de disulfuro, la estabilización se puede conseguir modificando los residuos sulfihidrilo, liofilizando a partir de disoluciones de carácter ácido, controlando el contenido en humedad, utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polímera específicas.
Composiciones de liberación retardada incluyen también preparados de cristales del anticuerpo suspendidos en formulaciones adecuadas, capaces de mantener a los cristales en suspensión. Estos preparados, cuando se inyectan por vía subcutánea o intraperitoneal, pueden producir un efecto de liberación retardada. Otras composiciones incluyen también anticuerpos atrapados en los liposomas. Liposomas que contienen anticuerpos de este tipo se preparan por métodos conocidos per se: Pat de EE.UU. nº 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, (1985) 82: 3688-3692; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, (1980) 77:4030-4034; documentos EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008, patentes de EE.UU. nºs 4.485.045 y 4.544.545 y documento EP 102.324.
La dosificación de la formulación de anticuerpos para un paciente dado vendrá determinada por el médico que le atienda, teniendo en consideración diversos factores conocidos para modificar la acción de fármacos, incluida la gravedad y el tipo de enfermedad, peso corporal, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, otras medicaciones y otros factores clínicos relevantes. Dosificaciones terapéuticamente eficaces serán determinadas por métodos in vitro
o in vivo.
Una cantidad eficaz de los anticuerpos, descritos en esta memoria, a emplear terapéuticamente, dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, de la vía de administración y del estado del paciente. Por consiguiente, se prefiere por parte del terapeuta valorar la dosificación y modificar la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica puede oscilar entre aproximadamente 0,001 mg/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores arriba mencionados. Típicamente, el médico administrará el
anticuerpo terapéutico hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado. El progreso de esta terapia se vigila fácilmente por ensayos convencionales o según se describe en esta memoria.
Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con las composiciones y métodos de esta memoria serán administradas con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que son incorporados en formulaciones para proporcionar una transferencia, suministro, tolerancia y similares mejorados. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas con contenido en lípidos (catiónicas o aniónicas) (tal como Lipofectin™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas que anteceden pueden ser apropiadas en los tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, con la condición de que el ingrediente activo en la formulación no sea inactivado por la formulación, y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también, Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance”. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32(2): 210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals”. Int. J. Pharm. 203 (1-2): 1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts”. J Pharm Sci. 89(8): 967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52: 238-311 (1998) y las citas en los mismos para una información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehículos bien conocidos para los químicos farmacéuticos.
Combinaciones
El tratamiento anti-angiogénico definido en esta memoria puede aplicarse como una terapia sola o puede implicar, además de los compuestos de la invención, una cirugía o radioterapia o quimioterapia convencional. Una quimioterapia de este tipo puede incluir una o más de las siguientes categorías de los agentes antitumorales:
(i)
agentes citostáticos tales como anti-estrógenos (por ejemplo tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno y yodoxifeno), sub-reguladores del receptor de estrógenos (por ejemplo fulvestrant), antiandrógenos (por ejemplo, bicalutamida, flutamida, nilutamida, y acetato de ciproterona), antagonistas de LHRH o agonistas de LHRH (por ejemplo, goserelina, leuproelina y buserelina), progestágenos (por ejemplo acetato de megestrol), inhibidores de aromatasa (por ejemplo anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de 5’ reductasa tales como finasterida;
(ii)
agentes que inhiben la invasión de células cancerígenas (por ejemplo inhibidores de metaloproteinasa tales como marimastat e inhibidores de la función receptora del activador de plasminógeno de uroquinasa);
(iii) inhibidores de la función del factor de crecimiento, por ejemplo inhibidores de este tipo incluyen anticuerpos del factor de crecimiento, anticuerpos del receptor del factor de crecimiento (por ejemplo el anticuerpo anti erbb2 trastuzumab [Herceptin™] y el anticuerpo anti-erbb1 cetuximab [C225]), inhibidores de farnesil transferasa, inhibidores de tirosina quinasa e inhibidores de serina/treonina quinasa, por ejemplo inhibidores de la familia de factores de crecimiento epidermales (por ejemplo inhibidores de tirosina
quinasa de la familia de EGFR tales como N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6- (3morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (gefitinib, AZD1839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4amina (erlotinib, OSI 774) y 6-acrilamido-N- (3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (Cl 1033)), por ejemplo inhibidores de la familia de factores de crecimiento derivados de
plaquetas y, por ejemplo, inhibidores de la familia de factores de crecimiento de hepatocitos;
(iv)
agentes anti-angiogénicos tales como los que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (por ejemplo el anticuerpo anti-factor de crecimiento de células endoteliales vasculares bevacizumab [Avastin™], anticuerpos del receptor anti-factor de crecimiento endotelial vascular tales como anticuerpos anti-KDR y anticuerpos anti-fltl, compuestos como los descritos en las solicitudes de patente internacionales WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/3285, WO 98/1354, WO 00/47212 y WO 01/32651) y compuestos que actúan por otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de la función de integrina avb3 y angiostatina);
(v)
agentes de lesión vascular tales como Combretastatina A4 y compuestos descritos en las solicitudes de patente internacional WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 y WO 02/08213;
(vi)
terapias antisentido, por ejemplo aquellas que se dirigen a las dianas listadas arriba, tales como ISIS 2503, un antisentido anti-ras;
(vii) enfoques de terapia génica que incluyen, por ejemplo, enfoques para reemplazar genes aberrantes
tales como p53 aberrante o BRCA1 o BRCA2 aberrante (GDEPT (enzima dirigida a genes por cada terapia de fármaco), enfoques tales como los que utilizan citosina desaminasa, timidina quinasa o una enzima nitrorreductasa bacteriana y, enfoques para aumentar la tolerancia de los pacientes a la quimioterapia o radioterapia tales como terapia génica de resistencia a múltiples fármacos; y
(viii) enfoques de inmunoterapia, incluidos, por ejemplo, enfoques ex vivo e in vivo para aumentar la inmunogenicidad de células tumorales del paciente tales como transfección con citocinas tales como interleucina 2, interleucina 4 o factor estimulante de colonias de macrófagos de granulocitos, enfoques para disminuir la energía de células T, enfoques que utilizan inmunocélulas transfectadas tales como células dendríticas transfectadas con citocinas, enfoques que utilizan líneas de células tumorales transfectadas con citocinas y enfoques que utilizan anticuerpos anti-idiotípicos.
Tratamientos que utilizan anti-angiogénicos se pueden combinar con agentes que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (por ejemplo el anticuerpo del anti-factor de crecimiento de células endoteliales vasculares bevacizumab (Avastin®), anticuerpos del receptor del anti-factor de crecimiento vascular endotelial tales como anticuerpos anti-KDR y anticuerpos anti-flt1, compuestos tales como los descritos en la solicitudes de patente internacional WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/3285, WO 98/13354, WO 00/47212 y WO 01/32651) y compuestos que actúan por otros mecanismos (por ejemplo linomida, inhibidores de la función de integrina avb3 y angiostatina); tratamientos anti-angiogénicos pueden ser agentes combinados que inhiben la actividad de tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento vascular endotelial, KDR (por ejemplo AZD2171 o AZD6474). Detalles adicionales sobre AZD2171 se pueden encontrar en Wedge et al (2005) Cancer Research, 65(10): 4389-400. Detalles adicionales sobre AZD6474 se pueden encontrar en Ryan &amp; Wedge (2005) British Journal of Cancer, 92 Supl 1:S6-13 los anticuerpos 3.19.3, 3.3.2 ó 5.88.3 totalmente humanos se pueden combinar solos o en combinación con Avastin®, AZD2171 o AZD6474.
Un tratamiento conjunto de este tipo se puede conseguir por medio de una dosificación simultánea, secuencial o separada de los componentes individuales del tratamiento. Productos de combinación de este tipo emplean los compuestos de esta invención, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, dentro del intervalo de dosificación descrito antes en esta memoria y el otro agente farmacéuticamente activo dentro de su intervalo de dosificación aprobado.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos, incluidos los experimentos realizados y los resultados conseguidos se proporcionan para fines ilustrativos únicamente, y no han de considerarse como limitantes por las enseñanzas en esta memoria.
EJEMPLO 1
INMUNIZACIÓN Y TITULACIÓN
Inmunización
Ang-2 humana recombinante, obtenida de R&amp;D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, nº de cat 623-AM/CF) se utilizó como un antígeno. Anticuerpos monoclonales contra Ang-2 se desarrollaron mediante inmunización secuencial de ratones XenoMouse® (cepas XenoMouse XMG2 y XMG4 (cepa 3C-1), Abgenix, Inc. Fremont, CA). Animales XenoMouse se inmunizaron a través de la vía de la almohadilla plantar para todas las inyecciones. El volumen total de cada inyección era de 50 !l por ratón, 25 !l por cada almohadilla plantar. La primera inyección se realizó con 2,35 !g de Ang-2 humana recombinante (rhAng-2, nº de cat 623-AM/CF; lote nº BN023202A) en PBS de Dulbecco apirógeno (DPBS) y se mezclaron en la relación 1:1 v/v con 10 !g de CpG (15 !l de Adyuvante de Ratón InmunEasy, nº de catálogo 303101; lote nº 11553042; Qiagen) por ratón. Los siguientes 6 estímulos se hicieron con 2,35 !g de rgANG-2 en DPBS apirógeno, mezclados con 25 !g de Adju-Phos (gel de fosfato de aluminio, nº de catálogo 1452250, lote nº 8937, HCl Biosector) y 10 !g de CpG por ratón, seguido de un estímulo final de 2,35 !g de rhAng-2 en DPBS apirógeno sin adyuvante. Los ratones XenoMouse se inmunizaron los días 0, 3, 6, 10, 13, 17, 20 y 24 para este protocolo y las fusiones se realizaron el día 29.
Selección de animales para la recogida mediante titulación
Títulos de anticuerpos anti-Ang-2 en el suero procedente de ratones XenoMouse inmunizados se determinaron mediante ELISA. En síntesis, Ang-2 recombinante (1 !g/ml) se revistió sobre placas de 96 pocillos Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene (Corning, Acton, MA) durante una noche a cuatro grados en tampón de revestimiento de antígeno (tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6, NaHCO3 8,4 g/L). Al día siguiente, las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado (Tween 20 al 0,05% en 1 x PBS) utilizando un lavador de placas Biotek. Las placas se bloquearon luego con 200 !l/pocillo de tampón de bloqueo (BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,1%, Thimerosal al 0,01% en 1 x PBS) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Después del bloqueo durante una hora, las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado utilizando un lavador de placas Biotek. Sueros procedentes de ratones XenoMouse
inmunizados con Ang-2 o animales XenoMouse nativos se titularon en tampón BSA/PBS al 0,5% a diluciones 1:3 en duplicado desde una dilución inicial de 1:100. El último pocillo se dejó en blanco. Estas placas se incubaron a la temperatura ambiente durante 2 h, y las placas se lavaron luego 3 veces con tampón de lavado utilizando un lavador de placas Biotek. Un anticuerpo conjugado anti-IgG humana de cabra específico para Fc - peroxidasa de rábano
5 picante (HRP, Pierce, Rockford, IL) se añadió a una concentración final de 1 !g/ml y se incubó durante 1 hora a la temperatura ambiente. Después, las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado utilizando un lavador de placas Biotek.
Después del lavado, las placas se revelaron con la adición de sustrato cromogénico TMB (BioFx BSTP-0100-01) durante 10-20 min o hasta que los pocillos control negativos iniciaban a mostrar color. Después, se detuvo el ELISA
10 mediante la adición de solución Stop (reactivo Stop 650 nM para TMB (BioFx BSTP-0100-01), reconstituida con 100 ml de H2O por frasco). El título específico de cada uno de los animales XenoMouse se determinó a partir de la densidad óptica a 650 nm y se muestra en las Tablas 2 y 3 que figuran a continuación. El valor del título es el recíproco de la dilución mayor de sueros con una lectura de la DO doble a la del fondo. Por lo tanto, cuando más elevado sea el número, tanto mayor será la respuesta inmune humoral a Ang-2
15 Tabla 2: Grupo 1: 10 ratones (cepa XMG2)
Después de 4 inyecciones
Después de 6 inyecciones
ID de ratón
Reactividad con rhAng-2
Títulos a través de hIgG
0825-1
92.000 231.000
0825-2
56.000 212.000
0825-3
73.000 331.000
0825-4
16.000 175.000
0825-5
95.000 236.000
0825-6
27.000 119.000
0825-7
100.000 239.000
0825-8
25.000 165.000
0825-9
68.000 136.000
0825-10
120.000 264.000
NC
35 65
PC
Sensibilidad: 10 ng/ml Sensibilidad: 9 ng/ml
*NC = cepa xmg2, ova gp 2, fp *PC = anticuerpo de cabra, anti-huAng-2 (R&amp;D Systems, nº de catálogo AF623) 1 mg/ml
Tabla 3: Grupo 2: 10 ratones (cepa XMG4)
Después de 4 inyecciones
Después de 6 inyecciones
ID de ratón
Reactividad con rhAng-2
Títulos a través de hIgG
0824-1
750 4.600
0824-2
200 5.800
0824-3
500 7.400
0824-4
225 4.700
0824-5
300 5.800
0824-6
550 7.400
0824-7
1.600 11.000
0824-8
45 2.400
0824-9
600 6.900
0824-10
225 2.300
NC
<100 35
PC
Sensibilidad: 12 ng/ml Sensibilidad: 8 ng/ml
*NC = 3c-1 N128-3 *PC = anticuerpo de cabra, anti-huAng-2 (R&amp;D Systems, nº de catálogo AF623) 1 mg/ml
EJEMPLO 2
RECUPERACIÓN DE LINFOCITOS, AISLAMIENTOS DE CÉLULAS B, FUSIONES Y GENERACIÓN DE HIBRIDOMAS
5 Ratones inmunizados fueron sacrificados mediante dislocación cervical y los nódulos linfáticos que drenaban se recolectaron y agruparon de cada uno de los cohortes. Las células linfoides se disociaron mediante molienda en DMEM para liberar las células de los tejidos y las células se suspendieron en DMEM. Las células se recontaron y al sedimento de células se añadieron 0,9 ml de DMEM por cada 100 millones de linfocitos con el fin de resuspender las células de forma suave pero completa. Al utilizar 100 !l de perlas magnéticas CD90+ por cada 100 millones de
10 células, las células se marcaron incubando las mismas con las perlas magnéticas a 4ºC durante 15 minutos. La suspensión de células marcadas magnéticamente que contenían hasta 108 células positivas (o hasta 2 x 109 células totales) se cargó sobre una columna LS+, y la columna se lavó con DMEM. El efluente total se recogió como la fracción CD90-negativa (se esperaba que la mayoría de las células fueran células B).
La fusión se realizó mezclando células B enriquecidas lavadas de antes y células de mieloma no secretoras
15 P3X63Ag8.653 adquiridas de ATCC, nº de cat. CRL 1580 (Kearney et al., J. Inmunol. 123, 1979, 1548-1550) a una relación de 1:1. La mezcla de células se sedimentó suavemente mediante centrifugación a 800 x g. Después de la separación completa del sobrenadante, las células se trataron con 2-4 mL de disolución Pronase (CalBiochem, nº de cat. 53702; 0,5 mg/ml en PBS) durante no más de 2 minutos. Después, se añadieron 3-5 ml de FBS para detener la actividad enzimática, y la suspensión se ajustó a un volumen total de 40 ml utilizando solución de fusión electrónica
20 de células (ECFS, sacarosa 0,3 M, Sigma, nº de cat. S7903, acetato de magnesio 0,1 mM, Sigma, nº de cat M2545, acetato de calcio 0,1 mM, Sigma, nº de cat. C4705). El sobrenadante se separó después de centrifugar, y las células se resuspendieron en 40 ml de ECFS. Esta etapa de lavado se repitió, y las células se resuspendieron de nuevo en ECFS hasta una concentración de 2 x 106 células/ml.
La electrofusión de células (ECF – siglas en inglés) se realizó utilizando un generador de fusión (modelo ECM2001,
25 Genetronic, Inc. San Diego, CA). El tamaño de la cámara de fusión utilizada era de 2,0 ml, utilizando las siguientes estipulaciones instrumentales:
Condición de alineamiento: voltaje: 50 V, tiempo: 50 s.
Rotura de la membrana a: voltaje: 3000 V, tiempo: !s
Tiempo de retención postfusión: 3 s.
Después de la ECF, las suspensiones de células se separaron con cuidado de la cámara de fusión en condiciones estériles y se transfirieron a un tubo estéril que contenía el mismo volumen de medio de cultivo de hibridoma (DMEM, JRH, Biosciences), FBS al 15% (Hyclone), suplementado con L-glutamina, pen/strep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim). Las células se incubaron durante 15-30 minutos a 37ºC y luego se centrifugaron a 400 x g (1000 rpm) durante cinco minutos. Las células se resuspendieron suavemente en un pequeño volumen de medio de selección de hibridoma (medio de cultivo de hibridoma suplementado con 0,5x HA (Sigma, nº de cat. A9666)), y el volumen se ajustó apropiadamente con más medio de selección de hibridoma, basado en una extensión en placas final de 5 x 106 células B totales por cada placa de 96 pocillos y 200 !l por pocillo. Las células se mezclaron suavemente y se pipetearon en placas de 96 pocillos y se dejaron crecer. El día 7 ó 10 se retiró la mitad del medio, y las células se realimentaron con medio de selección de hibridoma.
EJEMPLO 3
SELECCIÓN DE ANTICUERPOS CANDIDATOS MEDIANTE ELISA
Después de 14 días de cultivo, sobrenadantes de hibridoma se rastrearon en cuanto a la presencia de anticuerpos monoclonales específicos para Ang-2. Las placas ELISA (Fisher, nº de cat. 12-565-136) se revistieron con 50 !l/pocillo de Ang-2 humana (2 !g/ml) en tampón de revestimiento (tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6, NaHCO3 8,4 g/L) y luego se incubaron a 4ºC durante una noche. Después de la incubación, las placas se lavaron con tampón de lavado (Tween 20 al 0,05% en PBS) 3 veces, se añadieron 200 !l/pocillo de tampón de bloqueo (BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,1%, Thimerosal al 0,01% en 1x PBS) y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado, se añadieron 50 !l/pocillo de sobrenadantes de hibridoma y controles positivo y negativo, y las placas se incubaron a la temperatura ambiente durante 2 horas. El control positivo utilizado a lo largo del ensayo era suero procedente de ratones XenoMouse inmunizados con Ang-2, XMG2 del Ang-2 Grupo 1, almohadilla plantar (fp – siglas en inglés) N160-7, y el control negativo era suero procedente del ratón XenoMouse inmunizado con KLH, XMG2 KLH Grupo 1, almohadilla plantar (fp) L627-6.
Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado, se añadieron 100 !l/pocillo de anticuerpo de detección anti-hulgGFc-HRP de cabra (Caltag, nº de cat. H10507) y las placas se incubaron a la temperatura ambiente durante 1 hora. En el rastreo secundario, los controles positivos en el primer rastreo se rastrearon en dos conjuntos, uno para la detección de hlgG y el otro para la detección de la cadena ligera kappa de Ig humana (kappa-HRP anti-hlg de cabra (Southern Biotechnology, nº de cat. 2060-05) con el fin de demostrar una composición totalmente humana tanto para IgG como para Ig kappa. Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado, 100 !l/pocillo de TMB (BioFX Lab. nº de cat. TMSK-0100-01) y las placas se dejaron desarrollar durante aproximadamente 10 minutos (hasta que los pocillos de controles negativos apenas comenzaban a mostrar color). Luego se añadieron 50 !l/pocillo de solución Stop (solución Stop TMB, (BioFX Lab. nº de cat. STPR-0100-01), y las placas se leyeron en un lector de placas ELISA a 450 nm. Existían 185 anticuerpos IgG kappa totalmente humanos contra Ang-2.
Todos los anticuerpos que se unían en el ensayo ELISA fueron contra-rastreados para la unión a Ang-1 mediante ELISA con el fin de excluirles de aquellos que reaccionaban de forma cruzada con Ang-1. Las placas ELISA (Fisher, nº de cat. 12-565-136) se revistieron con 50 !l/pocillo de Ang-1 recombinante (2 !g/ml, obtenido de R&amp;D Systems, nº de cat. 293-AN-025/CF) en tampón de revestimiento (tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6, NaHCO3 8,4 g/L) y luego se incubaron a 4ºC durante una noche. Bajo las condiciones experimentales descritas en esta memoria, cuando la molécula de Ang-1 recombinante se inmovilizaba sobre la placa ELISA, no se encontró que los anticuerpos se unieran a Ang-1. Sin embargo, el contra-rastreo descrito en esta memoria tiene limitaciones técnicas. Primeramente, los anticuerpos se derivan de materiales en línea, pero no de un hibridoma clonado. Señales de unión procedentes de un clon particular, que únicamente responden a un porcentaje secundario de la línea, pueden caer por debajo del umbral de sensibilidad de detección. En segundo lugar, determinados epítopos en el antígeno pueden ser ocultados de los anticuerpos en este experimento debido a ligeros cambios conformacionales inducidos por la inmovilización del antígeno. Por todos estos motivos, se examinó adicionalmente la reactividad cruzada de cada anticuerpo con Ang-1 utilizando anticuerpos clonados y un sistema Biacore (véase el Ejemplo 8). Según se describe en el Ejemplo 8, se encontró que un clon (mAb 3.19.3) tenía de hecho una fuerte reactividad cruzada con Ang-1 recombinante humana (Ejemplos 8, 9 y 12).
EJEMPLO 4
INHIBICIÓN DE LA UNIÓN DE ANG-2 A TIE2
Como se ha discutido arriba, Ang-2 ejerce su efecto biológico al unirse al receptor Tie2. Anticuerpos monoclonales
que inhibían la unión Ang-2/Tie2 fueron identificados por un ensayo de unión competitiva utilizando un ELISA modificado. Los mAbs utilizados eran productos de micro-purificación procedentes de 50 ml de sobrenadantes exhaustivos de las agrupaciones de hibridoma que eran específicas para Ang-2 (véase el Ejemplo 3). Immplates™ Nunc de 96 pocillos se revistieron con 100 !l de proteína de fusión humana Tie2/Fc recombinante (R&amp;D Systems,
5 Inc. nº de cat. 313-TI-100) a razón de 4 !g/ml mediante incubación durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron cuatro veces utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS – siglas en inglés) con una estación Skan™ Washer 300 (SKATRON). Los pocillos se bloquearon mediante 100 !l de tampón de bloqueo ABX (BSA al 0,5%, Tween al 0,1%, Thimerosal al 0,01% en PBS) durante 1 hora.
A cada uno de los pocillos se añadió Ang-2 humana recombinante biotinilada (R&amp;D Systems, Inc. nº de cat. BT 623)
10 a razón de 100 ng/ml, con o sin los mAbs anti-Ang-2 a razón de 100 !g/ml. Las placas se incubaron a la temperatura ambiente durante dos horas antes de separar por lavado las moléculas no unidas. Después, Ang-2 biotinilada ligada se detectó utilizando 100 !l/pocillo de conjugado de estreptavidina-HRP a razón de 1:200 mediante incubación a la temperatura ambiente durante media hora. Después de lavar dos veces, la estreptavidina ligada se detectó mediante sustrato de HRP (R&amp;D Systems, nº de cat. DY998). Las placas se incubaron durante 30 minutos antes de añadir
15 solución 450 Stop (100 !l/pocillo, BioFX, nº de cat. BSTP 0100-01) para terminar la reacción. La absorbancia de la luz a 450 nm se determinó mediante un lector Spectramax Plus.
Como un control positivo se utilizó una proteína de fusión Tie2/Fc recombinante soluble en un exceso 10 veces molar con respecto a Ang-2. A esta concentración, Tie2/Fc inhibía la unión de Ang-2 a Tie2 inmovilizado en un 80%. Con esto como un criterio arbitrario, 74 de 175 mAbs de unión a Ang-2 mostraban una actividad inhibidora. Por
20 conveniencia operativa, los 27 neutralizadores superiores se seleccionaron para la subsiguiente clonación del hibridoma.
Cada uno de los hibridomas se clonó utilizando un método de dilución limitada mediante los procesos estándares siguientes. De cada uno de los hibridomas se recogieron 3 clones hermanas. Para cada uno de los clones, el sobrenadante se testó utilizando ELISA de unión a Ang-2 humana y unión antagonista a Ang-1, según se describe
25 arriba, para asegurar que cada uno de los anticuerpos fuera sólo específico para Ang-2. Se determinaron concentraciones de IgG en los sobrenadantes exhaustivos, y el clon con el rendimiento más elevado entre los tres clones hermanas de cada uno de los hibridomas se seleccionó para la purificación de IgG. De cada uno de los sobrenadantes se purificaron 0,5 a 1 mg de IgG para la caracterización ulterior.
Para cuantificar las actividades inhibidoras de los mAbs sobre la unión de Ang-2 a Tie2, se determinó el título para
30 los mAbs purificados procedentes de los 27 candidatos superiores utilizando un ensayo de unión competitiva. Cada una de las concentraciones del mAb se sometió a ensayo por duplicado. La relación concentración-respuesta se encontró mediante el ajuste de la curva utilizando el software gráfico Graphpad Prism™ (no lineal, curva sigmoide). Mediante el software se calcularon la inhibición máxima (eficacia) y la CI50 (potencia). Para la investigación ulterior se seleccionaron diez anticuerpos monoclonales que exhibían tanto una eficacia como una potencia elevadas. La
35 eficacia y la potencia de estos 10 mAbs se muestran en la Tabla 4
Tabla 4. Eficacia y potencia de 10 mAbs superiores
Clon
Eficacia* CE50 (µg/ml)
3.31.2
0,3751 0,04169
5.16.3
0,3279 0,08532
5.86.1
0,3844 0,1331
5.88.3
0,4032 0,1557
3.3.2
0,3881 0,1684
5.103.1
0,2317 0,3643
5.101.1
0,3639 0,3762
3.19.3
0,3945 0,7976
5.28.1
0,3892 2,698
5.78.3
0,2621 5,969
*Eficacia se expresa como la relación de Ang-2 ligado con mAbs (30 μg/ml) frente a sin mAbs.
EJEMPLO 5
COMPACTACIÓN DE ANTICUERPOS
La compactación de epítopos se realizó para determinar cuál de los anticuerpos anti-Ang-2 competiría de forma cruzada con otro y, así, fuese más probable unir al mismo epítopo a Ang-2. El proceso de compactación se describe 5 en la solicitud de patente de EE.UU. 20030175760, también descrita en Jia et al., J. Immunol. Methods (2004) 288: 91-98, las cuales se incorporan como referencia en su totalidad. En síntesis, perlas Luminex se acoplaron con antihulgG de ratón (Pharmingen nº 555784), siguiendo el protocolo de acoplamiento de proteínas proporcionado en la página web de Luminex. Perlas pre-acopladas se prepararon para el acoplamiento a anticuerpos desconocidos primarios utilizando el siguiente proceso, protegiendo las perlas de la luz. Se utilizaron tubos individuales para cada
10 sobrenadante desconocido. El volumen de sobrenadante necesario se calculó utilizando la siguiente fórmula: (nX2+10) x 50 !l (en que n = número total de muestras). En este ensayo se utilizó una concentración de 0,1 !g/ml. El material de perlas se sometió suavemente a un vórtice y se diluyó en sobrenadante hasta una concentración de 2500 de cada perla en 50 !l por pocillo o 0,5 x 105 perlas/ml.
Las muestras se incubaron en un sacudidor en la oscuridad a la temperatura ambiente durante una noche.
15 La placa de filtro se pre-humectó añadiendo 200 !l de tampón de lavado por pocillo, el cual luego se aspiró. A cada uno de los pocillos de la placa de filtro se añadieron 50 !l de cada una de las perlas. Las muestras se lavaron una vez añadiendo 100 !l/pocillo de tampón de lavado y aspirando. Antígeno y controles se añadieron a la placa de filtro a razón de 50 !l/pocillo. La placa se cubrió, se incubó en la oscuridad durante 1 hora en un sacudidor y luego las muestras se lavaron 3 veces. Después, un anticuerpo desconocido secundario se añadió a razón de 50 !l/pocillo.
20 Para el anticuerpo primario de utilizó una concentración de 0,1 !g/ml. Después, la placa se incubó en la oscuridad durante 2 horas a la temperatura ambiente en un sacudidor y luego las muestras se lavaron 3 veces. Se añadieron 50 !l/pocillo de IgG anti-humana de ratón biotinilada (Pharmingen nº 555785) diluida a razón de 1:500, y las muestras se incubaron en la oscuridad durante 1 hora con sacudimiento a la temperatura ambiente.
Las muestras se lavaron 3 veces. Se añadieron 50 !l/pocillo de estreptavidina-PE a una dilución de 1:1000, y las
25 muestras se incubaron en la oscuridad durante 15 minutos con sacudimiento a la temperatura ambiente. Después de pasar por dos ciclos de lavado en el Luminex 100, las muestras se lavaron 3 veces. El contenido en cada pocillo se resuspendió en 80 !l de tampón de bloqueo. Las muestras se mezclaron cuidadosamente con pipeteado varias veces para resuspender las perlas. Después, las muestras se analizaron en el Luminex 100. Los resultados se presentan abajo en la Tabla 5.
30 Tabla 5: Compactaciones para los 24 anticuerpos de Ang-2 superiores en ensayo funcional
Comp. 1
Comp. 2 Comp. 3 Comp. 4 Comp. 5 Comp. 6 Comp. 7 Comp. 7
3.3 3.28
3.38 5.103 5.56* 5.28 5.78 3.19 6.3 5.35 5.40
3.31
5.14
5.2
5.16 5.39 5.41 5.49 5.54 5.62 5.83 5.86 5.88 5.101 5.108
*Nota: el mAb 5.56 tenía un modelo de unión similar que el de 3.38 y 5.103, con pequeñas diferencias y una señal
mucho menor.
EJEMPLO 6
DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DE ANTICUERPOS ANTI-ANG-2 UTILIZANDO EL ANÁLISIS BIACORE
Rastreo de baja resolución de 27 anticuerpos monoclonales purificados
La resonancia de plasmon de superficie (SPR) exenta de marcadores, o Biacore se utilizó para medir la afinidad de 5 anticuerpos al antígeno. Para este fin, se preparó una superficie de anticuerpo anti-humano de cabra de alta densidad sobre un chip CM5 Biacore utilizando el acoplamiento de aminas rutinario. Todos los mAbs purificados se diluyeron hasta aproximadamente 8 !g/ml en tampón de desarrollo HBS-P que contenía 100 !g/ml de BSA y 10 mg/mL de carboximetildextrano. Cada uno de los mAb se capturó sobre una superficie separada utilizando un tiempo de contacto de 42 segundos y un lavado durante 5 minutos para la estabilización de la línea base del mAb.
10 Ang-2 se inyectó a razón de 90:9 nM sobre todas las superficies durante un minuto, seguido de una disociación durante 10 minutos. Datos de unión doblemente referenciados se prepararon sustrayendo la señal procedente de una célula de flujo control y sustrayendo la deriva de la línea base de un tampón inyectado justo antes de la inyección de Ang-2. Datos de unión de Ang-2 para cada mAb se normalizaron para la cantidad de mAb capturada en cada superficie, y se determinaron las respuestas normalizadas y corregidas en su deriva para los 27 mAbs. Los
15 datos se ajustaron globalmente a un modelo de interacción 1:1 para determinar la cinética de unión. Los resultados del análisis cinético de la unión de Ang-2 a 25ºC se listan en la tabla que figura más abajo. Los mAbs se clasifican desde la afinidad más elevada a la más baja.
Tabla 6. Rastreo Biacore de baja resolución de Ang-2 de 27 anticuerpos monoclonales purificados
Muestra
Amt. capturado (RU) ka(M-1s-1) Kd (s-1) Kd (pM)
5.16
157 3,6 x 105 1,0 x 10-5* 27
5.41
152 3,6 x 105 1,0 x 10-5* 28
5.35
138 3,4 x 105 1,0 x 10-5* 29
3.38
143 3,4 x 105 1,0 x 10-5* 30
5.108
66 3,2 x 105 1,0 x 10-5* 31
3.3
125 3,0 x 105 1,0 x 10-5* 33
5.49
260 2,7 x 105 1,0 x 10-5* 33
3.28 5.88
280 65 2,7 x 105 2,5 x 105 1,0 x 10-5*1,0 x 10-5* 37 37
5.28
136 2,5 x 105 1,0 x 10-5* 40
5.78
222 2,4 x 105 1,0 x 10-5* 42
5.39
166 2,3 x 105 1,0 x 10-5* 43
5.103
127 2,2 x 105 1,0 x 10-5* 45
5.13
78 2,1 x 105 1,0 x 10-5* 47
5.14
471 2,0 x 105 1,0 x 10-5* 49
3.31
196 1,9 x 105 1,0 x 10-5* 51
5.56
144 1,9 x 105 1,0 x 10-5* 52
5.2
111 1,6 x 105 1,0 x 10-5* 62
5.62
126 1,5 x 105 1,0 x 10-5* 65
5.54
131 1,5 x 105 1,0 x 10-5* 66
6.3
221 1,4 x 105 1,0 x 10-5* 73
3.19
252 9,0 x 104 1,0 x 10-5* 111
Muestra
Amt. capturado (RU) ka(M-1s-1) Kd (s-1) Kd (pM)
5.40
130 7,8 x 104 1,0 x 10-5* 129
5.83
157 6,8 x 104 1,0 x 10-5* 147
5.101
217 1,5 x 105 8,7 x 10-5* 581
5.86
126 1,5 x 105 1,1 x 10-5* 744
5.52
114 1,3 x 105 1,3 x 10-5* 750
Los asteriscos próximos a los resultados kd para todos los mAbs, excepto para los mAbs 5.101 y 5.86 indican que estas kds se mantuvieron constantes como una mejor estimación para el orden de la característica de magnitud de tasa de disociación lenta. El modelo de ajuste para estas muestras no detectó cambio mensurable en la tasa de disociación a lo largo del tiempo de disociación relativamente breve y, por lo tanto, requería que la kd fuese constante
5 con el fin de ajustar los datos de asociación. Los datos para las kd indicadas también se ajustan bien en una simulación con la kd en el orden de 10-6s-1, por lo tanto las interacciones pueden ser 10 veces o más intensas que las arriba reseñadas.
Los datos de disociación se miden normalmente durante 4-6 horas para experimentos de cinética de elevada resolución con mAbs con afinidades sub-100 pM. El tiempo de disociación máximo que se puede medir sin artefactos
10 de deriva de una superficie de mAb capturada es 20 minutos. Una disminución de la señal casi despreciable se mide a lo largo de un tiempo relativamente corto con mAbs de elevada afinidad, de modo que la estimación de kd puede variar tanto como dos órdenes de magnitud.
EJEMPLO 7
DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DE ANTICUERPOS ANTI-ANG-2 UTILIZANDO EL ANÁLISIS BIACORE
15 Rastreo de resolución media/alta de Ang-2 con tres anticuerpos monoclonales purificados
Los mAbs 5.16, 5.35 y 5.41 purificados se diluyeron hasta aproximadamente 8 !g/ml en acetato de sodio 10 mM, pH 5,0. Después, cada uno de los mAbs diluidos se inmovilizó en una superficie de célula de flujo diferente (chip CM5 de Biacore) utilizando un acoplamiento de amina rutinario.
Para la adquisición de datos de asociación, se inyectaron al azar durante 90 segundos, por triplicado, ocho
20 concentraciones (diluciones dobles) que oscilaban entre 90,9-0,71 nM de Ang-2 con varias inyecciones tampón intercaladas para la doble referencia, seguida de una disociación durante cuatro minutos. Las superficies de los anticuerpos se regeneraron con dos impulsos durante 9 segundos de glicina-HCl 10 nM, pH 1,5, después de cada ciclo de inyección.
Para la adquisición de datos de disociación, se inyectaron tres muestras de 90,9 nM de Ang-2 en tampón de
25 desarrollo HBS-P que contenía 100 !g/ml de BSA según se describe arriba, y los datos de disociación se registraron a lo largo de ocho horas. Las inyecciones de muestras alternaban con tres ciclos de inyecciones en blanco. La regeneración se realizó según se describe arriba.
Los datos se ajustaron globalmente a un modelo de interacción 1:1 con transporte de masa utilizando CLAMP (David
G. Myszka y Thomas Morton (1998) “CLAMP©: a biosensor kinetic data analysis program“, TIBS 23, 149-150). Las 30 constantes de unión resultantes se muestran en la Tabla 7 que figura a continuación.
Tabla 7. Rastreo por Biacore de resolución media de Ang-2 de 3 anticuerpos monoclonales purificados
Muestra
Rmax ka(M-1s-1) Kd (s-1) Kd (pM)
5.16
36 3,41 x 105 2,77 x 10-6 8,13
5.35
54 5,64 x 105 1,87 x 10-6 3,31
4.41
44 4,69 x 105 8,31 x 10-6* 17,7*
Se midió una caída significativa de la señal a lo largo del tiempo de disociación de 8 horas. Con los datos de disociación de ocho horas, la CLAMP era capaz de estimar de forma más razonable la kd para cada uno de los mAbs. En este caso, las kd tanto para 5.16 como para 5.35 son del orden de 10-6s-1.
35 La reactividad cruzada de anticuerpos a Ang-1 se investigó luego midiendo la afinidad de los mAbs a Ang-1, según
se describe más abajo en el Ejemplo 8.
EJEMPLO 8
DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DE ANTICUERPOS ANTI-ANG-1 UTILIZANDO EL ANÁLISIS BIACORE
La reactividad cruzada de anticuerpos a Ang-1 se investigó adicionalmente midiendo la afinidad de los mAbs a Ang
1. En lugar de inmovilizar Ang-1, según se describe en la unión antagonista basada en ELISA (Ejemplo 3), mAbs de Ang-1 se inmovilizaron a los chips CM5 Biacore, y Ang-1 en solución se inyectó para la determinación de la asociación y disociación. En este experimento se sometieron a ensayo seis mAbs, incluidos 3.3.2, 3.31.2, 5.16.3, 5.86.1, 5.88.3 y 3.19.3, según se describe más abajo para determinar la intensidad con la que reaccionaba de forma cruzada con Ang-1.
Rastreo de resolución media de sdeis anticuerpos monoclonales purificados
La resonancia de plasmón de superficie (SPR) exenta de marcador, o una intrumentación Biacore 2000, se utilizó para medir la afinidad de anticuerpos a Ang-1. Para este fin, se preparó una superficie de anticuerpo a-humano de cabra de alta densidad sobre un chip CM5 Biacore, utilizando el acoplamiento de aminas rutinario. Para los experimentos de desarrollo, mAbs purificados (clones 3.19.3, 3.3.2, 5.88.3, 5.86.1, 3.31.2, 5.16.3) se diluyeron hasta aproximadamente 2,5-3,5 !g/ml en tampón de desarrollo HBS-P que contenía 100 !g/ml de BSA. El nivel de captura para cada uno de los mAbs era de aproximadamente 150 RU. A cada ciclo de captura le siguió un lavado durante 5 minutos para estabilizar la línea base del mAb.
Una muestra única de Ang-1, diluida hasta 87,4 nM en el tampón de desarrollo, se inyectó durante un minuto sobre todas las superficies de captura. Para cinco mAbs no era evidente unión alguna, a pesar de que se encontró que Ang-1 se unía al mAb 3.19.3. Este experimento se repitió aumentando los niveles de captura de mAb a más de 500600 RU e inyectando Ang-1 380 nM durante 1 minuto. Se encontró de nuevo que el mAb 3.19.3 se unía a Ang-1.
Dado que Ang-1 únicamente mostraba una actividad de unión hacia el mAb 3.19.3, se determinó la afinidad de este mAb tanto a Ang-1 como a Ang-2. Dado que Ang-1 exhibía una lenta disociación durante los experimentos de desarrollo anteriores, un experimento de captura de resolución media no habría registrado datos de disociación suficientes para estimar de forma fiable la kd. Como resultado de ello, la unión de Ang-1 y Ang-2 al mAb 3.19.3 se midió bajo condiciones Biacore de alta resolución.
EJEMPLO 9
DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DEL mAb 3.19.3 POR ANG-1 Y ANG-2 UTILIZANDO EL ANÁLISIS BIACORE DE ALTA RESOLUCIÓN
El mAb 3.19.3 purificado se diluyó hasta 12,5 !g/ml en acetato de sodio 10 mM, pH 4,0. Después, el mAb se inmovilizó sobre células de flujo 1-3 (chip CM5 Biacore) utilizando el acoplamiento de aminas rutinario, dejando a la célula de flujo 4 como la célula de flujo de referencia.
Para la adquisición de datos de asociación, ocho concentraciones (diluciones dobles) que oscilaban entre 39,8 - 0,31 nM de Ang-1 (en tampón de desarrollo HBS-P que contenía 100 !g/ml de BSA) se inyectaron aleatoriamente durante 90 segundos (100 !L/min, caudal) en triplicado con varias inyecciones tampón intercaladas para doble referencia, seguido de una disociación durante 4 minutos. Las superficies de los anticuerpos se regeneraron con un impulso durante 6 segundos de NaOH 10 mM después de cada ciclo de inyección.
Para la adquisición de datos de disociación, tres muestras de 19 nM de Ang-1 se inyectaron según se describe arriba y los datos de disociación se registraron a lo largo de seis horas. Las inyecciones de muestra alternaban con tres ciclos de inyección en blanco. La regeneración se realizó como se describe arriba.
Los datos se fijaron globalmente a un modelo de interacción 1:1 con un término para el transporte de masa que incluía utilizar CLAMP (David G. Myzka y Thomas Morton (1998) “CLAMP©: a biosensor kinetic data analysis program, “TIBS 23, 149-150).
Estudio de Biacore de alta resolución de Ang-2 con mAb 3.19.3 purificado
El mAb 3.19.3 purificado se diluyó hasta 12,5 !g/ml en acetato de sodio 10 mM, pH 4,0. Después, el mAb se inmovilizó sobre células de flujo 1-3 (chip CM5 Biacore) utilizando el acoplamiento de aminas rutinario, dejando a la célula de flujo 4 como la célula de flujo de referencia.
Para la adquisición de datos de asociación, ocho concentraciones (diluciones dobles) que oscilaban entre 30,0 - 0,23 nM de Ang-2 (en tampón de desarrollo HBS-P que contenía 100 !g/ml de BSA) se inyectaron aleatoriamente durante 90 segundos (100 !L/min, caudal) en triplicado con varias inyecciones tampón intercaladas para doble referencia,
seguido de una disociación durante cuatro minutos. Las superficies de los anticuerpos se regeneraron con un impulso durante 6 segundos de NaOH 15 mM después de cada ciclo de inyección.
Para la adquisición de datos de disociación, tres muestras de 15,0 nM de Ang-2 se inyectaron según se describe arriba y los datos de disociación se registraron a lo largo de seis horas. Las inyecciones de muestra alternaban con 5 tres ciclos de inyección en blanco. Cada una de las superficies se regeneró con un impulso de 6 segundos de NaOH 15 mM después de cada ciclo de inyección de disociación largo.
Los datos se fijaron globalmente a un modelo de interacción 1:1 con un término para el transporte de masa que incluía utilizar CLAMP (David G. Myzka y Thomas Morton (1998) “CLAMP©: a biosensor kinetic data analysis program, “TIBS 23, 149-150).
10 Resultado y discusión: estudio de Biacore de alta resolución de Ang-1 y Ang-2 con el mAb 3.19.3
Con cada uno de los antígenos se realizaron dos experimentos independientes. Los resultados se muestran en la Tabla 8 que figura a continuación:
Tabla 8. Resultados de Biacore de resolución alta de la unión de Ang-1 y Ang-2 añ mAb 3.19.3 purificado
Antígeno
ka(M-1s-1) Kd (s-1) Kd (pM)
Ang-1 (1º)
1,33 x 105 4,05 x 10-6 30,4
Ang-1 (2º) Ang-2 (1º)
1,82 x 105 1,89 x 105 5,51 x 10-61,00 x 10-6* 30,2 5,3
Ang-2 (2º)
1,78 x 105 1,00 x 10-6* 5,6
Las kds para Ang-2 en la tabla anterior están provistas de un asterisco, ya que estos valores se mantuvieron
15 constantes durante el modelo de interacción 1:1 ajustado en el software CLAMP. No existía ninguna señal de disociación significativa registrada para los experimentos con Ang-2, de modo que la mejor estimación de disociación era mantener la constante kd a 1 x 10-6s-1. Los largos datos de disociación para Ang-2 exhibieron realmente una tendencia ascendente a lo largo de las seis horas de adquisición de datos. Esta tendencia se repitió en dos chips de sensor diferentes con dos instrumentos diferentes, después de haber sido sometidos los dos instrumentos a un
20 protocolo de mantenimiento “super-limpio”. Con el fin de medir con mayor precisión de la afinidad de unión del mAb
3.19.3 por Ang-1 y Ang-2, se realizó un experimento adicional (véase el Ejemplo 10) para determinar la kd del mAb
3.19.3 hacia estos antígenos.
De manera interesante, el mAb 3.19.3 no se unía a Ang-1 en el ensayo de unión basado en ELISA (Ejemplo 3) cuando Ang-1 estaba inmovilizado sobre la placa ELISA. La probable explicación de esta discrepancia es que
25 cuando Ang-1 se inmovilizaba sobre la superficie de plástico, no se expuso apropiadamente un sutil epítopo crítico para la unión de mAb 3.19.3. Sin embargo, cuando Ang-1 se encontraba en la fase líquida, tal como en las condiciones experimentales Biacore, el epítopo se convirtió en accesible al mAb 3.19.3 y se producía la unión.
EJEMPLO 10
DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD DEL mAb 3.19.3 POR ANG-2 HUMANO UTILIZANDO KINEXA DE ELEVADA 30 RESOLUCIÓN (ENSAYO DE EXCLUSIÓN CINÉTICA)
Cuando la afinidad del mAb 3.19.3 por la Ang-2 humana se midió utilizando Biacore de alta resolución (Ejemplo 9), se encontró que no existía ninguna señal de disociación significativa. Los datos de larga disociación para Ang-2 muestran una tendencia ascendente a lo largo de las seis horas de adquisición de datos. Debido a esto, la kd del mAb 3.19.3 que se une a Ang-2 humana se determinó utilizando la tecnología KinExA, con el objetivo de obtener un 35 valor kd más fiable. Para este fin, se utilizó un instrumento KinExA 3000. Primeramente, 1 ml (~ 271 !g) de Ang-2 patrón (R&amp;D Systems, Inc., lote nº BNO32510A) se intercambió con fosfato en 1x PBS, pH 7,0 utilizando una columna de desalación de 10 mL (columna de poliacrilamida Pierce D-Salt™, corte del peso molecular 6.000, lote nº GF97965). Se determinó que la concentración de las fracciones agrupadas era 1,7 !M utilizando el método de determinación de la concentración de proteínas descrito por C. Nick Pace (Pace et al., Protein Science, Vol. 4: 241140 2423 (1995). En segundo lugar, 200 mg de perlas de poli(metacrilato de metilo) (PMMA, lote nº 206-01) se acoplaron con 450 !l (~ 122 !g) de Ang-2 de partida durante una noche a 24ºC. Después, las perlas se centrifugaron y se lavaron una vez con tampón de bloqueo (1x PBS, 10 mg/ml de BSA), se centrifugaron de nuevo y luego se incubaron en tampón de bloqueo durante una hora a 24ºC. Después del bloqueo, las perlas se diluyeron en aproximadamente 30 mL de tampón HBS (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, pH 7,4) en un vial de depósito de perlas KinExA estándar y se
colocó en el instrumento.
Titulación contrada en kd
Doce disoluciones que contenían una concentración del sitio de unión del mAb 3.19.3 de 25,3 pM se titularon con concentraciones crecientes de Ang-2. La Ang-2 intercambiada con tampón se utilizó para las preparaciones de muestras. Cada disolución tenía un volumen total de 25 mL y se dejó equilibrar durante 5 días a -24ºC. Las disoluciones de titulación se prepararon utilizando elementos de vidrio volumétricos, y las concentraciones de Ang-2 se variaron de 5,09 nM a 99,3 fM. El método del instrumento KinExA utilizado para el análisis de estas disoluciones consistía en una etapa de empaquetamiento de perlas, en la que las perlas de PMMA se empaquetaron en un capilar de vidrio, y las disoluciones equilibradas se hicieron fluir a través de la columna de perlas a razón de 0,25 mL/min durante 6 min (1,5 mL) por duplicado. Subsiguientemente, un anticuerpo policlonal (específico para Fc) anti-humano de cabra Cy-5 marcado de modo fluorescente a una concentración 3,4 nM se hizo fluir a través del paquete de perlas durante 1 min a razón de 0,5 mL/min para marcar el mAb con sitios de unión libres capturados sobre las perlas. La emisión de fluorescencia del paquete de perlas se midió a 670 nm con una excitación a 620 nm. Las mediciones de fluorescencia resultantes se convirtieron en “% de sitio de unión al mAb libre” frente a la concentración total de antígenos utilizando el paquete de software KinExA acompañante (versión 1.0.3 Sapidyne, Inc.). La curva de titulación controlada para kd resultante se ajustó con el software KinExA a una isoterma en equilibrio 1:1 con un factor de corrección de la deriva incluido. El valor de la kd que se ajustaba a los datos óptimamente era 86,4 pM con límites de confianza bajos y elevados del 95% a 64,3 pM y 98,7 pM, respectivamente. No se realizó una curva de titulación controlada del mAb.
EJEMPLO 11
BLOQUEO DE LA FOSFORILACIÓN DE TIE2 INDUCIDA POR ANG-2, ECTÓPICAMENTE EXPRESADA EN CÉLULAS HEK293
Tal como se comenta arriba, Tie2 es un receptor de tirosina quinasa específico para células endoteliales. Experimentos in vitro con células endoteliales vasculares demuestran que Ang-1 induce la fosforilación de Tie2, mientras que Ang-2 inhibe la fosforilación del receptor inducida por Ang-1. Sin embargo, cuando Tie2 se expresa ectópicamente, tal como en fibroblastos, Ang-2 es también capaz de inducir la fosforilación de Tie2 bajo determinadas condiciones que incluyen, pero no se limitan a exposición prolongada a angiopoyetina-2 o exposición a elevadas concentraciones de angiopoyetina-2.
La fosforilación de Tie2 inducida por Ang-2 también se produce cuando el receptor se expresa en células HEK293F. La capacidad de mAbs anti-Ang-2 de bloquear la fosforilación de Tie2 inducida por Ang-2 se examinó utilizando células HEK293F transfectadas con el receptor Tie2 humano. El vector del plásmido pORK/pBS-SK que tiene un ADNc de Tie2 se obtuvo de la ATCC (nº de cat. 69003, secuencia Genbak BC033514). La exactitud del ADNc se confirmó mediante secuenciación de los nucleótidos. Un fragmento de 3,9 kb que contenía un ADNc de 3375 pb que codifica Tie2 humano se separó del vector mediante digestión con EcoRI. Este fragmento se subclonó en la orientación adecuada en un vector pCR3.1 digerido con EcoRI siguiendo procesos convencionales. El plásmido seleccionado se amplificó y purificó mediante protocolos estándares.
La construcción que contenía Tie2 obtenida por los procesos anteriores se transfectó a células HEK293F por el método de transfección con fosfato de calcio. 1 x 106 células HEK293F se hicieron crecer en placas de cultivo tisular de 100 mm revestidas con gelatina al 1% a 37ºC, con 5% de CO2. Las células se alimentaron con medio reciente durante 2-3 horas antes de la transfección. 10 !g del ADN del plásmido se disolvieron en disolución de fosfato de calcio 240 mM. La transfección se realizó utilizando procesos convencionales. Transfectantes adecuados se seleccionaron mediante incubación en 0,5 mg/ml de G418. Transfectantes estables que expresan Tie2 se identificaron mediante análisis FACS utilizando el mAb anti-Tie2 de ratón (R&amp;D nº de cat. MAB313) y un anticuerpo conjugado de IgG-PE anti-ratón de cabra (Caltag, nº de cat. M30004-4) para la detección.
Para realizar el ensayo de fosforilación de Tie2, transfectantes de HEK 293F/Tie-2 se hicieron crecer en placas de cultivo celulares de 60 mm a una densidad de 2 x 106 células/placa con medio completo a 37ºC, con 5% de CO2 hasta que habían alcanzado la sub-confluencia. El medio completo en cada placa se reemplazó por 2 ml de medio exento de suero. Las células se incubaron durante 16 horas adicionales. Subsiguientemente, el medio se reemplazó de nuevo por 2 ml de medio exento de suero. Después de 2 h de incubación adicionales, las células se trataron con ortovanadato de sodio 0,1 mM (Sigma, nº de cat. S 6508) durante 20 minutos. Las células fueron tratadas con Ang-2 (2 !g/ml) en presencia o ausencia de mAbs a razón de 100 !g/ml. Los tratamientos se realizaron por duplicado. Se incluyó un control negativo sin tratamiento con Ang-2. Las células se aclararon con vanadato que contenía TBS enfriado con hielo, y se lisaron con 300 !l/placa de tampón de lisis NP-40 enfriado (HEPES 50 mM, pH 7,2, suplementado con NaCl 0,15 M, glicerol al 10%, pirofosfato 10 mM, NaF 50 mM, NP40 al 1%, 100 U/ml de aprotinina, PMSF 1 mM, ortovanadato 0,1 mM, leupeptina 10 !M y pepstatina A 10 !M) al tiempo que se colocaban las placas sobre hielo durante 10 minutos. Las células tratadas se rascaron de las placas en un microtubo pre
enfriado rápidamente sobre hielo.
Los lisados de células se trataron brevemente con ultrasonidos y se centrifugaron a 12.000 x g a durante 10 minutos a 4ºC en una microcentrífuga de mesa. Los sobrenadantes se recogieron en microtubos recientes y al sobrenadante se añadieron 1-5 !g de mAb anti-Tie2 (R&amp;D Systems, Inc.), seguido de un balanceo suave durante 2 horas a 4ºC. A 5 la mezcla se añadieron 50 !l de proteína A inmovilizada ImmunoPure (PIERCE, nº de cat. nº 20333) y se incubó durante al menos 3 horas a 4ºC sobre una plataforma de balanceo. Los complejos se recogieron mediante centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos. Después de separar cuidadosamente el sobrenadante, los complejos se lavaron dos veces con el tampón de lisis mediante centrifugación (12.000 x g, 4ºC) durante 4 minutos. Los sedimentos se resuspendieron en 50 !l de tampón de muestra de electroforesis 2X (Invitrogen, nº de cat. NC-2676)
10 con 1 mm de �-mercaptoetanol o DTT y se hirvieron durante 5 minutos antes de ser centrifugados (12.000 x g, 4ºC) durante 5 minutos. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos recientes.
Las muestras se cargaron a los pocillos de un gel SDS-PAGE (p. ej. gel de Tris-glicina al 4-20%, Invitrogen, nº de cat. EC6025). La electroforesis se realizó en un sistema tampón de Tris-glicina. Después de la electroforesis, el gel se transfirió sobre una membrana de PVDF (Invitrogen, nº de cat. LC 2005) siguiendo un protocolo estándar. La 15 fosforilación de tirosina se sondeó con anticuerpo anti-fosfotirosina 4G10 a razón de 1 !g/ml (Upstate, nº de cat. 05321) mediante incubación durante 1 hora a la temperatura ambiente con sacudimiento, y seguido de lavado con 1 x TBST (TBS con Tween 20 al 0,1%) durante tres veces. Los anticuerpos ligados se detectaron mediante incubación con IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz nº de cat. sc-2302) a una dilución de 1:10.000 durante 1 hora a la temperatura ambiente, seguido por la reacción de quimioluminiscencia de
20 refuerzo utilizando el sistema SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (PIERCE, nº de cat. 34075). Subsiguientemente, el borrón se separó por arrastre con tampón de arrastre de transferencia Western Restore (PIERCE, nº de cat. 21059) y se volvió a sondear con anticuerpos específicos contra RTK para verificar la calidad de la carga de muestra.
Se descubrió que cuando Tie2 humano se expresaba ectópicamente en células HEK293F, la autofosforilación de
25 Tie2 no era detectable. En respuesta al tratamiento con Ang-2 (2 !g/ml), se detectó un nivel significativo de fosforilación por tirosina por parte de un mAb contra tirosina fosforilada (AG10) de Tie2 inmunoprecipitado por el mAb específico. A una concentración de 100 !g/ml, todos los mAbs anti-Ang-2 testados mostraban una inhibición obvia de la fosforilación con Tie2, mientras que el mAb control del isotipo no tenía efecto inhibidor (Figura 1). El anticuerpo monoclonal 5.103.1, que no se muestra en la Figura 1, tenía un efecto inhibidor similar.
30 Para clasificar la potencia de los mAbs Ang-2 para inhibir la fosforilación de Tie2 inducida por Ang-2 in vitro, se estableció un método cuantificable basado en ELISA para detectar la fosforilación de Tie2. En síntesis, se prepararon lisados de células de transfectantes HEK293F/Tie2 que se trataron con Ang-2 con los mAbs a diversas concentraciones. El Tie2 total procedente del lisado se capturó en la placa ELISA de 96 pocillos que se revistió con mAb anti-hTie2 de ratón. El Tie2 fosforilado se detectó utilizando el anticuerpo primario 4G10-HRP (adquirido de
35 Upstate) y la disolución de sustrato HRP. La DO a 650 nm se determinó mediante un lector SpectraMax. La relación concentración-respuesta se encontró mediante el ajuste de la curva utilizando el software gráfico Graphpad Prism™ (no lineal, curva sigmoide). La inhibición máxima (eficacia) y la CI50 (potencia) se calcularon como se muestra en la Figura 2. La CE50 se calculó tal como se muestra más abajo en la Tabla 9.
Tabla 9
mAb CE50(!g/ml) 95% de CI
3.19.3 0,006 0,004 a 0,009 5.86.1 0,008 0,007 a 0,011
5.88.3 0,016 0,011 a 0,024
3.31.2 0,043 0,029 a 0,064
3.3.2 0,046 0,020 a 0,105
5.16.3 0,089 0,046 a 0,174 5.103.3 0,095 0,046 a 0,199 5.101.1 0,733 0,487 a 1,105
Tal como se reseña anteriormente, se encontró que el mAb 3.19.3 reaccionaba de forma cruzada con Ang-1. Sin 40 embargo, los resultados de los experimentos iniciales no encontraban una inhibición de la fosforilación de Tie-2
inducida por angiopoyetina-1 por parte del mAb 3.19.3. Es digno de señalar que la expresión ectópica de Tie2 puede afectar a su susceptibilidad a la activación por parte de diferentes ligandos, según se evidencia por el hecho de que Ang-2 no induce la fosforilación de Tie2 en HUVECs, mientras que sí induce la fosforilación de Tie2 robusta cuando el receptor es expresado ectópicamente en células HEK293.
5 A la vista de estos resultados, se realizaron experimentos adicionales para investigar con mayor detalle si el mAb
3.19.3 era capaz de inhibir la unión tanto de Ang-1 como de Ang-2 a Tie2 ligado a las células. Además, la inhibición de la fosforilación de Tie-2 inducida por angiopoyetina-1 por parte del mAb 3.19.3 se investigó con mayor detalle según se describe en el Ejemplo 12 que figura a continuación.
EJEMPLO 12
10 EL Mab 3.19.3 INHIBE LA UNIÓN DE ANGIOPOYETINA-1 A TIE-2 Y LA FOSFORILACIÓN DE TIE2 INDUCIDA POR ANG-1
El mAb 3.19.3 reacciona de forma cruzada con Ang-1 humana (Ejemplos 8 y 9). Sin embargo, experimentos iniciales indicaron que el mAb 3.19.3 no inhibía la fosforilación de Tie2 inducida por Ang-1. La discrepancia puede explicarse por lo siguiente: (1) se puede requerir una elevada concentración de Ang-1, que es bastante superior a la 15 concentración fisiológica, para generar una señal de fosforilación de Tie2 robusta; o (2) la expresión ecotópica de Tie2 en HEK293 puede alterar la conformación de Tie2 y, así, cambiar su susceptibilidad a diferentes ligandos. Para testar estas hipótesis, el mAb 3.19.3 se testó en un ensayo de unión en donde una baja concentración de Ang-1 o Ang-2 (3 nM) se unía a Tie2 de la superficie de la célula. Se encontró que el mAb 3.19.3 inhibía la unión tanto de Ang-1 como de Ang-2 en este experimento. En segundo lugar, se utilizaron células endoteliales inmortalizadas
20 (EA.hy926/B3) para investigar la fosforilación de Tie2 inducida por Ang-1. Los resultados de este experimento, según se describe con mayor detalle más abajo, demuestran que el mAb 3.19.3 inhibe la fosforilación de Tie2 inducida por Ang-1 de una manera dependiente de la dosis.
Transfectantes HEK193F/Tie2 se dejaron crecer hasta un 95% de confluencia en matraces de cultivo antes de ser recolectados. Se preparó una suspensión de células de 4 millones de células/mL en tampón FACS, y luego se 25 distribuyeron en partes alícuotas a una placa de polipropileno de 96 pocillos con 50 !l por pocillo. El mAb 3.19.3 con las concentraciones indicadas se añadió a la suspensión de células. Subsiguientemente, se añadieron disoluciones de Ang-1 y Ang-2 humanas recombinantes a la suspensión de células, seguido de incubación a la temperatura ambiente durante 2 horas. Las células se lavaron mediante centrifugación de la placa a 1.200 rpm durante 5 minutos, separando el sobrenadante mediante aspiración, y resuspendiendo las células con 200 !l por pocillo de tampón 30 FACS. Los procesos de lavado se repitieron dos veces. Después, las células se suspendieron con 100 !l de anticuerpo anti-6X-histidina de ratón diluido hasta 2 !g/ml en tampón FACS, y se incubaron a la temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar, las células se suspendieron en 100 !l de IgG anti-ratón de cabra conjugada con PE, que se diluyó en una relación 1:100 en tampón FACS, para la incubación a la temperatura ambiente durante 30 minutos. El volumen de las muestras se llevó a 300 !l con tampón FACS y se midió con un
35 aparato Calibur FACS.
Los resultados se ilustran en la Figura 3 y se resumen en la Tabla 10. Tal como se muestra, Tie2/Fc soluble inhibía de forma dependiente de la dosis la unión tanto de Ang-1 como de Ang-2 bloqueando los ligandos, mientras que el mAb control del isotipo, PK 16.3.1, no tenía efecto alguno sobre la unión de ningún ligando. El mAb 3.19.3 mostraba una inhibición dependiente de la concentración tanto de Ang-1 como de Ang-2. Interesantemente, con la potencia de
40 Tie2/Fc como referencia, la potencia del mAb 3.19.3 a la unión de Ang-2 era mayor que a Ang-1.
Tabla 10. Inhibición de la unión de Ang-1 y Ang-2 a Tie 2
CE50 (nM)
Ang-1
Ang-2
Tie2/Fc
18,73 27,70
3.19.3
218,5 0,7310
Estos resultados indicaban que el mAb 3.19.3 no solamente se unía a Ang-1 humana, sino que también bloqueaba su unión al receptor Tie2. Esto se confirmó adicionalmente mediante la inhibición de la fosforilación de Tie2 inducida por Ang-1 en células endoteliales inmortalizadas según se describe más abajo.
45 La actividad inhibidora del mAb 3.19.3 sobre la fosforilación de Tie2 inducida por Ang-1 se cuantificó como sigue. El mAb mostró una inhibición creciente obvia de la fosforilación de Tie-2 con una concentración creciente de anticuerpos, tal como se muestra en las Figuras 4 y 5. Una gráfica de la curva de dosis-respuesta condujo al cálculo
de una CI50 de 99 nM.
Ensayo de fosforilación del receptor Tie-2 estimulada por el ligando de angiopoyetina-1
Células EA.hy926/B3 se sembraron en placas de 6 pocillos utilizando 2,5 x 105 células EA.hy926/pocillo en un volumen de DMEM de 2 ml; HAT; FCS al 10% y se incubaron durante 3 días bajo condiciones convencionales de células de mamíferos.
El medio de crecimiento fue reemplazado por 2 ml de DMEM (sin FCS), y a las células se las desproveyó de suero durante un total de 2 horas. Compuestos de ensayo se diluyeron en DMEM; FCS al 1% hasta el doble de la concentración final deseada. Después de 1 hora y 40 minutos de la privación de suero, se retiró el medio de las células y se reemplazó por 1 ml de diluciones del compuesto de ensayo. De manera similar, controles tratados sin compuesto también progresaban para proporcionar muestras que representan patrones de estimulación de ligandos del 100%.
La incubación se continuó durante 10 minutos adicionales, después de los cuales se añadieron a cada uno de los pocillos 100 !l de la disolución de ortovanadato 10 mM en DMEM para obtener una concentración final de ortovanadato de 1 mM en cada uno de los pocillos. Después, las células se incubaron durante los últimos 10 minutos de las 2 horas del período de privación de suero.
Una vez que se había completado el periodo de privación de suero de 2 horas, se añadió 1 ml de angiopoyetina-1 (diluida hasta la concentración apropiada en DMEM que contenía ortovanadato 1 mM) a cada uno de los pocillos y se incubó a 37ºC durante 10 minutos adicionales.
La o las placas de 6 pocillos se enfriaron luego colocándolas sobre una placa de metal enfriada con hielo (ella misma mantenida en hielo). El medio de las células se separó y la capa de células se lavó con 5 ml de PBS frío; ortovanadato 1 mM. Un ml del tampón de lisis enfriado con hielo (Tris 20 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, SDS al 0,1%, NP40 al 1%, DOC al 0,5%, ortovanadato 1 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, 30 !l/ml de aprotinina, 10 !l/ml de pepstatina, 10 !l/ml de leupeptina) se añadió a cada uno de los pocillos y se dejó en hielo durante 10-20 minutos. Las células se separaron por raspado de la placa utilizando un desprendedor de células, y toda la disolución del lisado se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se mantuvo en hielo. Después, las muestras se centrifugaron durante 3 minutos a 13.000 rpm a 4ºC, y todas las etapas subsiguientes se llevaron a cabo a 4ºC.
50 !l de cada uno de los lisados se mantuvieron para el ensayo de proteínas BCA (Pierce, nº de cat. 23225) (en placas de microtitulación de polipropileno de baja unión a proteínas de Greiner). La concentración de proteínas se determinó utilizando las condiciones de ensayo convencionales suministradas con el kit. 800 !l adicionales de cada lisado de muestras se transfirieron a un tubo Eppendorf de 2 ml reciente en preparación para la inmunoprecipitación (IP). 15 !l (3 mg) de anti P-Y (Santa Cruz, nº de cat. E2203) se añadieron a los lisados y se dejó incubar durante 2 horas a 4ºC antes de añadir 600 !l de las perlas Magnabind (IgG anti-ratón de cabra, Pierce, nº de cat. 21354). Las perlas Magnabind se prepararon como sigue: el volumen requerido se transfirió a tubos cónicos de 15 ml. Después, los tubos se colocaron en presencia de un campo magnético y el líquido se retiró. Se añadió PBS reciente utilizando el volumen original, y las perlas se resuspendieron. Este proceso se repitió dos veces. La disolución que contenía lisado se mezcló luego con las perlas y los tubos se dejaron rotar durante una noche a 4ºC en un mezclador con rotor.
Las muestras se expusieron durante aproximadamente 1 min al imán y el líquido se retiró cuidadosamente. Se añadió 1 ml de tampón de lisis y los tubos se hicieron girar durante 5 min para el lavado. Las etapas de lavado se repitieron dos veces. El líquido se retiró por completo y las perlas se resuspendieron en 12 !l de tampón de carga 2x Laemmli (94ºC) + bME, y luego se dejaron reposar durante 15 min a la temperatura ambiente. Los tubos se expusieron durante 1 min en el imán y el líquido que se separó de las perlas se analizó en geles de PAGE/SDS.
Las muestras se analizaron, utilizando geles de PAGE/SDS utilizando geles de Bis Tris NuPAGE /MOPS al 4-12% con 15 pocillos (Novex). Por cada ranura se cargó un total de 12 !l de cada uno de los inmunoprecipitados. Los geles se hicieron funcionar a 200 V / 120 mA / 25 vatios durante 55 minutos y después se realizó con las muestras una transferencia Western sobre una membrana de nitrocelulosa durante 1 h 30 min a 50 V / 250 mA. Todos los borrones se trataron luego con Marvel al 5% en PBS-Tween durante 1 hora a la temperatura ambiente y luego se lavaron con PBS-Tween.
Anticuerpo anti-Tie-2 de conejo (Santa Cruz, nº de cat. C1303) se diluyó en la relación 1:500 en Marvel al 0,5%/PBS-Tween y se añadieron 12,5 ml a cada borrón y se dejaron durante una noche a 4ºC. Después, los borrones se lavaron con PBS-Tween y POD anti-conejo de cabra (Dako, nº de cat. P 0448) (dilución 1:5.000 en Marvel al 0,5% / PBS-Tween) y se añadió a cada borrón y se dejó durante 1 hora a la temperatura ambiente. Los borrones se lavaron con PBS-Tween y cada uno de los borrones se reveló durante 10 minutos utilizando 12,5 ml (volúmenes iguales de disoluciones A y B) de Supersignal (PIERCE, nº de cat 34080). Los borrones se transfirieron a una casete de rayos X
y se expusieron a una película (exposiciones de 5 s/ 15 s / 30 s / 60s / 150 segundos). La Figura 4 es una transferencia Western que muestra los resultados de este ensayo. En este sistema, se observó una inhibición de la fosforilación de Tie-2 estimulada por angiopoyetina-1 por parte del mAb 3.19.3.
Las imágenes observadas en la película para cada una de las muestras se valoraron luego utilizando el sistema analizador de imágenes FluorS de BioRad. La densidad de los pixeles se midió como DO/mm2 y se expresó en porcentaje en volumen. Los resultados de porcentaje en volumen se normalizaron hasta 1 mg de proteína/inmunoprecipitación utilizando la concentración de proteínas determinada utilizando el ensayo BCA y el volumen de lisado de cada muestra utilizado en la inmunoprecipitación. El porcentaje de fosforilación de cada una de las muestras se calculó frente al valor de fosforilación del 100% de la muestra control no tratada en cada gel, calculándose el porcentaje de inhibición de cada una de las muestras frente al valor de fosforilación del 100%, que por sí mismo representa una inhibición del 0%). La Figura 5 es una gráfica que representa estos valores y muestra que la CI50 para la inhibición de la fosforilación de Tie-2 estimulada por angiopoyetina-1 es 99 nM.
Considerados conjuntamente, estos datos demuestran que en este sistema el mAb inhibe la fosforilación de Tie-2 inducida por angiopoyetina-1.
EJEMPLO 13
ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE ANTICUERPOS ANG-2
Las cadenas pesadas variables y las cadenas ligeras variables de los anticuerpos se secuenciaron para determinar sus secuencias de ADN. La información sobre la secuencia completa para los anticuerpos anti-Ang-2 se proporciona en el listado de secuencias con las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para cada una de las combinaciones de cadenas gamma y kappa. Se analizaron las secuencias pesadas variables para determinar la familia VH, la secuencia de la región D y la secuencia de la región J. Las secuencias se tradujeron luego para determinar la secuencia de aminoácidos primaria y se compararon con la línea germinal VH, las secuencias de las regiones D y J para verificar hipermutaciones somáticas.
La Tabla 11 es una tabla que compara las regiones de cadenas pesadas de anticuerpos con su región de cadena pesada para la línea germinal innata. La Tabla 12 es una tabla que compara las regiones de cadena ligera kappa de anticuerpos con su región de cadena ligera de la línea germinal cognata.
Las regiones variables (V) de las cadenas de inmunoglobulina son codificadas por múltiples segmentos de ADN de la línea germinal que están unidos en regiones funcionales variables (VHDJH o VKJK) durante la ontogenia de células B. La diversidad molecular y genética de la respuesta de anticuerpos a Ang-2 se estudió en detalle. Estos ensayos revelaron varios puntos específicos a anticuerpos anti-Ang-2.
El análisis de 152 anticuerpos individuales específicos para Ang-2 dieron como resultado la determinación de que los anticuerpos se derivaban de 21 genes VH de la línea germinal diferentes, 112 de ellos de la familia VH3, derivándose 46 anticuerpos del segmento de genes VH3-33. Las Tablas 11 y 12 muestran los resultados de estos análisis.
Debe apreciarse que las secuencias de aminoácidos entre los clones hermanas recogidos de cada uno de los hibridomas son idénticas. Por ejemplo, las secuencias de la cadena pesada y de la cadena ligera para el mAb 3.19.3 son idénticas a las secuencias mostradas en las Tablas 11 y 12 para los mAbs 3.19 y 3.19.1.
EJEMPLO 14
DETERMINACIÓN DE CLASES CANÓNICAS DE ANTICUERPOS
Chothia, et al. han descrito la estructura de anticuerpos en término de “clases canónicas” para las regiones hipervariables de cada una de las cadenas de inmunoglobulina (J. Mol Biol. 1987 Agosto 20; 196(4):901-17). Se 5 analizaron las estructuras atómicas de los fragmentos Fab y VL de una diversidad de inmunoglobulinas para determinar la relación entre sus secuencias de aminoácidos y las estructuras tridimensionales de sus sitios de unión a antígenos. Chothia et al. encontraron que existían relativamente unos pocos residuos que, a través de su empaquetamiento, unión a hidrógeno o su capacidad de asumir conformaciones phi, psi u omega inusuales, eran responsables, en principio, de sus conformaciones de la cadena principal de las regiones hipervariables. Se encontró
10 que estos residuos se producían en sitios dentro de las regiones hipervariables y en la estructura de marco de la lámina beta conservada. Examinando secuencias de inmunoglobulinas con estructura desconocida, Chothia et al. demuestran que muchas inmunoglobulinas tienen regiones hipervariables que son similares en su tamaño a una de las estructuras conocidas y, adicionalmente, contenían residuos idénticos en los sitios responsables de la conformación observada.
15 Su descubrimiento implicó que estas regiones hipervariables tienen conformaciones próximas a las de las estructuras conocidas. Para cinco de las regiones hipervariables, el repertorio de conformaciones parecía estar limitado a un número relativamente pequeño de clases estructurales discretas. Estas conformaciones de la cadena principal que se producen de forma común de las regiones hipervariables se denominaron “estructuras canónicas”. Un trabajo adicional por parte de Chothia et al. (Nature 1989, diciembre 21-28; 342(6252)):877-83) y otros (Martin, et
20 al. J. Mol Biol. 1996, noviembre 15; 263(5):800-15) confirmaron que existe un pequeño repertorio de conformaciones de la cadena principal para al menos cinco de las seis regiones hipervariables de anticuerpos.
Se analizaron las CDRs de cada uno de los anticuerpos descritos anteriormente para determinar su clase canónica. Como es conocido, las clases canónicas han sido sólo asignadas para CDR1 y CDR2 de la cadena pesada de los anticuerpos, junto con CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de los anticuerpos. La tabla que figura a 25 continuación (Tabla 13) resume los resultados del análisis. Los datos de clase canónica se encuentran en forma de “HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3”, en donde “HCDR” se refiere a la CDR de la cadena pesada y “LCDR” se refiere a la CDR de la cadena ligera. Así, por ejemplo, una clase canónica de 1-3-2-1-5 se refiere a un anticuerpo que tiene una HCDR1 que cae dentro de la clase canónica 1, una HCDR2 que cae dentro de la clase canónica 3, una LCDR1 que cae dentro de la clase canónica 2, una LCDR2 que cae dentro de la clase canónica 1 y una LCDR3
30 que cae dentro de la clase canónica 5.
Se realizaron asignaciones a una clase canónica particular en donde existía una identidad del 70% o mayor de los aminoácidos en el anticuerpo con los aminoácidos definidos para cada una de las clases canónicas. En los casos en los que existía una identidad menor que el 70%, la asignación a la clase canónica se marcó con un asterisco (“*”) para indicar que se había realizado la mejor estimación de la clase canónica apropiada, basado en la longitud de
35 cada CDR y la totalidad de los datos. En los casos en los que no existía emparejamiento de la clase canónica con la misma longitud de la CDR, la asignación a la clase canónica se marca con una “Y”. Los aminoácidos definidos para cada uno de los anticuerpos se pueden encontrar, por ejemplo, en los artículos por parte de Chothia, et al. a los que se ha referido anteriormente. La Tabla 13 reseña los datos de clases canónicas para cada uno de los anticuerpos Ang-2.
40 Tabla 13. Clases canónicas de anticuerpos contra Ang-2
Anticuerpo
Clase canónica
5.18
1-1-2-1-1
5.81
1-1-2-1-1
5.66
1-1-2-1-1
5.48
1-1-2-1-1
5.23
1-1-2-1-1
3.33
1-1-2-1-1
5.15
1-1-2-1-3*
4.3
1-1-4-1-1
Anticuerpo
Clase canónica
3.12
1-1-4-1-5*
4.16
1-1-4-1-5*
3.13
1-1-4-1-5*
3.7
1-1-4-1-5*
3.32
1-1-4-1-5*
3.37
1-1-4-1-Y
5.30
1-2-2-1-1
3.6
1-2-2-1-1
6.6
1-2-2-1-1
3.34
1-2*-2-1-1
5.74
1-2*-2-1-1
5.38
1-3-2-1-1
5.28.1
1-3-2-1-1
5.6
1-3-2-1-1
5.44
1-3-2-1-1
5.28
1-3-2-1-1
5.86.1
1-3-2-1-1
5.3 5.1
1-3-2-1-1
5.35
1-3-2-1-1
5.8
1-3-2-1-1
5.22
1-3-2-1-1
4.15
1-3-2-1-1
5.67
1-3-2-1-1
5.87
1-3-2-1-1
5.10
1-3-2-1-1
5.71
1-3-2-1-1
5.21
1-3-2-1-1
5.80
1-3-2-1-1
3.18
1-3-2-1-1
3.11
1-3-2-1-1
3.26
1-3-2-1-1
5.31
1-3-2-1-1
5.76
1-3-2-1-1
Anticuerpo
Clase canónica
4.9
1-3-2-1-1
5.17
1-3-2-1-1
3.39
1-3-2-1-1
5.37
1-3-2-1-1
3.22
1-3-2-1-1
5.29
1-3-2-1-1
5.73
1-3-2-1-1
5.12
1-3-2-1-1
3.1
1-3-2-1-1
5.11
1-3-2-1-1
4.8
1-3-2-1-1
5.24
1-3-2-1-1
6.3.1
1-3-2-1-1*
5.56.1
1-3-2-1-1*
5.111
1-3-2-1*-1
4.13
1-3-2-1*-1
5,52
1-3*-2-1-3*
5.16.1
1-3-2-1-3*
5.39.1
1-3-2-1-3*
5.103.1
1-3-2-1-3*
5.101.1
1-3-2-1-3*
5.54.1
1-3-2-1-3*
5.83.1
1-3-2-1-3*
5.62
1-3-2-1-3*
5.88.1
1-3-2-1-3*
5.40.2
1-3-2-1-3*
5.109
1-3-2-1-3*
5.64
1-3-2-1-3*
5.13
1-3-2-1-3*
3.3
1-3-2-1-3*
5.41
1-3-2-1-3*
3.3.1
1-3-2-1-3*
3.31.1
1-3-2-1-3*
Anticuerpo
Clase canónica
5.41.1
1-3-2-1-3*
5.62.1
1-3-2-1-3*
5.108.1
1-3-2-1-3*
5.13.1
1-3-2-1-3*
5.97
1-3-2-1-5*
5.52.1
1-3-2-1-Y
5.78.1
1-3-3-1-1
5.60
1-3-3-1-1
5.43
1-3-3-1-1
5.90
1-3-3-1*-1
3.42
1-3-3-1*-1
4.11
1-3-4-1-1
3.40
1-3-4-1-1
5.82
1-3-4-1-1
4.18
1-3-4-1-1
3.41
1-3-4-1-1
5.92
1-3-4-1-1
3.10
1-3-4*-1-1
4,14
1-3-4-1-5*
3.19.1
1-3-8*-1-1
6.2
1-3-8*-1-1
3.8
1-3-8*-1-1
5.58
1-3-8-1-1*
4.5
1-4*-2-1-1
5.1
1-4*-2-1-1
4.2
1-4*-2-1-1
3.9
1-4*-2-1-1
5.45
1-4*-2-1-1
3.17
1-4*-2-1-1
5.72
1-4*-2-1-1*
3.14
1-4*-2-1-Y
5.115
3-1-2-1-1
5.36
3-1*-2-1-1
Anticuerpo
Clase canónica
3.2
3-1-2-1-3*
3.21
3-1-8-1-1*
5.61
3-Y-2-1-3*
La Tabla 14 es un análisis del número de anticuerpos por clase. El número de anticuerpos que tiene la clase canónica particular designada en la columna de la izquierda se muestra en la columna de la derecha.
Tabla 14. Número de anticuerpos anti-Ang 2 en cada una de las clases canónicas
H1-H2-L1-L2-L3
Número de mAbs
1-1-2-1-1
6
1-1-2-1-3*
1
1-1-4-1-1 1-1-4-1-5*
1 5
1-1-4-1-Y
1
1-2-2-1
5
1-3-2-1-1
38
1-3-2-1-3*
21
1-3-2-1-5*
1
1-3-2-1-Y 1-3-3-1-1
1 5
1-3-4-1-1
7
1-3-4-1-5*
1
1-3-8*-1-1
4
1-4*-2-1-1
7
1-4*-2-1-1 3-1-2-1-1
1 2
3-1-2-1-3*
1
3-1-8-1-1*
1
3-Y-2-1-3*
1
Notas: 1. Lo marcado con un * seignifca que se le ha asignado a la mejor clase de emparejamiento, a pesar de que existen algunas violaciones en las posiciones definitorias. 2. Y significa que no existe clase canónica de emparejamiento con la misma longitud de la CDR
EJEMPLO 15 REPRESENTACIÓN EN MAPA DE EPÍTOPOS DE ANTICUERPOS ANG-2
Se analizó el dominio de unión de 27 anticuerpos que neutralizan la actividad de Ang-2.
Ang-2 humana recombinante se adquirió de R&amp;D Systems (623-AN): Anticuerpos policlonales Ang-2 anti-humana de cabra (R&amp;D Systems, AF623) se seleccionaron por su capacidad de reconocer rhAng-2 en ELISA directo y transferencias Western. Los anticuerpos policlonales se biotinilaron para la detección con estreptavidina conjugada
5 con HRP.
Todas las enzimas de restricción fueron suministradas por New England Bilolabs y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los ADNs de los plásmidos se purificaron utilizando minicolumnas rotatorias (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cebadores de oligonucleótidos utilizados para la clonación y la mutagénesis dirigida al sitio se sintetizaron por parte de Qiagen Operon.
10 Anticuerpos: 27 hibridomas derivados de anticuerpos anti-Ang-2 humana se seleccionaron en base a su capacidad para inhibir la unión de rhAng-2 a su receptor. Los anticuerpos se listan a continuación en la Tabla 15
Tabla 15
Código del hibridoma
DO650 en ensayo de inhibición
1
x5.56 0,0863
2
x3.38 0,0792
3
x3.19 0,0633
4
x3.28 0,0588
5
x3.3 0,0558
6
x3.31* 0,0516
7
x5.88* 0,0874
8
x5.49* 0,0856
9
x5.101 0,0824
10
x541* 0,0776
11
x5.108* 0,0688
12
x5.62 0,0650
13
x5.39 0,0519
14
x5.16* 0,0500
15
x5.83 0,0484
16
x5.54 0,0440
17
x5.14 0,0430
18
x.5.86 0,0419
19
x.5.78 0,0984
20
x5.103* 0,1013
21
x5.28 0,0821
22
x5.40 0,0691
23
x5.35* 0,0663
24
x6.3 0,0617
25
x5.13 0,0744
26
x5.2 0,0690
27
x5.52 0,0627
Caracterización de los epítopos de los 27 anticuerpos anti-Ang-2 neutralizantes
Transferencias de manchas
Rh-Ang-2 (R&amp;D Systems) se manchó sobre membrana de nitrocelulosa en su forma nativa o reducida utilizando la unidad Bio-Dot Microfiltration. Todos los anticuerpos monoclonales (mAbs) humanos se dirigieron contra Ang-2 5 humana que se había unido a Ang-2 no reducida pero no a la forma reducida, indicando que todos los mAbs se reconocen epítopos conformacionales que son aparentemente destruidos tras la reducción de la proteína.
Clonación y expresión de proteínas Ang 1 y Ang-2
Para comprender mejor la base estructural de la interacción de mAbs con Ang-2, se utilizó un conjunto de moléculas Ang-1/Ang-2 quiméricas. Este enfoque se aprovecha del hecho de que miembros de la familia angiogénica están
10 estructuralmente relacionados. A pesar de que Ang-2 y Ang-1 muestran sólo una homología del 60% en sus secuencias de proteínas, ambas comparten la misma estructura modular constituida por un dominio de doble alfa hélice amino-terminal y un dominio similar a fibrinógeno carboxilo-terminal.
Clonación de Ang-1 y Ang-2 humanas
Dos formas alternativamente cortadas y empalmadas de ADNcs de Ang-2 humana se amplificaron a partir de la línea
15 de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). La amplificación por PCR de ADNc de HUVEC utilizando cebadores específicos para Ang-2 reveló tanto una Ang-2 de longitud completa (1491 pb) como una variante Ang-2443 de 1330 pares de bases (Injune et al., (2000) JBC 275: 18550). Ang-2443 es una variante generada por corte y empalme alternativo del exón B y la parte omitida del dominio de doble alfa hélice (aminoácidos 96-148). Los dos ADNcs de Ang-2 se clonaron en el vector de expresión pCR3.1 y se expresaron en células 293F tal como se
20 muestra en la Figura 6. El ADNc de Ang-1 humana se obtuvo por RT-PCR utilizando el ARN total extraído de la línea de células de mama humana MDA-MB-231. Un ADNc de 1,5 kb se clonó en el vector de expresión pCR3.1 y la expresión se detectó en el sobrenadante de células 293F transitoriamente transfectadas.
ELISA
La unión de los 27 mAbs a sobrenadantes generados a partir de la transfección transitoria de ADNcs de Ang-2 y
25 Ang-1 se testó utilizando el ELISA de captura de anticuerpos. Ang-2, Ang-2443 y Ang-1 se ligaron a una placa ELISA revestida con anticuerpos policlonales de cabra contra Ang-2 o Ang-1 humana (respectivamente). La unión de los 27 anticuerpos monoclonales humanos se detectó con un anticuerpo anti-humano de cabra conjugado a HRP, seguido de un sustrato de peroxidasa de rábano picante colorimétrico (sustrato Enhanced K-Blue TMB Neogen Corporation). La absorbancia de cada uno de los pocillos de las placas ELISA se midió a 450 nm en un lector automático de
30 microplacas.
Transfección de células 293F
Células de riñón embrionario humano 293F se mantuvieron en suero de bovino fetal al 10% en medio de Eagle modificado por Dulbecco, suplementado con penicilina y estreptomicina. Células 293F se transfectaron transitoriamente utilizando un fosfato de calcio. A las 72 horas, el medio se recolectó y se filtró para el análisis ELISA
35 y de transferencia Western.
Todos los 27 anticuerpos demostraron unirse específicamente a antígenos Ang-2/Ang-2443. No se detectó reactividad cruzada alguna con la Ang-1 humana. Los aminoácidos 96-148 en el dominio de la doble alfa hélice de Ang-2, que faltan en la secuencia de las proteínas Ang-2443, fueron excluidos como el dominio de unión para cada uno de los 27 anticuerpos.
40 Construcción de moléculas quiméricas de Ang-1/Ang-2
Se utilizaron sitios de escisión por restricción comunes en genes Ang-1 y Ang-2 humanos para la construcción de proteínas quiméricas de angiopoyetina de fusión en marco.
Se realizaron cuatro construcciones: Ang-1/2 Bsml, Ang-1/2 Sspl y Ang-2/1 Sspl. Todas las proteínas se expresaron y secretaron en niveles detectables medidos mediante un ensayo ELISA utilizando anticuerpos policlonales contra
45 Ang-1 y Ang-2 humanas.
Los puntos de unión de los aminoácidos se encuentran en las siguientes posiciones:
BsmI – 117(Ang-2)/119 (Ang-1)
SspI - 353 (Ang-2)/354 (Ang-1)
La diferencia de un aminoácido es debida a la presencia de 497 residuos en la Ang-1 humana en comparación con los 496 residuos en la Ang-2 humana. Todas las construcciones se expresaron en células 293F, y se detectaron mediante anticuerpos policlonales anti-humanos de cabra contra Ang-1 y Ang-2. Los 27 anticuerpos superiores se testaron en cuanto a su capacidad de unir quiméricamente moléculas Ang-1/2. Todos los 27 anticuerpos mostraron un modelo similar de unión a la construcción Ang-1/2 Bsml únicamente. Los resultados de estos experimentos indican que el dominio de unión para todos los anticuerpos se encuentra entre los residuos 117-496, lo más probablemente en el dominio de unión del fibrinógeno, en donde el epítopo está interrumpido en las proteínas Ang de fusión a Sspl en torno al aminoácido 353.
Construcción de moléculas quiméricas de Ang-2 de ratón/ser humano
Dado que Ang-2 comparte una identidad de ~ 55% de aminoácidos con Ang-1, era difícil encontrar un sitio de restricción común a utilizar para la clonación de moléculas quiméricas. Ang-2 de ratón y humana eran más similares, teniendo una homología de la secuencia de aproximadamente el 85%. ADNc de Ang-2 de ratón clonado en el vector de expresión pCMCsport se adquirió de Invitrogen. Los 27 anticuerpos seleccionados se testaron en cuanto a su inmunorreactividad con Ang-2 de ratón recombinante. Seis de los 27 reaccionaban de forma cruzada con Ang-2 de ratón con un 100% de su inmunorreactividad sobre Ang-2 humana, indicando que el antígeno murino conserva la mayoría de la inmunorreactividad de Ang-2 humana (los datos se resumen en la Tabla 16).
El sistema quimérico de ser humano-ratón se eligió para la representación en mapa de los epítopos basado en los hallazgos de que la mayoría de los anticuerpos se unen específicamente al antígeno Ang-2 humano y no reaccionan de forma cruzada con Ang-2 de ratón. Se generaron diversas construcciones de ADNc de Ang-2 y se clonaron en un vector de expresión de mamífero.
Se realizaron construcciones de Ang-2 de ser humano-ratón utilizando el sitio de restricción StuI común, localizado en el dominio de unión a fibrinógeno, encontrándose el punto de unión del aminoácido en el residuo 311. Todos los mAbs específicos para la Ang-2 humana eran capaces de unirse a StuI de Ang-2 de ratón/ser humano, indicando que el dominio de unión se encuentra en el dominio de unión a fibrinógeno entre los residuos 311-496. Con el fin de estrechar el dominio de unión, se preparó una nueva construcción, en la que el fragmento humano StuI-TfiI reemplazaba la secuencia de ratón en el ADNc de Ang-2 de ratón (Figura 9).
Todos los anticuerpos específicos para Ang-2 humana mostraban una señal ELISA positiva, con un 15-100% de su inmunorreactividad sobre la Ang-2 humana. El dominio de unión de dos anticuerpos con un único uso del gen VH
5.35.1 (VH3-20) y 5.28.1 (VH3-43) tal como se muestra en la Tabla 17, se representó en mapa a una región en los aminoácidos 310-400.
Se esperaba que anticuerpos que reaccionaban de forma cruzada con Ang-2 de ratón mostraran una reactividad del 100% y no podían ser representados en mapa utilizando construcciones quiméricas de ratón/ser humano.
Mutagénesis dirigida al sitio
Con el fin de definir los importantes residuos implicados en el sitio de unión de diferentes anticuerpos, se mutó a unos pocos residuos de Ang-2 humana y se rastrearon frente al panel completo de anticuerpos en cuanto a su unión por parte del ensayo ELISA.
Dado que la unión directa detectada por ELISA no es sensible a pequeñas y moderadas diferencias en la afinidad, cambios grandes en la unión observados después de la sustitución de un sólo aminoácido identifican probablemente sitios clave que interactúan con el anticuerpo. Además, anticuerpos policlonales contra Ang-2 humana conservan un 100% de reactividad con cada una de las construcciones, indicando que el proceso de mutagénesis no introducía ningún cambio estructural amplio a través de la molécula de Ang-2. Por parte de todos los 27 anticuerpos se ignoraron dos cambios independientes de Val a Met en la posición 345 (V345M) y de His a Gln en la posición 375 (H375Q), indicando que estos residuos no son reactivos, o que los cambios en los epítopos conformacionales requieren más de una sustitución de un único aminoácido. El cambio de dos residuos en las posiciones 365 y 367 cambia drásticamente la unión del anticuerpo sencillo, mAb 5.35.1. El análisis de la secuencia de 5.35.1 mostró el uso único de VH3-20 y la CDR3 única tanto en las cadenas pesada como ligera. Todos los puntos de fusión de moléculas quiméricas Ang-2 y mutaciones puntuales están resaltados en la Figura 8. La Figura 9 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de Ang-1 de ratón (SEQ ID Nº: 5), Ang-1 humana (SEQ ID Nº: 2), Ang2 de ratón (SEQ ID Nº: 4) y Ang-2 humana (SEQ ID Nº: 3). La cabeza de flecha muestra el sitio de escisión para las secuencias conductoras hidrófobas. Las flechas definen los límites de la doble alfa hélice y los dominios similares a fibrinógeno. Los círculos en negro muestran los residuos cisteína conservados (imágenes tomadas de Maisonpierre et al., 1997, Science 277: 55.
Los datos de unión a todas las moléculas Ang-2 se resumen a continuación en la Tabla 16:
Tabla 16
Clon
Compac. Dominio de unión Ang-2443 humana CX de ratón M/H BsmI M/H Stul 310-496 Stu-Tfil 310-400 V345M N365Q367 H375Q
5.39.1
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 25% 100% 100% 100%
5.16.1*
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 30% 100% 100% 100%
5.86.1
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 23% 100% 100% 100%
5.54.1
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 77% 100% 100% 100%
5.14.1
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 31% 100% 100% 100%
5.83.1
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 86% 100% 100% 100%
5.101.1
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 28% 100% 100% 100%
6.3.1
7 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 27% 100% 100% 100%
5.103.1*
2 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 40% 100% 100% 100%
5.78.1
5 Dominio sim. a fib 100% Sí 100% 100% 100% 100% 100% 100%
5.35.1*
8 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 100% 100% 15% 100%
5.40.2*
8 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 65% 100% 100% 100%
3.19.1
6 Dominio sim. a fib 100% Sí 100% 100% 100% 100% 100% 100%
5.108.1*
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 36% 100% 100% 100%
5.52.1
Dominio sim. a fib 100% Sí 100% 100% 100% 100% 100% 100%
5.56.1
3 Dominio sim. a fib 100% Sí 100% 100% 100% 100% 100% 100%
5.2
Dominio sim. a fib 100% Sí 100% 100% 100% 100% 100% 100%
5.28.1
4 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 100% 100% 100% 100%
5.41.1*
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 30% 100% 100% 100%
5.13.1
Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 27% 100% 100% 100%
3.3.1
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 15% 100% 100% 100%
3.31.1*
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 15% 100% 100% 100%
5.62.1
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 30% 100% 100% 100%
3.28.1*
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 31% 100% 100% 100%
5.88.1*
1 Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 20% 100% 100% 100%
3.38
Dominio sim. a fib 100% Sí 100% 100% ND 100% 100% 100%
5.49*
Dominio sim. a fib 100% No 100% 100% 35% 100% 100% 100%
Los datos se presentan como porcentaje de unión en comparación con Ang-2 humana. Tabla 17: Análisis de la secuencia y reactividad cruzada con Ang-2 de ratón
Código de hibridoma
DO650 en ensayo de inhibición Ang-2 XR de ratón Compac. VH DH JH VK JK
x5.56 x3.38 x3.19 x3.28* x3.3 x3.31*
0.0863 0.0792 0.0633 0.0588 0.0558 0.0516 Sí Sí Sí No No No No 3 2 6 1 1 1 1 VH3-33 VH3-30 VH3-7 VH3-7 VH3-7 VH3-7 D1-7 D3-3 D6-19 D6-19 D6-19 D6-19 JH4b JH5b JH4b JH4b JH4b JH4b A20 A27 L2 L2 L2 L2 JK3 JK5 JK1 JK1 JK1 JK1
x5.88*
0.0874
x5.49*
0.0856 No 1
x5.101
0.0824 No 1 VH1-2 D6-19 JH4b L2 JK1
x5.41*
0.0776 No 1 VH3-7 D6-19 JH4b L2 JK1
x5.108*
0.0688 No 1 VH3-33 D1-7 JH5b L2 JK1
x5.62
0.0650 No 1 VH3-7 D6-19 JH4b L2 JK1
x5.39
0.0519 No 1 VH1-2 D6-13 JH4b L2 JK1
x5.16*
0.0500 No 1 VH1-2 D6-13 JH4b L2 JK1
x5.83
0.0484 No 1 VH1-2 D6-19 JH4b L2 JK1
x5.54
0.0440 No 1 VH1-2 D6-19 JH4b L2 JK1
x5.14
0.0430 No 1 VH1-2 D6-19 JH4b
x5.86
0.0419 No Sí No No 1 5 2 4 VH1-2 VH1-2 VH1-2 VH3-43 D6-13 D2-2 D6-19 D6-19 JH4b JH6b JH4a JH4b O12 B3 L2 L2 JK3 JK5 JK1 JK3
x5.78
0.0984
x5.103*
0.1013
x5.28
0.0821
x5.40
0.0691 No 8 VH3-23 D6-19 JH4B L2 JK1
x5.35*
0.0663 No 8 VH3-20 D6-19 JH2 L2 JK4
x6.3
0.0617 No No Sí Sí 7 VH1-2 VH3-7 VH3-33 VH3-33 D1-7 D6-19 D5-12 D1-1 JH4b JH4b JH6b JH4b O12 L2 L5 JK2 JK1 JK4
x5.13 x5.2 x5.52
0.0744 0.0690 0.0627
El análisis de secuencia de las secuencias IgH e IgL se consiguió utilizando herramientas de software del análisis de las secuencias y mediante la alineación de genes VH a una base de datos de la línea germinal. El software evalúa 5 también elementos D, marco de lectura, inserción en la región N, adición de nucleótidos P, pérdida de nucleótidos y longitud de la CDR3. El análisis de 27 anticuerpos individuales específicos para CR64 proporcionó solamente 7 genes VH de la línea germinal, 10 de ellos procedentes de la misma familia VH1. La selección de anticuerpos neutralizantes mostró que los anticuerpos expresan la misma VH de Ig y, en algunos casos, las mismas retransposiciones de VHDJH y que estaban conservados pares de la cadena H y L. Este hallazgo sugiere que para 10 algún epítopo dado, solamente se utilizan unos pocos miembros del repertorio de la línea germinal para formar el correspondiente parátopo y que para cada uno de los epítopos antigénicos puede aparecer un número limitado de
genes de las cadenas L y H para formar un parátopo específico.
El uso recurrente de estructuras VH, VK y de la región determinante de complementaridad (CDR) similares por parte de diferentes anticuerpos monoclonales está ligado al hecho de que toda la actividad neutralizante de Ang-2 está restringida al dominio similar a fibrinógeno, y está de acuerdo con el trabajo publicado por Procopio et al (1999, JBC
274: 30196), demostrando que el efecto de Ang-2 sobre Tie2 está ligado al dominio similar a fibrinógeno. Los datos en el mapa de epítopos indican que los anticuerpos monoclonales se unen a Ang-2 a través de una amplia interfaz que incluye a la mayoría del dominio similar a fibrinógeno.
EJEMPLO 16
DETERMINACIÓN DE LA REACTIVIDAD CRUZADA CON ANG-2 DE RATÓN
La reactividad cruzada de los mAbs anti-Ang-2 humana con Ang-2 de ratón se sometió a ensayo mediante ELISA. Para este fin, se construyó un vector de expresión de Ang-2 de ratón, y células eucarióticas se transfectaron de forma transitoria para producir Ang-2 de ratón.
La construcción de expresión de angiopoyetina-2 de ratón (mAng-2) se obtuvo de Research Genetics, un distribuidor del consorcio I.M.A.G.E. (véase la wold wide web en image.11nlgov). ADNc de Ang-2 de ratón (nº de acceso GenBank BC027216, IMAGE 3494566) se derivó del banco NCI_CGAP_Lu29, que es un banco de tumores de pulmón. El ADNc se clonó en el vector de expresión pCMV-SPORT6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) a través de los sitios SalI (5’) y NotI (3’) y contenía el marco de lectura abierto de Ang-2 de ratón (mAng-2) de longitud completa de 496 aminoácidos, así como las regiones flanqueantes 5’ y 3’ no traducidas para un total de 2471 pares de bases.
Diez !g del plásmido mAng-2 anterior se transfectaron a células HEK293F utilizando el método del fosfato de calcio. Aproximadamente 1 x 106 células HEK293F se sembraron en una placa de cultivo tisular de 10 cm el día anterior. El medio se cambió después de transfección durante 5 horas o durante una noche y las células se hicieron crecer durante otros 2-3 días antes de que se recogieran los sobrenadantes que contenían la proteína mAng-2 secretada. La expresión de mAng-2 se confirmó mediante ELISA utilizando un anticuerpo policlonal obtenido de R&amp;D Systems (nº de catálogo AF623).
Immplates Nunc de 96 pocillos se revistieron con medio acondicionado recogido de transfectantes HEK293F/Ang-2 de ratón, 100 !l en cada uno de los pocillos. Las placas se incubaron a 4ºC durante una noche, seguida de lavado cuatro veces utilizando solución salina tamponada con fosfato con una estación Skan Washer 300 (SKATRON). Los pocillos se bloquearon mediante 100 !l de tampón de bloqueo ABX (BSA al 0,5%, Tween al 0,1%, Thimerosal al 0,01% en PBS) durante 1 hora. MAbs anti-Ang-2 con concentraciones apropiadas y diluidos en el tampón de bloqueo se añadieron a los pocillos con un volumen de 100 !l/pocillo y se incubaron a la temperatura ambiente durante al menos 1 hora. Los mAbs y cada uno de sus productos diluidos se sometieron a ensayo por duplicado. Después de lavar dos veces, los mAbs unidos se detectaron mediante el anticuerpo conjugado Fc-HPPO anti-humano de cabra (Caltag, código H10507) a una dilución 1/1000 a la temperatura ambiente durante una hora. Para establecer la reacción cromagénica detectora, 100 !l de sustrato TMB (TMB-microwell, BioFX, nº de cat. TMSK-1000-01) se añadieron después de lavar los pocillos tres veces utilizando PBS. Las placas se incubaron durante 30 minutos antes de añadir solución 650 stop (100 !l/pocillo, BioFX, nº de cat. BSTP-0100-01) para terminar la reacción. La absorbancia de la luz a 650 nm se determinó mediante un lector Spectramax Plus.
En este ensayo se testaron los 27 mAbs neutralizantes superiores. La absorbancia de la luz demostró que los anticuerpos monoclonales 3.19.3, 3.38, 5.2.1 5.52.1, 5.56.1 y 5.78.1 eran capaces de unirse a Ang-2 de ratón bajo las condiciones experimentales. Para la confirmación, cada uno de los anticuerpos de unión se titularon mediante ELISA. Los valores de la DO 650 nm (+ D.E.) se representaron frente a la concentración Log de mAbs (!g/ml) y se muestran en la Figura 10. Los clones 5.2.1, 5.28.1, 3.19.3 y 3.31.2 se muestran en la figura. Los anticuerpos monoclonales 5.2.1 y 3.19.3 ligaban Ang-2 de ratón de una manera dependiente de la dosis, alcanzando la saturación a aproximadamente 10 !g/ml (Figura 10). Las curvas de unión de estos dos mAbs eran típicas curvas de relación dosis-respuesta sigmoidales. No se observó una dependencia de la dosis ni saturación en el intervalo de concentraciones de anticuerpos sometidos a ensayo, excepto para la clones 5.2.1 y 3.19.3. En base a este resultado, parece ser que solamente los mAbs 5.2.1 y 3.19.3 tienen una reactividad cruzada con Ang-2 de ratón.
EJEMPLO 17
INHIBICIÓN DE LA UNIÓN DE ANG-2-MURINA A TIE2 HUMANO
El anticuerpo monoclonal 3.19.3 se seleccionó para el ensayo ulterior de su capacidad de inhibir la unión de Ang-2 de ratón a Tie2 humano. Para este fin, una placa ELISA se revistió con 4 !g/ml de hTie2/Fc (R&amp;D Systems, Inc.) a razón de 100 !g/pocillo, y los pocillos se bloquearon de forma rutinaria a 4ºC durante una noche. Se empleó la Ang-2 de ratón (mAng-2) recombinante en el sobrenadante del cultivo de los transfectantes 293T/mAng-2 antes descritos. A los pocillos pre-revestidos se añadieron 100 !l de sobrenadante que contenía mAng-2 con el mAb 3.19.3 a
diversas concentraciones, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h.
Como control, se incluyó también Ang-2 humana recombinante (R&amp;D Systems, Inc.) mezclada con el anticuerpo. Cada una de las concentraciones del mAb se sometieron a ensayo por triplicado. La Ang-2 de ratón y humana ligadas se detectaron utilizando un anticuerpo policlonal Ang-2 anti-humano de cabra (Santa Cruz, Biotechnology, Santa Cruz, CA) que reacciona de forma cruzada con Ang-2 de ratón, se acopló con un IgG-HRP anti-cabra de conejo secundario. La DO650 se determinó 30 min después de añadir el sustrato HRP. Se descubrió que el mAb
3.19.3 inhibía la unión tanto de Ang-2 humana como de ratón a Tie2 humano de una manera dependiente de la dosis (Figura 11).
EJEMPLO 18
DETERMINACIÓN DE LA REACTIVIDAD CRUZADA CON VASCULATURA DE MONO
Dado que Ang-2 se expresa específicamente en células endoteliales angiogénicas, estas células procedentes de mono se tiñeron de modo inmunohistoquímico con anticuerpos anti-Ang-2 como una forma para determinar indirectamente si cada uno de los anticuerpos reaccionaba de forma cruzada con Ang-2 de mono.
Los 10 mAbs neutralizantes superiores seleccionados según se describe en el Ejemplo 4 (Tabla 4) se examinaron en este experimento utilizando tejido de ovario rico en células endoteliales procedente de monos. Secciones de tejido de ovario de mono (Cynomolgus macaque) congeladas de 6 !m, completamente secadas, se fijaron con acetona a 4ºC durante 5 minutos. Después de lavar tres veces los portaobjetos con PBS, la peroxidasa endógena de los tejidos se bloqueó con 0,3% de H2O2 durante 10 minutos. Subsiguientemente, los tejidos se lavaron con PBS y se bloquearon con 10 !g/ml del Fab de IgG anti-humana de cabra durante 15 minutos. Las secciones de tejido se lavaron de nuevo con PBS, seguido de tratamiento con suero de cabra normal al 10% durante 10 minutos. Después de drenar el suero, cada uno de los 10 mAbs anti-Ang-2 (10 !g/ml) se aplicó a las secciones y se incubó durante 2 horas. Los mAbs de Ang-2 unidos se detectaron con 10 !g/ml de IgG anti-humana de ratón durante 15 minutos, seguido de incubación con IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa durante 30 minutos. La tinción se realizó utilizando el sistema de sustrato AEC (DAKO, nº de cat. 3464) bajo observación microscópica para un resultado óptimo.
Se encontró que los 10 mAbs teñían las células endoteliales vasculares angiogénicas entre el tejido de los ovarios; mientras que los mAbs control del isotipo no las teñían. Esto demostró que los 10 mAbs procedentes de la Tabla 4 reaccionarían de forma cruzada con Ang-2 de mono.
EJEMPLO 19
MAB. 3.19.3 INHIBE LA ANGIOGÉNESIS IN VIVO EN EL ENSAYO DE TACO DE MATRIGEL
Para evaluar el potencial anti-angiogénico in vivo de anticuerpos monoclonales anti-Ang-2, se llevó a cabo un ensayo de la angiogénesis con taco de matrigel. Se encontró que células MCF-7 producían Ang-2 cuando se cultivaban in vitro o se implantaban en un ratón inmunodeficiente en forma de un xenoinjerto. Cuando MCF-7 se incorporó en matrigel y se implantó por vía subcutánea en ratones desnudos, se encontró un robusto crecimiento vascular en el gel. Para establecer el modelo de taco de matrigel, se emplearon ratones hembras BALB/c/nu/nu de 6-8 semanas de edad con pesos corporales que oscilaban entre 18 y 20 g (Charles River Laboratory, Wilmington, MA). En el flanco derecho de los ratones desnudos se inyectó un total de 0,5 mL de Matrigel que contenía 2 x 106 células MCF-7, con
o sin anticuerpos Ang-2, o agentes de control (incluido el Matrigel solo, controles de isotipo Tie2/Fc, IgG2 e IgG4 y mAb anti-VEGF). Para cada uno de los grupos de ensayo se utilizaron cinco ratones. Todos los mAbs testados se ajustaron a una concentración de 100 !g/ml.
Al cabo de siete días, los tacos de Matrigel se recolectaron y se puntuaron en cuanto a la densidad de vasos sanguíneos. Para este fin, se realizó una dislocación cervical de los ratones bajo profunda anestesia. Los tacos de Matrigel se expusieron a través de la separación del colgajo de piel cubriente. Después, los tacos de Matrigel se retiraron y luego se registraron las imágenes digitales. Los tacos de Matrigel se volvieron a seccionar con cuidado y se cortaron en dos partes. Una parte se congeló bruscamente en Tissue Tek y la otra se fijó en formalina tamponada. Las dos partes se embebieron entonces en parafina para el seccionamiento. Se cortaron tres secciones de 5 a 7 !m de espesor de cada uno de los ratones y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Después, las secciones se examinaron bajo un microscopio de contraste de fases. Se registraron fotomicrografías representativas [dos marcos (100 X y 400 X)] y se registró la infiltración de células endoteliales y de vasos sanguíneos.
Los tacos de Matrigel congelados se seccionaron (secciones de 10 !m) en un microtomo Cryocut. Se realizaron dos secciones independientes por cada ratón y se utilizaron para la tinción. Las secciones se bloquearon con BSA (al 0,1%) y luego se trataron con anticuerpo monoclonal reactivo a ratones. CD31 conjugado a ficoeritina (diluciones según se recomiendan por el fabricante). Después de lavados a fondo, las secciones se montaron bajo un reactivo anti-desvanecimiento (Vecta Shield) y se observaron bajo un microscopio UV utilizando un filtro rojo. Se capturaron imágenes digitales representativas (dos imágenes a los aumentos de 100 X y 200 X). Los núcleos se tiñeron de
forma antagonista con DAPI. Se analizaron las imágenes por inmunofluorescencia de la tinción con CD31 mediante un programa de esqueletinización. Los datos se procesaron para proporcionar la densidad media de los vasos, nódulos y longitudes de cada uno de los grupos. Los resultados se pueden encontrar en las Figuras 12A y 12B, que muestran el efecto de anticuerpos anti-Ang-2 sobre el número de extremos de vasos sanguíneos (Figura 12A) y la longitud de los vasos sanguíneos (Figura 12B).
Este experimento demostró que, en comparación con Matrigel solo, las células MCF-7 que se incorporaron en el Matrigel eran capaces de inducir un nivel significativo de angiogénesis. La angiogénesis inducida podía ser inhibida por un anticuerpo anti-VEGF control positivo. La angiogénesis también se inhibía de forma significativa por parte la proteína Tie2/Fc recombinante soluble, sugiriendo que Ang-2 producida por células MCF-7 juega un papel en la angiogénesis en este modelo. Al unirse a cualquier Ang-2, el Tie2/Fc reduciría eficazmente el nivel de Ang-2 que se expone a las células MCF-7.
No resulta clara la forma en que el anticuerpo control negativo del isotipo IgG2, PK16.1.3, impactaba sobre la angiogénesis, a pesar de que también se encontró que ocasionalmente este anticuerpo interfería en el crecimiento del tumor en algunos modelos de xenoinjerto (datos no mostrados). El anticuerpo control del isotipo IgG4 no tenía efecto alguno sobre la angiogénesis en este modelo. Como se observa en las Figuras 12A y 12B, los clones 5.88.3, 3.3.2, 3.19.3 y 5.28.1 inhibían de forma significativa la angiogénesis (P <0,05, test-t realizado por VasculoGen), mientras que otros tenían efectos menores.
Está bien establecido que la Ang-2 es expresada por parte de células endoteliales en el tumor y, así, se ha considerado como un factor angiogénico autocrino. Sin embargo, también se ha encontrado que Ang-2 es expresada por muchos tipos de células tumorales in vitro e in vivo. Excepto 3.19.3, los mAbs testados en este caso no reaccionan de forma cruzada con Ang-2 de ratón. En este modelo in vivo, los mAbs solamente neutralizaban Ang-2 humana producida por la célula MCF-7, pero no la Ang-2 de ratón. El efecto inhibidor de estos mAbs sugiere que la Ang-2 expresada por el tumor puede ser un factor de angiogénesis paracrino. La actividad global anti-angiogénica del mAb era en parte atribuible a la neutralización de la Ang-2 del tumor, además de la neutralización de Ang-2 expresada por el endotelio vascular.
EJEMPLO 20
DETERMINACIÓN DE LA EFICACIA TERAPÉUTICA DE MAB 3.19.3 EN EL MODELO DE XENOINJERTO PREVENTIVO A431
El clon del mAb anti-Ang-2 3.19.3 no solamente se unía a Ang-2 de ratón, sino que también inhibía la unión de Ang-2 de ratón a Tie2 humano. La actividad antitumoral de este anticuerpo monoclonal se testó en un modelo de xenoinjerto en ratón de carcinoma epidermoide de piel humano utilizando la línea de células A431.
Células A431 se cultivaron en matraces de forma rutinaria, hasta que las células alcanzaron la sub-confluencia. Para el desarrollo del modelo se emplearon ratones hembras inmunodeficientes de 6-8 semanas de edad (BALB/c/nu/nu). Las células A431 se recolectaron y suspendieron en Matrigel. En el flanco de los ratones se inyectó por vía intradérmica una suspensión de células que contenía 5 x 106 células. Los ratones se agruparon al azar en diferentes grupos, conteniendo cada uno de ellos 11 ratones. El mismo día, a los ratones se les inyectaron por vía intraperitoneal 0,5 mg de mAb 3.19.3 o anticuerpo control del isotipo, y después de ello dos veces por semana. Las dimensiones de cada uno de los tumores se midieron dos veces por semana. El volumen del tumor se calculó como: Volumen = Longitud x (Anchura)2 x 0,5 (cm3).
Tal como se ilustra en la Figura 13, el mAb 3.19.3 retardaba significativamente el crecimiento del tumor del xenoinjerto de A431. El volumen medio del tumor del grupo control isotipo alcanzó aproximadamente 1,5 cm3 al final del experimento, mientras que la tasa de crecimiento del grupo tratado disminuía significativamente después del día 10, y era de aproximadamente 0,5 cm3 al final. El día 23, la relación de volumen de T/C (tratamiento/control) es 1/3, indicando una inhibición del 66% del crecimiento.
Los resultados sugieren que a la dosis utilizada en este experimento, al unir a Ang-2 de ratón y bloquear la unión de este ligando a su receptor Tie2, el mAb 3.16.3 era capaz de demorar significativamente el crecimiento de xenoinjerto de A431 en ratones desnudos. Es probable que el efecto antitumoral del anticuerpo monoclonal sea debido a la inhibición de la angiogénesis en el hospedante, tal como se demuestra por los ensayos del taco de Matrigel. Utilizando la densidad de microvasos (MVD – siglas en inglés) en el tumor como un marcador farmacodinámico, se demuestra adicionalmente en el Ejemplo 22 el mecanismo de acción con respecto a la anti-angiogénesis.
El mecanismo de acción de mAb 3.19.3 no puede limitarse a su bloqueo de la asociación Ang-2/Tie2 y a la consiguiente señalización. Tal como se indica en el Ejemplo 7, se encuentra también que este mAb se une a Ang-1 y bloquea la unión de Ang-1 a Tie2. De modo interesante, el mAb bloquea también la fosforilación de Tie2 inducida por Ang-1. Es conocido que Ang-1 está implicada en la maduración de los vasos. Cuando se compara la potencia del
mAb 3.19.3 en cuanto a su inhibición en la unión de Ang-1 frente a Ang-2 a Tie2 (Ejemplo 12) es evidente que el mAb 3.19.3 es predominantemente un antagonista de Ang-2. Sin estar ligado a ninguna teoría particular, es posible que el bloqueo dual de la señalización de Ang-2 y Ang-1 afecte a la angiogénesis y, por consiguiente al crecimiento del tumor.
EJEMPLO 21
EL MAB 3.19.3 INHIBE EL CRECIMIENTO DEL TUMOR EN MODELOS DE XENOINJERTO ESTABLECIDOS
Ang-2 está suprarregulada por células endoteliales angiogénicas, y se correlaciona con el progreso de muchos tipos de tumores. Es razonable postular que un anticuerpo monoclonal que bloquea la unión de la asociación Ang-2/Tie2 será capaz de inhibir la angiogénesis y, por lo tanto, inhibir el crecimiento del tumor. En este experimento, se demostró la eficacia terapéutica de un mAb anti-Ang-2. Dado que el mAb 3.19.3 reacciona de forma cruzada y neutraliza la señalización de Ang-2 de ratón/Tie2, se eligió este mAb para demostrar la eficacia in vivo de inhibir el crecimiento del tumor.
Para someter a ensayo si el mAb 3.19.3 anti-Ang-2 inhibe también un tumor establecido y tumores distintos de A431, se empleó el modelo de xenoinjerto LoVo de adenocarcinoma de colon humano. Se administraron dos veces por semana por vía intraperitoneal dosis del mAb 3.19.3 a razón de 0, 5, 2 y 10 mg/kg. Los tratamientos no se iniciaron hasta que los tumores se establecieron con un volumen medio de 0,2 cm3. En estos tumores establecidos, el mAb
3.19.3 demostró también un efecto inhibidor en comparación con el control del isotipo. La Figura 14A demuestra que se consiguió una inhibición del 79% a 0,5 y 2 mg/kg (los valores p son 0,022 y 0,027, respectivamente), y se encontró una inhibición del 75% sobre el desarrollo del tumor (p = 0,006 a 10 mg/kg).
El efecto inhibidor del crecimiento del tumor se reprodujo en un modelo de xenoinjerto adicional, adenocarcinoma de colon humano SW480, que se dejó crecer hasta un volumen medio de 0,2 cm3. A pesar de que a 0,5 mg/kg, no se encontró que el mAb 3.19.3 tuviera un efecto significativo, tanto a 2 como a 10 mg/kg, el mAb inhibía el crecimiento del tumor en un 60% (p = 0,003 y 0,006, respectivamente) el día 53 después del implante del tumor (Figura 14B).
Resumiendo los resultados anteriores, el mAb 3.19.3 anti-Ang-2 inhibía significativamente el crecimiento del tumor en los tres modelos testados. De manera interesante, tanto LoVo como SW480 expresan Ang-2 humana. Sin embargo, otros dos mAbs que no tienen una reactividad cruzada con Ang-2 de ratón no mostraron una actividad inhibidora significativa sobre el crecimiento del tumor (datos no mostrados), a pesar del hecho de que Ang-2 humana era expresada por las células tumorales. Estos resultados implican que se requiere un antagonista del Ang-2 hospedante para bloquear la angiogénesis y el crecimiento del tumor.
Tal como se ha comentado anteriormente, el mAb 3.19.3 reacciona de forma cruzada con Ang-1. Sin embargo, la potencia del mAb 3.19.3 sobre la asociación Ang-1/Tie2 era bastante menor que sobre la asociación Ang-2/Tie2 (Ejemplo 12). Por este motivo, es razonable concluir que la eficacia terapéutica observada en estos modelos se debe predominantemente al antagonismo de Ang-2. Sin embargo, el bloqueo de Ang-1 in vivo en los modelos no podía ser excluido por completo. Durante todo el curso de los experimentos, no se observó efecto de toxicidad obvio tal como pérdida de peso o hemorragia.
EJEMPLO 22
EFICACIA IN VIVO DEL MAB 3.19.3 EN MODELOS DE XENOINJERTO DE TUMORES ADICIONALES
La actividad antitumoral del anticuerpo monoclonal 3.19.3 se testó en modelos de xenoinjerto de ratones de cáncer humano utilizando 9 diferentes líneas de células tumorales.
Células de adenocarcinoma de colon (LoVo, SW480, Colo205, HT29, HCT116), de carcinoma epidermoide (A431), carcinoma de pulmón (Calu-6) y adenocarcinoma de mama (MCF7, MDA-MB-231) se cultivaron en matraces de forma rutinaria hasta que las células alcanzaron la sub-confluencia. Para cada desarrollo del modelo se utilizaron ratones hembras inmunodeficientes de 7-10 semanas de edad. Las células se recolectaron, se suspendieron en Matrigel y luego se inyectaron por vía subcutánea a cada uno de los ratones. Después, los ratones se agruparon aleatoriamente en cohortes que contenían 10-12 ratones. A los ratones se les inyectaron por vía intraperitoneal 0,5 mg de mAb 3.19.3 o anticuerpo control del isotipo, y dos veces por semana después de ello. Para todos los experimentos, se incluyó un tratamiento del anticuerpo control del isotipo. Las dimensiones de cada uno de los tumores se midieron dos veces por semana. El volumen del tumor se calculó como: Volumen = Longitud x (Anchura)2 x 0,5 (cm3). Comparaciones gráficas de la inhibición del crecimiento del tumor se muestran para xenoinjertos HT29 (Figura 15A) y Calu6 (Figura 15B).
Tal como se observa en la Tabla 16, el mAb 3.19.3 mostró una actividad significativa en todos los 7 modelos subcutáneos de xenoinjerto sometidos a ensayo y los dos modelos ortotópicos sin dosis ni programa no optimizado.
Tabla 18. Sumario de la eficacia in vivo del mAb 3.19.3
Modelos de tumores
% de inhibición % de inhibición
Xenoinjertos SubQ
2 mg/k dos veces por semana 10 mg/k dos veces por semana
Colo205
35 46
A431
43 66
HT29
N.D. 54
Calu6
N.D. 38
HCT116
N.D. 33
Modelos ortópticos
MCF7
35* 74
MDA-MB-231
50 58
P <0,05 en todos los casos *Inhibición del crecimiento no estadísticamente significativa N.D. = no determinada
El tejido del tumor MDA-MB-231 se analizó a través de la densidad de tinción de los vasos CD31+. La densidad de tinción de CD31 se midió mediante los métodos de recuento del umbral y de recuento de rejilla manual. Se analizaron once tumores por grupo y al menos 20 imágenes por tumor. Como se observa en la Figura 15C, el
5 tratamiento de ratones con anticuerpo 3.19.3 disminuía la densidad de la tinción con CD31 en un 40%, en comparación con un anticuerpo IgG control. Esto era estadísticamente significativo con los dos métodos de recuento, el recuento del umbral (p < 0,015) y el recuento de rejilla manual (p< 0,00004) mediante test-t de cola única. Se realizaron recuentos de vasos CD31+ similares en tejido ex vivo para los xenoinjertos Colo205 y HCT116. Estas muestras exhibían también una reducción significativa similar en vasos CD31+.
10 EJEMPLO 23
USOS DE ANTICUERPOS ANTI-ANG-2 PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES RELACIONADAS CON LA ANGIOGÉNESIS
Para determinar los efectos in vivo del tratamiento con anticuerpos anti-Ang-1 y anti-Ang-2 en pacientes humanos con diversos tumores sólidos, pacientes humanos son dosificados periódicamente con una cantidad eficaz de
15 anticuerpo anti-Ang-1 y anti-Ang-2. En instantes periódicos durante el tratamiento, los pacientes humanos se vigilan para determinar si se inhibe el crecimiento del tumor. Después del tratamiento, se encuentra que pacientes que se ven sometidos a tratamiento con los anticuerpos anti-Ang-1 y anti-Ang-2 en comparación con pacientes que no han sido tratados tienen mejoras relativas en uno o más de los siguientes, que incluyen, pero no se limitan a tumores más pequeños, tiempo de demora al progreso o tiempo mayor de supervivencia.
20 EJEMPLO 24
USO DE ANTICUERPOS ANTI-ANG-2 COMO UN AGENTE DE DIAGNÓSTICO
Detección del antígeno Ang-2 en una muestra
Se puede desarrollar un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para la detección de antígeno Ang-1 o Ang-2 en una muestra. En el ensayo, pocillos de una placa de microtitulación, tal como una placa de microtitulación
25 de 96 pocillos o una placa de microtitulación de 384 pocillos, se adsorben durante varias horas con un primer anticuerpo monoclonal totalmente humano dirigido contra Ang-1 y Ang-2. El anticuerpo inmovilizado sirve como un anticuerpo de captura para cualquiera de los antígenos que puedan estar presentes en una muestra de ensayo. Los pocillos se aclaran y se tratan con un agente de bloqueo tal como proteína de la leche o albúmina para prevenir la adsorción no específica del analito.
30 Subsiguientemente, los pocillos se tratan con una muestra de ensayo de la que se sospecha que contiene el antígeno, o con una disolución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Una muestra de este tipo puede ser, por ejemplo, una muestra de suero procedente de un sujeto del que se sospecha que tiene niveles de antígeno circulante considerados como diagnósticos de una patología.
Después de separar por aclarado la muestra de ensayo o patrón, los pocillos se tratan con un segundo anticuerpo monoclonal anti-Ang-1 y anti-Ang-2 totalmente humano que está marcado mediante conjugación con biotina. También se puede utilizar un anticuerpo monoclonal o de ratón o de otro origen de especie. El anticuerpo anti-Ang-1 y anti-Ang-2 marcado sirve como un anticuerpo detector. Después de separar por aclarado el exceso de segundo anticuerpo, los pocillos se tratan con peróxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con avidina y un sustrato cromogénico adecuado. La concentración del antígeno en las muestras de ensayo se determina comparándolo con una curva patrón desarrollada a partir de las muestras estándares.
El ensayo ELISA proporciona un ensayo altamente específico y muy sensible para la detección del antígeno Ang-1 y Ang-2 en una muestra de ensayo.
Determinación de la concentración del antígeno Ang-2 en pacientes
Se desarrolla un ELISA sándwich para cuantificar los niveles de Ang-1 y Ang-2 en suero humano. Los dos anticuerpos anti-Ang-2 monoclonales totalmente humanos procedentes del ELISA sándwich reconocen diferentes epítopos en la molécula de Ang-2. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales de ratón o de otro origen de especie. El ELISA se podría realizar, pero no se realiza necesariamente como sigue: 50 !L de anticuerpo anti-Ang-2 de captura en tampón de revestimiento (NaHCO3 0,1 M, pH 9,6) a una concentración de 2 !g/mL se reviste sobre placas ELISA (Fisher). Después de incubación a 4ºC durante una noche, las placas se tratan con 200 !L de tampón de bloqueo (BSA al 0,5%, Tween 20 al 01%, Thimerosal al 0,01% en PBS) durante 1 hora a 25ºC. Las placas se lavan (3 veces) utilizando Tween 20 al 0,05% en PBS (tampón de lavado, WB). Sueros normales o de pacientes (Clinomics, Bioreclaimation) se diluyen en tampón de bloqueo que contiene suero humano al 50%. Las placas se incuban con muestras de suero durante una noche a 4ºC, se lavan con WB y luego se incuban con 100 !L/pocillo de anticuerpo anti-Ang-2 de detección biotinilado durante 1 hora a 25ºC. Después del lavado, las placas se incuban con HRP-estreptavidina durante 15 minutos, se lavan como antes y luego se tratan con 100 !L/pocillo de ofenilendiamina en H2O2 (disolución de desarrollo de Sigma) para la generación de color. La reacción se detiene con 50 !L/pocillo de H2SO4 (2M) y se finaliza utilizando un lector de placas de ELISA a 492 nm. La concentración de antígeno Ang-2 en muestras de suero se calcula comparándola con diluciones de antígeno Ang-2 purificado utilizando un programa de estipulaciones de curvas de cuatro parámetros.
EQUIVALENTES
La anterior descripción descrita se considera suficiente para permitir a un experto en la técnica poner en práctica la invención. La descripción que antecede y los ejemplos detallan determinadas realizaciones preferidas de la invención y describen el mejor modo contemplado por la invención. Sin embargo, se apreciará que independientemente del detalle con el que aparezca en el texto lo que antecede, la invención se puede poner en práctica de muchas maneras, y la invención debería interpretarse de acuerdo con las reivindicaciones anejas.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> ABGENIX, INC. ASTRAZENECA AB Green, Larry L. Zhou, Qing Keyt, Bruce A. Yang, Xiao-Dong Emery, Stephen Charles Blakey, David C.
<120> ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA LA ANGIOPOYETINA-2 Y USOS DE LOS MISMOS
<130> ABXAZ.002VPC
<150> US 60/638,354
<151> 21-12-2004
<150> US 60/711,289
<151> 25-08-2005
<160> 662
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 496
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de polipéptido quimérico de ratón/ser humano creada artificialmente
<400> 1
<210>
2
<211>
497
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
2
<210>
3
<211>
496
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
3
<210> 4
<211>
496
<212>
PRT
<213>
Mus musculus
<400>
4
<210>
5
<211>
498
<212>
PRT
<213>
Mus musculus
<400>
5
<210>
6
<211>
366
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
6
<210>
7
<211>
122
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
7
<210> 8
<211> 324
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
8
<210>
9
<211>
108
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
9
<210>
10
<211>
386
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
10
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11
<211>
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PRT
<213>
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ADN
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<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
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14
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366
<212>
ADN
<213>
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15
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122
<212>
PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210>
16
<211>
322
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
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16
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17
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<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
17
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18
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<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
18
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19
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<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
19
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20
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<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
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20
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PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
21
<210>
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<211>
366
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
22
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23
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<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
23
<210>
24
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322
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
24
<210> 25
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<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
25
<210>
26
<211>
366
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
26
<210>
27
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122
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
27
<210> 28
<211> 324
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
28
<210>
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<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
29
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30
<211>
351
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
30
<210>
31
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<212>
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<213>
Homo sapiens
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32
<211>
342
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
32
<210>
33
<211>
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<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
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<210>
34
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366
<212>
ADN
<213>
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<400>
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35
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122
<212>
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<213>
Homo sapiens
<400>
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36
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327
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
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<210>
37
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<212>
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<213>
Homo sapiens
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<210>
38
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366
<212>
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<213>
Homo sapiens
<400>
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39
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122
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
39
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40
<211>
324
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
40
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41
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108
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
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<210>
42
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374
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
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<212>
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<213>
Homo sapiens
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<210>
44
<211>
339
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
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45
<211>
113
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
45
<210>
46
<211>
366
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
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<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
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<210>
48
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324
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
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<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
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<210>
50
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351
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
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<212>
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<213>
Homo sapiens
<400>
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342
<212>
ADN
<213>
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<212>
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<400>
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<210>
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351
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
54
<210>
55
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<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
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56
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342
<212>
ADN
<213>
Homo sapiens
<400>
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<210>
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<211>
114
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
57
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366
<212>
ADN
<213>
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<400>
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<213>
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<400>
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<213>
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Homo sapiens
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PRT
<213> Homo sapiens
<400> 616
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617
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PRT
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Homo sapiens
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617
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117
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<213>
Homo sapiens
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622
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<213>
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622
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623
<210> 624
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<213>
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624
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625
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<213>
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626
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Homo sapiens
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PRT <213> Homo sapiens
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Homo sapiens
<400>
632
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PRT
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Homo sapiens
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Homo sapiens
<400>
634
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108
<212>
PRT <213> Homo sapiens
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635
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PRT
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<213>
Homo sapiens
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114
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<213>
Homo sapiens
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113
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<213>
Homo sapiens
<400>
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<210>
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114
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<213>
Homo sapiens
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PRT
<213>
Homo sapiens
<400>
643
<210>
644
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<213>
Homo sapiens
<400>
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Homo sapiens
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<213>
Homo sapiens
<400>
647
<210> 648
<211> 106
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
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648
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649
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111
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<213>
Homo sapiens
<400>
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650
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<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213>
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107
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<213>
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<400> 659
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Homo sapiens
<400>
660
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Homo sapiens
<400>
661
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662
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PRT
<213>
Homo sapiens
<400> 662

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1.- Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 81 y una cadena pesada variable que tiene una secuencia definida por SEQ ID NO: 79.
  2. 2.- El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA-7260 (mAb 3.19.3).
  3. 3.- Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión a Ang-2 con el anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA-7260 (mAb 3.19.3) que une Ang-1 y Ang-2 con una Kd de menos de 100 picomolar, medida por resonancia de plasmón de superficie de alta resolución.
  4. 4.- Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno que se une al mismo epítopo sobre Ang-2 que el anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA-7260 (mAb 3.19.3).
  5. 5.- Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno que se une a angiopoyetina-2 (Ang-2), en donde dicho anticuerpo comprende:
    a.
    tres CDRs de cadena pesada del anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA7260 (mAb 3.19.3), teniendo las tres CDRs de cadena pesada las secuencias:
    (i)
    GFTFTNYGMH,
    (ii)
    VISHDGNNKYYVDSVKG, y
    (iii) EGIDFWSGLNWFDP; y
    b.
    tres CDRs de cadena ligera del anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA7260 (mAb 3.19.3), teniendo las tres CDRs de cadena pesada las secuencias:
    (iv)
    RASQSITGSYLA,
    (v)
    GASSWAT, y
    (vi)
    QQYSSSPIT.
  6. 6.- Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno que se une al mismo epítopo sobre Ang-2 que el anticuerpo depositado como el Número de Acceso a ATCC PTA-7260 (mAb 3.19.3), comprendiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene secuencias de CDR:
    (i)
    GFTFTNYGMH,
    (ii)
    VISHDGNNKYYVDSVKG, y
    (iii) EGIDFWSGLNWFDP, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene secuencias de CDR
    (iv)
    RASQSITGSYLA,
    (v)
    GASSWAT, y
    (vi)
    QQYSSSPIT.
  7. 7.- Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es un anticuerpo monoclonal.
  8. 8.- Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 ó 6, que es un anticuerpo policlonal.
  9. 9.- Uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor maligno.
  10. 10.- El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho tumor maligno se selecciona del grupo que consiste en: melanoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (del hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (del estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer pancreático y carcinoma epidermoide.
  11. 11.- El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el tratamiento de un tumor maligno.
  12. 12.- El anticuerpo o fargmento de unión a antígeno de la reivindicación 11, en donde dicho tumor maligno se selecciona del grupo que consiste en: melanoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (del hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (del estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer pancreático y carcinoma epidermoide.
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