RS59986B1 - Antisens oligomeri i konjugati koji ciljno deluju na pcsk9 - Google Patents

Antisens oligomeri i konjugati koji ciljno deluju na pcsk9

Info

Publication number
RS59986B1
RS59986B1 RS20200114A RSP20200114A RS59986B1 RS 59986 B1 RS59986 B1 RS 59986B1 RS 20200114 A RS20200114 A RS 20200114A RS P20200114 A RSP20200114 A RS P20200114A RS 59986 B1 RS59986 B1 RS 59986B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
oligomer
region
group
lna
conjugate
Prior art date
Application number
RS20200114A
Other languages
English (en)
Inventor
Nanna Albæk
Maj Hedtjärn
Marie Lindholm
Niels Fisker Nielsen
Andreas Petri
Jacob Ravn
Original Assignee
Roche Innovation Ct Copenhagen As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2013/073858 external-priority patent/WO2014076195A1/en
Application filed by Roche Innovation Ct Copenhagen As filed Critical Roche Innovation Ct Copenhagen As
Publication of RS59986B1 publication Critical patent/RS59986B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/554—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a steroid plant sterol, glycyrrhetic acid, enoxolone or bile acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oligomerna jedinjenja i njihove konjugate koji ciljno deluju na proprotein konvertazu subtilizin/keksin tip 9 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9 - PCSK9) iRNK u ćeliji, dovodeći do smanjene ekspresije PCSK9. Smanjenje ekspresije PCSK9 je korisno za spektar medicinskih poremećaja, kao što su hiperholesterolemija i srodni poremećaji.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Proprotein konvertaza subtilizin/keksin tip 9 (PCSK9) pojavila se kao terapeutski cilj za redukciju holesterola lipoproteina male gustine (low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C). PCSK9 povećava degradaciju LDL receptora, rezultirajući u visokom LDL-C kod pojedinaca sa visokom PCSK9 aktivnošću.
[0003] Lindholm et al., Molecular Therapy (2012); 20 2, 376-381 izveštava o dva LNA antisens oligonukleotida koji ciljno deluju na PCSK9 koji proizvode trajno smanjenje LDL-C kod ne-humanih primata posle udarne doze (20 mg/kg) i četiri nedeljne doze održavanja (5 mg/kg). Upotrebljena jedinjenja bila su 14mer SPC5001 (SEQ ID NO 1) i 13mer SPC4061. SPC5001 takođe je objavljen u WO2011/009697. Efikasnost ovih inhibitora PCSK9 je pripisana njihovoj kratkoj dužini (Krieg et al., Molecular Therapy Nucleic Acids (2012) 1, e6).
[0004] WO2007/146511 izveštava o kratkim bicikličnim (LNA) gapmer antisens oligonukleotidima koji su naizgled potentniji i manje toksični od dužih jedinjenja. Čini se da su primerna jedinjenja u dužini od 14nts (nukleotida).
[0005] U skladu sa van Poelgeest et al., (American Journal of Kidney Disease, 2013 Oct;62(4):796-800), primena LNA antisens oligonukleotida SPC5001 u kliničkim ispitivanjima na ljudima može rezultirati akutnom povredom bubrega.
[0006] U skladu sa EP 1984 381B1, Seth et al., Nucleic Acids Symposium Series 2008 No.
52 553-554 i Swayze et al., Nucleic Acid Research 2007, vol 35, pp687 - 700, LNA oligonukleotidi uzrokuju značajnu hepatotoksičnost kod životinja. U skladu sa WO2007/146511, toksičnost LNA oligonukleotida može se izbeći upotrebom LNA gapmera toliko kratkih kao 12 - 14 nukleotida u dužini. EP 1 984 381B1 preporučuje upotrebu 6ꞌ supstituisanih bicikličnih nukleotida kako bi se smanjio hepatotoksični potencijal LNA oligonukleotida. U skladu sa Hagedorn et al., Nucleic Acid Therapeutics 2013, hepatotoksični potencijal antisens oligonukleotida može se predvideti iz njihove sekvence i obrasca modifikacije.
[0007] Konjugati oligonukleotida su opsežno procenjeni za upotrebu u siRNK (mala interferirajuća RNK small interfering RNA), gde se smatraju neophodnim za postizanje dovoljne in vivo potencije. Na primer, videti WO2004/044141 koji označava modifikovana oligomerna jedinjenja koja moduliraju ekspresiju gena preko RNK interferirajućeg puta. Oligomerna jedinjenja uključuju jedan ili više konjugatnih delova koji mogu modifikovati ili poboljšati farmakokinetička i farmakodinamička svojstva vezanog oligomernog jedinjenja.
[0008] WO2012/083046 izveštava o klasteru galaktoze-farmakokinetičkom modulatoru koji ciljno deluje na deo za siRNK.
[0009] Nasuprot tome, jednolančani antisens oligonukleotidi se tipično primenjuju terapeutski bez konjugacije ili formulacije. Glavna ciljna tkiva antisens oligonukleotida su jetra i bubreg, mada je širok spektar drugih tkiva takođe dostupan antisens modalitetu, uključujući limfni čvor, slezinu i kostnu srž.
[0010] WO 2005/086775 označava ciljanu isporuku terapeutskih agenasa određenim organima upotrebom dela terapeutske hemijske supstance, odvojivog linkera i domena za obeležavanje. Odvojiv linker može biti, na primer, disulfidna grupa, peptid ili odvojiv oligonukleotidni domen restrikcionog enzima.
[0011] WO 2011/126937 označava ciljanu unutarćelijsku isporuku oligonukleotida putem konjugacije sa ligandima malog molekula.
[0012] WO2009/025669 označava polimerne (polietilen glikol) linkere koji sadrže piridil disulfidne delove. Videti takođe Zhao et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 758 - 766.
[0013] Chaltin et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 827 - 836 izveštava o holesterolom modifikovanim mono- di- i tetramernim oligonukleotidima koji se upotrebljavaju za ugradnju antisens oligonukleotida u katjonske lipozome, kako bi proizveli dendrimerni sistem za isporuku. Holesterol se konjuguje sa oligonukleotidima putem lizinskog linkera.
[0014] Drugi neodvojivi konjugati holesterola upotrebljeni su da ciljno deluju na siRNK i antagomire prema jetri - videti na primer, Soutscheck et al., Nature 2004 vol. 432 173 - 178 i Krützfeldt et al., Nature 2005 vol 438, 685 - 689. Za delimično fosforotiolirane siRNK i antagomire, utvrđeno je da je upotreba holesterola kao entiteta koji ciljno deluje na jetru od suštinske važnosti za in vivo aktivnost.
[0015] WO2009/134487 objavljuje dsRNK (dvolančane RNK) za lečenje bolesti uzrokovanih ekspresijom PCSK9 gena.
CILJ PRONALASKA
[0016] Stoga postoji potreba za antisens jedinjenjima koja ciljno deluju na PCSK9, koja su efikasna kao SPC5001, ali imaju smanjeni rizik od toksičnosti, posebno smanjenu toksičnost za bubrege.
[0017] U skladu sa predmetnim pronalaskom ovo je postignuto identifikovanjem novih humanih PCSK9 sekvenci koje su naročito efikasne za ciljanje upotrebom antisens pristupa (SEQ ID NO 33 i SEQ ID NO 34), kao i duže varijante sekvence SPC5001 koje zadržavaju ili su poboljšane u odnosu na izuzetnu potenciju SPC5001 bez pitanja o toksičnosti. Ovde objavljeni antisens oligonukleotidi mogu se dalje poboljšati upotrebom konjugata, za koje je utvrđeno da značajno povećavaju terapeutski indeks LNA antisens oligonukleotida.
[0018] Jedinjenja predmetnog pronalaska su potentni i netoksični inhibitori PCSK9, korisni u lečenju hiperholesterolemije i srodnih poremećaja.
SAŽETAK PRONALASKA
[0019] Oligomer pronalaska je LNA gapmer, koji sadrži između 16 i 20 nukleotida u dužini, koji sadrži neprekidnu sekvencu od 16 nukleotida koji su komplementarni odgovarajućoj dužini SEQ ID NO 31.
[0020] Pronalazak obezbeđuje antisens oligonukleotidni konjugat koji sadrži oligomer u skladu sa pronalaskom, i najmanje jedan ne-nukleotidni ili ne-polinukleotidni deo kovalentno prikačen za navedeni oligomer.
[0021] Pronalazak takođe obezbeđuje antisens oligonukleotidni konjugat koji sadrži oligomer (A) u skladu sa pronalaskom, i namanje jedan ne-nukleotidni ili ne-polinukleotidni deo kovalentno prikačen za navedeni oligomer (C), opciono putem linker regiona (B i/ili Y) smeštenog između neprekidne sekvence oligomera i konjugatnog dela.
[0022] U nekim primerima izvođenja, pronalazak takođe obezbeđuje antisens oligonukleotidni konjugat koji sadrži oligomer pronalaska.
[0023] Pronalazak obezbeđuje antisens oligonukleotidni konjugat koji sadrži
a. antisens oligomer (A) od između 16 - 22 nukleotida u dužini, koji sadrži neprekidnu sekvencu od 16 nukleotida koji su komplementarni odgovarajućoj dužini SEQ ID NO 31, i pri čemu je navedeni antisens oligomer LNA gapmer, i
b. najmanje jedan konjugatni deo koji ciljno deluje na asijaloglikoproteinski receptor (C) kovalentno prikačen za navedeni oligomer (A).
[0024] Pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 2, 3, 18 i 19.
[0025] Pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži oligomer ili konjugat u skladu sa pronalaskom, i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač, so ili adjuvans.
[0026] Pronalazak obezbeđuje oligomer ili konjugat ili farmaceutsku kompoziciju u skladu sa pronalaskom, za upotrebu kao medikament, kao što je za lečenje hiperholesterolemije ili srodnog poremećaja, kao što je poremećaj odabran iz grupe koja se sastoji od ateroskleroze, hiperlipidemije, hiperholesterolemije, porodične hiperholesterolemije npr. dobijanje funkcionalnih mutacija u PCSK9, disbalansa HDL/LDL holesterola, dislipidemija, npr. porodična hiperlipidemija (FCHL) ili porodična hiperholesterolemija (FHC), stečene hiperlipidemije, hiperholesterolemije rezistentne na statine, bolesti koronarnih arterija (CAD), i koronarne bolesti srca (CHD).
[0027] Pronalazak obezbeđuje upotrebu oligomera ili konjugata ili farmaceutske kompozicije pronalaska, za proizvodnju medikamenta za lečenje hiperholesterolemije ili srodnog poremećaja, kao što je poremećaj odabran iz grupe koja se sastoji od ateroskleroze, hiperlipidemije, hiperholesterolemije, porodične hiperholesterolemije npr. dobijanje funkcionalnih mutacija u PCSK9, disbalansa HDL/LDL holesterola, dislipidemija, npr. porodična hiperlipidemija (FCHL) ili porodična hiperholesterolemija (FHC), stečene hiperlipidemije, hiperholesterolemije rezistentne na statine, bolesti koronarnih arterija (CAD), i koronarne bolesti srca (CHD).
[0028] Objavljen je postupak lečenja hiperholesterolemije ili srodnog poremećaja, kao što je poremećaj odabran iz grupe koja se sastoji od ateroskleroze, hiperlipidemije, hiperholesterolemije, porodične hiperholesterolemije npr. dobijanje funkcionalnih mutacija u PCSK9, disbalansa HDL/LDL holesterola, dislipidemija, npr. porodična hiperlipidemija (FCHL) ili porodična hiperholesterolemija (FHC), stečene hiperlipidemije, hiperholesterolemije rezistentne na statine, bolesti koronarnih arterija (CAD), i koronarne bolesti srca (CHD), navedeni postupak sadrži primenu efikasne količine oligomera ili konjugata ili farmaceutske kompozicije u skladu sa pronalaskom, pacijentu koji pati od, ili je verovatno da pati od hiperholesterolemije ili srodnog poremećaja.
[0029] Pronalazak obezbeđuje in vitro postupak inhibicije PCSK9 u ćeliji koja eksprimira PCSK9, navedeni postupak sadrži primenu oligomera ili konjugata ili farmaceutske kompozicije u skladu sa pronalaskom u navedenoj ćeliji tako da inhibira PCSK9 u navedenoj ćeliji.
[0030] Pronalazak takođe obezbeđuje oligomer u skladu sa pronalaskom koji sadrži neprekidni region od 10 - 22, kao što je 12-18, kao što je 13, 14, 15, 16 ili 17 nukleozida povezanih fosforotioatom (tj. region A, koji je uobičajeno komplementaran odgovarajućem regionu ciljne sekvence, kao što je SEQ ID NO 46) i dodatno sadrži između 1 i 6 DNK nukleozida koji su neprekidni sa LNA oligomerom, pri čemu su internukleozidne veze između DNK, i/ili neposredno uz DNK nukleozid(e), fiziološki labilne, kao što je/su fosfodiestarske veze. Takav LNA oligomer može biti u obliku konjugata, kako je ovde opisano, ili može, na primer biti intermedijer koji će se upotrebiti u narednom koraku konjugacije. Kada je konjugovan, konjugat može, na primer biti ili sadržati sterol, kao što su holesterol ili tokoferol, ili može biti ili sadržati (ne-nukleotidni) ugljeni hidrat, kao što je GalNAc konjugat, ili drugi konjugat kako je ovde opisano.
[0031] Objavljen je dodatni gapmer oligomer koji sadrži najmanje jedan cET, kao što su (S)-cET nukleotidi, od između 10 - 22, kao što je 12-18, kao što je 13, 14, 15, 16 ili 17 nukleotida u dužini, koji ciljno deluje na (tj. ima sekvencu koja je komplementarna odgovarajućem delu) humanog PCSK9.
KRATAK OPIS SLIKA
[0032]
Slika 1: Primeri tri-GalNAc konjugata koji se mogu upotrebljavati. Konjugati 1 - 4 ilustruju 4 pogodna GalNAc konjugatna dela, i konjugati 1a - 4a označavaju iste konjugate sa dodatnim linker delom (Y) koji se upotrebljava da veže konjugat za oligomer (region A ili za bio-odvojiv (bio-otcepljiv, bio-isecljiv) linker, kao što je region B). Talasasta linija predstavlja kovalentnu vezu do oligomera.
Slika 2: Primeri holesterol i tokoferol konjugatnih delova. Konjugati 5a i 6a označavaju iste konjugate sa dodatnim linker delom (Y) koji se upotrebljava da veže konjugat za oligomer (region A ili za bio-odvojiv linker, kao što je region B ). Talasasta linija predstavlja kovalentnu vezu do oligomera.
Slika 3: Specifična LNA jedinjenja. Beta-D-oksi LNA su predstavljeni superskriptom<L>posle slova, subskriptspredstavlja fosforotioatnu vezu, superskript Me ispred velikog slova C predstavlja 5-metil citozin LNA, nukleotidi koji nisu LNA su DNK nukleotidi (bez superskripta L).
Slika 4: Primeri holesterol konjugata LNA jedinjenja. Beta-D-oksi LNA su identifikovani superskriptom L posle slova, subskriptspredstavlja fosforotioatnu vezu, subskriptopredstavlja fosfodiestarsku vezu, superskript Me ispred velikog slova C predstavlja 5-metil citozin LNA, nukleotidi koji nisu LNA su DNK nukleotidi (bez superskripta L).
Slika 5: Primeri GalNAc konjugata LNA jedinjenja. Konjugati u suštini odgovaraju Conj2a na Slici gde je talasasta linija supstituisana LNA oligomerom. Beta-D-oksi LNA su identifikovani superskriptom L posle slova, subskriptspredstavlja fosforotioatnu vezu, superskript Me ispred velikog slova C predstavlja 5-metil citozin LNA, nukleotidi koji nisu LNA su DNK nukleotidi (bez superskripta L).
Slika 5A: Detaljna struktura SEQ ID NO 18
Slika 5B: Detaljna struktura SEQ ID NO 19
Slika 6: Primer FAM konjugatne grupe.
Slika 7: LNA-FAM konjugati sa i bez odvojivih fofodiestarskih veza. Beta-D-oksi LNA su identifikovani superskriptom L posle slova, subskriptspredstavlja fosforotioatnu vezu, subskriptopredstavlja fosfodiestarsku vezu, superskript Me ispred velikog slova C predstavlja 5-metil citozin LNA, nukleotidi koji nisu LNA su DNK nukleotidi (bez superskripta L).
Slika 8: Anti-PCSK9 gapmeri rangirani po potenciji in vitro.
Slika 9: Odabrani anti-PCSK9 gapmeri rangirani po potenciji in vitro.
Slika 10: In vitro potencija odabranih anti-PCSK9 jedinjenja i IC50 izračunavanja.
Slika 11: In vivo ALT podaci za odabrane anti-PCSK9 konjugate.
Slika 12: Internukleozidna veza L može biti, na primer, fosfodiestar, fosforotioat, fosforoditioat, boranofosfat ili metilfosfonat, kao što je fosfodiestar. PO je fosfodiestarska veza. Jedinjenje a) ima region B sa jednom DNK (ili RNK), veza između drugog i prvog regiona je PO. Jedinjenje b) ima dva DNK/RNK (kao što je DNK) nukleozida povezana fosfodiestarskom vezom. Jedinjenje c) ima tri DNK/RNK (kao što je DNK) nukleozida povezana fosfodiestarskim vezama. U nekim primerima izvođenja, region B se može dodatno produžiti dodatnom fosfodiestarskom DNK/RNK (kao što su DNK nukleozidi). Konjugatna grupa (označena sa X, inače region C ovde) je ilustrovana na levoj strani svakog jedinjenja (npr. Holesterol, GalNAc, Conj1-4, 1a -4a, i 5 ili 6), i može opciono biti kovalentno prikačena za terminalni nukleozid regiona B putem fosfor nukleozidne vezne grupe, kao što su fosfodiestar, fosforotioat, fosforoditioat, boranofosfat ili metilfosfonat, ili može biti povezana putem alternativne veze, npr. tiazol veze (videti L u jedinjenjima d), e), i f ).
Slika 13. Gde jedinjenja sadrže opcioni linker (Y) između trećeg (konjugatnog) regiona (X) i drugog regiona (region B). Ista nomenklatura kao na Slici 12. Ovde su objavljeni pogodni linkeri, i uključuju, na primer alkil linkere, na primer C6 linkere. U jedinjenjima a), b) i c), linker između X i regiona B je prikačen za region B putem fosfor nukleozidne vezne grupe, kao što su fosfodiestar, fosforotioat, fosforoditioat, boranofosfat ili metilfosfonat, ili može biti vezan putem alternativne veze, npr. triazol veze (Li). U ovim jedinjenjima Lii predstavlja internukleozidnu vezu između prvog (A) i drugog regiona (B). Jedinjenja d), e) i f) dodatno sadrže linker (Y) između regiona B i konjugatne grupe, i region Y može biti vezan za region B putem, na primer, fosfor nukleozidne vezne grupe, kao što su fosfodiestar, fosforotioat, fosforoditioat, boranofosfat ili metilfosfonat, ili u nekim primerima izvođenja triazol vezom. Pored toga, ili alternativno X može biti aktivaciona grupa ili reaktivna grupa. X može biti kovalentno prikačen za region B putem fosfor nukleozidne vezne grupe, kao što su fosfodiestar, fosforotioat, fosforoditioat, boranofosfat ili metilfosfonat, ili može biti vezan putem alternativne veze, npr. triazol veze.
Slika 14: Utišavanje PCSK9 iRNK sa holesterol-konjugatima in vivo. Miševima su injektirane pojedinačne doze od 10 mg/kg nekonjugovanog LNA-antisens oligonukleotida (#40) ili ekvimolarne količine LNA antisens oligonukleotida konjugovanih sa holesterolom sa različitim linkerima i žrtvovani su u danima 1, 3, 7 i 10 posle doziranja. RNK je izolovana iz jetre i bubrega i podvrgnuta PCSK9 specifičnom RT-qPCR A. Kvantifikacija PCSK9 iRNK iz uzoraka jetre normalizovana na BACT i pokazana kao procenat proseka ekvivalentnih kontrola sa fiziološkim rastvorom B. Kvantifikacija PCSK9 iRNK iz uzoraka bubrega normalizovana na BACT i pokazana kao procenat proseka ekvivalentnih kontrola sa fiziološkim rastvorom.
Slika 15: Ekspresija Kim-1 iz studije bezbednosti na pacovima (videti Primer 5).
Slika 16: Serumski PCSK9 i LDL holesterol u uzorcima cinomolgus majmuna injektiranih četiri puta (jedno injektiranje/nedelji) 0,5 ili 1,5 mg/kg/nedelji SEQ ID 2 i 18.
Slika 17: Serumski PCSK9 i LDL holesterol u uzorcima cinomolgus majmuna injektiranih četiri puta (jedno injektiranje/nedelji) 0,5 ili 1,5 mg/kg/nedelji SEQ ID 3 i 19.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0033] U sledećem tekstu su opisani različiti elementi pronalaska pod zasebnim naslovima. Razume se da primer izvođenja jednog elementa može biti kombinovan sa primerima izvođenja drugih elemenata kako bi se došlo do jedinjenja ovog pronalaska (npr. kao što je ilustrovano na slici 12 i 13).
Oligomer (region A)
[0034] Termin "oligomer" ili "oligonukleotid" u kontekstu predmetnog pronalaska, označava molekul formiran kovalentnim vezivanjem dva ili više nukleotida (tj. oligonukleotid). Ovde, jedan nukleotid (jedinica) može takođe biti označen sa monomer ili jedinica. U nekim primerima izvođenja, termini "nukleozid", "nukleotid", "jedinica" i "monomer" se upotrebljavaju naizmenično. Biće prepoznato da kada se govori o sekvenci nukleotida ili monomera, ono šta to označava je sekvenca baza, kao što su A, T, G, C ili U.
[0035] Oligomer pronalaska je LNA gapmer sa između 16 - 20 nukleotida u dužini i sadrži neprekidnu sekvencu od 16 nukleotida koji su komplementarni odgovarajućoj dužini SEQ ID NO 31.
[0036] Objavljeni su oligomeri koji sadrže neprekidnu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 26, 27, 28, 29 i 44.
[0037] Oligomer ili konjugat pronalaska ciljno deluje na PCSK9, i kao takav može da smanjuje ekspresiju ili inhibira PCSK9, kao što je PCSK9 kod čoveka ili u ćeliji koja eksprimira PCSK9.
[0038] Objavljene su internukleozidne veze neprekidne sekvence od 10-16 nukleotida koje su komplementarne odgovarajućoj dužini SEQ ID NO 33 ili 34 ili 45 koje mogu biti fosforotioatne veze.
[0039] U nekim primerima izvođenja, oligomer pronalaska sadrži ili se sastoji od neprekidne sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 2 i 3.
[0040] U nekim primerima izvođenja, oligomer sadrži 10 - 16 nukleozida povezanih fosforotiolatom.
[0041] U nekim primerima izvođenja, oligomer pronalaska je LNA gapmer koji sadrži neprekidnu sekvencu od 16 nukleotida koji su komplementarni odgovarajućoj dužini SEQ ID NO 31, pri čemu neprekidna sekvenca sadrži nukleotidne analoge. U jednom primeru izvođenja, oligomer pronalaska sadrži nukleotidne analoge koji povećavaju afinitet.
[0042] U nekim primerima izvođenja, nukleotidni analozi su nukleotidi modifikovani šećerom, kao što su nukleotidi modifikovani šećerom nezavisno ili zavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od: 2'-O-alkil-RNK jedinica, 2'-OMe-RNK jedinica, 2'-amino-DNK jedinica, i 2'-fluoro-DNK jedinica.
[0043] Oligomer pronalaska je LNA gapmer oligonukleotid.
[0044] U nekim primerima izvođenja, LNA gapmer sadrži krilo sa svake strane (5' i 3') od 2 do 4 nukleotidna analoga, poželjno LNA analoga.
[0045] U nekim primerima izvođenja, oligomer pronalaska može opciono da sadrži dodatnih 1-6 nukleotida, koji mogu da formiraju ili sadrže bio-odvojiv nukleotidni region, kao što je fosfat nukleotidni linker. Pogodno, bio-odvojiv nukleotidni region je formiran od kratkog niza (npr. 1, 2, 3, 4, 5 ili 6) nukleotida koji su fiziološki labilni. Ovo se može postići upotrebom fosfodiestarskih veza sa DNK/RNK nukleozidima, ili ukoliko se fiziološka labilnost može održavati, može se upotrebiti drugi nukleozid. Fiziološka labilnost može se meriti upotrebom ekstrakta jetre, kao što je ilustrovano u primeru 6.
[0046] Oligomer pronalaska se sastoji od neprekidne sekvence od 16 nukleotida koji su komplementarni odgovarajućoj dužini SEQ ID NO 31 (prvi region, ili region A). Oligomer pronalaska može da sadrži dodatni nukleotidni region. U nekim primerima izvođenja, dodatni nukleotidni region sadrži bio-odvojiv nukleotidni region, kao što je fosfatna nukleotidna sekvenca (drugi region, region B), koja može kovalentno povezati region A za ne-nukleotidni deo, kao što je konjugatna grupa, (treći region, ili region C). U nekim primerima izvođenja neprekidna nukleotidna sekvenca oligomera pronalaska (region A) je direktno kovalentno vezana sa regionom C. U nekim primerima izvođenja region C je bio-odvojiv.
[0047] Oligomer sadrži ili se sastoji od neprekidne nukleotidne sekvence od 16 - 20, kao što je 16, 17, 18, 19, 20, 21, nukleotida u dužini, kao što je 16 nukleotida u dužini. Oligomer može stoga da označava kombinovanu dužini regiona A i regiona B, npr. region A (16nt) i region B (1 - 6nt).
1
[0048] U različitim primerima izvođenja, jedinjenje pronalaska ne sadrži RNK (jedinice). U nekim primerima izvođenja, jedinjenje u skladu sa pronalaskom, prvi region, ili prvi i drugi region zajedno (npr. kao jedna neprekidna sekvenca), je linearni molekul ili se sintetiše kao linearni molekul. Zbog toga oligomer može biti jednolančani molekul. U nekim primerima izvođenja, oligomer ne sadrži kratke regione od, na primer, najmanje 3, 4 ili 5 neprekidnih nukleotida, koji su komplementarni ekvivalentnim regionima unutar istog oligomera (tj. duplekse). Oligomer, u nekim primerima izvođenja, ne može biti (suštinski) dvolančani. Oligomer pronalaska nije siRNK.
Sekvence oligomera
[0049] Sledeća tabela objavljuje oligomere i oligomerne konjugate i PCSK9 ciljne sekvence
Tabela 1
Pozicija na PCSK9 SEQ ID Sekvenca PO Hol-C6 GalNAc
genu SEQ ID NO 44
1 TGCtacaaaacCCA 3643-3656
2 AATgctacaaaaCCCA 3643-3658
3 AATgctacaaaacCCA 3643-3658
4 GCtgtgtgagcttGG 3251-3265
5 TGctgtgtgagctTGG 3251-3266
6 TGCtgtgtgagctTGG 3251-3266
7 TCCtggtctgtgtTCC 3373-3388
8 TCCtggtctgtgttCC 3373-3388
9 TGCtacaaaacCCA da da 3643-3656
10 AATgctacaaaaCCCA da da 3643-3658
11 AATgctacaaaacCCA da da 3643-3658
12 GCtgtgtgagcttGG da da 3251-3265
13 TGctgtgtgagctTGG da da 3251-3266
Pozicija na PCSK9 SEQ ID Sekvenca PO Hol-C6 GalNAc
genu SEQ ID NO 44 14 TGCtgtgtgagctTGG da da 3251-3266
15 TCCtggtctgtgtTCC da da 3373-3388
16 TCCtggtctgtgttCC da da 3373-3388
17 TGCtacaaaacCCA da 3643-3656
18 AATgctacaaaaCCCA da 3643-3658
19 AATgctacaaaacCCA da 3643-3658
20 GCtgtgtgagcttGG da 3251-3265
21 TGctgtgtgagctTGG da 3251-3266
22 TGCtgtgtgagctTGG da 3251-3266
23 TCCtggtctgtgtTCC da 3373-3388
24 TCCtggtctgtgttCC da 3373-3388
40 GTctgtggaaGCG 1005-1017
41 GTctgtggaaGCG da 1005-1017
42 GTctgtggaaGCG da da 1005-1017
43 GTctgtggaaGCG da da 1005-1017
25 tgctacaaaaccca 3643-3656
26 aatgctacaaaaccca 3643-3658
27 gctgtgtgagcttgg 3251-3265
28 tgctgtgtgagcttgg 3251-3266
29 tcctggtctgtgttcc 3373-3388
44 gtctgtggaagcg 1005-1017
30 UGGGUUUUGUAGCA 3643-3656
31 UGGGUUUUGUAGCAUU 3643-3658
32 CCAAGCUCACACAGC 3251-3265
Pozicija na PCSK9 SEQ ID Sekvenca PO Hol-C6 GalNAc
genu SEQ ID NO 44
33 CCAAGCUCACACAGCA 3251-3266
34 GGAACACAGACCAGGA 3373-3388
45 CGCUUCCACAGAC 1005-1017
[0050] SEQ ID NO 25 - 29 i 44 su motivi nukleobazne sekvence.
[0051] SEQ ID NO 30 - 34 i 45 su RNK ciljne sekvence prisutne u humanoj PCRK9 iRNK.
[0052] SEQ ID NO 1 je SPC5001.
[0053] SEQ ID NO 1 - 24 i 40 do 43 su oligomeri koji sadrže nukleotidne analoge kao što su LNA gapmer oligomeri, gde su mala slova DNK jedinice (nukleozid/nukleotid) gde su velika slova LNA jedinice.
[0054] U nekim primerima izvođenja sve LNA C su 5-metil citozin. U nekim primerima izvođenja sve LNA jedinice su beta-D-oksi LNA. U nekim primerima izvođenja internukleozidne veze između nukleozida SEQ ID NO 1 - 24 i 40 do 43 su sve fosforotioatne veze.
[0055] SEQ ID NO 9 - 16 i 41 do 43 sadrže oligomer (kako je ukazano sa SEQ ID) kao i holesterol konjugat koji može biti kovalentno vezan sa oligomernim 5' ili 3' krajem oligomera, opciono putem bio-odvojivog linkera, kao što je fosfat nukleozidni linker. U nekim primerima izvođenja, holesterol konjugat je vezan na 5' kraj oligomera.
[0056] SEQ ID NO 17 - 24 sadrže oligomer (kako je ukazano sa SEQ ID) kao i GalNAc konjugat koji može biti kovalentno vezan sa oligomernim 5' ili 3' krajem oligomera, opciono putem bio-odvojivog linkera, kao što je fosfat nukleozidni linker ili odvojiv peptidni linker. U nekim primerima izvođenja, GalNAc konjugat je vezan za 5' kraj oligomera.
[0057] Specifični oligomeri i konjugati ovde upotrebljeni su ilustrovani na Slici 3 (oligomeri), Slici 4 (holesterol konjugati), Slici 5 (GalNAc konjugati). Drugi primeri konjugata koji se mogu upotrebljavati sa oligomerom pronalaska su ilustrovani na Slikama 1 i 2 i opisani u odeljku GalNAc konjugatni delovi.
[0058] Tabela 2 obezbeđuje specifične kombinacije oligomera i konjugata.
1
Tabela 2: Kombinacije oligomer/konjugat
[0059] Sve ove kombinacije mogu se vizualizovati zamenom talasaste linije na Slici 1 ili 2 sekvencom oligomera. Slika 5 pokazuje kombinaciju Conj2a sa navedenim SEQ ID NO iznad. Slike 5A i 5B su dva detaljna primera jedinjenja na slici 5. Imajte na umu da bioodvojiv linker (B) može ili ne mora biti prisutan između konjugatnog dela (C) i oligomera (A). Za Conj1 - 4 i 1a - 4a sam GalNAc konjugat je bio-odvojiv, koristeći peptidni linker u GalNAc klasteru, i kao takav dodatni bio-odvojiv linker (B) može ili ne mora biti upotrebljen. Međutim, preliminarni podaci ukazuju da uključivanje bio-odvojivog linkera (B), kao što su fosfat nukleotidni linkeri ovde objavljeni može poboljšati aktivnost takvih GalNAc klastera oligomernih konjugata. Slika 4 pokazuje kombinaciju Conj5a sa navedenim SEQ ID NO iznad sa bio-odvojivim linkerom (B) sastavljenim od dva DNK monomera C i A povezanih fosfodiestarskom vezom. Za upotrebu sa Conj 5 i Conj 6, upotreba bio-odvojivog linkera veoma poboljšava uključivanje aktivnosti jedinjenja bio-odvojivog linkera (B), kao što se preporučuju ovde objavljeni fosfat nukleotidni linkeri.
[0060] Termini "odgovarajući" i "odgovara" označavaju poređenje između nukleotidne sekvence oligomera (tj. nukleobaze ili bazne sekvence) ili neprekidne nukleotidne sekvence (prvi region/region A) i reverznog komplementa nukleinske kiseline cilja, ili njegovog subregiona (npr. SEQ ID NO 31, 32 33, 34 ili 45). Nukleotidni analozi se porede direktno sa svojim ekvivalentnim ili odgovarajućim nukleotidima. U poželjnom primeru izvođenja, oligomeri (ili njihov prvi region) su komplementarni ciljnom regionu ili njegovom subregionu (npr. SEQ ID NO 31, 32, 33, 34 ili 45), kao što je potpuno komplementarni.
[0061] Termini "reverzni komplement", "reverzno komplementarno" i " reverzna komplementarnost" kako se ovde upotrebljava su međusobno zamenljivi terminima "komplement", "komplementarno" i "komplementarnost".
[0062] Termin "komplementarno" znači da su dve sekvence komplementarne kada se sekvenca jedne može vezati za sekvencu druge na anti-paralelan način pri čemu se 3ꞌ-kraj svake sekvence vezuje za 5ꞌ-kraj druge sekvence i svaki A, T(U), G, i C iz jedne sekvence se potom poravnava sa T(U), A, C, i G, respektivno, iz druge sekvence. Normalno, komplementarna sekvenca oligonukleotida ima najmanje 90%, poželjno 95%, najpoželjnije 100%, komplementarnosti sa definisanom sekvencom.
[0063] Termini "odgovarajući nukleotidni analog" i "odgovarajući nukleotid" imaju nameru da ukažu da su nukleotid u nukleotidnom analogu i nukleotid koji se javlja u prirodi identični. Na primer, kada je jedinica 2-dezoksiriboze nukleotida povezana sa adeninom, "odgovarajući nukleotidni analog" sadrži jedinicu pentoze (različitu od 2-dezoksiriboze) povezanu sa adeninom.
[0064] Termin "nukleobaza" označava bazni deo nukleotida i pokriva i varijante koje se javljaju u prirodi i koje se ne javljaju u prirodi. Stoga, "nukleobaza" pokriva ne samo poznate heterocikle purina i pirimidina već takođe i njihove heterociklične analoge i tautomere. Biće prepoznato da DNK ili RNK nukleozidi regiona B mogu imati nukleobazu(e) koja se javlja u prirodi i/ili koja se ne javlja u prirodi.
[0065] Primeri nukleobaza uključuju, ali nisu ograničeni na adenin, guanin, citozin, timidin, uracil, ksantin, hipoksantin, 5-metilcitozin, izocitozin, pseudoizocitozin, 5-bromuracil, 5-
1
propiniluracil, 6-aminopurin, 2-aminopurin, inozin, diaminopurin, i 2-hloro-6-aminopurin. U nekim primerima izvođenja nukleobaze mogu biti nezavisno odabrane iz grupe koja se sastoji od adenina, guanina, citozina, timidina, uracila, 5-metilcitozina. U nekim primerima izvođenja nukleobaze mogu biti nezavisno odabrane iz grupe koja se sastoji od adenina, guanina, citozina, timidina, i 5-metilcitozina.
[0066] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedna od nukleobaza prisutnih u oligomeru je modifikovana nukleobaza odabrana iz grupe koja se sastoji od 5-metilcitozina, izocitozina, pseudoizocitozina, 5-bromuracila, 5-propiniluracila, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inozina, diaminopurina, i 2-hloro-6-aminopurina.
Cilj
[0067] Pogodno oligomer pronalaska je sposoban da modulira ekspresiju PCSK9 gena. Poželjno oligomer je sposoban da smanjuje ekspresiju PCSK9 gena. S tim u vezi, oligomer pronalaska može uticati na ekspresiju PCSK9, tipično u sisarskoj kao što je humana ćelija, kao što je ćelija jetre. U nekim primerima izvođenja, oligomeri pronalaska se vezuju za ciljnu nukleinsku kiselinu i efekat na ekspresiju je najmanje 10% ili 20% smanjenja u poređenju sa normalanim nivoom ekspresije (npr. nivo ekspresije ćelije, životinjske ili humene tretirane fiziološkim rastvorom), poželjnije najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% inhibicije u poređenju sa normalnim nivoom ekspresije. U nekim primerima izvođenja, takva se modulacija vidi kada se upotrebljava između 0,04 i 25 nM, kao što je između 0,8 i 20 nM koncentracija jedinjenja pronalaska. U nekim primerima izvođenja, takva se modulacija vidi kada se upotrebljava između 0,01 i 15 mg/kg, kao što je između 0,05 i 10 mg/kg, kao što je između 0,1 i 7,5 mg/kg, kao što je između 0,25 i 5 mg/kg, kao što je između 0,5 i 2,5 mg/kg koncentracija jedinjenja pronalaska. U istom ili u drugom primeru izvođenja, inhibicija ekspresije je manja od 100%, kao što je manje od 98% inhibicije, manje od 95% inhibicije, manje od 90% inhibicije, manje od 80% inhibicije, kao što je manje od 70% inhibicije. Modulacija nivoa ekspresije se može odrediti merenjem nivoa proteina, npr. postupcima kao što je SDS-PAGE praćeno western blotingom upotrebom pogodnih antitela uzgajenih prema ciljnom proteinu. Alternativno, modulacija nivoa ekspresije može biti određena merenjem nivoa iRNK, npr. northern blotingom ili kvantitativnim RT-PCR. Kada se meri putem nivoa iRNK, nivo smanjenja je kada se upotrebljava odgovarajuća doza, kao što je između 0,04 i 25 nM, kao što je između 0,8 i 20 nM koncentracija, u nekim primerima izvođenja, tipično do nivoa između 10-20% od normalnih nivoa u odsustvu jedinjenja pronalaska.
1
[0068] Pronalazak dakle obezbeđuje in vitro postupak smanjenja ili inhibicije ekspresije PCSK9 proteina i/ili iRNK u ćeliji koja eksprimira PCSK9 protein i/ili iRNK, pri čemu navedeni postupak sadrži primenu oligomera ili konjugata u skladu sa pronalaskom navedenoj ćeliji smanjujući ili inhibirajući ekspresiju PCSK9 proteina i/ili iRNK u navedenoj ćeliji. Pogodno ćelija je ćelija sisara kao što je humana ćelija.
[0069] Termin "ciljna nukleinska kiselina", kako se ovde upotrebljava označava DNK ili RNK koja kodira PCSK9 polipeptid sisara, kao što je humani PCSK9, kao što je NCBI pristupni broj NM_174936 SEQ ID NO: 46. Nukleinske kiseline koje kodiraju PCSK9 ili njihove varijante koje se javljaju u prirodi, i RNK nukleinske kiseline izvedene iz njih, poželjno iRNK, kao što je pre-iRNK, iako je poželjno zrelu iRNK. U nekim primerima izvođenja, na primer kada se upotrebljava u istraživanju ili dijagnostici "ciljna nukleinska kiselina" može biti cDNK ili sintetički oligonukleotid izveden iz gornjih DNK ili RNK nukleinskih kiselina cilja. Oligomer u skladu sa pronalaskom je poželjno sposoban da hibridizuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Biće prepoznato da je SEQ ID NO: 46 sekvenca cDNK, i kao takva, odgovara ciljnoj sekvenci zrele iRNK, iako je uracil zamenjen timidinom u sekvencama cDNK.
[0070] Termin "njegova varijanta koja se javlja u prirodi" označava varijante PCSK9 polipeptida sekvence nukleinske kiseline koje u prirodi postoje unutar definisane taksonomske grupe, kao što su sisari, kao što su miš, majmun, i poželjno ljudsko biće. Tipično, kada označava "varijante koje se javljaju u prirodi" polinukleotida termin takođe može obuhvatati bilo koju alelnu varijantu genomske DNK koja kodira PCSK9 koja se nalazi na hromozomu 4, na 4 C7 pomoću hromozomske translokacije ili duplikacije, i RNK, kao što je iRNK izvedena iz njih. "Varijante koje se javljaju u prirodi" mogu takođe da uključuju varijante izvedene iz alternativnog splajsovanja PCSK9 iRNK. Kada se poziva na specifičnu polipeptidnu sekvencu, npr., termin takođe uključuje oblike proteina koji se javljaju u prirodi koji se prema tome mogu preraditi, npr. ko- ili post-translacionim modifikacijama, kao što su odvajanje signalnog peptida, proteolitičko odvajenje, glikozilacija, itd.
[0071] Objavljeni su oligomeri (ili njihov neprekidni nukleotidni deo), odabrani od, ili koji sadrže, jednu od sekvenci odabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 28 ili 29 ili 44, ili podsekvencu od njihovih najmanje 10 neprekidnih nukleotida, pri čemu navedeni oligomer (ili njegov neprekidni nukleotidni deo) može opciono da sadrži jedno, dva, ili tri pogrešna sparivanja kada se poredi sa sekvencom.
[0072] Ciljna sekvenca oligomera predmetnog pronalaska sadrži ili se sastoji od SEQ ID NO 31.
1
[0073] Međutim, prepoznato je da u nekim primerima izvođenja nukleotidna sekvenca oligomera može sadržati dodatne 5' ili 3' nukleotide, kao što su, nezavisno, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 dodatnih nukleotida 5' i/ili 3', koji su nekomplementarni ciljnoj sekvenci - takvi nekomplementarni oligonukleotidi mogu formirati region B. U tom pogledu oligomer pronalaska može, u nekim primerima izvođenja, sadržati neprekidnu nukleotidnu sekvencu kojoj su bočno sa 5' i/ili 3' strane dodati nukleotidi. U nekim primerima izvođenja dodatni 5' ili 3' nukleotidi su nukleotidi koji se javljaju u prirodi, kao što su DNK ili RNK. U nekim primerima izvođenja, dodatni 5' ili 3' nukleotidi mogu predstavljati region D kako je označeno ovde u kontekstu gapmer oligomera.
[0074] Objavljen je oligomer koji se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 27, ili njenu podsekvencu od najmanje 10 ili 12 nukleobaza.
[0075] Objavljen je oligomer koji se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 28, ili njenu podsekvencu od najmanje 10 ili 12 nukleobaza. Objavljen je oligomer koji se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 5 ili 6. Objavljen je oligomer konjugat koji se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 13 ili 14 ili 21 ili 22.
[0076] Objavljen je oligomer koji se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 29, ili njenu podsekvencu od najmanje 10 ili 12 nukleobaza. Objavljen je oligomer koji se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 7 ili 8. U drugom poželjnom primeru izvođenja oligomer konjugat u skladu sa pronalaskom se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 15 ili 16 ili 23 ili 24.
[0077] Objavljen je oligomer koji se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 44, ili njenu podsekvencu od najmanje 10 ili 12 nukleobaza. Objavljen je oligomer koji se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 40. Objavljen je oligomer konjugat koji se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 41, 42 ili 43.
[0078] Objavljen je oligomer koji se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 26. U poželjnom primeru izvođenja, oligomer u skladu sa pronalaskom se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 2 ili 3. U drugom poželjnom primeru izvođenja, oligomer konjugat u skladu sa pronalaskom se sastoji od ili sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 10 ili 11 ili 18 ili 19.
Dužina
1
[0079] Oligomeri mogu da sadrže ili se sastoje od neprekidne nukleotidne sekvence od ukupno 16, 17, 18, 19, 20, 21, ili 22 neprekidnih nukleotida u dužini. Dužine mogu uključivati region A ili region A i B na primer.
[0080] U nekim primerima izvođenja, oligomeri sadrže ili se sastoje od neprekidne nukleotidne sekvence od ukupno između 16 - 22, kao što je 16 neprekidnih nukleotida u dužini. Poželjno, oligomer regiona A sadrži ili se sastoji od neprekidne nukleotidne sekvence 16 neprekidnih nukleotida u dužini.
[0081] U nekim primerima izvođenja, oligomer u skladu sa pronalaskom se sastoji od ne više od 22 nukleotida, kao što je ne više od 20 nukleotida, kao što je ne više od 18 nukleotida, kao što je 16 ili 17 nukleotida. U nekim primerima izvođenja, oligomer pronalaska sadrži manje od 20 nukleotida.
Nukleotidni analozi
[0082] Termin "nukleotid" kako se ovde upotrebljava, označava glikozid koji sadrži šećerni deo, bazni deo i kovalentno vezanu grupu, kao što je fosfatna ili fosforotioatna internukleotidna vezna grupa, i pokriva i nukleotide koji se javljaju u prirodi, kao što su DNK ili RNK, i nukleotide koji se ne javljaju u prirodi koji sadrže modifikovane šećerne i/ili bazne delove, koji se ovde takođe označavaju kao "nukleotidni analozi". Ovde, pojedinačni nukleotid (jedinica) takođe može biti označen kao monomer ili jedinica nukleinske kiseline.
[0083] U oblasti biohemije, termin "nukleozid" uobičajeno se koristi za označavanje glikozida koji sadrži šećerni deo i bazni deo. Kovalentna veza između dva nukleozida može biti označena kao internukleozidna veza. Alternativno, termin internukleotidna veza može se upotrebiti za karakterizaciju veze između nukleotida oligomera.
[0084] Kao što bi prepoznao prosečan stručnjak u oblasti, 5' nukleotid oligonukleotida ne sadrži 5' internukleotidnu veznu grupu, iako može ili ne mora sadržati 5' terminalnu grupu, kao što su fofodiestar ili fosforotioat pogodan za konjugovanje linkera (B ili Y ili konjugatni deo).
[0085] Nukleotidi koji se ne javljaju u prirodi uključuju nukleotide koji imaju modifikovane šećerne delove, kao što su biciklični nukleotidi ili 2' modifikovani nukleotidi, kao što su 2' supstituisani nukleotidi.
[0086] "Nukleotidni analozi" su varijante prirodnih nukleotida, kao što su DNK ili RNK nukleotidi, zahvaljujući modifikacijama u šećernim i/ili baznim delovima. Analozi bi u principu mogli biti samo "tihi" ili "ekvivalentni" prirodnim nukleotidima u kontekstu
1
oligonukleotida, tj. nemaju funkcionalan efekat na način na koji oligonukleotid deluje na inhibiciju ekspresije ciljnog gena. Takvi "ekvivalentni" analozi ipak mogu biti korisni ukoliko su, na primer, jednostavniji ili jeftiniji za izradu, ili su stabilniji na uslove skladištenja ili izrade, ili predstavljaju oznaku ili obeleživač. Poželjno, međutim, analozi će imati funkcionalan efekat na način na koji oligomer deluje na inhibiciju ekspresije; na primer proizvodeći povećani afinitet vezivanja (povećanje afiniteta) za cilj i/ili povećanu otpornost na unutarćelijske nukleaze i/ili povećanu lakoću transporta u ćeliju. Specifični primeri nukleozidnih analoga su opisani od strane naprimer Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 i Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, i u Šemi 1:
2
[0087] Objavljeni su oligomeri koji sadrže ili se sastoje od jednostavne sekvence nukleotida koji se javljaju u prirodi - poželjno 2'-dezoksinukleotida (koji se ovde uglavnom označavaju sa "DNK"), ali takođe moguće ribonukleotida (koji se ovde uglavnom označavaju sa "RNK"), ili kombinacije takvih nukleotida koji se javljaju u prirodi i jednog ili više nukleotida koji se ne javljaju u prirodi, tj. nukleotidnih analoga. Takvi nukleotidni analozi mogu pogodno povećati afinitet oligomera za ciljnu sekvencu. Primeri pogodnih i poželjnih nukleotidnih analoga su obezbeđeni u WO2007/031091 ili su tamo referencirani.
[0088] Ugrađivanje nukleotidnih analoga koji povećavaju afinitet u oligomer, kao što su LNA ili 2'-supstituisani šećeri, može dozvoliti da se smanji veličina specifično vezujućeg oligomera, i takođe može da smanji gornju granicu veličine oligomera pre nego što dođe do nespecifičnog ili aberantnog vezivanja.
[0089] U jednom primeru izvođenja oligomer pronalaska sadrži najmanje 2 nukleotidna analoga. U nekim primerima izvođenja, oligomer sadrži od 3-8 nukleotidnih analoga, npr. 6 ili 7 nukleotidnih analoga.
[0090] Primeri nukleotidnih analoga uključuju modifikovanje šećernog dela kako bi se obezbedila 2'-supstituent grupa ili kako bi se proizvela biciklična struktura koja povećava afinitet vezivanja i takođe može obezbediti povećanu otpornost na nukleazu.
[0091] U nekim primerima izvođenja, nukleotidni analozi prisutni unutar antisens oligomera predmetnog pronalaska (kao što su regioni X' i Y' koji su pomenuti u odeljku "Dizajn gapmera") su nezavisno odabrani od, na primer: 2'-O-alkil-RNK jedinica, 2'-OMe-RNK jedinica, 2'-O-alkil-DNK jedinica, 2'-amino-DNK jedinica, 2'-fluoro-DNK jedinica, LNA jedinica, jedinica arabino nukleinske kiseline (ANA), 2'-fluoro-ANA jedinica, HNA jedinica, INA (interkalirajuća nukleinska kiselina - Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925) jedinica i 2'MOE jedinica.
[0092] U nekim primerima izvođenja, nukleotidni analozi su 2'-O-metoksietil-RNK (2'MOE), 2'-fluoro-DNK monomeri ili LNA nukleotidni analozi, i kao takav antisens oligonukleotid predmetnog pronalaska može sadržati nukleotidne analoge koji su nezavisno odabrani između ova tri tipa analoga, ili može sadržati samo jedan tip analoga odabranog između tri tipa. U nekim primerima izvođenja najmanje jedan od navedenih nukleotidnih analoga je 2'-MOE-RNK, kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 2'-MOE-RNK nukleotidne jedinice. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od navedenih nukleotidnih analoga je 2'-fluoro DNK, kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 102'-fluoro-DNK nukleotidne jedinice.
[0093] Poželjni nukleotidni analog je LNA, kao što su oksi-LNA (kao što su beta-D-oksi-LNA i alfa-L-oksi-LNA), i/ili amino-LNA (kao što su beta-D-amino-LNA i alfa-L-amino-LNA) i/ili tio-LNA (kao što su beta-D-tio-LNA i alfa-L-tio-LNA) i/ili ENA (kao što su beta-D-ENA i alfa-L-ENA). Najpoželjniji je beta-D-oksi-LNA.
[0094] U nekim primerima izvođenja, postoji samo jedan od gore navedenih tipova nukleotidnih analoga, tj. LNA, prisutan u antisens oligonukleotidu predmetnog pronalaska, ili njegovoj neprekidnoj nukleotidnoj sekvenci.
[0095] Antisens oligonukleotid predmetnog pronalaska sadrži najmanje jednu jedinicu zaključane nukleinske kiseline (Locked Nucleic Acid - LNA), kao što su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 LNA jedinica, kao što su 3 - 7 ili 4 do 8 LNA jedinica. Najmanje jedan od navedenih nukleotidnih analoga je zaključana nukleinska kiselina (LNA); na primer najmanje 3 ili najmanje 4, ili najmanje 5, ili najmanje 6, ili najmanje 7, ili 8, nukleotidnih analoga mogu biti LNA. U nekim primerima izvođenja svi nukleotidni analozi mogu biti LNA.
[0096] U nekim primerima izvođenja, antisens oligonukleotid predmetnog pronalaska može sadržati i nukleotidne analoge (poželjno LNA) i DNK jedinice. Poželjno, kombinovani ukupni broj nukleotidnih analoga (poželjno LNA) i DNK jedinica je poželjno 10-20, kao što je 10-18, još poželjnije 12-16. U nekim primerima izvođenja, nukleotidna sekvenca antisens oligonukleotida predmetnog pronalaska, kao što je neprekidna nukleotidna sekvenca, sastoji se od najmanje jednog nukleotidnog analoga (LNA) i preostale nukleotidne jedinice su DNK jedinice. U nekim primerima izvođenja, antisens oligonukleotid predmetnog pronalaska sadrži samo LNA nukleotidne analoge i nukleotide koji se javljaju u prirodi (kao što su RNK ili DNK, najpoželjnije DNK nukleotidi), opciono sa modifikovanim internukleotidnim vezama kao što je fosforotioat.
[0097] Biće prepoznato da kada se označava poželjni motiv nukleotidne sekvence ili nukleotidna sekvenca, koja se sastoji samo od nukleotida, oligomeri pronalaska koji su definisani tom sekvencom mogu sadržati odgovarajući nukleotidni analog umesto jednog ili više nukleotida prisutnih u navedenoj sekvenci, kao što su LNA jedinice ili drugi nukleotidni analozi, koji podižu stabilnost dupleksa/Tmoligomera/ciljnog dupleksa (tj. nukleotidni analozi za povećanje afiniteta).
[0098] Tmtest: Oligonukleotid: Oligonukleotid i RNK ciljni (PO) dupleksi se razblažuju do 3 mM u 500 ml vode bez RNaze i mešaju sa 500 ml 2x Tm-puferom (200mM NaCl, 0,2mM EDTA, 20mM Na fosfat, pH 7,0). Rastvor se zagreva na 95°C tokom 3 min i potom se ostavi da se veže na sobnoj temperaturi tokom 30 min. Temperature topljenja (Tm) dupleksa se mere na Lambda 40 UV/VIS spektrofotometru opremljenom Peltier temperaturnim programatorom PTP6 upotrebom PE Templab softvera (Perkin Elmer). Temperatura se povišava sa 20°C na 95°C i potom spušta do 25°C, beležeći apsorpciju na 260 nm. Prvi derivat i lokalni maksimumi i topljenja i vezivanja se upotrebljavaju za procenu Tmdupleksa.
[0099] U nekim primerima izvođenja, bilo kakva pogrešna sparivanja između nukleotidne sekvence oligomera i ciljne sekvence se poželjno nalaze u regionima izvan nukleotidnih analoga koji povećavaju afinitet, kao što je region Y' kao što je označeno u odeljku "Dizajn gapmera" i/ili na poziciji sa nemodifikovanim, kao što su DNK nukleotidi, u oligonukleotidu, i/ili u regionima koji su 5' ili 3' do neprekidne nukleotidne sekvence.
LNA
2
[0100] Termin "LNA" označava biciklični nukleozidni analog koji sadrži most između 2' i 4' pozicije u prstenu riboze (2' do 4' biciklični nukleotidni analog), i poznat je kao "zaključana nukleinska kiselina". LNA se u literaturi ponekad označava kao BNA (premošćena nukleinska kiselina (bridged nucleic acid) ili biciklična nukleinska kiselina (bicyclic nucleic acid)) i ova dva termina se mogu upotrebljavati naizmenično. Termin LNA može označavati LNA monomer, ili, kada se upotrebljava u kontekstu "LNA oligonukleotid", LNA označava oligonukleotid koji sadrži jedan ili više takvih bicikličnih nukleotidnih analoga. U nekim aspektima biciklični nukleozidni analozi su LNA nukleotidi, pa se zato ovi termini mogu upotrebljavati naizmenično, i u takvim primerima izvođenja, oba su okarakterisana prisustvom linker grupe (kao što je most) između C2' i C4' prstena šećera riboze.
[0101] U nekim primerima izvođenja, antisens oligonukleotid predmetnog pronalaska može da sadrži i beta-D-oksi-LNA, i jednu ili više od sledećih LNA jedinica: tio-LNA, amino-LNA, oksi-LNA, 5'-metil-LNA i/ili ENA bilo u beta-D ili alfa-L konfiguracijama ili njihovim kombinacijama. U nekim primerima izvođenja, sve LNA citozinske jedinice su 5'-metilcitozin. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan nukleozidni analog prisutan u prvom regionu (X') je biciklični nukleozidni analog, kao što su najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, (osim DNK i ili RNK nukleozida regiona Y') nukleozidna analoga modifikovana šećerom, kao što su biciklični nukleozidni analozi, kao što je LNA, npr. beta-D-X-LNA ili alfa-L-X-LNA (pri čemu je X oksi, amino ili tio), ili druge ovde objavljene LNA uključujući, ali ne ograničavajući se na, (R/S) cET, cMOE ili 5'-Me-LNA.
[0102] U nekim primerima izvođenja LNA koja se upotrebljava u oligonukleotidnim jedinjenjima pronalaska poželjno ima strukturu opšte formule II:
pri čemu je Y odabran iz grupe koja se sastoji od -O-, -CH2O-, -S-, -NH-, N(Re) i/ili -CH2-; Z i Z* su nezavisno odabrani između internukleotidnih vezivanja, R<H>, terminalna grupa ili zaštitna grupa; B predstavlja prirodan ili neprirodan nukleotidni bazni deo (nukleobaza), i R<H>je odabran od vodonika i C c
1-4-alkila; Ra, Rb, R , Rd i Re su, opciono nezavisno, odabrani iz grupe koja se sastoji od sledećeg: vodonik, opciono supstituisani C1-12-alkil, opciono supstituisani C2-12-alkenil, opciono supstituisani C2-12-alkinil, hidroksi, C1-12-alkoksi, C2-12-alkoksialkil, C2-12-alkeniloksi, karboksi, C1-12-alkoksikarbonil, C1-12-alkilkarbonil, formil, aril, ariloksi-karbonil, ariloksi, arilkarbonil, hetaroaril, hetaroariloksi-karbonil, hetaroariloksi, hetaroarilkarbonil, amino, mono- i di(C1-6-alkil)amino, karbamoil, mono- i di(C1-6-alkil)-amino-karbonil, amino-C1-6-alkil-aminokarbonil, mono- i di(C1-6-alkil)amino-C1-6-alkilaminokarbonil, C1-6-alkil- karbonilamino, karbamido, C1-6-alkanoiloksi, sulfono, C1-6-alkilsulfoniloksi, nitro, azido, sulfanil, C1-6-alkiltio, halogen, DNK interkalatori, fotohemijski aktivne grupe, termohemijski aktivne grupe, helirajuće grupe, reporter grupe, i ligandi, gde aril i hetaroaril mogu biti opciono supstituisani i gde dva geminalna supstituenta Ra i Rb zajedno mogu označavati opciono supstituisani metilen (=CH2); i RH je odabran od vodonika i C1-4-alkila. U nekim primerima izvođenja Ra, Rb, Rc, Rd i Re su, opciono nezavisno, odabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika i C1-6-alkila, kao što je metil. Za sve hiralne centre, asimetrične grupe mogu se naći u bilo R ili S orijentaciji, na primer, dva primerna stereohemijska izomera uključuju beta-D i alfa-L izoforme, koje mogu biti ilustrovane na sledeći način:
[0103] Specifične primerne LNA jedinice su pokazane ispod:
2
[0104] Termin "tio-LNA" sadrži zaključani nukleotid u kome je Y u opšoj formuli iznad odabran od S ili -CH2-S-. Tio-LNA može biti i u beta-D i alfa-L konfiguraciji.
[0105] Termin "amino-LNA" sadrži zaključani nukleotid u kome je Y u opšoj formuli iznad odabran od -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, i -CH2-N(R)- gde je R odabran od vodonika i C1-4-alkila. Amino-LNA može biti i u beta-D i u alfa-L konfiguraciji.
[0106] Termin "oksi-LNA" sadrži zaključani nukleotid u kome Y u opšoj formuli iznad predstavlja -O-. Oksi-LNA može biti i u beta-D i alfa-L konfiguraciji.
[0107] Termin "ENA" sadrži zaključani nukleotid u kome je Y u opšoj formuli iznad -CH2-O-(gde je atom kiseonika iz -CH2-O- prikačen za 2'-poziciju u odnosu na bazu B). Re je vodonik ili metil.
[0108] U nekim primernim primerima izvođenja LNA je odabran između beta-D-oksi-LNA, alfa-L-oksi-LNA, beta-D-amino-LNA i beta-D-tio-LNA, posebno beta-D-oksi-LNA.
[0109] Kako se ovde upotrebljava, "biciklični nukleozidi" označava modifikovane nukleozide koji sadrže biciklični šećerni deo. Primeri bicikličnih nukleozida uključuju, bez ograničenja, nukleozide koji sadrže most između 4' i 2' atoma u ribozil prstenu. U nekim primerima izvođenja, jedinjenja koja su ovde obezbeđena uključuju jedan ili više bicikličnih nukleozida pri čemu se most sadrži 4' do 2' bicikličnog nukleozida. Primeri takvih 4' do 2' bicikličnih nukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na, jednu od formula: 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' i 4'-CH(CH2OCH3)-O-2*, i njihove analoge (videti, SAD patent 7,399,845, izdat 15. jula 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2', i njegove
2
analoge (videti, publikovana PCT međunarodna prijava WO2009/006478, publikovana 8. januara 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2', i njegove analoge (videti, publikovana PCT međunarodna prijava WO2008/150729, publikovana 11. decembra 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (videti, publikovana SAD patentna prijava US2004/0171570, publikovana 2. septembra 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', pri čemu R je H, C1-C10alkil, ili zaštitna grupa (videti, SAD patent 7,427,672, izdat 23. septembra 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (videti, Chattopadhyaya, et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); i 4'-CH2-C(= CH2)-2', i njegove analoge (videti, publikovana PCT međunarodna prijava WO 2008/154401, publikovana 8. decembra 2008). Takođe videti, na primer: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 129(26) 8362-8379 (4. jul 2007); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al, Curr. Opinion Mol. Ther. 2001, 3, 239-243; SAD patent brojevi 6,670,461, 7,053,207, 6,268,490, 6,770,748, 6,794,499, 7,034,133, 6,525,191, 7,399,845; publikovane PCT međunarodne prijave WO 2004/106356, WO 94/14226, WO 2005/021570, i WO 2007/134181; SAD patentne publikacije brojevi US2004/0171570, US2007/0287831, i US2008/0039618; i SAD patenti serijski brojevi 12/129,154, 60/989,574, 61/026,995, 61/026,998, 61/056,564, 61/086,231, 61/097,787, i 61/099,844; i PCT međunarodne prijave brojevi PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154, i PCT/US2008/068922. Svaki od napred navedenih bicikličnih nukleozida može biti pripremljen tako da ima jednu ili više stereohemijskih šećernih konfiguracija uključujući na primer a-L-ribofuranozu i beta-D-ribofuranozu (videti PCT međunarodnu prijavu PCT DK98/00393, publikovana 25. marta 1999. kao WO 99/14226).
[0110] U nekim primerima izvođenja, biciklični šećerni delovi LNA nukleozida uključuju, ali nisu ograničeni na, jedinjenja koja imaju najmanje jedan most između 4' i 2' pozicije pentofuranozil šećernog dela pri čemu takvi mostovi nezavisno sadrže 1 ili od 2 do 4 povezane grupe nezavisno odabrane od - [CiRaXRb)]-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(= S)-, - O -, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, i -N(Ra)-; pri čemu: x je 0, 1, ili 2; n je 1, 2, 3, ili 4; svaki Rai Rbje nezavisno H, zaštitna grupa, hidroksil, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, hetaroaril, supstituisani heteroaril, C5-C7aliciklični radikal, supstituisani C5-C7aliciklični radikal, halogen, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acil (C(=O)-H), supstituisani acil,
2
CN, sulfonil (S(=O)2-J1), ili sulfoksil (S(=O)-J1); i svaki J1i J2je nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C5-C20aril, supstituisani C5-C20aril, acil (C(=O)-H), supstituisani acil, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, C1-C12aminoalkil, supstituisani C1-C12aminoalkil, ili zaštitna grupa.
[0111] U nekim primerima izvođenja most bicikličnog šećernog dela je, -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- ili, -C(RaRb)-O-N(R)-. U nekim primerima izvođenja most je 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2 ', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2', i 4'-CH2-N(R)-O-2'-, pri čemu je svaki R, nezavisno, H, zaštitna grupa, ili C1-C12alkil.
[0112] U nekim primerima izvođenja, biciklični nukleozidi su dodatno definisani izomernom konfiguracijom. Na primer, nukleozid koji sadrži 4'-2'metilen-oksi most, može biti u a-L konfiguraciji ili u beta-D konfiguraciji. Ranije su a-L-metilenoksi (4'-CH2-O-2')BNA ugrađene u antisens oligonukleotide koji su pokazali antisens aktivnost (Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365- 6372).
[0113] U nekim primerima izvođenja, biciklični nukleozidi uključuju, ali nisu ograničeni na, (A) a-L-Metilenoksi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) beta-D-Metilenoksi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) Etilenoksi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) Aminooksi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) Oksiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, (F), Metil(metilenoksi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) metilentio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metil karbocikličnu (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, i (J) propilen karbocikličnu (4'-(CH2)3-2') BNA kao što je prikazano ispod.
2
pri čemu je Bx bazni deo i R je, nezavisno, H, zaštitna grupa ili C1-C2alkil.
[0114] U nekim primerima izvođenja, biciklični nukleozid je definisan Formulom I:
pri čemu:
Bx je heterociklični bazni deo;
-Qa-Qb-Qc- je -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O-, ili -N(Rc)-O-CH2;
Rcje C1-C12alkil ili amino zaštitna grupa; i
Tai Tbsu svaki, nezavisno, H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalentno prikačinjanje za potporni medijum.
[0115] U nekim primerima izvođenja, biciklični nukleozid je definisan Formulom II:
pri čemu:
2
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno, H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalentno prikačinjanje za potporni medijum; Zaje C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C1-C6alkil, supstituisani C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkinil, acil, supstituisani acil, supstituisani amid, tiol, ili supstituisani tio.
[0116] U nekim primerima izvođenja, svaka od supstituisanih grupa je nezavisno, mono ili poli supstituisana sa supstituentnim grupama nezavisno odabranim od halogena, okso, hidroksila, OJc, NJ d, SJc, N3, OC(=X)Jc, i NJeC(=X)NJcJd, pri čemu je svaki Jc, Jd, i Je, nezavisno, H, C1-C6alkil, ili supstituisani C1-C6alkil i X je O ili NJc.
[0117] U nekim primerima izvođenja, biciklični nukleozid je definisan Formulom III:
pri čemu:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno, H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalentno prikačinjanje za potporni medijum;
Rdje C1-C6alkil, C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C1-C6alkil, supstituisani C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkinil, ili supstituisani acil (C(=O)-).
[0118] U nekim primerima izvođenja, biciklični nukleozid je definisan Formulom IV:
pri čemu:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno, H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalentno prikačinjanje za potporni medijum;
Rdje C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, supstituisani C2-C6alkinil; svaki qb, qci qdsu, nezavisno, H, halogen, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, ili supstituisani C2-C6alkinil, C1-C6alkoksil, supstituisani C1-C6alkoksil, acil, supstituisani acil, C1-C6aminoalkil, ili supstituisani C1-C6aminoalkil.
[0119] U nekim primerima izvođenja, biciklični nukleozid je definisan Formulom V:
pri čemu:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno, H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalentno prikačinjanje za potporni medijum; qa, qb, qci qfsu svaki, nezavisno, vodonik, halogen, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C1-C12alkoksi, supstituisani C1-C12alkoksi, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj,
1
C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJkili N(H)C(=S)NJjJk; ili qei qfzajedno su =C(qg)(qh); qgi qhsu svaki nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil, ili supstituisani C1-C12alkil.
[0120] Sinteza i priprema metilenoksi (4'-CH2-O-2') BNA monomera adenin, citozin, guanin, 5-metil-citozin, timin, i uracil, zajedno sa njihovom oligomerizacijom, i svojstva prepoznavanja nukleinske kiseline su opisani (videti, npr., Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNA i njihove pripreme su takođe opisane u WO 98/39352 i WO 99/14226.
[0121] Analozi metilenoksi (4'-CH2-O-2') BNA, metilenoksi (4'-CH2-O-2') BNA, i 2'-tio-BNA takođe su pripremljeni (videti, npr., Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Priprema zaključanih nukleozidnih analoga koji sadrže oligodezoksiribonukleotidne duplekse kao supstrate za polimeraze nukleinske kiseline takođe je opisana (videti, npr., Wengel et al., WO 99/14226). Osim toga, sinteza 2'-amino-BNA, novom konformacijom ograničenog oligonukleotidnog analoga visokog afiniteta, opisana je u struci (videti, npr., Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Dodatno, 2'-amino- i 2'-metilamino-BNA su pripremljene i termička stabilnost njihovih dupleksa sa komplementarnim lancima RNK i DNK prethodno je saopštena.
[0122] U nekim primerima izvođenja, biciklični nukleozid je definisan Formulom VI:
pri čemu:
Bx je heterociklični bazni deo;
Tai Tbsu svaki, nezavisno, H, hidroksilna zaštitna grupa, konjugatna grupa, reaktivna fosforna grupa, fosforni deo, ili kovalentno prikačinjanje za potporni medijum; svaki qi, qj, qki qlje, nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil, supstituisani C1-C12alkil, C2-C12alkenil, supstituisani C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, supstituisani C2-C12alkinil, C1-C12
2
alkoksil, supstituisani C1-C12alkoksil, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk, ili N(H)C(=S)NJjJk; i qii qjili qli qkzajedno su =C(qg)(qh); pri čemu su qgi qhsvaki nezavisno, H, halogen, C1-C12alkil, ili supstituisani C1-C6alkil.
[0123] Opisani su jedan karbociklični biciklični nukleozid koji ima 4'-(CH2)3-2' most i alkenilni analog, most 4'-CH=CH-CH2-2' (videti, npr., Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 i Albaek et al, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Sinteza i priprema karbocikličnih bicikličnih nukleozida zajedno sa njihovom oligomerizacijom i biohemijskim ispitivanjima takođe su opisani (videti, npr., Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
[0124] Kako se ovde upotrebljava, "4'-2' biciklični nukleozid" ili "4' do 2' biciklični nukleozid" označava biciklični nukleozid koji sadrži furanozni prsten koji sadrži most koji povezuje 2' atom ugljenika i 4' atom ugljenika.
[0125] Kako se ovde upotrebljava, "monociklični nukleozidi" označava nukleozide koji sadrže modifikovane šećerne delove koji nisu biciklični šećerni delovi. U nekim primerima izvođenja, šećerni deo, ili analog šećernog dela, nukleozida može biti modifikovan ili supstituisan na bilo kojoj poziciji.
[0126] Kako se ovde upotrebljava, "2'-modifikovani šećer" znači furanozil šećer modifikovan na 2' poziciji. U nekim primerima izvođenja, takve modifikacije uključuju supstituente odabrane između: halida, uključujući, ali ne ograničavajući se na supstituisan i nesupstituisan alkoksi, supstituisan i nesupstituisan tioalkil, supstituisan i nesupstituisan amino alkil, supstituisan i nesupstituisan alkil, supstituisan i nesupstituisan alil, i supstituisan nesupstituisan alkinil. U nekim primerima izvođenja, 2' modifikacije su odabrane od supstituenata koji uključuju, ali nisu ograničeni na: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)"NH2, O(CH2)"CH3, O(CH2)"ONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, i O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, pri čemu su n i m od 1 do oko 10. Ostale 2'-supstituent grupe se takođe mogu odabrati između: C1-C12alkila; supstituisanog alkila; alkenila; alkinila; alkarila; aralkila; O-alkarila ili O-aralkila; SH; SCH3; OCN; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocikloalkila; heterocikloalkarila; aminoalkilamina; polialkilamina; supstituisanog silila; R; grupe odvajanja (isecanja); reporter grupe; interkalatora; grupe za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava; i grupe za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava antisens jedinjenja, i drugih supstituenata koji imaju slična svojstva. U nekim primerima izvođenja, modifikovani nukleozidi sadrže 2'-MOE bočni lanac (videti npr. Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Opisano je da takva 2'-MOE supstitucija ima poboljšani afinitet vezivanja u poređenju sa nemodifikovanim nukleozidima i drugim modifikovanim nukleozidima, kao što su 2'-O-metil, O-propil, i O-aminopropil. Takođe je pokazano da su oligonukleotidi koji imaju 2'-MOE supstituent antisens inhibitori ekspresije gena sa obećavajućim svojstvima za in vivo upotrebu (videti, na primer, Martin, P., He/v. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; i Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
[0127] Kako se ovde upotrebljava, "modifikovani tetrahidropiran nukleozid" ili "modifikovani THP nukleozid" znači nukleozid koji ima šestočlani tetrahidropiran "šećer" supstituisan za pentofuranozilni ostatak u normalnim nukleozidima (surogat šećer). Modifikovani THP nukleozidi uključuju, ali nisu ograničeni na, ono što se u struci označava kao heksitol nukleinska kiselina (HNA), anitol nukleinska kiselina (ANA), manitol nukleinska kiselina (MNA) (videti Leumann, CJ. Bioorg. i Med. Chem. (2002) 10:841-854), fluoro HNA (F-HNA), ili ona jedinjenja definisana Formulom X:
X pri čemu nezavisno za svaki od navedenih najmanje jedan analog tetrahidropiran nukleozida Formule X:
Bx je heterociklični bazni deo;
T3i T4su svaki, nezavisno, internukleozidna vezna grupa koja povezuje analog tetrahidropiran nukleozida sa antisens jedinjenjem ili je jedna od T3i T4internukleozidna vezna grupa koja povezuje tetrahidropiran nukleozidni analog sa antisens jedinjenjem i druga od T3i T4je H, hidroksilna zaštitna grupa, povezana konjugatna grupa, ili 5' ili 3' terminalna grupa; q1, q2, q3, q4, q5, q6, i q7su svaki,
4
nezavisno, H, C1-C6alkil, supstituisani C1-C6alkil, C2-C6alkenil, supstituisani C2-C6alkenil, C2-C6alkinil, ili supstituisani C2-C6alkinil; i jedan od R1i R2je vodonik i drugi je odabran od halogena, supstituisanog ili nesupstituisanog alkoksi, NJ, J2, SJ, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X) NJ1J2, i CN, pri čemu X je O, S ili NJ1i svaki J1, J2, i J3je, nezavisno, H ili C1-C6alkil.
[0128] U nekim primerima izvođenja su obezbeđeni modifikovani THP nukleozidi Formule X pri čemu svaki od qm, qn, qp, qr, qs, qt, i quje H. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od qm, qn, qp, qr, qs, qti quje drugo nego H. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od qm, qn, qp, qr, qs, qti quje metil. U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su THP nukleozidi Formule X pri čemu jedan od R1i R2je F. U nekim primerima izvođenja, R1je fluoro i R2je H, Rlje metoksi i R2je H, i R1je metoksietoksi i R2je H.
[0129] Kako se ovde upotrebljava, "2'-modifikovan" ili "2'-supstituisan" označavaju nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži supstituent na poziciji 2' drugi nego H ili OH. 2'-modifikovani nukleozidi uključuju, ali nisu ograničeni na nukleozide sa ne-premošćavajućim 2' supstituentima, kao što su alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10alkil, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), ili O-CH2-C(=O)N(Rm)(Rn), gde je svaki Rmi Rn, nezavisno, H ili supstituisani ili nesupstituisani C1-C10alkil. 2'-modifikovani nukleozidi mogu dodatno sadržati druge modifikacije, na primer, na drugim pozicijama šećera i/ili na nukleobazi.
[0130] Kako se ovde upotrebljava, "2'-F" označava šećer koji sadrži fluoro grupu na 2' poziciji.
[0131] Kako se ovde upotrebljava, "2'-OMe" ili "2'-OCH3" ili "2'-O-metil" svaki označava nukleozid koji sadrži šećer koji sadrži -OCH3grupu na 2' poziciji šećernog prstena.
[0132] Kako se ovde upotrebljava, "oligonukleotid" označava jedinjenje koje sadrži mnogo povezanih nukleozida.
[0133] U nekim primerima izvođenja, jedan ili više od mnogo nukleozida je modifikovano. U nekim primerima izvođenja, oligonukleotid sadrži jedan ili više ribonukleozida (RNK) i/ili dezoksiribonukleozida (DNK).
[0134] Mnogi drugi sistemi prstena bicikličnog i tricikličnog surogata šećera su takođe poznati u struci koji se mogu upotrebljavati da modifikuju nukleozide za ugradnju u antisens jedinjenja (videti npr. pregledni članak: Leumann, J. C, Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854). Takvi sistemi prstena mogu proći različite dodatne supstitucije radi poboljšanja aktivnosti. Postupci za pripremu modifikovanih šećera dobro su poznati stručnjacima u oblasti. U nukleotidima koji imaju modifikovane šećerne delove, nukleobazni delovi (prirodni, modifikovani, ili njihova kombinacija) se održavaju za hibridizaciju sa odgovarajućom nukleinskom kiselinom cilja.
[0135] U nekim primerima izvođenja antisens jedinjenja sadrže jedan ili više nukleotida koji imaju modifikovane šećerne delove. U nekim primerima izvođenja, modifikovani šećerni deo je 2ꞌ-MOE. U nekim primerima izvođenja 2ꞌ -MOE modifikovani nukleotidi raspoređeni su u gapmer motivu. U nekim primerima izvođenja, modifikovani šećerni deo je cEt. U nekim primerima izvođenja, cEt modifikovani nukleotidi su raspoređeni po čitavim krilima gapmer motiva.
[0136] U nekim primerima izvođenja, u LNA, R<4*>i R<2*>zajedno označavaju biradikal -O-CH(CH2OCH3)- (2'O-metoksietil biciklična nukleinska kiselina - Seth at al., 2010, J. Org. Chem) - bilo u R- ili S- konfiguraciji.
[0137] U nekim primerima izvođenja, u LNA, R<4*>i R<2*>zajedno označavaju biradikal -O-CH(CH2CH3)- (2'O-etil biciklična nukleinska kiselina - Seth at al., 2010, J. Org. Chem). - bilo u R- ili S- konfiguraciji.
[0138] U nekim primerima izvođenja, u LNA, R<4*>i R<2*>zajedno označavaju biradikal -O-CH(CH3)-. - bilo u R- ili S- konfiguraciji. U nekim primerima izvođenja, u LNA, R4* i R2* zajedno označavaju biradikal -O-CH2-O-CH2- - (Seth et al., 2010, J. Org. Chem).
[0139] U nekim primerima izvođenja, u LNA, R<4*>i R<2*>zajedno označavaju biradikal -O-NR-CH3-- (Seth et al., 2010, J. Org. Chem).
[0140] U nekim primerima izvođenja, LNA jedinice imaju strukturu odabranu iz sledeće grupe:
[0141] Ugrađivanje nukleotidnih analoga koji povećavaju afinitet u oligomer, kao što su LNA ili 2'-supstituisani šećeri, može dozvoliti da se smanji veličina specifično vezujućeg oligomera, i takođe može da smanji gornju granicu veličine oligomera pre nego što dođe do nespecifičnog ili aberantnog vezivanja.
[0142] Procenili smo nefrotoksičnost cET jedinjenja upotrebom (S)-cET, sa sekvencom (ID jedinjenja 6/411847 iz WO2009/12495) i uporednog beta-D-oksi LNA jedinjenja (6/392063 iz WO2009/12495) i utvrdili da cET jedinjenja izazivaju iznenađujuće visoku nefrotoksičnost u poređenju sa beta-D-oksi LNA kontrolom. Studija je bila studija pojedinačne doze, sa žrtvovanjem posle 3 dana (videti EP1984381 primer 41 za metodologiju, mada smo upotrebili NMRI miševe). Nefrotoksičnost je potvrđena histološkom analizom. Primetni znakovi nefrotoksičnosti koji su uočeni kod doziranja cET jedinjenja ispod onih kod kojih je primećen ALT u serumu, ukazuju da za cET jedinjenja nefrotoksičnost može da bude poseban problem. Upotreba konjugata predmetnog pronalaska, kao što su tri-valentni GalNAc konjugati stoga je vrlo korisna u smanjenju nefrotoksičnosti LNA jedinjenja, kao što su cET jedinjenja.
[0143] Oligomer predmetnog pronalaska sadrži najmanje 1 zaključanu nukleinsku kiselinu (LNA). U nekim primerima izvođenja oligomer sadrži najmanje 2 nukleotidna analoga. U nekim primerima izvođenja, oligomer sadrži od 3-8 nukleotidnih analoga, npr. 6 ili 7 nukleotidnih analoga. Najmanje jedan od navedenih nukleotidnih analoga je zaključana nukleinska kiselina (LNA); na primer, najmanje 3 ili najmanje 4, ili najmanje 5, ili najmanje 6, ili najmanje 7, ili 8, nukleotidnih analoga mogu biti LNA. U nekim primerima izvođenja svi nukleotidni analozi mogu biti LNA.
[0144] Biće prepoznato da kada se označava poželjni motiv nukleotidne sekvence ili nukleotidna sekvenca, koja se sastoji samo od nukleotida, oligomeri pronalaska koji su definisani tom sekvencom mogu sadržati odgovarajući nukleotidni analog umesto jednog ili više nukleotida prisutnih u navedenoj sekvenci, kao što su LNA jedinice ili drugi nukleotidni analozi, koji podižu stabilnost dupleksa/Tmoligomera/ciljnog dupleksa (tj. nukleotidni analozi za povećanje afiniteta).
[0145] Poželjni nukleotidni analog je LNA, kao što su oksi-LNA (kao što su beta-D-oksi-LNA i alfa-L-oksi-LNA), i/ili amino-LNA (kao što su beta-D-amino-LNA i alfa-L-amino-LNA) i/ili tio-LNA (kao što su beta-D-tio-LNA i alfa-L-tio-LNA) i/ili ENA (kao što su beta-D-ENA i alfa-L-ENA).
[0146] U nekim primerima izvođenja, oligomer pronalaska, kao što je region A, može sadržati LNA jedinice i druge nukleotidne analoge. Dodatni nukleotidni analozi prisutni unutar oligomera pronalaska su nezavisno odabrani između, na primer: 2'-O-alkil-RNK jedinica, 2'-amino-DNK jedinica, 2'-fluoro-DNK jedinica, LNA jedinica, arabino nukleinska kiselina (ANA) jedinica, 2'-fluoro-ANA jedinica, HNA jedinica, INA (interkalirajuća nukleinska kiselina -Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925) jedinica i 2ꞌMOE jedinica. U nekim primerima izvođenja prisutan je samo jedan od gore navedenih tipova nukleotidnih analoga u oligomeru pronalaska, tj. LNA jedinice, kao što su prvi region, ili njegova neprekidna nukleotidna sekvenca.
[0147] Zbog toga oligomer u skladu sa pronalaskom (region A) sadrži najmanje jednu jedinicu zaključane nukleinske kiseline (LNA), kao što su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 jedinica LNA, kao što je od 3 - 7 ili 4 do 8 LNA jedinica, ili 3, 4, 5, 6 ili 7 LNA jedinica. U nekim primerima izvođenja, svi nukleotidni analozi su LNA. U nekim primerima izvođenja, oligomer može da sadrži i beta-D-oksi-LNA, i jednu ili više od sledećih LNA jedinica: tio-LNA, amino-LNA, oksi-LNA, i/ili ENA bilo u beta-D ili alfa-L konfiguracijama ili njihovim kombinacijama. U nekim primerima izvođenja sve LNA, citozinske jedinice su 5'metilcitozin. U nekim primerima izvođenja pronalaska, oligomer (kao što su prvi i opciono drugi region) može sadržati i LNA i DNK jedinice. U nekim primerima izvođenja, kombinovani ukupni broj LNA i DNK jedinica je 10-20, kao što je 10-18, kao što je 12-16. U nekim primerima izvođenja pronalaska, nukleotidna sekvenca oligomera, njegovog prvog regiona, kao što je neprekidna nukleotidna sekvenca sastoji se od najmanje jedne LNA i preostale nukleotidne jedinice su DNK jedinice. U nekim primerima izvođenja oligomer, ili njegov prvi region, sadrži samo LNA, nukleotidne analoge i nukleotide koji se javljaju u prirodi (kao što su RNK ili DNK, najpoželjnije DNK nukleotide), opciono sa modifikovanim internukleotidnim vezama kao što je fosforotioat.
Regrutovanje RNaze
[0148] Prepoznato je da oligomerno jedinjenje može funkcionisati u degradaciji ciljne iRNK koja nije posredovana RNazom, kao što je sterično ometanje translacije, ili drugi postupci. U nekim primerima izvođenja, oligomeri pronalaska sposobni su da regrutuju endoribonukleazu (RNaza), kao što je RNaza H.
[0149] Poželjno je da se takvi oligomeri, kao što su region A, ili neprekidna nukleotidna sekvenca, sastoje od regiona od najmanje 4, kao što je najmanje 5, kao što je najmanje 6, kao što je najmanje 7 uzastopnih nukleotidnih jedinica, kao što je najmanje 8 ili najmanje 9 uzastopnih nukleotidnih jedinica (ostataka), uključujući 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 uzastopnih nukleotida, koji su, kada se formiraju u dupleksu sa komplementarnom ciljnom RNK sposobni da regrutuju RNazu (kao što su DNK jedinice). Neprekidna sekvenca koja je sposobna da regrutuje RNazu može biti region Y' kako je označen u kontekstu gapmera kako je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja veličina neprekidne sekvence koja je sposobna da regrutuje RNazu, kao što je region Y', može biti veća, kao što je 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 nukleotidnih jedinica.
[0150] EP 1222 309 obezbeđuje in vitro postupke za određivanje aktivnosti RNaze H, koji se mogu upotrebiti za određivanje sposobnosti regrutovanja RNaze H. Smatra se da je oligomer sposoban da regrutuje RNazu H ukoliko, kada je obezbeđen sa komplementarnim RNK ciljem, ima početnu stopu, izmerenu u pmol/l/min, od najmanje 1%, kao što je najmanje 5%, kao što je najmanje 10% ili, više od 20% početne stope utvrđene upotrebom oligonukleotida samo od DNK, koji ima istu baznu sekvencu ali koji sadrži samo DNK monomere, bez 2' supstitucija, sa fosforotioatnim veznim grupama između svih monomera u oligonukleotidu, upotrebom metodologije obezbeđene u EP 1222 309 u Primeru 91 - 95.
[0151] U nekim primerima izvođenja smatra se da oligomer u osnovi nije u stanju da regrutuje RNazu H ukoliko je, kada je obezbeđen sa komplementarnim RNK ciljem, i RNazom H, početna stopa RNaze H, izmerena u pmol/l/min, manja od 1%, kao što je manja od 5%, kao što je manja od 10% ili manja od 20% početne stope utvrđene upotrebom ekvivalentnog oligonukleotida samo od DNK, bez 2' supstitucija, sa fosforotioatnim veznim grupama između svih nukleotida u oligonukleotidu, upotrebom metodologije obezbeđene u EP 1222 309 u Primeru 91 - 95.
[0152] U drugim primerima izvođenja, smatra se da je oligomer sposoban da regrutuje RNazu H ukoliko, kada je obezbeđen sa komplementarnim RNK ciljem, i RNazom H, početna stopa RNaze H, izmerena u pmol/l/min, iznosi najmanje 20%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 80% početne stope utvrđene upotrebom ekvivalentnog oligonukleotida samo od DNK, bez 2' supstitucija, sa fosforotioatnim veznim grupama između svih nukleotida u oligonukleotidu, upotrebom metodologije obezbeđene u EP 1222 309 u Primeru 91 - 95.
[0153] Uobičajeno region oligomera koji formira uzastopne nukleotidne jedinice koje su, kada se formiraju u dupleksu sa komplementarnom ciljnom RNK sposobne da regruju RNazu sastoji se od nukleotidnih jedinica koje formiraju dupleks sličan DNK/RNK sa RNK cilja. Oligomer pronalaska, kao što je prvi region, može sadržati nukleotidnu sekvencu koja sadrži i nukleotide i nukleotidne analoge, i u obliku je LNA gapmera.
Dizajn gapmera
[0154] Oligomer pronalaska je LNA gapmer. Gapmer oligomer je oligomer koji sadrži neprekidni niz nukleotida koji je sposoban da regrutuje RNazu, kao što je RNaza H, kao što je region od najmanje 6 ili 7 DNK nukleotida, koji se ovde označava kao region Y' (Y'), pri čemu se 5' i 3' bočno od regiona Y' nalaze nukleotidni analozi koji povećavaju afinitet, kao što su 1 - 6 nukleotidnih analoga 5' i 3' do neprekidnog niza nukleotida koji su sposobni da regrutuju RNazu - ovi regioni se označavaju kao regioni X' (X') i Z' (Z'), respektivno. X' i Z' regioni se takođe mogu označiti kao krila gapmera. Primeri gapmera su objavljeni u WO2004/046160, WO2008/113832, i WO2007/146511.
[0155] U nekim primerima izvođenja, monomeri koji su sposobni da regrutuju RNazu su odabrani iz grupe koji se sastoji od DNK monomera, alfa-L-LNA monomera, C4' alkilisanih DNK monomera (videti PCT/EP2009/050349 i Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300), i UNA (nepovezana nukleinska kiselina (unlinked nucleic acid)) nukleotida (videti Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 ovde uključeno putem reference). UNA je otključana nukleinska kiselina, uobičajeno gde je uklonjena C2 - C3 C-C veza riboze, formirajući otključani "šećerni" ostatak. Poželjno LNA gapmer sadrži (poli)nukleotidnu sekvencu formule (5' do 3'), X'-Y'-Z', pri čemu; region X' (X') (5' region) se sastoji od ili sadrži najmanje jedan nukleotidni analog, kao što je najmanje jedna LNA jedinica, kao što je od 1-6 nukleotidnih analoga, kao što su LNA jedinice i; region Y' (Y') se sastoji od ili sadrži najmanje četiri ili najmanje pet uzastopnih nukleotida koji su sposobni da regrutuju RNazu (kada se formiraju u dupleksu sa komplementarnim molekulom RNK, kao što je iRNK cilja), kao što su DNK nukleotidi i; region Z' (Z') (3' region) se sastoji od ili sadrži najmanje jedan nukleotidni analog, kao što je najmanje jedna LNA jedinica, kao što je od 1-6 nukleotidnih analoga, kao što su LNA jedinice.
[0156] U nekim primerima izvođenja, region X' se sastoji od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 nukleotidnih analoga, kao što su LNA jedinice, kao što su od 2-5 nukleotidnih analoga, kao što su 2-5 LNA jedinica, kao što su 3 ili 4 nukleotidna analoga, kao što su 3 ili 4 LNA jedinice; i/ili region Z' se sastoji od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 nukleotidnih analoga, kao što su LNA jedinice, kao što su od 2-5 nukleotidnih analoga, kao što su 2-5 LNA jedinica, kao što su 3 ili 4 nukleotidna analoga, kao što su 3 ili 4 LNA jedinice.
[0157] U nekim primerima izvođenja Y' se sastoji od ili sadrži 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 uzastopnih nukleotida koji su sposobni da regrutuju RNazu, ili od 4-12, ili od 6-10, ili od 7-9, kao što je 8 uzastopnih nukleotida koji su sposobni da regrutuju RNazu. U nekim primerima izvođenja region Y' se sastoji od ili sadrži najmanje jednu DNK nukleotidnu jedinicu, kao što su1-12 DNK jedinica, poželjno od 4-12 DNK jedinica, poželjnije od 6-10 DNK jedinica, kao što su od 7-10 DNK jedinica, najpoželjnije 8, 9 ili 10 DNK jedinica.
4
[0158] U nekim primerima izvođenja region X' se sastoji od 3 ili 4 nukleotidna analoga, kao što je LNA, region X' se sastoji od 7, 8, 9 ili 10 DNK jedinica, i region Z' se sastoji od 3 ili 4 nukleotidna analoga, kao što je LNA. Takvi primeri dizajna uključuju (X'-Y'-Z') 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4 , 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3. U poželjnom primeru izvođenja gapmer je 3-9-4 gapmer, još poželjnije on je 3-10-3 gapmer.
[0159] Dodatni primeri dizajna gapmera objavljeni su u WO2004/046160. WO2008/113832, koji zahteva prvenstvo prema SAD privremenoj prijavi 60/977,409, označava ꞌšortmer (shortmer)ꞌ gapmer oligomere. U nekim primerima izvođenja, oligomeri predstavljeni ovde mogu biti takvi šortmer gapmeri.
[0160] U nekim primerima izvođenja oligomer, npr. region X', se sastoji od neprekidne nukleotidne sekvence od ukupno 10, 11, 12, 13 ili 14 nukleotidnih jedinica, pri čemu neprekidna nukleotidna sekvenca sadrži ili je formule (5'-3'), X'-Y'-Z' pri čemu; X' se sastoji od 1, 2 ili 3 nukleotidne analogne jedinice, kao što su LNA jedinice; Y' se sastoji od 7, 8 ili 9 neprekidnih nukleotidnih jedinica koje su sposobne da regrutuju RNazu kada se formiraju u dupleksu sa komplementarnim molekulom RNK (kao što je iRNK cilja); i Z' se sastoji od 1, 2 ili 3 nukleotidne analogne jedinice, kao što su LNA jedinice.
[0161] U nekim primerima izvođenja X' se sastoji od 1 LNA jedinice. U nekim primerima izvođenja X' se sastoji od 2 LNA jedinice. U nekim primerima izvođenja X' se sastoji od 3 LNA jedinice. U nekim primerima izvođenja Z' se sastoji od 1 LNA jedinice. U nekim primerima izvođenja Z' se sastoji od 2 LNA jedinice. U nekim primerima izvođenja Z' se sastoji od 3 LNA jedinice. U nekim primerima izvođenja Y' se sastoji od 7 nukleotidnih jedinica. U nekim primerima izvođenja Y' se sastoji od 8 nukleotidnih jedinica. U nekim primerima izvođenja Y' se sastoji od 9 nukleotidnih jedinica. U određenim primerima izvođenja, region Y' se sastoji od 10 nukleozidnih monomera. U određenim primerima izvođenja, region Y' se sastoji od ili sadrži 1 - 10 DNK monomera. U nekim primerima izvođenja Y' sadrži od 1 - 9 DNK jedinica, kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 DNK jedinica. U nekim primerima izvođenja Y' se sastoji od DNK jedinica. U nekim primerima izvođenja Y' sadrži najmanje jednu LNA jedinicu koja je u alfa-L konfiguraciji, kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 LNA jedinica u alfa-L-konfiguraciji. U nekim primerima izvođenja Y' sadrži najmanje jednu alfa-L-oksi LNA jedinicu ili pri čemu su sve LNA jedinice u alfa-L- konfiguraciji alfa-L-oksi LNA jedinice. U nekim primerima izvođenja broj nukleotida prisutnih u X'-Y'-Z' odabran je iz grupe koja se sastoji od (nukleotidne analogne jedinice - region Y' - nukleotidne analogne jedinice): 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, ili; 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4, ili; 1-10-1, 1-10-2, 210-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 2-10-3, 3-10-2. U nekim primerima izvođenja broj nukleotida u X'-Y'-Z' je odabran iz grupe koja se sastoji od: 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4, i 4-7-3. U određenim primerima izvođenja, svaki od regiona X' i Y' se sastoji od tri LNA monomera, i region Y' se sastoji od 8 ili 9 ili 10 nukleozidnih monomera, poželjno DNK monomera. U nekim primerima izvođenja i X' i Z' se sastoje od dve LNA jedinice svaki, i Y' se sastoji od 8 ili 9 nukleotidnih jedinica, poželjno DNK jedinica. U različitim primerima izvođenja, ostali primeri dizajna gapmera uključuju one kod kojih se regioni X' i/ili Z' sastoje od 3, 4, 5 ili 6 nukleozidna analoga, kao što su monomeri koji sadrže 2'-O-metoksietil-ribozu šećer (2'-MOE) ili monomere koji sadrže 2'-fluoro-dezoksiribozu šećer, i region Y' se sastoji od 8, 9, 10, 11 ili 12 nukleozida, kao što su DNK monomeri, pri čemu regioni X'-Y'-Z' imaju 3-9-3, 3-10-3, 5-10-5 ili 4-12-4 monomera. Dodatni primeri dizajna gapmera objavljeni su u WO 2007/146511A2.
[0162] LNA Gapmeri: LNA gapmer je gapmer oligomer (region A) koji sadrži najmanje jedan LNA nukleotid. SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 i 40 su LNA gapmer oligomeri. Oligomeri sa neprekidnom sekvencom od 10 - 16 nukleotida koji su komplementarni odgovarajućoj dužini SEQ ID NO 33 ili 34 ili 45 takođe mogu biti gapmer oligomeri kao što su LNA gapmeri.
Internukleotidne veze
[0163] Nukleozidni monomeri oligomera (npr. prvi i drugi region) opisani ovde spojeni su zajedno preko internukleozidnih veznih grupa. Pogodno, svaki monomer povezan sa 3ꞌ susednim monomerom preko vezne grupe.
[0164] Osoba koja poseduje prosečnu stručnost u oblasti će razumeti da, u kontekstu predmetnog pronalaska, 5' monomer na kraju oligomera ne sadrži 5' veznu grupu, iako može ili ne mora sadržati 5' terminalnu grupu, ili veznu grupu za konjugaciju.
[0165] Termini "vezna grupa" ili "internukleotidna veza" su zamišljene da označe grupu koja je sposobna da kovalentno spoji dva nukleotida. Specifični i poželjni primeri uključuju fosfatne grupe i fosforotioatne grupe. Internukleozidna veza može se upotrebljavati naizmenično sa internukleotidnom vezom.
[0166] Nukleotidi oligomera pronalaska ili njihova neprekidna nukleotidna sekvenca su spojeni putem vezne grupe. Pogodno svaki nukleotid je povezan sa 3ꞌ susednim nukleotidom putem vezne grupe.
[0167] Pogodne internukleotidne veze uključuju one navedene unutar WO2007/031091, na primer internukleotidne veze navedene u prvom paragrafu strane 34 WO2007/031091. To je, u nekim primerima izvođenja, druga nego fosfodiestarska(ske) veza(e) regiona B (gde je prisutan), poželjno je modifikovati internukleotidnu vezu od njenog normalnog fosfodiestra na onu koja je otpornija na napad nukleaze, kao što su fosforotioat ili boranofosfat - ove dve, koje su odvojive RNazom H, takođe omogućavaju taj put antisens inhibicije u redukovanju ekspresije ciljnog gena.
[0168] U nekim primerima izvođenja oligomer predmetnog pronalaska sadrži jednu ili više nukleozidnih veza odabranih iz grupe koja se sastoji od fosforotioata, fosforoditioata i boranofosfata.
[0169] Pogodne internukleotidne veze koje sadrže sumpor (S) kako je ovde obezbeđeno mogu biti poželjne, kao što su fosforotioat ili fosfoditioat. Takođe su poželjne fosforotioatne internukleotidne veze, posebno za prvi region, kao što su gapmeri, miksmeri, oligomeri za preokret odvajanja antimira (antimirs splice switching oligomers), i totalmeri.
[0170] Termin "miksmer" označava oligomere koji sadrže i nukleotide koji se javljaju u prirodi i nukleotide koji se ne javljaju u prirodi, gde, za razliku od gapmera, tailmera, i headmera nema neprekidne sekvence od više od 5, i u nekim primerima izvođenja ne više od 4 uzastopna, kao što je ne više od tri uzastopna, nukleotida koji se javljaju u prirodi, kao što su DNK jedinice.
[0171] Termin "totalmer" označava jednolančani oligomer koji sadrži samo nukleozide koji se ne javljaju u prirodi, kao što su nukleozidni analozi modifikovani šećerom.
[0172] Za gapmere, internukleotidne veze u oligomeru mogu, na primer, biti fosforotioat ili boranofosfat, tako da se omogućava RNazi H odvajanje (isecanje) ciljne RNK. Poželjan je fosforotioat, zbog poboljšane otpornosti na nukleazu i drugih razloga, kao što je jednostavnost izrade.
[0173] U jednom aspektu, sa izuzetkom fosfodiestarske veze između prvog i drugog regiona, i opciono unutar regiona B, preostale internukleozidne veze oligomera ovog pronalaska, nukleotidi i/ili nukleotidni analozi su međusobno povezani pomoću fosforotioatnih grupa. U nekim primerima izvođenja, najmanje 50%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 90% kao što su sve internukleozidne veze između nukleozida u prvom regionu su druge nego fosfodiestar (fosfat), kao što su odabrane iz grupe koja se sastoji od fosforotioata, fosforoditioata, ili boranofosfata. U nekim primerima izvođenja, najmanje 50%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80%, kao što je najmanje 90% kao što su sve internukleozidne veze između nukleozida u prvom regionu su fosforotioat.
4
[0174] WO09124238 označava oligomerna jedinjenja koja imaju najmanje jedan biciklični nukleozid prikačen za 3' ili 5' terminuse neutralnom internukleozidnom vezom. Zbog toga oligomer pronalaska može imati najmanje jedan biciklični nukleozid prikačen za 3' ili 5' termini neutralnom internukleozidnom vezom, kao što je jedan ili više fosfotriestara, metilfosfonata, MMI, amid-3, formacetala ili tioformacetala. Preostale veze mogu biti fosforotioat.
Oligomerni konjugati (Region C)
[0175] Dodatno je objavljen antisens oligonukleotidni konjugat koji sadrži oligomer pronalaska, i najmanje jedan ne-nukleotidni ili ne-polinukleotidni deo (C) kovalentno prikačen za navedeni oligomer (A), opciono preko linker regiona smeštenog između neprekidne sekvence oligomera i konjugatnog dela (B i/ili Y).
[0176] Reprezentativni konjugatni delovi koji su upotrebljeni sa oligonukleotidima mogu uključivati lipofilne molekule (aromatične i nearomatične) uključujući steroidne molekule; proteine (npr. antitela, enzime, proteine seruma); peptide; vitamine (rastvorljive u vodi ili rastvorljive u lipidima); polimere (rastvorljive u vodi ili rastvorljive u lipidima); male molekule uključujući lekove, toksine, reporter molekule, i ligande receptora; komplekse ugljenih hidrata; komplekse odvajanja nukleinske kiseline; helatore metala (npr. porfirine, teksafirine, krunske etre, itd.); interkalatore uključujući hibrid fotonukelaza/interkalatori; agense umrežavanja (npr. fotoaktivne, redoks aktivne), i njihove kombinacije i derivate. Mnogobrojni odgovarajući konjugatni delovi, njihova priprema i vezivanje za oligomerna jedinjenja obezbeđeni su, na primer, u WO 93/07883 i SAD pat. br. 6,395,492. Oligonukleotidni konjugati i njihove sinteze su takođe navedene u opsežnim preglednim člancima od strane Manoharan u Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 i Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103.
[0177] Dodatni aspekt pronalaska obezbeđuje antisens oligonukleotidni konjugat koji sadrži
a. antisens oligomer (A) između od 16 - 22 nukleotida u dužini, koji sadrži neprekidnu sekvencu od 16 nukleotida koji su komplementarni odgovarajućoj dužini SEQ ID NO 31, i pri čemu je navedeni antisens oligomer LNA gapmer, i
b. najmanje jedan konjugatni deo koji ciljno deluje na asijaloglikoproteinski receptor (C) kovalentno prikačen za navedeni oligomer (A).
[0178] U nekim primerima izvođenja oligomer pronalaska je ciljan na jetru - tj. posle sistemske primene jedinjenje se akumulira u ćelijama jetre (kao što su hepatociti). Ciljanje na jetru može se uveliko poboljšati dodavanjem konjugatnog dela (C). Međutim, da bi se maksimalizovala efikasnost oligomera često je poželjno da je konjugat (ili ciljajući deo) povezan sa oligomerom putem bio-odvojivog linkera (B), kao što je nukleotid fosfatni linker. Zbog toga je poželjno upotrebljavati konjugatni deo koji poboljšava unos i aktivnost hepatocita. Poboljšanje aktivnosti može biti posledica povećanog unosa ili može biti posledica povećane potencije jedinjenja u hepatocitima.
[0179] Objavljeno je oligomerno jedinjenje u obliku LNA oligomera, kao što je gapmer, ili na primer LNA antisens oligomer, (koji se ovde može označiti kao region A) koji sadrži antisens oligomer, opciono bio-odvojiv linker, kao što je region B, i ugljenohidratni konjugat (koji se može označiti kao region C). LNA antisens oligomer može imati 7 - 30, kao što je 8 - 26 nukleozida u dužini i sadrži najmanje jednu LNA jedinicu (nukleozid).
[0180] U nekim primerima izvođenja, konjugat je ili može sadržati ugljeni hidrat ili sadrži ugljenohidratnu grupu. U nekim primerima izvođenja, ugljeni hidrat je odabran iz grupe koja se sastoji od galaktoze, laktoze, n-acetilgalaktozamina, manoze, i manozo-6-fosfata. U nekim primerima izvođenja, konjugatna grupa je ili može sadržati manozu ili manozo-6-fosfat. Ugljenohidratni konjugati mogu se upotrebljavati za poboljšanje isporuke ili aktivnosti u različitim tkivima, kao što su jetra i/ili mišići. Videti, na primer, EP1495769, WO99/65925, Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21. Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17.
[0181] Konjugat predmetnog pronalaska sadrži konjugatni deo koji ciljno deluje na asijaloglikoproteinski receptor u obliku ugljenohidratnog dela, kao što je GalNAc deo (koji se može označiti kao region C). Ugljenohidratni deo može biti multi-valentan, kao što, na primer, 2, 3, 4 ili 4 identična ili neidentična ugljenohidratna dela mogu biti kovalentno pridružena oligomeru, opciono putem jednog ili više linkera (kao što je region Y).
GalNAc konjugatni delovi
[0182] U nekim primerima izvođenja ugljenohidratni deo nije linearni ugljenohidratni polimer. Ugljenohidratni deo može međutim biti multi-valentan, kao što, na primer, 2, 3, 4 ili 4 identična ili neidentična ugljenohidratna dela mogu biti kovalentno pridružena oligomeru, opciono putem jednog ili više linkera. Pronalazak obezbeđuje konjugat koji sadrži oligomer
4
pronalaska i konjugatni deo koji ciljno deluje na asijaloglikoproteinski receptor, kao što je GalNAc deo, koji može formirati deo dodatnog regiona (koji se označava kao region C).
[0183] Pronalazak takođe obezbeđuje antisens oligonukleotidni konjugat koji sadrži
a. antisens oligomer (A) između od 16 - 22 nukleotida u dužini, koji sadrži neprekidnu sekvencu od 16 nukleotida koji su komplementarni odgovarajućoj dužini SEQ ID NO 31, i pri čemu je navedeni antisens oligomer LNA gapmer koji sadrži najmanje jednu LNA jedinicu, i
b. najmanje jedan konjugatni deo koji ciljno deluje na asijaloglikoproteinski receptor (C) kovalentno prikačen za navedeni oligomer (A). U nekim primerima izvođenja, konjugatni deo (kao što je treći region ili region C) sadrži konjugatni deo koji ciljno deluje na asijaloglikoproteinski receptor odabran iz grupe koja se sastoji od tavih kao galaktoza, galaktozamin, N-formil-galaktozamin, N-acetilgalaktozamin, N-propionilgalaktozamin, N-n-butanoil-galaktozamin, i N-izobutanoil-galaktozamin. U nekim primerima izvođenja, konjugat sadrži klaster galaktoze, kao što je N-acetilgalaktozamin trimer. U nekim primerima izvođenja, konjugatni deo sadrži GalNAc (N-acetilgalaktozamin), kao što su je mono-valentni, di-valentni, tri-valentni ili tetravalentni GalNAc. Tri-valentni GalNAc konjugati mogu se upotrebljavati za ciljanje jedinjenja na jetru. GalNAc konjugati su upotrebljeni sa metilfosfonatima i PNA antisens oligonukleotidima (npr. US 5,994517 i Hangeland et al., Bioconjug Chem.
1995. nov-dec; 6(6):695-701) i siRNK (npr. WO2009/126933, WO2012/089352 i WO2012/083046). WO2012/083046 objavljuje siRNK sa GalNAc konjugatnim delovima koji sadrže odvojive farmakokinetičke modulatore, koji su pogodni za upotrebu u predmetnom pronalasku, poželjni farmakokinetički modulatori su C16 hidrofobne grupe kao što su palmitoil, heksadek-8-enoil, oleil, (9E, 12E)-oktadeka-9,12-dienoil, dioktanoil, i C16-C20 acil. Odvojivi farmakokinetički modulatori ꞌ046 mogu takođe biti holesterol.
[0184] Ciljajući delovi (konjugatni delovi) mogu biti odabrani iz grupe koju se sastoji od sledećeg: galaktoza, galaktozamin, N-formil-galaktozamin, N-acetilgalaktozamin, N-propionil-galaktozamin, N-n-butanoil-galaktozamin, N-izo-butanoil-galaktozamin, klaster galaktoze, i N-acetilgalaktozamin trimer i mogu imati farmakokinetički modulator odabran iz grupe koja se sastoji od: hidrofobne grupe koja ima 16 ili više atoma ugljenika, hidrofobne grupe koja ima 16-20 atoma ugljenika, palmitoila, heksadek-8-enoila, oleila, (9E, 12E)-
4
oktadeka-9,12-dienoila, dioktanoila, i C16-C20 acila, i holesterola. Određeni GalNAc klasteri objavljeni u '046 uključuju: (E)-heksadek-8-enoil (C16), oleil (C18), (9E, 12E)-oktadeka-9,12-dienoil (C18), oktanoil (C8), dodecekanoil (C12), C-20 acil, C24 acil, dioktanoil (2xC8). Ciljajući deo-farmakokinetički modulator ciljajući deo može biti povezan sa polinukleotidom putem fiziološki labilne veze ili, npr. disulfidne veze, ili PEG linkera. Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu fosfodiestarskih linkera između oligomera i konjugatne grupe (ove se ovde označavaju kao region B, i pogodno su smeštene između LNA oligomera i ugljenohidratne konjugatne grupe).
[0185] Za ciljanje hepatocita u jetri, poželjan ciljajući ligand je klaster glaktoze.
[0186] Klaster galaktoze sadrži molekul koji ima npr. koji sadrži dva do četiri terminalna derivata galaktoze. Kako se ovde upotrebljava, termin derivat galaktoze uključuje i galaktozu i derivate galaktoze koji imaju afinitet prema asijaloglikoproteinskom receptoru jednak ili veći od onog kod galaktoze. Terminalni derivat galaktoze je prikačen za molekul svojim C-I ugljenikom. Asijaloglikoproteinski receptor (ASGPr) se primarno eksprimira na hepatocitima i vezuje razgranate galaktoza-terminalne glikoproteine. Poželjni klaster galaktoze ima tri terminalna galaktozamina ili derivata galaktozamina od kojih svaki ima afinitet za asijaloglikoproteinski receptor. Poželjniji klaster galaktoze ima tri terminalna N-acetilgalaktozamina. Drugi termini uobičajeni u struci uključuju tri-antensku galaktozu, trovalentnu galaktozu i galaktozni trimer. Poznato je da su tri-antenski klasteri derivata galaktoze vezani za ASGPr većim afinitetom od bi-antenskih ili mono-antenskih struktura derivata galaktoze (Baenzigerand Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982,1.Biol. Chem., 257, 939-945). Multivalencija je potrebna za postizanje nM afiniteta. U skladu sa WO 2012/083046 prikačinjanje jednog derivata galaktoze koji ima afinitet za asijaloglikoproteinski receptor ne omogućava funkcionalnu isporuku RNAi polinukleotida hepatocitima in vivo kada se primenjuje zajedno sa polimerom za isporuku.
[0187] Klaster galaktoze može sadržati dva ili poželjno tri derivata galaktoze od kojih je svaki povezan sa centralnom tačkom grananja. Derivati galaktoze su prikačeni za centralnu tačku grananja preko C-I ugljenika saharida. Derivat galaktoze je poželjno povezan sa tačkom grananja putem linkera ili spejsera. Poželjni spejser je fleksibilan hidrofilni spejser (SAD Patent 5885968; Biessen et al. J. Med. Chem.1995 Vol.39 p. 1538-1546). Poželjni fleksibilni hidrofilni spejser je PEG spejser. Poželjni PEG spejser je PEG3 spejser. Tačka grananja može biti bilo koji mali molekul koji dozvoljava prikačinjanje tri derivata galaktoze i dalje dozvoljava prikačinjanje tačke grananja za oligomer. Primer grupe tačke grananja je di-lizin. Molekul di-lizina sadrži tri amino grupe preko kojih tri derivata galaktoze mogu biti prikačeni
4
i karboksilnu reaktivnu grupa preko koje di-lizin može biti prikačen za oligomer. Prikačinjanje tačke grananja za oligomer može se dogoditi preko linkera ili spejsera. Poželjan spejser je fleksibilan hidrofilni spejser. Poželjni fleksibilni hidrofilni spejser je PEG spejser. Poželjni PEG spejser je PEG3 spejser (tri etilenske jedinice). Klaster galaktoze može biti prikačen za 3' ili 5' kraj oligomera upotrebom postupaka poznatih u struci.
[0188] Poželjni derivat galaktoze je N-acetil-galaktozamin (GalNAc). Drugi saharidi koji imaju afinitet za asijaloglikoproteinski receptor mogu biti odabrani sa liste koja sadrži: galaktozamin, N-n-butanoilgalaktozamin, i N-izo-butanoilgalaktozamin. Proučavani su afiniteti brojnih derivata galaktoze za asijaloglikoproteinski receptor (videti na primer: Jobst, S.T. i Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686) ili se lako utvrđuju upotrebom postupaka uobičajenih u struci.
[0189] Jedan primer izvođenja klastera galaktoze
4
[0190] Klaster galaktoze sa PEG spejserom između tačke grananja i nukleinske kiseline [0191] Dodatni Primeri konjugata pronalaska su ilustrovani ispod:
4
[0192] Gde je na hidrofobnom ili lipofilnom (ili dodatnom konjugatu) deo (tj. farmakokinetički modulator) u GalNAc klasteru konjugata iznad, kada se upotrebljavaju LNA oligomeri, kao što su LNA antisens oligonukleotidi, opcion.
[0193] Videti slike za specifične GalNAc klastere upotrebljene u predmetnoj studiji, Conj 1, 2, 3, 4 i Conj 1a, 2a, 3a i 4a (koji su prikazani sa opcionim C6 linkerom koji pridružuje GalNAc klaster za oligomer).
[0194] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska konjugatni deo antisens oligonukleotidnog konjugata sadrži ili se sastoji od Conj 1, 2, 3, 4 i Conj 1a, 2a, 3a i 4a. Najpoželjnije, konjugatni deo sadrži ili se sastoji od Conj 2a.
[0195] U sledećem poželjnom primeru izvođenja antisens oligonukleotidni konjugat je odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 18 i 19.
[0196] Svaka ugljenohidratna grupa GalNAc klastera (npr. GalNAc) može se dakle pridružiti oligomeru putem spejsera, kao što je (poli)etilen glikol linker (PEG), kao što je di, tri, tetra, penta, heksa-etilen glikol linker. Kao što je pokazano iznad PEG deo formira spejser između galaktoznog šećernog dela i peptidnog (pokazan je trilizin) linkera.
[0197] U nekim primerima izvođenja, GalNAc klaster sadrži peptidni linker, npr. Tyr-Asp(Asp) tripeptid ili Asp(Asp) dipeptid, koji je prikačen za oligomer (ili za region Y ili region B) putem biradikalnog linkera, na primer GalNAc klaster može sadržati sledeće biradikalne linkere:
R1 je biradikal poželjno odabran od -C2H4-, -C3H6-, -C4H8-, -C5H10-, -C6H12-, 1,4-cikloheksil (-C6H10-), 1,4-fenil (-C6H4-), -C2H4OC2H4-, -C2H4(OC2H4)2- ili -C2H4(OC2H4)3-, C(O)CH2-, -C(O)C2H4-, - C(O)C3H6-, - C(O)C4H8-, - C(O)C5H10-, - C(O)C6H12-, 1,4-cikloheksil (-C(O) C6H10-), 1,4-fenil (-C(O)C6H4-), - C(O)C2H4OC2H4-, - C(O)C2H4(OC2H4)2- ili -C(O)C2H4(OC2H4)3-.
[0198] U nekim primerima izvođenja, R<1>je biradikal poželjno odabran od -C2H4-, -C3H6-, -C4H8-, -C5H10-, -C6H12-, 1,4-cikloheksil (-C6H10-), 1,4-fenil (-C6H4-), -C2H4OC2H4-, -C2H4(OC2H4)2- ili -C2H4(OC2H4)3-.
[0199] Ugljenohidratni konjugat (npr. GalNAc), ili ugljenohidrat-linker deo (npr. ugljeni hidrat-PEG deo) može biti kovalentno pridružen (povezan) sa oligomerom putem grupe tačke grananja kao što je, amino-kiselina, ili peptid, koji pogodno sadrži dve ili više amino grupe (kao što su 3, 4, ili 5), kao što su lizin, di-lizin ili tri-lizin ili tetra-lizin. Molekul tri-lizina sadrži četiri amino grupe preko kojih mogu biti prikačene tri ugljenohidratne konjugatne grupe, kao što su galaktoza i derivati (npr. GalNAc) i dodatni konjugat, kao što su hidrofobni ili lipofilni deo/grupa i karboksilnu reaktivnu grupu preko koje tri-lizin može biti prikačen za oligomer. Dodatni konjugat, kao što je lipofilni/hidrodfobini deo, može biti prikačen za ostatak lizina koji je prikačen za oligomer.
[0200] Iznenađujuće, predmetni pronalazači su otkrili da GalNAc konjugati za upotrebu sa LNA oligomerima ne zahtevaju farmakokinetički modulator (kako je opisano ispod), i kao takav, u nekim primerima izvođenja, GalNAc konjugat nije kovalentno povezan sa lipofilnim ili hidrofobnim delom, kakvi su oni opisani ovde, npr. ne sadrže C8 - C36 masnu kiselinu ili sterol. Pronalazak stoga takođe obezbeđuje GalNAc konjugate LNA oligomera koji ne sadrže lipofilni ili hidrofobni farmakokinetički modulator ili konjugatni deo/grupu.
Farmakokinetički modulatori
1
[0201] Jedinjenje pronalaska može dalje sadržati jedan ili više dodatnih konjugatnih delova, od kojih su lipofilni ili hidrofobni delovi posebno zanimljivi, kao na primer kada je konjugatna grupa ugljenohidratni deo. Takvi lipofilni ili hidrofobni delovi mogu delovati kao farmakokinetički modulatori, i mogu biti kovalentno povezani bilo za ugljenohidratni konjugat, linker koji povezuje ugljenohidratni konjugat za oligomer ili linker koji povezuje više ugljenohidratnih konjugata (multi-valentnih konjugata), ili za oligomer, opciono preko linkera, kao što je bio-odvojivi linker.
[0202] Zbog toga oligomerni ili konjugatni deo može sadržati farmakokinetički modulator, kao što su lipofilni ili hidrofobni delovi. Takvi delovi su objavljeni u kontekstu siRNK konjugata u WO2012/082046. Hidrofobni deo može sadržati C8 - C36 masnu kiselinu, koja može biti zasićena ili nezasićena. U nekim primerima izvođenja, mogu se upotrebiti C10, C12, C14, C16, C18, C20, C22, C24, C26, C28, C30, C32 i C34 masne kiseline. Hidrofobna grupa može imati 16 ili više atoma ugljenika. Primeri pogodnih hidrofobnih grupa mogu biti odabrani iz grupe koja sadrži: sterol, holesterol, palmitoil, heksadek-8-enoil, oleil, (9E, 12E)-oktadeka-9,12-dienoil, dioktanoil, i C16-C20 acil. U skladu sa WOꞌ346, hidrofobne grupe koje imaju manje od 16 atoma ugljenika su manje efikasne u poboljšanju ciljajućih svojstava polinukleotida, ali se one mogu upotrebiti u više kopija (npr.2x, kao što je 2x C8 ili C10, C12 ili C14) radi poboljšanja efikasnosti. Farmakokinetički modulatori korisni kao polinukleotidni ciljajući delovi mogu biti odabrani iz grupe koja se sastoji od: holesterola, alkil grupe, alkenil grupe, alkinil grupe, aril grupe, aralkil grupe, aralkenil grupe, i aralkinil grupe, od kojih svaka može biti linearna, razgranata, ili ciklična. Farmakokinetički modulatori su poželjno ugljovodonici, koji sadrže samo atome ugljenika i vodonika. Međutim, supstitucije ili heteroatomi koji održavaju hidrofobnost, na primer fluor, mogu biti dozvoljeni.
Lipofilni konjugati
[0203] U nekim primerima izvođenja, konjugatna grupa je ili može sadržati lipofilni deo, kao što je sterol (na primer, holesterol, holesteril, holestanol, stigmasterol, holanska kiselina i ergosterol). U nekim primerima izvođenja konjugat je ili sadrži tokoferol (na primer kao Conj 6 i Conj 6a na Slici 2). U nekim primerima izvođenja konjugat je ili može sadržati holesterol (na primer kao Conj 5 i Conj 5a na Slici 2).
[0204] U nekim primerima izvođenja, konjugat je, ili može sadržati lipid, fosfolipid ili lipofilni alkohol, kao što je katjonski lipid, neutralni lipid, sfingolipid, i masne kiseline kao
2
što su stearinska, oleinska, elaidna, linolna, linolelaidinska, linoleinska, i miristična kiselina. U nekim primerima izvođenja masna kiselina sadrži C4-C30 zasićeni ili nezasićeni alkilni lanac. Alkilni lanac može biti linearan ili razgranat.
[0205] Lipofilni konjugatni delovi se mogu upotrebljavati, na primer, da pariraju hidrofilnoj prirodi oligomernog jedinjenja i poboljšaju ćelijsku penetraciju.
[0206] Lipofilni delovi uključuju, na primer, sterole, stanole, i steroide i srodna jedinjenja kao što su holesterol (SAD patent br. 4,958,013 i Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553), tioholesterol (Oberhauser et al., Nucl Acids Res., 1992, 20, 533), lanosterol, koprostanol, stigmasterol, ergosterol, kalciferol, holna kiselina, dezoksiholna kiselina, estron, estradiol, estratriol, progesteron, stilbestrol, testosteron, androsteron, dezoksikortikosteron, kortizon, 17-hidroksikortikosteron, njihove derivate, i slično. U nekim primerima izvođenja konjugat se može odabrati iz grupe koja se sastoji od holesterola, tioholesterola, lanosterola, koprostanola, stigmasterola, ergosterola, kalciferola, holne kiseline, dezoksiholne kiseline, estrona, estradiola, estratriola, progesterona, stilbestrola, testosterona, androsterona, dezoksikortikosterona, kortizona, i 17-hidroksikortikosterona. Drugi lipofilni konjugatni delovi uključuju alifatične grupe, kao što su, na primer, ravno-lančani, razgranati i ciklični alkili, alkenili, i alkinini. Alifatične grupe mogu imati, na primer, 5 do oko 50, 6 do oko 50, 8 do oko 50, ili 10 do oko 50 atoma ugljenika. Primeri alifatičnih grupa uključuju undecil, dodecil, heksadecil, heptadecil, oktadecil, nonadecil, terpene, bornil, adamantil, njihove derivate i slično. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više atoma ugljenika u alifatičnoj grupi mogu biti zamenjeni heteroatomom kao što su O, S, ili N (npr. geraniloksiheksil). Dodatni pogodni lipofilni konjugatni delovi uključuju alifatične derivate glicerola kao što su alkilgliceroli, bis(alkil)gliceroli, tris(alkil)gliceroli, monogliceridi, digliceridi, i trigliceridi. U nekim primerima izvođenja, lipofilni konjugat je di-heksildecil-rac-glicerol ili 1,2-di-O-heksildecil-rac-glicerol (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nuc. Acids Res., 1990, 18, 3777) ili njihovi fosfonati. Zasićene i nezasićene masne funkcionalnosti, kao što su, na primer, masne kiseline, masni alkoholi, masni estri, i masni amini, mogu takođe služiti kao lipofilni konjugatni delovi. U nekim primerima izvođenja, masne funkcionalnosti mogu sadržati od oko 6 ugljenika do oko 30 ili oko 8 do oko 22 ugljenika. Primeri masnih kiselina uključuju, kaprične, kaprilne, laurinske, palmitinske, miristične, stearinske, oleinske, linolne, linoleinske, arahidonske, eikozenske kiseline i slično.
[0207] U dodatnim primerima izvođenja, lipofilne konjugatne grupe mogu biti policiklične aromatične grupe koje imaju od 6 do oko 50, 10 do oko 50, ili 14 do oko 40 atoma ugljenika. Primeri policikličnih aromatičnih grupa uključuju pirene, purine, akridine, ksantene, fluorene, fenantrene, antracene, kvinoline, izokvinoline, naftalene, njihove derivate i slično. Drugi pogodni lipofilni konjugatni delovi uključuju mentole, tritile (npr. dimetoksitritil (DMT)), fenoksazine, lipoinsku kiselinu, fosfolipide, etre, tioetre (npr. heksil-S-tritiltiol), njihove derivate i slično. Priprema lipofilnih konjugata oligomernih jedinjenja je dobro opisana u struci, kao što je u, na primer, Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al, Biochimie, 1993, 75, 49; Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229, i Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651.
[0208] Oligomerna jedinjenja koja sadrže konjugatne delove sa afinitetom za lipoprotein male gustine (LDL) mogu pomoći da se obezbedi efikasan ciljajući sistem isporuke. Visoki nivoi ekspresije receptora za LDL na ćelijama tumora čini LDL atraktivnim nosačem za selektivnu isporuku lekova ovim ćelijama (Rump et al., Bioconjugate Chem., 1998, 9, 341; Firestone, Bioconjugate Chem., 1994, 5, 105; Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229). Delovi koji imaju afinitet za LDL uključuju mnoge lipofilne grupe kao što su steroidi (npr. holesterol), masne kiseline, njihovi derivati i njihove kombinacije. U nekim primerima izvođenja, konjugatne grupe koje imaju afinitet za LDL mogu biti dioleil estri holne kiseline kao što su henodezoksiholna kiselina i litoholna kiselina.
[0209] U nekim primerima izvođenja lipofilni konjugati mogu biti ili mogu sadržati biotin. U nekim primerima izvođenja, lipofilni konjugat može biti ili može sadržati glicerid ili glicerid estar.
[0210] Lipofilni konjugati, kao što su steroli, stanoli, i staini, kao što je holesterol ili kako je ovde objavljeno, mogu se upotrebljavati za poboljšanje isporuke oligonukleotida, na primer, jetri (tipično hepatocitima).
[0211] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska konjugatni deo antisens oligonukleotidnog konjugata sadrži ili se sastoji od Conj 5, 5a, 6 ili 6a. Najpoželjnije konjugatni deo sadrži ili se sastoji od Conj 5a.
[0212] U sledećem poželjnom primeru izvođenja antisens oligonukleotidni konjugat je odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 10 i 11.
[0213] Sledeće refefrence takođe označavaju upotrebu lipofilnih konjugata: Kobylanska et al., Acta Biochim Pol. (1999); 46(3): 679 - 91. Felber et al., Biomaterials (2012) 33(25): 599-65); Grijalvo et al., J Org Chem (2010) 75(20): 6806 - 13. Koufaki et al., Curr Med Chem (2009) 16(35): 4728-42. Godeau et al., J. Med. Chem. (2008) 51(15): 4374-6.
Linkeri (npr. Region B ili Y)
4
[0214] Veza ili linker je konekcija između dva atoma koja povezuje jednu hemijsku grupu ili segment od interesa sa drugom hemijskom grupom ili segmentom od interesa putem jedne ili više kovalentnih veza. Konugatni delovi (ili ciljajući ili blokirajući delovi) mogu se prikačiti na oligomerno jedinjenje direktno ili preko povezujućeg dela (linker ili tetar) - linkera. Linkeri su bifunkcionalni delovi koji služe za kovalentno povezivanje trećeg regiona, npr. konjugatnog dela, za oligomerno jedinjenje (kao što je za region A). U nekim primarima izvođenja, linker sadrži lančanu strukturu ili oligomer ponavljajućih jedinica kao što su jedinice etilen glikola ili amino-kiseline. Linker može imati najmanje dve funkcionalnosti, jednu za prikačinjanje za oligomerno jedinjenje i drugu za prikačinjanje za konjugatni deo. Primer funkcionalnosti linkera može biti elektrofilna za reakciju sa nukleofilnim grupama na oligomernom ili konjugatnom delu, ili nukleofilna za reakciju sa elektrofilnim grupama. U nekim primerima izvođenja, funkcionalnosti linkera uključuju amino, hidroksil, karboksilnu kiselinu, tiol, fosforamidat, fosforotioat, fosfat, fosfit, nezasićenja (npr. dvostruke ili trostruke veze), i slično. Neki primeri linkera uključuju 8-amino-3,6-dioksaoktanojičnu kiselinu (ADO), sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-I-karboksilat (SMCC), 6-aminoheksanoičnu kiselinu (AHEX ili AHA), 6-aminoheksiloksi, 4-aminobuternu kiselinu, 4-aminocikloheksilkarboksilnu kiselinu, sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-I-karboksi-(6-amido-kaproat) (LCSMCC), sukcinimidil m-maleimido-benzoilat (MBS), sukcinimidil N-e-maleimido-kaproilat (EMCS), sukcinimidil 6-(beta - maleimidopropionamido) heksanoat (SMPH), sukcinimidil N-(a-maleimido acetat) (AMAS), sukcinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirat (SMPB), beta -alanin (beta -ALA), fenilglicin (PHG), 4-aminocikloheksanoičnu kiselinu (ACHC), beta -(ciklopropil) alanin (beta - CYPR), amino dodekanoičnu kiselinu (ADC), alilen diole, polietilen glikole, amino-kiseline, i slično.
[0215] U struci je poznato mnoštvo dodatnih linker grupa koje mogu biti korisne u prikačinjanju konjugatnih delova za oligomerna jedinjenja. Pregled mnogih korisnih linker grupa može se naći, na primer, u Antisense Research and Applications, S. T. Crooke i B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p.303-350. Disulfidna veza je upotrebljena da poveže 3' terminus oligonukleotida sa peptidom (Corey et al., Science 1987, 238, 1401; Zuckermann et al., J Am. Chem. Soc.1988, 110, 1614; i Corey et al., J Am. Chem. Soc.1989, 111, 8524). Nelson et al., Nuc. Acids Res. 1989, 17, 7187 opisuju vezujući reagens za prikačinjanje biotina za 3'-terminus oligonukleotida. Ovaj reagens, N-Fmoc-O-DMT-3 -amino- 1,2-propandiol je komercijalno dostupan od Clontech Laboratories (Palo Alto, Kalifornija) pod imenom 3'-Amine. Takođe je komercijalno dostupan pod imenom 3'-AminoModifier reagens od Glen Research Corporation (Sterling, Va). Ovaj reagens je takođe korišćen da poveže peptid sa oligonukleotidom kako izveštavaju Judy et al., Tetrahedron Letters 1991, 32, 879. Sličan komercijalni reagens za povezivanje sa 5'-terminusom oligonukleotida je 5'-Amino-Modifier C6. Ovi reagensi su dostupni od Glen Research Corporation (Sterling, Va.). Ova jedinjenja ili slična su korišćena od strane Krieg et al., Antisense Research and Development 1991, 1, 161 za povezivanje fluoresceina za 5'-terminus oligonukleotida. Druga jedinjenja kao što je akridin su prikačena na 3'-terminalnu fosfatnu grupu oligonukleotida putem polimetilenske veze (Asseline, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297). Bilo koja od gore navedenih grupa može se upotrebiti kao pojedinačni linker ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih linkera.
[0216] Linkeri i njihova upotreba u pripremi konjugata oligomernih jedinjenja su obezbeđeni kroz struku kao što je u WO 96/11205 i WO 98/52614 i SAD Pat. brojevi 4,948,882; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,580,731; 5,486,603; 5,608,046; 4,587,044; 4,667,025; 5,254,469; 5,245,022; 5,112,963; 5,391,723; 5,510475; 5,512,667; 5,574,142; 5,684,142; 5,770,716; 6,096,875; 6,335,432; i 6,335,437; WO 2012/083046.
[0217] Kako se ovde upotrebljava, fiziološki labilna veza je labilna veza koja je odvojiva pod uslovima koji se uobičajeno sreću ili su analogni onima koji se nalaze unutar tela sisara (takođe označena kao odvojivi linker, ilustrovano kao region B na slikama 12 i 13). Fiziološki labilne vezne grupe su odabrane tako da se podvrgavaju hemijskoj transformaciji (npr. odvajanju) kada su prisutne u određenim fiziološkim uslovima. Unutarćelijski uslovi sisara uključuju hemijske uslove kao što su pH, temperatura, oksidacioni ili redukcioni uslovi ili agensi, i koncentracija soli koji se nalaze u ili su analogne onima koji se sreću u ćelijama sisara. Unutarćelijski uslovi sisara takođe uključuju prisustvo enzimske aktivnosti koja je normalno prisutna u ćeliji sisara kao što je od proteolitičkih ili hidrolitičkih enzima. U nekim primerima izvođenja, odvojivi linker je podložan nukleazi(ama) koja se može, na primer, eksprimirati u ciljnoj ćeliji - i kao takav, kako je ovde detaljno opisano, linker može biti kratak region (npr.1 - 10) fosfodiestrom povezanih nukleozida, kao što su DNK nukleozidi.
[0218] Hemijska transformacija (odvajanje labilne veze) se može započeti dodavanjem farmaceutski prihvatljivog agensa ćeliji ili se može javiti spontano kada molekul koji sadrži labilnu vezu dospe odgovarajuće unutar- i/ili vanćelijsko okruženje. Na primer, pH labilna veza može se odvojiti kada molekul uđe u zakišeljeni endozom. Stoga se pH labilna veza može smatrati endosomski odvojivom vezom. Enzimski odvojive veze se mogu odvojiti ukoliko su izložene enzimima kao što su oni koji su prisutni u endozomu ili lizozomu ili u citoplazmi. Disulfidna veza se može odvojiti kada molekul uđe u više redukujuće okruženje ćelijske citoplazme. Stoga, disulfid se može smatrati citoplazmatski odvijivom vezom. Kako se ovde upotrebljava, pH-labilna veza je labilna veza koja se selektivno raskida u kiselim uslovima (pH<7). Takve veze se takođe mogu nazvati endozomsko labilnim vezama, pošto ćelijski endozomi i lizozomi imaju pH manji od 7.
Bio-odvojivi konjugati vezani za oligomer
[0219] Oligomerno jedinjenje može opciono sadržati drugi region (region B) koji je smešten između oligomera (koji se označava kao region A) i konjugata (koji se označava kao region C) Videti Slike 12 i 13 za ilustracije). Region B može biti linker kao što je odvojivi linker (takođe se označava i kao fiziološki labilna veza). Fiziološki labilne veze podložne nukleazi: U nekim primerima izvođenja oligomer (koji se takođe označava kao oligomerno jedinjenje) pronalaska (ili konjugat) sadrži tri regiona:
i) prvi region (region A), koji sadrži 16 - 18 neprekidnih nukleotida;
ii) drugi region (region B) koji sadrži bio-odvojivi linker
iii) treći region (C) koji sadrži konjugatni deo, ciljajući deo, aktivacioni deo, pri čemu je treći region kovalentno vezan za drugi region.
[0220] U nekim primerima izvođenja, region B može biti fosfat nukleotidni linker. Na primer, takvi linkeri se mogu upotrebiti kada je konjugat lipofilni konjugat, kao što je lipid, masna kiselina, sterol, kao što je holesterol ili tokoferol. Fosfat nukleotidni linkeri se takođe mogu upotrebiti za druge konjugate, na primer ugljenohidratne konjugate, kao što je GalNAc.
Peptidni linkeri
[0221] U nekim primerima izvođenja, bio-odvojivi linker (region B) je peptid, kao što je trilizin peptidni linker koji se može upotrebiti u poliGalNAc konjugatu, kao što je triGalNAc konjugat. Videti takođe peptidne biradikale pomenute ovde.
[0222] Drugi linkeri poznati u struci koji se mogu upotrebiti, uključuju disulfidne linkere.
Fosfat nukleotidni linkeri
[0223] U nekim primerima izvođenja, region B sadrži između 1-6 nukleotida, koji su kovalentno vezani za 5' ili 3' nukleotid prvog regiona, kao putem internukleozidne vezne grupe kao što je fosfodiestarska veza, pri čemu ili
a. internukleozidna veza između prvog i drugog regiona je fosfodiestarska veza i nukleozid drugog regiona [kao što je odmah] susedni prvom regionu je ili DNK ili RNK; i/ili
b. najmanje 1 nukleozid drugog regiona je fosfodiestarski vezan DNK ili RNK nukleozid;
[0224] U nekim primerima izvođenja, region A i region B formiraju jednu neprekidnu nukleotidnu sekvencu od 12 - 22 nukleotida u dužini.
[0225] U nekim aspektima, internukleozidna veza između prvog i drugog regiona može se smatrati delom drugog regiona.
[0226] U nekim primerima izvođenja, postoji vezna grupa koja sadrži fosfor između drugog i trećeg regiona. Fosforna vezna grupa može, na primer, biti fosfatna (fosfodiestarska), fosforotioatna, fosforoditioatna ili boranofosfatna grupa. U nekim primerima izvođenja, ova vezna grupa koja sadrži fosfor je smeštena između drugog regiona i linker regiona koji je prikačen za treći region. U nekim primerima izvođenja fosfatna grupa je fosfodiestar.
[0227] Prema tome, u nekim aspektima oligomerno jedinjenje sadrži najmanje dve fosfodiestarske grupe, pri čemu je najmanje jedna u skladu sa gornjom izjavom pronalaska, i druga je smeštena između drugog i trećeg regiona, opciono između linker grupe i drugog regiona.
[0228] U nekim primerima izvođenja, treći region je aktivaciona grupa, kao što je aktivaciona grupa za upotrebu u konjugaciji. U tom pogledu, pronalazak takođe obezbeđuje aktivirane oligomere koji sadrže region A i B i aktivacionu grupu, npr. intermedijer koji je pogodan za kasnije vezivanje za treći region, kao što je pogodan za konjugaciju.
[0229] U nekim primerima izvođenja, treći region je reaktivna grupa, kao što je reaktivna grupa za upotrebu u konjugaciji. U tom pogledu, pronalazak takođe obezbeđuje oligomere koji sadrže region A i B i reaktivnu grupu, npr. intermedijer koji je pogodan za kasnije vezivanje za treći region, kao što je pogodan za konjugaciju. Reaktivna grupa može, u nekim primerima izvođenja sadržati amin alkoholne grupe, kao što je amino grupa.
[0230] U nekim primerima izvođenja region A sadrži najmanje jednu, kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 21 internukleozidne veze koje nisu fosfodiestarske, kao što su internukleozidne veze koje su (opciono nezavisno) odabrane iz grupe koja se sastoji od fosforotioata, fosforoditioata i boranofosfata i metilfosfonata, kao što je fosforotioat. U nekim primerima izvođenja region A sadrži najmanje jednu fosforotioatnu vezu. U nekim primerima izvođenja najmanje 50%, kao što je najmanje 75%, kao što je najmanje 90% internukleozidnih veza, kao što su sve internukleozidne veze unutar regiona A su druge nego fosfodiestar, na primer su fosforotioatne veze. U nekim primerima izvođenja, sve internukleozidne veze u regionu A su druge nego fosfodiestar.
[0231] U nekim primerima izvođenja, oligomerno jedinjenje sadrži antisens oligonukleotid, kao što je antisens oligonukleotidni konjugat. Antisens oligonukleotid može biti ili može sadržati prvi region, i opciono drugi region. S tim u vezi, u nekim primerima izvođenja, region B može formirati deo neprekidne nukleobazne sekvence koja je komplementarna (nukleinskoj kiselini) cilja. U drugim primerima izvođenja, regionu B može nedostajati komplementarnost sa ciljem.
[0232] Alternativno rečeno, u nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje nefosfodiestarski vezan, kao što je fosforotioatno vezan oligonukleotid (npr. antisens oligonukleotid) koji ima najmanje jedan terminalni (5' i/ili 3') DNK ili RNK nukleozid povezan sa susednim nukleozidom oligonukleotida putem fosfodiestarske veze, pri čemu je terminalni DNK ili RNK nukleozid dalje kovalentno vezan za konjugatni deo, ciljni deo ili blokirajući deo, opciono putem linker dela.
[0233] U nekim primerima izvođenja, oligomerno jedinjenje sadrži antisens oligonukleotid, kao što je antisens oligonukleotidni konjugat. Antisens oligonukleotid može biti ili može sadržati prvi region, i opciono drugi region. S tim u vezi, u nekim primerima izvođenja, region B može formirati deo neprekidne nukleobazne sekvence koja je komplementarna (nukleinskoj kiselini) cilja. U drugim primerima izvođenja, regionu B može nedostajati komplementarnost sa ciljem.
[0234] U nekim primerima izvođenja, najmanje dva uzastopna nukleozida drugog regiona su DNK nukleozidi (kao što su najmanje 3 ili 4 ili 5 uzastopnih DNK nukleotida).
[0235] U takvom primeru izvođenja, oligonukleotid ovog pronalaska može se opisati u skladu sa sledećom formulom:
5'-A-PO-B [Y)X-3' ili 3'-A-PO-B [Y) X- 5'
pri čemu je A region A, PO je fosfodiestarska veza, B je region B, Y je opciona vezna grupa, i X je konjugat, ciljajuća, blokirajuća grupa ili reaktivna ili aktivaciona grupa.
[0236] U nekim primerima izvođenja, region B sadrži 3'-5' ili 5'-3': i) fosfodiestarsku vezu sa 5' ili 3' nukleozidom regiona A, ii) DNK ili RNK nukleozid, kao što je DNK nukleozid, i iii) dodatnu fosfodiestarsku vezu 5'-A-PO-B - PO- 3' ili 3'-A-PO-B - PO- 5'
[0237] Dodatna fosfodiestarska veza povezuje region B nukleozida sa jednim ili više dodatnih nukleozida, kao što je jedan ili više DNK ili RNK nukleozida, ili se može povezati sa X (konjugat, ciljajuća ili blokirajuća grupa ili reaktivna ili aktivaciona grupa) opciono putem vezne grupe (Y).
[0238] U nekim primerima izvođenja, region B sadrži 3'-5' ili 5'-3': i) fosfodiestarsku vezu sa 5' ili 3' nukleozidom regiona A, ii) između 2-10 DNK ili RNK fosfodiestarski vezanih nukleozida, kao što je DNK nukleozid, i opciono iii) dodatnu fosfodiestarsku vezu:
5'-A-[PO-B]n - [Y]-X 3' ili 3'-A-[PO-B]n -[Y]-X 5'
5'-A-[PO-B]n - PO-[Y]-X 3' ili 3'-A-[PO-B]n - PO-[Y]-X 5'
[0239] Pri čemu A predstavlja region A, [PO-B]n predstavlja region B, pri čemu je n 1 - 10, kao što su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10, PO je opciona fosfodiestaraska vezna grupa između regiona B i X (ili Y ukoliko postoji).
[0240] U nekim primerima izvođenja pronalazak obezbeđuje jedinjenja u skladu sa (ili koja sadrže) jednu od sledećih formula:
5' [Region A] - PO - [region B] 3' -Y - X
5' [Region A] - PO - [region B] -PO 3' -Y - X
5' [Region A] - PO - [region B] 3' - X
5' [Region A] - PO - [region B] -PO 3' - X
3' [Region A] - PO - [region B] 5' -Y - X
3' [Region A] - PO - [region B] -PO 5' -Y - X
3' [Region A] - PO - [region B] 5' - X
3' [Region A] - PO - [region B] -PO 5' - X
[0241] Region B, može na primer sadržati ili se sastojati od:
5' DNK 3'
3' DNK 5'
5' DNK-PO-DNK-3'
3' DNK-PO-DNK-5'
5' DNK-PO-DNK-PO-DNK 3'
3' DNK-PO-DNK-PO-DNK 5'
5' DNK-PO-DNK-PO-DNK-PO-DNK 3'
3' DNK-PO-DNK-PO-DNK-PO-DNK 5'
5' DNK-PO-DNK-PO-DNK-PO-DNK-PO-DNK 3'
3' DNK-PO-DNK-PO-DNK-PO-DNK-PO-DNK 5'
[0242] Treba prepoznati da fosfatom povezani bio-odvojivi linkeri mogu upotrebiti nukleozide koji nisu DNK i RNK. Bio-odvojivi nukleotidni linkeri mogu se identifikovati upotrebom testova u primeru 6.
[0243] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje pronalaska sadrži bio-odvojivi linker (koji se takođe označava i kao fiziološki labilni linker, fiziološki labilne veze podložne nukleazi, ili linker podložan nukleazi), na primer fosfat nukleotidni linker (kao što je region B) ili peptidni linker, koji pridružuje oligomer (ili neprekidnoj nukleotidnoj sekvenci ili regionu A), za konjugatni deo (ili region C).
[0244] Podložnost odvajanju u testovima pokazanim u Primeru 6 može se upotrebiti za određivanje da li je linker bio-odvojiv ili fiziološki labilan.
[0245] Bio-odvojivi linkeri u skladu sa predmetnim pronalaskom označavaju linkere koji su podložni odvajanju u ciljnom tkivu (tj. fiziološki labilni), na primer jetri i/ili bubregu. Poželjno je da je stopa odvajanja viđena u ciljnom tkivu veća od one koja se nalazi u krvnom serumu. Pogodni postupci za određivanje nivoa (%) odvajanja u tkivu (npr. jetri ili bubregu) i u serumu nalaze se u primeru 6. U nekim primerima izvođenja, bio-odvojivi linker (koji se takođe označava i kao fiziološki labilni linker, ili linker podložan nukleazi), kao što je region B, u jedinjenju pronalaska, je najmanje oko 20% odvojen, kao što je najmanje oko 30% odvojen, kao što je najmanje oko 40% odvojen, kao što je najmanje oko 50% odvojen, kao što je najmanje oko 60% odvojen, kao što je najmanje oko 70% odvojen, kao što je najmanje oko 75% odvojen, u testu homogenata jetre ili bubrega Primera 6. U nekim primerima izvođenja, odvajanje (%) u serumu, kao što se upotrebljava u testu u Primeru 6, je manje od oko 30%, je manje od oko 20%, kao što je manje od oko 10%, kao što je manje od 5%, kao manje od oko 1%.
[0246] U nekim primerima izvođenja, koji mogu biti isti ili različiti, bio-odvojivi linker (koji se takođe označava i kao fiziološki labilni linker, ili linker podložan nukleazi), kao što je region B, u jedinjenju pronalaska je podložan na odvajanje S1 nukleazom. Podložnost na S1
1
odvajanje može se proceniti upotrebom S1 nukleaza testa pokazanog u Primeru 6. U nekim primerima izvođenja, bio-odvojivi linker (koji se takođe označava i kao fiziološki labilni linker, ili linker podložan nukleazi), kao što je region B, u jedinjenju pronalaska, je najmanje oko 30% odvojen, kao što je najmanje oko 40% odvojen, kao što je najmanje oko 50% odvojen, kao što je najmanje oko 60% odvojen, kao što je na najmanje oko 70% odvojen, kao što je najmanje oko 80% odvojen, kao što je najmanje oko 90% odvojen, kao što je najmanje 95% odvojen posle 120min inkubacije sa S1 nukleazom u skladu sa testom upotrebljenim u Primeru 6.
Odabir sekvence u drugom regionu:
[0247] U nekim primerima izvođenja, region B ne formira komplementarnu sekvencu kada je oligonukleotidni region A i B poravnat sa komplementarnom ciljnom sekvencom.
[0248] U nekim primerima izvođenja, region B formira komplementarnu sekvencu kada je oligonukleotidni region A i B poravnat sa komplementarnom ciljnom sekvencom. U tom pogledu, region A i B zajedno mogu formirati jednu neprekidnu sekvencu koja je komplementarna ciljnoj sekvenci.
[0249] U nekim primerima izvođenja, sekvenca baza u regionu B je odabrana da obezbedi optimalno endonukleazom odvojivo mesto, zasnovano na prevladavajućim enzimima za endonukleazno odvajanje koji su prisutni u ciljnom tkivu ili ćeliji ili subćelijskom odeljku. U tom pogledu, izolovanjem ćelijskih ekstrakata iz ciljnih tkiva i ne-ciljnih tkiva, endokulezom odvajive sekvence za upotrebu u regionu B mogu se odabrati na osnovu poželjne aktivnosti odvajanja u željenoj ciljnoj ćeliji (npr. jetra/hepatociti) u poređenju sa ne-ciljnom ćelijom (npr. bubreg). U tom pogledu, potencija jedinjenja za smanjenje ciljno deluje na može se optimizovati za željeno tkivo/ćeliju.
[0250] U nekim primerima izvođenja region B sadrži dinukleotid sekvence AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC, ili GG, pri čemu C može biti 5-metilcitozin, i/ili T može biti zamenjen sa U. U nekim primerima izvođenja region B sadrži trinukleotid sekvence AAA, AAT, AAC, AAG, ATA, ATT, ATC, ATG, ACA, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, TCT, TCC, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, CTA, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC, i GGG pri čemu C može biti 5-metilcitozin i/ili T može biti zamenjen sa U. U nekim primerima izvođenja region B sadrži
2
trinukleotid sekvence AAAX, AATX, AACX, AAGX, ATAX, ATTX, ATCX, ATGX, ACAX, ACTX, ACCX, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, TAAX, TATX, TACX, TAGX, TTAX, TTTX, TTCX, TAGX, TCAX, TCTX, TCCX, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, CAAX, CATX, CACX, CAGX, CTAX, CTGX, CTCX, CTTX, CCAX, CCTX, CCCX, CCGX, CGAX, CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX, i GGGX, pri čemu se X može odabrati iz grupe koja se sastoji od A, T, U, G, C i njihovih analoga, pri čemu C može biti 5-metilcitozin i/ili T može biti zamenjen sa U. Biće prepoznato da kada označava nukleobaze (koje se javljaju u prirodi) A, T, U, G, C, one mogu biti supstituisane analozima nukleobaza koji funkcionišu kao ekvivalentna prirodna nukleobaza (npr. baza se sparuje sa komplementarnim nukleozidom). U nekim primerima izvođenja region B ne sadrži T ili U.
Amino alkil intermedijeri
[0251] Objavljeni su LNA oligomerni intermedijeri koji sadrže antisens LNA oligomer koji sadrži (npr. terminalni, 5' ili 3') amino alkil linker, kao što je C2-C36 amino alkil grupa, na primer C6 do C12 amino alkil grupa, uključujući na primer C6 i C12 amino alkil grupe. Amino alkil grupa se može dodati LNA oligomeru kao deo standardne sinteze oligonukleotida, na primer upotrebom (npr. zaštićenog) amino alkil fosforamidita. Vezna grupa između amino alkila i LNA oligomera može, na primer, biti fosforotioat ili fosfodiestar, ili jedna od drugih nukleozidnih veznih grupa na koje se ovde poziva, na primer. Amino alkil grupa može biti kovalentno vezana za, na primer, 5' ili 3' LNA oligomera, kao što je pomoću nukleozidne vezne grupe, kao što je fosforotioatna ili fosfodiestarska veza.
[0252] Objavljen je postupak sinteze LNA oligomera koji sadrži sekvencijalnu sintezu LNA oligomera, kao što je sinteza oligonukleotida na čvrstoj fazi, koja sadrži korak dodavanja amino alkil grupe oligomeru, kao npr. tokom prvog ili poslednjeg kruga sinteze oligonukleotida. Postupak sinteze može dodatno da sadrži korak reakcije konjugata za amino alkil - LNA oligomer (korak konjugacije). Konjugat može sadržati pogodne linkere i/ili grupe tačke grananja, i opciono dodatne konjugatne grupe, kao što su hidrofobne ili lipofilne grupe, kako je ovde opisano. Korak konjugacije može se izvesti dok je oligomer vezan za čvrstu podlogu (npr. posle sinteze oligonukleotida, ali pre elucije oligomera sa čvrste podloge), ili naknadno (tj. posle elucije). Objavljena je upotreba amino alkil linkera u sintezi oligomera pronalaska.
Postupak izrade/sinteze
[0253] Objavljen je postupak sintetisanja (ili izrade) oligomernog jedinjenja, kao što je oligomerno jedinjenje pronalaska, navedeni postupak sadrži
bilo:
a) korak obezbeđivanja podloge za sintezu oligonukleotida [na čvrstoj fazi] za koju je prikačeno jedno od sledećih [treći region]:
i) linker grupa (-Y-)
ii) grupa odabrana iz grupe koja se sastoji od konjugata, ciljajuće grupe, blokirajuće grupe, reaktivne grupe [npr. amin ili alkohol] ili aktivacione grupe (X-)
iii) -Y - X grupa
i
b) korak [sekvencijalne] oligonukleotidne sinteze regiona B posle čega sledi region A,
i / ili:
c) korak [sekvencijalne] oligonukleotidne sinteze prvog regiona (A) i drugog regiona (B), pri čemu korak sinteze prati
d) korak dodavanja trećeg regiona [koji sadrži fosforamidit]
i) linker grupa (-Y-)
ii) grupa odabrana iz grupe koja se sastoji od konjugata, ciljajuće grupe, blokirajuće grupe, reaktivne grupe [npr. amin ili alkohol] ili aktivacione grupe (X-)
iii) -Y - X grupa
što prati
e) odvajanje oligomernog jedinjenja od podloge [čvrste faze]
4
pri čemu, opciono navedeni postupak dodatno sadrži dalji korak odabran od:
f) pri čemu je treća grupa aktivaciona grupa, korak aktiviranja aktivacione grupe kako bi se proizvela reaktivna grupa, praćeno dodavanjem konjugata, blokirajuće, ili ciljajuće grupe reaktivnoj grupi, opciono preko linker grupe (Y);
g) pri čemu je treći region reaktivna grupa, korak dodavanja konjugata, blokirajuće, ili ciljajuće grupe reaktivnoj grupi, opciono preko linker grupe (Y).
h) pri čemu je treći region linker grupa (Y), korak dodavanja konjugata, blokirajuće, ili ciljajuće grupe linker grupi (Y)
pri čemu se koraci f), g) ili h) izvode ili pre ili posle odvajanja oligomernog jedinjenja od podloge za sintezu oligonukleotida. Postupak se može izvesti upotrebom standardne hemije fosforamidita, i kao takav region X i/ili region X ili region X i Y mogu se obezbediti, pre ugradnje u oligomer, kao fosforamidit. Videti slike 5-10 koje ilustruju neograničavajuće aspekte postupka pronalaska.
[0254] Objavljen je postupak sintetisanja (ili izrade) oligomernog jedinjenja, kao što je oligomerno jedinjenje pronalaska, pri čemu navedeni postupak sadrži
korak sekvencijalne sinteze oligonukleotida prvog regiona (A) i drugog regiona (B), pri čemu je korak sinteze praćen korakom dodavanja fosforamidita trećeg regiona koji sadrži region X (takođe se označava kao region C) ili Y, kao što je region koji sadrži grupu odabranu iz grupe koja se sastoji od konjugata, ciljajuće grupe, blokirajuće grupe, funkcionalne grupe, reaktivne grupe (npr. amin ili alkohol) ili aktivacione grupe (X), ili -Y - X grupe praćeno odvajanjem oligomernog jedinjenja od podloge [čvrste faze].
[0255] Međutim, prepoznato je da se region X ili X-Y može dodati posle odvajanja od čvrste podloge. Alternativno, postupak sinteze može sadržati korake sintetisanja prvog (A), i opciono drugog regiona (B), praćeno odvajanjem oligomera od podloge, sa naknadnim korakom dodavanja trećeg regiona, kao što je X ili X-Y grupa oligomeru. Dodavanje trećeg regiona može se postići, na primer, dodavanjem amino fosforamiditne jedinice u završnom koraku sinteze oligomera (na podloži), koja se posle odvajanja od podloge može upotrebiti za pridruživanje X ili X-Y grupi, opciono putem aktivacione grupe na X ili Y (kada postoji) grupi. U primerima izvođenja gde odvojivi linker nije nukleotidni region, region B može biti ne-nukleotidni odvojivi linker na primer peptidni linker, koji može formirati deo regiona X (takođe se označava kao region C) ili biti region Y (ili njegov deo).
[0256] U nekim ovde objavljenim primerima, region X (kao što je C) ili (X-Y), kao što je konjugat (npr. GalNAc konjugat) sadrži aktivacionu grupu, (aktivirana funkcionalna grupa) i u postupku sinteze aktivirani konjugat (ili region X, ili X-Y) se dodaje prvim i drugim regionima, kao što je amino povezani oligomer. Amino grupa se može dodati oligomeru standardnom hemijom fosforamidita, na primer kao završni korak sinteze oligomera (koja će uobičajeno rezultirati amino grupom na 5' kraju oligomera). Na primer tokom poslednjeg koraka sinteze oligonukleotida upotrebljava se zaštićeni amino-alkil fosforamidit, na primer TFA-aminoC6 fosforamidit (6-(trifluoroacetilamino)-heksil-(2-cijanoetil)-(N,N-diizopropil)-fosforamidit).
[0257] Region X (ili region C kako se ovde označava), kao što je konjugat (npr. GalNAc konjugat) može biti aktiviran putem NHS estar postupka i zatim se dodaje amino-povezani oligomer. Na primer, N-hidroksisukcinimid (NHS) se može upotrebiti kao aktivaciona grupa za region X (ili region C), kao konjugat, kao što je GalNAc konjugatni deo.
[0258] Objavljen je oligomer pripremljen postupkom pronalaska.
[0259] U nekim primerima, region X i/ili region X ili region X i Y mogu biti kovalentno pridruženi (povezani) sa regionom B putem fosfat nukleozidne veze, kako je ovde opisano, uključujući fosfodiestar ili fosforotioat, ili putem alternativne grupe, kao što je triazol grupa.
[0260] U nekim primerima, internukleozidna veza između prvog i drugog regiona je fosfodiestar povezan sa prvim (ili samo) DNK ili RNK nukleozidom drugog regiona, ili region B sadrži najmanje jedan DNK ili RNK nukleozid povezan fosfodiestrom.
[0261] Drugi region može, u nekim primerima, sadržati dodatne DNK ili RNK nukleozide koji mogu biti povezani fosfodiestrom. Drugi region je dalje kovalentno povezan za treći region koji, na primer, može biti konjugat, ciljajuća grupa, reaktivna grupa, i/ili blokirajuća grupa.
[0262] Ovde je objavljen dodatni labilni region, drugi region, koji povezuje prvi region, npr. antisens oligonukleotid, i konjugat ili funkcionalnu grupu, npr. ciljajuću ili blokirajuću grupu. Labilni region sadrži najmanje jedan nukleozid povezan fosfodiestrom, kao što je DNK ili RNK nukleozid, kao što su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nukleozida povezana fosfodiestrom, kao što su DNK ili RNK. U nekim primerima izvođenja oligomerno jedinjenje sadrži odvojivi (labilni) linker. U tom pogledu odvojivi linker je poželjno prisutan u regionu B (ili u nekim primerima izvođenja, između regiona A i B).
[0263] Alternativno rečeno, u nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje nefosfodiestarski povezan, kao što je fosforotioatno povezan, oligonukleotid (npr. antisens oligonukleotid) koji ima najmanje jedan terminalni (5' i/ili 3') DNK ili RNK nukleozid povezan sa susednim nukleozidom oligonukleotida putem fosfodiestarske veze, pri čemu je terminalni DNK ili RNK nukleozid dalje kovalentno povezan za konjugatni deo, ciljajući deo ili blokirajući deo, opciono putem linker dela.
Kompozicije
[0264] Oligomer ili oligomerni konjugati pronalaska mogu se upotrebiti u farmaceutskim formulacijama i kompozicijama. Pogodno, takve kompozicije sadrže farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač, so ili adjuvans. WO2007/031091 obezbeđuje pogodan i poželjan farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač i adjuvanse. Pogodne doze, formulacije, putevi primene, kompozicije, dozni oblici, kombinacije sa drugim terapeutskim agensima, formulacije za lek takođe su obezbeđene u WO2007/031091.
Primene
[0265] Oligomeri ili oligomerni konjugati pronalaska mogu se koristiti kao istraživački reagensi za, na primer, dijagnostiku, terapeutiku i profilaksu.
[0266] U istraživanju, takvi oligomeri se mogu upotrebiti za specifično inhibiranje sinteze PCSK9 proteina (uobičajeno degradovanjem ili inhibiranjem iRNK i na taj način sprečavanjem formiranja proteina) u ćelijama i eksperimentalnim životinjama time olakšavajući funkcionalnu analizu ciljno deluje na ili procenu njegove korisnosti kao ciljno deluje na za terapeutsku intervenciju.
[0267] U dijagnostici se oligomeri mogu upotrebiti za otkrivanje i kvantifikaciju PCSK9 ekspresije u ćeliji i tkivima northern blotingom, in-situ hibridizacijom ili sličnim tehnikama.
[0268] Objavljeni su postupci lečenja sisara, kao što je lečenje čoveka, za kog se sumnja da ima ili je sklon bolesti ili stanju, povezanom sa ekspresijom PCSK9 primenom terapeutski ili profilaktički efikasne količine jednog ili više oligomera ili kompozicija pronalaska. Oligomer, konjugat ili farmaceutska kompozicija u skladu sa pronalaskom je uobičajeno za primenu u efikasnoj količini.
[0269] Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu jedinjenja ili konjugata pronalaska kako je opisano za izradu medikamenta za lečenje poremećaja kako je ovde označeno.
[0270] Objavljen je dodatni postupak za lečenje poremećaja kako je ovde označeno, navedeni postupak sadrži primenu jedinjenja u skladu sa pronalaskom kako je ovde opisano, i/ili konjugata u skladu sa pronalaskom, i/ili farmaceutske kompozicije u skladu sa pronalaskom pacijentu kome je to potrebno.
Medicinske indikacije
[0271] Oligomeri, oligomerni konjugati i druge kompozicije u skladu sa pronalaskom mogu biti za upotrebu u lečenju stanja povezanih sa prekomernom ekspresijom ili ekspresijom mutirane verzije PCSK9.
[0272] Pronalazak dalje obezbeđuje upotrebu jedinjenja pronalaska u izradi medikamenta za lečenje bolesti, poremećaja ili stanja kako je ovde označeno.
[0273] Objavljen je postupak lečenja sisara koji pati od ili je podložan stanjima koja su povezana s abnormalnim nivoima i/ili aktivnošću PCSK9, koji se sastoji od primene sisaru i terapeutski efikasne količine oligomera ili oligomernog konjugata ciljanog na PCSK9 koji sadrži jednu ili više LNA jedinica. Oligomer, konjugat ili farmaceutska kompozicija u skladu sa pronalaskom se uobičajeno primenjuje u efikasnoj količini.
[0274] Bolest ili poremećaj, kako je ovde označeno, može u nekim primerima izvođenja biti povezan sa mutacijom u PCSK9 genu ili genu čiji je proteinski proizvod povezan sa ili interaguje sa PCSK9. Stoga, u nekim primerima izvođenja, ciljna iRNK je mutirani oblik PCSK9 sekvence.
[0275] Zanimljiv aspekt pronalaska je usmeren na upotrebu oligomera (jedinjenja) pronalaska ili konjugata pronalaska za pripremu medikamenta za lečenje bolesti, poremećaja ili stanja kako je ovde označeno.
[0276] Ovde objavljeni postupci se poželjno koriste za lečenje ili profilaksu protiv bolesti uzrokovanih abnormalnim nivoima i/ili aktivnošću PCSK9.
[0277] Objavljen je postupak za lečenje abnormalnih nivoa i/ili aktivnosti PCSK9, navedeni postupak sadrži primenu oligomera pronalaska, ili konjugata pronalaska ili farmaceutske kompozicije pronalaska pacijentu kome je to potrebno.
[0278] Pronalazak se takođe odnosi na oligomer pronalaska, farmaceutsku kompoziciju pronalaska ili konjugat pronalaska za upotrebu kao medikament.
[0279] Pronalazak se dodatno odnosi na upotrebu jedinjenja, kompozicije, ili konjugata kao iz pronalaska za izradu medikamenta za lečenje abnormalnih nivoa i/ili aktivnosti PCSK9 ili ekspresiju mutantnih oblika PCSK9 (kao što su alelne varijante, kao što su one povezane sa jednom od bolesti označenih ovde).
[0280] Objavljen je postupak lečenja subjekta koji pati od bolesti ili stanja kao što su one označene ovde.
[0281] Pacijent kojme je potrebno lečenje je pacijent koji pati od ili je verovatno da pati od bolesti ili poremećaja.
[0282] U nekim primerima, termin "lečenje" kako se ovde upotrebljava označava i lečenje postojeće bolesti (npr. bolest ili poremećaj kako je ovde označeno), ili prevenciju bolesti, tj. profilaksu. Stoga će biti prepoznato da lečenje kako je ovde označeno, u nekim primerima može biti profilaktično.
[0283] U jednom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na oligomer pronalaska, antisens oligonukleotidni konjugat pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za lečenje hiperholesterolemije i srodnih poremećaja, ili postupke lečenja upotrebom takvih jedinjenja ili kompozicija za lečenje hiperholesterolemije i srodnih poremećaja, pri čemu termin "srodni poremećaji" kada se označava hiperholesterolemija označava jedno ili više od stanja odabranih iz grupe koja se sastoji od: ateroskleroze, hiperlipidemije, hiperholesterolemije, porodične hiperholesterolemije, npr. dobijanje funkcionih mutacija PCSK9, disbalans HDL/LDL holesterola, dislipidemija, npr. porodična hiperlipidemija (FCHL) ili porodična hiperholesterolemija (FHC), stečene hiperlipidemije, hiperholesterolemije rezistentne na statine, bolesti koronarnih arterija (CAD), i koronarne bolesti srca (CHD).
Kombinovana lečenja
[0284] U nekim primerima izvođenja oligomer pronalaska, antisens oligonukleotidni konjugat pronalaska ili farmaceutska kompozicija pronalaska je za upotrebu u kombinovanom lečenju sa drugim terapeutskim agensom. Na primer inhibitori HMG CoA reduktaze, kao što su na primer statini, široko se upotrebljavaju u lečenju metaboličkih bolesti (videti WO2009/043354, za primere kombinovanih lečenja). Kombinovana lečenja mogu biti druga jedinjenja za snižavanje holesterola, kao što je jedinjenje odabrano iz grupe koja se sastoji od smola za sekvestriranje žučne soli (npr., holestiramin, kolestipol, i kolesevelam hidrohlorid), inhibitora HMGCoA-reduktaze (npr. lovastatin, cerivastatin, pravastatin, atorvastatin, simvastatin, rosuvastatin, i fluvastatin), nikotinske kiseline, derivata fibrične kiseline (npr. klofibrat, gemfibrozil, fenofibrat, bezafibrat, i ciprofibrat), probukola, neomicina, dekstrotiroksina, estara biljnih stanola, inhibitora apsorpcije holesterola (npr. ezetimib), implitapida, inhibitora transportera žučne kiseline (apikalni transporteri žučne kiseline zavisni od natrijuma), regulatora CYP7a jetre, terapeutika za nadoknadu estrogena (npr. tamoksifen), i anti-inflamatora (npr. glukokortikoidi). Kombinacije sa statinima mogu biti posebno poželjne.
PRIMERI
[0285] Oligonukleotidi su sintetisani na uridin univerzalnim podlogama upotrebom fosforamiditnog pristupa na Expedite 8900/MOSS sintetizatoru (sistem za sintezu više oligonukleotida) ili Oligomaker 48 u količini od 4 ili 1 μmol, respektivno. Na kraju sinteze oligonukleotidi su odvojeni od čvrste podloge upotrebom vodenog amonijaka tokom 5-16 sati na 60°C. Oligonukleotidi su prečišćeni sa HPLC na obrnutim fazama (RP-HPLC) ili ekstrakcijama čvrste fazne supstance i okarakterisani pomoću UPLC, i molekulska masa je dodatno potvrđena pomoću ESI-MS. Videti ispod za više detalja.
Elongacija oligonukleotida
[0286] Spajanje β-cijanoetil-fosforamidita (DNK-A(Bz), DNK-G(ibu), DNK-C(Bz), DNK-T, LNA-5-metilC(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf), LNA-T ili C6-S-S-C6 linker) se izvodi upotrebom rastvora od 0,1 M 5'-O-DMT- zaštićenog amidita u acetonitrilu i DCI (4,5-dicijanoimidazol) u acetonitrilu (0,25 M) kao aktivatora. Za završni ciklus upotrebljen je komercijalno dostupan C6-povezan holesterol fosforamidit od 0,1 M u DCM. Tiolacija za uvođenje fosfortioatnih veza vrši se upotrebom ksantan hidrida (0,01 M u acetonitril/piridinu 9:1). Fosfordiestarske veze se uvode upotrebom 0,02 M joda u THF/piridin/vodi 7:2:1. Ostali reagensi su oni koji se uobičajeno upotrebljavaju za sintezu oligonukleotida. Za konjugaciju posle sinteze na čvrstoj fazi upotrebljen je komercijalno dostupan C6 aminolinker fosforamidit u poslednjem ciklusu sinteze na čvrstoj fazi i posle uklanjanja zaštite i odvajanja od čvrste podloge izolovan je amino-povezani deprotektovani oligonukleotid. Konjugati su uvedeni putem aktivacije funkcionalne grupe upotrebom standardnih postupaka sinteze.
Prečišćavanje putem RP-HPLC:
[0287] Sirova jedinjenja su prečišćena preparativnim RP-HPLC na Phenomenex Jupiter C18 10μ 150x10 mm koloni. 0,1 M amonijum acetat pH 8 i acetonitril su upotrebljeni kao puferi sa brzinom protoka od 5 mL/min. Prikupljene frakcije su liofilizovane da daju prečišćeno jedinjenje uobičajeno kao belu čvrstu supstancu.
Skraćenice:
[0288]
DCI: 4,5-dicijanoimidazol
DCM: Dihlorometan
DMF: Dimetilformamid
DMT: 4,4'-Dimetoksitritil
THF: Tetrahidrofuran
Bz: Benzoil
Ibu: Izobutiril
RP-HPLC: Tečna hromatografija visokih performansi na obrnutim fazama
[0289] Sintetisana jedinjenja pokazana su u Tabeli 1 i takođe su ilustrovana na Slikama.
Primer 1 Otkrivanje novog PCSK9 ciljnog motiva
[0290] 521 anti-PCSK9 antisens oligonukleotidi - svi sa tri zaključane nukleinske kiseline koje se nalaze bočno od deset DNK, tj. sa 16-mer LNA gapmer dizajnom - specifičnim za PCSK9 ljudi i primata je dizajniran i sintetisan. Humana ćelijska linija 15PC3 je inkubirana tokom tri dana bilo sa simuliranim (mock) ili zaključanim nukleinskom kiselinom modifikovanim oligonukleotidima koji ciljno deluju na humani PCSK9 u koncentraciji 0,3 μM. Svaki anti-PCSK9 oligonukleotid testiran je u tri nezavisna eksperimenta. Nivoi PCSK9 iRNK su kvantifikovani iz ekstrahovane RNK upotrebom PCR u realnom vremenu kako je opisano, i predstavljeni normalizovani do β-aktin iRNK i u odnosu na prosečne nivoe u dvanaest simulirano tretiranih uzoraka na slici 8, sa krupnim planom podgrupe najpotentnijih molekula na slici 9.
Primer 2 in vitro iRNK inaktiviranje (nokautiranje)
[0291] Humana ćelijska linija 15PC3 je inkubirana tokom 3 dana bilo sa simuliranim ili zaključanom nukleinskom kiselinom modifikovanim oligonukleotidima sa SEQ ID 1 do 8 ciljanih na humani PCSK9 u koncentracijama 0,0012, 0,06, 0,3 i 1,5 μM. Nivoi PCSK9 iRNK su kvantifikovani iz ekstrahovane RNK upotrebom PCR u realnom vremenu kako je opisano,
1
i predstavljeni u odnosu na prosečne nivoe u četiri simulirano tretirana uzorka na slici 10. Za svaki oligonukleotid, potencija, kvantifikovana kao polovina maksimalno efikasne koncentracije (EC50), određena je prilagođavanjem (fitting) najmanjim kvadratima Hilove jednačini u logističkom obliku sa dva parametra sa donjom granicom fiksiranom na 0% i gornjom granicom fiksiranom na 100%, kao EC50 = procena ± standardna devijacija.
Primer 3 - in vivo nivoi ALT
[0292] Četiri nedelje starim ženkama NMRI miševa (Taconic, Danska), težine približno 20 g po dolasku, injektiran je intravenski jednom ili fiziološki rastvor ili zaključanom nukleinskom kiselinom modifikovani, holesterolom konjugovani, oligonukleotidi sa SEQ ID 9 do 16 ciljani na humani PCSK9 u dozama 7,5 i 15 mg/kg. Miševi su žrtvovani 7 dana posle primene i nivoi alanin aminotransferaze (ALT) u serumu su određeni upotrebom enzimskog testa (Horiba ABX Diagnostics). Za svaku grupu tretmana od pet miševa, srednja vrednost i standardne devijacije su izračunate i predstavljene na slici 11 u odnosu na srednje vrednosti kod miševa tretiranih fiziološkim rastvorom. Primećeni su porast ALT-a kod obe koncentracije za neke, ali ne sve, holesterolom konjugovane molekule. Nekoliko jedinjenja, kao što su SEQ ID NO 9 i 10, nije povećalo ALT kod miševa na klinički značajan način čak ni kada se holesterol upotrebljavao kao konjugat za poboljšanje unosa jedinjenja u jetri.
Primer 4: Studija na ne-humanim primatima
[0293] Primarni cilj ove studije bio je istražiti odabrane lipidne markere tokom 7 nedelja posle jedne spore bolus injekcije anti-PCSK9 LNA jedinjenja cinomolgus majmunima i proceniti potencijalnu toksičnost jedinjenja kod majmun. Jedinjenja upotrebljena u ovoj studiji su SEQ ID NO 1013, 18, 19, 20 i 21, pripremljena u sterilnom fiziološkom rastvoru (0,9%) u početnoj koncentraciji od 0,625 i 2,5 mg/ml).
[0294] Mužjaci majmuna starosti od najmanje 24 meseca su upotrebljeni, omogućen im je slobodan pristup česmenskoj vodi i 180 g MWM(E) SQC SHORT proširene ishrane (Dietex France, SDS, Saint Gratien, Francuska) je distribuirano dnevno po životinji. Ukupna količina hrane distribuirana u svaki kavez izračunavaće se u skladu sa brojem životinja u kavezu tog dana. Uz to, voće ili povrće je svakodnevno davano svakoj životinji. Životinje su aklimatizovane na uslove studije tokom perioda od najmanje 14 dana pre početka perioda tretmana. Tokom ovog perioda izvršena su pred-tretman ispitivanja. Životinjama je dozirano
2
i.v. u jednoj dozi od 0,25, 1,0 ili 2,5 mg/kg (SEQ ID NO 10, 13, 18, i 21) ili u jednoj dozi od 1,0 ili 2,5 mg/kg (SEQ ID NO 19 i 20). Zapremina doze bila je 0,4 mL/kg. Upotrebljene su 2 životinje po grupi.
[0295] Doze formulacija su primenjene jednom dana 1. Životinje su posmatrane tokom perioda od 7 nedelja posle tretmana, i otpuštene su iz studije na dan 51. Dan 1 odgovara prvom danu perioda tretmana. Klinička opažanja i telesna težina i unos hrane (po grupi) biće zabeležena pre i tokom studije.
[0296] Krv je uzorkovana i analize su vršene u sledećim vremenskim tačkama:
Dan studije Parametri
-8 RCP, L, Apo-B, PCSK9*, OA
-1 L, Apo-B, PCSK9*, PK, OA
1 Doziranje
4 LSB, L, Apo-B, PCSK9*, OA
8 LSB, L, Apo-B, PCSK9*, PK, OA
15 RCP, L, Apo-B, PCSK9*, PK, OA
22 LSB, L, Apo-B, PCSK9*, PK, OA
29 L, Apo-B, PCSK9*, PK, OA
36 LSB, L, Apo-B, PCSK9*, PK, OA
43 L, PK, Apo-B, PCSK9*, PK, OA
50 RCP, L, Apo-B, PCSK9*, PK, OA
RCP = rutinska klinička patologija, LSB = biohemija bezbednosti jetre, PK = farmakokinetici, OA = druge analize, L = lipidi.
[0297] Sledeći parametri su određeni za sve preživele životinje u prilikama navedenim u daljem tekstu:
• potpuni biohemijski panel (kompletna lista ispod) - na dane -8, 15 i 50,
• bezbednost jetre (ASAT, ALP, ALAT, TBIL i GGT samo) - na dane 4, 8, 22 i 36,
• lipidni profil (ukupni holesterol, HDL-C, LDL-C i trigliceridi) i Apo-B samo - na dane -1, 4, 8, 22, 29, 36, i 43.
[0298] Krv (približno 1,0 mL) je uzeta u epruvete sa litijum heparinom (upotrebom ADVIA 1650 analizatora biohemije krvi): Apo-B, natrijum, kalijum, hlorid, kalcijum, neorganski fosfor, glukoza, HDL-C, LDL-C, urea, kreatinin, ukupan bilirubin (TBIL), ukupan holesterol, trigliceridi, alkalna fosfataza (ALP), alanin aminotransferaza (ALAT), aspartat aminotransferaza (ASAT), kreatin kinaza, gama-glutamil transferaza (GGT), laktat dehidrogenaza, ukupan protein, albumin, odnos albumin/globulin.
[0299] Analiza PCSK9 u krvi: Uzorci krvi za PCSK9 analizu prikupljeni su dana -8, -1, 4, 8, 15, 22, 29, 36, 43 i 50. Venska krv (približno 2 mL) prikupljena je iz odgovarajuće vene svake životinje u epruvetu za odvajanje seruma (SST) i ostavljena je da se zgruša najmanje 60 ± 30 minuta na sobnoj temperaturi. Krv je centrifugirana na 1000 g tokom 10 minuta u hlađenim uslovima (podešeno da održava 4°C). Serum će biti prenet u 3 pojedinačne epruvete i čuvan na -80°C dok se ne analizira na CitoxLAB Francuska upotrebom ELISA postupka (Circulex Human PCSK9 ELISA komplet, CY-8079, validiran za uzorke cinomolgus majmuna).
[0300] Druge analize: WO2011/009697 obezbeđuje postupke za sledeće analize: qPCR, PCSK9 iRNK analiza. Druge analize uključuju PCSK9 protein ELISA, analizu Lp(a) u serumu sa ELISA (Mercodia br. 10-1106-01), analizu oligonukleotida u tkivu i plazmi (sadržaj leka), ekstrakciju uzoraka, standardni- i QC-uzorci, određivanje sadržaja oligonukleotida pomoću ELISA.
[0301] Podaci za PCSK9 ciljajuća jedinjenja su pokazani u sledećoj tabeli:
4
[0302] Nije bilo naznaka hepatotoksičnosti ili nefrotoksičnosti sa PCSK9 ciljajućim jedinjenjima. Primetno, PCSK9-GalNAc jedinjenja dala su brzo i visoko efikasno smanjenje PCSK9 koje se zadržal tokom dužeg vremenskog perioda (čitavo trajanje studije), ilustrujući da su GalNAc konjugovana jedinjenja efikasnija, kako u pogledu brzog početnog inaktiviranja, tako i dužine trajanja, što ukazuje da se mogu dozirati relativno retko i u manjoj dozi, u poređenju i sa nekonjugovanim roditeljskim jedinjenjima, i jedinjenjima koja upotrebljavaju alternativnu tehnologiju konjugacije, kao što je holesterol konjugacija. SEQ ID NO 18 je dao brzo i dosledno smanjenje PCSK9 i LDL-C tokom trajanja studije (uočeno dana 34 pri dozi od 2,5 mg/kg, sa primetnim smanjenjem PCSK9 uočenim 48 dana posle primene jedne doze od 2,5 mg/kg gde je nivo PCSK9 proteina u plazmi bio 71% od pred-doze).
Primer 5: Procena toksičnosti na jetru i bubreg kod pacova
[0303] Jedinjenja pronalaska se mogu proceniti za svoj profil toksičnosti kod glodara, kao što su miševi ili pacovi. Može se upotrebiti sledeći protokol: Wistar Han Crl:WI(Han) su upotrebljeni pri starosti od približno 8 nedelja. U ovom uzrastu, mužjaci su težili približno 250 g. Sve životinje su imale slobodan pristup peletiranoj dijeti za održavanje SSNIFF R/M-H (SSNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest, Nemačka) i česmenskoj vodi (filtrirane sa 0,22 μm filterom) koja se nalazila u bocama. Upotrebljen je nivo doze od 10 i 40 mg/kg/dozi (subkutana primena) i doziran u danima 1 i 8. Životinje su eutanazirane na dan 15. Uzorci urina i krvi prikupljeni su dana 7 i 14. Klinička patološka procena je izvršena na dan 14. Telesna težina se određuje pre studije, prvog dana primene, i 1 nedelju pre nekropsije. Potrošnja hrane po grupi bila je procenjena dnevno. Uzorci krvi uzeti su iz repne vene posle 6 sati gladovanja. Obavljena je sledeća analiza krvnog seruma: broj eritrocita, srednja vrednost zapremine ćelija, puni volumen ćelija (hematokrit), hemoglobin, srednja vrednost koncentracije hemoglobina u ćeliji, broj trombocita, broj leukocita, diferencijalni broj belih krvnih zrnaca sa ćelijskom morfologijom, broj retikulocita, natrijum, kalijum, hlorid, kalcijum, neorganski fosfor, glukoza, urea, kreatinin, ukupni bilirubin, ukupni holesterol, trigliceridi, alkalna fosfataza, alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, ukupni protein, albumin, odnos albumin/globulin. Izvedena je analiza mokraće: α-GST, β-2 mikroglobulin, kalbindin, klusterin, cistatin C, KIM-1, osteopontin, TIMP-1, VEGF, i NGAL. Sedam analita (kalbindin, klusterin, GST-α, KIM-1, osteopontin, TIMP-1, VEGF) je kvantifikovano pod panelom 1 (MILLIPLEX® MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 1, RKTX1MAG-37K). Tri analita (β-2 mikroglobulin, cistatin C, lipokalin-2/NGAL) je kvantifikovano pod panelom 2 (MILLIPLEX® MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 2, RKTX2MAG-37K). Test za određivanje koncentracije ovih biomarkera u urinima pacova zasnovan je na tehnologiji Luminex xMAP®. Mikrosfere presvučene anti -α-GST / β-2 mikroglobulin / kalbindin / klusterin / cistatin C / KIM-1 / osteopontin / TIMP-1 / VEGF / NGAL antitelima su identifikovane po boji sa dve različite fluorescentne boje. Sledeći parametri su određeni (urin pomoću ADVIA 1650): protein u urinu, kreatinin u urinu. Kvantitativni parametri: zapremina, pH (upotrebom 10-Multistix SG test traka/Clinitek 500 analizatora urina), specifična težina (upotrebom refraktometra). Polu-kvantitativni parametri (upotrebom 10-Multistix SG test traka/Clinitek 500 analizatora urina): proteini, glukoza, ketoni, bilirubin, nitriti, krv, urobilinogen, citologija sedimenta (mikroskopskim pregledom). Kvalitativni parametri: izgled, boja. Posle žrtvovanja, određuje se telesna težina i težina bubrega, jetre i slezine i izračunava se odnos težine organa i telesne težine. Uzeti su uzorci bubrega i jetre i ili su zamrznuti ili uskladišteni u formalinu. Izvršena je mikroskopska analiza. Podaci za Kim-1 ekspresiju su pokazani na Slici 15, gde je pokazano da su svi molekuli osim SEQ ID NO 4 imali niži urinarni kim-1 signal nego SEQ ID NO 1, pokazujući poboljšanu bezbednost za bubreg u odnosu na originalni i ranije okarakterisani nekonjugovani molekul.
Primer 6 Analiza odvojivih linkera
[0304] FAM-obeleženi antisens oligomeri (ASO) sa različitim DNK/PO-linkerima podvrgnuti su in vitro odvajanju bilo u ekstraktu S1 nukleaze (tabela ispod), homogenatima jetre ili bubrega ili serumu.
[0305] Velika slova su LNA nukleozidi (kao što je beta-D-oksi LNA), mala slova su DNK nukleozidi. Subskript s predstavlja fosforotioatne internukleozidne veze. LNA citozini su opciono 5-metil citozin. FAM konjugatni deo je pokazan na Slici 6, a molekuli su pokazani na Slici 7.
[0306] FAM-obeleženi ASO 100 μM sa različitim DNK/PO-linkerima podvrgnuti su in vitro odvajanju putem S1 nukleaze u nukleaznom puferu (60 U pr.100 μL) tokom 20 i 120 minuta (A). Enzimska aktivnost je zaustavljena dodavanjem EDTA rastvoru pufera. Rastvori su tada podvrgnuti AIE HPLC analizama na Dionex Ultimate 3000 upotrebom Dionex DNApac p-100 kolona i gradijenta u opsegu od 10 mM - 1 M natrijum perhlorata na pH 7,5. Sadržaj odvojenih i neodvojenih oligonukleotida je određen prema standardu upotrebom i detektora fluorosensce na 615 nm i uv detektora na 260 nm.
[0307] Zaključak: PO linkeri (ili region B kako se ovde označava) rezultiraju odvajanjem konjugata (ili grupe C), i dužina i/ili sastav sekvence linkera mogu se upotrebiti za modulaciju podložnosti na nukleolitičko odvajanje regiona B. Sekvenca DNK/PO-linkera može modulirati stopu odvajanja kao što je uočeno posle 20 min u ekstraktu nukleaze S1. Selekcija sekvence za region B (npr. za DNK/PO-linker) može se stoga takođe upotrebiti za modulaciju nivoa odvajanja u serumu i u ćelijama ciljnih tkiva.
[0308] Homogenati jetre i bubrega i serum začinjeni su jedinjenjem SEQ ID NO 35 do koncentracije 200 μg/g tkiva. Uzorci jetre i bubrega prikupljeni iz NMRI miševa su homogenizovani u puferu za homogenizaciju (0,5% Igepal CA-630, 25 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, pH 8,0 (podešeno sa 1 N NaOH). Homogenati su inkubirati tokom 24 sata na 37°C i nakon toga homogenati su ekstrahovani sa fenol-hloroformom. Sadržaj odvojenog i neodvojenog oligo u ekstraktu iz jetre i bubrega i iz seruma određeni su prema standardu upotrebom gornje HPLC metode:
[0309] Zaključak: PO linkeri (ili region B kako se ovde označava) rezultiraju kada se konjugat (ili grupa C) odvoji, u homogenatu jetre ili bubrega, ali ne u serumu. Podložnost odvajanju u testovima pokazanim u Primeru 6 može se upotrebiti za određivanje da li je linker bio-odvojiv ili fiziološki labilan. Primetite da odvajanje u gore navedenim testovima označava odvajanje odvojivog linkera, oligomer ili region A treba da ostane funkcionalno netaknut.
Primer 7: Inaktiviranje PCSK9 iRNK sa holesterol konjugatima in vivo
[0310]
PCSK9 - Jedinjenja specifična za miša
[0311] NMRI miševima injektirana je jedna doza fiziološkog rastvora ili 10 mg/kg nekonjugovanog LNA-antisens oligonukleotida (SEQ ID 40) ili ekvimolarnih količine LNA antisens oligonukleotida konjugovanih za holesterol sa različitim linkerima i žrtvovani su u danima 1-10 u skladu sa Tab.5.
[0312] RNK je izolovana iz jetre i bubrega i podvrgnuta qPCR-u sa PCSK9 specifičnim prajmerima i istražena kako bi se analiziralo inaktiviranje PCSK9 iRNK. Rezultati su pokazani na slici 14.
[0313] Zaključci: holesterol konjugovan za PCSK9 LNA antisens oligonukleotid sa linkerom sastavljenim od 2 DNK sa fofodiestar-okosnicom (SEQ ID NO 42 i SEQ ID NO 43) pokazao je poboljšanu inaktivaciju PCSK9 (Sl.14) u jetri u poređenju sa nekonjugovanim jedinjenjem (SEQ ID NO 40), kao i u poređenju sa konjugatima holesterola sa stabilnim linkerom (SEQ ID NO 41).
Materijali i metode:
�
�
[0315] Primena doze. NMRI ženkama životinja, približno 20 g na dolasku, dozirano je 10 ml po kg TT (u skladu sa telesnom težinom dana 0) i.v. jedinjenja formulisanog u fiziološkom rastvoru ili samo fiziološkog rastvora u skladu sa tabelom iznad.
[0316] Uzorkovanje tkiva jetre i bubrega. Životinje su anestezirane sa 70% CO2-30% O2i žrtvovane cervikalnom dislokacijom u skladu sa Tabelom 4. Polovina velikog režnja jetre i jedan bubreg su samleveni i potopljeni u RNKlater.
[0317] Ukupna RNK je ekstrahovana iz maksimalno 10 mg tkiva homogenizovanog mlevenjem sa perlama u prisustvu MagNA Pure LC RNK izolacionog pufera za tkiva (Roche kat. br. 03 604 721 001) upotrebom MagNa Pure 96 Cellular RNK kompleta za veliku zapreminu (Roche kat. br. 5467535001), u skladu sa uputstvima proizvođača. Sinteza prvog lanaca je izvedena upotrebom Ambionovih reagenasa za reverznu transkriptazu u skladu sa uputstvima proizvođača.
[0318] Za svaki uzorak 0,5 μg ukupne RNK je podešeno na (10,8 μl) sa H2O bez RNaze i pomešano sa 2 μl nasumičnih dekamera (50 μM) i 4 μl dNTP mešavine (2,5 mM svaki dNTP) i zagrejano na 70 °C tokom 3 min, posle čega su uzorci brzo ohlađeni na ledu.2 μl 10x pufer RT, 1 μl MMLV reverzna transkriptaza (100 U/μl) i 0,25 μl inhibitora RNaze (10 U/μl) je dodato svakom uzorku, nakon čega je sledila inkubacija na 42 °C tokom 60 minuta, inaktivacija toplotom enzima na 95 °C tokom 10 min, i potom je uzorak ohlađen do 4 °C. cDNK uzorci su razblaženi 1:5 i podvrgnuti RT-QPCR upotrebom Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems Kat #4364103) i Taqman testa ekspresije gena (mPCSK9, Mn00463738_m1 i mActin #4352341E) prateći protokol proizvođača i obrađeni su u Applied Biosystems RT-qPCR instrumentu (7500/7900 ili ViiA7) u brzom režimu.
Primer 8: Studija na ne-humanim primatima; višestruko injektiranje s.c.
[0319] Cilj ove studije na ne-humanim primatima je bio da se proceni efikasnost i bezbednost anti-PCSK9 jedinjenja u okolnostima ponavljane primene, kada su jedinjenja primenjivana subkutanom injekcijom (s.c.). Jedinjenja upotrebljena u ovoj studiji su SEQ ID NO 2, 3, 18, i 19, pripremljena u sterilnom fiziološkom rastvoru (0,9%) u početnoj koncentraciji od 0,625 i 2,5 mg/ml.
[0320] Ženke cinomolgus majmuna starosti od najmanje 24 meseca su upotrebljene, i omogućen im je slobodan pristup česmenskoj vodi i 180 g OWM(E) SQC SHORT proširene ishrane (Dietex France, SDS, Saint Gratien, Francuska) je distribuirano dnevno po životinji. Uz to, voće ili povrće je svakodnevno davano svakoj životinji. Životinje su aklimatizovane na
4
uslove studije tokom perioda od najmanje 14 dana pre početka perioda tretmana. Tokom ovog perioda izvršena su pred-tretman ispitivanja. Životinjama je dozirano s.c. jednom nedeljno tokom četiri nedelje u dozi od 0,5 mg/kg (SEQ ID NO 2, 3, 18, i 19) ili 1,5 mg/kg/injekciji (SEQ ID NO 18 i 19), sa ukupno četiri injekcije tokom perioda od četiri nedelje. Zapremina doze bila je 0,4 mL/kg/injekciji. Upotrebljeno je šest životinja po grupi. Posle četvrte i završne doze životinje su posmatrane nedelju dana nakon čega je polovina životinja žrtvovano kako bi se proučili regulacija apoB transkripta jetre, lipidni parametri, histologija jetre i bubrega, i distribucija u tkivu jetre i bubrega. Dan 1 odgovara prvom danu perioda tretmana. Klinička opažanja i telesna težina i unos hrane (po grupi) zabeležena su pre i tokom studije.
[0321] Krv i tkiva su uzorkovani i analizirani u sledećim vremenskim tačkama:
Dan studije Parametri
-10 L, Apo-B, OA
-5 LSB, L, Apo-B, OA
-1 RCP, L, Apo-B, PK, OA
1 Doziranje
8 pre doze LSB, L, Apo-B, PK, OA
8 Doziranje
15 pre doze LSB, L, Apo-B, PK, OA
15 Doziranje
22 pre doze LSB, L, Apo-B, PK, OA
22 Doziranje
29 RCP, PK, OA glavna nekropsija
36 (životinje koje se oporavljaju) LSB, L, Apo-B, PK, OA
43 (životinje koje se oporavljaju) RCP, PK, Apo-B, PK, OA
50 (životinje koje se oporavljaju) LSB, L, Apo-B, PK, OA
57 (životinje koje se oporavljaju) LSB, L, Apo-B, PK, OA
64 (životinje koje se oporavljaju) LSB, L, Apo-B, PK, OA
Dan studije Parametri
71 (životinje koje se oporavljaju) LSB, L, Apo-B, PK, OA
78 (životinje koje se oporavljaju) RCP, L, Apo-B, PK, OA nekropsija oporavka
RCP: rutinska klinička patologija, LSB: biohemija bezbednosti jetre, PK: farmakokinetici, OA: druge analize, L: lipidi
[0322] Krv (približno 1,0 mL) je uzeta u epruvete sa litijum heparinom (upotrebom ADVIA 1650 analizatora biohemije krvi) analizirajući natrijum, kalijum, hlorid, kalcijum, neorganski fosfor, glukozu, HDL-C, LDL-C, ureu, kreatinin, ukupan bilirubin (TBIL), ukupan holesterol, trigliceride, alkalnu fosfatazu (ALP), alanin aminotransferazu (ALAT), aspartat aminotransferazu (ASAT), kreatin kinazu, gama-glutamil transferazu (GGT), laktat dehidrogenazu, ukupan protein, albumin, odnos albumin/globulin.
[0323] Analiza krvi: Uzorci krvi za ApoB analizu prikupljeni su samo od Grupe životinja 1-16 (tj. životinja tretiranih anti-ApoB jedinjenjima) dana -8, -1, 4, 8, 15, 22, 29, 36, 43 i 50. Venska krv (približno 2 mL) prikupljena je iz odgovarajuće vene svake životinje u epruvetu za odvajanje seruma (SST) i ostavljena je da se zgruša najmanje 60 ± 30 minuta na sobnoj temperaturi. Krv je centrifugirana na 1000 g tokom 10 minuta u hlađenim uslovima (podešeno da održava 4°C). Serum je prenet u 3 pojedinačne epruvete i čuvan na -80°C do analize ApoB proteina pomoću ELISA.
[0324] Druge analize: WO2010142805 obezbeđuje postupke za sledeće analize: qPCR, ApoB iRNK analiza. Druge analize uključuju analizu Lp(a) u serumu pomoću ELISA (Mercodia br.
10-1106-01), analizu oligonukleotida u tkivu i serumu (sadržaj leka), ekstrakciju uzoraka, standardni - i QC-uzorci, određivanje sadržaja oligonukleotida pomoću ELISA.
[0325] Predviđena farmakologija za anti-PCSK9 oligonukleotid je redukcija LDL holesterola redukcijom PCSK9 proteina u cirkulaciji ("PCSK9 u serumu"). GalNAc konjugovani molekuli pokazali su povećanu efikasnost u poređenju sa nekonjugovanim molekulima tokom ispitivanja i PCSK9 i LDL holesterola u serumu (Slika 16 i Slika 17). Slika 16 ilustruje da su četiri nedeljne injekcije 0,5 mg/kg/injekciji nekonjugovanog SEQ ID NO 2 imale samo manje efekte na serumski PCSK9 i LDL holesterol, dok je GalNAc konjugat iste LNA gap-mer (SEQ ID 18) imao potentan redukujući efekat i na serumski PCSK9 i na LDL holesterol. Isti odnos je primećen kada se uporede podaci za višestruka injektiranja SEQ ID NO 3 i SEQ ID NO 19 (Slika 17): samo manji efekti nekonjugovanog molekula i potentno smanjenje serumskog PCSK9 i LDL holesterola odgovarajućim GalNAc konjugatom (SEQ ID NO 19). Treba napomenuti da su efekti SEQ ID 18 i 19 na serumski PCSK9 i LDL holesterol zavisni od doze i sa dužim trajanjem delovanja, sa serumskim PCSK9 i LDL holesterolom nižim od proseka početnih nivoa tokom najmanje sedam nedelja nakon poslednje injekcije (poslednji dan injektiranja 22, podaci su ilustrovani za period oporavka do dana 71).
[0326] Sadržaj oligonukleotida u jetri i bubregu analiziran je jednu nedelju posle poslednje injekcije, tj. dana 29 studije. Sadržaj oligonukleotida je analiziran upotrebom hibridizacije ELISA (u osnovi kako je opisano u Lindholm et al, Mol Ther. 2012 Feb;20(2):376-81), upotrebom SEQ ID NO 2 za pripremu standardne krive za uzorke iz životinja koje su tretirane sa SEQ ID NO 2 i SEQ ID NO 18, nakon što je prekontrolisano da nije bilo promene rezultata ukoliko je (konjugovana) SEQ ID NO 18 upotrebljena za pripremu standardne krive. Na isti način, SEQ ID NO 3 je upotrebljena za pripremu standardne krive za SEQ ID NO 3 i SEQ ID NO 19 posle kontrole da nije bilo razlike u rezultatu ukoliko je SEQ ID NO 19 upotrebljena za pripremu standardne krive za ELISA analizu tih uzoraka.
[0327] Kao što je ilustrovano u tabeli iznad, konjugacija SEQ ID NO 2 i SEQ ID NO 3 rezultirala je višim jetri/bubreg odnosima za konjugovane molekule (SEQ ID NO 18 i SEQ ID 19) nego za odgovarajuće nekonjugovane molekule jednu nedelju posle poslednje injekcije kada su životinje injektirane s.c. jednom/nedelji tokom četiri nedelje. S obzirom na to da su znaci tubulotoksičnosti pokazani sa drugim nekonjugovanim anti-PCSK9 molekulima (kao što je SEQ ID NO 1, kako je ilustrovano na Slici 15), i imajući u vidu da je jetra ciljni organ za anti-PCSK9 tretman, očekuje se da pomak na viši jetra/bubreg odnos rezultira u povećanoj bezbednosti sa konjugovanim SEQ ID NO 18 i 19 u poređenju sa nekonjugovanim SEQ ID NO 2 i 3.
[0328] Kao što je ilustrovano na Slici 16 i Slici 18, SEQ ID NO 18 i 19 dozirane su na farmakološki relevantnim nivoima. Profili kliničke hemije istih životinja tokom perioda tretmana i faze oporavka nisu pokazali klinički relevantna povećanja parametara bezbednosti za jetru ili bubreg.
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11

Claims (21)

  1. Patentni zahtevi 1. Antisens oligonukleotidni konjugat naznačen time što sadrži a. antisens oligomer (A) od između 16 - 22 nukleotida u dužini, koji sadrži neprekidnu sekvencu od 16 nukleotida koji su komplementarni odgovarajućoj dužini SEQ ID NO 31, i pri čemu je navedeni antisens oligomer LNA gapmer, i b. najmanje jedan konjugatni deo koji ciljno deluje na asijaloglikoproteinski receptor (C) kovalentno prikačen za navedeni oligomer (A).
  2. 2. Antisens oligonukleotidni konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što sekvenca antisens oligomera (A) sadrži neprekidnu sekvencu SEQ ID NO 26.
  3. 3. Antisens oligonukleotidni konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što sekvenca antisens oligomera sadrži neprekidnu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 2 i SEQ ID NO 3.
  4. 4. Antisens oligonukleotidni konjugat u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što konjugatni deo (C) sadrži N-acetilgalaktozaminski (GalNAc) deo, kao što je mono-valentni, di-valentni, tri-valentni ili tetra-valentni GalNAc deo.
  5. 5. Antisens oligonukleotidni konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačen time što konjugatni deo (C) sadrži tri-valentni GalNAc deo.
  6. 6. Antisens oligonukleotidni konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačen time što je tri-valentni GalNAc deo odabran iz grupe koja se sastoji od Conj 1, 2, 1a i 2a:
  7. 7. Antisens oligonukleotidni konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 1, koji je odabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO 18 i SEQ ID NO 19.
  8. 8. Antisens oligonukleotidni konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačen time što je antisens oligomer (A) konjugovan za konjugatni deo (C) putem linker regiona (B i/ili Y) koji je smešten između neprekidne sekvence oligomera i konjugatnog dela. 11
  9. 9. Antisens oligonukleotidni konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačen time što je linker odabran od C6 do C12 amino alkil grupe ili bio-odvojivog fosfat nukleotidnog linkera koji sadrži između 1 do 6 nukleotida.
  10. 10. Antisens oligonukleotid u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što neprekidna sekvenca sadrži nukleotidne analoge za povećanje afiniteta.
  11. 11. Antisens oligonukleotid u skladu sa patentnim zahtevom 10, naznačen time što su navedeni nukleotidni analozi nukleotidi modifikovani šećerom nezavisno ili zavisno odabrani iz grupe koja se sastoji od 2'-O-alkil-RNK jedinica, 2'-OMe-RNK jedinica, 2'-amino-DNK jedinica, i 2'-fluoro-DNK jedinica.
  12. 12. Antisens oligonukleotid u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačen time što oligomer sadrži jednu ili više nukleozidnih veza odabranih iz grupe koja se sastoji od fosforotioata, fosforoditioata i boranofosfata.
  13. 13. Antisens oligonukleotidni konjugat u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što se oligonukleotidni konjugat sastoji od SEQ ID NO 18 i SEQ ID NO 19
    pri čemu superskript L predstavlja beta-D-oksi LNA jedinicu, MeC predstavlja 5-metilcitozin, subskriptspredstavlja fosforotioatnu internukleozidnu vezu, i pri čemu
    11 je Conj 2a konjugatni deo koji ciljno deluje na asijaloglikoproteinski receptor
  14. 14. Oligomer od između 16 - 20 nukleotida u dužini, naznačen time što sadrži neprekidnu sekvencu od 16 nukleotida koji su komplementarni odgovarajućoj dužini SEQ ID NO 31, pri čemu je navedeni oligomer LNA gamper.
  15. 15. Oligomer prema patentnom zahtevu 14, naznačen time što neprekidna sekvenca sadrži nukleotidne analoge za povećanje afiniteta nezavisno ili zavisno odabrane iz grupe koja se sastoji od 2'-O-alkil-RNK jedinica, 2'-OMe-RNK jedinica, 2'-amino-DNK jedinica, i 2'-fluoro-DNK jedinica.
  16. 16. Oligomer u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 14 do 15, naznačen time što oligomer sadrži jednu ili više nukleozidnih veza odabranih iz grupe koja se sastoji od fosforotioata, fosforoditioata i boranofosfata.
  17. 17. Oligomer u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 14 do 16, naznačen time što sadrži neprekidnu sekvencu SEQ ID NO 2 ili SEQ ID NO 3.
  18. 18. Farmaceutska kompozicija naznačena time što sadrži oligomer ili antisens oligonukleotidni konjugat u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 17 i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač, so ili adjuvans.
  19. 19. Oligomer ili antisens oligonukleotidni konjugat ili farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 18, za upotrebu kao medikament. 11
  20. 20. Oligomer ili antisens oligonukleotidni konjugat ili farmaceutska kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 19 za upotrebu u lečenju hiperholesterolemije ili srodnih poremećaja, kao što je poremećaj odabran iz grupe koja se sastoji od ateroskleroze, hiperlipidemije, hiperholesterolemije, porodične hiperholesterolemije, npr. dobijanjem funkcionalnih mutacija u PCSK9, disbalansa HDL/LDL holesterola, dislipidemija, npr. porodična hiperlipidemija (FCHL) ili porodična hiperholesterolemija (FHC), stečene hiperlipidemije, hiperholesterolemije rezistentne na statine, bolesti koronarnih arterija (CAD), i koronarne bolesti srca (CHD).
  21. 21. In vitro postupak za inhibiciju PCSK9 u ćeliji koja eksprimira PCSK9, naznačen time što navedeni postupak sadrži primenu oligomera ili antisens oligonukleotidnog konjugata ili farmaceutske kompozicije u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 18 navedenoj ćeliji. 11
RS20200114A 2013-06-27 2014-06-27 Antisens oligomeri i konjugati koji ciljno deluju na pcsk9 RS59986B1 (sr)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13174092 2013-06-27
EP13192930 2013-11-14
PCT/EP2013/073858 WO2014076195A1 (en) 2012-11-15 2013-11-14 Oligonucleotide conjugates
EP13192938 2013-11-14
EP14153253 2014-01-30
EP14168331 2014-05-14
EP14739708.7A EP3013959B1 (en) 2013-06-27 2014-06-27 Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
PCT/EP2014/063757 WO2014207232A1 (en) 2013-06-27 2014-06-27 Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59986B1 true RS59986B1 (sr) 2020-03-31

Family

ID=52141126

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200114A RS59986B1 (sr) 2013-06-27 2014-06-27 Antisens oligomeri i konjugati koji ciljno deluju na pcsk9

Country Status (30)

Country Link
US (7) US9879265B2 (sr)
EP (2) EP3591054A1 (sr)
JP (2) JP6255092B2 (sr)
KR (2) KR101931089B1 (sr)
CN (2) CN112263682B (sr)
AU (1) AU2014300981B2 (sr)
BR (1) BR112015032432B1 (sr)
CA (1) CA2915316C (sr)
CL (1) CL2015003728A1 (sr)
CY (1) CY1122738T1 (sr)
DK (1) DK3013959T3 (sr)
EA (1) EA201592215A1 (sr)
ES (1) ES2770667T3 (sr)
HR (1) HRP20200163T1 (sr)
HU (1) HUE048738T2 (sr)
IL (1) IL242875B (sr)
LT (1) LT3013959T (sr)
MX (2) MX391977B (sr)
MY (1) MY183049A (sr)
NZ (1) NZ715081A (sr)
PE (1) PE20160158A1 (sr)
PH (1) PH12015502761A1 (sr)
PL (1) PL3013959T3 (sr)
PT (1) PT3013959T (sr)
RS (1) RS59986B1 (sr)
SG (2) SG10201908122XA (sr)
SI (1) SI3013959T1 (sr)
SM (1) SMT202000104T1 (sr)
UA (1) UA119643C2 (sr)
WO (1) WO2014207232A1 (sr)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102282155B (zh) 2008-12-02 2017-06-09 日本波涛生命科学公司 磷原子修饰的核酸的合成方法
RU2612521C2 (ru) 2009-07-06 2017-03-09 Онтории, Инк. Новые пролекарства нуклеиновых кислот и способы их применения
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Wave Life Sciences Japan 不斉補助基
CN103796657B (zh) 2011-07-19 2017-07-11 波涛生命科学有限公司 合成官能化核酸的方法
PL2872485T3 (pl) 2012-07-13 2021-05-31 Wave Life Sciences Ltd. Asymetryczna grupa pomocnicza
KR102213609B1 (ko) 2012-07-13 2021-02-08 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
DK2992098T3 (da) 2013-05-01 2019-06-17 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af hbv- og ttr-ekspression
HUE048738T2 (hu) 2013-06-27 2020-08-28 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antiszensz oligomerek és konjugátumok, amelyek a PCK9-t célozzák meg
JPWO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
BR112016016400A2 (pt) 2014-01-16 2017-10-03 Wave Life Sciences Ltd Composições de oligonucleotídeos quiralmente controlados, seu uso, sua composição farmacêutica, e métodos
US9382540B2 (en) 2014-05-01 2016-07-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Compositions and methods for modulating angiopoietin-like 3 expression
EA036496B1 (ru) 2014-05-01 2020-11-17 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Конъюгированные олигонуклеотиды для модулирования экспрессии фактора комплемента b
BR112016022742B1 (pt) 2014-05-01 2022-06-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc Composto químico, composição compreendendo o composto e uso dos mesmos
GB201408623D0 (en) 2014-05-15 2014-07-02 Santaris Pharma As Oligomers and oligomer conjugates
KR102579520B1 (ko) 2015-08-06 2023-09-15 에프. 호프만-라 로슈 아게 Galnac 산 유도체의 제조 방법
US20210052631A1 (en) * 2015-09-25 2021-02-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
IL295755A (en) 2015-10-09 2022-10-01 Wave Life Sciences Ltd Oligonucleotide compositions and methods thereof
WO2017068087A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide detection method
KR20250078597A (ko) 2015-11-06 2025-06-02 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 아포리포프로테인 (a) 발현 조정
BR112018003910B1 (pt) 2015-11-16 2022-03-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Derivado de fosforamidita galnac, processo para a preparação de um derivado de fosforamidita galnac de fórmula i e uso dos derivados de fosforamidita galnac de fórmula i
RU2747822C2 (ru) 2016-03-14 2021-05-14 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Олигонуклеотиды для понижения экспрессии pd-l1
CA3020585A1 (en) * 2016-04-11 2017-10-19 Arbutus Biopharma Corporation Targeted nucleic acid conjugate compositions
JP7012033B2 (ja) 2016-06-17 2022-02-10 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー インビトロ腎毒性スクリーニングアッセイ
EP4219767A1 (en) 2016-06-17 2023-08-02 F. Hoffmann-La Roche AG Papd5 and papd7 inhibitors for treating a hepatitis b infection
CN109328236B (zh) * 2016-06-17 2022-10-25 豪夫迈·罗氏有限公司 体外肾毒性筛选测定法
WO2017220751A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded rna-editing oligonucleotides
CN110352244B (zh) 2016-09-01 2023-03-21 ProQR治疗上市公司Ⅱ 化学修饰的编辑rna的单链寡核苷酸
CA3035534A1 (en) 2016-09-07 2018-03-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
US11400161B2 (en) 2016-10-06 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method of conjugating oligomeric compounds
EP3568479A1 (en) 2017-01-13 2019-11-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating nfkb1 expression
EP3568477A1 (en) 2017-01-13 2019-11-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating rela expression
WO2018130584A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating nfkb2 expression
EP3568478A1 (en) 2017-01-13 2019-11-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating rel expression
US20190345496A1 (en) 2017-01-13 2019-11-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides for modulating relb expression
EP3594346A4 (en) 2017-03-10 2020-12-16 National Center For Child Health And Development ANTISENS OLIGONUCLEOTIDE AND COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF TYPE IA GLYCOGEN STORAGE DISEASE
JOP20190215A1 (ar) * 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
MX2019012280A (es) 2017-04-11 2020-01-23 Arbutus Biopharma Corp Composiciones dirigidas.
JP7050807B2 (ja) 2017-04-13 2022-04-08 カディラ ヘルスケア リミティド 新規ペプチドベースのｐｃｓｋ９ワクチン
WO2018215049A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for galnac oligonucleotide conjugates
US11273222B2 (en) 2017-05-26 2022-03-15 National Cerebral And Cardiovascular Center Antisense nucleic acid targeting PCSK9
US11597744B2 (en) 2017-06-30 2023-03-07 Sirius Therapeutics, Inc. Chiral phosphoramidite auxiliaries and methods of their use
WO2019030313A2 (en) 2017-08-11 2019-02-14 Roche Innovation Center Copenhagen A/S OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATION OF UBE3C EXPRESSION
WO2019038228A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Roche Innovation Center Copenhagen A/S OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATION OF TOM1 EXPRESSION
EP3694995A1 (en) 2017-10-13 2020-08-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Methods for identifying improved stereodefined phosphorothioate oligonucleotide variants of antisense oligonucleotides utilising sub-libraries of partially stereodefined oligonucleotides
CN111511914B (zh) 2017-10-16 2023-11-17 豪夫迈·罗氏有限公司 减少PAPD5和PAPD7 mRNA的核酸分子用于治疗乙型肝炎感染
WO2019115416A2 (en) 2017-12-11 2019-06-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating fndc3b expression
WO2019115417A2 (en) 2017-12-12 2019-06-20 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating rb1 expression
WO2019121838A1 (en) 2017-12-21 2019-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Companion diagnostic for htra1 rna antagonists
US11597926B2 (en) 2017-12-22 2023-03-07 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Thiophosphoramidites
CA3084170A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Gapmer oligonucleotides comprising a phosphorodithioate internucleoside linkage
WO2019122279A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides comprising a phosphorodithioate internucleoside linkage
US20210095274A1 (en) 2018-01-10 2021-04-01 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating pias4 expression
CN120310791A (zh) 2018-01-12 2025-07-15 百时美施贵宝公司 靶向α-突触核蛋白的反义寡核苷酸及其用途
SG11202006528XA (en) 2018-01-12 2020-08-28 Bristol Myers Squibb Co Antisense oligonucleotides targeting alpha-synuclein and uses thereof
SG11202006142PA (en) 2018-01-12 2020-07-29 Roche Innovation Ct Copenhagen As Alpha-synuclein antisense oligonucleotides and uses thereof
WO2019137974A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating gsk3b expression
CN111615558A (zh) 2018-01-17 2020-09-01 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 用于调节erc1表达的寡核苷酸
WO2019145386A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides for modulating csnk1d expression
MX2020008581A (es) 2018-02-21 2020-09-21 Bristol Myers Squibb Co Oligonucleotidos antisentido de la proteina cinasa del tipo ii delta dependiente del calcio/calmodulina (camk2d) y sus usos.
BR112020018902A2 (pt) * 2018-03-20 2021-01-26 Tokyo Institute Of Technology oligonucleotídeo antissenso com toxicidade reduzida
SG11202009680XA (en) 2018-04-05 2020-10-29 Hoffmann La Roche Use of fubp1 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
GB201808146D0 (en) 2018-05-18 2018-07-11 Proqr Therapeutics Ii Bv Stereospecific Linkages in RNA Editing Oligonucleotides
PE20210346A1 (es) 2018-07-03 2021-02-25 Hoffmann La Roche Oligonucleotidos para modular la expresion de tau
CN112534055A (zh) 2018-07-13 2021-03-19 豪夫迈·罗氏有限公司 用于调节rtel1表达的寡核苷酸
EP4122943B1 (en) 2018-07-31 2024-05-29 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotides comprising a phosphorotrithioate internucleoside linkage
BR112020025272A2 (pt) 2018-07-31 2021-03-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotídeos, oligonucleotídeo gapmer, sal farmaceuticamente aceitável, conjugado, composição farmacêutica, usos de um oligonucleotídeo, método para o tratamento ou profilaxia de uma doença, processo para a fabricação de um oligonucleotídeo e invenção
TW202045521A (zh) 2019-02-20 2020-12-16 丹麥商羅氏創新中心哥本哈根有限公司 新穎亞磷醯胺化物
TW202102516A (zh) 2019-02-20 2021-01-16 丹麥商羅氏創新中心哥本哈根有限公司 膦醯基乙酸酯間隙子寡核苷酸
JP7503072B2 (ja) 2019-02-26 2024-06-19 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス オリゴヌクレオチドの製剤化方法
US20220177894A1 (en) 2019-04-02 2022-06-09 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for immunotherapy
EP3947680A2 (en) 2019-04-03 2022-02-09 Bristol-Myers Squibb Company Angptl2 antisense oligonucleotides and uses thereof
WO2021122735A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of sept9 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2021122921A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of cops3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
JP2023506954A (ja) 2019-12-19 2023-02-20 エフ． ホフマン－ラ ロシュ エージー． Ｂ型肝炎ウイルス感染を処置するためのｓａｒａｆ阻害剤の使用
EP4077669A1 (en) 2019-12-19 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Use of sbds inhibitors for treating hepatitis b virus infection
WO2021122869A1 (en) 2019-12-19 2021-06-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Use of scamp3 inhibitors for treating hepatitis b virus infection
EP4081217A1 (en) 2019-12-24 2022-11-02 F. Hoffmann-La Roche AG Pharmaceutical combination of antiviral agents targeting hbv and/or an immune modulator for treatment of hbv
MX2022007908A (es) 2019-12-24 2022-07-21 Hoffmann La Roche Combinacion farmaceutica de un oligonucleotido terapeutico que actua sobre hbv y un agonista de tlr7 para el tratamiento de hbv.
GB2613225B (en) 2020-03-04 2024-01-03 Verve Therapeutics Inc Compositions and methods for targeted RNA delivery
CN115066498A (zh) * 2020-03-16 2022-09-16 阿尔戈诺特Rna有限公司 Pcsk9的拮抗剂
AR122731A1 (es) 2020-06-26 2022-10-05 Hoffmann La Roche Oligonucleótidos mejorados para modular la expresión de fubp1
CN116157522A (zh) 2020-08-21 2023-05-23 豪夫迈·罗氏有限公司 A1cf抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
CR20230308A (es) * 2020-12-11 2023-09-08 Civi Biopharma Inc Entrega oral de conjugados antisentido que tienen por blanco a pcsk9
TW202246500A (zh) 2021-02-02 2022-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 用於抑制 ｒｔｅｌ１ 表現之增強型寡核苷酸
WO2022189363A1 (en) 2021-03-08 2022-09-15 Les Laboratoires Servier Antisense oligonucleotides for inhibiting alpha-synuclein expression
WO2023015223A2 (en) 2021-08-03 2023-02-09 Verve Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeted rna delivery
AU2022349448A1 (en) * 2021-09-23 2024-04-11 Sirius Therapeutics, Inc. Polynucleic acid molecules targeting pcsk9 and uses thereof
WO2023111210A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination of oligonucleotides for modulating rtel1 and fubp1
AR128558A1 (es) 2022-02-21 2024-05-22 Hoffmann La Roche Oligonucleótido antisentido
US20230372508A1 (en) * 2022-05-19 2023-11-23 Olix Us, Inc. Linkers coupling functional ligands to macromolecules
KR20260006569A (ko) * 2023-05-04 2026-01-13 아르고노트 알엔에이 리미티드 이중 발현 억제
GB2629617B (en) * 2023-05-04 2025-05-14 Argonaute Rna Ltd Dual Silencing
CN116903684B (zh) * 2023-06-08 2025-12-12 弘亮(上海)生物医药科技有限公司 一种肝靶向化合物和寡核苷酸缀合物及其应用
IL326478A (en) 2023-08-16 2026-04-01 Servier Lab Oligonucleotides for modulation of KCNT1 expression
CN116854754B (zh) * 2023-09-01 2023-12-12 北京悦康科创医药科技股份有限公司 一种含有核糖环或其衍生结构的GalNAc化合物及其寡核苷酸缀合物
WO2025111578A1 (en) * 2023-11-22 2025-05-30 Olix Us, Inc. Linkers coupling functional ligands to macromolecules
WO2025264546A1 (en) * 2024-06-18 2025-12-26 Sirius Therapeutics, Inc. Lipid-polynucleic acid conjugate compositions and uses thereof
CN118546935B (zh) * 2024-07-25 2024-10-22 深圳大学 一种基于干扰或敲除人pcsk9基因制备增强型car-t细胞的方法及应用

Family Cites Families (146)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2699808A (en) 1944-10-06 1955-01-18 Mark W Lowe Apparatus for peeling tomatoes
US2699508A (en) 1951-12-21 1955-01-11 Selectronics Inc Method of mounting and construction of mounting for low frequency piezoelectric crystals
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4914210A (en) 1987-10-02 1990-04-03 Cetus Corporation Oligonucleotide functionalizing reagents
US4962029A (en) 1987-10-02 1990-10-09 Cetus Corporation Covalent oligonucleotide-horseradish peroxidase conjugate
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US6395492B1 (en) 1990-01-11 2002-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
DE69233046T2 (de) 1991-10-24 2004-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsfeld Derivatisierte oligonukleotide mit verbessertem aufnahmevermögen
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
JPH06311885A (ja) 1992-08-25 1994-11-08 Mitsubishi Kasei Corp Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子に相補的なアンチセンス化合物
US6423489B1 (en) 1992-09-10 2002-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus-associated diseases
WO1994005813A1 (en) 1992-09-10 1994-03-17 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Compositions and methods for treatment of hepatitis c virus-associated diseases
US6433159B1 (en) 1992-09-10 2002-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis C virus associated diseases
JPH08504559A (ja) 1992-12-14 1996-05-14 ハネウエル・インコーポレーテッド 個別に制御される冗長巻線を有するモータシステム
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
WO1995030746A1 (en) 1994-05-10 1995-11-16 The General Hospital Corporation Antisense inhibition of hepatitis c virus
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
AU3999495A (en) 1994-10-06 1996-05-02 Buchardt, Dorte Peptide nucleic acid conjugates
DK0832069T3 (da) 1995-06-07 2003-04-22 Pfizer Biphenyl-2-carboxylsyre-tetrahydroisoquinolin-6-ylamidderivater, deres fremstilling og deres anvendelse som inhibitorer af sekretion af mikrosomalt triglyceridoverførselsprotein og/eller apolipoprotein B (Apo B)
US5684142A (en) 1995-06-07 1997-11-04 Oncor, Inc. Modified nucleotides for nucleic acid labeling
CN1120707C (zh) * 1995-11-22 2003-09-10 约翰斯·霍普金斯大学 增强生物分子的细胞摄取的配体
US5656408A (en) 1996-04-29 1997-08-12 Xerox Corporation Coated carrier particles
EA001539B1 (ru) 1996-11-27 2001-04-23 Пфайзер Инк. Амиды, ингибирующие секрецию аполипопротеина в (аро в) и/или микросомного протеина переноса триглицеридов (мтр)
CA2283379A1 (en) 1997-03-05 1998-09-11 Michael G. Katze Novel screening methods to identify agents that selectively inhibit hepatitis c virus replication
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
US5770716A (en) 1997-04-10 1998-06-23 The Perkin-Elmer Corporation Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same
CN1263473A (zh) 1997-05-21 2000-08-16 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 增加跨生物膜转运的组合物和方法
JP4236812B2 (ja) 1997-09-12 2009-03-11 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6335432B1 (en) 1998-08-07 2002-01-01 Bio-Red Laboratories, Inc. Structural analogs of amine bases and nucleosides
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
US6410323B1 (en) 1999-08-31 2002-06-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of human Rho family gene expression
KR20020013513A (ko) 1999-03-18 2002-02-20 추후제출 Ｘｙｌｏ-ｌｎａ 유사체
DE60029314T2 (de) 1999-03-24 2007-07-12 Exiqon A/S Verbesserte Synthese für -2.2.1. I Bicyclo-Nukleoside
US7053207B2 (en) 1999-05-04 2006-05-30 Exiqon A/S L-ribo-LNA analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US20040146516A1 (en) 1999-06-17 2004-07-29 Utah Ventures Ii L.P. Lumen-exposed molecules and methods for targeted delivery
US7029895B2 (en) 1999-09-27 2006-04-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 27411, a novel human PGP synthase
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
AU7406700A (en) 1999-10-04 2001-05-10 Exiqon A/S Design of high affinity rnase h recruiting oligonucleotide
IL139450A0 (en) 1999-11-10 2001-11-25 Pfizer Prod Inc Methods of administering apo b-secretion/mtp inhibitors
IL149694A0 (en) 1999-12-23 2002-11-10 Exiqon As Therapeutic uses of lna-modified oligonucleotides
EP1257572A2 (en) 2000-02-07 2002-11-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Narc-1, subtilase-like homologs
JP4413493B2 (ja) 2000-10-04 2010-02-10 サンタリス ファーマ アー／エス プリンｌｎａ類似体の改善された合成方法
US20070173473A1 (en) 2001-05-18 2007-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2002317437A1 (en) 2001-05-18 2002-12-03 Cureon A/S Therapeutic uses of lna-modified oligonucleotides in infectious diseases
ATE287413T1 (de) 2001-07-12 2005-02-15 Santaris Pharma As Verfahren zur herstellung des lna phosphoramidite
US7888324B2 (en) 2001-08-01 2011-02-15 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
AU2003225495B2 (en) 2002-04-05 2009-01-15 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligomeric compounds for the modulation HIF-1alpha expression
AU2003222743B2 (en) 2002-05-08 2008-12-11 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
UA79300C2 (en) 2002-08-12 2007-06-11 Janssen Pharmaceutica Nv N-aryl piperidine substituted biphenylcarboxamides as inhibitors of apolipoprotein b secretion
AU2003264038A1 (en) 2002-08-12 2004-02-25 Bristol-Myers Squibb Company Combination pharmaceutical agents as inhibitors of hcv replication
US7087229B2 (en) 2003-05-30 2006-08-08 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Releasable polymeric conjugates based on aliphatic biodegradable linkers
WO2004041889A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
AU2003291755A1 (en) 2002-11-05 2004-06-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
AU2003295389A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
EP2336318B1 (en) 2002-11-13 2013-04-24 Genzyme Corporation Antisense modulation of apolipoprotein b expression
WO2004046160A2 (en) 2002-11-18 2004-06-03 Santaris Pharma A/S Amino-lna, thio-lna and alpha-l-oxy-ln
FR2848572B1 (fr) 2002-12-12 2005-12-09 Univ Joseph Fourier Molecules inhibitrices de la synthese proteique du virus de l'hepatite c et procede de criblage desdites molecules inhibitrices
DK1592793T3 (da) 2003-02-10 2009-10-26 Santaris Pharma As Oligomeriske forbindelser for modulation af Survivin ekspression
EP1471152A1 (en) 2003-04-25 2004-10-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Mutations in the human PCSK9 gene associated to hypercholesterolemia
WO2004106356A1 (en) 2003-05-27 2004-12-09 Syddansk Universitet Functionalized nucleotide derivatives
DK1495769T3 (da) 2003-07-11 2008-06-23 Lbr Medbiotech B V Mannose-6-phosphat-receptormedieret gentransfer til muskelceller
US7683036B2 (en) 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
EP1661905B9 (en) 2003-08-28 2012-12-19 IMANISHI, Takeshi Novel artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
US20050053981A1 (en) 2003-09-09 2005-03-10 Swayze Eric E. Gapped oligomeric compounds having linked bicyclic sugar moieties at the termini
GB2424887B (en) 2003-11-26 2008-05-21 Univ Massachusetts Sequence-specific inhibition of small RNA function
UA83510C2 (en) 2003-12-09 2008-07-25 Янссен Фармацевтика Н.В. N-aryl piperidine substituted biphenylcarboxamides as inhibitors of apolipoprotein b
WO2005061710A1 (en) 2003-12-23 2005-07-07 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of bcl-2
WO2005073378A1 (en) 2004-01-30 2005-08-11 Santaris Pharma A/S MODIFIED SHORT INTERFERING RNA (MODIFIED siRNA)
CA2562390C (en) 2004-04-07 2014-12-02 Exiqon A/S Novel methods for quantification of micrornas and small interfering rnas
ES2361458T5 (es) 2004-05-04 2016-04-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Procedimientos y composiciones para reducir las cantidades de genoma vírico de VHC en una célula diana
US20080213891A1 (en) 2004-07-21 2008-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi Agents Comprising Universal Nucleobases
WO2006093526A2 (en) 2004-07-21 2006-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
FR2873694B1 (fr) 2004-07-27 2006-12-08 Merck Sante Soc Par Actions Si Nouveaux aza-indoles inhibiteurs de la mtp et apob
AU2005330637B2 (en) 2004-08-04 2012-09-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
ES2401114T3 (es) 2004-08-10 2013-04-17 Genzyme Corporation Modulación antisentido de la expresión de apolipoproteína B
EP1791567B1 (en) 2004-08-10 2015-07-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemically modified oligonucleotides
EP2377873B1 (en) 2004-09-24 2014-08-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of ApoB and uses thereof
CA2587411A1 (en) 2004-11-17 2006-05-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Sirna silencing of apolipoprotein b
US20060185027A1 (en) 2004-12-23 2006-08-17 David Bartel Systems and methods for identifying miRNA targets and for altering miRNA and target expression
BRPI0607555A2 (pt) 2005-04-19 2009-09-15 Surface Logix Inc inibidores da proteìna microssomal de transferência de triglicirideo e secreção de apo-b
KR20080068019A (ko) 2005-09-15 2008-07-22 산타리스 팔마 에이/에스 아포지단백질-ｂ100 발현 억제용 ｒｎａ 길항제 화합물
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
WO2007090071A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP2007888A2 (en) 2006-04-03 2008-12-31 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides
JP2009536222A (ja) 2006-05-05 2009-10-08 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｐｃｓｋ９の発現を調節するための化合物および方法
CN101484588B (zh) * 2006-05-11 2013-11-06 阿尔尼拉姆医药品有限公司 抑制pcsk9基因表达的组合物和方法
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
CA2658183A1 (en) 2006-07-17 2008-01-24 Sirna Therapeutics Inc. Rna interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
WO2008034123A2 (en) 2006-09-15 2008-03-20 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric conjugates containing positively-charged moieties
MX2009002859A (es) 2006-09-15 2009-03-30 Enzon Pharmaceuticals Inc Enlazadores biodegradables a base de ester impedido para suministro de oligonucleotidos.
CA2666191C (en) 2006-10-09 2017-07-11 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of pcsk9
AU2007323469B2 (en) 2006-11-23 2014-07-24 Guangdong Maijinjia Biotechnology Co., Ltd Oligonucleotides for modulating target RNA activity
CA2670563A1 (en) 2006-11-27 2008-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
WO2008089767A1 (en) 2007-01-26 2008-07-31 Diramo A/S Stacking of optic sensor and microfluidic-chips with optically communication through windows
WO2008109369A2 (en) 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting tnf gene expression and uses thereof
DK2149605T3 (da) 2007-03-22 2013-09-30 Santaris Pharma As Korte RNA antagonist forbindelser til modulering af det ønskede mRNA
WO2008124384A2 (en) 2007-04-03 2008-10-16 Aegerion Pharmaceuticals, Inc. Combinations of mtp inhibitors with cholesterol absorption inhibitors or interferon for treating hepatitis c
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
AU2008272918B2 (en) 2007-07-05 2012-09-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
CN101816010A (zh) 2007-07-19 2010-08-25 数据匙电子有限公司 Rf令牌和接纳器系统与方法
US20100203066A1 (en) 2007-08-20 2010-08-12 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric linkers containing pyridyl disulfide moieties
EP2623599B1 (en) 2007-10-04 2019-01-02 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Micromirs
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
WO2009073809A2 (en) * 2007-12-04 2009-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
WO2009090182A1 (en) 2008-01-14 2009-07-23 Santaris Pharma A/S C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides
CA2713379A1 (en) * 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
US9290534B2 (en) 2008-04-04 2016-03-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having at least one neutrally linked terminal bicyclic nucleoside
CA2721183C (en) 2008-04-11 2019-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
US20110224280A1 (en) 2008-04-16 2011-09-15 Niels Fisker Nielsen Pharmaceutical Composition Comprising Anti PCSK9 Oligomers
WO2009148605A2 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
AU2009265194A1 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Enzon Pharmaceuticals Inc RNA antagonists targeting Hsp27
AT507215B1 (de) 2009-01-14 2010-03-15 Boehler Edelstahl Gmbh & Co Kg Verschleissbeständiger werkstoff
SG175390A1 (en) * 2009-04-29 2011-12-29 Amarin Corp Plc Pharmaceutical compositions comprising epa and a cardiovascular agent and methods of using the same
CA2764822A1 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Santaris Pharma A/S New potent anti apob antisense compounds
EP2456870A1 (en) * 2009-07-21 2012-05-30 Santaris Pharma A/S Antisense oligomers targeting pcsk9
WO2011126937A1 (en) 2010-04-06 2011-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Targeted intracellular delivery of oligonucleotides via conjugation with small molecule ligands
WO2012058693A2 (en) * 2010-10-29 2012-05-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of pcsk9 genes
EP3226459B1 (en) 2010-12-13 2020-11-25 Telefonaktiebolaget LM Ericsson (publ) Exchange of parameters relating to measurement periods
AU2011343664B2 (en) * 2010-12-17 2015-10-08 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Galactose cluster-pharmacokinetic modulator targeting moiety for siRNA
CA3131967A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 F. Hoffman-La Roche Ag Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
US10202599B2 (en) * 2011-08-11 2019-02-12 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Selective antisense compounds and uses thereof
US9984408B1 (en) 2012-05-30 2018-05-29 Amazon Technologies, Inc. Method, medium, and system for live video cooperative shopping
AU2014211406B2 (en) 2013-01-30 2019-07-18 Roche Innovation Center Copenhagen A/S LNA oligonucleotide carbohydrate conjugates
DK2992098T3 (da) * 2013-05-01 2019-06-17 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af hbv- og ttr-ekspression
HUE048738T2 (hu) 2013-06-27 2020-08-28 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antiszensz oligomerek és konjugátumok, amelyek a PCK9-t célozzák meg
US9778708B1 (en) 2016-07-18 2017-10-03 Lenovo Enterprise Solutions (Singapore) Pte. Ltd. Dual sided latching retainer for computer modules

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180136006A (ko) 2018-12-21
US20200248186A1 (en) 2020-08-06
CN112263682A (zh) 2021-01-26
BR112015032432B1 (pt) 2023-02-07
DK3013959T3 (da) 2020-02-17
US20180312847A1 (en) 2018-11-01
CY1122738T1 (el) 2021-03-12
US20180312846A1 (en) 2018-11-01
KR20160027042A (ko) 2016-03-09
US20160138025A1 (en) 2016-05-19
US11739332B2 (en) 2023-08-29
HUE048738T2 (hu) 2020-08-28
US10385342B2 (en) 2019-08-20
CA2915316A1 (en) 2014-12-31
JP2018064575A (ja) 2018-04-26
EA201592215A1 (ru) 2016-05-31
JP6672245B2 (ja) 2020-03-25
MX2019006284A (es) 2019-08-29
MX367083B (es) 2019-08-05
MX2015017601A (es) 2016-04-07
US12421516B2 (en) 2025-09-23
CA2915316C (en) 2024-01-02
UA119643C2 (uk) 2019-07-25
WO2014207232A4 (en) 2015-03-19
EP3013959A1 (en) 2016-05-04
MX391977B (es) 2025-03-21
NZ715081A (en) 2022-02-25
SG11201510656PA (en) 2016-01-28
US10443058B2 (en) 2019-10-15
PL3013959T3 (pl) 2020-05-18
CN112263682B (zh) 2024-08-20
HRP20200163T1 (hr) 2020-08-07
CL2015003728A1 (es) 2016-08-26
EP3591054A1 (en) 2020-01-08
AU2014300981B2 (en) 2017-08-10
CN105358692A (zh) 2016-02-24
HK1221740A1 (zh) 2017-06-09
PH12015502761A1 (en) 2016-03-21
US9879265B2 (en) 2018-01-30
US20240084307A1 (en) 2024-03-14
BR112015032432A2 (pt) 2017-08-29
MY183049A (en) 2021-02-09
WO2014207232A1 (en) 2014-12-31
US20180216116A1 (en) 2018-08-02
US11091764B2 (en) 2021-08-17
JP6255092B2 (ja) 2017-12-27
EP3013959B1 (en) 2019-12-04
US10370668B2 (en) 2019-08-06
US20220025376A1 (en) 2022-01-27
CN105358692B (zh) 2020-08-21
PE20160158A1 (es) 2016-03-18
SI3013959T1 (sl) 2020-04-30
LT3013959T (lt) 2020-03-10
KR101931089B1 (ko) 2019-03-14
ES2770667T3 (es) 2020-07-02
PT3013959T (pt) 2020-02-04
SG10201908122XA (en) 2019-10-30
KR102226110B1 (ko) 2021-03-10
JP2016523094A (ja) 2016-08-08
AU2014300981A1 (en) 2016-01-21
SMT202000104T1 (it) 2020-03-13
IL242875B (en) 2020-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12421516B2 (en) Antisense oligomers targeting PCSK9
DK2920307T3 (en) ANTI-APOB, ANTISENSE CONJUGATE RELATIONSHIPS
HK1220724A1 (zh) Apob反义缀合物化合物
HK40020164A (en) Antisense oligomers and conjugates targeting pcsk9
HK1221740B (zh) 靶向pcsk9的反义寡聚体和缀合物
EA043736B1 (ru) Антисмысловые олигомеры и их конъюгаты, направленные на пропротеин конвертазу субтилизин/кексин типа 9 (pcsk9)