RS59868B1

RS59868B1 - Antitela prema klaudinu 18.2 koja su korisna u dijagnozi kancera

Info

Publication number: RS59868B1
Application number: RS20200006A
Authority: RS
Inventors: Ugur Sahin; Özlem Türeci; Rita Mitnacht-Kraus; Stefan Wöll
Original assignee: Astellas Pharma Inc; Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2013-05-06
Publication date: 2020-03-31
Also published as: DK2847225T3; KR20150008095A; JP2023109883A; MX2014013542A; KR20210124501A; US9512232B2; MX369740B; EP2847225A1; JP6514294B2; HUE073109T2; AU2013258432A1; CN114573697A; BR112014026755B8; CN104321345B; ES3036493T3; JP6878491B2; SG10201606048PA; CY1122676T1; US11976130B2; CN104321345A

Description

Opis

[0001] Klaudini su integralni membranski proteini koji se nalaze unutar čvrstih veza epitela i endotela. Predviđa se da klaudini imaju četiri transmembranska segmenta sa dve vanćelijske petlje, i N- i C-terminusima koji se nalaze u citoplazmi. Familija transmembranskih proteina klaudina (CLDN) igra ključnu ulogu u održavanju epitelnih i endotelnih čvrstih veza i mogu takođe igrati ulogu u održavanju citoskeleta i u ćelijskoj signalizaciji.

[0002] Molekul klaudina 18 (CLDN18) je integralni transmembranski protein (tetraspanin) koji ima četiri hidrofobna regiona koji premošćuju (španuju) membranu i dve vanćelijske petlje (petlja1 povezuje hidrofobni region 1 i hidrofobni region 2; petlja2 povezuje hidrofobne regione 3 i 4). CLDN18 postoji u dve različite splajs varijante, koje su opisane kod miša i kod ljudi (Niimi, Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001). Splajs varijante (pristupni Genbank broj: splajs varijanta 1 (CLDN18.1): NP_057453, NM_016369, i splajs varijanta 2 (CLDN 18.2): NM_001002026, NP_001002026) imaju molekulsku masu od približno 27,9 / 27,72 kD. Splajs varijante CLDN18.1 i CLDN18.2 se razlikuju u N-terminalnom delu koji sadrži prvi transmembranski (TM) region i petlju1, dok je primarna proteinska sekvenca C-terminusa identična; videti Sliku 1.

[0003] CLDN18.1 se selektivno eksprimira na ćelijama normalnih pluća, dok se CLDN18.2 eksprimira samo na ćelijama želuca. Medutim, ekspresija CLDN18.2 u normalnom želucu ograničena je na diferencirane kratkoživeće ćelije epitela želuca. Ekspresija CLDN18.2 identifikovana je u različitim tumorskim tkivima. Na primer, pronađeno je da se CLDN18.2 eksprimira u karcinomu pankreasa, karcinomu jednjaka, karcinomu želuca, karcinomu bronhija, karcinomu dojke, i ENT tumorima. CLDN18.2 je dragoceni cilj za prevenciju i/ili lečenje primarnih tumora, kao što su kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer jajnika, kancer debelog creva, kancer jetre, kancer glave i vrata, i kanceri žučne kese, i njihovih metastaza, posebno metastaze kancera želuca poput Krukenbergovih tumora, peritonealne metastaze, i metastaze na limfnim čvorovima.

[0004] Diferencijalna ekspresija CLDN18.2 između kancerskih i normalnih ćelija, njegova membranska lokalizacija, njegovo odsustvo iz ogromne većine toksično relevantnih normalnih tkiva, njegova ograničena ekspresija na populaciji ćelija u želucu koja se može zameniti, diferenciranim ćelijama želuca, koje se mogu obnoviti ciljno-negativnim matičnim ćelijama želuca, čine CLDN18.2 atraktivnim ciljem za imunoterapiju protiv kancera i upotreba terapeutika na bazi antitela za ciljanje CLDN18.2 u terapiji kancera obećava visok nivo terapijske specifičnosti.

[0005] Klinička primena antitela koja ciljaju CLDN18.2 suočena je sa preprekom da je humani CLDN18.2 veoma homologan humanom CLDN18.1. Antitela specifična za CLDN18.2 koja ciljaju N-terminalni vanćelijski domen CLDN18.2 koji pokazuje razlike u sekvenci između humanog CLDN18.2 i humanog CLDN18.1 mogla bi biti uspešno uspostavljena. Pokušaji proizvodnje antitela koja ciljaju N-terminalni deo CLDN18.2 i koji imaju svojstva koja ih čine klinički primenljivim u dijagnostičke svrhe, npr. za detekciju ekspresije CLDN18.2 u ćelijama na presecima kancerskog tkiva, nisu uspeli.

[0006] WO2007/059997 i WO2008/145338 pominju proizvodnju različitih terapijskih antitela prema N-terminalnim epitopima CLDN18.2. WO2011/113546, CN101584860, i Klamp et al.

2011 (Canc. Res. 71: 516-527) pominju različite N-terminusne epitope CLDN18.2 za vakcinaciju protiv tumora. Sahin et al. 2008 (Clin. Cane. Res. 14: 7624-7634) pominje poliklonalno antitelo uzgajeno prema N-terminalnom peptidu DQWSTQDLYN CLDN18.2. WO2007/027867 opisuje potencijalna mesta fosforilacije tirozina na C-terminusu CLDN18.2.

[0007] Iznenađujuće, ovi pronalazači su otkrili da antitela usmerena prema određenom epitopu smeštenom unutar C-terminalnog dela CLDN18.2 ispunjavaju kriterijume za dijagnostičku primenljivost antitela, posebno za detekciju i identifikaciju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2. Najiznenađujuće, ova antitela iako usmerena prema sekvenci koja je identična na CLDN18.1 i CLDN18.2 ne ciljaju nekancerske ćelije pluća.

[0008] Antitela ovog pronalaska su korisna, na primer, u dijagnostikovanju kancera i/ili u određivanju da li ćelije kancera eksprimiraju CLDN18.2. Poželjno, bolest kancer ili ćeliju kancera karakteriše površinska ekspresija CLDN18.2. Ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2 su pogodni ciljevi za terapije koje ciljaju CLDN18.2 poput terapije antitelima usmerenim prema CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, ćelije kancera eksprimiraju ili aberantno eksprimiraju CLDN18.2 dok odgovarajuće normalne ćelije ne eksprimiraju CLDN18.2 ili eksprimiraju CLDN18.2 na nižem nivou. Ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 su poželjno odabrane iz grupe koja se sastoji od ćelija kancera tumorigenog želuca, jednjaka, pankreasa, pluća, jajnika, debelog creva, jetre, glave i vrata, i žučne kese.

Sažetak pronalaska

[0009] Ovaj pronalazak se odnosi na antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se (i) vezuje za peptid koji ima amino-kiselinsku sekvencu TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) ili EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6) i/ili (ii) se vezuje za klaudin 18.2 (CLDN18.2), pri čemu se navedeno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje za CLDN18.2 vezivanjem najmanje za epitop unutar CLDN18.2 koji ima amino-kiselinsku sekvencu TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) ili EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6).

[0010] U jednom primeru izvođenja, navedeni CLDN18.2 je CLDN18.2 ćelijske površine vezan za membranu. U jednom primeru izvođenja, navedeni CLDN18.2 je prisutan na ćelijama kancera, pri čemu su navedene ćelije kancera poželjno ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, navedene ćelije kancera su odabrane iz grupe koja se sastoji od ćelija kancera želuca, jednjaka, pankreasa, pluća, jajnika, debelog creva, jetre, glave i vrata, i žučne kese. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili antigenvezujući fragment pronalaska se ne vezuje za nekancerske ćelije osim ćelija epitela želuca. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili antigen-vezujući fragment pronalaska se ne vezuje za nekancerske ćelije pluća. U jednom primeru izvođenja, antitelo pronalaska je himerno, humano ili humanizovano antitelo. U jednom primeru izvođenja, antitelo pronalaska je monoklonalno antitelo.

[0011] U ovim i daljim aspektima, ovaj pronalazak se odnosi na antitelo koje sadrži:

(I) teški lanac antitela koji sadrži:

(i) sekvencu teškog lanca antitela u skladu sa SEQ ID NO: 7 ili njenu varijantu, (ii) najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence sekvence teškog lanca antitela u skladu sa SEQ ID NO: 7 ili njenu varijantu, ili (iii) CDR3 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 10 ili njenu varijantu i poželjno dalje sadrži CDR1 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 8 ili njenu varijantu i/ili CDR2 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 9 ili njenu varijantu,

i/ili

(II) laki lanac antitela koji sadrži:

(i) sekvencu lakog lanca antitela u skladu sa SEQ ID NO: 11 ili njenu varijantu, (ii) najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence sekvence lakog lanca antitela u skladu sa SEQ ID NO: 11 ili njenu varijantu, ili

(iii) CDR3 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 14 ili njenu varijantu i poželjno dalje sadrži CDR1 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 12 ili njenu varijantu i/ili CDR2 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 13 ili njenu varijantu.

[0012] U gore navedenim i daljim aspektima, ovaj pronalazak se takođe odnosi na antitelo koje sadrži:

(I) teški lanac antitela koji sadrži:

(i) sekvencu teškog lanca antitela u skladu sa SEQ ID NO: 15 ili njenu varijantu, (ii) najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence sekvence teškog lanca antitela u skladu sa SEQ ID NO: 15 ili njenu varijantu, ili (iii) CDR3 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 18 ili njenu varijantu i poželjno dalje sadrži CDR1 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 16 ili njenu varijantu i/ili CDR2 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 17 ili njenu varijantu,

i/ili

(II) laki lanac antitela koji sadrži:

(i) sekvencu lakog lanca antitela u skladu sa SEQ ID NO: 19 ili njenu varijantu, (ii) najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence sekvence lakog lanca antitela u skladu sa SEQ ID NO: 19 ili njenu varijantu, ili

(iii) CDR3 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 22 ili njenu varijantu i poželjno dalje sadrži CDR1 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 20 ili njenu varijantu i/ili CDR2 sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 21 ili njenu varijantu.

[0013] U poželjnim primerima izvođenja, antitelo pronalaska sadrži teški lanac antitela koji sadrži konstantni region gama-1 teškog lanca, poželjno konstantni region humanog gama-1 teškog lanca i/ili sadrži laki lanac antitela koji sadrži konstantni region kapa lakog lanca.

[0014] U gore navedenim i daljim aspektima ovaj pronalazak se odnosi na antitelo proizvedeno ili dobijeno iz hibridoma ćelije deponovane kod DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Nemačka) i ima jednu od sledećih oznaka i pristupnih brojeva:

1. muAB 43-14A, pristupni br. DSM ACC3144, deponovano 6. oktobra 2011; ili 2. muAB 35-22A, pristupni br. DSM ACC3143, deponovano 6. oktobra 2011.

[0015] Antitela pronalaska su ovde označena pozivanjem na oznaku antitela i/ili pozivanjem na klon koji proizvodi antitelo, npr. muAB 43-14A.

[0016] Dalja poželjna antitela su ona koja imaju specifičnost antitela proizvedenih i dobijenih iz gore opisanih hibridoma i, posebno, ona koja sadrže antigen vezujući deo ili antigen vezujuće mesto, posebno varijabilni region, identičan ili veoma homologan onom antitela proizvedenih i dobijenih iz gore opisanih hibridoma. Zamišljeno je da su poželjna antitela ona koja imaju CDR regione ili identične ili veoma homologne sa CDR regionima antitela proizvedenih i dobijenih iz gore opisanih hibridoma. Pod "veoma homolognim" se podrazumeva da se od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što je 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucije mogu izvršiti u svakom CDR regionu. Posebno poželjna antitela su himerizovani i humanizovani oblici antitela proizvedenih i dobijenih iz gore opisanih hibridoma.

[0017] Stoga, antitelo pronalaska može biti odabrano iz grupe koja se sastoji od (i) antitela proizvedenog i dobijenog iz klona deponovanog pod pristupnim br. DSM ACC3144 (muAB 43-14A) ili DSM ACC3143 (muAB 35-22A), (ii) antitela koje je himerizovani ili humanizovani oblik antitela pod (i), (iii) antitela koje ima specifičnost antitela pod (i), i (iv) antitela koje sadrži antigen vezujući deo ili antigen vezujuće mesto antitela pod (i). Antigen vezujući deo ili antigen vezujuće mesto antitela pod (i) može sadržati varijabilni region antitela pod (i). Nadalje, obuhvaćena ovim pronalaskom su antigen-vezujući fragmenti ovde opisanih antitela.

[0018] Antitelo pronalaska poželjno može da se veže za CLDN18.2 u njegovom nativnom, tj. stanju u kakvom se javlja u prirodi ili ne-denaturisanom stanju, ili u njegovom denaturisanom stanju.

[0019] U jednom primeru izvođenja, antitelo pronalaska se može dobiti postupkom koji sadrži korak imunizacije životinje peptidom koji sadrži, poželjno se sastoji od amino-kiselinske sekvence SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 6, ili imunološki ekvivalentnim peptidom, ili nukleinskom kiselinom ili ćelijom domaćina koja eksprimira navedeni peptid. Poželjno navedeni peptid sadrži ne više od 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, ili 20 susednih aminokiselina CLDN18.2.

[0020] U jednom primeru izvođenja, antitelo pronalaska se može dobiti postupkom koji sadrži korak imunizacije životinje peptidom koji sadrži, poželjno se sastoji od amino-kiselinske sekvence SEQ ID NO: 24 ili SEQ ID NO: 25, ili imunološki ekvivalentnim peptidom, ili nukleinskom kiselinom ili ćelijom domaćina koja eksprimira navedeni peptid. Poželjno navedeni peptid sadrži ne više od 110, 100, 90, 80, ili 75 susednih amino-kiselina CLDN18.2.

[0021] Antitela ili antigen-vezujući fragmenti pronalaska mogu biti kuplovani, tj. kovalentno ili nekovalentno povezani, sa ostalim grupama kao što su detektabilni obeleživači.

[0022] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na ćeliju kao što je ćelija hibridoma koja proizvodi antitelo kako je ovde opisano.

[0023] Poželjne ćelije hibridoma su one deponovane u DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Nemačka) i imaju jednu od sledećih oznaka i pristupnih brojeva:

[0024] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na peptid koji sadrži, poželjno se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 6, ili imunološki ekvivalentnog peptida. Poželjno navedeni peptid sadrži ne više od 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, ili 20 susednih amino-kiselina CLDN18.2.

[0025] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na peptid koji sadrži, poželjno se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 24 ili SEQ ID NO: 25, ili imunološki ekvivalentnog peptida, ili nukleinske kiseline ili ćelije domaćina koja eksprimira navedeni peptid. Poželjno, navedeni peptid sadrži ne više od 110, 100, 90, 80, ili 75 susednih amino-kiselina CLDN18.2.

[0026] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na nukleinske kiseline koje sadrže gene ili sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili njihove delove, npr. lanac antitela, ili antigenvezujuće fragmente, ili peptide kako je ovde opisano. Poželjno, nukleinska kiselina ovog pronalaska je operativno privezana za kontrolne elemente ekspresije koji omogućavaju ekspresiju u ćelijama eukariota ili prokariota. Kontrolni elementi koji obezbeđuju ekspresiju u ćelijama eukariota ili prokariota su dobro poznati stručnjacima u oblasti.

[0027] Nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu biti sadržane u vektoru, npr. plazmidu, kozmidu, virusu, bakteriofagu ili drugom vektoru koji se koristi npr. konvencionalno u genetskom inženjeringu. Vektor može sadržati dalje gene kao što su marker geni koji omogućavaju selekciju vektora u pogodnoj ćeliji domaćinu i pod pogodnim uslovima. Dalje, vektor može sadržati kontrolne elemente ekspresije koji omogućavaju pravilnu ekspresiju kodirajućih regiona u pogodnim domaćinima. Takvi kontrolni elementi su poznati stručnjacima i mogu uključivati promotor, splajs kasetu, i inicijalni kodon translacije.

[0028] Postupci za konstrukciju molekula nukleinske kiseline, za konstrukciju vektora koji sadrže molekule nukleinske kiseline, za introdukciju vektora u odgovarajuće odabrane ćelije domaćina, ili za izazivanje ili postizanje ekspresije molekula nukleinske kiseline su dobro poznati u struci.

[0029] Dalji aspekt ovog pronalaska odnosi se na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor kako je ovde objavljeno.

[0030] Dalji aspekt ovog pronalaska odnosi se na detekciju CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 ili određivanje količine CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 upotrebom antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta pronalaska. Detektuju se CLDN18.2 ili ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 ili se određuje količina CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 detekcijom ili određivanjem količine kompleksa između CLDN18.2 i antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta pronalaska. Formiranje kompleksa ukazuje na prisustvo CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2. Takvo detektovanje ili određivanje količine može biti obavljeno na više načina, uključujući ali nije ograničeno na imunodetekciju upotrebom antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta pronalaska. Postupci upotrebe antitela za detekciju peptida ili proteina su dobro poznati i uključuju ELISA, kompetitivne testove vezivanja, i slično. Uopšteno, takvi testovi upotrebljavaju antitelo ili fragment antitela koji se specifično veže za ciljni peptid ili protein direktno ili indirektno vezan za obeleživač koji omogućava detekciju, npr. indikatorski enzimi, radio-obeleživači, fluorofore, ili paramagnetne čestice. Postupci pronalaska omogućavaju kvantitativne i/ili kvalitativne procene, npr., apsolutne i/ili relativne procene nivoa CLDN18.2 ili nivoa ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2.

[0031] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za detekciju CLDN18.2 ili za određivanje količine CLDN18.2 u uzorku koji sadrži korake:

(i) dovođenje u kontakt uzorka sa antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom pronalaska ili konjugatom pronalaska i

(ii) detekciju formiranja kompleksa ili određivanje količine kompleksa između antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili konjugata i CLDN18.2.

[0032] U jednom primeru izvođenja, uzorak je ćelijski uzorak, tj. uzorak koji sadrži ćelije kao što su ćelije kancera. U ovom primeru izvođenja, kompleks se poželjno formira između antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili konjugata i CLDN18.2 koji eksprimiraju ćelije u navedenom uzorku.

[0033] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za određivanje da li ćelije eksprimiraju CLDN18.2 koji sadrži korake:

(i) dovođenje u kontakt ćelijskog uzorka sa antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom pronalaska ili konjugatom pronalaska i

(ii) detekciju formiranja kompleksa između antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili konjugata i CLDN18.2 koji eksprimiraju ćelije u navedenom uzorku.

[0034] U jednom primeru izvođenja, ćelije u uzorku su ćelije kancera. Kompleks se poželjno formira između antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili konjugata i CLDN18.2 koji eksprimiraju ćelije u navedenom uzorku.

[0035] Dalji aspekti ovog pronalaska se odnose na postupke dijagnostikovanja ili klasifikacije bolesti ciljanjem CLDN18.2 upotrebom antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta pronalaska. Ovi postupci obezbeđuju selektivnu detekciju ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 pri čemu dolazi do razlikovanja tih ćelija od normalnih ćelija koje ne eksprimiraju CLDN18.2 ili bolesnih ćelija koje ne eksprimiraju CLDN18.2. Bolesti koje su okarakterisane bolesnim ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 mogu se lečiti terapijom koja cilja CLDN18.2 kao što je terapija terapeutskim antitelima usmerenim prema CLDN 18.2. Poželjne bolesti za terapiju ili dijagnozu su one kod kojih se CLDN18.2 eksprimira ili aberantno eksprimira, posebno bolesti kancera, kao što su one opisane ovde.

[0036] U jednom aspektu ovaj pronalazak se odnosi na postupke za dijagnozu, detekciju ili praćenje, tj. određivanje regresije, progresije, toka i/ili početka bolesti kancera koja sadrži detekciju CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 i/ili određivanje količine CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 u biološkom uzorku izolovanom iz pacijenta upotrebom antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta pronalaska. Takvi postupci mogu se upotrebljavati za detekciju da li subjekat ima bolest kancera ili je pod (povećanim) rizikom od nastanka bolesti kancera ili, na primer, da li je režim lečenja efikasan.

[0037] Stoga, u jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za dijagnozu, detekciju ili praćenje kancera koji sadrži korake:

(i) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom pronalaska ili konjugatom pronalaska i

(ii) detekciju formiranja kompleksa i/ili određivanje količine kompleksa između antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili konjugata i CLDN18.2.

[0038] U jednom primeru izvođenja, biološki uzorak je ćelijski uzorak, tj. uzorak koji sadrži ćelije kao što su ćelije kancera. U ovom primeru izvođenja, kompleks se poželjno formira između antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili konjugata i CLDN18.2 koji eksprimiraju ćelije u navedenom uzorku.

[0039] Postupci praćenja u skladu sa pronalaskom poželjno sadrže detekciju i/ili određivanje količine CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 u prvom uzorku u prvoj vremenskoj tački i u dodatnom uzorku u drugoj vremenskoj tački, pri čemu se mogu odrediti regresija, progresija, tok i/ili početak tumorske bolesti poređenjem dva uzorka.

[0040] Uobičajeno, nivo CLDN18.2 ili nivo ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 u biološkom uzorku se upoređuje sa referentnim nivoom, pri čemu odstupanje od navedenog referentnog nivoa ukazuje na prisustvo i/ili stadijum bolesti kancera kod subjekta. Referentni nivo može biti nivo određen u kontrolnom uzorku (npr. iz zdravog tkiva ili subjekta, posebno pacijenta bez bolesti kancera) ili srednji nivo zdravih subjekata. "Odstupanje" od navedenog referentnog nivoa označava bilo kakvu značajnu promenu, kao što je povećanje za najmanje 10%, 20%, ili 30%, poželjno za najmanje 40% ili 50%, ili čak više.

[0041] Poželjno, prisustvo CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 i/ili količina CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 koja se povećava u poređenju sa referentnim nivoom, npr. u poređenju sa pacijentom bez bolesti kancera, ukazuje na prisustvo ili rizik od (tj. potencijal za razvoj) bolesti kancera kod pacijenta.

[0042] Količina CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 koja se smanjuje u poređenju sa biološkim uzorkom uzetim ranije od pacijenta može ukazivati na regresiju, pozitivan tok, npr. uspešno lečenje, ili smanjen rizik za nastanak bolesti kancera kod pacijenta.

[0043] Količina CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 koja se povećava u poređenju sa biološkim uzorkom uzetim ranije od pacijenta može ukazivati na progresiju, negativan tok, npr. neuspešno lečenje, recidiv ili metastatsko ponašanje, nastanak ili rizik za nastanak bolesti kancera kod navedenog pacijenta.

1

[0044] U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za određivanje da li je kancer moguće lečiti terapijom kancera koja cilja CLDN18.2 koji sadrži korake:

(i) dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži ćelije kancera sa antitelom ili antigenvezujućim fragmentom pronalaska ili konjugatom pronalaska i

(ii) detekciju formiranja kompleksa između antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili konjugata i CLDN18.2.

[0045] Kompleks ee poželjno formira između antitela, antigen-vezujućeg fragmenta ili konjugata i CLDN18.2 koji eksprimiraju ćelije kancera u navedenom uzorku.

[0046] Takvi postupci se mogu upotrebljavati za detekciju da li je pacijent pogodan za terapiju koja uključuje ciljanje ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 kao što je terapija upotrebom antitela koja ispoljavaju jednu ili više imunskih efektorskih funkcija kao što su citotoksična CLDN18.2 specifična antitela, npr. antitela obeležena citotoksičnom supstancom kao što je toksin ili radio-obeleživač ili indukovanjem mehanizma ubijanja ćelija kao što su CDC ili ADCC. Bolesti koje su okarakterisane bolesnim ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 mogu se lečiti terapijom koja cilja CLDN18.2 kao što su bolesti kancera, posebno one opisane ovde.

[0047] U jednom primeru izvođenja bilo kog od gore navedenih aspekata, uzorak, ćelijski uzorak ili biološki uzorak je iz pacijenta koji ima bolest kancera, za koga se sumnja da ima ili oboljeva od bolesti kancera ili ima potencijal za bolest kancera. U jednom primeru izvođenja, uzorak, ćelijski uzorak ili biološki uzorak je iz tkiva ili organa gde ćelije kada je tkivo ili organ bez kancera, u suštini ne eksprimiraju CLDN18.2. Poželjno navedeno tkivo je tkivo drugo nego želudačno tkivo. Poželjno, navedeno tkivo je tkivo pluća, jednjaka, pankreasa ili dojke i opciono je već dijagnostifikovano da je tkivo ili organ zahvaćeno bolešću kancera, npr. vizuelnim pregledom ili ispitivanjem kulture ćelija navedenog tkiva ili organa. U ovom primeru izvođenja, prisustvo CLDN18.2 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 i/ili količina CLDN18.2 ili ćelija koja eksprimiraju CLDN18.2 koja se povećava u poređenju sa referentnim nivoom, na primer, u poređenju sa pacijentom bez tumorske bolesti, može ukazivati da je pacijent pogodan za terapiju koja uključuje ciljanje ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2.

[0048] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje kompozicije, npr. dijagnostičke kompozicije, ili komplete (kitove), koji sadrže antitelo ili antigen-vezujući fragment ili kombinaciju antitela i/ili antigen-vezujućih fragmenata opisanih ovde. Takve dijagnostičke kompozicije ili test kompleti su korisni u postupcima pronalaska kao što su postupci za dijagnozu, detekciju ili praćenje pronalaska. Ovi kompleti mogu opciono sadržati obeleživač koji se može detektovati, npr. indikatorske enzime, radio-obeleživače, fluorofore, ili paramagnetne čestice. Kompleti mogu uključivati informativne brošure, na primer pamflete sa informacijama kako se upotrebljavaju reagensi za praktikovanje ovde opisanog postupka.

[0049] Ostala svojstva i prednosti ovog pronalaska biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.

Detaljan opis pronalaska

[0050] Iako je ovaj pronalazak detaljno opisan u daljem tekstu, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na ovde opisane pojedine metodologije, protokole i reagense, jer oni mogu varirati. Takođe treba razumeti da se ovde upotrebljena terminologija upotrebljava samo za opisivanje pojedinih primera izvođenja, i nije namenjena da ograniči opseg ovog pronalaska koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde upotrebljavaju imaju ista značenja kao što ih obično razume onaj koji je prosečno stručan u oblasti.

[0051] U tekstu koji sledi, biće opisani elementi ovog pronalaska. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, treba razumeti da oni mogu biti kombinovani na bilo koji način i u bilo kojem broju da bi se stvorili dodatni primeri izvođenja. Različite opisane primere i poželjne primere izvođenja ne treba tumačiti kao ograničenje ovog pronalaska na samo izričito opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba razumeti kao podršku i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju izričito opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem objavljenih i/ili poželjnih elemenata. Osim toga, bilo koje permutacije i kombinacije svih opisanih elemenata u ovoj prijavi treba smatrati objavljenim opisom ove prijave ukoliko kontekst ne naznačava drugačije.

[0052] Poželjno, termini koji su ovde upotrebljeni su definisani kako je opisano u "Višejezičnom pojmovniku biotehnoloških termina: (Preporuke IUPAC-a)" ("A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)"), H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, i H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Bazel, Švajcarska, (1995).

[0053] Praksa ovog pronalaska će koristiti, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke hemije, biohemije, ćelijske biologije, imunologije, i rekombinantne DNK tehnike koje su objašnjene u literaturi u oblasti (upor., na primer, Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), drugo izdanje, J. Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0054] U ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koje slede, osim ukoliko kontekst ne nalaže drugačije, reč "sadržati", i varijacije kao što su "sadrži" i "koji sadrži" podrazumevaju uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključenje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupa članova, celih brojeva ili koraka, mada je u nekim primerima izvođenja takav drugi član, ceo broj ili korak ili grupa članova, celih brojeva ili koraka mogu biti isključeni, tj. predmetna tema ima uključen navedeni član, ceo broj ili korak ili grupu članova, celih brojeva ili koraka. Određene i neodređene članove i slične reference koje se upotrebljavaju u kontekstu opisa pronalaska (posebno u kontekstu patentnih zahteva) treba tumačiti tako da pokrivaju i jedninu i množinu, osim ukoliko je ovde drugačije naznačeno ili nije jasno suprotstavljeno kontekstu. Navođenje raspona vrednosti u ovom tekstu služe samo kao skraćeni postupak pojedinačnog pozivanja na svaku pojedinačnu vrednost koja pada unutar raspona. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost uključena je u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Svi ovde opisani postupci mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redosledom osim ukoliko nije drugačije naznačeno u ovom tekstu ili je na drugi način jasno suprotstavljeno kontekstu. Upotreba bilo kojeg i svih primera, ili primernog jezika (npr. "kao što je"), koji su ovde obezbeđeni namenjena je samo da bolje ilustruje pronalazak i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska koji se inače zahteva. Nijedan jezik u specifikaciji ne treba tumačiti kao takav koji naznačava bilo koji element koji nije zahtevan koji je od suštinske važnosti za praksu pronalaska.

[0055] Nekoliko dokumenata je citirano u tekstu ove specifikacije. Svaki od ovde citiranih dokumenata (uključujući sve patente, patentne prijave, naučne publikacije, specifikacije proizvođača, uputstva, itd.), bilo supra ili infra, ovim se u svojoj celosti integrišu putem reference. Ništa se ovde ne može tumačiti kao priznanje da pronalazak nema pravo na takvo otkrivanje na osnovu prethodnog pronalaska.

[0056] Termin "rekombinantni" u kontekstu ovog pronalaska znači "načinjen genetskim inženjeringom". Poželjno, "rekombinantni objekat" kao što je rekombinantna ćelija u kontekstu ovog pronalaska ne javlja se prirodno.

[0057] Termin "prirodno se javlja" kako se ovde upotrebljava označava činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) i može biti izolovana iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji je ona koja se prirodno javlja.

1

[0058] Termin "antigen" odnosi se na agens koji sadrži epitop prema kome je imunskii odgovor usmeren i/ili se generiše. Poželjno, antigen u kontekstu ovog pronalaska je molekul koji, opciono posle obrade, indukuje imunsku reakciju, koja je poželjno specifična za antigen. Termin "antigen" uključuje posebno proteine, peptide, polisaharide, nukleinske kiseline, posebno RNK i DNK, i nukleotide.

[0059] Termin "epitop" označava antigenu determinantu u molekulu, tj. deo u molekulu koji je prepoznat od strane imunskog sistema, na primer, koji je prepoznat od strane antitela. Na primer, epitopi su diskretna, trodimenzionalna mesta na antigenu, koja prepoznaje imunski sistem. Epitopi se uobičajeno sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su amino-kiseline ili bočni lanci šećera i uobičajeno imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prve ali ne za kasnije gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop proteina, kao što je CLDN, poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinuirani deo navedenog proteina i poželjno je između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 amino-kiselina dugačak, na primer, epitop može biti poželjno 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 amino-kiselina dugačak.

[0060] Termin "diskontinuirani epitop" kako se ovde upotrebljava, znači konformacioni epitop na proteinskom antigenu koji je formiran od najmanje dva odvojena regiona u primarnoj sekvenci proteina.

[0061] U poželjnom primeru izvođenja, antigen je antigen povezan sa tumorom, kao što je CLDN 18.2, tj. konstituent ćelija kancera koji se može dobiti iz citoplazme, ćelijske površine i ćelijskog nukleusa, posebno oni antigeni koji se proizvode, poželjno u velikoj količini, unutarćelijski ili kao površinski antigeni na ćelijama kancera.

[0062] U kontekstu ovog pronalaska, termini "antigen povezan sa tumorom" ili "tumorski antigen" odnose se na proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim fazama razvoja, na primer, antigen povezan sa tumorom može biti pod normalnim uslovima specifično eksprimiran u želudačnom tkivu, poželjno u mukozi želuca, u reproduktivnim organima, npr. u testisima, u trofoblastnom tkivu, npr. u placenti, ili u ćelijama germinativne linije, i eksprimiraju se ili aberantno eksprimiraju u jednom ili više tkiva tumora ili kancera. U ovom kontekstu, "ograničen broj" poželjno znači ne više od 3, poželjnije ne više od 2. Antigeni povezani sa tumorom u kontekstu ovog pronalaska uključuju, na primer, antigene diferencijacije, poželjno antigene diferencijacije specifične za ćelijski tip, tj. proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u određenom ćelijskom tipu u određenom stadijumu diferencijacije, antigene kancera/testisa, tj. proteine koji se pod normalnim uslovima specifično eksprimiraju u testisima i ponekad u placenti, i antigene specifične za germinativnu liniju. U kontekstu ovog pronalaska, antigen povezan sa tumorom je poželjno povezan sa ćelijskom površinom ćelije kancera i poželjno je da se ne eksprimira ili samo retko eksprimira u normalnim tkivima. Poželjno, antigen povezan sa tumorom ili aberantna ekspresija antigena povezanog sa tumorom identifikuje ćelije kancera. U kontekstu ovog pronalaska, antigen povezan sa tumorom koji eksprimira ćelija kancera kod subjekta, npr. pacijenta koji boluje od bolesti kancera, poželjno je sopstveni protein kod navedenog subjekta. U poželjnim primerima izvođenja, antigen povezan sa tumorom u kontekstu ovog pronalaska se eksprimira pod normalnim uslovima specifično u tkivu ili organu koji je neesencijalan, tj. tkivima ili organima koji kad se oštete od strane imunskog sistema ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koje nisu ili su samo teško dostupne imunskom sistemu. Poželjno, amino-kiselinska sekvenca antigena povezanog sa tumorom je identična za antigen povezan sa tumorom koji se eksprimira u normalnim tkivima i antigen povezan sa tumorom koji se eksprimira u tkivima kancera.

[0063] Primeri za antigene diferencijacije koji idealno ispunjavaju kriterijume za antigene povezane sa tumorom kao ciljnim strukturama u imunoterapiji tumora, posebno u vakcinisanju protiv tumora su proteini ćelijske površine iz porodice klaudina, kao što je CLDN18.2. Klaudini su porodica proteina koji su najvažnije komponente čvrstih veza, gde oni uspostavljaju paraćelijsku barijeru koja kontroliše protok molekula u međućelijskom prostoru između ćelija epitela. Klaudini su transmembranski proteini koji premošćuju (španuju) membranu 4 puta sa N-terminalnim i C-terminalnim krajevima koja se oba nalaze u citoplazmi.

[0064] Termin "klaudin 18" ili "CLDN18" se poželjno odnosi na humani CLDN18 i uključuje bilo koje splajs varijante kao što su kao CLDN18.1 i CLDN18.2 od CLDN18. CLDN18.1 i CLDN18.2 se razlikuju u N-terminalnom delu koji sadrži prvi transmembranski (TM) region i petlju1, dok je primarna proteinska sekvenca C-terminusa identična.

[0065] Termin "CLDN18.1" poželjno se odnosi na humani CLDN18.1, i posebno, na protein koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 1 liste sekvenci ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence.

[0066] Termin "CLDN18.2" poželjno se odnosi na humani CLDN18.2, i posebno, na protein koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 2 liste sekvenci ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence.

1

[0067] Termin "varijanta" u skladu sa pronalaskom označava, posebno, mutante, splajs varijante, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrsta i homologe vrsta, posebno one koji su prirodno prisutni. Alelna varijanta se odnosi na promenu u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Kompletno sekvencioniranje gena često identifikuje brojne alelne varijante datog gena. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili amino-kiseline poreklom od različite vrste od one od date sekvence nukleinske kiseline ili amino-kiseline.

[0068] Termini "CLDN", "CLDN18", "CLDN18.1" i "CLDN18.2" treba da obuhvate sve posttranslaciono modifikovane varijante i konformacione varijante.

[0069] CLDN18.2 se selektivno eksprimira u normalnim tkivima u diferenciranim epitelnim ćelijama mukoze želuca. CLDN18.2 se eksprimira u kancerima različitog porekla, i posebno je pogodan kao ciljna struktura za razvoj imunoterapije kancera posredovane antitelom zbog svoje selektivne ekspresije (nema ekspresije u toksično relevantnom normalnom tkivu) i lokalizacije na ćelijskoj membrani. Na primer, pronađeno je da se CLDN18.2 eksprimira u karcinomu pankreasa, karcinomu jednjaka, karcinomu želuca, karcinomu bronhija, karcinomu dojke, i ENT tumorima. CLDN18.2 je dragoceni cilj za prevenciju i/ili lečenje primarnih tumora, kao što su kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer jajnika, kancer debelog creva, kancer jetre, kancer glave i vrata, i kanceri žučne kese, i njihovih metastaza, posebno metastaze kancera želuca poput Krukenbergovih tumora, peritonealne metastaze, i metastaze na limfnim čvorovima. Ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 su poželjno ćelije kancera i odabrane su posebno iz grupe koja se sastoji od ćelija kancera tumorigenog želuca, jednjaka, pankreasa, pluća, jajnika, debelog creva, jetre, glave i vrata, i žučne kese.

[0070] U skladu sa pronalaskom, ćelija koja eksprimira CLDN18.2 poželjno je okarakterisana sa CLDN18.2 ćelijske površine koji je vezan za membranu, tj. CLDN18.2 je povezan sa ćelijskom površinom. Osim toga, u skladu sa pronalaskom, ćelijski CLDN18.2 je poželjno CLDN18.2 ćelijske površine koji je vezan za membranu. Ćelija koja eksprimira CLDN18.2 ili ćelija okarakterisana udruživanjem CLDN18.2 sa njenom ćelijskom površinom poželjno je ćelija kancera, poželjno ćelija kancera od ovde opisanih kancera.

[0071] Termin "povezan sa ćelijskom površinom" znači da je antigen povezan sa tumorom kao što je CLDN18.2 povezan sa i smešten na ćelijskoj membrani ćelije, pri čemu je najmanje deo antigena povezanog sa tumorom okrenut ka vanćelijskom prostoru navedene ćelije i može mu se pristupiti sa spoljašnje strane navedene ćelije, npr., od strane antitela koja se nalaze izvan ćelije. U ovom kontekstu, deo je poželjno najmanje 4, poželjno najmanje 8, poželjno najmanje 12, poželjnije najmanje 20 amino-kiselina. Povezivanje može biti direktno ili

1

indirektno. Na primer, povezivanje može biti preko jednog ili više transmembranskih domena, jednog ili više lipidnih sidara, ili putem interakcije sa bilo kojim drugim proteinom, lipidom, saharidom, ili drugom strukturom koja se može naći na spoljašnjem sloju ćelijske membrane ćelije. Na primer, antigen povezan sa tumorom povezan sa površinom ćelije može biti transmembranski protein koji ima vanćelijski deo ili može biti protein povezan sa površinom ćelije interakcijom sa drugim proteinom koji je transmembranski protein.

[0072] "Ćelijska površina" ili "površina ćelije" upotrebljava se u skladu sa svojim normalnim značenjem u struci, i stoga uključuje spoljašnjost ćelije koja je dostupna za vezivanje od strane proteina i drugih molekula.

[0073] U skladu sa pronalaskom CLDN18.2 se ne eksprimira značajnoj meri u ćeliji i nije u značajnoj meri povezan sa ćelijskom površinom ukoliko nivo ekspresije i povezanosti premašuje nivo ekspresije i povezanosti u nekancerskom tkivu osim u želucu za ne više od 2 puta, poželjno 1,5 put, i poželjno ne premašuje nivo ekspresije i povezanosti u navedenom nekancerskom tkivu. Poželjno, CLDN18.2 nije u značajnoj meri eksprimiran u ćeliji i nije u značajnoj meri povezan sa ćelijskom površinom ukoliko je nivo ekspresije ili povezanosti ispod granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije ili povezanosti prenizak da omogući vezanje antitela specifičnih za CLDN18.2 dodatih ćelijama.

[0074] U skladu sa pronalaskom CLDN18.2 se eksprimira u ćeliji i povezan je sa ćelijskom površinom ukoliko nivo ekspresije i povezanosti prevazilazi nivo ekspresije i povezanosti u nekancerskom tkivu osim želuca, poželjno više od 2 puta, poželjno 10 puta, 100 puta, 1000 puta, ili 10000 puta. Poželjno, CLDN18.2 se eksprimira u ćeliji i povezan je sa ćelijskom površinom ukoliko je nivo ekspresije i povezanosti iznad granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije i povezanosti dovoljno velik da omogući vezivanje antitela specifičnih za CLDN18.2 dodatih ćelijama.

[0075] Termin "antitelo" označava glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, i uključuje bilo koji molekul koji sadrži njegov antigen vezujući deo. Termin "antitelo" uključuje monoklonalna antitela i fragmente ili derivate antitela, uključujući, bez ograničenja, humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, jednolančana antitela, npr., scFv i antigen-vezujuće fragmente antitela kao što su Fab i Fabꞌ fragmenti i takođe uključuje sve rekombinantne oblike antitela, npr., antitela eksprimirana u prokariotima, neglikozilovana antitela, i bilo koje antigenvezujuće fragmente i derivate antitela kako je ovde opisano. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i

1

konstantnog regiona lakog lanca. VH i VL regioni se dalje mogu podeliti na regione hipervarijabilnosti, koji su nazvani regioni koji određuju komplementarnost (CDR), isprekidani regionima koji su više konzervirani, koji su nazvani regioni okvira (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0076] Ovde opisana antitela mogu biti humana antitela. Termin "humano antitelo", kao što se ovde upotrebljava, namenjen je da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. Humana antitela ovog pronalaska mogu uključivati amino-kiselinske ostatke koji nisu kodirani imunoglobulinskim sekvencama humane germinativne linije (npr. mutacije introdukovane nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatska mutacija in vivo).

[0077] Termin "humanizovano antitelo" označava molekul koji ima antigen vezujuće mesto koje je pretežno izvedeno od imunoglobulina iz ne-humane vrste, pri čemu je preostala imunoglobulinska struktura molekula zasnovana na strukturi i/ili sekvenci humanog imunoglobulina. Antigen vezujuće mesto može ili da sadrži kompletne varijabilne domene spojene na konstantne domene ili samo region koji određuju komplementarnost (CDR) presađene na odgovarajuće regione okvira u varijabilnim domenima. Antigen vezujuća mesta mogu biti divljeg tipa ili modifikovana jednom ili više supstitucija amino-kiselina, npr. modifikovana da približnije podsećaju na humane imunoglobuline. Neki oblici humanizovanih antitela zadržavaju sve CDR sekvence (na primer humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR-a iz mišjeg antitela). Ostali oblici imaju jedan ili više CDR-ova koji su izmenjeni u odnosu na originalno antitelo.

[0078] Termin "himerno antitelo" označava ona antitela u kojima je jedan deo svake od amino-kiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi, dok je preostali segment lanca homologan odgovarajućim sekvencama u drugoj. Tipično, varijabilni region i lakog i teškog lanca oponaša varijabilne regione antitela dobijenih iz jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologni sa sekvencama antitela koja su dobijena iz druge. Jedna jasna prednost takvih himernih oblika je ta što varijabilni region može pogodno da se dobije od trenutno poznatih izvora upotrebom lako dostupnih B-ćelija ili hibridoma iz ne-humanih

1

organizama domaćina u kombinaciji sa konstantnim regionima dobijenim iz, na primer, preparata humane ćelije. Dok varijabilni region ima prednost u lakoj pripremi i izvor ne utiče na specifičnost, konstantni region koji je human, manje je verovatno da izazove imunski odgovor kod humanog subjekata kada se antitela injektiraju nego što bi to bilo kod konstantnog regiona iz ne-humanog izvora. Međutim definicija nije ograničena na ovaj konkretan primer.

[0079] Termini "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "vezujući deo") ili "antigenvezujući fragment" antitela (ili jednostavno "vezujući fragment") označavaju jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vežu za antigen. Pokazano je da antigen-vezujuću funkciju antitela mogu obavljati fragmenti antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih terminom "antigen-vezujući deo" antitela uključuju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od VL, VH, CL i CH domena; (ii) F(ab')2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; (iii) Fd fragmente koji se sastoje od VH i CH domena; (iv) Fv fragmente koji se sastoje od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragmente (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), koji se sastoje od VH domena; (vi) izolovane regione koji određuju komplementarnost (CDR) i (vii) kombinacije dva ili više izolovana CDR koji mogu biti opciono spojeni sintetičkim linkerom. Pored toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genima, oni se mogu spojiti, upotrebom rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji im omogućava da budu stvoreni kao jedan proteinski lanac u kojem se VL i VH regioni sparuju kako bi formirali monovalentne molekule (poznate kao jednolančana Fv (scFv); videti npr. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Ovakva jednolančana antitela su takođe predviđena da budu obuhvaćena terminom "antigen-vezujući fragment" antitela. Sledeći primer su fuzioni proteini vezujućeg-domena imunoglobulina koji sadrže (i) polipeptid vezujućeg domena koji je fuzionisan sa zglobnim regionom imunolobulinskog polipeptida, (ii) CH2 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa zglobnim regionom, i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa CH2 konstantnim regionom. Polipeptid vezujućeg domena može biti varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Fuzioni proteini vezujućeg-domena imunoglobulina dalje su objavljeni u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela su dobijeni upotrebom konvencionalnih tehnika poznatih onima koji imaju veštine u ovoj oblasti, i fragmenti su provereni za korisnost na isti način kao i intaktna antitela.

1

[0080] Ovde opisana antitela mogu biti monoklonalna antitela. Termin "monoklonalno antitelo" kako se ovde upotrebljava označava preparat molekula antitela jedne molekulske kompozicije. Monoklonalno antitelo pokazuje jednu specifičnost i afinitet vezivanja. U jednom primeru izvođenja, monoklonalna antitela se proizvode od strane hibridoma koji uključuje B ćeliju dobijenu od životinje koja nije čovek, npr. miš, fuzionisanu sa imortalizovanom ćelijom.

[0081] Ovde opisana antitela mogu biti rekombinantna antitela. Termin "rekombinantno antitelo", kao što se ovde upotrebljava, uključuje sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim načinima, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomalna u odnosu na imunoglobulinske gene ili hibridoma koji je pripremljen od njih, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane da eksprimira antitelo, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke antitela, i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana bilo kojim drugim načinima koji uključuju obradu sekvence imunoglobulinskih gena u druge DNK sekvence.

[0082] Termin "transfektom", kako se ovde upotrebljava, uključuje rekombinantne eukariotske ćelije domaćina koje eksprimiraju antitelo, kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293 ćelije, HEK293T ćelije, biljne ćelije, ili gljive, uključujući ćelije kvasca.

[0083] Kako se ovde upotrebljava, "heterologno antitelo" je definisano u odnosu na transgeni organizam koji proizvodi takvo antitelo. Ovaj termin označava antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu ili kodirajuću sekvencu nukleinske kiseline koja odgovara onoj koja se nalazi u organizmu koji se ne sastoji od transgenih organizama, i koja uglavnom potiče od vrste druge nego transgeni organizam.

[0084] Kako se ovde upotrebljava, "heterohibridno antitelo" označava antitelo koje ima lake i teške lance poreklom iz različitih organizama. Na primer, antitelo koje ima humani teški lanac povezan sa lakim lancem murina je heterohibridno antitelo.

[0085] Pronalazak uključuje sva antitela i derivate antitela kako je ovde opisano koja su u svrhe ovog pronalaska obuhvaćena terminom "antitelo". Termin "derivati antitela" označava bilo koji modifikovani oblik antitela, npr., konjugat antitela i drugog agensa ili antitela, ili fragment antitela.

[0086] Antitela koja su ovde opisana su poželjno izolovana. Namera je da "izolovano antitelo" kako se ovde upotrebljava, treba da označava antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti. Štaviše, izolovano antitelo može biti u suštini bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

2

[0087] U skladu sa ovim pronalaskom, antitelo je sposobno za vezivanje za unapred određeni cilj ukoliko ima značajan afinitet za navedeni unapred određeni cilj i vezuje se za navedeni unapred određeni cilj u standardnim testovima. "Afinitet" ili "afinitet vezivanja" često se meri ravnotežnom konstantom disocijacije (KD). Poželjno, termin "značajan afinitet" označava vezivanje za unapred određeni cilj sa konstantom disocijacije (KD) od 10-5 M ili nižom, 10<-6>M ili nižom, 10<-7>M ili nižom, 10<-8>M ili nižom, 10<-9>M ili nižom, 10<-10>M ili nižom, 10<-11>M ili nižom, ili 10<-12>M ili nižom.

[0088] Antitelo nije (suštinski) sposobno da se vezuje za cilj ukoliko nema značajan afinitet za navedeni cilj i ne vezuje se značajno, posebno se ne vezuje detektabilno, za navedeni cilj u standardnim testovima. Poželjno, antitelo se ne vezuje detektabilno za navedeni cilj ukoliko je prisutno u koncentraciji do 2, poželjno 10, još poželjnije 20, posebno 50 ili 100 μg/ml ili više. Poželjno, antitelo nema značajan afinitet za cilj ukoliko se za navedeni cilj vezuje sa KDkoja je najmanje 10-puta, 100-puta, 103-puta, 104-puta, 105-puta, ili 106 puta veća nego KDza vezivanje za unapred određeni cilj za koji je antitelo sposobno da se veže. Na primer, ukoliko je KDza vezivanje antitela za cilj za koji je antitelo sposobno da se veže 10-7 M, KDza vezivanje za cilj za koji antitelo nema značajan afinitet bila bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10-3 M, 10-2 M, ili 10-1 M.

[0089] Antitelo je specifično za unapred određeni cilj ukoliko je sposobno da se veže za navedeni unapred određeni cilj dok nije sposobno da se vezuje za druge ciljeve, tj. nema značajan afinitet prema drugim ciljevima i ne vezuje se značajno za druge ciljeve u standardnim ispotivanjima. U skladu sa pronalaskom, antitelo je specifično za CLDN18.2 ukoliko je sposobno da se vezuje za CLDN18.2 ali nije (suštinski) sposobno da se vezuje za druge ciljeve, posebno proteine koji nisu klaudin proteini, poželjno proteine koji nisu CLDN18, posebno proteine koji nisu CLDN18.2. Poželjno, antitelo je specifično za CLDN18.2 ukoliko afinitet za i vezivanje za takve druge ciljeve ne prelazi značajno afinitet za ili vezivanje za proteine koji nisu povezani sa klaudinom kao što su albumin goveđeg seruma (BSA), kazein, albumin humanog seruma (HSA) ili ne-klaudin transmembranski proteini kao što su MHC molekuli ili receptori transferina ili bilo kojeg drugog specificiranog polipeptida. Poželjno, antitelo je specifično za unapred određeni cilj ukoliko se vezuje za navedeni cilj sa KDkoja je najmanje 10-puta, 100-puta, 103-puta, 104-puta, 105-puta, ili 106-puta manja od KDza vezivanje za cilj za koji nije specifično. Na primer, ukoliko je KDza vezivanje antitela za cilj za koji je specifično 10<-7>M, KDza vezivanje za cilj za koji nije specifično bilo bi najmanje 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M, ili 10-1 M.

[0090] Vezivanje antitela za cilj može biti eksperimentalno određeno upotrebom bilo kog pogodnog postupka; videti, na primer, Berzofsky et al., "Interakcije antitela i antigena" u Fundamentalnoj imunologiji ("Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology), Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), i postupcima opisanim ovde. Afiniteti se mogu lako odrediti upotrebom konvencionalnih tehnika, kao što je ravnotežna dijaliza; upotrebom BIAcore 2000 instrumenta, upotrebom opštih procedura koje je naveo proizvođač; radioimunološkim testiranjem upotrebom radioaktivno obeleženog ciljnog antigena; ili drugim postupkom koji je poznat stručnjaku. Podaci o afinitetu mogu se analizirati, na primer, postupkom Scatchard et al., Ann N. Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Izmereni afinitet određene antitelo-antigen interakcije može varirati ukoliko se meri pod različitim uslovima, npr. koncentracija soli, pH. Stoga, merenja afiniteta i drugih antigen-vezujućih parametara, npr., KD, IC50, poželjno je napraviti sa standardizovanim rastvorima antitela i antigena, i standardizovanim puferom.

[0091] Kako se ovde upotrebljava, "izotip" označava klasu antitela (npr. IgM ili IgG1) koja je kodirana genima za konstantni region teškog lanca. Antitela u skladu sa pronalaskom uključuju poliklonalna i monoklonalna antitela i uključuju IgG2a (npr. IgG2a, κ, λ), IgG2b (npr. IgG2b, κ, λ), IgG3 (npr. IgG3, κ, λ) i IgM antitela. Međutim, drugi izotipovi antitela su takođe obuhvaćeni pronalaskom, uključujući IgG1, IgA1, IgA2, sekretorna IgA, IgD, i IgE antitela.

[0092] Kako se ovde upotrebljava, "promena izotipa" označava fenomen u kome se klasa, ili izotip, antitela menja iz jedne Ig klase u jednu od drugih Ig klasa.

[0093] Termin "preuređen" kako se ovde upotrebljava označava konfiguraciju lokusa teškog ili lakog lanca imunoglobulina u kojem je V segment pozicioniran odmah pored D-J ili J segmenta u konformaciji koja kodira suštinski kompletni VH ili VL domen, respektivno. Preuređeni lokus gena imunoglobulina (antitela) može biti identifikovan poređenjem sa DNK germinativne linije; preuređeni lokus će imati najmanje jedan rekombinovani heptamer/nonamer element homologije.

[0094] Termin "nepreuređena" ili "konfiguracija germinativne linije" kako se ovde upotrebljava u vezi sa V segmentom označava konfiguraciju pri kojoj V segment nije rekombinovan kako bi bio odmah pored D ili J segmenta.

[0095] U skladu sa pronalaskom, antitela se mogu izvesti iz različitih vrsta, uključujući ali ne ograničavajući se na miša, pacova, zeca, zamorca i ljudsko biće. Antitela takođe uključuju himerne molekule u kojima se konstantan region antitela izveden iz jedne vrste, po mogućnosti ljudskog bića, kombinuje sa antigen vezujućim mestom izvedenim iz druge vrste. Štaviše, antitela uključuju humanizovane molekule u kojima se antigen vezujuća mesta antitela izvedena iz ne-humane vrste kombinuju sa konstantnim i regionima okvira humanog porekla.

[0096] Antitela se mogu proizvesti različitim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonalnih antitela, npr., standardnu tehniku hibridizacije somatskih ćelija Kohler i Milstein, Nature 256: 495 (1975). Iako su procedure hibridizacije somatske ćelije poželjne, u principu, za proizvodnju monoklonalnih antitela mogu se koristiti druge tehnike, npr., virusna ili onkogena transformacija B-limfocita ili tehnike prikazivanja na površini faga upotrebom biblioteka gena antitela.

[0097] Poželjni životinjski sistem za pripremu hibridoma koji sekretuju monoklonalna antitela je sistem murina. Proizvodnja hibridoma kod miša je veoma dobro utvrđena procedura. Protokoli i tehnike imunizacije za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u struci. Fuzioni partneri (npr. ćelije mijeloma murina) i fuzione procedure su takođe poznate.

[0098] Drugi poželjni životinjski sistemi za pripremu hibridoma koji sekretuju monoklonalna antitela su sistem pacova i zeca (npr. opisano u Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), videti takođe Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol.124: 295 (2005)).

[0099] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, humana monoklonalna antitela usmerena prema CLDN18.2 mogu se generisati upotrebom transgenih ili transhromozomalnih miševa koji nose delove humanog imunskog sistema a ne mišjeg sistema. Ovi transgeni i transhromozomski miševi uključuju miševe poznate pod nazivom HuMAb miševi i KM miševi, respektivno, i ovde se zajedno označavaju kao "transgeni miševi". Proizvodnja humanih antitela kod takvih transgenih miševa može biti izvedena kako je detaljno opisano za CD20 u WO2004035607

[0100] Još jedna strategija za generisanje monoklonalnih antitela je direktno izolovanje gena koji kodiraju antitela iz limfocita koji proizvode antitela definisane specifičnosti; videti npr. Babcock et al., 1996; Nova strategija za generisanje monoklonalnih antitela iz pojedinačnih, izolovanih limfocita koji proizvode antitela definisanih specifičnosti (A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities). Za detalje o inženjeringu rekombinantnih antitela videti takođe Welschof i Kraus, Rekombinantna antitela za terapiju kancera (Recombinant antibodes for cancer therapy) ISBN-0-89603-918-8 i Benny K.C. Lo Inženjering antitela (Antibody Engineering) ISBN 1-58829-092-1.

2

[0101] Da bi se generisala antitela na CLDN18.2, miševi mogu biti imunizovani sa peptidima konjugovanim sa nosačem izvedenim iz CLDN18.2 sekvence, obogaćenim preparatom rekombinantno eksprimiranog CLDN18.2 antigena ili njegovim fragmenatima i/ili ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 ili njihove fragmenate, kako je opisano. Alternativno, miševi mogu biti imunizovani sa DNK koja kodira humani CLDN18.2 pune dužine ili njegove fragmenate. U slučaju da imunizacije upotrebom prečišćenih ili obogaćenih preparata CLDN18.2 antigena ne rezultiraju antitelima, miševi takođe mogu biti imunizovani sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2, npr. ćelijskom linijom, kako bi se promovisali imunski odgovori.

[0102] Imunski odgovor se može pratiti tokom protokola imunizacije sa uzorcima plazme i seruma dobijenim iz repne vene ili retroorbitalnim krvarenjima. Miševi sa dovoljnim titrima anti-CLDN18.2 imunoglobulina mogu se upotrebiti za fuzije. Miševi se mogu podstaći intraperitonealno ili intravenski sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 3-5 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine kako bi se povećala stopa hibridoma koji sekretuju specifična antitela.

[0103] Kako bi se generisali hibridomi koji proizvode monoklonalna antitela na CLDN18.2, ćelije iz limfnih čvorova, slezine ili kostne srži dobijene iz imunizovanih miševa mogu biti izolovane i fuzionisane sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mijeloma miša. Rezultirajući hibridomi mogu zatim biti ispitani za proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Pojedinačni bunarčići potom mogu biti ispitani putem ELISA za hibridome koji sekretuju antitela. Imunofluorescencom i FACS analizom upotrebom ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2, mogu biti identifikovana antitela sa specifičnošću za CLDN18.2. Hibridomi koji sekretuju antitela mogu biti ponovo zasejani, ponovo ispitani, i ukoliko su još uvek pozitivni na anti-CLDN18.2 monoklonalna antitela mogu se subklonirati graničnim razblaženjem. Stabilni subklonovi mogu biti zatim kultivisani in vitro da bi generisali antitelo u medijumu kulture tkiva za karakterizaciju.

[0104] Antitela pronalaska se takođe mogu proizvesti u transfektomu ćelije domaćina upotrebom, na primer, kombinacije rekombinantnih DNK tehnika i postupaka transfekcije gena kao što je dobro poznato u struci (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

[0105] Na primer, u jednom primeru izvođenja, gen(i) od interesa, npr. geni za antitela, mogu biti ligirani u ekspresioni vektor kao što je eukariotski ekspresioni plazmid kakav upotrebljava sistem ekspresije GS gena objavljen u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338 841 ili drugi sistemi ekspresije dobro poznati u struci. Prečišćeni plazmid sa kloniranim genima za antitela mogu se introdukovati u eukariotske ćelije domaćina kao što su CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293T ćelije ili HEK293 ćelije ili alternativno druge eukariotske ćelije poput ćelija izvedenih iz biljaka, ćelije gljiva ili kvasca. Postupak upotrebljen za introdukciju ovih gena mogu biti postupci opisani u struci kao što su elektroporacija, lipofektin, lipofektamin ili drugi. Posle introdukcije ovih gena za antitela u ćelije domaćina, ćelije koje eksprimiraju antitelo mogu biti identifikovane i odabrane. Ove ćelije predstavljaju transfektome koji se mogu amplifikovati za svoj nivo ekspresije i unaprediti za proizvodnju antitela. Rekombinantna antitela mogu biti izolovana i prečišćena iz supernatanta i/ili ćelija ovih kultura.

[0106] Alternativno, klonirani geni za antitela mogu biti eksprimirani u drugim ekspresionim sistemima, uključujući prokariotske ćelije, poput mikroorganizama, npr. E. coli. Osim toga, antitela mogu biti proizvedena u transgenim ne-humanim životinjama, kao u mleku ovaca i zečeva ili u jajima kokoši, ili u transgenim biljkama; videti npr. Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; i Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

[0107] Himerna antitela su antitela, čiji različiti delovi potiču od različitih životinjskih vrsta, kao što su ona koja imaju varijabilni region dobijen iz antitela murina i konstantni region humanog imunoglobulina. Himerizacija antitela postiže se spajanjem varijabilnih regiona teškog i lakog lanca antitela murina sa konstantnim regionom humanog teškog i lakog lanca (npr. kako su opisali Kraus et al., u ediciji Postupci u molekularnoj biologiji, Rekombinantna antitela za terapiju kancera (Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy) ISBN-0-89603-918-8). U poželjnom primeru izvođenja, himerna antitela se generišu spajanjem konstantnog regiona humanog kapa-lakog lanca sa varijabilnim regionom lakog lanca murina. U takođe poželjnom primeru izvođenja, himerna antitela mogu biti generisana spajanjem konstantnog regiona humanog lambda-lakog lanca sa varijabilnim regionom lakog lanca murina. Poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG1, IgG3 i IgG4. Drugi poželjni konstantni regioni teškog lanca za generisanje himernih antitela su IgG2, IgA, IgD i IgM.

[0108] Antitela interaguju sa ciljnim antigenima pretežno preko amino-kiselinskih ostataka koji se nalaze u šest regiona teškog i lakog lanca koji određuju komplementarnost (CDR). Iz tog razloga, amino-kiselinske sekvence unutar CDR se više razlikuju između pojedinih antitela nego sekvence izvan CDR. Pošto su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija antitelo-antigen, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja oponašaju svojstva specifičnih antitela koja se prirodno javljaju konstruisanjem ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz specifičnog antitela koje se prirodno javlja presađeno na sekvence

2

okvira iz različitih antitela sa različitim svojstvima (videti npr. Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; i Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Takve sekvence okvira mogu biti dobijene iz javnih baza podataka DNK koje uključuju sekvence gena za antitela germinativne linije. Ove sekvence germinativne linije će se razlikovati od sekvenci gena za zrelo antitelo, pošto neće uključivati potpuno sastavljene varijabilne gene, koji se formiraju V (D) J spajanjem tokom sazrevanja B ćelije. Sekvence gena germinativne linije takođe će se razlikovati od sekvenci za antitela sekundarnog repertoara velikog afiniteta na pojedinim pozicijama ravnomerno duž varijabilnog regiona. Na primer, somatske mutacije su relativno retke u amino terminalnom delu regiona okvira 1 i u karboksi terminalnom delu regiona okvira 4. Osim toga, mnoge somatske mutacije ne menjaju značajno vezujuća svojstva antitela. Iz ovog razloga, nije neophodno dobiti celokupnu DNK sekvencu određenog antitela da bi se rekonstruisalo intaktno rekombinantno antitelo koje ima vezujuća svojstva slična onima kod originalnog antitela (videti WO 99/45962). Delimične sekvence teškog i lakog lanca koje obuhvataju CDR regione obično su dovoljne za ovu svrhu. Delimična sekvenca se upotrebljava da se odredi koji su varijabilni i spajajući sementi gena germinativne linije doprineli varijabilnim genima rekombinovanog antitela. Sekvenca germinativne linije se potom upotrebljava za popunjavanje delova varijabilnih regiona koji nedostaju. Lider sekvence teškog i lakog lanca se isecaju tokom sazrevanja proteina i ne doprinose svojstvima konačnog antitela. Do bi se dodale nedostajuće sekvence, klonirane cDNK sekvence mogu biti kombinovane sa sintetičkim oligonukleotidima putem ligacije ili PCR amplifikacije. Alternativno, celokupni varijabilni region može biti sintetisan kao skup kratkih, preklapajućih oligonukleotida i kombinovan PCR amplifikacijom da bi se stvorio potpuno sintetički klon varijabilnog regiona. Ovaj postupak ima izvesne prednosti kao što su uklanjanje ili uključivanje određenih restrikcionih mesta, ili optimizacija određenih kodona.

[0109] Nukleotidne sekvence transkripata teškog i lakog lanca iz hibridoma mogu biti upotrebljene za dizajniranje preklapajućeg skupa sintetičkih oligonukleotida kako bi se stvorile sintetičke V sekvence identičnih kapaciteta kodiranja amino-kiselina kao prirodne sekvence. Sekvence sintetičkog teškog i kapa lanca mogu se razlikovati od prirodnih sekvenci na tri načina: nizovi ponovljenih nukleotidnih baza se prekidaju kako bi se olakšala sinteza oligonukleotida i PCR amplifikacija; optimalna mesta inicijacije translacije su inkorporirana u skladu sa Kozakovim pravilima (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); i HindIII mesta su projektovana uzvodno od mesta inicijacije translacije.

2

[0110] Za varijabilne regione i teškog i lakog lanca, optimizovane kodirajuće i odgovarajuće nekodirajuće, lančane sekvence su rastavljene na 30-50 nukleotida približno na srednjoj tački odgovarajućeg nekodirajućeg oligonukleotida. Stoga, za svaki lanac, oligonukleotidi mogu biti sakupljeni u preklapajuće dvolančane skupove koji obuhvataju segmenate od 150-400 nukleotida. Pulovi se potom upotrebljavaju kao templati za proizvodnju proizvoda PCR amplifikacije od 150-400 nukleotida. Obično će skup oligonukleotida jednog varijabilnog regiona biti rastavljen na dva pula koja se odvojeno amplifikuju kako bi se generisala dva preklapajuća PCR proizvoda. Ovi preklapajući proizvodi se potom kombinuju PCR amplifikacijom da formiraju kompletan varijabilni region. Takođe može biti poželjno uključiti preklapajući fragment konstantnog regiona teškog ili lakog lanca u PCR amplifikaciju kako bi se generisali fragmenti koji se mogu lako klonirati u konstrukte ekspresionog vektora.

[0111] Rekonstruisani himerizovani ili humanizovani varijabilni regioni teškog i lakog lanca se zatim kombinuju sa kloniranim sekvencama promotora, lidera, inicijacije translacije, konstantnog regiona, 3' netranslatirajućim, poliadenilacije, i terminacije transkripcije da formiraju konstrukte ekspresionog vektora. Ekspresioni konstrukti teškog i lakog lanca mogu biti kombinovani u jedan vektor, ko-transfektovani, serijski transfektovani, ili odvojeno transfektovani u ćelije domaćina koje se zatim fuzionišu kako bi se formirala ćelija domaćina koja eksprimira oba lanca. Opisani su plazmidi za upotrebu u konstruisanju ekspresionih vektora za humani IgGκ. Plazmidi mogu biti konstruisani tako da PCR amplifikovane cDNK sekvence V teškog i V kapa lakog lanca mogu biti upotrebljene za rekonstrukciju kompletnih minigena teškog i lakog lanca. Ovi plazmidi mogu biti upotrebljeni da eksprimiraju potpuno humana, ili himerna IgG1, Kapa ili IgG4, Kapa antitela. Slični plazmidi mogu biti konstruisani za ekspresiju drugih izotipova teškog lanca, ili za ekspresiju antitela koja sadrže lambda lake lance.

[0112] Stoga, u drugom aspektu ovog pronalaska, strukturne odlike anti-CLDN18.2 antitela opisanih ovde, upotrebljena su za stvaranje strukturno srodnih humanizovanih anti-CLDN18.2 antitela koja zadržavaju najmanje jedno funkcionalno svojstvo antitela pronalaska, kao što je vezivanje za CLDN18.2. Tačnije, jedan ili više CDR regiona mišjih monoklonalnih antitela mogu biti kombinovani rekombinantno sa poznatim humanim regionima okvira i CDR-ovima kako bi se stvorila dodatna, rekombinantno-projektovana, humanizovana anti-CLDN18.2 antitela.

[0113] Sposobnost antitela da veže CLDN18.2 može biti određena upotrebom standardnih testova vezivanja, npr. ELISA, Western blot, imunofluorescencija i analiza protočnom citometrijom. ELISA može biti upotrebljena za demonstriranje prisustva antitela u serumima

2

imunizovanih miševa ili vezivanja monoklonalnih antitela za CLDN18.2 protein ili peptide. Peptidi ili protein upotrebljeni za imunizaciju mogu biti upotrebljeni za određivanje specifičnosti hibridomskih supernatanata ili za analizu serumskih titara.

[0114] Kako bi se demonstriralo prisustvo antitela u serumima imunizovanih miševa ili vezivanje monoklonalnih antitela za žive ćelije, može biti upotrebljena protočna citometrija. Ćelijske linije koje eksprimiraju prirodno ili posle transfekcije antigen i negativne kontrole kojima nedostaje ekspresija antigena (uzgajane u standardnim uslovima rasta) mogu biti pomešane sa različitim koncentracijama monoklonalnih antitela u hibridoma supernatantima ili u PBS koji sadrži 1% FBS, i mogu biti inkubirane na 4°C tokom 30 min. Nakon ispiranja, APC- ili Alexa647-obeleženo anti IgG antitelo može da se veže za monoklonalno antitelo vezano za antigen pod istim uslovima kao i bojenje primarnim antitelom. Uzorci mogu biti analizirani protočnom citometrijom sa FACS instrumentom upotrebom svetla i svojstava bočnog raspršivanja za ulazak u pojedinačne, žive ćelije. Da bi se razlikovala monoklonalna antitela specifična za antigen od nespecifičnih povezivača u jednom merenju, može biti korišćen postupak ko-transfekcije. Ćelije prolazno transfektovane sa plazmidima koji kodiraju antigen i fluorescentni marker mogu biti obojene kako je opisano gore. Transfektovane ćelije mogu biti otkrivene u različitom kanalu fluorescencije od ćelija obojenih antitelom. Kako većina transfektovanih ćelija eksprimira oba transgena, monoklonalna antitela specifična za antigen poželjno se vezuju za ćelije koje eksprimiraju fluorescentni marker, dok se nespecifična antitela vezuju u uporedivom odnosu za netransfektovane ćelije. Alternativno testiranje upotrebom fluorescentne mikroskopije može biti upotrebljeno pored ili umesto testa protočne citometrije. Ćelije mogu biti obojene tačno onako kako je gore opisano i pregledane fluorescentnom mikroskopijom.

[0115] Kako bi se demonstriralo prisustvo anti-CLDN18.2 antitela u serumima imunizovanih miševa ili vezivanje monoklonalnih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2, može biti upotrebljena imunofluorescentna mikroskopska analiza. Na primer, ćelijske linije koje eksprimiraju bilo spontano ili posle transfekcije CLDN18.2 i negativne kontrole kojima nedostaje CLDN18.2 ekspresija se uzgajaju na pločicama sa komoricama pod standardnim uslovima rasta u DMEM/F12 medijumu, kome je dodat 10% fetalni teleći serum (FCS), 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin i 100 μg/ml streptomicin. Ćelije potom mogu biti fiksirane metanolom ili paraformaldehidom ili ostavljene netretirane. Ćelije potom mogu reagovati sa monoklonalnim antitelima prema CLDN18.2 tokom 30 min. na 25°C. Nakon ispiranja, ćelije mogu reagovati sa anti-mišjim IgG sekundarnim antitelom obeleženim sa

2

Alexa555 (Molecular Probes) pod istim uslovima. Ćelije potom mogu biti pregledane fluorescentnom mikroskopijom.

[0116] Ukupni nivoi CLDN18.2 u ćelijama mogu biti primećeni kada su ćelije fiksirane metanolom ili fiksirane paraformaldehidom i permeabilisane sa Triton X-100. U živim ćelijama i ne-permeabilisanim, površinska lokalizacija CLDN18.2 ćelija fiksiranih paraformaldehidom može biti ispitana. Dodatno ciljanje CLDN18.2 na čvrste veze može biti analizirano istovremenim bojenjem sa markerima čvrste veze kao što je ZO-1. Osim toga, mogu biti ispitani efekti vezivanja antitela i CLDN18.2 lokalizacija unutar ćelijske membrane.

[0117] Anti-CLDN18.2 IgG može biti dalje testirano na reaktivnost sa CLDN18.2 antigenom Western blotingom. Ukratko, ćelijski ekstrakti iz ćelija koji eksprimiraju CLDN18.2 i odgovarajuće negativne kontrole mogu biti pripremljene i podvrgnute natrijum dodecil sulfat (SDS) poliakrilamidnoj gel elektroforezi. Posle elektroforeze, razdvojeni antigeni biće preneti na nitrocelulozne membrane, blokirani, i ispitivani sa monoklonalnim antitelima da bi se testirali. IgG vezivanje može biti detektovano upotrebom anti-mišjeg IgG koje je obeleženo peroksidazom i razvijeno sa ECL supstratom.

[0118] Anti-CLDN18.2 mišji IgG mogu biti dalje testirani na reaktivnost sa CLDN18.2 antigenom pomoću imunohistohemije na način koji je dobro poznat stručnoj osobi, npr. upotrebom paraformaldehidom ili acetonom fiksiranih kriopreseka ili preseka tkiva ukalupljenih u parafin fiksiranih paraformaldehidom iz tkiva bez kancera ili uzoraka tkiva kancera koji su dobijeni od pacijenata tokom rutinskih hirurških procedura ili od miševa koji nose ksenograftovane tumore inokulirane sa ćelijskim linijama koje eksprimiraju spontano ili posle transfekcije CLDN18.2. Za imuno bojenje, antitela koja reaguju sa CLDN18.2 mogu biti inkubirana što je praćeno kozjim anti-mišjim ili kozjim anti-zečjim antitelima konjugovanim sa peroksidazom rena u skladu sa uputstvima prodavca.

[0119] Jedna posebno poželjna metodologija za testiranje CLDN18.2 u postupcima pronalaska je imunohistohemija ili IHC. Imunohistohemija ili IHC označava postupak detekcije antigena (npr. proteina) u ćelijama preseka tkiva, npr. ćelijama tkiva pomenutih ovde. Imunohistohemijsko bojenje je u širokoj upotrebi u dijagnozi abnormalnih ćelija kao što su one koje su pronađene u kancerskim tumorima. Vizualizacija interakcije antitelo-antigen može biti postignuta na više načina. U najčešćem slučaju, antitelo se konjuguje za enzim, kao što je peroksidaza, koji može da katalizuje reakciju stvaranja boje. Alternativno, antitelo takođe može biti obeleženo fluoroforom, kao što je fluorescein ili rodamin.

2

[0120] Priprema uzorka je presudna za održavanje morfologije ćelije, arhitekture tkiva i antigenosti ciljnih epitopa. Ovo zahteva pravilno sakupljanje, fiksaciju i sečenje tkiva. Paraformaldehid se uobičajeno koristi za fiksaciju. U zavisnosti od namene i debljine eksperimentalnog uzorka, seku se bilo tanki (oko 4-40 μm) preseci tkiva od interesa, ili ukoliko tkivo nije veoma debelo i propusno je upotrebljava se celo. Sečenje se obično postiže upotrebom mikrotoma, i preseci se montiraju na pločice.

[0121] Uzorak može zahtevati dodatne korake kako bi se epitopi učinili dostupnim za vezivanje antitela, uključujući deparafinizaciju i otkrivanje antigena. Deterdženti poput Triton X-100 uobičajeno se upotrebljavaju u imunohistohemiji za smanjenje površinske tenzije, što omogućava upotrebu manje reagensa za postizanje bolje i ravnomernije pokrivenosti uzorka.

[0122] Direktan postupak imunohistohemijskog bojenja upotrebljava jedno obeleženo antitelo, koje se direktno vezuje za antigen za koji se boji. Indirektni postupak imunohistohemijskog bojenja koji je češći upotrebljava jedno antitelo prema antigenu za koji se ispituje, i drugo, obeleženo, antitelo prema prvom.

[0123] Da bi se smanjilo pozadinsko bojenje u IHC, uzorci se inkubiraju sa puferom koji blokira reaktivna mesta na koje se u suprotnom mogu vezati primarna ili sekundarna antitela. Primarna antitela su uzgajena prema antigenu od interesa i obično su nekonjugovana (neobeležena), dok su sekundarna antitela uzgajena prema imunoglobulinima vrste primarnog antitela. Sekundarno antitelo se obično konjuguje za linker molekul, kao što je biotin, koji zatim regrutuje reporterske molekule, ili se sekundarno antitelo direktno veže za sam reporterski molekul. Uobičajeni blokirajući puferi uključuju normalni serum, obrano mleko u prahu, BSA ili želatin, i komercijalne blokirajuće pufere.

[0124] Reporterski molekuli variraju u zavisnosti od prirode postupka detekcije, i najpopularniji postupci detekcije su pomoću hromogene i fluorescentne detekcije koje su posredovane enzimom i fluoroforom, respektivno. Kod hromogenih reportera, enzim obeleživač reaguje sa supstratom da bi se dobio intenzivno obojeni proizvod koji može biti analiziran običnim svetlosnim mikroskopom. Dok je lista enzimskih supstrata opsežna, alkalna fosfataza (AP) i peroksidaza rena (HRP) su dva enzima koja se najšire upotrebljavaju kao obeleživači za detekciju proteina. Niz hromogenih, fluorogenih i hemiluminescentnih supstrata je dostupno za upotrebu sa jednim ili drugim enzimom, uključujući DAB ili BCIP/NBT. Fluorescentni reporteri su mali, organski molekuli koji se upotrebljavaju za IHC detekciju. Za hromogene i fluorescentne postupke detekcije, denzitometrijska analiza signala može dati polu- ili potpuno- kvantitativne podatke, respektivno, da korelišu nivo signala reportera sa nivoom ekspresije ili lokalizacije proteina.

[0125] Posle imunohistohemijskog bojenja ciljnog antigena, često se primenjuje druga boja da se dobije kontrast koji pomaže da se primarna boja istakne. Mnoge od tih boja pokazuju specifičnost za diskretne ćelijske kompartmente ili antigene, dok će druge obojiti čitavu ćeliju. I hromogene i fluorescentne boje su dostupne za IHC da obezbede širok spektar reagenasa za svaki eksperimentalni dizajn. Najčešće se upotrebljavaju hematoksilin, Hoechst boja i DAPI.

[0126] Mapiranje epitopa prepoznatih antitelom može biti izvedeno kako je detaljno opisano u "Protokoli mapiranja epitopa (Postupci u molekularnoj biologiji)" (Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology)) Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 i u "Mapiranje epitopa: Praktični pristup" Edicija praktični pristup ("Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series), 248 Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

[0127] Termin "imunske efektorske funkcije" u kontekstu ovog pronalaska uključuje sve funkcije posredovane komponentama imunskog sistema koje rezultiraju inhibicijom rasta tumora i/ili inhibicijom razvoja tumora, uključujući inhibiciju širenja tumora i metastaze. Poželjno, imunske efektorske funkcije rezultiraju ubijanjem ćelija kancera. Poželjno, imunske efektorske funkcije u kontekstu ovog pronalaska su efektorske funkcije posredovane antitelom. Takve funkcije sadrže citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), ćelijski posredovanu fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), indukciju apoptoze u ćelijama koje nose antigen povezan sa tumorom, na primer, vezivanjem antitela za površinski antigen, inhibicijom signalne transdukcije posredovane CD40L, na primer, vezivanjem antitela za CD40 receptor ili CD40 ligand (CD40L), i/ili inhibicijom proliferacije ćelija koje nose antigen povezan sa tumorom, poželjno ADCC i/ili CDC. Stoga, antitela koja su sposobna da posreduju u jednoj ili više imunskih efektorskih funkcija poželjno su sposobna da posreduju u ubijanju ćelija indukujući CDC-posredovanu lizu, ADCC-posredovanu lizu, apoptozu, homotipsku adheziju, i/ili fagocitozu, poželjno indukovanjem CDC-posredovane lize i/ili ADCC-posredovane lize. Antitela takođe mogu ispoljavati efekat jednostavno vezivanjem za antigene povezane sa tumorom na površini ćelije kancera. Na primer, antitela mogu blokirati funkciju antigena povezanog sa tumorom ili indukovati apoptozu samo vezivanjem za antigen povezan sa tumorom na površini ćelije kancera.

[0128] ADCC opisuje sposobnost efektorskih ćelija da ubijaju ćelije, posebno limfocita, koji poželjno zahtevaju da ciljna ćelija bude obeležena antitelom. ADCC se poželjno javlja kada se antitela vežu za antigene na ćelijama kancera i Fc domeni antitela zauzimaju Fc receptore (FcR) na površini imunskih efektorskih ćelija. Nekoliko porodica Fc receptora su

1

identifikovane, i specifične ćelijske populacije karakteristično eksprimiraju definisane Fc receptore. ADCC može biti posmatran kao mehanizam za direktnu indukciju promenljivog stepena trenutne destrukcije tumora koja takođe dovodi do prezentacije antigena i indukcije odgovora T-ćelije usmerenih na tumor. Poželjno, in vivo indukcija ADCC će dovesti do odgovora T-ćelije usmerenih na tumor i daljih odgovora antitela izvedenih iz domaćina.

[0129] CDC je još jedan postupak ubijanja ćelija koji može biti dirigovan antitelima. IgM je najefikasniji izotip za aktivaciju komplementa. IgG1 i IgG3 su oba takođe veoma efikasni u dirigovanju CDC klasičnim putem aktivacije komplementa. Poželjno, u ovoj kaskadi, formiranje kompleksa antigen-antitelo rezultira razotkrivanjem više mesta za vezivanje C1q u neposrednoj blizini CH2 domena uključenih molekula antitela kao što su IgG molekuli (C1q je jedna od tri podkomponente komplementa C1). Poželjno ta razotkrivena mesta za vezivanje C1q konvertuju prethodnu C1q-IgG interakciju malog afiniteta u onu velike privlačnosti, koja pokreće kaskadu događaja koji uključuju seriju drugih proteina komplementa i dovodi do proteolitičkog oslobađanja C3a i C5a hemotaktičkih/aktivirajućih agenasa efektorske ćelije. Poželjno, kaskada komplementa se završava formiranjem membranskog napadačkog kompleksa, koji stvara pore u ćelijskoj membrani koje olakšavaju slobodan prolaz vode i rastvoraka u i iz ćelije i može dovesti do apoptoze.

[0130] Termin "imunske efektorske ćelije" u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na ćelije koje ispoljavaju efektorske funkcije tokom imunske reakcije. Na primer, takve ćelije sekretuju citokine i/ili hemokine, ubijaju mikrobe, sekretuju antitela, prepoznaju kancerske ćelije, i opciono eliminišu takve ćelije. Na primer, imunske efektorske ćelije sadrže T-ćelije (citotoksične T-ćelije, pomoćničke T-ćelije, T-ćelije koje infiltriraju tumor), B-ćelije, ćelije prirodne ubice, neutrofile, makrofage, i dendritske ćelije.

[0131] Nukleinska kiselina je u skladu sa pronalaskom poželjno dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) ili ribonukleinska kiselina (RNK), poželjnije RNK, najpoželjnije in vitro transkribovana RNK (IVT RNK). Nukleinske kiseline uključuju u skladu sa pronalaskom genomske DNK, cDNK, iRNK, rekombinantno pripremljene i hemijski sintetisane molekule. Nukleinska kiselina može u skladu sa pronalaskom biti u obliku molekula koji je jednolančan ili dvolančan i lineran ili kovalentno zatvoren da formira krug. Nukleinska može biti upotrebljena za introdukciju u, tj. transfekciju ćelija, na primer, u obliku RNK koja može biti pripremljena in vitro transkripcijom od DNK templata. RNK takođe može biti modifikovana pre primene stabilizujućim sekvencama, dodavanjem kape, i poliadenilacijom.

[0132] Ovde opisane nukleinske kiseline mogu biti sadržane u vektoru. Termin "vektor" kako se ovde upotrebljava uključuje bilo koje vektore poznate stručnjaku uključujući plazmidne

2

vektore, kozmidne vektore, fagne vektore kao što je lambda fag, virusne vektore kao što su adenovirusni ili bakulovirusni vektori, ili vektore veštačkih hromozoma kao što su veštački hromozomi bakterija (BAC), veštački hromozomi kvasca (YAC), ili P1 veštački hromozomi (PAC). Navedeni vektori uključuju ekspresione kao i vektore za kloniranje. Ekspresioni vektori sadrže plazmide kao i virusne vektore i uobičajeno sadrže željenu kodirajuću sekvencu i odgovarajuće DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina (npr. bakterije, kvasci, biljka, insekt ili sisar) ili in vitro ekspresionim sistemima. Vektori za kloniranje se uobičajeno upotrebljavaju za konstruisanje i amplifikaciju određenog željenog DNK fragmenta i mogu im nedostajati funkcionalne sekvence potrebne za ekspresiju željenih DNK fragmenata.

[0133] Kao vektor za ekspresiju antitela može biti upotrebljen bilo tip vektora u kojem su lanci antitela prisutni u različitim vektorima ili tip vektora u kojem su lanci antitela prisutni u istom vektoru.

[0134] Kako se ovde upotrebljava, termin "RNK" znači da molekul sadrži najmanje jedan ribonukleotidni ostatak. Pod "ribonukleotidom" se podrazumeva nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2ꞌ poziciji beta-D-ribo-furanozne grupe. Termin uključuje dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično prečišćena RNK, u suštini čistu RNK, sintetičku RNK, rekombinantno proizvedenu RNK, kao i izmenjenu RNK koja se od one RNK koja se javlja prirodno razlikuje adicijom, delecijom, supstitucijom i/ili izmenom jednog ili više nukleotida. Takve izmene mogu uključivati adiciju ne-nukleotidnog materijala, kao što je za kraj(eve) RNK ili interno, na primer na jedan ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u RNK molekulima takođe mogu sadržati nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljaju prirodno ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ove izmenjene RNK mogu se označiti kao analozi ili analozi RNK koja se prirodno javlja.

[0135] U skladu sa ovim pronalaskom, termin "RNK" uključuje i poželjno se odnosi na "iRNA" što znači "informaciona RNK" i odnosi se na "transkript" koji može biti proizveden upotrebom DNK kao templata i kodira peptid ili protein. Uobičajeno iRNA sadrži 5' netranslatirajući region, region koji kodira protein ili peptid i 3' netranslatirajući region. iRNK ima ograničeno poluvreme u ćelijama i in vitro.

[0136] U kontekstu ovog pronalaska, termin "transkripcija" odnosi se na postupak, gde se genetski kod u DNK sekvenci transkribuje u RNK.

[0137] Nukleinske kiseline opisane u skladu sa pronalaskom su poželjno izolovane. Termin "izolovana nukleinska kiselina" znači u skladu sa pronalaskom da je nukleinska kiselina (i) amplifikovana in vitro, na primer lančanom reakcijom polimeraze (PCR), (ii) rekombinantno proizvedena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer isecanjem i gel-elektroforetskim frakcionisanjem, ili (iv) sintetisana, na primer hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja je dostupna za manipulaciju rekombinantnim DNK tehnikama.

[0138] Nukleinske kiseline mogu, u skladu sa pronalaskom, biti prisutne same ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama, koje mogu biti homologne ili heterologne. U poželjnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno povezana sa sekvencama kontrole ekspresije koje mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na navedenu nukleinsku kiselinu. Termin "homologne" znači da su nukleinske kiseline prirodno takođe funkcionalno povezane i termin "heterologne" znači da nukleinske kiseline nisu prirodno funkcionalno povezane.

[0139] Nukleinska kiselina i sekvenca kontrole ekspresije su "funkcionalno" povezane jedna sa drugom, ukoliko su kovalentno povezane jedna sa drugom na takav način da je ekspresija ili transkripcija navedene nukleinske kiseline pod kontrolom ili pod uticajem navedene sekvence kontrole ekspresije. Ukoliko se nukleinska kiselina translatira u funkcionalni protein, tada, sa sekvencom kontrole ekspresije funkcionalno povezanom sa kodirajućom sekvencom, indukcija navedene sekvence kontrole ekspresije rezultira transkripcijom navedene nukleinske kiseline, bez izazivanja pomeranja okvira u kodirajućoj sekvenci ili navedena kodirajuća sekvenca nije sposobna da bude translatirana u željeni protein ili peptid.

[0140] Termin "sekvenca kontrole ekspresije" ili "element kontrole ekspresije" sadrži u skladu sa pronalaskom promotore, mesta vezivanja ribozoma, pojačivače i druge kontrolne elemente koji regulišu transkripciju gena ili translaciju iRNK. U posebnim primerima izvođenja pronalaska, sekvence kontrole ekspresije mogu biti regulisane. Tačna struktura sekvenci kontrole ekspresije može varirati u zavisnosti od vrste ili tipa ćelije, ali generalno sadrži 5ꞌ-netranskribujuće i 5ꞌ- i 3ꞌ-netranslatirajuće sekvence koje su uključene u pokretanje transkripcije i translacije, respektivno, kao što je TATA boks, kaping sekvenca; CAAT sekvenca, i slične. Tačnije, 5ꞌ-netranskribujuće sekvence kontrole ekspresije sadrže region promotora koji uključuje promotor sekvencu za kontrolu transkripcije funkcionalno povezane nukleinske kiseline. Sekvence kontrole ekspresije mogu takođe sadržati pojačivač sekvence ili uzvodne sekvence aktivacije.

[0141] U skladu sa pronalaskom termin "promotor" ili "region promotora" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja se nalazi uzvodno (5') od sekvence nukleinske kiseline koja se eksprimira i kontroliše ekspresiju sekvence obezbeđivanjem prepoznavanja i mesta vezivanja za RNK-polimerazu. "Region promotora" može uključivati dalje prepoznavanje i

4

mesta vezivanja za dodatne faktore koji su uključeni u regulaciju transkripcije gena. Promotor može kontrolisati transkripciju prokariotskog ili eukariotskog gena. Osim toga, promotor može biti "inducibilan" i može inicirati transkripciju kao odgovor na indukujući agens ili može biti "konstitutivan" ukoliko transkripcija nije kontrolisana indukujućim agensom. Gen koji je pod kontrolom inducibilnog promotora se ne eksprimira ili se samo eksprimira u maloj meri ukoliko je indukujući agens odsutan. U prisustvu indukujućeg agensa gen se uključuje ili se nivo transkripcije povećava. Ovo je posredovano, uglavnom, vezivanjem određenog transkripcionog faktora.

[0142] Promotori koji su poželjni u skladu sa pronalaskom uključuju promotore za SP6, T3 i T7 polimerazu, humani U6 RNK promotor, CMV promotor, i njihove veštačke hibridne promotore (npr. CMV) gde su deo ili delovi fuzionisani sa delom ili delovima promotora gena za druge ćelijske proteine kao što je npr. humana GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza), i koji uključuju ili ne uključuju dodatni intron(e).

[0143] Termin "ekspresija" se ovde upotrebljava u najširem značenju i sadrži proizvodnju RNK ili RNK i proteina ili peptida. U odnosu na RNK, termin "ekspresija" ili "translacija" se posebno odnosi na proizvodnju peptida ili proteina. Ekspresija može biti prolazna ili može biti stabilna. U skladu sa pronalaskom, termin ekspresija takođe uključuje "aberantnu ekspresiju" ili "abnormalnu ekspresiju".

[0144] "Aberantna ekspresija" ili "abnormalna ekspresija" znači u skladu sa ovim pronalaskom da je ekspresija izmenjena, poželjno povećana, u poređenju sa referencom, npr. stanjem kod subjekta koji nema bolest povezanu sa aberantnom ili abnormalnom ekspresijom određenog proteina, npr., antigena koji je povezan sa tumorom. Povećanje espresije označava povećanje od najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%, ili više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se pronalazi samo u bolesnom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu potisnuta.

[0145] Termin "specifično eksprimiran" znači da se protein u suštini eksprimira samo u specifičnom tkivu ili organu. Na primer, antigen povezan sa tumorom koji se specifično eksprimira u mukozi želuca znači da se navedeni protein primarno eksprimira u mukozi želuca i ne eksprimira se u drugim tkivima ili se ne eksprimira u značajnoj meri u drugim tipovima tkiva ili organa. Stoga, protein koji se eksprimira isključivo u ćelijama mukoze želuca i u značajno manjoj meri u bilo kom drugom tkivu se specifično eksprimira u ćelijama mukoze želuca. U nekim primerima izvođenja, antigen povezan sa tumorom takođe može biti specifično eksprimiran pod normalnim uslovima u više od jednog tipa tkiva ili organu, kao što je u 2 ili 3 tipa tkiva ili organa, ali poželjno u ne više od 3 različita tipa tkiva ili organa. U ovom slučaju, antigen povezan sa tumorom se tada specifično eksprimira u ovim organima.

[0146] Termin "translacija" u skladu sa pronalaskom odnosi se na proces u ribozomima ćelije pomoću kog lanac informacione RNK usmerava sklapanje sekvence amino-kiselina kako bi se stvorio protein ili peptid.

[0147] U skladu sa pronalaskom, termin "kodiranje nukleinske kiseline" znači da se nukleinska kiselina, ukoliko postoji u odgovarajućem okruženju, poželjno unutar ćelije, može eksprimirati tako da proizvede protein ili peptid koji kodira.

[0148] Termin "peptid" sadrži oligo- i polipeptide i označava supstance koje sadrže dve ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 9 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 više, poželjno 21 ili više i do poželjno 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, posebno 100 amino-kiselina kovalentno vezanih peptidnim vezama. Termin "protein" označava velike peptide, poželjno peptide sa više od 100 aminokiselinskih ostataka, ali generalno su termini "peptidi" i "proteini" sinonimi i ovde se upotrebljavaju naizmenično.

[0149] Poželjno, proteini i peptidi opisani u skladu sa pronalaskom su izolovani. Termini "izolovani protein" ili "izolovani peptid" znače da je protein ili peptid izdvojen iz svog prirodnog okruženja. Izolovani protein ili peptid mogu biti u suštinski prečišćenom stanju. Termin "suštinski prečišćen" znači da je protein ili peptid u suštini bez drugih supstanci sa kojima je povezan u prirodi ili in vivo.

[0150] Ovde dato učenje u odnosu na specifične amino-kiselinske sekvence, npr. one koje su prikazane u spisku sekvence, treba tumačiti tako da se odnosi i na modifikacije, tj. varijante, navedenih specifičnih sekvenci koje rezultiraju u sekvencama koje su funkcionalno ekvivalentne navedenim specifičnim sekvencama, npr. amino-kiselinske sekvence koje pokazuju svojstva identična ili slična onima u specifičnim amino-kiselinskim sekvencama. Jedno važno svojstvo je zadržavanje vezivanja antitela za njegov cilj. Poželjno, sekvenca modifikovana u odnosu na specifičnu sekvencu, kada zamenjuje specifičnu sekvencu u antitelu zadržava vezivanje navedenog antitela za cilj.

[0151] Stručnjaci u ovoj oblasti će posebno ceniti da se posebno sekvence CDR sekvenci, hipervarijabilnih i promenljivih regiona mogu modifikovati bez gubitka sposobnosti da se vežu za cilj. Na primer, CDR sekvence će biti ili identične ili veoma homologne sa CDR sekvencama koje su ovde navedene.

[0152] Pod "veoma homolognim" se podrazumeva da se mogu izvršiti od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što je 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucije.

[0153] Termin "varijanta" u skladu sa pronalaskom takođe uključuje mutante, splajs varijante, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrsta i homologe vrsta, posebno one koje su prirodno prisutne. Alelna varijanta odnosi se na promenu u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Sekvenciranje kompletnog gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrste je nukleinska kiselina ili amino-kiselinska sekvenca poreklom od različite vrste od one date nukleinske kiseline ili amino-kiselinske sekvence.

[0154] Za potrebe ovog pronalaska, "varijante" amino-kiselinske sekvence sadrže varijante amino-kiselinske insercije, varijante amino-kiselinske adicije, varijante amino-kiselinske delecije i/ili varijante amino-kiselinske supstitucije. Varijante amino-kiselinske delecije koje sadrže deleciju na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju proteina takođe se nazivaju N-terminalne i/ili C-terminalne varijante skraćenja.

[0155] Varijante amino-kiselinske inservije sadrže inseriranje jedne ili dve ili više aminokiselina u određenu amino-kiselinsku sekvencu. U slučaju varijanti amino-kiselinske sekvence koje imaju inserciju, jedan ili više amino-kiselinskih ostataka se inserira na određeno mesto u amino-kiselinskoj sekvenci, mada je nasumično inseriranje uz odgovarajući skrining rezultirajućeg proizvoda takođe moguće.

[0156] Varijante amino-kiselinske adicije sadrže amino- i/ili karboksi-terminalne fuzije jedne ili više amino-kiselina, kao što su 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više amino-kiselina.

[0157] Varijante amino-kiselinske delecije su okarakterisane uklanjanjem jedne ili više amino-kiselina iz sekvence, kao što je uklanjanje 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više aminokiselina. Delecije mogu biti na bilo kojoj poziciji proteina.

[0158] Varijante amino-kiselinske supstitucije su okarakterisane uklanjanjem najmanje jednog ostatka u sekvenci i inseriranjem drugog ostatka na njegovo mesto. Prednost se daje modifikacijama koje su na pozicijama u amino-kiselinskoj sekvenci koje nisu konzervirane između homolognih proteina ili peptida i/ili zamenama amino-kiselina sa drugim koje imaju slična svojstva. Poželjno, promene amino-kiselina u varijantama proteina su konzervativne amino-kiselinske promene, tj. supstitucije slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih aminokiselina. Konzervativna amino-kiselinska promena uključuje supstituciju jedne iz porodice amino-kiselina koje su srodne po svojim bočnim lancima. Amino-kiseline koje se prirodno javljaju su načelno podeljene u četiri porodice: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), i nenaelektrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) amino-kiseline. Ponekad su fenilalanin, triptofan, i tirozin klasifikovani zajedno kao aromatične amino-kiseline.

[0159] Poželjno stepen sličnosti, poželjno identičnost između date amino-kiselinske sekvence i amino-kiselinske sekvence koja je varijanta navedene amino-kiselinske sekvence biće najmanje oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99%. Stepen sličnost ili identitet je dat poželjno za amino-kiselinski region koji je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili oko 100% celokupne dužine referentne aminokiselinske sekvence. Na primer, ukoliko se referentna amino-kiselinska sekvenca sastoji od 200 amino-kiselina, stepen sličnosti ili identičnost daje se poželjno za najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, ili oko 200 amino-kiselina, poželjno kontinuiranih amino-kiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnost daje se za celokupnu dužinu referentne amino-kiselinske sekvence. Poravnanje za određivanje sličnosti sekvenci, poželjno identičnosti sekvence može se izvršiti pomoću alata poznatih u struci, poželjno upotrebom najboljeg poravnanja sekvenci, na primer, upotrebom Align, upotrebom standardnih podešavanja, poželjno EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.

[0160] "Sličnost sekvence" ukazuje na procenat amino-kiselina koje su ili identične ili predstavljaju konzervativne amino-kiselinske supstitucije. "Identičnost sekvence" između dve amino-kiselinske sekvence ukazuje na procenat amino-kiselina koje su identične između sekvenci.

[0161] Termin "procenat identičnosti" je namenjen da označi procenat amino-kiselinskih ostataka koji su identični između dve sekvence koje se porede, dobijen nakon najboljeg poravnanja, pri čemu je ovaj procenat čisto statistički i razlike između dve sekvence su raspodeljene nasumično i po celoj njihovoj dužini. Poređenja sekvence između dve aminokiselinske sekvence konvencionalno se vrši poređenjem tih sekvenci pošto su optimalno poravnate, navedeno poređenje se obavlja po segmentu ili po "prozoru poređenja" kako bi se identifikovali i poredili lokalni regioni sličnosti sekvence. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može se proizvesti, osim ručno, pomoću algoritma lokalne homologije Smita i Vatermana (Smith and Waterman), 1981, Ads App. Math. 2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije Nidlemana i Vunša (Neddleman and Wunsch), 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, pomoću postupka pretrage sličnosti Pirsona i Lipmana (Pearson and Lipman), 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću računarskih programa koji koriste ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u softverskom paketu Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0162] Procentualna identičnost izračunava se određivanjem broja identičnih pozicija između dve sekvence koje se porede, deljenjem ovog broja sa brojem upoređenih pozicija i množenjem dobijenog rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti između ove dve sekvence.

[0163] Homologne amino-kiselinske sekvence pokazuju u skladu sa pronalaskom najmanje 40%, posebno najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% i poželjno najmanje 95%, najmanje 98 ili najmanje 99% identičnosti amino-kiselinskih ostataka.

[0164] Ovde opisane varijante amino-kiselinske sekvence lako može da pripremi stručnjak, na primer, rekombinantnom DNK manipulacijom. Manipulacija DNK sekvenci za pripremu proteina i peptida koji imaju supstitucije, adicije, insercije ili delecije detaljno je opisana u Sambrook et al. (1989), na primer. Osim toga, ovde opisani peptidi i amino-kiselinske varijante mogu se lako pripremiti uz pomoć poznatih tehnika sinteze peptida kao što su, na primer, sinteza u čvrstoj fazi i slični postupci.

[0165] Pronalazak uključuje derivate peptida ili proteina opisane ovde koji su sadržani terminima "peptid" i "protein". U skladu sa pronalaskom, "derivati" proteina i peptida su modifikovani oblici proteina i peptida. Takve modifikacije uključuju bilo koju hemijsku modifikaciju i sadrže jednu ili više supstitucija, delecija i/ili adicija bilo kojih molekula povezanih sa proteinom ili peptidom, kao što su ugljeni hidrati, lipidi i/ili proteini ili peptidi. U jednom primeru izvođenja, "derivati" proteina ili peptida uključuju one modifikovane analoge koji rezultiraju iz glikozilacije, acetilacije, fosforilacije, amidacije, palmitoilacije, miristoilacije, izoprenilacije, lipidacije, alkilacije, derivatizacije, uvođenja zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog isecanja ili vezivanja za antitelo ili za drugi ćelijski ligand. Termin "derivat" takođe se proteže na sve funkcionalne hemijske ekvivalente navedenih proteina i peptida. Poželjno, modifikovani peptid ima povećanu stabilnost i/ili povećanu imunogenost.

[0166] U skladu sa pronalaskom, varijanta, derivat, modifikovani oblik, fragment, deo ili porcija amino-kiselinske sekvence, peptida ili proteina poželjno ima funkcionalno svojstvo amino-kiselinske sekvence, peptida ili proteina, respektivno, iz kog je izvedena, tj. funkcionalno je ekvivalentna. U jednom primeru izvođenja, varijanta, derivat, modifikovani oblik, fragment, deo ili porcija amino-kiselinske sekvence, peptida ili proteina je imunološki ekvivalentna amino-kiselinskoj sekvenci, peptidu ili proteinu, respektivno, iz kog je izvedena. U jednom primeru izvođenja, funkcionalno svojstvo je imunološko svojstvo.

[0167] Termin "izveden" znači u skladu sa pronalaskom da je određeni entitet, posebno određena sekvenca, prisutan u objektu iz koga je izveden, posebno u organizmu ili molekulu. U slučaju amino-kiselinskih sekvenci, naročito određenih regiona sekvenci, "izvedene" posebno znači da je relevantna amino-kiselinska sekvenca izvedena iz amino-kiselinske sekvence u kojoj je prisutna.

[0168] Termin "ćelija" ili "ćelija domaćin" poželjno je intaktna ćelija, tj. ćelija sa intaktnom membranom koja nije otpustila svoje normalne unutarćelijske komponente kao što su enzimi, organele, ili genetski materijal. Intaktna ćelija je poželjno održiva ćelija, tj. živa ćelija koja je sposobna da obavlja svoje normalne metaboličke funkcije. Termin "ćelija" uključuje u skladu sa pronalaskom prokariotske ćelije (npr. E. coli) ili eukariotske ćelije (npr. dendritske ćelije, B ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, HEK293 ćelije, HELA ćelije, ćelije kvasca, i ćelije insekata). Posebno su poželjne ćelije sisara, kao što su ćelije ljudskih bića, miševa, hrčaka, svinja, koza, i primata. Ćelije mogu biti izvedene iz velikog broja tipova tkiva i uključuju primarne ćelije i ćelijske linije. Termin "ćelija" uključuje ne-kancerske ćelije i ćelije kancera kao što su ćelije ovde opisanih tipova kancera.

[0169] Ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline poželjno eksprimira peptid ili protein kodiran nukleinskom kiselinom.

[0170] "Ciljna ćelija" treba da znači ćelija koja je cilj za imunski odgovor, kao što je antitelo. Ciljne ćelije uključuju bilo koju nepoželjnu ćeliju kao što je ćelija kancera kao što je ovde opisano. U poželjnim primerima izvođenja ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira CLDN18.2. Ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 uobičajeno uključuju ćelije kancera.

[0171] Termin "transgena životinja" označava životinju koja ima genom koji sadrži jedan ili više transgena, poželjno transgene teškog i/ili lakog lanca antitela, ili transhromozome (bilo integrisane ili neintegrisane u prirodnu gensku DNK životinje) i koja je poželjno sposobna da eksprimira transgene. Na primer, transgeni miš može imati transgen humanog lakog lanca i bilo transgen humanog teškog lanca ili transhromozom humanog teškog lanca, tako da miš proizvodi humana antitela prema CLDN18.2 kada je imunizovan sa CLDN18.2 antigenom i/ili ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2. Transgen humanog teškog lanca može biti integrisan u hromozomsku DNK miša, kao što je slučaj kod transgenih miševa, npr. HuMAb miševi, kao što su HCo7 ili HCol2 miševi, ili transgen humanog teškog lanca može biti održavan vanhromozomski, kao što je slučaj kod transhromozomskih (npr. KM) miševa kako je opisano u WO 02/43478. Takvi transgeni i transhromozomski miševi mogu biti sposobni da

4

proizvode više izotipova humanih monoklonalnih antitela na CLDN18.2 (npr. IgG, IgA i/ili IgE) podvrgavanjem V-D-J rekombinaciji i promeni izotipa.

[0172] Termin "imunološki ekvivalentno" znači da imunološki ekvivalentni molekul kao što je imunološki ekvivalentna amino-kiselinska sekvenca pokazuje ista ili suštinski ista imunološka svojstva i/ili ispoljava iste ili suštinski iste imunološke efekte, npr. u odnosu na tip imunološkog efekta kao što je indukcija humoralne imunske reakcije, jačina i/ili trajanje indukovane imunske reakcije, ili specifičnost imunske reakcije. U kontekstu ovog pronalaska, termin "imunološki ekvivalentno" se poželjno upotrebljava u odnosu na imunološke efekte ili svojstva peptida ili varijante peptida koji se upotrebljava za imunizaciju ili antitela. Posebno imunološko svojstvo je sposobnost vezivanja za antitela i, gde je to prikladno, generisanje imunskog odgovora, poželjno stimulisanjem stvaranja antitela. Na primer, amino-kiselinska sekvenca je imunološki ekvivalentna referentnoj amino-kiselinskoj sekvenci ukoliko navedena amino-kiselinska sekvenca kada je izložena imunskom sistemu subjekta indukuje imunsku reakciju, poželjno antitela, koja specifično reaguju sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, kao što je referentna amino-kiselinska sekvenca koja čini deo CLDN18.2.

[0173] Pronalazak obezbeđuje postupke za detekciju prisustva CLDN18.2 antigena u uzorku, ili za merenje količina CLDN18.2 antigena, koji sadrže dovođenje u kontakt uzorka, i opciono kontrolnog uzorka, sa antitelom pronalaska koje se vezuje za CLDN18.2, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antitela i CLDN18.2. Zatim se detektuje formiranje kompleksa, pri čemu je razlika u formiranju kompleksa između uzorka u poređenju sa kontrolnim uzorkom indikativna za prisustvo CLDN18.2 antigena u uzorku.

[0174] Postupci opisani gore upotrebljivi su, posebno, za dijagnostikovanje bolesti povezanih sa CLDN18.2 kao što su bolesti kancera. Poželjno količina CLDN18.2 u uzorku koja je veća od količine CLDN18.2 u referentnom ili kontrolnom uzorku je indikativna za prisustvo bolesti povezane sa CLDN18.2 kod subjekta, posebno ljudskog bića, od kojeg je uzorak dobijen.

[0175] Kada se upotrebljava u gore opisanim postupcima, antitelo opisano ovde može biti obezbeđeno sa obeleživačem koji funkcioniše da: (i) obezbedi signal koji se može detektovati; (ii) interaguje sa drugim obeleživačem da modifikuje signal koji se može detektovati koji obezbeđuje prvi ili drugi obeleživač, npr. FRET (fluorescentno rezonantni energetski transfer (Fluorescence Resonance Energy Transfer)); (iii) utiče na mobilnost, npr. elektroforetsku mobilnost, naelektrisanjem, hidrofobnošću, oblikom, ili drugim fizičkim parametrima, ili (iv) obezbedi deo za hvatanje, npr. afinitet, antitelo/antigen, ili jonsko kompleksovanje. Pogodne kao obeleživači su strukture, kao što su fluorescentni obeleživači, luminescentni obeleživači, obeleživači hromofore, radioizotopski obeleživači, izotopski obeleživači, poželjno stabilni izotopski obeleživači, izobarski obeleživači, enzimski obeleživači, obeleživači čestice, posebno obeleživači čestice metala, obeleživači magnetne čestice, obeleživači polimerne čestice, mali organski molekuli kao što je biotin, ligandi receptora ili vezujućih molekula kao što su ćelijski adhezivni proteini ili lektini, sekvence-obeleživači koje sadrže nukleinske kiseline i/ili amino-kiselinske ostatke koji se mogu detektovati upotrebom vezujućih agenasa, itd. Obeleživači sadrže, na neograničavajući način, barijum sulfat, jocetamsku kiselinu, jopanojsku kiselinu, kalcijum ipodat, natrijum diatrizoat, meglumin diatrizoat, metrizamid, natrijum tiropanoat i radio dijagnostik, uključujući emitere pozitrona kao što su fluorin-18 i ugljenik-11, gama emitere kao što su jod-123, tehnecijum-99m, jod-131 i indijum-111, nuklide za nuklearnu magnetnu rezonancu, kao što su fluor i gadolinijum.

[0176] U skladu sa pronalaskom, "referenca", kao što je referentni uzorak ili referentni organizam može biti upotrebljen za korelaciju i upoređivanje rezultata dobijenih postupcima pronalaska iz test uzorka ili test organizma. Tipično referentni organizam je zdrav organizam, posebno organizam koji ne pati od bolesti kao što je bolest kancera. "Referentna vrednost" ili "referentni nivo" mogu se odrediti iz reference empirijski merenjem dovoljno velikog broja referenci. Poželjno je da se referentna vrednost odredi merenjem najmanje 2, poželjno najmanje 3, poželjno najmanje 5, poželjno najmanje 8, poželjno najmanje 12, poželjno najmanje 20, poželjno najmanje 30, poželjno najmanje 50, ili poželjno najmanje 100 referenci.

[0177] "Smanjiti" ili "inhibirati" kako se ovde upotrebljava, znači sposobnost izazivanja ukupnog sniženja nivoa, poželjno za 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije za 50% ili više, i najpoželjnije za 75% ili više. Termin "inhibirati" ili slične fraze uključuju potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju, tj. smanjenje na nulu ili suštinski na nulu.

[0178] Termini kao što su "povećati" ili "poboljšati" poželjno se odnose na povećanje ili poboljšanje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%.

[0179] Agensi, kompozicije i postupci opisani ovde mogu biti upotrebljeni za dijagnoziranje subjekta sa bolešću. Bolesti koje se mogu dijagnozirati obuhvataju sve bolesti koje eksprimiraju CLDN18.2. Posebno poželjne bolesti su bolesti kancera kao što su bolesti kancera opisane ovde.

[0180] U skladu sa pronalaskom, termin "bolest" označava svako patološko stanje, uključujući bolesti kancera, posebno one oblike bolesti kancera opisane ovde.

[0181] Termin "normalno", kako se upotrebljava u terminima "normalno tkivo" ili "normalna stanja", označava zdravo tkivo ili stanja kod zdravog subjekta, tj. nepatološka stanja, pri čemu "zdrav" poželjno znači nekancerogen.

[0182] "Bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2" znači u skladu sa pronalaskom da je ekspresija CLDN18.2 u ćelijama obolelog tkiva ili organa poželjno povećana u poređenju sa stanjem u zdravom tkivu ili organu. Povećanje označava povećanje za najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, na najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija je pronađena samo kod obolelog tkiva, dok je ekspresija u zdravom tkivu potisnuta. U skladu sa pronalaskom, bolesti koje uključuju ili su povezane sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2 uključuju bolesti kancera, posebno one oblike kancera opisane ovde.

[0183] U skladu sa pronalaskom, termin "tumor" ili "tumorska bolest" označava oticanje ili leziju formiranu abnormalnim rastom ćelija (zvane neoplastične ćelije ili tumorske ćelije). Pod "ćelijom tumora" podrazumeva se abnormalna ćelija koja raste rapidnom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste nakon što prestanu stimulusi koji su inicirali novi rast. Tumori pokazuju delimično ili potpuno nepostojanje strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom, i obično formiraju posebnu masu tkiva koje može biti bilo benigno, premaligno ili maligno.

[0184] Benigni tumor je tumor kome nedostaju sva tri maligna svojstva kancera. Stoga, po definiciji, benigni tumor ne raste na neograničeno, agresivan način, ne napada okolna tkiva, i ne širi se na nesusedna tkiva (metastazira). Uobičajeni primeri benignih tumora uključuju mladeže i fibroide materice.

[0185] Termin "benigni" ukazuje na blagu i neprogresivnu bolest, i zaista, mnoge vrste benignih tumora su bezopasni za zdravlje. Međutim, neke neoplazme koje su definisane kao "benigni tumori" pošto im nedostaju invazivna svojstva kancera, i dalje mogu proizvesti negativne efekte na zdravlje. Primeri toga uključuju tumore koji stvaraju "efekat mase" (kompresija vitalnih organa poput krvnih sudova), ili "funkcionalni" tumori endokrinih tkiva, koji mogu preterano produkovati određene hormone (primeri uključuju adenome štitne žlezde, adrenokortikalne adenome, i adenome hipofize).

[0186] Benigni tumori su uobičajeno okruženi spoljašnjom površinom koja sprečava njihovu sposobnost ponašanja na maligni način. U nekim slučajevima, određeni "benigni" tumori

4

mogu kasnije dovesti do malignih kancera, koji su posledica dodatnih genetskih promena u subpopulaciji neoplastičnih ćelija tumora. Istaknuti primer ovog fenomena je tubularni adenom, uobičajeni tip polipa debelog creva koji je važan prethodnik kancera debelog creva. Ćelije u tubularnim adenomima, kao i većina tumora koji često napreduju do kancera, pokazuju određene abnormalnosti ćelijske maturacije i izgleda zajednički poznate kao displazija. Ove ćelijske abnormalnosti se ne primećuju u benignim tumorima koji retko ili nikada ne postaju kancerski, ali se primećuju u abnormalnostima drugog prekancerskog tkiva koje ne formiraju diskretne mase, kao što su prekancerske lezije grlića materice. Neki izvori radije označavaju displastične tumore kao "premaligne", i termin "benigni" rezervišu za tumore koji retko ili nikada ne dovode do kancera. Neoplazma je abnormalna masa tkiva kao rezultat neoplazije. Neoplazija (novi rast na grčkom) je abnormalna proliferacija ćelija. Rast ćelija premašuje, i nije koordinisan sa onim normalnih tkiva oko nje. Rast traje na isti preterani način čak i nakon prestanka stimulusa. Obično uzrokuje kvržicu ili tumor. Neoplazme mogu biti benigne, premaligne ili maligne.

[0187] "Rast tumora" ili "tumorski rast" u skladu sa pronalaskom odnosi se na tendenciju tumora da poveća svoju veličinu i/ili na tendenciju tumorskih ćelija da proliferišu.

[0188] Kancer (medicinski termin: maligna neoplazma) je klasa bolesti kod koje grupa ćelija pokazuje nekontrolisani rast (deoba izvan granica normale), invaziju (upad i uništavanje susednih tkiva), i ponekad metastazu (širenje na druge lokacije u telu putem limfe ili krvi). Ova tri maligna svojstva kancera razlikuju ih od benignih tumora, koji su samo-ograničeni, i ne napadaju ili metastaziraju. Većina kancera formira tumor ali neki, poput leukemije, ne. U skladu sa pronalaskom, termini "kancer" i "tumor" ili "bolest kancera" i "bolest tumora" se ovde generalno upotrebljavaju naizmenično za označavanje bolesti kod kojih ćelije pokazuju nekontrolisani rast i opciono invaziju i/ili metastazu.

[0189] Poželjno, "bolest kancera" u skladu sa pronalaskom je okarakterisana ćelijama koje eksprimiraju CLDN 18.2. Ćelija koja eksprimira CLDN18.2 poželjno je ćelija kancera, poželjno od ovde opisanih tumora i kancera. Poželjno, takva ćelija je ćelija druga nego ćelija želuca.

[0190] Kanceri se klasifikuju prema tipu ćelije koja je slična tumoru i, prema tome, tkivu za koje se pretpostavlja da je poreklo tumora. Ovo su histologija i lokacija, respektivno.

[0191] Termin "kancer" u skladu sa pronalaskom sadrži leukemije, seminome, melanome, teratome, limfome, neuroblastome, gliome, rektalni kancer, endometrijalni kancer, kancer bubrega, kancer nadbubrežne žlezde, kancer štitne žlezde, kancer krvi, kancer kože, kancer mozga, kancer grlića materice, intestinalni kancer, kancer jetre, kancer debelog creva, kancer želuca, kancer creva, kancer glave i vrata, gastrointestinalni kancer, kancer limfnih čvorova, kancer jednjaka, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer uha, nosa i grla (ENT), kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, kancer jajnika i kancer pluća i njihove metastaze. Primeri za to su karcinomi pluća, karcinomi dojke, karcinomi prostate, karcinomi debelog creva, karcinomi bubrežnih ćelija, karcinomi grlića materice, ili metastaze tipova kancera ili tumora opisanih gore. Termin kancer u skladu sa pronalaskom takođe sadrži metastaze kancera.

[0192] Glavni tipovi kancera pluća su sitnoćelijski karcinom pluća (SCLC) i nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC). Postoje tri glavna podtipa nesitnoćelijskih karcinoma pluća: karcinom pločastih ćelija pluća, adenokarcinom, karcinom velikih ćelija pluća. Adenokarcinomi otprilike čine 10% kancera pluća. Ovaj kancer se uobičajeno vidi periferno u plućima, za razliku od sitnoćelijskog kancera pluća i kancera pločastih ćelija pluća, koji oba imaju tendenciju da budu centralno postavljeni.

[0193] U skladu sa pronalaskom, "karcinom" je maligni tumor nastao od epitelnih ćelija. Ova grupa predstavlja najčešće kancere, uključujući uobičajene oblike kancera dojke, prostate, pluća i debelog creva.

[0194] Pod "metastazom" se podrazumeva širenje ćelija kancera sa njegovog originalnog mesta u drugi deo tela. Formiranje metastaze je veoma složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije vanćelijskog matriksa, penetracije endotelnih bazalnih membrana da uđu u telesnu šupljinu i sudove, i zatim, nakon transporta krvlju, infiltracije ciljnih organa. Konačno, rast novog tumora, tj. sekundarni tumor ili metastatski tumor, na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaza tumora često nastaje čak i nakon uklanjanja primarnog tumora pošto tumorske ćelije ili komponente mogu ostati i razviti metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" u skladu sa pronalaskom odnosi se na "udaljenu metastazu" koja se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i regionalnog sistema limfnih čvorova.

[0195] Ćelije sekundarnog ili metastatskog tumora su poput onih u originalnom tumoru. To znači, na primer, da ukoliko kancer jajnika metastazira u jetru, sekundarni tumor sačinjavaju abnormalne ćelija jajnika, a ne abnormalne ćelije jetre. Tumor u jetri se tada naziva metastatski kancer jajnika, a ne kancer jetre.

[0196] Do relapsa ili recidiva dolazi kada je na osobu ponovo deluje stanje koje je u prošlosti delovalo na nju. Na primer, ukoliko je pacijent oboleo od bolesti kancera, primio je uspešno lečenje navedene bolesti i ponovo razvije navedenu bolest, navedena novorazvijena bolest može se smatrati relapsom ili recidivom. Međutim, u skladu sa pronalaskom, relaps ili recidiv

4

bolesti kancera može ali se ne mora nužno pojaviti na mestu originalne bolesti kancera. Stoga, na primer, ukoliko je pacijent oboleo od tumora jajnika i primio je uspešno lečenje relaps ili recidiv može biti pojava tumora jajnika ili pojava tumora na mestu različitom od jajnika. Relaps ili recidiv tumora takođe uključuje situacije u kojima se tumor pojavljuje na mestu različitom od mesta originalnog tumora kao i na mestu originalnog tumora. Poželjno, originalni tumor za koji je pacijent primio lečenje je primarni tumor i tumor na mestu različitom od mesta originalnog tumora je sekundarni ili metastatski tumor.

[0197] Pod "lečiti" podrazumeva se davanje jedinjenja ili kompozicije subjektu radi sprečavanja ili eliminisanja bolesti, uključujući smanjenje veličine tumora ili broja tumora kod subjekta; zaustavljanja ili usporavanja bolesti kod subjekta; inhibiranja ili usporavanja razvoja nove bolesti kod subjekta; smanjivanja učestalosti ili ozbiljnosti simptoma i/ili recidiva kod subjekta koji trenutno ima ili je prethodno imao bolest; i/ili produžavanja, tj. povećavanja životnog veka subjekta.

[0198] Posebno, termin "lečenje bolesti" uključuje lečenje, skraćenje trajanja, ublažavanje, sprečavanje, usporavanje ili inhibiranje napredovanja ili pogoršanja, ili sprečavanje ili odlaganje početka bolesti ili njenih simptoma.

[0199] Pod "biti u riziku" podrazumeva se subjekt, tj. pacijent, za kojeg je identifikovano da ima veću šansu od normalne za razvijanje bolesti, posebno kancera, u poređenju sa opštom populacijom. Pored toga, subjekt koji je imao, ili koji trenutno ima bolest, posebno kancer je subjekt koji ima povećan rizik za razvijanje bolesti, kao takav subjekt može nastaviti da razvija bolest. Subjekti koji trenutno imaju, ili su imali, kancer takođe imaju povećan rizik za metastaze kancera.

[0200] Termin "imunoterapija" odnosi se na lečenje koje uključuje specifičnu imunsku reakciju. U kontekstu ovog pronalaska, termini kao što su "zaštititi", "sprečiti", "profilaktički", "preventivno" ili "zaštitno" odnose se na prevenciju ili lečenje ili oba pojave i/ili širenja bolesti kod subjekta i, posebno, na minimiziranje šanse da će subjekt razviti bolest ili na odlaganje razvoja bolesti. Na primer, osoba u riziku za tumor, kako je opisano gore, bila bi kandidat za terapiju za sprečavanje tumora. Imunoterapija može biti izvedena upotrebom bilo koje od različitih tehnika, u kojima agensi deluju da uklone iz pacijenta ćelije koje eksprimiraju antigen.

[0201] U okviru određenih primera izvođenja, imunoterapija može biti aktivna imunoterapija, u kojoj se lečenje oslanja na in vivo stimulaciju endogenog imunskog sistema domaćina da reaguje protiv obolelih ćelija uz primenu agenasa za modifikaciju imunskog odgovora (kao što su imunoreaktivni peptidi i nukleinske kiseline).

4

[0202] U okviru drugih primera izvođenja, imunoterapija može biti pasivna imunoterapija, u kojoj lečenje uključuje isporuku agenasa sa utvrđenom tumor-imunskom reaktivnošću (kao što su antitela) koji mogu direktno ili indirektno isposredovati antitumorske efekte i ne moraju nužno zavisiti od intaktnog imunskog sistema domaćina.

[0203] Termin "in vivo" odnosi se na situaciju u subjektu.

[0204] Termini "subjekt", "pojedinac", "organizam" ili "pacijent" upotrebljavaju se naizmenično i odnose se na kičmenjake, poželjno sisare. Na primer, sisari u kontekstu ovog pronalaska su ljudi, primati koji nisu ljudi, domaće životinje kao što su psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci, itd. kao i životinje u zatočeništvu, kao što su životinje u zoološkim vrtovima. Termin "životinja" kako se ovde upotrebljava takođe uključuje ljude. Termin "subjekt" takođe može uključivati pacijenta, tj. životinju, poželjno čoveka koji ima bolest, poželjno bolest kako je ovde opisano.

[0205] U skladu sa pronalaskom, "uzorak" može biti bilo koji uzorak koristan u skladu sa ovim pronalaskom, posebno biološki uzorak kao što je uzorak tkiva, uključujući telesne tečnosti, i/ili ćelijski uzorak i može biti dobijen na konvencionalan način, kao što je biopsija tkiva, uključujući panč (punch) biopsiju, i uzimanjem krvi, bronhijalnog aspirata, sputuma, urina, izmeta ili drugih telesnih tečnosti. U skladu sa pronalaskom, termin "uzorak" takođe uključuje prerađene uzorke kao što su frakcije ili izolati bioloških uzoraka, npr. izolati nukleinske kiseline i peptida/proteina. Poželjno uzorak sadrži ćelije ili tkivo organa koji treba ispitati, npr. koji treba da bude dijagnostikovan za kancer. Na primer, ukoliko je kancer koji treba dijagnostikovati kancer pluća, uzorak može sadržati ćelije ili tkivo dobijeno iz pluća.

[0206] U skladu sa pronalaskom, uzorak može biti uzorak kao što je telesni uzorak dobijen od pacijenta koji sadrži ili se očekuje da sadrži ćelije tumora ili kancera. Telesni uzorak može biti bilo koji uzorak tkiva kao što je krv, uzorak tkiva dobijen iz primarnog tumora ili iz metastaza tumora ili bilo kog drugog uzorka koji sadrži ćelije tumora ili kancera.

[0207] Ovaj pronalazak je detaljno opisan slikama i primerima koje slede.

Slike:

[0208]

Slika 1: Poravnanje sekvence klaudin 18 proteina (humani/murina)

4

Poravnanje sekvence pokazuje veliku homologiju između humanog i mišjeg klaudina 18.2 i humanog klaudina 18.1 i klaudina 18.2.

Slika 2: Rekombinantni protein koji uključuje C-terminalni deo CLDN18.2 (ak191-261) upotrebljen za imunizaciju miševa

Slika 3: Analiza sekvence antitela 43-14A i 35-22A

Primeri

[0209] Tehnike i postupci upotrebljeni ovde su opisani ovde ili se izvode na način poznat sam po sebi kako je opisano, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Svi postupci uključujući upotrebu kompleta i reagenasa izvedeni su u skladu sa informacijama proizvođača ukoliko nije posebno naznačeno.

Primer 1: Generisanje monoklonalnih antitela

[0210] Cilj ovog projekta bio je da se generišu monoklonalna antitela murina specifična na CLDN18 sposobna da detektuju tumorske ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 u FFPE tkivima želuca CA, jednjaka CA, pankreasa CA i pluća CA.

[0211] Da bi se generisalo veoma specifično, dijagnostičko antitelo velikog afiniteta na CLDN18.2, bilo je neophodno započeti imunizacijske protokole sa velikom varijacijom različitih imunogena i adjuvanasa. Tokom projekta oko 100 miševa (C57Bl/6 i Balb/c) su inokulirani, upotrebom različitih strategija imunizacije da aktiviraju ɑ-CLDN18 imunski odgovor.

[0212] Za aktiviranje imunskog sistema miša i prevazilaženje imunske tolerancije upotrebili smo čestice slične virusima (VLP), peptidne konjugate i rekombinantne proteine koji kodiraju za različite delove humanog CLDN18.2 eksprimiranog kao rekombinantni fuzioni proteini sa različitim ekspresionim partnerima (oznakama).

[0213] Od 13 različitih strategija imunizacije, najbolji rezultati postignuti su tretiranjem miševa HIS-označenim CLDN18 C-terminalnim rekombinantnim proteinom (videti Sliku 2; Imunizacija #20) u kombinaciji sa različitim adjuvansima (videti Tabelu 1, ispod, fuzija 35).

4

[0214] Jedan kandidat (35-22A) rezultirao je iz strategije imunizacije u 4 koraka (30 dana). Sledeći kandidat (43-14A) je generisan prateći protokol imunizacije u 7 koraka (79 dana) (videti Tabelu 1, ispod, fuzija 43).

[0215] Dva dana pre splenektomije, miševi su podstaknuti (boosted) da aktiviraju ciljane B-ćelije.

[0216] Na dan fuzije izolovani su mišji splenociti i fuzionisani sa ćelijskom linijom mišjeg mijeloma Ag8.653. Za fuziju mišjih ćelija sa mijelomom pratili smo standardni protokol koji su objavili Köhler i Milstein 1975. Nakon HAT selekcije supernatanti su testirani u ELISA na sekreciju antitela koja prepoznaju antigen upotrebljen za imunizacije.

[0217] Ćelije hibridoma ELISA pozitivnih supernatanata su subklonirane da generišu monoklonalne hibridome i supernatanti subkloniranih ćelija hibridoma su ponovo provereni u ELISA. Ćelije hibridoma pozitivnih klonova su umnožene i supernatanti dalje analizirani.

Primer 2: Western blot provera supernatanata monoklonalnih hibridoma

[0218] Da bi odgovorili na pitanje da li su ELISA-pozitivna antitela u supernatantima sposobna da se vežu za bilo rekombinantni klaudin 18 ili lizate proteina iz stabilnih transfektovanih HEK293 ćelija koje eksprimiraju klaudin 18 izvedena je Western blot analiza. Antitela koja su se mogla vezati specifično za klaudin 18 u Western blot analizi su umnožena. Ćelije su kriokonzervirane i antitela prečišćena putem MABselect (FPLC). Antitela koja su odabrana Western blot proverom prečišćena su i procenjena je njihova sposobnost da vežu svoj antigen u tkivima fiksiranim formalinom i ukalupljenim u parafin (FFPE) imunohistohemijom.

Primer 3: Histološka analiza - prva provera Western blot pozitivnih antitela

[0219] Cilj ovog eksperimenta bio je da se proveri CLDN18 specifičnost i osetljivost antitela. Ovo je izvedeno upotrebom FFPE normalnog tkiva želuca koje eksprimira CLDN18.

[0220] U prvom eksperimentu Western blot testirana prečišćena antitela su analizirana u koncentraciji od 0,5 μg/ml na FFPE presecima humanog želuca. Antitela koja su dobro funkcionisala i nisu stvorila velike količine pozadinske reakcije dalje su titrirana na 0,2 i 0,1 μg/ml na različitim tkivima normalnog želuca radi testiranja osetljivosti i specifičnosti. U kasnijim fazama razvoja sveže generisana antitela su direktno testirana u koncentraciji od 0,2 μg/ml pošto se najbolje antitelo već pokazalo kao veoma dobro na 0,2 μg/ml i poslužilo je kao

4

polazna vrednost. Antitela koja generišu jake signale na epitelu mukoze testiranih tkiva humanog želuca i nemaju pozadinske reakcije na susednim tkivima mukoze odabrana su za dalje titracijske eksperimente i analizu specifičnosti. Dva antitela su se pokazala kao izvanredna: 35-22A i 43-14A; videti Tabele 2 i 3, ispod.

[0221] Antitela koja proizvode jake signale na testiranom tkivu normalnog želuca dalje su analizirana na tkivima kancera. Odgovarajuće ćelije hibridoma prilagođene su medijumu bez seruma. Signali proizvedeni upotrebom mumAb 43-14A su nešto jači od signala proizvedenih upotrebom mumAb 35-22A; videti Tabelu 4, ispod.

Primer 4: Histološka detaljna analiza i karakterizacija antitela

[0222] Antitela proizvedena bez seruma upotrebljena su za bojenje želudačnih CA tkivnih mikročipova (TMA). Analizirane su količina obojenih slučajeva, jačina signala i količina pozitivnih ćelija tumora.

[0223] Intenziteti bojenja sa mumAbs 35-22A i 43-14A bili su odlični. Nema značajnih razlika u obrascu bojenja i otkrivene su samo neznatne razlike u intenzitetima bojenja između testiranih antitela 35-22A i 43-14A.

Primer 5: Analiza specifičnosti antitela upotrebom normalnog tkivnog panela

[0224] Odabrana antitela su testirana na različitim, relevantnim normalnim tkivima da bi se osigurala velika specifičnost ciljana na CLDN18; videti Tabele 5A i 5B, ispod.

[0225] U prethodnim eksperimentima nije bilo vidljivih značajnih razlika u obrascu bojenja i intenzitetima bojenja antitela 35-22A i 43-14A. Zbog toga su antitela podvrgnuta eksperimentima bojenja sa više klinički orijentisanim protokolom. Da bi se simulirali postupci bojenja primenjeni u standardnim patološkim laboratorijima uspostavljen je jednodnevni protokol sa kratkim (1 sat) korakom inkubacije primarnim antitelom.

[0226] U svim analiziranim slučajevima mumAb 43-14A pokazao se kao izuzetno dobar i čak bolji u poređenju sa mumAb 35-22A; videti Tabelu 6, ispod.

Primer 6: Detaljna analiza na relevantnom tkivu - respiratorni epitel

[0227] mumAb 43-14A je dodatno analiziran na različitim relevantnim respiratornim tkivima kako bi se osigurala njegova specifičnost, naročito u ciljnim tkivima pluća/bronhijalnog trakta. Za ta tkiva prijavljena je ekspresija CLDN18.1. Da bi se analiziralo da li dijagnostičko antitelo unakrsno reaguje sa izoformom CLDN18.1 eksprimiranom na plućima/bronhijama proverena su sva raspoloživa tkiva pluća/bronhija. Nisu otkriveni signali sa plućnih i bronhijalnih tkiva; videti Tabelu 7, ispod. Antitelo 43-14A ne prepoznaje izoformu CLDN18 eksprimiranu u ovim respiratornim tkivima.

Primer 7: Mapiranje epitopa mumAbs 43-14A i 35-22A

[0228] ELISA peptida je izvedena da bi se identifikovali epitopi na CLDN18.2 koji vezuju antitelo. Svako prečišćeno antitelo je testirano na peptide koji se preklapaju i prekrivaju C-terminalnu sekvencu CLDN18.2. I 35-22A i 43-14A su pokazali specifično vezivanje za epitop mapiran na peptid TEDEVQSYPSKHDYV. Sledeća sekvenca je određena kao reaktivna sekvenca: EVQSYPSKHDYV.

Primer 8: Analiza sekvence mumAbs 43-14A i 35-22A

[0229] Analiza sekvence antitela 43-14A i 35-22A prikazana je na Slici 3.

Primer 9: Bojenje različitih tkiva kancera

[0230] Imunohistohemija (IHC) je izvedena na pločicama sa uzorcima koji su fiksirani u 4% puferisanom formalinu i ukalupljeni u parafin. Kalupljenje u parafin izvedeno je u skladu sa standardnim protokolima.

[0231] Nakon deparafinizacije, sve pločice su podvrgnute otkrivanju antigena kuvanjem u 10 mM limunskoj kiselini sa dodatkom 0,05% Tween-20 (pH 6,0) na 120 °C tokom 10 min, nakon čega su zaustavljene (sa 2% H2O2) blokirane i inkubirane preko noći na 4 °C sa 0,2 do 0,5 μg/ml dijagnostičkog monoklonalnog mišjeg anti-CLNDN18.2 antitela 43-14A ili 35-22A. Vezivanje antitela je vizualizovano sekundarnim antitelima obeleženim peroksidazom rena upotrebom Powervision antitela sa polimernom osnovom (Power Vision HRP goat-amouse; Immunologic, Duiven, The Netherlands) i rastvorom supstrat-hromogena (VectorRed; Vector Labs, Burlingame, USA). Nakon toga sledilo je kontra-bojenje preseka Majerovim (Mayerꞌs) hematoksilinom (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Nemačka) i podvrgnuti su proceni od strane ocenjivača.

1

Histološka procena

[0232] Svi uzorci su analizirani u pogledu relativne proporcije pozitivno obojenih ćelija tumora u odnosu na sve vidljive ćelije tumora za svaki presek. Intenzitet bojenja klasifikovan je kao negativan (-), slabo pozitivan (1+), srednje pozitivan (2+) i jako pozitivan (3+). Samo se membransko bojenje smatralo pozitivnim. Tkivo humanog želuca služilo je kao pozitivna kontrola za svako bojenje. Pošto je često pronađeno da je PanIN (pankreasna intraepitelna neoplazija) jako pozitivna, ta područja su takođe smatrana internim referentnim intenzitetom bojenja za jaku pozitivnost (3+).

[0233] Jaki, membranski signali generisani su sa oba antitela u kancerskim tkivima pankreasa, jednjaka i želuca (Tabela 8) ili sa antitelom 43-14A u kancerskim tkivima pluća (Tabela 9). Broj pozitivnih ćelija tumora varirao je interindividualno između različitih slučajeva tumora. Najveći deo analiziranih uzoraka bio je 2+ do 3+ pozitivno.

2

�

Tabela 8: Analiza ekspresije CLDN18.2 u kancerskim tkivima jednjaka, pankreasa i želuca, upotrebom monoklonalnih antitela murina 43-14A i 35-22A

4

(nastavak)

Tabela 9: Analiza ekspresije CLDN18.2 u kancerskim tkivima pluća, upotrebom monoklonalnog antitela murina 43-14A

(nastavak)

1

�

4

1

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koje

(i) se vezuje za peptid koji ima amino-kiselinsku sekvencu TEDE-VQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) ili EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6) i/ili (ii) se vezuje za klaudin 18.2 (CLDN18.2), naznačeno time što se navedeno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje za CLDN18.2 vezivanjem najmanje za epitop unutar CLDN18.2 koji ima amino-kiselinsku sekvencu TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) ili EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6).

2. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što, navedeni CLDN18.2 je CLDN18.2 vezan za membranu ćelijske površine.

3. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što je navedeni CLDN18.2 prisutan na ćelijama kancera.

4. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što su navedene ćelije kancera ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2.

5. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 3 ili 4, naznačeno time što su navedene ćelije kancera odabrane iz grupe koja se sastoji od ćelija kancera želuca, jednjaka, pankreasa, pluća, jajnika, debelog creva, jetre, glave i vrata, i žučne kese.

6. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 5 koje se ne vezuje za nekancerske ćelije izuzev ćelija epitela želuca.

7. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 6 koje se ne vezuje za nekancerske ćelije pluća.

8. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 5 koje je himerno, humano ili humanizovano antitelo.

9. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 8, koje je monoklonalno antitelo.

10. Antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od:

(i) antitela proizvedenog iz ili koje se može dobiti iz klona deponovanog pod pristupnim br. DSM ACC3144 (muAB 43-14A) ili DSM ACC3143 (muAB 35-22A),

(ii) antitela koje je himerizovani ili humanizovani oblik antitela pod (i), i (iii) antitela koje sadrži deo za vezivanje antigena ili mesto za vezivanje antigena antitela pod (i), ili

(iv) antigen-vezujućeg fragmenta antitela pod bilo kojim od (i) do (iii).

11. Antitelo prema patentnom zahtevu 10, naznačeno time što deo za vezivanje antigena ili mesto za vezivanje antigena antitela pod (i) sadrži varijabilni region antitela pod (i).

12. Konjugat koji sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11 povezano sa najmanje jednim detektabilnim obeleživačem.

13. Hibridom koji može proizvoditi antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11.

14. Hibridom deponovan pod pristupnim br. DSM ACC3144 (muAB 43-14A) ili DSM ACC3143 (muAB 35-22A).

15. Postupak za detekciju CLDN18.2 ili određivanje količine CLDN18.2 u uzorku koji sadrži korake:

(i) dovođenje u kontakt uzorka sa antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11 ili konjugatom prema patentnom zahtevu 12 i

16. Postupak za određivanje da li ćelije eksprimiraju CLDN18.2 koji sadrži korake:

4

(i) dovođenje u kontakt ćelijskog uzorka sa antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11 ili konjugatom prema patentnom zahtevu 12 i

17. Postupak za dijagnozu, detekciju ili praćenje kancera koji sadrži korake:

(i) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11 ili konjugatom prema patentnom zahtevu 12 i

18. Postupak za određivanje da li je kancer moguće lečiti terapijom kancera koja ciljno deluje na CLDN18.2 koji sadrži korake:

(i) dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži ćelije kancera sa antitelom ili antigenvezujućim fragmentom prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11 ili konjugatom prema patentnom zahtevu 12 i

19. Dijagnostički test komplet koji sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11 ili konjugat prema patentnom zahtevu 12.

20. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11, konjugat prema patentnom zahtevu 12, hibridom prema patentnom zahtevu 13 ili 14, ili postupak prema bilo kojem od patentnih zahteva 15 do 18, naznačeni time što navedeni CLDN18.2 sadrži amino-kiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 2 liste sekvenci ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence.