RS60043B1 - Anti-ceacam5 antitela i njihova primena - Google Patents

Anti-ceacam5 antitela i njihova primena

Info

Publication number
RS60043B1
RS60043B1 RS20200296A RSP20200296A RS60043B1 RS 60043 B1 RS60043 B1 RS 60043B1 RS 20200296 A RS20200296 A RS 20200296A RS P20200296 A RSP20200296 A RS P20200296A RS 60043 B1 RS60043 B1 RS 60043B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
sequence
seq
ceacam5
human
Prior art date
Application number
RS20200296A
Other languages
English (en)
Inventor
Pierre-François Berne
Francis Blanche
Hervé Bouchard
Béatrice Cameron
Tarik Dabdoubi
Stéphanie Decary
Paul Ferrari
Alexey Rak
Original Assignee
Sanofi Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Sa filed Critical Sanofi Sa
Publication of RS60043B1 publication Critical patent/RS60043B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57565—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen [CEA]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak obelodanjuje antitela koja specifično vezuju ljudske i Macaca fascicularis CEACAM5 proteine, kao i izolovane nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćine koji sadrže kodirajuću sekvencu navedenih antitela. Pronalazak takođe obelodanjuje imunokonjugate koji sadrže pomenuta antitela konjugovana ili povezana sa agensom za inhibiranje rasta, i farmaceutske sastave koji sadrže antitela ili imunokonjugate prema predmetnom pronalasku. Pronalazak obelodanjuje upotrebu antitela ili imunokonjugata pronalaska za lečenje kancera ili za dijagnostičke svrhe.
[0002] Karcino-embrionski antigen (CEA) je glikoprotein uključen u ćelijsku adheziju. CEA je prvi put identifikovan 1965. (Gold and Freedman, J Exp Med, 121, 439, 1965) kao protein koji se obično eksprimira od strane fetalnih creva tokom prvih šest meseci trudnoće, i pronalazi se u kancerima pankreasa, jetre i debelog creva. CEA porodica pripada superporodici imunoglobulina. CEA porodica, koji se sastoji od 18 gena, podeljena je u dve podgrupe proteina: podgrupa ćelijskih adhezionih molekula povezanih sa karcinoembrionskim antigenom (CEACAM), i glikoproteinska podgrupa specifična za trudnoću (Kammerer & Zimmermann, BMC Biology 2010, 8:12).
[0003] Kod ljudi, CEACAM podgrupu čini 7 članova: CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8. Brojne studije su pokazale da je CEACAM5, identičan prvobitno identifikovanom CEA, visoko eksprimiran na površini kolorektalnih ćelija tumora, ćelija tumora želuca, pluća, dojke, prostate, jajnika, grlića materice i bešike, i nisko eksprimiran u nekoliko normalnih epitelnih tkiva poput cilindričnog epitela i peharastih ćelija u debelom crevu, mukoznim ćelijama vrata u stomaku i skvamoznih epitelnih ćelija u jednjaku i cerviksu (Hammarström et al, 2002, in "Tumor markers, Physiology, Pathobiology, Technology and Clinical Applications" Eds. Diamandis E. P. et al., AACC Press, Washington pp 375). Tako, CEACAM5 može da predstavlja terapeutsku metu pogodnu za tumorski specifične pristupe targetiranja, kao što su imunokonjugati.
Predmetni pronalazak pruža monoklonska antitela usmerena protiv CEACAM5, i pokazuje da se mogu konjugovati sa citotoksičnim agensom kako bi indukovali citotoksično dejstvo sposoban da ubija ćelije tumora in vitro i kako bi indukovali regresiju tumora in vivo.
[0004] Vanćelijski domeni članova porodice CEACAM sastoje se od ponovljenih domena nalik imunoglobulinu (Ig-sličnih) koji su kategorisani u 3 tipa, A, B i N, prema homologijama sekvenci. CEACAM5 sadrži sedam takvih domena, odnosno N, A1, B1, A2, B2, A3 i B3.
[0005] CEACAM5 A1, A2 i A3 domeni, sa jedne strane, i B1, B2 i B3 domeni, sa druge strane, pokazuju visoke homologije sekvenci, A domeni ljudskog CEACAM5 predstavljaju od 84 do 87% poravnavanja sličnosti sekvence i B domeni od 69 do 80%. Osim toga, drugi ljudski CEACAM članovi predstavljaju A i/ili B domene u njihovoj strukturi, odnosno CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 i CEACAM8, pokazuju homologiju sa ljudskom CEACAM5. Posebno, A i B domeni ljudskog CEACAM6 proteina pokazuju homologiju sekvenci sa A1 i A3 domenima, i bilo koji od B1 do B3 domena ljudskog CEACAM5, odnosno, koji su čak i veći nego mereno između A domena i B domena ljudskog CEACAM5.
[0006] Brojna anti-CEA antitela su generisana u pogledu CEA-targetirane dijagnostičke ili terapijske svrhe. Specifičnost prema povezanim antigenima uvek se pominje kao problem u ovoj oblasti, kao primer od Sharkey et al (1990, Cancer Research 50, 2823). Zbog navedenih homologija, neka od prethodno opisanih antitela mogu pokazati vezivanje za ponavljajuće epitope CEACAM5 prisutne u različitim imunoglobulinskim domenima koji pokazuju unakrsnu reaktivnost sa drugim članovima CEACAM poput CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 ili CEACAM8, kojima nedostaje specifičnost CEACAM5. Specifičnost anti-CEACAM5 antitela je željeni pogled CEA-targetiranih terapija tako da se vezuje za ljudske tumorske ćelije koje eksprimiraju CEACAM5, ali se ne vezuje za neka normalnih tkiva koja eksprimiraju druge CEACAM članova. Važno je napomenuti da su CEACAM1, CEACAM6 i CEACAM8 opisani kao eksprimirani neutrofili ljudskih i ne-ljudskih primata (Ebrahimmnejad et al, 2000, Exp Cell Res, 260, 365; Zhao et al, 2004, J Immunol Methods 293, 207; Strickland et al, 2009 J Pathol, 218, 380) koji su se pokazali da regulišu granulopoezu, i da igraju ulogu u imunom odgovoru.
[0007] Antitelo-CEACAM6 antitelo-lek konjugat je opisan, kao što je majtanzinoid anti-CEACAM6 antitelo razvijeno od Genentech (Strickland et al, 2009 J Pathol, 218, 380), za koji se pokazalo da indukuje hematopeičnu toksičnost zavisnu od CEACAM6 kod neljudskih primata. Ova toksičnost, pripisana akumulaciji antitelo-lek konjugata u koštanoj srži i iscrpljivanju granulocita i njihovih ćelijskih prekursora, smatra se od strane autora kao glavna bezbednosna zabrinutost. Dakle, tačnije, u terapijske svrhe, unakrsna reaktivnost anti-CEACAM5 antitela sa CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 ili CEACAM8 može smanjiti terapijski indeks jedinjenja povećanom toksičnošću na normalnim tkivima. Stoga, postoji snažna prednost u dobijanju antitela specifično usmerenih na CEACAM5, koji neće unakrsno reagovati sa drugim molekulima porodice CEACAM, naročito za primenu kao antitelo-lek konjugat (ADC) ili će sa bilo kojim drugim načinom delovanja rezultovati ubijanjem ciljane ćelije.
[0008] Štaviše, kako je CEACAM5 opisan da se eksprimira, iako na niskom nivou, u nekim normalnim ćelijskim tkivima, važno je razviti anti-CEACAM5 antitela sposobna za vezivanje za ljudski CEACAM5, kao i za CEACAM5 makaki majmuna (Macaca fascicularis), jer se takva antitela mogu lako testirati u predkliničkim toksikološkim istraživanjima kod makaki majmuna kako bi mogao da se proceni njihov bezbednosni profil. Pošto se pokazalo da efikasnost terapijskih antitela može biti zavisna od lokalizacije epitopa na metama, kao u slučaju funkcionalnih antitela (Doern et al.2009, J. Biol. Chem 28410254), i u slučaju gde su uključene efektorske funkcije (Beers et al. Semin Hematol 47:107-114), za ljudsko/majmunsko unakrsno reaktivno antitelo mora da se pokaže da vezuju epitope na istom ponovljenom Ig-sličnom homologu domena ljudskih i proteina makaki majmuna.
[0009] Kombinacija potrebe za unakrsnu reaktivnost između vrsta takvih antitela sa specifičnošću za ljudski i Macaca fascicularis CEACAM5, odnosno bez unakrsne reaktivnosti sa drugim Macaca fascicularis i ljudskim CEACAM članovima, dodaje još jedan stepen složenosti, uzimajući u obzir ukupne homologije sekvenci između ljudskih i Macaca fascicularis CEACAM proteina.
[0010] Zaista, globalno upareno usklađivanje Macaca fascicularis CEACAM5 sekvence sa ljudskom CEACAM5 sekvencom (AAA51967.1/GI:180223, 702 aminokiseline) pokazalo je samo 78,5% identičnosti. Macaca fascicularis CEACAM1, CEACAM5 i CEACAM6 geni su klonirani i globalno usklađivanje ljudskih i Macaca fascicularis A, B i N domena je izvršeno. Za ovo poravnanje je predviđeno da ima vrlo malo regiona, ako ih ima, kako bi se lokalizovao idealni epitop koji bi bio zajednički za ljudski i makaki CEACAM5, i ne deli se sa bilo kojim drugim članom porodice. Iz tih razloga, od razvijanja unakrsno reaktivnih antitela između čoveka i Macaca fascicularis CEACAM5 bez unakrsne reaktivnosti sa drugim ljudskim i Macaca fascicularis CEACAM članova, očekivalo se da ima nisku verovatnoću uspeha.
Vredna pomena, prethodno opisana anti-CEACAM5 antitela, skoro nikada nisu dokumentovana za Macaca fascicularis unakrsnu reaktivnost, sa vrlo malo izuzetaka (MT111, pogledati dole).
[0011] Anti-ljudska CEACAM5 antitela već se koriste u kliničkim ispitivanjima, poput imunoleka labetuzumab (takođe poznat kao hMN14, Sharkey et al, 1995, Cancer Research 55, 5935). Za ovo antitelo se pokazalo da se ne vezuje za povezane, ali nije unakrsno povezan sa CEACAM5 iz Macaca fascicularis. Vredno pomena, Micrometovo MT111 antitelo (takođe poznato kao MEDI-565 antitelo od Medlmmune) je bispecifično antitelo za vezivanje ljudskog CEACAM5 i ljudskog CD3 (Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641; WO 2007/071426). Za MT111 se kaže da su stvoreni fuzijom jednolančanog varijabilnog fragmenta (scFv) od antitela koje prepoznaje ljudski i makaki CEACAM5 sa scFv od antitela koja prepoznaju ljudski CD3 (poster od Oberst et al., AACR Annual Meeting April 2009 Denver, CO). Takođe je objavljeno da MT111 ne vezuje druge CEACAM članove porodice (Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641). MT111 se vezuje za konformacioni epitop u A2 domenu ljudskog CEACAM5. Ovaj konformacioni epitop nedostaje u isečenoj varijanti ljudskog CEACAM5, koji se eksprimira istovremeno sa CEACAM5 pune dužine na tumorima (Peng et al., PLoS ONE 7(5): e3641). Pored toga, ne postoje dokazi da se MT111 vezuje za isti epitop na Macaca fascicularis CEACAM5.
[0012] U pokušaju da se proizvedu nova antitela protiv CEACAM5 površinskog proteina sa optimalnim karakteristikama za terapeutske svrhe, pronalazači su imunizovali miševe sa rekombinantnim proteinima i sa tumorskim ćelijama. Oni su ispitali stotine hibridoma korišćenjem ELISA na nekoliko rekombinantnih proteina CEACAM porodice, i protočnom citometrijom sa relevantnim ćelijskim linijama, u cilju izbora samo imunoglobulina (IgG) sa povoljnim profilom. Neočekivano, oni su u stanju da odaberu hibridoma klonove i da proizvedu odgovarajuće zrele IgG koji sadrže sve željene funkcije. Oni se specifično vezuju za A3-B3 domen ljudskog CEACAM5 sa visokim afinitetom, i ne prepoznaju ljudske CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 i CEACAM8 proteine. U ćelijskom kontekstu, ova antitela prikazuju visok afinitet za ćelije tumora (u nanomolarnom opsegu). Pored toga, ova antitela takođe vezuju Macaca fascicularis CEACAM5 protein sa odnosom afiniteta majmun/čovek manjim ili jednakim od 10. Antitela iz ovog pronalaska specifično se vezuju za A3-B3 domen Macaca fascicularis CEACAM5 i ne priznaju druge Macaca fascicularis CEACAM članove.
[0013] Targetiranjem A3-B3 domena od CEACAM5, ova antitela imaju povećan potencijal za targetiranje tumora, jer imaju sposobnost da se vežu kako za ljudski CEACAM5 pune dužine, tako i za njegovu rasparčanu varijantu identifikovanu od Peng et al. (PLoS ONE 7(5): e3641).
[0014] Konačno, CEACAM5 je opisan u literaturi kao slabo internalizujući površinski protein (prikazano u Schmidt et al, 2008, Cancer Immunol. Immunother.57, 1879), i zbog toga ne može biti povoljna meta antitelo lek konjugata. Uprkos onome što je prijavljeno u stanju tehnike, pronalazači su pokazali da su antitela koja su proizveli u stanju da internalizuju kompleks CEACAM5-antitela posle vezivanja, i da izazovu citotoksično dejstvo na tumorske ćelije in vitro u kombinaciji sa citotoksičnim agensom. Ista antitela kombinovana sa citotoksičnim agensom su takođe u stanju da značajno inhibiraju rast tumora kod miševa koji nose ljudske primarne tumore creva i stomaka.
Definicije
[0015] Kad s ovde koristi „CEACAM5“ označava „karcino-embrionski ćelijski adhezioni molekul 5 povezan sa antigenom“, takođe poznat kao „CD66e“ (klaster diferencijacija 66e) ili CEA. CEACAM5 je glikoprotein uključen u ćelijsku adheziju. CEACAM5 je visoko eksprimiran, posebno na površini kolorektalnih, želudačnih, plućnih i tumorskih ćelija materice.
[0016] Referentna sekvenca ljudskog CEACAM5 pune dužine, uključujući signalni peptid (položaji 1-34) i propeptid (položaji 686-702), dostupna je iz GenBank baze podataka pod pristupnim brojem AAA51967.1 (SEQ ID NO: 52) Pet nesinonimih SNP su identifikovani sa frekvencijom većom od 2% u populaciji belaca, četvoro njih je lokalizovano u N domenu (na položajima 80, 83, 112, 113), a poslednji u domenu A2 (na položaju 398) ljudskog CECAM5 (SEQ ID NO: 58). GenBank AAA51967.1 sadrži glavni haplotip (I80, V83, I112, I113 i E398).
[0017] Sekvenca vanćelijskog domena Macaca fascicularis CEACAM5, klonirana od strane pronalazača, obelodanjena je u SEQ ID NO: 53.
[0018] „Domen“ može biti bilo region proteina, generalno definisan na osnovu homologija sekvenci i često povezan sa specifičnom strukturnom ili funkcionalnom celinom. CEACAM članovi porodice su poznati da se sastoje od Ig-sličnih domena. Izraz domen se koristi u ovom dokumentu kako bi odredio pojedinačnih Ig-slične domene, kao što je „N-domena“, ili za grupe uzastopnih domena, kao što je „A3-B3 domen“.
[0019] Domenska organizacija ljudskog CEACAM5 je kako sledi (na osnovu GenBank AAA51967.1 sekvence; SEQ ID N0: 52):
[0020] Prema tome, A3-B3 domen ljudskog CEACAM5 se sastoji od aminokiselina na položajima 499-685 u SEQ ID NO: 52.
[0021] Domen organizacija Macaca fascicularis CEACAM5 je kako sledi (na osnovu klonirane vanćelijske domen sekvence; SEQ ID NO: 53):
[0022] Prema tome, A3-B3 domen Macaca fascicularis CEACAM5 čine aminokiseline na položajima 465-654 SEQ ID NO: 53.
[0023] „Kodirajuća sekvenca“ ili sekvenca „koja kodira“ proizvod eksprimiranja, kao što su RNK, polipeptid, protein ili enzim je nukleotidna sekvenca koja, kada se eksprimira, rezultuje u proizvodnji tog RNK, polipeptida, proteina, ili enzima, odnosno nukleotidna sekvenca kodira aminokiselinsku sekvencu za taj polipeptid, protein ili enzim. Sekvenca kodiranja za protein može uključivati početni kodon (obično ATG) i zaustavni kodon.
[0024] Kad se ovde koristi, reference na specifične proteine (npr., antitela) mogu uključivati polipeptid koji ima nativnu sekvencu aminokiseline, kao i varijante i modifikovane oblike bez obzira na njihovo poreklo ili način pripreme. Protein koji ima nativnu sekvencu aminokiseline je protein koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao što se pronalazi u prirodi. Takvi proteini nativnih sekvenci mogu biti izolovani iz prirode ili se mogu dobiti korišćenjem standardnih rekombinantnih i/ili postupaka sinteze. Proteini nativne sekvence specifično obuhvataju prirodne skraćene ili rastvorljive oblike, prirodne varijantne oblike (npr. alternativno upletene oblike), prirodne alelske varijante i oblike, uključujući posttranslacijske modifikacije. Nativne sekvence proteina uključuju proteine koji nose posttranskripcione modifikacije poput glikozilacije ili fosforilacije ili druge modifikacije nekih aminokiselinskih ostataka.
[0025] Izraz „gen“ označava DNK sekvencu koja kodira, ili odgovara, određenoj sekvenci aminokiselina koja sadrži ceo ili deo jednog ili više proteina ili enzima, a može ali ne mora uključivati regulatorne DNK sekvence, kao što su promoter sekvence, koje određuju npr. uslove pod kojima je gen eksprimiran. Neki geni, koji nisu strukturni geni, mogu se transkribovati iz DNK do RNK, ali nisu translakovani u aminokiselinskoj sekvenci. Drugi geni mogu da funkcionišu kao regulatori strukturalnih gena ili kao regulatori DNK transkripcije. Posebno, izraz gen može biti namenjen za genomsku sekvencu koja kodira protein, tj. sekvencu koja sadrži regulator, promoter, intron i ekson sekvence.
[0026] Sekvenca „barem 85% identična sa referentnom sekvencom“ je sekvenca koja, na celoj dužini, ima 85%, ili više, na primer 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa čitavom dužinom referentne sekvence.
[0027] Procenat „identičnost sekvence“ se može odrediti upoređivanjem dve sekvence, optimalno poravnate preko prozora poređenja, gde deo sekvence polinukleotida ili polipeptida u prozoru poređenja može sadržati adicije ili delecije (tj. praznine) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži adicije ili delecije) za optimalno poravnavanje dve sekvence. Procenat se izračunava određivanjem broja položaja u kojima se identična osnova nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak javljaju u obe sekvence, dajući broj usklađenih položaja, deljenjem broja podudarnih položaja sa ukupnim brojem položaja u prozoru poređenja i množenjem rezultata sa 100, kako bi se dobio procenat identičnosti sekvence. Optimalno usklađivanje sekvenci za poređenje vrši se globalnim uparenim poravnavanjem, npr. koristeći algoritam dat od Needleman and Wunsch J. Mol. Biol.48:443 (1970). Procenat identičnosti sekvence može se lako odrediti, na primer, korišćenjem programa Needle sa matricom BLOSUM62, i sledeći parametre gap-open=10, gap-extend=0.5.
[0028] „Konzervativna aminokiselinska supstitucija“ je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim osobinama (npr., naelektrisanje, veličina ili hidrofobnost). U opštem slučaju, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalna svojstva proteina. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju 1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatične-hidroksil bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin i histidin; 6) kisele bočne lance: asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Konzervativne aminokiseline supstitucione grupe se takođe mogu definisati na osnovu veličine aminokiseline.
[0029] „Antitelo“ može biti prirodno ili konvencionalano antitelo u kome su dva teška lanca vezana jedan za drugi putem disulfidne veze, i svaki teški lanac je povezan sa lakim lanca putem disulfidne veze. Postoje dve vrste lakog lanca, lambda (l) i kapa (k). Postoji pet glavnih klasa teškog lanca (ili izotipa) koji određuju funkcionalnu aktivnost molekula antitela: IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Svaki lanac sadrži različite domene sekvenci. Laki lanac sadrži dva domena ili regije, varijabilni domen (VL) i konstantni domen (CL). Teški lanac sadrži četiri domena, varijabilni domen (VH) i tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3, kolektivno označeni kao CH). Varijabilni regioni lakih (VL) i teških (VH) lanaca određuju prepoznavanje vezivanja i specifičnosti za antigen. Konstantne regije domena lakih (CL) i teških (CH) lanaca prenose važne biološke osobine antitela, poput povezanosti, lučenja, transplacentne mobilnosti, komplementarnog vezivanja, i vezivanja za Fc receptore (FCR). Fv fragment je N-terminalni deo Fab fragmenta imunoglobulina i sastoji se od varijabilnih delova jednog lakog lanca i jednog teškog lanca. Specifičnost antitela leži u strukturnoj komplementarnosti između mesta kombinovanja antitela i antigenske determinanta. Mesta kombinovanja antitela se sastoje od ostataka koji su uglavnom iz hipervarijabilnih ili regija koje određuju komplementarnost (CDR). Povremeno, ostaci iz nehipervarijabilnih ili okvirnih regija (FR) utiču na ukupnu strukturu domena i samim tim mesta kombinovanja. Regije koje određuju komplementarnost ili CDR se zato odnose na aminokiselinske sekvence koje zajedno definišu afinitet vezivanja i specifičnost prirodne Fv regije nativnog imunoglobulinskog mesta za vezivanje. Laki i teški lanci imunoglobulina svaki imaju po tri CDR, označene kao CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L i CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, respektivno. Konvencionalno mesto za vezivanje antigena antitela, dakle, uključuje šest CDR, i sadrži CDR set V regije teškog i lakog lanca.
[0030] „Okvirne regije“ (FR) odnose na aminokiselinske sekvence umetnute između CDR, tj. na one delove varijabilnih regija lakog i teškog lanca imunoglobulina koji su relativno očuvani između različitih imunoglobulina u samo jednom vrstom. Laki i teški lanci imunoglobulina imaju četiri FR, označene kao FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, i FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H, respektivno.
[0031] Kad se ovde koristi, „ljudska okvirna regija“ predstavlja okvirnu regiju koja je u suštini identična (oko 85% ili više, na primer 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98% ili 99%) okvirnoj regiji prirodnog ljudskog antitela.
[0032] U kontekstu ovog pronalaska, definicija CDR/FR u nekom lakom ili teškom lancu imunoglobulina se utvrđuje na osnovu IMGT definicije (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org).
[0033] Kad se ovde koristi, izraz „antitelo“ označava konvencionalna antitela i njihove fragmente, kao i pojedinačne domene antitela i fragmente, posebno varijabilni deo teškog lanca antitela jednog domena, i himerna, humanizovana, bispecifična ili multispecifična antitela.
[0034] Kad se ovde koriste, antitelo ili imunoglobulin takođe uključuju „antitela jednog domena“ koji su nedavno opisani i koji su antitela čije regije koje određuju komplementarnost su deo jednog domena polipeptida. Primeri antitela jednog domena
1
obuhvataju antitela teškog lanca, antitela prirodno lišena lakih lanaca, antitela jednog domena izvedena od konvencionalnih antitela sa četiri lanca, dizajnirana antitela jednog domena. Antitela jednog domena mogu biti izvedena iz bilo koje vrste, uključujući, ali ne ograničavajući se miša, čoveka, kamilu, lamu, kozu, zeca, goveda. Antitela jednog domena mogu biti prirodna antitela jednog domena poznate kao antitela teškog lanca lišene lakih lanaca. Konkretno, Camelidae vrste, na primer kamila, lama, alpaka i guanako, proizvode antitelo teškog lanca prirodno lišeno lakog lanca. Kamilja antitela teškog lanca takođe nemaju CH1 domen.
[0035] Varijabilni teški lanac ovih antitela jednog domena lišenih lakih lanaca je poznati u tehnici kao „VHH“ ili „nanotelo“. Slično sa konvencionalnim VH domenima, VHH sadrže četiri FR i tri CDR. Nanotela imaju prednosti nad konvencionalnim antitelima: oni su oko deset puta manji od IgG molekula, i kao posledica toga, pravilno savijena funkcionalna nanotela mogu biti proizvedena in vitro eksprimiranjem uz postizanje visokog prinosa.
Štaviše, nanotela su veoma stabilna, i otporna na delovanje proteaza. Osobine i proizvodnja nanotela su opisani od strane Harmsen i De Haard HJ (Appl. Microbiol. Biotechnol.2007 Nov;77(1):13-22).
[0036] Izraz „monoklonsko antitelo“ ili „mAb“ kad se ovde koristi odnosi se na molekul antitela sa jednom aminokiselinskom sekvencom, koja je usmerena protiv specifičnog antigena, i ne treba da se tumači kao da zahteva proizvodnju antitela na bilo koji poseban postupak. Monoklonsko antitelo može se proizvesti od strane jednog klona B ćelija ili hibridoma, ali može takođe biti rekombinantno, tj. proizvedeno proteinskim inženjeringom.
[0037] Izraz „himerno antitelo“ odnosi se na konstruisano antitelo koje, u najširem smislu, sadrži jednu ili više regija iz jednog antitela i jednu ili više regija iz jednog ili više drugih antitela. U jednom otelotvorenju, himerno antitelo sadrži VH domen i VL domen antitela izvedene iz ne-ljudske životinje, povezan sa CH domenom i CL domena drugog antitela, u jednom otelotvorenju, ljudskog antitela. Kao ne-ljudska životinja, bilo koja životinja poput miša, pacova, hrčka, zeca ili slično može se koristiti. Himerno antitelo može takođe označavati multispecifična antitela koja imaju specifičnost za najmanje dva različita antigena.
[0038] Izraz „humanizovano antitelo“ odnosi se na antitelo koje je u potpunosti ili delimično ne-ljudskog porekla i koje je modifikovano da mu se zamene određene aminokiseline, na primer u okvirnim regijama VH i VL domena, kako bi se izbegao ili minimizovao imuni odgovor kod ljudi. Konstantni domeni humanizovanog antitela su uglavnom ljudski CH i CL domeni.
[0039] „Fragmenti“ (konvencionalnog) antitela sadrže deo netaknutog antitela, naročito, regiju za vezivanje antigena ili varijabilnu regiju netaknutog antitela. Primeri fragmenata antitela obuhvataju Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, dijatela, bispecifična i multispecifična antitela formirana iz fragmenata antitela. Fragment konvencionalnog antitela može takođe biti jedan domen antitela, kao što je teški lanac antitela ili VHH.
[0040] Izraz „Fab“ označava fragment antitela koji ima molekulsku težinu od oko 50.000 i aktivnost vezivanja antigena, gde su oko polovine N-terminalne strane teškog lanca i lakog lanca celog zajedno vezani preko disulfidne veze. Obično se dobija od fragmenata tretiranjem IgG sa proteazom, papainom.
[0041] Izraz „F(ab')2“ označava fragment antitela koji ima molekulsku težinu od oko 100.000 i aktivnost vezivanja antigena, što je neznatno veće od 2 identična Fab fragmenti vezana preko disulfidne veze u zglobnoj regiji. Obično se dobija od fragmenata tretiranjem IgG sa proteazom, pepsinom.
[0042] Izraz „Fab'“ se odnosi na fragment antitela koji ima molekulsku težinu od oko 50.000 i aktivnost vezivanja antigena, koji se dobija sečenje disulfidne veze u zglobnoj regiji F(ab')2.
[0043] Jednolančani Fv („scFv“) polipeptid je kovalentno vezan VH::VL heterodimer, koji se obično eksprimira od fuzije gena, uključujući gene koji kodiraju VH i VL povezane preko veznika koji kodira peptide. Ljudski scFv fragment prema pronalasku obuhvata CDR koji se održavaju u odgovarajućoj konformaciji, na primer korišćenjem tehnika genske rekombinacije. Dvovalentni i multivalentni fragmenti antitela mogu se formirati spontano spajanjem monovalentnih scFv, ili se mogu generisati kuplovanjem monovalentnih scFv sa peptidnim veznikom, poput dvovalentnog sc(Fv)2. „dsFv“ je VH::VL heterodimer stabilizovan pomoću disulfidne veze. „(dsFv)2“ označava dva dsFv spojena peptidnim veznikom.
[0044] Izraz „bispecifično antitelo“ ili „BsAb“ označava antitelo koje kombinuje mesta za vezivanje antigena od dva antitela u jednom molekulu. Stoga, BsAb mogu da vezuju dva različita antigena istovremeno. Genetski inženjering je korišćen sa povećanom učestalošću da dizajnira, modifikuje, i proizvede antitela ili derivate antitela sa željenim setom svojstava vezivanja i efektorskim funkcijama kao što je opisano na primer u EP 2050 764 A1.
[0045] Izraz „multispecifično antitelo“ označava antitelo koje kombinuje mesta dva ili više antitela koja vezuju antigen u jednom molekulu.
[0046] Izraz „dijatela“ označava male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, gde fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH -VL). Korišćenjem veznika koji je suviše kratak da dozvoli uparivanje između dva domena istog lanca, domeni su prinuđeni da se upare sa komplementarnim domenima drugog lanca, i stvore dva mesta za vezivanje antigena.
[0047] Izraz „hibridoma“ označava ćeliju koja se dobija podvrgavanjem B ćelije, pripremljene imunizacijom ne-ljudskog sisara sa antigenom, ćelijskoj fuziji sa mijeloma ćelijom izvedenom iz miša, ili slično, koja proizvodi željeno monoklonsko antitelo koje ima antigen specifičnost.
[0048] Pod „prečišćeno“ i „izolovano“ se podrazumeva, kada se odnosi na polipeptid (tj. antitelo pronalaska) ili nukleotidnu sekvencu, da je navedeni molekul prisutan u značajnom nedostatku drugih bioloških makromolekula istog tipa. Izraz „prečišćeno“ kada se ovde koristi, označava da je najmanje 75%, 85%, 95% ,, 96%, 97% ili 98% po težini, bioloških makromolekula istog tipa su prisutno. „Izolovani“ molekul nukleinske kiseline koji kodira određeni polipeptid odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je suštinski bez drugih molekula nukleinske kiseline koji ne kodiraju predmetni polipeptid; Međutim, molekul može da sadrži dodatne baze ili komponente koje nemaju negativan efekat na osnovne karakteristike sastava.
[0049] Kad se ovde koristi, izraz „pacijent“ označava sisara, kao što je glodar, mačka, pas, i primata. Pored toga, pacijent prema pronalasku je čovek.
1
Antitela
[0050] Pronalazači su uspeli u stvaranju, ispitivanju i selektovanju specifičnih mišljih anti-CEACAM5 antitela koja pokazuju visok afinitet za ljudski i Macaca fascicularis CEACAM5 protein, i koja nemaju značajno unakrsno reagovanje sa ljudskim CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 i CEACAM8 proteinima, ni sa Macaca fascicularis CEACAM1, CEACAM6 i CEACAM8 proteinima.
[0051] Pronalazači su odredili sekvencu varijablnih teških i lakih lanaca takvih monoklonskih antitela, takozvana antitela MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, i MAb5.
[0052] Takozvano „antitelo MAb1“ obuhvata:
• varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVATI
SSGG
SYIYYLDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARPAYYGNPA
MDYWG QGTSVTVSS (SEQ ID NO:31, gde su CDR prikazane podebljano) gde se FR1-H proteže na aminokiselinskim položajima 1 do 25, CDR1-H se proteže na aminokiselinskim položajima 26 do 33 (SEQ ID NO:1), FR2-H se proteže na aminokiselinskim položajima 34 do 50, CDR2-H se proteže na aminokiselinskim položajima 51 do 58 (SEQ ID NO:2), FR3-H se proteže na aminokiselinskim položajima 59 do 96, CDR3-H se proteže na aminokiselinskim položajima 97 do 109 (SEQ ID NO:3), i FR4-H se proteže na aminokiselinskim položajima 110 do 120, i
• varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence
DILMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSA
SYRYS
GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPLYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:32, gde su CDR prikazane podebljano) gde se FR1-L proteže na aminokiselinskim položajima 1 do 26, CDR1-L se proteže na aminokiselinskim položajima 27 do 32 (SEQ ID NO:4), FR2-L se proteže na aminokiselinskim položajima 33 do 49, CDR2-L se proteže na aminokiselinskim položajima 50 do 52, FR3-L se proteže na aminokiselinskim položajima 53 do 88, CDR3-L se proteže na aminokiselinskim položajima 89 do 98 (SEQ ID NO:6), i FR4-L se proteže na aminokiselinskim položajima 99 do 108.
[0053] Takozvano „antitelo MAb2“ obuhvata:
• varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence
EVQLQESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFVFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYI
SSGG GITYFPDTVQGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLKSEDTAIYYCAAHYFGSSGPF AYWG QGTLVTVSA (SEQ ID NO:33, gde su CDR prikazane podebljano) gde se FR1-H proteže na aminokiselinskim položajima 1 do 25, CDR1-H se proteže na aminokiselinskim položajima 26 do 33 (SEQ ID NO:7), FR2-H se proteže na aminokiselinskim položajima 34 do 50, CDR2-H se proteže na aminokiselinskim položajima 51 do 58 (SEQ ID NO:8), FR3-H se proteže na aminokiselinskim položajima 59 do 96, CDR3-H se proteže na aminokiselinskim položajima 97 do 109 (SEQ ID NO:9), i FR4-H se proteže na aminokiselinskim položajima 110 do 120, i
• varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIFSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNTK
TLAEG VPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:34, gde su CDR prikazane podebljano) gde se FR1-L proteže na aminokiselinskim položajima 1 do 26, CDR1-L se proteže na aminokiselinskim položajima 27 do 32 (SEQ ID NO:10), FR2-L se proteže na aminokiselinskim položajima 33 do 49, CDR2-L se proteže na aminokiselinskim položajima 50 do 52, FR3-L se proteže na aminokiselinskim položajima 53 do 88, CDR3-L se proteže na aminokiselinskim položajima 89 do 97 (SEQ ID NO:12), i FR4-L se proteže na aminokiselinskim položajima 98 do 107.
[0054] Varijanta antitela MAb2 je takođe generisana uvođenjem K52R supstitucije u CDR2-L. Ova varijanta, koja se ovde zove „Mab2K52R“, ima značajno isti afinitet za ljudski i Macaca fascicularis CEACAM5 kao i MAb2.
[0055] Takozvano „antitelo MAb3“ obuhvata:
• varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVKLVESGGGLVKPGGSLTLPCAASGFTFSRYAMSWVRQTPEKRLEWVASIS SGG
DTYYPDSVKGRFTVSRDNARNILFLQMSSLRSEDTGMYYCARVNYYDSSFL
DWWG QGTTLTVSS (SEQ ID NO:35, gde su CDR prikazane podebljano) gde se FR1-H proteže na aminokiselinskim položajima 1 do 25, CDR1-H se proteže na
1
aminokiselinskim položajima 26 do 33 (SEQ ID NO:13), FR2-H se proteže na aminokiselinskim položajima 34 do 50, CDR2-H se proteže na aminokiselinskim položajima 51 do 57 (SEQ ID NO:14), FR3-H se proteže na aminokiselinskim položajima 58 do 95, CDR3-H se proteže na aminokiselinskim položajima 96 do 108 (SEQ ID NO:15), i FR4-H se proteže na aminokiselinskim položajima 109 do 119, i
• varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIVMTQSQRFMSTLEGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSA SYRY SGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNNYPLYTFGGGTKLEIK
(SEQ ID NO:36, gde su CDR prikazane podebljano) gde se FR1-L proteže na aminokiselinskim položajima 1 do 26, CDR1-L se proteže na aminokiselinskim položajima 27 do 32 (SEQ ID NO:16), FR2-L se proteže na aminokiselinskim položajima 33 do 49, CDR2-L se proteže na aminokiselinskim položajima 50 do 52, FR3-L se proteže na aminokiselinskim položajima 53 do 88, CDR3-L se proteže na aminokiselinskim položajima 89 do 98 (SEQ ID NO:18), i FR4-L se proteže na aminokiselinskim položajima 99 do 108.
[0056] Takozvano „antitelo MAb4“ obuhvata:
• varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAFIS SYG GRTYYADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMFYCAAHYFGTSGP FAYWG QGTLVTVSA (SEQ ID NO:37, gde su CDR prikazane podebljano) gde se FR1-H proteže na aminokiselinskim položajima 1 do 25, CDR1-H se proteže na aminokiselinskim položajima 26 do 33 (SEQ ID NO:19), FR2-H se proteže na aminokiselinskim položajima 34 do 50, CDR2-H se proteže na aminokiselinskim položajima 51 do 58 (SEQ ID NO:20), FR3-H se proteže na aminokiselinskim položajima 59 do 96, CDR3-H se proteže na aminokiselinskim položajima 97 do 109 (SEQ ID NO:21), i FR4-H se proteže na aminokiselinskim položajima 110 do 120, i
• varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYFAWYQQKQGKSPQLLVYNAKI LAEG VPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGTYYCQHHYGIPFTFGSGTKLELK (SEQ ID NO:38, gde su CDR prikazane podebljano) gde se FR1-L proteže na
1
aminokiselinskim položajima 1 do 26, CDR1-L se proteže na aminokiselinskim položajima 27 do 32 (SEQ ID NO:22), FR2-L se proteže na aminokiselinskim položajima 33 do 49, CDR2-L se proteže na aminokiselinskim položajima 50 do 52, FR3-L se proteže na aminokiselinskim položajima 53 do 88, CDR3-L se proteže na aminokiselinskim položajima 89 do 97 (SEQ ID NO:24), i FR4-L se proteže na aminokiselinskim položajima 98 do 107.
[0057] Takozvano „antitelo MAb5“ obuhvata:
• varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence
ELQLVESGGVLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVTYI
NSGG
GITYYPDTVKGRFTISRDNARNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCTAHYFGSSGPF
AYWGQ GTLVTVSA (SEQ ID NO:39, gde su CDR prikazane podebljano) gde se FR1-H proteže na aminokiselinskim položajima 1 do 25, CDR1-H se proteže na aminokiselinskim položajima 26 do 33 (SEQ ID NO:25), FR2-H se proteže na aminokiselinskim položajima 34 do 50, CDR2-H se proteže na aminokiselinskim položajima 51 do 58 (SEQ ID NO:26), FR3-H se proteže na aminokiselinskim položajima 59 do 96, CDR3-H se proteže na aminokiselinskim položajima 97 do 109 (SEQ ID NO:27), i FR4-H se proteže na aminokiselinskim položajima 110 do 120, i • varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAK TLTEG VPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGTPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:40, gde su CDR prikazane podebljano) gde se FR1-L proteže na aminokiselinskim položajima 1 do 26, CDR1-L se proteže na aminokiselinskim položajima 27 do 32 (SEQ ID NO:28), FR2-L se proteže na aminokiselinskim položajima 33 do 49, CDR2-L se proteže na aminokiselinskim položajima 50 do 52, FR3-L se proteže na aminokiselinskim položajima 53 do 88, CDR3-L se proteže na aminokiselinskim položajima 89 do 97 (SEQ ID NO:30), i FR4-L se proteže na aminokiselinskim položajima 98 do 107.
[0058] Stoga, pronalazak se odnosi na antitelo koje se vezuje za ljudski i Macaca fascicularis CEACAM5.
1
[0059] U jednom otelotvorenju, antitelo pronalaska se vezuje za A3-B3 domene ljudskog i Macaca fascicularis CEACAM5. Još specifičnije, antitelo može da se veže za ljudske i Macaca fascicularis A3-B3 domene nezavisno od toga da li je eksprimirano u izolovanom obliku, ili je prisutno u rastvorljivom vanćelijskom domenu ili CEACAM5 proteinu pune dužine usidrenom u membrani.
[0060] Specifičnost antitela A3-B3 domena ljudskog CEACAM5 ima prednosti jer SNP sa frekvencijom višom od 2% u populaciji belaca nije prijavljen u ovom domenu, što minimizuje rizik da se epitopi antitela na CEACAM5 izmene u delu populacije.
[0061] Pronalazak takođe daje antitelo koje se nadmeće za vezivanje za A3-B3 domen ljudskih i Macaca fascicularis CEACAM5 proteina sa antitelom koje obuhvata varijabilne teške i lake lance antitela izabranih iz grupe koja se sastoji od takozvanih antitela MAb1, MAb2, MAb2K52R,MAb3, MAb4, i MAb5, tj. izabranih iz grupe koja se sastoji od:
a) antitela koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:31 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO:32;
b) antitela koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:33 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO:34;
c) antitela koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:33 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO:34 gde je K na položaju 52 zamenjen sa R;
d) antitela koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:35 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO:36;
e) antitela koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:37 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO:38; i
f) antitela koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:39 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO:40.
[0062] Sposobnost kandidat antitela da se nadmeće za vezivanje za A3-B3 domena ljudskih i Macaca fascicularis CEACAM5 proteina sa antitelom koje sadrži varijabilne teške i lake lance antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od antitela MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 i MAb5 (u daljem tekstu „referentno“ antitelo) može se lako testirati, na primer, kompetitivnom ELISA, gde je antigen (tj. A3-B3 domen ljudskog ili Macaca fascicularis CEACAM5, ili polipeptid koji sadrži ili se sastoji od fragmenta ljudskog ili Macaca
1
fascicularis CEACAM5 uključujući A3-B3 domen, naročito vanćelijski domen ljudskog ili Macaca fascicularis CEACAM5) vezan za čvrstu podlogu i dva rastvora koji sadrže kandidat antitelo i referentno antitelo, respektivno, su dodata, i antitela mogu da se nadmeću za vezivanje antigena. Količina referentnog antitela vezanog za antigen može zatim biti merena i u poređenju sa količinom referentnog antitelu vezanog za antigen merenog u odnosu na negativnu kontrolu (npr. rastvor koji ne sadrži antitelo). Količina vezanog referentnog antitela u prisustvu kandidat antitela smanjena je u poređenju sa količinom vezanog referentnog antitela u prisustvu negativne kontrole, što pokazuje da se kandidat antitelo nadmeće sa referentnim antitelom. Prikladno, referentno antitelo može biti obeleženo (npr. fluorescentno) kako bi se olakšala detekcija vezanog referentnog antitela. Ponovljena merenja mogu biti izvedena sa serijom razblaženja kandidat i/ili referentnog antitela.
[0063] Prema jednom otelotvorenju, ovakvo antitelo, a na primer antitelo koji se nadmeće za vezivanje za A3-B3 domen ljudskog i Macaca fascicularis CEACAM5 proteina sa antitelom kao što je definisano pod b), c), e) i f) gore, vezuje se za dva regiona A3-B3 domena ljudskog CEACAM5 proteina koji se sastoji od aminokiselina na položajima 109-115 (SEQ ID NO: 76) i aminokiselina na položajima 131-143 (SEQ ID NO: 77) A3-B3 domena ljudskog CEACAM5 proteina, respektivno. Zaista, uz konformacioni epitop za MAb2 antitelo je identifikovan da pripada regijama 109-115 i 131-143 od A3-B3 domena ljudskog CEACAM5 proteina, i uz MAb2, MAb4 i MAb5 koji su strukturalno usko povezani, pretpostavlja se od strane pronalazača da se navedena antitela vezuju za isti epitop.
[0064] Prema jednom otelotvorenju, antitelo prema pronalasku je specifično za površinu ljudskih i Macaca fascicularis CEACAM5 proteina. U jednom otelotvorenju, antitelo pronalaska se ne vezuje, ili značajno ne reaguju unakrsno sa ljudskim CEACAM1, ljudskim CEACAM6, ljudske CEACAM7, ljudskim CEACAM8, Macaca fascicularis CEACAM1, Macaca fascicularis CEACAM6 i Macaca fascicularis CEACAM8 proteinima.
[0065] Posebno, antitelo se ne vezuje, ili značajno ne reaguje unakrsno sa vanćelijskim domenom gore navedenih ljudskih i Macaca fascicularis CEACAM proteina.
[0066] Humani CEACAM1 protein pune dužine je dostupan u GenBank bazi podataka pod pristupnim brojem NP_001703.2 (SEQ ID NO: 11). Vanćelijski domen ljudskog CEACAM1 se sastoji od aminokiselina na položajima 35-428 od SEQ ID NO: 11. Ljudski CEACAM6
1
protein pune dužine je dostupan u GenBank bazi podataka pod pristupnim brojem NP_002474.3 (SEQ ID NO: 71). Vanćelijski domen ljudskog CEACAM6 se sastoji od aminokiselina na položajima 35-327 od SEQ ID NO: 71.
[0067] Humani CEACAM7 protein pune dužine je dostupan u GenBank bazi podataka pod pristupnim brojem NP_008821.1 (SEQ ID NO: 72). Vanćelijski domen ljudskog CEACAM7 se sastoji od aminokiselina na položajima 36-248 od SEQ ID NO: 72.
[0068] Humani CEACAM8 protein pune dužine je dostupan u GenBank bazi podataka pod pristupnim brojem NP_001807.2 (SEQ ID NO: 73). Vanćelijski domen ljudskog CEACAM8 se sastoji od aminokiselina na položajima 35-332 od SEQ ID NO: 73.
[0069] M.fascicularis CEACAM1 vanćelijski domen se sastoji od aminokiselina na položajima 35-428 proteina pune dužine, tj. aminokiseline 1-394 od SEQ ID NO: 57.
[0070] M.fascicularis CEACAM6 vanćelijski domen se sastoji od aminokiselina na položajima 35-327 proteina pune dužine, tj. aminokiseline 1-293 od SEQ ID NO: 61.
[0071] M.fascicularis CEACAM8 vanćelijski domen se sastoji od aminokiselina na položajima 35-332 proteina pune dužine, tj. aminokiseline 1-298 od SEQ ID NO: 63.
[0072] „Afinitet“ je definisan, u teoriji, ravnotežom asocijacije između celog antitela i antigena. Može se eksperimentalno proveriti pomoću različitih poznatih postupaka, kao što je merenje povezanosti i stope disocijacije sa površinskom rezonancom plazme ili merenje EC50(ili očiglednog KD) u imunohemijskom testu (ELISA, FACS). U ovim testovima, EC50je koncentracija antitela koja izaziva odgovor na pola puta između osnovice i maksimuma nakon nekog određenog vremena izlaganja, na definisanoj koncentraciji antigena pomoću ELISA (enzimski-povezan imuno-sorbent test) ili ćelije koja eksprimira antigen FACS (ćelijsko sortiranje aktivirano fluorescencijom).
[0073] Vezivanje monoklonskog antitela za antigen 1 Ag1) je „unakrsno-reaktivno“ za antigen 2(Ag2) kada su EC50u sličnom opsegu za oba antigena. U ovoj prijavi, vezivanje monoklonskog antitela za Ag1 je unakrsno reaktivni sa Ag2 kada je odnos afiniteta Ag2 u
2
odnosu na afinitet Ag1 jednaka ili manja od 10 (npr.5, 2, 1 ili 0.5), afiniteti se meri istim postupkom za oba antigena.
[0074] Monoklonsko antitelo koje se vezuje za Ag1 „nije značajno unakrsno reaktivno“ sa AG2 kada afiniteti se veoma razlikuju za dva antigena. Afinitet za AG2 ne može biti merljiv ako je odgovor na vezivanje prenizak. U ovoj prijavi, vezivanje monoklonskog antitela za Ag1 nije značajno unakrsno reaktivno sa AG2, kada je odgovor na vezivanje monoklonskog antitela za AG2 manji od 5% odgovora na vezivanje istog monoklonskog antitela za Ag1 u istoj eksperimentalnoj postavci i pri istoj koncentraciji antitela. U praksi, koncentracija korišćenog antitelo može biti EC50ili koncentracija potrebna da dostigne plato zasićenja dobijen sa Ag1.
[0075] Monoklonsko antitelo „se specifično vezuje“ za, ili je „specifično za“ Ag1 kada nije značajno unakrsno reaktivno za AG2. Shodno tome, antitelo prema pronalasku ima odnos afinitet za ljudski CEACAM5 sa afinitetom za Macaca fascicularis CEACAM5 koji je ≤10, na primer ≤5, ≤2, ≤1 ili ≤0,5. Dakle, polipeptid prema pronalasku može biti korišćen u toksikološkim ispitivanjima obavljenim na majmunima jer bi profil toksičnost primećeno kod majmuna bio relevantan da predvidi potencijalne negativne efekte kod ljudi
[0076] Jedno otelotvorenje ovog pronalaska ima afinitet za ljudski CEACAM5 ili Macaca fascicularis CEACAM5, ili oba, koji je ≤10nM, na primer ≤ 5nM, ≤ 3nM, ≤ 1 nM ili ≤ 0,1 nM, na primer afinitet 0,01 nM do 5 nM, ili i afinitet 0,1 nM do 5 nM, ili 0,1 nM do 1 nM.
[0077] Afiniteti ljudskog CEACAM5 ili Macaca fascicularis CEACAM5 mogu se utvrditi kao EC50 vrednost u ELISA korišćenjem rastvorljivog rekombinantnog CEACAM5 kao antigena za hvatanje.
[0078] Antitelo pronalaska može takođe imati očiglednu konstantu disocijacije (očigledan KD), kao što može da se odredi putem FACS analizom na ćelijskoj liniji tumora MKN45 (DSMZ, ACC 409) ili na ksenograftu ćelija tumora koji su dobijene od pacijenta (CR-IGR-034P dostupne Oncodesign Biotechnology, kolekcija tumora CReMEC), koje jsu ≤25nM, na primer ≤20nM, ≤10nM, ≤5nM, ≤3nM ili ≤1nM. Očigledni KD može da bude u opsegu 0,01-20 nM, ili može biti u opsegu 0,1-20nM, 0,1-10nM ili 0,1-5nM.
[0079] Dodatno, za antitela prema ovom pronalasku se pokazalo da bi mogla da detektuju CEACAM5 ekspresimiranje putem imunohistohemije u smrznutim i formalinom fiksiranim i parafinom obloženim (FFPE) presecima tkiva.
[0080] Poravnanja sekvenci VH i VL regija MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 i MAb5 antitela su prikazana na Slici 7. Poređenje CRD-H i CDR-L sekvenci ukazuje da su, strukturalno, MAb2, MAb4 i MAb5, s jedne strane, i MAb1 i MAb3, s druge strane, usko povezani, gde pomenuta antitela verovatno vezuje za isti epitop. Poređenje CRD-H i CDR-L sekvenci dalje identifikuje CDR mesta koja su striktno konzervirana između dve grupe antitela, i za koja se stoga pretpostavlja da su važna za specifičnost, dok ostali položaji mogu podržati supstituciju.
[0081] Dalje je identifikovano od strane pronalazača da ostaci na položajima 101-109 od MAb2 VH (tj. ostaci CDR3-H) i ostacima na položajima 47-54 i 88-104 od MAb2 VL (tj. regije uključujući CDR2-L i CDR3-L, respektivno) čine deo, ili formiraju paratop antitela za ljudski CEACAM5-A3B3 domen.
[0082] Dalje, ostaci na položajima 27, 28, 29, 31, 51, 52, 89, 90, 93, 94, 96, i 97 od MAb2 VL (tj. unutar CDR1-L, CDR2-L i CDR3-L), i ostaci na položajima 26 do 31, 51 do 58, 97, 103, 104, 107, i 109 za MAb2 VH (tj. unutar CDR1-H, svi CDR2-H i unutar CDR3-H) su identifikovani putem jedne supstitucije kiselina kao neutralni za vezivanje za ljudske i makaki CEACAM5 vanćelijske domene. Pored toga, za ostatke na položajima 30 i 92 od MAb2 VL (tj. unutar CDR1-L i CDR3-L), i za ostatke na položajima 98 i 100 od MAb2 VH (odnosno unutar CDR3-H), pokazalo se da tolerišu konzervativnu supstituciju. Pošto MAb2, MAb4 i MAb5 nose isti set od 6 CDR, ili veoma blisko srodni, smatra se da će varijacije na istim položajima MAb4 ili MAb5 u VH ili VL ili VH i CL sekvencama takođe rezultovati u varijantama antitela koje održavaju specifičnost vezivanja i/ili afinitet za ljudski i makaki CEACAM5.
[0083] Vredno pomena, svi ostaci CDR2-H su identifikovani kao neutralni za vezivanje za ljudske i makaki CEACAM5 vanćelijske domene, pronalazači su pretpostavili da CDR2-H možda neće učestvovati u interakciji. Shodno tome, u antitelima iz ovog pronalaska, CDR2-H može biti bilo koja sekvenca od 6 do 10 aminokiselina, a to je redovna dužina CDR2-H sekvenci u ljudskim antitelima.
[0084] Stoga, antitelo prema pronalasku obuhvata:
a) CDR1-H koji se sastoji od sekvence X1X2X3X4X5X6YD (SEQ ID NO:83) gde je svaki od X1, X2, X3, X4, X5i X6bilo koja aminokiselina; i
CDR2-H koji se sastoji od 6 do 10 aminokiselina duge sekvence, poželjno 8 aminokiselina duge sekvence gde bilo koja aminokiselina može biti prisutna na bilo kom položaju; i
CDR3-H koji se sastoji od sekvence X1X2HX3FGX4X5GPX6AX7(SEQ ID NO:84) gde je svaki od X1, X4, X5, X6, i X7bilo koja aminokiselina, X2je A ili S, i X3je Y, F ili W; i/ili b) CDR1-L koji se sastoji od sekvence X1X2X3X4X5Y (SEQ ID NO:85) gde je svaki od X1, X2, X3i X5bilo koja aminokiselina, i X4je Y, F ili W; i
CDR2-L koji se sastoji od sekvence NX1X2gde je svaki od X1i X2bilo koja aminokiselina; i
CDR3-L koji se sastoji od sekvence X1X2HX3X4X5PX6X7(SEQ ID NO:86) gde je svaki od X1, X2, X4, X5, X6i X7bilo koja aminokiselina, X3je Y, F ili W.
[0085] U jednom otelotvorenju, u CDR1-H koji se sastoji od sekvence X1X2X3X4X5X6YD (SEQ ID NO:83), X1je G, ili X2je F, ili X3je T, A ili V, ili X4je F, ili X5je S, ili X6je S, ili bilo koja kombinacija pomenutog.
[0086] U jednom otelotvorenju, CDR2-H se sastoji od sekvence IX1SX2GGX3T (SEQ ID NO:79) gde X1je S ili N (posebno S), X2je Y ili G (posebno G), X3je R ili I. U daljem otelotvorenju X3je I.
[0087] U jednom otelotvorenju, u CDR3-H koji se sastoji od sekvence X1X2HX3FGX4X5GPX6AX7(SEQ ID NO:84), X1je A ili T, ili X4je T ili S, ili X5je S, ili X6je F, ili X7je Y, ili bilo koja kombinacija pomenutog.
[0088] U jednom otelotvorenju, u CDR1-L koji se sastoji od sekvence X1X2X3X4X5Y (SEQ ID NO:85), X1je E, ili X2je N, ili X3je I, ili X5je S, ili bilo koja kombinacija pomenutog.
[0089] U jednom otelotvorenju, CDR2-L se sastoji od sekvence NX1X2gde X1je A ili T, i X2je K ili R.
2
[0090] U jednom otelotvorenju, u CDR3-L koji se sastoji od sekvence X1X2HX3X4X5PX6X7(SEQ ID NO:86), X1je Q, ili X2je H, ili X4je G, ili X5je T, ili X6je F, ili X7je T, ili bilo koja kombinacija pomenutog. Prema jednom otelotvorenju, antitelo prema pronalasku obuhvata:
a) CDR1-H koji se sastoji od sekvence GFX1FSSYD (SEQ ID NO:78) gde X1je T, A ili V; i
CDR2-H koji se sastoji od sekvence IX1SX2GGX3T (SEQ ID NO:79) gde X1je S ili N (posebno S), X2je Y ili G (posebno G), X3je R ili I ; i
CDR3-H koji se sastoji od sekvence X1AHYFGX2SGPFAY (SEQ ID NO:80) gde X1je A ili T (posebno A), i X2je T ili S ; i/ili
b) CDR1-L koji se sastoji od sekvence ENIFSY (SEQ ID NO:10) ili ENIYSY (SEQ ID NO:22); i
CDR2-L koji se sastoji od sekvence NX1X2gde X1je A ili T, i X2je K ili R, posebno R; CDR2-L koji se sastoji posebno od NAK, NTK i NTR; i
CDR3-L koji se sastoji od sekvence QHHYGTPFT (SEQ ID NO:12) ili QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24).
[0091] Prema jednom otelotvorenju, u CDR2-H, X1je S ili N, X2je G i X3je I.
[0092] Prema jednom otelotvorenju, CDR2-H se sastoji od ISSGGGIT (SEQ ID NO:8), ISSYGGRT (SEQ ID NO:20) ili INSGGGIT (SEQ ID NO:26).
[0093] Prema jednom otelotvorenju, u CDR3-H, X1je A ili T, i X2je S.
[0094] Prema jednom otelotvorenju, CDR3-H se sastoji od AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), ili TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27).
[0095] Bilo koja kombinacija ovih otelotvorenja čini deo pronalaska.
[0096] Alternativno, antitelo prema pronalasku obuhvata:
a) CDR1-H koji se sastoji od sekvence GFTFSX1YX2(SEQ ID NO:81) gde X1je R ili S, posebno S, i X2je A ili D; i
CDR2-H koji se sastoji od sekvence ISSGGX1X2X3(SEQ ID NO:82) gde X1je absent, S ili G (posebno G), X2je D, Y ili I, i X3je T ili I; i
CDR3-H koji se sastoji od sekvence ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) ili ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15); i/ili
b) CDR1-L koji se sastoji od sekvence QNVGTN (SEQ ID NO:4); i
CDR2-L koji se sastoji od sekvence SAS; i
CDR3-L koji se sastoji od sekvence QQYNSYPLYT (SEQ ID NO:6) ili QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18).
[0097] Prema jednom otelotvorenju, CDR2-H se sastoji od sekvence ISSGGSYI (SEQ ID NO:2) ili ISSGGDT (SEQ ID NO:14).
[0098] Prema jednom otelotvorenju, CDR2-H se sastoji od sekvence ISSGGSYI (SEQ ID NO:2) i CDR3-H od sekvence ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3).
[0099] Prema jednom otelotvorenju, CDR2-H se sastoji od ISSGGDT (SEQ ID NO:14) i CDR3-H od sekvence ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15).
[0100] Prema jednom otelotvorenju, antitelo prema pronalasku obuhvata CDR sekvence teških i/ili lakih lanaca jednog od takozvanih anti-CEACAM5 antitela MAb1, MAb2, MAb2K52R, MAb3, MAb4, i MAb5.
[0101] Stoga, pronalazak se odnosi na antitelo koje obuhvata:
a) CDR1-H sekvence GFTFSSYA (SEQ ID NO:1) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:1 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H sekvence ISSGGSYI (SEQ ID NO:2) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:2 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H sekvence ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:3 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR1-L sekvence QNVGTN (SEQ ID NO:4) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:4 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L sekvence SAS ili sekvence koja se razlikuje od SAS po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L sekvence QQYNSYPLYT (SEQ ID NO:6) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:6 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili
b) CDR1-H sekvence GFVFSSYD (SEQ ID NO:7) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:7 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H sekvence ISSGGGIT (SEQ ID NO:8) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:8 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H sekvence AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9) ili sekvence koja se
2
razlikuje od SEQ ID NO:9 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR1-L sekvence ENIFSY (SEQ ID NO:10) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:10 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L sekvence NTK ili NTR ili sekvence koja se razlikuje od NTK ili NTR po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L sekvence QHHYGTPFT (SEQ ID NO:12) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:12 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili
c) CDR1-H sekvence GFTFSRYA (SEQ ID NO:13) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:13 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H sekvence ISSGGDT (SEQ ID NO:14) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:14 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H sekvence ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:15 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR1-L sekvence QNVGTN (SEQ ID NO:16) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:16 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L sekvence SAS ili sekvence koja se razlikuje od SAS po jednoj aminokiselinskoj supstituciji i CDR3-L sekvence QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:18 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili
d) CDR1-H sekvence GFTFSSYD (SEQ ID NO:19) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:19 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H sekvence ISSYGGRT (SEQ ID NO:20) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:20 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H sekvence AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:21 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR1-L sekvence ENIYSY (SEQ ID NO:22) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:22 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L sekvence NAK ili sekvence koja se razlikuje od NAK po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija i CDR3-L sekvence QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:24 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; ili
e) antitelo koje obuhvata CDR1-H sekvence GFAFSSYD (SEQ ID NO:25) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:25 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-H sekvence INSGGGIT (SEQ ID NO:26) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:26 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR3-H sekvence TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:27 po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija; CDR1-L sekvence ENIYSY (SEQ ID NO:28) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:28 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji; CDR2-L sekvence NAK; ili sekvence koja se razlikuje od NAK po jednoj ili više aminokiselinskih
2
supstitucija i CDR3-L sekvence QHHYGTPFT (SEQ ID NO:30) ili sekvence koja se razlikuje od SEQ ID NO:30 po jednoj aminokiselinskoj supstituciji.
[0102] Jedna ili više pojedinačna aminokiselina može da se izmeni supstitucijom, posebno konzervativnom supstitucijom, u jednoj ili više od gore navedenih CDR sekvenci. Takve izmene mogu biti namenjene kao primer za uklanjanje mesta glikozilacije ili mesta deamidairanje, u vezi sa humanizacijom antitela.
[0103] Na osnovu poravnanja sekvenci VH i VL regija od MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 i MAb5, i na osnovu jedne kisele supstitucije u varijanti MAb2 antitela, aminokiselina može da se supstituiše:
• u CDR1-H: na jednom ili više položaja 1 do 6, na primer na položaju 3, od CDR1-H sekvence GFVFSSYD (SEQ ID NO:7), GFTFSSYD (SEQ ID NO:19) ili GFAFSSYD (SEQ ID NO:25), ili na položaju 6 od CDR1-H sekvence GFTFSSYA (SEQ ID NO:1) ili GFTFSRYA (SEQ ID NO:13); i/ili
• u CDR2-H, na jednom ili više od bilo kog položaja, ili na jednom, dva ili tri od položaja 2, 4, i 7 od CDR2-H sekvence ISSGGGIT (SEQ ID NO:8), ISSYGGRT (SEQ ID NO:20) ili INSGGGIT (SEQ ID NO:26), ili na jednom, dva ili tri od položaja 6, 7 i 8 (gde je sekvenca dugačka 8 aminokiselina) od CDR2-H sekvence ISSGGSYI (SEQ ID NO:2) ili ISSGGDT (SEQ ID NO:14); i/ili pogledati gore
• u CDR3-H, na jednom ili više položaja 1, 7, 8, 11 i 13, na primer na jednom ili dva od položaja 1 i 7 od CDR3-H sekvence AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), ili TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27), ili na položaju 3, 4, 7, 8, 9, 10, ili 11 sekvence ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) orARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15); i/ili
• u CDR1-L, na jednom ili više položaja 1 do 5, posebno na jednom ili više položaja 1, 2, 3 i 5 ili na položaju 4 od CDR1-L sekvence ENIFSY (SEQ ID NO:10) ili ENIYSY (SEQ ID NO:28); i/ili
• u CDR2-L, na položajima 2 i/ili 3 sekvence NAK, NTK ili NTR, posebno barem na položaju 3 ako je K prisutan. U tom slučaju, R na primer može biti supstituisan za K na položaju 3 od CDR2-L ; i/ili
• u CDR3-L, na jednom ili više položaja 1, 2, 5, 6, 8 i 9, na primer na položaju 6 od CDR3-L sekvence QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) ili QHHYGTPFT (SEQ ID
2
NO:30), ili na položaju 5 od CDR3-L sekvence QQYNSYPLYT (SEQ ID NO:6) ili QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18).
[0104] Prema jednom otelotvorenju, u antitelu pronalaska:
• položaj 5 od CDR3-H sekvence AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), ili TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27); i/ili
• položaj 6 od CDR1-L sekvence ENIFSY (SEQ ID NO:10) ili ENIYSY (SEQ ID NO:28); i/ili
• položaj 3 od CDR3-L sekvence QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) ili QHHYGTPFT (SEQ ID NO:30)
je (su) nemodifikovani.
[0105] Prema jednom otelotvorenju, u CDR1-H sekvence GFVFSSYD (SEQ ID NO:7), GFTFSSYD (SEQ ID NO:19) ili GFAFSSYD (SEQ ID NO:25), aminokiselina koja je supstituisana za aminokiselinu na položaju na položaju 3 od CDR1-H je izabrana iz grupe koji se sastoji od T, A ili V.
[0106] Prema jednom otelotvorenju, u CDR1-H sekvence GFTFSSYA (SEQ ID NO:1) ili GFTFSRYA (SEQ ID NO:13), aminokiselina koja je supstituisana za aminokiselinu na položaju 6 od CDR1-H je R ili S.
[0107] Prema jednom otelotvorenju, u CDR3-H sekvence AAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:9), AAHYFGTSGPFAY (SEQ ID NO:21), ili TAHYFGSSGPFAY (SEQ ID NO:27), aminokiselina koja je supstituisana za aminokiselinu na položaju 1 od CDR3-H je A ili T i/ili aminokiselina koja je supstituisana za aminokiselinu na položaju 7 od CDR3-H je T ili S.
[0108] Prema jednom otelotvorenju, u CDR3-H sekvence ARPAYYGNPAMDY (SEQ ID NO:3) ili ARVNYYDSSFLDW (SEQ ID NO:15), aminokiselina koja je supstituisana za aminokiselinu na položaju 3 od CDR3-H je V ili P, na položaju 4 je A ili N, na položaju 7 je D ili G, na položaju 8 je S ili N, na položaju 9 je S ili P, na položaju 10 je F ili A, ili na položaju 11 je W ili Y.
2
[0109] Prema jednom otelotvorenju, aminokiselina koja je supstituisana za aminokiselinu na položaju 4 od CDR1-L je Y ili F.
[0110] Prema jednom otelotvorenju, u CDR2-L od sekvence NAK, NTK ili NTR, aminokiselina koja je supstituisana za aminokiselinu na položaju 2 od CDR2-L je A ili T.
[0111] Prema jednom otelotvorenju, u CDR3-L od sekvence QQYNSYPLYT (SEQ ID NO:6) ili QQYNNYPLYT (SEQ ID NO:18), aminokiselina koja je supstituisana za aminokiselinu na položaju 5 od CDR3-L je N ili S.
[0112] Prema jednom otelotvorenju, u CDR3-L od sekvence QHHYGIPFT (SEQ ID NO:24) ili QHHYGTPFT (SEQ ID NO:30), aminokiselina koja je supstituisana za aminokiselinu na položaju 6 od CDR3-L je I ili T.
[0113] Bilo koja kombinacija gore navedenih otelotvorenja čini deo pronalaska.
[0114] U jednom otelotvorenju, antitelo prema pronalasku je konvencionalno antitelo, kao što je konvencionalno monoklonsko antitelo, fragment antitela, bispecifično ili multispecifično antitelo.
[0115] U otelotvorenju antitelo prema pronalasku obuhvata ili se sastoji od IgG, ili je njihov fragment.
[0116] Pronalazak takođe pruža antitela kako je definisano gore koja obuhvataju barem varijabilni domen teškog lanca i/ili varijabilni domen lakog landa od jednog od pet takozvanih anti-CEACAM5 antitela MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, i MAb5.
[0117] Stoga otelotvorenje pronalaska se odnosi na antitelo koje obuhvata:
a) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:31 ili sekvence koja je barem 85% identična njoj, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence od sekvence SEQ ID NO:32, ili sekvence koja je barem 85% identična njoj; ili
b) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:33, ili sekvence koja je barem 85% identična njoj, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence od sekvence SEQ ID NO:34, ili sekvence koja je barem 85% identična njoj; ili
2
c) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:35, ili sekvence koja je barem 85% identična njoj, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence od sekvence SEQ ID NO:36, ili sekvence koja je barem 85% identična njoj; ili
d) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:37, ili sekvence koja je barem 85% identična njoj, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence od sekvence SEQ ID NO:38, ili sekvence koja je barem 85% identična njoj; ili
e) varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:39, ili sekvence koja je barem 85% identična njoj, i/ili varijabilni domen lakog lanca sekvence od sekvence SEQ ID NO:40, ili sekvence koja je barem 85% identična njoj. Na primer, sekvenca varijabilnog domena teškog ili lakog lanca može se razlikovati od sekvence SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40, kako je odgovarajuće, po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija, posebno jednom ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija i/ili supstitucija sa kanonskim ostacima. U otelotvorenju, sekvenca varijabilnog domena teškog ili lakog lanca može da se razlikuje od sekvence SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 samo po konzervativnoj aminokiselinskoj supstituciji.
[0118] Izmene sekvence u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO:31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 biće prisutne značajno u jednoj ili više okvirnih regija, FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L i/ili FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H.
[0119] Međutim, aminokiselinske supstitucije u jednoj ili više CDR su takođe moguće. U otelotvorenju, sekvenca varijabilnog domena lakog lanca može se razlikovati od sekvence SEQ ID NO:34 barem po K do R supstituciji na položaju 52 od SEQ ID NO:34 (u CDR2-L).
[0120] Antitelo pronalaska i njegov fragment mogu biti, respektivno, mišje antitelo i fragment mišjeg antitela.
[0121] Antitelo takođe može biti himerno antitelo. U otelotvorenju mišleg/ljudskog antitela, npr. antitela koje obuhvata mišje varijabilne domene teških i lakih lanaca i CH domen i CL domen od ljudskog antitela. Polipeptid može biti fragment takvog antitela.
[0122] Prema jednom otelotvorenju, antitelo pronalaska je:
a) himerno antitelo koje obuhvata, ili koji se sastoji od, teškog lanca sekvence SEQ ID NO:41 ili sekvence koja je barem 85% identična njoj ili lakog lanca sekvence od sekvence SEQ ID NO:42 ili sekvence koja je barem 85% identična njoj (tj. teški i/ili laki lanac od chMAb1 kako je opisano u primeru 5); ili teški lanac i laki lanac ili,
b) himerno antitelo koje obuhvata, ili koji se sastoji od, teškog lanca sekvence SEQ ID NO:43 ili sekvence koja je barem 85% identična njoj ili lakog lanca sekvence od sekvence SEQ ID NO:44 ili sekvence koja je barem 85% identična njoj; (tj. teški i/ili laki lanac od chMAb2 kako je opisano u primeru 5); ili or teški lanac i laki lanac ili, c) himerno antitelo koje obuhvata, ili koji se sastoji od, teškog lanca sekvence SEQ ID NO:45 ili sekvence koja je barem 85% identična njoj ili lakog lanca sekvence od sekvence SEQ ID NO:46 ili sekvence koja je barem 85% identična njoj; (tj. teški i/ili laki lanac od chMAb3 kako je opisano u primeru 5); ili teški lanac i laki lanac ili,
d) himerno antitelo koje obuhvata, ili koji se sastoji od, teškog lanca sekvence SEQ ID NO:47 ili sekvence koja je barem 85% identična njoj ili lakog lanca sekvence od sekvence SEQ ID NO:48 ili sekvence koja je barem 85% identična njoj, (tj. teški i/ili laki lanac od chMAb4 kako je opisano u primeru 5); ili or teški lanac i laki lanac ili, e) himerno antitelo koje obuhvata, ili koji se sastoji od, teškog lanca sekvence SEQ ID NO:49 ili sekvence koja je barem 85% identična njoj ili lakog lanca sekvence od sekvence SEQ ID NO:50 ili sekvence koja je barem 85% identična njoj (tj. teški i/ili laki lanac od chMAb5 kako je opisano u primeru 5), ili or teški lanac i laki lanac ili, f) fragment himernog antitela definisanog u a), b), c), d) ili e).
[0123] Antitelo takođe može biti humanizovano antitelo ili fragment humanizovanog antitela. U otelotvorenju, antitelo pronalaska može da bude rezultat humanizacije bilo kog himernog antitela koje je definisano gore u a), b), c), d), e) ili f).
[0124] Brojni postupci za humanizaciju sekvenci antitela poznati su u struci; pogledati npr. pregled od Almagro & Fransson (2008) Front Biosci.13: 1619-1633. Jedan često korišćen postupak je presađivanje CDR, ili preoblikovanje antitela, koja obuhvata presađivanje CDR sekvenci donor antitela, generalno mišjeg antitela, u okvirnu građu ljudskog antitela različite specifičnosti. Pošto presađivanje CDR može da smanji specifičnost i afinitet vezivanja, a time i biološke aktivnosti CDR-presađenog ne-ljudskog antitela, povratne mutacije mogu se uvesti u odabranim položajima CDR-presađenog antitela kako bi se zadržali specifičnost i afinitet vezivanja roditeljskog antitela. Identifikacija položaj za eventualne povratne mutacije može se obaviti korišćenjem informacija dostupnih u literaturi i u bazama podataka antitela.
Aminokiselinski ostaci koji su kandidati za povratne mutacije su tipično ona koja se nalaze na
1
površini molekula antitela, dok ostaci koji su duboki ili imaju nizak stepen površinske izloženosti obično neće biti promenjeni. Alternativna tehnika humanizacije za CDR presađivanje i povratne mutacije je ponovno izbijanje na površinu, gde se zadržavaju nepovršinski izloženi ostaci ne-ljudskog porekla, dok su površinski ostaci modifikovani do ljudskih ostataka. Druga alternativa tehnika je poznata kao „vođena selekcija“ (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12, 899) i može se koristiti za izvođenje iz mišijeg antitela potpuno ljudsko antitela uz očuvanje epitopa i vezujuće karakteristike roditeljskog antitela.
[0125] Za himerna antitela, humanizacija obično uključuje modifikaciju okvirnih regija sekvenci varijabilne regije.
[0126] Aminokiselinski ostaci koji su deo CDR se po pravilu ne menjaju u vezi sa humanizacijom, iako u nekim slučajevima može biti poželjno da se promene pojedinačni CDR aminokiselinski ostaci, na primer za uklanjanje mesta glikozilacije, mesta deamidovanja ili neželjenog cistein ostatka. N-vezana glikozilacija nastaje spajanjem nekog oligosaharid lanca za asparaginski ostatkom u tripeptidnoj sekvenci Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, gde X može biti bilo koja aminokiselina osim Pro. Uklanjanje N-glikozilacije može se postići mutacijom Asn ili Ser/Thr ostatka do drugog ostatka, na primer putem konzervativne supstitucije.
Deamidairanje asparagin i glutamin ostataka može se javiti u zavisnosti od faktora kao što su pH i površinska izloženost. Asparagin ostaci su posebno podložni deamidaciji, pre svega kada su prisutni u sekvenci Asn-Gly, i u manjoj meri u drugim dipeptidnim sekvencama kao što je Asn-Ala. Kada je takvo mesto deamidairanja, na primer Asn-Gly prisutno u CDR sekvenci, može stoga biti poželjno ukloniti mesto, tipično putem konzervativne supstitucije ukloniti jedan od impliciranih ostataka. Supstitucija u CDR sekvenci kako bi se uklonio jedan od impliciranih ostataka je takođe namerena da bude obuhvaćena ovim pronalaskom.
[0127] Uzimajući takozvano „MAb2 antitelo“ kao primer, humanizovan fragment antitela stoga može da sadrži naredne mutacije u varijabilnom teškom lancu: P umesto G na položaju 9 ; i/ili G umesto V na položaju 10 ; i/ili S umesto K na položaju 19 ; i/ili R umesto K na položaju 43 ; i/ili G umesto R na položaju 44 ; i/ili A umesto F na položaju 60 ; i/ili S umesto D na položaju 62 ; i/ili K umesto Q na položaju 65 ; i/ili T umesto K na položaju 87 ; i/ili V umesto I na položaju 89 ; i/ili S umesto A na položaju 113 ; gde su položaji dati kao referenca na SEQ ID NO:33.
2
[0128] I dalje uzimajući takozvano „MAb2 antitelo“ kao primer, humanizovan fragment antitela stoga može da sadrži naredne mutacije u varijabilnom teškom lancu: D umesto E na položaju 17 ; i/ili R umesto T na položaju 18 ; i/ili P umesto Q na položaju 40 ; i/ili K umesto Q na položaju 45 ; i/ili R umesto K na položaju 52 ; i/ili D umesto Q na položaju 70 ; i/ili T umesto K na položaju 74 ; i/ili S umesto N na položaju 76 ; i/ili A umesto G na položaju 84 ; i/ili T umesto S na položaju 85 ; gde su položaji dati kao referenca na SEQ ID NO:34.
[0129] U otelotvorenju, antitelo pronalaska je ljudsko antitelo koje obuhvata, ili se sastoji od, teškog lanca koji obuhvata naredne mutacije, gde su položaji dati kao referenca na SEQ ID NO:33:
a) P umesto G na položaju 9 ; i G umesto V na položaju 10 ; i S umesto K na položaju 19 ; i R umesto K na položaju 43 ; i S umesto D na položaju 62 ; i K umesto Q na položaju 65 ; i T umesto K na položaju 87; ili
b) P umesto G na položaju 9 ; i G umesto V na položaju 10 ; i S umesto K na položaju 19 ; i R umesto K na položaju 43 ; i G umesto R na položaju 44 ; i A umesto F na položaju 60 ; i S umesto D na položaju 62 ; i K umesto Q na položaju 65 ; i T umesto K na položaju 87 ; i V umesto I na položaju 89 ; i S umesto A na položaju 113; i/ili humanizovanog antitela koje obuhvata lak lanac koji obuhvata naredne mutacije, gde su položaji dati kao referenca na SEQ ID NO:34:
c) D umesto E na položaju 17 ; i P umesto Q na položaju 40 ; i K umesto Q na položaju 45 ; i T umesto K na položaju 74 ; i S umesto N na položaju 76 ; ili
d) D umesto E na položaju 17 ; i R umesto T na položaju 18 ; i P umesto Q na položaju 40 ; i K umesto Q na položaju 45 ; i D umesto Q na položaju 70 ; i T umesto K na položaju 74 ; i S umesto N na položaju 76 ; i A umesto G na položaju 84 ; i T umesto S na položaju 85 ; ili
e) D umesto E na položaju 17 ; i R umesto T na položaju 18 ; i P umesto Q na položaju 40 ; i K umesto Q na položaju 45 ; i R umesto K na položaju 52 ; i D umesto Q na položaju 70 ; i T umesto K na položaju 74 ; i S umesto N na položaju 76 ; i A umesto G na položaju 84 ; i T umesto S na položaju 85.
[0130] U otelotvorenju, antitelo pronalaska je ljudsko antitelo dobijeno presađivanjem CDR antitela pronalaska do alternativnih okvirnih regija antitela, specifičnije u ljudske okvirne regije. Uzimajući MAb2 kao primer, 6 CDR od MAb2K52Rsu presađene u ljudski okvir koji se sastoji od IGHV3-23 i IGKV1D-39 gena, i tri povratne mutacije su uvedene na odgovarajuće položaje 34 i 53 u VL (SEQ ID NO.34) i položaj 50 u VH (SEQ ID NO.33) rezultujući u antitelu koje obuhvata varijabilni domen teškog lanca sekvence SEQ ID NO:74 i varijabilni domen lakog lanca sekvence SEQ ID NO:75.
[0131] U otelotvorenju, antitelo pronalaska je ljudsko antitelo koje obuhvata, ili se sastoji od, teškog lanca sekvence SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:5, ili SEQ ID NO: 74, ili sekvence barem 85% identične njemu; i/ili lakog lanca sekvence SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:55 ili SEQ ID NO: 75 ili sekvence barem 85% identične njemu (humanizovani varijabilni domeni teških i lakih lanaca MAb2).
[0132] U otelotvorenju, antitelo pronalaska je ljudsko antitelo koje obuhvata teški lanac sekvence SEQ ID NO:51 ili sekvence barem 85% identične njemu i laki lanac sekvence SEQ ID NO:17 ili sekvence barem 85% identične njemu, ili teški lanac sekvence SEQ ID NO:5 ili sekvence barem 85% identične njemu i laki lanac sekvence SEQ ID NO:23 ili sekvence barem 85% identične njemu, ili teški lanac sekvence SEQ ID NO:5 ili sekvence barem 85% identične njemu i laki lanac sekvence SEQ ID NO:29 ili sekvence barem 85% identične njemu, ili teški lanac sekvence SEQ ID NO:51 ili sekvence barem 85% identične njemu i laki lanac sekvence SEQ ID NO:55 ili sekvence barem 85% identične njemu, ili teški lanac sekvence SEQ ID NO: 74 ili sekvence barem 85% identične njemu i laki lanac sekvence SEQ ID NO: 75 ili sekvence barem 85% identične njemu.
[0133] U navedenom humanizovanom antitelu ili njegovom fragmentu, varijabilni domeni teških i lakih lanaca mogu obuhvatati ljudske prihvatne okvirne regije. Humanizovano antitelo dalje obuhvata ljudske konstantne domene teškog i lakog lanca, gde su prisutni.
[0134] U otelotvorenju, antitelo iz pronalaska je antitelo huMAb2-3 ili njegova varijanta, tj. izolovano antitelo koje se vezuje za A3-B3 domen ljudskih i Macaca fascicularis CEACAM5 proteina i koje sadrži:
a) teški lanac koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 87 ili sekvence barem 85% identične njoj ili
b) laki lanac koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 88 ili sekvence barem 85% identične njoj ili teškom lancu i lakom lancu.
4
[0135] U otelotvorenju, antitelo iz pronalaska je antitelo huMAb2-4 (MAb2_VL1d VH1-IgG1) ili njegova varijanta, tj. izolovano antitelo koje se vezuje za A3-B3 domen ljudskih i Macaca fascicularis CEACAM5 proteina i koje sadrži:
c) teški lanac koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 89 ili sekvenca barem 85% identične njoj; i/ili
d) laki lanac koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 90 ili sekvence barem 85% identične njoj.
[0136] Antitelo prema pronalasku može takođe biti antitelo sa jednim domenom ili njegov fragment. U otelotvorenju pronalaska,fragment antitela sa jednim domenom može da se sastoji od varijabilnog teškog lanca (VHH) koji sadrži CDR1-H, CDR2-H i CDR3-H od antitela kako je gore opisano. Antitelo može takođe biti antitelo teškog lanca, tj. antitelo lišeno lakog lanca, koji može ali ne mora da sadrži CH1 domen.
[0137] Antitelo sa jednim domenom ili njegov fragmenta mogu da sadrže i okvirnu regiju kamiljeg antitela sa jednim domenom, i opciono konstantan domen kamiljeg antitela sa jednim domenom.
[0138] Antitelo prema pronalasku može takođe biti fragment antitela na primer humanizovan fragment antitelo, izabran iz grupe koju čine Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, i dijatela.
[0139] Antitelo može takođe biti bispecifično ili multispecifično antitelo formirano od fragmenata antitela, gde je najmanje jedan fragment antitela fragment antitela prema pronalasku. Multispecifična antitela su polivalentni proteinski kompleksi kao što je opisano na primer u EP 2050 764 A1 ili US 2005/0003403 A1.
[0140] Bispecifična ili multispecifična antitela prema pronalasku mogu imati specifičnost za (a) A3-B3 epitop na ljudskom/Macaca fascicularis CEACAM5 targetiranom od strane jednog od takozvanih MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 i MAb5 antitela i (b) najmanje jedan drugi antigen. Prema jednom otelotvorenju, najmanje jedan drugi antigen nije ljudski ili Macaca fascicularis CEACAM člana porodice, i u otelotvoranju više od jednog ili sveiljudski i Macaca fascicularis CEACAM1, ljudski i majmunski CEACAM6, ljudski i Macaca fascicularis CEACAM7 i ljudski i Macaca fascicularis CEACAM8. Prema drugom otelotvorenju, najmanje jedan drugi antigen može biti epitop na ljudskom Macaca fascicularis CEACAM5 osim navedenog A3-B3 epitopa targetiranog od strane jednog od takozvanih MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 i MAb5 antitela.
[0141] Pomenuta antitela mogu se proizvesti bilo kojom tehnikom poznatom u struci. U otelotvorenju, navedena antitela se proizvode tehnikama kao što je niže opisano. Antitela i njihovi fragmenti prema pronalasku mogu se koristiti u izolovanom (npr. prečišćenom) obliku ili biti sadržani u vektoru, kao što je membrana ili lipidna vezikula (npr. lipozom).
Nukleinske kiseline, vektori i rekombinantne ćelije domaćini
[0142] Dalji predmet pronalaska se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline obuhvata ili sadrži sekvencu koja kodira antitelo iz ovog pronalaska kao što je definisano u prethodnom tekstu.
[0143] Tipično, navedena nukleinska kiselina je DNK ili RNK molekul, koji može biti uključen u bilo koji pogodan vektor, kao što je plazmid, kozmid, epizom, veštački hromozom, fag ili virusni vektor.
[0144] Izrazi „vektor“, „vektor kloniranja“ i „vektor eksprimiranja“ označavaju nosač kojim se DNK ili RNK sekvenca (npr. strani gen) mogu uvesti u ćeliju domaćina, tako da transformišu domaćina i promovišu eksprimiranje (npr. transkripcija i translacija) uvedene sekvence.
[0145] Dakle, dalji predmet ovog pronalaska se odnosi na vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu iz pronalaska.
[0146] Takvi vektori mogu sadržati regulatorne elemente, kao što je promotor, pojačavač, terminator i slično, kako bi izazvali ili usmerili eksprimiranje navedenog polipeptida posle primene na pacijentu. Primeri promotera i pojačavača koji se koriste u vektoru eksprimiranja za životinjske ćelije uključuju rani promoter i pojačavač SV40 (Mizukami T. et al.1987), LTR promoter i pojačavač Moloni virusa mišje leukemije (Kuwana Y et al.1987), promotor (Mason JO et al.1985) i pojačavač (Gillies SD et al.1983) na immunoglobulin H lancu i slično.
[0147] Bilo koji vektor eksprimiranja za životinjske ćelije može da se koristi, sve dok gen koji kodira C regiju ljudskog antitelo može da se umetne i eksprimira. Primeri pogodnih vektora uključuju pAGE107 (Miyaji H et al.1990), pAGE103 (Mizukami T et al.1987), pHSG274 (Brady G et al.1984), pKCR (O'Hare K et al.1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990) i slično.
[0148] Drugi primeri plazmida uključuju repliciranje plazmida koji sadrže poreklo replikacije, ili integrativne plazmidi kao što su na primer JKP pcDNK, PBR, i slično.
[0149] Drugi primeri virusnog vektora uključuju adenovirusni, retrovirusni, herpes virus i AAV vektora. Takvi rekombinantni virusi mogu se proizvesti tehnikama poznatim u struci, kao što je putem transfekcije pakovanja ćelija ili prolazne transfekcije sa pomoćnim plazmidima ili virusima. Tipični primeri ćelija za pakovanje virusa uključuju PA317 ćelije, PsiCRIP ćelije, GPenv+ ćelije, 293 ćelije, itd. Detaljni protokoli za dobijanje takvih rekombinantnih virusa defektnih u replikaciji mogu se naći na primer u WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 i WO 94/19478.
[0150] Dalji predmet ovog pronalaska se odnosi na ćeliju koja je transficirana, inficirana ili transformisane sa nukleinskom kiselinom i/ili vektorom prema pronalasku.
[0151] Izraz „transformacija“ označava uvođenje „stranog“ (tj. spoljašnjeg) gena, DNK ili RNK sekvence u ćeliju domaćina, tako da će ćelija domaćin eksprimirati uvedeni gena ili sekvencu kako bi proizvela željenu supstancu, obično protein ili enzim kodirana od strane uvedenog gena ili sekvence. Ćelija domaćin koja prima i eksprimira uveden DNK ili RNK je „transformisana“.
[0152] Nukleinske kiseline prema pronalasku mogu se koristiti za proizvodnju rekombinantnog antitela iz pronalaska u pogodnom sistemu eksprimiranja. Izraz „sistem esksprimiranja“ označava ćeliju domaćina i kompatibilni vektor pod odgovarajućim uslovima, npr. za eksprimiranje proteina kodiranog od strane strane DNK koju nosi vektor i uvodi u ćeliju domaćina.
[0153] Uobičajeni sistemi eksprimiranja obuhvataju E. coli ćelije domaćine i vektore plazmida, ćelije domaćine insekata i baculovirusne vektore, i ćelije sisara kao domaćine i vektore. Drugi primeri ćelija domaćina uključuju, bez ograničenja, prokariotske ćelije (kao što su bakterije) i eukariotske ćelije (kao što su ćelije kvasca, ćelije sisara, ćelije insekata, biljne ćelije, itd). Specifični primeri uključuju E. coli, Kluyveromyces ili Saccharomyces kvasace, ćelijske linije sisara (npr. Vero ćelije, CHO ćelije, 3T3 ćelije, COS ćelije, itd) kao i primarne ili formirane ćelijske kulture sisara (npr. proizvedene od limfoblasta, fibroblasta, embrionalne ćelije, epitelne ćelije, nervne ćelije, masne ćelija, itd). Primeri takođe uključuju mišje SP2/0-Ag14 ćelije (ATCC CRL1581), mišje P3X63-Ag8.653 ćelije (ATCC CRL1580), CHO ćelija kod kojih je dihidrofolat reduktaza gen (u daljem tekstu „DHFR gen“) je defektan (Urlaub G et al; 1980), pacovske YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 ćelije (ATCC CRL1662, u daljem tekstu „YB2/0 ćelija“), i slično. U otelotvorenju se koristi YB2/0 ćelija, jer je aktivnost ADCC himernih ili humanizovanih antitela pojačana kada je eksprimirana u ovoj ćeliji.
[0154] Za eksprimiranje humanizovanog antitela, vektor eksprimiranja može biti bilo koji od tipova kod kojih gen koji kodira teški lanac antitela i gen kodira laki lanac antitela postoje na odvojenim vektorima, ili tipova kod kojih postoje oba gena na istom vektoru (tandem tip). U pogledu lakoće izgradnje humanizovanog vektora eksprimiranja antitela, lakoću uvođenja u životinjske ćelije, i ravnoteža između nivoa eksprimiranja antitela H i L lanaca u životinjskim ćelijama, humanizovan vektor eksprimiranja antitela je tandemskog tipa Shitara K et al. J Immunol Methods. 1994 Jan.3;167(1-2):271-8). Primeri tandemskog tipa humanizovanog vektora eksprimiranja antitela uključuju pKANTEX93 (WO 97/10354), pEE18 i slično.
[0155] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za proizvodnju rekombinantne ćelije domaćina koja eksprimira antitelo prema pronalasku, gde navedeni postupak obuhvata sledeće korake koji se sastoje od: (i) uvođenja in vitro ili ex vivo rekombinantne nukleinske kiseline ili vektora kako je gore opisano u kompetentnu ćeliju domaćina, (ii) kultivisanje in vitro ili ex vivo dobijene rekombinantne ćelije domaćina i (iii), opciono, odabir ćelija koje eksprimiraju i/ili luče navedeno antitela.
[0156] Takve rekombinantne ćelije domaćini mogu da se koriste za proizvodnju antitela iz pronalaska.
Postupci za proizvodnju antitela iz pronalaska
[0157] Antitela iz ovog pronalaska mogu se proizvesti bilo kojom tehnikom poznatom u struci, kao što su, bez ograničenja, bilo koje hemijske, biološke, genetske ili enzimske tehnike, bilo pojedinačno ili u kombinaciji.
[0158] Poznajući aminokiselinsku sekvencu željene sekvence, stručnjak u oblasti lako može da proizvede pomenuta antitela ili imunoglobulinski lanac, standardnim tehnikama za proizvodnju polipeptida. Na primer, oni mogu biti sintetisani korišćenjem dobro poznatih postupaka čvrste faze korišćenjem komercijalno dostupnih peptid sintetskih aparatura (kao što su one proizvedeni od Applied Biosystems, Foster City, California) i prateći uputstva proizvođača. Alternativno, antitela i lanci imunoglobulina pronalaska se mogu sintetisati pomoću tehnika rekombinantne DNK kao što je dobro poznato u struci. Na primer, ovi fragmenti se mogu dobiti kao DNK proizvodi eksprimiranja nakon inkorporacije DNK sekvenci koje kodiraju željeni (poli)peptida u vektore eksprimiranja i uvođenje takvih vektora u odgovarajuće eukariotske ili prokariotske domaćine koje će eksprimirati željeni polipeptid, iz kog se kasnije mogu izolovati primenom dobro poznatih tehnika.
[0159] Pronalazak se dalje odnosi na postupak za proizvodnju antitela iz pronalaska, pri čemu postupak obuhvata korake koji se sastoje od: (i) kultivisanja transformisane ćelije domaćina prema pronalasku; (ii) eksprimiranje navedenog antitela ili polipeptida; i (iii) dobijanje eksprimiranog antitela ili polipeptida.
[0160] Antitela iz pronalaska su pogodno odvajaju od medijuma kulture konvencionalnim procedurama prečišćavanja imunoglobulina, kao što je, na primer, protein A-Sefaroza, hidroksilapatit hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.
[0161] U otelotvorenju, humanizovano himerno antitelo predmetnog pronalaska može se proizvesti dobijanjem nukleinske sekvence koja kodiraju humanizovane VL i VH domene kako je prethodno opisano, konstruisanjem ljudskog himernog vektora eksprimiranja antitela, njihovim umetanjem u vektor eksprimiranja za životinjske ćelije koje imaju gene koji kodiraju ljudski CH antitela i ljudski CL antitelo, i eksprimiraju kodirajuću sekvencu uvođenjem vektora eksprimiranja u životinjsku ćeliju.
[0162] Kao CH domen ljudskog himernog antitela, može biti bilo koja regija koji pripada ljudskim teškim lancima imunoglobulina, ali oni iz IgG klase su pogodni i bilo koja od potklasa koje pripadaju IgG klasi, kao što su IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, se takođe mogu koristiti. Takođe, kao CL ljudskog himernog antitela, može biti bilo koja regija koji pripada ljudskim lakim lancima imunoglobulina, i oni od kapa klasa ili lambda klase se mogu koristiti.
[0163] Postupci za proizvodnju humanizovanih ili himernih antitela koji uključuju konvencionalne tehnike rekombinantne DNK i tehnike transfekcije gena dobro su poznati u struci (pogledati Morrison SL. et al. (1984) i patentni dokumenti US5,202,238; i US5,204, 244).
[0164] Postupci za proizvodnju humanizovanih antitela zasnovani na konvencionalnim tehnikama rekombinantne DNK i tehnikama transfekcije gena dobro su poznati u struci (pogledati npr., Riechmann L. et al.1988; Neuberger MS. et al.1985). Antitela mogu biti humanizovana pomoću različitih tehnika poznatih u struci, uključujući, na primer, tehnike opisane u prijavi WO2009/032661, CDR-presađivanje (EP 239.400; PCT publikacija WO91/09967; US Patent Nos. 5,225,539;.. 5,530,101; i 5,585,089), furniranje ili ponovno izbijanje na površinu (EP 592,106; EP 519,596; Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994)), i mešanje lanaca (US Pat No.5,565,332 ). Takođe je poznata opšta tehnologija rekombinantne DNK za dobijanje takvih antitela (pogledati European Patent Application EP 125023 i International Patent Application WO 96/02576).
[0165] Fab iz ovog pronalaska može se dobiti tretiranjem antitela koje specifično reaguje sa CEACAM5 sa proteazom, kao što je papain. Takođe, Fab se može proizvesti umetanjem DNK sekvence koja kodiraju oba lanca Fab antitela u vektor za prokariotsko eksprimiranje, ili za eukariotsko eksprimiranje, ili uvođenje vektora u prokariotske ili eukariotske ćelije (prema potrebi) kako bi eksprimirali Fab.
[0166] F(ab')2 iz ovog pronalaska mogu se dobiti tretiranjem antitela koje specifično reaguje sa CEACAM5 sa proteazom, pepsinom. Takođe, F(ab')2 se može proizvesti vezivanjem Fab' opisanog u nastavku preko tioetar veze ili disulfidne veze.
4
[0167] Fab' iz ovog pronalaska može se dobiti tretiranjem F(ab')2 koji specifično reaguje sa CEACAM5 sa redukcionim agensom, kao što je ditiotreitol. Takođe, Fab' se može proizvesti umetanjem DNK sekvence koja kodiraju Fab' lance antitela u vektor za prokariotsko eksprimiranje ili vektor za eukariotsko eksprimiranje i uvođenje vektora u prokariotske ili eukariotske ćelija (prema potrebi) kako bi obavio njihovo eksprimiranje.
[0168] scFv ovog pronalaska mogu se proizvesti uzimanjem sekvenci CDR ili VH i VL domena kako je prethodno opisano, konstruisanjem DNK koji kodira scFv fragment, umetanjem DNK u prokariotski ili eukariotski vektor eksprimiranja, i zatim uvođenjem vektora eksprimiranja u prokariotske ili eukariotske ćelija (prema potrebi) kako bi eksprimirale scFv. Kako bi se generisao humanizovan scFv fragment, dobro poznata tehnologija pod nazivom presađivanje CDR može se koristiti, a ona uključuje odabir regija za određivanje komplementarnosti (CDR) prema ovom pronalasku, i njihovo presađivanje na ljudski scFv fragment okviru poznate trodimenzionalne strukture (pogledati, npr.
WO98/45322; WO 87/02671; US5,859,205; US5,585,089; US4,816,567; EP0173494).
Modifikacija antitela prema pronalasku
[0169] Razmatrane su modifikacije aminokiselinske sekvence ovde opisanih antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke osobine antitela. Poznato je da kada se humanizovano antitelo proizvodi jednostavnim presađivnjem samo CDR u VH i VL antitela izvedenog od ne-ljudske životinje u FR od VH i VL ljudskog antitela, aktivnost vezivanja antigena može biti smanjena u poređenju sa onim originalnim antitelom porekla od ne-ljudske životinje. Smatra se da nekoliko aminokiselinskih ostataka VH i VL od ne-ljudskog antitela, ne samo u CDR već takođe i u FR, može biti direktno ili indirektno povezano sa aktivnošću vezivanja antigena. Stoga, supstitucija ovih aminokiselinskih ostataka sa drugim aminokiselinskim ostacima izvedenim iz FR od VH i VL ljudskog antitela bi smanjila aktivnost vezivanja. U cilju rešavanja problema, kod ljudskih antitela kojima su presađene ne-ljudske CDR, pokušaji moraju biti identifikovati, između aminokiselinskih sekvenci od FR od VH i VL ljudskih antitela, aminokiselinskog ostatka koji je direktno povezan sa vezivanjem antitela, ili koji interaguje sa aminokiselinskim ostatkom nekog CDR, ili koji održava trodimenzionalnu strukturu antitela i koji je direktno povezan sa vezivanjem antigena. Smanjena aktivnost vezivanja antigena može se povećati zamenom identifikovanih aminokiselina sa aminokiselinskim ostacima originalnog antitela poreklom od ne-ljudske životinje.
[0170] U jednom otelotvorenju ovog pronalaska, šest CDR mišjeg antitela pronalaska i tri aminokiseline iz njegovog okvira su presađene na ljudski okvira, što rezultuje u humanizovanom antitelu (MAb2_VLg5VHg2) koje poseduju teški lanac sekvence SEQ ID NO: 74 i laki lanac sekvence SEQ ID NO: 75, koji održava karakteristike vezivanja za ljudski i makaki CEACAM5.
[0171] Modifikacije i promene mogu biti urađene u strukturi antitela ovog pronalaska, i u DNK sekvencama koje ih kodiraju, i da i dalje rezultuju u funkcionalnom antitelu ili polipeptida sa željenim karakteristikama.
[0172] Prilikom pravljenja promena u amino sekvencama polipeptida, može se uzeti u obzir hidropatski indeks aminokiselina. Važnost hidropatskog indeksa aminokiselina u ispoljavanju interaktivne biološke funkcije na proteinu je opšte poznata u struci. Prihvaćeno je da relativan hidropatski karakter aminokiseline doprinosi sekundarnoj strukturi nastalog proteina, što zauzvrat definiše interakciju proteina sa drugim molekulima, na primer, enzimima, supstratima, receptorima, DNK, antitelima, antigenima, i slično. Svakoj aminokiselini je dodeljen hidropatski indeks na osnovu njene hidrofobičnosti i karakteristika naelektrisanja, a oni su: izoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenilalanin (+2,8); cistein/cistin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glicin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); triptofana (-0,9); tirozin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lizin (-3,9); i arginin (-4,5).
[0173] Dalji predmet ovog pronalaska takođe obuhvata funkciono-konzervativne varijante polipeptida prema ovom pronalasku.
[0174] Na primer, određene aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama u strukturi proteina bez značajnijeg gubitka aktivnosti. Pošto interaktivni kapacitet i priroda proteina definišu njegovu biološku funkcionalnu aktivnost, određene aminokiselinske supstitucije mogu biti u sekvenci proteina, i naravno u svojoj DNK kodirajućoj sekvenci, dok se i dalje dobija proteina sa sličnim osobinama. Stoga se razmatra da se različite promene mogu napraviti u sekvencama antitela pronalaska, ili odgovarajućim DNK sekvencama koje kodiraju navedene polipeptide, bez značajnijeg gubitka njihove biološke aktivnosti.
[0175] Poznato je u struci da izvesne aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama koje poseduju sličan hidropatski indeks ili vrednost, a da i dalje rezultuju proteinom sa sličnom biološkom aktivnošću, tj. i dalje se dobija biološki funkcionalno ekvivalentan protein. Takođe je moguće koristiti dobro ustanovljene tehnologije, kao što su pristupi alanin-skeniranja, kako bi se identifikovale, u antitelu ili polipeptidu pronalaska, sve aminokiseline koje se mogu supstituisani bez značajnog gubitka vezivanja antigena. Takvi ostaci mogu se okvalifikovati kao neutralani, jer nisu uključeni u vezivanje antigena ili u održavanje strukture antitela. Jedan ili više ovih neutralnih položaja može biti supstituisan sa alaninom ili drugom aminokiselinom bez promene osnovnih karakteristika antitela ili polipeptida prema ovom pronalasku.
[0176] Ovo je ilustrovano u ovom pronalasku putem pristupa alanin-skeniranja sprovedenog na CDRs MAb2K52R, koji pokazuje da se nekoliko položaja ovih CDR pojavljuju kao neutralni, pošto alanin može zaista biti supstituisan bez značajnog efekta na vezivanje za ljudski i makaki CEACAM5. Od varijanti antitela koje proizilaze iz takvih neutralnih supstitucija se stoga očekuje da ostanu funkcionalno identične roditeljskom antitelu. U pruženom primeru 6.4, supstitucije su rađene u humanizovanoj varijanti MAb2, ali je predvidljivo da će iste varijacije takođe održati biološku funkciju kada se uvedu u bilo kojoj vrsti MAb2, Mab4 ili Mab5, jer ova povezani antitela svi nose isti set od 6 CDR ili veoma blisko povezanih. Neutralni položaji mogu se definisati kao ostaci 27, 28, 29, 31, 51, 52, 89, 90, 93, 94, 96, 97 u VL sekvencama ove porodice antitela (SEQ ID NO:34 ili SEQ ID NO:38 ili SEQ ID NO:40 ili SEQ ID NO:17 ili SEQ ID NO:23 ili SEQ ID NO:29 ili SEQ ID NO:55 ili SEQ ID NO:75) i ostaci od 26 do 31, 51 do 58, 97, 103 , 104, 107, 109 u VH sekvencama ove porodice antitela (SEQ ID NO:33 ili SEQ ID NO:37 ili SEQ ID NO:39 ili SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:51 ili SEQ ID NO:74).
[0177] Neutralnim položajima mogu se smatrati položaji u kojima bi bilo koja supstitucija aminokiselina mogla da se ugradi na CDR od Mab2, Mab4 ili Mab5. Zaista, u principu alanin-skeniranja, alanin je izabran jer ovaj ostatak ne prenosi specifične strukturne ili hemijske karakteristike. Opšte je prihvaćeno da ako alanin može da se supstituiše za određenu aminokiselinu bez promene svojstva proteina, mnoge druge, ako ne i sve supstitucije aminokiselina su verovatno takođe neutralni. U suprotnom slučaju, kada je alanin aminokiselina divljeg tipa, ako specifični supstitucija može da se prikaže kao neutralna, verovatno je da će druge supstitucije takođe biti neutralne.
4
[0178] U pruženom primeru 6.4, četiri položaja u CDR od Mab2, Mab4 ili Mab5 su takođe identifikovani, koji nisu potvrđeni kao neutralni u kontekstu alanin-skeniranja, ali gde konzervativna vrsta aminokiselinskih supstitucija ima neutralni efekat (ostaci 30 i 92 u VL sekvenci i ostaci 98 i 100 u VH sekvenci ove porodice antitela).
[0179] Takođe se očekuje da će dve ili više neutralne mutacije na različitim položajima u bilo kojoj ili u obe ove sekvence lanca antitela, kada se kombinuju, obično rezultovati antitelom koje suštinski zadržava funkcionalne aktivnosti roditeljskog antitela. Ovo je ilustrovano na primer sa kombinovanim supsttucijama LC_T51A i LC_T94A , VL_S31A i VH_G54I ili VL_T53I i VH_S53A u MAb2_VLg5VHg2.
[0180] Kao što je navedeno gore, aminokiselinske supstitucije su generalno zbog toga zasnovane na relativnoj sličnosti supstituenata bočnih lanaca aminokiselina, na primer, njihovoj hidrofobnosti, hidrofilnosti, naponu, veličinu, i slično. Primeri supstitucija koje uzimaju bilo koje od navedenih karakteristika u obzir su dobro poznate stručnjacima u oblasti i obuhvataju: arginin i lizin; glutamat i aspartat; serin i treonin; glutamin i asparagin; i valin, leucin i izoleucin.
[0181] Može biti takođe poželjno da se modifikuje antitelo pronalaska u pogledu efektorske funkcije, npr. da poboljša antigen-zavisne ćelijski posredovana citotoksičnost (ADCC) i/ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) antitela. Ovo se može postići uvođenjem jedne ili više aminokiselinskih supstitucija u Fc regiji antitela. Alternativno ili dodatno, cistein ostatak može biti uvedeni u Fc regiju, omogućavajući formiranje međulančane disulfidne veze u ovoj regiji. Tako generisano homodimerno antitelo može da ima unapređenu sposobnost internalizacije i/ili povećano komplementom-posredovano ubijanje ćelija i/ili antitelom-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) (Caron PC. et al.1992; and Shopes B.1992).
[0182] Drugi tip aminokiselinske modifikacije antitela iz ovog pronalaska može biti koristan za menjanje originalnog obrasca glikozilacije antitela, odnosno brisanjem jedne ili više ugljovodonične grupe nađene u antitelu, i/ili dodavanjem jednog ili više mesta glikozilacije koji nisu prisutni u antitelu. Prisustvo bilo čega od toga u tripeptid sekvencama asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, stvara potencijalno mesto glikozilacije. Dodavanje ili brisanje mesta glikozilacije na antitelu pogodno se postiže menjanjem aminokiselinske sekvencu tako da sadrži jednu ili više gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-povezanih mesta glikozilacije).
[0183] Drugi tip modifikacije uključuje uklanjanje identifikovanih sekvenci, bilo u silici ili eksperimentalno, što potencijalno dovodi do razgradnje proizvoda ili heterogenosti pripremljenih antitela. Kao primeri, deamidairanje asparagin i glutamin ostataka može se javiti u zavisnosti od faktora kao što su pH i površinska izloženost. Asparagin ostaci su posebno podložni deamidaciji, pre svega kada su prisutan u sekvenci Asn-Gly, i u manjoj meri u drugim dipeptidnim sekvencama kao što su Asn-Ala. Kada je takvo mesto deamidairanja, posebno Asn-Gly, prisutno u antitelu ili polipeptidu pronalaska, može stoga biti poželjno ukloniti mesto, tipično putem konzervativne supstituciji ukloniti jedan od impliciranih ostataka. Takve supstitucije u sekvenci da uklonite jedan ili više od impliciranih ostataka takođe su obuhvaćene ovim pronalaskom.
[0184] Drugi tip kovalentne modifikacije obuhvata hemijsko ili enzimsko spajanje glikozida za antitelo. Ove procedure imaju prednosti po tome što ne zahtevaju proizvodnju antitela u ćeliji domaćinu koja ima glikozilacije mogućnosti za N- ili O-povezanu glikozilaciju. U zavisnosti od načina kuplovanja koji se koristi, šećeri mogu biti vezani za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidril grupe kao što su one od cisteina, (d) slobodne hidroksilne grupe kao što one od serina, treonina, orhidrokiprolina, (e) aromatični ostaci kao što su oni od fenilalanina, tirozina i triptofana, ili (f) amidne grupe glutamina. Na primer, takvi postupci su opisani u WO87/05330.
[0185] Uklanjanje bilo kog ugljenohidratnog dela prisutnog na antitelu može se postići hemijski ili enzimatski. Hemijska deglikozilacija zahteva izlaganje antitela prema jedinjenju trifluorometansulfonske kiselina, ili ekvivalentnog jedinjenja. Ovaj tretman rezultuje u cepanju većine ili svih šećera osim vezujućeg šećera (N-acetilglikozamin ili N-acetilgalaktozamin), ostavljajući antitelo netaknuto. Hemijska deglikozilacija je opisana od strane Sojahr H. et al. (1987) and by Edge, AS. et al. (1981). Enzimsko razlaganjem ugljenohidratnih grupa na antitelu može se postići upotrebom različitih endo-i egzoglikozidaza kao što su opisali Thotakura, NR. et al. (1987).
4
[0186] Drugi tip kovalentne modifikacije antitela obuhvata povezivanje antitela za jednim od mnoštva neproteinskih polimera, npr., polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksialkileni, na način navedeni u US Patent Nos. 4,640, 835; 4,496, 689; 4,301, 144; 4,670, 417; 4,791, 192 ili 4,179,337.
Imunokonjugati
[0187] Ovaj pronalazak takođe obuhvata citotoksične konjugate, ili imunokonjugate ili antitelo-lek konjugate, ili konjugate. Kad se ovde koristi, svi ovi izrazi imaju isto značenje i međusobno su zamenljivi.
[0188] Mišja antitela, MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 i MAb5, konjugovana su sa majtanzinoidom (DM4) preko SPDB veznika (N-sukcinimidil piridildithiobutirat). Za dobijeni antitelo-lek-konjugat (ADC) je otkriveno da ima citotoksično dejstvo na MKN45 ljudske ćelije raka želuca sa IC50vrednostima ≤ 1 nM.
[0189] Slično, antitelo-SPDB-DM4 konjugati su pripremljeni na osnovu himernog oblika svakog od MAb1, MAb2, MAb4 i MAb5. Dobijeni chMAb1-SPDB-DM4, chMAb2-SPDB-DM4, chMAb3-SPDB-DM4 i chMAb4-SPDB-DM4 procenjeni su pri dve doze protiv merljivih primarnih CR-IGR-034P tumora debelog creva implantiranih s.c. in ženske SCID miševe. Analiza promena zapremine tumora za svaki tretman i kontrolu i % regresije tumora ukazuje da su chMAb2-SPDB-DM4, chMAb4-SPDB-DM4 i chMAb5-SPDB-DM4 bili veoma aktivni, barem na najvišoj ispitivanoj dozi i da je chMAb2-SPDB-DM4 bio aktivan u obe ispitivane doze. Procenti regresije tumora do 82% su dobijeni.
[0190] Antitelo-SPDB-DM4 konjugati su pripremljeni korišćenjem humanizovane varijante MAb2 (huMAb2-1-SPDB-DM4, huMAb2-2-SPDB-DM4 i huMAb2-3-SPDB-DM4). ADC uključujući himerne (chMAb2-SPDB-DM4) ili humanizovane varijante MAb2 su upoređeni sa irelevantnim antitelom-SPDB-DM4 za citotoksične aktivnosti na MKN45 ćelijama. Sve himerne i humanizovane varijante MAb2 ADC prikazale su IC50vrednosti ≤ 1 nM, tj. IC50vrednosti 53 do 35 puta niže od izmerenog citotoksičnog dejstva na irelevantnim DM4 konjugatima, čime se ukazuje na CEACAM5-posredovanu citotoksičnu aktivnost anti-CEACAM5 konjugata.
4
[0191] Anti-tumor aktivnost huMAb2-3-SPDB-DM4 i huMAb2-4-SPDB-DM4 procenjena je i upoređena sa chMAb2-SPDB-DM4 u odnosu na merljive primarne CR-IGR-034P tumore debelog creva implantirane s.c. kod ženki CD-1 golih miševa. Svi konjugati su bili veoma aktivni na najvišoj ispitivanoj dozi (10 mg/kg).
[0192] Anti-tumor aktivnost huMAb2-3-SPDB-DM4 i huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 dodatno je procenjena u odnosu na merljive primarne CR-IGR-034P tumore debelog creva implantirane s.c. kod ženki SCID miševa. huMAb2-3-SPDB-DM4 je bio aktivan u 5 i 2,5 mg/kg, huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 je bio veoma aktivan na 5 mg/kg i aktivan na 2,5 mg/kg.
[0193] Anti-tumor aktivnost huMAb2-3-SPDB-DM4 dodatno je procenjena u odnosu na merljive primarne LUN-NIC-0014 tumore pluća implantirane s.c. kod ženki SCID miševa i utvrđeno je da je veoma aktivna na 10 i 5 mg/kg.
[0194] Svaki DM4 konjugat uključuje srednji broj DM4 molekula (ili „odnos leka i antitela“ ili „DAR“) u rasponu od 2 do 5.
[0195] Prema tome, pronalazak se odnosi na „imunokonjugate“ koji sadrže antitelo prema pronalasku povezano ili konjugovano sa najmanje jednim agensom za inhibiciju rasta, kao što je citotoksični agensom ili radioaktivni izotop.
[0196] „Agens za inhibiciju rasta“ , ili „anti-proliferativni agens“, koji se mogu koristiti kao sinonimi, odnose se na jedinjenje ili sastav koji inhibira rast ćelije, posebno ćelija tumora, bilo in vitro ili in vivo.
[0197] Izraz „citotoksični agens“ kad se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili izaziva destrukciju ćelija. Izraz „citotoksični agens“ je namenjen da uključi hemoterapijske agense, enzime, antibiotike i toksine kao što su toksini malih molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući fragmente i/ili njihove varijante, i razne antitumorske ili antikancerogene agense, date u nastavku. U nekim otelotvorenjima, citotoksični agens taksoid, vincas, je majtanzinoid ili majtanzinoidov analog poput DM1 ili DM4, mali lek, tomaimicin ili derivat pirolobenzodiazepina, derivat kriptoficina, derivat leptomicina, analog auristatina ili
4
dolastatina, prolek, inhibitor topoizomeraze II, agens za DNK alkilaciju, anti-tubulin agens, CC-1065 i CC-1065 analog.
[0198] Kad se ovde koriste, „majtanzinoidi“ označavaju majtanzinoide i analoge majtanzinoidna. majtanzinoidi su lekovi koji inhibiraju formiranje mikrotubula i koji su veoma toksični za ćelije sisara.
[0199] Primeri pogodnih majtanzinoidima obuhvataju majtanzinol i analoge majtanzinola.
[0200] Primeri pogodnih analoga majtanzinola uključuju one koji imaju modifikovan aromatični prsten i one koji imaju modifikacije na drugim položajima. Takvi pogodni majtanzinoidi su opisani u U.S. Patent Nos.4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; i 5,846,545.
[0201] Specifični primeri pogodnih analoga majtanzinola koji imaju modifikovanu aromatični prsten uključuju:
(1) C-19-dehloro (U.S. Pat. No.4,256,746) (pripremljen LAH redukcijom ansamitocina P2);
(2) C-20-hidroksi (ili C-20-demetil) /- C-19-dehloro (U.S. Pat. Nos.4,361,650 i 4,307,016) (pripremljen demetilacijom korišćenjem Streptomices ili Actinomices ili dehlorinacijom pomoću LAH); i
(3) C-20-demetoksi, C-20-aciloksi (-OCOR), /- dehloro (U.S. Pat. No 4,294,757) (pripremljen acilacijom koristeći acil hlorid).
[0202] Specifični primeri pogodnih analoga majtanzinola koji imaju modifikacije drugih položaja uključuju:
(1) C-9-SH (U.S. Pat. No.4,424,219) (pripremljen reakcijom majtanzinola sa H2S ili P2S5);
(2) C-14-alkoksimetil (demetoksi/CH2OR) (U.S. Pat. No.4,331,598);
(3) C-14-hidroksimetil ili aciloksimetil (CH2OH or CH2OAc) (U.S. Pat. No.
4,450,254) (pripremljen od Nocardia);
(4) C-15-hidroksi/aciloksi (U.S. Pat. No.4,364,866) (pripremljen konverzijom majtanzinola sa Streptomices);
4
(5) C-15-metoksi (U.S. Pat. Nos.4,313,946 i 4,315,929) (izolovan iz Trevia nudiflora);
(6) C-18-N-demetil (U.S. Pat. Nos.4,362,663 i 4,322,348) (pripremljen demetilacijom majtanzinola sa Streptomices); i
(7) 4,5-deoksi (U.S. Pat. No 4,371,533) (pripremljen titanium trihlorid/LAH redukcijom majtanzinola).
[0203] U jednom otelotvorenju pronalaska, citotoksični konjugati ovog pronalaska koriste majtanzinoid (DM1) koji sadrži tiol, formalnog naziva N<2'>-deacetil-N<2'>-(3-merkapto-1-oksopropil)-majtanzin, kao citotoksični agens. DM1 je predstavljen sledećom strukturnom formulom (I):
[0204] U drugom otelotvorenju, citotoksični konjugati prema predmetnom pronalasku koriste majtanzinoid DM4 koji sadrži tiol, formalnog naziva N<2'>-deacetil-N<2'>-(4-metil-4-merkapto-1-oksopentil)-majtanzin, kao citotoksični agens. DM4 je predstavljen sledećom strukturnom formulom (
[0205] U daljim otelotvorenjima pronalaska, mogu se koristiti drugi majtanzini, uključujući one majtanzinoide koji sadrže tiola i disulfid i nose mono ili di-alkil supstituciju na atomu ugljenika koji nosi atom sumpora. Oni uključuju majtanzinoid koji, na C-3, C-14
4
hidroksimetil, C-15 hidroksi, ili C-20 desmetil, acilovanom bočnom lancu aminokiseline sa acil grupom nosi ometenu sulfhidrilnu grupu, gde ugljenikov atom na acil group koja nosi tiol funkcionalnost ima jedan ili dva supstituenta, gde su navedeni supstituenti: CH3, C2H5, linearni ili razgranati alkil ili alkenil koji ima 1 do 10 reagenasa i bilo koji agregat koji može da bude prisutan u rastvoru.
[0206] Primeri ovih citotoksičnih agenasa i postupaka konjugacije su dalje dati u prijavi WO2008/010101 koja je ovde inkorporirana sa referencom.
[0207] Izraz „radioaktivni izotop“ je namenjen da uključi radioaktivne izotope pogodne za lečenje kancera, kao što su At<211>, Bi<212>, Er<169>, I<131>, I<125>, Y<90>, In<111>, P<32>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Sr<89>i radioaktivni izotopi od Lu. Takvi radioizotopi generalno emituju uglavnom beta-zračenje. U otelotvorenju radioaktivni izotop je alfa-emiter izotop, preciznije Thorium 227 koji emituje alfa-zračenje. Imunokonjugati prema predstavljenom pronalasku mogu biti pripremljena kao što je opisano u prijavi WO2004/091668.
[0208] U nekim otelotvorenjima, antitela prema predmetnom pronalasku su kovalentno vezana direktno ili preko raskinutog ili ne-raskinutog veznika, za najmanje jedan agens za inhibiciju rasta.
[0209] „Veznik“, kad se ovde koristi, označava hemijsku grupu koja sadrži kovalentnu vezu ili lanac atoma koji kovalentno vezuju polipeptid za deo leka.
[0210] Konjugati mogu biti pripremljeni in vitro postupcima. Da bi se povezali lek ili prolek na antitelo, koristi se vezujuća grupa. Pogodne vezujuće grupe su dobro poznate u struci i uključuju disulfidne grupe, tioetarske grupe, kisele labilne grupe, fotolabilne grupe, peptidaza labilne grupe i esteraza labilne grupe. Konjugacija antitela pronalaska sa citotoksičnim agensima ili agensima za inhibiciju rasta može se napraviti korišćenjem različitih agenasa za bifunkcionalno kuplovanje proteina, uključujući, ali ne ograničavajući se na N-sukcinimidil piridildithiobutirat (SPDB), buternu kiselinu 4-[(5-nitro-2-piridinil)ditio]-2,5-diokso-1-pirolidinil ester (nitro-SPDB), 4-(piridin-2-ildisulfanil)-2-sulfo-buterna kiselina(sulfo-SPDB), N-sukcinimidil(2-piridilditio)propionat(SPDP), sukcinimidil(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat(SMCC), iminotiolan(IT), bifunkcionalne derivate imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehidu), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(p-azidobenzoil)-hekanediamin), bisdiazonijum derivate (kao što je bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanate (kao što je toluen 2,6-diisocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin može biti pripremljen kao što je opisano u Vitetta et al (1987). Ugljenikom obeležena 1-izotiocijanatobenzil metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MKS-DTPA) je primer helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida sa antitelom (WO 94/11026).
[0211] Veznik može biti „veznik za cepanje“ koji olakšava oslobađanje u ćeliji citotoksičnog agensa ili agensa za inhibiciju rasta. Na primer, kiselo-labilni veznik, peptidaza-senzitivni veznik, esteraza labilni veznik, fotolabilni veznik ili veznik koji sadrži disulfid (pogledati npr. U.S. Patent No.5,208,020) mogu da se koriste. Veznik može biti i „veznik koji nije za cepanje“ (na primer SMCC veznik) koji može dovesti do bolje tolerancije u nekim slučajevima.
[0212] Alternativno, fuzioni protein koji sadrži antitelo prema pronalasku i citotoksični, ili polipeptid koji inhibira rast, može se napraviti, rekombinantnim tehnikama ili sintezom peptida. Dužina DNK može sadržati odgovarajuće regije koji kodiraju dva dela konjugata, ili blizu jedan drugom, ili odvojene regijom koji kodira veznik peptid koji ne uništava željene osobine konjugata.
[0213] Antitela iz ovog pronalaska takođe mogu biti upotrebljena u terapiji prolekova posredovanoj zavisnim enzimom, konjugacijom polipeptida na enzim za aktiviranje proleka koji konvertuje prolek (npr. peptidil hemoterapeutski agensa, pogledati WO81/01145) u aktivni anti kancerogeni lek (pogledati, na primer, WO 88/07378 i U.S. Patent No.
4,975,278). Komponenta enzim imunokonjugata korisna za ADEPT uključuje bilo koji enzim sposoban da deluje na prolek na takav način da se konvertuje u svoj aktivniji, citotoksični oblik. Enzimi koji su korisni u postupku iz ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, alkalne fosfataze korisne za konvertovanje prolekova koji sadrže fosfat u slobodne lekove; arilsulfatazu korisnu za konvertovanje prolekova koji sadrže fosfat u slobodne lekove; citozin deaminazu korisnu za konvertovanje ne-toksičnog fluorocitozina u antikancerogeni lek, 5-fluorouracil; proteaze, kao što seratia proteaza, termolizin, subtilizin, karboksipeptidaza i katepsin (kao što su katepsini B i L), koji su korisni za konverziju prolekova koji sadrže peptid u slobodne lekove; D-alanilkarboksipeptidazu, korisnu za konvertovanje prolekova
1
koji sadrže supstituente D-aminokiselina; enzime za cepanje ugljenih hidratima cepanje O-galaktozidaze i neuraminidaze. korisne za konvertovanje glikozilovanih prolekova u slobodne lekove; P-laktamazu, korisnu za konvertovanje lekova dobijenih sa P-laktama u slobodne lekove; i penicilin amidaze, kao što je penicilin V amidaza ili penicilin G amidaza, korisne za konvertovanje lekova dobijenih na svojim amin azotima sa fenoksiacetil ili fenilacetil grupama, respektivno, u slobodne lekove. Enzimi mogu biti kovalentno vezani za polipeptide iz ovog pronalaska, tehnikama koje su dobro poznate u struci, kao što je upotreba heterobifunkcionalnih ukrštanja reagenasa, koja je diskutovana gore.
[0214] Prema jednom otelotvorenju, u konjugatu pronalaska, agens za inhibiciju rasta je majtanzinoid, u otelotvorenju DM1 ili DM4.
[0215] U navedenom konjugatu, antitelo je konjugovano za navedeni barem jedan agens za inhibiciju rasta, uz pomoć vezujuće grupe. U otelotvorenju, navedena vezujuća grupa je veznik za cepanje ili veznik koji nije za cepanje, poput SPDB, sulfo-SPDB ili SMCC.
[0216] Konjugat može biti izabran iz grupe koju čine:
i) antitelo-SPDB-DM4 konjugat formule (III)
ii) antitelo-sulfo-SPDB-DM4 konjugat formule (IV)
2
iii) antitelo-SMCC-DM1 konjugat formule (V)
[0217] U navedenom otelotvorenju, antitelo uključeno u konjugat je izabrano iz grupe koju čine:
i) humanizovano antitelo koje sadrži teški lanac sekvence SEQ ID NO: 51 i laki lanac sekvence SEQ ID NO: 17,
ii) humanizovano antitelo sadrži teški lanac sekvence SEQ ID NO: 5 i laki lanac sekvence SEQ ID NO: 23,
iii) humanizovano antitelo sadrži teški lanac sekvence SEQ ID NO: 5 i laki lanac sekvence SEQ ID NO: 29, i
iv) humanizovano antitelo sadrži teški lanac sekvence SEQ ID NO: 51 i laki lanac sekvence SEQ ID NO: 55.
[0218] U otelotvorenju konjugat je konjugat formule (III), (IV) ili (V) kao što je definisano gore, u kom je antitelo humanizovano antitelo koje sadrži teški lanac sekvence SEQ ID NO: 5 i laki lanac sekvence SEQ ID NO: 29.
[0219] Uopšteno, konjugat se može dobiti postupkom koji obuhvata korake:
(i) dovođenja u kontakt izborno puferovanog vodenog rastvora agensa za vezivanje ćelija (npr. antitela prema pronalasku) sa rastvorima veznika i citotoksičnog jedinjenja;
(ii) zatim izbornog odvajanja konjugata koji je formirana u (i) od nereagovanog agensa za vezivanje ćelija.
[0220] Vodeni rastvor agensa za vezivanje ćelija može biti puferovan sa puferima kao što su, npr. kalijum fosfat, acetat, citrat ili N-2-Hidrokiethilpiperazin-N'-2-etansulfonska kiselina (Hepes pufer). Pufer zavisi od prirode agensa za vezivanje ćelja. Citotoksično jedinjenje je u rastvoru u organskom polarnom rastvaraču, npr. dimetil sulfoksidu (DMSO) ili dimetilacetamidu (DMA).
[0221] Reakciona temperatura je obično između 20 i 40°C. Vreme reakcije može varirati od 1 do 24 sata. Reakcija između agensa za vezivanje ćelija i citotoksičnog agensom može se pratiti hromatografijog na osnovu veličine (SEC) sa refraktometrijskim i/ili UV detektorom. Ako je prinos konjugata prenizak, vreme reakcije može da se produži.
[0222] Brojni različiti postupci hromatografije mogu koristiti od strane osobe sa iskustvom u struci radi obavljanja odvajanje koraka (ii): konjugat može biti prečišćen npr. pomoću SEC, adsorpcione hromatografije (kao jonoizmenjivačka hromatografije, IEC), hromatografije hidrofobne interakcije (HIC), afinitetne hromatografije, hromatografije pomešane podrške kao što je hidroksiapatitna hromatografija ili visoko efikasna tečna hromatografija (HPLC). Takođe se može primeniti i prečišćavanje dijalizom ili diafiltracijom.
[0223] Kad se ovde koristi, izraz „agregati“ označava grupacije koje mogu biti formirane između dva ili više agenasa za vezivanje ćelija, gde su navedeni agensi modifikovan ili nisu modifikovani konjugovanjem. Agregati mogu biti formirani pod uticajem velikog broja parametara, kao što je visoka koncentracija agensa za vezivanje ćelija u rastvoru, pH rastvora, visokih sila cepanja, broja vezanih dimera i njihovog hidrofobnog karaktera, temperature
4
(pogledati Wang & Gosh, 2008, J. Membrane Sci., 318: 311-316, i reference citirane tu); treba napomenuti da nije jasno utvrđen relativni uticaj nekih od ovih parametara. U slučaju proteina i antitela, stručnjak iz ove oblasti će pogledati Cromwell et al. (2006, AAPS Jounal, 8(3): E572-E579). Sadržaj u agregatima može se odrediti tehnikama dobro poznatim stručnjaku, kao što je SEC (pogledati Walter et al., 1993, Anal. Biochem., 212(2): 469-480).
[0224] Nakon koraka (i) ili (ii), rastvor koji sadrži konjugat može se podvrgnuti dodatnom koraku (iii) hromatografije, ultrafiltracije i/ili dijafiltracije.
[0225] Konjugat je dobijen na kraju ovih koraka u vodenom rastvoru.
[0226] Prema jednom otelotvorenju, konjugat prema pronalasku se karakteriše „lek-antitelo odnosom“ (ili „DAR“) u rasponu od 1 do 10, na primer od 2 do 5, posebno od 3 do 4. Ovo je obično slučaj konjugata, uključujući majtanzinoidne molekule.
[0227] Ovaj DAR broj može da varira sa prirodom antitela i leka (tj. agensa za inhibiciju rasta) koji se koriste, zajedno sa eksperimentalnim uslovima koji su korišćeni za konjugaciju (poput odnosa agens za inhibiciju rasta/antitelo, vremena reakcije, prirode rastvarača i korastvarača ukoliko postoji). Stoga dodir između antitela i agensa za inhibiciju rasta dovodi do smeše koja sadrži više konjugata koji se razlikuju jedan od drugog po različitim odnosima leka i antitela; opciono golo antitelo; opciono agregati. DAR koji je tako određen je stoga srednja vrednost.
[0228] Postupak koji može da se koristi za određivanje DAR sastoji se od spektrofotometrijskog merenja odnosa apsorpcije pri rastvoru značajno prečišćenog konjugata na λDi 280 nm.280 nm je talasna dužina koja se generalno koristi za merenje koncentracije proteina, kao što je koncentracija antitela. Talasna dužina λDse bira tako da omogući razlikovanje lek i antitela, odnosno kao je već poznato stručnjaku, λDje talasna dužina na kojoj lek ima visoku apsorbanciju i λDje dovoljno udaljen od 280 nm kako bi se izbeglo preklapanje u vrhovima apsorpcije leka i antitela. λDmože biti izabran kao 252 nm u slučaju majtanzinoidnih molekula. Postupak izračunavanja DAR može biti izveden od Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science:
Apsorbancije za konjugat na λD(AλD) i na 280 nm (A280) se mere ili na monomernom vrhu analize hromatografije koja isključuje po veličini (SEC) (omogućujući računanje „DAR(SEC)“ parametra) ili korišćenjem klasične spektrofotometrijske aparature (omogućujući računanje „DAR(UV)“ parametra). Apsorbancije mogu da se izraze kako sledi:
gde :
• CDi CAsu respektivno koncentracije u rastvoru leka i antitela
• εDλDi εD280su respektivno koeficijenti molarne ekstinkcije leka na λDi 280 nm
• εAλDi εA280su respektivno koeficijenti molarne ekstinkcije antitela na λDi 280 nm.
[0229] Rešavanje ove dve jednačine sa dve nepoznate vodi do narednih jednačina:
[0230] Prosečni DAR se zatim računa od odnosa koncentracija leka i antitela: DAR = CD/CA.
Farmaceutski sastavi
[0231] Antitela ili imunokonjugati pronalaska mogu se kombinovati sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima i opciono matricama sa odloženim oslobađanjem, poput biorazgradivih polimera, kako bi formirali terapeutske sastave.
[0232] Tako, sledeći cilj ovog pronalaska se odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži antitelo ili imunokonjugate iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.
[0233] Pronalazak se takođe odnosi na polipeptid ili imunokonjugat prema pronalasku, za upotrebu kao lek.
[0234] „Farmaceutski“ ili „farmaceutski prihvatljiv“ se odnosi na molekulske entitete i sastave koji ne proizvode štetne, alergijske ili druge neželjene reakcije kada se daju sisaru, naročito čoveku, kako je odgovarajuće. Farmaceutski prihvatljivi nosač ili ekscipijens odnosi se na netoksične čvrste, polu-čvrste ili tečne punioce, razblaživače, materijale za kapsuliranje ili pomoćnu formulaciju bilo kog tipa.
[0235] Kad se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljivi nosači“ obuhvataju bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, i slično, koji su fiziološki kompatibilni. Primeri pogodnih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenasa uključuju jedno ili više od vode, aminokiselina, fiziološkog rastvora, slanog fosfatnog pufera, puferisanog fosfata, acetata, citrata, sukcinata; aminokiselina i derivata kao što su histidin, arginin, glicin, prolin, glicilglicin; neorganskih soli NaCl, kalcijum hlorida; šećera ili polialkohola kao što su dekstroza, glicerol, etanol, saharoza, trehaloza, manitol; surfaktanata kao što je polisorbat 80, polisorbat 20, poloksamer 188; i slično, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se u sastav uključe i izotonični agensi, kao što su šećeri, polialkoholi ili natrijum hlorid, i formulacija može da sadrži i antioksidant kao što je triptamin i agensa za stabilizaciju kao što je Tween 20.
[0236] Oblik farmaceutskih sastava, načina primene, doza i režim prirodno zavisiti od stanja koje se leči, ozbiljnosti bolesti, starosti, težine i pola pacijenta itd.
[0237] Farmaceutski sastavi prema pronalasku mogu biti formulisani za topikalnu, oralnu, parenteralnu, intranazalnu, intravenoznu, intramuskularnu, potkožnu ili intraokularnu primenu i slično.
[0238] U otelotvorenju, farmaceutski sastavi sadrže nosače koje su farmaceutski prihvatljivi za formulaciju koja može da se ubrizgava. To može biti izotonični, sterilni fiziološki rastvor (mononatrijum ili dinatrijum fosfat, natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijum hlorid i slično, ili smeše takvih soli), ili suv, posebno zamrzavanjem osušen rastvor koji posle dodavanja, u zavisnosti od slučaja, sterilisane vode ili fiziološkog rastvora, omogućava pravljenje injekcionih rastvora.
[0239] Farmaceutski sastav može se primenjivati putem uređaja za kombinovanje leka.
[0240] Doze koje se koriste za primenu mogu se prilagoditi kao funkcija različitih parametara, na primer kao funkcija načina davanja, relevantne patologije, ili alternativno željenog trajanja tretmana.
[0241] Za pripremu farmaceutskih sastava, efikasne količine antitela ili imunokonjugata pronalaska mogu biti rastvorene ili disperzovane u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili vodenom medijumu.
[0242] Farmaceutski oblici pogodni za injektiranje obuhvataju sterilne vodene rastvore ili disperzije; formulacije, uključujući susamovo ulje, kikiriki ulje ili vodeni rastvor propilen glikola; i sterilne praškove za ekstemporane pripreme sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima, oblik mora biti sterilan i injektibilan sa odgovarajućim uređajem ili sistemom za isporuku bez degradacije. Mora biti stabilan pod uslovima proizvodnje i čuvanja i mora biti zaštićen od kontaminacije mikroorganizmima kao što su bakterije i gljivice.
[0243] Rastvori aktivnih jedinjenja kao slobodne baze ili farmaceutski prihvatljive soli mogu biti pripremljeni u vodi pogodno pomešanoj sa surfakantom. Disperzije mogu takođe biti pripremljene u glicerolu, tečnom polietilen glikolu, i njihovim smešama, i u uljima. Pod uobičajenim uslovima čuvanja i upotrebe, ove pripreme sadrže konzervans za sprečavanje rasta mikroorganizama.
[0244] Polipeptid, antitelo ili imunokonjugat iz pronalaska mogu formulisati u sastav u neutralnom ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele adicione soli (formirane sa slobodnim amino grupama proteina) i koje su formirane sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili takve organske kiseline kao što su sirćetna, oksalna, vinska, bademova, i slično. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu biti izvedene iz neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili feri hidroksidi i takve organske baze kao izopropilamin, trimetilamin, glicina, histidin, prokain i slično.
[0245] Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), njihove pogodne smeše, i biljna ulja. Odgovarajuća tečnost se može održavati, na primer, upotrebom obloga kao što je lecitin, održavanjem zahtevane veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama se može ostvariti raznim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolim, fenolim, sorbinskom kiselinom, timerosalom i slično. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se uključe izotonični agensi, na primer, šećeri ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injekcionih smeša se može postići upotrebom u sastavima agenasa koji odlažu absorpciju, na primer, aluminijum monostearat i želatin.
[0246] Sterilni injekcioni rastvori se proizvode ugrađivanjem aktivnih jedinjenja u zahtevanoj količini u odgovarajući rastvarač sa bilo kojim drugim gore nabrojanim sastojkom, po potrebi, što je praćeno filtriranom sterilizacijom. Generalno, disperzije se dobijaju uključivanjem različitih sterilisanih aktivnih sastojak u sterilni tečni nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i druge potrebne sastojke od onih nabrojanih gore. U slučaju sterilnih praškova za pripremanje sterilnih rastvora za injektiranje, poželjni postupci dobijanja su vakuum sušenje i sušenje tehnikom zamrzavanja kojom se dobija prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilnog filtriranog rastvora.
[0247] Dobijanje koncentrisanijih ili visoko koncentrisanih rastvora za direktno ubrizgavanje se takođe razmatra, gde je za upotrebu DMSO kao rastvarača predviđeno da rezultuje u ekstremno brzom prodiranju, dajući visoke koncentracije aktivnih agenasa na malom području tumora.
[0248] Nakon formulacije, rastvori će biti primenjeni na način koji je kompatibilan sa formulacijom doziranja, i u takvoj količini koja je terapeutski efikasna. Formulacije se lako primenjuju u različitim oblicima doziranja, kao što su vrsta prethodno opisanog rastvora za injekcije, ali kapsule za oslobađanje leka i slično mogu se takođe koristiti.
[0249] Za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, na primer, rastvor treba da bude odgovarajuće puferisan ako je neophodno, i tečni razblaživač se prvo izotonizuje sa dovoljnom količinom soli ili glukoze. Ovi vodeni rastvori su posebno pogodni za intravenoznu, intramuskularnu, potkožnu i intraperitonealnu primenu. U vezi s tim, sterilni vodeni medijumi koji se mogu koristiti biće poznati stručnjacima u oblasti u svetlu ovog obelodanjenja. Na primer, jedna doza može biti rastvorena u 1 ml izotoničnom NaCl rastvoru i dodata u 1000 ml hipodermoklizne tečnosti ili injektirana na predloženom mestu infuzije, (pogledati na primer, „Remington's Pharmaceutical Sciences“ 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580). Neke varijacije u doziranju će neophodno zavisiti od stanja pacijenta koji se leči. Lice odgovorno za primenu će, u svakom slučaju, odrediti odgovarajuću dozu za pojedinačnog pacijenta.
[0250] Antitelo ili imunokonjugat pronalaska mogu biti formulisani unutar terapeutske smeše da sadrže oko 0,01 do 100 miligrama, po dozi.
[0251] Pored antitela ili imunokonjugata formulisanih za parenteralnu primenu, kao što su intravenska ili intramuskularna injekcija, drugi farmaceutski prihvatljivi oblici uključuju, na primer, tablete ili druge čvrste materije za oralnu primenu; kapsule sa odloženim oslobađanjem; i svaki drugi oblik koji se trenutno koristi.
[0252] U određenim otelotvorenjima, upotreba lipozoma i/ili nano-čestica je razmatrana za uvođenje polipeptida u ćelije domaćina. Formiranje i upotreba lipozoma i/ili nano-čestica su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
[0253] Nanokapsule mogu generalno da zarobe jedinjenje u stabilnom i reproduktibilnom obliku. Kako bi ste izbegli neželjeni efekti usled međućelijskog polimernog preopterećenja, takve ultrafine čestice (veličine oko 0,1 µm) su uglavnom dizajnirane korišćenjem polimera koji je u stanju da se razgrađuje in vivo. Biorazgradive polialkil-cijanoakrilat nanočestice ili biorazgradive polilaktid ili polilaktid koglikolid nano-čestice koje ispunjavaju ove uslove su razmatrana za upotrebu u ovom pronalasku, a takve čestice se mogu lako napraviti.
[0254] Lipozomi se formiraju od fosfolipida koji su raspršeni u vodenom medijumu i spontano formiraju multilamelarne koncentrične dvoslojne vezikule (koje se takođe nazivaju i multilamelarne vezikule (MLV)). MLV generalno imaju prečnik od 25 nm do 4 µm.
Sonikacija MLV rezultuje u formiranju malih unilamelarnih vezikula (SUV) sa prečnikom u rasponu od 200 do 500 Å, koje sadrže vodeni rastvor u jezgru. Fizičke karakteristike lipozoma zavise od pH, jonske jačine i prisustva dvovalentnih katjona.
Terapijski postupci i primene
[0255] Pronalazači su pokazali da su pet antitela koja su proizveli u stanju da internalizuju CEACAM5-antitelo kompleks posle vezivanja. Štaviše, oni su pokazali da ova antitela, u kombinaciji sa citotoksičnim majtanzinoidom (DM4), indukuju citotoksično dejstvo na ljudskim MKN45 ćelija tumora in vitro. Oni su takođe pokazali da ovi imunokonjugati indukuju označenu antitumorsku aktivnost in vivo na mišjem modelu ksenografta ljudskog primarnog tumora debelog creva dobijenog od pacijenta, kada se koristi u dozi od 5 mg/kg i 2,5 mg/kg, sa jednom injekcije u danu 14 nakon implantacije tumora.
[0256] Stoga, polipeptidi, antitela, imunokonjugati, ili farmaceutski sastavi prema pronalasku mogu biti korisna u lečenju kancera.
[0257] Kancer koji će se tretirati sa antitelima, imunokonjugatima ili farmaceutskim sastavima pronalaska je rak koji eksprimira CEACAM5, naročito prekomerno eksprimira CEACAM5 u poređenju sa normalnim (tj. non tumorskim) ćelijama istog tkivnog porekla. Eksprimiranje CEACAM5 od strane ćelija raka može se lako testirati na primer pomoću antitela pronalaska, kao što je opisano u sledećem odeljku „Dijagnostičkih primena“, a naročito pomoću imunohistohemijskog postupka, na primer kao što je opisano u Primeru 8.
[0258] U otelotvorenju, kancer može biti kolorektalni, stomačni, rak pluća, cerviksa materice, pankreasa, jednjaka, jajnika, štitaste žlezde, bešike, endometrijuma, dojke, jetre (npr. holangiokarcinom), prostate ili rak kože. Posmatranje ljudskih tumora imunohistohemijom korišćenjem mišjeg anti-ljudskog CEACAM5 antitela prema pronalasku zaista je pokazalo bojenje antitelom kod ove vrste kancera, kako je opisano u više detalja u Primeru 8.
[0259] Antitela ili imunokonjugati ovog pronalaska mogu se koristiti sama ili u kombinaciji sa bilo kojim pogodnim agensom za inhibiciju rasta.
[0260] Antitela iz ovog pronalaska mogu biti konjugovana ili povezana sa agensom za inhibiciju rasta, citotoksični agensom, ili enzimom za aktiviranje proleka kako je prethodno opisano. Antitela prema pronalasku mogu zaista da budu korisna za navođenje navedenog agensa za inhibiciju rasta, citotoksičnog agensa ili proleka do kanceroznih ćelija koje eksprimiraju ili preterano eksprimiraju CEACAM5 na svojoj površini.
[0261] Takođe je dobro poznato da terapeutska monoklonska antitela mogu dovesti do iscrpljivanja ćelija koje nose antigen koji se specifično prepoznaje od strane antitela. Ovo iscrpljivanje može biti posredovano kroz najmanje tri mehanizma: ćelijski posredovana
1
citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), liza zavisna od komplemenata i direktnu antitumorska inhibicija rasta tumora putem signala datih preko antigena ciljanog od strane antitela.
[0262] „Citotoksičnost zavisna od komplemenata“ ili odnosi se na lizu targetirane ćelije u prisustvu komplementa. Aktivacija klasičnog puta komplementa je inicirana vezivanjem prve komponente sistema komplemenata za antitela koja su vezana za svo srodni antigenom. Kako bi se procenila aktivacija komplementa, može da se sprovede CDC test, npr. kao što je opisano u Gazzano-Santoro et al. (1997).
[0263] „Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela“ ili „ADCC“ odnosi se na oblik citotoksičnosti gde izlučena antitela vezana na Fc receptore (FcR) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) omogućavaju ovde citotoksične efektorske ćelije da se specifično vezuju na na targetiranu ćeliju koja nosi antigen i zatim ubiju targetiranu ćeliju. Kako bi se procenila ADCC aktivnost željenog molekula, može biti sproveden in vitro ADCC test, kao što je opisano u US Patent No. 5,500,362 ili 5,821,337.
[0264] Tako, cilj ovog pronalaska odnosi se na postupak za lečenje kancera koji obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno terapeutski efikasne količine polipeptida, antitela, imunokonjugata ili farmaceutskog sastava prema pronalasku.
[0265] U kontekstu ovog pronalaska, izraz „tretiranje“ ili „tretman“, kad se ovde koriste, označavaju preokretanje, ublažavanje, inhibiranje napredovanja ili prevenciju poremećaja ili stanja na koje se izraz odnosi, ili jedan ili više simptoma takvog poremećaja ili stanja. Izraz „lečenje kancera“ kad se ovde se koristi podrazumeva inhibiciju rasta malignih ćelija tumora i/ili progresiju metastaza od pomenutog tumora. Takav tretman može dovesti do regresije rasta tumora, tj., smanjenja veličine merljivih tumora. Posebno, takav tretman dovodi do potpune regresije tumora ili metastaze.
[0266] Prema pronalasku, izraz „pacijent“ ili „pacijent kome je to potrebno“ je namenjen za ljudskog ili ne-ljudskog sisara kog pogađa ili će verovatno biti pogođen sa malignim tumorom. Posebno, navedeni pacijent može biti pacijent za kog je utvrđeno da je podložan
2
terapeutskom agensu koji targetira CEACAM5, posebno sa antitelom ili imunokonjugatom prema pronalasku, na primer prema postupku koji je opisan u nastavku.
[0267] Pod „terapeutski delotvorna količina" polipeptida pronalaska podrazumeva se dovoljna količina polipeptida da se tretiraju navedena kancerozna bolest, pri razumnom odnosu koristi/rizici primenjenom na bilo koji medicinski tretman. Podrazumeva se, međutim, da će ukupna dnevna upotreba polipeptida i sastava prema predstavljenom pronalasku odrediti nadležni lekar unutar obima racionalnog medicinskog rasuđivanja.
Specifičan terapeutski efikasan nivo doze za bilo kog određenog pacijenta zavisiće od različitih faktora uključujući poremećaj koji se leči i ozbiljnosti poremećaja; aktivnosti specifičnog polipeptida koji se koristi; specifičnog upotrebljenog sastava, starosti, telesne težine, opšteg zdravstvenog stanja, pola i načina ishrane pacijenta; vremena primene, puta primene, i stope lučenja specifičnog polipeptida koji se koristi; trajanja tretmana; lekove koji se koriste u kombinaciji ili istovremeno sa specifičnim primenjenim polipeptidom; i slični faktori dobro poznati u medicini. Na primer, dobro je poznato u struci da se počne sa dozama jedinjenja na nivoima nižim od onih koje su potrebne za postizanje željenog terapeutskog efekta, uz postepeno povećavanje dozu sve dok se ne postigne željeni efekat.
[0268] Sledeći cilj ovog pronalaska se odnosi na polipeptid, antitelo, imunokonjugat ili farmaceutski sastav prema pronalasku za primenu u lečenju malignog tumora.
[0269] Polipeptid, antitelo, imunokonjugat ili farmaceutski sastav mogu da se koristie za inhibiranje napredovanja metastaza malignog tumora.
[0270] Polipeptidi prema pronalasku mogu da se koriste u kombinaciji sa bilo kojim drugim terapijskim strategijama za tretiranje malignog tumora (npr. adjuvant terapije), i/ili za smanjenje rasta metastatskog tumora.
[0271] Efikasnost tretmana sa antitelom ili imunokonjugatom prema pronalasku može biti lako testirana in vivo, na primer na mišjem modelu tumora i merenjem npr. promene zapremine tumora između tretiranih i kontrolnih grupa,% regresije tumora, delimične regresiju i/ili potpune regresije kao što je definisano u Primeru 5.3.
Dijagnostičke primene
[0272] Za CEACAM5 je prijavljeno da je visoko eksprimiran na površini kolorektalnih, želudačnih, plućnih, i ćelija tumora materice, i slabo eksprimiran kod nekoliko normalnih epitelnih ćelija poput debelog creva i epitelnih ćelija jednjaka. Dodatno, ispitivanje ljudskih tumora imunohistohemijom koristeći mišje anti-ljudsko CEACAM5 antitelo prema pronalasku pokazalo je bojenje antitela kod kolorektalnog, stomačnog, raka pluća, grlić materice, pankreasa, jednjaka, jajnika, štitne žlezde, bešike, endometrijuma, dojke, jetre (posebno holangiokarcinom), prostate, i kancera kože.
[0273] Prema tome, CEACAM5 predstavlja marker za kancer i stoga ima potencijal da se koristi za indikovanje efikasnosti anti-kancer terapije ili detektovanje ponavljanja bolesti.
[0274] U jednom otelotvorenju, antitelo iz pronalaska se koristi kao komponenta testa u kontekstu terapije targetiranja tumora koji eksprimiraju CEACAM5, kako bi utvrdila osetljivost pacijenta na terapeutski agensa, pratila efikasnost anti-kancer terapije ili detektovale ponovne pojave bolesti nakon tretmana. Konkretno, isto antitelo pronalaska se koristi i kao komponenta terapeutskog agensa i kao komponenta dijagnostičkog testa.
[0275] Prema tome, dalji predmet ovog pronalaska se odnosi na antitelo prema pronalasku, za upotrebu za in vivo detektovanje CEACAM5 eksprimiranja kod pacijenta, ili upotrebu za ex vivo detektovanje CEACAM5 eksprimiranja u biološkom uzorku pacijenta. Pomenuto detektovanje može da bude posebno namenjeno za
a) dijagnostikovanje prisustva kancera kod pacijenta ili
b) utvrđivanje osetljivosti pacijenta koji ima raka na terapeutski agens koji targetira CEACAM5, naročito imunokonjugat prema pronalasku ili
c) praćenje efikasnosti anti-CEACAM5 terapije kancera ili detektovanje ponovne pojave raka posle anti-CEACAM5 terapije kancera, posebno za terapiju sa imunokonjugatu prema pronalasku;
detektovanjem eksprimiranja površinskog proteina CEACAM5 na ćelijama tumora.
[0276] U otelotvorenju, antitelo je namenjeno za in vitro ili ex vivo upotrebu. Na primer, CEACAM5 se može detektovati in vitro ili ex vivo u biološkom uzorku dobijenom od pacijenta, koristeći antitela pronalaska. Upotreba prema pronalasku može takođe biti upotreba in vivo. Na primer, antitelo prema pronalasku se primenjuje pacijentu i antitelo-ćelija
4
kompleks se detektuje i/ili kvantifikuje, pri čemu je detektovanje navedenog kompleksa indikativno za rak.
[0277] Pronalazak se dalje odnosi na in vitro ili ex vivo postupak otkrivanja prisustva raka kod pacijenta, koji obuhvata korake koji se sastoji od:
(a) dovođenja u dodir biološkog uzorka pacijenta sa antitelom pronalaska, naročito u uslovima dovoljnim za antitelo da formira komplekse sa navedenim biološkim uzorkom;
(b) merenje nivoa antitela vezanog za navedeni biološki uzorak,
(c) detektovanje prisustva raka upoređivanjem izmerenog nivoa vezanog antitela sa kontrolom, gde je povećan nivo vezanog antitela u poređenju sa kontrolom indikator za rak.
[0278] Pronalazak se takođe odnosi na in vitro ili ex vivo postupak određivanja osetljivosti pacijenta koji ima rak na terapeutski agens koji targetira CEACAM5, naročito imunokonjugat prema pronalasku, pri čemu postupak obuhvata korake koji se sastoje od:
(a) dovođenja u dodir biološkog uzorka pacijenta koji ima rak sa antitelom pronalaska, naročito u uslovima dovoljnim za antitelo da formira komplekse sa navedenim biološkim uzorkom;
(b) merenje nivoa antitela vezanog za navedeni biološki uzorak,
(c) poređenje izmerenog nivoa antitela vezanog za navedeni biološki uzorak sa nivoom antitela vezanog za kontrolu;
gde je povećan nivo antitela vezanog za navedeni biološki uzorak u poređenju sa kontrolom indikacija da je pacijent osetljiv na terapeutski agens koji targetira CEACAM5.
[0279] U gore navedenim postupcima, pri čemu navedena kontrola može biti normalan, nekancerogeni, biološki uzorak istog tipa, ili referentna vrednost određena kao reprezetativna za nivo vezivanja antitela u normalnom biološkom uzorku istog tipa.
[0280] U otelotvorenju, antitela pronalaska su korisna za dijagnostikovanje kancera koji eksprimira CEACAM5, kao što je kolorektalni, stomačni, rak pluća, cerviksa materice, pankreasa, jednjaka, jajnika, štitaste žlezde, bešike, endometrijuma, dojke, jetre (posebno holangiokarcinom), prostate ili rak kože.
[0281] Pronalazak se dalje odnosi na in vitro ili ex vivo postupak praćenja efikasnosti anti-CEACAM5 terapije kancera, koji sadrži korake koji se sastoje od:
(a) dovođenja u dodir biološkog uzorka pacijenta koji prolazi kroz anti-CEACAM5 terapiju kancera sa antitelom pronalaska, naročito u uslovima dovoljnim za antitelo da formira komplekse sa navedenim biološkim uzorkom;
(b) merenje nivoa antitela vezanog za navedeni biološki uzorak,
(c) poređenje izmerenog nivoa antitela vezanog za navedeni biološki uzorak sa nivoom antitela vezanog za kontrolu;
gde je povećan nivo antitela vezanog za navedeni biološki uzorak u poređenju sa kontrolom indikacija efikasnosti navedene anti-CEACAM5 terapije kancera.
[0282] U navedenom postupku, povećan nivo antitela vezanog za navedeni biološki uzorak poređenju sa kontrolom je indikacija neefikasnosti navedene anti-CEACAM5 terapija kancera.
[0283] U otelotvorenju navedena kontrola je biološki uzorak istog tipa kao biološki uzorak dostavljen analizi, ali koji je dobijen od pacijenta prethodno na vreme, tokom toka anti-CEACAM5 terapije kancera.
[0284] Pronalazak se dalje odnosi na in vitro ili ex vivo postupak otkrivanja ponovne pojave raka nakon anti-CEACAM5 terapije kancera, koji sadrži korake koji se sastoji od:
(a) dovođenja u dodir biološkog uzorka pacijenta koji prolazi kroz anti-CEACAM5 terapiju kancera sa antitelom pronalaska, naročito u uslovima dovoljnim za antitelo da formira komplekse sa navedenim biološkim uzorkom;
(b) merenje nivoa antitela vezanog za navedeni biološki uzorak,
(c) poređenje izmerenog nivoa antitela vezanog za navedeni biološki uzorak sa nivoom antitela vezanog za kontrolu;
gde je povećan nivo antitela vezanog za navedeni biološki uzorak u poređenju sa kontrolom indikacija ponovne pojave raka posle anti-CEACAM5 terapije kancera.
[0285] Navedena kontrola je posebno biološki uzorak istog tipa kao biološki uzorak dostavljen analizi, ali koji je dobijen od pacijenta prethodno na vreme, posle ili nakon završetka anti-CEACAM5 terapije kancera.
[0286] Navedena anti-CEACAM5 terapija kancera je naročito terapija korišćenjem antitela ili imunokonjugata prema pronalasku. Navedena anti-CEACAM5 terapija kancera targetira kancere koji eksprimiraju CEACAM5, naročito kolorektalni, stomačni, rak pluća, cerviksa materice, pankreasa, jednjaka, jajnika, štitaste žlezde, bešike, endometrijuma, dojke, jetre (posebno holangiokarcinom), prostate ili rak kože.
[0287] U otelotvorenju, antitela pronalaska mogu biti obeležena sa detektabilnim molekulom ili supstancom, kao što je fluorescentni molekul, radioaktivni molekul ili bilo koje drugo poznato obeležje koje pruža (bilo direktno ili indirektno) signal.
[0288] Kad se ovde koristi, izraz „obeleženo“, u vezi sa antitelom prema pronalasku, namenjen da obuhvati direktno obeležavanje antitela kuplovanjem (tj. fizičko povezivanje) detektabilne supstance, kao što je radioaktivni agens ili fiuorofor (npr. fluorescein izotiocijanat (FITC) ili fikoeritrin (PE) ili indociajnin (Cy5)) sa polipeptidom, kao i indirektno obeležavanja polipeptida putem reaktivnosti sa detektabilnom supstancom.
[0289] Antitelo iz ovog pronalaska može biti obeleženo sa radioaktivnim molekulom bilo kojim postupkom poznatim u struci. Na primer radioaktivni molekuli uključuju, ali nisu ograničeni radioaktivni atom za scintigrafske studije poput I<123>, I<124>, In<111>, Re<186>, Re<188>, Tc<99>. Polipeptidi pronalaska mogu takođe biti obeležena sa spin obeležjem za nuklearnu magnetnu rezonancu (NMR) (takođe poznata kao magnetna rezonantna tomografija, MRI), kao što su jod-123, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot -15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
[0290] „Biološki uzorak“ obuhvata različite vrste uzoraka dobijenih od pacijenta i može se koristiti u dijagnostičkom ili monitoring testu. Biološki uzorci obuhvataju, ali nisu ograničeni na krv i druge tečne uzorke biološkog porekla, uzorke čvrstih tkiva poput uzorka za biopsiju ili kulture tkiva ili ćelije izvedene iz njih, i njihovo potomstvo. Stoga, biološki uzorci obuhvataju kliničke uzorke, ćelije u kulturi, ćelijski supernatante, ćelijske lizate, serum, plazmu, biološku tečnost i uzorke tkiva, posebno uzorak tumora.
[0291] U otelotvorenju, biološki uzorak može biti uzorak tkiva fiksiran formalinom i obložen parafinom (FFPE). Zaista, antitela prema pronalasku mogu poželjno da se koristi na FFPE tkivima, što je format koji koristi većina bolnica za prikupljanje i arhiviranje uzoraka tkiva.
[0292] Pronalazak se takođe odnosi na in vivo postupak otkrivanja prisustva raka kod pacijenta, koji obuhvata korake koji se sastoje od:
a) davanje pacijentu detektabilno obeleženog antitela prema pronalasku;
b) detektovanje lokalizacije navedenog obeleženog antitela kod pacijenata putem snimanja.
[0293] Antitela iz pronalaska mogu da budu korisna za određivanje faze kancera (npr., kod radiološkog snimanje). Mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa drugim markerima raka.
[0294] Izrazi „detektovanje“ ili „detektovan“ kad se ovde koristi obuhvataju kvalitativno i/ili kvantitativno detektovanje (merenje nivoa) sa ili bez reference na kontrolu.
[0295] U sadržaju pronalaska, izraz „dijagnostifikovanje“, kad se ovde koristi, označava određivanje prirode medicinskog stanja namenjeno da identifikuje patologiju koja utiče na pacijenta iz velikog broja prikupljenih podataka.
[0296] U navedenom postupku, kancer je kancer koji eksprimira CEACAM5, naročito kolorektalni, stomačni, rak pluća, cerviksa materice, pankreasa, jednjaka, jajnika, štitaste žlezde, bešike, endometrijuma, dojke, jetre (posebno holangiokarcinom), prostate ili rak kože.
Kompleti
[0297] Konačno, pronalazak takođe pruža komplete koji sadrže najmanje jedno antitelo ili imunokonjugat pronalaska. Kompleti sadrže antitela pronalaska koja pronalaze upotrebu u detektovanju površinskog proteina CEACAM5, ili u terapeutskim ili dijagnostičkim testovima. Kompleti prema pronalasku mogu da sadrže polipeptid ili antitelo vezano za čvrstu podlogu, npr. ploče ili kuglice sa kulturom tkiva (npr. kuglice sefaroze). Mogu se pružiti kompleti koji sadrže antitela za detektovanje i kvantifikovanje površinskog proteina CEACAM5 in vitro, npr. u ELISA ili Western blot. Ovakvo antitelo korisno za detektovanje može biti pruženo za obeležjem kao što je fluorescentno ili radioaktivno obeležje.
KRATAK OPIS SEKVENCI
[0298]
SEQ ID NO:1-4, i 6 pokazuju sekvence od CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „MAb1“ antitela.
SEQ ID NO:5 pokazuje VH varijantu sekvence VH1a humanizovanog MAb2 antitela. SEQ ID NO:7-10, i 12 pokazuju sekvence od CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „MAb2“ antitela.
SEQ ID NO:11 pokazuje sekvencu ljudskog CEACAM1 kako je dostupno od GenBank NP_001703.2.
SEQ ID NO:13-16, i 18 pokazuju sekvence od CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „MAb3“ antitela.
SEQ ID NO:17 pokazuje VL varijantu sekvence VL1 humanizovanog MAb2 antitela. SEQ ID NO:19-22, i 24 pokazuju sekvence od CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „MAb4“ antitela.
SEQ ID NO:23 pokazuje VL varijantu sekvenci VL1a humanizovanog MAb2 antitela.
SEQ ID NO:25-28, i 30 pokazuju sekvence od CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L i CDR3-L od takozvanog „MAb5“ antitela.
SEQ ID NO:29 pokazuje VL varijantu sekvenci VL1c humanizovanog MAb2 antitela.
SEQ ID NO:31 pokazuje VH sekvencu od „MAb1“ antitela.
SEQ ID NO:32 pokazuje VL sekvencu od „MAb1“ antitela.
SEQ ID NO:33 pokazuje VH sekvencu od „MAb2“ antitela.
SEQ ID NO:34 pokazuje VL sekvencu od „MAb2“ antitela.
SEQ ID NO:35 pokazuje VH sekvencu od „MAb3“ antitela.
SEQ ID NO:36 pokazuje VL sekvencu od „MAb3“ antitela.
SEQ ID NO:37 pokazuje VH sekvencu od „MAb4“ antitela.
SEQ ID NO:38 pokazuje VL sekvencu od „MAb4“ antitela.
SEQ ID NO:39 pokazuje VH sekvencu od „MAb5“ antitela.
SEQ ID NO:40 pokazuje VL sekvencu od „MAb5“ antitela.
SEQ ID NO:41 pokazuje težak lanac sekvence od chMAb1 antitela.
SEQ ID NO:42 pokazuje laki lanac sekvence od chMAb1 antitela.
SEQ ID NO:43 pokazuje težak lanac sekvence od chMAb2 antitela.
SEQ ID NO:44 pokazuje laki lanac sekvence chMAb2 antitela.
SEQ ID NO:45 pokazuje teški lanac sekvence chMAb3 antitela.
SEQ ID NO:46 pokazuje laki lanac sekvence chMAb3 antitela.
SEQ ID NO:47 pokazuje teški lanac sekvence chMAb4 antitela.
SEQ ID NO:48 pokazuje laki lanac sekvence od chMAb4 antibody
SEQ ID NO:49 pokazuje težak lanac sekvence od chMAb5 antitela.
SEQ ID NO:50 pokazuje laki lanac sekvence od chMAb5 antitela.
SEQ ID NO:51 pokazuje VH varijantu sekvence VH1 humanizovanog MAb2 antitela. SEQ ID NO:52 pokazuje sekvencu ljudskog CEACAM5 pune dužine kako je dostupno od GenBank baze podataka pod pristupnim brojem AAA51967.1.
SEQ ID NO:53 pokazuje sekvencu vanćelijskog domena od Macaca fascicularis CEACAM5.
SEQ ID NO:54 pokazuje sekvencu lakog lanca himernog antitela (dobijeno od „MAb2“ antitela) koji obuhvata K52 do R52 mutacije.
SEQ ID NO: 55 pokazuje VL varijantu sekvence VL1d humanizovanog MAb2 antitela.
SEQ ID NO:56 pokazuje sekvencu od hCEACAM1 vanćelijskog domena (položaji 35-428 od hCEACAM1 pune dužine (NP_001703.2), praćenog 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag).
SEQ ID NO:57 pokazuje sekvencu od cCEACAM1 vanćelijskog domena praćenog 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag.
SEQ ID NO:58 pokazuje sekvencu od hCEACAM5 vanćelijskog domena (položaji 35-685 od hCEACAM5 pune dužine (AAA51967.1) praćenog 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag).
SEQ ID NO:59 pokazuje sekvencu od cCEACAM5 vanćelijskog domena praćenog 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag.
SEQ ID NO:60 pokazuje sekvencu od hCEACAM6 vanćelijskog domena (položaji 35-327 od hCEACAM6 pune dužine (NP_002474.3), praćenog 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag).
SEQ ID NO:61 pokazuje sekvencu od cCEACAM6 vanćelijskog domena praćenog 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag.
SEQ ID NO:62 pokazuje sekvencu od hCEACAM8 vanćelijskog domena (položaji 35-332 od hCEACAM8 pune dužine (NP_001807.2), praćenog 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag.
SEQ ID NO:63 pokazuje sekvencu od cCEACAM8 vanćelijskog domena, praćeno 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag.
SEQ ID NO:64 pokazuje sekvencu od hCEACAM7 vanćelijskog domena (položaji 36-248 od hCEACAM7 pune dužine (NMP_008821.1), praćeno 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag).
SEQ ID NO:65 pokazuje sekvencu od hCEACAM5 N-A1-B1 (položaji 35-320 od hCEACAM5 pune dužine (AAA51967.1.)) praćeno 6 aminokiselinom His-Tag.
SEQ ID NO:66 pokazuje sekvencu od hCEACAM5- A2-B2 (položaji 321-498 od hCEACAM5 pune dužine (AAA51967.1.)) praćeno 6 aminokiselinom His-Tag.
SEQ ID NO:67 pokazuje sekvencu od hCEACAM5 A3-B3 (položaji 499-685 od hCEACAM5 pune dužine(AAA51967.1.)) praćeno 6 aminokiselinom His-Tag-.
SEQ ID NO:68 pokazuje sekvencu od cCEACAM5 N-A1-B1, praćeno 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag.
SEQ ID NO:69 pokazuje sekvencu od cCEACAM5 A2-B2, praćeno 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag.
SEQ ID NO:70 pokazuje sekvencu od cCEACAM5 A3-B3, praćeno 24 aminokiselinskim nastavkom koji sadrži His-Tag.
SEQ ID NO:71 pokazuje sekvencu ljudskog CEACAM6 proteina pune dužine kako je dostupno od GenBank NP_002474.3.
SEQ ID NO:72 pokazuje sekvencu ljudskog CEACAM7 proteina pune dužine kako je dostupno od GenBank NP_008821.1.
SEQ ID NO:73 pokazuje sekvencu ljudskog CEACAM8 proteina pune dužine kako je dostupno u GenBank NP_001807.2.
SEQ ID NO: 74 pokazuje VH sekvencu varijante humanizovanog MAb2_VLg5VHg2.
SEQ ID NO: 75 pokazuje VL sekvencu varijante humanizovanog MAb2_VLg5VHg2. SEQ ID NO: 76 pokazuje sekvencu aminokiselina na položajima 109-115 ljudskog CEACAM5 A3-B3.
SEQ ID NO: 77 pokazuje sekvencu aminokiselina na položajima 131-143 ljudskog CEACAM5 A3-B3.
SEQ ID NO: 78 pokazuje konsenzus sekvencu za CDR1-H od MAb2/MAb4/MAb5 porodice antitela zasnovane na poređenju sekvenci.
SEQ ID NO: 79 pokazuje konsenzus sekvencu za CDR2-H od MAb2/MAb4/MAb5 porodice antitela zasnovane na poređenju sekvenci.
SEQ ID NO: 80 pokazuje konsenzus sekvencu za CDR3-H od MAb2/MAb4/MAb5 porodice antitela zasnovane na poređenju sekvenci.
SEQ ID NO: 81 pokazuje konsenzus sekvencu za CDR1-H od MAb1/MAb3 prodice antitela.
1
SEQ ID NO: 82 pokazuje konsenzus sekvencu za CDR2-H od MAb1/MAb3 prodice antitela.
SEQ ID NO:83 pokazuje konsenzus sekvencu za CDR1-H od MAb2/MAb4/MAb5 prodice antitela zasnovane na ostacima koji su identifikovani kao neutralni u vezivanju ljudskih i Macaca fascicularis CEACAM5 vanćelijskih domena.
SEQ ID NO:84 pokazuje konsenzus sekvencu za CDR3-H od MAb2/MAb4/MAb5 prodice antitela zasnovane na ostacima koji su identifikovani kao neutralni u vezivanju ljudskih i Macaca fascicularis CEACAM5 vanćelijskih domena.
SEQ ID NO:85 pokazuje konsenzus sekvencu za CDR1-L od MAb2/MAb4/MAb5 prodice antitela zasnovane na ostacima koji su identifikovani kao neutralni u vezivanju ljudskih i Macaca fascicularis CEACAM5 vanćelijskih domena.
SEQ ID NO:86 pokazuje konsenzus sekvencu za CDR3-L od MAb2/MAb4/MAb5 prodice antitela zasnovane na ostacima koji su identifikovani kao neutralni u vezivanju ljudskih i Macaca fascicularis CEACAM5 vanćelijskih domena.
SEQ ID NO:87 pokazuje težak lanac sekvence od huMAb2-3 (MAb2_VL1cVH1a-IgG1).
SEQ ID NO:88 pokazuje laki lanac sekvence od huMAb2-3 (MAb2_VL1cVH1a-IgG1).
SEQ ID NO:89 pokazuje težak lanac sekvence od huMAb2-4 (MAb2_VL1d VH1-IgG1).
SEQ ID NO:90 pokazuje laki lanac sekvence od huMAb2-4 (MAb2_VL1d VH1-IgG1).
OPIS SLIKA
[0299]
Slika 1: Procena selektivnosti anti-CEACAM5 antitela.
Slika 2: Mapiranje domena anti-CEACAM5 antitela na ljudskom CEACAM5. Slika 3: Mapiranje domena anti-CEACAM5 antitela na makaki CEACAM5.
Slika 4: Procena anti-tumorske aktivnosti chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4, i chMAb2-SPDB-DM4 konjugata protiv primarnog ljudskog adenokarcinoma debelog creva CR-IGR-034P kod SCID ženskih miševa. Slika 5: Procena anti-tumorske aktivnosti huMAb2-3-SPDB-DM4, huMAb2-4-SPDB-DM4 i chMAb2-SPDB-DM4 konjugata protiv primarnog ljudskog adenokarcinoma debelog creva CR-IGR-034P kod SCID ženskih miševa.
2
Slika 6: Procena anti-tumorske aktivnosti huMAb2-3-SPDB-DM4 konjugata protiv primarnog ljudskog stomačnog adenokarcinoma STO-IND-006 kod SCID ženskih miševa.
Slika 7: Poravnanja sekvenci VH i VL regija od MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 i MAb5 antitela.
Slika 8: HRMS analiza chMAb1-SPDB-DM4 konjugata.
Slika 9: HRMS analiza chMAb2-SPDB-DM4 konjugata.
Slika 10: HRMS analiza chMAb4-SPDB-DM4 konjugata.
Slika 11: HRMS analiza chMAb5-SPDB-DM4 konjugata.
Slika 12: HRMS analiza huMAb2-2-SPDB-DM4 konjugata.
Slika 13: HRMS analiza huMAb2-1-SPDB-DM4 konjugata.
Slika 14: HRMS analiza huMAb2-3-SPDB-DM4 konjugata.
Slika 15: HRMS analiza huMAb2-4-SPDB-DM4 konjugata.
Slika 16: Aktivnost vezivanja humanizovanih varijanti MAb2 za ljudski i majmunski CEACAM5 vanćelijski domen.
Slika 17: Stabilnost vezivanja humanizovanih varijanti MAb2 za ljudski i majmunski CEACAM5 vanćelijski domen.
Slika 18: Procena anti-tumorske aktivnosti huMAb2-3-SPDB-DM4 konjugata protiv primarnog ljudskog plućnog adenokarcinoma LUN-NIC-0014 kod SCID ženskih miševa.
Slika 19: Procena anti-tumorske aktivnosti huMAb2-3-SPDB-DM4 i huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 konjugata protiv primarnog ljudskog adenokarcinoma debelog creva CR-IGR-034P kod CD1 golih ženskih miševa.
Slika 20: HRMS analiza huMAb2-3-sulfoSPDB-DM4.
Slika 21: HRMS analiza huMAb2-3-SMCC-DM1.
Slika 22: Poravnanje varijabilnog domena teškog lanca od MAb2, MAb4, MAb5, humanizovanog VH1a, humanizovanog VH1 i humanizovanog VHg2.
Slika 23: Poravnanje varijabilnog domena lakog lanca od MAb2, MAb4, MAb5, humanizovanog VL1, humanizovanog VL1a, humanizovanog VL1c, humanizovanog VL1d i humanizovanog VLg5.
PRIMERI
[0300] Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan narednim primerima, koje ne treba tumačiti kao dalje ograničavajuće.
Primer 1: Dobijanje rekombinantnih vanćelijskih domena CEACAM proteina [0301] U ovom primeru, vanćelijski domeni proteina (ECD) od CEACAM iz čoveka (h) ili makaki majmuna (c) su pripremljeni prolaznim eksprimiranjem u ćelijama bubrega ljudskog embriona HEK293 sa plazmidima koji omogućavaju eksprimiranje odgovarajućeg cDNK kako je navedeno u Tabeli 1.
[0302] Svaki eksprimirajući plazmid je u kompleku sa 293fectin™ (Life Technologies) i dodat suspenziono kultivisanim 293-F ćelijama (izvedene iz HEK293 ćelija). Osam dana posle transfekcije, supernatanti kulture su sakupljeni i odgovarajući rastvorljivi protein je prečišćen putem IMAC (GE Healthcare) kako bi se generisala serija proteina (pogledati Tabelu 1).
Tabela 1: Opis rekombinantnih vanćelijskih domena CEACAM proteina
4
Primer 2: Proizvodnja monoklonskog mišjeg anti-CEACAM5 antitela
[0303] U ovom primeru, monoklonska antitela su stvorena prateći mišju imunizaciju prema protokolu koji je doveo do stvaranja antiCEACAM5 mAb.
Primer 2.1: Imunizacija i stvaranje hibridoma
[0304] Imunizacija, fuzija i testiranje su obavljeni korišćenjem P3Ks63-Ag8.653 ćelija mijeloma sa vanćelijskim domenom ljudskog CEACAM5, vanćelijskim domenom makaki CEACAM5 ili ljudskim tumorskim UMC11 ćelijama kao što je opisano u Wennerberg A.E et al., 1993. Am. J. Pathol., 143(4), 1050-1054 and Kilpatrick et al.1997. Hybridoma 16:
381389.
[0305] Primenom RIMMS postupka kako je opisano od strane Kilpatrick et al. (1997.
Hybridoma 16: 381389), 6-8 nedelja stare ženke BALB/c miševa (S082342; Charles River Labs, Bar Harbor, ME) su sve primile četiri runde imunizacije tokom trajanja od 14 dana u intervalima od 3-4 dana. Antigeni emulgovani u Titermax adjuvansu (TierMax Gold Adjuvant; Sigma #T2684) su primenjivani potkožno na šest lokacija blizu pražnjenja limfnih čvorova, duž leđa miševa i šest jukstaponiranih lokacije duž abdomena. Četiri dana nakon poslednje injekcije, miševi su žrtvovani. Bilateralni poplitejalni, površinski ingvinalni, aksilarni i razgranati limfni čvorovi su izolovani aseptično i isprani sa svežim RPMI medijumom.
[0306] Korišćenjem klasičnog postupka kao što su opisali Wennerberg A.E et al. (1993. Am. J. Pathol., 143(4), 1050-1054), 6-8 nedelja stare ženke BALB/c miševa (S082342; Charles River Labs, Bar Harbor, ME) su sve primile tri runde imunizacije tokom perioda od 41 dana. Antigeni su davani intraperitonealno na trbušna mestu miševa. Tri dana nakon poslednje injekcije, miševi su žrtvovani i slezine su izolovane aseptično i isprane sa svežim RPMI medijumom.
[0307] Limfociti su oslobođeni iz limfnih čvorova ili iz slezina, i jednoćelijske suspenzije su isprane dva puta sa RPMI medijumom pre fuzije sa P3Ks63-Ag8.653 mijeloma ćelijama korišćenjem polietilen glikola. Nakon fuzije, smeša ćelija je inkubirana u inkubatoru na 37°C tokom 16-24 sati. Priprema dobijenih ćelija je prebačena u selektivni polu-čvrsti medijum i aseptično postavljena u 100 mm Petrijeve ploče i inkubirana na 37°C. Deset dana nakon pokretanja selekcije, ploče su ispitane na rast hibridoma, a vidljive kolonije su sakupljene i postavljene u 96-komorične ploče koje sadrže 200 µl medijuma rasta.96-komorične ploče su držane u inkubatoru na 37°C tokom 2 do 4 dana.
Primer 2.2: Ispitivanje i in vitro karakterisanje mišjih anti-CEACAM5 antitela
[0308] Primarno ispitivanje anti-CEACAM5 IgG proizvodnje je obavljeno enzimski vezanim imunosorbent testom (ELISA) korišćenjem ljudskog CEACAM5 proteina (pripremljen kao što je opisano u Primeru 1) kao antigena za hvatanje, i korišćenjem FACS koji koristi nekoliko ljudskih tumorskih ćelija (H460, MKN45, SV1463, SKMEL28 i UMC11). Za ELISA test, ploče su obložene ljudskim CEACAM5 proteinom na 0,25 µg/komorica u PBS i 100 µl/komorica anti-CEACAM5 antitela su dodata na ploču. Ploča je inkubirana na 37°C tokom 1 sata i isprana pet puta sa PBS koji sadrži 0,05% Tween-20 (PBS-T). Zatim 100 µl od 1:50.000 rastvora zečjeg anti-mišjeg IgG je konjugovanog sa peroksidazom rena (Sigma; #A9044) je dodato svakoj komori. Posle inkubacije na 37°C tokom 1 sata u mraku, ploče su isprane sa PBS-T pet puta. Vezivanje antitela je vizuelizovano dodavanjem TMB-H2O2 pufera i čitanjem na talasnoj dužini od 450 nm. Za FACS test, ljudske tumorske ćelije su obložene na 40,000 ćelija/komorica na 96-komoričnoj High Bind ploči (MSD L15XSB-3) i 100 µl/bazenčić anti-CEACAM5 antitela su dodata 45 min na 4°C i isprana su tri puta sa PBS 1% BSA.100 µl/komorica kozjeg anti-mišjeg IgG konjugovanog sa Alexa647 (Invitrogen; #A2135) je dodato tokom 45 min na 4°C i isprano tri puta sa PBS 1% BSA. Vezivanje antitela je procenjeno nakon centrifugiranja i resuspenzije ćelija dodavanjem 200 µl/komorica PBS 1% BSA i pročitano korišćenjem Guava<®>easiCite™ 8HT sistema protočne citometrije.
[0309] Za procenjivanje specifičnosti CEACAM5 anti-CEACAM5 antitela, 96-komorične ploče su obložene rekombinantnim ljudskim CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 i CEACAM8 proteinima (pripremljeno kao što je opisano u Primeru 1) koristeći iste uslove oblaganja koji su prethodno opisani. Anti-CEACAM5 antitela su dodata pločama i detektovana primenom zečjeg anti-mišjeg IgG, konjugovana sa peroksidazom rena (Sigma; #A9044). Vezivanje antitela je vizuelizovano dodavanjem TMB-H2O2 pufera, i pročitano na talasnoj dužini od 450 nm. Rezultati su predstavljeni na Slici 1 pokazuju da su anti-CEACAM5 antitela su selektivna za ljudski CEACAM5 u odnosu na ljudske CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 i CEACAM8.
Primer 2.3: Karakterisanje vezivanja monoklonskih antitela
[0310] Vidljiv afinitet anti-CEACAM5 antitela za hCEACAM5 eksprimiranim na površini ljudskih MKN45 (DSMZ, ACC 409) tumorskih ćelija je utvrđen sa Guava® easiCite ™ 8HT sistemom protočne citometrije. MKN45 tumorske ćelije su obložene na 40,000 ćelija/komorica na 96-komoričnoj High Bind ploči (MSD L15KSB-3) i 100 µl/komorica anti-CEACAM5 antitela je dodato u dvostrukim serijskim razblaživanjima sa početkom u 20 µg/ml do 12 razblaženja u testnom diluantu tokom 45 min na 4°C, i isprane su tri puta sa PBS 1% BSA.100 µl/komorica kozjeg anti-mišjeg IgG konjugovanog sa Alexa647 (Invitrogen; #A2135) je dodato tokom 45 min na 4°C i isprano tri puta sa PBS 1% BSA. Vezivanje antitela je procenjeno nakon centrifugiranja i resuspenzije ćelija dodavanjem 200 µl/komorica PBS 1% BSA i pročitano korišćenjem Guava® easiCite™ 8HT sistema protočne citometrije. Vidljive KD i EC50 vrednosti su procenjene korišćenjem BIOST@T-BINDING and BIOST@T-SPEED softvera, respektivno.
Tabela 2: EC50 vrednosti dobijene na MKN45 ćelijama
[0311] Mapiranje domena anti-CEACAM5 antitela za ljudske CEACAM5 i makaki CEACAM5 proteine je određeno pomoću ELISA.96-komorične ploče su obložene sa rekombinantnim ljudskim A1 (143-237), A1-B1 (143-320), A2-B2 (321-498) i A3-B3 (499-685) domenima CEACAM5 proteina (pripremljeni kao što je opisano u Primeru 1) i sa rekombinantnim makaki N-A1-B1 (1-320), A1-B1 (143-320), A2-B2 (321-498) i A3-B3 (499-688) domenima CEACAM5 proteina (pripremljeni kako je opisano u Primeru 1) korišćenjem istih uslova oblaganja koji su prethodno opisani. Prečišćena antitela su dodata pločama i detektovana korišćenjem zečjeg anti-mišjeg IgG, konjugovanim sa peroksidazom rena (Sigma; #A9044). Vezivanje antitela je vizuelizovano dodavanjem TMB-H2O2 pufera i pročitano na talasnoj dužini od 450 nm. Rezultati su prikazani na Slikama 2 i 3, i pokazuju da se anti-CEACAM5 antitela vezuju za A3-B3 oblasti ljudskih i makaki CEACAM5 proteina.
[0312] Izotopi pojedinačnih monoklonskih antitela su određivani korišćenjem mišjeg IgG kompleta za izotipovanje, prema uputstvima proizvođača (SEROTEC ref. MMT1). Pet CEACAM5-specifičnih monoklonskih antitela pripadaju IgG1, k izotip.
Primer 3: Karakterisanje mišjih anti-CEACAM5 antitela
Primer 3.1: In vitro karakterisanje mišjih anti-CEACAM5 antitela
[0313] Mišje hibridomi koji esprimiraju CEACAM5 specifična antitela su proizvedeni u T500 boci i kondicionirani medijum je sakupljena posle 7 dana rasta. CEACAM5 specifična antitela su prečišćena propuštanjem kondicioniranog medijuma kroz Protein-G kolonu, isprana i eluirana sa glicin/HCl 100 mM pH 2,7 puferom. Eluat je dijalizovan prema PBS pre sterilne filtracije i čuvan na 4°C.
[0314] Sva CEACAM5 specifična monoklonska antitela su procenjena na svoju sposobnost da vezuju ljudski i primatski CEACAM5 protein pomoću ELISA. Ploče su obložene sa ljudskim ili primatskim CEACAM5 proteinom, anti-hCEACAM5 monoklonska antitela su dodata na ploču i detektovana sa zečjim anti-mišjim IgG konjugovanim sa peroksidazom rena (Sigma; #A9044). Vezivanje antitela je vizuelizovano dodavanjem TMB-H2O2 pufera i pročitano na talasnoj dužini od 450 nm.
Tabela 3: EC50 vrednosti koje odgovaraju sposobnosti vezivanja CEACAM5 specifičnih monoklonskih antitela za primatske CEACAM5 proteine
Primer 3.2: Vidljivi afinitet i kapacitet vezivanja anti-CEACAM5 antitela za CR-IGR-034P ćelije ljudskog tumora debelog creva u odmakloj fazi, putem protočne citometrije
[0315] Ljudski tumor debelog creva u odmakloj fazi CR-IGR-034P (Julien et al., Clin Cancer Res October 1, 201218:5314-5328) dobijen je od ksenografta kod miševa izvedenih od pacijenta. Tumor CR-IGR-034P je enzimatski ograđen korišćenjem tip IV kolagenaze (Invitrogen; # 17104-019) i dezoksiribonukleaze (Invitrogen; # 18047-019) tokom 1 sata na 4°C. Ćelijska održivost je procenjena Viacount aplikacijom pomoću Guava® easiCite™ 8HT sistema protočne citometrije. Za procenu vidljivog afiniteta, CR-IGR-034P tumorski ćelije su obložene na 40,000 ćelija/komorica na 96-komoričnoj High Bind ploči (MSD L15KSB-3) i 100 µl/komorica anti-CEACAM5 antitela je dodato u dvostrukim serijskim razblaženjima sa početkom u 20 µg/ml do 12 razređenja u testiranom razblaživaču tokom 45 min na 4°C i isprana su tri puta sa PBS 1% BSA.100 µl/komorica kozjeg anti-mišjeg IgG konjugovanog sa Alexa647 (Invitrogen; #A2135) ili kozjeg anti-ljudskog IgG konjugovanog sa Aleksa488 (Invitrogen; #A11013) je dodato tokom 45 min na 4°C i isprano tri puta sa PBS 1 % BSA. Vezivanje antitela je procenjeno nakon centrifugiranja i resuspenziju ćelija dodavanjem 200 µl/komorica PBS 1% BSA i čitanja korišćenjem Guava® easiCite ™ 8HT sistema protočne citometrije. Vidljive KD i EC50 vrednosti su procenjene korišćenjem BIOST@T-BINDING and BIOST@T-SPEED softvera, respektivno.
[0316] Kapacitet vezivanja anti-CEACAM5 antitela je određen korišćenjem Mouse IgG Calibrator kompleta (Biocytex # 7208) ili Human IgG Calibrator kompleta (Biocytex # CP010), prema uputstvima proizvođača.
Tabela 4: KD i EC50 vrednosti dobijene kod CR-IGR-034P ćelija ljudskog primarnog tumora debelog creva u odmakloj fazi
Primer 3.3: Internalizacija aktivnosti mišjih CEACAM5 specifičnih antitela
[0317] Za procenu internalizacije anti-CEACAM5 antitela MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 i MAb5, održive MKN45 ćelije su inkubirane tokom 24 sata na 37°C/5% CO2 (ili 4°C na ledu za negativnu kontrole) sa 10 µg/ml AlexaFluor488-pre-obeleženim anti-CEACAM5 antitelima. Zatim, jedan deo komorica je ispran u medijumu za kultivisanje i vanćelijska AF-obeležena antitela vezana za ćelije su neutralisana inkubiranjem ćelija sa anti-AlexaFluor 488 antitelima (50 µg/mL) na ledu tokom 30 min (međućelijski nivo fluorescencije). Drugi deo komorica je inkubiran samo sa medijumom za rast u istom vremenskom uslovu (ukupan nivo fluorescencije).
[0318] Ćelije su zatim odvojene i oprane, i sakupljene u medijumu kulture pre analize protočne citometrije korišćenjem MACSQUANT Vyb analizatora. Merena je fluorescencija povezana sa ćelijama od 1 × 10<4>ćelija, a srednji fluorescentni intenzitet ograđenih održivih ćelija je kvantifikovan. Odnos internalizacije (%) je definisan deljenjem neutralizovane fluorescencije povezane sa ćelijama sa ukupnom fluorescencijom povezanom sa ćelijama, pomnoženo sa 100. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± standardna devijacija (SD) Tabela 5: Internalizacija anti-CEACAM5 mišjeg antitela na 24 sata u MKN45 ćelijskoj liniji
[0319] Pet CEACAM5-specifičnih antitela podvrgnuto je internalizaciji nakon vezivanja CEACAM5 eksprimiranog na površinskoj membrani ćelija, podržavajući njihove upotrebe u oblasti imunokonjugata antitela da se specifično pozabave citotoksičnosti za ćelije kancera. Anti-CEACAM5 antitela MAb1, MAb2, MAb3, MAb4 i MAb5 pokazala su internalizaciju u MKN45 ljudskim ćelijskim linijama raka od 49,9%, 45%, 51,1%, 42,5%, 51,7%, respektivno, nakon 24 sata inkubacije.
Primer 3.4: Citotoksična aktivnost odgovarajućih mišjih ADC na MKN45 ćelijskim linijama
[0320] Mišja antitela su konjugovana u cilju definisanja njihove in vitro citotoksične aktivnosti. U 15 ml epruveti, na sobnoj temperaturi (23°C), mAb, Pufer A/HEPES (4%), DMA (dimetilacetamid, 20% v/v), zatim 6 ekvivalenta SPDB veznika se uzastopno uvedeni uz mešanje magnetnom mešalicom. Posle jedne noći na sobnoj temperaturi, dodat je DM4 (majtanzinoid, 9,6 ekvivalenta) u 15 mM rastvor DMA, i reagovano je 5 sati. Sirova konjugacija smeše je prečišćena na Superdex 200pg 16/60 ili G2526/10 kolonama (PBS-Na pH 7,4/5% NMP), koncentrisana na Amicon 15@5000g i filtrirana na Millex 0,22mm.
[0321] Efekat anti-CEACAM5 majtanzinoidnih konjugata je zatim testiran na održivost tumorskih ćelija primenom Cell Titar-Glo kompleta (Promega). Da se to učini, MKN45 ljudske ćelije želudačnog kancera su zasejane u 96-komorica i ostavljene da se pridržavaju tokom 4 sata u 37°C/5% CO2 atmosferi. Različite koncentracije anti-CEACAM5 konjugata su dodate posejanim ćelijama. Ćelije su zatim inkubirane tokom 96 sati u istoj atmosferi. Cell Titar-Glo reagensa je zatim dodat u komorice tokom 10 min na sobnoj temperaturi i luminescenti signal je izmeren korišćenjem EnVision brojač ploča (Perkin-Elmer).
Tabela 6: Citotoksične aktivnosti CEACAM5 specifičnih mišjih ADC na CEACAM5+ MKN45 ćelijskoj liniji
[0322] Anti-CEACAM5 antitela konjugovana do majtanzinoidna (DM4) MAb1-SPDB-DM4, MAb2-SPDB-DM4, MAb3-SPDB-DM4, MAb4-SPDB-DM4 i MAb5-SPDB-DM4 pokazala su in vitro citotoksične aktivnosti sa IC50 od 0,89, 0,14, 0,53, 0,96 i 0,24 nM, respektivno.
Primer 4: Određivanje sekvence teških i lakih lanaca anti-CEACAM5 monoklonskih antitela
[0323] Sekvence varijabilnih domena monoklonskih antitela su preuzete iz hibridoma i klonirane u vektor eksprimiranja kako bi se osiguralo da klonirana monoklonska antitela imaju iste karakteristike kao početna mišja monoklonska antitela.
[0324] Izvedene aminokiselinske sekvence pružaju informacije u skladu sa podacima koji su dobijeni na prečišćenim monoklonskim antitelima izvedenim iz hibridoma pomoću N-
1
terminalnog sekvenciranja i masene spektrometrije (LC/MS) teških i lakih lanaca (LC, HC) (pogledati tabelu 7).
Tabela 7: Analiza masene spektrometrije anti-CEACAM5 monoklonskih antitela od hibridoma
Primer 5: Antitelo-lek konjugat (ADC) (himera)
Primer 5.1: Golo himerno monoklonsko antitelo
[0325] Sekvence nukleinskih kiselina varijabilnih domena VH, VL su klonirane u vektore eksprimiranja u fuziji sa ljudskim IgG1 ili ljudskim Ckappa kodirajućim sekvencama konstantnog domena, respektivno, kako bi zatim generisale serije himernih monoklonskih antitela sa prolaznim eksprimiranjem u HEK293 kao što je opisano u Primeru 1. Afiniteti za ljudski i makaki CEACAM5 ostali su slični za mišja i himerna monoklonska antitela. U Tabeli 8, afiniteti su ilustrovani pomoću EC50 dobijenih iz ELISA sa ljudskim ili makaki CEACAM5.
2
Tabela 8: EC50 dobijeni sa CEACAM5 za mišje hibridome i odgovarajuća himerna monoklonska antitela
[0326] Sekvence za CDR regije su izvedene iz sekvence proteina koristeći IMGT nomenklaturu. One odgovaraju SEQ ID NO: 1-4, 6, 7-10, 12, 13-16, 18, 19-22, 24, 25-28, 30.
[0327] Značajno u poređenju sa antitelima proizvedenim pomoću kloniranih hibridoma (MAb2i), kanonski ostaci su uvedeni u MAb2 klona na položajima 41G, 42K i 45K u VL i na položajima 5k i 7S na VH.
[0328] Pored toga, lizin na položaju 52 na VL od MAb2 CEA-4 klona koji se nalazi u CDR2, zamenjen je sa argininom u Mab2K52Rklonu. Serija je generisana u istim uslovima koji odgovaraju MAb2 klonu, i dovelo je do sličnog afiniteta za ljudski i makaki CEACAM5 vanćelijski domen kao što je prikazano u Tabeli 7. Naglašeno je da ova tačkasta mutacija u CDR može biti bez ikakvog uticaja na vezivanje.
[0329] LC i HC sekvence himernog monoklonskog antitela za MAb2 klona i Mab2K52Rklona odgovaraju SEQ ID NO: 43, 44, 54.
[0330] chMAb2 je konstruisan kao što je opisano u primeru 4. To je himerno monoklonsko antitelo izvedeno iz MAb2 klona sa ljudskim IgG1, Ck izotipom. Sekvence odgovaraju SEQ ID NO: 43, i 44. Serija je pripremljen na 300 mg skali prolaznim eksprimiranjem u HEK293 što je praćeno pročišćavanjem proteina afinitetnom hromatografijom, pogledati Tabelu 7 za podatke vezivanja. Golo monoklonsko antitelo je korišćeno za proizvodnju ADC.
Primer 5.2: Izrada i karakterisanje ADC
[0331] U ovom primeru, imunokonjugati su pripremljeni od golog himernog monoklonskog antitela. in vivo efikasnost je zatim procenjena.
DAR kalkulacija:
[0332] Konjugat obuhvata obično od 1 do 10 molekula majtanzinoida vezanih kovalentno za antitelo (tzv. „odnos leka i antitela“ ili „DAR“). Ovaj broj može da varira sa prirodom antitela i majtanzinoida koji se koristi zajedno sa eksperimentalnim uslovima koji su korišćeni za konjugaciju (poput odnosa majtanzinoid/antitelo, vremena reakcije, prirode rastvarača i korastvarača, ukoliko postoji). Stoga dodir između antitela i majtanzinoidna dovodi do smeše koja sadrži više konjugata koji se razlikuju jedan od drugog po različitim odnosima leka i antitela; opciono golog antitela; opciono agregata. DAR koji je određen je stoga srednja vrednost.
[0333] Postupak koji je ovde korišćen za određivanje DAR se sastoji od spektrofotometrijskog merenja odnosa apsorpcije na 252 nm i 280 nm rastvora suštinski prečišćenog konjugata. Posebno, navedeni DAR se može spektrofotometrijski odrediti korišćenjem izmerenih ekstinkcionih koeficijenata na, respektivno, 280 i 252 nm za antitelo i majtanzinoid ( εD280= 5,180 M<-1>cm<-1>i εD252= 26,159 M<-1>cm<-1>). Postupak izračunavanja je izveden od Antony S. Dimitrov (ed), LLC, 2009, Therapeutic Antibodies and Protocols, vol 525, 445, Springer Science i opisan detaljnije u nastavku:
Apsorbancije za konjugat na 252 nm (A252) i na 280 nm (A280) se mere na monomernom vrhu analize hromatografije isključivanja veličine (SEC) (omogućavajući računanje „DAR (SEC)“ parametra), ili koristite klasičan spektrofotometerski aparat (omogućavajući računanje „DAR (UV)“ parametra). Apsorbancije se mogu izraziti na sledeći način :
gde:
4
• CDi CAsu, respektivno, koncentracije u rastvoru majtanzinoida i antitela
• εD252i εD280su, respektivno, koeficijenti molarne ekstinkcije majtanzinoidna na 252 nm i 280 nm
• εD252i εD280su, respektivno, koeficijenti molarne ekstinkcije antitela na 252 nm i 280 nm.
[0334] Razdvajanje ove dve jednačine sa dvije nepoznate dovodi do sledećih jednačinama:
[0335] Prosečan DAR se izračunava iz odnosa koncentracije leka i antitela: DAR = CD/CA
Deglikozilacija i masena spektrometrija visoke rezolucije konjugata (HRMS)
[0336] Deglikozilacija je tehnika enzimske digestije pomoću glikozidaze. Deglikozilacija je napravljen od 500 µl konjugovanog 100 µl Tris pufera HCl 50 mM 10 µl glicanaza-F enzima (100 jedinica enzima osušenog zamrzavanjem/100 µl vode). Medijum se centrifugira i održava tokom jedne noći na 37°C. Uzorak deglikozilacije je onda spremna da se analizira u HRMS. Maseni spektri su dobijeni na Waters Q-Tof-2 sistemu u pozitivnom modu elektrospreja (ES+). Hromatografski uslovi su sledeći: kolona: 4 µm BioSuite 250 URH SEC 4,6x300 mm (Waters); rastvarači: A: amonijum formijat 25 mM 1% mravlja kiselina: B: CH3CN; temperatura kolone: 30°C; brzina protoka 0,4 ml/min; izokratsko eluiranje 70% A 30% B (15 min).
Analitička hromatografija isključenja veličine (SEC)
[0337]
• Kolona: TSKgel G3000 SWXL 5µm kolona, 7,8 mm x 30 cm, TOSOH BIOSCIENCE, LLC Part # 08541 zaštitna kolona TSK-GEL SWXL 7 µM, 40 mm x 6mm, TOSOH BIOSCIENCE, LLC Part # 08543
• Mobilna faza: KCI (0,2M), KH2PO4 (0,052 M), K2HPO4 (0,107 M), iPrOH (20% u zapremini)
• Uslovi analize: izokratsko eluiranje na 0,5 ml/min tokom 30 min
• Analiza je obavljena na Lachrom Elite HPLC sistemu (Merck) koristeći L2455 DAD spektrofotomerski detektor.
Sadržaj pufera
[0338]
• Pufer A (pH 6,5) : NaCl (50 mM), kalcijum fosfatni pufer (50 mM), EDTA (2 mM)
• Pufer HGS (pH 5,5): histidin (10 mM), glicin (130 mM), sukroza 5% (w/v), HCl (8 mM)
Korišćene skraćenice
[0339] CV: zapremina kolone ; DAR : odnos leka i antitela ; DMA : dimetilacetamid ;
HEPES : 4-(2-hidroksietil)-1-piperazin-etanesulfonska kiselina ; HRMS : masena spektroskopija visoke rezolucije ; NHS : N-hidroksisukcinimidn ; Nitro-SPDB : buterna kiselina, 4-[(5-nitro-2-piridinil)ditio]-, 2,5-diokso-1-pirolidinil ester (može da se pripremi kako je opisano u WO2004016801 patentu) ; NMP : N-metilpirolidinon ; RT : sobna temperatura ; sekundi : hromatografija isključenja veličine
ADC (himere):
chMAb1-SPDB-DM4
Analitički podaci:
[0340] MW(antitelo) = 148438 g/mol ; MW(DM4) = 780,38 g/mol
ε280nm(antitelo) = 213320; ε252nm(antitelo) = 73473
ε280nm(DM4) = 5180; ε252nm(DM4) = 26159
[0341] Pod mešanjem, na RT, 3,59 ml chMAb1 (C = 5,72 mg/ml u PBS pH = 7,4 puferu) uvedeni su u posudu, što je praćeno sa 0,312 ml DMA i 0,046 ml nitro-SPDB veznik rastvora (5,0 ekvivalenta - 15mM rastvor u DMA). Rastvor je centrifugiran tokom 30 sekundi i zatim polako mešan na RT tokom 3 sata. Pod mešanjem magnentnom mešalicom, 3,8 ml PBS pH7,5 pufera, 0,389 ml DMA i 0,074 ml DM4 rastvora (15 mM rastvor u DMA) su dodati jedan za drugim. Nakon 2,5 sata na RT, sirova reaktivna smeša je pročišćena na HiLoad 26/60 koloni za desaliranje (Superdex 200 pg ; GE Healthcare), pre-kondicionarni sa 1 CV NaOH 1 M, 2 CV vode i 2 CV PBS pH7,4 puferom koji sadrži 5% NMP u zapremini.
Konjugat je eluiran sa PBS pH7,4 puferom koji sadrži 5% NMP, i monomerni fragmenti konjugata su prikupljeni, koncentrisani na Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore) i filtrirani na 0,22µm filteru.
[0342] 7,6 ml chMAb1-SPDB-DM4 konjugata (c=2,19 mg/ml) je stoga dobijeno kao bezbojni čist rastvor. Konjugat je zatim analiziran za konačno postavljanje leka i monomersku čistoću : DAR (UV)= 3,38 ; DAR (SEC)= 3,34 ; RT= 17,54 min ; monomerska čistoća= 99,8%.
[0343] Rezultati HRMS analize su prikazani na Slici 8.
chMAb2-SPDB-DM4
Analitički podaci:
[0344]
MW(antitelo) = 147900 g/mol ; MW(DM4) = 780,38 g/mol
ε280nm(antitelo) = 201400 ; ε252nm(antitelo) = 70889
ε280nm(DM4) = 5180 ; ε252nm(DM4) = 26159
[0345] Pod mešanjem, na RT, 3,8 ml chMAb2 (C = 5,08 mg/ml u PBS pH = 7,4 puferu) uvedeni su u posudu, što je praćeno sa 0,337 ml DMA i 0,0433 ml nitro-SPDB veznik rastvora (5,0 ekvivalenta - 15 mM rastvor u DMA). Rastvor je centrifugiran tokom 30 sekundi i zatim polako mešan na RT tokom 3 sata. Pod mešanjem magnentnom mešalicom, 3,12 ml PBS pH7,5 pufer, 0,319 ml DMA i 0,069 ml DM4 rastvora (15 mM rastvor u DMA) su dodati jedan za drugim. Nakon 2 sata na RT, sirova reaktivna smeša je filtrirana na 0,45 µm filteru i pročišćena na HiLoad 26/60 koloni za desaliranje (Superdex 200 pg ; GE Healthcare), pre-kondicionarna sa 1 CV NaOH 1 M, 2 CV vode i 2 CV PBS pH7,4 puferom koji sadrži 5% NMP u zapremini. Konjugat je eluiran sa PBS pH7,4 puferom koji sadrži 5% NMP, i monomerni fragmenti konjugata su prikupljeni, koncentrisani na Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore) i filtrirani na 0,22µm filteru.
[0346] 7,5 ml chMAb2-SPDB-DM4 konjugata (c=1,8 mg/ml) je stoga dobijeno kao bezbojni čist rastvor. Konjugat je zatim analiziran za konačno postavljanje leka i monomersku čistoću : DAR (UV)= 4,10 ; DAR (SEC)= 4,05 ; RT= 17,52 min ; monomerska čistoća= 99,9%.
[0347] Rezultati HRMS analize su prikazani na Slici 9.
chMAb4-SPDB-DM4
Analitički podaci:
[0348]
MW(antitelo) = 148124 g/mol ; MW(DM4) = 780,38 g/mol
ε280nm280nm(antitelo) = 204380 ; ε280nm252nm(antitelo) = 73142
ε280nm280nm(DM4) = 5180 ; ε280nm252nm(DM4) = 26159
[0349] Pod mešanjem, na RT, 3,63 ml chMAb4 (C = 5,69 mg/ml u PBS pH = 7,4 puferu) uvedeni su u posudu, što je praćeno sa 0,316 ml DMA i 0,0465 ml nitro-SPDB veznik rastvora (5,0 ekvivalenta - 15 mM rastvor u DMA). Rastvor je centrifugiran tokom 30 sekundi i zatim polako mešan na RT tokom 3 sata. Pod mešanjem magnentnom mešalicom, 3,8 ml PBS pH7,5 pufer, 0,389 ml DMA i 0,074 ml DM4 rastvora (15 mM rastvor u DMA) su dodati jedan za drugim. Nakon 2 sata na RT, sirova reaktivna smeša je pročišćena na HiLoad 26/60 koloni za desaliranje (Superdex 200 pg ; GE Healthcare), pre-kondicionarna sa 1 CV NaOH 1 M, 2 CV vode i 2 CV PBS pH7,4 puferom koji sadrži 5% NMP u zapremini. Konjugat je eluiran sa PBS pH7,4 puferom koji sadrži 5% NMP, i monomerni fragmenti konjugata su prikupljeni, koncentrisani na Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore) i filtrirani na 0,22µm filteru.
[0350] 6,5 ml chMAb4-SPDB-DM4 konjugata (c=2,20 mg/ml) je stoga dobijeno kao bezbojni čist rastvor. Konjugat je zatim analiziran za konačno postavljanje leka i monomersku čistoću : DAR (UV)= 3,87 ; DAR (SEC)= 3,85 ; RT= 17,52 min ; monomerska čistoća= 99,8%.
[0351] Rezultati HRMS analize su prikazani na Slici 10.
chMAb5-SPDB-DM4
Analitički podaci:
[0352]
MW(antitelo) = 148040 g/mol ; MW(DM4) = 780,38 g/mol
ε280nm280nm(antitelo) = 207360 ; ε280nm252nm(antitelo) = 72288
ε280nm280nm(DM4) = 5180 ; ε280nm252nm(DM4) = 26159
[0353] Pod mešanjem, na RT, 3,15 ml chMAb5 (C = 6,38 mg/ml u PBS pH = 7,4 puferu) uvedeni su u posudu, što je praćeno sa 0,269 ml DMA i 0,0453 ml nitro-SPDB veznik rastvora (5,0 ekvivalenta - 15 mM rastvor u DMA). Rastvor je centrifugiran tokom 30 sekundi i zatim polako mešan na RT tokom 3 sata. Pod mešanjem magnentnom mešalicom, 4,1 ml PBS pH7,5 pufer, 0,317 ml DMA i 0,072 ml DM4 rastvora (15 mM rastvor u DMA) su dodati jedan za drugim. Nakon 2 sata na RT, sirova reaktivna smeša je filtrirana na 0,45 µm filteru i pročišćena na HiLoad 26/60 koloni za desaliranje (Superdex 200 pg ; GE Healthcare), pre-kondicionarna sa 1 CV NaOH 1 M, 2 CV vode i 2 CV PBS pH7,4 puferom koji sadrži 5% NMP u zapremini. Konjugat je eluiran sa PBS pH7,4 puferom koji sadrži 5% NMP, i monomerni fragmenti konjugata su prikupljeni, koncentrisani na Amicon Ultra-15 (Ultracel 10 k, Millipore) i filtrirani na 0,22µm filteru.
[0354] 7,5 ml od AntiCEACAM5_hib_1917CEA4_VH5Q7S_VL41G42K45Q_IgG1-SPDB-DM4 konjugata (c=3,4 mg/ml) je stoga dobijeno kao bezbojni čist rastvor. Konjugat je zatim analiziran za konačno postavljanje leka i monomersku čistoću : DAR (UV)= 3,4 ; DAR (SEC)= 3,4 ; RT= 17,49 min ; monomerska čistoća= 99,8%.
[0355] Rezultati HRMS analize su prikazani na Slici 11.
Primer 5.3: In vivo efikasnost
[0356] Četiri himerna konjugata (chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4 i chMAb2-SPDB-DM4) su procenjena na 2 doze u odnosu na merljive primarne tumore debelog creva CR-IGR-034P implantirani s.c. in ženske SCID miševe. Kontrolne grupe su ostavljene bez tretmana. Doze konjugata su date u mg/kg. Oni su davani na 5 i 2,5 pomoću intravenske (IV) bolus injekcija, na dan 14 nakon implantacije tumora.
[0357] Za procenu anti-tumorske aktivnosti konjugata, životinje su merene svakog dana i tumori su mereni 2 puta nedeljno šestarom. Doze koje proizvode gubitak težine od 20% na nadiru (srednja vrednost grupe) ili 10% ili više smrti od leka, smatrane su preterano toksičnim dozama. Telesnu težina životinja uključuje težine tumora. Zapremine tumora su izračunate korišćenjem formule masa (mm<3>) = [dužina (mm) x širina (mm)2]/2. Primarna efikasnosti i krajnje tačke su ΔT/ΔC, procenat medijane regresije, parcijalne i kompletne regresije (PR i CR).
[0358] Promene u zapremini tumora za svaku tretiranu (T) i kontrolnu (C) grupu se izračunavaju za svaki tumor oduzimanjem zapremine tumora na dan prvog tretmana (početni dan) iz zapremine tumora na određeni dana posmatranja. Medijana ΔT se izračunava za tretirane grupe i medijana ΔC izračunava se za kontrolnu grupu. Onda se odnos ΔT/ΔC izračunava, i izražen je u procentima: ΔT/ΔC = (delta T/delta C) x 100.
[0359] Doza se smatra kao terapeutski aktivan kada je ΔT/ΔC manji od 40% i vrlo aktivna kada je ΔT/ΔC manji od 10%. Ako je ΔT/ΔC manji od 0, doza se smatra visoko aktivnom i procenat regresije se beleži (Plowman J, Dykes DJ, Hollingshead M, Simpson-Herren L and Alley MC. Human tumor xenograft models in NCI drug development. In: Feibig HH BA, editor. Basel: Karger.; 1999 p 101-125):
% regresija tumora je definisana kao smanjenja % zapremine tumora u tretiranoj grupi, na određeni dan posmatranja u odnosu na svoju zapremine na prvi dana prvog tretmana.
[0360] U specifičnoj vremenskoj tački i za svaku životinju, izračunava se % regresije.
Medijana % regresije se zatim izračunava za grupu:
[0361] Parcijalna regresija (PR): regresije se definišu kao parcijalne ako se zapremina tumora smanji na 50% zapremine tumora na početku tretmana.
[0362] Kompletna regresija (CR): Kompletna regresija se postiže kada zapremina tumora = 0 mm<3>(CR smatra kada nije moguće snimiti zapreminu tumora).
Rezultati:
[0363] Rezultati su prikazani na Slici 4 i u Tabeli 9 (ispod). Korišćenje jednog planiranog rasporeda primeni na 2,5 i 5 mg/kg, nijedan od konjugata testiranih u ovom ispitivanju nisu indukovali toksičnost.
[0364] chMAb1-SPDB-DM4 je bio veoma aktivan na 5 i 2,5 mg/kg sa ΔT/ΔC od 0 i 7% (p < 0,0001 i p = 0,0170 u poređenju sa kontrolom), respektivno. chMAb4-SPDB-DM4 i chMAb5-SPDB-DM4 su visoko aktivni na 5 mg/kg sa ΔT/ΔC od -5 i -7% (p < 0,0001 u poređenju sa kontrolom), respektvno i regresije tumora od 25 i 65%, respektivno. Oni su bili veoma aktivni na 2,5 mg/kg sa ΔT/ΔC od 7 i 2% (p = 0.0152 i p = 0.0020 u poređenju sa kontrolom), respektivno. chMAb2-SPDB-DM4 je bio veoma aktivan na 5 i 2,5 mg/kg sa ΔT/ΔC od -10 i -8% (p < 0,0001 u poređenju sa kontrolom), respektivno, regresije tumora pde 82 i 39%, respektivno i 3 i 1 CR/6, respektivno.
[0365] Iz ovih rezultata, svi himerni konjugati chMAb4-SPDB-DM4, chMAb1-SPDB-DM4, chMAb5-SPDB-DM4 i chMAb2-SPDB-DM4 su upotrebljivi za razvijanje terapeutskog ADC.
Tabela 9: Procena anti-tumorske aktivnosti chMAb1-SPDB-DM4, chMAb2-SPDB-DM4, chMAb4-SPDB-DM4, i chMAb5-SPDB-DM4 konjugata protiv primarnog ljudskog adenokarcinoma debelog creva CR-IGR-034P kod SCID ženskih miševa
1
Primer 6: humanizacija anti-CEACAM5_MAb2 monoklonskih antitela
[0366] U ovom primeru, humanizovane varijante roditeljskog mišjeg IgG MAb2 su dizajnirane in silico. Dobijena monoklonska antitela su proizvedena i date su im slične osobine kao himernom IgG ch-MAb2.
Primer 6.1: protokol 4D-humanizacije
a) Humanizacija na osnovu putanja molekularne dinamike
[0367] VL i VH sekvence mišjeg MAb2 klona su poređene sa bazom podataka proteina (PDB) (Berman et al., Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242). Korišćeni su sledeći šabloni: okvir lakog i teškog lanca - 3EHB (90,9% identičnosti okvira lakog lanca i 90,8% identičnosti okvira teškog lanca), L1-1I8M, L2 - 1 F6L, L3 - 1 P7K, H1 - 2KHR, H2 - 1IGT i H3 - 1 P4B kako bi se izgradio model homologije anti-CEACAM5 LC i HC primenom molekularnog radnog okruženja (MOE) (v.2011.10 - Chemical Computing Group, Quebec,
2
Canada). Model homologije je naknadno energetski svedena na minimum korišćenjem standardnih postupaka implementiranih u MOE.
[0368] Potom je izvedena simulacija molekularne dinamike (MD) minimizovanim 3D modelom homologije mišjeg MAb2, sa ograničenjima na skeletu proteina na 500 K temperaturi tokom 1,1 nanosekundi (ns) u generalizovanom Born implicitnom rastvaraču. 10 različitih konformacija je ekstrakovano iz ovog prvog MD ponavljanja na svakih 100 pikosekundi (PS), tokom poslednje 1 ns. Ove različite konformacije su zatim sve dostavljene simulaciji MD, bez ograničenja na skelet proteina i na 300 K temperaturi, tokom 2,3 ns. Za svaki od 10 MD ponavljanja, poslednjih 2,000 snimaka, jedan svake ps, MD putanje su zatim upotrebljeni za izračunavanje svake mišje MAb2 aminokiseline, njen koren srednje kvadratne devijacije (rmsd) u poređenju sa referentnim medoidnim položajem. Poređenjem prosečnog rmsd na 10 odvojenih MD ponavljanja date aminokiseline u ukupnom prosečnom rmsd svih MAb2 mišjih aminokiselina, odlučuje se da li je amino-kiselina je dovoljno fleksibilna, što kad se vidi tokom MD treba smatrati verovatnim za interakciju sa T-ćelijskim receptorima i odgovornim za aktiviranje imunog odgovora. 32 aminokiseline su identifikovane kao fleksibilne u mišjem MAb2 antitela, izuzev CDR i njegove neposredne 5 Å blizine.
[0369] Kretanje 60 najfleksibilnijih mišjih MAb2 aminokiselina, tokom 20 ns (10 x 2 ns) sa simulacijom molekularne dinamike, su zatim upoređeni sa kretanjem odgovarajućih fleksibilnih aminokiselina 49 ljudskih 3D modela homologije, od kojih su svi imali iste MD simulacije. Ovih 49 ljudskih embrionskih modela je izrađeno sistematski kombinovanjem reprezentativnog panela od 7 ljudskih lakih lanaca (poimence vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) sa reprezentativnim panelom od 7 ljudskih teških lanaca (poimence vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) (Nucleic Acid Research, 2005, Vol.33, Database issue D593-D597).
[0370] Kombinacija vk1-vh6 pokazala je najvišu (72,6%) 4D sličnost svojih fleksibilnih aminokiselina u poređenju sa fleksibilnim aminokiselinama mišjeg MAb2 antitela; ovaj model je stoga korišćen da humanizuje MAb2 antitelo fokusirajući se na fleksibilne aminokiseline. Za povezivanje uparenih aminokiselina između mišjeg MAb2 i vk1-vh6 aminokiselina, dve sekvence su poravnate na osnovu optimalne 3D superpoložaje alfa ugljenika f na dva odgovarajuća modela homologije.
b) Stabilišuće mutacije
[0371] Da bi se poboljšala stabilnost VL i VH regija anti-CEACAM5 antitela, aminokiseline lakih i teških lanaca sa nižim učestalošću pojavljivanja u odnosu na svoje kanonske sekvenci, isključujući CDR, prvobitno su predložene da se mutiraju u najučestalije aminokiseline (ΔΔGth> 0,5 kcal/mol; (Monsellier et al. J. Mol. Biol.2006, 362,580-593). Prvi spisak konsenzus mutacija za LC i za HC je ograničen na aminokiseline koje se nalaze u najbližem ljudskom modelu (tj. vk1-vh6). Nijedna od ovih mutacija se ne nalazi u „Vernier“ zoni. (Foote et al., J. Mol. Biol.1992, 224, 487-499). Drugi kriterijumi se uzimaju u obzir kako bi se ove konsenzus mutacije razmotrile za potencijalnu stabilizaciju anti-CECAM5 MAb2 antitela. Ovi kriterijumi su povoljna promena hidropatije na površini ili molekularna mehanika zasnovana na predviđenoj stabilizaciji mutanta. Stabilišuće mutacije prijavljene kao uspešne u literaturi (Bedouelle, H. J. Mol. Biol.2006, 362,580-593; Steipe B. J. Mol. Biol. 1994, 240, 188-192) su uzete u obzir.
c) Uklanjanje neželjenih motiva sekvenci
[0372] Sledeći motivi sekvenci su razmatrani: Asp-Pro (kiselia labilna veza), Asn-X-Ser/Thr (glikozilacija, X = bilo koja aminokiselina osim Pro), Asp-Gly/Ser/Thr (sukcinimid/iso-asp formiranje in fleksibilnim područjima), Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cis (izložena mesta deamidovanja), Met (oksidacija u izloženom području). Dobijene humanizovane sekvence su proverene za sličnosti sekvence u poređenju sa Immune Epitope Data Base (IEDB) bazom podataka ((PLos Biol (2005) 3(3)e91) http://www.immuneepitope.org) kako bi se obezbedilo da nijedna od sekvenci ne sadrži bilo koja poznat tamo naveden B- ili T-ćelijski epitop.
d) Humanizovane VH i VL regije
[0373] Predložene su tri verzije za lakog lanca (VL1, VL1 a, i VL1 c) i tri verzije za teškog lanca (VH1, VH1a i VH1b). Posebne kombinacije aminokiselinskih ostatka izmenjenih u svakoj humanizovanoj MAb2 VL i VH varijanti su navedene u Tabeli 10 i Tabeli 11, respektivno. Kompletne aminokiselinske sekvence humanizovanih VH i VL domena su navedene u Tabeli 12.
[0374] VL1 varijanta pokazuje 5 mutacija koje potiču iz direktnog poređenja između ne-CDR najfleksibilnijih aminokiselina lakog lanca anti-CEACAM5 MAb2 i vk1 sekvence ljudskog lakog lanca.
4
[0375] VL1a varijanta potiče od VL1 i uključuje 4 nove mutacije koje su konsenzus (vk1 sekvenca) i potencijalno stabilišuće. Štaviše, 1 od ovih mutacija se odnosi na potencijalno problematično mesto deamidovanja (D17T18).
[0376] VL1c varijanta potiče od VL1a sa uvođenjem 1 mutacije R umesto K na položaju 52. Zaista, ovaj K52 se nalazi u CDR L2 i mogao bi da bude „meta“ za proces konjugacije.
[0377] VH1 varijanta prikazuje 7 mutacija koje potiču iz direktnog poređenja između ne-CDR najfleksibilnijih aminokiselina teškog lanca anti-CEACAM5 i vh6 sekvence ljudskog teškog lanca.
[0378] VH1a varijanta potiče iz VH1 i uključuje 4 nove mutacije koje su konsenzus (vh6 sekvenca) i potencijalno stabilišuće.
[0379] VL i VH domeni humanizovanog anti-CEACAM5 MAb2 antitela su kombinovani na sledeći način: VL1 i VH1; VL1a i VH1a; VL1c i VH1a; VL1a i VH1b
Tabela 10: Mutacije VL varijanti anti-CEACAM5 MAb2 antitela
Tabela 11: Mutacije VH varijanti anti-CEACAM5 MAb2 antitela
Tabela 12: VH i VL aminokiselinske sekvence primernih humanizovanih anti-CEACAM5 antitela.
Primer 6.2: Sekvenca humanizovanih anti CEACAM5 monoklonskih antitela
[0380] Iz aminokiselinskih sekvenci in silico VL i VH varijanti, izvedene su sekvence nukleinske kiseline i sintetisane uz pomoć Geneart. Sekvence su klonirane u vektore eksprimiranja u fuziji sa ljudskim IgG1 ili ljudskim Ckappa konstantnim domenom koja kodira sekvence respektivno.
Primer 6.3: Proizvodnja i in vitro karakterisanje
[0381] Serije humanizovanih monoklonskih antitela proizvedene su prolaznim eksprimiranjem u HEK293 i pročišćene protein A afinitetnom hromatografijom. Struktura i identitet su potvrđeni SDS-PAGE analizom, hromatografijom isključenja veličine i masenom spektrometrijom.
[0382] Afinitet za ljudski i makaki CEACAM5 je verifikovan pomoću ELISA, EC50 su dati u Tabeli 13.
Tabela 13: Afinitet humanizovanog anti-CEACAM5 monoklonskog antitela za ljudski i makaki CEACAM5
[0383] Specifičnost ljudskog CEACAM5 u odnosu na ljudske CEACAM1, CEACAM6, CEACAM7 i CEACAM8 je verifikovana pomoću ELISA. Dat je kao procenat vezivanja u poređenju sa punim vezivanjem sa ljudskog CEACAM5, pogledati Tabelu 14.
Tabela 14: Procenat vezivanja humanizovanog anti-CEACAM5 monoklonskog antitela za ljudske CEACAM
[0384] Domen za vezivanje epitopa je potvrđen pomoću ELISA, i pokazao je da humanizovane varijante specifično prepoznaju A3-B3 domen. Dat je kao procenat vezivanja u poređenju sa punim vezivanjem sa ljudskim CEACAM5 na Tabeli 15.
Tabela 15: Procenat vezivanja humanizovanog anti-CEACAM5 monoklonskog antitela za ljudske CEACAM5 domene
[0385] Kinetike vezivanja humanizovanih anti-CEACAM5_MAb2 varijanti, u poređenju sa himernim MAb2, za rekombinantni ljudski CEACAM5 (hCEACAM5) i makaki CEACAM5 (cCEACAM5) određene su testom površinske plazmonske rezonance korišćenjem BIAcore 2000 (BIAcore Inc., Uppsala, NJ).
[0386] Ukratko, CM5 BIAcore biosenzor čip je smešten u instrument i aktiviran sa 70 µl 1:1 NHS/EDC na sobnoj temperaturi. Mišji anti-ljudski Fc IgG1 (BIAcore # BR-1008-39) (50 µg/mL u 1M acetat pufera, pH5) su imobilizovani na aktiviranim čipovima u svim ćelijama protoka. Imobilizacija je izvedena pri brzini protoka od 10 µl/min do zasićenja. Čip je zatim blokiran injekcijom 70 µl etanolamin-HCl, pH8,5, što je praćeno jednim ispiranjem sa 3M MgCl2. Za merenje vezivanja anti-CEACAM5 monoklonskih antitela na ljudski CEACAM5 protein ili makaki CEACAM5 protein, antitela su korišćena na 1-5 µg/mL u BIAcore puferu (HBS-EP). Antigeni (ljudski CEACAM5 ili makaki CEACAM5) su injektirane od 1 do 500 nM. Nakon završetka faze injekcije, disocijacija je praćena BIAcore protočnim puferom na istoj brzini protoka tokom 600 sekundi. Površina je regenerisana između injekcija koristeći 2 x 5 µl MgCI23M (2 x 30s). Pojedinačni senzorgrami su analizirani korišćenjem BIAevaluation softvera.
Tabela 16: Vezivanje humanizovanih anti-CEACAM5 monoklonskih antitela za ljudski i makaki CEACAM5
[0387] Specifičnost humanizovanih anti-CEACAM5_MAb2 varijanti, u poređenju sa himernim MAb2, za makaki CEACAM5 u poređenju sa makaki CEACAM1, CEACAM6 i CEACAM8, verifikovana je pomoću ELISA. Data je kao procenat vezivanja u poređenju sa punim vezivanjem sa CEACAM5 ili vezivanjem na EC50, pogledati Tabelu 17 ispod Tabela 17: Procenat vezivanja humanizovanog anti-CEACAM5 monoklonskog antitela za makaki CEACAM
Primer 6.4: Karakterisanje humanizovanih varijanti Mab2 dobijenih graftovanjem na ljudske embrionske okvire
[0388] U ovom primeru, humanizovane varijante Mab2 su dobijeni pomoću pristupa CRD-graftovanja. Dalje, CDR humanizovanog antitela su dostavljeni za alanin-skeniranje pristup kako bi se pokazalo da nekoliko položaja mogu da se supstituišu bez uticaja na vezivanje za ljudski i Macaca fascicularis CEACAM5.
[0389] Sekvenca humanizovane verzije Mab2 je prvi put generisana in silico biranjem ljudske embrionske okvire na osnovu strukturne homologije sa mišjim Mab2 antitelom. Za laki lanac, izabrani ljudski okviri su definisani genima IGKV1D-39*01 i IGKJ2*02 i za teški
1
lanca, genima IGHV3-23*04 i IGHJ4*01. Šest CDR od Mab2K52Rsu graftovane na ove ljudske okvire. Uvedene su tri povratne mutacije, što odgovara položajima 34 i 53 u VL (SEQ ID NO.34) (FR2-L i FR3-L regije, respektivno) i položaju 50 u VH (SEQ ID NO.33) (FR2-H regija), što dovodi do naredne sekvenci, definisiane kao MAb2_VLg5VHg2.
Tabela 18: VH i VL sekvence od MAb2_VLg5VHg2
[0390] Nekoliko varijanti MAb2_VLg5VHg2 su dobijene jednom zamenom svake aminokiseline od šest CDR-a, poželjno sa alaninom. Kada se alanin već nalazi u MAb2_VLg5VHg2 CDR, koji se javlja u H-CDR3, druga aminokiselina je supstituisana (Val na ostatku 97, Arg na ostatku 98 i Asp na ostatku 108 od SEQ ID NO: 74).
[0391] Iz in silico aminokiselinskih sekvenci VL i VH varijanti, sekvence nukleinske kiseline su izvedene i generisane sintezom gena. Sekvence su klonirani u sisarski vektor eksprimiranja u fuziji sa ljudskim IgG1 ili ljudskim Ckappa konstantnim domenom koji kodira sekvence respektivno. Humanizovano MAb2_VLg5VHg2, pojedinačne varijante se razlikuju od njega za jedan položaj, i ograničen broja kombinacija mutanata je proizveden prolaznim eksprimiranjem u HEK293 ćelijama. Ćelijski supernatanti koji sadrže izlučeni IgG (20 do 70 µg/ml) su razblaženi do 1 µg/ml za upotrebu u testovima vezivanja za ljudski CEACAM5 ECD, Macaca fascicularis ECD i A3-B3 domen ljudskog CEACAM5.
[0392] Kako bi se ocenio uticaj ovih modifikacija, IgG vezivanje je određeno merenjem SPR signala sa Biacore T200 jedinicom (GE Healthcare). Anti-ljudska Fc antitela su spojena sa Series S CM5 čipom preko kompleta za uparivanje amina kako bi se dostigao nivo od 10.000 jedinica odgovora (RU). Otprilike 300 do 600 RU svakog varijante je uhvaćeno injektiranjem
1 1
supernatanta na 1 µg/ml sa vremenom dodira od 60 sekundi i protokom od 10 µl/min. Svi eksperimenti su izvedeni na 25°C sa HBS-EP+ (10 mM Hepes, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0,05% surfaktanta P20) kao protočnim puferom. U režimu ispitivanja, ljudski CEACAM5/makaki CEACAM5/ljudski A3B3 domen su injektirani na 50nM nad preko zhvaćenih IgG varijanti pri brzini protoka od 30 µl/min tokom 1 minuta. Faza disocijacije od 60 sekundi je održano pre nego što je površina regenerisana sa 1 impulsnom injekcijom sa 3 M MgCl2pri brzini protoka od 10 µl/minut i vremenom dodira od 30 sekundi.
[0393] Za svaki eksperiment, podaci odgovora su obrađeni korišćenjem referentne površine, omogućavajući korekcije rasutih promena indeksa prelamanja i bilo kog ne-specifičnog vezivanja. Podaci su dvostruko označeni korišćenjem odgovora od praznih injekcija. Prema postupku ispitivanja opisanom u prijavnoj beleški od GE Healthcare (Application Note 28-9777-72 AA), za dva parametra se smatralo da rangiraju varijante u pogledu karakteristika vezivanja. Prvo, aktivnost vezivanja se procenjuje proporcijom izmerenog teoretskog maksimalnog signala (procenat Rmax, pogledati Sliku 16). Drugo, procenat preostalih signala se izračunava pomoću disocijacije tačaka izveštaja (prvi 10 sekundi nakon završetka injekcije, a drugi 50 sekundi nakon završetka injekcije) i odražava stabilnost vezivanja (pogledati Sliku 17).
[0394] Pojedinačne alanin varijante na sledećim položajima pokazale su ekvivalentne parametre vezivanja, u poređenju sa originalnim antitelom, sugerišući da su CDR aminokiseline na ovim položajima neutralni za vezivanje: LC ostaci 27, 28, 29, 31, 51,52, 89, 90, 93, 94, 96, 97 i HC ostaci 26 do 31, 51 do 58, 97, 103, 104, 107, 109. Ponašanja ovih varijanti su slična ljudskim i majmunskim CEACAM5, tako održavajući svoju unakrsnu reaktivnost. Takođe je otkriveno da je vezivanje za A3-B3 domen CEACAM5 nepromenjeno. Neke kombinacije dve neutralne supstitucije su generisane, i otkriveno je da dovode do neizmenjenih parametara vezivanja, kao što je ilustrovano sa povezanošću LC_T51A sa LC_T94A, LC_S31A sa HC_G54I ili LC_T53I sa HC_S53A.
[0395] Suprotno, na svim ostalim CDR položajima, za supstituciju alanina za originalnu aminokiselinu je otkriveno da indukuje potpun gubitak vezivanja ili dramatično menja parametre vezivanje. Položaj 101 teškog lanca ili položaji 32 i 91 lakog lanca su primeri prikazani na Slikama 16 i 17), Drugi set varijanti sastojao se od testiranja više konzervativnih mutacija na nekim takvim položajima. Time smo otkrili da su naredne konzervativne
1 2
supstitucije neutralne za vezivanje antigena: Tyr za Phe na ostatku 30 od MAb2_VLg5, Phe za Tyr na ostatku 92 od MAb2_VLg5, Ser za Ala na ostatku 98 od MAb2_VHg2 i Phe za Tyr na ostatku 100 od MAb2_VHg2 (prikazano na slikama)
Primer 7: Humanizovane varijante MAb2 lek konjugata
Primer 7.1: Proizvodnja i karakterisanje
huMAb2-2-SPDB-DM4
Analitički podaci:
[0396]
MW(antitelo) = 147360 g/mol ; MW(DM4) = 780,38 g/mol
ε280nm(antitelo) = 201400 ; ε280nm(antitelo) = 71693
ε280nm(DM4) = 5180 ; ε280nm(DM4) = 26159
[0397] Pod mešanjem, na RT, 19,4 mg huMAb2-2 (C = 5,1 mg/ml in PBS pH = 7,4 pufer) uvedeni su u posudu, što je praćeno sa 0,375 ml DMA i 0,0439 ml nitro-SPDB veznik rastvora (5,0 ekvivalenta - 15 mM rastvor u DMA). Rastvor je centrifugiran tokom 30 sekundi i zatim polako mešan na RT tokom 2 sata. Dodatna zapremina 0,0044 ml nitro-SPDB veznik rastvora (5,0 ekvivalenta - 15 mM rastvor u DMA) je dodata. Nakon 2 sata na RT pod mešanjem magnentnom mešalicom, 2 ml PBS pH=7,5 puferoma i 0,0702 ml DM4 rastvora (15 mM rastvor u DMA) su dodati jedan za drugim. Nakon 2 sata na RT, sirova reaktivna smeša je filtrirana na 0,45 µm filteru i pročišćena na HiPrep 26/10 koloni za desaliranje (Sephadex G25, GE Healthcare), pre-kondicionarni sa1CV NaOH 1M, 2 CV vode i 2 CV histidin (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferomom. Konjugat je eluiran sa histidin (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferom, i monomerni fragmenti konjugata su prikupljeni i filtrirani na 0,22µm filteru.
[0398] 10,3 ml huMAb2-2-SPDB-DM4 konjugata (c=1,35 mg/ml) je stoga dobijeno kao bezbojni čist rastvor. Konjugat je zatim analiziran za konačno postavljanje leka i monomersku čistoću: DAR (UV)= 3,7 ; DAR (SEC)= 3,6 ; RT= 17,29 min ; monomerska čistoća= 97,9%.
[0399] Rezultati HRMS analize su prikazani na Slici 12.
huMAb2-1-SPDB-DM4
1
Analitički podaci:
[0400]
MW(antitelo) = 147563 g/mol ; MW(DM4) = 780,38 g/mol
ε280nm(antitelo) = 201400. ε252nm(antitelo) = 69669
ε280nm(DM4) = 5180 ; ε252nm(DM4) = 26159
[0401] Pod mešanjem, na RT, 3,8 ml od a solution huMAb2-1 (C = 5,08 mg/ml in PBS pH = 7,4 pufer) uvedeni su u posudu, što je praćeno sa 0,341 ml DMA i 0,0392 ml nitro-SPDB veznik rastvora (4,5 ekvivalenta - 15 mM rastvor u DMA). Rastvor je centrifugiran tokom 30 sekundi i zatim polako mešan na RT for 3 sata. Dodatna zapremina 0,0087 ml nitro-SPDB veznik rastvora (1,0 ekvivalenta - 15 mM rastvor u DMA) je dodata. Nakon 2 sata na RT pod mešanjem magnentnom mešalicom, 2,62 ml PBS pH7,5 puferom, 0,254 ml DMA i 0,076 ml DM4 rastvora (15 mM rastvor u DMA) su dodati jedan za drugim. After 1 hour na RT, sirova reaktivna smeša je filtrirana na 0,45 µm filteru i pročišćena na HiPrep 26/10 koloni za desaliranje (Sephadex G25, GE Healthcare), pre-kondicionarni sa1CV NaOH 1M, 2 CV vode i 2 CV histidina (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferomom. Konjugat je eluiran sa histidin (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferom, i monomerni fragmenti konjugata su prikupljeni i filtrirani na 0,22µm filteru
[0402] 9,5 ml huMAb2-1-SPDB-DM4 konjugata (c=1,35 mg/ml) je stoga dobijeno kao bezbojni čist rastvor. Konjugat je zatim analiziran za konačno postavljanje leka i monomersku čistoću: DAR (UV)= 4,1 ; DAR (SEC)= 4,0 ; RT= 17,39 min ; monomerska čistoća= 96,7%.
[0403] Rezultati HRMS analize su prikazani na Slici 13.
huMAb2-3-SPDB-DM4
Analitički podaci:
[0404]
MW(antitelo) = 147417 g/mol ; MW(DM4) = 780,38 g/mol
ε280nm(antitelo) = 201400 ; ε252nm(antitelo) = 71451
ε280nm(DM4) = 5180 ; ε252nm(DM4) = 26159
1 4
[0405] Pod mešanjem, na RT, 3,8 ml od a solution huMAb2-3 (C = 5,09 mg/ml in PBS pH = 7,4 pufer) uvedeni su u posudu, što je praćeno sa 0,336 ml DMA i 0,0437 ml nitro-SPDB veznik rastvora (5 ekvivalenta - 15 mM rastvor u DMA). Rastvor je centrifugiran tokom 30 sekundi i zatim polako mešan na RT for 3 sata. Dodatna zapremina 0,0035 ml nitro-SPDB veznik rastvora (0,4 ekvivalenta - 15 mM rastvor u DMA) je dodata. After 1 hour na RT pod mešanjem magnentnom mešalicom, 2,60 ml PBS pH7,5 puferom, 0,248 ml DMA i 0,074 ml DM4 rastvora (15 mM rastvor u DMA) su dodati jedan za drugim. After 1 hour na RT, sirova reaktivna smeša je filtrirana na 0,45 µm filteru i pročišćena na HiPrep 26/10 koloni za desaliranje (Sephadex G25, GE Healthcare), pre-kondicionarni sa1CV NaOH 1M, 2 CV vode i 2 CV histidina (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferomom. Konjugat je eluiran sa histidin (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferom, i monomerni fragmenti konjugata su prikupljeni i filtrirani na 0,22µm filteru
[0406] 11 ml huMAb2-3-SPDB-DM4 konjugata (c=1,08 mg/ml) je stoga dobijeno kao bezbojni čist rastvor. Konjugat je zatim analiziran za konačno postavljanje leka i monomersku čistoću: DAR (UV)= 3,9 ; DAR (SEC)= 3,8 ; RT= 17,44 min ; monomerska čistoća= 98,4%.
[0407] Rezultati HRMS analize su prikazani na Slici 14.
huMAb2-4-SPDB-DM4
Analitički podaci:
[0408]
MW(antitelo) = 147628 g/mol ; MW(DM4) = 780,38 g/mol
ε280nm(antitelo) = 201400 ; ε252nm(antitelo) = 70628
ε280nm(DM4) = 5180 ; ε252nm(DM4) = 26159
[0409] Pod mešanjem, na RT, 3,8 ml od a solution huMAb2-4 (C = 5,09 mg/ml in PBS pH = 7,4 pufer) uvedeni su u posudu, što je praćeno sa 0,345 ml DMA i 0,0448 ml nitro-SPDB veznik rastvora (5 ekvivalenta - 15 mM rastvor u DMA). Rastvor je centrifugiran tokom 30 sekundi i zatim polako mešan na RT for 3 sata. Dodatna zapremina 0,0027 ml nitro-SPDB veznik rastvora (0,3 ekvivalenta - 15 mM rastvor u DMA) je dodata. After 1 hour na RT pod mešanjem magnentnom mešalicom, 2,70 ml PBS pH7,5 puferom, 0,263 ml DMA i 0,075 ml DM4 rastvora (15 mM rastvor u DMA) su dodati jedan za drugim. After 1 hour na RT, sirova
1
reaktivna smeša je filtrirana na 0,45 µm filteru i pročišćena na HiPrep 26/10 koloni za desaliranje (Sephadex G25, GE Healthcare), pre-conditioned with 1 CV NaOH 1M, 2 CV vode i 2 CV histidina (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferomom. Konjugat je eluiran sa histidin (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferom, i monomerni fragmenti konjugata su prikupljeni i filtrirani na 0,22µm filteru
[0410] 11 ml huMAb2-4-SPDB-DM4 konjugata (c=1,23 mg/ml) je stoga dobijeno kao bezbojni čist rastvor. Konjugat je zatim analiziran za konačno postavljanje leka i monomersku čistoću: DAR (UV)= 3,8 ; DAR (SEC)= 3,8 ; RT= 17,53 min ; monomerska čistoća= 99,3%.
[0411] Rezultati HRMS analize su prikazani na Slici 15.
Primer 7.2: in vitro citotoxiciti
Materijal i postupci:
[0412] Efekat anti-CEACAM5 majtanzinoid konjugata na održivost ćelija tumora je procenjena kako je opisano u primeru 3.4.
Rezultati:
[0413]
Tabela 19: Citotoksične aktivnosti CEACAM5-specifičnih humanizovanih ADC na CEACAM5+ MKN45 ćelijskoj liniji
[0414] Ovi chMAb2-SPDB-DM4, huMAb2-1-SPDB-DM4, huMAb2-2-SPDB-DM4, i huMAb2-3-SPDB-DM4 konjugati i DM4 irelevantni konjugat pokazali su in vitro citotoksične aktivnosti na MKN45 ćelijama u kulturi sa IC50 od 0,24, 0,18, 0,23, 0,16, i 8,52
1
nM respektivno. Citotoksične aktivnosti anti-CEACAM5 konjugata bile su 53 to 35 puta niže nego izmerene aktivnosti irelevantnog DM4 konjugata što indikuje CEACAM5-posredovano citotoksičnu aktivnosti anti-CEACAM5 konjugata.
Primer 7.3: in vivo efikasnost protiv primarnih CR-IGR-034P tumora debelog creva implantiranih s.c. u ženske CD-1 gole miševe
Materijal i postupak
[0415] Dve humanizovane sekvence kao konjugati konjugati huMAb2-3-SPDB-DM4 i huMAb2-4-SPDB-DM4 su procenjene na četvorodoznum nivoima u poređenju sa chMAb2-SPDB-DM4, protiv merljivih primarnih CR-IGR-034P tumora debelog creva implantiranih s.c. u ženske CD-1 gole miševe. Kontrolne grupe su ostavljene bez tretmana. Doze konjugata su date u mg/kg. One su primenjene na 10, 5, 2,5 i 1,25 mg/kg putem intravenske (IV) bolus injekcije, na dan 19 nakon implantacije tumora.
[0416] Procene toksičnosti i efikasnosti su obavljene kako je dato u primeru 5.
Rezultati:
[0417] Rezultati su dati na Slici 5 i Tabeli 20 (ispod).
[0418] Koristeći jedan raspored primene na 1,25, 2,5, 5 i 10 mg/kg, nijedan od konjugata testiran u ovom ispitivanju nije indukovao toksičnost.
[0419] huMAb2-4-SPDB-DM4 i chMAb2-SPDB-DM4 su bili visoko aktivni na 10 mg/kg sa ΔT/ΔC od -4 % (p < 0,0001 u poređenju sa kontrolom) i regresijom tumora od 21 i 19%, respektivno, aktivni na 5 mg/kg sa ΔT/ΔC od 12 (p = 0,0105 u poređenju sa kontrolom) i 17 % (p = 0,0417 u poređenju sa kontrolom), respektivno i marginalno aktivni na 2,5 mg/kg sa ΔT/ΔC od 36 i 37% (ns u poređenju sa kontrolom), respektivno, i neaktivni na 1,25 mg/kg. huMAb2-3-SPDB-DM4 je bio visoko aktivan na 10 mg/kg sa ΔT/ΔC od -6 % (p < 0,0001 u poređenju sa kontrolom) i regresijom tumora od 31%, veoma aktivan na 5 mg/kg sa ΔT/ΔC od 4 % (p < 0,0001 u poređenju sa kontrolom), aktivan na 2,5 mg/kg sa ΔT/ΔC od 12 (p = 0,0322 u poređenju sa kontrolom) i marginalno aktivan na 1,25 mg/kg ΔT/ΔC od 34% (ns u poređenju sa kontrolom).
1
[0420] Iz ovih rezultata, obe humanizovane sekvence huMAb2-3-SPDB-DM4 i huMAb2-4-SPDB-DM4 su korisne za razvijanje terapeutskog ADC. huMAb2-3-SPDB-DM4 je bolja od dve sekvence.
Tabela 20: Procena anti-tumorske aktivnosti huMAb2-3-SPDB-DM4 i huMAb2-4-SPDB-DM4 i chMAb2-SPDB-DM4 konjugata protiv primarnog CR-IGR-034P ljudskog adenokarcinoma debelog creva kod CD-1 ženskih miševa
1
Primer 7.4: in vivo efikasnost protiv primarnih STO-IND-006 stomačnih tumora implantiranih s. c. kod ženskih SCID miševa
Materijal i postupak
[0421] Humanizovan konjugat huMAb2-3-SPDB-DM4 je procenjen na 3 dozna nivoa protiv merljivih primarnih STO-IND-006 stomačnih tumora implantiranih s.c. kod ženskih SCID miševa. Kontrolne grupe su ostavljene bez tretmana. Doze konjugata su date umg/kg. One su primenjene na 10, 5 i 2,5 mg/kg putem intravenske (IV) bolus injekcije, na dan 27 nakon implantacije tumora.
[0422] Procene toksičnosti i efikasnosti su obavljene kako je dato u primeru 5.
Rezultati:
[0423] Koristeći jedan raspored primene na 2,5, 5 i 10 mg/kg, huMAb2-3-SPDB-DM4 nije indukovao toksičnost.
[0424] Kako je prikazano na Slici 6 i u Tabeli 21, huMAb2-3-SPDB-DM4 je bio veoma aktivan na 10 mg/kg sa ΔT/ΔC od 7 % (p < 0,0001 u poređenju sa kontrolom), aktivan na 5 mg/kg sa ΔT/ΔC od 36 % (p = 0,0281 u poređenju sa kontrolom) i neaktivan na 2,5 mg/kg.
Tabela 21: Procena anti-tumorske aktivnosti huMAb2-3-SPDB-DM4 konjugata protiv primarnog STO-IND-006 stomačnog adenokarcinoma kod SCID ženskih miševa
1
Primer 7.5: in vivo efikasnost protiv primarnih LUN-NIC-0014 tumora pluća implantiranih s. c. kod ženskih SCID miševa
Materijal i postupak
[0425] Humanizovan konjugat huMAb2-3-SPDB-DM4 je procenjen na 3-doznim nivoima protiv merljivih primarnih LUN-NIC-0014 tumora pluća implantiranih s.c. kod ženskih SCID miševa. Kontrolne grupe su ostavljene bez tretmana. Doze konjugata su date u mg/kg.
Primenjen je na 10, 5 i 2,5 mg/kg putem intravenske (IV) bolus injekcije, na dan 29 nakon implantacije tumora.
[0426] Procene toksičnosti i efikasnosti su obavljene kako je dato u primeru 5.
Rezultati
[0427] Koristeći jedan raspored primene na 2,5, 5 i 10 mg/kg, huMAb2-3-SPDB-DM4 nije indukovao toksičnost.
[0428] Kako je prikazano na Slici 18 i u Tabeli 22, huMAb2-3-SPDB-DM4 je bio visoko aktivan na 10 i 5 mg/kg sa ΔT/ΔC inferiornim do 0 % (p < 0,0001 u poređenju sa kontrolom) i regresijom tumora od 67 i 57% respektivno i aktivan na 2,5 mg/kg sa ΔT/ΔC od 12% (p = 0,0363 u poređenju sa kontrolom).
11
Tabela 22 : Procena anti-tumorske aktivnosti huMAb2-3-SPDB-DM4 konjugata protiv primarnog ljudskog LUN-NIC-0014 adenokarcinoma pluća kod SCID ženskih miševa
Primer 7.6: in vivo efikasnost protiv primarnih CR-IGR-034P tumora debelog creva implantiranih s.c. kod ženskih SCID miševa
Materijal i postupak
[0429] Tri konjugata, konstituisana od humanizovanog huMAb2-3 konjugovanog za DM4 kroz dva različita veznika (SPDB i sulfo-SPDB), procenjena su na 2 dozna nivoa protiv merljivih primarnih CR-IGR-034P tumora debelog creva implantiranih s.c. kod ženskih SCID miševa. Kontrolne grupe su ostavljene bez tretmana. Doze konjugata su date umg/kg. One su primenjene na 5 i 2,5 mg/kg putem intravenske (IV) bolus injekcije, na dan 19 nakon implantacije tumora.
[0430] Procene toksičnosti i efikasnosti su obavljene kako je dato u primeru 5.
Rezultati
[0431] Koristeći jedan raspored primene na 2,5 i 5 mg/kg, huMAb2-3-SPDB-DM4 i huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 nije indukovao toksičnost.
[0432] Kako je prikazano na Slici 19 i u Tabeli 23, huMAb2-3-SPDB-DM4 je bio aktivan na 5 i 2,5 mg/kg sa ΔT/ΔC of12% i 40%, respektivno (p < 0,0001 u poređenju sa kontrolom), huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 je bio visoko aktivan na 5 mg/kg sa ΔT/ΔC inferiornim do 0% (p < 0,0001 u poređenju sa kontrolom) i regresijom tumora od 12% i aktivan na 2,5 mg/kg sa ΔT/ΔC od 1 % (p < 0,0001 u poređenju sa kontrolom).
Tabela 23 : Procena anti-tumorske aktivnosti huMAb2-3-SPDB-DM4 i huMAb2-3-sulfo-SPDB-DM4 konjugata protiv primarnog CR-IGR-034P ljudskog adenokarcinoma debelog creva kod SCID ženskih miševa
Primer 8: Razvoj imunohistohemijskog (IHC) protokola posvećen detektovanju ljudskog i majmunskog CEACAM5 proteina u formalinom fiksiranim i parafinom obloženim (FFPE) tkivima.
Materijali i postupci
Tkiva
[0433] Mikroaranžiranje FFPE tkiva (TMA, Tabela 24) je korišćeno kao izvor ljudskih (tumorskih i netumorskih), kao i makaki (normalnih) tkiva.
Tabela 24: Mikroaranžiranje formalinom fiksiranih i parafinom obloženih tkiva koja su korišćena kao izvori tkiva
11
11 Antitela
[0434] MAb2 je upotrebljen kao primarno mišje anti-ljudsko CEACAM5 monoklonsko antitelo. Biotin-konjugovano kozije anti-mišje IgG1 (γ1 specifično za lanac) (reference 1070-08, batch L4309-X761, Southern Biotech, USA) je korišćeno kao sekundarno antitelo.
Imunobojenje
[0435] Postupak oživljavanja antigena je primenjen sa Cell Conditioning 1 (CC1) puferom na 95°C tokom 8 min i zatim na 100°C tokom 28 min. Nakon koraka endogenog blokiranja biotina, pločice su inkubirane sa primarnim antiantitelom razblaženim u fosfatno puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS) na 5 µg/mL tokom 2 časa na 24°C. Sekundarno biotinkonjugovano kozje anti-mišje antitelo je inkubirano na 24°C tokom 32 minuta na 0,5 µg/mL. Imunobojenje je urađeno sa 3,3-diaminobenzidin tetrahidrohloridom (DAB) od DABMap™ hromogenog kompleta za detektovanje (760-124, Ventana Medical Systems, Inc, USA) prema preporukama proizvođača. Korak kontrabojenja je urađen hematoksilinom (760-2037, Ventana Medical Systems, Inc, USA) i primenjen je plavi reagens (760-2037, Ventana Medical Systems, Inc, USA). Obojene pločice su dehidrirane i obložene sa cytoseal XYL (8312-4, Richard-Allan Scientific, USA).
IHC bodovanje
[0436] Imunoobojene pločice su skenirane pomoću ScanScope XT sistema (Aperio Technologies, Vista, CA). Digitalizovane slike su snimljene koristeći ImageScope softver (verzija 10.2.2.2319, Aperio Technologies) pri x20 uvećanju.
[0437] Procena bojenja uključila je histološko mesto reaktivnosti, glavni tip reaktivnih ćelija, intenzitet bojenja i učestalost bojenja ćelija. Negativni Uzorci su zabeleženi kao 0+. Pozitivni uzorci bodovani sa intenzitetom skale od 1+ do 4+. Rasponi intenziteta su opisani kao slab ]0;2+[, umeren [2+;3+[ i jak [3+;4+]. Učestalost ćelija je procenat imunoobojenih ćelija i procenjen je histološkim posmatranjem kao medijana uzorka. Učestalost ćelija je raspoređena u 5 kategorija proporcionalnog rezultata: 1 (0-5%), 2 (6-25%), 3 (26-50%), 4 (51-75%) i 5 (76-100% ).
[0438] Za tumore, globalni rezultat eksprimiranja je prilagođen od Allred rezultata (AS) (Mohsin S, Weiss H, Havighurst T, Clark GM, Berardo M, Roanh LD, et al. Progesterone receptor by immunohistochemistry and clinical outcome in breast cancer: a validation study.
11
Mod. Pathol.2004; 17:1545-1554). Ovaj AS je dobijen dodavanjem intenziteta i proporcionalnog rezultata kako bi se dobila ukupna ocenu koja se kretala od 0-9. AS je dat kao procenat maksimalnog globalnog rezultata i kretao se u 5 kategorija: veoma nizak (0-25%), slab (26-50%), umeren (51-75%), i visok (76-100% ). Učestalost je definisana kao procenat pozitivnih slučajeva za indikaciju
Opisna statistička analiza
[0439] Opisne statistike su izračunate sa Microsoft Excel 2003 softverom. Za svaku indikaciju, opisani su broj slučajeva, broj pozitivnih slučajeva, rasprostranjenost, medijana intenziteta rezultata, učestalost medijana, srednji Allred rezultat, opseg intenziteta, opseg učestalosti i opseg Allred rezultata.
Primer 8.1: Upotreba anti-CEACAM5 monoklonskog antitela za procenu CEACAM5 proteina u FFPE ljudskim tumorima uz pomoć imunohistohemije (IHC)
[0440] Veliki panel ljudskih tumora je ispitivan korišćenjem komercijalnih pločica sa aranžiranim tkivom (FFPE format). Eksprimiranje CEACAM5 proteina je locirano u membrani /citoplazmi ćelija tumora (Slika 1C, D). Neka bojenja membrane su polarizovana na apeksnim polovima ćelija u više diferenciranim tumorima. Za CEACAM5 protein je utvrđeno da je eksprimiran u:
• 89% slučajeva adenokarcinoma debelog creva(194/219, intenzitet 2-2,5+, učestalost 53-59%, AS 60-66%)
• 49% slučajeva adenokarcinoma stomaka (95/195, intenzitet 2,5+, učestalost 53%, AS 62%)
• 41% slučajeva adenokarcinoma pluća(24/58, intenzitet 1,8-2+, učestalost 50-53%, AS 54-58%)
• 79% slučajeva skvamoznih karcinoma grlića materice (11/14, intenzitet 2+, učestalost 22%, AS 46%)
• 53% slučajeva adenokarcinoma pankreasa (18/34, intenzitet 2+, učestalost 23%, AS 42%)
• 37% slučajeva karcinoma skvamoznih ćelija jednjaka (23/62, intenzitet 2+, učestalost 16%, AS 38%)
• 4% slučajeva karcinoma jajnika (3/77, intenzitet 2+, učestalost 43%, AS 54%)
11
• 11% slučajeva karcinoma štitne žlezde (2/18, intenzitet 1,5+, učestalost 63%, AS 56%)
• 25% slučajeva karcinoma bešike (5/20, intenzitet 1,5+, učestalost 61%, AS 56%)
• 7% slučajeva adenokarcinoma endometrijuma (1/14, intenzitet 2+, učestalost 50%, AS 56%)
• 11% slučajeva karcinoma dojke (2/18, intenzitet 1,5+, učestalost 53%, AS 50%)
• 53% slučajeva holangiokarcinoma (2/6, intenzitet 1,5+, učestalost 75%, AS 50%)
• 53% slučajeva karcinoma skvamoznih ćelija pluća (31/148, intenzitet 1,5+, učestalost 22%, AS 39%)
• 8% slučajeva karcinoma prostate (1/13, intenzitet 2+, učestalost 50%, AS 44%)
• 25% slučajeva skvamoznih karcinoma kože (2/8, intenzitet 1,5+, učestalost 23%, AS 39%)
Primer 8.2: Unakrsna reaktivnost u tkivu anti-CEACAM5 monoklonskog antitela kod makaki majmuna (Macaca fascicularis) i poređenje sa ljudskim obrascem eksprimiranja [0441] Vanćelijski protein domen CEACAM5 iz ljudskog (h) ili makaki majmunskog (c) porekla je pripremljen prolaznim eksprimiranjem u HEK293 ćelijama bubrega ljudskog embriona sa CEACAM5 cDNK plazmidom (primer 1, Tabela 1). Ćelijske pelete su fiksirane u 10% formalinu (Sigma Aldrich, USA) tokom 16 sati, i obložene parafinom kao komad tkiva prema standardoj histološkoj proceduri.
[0442] Komercijalni TMA su korišćeni kao izvor ljudskog i majmunskog normalnog tkiva (Tabela 21).
[0443] Unakrsna reaktivnost od Mab2 je prikazana imunobojenjem u ljudskim i majmunskim CEACAM5 transficiranim ćelijama (lokalizacija membrane i citoplazme).
[0444] U makaki normalnim tkivima, eksprimiranje CEACAM5 proteina je pronađeno u kolonama upijajućih epitelnih ćelija (2/3 pozitivnih slučajeva, medijana intenziteta 1.5+, srednja učestalost 55%).
[0445] Kod ljudskih netumorskih tkiva, CEACAM5 eksprimiranje je takođe primećeno u kolonama upijajućih epitelnih ćelija (62/64 pozitivnih slučajeva, medijana intenziteta 2+,
11
srednja učestalost 0%). U ljudskim tkivima, CEACAM5 eksprimiranje je primećeno u manjoj meri u epitelnim ćelijama jednjaka, epitelnim ćelijama glave i vrata, stomačnim želudačnim epitelnim ćelijama i epitelnim ćelijama grlića materice.
Primer 9: Antitelo lek konjugat (varijanta)
AntiCEACAM5 huMAb2-3-sulfoSPDB-DM4
Analitički podaci:
[0446]
MW(Ab) = 147417 g/mol ; MW(DM4) = 780,38 g/mol
ε280nm(Ab) = 201400 ; ε252nm(Ab) = 71451
ε280nm(DM4) = 5180 ; ε252nm(DM4) = 26159
[0447] Pod mešanjem, na RT, 7,0 ml rastvora antiCEACAM5 huMAb2-3 (C = 5,32 mg/ml u PBS pH = 7,4 puferu) uvedeni su u posudu, što je praćeno sa 1,6 ml DMA i 168,4 µl nitrosulfoSPDB veznik (opisano u WO2009134977) rastvora (10 ekvivalenata - 15 mM rastvor u DMA). Rastvor je sporo mešan na RT tokom 3 sata. Dodatna zapremina 3,4 µl nitrosulfoSPDB veznik rastvora (2,0 ekvivalenata - 15 mM rastvor u DMA) je dodata. Nakon 2 sata na RT pod mešanjem magnetnom mešalicom, 2,90 ml PBS pH 7,4 pufera, 0,407 ml DMA i 0,322 ml DM4 rastvora (15 mM rastvor u DMA) su dodati jedan za drugim. Nakon 1 sata na RT, i 16 sati na 5°C, sirova reaktivna smeša je pročišćena na HiPrep 26/10 koloni za desaliranje (Sephadex G25, GE Healthcare), pre-kondicionirana sa 1CV NaOH 1M, 2 CV vode i 2 CV histidin (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferom. Konjugat je eluiran sa histidin (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferom, i monomerni fragmenti konjugata su prikupljeni i filtrirani na 0,22µm filteru.
[0448] 19 ml antiCEACAM5 huMAb2-3-sulfoSPDB-DM4 konjugata (c=1,51 mg/ml) je stoga dobijeno kao bezbojni čist rastvor. Konjugat je zatim analiziran za konačno postavljanje leka i monomersku čistoću : DAR (UV)= 3,4 ; DAR (SEC)= 3,3 ; monomerska čistoća= 99,8% ; HRMS podaci : pogledati Sliku 20.
AntiCEACAM5 huMAb2-3-SMCC-DM1
Analitički podaci:
[0449]
MW(Ab) = 147417 g/mol ; MW(DM1) = 738 g/mol
11
ε280nm(Ab) = 201400; ε252nm(Ab) = 71451
ε280nm(DM1) = 5180 ; ε252nm(DM1) = 26159
[0450] Pod mešanjem, na RT, 11,3 ml rastvora antiCEACAM5 huMAb2-3 (C = 3,47 mg/ml u puferu A pH = 6,5) uvedeni su u posudu, što je praćeno sa 0,387 ml DMA i 178 µl of SMCC veznik rastvora (10 ekvivalenata - 15 mM rastvor u DMA). Rastvor je sporo mešan na RT tokom 2 sata. Sirova reakciona smeša je razmenjena puferom na HiPrep 26/10 koloni za desaliranje (Sephadex G25, GE Healthcare), pre-kondicionirana sa 2CV NaOH 0,2M, 5 CV vode i 5 CV citrat pufera (pH 5,5). Konjugat je eluiran sa citrat puferom (pH 5,5) i monomerni fragmenti konjugata su prikupljeni i filtrirani na 0,22µm filteru. Ovom rastvoru su jedan za drugim dodati, pod mešanjem, na RT, 0,476 ml DMA i 0,124 ml DM1 rastvor (15 mM rastvor u DMA). Nakon 2 sata na RT, sirova reakciona smeša je pročišćena dvaput na HiPrep 26/10 koloni za desaliranje (Sephadex G25, GE Healthcare), pre-kondicionirana sa 2CV NaOH 0,2M, 5 CV vode i 5 CV histidin (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferom. Konjugat je eluiran sa histidin (10mM), glicin (130mM), sukroza (5%), pH=5,5 puferom, i monomerni fragmenti konjugata su prikupljeni i filtrirani na 0,22µm filteru.
[0451] 9,5 ml antiCEACAM5 huMAb2-3-SMCC-DM1 (c=1,73 mg/ml) je stoga dobijeno kao bezbojni čist rastvor. Konjugat je zatim analiziran za konačno postavljanje leka i monomersku čistoću: DAR (UV)= 2,7 ; DAR (SEC)= 2,9 ; monomerska čistoća= 99,6% ; HRMS podaci : pogledati Sliku 21.
Primer 10: Karakterisanje epitopa i paratopa CEACAM5-A3B3 u kompleksu sa MAb2 VH1aVL1c Fab koristeći vodonik-deuterijum razmenu povezanu sa masenom spektrometrijom (MS HDX)
Primer 10.1: Princip HDX MS
[0452] Amid vodonik-deuterijum razmena (HDX) povezana sa masenom spektrometrijom (MS) omogućava identifikaciju regija proteina impliciranim u konformacionim promenama ili interakcijama. Ova tehnika omogućava specifičnije identifikovanje regioja prikazivanja antigena, posle inkubacije u deuterizovanom puferu i proteolize, smanjenje ugrađenog deuterijuma u svom obliku vezanog za antitelo u poređenju sa svojim slobodnim oblikom.
12
[0453] Epitop pripada ovim regijama, a njegova razmena je usporena vezivanjem za antitelo. Nedavni članak detaljno opisuje različite korake da se karakterišu epitopi koristeći ovaj pristup (Zhang, Q., Willison, L. N., Tripathi, P., Sathe, S. K., Roux, K. H., Emmett, M. R., Blakney, G. T., Zhang, H. M. & Marshall, A. G. (2011). Analytical Chemistry 83, 7129-7136.).
Primer 10.2: Materijali
[0454] Varijabilni domeni kodirajućih sekvenci MAb2_VH1aVL1c (SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 29) su klonirani u sisarski vektor eksprimiranja u fuziji sa kodirajućim sekvencama ljudskog CH1 domena (kao što se pronalazi kod Fab izvedenog iz papain cepanog IgG1), nakon čega sledi heksa-histidin obeležje, ili ljudski Ckappa konstantni domen, respektivno. Serija MAb2_VH1aVL1c Fab je proizvedena u suspenzijom kultivisanim HEK293-FS™ ćelijama putrem tranzitne transfekcije dva eksprimirajuća plazmida, koji kodiraju dva lanca, u kompleksu sa 293fectin™ (Invitrogen). Supernatant kulture koji sadrži izlučeni protein je sakupljen sedam dana posle transfekcije, centrifugiran i filtriran na 0:22 µm membrani. Fab je prečišćen pomoću afinitetne hromatografije an IMAC (HisTrap, GE Healthcare) korišćenjem imidazol gradijenta u PBS. Zatim, grupa fragmenata koje sadrže Fab je prečišćena hromatografijom isključenja veličine (Superdex 200, GE Healthcare) uravnoteženo, sa PBS.
[0455] His-obeleženi hCEACAM5 A3B3-domen (SEQ ID NO: 67) je proizveden sa HEK293-FS™ ćelijama kultivisanim u boci pomoću tranzitne transfekcije eksprimirajućeg plazmida. Kifunensin (inhibitor skraćenja procesa glikozilacije) je dodat svaki dan.
Supernatant kulture koji sadrži izlučeni protein je sakupljen sedam dana posle transfekcije, centrifugiran i filtriran na 0:22 µm membrani. EndoH je dodat u supernatant do 625 u/ml, zatim su inkubirane tokom 3 sata na 37°C. Deglikozilovan hCEACAM5-A3B3 je prečišćen pomoću afinitetne hromatografije na IMAC (HisTrap, GE Healthcare) korišćenjem gradijenta imidazola u PBS. Zatim, prikupljeni fragmenti koje sadrže deglikozilovan hCEACAM5-A3B3 su prečišćeni hromatografijom isključenja veličine (Superdex 200, GE Healthcare) uravnoteženo, sa PBS. Analiza masene spektrometrije deglikozilovanog hCEACAM5-A3B3 pokazala dva vrste (22485 i 22278 Da), što ukazuje da protein poseduje 7 ili 8 N-acetilglukozaminske ostatke (GlcNAc).
[0456] Kako bi se izgradio kompleks, oba proteina su prikupljena sa viškom od 1,5 molova deglikozilovanog hCEACAM5-A3B3 za jedan mol Fa-ab. Višak je uklonjen hromatografijom isključenja veličine na Superdex 200 uravnoteženom sa fosfatnim fiziološkim rastvorom fosfatnog pufera. Frakcije koje odgovaraju kompleksnim Fab sa antigenom su korišćene za ispitivanje razmene deuterijuma.
Primer 10.3: Postupci
[0457] Eksperimenti razmene vodonik/deuterijum (HDX) su potpuno automatizovani korišćenjem PAL autosamplera (CTC Analytics). To je omogućilo početak i neutralisanje razmene, kontrolu temperature proteolize (4°C), ubrizgavanje deuterizovanih peptida, upravljanje ubrizgavanja i pranja ventilima i aktiviranje pribavljanja masenog spektrometra i HPLC pumpi. Peltierom ohlađena kutija (4°C) sadrži dva Rheodyne automatizovana ventila (6-port za ubrizgavanje i 10-port za pranje), patronu za desalinizaciju (peptid Micro Trap sa Bruker-Michrom) i HPLC kolonu (Poroshell 120 EC-C18, 1x 50 mm, 2.7 µM od Agilent Technologies). Deuterizacija je inicirana petostrukim razblaživanjem CEACAM5, monoklonskog antitela ili kompleksa sa PBS u D2O.2M GndHCl, 0,8 M TCEP, 1 M glicin je korišćen da se neutrališe povratna razmena i redukuju disulfidni mostovi tokom 2 min na 4°C.
[0458] Proteini su digestovani sa pepsin i nepentezin proteazama, i peptidi su desaltirani korišćenjem Agilent Technologies HPLC pumpe sa TFA 0,03% u vodi na 100 µl/min. Peptidi su zatim razdvojeni korišćenjem druge Agilent Technologies HPLC pumpe sa 15-100% B gradijentom tokom 20 min (A: TFA 0,03% u vodi; B: acetonitril 90%, TFA 0,03% u vodi). Mase peptida su merene korišćenjem elektrosprej-TOF masenog spektrometra (Agilent 6210).
[0459] Peptidi su identifikovani uz pomoć tandem MS (MSMS), korišćenjem Bruker APEX-Q FTMS (9,4 T) Bruker 12 T SolariX-
[0460] Data Analysis (Bruker) i Mass Hunter (Agilent Technologies) softveri su korišćeni za dobijanje podataka. Data Analysis i Mascot (Matrix Science) su korišćeni za obradu MSMS podataka. Mass Hunter i HD Examiner (Sierra Analytics) softveri su korišćeni za HDX obradu podataka.
[0461] HDX eksperimenti su ponovljeni najmanje tri puta.
Primer 10.4: Rezultati
Identifikacija i izbor peptida
[0462] Disulfidni mostovi su ostali netaknuti tokom deuterizacije kako bi zadržali strukturne informacije povezane sa njima. Kako bi se favorizovali proteoliza i identifikacija peptida, mostovi su redukovani sa TCEP posle koraka neutralisanja pri niskom pH i niskoj temperaturi. Koristeći MSMS nakon digestije CEACAM5-Fab kompleksa, bilo je moguće identifikovati veliki broj peptida koji proizilaze iz tri proteinska lanca. Nakon HDX eksperimenata, izabrani su samo oni koji daju kvalitetne signale: 25, 30 i 20 peptida od CEACAM5-A3-B3 antigena MAb2_VH1aVL1c Fab teškog lanca i MAb2_VH1aVL1c lakog lanca, respektivno. Ovi peptidi pokrivaju 89%, 77% i 68% od CEACAM5-A3-B3 antigena, sekvenci MAb2_VH1aVL1c Fab teškog lanca i MAb2_VH1aVL1c lakog lanca, respektivno (Tabela 25). Nepokrivene regije Fab lanaca su uglavnom u njihovim C-terminalnim delovima.
Tabela 25: Pokrivenost sekvenci sa deuterisanim peptidima
[0463] Svi 8 asparagin ostaci koji su potencijalna mesta glikozilacije su identifikovani u nekoliko peptida sa GlcNAc preostalim od endo H deglikozilacije. Posebno, N114 je pronađen u peptidu 108-115. U prvim eksperimentima (koji nisu korišćeni za HDX), N166 je
12
pronađen u oba oblika (sa i bez GIcNAc). To može da objasni heterogenost uočenu u masenom spektru CEACAM5-A3B3 posle deglikozilacijom, koji odgovara 7 i 8 GlcNAc.
Identifikacija epitopa i paratopa
[0464] Slobodni antigen, slobodni Fab i njihov kompleks su deuterizovani trajanju od 2 min ili 20 min na 4°C ili 20 minuta na sobnoj temperaturi (26°C). Uzimajući u obzir kinetiku razmene amid vodonika sa temperaturom (oko trostruko povećanje razmene na 10°C) poslednji uslov je ekvivalentan 200 min deuterizaciji na 4°C.
Epitop
[0465] Kinetike ugradnje deuterijuma za 25 izabranih peptida CEACAM5-A3B3 su poređene kada je antigen deuterizovan u slobodnom obliku, i kada je bio u kompleksu sa Fab. Nekoliko peptida nije pokazalo nikakvu značajnu HDX razliku (ΔHDX) između dva stanja. Nasuprot tome, neki od njih (108-115 i 128-143) su pokazali značajan ΔHDX. Druga regija je pokrivena sa 5 različitih peptida: 128-142, 128-143, 130-142, 130-143 i 140-143 pokazuju 13-15 ± 2% (do 1,6 ± 0,2 D) ΔHDX posle 2 minuta deuterizacije.
[0466] U poređenju 128-142 sa 130-142 i 128-143 sa 130-143, nismo izmerili značajniju promenu ΔHDX ni u jednom od slučajeva (1,3-1,4 D za prva dva peptida i 1,6 za druga dva, posle 2 minuta deuterizacije), što znači da amidi V129 i R130 verovatno nisu uključeni u epitop. Nasuprot tome, u poređenju 128-142 sa 128-143 i 130-142 sa 130-143, izmerili smo malu promenu ΔHDX (oko 0,2 D), što znači da je amid F143 uključen. ΔHDX u peptidu 140-143 (oko 0,3 D) ukazuje da bi amidi V141 ili L142 takođe mogli da budu uključeni. Unutar 9 amida od I131 do K140, nekoliko njih je uključeno u epitop (oko 1 ΔHDX podeljeno u proseku).
[0467] Ove razlike ugrađenog deuterijuma ukazuju da epitop posebno pripada u regijama (amidima), tj. peptidima iz sekvenci SGANLNL (SEQ ID NO: 76) i INGIPKKHTKVLF (SEQ ID NO: 77).
Paratopi
[0468] Kinetike ugradnje deuterijuma za 30 odabranih peptida teškog lanca Fab su poređene kada je Fab deuterizovan u slobodnom obliku i kada je u kompleksu sa antigenom. Skoro nijedan od peptida nije pokazao nikakav značajan ΔHDX između oba stanja. Samo jedan peptid (100-109) je dao ΔHDX posle 200 minuta deuterizacije: 11 ± 2% (0,7 ± 0,2 D). Regije (amidi) 101-109 od MAb2_VH1aVL1c Fab teškog lanca su implicirane u paratopu.
[0469] Kinetika ugradnje deuterijuma za 20 odabranih peptida Fab lakog lanca su upoređene kada je Fab deuterizovan u slobodnom obliku i kada je u kompleksu sa antigenom. Skoro nijedan od peptida nije pokazao nikakav značajan ΔHDX između oba stanja. Samo dva peptida (47-54 i 87-104) su pokazala razliku. Nakon 20 minuta deuterizacije, bilo je 10 ± 2% (0,6 ± 0,2 D) za prvi i 5 ± 2% (0,9 ± 0,2 D) za drugi, respektivno. Regije 48-54 i 88-104 od MAb2_VH1aVL1c lakog lanca su uključeni u paratopu.
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
��
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
�
�
11
��
�
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
��
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
��
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2

Claims (22)

Patentni zahtevi
1. Antitelo koje sadrži teški lanac i laki lanac naznačeno time što varijabilni domen teškog lanca sadrži sekvencu SEQ ID NO: 5, ili sekvencu koja je barem 85% identična sa njom, CDR1-H od sekvence SEQ ID NO:7, CDR2-H od sekvence SEQ ID NO:8, i CDR3-H od sekvence SEQ ID NO:9, te varijabilni domen lakog lanca sadrži sekvencu SEQ ID NO: 29, ili sekvencu koja je barem 85% identična sa njom, CDR1-L od sekvence SEQ ID NO:10, CDR2-L od sekvence NTR i CDR3-L od sekvence SEQ ID NO:12.
2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 naznačeno time što varijabilni domen teškog lanca sadrži sekvencu SEQ ID NO: 5, ili sekvencu koja je barem 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa njom.
3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 naznačeno time što varijabilni domen lakog lanca sadrži sekvencu SEQ ID NO: 29, ili sekvencu koja je barem 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa njom.
4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 naznačeno time što antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:87, ili sekvencu koja je barem 85% identična sa njom, te laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:88, ili sekvencu koja je barem 85% identična sa njom.
5. Izolirana nukleinska kiselina naznačena time što obuhvata sekvencu koja kodira antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4.
6. Ćelija domaćin naznačena time što je transformisana nukleinskom kiselinom prema zahtevu 5.
7. Imunokonjugat naznačen time što sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4 konjugovano ili vezano na najmanje jedan agens za inhibiciju rasta.
8. Imunokonjugat prema zahtevu 7, naznačen time što je navedeni agens za inhibiciju rasta citotoksični agens ili radioaktivni izotop.
2
9. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 7 ili 8, naznačen time što je navedeni agens za inhibiciju rasta izabran iz grupe koja se sastoji od hemoterapijskih agenasa, enzima, antibiotika i toksina kao što su toksini malih molekula ili enzimatski aktivni toksini, taksoidi, vinke, taksani, majtanzinoid ili analozi majtanzinoida, tomaimicin ili derivati pirolobenzodiazepina, derivati kriptoficina, derivati leptomicina, analozi auristatina ili dolastatina, prolekovi, inhibitori topoizomeraze II, agensi za alkilovanje DNK, anti-tubulin agensi i CC-1065 ili analozi CC-1065.
10. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 7 do 9, naznačen time što je navedeni agens za inhibiciju rasta (N2'-deacetil-N2'-(3-merkapto-1-oksopropil)-majtanzin) DM1 ili N2'-deacetil-N-2'(4-metil-4-merkapto-1-oksopentil)-majtanzin (DM4).
11. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 7 do 10, naznačen time što je antitelo kovalentno vezano, putem veznika za cepanje ili veznika koji nije za cepanje, za barem jedan agens za inhibiciju rasta.
12. Imunokonjugat prema patentnom zahtevu 11, naznačen time što je navedeni veznik izabran iz grupe koja se sastoji od N-sukcinimidil piridilditiobutirata (SPDB), 4-(piridin-2-ildisulfanil)-2-sulfo-buterne kiseline (sulfo-SPDB), i sukcinimidil (N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilata (SMCC).
13. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 7 do 11 naznačen time što je antitelo kovalentno vezano putem N-sukcinimidil piridilditiobutirata (SPDB) na N2'-deacetil-N-2'(4-metil-4-merkapto-1-oksopentil)-majtanzin (DM4).
14. Imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 7 do 13 naznačen time što antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:87 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID NO:88 i kovalentno je vezano putem N-sukcinimidil piridilditiobutirata (SPDB) na N2'-deacetil-N-2'(4-metil-4-merkapto-1-oksopentil)-majtanzin (DM4).
15. Farmaceutski sastav naznačen time što obuhvata antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4 ili imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 7 do 14, te farmaceutski prihvatljiv nosač.
16. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4, ili imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 7 do 14, ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 15, naznačen time što je za upotrebu za tretman kancera.
17. Antitelo ili imunokonjugat prema patentnom zahtevu 16 naznačen time što kancer je kancer debelog creva, kancer stomaka, gastrični kancer ili kancer pluća.
18. Postupak za proizvodnju antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koji postupak obuhvata korake koji se sastoje od: (i) kultivisanja transformisane ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 6; (ii) eksprimiranje navedenog antitela ili polipeptida; i (iii) izdvajanje eksprimiranog antitela ili polipeptida.
19. Postupak prema patentnom zahtevu 18 naznačen time što je navedeno antitelo prikladno izvojeno iz medijuma za kultivisanje konvencionalnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina.
20. Postupak za proizvodnju imunokonjugata ili imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 7 do 14 naznačen time što obuhvata korake (i) dovođenje u kontakt po izboru puferiranog vodenog rastvora antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 4 s rastvorima poveznice i citotoksičnog spoja, i (ii) zatim izborno izdvajanje konjugata koji je nastao u (i) iz nereagovanog antitela.
21. Postupak za proizvodnju imunokonjugata ili imunokonjugat prema patentnom zahtevu 20 naznačen time što se posle koraka (i) ili (ii), rastvor koji sadrži konjugat može podvravati dodatnom koraku (iii) hromatografije, ultrafiltracije i/ili diafiltracije.
22. Postupak za pripremu farmaceutskog sastava koji sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4 ili dobivenog postupkom prema patentnim zahtevima 18 ili 19, ili imunokonjugat prema bilo kom od zahteva 7 do 14 ili dobivenog postupkom prema patentnim zahtevima 20 ili 21, naznačen time što je delotvorna količina navedenog antitela ili navedenog imunokonjugata rastvorena ili dispergovana u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili vodenom medijumu.
2
RS20200296A 2012-11-20 2013-11-20 Anti-ceacam5 antitela i njihova primena RS60043B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12306444 2012-11-20
EP17157890.9A EP3199552B1 (en) 2012-11-20 2013-11-20 Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60043B1 true RS60043B1 (sr) 2020-04-30

Family

ID=47257727

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170498A RS55987B1 (sr) 2012-11-20 2013-11-20 Anti-ceacam5 antitela i njihova primena
RS20200296A RS60043B1 (sr) 2012-11-20 2013-11-20 Anti-ceacam5 antitela i njihova primena

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170498A RS55987B1 (sr) 2012-11-20 2013-11-20 Anti-ceacam5 antitela i njihova primena

Country Status (38)

Country Link
US (4) US9617345B2 (sr)
EP (3) EP2922875B1 (sr)
JP (1) JP6324399B2 (sr)
KR (4) KR102661801B1 (sr)
CN (2) CN104918958B (sr)
AR (1) AR093557A1 (sr)
AU (2) AU2013349733C1 (sr)
BR (1) BR112015010993B1 (sr)
CA (2) CA3207769A1 (sr)
CL (1) CL2015001321A1 (sr)
CR (1) CR20150258A (sr)
CY (1) CY1119219T1 (sr)
DK (2) DK3199552T3 (sr)
DO (1) DOP2015000110A (sr)
EA (1) EA039377B1 (sr)
EC (1) ECSP15025845A (sr)
ES (2) ES2778823T3 (sr)
HR (2) HRP20170743T1 (sr)
HU (1) HUE033369T2 (sr)
IL (1) IL238559B (sr)
LT (2) LT2922875T (sr)
MA (1) MA38194B1 (sr)
MX (1) MX358321B (sr)
MY (1) MY171100A (sr)
NZ (1) NZ708528A (sr)
PE (1) PE20151180A1 (sr)
PH (1) PH12015501092B1 (sr)
PL (2) PL3199552T3 (sr)
PT (2) PT2922875T (sr)
RS (2) RS55987B1 (sr)
SG (1) SG11201503285TA (sr)
SI (2) SI3199552T1 (sr)
TN (1) TN2015000177A1 (sr)
TW (2) TWI664192B (sr)
UA (1) UA120247C2 (sr)
UY (1) UY35147A (sr)
WO (1) WO2014079886A1 (sr)
ZA (1) ZA201502959B (sr)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20200043A1 (ar) 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
HUE033369T2 (en) 2012-11-20 2017-11-28 Sanofi Sa Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
US9753036B2 (en) 2014-04-29 2017-09-05 Edp Biotech Corporation Methods and compositions for screening and detecting biomarkers
CN106999604B (zh) * 2014-09-02 2021-08-03 伊缪诺金公司 用于配制抗体药物缀合物组合物的方法
EP3356410B1 (en) 2015-10-02 2021-10-20 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-ceaxcd3 t cell activating antigen binding molecules
JP6949030B2 (ja) 2016-01-08 2021-10-13 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｐｄ−１軸結合アンタゴニスト及び抗ｃｅａ／抗ｃｄ３二重特異性抗体を用いたｃｅａ陽性がんの治療方法
AU2017343377B2 (en) * 2016-10-10 2024-07-11 Agency For Science, Technology And Research Anti-CEACAM6 antibodies and methods of use
TWI780082B (zh) 2016-11-18 2022-10-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎抗人類ＭＵＣ１抗體Ｆａｂ片段
CN106749667B (zh) * 2016-12-04 2020-07-14 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种抗癌胚抗原的纳米抗体及其应用
CN108341876B (zh) * 2017-01-22 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用
CN106946989B (zh) * 2017-03-02 2020-02-18 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 抗cea抗原vhh结构域及含有其的双特异性抗体
TWI795415B (zh) 2017-07-07 2023-03-11 日商安斯泰來製藥股份有限公司 新穎的抗人類ＣＥＡＣＡＭ５抗體Ｆａｂ片段
PE20200613A1 (es) * 2017-07-11 2020-03-11 Pfizer Composiciones inmunogenicas
EP3502140A1 (en) 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
ES2958933T3 (es) 2018-03-13 2024-02-16 Zymeworks Bc Inc Conjugados de anticuerpo biparatópico anti-HER2-fármaco y métodos de uso
CA3096222A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Atyr Pharma, Inc. Compositions and methods comprising anti-nrp2 antibodies
US20210236548A1 (en) * 2018-04-20 2021-08-05 The Regents Of The University Of California Treatment of prostate cancer using chimeric antigen receptors
MX2020012351A (es) 2018-05-17 2021-01-29 Astellas Pharma Inc Complejo que tiene fragmento fab de anticuerpo anti-muc1 de humano, enlazador peptido y/o ligando.
EP3802599B1 (en) 2018-06-03 2023-12-20 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
TWI851577B (zh) 2018-06-07 2024-08-11 美商思進公司 喜樹鹼結合物
CN110684108B (zh) * 2018-07-06 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗MG7-Ag的单克隆抗体(CEA37)及其用途
CN110684107B (zh) * 2018-07-06 2021-03-23 中国人民解放军第四军医大学 抗MG7-Ag的单克隆抗体(MGd1)及其用途
US11518792B2 (en) 2018-08-30 2022-12-06 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
US11401324B2 (en) 2018-08-30 2022-08-02 HCW Biologics, Inc. Single-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CA3109361A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 HCW Biologics, Inc. Single-chain and multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CA3115747A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Astellas Pharma Inc. Pharmaceutical composition containing tagged site-antihuman antibody fab fragment complex
CN111487411B (zh) * 2019-01-29 2023-05-09 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 Ceacam1多肽的新应用
WO2020161214A1 (en) 2019-02-07 2020-08-13 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
EP3693023A1 (en) 2019-02-11 2020-08-12 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
BR112021021099A2 (pt) * 2019-04-23 2021-12-14 Sanofi Sa Formulações de anticorpos estáveis, de baixa viscosidade, e usos das mesmas
US20220235142A1 (en) * 2019-06-04 2022-07-28 Shanghai GenBase Biotechnology Co., Ltd. Anti-ceacam5 monoclonal antibody, preparation method thereof and use thereof
US11655302B2 (en) 2019-06-10 2023-05-23 Sanofi Anti-CD38 antibodies and formulations
AU2020291014B2 (en) 2019-06-13 2025-06-05 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aminobenzazepine compounds, immunoconjugates, and uses thereof
CN120924491A (zh) 2019-06-21 2025-11-11 免疫生物公司 多链嵌合多肽和其用途
JP7354306B2 (ja) 2019-06-27 2023-10-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 新規ｉｃｏｓ抗体及びそれらを含む腫瘍標的化抗原結合分子
CA3148694A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Romas Kudirka Aminoquinoline compounds, immunoconjugates, and uses thereof
CN114786776B (zh) 2019-09-18 2026-03-24 拉姆卡普生物阿尔法股份公司 针对ceacam5和cd3的双特异性抗体
JP2022549510A (ja) 2019-09-30 2022-11-25 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド アミド結合したアミノベンズアゼピン免疫複合体、及びその使用
CN114746120B (zh) 2019-10-03 2024-07-30 Atyr医药公司 包含抗nrp2抗体的组合物和方法
CA3155077A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Romas Kudirka Thienoazepine immunoconjugates, and uses thereof
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
CA3169243A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 HCW Biologics, Inc. Methods of activating regulatory t cells
WO2021163299A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 HCW Biologics, Inc. Chromatography resin and uses thereof
AU2021220870A1 (en) 2020-02-11 2022-08-04 Immunitybio, Inc. Methods of treating age-related and inflammatory diseases
US20230151088A1 (en) * 2020-04-24 2023-05-18 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates and folfox
WO2021214222A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates, trifluridine and tipiracil
AU2021261553A1 (en) 2020-04-24 2023-01-05 Sanofi Antitumor combinations containing anti-CEACAM5 antibody conjugates and FOLFIFI
WO2021214227A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates and cetuximab
CN115836087A (zh) 2020-04-29 2023-03-21 Hcw生物科技公司 抗cd26蛋白及其用途
CN115996756A (zh) 2020-05-08 2023-04-21 博尔特生物治疗药物有限公司 弹性蛋白酶底物肽连接子免疫缀合物及其用途
US12024545B2 (en) 2020-06-01 2024-07-02 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
JP2023527869A (ja) 2020-06-01 2023-06-30 エイチシーダブリュー バイオロジックス インコーポレイテッド 加齢関連障害の治療法
WO2021247003A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
CN111690061B (zh) * 2020-06-28 2022-08-23 中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心 人源化抗鼠疫耶尔森菌抗原f1的抗体及应用
CN113278074B (zh) * 2020-08-04 2022-03-29 中山大学附属第五医院 抗ceacam5纳米抗体
CN116234586A (zh) 2020-08-13 2023-06-06 博尔特生物治疗药物有限公司 吡唑并氮呯免疫缀合物及其用途
WO2022040454A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating mesothelin positive cancers
KR102859550B1 (ko) 2020-08-20 2025-09-16 에이투 바이오쎄라퓨틱스, 인크. Ceacam 양성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
KR20230062600A (ko) * 2020-09-04 2023-05-09 메르크 파텐트 게엠베하 항-ceacam5 항체 및 접합체 및 이의 용도
US12564642B2 (en) 2020-11-10 2026-03-03 Sanofi CEACAM5 antibody-drug conjugate formulation
WO2022116079A1 (zh) * 2020-12-03 2022-06-09 上海吉倍生物技术有限公司 一种抗ceacam5的人源化抗体及其制备方法和用途
CN116635084A (zh) 2020-12-11 2023-08-22 博尔特生物治疗药物有限公司 抗cea免疫缀合物和其用途
US20220195066A1 (en) 2020-12-11 2022-06-23 Bolt Biotherapeutics, Inc. Anti-cea immunoconjugates, and uses thereof
AU2021409465A1 (en) 2020-12-21 2023-08-03 Freenome Holdings, Inc. Markers for the early detection of colon cell proliferative disorders
CN112521509B (zh) * 2020-12-23 2022-07-08 姚雪英 一种抗ceacam5人源化抗体、其缀合物及其用途
EP4305069A4 (en) * 2021-03-08 2025-01-01 University of Pittsburgh - of the Commonwealth System of Higher Education MOLECULES THAT BIND TO CD66E POLYPEPTIDES
CN117940168A (zh) 2021-03-26 2024-04-26 博尔特生物治疗药物有限公司 2-氨基-4-甲酰胺-苯并氮杂䓬免疫缀合物及其用途
CA3212926A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Gary Brandt 2-amino-4-carboxamide-benzazepine immunoconjugates, and uses thereof
CA3219672A1 (en) * 2021-05-21 2022-11-24 Liang QU Anti-cea and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use
WO2022242681A1 (en) * 2021-05-21 2022-11-24 Beigene, Ltd. Anti-cea antibodies and methods of use
JP2024536382A (ja) 2021-10-07 2024-10-04 サノフイ イミダゾ［４，５－ｃ］キノリン－４－アミン化合物及びそのコンジュゲート、それらの調製並びにそれらの治療用途
WO2023081818A1 (en) * 2021-11-05 2023-05-11 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigens, and their uses
CA3237142A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates and anti-vegfr-2 antibodies
KR20240112348A (ko) 2021-12-02 2024-07-18 사노피 암 치료법에서 환자 선택을 위한 cea 검정
WO2023099682A1 (en) 2021-12-02 2023-06-08 Sanofi Ceacam5 adc–anti-pd1/pd-l1 combination therapy
US20250188170A1 (en) * 2022-02-25 2025-06-12 Atyr Pharma, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING ANTI-NRP2b ANTIBODIES
JP2025508939A (ja) 2022-03-02 2025-04-10 イミュニティーバイオ インコーポレイテッド 膵臓癌の治療方法
AR128745A1 (es) * 2022-03-09 2024-06-12 Merck Patent Gmbh Anticuerpos y conjugados anti-ceacam5 y usos de los mismos
IL315205A (en) 2022-03-23 2024-10-01 Synaffix Bv Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing carcinoembyronic antigen
WO2023201311A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptide for use in the treatment of treating neuroinflammatory disorder
KR20250046323A (ko) 2022-08-10 2025-04-02 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 Nkg2d, cd16 및 ceacam5에 결합하는 단백질
EP4642810A1 (en) * 2022-12-28 2025-11-05 Full-Life Technologies HK Limited Antibodies specifically binding to ceacam5
KR20250154496A (ko) 2023-03-01 2025-10-28 사노피 Ceacam5를 발현하는 신경내분비암을 치료하기 위한 항-ceacam5 면역접합체의 용도
EP4427763A1 (en) 2023-03-06 2024-09-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates, anti-vegfr-2 antibodies and anti-pd1/pd-l1 antibodies
CN117545780B (zh) * 2023-05-16 2025-12-30 成都优洛生物科技有限公司 抗lilrb1纳米抗体或其抗原结合片段、制备方法和用途
EP4720134A1 (en) * 2023-06-05 2026-04-08 Nona Biosciences (Suzhou) Co., Ltd. Anti-ceacam5/6 dual-binding antibodies
AU2024286132A1 (en) 2023-06-05 2026-01-22 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates, anti-pd1/pd-l1 antibodies and anti-ctla4 antibodies
CN121568941A (zh) 2023-08-04 2026-02-24 赛诺菲 咪唑并[4,5-d]哒嗪化合物及其缀合物、它们的制备和它们的治疗性应用
WO2025098480A1 (zh) * 2023-11-10 2025-05-15 信达生物制药(苏州)有限公司 抗dr5和ceacam5的双特异性抗体及其用途
WO2025137640A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
WO2025169012A1 (en) 2024-02-06 2025-08-14 Sanofi Methods of treating ceacam5-expressing cancers
TW202600608A (zh) * 2024-02-27 2026-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗ｃｅａｃａｍ５抗體及其用途
EP4658320A1 (en) 2024-02-27 2025-12-10 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibody drug conjugates
WO2025242098A1 (zh) * 2024-05-21 2025-11-27 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 针对ceacam5的抗体偶联药物及其用途
WO2026002995A1 (en) 2024-06-24 2026-01-02 Avacta Life Sciences Limited Target-specific fap-activated topoisomerase inhibitor conjugates and uses thereof
WO2026006689A2 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Firefly Bio, Inc. Bcl-xl degrader antibody conjugates and uses thereof
WO2026019161A1 (ko) * 2024-07-19 2026-01-22 주식회사 다안바이오테라퓨틱스 신규한 항-ceacam5 항체 및 그의 치료제로서의 용도
WO2026043906A1 (en) 2024-08-19 2026-02-26 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
US20260049118A1 (en) 2024-08-19 2026-02-19 HCW Biologics, Inc. Single-chain chimeric polypeptides and uses thereof

Family Cites Families (135)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US417A (en) 1837-09-28 Endless-ghain horse-power for driving iviaci-iii
US689A (en) 1838-04-13 Julius austin
US835A (en) 1838-07-12 X i i i x
US4496A (en) 1846-05-02 Machinery for
US144A (en) 1837-03-11 Improvement in scythe-snaths
US244A (en) 1837-06-30 Edward flint
US4301A (en) 1845-12-11 Ebenezbr barrows
US4791A (en) 1846-10-03 john g
US5204A (en) 1847-07-24 james cantelo
US4670A (en) 1846-07-28 Improvement in fish-hooks
US192A (en) 1837-05-15 Machine for cutting
US4640A (en) 1846-07-14 Book-lock
US1045773A (en) 1911-08-30 1912-11-26 John A Cole Quick-action electric switch.
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
JPS63501765A (ja) 1985-11-01 1988-07-21 インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング　インコ−ポレ−テッド 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途
AU597574B2 (en) 1986-03-07 1990-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Method for enhancing glycoprotein stability
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5278056A (en) 1988-02-05 1994-01-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Retroviral packaging cell lines and process of using same
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5670488A (en) 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5215534A (en) 1991-12-02 1993-06-01 Lawrence De Harde Safety syringe system
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
MD1367C2 (ro) 1992-11-13 2000-11-30 Idec Pharmaceuticals Corporation Metode de tratament al limfomului celulelor B, anticorpi anti-CD20, hibridom.
DE69434860T2 (de) 1993-02-22 2007-03-15 The Rockefeller University Herstellung von helfer-freien retroviren mit hohem titer mittels transienter transfektion
FR2712812B1 (fr) 1993-11-23 1996-02-09 Centre Nat Rech Scient Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo.
CA2194907A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Kouji Matsushima Reshaped human antibody against human interleukin-8
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
CN1241944C (zh) 1995-09-11 2006-02-15 协和发酵工业株式会社 抗人白介素－5受体α链的抗体
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
JP2001522241A (ja) 1997-04-10 2001-11-13 ロイヤル ネザーランズ アカデミー オブ アーツ アンド サイエンシズ 診断方法および試薬
US6659982B2 (en) 2000-05-08 2003-12-09 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
US6629949B1 (en) 2000-05-08 2003-10-07 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
JP2006500364A (ja) 2002-08-16 2006-01-05 イムノージェン インコーポレーテッド 高い反応性と溶解度を有する架橋剤および小分子薬物の標的化送達用コンジュゲートの調製におけるそれらの使用
GB0308731D0 (en) 2003-04-15 2003-05-21 Anticancer Therapeutic Inv Sa Method of radiotherapy
US20050003403A1 (en) 2003-04-22 2005-01-06 Rossi Edmund A. Polyvalent protein complex
US20050175619A1 (en) 2004-02-05 2005-08-11 Robert Duffy Methods of producing antibody conjugates
CA2633756C (en) 2005-12-21 2015-11-24 Micromet Ag Pharmaceutical antibody compositions with resistance to soluble cea
LT1976880T (lt) 2005-12-21 2016-10-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Farmacinės kompozicijos, pasižyminčios atsparumu tirpiam cea
ES2673822T3 (es) 2006-07-18 2018-06-25 Sanofi Anticuerpo antagonista contra EphA2 para el tratamiento de cáncer
DK2474557T3 (da) 2007-07-16 2014-11-10 Genentech Inc Anti-CD79b-antistoffer og immunkonjugater og fremgangsmåder til anvendelse
CN111909273B (zh) 2007-08-29 2024-03-26 塞诺菲-安万特股份有限公司 人源化的抗-cxcr5抗体、其衍生物及它们的应用
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
EP2631302A3 (en) 2008-03-31 2014-01-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing asthma
KR20200058590A (ko) 2008-04-30 2020-05-27 이뮤노젠 아이엔씨 가교제 및 그 용도
EP3912643B8 (en) 2009-02-13 2023-08-23 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
NZ613647A (en) 2009-05-06 2015-02-27 Biotest Ag Uses of immunoconjugates targeting cd138
FR2947269B1 (fr) 2009-06-29 2013-01-18 Sanofi Aventis Nouveaux composes anticancereux
EP3009455A1 (en) * 2009-09-16 2016-04-20 Immunomedics Inc. Class i anti-cea antibodies and uses thereof
TW201116297A (en) 2009-10-02 2011-05-16 Sanofi Aventis Antibodies that specifically bind to the EphA2 receptor
US9427531B2 (en) 2010-06-28 2016-08-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Auto-injector
RS56793B1 (sr) * 2011-03-02 2018-04-30 Roche Glycart Ag Cea antitela
US9248242B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Safety Syringes, Inc. Anti-needle stick safety device for injection device
US8961957B2 (en) 2012-06-27 2015-02-24 Hasumi International Research Foundation Therapy and method for intratumorally introducing cytotoxic T lymphocyte and/or NKT cell with anti-TNF and/or anti-IL-10
HUE033369T2 (en) 2012-11-20 2017-11-28 Sanofi Sa Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
US20140155827A1 (en) 2012-12-03 2014-06-05 Mylan, Inc. Medicament information system and method
WO2015012904A2 (en) 2012-12-13 2015-01-29 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
SI2900277T1 (sl) 2012-12-13 2022-05-31 Immunomedics, Inc. Odmerki imunokonjugatov protiteles in SN-38 za boljšo učinkovitost in zmanjšano toksičnost
RU2668125C2 (ru) 2013-03-27 2018-09-26 Тайхо Фармасьютикал Ко., Лтд. Противоопухолевое лекарственное средство, включающее низкодозированный гидрохлорида иринотекана гидрат
US20150125386A1 (en) 2013-11-05 2015-05-07 Immunomedics, Inc. Humanized anti-ceacam5 antibody and uses thereof
KR102372245B1 (ko) 2013-11-21 2022-03-08 젠맵 에이/에스 항체-약물 접합체 동결건조 제제
ES2808684T3 (es) 2013-11-25 2021-03-01 Famewave Ltd Composiciones que incluyen anticuerpos anti-ceacam1 y anti-pd para terapia de cáncer
EP3145531A4 (en) 2014-05-02 2018-03-21 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Ceacam5 peptides for crohn's disease
TWI595006B (zh) * 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
WO2016180941A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Sanofi Liquid compositions for anti-cd19 antibody-drug conjugates
CN107708741A (zh) 2015-06-12 2018-02-16 免疫医疗公司 用嵌合抗原受体(car)构建体和表达car构建体的t细胞(car‑t)或nk细胞(car‑nk)进行的疾病疗法
EP4257134A3 (en) 2015-06-25 2024-01-24 Immunomedics, Inc. Combining anti-hla-dr or anti-trop-2 antibodies with microtubule inhibitors, parp inhibitors, bruton kinase inhibitors or phosphoinositide 3-kinase inhibitors significantly improves therapeutic outcome in cancer
CN104948958A (zh) * 2015-07-01 2015-09-30 上海顿格电子贸易有限公司 一种利用热敏电阻限流的led灯
US10954301B2 (en) 2015-12-14 2021-03-23 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules having immunoreactivity with PD-1 and CTLA-4, and methods of use thereof
CN108341876B (zh) * 2017-01-22 2021-06-04 中国人民解放军第四军医大学 抗人ceacam5单克隆抗体及其制备方法和应用
US20200069799A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Arecor Limited Stabilized antibody protein solutions
KR102655301B1 (ko) 2017-04-06 2024-04-08 항저우 디에이씨 바이오테크 씨오, 엘티디 비스-링키지를 사용한 세포독성 약물의 접합
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
SG11201910134SA (en) 2017-05-02 2019-11-28 Merck Sharp & Dohme Stable formulations of anti-ctla4 antibodies alone and in combination with programmed death receptor 1 (pd-1) antibodies and methods of use thereof
EP3634401A1 (en) 2017-06-07 2020-04-15 Silverback Therapeutics, Inc. Antibody construct conjugates
EP3866924A4 (en) * 2018-06-29 2022-07-06 Krystal Biotech, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF ANTIBODY DELIVERY
EP3849513A1 (en) 2018-09-11 2021-07-21 Ichnos Sciences SA Compositions comprising a bispecific antibody, bufffer and one or more stabilizing agents
US20200113912A1 (en) 2018-09-12 2020-04-16 Silverback Therapeutics, Inc. Methods and Compositions for the Treatment of Disease with Immune Stimulatory Conjugates
CN113015747A (zh) 2018-10-19 2021-06-22 默克专利股份公司 用于治疗结肠直肠癌的阿比妥单抗
EP3693023A1 (en) 2019-02-11 2020-08-12 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
WO2020161214A1 (en) * 2019-02-07 2020-08-13 Sanofi Use of anti-ceacam5 immunoconjugates for treating lung cancer
WO2020190734A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting pd-l1
AU2020241686A1 (en) 2019-03-15 2021-11-04 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting HER2
WO2020190762A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 Bolt Biotherapeutics, Inc. Macromolecule-supported tlr agonists
US20220226492A1 (en) 2019-03-15 2022-07-21 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates Targeting HER2
US20220152215A1 (en) 2019-03-15 2022-05-19 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates Targeting CEA
US20210093730A1 (en) 2019-10-01 2021-04-01 Immunomedics, Inc. Biomarkers for antibody-drug conjugate monotherapy or combination therapy
AU2021261553A1 (en) * 2020-04-24 2023-01-05 Sanofi Antitumor combinations containing anti-CEACAM5 antibody conjugates and FOLFIFI
US20230151088A1 (en) 2020-04-24 2023-05-18 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates and folfox
WO2021214222A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates, trifluridine and tipiracil
WO2021214227A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates and cetuximab
US12564642B2 (en) * 2020-11-10 2026-03-03 Sanofi CEACAM5 antibody-drug conjugate formulation
CA3237142A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates and anti-vegfr-2 antibodies
WO2023099682A1 (en) 2021-12-02 2023-06-08 Sanofi Ceacam5 adc–anti-pd1/pd-l1 combination therapy
KR20240112348A (ko) * 2021-12-02 2024-07-18 사노피 암 치료법에서 환자 선택을 위한 cea 검정
TW202435917A (zh) * 2022-11-17 2024-09-16 美商西雅圖遺傳學公司 Ceacam5抗體-藥物接合物及其使用方法
KR20250154496A (ko) 2023-03-01 2025-10-28 사노피 Ceacam5를 발현하는 신경내분비암을 치료하기 위한 항-ceacam5 면역접합체의 용도
EP4427763A1 (en) 2023-03-06 2024-09-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates, anti-vegfr-2 antibodies and anti-pd1/pd-l1 antibodies
KR20250169564A (ko) 2023-03-23 2025-12-03 사노피 암 치료법에서 환자 선택을 위한 CEACAM5 mRNA 검정
AU2024286132A1 (en) 2023-06-05 2026-01-22 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates, anti-pd1/pd-l1 antibodies and anti-ctla4 antibodies
WO2025169012A1 (en) 2024-02-06 2025-08-14 Sanofi Methods of treating ceacam5-expressing cancers

Also Published As

Publication number Publication date
TN2015000177A1 (en) 2016-10-03
MY171100A (en) 2019-09-25
IL238559A0 (en) 2015-06-30
AU2013349733B2 (en) 2018-08-23
KR102661801B1 (ko) 2024-04-26
US20160108131A1 (en) 2016-04-21
EP3199552B1 (en) 2019-12-25
SG11201503285TA (en) 2015-05-28
TW201427997A (zh) 2014-07-16
MA38194A1 (fr) 2018-02-28
EP2922875B1 (en) 2017-03-15
ZA201502959B (en) 2016-01-27
KR20150085828A (ko) 2015-07-24
PH12015501092A1 (en) 2015-07-27
RS55987B1 (sr) 2017-09-29
CL2015001321A1 (es) 2015-07-17
DOP2015000110A (es) 2015-08-16
CR20150258A (es) 2015-06-11
US20180022817A1 (en) 2018-01-25
HRP20200415T1 (hr) 2020-06-26
PT2922875T (pt) 2017-05-31
PH12015501092B1 (en) 2019-01-11
EP3199552A1 (en) 2017-08-02
BR112015010993B1 (pt) 2022-08-30
CA3207769A1 (en) 2014-05-30
US10457739B2 (en) 2019-10-29
PT3199552T (pt) 2020-03-25
SI2922875T1 (sl) 2017-06-30
KR20220084193A (ko) 2022-06-21
CA2889962A1 (en) 2014-05-30
UY35147A (es) 2014-06-30
UA120247C2 (uk) 2019-11-11
KR20240063172A (ko) 2024-05-09
HUE033369T2 (en) 2017-11-28
ES2778823T3 (es) 2020-08-12
MA38194B1 (fr) 2018-12-31
CN104918958B (zh) 2019-12-10
CN109180815B (zh) 2022-06-21
PE20151180A1 (es) 2015-08-12
AU2013349733A1 (en) 2015-06-11
EA039377B1 (ru) 2022-01-20
KR102194748B1 (ko) 2020-12-23
AU2013349733C1 (en) 2020-10-01
ECSP15025845A (es) 2016-01-29
NZ708528A (en) 2020-07-31
EP2922875A1 (en) 2015-09-30
ES2625742T3 (es) 2017-07-20
LT3199552T (lt) 2020-04-10
TW201940519A (zh) 2019-10-16
KR102408660B1 (ko) 2022-06-15
IL238559B (en) 2018-10-31
JP6324399B2 (ja) 2018-05-16
BR112015010993A2 (sr) 2017-08-22
LT2922875T (lt) 2017-06-12
US12570761B2 (en) 2026-03-10
EA201590986A1 (ru) 2016-05-31
US20220340682A1 (en) 2022-10-27
TWI664192B (zh) 2019-07-01
JP2016506370A (ja) 2016-03-03
US9617345B2 (en) 2017-04-11
US11332542B2 (en) 2022-05-17
WO2014079886A1 (en) 2014-05-30
DK3199552T3 (da) 2020-03-30
KR20200143527A (ko) 2020-12-23
CN109180815A (zh) 2019-01-11
HRP20170743T1 (hr) 2017-07-28
CA2889962C (en) 2023-10-24
AU2018267636A1 (en) 2018-12-13
MX2015006374A (es) 2015-10-09
PL2922875T3 (pl) 2017-08-31
EP3594243A1 (en) 2020-01-15
HK1215444A1 (en) 2016-08-26
CN104918958A (zh) 2015-09-16
AR093557A1 (es) 2015-06-10
US20200102401A1 (en) 2020-04-02
SI3199552T1 (sl) 2020-06-30
MX358321B (es) 2018-08-14
PL3199552T3 (pl) 2020-06-01
DK2922875T3 (en) 2017-06-06
CY1119219T1 (el) 2018-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12570761B2 (en) Anti-CEACAM5 antibodies and uses thereof
EP3400961B1 (en) Anti-lamp1 antibodies and antibody drug conjugates, and uses thereof
HK1215444B (en) Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
EA047681B1 (ru) Способы получения антител к ceacam5
OA17305A (en) Anti-CEACAM5 antibodies and uses thereof.