RS59833B1 - Sastavi faktora viii i postupci za pravljenje i upotrebu istih - Google Patents

Description

Opis

POZADINA PRONALASKA

[0001] Faktor VIII je važna komponenta unutrašnjeg puta kaskade koagulacije krvi. U cirkulaciji je faktor VIII uglavnom sastavljen sa von Willebrandovim faktorom. Nakon aktiviranja trombinom (Faktor IIa), on se odvaja od kompleksa za interakciju sa faktorom IXa u kaskadi unutrašnje koagulacije, koji zauzvrat aktivira faktor X. Kada se ukloni iz kompleksa von Willebrandovog faktora, aktivirani faktor VIII se proteolitički inaktivira aktiviranim proteinom C (APC), faktorom Xa i faktorom IXa i brzo se uklanja iz krvotoka. Kada je kompleksan sa normalnim proteinima von Willebrandovog faktora, polu-raspad faktora VIII iznosi oko 12 sati, dok u nedostatku von Willebrandovog faktora, polu-raspad faktora VIII smanjuje se na 2 sata (Tuddenham EG, i dr., Br J Haematol. (1982) 52(2):259-267).

[0002] Kod hemofilije, zgrušavanje krvi je poremećeno nedostatkom određenih faktora zgrušavanja krvi u plazmi. Hemofilija A je deficit faktora VIII i predstavlja recesivni poremećaj vezan za polni X hromozom koji predstavlja 80% slučajeva hemofilije. Standard nege za lečenje hemofilije A je zamena terapije sa rekombinantnim koncentratima faktora VIII. Ispitanici sa teškom hemofilijom A imaju nivo cirkulišućeg prokoagulantnog faktora VIII ispod 1-2% od normalnog i obično se nalaze na profilaktičkoj terapiji sa ciljem da se faktor VIII zadrži iznad 1% između doza, što se obično može postići davanjem faktora VIII dva do tri puta nedeljno. Osobe sa umereno jakom hemofilijom (nivo faktora VIII od 2-5% od normalne) čine 25-30% incidenata sa hemofilijom i manifestuju krvarenje nakon manje traume. Osobe s blagom hemofilijom A (nivo faktora VIII od 5-40% od normalne) čine 15-20% svih slučajeva sa hemofilijom, a krvarenje razvijaju tek nakon značajne traume ili operacije.

[0003] In vivo aktivnost egzogeno obezbeđenog faktora VIII ograničena je i kratkim poluraspadom proteina i inhibitorima koji se vezuju za faktor VIII i smanjuju ili uništavaju hemostatsku funkciju.

[0004] Do 30% pacijenata sa hemofilijom A koji primaju egzogeni faktor VIII postavljaju imunološki odgovor na IgG prema faktoru VIII (Towfighi, F., i dr. Uporednim merenjima antitela anti-faktora VIII pomoću Bethesda testa i ELISA otkriva se ograničen profil izotipa i specifičnost epitopa. Acta Haematol (2005) 114:84-90), što može rezultirati potpunom inhibicijom njegove prokoagulantne aktivnosti i/ili promovisanjem bržeg uklanjanja faktora VIII (Briët E i dr. Inhibitori visokog titra kod teške hemofilije A. Meta-analiza zasnovana na osam dugoročnih naknadnih ispitivanja o inhibitorima povezanim sa sirovim ili srednjim proizvodima faktora čistoće VIII. Throm. Haemost. (1994) 72: 162-164). IgG antitela, koja se nazivaju FVIII inhibitori, primarno su usmerena prema domenima A2, A3 i C2 (Scandella D i dr. Lokalizacija epitopa za antitela inhibitora humanog faktora VIII imunoblotovanjem i neutralizacijom antitela. Blood (1989) 74:1618-1626), ali može nastati i protiv domena A1, B i C1. Kao takve, mogućnosti lečenja za pacijente sa FVIII inhibitorima su ograničene.

[0005] Veliki proteini poput faktora VIII obično se daju intravenski, tako da je lek direktno dostupan u krvotoku. Ranije je pokazano da nemodifikovani faktor VIII, intramuskularno ubrizgan, daje maksimalan nivo cirkulacije od samo 1.4% od normalnog nivoa u plazmi (Pool i dr., Ineffectiveness of Intramuscularly Injected Factor VIII Concentrate in Two Hemophilic Patients. New England J. Medicine (1966) 275(10):547-548). Formulacije koje se mogu davati drugačije nego intravenskim putem znatno bi pojednostavile njihovu upotrebu, povećali sigurnost i rezultirali znatnim uštedama troškova.

[0006] Hemijske modifikacije terapijskog proteina mogu modifikovati njegovu in vivo stopu klirensa i naknadni polu-raspad u serumu. Jedan primer uobičajene modifikacije je dodavanje dela polietilen glikola (PEG), obično povezanog sa proteinom preko aldehida ili N-hidroksisukcinimidne (NHS) grupe na PEG koji reaguje sa aminskom grupom (npr., bočnim lancem lizina ili N -terminusa). Međutim, korak konjugacije može rezultirati formiranjem heterogenih smeša proizvoda koje zahtevaju ekstrakciju, prečišćavanje i/ili druge dalje procese, a to neizbežno utiče na prinos proizvoda i kontrolu kvaliteta. Takođe, farmakološka funkcija faktora koagulacije može biti ometana ako bočni lanci aminokiselina u blizini mesta vezivanja postanu modifikovani postupkom PEGilacije. Drugi pristupi uključuju genetsku fuziju Fc domene sa terapijskim proteinima, što povećava veličinu terapeutskog proteina, čime smanjuje brzinu klirensa kroz bubreg. U nekim slučajevima, Fc domen daje sposobnost vezanja i recikliranja iz lizozoma FcRn receptorom, što rezultira povećanim farmakokinetičkim polu-raspadom. Nažalost, Fc domen se ne savija efikasno tokom rekombinantne ekspresije, i teži da formira nerastvorljive taloge poznate kao inkluzijska tela. Ova tela za inkluziju moraju biti rastvorena , a funkcionalni protein se mora obnoviti iz pogrešno sabranog agregata, što je dugotrajan, neefikasan i skup proces.

[0007] WO 2008/077616 odnosi se na modifikovane faktore koagulacije sa produženim in vivo polu-raspadom.

[0008] Gruppo i dr. Haemophilia.2003 May;9(3):251-60 izveštava o uporednoj efikasnosti faktora VIII za brisanje pune dužine i izbrisanog B domena za profilaksu.

REZIME PRONALASKA

[0009] Predmetno obelodanjivanje, uključujući predmetni pronalazak, odnosi se na nove sastave fuzionih proteina faktora koagulacije VIII i njihovu upotrebu. Konkretno, ovde sastavi dati posebno se koriste za lečenje ili poboljšanje stanja povezanog sa hemofilijom A, nedostatkom faktora VIII, poremećajima krvarenja i koagulopatijama. U jednom slučaju, predmetno obelodanjivanje obezbeđuje sastave izolovanih fuzionih proteina koji sadrže faktor VIII (FVIII) i jedan ili više proširenih rekombinantnih polipeptida (XTEN) gde fuzioni protein pokazuje prokoagulantnu aktivnost. Predmet XTEN koristan za konstrukciju takvih fuzionih proteina je tipično polipeptid sa ponavljajućom sekvencom i nestruktuiranom konformacijom. U jednom slučaju, jedan ili više XTEN je povezano sa faktorom koagulacije FVIII ("CF") odabranim iz matičnog humanog faktora VIII, izbrisanih sekvenci B-domena faktora VIII ("FVIII BDD") i njihovih varijantnih sekvenci (sve prethodno zajednički "FVIII" ili "CF"), što rezultira rekombinantnim fuzionim proteinom faktora VIII-XTEN ("CFXTEN"). Polipeptidna komponenta faktora VIII CFXTEN sadrži A1 domen, A2 domen, C1 domen, C2 domen i opciono B domen ili njegov deo. U nekim slučajevima, FVIII se dalje karakteriše razgraničenjem iznad pomenutih domena koji sadrže kiseli razdelnik a1, a2 i a3. U drugom slučaju, ovo obelodanjivanje je usmereno na farmaceutske sastave koji sadrže fuzione proteine i njihovu upotrebu u postupcima i režimima za lečenje stanja povezanih sa faktorom VIII. CFXTEN sastave imaju poboljšana farmakokinetička i farmakološka svojstva u poređenju sa FVIII koji nisu povezani sa XTEN, što može omogućiti pogodnije doziranje i poboljšati efikasnost.

[0010] U prvom slučaju, obelodanjivanje se odnosi na rekombinantne fuzione proteine faktora VIII koji sadrže polipeptid faktora VIII i jedan ili više produženog rekombinantnog polipeptida (XTEN) koji su povezani sa faktorom VIII. U nekim slučajevima, obelodanjivanje obezbeđuje rekombinantne fuzione proteine faktora VIII koji sadrže polipeptid faktora VIII i najmanje jedan prošireni rekombinantni polipeptid (XTEN), pri čemu navedeni polipeptid faktora VIII sadrži A1 domenu uključujući a1 kiseli razdelnički region, A2 domen uključujući a2 kiseli razdelnički region, A3 domena koji uključuje a3 kiseli razdelnički region, C1 domen, C2 domen i opciono ceo ili deo B domena i gde je navedeni najmanje jedan XTEN povezan sa pomenutim polipeptidom faktora VIII na (i) C-terminusu pomenutog polipeptida faktora VIII; (ii) unutar B domena pomenutog polipeptida faktora VIII ako je prisutan ceo ili deo B domena; (iii) unutar A1 domena pomenutog polipeptida faktora VIII; (iv) unutar A2 domena pomenutog polipeptida faktora VIII; (v) unutar A3 domena pomenutog polipeptida faktora VIII; (vi) unutar C1 domena pomenutog polipeptida faktora VIII; (vii) unutar C2 domena pomenutog polipeptida faktora VIII; (viii) na N-terminusu pomenutog polipeptida faktora VIII, ili (ix) između dva domena pomenutog polipeptida faktora VIII, pri čemu fuzioni protein zadržava najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400% ili 500% prokoagulacione aktivnosti, mereno in vitro testom koagulacije, u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN. U jednom slučaju, u prethodnom rekombinantnom fuzionom proteinu faktora VIII, najmanje jedan XTEN je povezan sa navedenim polipeptidom faktora VIII na mestu ili unutar 1 do 6 aminokiselina mesta izabranog iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9. U drugim slučajevima, obelodanjivanje obezbeđuje rekombinantne fuzione proteine faktora VIII koji sadrže polipeptid faktora VIII i najmanje prvi prošireni rekombinantni polipeptid (XTEN), pri čemu navedeni polipeptid faktora VIII sadrži A1 domenu uključujući a1 kiseli razdelnički region, A2 domen uključujući a2 kiseli razdelnički region, A3 domena koji uključuje a3 kiseli razdelnički region, C1 domen, C2 domen i opciono ceo ili deo B domena i gde je navedeni najmanje prvi XTEN povezan sa pomenutim polipeptidom faktora VIII na (i) C-terminusu pomenutog polipeptida faktora VIII; (ii) unutar B domena pomenutog polipeptida faktora VIII ako je prisutan ceo ili deo B domena; (iii) unutar A1 domena pomenutog polipeptida faktora VIII; (iv) unutar A2 domena pomenutog polipeptida faktora VIII; (v) unutar A3 domena pomenutog polipeptida faktora VIII; (vi) unutar C1 domena pomenutog polipeptida faktora VIII; ili (vii) unutar C2 domena pomenutog polipeptida faktora VIII; i u poređenju sa odgovarajućim proteinom faktora VIII koji nije povezan sa XTEN, fuzioni protein (a) zadržava najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 100%, 200%, 300%, 400% ili 500% prokoagulantne aktivnosti u in vitro ispitivanju koagulacije opisano ovde ili drugim takvim testovima poznatim u oblasti, i/ili (b) pokazuje smanjeno vezivanje za anti-faktor VIII antitelo u in vitro ispitivanju vezivanja koje je ovde opisano ili u drugim takvim testovima poznatim u stanju tehnike. U jednom slučaju, u prethodnom rekombinantnom fuzionom proteina faktora VIII, najmanje jedan XTEN je povezan sa navedenim polipeptidom faktora VIII na mestu ili unutar 1 do 6 aminokiselina mesta izabranog iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9. U drugim slučajevima, obelodanjivanje obezbeđuje rekombinantne fuzione proteine faktora VIII koji sadrže polipeptid faktora VIII i najmanje prvi prošireni rekombinantni polipeptid (XTEN), pri čemu navedeni polipeptid faktora VIII sadrži A1 domenu uključujući a1 kiseli razdelnički region, A2 domen uključujući i a2 kiseli razdelnički region, A3 domen uključujući a3 kiseli razdelnički region, C1 domen, C2 domen i opciono ceo ili deo B domena i gde je navedeni prvi XTEN povezan sa pomenutim polipeptidom faktora VIII na mestu umetanja koje je izabrano iz Tabele 6 i Tabele 7 i gde fuzioni protein zadržava najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,100%, 200%, 300%, 400% ili 500% prokoagulantne aktivnosti, mereno testom in vitro koagulacije opisanim ovde ili drugim takvim testovima poznatim u stanju tehnike, u poređenju sa odgovarajućim proteinom faktora VIII koji nije povezan sa XTEN. Neograničavajući primeri proteina faktora VIII koji nisu povezani sa XTEN uključuju izvorne FVIII, BDD FVIII, pBC100 i sekvence iz Tabele 1. U drugom primeru rekombinantnog fuzionog proteina faktora VIII, polipeptid faktora VIII ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, do oko 100% identiteta sekvence od sekvence odabrane iz grupe koja sadrži sekvence iz Tabele 1, sekvence prikazane na Sl. 3, i sekvenca je prikazana na Sl.4, kada je optimalno poravnata. U još jednom primeru, fuzioni protein sadrži najmanje još jedan XTEN povezan sa pomenutim polipeptidom faktora VIII na C-terminusu pomenutog polipeptida faktora VIII, unutar ili opciono zamenjiv B domen navedenog polipeptida faktora VIII. U specifičnom primeru, fuzioni protein sadrži najmanje jednu XTEN sekvencu koja se nalazi unutar ili opciono zamenjuje B domen pomenutog polipeptida faktora VIII. U drugom konkretnom primeru, fuzioni protein sadrži najmanje jednu sekvencu XTEN koja je povezana sa pomenutim polipeptidom faktora VIII na C-terminusu pomenutog polipeptida faktora VIII. U jednom slučaju, fuzioni protein rekombinantnog faktora VIII sadrži uklonjenu varijantu humanog faktora VIII sa izbrisanog domena B, pri čemu brisanje B-domena počinje od prve pozicije oko aminokiselinskog broja 741 do oko 750 i završava na drugoj poziciji na aminokiselinski ostatak broj 1635 do oko 1648 u odnosu na sekvencu humanog faktora VIII u celoj dužini, kako je prikazano na Sl.3. U drugom primeru, rekombinantni fuzioni protein faktora VIII sadrži prvu sekvencu XTEN povezanu sa navedenim polipeptidom faktora VIII na C-terminusu pomenutog polipeptida faktora VIII, i najmanje drugi XTEN unutar ili zamenjujući B domen pomenutog polipeptida faktora VIII, pri čemu je drugi XTEN povezan sa C-terminusom kod otprilike aminokiselinskog broja 741 do oko 750 i na N-terminusnom kraju ostataka aminokiselina od 1635 do oko 1648 u odnosu na sekvencu humanog faktora VIII u celoj dužini, kao što je postavljeno dalje na Sl.3, pri čemu je kumulativna dužina XTEN najmanje oko 100 aminokiselinskih ostataka. U jednom slučaju, u prethodnom fuzionom proteinu, drugi XTEN povezuje aminokiseline faktora VIII između N745 i P1640 ili između S743 do Q1638 ili između P747 do V1642 ili između N745 i Q1656 ili između N745 i S1657 ili između N745 i T1667 ili između N745 i Q1686 ili između R747 i V1642 ili između T751 i T1667. U jednom slučaju, rekombinantni fuzioni protein faktora VIII sadrži sekvencu koja ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 91%, ili najmanje oko 92%, ili najmanje oko 93%, ili najmanje oko 94%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili barem oko 99%, do oko 100% identiteta sekvence u poređenju sa nizom uporedivih dužina odabranih iz Tabele 21, kada je optimalno poravnata. U drugom slučaju, rekombinantni fuzioni protein faktora VIII sadrži najmanje drugi XTEN, opciono treći XTEN, opciono četvrti XTEN, opciono četvrti XTEN i opciono šesti XTEN, pri čemu je svaki drugi, treći, četvrti, peti ili šesti XTEN je povezan sa navedenim polipeptidom faktora VIII na drugom, trećem, četvrtom, petom ili šestom mestu izabranom iz grupe koja se sastoji od mesta umetanja iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9; mesto unutar 6 aminokiselina aminokiselinskog ostatka 32, 220, 224, 336, 339, 390, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 i 1910 zrelog faktora VIII; lokaciju između bilo koja dva susedna domena pomenutog polipeptida faktora VIII, pri čemu su navedena dva susedna domena izabrana iz grupe koja se sastoji iz A1 i A2 domena, A2 i B domena, B i A3 domena, A3 i C1 domena i C1 i C2 domena; mesto unutar B domena pomenutog polipeptida faktora VIII, pri čemu je drugi XTEN povezan sa krajnjim C-terminusom otprilike 741 do oko 750 aminokiselinskih ostataka i N-terminusnim krajem aminokiselinskih ostataka od 1635 do oko 1648 prirodne sekvence faktora VIII; i C-terminus pomenutog polipeptida faktora VIII. U jednom slučaju, prva XTEN je odvojena od druge XTEN najmanje 10 aminokiselina, najmanje 50 aminokiselina, najmanje 100 aminokiselina, najmanje 200 aminokiselina, najmanje 300 aminokiselina ili najmanje 400 aminokiselina. U jednom primeru fuzionog proteina rekombinantnog faktora VIII koji sadrži najmanje drugi XTEN, opciono treći XTEN, opciono četvrti XTEN, opciono četvrti XTEN i opciono šesti XTEN, svaki XTEN ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili barem otprilike 90%, ili najmanje oko 91%, ili najmanje oko 92%, ili barem oko 93%, ili najmanje oko 94%, ili barem oko 95%, ili barem oko 96%, ili barem oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%, ili oko 100% identiteta sekvenci u poređenju sa XTEN slične dužine, izabranim iz grupe koja se sastoji iz sekvenci u Tabeli 4, Tabeli 13, Tabeli 14, Tabeli 15, Tabeli 16 i Tabeli 17 kada je optimalno poravnata. U još jednom primeru rekombinantnog fuzionog proteina faktora VIII koji sadrži najmanje drugi XTEN, opciono treći XTEN, opciono četvrti XTEN, opciono četvrti XTEN i opciono šesti XTEN, u poželjnim slučajevima, rekombinantni fuzioni protein faktora VIII pokazuje terminusni polu-raspad najmanje oko 3 sata, ili 4 sata, ili 6 sati, ili 12 sati, ili 13 sati, ili 14 sati, ili 16 sati, ili 24 sata, ili 48 sati, ili 72 sata, ili 96 sati, ili 120 sati, ili 144 sata, ili 7 dana, ili 14 dana, ili 21 dan kada se daje ispitaniku, pri čemu je navedeni ispitanik odabran iz humanog i faktora VIII/von Willebrandovog faktora dvostrukog nokaut miša. Nadalje, u slučajevima ovog paragrafa, fuzioni protein pokazuje smanjeno vezivanje za antitelo protiv faktora VIII ili veću zadržavanu prokoagulantnu aktivnost ili oba u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN. U jednom slučaju, prokoagulantna aktivnost fuzionog proteina rekombinantnog faktora VIII iznosi najmanje 30%, ili 40%, 50%, 80%, 100%, 200%, 300%, 400%, ili 500% veća aktivnost prokoagulanse u prisustvo anti-FVIII antitela u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN, kada je svako testirano testom in vitro koagulacije. U jednom slučaju, redukovano vezanje fuzionog proteina antitelo antifaktora VIII određeno je korišćenjem Bethesda testa korišćenjem antitela anti-faktora VIII izabranog iz grupe koja sadrži antitela iz Tabele 10 i poliklonska antitela iz hemofilije A pacijent sa inhibitorima faktora VIII, pri čemu je smanjena aktivnost vezivanja i zadržana prokoagulantna aktivnost fuzionog proteina dokazana nižim Bethesda titrom od najmanje oko 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 , 100 ili 200 Bethesda jedinica za fuzioni protein u poređenju sa onim za faktor VIII koji nije povezan sa XTEN.

[0011] U jednom slučaju, rekombinantni fuzioni protein faktora VIII može, na primer, da sadrži jedan ili više XTEN gde XTEN ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93 %, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, do oko 100% identiteta sekvence u poređenju sa jednim ili više XTEN uporedivih dužina odabranih iz Tabele 4, Tabele 13, Tabele 14, Tabele 15, Tabele 16 i Tabele 17, kada je optimalno poravnata.

[0012] U drugom slučaju, obelodanjivanje se odnosi na rekombinantne fuzione proteine faktora VIII koji sadrže FVIII i jedan ili više XTEN u specifičnim konfiguracijama N- do C-terminusa. U jednom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule I:

(XTEN)x-CF-(XTEN)yI

gde CF nezavisno za svaku pojavu predstavlja faktor VIII kako je ovde definisan, uključujući sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97% %, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama iz Tabele 1; x je ili 0 ili 1 i y je ili 0 ili 1 gde x+y ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4. U skladu sa time, CFXTEN fuzioni sastav može imati XTEN-CF, XTEN-CF-XTEN ili CF-XTEN konfiguracije.

[0013] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule II:

(XTEN)x-(S)x-(CF)-(XTEN)yII

gde CF nezavisno za svaku pojavu predstavlja faktor VIII kako je ovde definisan, uključujući sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97% %, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 1; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; x je ili 0 ili 1 i y je ili 0 ili 1 gde x+y ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli

[0014] U drugom primeru CFXTEN sastava, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII, pri čemu je fuzioni protein formule III:

(XTEN)x-(S)x-(CF)-(S)y-(XTEN)yIII

gde CF nezavisno za svaku pojavu predstavlja faktor VIII kako je ovde definisan, uključujući sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97% %, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% ili 100% identiteta sekvenci iznetih u Tabeli 1; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; x je ili 0 ili 1 i y je ili 0 ili 1 gde x+y ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4.

[0015] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule IV:

(A1)-(XTEN)u-(A2)-(XTEN)v-(B)-(XTEN)w(A3)-(XTEN)x-(C1)-(XTEN)y-(C2)-(XTEN)zIV

gde je nezavisno za svaku pojavu, A1 domen AV od FVIII; A2 je A2 domen FVIII; A3 je A3 domen FVIII; B je B domen FVIII koji može biti fragment ili varijanta spajanja B domena; C1 je C1 domen FVIII; C2 je C2 domen FVIII; v je ili 0 ili 1; w je ili 0 ili 1; x je ili 0 ili 1; y je ili 0 ili 1; y je 0 ili 1 pod uslovom da je u v x y+z ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4.

[0016] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni

1

protein faktora VIII formule V:

(XTEN)t-(S)a-(A1)-(S)b-(XTEN)u-(S)b-(A2)-(S)c-(XTEN)v-(S)c-(B)-(S)d-(XTEN)w-(S)d-(A3)-(S)e-(XTEN)x-(S)e-(C1)-(S)f-(XTEN)y-(S)f-(C2)-(S)g-(XTEN)zV

gde je nezavisno za svaku pojavu, A1 domen AV od FVIII; A2 je A2 domen FVIII; A3 je A3 domen FVIII; B je B domen FVIII koji može biti fragment ili varijanta spajanja B domena; C1 je C1 domen FVIII; C2 je C2 domen FVIII; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; a je ili 0 ili 1; b je ili 0 ili 1; c je ili 0 ili 1; d je ili 0 ili 1; e je ili 0 ili 1; f je ili 0 ili 1; g je ili 0 ili 1; t je ili 0 ili 1; u je ili 0 ili 1; v je ili 0 ili 1; w je 0 ili 1, x je ili 0 ili 1; y je ili 0 ili 1; z je 0 ili 1 pod uslovom da je t u v w+ x y z ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4. U drugom primeru formule V, razdelnička sekvenca je glicin ili sekvenca odabrana iz Tabela 11 i 12.

[0017] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule VI:

(XTEN)u-(S)a-(A1)-(S)b-(XTEN)v-(S)b-(A2)-(S)c-(XTEN)w-(S)c-(A3)-(S)d-(XTEN)x-(S)d-(C1)-(S)e-(XTEN)y-(S)e-(C2)-(S)f-(XTEN)zVI

gde je nezavisno za svaku pojavu, A1 domen AV od FVIII; A2 je A2 domen FVIII; A3 je A3 domen FVIII; C1 je C1 domen FVIII; C2 je C2 domen FVIII; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; a je ili 0 ili 1; b je ili 0 ili 1; c je ili 0 ili 1; d je ili 0 ili 1; e je ili 0 ili 1; f je ili 0 ili 1; u je ili 0 ili 1; v je ili 0 ili 1; w je 0 ili 1, x je ili 0 ili 1; y je ili 0 ili 1; z je 0 ili 1 pod uslovom da je u v w+ x y z ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4. U drugom otelotvorenju formule V, razdelnička sekvenca je glicin ili sekvenca odabrana iz Tabela 11 i 12.

[0018] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule VII:

(SP)-(XTEN)x-(CS)x-(S)x-(FVIII_1-745)-(S)y-(XTEN)y-(S)y-(FVIII_1640-2332)-(S)z-(CS)z-(XTEN)zVII

pri čemu je nezavisno za svaku pojavu SP signalni peptid, poželjno sa sekvencom MQIELSTCFFLCLLRFCFS (SEQ ID NO:1611), CS je sekvenca deljenja navedena u Tabeli 12, S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji opciono mogu da sadrže aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja, "FVIII_1-745" je ostatak 1-745 faktora FVIII i " FVIII_1640-2332 "je ostatak 1640-2332 od FVIII, x je ili 0 ili 1, y je 0 ili 1, i z je 0 ili 1, pri čemu x+y+z >2; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnost sekvenci navedenim u Tabeli 4. U jednom primeru formule VII, razdelnička sekvenca je GPEGPS (SEQ ID NO:1612). U drugom primeru formule V, razdelnička sekvenca je glicin ili sekvenca odabrana iz Tabela 11 i 12.

[0019] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule VIII:

(A1)-(S)a-(XTEN)v-(S)a-(A2)-(B1)-(S)b-(XTEN)w-(S)b-(B2)-(A3)-(S)c-(XTEN)x-(S)c-(C1)-(S)d-(XTEN)y-(S)d-(C2)-(S)e-(XTEN)zVIII

gde je nezavisno za svaku pojavu, A1 domen AV od FVIII; A2 je A2 domen FVIII; B1 je fragment B domena koji može imati od ostatka 741 do 743-750 od FVIII ili alternativno od oko 741 do ostataka 745 od FVIII; B2 je fragment B domena koji može imati od ostataka 1635-1686 do 1689 FVIII ili alternativno od oko 1640 do ostataka 1689 od FVIII; A3 je A3 domen FVIII; C1 je C1 domen FVIII; C2 je C2 domen FVIII; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; a je ili 0 ili 1; b je ili 0 ili 1; c je ili 0 ili 1; d je ili 0 ili 1; e je ili 0 ili 1; f je ili 0 ili 1; u je ili 0 ili 1; v je ili 0 ili 1; w je 0 ili 1, x je ili 0 ili 1; y je ili 0 ili 1; z je 0 ili 1 pod uslovom da je u v w+ x y z ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4. U jednom primeru formule VIII, razdelnička sekvenca je GPEGPS (SEQ ID NO:1612). U drugom primeru formule V, razdelnička sekvenca je glicin ili sekvenca odabrana iz Tabela 11 i 12.

[0020] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule X:

(A1N)-(S)a-(XTEN)t-(S)b-(A1C)-(A2N)-(S)c-(XTEN)u-(S)d-(A2C)-(BN)-(S)e-(XTEN)v-(S)f-(BC)-(A3N)-(S)g-(XTEN)w-(S)h-(A3C)-(C1N)-(S)i-(XTEN)x-(S)j-(C1C)-(C2N)-(S)k-(XTEN)y-(S)1-(C2C)-(S)m-(XTEN)zIX

pri čemu je nezavisno za svaku pojavu, A1Nfragment A1 domene od najmanje ostatka broja 1 (numerisanog u odnosu na izvorni, zreli FVIII) do ne više od broja ostatka 371, A1c je fragment A1 domene od najmanje ostatka broja 2 do ne više od ostatka broj 372, uz uslov da nijedan niz A1Nfragmenta koji se duplira u A1c je fragment; A2Nfragment A2 domene od najmanje ostatka broja 373 do ne više od broja ostatka 739, A1cje fragment A2 domene od najmanje ostatka broja 374 do ne više od ostatka broj 740, uz uslov da nijedan niz A2Nfragmenta koji se duplira u A1cje fragment; BNfragment B domene od najmanje ostatka broja 741 do ne više od broja ostatka 1647, Bcje fragment B domene od najmanje ostatka broja 742 do ne više od ostatka broj 1648, uz uslov da nijedan niz BNfragmenta koji se duplira u Bcje fragment; A3Nfragment A3 domene od najmanje ostatka broja 1649 do ne više od broja ostatka 2019, A3cje fragment A3 domene od najmanje ostatka broja 1650 do ne više od ostatka broj 2019, uz uslov da nijedan niz A3Nfragmenta koji se duplira u A3cje fragment; C1Nfragment C1 domene od najmanje ostatka broja 2020 do ne više od broja ostatka 2171, C1cje fragment C1 domene od najmanje ostatka broja 2021 do ne više od ostatka broj 2171, uz uslov da nijedan niz C1Nfragmenta koji se duplira u C1cje fragment;

1

C2Nfragment C2 domene od najmanje ostatka broja 2173 do ne više od broja ostatka 2331, C2cje fragment C2 domene od najmanje ostatka broja 2174 do ne više od ostatka broj 2332, uz uslov da nijedan niz C2Nfragmenta koji se duplira u C2cje fragment; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; a je ili 0 ili 1; b je ili 0 ili 1; c je ili 0 ili 1; d je ili 0 ili 1; e je ili 0 ili 1; f je ili 0 ili 1; g je ili 0 ili 1; h je ili 0 ili 1; i je ili 0 ili 1; j je ili 0 ili 1; k je ili 0 ili 1; l je ili 0 ili 1; m je ili 0 ili 1; t je ili 0 ili 1; u je ili 0 ili 1; v je ili 0 ili 1; w je 0 ili 1, x je ili 0 ili 1; y je ili 0 ili 1; z je 0 ili 1 pod uslovom da je t u v w+ x y z ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94% ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, do oko 100% identiteta sekvence u poređenju sa jednim ili više XTEN slične dužine odabranih iz Tabele 4. U jednom primeru formule IX, razdelnička sekvenca je GPEGPS (SEQ ID NO:1612). U drugom primeru formule V, razdelnička sekvenca je glicin ili sekvenca odabrana iz Tabela 11 i 12. U drugom slučaju formule IX, Z je 1. U drugom otelotvorenju fuzioni protein formule IX V je 1 i XTEN je povezan sa krajem C-terminusa kod otprilike 741 do oko 750 aminokiselinskih ostataka i kraja N-terminusa aminokiselinskih ostataka od 1635 do oko 1648 sa referencom na sekvencu humanog faktora VIII u celoj dužini, kao što je prikazano na Sl.3. U drugom primeru fuzionog proteina formule IX, suma t, u, v, w, x, y i z jednaka je 2, 3, 4, 5 ili 6. U drugom primeru formule IX, suma t, u, v, w, x, y i z jednaka je 2 i v je 1 i z je 1. U drugom primeru fuzionisanog proteina formule IX, suma t, u, v, w, x, y i z je jednak 3, v i z, svaki je jednak 1, i bilo t, u, w, x ili y je 1. U drugom primeru formule IX, zbir t, u, v, w, x, y i z je jednak 4, v i w i z svaki je jednak 1, a dva od t, u, x ili y je 1. U drugom primeru fuzionog proteina formule IX, kumulativna dužina XTEN- je između oko 84 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka. U drugom primeru formule IX, najmanje jedan XTEN je odmah ubačen niz aminokiselinu koja odgovara aminokiselini u zrelom prirodnom humanom faktoru VIII izabranom iz grupe koja se sastoji iz aminokiselinskih ostataka broj 32, 220, 224, 336, 339 , 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 i 1910. U drugom primeru fuzionog proteina formule IX, svaki XTEN je vezan za navedeni fuzioni protein na mestima izabranim iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9. U drugom primeru fuzionog proteina formule IX, svaki XTEN ima najmanje oko 80%, ili oko 90%, ili najmanje 91%, ili najmanje oko 92%, ili najmanje oko 93%, ili najmanje oko 94% %, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%, ili oko 100% identičnosti sekvence u poređenju sa XTEN slične dužine izabran iz grupe koja se sastoji iz sekvenci u Tabeli 4, Tabeli 13, Tabeli 14, Tabeli 15, Tabeli 16 i Tabeli 17, kada su optimalno poravnate.

[0021] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje prvi rekombinantni faktor VIII polipeptid formule X:

(A1)-a1-(A2)-a2-[B] X

i drugi polipeptid koji sadrži Formulu XI:

a3-(A3)-(C1)-(C2) XI

gde prvi polipeptid i drugi polipeptid jesu spojeni ili postoje kao heterodimer; gde, A1 je A1 domen faktora VIII; A2 je A2 domen faktora VIII; [B] je B domen faktora VIII, njegov fragment, ili je izbrisan; A3 je A3 domen faktora VIII; C1 je C1 domen faktora VIII; C2 je C2 domen faktora VIII; a1, a2 i a3 su kiseli razdelnički regioni; pri čemu A1 domen sadrži XTEN blagu petlju-1 (A1-1) regiona i XTEN blagu petlju-2 (A1-2) regiona; pri čemu A2 domen sadrži XTEN blagu petlju-1 (A2-1) regiona i XTEN blagu petlju-2 (A2-2) regiona; pri čemu A3 domen sadrži XTEN blagu petlju-1 (A3-1) regiona i XTEN blagu petlju-2 (A3-2) regiona; gde je XTEN sekvenca ubačena u barem jedan od regiona A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 ili A3-2; i gde rekombinantni protein faktora VIII pokazuje prokoagulantnu aktivnost. U jednom slučaju heterodimera, prvi polipeptid i drugi polipeptid formiraju jedan polipeptidni lanac koji sadrži formulu (A1) - a1 - (A2) - a2 - [B] - [a3] - (A3) - (C1) - (C2). U jednom slučaju iznad navedenog, "spojena" znači peptidna veza.

[0022] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje prvi rekombinantni faktor VIII polipeptid formule X:

(A1)-a1-(A2)-a2-[B] X

i drugi polipeptid koji sadrži Formulu XI:

a3-(A3)-(C1)-(C2) XI

1

gde prvi polipeptid i drugi polipeptid jesu spojeni ili postoje kao heterodimer; gde, A1 je A1 domen faktora VIII; A2 je A2 domen faktora VIII; [B] je B domen faktora VIII, njegov fragment, ili je izbrisan; A3 je A3 domen faktora VIII; C1 je C1 domen faktora VIII; C2 je C2 domen faktora VIII; a1, a2 i a3 su kiseli razdelnički regioni; gde je XTEN sekvenca ubačena u a3; i gde rekombinantni protein faktora VIII pokazuje prokoagulantnu aktivnost. U jednom slučaju heterodimera, prvi polipeptid i drugi polipeptid formiraju jedan polipeptidni lanac koji sadrži formulu (A1) - a1 - (A2) - a2 - [B] - [a3] - (A3) - (C1) - (C2). U jednom slučaju iznad navedenog, "spojena" znači peptidna veza.

[0023] U slučajevima prethodno pomenutih formula X i XI polipeptida, XTEN blage petlje sadrže unutar njihove izložene površine, fleksibilne strukture petlji, i unutar A1-1 je lociran između beta ravni 1 i beta ravni 2, A1-2 je lociran između beta ravni 11 i beta ravni 12, A2-1 je lociran između beta ravni 22 i beta ravni 23, A2-2 je lociran između beta ravni 32 i beta ravni 33, A3-1 je lociran između beta ravni 28 i beta ravni 39 i A3-2 je lociran između beta ravni 45 i beta ravni 46, prema sekundarnoj strukturi zrelog faktora VIII koji se čuva se kao Pristupni broj 2R7E DSSP baze podataka. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A1-1 odgovara regionu izvornog zrelog humanog faktora VIII od oko aminokiseline 15 do oko aminokiseline 45. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, A1-1 odgovara regionu izvornog zrelog humanog faktora VIII od oko aminokiseline 18 do oko aminokiseline 41. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A1-2 odgovara regionu izvornog zrelog humanog faktora VIII od oko aminokiseline 201 do oko aminokiseline 232. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, A1-2 odgovara regionu izvornog zrelog humanog faktora VIII od oko aminokiseline 218 do oko aminokiseline 229. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A2-1 odgovara regionu izvornog zrelog humanog faktora VIII od oko aminokiseline 395 do oko aminokiseline 421. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, A2-1 odgovara regionu izvornog zrelog humanog faktora VIII od oko aminokiseline 397 do oko aminokiseline 418. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A2-2 odgovara regionu izvornog zrelog humanog faktora VIII od oko aminokiseline 577 do oko aminokiseline 635. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, A2-2 odgovara regionu izvornog zrelog

1

humanog faktora VIII od oko aminokiseline 595 do oko aminokiseline 607. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A3-1 odgovara regionu izvornog zrelog humanog faktora VIII od oko aminokiseline 1705 do oko aminokiseline 1732. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, A3-1 odgovara regionu izvornog zrelog humanog faktora VIII od oko aminokiseline 1711 do oko aminokiseline 1725. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A3-2 odgovara regionu izvornog zrelog humanog faktora VIII od oko aminokiseline 1884 do oko aminokiseline 1917. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, A3-2 odgovara regionu izvornog zrelog humanog faktora VIII od oko aminokiseline 1899 do oko aminokiseline 1911. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, XTEN sekvenca se ubacuje u najmanje dva regiona A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 ili A3-2. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, XTEN sekvenca je odmah ubačena nizu aminokiselina koja odgovara aminokiselini u zrelom prirodnom humanom faktoru VIII, izabranom iz grupe koja se sastoji iz broja aminokiselinskih ostataka 32, 220, 224, 336, 339, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 i 1910. U ostalim slučajevima gore navedenih formula X i XI polipeptida, dodatna XTEN sekvenca se ubacuje u a3 kiseli razdelnički region. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, dodatna XTEN sekvenca se ubacuje u kiseli razdelnik a3 odmah iza aminokiseline koja odgovara aminokiselini 1656. U ostalim slučajevima iznad navedenih formula X i XI polipeptida, A1 domen sadrži XTEN blagu petlju-1 (A1-1) regiona i XTEN blagu petlju-2 (A1-2) regiona gde A2 domen sadrži XTEN blagu petlju-1 (A2-1) regiona i XTEN blagu petlju-2 (A2-2) regiona, i gde A3 domen sadrži XTEN blagu petlju-1 (A3-1) regiona i XTEN blagu petlju-2 (A3- 2) regiona i gde je dodatna XTEN sekvenca ubačena u bar jednu od oblasti A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 ili A3-2. U drugim slučajevima prethodnih formula X i XI polipeptida, dodatna XTEN sekvenca je odmah ubačena nizu aminokiselina koja odgovara aminokiselini u zrelom prirodnom humanom faktoru VIII, izabranom iz grupe koja se sastoji iz broja aminokiselinskih ostataka 32, 220, 224, 336, 339, 390, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 i 1910. U iznad navedenim primerima formula X i XI polipeptida, fuzioni protein pokazuje najmanje oko 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, ili 80%, ili 90% prokoagulantne aktivnosti odgovarajućeg faktora VIII nije povezan sa XTEN, pri čemu se aktivnost prokoagulanse određuje pomoću in vitro testa koagulacije.

[0024] U svim slučajevima, polipeptid može, na primer, pokazati in vitro prokoagulantnu

1

aktivnost koja prelazi 0.5 IU/ml, ili 1.0 ili 1.5 ili 2.0 IU/ml kada se izražava u podlozi za ćelijsku kulturu i testira pomoću in vitro testa koagulacije. Prokoagulantna aktivnost može se meriti hromogenim testom, testom zgrušavanja u jednoj fazi (npr., APTT) ili oboje.

[0025] U nekim slučajevima, gde rekombinantni fuzioni protein faktora VIII sadrži faktor VIII i najmanje prvi i drugi XTEN, najmanje prvi XTEN je odvojen od najmanje drugog XTEN sa najmanje 10 aminokiselina, najmanje 50 aminokiselina , najmanje 100 aminokiselina, najmanje 200 aminokiselina, najmanje 300 aminokiselina ili najmanje 400 aminokiselina.

[0026] U poželjnim slučajevima, rekombinantni fuzioni protein faktora VIII koji sadrži faktor VIII i najmanje prvi XTEN i, opciono, najmanje drugi, ili opciono najmanje treći, ili opciono najmanje četvrti XTEN, fuzioni protein pokazuje smanjeno vezivanje na antitelo anti-faktora VIII u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN. Redukovano vezivanje može se proceniti ili in vivo ili in vitro ispitivanjem. U jednom slučaju, in vitro test je ELISA test, pri čemu se vezivanje anti-FVIII antitela na fuzioni protein smanjuje za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35 % ili najmanje oko 40% ili više u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN. U drugom slučaju, in vitro ispitivanje je Bethesda test u kome je smanjeno vezivanje fuzionog proteina dokazano nižim Bethesda titrom od najmanje oko 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 30, 40 , 50, 60, 70, 80, 100, ili 200 Bethesda jedinica za fuzioni protein u poređenju sa faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN. U in vitro testovima, antitelo anti-faktora VIII je izabrano iz antitela iz Tabele 10, a poliklonska antitela iz hemofilije A pacijenta sa inhibitorima faktora VIII. U konkretnim slučajevima, rekombinantni fuzioni protein faktora VIII koji sadrži faktor VIII i najmanje prvi i drugi XTEN koji pokazuju redukovano vezanje na antitelo inhibitora faktora VIII, prvi XTEN je povezan sa pomenutim polipeptidom faktora VIII unutar C2 domena pomenutog faktora VIII polipeptid VIII, a drugi XTEN je povezan sa pomenutim polipeptidom faktora VIII unutar A1 ili A2 domena pomenutog polipeptida faktora VIII, pri čemu navedeni fuzioni protein pokazuje redukovano vezanje na antitelo inhibitora faktora VIII u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII, a nije povezan sa XTEN gde je antitelo inhibitora faktora VIII sposobno da se veže za epitop smešten u domenu A1, A2 ili C2, i dalje pri čemu fuzioni protein pokazuje prokoagulantnu aktivnost. U jednom primeru prethodnog fuzionog proteina, drugi XTEN je povezan sa pomenutim polipeptidom faktora VIII unutar A2 domene polipeptida faktora VIII, a antitelo inhibitora faktora VIII se vezuje za A2 domen polipeptida

1

faktora VIII. U drugom primeru prethodnog fuzionog proteina, drugi XTEN je povezan sa pomenutim polipeptidom faktora VIII unutar C2 domene polipeptida faktora VIII, a antitelo inhibitora faktora VIII se vezuje za C2 domen polipeptida faktora VIII. Vezanje antitela antifaktora VIII na fuzioni protein smanjuje se za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII, a nije povezano na XTEN kada se testira ELISA testom, pri čemu je antitelo anti-faktora VIII izabrano iz grupe koja se sastoji iz antitela iz Tabele 10 i poliklonskog antitela iz hemofilije A ispitanika sa inhibitorima faktora VIII. Prethodni fuzioni proteini mogu dalje sadržati najmanje tri XTEN, pri čemu je najmanje treći XTEN povezan sa faktorom VIII na mestu koje je izabrano iznutra ili zamenjuje B domen, na C-terminusu i na ili unutar 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselina mesta umetanja izabranog iz Tabele 7 ili Tabele 9. U slučajevima sa smanjenim vezanjem za antitela antifaktora VIII, fuzioni protein ima veću aktivnost prokoagulanse u prisustvu antitela anti-FVIII od najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 80%, 100%, 200%, 300%, 400% ili 500% ili više u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN kada je testiran in vitro testom koagulacije (npr., hromogenim ili jednostepenim testom zgrušavanja).

[0027] U svakom slučaju, XTEN fuzionog proteina može, na primer, da se karakteriše po tome što XTEN sadrži najmanje 36, ili najmanje 42, ili najmanje 72, ili najmanje 96, ili najmanje 144, ili najmanje 288 ili najmanje 400, ili najmanje 500, ili najmanje 576, ili najmanje 600, ili najmanje 700, ili najmanje 800, ili najmanje 864, ili najmanje 900, ili najmanje 1000, ili najmanje 2000, do oko 3000 aminokiselinskih ostataka ili čak više ostataka; suma ostataka glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P) čini najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% ukupnih aminokiselinskih ostataka XTEN; XTEN se u osnovi ne ponavlja, tako da (i) XTEN ne sadrži tri povezane aminokiseline koje su identične osim ako su aminokiseline serin; (ii) najmanje oko 80% XTEN sekvence sastoji se iz motiva koji se ne preklapaju sa sekvencom, a svaki od motiva sekvence sadrži oko 9 do oko 14, ili oko 12 aminokiselinskih ostataka koji se sastoje od četiri do šest aminokiselina odabranih od glicina (G ), alanin (A), serin (S), treonin (T), glutamat (E) i prolin (P), pri čemu se bilo koja dva vezana ostatka aminokiselina ne javljaju više od dva puta u svakom od motiva sekvence koji se ne preklapaju; ili (iii) XTEN sekvenca ima naknadnu ocenu manju od 10; XTEN ima veće od 90% ili veće od 95%, ili veće od 99% nasumičnih formiranja zavojnica kako je određeno GOR algoritmom; XTEN ima manje od 2% alfa helikoptera i 2% beta lista kako je određeno Chou-Fasman algoritmom; XTEN

1

nedostaje predviđeni epitop T-ćelija kada se analizira algoritam TEPITOPE, pri čemu vrednost praga TEPITOPE za pomenuto predviđanje navedenim algoritmom ima prag od -9, a pri čemu navedeni fuzioni protein pokazuje terminusni polu-raspad koji je duži od najmanje oko 12 h, ili najmanje oko 24 h, ili najmanje oko 48 h, ili najmanje oko 72 h, ili najmanje oko 96 h, ili najmanje oko 120 h, ili najmanje oko 144 h, ili najmanje oko 21 dan ili više. U jednom slučaju, rekombinantni fuzioni protein faktora VIII sadrži najmanje drugi, ili najmanje treći, ili najmanje četvrti XTEN, koji može biti identičan ili različit od drugog XTEN. Prema drugačijem pristupu, najmanje jedan, najmanje drugi, ili najmanje treći, ili najmanje četvrti XTEN fuzioni protein CFXTEN ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93 %, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, do oko 100% identiteta sekvence u poređenju sa jednim ili više XTEN uporedivih dužina odabranih iz Tabele 4, Tabele 13, Tabele 14, Tabele 15, Tabele 16 i Tabele 17, kada je optimalno poravnata. U još jednom drugačijem pristupu, najmanje jedan, najmanje drugi ili najmanje treći, ili barem četvrti XTEN fuzioni protein CFXTEN ima najmanje 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, do oko 100% identičnosti sekvence u poređenju sa sekvencom odabranom iz AE42_1, AE42_2, AE42_3, AG42_1, AG42_2, AG42_3, AG42_4, AE144_1A, AE144_2A, AE144_2B, AE144_3A, AE144_3B, AE144_4A, AE144_4B, AE144_5A, AE144_6B, AG144_1, AG144_2, AG144 A, AG144_B, AG144_C, AG144_F, AG144_3, AG144_4, AE288_1, AE288_2, AG288_1 i AG288_2.

[0028] U jednom slučaju, komponenta faktora VIII CFXTEN rekombinantnog proteina fuzije faktora VIII sadrži jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina odabrane od ostataka R1648, Y1680 i R1689, numerisanih u odnosu na zreli humani faktor VIII, pri čemu su supstitucije izabrane od alanina, glicin i fenilalanin. Neograničavajući primeri pomenutih supstitucija uključuju R1648A, Y1680F i R1689A.

[0029] U drugom slučaju, CFXTEN fuzioni protein pokazuje prividni faktor molekulske težine od najmanje oko 1.3, ili najmanje oko dva, ili najmanje oko tri, ili najmanje oko četiri, ili najmanje oko pet, ili najmanje oko šest, ili najmanje oko sedam, ili najmanje oko osam, ili najmanje oko devet, ili najmanje oko 10, mereno hromatografijom za isključenje veličine ili sličnim postupkom.

2

[0030] U nekim slučajevima CFXTEN fuzionih proteina, jedan ili više XTEN je u FVIII preko jedne ili dve sekvence deljenja, a svaki se može podeliti proteinom sisara odabranom iz grupe koja se sastoji od faktora XIa, faktora XIIa, kalikreina, faktora VIIa, faktor IXa, faktor Xa, faktor IIa (trombin), Elastasc-2, MMP-12, MMP13, MMP-17 i MMP-20, pri čemu deljenja sekvencom deljenja proteina kod sisara oslobađa sekvencu faktora VIII iz XTEN sekvence, i gde oslobođena sekvenca faktora VIII pokazuje povećanje prokoagulantne aktivnosti u poređenju sa ne podeljenim fuzionim proteinom. U jednom slučaju, sekvence deljenja, dele se faktorom XIa.

[0031] Prema drugačijem pristupu, CFXTEN fuzioni proteini sadrže najmanje tri XTEN koja se nalaze na različitim lokacijama polipeptida faktora VIII, pri čemu su navedene različite lokacije odabrane iz: mesto umetanja na ili unutar 1 do 6 aminokiselina sa mesta izabranog iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9; mesto kod ili unutar 1 do 6 aminokiselina aminokiselinskog ostatka 32, 220, 224, 336, 339, 390, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 i 1910 zrelog faktora VIII; lokaciju između bilo koje dve susedne domene u nizu faktora VIII, pri čemu su pomenute dve susedne domene izabrane iz grupe koja se sastoji od A1 i A2, A2 i B, B i A3, A3 i C1, i C1 i C2; mesto unutar brisanja unutrašnjeg B domena, počevši od prvog položaja kod aminokiselinskog ostatka broja 741 do oko 750 i završava na drugom položaju kod aminokiselinskog ostatka broja 1635 do oko 1648, u odnosu na sekvencu humanog faktora VIII u celoj dužini, kao što je postavljeno dalje na Sl.3 i C-terminusa sekvence faktora VIII, pri čemu je kumulativna dužina više XTEN najmanje oko 100 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka i gde fuzioni protein zadržava najmanje oko 30%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70%, ili oko 80%, ili oko 90% prokoagulantne aktivnosti u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII, koji nije povezan sa XTEN, pri čemu se prokoagulantna aktivnost određuje pomoću in vitro testa koagulacije. U jednom primeru koji je iznad naveden, fuzioni protein pokazuje produženi terminusni polu-raspad kada se daje ispitaniku u poređenju sa odgovarajućim polipeptidom faktora VIII koji nedostaje pomenuti XTEN, pri čemu navedeni fuzioni protein pokazuje terminusni polu-raspad najmanje oko 3 sata, ili 4 sata, ili 6 sati, ili 12 sati, ili 13 sati, ili 14 sati, ili 16 sati, ili 24 sata, ili 48 sati, ili 72 sata, ili 96 sati, ili 120 sati, ili 144 sata, ili 7 dana, ili 14 dana, ili 21 dan kada se daje ispitaniku. U jednom slučaju, ispitanik je izabran iz grupe koja se sastoji od čoveka i faktora VIII/von Willebrandovog faktora, dvostrukog nokaut miša. U jednom slučaju koji je iznad naveden, fuzioni protein ne sadrži sekvencu odabranu iz GTPGSGTASSSP (SEQ ID NO:31), GSSTPSGATGSP (SEQ ID NO:32), GSSPSASTGTGP (SEQ ID NO:33), GASPGTSSTGSP (SEQ ID NO:34), i GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GSEPATSG SETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTST EPSEGSAP (SEQ ID NO:59). U drugom primeru koji je iznad naveden, fuzioni protein ne sadrži XTEN sekvencu koju čine

[0032] U daljem slučaju, obelodanjivanje se odnosi na CFXTEN fuzione proteine sa poboljšanim farmakokinetičkim svojstvima, uključujući poboljšane parametre u poređenju sa FVIII koji nisu povezani sa XTEN, pri čemu poboljšana svojstva uključuju, ali nisu ograničena na duži terminusni polu-raspad, veću površinu ispod krive, povećavaju se vreme u kome koncentracija krvi ostaje unutar terapijskog prozora, povećano vreme između uzastopnih doza dovodi do koncentracije krvi u terapijskom prozoru i smanjene doze IU tokom vremena koje se mogu davati u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN, a ipak rezultiraju u koncentracijama krvi iznad granične koncentracije potrebne za efekat prokoagulanse. U nekim slučajevima, fuzioni proteini CFXTEN pokazuju produženi terminusni polu-raspad kada se daju ispitaniku u poređenju sa odgovarajućim polipeptidom faktora VIII kojem nedostaje pomenuti XTEN. Ispitanik može biti čovek ili miš, kao što je faktor VIII/von Willebrandov faktor sa dvostrukim nokaut mišem. U jednom primeru koji je iznad naveden, CFXTEN pokazuje terminusni polu-raspad koji je najmanje skoro dvostruko, ili skoro trostruko, ili skoro četvorostruko, ili skoro petostruko, ili skoro desetostruko, ili skoro dvadesetostruko duži kada se daje ispitaniku u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN. U jednom slučaju, fuzioni protein CFXTEN pokazuje terminusni polu-raspad najmanje oko 3 sata, ili 4 sata, ili 6 sati, ili 12 sati, ili 13 sati, ili 14 sati, ili 16 sati, ili 24 sata, ili 48 sati, ili 72 sata, ili 96 sati, ili 120 sati, ili 144 sata, ili 7 dana, ili 14 dana, ili 21 dan kada se daje ispitaniku. U drugim slučajevima, pojačano farmakokinetičko svojstvo fuzionih proteina instanci je svojstvo održavanja koncentracije prokoagulantnog fuzionog proteina u krvi u cirkulaciji u krvi kojem je potreban, iznad granične koncentracije od 0.01 IU/ml ili 0.05 IU/ml ili 0.1 IU/ml ili 0.2 IU/ml ili 0.3 IU/ml ili 0.4 IU/ml ili 0.5 IU/ml u periodu koji je najmanje oko dvostruko, ili najmanje skoro trostruko, ili najmanje skoro četvorostruko, ili barem skoro petostruko, ili najmanje skoro šest puta, ili najmanje skoro osmostruko, ili najmanje desetostruko, ili najmanje skoro dvadesetostruko, ili najmanje oko četrdesetostruko ili barem oko šezdesetostruko duži u odnosu na odgovarajući FVIII koji nije povezan sa XTEN i koji se daje ispitaniku u uporedivoj dozi. Povećanje polu-raspada i vremena provedenog iznad granične koncentracije omogućava manje učestalo doziranje i smanjene količine fuzionog proteina (u ekvivalentu molova) koji se daju ispitaniku, u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN. U jednom slučaju, davanje predmetnog fuzionog proteina ispitaniku koristeći terapijski efikasan režim doziranja, rezultira dobitkom u vremenu najmanje dva puta, ili najmanje tri puta, ili najmanje četiri puta, ili najmanje pet puta, ili najmanje šest puta, ili najmanje osam puta, ili najmanje 10 puta, ili najmanje oko 20 puta, ili najmanje oko 40 puta, ili najmanje oko 60 puta ili više između najmanje dva uzastopna Cmax maksimuma i/ili Cmin korita za nivo fuzionog proteina u krvi u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN i koji se primenjuje pomoću uporedivog režima doziranja kod ispitanika.

[0033] U poželjnim slučajevima, fuzioni proteini CFXTEN zadržavaju najmanje oko 30%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70%, ili oko 80%, ili oko 90% aktivnosti prokoagulanse u poređenju sa odgovarajući faktor VIII koji nije povezan sa XTEN, pri čemu je prokoagulantna aktivnost određena in vitro testom koagulacije, kao što je, ali nije ograničeno, hromogeno ispitivanje ili jedno- ili dvostepeni test zgrušavanja.

[0034] Prema drugačijem pristupu, obelodanjivanje obezbeđuje rekombinantne fuzione proteine faktora VIII koji sadrže polipeptid faktora VIII i najmanje jedan prošireni rekombinantni polipeptid (XTEN), pri čemu navedeni polipeptid faktora VIII sadrži A1 domen, A2 domen, A3 domen, C1 domen, C2 domen i opciono ceo ili deo B domena, i gde je navedeni najmanje jedan XTEN povezan sa pomenutim polipeptidom faktora VIII na mestu

2

umetanja, izabran iz broja ostataka 18-32, ili 40, ili 211-224, ili 336-403, ili 599, ili 745-1640, ili 1656-1728, ili 1796-1804, ili 1900-1912, ili 2171-2332; i gde fuzioni protein zadržava najmanje oko 30%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70%, ili oko 80%, ili oko 90% aktivnosti prokoagulanse u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII nije povezan sa XTEN. U jednom primeru prethodnog, fuzioni protein sadrži najmanje drugi XTEN, ili najmanje treću, ili najmanje četvrtu XTEN, pri čemu je XTEN povezan sa faktorom VIII na mestu na ili unutar 1 do 6 aminokiselina od mesto izabrano iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9. U drugom slučaju, obelodanjivanje obezbeđuje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII koji dalje sadrži najmanje drugi XTEN, ili najmanje treći, ili bar četvrti XTEN povezan sa pomenutim FVIII polipeptidom na mestu umetanja koje je izabrano iz Tabele 5, Tabela 6, Tabela 7, Tabela 8, Tabela 9, na ili unutar 6 aminokiselina na N- ili C-terminusnoj strani mesta umetanja na jednoj ili više mesta umetanja sa slike 8 i unutar jednog ili više umetaka u rasponu od Slike 9, pri čemu je najmanje dva XTEN su razdvojene sekvencom aminokiselina od najmanje 100 do oko 400 aminokiselina.

[0035] Obelodanjivanje pruža CFXTEN pri čemu XTEN ima odnose XTEN radijusa od najmanje 2.3 ili najmanje 2.5, a razdvajaju se aminokiselinskim nizom od najmanje oko 20 aminokiselinskih ostataka ili najmanje oko 50, ili najmanje oko 100, ili najmanje oko 200, ili najmanje oko 300, ili najmanje oko 400 aminokiselinskih ostataka. U drugim slučajevima, CFXTEN sadrži najmanje četiri XTEN pri čemu XTEN ima odnose XTEN radijusa od najmanje 2.3, ili najmanje 2.5, ili najmanje 2.8, i pri čemu su najmanje tri od četiri XTEN povezana sa fuzionim proteinom. razdvojeni su sekvencom aminokiselina od najmanje oko 20 aminokiselinskih ostataka ili najmanje oko 50, ili najmanje oko 100, ili najmanje oko 200, ili najmanje oko 300, ili najmanje oko 400 aminokiselinskih ostataka, i četvrti XTEN je povezan unutar B domena (ili njegovog fragmenta) ili unutar C domena (ili njegovog terminusa).

[0036] U nekim slučajevima, predmetni sastavi su konfigurisane tako da imaju smanjeni afinitet vezivanja za receptor za uklanjanje kod ispitanika u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN. U jednom slučaju, fuzioni protein CFXTEN pokazuje afinitet vezivanja za klirens receptor FVIII u opsegu od oko 0.01%-30%, ili oko 0.1% do oko 20%, ili oko 1% do oko 15%, ili oko 2 % do oko 10% afiniteta vezivanja odgovarajućeg FVIII koji nije povezan sa XTEN. U drugom slučaju, fuzioni protein sa smanjenim afinitetom za receptor klirensa ima smanjeni aktivni klirens i odgovarajuće povećanje polu-raspada od najmanje oko dva puta, ili trostruko, ili najmanje četvorostruko, ili bar oko 5 puta ili najmanje oko 6 puta, ili najmanje oko 7 puta, ili najmanje oko 8 puta, ili najmanje oko 9 puta, ili najmanje oko 10 puta, ili najmanje oko 12 puta pregib, ili najmanje oko 15 puta, ili najmanje oko 17 puta, ili barem oko 20 puta duže u poređenju sa odgovarajućim FVIII, koji nije povezan sa XTEN.

[0037] Na primer, obelodanjivanje obezbeđuje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII koji sadrži FVIII i jedan ili više XTEN gde fuzioni protein pokazuje povećanu rastvorljivost najmanje trostruko, ili bar oko četvorostruko, ili bar oko petostruko, ili najmanje oko šest puta, ili najmanje oko sedam puta, ili najmanje oko osmostruko, ili najmanje oko devet puta, ili najmanje desetostruko, ili najmanje oko 15 puta, ili na najmanje 20 puta ili najmanje 40 puta ili najmanje 60 puta u fiziološkim uslovima u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN.

[0038] U sledećem primeru, obelodanjivanje pruža farmaceutski sastav koji sadrži fuzioni protein bilo kog od ovde opisanih slučajeva i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0039] U drugom slučaju, obelodanjivanje obezbeđuje postupak lečenja koagulopatije kod ispitanika, koji obuhvata davanje ispitaniku pomenutog sastava koji sadrži efikasnu količinu farmaceutskog sastava. U jednom primeru postupka, posle pomenutog davanja, koncentracija prokoagulantnog faktora VIII u krvi se održava na oko 0.05, ili 1, ili 1.5 IU/ml ili više, tokom najmanje 48 sati posle pomenute primene. U drugom slučaju, obelodanjivanje obezbeđuje postupak zgrušavanja krvi kod ispitanika, koji sadrži kontakt efikasne količine farmaceutske sastave sa zgrušavanjem krvi.

[0040] U drugom slučaju, Obelodanjivanje obezbeđuje postupak lečenja koagulopatije kod ispitanika sa cirkulišućim inhibitorima faktora VIII, koji obuhvata primenu navedenom ispitaniku sastav koji sadrži terapeutski efikasnu količinu farmaceutskih sastava CFXTEN, pri čemu sastav pokazuje veću aktivnost prokoagulanse u navedeni ispitanik je uporedio sa sastavom koja sadrži odgovarajući faktor VIII koji nije povezan sa XTEN i koji se primenjuje koristeći uporedivu količinu. U jednom slučaju metode, koagulopatija je hemofilija A. U drugom slučaju, koagulopatija je rezultat traume ili operacije ili infekcije.

[0041] Obelodanjivanje pruža postupak lečenja epizode krvarenja kod ispitanika, koji

2

obuhvata davanje pomenutom ispitaniku sastava koji sadrži efikasnu količinu zgrušavanja farmaceutskog sastava CFXTEN, pri čemu efektivna količina zgrušavanja proteinskog proteina zaustavlja epizodu krvarenja tokom perioda koji je najmanje trostruko, ili najmanje četvorostruko, ili barem petostruko duže u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII, koji nije povezan sa XTEN i koji se primenjuje koristeći uporedivu količinu sa navedenim ispitanikom. Neograničavajući primeri odgovarajućeg faktora VIII koji nije povezan sa XTEN uključuju izvorni FVIII, sekvence Tabele 1, BDD-FVIII i pCB0114 FVIII.

[0042] U drugom slučaju, obelodanjivanje omogućava CFXTEN rekombinantni fuzioni protein faktora VIII za upotrebu u farmaceutskom režimu za lečenje pacijenta sa hemofilijom, pri čemu navedeni režim sadrži farmaceutski sastav koji sadrži CFXTEN fuzioni protein. U jednom primeru farmaceutskog režima, režim dalje obuhvata korak određivanja količine farmaceutskog sastava koji sadrži CFXTEN potrebnu za postizanje hemostaze kod pacijenta sa hemofilijom A. U drugom slučaju, farmaceutski režim lečenja hemofilije A kod ispitanika obuhvata davanje farmaceutskog sastava u dve ili više uzastopnih doza u efikasnoj količini, pri čemu primena daje najmanje 10%, ili 20%, ili 30% ili 40%, ili 50%, ili 60%, ili 70%, ili 80%, ili 90% veće poboljšanje bar jednog, dva ili tri parametra povezana sa bolešću hemofilije A u poređenju sa faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN i primenjuje se uporedivom dozom. Neograničavajući primeri poboljšanih parametara uključuju koncentraciju prokoagulansa u krvi FVIII u krvi, skraćeno vreme aktiviranja parcijalnog protrombina (aPTT), skraćeno vreme ispitivanja u jednoj fazi ili dvostepenom zgrušavanju, odložen početak epizode krvarenja, skraćeno vreme hromogenog ispitivanja, skraćeno vreme ispitivanja krvarenja, rezolucija događaja krvarenja ili smanjeni Bethesda titar na izvorni FVIII.

[0043] U drugom slučaju, obelodanjivanje obezbeđuje izolovane sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju fuzione proteine bilo kog od primera CFXTEN fuzionog proteina. U jednom slučaju, izolovana nukleinska kiselina je komplement sekvence koja kodira CFXTEN fuzioni protein primeraka. U jednom slučaju, izolovana nukleinska kiselina dalje sadrži sekvencu koja kodira signalni peptid, pri čemu je navedena sekvenca ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAG

T (SEQ ID NO:1613), ili njegov komplement. U drugom slučaju, obelodanjivanje obezbeđuje vektor ekspresije koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira fuzioni protein ili njegov komplement. U drugom slučaju, obelodanjivanje obezbeđuje izolovanu ćeliju domaćina koja

2

sadrži gornji ekspresioni vektor. U drugom slučaju, obelodanjivanje obezbeđuje postupak proizvodnje fuzionog proteina bilo kog slučaja, koji obuhvata obezbeđivanje ćelije domaćina koja sadrži ekspresijski vektor; kultivisanje ćelije domaćina radi postizanja proizvodnje fuzionog proteina; i oporavljajući fuzioni protein.

[0044] U jednom slučaju, obelodanjivanje daje izolovan fuzioni protein koji sadrži polipeptid koji ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, do oko 100% identičnosti sekvence u poređenju sa sekvencom slične dužine, odabranom iz Tabele 21, kada je optimalno poravnata.

[0045] U drugom slučaju, obelodanjivanje obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži polinukleotidnu sekvencu odabranu između (a) sekvence koja ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93% ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, do oko 100% identiteta sekvence u poređenju sa sekvencom uporedive dužine, odabranom iz Tabele 21, kada optimalno poravnan ili (b) komplement polinukleotida iz (a). U drugom slučaju, izolovana nukleinska kiselina sadrži sekvencu ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAG

T (SEQ ID NO:1613) vezan za 5' kraj nukleinske kiseline iz (a) ili komplementarne sekvence vezane za 3' kraj (b).

[0046] Specifično se predviđa da rekombinantni fuzioni proteini faktora VIII mogu da pokazuju jednu ili više ili bilo koju kombinaciju ovde obelodanjenih svojstava.

[0047] Na osnovu obelodanjivanja koje je ovde sadržano, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII koji sadrži polipeptid faktora VIII i najmanje jedan prošireni rekombinantni polipeptid (XTEN), pri čemu polipeptid faktora VIII sadrži domen A3, domen A2, i A1 domen, C2 domen, C1 domen i B domen ili deo B domena, pri čemu je najmanje jedan XTEN je ubačen u polipeptid faktora VIII na mestu koje odgovara aminokiselini 745 iz sekvence navedene u SEQ ID NO:1592, pri čemu rekombinantni FVIII fuzioni protein zadržava najmanje 10% prokoagulantne aktivnosti odgovarajućeg polipeptida faktora VIII koji nedostaje pomenuti XTEN, i gde rekombinantni FVIII fuzioni protein pokazuje produženi terminusni polu-raspad kada se daje ispitaniku u poređenju sa

2

odgovarajućim polipeptidom faktora VIII koji nedostaje XTEN.

[0048] U srodnom aspektu, predmetni pronalazak pruža kompleks koji sadrži rekombinantni fuzioni protein faktora VIII predmetnog pronalaska i von Willebrandov faktor.

[0049] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovanu sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira rekombinantni fuzioni protein faktora VIII predmetnog pronalaska.

[0050] U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji sadrži niz nukleinskih kiselina iz predmetnog pronalaska.

[0051] U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža postupak pravljenja rekombinantnog fuzionog proteina faktora VIII predmetnog pronalaska, pri čemu se postupak kultiviše ćelijom domaćina pronalaska u podlozi pod uslovima pogodnim za pravljenje fuzionog proteina i obnavljanje fuzionog proteina.

[0052] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak pruža farmaceutski sastav koji sadrži (i) rekombinantni fuzioni protein faktora VIII predmetnog pronalaska ili sekvencu nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska i (ii) farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0053] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII predmetnog pronalaska ili farmaceutski sastav predmetnog pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti krvarenja ili stanja kod ispitanika kome je potrebna, gde je bolest ili stanje krvarenja je epizoda krvarenja ili hemofilija A.

[0054] Predmetni pronalazak i njegova otelotvorenja su izloženi u priloženim patentnim zahtevima.

KRATAK OPIS SLIKA

[0055] Karakteristike i prednosti pronalaska mogu se dalje objasniti pozivanjem na sledeći detaljan opis i prateće crteže koji daju ilustrativna otelotvorenja.

Sl. 1 prikazuje šematski prikaz FVIII arhitekture i prostornog rasporeda domena tokom obrade i zgrušavanja, a predviđen je da predstavlja i varijante izbrisanog izvornog FVIII i B domena. A1 domen se kreće od ostatka 1 do 372 (numerisanje u odnosu na zreli oblik FVIII sekvence NCBI proteina RefSeq NP_000123 i obuhvata

2

a1 ostatke), A2 domen kreće se od ostatka 373 do 740, B domen se kreće od ostatka 741 do 1648, A3 domen se kreće od ostatka 1649 do 2019 (obuhvatajući a3 kiseli region), domen C1 se kreće od 2020 do 2172, a domen C2 se kreće od ostatka 2173 do 2332. BDD varijante uključuju brisanje između raspona 741 do 1648, ostavljajući neke ili nikakve ostatke ostataka, pri čemu je neograničavajući BDD ostatak sekvence SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO:1614). Sl.1A prikazuje arhitekturu domena jednog lanca FVIII pre obrade. Strelice označavaju mesta sa ostacima R372, R740, R1648 i R1689 koja se dele tokom obrade i konverzije FVIII u FVIIIa. Sl.1B prikazuje molekul FVIII koji je deljenjem na ostatku R1648 prerađen u heterodimer, sa a3 kiselim regionom domena A3 naznačenom na N-terminusu A3. Sl.1C prikazuje molekul FVIII koji je razgrađen u ostatke R372, R740 i R1689 prešao u heterotrimer FVIIIa.

Sl. 2 je šema kaskade koagulacije, koja pokazuje unutrašnje i spoljašnje krake koji vode do zajedničkog puta.

Sl. 3 prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrelog humanog faktora VIII (SEQ ID NO:1592).

Sl. 4 prikazuje sekvencu faktora VIII sa brisanjem dela B domena (SEQ ID NO:1593).

Sl. 5 ilustruje nekoliko primera CFXTEN konfiguracija FVIII povezanih sa XTEN (poslednja je prikazana kao podebljane, talasaste linije). U svim slučajevima, FVIII može biti izvorni ili BDD oblik FVIII, ili oblik jednog lanca u kome je uklonjen ceo B domen, uključujući i matična mesta deljenja. Sl.5A prikazuje, s leva na desno, tri varijacije jednolančanog lanca faktora VIII sa XTEN povezanim sa N-terminusom, C-terminusom i dva XTEN povezana sa N- i C-terminusom. Sl.5B prikazuje šest varijacija zrelog heterodimera FVIII s leva na desno, XTEN povezanim s N-terminusom A1 domena; XTEN povezan sa C-terminusom C2 domena; XTEN povezan na N-terminusom A1 domena i C-terminusom C2 domena; XTEN povezan na N-terminusom A1 domena i sa N-terminusom A3 domena; XTEN povezan sa C-terminusom C2 domena i sa N-terminusom A3 domena preko preostalih aminokiselina B domena; i XTEN povezan sa N-terminusom A1 domene, C-terminusom A2 domena preko zaostalih aminokiselina B domena i sa C-terminusom C2 domena. Sl.5C prikazuje, s leva na desno, tri varijacije jednolančanog faktora VIII: XTEN povezan sa N-terminusom A1 domena, XTEN povezan unutar površinske petlje A1 domena i XTEN povezan unutar površinske petlje domena A3;

2

XTEN povezan unutar površinske petlje domena A2, XTEN povezan unutar površinske petlje C2 domena i XTEN povezan sa C-terminusom C2 domena; XTEN povezan sa N-terminusom A1 domena i unutar površinske petlje C1 domena i sa C-terminusom C domena. Sl.5D prikazuje šest varijacija zrelog heterodimera FVIII sa, s leva na desno, XTEN povezan sa N-terminusom A1 domena, XTEN povezan unutar površinske petlje A1 domena i XTEN povezan unutar površinske petlje domena A3; XTEN povezan unutar površinske petlje domena A2, XTEN povezan unutar površinske petlje C1 domena i XTEN povezan sa C-terminusom C2 domena; XTEN povezan sa N-terminusom A1 domena, XTEN povezan unutar površinske petlje A1 domena, XTEN povezan unutar površinske petlje domena A3 i XTEN povezan sa C-terminusom domena C2; XTEN povezan sa N-terminusom A1 domena, XTEN povezan sa N-terminusom A3 domena preko zaostalih aminokiselina B domena i XTEN povezan unutar površinske petlje domena C2; XTEN povezan unutar površinske petlje domena A2, XTEN povezan sa N-terminusom A3 domena preko zaostalih aminokiselina B domena, XTEN povezan unutar površinske petlje C1 domena i XTEN povezan sa C-terminusom C2 domena; i XTEN povezan unutar B domena ili između zaostalih B domena BDD varijante (a pronalazak takođe razmatra varijaciju u kojoj XTEN zamenjuje celokupnost B domena, uključujući sva matična mesta deljenja, povezujući A2 i A3 domena, što rezultira jednolančanim oblikom faktora VIII). Na ovoj slici su takođe predstavljene sve varijacije u kojima se jedna ili više XTEN sekvenci ubacuju unutar B domena i rezultirajuća fuzija se deli na jednom ili više mesta (npr., na mestu R1648) tokom intracelularne obrade.

Sl. 6 je grafički prikaz CFXTEN konstrukcije sa XTEN umetnutom u B domen i povezan sa C-terminusom C2 domena koji ilustruje nestrukturiranu karakteristiku XTEN, što vodi ka stvaranju nasumičnih zavojnica koje mogu pokriti delove faktora VIII u blizini XTEN. Na donjem panelu, crtež prikazuje da kada je XTEN nasumična zavojnica, on može usvojiti konformaciju koja rezultira sterilnom ometanjem koja blokira vezivanje antitela inhibitora faktora VIII koja bi inače imala afinitet za epitope bliže XTEN mestu umetanja.

Sl. 7 je grafički prikaz različitih analiza vršenih na izbrisanoj sekvenciji B-domena FVIII radi identifikacije mesta umetanja za XTEN unutar FVIII sekvence. Svaki od linija A-H nalazi se na proizvoljnoj skali vrednosti Y osi kroz FVIII BDD sekvencu tako da niske vrednosti predstavljaju područja sa visokom predviđenom tolerancijom na XTEN umetanje, sa brojevima ostataka na X osi. Red A prikazuje granice domena; svi diskontinuiteti u ovoj liniji predstavljaju granice koje će verovatno prihvatiti XTEN. Linija B prikazuje granice eksona; tj. svaki korak u liniji predstavlja novi egzon. Linija C pokazuje područja koja nisu vidljiva u strukturi rendgenskih zraka zbog nedostatka reda u kristalu. Linije označene sa D predstavljaju višestruka predviđanja redosleda koja su izračunata pomoću odgovarajućih programa FoldIndex koji se nalaze na web sajtu bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex (poslednji pristup 23. februara, 2011) (videti Jaime Prilusky, Clifford E. Felder, Tzviya Zeev-Ben-Mordehai, Edwin Rydberg, Orna Man, Jacques S. Beckmann, Israel Silman, i Joel L. Sussman, 2005, Bioinformatics na osnovu Kyte & Doolitlle algoritma, kao i RONN koji se nalazi na web sajtu strubi.ox.ac.uk/RONN (poslednji pristup 23. februara, 2011) (videti Yang,Z.R., Thomson, R., McMeil, P. and Esnouf, R.M. (2005) RONN: tehnika neuronske mrežne funkcije koja se primenjuje za otkrivanje urođeno neuređenih regiona u proteinima Bioinformatika 21: 3369-3376. Linije E i F su izračunate na osnovu višestrukog poravnavanja sekvenci FVIII gena od 11 sisara dostupnih u GenBank. Linija E predstavlja očuvanje pojedinačnih ostataka. Linija F predstavlja očuvanje 3 segmenta aminokiseline FVIII. Linije G i H predstavljaju praznine i umetke uočene u poravnavanju višestrukih sekvenci 11 FVIII gena sisara. Linija J navodi tačke unosa XTEN prema broju aminokiselina koje su dobijene kombinovanjem višestrukih merenja iznad.

Sl. 8 prikazuje mesta u izbrisanoj sekvenciji B-domena FVIII (SEQ ID NO:1594) identifikovana kao aktivne tačke umetanja za XTEN koristeći informacije prikazane na Sl.8 i kako je potvrđeno u analizama iz Primera 34.

Sl. 9 prikazuje opseg mesta u izbrisanoj sekvenciji B-domena FVIII (SEQ ID NO:1595) identifikovani za ubacivanje XTEN korišćenjem podataka prikazanih na Sl.

8 i ili Primer 34 plus raspon aminokiselina oko svake tačke umetanja koje se smatraju pogodnim za ubacivanje XTEN.

Sl. 10 je šematski sklop CFXTEN biblioteke koja je stvorena identifikovanjem tačaka umetanja kao što je opisano na Sl.7 nakon čega sledi ubacivanje pojedinačnih XTEN (crnih traka) na različitim tačkama umetanja korišćenjem tehnika molekularne biologije. Konstrukti se ispoljavaju i oporavljaju, zatim procenjuju na FVIII aktivnost i farmakokinetička svojstva kako bi se identifikovali one CFXTEN konfiguracije koje rezultiraju pojačanim svojstvima.

Sl. 11 je šematski sklop biblioteke komponenti CFXTEN u kojoj su segmenti FVIII BDD domena, pojedinačno ili povezani različitom dužinom XTEN (crne trake),

1

kombinatorno montirani u biblioteke gena koji kodiraju CFXTEN, a koji potom mogu se ocenjuju na FVIII aktivnost i farmakokinetička svojstva da se identifikuju one CFXTEN konfiguracije koje rezultiraju pojačanim svojstvima.

Sl. 12 ilustruje nekoliko primera konfiguracija CFXTEN sa XTEN (prikazan kao debele, talasaste linije), sa određenim XTEN koji se može otpustiti umetanjem sekvenci deljenja (označenih crnim trouglovima) koje se dele prokoagulantnim proteazama. Sl.12A ilustruje scFVIII sa dva XTEN koja se može otpustiti. Sl.12B prikazuje istu konfiguraciju kao na Sl.12A, ali sa dodatnim XTEN nepopustljivim XTEN koji povezuje A3 i C1 domene. Sl.12C ilustruje zreli heterodimer FVIII sa dva XTEN koja se mogu otpustiti. Sl.12D ilustruje istu konfiguraciju kao 10C, ali sa dodatnim XTEN nepopustljivim XTEN koji povezuje A3 i C1 domene.

Sl. 13 je šematski dijagram toka reprezentativnih koraka u montaži, proizvodnji i proceni XTEN.

Sl. 14 je šematski dijagram toka reprezentativnih koraka u sklapanju CFXTEN polinukleotidne konstrukcije koja kodira fuzioni protein. Pojedinačni oligonukleotidi 501 su sagorevani u motivima sekvenci 502, kao što je motiv 12 aminokiselina ("12-mer"), koji su vezani za dodatne motive sekvenci iz biblioteke da bi se stvorio bazen koji takođe obuhvata željenu dužinu XTEN 504, vezan na manju koncentraciju oligo koji sadrži BbsI i KpnI restrikciona mesta 503. Dobijeni bazen proizvoda za vezivanje je prečišćen gelom i reza se trakom željene dužine XTEN, što rezultira izolovanim XTEN genom sa stop sekvencom 505. XTEN gen je kloniran u vektor za punjenje. U ovom slučaju, vektor kodira opcionu CBD sekvencu 506 i GFP gen 508. Digestija se zatim izvodi sa BbsI/HindIII da bi se uklonili 507 i 508 i postavili stop kodon.

Rezultirajući proizvod se zatim klonira u vektor digestije BsaI/HindIII koji sadrži gen koji kodira FVIII, što rezultira genom 500 koji kodira FVIII-XTEN fuzioni protein. Sl. 15 je šematski dijagram toka reprezentativnih koraka u sastavljanju gena koji kodira fuzioni protein koji sadrži CF i XTEN, njegovu ekspresiju i oporavak kao fuzioni protein i njegovu ocenu kao proizvod CFXTEN.

Sl. 16 ilustruje upotrebu donatorske XTEN sekvence za proizvodnju skraćenih XTEN. Sl. 16A daje sekvencu AG864 (SEQ ID NO:1596), sa podvučenom sekvencom koja se koristi za dobijanje dužine sekvence od 576 (SEQ ID NO:1597). Sl.16B daje sekvencu AG864 (SEQ ID NO:1598), sa podvučenom sekvencom koja se koristi za dobijanje dužine sekvence od 288 (SEQ ID NO:1599). Sl.16C daje sekvencu AG864 (SEQ ID NO:1600), sa podvučenom sekvencom koja se koristi za dobijanje dužine

2

sekvence od 144 (SEQ ID NO:1601). Sl.16D daje sekvencu AE864 (SEQ ID NO:1602), sa podvučenom sekvencom koja se koristi za dobijanje dužine sekvence od 576 (SEQ ID NO:1603). Sl.16E daje sekvencu AE864 (SEQ ID NO:1604), sa podvučenom sekvencom koja se koristi za dobijanje dužine sekvence od 288 (SEQ ID NO:1605). Sl.16F daje sekvencu AE864 (SEQ ID NO:1606) koristi se za generisanje četiri sekvence dužine 144 (SEQ ID NOS 1607-1610, po redosledu pojavljivanja) (dvostruko podvlačenje označava prvu aminokiselinu u 144 sekvenci sa jednim podvlačenjem koje predstavlja ravnotežu te sekvence).

Sl. 17 je šematski prikaz dizajna ekspresionih vektora faktora VIII-XTEN sa različitim strategijama uvođenja XTEN elemenata u FVIII kodirajuću sekvencu. Sl.

17A prikazuje ekspresioni vektor koji kodira XTEN spojen na 3' kraju sekvence koja kodira FVIII. Sl.17B prikazuje ekspresioni vektor koji kodira XTEN element umetnut u sredinu kodirajuće sekvence koja kodira jedan FVIII. Sl.17C prikazuje vektor ekspresije koji kodira dva XTEN elementa: jedan je ubačen unutar FVIII kodirajuće sekvence, a drugi spojen na 3' kraj FVIII kodirajuće sekvence.

Sl. 18 prikazuje postupak kombinatorne generacije gena koji kodiraju XTEN. U ovom slučaju, geni su sastavljeni iz 6 osnovnih fragmenata i svaki fragment je dostupan u 4 različite verzije kodona (A, B, C i D). Ovo omogućava teorijsku raznolikost od 4096 u sastavu motiva 12 aminokiselina.

Sl. 19 prikazuje farmakokinetički profil (koncentracije u plazmi) kod majmuna cinomolgus nakon pojedinačnih doza različitih sastava GFP povezanih sa nestruktuiranim polipeptidima različite dužine, koji se daju subkutano ili intravenski, kao što je opisano u Primeru 41. Sastavi su GFP-L288, GFP-L576, GFP-XTEN AF576, GFP-Y576 i XTEN_AD836-GFP. Uzorci krvi su analizirani u različitim vremenima nakon injekcije i koncentracija GFP-a u plazmi je izmerena ELISA korišćenjem poliklonskog antitela protiv GFP za hvatanje i biotiniliranog sastava istog poliklonskog antitela za detekciju. Rezultati su predstavljeni kao koncentracija u plazmi u odnosu na vreme (h) nakon doziranja, a naročito pokazuju značajno povećanje polu-raspada za XTEN_AD836-GFP, sastav sa najdužom dužinom sekvence XTEN. Konstrukcija sa najkraćom dužinom sekvence, GFP-L288 imala je najkraći polu-raspad.

Sl. 20 prikazuje SDS-PAGE gel uzoraka iz ispitivanja stabilnosti fuzionog proteina XTEN_AE864 spojene sa N-terminusom GFP (videti Primer 42). GFP-XTEN je inkubiran u plazmi cinomolgus i lizatu bubrega pacova do 7 dana na 37°C. Pored toga, takođe je procenjen GFP-XTEN koji se daje majmunima cinomolgus. Uzorci su povučeni na 0, 1 i 7 dana i analizirani pomoću SDS PAGE, a potom detekcijom pomoću Zapadne analize sa antitelom na GFP.

Sl. 21 pokazuje rezultate analize veličine hromatografije za isključivanje veličine uzoraka konstrukcije glukagon-XTEN merene prema standardima proteina poznate molekulske težine, sa grafičkim izlazom kao apsorbancijom u odnosu na zadržavanje, kao što je opisano u Primeru 40. Konstrukti glukagon-XTEN su 1) glukagon-Y288; 2) glukagon Y-144; 3) glukagon-Y72; i 4) glukagon-Y36. Rezultati ukazuju na povećanje prividne molekulske težine sa povećanjem dužine XTEN grupe (videti primer 40).

Sl. 22 pokazuje rezultate Zapadnog blotovanja proteina eksprimiranih ćelijskom kulturom ćelija transformisanih konstrukcijama kako je određeno (Primer 25). Uzorci u trakama 1-12 bili su: MW standardi , FVIII (42.5 ng), pBC0100B, pBC0114A, pBC0100, pBC0114, pBC0135, pBC0136, pBC0137, pBC0145, pBC0149, i pBC0146, respektivno. Trake 8, 9 i 12 prikazuju opsege u skladu sa FVIII sa C-terminusom XTEN288, sa procenjenim MW od 95 kDa. Trake 7 i 11 prikazuju opsege u skladu sa FVIII sa C-terminusom XTEN42, sa procenjenim MW od 175 kDa. Trake 2-6 pokazuju trake u skladu sa FVIII i teškim lancem. Trake 10 i 23 pokazuju trake u skladu sa teškim lancem. Traka 7 prikazuje traku konzistentnu sa teškim lancem i priključenim XTEN42.

Sl. 23 prikazuje rezultate ispitivanja FVIII na uzorcima dobijenim iz faktora FVIII i von Willebrandov faktora sa dvostrukim nokaut miševima sa hidrodinamičkom injekcijom plazmidne DNK, kao što je detaljno opisano u Primeru 36.

Sl. 24 je grafički i tabelarni prikaz farmakokinetičkih svojstava rBDD-FVIII i prečišćenih CFXTEN fuzionih proteina pBC0145 i pBC0146 (sa C-terminusom XTEN) koji se daju ili HemA ili FVIII/VWF dvostrukim oborenim miševima kao što je opisano u Primeru 30, pokazujući produženi polu-raspad CFXTEN kod oba soja miševa.

Sl. 25 je grafički i tabelarni prikaz farmakokinetičkih svojstava rBDD-FVIII i CFXTEN fuzionih proteina pSD0050 i pSD0062 (sa unutrašnjim umetnutim XTEN) koji se daju bilo HemA (Sl.25A) ili FVIII/VWF dupli nokaut miševi (FIG.25B) korišćenjem PK testa ćelijske kulture kod HemA miševa. Doze, 5-minutni oporavak i polu-raspad (T1/2) su prikazani, kao što je opisano u Primeru 32, podvlačeći poboljšani oporavak i polu-raspad CFXTEN u poređenju sa pozitivnom kontrolom

4

FVIII u oba soja miševa.

Sl. 26 je grafički prikaz titracije GMA8021 FVIII inhibitora upotrebom pBC0114 BDD-FVIII I CFXTEN konstrukcije LSD0049.002 sa tri XTEN 144 umetka aminokiseline uz ostatke 18, 745 i 2332. Podaci ukazuju na pomak desne strane od približno 0.7 reda veličine količine antitela u µg/ml potrebnih da se inhibira CFXTEN do nivoa od 50%, u poređenju sa FVIII pozitivnom kontrolom.

Sl. 27 je šema dijagrama logičkog toka algoritma SegScore. Na slici važi sledeća legenda: i, j - brojači koji se koriste u kontrolnim petljama koji prolaze kroz celu sekvencu; HitCount - ova varijabla je brojač koji prati koliko puta se u podsekvenci nađe identična podsekvenca; SubSeqX - ova varijabla drži podsekvencu koja se proverava radi suvišnosti; SubSeqY - ova varijabla sadrži podsekvencu za koju je SubSeqX proveren; BlockLen - ova varijabla drži dužinu bloka koju određuje korisnik; SegLen - ova varijabla drži dužinu segmenta. Program je tvrdo kodiran za generisanje rezultata za nizove dužina 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10; Blokiraj - ova promenljiva sadrži niz dužine BlockLen. Niz je sastavljen od slova iz ulazne XTEN sekvence i određen je položajem i brojača; SubSeqList - ovo je lista na kojoj se nalaze svi generisani rezultati naknadnih preslikavanja.

Sl. 28 prikazuje primenu algoritma SegScore na hipotetički XTEN od 11 aminokiselina (SEQ ID NO:1591) da bi se utvrdila ponavljanje. XTEN sekvenca koja se sastoji od N aminokiselina je podeljena na N-S+1 sekvence dužine S (u ovom slučaju S=3). Poredi se parna upotreba svih sekvenci, a izračunava se prosečan broj identičnih poduhvata da bi se dobio rezultat naknadne vrednosti 1.89.

Sl. 29 je grafik vrednosti pojedinačnih konstrukcija odnosa FVIII aktivnosti u ispitivanom CFXTEN prema pozitivnoj kontroli pBC114 FVIII nakon izlaganja antitelu GMA8021 na FVIII, grupisanog prema broju XTEN u konstrukcijskom fuzionom proteinu (videti Primer 28). Rezultati pokazuju suštinski linearni odnos u sposobnosti CFXTEN da zadrži FVIII aktivnost s povećanim brojem ugrađenih XTEN.

Sl. 30 prikazuje primarnu sekvencu i strukturu domena zrelog BV domena (BDD), humanog FVIII konstrukta (Primer 46). Prikazana je lokacija uvedenih mesta ograničenja NheI i ClaI. Imajte na umu da numerisanje aminokiselina odgovara položajima aminokiselina u primarnoj sekvenci zrelog FVIII (Sl.30). Pojedinačne domene ograničene su sivim linijama/okvirima sa identifikacijom domena u sivom tekstu. Kiseli regioni (a1, a2, a3) označeni su isprekidanim kutijama. Čvrsti klinovi/trouglovi pokazuju mesta deljenja trombina u aktivaciji FVIII na FVIIIa. Neispunjeni klinovi/trougao označavaju mesto intracelularne proteolitičke obrade do dvolančanog oblika FVIII. Heksagoni označavaju mesta N-vezane glikozilacije.

Krugovi pokazuju mesta Tyr sulfacije. Jedinstvena ne izvorna ograničenja (NheI, GCTAG; ClaI, ATCGAT) uvedeni u cDNK radi olakšavanja XTEN ubacivanja/rekombinacije su označeni sivom bojom i dvostrukim podvlačenjem. Sl. 31 prikazuje grafički prikaz konstrukcije FVIII opisanog na Sl.30, što ukazuje na organizaciju domena i lokaciju izvornih i tuđih restriktivnih lokacija.

Sl. 32 prikazuje grafik ASAView izlaze za strukturne skupove podataka 2R7E, 3CDZ i PM0076106. Prikazana su područja pristupačnih rastvarača (ASA) za aminokiseline u domenima A1, A2, A3, C1 i C2. Analize su vršene na rendgenskim koordinatama 3CDZ (Ngo i dr., Struktura 16: 597-606 (2008)) i 2R7E (Shen i dr., Blood 111:1240-1247 (2008)) deponovani u Banci podataka o proteinima, koju održava Istraživačka kolaboracija za strukturnu bioinformatiku (RCSB; http://www.rcsb.org/pdb), kao i na atomskim koordinatama PM0076106 za predviđenu rafiniranu FVIII strukturu izvedenu iz simulacijskog ispitivanja molekularne dinamike (Venkateswarlu, BMC Struct. Biol.10:7 (2010) deponovana u bazi podataka proteinskih modela (http://mi.caspur.it/PMDB/main.php) koju održava Consorzio Interuniversitario za aplikaciju Supercalcolo za Università e Riserca (CASPUR) i Odeljenje za Biohemijske nauke sa Univerziteta u Rimu.

Sl. 33 prikazuje strukturni prikaz lokacije XTEN mesta umetanja. Centralni crtež koji odgovara kristalnoj strukturi FVIII (PDB: 2R7E) je okružen detaljnim prikazom domena A1, A2, A3, C1 i C2. Beta pramenovi i alfa helikopteri prikazani su u obliku vrpce. Petlje su prikazane kao alfa ugljenične cevi. Aminokiseline na XTEN mestima umetanja su prikazane kao CPK reprezentacija sfere. Broj na svakom grafiku označava lokaciju XTEN mesta umetanja prema numerisanju na Sl.30.

Sl. 34 prikazuje strukturni prikaz lokacije XTEN mesta umetanja prikazanih na Sl.33, pri čemu rezultirajući rekombinantni FVIII protein pokazuje FVIII aktivnost.

Sl. 35 prikazuje strukturni prikaz lokacije XTEN mesta umetanja prikazanih na Sl.34, pri čemu rezultirajući rekombinantni FVIII protein pokazuje FVIII aktivnost.

Sl. 36 prikazuje strukturni prikaz lokacije XTEN mesta umetanja prikazanih na Sl.35, pri čemu rezultirajući rekombinantni FVIII protein pokazuje FVIII aktivnost.

Sl. 37 prikazuje ClustalW poravnavanje višestrukih sekvenci domena A1, A2, A3, C1 i C2 od FVIII, koje pokazuju lokaciju XTEN umetanja što rezultira rekombinantnim FVIII proteinima koji pokazuju FVIII aktivnost (crna kutija, beli tekst) ili ne pokazuju aktivnost FVIII (siva kutija, zadebljani tekst).

Sl. 38 prikazuje DSSP grafički prikaz sekundarne strukture dva polipeptidna lanca u izvornoj aktivnoj humanoj FVIII kristalnoj strukturi deponovanoj pod identifikatorom 2R7E u Protein Data Bank (videti Primer 47). Numerisanje nizova aminokiselina je isto kao u sekvenci proteina na Sl.30. Regioni beta lista prikazana su kao popunjene strelice i označene su od β1 do β66. Lokacija XTEN dozvoljenih petlji označena je umreženim kutijama. Permisivne petlje za domen A1 XTEN su označene petljom A1-1 i petljom A1-2. Permisivne petlje za domen A2 XTEN su označene petljom A2-1 i petljom A2-2. Permisivne petlje za domen A3 XTEN su označene petljom A3-1 i petljom A3-2.

Sl. 39 prikazuje DSSP grafički prikaz sekundarne strukture dva polipeptidna lanca u izvornoj aktivnoj humanoj FVIII kristalnoj strukturi deponovanoj pod identifikatorom 2R7E u Protein Data Bank (videti Primer 47). Numerisanje nizova aminokiselina je isto kao u sekvenci proteina na Sl.30. Regioni beta lista prikazana su kao popunjene strelice i označene su od β1 do β66. Lokacija XTEN dozvoljenih petlji označena je umreženim kutijama. Permisivne petlje za domen A1 XTEN su označene petljom A1-1 i petljom A1-2. Permisivne petlje za domen A2 XTEN su označene petljom A2-1 i petljom A2-2. Permisivne petlje za domen A3 XTEN su označene petljom A3-1 i petljom A3-2.

Sl. 40 prikazuje ClustalW poravnavanje višestrukih sekvenci domena A1, A2, A3, C1 i C2 od FVIII, koje pokazuju lokaciju XTEN umetanja što rezultira rekombinantnim FVIII proteinima koji pokazuju FVIII aktivnost (crna kutija, beli tekst) ili ne pokazuju aktivnost FVIII (siva kutija, zadebljani tekst). Lokacije permisivnih petlji XTEN su označene isprekidanim pravougaonicima (videti Primer 47).

Sl. 41. Sl.41A prikazuje prednji prikaz ljudskog FVIII (PDB:2R7E) sa prednje strane, koji prikazuje lokaciju domena A1, A2, A3, C1 i C2 (kružno iscrtanim obrubom) i lokacije XTEN permisivnih petlji A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 i A3-2 istaknuti kao CPK reprezentacije sfere. Sl.41B prikazuje prikaz sa strane ljudskog FVIII (PDB:2R7E) sa prednje strane, koji prikazuje lokaciju domena A1, A2, A3, C1 i C2 (kružno iscrtanim obrubom) i lokacije XTEN permisivnih petlji A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 i A3-2 istaknuti kao CPK reprezentacije sfere.

Sl. 42 prikazuje gornji prikaz izolovane humane FVIII (PDB:2R7E) domene koje prikazuju XTEN permisivne petlje označene kao CPK reprezentacije sfere. Sl.42B, 42D i 42F prikazuju prikaz sa strane izolovanog humanog FVIII (PDB:2R7E) domena koji prikazuju XTEN permisivne petlje označene kao CPK reprezentacije sfere.

Sl. 43 prikazuje sekvence različitih delecija B-domena faktora VIII i pojedinačne mutacije. Linije 4-10 prikazuju različite brisanja B domena sa naznačenim XTEN koji povezuje zaostale B-domene ili ostatke A3 domena. Mutacija R1648A je označena strelicom u linijama 5 i 8, dok je mutacija I1680F označena strelicom u linijama 8-10. Sl. 44 je grafik hromogene i aPTT aktivnosti ispitivanja različitih CFXTEN sa jednim XTEN ubacivanjem (Primer 49).

Sl. 45 je grafik hromogene i aPTT aktivnosti ispitivanja različitih CFXTEN sa 2 XTEN ubacivanjem (Primer 49).

Sl. 46 je grafik hromogene i aPTT aktivnosti ispitivanja različitih CFXTEN sa 3 XTEN ubacivanjem (Primer 49).

Sl. 47 je grafik nivoa plazme u DKO miševima različitih primenjenih CFXTEN sa jednim XTEN umetkom u poređenju sa BDD-FVIII kontrolom, pokazujući 10 do 20 puta duži polu-raspad postignut XTEN ubacivanjem na različitim lokacijama (Primer 50).

Sl. 48 je grafik nivoa plazme u DKO miševima različitih primenjenih CFXTEN sa jednim, dva i tri XTEN umetanja u poređenju sa BDD-FVIII kontrolom, demonstrirajući porast polu-raspada postignut uključivanjem dodatnih XTEN umetanja u poređenju sa pojedinačnim ili dva umetanja (Primer 51).

Sl. 49 su grafikoni prikazanih krivih inhibicije za preostalu prokoagulantnu aktivnost faktora VIII u uzorcima testiranim u Bethesda testu sa tri seruma bolesnika na hemofiliju (Sl. 49A-C) ili ovčje anti-FVII (Sl.49D) opisan u Primeru 52, demonstrirajući jasan pomak leve inhibicijske krive za dva CFXTEN molekula u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0056] Pre nego što su opisana otelotvorenja predmetnog pronalaska, treba razumeti da su takva otelotvorenja data samo primerom i da se u primeni pronalaska mogu koristiti različite alternative otelotvorenja pronalaska opisana ovde. Brojne varijacije, promene i supstitucije sada će se pojaviti onima koji su vešti u ovoj oblasti bez odstupanja od pronalaska.

[0057] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što se uobičajeno shvataju oni koji su uobičajeno upoznati sa stanjem tehnike kojem pripada pronalazak. Mada se postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, opisani su ispod odgovarajući postupci i materijali. U slučaju sukoba kontrolisaće se specifikacija patenta, uključujući definicije. Pored toga, materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni ograničavanju. Brojne varijacije, promene i supstitucije sada će se pojaviti onima koji su vešti u ovoj oblasti bez odstupanja od pronalaska.

DEFIINICIJE

[0058] U kontekstu patentne prijave, za sledeće pojmove su im pripisana značenja, osim ako nije drugačije određeno:

Kao što se koristi u specifikaciji i patentnim zahtevima, jednine formiraju "a", "an" i "the" uključuju množinske reference, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije. Na primer, termin "ćelija" uključuje mnoštvo ćelija, uključujući njihove smeše.

[0059] Termini "polipeptid", "peptid" i "protein" ovde su korišćeni naizmenično za označavanje polimera aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili razgranat, može da sadrži modifikovane aminokiseline, a može da ih prekine neaminokiselinama. Termini takođe obuhvataju aminokiselinski polimer koji je modifikovan, na primer, formiranjem disulfidne veze, glikozilacijom, lipidiranjem, acetilacijom, fosforilacijom ili bilo kojom drugom manipulacijom, poput konjugacije sa komponentom obeležavanja.

[0060] Kao što je ovde korišćen, termin "aminokiselina" odnosi se na prirodne i/ili neprirodne ili sintetičke aminokiseline, uključujući, ali ne ograničavajući se na D ili L optičke izomere i analoge aminokiselina i peptidomimetike. Za označavanje aminokiselina koriste se standardna jednoslovni ili troslovni kodovi.

[0061] Termin "domen", kada se koristi u vezi s polipeptidom faktora VIII, odnosi se ili na domen pune dužine ili na njen funkcionalni fragment, na primer, punu dužinu ili funkcionalne fragmente A1 domena, A2 domena, A3 domena, B domena, C1 domena i/ili C2 domena faktora VIII.

[0062] Termin "prirodna L-aminokiselina" označava L optičkih izomernih oblika glicina (G), prolina (P), alanina (A), valina (V), leucina (L), izoleucina (I), metionina (M) , cisteina (C), fenilalanina (F), tirozina (Y), triptofana (W), histidina (H), lizina (K), arginina (R), glutamina (Q), asparagina (N), glutaminske kiseline (E), asparaginske kiseline (D), serina (S) i treonina (T).

[0063] Termin "koji se ne javlja u prirodi", kako se primenjuje na sekvence i kao što se ovde koristi, označava polipeptidne ili polinukleotidne sekvence koje nemaju duplikat, ne dopunjuju se ili nemaju visok stepen homologije sa divljim tipom ili prirodno prisutna sekvenca pronađena kod sisara. Na primer, polipeptid ili fragment koji nije prisutan u prirodi može da sadrži ne više od 99%, 98%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50% ili čak manje identičnosti sekvenci aminokiselina u poređenju sa prirodnom sekvencom kada je prikladno usklađena.

[0064] Termini "hidrofilni" i "hidrofobni" odnose se na stepen afiniteta koji supstanca ima sa vodom. Hidrofilna supstanca ima snažan afinitet prema vodi, koja ima tendenciju da se rastvara, pomeša sa vodom ili vlaži vodom, dok hidrofobnoj supstanci bitno nedostaje afinitet za vodu, teži da odbija i ne upija vodu i teži da se ne rastvara u ili pomeša sa ili da bude ovlažena vodom. Aminokiseline se mogu karakterisati na osnovu njihove hidrofobnosti. Razvijene su brojne skale. Primer je skala koju je razvio Levitt, M, i dr., J Mol Biol (1976) 104:59, koja je navedena u Hopp, TP, i dr., Proc Natl Acad Sci USA (1981) 78:3824. Primeri „hidrofilnih aminokiselina“ su arginin, lizin, treonin, alanin, asparagin i glutamin. Posebno su zanimljive hidrofilne aminokiseline aspartat, glutamat, serin i glicin. Primeri „hidrofobnih aminokiselina“ su triptofan, tirozin, fenilalanin, metionin, leucin, izoleucin i valin.

[0065] "Fragment" kada se primenjuje na protein, je skraćeni oblik izvornog biološki aktivnog proteina koji zadržava bar deo terapijske i/ili biološke aktivnosti. "Varijanta" kada se primenjuje na protein je protein sa homologijom sekvence izvornog biološki aktivnog proteina koji zadržava bar deo terapeutske i/ili biološke aktivnosti biološki aktivnog proteina. Na primer, varijantni protein može da deli najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence aminokiselina u poređenju sa referentnim biološki aktivnim proteinom. Kao što je ovde korišćen, termin "biološki aktivni proteinski deo" uključuje proteine namerno modifikovane, na primer, mutagenezom usmerenom na mesto, sintezu gena koji kodira, umetanje ili slučajno mutacijama.

[0066] Termin "varijanta sekvence" označava polipeptide koji su modifikovani u poređenju sa njihovim izvornim ili originalnim nizom jednim ili više ubacivanja, brisanja ili supstitucija

4

aminokiselina. Ubacivanja se mogu nalaziti na jednom ili oba kraja proteina i/ili mogu biti smeštena unutar unutrašnjih regiona sekvence aminokiselina. Neograničavajući primer je ubacivanje XTEN sekvence unutar sekvence biološki aktivnog proteina korisnog opterećenja. U varijantama brisanja uklanja se jedan ili više aminokiselinskih ostataka polipeptida kao što je ovde opisano. Varijante brisanja, dakle, uključuju sve fragmente polipeptidne sekvence korisnog opterećenja. U varijantama supstitucije, jedan ili više aminokiselinskih ostataka polipeptida se uklanjaju i zamenjuju alternativnim ostacima. U jednom aspektu, supstitucije su konzervativne prirode i konzervativne supstitucije ovog tipa su dobro poznate u stanju tehnike.

[0067] Kako se ovde koristi, "unutrašnji XTEN" se odnosi na XTEN sekvence koje su ubačene u sekvencu faktora koagulacije. Unutrašnji XTEN se mogu konstruisati ubacivanjem XTEN sekvence u sekvencu faktora koagulacije poput FVIII, bilo ubacivanjem između dve susedne aminokiseline unutar domena ("intradomena") ili između dva domena ("interdomena") koagulacije faktor ili gde XTEN zamenjuje parcijalni, unutrašnji niz faktora koagulacije.

[0068] Kako se ovde koristi, "terminus XTEN" se odnosi na XTEN sekvence koje su spojene na ili u N- ili C-terminus faktora koagulacije ili na proteolitičku sekvencu deljenja ili veznik na N- ili C-terminus faktora koagulacije. Terminusni XTEN se mogu spojiti sa matičnim terminima faktora koagulacije. Alternativno, terminusni XTEN mogu zameniti deo terminusne sekvence faktora koagulacije.

[0069] Termin "mesto oslobađanja XTEN" odnosi se na sekvencu deljenja CFXTEN fuzionih proteina koje može prepoznati i podeliti proteaza sisara, što efektivno oslobađa XTEN ili deo XTEN iz fuzionog proteina CFXTEN. Kako se ovde koristi, "proteaza sisata" znači proteaza koja normalno postoji u telesnim tečnostima, ćelijama ili tkivima sisara. Mesta za oslobađanje XTEN mogu se konstruisati da se podele od različitih proteaza sisara (poznatih kao "XTEN oslobađajuće proteaze"), kao što su FXIa, FXIIa, kalikrein, FVIIIa, FVIIIa, FXa, FIIa (trombin), Elastaza-2, MMP-12, MMP13, MMP-17, MMP-20 ili bilo koja proteaza prisutna tokom događaja zgrušavanja. Mogu se koristiti i druge ekvivalentne proteaze (endogene ili egzogene) koje su sposobne da prepoznaju definisano mesto deljenja. Mesta deljenja se mogu prilagoditi i prilagoditi korišćenim proteazama.

[0070] Termin "unutar", kada se odnosi na prvi polipeptid koji je vezan za drugi polipeptid, obuhvata vezu koja povezuje N-terminus prvog ili drugog polipeptida sa C-terminusom drugog ili prvog polipeptida, respektivno, kao i ubacivanje prvog polipeptida u sekvencu drugog polipeptida. Na primer, kada je XTEN povezan „unutar“ domene polipeptida faktora VIII, XTEN može biti povezan sa N-terminusom, C-terminusom ili može biti ubačen u navedeni domen.

[0071] Kao što je ovde korišćen, termin "mesto", kada se koristi za mesto ubacivanja XTEN unutar ili na biološki polipeptid, kao što je faktor VIII, predstavlja položaj aminokiselina na kome je XTEN povezan. Kada su opisane numerisane lokacije, kao što su prvo, drugo, treće, četvrto, peto, ili šesto mesto za ubacivanje XTEN unutar ili u faktor VIII, razumeće se da svako mesto predstavlja različito mesto u faktoru VIII; npr., druga lokacija je različita lokacija faktora VIII od prve lokacije, treća lokacija se razlikuje od druge i prve, itd.

[0072] "Aktivnost" ili "prokoagulantna aktivnost" kako se primenjuje za oblike CFXTEN polipeptida koji su ovde obezbeđeni, odnosi se na sposobnost vezivanja na ciljni supstrat proteina koagulacije ili kofaktor i promovisanje događaja zgrušavanja, bilo da se meri in vitro, ex vivo ili in vivo testom. Takvi testovi uključuju, ali nisu ograničeni na, jednofazne testove zgrušavanja, dvostepene testove zgrušavanja, hromogene testove i ELISA testove. "Biološka aktivnost" odnosi se na in vitro ili in vivo biološku funkciju ili efekat, uključujući, ali bez ograničenja, bilo vezivanje receptora ili liganda, ili efekat na koagulaciju koji je u nauci opšte poznat za faktor koagulacije FVIII, ili ćelijski, fiziološki, ili klinički odgovor, uključujući zaustavljanje epizode krvarenja.

[0073] Kao što je ovde korišćen, termin "ELISA" odnosi se na enzimski povezani imunosorbentni test kako je ovde opisano ili kao što je inače poznato u struci.

[0074] "Ćelija domaćina" uključuje pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može biti ili je primalac predmetnih vektora. Ćelije domaćina uključuju potomstvo jedne ćelije domaćina. Potomstvo ne mora nužno biti potpuno identično (u morfologiji ili u genomu ukupnog komplementa DNK) sa originalnom matičnom ćelijom zbog prirodne, slučajne ili namerne mutacije. Ćelija domaćina uključuje ćelije koje su transficirane in vivo vektorom predmetnog pronalaska.

[0075] "Izolovani" kada se koristi da se opišu ovde opisani različiti polipeptidi, znači polipeptid koji je identifikovan i odvojen i/ili izbačen iz komponente prirodnog okruženja. Zagađivačke komponente njegove prirodne sredine su materijali koji obično ometaju dijagnostičku ili terapijsku upotrebu polipeptida, a mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili ne-proteinske rastvore. Kao što je očigledno onima koji poznaju ovu oblast, polinukleotid koji nije prirodno prisutan, peptid, polipeptid, protein, antitelo ili njegovi fragmenti, ne zahteva „izolaciju“ da bi ga razlikovali od svog prirodnog primerka. Pored toga, „koncentrovani“, „razdvojeni“ ili „razređeni“ polinukleotid, peptid, polipeptid, protein, antitelo ili njegovi fragmenti se razlikuju od prirodnog porekla po tome što je koncentracija ili broj molekula po zapremini uglavnom veći od njegovog prirodnog primerka. Generalno, polipeptid napravljen rekombinantnim sredstvima i ispoljavan u ćeliji domaćinu smatra se „izolovanim“.

[0076] "Izolovani" polinukleotid ili nukleinska kiselina koja kodira polipeptid ili nukleinska kiselina koja kodira polipeptid je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog zagađivačkog molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično povezan u prirodnom izvoru polipeptida- kodirajući nukleinsku kiselinu. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid različit je od oblika ili okruženja u kojem se nalazi u prirodi. Zbog toga se izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptid razlikuju od specifičnih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide kao što to postoji u prirodnim ćelijama. Međutim, izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid uključuje molekule nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid i sadrže se u ćelijama koje obično eksprimiraju polipeptid gde je, na primer, molekul nukleinske kiseline na hromozomskom ili ekstra hromozomskom mestu različitom od prirodnih ćelija.

[0077] "Himerni" protein sadrži najmanje jedan fuzioni polipeptid koji sadrži najmanje jedan region u različitom položaju u nizu od onoga koji se dešava u prirodi. Regioni mogu normalno da postoje u odvojenim proteinima i spajaju se u fuzionom polipeptidu; ili oni mogu normalno da postoje u istom proteinu, ali su smešteni u novom aranžmanu u fuzionom polipeptidu. Fuzioni protein može nastati, na primer, hemijskom sintezom ili stvaranjem i prevođenjem polinukleotida u kojem su peptidnog regiona kodirane u željenom odnosu.

[0078] "Konjugovani", "povezani", "spojeni" i "fuzija" ovde su korišćeni naizmenično. Ovi termini se odnose na spajanje dva ili više hemijskih elemenata, sekvence ili komponenata,

4

bilo kojim sredstvom uključujući hemijsku konjugaciju ili rekombinantne načine. Na primer, promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence. Generalno, "operativno povezano" znači da su DNK sekvence koje se povezuju neprekidno, u fazi čitanja ili u okviru. "Fuzija unutar okvira" odnosi se na spajanje dva ili više otvorenih okvira za čitanje (ORF) da bi se formirao kontinuirani duži ORF, na način koji održava ispravan okvir za čitanje originalnih ORF. Dakle, rezultirajući rekombinantni fuzioni protein je jedan protein koji sadrži dva ili više segmenata koji odgovaraju polipeptidima kodiranim originalnim ORF (koji segmenti nisu po prirodi tako spojeni).

[0079] U kontekstu polipeptida, "linearna sekvenca" ili "sekvenca" je redosled aminokiselina u polipeptidu u pravcu amino-karboksilnog kraja u kome su ostaci koji su susedni jedan u drugom u sekvenci u primarnoj strukturi polipeptid. "Delimična sekvenca" je linearna sekvenca dela polipeptida za koju se zna da sadrži dodatne ostatke u jednom ili oba smera.

[0080] "Heterologni" znači izveden iz genotipski različitog entiteta od ostatka entiteta sa kojim se upoređuje. Na primer, sekvenca bogata glicinom uklonjena iz matične sekvence kodiranja i operativno povezana sa kodirajućom sekvencom koja nije matična sekvenca je heterologna sekvenca bogata glicinom. Termin "heterologan" kako se primenjuje na polinukleotid ili polipeptid, znači da je polinukleotid ili polipeptid izveden iz genotipski različitog entiteta od ostatka entiteta sa kojim se upoređuje.

[0081] Termini "polinukleotidi", "nukleinske kiseline", "nukleotidi" i "oligonukleotidi" koriste se naizmenično. Oni se odnose na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bilo deoksiribonukleotidne ili ribonukleotide, ili njihove analoge. Polinukleotidi mogu imati bilo koju trodimenzionalnu strukturu i mogu obavljati bilo koju funkciju, poznatu ili nepoznatu. Sledeći su neograničavajući primeri polinukleotida: kodirajuća ili nekodirajuća područja gena ili fragmenta gena, lokusa (lokusa) definisanih iz analize veze, egzona, introna, mesna RNK (mRNK), transferna RNK, ribozomalna RNK, ribozimi, cDNK, rekombinantnih polinukleotida, razgranatih polinukleotida, plazmida, vektori, izolovana DNK bilo koje sekvence, izolovana RNK bilo koje sekvence, sonde nukleinske kiseline i prajmeri.

Polinukleotid može da sadrži modifikovane nukleotide, poput metilovanih nukleotida i nukleotidnih analoga. Ako postoje, modifikacije nukleotidne strukture mogu se uneti pre ili posle sklapanja polimera. Sekvenca nukleotida može biti prekinuta ne-nukleotidnim komponentama. Polinukleotid se može dalje modifikovati nakon polimerizacije, poput konjugacije sa komponentom za obeležavanje.

[0082] Termin "komplement polinukleotida" označava polinukleotidni molekul koji ima komplementarnu baznu sekvencu i obrnutu orijentaciju u poređenju sa referentnom sekvencom, tako da se može hibridizovati sa referentnom sekvencom sa potpunom vernošću.

[0083] "Rekombinantni" kao što se primenjuje na polinukleotid znači da je polinukleotid produkt različitih kombinacija in vitro koraka kloniranja, restrikcije i/ili ligacije i drugih postupaka koji rezultiraju konstruktom koja se potencijalno može ispoljavati kao rekombinantni protein u ćeliji domaćinu.

[0084] Termini "gen" i "fragment gena" ovde su korišćeni naizmenično. Oni se odnose na polinukleotid koji sadrži bar jedan otvoreni okvir za čitanje koji je sposoban da kodira određeni protein nakon što je prepisan i preveden. Gen ili fragment gena može biti genomska ili cDNK, sve dok polinukleotid sadrži najmanje jedan otvoreni okvir za čitanje, koji može da obuhvati celokupno kodirajuće područje ili njegov segment. "Fuzioni gen" je gen sastavljen od najmanje dva heterologna polinukleotida koji su povezani zajedno.

[0085] "Homologija" ili "homologna" ili "identičnost sekvence" odnosi se na sličnost sekvenci ili izmenljivost između dve ili više polinukleotidnih sekvenci ili između dve ili više polipeptidnih sekvenci. Kada se koristi program kao što je BestFit za utvrđivanje identiteta sekvence, sličnosti ili homologije između dve različite sekvence aminokiselina, mogu se koristiti podrazumevana podešavanja ili se izabere odgovarajuća matrica za ocenjivanje, kao što je blosum45 ili blosum80, da se optimizuje identitet, sličnost ili rezultati homologije. Poželjno, polinukleotidi koji su homologni su oni koji hibridizuju pod strogim uslovima kao što je ovde definisano i imaju najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, poželjnije najmanje 90%, poželjnije 95%, poželjnije 97%, poželjnije 98% , i još poželjnije 99% identitet sekvence u poređenju sa tim sekvencama. Polipeptidi koji su homologni preferirano imaju identitet sekvenci koji su najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95-99%, a najpoželjnije 100% identični.

[0086] "Ligacija" se odnosi na proces formiranja fosfodiesterskih veza između dva fragmenta ili gena nukleinske kiseline, povezujući ih. Da bi se fragmenti ili geni vezali zajedno, krajevi

4

DNK moraju biti kompatibilni jedan sa drugim. U nekim slučajevima krajevi će biti direktno kompatibilni nakon varenja endonukleaze. Međutim, možda će biti potrebno prvo pretvoriti raspoređene krajeve koji se obično stvaraju nakon varenja endonukleaze u tupim krajevima kako bi ih učinili kompatibilnim za ligaciju.

[0087] Termini "strogi uslovi" ili "strogi uslovi hibridizacije" uključuju upućivanje na uslove pod kojima će polinukleotid hibridizovati na svoju ciljnu sekvencu, u vidljivom stepenu od ostalih sekvenci (npr., najmanje dvostruko iznad pozadine). Generalno, strogost hibridizacije se delimično izražava u odnosu na temperaturu i koncentraciju soli pod kojima se izvodi korak pranja. Tipično, strogi uslovi će biti oni u kojima je koncentracija soli manja od oko 1,5 M Na jona, obično oko 0.01 do 1.0 M Na-jona (ili drugih soli) na pH 7.0 do 8.3, a temperatura je najmanje oko 30°C za kratke polinukleotide (npr., 10 do 50 nukleotida) i najmanje oko 60°C za duge polinukleotide (npr.. veći od 50 nukleotida)-na primer, "strogi uslovi" mogu uključivati hibridizaciju u 50% formamidu, 1 M NaCl, 1 % SDS na 37°C i tri pranja tokom 15 minuta, svaki u 0.1 xSSC/1% SDS na 60°C do 65°C. Alternativno, mogu se koristiti temperature od oko 65°C, 60°C, 55°C ili 42°C. Koncentracija SSC može da varira od oko 0.1 do 2xSSC, pri čemu je SDS prisutan na oko 0.1%. Takve temperature pranja su obično izabrane da budu oko 5°C do 20°C niže od tačke toplotnog topljenja za specifičnu sekvencu pri definisanoj jonskoj snazi i pH. Tm je temperatura (pod definisanom jonskom snagom i pH) pri kojoj se 50% ciljane sekvence hibridizira na savršeno usklađenu sondu. Jednadžba za izračunavanje Tm i uslovi za hibridizaciju nukleinskih kiselina su dobro poznati i mogu se naći u Sambrook, J. i dr., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. Obično se blokirajući reagensi koriste za blokiranje nespecifične hibridizacije. Takvi blokirajući reagensi uključuju, na primer, odsečenu i denaturiranu DNK sperme lososa u količini od oko 100-200 µg/ml. Organski rastvarač, poput formamida u koncentraciji od oko 35-50% v/v, takođe se može koristiti u određenim okolnostima, kao što je za hibridizaciju RNK:DNK. Korisne varijacije ovih uslova pranja biće lako vidljive stručnjacima u tehnici.

[0088] Termini "procenat identiteta", procenat identiteta sekvence" i "% identiteta", kako se primenjuju na polinukleotidne sekvence, odnose se na procenat ostatka podudaranja između najmanje dve polinukleotidne sekvence poređane korišćenjem standardizovanog algoritma. Takav algoritam može na standardizovani i ponovljiv način umetnuti praznine u nizovima koji se upoređuju kako bi se optimiziralo poravnanje između dve sekvence i samim tim

4

postigla smislenija poređenje dveju sekvenci. Procentni identitet može se meriti dužinom čitave definisane polinukleotidne sekvence, ili se može meriti kraćom dužinom, na primer, dužom dužinom fragmenta uzetog iz veće, definisane polinukleotidne sekvence, na primer, fragmenta od najmanje 45, najmanje 60, najmanje 90, najmanje 120, najmanje 150, najmanje 210 ili najmanje 450 susednih ostataka. Takve dužine su samo primere i podrazumeva se da se svaka dužina fragmenta podržana sekvencijama prikazanim ovde, u tabelama, slikama ili popisu sekvenci, može koristiti za opisivanje dužine preko koje se može meriti procenat identiteta. Procenat identiteta sekvence izračunava se upoređivanjem dve optimalno poređane sekvence preko prozora poređenja, određivanjem broja podudarnih pozicija (na kojima se identični ostaci pojavljuju u obe polipeptidne sekvence), deljenjem broja podudarnih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u prozor upoređivanja (tj., veličina prozora) i umnožavanje rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identiteta sekvence. Kada treba upoređivati nizove različite dužine, najkraći niz definiše dužinu prozora poređenja. Konzervativne supstitucije se ne uzimaju u obzir prilikom izračunavanja identiteta sekvence.

[0089] "Procentualni (%) identitet sekvence", u odnosu na ovde identifikovane polipeptidne sekvence, je definisan kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvence upita koji su identični sa aminokiselinskim ostacima druge, referentne polipeptidne sekvence ili njenog dela, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identiteta sekvence, i ne uzimajući u obzir konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Usklađivanje radi određivanja procenta aminokiselinskih procenata može se postići na različite načine koji su poznati u struci, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera, poput softvera BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR). Oni koji poznaju ovu oblast mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući bilo koje algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja po celoj dužini sekvence koja se upoređuje. Procentni identitet može se meriti dužinom čitave definisane polipeptidne sekvence, ili se može meriti kraćom dužinom, na primer, dužom dužinom fragmenta uzetog iz veće, definisane polipeptidne sekvence, na primer, fragmenta od najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 70 ili najmanje 150 susednih ostataka. Takve dužine su samo primere i podrazumeva se da se svaka dužina fragmenta podržana sekvencijama prikazanim ovde, u tabelama, slikama ili popisu sekvenci, može koristiti za opisivanje dužine preko koje se može meriti procenat identiteta.

4

[0090] Termin "neponovljivost" kako se ovde koristi u kontekstu polipeptida odnosi se na nedostatak ili ograničen stepen unutrašnje homologije u sekvenci peptida ili polipeptida. Termin "u suštini se ne ponavlja" može, na primer, značiti da postoji malo ili nijedan primer četiri susedne aminokiseline u nizu koje su identične vrste aminokiselina ili da polipeptid ima ocenu naknadne reakcije (definisanu dole) od 10 ili manje ili više nema obrasca u redosledu, od N- do C-terminusa, motiva sekvenci koji čine polipeptidnu sekvencu. Termin "ponovljivost" kako se ovde koristi u kontekstu polipeptida odnosi se na stepen unutrašnje homologije u sekvenci peptida ili polipeptida. Suprotno tome, „ponavljajuća“ sekvenca može sadržati više identičnih kopija kratkih sekvenci aminokiselina. Na primer, polipeptidna sekvenca koja nas zanima može biti podeljena na n-mer sekvence i broj identičnih sekvencija se može prebrojati. Visoko ponavljajuće sekvence sadrže veliki deo identičnih sekvenci dok neprekidne sekvence sadrže nekoliko identičnih sekvenci. U kontekstu polipeptida, sekvenca može da sadrži više kopija kraćih sekvenci definisane ili promenljive dužine, ili motive, pri čemu sami motivi imaju ne ponavljajuće sekvence, što čini da polipeptid pune dužine u osnovi nije ponavljajući. Dužina polipeptida unutar kojeg se meri neponovljivost može varirati od 3 aminokiseline do oko 200 aminokiselina, otprilike od 6 do oko 50 aminokiselina ili od oko 9 do oko 14 aminokiselina. "Ponavljanje" korišćeno u kontekstu polinukleotidnih sekvenci odnosi se na stepen unutrašnje homologije u sekvenci kao što je, na primer, frekvencija identičnih nukleotidnih sekvenci date dužine. Ponavljanje se, na primer, može meriti analizom učestalosti identičnih sekvenci.

[0091] "Vektor" je molekul nukleinske kiseline, poželjno da se automatski razmnožava u odgovarajućem domaćinu, koji prenosi umetnuti molekul nukleinske kiseline u i/ili između ćelija domaćina. Termin uključuje vektore koji primarno funkcionišu za ubacivanje DNK ili RNK u ćeliju, replikaciju vektora koji primarno funkcionišu na replikaciju DNK ili RNK i ekspresione vektore koji funkcionišu na transkripciji i/ili prevođenju DNK ili RNK. Takođe su uključeni vektori koji pružaju više od jedne od iznad navedenih funkcija. "Ekspresioni vektor" je polinukleotid koji se, kada se unese u odgovarajuću ćeliju domaćina, može prepisati i prevesti u polipeptid(e). "Sistem ekspresije" obično označava pogodnu ćeliju domaćina koja se sastoji iz vektora ekspresije koji može funkcionisati da bi se dobio željeni proizvod ekspresije.

[0092] "Otpornost na razgradnju seruma", kako se primenjuje na polipeptid, odnosi se na sposobnost polipeptida da izdrže razgradnju u krvi ili njihovim komponentama, što obično

4

uključuje proteaze u serumu ili plazmi. Otpornost na razgradnju seruma može se meriti kombinovanjem proteina sa ljudskim (ili mišem, pacovom, majmunom, serumom ili plazmom, obično u toku dana (npr., 0.25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16 dana) ), obično na oko 37°C. Uzorci za ove vremenske tačke mogu se izvesti sa testom zapadnog blotovanja i protein je otkriven antitelom. Antitelo može biti oznaka proteina. Ako protein pokazuje jednu traku na zapadnoj, gde je veličina proteina identična veličini ubrizganog proteina, tada nije došlo do razgradnje. U ovom oglednom postupku, vremenska tačka u kojoj je 50% proteina razgrađeno, kako je određeno zapadnim blotovanjem ili ekvivalentnim tehnikama, je poluraspad razgradnje seruma ili „polu-raspad u serumu“ proteina.

[0093] Termin "t1/2", kako je ovde korišćen, označava terminusni polu-raspad izračunat kao ln(2)/Kel. Kelje konstanta brzine eliminacije terminusa izračunata linearnom regresijom krajnjeg linearnog dela koncentracije log prema vremenskoj krivoj. Polu-raspad se obično odnosi na vreme potrebno da se polovina količine davane supstance deponovane u živom organizmu metabolizuje ili eliminiše normalnim biološkim procesima. Termini "t1/2", "terminusni polu-raspad", "polu-raspad eliminacije" i "polu-raspad u cirkulaciji" ovde su korišćeni naizmenično.

[0094] "Aktivni klirens" označava mehanizme pomoću kojih se protein uklanja iz cirkulacije, osim filtracijom ili koagulacijom, i koji uključuje uklanjanje iz cirkulacije posredovane ćelijama, receptorima, metabolizmom ili razgradnjom proteina.

[0095] "Prividni faktor molekulske težine" i "prividna molekulska težina" povezani su pojmovi koji se odnose na meru relativnog povećanja ili smanjenja prividne molekulske težine izložene određenom sekvencom aminokiselina. Prividna molekulska težina se određuje korišćenjem hromatografije za isključivanje veličine (SEC) ili sličnim metodama poređenjem sa globularnim standardima proteina, a meri se u jedinicama "prividnog kD". Faktor prividne molekulske mase je odnos između prividne molekulske mase i stvarne molekulske mase; potonji je predvideo dodavanjem, na osnovu aminokiselinskog sastava, izračunate molekulske težine svake vrste aminokiselina u sastavu ili procenom poređenja sa standardima molekulske težine u SDS gela za elektroforezu.

[0096] Termini „hidrodinamički radijus“ ili „Stokes radijus“ su efektivni radijus (Rhu nm) molekula u rastvoru, mereno pretpostavljajući da je to telo koje se kreće kroz rastvor i

4

odupire se viskozitetu rastvora. U otelotvorenjima pronalaska, hidrodinamička merenja radijusa XTEN fuzionih proteina su u vezi sa „prividnim faktorom molekularne težine“, što je intuitivnija mera. "Hidrodinamički radijus" proteina utiče na brzinu difuzije u vodenom rastvoru kao i na njegovu sposobnost migracije u gelovima makromolekula. Hidrodinamički radijus proteina određuje se njegovom molekularnom težinom kao i njegovom strukturom, uključujući oblik i kompaktnost. Postupci za određivanje hidrodinamičkog radijusa su dobro poznati u stanju tehnike, kao što je korišćenje hromatografije za isključivanje veličine (SEC), kao što je opisano u patentima SAD br.6,406,632 i 7,294,513. Većina proteina ima globularnu strukturu, što je najkompaktnija trodimenzionalna struktura koju protein može imati sa najmanjim hidrodinamičkim radijusom. Neki proteini usvajaju nasumičnu i otvorenu, nestrukturiranu ili „linearnu“ konformaciju i kao rezultat toga imaju mnogo veći hidrodinamički radijus u poređenju sa tipičnim globularnim proteinima slične molekulske težine.

[0097] "Fiziološki uslovi" odnosi se na skup uslova u živom domaćinu, kao i in vitro uslove, uključujući temperaturu, koncentraciju soli, pH, koji oponašaju te uslove živog ispitanika. Osnovan je niz fiziološki relevantnih uslova za upotrebu in vitro ispitivanja. Uopšteno, fiziološki pufer sadrži fiziološku koncentraciju soli i podešava se na neutralni pH u opsegu od oko 6.5 do oko 7.8, a poželjno od oko 7.0 do oko 7.5. Različiti fiziološki puferi su navedeni u Sambrook i dr. (2001). Fiziološki relevantne temperature se kreću od oko 25°C do oko 38°C, a poželjno od oko 35°C do oko 37°C.

[0098] "Reaktivna grupa" je hemijska struktura koja se može povezati sa drugom reaktivnom grupom. Primeri reaktivnih grupa su amino grupe, karboksilne grupe, sulfhidrilne grupe, hidroksilne grupe, aldehidne grupe, azidne grupe. Neke reaktivne grupe se mogu aktivirati kako bi se olakšalo spajanje sa drugom reaktivnom grupom. Neograničavajući primeri aktiviranja su reakcija karboksilne grupe sa karbodiimidom, konverzija karboksilne grupe u aktivirani ester ili konverzija karboksilne grupe u azidnu funkciju.

[0099] "Sredstvo za kontrolisano oslobađanje", "sredstvo za sporo oslobađanje", "formulacija za deponovanje" i "sredstvo za trajno oslobađanje" koriste se naizmenično da bi se odnosilo na sredstvo koje može produžiti trajanje otpuštanja polipeptida predmetnog pronalaska u odnosu na trajanje otpuštanja kada polipeptid se daje u odsustvu sredstva. Različita otelotvorenja predmetnog pronalaska mogu imati različite brzine oslobađanja, što rezultira različitim terapijskim količinama.

[0100] Termini "antigen", "ciljni antigen" i "imunogen" su ovde korišćeni naizmenično da bi se odnosilo na strukturu ili odrednicu vezivanja za koju se fragment antitela ili terapeutski baziran na fragmentu antitela veže ili ima specifičnost protiv.

[0101] Termin "korisni teret" kako se ovde koristi odnosi se na protein ili peptidnu sekvencu koja ima biološku ili terapijsku aktivnost; pandan farmakoforu malih molekula. Primeri korisnih opterećenja uključuju, ali nisu ograničeni na, faktore koagulacije, citokine, enzime, hormone i faktore krvi i rasta.

[0102] Termin "antagonist", kako se ovde koristi, uključuje bilo koji molekul koji delimično ili u potpunosti blokira, inhibira ili neutralizuje biološku aktivnost izvornog polipeptida koji je ovde obelodanjen. Postupci za identifikaciju antagonista polipeptida mogu obuhvatati kontakt izvornog polipeptida sa molekulom kandidatovog antagonista i merenje detektabilne promene u jednoj ili više bioloških aktivnosti koje su normalno povezane sa izvornim polipeptidom. U kontekstu predmetnog pronalaska, antagonisti mogu da sadrže proteine, nukleinske kiseline, ugljene hidrate, antitela ili bilo koje druge molekule koji smanjuju efekat biološki aktivnog proteina.

[0103] Termin "agonist" se koristi u najširem smislu i uključuje bilo koji molekul koji oponaša biološku aktivnost izvornog polipeptida koji je ovde obelodanjen. Pogodni molekuli agonista specifično uključuju agonistička antitela ili fragmente antitela, fragmente ili varijante izvorne sekvence aminokiselina, izvornih polipeptida, peptida, malih organskih molekula, itd. Postupke za identifikovanje agonista izvornog polipeptida mogu obuhvatati kontaktiranje izvornog polipeptida sa kandidatom molekula agonista i merenje detektujuća promena jedne ili više bioloških aktivnosti koje su normalno povezane sa izvornim polipeptidom.

[0104] Kao što je ovde korišćeno, "lečenje" ili "tretiranje", "palijacija" ili "poboljšanje" koriste se naizmenično i znače davanje leka ili biološkog leka radi postizanja terapijske koristi, lečenja ili smanjenja ozbiljnosti postojećeg stanja ili postići profilaktičku korist, sprečiti ili smanjiti verovatnoću pojave ili ozbiljnosti pojave stanja. Pod terapeutskim benefitom podrazumeva se iskorenjivanje ili poboljšanje osnovnog stanja koje se leči ili

1

jednog ili više fizioloških simptoma povezanih sa osnovnim stanjem, tako da se opaža poboljšanje kod ispitanika, bez obzira na to da ispitanik i dalje može biti pogođen osnovnim stanjem.

[0105] "Terapeutski efekat" ili "terapeutska korist", kako se ovde koristi, odnosi se na fiziološki efekat, uključujući, ali ne ograničavajući se na ublažavanje, ublažavanje ili sprečavanje bolesti kod ljudi ili drugih životinja ili na drugi način da poboljša fizičko ili mentalno blagostanje ljudi ili životinje, što je rezultat primene fuzionisanog proteina predmetnog pronalaska, osim sposobnosti indukovanja proizvodnje antitela protiv antigenskog epitopa koji poseduje biološki aktivni protein. Radi profilaktičke koristi, sastavi se mogu davati ispitaniku za koji postoji rizik od razvoja određene bolesti, stanja ili simptoma bolesti (npr., krvarenja u dijagnosticiranom ispitaniku sa hemofilijom), ili ispitaniku koji izveštava o jednom ili više fizioloških simptomi bolesti, iako dijagnoza ove bolesti možda nije postavljena.

[0106] Termini "terapeutski efikasna količina" i "terapeutski efikasna doza", kako se ovde koristi, odnose se na količinu leka ili biološki aktivnog proteina, bilo samog ili kao deo fuzije proteinskih sastava, koja je sposobna da ima bilo koje detektibilne, blagotvorno dejstvo na bilo koji simptom, aspekt, mereni parametar ili karakteristike stanja ili stanja bolesti kada se daje ispitaniku u jednoj ili više doza. Takav efekat ne mora biti apsolutni da bi bio koristan. Određivanje terapeutski efikasne količine je u skladu sa sposobnostima stručnjaka, naročito u svetlu detaljnog obelodanjivanja koje je ovde dato.

[0107] Termin "terapeutski efikasan režim doza", kao što je ovde korišćen, odnosi se na raspored za uzastopno administrirane višestruke doze (tj., najmanje dve ili više) biološki aktivnog proteina, bilo sam ili kao deo fuzije proteinskih fuzija, pri čemu doze su date u terapeutski efikasnim količinama što rezultira stalnim blagotvornim efektom na bilo koji simptom, aspekt, mereni parametar ili karakteristike bolesti ili stanja.

I). GENERALNE TEHNIKE

[0108] Praksa predmetnog pronalaska koristi, ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike imunologije, biohemiju, hemiju, molekularnu biologiju, mikrobiologiju, ćelijsku biologiju, genetiku i rekombinantnu DNK, koje su u struci. Videti Sambrook, J. i dr., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; "Current protocols in molecular biology", F. M. Ausubel, i dr. eds., 1987; serije

2

"Methods in Enzymology," Academic Press, San Diego, CA.; "PCR 2: a practical approach", M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., Oxford University Press, 1995;

"Antibodies, a laboratory manual" Harlow, E. and Lane, D. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; "Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics," 11th Edition, McGraw-Hill, 2005; i Freshney, R.I., "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique," 4th edition, John Wiley & Sons, Somerset, NJ, 2000.

II). KOAGULACIONI FAKTOR VIII

[0109] Predmetni pronalazak se delom odnosi na sastave koji sadrže faktor VIII faktora koagulacije (CF) vezan za jedan ili više produženih rekombinantnih proteina (XTEN), što rezultira CFXTEN fuzionim proteinskim sastavom. Kako se ovde koristi, "CF" se odnosi na faktor VIII (FVIII) ili mimetike, varijante sekvenci i skraćene verzije FVIII, kao što je opisano u daljem tekstu.

[0110] "Faktor VIII" ili "FVIII" ili "protein FVIII" znači protein i vrste faktora koagulacije krvi (uključujući humani, svinjski, pasji, pacovski ili mišji FVIII protein) i njegove varijante sekvenci koje uključuju, ali nije ograničeno na 2351 amino prekursorski protein jednog lanca (sa peptidom hidrofobnog signala od 19 aminokiselina), kofaktorni protein 2332 aminokiselinske kiseline od približno 270-330 kDa sa domenskom strukturom A1-A2-B-A3-C1-C2, kao i ne-enzimski "aktivni" ili kofaktorni oblik FVIII (FVIIIa) koji je cirkulirajući heterodimer dva lanca koji se formiraju kao rezultat proteolitičkog deljenja nakon R1648 oblika teškog lanca sastavljenog od A1-A2-B (u rasponu od 90-220 kD) aminokiselina 1-1648 (numerisano u odnosu na zreli oblik FVITI) i lakog lanca A3-C1-C2 od 80 kDa aminokiselina 1649-2232, od kojih je svaka šematski prikazana na Sl.1. Dalje, i kao što je ovde korišćeno, svaki od A1, A2 i A3 domena obuhvata kisele razdelničke regione; a1, a2 i a3 kisele regione, respektivno. Dakle, razumeće se da CFXTEN konstrukti opisani kao da imaju domene A1, A2, A3, B, C1 i C2 uključuju a1, a2 i a3 kisele regione. Kao što se ovde koristi, „faktor VIII“ ili „FVIII“ ili „FVIII polipeptid“ takođe obuhvata varijante oblika, uključujući proteine sa supstitucijama, dodavanjima i/ili delecijama sve dok varijanta zadržava željenu biološku aktivnost, kao što je prokoagulantna aktivnost. Konstruisano je bezbroj funkcionalnih FVIII varijanti i mogu se koristiti kao rekombinantni FVIII proteini kako je ovde opisano. Videti PCT objavu br. WO 2011/069164 A2, WO 2012/006623 A2, WO 2012/006635 A2 ili WO 2012/006633 A2. Poznato je mnogo funkcionalnih FVIII varijanti. Pored toga, stotine nefunkcionalnih mutacija u FVIII identifikovane su kod pacijenata sa hemofilijom. Videti npr.., Cutler i dr., Hum. Mutat.19:274-8 (2002). Pored toga, poređenjem FVIII ljudi i drugih vrsta utvrđeni su sačuvani ostaci koji će verovatno biti potrebni za funkciju. Videti, npr., Cameron i dr., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998) i US 6,251,632.

[0111] U jednom otelotvorenju, ostaci humanog faktora VIII su definisani sledećim aminokiselinskim ostacima: A1, ostaci Ala1-Arg372; A2, ostaci Ser373-Arg740; B, ostaci Ser741-Arg1648; A3, ostaci Ser1649-Asn2019; C1, ostaci Lys2020-Asn2172; C2, ostaci Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 sekvenca uključuje ostatke Ser1649-Tyr2332. U drugom otelotvorenju, ostaci Arg336-Arg372 se obično nazivaju a1 region, a Arg372 se odvaja trombinom. U nekim otelotvorenjima, a2 region je deo A1 domena. U drugom otelotvorenju, ostaci Glu1649-Arg1689, nazivaju se kiselom regionom a3. U nekim otelotvorenjima, a3 kiseli region je deo A3 domena. U drugom otelotvorenju, izvorni protein FVIII ima sledeću formulu: A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2, gde su A1, A2, i A3 strukturno povezani „A domeni“, B je „B domen“, C1 i C2 su strukturno povezani „C domeni“, a a1, a2 i a3 su kiseli razdelnički regioni.

U prethodnoj formuli i odnosi se na položaj primarne aminokiseline u FTG. 30, A1 domen humanog FVIII proteže se od Ala1 do oko Arg336, razdelnički region se proteže od oko Met337 do Arg372, A2 domen se proteže od oko Ser373 do približno Tyr719, a2 razdelnički region se proteže od oko Glu720 do oko Arg740, domen B se proteže od oko Ser741 do oko Arg 1648, a3 razdelnički region se proteže od oko Glu1649 do oko Arg1689, A3 domen se proteže od oko Ser1690 do oko Asn2019, C1 domen se proširuje od oko Lys2020 do oko Asn2172, i C2 domen proteže se od otprilike Ser2173 do Tyr2332 (Saenko i dr., 2005, J Thromb Hemostasis, 1, 922-930). Pored specifičnih mesta proteolitičkog deljenja, označavanje mesta granica između domena i regiona FVIII može se razlikovati u različitim literaturama. Ograničene vrednosti ovde su označene kao približne upotrebom termina "otprilike".

[0112] Takav faktor VIII uključuje skraćene sekvence poput BDD sekvencija izbrisanih u kojima je deo ili većina sekvence B domena izbrisan (kao što su BDD sekvence otkrivene ili na koje se poziva u pat. SAD br.6,818,439 i 7,632,921). Primer BDD FVIII je REFACTO® ili XYNTHA® (rekombinantni BDD FVIII), koji sadrži prvi polipeptid koji odgovara aminokiselinama od 1 do 743 od Sl.30, spojeni sa drugim polipeptidom koji odgovara aminokiselinama 1638 do 2332 sa Sl.30. Primerni konstrukti BDD FVIII koji se mogu

4

koristiti za proizvodnju rekombinantnih proteina predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na FVIII, sa delecijom aminokiselina koje odgovaraju aminokiselinama 747-1638 zrelog humanog FVIII (Sl.30) (Hoeben R.C., i dr. J. Biol. Chem.265 (13): 7318-7323 (1990), i FVIII sa delecijom aminokiselina koje odgovaraju aminokiselinama 771-1666 ili aminokiselinama 868-1562 zrelog humanog FVIII (Sl.30) (Meulien P., i dr. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988).

[0113] Pored toga, sekvence koje uključuju heterologna umetanja ili supstitucije aminokiselina (kao što je asparaginska kiselina supstituisana valinom na položaju 75) ili jednolančani FVIII (scFVIII) u kojima su teški i laki lanci kovalentno povezani veznikom. Kao što se ovde koristi, "FVIII" je bilo koji funkcionalni oblik molekula faktora VIII sa tipičnim karakteristikama faktora koagulacije krvi VIII koji može da popravi nedostatak humanog faktora VIII kada se daje takvom ispitaniku, npr. ispitanik sa hemofilijom A. FVIII ili sekvencom varijante su izolovane, okarakterisane i klonirane, kao što je opisano u patentu SAD ili patentnim prijavama br.4,757,006; 4,965,199; 5,004,804; 5,198,349, 5,250,421; 5,919,766; 6,228,620; 6,818,439; 7,138,505; 7,632,921; i 20100081615.

[0114] Humani faktor VIII je kodiran genom u jednoj kopiji koja se nalazi na vrhu dugog kraka X hromozoma (q28). Sastoji se iz gotovo 186000 baznih parova (bp) i čini otprilike 0.1% X-hromozoma (White, G.C. and Shoemaker, C.B., Blood (1989) 73:1-12). Humana FVIII sekvenca aminokiselina je izvedena iz cDNK kao što je prikazano na slici Pat. SAD br.

4,965,199. Prirodno zreli humani FVIII dobijeni iz cDNK sekvence (tj., bez sekretornog signalnog peptida, ali pre druge post-translacijske obrade) predstavljen je kao Sl.3.

[0115] DNK koja kodira zrelu mRNK faktora VIII pronađena je u 26 zasebnih egzona veličine od 69 do 3,106 bp.25 internih regiona koji odvajaju egzone kreću se u veličini od 207 do 32,400 bp. Kompletni gen sastoji se od otprilike 9 kb egzona i 177 kb introna. Tri ponovljena A domena imaju približno 30% homolognosti sekvence. B domen sadrži 19 od približno 25 predviđenih mesta glikozilacije, a veruje se da A3 domen sadrži vezno mesto za von Willebrandov faktor. Tandem C domeni prate A3 domen i imaju približno 37% homolognosti jedni drugima (White, G.C. and Shoemaker, C.B., Blood (1989) 73:1-12).

[0116] B domen razdvaja domene A2 i A3 izvornog faktora FVIII u novo sintetizovanom jednolančanom molekulu prekursora. O tačnim granicama domena B različito se navodi da se protežu od aminokiselina 712 do 1648 prethodne sekvence (Wood i dr., Nature (1984) 312:330-337) ili aminokiseline 741-1648 (Pipe, SW, Haemophilia (2009) 15:1187-1196 i Pat. SAD br.7,560,107) ili aminokiseline 740-1689 (Toole, JJ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:5939-5942). Kako se ovde koristi, "B domen" znači aminokiseline 741-1648 zrelog faktora VIII. Kao što se ovde koristi, „brisanje domena FVIII B“ ili „FVIII BDD“ znači FVIII sekvenca sa bilo kojim izbrisanim fragmentom ili svim aminokiselinama 741 do 1648. U jednom otelotvorenju, varijante FVIII BDD zadržavaju preostale aminokiseline B domena sa kraja N-terminusa ("B1" kako se ovde koristi) i C-terminusa ("B2" kako se ovde koristi). U jednoj FVIII BDD varijanti ostaci aminokiselina iz domena B su SFSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO:1614). U jednoj varijanti FVIII BDD ostatak B1 je SFS, a B2 ostatak QNPPVLKRHQR (SEQ ID NO:1615). U drugoj FVIII BDD varijanti ostatak B1 je SFSQN (SEQ ID NO:1616) i B2 ostatak je PPVLKRHQR (SEQ ID NO:1617). Faktor VIII „izbrisan iz B-domena“, „FVIII BDD“ ili „BDD FVIII“ može imati potpuna ili delimična brisanja obelodanjena u Pat. SAD br.6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, i 6,458,563. U nekim otelotvorenjima, izbrisani faktor VIII B-domena sekvence iz predmetnog pronalaska sadrži bilo koje od brisanja koja su obelodanjena u kol.4, red 4 do kol. 5, red 28 i primeri 1-5 patenta SAD br.6,316,226 (takođe u SAD 6,346,513). U drugom otelotvorenju, faktor VIII sa izbrisanim B domenom je faktor VIII izbrisan iz B domena S743/Q1638 (SQ verzija faktora VIII) (npr., faktor VIII koji ima deleciju iz aminokiseline 744 u aminokiselinu 1637, npr., faktor VIII koji ima amino kiseline 1-743 i aminokiseline 1638-2332 pune dužine faktora VIII). U nekim otelotvorenjima, faktor VIII iz predmetnog pronalaska izbrisan B-domen ima brisanje obelodanjeni u kol.2, redovi 26-51 i primeri 5-8 patenta SAD br.5,789,203 (takođe SAD 6,060,447, SAD 5,595,886, i SAD 6,228,620). U nekim otelotvorenjima, faktor VIII sa izbrisanom iz B domena ima brisanje opisano u kol.1, red 25 do kol.2, red 40 od Patent SAD br.5,972,885; kol.6, redovi 1-22 i primer 1 iz patenta SAD br.6,048,720; kol.2, redovi 17-46 iz patenta SAD br.5,543,502; kol.4, red 22 do kol.

5, red 36 od patenta SAD br.5,171,844; kol.2, redovi 55-68, slika 2, i primer 1 iz patenta SAD br.5,112,950; kol.2, red 2 do kol.19, red 21 i tabela 2 od patenta SAD br.4,868,112; kol. 2, red 1 do kol.3, red 19, kol.3, red 40 do kol.4, red 67, kol.7, red 43 do kol.8, red 26, i kol. 11, red 5 do kol.13, red 39 od patenta SAD br.7,041,635; ili kol.4, redovi 25-53 od patenta SAD br.6,458,563. U nekim otelotvorenjima, izbrisani B-domen faktora VIII ima deleciju većine B domena, ali još uvek sadrži amino-terminusne sekvence B domena koji su neophodni za in vivo proteolitičku obradu primarnog proizvoda prevođenja u dva polipeptidna lanca, kako je obelodanjeno u WO 91/09122. U nekim otelotvorenjima, faktor VIII izbrisan iz B domene konstruisan je sa delecijom aminokiselina 747-1638, tj., praktično potpunim brisanjem B domena. Hoeben R.C., i dr. J. Biol. Chem.265 (13): 7318-7323 (1990). Faktor VIII izbrisan iz B domene takođe može sadržati brisanje aminokiselina 771-1666 ili aminokiselina 868-1562 iz faktora VIII. Meulien P., i dr. Protein Eng.2(4): 301-6 (1988). Dodatna brisanja domena B koja su deo pronalaska uključuju: delecija aminokiselina 982 do 1562 ili 760 do 1639 (Toole i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 do 1562 (Eaton, i dr. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 do 1646 (Kaufman (PCT patentna prijava br. WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, i dr., DNA (1987) 6:553-564)), 741 do 1648 (Pasek (PCT patentna prijava br.88/00831)), ili 816 do 1598 ili 741 do 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) br 82:16-25, EP 295597). Svaka od prethodnih brisanja može se izvršiti u bilo kojoj sekvenci faktora VIII koja se koristi u otelotvorenjima predmetnog pronalaska.

[0117] Proteini koji su uključeni u zgrušavanje uključuju faktor I, faktor II, faktor III, faktor IV, faktor V, faktor VI, faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor XI, faktor XII, faktor XIII, protein C i tkivni faktor (kolektivno ili pojedinačno „protein zgrušavanja“). Interakcija glavnih proteina zgrušavanja u unutrašnjim i spoljašnjim putevima zgrušavanja prikazana je na Sl.2. Većina proteina zgrušavanja prisutni su u obliku zimogena, ali kada se aktiviraju, pokazuju prokoagulantnu protezanu aktivnost u kojoj aktiviraju druge od proteina zgrušavanja, doprinoseći unutrašnjem ili spoljašnjem putu koagulacije i stvaranju ugrušaka. U svojstvenom putu kaskade koagulacije, FVIII se povezuje sa kompleksom aktiviranog faktora IX, faktora X, kalcijuma i fosfolipida. Heterodimer faktora VIII nema enzimsku aktivnost, ali heterodimer postaje aktivan kao kofaktor enzimskog faktora IXa nakon proteolitičke aktivacije trombinom ili faktorom Xa, pri čemu aktivnost faktora VIIIa karakteriše njegova sposobnost da formira mesto vezivanja za membranu za faktore IXa i X u konformaciji pogodnoj za aktiviranje faktora X faktorom IXa. Nakon deljenja trombinom, aktivirani FVIII (FVIIIa) se disocira od von Willebrandovog faktora i veže se na negativno naelektrisani fosfolipid PL, a rezultirajući kompleks učestvuje kao kofaktor faktora IXa u kompleksu koji aktivira faktor X (tenaza). Unutar C2 domena i aminokiselinskih ostataka 1649 do 1689 u domenu A3 nalaze se mesta vezivanja von Willebrandovog faktora (vWF) koja deluju na kompleks sa von Willebrandovim faktorom, rezultirajući cirkulišući kompleks štiti FVIII od brze razgradnje u krvi (Weiss HJ, i dr. Stabilizacija faktora VIII u plazmi pomoću Willebrandovog faktora. Ispitivanja o post-transfuziji i disociranom faktoru VIII i kod pacijenata sa von Willebrandovom bolešću. J Clin Invest (1977) 60:390).

[0118] Aktivirani faktor VIII je heterotrimer koji se sastoji od A1 domena i A2 domena i lakog lanca, uključujući domene A3-C1-C2. Aktivacija faktora IX postiže se dvostepenim uklanjanjem aktivacionog peptida (Ala 146-Arg 180) iz molekula (Bajaj i dr., Humani faktor IX i faktor IXa, u METODAMA U ENZIMOLOGIJI).1993). Prvo deljenje se vrši na mestu Arg 145-Ala 146 ili faktor XIa ili faktor Vila/tkivni faktor. Drugo deljenje koje ograničava brzinu je napravljeno na Arg 180-Val 181. Aktivacijom se uklanja 35 ostataka. Aktivirani humani faktor IX postoji kao heterodimer teškog lanca C (28 kDa) i lakog lanca N-terminusa (18 kDa), koji su spojeni jednim disulfidnim mostom koji veže enzim na domenu Gla. Faktor IXa zauzvrat aktivira faktor X zajedno sa aktiviranim faktorom VIII. Alternativno, faktori IX i X mogu se aktivirati faktorom Vila složenim faktorom lipidiranog tkiva, generisanim spoljašnjim putem. Faktor Xa zatim učestvuje u konačnom zajedničkom putu po kome se protrombin pretvara u trombin, a trombin zauzvrat pretvara fibrinogen u fibrin da bi stvorio ugrušak.

[0119] Defekti u procesu koagulacije mogu dovesti do poremećaja krvarenja (koagulopatije) u kojima se produžava vreme potrebno za stvaranje ugruška. Takvi nedostaci mogu biti urođeni ili stečeni. Na primer, hemofilija A i B su nasledne bolesti koje karakterišu nedostatak u FVIII i FIX, respektivno. Izrazito različit, biološki aktivni faktor VIII ispravlja grešku koagulacije u plazmi koja potiče od pojedinaca obolelih od hemofilije A.

Rekombinantna FVIII pokazala se efikasnom i odobrena je za lečenje hemofilije A kod odraslih i pedijatrijskih pacijenata, a takođe se koristi za zaustaviti epizode krvarenja ili sprečiti krvarenje povezano sa traumom i/ili operacijom. Trenutna terapijska upotreba faktora VIII može biti problematična u lečenju osoba koje pokazuju nedostatak faktora VIII, kao i onih koji imaju Von Willebrandovu bolest. Pored toga, pojedinci koji primaju faktor VIII u terapiji zamenjivanja često razvijaju antitela na ove proteine koji često smanjuju ili eliminišu aktivnost prokoagulanse vezanog FVIII. Nastavak lečenja je izuzetno težak zbog prisustva ovih antitela koja smanjuju ili negiraju efikasnost lečenja.

[0120] U jednom aspektu, pronalazak razmatra uključivanje FVIII sekvence u sastave CFXTEN fuzionih proteina koji su identični humani FVIII, sekvence koje imaju homolognost sa sekvencama FVIII, sekvencije koje su prirodne, kao što su ljudi, primati, osim čoveka, sisari (uključujući domaće životinje), ili skraćena verzija FVIII; od kojih svi zadržavaju barem deo aktivnosti prokoagulantne nativne FVIII i koji su korisni za sprečavanje, lečenje, posredovanje ili ublažavanje hemofilije A ili epizoda krvarenja u vezi sa traumom, hirurškim zahvatom ili nedostatkom faktora koagulacije VIII. Sekvence s homologijom prema FVIII mogu se naći pomoću standardnih tehnika pretraživanja homologije, kao što su NCBI BLAST, ili u javnim bazama podataka, kao što su Chemical Abstracts Services Databases (npr., CAS Registry), GenBank, The Universal Protein Resource (UniProt) i pretplatu osigurane baze podataka kao što su GenSeq (npr., Derwent).

[0121] U jednom otelotvorenju, FVIII ugrađen u predmetne sastave CFXTEN je rekombinantni polipeptid sa sekvencom koja odgovara proteinu FVIII koji se nalazi u prirodi. U drugom otelotvorenju, FVIII je varijanta, fragment, homolog ili mimetik prirodne sekvence koja nije prirodna sekvenca FVIII koja zadržava bar deo prokoagulantne aktivnosti odgovarajućeg izvornog FVIII. U drugom otelotvorenju, FVIII je skraćena varijanta sa izbrisanim celim ili delom B domena ("FVIII BDD"), koji može biti u heterodimernom obliku ili može ostati kao jednolančani ("scFVIII"), koji je potonji opisan u Meulien i dr., Protein Eng. (1988) 2(4):301-306. Neograničavajući primeri FVIII BDD su sekvence faktora VIII u kojima su aminokiseline izbrisane između broja 741 ostatka i broja ostatka 1640 (numerisani u odnosu na matični, zreli FVIII), ili između broja ostatka 745 i broja ostatka 1640, ili između broja ostatka 745 i broj ostatka 1640, ili između broja ostatka 741 i broja ostatka 1690, ili između broja ostatka 745 i broja ostatka 1667, ili između broja ostatka 745 i broja ostatka 1657, ili između broja ostatka 747 i broja ostatka 1642, ili između broja ostatka 751 i broj ostatka 1667.

[0122] U drugom otelotvorenju, heterologne sekvence su ugrađene u FVIII, koji mogu uključivati XTEN, kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu. Tabela 1 daje neograničenu listu aminokiselinskih sekvenci FVIII koje su obuhvaćene CFXTEN fuzionim proteinima iz predmetnog pronalaska. U nekim otelotvorenjima, FVIII ugrađeni u CFXTEN fuzione proteine uključuju proteine koji imaju bar oko 70% identičnost sekvenci, ili alternativno 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa sekvencom aminokiselina slične dužine, izabranim iz Tabela 1.

Tabela 1: FVIII sekvence aminokiselina

1

2

4

[0123] Predmetni pronalazak takođe razmatra CFXTEN pronalazeći FVIII sa različitim delecijama aminokiselina, ubacivanjima i supstitucijama načinjenim u sekvencama FVIII tabele 1 koje zadržavaju prokoagulantnu aktivnost. Primeri konzervativnih supstitucija za aminokiseline u polipeptidnim sekvencama su prikazani u Tabeli 2. U otelotvorenjima CFXTEN u kojima je identitet sekvence FVIII manji od 100% u poređenju sa specifičnom sekvencom koja je ovde obelodanjena, pronalazak razmatra supstituciju bilo koje od ostalih 19 prirodnih L-aminokiselina za dati aminokiselinski ostatak datog FVIII, koji može biti u bilo kom položaju unutar sekvence FVIII, uključujući susedne aminokiselinske ostatke. Ako bilo koja supstitucija rezultira neželjenom promenom aktivnosti prokoagulantne supstance, tada se može primeniti jedna od alternativnih aminokiselina i konstruktivni protein proceniti ovde opisanim postupcima (npr., ispitivanja Tabele 49), ili korišćenjem bilo koje od tehnika i smernica za konzervativne i nekonzervativne mutacije izložene, na primer, u Pat. SAD 5,364,934, ili koristeći postupke opšte poznate u stanju tehnike. U poželjnoj supstituciji, FVIII komponenta otelotvorenja CFXTEN je modifikovana zamenom ostatka R1648 (numerisanog u odnosu na matični zreli oblik FVIII) glicinom ili alaninom da bi se sprečila proteolitička obrada u heterodimerni oblik. U drugoj supstituciji, FVIII komponenta realizacije CFXTEN je modifikovana zamenom ostatka Y1680 (numerisanog u odnosu na matični zreli oblik FVIII) sa fenilalaninom. U drugom otelotvorenju, komponenta FVIII otelotvorenja CFXTEN je modifikovana zamenom ostatka Y1680 (numerisanog u odnosu na matični zreli oblik FVIII) fenilalaninom, a ostatak R1648 (numerisan u odnosu na matični zreli oblik FVIII) glicinom ili alaninom.

[0124] U jednom otelotvorenju, FVIII sastavi fuzionog proteina ima jednu ili više aminokiselinskih supstitucija dizajniranih da smanje vezanje FVIII inhibitora na epitopima prepoznatim antitelom iz Tabele 9, uključujući, ali ne ograničavajući se na supstitucije na Lys(377), Lys(466), Lys(380), Ser(488), Arg(489), Arg(490), Leu(491), Lys(493), Lys(496), His(497), Lys(499), Lys(512), Lys(523), Lys(556), Met (2199), Phe(2200), Leu(2252), Val(2223), i Lys(2227). Pored toga, varijante mogu da uključuju, na primer, polipeptide u kojima se dodaju ili brišu jedan ili više aminokiselinskih ostataka na ili u blizini N- ili C-terminusa celokupne izvorne sekvence aminokiselina ili domena dugog FVIII kao što varijanta zadržava neku, ako ne i svu prokoagulantnu aktivnost izvornog peptida. Dobijene FVIII sekvence koje zadržavaju barem deo (npr., najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili najmanje 95% ili više) prokoagulantne aktivnosti u poređenju sa izvornim cirkulišućim FVIII smatra se korisnim za sastave fuzionih proteina predmetnog pronalaska. Primeri FVIII varijanti su poznati u struci, uključujući one opisane u patentu SAD i

1

patentnim prijavama br.6,316,226; 6,818,439; 7,632,921; 20080227691. U jednom otelotvorenju, varijanta FVIII sekvence ima asparaginsku kiselinu supstituisanu valinom na položaju aminokiselina 75 (numerisana u odnosu na matični zreli oblik FVIII).

Tabela 2: Primeri supstitucija konzervativnih aminokiselina

III). PROŠIRENI PREPORUČENI POLIPEPTIDI

2

[0125] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje XTEN polipeptidne sastave koji su korisni kao partner(i) fuzionog proteina da bi se povezali i/ili uklopili u FVIII polipeptid, što rezultira CFXTEN fuzionim proteinom. XTEN su generalno polipeptidi sa prirodno prisutnim, u osnovi neprekidnim sekvencama koje imaju nizak stepen sekundarne ili tercijarne strukture pod fiziološkim uslovima. XTEN obično ima od oko 36 do oko 3000 aminokiselina od kojih su većina ili ceo deo male hidrofilne aminokiseline. Kao što je ovde korišćeno, "XTEN" posebno izuzima cela antitela ili fragmente antitela (npr. jednolančana antitela i Fc fragmenti). XTEN polipeptidi imaju korisnost kao partneri fuzionog proteina u tome što oni obavljaju različite uloge, dodeljujući određena poželjna farmakokinetička, fizičko-hemijska, farmakološka i farmaceutska svojstva kada su povezana sa FVIII proteinom da bi stvorili CFXTEN fuzioni protein. Takvi sastavi CFXTEN fuzionih proteina imaju poboljšana svojstva u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nisu povezani sa XTEN, što ih čini korisnim u lečenju određenih stanja povezanih sa nedostatkom FVIII ili poremećajima krvarenja, kako je dole detaljnije opisano.

[0126] Kriterijumi za izbor XTEN za fuziju sa FVIII proteinom koji se koriste za stvaranje sastava fuzionih proteina prema pronalasku se uglavnom odnose na atribute fizičkih/hemijskih svojstava i konformacionu strukturu XTEN koji se zauzvrat koriste za dodelu poboljšanih farmaceutskih, farmakoloških i farmakokinetička svojstva sastava FVIII fuzionih proteina. Nestrukturirana karakteristična i fizička/hemijska svojstva XTEN rezultat su, delom, od celokupnog sastava aminokiselina nesrazmerno ograničenih na 4-6 hidrofilnih aminokiselina, povezivanja aminokiselina u kvantitativno repetitivnom dizajnu i dužine XTEN polipeptid. U povoljnoj karakteristici koja je zajednička XTEN, ali je neuobičajena za polipeptide, svojstva XTEN ovde otkrivena nisu vezana za apsolutne primarne sekvence aminokiselina, o čemu svedoči raznolikost oglednih sekvenci Tabele 4, koje u različitim rasponima dužina imaju slične vrednosti svojstva od kojih su mnoga dokumentovana u Primerima. XTEN predmetnog pronalaska može da pokazuje jedno ili više, ili svih sledećih povoljnih svojstava: nestruktuirana konformacija, konformaciona fleksibilnost, povećana rastvorljivost u vodi, visok stepen otpornosti na proteazu, niska imunogenost, slabo vezanje za receptore sisara, definisan stepen naelektrisanja i povećani hidrodinamički (ili Stokes) radijusi; svojstva koja ih mogu učiniti korisnim kao partneri fuzionih proteina.

Neograničavajući primeri poboljšanih svojstava koja XTEN daje fuzionim proteinima koji sadrže FVIII spojen sa XTEN, u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN, uključuju povećanje ukupne rastvorljivosti i/ili metaboličke stabilnosti, smanjenu osetljivost na proteolizu, smanjenu imunogenost, smanjenu brzina apsorpcije kada se daje subkutano ili intramuskularno, smanjeno vezivanje za FVIII receptore klirensa, smanjena reaktivnost na antitela protiv korisnog opterećenja, poboljšane interakcije sa supstratom i/ili pojačana farmakokinetička svojstva kada se daju ispitaniku. Pojačana farmakokinetička svojstva preparata CFXTEN u poređenju sa FVIII koji nisu povezani sa XTEN uključuju duži terminusni polu-raspad (npr., dvostruki, trostruki, četvorostruki ili više), povećanu površinu ispod krive (npr., 25%, 50%, 100% ili više), manja zapremina distribucije i pojačana apsorpcija nakon potkožne ili intramuskularne injekcije (prednost u odnosu na komercijalno dostupne oblike FVIII koji se moraju davati intravenski). Pored toga, veruje se da CFXTEN sastavi koji sadrže sekvence deljenja (detaljnije opisane ispod) omogućavaju trajno oslobađanje biološki aktivnog FVIII, tako da primenjeni CFXTEN deluje kao skladište. Specifično se predviđa da fuzioni proteini CFXTEN pronalaska mogu da pokazuju jednu ili više ili bilo koju kombinaciju ovde poboljšanih svojstava. Kao rezultat ovih poboljšanih svojstava, veruje se da CFXTEN sastavi dozvoljavaju manje često doziranje u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN kada se primenjuje u uporedivim dozama. Ovakvi sastavi CFXTEN fuzionih proteina imaju korisnost u lečenju određenih stanja povezanih sa faktorom VIII, kao što je ovde opisano.

[0127] U oblasti su poznati različiti postupci i ispitivanja za određivanje fizičkih/hemijskih svojstava proteina, kao što su CFXTEN sastava koji sadrže XTEN. Takva svojstva uključuju, ali nisu ograničena na sekundarnu ili tercijarnu strukturu, rastvorljivost, agregacija proteina, stabilnost, apsolutnu i prividnu molekularnu težinu, čistoću i jednoličnost, svojstva topljenja, zagađenje i sadržaj vode. Postupci ispitivanja ovih svojstava uključuju analitičko centrifugiranje, EPR, HPLC-jonsku razmenu, isključenje veličine HPLC, HPLC-reverznu fazu, rasipanje svetlosti, kapilarnu elektroforezu, kružni dihroizam, diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju, fluorescenciju, HPLC-jonsku razmenu, isključenje veličine HPLC , IR, NMR, Ramanska spektroskopija, refraktometrija i UV/Vidljiva spektroskopija. Dodatni postupci su obelodanjeni u Arnau, i dr., Prot Expr and Purif (2006) 48, 1-13.

[0128] XTEN komponente CFXTEN dizajnirane su tako da se ponašaju kao denaturirane peptidne sekvence u fiziološkim uslovima, uprkos produženoj dužini polimera.

"Denaturirano" opisuje stanje peptida u rastvoru za koje je karakteristična velika konformaciona sloboda peptidnog glavnog lanca. Većina peptida i proteina usvaja denaturiranu konformaciju u prisustvu visokih koncentracija denaturanata ili na povišenoj

4

temperaturi. Peptidi u denaturiranoj konformaciji imaju, na primer, karakteristične spektralne kristale dihroizma (CD) i karakteriše ih nedostatak interakcija dugog dometa kako je utvrđeno pomoću NMR. "Denaturirana konformacija" i "nestrukturirana konformacija" ovde se koriste sinonimno. U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža XTEN sekvence koje su u fiziološkim uslovima uglavnom lišene sekundarne strukture. U drugim slučajevima, XTEN sekvence su uglavnom lišene sekundarne strukture pod fiziološkim uslovima, tako da XTEN može da usvoji nasumičnu konformaciju zavojnice. "Veoma lišen", kako se koristi u ovom kontekstu, znači da najmanje 50% XTEN aminokiselinskih ostataka XTEN sekvence ne doprinosi sekundarnoj strukturi merenoj ili određenoj na način opisan ovde. "Suštinski lišen", kako se koristi u ovom kontekstu, znači da najmanje oko 60%, ili oko 70%, ili oko 80%, ili oko 90%, ili oko 95%, ili barem oko 99% XTEN aminokiseline ostaci XTEN sekvence ne doprinose sekundarnoj strukturi, mereno ili određeni postupcima opisanim ovde.

[0129] U struci su ustanovljeni različiti postupci da se utvrdi prisustvo ili odsustvo sekundarnih i tercijarnih struktura u datom polipeptidu. Naročito se sekundarna struktura može meriti spektrofotometrijski, npr., kružnom dihroizmom spektroskopijom u spektralnom području „far-UV“ (190-250 nm). Elementi sekundarne strukture, poput alfa-heliksa i betalista, stvaraju karakterističan oblik i veličinu CD spektra, kao i nedostatak ovih elemenata strukture. Sekundarna struktura se takođe može predvideti za polipeptidnu sekvencu preko određenih računarskih programa ili algoritama, poput dobro poznatog Chou-Fasman algoritma (Chou, P. Y., i dr. (1974) Biochemistry, 13: 222-45) i Garnier-Osguthorpe-Robson ("GOR") algoritma (Garnier J, Gibrat JF, Robson B. (1996), GOR postupka za predviđanje sekundarne strukture proteina iz sekvence aminokiselina. Methods Enzymol 266:540-553), kao što je opisano u patentnoj prijavi SAD br.20030228309A1. Za datu sekvencu, algoritmi mogu predvideti da li postoji uopšte neka ili nema sekundarne strukture, izražene kao ukupni i/ili procenat ostataka sekvence koji formiraju, na primer, alfa-helikos ili beta-listove ili procenat ostaci sekvence za koje se predviđa da će rezultirati u slučajnom stvaranju zavojnice (kojoj nedostaje sekundarna struktura).

[0130] U jednom otelotvorenju, XTEN sekvence korišćene u predmetnim sastavima fuzionih proteina imaju procenat alfa-heliksa u rasponu od 0% do manje od oko 5% kako je određeno Chou-Fasman algoritmom. U drugom otelotvorenju, XTEN sekvence u predmetnim sastavima fuzionih proteina imaju procenat beta-listova u rasponu od 0% do manje od oko 5% kako je određeno Chou-Fasman algoritmom. U nekim otelotvorenjima, XTEN sekvence sastava fuzionih proteina imaju procenat alfa-heliksa u rasponu od 0% do manje od oko 5% i procenat beta-lista u rasponu od 0% do manje od oko 5% kako je utvrđeno Chou-Fasman algoritam. U nekim otelotvorenjima, XTEN sekvence sastava fuzionih proteina imaju procenat alfa-heliksa manji od oko 2% i procenat beta-lista manji od oko 2%. XTEN sekvence sastava fuzionih proteina imaju visok stepen slučajnih zavojnica, što je određeno GOR algoritmom. U nekim otelotvorenjima, XTEN sekvenca ima najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, i najpoželjnije najmanje oko 99% nasumičnih zavojnica, kako je utvrđeno algoritmom GOR. U nekim otelotvorenjima, XTEN sekvence sastava fuzionih proteina imaju procenat alfa-heliksa u rasponu od 0% do manje od oko 5% i procenat beta-lista u rasponu od 0% do manje od oko 5% kako je određeno Chou-Fasman algoritmom i najmanje oko 90% nasumičnih zavojnica, kako je utvrđeno algoritmom GOR. U drugim otelotvorenjima, XTEN sekvence sastava fuzionih proteina imaju procenat alfa-heliksa u rasponu od 0% do manje od oko 2% i procenat beta-lista u rasponu od 0% do manje od oko 2% najmanje oko 90% nasumičnih zavojnica, kako je utvrđeno algoritmom GOR.

1. Neponavljajuće sekvence

[0131] Zamišljeno je da se XTEN sekvence otelotvorenja CFXTEN u osnovi ne ponavljaju. Uopšteno, nizovi koji se ponavljaju aminokiselinama imaju tendenciju nagomilavanja ili formiranja struktura višeg reda, kao što su primeri prirodnih ponavljajućih sekvenci kao što su kolageni i leucinski zatvarači. Ove ponavljajuće aminokiseline mogu takođe imati tendenciju da formiraju kontakte što rezultira u kristalnim ili pseudokristalnim strukturama. Suprotno tome, mala tendencija neprekidnih sekvencija da se nagomilavaju omogućava dizajniranje XTEN duge sekvence sa relativno niskom frekvencijom naelektrisanih aminokiselina koje bi se inače verovale da bi se nagomilale ako bi se sekvence ponavljale. Neponovljivost ispitanikovog XTEN može se uočiti procenom jedne ili više sledećih karakteristika. U jednom otelotvorenju, "suštinski neponavljajuća" XTEN sekvenca ima oko 36, ili najmanje 72, najmanje 96, ili najmanje 144, ili najmanje 288, ili najmanje 400, ili najmanje 500, ili najmanje 600, ili najmanje 700, ili najmanje 800, ili najmanje 864, ili najmanje 900, ili najmanje 1000, ili najmanje 2000, do oko 3000 ili više aminokiselinskih ostataka, ili ima dužinu u rasponu od oko 36 do oko 3000, oko 100 do oko 500, oko 500 do oko 1000, oko 1000 do oko 3000 aminokiselina i ostataka, u kojima nijedna od tri susedne aminokiseline u nizu nisu identične aminokiselinske vrste, osim ako je aminokiselina serin, u kom slučaju najviše tri susedne aminokiseline su ostaci serina. U drugom otelotvorenju, kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu, "bitno ne ponavljajuća" XTEN sekvenca sadrži motive od 9 do 14 aminokiselinskih ostataka gde se motivi sastoje od 4 do 6 vrsta aminokiselina odabranih između glicina (G), alanina (A ), serin (S), treonin (T), glutamat (E) i prolin (P), i pri čemu se niz bilo kog ostatka aminokiselina u bilo kojem motivu ne ponavlja više od dva puta u sledu motiva.

[0132] Stepen ponavljanja polipeptida ili gena može se meriti računarskim programima ili algoritmima ili drugim sredstvima poznatim u struci. Prema sadašnjem pronalasku, ovde su obelodanjeni algoritmi koji će se koristiti za izračunavanje stepena ponavljanja određenog polipeptida, kao što je XTEN, a dati su primeri sekvenci koje analiziraju algoritmi (videti Primere, ispod). U jednom aspektu, ponavljanje polipeptida unapred određene dužine može se izračunati (u daljem tekstu „ocena podsekvence“) prema formuli datoj u Jednačini 1:

Ocena podsekvence

gde: m = (dužina aminokiseline polipeptida) - (dužina aminokiseline podsekvence) 1; i Broji= kumulativni broj pojava svake jedinstvene sekvence unutar sekvencei

[0133] Algoritam nazvan "SegScore" razvijen je da primeni prethodnu jednačinu za kvantitativnu ponavljanje polipeptida, poput XTEN, obezbeđujući ocenu podsekvence gde sekvence unapred određene dužine aminokiselina "n" analiziraju na ponavljanje određivanjem broja puta ("broji") jedinstvena sekvencija dužine "s" pojavljuje se u zadanoj dužini, deljenoj sa apsolutnim brojem podsekvenci unutar unapred određene dužine sekvence. Sl. 27 prikazuje dijagram toka algoritma SegScore, dok Sl.28 prikazuje šemu načina izračunavanja ocene podsekvence za fiktivni XTEN sa 11 aminokiselina i dužinom podsekvence e od 3 aminokiselinska ostatka. Na primer, unapred određena dužina polipeptida od 200 aminokiselinskih ostataka ima 192 preklapajuće sekvence 9-aminokiselina i 1983-mer podsekvence, ali ocena vrednosti podsekvence bilo kog polipeptida će zavisiti od apsolutnog broja jedinstvenih sekvenci i od toga koliko često će svaka jedinstvena sekvencija (što znači različitu sekvencu aminokiselina) pojavljuje se u unapred određenoj dužini sekvence.

[0134] U kontekstu predmetnog pronalaska, "ocena podsekvence" označava zbir pojavljivanja svakog jedinstvenog 3-mer okvira kroz 200 uzastopnih aminokiselina kumulativnog XTEN polipeptida podeljenog sa apsolutnim brojem jedinstvenih 3-mer sekvenci unutar sekvence 200 aminokiselina. Primeri takvih ocena podsekvence izvedenih iz 200 uzastopnih aminokiselina ponavljajućih i neponavljajućih polipeptida su predstavljeni u Primeru 45. U jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN koji sadrži jedan XTEN u kome XTEN ima naknadnu ocenu manju od 12, poželjnije manju od 10, poželjnije manju od 9, poželjnije manju od 8, poželjnije manju od 7, poželjnije manje od 6, a najpoželjnije manje od 5. U drugom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN koji sadrži najmanje dva do oko šest XTEN u kojima 200 aminokiselina XTEN ima ocenu podsekvence manje od 10, poželjnije manje od 9, poželjnije manje od 8, poželjnije manje od 7 , poželjnije manje od 6 i najpoželjnije manje od 5. U otelotvorenjima sastava fuzionih proteina CFXTEN ovde opisanih, XTEN komponenta fuzionog proteina sa ocenom podsekvence 10 ili manjim (tj., 9, 8, 7, itd.) takođe se u osnovi ne ponavlja.

[0135] Veruje se da neponavljajuća karakteristika XTEN predmetnog pronalaska, zajedno sa određenim tipovima aminokiselina koje preovlađuju u XTEN, pre nego apsolutna primarna sekvenca, daje mnoga poboljšana fizičko-hemijska i biološka svojstva CFXTEN fuzionih proteina. Ova poboljšana svojstva uključuju veći stepen ekspresije fuzionog proteina u ćeliji domaćinu, veću genetsku stabilnost gena koji kodira XTEN, veći stepen rastvorljivosti, manju tendenciju ka agregaciji i poboljšanu farmakokinetiku rezultujućeg CFXTEN u poređenju sa fuzionim proteinima koji sadrže polipeptidi koji imaju ponavljajuće sekvence. Ova poboljšana svojstva omogućavaju efikasniju proizvodnju, niže troškove robe i olakšavaju formulaciju farmaceutskih sastava koji sadrže XTEN koji sadrže izuzetno visoke koncentracije proteina, u nekim slučajevima veće od 100 mg/ml. Pored toga, XTEN polipeptidne sekvence otelotvorenja su dizajnirane da imaju nizak stepen unutrašnjeg ponavljanja da bi se smanjila ili suštinski eliminisala imunogenost kada se daje sisaru.

Polipeptidne sekvence sastavljene od kratkih, ponovljenih motiva koji su uglavnom ograničeni na samo tri aminokiseline, poput glicina, serina i glutamata, mogu rezultirati relativno visokim titrima antitela kada se daju sisaru uprkos nedostatku predviđenih epitopa T-ćelija u ovim sekvencama. Ovo može biti uzrokovano ponavljajućom prirodom polipeptida, jer je pokazano da su imunogeni sa ponovljenim epitopima, uključujući proteinske agregate, umrežene imunogene i ponavljajuće ugljene hidrate, visoko imunogeni i da mogu, na primer, dovesti do umrežavanja B-ćelijskih receptora koji izazivaju aktivaciju B-ćelija. (Johansson, J., i dr. (2007) Vaccine, 25 :1676-82 ; Yankai, Z., i dr. (2006) Biochem Biophys Res Commun, 345 :1365-71 ; Hsu, C. T., i dr. (2000) Cancer Res, 60:3701-5);

Bachmann MF, i dr. Eur J Immunol. (1995) 25(12):3445-3451).

2. Primerni motiva sekvence

[0136] Predmetni pronalazak obuhvata TEN koji se koristi kao fuzioni partneri koji sadrže više jedinica kraćih sekvenci ili motiva, pri čemu se aminokiselinske sekvence motiva ne ponavljaju. Neponavljajuće svojstvo je zadovoljeno uprkos korišćenju pristupa "gradivnom bloku" koristeći biblioteku sekvencijalnih motiva koji su multimerizirani za stvaranje XTEN sekvenci. Prema tome, dok se XTEN sekvenca može sastojati od više jedinica od čak četiri različite vrste sekvencijskih motiva, jer se sami motivi obično sastoje od ponavljajućih aminokiselinskih sekvenci, celokupna XTEN sekvenca je dizajnirana tako da se sekvenca suštinski ne ponavlja.

[0137] U jednom otelotvorenju, XTEN ima suštinski ponavljajuću sekvencu veću od oko 36 do oko 3000, ili oko 100 do oko 2000, ili oko 144 do oko 1000 aminokiselinskih ostataka, ili čak i duže, pri čemu je najmanje oko 80%, ili najmanje oko 85%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 97%, ili oko 100% XTEN sekvence, sastoji se iz motiva koji se preklapaju, i gde svaki od motiva ima oko 9 do 36 aminokiselinskih ostataka. U drugim otelotvorenjima, najmanje oko 80%, ili najmanje oko 85%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 97%, ili oko 100%, XTEN sekvence, se sastoji od nepreklapajući motivi sekvence pri čemu svaki od motiva ima 9 do 14 aminokiselinskih ostataka. U drugim otelotvorenjima, najmanje oko 80%, ili najmanje oko 85%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 97%, ili oko 100%, XTEN sekvence, se sastoji od ne-preklapajući motivi sekvence pri čemu svaki od motiva ima 12 aminokiselinskih ostataka. U ovim otelotvorenjima, poželjno je da se motivi sekvenci sadrže u osnovi (npr., 90% ili više) ili isključivo male hidrofilne aminokiseline, tako da celokupna sekvenca ima nestrukturiranu, fleksibilnu karakteristiku. Primeri aminokiselina koje su uključene u XTEN su, na primer, arginin, lizin, treonin, alanin, asparagin, glutamin, aspartat, glutamat, serin i glicin. Kao rezultat ispitivanja promenljivih poput optimizacije kodona, montaže polinukleotida koji kodiraju motive sekvenci, ekspresije proteina, raspodele naelektrisanja i rastvorljivosti eksprimiranog proteina i sekundarne i tercijarne strukture, otkriveno je da su XTEN sastavi sa poboljšanim karakteristikama ovde ili isključivo obelodanjeni, uključuju ostatke glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P), pri čemu su sekvence oblikovane tako da se uglavnom ne ponavljaju. U jednom otelotvorenju, XTEN sekvence imaju pretežno četiri do šest vrsta aminokiselina odabranih između glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) ili prolina (P) koji su smešteni u suštinski ne ponavljajuća sekvenca veća od oko 36 do oko 3000, ili oko 100 do oko 2000, ili dužine od oko 144 do oko 1000 aminokiselina. U nekom otelotvorenju, XTEN sekvenca je napravljena od 4, 5 ili 6 vrsta aminokiselina odabranih iz grupe koja se sastoji iz glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) ili prolin (P). U nekim otelotvorenjima, XTEN ima sekvence veće od oko 36 do oko 1000, ili oko 100 do oko 2000, ili oko 400 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka, pri čemu se najmanje oko 80% sekvence sastoji od nepreklapajućih motiva sekvenci, pri čemu svaki motiv sadrži 9 do 36 aminokiselinskih ostataka i gde najmanje 90%, ili najmanje 91%, ili najmanje 92%, ili najmanje 93%, ili najmanje 94%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96% ili najmanje 97% ili 100% svakog motiva obuhvata 4 do 6 vrsta aminokiselina odabranih između glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolin (P), i pri čemu sadržaj bilo koje vrste aminokiselina u XTEN celih dužina ne prelazi 30%. U ostalim otelotvorenjima, najmanje oko 90% XTEN sekvence sastoji se iz motiva koji se preklapaju sa sekvencama gde svaki od motiva ima 9 do 36 aminokiselinskih ostataka gde se motivi sastoje od 4 do 6 vrsta aminokiselina odabranih između glicina (G), alanin (A), serin (S), treonin (T), glutamat (E) i prolin (P) i pri čemu sadržaj bilo koje vrste jedne aminokiseline u XTEN cele dužine ne prelazi 40%, ili oko 30%, ili 25%, ili oko 17%. U ostalim otelotvorenjima, najmanje oko 90% XTEN sekvence sastoji se iz motiva koji se preklapaju sa sekvencama gde svaki od motiva ima 12 aminokiselinskih ostataka gde se motivi sastoje od 4 do 6 vrsta aminokiselina odabranih između glicina (G), alanin (A), serin (S), treonin (T), glutamat (E) i prolin (P) i pri čemu sadržaj bilo koje vrste jedne aminokiseline u XTEN cele dužine ne prelazi 40%, ili 30%, ili oko 25%. U dodatnim otelotvorenjima, najmanje oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98% ili oko 99%, do oko 100% XTEN sekvence sastoji se od motiva preklapajuće sekvence gde svaki od motiva ima 12 aminokiselinskih ostataka koji se sastoje iz glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamat (E) i prolin (P).

[0138] U još nekim otelotvorenjima, XTEN sadrže uglavnom neprekidne sekvence veće od oko 36 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka gde je najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93 %, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99% sekvence, sastoji se iz motiva koji se preklapaju sa sekvencama od 9 do 14 aminokiselinskih ostataka, pri čemu su motivi se sastoje od 4 do 6 vrsta aminokiselina odabranih između glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P) i pri čemu je redosled bilo koje dva bliska aminokiselinska ostatka u bilo kojem motivu se ne ponavljaju više od dva puta u motivu sekvence. U drugim otelotvorenjima, najmanje oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99% XTEN sekvence sastoji se iz motiva koji se preklapaju sa sekvencom od 12 aminokiselinskih ostataka, pri čemu se motivi sastoje iz četiri do šest vrsta aminokiselina odabranih između glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamat (E) i prolin (P), i pri čemu se niz motiva bilo kojih dva uzastopna ostatka aminokiselina u bilo kojem motivu sekvence ne ponavlja više od dva puta u motivu sekvence. U drugim otelotvorenjima, najmanje oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99% XTEN sekvence sastoji se iz motiva koji se ne preklapaju sa sekvencom od 12 aminokiselinskih ostataka, pri čemu se motivi sastoje iz četiri do šest vrsta aminokiselina odabranih između glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamat (E) i prolin (P), i pri čemu se niz motiva bilo kojih dva uzastopna ostatka aminokiselina u bilo kojem motivu sekvence ne ponavlja više od dva puta u motivu sekvence. U još nekim otelotvorenjima, XTEN se sastoji iz 12 motiva aminokiselinske sekvence gde su aminokiseline odabrane iz glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P), i pri čemu sekvencija bilo kojih dva uzastopna ostatka aminokiselina u bilo kojem motivu sekvence ne ponavlja više od dva puta u motivu sekvence, i pri čemu sadržaj bilo koje vrste jedne aminokiseline u XTEN pune dužine ne prelazi 30%. Prethodna otelotvorenja su primeri suštinski neponavljajućih XTEN sekvenci. Dodatni primeri su detaljno navedeni u nastavku.

[0139] U nekim otelotvorenjima, pronalazak pruža CFXTEN sastave koji sadrže jednu, ili dve, ili tri, ili četiri, pet, šest ili više ponavljajućih XTEN sekvenci od oko 36 do oko 1000 aminokiselinskih ostataka, ili kumulativno oko 100 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka gde je najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99% do oko 100% sekvence sastoji se od više jedinica od četiri ili više motiva sekvenci koje se ne preklapaju, izabranih iz aminokiselinskih sekvenci iz Tabele 3, pri čemu celokupna sekvenca u suštini ostaje neponavljajuća. U nekim otelotvorenjima, XTEN sadrži motive sekvence koji se ne preklapaju u kojima je oko 80%, ili najmanje oko 85%, ili najmanje oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94 %, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, ili oko 100% sekvence, sastoji se od više jedinica sekvenci koja se ne preklapaju, izabranih iz jedne porodice motiva izabranih iz Tabela 3, što rezultira porodičnom sekvencom. Kako se ovde koristi, "porodica" znači da XTEN ima motive odabrane samo iz jedne kategorije motiva iz Tabele 3; tj. AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC ili BD XTEN i da su

1

bilo koje druge aminokiseline u XTEN iz porodičnog motiva izabrane da bi se postigla potrebna osobina, kao što je dopuštanje ugradnje ograničenja mesto kodiranjem nukleotida, ugradnjom sekvence deljenja ili za postizanje bolje povezanosti sa komponentom faktora koagulacije FVIII CFXTEN. U nekim otelotvorenjima XTEN porodica, XTEN sekvenca sadrži više jedinica nepreklapajućih sekvenci motiva porodice AD, ili porodice AE motiva, ili porodice AF motiva, ili porodice AG motiva, ili AM porodica motiva, ili porodica AQ motiva, ili BC porodice, ili porodice BD, pri čemu dobijeni XTEN pokazuje opseg homologije opisan iznad. U drugim otelotvorenjima, XTEN sadrži više jedinica sekvenci motiva iz dve ili više porodica motiva iz Tabele 3. Ove sekvence mogu biti odabrane tako da postignu željene fizičke/hemijske karakteristike, uključujući takva svojstva kao što su neto naelektrisanje, hidrofilnost, nedostatak sekundarne strukture ili nedostatak ponavljanja koji su dodeljeni aminokiselinskom sastavu motiva, koji su detaljnije opisani ispod. U otelotvorenjima opisanim iznad u ovom paragrafu, motivi ugrađeni u XTEN mogu se izabrati i sastaviti koristeći ovde opisane postupke da bi se postigao XTEN od oko 36 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka.

Tabela 3: XTEN motivi sekvence 12 aminokiselina i porodice motiva

2

[0140] U nekim otelotvorenjima XTEN porodica, XTEN sekvenca sadrži više jedinica nepreklapajućih sekvenci motiva porodice AD, ili porodice AE motiva, ili porodice AF motiva, ili porodice AG motiva, ili AM porodica motiva, ili porodica AQ motiva, ili BC porodice, ili porodice BD, pri čemu dobijeni XTEN pokazuje opseg homologije opisan iznad. U drugim otelotvorenjima, XTEN sadrži više jedinica sekvenca motiva iz dve ili više porodica motiva iz Tabele 3, izabranih da postignu željene fizičko-hemijske karakteristike, uključujući takva svojstva kao što su neto naelektrisanje, nedostatak sekundarne strukture ili nedostatak ponavljanja koji mogu biti dodeljena aminokiselinskim sastavom motiva, detaljnije opisanih u daljem tekstu. U otelotvorenjima opisanim iznad u ovom paragrafu, motivi ili delovi motiva ugrađenih u XTEN mogu se izabrati i sastaviti koristeći ovde opisane postupke da bi se postigao XTEN od oko 36, oko 42, oko 72, oko 144, oko 288, oko 576, oko 864, oko 1000, oko 2000 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka ili bilo koje srednje dužine. Neograničavajući primeri sekvenci porodice XTEN korisnih za uključivanje u predmet CFXTEN prikazani su u Tabeli 4. Zamišljeno je da određena sekvenca koja se spominje u odnosu na Tabelu 4 ima tu sekvencu navedenu u Tabeli 4, dok generalna referenca na AE144 sekvencu, na primer, ima za cilj da obuhvati bilo koju AE sekvencu koja ima 144 aminokiselinska ostatka; npr., AE144_1A, AE144_2A, itd., ili uopštena referenca na AG144 sekvencu, na primer, treba da obuhvati bilo koju AG sekvencu koja ima 144 aminokiselinska ostatka, npr., AG144_1, AG1442, AG144A, AG144_B, AG144_C, itd.

Tabela 4: XTEN Polipeptidi

4

1

2

4

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

[0141] U drugim otelotvorenjima, CFXTEN sastav sadrži jednu ili više XTEN sekvenci koje se ponavljaju u dužini od oko 36 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka, pri čemu je najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99% do oko 100% sekvence sastoji se iz neprekidnih 36 aminokiselinskih motiva sekvence izabrani iz jedne ili više polipeptidnih sekvenci Tabela 13-17, bilo kao porodični niz ili gde su motivi izabrani iz dve ili više porodica motiva.

[0142] U onim otelotvorenjima gde XTEN komponenta fuzionog proteina CFXTEN ima manje od 100% njegovih aminokiselina koje se sastoje od 4, 5 ili 6 vrsta aminokiselina odabranih između glicina (G), alanina (A), serina (S), treonin (T), glutamat (E) i prolin (P), ili manje od 100% sekvence koja se sastoji iz motiva sekvenci iz Tabele 3 ili XTEN sekvence tabele 4 i 13-17, ostalih aminokiselinskih ostataka od XTEN je izabran od bilo koje od ostalih 14 prirodnih L-aminokiselina, ali su preferirano izabrane od hidrofilnih aminokiselina tako da KSTEN sekvenca sadrži najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% ili barem oko 99% hidrofilnih aminokiselina. XTEN aminokiseline koje nisu glicin (G), alanin (A), serin (S), treonin (T), glutamat (E) i prolin (P) su ili isprekidane kroz XTEN sekvencu, a nalaze se unutar ili između njih motivi sekvence, ili su koncentrisani u jednom ili više kratkih proteza XTEN sekvence, npr., da bi se stvorio veznik između XTEN i FVIII komponenti. U takvim slučajevima kada XTEN komponenta CFXTEN sadrži aminokiseline osim glicina

11

(G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P), poželjnije je da manje više od oko 2% ili manje od oko 1% aminokiselina su hidrofobni ostaci tako da rezultirajuće sekvence uglavnom nemaju sekundarnu strukturu, npr., ne sadrže više od 2% alfa heliksa ili 2% beta-listova, kako je određeno postupcima obelodanjenim ovde. Hidrofobni ostaci koji su manje povoljni za izgradnju XTEN uključuju triptofan, fenilalanin, tirozin, leucin, izoleucin, valin i metionin. Pored toga, sekvence XTEN mogu da dizajniraju tako da sadrže manje od 5% ili manje od 4% ili manje od 3% ili manje od 2% ili manje od 1% ili nijednu od sledećih aminokiselina: cistein (da bi se izbeglo stvaranje disulfida i oksidacija), metionin (da bi se izbegla oksidacija), asparagin i glutamin (da bi se izbegla desamidacija). Tako je u nekim otelotvorenjima XTEN komponenta fuzionog proteina CFXTEN koja sadrži druge aminokiseline pored glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P) imati sekvencu sa manje od 5% ostataka koji doprinose alfa-heliksima i beta-listovima, mereno Chou-Fasman algoritmom i imaju najmanje 90% ili najmanje oko 95% ili više nasumičnih formiranja zavojnica mereno merenjem GOR algoritam.

3. Dužina sekvence

[0143] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje XTEN različitih dužina za uključivanje u CFXTEN sastava gde se dužina XTEN sekvenci bira na osnovu svojstva ili funkcije koja se treba postići u fuzionom proteinu. U zavisnosti od predviđenog svojstva ili funkcije, CFXTEN sastavi sadrže kratku ili srednju dužinu XTEN smeštene unutar FVIII sekvence ili između FVIII domena i/ili duže XTEN sekvence koje mogu služiti kao nosači, smeštenih u fuzionim proteinima kao što je ovde opisano. Iako nije predviđeno da ograničavaju, XTEN ili fragmenti XTEN uključuju kratke segmente od oko 6 do oko 99 aminokiselinskih ostataka, srednje dužine od oko 100 do oko 399 aminokiselinskih ostataka i veće dužine od oko 400 do oko 1000 i do oko 3000 aminokiselinskih ostataka. Dakle, XTEN za ugradnju u predmet CFXTEN obuhvata XTEN ili fragmente XTEN dužine oko 6, ili oko 12, ili oko 36, ili oko 40, ili oko 42, ili oko 72, oko 96, ili oko 144, ili oko 288, ili oko 400, ili oko 500, ili oko 576, ili oko 600, ili oko 700, ili oko 800, ili oko 864, ili oko 900, ili oko 1000, ili oko 1500, ili oko 2000, ili oko 2500 ili dužine do oko 3000 aminokiselinskih ostataka. Alternativno, XTEN sekvence mogu biti od 6 do oko 50, oko 50 do oko 100, oko 100 do 150, oko 150 do 250, oko 250 do 400, oko 400 do oko 500, oko 500 do oko 900, oko 900 do 1500 , u dužini od oko 1500 do 2000, ili oko 2000 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka. Precizna dužina XTEN ugrađenog u predmetni CFXTEN može varirati bez negativnog uticaja na aktivnost CFXTEN sastave. U jednom otelotvorenju, jedan ili više XTEN korišćenih u ovde obelodanjenom CFXTEN sadrži 36 aminokiselina, 42 aminokiselina, 144 aminokiseline, 288 aminokiselina, 576 aminokiselina ili 864 aminokiselina i mogu biti odabrani od jedne od sekvence porodice XTEN; tj., AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC ili BD. U drugom otelotvorenju, dva ili više XTEN korišćenih u ovde obelodanjenom CFXTEN sadrži 36 aminokiselina, 42 aminokiselina, 144 aminokiseline, 288 aminokiselina, 576 aminokiselina ili 864 aminokiselina i mogu biti odabrani od dve sekvence porodice XTEN; tj., AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC ili BD sa poželjnom kombinacijom AE i AG porodice sekvenci U nekim otelotvorenjima, CFXTEN koji sadrži jedan ili više ovde korišćenih XTEN sadrži XTEN odabran iz bilo koje od sekvenci u Tabeli 4, koji mogu biti direktno povezani sa FVIII komponentom ili preko razmaknutih sekvenci obelodanjenih ovde.

[0144] Konkretno, CFXTEN konfiguracijski dizajni, gde XTEN služi kao fleksibilni veznik, ili su ubačeni u spoljne petlje ili neuređene regione FVIII sekvence za povećanje obima, fleksibilnosti ili hidrofilnosti regiona, ili su dizajnirani tako da ometaju receptore za čišćenje FVIII za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava, ili za ometanje vezivanja FVIII inhibitora ili drugih anti-FVIII antitela, ili gde se koristi kratka ili srednja dužina XTEN da se olakša penetracija u tkivo ili da se promeni snaga interakcije CFXTEN fuzionog proteina sa njegovim ciljem, ili gde je poželjno da se ukupna dužina XTEN podeli u segmente kratke ili srednje dužine na više lokacija unutar FVIII sekvence, pronalazak razmatra CFXTEN sastave sa jednom, dve, tri, četiri, pet ili više kratkih ili srednjih XTEN sekvenci između ili unutar jednog ili više domena FVIII ili unutar spoljnih petlji, ili na drugim mestima u sekvenci FVIII, kao što su, ali ne ograničavajući se na, lokacije na ili proksimalno od mesta umetanja koja su identifikovana u Tabela 5, Tabela 6, Tabela 7, Tabela 8 i Tabela 9 ili kako je prikazano na Sl.8-9. U jednom otelotvorenju prethodnog, fuzioni protein CFXTEN sadrži više XTEN segmenata, npr., najmanje dva, ili najmanje tri, ili najmanje četiri, ili najmanje pet ili više XTEN segmenata u kojima KXTEN segmenti mogu biti identični ili oni mogu biti različiti i gde CFXTEN zadržava najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ili više prokoagulantne aktivnosti izvornog FVIII kada je testiran jednim od ovde obelodanjenih ispitivanja. U drugim posebnim konfiguracijama CFXTEN konfiguracije, gde XTEN služi kao nosač za povećanje obima fuzionog proteina, ili za promenu snage interakcije CFXTEN fuzionog proteina sa njegovim ciljem, ili za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava fuzionog proteina, pronalazak razmatra CFXTEN sastave sa jednom ili više XTEN sekvenci srednjih ili većih dužina koje su ubačene na C-terminus, unutar B domena (ili zaostatka BDD sekvence) između ili unutar jednog ili više domena FVIII, unutar spoljnih petlji ili na druga mesta u sekvenci FVIII, kao što su, ali nisu ograničena na, mesta umetanja identifikovana u Tabela 5, Tabela 6, Tabela 7, Tabela 8, i Tabela 9 ili kako je prikazano na Sl.8-9. Međutim, veruje se da ugradnja više XTEN kratkih do srednjih dužina u CFXTEN sastave daje pojačana svojstva fuzionim proteinima u poređenju sa CFXTEN fuzionim proteinima sa istim brojem aminokiselina u manjoj, ali većoj dužini XTEN, ali ipak rezultira sastavima sa prokoagulantnom aktivnošću i produženim polu-raspadom; čija je osnova ovde detaljno data u vezi sa izvedenim radijusima višestrukog XTEN.

[0145] U otelotvorenjima gde CFXTEN fuzioni proteini sadrže više XTEN sekvenci, kumulativna dužina ukupnih ostataka u XTEN sekvencama je veća od oko 100 do oko 3000, ili oko 200 do oko 2000, ili oko 400 do oko 1000 aminokiselinskih ostataka i XTEN može biti identičan ili može biti različit u nizu, neto naelektrisanja ili dužini. U jednom otelotvorenju CFXTEN koji sadrži višestruki XTEN, pojedinačne XTEN sekvence pokazuju najmanje oko 80% identičnosti sekvence, ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa motivom ili XTEN odabranim iz Tabele 3, 4 i 13-17 ili njegov fragment, kada je optimalno poravnat sa sekvencom uporedive dužine.

[0146] Kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu, obelodanjeni su postupcima u kojima je CFXTEN dizajniran odabirom dužine XTEN i mesta njegove ugradnje u CFXTEN za dodeljivanje ciljanog polu-raspada, zadržavanje prokoagulantne aktivnosti, smanjeno vezivanje za inhibitore FVIII ili pojačano fizičko-hemijsko svojstvo (npr., stabilnost ili rastvorljivost) CFXTEN fuzionog proteina, kodirajuće konstrukcije se stvaraju i eksprimiraju, a rekombinantni CFXTEN fuzioni proteini se izoluju i oporavljaju. Uopšteno, ukupne dužine XTEN duže od oko 400 ostataka ugrađenih u CFXTEN sastava rezultiraju dužim poluraspadom u odnosu na kraće kumulativne dužine, npr., kraćim od oko 280 ostataka. U jednom otelotvorenju, CFXTEN fuzioni proteini dizajnirani da sadrže najmanje jedan XTEN kao nosač, sa dugom dužinom sekvence najmanje oko 400, ili najmanje oko 600, ili najmanje oko 800, ili najmanje oko 900, ili najmanje oko 1000 ili više aminokiselina. U drugom otelotvorenju, više XTEN je ugrađeno u fuzioni protein da bi se postigle kumulativne dužine od najmanje oko 400, ili najmanje oko 600, ili najmanje oko 800, ili najmanje oko 900, ili najmanje oko 1000 ili više aminokiselina, pri čemu XTEN može biti identičan ili može biti različit u nizu ili dužini. Kao što je ovde korišćeno, "kumulativna dužina" treba da obuhvati ukupnu dužinu u aminokiselinskim ostacima, kada je više od jednog XTEN ugrađeno u CFXTEN fuzioni protein. Oba iznad navedena otelotvorenja su dizajnirana da daju povećanu

11

bioraspoloživost i/ili povećan terminusni polu-raspad nakon davanja ispitaniku u poređenju sa CFXTEN koji sadrži kraće kumulativne XTEN dužine, ali ipak rezultiraju prokoagulacionom aktivnošću i efektom hemostaze. Kada se daje subkutano ili intramuskularno, Cmaxse smanjuje, ali se površina ispod krive (AUC) povećava u poređenju sa uporedivom dozom CFXTEN sa kraćom kumulativnom dužinom XTEN ili FVIII, koji nije povezan sa XTEN, čime doprinosi sposobnosti održavanja efektivnog nivoa sastava CFXTEN tokom dužeg perioda i koji dozvoljavaju produžene periode od 2, 4, 7, 10, 14 ili 21 dana između doziranja, kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu. Stoga, XTEN daje svojstvo depoa upravljanom CFXTEN, pored ostalih fizičko-hemijskih svojstava opisanih ovde.

[0147] Kada se XTEN koristi kao nosač, pronalazak koristi prednost pronalaska da povećanje dužine neponavljajućih, nestrukturiranih polipeptida pojačava nestrukturiranu prirodu XTEN i na odgovarajući način poboljšava fizička/hemijska i farmakokinetička svojstva fuzionih proteina koji sadrže XTEN prevoznik. Kao što je detaljnije opisano u Primerima, proporcionalno povećanje dužine XTEN, čak i ako je stvoreno ponovljenim redosledom motiva jedne sekvence porodice (npr., četiri AE motiva iz Tabele 3), rezultira sekvencom s većim procentom (npr., 90% ili više) nasumičnog stvaranja zavojnice, kako je određeno algoritamom GOR, ili smanjenim sadržajem alfa-helikostera ili beta-listova (npr., manje od 2%), što je određeno Chou-Fasman algoritmom, u poređenju sa kraćim XTEN algoritmom dužine. Pored toga, povećanje dužine nestrukturiranog fuzionog polipeptidnog partnera, kako je opisano u primerima, rezultira fuzionim proteinom sa nesrazmernim povećanjem terminusnog polu-raspada (npr., čak 50, 100, 200 ili više sati) u poređenju sa fuzionim proteinima sa nestrukturiranim polipeptidnim partnerima sa kraćim dužinama sekvenci. Pojačana farmakokinetička svojstva CFXTEN u poređenju sa FVIII koja nisu povezana sa XTEN su detaljnije opisana u nastavku.

[0148] U drugom aspektu, pronalazak pruža postupke za stvaranje XTEN kratkih ili srednjih dužina iz dužih „donorskih“ XTEN sekvenci, pri čemu je duža XTEN sekvenca donora skraćen na N-terminusu, ili C-terminusu, ili je fragment stvoren od unutrašnjost donatorske sekvence, što rezultira kratkom ili srednjom dužinom XTEN. U neograničavajućim primerima, kao što je šematski prikazano na Sl.16A-C, AG sekvenca od 864 aminokiselinskih ostataka može biti skraćena da bi se dobila AG sekvenca sa 144 ostataka, AG sekvenca sa 288 ostataka, AG sekvenca sa 576 ostataka ili druge intermedijarne dužine, dok je AE sekvenca od 864 ostataka (kao što je prikazano na Sl.16D, E) može biti skraćen da bi se dobilo više AE sekvenci od 144 ostataka, AE sekvenca sa 288 ili 576 ostataka ili druge kraće ili srednje dužine. Specifično se razmatra da se takav pristup može koristiti sa bilo kojom od ovde opisanih otelotvorenja XTEN ili sa bilo kojom od sekvencija navedenih u Tabelama 4 ili 13-17 da bi se dobio XTEN željene dužine. U poželjnim otelotvorenjima, CFXTEN koji sadrži više XTEN ima XTEN koji ima najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 91%, ili najmanje oko 92%, ili najmanje oko 93%, ili najmanje oko 94%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%, ili 100% identičnost sekvenci u sekvencama odabranim iz AE42_1, AE42_2, AE42_3, AG42_1, AG42_2, AG42_3, AG42_4, AE144_1A, AE144_2A, AE144_2B, AE144_3A, AE144_3B, AE144_4A, AE144_4B, AE144_5A, AE144_6B, AG144_1, AG144_2, AG144A, AG144_B, AG144_C, AG144_F, AG144_3, AG144_4, AE288_1, AE288_2, AG288_1, AG288_2 i AG288_DE.

4. Ukupno naelektrisanje

[0149] U drugim otelotvorenjima, nestruktuirana karakteristika XTEN polipeptida može se poboljšati ugradnjom aminokiselinskih ostataka sa neto naelektrisanjem i/ili smanjenjem ukupnog procenta (npr., manje od 5%, ili 4%, ili 3%, ili 2% ili 1%) hidrofobnih aminokiselina u XTEN sekvenci. Ukupno neto naelektrisanje i neto gustina naelektrisanja kontroliše se modifikovanjem sadržaja naelektrisanih aminokiselina u XTEN sekvenci, bilo pozitivnom ili negativnom, pri čemu je neto naelektrisanje obično predstavljeno kao procenat aminokiselina u polipeptidu koji doprinose naelektrisanom stanju iznad onih ostataka koji otkazuju ostatak sa suprotnim naelektrisanjem. U nekim otelotvorenjima, neto gustina naelektrisanja XTEN sastava može biti iznad 0.1 ili ispod -0.1 naelektrisanja/ostatak. Pod "neto gustinom naelektrisanja" proteina ili peptida ovde se misli na neto naelektrisanje podeljeno sa ukupnim brojem aminokiselina u proteinu ili propeptidu. U drugim otelotvorenjima, neto naelektrisanje XTEN može biti oko 0%, oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7%, oko 8%, oko 9 %, oko 10%, oko 11%, oko 12%, oko 13%, oko 14%, oko 15%, oko 16%, oko 17%, oko 18%, oko 19%, ili oko 20% ili više. Na osnovu neto naelektrisanja , neki XTEN imaju izoelektričnu tačku (pI) od 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, ili čak 6.5. U poželjnim otelotvorenjima, XTEN će imati izoelektričnu tačku između 1.5 i 4.5 i nositi neto negativno naelektrisanje pod fiziološkim uslovima.

[0150] Pošto većina tkiva i površina kod čoveka ili životinje ima neto negativno naelektrisanje, u nekim otelotvorenjima XTEN sekvence su dizajnirane tako da imaju neto

11

negativno naelektrisanje da bi se umanjile nespecifične interakcije između sastava koji sadrže XTEN i različitih površina poput krvnih sudova, zdravih tkiva ili raznih receptora. Da ne bi bila vezana određenom teorijom, XTEN može usvojiti otvorene konformacije usled elektrostatičkog odbijanja između pojedinih aminokiselina XTEN polipeptida koje pojedinačno nose neto negativno naelektrisanje i koje se distribuiraju kroz sekvencu XTEN polipeptida. U nekim otelotvorenjima, XTEN sekvenca je dizajnirana sa najmanje 90% ili 95% naelektrisanih ostataka razdvojenih drugim ostacima, kao što su serin, alanin, treonin, prolin ili glicin, što dovodi do jednolikog rasporeda naelektrisanja, bolje ekspresije ili ponašanje pročišćavanja. Takva raspodela neto negativnog naelektrisanja u produženim dužinama sekvenci XTEN može dovesti do nestrukturirane konformacije koja zauzvrat može rezultirati efikasnim povećanjem hidrodinamičkog radijusa. U poželjnim otelotvorenjima, negativno naelektrisanje ispitanika XTEN daje se ugradnjom ostataka glutaminske kiseline. Generalno, glutamični ostaci su raspoređeni jednoliko po XTEN sekvenci. U nekim slučajevima, XTEN može sadržati oko 10-80 ili oko 15-60, ili oko 20-50 glutamičnih ostataka po 20kDa XTEN, što može rezultirati XTEN sa naelektrisanim ostacima koji bi imali vrlo slične pKa, što može povećati homogenost naelektrisanja proizvoda i izoštriti njegovu izoelektričnu tačku, poboljšati fizikalno-hemijska svojstva dobijenog fuzionog proteina CFXTEN za, a samim tim i pojednostaviti postupke prečišćavanja. Na primer, gde je poželjan XTEN sa negativnim naelektrisanjem, XTEN može biti izabran isključivo iz AE sekvence porodice, koja ima oko 17% neto naelektrisanja zbog ugrađene glutaminske kiseline, ili može uključivati različite proporcije motiva koji sadrže glutaminsku kiselinu Tabele 3 da obezbedi željeni stepen neto naelektrisanja. Neograničavajući primeri AE XTEN uključuju, ali nisu ograničeni na sekvence porodice 36, 42, 144, 288, 576, 624, 864 i 912 AE iz Tabela 4 i 14 ili njihove fragmente. U jednom otelotvorenju, XTEN niz tabela 4 ili 13-17 može biti modifikovan tako da uključuje dodatne ostatke glutaminske kiseline da bi se postiglo željeno neto negativno naelektrisanje. Prema tome, u jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje XTEN u kome XTEN sekvence sadrže oko 1%, 2%, 4%, 8%, 10%, 15%, 17%, 20%, 25%, ili čak oko 30% glutaminske kiseline. U jednom otelotvorenju, pronalazak razmatra ugradnju do 5% ostataka aspartanske kiseline u XTEN pored glutaminske kiseline da bi se postiglo neto negativno naelektrisanje.

[0151] U drugim otelotvorenjima, gde nije poželjno neto naelektrisanje, XTEN se može odabrati između, na primer, AG XTEN komponenti, kao što su AG motivi Tabele 3, ili onih AM motiva Tabele 3 koji nemaju neto naelektrisanje. Neograničavajući primeri AG XTEN

11

uključuju, ali nisu ograničeni na sekvence porodice 36, 42, 144, 288, 576 i 864 AG iz Tabela 4 i 16 ili njihove fragmente. U drugom otelotvorenju, XTEN može da sadrži različite proporcije AE i AG motiva (da bi imao neto naboj koji se smatra optimalnim za određenu upotrebu ili za održavanje određenog fizičko-hemijskog svojstva.

[0152] Neće biti vezani određenom teorijom, očekuje se da će XTEN sastavi CFXTEN sa većim neto naelektrisanjem imati manje nespecifične interakcije sa različitim negativno naelektrisanim površinama, kao što su krvni sudovi, tkiva ili različiti receptori, što bi dodatno doprinelo do smanjenog aktivnog klirensa. Suprotno tome, veruje se da bi XTEN sastav CFXTEN sa niskim (ili nikakvim) naelektrisanjem imao veći stepen interakcije sa površinama koje mogu potencirati aktivnost povezanog faktora koagulacije, imajući u vidu poznati doprinos ćelije (npr. trombocita) i vaskularne površine za proces koagulacije i intenzitet aktiviranja faktora koagulacije (Zhou, R., i dr., Biomaterials (2005) 26(16):2965-2973; London, F., i dr. Biochemistry (2000) 39(32):9850-9858).

[0153] XTEN sastav predmetnog pronalaska generalno nema ili ima nizak sadržaj pozitivno naelektrisanih aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, XTEN može imati manje od oko 10% aminokiselinskih ostataka sa pozitivnim naelektrisanjem, ili manje od oko 7%, ili manje od oko 5%, ili manje od oko 2%, ili manje od oko 1% aminokiselina ostaci sa pozitivnim naelektrisanjem. Međutim, pronalazak razmatra konstrukcije gde je ograničeni broj aminokiselina sa pozitivnim naelektrisanjem, kao što je lizin, ugrađen u XTEN kako bi se omogućila konjugacija između epsilonskog amina lizina i reaktivne grupe na peptidu, veznom mostu ili reaktivna grupa na leku ili malom molekulu koji treba da bude konjugovan sa XTEN glavnim lancem. U jednom otelotvorenju prethodnog, XTEN ispitanik CFXTEN ima između oko 1 do oko 100 lizinskih ostataka ili oko 1 do oko 70 ostataka lizina, ili oko 1 do oko 50 ostataka lizina, ili oko 1 do oko 30 ostataka lizina, ili oko 1 do oko 20 lizinskih ostataka, ili oko 1 do oko 10 lizinskih ostataka, ili oko 1 do oko 5 lizinskih ostataka, ili alternativno samo jedan lizinski ostatak. Koristeći prethodno navedeni XTEN koji sadrži lizin, mogu se konstruisati fuzioni proteini koji sadrže XTEN, FVIII faktor koagulacije, plus hemoterapijsko sredstvo ili drugi faktor koagulacije ili kofaktor koji je koristan u lečenju stanja koagulopatije, pri čemu je maksimalni broj molekula sredstva uključen u XTEN komponentu određuje se brojem lizina ili drugih aminokiselina sa reaktivnim bočnim lancima (npr., cisteinom) ugrađenim u XTEN.

11

[0154] Kako hidrofobne aminokiseline daju strukturu polipeptidu, pronalazak predviđa da sadržaj hidrofobnih aminokiselina u XTEN obično bude manji od 5%, ili manji od 2%, ili manji od 1% sadržaja hidrofobnih aminokiselina. U jednom otelotvorenju, sadržaj aminokiselina metionina i triptofana u XTEN komponenti fuzionog proteina CFXTEN je obično manji od 5%, ili manji od 2%, i najpoželjnije manji od 1%. U drugom otelotvorenju, XTEN predmetnih sastava CFXTEN imaće sekvencu koja ima manje od 10% aminokiselinskih ostataka sa pozitivnim nabojem, ili manjim od oko 7%, ili manjim od oko 5%, ili manjim od oko 2% amino kiselih ostataka sa pozitivnim naelektrisanjem, zbir ostataka metionina i triptofana biće manji od 2%, a zbir ostataka asparagina i glutamina biće manji od 5% ukupne XTEN sekvence.

5. Niska imunogenost

[0155] U drugom aspektu, XTEN sekvence koje su ovde date imaju nizak stepen imunogenosti ili su u osnovi bez imunogenosti. Nekoliko faktora može doprineti niskoj imunogenosti XTEN, npr., ponavljajuća sekvenca, nestrukturirana konformacija, visok stepen rastvorljivosti, nizak stepen ili nedostatak samo-agregacije, nizak stepen ili nedostatak proteolitičkih mesta u nizu i nizak stepen ili nedostatak epitopa u XTEN sekvenci.

[0156] Konformacioni epitopi nastaju u regionima proteinske površine koji su sačinjeni od više diskontinuiranih nizova aminokiselina proteinskog antigena. Precizno savijanje proteina dovodi ove sekvence u dobro definisane, stabilne prostorne konfiguracije ili epitope, koje imunološki sistem domaćina može prepoznati kao "strane", što rezultira proizvodnjom antitela na protein ili aktiviranjem ćelijski posredovani imuni odgovor. U poslednjem slučaju, na imuni odgovor proteina kod pojedinca snažno utiče prepoznavanje epitopa T-ćelija koje je funkcija specifičnosti vezanja za peptid u HLA-DR alotipu tog pojedinca. Angažovanje peptidnog kompleksa MHC klase II pomoću kognitivnog T-ćelijskog receptora na površini T-ćelije, zajedno sa unakrsnim vezivanjem određenih drugih ko-receptora, kao što je molekul CD4, može indukovati aktivirano stanje unutar T -mobilni. Aktivacija dovodi do oslobađanja citokina što dalje aktivira ostale limfocite kao što su B ćelije za proizvodnju antitela ili aktiviranje T ćelija ubojica kao puni ćelijski imuni odgovor.

[0157] Sposobnost peptida da veže dati molekul MHC klase II za prezentaciju na površini APC (ćelija koja predstavlja antigen) zavisi od niza faktora; posebno njegova primarna sekvenca. U jednom aspektu, niži stepen imunogenosti se postiže dizajniranjem XTEN sekvenci koje odolevaju preradi antigena u ćelijama koje predstavljaju antigen i/ili odabirom

11

sekvenci koje ne vežu dobro MHC receptore. Pronalazak obezbeđuje fuzione proteine CFXTEN sa suštinski neponovljivim XTEN polipeptidima koji su dizajnirani da smanje vezanje sa MHC II receptorima, kao i izbegavanje stvaranja epitopa za T-ćelijski receptor ili vezivanje antitela, što rezultira niskim stepenom imunogenosti. Izbegavanje imunogenosti može, barem delom, pripisati rezultatu konformacijske fleksibilnosti XTEN sekvenci; tj., nedostatak sekundarne strukture zbog odabira i redosleda aminokiselinskih ostataka. Na primer, od posebnog interesa su sekvence koje imaju malu tendenciju prilagođavanja kompaktno presavijenih konformacija u vodenom rastvoru ili pod fiziološkim uslovima koje mogu rezultirati konformacijskim epitopima. Davanje fuzionih proteina koji sadrže XTEN, korišćenjem uobičajenih terapijskih postupaka i doziranjem, generalno ne bi rezultiralo formiranjem neutralizujućih antitela na XTEN sekvencu, a takođe bi smanjilo imunogenost FVIII fuzionog partnera u CFXTEN sastavima.

[0158] U jednom otelotvorenju, XTEN sekvence korišćene u predmetnim fuzionim proteinima mogu biti u suštini bez epitopa prepoznatih od strane humanih T ćelija.

Eliminacija takvih epitopa u svrhu stvaranja manje imunogenskih proteina prethodno je obelodanjena; videti na primer WO 98/52976, WO 02/079232 i WO 00/3317. Opisani su testovi za humane T ćelijske epitope (Stickler, M., i dr. (2003) J Immunol Methods, 281: 95-108). Poseban interes predstavljaju peptidne sekvence koje se mogu oligomerisati bez stvaranja epitopa T ćelija ili ne-humanih sekvenci. To se postiže testiranjem direktnih ponavljanja ovih sekvenci na prisustvo epitopa T-ćelija i na pojavu od 6 do 15-mernih i, posebno, 9-mernih sekvenci koje nisu humani, a zatim promene dizajna XTEN sekvenca za uklanjanje ili ometanje epitopske sekvence. U nekim otelotvorenjima, XTEN sekvence su uglavnom neimunogene ograničavanjem broja epitopa XTEN za koje se predviđa da vezuju MHC receptore. Sa smanjenjem broja epitopa sposobnih da se vezuju za MHC receptore, dolazi do istodobnog smanjenja potencijala za T ćelijsku aktivaciju, kao i za pomoćnu funkciju T ćelija, smanjene aktivacije ili regulacije B ćelija i smanjene proizvodnje antitela. Nizak stepen predviđenih epitopa za T ćelije može se odrediti algoritmima za predviđanje epitopa, kao što su npr., TEPITOPE (Sturniolo, T., i dr. (1999) Nat Biotechnol, 17: 555-61), kao što je prikazano u Primeru 46. TEPITOPE ocena datog peptidnog okvira unutar proteina je zapis Kd(konstanta disocijacije, afinitet, brzina) vezivanja tog peptidnog okvira na više najčešćih humanih MHC alela, kao što je otkriveno u Sturniolo, T i dr. (1999) Nature Biotechnology 17:555). Rezultat se kreće na najmanje 20 dnevnika, od oko 10 do oko -10 (što odgovara ograničenjima vezivanja od 10e<10>Kd do 10e<-10>Kd), a može se smanjiti

11

izbegavanjem hidrofobnih aminokiselina koje služe kao ostaci sidra tokom prikazivanja peptida na MHC , kao što su M, I, L, V, F. U nekim otelotvorenjima, XTEN komponenta ugrađena u CFXTEN nema predviđeni epitop za T-ćeliju pri TEPITOPE pragu vrednosti od oko -5, ili -6, ili -7 , ili -8, ili -9, ili pri TEPITOPE rezultatu -10. Kao što je ovde korišćeno, ocena "-9" je stroži prag TEPITOPE nego rezultat -5.

[0159] U drugom otelotvorenju, inventivni XTEN nizovi, uključujući one koji su ugrađeni u predmetne CFXTEN fuzione proteine, dobijaju se u osnovi neimunogeno restrikcijom poznatih proteolitičkih mesta iz sekvence XTEN, smanjujući preradu XTEN u male peptide koji se mogu vezati do MHC II receptora. U drugom otelotvorenju, XTEN sekvenca je načinjena pretežno neimunogenom upotrebom sekvence koja je u suštini lišena sekundarne strukture, pružajući otpor mnogim proteazama zbog velike entropije strukture. Shodno tome, smanjeni rezultat TEPITOPE i eliminacija poznatih proteolitičkih mesta iz XTEN čine XTEN sastave, uključujući XTEN iz CFXTEN fuzionisanih proteinskih sastava, u suštini nesposobne da ih vežu receptori sisara, uključujući one imunog sistema ili receptore aktivnog klirensa koji cilj FVIII. U jednom otelotvorenju, XTEN fuzionog proteina CFXTEN može imati > 100 nM Kdvezanje na receptor sisara ili veće od 500 nM Kd, ili veće od 1 µM Kdprema površinskom receptoru ćelije sisara ili cirkulišućem polipeptidnom receptoru.

[0160] Pored toga, neprekidni niz i odgovarajući nedostatak epitopa XTEN ograničavaju sposobnost B ćelija da se vežu za XTEN ili aktiviraju ih. Prepoznata je ponavljajuća sekvenca i može formirati multivalentne kontakte sa čak nekoliko B ćelija i, kao posledica umrežavanja više nezavisnih receptora T-ćelije, može stimulisati proliferaciju B ćelija i stvaranje antitela. Suprotno tome, dok XTEN može uspostaviti kontakte sa mnogo različitih B ćelija tokom svog produženog niza, svaka pojedinačna B ćelija može uspostaviti samo jedan ili mali broj kontakata sa pojedinom XTEN usled nedostatka ponavljanja sekvence. Nezavisno od teorije, XTEN obično imaju mnogo nižu tendenciju da stimulišu proliferaciju B ćelija i samim tim imunološki odgovor. U jednom otelotvorenju, CFXTEN ima smanjenu imunogenost u poređenju sa odgovarajućom FVIII koja nije spojena sa XTEN. U jednom otelotvorenju, davanje do tri parenteralne doze CFXTEN sisaru rezultira detektabilnim anti-CFXTEN IgG pri razblaživanju seruma od 1:100, ali ne u razređivanju od 1:1000. U drugom otelotvorenju, davanje do tri parenteralne doze CFXTEN sisaru rezultira detektabilnim anti-FVIII IgG pri razblaživanju seruma od 1:100, ali ne u razređivanju od 1:1000. U drugom otelotvorenju, davanje do tri parenteralne doze CFXTEN sisaru rezultira detektabilnim anti-

12

XTEN IgG pri razblaživanju seruma od 1:100, ali ne u razređivanju od 1:1000. U prethodnim otelotvorenjima, sisar može biti miš, pacov, zec ili majmun cinomolgus.

[0161] Dodatna karakteristika XTEN sa neprekidnim sekvencama u odnosu na sekvence sa visokim stepenom ponavljanja su neponavljajući XTEN koji stvaraju slabije kontakte sa antitelima. Antitela su multivalentni molekuli. Na primer, IgG imaju dva identična mesta vezivanja, a IgM sadrže 10 identičnih mesta vezanja. Prema tome, antitela protiv ponavljajućih sekvenci mogu formirati multivalentne kontakte sa takvim ponavljajućim sekvencama sa visokom avidnošću, što može uticati na potenciju i/ili eliminaciju takvih ponavljajućih sekvenci. Suprotno tome, antitela protiv ponavljajućih XTEN mogu da daju monovalentne interakcije, što rezultira manjom verovatnoćom imunog klirensa tako da CFXTEN sastavi mogu da ostanu u cirkulaciji tokom dužeg vremenskog perioda. Pored toga, veruje se, kao šematski prikazano na Sl. 6, fleksibilna nestrukturirana priroda XTEN obezbeđuje prostorni štit FVIII regiona proksimalno XTEN mestu umetanja i pruža prostorno ometanje vezivanja od strane FVIII inhibitora.

[0162] U drugom aspektu, predmet XTEN koristan kao partner za fuziju ima visok hidrodinamički radijus; svojstvo koje u nekim otelotvorenjima daje odgovarajuću povećanu prividnu molekulsku masu CFXTEN fuzionom proteinu koji sadrži XTEN, dok u ostalim otelotvorenjima pojačava steričnu prepreku FVIII inhibitorima i anti-FVIII antitela, smanjujući njihovu sposobnost da se vežu za CFXTEN. Kao što je detaljno prikazano u Primeru 26, povezivanje XTEN sa sekvencom terapeutskih proteina rezultira CFXTEN sastavima koje mogu povećati hidrodinamičke radijuse, povećati prividnu molekulsku težinu i povećati faktor prividne molekulske težine u poređenju sa terapeutskim proteinom koji nije povezan sa XTEN. Na primer, u terapijskim primenama u kojima je poželjan produženi poluraspad, sastavi u kojima je XTEN sa visokim hidrodinamičkim radijusom ugrađen u fuzioni protein koji sadrži terapeutski protein može efikasno povećati hidrodinamički radijus sastava preko veličine glomerularnih pora od približno 3-5 nm (što odgovara prividnoj molekularnoj težini od oko 70 kDa) (Caliceti.2003. Farmakokinetička i biodistribuciona svojstva konjugata poli (etilen glikol) -proteina. Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277), što rezultira smanjenim bubrežnim klirensom cirkulišućih proteina sa odgovarajućim povećanjem terminusnog polu-raspada i drugim poboljšanim farmakokinetičkim svojstvima.

Hidrodinamički radijus proteina dodeljuje se njegovom molekularnom težinom kao i njegovom strukturom, uključujući oblik ili kompaktnost. Da se ne veže određenom teorijom, XTEN može usvojiti otvorene konformacije usled elektrostatičkog odbijanja između pojedinih naelektrisanja peptida ili svojstvene fleksibilnosti koju daju određene aminokiseline u nizu koji nemaju potencijal za dodelu sekundarne strukture. Otvorena, proširena i nestrukturirana konformacija XTEN polipeptida može imati veći proporcionalni hidrodinamički radijus u poređenju sa polipeptidima slične dužine sekvenci i/ili molekulske težine koji imaju sekundarnu i/ili tercijarnu strukturu, kao što su tipični globularni proteini. Postupci za određivanje hidrodinamičkog radijusa su dobro poznati u stanju tehnike, kao što je korišćenje hromatografije za isključivanje veličine (SEC), kao što je opisano u patentima SAD br.6,406,632 i 7,294,513. Primer 26 pokazuje da povećanje dužine XTEN dovodi do proporcionalnog povećanja hidrodinamičkog radijusa, prividne molekulske mase i/ili prividnog faktora molekularne težine, i na taj način omogućava prilagođavanje CFXTEN željenim presečnim vrednostima prividnih molekulskih težina ili hidrodinamičkih radijusa. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, CFXTEN fuzioni protein može biti konfigurisan sa XTEN tako da fuzioni protein može imati hidrodinamički radijus od najmanje oko 5 nm, ili najmanje oko 8 nm, ili najmanje oko 10 nm, ili oko 12 nm, ili oko 15 nm, ili oko 20 nm, ili oko 30 nm ili više. U prethodnim otelotvorenjima, veliki hidrodinamički radijus koji XTEN daje CFXTEN fuzionom proteinu može dovesti do smanjenog klirensa rezultujućeg fuzionisanog proteina, povećanja terminusnog polu-raspada i povećanja srednjeg vremena boravka.

[0163] Uopšteno, stvarna molekulska masa zrelog oblika komponente FVIII iznosi oko 265 kDa, dok u slučaju FVIII BDD iznosi oko 165 kDa. Stvarna molekulska težina CFXTEN fuzionisanog proteina koja sadrži FVIII BDD plus jedan ili više XTEN kreće se od oko 200 do oko 270 kDa, u zavisnosti od dužine XTEN komponenata. Kao što je opisano u primerima, kada je molekularna težina CFXTEN fuzionih proteina izvedena analizom hromatografije za isključivanje veličine, otvorena konformacija XTEN usled niskog stepena sekundarne strukture dovodi do povećanja prividne molekulske težine fuzionisanih proteina u koji su inkorporirani. U nekim otelotvorenjima, CFXTEN koji sadrži FVIII i najmanje jedan ili više XTEN pokazuje prividnu molekulsku masu od najmanje oko 400 kD, ili najmanje oko 500 kD, ili najmanje oko 700 kD, ili najmanje oko 1000 kD, ili najmanje oko 1400 kD, ili najmanje oko 1600 kD, ili najmanje oko 1800kD, ili najmanje oko 2000 kD. Prema tome, CFXTEN fuzioni proteini koji sadrže jedan ili više XTEN pokazuju prividnu molekulsku masu koja je oko 1.3 puta veća, ili oko dvostruko veća, ili oko 3 puta veća, ili oko 4 puta veća, ili oko 8 puta veća , ili oko 10 puta veća, ili oko 12 puta veća, ili oko 15 puta veća od stvarne molekulske težine fuzionog proteina. U jednom otelotvorenju, izolovani CFXTEN fuzioni protein bilo kog ovde prikazanog obelodanjivanja pokazuje faktor molekulske težine pod fiziološkim uslovima koji je veći od oko 1.3, ili oko 2, oko 3, ili oko 4, ili oko 5, ili oko 6, ili oko 7, ili oko 8, ili oko 10, ili veće od oko 15. U drugom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN ima, u fiziološkim uslovima, faktor molekulske težine koji je oko 3 do oko 20, ili je oko 5 do oko 15, ili je oko 8 do oko 12, ili je oko 9 do oko 10 u odnosu na stvarnu molekulsku masu fuzionog proteina. Veruje se da povećana prividna molekulska težina predmetnih sastava CFXTEN povećava farmakokinetička svojstva fuzionih proteina kombinacijom faktora, koji uključuju smanjeni aktivni klirens, smanjeno vezivanje inhibitorima FVIII i smanjeni gubitak u kapilarnom i venskom krvarenju.

IV). CFXTEN SASTAVI

[0164] Predmetni pronalazak pruža sastave koji sadrže fuzione proteine koji imaju faktor VIII vezan za jednu ili više XTEN sekvenci, pri čemu fuzioni protein deluje kao zamena ili povećava količinu postojećeg FVIII u unutrašnjem ili kontaktno aktiviranom putu koagulacije kada se daje ispitaniku. Pronalazak se bavi dugogodišnjom potrebom u povećanju terminusnog polu-raspada egzogeno davanog faktora VIII, ispitanika koji ima potrebu za time. Jedan od načina da se poveća polu-raspad cirkulacije terapeutskog proteina jeste obezbeđivanje smanjenja bubrežnog klirensa ili metabolizma proteina. Drugi način da se poveća terminusni polu-raspad je smanjenje aktivnog klirensa terapijskog proteina, bilo da je posredovano receptorima, aktivnim metabolizmom proteina ili drugim endogenim mehanizmima. Oboje se može postići spajanjem proteina sa polimerom, koji je, s jedne strane, sposoban da daje povećanu molekularnu veličinu (ili hidrodinamički radijus) proteinu, a samim tim i smanjeni bubrežni klirens, a sa druge strane interferira sa vezivanjem proteina za receptore čišćenja ili druge proteine koji doprinose metabolizmu ili klirensu. Prema tome, određeni predmeti ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, obezbeđivanje poboljšanih FVIII molekula sa dužom cirkulacijom ili terminusnim polu-raspadom, smanjujući broj ili učestalost potrebnih davanja sastava FVIII, zadržavajući bar deo aktivnosti u poređenju sa matičnim faktorom koagulacije VIII i/ili povećanjem sposobnosti za efikasnije, efektivnije, ekonomičnije i/ili sa većom sigurnošću tretiranje nedostataka koagulacije i nekontrolisanih krvarenja u poređenju sa trenutno dostupnim sastavima faktora VIII.

[0165] Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantne sastave fuzionih proteina faktora VIII koji sadrže FVIII kovalentno povezan sa jednim ili više proširenih

12

rekombinantnih polipeptida ("XTEN"), što rezultira CFXTEN fuzionim proteinskim sastavom. Termin "CFXTEN", kako se ovde koristi, podrazumeva da obuhvata fuzione polipeptide koji spadaju u obim patentnih zahteva. U jednom otelotvorenju, FVIII je izvorni FVIII. U drugom otelotvorenju, FVIII je varijanta sekvence, fragment, homolog ili mimetik prirodne sekvence koji zadržava bar deo prokoagulantne aktivnosti izvornog FVIII, kao što je ovde obelodanjeno. Neograničavajući primeri FVIII pogodni za uključivanje u sastave uključuju sekvence Tabele 1 ili sekvence koje imaju najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 91%, ili najmanje 92%, ili najmanje 93%, ili najmanje 94%, ili najmanje 95%, ili najmanje 96%, ili najmanje 97%, ili najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnost sekvenci u sekvenci iz Tabele 1. U poželjnom otelotvorenju, FVIII je izbrisana BVD domena (BDD) varijanta FVIII sekvence, kao što su one BDD sekvence iz Tabele 1 ili druge takve sekvence poznate u struci. U drugom poželjnom otelotvorenju, CFXTEN sadrži varijantu izbrisane BV domene (BDD) FVIII sekvence izražene izvornom signalnom sekvencom 19 aminokiselina, koja se deli tokom sazrevanja proteina.

[0166] Sastave pronalaska uključuju fuzione proteine koji su korisni, kada se daju ispitaniku kome je to potrebno, za posredovanje ili sprečavanje ili ublažavanje stanja povezanog sa nedostatkom faktora VIII ili defektima endogeno proizvedenog FVIII, ili poremećajima krvarenja povezanim sa traumom, operativnim zahvatima, nedostaci ili nedostaci faktora VIII. Posebno su zanimljivi sastavi fuzionih proteina CFXTEN za koje se traži povećanje farmakokinetičkih parametara, povećana rastvorljivost, povećana stabilnost ili neko drugo pojačano farmaceutsko svojstvo u poređenju sa matičnim FVIII, ili za koje bi povećanje terminusnog polu-raspada poboljšalo efikasnost, sigurnost ili rezultirati smanjenom učestalošću doziranja i/ili poboljšati upravljanje pacijentima. CFXTEN fuzioni proteini ovde prikazanih ostvarenja pokazuju jednu ili više ili bilo koju kombinaciju poboljšanih svojstava i/ili ostvarenja kao što je ovde detaljno opisano. U nekim otelotvorenjima, CFXTEN fuzioni sastav ostaje na nivou iznad granične vrednosti od najmanje 0.01-0.05, ili 0.05 do 0.1, ili 0.1 do 0.4 IU/ml, kada se daje subjektu, tokom dužeg perioda u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN i primenjuje se u uporedivoj dozi sa subjektom kome je to potrebno (npr., ispitanikom kao što su čovek ili miš ili majmun sa hemofilijom A).

[0167] FVIII predmetnih sastava, posebno onih obelodanjenih u Tabeli 1, zajedno sa njihovim odgovarajućim nizovima nukleinskih kiselina i aminokiselina, dostupni su u javnim bazama podataka, kao što su baze podataka o hemijskim apstraktnim uslugama (npr., CAS registar), GenBank, Univerzalni resurs proteina (UniProt), pretplata obezbedila baze podataka kao što su GenSeq (npr., Derwent), kao i u patentnoj i primarnoj literaturi. Polinukleotidne sekvence primenjive za ekspresiju predmetnih CFXTEN sekvenci mogu biti polinukleotidne sekvence divljih vrsta koje kodiraju dati FVIII (npr., pune dužine ili zrele), ili u nekim slučajevima sekvenca može biti varijanta polinukleotidne sekvence divljeg tipa (npr., polinukleotid koji kodira biološki aktivni protein divljeg tipa, pri čemu je DNK sekvenca polinukleotida optimizovana, na primer, za ekspresiju u određenoj vrsti, ili polinukleotid koji kodira varijantu proteina divljeg tipa, kao što je mesto usmereno mutant ili alelna varijanta. Dobro je poznato u stanju iskusnog stručnjaka da koristi cDNK sekvencu divljeg tipa ili konsenzus ili varijantu FVIII optimizovanu za kodon da bi stvorio CFXTEN konstrukcije predviđene izumom koristeći postupke poznate u struci i/ili u saradnji sa uputstva i ovde date postupke i detaljnije opisani u Primerima.

[0168] U jednom otelotvorenju, CFXTEN fuzioni protein sadrži jedan molekul FVIII koji pokazuje najmanje oko 80% identiteta sekvence ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili barem oko 99%, ili 100% identitet sekvence u sekvenci Tabele 1 povezane u jedno XTEN (npr., XTEN kao što je iznad opisano) uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence porodice AE ili AG sa 42, 144, 288, 576 ili 864 aminokiselinama, kako je navedeno u Tabeli 4. U drugom otelotvorenju, CFXTEN sadrži jedan FVIII povezan na dva XTEN, pri čemu XTEN može biti identičan ili mogu biti različiti. U drugom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN sadrži jedan molekul FVIII povezan na jednu, dve, tri, četiri, pet, šest ili više XTEN sekvenci, u kojima je FVIII sekvenca koja ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, ili najmanje oko 99%, ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa proteinskom sekvencom odabranom iz Tabele 1, kada je optimalno poravnata, i jedan ili više XTEN imaju najmanje oko 80% identičnosti sekvence, ili alternativno 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili najmanje oko 99%, ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa jednom ili više sekvenci izabranih iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17, kada je optimalno poravnato. U prethodnom otelotvorenju, kada CFXTEN ima dva ili više XTEN, XTEN može biti identičan ili mogu biti različite sekvence. U još jednom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN sadrži jedan FVIII koji pokazuje najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili barem oko 99%, ili

12

100% identičnosti sekvence u poređenju sa sekvencama slične dužine odabranim iz Tabele 1, kada su optimalno usklađene, sa delovima isprepletanim i povezanim sa tri, četiri, pet, šest ili više XTEN sekvenci koje mogu biti identične ili mogu biti različite i gde svaki ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence ili alternativno 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili barem oko 99% ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa sekvencama odabranim iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17, ili njihovih fragmenata, kada je optimalno poravnato. U još jednom primeru, obelodanjivanje obezbeđuje fuzioni protein CFXTEN koji sadrži sekvencu sa najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili barem oko 99%, ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa sekvencama iz Tabele 21, kada su optimalno poravnate.

1. Konfiguracije fuzionih CFXTEN proteina

[0169] Obelodanjivanje daje CFXTEN fuzione proteinske sastave sa CF i XTEN komponentama povezanim u specifičnim konfiguracijama N-C-terminusa.

[0170] U jednom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje fuzioni protein formule I:

(XTEN)x-F-(XTEN)yI

gde CF nezavisno za svaku pojavu predstavlja faktor VIII kako je ovde definisan, uključujući sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97% %, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% ili 100% identiteta sekvence sa sekvencama iz Tabele 1; x je ili 0 ili 1 i y je ili 0 ili 1 gde x+y ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4. U skladu sa time, CFXTEN fuzioni sastav može imati XTEN-CF, XTEN-CF-XTEN ili CF-XTEN konfiguracije.

[0171] U jednom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje fuzioni protein formule II:

(XTEN)x-(S)x-(CF)-(XTEN)yII

12

gde CF nezavisno za svaku pojavu predstavlja faktor VIII kako je ovde definisan, uključujući sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97% %, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa onim navedenim u Tabeli 1; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; x je ili 0 ili 1 i y je ili 0 ili 1 gde x+y ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4.

[0172] U drugom primeru CFXTEN sastava, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII, pri čemu je fuzioni protein formule III:

(XTEN)x-(S)x-(CF)-(S)y-(XTEN)yIII

gde CF nezavisno za svaku pojavu predstavlja faktor VIII kako je ovde definisan, uključujući sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97% %, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% ili 100% identiteta sekvenci iznetih u Tabeli 1; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; x je ili 0 ili 1 i y je ili 0 ili 1 gde x+y ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4.

[0173] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule IV:

(Al)-(XTEN)u-(A2)-(XTEN)v-(B)-(XTEN)w-(A3)-(XTEN)x-(Cl)-(XTEN)y-(C2)-(XTEN)zIV

12

gde je nezavisno za svaku pojavu, A1 domen AV od FVIII; A2 je A2 domen FVIII; A3 je A3 domen FVIII; B je B domen FVIII koji može biti fragment ili varijanta spajanja B domena; C1 je C1 domen FVIII; C2 je C2 domen FVIII; v je ili 0 ili 1; w je ili 0 ili 1; x je ili 0 ili 1; y je ili 0 ili 1; y je 0 ili 1 pod uslovom da je u v x y+z ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4.

[0174] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule V:

(XTEN)t-(S)a-(Al)-(S)b-(XTEN)u-(S)b-(A2)-(S)c-(XTEN)v-(S)c-(B)-(S)d-(XTEN)w-(S)d-(A3)-(S)e-(XTEN)x-(S)e-(C1)-(S)f-(XTEN)y-(S)f-(C2)-(S)g-(XTEN)zV

gde je nezavisno za svaku pojavu, A1 domen AV od FVIII; A2 je A2 domen FVIII; A3 je A3 domen FVIII; B je B domen FVIII koji može biti fragment ili varijanta spajanja B domena; C1 je C1 domen FVIII; C2 je C2 domen FVIII; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; a je ili 0 ili 1; b je ili 0 ili 1; c je ili 0 ili 1; d je ili 0 ili 1; e je ili 0 ili 1; f je ili 0 ili 1; g je ili 0 ili 1; t je ili 0 ili 1; u je ili 0 ili 1; v je ili 0 ili 1; w je 0 ili 1, x je ili 0 ili 1; y je ili 0 ili 1; z je 0 ili 1 pod uslovom da je t u v w+ x y z ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4. U drugom primeru formule V, razdelnička sekvenca je glicin ili sekvenca odabrana iz Tabela 11 i 12.

[0175] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule VI:

(XTEN)u-(S)a-(Al)-(S)b-(XTEN)v-(S)b-(A2)-(S)c-(XTEN)w-(S)c-(A3)-

12

(S)d-(XTEN)x-(S)d-(C1)-(S)e-(XTEN)y-(S)e-(C2)-(S)f-(XTEN)zVI

gde je nezavisno za svaku pojavu, A1 domen AV od FVIII; A2 je A2 domen FVIII; A3 je A3 domen FVIII; C1 je C1 domen FVIII; C2 je C2 domen FVIII; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; a je ili 0 ili 1; b je ili 0 ili 1; c je ili 0 ili 1; d je ili 0 ili 1; e je ili 0 ili 1; f je ili 0 ili 1; u je ili 0 ili 1; v je ili 0 ili 1; w je 0 ili 1, x je ili 0 ili 1; y je ili 0 ili 1; z je 0 ili 1 pod uslovom da je u v w+ x y z ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4. U drugom primeru formule V, razdelnička sekvenca je glicin ili sekvenca odabrana iz Tabela 11 i 12.

[0176] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule VII:

(SP)-(XTEN)x-(CS)x-(S)x-(FVIII_1-745)-(S)y-(XTEN)y-(S)y-(FVIII_1635-2332)-(S)z-(CS)z-(XTEN)zVII

pri čemu je nezavisno za svaku pojavu SP signalni peptid, poželjno sa sekvencom MQIELSTCFFLCLLRFCFS (SEQ ID NO:1611), CS je sekvenca deljenja navedena u Tabeli 12, S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji opciono mogu da sadrže aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja, "FVIII_1-745" je ostatak 1-745 faktora FVIII i " FVIII_1635-2332 "je ostatak 1635-2332 od FVIII, x je ili 0 ili 1, y je 0 ili 1, i z je 0 ili 1, pri čemu x+y+z >2; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4. U jednom primeru formule VII, razdelnička sekvenca je GPEGPS (SEQ ID NO:1612). U drugom primeru formule V, razdelnička sekvenca je glicin ili sekvenca odabrana iz Tabela 11 i 12.

[0177] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni

12

protein faktora VIII formule VIII:

(A1)-(S)a-(XTEN)v-(S)a-(A2)-(B1)-(S)b-(XTEN)w-(S)b-(B2)-(A3)-(S)c-(XTEN)x-(S)c-(C1)-(S)d-(XTEN)y-(S)d-(C2)-(S)e-(XTEN)zVIII

gde je nezavisno za svaku pojavu, A1 domen AV od FVIII; A2 je A2 domen FVIII; B1 je fragment B domena koji može imati od ostatka 741 do 743-750 od FVIII ili alternativno od oko 741 do ostataka 745 od FVIII; B2 je fragment B domena koji može imati od ostataka 1635-1686 do 1689 FVIII ili alternativno od oko 1640 do ostataka 1689 od FVIII; A3 je A3 domen FVIII; C1 je C1 domen FVIII; C2 je C2 domen FVIII; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; a je ili 0 ili 1; b je ili 0 ili 1; c je ili 0 ili 1; d je ili 0 ili 1; e je ili 0 ili 1; f je ili 0 ili 1; u je ili 0 ili 1; v je ili 0 ili 1; w je 0 ili 1, x je ili 0 ili 1; y je ili 0 ili 1; z je 0 ili 1 pod uslovom da je u v w+ x y z ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili bar oko 99% ili 100% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4. U jednom primeru formule VIII, razdelnička sekvenca je GPEGPS (SEQ ID NO:1612). U drugom primeru formule V, razdelnička sekvenca je glicin ili sekvenca odabrana iz Tabela 11 i 12.

[0178] U drugom primeru sastava CFXTEN, obelodanjivanje daje rekombinantni fuzioni protein faktora VIII formule X:

(A1N)-(S)a-(XTEN)t-(S)b-(AlC)-(A2N)-(S)c-(XTEN)u-(S)d-(A2C)-(BN)-(S)c-(XTEN)v-(S)f-(BC)-(A3N)-(S)g-(XTEN)w-(S)h-(A3C)-(C1N)-(S)i-(XTEN)x-(S)j-(C1C)-(C2N)-(S)k-(XTEN)y-(S)l-(C2C)-(S)m-(XTEN)zIX

pri čemu je nezavisno za svaku pojavu, A1Nfragment A1 domene od najmanje ostatka broja 1 (numerisanog u odnosu na izvorni, zreli FVIII) do ne više od broja ostatka 371, A1cje fragment A1 domene od najmanje ostatka broja 2 do broja ostataka 372; A2Nje fragment A2 domena od najmanje ostatka broja 373 do ne više od broja ostatka 739, A2cje fragment A2 domena od najmanje ostatka broja 374 do ne više od broja ostatka 740; BNje fragment B domena od najmanje ostatka broja 741 do ne više od broja ostatka 1647, Bcje fragment B

1

domena od najmanje ostatka broja 742 do ne više od broja ostatka 1648; A3Nje fragment A3 domena od najmanje ostatka broja 1649 do ne više od broja ostatka 2019, A3cje fragment A3 domena od najmanje ostatka broja 1650 do ne više od broja ostatka 2019; C1Nje fragment C1 domena od najmanje ostatka broja 2020 do ne više od broja ostatka 2171, C1cje fragment C1 domena od najmanje ostatka broja 2021 do ne više od broja ostatka 2172; C2Nje fragment C2 domena od najmanje ostatka broja 2173 do ne više od broja ostatka 2331, C2cje fragment C2 domena od najmanje ostatka broja 2174 do ne više od broja ostatka 2332; S je razdelnička sekvenca koja ima između 1 do oko 50 aminokiselinskih ostataka koji mogu opciono uključivati sekvencu deljenja ili aminokiseline kompatibilne sa mestima ograničenja; a je ili 0 ili 1; b je ili 0 ili 1; c je ili 0 ili 1; d je ili 0 ili 1; e je ili 0 ili 1; f je ili 0 ili 1; g je ili 0 ili 1; h je ili 0 ili 1; i je ili 0 ili 1; j je ili 0 ili 1; k je ili 0 ili 1; 1 je ili 0 ili 1; m je ili 0 ili 1; t je ili 0 ili 1; u je ili 0 ili 1; v je ili 0 ili 1; w je 0 ili 1, x je ili 0 ili 1; y je ili 0 ili 1; z je 0 ili 1 pod uslovom da je t u v w+ x y z ≥1; i XTEN je produženi rekombinantni polipeptid kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na sekvence koje imaju najmanje 90% identičnosti sekvence sa sekvencama navedenim u Tabeli 4. U jednom primeru formule IX, razdelnička sekvenca je GPEGPS (SEQ ID NO:1612). U drugom primeru formule IX, razdelnička sekvenca je glicin ili sekvenca odabrana iz Tabela 11 i 12.

[0179] Primeri formula IV-VIII obuhvataju CFXTEN konfiguracije u kojima je jedna ili više XTEN duljina u rasponu od oko 6 aminokiselina do ≥ 1000 aminokiselina (npr., sekvence odabrane iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17 ili njihovih fragmenata, ili sekvence koje pokazuju najmanje oko 90-99% ili više identiteta sekvence na njih) su ubačene i povezane između susednih domena faktora VIII ili su povezane sa N- ili C-terminusom FVIII. U ostalim slučajevima formula V-VIII, obelodanjivanje dalje pruža konfiguracije u kojima je XTEN povezan sa FVIII domenima pomoću razmaknutih sekvenci koje mogu opciono sadržavati aminokiseline kompatibilne sa restrikcijskim mestima ili mogu uključivati sekvence deljenja (npr., sekvence Tabela 11 i 12, detaljnije opisano u daljem tekstu) tako da XTEN kodirajuća sekvenca može biti, u slučaju restriktivnog mesta, integrisana u CFXTEN konstrukt, a u slučaju sekvence deljenja, XTEN se može osloboditi iz fuzionog proteina dejstvom proteaze pogodne za sekvencu deljenja.

[0180] Primeri formula VI -VIII se razlikuju od onih formule V po tome što su komponenta FVIII formule VI-VIII samo obrisani oblici B domene ("FVIII BDD") faktora VIII koji zadržavaju kratke rezidualne sekvence B-domena, neograničavajući primeri njihovih

1 1

sekvencija dati su u Tabeli 1, pri čemu je jedan ili više XTEN ili fragmenata XTEN dužine u rasponu od oko 6 aminokiselina do ≥ 1000 aminokiselina (npr., sekvence izabrane iz bilo koje od Tabela 3, 4, i 13-17) su ubačeni i povezani između susednih domena faktora VIII i/ili između ostataka B domena, kao što su oni iz Tabele 8. Primer formule IX se uglavnom razlikuje od ostalih formula po tome što je jedan ili više XTEN ubačeno unutar domena FVIII, a ne između domena i/ili ima XTEN povezan sa C-terminusom FVIII (ili je preko razmaknutih sekvenci povezanih preko C-terminusa FVIII).

[0181] U nekim slučajevima CFXTEN, fuzioni protein sadrži oblik FVIII izbrisanog iz B domena gde delecija B-domena započinje sa prve pozicije oko 745 aminokiselinskog ostatka i završava na drugoj poziciji kod aminokiselinskog ostatka broj 1635 do oko 1690. u vezi sa sekvencijom humanog faktora VIII u celoj dužini i XTEN povezuje prvi položaj i drugi položaj za brisanje B-domena. U jednom primeru iznad navedenog, prva pozicija i druga pozicija brisanja B domene su izabrane sa pozicija Tabele 8. U drugom primeru iznad navedenog, najmanje jedan XTEN povezuje prvi i drugi položaj gde najmanje jedan XTEN povezuje aminokiselinski faktor VIII i ostatak aminokiseline 1640, ili aminokiselinski ostatak 741 i aminokiselinski ostatak 1640, ili aminokiselinu ostatak 741 i aminokiselinski ostatak 1690, ili aminokiselinski ostatak 745 i aminokiselinski ostatak 1667, aminokiselinski ostatak 745 i aminokiselinski ostatak 1657, ili aminokiselinski ostatak 745 i aminokiselinski ostatak 1657, ili aminokiselinski ostatak 747 i aminokiselinski ostatak 1642, ili aminokiselinski ostatak 751 i aminokiselinski ostatak 1667. U jednom primeru CFXTEN, gde faktor VIII sadrži XTEN koji povezuje prvi položaj i drugi položaj brisanja B-domena opisan u slučajevima ovog odeljka, XTEN je sekvenca koja ima najmanje 80% ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili barem oko 99% ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa sekvencom slične dužine izabrano iz bilo kojeg od Tabela 4, Tabele 13, Tabele 14, Tabele 15, Tabele 16 i Tabele 17, kada je optimalno poravnato, pri čemu CFXTEN zadržava najmanje oko 30%, ili najmanje oko 40%, ili najmanje oko 50 %, ili najmanje oko 60%, ili najmanje oko 70%, ili najmanje oko 80%, ili barem oko 90% prokoagulantne aktivnosti izvornog FVIII.

[0182] Obelodanjivanje razmatra sve moguće permutacije umetanja XTEN između ili unutar domena FVIII ili u ili blizu mesta ubacivanja iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili one koje su prikazane na SL.8-9, sa opcionim povezivanjem dodatnog XTEN na N- ili C-terminus FVIII, opciono povezan preko dodatne sekvence deljenja odabrane iz

1 2

Tabele 12, što rezultira CFXTEN sastavom; neograničavajući primeri koji su prikazani na Sl.

5 i 12. U jednom slučaju, CFXTEN sadrži FVIII BDD sekvencu Tabele 1 u kojoj jedan ili više XTEN od kojih svaki ima najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% ili više identiteta sekvence u poređenju sa sekvencom iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17 ili njihovih fragmenata su ubačeni između bilo koje dve preostale aminokiseline B domena FVIII BDD sekvence, što rezultira fuzionim proteinom jednolančanog FVIII, pri čemu CFXTEN zadržava najmanje oko 30%, ili najmanje oko 40%, ili najmanje oko 50%, ili najmanje oko 60%, ili barem oko 70%, ili barem oko 80%, ili barem oko 90% prokoagulantne aktivnosti izvornog FVIII. U prethodnom primeru, CFXTEN može imati dodatnu XTEN sekvencu bilo koje od Tabela 4 i 13-17 koja je povezana sa N- ili C-terminusom fuzionog proteina. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži najmanje prvi XTEN ubačen na mesto navedeno u Tabeli 8, pri čemu CFXTEN zadržava najmanje oko 30%, ili najmanje oko 40%, ili najmanje oko 50%, ili najmanje oko 60%, ili najmanje oko 70%, ili najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90% prokoagulantne aktivnosti izvornog FVIII. U jednom slučaju fuzionog proteina formule VII, CFXTEN sadrži FVIII BDD sekvencu Tabele 1 u kojoj dva ili više XTEN od kojih svaki ima najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%, ili 100% identitet sekvence u poređenju sa sekvencama iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17 ili njihovi fragmenti povezani su sa sekvencom FVIII-BDD u kojoj je najmanje jedan XTEN ubačen od oko 3 do oko 20 aminokiselinskih ostataka na strani C-terminusa aminokiseline R740 na mestu deljenja FVIII i od oko 3 do oko 20 aminokiselinskih ostataka na N-terminusnoj strani FVIII aminokiseline na mestu deljenja R1689 preostalih aminokiselina B domena FVIII BDD sekvence, što rezultira jednolančanim FVIII fuzionog proteina i jednim ili dva XTEN je povezan sekvencijom deljenja sa N- i/ili C-terminusom FVIII-BDD sekvence, pri čemu CFXTEN ima najmanje oko 40%, ili najmanje oko 50%, ili najmanje oko 60%, ili na najmanje oko 70%, ili najmanje oko 80%, ili bar oko 90% prokoagulantne aktivnosti izvornog FVIII nakon oslobađanja XTEN deljenjem sekvenci deljenja.

[0183] U jednom slučaju, A3 domen sadrži a3 kiseli region ili njegov deo. U drugom slučaju, najmanje jedan XTEN je ubačen unutar a3 kiselog regiona ili njegovog dela, N-terminus a3 kiselog regiona ili njegovog dela, C-terminus a3 kiselog regiona ili njegovog dela ili njihove kombinacije. U određenim slučajevima, najmanje jedan XTEN je ubačen unutar C2 domena,

1

N-terminusa C2 domena, C-terminusa C2 domena ili njihove kombinacije. U drugim slučajevima, faktor VIII sadrži čitav ili deo B domena. U još drugim slučajevima, najmanje jedan XTEN je ubačen u ceo ili deo B domena, N-terminus B domena, C-terminus B domena ili njihovu kombinaciju.

2. Konfiguracije proteina CFXTEN fuzionog proteina sa unutrašnjim XTEN

[0184] U drugom aspektu, obelodanjivanje pruža CFXTEN konfigurisan sa jednom ili više XTEN sekvenci koje se nalaze unutar FVIII sekvence. U jednom slučaju, obelodanjivanje omogućava CFXTEN konfigurisan sa jednom ili više XTEN sekvenci smeštenih unutar FVIII sekvence za dodeljivanje svojstava kao što su, ali ne ograničavajući se na, povećana stabilnost, povećana otpornost na proteaze, povećana otpornost na mehanizme čišćenja, uključujući ali ne ograničavajući na interakciju sa receptorima čišćenja ili FVIII inhibitorima i povećanom hidrofilnošću u poređenju sa FVIII bez ugrađenog XTEN.

[0185] Obelodanjivanje predviđa da se različite konfiguracije ili varijante sekvence FVIII mogu koristiti kao platforma u koju je ubačen jedan ili više XTEN. Ove konfiguracije uključuju, ali nisu ograničene na, nativne FVIII, FVIII BDD i jednolančane FVIII (scFVIII), i varijante tih konfiguracija. U slučaju scFVIII, obelodanjivanje daje CFXTEN koji se može konstruisati zamenom jedne ili više aminokiselina na mestu obrade FVIII. U jednom slučaju, scFVIII korišćen u CFXTEN je stvoren zamenom R1648 u FVIII sekvenci RHQREITR (SEQ ID NO:1698) sa glicinom ili alaninom da se spreči prerada proteolitika u heterodimerni oblik. Specifično se razmatra da bilo koji od ovde obelodanjenih CFXTEN primera sa ostatkom 1648 FVIII može imati zamenu za glicin ili alanin za arginin na položaju 1648. U nekim slučajevima, obelodanjivanje pruža CFXTEN koji sadrži scFVIII pri čemu su delovi sekvence koja okružuje mesto obrade R1648 zamenjeni sa XTEN, kao što je prikazano na Sl.

10A i 10B. U jednom slučaju, najmanje oko 60%, ili oko 70%, ili oko 80%, ili oko 90%, ili oko 95%, ili oko 97% ili više B-domena je zamenjeno XTEN sekvencom koja je ovde obelodanjena, uključujući jedno ili više mesta odvajanja R740, R1648 ili R1689. U drugom slučaju, CFXTEN ima FVIII sekvencu B domena između mesta odvajanja FXIa na R740 i R1689 (sa najmanje 1-5 susednih aminokiselina iz B domena, takođe zadržanih između mesta preseka i početka XTEN do dozvolite proteazi da pristupi odsečenom mestu) zamenjeno XTEN-om. U drugom slučaju, CFXTEN ima FVIII sekvencu B domene između mesta odvajanja FXIa na N745 i P1640 zamenjene s XTEN. U drugim slučajevima, Obelodanjivanje pruža CFXTEN FVIII BDD varijante sekvence u kojima se delovi B-domena brišu, ali samo jedno od mesta aktiviranja FXI R740 ili R1689 (i 1-5 susednih

1 4

aminokiselina B-domena) ostaje unutar konstrukt, pri čemu XTEN ostaje vezan na jednom kraju ili za laki ili teški lanac nakon deljenja pomoću FXIa, kao što je prikazano na Sl.5B i 5D. U jednom slučaju iznad navedenog, CFXTEN sadrži FVIII BDD sekvencu u kojoj su aminokiseline između N745 do P1640 ili između S743 do Q1638 ili između P747 do V1642 ili između N745 i Q1656 ili između N745 i S1657 ili između N745 i T1667 ili između N745 i Q1686 ili između R747 i V1642 ili između T751 i T1667 se brišu, a XTEN sekvenca je vezana između ovih aminokiselina, koja povezuje teški i laki lanac, i može dalje da sadrži dodatni XTEN umetnut bilo u spoljnu površinsku petlju, između FVIII domena, ili na N- ili C-terminusima FVIII BDD sekvence, kao što je jedno ili više mesta umetanja iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili ona koja su prikazana na SL.8-9. U drugom primeru iznad navedenog, CFXTEN sadrži FVIII BDD sekvencu u kojoj su aminokiseline između K713 do K1686 ili između ostataka 741 i 1648 izbrisane i XTEN povezan između dve aminokiseline, a dodatni XTEN se može ubaciti bilo u površinu petlje, između domena FVIII ili na N- ili C-terminusima FVIII BDD sekvence, uključujući, ali ne ograničavajući se na jedno ili više mesta umetanja iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili one ilustrovane na Sl.8-9. U nekim slučajevima takve CFXTEN sekvence mogu imati jedan ili više XTEN koji pokazuje najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 96%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%, ili 100% identiteta sekvence XTEN sekvenci iz bilo koje od Tabela 4 i 13-17.

[0186] Ovo obelodanjivanje razmatra druge CFXTEN sa unutrašnjim XTEN u različitim konfiguracijama; šeme oglednih konfiguracija prikazane su na Sl.5 i 10. Područja pogodna za mesta umetanja XTEN uključuju poznate granice domena FVIII, granice egzona, poznate površinske (spoljne) petlje i mesta površine dostupne rastvaraču identifikovane analizom rendgenske kristalografije i strukture izvedene iz molekularno-dinamičkih simulacija FVIII, regiona sa malim stepenom reda (procenjeno programima opisanim na SL.7 legenda), regioni niske homologije/nedostatka očuvanja kod različitih vrsta i hidrofilni regioni. U drugom primeru, mesta umetanja XTEN su izabrana na osnovu mesta vezivanja FVIII pretpostavljenih receptora deljenja. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži XTEN umetnut na lokacijama koje nisu u neposrednoj blizini mutacija impliciranih na hemofiliju A, navedene u bazi hemofilija A mutacije, pretrage, ispitivanja i resursa (HAMSTeRS), eliminisane su (Kemball-Cook G, i dr. Faktor VIII Struktura i izvor mutacionih resursa: HAMSTeRS verzija 4. Nucleic Acids Res. (1998) 26(1):216-219). U drugom slučaju, potencijalna mesta zaXTEN

1

umetanja uključuju ostatke unutar FVIII epitopa koji su sposobni da se vezuju anti-FVIII antitela koja se javljaju u senzibilizovanim hemofiličarima i koja inače ne deluju kao protein interaktivna mesta. Regioni i/ili mesta koja se za izuzeće smatraju kao mesta XTEN umetanja uključuju ostatke/oblasti faktora VIII koji su važni u različitim interakcijama, uključujući ostale proteine zgrušavanja, ostatke oko svakog arginina koji aktivira/inaktivira mesto deljenja na koji deluje na trombin proteaze, faktor Xa, aktivirani protein C, ostaci koji okružuju mesto za obradu signalnog peptida (ostatak 1) ako konstrukt sadrži signalni peptid, regiona za koji je poznato da deluju sa drugim proteinima, kao što su FIXa, FX/FXa, trombin, aktivirani protein C, protein kofaktor proteina C, von Willebrandov faktor, mesta za koja se zna da utiču na fosfolipidne kofaktore u koagulaciji, ostatke uključene u interakcije domena, ostatke koji koordiniraju Ca<++>ili Cu<++>jone, ostatke cisteina koji su uključeni u S-S intramolekularne veze, dokumentovani amino mesta ubacivanja kiseline i tačaka mutacije u FVIII proizvedenih u hemofiliji A ispitanika koji utiču na prokoagulantnu aktivnost i mesta mutacije u FVIII napravljena u istraživačkoj laboratoriji koja utiču na aktivnost prokoagulanse. Veb lokacije koje se razmatraju ili za umetanje (za produženje polu-raspada) ili za izuzeće (potrebno za uklanjanje potrošenog FVIIIa ili FXa) uključuju regione za koje se zna da utiču na proteproglikan heparin sulfat proteoglikan (HSPG) ili protein povezan sa lipoprotein proteinima niske gustine (LPR).

[0187] Analizom prethodnih kriterijuma, kako je opisano u Primeru 34, različita mesta umetanja ili rasponi mesta umetanja preko FVIII BDD sekvence su identifikovani i/ili potvrđeni kao kandidati za ubacivanje XTEN, neograničavajući primeri koji su navedeni u Tabeli 5, Tabela 6, Tabela 7, Tabela 8 i Tabela 9 i šematski su prikazane na SL.8 i 9. U jednom slučaju, CFXTEN sadrži XTEN umetke između pojedinih domena FVIII, tj. Između A1 i A2, ili između A2 i B, ili između B i A3, ili između A3 i C1, ili između C1 i C2 domene. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži XTEN umetnut unutar B domena ili između ostataka BDD sekvence. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži XTEN ubačen na poznate egzonske granice kodirajućeg FVIII gena, pošto egzoni predstavljaju module evoluciono sačuvanih sekvenci koji imaju veliku verovatnoću da funkcionišu u kontekstu ostalih proteinskih sekvenci. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži XTEN umetnut u površinske petlje identifikovane rendgenskom strukturom FVIII. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži XTEN ubačen u regione malog reda koje su identifikovane kao da imaju nisku ili nikakvu detektovanu elektronsku gustinu analizom rentgenske strukture. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži XTEN umetnut unutar regiona niskog reda, predviđenih algoritmima za predviđanje

1

strukture kao što su, ali ne ograničavajući se na algoritme FoldIndex, RONN, i Kyte & Doolitlle. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži XTEN umetnut u oblasti sekvenciranja visoke frekvencije hidrofilnih aminokiselina. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži XTEN umetnut u epitope koji mogu da se vežu antitela koja nastaju u prirodi protiv FVIII antitela kod senzibilisanih hemofilija. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži XTEN umetnut u oblasti sekvenciranja sa niskim očuvanjem sekvenci i/ili razlike u dužini segmenta sekvenci kroz FVIII sekvence različitih vrsta. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži XTEN povezan na N-terminus i/ili C-terminus. U drugoj instanci, obelodanjivanje pruža CFXTEN konfiguracije sa umetnutim XTEN odabranim između dva ili više kriterijuma iz iznad navedenih slučajeva. U drugom slučaju, obelodanjivanje pruža CFXTEN konfiguracije sa najmanje jednom, alternativno najmanje dve, alternativno najmanje tri, alternativno najmanje četiri, alternativno najmanje pet ili više XTEN ubačenih u sekvencu faktora VIII gde su tačke umetanja na ili proksimalno na strani N- ili C-terminusa najmanje jedne, dve, tri, četiri ili pet, ili šest ili više aminokiselina odabranih iz aminokiselina za ubacivanje preostalih aminokiselina iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabela 9 ili one prikazane na Sl.8-9, ili alternativno unutar jedne, ili unutar dve, ili unutar tri, ili unutar četiri, ili unutar pet, ili unutar šest aminokiselina ubacivanja preostalih aminokiselina iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabela 9, ili unutar različitih raspona aminokiselina umetanja, shematski su prikazane za oglednu sekvencu FVIII BDD na Sl.9.

[0188] Kao što je iznad opisano, jedan ili više interno lociranih XTEN ili fragment XTEN može imati dužinu sekvence od 6 do 1000 ili više aminokiselinskih ostataka. U nekim slučajevima, kada CFXTEN ima jednu ili dve ili tri ili četiri ili pet ili više XTEN sekvenci unutar FVIII, XTEN sekvence mogu biti identične ili mogu biti različite. U jednom slučaju, svaki interno-locirani XTEN ima najmanje oko 80% identiteta sekvence ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identiteta sekvence u poređenju sa uporedivim dužinama ili fragmentima XTEN ili motivima odabranim iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17, kada su optimalno postavljeni. U drugom slučaju, obelodanjivanje obezbeđuje CFXTEN konfigurisan sa jednim ili više XTEN umetnutih unutar FVIII BDD sekvence sa najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% , 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identiteta sekvence u poređenju sa sekvencom od Tabela 1, gde su umetanja smešteni na tačkama umetanja ili rasponu tačaka umetanja navedenih u Tabeli 5, Tabeli 6, Tabeli 7, Tabeli 8 i Tabeli 9, Sl.8 ili unutar raspona

1

umetanja kao što je prikazano na Sl.9. Stručnjaci će razumeti da je XTEN ubačen u FVIII sekvencu u tački umetanja Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8, i Tabele 9 povezana je svojim N- i C-terminusima sa bočne FVIII aminokiseline (ili preko vezivnog razdelnika ili sekvence deljenja, kao što je iznad opisano), dok je XTEN povezan na N- ili C-terminus FVIII povezan samo sa jednom FVIII aminokiselinom (ili sa povezujućim odstojnikom ili sekvenca deljenja aminokiselina, kao što je iznad opisano). Samo kao primer, varijacije CFXTEN sa tri unutrašnja XTEN mogu imati: XTEN (kao što je ovde opisano) ugrađen između FVIII BDD ostataka 741 i 1640, ostataka 18 i 19 i ostataka 1656 i 1657; ili XTEN inkorporiran između FVIII BDD ostataka 741 i 1640, ostataka 1900 i 1901, i na C-terminusu u ostatku 2332; ili XTEN inkorporiran između FVIII BDD ostataka 26 i 27, ostataka 1656 i 1657 i ostataka 1900 i 1901; ili XTEN inkorporiran između FVIII BDD ostataka 741 i 1640, ostataka 1900 i 1901, i na C-terminusu u ostatku 2332.

[0189] Ocenjujući fuzione proteine CFXTEN sa XTEN ubačenim na lokacije iz Tabele 5, otkriveno je da ubacivanje u određene oblasti FVIII sekvence rezultira CFXTEN sa dobrom ekspresijom i zadržavanjem prokoagulantne aktivnosti. Prema tome, u preferiranim slučajevima, obelodanjivanje daje CFXTEN fuzione proteine konfigurisane sa jednim, ili dva, ili tri, ili četiri, ili pet, ili šest ili više XTEN, od kojih svaki ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili alternativno 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa XTEN odabranim iz bilo koje od Tabela 4, i 13-17, umetnutih unutarnjih ili povezanih sa FVIII BDD sekvencom sa najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa sekvencom iz Tabele 1, gde su insercije smeštene na mestu umetanja unutar jednog, ili dva, ili tri, ili četiri, ili pet, ili šest ili više raspona navedenih u Tabeli 7. U prethodnim slučajevima, CFXTEN fuzioni proteini sa XTEN umetanjima zadržavaju najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% ili više prokoagulantne aktivnosti u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN.

[0190] Procenjujući CFXTEN fuzione proteine sa XTEN ubačenim na jednoj ili više lokacija iz Tabele 5, iznenađujuće je otkriveno da je visok procenat fuzionih proteina sa XTEN ulošcima zadržao aktivnost prokoagulanse, kao što je opisano u Primeru 25. Prema tome, Obelodanjivanje daje CFXTEN fuzione proteine konfigurisane sa jednim, dva, tri, četiri, pet,

1

šest ili više XTEN pri čemu dobijeni fuzioni protein pokazuje najmanje oko 10%, ili 20%, ili 30%, ili 40%, ili 50 %, ili 60%, ili 70%, ili 80%, ili 90% ili više prokoagulantne aktivnosti u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN, kada je testiran testom koagulacije opisanom ovde. U poželjnom primeru, obelodanjivanje daje CFXTEN fuzione proteine koji sadrže jedan, ili dva, ili tri, ili četiri, ili pet, ili šest ili više XTEN, a svaki ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa XTEN odabranim iz bilo kog od Tabela 4 i 13-17 koji je povezan sa FVIII BDD sekvencom sa najmanje oko 80% identiteta sekvence ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa sekvencom iz Tabele 1, gde su insercije smeštene na jednoj ili više mesta umetanja odabranih iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8, i Tabele 9 i gde rezultirajući fuzioni protein pokazuje najmanje oko 30 %, ili najmanje oko 40%, ili najmanje oko 50%, ili najmanje oko 60%, ili barem oko 70% ili više prokoagulantne aktivnosti u poređenju sa odgovarajućim FVIII, koji nije povezan sa XTEN, kada se in vitro testira testom ovde opisani (npr., hromogenim testom). Pošto predmetni CFXTEN fuzioni proteini obično pokazuju produženi polu-raspad u odnosu na izvorni FVIII, stručnjak iz oblasti tehnike će razumeti da će CFXTEN sa nižom prokoagulantnom aktivnošću u odnosu na ekvimolarnu količinu izvornog FVIII ipak biti prihvatljiv kada se primeni kao terapijski sastav za ispitanika kome je potrebno. U drugom slučaju, CFXTEN fuzioni proteini koji sadrže jedan, ili dva, ili tri, ili četiri, ili pet ili više XTEN, od kojih svaki ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa XTEN odabranim iz bilo kog od Tabela 4 i 13-17 koji je povezan sa FVIII BDD sekvencom sa najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili alternativno 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sekvence u poređenju sa sekvencom iz Tabele 1, gde su insercije smeštene na jednoj ili više tačaka umetanja ili rasponu tačaka umetanja odabranih iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9, gde je rezultirajući fuzioni protein pokazuje najmanje oko 0.5 IU/ml ili najmanje oko 0.75 IU/ml, ili najmanje 1.0 IU/ml, ili najmanje oko 1.5 IU/ml, ili najmanje oko 2.0 IU/ml, ili najmanje oko 2.5 IU/ml, ili najmanje oko 3 IU/ml, ili najmanje oko 4 IU/ml, ili najmanje oko 5 IU/ml, ili najmanje oko 7 IU/ml, ili najmanje oko 10 IU/ml, ili najmanje oko 20 IU/ml, ili najmanje oko 30 IU/ml FVIII aktivnosti, kada se eksprimira u medijumu ćelijske kulture i testira u hromogenom

1

ispitivanju, pri čemu su kultura i ekspresija prema ovde opisanim postupcima; npr., postupcima Primera 25.

[0191] Smatra se da bi Obelodanjivanje mesta umetanja u kojima FVIII zadržao bar deo svoje prokoagulantne aktivnosti takođe omogućilo ubacivanje drugih peptida i polipeptida sa bilo nestruktuiranim ili struktuiranim karakteristikama koje su povezane sa produženjem polu-raspada kada se stapaju na protein FVIII na jednom ili više istih mesta.

Neograničavajući primeri uključuju albumin, fragmente albumina, Fc fragmente imunoglobulina, P podjedinicu C-terminusnog peptida (CTP) humanog horionskog gonadotropina, HAP sekvencu, transferin, PAS polipeptide iz US patentne prijave br.

20100292130, poliglicinski veznici, poliserinski veznici, peptidi i kratki polipeptidi 6-40 aminokiselina dve vrste aminokiselina odabranih između glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P) sa različitim stepenom sekundarne strukture od manje od 50% do većih od 50%, između ostalog, bi bilo pogodno za ubacivanje u identifikovana mesta aktivnih umetanja FVIII.

[0192] U ovde opisanim primerima fuzionog proteina, CFXTEN fuzioni protein može dalje da sadrži jednu ili više sekvenci deljenja iz Tabele 12 ili druge sekvence poznate u oblasti, pri čemu se sekvencija deljenja nalazi između ili unutar 6 aminokiselinskih ostataka od preseka FVIII i XTEN sekvence, koje mogu da sadrže dve sekvence deljenja u datoj unutrašnjoj XTEN sekvenci. U jednom slučaju, CFXTEN koji sadrži sekvence deljenja ima dve identične sekvence deljenja, svaka smeštena na ili blizu odgovarajućih krajeva jednog ili više unutrašnjih XTEN tako da se XTEN oslobađa iz fuzionog proteina kada se deli proteaza koja se vezuje i deli sekvencu. Sekvence koje mogu da se dele detaljnije su opisane u daljem tekstu, a primeri se daju u Tabeli 12.

Tabela 5: Lokacije umetanja za XTEN povezane sa FVIII BDD sekvencom

14

14

Tabela 6. Primeri mesta umetanja za XTEN povezane sa FVIII polipeptidom

14

Tabela 7. Dalja primerna mesta umetanja za XTEN povezanih sa FVIII polipeptidom

Tabela 8. Primerne XTEN lokacije umetanja unutar izbrisanih varijanti FVIII

polipeptida izbrisanog iz B domene

14

Tabela 9. Primeri mesta umetanja za XTEN povezane sa FVIII polipeptidom što rezultira prokoagulantnom aktivnošću

14

14

[0193] U drugom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje biblioteke komponenti i metoda za stvaranje biblioteka izvedenih iz nukleotida koji kodiraju FVIII segmente, XTEN i FVIII segmente povezane sa XTEN koji su korisni u pripremi gena koji kodiraju ispitanikov CFXTEN. U prvom koraku, biblioteka gena koji kodira FVIII i XTEN ubačena je u različita pojedinačna mesta na ili unutar 1-6 aminokiselina mesta umetanja koja su identifikovana u Tabeli 5 ili prikazana na Sl.8-9 je stvoreno, izraženo i CFXTEN je oporavljen i procenjen za aktivnost i farmakokinetiku kao što je prikazano na Sl.15. Oni CFXTEN koji pokazuju poboljšana svojstva se zatim koriste za stvaranje gena koji kodiraju FVIII segment i mesto umetanja plus XTEN, sa komponentama iz svakog poboljšanog umetanja predstavljenog u biblioteci, kao što je prikazano na Sl.11. U jednom slučaju, komponente biblioteke su sastavljene korišćenjem standardnih rekombinantnih tehnika na kombinatorni način, kao što je prikazano na Sl.11, rezultirajući permutacijama CFXTEN sa višestrukim unutrašnjim i N-i C-terminusom XTEN, koji mogu uključivati mesta umetanja ili proksimalna od onih Tabela

14

5, Tabela 6, Tabela 7, Tabela 8 i Tabela 9, ili kako je prikazano na SL.8-9. Rezultirajući konstrukti bi se zatim procenjivali na aktivnost i pojačanu farmakokinetiku, a ocenjuju se oni kandidati koji rezultiraju CFXTEN sa poboljšanim svojstvima, npr., smanjenim aktivnim klirensom, otpornošću na proteaze, smanjenom imunogenošću i poboljšanjem farmakokinetike u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN.

3. XTEN permisivne petlje

[0194] Kao što je ovde detaljno opisano i kao što je prikazano na Slikama 33-36, pronalazači su prepoznali da svaki domen FVIII "A" sadrži najmanje dve "XTEN permisivne petlje" u koje se mogu umetati XTEN sekvence bez eliminisanja prokoagulantne aktivnosti rekombinantnog protein ili sposobnost rekombinantnih proteina da se eksprimiraju in vivo ili in vitro u ćeliji domaćinu. Pronalazači su identifikovali dozvoljene petlje XTEN kao oblasti sa, između ostalog, atributima, velikom izloženošću površini ili rastvaraču i velikom konformacijskom fleksibilnošću. A1 domen sadrži XTEN permisivnu petlju-1 (A1-1) region i XTEN permisivnu petlju-2 (A1-2) region, A2 domen sadrži XTEN permisivnu petlju-1 (A2-1) region i XTEN permisivni region petlje-2 (A2-2), domen A3 sadrži XTEN region permisivne petlje-1 (A3-1) i region XTEN permisivne petlje-2 (A3-2).

[0195] U određenim aspektima, rekombinantni protein FVIII, kako je opisano iznad, sadrži najmanje jednu sekvencu XTEN umetnute u najmanje jednu od XTEN permisivnih petlji A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 ili A3-2, pri čemu rekombinantni FVIII protein ima prokoagulantnu aktivnost i može se eksprimirati in vivo ili in vitro u ćeliji domaćinu. U određenim aspektima, rekombinantni protein FVIII, kako je opisano iznad, sadrži najmanje dve sekvence XTEN umetnute u FVIII, npr., u dve različite XTEN permisivne petlje A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 ili A3-2, pri čemu rekombinantni FVIII protein ima prokoagulantnu aktivnost i može se eksprimirati in vivo ili in vitro u ćeliji domaćinu. Alternativno, rekombinantni protein FVIII, kao što je opisano iznad, može da sadrži dve ili više XTEN sekvencija umetnutih u jednu XTEN permisivnu petlju bilo s našom bez XTEN sekvence umetnute u druge XTEN permisivne petlje, pri čemu rekombinantni protein FVIII ima prokoagulantnu aktivnost i može se izraziti in vivo ili in vitro u ćeliji domaćina. U određenim aspektima, rekombinantni FVIII protein, kao što je opisano iznad, može sadržavati najmanje jednu XTEN sekvencu umetnutu u najmanje jednu od XTEN permisivnih petlji kao što je iznad opisano, i može dalje da sadrži jednu ili više XTEN sekvenci umetnutih u a3, pri čemu rekombinantni protein FVIII ima prokoagulantnu aktivnost i može se izraziti in vivo ili in vitro u ćeliji domaćinu. U određenim aspektima, rekombinantni FVIII protein iz

1

obelodanjivanja može sadržati tri, četiri, pet, šest ili više XTEN sekvenci umetnutih u jednu ili više XTEN permisivnih petlji ili u a3, pri čemu rekombinantni FVIII protein ima prokoagulantnu aktivnost i može se eksprimirati in vivo ili in vitro u ćeliji domaćina.

[0196] U određenim aspektima, rekombinantni protein FVIII, kako je opisano iznad, sadrži najmanje jednu sekvencu XTEN umetnute u najmanje jednu od XTEN permisivnih petlji a3, pri čemu rekombinantni FVIII protein ima prokoagulantnu aktivnost i može se eksprimirati in vivo ili in vitro u ćeliji domaćinu. U određenim aspektima, rekombinantni FVIII protein iz obelodanjivanja sadrži najmanje jednu XTEN sekvencu umetnutu u a3 i dalje sadrži jednu ili više XTEN sekvenci umetnutih u jednu ili više XTEN permisivnih petlji kao što je iznad opisano, pri čemu rekombinantni FVIII protein ima prokoagulantno delovanje i može biti izraženi in vivo ili in vitro u ćeliji domaćinu.

[0197] Pronalazači su prepoznali da rekombinantni FVIII protein sadrži najmanje dve XTEN permisivne petlje u svakoj od oblasti domena FVIII A koja omogućava ubacivanje XTEN sekvence, a istovremeno ima prokoagulantnu aktivnost i još uvek može da se eksprimira in vivo ili in vitro od strane ćelije domaćina. Određene su različite kristalne strukture FVIII, različitih stepena rezolucije. Ove strukture FVIII i FVIIIa, određene rendgenskom kristalografijom i molekularno-dinamičkom simulacijom, korišćene su za generisanje modela pristupačne površine i konformacione fleksibilnosti za FVIII. Na primer, kristalnu strukturu humanog FVIII utvrdili su Shen i dr. Blood 111: 1240-1247 (2008) i Ngo i dr. Structure 16: 597-606 (2008). Podaci za ove strukture dostupni su u Protein Data Bank (pdb.org) pod Pristupnim brojevima 2R7E i 3CDZ, respektivno.

[0198] Predviđena sekundarna struktura teških i lakih lanaca humanog FVIII prema Shen i dr. kristalna struktura reprodukovana je na Sl.37A i 37B. Različiti beta lanci predviđeni od Shen i dr. kristalna struktura je numerisana uzastopno na Sl.8A i 8B. U određenim slučajevima, dozvoljene petlje XTEN A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 i A3-2 nalaze se unutar površinski izložene, fleksibilne strukture petlje u A domenima FVIII. A1-1 je smešten između beta lanca 1 i beta lanca 2, A1-2 je smešten između beta lanca 11 i beta lanca 12, A2-1 je smešten između beta lanca 22 i beta lanca 23, A2-2 je smešten između beta lanca 32 i beta lanca 33, A3-1 je smešten između beta lanca 38 i beta lanca 39, a A3-2 je smešten između beta lanca 45 i beta lanca 46, prema sekundarnoj strukturi zrelog FVIII sačuvanog kao pristupni broj 2R7E PDB baze podataka (PDB:2R7E) i kao što je prikazano na SL.8A i 8B. Sekundarna

1 1

struktura PDB pristupnog broja 2R7E prikazana na Sl.8A i 8B odgovara standardizovanom dodeljenju sekundarne strukture prema DSSP programu (Kabsch i Sander, Biopolymers, 22: 2577-2637 (1983)). DSSP sekundarnoj strukturi zrelog FVIII sačuvanog kao PDB pristupni broj 2R7E može se pristupiti u bazi podataka DSSP, dostupnoj na veb lokaciji swift.cmbi.ru.nl/gv/dssp/ (poslednji put pristupano, 9. februara, 2012) (Joosten i dr., 39(Suppl. 1): D411-D419 (2010)).

[0199] U određenim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A1-1 odgovara oblasti u matičnom zrelom čoveku FVIII od oko aminokiseline 15 do oko aminokiseline 45 sa Sl.30. U određenim aspektima, A1-1 odgovara regionu matične zrele humane FVIII, od oko aminokiseline 18 do približno aminokiseline 41 sa Sl.30. U određenim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A1-2 odgovara oblasti u matičnom zrelom čoveku FVIII od oko aminokiseline 201 do oko aminokiseline 232 sa Sl.30. U određenim aspektima, A1-2 odgovara regionu matične zrele humane FVIII, od oko aminokiseline 218 do približno aminokiseline 229 sa Sl.30. U određenim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A2-1 odgovara oblasti u matičnom zrelom čoveku FVIII od oko aminokiseline 395 do oko aminokiseline 421 sa Sl.30. U određenim aspektima, A2-1 odgovara regionu matične zrele humane FVIII, od oko aminokiseline 397 do približno aminokiseline 418 sa Sl.30. U određenim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A2-2 odgovara oblasti u matičnom zrelom čoveku FVIII od oko aminokiseline 577 do oko aminokiseline 635 sa Sl.30. U određenim aspektima, A2-2 odgovara regionu matične zrele humane FVIII, od oko aminokiseline 595 do približno aminokiseline 607 sa Sl.30. U određenim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A3-1 odgovara oblasti u matičnom zrelom čoveku FVIII od oko aminokiseline 1705 do oko aminokiseline 1732 sa Sl.30. U određenim aspektima, A3-1 odgovara regionu matične zrele humane FVIII, od oko aminokiseline 1711 do približno aminokiseline 1725 sa Sl.30. U određenim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A3-2 odgovara oblasti u matičnom zrelom čoveku FVIII od oko aminokiseline 1884 do oko aminokiseline 1917 sa Sl.3. U određenim aspektima, A3-2 odgovara regionu matične zrele humane FVIII, od oko aminokiseline 1899 do približno aminokiseline 1911 sa Sl.30.

[0200] U određenim aspektima, rekombinantni FVIII protein iz obelodanjivanja sadrži jednu ili više XTEN sekvenci umetnutih u jednu ili više XTEN permisivnih petlji FVIII, ili u a3

1 2

region, gde rekombinantni FVIII protein ima prokoagulantnu aktivnost i može se eksprimirati in vivo ili in vitro u ćeliji domaćina. XTEN sekvence koje treba ubaciti uključuju one koje povećavaju in vivo polu-raspad ili in vivo ili in vitro stabilnost FVIII.

[0201] U određenim aspektima, rekombinantni FVIII protein predmetnog obelodanjivanja sadrži XTEN sekvence ubačene odmah nizvodno od jedne ili više aminokiselina koje odgovaraju jednoj ili više aminokiselina u zrelom prirodnom humanom FVIII, uključujući, ali ne ograničavajući se na: aminokiselina 18 sa Sl.30, aminokiselina 26 sa SL.30, aminokiselina 40 sa SL.30, aminokiselina 220 sa SL.30, aminokiselina 224 sa SL.30, aminokiselina 399 sa SL.30, aminokiselina 403 sa SL.30, aminokiselina 599 sa SL.30, aminokiselina 603 sa SL.30, aminokiselina 1711 sa SL.30, aminokiselina 1720 sa SL.30, aminokiselina 1725 sa SL.30, aminokiselina 1900 sa SL.30, aminokiselina 1905 sa SL.30, aminokiselina 1910 sa SL.30, ili bilo koja njihova kombinacija, uključujući odgovarajuće umetanje u BDD-varijante FVIII ovde opisane.

[0202] U određenim aspektima, rekombinantni FVIII protein iz obelodanjivanja sadrži najmanje jednu sekvencu XTEN ubačenu u a3 region FVIII, bilo sam ili u kombinaciji sa jednom ili više XTEN sekvenci koje su umetnute u XTEN permisivne petlje A domena (npr., A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 ili A3-2 kao što je gore opisano), pri čemu rekombinantni FVIII protein ima prokoagulantnu aktivnost i može se eksprimirati in vivo ili in vitro u ćeliji domaćinu. U određenim aspektima, najmanje jedna XTEN sekvenca je umetnuta u a3 region odmah iza aminokiseline koja odgovara aminokiselini 1656 sa Sl.30. U određenim aspektima, rekombinantni FVIII protein iz obelodanjivanja sadrži XTEN sekvencu umetnutu u a3 region kao što je opisano, i dalje uključuje jednu ili više XTEN sekvenci koje su umetnute odmah nizvodno od jedne ili više aminokiselina koje odgovaraju jednoj ili više aminokiselina u matičnom humani FVIII koji uključuje, ali nije ograničen na: aminokiselina 18 sa Sl.30, aminokiselina 26 sa SL.30, aminokiselina 40 sa SL.30, aminokiselina 220 sa SL. 30, aminokiselina 224 sa SL.30, aminokiselina 399 sa SL.30, aminokiselina 403 sa SL.

30, aminokiselina 599 sa SL.30, aminokiselina 603 sa SL.30, aminokiselina 1711 sa SL.30, aminokiselina 1720 sa SL.30, aminokiselina 1725 sa SL.30, aminokiselina 1900 sa SL.30, aminokiselina 1905 sa SL.30, aminokiselina 1910 sa SL.30, ili kombinacije navedenog.

[0203] Stručnjak u oblasti tehnike razumeće da su gornji aspekti permisivnih petlji izvornog proteina FVIII u koji se može umetnuti heterologni protein takođe primenljivi na ovde

1

uklonjene varijante FVIII iz izbrisane B domene; npr., sekvence prikazane u Tabeli 1. U praksi predmetnog obelodanjivanja, razumeće se da BDD-FVIII sekvenca iz Tabele 1 može biti zamenjena za rekombinantni FVIII protein različitih iznad opisanih slučajeva, i veruje se da će rezultirajući konstrukti na sličan način zadržati prokoagulantnu aktivnost.

4. Interferencija sa FVIII sredstvima za vezivanje

[0204] Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi sastave fuzionih proteina prokoagulanse CFXTEN za upotrebu kod humanih pacijenata koji pate od koagulopatije, poput hemofilije A, koji imaju izvorna ili stečena antitela, inhibitore ili druge proteine ili molekule koji se vezuju za FVIII koji utiču na aktivnost ili polu-raspad CFXTEN fuzionih proteina, pri čemu CFXTEN zadržava veću količinu prokoagulantne aktivnosti u poređenju s odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN. Kao što je ovde korišćeno, "FVIII sredstvo za vezivanje" označava bilo koji molekul koji se može vezati za izvorni FVIII ili za rekombinantni fuzioni protein faktora VIII predmetnog pronalaska koji sadrži faktor VIII ili njegov fragment, bilo da je izvorni, dobijen ili proizveden rekombinantno. Specifično se predviđa da sredstvo za vezivanje FVIII uključuje anti-FVIII antitela i FVIII inhibitore, između ostalih proteina koji se mogu specifično vezivati za FVIII. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje fuzione proteine prokoagulanse CFXTEN koji pokazuju smanjeno vezivanje za anti-FVIII antitelo ili FVIII inhibitor koji interferira sa prokoagulantnom aktivnošću FVIII. Kao što je ovde korišćeno, "anti-FVIII antitelo" ili "antitelo anti-faktora VIII" znači antitelo sposobno da vezuje FVIII ili FVIII komponentu CFXTEN predmetnog pronalaska, pri čemu pomenuto antitelo uključuje ali nije ograničeno na antitela iz Tabele 10 ili poliklonsko antitelo iz hemofilije Pacijent sa inhibitorima FVIII. Termin antitelo uključuje monoklonska antitela, poliklonalna antitela, fragmente antitela i klone fragmenata antitela. Kao što se ovde koristi, "inhibitor FVIII" ili "antitelo na inhibitor anti-FVIII" znači antitelo koje je sposobno da vezuje FVIII ili FVIII komponentu CFXTEN predmetnog pronalaska i da na bilo koji način smanjuje prokoagulantnu aktivnost FVIII ili FVIII komponentu CFXTEN. U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje fuzione proteine CFXTEN koji zadržavaju aktivnost prokoagulanse u prisustvu FVIII inhibitora. U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje fuzione proteine CFXTEN koji sadrže FVIII koji pokazuju produženi polu-raspad u prisustvu sredstva za vezivanje FVIII u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN.

[0205] Većina inhibicijskih antitela na humani faktor VIII deluju vezanjem na epitope smeštene u A2 domenu ili C2 domen faktora VIII, narušavajući specifične funkcije povezane sa tim domenima (patent SAD br.6,770,744; Fulcher i dr. Lokalizacija epitopa inhibitora

1 4

humanog faktora FVIII na dva polipeptidna fragmenta. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:7728-7732; Scandella i dr. Mapiranje epitopa antitela za inhibitor humanog faktora VIII deletskom analizom fragmenata fVIII izraženih u Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:6152-6156). Dok se izveštava da je za 68% procenata inhibicijskih antitela usmereno protiv A2 i/ili C2 domena, 3% deluje protiv A1 domena i 46% protiv a3 kiselog regiona (Lavigne-Lissalde, G., i dr. Karakteristike, mehanizmi dejstva i mapiranje epitopa antitela protiv faktora VIII. Clin Rev Allergy Immunol (2009) 37:67-79). Na primer, određeni inhibitori specifični za teški lanac reaguju sa 18.3-kD amino-terminusnim segmentom A2 domena (Scandella D, i dr.1988); Lollar P i dr. Inhibicija humanog faktora VIIIa antitela anti-A2 podjedinice. J Clin Invest 1994;93:2497). FVIII sadrži mesto vezivanja fosfolipida u C2 domenu između aminokiselina 2302 i 2332, a takođe postoji i mesto vezivanja von Willebrandovog faktora u C2 domenu koje deluje zajedno sa aminokiselinama 1649-1689 u domenu A3. C2 domen takođe ima epitope koji, kada su povezani inhibitorima, blokiraju aktivaciju FVIII trombinom ili faktorom Xa. Inhibitori koji se specifično vezuju za laki lanac prepoznaju epitope u domenu A3 ili glavni antigeni region u domeni C2 i mogu rezultirati smanjenom prokoagulantnom aktivnošću sprečavanjem vezivanja FVIII na fosfolipid ili smanjenjem brzine disocijacije FVIII od von Willebrandovog faktora (Gilles JG, i dr. Antitela protiv faktora VIII kod pacijenata sa hemofilijom često su usmerena prema nefunkcionalnim odrednicama i ne pokazuju izotipsko ograničenje. Blood (1993) 82:2452; Shima M, i dr. Faktor VIII koji neutrališe monoklonsko antitelo i humani inhibitor humanog inhibitora koji prepoznaju epitope u C2 domeni inhibira faktor VIII koji se vezuje za von Willebrandov faktor i fosfatidilserin. Thromb Haemost (1993) 69:240). Neograničavajući primeri monoklonskih FVIII inhibitora navedeni su u Tabeli 9. Kod pacijenata sa inhibitorima visokog titra, postoji povećan rizik od nastanka ponavljajućih krvarenja u pojedinim zglobovima, što u konačnici može rezultirati smanjenim kvalitetom života, invalidnošću ili smrću od prekomernog gubitka krvi (pat. SAD prijava br.20120065077; Zhang i dr., Clinic. Rev. Allerg. Immunol., 37:114-124 (2009); Gouw and van den Berg, Semin. Thromb. Hemost., 35:723-734 (2009))

[0206] Iako se ne namerava vezati nikakvom određenom teorijom, veruje se da nestrukturirana karakteristika XTEN ugrađenog u CFXTEN fuzione proteine omogućava XTEN da usvoji konformacije koje rezultiraju sterilnom ometanjem prema inhibitorima koji bi se inače vezali za FVIII epitope. Kao što je prikazano na Sl.6, kako ugrađeni XTEN pretpostavlja različite slučajne konformacije zavojnice, on prostorno pokriva regiona FVIII

1

komponente fuzionog proteina i sterilno ometa sposobnost inhibitora da se veže za FVIII epitop.

[0207] U jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN koji pokazuje prokoagulantnu aktivnost i redukovano vezivanje u prisustvu antitela koje se veže za C2 domen faktora VIII u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN i/ili sa matičnim FVIII. U drugom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN koji pokazuje prokoagulantnu aktivnost i redukovano vezivanje u prisustvu antitela koje se veže za A2 domen Faktora VIII u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN ili sa matičnim FVIII. U drugom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN koji pokazuje prokoagulantnu aktivnost i redukovano vezivanje u prisustvu antitela koja se vezuju za A2 i C2 domen faktora VIII, u poređenju sa odgovarajućim faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN ili matičnim FVIII. U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža CFXTEN koji pokazuje prokoagulantnu aktivnost i redukovano vezivanje, u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN, u prisustvu antitela izabranog iz grupe koja se sastoji od antitela iz Tabele 10. U jednom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN pokazuje smanjeno vezivanje za antitelo GMA8021. U drugom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN pokazuje smanjeno vezivanje za antitelo GMA8008. U drugom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN pokazuje smanjeno vezivanje za antitelo ESH4. U drugom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN pokazuje smanjeno vezivanje za antitelo ESH8. U drugom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN pokazuje smanjeno vezivanje za antitelo B02C11. U drugom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN pokazuje smanjeno vezivanje i veći stepen aktivnosti prokoagulanse, u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN, u prisustvu plazme ispitanika hemofilije A sa inhibitorima poliklonalnih antitela FVIII, pri čemu je veći stepen prokoagulantne aktivnost određuje se in vitro testom kao što je Bethesda test ili drugi test opisan ovde.

[0208] CFXTEN koji pokazuje redukovano vezanje FVIII inhibitorima može imati jedan, ili dva, ili tri, ili četiri, ili pet, ili šest ili više pojedinačnih XTEN, čija su otelotvorenja ovde obelodanjena. U prethodnim otelotvorenjima ovog stava, CFXTEN ima najmanje 5%, ili 10%, ili 15%, ili 20%, ili 30%, ili 40%, ili 50%, ili 60%, ili 70% ili manje vezivnog na antitelo kada se procenjuje in vitro u testu sposobnom za ispitivanje vezivanja antitela na FVIII, kao što su ispitivanja opisana ovde u daljem tekstu ili ona poznata u struci.

Alternativno, redukovano vezivanje ispitanika CFXTEN za antitela koja vežu FVIII može se

1

proceniti zadržavanjem većeg stepena prokoagulantne aktivnosti u prisustvu antitela u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN, kao što je opisano u Primerima. Prema tome, u otelotvorenjima koja se odnose na redukovano vezivanje FVIII inhibitora opisanih ovde, CFXTEN pokazuje, kada reaguje sa antitelom anti-FVIII, najmanje 5%, ili 10%, ili 15%, ili 20%, ili 30%, ili 40%, ili 50%, ili 60%, ili 70%, ili 80%, ili 100%, ili 200%, ili 300%, ili 400%, ili 500% ili više aktivnosti u testu koagulacije (kao što je ovde opisano ispod) u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN i reagovao sa antitelom. U iznad navedenom, antitelo anti-FVIII može biti antitelo iz Tabele 9 ili cirkulišuće anti-FVIII antitelo ispitanika hemofilije A. U drugom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN u kome je ispitivani fuzioni protein, kada se koristi korišćenjem Bethesda testa, i anti-FVIII antitelo izabrano iz Tabele 10 ili preparat poliklonskog anti-FVIII antitela, kao što je, ali nije ograničeno na, plazmu iz hemofiliju A ispitanika sa inhibitorima FVIII, rezultira Bethesda titrom sa najmanje oko 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, ili 200 manje Bethesda jedinica u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN i testiran u uporedivim uslovima. U drugom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN u kome ispitivani fuzioni protein rezultira sa manje od 50%, ili manje od 40%, ili manje od 30%, ili manje od 25%, ili manje od 20%, ili manje od 15% ili manje od 14%, ili manje od 13%, ili manje od 12%, ili manje od 11%, ili manje od 10% Bethesdskih jedinica u poređenju sa FVIII, koji nije povezan sa XTEN, kada je testiran u uporedivim uslovima koristeći Bethesda test i sastav poliklonskog anti-FVIII antitela, kao što je, ali nije ograničeno na, plazmu ispitanika hemofilije A sa inhibitorima FVIII.

Tabela 10: Antitela anti-faktora VIII

1

1

1

1 Testovi za vezivanje inhibitora i antitela

[0209] Fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu se testirati da potvrde smanjeno vezanje FVIII inhibitorima korišćenjem postupaka poznatih u struci. Testovi koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, kompetetivne i nekonkurentne sisteme ispitivanja koristeći tehnike poput zapadnog blotovanja, radioimunoanalize, ELISA, "sendvič" imunoispitivanja, imunoprecipitacije, reakcije taloženja, difuziju gela reakcija taloženja, imunodifuzijske analize testovi aglutinacije, imunoradiometrijski testovi, fluorescentni imunotestovi, testovi zgrušavanja, testovi inhibitora faktora VIII, da nabrojimo samo nekoliko. Takvi testovi su rutinski i dobro poznati u struci (videti, npr., Ausubel i dr, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons, Inc., New York). U nastavku su ukratko opisani primeri, ali nisu predviđeni ograničenjem.

[0210] Bethesda test i Nijmegen modifikacija Bethesda testa su testovi inhibitora faktora VIII, poznati kao postupci za otkrivanje inhibitora FVIII (Kasper CK, i dr. Zapisnik:

Ravnomernije merenje inhibitora faktora VIII. Thromb Diath Haemorrh. (1975) 34(2):612). Međutim, testovi se mogu modifikovati da bi se ispitivalo vezivanje inhibitora u FVIII sastavima koristeći inhibitore kao što su poliklonalna ili monoklonska anti-FVIII antitela, uključujući antitela iz Tabele 10, i postupke opisane u Primeru 52. Ukratko, modifikovani Bethesda test uključuje mešanje određenih količina testiranog uzorka sa jednakom zapreminom inhibitora u zadatoj koncentraciji. Smeše se inkubiraju tokom 2 sata na 37°C pre analize koncentracije faktora koagulacijskim testom, kao što je hromogeni test. Slično tome, inkubira se referentna plazma sa prirodnim nivoom faktora VIII koja se tada analizira kao pozitivna kontrola. Tačka sagorevanja je titar koji rezultira sa 50% FVIII aktivnosti pozitivne kontrole, prijavljene kao Bethesda jedinice. U Nijmegen modifikaciji Bethesda testa, uzorci ispitivanja su stabilizovani imidazol puferom i kontrolni uzorak je pomešan sa deficitarnom plazmom umesto sa puferom (Verbruggen B, i dr. Nijmegen modifikacija Bethesda testa za inhibitore faktora VIII:C: poboljšana specifičnost i pouzdanost. Thromb Haemost. (1995) 73(2):247-251).

[0211] Analiza zapadnog blotovanja uglavnom uključuje pripremu uzoraka proteina, elektroforezu uzoraka proteina u poliakrilamidnom gelu (npr., 8% -20% SDS-PAGE u zavisnosti od molekulske težine antigena), prenošenje uzorka proteina iz gela s poliakrilamidom na membranu kao što je nitroceluloza, PVDF ili najlon, blokirajući membranu u blokirajućem rastvoru (npr., PBS sa 3% BSA ili nemasnim mlekom), ispiranje

1 1

membrane u puferu za pranje (npr., PBS-Tween 20), blokiranje membrane primarnim antitelom (antitelo koje vas zanima) razblaženo u blokirajućem puferu, pranje membrane u puferu za pranje, blokiranje membrane sa sekundarnim antitelom (koje prepoznaje primarno antitelo, npr., anti-humano antitelo) konjugovano sa enzimatskim supstratom (npr., peroksidazom hrena ili alkalnom fosfatazom) ili radioaktivnim molekulom (npr., 32 P ili 125 I) razblažen u blokirajućem puferu, ispiranje membrane u puferu za pranje i otkrivanje prisustva antigena. Osoba koja poznaje ovo područje biće poznata u pogledu parametara koji se mogu modifikovati da bi se povećao otkriveni signal i smanjila pozadinska buka. Za dalju raspravu o protokolima zapadnog blotovanja pogledajte, npr., Ausubel i dr, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 10.8.1.

[0212] Testovi ELISA mogu otkriti antitela na FVIII nezavisno od njihove sposobnosti da blokiraju aktivnost prokoagulanse FVIII i korišćena su za otkrivanje anti-FVIII koji se razvija kod pacijenata sa hemofilijom A. U populaciji od 131 pacijenta sa hemofilijom A sa inhibitorima, ELISA tehnika je rezultirala 97.7% osetljivosti i 78.8% specifičnosti i imala je visoku negativnu prediktivnu vrednost (98.6%) [Martin, P. G., i dr. Procena novog ELISA skrining testa za otkrivanje inhibicijskih antitela faktora VIII kod hemofiličara. Clin Lab Haematol (1999) 21:125-128]. Drugi istraživači su otkrili visoko značajnu povezanost između Bethesda titra i vrednosti apsorpcije u ELISA testu za otkrivanje anti-FVIII Abs (Towfighi, F., i dr. Uporednim merenjima antitela anti-faktora VIII pomoću Bethesda testa i ELISA otkriva se ograničen profil izotipa i specifičnost epitopa. Acta Haematol (2005) 114: 84-90), sa dodatnom prednošću u otkrivanju neinhibicijskih anti-FVIII antitela. Protokoli ispitivanja obuhvataju pripremu vezujućeg liganda, koji može obuhvatati uzorak koji sadrži ili polipeptid faktora VIII ili CFXTEN fuzioni protein, oblaganje udubljenja mikrotitracijske ploče sa 96 udubljenja sa antitelom, dodavanje testiranog uzorka liganda i inkubiranjem, zatim dodavanjem antitela za otkrivanje i inkubiranjem pre ispiranja i dodavanje antitela konjugovanog alkalnom fosfatazom ili peroksidazom i inkubiranje tokom dodatnog perioda pre dodavanja TMB supstrata i obrada za očitavanje spektrofotometrom na 450 nm. U ELISA testu antitelo ili inhibitor od interesa ne mora biti konjugovan sa jedinjenjem koje se može detektovati; umesto toga, u udubljenje se može dodati drugo antitelo (koje prepoznaje antitelo ili inhibitor od interesa) konjugovano na detektibilno jedinjenje. Dalje, umesto da se udubljenja oblažu antitelom, ligand može biti obložen u udubljenju. Osoba koja poznaje ovo područje biće poznata u pogledu parametara koji se mogu modifikovati da bi se povećao

1 2

otkriveni signal, kao i druge varijacije ELISA poznatih u struci.

[0213] Standardni ili modifikovani testovi koagulacije se koriste za merenje smanjenog vezanja FVIII sredstva za vezivanje. U jednom primernom postupku (dalje opisano u Primeru 28), optimalna koncentracija datog FVIII inhibitora za upotrebu u testu prvo se određuje titracijskim eksperimentom uz korišćenje različitih količina inhibitora antitela inkubiranog na 37°C tokom 2 sata sa bazom vektor koji izražava divlji tip FVIII koji sadrži His/Myc dvostruku oznaku. FVIII aktivnost se meri postupkom Coatest testa koji je ovde opisan. Najniža koncentracija koja rezultira optimalnom inhibicijom FVIII aktivnosti je korištena u testu. U ispitivanju, antitelo inhibitora FVIII u optimalnoj koncentraciji je pomešano sa pojedinačnim ispitnim uzorcima i inkubirano tokom 2 sata na 37°C. Rezultirajući test uzorci su zatim prikupljeni i korišćeni u testu Coatest aktivnosti, zajedno sa neobrađenim alikvotima CFXTEN i pozitivnom kontrolom kako bi se procenila rezidualna i osnovna FVIII aktivnost za svaki test uzorak.

[0214] Obelodanjivanje pruža postupke izrade CFXTEN koji pokazuju smanjeno vezivanje na sredstva za vezivanje FVIII, uključujući FVIII inhibitore, i zadržavanje aktivnosti prokoagulansa. U jednom slučaju, postupak za pravljenje CFXTEN sa redukovanim vezivanjem na FVIII inhibitore obuhvata korake odabira FVIII sekvence sa najmanje 90% identitetom sekvence za sekvencu iz Tabele 1, izbor jednog, dva, tri, četiri, pet, ili šest ili više XTEN svaki sa najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 95-99% identiteta sekvence XTEN sekvence uporedive dužine iz Tabele 4, stvarajući ekspresione konstrukcije dizajnirane da pronađu pomenuti XTEN na ili blizu lokacija izabranih iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9, koja izražava i oporavlja rezultirajući CFXTEN i ispitivanje rezultirajućih fuzionih proteina u ispitivanju opisanom ovde kako bi se potvrdilo smanjeno vezivanje CFXTEN fuzionog proteina. Prema pronađenom postupku, CFXTEN pokazuje najmanje 5% smanjenog ili najmanje 10% smanjenog, ili najmanje 15% smanjenog, ili najmanje 20% smanjenog, ili najmanje 25% smanjenog, ili najmanje 40% smanjenog, ili najmanje 50% smanjeno, ili najmanje 60% smanjeno, ili najmanje 70% reducirano, ili najmanje 80% redukovano vezanje na sredstvo za vezivanje FVIII, uključujući, ali ne ograničavajući se na antitela iz Tabele 10 ili anti-FVIII antitela iz hemofilija Subjekt, i zadržava najmanje oko 10%, ili najmanje oko 20%, ili najmanje oko 30%, ili najmanje oko 40%, ili najmanje oko 50%, ili najmanje oko 60%, ili najmanje oko 70% prokoagulantne aktivnosti u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN.

1

[0215] Do 8-10% bolesnika sa hemofilijom A ima antitela koja vezuju FVIII ne utičući na njegova svojstva prokoagulanse; stoga nisu kategorisani kao inhibitori FVIII. Međutim, veruje se da vezivanje antitela na FVIII dovodi do imunih kompleksa koji se uklanjaju urođenim imunim odgovorom ili su podložniji proteolitičkoj razgradnji (Kazatchkine MD. Cirkulišući imunološki kompleksi koji sadrže antitela anti-VIII kod multi-transfuziranih pacijenata sa hemofilijom A. Clin Exp Immunol. (1980) 39(2):315-320). Shodno tome, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi fuzione proteine CFXTEN koji sadrže jedan ili više XTEN koji pokazuju smanjeno vezivanje antitela na FVIII koji nisu inhibitori, pri čemu je razgradnja ili klirens CFXTEN smanjen za najmanje 5%, ili 10% ili 15%, ili 20%, ili 30%, ili 40%, ili 50%, ili 60%, ili 70% ili manje u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN ili za izvorni FVIII vezan takvim antitelom. Smanjeno vezivanje antitela za CFXTEN u poređenju sa FVIII koje nije povezano sa XTEN ili za izvorni FVIII može se testirati metodama in vitro i in vivo. In vitro metode uključuju iznad pomenute ELISA i postupke zapadnog blotovanja. Smanjena razgradnja ili klirens CFXTEN može se proceniti in vivo upotrebom životinjskih modela ili kliničkim ispitivanjima na ljudima. U jednoj vrsti ispitivanja, faktor VIII ili CFXTEN se primenjuju odvojeno, poželjno intravenskom infuzijom, kohortama pacijenata sa manjkom faktora VIII koji imaju antitela koja promovišu degradaciju ili klirens terapijskog humanog faktora VIII. Doziranje primenjenog testiranog proizvoda je u opsegu između 5 i 50 IU/kg telesne mase, poželjno 10-45 IU/kg, a najpoželjnije 40 IU/kg telesne težine. Otprilike jedan sat nakon svake primene, oporavak faktora VIII ili CFXTEN iz uzoraka krvi meri se funkcionalnim testom jednostepene ili hromogene koagulacije za procenu aktivnosti i pomoću ELISA, HPLC ili sličnog testa da bi se kvalifikovala količina netaknutog faktora VIII ekvivalenta. Uzorci se uzimaju ponovo otprilike 5-10 sati nakon infuzije, a meri se oporavak. Ukupni oporavak i stopa nestanka faktora VIII iz uzoraka prediktivni su titar antitela, a poređenje rezultata iz faktora VIII i CFXTEN ukazuje na stepen smanjenog klirensa i/ili razgradnje CFXTEN. U jednom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN pokazuje najmanje 5% smanjenog, ili najmanje 10% smanjenog, ili najmanje 15% smanjenog, ili najmanje 20% smanjenog, ili najmanje 25%, ili najmanje 40% smanjenog, ili najmanje 50% smanjeno, ili najmanje 60% smanjeno, ili najmanje 70% smanjeno, ili najmanje 80% smanjeno vezivanje za anti-FVIII antitelo koje promoviše klirens, ali na drugi način ne inhibira prokoagulansku aktivnost netaknutog izvornog FVIII. U drugom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN pokazuje najmanje 5% smanjenog, ili najmanje 10% smanjenog, ili najmanje 15% smanjenog, ili najmanje 20%

1 4

smanjenog, ili najmanje 25%, ili najmanje 40% smanjenog, ili najmanje 50% smanjeno, ili najmanje 60% smanjeno, ili najmanje 70% smanjeno, ili najmanje 80% smanjeno vezivanje za anti-FVIII antitelo koje promoviše degradaciju FVIII. U prethodnim otelotvorenjima ovog paragrafa, redukovano vezivanje anti-FVIII antitela je alternativno okarakterisano povećanom KDvrednošću FVIII antitela na fuzioni protein u poređenju sa FVIII od najmanje dvostrukog, ili trostrukog, ili četvorostrukog ili petostrukog, ili 10 puta, ili 33 puta, 100 ili 100 puta ili 330 puta ili najmanje 1000 puta u odnosu na vezivanje za odgovarajući FVIII koji nije povezan sa XTEN. U jednom otelotvorenju, fuzioni proteini CFXTEN koji sadrže jedan ili više XTEN koji pokazuju smanjenu reaktivnost na anti-FVIII antitelo pokazuju produženi terminusni polu-raspad kada se daju ispitaniku sa anti-FVIII antitelom od najmanje 48 h, ili najmanje 72 h ili najmanje 96 h, ili najmanje 120 h, ili najmanje 144 h, ili najmanje 14 dana, ili najmanje 21 dan, u poređenju sa FVIII, koji nije povezan sa XTEN. U prethodnom otelotvorenju, predmet može biti humana hemofilija A ili može biti mišja hemofilija A sa cirkulišućim anti-FVIII antitelama.

[0216] Sledeći aspekt predmetnog obelodanjivanja je upotreba fuzionog proteina CFXTEN za specifičnu terapiju koagulopatije kod ispitanika sa FVIII inhibitorom. Obelodanjivanje obezbeđuje postupak lečenja ispitanika sa cirkulišućim FVIII inhibitorima, koji obuhvata korak davanja efektivne količine zgrušavanja CFXTEN fuzionog proteina ispitaniku gde fuzioni protein pokazuje veću prokoagulansku aktivnost i/ili efikasne koncentracije zgrušavanja duže trajanje u poređenju s odgovarajućim faktorom VIII koji nije povezan sa XTEN ili u poređenju sa izvornim faktorom VIII koji se daje ispitaniku koristeći uporedivu količinu i put primene. U jednom slučaju postupka, inhibitor FVIII kod ispitanika je anti-FVIII antitelo. U drugom slučaju, inhibitor FVIII je neutralizujuće anti-FVIII antitelo. U jednom slučaju, inhibitor FVIII je antitelo protiv FVIII koje se vezuje za A1 domen FVIII. U drugom slučaju, inhibitor FVIII je antitelo protiv FVIII koje se vezuje za A2 domen FVIII. U drugom slučaju, inhibitor FVIII je antitelo protiv FVIII koje se vezuje za A3 domen FVIII. U drugom slučaju, inhibitor FVIII je antitelo protiv FVIII koje se vezuje za C1 domen FVIII. U drugom slučaju, inhibitor FVIII je antitelo protiv FVIII koje se vezuje za C2 domen FVIII. U drugom slučaju, inhibitor FVIII je antitelo protiv FVIII koje se vezuje i za C2 i za A2 domen FVIII. U drugom slučaju, inhibitor FVIII se vezuje za FVIII epitop koji može biti vezan sa jednim ili više antitela iz Tabele 10. U drugom slučaju, inhibitor FVIII je poliklonalno antitelo ispitanika sa hemofilijom A sa antitelom za inhibitor FVIII.

1

[0217] Cilj predmetnog pronalaska je stvaranje CFXTEN sa XTEN ubačenim da se maksimizira stroga interferencija FVIII-vezujućih sredstava koja bi se inače vezala za FVIII i neutralizovala prokoagulantnu aktivnost ili rezultirala čistom ili degradacijom FVIII. Prema tome, u jednom pristupu obelodanjivanje pruža CFXTEN koji sadrži jedan ili više XTEN gde je XTEN ubačen proksimalno do mesta vezivanja FVIII inhibitora ili anti-FVIII antitela. U jednom slučaju, XTEN je povezan sa FVIII na lokaciji odabranoj iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 koja je unutar oko 50, ili oko 100, oko 150, ili oko 200, ili oko 250, ili oko 300 aminokiselina FVIII epitopa koji je vezan antitelom iz Tabele 10. U drugom slučaju, XTEN je povezan sa FVIII unutar oko 50, ili oko 100, ili oko 150, ili oko 200, ili oko 250, ili oko 300 aminokiselina FVIII epitopa u domenu A2 ili C2 koji je vezan antitelo iz Tabele 10. Shodno tome, obelodanjivanje obezbeđuje CFXTEN fuzione proteine koji sadrže jedan ili više XTEN gde je vezivanje inhibitora FVIII na FVIII komponentu fuzionog proteina smanjeno u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN ili sa izvornim FVIII, a CFXTEN zadržava aktivnost prokoagulanse. U iznad navedenim slučajevima opisanim u ovom paragrafu, fuzioni proteini mogu se analizirati niže opisanim ispitivanjima, testima primera ili drugim testovima poznatim u oblasti, a inhibitori mogu biti antitelo iz Tabele 10, poliklonski anti-FVIII, ili može biti krv ili plazma ispitanika sa hemofilijom A sa inhibitorima FVIII.

[0218] U drugom aspektu, CFXTEN je dizajniran da maksimizira regione preko kojih XTEN može usvojiti nasumične konformacije zavojnice koje pokrivaju fuzioni protein, što rezultira sterilnom preprekom za anti-FVIII antitela koja bi inače vezala epitope za FVIII komponentu fuzionog proteina. Veruje se da ugradnja više XTEN u CFXTEN obezbeđuje veći ukupni hidrodinamički radijus komponente XTEN u poređenju sa CFXTEN sa manje XTEN, a ima približno isti ukupan broj XTEN aminokiselina. Empirijski, hidrodinamički radijus za protein može se izračunati na osnovu hromatografije za isključivanje veličine i rezultata nekoliko fuzionih proteina upotrebom takvih postupaka opisanih u Primerima. Alternativno, radijus za XTEN polipeptide, poput onih koji su ugrađeni u ovde predstavljene slučajeve, može se aproksimirati matematičkim formulama, jer ograničene vrste korišćenih aminokiselina imaju poznate karakteristike koje se mogu kvantifikovati. U jednom slučaju, izračunava se maksimalni radijus jednog XTEN polipeptida (u daljem tekstu „XTEN radijus“) prema formuli datoj u Jednačini II:

[0219] U drugom slučaju, izračunava se zbir maksimalnog XTEN radijusa za sve XTEN

1

segmente u CFXTEN (u daljem tekstu: „Suma XTEN radijusa“) u skladu sa formulom koja je data u Jednačini III:

Suma XTEN radijusa =

gde: n = broj XTEN segmenata

i i je iterator

[0220] U drugom slučaju, izračunava se odnos SUM XTEN radijusa CFXTEN koji sadrži više XTEN i radijusa XTEN za jedan XTEN ekvivalentne dužine (u ukupnim aminokiselinskim ostacima u odnosu na CFXTEN) (u daljem tekstu „Odnos XTEN Radijusa") prema formuli datoj u Jednačini IV:

gde: n = broj XTEN segmenata

i i je iterator

[0221] Primena u Jednačini na XTEN, stručnjak će razumeti da izračunate vrednosti predstavljaju maksimalne vrednosti koje mogu varirati ili biti smanjene u zavisnosti od ćelije domaćina koja se koristi za ekspresiju XTEN polipeptida. Smatra se da dok bi ekspresija E. coli rezultirala XTEN koji postiže izračunate vrednosti, ekspresija u eukariotskim ćelijama domaćina u kojima XTEN može biti glikozilirana može rezultirati polimerom polipeptida manjim od maksimalno izračunate vrednosti. Takve razlike mogu se kvantifikovati postupcima kao što je hromatografija za isključivanje veličine, čiji su postupci detaljno opisane u Primerima.

[0222] Da bi se dizajnirao CFTEN koji maksimizira površinu preko koje XTEN može usvojiti slučajne konformacije zavojnice, otkriveno je da CFXTEN projektuje Odnos XTEN radijusa iznad 2 pružaju veću pokrivenost fuzionim proteinima od dizajna sa vrednostima <2. Shodno tome, u jednom otelotvorenju predmetni pronalazak pruža CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0, ili 2.1, ili 2.2, ili 2.3, ili 2.4, ili 2.5, ili 2.6, ili 2.7, ili 2.8, ili 2.9, ili 3.0, ili 3.1, ili 3.2, ili 3.3, ili 3.4, ili 3.5 ili veći. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje CFXTEN u kome odnosi XTEN radijusa imaju najmanje 2.0-3.5 ili veći sadrže najmanje tri XTEN, a svaki XTEN ima najmanje 42 do oko 288 aminokiselina i gde su najmanje dva od XTEN povezana sa fuzionim proteinom sa ne manje od oko 100, ili oko 200, ili oko 300, ili oko 400, ili oko 500 aminokiselina za razdvajanje između dva XTEN. U drugim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje CFXTEN u kome odnosi XTEN radijusa

1

imaju najmanje 2.0-3.5 ili veći sadrže najmanje četiri XTEN pri čemu svaki XTEN ima najmanje 42 do oko 288 aminokiselina i pri čemu su najmanje tri od XTEN povezane sa fuzionim proteinom sa ne manje od oko 100, oko 200, ili oko 300, ili oko 400 aminokiselina odvajanja između bilo koje dve od tri XTEN.

[0223] U još jednom otelotvorenju, pronalazak pruža CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0-3.5 ili veći, CFXTEN sadrži najmanje tri XTEN, a svaki XTEN ima najmanje 42 do oko 288 aminokiselina i gde su najmanje dva od tri od XTEN povezana sa fuzionim proteinom su razdvojene sekvencom aminokiselina od najmanje 100, ili oko 200, ili oko 300 do oko 400 aminokiselina, a treći XTEN je povezan unutar B domena (ili njegovog fragmenta) ili unutar C domena (ili njegovog termina). U još jednom otelotvorenju, pronalazak pruža CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0-3.5 ili veći, CFXTEN sadrži najmanje četiri XTEN, a svaki XTEN ima najmanje 42 do oko 288 aminokiselina i gde su najmanje tri od četiri od XTEN povezana sa fuzionim proteinom su razdvojene sekvencom aminokiselina od najmanje 300 do oko 400 aminokiselina, a četvrti XTEN je povezan unutar B domena (ili njegovog fragmenta) ili unutar C domena (ili njegovog termina).

[0224] U drugim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0-3.5 ili veći, CFXTEN sadrži najmanje pet XTEN sa četiri XTEN koji imaju najmanje 42 do oko 144 aminokiselina, pri čemu je najmanje četiri od XTEN vezano za fuzioni protein sa ne manje od oko 100, 200 ili oko 300, ili oko 400 aminokiselina odvajanja između bilo koja od četiri od četiri XTEN i peta XTEN je povezana unutar B domena (ili njegovog fragmenta) ili unutar domena C (ili njegovog terminusa). U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0-3.5 ili veći, CFXTEN sadrži najmanje pet XTEN, sa četiri XTEN ima najmanje 42 do oko 144 aminokiselina gde su najmanje tri XTEN povezana sa fuzionim proteinom su razdvojene sekvencom aminokiselina od najmanje 300 do oko 400 aminokiselina, a četvrti XTEN je povezan unutar B domena (ili njegovog fragmenta) i peti XTEN je povezan sa C domenom (ili njegovim terminusom).

[0225] U jednom aspektu, pronalazak pruža CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0, ili 2.1, ili 2.2, ili 2.3, ili 2.4, ili 2.5, ili 2.6, ili 2.7, ili 2.8, ili 2.9, ili 3.0, ili 3.1, ili 3.2, ili 3.3, ili 3.4, ili 3.5 ili veći, i sastav ne sadrži određene sekvence. U jednom

1

otelotvorenju prethodnog, pronalazak obezbeđuje CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0-3.5 ili veći, pod uslovom da fuzioni protein ne sadrži sekvencu iz bilo koje Tabele 50 ili Tabele 51. U drugom otelotvorenju prethodnog, pronalazak obezbeđuje CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0-3.5 ili veći, pod uslovom da fuzioni protein ne sadrži sekvencu iz bilo koje Tabele 50 ili Tabele 51. U drugom otelotvorenju prethodnog, pronalazak obezbeđuje CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0-3.5 ili veći, pod uslovom da fuzioni protein ne sadrži sekvencu odabranu iz GTPGSGTASSSP (SEQ ID NO:31), GSSTPSGATGSP (SEQ ID NO:32), GSSPSASTGTGP (SEQ ID NO:33), GASPGTSSTGSP (SEQ ID NO:34). U drugom otelotvorenju prethodnog, pronalazak obezbeđuje CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0-3.5 ili veći, pod uslovom da fuzioni protein ne sadrži sekvencu odabranu iz GTPGSGTASSSP (SEQ ID NO:31), GSSTPSGATGSP (SEQ ID NO:32), GSSPSASTGTGP (SEQ ID NO:33), GASPGTSSTGSP (SEQ ID NO:34) i GSEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAP GSEPATSG SETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPSEGSAPGTSESATPESGPGSEPATSGS ETPGTST EPSEGSAP (SEQ ID NO:59). U drugom otelotvorenju prethodnog, pronalazak obezbeđuje CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0-3.5 ili veći, pod uslovom da fuzioni protein ne sadrži sekvencu odabranu iz

PGASPGTSSTGSPGASPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGTPGSGTASSS PGSSTPSG ATGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSAS TGTGPGA SPGTSSTGSPGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGSSPSASTGTGPGA SPGTSSTG SPGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSPSASTGTGPGASPGTSSTGSPGSSPSASTGT GPGTPGSG TASSSPGSSTPSGATGS (SEQ ID NO:80). U drugom otelotvorenju prethodnog, pronalazak obezbeđuje CFXTEN u kome je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0-

1

3.5 ili veći, pod uslovom da fuzioni protein ne sadrži sekvencu XTEN koja se sastoji iz

[0226] U jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje pruža postupak za stvaranje CFXTEN sa XTEN ubačenim da se maksimizira sterična interferencija FVIII-vezujućih sredstava koja bi se inače vezala za FVIII i neutralizovala prokoagulantna aktivnost ili rezultirala čistim ili degradacijom FVIII. Prema tome, u jednom slučaju, obelodanjivanje pruža postupak koji sadrži korake odabira FVIII sekvence sa najmanje 90% identiteta sekvence za sekvencu iz Tabele 1, odabirom tri ili više XTEN iz Tabele 4 u kojoj je odnos XTEN radijusa najmanje 2.0, ili 2.1, ili 2.2, ili 2.3, ili 2.4, ili 2.5, ili 2.6, ili 2.7, ili 2.8, ili 2.9, ili 3.0, ili 3.1, 3.2, ili 3.3, ili 3.4, ili 3.5 ili više, stvarajući ekspresione konstrukcije dizajnirane da lociraju rečeni XTEN na ili blizu mesta odabranih iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9, pri čemu su tri ili više XTEN najmanje 300 do 400 aminokiselina, ispoljavajući i oporavljajući rezultirajuće CFXTEN i ispitivanje rezultirajućih fuzionih proteina u ispitivanju opisanom ovde kako bi se potvrdilo redukovano vezanje CFXTEN fuzionog proteina. Prema pronađenom postupku, CFXTEN pokazuje najmanje 5% smanjeno ili najmanje 10% smanjeno, ili najmanje 15% smanjeno, ili najmanje 20% smanjeno, ili najmanje 25% smanjeno, ili najmanje 40% smanjeno, ili najmanje 50% smanjeno, ili najmanje 60% smanjeno, ili najmanje 70% smanjeno, ili najmanje 80% redukovano vezivanje za FVIII sredstvo za vezivanje, uključujući, ali ne ograničavajući se na antitela iz Tabele 10, i pokazuje aktivnost prokoagulanse.

5. Konfiguracije fuzionih proteina CFXTEN sa razdelničkim i sekvencama deljenja [0227] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje CFXTEN konfigurisan sa jednom ili više razdelničkih sekvenci integrisanih u XTEN ili pored njih koji su dizajnirani da uključe ili

1

poboljšaju funkcionalnost ili svojstvo sastava, ili kao pomoć u sastavljanju ili proizvodnji fuzionog proteina sastava. Takva svojstva uključuju, ali nisu ograničena na, uključivanje sekvence(i) deljenja kako bi se omogućilo oslobađanje komponenti, uključivanje aminokiselina kompatibilnih sa nukleotidnim restrikcijskim mestima da bi se omogućilo povezivanje XTEN-kodirajućeg nukleotida sa FVIII-kodirajućeg nukleotidima ili da se olakša izgradnja ekspresionih vektora i veznici koji su dizajnirani da smanje sterično ometanje u regionima CFXTEN fuzionih proteina.

[0228] U jednom otelotvorenju, razdelnička sekvenca može da se uvede između XTEN sekvence i FVIII komponente da bi se smanjila sterička prepreka tako da FVIII komponenta može pretpostaviti svoju željenu tercijarnu strukturu i/ili na odgovarajući način komunicirati sa svojim ciljnim supstratom ili enzimom za obradu. Za razmake i postupke identifikacije poželjnih razdelnika, pogledajte, na primer, George, i dr. (2003) Protein Engineering 15:871-879. U jednom otelotvorenju, razdelnik sadrži jednu ili više sekvenci peptida koje su dužine 1-50 aminokiselinskih ostataka, ili oko 1-25 ostataka, ili oko 1-10 ostataka u dužini.

Razdelničke sekvence, isključujući mesta deljenja, mogu da sadrže bilo koju od 20 prirodnih L aminokiselina, i pogodno će imati svojstva slična XTEN, jer će većina ostataka biti hidrofilne aminokiseline koje su sterilno neometane, kao što su, ali nisu ograničene na, glicin (G), alanin (A), serin (S), treonin (T), glutamat (E), prolin (P) i aspartat (D). Razdelnik može biti pojedinačni glicinski ostatak, poliglicin ili polialanin, ili je pretežno smeša kombinacija ostataka glicina, serina i alanina. U jednom otelotvorenju, razdelnički niz, isključujući aminokiseline na mestu deljenja, ima oko 1 do 10 aminokiselina koje se sastoje od aminokiselina odabranih između glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolin (P) i u suštini su lišeni sekundarne strukture; npr., manje od oko 10% ili manje od oko 5% kako je određeno Chou-Fasman i/ili GOR algoritmima. U jednom otelotvorenju, razdelnička sekvenca je GPEGPS (SEQ ID NO:1612). U drugom otelotvorenju, razdelnička sekvenca je GPEGPS (SEQ ID NO:1612) povezan sa sekvencom deljenja iz Tabele 12. Pored toga, distancirane sekvence su dizajnirane tako da izbegnu uvođenje T-ćelijskih epitopa što se delom može postići izbegavanjem ili ograničenjem broja hidrofobnih aminokiselina korišćenih u razdelnika; određivanje epitopa je opisano iznad i u Primerima.

[0229] U posebnom otelotvorenju, CFXTEN fuzioni protein sadrži jednu ili više razdelničkih sekvenci povezanih na mestu spajanja između FVIII sekvence korisnog opterećenja i jednog ili više XTEN inkorporiranih u fuzioni protein, pri čemu razdelničke sekvence sadrže

1 1

aminokiseline koje su kompatibilne sa nukleotidi koji kodiraju mesta restrikcije. U drugom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN sadrži jednu ili više razdelničkih sekvenci povezanih na mestu (spojnica) između FVIII sekvence korisnog opterećenja i one više XTEN inkorporirane u fuzioni protein pri čemu razdelničke sekvence sadrže aminokiseline koje su kompatibilne sa nukleotidima koji kodiraju restrikciona mesta i aminokiseline i jedna više razdelničkih aminokiselina biraju se između glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P). U drugom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN sadrži jednu ili više razdelničkih sekvenci povezanih na mestu (spojnicama) između FVIII sekvence korisnog opterećenja i još jednog XTEN ugrađenog u fuzioni protein pri čemu razdelničke sekvence sadrže aminokiseline koje su kompatibilne sa nukleotidima koji kodiraju restrikciona mesta a jedna od narednih razdelničkih sekvenci izabrana je iz sekvenci Tabele 11. Tačna sekvenca svake razdelničke sekvence je odabrana da bude kompatibilna sa kloniranim mestima u ekspresijskim vektorima koji se koriste za određeni CFXTEN konstrukt. U jednom otelotvorenju, razdelnička sekvenca ima svojstva kompatibilna sa XTEN. U jednom otelotvorenju, razdelnička sekvenca je GAGSPGAETA (SEQ ID NO:178). Za XTEN sekvence koje su luk ugrađene u FVIII sekvencu, svaki XTEN bi obično bio okružen sa dve razdelničke sekvence koje sadrže aminokiseline kompatibilne sa restrikcijskim mestima, dok će XTEN vezan za N- ili C-terminus trebati samo jednu razdelničku sekvencu na spoju dveju komponenti i druge na suprotnom kraju radi ugradnje u vektor. Kao što je očigledno stručnjacima u ovoj oblasti, razdelničke sekvence koje sadrže aminokiseline kompatibilne sa restrikcijskim mestima koja su unutrašnja za FVIII mogu se izostaviti iz konstrukta kada se genetski generiše čitav gen CFXTEN.

Tabela 11: Razdelničke sekvence kompatibilne sa mestima ograničenja

1 2

[0230] U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža CFXTEN konfiguracije sa sekvencama deljenja ugrađenim u razmaknute sekvence. U nekim otelotvorenjima, razmaknute sekvence u CFXTEN sastavu fuzionog proteina sadrže jednu ili više sekvenci deljenja, koje su identične ili različite, pri čemu sekvenca deljenja može biti delovana proteazom, kao što je prikazano na Sl.12, da se oslobodi FVIII, FVIII komponenta (npr., B domen) ili XTEN sekvenca(e) iz fuzionog proteina. U jednom otelotvorenju, ugradnja sekvence deljenja u CFXTEN je dizajnirana tako da omogući oslobađanje FVIII komponente koja postaje aktivna ili aktivnija (s obzirom na njenu sposobnost da služi kao vezivno mesto za membranu za faktore IXa i X) nakon oslobađanja iz XTEN. U prethodnom otelotvorenju, prokoagulantna aktivnost FVIII komponente CFXTEN se nakon deljenja povećava za najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili na najmanje 80% ili najmanje 90% u odnosu na netaknuti CFXTEN. Sekvence deljenja smeštene su dovoljno blizu FVIII sekvence, uglavnom unutar 18, ili unutar 12, ili unutar 6, ili unutar 2 aminokiseline FVIII sekvence, tako da bilo koji preostali ostatak vezan za FVIII nakon deljenja ne utiče značajno na aktivnost (npr., vezanje za protein zgrušavanja) FVIII, ali ipak pruža dovoljan pristup proteazi da bi se moglo izvršiti deljenje sekvence deljenja. U nekim slučajevima, CFXTEN koji sadrži sekvence deljenja će takođe imati jednu ili više aminokiselinskih razdelnika između FVIII i sekvenci deljenja ili XTEN i sekvenci deljenja da olakša pristup proteazi; razdelničke aminokiseline koje sadrže bilo koju prirodnu aminokiselinu, uključujući glicin, serin i alanin kao poželjne aminokiseline. U jednom otelotvorenju, mesto deljenja je sekvenca koja se može deliti proteazom, endogenom za sisara, tako da se CFXTEN može deliti nakon davanja ispitaniku. U tom slučaju, CFXTEN može poslužiti kao prolek ili cirkulirajući depo za FVIII. U određenoj konstrukciji iznad navedenog, CFXTEN bi imao jedan ili dva XTEN povezana na N- i/ili C-terminus FVIII-BDD preko sekvence deljenja na koju se može aktivirati aktivirani faktor koagulacije i imaju dodatni XTEN smešten između aminokiselina za obradu na položaju R740 i R1689, tako da se XTEN može osloboditi, ostavljajući oblik FVIII sličan izvornom aktiviranom FVIII. U jednom aspektu prethodnog konstrukta, FVIII koji se oslobađa iz fuzionog proteina deljenjem sekvenci deljenja ima najmanje oko dvostruko, ili bar oko trostruko, ili najmanje oko četvorostruko, ili barem približno petostruko, ili bar oko šest puta, ili najmanje osmostruko,

1

ili najmanje desetostruko, ili barem oko 20 puta više u odnosu na povećanje netaknuti fuzioni protein CFXTEN.

[0231] Primeri mesta deljenja razmatrani u pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptidnu sekvencu koju deli endogena proteaza sisara izabrana od FXIa, FXIIa, kalikrein, FVIIIa, FVIIIa, FXa, FIIa (trombin), Elastaza-2, granzim B , MMP-12, MMP-13, MMP-17 ili MMP-20, ili proteazama koje nisu sisari, kao što su TEV, enterokinaza, PreScission ™ proteaza (rinvirus 3C proteaza), i sorta A. Sekvence za koje se zna da su podeljene sa prethodno pomenutim proteazama i druge su poznate u stanju tehnike. Primeri sekvenci deljenja koje su razmatrano u pronalasku i odgovarajućih mesta deljenja unutar sekvenci predstavljeni su u Tablici 12, kao i njihove varijante sekvenci. Za CFXTEN koji sadrži integrisane sekvence deljenja, uglavnom je poželjno da jedna ili više sekvenci deljenja budu supstrati za aktivirane proteine zgrušavanja. Na primer, trombin (aktivirani faktor zgrušavanja II) deluje na sekvencu LTPRSLLV (SEQ ID NO:1618) [Rawlings N.D., i dr. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], koji se seče nakon arginina na položaju 4 u sekvenci. Aktivni FIIa nastaje deljenjem FII od strane FXa u prisustvu fosfolipida i kalcijuma i nalazi se nizvodno od faktora VIII na putu koagulacije. Jednom kada se aktivira, njegova prirodna uloga u koagulaciji je deljenje fibrinogena, koji potom započinje stvaranje ugrušaka.

Aktivnost FIIa je strogo kontrolisana i javlja se samo kada je koagulacija neophodna za pravilnu hemostazu. Ugrađivanjem LTPRSLLV sekvence (SEQ ID NO:1618) u CFXTEN između i povezivanja komponenti FVIII i XTEN, XTEN se uklanja iz susednog FVIII paralelno sa aktiviranjem bilo spoljašnjih ili unutrašnjih puteva koagulacije kada se koagulacija zahteva fiziološki, čime se selektivno oslobađa FVIII. U drugom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN sa ugrađenim sekvencama deljenja FXIa između komponenti FVIII i XTEN, koje deluju samo pokretanjem sistema svojstva koagulacije, pri čemu se prokoagulantni oblik FVIII oslobađa iz XTEN od strane FXIa da učestvuje u kaskada koagulacije. Iako se ne namerava vezati nikakvom određenom teorijom, veruje se da će CFXTEN iz prethodnog otelotvorenja odvojiti FVIII dalje od ostalih faktora koagulacije osim na mestu aktivnog zgrušavanja, omogućavajući tako veće doze (a samim tim i duže intervale doziranja) sa minimalnim pitanjima sigurnosti.

[0232] Dakle, sekvence deljenja, posebno one osetljive na proteine zgrušavanja aktivirane prokoagulantom, navedene u Tablici 12, omogućile bi kontinuirano otpuštanje FVIII koji u određenim otelotvorenjima CFXTEN može osigurati veći stepen aktivnosti za komponentu

1 4

FVIII oslobođenu netaknutom oblik CFXTEN, kao i dodatna sigurnosna granica za velike doze CFXTEN koje se daju ispitaniku. U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža CFXTEN koji sadrži jednu ili više sekvenci deljenja operativno postavljenih da oslobađa FVIII iz fuzionog proteina nakon deljenja, pri čemu jedna ili više sekvenci deljenja ima najmanje oko 86%, ili najmanje oko 92%, ili 100 % identiteta sekvence odabrane iz Tabele 12.

[0233] U nekim otelotvorenjima, samo dve ili tri aminokiseline koje su obe strane preseka (ukupno četiri do šest aminokiselina) su uklopljene u sekvencu deljenja koja je zauzvrat ugrađena u CFXTEN otelotvorenja, pružajući, na primer, XTEN mesta oslobađanja. U drugim otelotvorenjima, integrisana sekvenca deljenja u Tabeli 12 može imati jednu ili više delecija ili umetanja ili jednu ili dve ili tri aminokiselinske supstitucije za bilo koju jednu ili dve ili tri aminokiseline u poznatoj sekvenci, pri čemu brisanja, ubacivanja ili supstitucije rezultiraju u smanjenoj ili povećanoj osetljivosti, ali ne i u odsustvu osetljivosti na proteazu, što rezultira sposobnošću prilagođavanja brzine otpuštanja FVIII iz XTEN. Primeri supstitucija unutar sekvenci deljenja koje se koriste u CFXTEN predmetnog pronalaska prikazani su u Tabeli 12.

Tabela 12: Sekvence deljenja proteaze

1

6. Primeri CFXTEN fuzionih proteinskih sekvenci

[0234] Neograničavajući primeri sekvence fuzionih proteina koji sadrže jedan FVIII povezan sa jednim ili više XTEN prikazani su u Tabeli 21. Primer sekvence aminokiselina iz Tabele 21 (i DNK sekvence koja ih kodira) sadrže njegove oznake za potrebe prečišćavanja koje, kao što bi bilo očigledno stručnjacima u oblasti, mogu biti izbrisane iz sekvence bez uticaja na prokoagulantnu aktivnost fuzionog proteina CFXTEN. U jednom slučaju, CFXTEN iz Tabele 21 dalje sadrži aminokiseline na N-terminusu koji odgovaraju onom iz izvornog humanog FVIII (naime, sekvenca MQIELSTCFFLCLLRFCFS (SEQ ID NO:1611)) da pomogne u ekspresiji i izlučivanju fuzionog proteina CFXTEN. U jednom slučaju, CFXTEN sastav sadrži fuzioni protein koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence u poređenju sa CFXTEN iz Tabele 21, alternativno najmanje oko 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili oko 100% identitet sekvence u poređenju sa CFXTEN iz Tabela 21, kada je optimalno poravnata. U drugom slučaju, CFXTEN sastav sadrži fuzioni protein iz Tabele 21 u kome je C-terminus his-his-hishis-his sekvence (SEQ ID NO:1700) izbrisan. Međutim, obelodanjivanje takođe razmatra supstituciju bilo koje od sekvenci FVIII tabele 1 za FVIII komponentu CFXTEN Tabele 21, i/ili zamenu bilo kog niza iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17 za XTEN komponenta CFXTEN iz Tabele 21. Generalno, rezultirajući CFXTEN iz prethodnih primera zadržava bar deo prokoagulantne aktivnosti odgovarajućeg FVIII koji nije povezan sa XTEN. U prethodnim fuzionim proteinima, iznad opisanim u ovom paragrafu, CFXTEN fuzioni protein može dalje da sadrži jednu ili više sekvenci deljenja; npr., sekvenca iz Tabele 12, sekvenca deljenja je

1

locirana između FVIII i XTEN sekvence ili između susednih FVIII domena povezanih XTEN. U nekim slučajevima koji sadrže sekvence deljenja, netaknuti sastav CFXTEN ima manju aktivnost, ali duži polu-raspad u svom netaknutom obliku u odnosu na odgovarajući FVIII koji nije povezan sa XTEN, ali je dizajniran tako da nakon primene ispitaniku, FVIII komponenta se postepeno oslobađa iz fuzionog proteina deljenjem u sekvencama deljenja endogenim proteazama, nakon čega FVIII komponenta pokazuje prokoagulantnu aktivnost.

[0235] Sastavi CFXTEN mogu se proceniti na aktivnost korišćenjem testova ili in vivo parametara kao što je ovde opisano (npr., in vitro testovi koagulacije, ispitivanja iz Tabele 49, ili farmakodinamički efekat u predkliničkom modelu hemofilije ili u kliničkim ispitivanjima na ljudima, koristeći postupke opisane u primerima ili drugim postupcima poznatim u tehnici za procenu aktivnosti FVIII) za određivanje pogodnosti konfiguracije ili varijante FVIII sekvence i onih CFXTEN sastavima (uključujući nakon deljenja bilo kojeg ugrađenog mesta deljenja koje oslobađa XTEN) koje zadržavaju najmanje oko 30%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 55%, ili oko 60%, ili oko 70%, ili oko 80%, ili oko 90%, ili oko 95% ili više aktivnosti u poređenju sa izvornom sekvencom FVIII se smatraju pogodnim za upotrebu u lečenju FVIII-povezanih stanja.

V). SVOJSTVA SFXTEN SASTAVA PRONALASKA

(a) Farmakokinetička svojstva CFXTEN

[0236] Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi fuzione proteine CFXTEN i farmaceutske sastave koji sadrže CFXTEN sa poboljšanom farmakokinetikom u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN. Farmakokinetička svojstva FVIII pojačana vezanjem datog XTEN na FVIII uključuju, ali nisu ograničena na, terminusni polu-raspad, površinu ispod krive (AUC), Cmax, volumen distribucije, održavajući biološki aktivni CFXTEN iznad minimalnog efektivna koncentracija u krvi tokom dužeg perioda u poređenju sa FVIII koja nije povezana sa XTEN. Pojačana svojstva omogućavaju ređe doziranje i/ili dugovečniji prokoagulantni efekat u poređenju sa uporedivom dozom FVIII koja nije povezana sa XTEN. Poboljšanje jednog ili više ovih svojstava može imati koristi u lečenju stanja povezanih sa faktorom VIII.

[0237] Izveštava se da egzogeni faktor VIII ima terminusni polu-raspad kod ljudi od oko 12-14 sati kada se komplikuje sa normalnim proteinima Willebrandovog faktora, dok kod nedostatka Willebrandovog faktora, polu-raspad faktora VIII smanjuje se na 2 sata (Tuddenham EG, i dr., Br J Haematol. (1982) 52(2):259-267; Bjorkman, S., i dr. Clin

1

Pharmacokinet. (2001) 40:815). Kao rezultat poboljšanih svojstava dodeljenih od strane XTEN, CFXTEN, kada se koristi u režimu doze i doze koji su određeni kao prikladni za ispitanika i njegovo osnovno stanje, može postići cirkulišuću koncentraciju što dovodi do željenog prokoagulanta ili produženog kliničkog efekta vremenski period u poređenju sa uporedivom dozom odgovarajućeg FVIII koji nije povezan sa XTEN. Kako se ovde koristi, "uporediva doza" označava dozu sa ekvivalentnim molom/kg ili međunarodnim jedinicama/kg (IU/kg) za sastav koji se daje ispitaniku. U tehnici će se razumeti da „uporediva doza“ FVIII koja nije povezana sa XTEN predstavlja manju težinu leka, ali bi u suštini imala iste IU ili mol-ekvivalente CFXTEN.

[0238] Međunarodna jedinica ("IU") faktora VIII definisana je u struci kao aktivnost koagulanta prisutna u 1 ml normalne ljudske plazme. Očekuje se da će normalan, nehemofilični pojedinac imati oko 100 IU/dL faktora VIII aktivnosti. Kod hemofilije A doze potrebne za lečenje zavise od stanja. Za manje krvarenje, po potrebi se daju doze izvornog ili rekombinantnog faktora VIII od 20 do 40 IU/kg. Za umereno krvarenje, po potrebi se daju doze od 30 do 60 IU/kg, a za veće krvarenje mogu biti potrebne doze od 80 do 100 IU/kg, uz ponavljane doze od 20 do 25 IU/kg, koje se daju svakih 8 do 12 sati dok se krvarenje ne reši. Za profilaksu protiv krvarenja kod pacijenata sa teškom hemofilijom A, uobičajene doze urođenih ili rekombinantnih preparata FVIII su od 20 do 40 IU/kg telesne težine u intervalima od oko 2 do 3 dana. Standardna jednačina za procenu odgovarajuće doze sastava koji sadrži FVIII je:

[0239] U mnogim slučajevima su terapijski nivoi za FVIII kod osoba različitih starosnih doba ili stepena bolesti utvrđeni i dostupni u objavljenoj literaturi ili su navedeni na etiketi leka za odobrene proizvode koji sadrže FVIII. Na primer, Pododbor za faktor VIII i faktor IX Naučnog i standardizacionog odbora Međunarodnog društva za trombozu i hemostazu objavio je, na internet lokaciji ISTH, 29. novembra 2000. godine, da se najčešće korišćena mera hemofilije A utvrđuje određivanjem cirkulišuće koncentracije prokoagulanata FVIII u plazmi, kod osoba sa <1% (<0.01 IU/ml) faktora VIII definisane kao teške; 1-5% (0.01 - 0.05 IU/ml) kao umereno teške; i >5-40% (0.05 - <0.40 IU/ml) kao blage, gde je normalno 1 IU/ml faktora VIIIC (100%). Terapeutski nivoi se mogu utvrditi za nove sastave, uključujući one CFXTEN i farmaceutske sastave koji sadrže CFXTEN iz obelodanjivanja, koristeći standardne postupke. Kada se primenjuje predmetni pronalazak, razumeće se da bilo koja

1

efikasna doza CFXTEN može da se koristi za lečenje epizoda krvarenja ili održavanje hemostaze. Postupci za uspostavljanje terapijskih nivoa i raspored doziranja za dati sastav poznati su stručnjacima (videti npr., Goodman & Gilman's Farmakološka osnova terapije, 11. izdanje, McGraw-Hill (2005)). Na primer, korišćenjem ispitivanja eskalacije doze kod ispitanika sa ciljanim stanjem da bi se utvrdila efikasnost ili poželjan farmakološki efekat, pojava neželjenih događaja i određivanje nivoa u krvi koji cirkulišu, terapeutski nivo krvi u datom ispitaniku ili populaciji ispitanika može biti određuje se za određeni lek ili biološki lek. Ispitivanja eskalacije doze oceniće aktivnost CFXTEN kroz ispitivanja kod ispitanika ili grupe ispitanika hemofilije A. Ispitivanja bi nadgledala nivo prokoagulansa u krvi, kao i fiziološke ili kliničke parametre poznate u struci ili kao što je ovde opisano za jedan ili više parametara povezanih sa stanjem povezanim sa faktorom VIII ili kliničkim parametrima povezanim sa povoljnim ishodom, zajedno sa opažanjima i/ili izmereni parametri za određivanje doze bez učinka, neželjenih događaja, minimalne efektivne doze i slično, zajedno sa merenjem farmakokinetičkih parametara koji uspostavljaju utvrđeni ili izvedeni nivo cirkulišuće krvi. Rezultati mogu biti u vezi sa primenom doze i koncentracijama u terapiji u krvi, koje se podudaraju sa prethodno utvrđenim parametrima ili nivoima efekta. Ovim postupcima raspon doza i koncentracija u krvi može se povezati sa minimalnom efektivnom dozom, kao i maksimalnom dozom i koncentracijom u krvi u kojoj se pojavljuje ili održava željeni efekat i vremenom za koji se može održavati, uspostavljajući tako terapijski nivo u krvi i raspored doziranja za sastav. Dakle, prethodnim postupcima uspostavlja se nivo Cminu krvi, ispod kojeg CFXTEN fuzioni protein ne bi imao željeni farmakološki efekat i nivo Cmaxu krvi, iznad kojih se mogu javiti neželjeni efekti poput tromboze (Brobrow, RS, JABFP (2005) 18(2):147-149), uspostavljajući terapijski prozor za sastav.

[0240] Stručnjak u ovoj oblasti može, ovde obelodanjenim sredstvima ili drugim postupcima poznatim u struci, potvrditi da primenjeni CFXTEN ostaje na terapijskom nivou u krvi da bi se održao hemostaza u željenom intervalu ili zahteva prilagođavanje doze, dužine ili sekvence XTEN. Dalje, određivanjem odgovarajuće doze i učestalosti doze za održavanje CFXTEN u terapijskom prozoru uspostavlja se terapeutski efikasan režim doziranja; raspored davanja više uzastopnih doza koristeći terapeutski efikasnu dozu fuzionog proteina subjektu kome je to potrebno, što rezultira uzastopnim Cmaxvrhovima i/ili Cminkoritima koji ostaju iznad terapeutski efikasnih koncentracija i rezultiraju poboljšanjem u najmanje jednoj izmerenoj parametar relevantan za ciljno stanje. U jednom otelotvorenju, CFXTEN ili farmaceutski sastav koji sadrži CFXTEN koji se daje u odgovarajućoj dozi ispitaniku

1

rezultira koncentracijom CFXTEN fuzionog proteina u krvi koja ostaje iznad minimalne efektivne koncentracije za održavanje hemostaze tokom perioda najmanje oko dva puta duže u poređenju sa na odgovarajući FVIII koji nije povezan sa XTEN i koji se daje u uporedivoj dozi; alternativno najmanje oko trostruko duže; alternativno najmanje oko četvorostruko duže; alternativno najmanje oko petostruko duže; alternativno najmanje oko šestostruko duže; alternativno najmanje oko sedmostruko duže; alternativno najmanje oko osmostruko duže; alternativno najmanje oko devetostruko duže, alternativno najmanje desetostruko duže, ili barem oko dvadeset puta duže ili veće u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN i koji se primenjuje u uporedivoj dozi. Kao što je ovde korišćeno, "odgovarajuća doza" znači doza leka ili biološkog leka koja bi, kada se daje ispitaniku, rezultirala poželjnim terapeutskim ili farmakološkim efektom (npr., hemostazom) i/ili koncentracijom krvi u terapijskom prozoru.

[0241] U primeni pronalaska, CFXTEN sa dužim terminusnim polu-raspadom je uglavnom poželjan, kako bi se poboljšala udobnost pacijenta, povećao interval između doza i smanjila količina leka koja je potrebna za postizanje održivog efekta. Poboljšani PK parametri omogućavaju smanjeno doziranje predmetnih sastava, u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN, posebno za one ispitanike sa hemofilijom A koji primaju rutinsku profilaksu.

[0242] Kao što je detaljnije opisano u Primerima koji se odnose na farmakokinetičke karakteristike fuzionih proteina koji sadrže XTEN, primećeno je da povećanje ukupne dužine XTEN, pojedinačno ili u kombinaciji, dovodi do nesrazmernog povećanja krajnjeg poluraspada fuzionog proteina koji sadrži XTEN. Shodno tome, pronalazak obezbeđuje fuzione proteine CFXTEN i farmaceutske sastave koji sadrže CFXTEN gde CFXTEN pokazuje povećan polu-raspad kada se daje ispitaniku. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje monomerne CFXTEN fuzione proteine koji sadrže jedan ili više XTEN gde su broj i lokacija XTEN odabrani da donesu povećanje krajnjeg polu-raspada za CFXTEN koji se daje ispitaniku u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan XTEN i primenjuje se u uporedivoj dozi, pri čemu je povećanje najmanje oko dvostruko duže, ili najmanje oko trostruko, ili najmanje oko četvorostruko, ili najmanje oko pet puta, ili najmanje oko šestostruko, ili najmanje oko sedam puta, ili najmanje osmostruko, ili najmanje devetostruko, ili najmanje desetostruko, ili najmanje oko 15 puta, ili najmanje dvadeset puta pregib, ili barem 40-puta ili veće povećanje terminalnog polu-raspada u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN. U drugim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje CXTEN sastave i

1

farmaceutske sastave koji sadrže CFXTEN pri čemu davanje sastava ispitaniku kome je potreban rezultira terminusnim polu-raspadom koji je najmanje 12 h veći ili najmanje oko 24 h, ili najmanje oko 48 h, ili najmanje oko 96 h, ili najmanje oko 144 h, ili najmanje oko 7 dana, ili najmanje oko 14 dana, ili najmanje oko 21 dan, veći u poređenju sa uporedivom dozom FVIII koji nije povezan sa XTEN. U drugom otelotvorenju, davanje doze efektivne za koagulaciju fuzionog proteina CFXTEN ispitanika koji ima potrebu za time može dovesti do dobitaka između uzastopnih doza potrebnih za održavanje nivoa krvi od oko 0.1 IU/ml od najmanje 48 h, ili najmanje 72 h, ili najmanje oko 96 h, ili najmanje oko 120 h, ili najmanje oko 7 dana, ili najmanje oko 14 dana, ili najmanje oko 21 dan između uzastopnih doza, u poređenju sa FVIII, koji nije povezan sa XTEN i primenjeni u uporedivoj dozi.

[0243] U jednom otelotvorenju, predmetni pronalazak obezbeđuje fuzione proteine CFXTEN i farmaceutske sastave koji sadrže CFXTEN koji pokazuju, kada se daju ispitanika koji ima potrebu za time, povećanje AUC od najmanje oko 50%, ili bar oko 60%, ili bar oko 70%, ili najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 100%, ili najmanje oko 150%, ili najmanje oko 200%, ili najmanje oko 300%, ili najmanje oko 500% ili najmanje oko 1000% ili barem oko 2000% u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN i koji se daje ispitaniku u uporedivoj dozi. Farmakokinetički parametri CFXTEN mogu se odrediti standardnim postupcima koji uključuju doziranje, uzimanje uzoraka krvi u vremenskim intervalima i ispitivanje proteina korišćenjem ELISA, HPLC, radiotesta, ispitivanja zgrušavanja, ispitivanja iz Tabele 49 ili drugih poznatih postupaka u stanju tehnike ili kako je ovde opisano, praćeno standardnim proračunima podataka da bi se dobio polu-raspad i drugi PK parametri.

[0244] U jednom otelotvorenju, manja IU količina oko dvostruko manja, ili oko trostruko manja, ili oko četvorostruko manje, ili oko pet puta manja, ili oko šest puta manja, ili oko osam puta manja, ili se daje fuzioni protein oko 10 puta manje ili više u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN u režimu doziranja potrebnom za održavanje hemostaze i fuzioni protein postiže uporedivu površinu ispod krive kao odgovarajuća IU količina FVIII nije povezan sa XTEN potrebnim za održavanje hemostaze. U drugom otelotvorenju, fuzioni protein CFXTEN ili farmaceutski sastav koji sadrži CFXTEN zahteva manje učestalu primenu za rutinsku profilaksu ispitaniku hemofilije A, pri čemu se doza fuzionog proteina daje oko svaka četiri dana, otprilike svakih sedam dana, otprilike svakih 10 dana, otprilike svakih 14 dana, oko svakih 21 dana ili približno mesečno

1 1

kod subjekta, i fuzioni protein postiže uporedivu površinu ispod krive kao odgovarajuća FVIII koja nije povezana sa XTEN i davana ispitaniku. U još nekim otelotvorenjima, akumulaciona manja IU iznosi oko 5%, ili oko 10%, ili oko 20%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70%, ili oko 80%, ili oko 90% manje fuzionog proteina se daje ispitaniku u poređenju sa odgovarajućom IU količinom FVIII koja nije povezana sa XTEN u režimu doziranja potrebnom za održavanje koncentracije krvi od 0.1 IU/ml, ali fuzioni protein postiže barem uporediva površina ispod krive kao odgovarajuća FVIII koja nije povezana sa XTEN. Akumulativna manja količina IU meri se tokom perioda od najmanje jedne nedelje, ili oko 14 dana, ili oko 21 dan, ili oko mesec dana.

[0245] U jednom aspektu, pronalazak pruža CFXTEN sastave dizajnirane da smanje vezivanje FVIII sredstva za vezivanje, povećavajući na taj način polu-raspad CFXTEN davanog ispitaniku, uz zadržavanje aktivnosti prokoagulanse. Veruje se da CFXTEN predmetnog pronalaska ima relativno veću i/ili stalnu aktivnost postignutu smanjenim aktivnim klirensom molekula dodavanjem nestrukturiranog XTEN faktoru koagulacije FVIII. Mehanizmi čišćenja za uklanjanje FVIII iz cirkulacije još uvek nisu u potpunosti rasvetljeni. Unos, eliminacija i inaktivacija proteina koagulacije mogu se javiti u cirkulacionom sistemu, kao i u ekstravaskularnom prostoru. Faktori koagulacije su složeni proteini koji su u interakciju sa velikim brojem drugih proteina, lipida i receptora, a mnoge od tih interakcija mogu doprineti eliminaciji CF iz cirkulacije. Faktor proteina von Willebrandovog faktora je primer sredstva za vezivanje FVIII koje se vezuje za FVIII. Faktor VIII i von Willebrandov faktor (VWF) cirkulišu u krvi kao tesan, nekovalentno povezan kompleks u kojem VWF služi kao nosilac koji verovatno doprinosi zaštiti FVIII od aktivnih mehanizama deljenja, ali ipak rezultira ograničenjem na terminusni polu-raspad FVIII. Na primer: (i) VWF stabilizuje heterodimernu strukturu FVIII; (ii) VWF štiti FVIII od proteolitičke razgradnje proteazama koje vezuju fosfolipid poput aktiviranog proteina C i aktiviranog FKS (FXa); (iii) VWF ometa vezivanje FVIII na negativno naelektrisane fosfolipidne površine izložene unutar aktiviranih trombocita; (iv) VWF inhibira vezivanje FVIII na aktivirani FIX (FIXa), uskraćujući tako FVIII pristupu kompleksu koji aktivira FX; i (v) VWF sprečava ćelijski unos FVIII (Lenting, P.J., i dr., J Thrombosis and Haemostasis (2007) 5(7):1353-1360).

Pored toga, protein vezan za LDL receptor (LRP1, takođe poznat kao a2-makrogobulinski receptor ili CD91) identifikovan je kao receptor za odobrenje FVIII, sa vezanim LRP1 vezanim na oba lanca heterodimernog oblika FVIII (Lenting PJ, i dr.,. J Biol Chem (1999) 274: 23734-23739; Saenko EL, i dr., J Biol Chem (1999) 274: 37685-37692). LRP su

1 2

uključeni u čišćenje različitih liganda koje uključuju proteaze, inhibitore tipa Kunitz, proteazne serpin komplekse, lipaze i lipoproteine (Narita, i dr., Blood (1998) 2:555-560). Pokazano je da se laki lanac, ali ne i teški lanac faktora VIII, vezuje za površinski izložen protein LRP1 receptora (Lentig i dr. (J Biol Chem (1999) 274(34):23734-23739; i Pat. SAD br. 6,919,311), što sugeriše da LRP1 može igrati suštinsku ulogu u aktivnom klirensu proteina poput FVIII. Iako je interakcija VWF-FVIII visokog afiniteta (<1 nM), kompleks je ipak u dinamičkoj ravnoteži, tako da mali, ali značajan deo molekula FVIII (5-8%) cirkuliše kao slobodni protein (Leyte A, i dr., Biochem J (1989) 257: 679-683; Noe DA. Haemostasis (1996) 26: 289-303). Kao takav, deo izvornog FVIII nezaštićen od strane VWF, što omogućava aktivnim mehanizmima čišćenja da uklone nezaštićeni FVIII iz cirkulacije.

[0246] U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža CFXTEN koji se povezuje sa VWF, ali ima pojačanu zaštitu od aktivnih receptora čišćenja koji se daju ugradnjom još dva XTEN na jednoj ili više lokacija unutar molekule FVIII (npr., lokacije odabrane iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili Sl.8-9), pri čemu XTEN ometa interakciju rezultirajućeg CFXTEN sa onim receptorima klirensa, što rezultira poboljšanjem farmakokinetičkih svojstava CFXTEN u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN. U drugom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN koji imaju smanjeni afinitet vezivanja sa VWF najmanje 5% manje, ili oko 10%, ili oko 20%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70 % manje, ali su ipak konfigurisani tako da imaju poboljšanu zaštitu od receptora aktivnog klirensa koji se daju ugradnjom XTEN na jednoj ili više lokacija unutar FVIII molekula, pri čemu XTEN ometa interakciju faktora VIII sa tim receptorima. U prethodnim otelotvorenjima, CFXTEN ima produženi terminusni polu-raspad od najmanje 12 h, ili 24 h, ili 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, ili 7 dana, ili 10 dana, ili 14 dana, ili 21 dan u poređenju sa FVIII koji nisu povezani sa XTEN. Obelodanjivanje pruža postupak za stvaranje CFXTEN sa smanjenim klirensom pri čemu se CFXTEN fuzioni proteini stvoreni sa višestrukim umetanjem procenjuju na inhibiciju vezivanja za receptore klirensa, u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN, korišćenjem ispitivanja in vitro vezivanja ili opisanih in vivo farmakokinetičkih modela ovde ili u drugim testovima poznatim u struci, i odabir onih koji pokazuju smanjeno vezivanje, a ipak zadržavaju prokoagulantnu FVIII aktivnost. Pored toga, gornji fuzioni proteini mogu biti optimizovani da imaju povećan odnos XTEN radijusa od najmanje 2.0-3.5 da bi se postigla farmakokinetička svojstva koja su dodatno poboljšana. Tabela 5, Tabela 6, Tabela 7, Tabela 8, i Tabela 9 i SL.8-9 daju neograničavajuće primere XTEN tačaka unosa unutar sekvence faktora VIII. Koristeći takve

1

tačke umetanja, obelodanjivanje razmatra CFXTEN sastave koji imaju konfiguracije sa više XTEN umetnutih sa oko 100, ili oko 200, ili oko 300, ili oko 400, ili oko 500 aminokiselina koje razdvajaju najmanje tri XTEN kako bi se dodatno povećala zaštita od aktivnih mehanizama čišćenja i, samim tim, povećavaju terminusni polu-raspad CFXTEN. Neće biti vezani određenom teorijom, očekuje se da će XTEN sastavi CFXTEN sa velikim neto naelektrisanjem (npr., CFXTEN koji sadrži AE porodicu XTEN) imati manje nespecifične interakcije sa različitim negativno naelektrisanim površinama kao što su krvnih sudova, tkiva ili različitih receptora, što bi dodatno doprinelo smanjenom aktivnom klirensu. Suprotno tome, očekuje se da će XTEN sastav CFXTEN sa malim (ili bez) neto naelektrisanjem (npr., CFXTEN koji sadrži AG porodicu XTEN) imati veći stepen interakcije sa površinama koje, istovremeno doprinoseći aktivnom klirensu, mogu pojačati aktivnost pridruženi faktor koagulacije, s obzirom na poznati doprinos ćelijskih (trombocita) i vaskularnih površina procesu koagulacije i intenzitetu aktiviranja faktora koagulacije (Zhou, R., i dr., Biomaterials (2005) 26(16):2965-2973; London, F., i dr. Biochemistry (2000) 39(32):9850-9858).

Obelodanjivanje, delom, koristi činjenicu da se određeni ligandi kod kojih je smanjeno vezivanje za receptor klirensa, bilo kao rezultat smanjene brzine ili povećane brzine, mogu izvršiti opstrukcijom mesta receptora od strane ubačeni XTEN formira slučajnu zavojnicu, što rezultira smanjenim vezivanjem. Izbor posebne konfiguracije CFXTEN fuzionog proteina može se testirati postupcima koji su ovde obelodanjeni kako bi se potvrdile one konfiguracije koje smanjuju stepen vezivanja na receptor klirensa tako da se postiže smanjena brzina aktivnog klirensa. U jednom slučaju, CFXTEN sadrži FVIII-XTEN sekvencu koja ima jedan ili više XTEN umetnutih na lokacijama odabranim iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili SL.8-9, pri čemu je terminusni polu-raspad CFXTEN povećan barem oko dva puta, ili najmanje oko tri puta, ili najmanje oko četiri puta, ili najmanje oko pet puta, ili najmanje oko šest puta, ili najmanje oko osam puta, ili najmanje deset puta, ili najmanje oko dvadeset puta, u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži FVIII-XTEN sekvencu koja ima prvi i najmanje drugi XTEN ubačen na prvo i drugo mesto odabrano iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili SL.8-9, pri čemu je terminusni polu-raspad CFXTEN povećan barem oko dva puta, ili najmanje oko tri puta, ili najmanje oko četiri puta, ili najmanje oko pet puta, ili najmanje oko šest puta, ili najmanje oko osam puta, ili najmanje deset puta, ili najmanje oko dvadeset puta, u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN. U još jednom primeru, CFXTEN sadrži FVIII-XTEN sekvencu koja uključuje više XTEN sekvenci koristeći tri više XTEN mesta umetanja odabranih iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili SL.8-9 razdvojeno sa oko 100, ili oko

1 4

200, ili oko 300, ili oko 400, ili oko 500 aminokiselina, pri čemu je terminalni polu-raspad CFXTEN povećan barem oko dva puta, ili najmanje oko tri puta, ili najmanje oko četiri puta, ili najmanje oko pet puta, ili najmanje oko šest puta, ili najmanje oko osam puta, ili najmanje deset puta, ili najmanje oko dvadeset puta, u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN. U gore navedenim slučajevima opisanim u ovom paragrafu, XTEN ugrađen u CFXTEN konfiguracije može biti identičan ili može biti različit, i može imati najmanje oko 80%, ili 90%, ili 91%, ili 92%, ili 93% ili 94%, ili 95%, ili 96%, ili 97%, ili 98%, ili 99%, identitet sekvence sekvenci iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17, a opciono može da obuhvata jednu ili više sekvenci deljenja iz Tabele 12, olakšavajući oslobađanje jednog ili više XTEN iz CFXTEN fuzionog proteina.

[0247] U jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN koji pojačava farmakokinetiku fuzionog proteina povezivanjem jednog ili više XTEN sa FVIII komponentom fuzionog proteina pri čemu fuzioni protein ima povećanje prividnog faktora molekulske mase od najmanje oko dva puta, ili barem oko trostruko, ili najmanje oko četvorostruko, ili najmanje oko petostruko, ili najmanje oko šest puta, ili najmanje oko sedam puta, ili najmanje oko osam puta, ili na najmanje oko deset puta, ili najmanje oko dvanaest puta, ili najmanje oko petnaest puta, i pri čemu je terminusni polu-raspad CFXTEN kada se daje ispitaniku uvećan barem oko dva puta, ili bar oko četiri puta, ili barem oko osam puta, ili najmanje oko 10 puta ili više u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN. U prethodnom otelotvorenju, u kojem su najmanje dva XTEN molekulska luka ugrađena u CFXTEN, XTEN može biti identičan ili može biti različitog sastava sekvence, neto naelektrisanja ili dužine. XTEN može imati najmanje oko 80%, ili 90%, ili 91%, ili 92%, ili 93% ili 94%, ili 95%, ili 96%, ili 97%, ili 98%, ili 99%, identitet sekvence sekvenci iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17, a opciono može da obuhvata jednu ili više sekvenci deljenja iz Tabele 12, olakšavajući oslobađanje jednog ili više XTEN iz CFXTEN fuzionog proteina.

[0248] Prema tome, pronalazak pruža CFXTEN sastave u kojima se stepen aktivnosti, bioraspoloživost, polu-raspad ili fizičko-hemijske karakteristike fuzionog proteina mogu prilagoditi izborom i smeštanjem tipa i dužine XTEN u CFXTEN sastave. Prema tome, obelodanjivanje razmatra sastave u kojima se, na primer, proizvodi FVIII iz Tabele 1 i XTEN ili XTEN fragment iz bilo koje od Tabela 3, 4 ili 13-17, u konfiguraciji odabranoj iz bilo koje od formula I-VIII ili XTEN su ubačeni na mesta odabrana iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7,

1

Tabele 8 i Tabele 9 ili SL.8-9 tako da konstrukt ima željeno svojstvo.

[0249] Obelodanjivanje pruža postupke za proizvodnju CFXTEN sastava koji mogu održavati FVIII komponentu na terapijskim nivoima kod ispitanika koji ima potrebu za time, najmanje dvostruko, ili najmanje trostruko, ili najmanje četvorostruko, ili na najmanje pet puta veći vremenski period u poređenju sa uporedivim dozama odgovarajućeg FVIII koji nije povezan sa XTEN. U jednom slučaju postupka, ispitanik prima rutinsku profilaksu za sprečavanje epizoda krvarenja. U drugom slučaju postupka, ispitanik se leči za epizodu krvarenja. U drugom slučaju postupka, ispitanik se tretira da podigne koncentraciju prokoagulansa FVIII u cirkulišućoj krvi iznad 1%, ili iznad 1-5%, ili iznad 5-40% u odnosu na koncentracije FVIII u normalnoj plazmi. "Prokoagulant" kao što je ovde korišćen ima svoje opšte značenje u nauci i uglavnom se odnosi na aktivnost koja promoviše stvaranje ugrušaka, bilo u in vitro testu ili in vivo. Postupak za proizvodnju sastava koje mogu održavati FVIII komponentu na terapijskim nivoima uključuje korake odabira jednog ili više XTEN odgovarajućih za konjugaciju sa FVIII radi dobijanja željenih farmakokinetičkih svojstava s obzirom na zadati režim doziranja i doziranja, stvarajući gensku konstrukciju koja kodira CFXTEN u jednoj od ovde prikazanih konfiguracija, transformišući odgovarajuću ćeliju domaćina sa ekspresijskim vektorom koji sadrži kodirajući gen, eksprimirajući fuzioni protein pod pogodnim uslovima kulture, oporavljajući CFXTEN, davanje CFXTEN sisaru nakon čega slede testovi za verifikovanje farmakokinetička svojstva i aktivnosti CFXTEN fuzionog proteina (npr., sposobnost održavanja hemostaze ili služiti kao prokoagulant) i bezbednosti primenjenog sastava. Oni sastavi koji pokazuju željena svojstva su izabrani za dalju upotrebu. CFXTEN kreiran ovde datim postupcima može rezultirati povećanom efikasnošću primenjenog sastava, između ostalog, održavanjem koncentracija prokoagulantne komponente FVIII na terapeutskim nivoima tokom poboljšanog perioda vremena.

[0250] Obelodanjivanje pruža postupke za ispitivanje CFXTEN fuzionih proteina različitog sastava ili konfiguracije, kako bi se CFXTEN obezbedio željeni stepen prokoagulantne i terapeutske aktivnosti i farmakokinetička svojstva, kao i dovoljan bezbednosni profil.

Specifični in vitro i in vivo testovi ili lukovi na životinjama koji se koriste za procenu aktivnosti i funkcionalnih karakteristika svakog konfigurisanog CFXTEN i/ili FVIII komponente koje treba ugraditi u CFXTEN, uključujući, ali ne ograničavajući se na, primere, testove Tabele 49 kao i sledeći testovi ili drugi takvi testovi poznati u tehnici za ispitivanje svojstava i efekata FVIII. Mogu se izvesti funkcionalna ispitivanja koja omogućavaju

1

određivanje aktivnosti koagulacije, kao što su jednofazni test zgrušavanja i dvostepeni test zgrušavanja (Barroveliffe TV, Semin Thromb Hemost). (2002) 28(3):247-256), testovi aktiviranog delimičnog protrombina (aPTT) (Belaaouaj AA i dr., J. Biol. Chem. (2000) 275:27123-8; Diaz-Collier JA. Haemost (1994) 71:339-46), hromogeni FVIII testovi (Lethagen, S., i dr., Scandinavian J Haematology (1986) 37:448-453), ili farmakodinamički testovi na životinjama, uključujući vreme krvarenja ili trombelastografiju (TEG ili ROTEM), između ostalog. Ostali testovi uključuju određivanje afiniteta vezivanja CFXTEN za ciljni supstrat upotrebom testova vezivanja ili kompetitivnog vezivanja, kao što su Biacore testovi sa receptorima vezanim čipom ili proteinima vezivanja ili ELISA testima, kao što je opisano u Patentu SAD 5,534,617, ispitivanjima opisanim u ovde navedenim primerima. radioreceptorski testovi ili drugi testovi poznati u stanju tehnike. Drugi testovi za određivanje vezivanja FVIII inhibitora na CFXTEN uključuju Bethesda test ili Nijmegen modifikaciju Bethesda testa. Prethodni testovi se takođe mogu koristiti za procenu varijanti sekvence FVIII (ispitivane kao pojedinačne komponente ili kao CFXTEN fuzioni proteini) i mogu se uporediti sa matičnim FVIII da bi se utvrdilo da li imaju isti stepen aktivnosti prokoagulanse kao izvorni CF, ili neka frakcija tako da su pogodne za uključivanje u CFXTEN; npr., najmanje oko 10%, ili najmanje oko 20 $, ili oko 30%, ili najmanje oko 40%, ili najmanje oko 50%, ili najmanje oko 60%, ili najmanje oko 70%, ili na najmanje oko 80%, ili barem oko 90% aktivnosti u poređenju sa matičnim FVIII.

[0251] Optimizacija doze je važna za sve lekove. Terapeutski efikasna doza ili količina CFXTEN varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pojedinca, i sposobnost primenjenog fuzionog proteina da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Na primer, standardizovana pojedinačna doza FVIII za sve pacijente koji imaju različita stanja krvarenja ili nenormalne kliničke parametre (npr., neutrališuća antitela) ne mogu uvek biti efikasni. Hemofilija A kod pacijenata sa traumom, koji su bili podvrgnuti operaciji ili koji imaju visok titar FVIII inhibitornih antitela generalno će biti potrebno veće i češće doziranje. Uopšteno, nivo doziranja se prilagođava u učestalosti, trajanju i jedinicama u skladu sa težinom i trajanjem svake epizode krvarenja pacijenta. Shodno tome, CFXTEN je uključen u farmaceutski prihvatljiv nosač, nosač ili stabilizator u količini dovoljnoj da pacijentu isporuči terapeutski efikasnu količinu fuzionisanog proteina za zaustavljanje krvarenja, mereno standardnim testovima zgrušavanja. Razmatranje ovih faktora je u nadležnosti uobičajeno kvalifikovanog lekara radi utvrđivanja terapijske ili farmakološki efikasne količine CFXTEN i odgovarajućeg rasporeda doziranja, nasuprot toj količini koja bi

1

rezultirala nedovoljnom potencijalom, poput kliničkog poboljšanja ili zaustavljanje krvarenja nije postignuto.

[0252] Obelodanjivanje pruža postupke za uspostavljanje režima doze za CFXTEN farmaceutskog sastava pronalaska. Postupci uključuju davanje uzastopnih doza terapeutski efikasne količine farmaceutskog sastava CFXTEN, korišćenjem različitih vremenskih perioda između doza da bi se odredio taj interval doziranja dovoljan da se postigne i/ili održi željeni parametar, nivo krvi ili klinički efekat; takve uzastopne doze terapeutski efikasne količine u efektivnom intervalu uspostavljaju terapeutski efikasan režim doza za CFXTEN za bolesno stanje ili stanje povezano sa faktorom VIII. Profilaktički efikasna količina odnosi se na količinu CFXTEN potrebnu u određenom vremenskom periodu, potrebnom za sprečavanje fiziološkog ili kliničkog rezultata ili događaja; npr. odložen početak epizode krvarenja ili održavanje koncentracije prokoagulansa FVIII u krvi ili ekvivalentne vrednosti iznad granice (npr., 1-5% do 5-40% od normale). U postupcima lečenja, dozirana količina CFXTEN koja se daje ispitaniku kreće se od oko 5 do 300 IU/kg/doza, ili od oko 10 do 100 IU/kg/dozu, ili od oko 20 do oko 65 IU/kg/doza, ili od oko 20 do oko 40 IU/kg/doza za ispitanika. Pogodna doza može takođe da zavisi od drugih faktora koji mogu uticati na odgovor na lek; npr., epizode krvarenja obično zahtevaju veće doze u češćim intervalima u poređenju sa profilaksom.

[0253] U nekim slučajevima, postupak obuhvata primenu terapeutski efikasne količine farmaceutskog sastava koji sadrži CFXTEN sastav fuzionog proteina i bar jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ispitaniku kome je potrebna, pri čemu primena dovodi do većeg poboljšanja najmanje jednog parametra ili fiziološko stanje povezano sa FVIII deficitom ili koagulopatijom, ili rezultira povoljnijim kliničkim ishodom posredovanim FVIII komponentom CFXTEN u poređenju sa efektom na parametar, stanje ili klinički ishod posredovan davanjem farmaceutskog sastava koji sadrži FVIII vezan za XTEN i davana u uporedivoj dozi. Neograničavajući primeri poboljšanih parametara koji uključuju koncentraciju prokoagulansa u krvi FVIII u krvi, skraćeno vreme aktiviranja parcijalnog protrombina (aPTT), skraćeno vreme ispitivanja u jednoj fazi ili dvostepenom zgrušavanju, odložen početak epizode krvarenja, skraćeno vreme hromogenog FVIII ispitivanja, skraćeno vreme ispitivanja krvarenja, rezolucija događaja krvarenja ili smanjeni Bethesda titar na CFXTE povezani izvorni FVIII. U jednom slučaju iznad navedenog, poboljšanje se postiže davanjem farmaceutskog sastava CFXTEN u dozi koja postiže cirkulišuću koncentraciju

1

prokoagulansa FVIII (ili ekvivalentne vrednosti) iznad granične vrednosti (npr., 1-5% do 5-40% od normalne nivoe FVIII), čime se uspostavlja terapeutski efikasna doza. U drugom primeru iznad navedenog, poboljšanje se postiže davanjem više uzastopnih doza farmaceutskih sastava CFXTEN koristeći terapijski efikasan režim doziranja koji održava cirkulišuću koncentraciju prokoagulansa FVIII (ili ekvivalent) iznad nivoa praga (npr., 1-5 % do 5-40% normalne vrednosti FVIII) tokom dužine perioda doziranja. U drugom primeru postupka, davanje najmanje dve uzastopne doze farmaceutskog sastava CFXTEN uz korišćenje terapijski efikasnog režima doza održava cirkulišuću koncentraciju prokoagulansa FVIII (ili ekvivalent) iznad oko 1%,, 2%, 3%, 4 %, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40% normalnih nivoa FVIII u periodu koji je najmanje oko trostruko duži; alternativno najmanje oko četvorostruko duže; alternativno najmanje oko petostruko duže; alternativno najmanje oko šestostruko duže; alternativno najmanje oko sedmostruko duže; alternativno najmanje oko osmostruko duže; alternativno, najmanje oko devet puta duži ili najmanje oko deset puta duži u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN i koji se primenjuje koristeći terapeutski efikasan režim doziranja

[0254] U jednom otelotvorenju, CFXTEN ili farmaceutski sastav koji sadrži CFXTEN primenjena u terapijski efikasnom režimu doziranja rezultira dobitkom u vremenu najmanje oko trostruko dužim; alternativno najmanje oko četvorostruko duže; alternativno najmanje oko petostruko duže; alternativno najmanje oko šestostruko duže; alternativno najmanje oko sedmostruko duže; alternativno najmanje oko osmostruko duže; alternativno, najmanje oko devet puta duže ili barem oko deset puta duže, između najmanje dva uzastopna vrha Cmaxi/ili korita Cminza nivo fuzionog proteina u krvi u poređenju sa odgovarajućim biološki aktivnim proteinom fuzionim proteinom koji nije povezan sa XTEN i primenjivan je u uporedivom režimu doze kod ispitanika. U drugom otelotvorenju, CFXTEN primenjen u terapijski efikasnom režimu doziranja rezultira uporedivim poboljšanjem jednog, dva ili tri ili više izmerenih parametara korišćenjem ređeg doziranja ili niže ukupne doze u IU fuzionog proteina farmaceutskog sastava u poređenju na odgovarajuće biološki aktivne komponente proteina koje nisu povezane sa XTEN i koje se daju ispitaniku koristeći terapijski efikasan režim doziranja za FVIII. Izmereni parametri uključuju bilo koji od ovde obelodanjenih kliničkih, biohemijskih ili fizioloških parametara ili druge poznate u struci za procenu subjekata sa uslovima faktora VIII-povezanih.

(b) Farmakologija i farmaceutska svojstva CFXTEN

[0255] Predmetni pronalazak pruža CFXTEN sastave koji sadrže FVIII kovalentno vezan za

1

XTEN koji imaju pojačana farmaceutska i farmakološka svojstva u poređenju sa FVIII koji nisu povezani sa XTEN, kao i postupke za pojačavanje terapeutskog i/ili prokoagulantnog dejstva FVIII komponenata sastava. Pored toga, pronalazak obezbeđuje CFXTEN sastave sa poboljšanim svojstvima u poređenju sa onim poznatim fuzionim proteinima faktora VIII koji sadrže albumin, polipeptidne partnere imunoglobulina, polipeptide kraće dužine i/ili polipeptidne partnere sa ponavljajućim sekvencama. Pored toga, CFXTEN fuzioni proteini pružaju značajne prednosti u odnosu na hemijske konjugate, poput pegilovanih konstrukcija FVIII, posebno činjenicu da se rekombinantni CFXTEN fuzioni proteini mogu proizvesti u sistemima za ekspresiju ćelija domaćina, što može smanjiti vreme i troškove i za istraživanje i za razvoj i faze proizvodnje proizvoda, kao i rezultirajući homogenim, definisanim proizvodom sa manje toksičnosti i od proizvoda i od metabolita CFXTEN u poređenju sa pegilovanim konjugatima.

[0256] Kao terapeutska sredstva CFXTEN poseduje brojne prednosti u odnosu na terapeutske lekove koji ne sadrže XTEN, uključujući jedno ili više sledećih neograničavajućih svojstava: povećana rastvorljivost, povećana termička stabilnost, smanjena imunogenost, povećana prividna molekularna težina, smanjen bubrežni klirens, smanjena proteoliza, smanjen metabolizam, poboljšana terapijska efikasnost, manje učestali režim doziranja sa povećanim vremenom između doza sposobnih za održavanje hemostaze kod subjekta sa hemofilijom A, sposobnost davanja CFXTEN sastava subkutano ili intramuskularno, "skrojena" stopa apsorpcije ako se daje subkutano ili intramuskularno, povećana stabilnost liofilizacije, poboljšana stabilnost seruma/plazme, povećani terminalni polu-raspad, povećana rastvorljivost u protoku krvi, smanjeno vezivanje neutraliziranjem antitela, smanjen aktivni klirens, prilagođeni afinitet vezivanja supstrata, stabilnost do razgradnje, stabilnost do smrzavanja-odmrzavanje, stabilnost na proteaze, stabilnost ubikvitacije, jednostavnost primene, kompatibilnost sa drugim farmaceutskim pomoćnim tvarima ili nosačima, postojanost u ispitaniku, povećana stabilnost u skladištenje (npr., produženi rok trajanja) i slično. Neto efekat pojačanih svojstava je da upotreba CFXTEN sastava može rezultirati ukupnim pojačanim terapeutskim efektom u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN, rezultirati ekonomskim koristima povezanim sa manje čestim doziranjem i/ili rezultirati poboljšanjem usklađenosti pacijenta kada se daje ispitaniku sa stanjem vezanim za faktor VIII.

[0257] Pronalazak obezbeđuje CFXTEN sastave i farmaceutske sastave koji sadrže CFXTEN

1

gde primena sastava dovodi do poboljšanja bar jednog od ovde prikazanih kliničkih ili biohemijskih parametara kao korisnih za procenu predmetnih bolesti, stanja ili poremećaja. Neograničavajući primeri poboljšanih parametara koji uključuju koncentracije prokoagulansa u krvi FVIII u krvi, skraćeno vreme aktiviranja parcijalnog protrombina (aPTT), skraćeno vreme ispitivanja u jednoj fazi ili dvostepenom zgrušavanju, odložen početak epizode krvarenja, skraćeno vreme hromogenog FVIII ispitivanja, skraćeno vreme ispitivanja krvarenja, rezolucija događaja krvarenja ili smanjeni Bethesda titar na CFXTE povezani izvorni FVIII. Pojačana farmakokinetička svojstva ispitanika CFXTEN dozvoljavaju korišćenje akumulativno niže IU doze fuzionog proteina za održavanje parametra u poređenju sa odgovarajućom komponentom FVIII koja nije povezana sa XTEN. U jednom otelotvorenju, ukupna doza CFXTEN realizacije koja je potrebna za postizanje i održavanje poboljšanja najmanje jednog parametra tokom 2-7 dana je najmanje oko trostruko niža, ili najmanje oko četiri puta. ili barem oko pet puta, ili najmanje oko šest puta, ili najmanje oko osam puta, ili barem oko 10 puta niže u poređenju sa odgovarajućom komponentom FVIII, koja nije povezana sa XTEN. U drugom otelotvorenju, ukupna doza u IU ispitanika CFXTEN potrebna za postizanje i održavanje poboljšanja najmanje jednog parametra tokom dve, tri ili četiri uzastopne doze je najmanje oko trostruko niža, ili najmanje oko četvorostruka. ili barem oko pet puta, ili najmanje oko šest puta, ili najmanje oko osam puta, ili barem oko 10 puta niže u poređenju sa odgovarajućom komponentom FVIII, koja nije povezana sa XTEN. Alternativno, pronalazak pruža određena otelotvorenja CFXTEN pri čemu je period između uzastopnih davanja koji rezultira postizanjem i održavanjem poboljšanja barem jednog parametra najmanje oko tri puta, ili najmanje oko četiri puta, ili najmanje oko pet puta, ili najmanje oko šest puta, ili barem oko osam puta, ili barem oko 10 puta duže u poređenju sa odgovarajućom komponentom FVIII, koja nije povezana sa XTEN i koja se daje u uporedivoj IU dozi. Alternativno, pronalazak pruža određena otelotvorenja CFXTEN gde primena 25 IU/kg dovodi do poboljšanja od 30% u periodu aPTT (ili sličnog testa koagulacije) kod ispitanika sa hemofilijom A u poređenju sa 25 IU/kg odgovarajućeg FVIII koji nije povezan na XTEN kada je testiran otprilike 2-7 dana nakon davanja. U još jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN gde primena 25 IU/kg dovodi do poboljšanja od 30% u vremenu ispitivanja krvarenja kod ispitanika sa hemofilijom A u poređenju sa 25 IU/kg odgovarajućeg FVIII koji nije povezan sa XTEN kada je testiran na oko 2-7 dana nakon davanja.

[0258] U jednom otelotvorenju, XTEN kao fuzioni partner povećava rastvorljivost FVIII

1 1

korisnog opterećenja. Shodno tome, tamo gde je poželjno pojačavanje farmaceutskih ili fizičko-hemijskih svojstava FVIII, kao što je stepen rastvorljivosti ili stabilnosti u vodi, dužina i/ili motiv porodice XTEN sekvence ugrađenih u fuzioni protein mogu se izabrati da bi se dodelio različit stepen rastvorljivosti i/ili stabilnosti na odgovarajućim fuzionim proteinima tako da su poboljšana opšta farmaceutska svojstva CFXTEN sastava. CFXTEN fuzioni proteini mogu se konstruisati i testirati, koristeći ovde opisane metode, da potvrde fizičko-hemijska svojstva i izbor XTEN sekvence dužine ili lokacije prilagođene, prema potrebi, da dovedu do željenih svojstava. U jednom otelotvorenju, CFXTEN ima rastvorljivost u vodi koja je najmanje oko 25% veća u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN, ili najmanje oko 30%, ili najmanje oko 40%, ili najmanje oko 50%, ili najmanje oko 75%, ili najmanje oko 100%, ili najmanje oko 200%, ili najmanje oko 300%, ili najmanje oko 400%, ili najmanje oko 500%, ili najmanje oko 1000%, veći od odgovarajući FVIII nije povezan sa XTEN.

[0259] Obelodanjivanje pruža postupke za proizvodnju i obnavljanje izraženog CFXTEN iz ćelije domaćina sa poboljšanom rastvorljivošću i lakoćom oporavka u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN. U jednom slučaju, postupak uključuje korake transformacije eukariotske ćelije domaćina polinukleotidom koji kodira CFXTEN sa jednom ili više XTEN komponenti kumulativne dužine niza veće od oko 100, ili veće od oko 200, ili veće od oko 400, ili veće više od oko 600, ili veće od oko 800, ili veće od oko 1000, ili veće od oko 2000, ili veće od oko 3000 aminokiselinskih ostataka, izražavajući CFXTEN fuzioni protein u ćeliji domaćina u pogodnim kulturama i indukcionim uslovima, i oporavljajući izraženi fuzioni protein u rastvorljivom obliku. U jednom slučaju, jedan ili više XTEN fuzionih proteina CFXTEN imaju najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, do oko 100% identiteta sekvence u poređenju sa jednim ili više KSTEN odabranih iz bilo koje od Tabela 4, i 13-17, ili njihovi fragmenti i FVIII imaju najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, ili 100% identitet sekvence u poređenju sa FVIII odabranim iz Tabele 1, i CFXTEN komponente su u konfiguraciji N-C-terminusom odabrane iz bilo koje od slučajeva konfiguracija koji su ovde objavljeni.

VI). KORIŠĆENJE SASTAVA CFXTEN

[0260] Obelodanjivanje pruža postupke i režime za postizanje blagotvornog efekta u stanju vezanom za faktor VIII primenom sastava koji sadrže CFXTEN. Kao što je ovde korišćeno,

1 2

"stanje vezano za faktor VIII" treba da uključi, ali nije ograničeno na nedostatak faktora VIII, poremećaje krvarenja koji su povezani sa nedostatkom faktora VIII, hemofiliju A, neutralizaciju faktora VIII anti-FVIII antitelom ili drugim inhibitorima faktora VIII i epizode krvarenja koje su posledica traume ili hirurgije ili vaskularne povrede i drugih takvih stanja koja se mogu poboljšati ili ispraviti davanjem FVIII ispitaniku . Pronalazački postupci postižu blagotvoran efekat dok se bave nedostacima i/ili ograničenjima drugih metoda lečenja korišćenjem preparata faktora VIII koji imaju relativno kratak terminusni polu-raspad, zahtevaju česte primene, neutrališu ih inhibitori ili imaju nepovoljnu farmakoekonomiju.

[0261] Hemostazu reguliše više proteinskih faktora, a takvi proteini, kao i njihovi analozi, pronašli su korisnost u lečenju stanja povezanih sa faktorom VIII. Međutim, upotreba FVIII na tržištu dostupna je sa manje od optimalnog uspeha u upravljanju ispitanicima koji su pogođeni takvim uslovima. Konkretno, optimizacija doze i učestalost doziranja su važni za FVIII koji se koristi za održavanje cirkulišućih koncentracija FVIII iznad graničnih nivoa potrebnih za hemostazu, kao i za lečenje ili sprečavanje epizoda krvarenja kod ispitanika sa hemofilijom A. Činjenica da komercijalno dostupni proizvodi FVIII imaju kratak polu-raspad zahteva često doziranje da bi se postigla klinička korist, što rezultira poteškoćama u upravljanju takvim pacijentima.

[0262] Kao što je ustanovljeno od strane odbora za faktor VIII i faktor IX Naučnog i standardizacionog odbora Međunarodnog društva za trombozu i hemostazu objavio je, na internet lokaciji ISTH, 29. novembra 2000. godine, da se najčešće korišćena mera hemofilije A utvrđuje određivanjem ozbiljnosti cirkulišuće koncentracije prokoagulanata FVIII u plazmi, kod osoba sa <1% (<0.01 IU/ml) faktora VIII definisane kao teške; 1-5% (0.01 - 0.05 IU/ml) kao umereno teške; i >5-40% (0.05 - <0.40 IU/ml) kao blage, gde je normalno 1 IU/ml faktora VIIIC (100%).

[0263] Obelodanjivanje pruža postupke lečenja ispitanika koji pati ili je u riziku od razvoja stanja povezanog sa faktorom VIII. Preciznije, obelodanjivanje daje postupke za lečenje ili sprečavanje kontrolisanja krvarenja kod ispitanika. Ispitanik može biti bilo koja životinja, ali poželjno je čovek. U jednom slučaju, postupak obuhvata primenu količine efektivne koagulacije sastava CFXTEN ispitanika kome je potreban. U drugom slučaju, postupak obuhvata korak davanja ispitaniku efektom koagulacije krvarenja, farmaceutske sastave koji uključuju CFXTEN, pri čemu primena dovodi do zaustavljanja ili slabljenja krvarenja. Kao

1

što je ovde korišćeno, "koagulaciona efikasna količina" je količina FVIII sastava koja je, kada se daje ispitaniku, dovoljna da izvrši hemostazu ili druge korisne ili željene terapijske (uključujući preventivne) rezultate. U praksi predmetnog obelodanjivanja, razumeće se da količina koagulacione efikasnosti može biti data u jednom ili više davanja. Precizna praktična količina koagulacione količine farmaceutskog sastava koji će se primenjivati će se voditi presudom lekara, međutim, jedinična doza će generalno zavisiti od težine ili uzroka krvarenja i količine prethodno postojećeg FVIII u ispitaniku. U posebnom primeru postupka lečenja krvarenja, količina lekovite efikasne koagulacije farmaceutskih sastava koji sadrži CFXTEN primenjuje se kod ispitanika koji pati od epizode krvarenja, gde primena rezultira rešavanjem krvarenja u trajanju od najmanje dva puta ili najmanje tri puta ili najmanje četiri puta duže u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN i koji se daje odgovarajućem ispitaniku sa uporedivim krvarenjem u uporedivoj dozi.

[0264] U drugom slučaju, davanje koagulaciono-efektivne količine CFXTEN sastava ispitaniku sa stanjem povezanim sa faktorom VIII rezultira sa 10%, ili 20%, ili 30%, ili 40%, ili 50%, ili 60 %, ili 70% ili veće poboljšanje jednog ili više biohemijskih, fizioloških ili kliničkih parametara povezanih sa stanjem FVIII, u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN, mereno između 2 i 7 dana nakon primene. U drugom slučaju, davanje količine CFXTEN sastava efektivne za koagulaciju ispitanika koji ima potrebu za time dovodi do poboljšanja jednog ili više biohemijskih, fizioloških ili kliničkih parametara povezanih sa stanjem FVIII tokom perioda najmanje dvostruko dužeg ili barem četvorostruko duže ili najmanje pet puta duže, ili barem šest puta duže u poređenju s vremenom postignutim FVIII koji nije povezan sa XTEN i koji se daje u uporedivoj dozi. Primeri neograničavajućih parametara koji se poboljšavaju u dužem trajanju uključuju koncentracije prokoagulanta u krvi FVIII u krvi, skraćeno vreme probnog aktiviranja parcijalnog protrombina (aPTT), skraćeno vreme ispitivanja u jednoj fazi ili dvostepenom zgrušavanju, odložen početak epizode krvarenja, smanjeno vreme hromogenog testiranja FVIII, skraćeno vreme krvarenja, između ostalih parametara koji se odnose na FVIII, poznati u stanju tehnike. U prethodnim slučajevima paragrafa, primenjeni CFXTEN sadrži FVIII sa najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identiteta sekvence na faktor VIII Tabele 1 i jednu ili više XTEN sekvenci sa najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 97%, ili bar oko 99% identiteta sekvence za XTEN iz Tabele 4 ubačen u FVIII na jednoj ili više lokacija odabranih iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili kako je prikazano na SL.8-9. U nekim

1 4

slučajevima, najmanje jedno XTEN mesto umetanja CFXTEN je izabrano od aminokiselina 32, 220, 224, 336, 339, 390, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 i 1910 (numerisano u odnosu na zreli izvorni humani FVIII).

[0265] U posebnom primeru metode lečenja, koagulaciona efikasna količina fuzionog proteina CFXTEN koja se primenjuje kod ispitanika koji boluje od hemofilije A dovoljna je za povećanje koncentracije prokoagulanata u cirkulišućem FVIII na veću od 0.05 IU/ml i za održavanje hemostaze najmanje oko 24 h, ili najmanje oko 48 h, ili najmanje oko 72 h, ili najmanje oko 96 h, ili najmanje oko 120 h, ili najmanje oko 144 h, ili najmanje oko 168 h ili više. U drugom slučaju, davanje farmaceutskog sastava sa količnom efektivnom za koagulaciju, ispitaniku kome je potreban rezultira većim smanjenjem vremena jednostepenog zgrušavanja za najmanje oko 5%, ili oko 10%, ili oko 20%, ili oko 30%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70%, ili više u uzorku krvi od subjekta 2-7 dana nakon davanja, u poređenju sa testom vremena kod ispitanika nakon davanja uporedive količine odgovarajućeg FVIII koji nije povezan sa XTEN. U drugom slučaju, davanje terapeutski efikasne količine CFXTEN ili farmaceutskih sastava koji sadrže CFXTEN ispitaniku kome je potreban rezultira većim smanjenjem aktiviranog delimičnog protrombinskog vremena za najmanje oko 5%, ili oko 10%, ili oko 20%, ili oko 30%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70%, ili više u uzorku krvi od ispitanika 2-7 dana nakon primene, u poređenju sa aktiviranim delimičnim protrombinom vremena kod subjekta nakon davanja uporedive količine odgovarajućeg FVIII koji nije povezan sa XTEN. U drugom slučaju, davanje CFXTEN ili farmaceutskih sastava koji sadrže CFXTEN ispitaniku kome je potreban korišćenjem terapeutski efikasne količine dovodi do održavanja aktiviranog delimičnog protrombinskog vremena unutar 30% od normalnog u uzorku krvi od ispitanika u periodu koje je najmanje dvostruko ili najmanje oko trostruko, ili barem oko četvorostruko duže u poređenju s vremenom FVIII koji nije povezan sa XTEN i davan ispitaniku koristeći uporedivu dozu.

[0266] U jednom primeru postupka lečenja, CFXTEN fuzioni protein se formuliše i daje kao farmaceutski sastav koji sadrži CFXTEN u mešavini sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom. Postupci za pravljenje farmaceutskih formulacija su dobro poznati u stanju tehnike. Tehnike i formulacije se uglavnom mogu naći u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa.1990 (Videti takođe, Wang and Hanson, Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology , Technical Report No.10, Supp.42-2S (1988)).

1

[0267] U drugom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje režim lečenja pacijenta sa hemofilijom, pri čemu navedeni režim sadrži sastav koji sadrži fuzioni protein CFXTEN. U jednom primeru režima za lečenje pacijenta sa hemofilijom A, režim dalje obuhvata korak određivanja količine farmaceutskog sastava koji sadrži CFXTEN potrebnu za postizanje hemostaze kod pacijenta. U nekim slučajevima režima, (i) manja količina IU oko dvostruko manja, ili oko trostruko manja, ili oko četiri puta manje, ili oko pet puta manje, ili oko šest puta manje, ili približno osam puta manje ili oko 10 puta manje farmaceutske sastave koji sadrže CFXTEN daje se ispitaniku kome je potreban u poređenju sa odgovarajućim faktorom koagulacije koji nije povezan sa XTEN u inače istom režimu doziranja, i fuzioni protein postiže uporediva površina ispod krive (zasnovana na IU/ml) i/ili uporedivi terapeutski efekat kao odgovarajući FVIII koji nije povezan sa XTEN; (ii) farmaceutski sastav se primenjuje ređe (npr., svaka tri dana, otprilike svakih sedam dana, otprilike svakih 10 dana, otprilike svakih 14 dana, otprilike svakih 21 dana ili otprilike mesečno) u poređenju sa odgovarajućim FVIII, koji nisu povezani sa XTEN pod inače istom doznom dozom, i fuzioni protein postiže uporedivu površinu ispod krive i/ili uporedivi terapeutski efekat kao odgovarajući faktor koagulacije koji nije povezan sa XTEN; ili (iii) akumulativna manja količina IU od najmanje oko 20%, ili oko 30%, ili oko 40%, ili oko 50%, ili oko 60%, ili oko 70%, ili oko 80%, ili oko 90% manje farmaceutskog sastava koji se daje u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN po inače istom rasporedu doza i CFXTEN fuzioni protein postiže uporedivi terapeutski efekat kao odgovarajući FVIII koji nije povezan sa XTEN.

Akumulativna manja količina IU meri se tokom perioda od najmanje jedne nedelje, ili oko 14 dana, ili oko 21 dan, ili oko mesec dana. U iznad navedenim slučajevima, terapeutski efekat može se odrediti bilo kojim od ovde opisanih izmerenih parametara, uključujući, ali ne ograničavajući se na koncentraciju prokoagulanta u krvi FVIII, redukovano vreme parcijalnog aktiviranja protrombina (aPTT), skraćeno jedno-fazno ili dvo-fazno vreme spitivanja faze zgrušavanja, odložen početak epizode krvarenja, skraćeno vreme hromogenog ispitivanja FVIII, skraćeno vreme krvarenja, rezolucija događaja krvarenja ili smanjeni Bethesda titar prema CFXTEN u odnosu na izvorni FVIII, nivo fibrinogena ili drugi poznati testovi u oblasti za procenu koagulopatije FVIII. U drugom slučaju, pronalazak obezbeđuje CFXTEN za upotrebu u režimu lečenja hemofilije A kod pacijenta koji obuhvata davanje sastava CFXTEN u dve ili više uzastopnih doza ispitaniku u efektivnoj količini, pri čemu davanje daje najmanje 10%, ili 20%, ili 30%, ili 40%, ili 50%, ili 60%, ili 70%, ili 80%, ili 90% veće poboljšanje barem jednog, dva ili tri parametra povezana sa bolešću u poređenju sa

1

FVIII nije povezan sa XTEN i primenjuje se uporedivom dozom.

[0268] U jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje se odnosi na postupak sprečavanja ili lečenja krvarenja kod pacijenta, opciono pacijenta sa hemofilijom, koji ima prethodno postojeće inhibitore protiv FVIII. Inhibicijska antitela protiv FVIII obično se razvijaju kod pacijenata sa hemofilijom, gde je ukupna učestalost razvoja inhibitora 15-30%, posebno kod pacijenata sa hemofilijom koji su jako izloženi koncentracijama FVIII (Algiman i dr.

Prirodna antitela za faktor VIII (antihemofilični faktor) kod zdravih pojedinaca. PNAS USA (1992) 89: 3795-3799). Međutim, inhibitorna antitela se takođe javljaju kod pacijenata kod auto-imunih poremećaja, malignih oboljenja (poput limfoproliferativnih poremećaja, limfoma i solidnih tumora), tokom trudnoće i u post-porođajnom stanju. Inhibicija se takođe može dogoditi kada antitela ometaju vezivanje FVIII na FIX i FX. Istovremeno ili alternativno, antitela protiv FVIII mogu ometati vezivanje Willebrandovog faktora i/ili fosfolipida na FVIII, utičući na koagulaciju i/ili polu-raspad FVIII. Prisustvo inhibitornih antitela često se prvo otkriva sa simptomima kao što su lako modrice i nekontrolisano krvarenje, a obično ih se naziva stečenom hemofilijom. Antitela protiv FVIII mogu se odrediti različitim metodama, uključujući kvantitaciju anti-FVIII aktivnosti u testovima koagulacije, ELISA za inhibitore FVIII i prečišćavanje hromatografijom i imunoadsorpcijom (Algiman i dr., 1992). Shodno tome, pronađeni postupci se koriste u lečenju ili prevenciji bilo kojeg stanja povezanog ili karakteriziranog prisustvom inhibitornih antitela na FVIII. U jednom slučaju, Obelodanjivanje obezbeđuje postupak lečenja pacijenta koji ima prethodno postojeći inhibitor protiv FVIII, pri čemu postupak sadrži korak primene pacijentu efikasne koagulacione fuzionog proteina CFXTEN koja se mora primeniti za postizanje hemostaze, pri čemu se količina fuzionog proteina koja je efektivna za koagulaciju smanjuje u poređenju sa količinom FVIII koja nije povezana sa XTEN (ili izvornim FVIII) koja se mora davati da bi se postigla hemostaza. U postupku, smanjena količina CFXTEN je oko dvostruko, trostruko, četvorostruko ili pet puta manje u IU/kg u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN. U drugom primeru postupka, količina CFXTEN koja se daje kao doza za postizanje hemostaze je najmanje 20 do 40 IU/kg manje, ili 30 do 60 IU/kg manje, ili 40 do 80 IU/kg manje, ili 60 do 100 IU/kg manje, ili 100 do 140 IU/kg manje, ili 120 do 180 IU/kg manje, ili 140 do 200 IU/kg manje, u poređenju sa odgovarajućim FVIII koji nije povezan sa XTEN ili nativnim FVIII potrebnim za postizanje hemostaza. U drugom slučaju, obelodanjivanje pruža postupak lečenja epizode krvarenja kod ispitanika sa hemofilijom A koji ima titar od najmanje 10, ili 20, ili 30, ili 40, ili 50, ili 75, ili 100, ili 150, ili 200 ili više

1

Bethesda jedinica protiv FVIII koji nisu povezani sa XTEN, pri čemu je doza fuzionog proteina CFXTEN potrebna za zaustavljanje epizode koja krvari najmanje dvostruka, trostruka, četvorostruka, petostruka, ili šest-puta ili sedam-puta ili osam-puta ili devet-puta ili deset-puta manji u odnosu na količinu FVIII koja nije povezana sa XTEN (ili izvornim FVIII) koja se mora primeniti da bi se postigla hemostaza kod uporedivog ispitanika.

Stručnjak u oblasti će razumeti da će količina prokoagulansa koja se daje za održavanje hemostaze zavisiti od ozbiljnosti nedostatka FVIII i/ili učestalosti ili trajanja krvarenja.

[0269] Konkretni cilj predmetnog obelodanjivanja odnosi se na upotrebu CFXTEN sa redukovanim vezanjem FVIII inhibitora koji vezuju A2 i/ili C2 domene faktora VIII kao leka. Takav lek se pogodno koristi za održavanje hemostaze kod pacijenta obolelog od hemofilije, pri čemu takav pacijent ima cirkulišuće FVIII inhibitore usmerene protiv A2 domena i/ili C2 domena faktora VIII. U jednom slučaju, obelodanjivanje obezbeđuje postupak lečenja, pri čemu postupak uključuje korak primene na pacijenta sa inhibitorom vezivanja A2 domena koagulaciono efikasne količine fuzionog proteina CFXTEN, pri čemu CFXTEN ima najmanje 10%, ili 20%, ili 30%, ili 40%, ili 50%, ili 60%, ili 70%, ili 80% ili manje vezanja na inhibitor koji veže A2 domen FVIII, u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN ili za urođeni FVIII i gde primena dovodi do hemostaze. U drugom slučaju, obelodanjivanje obezbeđuje postupak lečenja, pri čemu postupak uključuje korak primene na pacijenta sa inhibitorom vezivanja C2 domena koagulaciono efikasne količine fuzionog proteina CFXTEN, pri čemu CFXTEN ima najmanje 10%, ili 20%, ili 30%, ili 40%, ili 50%, ili 60%, ili 70%, ili 80% ili manje vezanja na inhibitor koji veže C2 domen FVIII, u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN ili za urođeni FVIII i gde primena dovodi do hemostaze. Smanjeno vezivanje predmetnog CFXTEN može se direktno testirati ELISA testom koji detektuje inhibitore FVIII, ili mereno indirektno demonstriranjem smanjene inhibicije FVIII aktivnosti CFXTEN u poređenju sa nativnim FVIII u prisustvu inhibitora, mereno hromogenim testom faktora VIII ili test u jednom koraku, kako je ovde opisano, ili drugim pogodnim postupcima koagulacije poznate u tehnici. Alternativno, predmetni CFXTEN može da se meri za smanjenu (ili odsustvo) inhibicije u prisustvu poznatih inhibitora korišćenjem modifikovanog Bethesda testa. Prema određenom aspektu ovog pronalaska, CFXTEN koristan u ovim postupcima ima smanjenu reaktivnost na jedno ili više antitela iz Tabele 10, kao i antitela koja se javljaju u prirodi kod pacijenata sa hemofilijom. U svrhu testiranja, takva i druga inhibitorna antitela mogu se nabaviti od ljudi (tj. Iz seruma pacijenata koji imaju inhibitorna antitela) ili se mogu dobiti od miševa, zamoraca, konja, koza, ne-humanih

1

primata i drugih sisara imunizacijom sa FVIII, ili njegovi fragmenti, tačnije sa fragmentom koji sadrži ceo ili deo domena A2 ili C2, bilo u poliklonskom ili monoklonskom obliku.

[0270] Obelodanjivanje dalje predviđa da se CFXTEN korišćen u skladu sa ovde datim postupcima može primenjivati zajedno sa drugim postupcima i preparatima za tretiranje (npr., drugim proteinima koagulacije) korisnim za lečenje stanja povezanih sa faktorom VIII ili uslovima za koje je faktor koagulacije pomoćni terapija; npr., epizode krvarenja usled povrede ili operacije.

[0271] U drugom aspektu, Obelodanjivanje pruža metode pripreme leka za stanje povezano sa faktorom VIII, koje uključuje kombinovanje sekvence faktora VIII odabrane iz Tabele 1 sa jednim ili više XTEN odabranih iz Tabele 4, umetnute u jedno ili više mesta umetanja, izabranih iz Tabele 5, Tabela 6, Tabela 7, Tabela 8 i Tabela 9 rezultiraju lekom koji zadržava bar deo aktivnosti izvornog FVIII. Obelodanjivanje obezbeđuje postupak pripreme farmaceutskog sastava, koji sadrži korak kombinovanja leka prethodne instance sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem. U jednom primeru postupka pripreme leka za stanje povezano sa faktorom VIII, faktor VIII ima sekvencu sa najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 97% %, ili barem oko 99% identiteta sekvence u poređenju sa sekvencom odabranom iz Tabele 1, a jedan ili više XTEN ima sekvencu sa najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identiteta sekvence u poređenju sa sekvencom odabranom iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17, ili a njegov fragment, gde je jedan ili više XTEN ubačeno na jednu ili više lokacija odabranih iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9. U posebnom primeru iznad navedenog, najmanje jedno mesto umetanja XTEN je izabrano od aminokiselina 32, 220, 224, 336, 339, 390, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 i 1910 (numerisano u odnosu na zreli domaći čovek FVIII). U drugom primeru postupka, CFXTEN sadrži sekvencu sa najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 97%, ili bar oko 99% identitet sekvence u poređenju sa sekvencom odabranom iz bilo kog iz Tabele 21.

[0272] U drugom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak pravljenja CFXTEN sastava za postizanje željenih farmakokinetičkih, farmakoloških ili farmaceutskih svojstava.

Uopšteno, koraci u dizajnu i proizvodnji sastava fuzionog proteina prema pronalasku, kao što je ilustrovano na SL.11-13, obuhvata: (1) izbor FVIII (npr., izvornih proteina, sekvence

1

Tabele 1, analozi ili derivati sa aktivnošću) za lečenje određenog stanja; (2) odabir jednog ili više XTEN (npr., Sekvence sa najmanje 80% identiteta sekvencijama navedenim u Tabeli 4) koji će dati željene farmakokinetičke i fizikalno-hemijske karakteristike rezultirajućem CFXTEN (npr., davanje CFXTEN sastava ispitaniku rezultira da se fuzioni protein održava iznad 0.05-0.4 IU/ml tokom dužeg perioda u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN); (3) uspostavljanje željene konfiguracije N-do C-terminusa konfiguracije CFXTEN radi postizanja željene efikasnosti ili PK parametara (npr., odabir jednog ili više mesta umetanja iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9) ; (4) uspostavljanje dizajna ekspresionog vektora koji kodira konfigurisani CFXTEN; (5) transformacija pogodnog domaćina sa ekspresijskim vektorom; i (6) eksprimiranja i oporavka dobijenog izolovanog fuzionog proteina CFXTEN. U jednom slučaju postupak izrade CFXTEN, XTEN za umetanje se procenjuje primenom jednadžbe IV da bi se maksimizirao odnos XTEN radijusa za konstrukciju fuzionisanog proteina, pri čemu XTEN rezultira vrednostima većim od 2.0, ili 2.1, ili 2.2, ili 2.3, ili 2.4, ili 2.5, ili 2.6, ili 2.7, ili 2.8, ili 2.9. ili 3.0 je poželjnije. Za one CFXTEN kod kojih je poželjno povećanje polu-raspada ili produženo vreme provedeno iznad minimalne koncentracije efikasne u koagulaciji, XTEN odabran za ugradnju uglavnom ima najmanje oko 144, ili oko 288, ili oko 432, ili oko 576, ili oko 864, ili oko 875, ili oko 912, ili oko 923 aminokiselinskih ostataka gde bi jedan XTEN trebalo da bude ugrađen u CFXTEN. U drugom slučaju, CFXTEN sadrži prvi XTEN prethodno navedenih dužina i najmanje drugi XTEN od oko 36, ili oko 42, ili oko 72, ili oko 144, ili oko 288, ili oko 576, ili oko 864, ili oko 875, ili oko 912, ili oko 923, ili oko 1000 ili više aminokiselinskih ostataka. Lokacija XTEN u fuzionom proteinu može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili više lokacija odabranih iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili SL.8-9. U jednom slučaju, metoda dizajna uključuje ubacivanje XTEN u FVIII najmanje jedno mesto odabrano između aminokiselina 32, 220, 224, 336, 339, 390, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 i 1910 (numerisano u odnosu na zrele izvorne humane FVIII).

[0273] U drugom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupke pravljenja CFXTEN sastava za poboljšanje jednostavnosti proizvodnje, rezultirajući povećanom stabilnošću, povećanom rastvorljivošću u vodi i/ili lakoćom formulacije, u poređenju sa matičnim FVIII. U jednom slučaju, obelodanjivanje uključuje postupak povećanja rastvorljivosti u vodi FVIII koji sadrži korak povezivanja FVIII sa najmanje oko 80%, ili oko 90%, ili oko 95% identiteta u sekvenci iz Tabele 1 u jednu ili više XTEN na jednoj, dve, tri, četiri, pet ili više lokacija izabranih iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili SL.8-9 gde XTEN predstavlja sekvencu

2

sa najmanje oko 80%, ili oko 90%, ili oko 95% identiteta sekvence u poređenju sa sekvencom iz bilo koje od tabela 3, 4 i 13-17, tako da je veća koncentracija u rastvorljivi oblik rezultirajućeg CFXTEN može se postići u fiziološkim uslovima, u poređenju sa FVIII u ne-fuzionisanom stanju. U posebnom slučaju, CFXTEN sadrži FVIII povezan sa dva, tri, četiri ili pet XTEN koji imaju najmanje oko 24, ili oko 36, ili oko 48, ili oko 60, oko 72, ili oko 84, ili oko 96 ili oko 144, ili oko 288 aminokiselinskih ostataka ubačenih na mesta izabrana iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili SL.8-9, pri čemu je rastvorljivost fuzionog proteina pod fiziološkim uslovima najmanje trostruko veća od odgovarajuće FVIII koja nije vezana za XTEN, ili alternativno, najmanje četvorostruko, petostruko ili šest puta, ili sedmostruko, ili osmostruko, ili devet puta, ili najmanje 10 puta, ili najmanje 20 puta, ili najmanje 30 puta, ili najmanje 50 puta, ili najmanje 60 puta ili najmanje 60 puta ili veći od FVIII koji nije povezan sa XTEN. Faktori koji doprinose svojstvu XTEN da povećava rastvorljivost u vodi CF-a kada je ugrađen u fuzioni protein uključuje visoku rastvorljivost XTEN fuzionog partnera i nizak stepen samo-agregacije između molekula XTEN u rastvoru, kao i širenje. hidrofilnost FVIII spoljašnjih petlji u koje se ubacuje XTEN. U nekim slučajevima, postupak rezultira fuzionim proteinom CFXTEN pri čemu je rastvorljivost u vodi najmanje oko 20%, ili barem oko 30% veća, ili bar oko 50% veća, ili bar oko 75% veća, ili najmanje oko 90% veći, ili bar oko 100% veći, ili bar oko 150% veći, ili najmanje oko 200% veći, ili najmanje oko 400% veći, ili bar oko 600% veći, ili bar oko 800 % veći, ili bar oko 1000% veći, ili bar oko 2000% veći u fiziološkim uslovima, u poređenju sa ne-fuzionisanim FVIII. U jednom slučaju, XTEN fuzionog proteina CFXTEN je sekvenca sa najmanje oko 80%, ili oko 90%, ili oko 95% identiteta sekvence, u poređenju sa sekvencama iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17. U drugom slučaju, obelodanjivanje uključuje postupak povećanja roka trajanja FVIII koji sadrži korak povezivanja FVIII sa jednim ili više XTEN na jednom ili više mesta izabranih iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9, gde je rok trajanja dobijenog CFXTEN produžen u poređenju sa FVIII u stanju bez spajanja. Kao što je ovde korišćeno, rok trajanja odnosi se na vremenski period tokom kojeg prokoagulantna aktivnost FVIII ili CFKSTEN koja je u rastvoru, liofilizovana ili u nekoj drugoj formulaciji skladištenja ostaje stabilna bez nepotrebnog gubitka aktivnosti ili koja ostaje unutar specifikacija otpuštanja utvrđenih za farmaceutski sastav. FVIII koji razgrađuje ili agregira uglavnom ima smanjenu funkcionalnu aktivnost ili smanjenu bioraspoloživost u poređenju sa onom koja ostaje u rastvoru. Faktori koji doprinose sposobnosti ove metode da produži rok trajanja FVIII kada je ugrađen u fuzioni protein uključuju povećanu rastvorljivost u vodi, smanjenu samo-agregaciju u rastvoru i povećanu toplotnu stabilnost XTEN partnera

2 1

za fuziju. Konkretno, niska tendencija XTEN za agregaciju olakšava metode formulisanja farmaceutskih preparata koji sadrže veće koncentracije lekova CF, a toplotna stabilnost XTEN doprinosi svojstvu fuzionih proteina CFXTEN da ostaju rastvorljivi i funkcionalno aktivni tokom dužeg perioda. Postupak rezultira CFXTEN fuzionim proteinima sa prolongiranim ili produženim rokom trajanja koji pokazuju veću aktivnost u odnosu na FVIII standard koji je podvrgnut istim uslovima skladištenja i rukovanja. Standard može biti nekontrolisan FVIII celom dužinom ili komercijalno dostupan FVIII farmaceutski sastav. U jednom slučaju, postupak uključuje korak formulisanja izolovanog CFXTEN sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih pomoćnih sastojaka koji povećavaju sposobnost XTEN da zadrži svoju nestrukturiranu konformaciju i da CFXTEN ostane rastvorljiv u formulaciji duže vreme veće od onog odgovarajućeg ne-fuzionisanog FVIII. U jednom slučaju, postupak uključuje povezivanje FVIII odabranog iz Tabele 1 sa jednim ili više XTEN odabranih iz bilo koje od Tabela 3, 4 i 13-17, umetnutih na jednom ili više mesta izabranih iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabela 8 i Tabela 9 i mešanje sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim pomoćnim sastojkom kako bi se stvorio farmaceutski sastav koji zadržava više od oko 100% prokoagulantne aktivnosti ili veće od oko 105%, 110%, 120%, 130%, 150% ili 200% prokoagulantne aktivnosti FVIII standarda podvrgnuto istim uslovima skladištenja i rukovanja u poređenju sa vremenskom tačkom od najmanje 90 dana, ili najmanje 6 meseci, ili najmanje 12 meseci. Rok trajanja se takođe može proceniti u pogledu funkcionalne aktivnosti koja ostaje nakon skladištenja, normalizovane na funkcionalnu aktivnost kada je počelo skladištenje. U nekim slučajevima, CFXTEN farmaceutski sastav predmetnog obelodanjivanja zadržavaju oko 50% više prokoagulantne aktivnosti ili oko 60%, 70%, 80% ili 90% više aktivnosti prokoagulanse FVIII standarda kada su izložene istim uslovima za iste period do 2 nedelje, ili 4 nedelje, ili 6 nedelja ili duže pod različitim temperaturnim uslovima. U jednom slučaju, farmaceutski sastav CFXTEN zadržava najmanje oko 50%, ili oko 60%, ili najmanje oko 70%, ili najmanje oko 80%, i najpoželjnije najmanje oko 90% ili više njegove prvobitne aktivnosti u rastvoru kada se zagreva na 80°C tokom 10 minuta. U drugom slučaju, farmaceutski sastav CFXTEN zadržava najmanje oko 50%, poželjno najmanje oko 60%, ili najmanje oko 70%, ili najmanje oko 80%, ili alternativno najmanje oko 90% ili više svoje originalne aktivnosti u rastvor se zagreva ili održava na 37°C tokom oko 7 dana. U drugom slučaju, farmaceutski sastav CFXTEN zadržava najmanje oko 80% ili više svoje funkcionalne aktivnosti nakon izlaganja temperaturi od oko 30°C do oko 70°C tokom perioda od oko jednog do oko 18 sati. U iznad navedenim slučajevima opisanim u ovom paragrafu, zadržana aktivnost CFXTEN farmaceutskih sastava je najmanje oko dvostruko, ili najmanje

2 2

oko trostruko, ili najmanje oko četvorostruko, ili najmanje oko petostruko, ili barem oko šest puta veći u datom vremenskom trenutku od odgovarajućeg farmaceutskog sastava koji sadrži FVIII koji nije povezan sa XTEN.

VII). SEKVENCE NUKLEINSKIH KISELINA PREMA PRONALASKU

[0274] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovane polinukleinske kiseline koje kodiraju CFXTEN himerne fuzione proteine i sekvence komplementarne molekulima polinukleinske kiseline koja kodira CFXTEN himerne fuzione proteine, uključujući njihove homologne varijante. U drugom aspektu, obelodanjivanje obuhvata postupke proizvodnje polinukleinskih kiselina koje kodiraju CFXTEN himerne fuzione proteine i sekvence komplementarne molekulima polinukleinske kiseline koja kodira CFXTEN himerni fuzioni protein, uključujući njihove homologne varijante. Uopšteno, kao što je prikazano na Sl.11-13, postupci proizvodnje polinukleotidne sekvence koja kodira CFXTEN fuzioni protein i ekspresije dobijenog genskog proizvoda uključuju sastavljanje nukleotida koji kodiraju FVIII i XTEN, ligaciju komponenti u okviru, inkorporiranje gena koji kodira u ekspresijski vektor pogodan za ćeliju domaćina, transformišući odgovarajuću ćeliju domaćina ekspresijskim vektorom i kultiviranje ćelije domaćina pod uslovima koji izazivaju ili dozvoljavaju ekspresiju fuzionog proteina u transformisanoj ćeliji domaćina, stvarajući na taj način biološki aktivni CFXTEN polipeptid, koji se oporavlja kao izolovani fuzioni protein standardnim postupcima prečišćavanja proteina poznatim u stanju tehnike. Standardne rekombinantne tehnike u molekularnoj biologiji koriste se za pravljenje polinukleotida i ekspresionih vektora predmetnog obelodanjivanja.

[0275] U skladu sa obelodanjivanjem, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju CFXTEN (ili njegov komplement) koriste se za generisanje rekombinantnih molekula DNK koji usmeravaju ekspresiju CFXTEN fuzionisanih proteina u odgovarajućim ćelijama domaćinima. Za potrebe predmetnog pronalaska, nukleinska kiselina koja kodira signalni peptid koji odgovara onome iz izvornog humanog FVIII (kodirajući MQIELSTCFFLCLLRFCFS (SEQ ID NO:1611)) mogu se dodati bilo kom od ovde opisanih kodirajućih konstrukcija da pomognu u ekspresiji i izlučivanju fuzionog proteina CFXTEN. U jednom otelotvorenju, dodavanje nukleinske kiseline je ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAG

T (SEQ ID NO:1613), ili njegov komplement.

[0276] Nekoliko strategija kloniranja je pogodno za izvođenje predmetnog obelodanjivanja,

2

od kojih se mnoge koriste za generisanje konstrukta koji sadrži gen koji kodira fuzioni protein iz CFXTEN sastava predmetnog obelodanjivanja ili njegovog komplementa. U nekim slučajevima, strategija kloniranja koristi se za stvaranje gena koji kodira monomerni CFXTEN koji sadrži najmanje prvi FVIII i najmanje prvi XTEN polipeptid, ili njihov komplement. U jednom primeru prethodnog, gen sadrži sekvencu koja kodira FVIII ili varijantu sekvence. U drugim slučajevima, strategija kloniranja koristi se za stvaranje gena koji kodira monomerni CFXTEN koji sadrži nukleotide koji kodiraju barem prvi molekul FVIII ili njegov komplement i prvi i najmanje drugi XTEN ili njihov komplement koji se koristi za transformisanje a ćelija domaćina za ekspresiju fuzionog proteina CFXTEN sastava. U iznad navedenim slučajevima opisanim u ovom paragrafu, geni mogu dalje da sadrže nukleotide koji kodiraju razmaknute sekvence koje takođe kodiraju sekvencu(e) deljenja.

[0277] Dizajnirajući željene XTEN sekvence, otkriveno je da se ne ponavljajuća priroda XTEN sastava pronalaska postiže uprkos korišćenju molekularnog pristupa "gradivnog bloka" u stvaranju XTEN-kodirajućih sekvenci. Ovo je postignuto upotrebom biblioteke polinukleotida koji kodiraju iznad opisane motive peptidne sekvence, koji se zatim liziraju i/ili multimerizuju da bi se stvorili geni koji kodiraju XTEN sekvence (videti Sl.11 i 12 i Primeri). Dakle, dok XTEN(i) eksprimiranog fuzionog proteina mogu da se sastoje od više jedinica od čak četiri različita motiva sekvence, jer se sami motivi sastoje od ponavljajućih aminokiselinskih sekvenci, celokupna XTEN sekvenca se ne ponavlja. Prema tome, u jednom slučaju polinukleotidi koji kodiraju XTEN sadrže više polinukleotida koji kodiraju ponavljajuće sekvence ili motive, operativno povezane u okvir i u kojima rezultirajuće eksprimirane sekvence aminokiselina XTEN ne ponavljaju.

[0278] U jednom pristupu, prvo se priprema konstrukt koji sadrži DNK sekvencu koja odgovara CFXTEN fuzionom proteinu. DNK koja kodira FVIII sastave dobija se sintetički, iz komercijalnog izvora ili iz biblioteke cDNK pripremljene korišćenjem standardnih postupaka iz tkiva ili izolovanih ćelija za koje se veruje da poseduju FVIII mRNK i da ih eksprimiraju na nivou koji se može otkriti. Ako je potrebno, kodirajuća sekvenca može se dobiti korišćenjem konvencionalnih postupaka produženja primera kao što je opisano u Sambrook, i dr., supra, za otkrivanje prekursora i obradu međujedinjenja mRNK koji možda nije reverzibilno transkribovan u cDNK. Zatim se može koristiti metodologija lančane reakcije polimerazom (PCR) da bi se amplifikovala ciljna sekvenca DNK ili RNK radi dobijanja

2 4

dovoljno materijala za pripremu CFXTEN konstrukata koji sadrže FVIII gen. Zatim se mogu izvršiti ispitivanja kako bi se potvrdilo da su hibridizacijski geni pune dužine željeni FVIII geni. Ovim konvencionalnim postupcima DNK se može pogodno dobiti iz cDNK biblioteke pripremljene iz takvih izvora. FVIII kodiranje gena može se takođe stvoriti standardnim sintetskim postupcima poznatim u struci (npr., automatizovana sinteza nukleinske kiseline korišćenjem, na primer jednog od postupaka opisanih u Engels i dr. (Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-7341989)), koristeći DNK sekvence dobijene iz javno dostupnih baza podataka, patenata ili literature. Takvi postupci su dobro poznati u tehnici i dobro su opisani u naučnoj i patentnoj literaturi. Na primer, sekvence se mogu dobiti od registarskih brojeva hemijskih Abstracts Services (CAS) (objavljeno od strane American Chemical Societi+y) i/ili GenBank Pristupnih brojeva (npr., Lokus ID, NP_XXXXX i XP_XXXXX) Model identifikatora proteina koji su dostupni putem Nacionalnog centra za Veb stranica o biotehnološkim informacijama (NCBI), dostupna na svetskom vebu na ncbi.nlm.nih.gov koja odgovara unosima u CAS registru ili GenBank bazi podataka koji sadrže aminokiselinski niz proteina koji vas zanima ili fragment ili varijantu protein. U jednom slučaju, FVIII kodirajući gen kodira proteinsku sekvencu iz Tabele 1, ili njen fragment ili varijantu.

[0279] Gen ili polinukleotid koji kodira FVIII deo predmetnog proteina CFXTEN, u slučaju eksprimiranog fuzionog proteina koji sadrži jedan FVIII, tada se klonira u konstrukt koji je plazmid ili drugi vektor pod kontrolom odgovarajućih sekvenci transkripcije i prevođenja za ekspresiju proteina visokog nivoa u biološkom sistemu. U kasnijem koraku, drugi gen ili polinukleotid, koji kodira XTEN, genetski se spaja sa nukleotidima koji kodiraju N- i/ili C-terminus FVIII gena kloniranjem u konstrukciju koja je susedna i u okviru sa genima koji kodiraju za FVIII. Ovaj drugi korak se odvija putem koraka ligacije ili multimerizacije. U iznad navedenim slučajevima opisanim u ovom paragrafu, podrazumeva se da genetske konstrukcije koje se stvore mogu alternativno biti komplement odgovarajućih gena koji kodiraju odgovarajuće fuzione proteine.

[0280] Kodiranje gena za XTEN može se izvršiti u jednom ili više koraka, bilo potpuno sintetički, bilo sintezom u kombinaciji sa enzimatskim procesima, kao što su kloniranje posredovano restrikcijskim enzimom, PCR i ekstenzija preklapanja, uključujući postupke detaljnije opisane u Primerima. Ovde opisani postupci mogu se koristiti, na primer, za vezanje kratkih sekvenci polinukleotida koji kodiraju XTEN u duže XTEN gene željene dužine i sekvence. U jednom slučaju, postupak lizira dva ili više oligonukleotida

2

optimizovanih kodonom koji kodiraju XTEN motiv ili segmente sekvence od oko 9 do 14 aminokiselina, ili oko 12 do 20 aminokiselina, ili oko 18 do 42 aminokiselina, ili oko 42 do oko 144 aminokiseline, ili oko 144 do oko 288 aminokiselina, ili 288 do oko 864 aminokiselina ili duže, ili bilo koja kombinacija prethodnih raspona dužina motiva ili segmenta.

[0281] Alternativno, obelodanjeni postupak se koristi za multimerizaciju nizova koje kodiraju XTEN u duže sekvence željene dužine; npr., gen koji kodira 36 aminokiselina XTEN može se dimerizovati u gen koji kodira 72 aminokiseline, zatim 144, zatim 288, itd. čak i uz multimerizaciju, XTEN polipeptidi mogu biti konstruisani tako da gen koji kodira XTEN ima nizak ili gotovo nikakav ponavljanja kroz dizajn kodona izabranih za motive najkraće jedinice koja se koristi, što može smanjiti rekombinaciju i povećati stabilnost gena za kodiranje u transformisanom domaćinu.

[0282] Geni koji kodiraju XTEN s ponavljajućim sekvencama sastavljaju se iz oligonukleotida koristeći standardne tehnike sinteze gena. Dizajn gena može se izvesti pomoću algoritama koji optimiziraju upotrebu kodona i sastav aminokiselina. U jednom postupku obelodanjivanja, biblioteka relativno kratkih XTEN-kodirajućih polinukleotidnih konstrukcija se stvara i zatim sastavlja, kao što je iznad opisano. Rezultirajući geni se zatim spajaju sa genima koji kodiraju FVIII ili regione FVIII, kao što je prikazano na Sl.11 i 12, a dobijeni geni korišćeni su za transformaciju ćelije domaćina i proizvodnju i obnavljanje CFXTEN za procenu njegovih svojstava, kao što je ovde opisano.

[0283] U drugom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotidnu sekvencu koja kodira otelotvorenja CFXTEN fuzionog proteina. U jednom slučaju, izolovana nukleinska kiselina sadrži polinukleotidnu sekvencu odabranu između (a) sekvence koja ima najmanje oko 80% identiteta sekvence, ili oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93% ili oko 94%, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, do oko 100% identiteta sekvence u poređenju sa sekvencom uporedive dužine, odabranom iz Tabele 21, kada optimalno poravnan ili (b) komplement polinukleotida iz (a). U drugom slučaju, izolovana nukleinska kiselina sadrži sekvencu ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAG

T (SEQ ID NO:1613) vezan za 5' kraj nukleinske kiseline iz (a) ili komplementarne sekvence vezane za 3' kraj (b).

2

Polinukleotidne biblioteke

[0284] U drugom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje biblioteke polinukleotida koji kodiraju XTEN sekvence koje se koriste za skupljanje gena koji kodiraju XTEN željene dužine i sekvence.

[0285] U određenim slučajevima, konstrukcije biblioteke koja kodira XTEN sadrže polinukleotide koji kodiraju polipeptidne segmente fiksne dužine. Kao početni korak može se sastaviti biblioteka oligonukleotida koja kodira motive 9-14 aminokiselinskih ostataka. U poželjnom slučaju su sakupljene biblioteke oligonukleotida koje kodiraju motive 12 aminokiselina.

[0286] Segmenti sekvenciranja koji kodiraju XTEN mogu da se dimerizuju ili multimerizuju u duže kodirajuće sekvence, kao što je šematski prikazano na Sl.13. Dimerizacija ili multimerizacija može se izvesti ligacijom, ekspanzijom preklapanja, PCR sklapanjem ili sličnim tehnikama kloniranja poznatim u stanju tehnike. Ovaj postupak se može ponoviti više puta sve dok rezultirajuće sekvence kodiranja XTEN ne postignu organizaciju sekvence i željene dužine, obezbeđujući XTEN-kodirajuće gene. Kao što će se razumeti, biblioteka polinukleotida koja kodira, na primer, 12 motiva aminokiselina može se dimerizovati i/ili lizirati u biblioteku polinukleotida koji kodira 36 aminokiselina. Biblioteke koje kodiraju motive različite dužine; npr., 9-14 motiva aminokiselina koji vode do biblioteka koje kodiraju 27 do 42 aminokiseline razmatraju obelodanjivanje. Zauzvrat, biblioteka polinukleotida koja kodira 27 do 42 aminokiseline i poželjno 36 aminokiselina (kao što je opisano u primerima) može se serijski dimerizovati u biblioteku koja sadrži sukcesivno veće dužine polinukleotida koje kodiraju XTEN sekvence željene dužine za ugradnju u gen koji kodira CFXTEN fuzioni protein, kao što je ovde obelodanjeno.

[0287] Efikasniji način optimizacije DNK sekvence koja kodira XTEN zasnovan je na kombinatornim bibliotekama. Gen koji kodira XTEN može se konstruisati i sintetizovati u segmentu tako da se dobije više verzija kodona za svaki segment. Ovi segmenti mogu se nasumično sastaviti u biblioteku gena tako da svaki član biblioteke kodira iste sekvence aminokiselina, ali članovi biblioteke sadrže veliki broj verzija kodona. Takve biblioteke mogu biti pretražene na gene koji rezultiraju visokom ekspresijom i/ili malim obiljem produkata skraćenja. Proces kombiniranja kombinatornih gena prikazan je na Sl.18. Geni na SL. 18 su sastavljeni iz 6 osnovnih fragmenata i svaki fragment je dostupan u 4 različite

2

verzije kodona. To omogućava teorijsku raznolikost od 4096.

[0288] U nekim slučajevima, biblioteke su sastavljene od polinukleotida koji kodiraju aminokiseline koje su ograničene na XTEN porodice specifične sekvence; npr., the AD, AE, AF, AG, AM, ili AQ sekvence Tabele 4. U drugim slučajevima, biblioteke sadrže sekvence koje kodiraju dve ili više sekvenci porodice motiva iz Tabele 3. Nazivi i sekvence reprezentativnih, neograničavajućih polinukleotidnih nizova biblioteka koje kodiraju 36mers predstavljene su u Tabelama 13-17, a postupci koji se koriste za njihovo stvaranje detaljnije su opisani u odgovarajućim Primerima. U drugim slučajevima, biblioteke koje kodiraju XTEN su izgrađene od segmenata polinukleotidnih kodona povezanih u slučajnoj sekvenci koja kodira aminokiseline u kojima je najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 91%, ili najmanje oko 92% %, ili najmanje oko 93%, ili najmanje oko 94%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 97%, ili najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%, kodona, izabranih iz grupa koja se sastoji iz kodona za glicin (G), alanin (A), serin (S), treonin (T), glutamat (E) i prolin (P) aminokiseline. Biblioteke se mogu zauzvrat koristiti za serijsku dimerizaciju ili ligaciju za postizanje biblioteka polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju XTEN sekvence, na primer, 42, 48, 72, 144, 288, 576, 864, 875, 912, 923, 1318 aminokiseline, ili do ukupne dužine od oko 3000 aminokiselina, kao i srednje dužine, u kojima kodirani XTEN može imati jedno ili više ovde opisanih svojstava, kada se ispoljava kao komponenta fuzionog proteina CFXTEN. U nekim slučajevima, polinukleotidne bibliotečne sekvence mogu takođe da sadrže dodatne baze koje se koriste kao "ostrva za sekvenciranje", detaljnije opisane u daljem tekstu.

[0289] Sl.14 je šematski dijagram toka reprezentativnih, neograničavajućih koraka u sklapanju XTEN polinukleotidne konstrukcije i CFXTEN polinukleotidne konstrukcije u slučajevima obelodanjivanja. Pojedinačni oligonukleotidi 501 su sagorevani u motivima sekvenci 502, kao što je motiv 12 aminokiselina ("12-mer"), koji su vezani za dodatne motive sekvenci iz biblioteke da bi se stvorio bazen koji takođe obuhvata željenu dužinu XTEN 504, vezan na manju koncentraciju oligo koji sadrži BbsI i KpnI restrikciona mesta 503. Dobijeni bazen proizvoda za vezivanje je prečišćen gelom i reza se trakom željene dužine XTEN, što rezultira izolovanim XTEN genom sa stop sekvencom 505. XTEN gen je kloniran u vektor za punjenje. U ovom slučaju, vektor kodira opcionalnu CBD sekvencu 506 i GFP gen 508. Digestija se zatim izvodi sa BbsI/HindIII da bi se uklonili 507 i 508 i postavili stop kodon. Rezultirajući proizvod se zatim klonira u vektor digestije BsaI/HindIII koji sadrži gen koji

2

kodira FVIII, što rezultira genom 500 koji kodira FVIII-XTEN fuzioni protein.

[0290] Može se klonirati biblioteka gena koji kodiraju XTEN u jedan ili više vektora ekspresije koji su poznati u stanju tehnike. Da bi se olakšala identifikacija dobro izraženih članova biblioteke, biblioteka može biti konstruisana kao fuzija sa proteinskim reporterima. Neograničavajući primeri pogodnih reporterskih gena su zeleni fluorescentni protein, lucifrak, alkalna fosfataza i beta-galaktosidask. Skriningom se mogu prepoznati kratke XTEN sekvence koje se mogu ispoljiti u visokoj koncentraciji u organizmu domaćina po izboru. Nakon toga, može se generisati biblioteka slučajnih XTEN dimera i ponoviti ekran za visoki nivo ekspresije. Potom se mogu dobiti ekranizacija dobijenih konstrukcija za određena svojstva kao što su nivo ekspresije, stabilnost proteaze ili vezivanje za antiserum.

[0291] Jedan aspekt obelodanjivanja je obezbeđivanje polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju komponente fuzionog proteina gde je stvaranje sekvence prošlo kodonsku optimizaciju. Od posebnog interesa je optimizacija kodona sa ciljem da se poboljša ekspresija polipeptidnih sastava i da se poboljša genetska stabilnost kodirajućeg gena u proizvodnim domaćinima. Na primer, optimizacija kodona je od posebnog značaja za XTEN sekvence koje su bogate glicinom ili imaju vrlo ponavljajuće sekvence aminokiselina. Codon optimizacija se vrši pomoću računarskih programa (Gustafsson, C., i dr. (2004) Trends Biotechnol, 22: 346-53), od kojih neki minimiziraju ribosomalna pauziranja (Coda Genomics Inc.). U jednom slučaju, može se izvršiti optimizacija kodona konstrukcijom kodonskih biblioteka gde svi članovi biblioteke kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu, ali gde je upotreba kodona različita. Takve biblioteke mogu biti pregledane za visoko ekspresivne i genetski stabilne članove koji su posebno pogodni za veliku proizvodnju proizvoda koji sadrže XTEN. Prilikom dizajniranja XTEN sekvenci može se uzeti u obzir niz svojstava. Može se smanjiti ponavljanje u kodirajućim DNK sekvencama. Pored toga, može se izbeći ili minimizirati upotreba kodona koje retko koristi proizvodni domaćin (npr., kodovi AGG i AGA arginina i jedan leucin kodon u E. coli). U slučaju E. coli, dva glicinska kodona, GGA i GGG, retko se koriste u visoko eksprimiranim proteinima. Stoga optimizacija kodona gena koji kodira XTEN sekvence može biti veoma poželjna. DNK sekvence koje imaju visok nivo glicina imaju visok sadržaj GC što može dovesti do nestabilnosti ili niskog nivoa ekspresije. Stoga, kad je moguće, preferira se odabir kodona tako da je sadržaj GC u XTEN-kodirajućoj sekvenci pogodan za proizvodni organizam koji će se koristiti za proizvodnju XTEN

2

[0292] U jednom slučaju, polinukleotidne biblioteke se konstruišu korišćenjem opisanih postupaka gde svi članovi biblioteke kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu, ali gde se upotreba kodona za odgovarajuće aminokiseline u nizu menja ili optimizira za željenu ćeliju domaćina. Takve biblioteke mogu biti pregledane za visoko ekspresivne i genetski stabilne članove koji su posebno pogodni za veliku proizvodnju proizvoda koji sadrže XTEN. U jednom slučaju, biblioteke su optimizovane za ekspresiju u eukariotskoj ćeliji domaćina.

[0293] Po izboru, u biblioteci se može klonirati sekvencija da bi se eliminisali izolati koji sadrže neželjene sekvence. Početna biblioteka kratkih XTEN sekvenci omogućava određenu varijaciju u sekvenci aminokiselina. Na primer, neki se kodoni mogu nasumično odraziti tako da se u određenoj poziciji može pojaviti niz hidrofilnih aminokiselina. Tokom procesa iterativne multimerizacije možete prikazati rezultirajuće članove biblioteke za druge karakteristike kao što su rastvorljivost ili otpornost na proteazu uz ekran za ekspresiju visokog nivoa.

[0294] Jednom kada je odabran gen koji kodira XTEN željene dužine i svojstava, on se genetski spaja na željenoj lokaciji s nukleotidima koji kodiraju FVIII gene klonirajući ih u konstrukt susedni i u okviru sa genom koji kodira za FVIII, ili alternativno između nukleotida koji kodiraju susedne domene FVIII, ili alternativno unutar sekvence koja kodira datu FVIII domenu, ili alternativno u okviru sa nukleotidima koji kodiraju sekvencu za razdeljivanje/deljenje vezanu za terminusni XTEN. Obelodanjivanje pruža različite permutacije iznad navedenog, zavisno od CFXTEN koji treba da se kodira. Na primer, gen koji kodira CFXTEN fuzioni protein koji sadrži FVIII i dva XTEN, kao što je ostvareno formulom VI, kao što je iznad prikazano, gen bi imao polinukleotide koji kodiraju FVIII, koji kodiraju dva XTEN, koji mogu biti identični ili različiti po sastavu i redosledu dužina. U jednom neograničavajućem slučaju iz prethodnog, FVIII polinukleotidi bi kodirali faktor VIII, a polinukleotidi koji kodiraju C-terminus XTEN bi kodirali XTEN od 288 aminokiselina, a polinukleotidi koji kodiraju unutrašnji XTEN pored C-terminusa A2 domen bi kodirao XTEN od 144 aminokiselina. Korak kloniranja FVIII gena u XTEN konstrukt može se dogoditi ligacijskim ili multimerizacionim korakom, kao što je prikazano na Sl.14. Konstrukti koji kodiraju CFXTEN fuzione proteine mogu se konstruisati u različitim konfiguracijama komponenti XTEN, CF i razmaknutih sekvenci, kao što su konfiguracije formula I-VIII. U jednom slučaju, konstrukt sadrži polinukleotidne sekvence komplementarne ili one koje kodiraju monomerni polipeptid komponenti u sledećem

21

redosledu (5' do 3') FVIII, XTEN unutar B domena i C-terminusni XTEN. U jednom slučaju, konstrukt sadrži polinukleotidne sekvence komplementarne ili one koje kodiraju monomerni polipeptid komponenti u sledećem redosledu (5' do 3') FVIII, XTEN unutar B domena i C-terminusni XTEN. Razdelnički polinukleotidi mogu opciono da sadrže sekvence koje kodiraju sekvence deljenja. Kao što će biti očigledno stručnjacima u oblasti, moguće su višestruke permutacije FVIII domena i ubačenog XTEN.

[0295] Homologija, sličnost sekvenci ili identitet sekvenci nukleotidnih ili aminokiselinskih sekvenci takođe se mogu odrediti konvencionalno korišćenjem poznatog softvera ili računarskih programa, poput programa za poređenje BestFit ili Gap (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.53711). BestFit koristi algoritam domaće homologije Smith and Waterman (Advances in Applied Mathematics. 1981. 2: 482-489), kako bi se pronašao najbolji segment identiteta ili sličnosti između dve sekvence. Gap vrši globalna prilagođavanja: sve jedne sekvence sa svim drugim sličnim sekvencama koristeći postupak Needleman and Wunsch, (Journal of Molecular Biology. 1970. 48:443-453). Kada se koristi program za poravnavanje redosleda, kao što je BestFit, za određivanje stepena homologije sekvence, sličnosti ili identiteta, može se koristiti podrazumevana postavka ili se može izabrati odgovarajuća matrica za ocenjivanje radi optimizacije identiteta, sličnosti ili homologije.

[0296] Sekvence nukleinske kiseline koje su "komplementarne" su one koje mogu da se spajaju prema standardnim pravilima o komplementarnosti Watson-Crick. Kao što je ovde korišćen, termin "komplementarne sekvence" označava sekvence nukleinskih kiselina koje su suštinski komplementarne, što se može proceniti istim upoređivanjem nukleotida iznad navedenim ili kao što je definisano kao sposobno hibridizovati na polinukleotide koji kodiraju CFXTEN sekvence pod strogim stanja, kao što su oni opisani ovde.

[0297] Rezultujući polinukleotidi koji kodiraju CFXTEN himerne fuzione proteine mogu se zatim pojedinačno klonirati u ekspresijski vektor. Nukleinska kiselina se unosi u vektor različitim postupcima. Generalno, DNK se ubacuje u odgovarajuće mesto (a) restrikcione endonukleaze koristeći tehnike poznate u struci. Vektorske komponente obično uključuju, ali nisu ograničene na, jednu ili više signalnih sekvenci, poreklo replikacije, jedan ili više marker gena, pojačivač, promoter i sekvencu prekida transkripcije. Konstrukcija pogodnih vektora koji sadrže jednu ili više ovih komponenti koristi standardne tehnike ligacije koje su poznate stručnjacima. Takve tehnike su dobro poznate u tehnici i dobro su opisani u naučnoj i patentnoj literaturi.

[0298] Različiti vektori su javno dostupni. Vektor može, na primer, biti u obliku plazmida, kosmida, virusne čestice ili faga koji se može podvrgnuti rekombinantnim DNK procedurama, a izbor vektora će često zavisiti od ćelije domaćina u koju treba da se ubaci. Prema tome, vektor može biti autonomno replicirajući vektor, tj., vektor, koji postoji kao ekstrahromozomalni entitet, čija je replikacija nezavisna od hromozomske replikacije, npr., plazmida. Alternativno, vektor može biti onaj koji se, kada se uvede u ćeliju domaćina, integriše u genom ćelije domaćina i replicira zajedno sa hromozomom(ima) u koji je integrisan. Reprezentativni plazmidi su prikazani na Sl.17, sa regionima za kodiranje različitih konfiguracija FVIII i XTEN prikazanih komponenti.

[0299] Pronalazak obezbeđuje upotrebu plazmidnih vektora koji sadrže replikacijske i kontrolne sekvence koje su kompatibilne i prepoznate od strane domaćinske ćelije i operativno su povezane sa CFXTEN genom za kontrolisanu ekspresiju CFXTEN fuzionih proteina. Vektor obično nosi mesto replikacije, kao i sekvence koje kodiraju proteine koji su u stanju da obezbede fenotipsku selekciju u transformisanim ćelijama. Takve vektorske sekvence su dobro poznate po raznim bakterijama, kvascima i virusima. Korisni ekspresijski vektori koji se mogu koristiti uključuju, na primer, segmente hromozomske, nehromozomske i sintetičke DNK sekvence. "Ekspresioni vektor" odnosi se na DNK konstrukt koji sadrži DNK sekvencu koja je operativno povezana sa pogodnom kontrolnom sekvencom koja može izvršiti ekspresiju DNK koja kodira fuzioni protein u pogodnom domaćinu. Zahtevi su da su vektori ponovljivi i održivi u ćeliji domaćina po izboru. Vektorski brojevi sa malim ili velikim brojem kopija mogu se koristiti po želji.

[0300] Ostali pogodni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, derivate SV40 i pcDNA i poznate bakterijske plazmide kao što su col EI, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX kako su opisali Smith, i dr., Gene 57:31-40 (1988), pMB9 i njihovi derivati, plazmidi kao što su RP4, fagne DNK, kao što su brojni derivati faga I, kao što je NM989, kao i druga fazna DNK, kao što su M13 i jednolančana vlaknasta DNK faga; kvasni plazmidi kao što je 2 mikron plazmid ili derivati 2m plazmida, kao i centomerni i integrativni transferni vektori kvasca; vektori korisni u eukariotskim ćelijama kao što su vektori korisni u ćelijama insekata ili sisara; vektori izvedeni iz kombinacija plazmida i fage DNK, kao što su plazmidi koji su modifikovani tako da koriste fagnu DNK ili kontrolne sekvence ekspresije; i slično. Sistemi za ekspresiju kvasca koji se takođe mogu koristiti u ovom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, ne-fuzioni vektor pYES2 (Invitrogen), fuziju pYESHisA, B, C (Invitrogen), pRS vektore i slično.

[0301] Kontrolne sekvence vektora uključuju promotor za efektivnu transkripciju, opcionalni operativni niz za kontrolu takve transkripcije, sekvencu koja kodira pogodna mesta vezanja mRNK ribozome i sekvence koje kontroliraju prekid transkripcije i translacije. Promoter može biti bilo koja DNK sekvenca, koja pokazuje transkripcijsku aktivnost u ćeliji domaćinu po izboru i može se izvesti iz gena koji kodiraju proteine ili homologne ili heterologne ćeliji domaćinu.

[0302] Primeri pogodnih promotora za usmeravanje transkripcije DNK koja kodira varijantu FVIII polipeptida u ćelijama sisara su promotor SV40 (Subramani i dr., Mol. Cell. Biol.1 (1981), 854-864), MT-1 (metalotioneinski gen) promoter (Palmiter i dr., Science 222 (1983), 809-814), CMV promoter (Boshart i dr., Cell 41:521-530, 1985) ili adenovirus 2 glavni kasni promotor (Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982). Vektor takođe može da ima sekvence kao što su UCOE (sveprisutni elementi za otvaranje hromatina).

[0303] Primeri pogodnih promotora za upotrebu u ćelijama domaćinima filamentozne gljivice su, na primer, promotor ADH3 ili tpiA promotor. Primeri drugih korisnih promotora su oni koji su izvedeni iz kodiranja gena A. oryzae TAKA amilaza, Rhizomucor miehei aspartic proteinaza, A. niger neutralna α-amilaza, A. niger kiselinski stabilna α-amilaza, A. niger ili A. awamoriglucoamylase (gluA), Rhizomucor miehei lipaza, A. oryzae alkalna proteaza, A. oryzae triozna fosfatna izomeraza ili A. nidulans acetamidaza. Poželjni su TAKA-amilaza i gluA promoteri.

[0304] Promoteri pogodni za upotrebu u ekspresijskim vektorima sa prokariotskim domaćinima uključuju β-laktamazu i laktozne promotorne sisteme [Chang i dr., Nature, 275:615 (1978); Goeddel i dr., Nature, 281:544 (1979)], alkalna fosfataza, sistem promotora triptofana (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], i hibridni promotori, kao što je tac promotor [deBoer i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)], sve je operativno povezano sa DNK koji kodira CFXTEN polipeptide. Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima mogu takođe sadržati Shine-Dalgarno (S.D.) sekvencu,

21

operativno povezanu sa DNK koji kodira CFXTEN polipeptide.

[0305] Izum razmatra upotrebu drugih sistema ekspresije, uključujući, na primer, sistem ekspresije bakulovirusa sa oba ne-fuziona vektora za prenos, kao što je, ali nije ograničeno na pVL941 Summers, i dr., Virologi 84: 390-402 (1978)), pVL1393 (Invitrogen), pVL1392 (Summers i dr., Virologi 84: 390-402 (1978) i Invitrogen) i pBlueBacIII (Invitrogen), i vektori za prenos fuzije, kao što su, ali ne ograničavajući se na, pAc700 (Summers, i dr ., Virology 84:390-402 (1978)), pAc701 i pAc70-2 (isto kao pAc700, sa različitim okvirima za čitanje), pAc360 Invitrogen) i pBlueBacHisA, B, C (; Invitrogen) se može upotrebiti.

[0306] Primeri pogodnih promotora za usmeravanje transkripcije DNK koja kodira FVIII polipeptidnu varijantu u ćelijama sisara su CMV promotor (Boshart i dr., Cell 41:521-530, 1985), the SV40 promoter (Subramani i dr., Mol. Cell. Biol.1 (1981), 854-864), MT-1 (metalotioneinski gen) promoter (Palmiter i dr., Science 222 (1983), 809-814), adenovirus 2 glavni kasni promotor (Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982). Vektor takođe može da ima sekvence kao što su UCOE (sveprisutni elementi za otvaranje hromatina).

[0307] DNK sekvence koje kodiraju CFXTEN mogu se, ako je potrebno, operativno povezati sa pogodnim terminatorom, kao što je hGH terminator (Palmiter i dr., Science 222, 1983, pp.

809-814) ili TPI1 terminatori (Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen.1, 1982, pp.419-434) ili ADH3 (McKnight i dr., The EMBO J.4, 1985, pp.2093-2099). Ekspresijski vektori takođe mogu da sadrže skup mesta RNK spajanja smeštenih nizvodno od promotora i uzvodno od mesta umetanja za sam CFXTEN niz, uključujući mesta spajanja dobijena iz adenovirusa. Takođe se u ekspresijskim vektorima nalazi i signal za poliadenilaciju koji se nalazi nizvodno od mesta umetanja. Posebno poželjni signali za poliadenilaciju uključuju rani ili kasni signal poliadenilacije iz SV40 (Kaufman i Sharp, ibid.), poliadenilacioni signal iz adenovirus 5 Elb regione, hGH terminator (DeNoto i dr. Nucl. Acids Res.9:3719-3730, 1981). Ekspresijski vektori mogu takođe da sadrže nekodirajuću sekvencu virusnog vođe, kao što je tripartitni lider adenovirus 2, smešten između promotera i mesta spajanja RNK; i sekvence pojačivača, kao što je pojačivač SV40.

[0308] Za usmeravanje CFXTEN predmetnog pronalaska u sekretorni put ćelija-domaćina, u rekombinantni vektor može biti uključena sekvencija sekretornog signala (poznatih kao, vođa sekvenca, prepro sekvenca ili pre sekvenca). Sekretorna signalna sekvenca operativno je povezana sa DNK sekvencama koje kodiraju CFXTEN, obično se postavljaju 5' na DNK sekvencu koja kodira CFXTEN fuzioni protein. Sekretorna signalna sekvenca može biti ona, koja je normalno povezana sa izvornim proteinom FVIII ili može biti iz gena koji kodira neki drugi izlučeni protein. Neograničavajući primeri uključuju OmpA, PhoA i DsbA za ekspresiju E. coli, ppL-alfa, DEX4, invertni signalni peptid, signalni peptid kisele fosfataze, CPY ili INU1 za ekspresiju kvasca i IL2L, SV40, IgG kappa i IgG lambda za sisarsku ekspresiju. Signalne sekvence se obično proteolitički uklanjaju iz proteina tokom procesa translokacije i izlučivanja, stvarajući definisan N-terminusom. Postupci su obelodanjeni u Arnau, i dr., Protein Expression and Purification 48: 1-13 (2006).

[0309] Postupci koji se koriste za vezivanje DNK sekvenci koje kodiraju CFXTEN, promotor i opciono terminator i/ili sekretornu signalnu sekvencu, respektivno, i za njihovo umetanje u pogodne vektore koji sadrže informacije potrebne za replikaciju, dobro su poznati osobama veštim u umetnost (u poređenju sa, na primer, Sambrook, J. i dr., "Molekularno kloniranje: A Laboratory Manual," 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Na ovaj način, u konstrukciji se stvara himerni molekul DNK koji kodira monomeran CFXTEN fuzioni protein. Po izboru, ovaj himerni molekul DNK može se preneti ili klonirati u drugi konstrukt koji je pogodniji vektor ekspresije. U ovom trenutku, ćelija domaćina sposobna da izražava himerni molekul DNK može se transformisati himernim molekulom DNK.

[0310] Neograničavajući primeri ćelijskih linija sisara za upotrebu u ovom pronalasku su COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), BHK-21 (ATCC CCL 10)) i BHK-293 (ATCC CRL 1573; Graham i dr., J. Gen. Virol.36:59-72, 1977), BHK-570 ćelije (ATCC CRL 10314), CHO-K1 (ATCC CCL 61), CHO-S (Invitrogen 11619-012), i 293-F (Invitrogen R790-7), i roditeljske i derivatne ćelijske linije poznate u struci korisne za ekspresiju FVIII. TK-ts13 BHK ćelijska linija je takođe dostupna od ATCC pod pristupnim brojem CRL 1632. Dodatno, broj drugih ćelijskih linija može se koristiti u okviru predmetnog pronalaska, uključujući pacov hep I (Rat hepatoma štakora; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), pluće čoveka (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61) i DUKX ćelije (Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980).

[0311] Primeri pogodnih ćelija kvasca uključuju ćelije Saccharomyces spp. ili

21

Schizosaccharomyces spp., posebno sojeve Saccharomyces cerevisiae ili Saccharomyces kluyveri. Opisani su postupci za transformaciju ćelija kvasca sa heterolognom DNK i proizvodnju tamo heterolognih polipeptida, npr. u patentu SAD br. br.4,599,311, Pat. SAD br. 4,931,373, Pat. SAD br.4,870,008, 5,037,743, i Pat. SAD br.4,845,075. Transformisane ćelije su izabrane fenotipom određenim selektivnim markerom, uobičajenom otpornošću na lekove ili sposobnošću da raste u nedostatku određenog hranljivog sastojka, npr. leucin.

Poželjni vektor za upotrebu u kvascu je POT1 vektor otkriven u patentu SAD br. br.

4,931,373. DNK sekvenci koja kodira CFXTEN može da prethodi signalnom nizu i opciono vodećem nizu, npr., kao što je iznad opisano. Dalji primeri pogodnih ćelija kvasca su sojevi Kluyveromyces, kao što su K. lactis, Hansenula, npr. H. polymorpha, ili Pichia, npr. P. pastoris (u poređenju sa Gleeson i dr., J. Gen. Microbiol.132, 1986, pp.3459-3465; pat. SAD. br.4,882,279). Primeri drugih ćelija gljivica su ćelije vlaknastih gljivica, npr.

Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. ili Trichoderma spp., posebno sojeve A. oryzae, A. nidulans ili A. niger. Upotreba Aspergillus spp. za ekspresiju proteina je opisano u, npr., EP 272277, EP 238023, EP 184438 Transformacija F. oxysporum se može, na primer, izvesti kao što su opisali Malardier i dr., 1989, Gene 78: 147-156. Transformacija Trichoderma spp. može se izvesti na primer kako je opisano u EP 244234.

[0312] Ostale pogodne ćelije koje se mogu koristiti u ovom pronalasku uključuju, ali nisu ograničene na, prokariotske sojeve domaćina kao što su Escherichia coli, (npr., sojevi DH5-α), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, ili sojevi roda Pseudomonas, Streptomyces i Staphylococcus. Neograničavajući primeri pogodnih prokariota uključuju one iz rodova: Actinoplanes; Archaeoglobus; Bdellovibrio; Borrelia; Chloroflexus; Enterococcus;

Escherichia; Lactobacillus; Listeria; Oceanobacillus; Paracoccus; Pseudomonas;

Staphylococcus; Streptococcus; Streptomyces; Thermoplasma; i Vibrio.

[0313] Postupci transfekcije ćelija sisara i eksprimiranje DNK sekvencija uvedenih u ćelije opisani su npr., Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol.159 (1982), 601-621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet.1 (1982), 327-341; Loyter i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422-426; Wigler i dr., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; i Neumann i dr., EMBO J.1 (1982), 841-845.

[0314] Klonirane sekvence DNK uvode se u uzgajane ćelije sisara, na primer, transfekcijom

21

posredovanom kalcijum fosfatom (Wigler i dr., Cell 14: 725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973), transfekcija mnogim komercijalno dostupnim reagensima kao što je FuGENEG Roche Diagnostics, Mannheim, Nemačka) ili lipofektaminom (Invitrogen) ili elektroporacijom (Neumann i dr., EMBO J.1:841-845, 1982). Da bi se identifikovale i odabrale ćelije koje eksprimiraju egzogenu DNK, gen koji daje selektirani fenotip (selektabilni marker) se obično uvodi u ćelije zajedno sa genom ili cDNK od interesa. Poželjni selektivni markeri uključuju gene koji daju otpornost na lekove kao što su neomicin, higromicin, puromicin, zeocin i metotreksat. Odabir markera može biti marker koji se može odabrati. Poželjni marker koji se može odabrati je sekvencija dihidrofolat reduktaze (DHFR). Dalji primeri markera koji se mogu odabrati su dobro poznati stručnjacima i uključuju izveštače poput pojačanog zelenog fluorescentnog proteina (EGFP), beta-galaktozidaze (β-gal) ili hloramfenikol acetiltransferaze (CAT). Odabir markera pregledava Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass.). Osoba vešta u ovoj oblasti lako će moći da odabere odgovarajuće markere koji se mogu odabrati. Bilo koji poznati marker koji se može odabrati, može se upotrebiti sve dok je sposoban da se eksprimira istovremeno sa nukleinskom kiselinom koja kodira genski proizvod.

[0315] Selektivni markeri se mogu uvesti u ćeliju na odvojenom plazmidu istovremeno sa genom koji vas zanima, ili se mogu uvesti na istom plazmidu. Ako na istom plazmidu, marker koji se može izabrati i gen koji vas zanima mogu biti pod kontrolom različitih promotora ili istog promotora, poslednji aranžman stvara diistroničnu poruku. Konstrukcije ovog tipa su poznate u struci (na primer, Levinson and Simonsen Pat. SAD br.4,713,339). Takođe može biti korisno dodati dodatnu DNK, poznatu kao "nosač DNK", u smešu koja se unosi u ćelije.

[0316] Nakon što ćelije preuzmu DNK, uzgajaju se u odgovarajućem mediju za rast, obično 1-2 dana, da bi započele ekspresiju gena koji ih zanima. Kako se ovde koristi, termin "odgovarajuća podloga za rast" označava podlogu koja sadrži hranljive materije i druge komponente potrebne za rast ćelija i ekspresiju CFXTEN od interesa. Kako se ovde koristi, termin "odgovarajući medijum za rast" označava podlogu koja sadrži hranljive materije i druge komponente potrebne za rast ćelija i ekspresiju CFXTEN od interesa. Za proizvodnju gama-karboksiliranih proteina, medijum će sadržavati vitamin K, poželjno u koncentraciji od oko 0.1 µg/ml do oko 5 µg/ml. Zatim se primenjuje izbor lekova za izbor rasta ćelija koje na

21

stabilan način izražavaju selektirajući marker. Za ćelije koje su transficirane amplifikovanim selektivnim markerom koncentracija leka može se povećati da bi se izabrao za povećani broj primeraka kloniranih sekvenci, povećavajući tako nivo ekspresije. Klonovi stabilno transficiranih ćelija su zatim pretraženi na ekspresiju FVIII polipeptidne varijante koja nas zanima.

[0317] Transformisana ili transficirana ćelija domaćina se zatim uzgaja u pogodnoj hranljivoj podlozi pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju CFXTEN polipeptida nakon čega se rezultirajući peptid može obnoviti iz kulture kao izolovani fuzioni protein. Medijum koji se koristi za uzgoj ćelija može biti bilo koji konvencionalni medijum pogodan za uzgoj ćelija domaćina, kao što su jednostavne ili složene podloge koji sadrže odgovarajuće dodatke. Prikladne podloge su dostupne od komercijalnih dobavljača ili se mogu pripremiti prema objavljenim receptima (npr., u katalozima američke kolekcije kultura tipova). Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju i biće očigledno uobičajenom stručnjaku.

[0318] Ekspresija gena se može direktno meriti u uzorku, na primer, konvencionalnim južnim blotovanjem, severnim blotovanjem kako bi se kvantifikovala transkripcija mRNK [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], brisanje tačkama (DNK analiza) ili in situ hibridizacija, korišćenjem odgovarajuće obeležene sonde, zasnovane na ovde navedenim sekvencama. Alternativno, mogu se koristiti antitela koja mogu prepoznati specifične duplekse, uključujući DNK duplekse, RNK duplekse i DNK-RNK hibridne duplekse ili duplekse DNK proteina. Antitela zauzvrat mogu biti obeležena i ispitivanje se može obaviti tamo gde je dupleks vezan za površinu, tako da se formiranjem dupleksa na površini može otkriti prisustvo antitela vezanog za dupleks.

[0319] Ekspresija gena, alternativno, može da se meri imunološkim fluorescentnim metodama, kao što su imunohistohemijsko bojenje ćelija ili preseka tkiva i ispitivanjem ćelijske kulture ili telesnih tečnosti ili detekcijom selektivnih markera, da bi direktno kvantizovali ekspresiju genskog proizvoda. Antitela koja su korisna za imunohistohemijsko bojenje i/ili ispitivanje uzorka tečnosti mogu biti monoklonska ili poliklonska, i mogu se pripremiti kod bilo kojeg sisara. Pogodno, antitela se mogu pripremiti protiv nativne sekvence FVIII polipeptida ili protiv sintetičkog peptida zasnovanog na ovde navedenom DNK sekvenci ili protiv egzogene sekvence spojene u FVIII i koja kodira specifični epitop

21

antitela. Dalji primeri markera koji se mogu odabrati su dobro poznati stručnjacima i uključuju izveštače poput pojačanog zelenog fluorescentnog proteina (EGFP), betagalaktozidaze (β-gal) ili hloramfenikol acetiltransferaze (CAT).

[0320] Eksprimirani CFXTEN polipeptidni proizvodi mogu se prečistiti postupcima poznatim u struci ili ovde opisanim postupcima. Mogu se koristiti postupci kao što su filtracija gela, prečišćavanje afiniteta (npr. korišćenje kolona antitela FVIII), frakcionacija soli, hromatografija za izmenu jona, hromatografija za isključivanje veličine, adsorpciona hromatografija hidroksiapatita, hidrofobna interakciona hromatografija i gel elektroforeza; od kojih je svaki prilagođen za oporavak i prečišćavanje fuzionih proteina proizvedenih od odgovarajućih ćelija domaćina. Dodatno prečišćavanje može se postići uobičajenim sredstvima za hemijsko prečišćavanje, kao što je tečna hromatografija visokih performansi. Neki ispoljeni CFXTEN mogu zahtevati ponovno savijanje tokom izolacije i prečišćavanja. Postupci prečišćavanja su opisani u Robert K. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Charles R. Castor (ed.), Springer-Verlag 1994, i Sambrook, i dr., supra. Takođe su opisana i odvajanja u više koraka za prečišćavanje Baron, i dr., Crit. Rev. Biotechnol.10:179-90 (1990) i Below, i dr., J. Chromatogr. A.679:67-83 (1994). U terapeutske svrhe je poželjno da CFXTEN fuzioni proteini predmetnog pronalaska su suštinski čisti. Prema tome, u poželjnom ostvarenju pronalaska CFXTEN iz predmetnog pronalaska se prečišćava do najmanje oko 90 do 95% homogenosti, poželjno do najmanje oko 98% homogenosti. Čistoća se može oceniti npr., gel elektroforezom, HPLC i aminokiselinskim sekvenciranjem aminokiselina.

VIII). FARMACEUTSKI SASTAVI

[0321] Predmetni pronalazak pruža farmaceutske sastave koji sadrže CFXTEN. U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav sadrži CFXTEN fuzioni protein ovde otkriven pomešan sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem. CFXTEN polipeptidi predmetnog pronalaska mogu se formulisati prema poznatim postupcima za dobijanje farmaceutski korisnih sastava, pri čemu se polipeptid kombinuje u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, kao što su vodeni rastvori, puferi, rastvarači i/ili farmaceutski prihvatljive suspenzije, emulzije, stabilizatori ili pomoćni ekscipijensi. Primeri nevodenih rastvarača uključuju propil etilen glikol, polietilen glikol i biljna ulja. Formulacije farmaceutskih sastava se pripremaju za čuvanje mešanjem aktivnog sastojka CFXTEN koji ima željeni stepen čistoće sa opcionalnim fiziološki prihvatljivim nosačima, pomoćnim tvarima (npr., natrijum hloridom, kalcijumovom soli, saharozom ili polisorbatom) ili stabilizatorima (npr.,

21

Saharozom, trehaloza, rafinoza, arginin, kalcijumova so, glicin ili histidin), kako je opisano u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora.

[0322] Farmaceutski sastav može biti isporučen kao liofilizovani prah koji se rekonstituiše pre davanja. U drugom otelotvorenju, farmaceutski sastav može da se daje u tečnom obliku u bočici, čiji se sadržaj može primeniti direktno pacijentu. Alternativno, sastav se daje kao tečnost u napunjenoj špricu za davanje sastava. U drugom otelotvorenju, sastav se isporučuje kao tečnost u napunjenoj bočici koja se može ugraditi u pumpu.

[0323] Farmaceutski sastavi mogu se primeniti bilo kojim pogodnim načinom ili putem, uključujući potkožno, subkutano infuzionom pumpom, intramuskularno i intravenski. Biće poznato da će poželjni put varirati u zavisnosti od bolesti i starosti primaoca i težine stanja koje se leči.

[0324] U jednom otelotvorenju, farmaceutski sastav CFXTEN u tečnom obliku ili posle rekonstitucije (kada se daje u obliku liofilizovanog praha) sadrži faktor koagulacije VIII sa aktivnošću od najmanje 50 IU/ml, ili najmanje 100 IU/ml, ili najmanje 200 IU/ml, ili najmanje 300 IU/ml, ili najmanje 400 IU/ml, ili aktivnost od najmanje 500 IU/ml, ili aktivnost od najmanje 600 IU/ml, koji sastav može povećati aktivnost faktora VIII na najmanje 1.5% od normalnog nivoa u plazmi u krvi najmanje oko 12 sati, ili najmanje oko 24 sata, ili najmanje oko 48 sati, ili najmanje oko 72 sata, ili najmanje oko 96 sati, ili u najmanje oko 120 sati nakon davanja farmaceutskog sastava faktora VIII ispitaniku kome je potrebna rutinska profilaksa. U drugom otelotvorenju, farmaceutski sastav CFXTEN u tečnom obliku ili posle rekonstitucije (kada se daje u obliku liofilizovanog praha) sadrži faktor koagulacije VIII sa aktivnošću od najmanje 50 IU/ml, ili najmanje 100 IU/ml, ili najmanje 200 IU/ml, ili najmanje 300 IU/ml, ili najmanje 400 IU/ml, od najmanje 500 IU/ml, ili aktivnost od najmanje 600 IU/ml, koji sastav može povećati aktivnost faktora VIII na najmanje 2.5% od normalnog nivoa u plazmi u krvi najmanje oko 12 sati, ili najmanje oko 24 sata, ili najmanje oko 48 sati, ili najmanje oko 72 sata, ili najmanje oko 96 sati, ili u najmanje oko 120 sati nakon davanja ispitaniku kome je potrebna rutinska profilaksa. Specifično se predviđa da farmaceutski sastavi iz prethodnog mogu biti formulisani tako da uključuju jedan ili više ekscipijenata, pufera ili drugih sastojaka poznatih u struci, koji su kompatibilni sa davanjem intravenskim putem ili potkožnim ili intramuskularnim putem. Prema tome, u

22

otelotvorenjima opisanim iznad u ovom paragrafu, farmaceutski sastav se daje subkutano, intramuskularno ili intravenski.

[0325] Sastavi predmetnog pronalaska mogu se formulisati koristeći razne pomoćne sastojke. Pogodni pomoćni sastojci uključuju mikrokristalnu celulozu (npr. Avicel PH102, Avicel PH101), polimetakrilat, poli (etil-akrilat, metilmetakilat, trimetilamonijetiometakrilat hlorid) (kao što je Eudragit RS-30D), hidroksipropil metilceluloza (Methocel K100M, Premium CR Methocel K100M, Methocel E5, Opadry®), magnezijum stearat, talk, trietil citrat, vodena disperzija etilceluloze (Surelease®) i protamin sulfat. Sredstvo za sporo oslobađanje može takođe da sadrži nosač, koji može da sadrži, na primer, rastvarače, disperzione podloge, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonične i sredstva za odlaganje apsorpcije. Farmaceutski prihvatljive soli mogu se takođe koristiti u ovim agensima sa sporim oslobađanjem, na primer, mineralnim solima kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati ili sulfati, kao i soli organskih kiselina kao što su acetati, propionati, malonati, ili benzoati. Sastav takođe može da sadrži tečnosti, kao što su voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol, kao i supstance poput ovlaživača, emulgatora ili pH puferirajućih sredstava. Lipozomi se takođe mogu koristiti kao nosači.

[0326] U drugom otelotvorenju, sastavi predmetnog pronalaska su kapsulirane u lipozome, koji su pokazali korisnost u davanju korisnih aktivnih sredstava na kontrolisan način tokom dužeg vremenskog perioda. Lipozomi su zatvorene dvoslojne membrane koje sadrže uvučenu vodenu zapreminu. Lipozomi mogu takođe biti jednoslojni vezikuli koji poseduju jednostruki membranski dvoslojni ili višeslojni vezikuli sa više membranskih slojeva, svaki odvojen od sledećeg vodenim slojem. Struktura rezultirajućeg membranskog dvosloja je takva da su hidrofobni (nepolarni) repovi lipida orijentisani prema sredini dvosloja, dok se hidrofilne (polarne) glave usmere prema vodenoj fazi. U jednom otelotvorenju, lipozom može biti presvučen fleksibilnim polimerom rastvorljivim u vodi koji izbegava unošenje u mononuklearni sistem fagocita od strane organa, pre svega jetre i slezine. Pogodni hidrofilni polimeri za okružuje lipozoma uključuju, bez ograničenja, PEG, polivinilpirolidon, polivinilmetileter, polimetilokazolin, polietilokazolin, polihidroksipropilokazolin, polihidroksipropilmetakrilamid, polimetakrilamid, polidimetilakrilamid, polihidroksipropilmetakrilat, polihidroketilakrilat, hidroksimetilceluloza hidroksietilceluloza, polietilenglikol, poliaspartamida i hidrofilne peptidne sekvence kao što je opisano u patentu SAD. br.6,316,024; 6,126,966; 6,056,973; 6.043.094. Dodatne lipozomske tehnologije opisane su u patentu SAD br. br.6,759,057; 6,406,713; 6,352,716; 6,316,024; 6,294,191; 6,126,966; 6,056,973; 6,043,094; 5,965,156; 5,916,588; 5,874,104; 5,215,680; i 4.684.479. Opisani su lipozomi i mikromehuri obloženi lipidima, kao i postupke za njihovu proizvodnju. Stoga, stručnjak u oblasti, uzimajući u obzir i obelodanjivanje prema pronalaska i obelodanjivanja ovih drugih patenata, može proizvesti lipozom za produženo oslobađanje polipeptida predmetnog pronalaska.

[0327] Za tečne formulacije, poželjno svojstvo je da se formulacija daje u obliku koji može proći kroz igle veličine 25, 28, 30, 31, 32 za intravensku, intramuskularnu, intraartikularnu ili subkutanu primenu.

[0328] Pumpe za štrcaljke mogu se takođe koristiti kao sredstva za sporo oslobađanje. Takva sredstva su opisana u patentu SAD br. br.4,976,696; 4,933,185; 5,017,378; 6,309,370;

6,254,573; 4,435,173; 4,398,908; 6,572,585; 5,298,022; 5,176,502; 5,492,534; 5,318,540; i 4.988.337. Stručnjak u ovoj oblasti, imajući u vidu i obelodanjivanje prema pronalaska i obelodanjivanja ovih drugih patenata, može proizvesti pumpu za špriceve za produženo oslobađanje sastava ovog pronalaska.

IX). FARMACEUTSKI KOMPLETI

[0329] U drugom slučaju, obelodanjivanje pruža komplet koji olakšava upotrebu CFXTEN polipeptida. Komplet sadrži ovde farmaceutski sastav, ambalažu i etiketu ili umetak za pakovanje na ili koji je povezan sa ambalažom. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve itd., načinjene od raznih materijala, kao što su staklo ili plastika.

Kontejner sadrži farmaceutski sastav kao formulaciju koja je efikasna za lečenje stanja vezanog za FVIII i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti vrećica za intravenski rastvor ili bočica sa čepom koji se može probiti hipodermičkom injekcijskom iglom). Paketni umetak može navesti odobrene indikacije za lek, uputstva za rekonstituciju i/ili primenu leka za upotrebu za odobrenu indikaciju, odgovarajuće informacije o doziranju i bezbednosti i informacije koje identifikuju seriju i rok trajanja leka. U drugom primeru iznad navedenog, kit može da sadrži drugi kontejner koji može da sadrži pogodan razblaživač za farmaceutski sastav, čija upotreba će obezbediti korisniku odgovarajuću koncentraciju koja će se isporučiti ispitaniku.

PRIMERI

Primer 1: Konstruisanje motiva XTEN_AD36 segmenata

[0330] Sledeći primer opisuje izgradnju kolekcije gena optimizovanih kodonom koji kodiraju motivske sekvence 36 aminokiselina. Kao prvi korak, vektor za punjenje pCW0359 je konstruisan na osnovu pET vektora i koji uključuje T7 promotor. pCW0359 kodira domen za vezivanje celuloze (CBD) i mesto za prepoznavanje TEV proteaze, praćen sekvencom pušača koja je sa strane BsaI, BbsI i KpnI. Veb lokacije BsaI i BbsI su umetnute tako da stvaraju kompatibilne pregrade posle varenja. Posle sekvenci za prebacivanje sledi skraćena verzija gena GFP i His oznaka. Sekvenca punila sadrži stop kodone i tako ćelije E. coli koje nose plazmid punila pCW0359 formiraju nefluorescentne kolonije. Vektor punioca pCW0359 je digestiran sa BsaI i KpnI da bi se uklonio segment punila, a rezultirajući fragment vektora je izolovan prečišćavanjem agaroznog gela. Sekvence su označene sa XTEN_AD36, koje odražavaju porodicu AD motiva. Njeni segmenti imaju sekvencu aminokiselina [X]3gde je X 12mer peptid sa sekvencama: GESPGGSSGSES (SEQ ID NO:19), GSEGSSGPGESS (SEQ ID NO:20), GSSESGSSEGGP (SEQ ID NO:21), ili GSGGEPSESGSS (SEQ ID NO:22). Umetak je dobijen prekaljivanjem sledećih parova fosforilisanih sintetičkih oligonukleotidnih parova:

AD1for: AGGTGAATCTCCDGGTGGYTCYAGCGGTTCYGARTC (SEQ ID NO:1619)

AD1rev: ACCTGAYTCRGAACCGCTRGARCCACCHGGAGATTC (SEQ ID NO:1620)

AD2for: AGGTAGCGAAGGTTCTTCYGGTCCDGGYGARTCYTC (SEQ ID NO:1621)

AD2rev: ACCTGARGAYTCRCCHGGACCRGAAGAACCTTCGCT (SEQ ID NO:1622)

AD3for: AGGTTCYTCYGAAAGCGGTTCTTCYGARGGYGGTCC (SEQ ID NO:1623)

AD3rev: ACCTGGACCRCCYTCRGAAGAACCGCTTTCRGARGA (SEQ ID NO:1624)

AD4for: AGGTTCYGGTGGYGAACCDTCYGARTCTGGTAGCTC (SEQ ID NO:1625)

[0331] Takođe smo prekalili fosforilisani oligonukleotid 3KpnIstopperFor:

AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC (SEQ ID NO:1626) i nefosforilisani oligonukleotid pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA (SEQ ID NO:1627). Otpali oligonukleotidni parovi su lizirani, što je rezultiralo mešavinom proizvoda različite dužine koja predstavlja različiti broj od 12mer ponavljanja vezanih na jedan BbsI/KpnI segment.

22

Proizvodi koji odgovaraju dužini od 36 aminokiselina izolovani su iz smeše preparativnom agaroznom gel elektroforezom i lizirani u BsaI/KpnI prebačeni vektor pCW0359. Većina klonova u rezultirajućoj biblioteci označenoj LCW0401 pokazala je zelenu fluorescenciju nakon indukcije, što pokazuje da je sekvenca XTEN_AD36 bila lizirana u okviru gena GFP i da je većina sekvenci XTEN_AD36 imala dobre nivoe ekspresije.

[0332] Pregledali smo 96 izolata iz biblioteke LCW0401 na visok nivo fluorescencije tako što smo ih utisnuli na agar pločicu koja sadrži IPTG. Isti izolati su procenjeni pomoću PCR i identifikovano je 48 izolata koji sadrže segmente sa 36 aminokiselina kao i jaku fluorescenciju. Ovi izolati su sekvencionirani i identifikovano je 39 klonova koji sadrže ispravne XTEN_AD36 segmente. Nazivi datoteka nukleotidnih i aminokiselinskih konstrukcija i sekvence za ove segmente su navedeni u Tabeli 13.

Tabela 13: DNK i aminokiselinske sekvence za AD 36-mer motive (SEQ ID NOS 203-278, respektivno, po redosledu pojavljivanja)

22

22

22

Primer 2: Konstruisanje XTEN_AE36 segmenata

[0333] Konstruisana je biblioteka kodona koja kodira XTEN sekvence dužine 36 aminokiselina. XTEN sekvenca je označena kao XTEN_AE36. Njeni segmenti imaju

22

sekvencu aminokiselina [X]3gde je X 12mer peptid sa sekvencama: GSPAGSPTSTEE (SEQ ID NO:23), GSEPATSGSETP (SEQ ID NO:24), GTSESATPESGP (SEQ ID NO:25), ili GTSTEPSEGSAP (SEQ ID NO:26). Umetak je dobijen prekaljivanjem sledećih parova fosforilisanih sintetičkih oligonukleotidnih parova:

AE1for: AGGTAGCCCDGCWGGYTCTCCDACYTCYACYGARGA (SEQ ID NO:1628)

AE1rev: ACCTTCYTCRGTRGARGTHGGAGARCCWGCHGGGCT (SEQ ID NO:1629)

AE2for: AGGTAGCGAACCKGCWACYTCYGGYTCTGARACYCC (SEQ ID NO:1630)

AE2rev: ACCTGGRGTYTCAGARCCRGARGTWGCMGGTTCGCT (SEQ ID NO:1631)

AE3for: AGGTACYTCTGAAAGCGCWACYCCKGARTCYGGYCC (SEQ ID NO:1632)

AE3rev: ACCTGGRCCRGAYTCMGGRGTWGCGCTTTCAGARGT (SEQ ID NO:1633)

AE4for: AGGTACYTCTACYGAACCKTCYGARGGYAGCGCWCC (SEQ ID NO:1634)

AE4rev: ACCTGGWGCGCTRCCYTCRGAMGGTTCRGTAGARGT (SEQ ID NO:1635)

[0334] Takođe smo prekalili fosforilisani oligonukleotid 3KpnIstopperFor:

AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC (SEQ ID NO:1626) i nefosforilisani oligonukleotid pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA (SEQ ID NO:1627). Otpali oligonukleotidni parovi su lizirani, što je rezultiralo mešavinom proizvoda različite dužine koja predstavlja različiti broj od 12mer ponavljanja vezanih na jedan BbsI/KpnI segment. Proizvodi koji odgovaraju dužini od 36 aminokiselina izolovani su iz smeše preparativnom agaroznom gel elektroforezom i lizirani u BsaI/KpnI prebačeni vektor pCW0359. Većina klonova u rezultirajućoj biblioteci označenoj LCW0402 pokazala je zelenu fluorescenciju nakon indukcije, što pokazuje da je sekvenca XTEN_AE36 bila lizirana u okviru gena GFP i da je većina sekvenci XTEN_AE36 pokazala da ima dobru ekspresiju.

[0335] Pregledali smo 96 izolata iz biblioteke LCW0402 na visok nivo fluorescencije tako što smo ih utisnuli na agar pločicu koja sadrži IPTG. Isti izolati su procenjeni pomoću PCR i identifikovano je 48 izolata koji sadrže segmente sa 36 aminokiselina kao i jaku

22

fluorescenciju. Ovi izolati su sekvencionirani i identifikovano je 37 klonova koji sadrže ispravne XTEN_AE36 segmente. Nazivi datoteka nukleotidnih i aminokiselinskih konstrukcija i sekvence za ove segmente su navedeni u Tabeli 14.

Tabela 14: DNK i aminokiselinske sekvence za AE 36-mer motive (SEQ ID NOS 279-352, respektivno, po redosledu pojavljivanja)

2

21

22

2

Primer 3: Konstruisanje XTEN_AF36 segmenata

[0336] Konstruisana je biblioteka kodona koja kodira sekvence dužine 36 aminokiselina. Sekvence su dizajnirane XTEN_AF36. Njeni segmenti imaju sekvencu aminokiselina [X]3gde je X 12mer peptid sa sekvencama: GSTSESPSGTAP (SEQ ID NO:27), GTSTPESGSASP (SEQ ID NO:28), GTSPSGESSTAP (SEQ ID NO:29) ili GSTSSTAESPGP (SEQ ID NO:30). Umetak je dobijen prekaljivanjem sledećih parova fosforilisanih sintetičkih oligonukleotidnih parova:

AF1for: AGGTTCTACYAGCGAATCYCCKTCTGGYACYGCWCC (SEQ ID NO:1636)

AF1rev: ACCTGGWGCRGTRCCAGAMGGRGATTCGCTRGTAGA (SEQ ID NO:1637)

AF2for: AGGTACYTCTACYCCKGAAAGCGGYTCYGCWTCTCC (SEQ ID NO:1638)

2 4

AF2rev: ACCTGGAGAWGCRGARCCGCTTTCMGGRGTAGARGT (SEQ ID NO:1639)

AF3for: AGGTACYTCYCCKAGCGGYGAATCTTCTACYGCWCC (SEQ ID NO:1640)

AF3rev: ACCTGGWGCRGTAGAAGATTCRCCGCTMGGRGARGT (SEQ ID NO:1641)

AF4for: AGGTTCYACYAGCTCTACYGCWGAATCTCCKGGYCC (SEQ ID NO:1642)

AF4rev: ACCTGGRCCMGGAGATTCWGCRGTAGAGCTRGTRGA (SEQ ID NO:1643)

[0337] Takođe smo prekalili fosforilisani oligonukleotid 3KpnIstopperFor:

AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC (SEQ ID NO:1626) i nefosforilisani oligonukleotid pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA (SEQ ID NO:1627). Spaljeni oligonukleotidni parovi su lizirani, što je rezultiralo mešavinom proizvoda različite dužine koja predstavlja promenljivi broj od 12mer ponavljanja vezanih u jedan BbsI/KpnI segment. Proizvodi koji odgovaraju dužini od 36 aminokiselina su izolovani iz smeše preparativnom agarozom gel elektroforeza i veže se u BsaI/KpnI prebačen vektor pCW0359. Većina klonova u rezultirajućoj biblioteci označenoj LCW0403 pokazala je zelenu fluorescenciju nakon indukcije, što pokazuje da je sekvenca XTEN_AF36 bila lizirana u okviru gena GFP i da je većina sekvenci XTEN_AF36 pokazala da ima dobru ekspresiju.

[0338] Pregledali smo 96 izolata iz biblioteke LCW0403 na visok nivo fluorescencije tako što smo ih utisnuli na agar pločicu koja sadrži IPTG. Isti izolati su procenjeni pomoću PCR i identifikovano je 48 izolata koji sadrže segmente sa 36 aminokiselina kao i jaku fluorescenciju. Ovi izolati su sekvencionirani i identifikovano je 44 klonova koji sadrže ispravne XTEN_AF36 segmente. Nazivi datoteka nukleotidnih i aminokiselinskih konstrukcija i sekvence za ove segmente su navedeni u Tabeli 15.

Tabela 15: DNK i aminokiselinske sekvence za AF 36-mer motive (SEQ ID NOS 353-440, respektivno, po redosledu pojavljivanja)

2

2

2

2

2

24

Primer 4: Konstruisanje XTEN_AG36 segmenata

[0339] Konstruisana je biblioteka kodona koja kodira sekvence dužine 36 aminokiselina. Sekvence su dizajnirane XTEN_AG36. Njeni segmenti imaju sekvencu aminokiselina [X]3gde je X 12mer peptid sa sekvencama: GTPGSGTASSSP (SEQ ID NO:31), GSSTPSGATGSP (SEQ ID NO:32), GSSPSASTGTGP (SEQ ID NO:33) ili GASPGTSSTGSP (SEQ ID NO:34). Umetak je dobijen prekaljivanjem sledećih parova fosforilisanih sintetičkih oligonukleotidnih parova:

AG1for: AGGTACYCCKGGYAGCGGTACYGCWTCTTCYTCTCC (SEQ ID NO:1644)

AG1rev: ACCTGGAGARGAAGAWGCRGTACCGCTRCCMGGRGT (SEQ ID NO:1645)

AG2for: AGGTAGCTCTACYCCKTCTGGTGCWACYGGYTCYCC (SEQ ID NO:1646)

AG2rev: ACCTGGRGARCCRGTWGCACCAGAMGGRGTAGAGCT (SEQ ID NO:1647)

AG3for: AGGTTCTAGCCCKTCTGCWTCYACYGGTACYGGYCC (SEQ ID NO:1648)

AG3rev: ACCTGGRCCRGTACCRGTRGAWGCAGAMGGGCTAGA (SEQ ID NO:1649)

AG4for: AGGTGCWTCYCCKGGYACYAGCTCTACYGGTTCTCC (SEQ ID NO:1650)

AG4rev: ACCTGGAGAACCRGTAGAGCTRGTRCCMGGRGAWGC (SEQ ID NO:1651)

[0340] Takođe smo prekalili fosforilisani oligonukleotid 3KpnIstopperFor:

AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC (SEQ ID NO:1626) i nefosforilirani oligonukleotid pr_3KpnIstopperRev: CCTCGAGTGAAGACGA (SEQ ID NO:1627). Otpali oligonukleotidni parovi su lizirani, što je rezultiralo mešavinom proizvoda različite dužine koja predstavlja različiti broj od 12mer ponavljanja vezanih na jedan BbsI/KpnI segment. Proizvodi koji odgovaraju dužini od 36 aminokiselina izolovani su iz smeše preparativnom agaroznom gel elektroforezom i lizirani u BsaI/KpnI prebačeni vektor pCW0359. Većina klonova u rezultirajućoj biblioteci označenoj LCW0404 pokazala je zelenu fluorescenciju nakon indukcije, što pokazuje da je sekvenca XTEN_AG36 bila lizirana u okviru gena GFP i da je većina sekvenci XTEN_AG36 pokazala da ima dobru ekspresiju.

[0341] Pregledali smo 96 izolata iz biblioteke LCW0404 na visok nivo fluorescencije tako što smo ih utisnuli na agar pločicu koja sadrži IPTG. Isti izolati su procenjeni pomoću PCR i identifikovano je 48 izolata koji sadrže segmente sa 36 aminokiselina kao i jaku fluorescenciju. Ovi izolati su sekvencionirani i identifikovano je 44 klonova koji sadrže ispravne XTEN_AG36 segmente. Nazivi datoteka nukleotidnih i aminokiselinskih konstrukcija i sekvence za ove segmente su navedeni u Tabeli 16.

Tabela 16: DNK i aminokiselinske sekvence za AG 36-mer motive (SEQ ID NOS 441-528, respektivno, po redosledu pojavljivanja)

24

24

24

Primer 5: Konstruisanje XTEN_AE864

[0342] XTEN AE864 je konstruisan od serijske dimerizacije XTEN_AE36 do AE72, 144, 288, 576 i 864. Kolekcija XTEN_AE72 segmenata izgrađena je iz 37 različitih segmenata XTEN_AE36. Kulture E. coli koje sadrže svih 37 različitih segmenata 36-aminokiselina su pomešane i izolovan je plazmid. Ovaj bazen plazmida je digestiran sa BsaI/NcoI da bi se stvorio mali fragment kao uložak. Isti bazen plazmida je digestiran sa BbsI/NcoI da bi se stvorio veliki fragment kao vektor. Fragmenti inserta i vektora su lizirani što je rezultiralo udvostručenjem dužine i vezivna smeša je transformisana u ćelije BL21Gold (DE3) da bi se dobile kolonije XTEN_AE72.

[0343] Ova biblioteka od XTEN_AE72 segmenata označena je kao LCW0406. Svi klonovi iz LCW0406 su kombinovani i ponovo dimerizovani koristeći isti postupak kao što je opisano

24

iznad dajući biblioteku LCW0410 XTEN_AE144. Svi klonovi iz LCW0410 su kombinovani i ponovo dimerizovani koristeći isti postupak kao što je opisano iznad dajući biblioteku LCW0414 XTEN_AE288. Svi klonovi iz LCW0410 su kombinovani i ponovo dimerizovani koristeći isti postupak kao što je opisano iznad dajući biblioteku LCW0414 XTEN_AE288. Svi klonovi iz LCW0414 su kombinovani i ponovo dimerizovani koristeći isti postupak kao što je opisano iznad dajući biblioteku LCW0418 XTEN_AE576. Pregledali smo 96 izolata iz biblioteke LCW0418 na visok nivo fluorescencije GFP.8 izolata ispravnih veličina umetka pomoću PCR i jake fluorescencije su sekvencionirani, a 2 izolata (LCW0418.018 i LCW0418.052) su izabrana za buduću upotrebu na osnovu podataka o sekvencionisanju i ekspresiji.

[0344] Specifični klon pCW0432 od XTEN_AE864 je konstruisan kombinovanjem LCW0418.018 od XTEN_AE576 i LCW0414.002 od XTEN_AE288 koristeći isti postupak dimerizacije kao što je iznad opisano.

Primer 6: Konstruisanje XTEN_AM144

[0345] Kolekcija XTEN_AM144 segmenata izgrađena je počevši od 37 različitih segmenata XTEN_AE36, 44 segmenta XTEN_AF36 i 44 segmenta XTEN_AG36.

[0346] Kulture E. coli koje sadrže svih 125 različitih segmenata 36-aminokiselina su pomešane i izolovan je plazmid. Ovaj bazen plazmida je digestiran sa BsaI/NcoI da bi se stvorio mali fragment kao uložak. Isti bazen plazmida je digestiran sa BbsI/NcoI da bi se stvorio veliki fragment kao vektor. Fragmenti inserta i vektora su lizirani što je rezultiralo udvostručenjem dužine i vezivna smeša je transformisana u ćelije BL21Gold (DE3) da bi se dobile kolonije XTEN_AM72.

[0347] Ova biblioteka od XTEN_AM72 segmenata označena je kao LCW0461. Svi klonovi iz LCW0461 su kombinovani i ponovo dimerizovani koristeći isti postupak kao što je opisano iznad dajući biblioteku LCW0462. Prikazani su 1512 izolata iz biblioteke LCW0462 na ekspresiju proteina. Pojedinačne kolonije prebačene su u pločice sa 96 udubljenja i uzgajane preko noći kao starter kulture. Ove početne kulture su razblažene u svežoj podlozi za autoindukciju i kultivisane 20-30h. Ekspresija je merena korišćenjem čitača fluorescentnih ploča sa ekscitacijom na 395 nm i emisijom pri 510 nm.192 izolata su pokazali ekspresiju visokog nivoa i podneseni su na sekvenciranje DNK. Većina klonova u biblioteci LCW0462 pokazala je dobru ekspresiju i slična fizičko-hemijska svojstva što sugeriše da većina

24

kombinacija XTEN_AM36 segmenata daje korisne XTEN sekvence. Trideset izolata iz LCW0462 je izabrano kao preferirana kolekcija XTEN_AM144 segmenata za izgradnju multifunkcionalnih proteina koji sadrže više XTEN segmenata. Nazivi datoteka nukleotidnih i aminokiselinskih konstrukcija i sekvence za ove segmente su navedeni u Tabeli 17.

Tabela 17: Sekvence DNK i aminokiselina za AM144 segmente (SEQ ID NOS 529-594, po redosledu pojavljivanja)

24

2

21

22

2

24

2

2

Primer 7: Konstruisanje XTEN_AM288

[0348] Čitava biblioteka LCW0462 je dimerizovana kao što je opisano u Primeru 6, što je rezultiralo u biblioteci XTEN_AM288 klonova označenih LCW0463. Pregledano je 1512 izolata iz biblioteke LCW0463 koristeći protokol opisan u Primeru 6. Sekvencionirano je 176 visoko ekspresivnih klonova i odabrano je 40 poželjnih XTEN_AM288 segmenata za izgradnju multifunkcionalnih proteina koji sadrže više XTEN segmenata sa 288 aminokiselinskih ostataka.

Primer 8: Konstruisanje XTEN_AM432

[0349] Generisali smo biblioteku XTEN_AM432 segmenata rekombinovanjem segmenata iz biblioteke LCW0462 od XTEN_AM144 segmenata i segmenata iz biblioteke LCW0463 od XTEN_AM288 segmenata. Ova nova biblioteka od XTEN_AM432 segmenta označena je kao LCW0464. Plazmidi su izolovani iz kultura E. Coli koja sadrži LCW0462 i LCW0463, respektivno. Pregledano je 1512 izolata iz biblioteke LCW0464 koristeći protokol opisan u Primeru 6. Sekvencirano je 176 visoko ekspresivnih klonova, a 39 poželjnih XTEN_AM432 segmenata je izabrano za izgradnju dužih XTEN i za izgradnju multifunkcionalnih proteina koji sadrže više XTEN segmenata sa 432 aminokiselinskih ostataka.

[0350] Paralelno smo konstruisali biblioteku LMS0100 od XTEN_AM432 segmenata

2

koristeći preferirane segmente XTEN_AM144 i XTEN_AM288. Pregledom ove biblioteke dobijeno je 4 izolata koji su odabrani za dalju izgradnju

Primer 9: Konstruisanje XTEN_AM875

[0351] Vektor punioca pCW0359 je digestiran sa BsaI i KpnI da bi se uklonio segment punila, a rezultirajući fragment vektora je izolovan prečišćavanjem agaroznog gela.

[0352] Prekalili smo fosforilisani oligonukleotid BsaI-AscI-KpnIforP:

AGGTGCAAGCGCAAGCGGCGCGCCAAGCACGGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGG TAC (SEQ ID NO:1652) i nefosforilisani oligonukleotid BsaI-AscI-KpnIrev:

CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCCGTGCTTGGCGCGCCGCTTGCGCTTGC (SEQ ID NO:1653) za uvođenje sekvencijalnog ostrva A (SI-A) koji kodira aminokiseline GASASGAPSTG (SEQ ID NO:1654) i ima u sebi restrikcijski enzim AscI prepoznavanje nukleotidne sekvence GGCGCGCC. Otpali oligonukleotidni parovi su lizirani BsaI i KpnI digestiranim puferskim vektorom pCW0359, pripremljenim gore da bi se dobio pCW0466 koji sadrži SI-A. Zatim smo generisali biblioteku XTEN_AM443 segmenata rekombinovanjem 43 poželjna XTEN_AM432 segmenta iz Primera 8 i SI-A segmenata iz pCW0466 na C-terminusu koristeći isti postupak dimerizacije opisan u Primeru 5. Ova nova biblioteka od XTEN_AM443 segmenta označena je kao LCW0479.

[0353] Generisali smo biblioteku XTEN_AM875 segmenata rekombinovanjem segmenata iz biblioteke LCW0479 iz XTEN_AM443 segmenata i 43 preferiranih XTEN_AM432 segmenata iz primera 8, koristeći isti postupak dimerizacije opisan u primeru 5. Ova nova biblioteka od XTEN_AM875 segmenta označena je kao LCW0481.

Primer 10: Konstruisanje XTEN_AM1318

[0354] Izgarali smo fosforilisani oligonukleotid BsaI-FseI-KpnIforP:

AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGG TAC (SEQ ID NO:1655) i nefosforilisani oligonukleotid BsaI-FseI-KpnIrev:

CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCGCTTGGGGCCGGCCCCGTTGGTTCTGG (SEQ ID NO:1656) za uvođenje sekvencijalnog ostrva B (SI-B) koji kodira aminokiseline GPEPTGPAPSG (SEQ ID NO:1657) i ima u sebi restrikcijski enzim FseI prepoznavanje nukleotidne sekvence GGCCGGCC. Otpali oligonukleotidni parovi su lizirani BsaI i KpnI digestiranim puferskim vektorom pCW0359, kao što je korišćeno u Primeru 9 kako bi se dobio pCW0467 koji sadrži SI-B. Zatim smo generisali biblioteku XTEN_AM443 segmenata rekombinovanjem 43 poželjna XTEN_AM432 segmenta iz Primera 8 i SI-B segmenata iz

2

pCW0467 na C-terminusu koristeći isti postupak dimerizacije opisan u Primeru 5. Ova nova biblioteka od XTEN_AM443 segmenta označena je kao LCW0480.

[0355] Generisali smo biblioteku XTEN_AM1318 segmenata rekombinovanjem segmenata iz biblioteke LCW0480 od XTEN_AM443 segmenata i segmenata iz biblioteke LCW0481 od XTEN_AM875 segmenata koristeći isti postupak dimerizacije kao u primeru 5. Ova nova biblioteka od XTEN_AM1318 segmenta označena je kao LCW0487.

Primer 11: Konstruisanje XTEN_AD864

[0356] Koristeći nekoliko uzastopnih krugova dimerizacije, sastavili smo kolekciju XTEN_AD864 nastavka počevši od segmenata XTEN_AD36 navedenih u Primeru 1. Ove sekvence su sastavljene kako je opisano u Primeru 5. Nekoliko izolata iz XTEN_AD864 je procenjeno i otkriveno je da pokazuju dobru ekspresiju i odličnu rastvorljivost u fiziološkim uslovima. Jedan intermedijarni konstrukt XTEN_AD576 je sekvencioniran. Ovaj klon je procenjen u PK eksperimentu kod majmuna cinomolgus i meren je polu-raspad od oko 20 h.

Primer 12: Konstruisanje XTEN_AF864

[0357] Koristeći nekoliko uzastopnih krugova dimerizacije, sastavili smo kolekciju XTEN_AF864 nastavka počevši od segmenata XTEN_AF36 navedenih u Primeru 3. Ove sekvence su sastavljene kako je opisano u Primeru 5. Nekoliko izolata iz XTEN_AF864 je procenjeno i otkriveno je da pokazuju dobru ekspresiju i odličnu rastvorljivost u fiziološkim uslovima. Jedan intermedijarni konstrukt XTEN_AF540 je sekvencioniran. Ovaj klon je procenjen u PK eksperimentu kod majmuna cinomolgus i meren je polu-raspad od oko 20h. Klon pune dužine XTEN_AF864 imao je odličnu rastvorljivost i pokazao je polu-raspad veći od 60 h kod majmuna cinomolgus. Sklopljen je drugi niz XTEN_AF sekvenci uključujući ostrvo za sekvenciranje kako je opisano u Primeru 9.

Primer 13: Konstruisanje XTEN_AG864

[0358] Koristeći nekoliko uzastopnih krugova dimerizacije, sastavili smo kolekciju XTEN_AG864 nastavka počevši od segmenata XTEN_AD36 navedenih u Primeru 1. Ove sekvence su sastavljene kako je opisano u Primeru 5. Nekoliko izolata iz XTEN_AG864 je procenjeno i otkriveno je da pokazuju dobru ekspresiju i odličnu rastvorljivost u fiziološkim uslovima. Klon pune dužine XTEN_AG864 imao je odličnu rastvorljivost i pokazao je poluraspad veći od 60 h kod majmuna cinomolgus.

Primer 14: Postupci za proizvodnju i procenu CFXTEN sa unutrašnjim i terminusnim XTEN

[0359] Dizajn, konstrukcija i procena CFXTEN koji sadrži FVIII i jedan ili više XTEN

2

ostvaruje se sistematskim pristupom. Područja pogodna za mesta umetanja XTEN uključuju, ali moraju biti ograničena na regione koji su ili su blizu poznatih granica domena FVIII, granice egzona, poznate površinske petlje, regioni sa malim stepenom reda i hidrofilna područja. Analizom prethodnog, različita regiona u nizu izbrisanih domena FVIII B domena (BDD) identifikovana su kao mesta umetanja za XTEN, čiji su neograničavajući primeri navedeni u Tabelama 5-8, a shematski su prikazani na Sl.8 i 9. U početku se stvaraju pojedinačni konstrukti (koristeći postupke opisane ispod) u kojima se DNK koja kodira jedan XTEN ili XTEN fragment dužine u rasponu od 6 do 2004 aminokiselinskih ostataka ubacuje u FVIII sekvencu koja odgovara ili je blizu (npr., unutar 6 amino grupa kiseline) svako pojedinačno mesto umetanja identifikovano u Tabela 5, Tabela 6, Tabela 7, Tabela 8 i Tabela 9, i rezultirajući konstrukti su izraženi i oporavljeni protein zatim je procenjen na njihove efekte na zadržavanje aktivnosti prokoagulanse koristeći, npr., jedan od in vitro testova Tabele 49. Na primer, koristeći metode opisane u daljem tekstu, napravljeni su konstrukti u kojima je XTEN sekvenca umetnuta u sekvence domena A1, A2, B, A3, C1 i C2 na FVIII, kao i povezana sa C-terminusom i rezultirajućim eksprimirani fuzioni proteini su procenjeni u hromogenom testu iz Tabele 49, u poređenju sa FVIII koji nije povezan sa XTEN. CFXTEN fuzioni proteini mogu se dalje klasifikovati delujući u visoke, srednje i niske kategorije na osnovu aktivnosti koje izlažu. U slučajevima kada CFXTEN pokazuje aktivnost koja je uporediva ili skromno smanjena u odnosu na FVIII, mesto umetanja se smatra povoljnim. U onim slučajevima kada je aktivnost intermedijarna, mesto umetanja se može podesiti od 1-6 aminokiselina prema N- ili C-terminusu mesta umetanja i/ili dužina ili neto naelektrisanje XTEN može se promeniti i rezultat konstrukcije ponovo se procenjuju kako bi se utvrdilo da li je aktivnost poboljšana. Alternativno, XTEN je ubačen u konstrukciju sa bočnih mesta deljenja; poželjno mesta koja su podložna deljenju proteazama koja se nalaze u testovima zgrušavanja, tako da se XTEN oslobodi tokom aktivacije FVIII komponente, pružajući tako dodatne informacije o pogodnosti mesta za ubacivanje XTEN u fuzioni protein.

[0360] Jednom kada se procene sva pojedinačna mesta umetanja i utvrde povoljna mesta za umetanje, stvaraju se biblioteke konstrukcija sa dva, tri, četiri, pet ili više XTEN koji su ubačeni u permutacije povoljnih mesta. Dužina i neto naelektrisanje XTEN (npr., XTEN iz AE u odnosu na AG porodicu) variraju da bi se utvrdili efekti ovih promenljivih na FVIII aktivnost i fizičko-hemijska svojstva fuzionog proteina. CFXTEN konstrukti koji zadržavaju željeni stepen in vitro prokoagulantne aktivnosti FVIII zatim se procenjuju in vivo upotrebom mišjih i/ili pasjih modela hemofilije A, kao što je opisano u donjim primerima, ili drugih

2

modela poznatih u tehnici. Pored toga, konstrukti se testiraju u prisustvu FVIII inhibitora i drugih anti-FVIII antitela da bi se odredili konstrukti koji zadržavaju aktivnost. Pored toga, napravljeni su CFXTEN konstrukti koji uključuju sekvence deljenja na ili blizu spojnog polja (FVIII) i XTEN (npr., sekvence iz Tabele 8) dizajnirane za oslobađanje XTEN i procenjuju se na pojačanje aktivnosti FVIII i efekte na terminusni polu-život. Iterativnim postupkom pravljenja konstrukcija kombinujući različita mesta umetanja, promenu dužine i kvaliteta sastava XTEN (npr., različitih XTEN porodica), i procenom, vešt stručnjak dobija gore navedenim metodama CFXTEN sa željenim svojstvima, kao što su nije ograničeno na aktivnost prokoagulantne FVIII, smanjeno vezivanje sa FVIII inhibitorima, pojačana farmakokinetička svojstva, sposobnost davanja ispitaniku na različite načine i/ili poboljšana farmaceutska svojstva.

Primer 15: Postupci za proizvodnju i procenu CFXTEN koji sadrži FVIII i AE XTEN [0361] Opšta šema za proizvodnju i procenu sastava CFXTEN je prikazana na Sl.15, i čini osnovu za opšti opis ovog Primera. Koristeći obelodanjene postupke i one poznate stručnjacima uobičajene struke, zajedno sa uputstvima koja su data u ilustrativnim primerima, vešt stručnjak može da stvori i proceni CFXTEN fuzione proteine koji sadrže XTEN i FVIII ili varijante FVIII poznate u tehnici. Primer se, prema tome, treba tumačiti kao ilustrativni, a ne ograničavajući na bilo koji način; brojnim varijacijama će biti očigledne stručnjacima. U ovom primeru je stvoren CFXTEN faktora VIII BDD povezan sa XTEN iz AE porodice motiva.

[0362] Opšta šema za proizvodnju polinukleotida koji kodiraju XTEN prikazana je na SL.11 i 12. Sl.14 je šematski dijagram toka reprezentativnih koraka u sastavljanju XTEN polinukleotidnog konstrukta u jednom od otelotvorenja predmetnog pronalaska. Pojedinačni oligonukleotidi 501 su sagorevani u motivima sekvenci 502, kao što je motiv 12 aminokiselina ("12-mer"), koji su vezani za dodatne motive sekvenci iz biblioteke koja se može pretvoriti u multimer da bi se stvorio bazen koji takođe obuhvata željenu dužinu XTEN 504, vezan na manju koncentraciju oligo koji sadrži BbsI i KpnI restrikciona mesta 503. Biblioteke motiva uključuju određene XTEN sekvence porodice; npr., AD, AE, AF, AG, AM, ili AQ sekvence Tabele 3. Kao što je prikazano na Sl.14, dužina XTEN u ovom slučaju je 36 aminokiselinskih ostataka, ali se dužim dužinama postiže i ovaj opšti postupak. Na primer, multimerizacija se vrši ligacijom, ekspanzijom preklapanja, PCR sklopom ili sličnim tehnikama kloniranja poznatim u struci, koje u ovom slučaju rezultiraju konstruktom sa 288 aminokiselinskih ostataka. Dobijeni bazen proizvoda za vezivanje je prečišćen gelom i reza

2 1

se trakom željene dužine XTEN, što rezultira izolovanim XTEN genom sa stop sekvencom 505. XTEN gen može biti kloniran u vektor za punjenje. U ovom slučaju, vektor kodira opcionalnu CBD sekvencu 506 i GFP gen 508. Digestija se zatim izvodi sa BbsI/HindIII da bi se uklonili 507 i 508 i postavili stop kodon. Rezultirajući proizvod se zatim klonira u vektor digestije BsaI/HindIII koji sadrži gen koji kodira FVIII, što rezultira time da gen 500 kodira CFXTEN fuzioni protein sa 288 aminokiselinom XTEN povezan sa C-terminusom faktora VIII. Kao što je očigledno stručnjacima u ovoj oblasti, postupci se primenjuju za stvaranje konstrukata u alternativnim konfiguracijama i sa različitim XTEN dužinama ili na više lokacija.

[0363] DNK sekvence koje kodiraju FVIII prikladno se dobijaju standardnim postupcima poznatim u struci iz biblioteke cDNK pripremljene iz odgovarajućeg ćelijskog izvora, iz genomske biblioteke, ili se mogu stvoriti sintetički (npr., automatizovana sinteza nukleinske kiseline) koristeći DNK sekvence dobijene iz javno dostupnih baze podataka, patenti ili reference u literaturi. U ovom primeru, varijanta izbrisanog domena FVIII B (BDD) se priprema kao što je opisano u Primeru 17. Gen ili polinukleotid koji kodira FVIII deo proteina ili njegovog komplementa se zatim klonira u konstrukt, kakav su oni opisani ovde, koji mogu biti plazmid ili drugi vektor pod kontrolom odgovarajućih transkripcionih i prevodilačkih sekvenci za ekspresiju proteina visokog nivoa u biološki sistem. Drugi gen ili polinukleotid koji kodira XTEN deo ili njegov komplement genetski se spaja sa nukleotidima koji kodiraju kraj FVIII gena klonirajući ga u konstrukciju susednu i u okviru sa genom koji kodira CF, putem ligacije ili koraka multimerizacije. Na ovaj način, u konstrukciji se stvara himerni DNK molekul koji kodira (ili komplementarni) CFXTEN fuzioni protein. Po izboru, gen koji kodira za drugi XTEN je ubačen i liziran unutra unutar nukleotida koji kodiraju FVIII-kodirajući region. Konstrukti su dizajnirani u različitim konfiguracijama da kodiraju različita mesta umetanja XTEN u FVIII sekvenci, uključujući ona iz Tabele 5, Tabele 6, Tabele 7, Tabele 8 i Tabele 9 ili one koje su prikazane na Sl.8-9. Po izboru, ovaj himerni DNK molekul se prenosi ili klonira u drugi konstrukt koji je pogodniji vektor ekspresije; npr., vektor pogodan za sisarsku ćeliju domaćina, kao što su CHO, BHK i slično. U ovom trenutku, ćelija domaćina sposobna da izražava himerni molekul DNK transformiše se himernom molekulom DNK, detaljnije opisanom, ispod, ili dobro poznatim postupcima, u zavisnosti od vrste ćelijskog domaćina, kako je opisano iznad.

[0364] Ćelije domaćina koje sadrže XTEN-FVIII ekspresijski vektor kultiviraju se u

2 2

konvencionalnim hranljivim podlogama, modifikovanim prema potrebi za aktiviranje promotera. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju i biće očigledno uobičajenom stručnjaku. Nakon ekspresije fuzionog proteina, bujonski kultura se skuplja i odvaja od ćelijske mase, a dobijeni sirovi ekstrakt se zadržava za prečišćavanje fuzionim proteinom.

[0365] Ekspresija gena se direktno meri u uzorku, na primer, konvencionalnim južnim blotovanjem, severnim blotovanjem kako bi se kvantifikovala transkripcija mRNK [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], brisanje tačkama (DNK analiza) ili in situ hibridizacija, korišćenjem odgovarajuće obeležene sonde, zasnovane na ovde navedenim sekvencama. Alternativno, ekspresija gena se meri imunološkim fluorescentnim metodama, kao što je imunohistohemijsko bojenje ćelija kako bi se direktno kvantifikovala ekspresija genskog proizvoda. Antitela koja su korisna za imunohistohemijsko bojenje i/ili ispitivanje uzorka tečnosti mogu biti monoklonska ili poliklonska, i mogu se pripremiti kod bilo kojeg sisara. Prikladno, antitela se mogu pripremiti protiv polipeptida sekvence FVIII korišćenjem sintetičkog peptida zasnovanog na ovde navedenim sekvencama ili protiv egzogene sekvence spojene u FVIII i koja kodira specifični epitop antitela. Dalji primeri markera koji se mogu odabrati su dobro poznati stručnjacima i uključuju izveštače poput pojačanog zelenog fluorescentnog proteina (EGFP), beta-galaktozidaze (β-gal) ili hloramfenikol acetiltransferaze (CAT).

[0366] CFXTEN polipeptidni proizvod se prečišćava postupcima poznatim u stanju tehnike. Postupci kao što su filtracija gela, prečišćavanje afiniteta, frakcionacija soli, hromatografija za izmenu jona, hromatografija za isključivanje veličine, adsorpciona hromatografija hidroksiapatita, hidrofobna interakciona hromatografija ili gel elektroforeza sve su tehnike koje se mogu koristiti u prečišćavanju. Specifični postupci prečišćavanja su opisani u Robert K. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Charles R. Castor ed., Springer-Verlag 1994, i Sambrook, i dr., supra. Takođe su opisana i odvajanja u više koraka za prečišćavanje Baron, i dr., Crit. Rev. Biotechnol.10:179-90 (1990) i Below, i dr., J.

Chromatogr. A. 679:67-83 (1994).

[0367] Kao što je prikazano na Sl.15, izolovani CFXTEN fuzioni proteini su karakteristični po svojim hemijskim i aktivnim svojstvima. Izolovani fuzioni protein je karakterističan, na primer, za sekvencu, čistoću, prividnu molekulsku težinu, rastvorljivost i stabilnost koristeći

2

standardne postupke poznate u stanju tehnike. Fuzioni protein koji zadovoljava očekivane standarde procenjuje se za aktivnost, koja se može meriti in vitro ili in vivo merenjem jednog od ovde opisanih parametara povezanih sa faktorom VIII, korišćenjem jednog ili više ovde opisanih ispitivanja, ili korišćenjem analiza primera ili Tabele 49.

[0368] Pored toga, CFXTEN FVIII fuzioni protein se daje jednoj ili više životinjskih vrsta radi određivanja standardnih farmakokinetičkih parametara i farmakodinamičkih svojstava, kako je opisano u primerima 25 i 26.

[0369] Iterativnim postupkom proizvodnje, ekspresije i povratak CFXTEN konstrukata, praćeno njihovim karakterizacijom upotrebom ovde opisanih metoda ili drugih poznatih u struci, CFXTEN sastavi koje sadrže CF i XTEN se proizvode i procenjuju u svrhu potvrđivanja očekivanih svojstava, kao što je povećana rastvorljivost, povećana stabilnost, poboljšana farmakokinetika i smanjena imunogenost, što dovodi do ukupne pojačane terapijske aktivnosti u poređenju sa odgovarajućim ne fuzionisanim FVIII. Za one fuzione proteine koji ne poseduju željena svojstva, pomoću ovih metoda se konstruiše, izražava, izoluje i procenjuje drugačija sekvenca ili konfiguracija da bi se dobio sastav sa takvim svojstvima.

Primer 16: Konstrukcija ekspresionih plazmida za BDD FVIII

I. Konstruisanje B domena izbrisanih FVIII (BDD FVIII) ekspresionih vektora [0370] Ekspresijski vektor koji kodira BDD FVIII je stvoren kloniranjem BDD FVIII otvorenog okvira za čitanje u pcDNK4 vektor (Invitrogen, CA) koji sadrži polyA da bi se omogućila optimalna ekspresija gena FVIII kod sisara, što je rezultiralo konstruktom označenim pBC0100. U ovom konstruktu je identifikovano nekoliko prirodnih nalazišta za upotrebu za kloniranje, uključujući BsiWI 48, AflII 381, PshAI 1098, KpnI 1873, BamHI 1931, PflMI 3094, ApaI 3574, XbaI 4325, NotI 4437, XhoI 4444, BstEII 4449, AgeI 4500, PmeI 4527. Da bi se olakšao razvoj testa, nukleotidi koji kodiraju Myc i His tag su uvedeni u FVIII otvoren okvir za čitanje. pBC0100 je PCR amplifikovan korišćenjem sledećih prajmera: 1) F8-BsiWI-F: tattccCGTACGgccgccaccATGCAAATAGAGCTCTCCACCT (SEQ ID NO:1658); 2) F8-nostop-XhoI-R1: GGTGACCTCGAGcgtagaggtcctgtgcctcg (SEQ ID NO:1659) uvesti BsiWI i XhoI na odgovarajuće lokacije. PCR proizvod je digestiran pomoću BsiWI i KshoI. PcDNA4-Myc-His/C je digestiran sa Acc65I i XhoI, što je stvorilo dva proizvoda od 5003 i 68 bps. Proizvod od 5003bps je vezan sa digestiranim PCR'ed FVIII

2 4

fragmentom i korišćen za transformaciju DH5alpha. Enzimi Acc65I i BsiWI stvaraju kompatibilne krajeve, ali ova ligacija uništava mesto za buduću probavu. Rezultirajući konstrukt je označen sa pBC0102 (pcDNA4-FVIII_3-Myc-His). Da bismo olakšali dizajn i izvršenje budućih strategija kloniranja, posebno onih koje uključuju stvaranje BDD FVIII ekspresivnih konstrukcija koje sadrže više XTEN umetanja, odabrali smo dodatne jedinstvene restrikcijske enzimske lokacije koje uključuju, uključujući BsiWI 908, NheI 1829 i Clal 3281. Uvođenje ovih lokacija izvršeno je QuikChange postupkom (Agilent, CA) pojedinačno. Rezultirajući konstrukt je označen sa pBC0112 (pcDNA4-FVIII_4-Myc-His). Da ne bi došlo do problema koji mogu nastati od veznih peptida koji se povezuju između Myc/His i FVIII/Myc, i da uklonimo restrikcione enzimske lokacije pogodne za buduću XTEN umetanje, mutirali smo sekvence koje kodiraju peptidne sekvence iz ARGHPF (SEQ ID NO:1660) do GAGSPGAETA (SEQ ID NO:178) (između FVIII i Myc), NMHTG (SEQ ID NO:1661) do SPATG (SEQ ID NO:1662) (između Myc i His) preko QuikChange postupka. Konstrukt dizajniran pBC0114 (pcDNA4-FVIII_4-GAGSPGAETA-Myc-SPATG-His ('GAGSPGAETA' i 'SPATG' obelodanjen kao SEQ ID NOS 178 i 1662, respektivno)) (sekvenca u Tabeli 21), koji je korišćen kao osnovni vektor za projektovanje i stvaranje drugih ekspresionih vektora koji uključuju XTEN sekvence. Podaci o ekspresiji i FVIII aktivnosti ovog konstrukta su predstavljeni u

II. Konstruisanje B domena izbrisanih FVIII (BDD FVIII) ekspresionih vektora [0371] Gen koji kodira BDD FVIII sintetiše GeneArts (Regensburg, Nemačka) u vektoru kloniranja pMK (pMK-BDD FVIII). BDD FVIII proteini sadrže 1457 aminokiselina u ukupnoj molekulskoj masi 167539,66. Postoji 6 domena unutar FVIII proteina divljih vrsta, domena A1, A2, B, A3, C1 i C2. U BDD FVIII proteinu je najveći deo domena B izbrisan jer se pokazalo da je nestrukturirani domen, a uklanjanje domena ne menja kritične funkcije ovog proteina. Vektor pMK koji koristi GeneArts ne sadrži promotor i ne može se koristiti kao ekspresijski vektor. Restriktivna enzimska mesta NheI na 5' kraju i éSfil, SalI i XhoI na 3' kraju uvode se kako bi se olakšalo subkloniranje DNK sekvence koja kodira BDD FVIII u ekspresione vektore, kao što su CET1019-HS (Millipore). Nekoliko jedinstvenih restrikcionih enzimskih mesta takođe se uvodi u FVIII sekvencu kako bi se omogućila dalja manipulacija (npr., ubacivanje, mutageneza) DNK sekvenci. Jedinstvene lokacije navedene sa njihovim odsečenim mestima uključuju, ali nisu ograničene na: SacI 391, AfiII 700, SpeI 966, PshAI 1417, Acc65I 2192, KpnI 2192, BamHI 2250, HindIII 2658, PfoI 2960, Pf1MI 3413, ApaI 3893, Bsp12013893, SwaI 4265, OliI 4626, XbaI 4644, i BstBI 4673.. Mesto HindIII nalazi se na samom kraju A2 domena i potencijalno se može koristiti za modifikaciju B domena.

2

Sintetizovani pMK-BDD FVIII od GeneArts ne sadrži stop kodon. Stop kodon je uveden amplifikacijom fragmenta FVIII od 127 bp koristeći sledeće prajmere: 5'-GTGAACTCTCTAGACCCACCG-3' (SEQ ID NO:1663); 5'-CTCCTCGAGGTCGACTCAGTAGAGGTCCTGTGCCTCG-3' (SEQ ID NO:1664).

Fragment je digestiran sa XbaI i SalI, i vezan u XbaI/SalI digestiranom pMK-BDD FVIII. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konstrukt nazvan pBC0027 (pMK-BDD FVIII-STOP) sadrži kodirajuće sekvence koje kodiraju BDD FVIII protein. Konstrukcija pBC0027 se digestira sa NheI/SalI, i liguje se vektori CET1019-HS (Millipore) koji je NheI/SalI digestiran. Vektor CET1019-HS sadrži humani CMV promotor i UCOE sekvencu da olakša ekspresiju gena. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je označen pBC0025 (CET1019-HS-BDD FVIII-STOP), koji kodira BDD FVIII protein pod kontrolom humanog CMV promotora. Uvođenje pBC0025 konstrukta u ćelije sisara očekuje se da omogućava ekspresiju BDD FVIII proteina sa prokoagulantnom aktivnošću.

Primer 17: Konstruisanje ekspresionih plazmida za BDD FVIII koji sadrži XTEN

1. AE42 ubacivanje B domena

[0372] Dve PCR reakcije su izvedene paralelno da bi se XTEN_AE42 ubacio u preostali B domenski region BDD FVIII konstrukata. PCR reakcije su uključivale sledeće prajmere:

tctcaggcgtagcgctttcgCTTGTCCCCTCTTCTGTTGAGGTGGGGGAGCCAGCAGGAGAAC CTGGCG CGCCgttttgagagaagcttcttggt (SEQ ID NO:1668). PCR proizvodi su zatim služili kao obrasci, a drugi PCR je izvršen da bi se XTEN_AE42 uveo u FVIII kodirajuće nukleotidne sekvence na kojima su stali BamHI i ClaI. Ovaj PCR proizvod je razgrađen sa BamHI i ClaI istovremeno sa varenjem PBC0114 sa ista dva enzima. PCR proizvod je vezan na digestirani vektor. Konstrukt je dizajniran pBC0135 (pcDNA4-FVIII_4XTEN_AE42-GAGSPGAETA-Myc-SPATG-His) ('GAGSPGAETA' i 'SPATG' obelodanjen kao SEQ ID NOS 178 i 1662, respektivno), i kodira BDD FVIII sa AE42 XTEN ugrađenim u preostalu B-

2

domenu.

2. Ubacivanje AE42 i mutacija R1648A

[0373] Za uvođenje mutacije R1648A u PBC0135 korišćen je QuikChange postupak (Agilent, CA). Konstrukt je dizajniran pBC0149 (pcDNA4-FVIII_4XTEN_AE42-GAGSPGAETA-Myc-SPATG-His_R1648A) ('GAGSPGAETA' i 'SPATG' obelodanjen kao SEQ ID NOS 178 i 1662, respektivno), eliminišući to mesto obrade FVIII.

3. AE288 ubacivanje B domena

[0374] XTEN_AE288 je PCR pojačan koristeći sledeće prajmere: tctcaaaacGGCGCGCCAggtacctcagagtctgctacc (SEQ ID NO:1669) i tggtggGCTCGAGGCtggcgcactgccttc (SEQ ID NO:1670). PBC0075 je korišćen kao obrazac za ovu PCR reakciju. PCR proizvod je razgrađen sa AscI i XhoI, a PBC0135 je razgrađen istim enzimima. PCR proizvod je vezan za PBC0135 fragment. Konstrukt je dizajniran pBC0136 (pcDNA4-FVIII_4XTEN_AE288-GAGSPGAETA-Myc-SPATG-His) ('GAGSPGAETA' i 'SPATG' obelodanjen kao SEQ ID NOS 178 i 1662, respektivno), i kodira BDD FVIII sa AE288 XTEN ugrađenim u preostalu B-domenu.

4. Ubacivanje AE288 i mutacija R1648A

[0375] XTEN_AE288 je PCR pojačan koristeći sledeće prajmere: tctcaaaacGGCGCGCCAggtacctcagagtctgctacc (SEQ ID NO:1671) i tggtggGCTCGAGGCtggcgcactgccttc (SEQ ID NO:1672). Konstrukt pBC0075 je korišćen kao obrazac za ovu PCR reakciju. PCR proizvod je razgrađen sa AscI i XhoI, a pBC0149 je razgrađen istim enzimima. PCR proizvod je vezan za pBC0149 fragment. Konstrukt je dizajniran pBC0137 (pcDNA4-FVIII_4XTEN_AE288-GAGSPGAETA-Myc-SPATG-His R1648A) ('GAGSPGAETA' i 'SPATG' obelodanjen kao SEQ ID NOS 178 i 1662, respektivno) i sadrži AE288 XTEN sekvencu unutar B domena, sa mutacijom R1648A eliminišući to FVIII mesto obrade.

3. B domen AE144, AG144, AG288 umetanja sa i bez R1648A mutacija

[0376] Odabrani XTEN fragmenti su PCR amplifikovani da bi se mesta AscI i XhoI uvela na kraj 5' i 3'. PCR produkt je digestiran sa AscI i XhoI, a pBC0135 (za R1648) ili pBC0149 (za A1648) su digestirani sa istim enzimima. PCR proizvod je vezan na vektor pBC0135 ili pBC0149. Ovi konstrukti su označeni kao pSD0005, 6, 7, 8, 17 i 18.

[0377] Konstruisanje ekspresionih plazmida za BDD FVIII sa XTEN ubacivanjem na C-terminusu

1. Umetanje AE288 C terminusa

2

[0378] XTEN_AE288 je PCR pojačan koristeći sledeće prajmere: ggggccgaaacggccggtacctcagagtctgctacc (SEQ ID NO:1673) i tgttcggccgtttcggcccctggcgcactgccttc (SEQ ID NO:1674). Konstrukt pBC0075 je korišćen kao obrazac za ovu PCR reakciju. PCR proizvod je razgrađen sa SfiI, a pBC0114 je razgrađen istim enzimima. PCR proizvod je vezan za varenje pBC0114 fragment. Konstrukt je dizajniran pBC0145 (pcDNA4-FVIII_4-XTEN_AE288-GAGSPGAETA-Myc-SPATG-His) ('GAGSPGAETA' i 'SPATG' obelodanjen kao SEQ ID NOS 178 i 1662, respektivno), i kodira AE288 sekvencu na C-terminusu BDD FVIII.

2. Umetanje AG288 C terminusa

[0379] XTEN_AG288 je dizajniran i sintetizovan od strane DNA2.0 (Menlo Park, CA). Sintetizovani gen je PCR amplifikovan korišćenjem sledećih prajmera: ggggccgaaacggccccgggagcgtcacc (SEQ ID NO:1675) i tgttcggccgtttcggcccctgacccggttgcccc (SEQ ID NO:1676). PCR proizvod je razgrađen sa SfiI, a PBC0114 bazni vektor je razgrađen istim enzimima. PCR proizvod je vezan za varenje PBC0114 fragment. Konstrukt je dizajniran pBC0146 (pcDNA4-FVIII_4-XTEN_AG288-GAGSPGAETA-Myc-SPATG-His) ('GAGSPGAETA' i 'SPATG' obelodanjen kao SEQ ID NOS 178 i 1662, respektivno), i kodira AG288 sekvencu na C-terminusu BDD FVIII.

3. C terminus AE/AG144, 288. 864 umetanja

[0380] Lokacije AscI i XhoI uvedene su u vektor zasnovan na PBC0114 putem QuikChange metoda pomoću primera: 5O37-PBC0114-AscI-XhoI-F:

CAGGACCTCTACGGCGCgccagcctcgaGCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGG (SEQ ID NO:1677); 5O38-PBC0114-AscI-XhoI-R:

CCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGCtcgaggctggcGCGCCGTAGAGGTCCTG (SEQ ID NO:1678). Različiti XTEN fragmenti su PCR amplifikovani sa AscI i XhoI uvedeni na 5' i 3' kraj respektivno. PCR proizvod je vezan za varenje PBC0114 vektor. Ovi konstrukti su označeni pSD0013, pSD0014, pSD0015, pSD0016, pSD0019 i pSD0020.

Konstruisanje ekspresionih plazmida za BDD FVIII sa inter- i intra-domenom XTEN

1. AE7, AE42 i AE144 umetanja

[0381] Četiri različite strategije koriste se za umetanje AE42 na određena mesta (npr., prirodna ili uvedena restriktivna mesta BsiWI 48, AflII 381, PshAI 1098, KpnI 1873, BamHI 1931, Pf1MI 3094, ApaI 3574, XbaI 4325, NotI 4437, XhoI 4444, BstEII 4449, AgeI 4500, PmeI 4527, BsiWI 908, NheI 1829 i ClaI 3281) unutar BDD FVIII kodirajuće sekvence, a svaki je doprineo stvaranju nekoliko konstrukcija. Po dizajnu, ova umetanja AE42 stvaraju

2

AscI i XhoI mesta sa svake strane umetanja omogućavajući uvođenje/supstituciju dužih XTEN, kao i XTEN sa različitim sekvencama ili ugrađenim sekvencijama deljenja, prema potrebi. Konkretno, konstrukcije koje sadrže XTEN_144 umetanja su navedene u Tabeli 21. Ova umetanja su stvorena zamenom AE7 ili AE42 sa PCRed XTEN_144 fragmentom sa strane AscI i XhoI.

2. Dvostruki PCR posredovani postupak

[0382] Dve PCR reakcije se pokreću paralelno da bi se XTEN_AE42 ubacio na određeno mesto. Dve PCR reakcije uvode XTEN ili na 3' ili na 5' kraju upotrebom dugog prajmera koji sadrži delimični XTEN. PCR proizvodi tada služe kao obrasci, a drugi PCR se izvodi da bi se XTEN_AE42 uveo u FVIII kodirajuće nukleotidne sekvence flankirane odabranim restrikcijskim enzimskim mestima. Ovaj PCR proizvod se digestira odgovarajućim enzimima istovremeno sa varenjem PBC0114 koristeći ista dva enzima. PCR proizvod je vezan na digestirani vektor. Koristeći ovu metodu, konstrukcije su stvorene sa oznakama pBC0126, pBC0127, pBC0128 i pBC0129, što rezultira umetanjem AE42 na lokacije R3, R3, P130, L216. Sekvence su navedene u Tabeli 21. Izabrane XTEN_144 sekvence mogu se zatim PCRed uvesti kako bi se uveli AscI i XhoI mesta na oba kraja fragmenta, i vezali za digestirani konstrukt FVIII-XTEN_AE42. Na primer, pSD0053 je kreiran zamenom AE42 pBC0129 sa KSTEN_AE144. Ostali XTEN_144 konstrukti su stvoreni istom strategijom i navedeni su u Tabeli 21.

3. QuikChange posredovani postupak kloniranja u dva koraka

[0383] QuikChange postupak se koristi za uvođenje XTEN_AE7 kodirajućih sekvenci koje AscI i XhoI flankiraju na označena mesta. Dobijeni konstrukt međujedinjenja se zatim digestira sa AscI i XhoI. XTEN_AE42 ili XTEN_AE144 je PCR pojačan da se uvedu dve lokacije i digestira u skladu s tim. Vektor i umetak su zatim podvezani da bi se stvorili završni konstrukti. Sekvence su navedene u Tabeli 21.

4. Tri ligacije posredovane restrikcijom enzima tipa PCR

[0384] Tri PCR reakcije su izvedene da bi se stvorila dva dela FVIII kodirajućih fragmenata obloženih jednim restrikcijskim enzimom tipa I koji je u korelaciji sa jedinstvenim mestom unutar FVIII 4 gena i enzimom tipa II (npr. BsaI, BbsI, BfuAI), treća PCR reakcija je stvorena XTEN_AE42 obrubljen sa dva mesta II restrikcionog enzima. Tri fragmenta PCR-a se digestira odgovarajućim enzimima i vežu u jedan linearni komad koji sadrži XTEN_AE42 umetanje u fragment FVIII kodirajuće sekvence. Ovaj proizvod se zatim digestira odgovarajućim jedinstvenim enzimima u kodirajućim sekvencama FVIII i veže se na konstrukciju PBC0114 digestiranu sa istim enzimima, pa se dobijaju konstrukti označeni

2

pBC0130 (sa XTEN umetanjem u ostatku P333), pBC0132 (sa XTEN umetanjem u ostatku D403), pBC0133 (sa XTEN ubacivanjem u ostatku R490). Sekvence su navedene u Tabeli 21. Izabrane XTEN_144 sekvence mogu se zatim PCRed uvesti kako bi se uveli AscI i XhoI mesta na oba kraja fragmenta, i vezali za digestirani konstrukt FVIII-XTEN_AE42. Na primer, pSD0001 i pSD0003 su stvoreni zamenom AE42 pBC0132 sa XTEN_AE144 i XTEN_AG144. Ostali XTEN_144 konstrukti navedeni u Tabeli 21, stvoreni su istom strategijom.

5. Prilagođena sinteza gena

[0385] Prilagođenu sintezu gena vrši GeneArt (Regensburg, Nemačka). Geni su dizajnirani tako da uključuju nukleotide koji kodiraju XTEN_AE42 ubačen na određeno mesto (mesta) i geni su povezani sa dva jedinstvena mesta restrikcionog enzima odabrana unutar gena FVIII_4. Sintetizovani geni i PBC0114 se digestiraju sa odgovarajućim enzimima i liziraju da bi se stvorio konačni proizvod sa BDD FVIII koji uključuje XTEN_AE42 između mesta restrikcije. Izabrane XTEN_144 sekvence mogu se zatim PCRed uvesti kako bi se uveli AscI i XhoI mesta na oba kraja fragmenta, i vezali za digestirani konstrukt FVIII-XTEN_AE42.

Konstruisanje ekspresionih plazmida sa dvostrukim XTEN umetanjima u B domenu i na C terminusu

[0386] Konstrukt pBC0136, koji kodira BDD FVIII sa AE288 XTEN ugrađenim u preostalu B-domenu, digestira se sa BamHI i ClaI, a rezultirajući fragment od 1372bps iz ove probave je umetak. Konstrukt pBC0146 se digestira sa BamHI i ClaI, a komad od 9791bps iz ove probave je vektor. Vektor i umetak su vezani zajedno da bi se stvorio pBC0209, koji sadrži umetanje AE288 unutar B domena i AG288 na C terminusu. Ista strategija se koristi za kreiranje konstrukcija koje sadrže dve AE288 umetanja u B domenu i na C terminusu, koristeći PBC0145 kao vektor.

Konstrukcija ekspresijskih plazmida sa višestrukim XTEN umetanjima

[0387] Konstrukt pBC0127, koji kodira BDD FVIII sa R3 XTEN ugrađenim u preostalu B-domenu, digestira se sa BamHI i ClaI, a rezultirajući fragment od 468bps iz ove probave je umetak. Konstrukt pBC0209 se digestira sa BsiWI i AflII, komad od 10830bps iz ove probave je vektor. Vektor i umetak su vezani zajedno da bi se stvorila konstrukcija označena pBC0210, koja sadrži umetanje AE42 u A1 domen, dodatne tri ATR aminokiseline za obnavljanje sekvence deljenja signala, AE288 XTEN umetanje unutar B domena i AG288 na C terminusu. Ista se metodologija koristi za stvaranje konstrukcija koje kodiraju više XTEN na prirodnim i uvedenim restrikcijskim mestima; npr., BsiWI 48, Af1II 381, PshAI 1098, KpnI 1873, BamHI 1931, Pf1MI 3094, ApaI 3574, XbaI 4325, NotI 4437, XhoI 4444, BstEII

2

4449, AgeI 4500, PmeI 4527, BsiWI 908, NheI 1829 i ClaI 3281.

Konstruisanje BDD FVIII-Internal-XTEN AE288 ekspresionih vektora

[0388] Dva restrikciona enzima BsaI uvode se u konstrukciju PBC0027 pMK-BDD FVIII između baznog para 2673 i 2674 koristeći QuikChange postupak prema protokolu proizvođača (Agilent Technologies, CA). Umetnuti DNK sekvence su gggtctcccgcgccagggtctccc, a rezultirajući konstrukt je označen pBC0205 (sekvenca u Tabeli 21). DNK sekvenca koja kodira AE288 (ili druge varijante i dužine XTEN; na primer. AE42, AG42, AG288, AM288) je zatim PCR'ed sa prajmerima koji uvode BsaI mesta i na 5' i na 3'. Vektor pBC0205 i umetak (XTEN 288) se zatim digestiraju sa BsaI i liziraju da bi se stvorio pBC0206, koji kodira FVIII gen sa XTEN_AE288 umetanjem unutar B domena (sekvenca u Tabeli 21). Konstrukcija pBC0206 se digestira sa NheI/SalI, i lizira se vektori CET1019-HS (Millipore) koji je NheI/SalI digestiran. Vektor CET1019-HS sadrži humani CMV promotor i UCOE sekvencu da olakša ekspresiju gena. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je označen pBC0207 (CET1019-HS-BDD FVIII-STOP), koji kodira BDD FVIII protein pod kontrolom humanog CMV promotora (sekvenca u Tabeli 21). Uvođenje pBC0207 konstrukta u ćelije sisara očekuje se da omogućava ekspresiju BDD FVIII proteina sa unutrašnjim XTEN AE288. Isti protokol se koristi za uvođenje, transformisanje i izražavanje konstrukata koji sadrže druge varijante i dužine XTEN; npr. AE42, AG42, AG288, AM288, AE864, AG864, ili drugi XTEN Tabele 4.

Konstruisanje BDD FVIII-/-XTEN AE864 ekspresionih vektora

[0389] BDD FVIII fragment sa NheI i SfiI koji obrubljuju 5' i 3' kraj nastaje vađenjem konstrukcije pBC0025. Ovaj digestirani fragment se zatim veže na vektor pSecTag digestiranog NheI/SfiI (pBC0048 pSecTag-FVIII-/-XTEN_AE864) koji kodira FVIII, a zatim sledi sekvenca XTEN_AE864. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je pBC0060, koji kodira BDD FVIII-/-XTEN_AE864 protein pod kontrolom humanog CMV promotora. Uvođenjem pBC0060 konstrukta u ćelije sisara očekuje se da eksprimira FVIII protein sa C terminusnom XTEN fuzijom (BDD FVIII-/-XTEN_AE864) sa prokoagulacionom aktivnošću.

Konstruisanje BDD FVIII-/FXI/-XTEN AE864 ekspresijskih vektora

[0390] BDD FVIII fragment sa NheI i SfiI koji obrubljuju 5' i 3' kraj nastaje vađenjem konstrukcije pBC0025. Ovaj digestirani fragment se zatim lizira u vektor NheI/SfiI

2 1

digestiranog pSecTag vektora (pBC0047 pSecTag-FVIII-/FXI/-XTEN_AE864) koji kodira FVIII, nakon čega sledi sekvenca deljenja FXI (/ FXI /) i XTEN_AE864. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je pBC0051, koji kodira BDD FVIII-/FXI/-XTEN_AE864 protein pod kontrolom humanog CMV promotora. Uvođenjem pBC0051 konstrukta u ćelije sisara očekuje se da eksprimira FVIII protein sa C terminusnom XTEN fuzijom (BDD FVIII-/FXI/-XTEN_AE864), koji se nakon toga može podeliti FXI, čime se oslobađa BDD FVIII protein sa prokoagulacionom aktivnošću.

Konstruisanje BDD FVIII-/FXI/-XTEN ekspresionih vektora koji sadrže AE288 ili AG288

[0391] Spojeni AE864 XTEN niz u pBC0060 je zamenjen varenjem XTEN sekvence AE288 i AG288 sa BsaI i HindIII. Sledeći korak ligacije koristeći odgovarajući fragment AE288 ili AG288 XTEN i pBC0051 digestiranog BsaI/HindIII omogućava razmenu sekvenci AE288 ili AG288 u BDD FVIII ekspresijski vektor. Konačni konstrukti su pBC0061 za BDD FVIII-AE288 i pBC0062 za BDD FVIII-AG288. Uvođenjem pBC0061 konstrukta u ćelije sisara očekuje se da eksprimira FVIII protein sa C terminusnom AE288 XTEN fuzijom (BDD FVIII-/-XTEN_AE288) sa prokoagulacionom aktivnošću. Uvođenjem pBC0062 konstrukta u ćelije sisara očekuje se da eksprimira FVIII protein sa C terminusnom AG288 XTEN fuzijom (BDD FVIII-/-XTEN_AG288) sa prokoagulacionom aktivnošću.

Konstruisanje BDD FVIII-/FXI/-XTEN ekspresionih vektora sa naizmeničnim XTEN [0392] Spojeni XTEN niz u pBC0051 je zamenjen varenjem DNK koji kodira druge XTEN sekvence (npr., druge varijante i dužine XTEN; npr. AE42, AG42, AG288, AM288) sa BsaI i HindIII. Ligacija upotrebom XTEN fragmenta i BBII/HindIII digestiranog pBC0051 omogućava razmenu različitih sekvenci kodiranja XTEN u ekspresijski vektor BDD FVIII, obezbeđujući alternativne konstrukcije. Uvođenjem alternativnih konstrukata u ćelije sisara očekuje se da eksprimiraju protein FVIII sa C-terminusnim XTEN (BDD FVIII-/FXI/-XTEN) koji se može naknadno podeliti FXI, oslobađajući FVIII, što rezultira fuzijom prokoagulanta FVIII sa prokoagulantom aktivnost.

Primer 18: Konstruisanje ekspresionih plazmida za peptid FVIII signala-XTEN-/FKXI/- BDD FVIII

Konstruisanje ekspresionih vektora za peptid FVIII signala-XTEN AE864

[0393] Kodirajuće sekvence za peptid FVIII signala nastaju prekaljivanjem sledeća dva oliga:

2 2

CTAGCATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGC TTTAGTG GGTCTCC-3' (SEQ ID NO:1679); 5'-ACCTGGAGACCCACTAAAGCAGAATCGCAAAAGGCACAGAAAGAAGCAGGTGG AGAGCTC TATTTGCATG-3' (SEQ ID NO:1680). Otpali oligoi obrubljen je restrikcijskim enzimima NheI i BsaI na oba kraja i vezan je na vektor NCl/BsaI digestiran pCW0645 koji kodira FVII-XTEN_AE864. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je označen sa pBC0029, koji kodira signalni peptid-XTEN_AE864 protein pod kontrolom humanog CMV promotora. Ova konstrukcija se koristi kao konstrukt međujedinjenja za kreiranje ekspresione konstrukcije sa XTEN spojenim na N-terminusu FVIII proteina, a može se koristiti i kao glavni plazmid za stvaranje ekspresionih konstrukcija koje omogućavaju XTEN fuziju na N-terminusu izlučeni protein.

Konstruisanje signalnog peptida-XTEN AE864-/FXI/-BDD FVIII ekspresionih vektora [0394] Fragment od 1800bp unutar FVIII kodirajućeg regiona se pojačava korišćenjem prajmera koji uvode NheI-BbsI-/FXI/-AgeI mesta na 5' i endogenom KpnI restrikcionom enzimu na 3' kraju. FVIII fragment NheI/KpnI digestiran je vezan vektorom pheCB27 digestije NheI/KpnI. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Rezultirajući konstrukt je označen pBC0052, koji sadrži sekvence koje kodiraju/FXI/-FVIII protein bez peptida signala FVIII. Ovaj konstrukt se koristi kao konstrukt međujedinjenja za stvaranje ekspresione konstrukcije sa XTEN spojenim na N-terminusu proteina FVIII.

[0395] Vektor pBC0052 se digestira sa BbsI/XhoI enzimima, a koristi se za vezanje s BBsi/XhoI digestiranim pBC0029. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je označen sa pBC0053, koji kodira signalni peptid-XTEN_AE864-/FXI/-BDD FVIII protein pod kontrolom humanog CMV promotora. Uvođenjem pBC0053 konstrukta u ćelije sisara očekuje se da eksprimira protein FVIII N-terminusnom fuzijom XTEN (signalni peptid-XTEN_AE864-/FXI/-BDD FVIII), koji može biti naknadno podeljen FXI, čime se oslobađa BDD FVIII protein.

Konstruisanje signalnog peptida-XTEN -/FXI/-BDD FVIII ekspresionih vektora

2

[0396] Spojeni XTEN niz u pBC0053 može se zameniti vađenjem drugih XTEN fragmenata (npr. AM, AF, AG) sa BsaI i BbsI. Ligacija upotrebom XTEN fragmenta i BBlI/BbsI digestiranog pBC0053 omogućava razmenu različitih delova XTEN (npr. AM, AF, AG) u BDD FVIII ekspresijski vektor. Različite fuzije XTEN mogu različito povećati polu-raspad ovih proteina, omogućavajući modifikaciju svojstava (npr. efikasnosti, potencije) tih proteina. Očekuje se da će uvođenje bilo kojeg od ovih fuzija u ćelije sisara eksprimirati FVIII protein N-terminusnom XTEN fuzijom (signalni peptid-XTEN-/FXI/-BDD FVIII), pri čemu spojeni XTEN peptid može naknadno da se deli FXI, generišući BDD FVIII protein.

Primer 19: Konstruisanje BDD FVIII sa interdomenskim XTEN umetanjem

Konstruisanje BDD FVIII ekspresionih vektora sa KSTEN umetanjem na granicama domena A2-B

[0397] Konstrukcija pBC0027 (pMK-BDD FVIII-STOP) je klonski vektor dizajniran da sadrži BDD FVIII kodirajuće proteine, ali nije promotor pozicioniran da inicira ekspresiju BDD FVIII. Ova konstrukcija se koristi za manipulaciju kodirajućih sekvenci BDD FVIII, jer vektorska okosnica sadrži veoma malo restrikcijskih enzima. stoga omogućavaju jednostavne strategije kloniranja. BDD FVIII proteini sadrže 1457 aminokiselina u ukupnoj molekulskoj masi 167539,66. Postoji 6 domena unutar FVIII proteina divljih vrsta, domena A1, A2, B, A3, C1 i C2. U BDD FVIII proteinu je najveći deo domena B izbrisan jer se veruje da je nestrukturirani domen, a uklanjanje domena ne menja kritične funkcije ovog proteina.

Međutim, izgleda da su granice domena B odlične pozicije za stvaranje XTEN fuzije kako bi se omogućilo produženje polu-raspada proteina.

[0398] Unutar konstrukcije pBC0027 nalazi se jedinstveno HindIII mesto restrikcionog enzima na granici spajanja A2-B. XTEN (npr., sekvence Tabele 4, ili 13-17) se amplifikuju korišćenjem prajmera koji uvode mesto deljenja HindIII i FXI na bilo kojem kraju XTEN kodirajuće sekvence. Kondenzovana XTEN sekvenca može da se izmeni amplifikacijom različitih XTEN fragmenata. Različite fuzije XTEN mogu različito povećati polu-raspad ovih proteina, omogućavajući modifikaciju svojstava (npr. efikasnosti, potencije) tih proteina. Fragment HindIII-/FXI/-XTEN-/FXI/-HindIII se digestira sa HindIII i lizira se sa digestiranim HindIII pBC0027. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je označen sa pBC0054, koji kodira BDD FVIII protein sa interdomenom XTEN fuzije (FVIII(A1-A2)-/FXI/-XTEN-/FXI/-FVIII(C1-

2 4

C2)), ali nije promotor za pokretanje gena ispoljavanja.

[0399] Konstrukcija pBC0054 se digestira sa NheI/SalI, i lizira se vektori CET1019-HS (Millipore) koji je NheI/SalI digestiran. Vektor CET1019-HS sadrži humani CMV promotor i UCOE sekvencu da olakša ekspresiju gena. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je označen pBC0055 (CET1019-HS- FVIII(A1-A2)-/FXI/- XTEN-/FXI/-FVIII(C1-C2)), koji kodira BDD FVIII protein sa interdomenom (inter-A2/B domen) XTEN fuzija (FVIII(A1-A2)-/FXI/-XTEN-/FXI/-FVIII(C1-C2)) pod kontrolom humanog CMV promotera. Uvođenje pBC0055 konstrukta u ćelije sisara očekuje se da eksprimira BDD FVIII protein interdomenom XTEN fuzije (FVIII(A1-A2)-/FXI/-XTEN-/FXI/-FVIII(C1-C2)), što bi moglo biti nakon toga se deli FXI, čime se oslobađa BDD FVIII proteina.

Konstruisanje BDD FVIII ekspresionih vektora sa KSTEN umetanjem na granicama domena A1-A2

[0400] Konstrukcija pBC0027 je dizajnirana kao obrazac za dve PCR reakcije koristeći sledeća četiri prajmera:

(Reakcija I) 5'-ATGATGGCATGGAAGCCTAT-3' (SEQ ID NO:1681); 5'-ATCCCTCACCTTCGCCAGAACCTTCAGAACCCTCACCTTCAGAACCTTCAC

CAGAACCTTCA CCATCTTCCGCTTCTTCATTATTTTTCAT-3' (SEQ ID

NO:1682).

(Reakcija II) 5'-TTCTGGCGAAGGTGAGGGATCTGAAGGCGGTTCTGAAGGTGAAGGTGGCT

CTGAGGGTTCC GAATATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAAT-3' (SEQ ID

NO:1683); 5'-TATTCTCTGTGAGGTACCAGC-3' (SEQ ID NO:1684).

[0401] Generirani PCR proizvodi su 150 bps odnosno 800 bps. Proizvod od 800 bp koristi se kao predložak za sledeću rundu PCR reakcije sa proizvodom od 150 bp kao jednim prajmerom i 5'-TATTCTCTGTGAGGTACCAGC-3 '(SEQ ID NO:1685) kao drugi. Proizvod za drugi krug PCR-a je 930 bps i razgrađuje se restrikcijskim enzimima PshAI i ACC65I. Ovaj fragmentirani DNK s bojom PshAI/Acc65I liziran je pBC0027 digestiranim PshAI/Acc65I. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je označen pBC0058 (pMK-BDD FVIII-D345-XTEN_I36), koji kodira BDD FVIII protein sa interdomenom (inter-A1/A2 domen) XTEN

2

fuzijom nakon ostatka D345.

[0402] Konstrukcija pBC0058 se digestira sa NheI/SalI, i lizira se vektori CET1019-HS (Millipore) koji je NheI/SalI digestiran. Vektor CET1019-HS sadrži humani CMV promotor i UCOE sekvencu da olakša ekspresiju gena. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je označen sa pBC0059 (CET1019-HS-BDD FVIII D345-XTEN_I36), koji kodira BDD FVIII protein sa interdomenom (inter-A1/A2 domen) XTEN fuzijom nakon ostatka D345 pod kontrolom humanog CMV promotora. Uvođenje pBC0059 konstrukta u ćelije sisara očekuje se da eksprimira BDD FVIII protein interdomenom XTEN fuzije (BDD FVIII D345-XTEN_I36).

Primer 20: Konstruisanje FVIII sa intradomenskim XTEN umetanjem

Konstruisanje BDD FVIII ekspresionih vektora sa XTEN umetanjem nakon P598 (unutar domena A2)

[0403] Kodirajuće sekvence za XTEN_Y36 se pojačavaju pomoću PCR tehnika sa sledećim prajmerima:

5'-

GAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGGT

GAAGGTTCTGGTGAAGG63' (SEQ ID NO:1686)

5'-AACTCTGGATCCTCAAGCTGCACTCCAGCTTCGGAACCCTCAGAGCC-3'

(SEQ ID NO:1687).

[0404] PCR proizvod od 184 bp obrubljen je restrikcionim enzimima KpnI i BamHI na oba kraja i vezan je za vektor pBC0027 digestiran sa KpnII/BamHI koji kodira BDD FVIII gen. Ligaciona smeša DNK koristi se za transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je označen sa pBC0056, koji sadrži DNK sekvence koje kodiraju FVIII protein XTEN_I36 fuzijom nakon ostatka P598. Ova strategija kloniranja koristi se za uvođenje različitih oblika XTEN u BDD FVIII protein menjanjem obrasca za PCR reakciju i menjanjem prajmera u skladu sa tim.

[0405] Konstrukcija pBC0056 se digestira sa NheI/SalI, i liziraju se vektori CET1019-HS (Millipore) koji je NheI/SalI digestiran. Vektor CET1019-HS sadrži humani CMV promotor i UCOE sekvencu da olakša ekspresiju gena. Ligaciona smeša DNK koristi se za

2

transformisanje DH5a bakterijskih ćelija. Transformanti se pretražuju DNK miniprepom, a željeni konstrukti su potvrđeni sekvenciranjem DNK. Konačni konstrukt je označen sa pBC0057 (CET1019-HS-FVIII P598-XTEN_I32), koji kodira BDD FVIII protein sa intradomenom (unutar A2 domena) XTEN fuzijom pod kontrolom humanog CMV promotera. Uvođenje pBC0057 konstrukta u ćelije sisara očekuje se da eksprimira BDD FVIII protein intradomenom XTEN fuzije (FVIII P598-XTEN_Y32).

Konstruisanje BDD FVIII ekspresionih vektora sa drugim intradomenskim XTEN umetanjem

[0406] Da bi se uveli različiti segmenti XTEN na druga mesta unutar domena unutar BDD FVIII (npr., XTEN Tabele 4 ili 13-17), dizajnirani su prajmeri koji pojačavaju XTEN s ispustom koji može da prekaljuje sa BDD FVIII. Kodirajuća sekvenca FVIII (pMK-BDD FVIII) dizajnirana je sa različitim jedinstvenim restrikcijskim enzimskim lokacijama kako bi se omogućile ove specifične insercije. Dole su navedeni jedinstveni restriktivni enzimi sa njihovim presečnim mestom: NheI 376, SacI 391, AfiII 700, SpeI 966, PshAI 1417, Acc65I 2192, KpnI 2192, BamHI 2250, HindIII 2658, PfoI 2960, Pf1MI 3413, ApaI 3893, Bsp1201 3893, SwaI 4265, OliI 4626, XbaI 4644, BstBI 4673, SalI4756, i XhoI 4762. NheI i SalI mesta na bilo kojem kraju kodirajuće sekvence koriste se za umetanje DNK fragmenta u vektor koji vodi humani CMV, CET1019-HS (Millipore) za ekspresiju u ćelijama sisara. Ovi konstrukti eksprimiraju BDD FVIII protein XTEN fuzijom sa sekvencijama navedenim u Tabeli 21.

Primer 21: Konstruisanje FVIII sa XTEN umetanjem

CFXTEN i dva XTEN:

[0407] Da biste dobili CFXTEN sa dva XTEN umetanja u različitim regionima (od N-terminusa do C-terminusa: A1-R1, A1-R2, A2-R1, A2-R2, B domen, a3, A3-R1, A3-R2, C-terminus), korišćeni su konstrukti koji su izrazili fuziju sa jednostrukim XTEN umetanjima koji su zadržali FVIII aktivnost. Kodirajuća sekvenca FVIII (pBC0114 pcDNA4-FVIII_4-X10-Myc-SPATG-His extra RE) ("SPATG" obelodanjen kao SEQ ID NO:1662) dizajniran je sa različitim jedinstvenim restrikcionim enzimima kako bi se omogućile ove specifične kombinacije. Jedinstveni restrikcioni enzimi navedeni su u Tabeli 18 ispod sa njihovim relativnim lokacijama između različitih regiona: BsiWI (između N-terminusa i A1-R1), Af1II (između A1-R1 i A1-R2), NheI (između A1-R2 i A2-R1), KpnI (između A2-R1 i A2-R2), BamHI (između A2-R2 i B domena), ClaI (između a3 i A3-R1), Pf1MI (između A3-R1 i A3-R2), XbaI (između A3-R2 i C-terminusa), AgeI (između FVIII C-terminusa i stop kodon).

2

Gradivni blokovi i restrikcioni enzimi za kloniranje biblioteka izabrani su, kako je navedeno u tabeli ispod. Izabrane komponente u svakom regionu su pomešane u molarnom odnosu 1:1, a dva seta DNK smeše su digestirane jedinstvenim restrikcijskim enzimima. Fragmenti DNK su razdvojeni sa 1% agaroznim gelom i prečišćeni pomoću Qiagen gela za ekstrakciju. DNK sa XTEN ubacivanjem u prvom željenom regionu smatrana je umetkom (manji fragment DNK u agaroznom gelu), dok se DNK sa XTEN ubacivanjem u drugi željeni region smatra vektorskim (veći fragment DNK u agaroznom gelu). Umetak i vektor su lizirani da bi se rekonstituisao plazmid. Ligaciona smeša DNK korišćena je za transformaciju DH5α E. coli kompetentnih ćelija domaćina. Transformanti su ekranizovani uz pomoć amplifikacije kotrljajućih krugova (RCA) i Sanger sekvenciranja da bi pokrili približno 3-4 puta veću potencijalnu veličinu biblioteke. Jedinstveni klonovi su identifikovani i miniprepisani. Dve različite restriktivne varenje su zatim korišćene da se dodatno potvrdi integritet XTEN u svakom regionu. Aminokiselina i kodirajuća DNK sekvence za rezultirajuće CFXTEN fuzione proteine su navedeni u Tabeli 21.

CFXTEN sa jednim ili dva XTEN umetanja unutar B/a3 domena i C terminusa:

[0408] B/a3 domen i C-terminus FVIII su nestrukturirane oblasti koje dobro podnose XTEN umetanje. Domen B/a3 dalje je posredovao interakcije sa drugim kofaktorima, uključujući von Willebrandov faktor. Da bi se istražila optimalna XTEN umetanja u B/a3 domenu, izvršene su selekcije i mutacije regiona pomoću PC-postupka zasnovanih na mutagenezi. Odaberite PCR reakcije i vektori su digestirani jedinstvenim restrikcijskim enzimima kako je navedeno u Tabeli 18. Fragmenti DNK su razdvojeni sa 1% agaroznim gelom i prečišćeni pomoću Qiagen gela za ekstrakciju. DNK sa XTEN ubacivanjem u prvom željenom regionu smatrana je umetkom (manji fragment DNK u agaroznom gelu), dok se DNK sa XTEN ubacivanjem u drugi željeni region smatra vektorskim (veći fragment DNK u agaroznom gelu). Umetak i vektor su lizirani da bi se rekonstituisao plazmid. Ligaciona smeša DNK korišćena je za transformaciju DH5α E. coli kompetentnih ćelija domaćina. Transformanti su pregledani PCR kolonijom i Sanger sekvenciranjem da bi pokrili približno 8X potencijalne veličine biblioteke. Jedinstveni klonovi su identifikovani i miniprepisani. Tada je probavljeno jedno enzim restrikcijskog varenja da se dodatno potvrdi integritet XTEN u svakom regionu. Aminokiselina i kodirajuća DNK sekvence za rezultirajuće CFXTEN fuzione proteine su navedeni u Tabeli 21.

Tabela 18. Dizajn kloniranja za FVIII biblioteke sa dva XTEN umetka

2

2

2

Primer 22: Konstruisanje BDD FVIII ekspresionih vektora sa 3-5 XTEN umetanjem na mestima 18/26. 403, 745/1656, 1720, 1900 ili 2332

[0409] FVIII-fuzioni konstrukti sa XTEN umetanjima na mestima 18/26, 403, 745/1656, 1720, 1900 ili 2332 izabrani su za rekombinaciju i generisanje konstrukcija sa 3, 4, 5 ili 6 XTEN umetanja.

Konstruisanje BDD FVIII ekspresionih vektora sa 3-5 XTEN umetanjem na mestima 26, 403, 1656, 1720, ili 1900

[0410] Odabrani konstrukti sa jednim XTEN na željenim lokacijama bili su: pSD0050, pSD0001, pSD0039, pSD0010 i pSD0062. Konstrukti sa duplim XTEN na željenim mestima uključuju LSD0005.002, LSD0038.001, LSD0040.002, LSD0042.013, LSD0039.010, LSD0041.008, LSD0043.008, LSD0045.002, LSD0046.002 i LSD0044.002. Gradivni blokovi i restrikcioni enzimi za kloniranje konstrukata izabrani su, kako je navedeno u Tabeli 19 dole. Odabrane komponente su probavljene jedinstvenim restrikcijskim enzimima. DNK dodataka i vektora je odvojen sa 1% agaroznim gelom i prečišćen Qiagen gelom za ekstrakciju. Uložak i vektor su lizirani, a zatim transformisani u DH5α E. coli kompetentne ćelije domaćina. Četiri kolonije za svaki konstrukt analizirane su RCA i DNK sekvenciranjem. Klonovi sa željenim XTEN umetanjima su miniprepisani. Restriktivna varenja su zatim korišćena da se dodatno potvrdi integritet XTEN u svakom regionu.

Aminokiselina i kodirajuća DNK sekvence za rezultirajuće CFXTEN fuzione proteine su navedeni u Tabeli 21. Rezultirajući konstrukti su numerisani pSD0077 do pSD0092.

Konstruisanje BDD FVIII ekspresionih vektora sa 4-6 XTEN umetanjem na mestima

2 1

18, 403, 1656, 1720, 1900 ili 2332

[0411] Konstrukcije pSD0077 do pSD0092 služile su kao gradivni blokovi za generisanje 4-do 6-XTEN konstrukcija sa umetanjima u 18, 403, 1656, 1720, 1900 i 2332. Gradivni blokovi konstrukti i restrikcioni enzimi za kloniranje konstrukata izabrani su, kako je navedeno u Tabeli 19 dole. Odabrane komponente su probavljene jedinstvenim restrikcijskim enzimima. DNK dodataka i vektora je odvojen sa 1% agaroznim gelom i prečišćen Qiagen gelom za ekstrakciju. Uložak i vektor su lizirani, a zatim transformisani u DH5α E. coli kompetentne ćelije domaćina. Osam kolonija za svaki konstrukt analizirano je PCR kolonijom i DNK sekvenciranjem. Klonovi sa željenim XTEN umetanjima su miniprepisani. Restriktivna varenja su zatim korišćena da se dodatno potvrdi integritet XTEN u svakom regionu. Aminokiselina i kodirajuća DNK sekvence za rezultirajuće CFXTEN fuzione proteine su navedeni u Tabeli 21. Rezultirajući konstrukti su numerisani pBC0247 do pBC0257, pNL0022, 23, 24, 25, i 30

Konstruisanje BDD FVIII ekspresionih vektora sa 4-6 XTEN umetanjem na mestima 18, 403, 745, 1720, 1900 ili 2332

[0412] Konstrukcije pBC0247 do pBC0252, pBC0255, pNL0022 do pNL0025 služile su kao gradivni blokovi za generisanje 4- do 6-XTEN konstrukcija sa umetanjima u 18, 403, 745, 1720, 1900 i 2332. Gradivni blokovi konstrukti i restrikcioni enzimi za kloniranje konstrukata izabrani su, kako je navedeno u Tabeli 19 dole. Odabrane komponente su probavljene jedinstvenim restrikcijskim enzimima. DNK dodataka i vektora je odvojen sa 1% agaroznim gelom i prečišćen Qiagen gelom za ekstrakciju. Uložak i vektor su lizirani, a zatim transformisani u DH5α E. coli kompetentne ćelije domaćina. Osam kolonija za svaki konstrukt analizirano je PCR kolonijom i DNK sekvenciranjem. Klonovi sa željenim XTEN umetanjima su miniprepisani. Restriktivna varenja su zatim korišćena da se dodatno potvrdi integritet XTEN u svakom regionu. Aminokiselina i kodirajuća DNK sekvence za rezultirajuće CFXTEN fuzione proteine su navedeni u Tabeli 21. Rezultirajući konstrukti su numerisani pBC0258 do pBC0268.

Tabela 19: Dizajn kloniranja za biblioteke FVIII sa 3-5 XTEN umetanja na lokacijama 26, 403, 1656, 1720 ili 1900

2 2

2

Primer 23: Konstruisanje CFXTEN ekspresionih vektora sa tri ili četiri XTEN: prvi XTEN u B domenu, drugi XTEN na C-terminusu i treći ili četvrti XTEN umetanje unutar A1 ili A2 ili A3 domena

[0413] Biblioteke CFXTEN fuzionih proteina konstruisane su sa tri XTEN umetanja kombinovanjem kloniranih aktivnih klonova sa XTEN umetanjima u A1, A2 ili A3 domenima i klonovima sa XTEN ubačenim u B domenu i na C-terminusu. Konstruisane su dodatne biblioteke sa četvrtim XTEN dodanim u domenima A1, A2 ili A3 da bi odabrali članove 3 XTEN biblioteke. Dizajn šeme kloniranja rezimiran je u donjoj tabeli. DNK je

2 4

pripremljena za umetke i vektore vađenjem restrikcijskim enzimima i prečišćavanjem agaroznog gela. Posle vezivanja umetaka sa odgovarajućim vektorima, vezana DNK smeša je korišćena za transformaciju DH5α kompetentnih ćelija domaćina E. coli. Transformanti su pregledani RCA i sekvenciranjem da bi pokrili približno 3-4 puta veću potencijalnu veličinu biblioteke. Jedinstveni klonovi su identifikovani i mini pripremljeni. Tri različita restriktivna varenja zatim su korišćene za dalju potvrdu integriteta svakog XTEN. Aminokiselina i kodirajuća DNK sekvence za rezultirajuće CFXTEN fuzione proteine su navedeni u Tabeli 21.

Tabela 20: Dizajn kloniranja za FVIII biblioteke sa 3 XTEN umetanja na lokacijama B domena. C-terminusi i domen A1/A2/A3

2

2

2

2

Tabela 21: DNK i aminokiselinske sekvence FVIII-XTEN konstrukata

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

2

4

Primer 24: Transfekcija ćelija sisara, ekspresija FVIII-XTEN i procena aktivnosti FVIII

[0414] Ćelije sisara, uključujući, ali bez ograničenja na CHO, BHK, COS, i HEK293, pogodne su za transformaciju sa vektorima Primera koji su iznad navedeni, u cilju ekspresije i oporavka FVIII-XTEN fuzionog proteina. Slede detalji za metode koje se koriste za ekspresiju BDD FVIII i FVIII-XTEN fuzionih proteinskih konstrukcija pBC0114, pBC0135, pBC0136, pBC0137, pBC0145, pBC0146 i pBC0149 prolaznom transfekcijom, koja uključuje elektroporaciju i hemijsku (PEI) transfekciju.

[0415] Adherentne ćelije HEK293 kupljene od ATCC oživele su u medijumu preporuke prodavca i pasirale nekoliko generacija pre nego što su više bočica zamrznute u medijumu sa 5% DMSO. Jedna bočica je oživljena i pasirana još jednom pre transfekcije. HEK293 ćelije su postavljene 1-2 dana pre transfekcije, pri gustini od približno 7x 10<5>po ml u jednoj T175 po transfekciji, koristeći 35 ml medijuma. Na dan transfekcije ćelije su tripsinisane, odvojite i prebrojene, zatim isprane u podlozi dok nije postignuta ravnomerna ćelijska suspenzija.

Ćelije su brojene i odgovarajuća zapremina ćelija (na osnovu broja ćelija iznad) prebačene su u 50mL epruvetu za centrifugu, tako da je bilo oko 4 x 10<6>ćelija po transfekciji. Ćelije su centrifugirane 5 minuta na 500 RCF, supernatant je odbačen, a ćelije su resuspendovane u 10 ml D-PBS.

[0416] Elektroporacija: Za elektroporaciju, dodata je odgovarajuća zapremina pufera za resuspenziju pomoću mikropipete (koja se isporučuje u Neon™ transfekcionom sistemu 100 µL Kit), tako da je bilo dostupno 110 µL pufera po transfekciji. Odvojene količine 110 µl suspenzije ćelija dodate su u svaku Eppendorf epruvetu koja sadrži 11 µl plazmidne DNK za svaki od pojedinačnih FVIII-XTEN konstrukcija za ukupno 6 µg (zapremina DNK može biti manja, ks do 11 ul sa sterilnom H2O). Za transfekciju je korišćen Neon™ uređaj za transfekciju. Program je bio postavljen na elektroporaciju na 1100v za širinu impulsa od 20 ms, za ukupno dva impulsa. Neon™ epruveta (isporučena u Neon™ sistemu za transfekciju 100 µL Kit) je postavljena u Neon™ pipetsku stanicu. Zapremina od 3 mL elektrolitičkog pufera E2 (isporučen u Neon™ Transfekcionom sistemu 100 µL Kit) je dodata u Neon™ epruvetu. Neon™ pipete i 100 ul Neon™ Tips korišćeni su za elektroporaciju 100 µL smeše DNK ćelije plazmida pomoću Neon™ pipetske stanice. Elektroporacija je izvršena i kada je završena, Neon™ pipeta je uklonjena sa stanice, a pipeta sa transfektiranim ćelijama korišćena je za prenošenje ćelija, kružnim pokretom, u petri ploču veličine 100 mm x 20 mm, koja sadrži 10 ml opti- MEM I redukovani serumski medijum (1X, Invitrogen), tako da su zaražene ćelije ravnomerno raspoređene na ploči. Ćelije za svaku transfekciju se inkubiraju na 37°C radi ekspresije. Trećeg dana nakon transfekcije, u svaku ćelijsku kulturu je dodan 10% volumen rastvora soli od 10 mM Hepes, 5 mM CaCl2i 4M NaCl i lagano je mešano tokom 30 minuta. Svaka ćelijska kultura prenesena je u konusnu epruvetu za centrifugu od 50 ml i centrifugirana je na 3000 o/min tokom 10 minuta na 4°C. Supernatanti svake kulture stavljeni su u novu konusnu epruvetu od 50 ml i zatim podeljeni u alikvote od 5x1 ml u Eppendorfu i 2x15 ml konusne epruvete za ispitivanje ili su fleš zamrznuti pre testiranja na ekspresiju FVIII-XTEN u ELISA i performanse u FVIII aktivnosti test, kao što je ovde opisano.

[0417] Hemijska transfekcija: Hemijska transfekcija se može postići standardnim postupcima poznatim u stanju tehnike. U ovom primeru, koristi se PEI, kako je opisano.

[0418] Suspenzija 293 ćelija se poseju dan pre transfekcije u 7 x 10<5>ćelija/mL u dovoljnom mediju Freestyle 293 (Invitrogen) da se obezbedi najmanje 30 ml radne zapremine i inkubiraju na 37°C. Na dan transfekcije, alikvotna količina 1.5 ml transfekcionog medijuma se drži na sobnoj temperaturi, kojoj se dodaje 90 µL 1 mg/ml PEI i kratko se meša.

Zapremina od 30 µl DNK koja kodira FVIII-XTEN_AE288 konstrukt (koncentracija 1 mg/ml) je dodata u rastvor PEI, koji se meša 30 sekundi. Smeša se drži na sobnoj temperaturi tokom 5-15 minuta. DNK/PEI smeša je dodata ćelijama HEK293 i suspenzija se inkubirala na 37°C korišćenjem unapred utvrđenih uslova za mućkanje. Otprilike četiri sata nakon dodavanja smeše DNK/PEI, dodaje se 1x zapremina ekspanzijske podloge i ćelije se inkubiraju na 37°C tokom 5 dana. Na dan žetve, ćelijskoj kulturi je dodan 10% volumen rastvora soli od 10 mM Hepesa, 5 mM CaCl2i 4M NaCl i lagano se mešati tokom 30 minuta.

Ćelijska kultura prenesena je u konusnu epruvetu za centrifugu od 50 ml i centrifugirana je na 4000 o/min tokom 10 minuta na 4°C. Supernatant stavljen u novu konusnu epruvetu od 50 ml i zatim podeljeni u alikvote od 5x1 ml u Eppendorfu i 2x15 ml konusne epruvete za ispitivanje ili su fleš zamrznuti pre testiranja na ekspresiju FVIII-XTEN u ELISA i performanse u FVIII aktivnosti test, kao što je ovde opisano.

Stvaranje stabilnih bazena i ćelijskih linija koje proizvode FVIII-XTEN

[0419] Stabilni bazeni se stvaraju kultivacijom transfektiranih ćelija tokom 3-5 nedelja u medijumu koji sadrži selektivne antibiotike, kao što je puromicin, sa promenama na sredinu svaka 2-3 dana. Stabilne ćelije se mogu koristiti ili za proizvodnju ili za stvaranje stabilnih klonova. Za stabilnu selekciju ćelijskih linija tokom primarnog skrininga, ćelije iz stabilnih bazena bilo tokom trajnog pasiranja ili oživljenih iz smrznutih bočica posejane su u pločice sa 96 udubljenja pri ciljanoj gustini od 0.5 ćelija/udubljenju. Otprilike nedelju dana nakon setve potrošene podloge iz udubljenja sa jednoćelijskim grozdom, posmatrano pod mikroskopom, testira se ekspresija FVIII analizom aktivnosti ili merenjem antigena.

[0420] Za dodatne runde skrininga, normalizovani broj ćelija se seji u ploče sa više udubljenja. Potrošena podloga se skuplja i ispituje na koncentraciju FVIII pomoću ispitivanja ELISA i FVIII aktivnosti. Ćelije će se takođe skupljati sa ploča i računati korišćenjem Vi-Cell. Klonovi su rangirani prema (1) FVIII titrima prema ELISA i aktivnosti; (2) odnosi ELISA titra/broja ćelija i titra aktivnosti/broja ćelija; i (3) integritet i homogenost proizvoda proizvedenih od strane klonova, mereno zapadnim blotovanjem. Brojni klonovi za svaki od konstrukata su izabrani iz primarne probe za dodatne runde skrininga.

[0421] Za drugi krug skrininga, ćelije u pločama sa 96 udubljenja za gornje klonove odabrane iz primarnog skrininga prvo se šire u T25 boce i zatim se seču u duplikatne pločice sa 24 udubljenja. Potrošena podloga se skuplja sa ploča za FVIII aktivnost i kvantifikaciju antigena i ćelije koje su sakupljane i brojene od strane Vi-Cell. Klonovi su rangirani i zatim odabrani prema titrima ELISA testom i aktivnošću, ELISA titrom/ćelijom i odnosima titra aktivnosti/broja ćelija. Smrznute bočice se pripremaju za najmanje 5-10 klonova, a opet su ti klonovi pregledani i rangirani prema titrima pomoću ELISA i aktivnosti, i odnosa ELISA titra/broja ćelija i titra aktivnosti/broja ćelija i integriteta proizvoda i homogenosti od zapadnog blotovanja, i odabire se 2-3 klona za procenu produktivnosti u tikvicama. Konačni klonovi se biraju na osnovu specifične produktivnosti i kvaliteta proizvoda.

Proizvodnja FVIII-XTEN izlučena u podlozi ćelijske kulture suspenzijom 293 stabilnih

1

klonova

[0422] HEK293 stabilni ćelijski klonovi odabrani iznad navedenim postupcima seju u tikvice sa 1-2 X 10<5>ćelija/ml u ekspresionoj podlozi. Broj ćelija, vitalnost ćelije, FVIII aktivnost i titri ekspresije antigena prate se svakodnevno. Na dan kada su aktivnost FVIII, titri antigena i kvaliteta proizvoda optimalni, kultura se sakuplja ili centrifugiranjem/sterilnom filtracijom ili dubinskom filtracijom/sterilnom filtracijom. Filtrat se ili odmah koristi za prečišćavanje i prečišćavanje tangencijalnog protoka (TFF) ili se čuva u zamrzivaču -80°C za kasnije obradu i prečišćavanje TFF.

Primer 25: Pročišćavanje i karakterizacija CFXTEN konstrukcija

[0423] Slede primerni postupci za prečišćavanje i karakterizaciju CFXTEN konstrukata sa jednim ili više XTEN.

Prečišćavanje FVII-XTEN AE864 pomoću afinitetne hromatografije FVIII

[0424] Supernatant koji sadrži CFXTEN se filtrira pomoću Cuno ZetaPlus Biocap filtera i Cuno BioAssure kapsule, a zatim se koncentriše tangencijalnom filtracijom protoka upotrebom Millipore Pellicon 2 Mini kertridža sa 30,000 Da MVCO. Upotrebom iste patrone za filtriranje tangencijalnog protoka uzorak se filtrira u 10 mM histidina, 20 mM kalcijumhlorida, 300 mM natrijum-hlorida i 0.02% Tween 80 pri pH 7.0. FVIII selektorska smola (GE 17-5450-01) selektivno veže FVIII ili B domen izbrisan FVIII koristeći 13kDa rekombinantni protein ligand spojen sa hromatografskom smolu. Smola je izbalansirana sa 10 mM histidina, 20 mM kalcijum hlorida, 300 mM natrijum hlorida i 0.02% Tween 80 pri pH 7.0 i napunjena supernatant. Kolona se ispere sa 20 mM histidina, 20 mM kalcijum-hlorida, 300 mM natrijum-hlorida i 0.02% Tween 80 pri pH 7.0, zatim se ispere sa 20 mM histidina, 20 mM kalcijum-hlorida, 1.0 M natrijum-hlorida i 0.,02% Tween 80 na pH 7,0 i eluirano sa 20 mM histidina, 20 mM kalcijum hlorida, 1.5 M natrijum hlorida i 0.02% Tween 80 rastvoreno u 50% etilen glikola pri pH 7.0.

Koncentracija i izmena pufera tangencijalnom filtracijom protoka i dijafiltracijom [0425] Serije supernatanta ukupne zapremine najmanje 10 L, iz stabilnih CHO ćelijskih linija koje izražavaju CFXTEN, filtrirane su koristeći Cuno ZetaPlus Biocap filter i Cuno BioAssure kapsulu. Oni se zatim koncentrišu približno 20 puta tangencijalnom filtracijom protoka pomoću Millipore Pellicon 2 Mini uloška sa 30,000 Da MWCO. Upotrebom istog uloška za filtriranje tangencijalnog protoka uzorak se filtrira sa 10 mM histidina, 20 mM kalcijum-hlorida, 300 mM natrijum-hlorida i 0.02% Tween 80 pri pH 7.010 mM tris pH 7.5, 1 mM EDTA sa 5 zapremina u vrednosti razmena pufera . Uzorci su podeljeni u alikvote od 50 ml i zamrznuti na -80°C.

11

Koncentracija i izmena pufera tangencijalnom filtracijom protoka i dijafiltracijom [0426] Korišćenjem Akta FPLC sistema, uzorak se prečišćava kolonom SuperQ-650M.

Kolona je izbalansirana u pufer A (0.02 mol/L imidazola, 0.02 mol/L glicin etil ester hidrohlorida, 0.15 mol/L, NaCl, 2.5% glicerola, pH 6.9) i uzorak je napunjen. Uzorak se eluira pomoću pufera B (5 mmol/L histidin HCl (His/HCI), 1.15 mol/L NaCl, pH 7.0).215 nm hromatogram koristi se za nadgledanje profila elucije. Eluirane frakcije su ispitivane na FVIII ELISA, SDS-PAGE ili testom aktivnosti. Vršne frakcije se skupljaju i skladište ili podvrgavaju aktiviranju trombina odmah (O'Brien i dr., Blood (1990) 75:1664-1672).

Frakcije se testiraju na FVIII aktivnost korišćenjem aPTT faktora. Izvršen je Bradford test kako bi se utvrdila ukupna količina proteina u frakcijama opterećenja i elucije.

Prečišćavanje CFXTEN hidrofobnom interakcionom hromatografijom

[0427] CFXTEN uzorci u puferu A (50 mmol/l histidina, 1 mmol/l CaCl 2, 1 M NaCl i 0.2 g/l Tween 80®, pH 7.0) se učitavaju u toiopearl eter 650M smolu uravnoteženu u puferu A. Kolona se ispira sa 10 zapremina u koloni pufera A da bi se uklonila DNK, nepravilno presavijeni oblici i FVIII i ostali kontamirani proteini. CFXTEN se eluira sa puferom B (25 mmol/l histidina, 0.5 mmol/l CaCl 2 i 0.4 mol/l NaCl, pH 7.0) kao eluacija u jednom koraku (patent SAD 6005082). Frakcije se testiraju na FVIII aktivnost korišćenjem aPTT faktora. Izvršen je Bradford test kako bi se utvrdila ukupna količina proteina u frakcijama opterećenja i elucije.

Uklanjanje agregiranog proteina iz monomernog CFXTEN hromatografijom sa anjonskom razmenom

[0428] Korišćenjem Akta FPLC sistema, uzorak se prečišćava kolonom macrocap Q. Kolona je uravnotežena u puferu A (20 mM MES, 1mM CaCl2, pH 7.0) i uzorak je napunjen. Uzorak se eluira linearnim gradijentom od 30% do 80% pufera B (20 mM MES, 1mM CaCl2, pH 7.0 500 mM NaCl) zapremina preko 20 kolona.215 nm hromatogram koristi se za nadgledanje profila elucije. Frakcije koje odgovaraju ranom delu elucije sadrže pre svega monomerni protein, dok kasniji deo elucije sadrži pre svega agregirane vrste. Frakcije iz makrocapQ kolone analiziraju se pomoću hromatografije za isključivanje veličine sa 60 cm BioSep G4000 kolonom kako bi se odredilo na koji se objedinjuje da bi se stvorio agregatni slobodni uzorak.

Aktivacija FVIII pomoću trombina

[0429] Prečišćeni FVIII u 5 mmol/L histidin HCl (His/HCI), 1,15 mol/L NaCl, pH 7.0 se tretira trombinom u odnosu 1: jedinica humanog trombina i jedinica FVIII, a uzorak se inkubira na 37°C do 2 sata. Da bi se nadgledao postupak aktivacije, alikvoti ovog uzorka su

12

povučeni i aceton istaloženi dodatkom 4.5 zap. ledenog acetona. Uzorak se inkubira na ledu tokom 10 minuta, a talog se sakupi centrifugiranjem na 13.000 g u mikrofugi tokom 3 minuta. Aceton je uklonjen, a talog je ponovo suspendiran u 30 µL SDS-PAGE redukovanjem puferu uzorka i prokuvan tokom 2 minuta. Zatim se uzorci testiraju SDS-PAGE ili zapadnim blotovanjem. Konverzija FVIII u FVIIIa ispituje se pretvaranje teškog lanca u fragmente od 40 i 50 kDa i pretvaranje lakog lanca u fragment od 70 kDa.

SEC analiza CFXTEN

[0430] FVII-XTEN prečišćen afinitetom i hromatografijom za razmenu anjona analizira se hromatografijom za isključivanje veličine sa 60 cm BioSep G4000 kolonom.

Monodisperzirana populacija sa hidrodinamičkim radijusom odf ∼10 nm/prividni MW ∼1.7 MDa (XTEN-288 fuzija) ili ∼12 nm/prividni MW 5.3 MDa (XTEN-864 fuzija) ukazuje na uzorak bez agregacije. CFXTEN očekuje se da ima faktor molekulske težine do ili oko 8 (za fuziju XTEN-288 sa FVIII) ili do ili oko ∼15 (za XTEN-864 fuziju sa FVIII).

Određivanje koncentracije CFXTEN na osnovu ELISA

[0431] Kvantitativno određivanje koncentracija antigena faktora VIII/CFXTEN korišćenjem imuno-sorbentnog testa za dvostruko antitelo (ELISA) vrši se korišćenjem dokazanih parova antitela (VisuLize™ FVIII komplet antigena, Affinity Biologicals, Ontario, Kanada).

Prugasta udubljenja su prethodno obložene ovčjim poliklonskim antitelom na humani FVIII. Uzorci plazme se razblažuju i nanose u udubljenja. Prisutan antigen FVIII vezuje se za obloženo antitelo. Nakon ispiranja nevezanog materijala, naneseno je antitelo za detekciju peroksidaze i dozvoljeno je da se veže za zarobljeni FVIII. Udubljenja se ponovo isperu i nanese se rastvor TMB (peroksidazni supstrat tetrametilbenzidin) i ostavi se da reaguje tokom određenog vremenskog perioda. Razvija se plava boja koja se menja u žutu posle gašenja reakcije sa kiselinom. Formirana boja se meri spektrofotometrijski u čitaču mikroploča na 450 nm. Apsorbancija na 450 nm direktno je proporcionalna količini antigena FVIII zarobljenog u udubljenje. Ispitivanje se kalibrira pomoću kalibrator plazme koja je data u kompletu ili zamenom CFXTEN standarda u odgovarajućoj matrici.

Procena CFXTEN aktivnosti pomoću analize FXa spojenih hromogenih supstrata [0432] Korišćenjem Chromogenix Coamatic Factor VIII (Chromogeniy, cat# 82258563) aktivnost FVIII ili CFXTEN koja sadrži FVIII procenjuje se na sledeći način. U prisustvu jona kalcijuma i fosfolipida, faktor X se aktivira na faktor Xa faktorom IXa. Ovu aktivaciju uveliko podstiče faktor VIII koji u ovoj reakciji deluje kao kofaktor. Korišćenjem optimalnih količina Ca<2+>, fosfolipida i faktora IXa i viška faktora X, brzina aktivacije faktora X linearno

1

je povezana sa količinom faktora VIII. Faktor Xa hidrolizira hromogeni supstrat S-2765 i tako oslobađa hromofornu grupu, pNA. Zatim se boja očitava spektrofotometrijski na 405 nm. Stvoreni faktor Xa, a samim tim i intenzitet boje, proporcionalan je aktivnosti faktora VIII u uzorku. Hidroliza S-2765 formiranim trombinom sprečava se dodavanjem sintetičkog inhibitora trombina I-2581 zajedno sa supstratom. Aktivnost nepoznatog uzorka određuje se upoređivanjem konačnog A405 tog uzorka sa onim iz standardne krive konstruirane iz poznatih količina FVIII. Takođe određivanjem količine antigena FVIII prisutnog u uzorcima (preko A280 ili ELISA), određuje se specifična aktivnost uzorka da bi se razumela relativna moć određenog preparata FVIII. To omogućava da se proceni relativna efikasnost različitih strategija izolacije ili konstrukcije dizajna za CFXTEN fuziju za aktivnost i rangira se.

aPTT analiza zasnovana na određivanju CFXTEN aktivnosti

[0433] CFXTEN deluje kao zamena FVIII u unutrašnjem ili koagulacijskom putu aktiviranom kontaktom. Aktivnost ovog puta koagulacije se procenjuje korišćenjem aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (aPTT). FVIII aktivnost se posebno meri na sledeći način: standardna kriva se priprema razblaživanjem normalne kontrolne plazme (pacifička hemostaza cat# 100595) dvostruko sa plazmom deficitarnom FVIII (cat# 100800), a zatim se izvrši 6-četvorostruka serijska razblaženja ponovo sa plazmom deficitarnim faktorom VIII. Ovo stvara standardnu krivu sa tačkama aktivnosti 500, 130, 31, 7.8, 2.0, 0.5 i 0.1 IU/ml aktivnosti, pri čemu se jedna jedinica aktivnosti definiše kao količina FVIIIC aktivnosti u 1 ml normalne humane plazme. Takođe je uključena i plazma deficitarna FVIII da se odredi pozadinski nivo aktivnosti u nultoj plazmi. Uzorak se priprema dodavanjem CFXTEN u plazmu deficitarnu FVIII u odnosu 1:10 po zapremini. Uzorci su testirani koristeći aPTT test na sledeći način. Uzorci se inkubiraju na 37°C u spektrofotometru za čitanje ploča sa molekularnim uređajima tokom 2 minuta, nakon čega se dodaje jednaka zapremina aPTT reagensa (Pacific Hemostasis cat # 100402) i izvršava se dodatna 3-minutna 37C inkubacija. Posle inkubacije, test se aktivira dodavanjem jedne zapremine kalcijum hlorida (Pacifičke hemostaze cat # 100304). Zamućenost se prati na 450 nm tokom 5 minuta radi stvaranja profila reakcije. APTT vreme, odnosno vreme do početka aktivnosti zgrušavanja, je definisano kao prvi put gde se OD405 nm povećao za 0.06 u odnosu na osnovnu liniju. Dnevnik - linearna standardna kriva kreira se sa logom aktivnosti koja se linearno odnosi na vreme aPTT. Iz toga se određuje aktivnost uzorka u pločici i zatim se aktivnost u uzorku određuje množenjem sa 11 da bi se računalo razblaživanje u plazmi deficitarnoj FVIII. Takođe određivanjem količine antigena FVIII prisutnog u uzorcima (preko A280 ili ELISA), određuje se specifična aktivnost uzorka da bi se razumela relativna

14

moć određenog preparata FVIII. To omogućava da se proceni relativna efikasnost različitih strategija izolacije ili konstrukcije dizajna za CFXTEN fuziju i rangira se.

Analiza zapadnog blotovanja FVIII/FVIII-XTEN eksprimiranih proteina

[0434] Uzorci su vođeni na 8% homogenom SDS gelu i potom prebačeni na PVDF membranu. Uzorci u trakama 1-15 bili su: MW Standardi, FVIII(42.5 ng), pBC0100B, pBC0114A, pBC0100, pBC0114, pBC0126, pBC0127 (8/5/11; #9), pBC0128, pBC0135, pBC0136, pBC0137, pBC0145, pBC0149, i pBC0146, respektivno. Membrana je u početku blokirana sa 5% mleka, a zatim je ispitivana anti-FVIII monoklonskim antitelom, GMA-012, specifičnim za A2 domen teškog lanca (Ansong C, Miles SM, Fai PJ.J Thromb Haemost. 2006 Apr;4(4):842-7). Umetanje XTEN288 u B-domenu primećeno je za pBC0136 (linija 8, Sl. 22) i pBC0137 (linija 9, Sl.22), dok je umetanje XTEN288 na C-terminus primećeno za pBC0146 (linija 12, Sl.22). Svi ispitivani proteini FVIII-XTEN otkrili su prisustvo jednolančanog proteina molekulske mase najmanje 21 kDa veće od pBC0114 bazne konstrukcije ili FVIII standarda. Pored toga, primećeno je umetanje AE42 za pBC0135 (linija 7, Sl.22) i pBC0149 (linija 11, Sl.22) sa jednim lancem koji ima ∼5 kDa veći od proteina pBC0114 baznog proteina i teškim lancem koji radi na ∼5 kDa većim od 90 kDa opsega baznog proteina.

Analiza ispoljenog FVIII pomoću ELISA

[0435] Da bi se verifikovala i kvantifikovala ekspresija FVIII-XTEN fuzionih proteina konstrukata pomoću ćelijske kulture, ustanovljen je test ELISA. Hvatanje antitela, bilo SAF8C-AP (Affiniti Biologicals), ili GMA-8002 (Green Mountain antitela), ili GMA011 antitela (Green Mountain antitela) za FVIII-LC ELISA) ili GMA016 antitela su imobilisane na udubljenja ELISA ploče. Udubljenja su zatim inkubirana sa blokirajućim puferom (1x PBS/3% BSA) da se spreči nespecifično vezivanje drugih proteina za antitelo FVIII.

Standardna razblaženja FVIII (∼50 ng-0.024 ng opseg), kontrole kvaliteta i uzorci podloge ćelijske kulture zatim su inkubirani tokom 1.5 h u udubljenjima da se omogući vezivanje eksprimiranog proteina FVIII na obloženo antitelo. Dobro su isprani otvori, a vezani protein se inkubira sa anti-FVIII antitelom za detekciju, SAF8C-Biotinylated (Affinity Biologicals). Zatim se streptavidin-HRP, koji veže biotin konjugiran na antitelo za detekciju FVIII, dodaje u udubljenje i inkubira tokom 1 sata. Konačno, OPD supstrat se dodaje u udubljenja i njegova hidroliza HRP enzimom se prati čitačem ploča na talasnoj dužini od 490 nm. Koncentracije uzoraka koji sadrže FVIII zatim su izračunati upoređivanjem kolorimetrijskog odgovora pri svakom razblaženju kulture sa standardnom krivom. Rezultati, u Tabeli 22, niže, pokazuju da

1

se FVIII-XTEN različitih konstrukata izražava u 0.4 - 1 µg/ml u podlozi ćelijske kulture. Rezultati dobijeni ELISA i podaci o aktivnosti pokazuju da su fuzioni proteini FVIII-XTEN vrlo dobro eksprimirani pomoću opisanih postupaka transfekcije. Nadalje, pod eksperimentalnim uslovima, rezultati pokazuju da su vrednosti specifične aktivnosti proteina FVIII-XTEN slične ili veće od vrednosti pBC0114 bazne konstrukcije (izražavajući BDD FVIII) i podržavaju ubacivanje XTEN u C-terminusu ili B-domenu FVIII rezultira očuvanjem funkcije proteina FVIII.

Hromogena analiza aktivnosti za fuzioni protein CFXTEN

[0436] BDD FVIII i CFXTEN fuzioni proteinski konstrukti pBC0114, pBC0135, pBC0136, pBC0137, pBC0145, pBC0146 i pBC0149, u različitim konfiguracijama, uključujući XTEN AE288 i AG288 koji su ubačeni na C-terminus FvIII FDIII proteina FVIII BD-FTIII i AE288 ubačeni posle ostatka 745 (ili ostatka 743) i pre ostatka 1640 (ili ostatka 1638) B-domene (uključujući konstrukte sa P1648 mesta za obradu mutiranih na alanin), izraženi su u prolazno transficiranim ćelijama Freestyle 293, kako je iznad opisano i testirano na aktivnost prokoagulanse. Prokoagulantna aktivnost svakog proteina FVIII-XTEN prisutnog u medijumu ćelijske kulture procenjena je korišćenjem Chromogenix Coamatic® Factor VIII testa, testa u kojem je aktiviranje faktora X bilo linearno povezano sa količinom faktora VIII u uzorku. Ispitivanje je izvedeno prema uputstvima proizvođača koristeći postupak krajnje tačke, koja je merena spektrofotometrijski na OD405 nm. Standardna kriva je stvorena korišćenjem prečišćenog proteina FVIII u koncentracijama 250, 200, 150, 100, 75, 50, 37.5, 25, 12.5, 6.25, 3.125 i 1.56 mU/ml. Razblaženja standarda faktora VIII, kontrole kvaliteta i uzoraka su pripremljeni pomoću pufera za ispitivanje i medijuma za PEI kulturu da bi se odrazio efekat podloge na performanse ispitivanja. Pozitivne kontrole sastoje se od prečišćenog proteina faktora VIII u koncentracijama 20, 40 i 80 mU/ml i podloge ćelijske kulture pBC0114 FVIII bazne konstrukcije, a nedostaju mu XTEN insercije. Negativne kontrole sastojale su se od samog pufera za analizu ili PEI kulture. Podloge ćelijske kulture konstrukata FVIII-XTEN su dobijeni kao što je iznad opisano, i testirani su u replikama u razređenjima 1:50, 1:150 i 1:450, a aktivnost svake od njih je izračunata u U/ml. Svaka konstrukcija FVIII-XTEN pokazala je prokoagulantnu aktivnost koja je bila najmanje uporediva, a u nekim slučajevima i veća od one pozitivne kontrole bazne konstrukcije, i podržavaju da u uslovima eksperimenata, veza XTEN, uključujući AE288 ili AG288, na C-terminus FVIII ili ubacivanje XTEN, uključujući AE42 ili AE288 unutar B-domena, rezultiralo je zadržavanjem ili čak pojačavanjem FVIII prokoagulacione aktivnosti Tabela 22: Rezultati ispitivanja ELISA i hromogenih FVIII aktivnosti

1

Coatest test za analizu uzorka ćelijske kulture koji sadrži CFXTEN fuzioni protein [0437] Korišćenjem Coatest testa, aktivnost FVIII ili CFXTEN koja sadrži FVIII procenjuje se na sledeći način.

1

[0438] Matrica ispitivanja: Sva udubljenja u istoj ploči su podešene na isti procenat podloge da se kontroliše efekat matrice. Ispitni uzorci su razblaženi tako da će očitavanje OD405 pasti unutar linearnog opsega standarda. Raspon koncentracija za FVIII standard bio je 100 mU/mL do 0.78 mU/mL, pripremljen četvorostrukim serijskim razblaživanjem FVIII standarda u IX Coatest puferu (DiaPharma) plus unapred određenom procentu kulture podloge.

[0439] Paket reagensa Coatest SP FVIII (DiaPharma) uključuje 10x Coatest puferni rastvor, faktor IXa faktor X, fosfolipid, CaCl2i supstrat. 1x Coatest rastvor je pripremljen dodavanjem 9Ks zapremine hladnog ddH2O u IX zapreminu zaliha. Podloga ćelijske kulture zatim je dodan u pripremljeni IX rastvor u unapred određenom odnosu da bi se normalizovao procenat matriksa u svim test udubljenjima. Faktor IXa faktor X, fosfolipid i supstrat su rekonstituisani u skladu sa preporukama proizvođača.

Postupak ispitivanja Coatest:

[0440] Ispitni reagensi su pripremljeni i držani na ledu dok nije potrebno.25 ul razblaženih testnih uzoraka i standarda dodato je u ploču sa 96 udubljenja u duplikatu. U svako udubljenje je dodato 50 ul fosfolipida/faktora IXa/faktor X i mešano nežnim tapkanjem po strani ploče. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 5 minuta na 37°C grejaču. U svako udubljenje je dodato 25 µl CaCl2i mešano. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 5 minuta na grejaču ploči. Zatim je dodato 50 µl supstrata u svako udubljenje , mešano i ploče su inkubirane na 37°C tokom dodatnih 5-10 minuta dok gornji standard nije stvorio očitavanje OD405 od oko 1.5. U svako udubljenje je dodavano 25 µl 20% sirćetne kiseline uz mešanje da bi se zaustavila reakcija i otvori su očitani na OD405 korišćenjem spektrofotometra SpectraMAX® plus (Molecular Devices). Analiza podataka izvršena je pomoću SoftMax programa (verzija 5.2). LLOQ je varirao po ispitivanju, ali generalno je iznosio 0.0039 IU/ml.

[0441] Rezultati: Podaci su predstavljeni u Tabelama 23-26. Tabela 23 prikazuje rezultate iz CFXTEN fuzionih proteina sa XTEN ubačenim na pojedinačna mesta izabrana na osnovu ovde opisanih kriterijuma, uključujući Primer 34. Pozitivna kontrola pBC00114 FVIII pokazala je dobru ekspresiju i FVIII aktivnost. Od ispitivanih 106 jednostrukih XTEN fuzionih proteina, 68% je zadržalo merljivu FVIII aktivnost, pri čemu 30% pokazuje aktivnost 3+ do 4+ u testu koagulacije. Trideset i jedan procenat ispitanih fuzionih proteina imao je rezultate ispod granica kvantizacije (što može biti posledica loše ekspresije, što se odražava na odgovarajuće rezultate ELISA ekspresije). Sve četiri konstrukcije za umetanje B

1

domene pokazale su dobru aktivnost, kao i konstrukcije povezane na C-terminusu, što ukazuje da su to verovatno povoljna mesta umetanja

[0442] Rezultati podataka o mestu jednog umetanja vodili su kreiranje XTEN konstrukcija sa 2 XTEN umetanja, čiji su rezultati predstavljeni u Tabeli 24. Sveukupno, stopa pozitivnosti je bila 67%, pri čemu je 31% fuzionih proteina pokazalo aktivnost 3+ do 4+ u testu koagulacije.

[0443] Rezultati podataka prethodno datim podacima vodili su kreiranje XTEN konstrukcija sa 3 XTEN umetanja, čiji su rezultati predstavljeni u Tabeli 25. Sveukupno, 92% uzoraka je imalo merljivu FVIII aktivnost, pri čemu je potpuno 79% pokazalo aktivnost 3+ do 4+ u testu koagulacije.

[0444] Ograničeni broj konstrukata sa 4 XTEN ubačenih u domene A1, A2 i A3 je stvoren i testiran, pri čemu 4 od 5 pokazuju FVIII aktivnost (Tabela 26), što sugeriše da ubacivanje više XTEN ne ugrožava sposobnost nastalih fuzionih proteina da zadrži FVIII aktivnost.

[0445] Zaključci: U uslovima eksperimenata, rezultati podržavaju da su kriterijumi korišćeni za izbor mesta umetanja XTEN validni, da je ubacivanje jednog ili više XTEN u odabrana mesta FVIII verovatnije nego da će rezultirati zadržavanjem aktivnosti prokoagulanta rezultirajućih CFXTEN molekul i čini se da ubacivanje tri XTEN dovodi do većeg udela fuzionih proteina koji zadržavaju visoke nivoe FVIII prokoagulacione aktivnosti u poređenju sa jednostrukim ili dvostrukim XTEN konstrukcijama za ubacivanje.

Tabela 23: Rezultati ispitivanja koagulacione aktivnosti za CFXTEN koji sadrže jedan

XTEN

1

2

21

22

Tabela 24: Rezultati ispitivanja koagulacione aktivnosti za CFXTEN koji sadrže dva

XTEN

2

24

2

2

2

Tabela 25: Rezultati ispitivanja koagulacione aktivnosti za CFXTEN koji sadrže tri

XTEN

2

2

Tabela 26: Rezultati ispitivanja koagulacione aktivnosti za CFXTEN koji sadrže četiri

XTEN

1

2

4

Primer 26: Određivanje XTEN radijusa i srodnih parametara

[0446] Da bi se utvrdili hidrodinamički radijusi XTEN komponenata fuzionih proteina CFXTEN i kako vrednost više XTEN u odnosu na pojedinačni XTEN varira, kreiran je niz formula na osnovu empirijski izvedenih podataka iz ispitivanja hromatografije isključenja veličine raznih fuzionih proteina koji sadrže jedan ili više XTEN. Veruje se da ugradnja više XTEN u CFXTEN obezbeđuje veći ukupni hidrodinamički radijus komponente XTEN u poređenju sa CFXTEN sa manje XTEN, a ima približno isti ukupan broj XTEN aminokiselina. Izračunava se maksimalni radijus jednog XTEN polipeptida (u daljem tekstu „XTEN radijus“) prema formuli datoj u Jednačini II:

[0447] Izračunava se zbir maksimalnog XTEN radijusa za sve XTEN segmente u CFXTEN (u daljem tekstu: „Suma XTEN radijusa“) u skladu sa formulom koja je data u Jednačini III:

gde: n = broj XTEN segmenata

i i je iterator

[0448] Izračunava se odnos SUM XTEN radijusa CFXTEN koji sadrži više XTEN i radijusa XTEN za jedan XTEN ekvivalentne dužine (u ukupnim aminokiselinskim ostacima u odnosu na CFXTEN) (u daljem tekstu „Odnos XTEN Radijusa") prema formuli datoj u Jednačini IV:

gde: n = broj XTEN segmenata

i i je iterator

[0449] Rezultati: Jednačina II primenjena je na XTEN dužine 144, 288, 576 i 864. Rezultati su predstavljeni u Tabeli 27. Jednačina IV primenjena je na različite CFXTEN fuzione proteine ovde opisane sa dva, tri ili četiri XTEN. Odnos XTEN radijusa ima vrednost 1 za sve CFXTEN koji sadrže jedan XTEN. Odnosi XTEN radijusa su predstavljeni u tabeli 28.

Odnos XTEN radijusa za pSD0092, koji sadrži 5 XTEN umetanja, ima vrednost 3.31.

Kolektivno, rezultati pokazuju da uključivanje više XTEN radijusa povećava odnos XTEN na vrednosti veće od 2, sa četiri umetanja što rezultira višim vrednostima od tri umetanja.

Tabela 27: Rezultati računanja radijusa za CFXTEN koji sadrže XTEN

Tabela 28: Rezultati računanja radijusa za CFXTEN koji sadrže XTEN

4

41

42

4

44

4

4

4

4

4

Primer 27: Interferencija vezivanja FVIII-XTEN za antitelo anti-FVIII

[0450] Sposobnost XTEN ubačenog na različite lokacije CFXTEN fuzionih proteina da utiču na vezivanje anti-FVIII antitela određena je testom ELISA sendviča. Dva anti-FVIII antitela; tj. GMA-8021 (Green Mountain antitela, Burlington, VT) i ESH8 (American Diagnostica Inc., Stamford, CT), koji se vezuju za A2 i C2 domene, odnosno, korišćeni su kao hvatanje antitela. Ne-XTEN koji sadrži protein FVIII-His-Myc korišćen je kao standard kalibracije i pozitivna kontrola za sve ELISA. Napravljeno je deset CFXTEN fuzionih proteina sa jednim XTEN umetanjem bilo u A1, A2 ili A3 domenu koji dodatno sadrže His i Myc oznake afiniteta. Koncentracije proteina svakog ispitnog uzorka su normalizovane na 100% na osnovu anti-His hvatanja-anti-Myc detekcije ELISA rade istovremeno na istoj ploči kao i anti-Myc hvatanje antitela ELISA.

[0451] Ukratko, odgovarajući otvori na ploči sa 96 udubljenja su obloženi GMA-8021, ESH8 ili anti-His antitelom preko noći na 4°C, a zatim su isprani i blokirani BSA. Jednake količine odgovarajućih kontrolnih ili fuzionih proteina su unete u dupla udubljenja i ostavljene su da stupe u interakciju sa obloženim GMA-8021, ESH8 ili anti-His antitelom u trajanju od 2 sata na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije, nepovezani materijal je ispran i dodato je zečje anti-Mic antitelo za detekciju i inkubirano tokom dodatnih sat na sobnoj temperaturi. Ploča je zatim isprana i sekundarno antitelo konjugirano na peroksidazu, magareće antitelo i inkubirano je 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploča je ponovo isprana, zatim dodatkom TMB supstrata i reakcija je ostavljena da traje 5-20 minuta. H2SO4 je uveden da zaustavi reakciju i apsorbancija je očitana spektrofotometrom na 450 nm.

[0452] Rezultati: Rezultati su predstavljeni u Tabeli 29. Kolektivno, rezultati pokazuju da su dva antitela protiv CFXTEN fuzionih proteina sa XTEN ubačenim u A2 domen pokazala smanjeno vezanje FVIII u poređenju sa CFXTEN sa XTEN ubačenim u domen A1 ili A3 kada je antitelo za hvatanje protiv FVIII bilo GMA-8021 (sa afinitetom vezivanja za A2 domen). Suprotno tome, nije bilo uočljivog uzorka inhibicije ili poboljšanja vezivanja bilo kog od CFXTEN kada je antitelo za hvatanje protiv FVIII bilo ESH8, sa afinitetom vezanja za C2 domen.

Tabela 29: Interferencija vezivanja FVIII-XTEN za antitelo anti-FVIII

Primer 28: Analiza aktivnosti CFXTEN fuzionih proteina u prisustvu FVIII inhibitora

Postupak titracije inhibitora:

[0453] Odabrana antitela koja inhibiraju aktivnost prokoagulanta FVIII nabavljena su od komercijalnih izvora. Antitela ciljaju domene FVIII (npr. A2, A3, C1, C2) i inhibiraju prokoagulantnu aktivnost zavisnu od FVIII. Da bi se uspostavila optimalna koncentracija

1

FVIII inhibitora za upotrebu u testu, izveden je početni eksperiment titracije korišćenjem različitih količina svakog inhibitornog antitela inkubiranog na 37°C tokom 2 sata sa baznim vektorom koji eksprimira divlji tip FVIII sa His/Myc dvostruka oznaka, a drugi uzorak sa antitelom i najmanje jednim CFXTEN fuzionim proteinom. Uzorci su potom upotrebljeni u testu koagulacije da se odredi aktivnost FVIII. Aktivnost je merena postupkom Coatest testa koji je ovde opisan. Koncentracija koja je rezultirala optimalnom inhibicijom FVIII aktivnosti određena je za svako antitelo pojedinačno.

Procedura testiranja inhibitora:

[0454] Antitela za inhibitor FVIII su zatim korišćena u optimalnoj koncentraciji za ispitivanje uzoraka. CFXTEN i pozitivni kontrolni uzorci su pojedinačno inkubirani sa svakim antitelom na 37°C tokom 2 sata, a uzorci su zatim sakupljeni i korišćeni u testu Coatest aktivnosti, zajedno sa neobrađenim alikvotima CFXTEN i pozitivnom kontrolom. U nekim slučajevima, CFXTEN konstrukcije sa mutacijom R1648A testirane su da bi se utvrdio efekt ove mutacije na rezistenciju na inhibitore, mereno zadržavanjem aktivnosti FVIII.

Rezultati:

[0455] Rezultati eksperimenta titracije prikazani su na Sl.26. Podaci ukazuju na pomak desne strane od približno 0.7 veličine antitela potrebnog da inhibira prokoagulantnu aktivnost CFXTEN LSD0049.002 na nivo od 50%, u poređenju sa FVIII pozitivnom kontrolom, što ukazuje da CFXTEN sa tri XTEN umetanja (u tačkama umetanja koje odgovaraju aminokiselinskim ostacima 18, 745 i 2332 BDD-FVIII) imalo je niže vezivanje sa antitelom u poređenju sa FVIII, što se ogleda u zadržavanju aktivnosti koagulacije.

[0456] Rezultati ispitivanja Coatest prikazani su u Tabelama 30 i 31, za antitela za inhibitor FVIII GMA8008 i GMA8021, respektivno. Sve ispitivane neobrađene CFXTEN konstrukcije fuzionog proteina su pokazale prokoagulansku aktivnost, kao i pozitivna kontrola pBC00114 FVIII. Pozitivni kontrolni uzorak pre inkubiranja antitela za inhibitor FVIII rezultirao je naglim padom izmerene aktivnosti koagulacije na 0.05-0.15 (5-15%) u odnosu na neobrađeni uzorak, kao i većina CFXTEN konstrukcija tretiranih antitelom GMA8008 na C2 domen. Međutim, tri CFXTEN fuziona proteina zadržala su najmanje dvostruko veću preostalu aktivnost u poređenju s kontrolom FVIII; LSD0049.020, LSD0053.024 i LSD0056.025, svaki sa tri XTEN umetanja.

[0457] CFXTEN uzorci su pokazali niži stepen inhibicije antitela GMA8021 na domenu A2 u poređenju sa neobrađenim uzorcima koji je dodatno smanjen ili dodatnim brojem XTEN

2

umetanja (tabelarni podaci prikazani u Tabeli 30). Sl.29 prikazuje grafik srednjih vrednosti odnosa za kontrolu zadržane aktivnosti koji pokazuje linearni odnos između broja XTEN koji je ubačen i smanjene inhibicije prema GMA8021 antitelu u odnosu na inhibiciju FVIII kontrole. Slično tome, sredstva S.E. za odnos prema kontrolnim vrednostima je bio 2.26 ± 0.12 za 1 XTEN, 3.48 0.26 za 2 XTEN i 5.70 ± 0.29 za 3 XTEN umetanja. CFTXEN sa najmanje tri XTEN umetka tretirana antitelom GMA8021 imao je najmanje 4.5 do 9.2 puta veće zadržavanje aktivnosti FVIII u poređenju sa kontrolom FVIII. Pored toga, kod onih CFXTEN sa tri XTEN umetanja, izgledalo je da konstrukcije sa većim stepenom razdvajanja (u broju aminokiselinskih ostataka) između bilo koje dve insercije rezultiraju većim stepenom aktivnosti prokoagulanse i, samim tim, manjim vezivanjem FVIII inhibitorom antitela, u poređenju sa insercijama koje su pobliže grupisane; na primer na strani C-terminusa B domena. Rezultati ispitivanja konstrukata sa mutacijom R1648A činili su se uporedni sa onima bez mutacije.

[0458] Zaključci: Rezultati potvrđuju da je, u uslovima eksperimenata, ubacivanje XTEN u FVIII rezultiralo zaštitom od vezanja inhibitorima FVIII, zadržavanjem aktivnosti prokoagulansa i da je uključivanje više XTEN umetka povećalo otpornost, naročito na inhibitor domena A2 antitelo. I na kraju, čini se da postoji efekat postojanjem prostornog odvajanja između XTEN umetka.

Tabela 30: Rezultati testa koagulacije CFXTEN tretiranim antitelom GMA8008 do C2 domena

4

Tabela 31: Rezultati testa koagulacije CFXTEN tretiranim antitelom GMA8021 do A2 domena

Primer 29: Prečišćavanje proteina CFXTEN fuzionim proteinima pBC0145 i pBC0146

[0459] Dva CFXTEN konstrukta sa C-terminusom XTEN korišćena su za uspostavljanje postupka prečišćavanja. I za pBC0145 sa C-terminusnim XTEN od 288 aminokiselina AE porodice (videti sekvencu u Tabeli 21) i pBC0146 sa C-terminusnim XTEN od 288 aminokiselina iz porodice AG (videti sekvencu u Tabeli 21), tangencijalni korak protočne filtracije (TFF) korišćen je za pufer razmenjivanje pročišćenog kondicionirane podloge iz ćelijske kulture. Proizvodi su zatim hvatani pomoću jake anjonske hromatografske smole, a zatim dalje prečišćeni pomoću VIII afinitetne hromatografije (GE Healthcare). Dodatna hromatografija za isključenje veličine (GE Healthcare) primenjena je na FVIII-pBC0146 kao treći poljski korak za uklanjanje vrsta velike molekularne mase. Čistoća oba fuziona proteina je HPLC-SEC ocenjena prihvatljivom i dalje je potvrđena SDS-PAGE analizom dva CFXTEN konstrukta koji pokazuju CFXTEN proizvode u očekivanim veličinama. Specifična aktivnost oba molekula bila je uporediva sa FVIII izbrisanim iz B domene, mereno testom koagulacije aPTT i određivanjem ELISA koncentracije FVIII.

Primer 30: Farmakokinetika fuzionih proteina CFXTEN pBC0145 i pBC0146 kod HemA i FVIII/VWF DKO miševa

[0460] Muški FVIII nokaut (HemA) miševi ili FVIII/VWF dvostruki nokaut (DKO) miševi, stari 8-12 nedelja, tretirani su jednom intravenskim davanjem bilo rekombinantnih BDD-FVIII, CFXTEN pBC0145 ili pBC0146 fuzionih proteina prečišćenih (iz Primera 23) u dozi od 200 IU/kg (n = 4/vremenska tačka). U određenim vremenskim tačkama, uzorci krvi su uzimani uzorkom šuplje vene. Kod HemA miševa, uzorci krvi prikupljeni su za 5 minuta, 1, 4, 8, 16, 20, 24, 32 i 48 sati posle doziranja za rBDD-FVIII, i za 5 minuta, 8, 16, 24, 32, 48 , 55 i 72 sata posle doziranja za fuzione proteine pBC0145 i pBC0146. Kod miševa FVIII/VWF DKO, uzorci krvi su sakupljeni na 5 minuta, 30 minuta i 1 sat nakon doziranja za rBDD-FVIII, i nakon 5 minuta, 4, 8, 16 i 24 sata nakon doziranja za fuzione proteine pBC0145 i pBC0146. Aktivnost plazme FVIII merena je hromogenim testom FVIII, a PK profil je analiziran WinNonlin programom.

[0461] Rezultati: Kao što je prikazano u Tabeli 32 i Sl.24, CFXTEN sa AE C-terminus XTEN umetanjem (pBC0145) pokazao je 1.6-puta i 14.1-puta FVIII polu-raspad (T1/2) produžetak u poređenju sa rBDD FVIII kod HemA miševa i FVIII/VWF DKO miševa, respektivno. CFXTEN sa AG C-terminusom XTEN umetanjem (pBC0146) imao je 1.4-puta i 14.4-puta produženi polu-raspad u poređenju sa rBDD-FVIII kod miševa HemA i FVIII/VWF DKO miševa, respektivno. Veličina produženja polu-raspada FVIII dodeljena XTEN umetanjem bila je mnogo izraženija kod FVIII/VWF DKO miševa u poređenju sa HemA miševima, što je pokazalo 14 puta duži FVIII polu-raspad iz FVIII-AE-XTEN i FVIII-AG-XTEN u poređenju sa rBDD-FVIII. Pored toga, u poređenju sa rBDD-FVIII, FVIII sa C-terminusnim ubacivanjem AE ili AG-XTEN takođe je značajno poboljšao oporavak FVIII u intervalu od 5 minuta, smanjio klirens i zapreminu distribucije i povećao AUC kod DKO miševa. U uslovima eksperimenta, CFXTEN sa C-terminusom XTEN umetanjem pokazao je veliki potencijal na produženju polu-raspada FVIII, i, u kombinaciji sa drugim FVIII umetanjem unutar domena, potencijalno može produžiti polu-raspad FVIII.

Tabela 32: Farmakokinetički parametri CFXTEN kod HemA i FVIII/VWF DKO miševa

Primer 31: Ćelijska kultura i koncentracija podloge ćelijske kulture za CFXTEN fuzione proteine pSD0050 i pSD0062

[0462] CFXTEN konstrukcije varijante pSD0050 sa intradomenom AG XTEN od 144 aminokiselina koje su ubačene posle aminokiselinskog ostatka 26 BDD FVIII, pSD0062 sa intradomena AE XTEN od 144 aminokiselina, ubačenih posle ostatka 1900 BDD FVIII (Napomena: numerisanje aminokiselina na osnovu pune dužine FVIII, kao i konstrukt koji kodira rBDD-FVIII, transficirani su u ćelije HEK293F (Invitrogen, Carlsbad, CA) koristeći polietilenimin (PEI, Polisciences Inc. Warrington, PA). Prolazno transficirane ćelije su uzgajane u 293 srednjem medijumu slobodnog stila (Invitrogen, Carlsbad, CA) tokom 4 dana, a 50-100 ml podloge ćelijske kulture koncentrovani su 10 do 20 puta Centrikonskim spino kolonom (presek 100 kDa MV) da se dostigne 10-30 IU/ml FVIII aktivnosti. Koncentrovani materijali su zatim naglo zamrznuti i čuvani na -80°C za buduće in vitro analize i in vivo farmakokinetičke studije.

Primer 32: Farmakokinetika fuzionih proteina CFXTEN pSD0050 i pSD0062 kod HemA i FVIII/VWF DKO miševa

[0463] Muški HemA ili FVIII/VWF dvostruki nokaut (DKO) miševi, stari 8-12 nedelja,

1

tretirani su jednom intravenskim davanjem koncentrata ćelijske kulture iz Primera 31 koji sadrže ili rekombinantni BDD-FVIII, CFXTEN pBD0050 ili pBD062 na 100- 300 IU/kg (n = 3/grupa). U određenim vremenskim tačkama, uzorci krvi su uzeti putem retro orbitalnih krvarenja iz istog seta miševa. Kod HemA miševa uzorci krvi su sakupljeni nakon 5 minuta, 24 sata i 48 sati nakon doziranja, dok su u FVIII/VWF DKO uzorci krvi miševima prikupljeni za 5 minuta, 8 sati i 16 sati. Aktivnost FVIII uzoraka plazme i koncentrata ćelijskih kultura analizirana je FVIII hromogenim testom, a PK profil rBDD FVIII i FVIII-XTEN varijante analiziran pomoću WinNonlin programa.

[0464] Rezultati: PK profili dve varijante umetanja CFXTEN intradomena pSD0050 i pSD0062 i rBDD-FVIII kod HemA miševa i FVIII/VWF DKO miševa prikazani su na Sl.25 i Tabla 33. Kod HemA miševa primećen je uporedivi početni oporavak u intervalu od 5 minuta za tri testna FVIII molekula. Oba CFXTEN fuziona proteina pokazala su dvostruko duži polu-raspad u poređenju sa divljim tipom BDD-FVIII. Kod miševa FVIII-VWF DKO, zbog gubitka VWF zaštite, rBDD-FVIII imao je samo 15 minuta polu-raspada u plazmi. U slučaju dva CFXTEN, polu-raspad je produžen na 3.15 h, odnosno 3.83 sata, respektivno; vrednosti koje su uporedive sa CFXTEN sa 288 C-terminusom XTEN umetanjem (primer 24), što sugeriše da daljnje produženje XTEN dužine u datoj tački umetanja možda neće biti potrebno. Pod eksperimentalnim uslovima, rezultati ispitivanja jasno pokazuju da intradomensko umetanje XTEN sa 144 aminokiselinskih ostataka ne samo da zadržava aktivnost FVIII, već je takođe pružalo sličnu korist polu-raspada FVIII kao varijante ubacivanja XTEN aminokiseline C-terminusa 288, sugerišući da kombinacija intradomena FVIII i umetaka C-terminusa može omogućiti dalje produžavanje polu-raspada FVIII.

Tabela 33: Farmakokinetički parametri CFXTEN kod HemA i FVIII/VWF DKO miševa

2

Primer 33: Farmakokinetička analiza fuzionih polipeptida CFXTEN kod pacova [0465] Farmakokinetika različitih CFXTEN fuzionih proteina, u poređenju sa FVIII samim, testirana je na Sprague-Dawley pacovima. CFXTEN i FVIII daju se ženkama pacova Sprague-Dawley (n = 3) IV kroz kateter jugularne vene sa 3-10 µg/pacov. Uzorci krvi (0,2 mL) se skupljaju u prethodno ohlađenim heparinizovanim epruvetama na prethodno doziranoj, 0.08, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72 satnoj tački i obrađuju se u plazmu. Kvantitacija proizvoda za testiranje se vrši ELISA testom koristeći anti-FVIII antitelo i za hvatanje i za detekciju. U WinNonLin se vrši nepartmentaciona analiza sa svim vremenskim tačkama uključenim u podešavanje za određivanje PK parametara. Očekuje se da će rezultati pokazati povećani terminusni polu-raspad i površinu ispod krive i smanjenu količinu distribucije za CFXEN u poređenju sa samim FVIII, a rezultati se koriste u kombinaciji s rezultatima koagulacijskih i farmakodinamičkih ispitivanja za odabir tih konfiguracija fuzionih proteina. sa željenim svojstvima.

Primer 34: Analiza FVIII za mesta XTEN umetanja

[0466] Odabir mesta umetanja XTEN u molekuli faktora VIII izvršen je predviđanjem lokacija dopuštenih mesta unutar petlji ili drugih strukturnih elemenata koji su izloženi fleksibilnoj površini. Za ove analize korišćene su atomske koordinate dveju nezavisno određenih kristalografskih rendgenskih struktura FVII (Shen BW, i dr. Tercijarna struktura i domena organizacije faktora koagulacije VIII. Blood. (2008) Feb 1;111(3):1240-1247; Ngo JC, i dr. Kristalna struktura humanog faktora VIII: implikacije na stvaranje kompleksa faktora IXa-faktora VIIIa. Structure (2008)16(4):597-606), kao i faktori VIII i faktora VIIIa izvedeni molekularno-dinamičkom simulacijom (MDS) (Venkateswarlu, D. Strukturno istraživanje zimogenih i aktiviranih oblika čovekovog faktora koagulacije krvi VIII : računarsko ispitivanje molekularne dinamike. BMC Struct Biol. (2010) 10:7). Atomske koordinate u formatu proteinske baze podataka (PDB) analizirane su da bi se identifikovale oblasti FVIII/FVIIIa za koje se predviđa da će imati visok stepen pristupačne površini rastvarača koristeći algoritme ASAView (Ahmad S, i dr. ASAView: baza podataka i alat za predstavljanje pristupačnosti rastvarača u proteinima. BMC Bioinformatics (2004) 5:51) i GetArea (Rychkov G, Petukhov M. Joint neighbors approximation of macromolecular solvent accessible surface area. J Comput Chem (2007) 28(12):1974-1989). Nastali skup lokacija zatim je dodatno prioritetno postavljen na osnovu visoko predviđene fluktuacije atoma na osnovu objavljenih rezultata ispitivanja MDS. Lokacije unutar kiselih peptidnih regiona koje pokrivaju domene A1, A2 i A3, kao i one koje su se vizuelnim pregledom pojavile na područjima koja nisu petlja izložena površini, su podvrgnuti. Dobijeni skup potencijalnih nalazišta procenjen je na osnovu očuvanja redosleda među vrstama, pri čemu su mesta u oblastima visoke očuvanja sekvenci među 20 kičmenjaka rangirana povoljno. Pored toga, vezna mesta vezivanja receptora za uklanjanje, mesta interakcije FVIII sa drugim molekulima (kao što su vWF, FIX), granice domena i egzona takođe su uzeti u obzir u odabiru mesta fuzije. Konačno, eliminisana su mesta u neposrednoj blizini mutacija upletenih u hemofiliju A koja su navedena u bazi podataka o mutacijama, pretraživanju, ispitivanju i resursima (HAMSTeRS) Haemofilije A (Kemball-Cook G, i dr. Faktor VIII Struktura i izvor mutacionih resursa: HAMSTeRS verzija 4. Nucleic Acids Res. (1998) 26(1):216-219). Na osnovu ovih kriterijuma, predložena je konstrukcija 42 varijante FVIII-XTEN za XTEN umetanja. Od toga, tri predstavljaju XTEN umetanja unutar rezidualne sekvence B domena, dva predstavljaju proširenja na C-kraj molekule faktora VIII, a 37 predstavljaju XTEN umetanja unutar strukturno definisanih inter- i intradomenskih strukturnih elemenata; tj. ostaci 3, 18, 22, 26, 40, 60, 116, 130, 188, 216, 230, 333, 375, 403, 442, 490, 518, 599, 713, 745, 1720, 1796, 1802, 1827, 1861, 1896, 1900, 1904, 1937, 2019, 2068, 2111, 2120, 2171, 2188, 2227, 2277 i 2332.

Primer 35: Funkcionalna analiza FVIII-XTEN konstrukata

[0467] Dva fuziona proteina FVIII-XTEN, FVIII-AE288 (F8X-40) i FVIII-AG288 (F8X-41), sadrže AE288_1 XTEN ili AG288_1 XTEN, fuzione na C-terminusu domena FVIII C2. Da bi se utvrdilo da li je aktivnost FVIII zadržana nakon fuzije XTEN, HEK293 ćelije su odvojeno transficirane sa ove dve fuzione konstrukcije FVIII-XTEN korišćenjem polietilenimina (PEI) u podlozi bez seruma.3 ili 5 dana nakon transfekcije, supernatant ćelijske kulture testiran je na FVIII aktivnost dvostepenim hromogenim testom. Pročišćeni

4

rekombinantni FVIII, kalibrisan prema međunarodnom standardu WHO, korišćen je za uspostavljanje standardne krive u hromogenskom ispitivanju. Produkti fuzije proteina i konstrukata F8X-40 i F8X-41 izraženi su u nivoima koji su uporedivi s onima divljeg tipa BDD-FVIII konstrukata. (Tabela 34).

Tabela 34. FVIII Titar fuzionih proteina FVIII-XTEN u kulturi ćelija prolazne transfekcije

Primer 36: Funkcionalna analiza FVIII-XTEN konstrukata: FVIII aktivnost i PK svojstva

[0468] Potencijal produženja polu-raspada konstrukata F8X-40 i F8X-41 procenjen je u FVIII i von Willebrand faktoru dvostrukim izbacivanjem miševa hidrodinamičkom injekcijom plazmidne DNK, a konstrukcija DNK FVIIIFc služi kao pozitivna kontrola.

Miševi su nasumično podeljeni u 3 grupe sa 4 miševa po grupi. Plazmidna DNK koja kodira fuzioni protein BDD FVIIIFc, F8X-40 ili F8X-41, koji svi imaju istu okosnicu vektora DNK, primenjena je miševima u odgovarajućim grupama. Otprilike 100 mikrograma odgovarajuće plazmidne DNK ubrizgano je svakom mišu hidrodinamičkom injekcijom, a uzorci krvi plazme su sakupljeni tokom 24 sata i 48 sati posle injekcije. Aktivnost plazme FVIII merena je dvostepenim hromogenim testom koristeći kalibrisani rekombinantni FVIII kao standard. Kao što je prikazano na Sl.23, uzorci iz grupa F8X-40 i F8X-41 pokazali su veći FVIII titar u plazmi nego oni iz BDD FVIIIFc, što sugeriše da fuzija FVIII sa XTEN produžava poluraspad FVIII in vivo. Uzeto zajedno, ovi podaci podržavaju zaključak da su fuzijski proteini FVIII-XTEN zadržali aktivnost FVIII u prolaznoj transfekciji i pokazali produženi poluraspad u cirkulaciji na životinjskom modelu.

Primer 37: Farmakodinamička procena CFXTEN u modelima životinja

[0469] In vivo farmakološka aktivnost fuzionih proteina CFXTEN se procenjuje korišćenjem različitih predkliničkih modela krvarenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na one na hemofiliju, operaciju, traumu, trombocitopeniju/disfunkciju trombocita, klopidogrel/heparin izazvano krvarenje i hidrodinamičku injekciju. Ovi modeli su razvijeni u više vrsta, uključujući miševe, štakore, zečeve i pse koristeći postupke ekvivalentne onima koji su korišćeni i objavljeni za druge FVIII pristupe. CFXTEN sastavi su obezbeđeni u vodenom puferu kompatibilnom sa in vivo primenom (na primer: fiziološki rastvor puferisan fosfatima ili fiziološki rastvor puferisan Trisom). Sastavi se primenjuju u odgovarajućim dozama, frekvenciji doziranja, rasporedu doziranja i načinu davanja, optimizovanim za određeni model. Određivanje efikasnosti uključuje merenje FVIII aktivnosti, jednofazni test zgrušavanja, FVIII hromogeni test, aktivirano delimično protrombinsko vreme (aPTT), vreme krvarenja, vreme zgrušavanja cele krvi (VBCT), trombelastografiju (TEG ili ROTEM), između ostalih.

[0470] U jednom primeru PD modela CFXTEN i FVIII se primenjuju na genetski deficitarne ili eksperimentalno indukovane HemA miševe. U različitim vremenskim tačkama posle primene, nivoi FVIII i CFXTEN se mere ELISA, aktivnost FVIII i CFXTEN se meri komercijalno dostupnim setovima FVIII aktivnosti, a vreme zgrušavanja se meri aPTT testom. Sveukupno, rezultati mogu ukazivati na to da CFXTEN konstrukti mogu biti efikasniji u inhibiciji krvarenja u poređenju sa FVIII i/ili ekvivalentni po snazi u uporedivoj dozi FVIII sa manje čestim ili pogodnijim intervalima doziranja.

[0471] U izazovu krvarenja kod miša PD model CFXTEN i FVIII se primenjuju na genetski deficitarne ili eksperimentalno indukovane HemA miševe i meri se uticaj na hemostatski izazov. Izazov za hemostatiku može uključivati izazov u vezi sa transformacijom repa, izazov hemartropije, krvarenje u zglobovima ili izazov vene. U različitim vremenskim tačkama nivoi nakon davanja FVIII i CFXTEN se mere ELISA, aktivnost FVIII i CFXTEN se meri komercijalno dostupnim kompletom FVIII aktivnosti, meri se vreme krvarenja i vreme zgrušavanja meri se aPTT testom. Sveukupno, očekuje se da rezultati pokazuju da su CFXTEN konstrukti efikasniji u inhibiranju krvarenja u poređenju sa FVIII i/ili ekvivalentnim potencijalom u poređenju sa dozama FVIII sa manje čestim ili pogodnijim intervalima doziranja, a rezultati se koriste zajedno sa rezultatima od koagulacije i drugih testova za izbor onih konfiguracija fuzionog proteina sa željenim svojstvima.

[0472] U PD modelu psa, CFXTEN i FVIII se primenjuju kod genetski deficitarnih hemofiličara. U različitim vremenskim tačkama posle primene, nivoi FVIII i CFXTEN se mere ELISA, aktivnost FVIII i CFXTEN se mere komercijalno dostupnim setovima FVIII aktivnosti, a vreme zgrušavanja se meri aPTT testom. Sveukupno, rezultati pokazuju da CFXTEN konstrukti mogu biti efikasniji u inhibiciji krvarenja u poređenju sa FVIII i/ili ekvivalentnim potencijalom u poređenju sa dozom FVIII sa manje čestim ili pogodnijim doziranjem, a rezultati se koriste zajedno sa rezultatima koagulacije i drugi testovi za odabir onih konfiguracija fuzionog proteina sa željenim svojstvima.

[0473] Kod izazova krvarenja pasa PD model CFXTEN i FVIII se primenjuju kod genetski deficitarnih pasa sa hemofilijom i meri se uticaj na hemostatski izazov. Izazov za hemostatiku uključuje između ostalog i vreme krvarenja kutikule. U različitim vremenskim tačkama posle primene, nivoi FVIII i CFXTEN se mere ELISA, aktivnost FVIII i CFXTEN se mere komercijalno dostupnim setovima FVIII aktivnosti, vreme krvarenja je mereno i vreme zgrušavanja se meri aPTT testom. Sveukupno, rezultati pokazuju da CFXTEN konstrukti mogu biti efikasniji u inhibiciji krvarenja u poređenju sa FVIII i/ili ekvivalentnim potencijalom u poređenju sa dozom FVIII sa manje čestim ili pogodnijim doziranjem, a rezultati se koriste zajedno sa rezultatima koagulacije i drugi testovi za odabir onih konfiguracija fuzionog proteina sa željenim svojstvima.

[0474] Dodatni predklinički modeli krvarenja uključuju, ali nisu ograničeni na one hemofilije, hirurgije, traume, disfunkcije trombocitopenije/trombocita, krvarenja izazvanih klopidogrelom/heparinom i hidrodinamičke injekcije. Ovi modeli mogu biti razvijeni u više vrsta, uključujući miševe, štakore, zečeve i pse koristeći postupke ekvivalentne onima koji su korišćeni i objavljeni za druge FVIII pristupe. Sveukupno, rezultati pokazuju da CFXTEN konstrukti mogu biti efikasniji u inhibiciji krvarenja u poređenju sa FVIII i/ili ekvivalentnim potencijalom u poređenju sa dozom FVIII sa manje čestim ili pogodnijim doziranjem, a rezultati se koriste zajedno sa rezultatima koagulacije i drugi testovi za odabir onih konfiguracija fuzionog proteina sa željenim svojstvima.

Primer 38: CFXTEN sa sekvencama deljenja

C-terminus XTEN oslobođen od strane FXIa

[0475] CFXTEN fuzioni protein koji se sastoji iz proteina XTEN spojen na C-terminus FVIII stvoren je sekvencom deljenja XTEN mesta otpuštanja koja je smeštena između komponenti FVIII i XTEN, kao što je prikazano na Sl.12. Primer sekvence je dat u Tabeli 51. U ovom slučaju, sekvenca deljenja mesta otpuštanja je ugrađena u CFXTEN koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prepoznata i podeljena FXIa proteazom (EC 3.4.21.27, Uniprot P03951). Specifično aminokiselinska sekvenca KLTRAET (SEQ ID NO:1688) seče posle arginina sekvence pomoću FXIa proteaze. FXI je prokoagulantna proteaza koja se nalazi neposredno pre FVIII u unutrašnjem ili koagulacijskom putu aktiviranom kontaktom. Aktivna FXIa se proizvodi iz FXI proteolitičkim deljenjem zimogena od strane FXIIa.

Proizvodnja FXIa je strogo kontrolisana i javlja se samo kada je koagulacija neophodna za pravilnu hemostazu. Stoga se ugradnjom KLTRAET sekvence deljenja (SEQ ID NO:1688), XTEN domen se uklanja samo iz FVIII paralelno sa aktiviranjem svojstvenog puta koagulacije i kada je potrebna koagulacija fiziološki. Ovo stvara situaciju kada se CFXTEN fuzioni protein obrađuje na dodatni način tokom aktivacije intrinzičnog puta.

C-terminus XTEN oslobođen od strane FXII

[0476] CFXTEN fuzioni protein koji se sastoji iz proteina XTEN spojen na C-terminus FVIII stvoren je sekvencom deljenja XTEN mesta otpuštanja koja je smeštena između komponenti FVIII i XTEN, kao što je prikazano na Sl.12. U ovom slučaju, mesto oslobađanja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prepoznata i podeljena FIIa proteazom (EC 3.4.21.5, Uniprot P00734). Specifično aminokiselinska sekvenca LTPRSLLV (SEQ ID NO:1618) [Rawlings N.D., i dr. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], se seče nakon arginina na položaju 4 u sekvenci. Aktivni FIIa nastaje deljenjem FII od strane FXa u prisustvu fosfolipida i kalcijuma i nalazi se nizvodno od faktora IX na putu koagulacije. Jednom kada se aktivira njegova prirodna uloga u koagulaciji je deljenje fibrinogena (Sl.2) koja zatim zauzvrat započinje formiranje ugrušaka. Aktivnost FIIa je strogo kontrolisana i javlja se samo kada je koagulacija neophodna za pravilnu hemostazu. Stoga, ugrađivanjem LTPRSLLV sekvence (SEQ ID NO:1618), XTEN domen se uklanja samo iz FVIII istovremeno aktiviranjem ili vanjskih ili unutrašnjih puteva koagulacije i kada je koagulacija potrebna fiziološki. To stvara situaciju kada se CFXTEN fuzija obrađuje na dodatni način tokom aktiviranja koagulacije.

C-terminus XTEN otpušta Elastazu-2

[0477] CFXTEN fuzioni protein koji se sastoji iz proteina XTEN spojen na C-terminus FVIII stvoren je sekvencom deljenja XTEN mesta otpuštanja koja je smeštena između komponenti FVIII i XTEN, kao što je prikazano na Sl.12. Primer sekvence je dat u Tabeli 51. U ovom slučaju, mesto oslobađanja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prepoznata i podeljena elastazom-2 proteazom (EC 3.4.21.37, Uniprot P08246). Specifično aminokiselinska sekvenca LGPVSGVP (SEQ ID NO:1689) [Rawlings N.D., i dr. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], preseče se nakon položaja 4 u sekvenci. Elastaza se konstitutivno izražava neutrofilima i prisutna je u svakom trenutku u cirkulaciji. Njegova aktivnost je pod čvrstim kontrolama serpina i zato je većinom vremena minimalno aktivna. Stoga, dok cirkuliše dugo postojeći CFXTEN, njegov deo se deli, stvarajući bazen kratko živećeg FVIII koji će se koristiti u koagulaciji. U poželjnoj karakteristici inventivnog sastava, ovo stvara cirkulišući depo za lekove koji stalno oslobađa profilaktičku količinu FVIII.

C-terminus XTEN oslobođen od strane MMP-12

[0478] CFXTEN fuzioni protein koji se sastoji iz proteina XTEN spojen na C-terminus FVIII stvoren je sekvencom deljenja XTEN mesta otpuštanja koja je smeštena između komponenti FVIII i XTEN, kao što je prikazano na Sl.12. Primer sekvence je dat u Tabeli 51. U ovom slučaju, mesto oslobađanja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prepoznata i podeljena MMP-12 proteazom (EC 3.4.24.65, Uniprot P39900). Naročito sekvenca GPAGLGGA (SEQ ID NO:1690) [Rawlings N.D., i dr. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], je presečena posle položaja 4 u sekvenci. MMP-12 konstitutivno se ispoljava u punoj krvi. Stoga, dok cirkuliše dugo postojeći CFXTEN, njegov deo se deli, stvarajući bazen kratko živećeg FVIII koji će se koristiti u koagulaciji. U poželjnoj karakteristici inventivnog sastava, ovo stvara cirkulišući depo za lekove koji stalno oslobađa profilaktičku količinu FVIII.

C-terminus XTEN oslobođen od strane MMP-13

[0479] CFXTEN fuzioni protein koji se sastoji iz proteina XTEN spojen na C-terminus FVIII stvoren je sekvencom deljenja XTEN mesta otpuštanja koja je smeštena između komponenti FVIII i XTEN, kao što je prikazano na Sl.12. Primer sekvence je dat u Tabeli 51. U ovom slučaju, mesto oslobađanja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prepoznata i podeljena MMP-13 proteazom (EC 3.4.24.-, Uniprot P45452). Naročito sekvenca GPAGLRGA (SEQ ID NO:1691) [Rawlings N.D., i dr. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], je presečena posle položaja 4. MMP-13 konstitutivno se ispoljava u punoj krvi. Stoga, dok cirkuliše dugo postojeći CFXTEN, njegov deo se deli, stvarajući bazen kratko živećeg FVIII koji će se koristiti u koagulaciji. U poželjnoj karakteristici inventivnog sastava, ovo stvara cirkulišući depo za lekove koji stalno oslobađa profilaktičku količinu FVIII.

C-terminus XTEN oslobođen od strane MMP-17

[0480] CFXTEN fuzioni protein koji se sastoji iz proteina XTEN spojen na C-terminus FVIII stvoren je sekvencom deljenja XTEN mesta otpuštanja koja je smeštena između komponenti FVIII i XTEN, kao što je prikazano na Sl.12. Primer sekvence je dat u Tabeli 51. U ovom slučaju, mesto oslobađanja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prepoznata i podeljena MMP-20 proteazom (EC.3.4.24.-, Uniprot Q9ULZ9). Naročito sekvenca APLGLRLR (SEQ ID NO:1692) [Rawlings N.D., i dr. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], preseče se nakon položaja 4 u sekvenci. MMP-17 konstitutivno se ispoljava u punoj krvi. Stoga, dok cirkuliše dugo postojeći CFXTEN, njegov deo se deli, stvarajući bazen kratko živećeg FVIII koji će se koristiti u koagulaciji. U poželjnoj karakteristici inventivnog sastava, ovo stvara cirkulišući depo za lekove koji stalno oslobađa profilaktičku količinu FVIII.

C-terminus XTEN oslobođen od strane MMP-20

[0481] CFXTEN fuzioni protein koji se sastoji iz proteina XTEN spojen na C-terminus FVIII stvoren je sekvencom deljenja XTEN mesta otpuštanja koja je smeštena između komponenti FVIII i XTEN, kao što je prikazano na Sl.12. Primer sekvence je dat u Tabeli 51. U ovom slučaju, mesto oslobađanja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je prepoznata i podeljena MMP-20 proteazom (EC.3.4.24.-, Uniprot 060882). Naročito sekvenca PALPLVAQ (SEQ ID NO:1693) [Rawlings N.D., i dr. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320], preseca se nakon položaja 4 (prikazano pomoću strelice). MMP-20 konstitutivno se ispoljava u punoj krvi. Stoga, dok cirkuliše dugo postojeći CFXTEN, njegov deo se deli, stvarajući bazen kratko živećeg FVIII koji će se koristiti u koagulaciji. U poželjnoj karakteristici inventivnog sastava, ovo stvara cirkulišući depo za lekove koji stalno oslobađa profilaktičku količinu FVIII.

Optimizacija brzine oslobađanja XTEN

[0482] Mogu se stvoriti varijante prethodnih primera u kojima je promena brzina otpuštanja XTEN ugrađena na C-terminusu, N-terminusu ili unutrašnji XTEN. Kako je brzina oslobađanja XTEN protestazom oslobađanja XTEN zavisna od sekvence mesta oslobađanja XTEN, promenom sekvence aminokiselina na mestu oslobađanja XTEN može se kontrolisati brzina otpuštanja XTEN. Specifičnost sekvenci mnogih proteaza je dobro poznata u stanju tehnike i dokumentovana je u više baza podataka. U ovom slučaju, specifičnost aminokiselina proteaza se preslikava pomoću kombinatornih biblioteka supstrata [Harris, J. L., i dr. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97: 7754] ili praćenjem deljenja mešavina supstrata kao što je prikazano u [Schellenberger, V., i dr. (1993) Biochemistry, 32: 4344]. Alternativa je identifikacija optimalnih sekvenci deljenja proteaze faznim prikazom [Matthevs, D., i dr. (1993) Science, 260: 1113]. Konstrukcije su napravljene sa varijantnim sekvencama i analizirane su za oslobađanje XTEN korišćenjem standardnih testova za detekciju XTEN polipeptida.

Primer 39: Klinička ispitivanja čoveka za procenu CFXTEN koji sadrže FVIII [0483] Kogenate® FS je rekombinantni humani faktor koagulacije VIII, namenjen promociji hemostaze kod ispitanika sa hemofilijom A. Zbog kratkog perioda polu-raspada, Kogenate se dozira intravenski svaki drugi dan za profilaksu i 8 do 12 sati u lečenju krvarenja, sve dok se ne postigne hemostaza. Smatra se da fuzija jednog ili više XTEN u FVIII poboljšava poluraspad proteina, omogućavajući smanjenu učestalost doziranja korišćenjem takvih preparata fuzionih proteina koji sadrže CFXTEN.

[0484] Klinička ispitivanja su dizajnirana tako da se efikasnost i prednosti CFXTEN u odnosu na Kogenate ili druge komercijalno dostupne FVIII preparate mogu verifikovati na ljudima. Takva ispitivanja sadrže tri faze. Prvo, sprovedeno je ispitivanje bezbednosti i farmakokinetike faze I kod odraslih pacijenata kako bi se utvrdila maksimalna tolerisana doza i farmakokinetika i farmakodinamika kod ljudi (bilo normalnih ispitanika, bilo pacijenata sa hemofilijom), kao i da bi se definisale potencijalne toksičnosti i neželjeni događaji u kojima treba pratiti buduća ispitivanja. Obavljaju se studije faze I u kojima se pojedinačne rastuće doze CFXTEN sastava primenjuju putem (npr., potkožno, intramuskularno ili intravenski), a biohemijski, PK i klinički parametri se mere u definisanim intervalima. Ovo dozvoljava određivanje minimalne efektivne doze i maksimalne tolerisane doze i utvrđuje prag i maksimalne koncentracije u doziranom i cirkulišućem leku koji predstavljaju terapijski prozor za dotične komponente, kao i bioraspoloživost kada se primenjuju intramuskularno ili potkožno. Iz ovih informacija, dobijen je raspored doza i doza koji dozvoljavaju ređe davanje CFXTEN sastava, a zadržavaju farmakološki odgovor. Nakon toga, sprovode se klinička ispitivanja na pacijentima sa stanjem, verifikujući efikasnost sastava CFXTEN u uslovima doze, koja se može izvesti u poređenju sa pozitivnom kontrolom, kao što je Kogenate, radi utvrđivanja pojačanih svojstava sastava CFXTEN.

[0485] Klinička ispitivanja faze II i III sprovode se kod pacijenata koji pate od bilo koje bolesti u kojoj se može očekivati da faktor VIII daje kliničku korist. Na primer, CFXTEN se koristi u kliničkim ispitivanjima za lečenje indikacija koje su odobrene za upotrebu faktora VIII; takve indikacije uključuju epizode krvarenja kod hemofilije A, pacijente sa inhibitorima faktora VIII, sprečavanje krvarenja hirurškim intervencijama ili invazivne procedure kod hemofilije A pacijente sa inhibitorima faktora VIII, lečenje epizoda krvarenja kod pacijenata sa urođenim nedostatkom faktora VIII i prevenciju krvarenje u hirurškim intervencijama ili invazivnim procedurama kod pacijenata sa urođenim nedostatkom faktora VIII. CFXTEN takođe može biti indiciran za upotrebu u dodatnoj populaciji pacijenata. Ispitivanja doziranja faze II se sprovodi kod pacijenata sa hemofilijom A kod kojih se mere farmakodinamika, koagulacija, krvarenje i druge fiziološke, PK, bezbednosni i klinički parametri i kliničke krajnje tačke pogodne za ispitivanja, u zavisnosti od doziranja sastava fuzionih proteina, dajući dozu- raspona informacija o dozama koje su pogodne za naredno ispitivanje faze III, pored prikupljanja podataka o sigurnosti povezanih sa štetnim događajima. PK parametri su u

1

korelaciji sa podacima fizioloških, kliničkih i bezbednosnih parametara radi uspostavljanja terapijskog prozora i režima terapijskih doza za CFXTEN sastav, što kliničaru omogućava da utvrdi odgovarajuće raspone doza za sastav. U jednom ispitivanju, pacijenti sa hemofilijom A sa inhibitorima faktora VIII procenjivali bi se radi uspostavljanja doza i režima doze farmaceutskih sastava CFXTEN koji rezultiraju postizanjem i održavanjem hemostaze i sprečavanjem ili ublažavanjem epizoda krvarenja. Konačno, sprovodi se ispitivanje efikasnosti faze III u kojoj se pacijentima daje CFXTEN farmaceutski sastav i pozitivna kontrola (kao što je komercijalno dostupan Kogenat) se primenjuje koristeći raspored doziranja koji se smatra prikladnim imajući u vidu farmakokinetičkih i farmakodinamičkih svojstva odgovarajućih sastava izvedenih iz Faze II, sa svim sredstvima koja su primenjivana na odgovarajuće produžen vremenski period da bi se postigle krajnje tačke ispitivanja.

Parametri koji se prate uključuju test aPTT, jedno- ili dvostepene analize zgrušavanja, kontrolu epizoda krvarenja ili pojavu spontanih epizoda krvarenja; parametre koji se prate u odnosu na placebo ili pozitivne kontrolne grupe. Rezultati efikasnosti utvrđuju se standardnim statističkim postupcima. Toksičnost i markeri neželjenih događaja takođe se prate u ovom ispitivanju kako bi se potvrdilo da li je jedinjenje bezbedno kada se koristi na opisani način. U drugom ispitivanju faze III trebalo bi proceniti pacijente sa hemofilijom A sa inhibitorima faktora VIII da bi se utvrdila efikasnost farmaceutskih sastava CFXTEN u postizanju i održavanju hemostaze i sprečavanju ili ublažavanju epizoda krvarenja.

Primer 40: Analitička hromatografija za isključivanje veličina XTEN fuzionih proteina sa različitim korisnim opterećenjima

[0486] Analize hromatografije za isključivanje veličine izvedene su na fuzionim proteinima koji sadrže različite terapeutske proteine i nestrukturiranim rekombinantnim proteinima sve veće dužine. Primer uzorka koristio je kolonu TSKGel-G4000 SWXL (7.8 mm x 30 cm) u kojoj je razdvojeno 40 µg prečišćenog fuzionog proteina glukagona u koncentraciji od 1 mg/ml sa brzinom protoka od 0.6 ml/min u 20 mM fosfatu pH 6.8, 114 mM NaCl. Profili hromatograma praćeni su korišćenjem OD214nm i OD280nm. Kalibracija kolona za sva ispitivanja izvedena je korišćenjem standarda za kalibraciju za isključivanje veličine iz BioRad; markeri uključuju tiroglobulin (670 kDa), goveđi gama-globulin (158 kDa), pileći ovalbumin (44 kDa), mioglobuin kopitara (17 kDa) i vitamin B12 (1.35 kDa).

Reprezentativni hromatografski profili Glukagon-Y288, Glukagon-I144, Glukagon-I72, Glukagon-I36 prikazani su kao prekrivanje na Sl.21. Podaci pokazuju da je prividna molekulska masa svakog jedinjenja proporcionalna dužini priključene XTEN sekvence. Međutim, podaci takođe pokazuju da je prividna molekulska težina svakog konstrukta

2

značajno veća od očekivane za globularni protein (kao što je prikazano u poređenju sa standardnim proteinima koji se rade u istom testu). Na osnovu analiza SEC za sve ocenjene konstrukte, uključujući CFXTEN sastav, prividni molekulski tegovi, prividni faktor molekulske težine (izražen kao odnos prividne molekulske mase prema izračunatoj molekulskoj masi) i hidrodinamički radijus (RHu nm) su prikazani u Tabeli 35. Rezultati pokazuju da ugradnja različitih XTEN od 576 aminokiselina ili više daje prividnu molekulsku masu fuzionom proteinu od približno 339 kDa do 760, a da XTEN od 864 aminokiselina ili više daje prividnu molekulsku masu veću od oko 800 kDA. Rezultati proporcionalnog povećanja prividne molekulske težine do stvarne molekulske mase bili su konzistentni za fuzione proteine kreirane XTEN iz nekoliko različitih motiva grupa; tj. AD, AE, AF, AG i AM, sa povećanjem od najmanje četvorostrukog i odnosom čak oko 17 puta. Pored toga, ugradnja XTEN fuzionih partnera sa 576 aminokiselina ili više u fuzione proteine sa različitim korisnim opterećenjima (i 288 ostataka u slučaju glukagona spojenih sa I288) rezultiralo je hidrodinamičkim radijusom od 7 nm ili većim, daleko izvan glomerularnih pora veličine otprilike 3-5 nm. Shodno tome, očekuje se da fuzioni proteini koji sadrže rast i XTEN imaju smanjeni bubrežni klirens, doprinoseći povećanim terminusnom polu-raspadom i poboljšavaju terapeutski ili biološki efekat u odnosu na odgovarajući ne-fuzioni biološki protein opterećenja.

Tabela 35: SEC analiza različitih polipeptida

Primer 41: Farmakokinetika proširenih polipeptida spojenih sa GFP kod cinomolgus majmuna

[0487] Farmakokinetika GFP-L288, GFP-L576, GFP-XTEN_AF576, GFP-XTEN_I576 i XTEN_AD836-GFP testirana je na majmunima cinomolgus da bi se utvrdio uticaj sastava i dužine nestrukturiranih polipeptida na parametre PK. Uzorci krvi su analizirani u različitim vremenima nakon injekcije i koncentracija GFP-a u plazmi je izmerena ELISA korišćenjem poliklonskog antitela protiv GFP za hvatanje i biotiniliranog sastava istog poliklonskog antitela za detekciju. Rezultati su rezimirani na Sl.19. Oni pokazuju iznenađujuće povećanje polu-raspada s povećanjem dužine XTEN sekvence. Na primer, vreme polu-raspada od 10 h određeno je za GFP-XTEN_L288 (sa 288 aminokiselinskih ostataka u XTEN).

Udvostručenje dužine nestrukturiranog partnera za fuziju polipeptida na 576 aminokiselina povećalo je polu-raspad do 20-22 h za konstrukcije više proteina fuzije; tj., GFP-XTEN_L576, GFP-XTEN AF576, GFP-XTEN_Y576. Daljnje povećanje dužine nestrukturiranog partnera polipeptidne fuzije na 836 ostataka rezultiralo je polu-raspadom od 72-75 h za XTEN_AD836-GFP. Tako se povećavanjem dužine polimera za 288 ostataka sa 288 na 576 ostataka povećava polu-raspad in vivo za oko 10 h. Međutim, povećavanjem dužine polipeptida za 260 ostataka sa 576 ostataka na 836 ostataka produžen je polu-raspad za više od 50 h. Ovi rezultati pokazuju da postoji iznenađujući prag dužine nestrukturiranog polipeptida koji rezultira većim od proporcionalnog dobitka i polu-raspada. Stoga se očekuje da fuzioni proteini koji sadrže proširene, nestrukturirane polipeptide imaju svojstvo poboljšane farmakokinetike u odnosu na polipeptide kraće dužine.

Primer 42: Stabilnost XTEN seruma

[0488] Fuzioni protein koji sadrži XTEN AE864 spojen sa N-terminusom GFP-a inkubiran je u majmunskoj plazmi i lizatu bubrega štakora do 7 dana na 37°C. Uzorci su povučeni u

4

vremenu 0, 1. i 7. dan i analizirani pomoću SDS PAGE, a zatim detekcijom pomoću zapadne analize i detekcijom antitela protiv GFP-a kao što je prikazano na Sl.20. Sekvenca XTEN_AE864 pokazala je zanemarljive znakove razgradnje tokom 7 dana u plazmi.

Međutim, XTEN_AE864 se brzo razgradio u lizatu bubrega pacova tokom 3 dana. In vivo stabilnost fuzionog proteina testirana je u uzorcima plazme gde je GFP_AE864 imunoprecipitiran i analiziran pomoću SDS PAGE kao što je iznad opisano. Uzorci koji su povučeni do 7 dana nakon injekcije pokazali su vrlo malo znakova propadanja. Rezultati pokazuju otpornost CFXTEN na degradaciju usled serumskih proteaza; faktor povećanja farmakokinetičkih svojstava CFXTEN fuzionih proteina.

Primer 43: Povećava rastvorljivost i stabilnost korisnog opterećenja peptida povezivanjem sa XTEN

[0489] Da bi se procenila sposobnost XTEN da poboljša fizičko-hemijska svojstva rastvorljivosti i stabilnosti, pripremljeni su i procenjeni fuzioni proteini glukagona i XTEN kraće dužine. Članci za testiranje pripremljeni su u Tris puferisanim fiziološkim rastvorom pri neutralnom pH, a karakterizacija Gcg-XTEN rastvora je pomoću HPLC reverzne faze i hromatografija za isključivanje veličine da se potvrdi da je protein homogen i ne agregiran u rastvoru. Podaci su predstavljeni u Tabeli 36. Za komparativne svrhe, granica rastvorljivosti nemodifikovanog glukagona u istom puferu merena je na 60 µM (0.2 mg/mL), a rezultat pokazuje da je za sve dužine dodatih XTEN postignuto značajno povećanje rastvorljivosti. Važno je da su u većini slučajeva fuzioni proteini glukagon-XTEN pripremljeni tako da postignu ciljne koncentracije i nisu procenjeni da bi se odredila maksimalna granica rastvorljivosti za dati konstrukt. Međutim, u slučaju glukagona povezanog sa AF-144 XTEN, određena je granica rastvorljivosti, što je rezultiralo da se postigne 60-puta povećanje rastvorljivosti u poređenju sa glukagonom koji nije povezan sa XTEN. Pored toga, procenjena je stabilnost glukagon-AF144 CFXTEN i utvrđeno je da je u tečnoj formulaciji stabilan najmanje 6 meseci u hladnjačama i približno mesec dana na 37°C (podaci nisu prikazani).

[0490] Podaci podržavaju zaključak da povezivanje XTEN polipeptida kratke dužine sa biološki aktivnim proteinom, poput glukagona, može značajno poboljšati svojstva rastvorljivosti proteina dobijenim fuzionim proteinom, kao i dati stabilnost pri višim koncentracijama proteina.

Tabela 36: Rastvorljivost Glukagon-XTEN konstrukata

Primer 44: Analiza nizova za sekundarnu strukturu pomoću algoritama predviđanja [0491] Sekvence aminokiselina mogu se proceniti kao sekundarna struktura putem određenih računarskih programa ili algoritama, kao što je poznati Chou-Fasman algoritam (Chou, P. Y., i dr. (1974) Biochemistry, 13: 222-45) i Garnier-Osguthorpe-Robson, ili "GOR" postupak (Garnier J, Gibrat JF, Robson B. (1996). GOR postupak za predviđanje sekundarne strukture proteina iz sekvence aminokiselina. Methods Enzymol 266:540-553). Za datu sekvencu, algoritmi mogu predvideti da li postoji uopšte neka ili nema sekundarne strukture, izražene kao ukupni i/ili procenat ostataka sekvence koji formiraju, na primer, alfa-helikos ili betalistove ili procenat ostaci sekvence za koje se predviđa da će rezultirati u slučajnom stvaranju zavojnice.

[0492] Nekoliko reprezentativnih sekvenci iz "porodica" XTEN procenjeno je korišćenjem dva algoritamska alata za Chou-Fasman i GOR postupke za procenu stepena sekundarne strukture u ovim nizovima. Alat Chou-Fasman obezbedili su William R. Pearson i Univerzitet u Virdžiniji, na internet lokaciji "Biosupport", URL koji se nalazi na internet adresi .fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1 kao što je postojalo 19. juna, 2009. Alat GOR pružio je Pole Informatique Lyonnais na internet lokaciji mrežne analize proteina, URL koji se nalazi na internet adresi .npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred gor4.pl kao što je postojalo 19. juna, 2008.

[0493] Kao prvi korak u analizama, dva algoritma su analizirana jedna XTEN sekvenca. Sastav AE864 je XTEN sa 864 aminokiselinskih ostataka stvorenih iz višestrukih kopija od četiri motiva 12 sekvenci aminokiselina koji se sastoje od aminokiselina G, S, T, E, P i A. Motive sekvenci karakteriše činjenica da tamo ograničena je ponavljanje unutar motiva i unutar celokupne sekvence u tome što se sekvencija bilo koje dve uzastopne aminokiseline ne ponavlja više od dva puta u bilo kojem motivu 12 aminokiselina, i da nijedna tri uzastopne aminokiseline u celoj dužini XTEN nisu identične. Sukcesivno duži delovi sekvence AF 864 sa N-terminusa analizirani su algoritmima Chou-Fasman i GOR (za poslednju je potrebna najmanje dužina od 17 aminokiselina). Sekvence su analizirane unosom sekvence formata FASTA u alate za predviđanje i pokretanjem analize. Rezultati analiza prikazani su u Tabeli 37.

[0494] Rezultati pokazuju da, prema Chou-Fasmanovim proračunima, kratki XTEN iz AE i AG porodica, do najmanje 288 aminokiselinskih ostataka, nema alfa-heliksa ili beta-listove, već iznosi predviđenog procenta slučajnih zavojnica od strane GOR algoritam varira od 78-99%. Sa povećanjem XTEN dužina od 504 ostataka na većim od 1300, XTEN analiziran Chou-Fasman algoritmom je predvideo procente alfa-heliksa ili beta-listova od 0 do oko 2%, dok su izračunati procenti slučajnih zavojnica porasli na 94 -99%. Oni XTEN sa alfaheliksima ili beta-listovima bili su oni nizovi sa jednim ili više primeraka od tri uzastopna serinska ostatka, što je rezultiralo predviđenim formiranjem beta-listova. Međutim, čak su i ove sekvence još uvek imale oko 99% nasumičnih formiranja zavojnica.

[0495] Podaci ovde dati sugerišu da 1) XTEN stvoren iz višestrukih motiva sekvenci G, S, T, E, P i A koji imaju ograničenu ponavljanje u odnosu na susedne aminokiseline predviđa se da imaju veoma male količine alfa-helikoptera i beta-listovi; 2) da povećanje dužine XTEN ne značajno povećava verovatnoću formiranja alfa-heliksa ili beta-lista; i 3) da progresivno povećava dužinu XTEN sekvence dodavanjem neponavljajućih12-mers koji se sastoje od aminokiselina G, S, T, E, P i A dovodi do povećanog procenta stvaranja slučajnih zavojnica. Rezultati dalje pokazuju da su XTEN sekvence ovde definisane (uključujući npr. XTEN stvorene iz motiva sekvenci G, S, T, E, P i A) ograničene ponavljanja (uključujući one sa ne više od dve identične susedne aminokiseline u bilo kojem motivu ) očekuje se da imaju vrlo ograničenu sekundarnu strukturu. Bilo koji redosled ili kombinacija motiva sekvenci iz Tabele 3 može se koristiti za stvaranje XTEN polipeptida koji će rezultirati XTEN sekvencom koja je u osnovi lišena sekundarne strukture, mada tri susedna serina nisu poželjna. Nepovoljna osobina triju bliskih serija, međutim, može se poboljšati povećanjem dužine XTEN. Očekuje se da takve sekvence imaju karakteristike opisane u CFXTEN otelotvorenjima pronalaska koji je ovde obelodanjen.

Tabela 37: CHOU-FASMAN i GOR izračunata predviđanja polipeptidnih sekvenci

Primer 45: Analiza polipeptidnih sekvenci za ponavljanje

[0496] U ovom primeru, različiti polipeptidi, uključujući nekoliko XTEN sekvenci, procenjeni su na ponavljanje u sekvenci aminokiselina. Sekvence aminokiselina polipeptida mogu se proceniti na ponavljanje kvantitativnim brojem puta koliko se pojavi kraća sekvenca u okviru ukupnog polipeptida. Na primer, polipeptid dužine 200 aminokiselinskih ostataka ima ukupno 165 preklapajućih „blokova“ 36-aminokiselina (ili „36-mers“) i 198 „podsekvenci“ od 3-mer, ali broj jedinstvenih 3-mer podsekvenci zavisi od količine ponavljanja unutar sekvence. Za analize, različite polipeptidne sekvence su ocenjene za ponavljanje određivanjem rezultata naknadne vrednosti dobijene primenom sledeće jednačine:

gde: m = (dužina aminokiseline polipeptida) - (dužina aminokiseline podsekvence) 1; i Broji= kumulativni broj pojava svake jedinstvene sekvence unutar sekvencei

U analizama ovog Primera, naknadna ocena za polipeptide iz Tabele 38 je određena korišćenjem prethodne jednačine u računarskom programu koristeći algoritam prikazan na Sl.

27, pri čemu je dužina naknadne podele postavljena na 3 aminokiseline. Dobijeni rezultat naknadne reakcije je odraz stepena ponavljanja unutar polipeptida.

[0497] Rezultati, prikazani u Tabeli 38, pokazuju da nestrukturirani polipeptidi koji se sastoje od 2 ili 3 vrste aminokiselina imaju visoke rezultate naknadne podređenosti, dok se oni sastoje od 12 motiva aminokiselina od šest aminokiselina G, S, T, E, P , i A sa niskim stepenom unutrašnje ponavljanja, imaju naknadne ocene manje od 10, a u nekim slučajevima

1

i manje od 5. Na primer, sekvenca L288 ima dve vrste aminokiselina i ima kratke, jako ponavljajuće sekvence, što rezultira naknadnom ocenom 50.0. Polipeptid J288 ima tri vrste aminokiselina, ali takođe ima kratke, ponavljajuće sekvence, što rezultira naknadnom ocenom od 33.3. Y576 takođe ima tri vrste aminokiselina, ali nije izrađen od unutrašnjih ponavljanja, što se odražava na skor naknadne reakcije od 15.7 u prvih 200 aminokiselina. W576 se sastoji od četiri vrste aminokiselina, ali ima viši stepen unutrašnje ponavljanja, npr. „GGSG“ (SEQ ID NO:1694) ", što rezultira rezultatom podsekvence od 23.4. AD576 se sastoji od četiri vrste 12 motiva aminokiselina, od kojih se svaki sastoji od četiri vrste aminokiselina. Zbog niskog stepena unutrašnje ponavljanja pojedinih motiva, ukupni rezultat naknadne reakcije u prvih 200 aminokiselina je 13,6. Suprotno tome, XTEN koji se sastoji od četiri motiva sadrži šest vrsta aminokiselina, a svaka sa niskim stepenom unutrašnje ponavljanja ima niže rezultate naknadne podređenosti; tj., AE864 (6.1), AF864 (7.5) i AM875 (4.5), dok se XTEN koji se sastoji od četiri motiva koji sadrže pet vrsta aminokiselina bio posredni; tj. AE864, sa ocenom 7.2.

[0498] Zaključci: Rezultati pokazuju da kombinacija 12 motiva podsekvence aminokiselina, od kojih se svaki sastoji od četiri do šest vrsta aminokiselina koje se ne ponavljaju, u duži XTEN polipeptid, rezultira u ukupnoj sekvenci koja se u osnovi ne ponavlja, što je naznačeno ukupnom naknadnom ima manje od 10, a u mnogim slučajevima i manje od 5. Ovo je uprkos činjenici da se svaki motiv naknadne upotrebe može koristiti više puta tokom sekvence. Suprotno tome, polimeri stvoreni iz manjeg broja tipova aminokiselina rezultirali su višim rezultatima naknadne podređenosti, pri čemu su polipeptidi koji se sastoje od dva tipa aminokiselina imaju veći rezultat od onih koji se sastoje od tri vrste aminokiselina.

Tabela 38: Naknadna izračunavanja polipeptidnih sekvenci

2

Primer 46: Računanje TEPOTOPE rezultata

[0499] TEPITOPE rezultati 9mer peptidne sekvence mogu se izračunati dodavanjem džepnih potencijala kao što je opisano od Sturniolo [Sturniolo, T., i dr. (1999) Nat Biotechnol, 17: 555]. U ovom primeru su izračunati odvojeni rezultati Tepitopa za pojedinačne HLA alele. Tabela 39 prikazuje kao primer džepnih potencijala za HLA0101B, koji se javlja u visokoj frekvenciji kod evropeidne populacije. Da bi se izračunao TEPITOPE rezultat peptida sa sekvencom P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9, dodani su odgovarajući pojedinačni potencijali u Tabeli 39. HLA0101B rezultat 9mer peptida sa sekvencom FDKLPRTSG (SEQ ID NO:1695) je zbir 0, -1.3, 0, 0.9, 0, -1.8, 0.09, 0, 0.

[0500] Da bi se ocenio rezultat TEPITOPE za duge peptide, može se ponoviti postupak za svih 9mer sekvenci. Ovaj postupak se može ponoviti za proteine kodirane drugim HLA alelima. Tabele 40-43 daju džepne potencijale za proteinske proizvode HLA alela koji se javljaju sa velikom frekvencijom u evropeidnoj populaciji.

[0501] TEPITOPE rezultati izračunati ovim postupkom kreću se u rasponu od -10 do 10. Međutim, 9mer peptida kojima nedostaje hidrofobna aminokiselina (FKLMVWY (SEQ ID NO:1696)) u položaju P1 izračunali su TEPITOPE rezultate u opsegu od -1009 do -989. Ova vrednost je biološki besmislena i odražava činjenicu da hidrofobna aminokiselina služi kao sidreni ostatak za HLA vezivanje, a peptidi kojima nedostaje hidrofobni ostatak u P1 smatraju se ne vezivima za HLA. Budući da u većini XTEN sekvenci nedostaju hidrofobni ostaci, sve kombinacije 9mer sekvenci će imati TEPITOPE u opsegu od -1009 do -989. Ovaj postupak potvrđuje da XTEN polipeptidi mogu imati malo ili nimalo predviđenih epitopa za T-ćelije.

Tabela 39: Stop potencijal za alat HLA0101B.

Tabela 40: Stop potencijal za alat HLA0301B.

4

Tabela 41: Stop potencijal za alat HLA0401B.

Tabela 42: Stop potencijal za alat HLA0701B.

Tabela 43: Stop potencijal za alat HLA1501B.

Primer 46: Procena ubacivanja XTEN u permisivne petlje.

XTEN AE42-4 ubacivanja

[0502] Konstrukcija i ekspresija FVIII sa XTEN AE42 umetanjima su opisani u Primerima 17 i 24. Prema tome, tamo gde ostatak X označava mesto umetanja, a ostatak Z označava sledeći ostatak u izvornom FVIII polipeptidnom nizu, polipeptid koji nastaje ubacivanjem XTEN AE42 bi sadržavao sekvencu:

X-GAPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGSEPATSGSETPASS-Z (SEQ ID NO:1697)

[0503] Za ubacivanje XTEN AE42 odabrano je 16 različitih mesta u FVIII sekvenci, i one su dizajnirane kao Serija 1. Dodatna 21 lokacija izabrana za ubacivanje XTEN AE42 dizajnirana je za Seriju 2. Kolektivno, lokacije Serije 1 i Serije 2 predstavljaju 12 lokacija u domenu A1, 7 lokacija u domenu A2, 10 lokacija u domenu A3, 4 mesta u domeni C1 i 3 mesta u domenu C2. Lokacije Serija 1 i 2 u 3-D strukturi FVIII prikazane su na Sl.32.

[0504] Lokacija ovih mesta umetanja Serije 1 i Serije 2 rezultira sa 37 konstrukcija označenih pSD0001- pSD0004, pSD0009- pSD0012, pSD0023- pSD0032, pSD0034- pSD0063 [prethodni rasponi uključuju i sve intermedijarne brojeve], čiji su nizovi postavljeni dalje u Tabeli 21 i čija su mesta umetanja navedena u Tabeli 23.

In vitro testovi

[0505] Da bi se procenila podnošljivost FVIII na umetanje XTEN AE42-4, aktivnost FVIII u uzorcima podloge kulture iz ćelijskih kultura FVIII-XTEN analizirana je korišćenjem FVIII hromogenog testa. Nivoe ekspresije antigena analizirali su FVIII-HC (FVIII teški lanac) i FVIII-LC (FVIII laki lanac) ELISA.

FVIII Merenje aktivnosti hromogenim testom

[0506] FVIII aktivnost je merena korišćenjem COATEST® SP FVIII kompleta iz DiaPharme (serija#N089019) i sve inkubacije su izvedene na 37°C ploči sa grejačem. Sakupljanje ćelijske kulture iz privremenih transfekcionih podloga FVIII-XTEN AE42-4 varijante sa ploča sa 6 udubljenja je razblaženo do željenog raspona aktivnosti FVIII korišćenjem 1x FVIII COATEST® pufera. FVIII standardi su pripremljeni u 1x FVIII COATEST® puferu koji sadrži podloge za transfekciju s uzorkom sa odgovarajućom koncentracijom podloge za kulturu kao testni uzorak. Raspon standarda rekombinantnog faktora VIII (rFVIII) bio je od 100 mIU/mL do 0.78 mIU/mL. Standardi, razblaženi uzorci ćelijskih kultura i združena normalna kontrola ljudske plazme dodani su pločama sa 96 udubljenja Immulon® 2HB u duplikatima (25 µL/udubljenju).

[0507] Sveže pripremljena smeša IXa/FX/fosfolipida (50 µL), 25 µL 25 mM CaCl2 i 50 µL FXa supstrata dodata su uzastopno u svaki otvor sa 5 minuta inkubacije između svakog dodavanja. Posle inkubacije sa supstratom, dodato je 25 µL 20% sirćetne kiseline da bi se prekinula reakcija u boji, a apsorbancija na 405 nm je merena pomoću SpectraMAX® plus (Molecular Devices) instrumenta.

[0508] Analiza podataka izvršena je pomoću SoftMax programa (verzija 5.2). Najniži nivo kvantifikacije (LLOQ) je 39 mIU/mL. Rezultati su predstavljeni u Tabeli 22.

Merenje ekspresije pomoću FVIII-HC i FVIII-LC ELISA

[0509] Ekspresija varijanti je kvantifikovana korišćenjem ELISA. Nivoi ekspresije FVIII antigena DNK konstrukata koji odgovaraju XTEN ubacivanjima u A1 i A2 domene FVIII analizirani su FVIII-LC ELISA. Nivoi ekspresije FVIII antigena DNK konstrukata koji odgovaraju XTEN ubacivanjima u A3, C1 i C2 domene FVIII analizirani su FVIII-HC ELISA. Rezultati su predstavljeni u Tabeli 22.

[0510] FVIII-XTEN antigeni u medijumu ćelijske kulture nakon sakupljanja su zarobljeni od GMA011 antitela (Green Mountain antitela) za FVIII-LC ELISA) ili GMA016 antitela (Green Mountain antitela) za FVIII-HC ELISA. Ploče sa 96 udubljenja Immulon® 2HB su obložene sa 100µl/udubljenju anti-FVIII antitela (2 µg/ml) preko noći inkubacijom na 4°C. Ploče su zatim četiri puta isprane fiziološkim rastvorom fosfatnog pufera sa Tween-20 (PBST) i blokirane su puferima za blokiranje (PBST sa 10% konjskim serumom termički inaktiviranim) na sobnoj temperaturi.

[0511] Prinosi ćelijske kulture iz prolaznih medija za transfekciju FVIII-XTEN varijanti sa ploče sa 6 udubljenja su razblaženi do željenog raspona antigena FVIII koristeći 1x pufer za blokiranje. FVIII standardi su pripremljeni u 1x FVIII blokirajućem puferu koji sadrži podloge za transfekciju lakiranja sa odgovarajućom koncentracijom podloge kao uzorka za testiranje. Raspon rFVIII standarda bio je od 50 ng/mL do 0,39 ng/mL.

[0512] Standardi, razblaženi uzorci ćelijskih kultura i združena normalna kontrola ljudske plazme dodani su u ploče sa 96 udubljenja Immulon® 2HB u duplikatima (100 µL/udubljenje) i inkubirani 2 sata na 37°C. Posle četvorostrukog ispiranja s PBST-om, 100 µL HRP-ovčjeg anti-hFVIII antitela (Affiniti Biologicals, F8C-EIC-D) je dodato u svako udubljenje i ploče su inkubirane 1 sat na 37°C. Posle još četiri ispiranja sa PBST-om, 100 µL TMB super osetljivog supstrata (BioFX) je dodato u svako udubljenje, a zatim 5-10 minuta razvijanja boje. Da bi se prekinula reakcija u boji, dodato je 50 µL H2SO4 u svako udubljenje, a apsorbancija od 450 nm je merena instrumentom SpectraMAX plus (Molekularni uređaji).

[0513] Analiza podataka izvršena je pomoću SoftMax programa (verzija 5.4). Najniži nivo kvantifikacije (LLOQ) je 0.0039 µg/mL. Rezultati su predstavljeni u Tabeli 22.

[0514] Dozvoljena mesta u koja su ubačene XTEN sekvence nisu eliminisali prokoagulantnu aktivnost rekombinantnog proteina ili sposobnost rekombinantnih proteina da se eksprimiraju u ćeliji domaćinu grupirani su u petlje u svakom od tri A domena FVIII. Sl.36 prikazuje lokaciju ubacivanja u rekombinantne proteine FVIII koji su pokazali aktivnost FVIII na domenima A1, A2 i A3. Sl.33 prikazuje strukturni prikaz koji prikazuje lokaciju ubacivanja u rekombinantne proteine FVIII koji su pokazali aktivnost FVIII.

[0515] Dopusna mesta sjedinjena u izložene rastvaračima, vrlo fleksibilne površinske petlje (XTEN permisivne petlje). Petlje A1 domena bile su smeštene u oblasti koja približno odgovara položajima aminokiselina 15 do 45, i 201 do 232, u redosledu zrelog čoveka FVIII (Sl. 30). Petlje A2 domena bile su smeštene u oblasti koja približno odgovara položajima aminokiselina 395 do 421, i 577 do 635, u redosledu zrelog čoveka FVIII (Sl.30). Petlje A3 domena bile su smeštene u oblasti koja približno odgovara položajima aminokiselina 1705 do 1732, i 1884 do 1917, u redosledu zrelog čoveka FVIII (Sl.30). SL.37A i 37B prikazuju lokaciju dozvoljenih petlji XTEN u odnosu na elemente sekundarne strukture u trodimenzionalnoj strukturi FVIII.

Primer 47: CFXTEN sa umetanjima XTEN koji sadrži 144 aminokiseline

[0516] Analiza prethodno predstavljenih preliminarnih podataka (Primer 46) sugerisala je postojanje definisanih regiona unutar linearnih polipeptidnih sekvenci i 3-D struktura domena FVIII A koji mogu da ubace ubacivanje XTEN sekvenci. Da bi se testirala ova hipoteza i dalje definisale granice pretpostavljenih područja koja mogu prihvatiti umetanje XTEN sekvenci bez gubitka FVIII aktivnosti, izabrana su 23 dodatna mesta umetanja koja nisu prisutna ni u Seriji 1 ni u Seriji 2 i označena su kao Serija 3.

[0517] Konstrukcije Serije 3 su generisane umetanjem 144-ostatnog XTEN AE polipeptida, koji sadrži aminokiselinske ostatke Gly (G), Ala (A), Pro (P), Ser (S), Thr (T) i Glu (E) ili 144-ostatak XTEN AG polipeptida, koji sadrži aminokiselinske ostatke Gly (G), Ala (A), Pro (P), Ser (S) i Thr (T). Generirano je pet različitih verzija polipeptida sa 144E AE i označeno XTEN-AE144-2A, XTEN-AE144-3B, XTEN-AE144-4A, XTEN-AE144-5A, XTEN-AE144-6B. Sekvence aminokiselina su navedene u Tabeli 4. Generirano je pet različitih verzija polipeptida sa 144 ostatka i označeno sa XTEN-AG144-1, XTEN-AG144-A, XTEN-AG144-B, XTEN-AG144-C i XTEN-AG144-F. Sekvence aminokiselina su navedene u Tabeli 4.

[0518] 144 ostatka XTEN koji kodira DNK sekvencu uveden je hemijskom sintezom DNK segmenata (DN 2.0, Redwood City, CA) koji obuhvataju najbliža jedinstvena restrikciona mesta unutar baznog vektora sa obe strane mesta umetanja.

[0519] DNK sekvence koje odgovaraju XTEN 144 peptidima su ubačene tako da rezultirajući DNK konstrukt kodira FVIII protein u koji je XTEN 144 proteinska sekvenca ubačena odmah posle ostatka naznačenog u selekciji mesta, a flankirana je AscI i XhoI mestima.

1

[0520] Pored ovih mesta, one lokacije iz Serija 1 i 2 na kojima ubacivanje XTEN AE42 polipeptida nije ukinulo aktivnost prokoagulanta FVIII modifikovano je izrezivanjem AE42 polipeptida koji kodira DNK segment sa restrikcijskim enzimima AscI i XhoI i uvođenjem XTEN AE144 i XTEN AG144 kodirajuće sekvence na istim lokacijama. Lokacija ovih mesta Serije 1, Serije 2 i Serije za umetanje rezimirana je u Tabeli III. Sl.34 prikazuje strukturalni prikaz FVIII koji prikazuje lokaciju XTEN 144 mesta umetanja.

[0521] Ukupno je stvoreno 48 konstrukcija sa 144 XTEN umetka. Konstrukti su pSD0001-pSD0004, pSD0009-pSD0012, pSD0023-63 [prethodni rasponi uključuju i sve intermedijarne brojeve], čije su sekvence navedene u Tabeli 21 i čija su mesta umetanja detaljno prikazana u Tabeli 22.

Ispoljavanje FVIII-XTEN 144 varijante

[0522] FVIII varijante sa XTEN 144 ubacivanjem su transfektovane u ćelije HEK293F (Invitrogen, Carlsbad, CA) koristeći polietilenimin (PEI, Polisciences Inc. Warrington, PA) ili reagens za transfekciju lipofektamina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Prolazno transficirane ćelije uzgajane su u podlozi 293 Free Stile ili smeši 293 Free Style i CD Opti CHO medija (Invitrogen, Carlsbad, CA). Podloga ćelijske kulture je sakupljena 3-5 dana nakon transfekcije i analiziran na FVIII ekspresiju hromogenoj analizom FVIII aktivnosti i FVIII ELISA sprovedenom kako je ovde opisano.

[0523] Podloga ćelijske kulture prolazne transfekcije koncentrovana je 10 puta u Centricon® spin koloni (100kd presek). Koncentrovani materijal je zatim iznenada zamrznut i čuvan na -80°C za buduće in vitro analize i in vivo PK ispitivanja.

In vitro ispitivanja

[0524] Da bi se procenila podnošljivost FVIII na umetanje, aktivnost FVIII u uzorcima podloge za kultivisanje analizirana je korišćenjem FVIII hromogenog testa. Nivoe ekspresije antigena analizirali su FVIII-HC (FVIII teški lanac) i FVIII-LC (FVIII laki lanac) ELISA.

[0525] Merenje aktivnosti FVIII hromogenim testom i merenje ekspresije pomoću FVIII-HC i FVIII-LC ELISA

[0526] Hromogeni i ELISA postupci ispitivanja izvedeni su kao što je opisano. Dobijeni rezultati su predstavljeni u Tabeli 23.

2

[0527] Dozvoljena mesta u koja su ubačene XTEN sekvence nisu eliminisali prokoagulantnu aktivnost rekombinantnog proteina ili sposobnost rekombinantnih proteina da se eksprimiraju u ćeliji domaćinu grupirani su u petlje u svakom od tri A domena FVIII. Otkriveno je da iste XTEN regioni permisivne petlje tolerišući ubačene kraće XTEN tolerišu ubacivanje dužih XTEN sekvenci. Sl.38 prikazuje lokaciju XTEN 144 ubacivanja u rekombinantne proteine FVIII koji su pokazali aktivnost FVIII na domenima A1, A2 i A3. Sl.35 prikazuje strukturni prikaz koji prikazuje lokaciju ubacivanja u rekombinantne proteine FVIII koji su pokazali aktivnost FVIII.

[0528] Ova zapažanja pokazuju da su dva regiona unutar svakog od A domena FVIII sposobne da primene ubacivanje XTEN sekvence bez gubitka aktivnosti kofaktora FVIII. Strukturalni prikaz ovih takozvanih XTEN permisivnih petlji (Sl.40 i 41) pokazuju da oni zauzimaju strukturno analogne položaje u svakoj od A domena i projektuju se sa jednog lica molekula FVIII. Identifikovane XTEN permisivne petlje odgovaraju visoko fleksibilnim petljama smeštenim između beta niti u trodimenzionalnim strukturama domena A1, A2 i A3, kao što je prikazano na SL. 37A i 37B.

[0529] In vivo evaluacija XTEN 144 umetanja na produženje polu-raspada FVIII, kako je utvrđeno farmakokinetikom, opisana je u Primeru 32.

Primer 48: Spašavanje ili pojačavanje FVIII ekspresije ubacivanjem XTEN sekvence unutar a3 kiselog peptidnog regiona FVIII.

[0530] Adherentne ćelije HEK293 su transficirane (kao što je opisano u Primeru 24) sa FVIII-XTEN DNK konstrukcijama u kojima kodirajuća sekvenca izbrisanog faktora VIII iz B domene sadrži 2 do 4 XTEN umetanja od 144 ostataka aminokiselina, po sastavu i mestu unosa kao naznačeno u Tabeli 44 ispod.5 dana nakon transfekcije, supernatanti ćelijske kulture su testirani na FVIII aktivnost hromogenim testom (kao što je opisano u Primeru 25). Rezultati su prikazani u Tabeli 44.

Tabela 44. Nivoi ekspresije FVIII aktivnosti CFXTEN varijantama koje sadrže XTEN na položaju 1720 i jedan, dva ili tri dodatna XTEN umetanja.

[0531] Za poređenje, svi konstrukti FVIII-XTEN su imali AG144 XTEN umetanje na položaju aminokiseline 1720 (numerisano u odnosu na faktor VIII cele dužine) unutar domene A3. Nivoi ekspresije FVIII-XTEN varijanti su određeni hromogenim testom i izraženi u jedinicama mIU/mL. Konstrukcije sa jednom dodatnom XTEN umetanjem bilo u položaju 26 u A1 domenu (LSD0040.002) ili položaju 403 u A2 domenu (LSD0041.008) dovele su do nivoa ekspresije od 175 i 279 mIU/mL, respektivno. Suprotno tome, konstrukt sa jednom dodatnom XTEN umetanjem na položaju 1656 unutar a3 kiselog peptida dao je nivo ekspresije od 2598 mIU/mL, demonstrirajući povećanje nivoa ekspresije za a3 XTEN konstrukciju umetanja u odnosu na konstrukcije za ubacivanje A1 i A2. Pored toga, u poređenju sa konstruktom FVIII-XTEN sa XTEN umetanjima na pozicijama 26 u A1 domenu i 1720 u domenu A3 (LSD0040.002), konstrukcija sa dodatnim XTEN ubacivanjem na poziciji 1656 unutar a3 kiselog peptidnog regiona ( PSD080.002) dao je značajno veću ekspresiju (175 i 1081 mIU/mL, respektivno). U skladu sa ovim nalazima, konstrukt sa XTEN umetanjima na pozicijama 403 u A2 domenu i 1720 u A3 domenu (LSD0041.008) dao je nivo ekspresije od 279 mIU/mL, dok je dodatni XTEN ubacivanje na položaju 1656 unutar a3 kiselog peptidnog regiona (PSD083.001) rezultirala je povećanjem nivoa ekspresije na 789 mIU/mL. Konačno, konstrukcija FVIII-XTEN sa XTEN umetanjem na poziciji 26 unutar A1 domena i dve XTEN insercije na pozicijama 1720 i 1900 unutar A3 domena (PSD082.001) nije dala aktivnost iznad donje granice kvantitacije. Međutim, konstrukcija FVIII-XTEN sa dodatnim ubacivanjem XTEN unutar a3 kiselog peptidnog regiona

4

(PSD090.003) rezultirala je detektabilnom aktivnošću, pokazujući da uključivanje XTEN sekvence u a3 domen može rezultirati oporavkom ekspresije (mereno aktivnošću ) u konstruktima FVIII-XTEN koji su inače izraženi na nivoima ispod donje granice kvantitacije. Pod uslovima eksperimenta, rezultati podržavaju zaključak da ubacivanje XTEN na položaj 1656 i, ekstenzijom, unutar a3 regiona, rezultira pojačanom ekspresijom prokoagulantnih sastava FVIII-XTEN.

Primer 49: Uticaj XTEN ubacivanja na FVIII aktivnost mereno aPTT

[0532] Za hromogeni test (kao što je opisano u Primeru 25) korišćen je parcijalni protrombinski koagulacijski test u jednoj fazi da se odredi FVIII aktivnost raznih FVIII-XTEN fuzionih proteina.

[0533] Postupak: Aktivnost FVIII-XTEN aPTT je merena korišćenjem instrumenta Sysmex CA-1500 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Tarrytown, NY). Da bi se stvorila standardna kriva za ispitivanje, standard WHO faktora VIII razblažen je 2% lakim transfekcijskom podlogom do 100 mU/mL, a zatim je izvršena dvostruka serijska razređivanje, pri čemu je poslednji standard bio 0.78 mU/mL. Uzorci FVIII-XTEN ćelijske kulture prvo su razređeni u 1:50 sa puferom za određivanje aPTT, a dodatna razblaženja su rađena sa 2% mak-sredstvom za transfekciju po potrebi.

Nakon razblaživanja, aPTT test je izveden korišćenjem Sysmex instrumenta na sledeći način: 50 µl razblaženih standarda i uzoraka je pomešano sa 50 ul humane plazme deficitarne FVIII, a zatim 50 µl aPTT reagensa. Smeša se inkubirala na 37°C tokom 4 minuta, a posle inkubacije, smeši je dodato 50 µl CaCl2, a vreme zgrušavanja je izmereno odmah.

Da bi se odredio test uzoraka FVIII aktivnosti, vreme zgrušavanja normi je crtano pomoću polu-log skale (Vreme zgrušavanja: Linear; Standardna koncentracija: Log) za ekstrapolaciju jednadžbe između vremena zgrušavanja i FVIII aktivnosti, a FVIII-XTEN aktivnost je zatim izračunata prema standardnoj krivoj. Osetljivost ispitivanja je bila 40 mU/mL faktora VIII.

[0534] Rezultati: Rezultati su rezimirani na Sl.44-46. Kada su pojedinačni XTEN od 144 ili 288 aminokiselina ubačeni u FVIII, svi FVIII-XTEN fuzioni proteini koji pokazuju aktivnost u hromogenoj analizi su takođe bili aktivni u testu aPTT. APTT aktivnost pratila je trend hromogenog ispitivanja, na primer, oni molekuli koji su pokazali nisku FVIII aktivnost u hromogenoj analizi takođe su imali niske vrednosti aPTT. Uopšteno, aPTT rezultati za fuzione proteine bili su niži od onih dobijenih hromogenim testom, sa odnosom hromogena prema aPTT od 1.1 do 2.2, kao što je prikazano na Sl.44, za pojedinačna XTEN umetanja.

FVIII-XTEN fuzioni proteini sa višestrukim XTEN ubacivanjem, generalno su pokazali dalje smanjenje aPTT aktivnosti u poređenju sa hromogenim testom. Testovi FVIII-XTEN sa dva XTEN umetanja pokazali su aktivnost sa svim konstruktima, ali sa odnosima hromogena/aPTT koji su u nekim slučajevima približili 4 (Sl.45). Testovi FVIII-XTEN sa nekih tri XTEN ubacivanja su takođe pokazali aktivnost u oba testa, sa odnosima hromogen/aPTT koji se približava 5, u nekim slučajevima.46), dok su odnosi za BDD-FVIII kontrolu bili uporediviji (desna strana sa slike 46). Pored toga, činilo se da mesto ubacivanja XTEN doprinosi razlikama koje se vide između aPTT i hromogenih aktivnosti. Na primer, dok su neki molekuli sa 2 XTEN umetanja rezultirali i do 4 puta nižom aktivnošću od hromogenih vrednosti, aPTT aktivnost drugih molekula FVIII sa 2 XTEN bila je prilično uporediva sa hromogenom aktivnošću (Sl.45). Neki molekuli sa 3 XTEN umetanja pokazali su se do 5 puta niže od hromogenih aktivnosti, drugi molekuli FVIII sa 3 XTEN imaju aPTT aktivnost manju od 2 puta nižu od hromogene aktivnosti (Sl.45). Pod uslovima eksperimenta, rezultati podržavaju zaključak da konstrukcije fuzionog proteina FVIII-XTEN zadržavaju prokoagulansku aktivnost, ali da hromogeni test uglavnom pruža veće nivoe aktivnosti od onog u sistemu ispitivanja aPTT korišćenom u istraživanju.

Primer 50: Procene efekta XTEN mesta umetanja na FVIII produžetak polu-raspada [0535] Postupci: Šest FVIII-XTEN fuzionih proteina sa jednom XTEN AG-144 ubacivanjem na definisanim lokacijama testirano je na FVIII/VWF DKO miševima (kao što je opšte opisano u Primeru 32) da bi se procenio uticaj mesta ubacivanja XTEN na period poluraspada FVIII. Za ovo je odabrano šest reprezentativnih varijanti XTEN (navedene u tabeli 1) sa XTEN umetanjem ili u A1, A2, a3, A3-regionl (A3-R1), A3-region 2 (A3-R2) ili na C-terminus ispitivanja i BDD-FVIII generisan iz baznog vektora korišćen je kao kontrola.

FVIII/VWF DKO miševi su tretirani jednom intravenskom aplikacijom koncentrata prolazne transfekcione ćelijske kulture koncentracije iz šest konstrukcija FVIII-XTEN (ili pozitivnog kontrolnog medijuma) na 100-200 IU/kg, a uzorci plazme su naknadno prikupljeni na 5 minuta, 7 sati i 16 sati nakon doziranja. Aktivnost plazme FVIII testirana je korišćenjem hrogenetskog testa FVIII i vreme poluraspada FVIII-XTEN je procenjeno korišćenjem programa WinNonlin. Podaci ispitivanja rezimirani su u Tabeli 45 i Slici 47.

[0536] Rezultati: Primećen je znatno duži polu-raspad za sve testirane varijante FVIII-XTEN u poređenju sa kontrolom BDD-FVIII, ali stepen povećanja polu-raspada je varirao, a varijanta sa XTEN na mestu umetanja 403 daje najmanje produženje perioda polu-raspada u 10 puta (u poređenju s kontrolom), dok je varijanta umetanja iz 1900. dala najviše produžetka polu-raspada u 18 puta. Razlike mesta umetanja XTEN u produženim polu-raspadom FVIII mogu odražavati uloge različitih FVIII domena u FVIII klirensu in vivo.

Tabela 45: FVIII-XTEN pojedinačne varijante umetanja AG-144 PK u FVIII/VWF DKO miševe

Primer 51: Procene aditivnog učinka XTEN iUmetanja na produžetak polu-raspada FVIII.

[0537] Postupci: Da bi se procenili efekti višestrukih XTEN umetanja na period polu-raspada fuzionog proteina FVIII-XTEN, varijante polu-raspada FVIII-XTEN sa 1-3 XTEN umetanjem su određene kod FVIII-XTEN DKO miševa korišćenjem koncentrata ćelijske kulture iz pet konstrukata (kao što je uopšteno opisano u Primeru 32). Pet varijanti FVIII-XTEN su testirana u ispitivanju: pSD-062, sa umetkom AE144 na položaju 1900 (numerisano u odnosu na faktor dužine VIII); pSD-0005 sa AE144 u FVIII B domenu (B-domena aminokiseline 745); pSD-0019 sa AE288 na FVIII C-terminusu (CT); LSD0003.006 sa AE144 ubačenim u B-domenu i AE288 ubačenim na C-terminus, a LSD0055.021 sa tri XTEN AE144, AE144 i AE288 ubačenim na poziciji 1900, sa B domenom i na C-terminusu. Vrednosti polu-raspada FVIII-KSTEN procenjene su korišćenjem programa WinNonlin.

[0538] Rezultati: Rezultati ispitivanja sumirani su u Tabeli 46, a PK krive su prikazane na Sl.

48. Rezultati studije jasno su pokazali aditivni efekat višestrukih XTEN umetanja na produžetak polu-raspad FVIII. Sa jednim XTEN umetanjem, polu-raspad FVIII produžen je sa 0.25 h na 3.2-4.0 h, što je 13 puta više. Kada su B i CT XTEN umetanja kombinovani, polu-raspad FVIII je produžen na 10,6 h, što je produženje za 42 puta. Konačno, u slučaju treće XTEN umetanja koja je dodata na položaju 1900 konstrukciji B/CT, polu-raspad je dostigao 16 sati kod FVIII-VWF DKO miševa, 64-puta više.

Tabela 46: Aditivni efekat XTEN umetanja na FVIII t1/2 kod FVIII/VWF DKO miševa

Primer 52: Procena FVIII-XTEN interferencije sa vezanjem anti-FVIII antitela korišćenjem Bethesda testa

[0539] Procenjena je sposobnost XTEN ubacivanja u molekuli FVIII da interferiraju sa vezivanjem već postojećih anti-FVIII antitela za FVIII-XTEN fuzioni protein kako bi se utvrdila njihova korisnost u lečenju pacijenata sa anti-FVIII inhibitornim antitelom.

[0540] Postupci: Za procenu vezivanja anti-FVIII antitela, dve varijante FVIII-XTEN (PSD088, sa 144 XTEN ubačene na lokacije 26/403/1656/1900; i PSD-090, sa 144 XTEN ubačenih na lokacijama 26/1656/1720/1900) testirani su u poređenju sa Refactom (na tržištu je rFVIII) na uzorcima plazme tri pacijenta sa hemofilijom A sa inhibitorima faktora VIII (označenih 04-483, 05-505 i GK1838-2079), kao i ovčje anti-FVIII poliklonsko antitelo kompanije Affinity Biologicals Inc (F8C-EIA-C). Bethesda titar četiri anti-FVIII ab u odnosu na dve varijante FVIII-XTEN (pSD-088 i pSD-090) i Refacto kontrolu su određeni korišćenjem modifikovanih Bethesda postupke ispitivanja, detaljno kako sledi. Uzorci antitela anti-FVIII inaktivirani toplotom u različitim razblaženjima inkubiraju se sa 1 IU/mL svake varijante FVIII (razblažene u IX u FVIII hromogenoj puferu za ispitivanje) u odnosu 1:1. Smeše FVIII/antitela su zatim inkubirane tokom 2 sata u inkubatoru pri 37°C. Nakon inkubacije, uzorci su 10 puta razređeni sa 1 x FVIII hromogenog pufera za ispitivanje, a 25 µL razblažene smeše zatim je korišćeno za FVIII hromogeni test, procenat preostale aktivnosti FVIII izračunat je u odnosu na aktivnost nakon inkubacije od poznati neutralizujući uzorak. Jedinice Bethesda izračunate su sledećom formulom: BU = faktor razblaživanja X (LN(procenat preostale aktivnosti) 6.6438).

[0541] Rezultati: Rezultati su navedeni u Tabeli 47. Zapaženi su titri Bethesda jedinice (BU) za sva četiri antitela kada su testirani na dve varijante FVIII-XTEN, u poređenju sa Refacto. Dobijeno je smanjenje od 5 do 8 puta u odnosu na PSD-088 i 3 do 5 puta smanjenje u odnosu na pSD-090. Krive inhibicije protiv FVIII varijante za svako antitelo su crtane (Sl.49) i upoređen sa Refactom, i pokazuje jasno levo pomeranje inhibicijske krive za dva molekula FVIII-XTEN, sa varijantom pSD-088 FVIII-XTEN, što je rezultiralo dodatnim pomeranjem ulevo u odnosu na pSD-090. Ovi rezultati jasno pokazuju da: 1) oba fuziona proteina varijante FVIII-XTEN su otpornija na prethodno postojeća anti-FVIII inhibitorna antitela nego Refacto; i 2) PSD-088 je otporniji na anti-FVIII antitela od PSD-090, koji mogu pružiti informacije korisne za utvrđivanje razlika na XTEN mestima umetanja u ometanju vezivanja anti-FVIII antitela. Pod uslovima eksperimenta, rezultati pružaju određenu podršku potencijalnoj upotrebi preparata FVIII-XTEN za lečenje pacijenata sa hemofilijom A sa inhibitorima faktora VIII.

Bethseda titar Anti-FVII antitela protiv FVIII-XTEN varijante

Primer 53: Procena polu-raspada fuzionih molekula FVIII XTEN koji sadrže četiri XTEN umetanja kod miševa sa Hemofilijom A

[0542] Postupci: Osam FVIII-XTEN fuzionih proteina sa četiri XTEN umetanja svaki na definisanim lokacijama testirano je na FVIII/VWF DKO miševima da bi se procenio efekat XTEN umetanja na produžetak polu-raspada FVIII: LSD0071.001, sadrži 403-AG144, 1900-AE144, 745 (B)-AE144, 2332(CT)-AE288 XTEN umetak (označen kao FVIII broj aminokiselina i XTEN umetnut); LSD0071.002, sadrži 403-AE144, 1900-AE144, 745(B)-AE144, 2332(CT)-AE288 XTEN umetanja; LSD0072.001, sadrži 403-AG144, 1900-AG144, 745(B)-AE144, 2332(CT)-AE288 XTEN umetanja; LSD0072.002, sadrži 403-AE144, 1900-AG144, 745(B)-AE144, 2332(CT)-AE288 XTEN umetanja; pBC0247.004, sadrži 18-AG144, 403-AE144, 1656-AG144, 2332(CT)-AE288 XTEN umetanja; pBC0251.002, sadrži 18-AG144, 1656-AG144, 1900-AE144, 2332(CT)-AE288 XTEN umetanja; pSD088, sadrži 26-AG144, 403-AE144, 1656)-AG144, 1900-AE144 XTEN umetanja i pSD090, sadrži 26AG144, 1656-Ag144, 1720-AG144, 1900-AE144 XTEN umetanja. FVIII/VWF DKO miševi su tretirani, kao što je opšte opisano u Primeru 32, jednim intravenskim davanjem koncentrata za transfekcione ćelije FVIII-XTEN od osam konstrukata na 100-200 IU/kg, a uzorci plazme su kasnije sakupljeni na 5 minuta, 8 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata i 96 sati nakon doziranja. Aktivnost plazme FVIII testirana je korišćenjem hrogenetskog testa FVIII i vreme poluraspada FVIII-XTEN je procenjeno korišćenjem programa WinNonlin.

[0543] Rezultati: Svih osam FVIII XTEN fuzionih molekula koji sadrže četiri XTEN umetanja pokazali su duži polu-raspad od nemodifikovanog FVIII (rezultati u Tabeli 48). Tri molekule sa XTEN umetanjima na pozicijama 403, 1900, B domena i C-terminusa postigle su polu-raspad do 16.3 h, što je 65-puta poboljšanje u poređenju sa nemodifikovanim BDD FVIII. Međutim, molekuli testirani XTEN umetanjima 26/403/1656/1900 (pSD088) ili 26/1656/1720/1900 (pSD090) pokazali su polu-raspad od 9.1 h odnosno 9,5 sati, što je, u poređenju sa BDD FVIII, predstavlja povećanje od 36 puta, odnosno 38 puta. pBC247.004 (XTEN umetanja pri 18/403/1656/CT) i pBC251.002 (XTEN umetanja u 18/1900/1656/CT) postigli su vrednosti polu-raspada od 14.1 sati i 13 sati. Rezultati pokazuju da više XTEN umetanja (u ovom slučaju četiri XTEN umetanja za svaki FVIII molekul) mogu značajno poboljšati polu-raspad FVIII. Nadalje pokazuje da je efekat XTEN na polu-raspad FVIII zavisan od mesta umetanja, čak i u slučaju višestrukih XTEN umetanja.

Tabela 48: PK FVIII-XTEN varijante sa četiri XTEN umetanja u FVIII/VWF DKO miševe

4

41 Tabela 50: Primer CFXTEN koji sadrži FVIII i unutrašnju/spoljašnju XTEN sekvencu (SEQ ID NOS 1537-1554, po redosledu pojavljivanja)

4 2

4

44

4

4

4

4

4

41

Tabela 51: Primer CFXTEN koji sadrži FVIII, sekvence deljenja i XTEN sekvence SEQ ID NOS 1555-1590, po redosledu pojavljivanja)

41

41

41

41

41

41

42

42

42

42

42

42

42

4

41

42

4

44

4

4

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII koji sadrži polipeptid faktora VIII i najmanje jedan prošireni rekombinantni polipeptid (XTEN), pri čemu polipeptid faktora VIII sadrži domen A3, domen A2, i A1 domen, C2 domen, C1 domen i B domen ili deo B domena, pri čemu je najmanje jedan XTEN je ubačen u polipeptid faktora VIII na mestu koje odgovara aminokiselini 745 iz sekvence navedene u SEQ ID NO:1592, pri čemu rekombinantni FVIII fuzioni protein zadržava najmanje 10% prokoagulantne aktivnosti odgovarajućeg polipeptida faktora VIII koji nedostaje pomenuti XTEN, i gde rekombinantni FVIII fuzioni protein pokazuje produženi terminusni polu-raspad kada se daje ispitaniku u poređenju sa odgovarajućim polipeptidom faktora VIII koji nedostaje XTEN.

2. Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII prema patentnom zahtevu 1, gde polipeptid faktora VIII sadrži jednolančani polipeptid faktora VIII.

3. Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde rekombinantni fuzioni protein faktora VIII sadrži najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet ili najmanje šest XTEN.

4. Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde najmanje jedan XTEN sadrži najmanje 36 aminokiselina, najmanje 42 aminokiselina, najmanje 72 aminokiselina, najmanje 96 aminokiselina, najmanje 144 aminokiselina ili na najmanje 288 aminokiselina.

5. Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII prema patentnom zahtevu 4, gde najmanje jedan XTEN sadrži više jedinica motiva sekvenci iz dve ili više porodica motiva iz Tabele 3.

6. Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII prema patentnom zahtevu 4, pri čemu najmanje jedan XTEN sadrži sekvencu aminokiselina koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiselina odabranoj iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NO:49, 50, 51, 52, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 78 i 79-81.

7. Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII prema patentnom zahtevu 4, gde najmanje jedan XTEN sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOs: 49, 50, 51, 52, 57, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 i 78-81.

4

8. Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII prema patentnom zahtevu 4, pri čemu najmanje jedan XTEN sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiselina odabranoj iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NO:279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349 i 351.

9. Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII prema patentnom zahtevu 1, gde polipeptid faktora VIII sadrži aminokiselinsku sekvencu faktora VIII SEQ ID NO:691.

10. Kompleks koji sadrži rekombinantni fuzioni protein faktora VIII prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva i von Willebrandov faktor.

11. Izolovana sekvenca nukleinskih kiselina koja kodira rekombinantni fuzioni protein faktora VIII prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-9.

12. Ćelija domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinskih kiselina iz patentnog zahteva 11.

13. Postupak za konstruisanje rekombinantnog fuzionog proteina faktora VIII prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 9, gde postupak uključuje kultivisanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 12 u podlozi pod uslovima pogodnim za pravljenje fuzionog proteina i obnavljanje fuzionog proteina.

14. Farmaceutski sastav koja sadrži (i) fuzioni protein rekombinantnog faktora VIII prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 9 ili sekvencu nukleinskih kiselina iz patentnog zahteva 11 i (ii) farmaceutski prihvatljiv nosač.

15. Rekombinantni fuzioni protein faktora VIII prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 9, ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 14, namenjen upotrebi za lečenje bolesti krvarenja ili stanja kod ispitanika koji ima potrebu za time, pri čemu je bolest ili stanje krvarenja epizoda krvarenja ili hemofilija A.

4