RS60819B1 - Vezujući proteini st2 antigena - Google Patents

Description

Opis

POZADINA PRONALASKA

[0001] ST2 je vezujući receptor za interleukin-33 (IL-33), citokin koji se odnosi na IL-1 i IL-18 i takođe poznat kao NF-HEV ili IL-1F11. ST2 je eksprimiran i kao rastvorljiva varijanta bez signalizacije (rastvorljiva ST2 ili sST2) i oblik celog opsega membrane (FL ST2, ST2 ili ST2L) koji posreduje ćelijskim odgovorima na IL-33. Poslednji oblik se eksprimira na širokom rasponu tipova ćelija koji su umešani u patološku inflamaciju u velikom broju bolesti. Oni uključuju limfocite, posebno T-pomoćne ćelije koje eksprimiraju IL-5 i IL-13, prirodne ćelije ubice (NK) i prirodne ubojice-T (NKT), kao i mnoge takozvane urođene imune ćelije, poput mastocita, bazofila, eozinofila, makrofaga i urođenih pomoćnih ćelija (takođe poznate kao nuociti (Neill, Wong i dr. 2010)). Vezivanje IL-33 na ST2 u ovim ćelijama dovodi do regrutovanja široko eksprimiranog zajedničkog receptora poznatog kao IL-1R pomoćni protein (AcP) i aktiviranja pro-inflamatorne signalizacije, slično kao IL-1 i IL-18. Stoga je IL-33 sposoban da direktno aktivira ćelije koje eksprimiraju ST2 ili pojačaju njihovu aktivaciju, u prisustvu drugih aktivirajućih podsticaja. Primeri ćelijskih odgovora izazvanih IL-33 uključuju proizvodnju inflamatornih citokina, kao što su IL-5, IL-6, IL-13, TNF, IFN-γ i GM-CSF, kao i proizvodnju hemokina, kao što je CXCL8, CCL17 i CCL24. Takođe je pokazano da IL-33 pojačava akutne alergijske odgovore pojačavanjem aktiviranja mastocita i bazofila izazvanih signalizacijom IgE receptora ili drugim aktivatorima mastocita i bazofila. IL-33 će takođe poboljšati regrutovanje, preživljavanje i adhezivna svojstva imunoloških ćelija koja eksprimiraju ST2 i stoga je važan u izazivanju i održavanju ćelijske inflamacije u lokalnim tkivima.

[0002] Pro-inflamatorne dejstva IL-33 na urođene i adaptivne imune ćelije kulminiraju da promovišu brojne patološke procese. U plućima to uključuje pojačanu inflamaciju disajnih puteva, stvaranje sluzi, hiperreaktivnost disajnih puteva i fibrotičku pregradnju IL-33 takođe može doprineti lokalizovanoj inflamaciji u zglobovima, kao i kožnoj i zglobnoj hipernocicepciji, promovišući proizvodnju proinflamatornih citokina (Verri, Guerrero i dr. 2,008; Xu, Jiang i dr. 2008). Prekomerni IL-33 povezan je sa patološkim taloženjem kolagena i fibrozom, a takođe doprinosi oštećenju epitela u okruženju inflamatornih bolesti creva. Kroz snažne efekte na bazofilne i IgE-senzibilisane mastocite IL-33 takođe može izazvati anafilaktički šok (Pushparaj, Tay i dr. 2009) i mogu imati doprinos u alergijskim bolestima. Mnoge od ovih bolesti su hronične i progresivne prirode i teško se leče i postoji potreba za efikasnijim lečenjem.

[0003] U skladu sa svojim dokumentovanim biološkim efektima, postoji nekoliko linija dokaza da put IL-33/ST2 doprinosi ljudskim bolestima. Na primer, nenormalno visoka ekspresija IL-33 pronađena je kod oboljenja koja uključuju inflamacije na sluzokoži i zglobne inflamacije. Oni uključuju astmu (Prefontaine, Lajoie-Kadoch i dr. 2009; Prefontaine, Nadigel i dr. 2010), inflamatornu bolest creva (Beltran, Nunez i dr.

2010; Pastorelli, Garg i dr. 2010; Sponheim, Pollheimer i dr. 2010) i reumatoidni artritis (Palmer, Talabot-Ayer i dr. 2009; Matsuyama, Okazaki i dr. 2010). Ekspresija IL-33 je povećana kod psorijatične kože (Theoharides, Zhang i dr. 2010) i kože pacijenata sa atopijskim dermatitisom (Pushparaj, Tay i dr. 2009) i takođe se povećava u patološkim uslovima fibroze, poput sistemske skleroze (Yanaba, Yoshizaki i dr. 2011) (Manetti, Ibba-Manneschi i dr.2009) i fibroze jetre (Marvie, Lisbonne i dr.2009). Koncentracija cirkulišućeg rastvorljivog ST2 je takođe povišena u brojnim situacijama bolesti, što dodatno ukazuje na vezu između ovog puta citokina i ovih bolesti. Primeri uključuju astmu (Kuroiwa, Arai i dr.2001; Oshikawa, Kuroiwa i dr.2001; Ali, Zhang i dr. 2009), hroničnu opstruktivnu bolest pluća (Hacker, Lambers i dr. 2009), plućnu fibrozu (Tajima, Oshikawa i dr.2003), sepsu i traumu (Brunner, Krenn i dr.2004), HIV infekciju (Miyagaki, Sugaya i dr.2011), sistemski eritematozni lupus (Mok, Huang i dr.2010), inflamatornu bolest creva (Beltran, Nunez i dr.2010) kao i reumatoidni artritis, skleritis, Vegenerovu granulomatozu i Behčetovu bolest (Kuroiwa, Arai i dr.2001) i kardiovaskularnu bolest (Shah and Januzzi 2010). IL-33 potencira eozinofilnu inflamaciju i postoje dokazi da je ovaj put uključen u bolest povezanu sa eozinofilima, poput rinosinusitisa i nosne polipoze (Plager, Kahl i dr.2010) i eozinofilni bronhitis (Oshikawa, Kuroiwa i dr.2001).

[0004] Dodatni dokazi koji povezuju put IL-33/ST2 sa ljudskom bolešću pružaju genetička ispitivanja, koja su identifikovala polimorfizme gena IL-33 i/ili ST2 u opštoj populaciji koji su značajno povezani sa povećanim rizikom od bolesti ili parametrima ozbiljnosti bolesti. Nekoliko velikih ispitivanja udruživanja širom genoma povezalo je genetsku varijaciju ST2 (IL1RL1) ili IL-33 sa povećanim rizikom od astme (Gudbjartsson, Bjornsdottir i dr.2009; Moffatt, Gut i dr.2010; Wu, Romieu i dr.2010) i druga ispitivanja su genetski povezala ovaj put s povećanom ozbiljnošću astme (Ali, Zhang i dr.2009) i bronhijalnom hiperreaktivnosti (Reijmerink, Postma i dr.2008). Slični nalazi genetski su implicirali ovaj put kod alergijskih poremećaja kao što je atopijski dermatitis (Shimizu, Matsuda i dr.2005), upala sinusa (Sakashita, Yoshimoto i dr.2008; Castano R 2009) kao i nosna polipoza (Buysschaert, Grulois i dr.2010).

[0005] Kolektivno, ove veze sa nekoliko ljudskih bolesti i sposobnost ovih osa citokina da promovišu mnoge oblike štetne inflamacije podrazumevaju da je ovo korisna meta za terapijsku intervenciju.

REZIME PRONALASKA

[0006] Pronalazak obezbeđuje proteine koji vezuju anti-ST2, posebno antitela i njihove funkcionalne fragmente, koji imaju svojstva podložna komercijalnoj proizvodnji i terapijskoj upotrebi kod ljudi. Proteini koji se vezuju za anti-ST2 posebno su korisni u postupcima lečenja bolesti i poremećaja povezanih sa osi IL-33/ST2. Ovde su data antitela koja vezuju ST2 koja vezuju ST2 sa visokim afinitetom i efikasno blokiraju vezivanje IL-33, smanjujući tako signalizaciju posredovanu IL-33 u ćeliji.

[0007] U prvom aspektu, ST2 protein koji se vezuje za antigen sadrži a) varijabilni domen lakog lanca naveden u SEQ ID NO:96 i b) varijabilni domen teškog lanca kao što je navedeno u SEQ ID NO:30.

[0008] Ovde je opisani protein za vezivanje antigena ST2 može da se veže za humani ST2 sa afinitetom manjim ili jednakim 1 x 10<-10>M.

[0009] Proteinski vezujući protein antigena inhibira vezivanje ljudskog ST2 na humani IL-33 i smanjuje ljudsku IL-33 posredovanu ST2 signalizaciju u ljudskim ćelijama koje eksprimiraju ST2.

[0010] Ovde opisani protein za vezivanje antigena ST2 može smanjiti signalizaciju majmuna ST2 posredovane od IL-33 u ST2 ćelijama koje eksprimiraju cinomolgus majmuna.

[0011] Antitelo pronalaska može biti humano antitelo. Poželjna antitela uključuju ona antitela koja sadrže laki lanac sa sekvencom aminokiselina navedenom u SEQ ID:85 i teški lanac sa sekvencom aminokiselina navedenim u SEQ ID NO:19.

[0012] U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca antitela predmetnog pronalaska.

[0013] Ovde je takođe opisan ekspresioni vektor koji sadrži jednu ili više izolovanih nukleinskih kiselina gornjeg aspekta. U određenim otelotvorenjima, ekspresioni vektor kodira laki lanac antitela, teški lanac antitela ili i laki lanac antitela i teški lanac.

[0014] Pronalazak dalje obezbeđuje rekombinantnu ćeliju domaćina koja sadrži jednu ili više izolovanih nukleinskih kiselina gornjeg aspekta, operativno povezanih na promoter, uključujući rekombinantne ćelije domaćina koji sadrže jedan ili više ekspresionih vektora opisanih iznad. U poželjnim otelotvorenjima, rekombinantna ćelija domaćina izlučuje antitelo koje se vezuje za ST2. Poželjne ćelije domaćina su ćelije domaćina sisara, uključujući CHO ćelijske linije.

[0015] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo predmetnog pronalaska za upotrebu u lečenju autoimunog ili inflamatornog poremećaja, izabranog iz astme, inflamatorne bolesti creva, reumatoidnog artritisa, psorijaze, atopijskog dermatitisa, plućne fibroze, hronične opstruktivne plućne bolesti, sistemskog eritematoznog lupusa, skleroze, Vegenerove granulomatoze, Behčhetove bolesti, upale sinusa, nosne polipoze, eozinofilnog bronhitisa i kardiovaskularne bolesti.

[0016] Pronalazak dalje obezbeđuje postupak pravljenja proteina za vezivanje ST2 antigena prema pronalasku kultivacijom rekombinantne ćelije domaćina kao što je iznad navedeno i izolovanjem proteina koji vezuje ST2 antigen iz navedene kulture.

KRATAK OPIS SLIKA

[0017]

Sl. Tretman 1 ST2 mAb značajno je inhibirao IL-33-indukovani IL-5 u miševima Balb/c tečnosti bronhoalveolarnog ispiranja (BALF) i C57B1/6.

Sl. Lečenje 2 ST2 mAb efikasno je u modelu astme izazvanom alergenom od bubašvaba (CRA). Miševi tretirani antitelima na ST2 imali su znatno manje BALF eozinofila od miševa tretiranih sa izotipom Ig.

Sl.3 ST2 mAb u inhibiciji humane IL-33-indukovane proizvodnje IL-5 iz CD4+ T ćelija od različitih davalaca. Linija (-) prikazuje pozitivnu kontrolnu vrednost humanog IL-33 u kombinaciji sa humanim IL-2 bez inhibicije. (++++) prikazuje pozitivnu kontrolnu vrednost humanog IL-2. Red (- -) prikazuje kontrolnu vrednost podloge.

Sl.4 odgovor doze humanog IL-33 u testu humanih NK ćelija.

Sl. 5 Smanjenje aktivnosti IL-33 u testu na ljudskim NK ćelijama izazvanim Ab2 naspram komercijalno dostupnih antitela ST2. Klonovi HB12, FB9 i 2A5 su dobijeni od MBL International Corporation. Klon B4E6 je dobijen od kompanije MD Biosciences. Klon 97203 je dobijen od R&D Systems.

Sl.6 Lokacija regiona ST2 vezanih za Ab2 kako je određeno pomoću HDX (videti Primer 12). Region koji odgovara aminokiselinama 15-26 vanćelijskog domena ST2 je označen crvenom bojom, a region koji odgovara aminokiselinama 70-76 vanćelijskog domena ST2 je označen magenta.

Sl. 7 ukupna struktura kompleksa ST2/Ab2 sc-dsFv. Dva Ab2 sc-dsFv molekula prikazana su u karikaturnim prikazima i obojena u cijan/plavu ili svetlo žutu/zlatnu za par lakih lanaca (LC)/teških lanaca (HC). Dva molekula ST2 prikazana su u magenta i zelenom crtanom filmu.

Sl.8 Interfejs za povezivanje. ST2 je prikazan u žutom crtanom filmu. Teški i laki lanac Ab2 prikazani su u sivim i pšeničnim karikaturama. CDR petlje za teški i laki lanac su obojene sledećim redosledom: CDR1: crveno(HC) ili svetlo crveno(LC); CDR2 : zeleno(HC) ili svetlo zeleno (LC); i CDR3 : plavo(HC) ili svetlo plavo (LC).

Sl. 9 Elektrostatička karta površinskog potencijala ST2 i Ab2 sc-dsFv. Sl. 9A) Komplementarnost punjenja i površine ST2 i Ab2 sc-dsFv. Interfejs za povezivanje je istaknut u krugu. Sl.9B) Levo: Ab2 ( siva/pšenična karikatura) vezuje se za pozitivno naelektrisani flaster na ST2 (površina); Desno: ST2 (žuta karikatura) vezuje se za kiseli flaster Ab2 sc-dsFv (površina). Za mapu elektrostatičkog potencijala crvena površina predstavlja negativni naboj, a plava površinu pozitivan naboj.

Sl.10 Ostaci unutar promenljivih domena Ab2 koji čine vezu sa ST2 kada su vezani za antigen. CDR regioni su uokvireni. Ostaci unutar interfejsa prikazani su podebljanim slovima. Ostaci koji formiraju vodonične veze ili mostove soli sa aminokiselinama unutar ST2 su u kurzivu.

DETALJNI OPIS

[0018] Ovde su korišćeni odeljci odeljka samo u organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje opisane teme.

[0019] Standardne tehnike mogu se koristiti za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, kulturu tkiva i transformaciju, pročišćavanje proteina, itd. enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu se izvesti u skladu sa specifikacijama proizvođača ili kao što se obično izvodi u tehnici ili kako je ovde opisano. Sledeći postupci i tehnike mogu se generalno izvoditi u skladu sa konvencionalnim postupcima dobro poznatim u struci i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje se navode i raspravljaju u celoj specifikaciji. Videti npr., Sambrook i dr., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 3. izdanje., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.. Ako nisu date posebne definicije, nomenklatura koja se koristi u vezi sa i laboratorijskim procedurama i tehnikama analitičke hemije, organske hemije i lekarske i farmaceutske hemije opisane ovde su one koje su dobro poznate i uobičajeno se koriste u nauci. Standardne tehnike mogu se koristiti za hemijsku sintezu, hemijske analize, farmaceutske pripreme, formulacije i isporuku i lečenje pacijenata.

ST2

[0020] Ovde opisani proteini za vezivanje antigena vezuju se za ST2. ST2 je eksprimiran i kao rastvorljiva varijanta bez signalizacije (rastvorljiva ST2 ili sST2) i u obliku membrane koja se proteže u celoj dužini (FL ST2, ST2 ili ST2L). Ovde je prikazan primer primene humane aminokiselinske sekvencije ST2L u Tabeli 1. Protein se sastoji iz nekoliko domena: Aminokiseline 1-18 odgovaraju vodećoj sekvenci koja se može deliti tokom prerade proteina u ćelijama sisara; aminokiseline 19-331 odgovaraju vanćelijskom domenu; aminokiseline 332-350 odgovaraju transmembranskom domenu; i aminokiseline 351-556 odgovaraju unutarćelijskom domenu. U poželjnim otelotvorenjima, antigen vezujućeg proteina vezuje se za vanćelijski domen ST2L i sprečava interakciju ST2 sa IL-33. Primer ljudske IL-33 aminokiselinske sekvence je dat u Tabeli 1.

[0021] IL-33 signalizira kroz heterodimerni receptor koji sadrži ST2L i AcP. Primer ljudske AcP aminokiselinske sekvence je dat u Tabeli 1. Ovaj protein se takođe sastoji iz nekoliko domena: Aminokiseline 1-20 odgovaraju vodećoj sekvenci koja se može deliti tokom prerade proteina u ćelijama sisara; aminokiseline 21-367 odgovaraju vanćelijskom domenu; aminokiseline 368-388 odgovaraju transmembranskom domenu; i aminokiseline 389-570 odgovaraju unutarćelijskom domenu. U oglednim otelotvorenjima, antigen ST2 vezujućeg proteina veže ST2L i sprečava signalizaciju posredovanu IL-33 u ćelijama koje eksprimiraju ST2L i AcP.

Tabela 1

[0022] Primer otelotvorenja predmetnog pronalaska vezuje i humani i ST2 majmuna cinomolgus sa visokim afinitetom, uključujući one koji se vezuju sa visokim afinitetom i blokiraju interakciju IL-33 majmuna cinomolgus sa ST2 cinomolgus majmuna. Ove karakteristike omogućavaju informativna ispitivanja toksikologije kod ne-humanih primata.

[0023] Primer aminokiselinske sekvence ST2L majmuna cinomolgus dat je u Tabeli 2. Protein se sastoji iz nekoliko domena: aminokiseline 1-18 odgovaraju vodećoj sekvenci koja se može deliti tokom prerade proteina u ćelijama sisara; aminokiseline 19-331 odgovaraju vanćelijskom domenu; aminokiseline 332-350 odgovaraju transmembranskom domenu; i aminokiseline 351-556 odgovaraju unutarćelijskom domenu.

[0024] Primer aminokiselinske sekvence AcP majmuna cinomolgus dat je u Tabeli 2. Protein se sastoji iz nekoliko domena: aminokiseline 1-20 odgovaraju vodećoj sekvenci koja se može deliti tokom prerade proteina u ćelijama sisara; aminokiseline 21-367 odgovaraju vanćelijskom domenu; aminokiseline 368-388 odgovaraju transmembranskom domenu; i aminokiseline 389-570 odgovaraju unutarćelijskom domenu.

[0025] Primer aminokiselinske sekvence IL-33 majmuna cinomolgus dat je u Tabeli 2.

Tabela 2

Aminokiselinska ST2 sekvenca majmuna cinomolgus (SEQ ID NO:4)

Vezujući proteini ST2 antigena

[0026] Ovde su opisani antigen vezujući proteini koji se specifično vezuju za ST2. Primeri antigen vezujućih proteina sadrže peptide i/ili polipeptide koji se specifično vezuju za ST2. Takvi peptidi ili polipeptidi mogu opciono da uključuju jednu ili više post-translacionih modifikacija. Primeri antigen vezujućih proteina uključuju antitela i njihove fragmente, kao što su ovde različito definisani, a koja specifično vezuju ST2. Oni uključuju antitela koja se specifično vezuju za ljudski ST2, uključujući ona koja inhibiraju IL-33 na vezivanje i/ili aktiviranje ST2.

[0027] Ovde opisani antigeni vezujućih proteina se specifično vezuju se za ST2. "Specifično se vezuje" kao što je ovde korišćeno, znači da protein koji se vezuje za antigen poželjno vezuje ST2 za druge proteine. U nekim otelotvorenjima "specifično se vezuje" znači da protein koji se vezuje za ST2 ima veći afinitet za ST2 nego za ostale proteine. Proteini koji vezuju ST2 antigen koji se specifično vezuju za ST2 mogu imati afinitet vezivanja za humani ST2 manji ili jednak 1 x 10<-7>M, manji ili jednak 2 x 10<-7>M, manji ili jednak 3 x 10<-7>M, manji ili jednak 4 x 10<-7>M, manji ili jednak 5 x 10<-7>M, manji ili jednak 6 x 10<-7>M, manji ili jednak 7 x 10<-7>M, manji ili jednak 8 x 10<-7>M, manji ili jednak 9 x 10<-7>M, manji ili jednak 1 x 10<-8>M, manji ili jednak 2 x 10<-8>M, manji ili jednak 3 x 10<-8>M, manji ili jednak 4 x 10<-8>M, manji ili jednak 5 x 10<-8>M, manji ili jednak 6 x 10<-8>M, manji ili jednak 7 x 10<-8>M, manji ili jednak 8 x 10<-8>M, manji ili jednak 9 x 10<-8>M, manji ili jednak 1 x 10<-9>M, manji ili jednak 2 x 10<-9>M, manji ili jednak 3 x 10<-9>M, manji ili jednak 4 x 10<-9>M, manji ili jednak 5 x 10<-9>M, manji ili jednak 6 x 10<-9>M, manji ili jednak 7 x 10<-9>M, manji ili jednak 8 x 10<-9>M, manji ili jednak 9 x 10<-9>M, manji ili jednak 1 x 10<-10>M, manji ili jednak 2 x 10<-10>M, manji ili jednak 3 x 10<-10>M, manji ili jednak 4 x 10<-10>M, manji ili jednak 5 x 10<-10>M, manji ili jednak 6 x 10<-10>M, manji ili jednak 7 x 10<-10>M, manji ili jednak 8 x 10<-10>M, manji ili jednak 9 x 10<-10>M, manji ili jednak 1 x 10<-11>M, manji ili jednak 2 x 10<-11>M, manji ili jednak 3 x 10<-11>M, manji ili jednak 4 x 10<-11>M, manji ili jednak 5 x 10<-11>M, manji ili jednak 6 x 10<-11>M, manji ili jednak 7 x 10<-11>M, manji ili jednak 8 x 10<-11>M, manji ili jednak 9 x 10<-11>M, manji ili jednak 1 x 10<-12>M, manji ili jednak 2 x 10<-12>M, manji ili jednak 3 x 10<-12>M, manji ili jednak 4 x 10<-12>M, manji ili jednak 5 x 10<-12>M, manji ili jednak 6 x 10<-12>M, manji ili jednak 7 x 10<-12>M, manji ili jednak 8 x 10<-12>M, ili manji ili jednak 9 x 10<-12>M.

[0028] Postupci za merenje afiniteta vezivanja proteina koji se vezuje za antigen dobro su poznati u stanju tehnike. Postupci koji se uobičajeno koriste za određivanje afiniteta uključuju rezonanciju površinskog plazmona (SPR) (Morton and Myszka "Kinetic analysis of macromolecular interactions using surface plasmon resonance biosensors" Methods in Enzymology (1998) 295, 268-294), interferometrija biološkog sloja, (Abdiche i dr "Determining Kinetics and Affinities of Protein Interactions Using a Parallel Real-time Labelfree Biosensor, the Octet" Analytical Biochemistry (2008) 377, 209-217), test kinetičkog isključenja (KinExA) (Darling and Brault "Kinetic exclusion assay technology: characterization of molecular interactions" Assay and Drug Dev Tech (2004) 2, 647-657), izotermalna kalorimetrija (Pierce i dr "Isothermal Titration Calorimetry of Protein-Protein Interactions" Methods (1999) 19, 213-221) i analitička ultracentrifugacija (Lebowitz i dr "Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review" Protein Science (2002), 11:2067-2079). Primer 3 pruža primerne postupke.

[0029] Podrazumeva se da kada se upućuje na različite primere antitela za vezivanje ST2, ovde takođe obuhvaćena fragmenti koji se vezuju za ST2. Fragment koji se vezuje za ST2 sadrži bilo koji od ovde opisanih fragmenata antitela ili domena koji zadržava sposobnost da se specifično vezuje za ST2. Fragment koji se vezuje za ST2 može biti u bilo kojoj od ovde opisanih skela.

[0030] U određenim terapeutskim primerima, ST2 antigen vezujući protein inhibira vezivanje ST2 za IL-33 i/ili inhibira jednu ili više bioloških aktivnosti povezanih sa vezivanjem ST2 na IL-33, na primer, signalizacijom posredovanom sa IL-33. Za takve proteine koji se vezuju za antigen se kaže da "neutrališu". U određenim primerima, neutrališući protein za vezivanje antigena ST2 specifično vezuje ST2 i inhibira vezivanje ST2 za IL-33 sa bilo kog mesta između 10% do 100%, kao što je bar oko10% do 100%, kao što je za bar 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% ili više. Na primer, proteini koji se vezuju za antigen ST2 mogu se testirati na sposobnost neutralizacije određivanjem sposobnosti proteina koji vezuje antigen da blokira vezivanje IL-33 za ST2 ili IL-33 za zajedničke receptore ST2 i AcP, videti, na primer, IL- 33 ispitivanja blokiranja iz Primera 6. Alternativno, antigen ST2 vezujući proteini mogu se testirati na sposobnost neutralizacije u testu koji meri efekat prisustva proteina koji se vezuje za ST2 u testu koji meri IL-33 posredovanu biološku funkciju. Na primer, sposobnost IL-33 da indukuje biološki odgovor, kao što je intracelularna signalizacija ili povećana ekspresija medijatora mRNK ili izlučivanje medijatora, kao što su citokini i hemokini iz ćelija kao što su eozinofili, bazofili, T ćelije, mastociti, NK ćelije, NKT ćelije, neutrofili ili urođene ćelije za pomoć. Alternativno, sposobnost IL-33 da promoviše diferencijaciju, proliferaciju, preživljavanje, hemotaksiju, promenu oblika ili adhezivna svojstva ćelija kao što su eozinofili, bazofili, T ćelije, mastociti, NK ćelije, NKT ćelije, neutrofili ili urođene ćelije pomagača. Alternativno, sposobnost IL-33 da indukuje ekspresiju ćelijske površine određenih markera ćelijske aktivacije, kao što je CD11b, na ćelijama poput eozinofila, bazofila, T ćelija, mastocita, NK ćelija, NKT ćelija, neutrofila ili urođenih ćelija pomagača. Primerni postupci su dati u Primerima 7-10.

[0031] Primeri antigen vezujućih proteina mogu sadržati strukturu skela, kao što je ovde različito definisano, sa jednom ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Primeri dalje uključuju antigen vezujuće proteine koji sadrže konstrukciju skela sa jednim ili više varijabilnih domena antitela, bilo teških ili lakih. Primeri uključuju antitela koja sadrže varijabilni domen lakog lanca izabran iz grupe koja se sastoji iz Ab1 promenljivog domena lakog lanca (LCv), Ab2 LCv, Ab3 LCv, Ab4 LCv, Ab5 LCv, Ab6 LCv, Ab7 LCv, Ab8 LCv, Ab9 LCv, Ab10LCv, Ab11 LCv, Ab30 LCv, Ab32 LCv, i Ab33 LCv (SEQ ID NO:95-105, 163-165, respektivno) i/ili varijabilni domen teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji iz Ab1 domene varijabilne teške lance (HCv), Ab2 HCv, Ab3 HCv, Ab4 HCv, Ab5 HCv, Ab6 HCv, Ab7 HCv, Ab8 HCv, Ab9 HCv, Ab10 HCv, Ab11HCv, Ab30HCv, Ab32HCv, i Ab33HCv (SEQ ID NO:29-39, 145-147, respektivno) i njihove fragmente, derivate, muteine, i njihove varijante.

[0032] Primer lakog lanca koji sadrži Ab1 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:84.

[0033] Primer lakog lanca koji sadrži Ab2 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:85.

[0034] Primer lakog lanca koji sadrži Ab3 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:86.

[0035] Primer lakog lanca koji sadrži Ab4 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:87.

[0036] Primer lakog lanca koji sadrži Ab5 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:88.

[0037] Primer lakog lanca koji sadrži Ab6 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:89.

[0038] Primer lakog lanca koji sadrži Ab7 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:90.

[0039] Primer lakog lanca koji sadrži Ab8 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:91.

[0040] Primer lakog lanca koji sadrži Ab9 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:92.

[0041] Primer lakog lanca koji sadrži Ab10 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:93.

[0042] Primer lakog lanca koji sadrži Ab11 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:94.

[0043] Primer lakog lanca koji sadrži Ab30 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:160.

[0044] Primer lakog lanca koji sadrži Ab32 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:161.

[0045] Primer lakog lanca koji sadrži Ab33 LCv je laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:162.

[0046] Primer teškog lanca koji sadrži Ab1 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:18.

[0047] Primer teškog lanca koji sadrži Ab2 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:19.

[0048] Primer teškog lanca koji sadrži Ab3 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:20.

[0049] Primer teškog lanca koji sadrži Ab4 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:21.

[0050] Primer teškog lanca koji sadrži Ab5 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:22.

[0051] Primer teškog lanca koji sadrži Ab6 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:23.

[0052] Primer teškog lanca koji sadrži Ab7 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:24.

[0053] Primer teškog lanca koji sadrži Ab8 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:25.

[0054] Primer teškog lanca koji sadrži Ab9 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:26.

[0055] Primer teškog lanca koji sadrži Ab10 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:27.

[0056] Primer teškog lanca koji sadrži Ab11 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:28.

[0057] Primer teškog lanca koji sadrži Ab30 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:142.

[0058] Primer teškog lanca koji sadrži Ab32 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:143.

[0059] Primer teškog lanca koji sadrži Ab33 HCv je teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:144.

[0060] Dodatni primeri skela koji su predviđeni uključuju: fibronektin, neokarzinostatin CBM4-2, lipokaline, receptor T-ćelija, protein -A domena (protein Z), Im9, TPR proteine, domene cinka prsta, pVIII, polipeptid ptičjeg pankreasa, GCN4, WW domen Src homologije 3, PDZ domene, TEM-1 beta-laktamazu, tioredoksin, stafilokokna nukleaza, PHD domene prstiju, CL-2, BPTI, APPI, HPSTI, ekotin, LACI-D1, LDTI, MTI-II, toksine škorpiona, insekte defenzin-A peptid, EETI- II, Min-23, CBD, PBP, citohrom b-562, domene Ldl receptora, gama-kristalini, ubikvitin, transferin i domene slične lektinu C-tipa. Pregledaju se skele bez antitela i njihova upotreba kao terapija Gebauer and Skerra, Curr. Opin. Chem. Biol., 13:245-255 (2009) i Binz i dr., Nat. Biotech., 23(10):1257-1268 (2005).

[0061] Ovde su opisana antitela koja sadrže sledeće varijabilne domene: Ab1 LCv/Ab1 HCv (SEQ ID NO:95/SEQ ID NO:29), Ab2 LCv/Ab2 HCv (SEQ ID NO:96/SEQ ID NO:30), Ab3 LCv/Ab3 HCv (SEQ ID NO:97/SEQ ID NO:31), Ab4 LCv/Ab4 HCv (SEQ ID NO:98/SEQ ID NO:32), Ab5 LCv/Ab5 HCv (SEQ ID NO:99/SEQ ID NO:33), Ab6 LCv/Ab6 HCv (SEQ ID NO:100/SEQ ID NO:34), Ab7 LCv/Ab7 HCv (SEQ ID NO:101/SEQ ID NO:35), Ab8 LCv/Ab8 HCv (SEQ ID NO:102/SEQ ID NO:36), Ab9 LCv/Ab9 HCv (SEQ ID NO:103/SEQ ID NO:37), Ab10 LCv/Ab10 HCv (SEQ ID NO:104/SEQ ID NO:38), Ab11 LCv/Ab11 HCv (SEQ ID NO:105/SEQ ID NO:39), Ab30 LCv/Ab30 HCv (SEQ ID NO:163/SEQ ID NO:145), Ab32 LCv/Ab32 HCv (SEQ ID NO:164/SEQ ID NO:146), Ab33 LCv/Ab33 HCv (SEQ ID NO:165/SEQ ID NO:147), i njihove kombinacije, kao i njihove fragmente, derivate, muteine i njihove varijante.

[0062] Primeri antitela opisanih ovde uključuju (SEQ ID NO:84/SEQ ID NO:18), Ab2 (SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:19), Ab3 (SEQ ID NO:86/SEQ ID NO:20), Ab4 (SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:21), Ab5 (SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:22), Ab6 (SEQ ID NO:89/SEQ ID NO:23), Ab7 (SEQ ID NO:90/SEQ ID NO:24), Ab8 (SEQ ID NO:91/SEQ ID NO:25), Ab9 (SEQ ID NO:92/SEQ ID NO:26), Ab10 (SEQ ID NO:93/SEQ ID NO:27), Ab11 (SEQ ID NO:94/SEQ ID NO:28), Ab30 (SEQ ID NO:160/SEQ ID NO:142), Ab32 (SEQ ID NO:161/SEQ ID NO:143), i Ab33 (SEQ ID NO:162/SEQ ID NO:144).

[0063] Tipično, svaki varijabilni domen antitela lakog ili teškog lanca sadrži tri CDR-a. Varijabilni domen teškog lanca sadrži CDR1 teškog lanca (HCDR1), CDR2 teškog lanca (HCDR2) i CDR3 teškog lanca (HCDR3). Varijabilni domen teškog lanca sadrži CDR1 teškog lanca (LCDR1), CDR2 teškog lanca (LCDR2) i CDR3 teškog lanca (LCDR3). U nekim otelotvorenjima, protein koji se vezuje za antigen sadrži jedan ili više CDR-a koji se nalaze u preferiranim varijabilnim domenima ovde opisanim.

[0064] Primeri takvih CDR-a uključuju, ali nisu ograničeni na:

CDR-ovi Ab1 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:106), LCDR2 (SEQ ID NO:117), i LCDR3 (SEQ ID NO:128); CDR-ovi Ab2 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:107), LCDR2 (SEQ ID NO:118), i LCDR3 (SEQ ID NO:129); CDR-ovi Ab3 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:108), LCDR2 (SEQ ID NO:119), i LCDR3 (SEQ ID NO:130); CDR-ovi Ab4 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:109), LCDR2 (SEQ ID NO:120), i LCDR3 (SEQ ID NO:131); CDR-ovi Ab5 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:110), LCDR2 (SEQ ID NO:121), i LCDR3 (SEQ ID NO:132); CDR-ovi Ab6 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:111), LCDR2 (SEQ ID NO:122), i LCDR3 (SEQ ID NO:133); CDR-ovi Ab7 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:112), LCDR2 (SEQ ID NO:123), i LCDR3 (SEQ ID NO:134); CDR-ovi Ab8 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:113), LCDR2 (SEQ ID NO:124), i LCDR3 (SEQ ID NO:135); CDR-ovi Ab9 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:114), LCDR2 (SEQ ID NO:125), i LCDR3 (SEQ ID NO:136); CDR-ovi Ab10 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:115), LCDR2 (SEQ ID NO:126), i LCDR3 (SEQ ID NO:137); CDR-ovi Ab11 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:116), LCDR2 (SEQ ID NO:127), i LCDR3 (SEQ ID NO:138); CDR-ovi Ab30 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:166), LCDR2 (SEQ ID NO:169), i LCDR3 (SEQ ID NO:172); CDR-ovi Ab32 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:167), LCDR2 (SEQ ID NO:170), i LCDR3 (SEQ ID NO:173); CDR-ovi Ab33 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO:168), LCDR2 (SEQ ID NO:171), i LCDR3 (SEQ ID NO:174); CDR-ovi Ab1 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:40), HCDR2 (SEQ ID NO:51), i HCDR3 (SEQ ID NO:62); CDR-ovi Ab2 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:41), HCDR2 (SEQ ID NO:52), i HCDR3 (SEQ ID NO:63); CDR-ovi Ab3 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:42), HCDR2 (SEQ ID NO:53), i HCDR3 (SEQ ID NO:64); CDR-ovi Ab4 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:43), HCDR2 (SEQ ID NO:54), i HCDR3 (SEQ ID NO:65); CDR-ovi Ab5 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:44), HCDR2 (SEQ ID NO:55), i HCDR3 (SEQ ID NO:66);

CDR-ovi Ab6 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:45), HCDR2 (SEQ ID NO:56), i HCDR3 (SEQ ID NO:67);

CDR-ovi Ab7 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:46), HCDR2 (SEQ ID NO:57), i HCDR3 (SEQ ID NO:68);

CDR-ovi Ab8 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:47), HCDR2 (SEQ ID NO:58), i HCDR3 (SEQ ID NO:69);

CDR-ovi Ab9 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:48), HCDR2 (SEQ ID NO:59), i HCDR3 (SEQ ID NO:70);

CDR-ovi Ab10 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:49), HCDR2 (SEQ ID NO:60), i HCDR3 (SEQ ID NO:71);

CDR-ovi Ab11 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:50), HCDR2 (SEQ ID NO:61), i HCDR3 (SEQ ID NO:72);

CDR-ovi Ab30 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:148), HCDR2 (SEQ ID NO:151), i HCDR3 (SEQ ID NO:154);

CDR-ovi Ab32 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:149), HCDR2 (SEQ ID NO:152), i HCDR3 (SEQ ID NO:155); i

CDR-ovi Ab33 HCv: HCDR1 (SEQ ID NO:150), HCDR2 (SEQ ID NO:153), i HCDR3 (SEQ ID NO:156).

[0065] U nekim primerima, vezujući protein antigena sadrži: A) polipeptid, npr., laki lanac, koji sadrži LCDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS:106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 166, 167, i 168; LCDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS:117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 169, 170, i 171; i/ili LCDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS:128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 172, 173, i 174; i/ili B) polipeptid, npr. teški lanac, koji sadrži HCDRl koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS:40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 148, 149, i 150; HCDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS:51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 151, 152, i 153; i/ili HCDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS:62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 154, 155, i 156.

[0066] U daljim primerima, antigen vezujući protein sadrži A) aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži LCDR1, LCDR2 i LCDR3 bilo kog od Ab1 LCv, Ab2 LCv, Ab3 LCv, Ab4 LCv, Ab5 LCv, Ab6 LCv, Ab7 LCv, Ab8 LCv, Ab9 LCv, Ab10 LCv, Ab11 LCv, Ab30 LCv, Ab32 LCv, i Ab33 LCv i B) aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži HCDR1, HCDR2, i HCDR3 bilo kog od Ab1 HCv, Ab2 HCv, Ab3 HCv, Ab4 HCv, Ab5 HCv, Ab6 HCv, Ab7 HCv, Ab8 HCv, Ab9 HCv, Ab10 HCv, Ab11 HCv, Ab30 HCv, Ab32 HCv, i Ab33 HCv.

[0067] U određenim primerima, CDR uključuju ne više od jednog, ne više od dva, ne više od tri, ne više od četiri, ne više od pet, ili ne više od šest adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz uzornog CDR seta ovde.

[0068] Ovde su opisana antitela koja sadrže varijabilni domen lakog lanca izabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS:95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164 i 165. Ovde su opisana antitela koja sadrže varijabilni domen teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS:29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146 i 147. Ovde su dalje opisana antitela koja sadrže A) varijabilni domen lakog lanca izabran iz grupe koja sadrži SEQ ID NOS: 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164 i 165 i B) varijabilni domen teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146, i 147.

[0069] Antitela iz predmetnog pronalaska mogu da sadrže bilo koji konstantni region poznat u stanju tehnike. Konstantni region lakog lanca može biti, na primer, konstantna oblast lakog lanca kapa ili lambda, npr., konstantni region lakog lanca tipa kapa ili lambda. Konstantni region teškog lanca može biti, na primer, alfa-, delta-, epsilon-, gama- ili mu-konstantni konstantni region teškog lanca, npr., ljudska alfa-, delta-, epsilon-, gama-, ili mu konstantni region teškog lanca. U jednom otelotvorenju konstantni region lakog ili teškog lanca je fragment, derivat, varijanta ili mutein prirodnog konstantnog regiona.

[0070] Ovde opisana antitela uključuju antitela koja sadrže varijabilni region lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS: 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164 i 165 koji nemaju više od jednog, ne više od dva, ne više od tri, ne više od četiri, ne više od pet, ne više od šest, ne više od sedam, ne više od osam, ne više od devet, ili ne više od deset aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija. Ovde opisana antitela uključuju antitela koja sadrže varijabilni region teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146 i 147 koji nemaju više od jednog, ne više

1

od dva, ne više od tri, ne više od četiri, ne više od pet, ne više od šest, ne više od sedam, ne više od osam, ne više od devet, ili ne više od deset aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija. Dalje ovde opisana antitela uključuju antitela koja sadrže A) varijabilni region lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS: 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164 i 165 imaju više od jednog, ne više od dva, ne više od tri, ne više od četiri, ne više od pet, ne više od šest, ne više od sedam, ne više od osam, ne više od devet, ili ne više od deset aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija i B) varijabilni region teškog lanca izabranog iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146 i 147 koji nemaju više od jednog, ne više od dva, ne više od tri, ne više od četiri, ne više od pet, ne više od šest, ne više od sedam, ne više od osam, ne više od devet, ili ne više od deset aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija.

[0071] U jednoj varijanti, protein za vezivanje antigena sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci promenljivog regiona teškog lanca odabranih iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS: 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164, i 165. U drugoj varijanti, protein za vezivanje antigena sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci promenljivog regiona teškog lanca odabranih iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146, i 147. U još jednoj varijanti, protein za vezivanje antigena sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci promenljivog regiona lakog lanca odabranih iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS: 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164 i 165 i B) aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca, izabranog iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID NOS: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146, i 147.

[0072] U određenim primerima, protein za vezivanje antigena sadrži CDR3 lakog i/ili teškog lanca. U nekim primerima, antigen vezujućeg proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe sekvenci navedenih u SEQ ID NOS:128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 172, 173, 174, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 154, 155 i 156. U određenim primerima, aminokiselinska sekvenca uključuje ne više od jednog, ne više od dva, ne više od tri, ne više od četiri, ne više od pet, ili ne više od šest dodataka, delecija ili supstitucija aminokiselina iz primernih sekvenci navedenih u SEQ ID NOS: 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 172, 173, 174, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 154, 155, i 156. Dakle, ovde opisani primeri uključuju vezujućeg proteina antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86% , najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96% , najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe sekvenci navedenih u SEQ ID NOS: 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 172, 173, 174, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 154, 155, i 156.

[0073] U određenim primerima, protein za vezivanje antigena sadrži CDR2 lakog i/ili teškog lanca. U nekim primerima, antigen vezujućeg proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe sekvenci navedenih u SEQ ID NOS:117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 169, 170, 171, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 151, 152 i 153. U određenim primerima, aminokiselinska sekvenca uključuje ne više od jednog, ne više od dva, ne više od tri, ne više od četiri, ne više od pet, ili ne više od šest dodataka, delecija ili supstitucija aminokiselina iz primernih sekvenci navedenih u SEQ ID NOS: 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 169, 170, 171, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 151, 152, i 153. Dakle, ovde opisani primeri uključuju vezujućeg proteina antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86% , najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96% , najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe sekvenci navedenih u SEQ ID NOS: 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 169, 170, 171, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 151, 152, i 153.

[0074] U određenim primerima, protein za vezivanje antigena sadrži CDR1 lakog i/ili teškog lanca. U nekim primerima, antigen vezujućeg proteina sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe sekvenci navedenih u SEQ ID NOS: 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 166, 167, 168, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 148, 149, i 150. U određenim primerima, aminokiselinska sekvenca uključuje ne više od jednog, ne više od dva, ne više od tri, ne više od četiri, ne više od pet, ili ne više od šest dodataka, delecija ili supstitucija aminokiselina iz primernih sekvenci navedenih u SEQ ID NOS: 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 166, 167, 168, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 148, 149, i 150. Dakle, primeri uključuju vezujućeg proteina antigen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86% , najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96% , najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe sekvenci navedenih u SEQ ID NOS: 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 166, 167, 168, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 148, 149, i 150.

[0075] Ovde opisani antigeni vezujućeg proteina sadrže skele tradicionalnih antitela, uključujući humana i monoklonska antitela, bispecifična antitela, diatela, mini antitela, antitela na domenu, sintetička antitela (koja se ovde nazivaju „mimetici antitela“), himerna antitela, fuzije antitela (ponekad koja se nazivaju "konjugati antitela"), i njihovi fragmenti, respektivno. Iznad opisani CDR-ovi, uključujući različite kombinacije CDR-ova, mogu se ugraditi u bilo koji od sledećih skela.

[0076] Kako se ovde koristi, pojam "antitelo" odnosi se na različite oblike monomernih ili multimernih proteina koji sadrže jedan ili više polipeptidnih lanaca koji se specifično vezuju za antigen, kao što je ovde različito opisano. U nekim otelotvorenjima, antitela se proizvode rekombinantnim DNK tehnikama. U dodatnim otelotvorenjima, antitela se proizvode enzimatskim ili hemijskim deljenjem antitela koja se prirodno javljaju. U drugom aspektu, antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji iz: a) humano antitelo; b) humanizovano antitelo; c) himerno antitelo; d) monoklonsko antitelo; e) poliklonalno antitelo; f) rekombinantno antitelo; g) fragment koji se vezuje za antigen; h) jednolančano antitelo; i) dijatelo; j) trijatelo, k) tetratelo, l) Fab fragment; m) F(ab')2 fragment, n) IgA antitelo, o) IgD antitelo, p) IgE antitelo, k) IgG1 antitelo, r) IgG2 antitelo, s) IgG3 antitelo, t) an IgG4 antitelo i u) IgM antitelo.

[0077] Promenljivi region ili domen sadrže najmanje tri CDR-a teškog ili lakog lanca ugrađenih u region okvira čitanja (označeni okvirni regioni FR1, FR2, FR3 i FR4). Kabat i dr., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD. Tradicionalne strukturne jedinice antitela obično sadrže tetramer. Svaki tetramer se obično sastoji iz dva identična para polipeptidnih lanaca, od kojih svaki par ima jedan laki i jedan "teški" lanac. Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje promenljivo područje od oko 100 do 110 ili više aminokiselina, prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region prvenstveno odgovornu za efektorsku funkciju. Humani lagani lanac je klasifikovan kao kapa ili lambda lanac. Teški lanci su klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, i IgE, respektivno. IgG ima nekoliko podklasa, uključujući, ali ne ograničavajući se na IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. IgM ima podrazrede, uključujući, ali ne ograničavajući se na IgM1 i IgM2. Otelotvorenja pronalaska uključuju sve takve klase i podklase antitela koja uključuju varijabilne domene antigen vezujućeg proteina prema pronalasku.

[0078] Neka antitela koja se javljaju u prirodi, poput onih koja se nalaze u kamilama i lalamama, su dimeri koji se sastoje iz dva teška lanca i ne sadrže lake lance. Ovde su takođe opisana dimerna antitela dva teška lanca ili njihovi fragmenti, koja se mogu vezivati za ST2.

[0079] Promenljivi regioni teških i lakih lanaca obično pokazuju istu opštu strukturu relativno očuvanih regiona okvira čitanja (FR) spojenih sa tri hipervarijabilna regiona, tj. sa regionima koji determinišu komplementarnost ili CDR. CDR su primarno odgovorni za prepoznavanje i vezivanje antigena. CDR-ovi iz dva lanca svakog para su poređani sa okvirnim regionima, omogućavajući vezivanje za određeni epitop. Od N-terminala do C-terminala, i laki i teški lanci sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodela aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama Kabata.

[0080] CDR-ovi predstavljaju glavne površinske kontaktne tačke za vezivanje antigena. CDR3 ili laki lanac i naročito CDR3 teškog lanca mogu predstavljati najvažnije odrednice u vezivanju antigena u varijabilnim regionima lakog i teškog lanca. U nekim antitelima čini se da je CDR3 teškog lanca glavni deo kontakta između antigena i antitela. Šeme selekcije in vitro u kojima sam CDR3 varira mogu se koristiti za promenu svojstava vezivanja antitela ili za određivanje koji ostaci doprinose vezivanju antigena.

[0081] Antitela koja se javljaju u prirodi obično uključuju signalnu sekvencu koja usmerava antitelo u ćelijski put za sekreciju proteina i koja obično nije prisutna u zrelom antitelu. Polinukleotid koji kodira antitelo predmetnog pronalaska može da kodira signalnu sekvencu koja je prirodno prisutna ili heterolognu signalnu sekvencu kao što je opisano u daljem tekstu.

[0082] U jednom primeru, antigena vezujući protein je antitelo koje sadrži od jedan do šest ovde opisanih primernih CDR-ova. Antitela pronalaska mogu biti bilo kog tipa uključujući IgM, IgG (uključujući IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgD, IgA ili IgE antitelo. U specifičnom otelotvorenju protein koji vezuje antigen je antitelo tipa IgG, npr., IgGl antitelo.

[0083] U nekim primerima, na primer kada je protein za vezivanje antigena antitelo sa kompletnim teškim i lakim lancima, CDR su svi od iste vrste, npr., ljudi. Alternativno, na primer u primerima u kojima protein koji vezuje antigen sadrži manje od šest CDR-ova iz iznad navedenih sekvenci, dodatni CDR-ovi mogu biti ili od drugih vrsta ili mogu biti različiti humani CDR-ovi od onih prikazanih u primernim sekvencama. Na primer, HCDR3 i LCDR3 regioni iz odgovarajućih ovde identifikovanih sekvenci mogu se koristiti sa HCDR1, HCDR2, LCDR1 i LCDR2, izborno odabranim od alternativnih vrsta ili različitih sekvenci humanih antitela ili njihovih kombinacija. Na primer, ovde opisani CDR mogu da zamene CDR regione komercijalno relevantnih himernih ili humanizovanih antitela.

[0084] Specifični primeri koriste komponente skela proteina koji vezuju antigen koji su ljudski sastojci. U nekim primerima, međutim, komponente skela mogu biti mešavina različitih vrsta. Kao takvo, ako je protein koji vezuje antigen antitelo, takvo antitelo može biti himerno antitelo i/ili humanizovano antitelo. Uopšte, i "himerna antitela" i humanizovana antitela "odnose se na antitela koja kombinuju regione više vrsta. Na primer, "himerna antitela" tradicionalno sadrže varijabilne region(e) miša (ili pacova, u nekim slučajevima) i konstantni region(e) čoveka.

[0085] "Humanizovana antitela" generalno se odnose na nehumana antitela koja su izmenjena područja varijabilnih domena zamenjena za sekvence pronađene u humanim antitelima. Generalno, u humanizovanom antitelu, celokupno antitelo, osim jednog ili više CDR-a, je kodirano polinukleotidom humanog porekla ili je identično takvom antitelu, osim unutar jednog ili više CDR-ova. CDR-ovi, od kojih su neki ili svi kodirani nukleinskim kiselinama poreklom iz ne-humanog organizma, ugrađuju se u okvir beta lista u promenljivom regionu humanog antitela da bi se stvorilo antitelo, čija se specifičnost utvrđuje ugrađenim CDR-ima. Stvaranje takvih antitela je opisano u, npr.., WO 92/11018, Jones 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen i dr., 1988, Science 239:1534-1536. Humanizovana antitela se takođe mogu generisati korišćenjem miševa sa genetski projektovanim imunološkim sistemom. Roque i dr., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. U ovde opisanim otelotvorenjima, identifikovani CDR su humani, pa humanizovana i himerna antitela u ovom kontekstu uključuju i neke ne-humane CDR; na primer, mogu se stvoriti humanizovana antitela koja sadrže HCDR3 i LCDR3 regione, pri čemu jedan ili više ostalih CDR regiona imaju različito poreklo vrsta.

[0086] U jednom otelotvorenju, antigen ST2 vezujućeg proteina je multispecifično antitelo, i posebno bispecifično antitelo, koje se takođe ponekad naziva i "antitela". Ovo su antitela koja se vezuju za dva ili više različitih antigena ili različite epitope na jednom antigenu. U nekim otelotvorenjima, bispecifično antitelo vezuje ST2 i antigen na ljudsku ćeliju efektora (npr. T ćeliju). Ova antitela su korisna za ciljanje odgovora ćelije efektora na ćelije koje eksprimiraju ST2, kao što je tumorska ćelija koja eksprimira ST2. U poželjnim otelotvorenjima, humani efektorski ćelijski antigen je CD3. pat. SAD. No. 7,235,641. Postupci pravljenja bispecifičnih antitela su poznati u stanju tehnike. Jedan takav postupak uključuje konstrukciju Fc dela teških lanaca, kao što je stvaranje „čvorova“ i „rupa“ koji olakšavaju heterodimerov formiranje teških lanaca kada se zajedno eksprimiraju u ćeliji. U.S. 7,695,963. Drugi postupak takođe uključuje inženjering Fc dela teškog lanca, ali koristi elektrostatičko upravljanje da ohrabri stvaranje heterodimera, istovremeno obeshrabrujući formiranje homodimera teških lanaca kada se ekspresioniraju u ćeliji. WO 09/089,004.

[0087] U jednom otelotvorenju, ST2 protein koji se vezuje za antigen je mini telo. Minitela su minimizirani proteini slični antitelu koja sadrže scFv spojen na CH3 domen. Hu i dr., 1996, Cancer Res.56:3055-3061.

[0088] Kao što je ovde opisano, protein za vezivanje antigena ST2 je antitelo na domen; videti, na primer U.S. Patent No. 6,248,516. Domen antitela (dAbs) su funkcionalni domeni vezivanja antitela, koja odgovaraju varijabilnim regionima ili teškog (VH) ili lakog (VL) lanca humanih antitela. dABs imaju molekulsku težinu od približno 13 kDa ili manju od jedne desetine veličine punog antitela. DAB su dobro eksprimirani u različitim domaćinima uključujući bakterijske, kvasce i ćelijske sisteme sisara. Pored toga, dAbs su visoko

1

stabilni i zadržavaju aktivnost čak i nakon što su izloženi oštrim uslovima, kao što su sušenje smrzavanjem ili toplotna denaturacija. Videti, na primer, patent SAD 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; SAD serijski br. 2004/0110941; Evropski Patent 0368684; SAD Patent 6,696,245, WO04/058821, WO04/003019 i WO03/002609.

[0089] U jednom otelotvorenju, protein za vezivanje antigena ST2 je fragment antitela, to je fragment bilo kog od ovde naznačenih antitela koja zadržavaju specifičnost vezivanja na ST2 do mere u kojoj je ostvarenje pokriveno patentnim zahtevima. U različitim otelotvorenjima, antitela koja vezuju antitela sadrže, ali nisu ograničena na, F(ab), F(ab'), F(ab') 2, Fv, ili jednolančane Fv fragmente. U najmanju ruku, antitelo, kako je ovde pomenuto, sadrži polipeptid koji se može specifično vezati za ST2 koji obuhvata sve ili deo varijabilnog regiona lakog ili teškog lanca, kao što je jedan ili više CDR-ova.

[0090] Dalji primeri fragmenata antitela koji se vezuju za ST2 uključuju, ali nisu ograničeni na, (i) Fab fragment koji se sastoji iz VL, VH, CL i CH1 domena, (ii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena, (iii) Fv fragment koji se sastoji iz VL i VH domena jednog antitela; (iv) dAb fragment (Ward i dr., 1989, Nature 341:544-546) koja se sastoji iz jednog promenljivog, (v) izolovanog CDR regiona, (vi) F (ab ') 2 fragmenta, bivalentnog fragmenta koji sadrži dva povezana Fab fragmenta (vii) jednolančane Fv molekule (scFv), gde su VH domen i VL domen povezani peptidnom vezom koja omogućava da se dva domena povežu kako bi formirali mesto vezivanja antigena (Bird i dr., 1988, Science 242:423-426, Huston i dr., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883), (viii) bispecifični jednolančani Fv dimeri (PCT/US92/09965) i (ix) "diatela" ili „triatela“, multivalentni ili multispecifični fragmenti konstruisani fuzijom gena (Tomlinson i dr., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger i dr., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

90:6444-6448). Fragmenti antitela mogu da se modifikuju. Na primer, molekuli se mogu stabilizovati ugradnjom disulfidnih mostova koji povezuju VH i VL domene (Reiter i dr., 1996, Nature Biotech.14:1239-1245). U nekim primerima, ne-CDR komponente ovih fragmenata su humane sekvence.

[0091] U jednom otelotvorenju, ST2 protein koji vezuje antigen je potpuno humano antitelo. U ovom otelotvorenju, kao što je prethodno opisano, specifične strukture sadrže kompletne teške i lake lance prikazane koji sadrže CDR regione. Dodatni primeri koriste jedan ili više ovde opisanih CDR-a, sa ostalim CDR-ima, okvirnim regionima, J i D regionima, konstantnim regionima itd., koji potiču iz drugih humanih antitela. Na primer, ovde opisani CDR mogu zameniti CDR bilo kog broja humanih antitela, posebno komercijalno relevantnih antitela.

[0092] Jednolančana antitela mogu da se formiraju povezivanjem fragmenata varijabilnog domena teškog i lakog lanca (Fv region) preko aminokiselinskog mosta (kratak peptidni veznik), što rezultira jednim polipeptidnim lancem. Takvi jednolančani Fvs (scFvs) pripremljeni su spajanjem DNK koja kodira peptidni veznik između DNK koji kodira dva polipeptida varijabilnog domena (VL i VH). Rezultirajući polipeptidi mogu se saviti na sebe kako bi formirali monomere koji vezuju antigen ili mogu formirati multimere (npr., dimere, trimere ili tetramere), u zavisnosti od dužine fleksibilnog veznika između dva promenljiva domena (Kortt i dr., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt i dr., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Kombinovanjem različitih polipeptida koji sadrže VL i VH može se formirati multimerni scFv koji se vezuje za različite epitope (Kriangkum i dr., 2001, Biomol. Eng.18:31-40). Tehnike razvijene za proizvodnju antitela sa jednim lancem uključuju one opisane u U.S. Patent No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston i dr., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward i dr., 1989, Nature 334:544, de Graaf i dr., 2002, Methods Mol Biol.

178:379-87. Jednolančana antitela izvedena iz antitela koja su ovde data (uključujući, ali nisu ograničena na SCFv, koja sadrže kombinacije varijabilnih domena od Ab1 LCv/Ab1 HCv (SEQ ID NO:95/SEQ ID NO:29), Ab2 LCv/Ab2 HCv (SEQ ID NO:96/SEQ ID NO:30), Ab3 LCv/Ab3 HCv (SEQ ID NO:97/SEQ ID NO:31), Ab4 LCv/Ab4 HCv (SEQ ID NO:98/SEQ ID NO:32), Ab5 LCv/Ab5 HCv (SEQ ID NO:99/SEQ ID NO:33), Ab6 LCv/Ab6 HCv (SEQ ID NO:100/SEQ ID NO:34), Ab7 LCv/Ab7 HCv (SEQ ID NO:101/SEQ ID NO:35), Ab8 LCv/Ab8 HCv (SEQ ID NO:102/SEQ ID NO:36), Ab9 LCv/Ab9 HCv (SEQ ID NO:103/SEQ ID NO:37), Ab10 LCv/Ab10 HCv (SEQ ID NO:104/SEQ ID NO:38), i Ab11 LCv/Ab11 HCv (SEQ ID NO:105/SEQ ID NO:39), Ab30 LCv/Ab30 HCv (SEQ ID NO:163/SEQ ID NO:145), Ab32 LCv/Ab32 HCv (SEQ ID NO:164/SEQ ID NO:146), Ab33 LCv/Ab33 HCv (SEQ ID NO:165/SEQ ID NO:147), i njihove kombinacije su ovde opisane.

[0093] U jednom aspektu, ST2 protein koji se vezuje za antigen je fuzioni protein antitela (koji se ovde naziva "konjugat antitela"). Konjugovani partner može biti proteinski ili ne-proteinski. potonji se obično generišu upotrebom funkcionalnih grupa na antigen-vezujućem proteinu i na konjugovanom partneru. U određenim otelotvorenjima, antitelo se konjuguje sa ne-proteinskom supstancom (lekom) da bi se formirao konjugat leka antitela.

[0094] Ovde je takođe opisan protein koji se vezuje za ST2 koji je analog antitela, koji se ponekad nazivaju i „sintetička antitela“. Na primer, različiti radovi koriste bilo alternativne skele proteina ili veštačke skele sa deljenjem CDR-ima. Takve skele uključuju, ali nisu ograničene na, mutacije uvedene za stabilizaciju trodimenzionalne strukture vezujućeg proteina, kao i potpuno sintetičke skele koje se sastoje iz na primer biokompatibilnih polimera. Videti, na primer, Korndorfer i dr., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129. Roque i dr., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. Pored toga, mogu se koristiti mimetici za peptidna antitela ("PAMs"), kao i rad zasnovan na mimeticima antitela koji koriste komponente fibronekcije kao skele.

[0095] Pod "proteinom", kako se ovde koristi, podrazumevaju se najmanje dve kovalentno vezane aminokiseline, koje uključuju proteine, polipeptide, oligopeptide i peptide. Dve ili više kovalentno vezanih aminokiselina mogu biti povezane peptidnom vezom. Protein se može sastojati iz aminokiselina i peptidnih veza koje se javljaju u prirodi, na primer kada se protein pravi rekombinantno korišćenjem ekspresionih sistema i ćelija domaćina, kao što je ispod naznačeno. Alternativno, protein može da uključuje sintetičke aminokiseline (npr., homofenilalanin, citrulin, ornitin i norleucin) ili peptidomimetičke strukture, tj. „peptidne ili proteinske analoge“, poput peptoida (videti, Simon i dr., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:9367), koja može biti otporna na proteaze ili druge fiziološke i/ili uslove skladištenja. Takve sintetičke aminokiseline mogu naročito da budu ugrađene kada se protein za vezivanje antigena sintetiše in vitro uobičajenim postupcima dobro poznatim u tehnici. Pored toga, može se koristiti bilo koja kombinacija peptidomimetičkih, sintetičkih i prirodnih ostataka/struktura. "Aminokiselina" takođe uključuje ostatke imino kiselina kao što su prolin i hidroksiprolin. Aminokiselina "R grupa" ili "bočni lanac" može biti u (L)- ili (S)-konfiguraciji. U konkretnom primeru, aminokiseline su u (L)- ili (S)-konfiguraciji.

[0096] U određenim aspektima, predmetna prijava opisuje rekombinantne proteine koji vezuju antigen koji vezuju ST2 i, u nekim primerima, rekombinantni humani ST2 ili njegov deo. U ovom kontekstu, "rekombinantni protein" je protein napravljen korišćenjem rekombinantnih tehnika koristeći bilo koje tehnike i postupke poznate u struci, tj., ekspresijom rekombinantne nukleinske kiseline kao što je ovde opisano. Postupci i tehnike za proizvodnju rekombinantnih proteina su dobro poznati u stanju tehnike. Primeri uključuju proteine koji se vežu za rekombinantne antigene koji vezuju divlji tip ST2 i njegove varijante.

[0097] "U osnovi se sastoji iz" znači da sekvenca aminokiselina može da varira za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15% u odnosu na navedenu SEQ ID NO: sekvence i dalje zadržavaju biološku aktivnost, kao što je ovde opisano.

[0098] U nekim otelotvorenjima, antitela pronalaska su izolovani proteini ili suštinski čisti proteini. "Izolovani" protein nije praćen bar nekim materijalom sa kojim je on normalno povezan u svom prirodnom stanju, na primer koji čini najmanje oko 5%, ili bar oko 50% težine ukupnog proteina u datom uzorku. Podrazumeva se da izolovani protein može da čini od 5 do 99.9 mas.% ukupnog sadržaja proteina u zavisnosti od okolnosti. Na primer, protein može da se napravi u značajno većoj koncentraciji korišćenjem inducibilnog promotora ili promotora visoke ekspresije, tako da je protein napravljen u povećanim nivoima koncentracije. Definicija uključuje proizvodnju proteina koji se vezuje za antigen u velikom broju organizama i/ili ćelija domaćina koji su poznati u stanju tehnike.

[0099] Za aminokiselinske sekvence, identitet sekvencije i/ili sličnost se određuje korišćenjem standardnih tehnika poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, algoritam identiteta lokalne sekvence Smith and Waterman, 1981, Adv. prijava. Math. 2:482, algoritam za poravnavanje identiteta sekvence Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48:443, the search for similarity method of Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.85:2444, kompjuterizovane implementacije ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u softverskom paketu Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), Best Fit programski program koji opisuje Devereux i dr., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, po mogućnosti pomoću podrazumevanih podešavanja ili pregledom. Poželjno, procenat identiteta izračunava FastDB na osnovu sledećih parametara: kazna neusklađenosti od 1; kazna zazora od 1; kazna veličine zazora 0.33; i kazna pridruživanja od 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

[0100] Primer korisnog algoritma je PILEUP. PILEUP stvara više poravnanja sekvenci iz grupe srodnih sekvenci koristeći progresivne, parne poravnanja. Takođe može da crta drvo koje prikazuje odnose klastera koji se koriste za kreiranje poravnanja. PILEUP koristi pojednostavljenje postupaka progresivnog poravnanja Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol.35:351-360; postupak je sličan kao što je opisano u Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Korisni PILEUP parametri, uključujući zadatu masu zazora 3.00, zadanu težinu

1

zazora 0.10, i ponderisane krajnje praznine.

[0101] Drugi primer korisnog algoritma je BLAST algoritam, opisan u: Altschul i dr., 1990, J. Mol. Biol.

215:403-410; Altschul i dr., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402; i Karin i dr., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Posebno koristan BLAST program je WU-BLAST-2 program koji je dobijen od Altschul i dr., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 koristi nekoliko parametara pretraživanja, od kojih je većina postavljena na zadate vrednosti. Podesivi parametri se postavljaju sa sledećim vrednostima: raspon preklapanja=1, frakcija preklapanja=0.125, prag reči (T)=II. Parametri HSP S i HSP S2 su dinamičke vrednosti i određuje ih sam program ovisno o sastavu određene sekvence i sastavu određene baze podataka protiv koje se pretražuje interesantni niz; međutim, vrednosti se mogu podesiti da povećaju osetljivost.

[0102] Dodatni koristan algoritam je razbijen BLAST kako je izvestio Altschul i dr., 1993, Nucl. Acids Res.

25:3389-3402. Zazor BLAST koristi BLOSUM-62 rezultate supstitucije; parametar praga T postavljen na 9; postupak sa dva pogotka za pokretanje nekorišćenih ekstenzija, punjenje dužine praznina od k košta 10+k; Xuje postavljen na 16, a Xgpostavljen na 40 za fazu pretrage baze podataka i na 67 za izlaznu fazu algoritama. Dostupni poravnanja pokreću se rezultatom koji odgovara oko 22 bita.

[0103] Generalno, homolognost aminokiselina, sličnost ili identitet između pojedinih varijanti CDR-a su najmanje 80% u odnosu na ovde prikazane sekvence, a tipičnije sa poželjno rastućim homologijama ili identitetima od najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, i gotovo 100%. Na sličan način, "procenat (%) identiteta nukleinske kiseline" u vezi sa sekvencom nukleinskih kiselina ovde vezanih proteina je definisan kao procenat nukleotidnih ostataka u kandidatskoj sekvenci koji su identični sa nukleotidnim ostacima kodiranja sekvencu proteina koji vezuje antigen. Specifični postupak koristi BLASTN modul WU-BLAST-2 podešen na zadate parametre, sa rasponom preklapanja i frakcijom preklapanja podešenim na 1 i 0.125, respektivno.

[0104] Uopšteno, homologija, sličnost ili identitet nukleinske kiseline između nukleotidnih sekvenci koje kodiraju pojedinačnu varijantu CDR-a i nukleotidne sekvence prikazane ovde su najmanje 80%, a tipičnije sa poželjno rastućim homologijama ili identitetima od najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , ili 99%, i skoro 100%.

[0105] Prema tome, "varijantna CDR" je ona sa navedenom homologijom, sličnošću ili identitetom ovde opisanog matičnog CDR-a i deli biološku funkciju, uključujući, ali ne ograničavajući se na, najmanje 80%, 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% specifičnost i/ili aktivnost matičnog CDR.

[0106] Dok je mesto ili region za uvođenje varijacije sekvenci aminokiselina unapred određeno, mutacije same po sebi ne moraju biti unapred određene. Na primer, da bi se optimiziralo performanse mutacije na datom mestu, može se izvesti nasumična mutageneza na ciljnom kodonu ili regionu, a prikazane varijante CDR proteina koji se vezuju za antigen pregledaju se na optimalnu kombinaciju željene aktivnosti. Tehnike izrade supstitucionih mutacija na unapred određenim mestima u DNK koja imaju poznatu sekvencu su dobro poznate, na primer, M13 mutageneza prajmera i PCR mutageneza. Skrining mutanata se vrši korišćenjem ispitivanja proteinskih aktivnosti koje vežu antigen, kao što je ST2 vezivanje.

[0107] Aminokiselinske supstitucije su obično od pojedinačnih ostataka; ubacivanje obično bude reda od oko jednog (1) do oko dvadeset (20) aminokiselinskih ostataka, mada se mogu tolerisati znatno veća umetanja. Delecije se kreću u rasponu od oko jednog (1) do oko dvadeset (20) aminokiselinskih ostataka, mada u nekim slučajevima delecije mogu biti i mnogo veće.

[0108] Supstitucije, delecije, umetanja ili bilo koja njihova kombinacija mogu se koristiti za postizanje konačnog derivata ili varijante. Obično se ove promene vrše na nekoliko aminokiselina da bi se smanjila promena molekula, posebno imunogenost i specifičnost proteina koji se vezuje za antigen. Međutim, veće promene se mogu tolerisati u određenim okolnostima. Konzervativne supstitucije se obično rade u skladu sa sledećim tabelom predstavljenim kao TABELA 3.

Tabela 3

Originalni Ostatak Primerna Supstitucija

Ala Ser

Arg Lys

1

Originalni Ostatak Primerna Supstitucija

Asn Gln, His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn, Gln

Ile Leu, Val

Leu Ile, Val

Lys Arg, Gln, Glu

Met Leu, Ile

Phe Met, Leu, Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp, Phe

Val Ile, Leu

[0109] Značajne promene u funkciji ili imunološkom identitetu vrše se izborom supstitucija koje su manje konzervativne u odnosu na one prikazane u Tabeli 3. Na primer, mogu se izvršiti zamene koje značajno utiču na: struktura polipeptidnog glavnog lanca u području promene, na primer alfa-spiralna ili beta-ploča struktura; naboj ili hidrofobnost molekula na ciljnom mestu; ili veći deo bočnog lanca. Supstitucije od kojih se, kako se očekuje, najveće promene u svojstvima polipeptida, su one u kojima (a) hidrofilni ostatak, npr., seril ili treonil, supstituiše (ili pomoću) hidrofobnog ostatka, npr., leucil, izoleucil, fenilalanin, valil ili alanil; (b) cistein ili prolin je supstituisan (ili drugim) ostatkom; (c) ostatak koji ima elektropozitivni bočni lanac, npr., lizil, arginil ili histidil, supstituisan je (ili pomoću) elektronegativnog ostatka, npr., glutamil ili aspartil; ili (d) ostatak koji ima glomazan bočni lanac, npr., fenilalanin, je supstituisan za (ili sa) onaj koji nema bočni lanac, npr. glicin.

[0110] Varijante obično pokazuju istu kvalitativnu biološku aktivnost i izazivaće isti imuni odgovor kao analog koji se javlja u prirodi, mada su i varijante izabrane da modifikuju karakteristike proteina koji se vezuju za antigen po potrebi. Alternativno, varijanta može biti dizajnirana tako da se menja biološka aktivnost proteina koji se vezuje za antigen. Na primer, mesta glikozilacije mogu se izmeniti ili ukloniti kao što je ovde diskutovano.

[0111] Ostali derivati ST2 antitela u okviru predmetnog pronalaska uključuju kovalentne ili agregativne konjugate ST2 antitela ili njihove fragmente, sa drugim proteinima ili polipeptidima, kao što je ekspresija rekombinantnih fuzionih proteina koji sadrže heterologne polipeptide spojene na N-kraj ili C-termin na polipeptidu antitela ST2. Na primer, konjugovani peptid može biti heterologni signalni (ili vođa) polipeptid, npr. vođa alfa-faktora kvasca, ili peptid, poput epitopske oznake. Fuzioni proteini koji sadrže ST2 antitela mogu sadržati peptide dodate da olakšaju prečišćavanje ili identifikaciju ST2 antitela (npr., poli-Hys). Polipeptid antitela na ST2 takođe se može povezati sa FLAG peptidom kako je opisano u Hopp i dr., Bio/Technology 6:1204, 1988, i U.S. Patent 5,011,912. FLAG peptid je visoko antigenski i obezbeđuje epitop reverzibilno vezan specifičnim monoklonskim antitelom (mAb), omogućavajući brzo ispitivanje i lagano pročišćavanje eksprimiranog rekombinantnog proteina. Reagensi koji su korisni za pripremu fuzionog proteina u kojima je FLAG peptid spojen sa određenim polipeptidom komercijalno su dostupni (Sigma, St. Louis, MO).

[0112] U jednom otelotvorenju, oligomer se priprema korišćenjem polipeptida koji su izvedeni iz imunoglobulina. Priprema fuzionih proteina koji sadrži određene heterologne polipeptide spojene sa različitim delovima polipeptida dobijenih antitelom (uključujući Fc domenu) je opisana, npr., u Ashkenazi i dr., 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn i dr., 1990, Nature 344:677; i Hollenbaugh i dr., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl.4, stranice 10.19.1 - 10.19.11.

1

[0113] Jedno otelotvorenje predmetnog pronalaska je usmereno na dimer koji sadrži dva fuziona proteina stvorena fuzijom ST2 vezujućeg fragmenta ST2 antitela, u skladu sa patentnim zahtevima, u Fc region antitela. Dimer se može načiniti, na primer, ubacivanjem genske fuzije koja kodira fuzioni protein u odgovarajući ekspresijski vektor, ekspresijom genske fuzije u ćelijama domaćinima transformisanim rekombinantnim ekspresijskim vektorom i omogućava eksprimiranom fuzionom proteinu da se sakupi slično kao molekuli antitela, pri čemu se među-lančane disulfidne veze formiraju između grupa Fc da bi se dobio dimer.

[0114] Termin "Fc polipeptid", kako se ovde koristi, uključuje izvorne i muteinske oblike polipeptida izvedenih iz Fc regiona antitela. Uključeni su i skraćeni oblici takvih polipeptida koji sadrže zglobni region koji promoviše dimerizaciju. Fuzioni proteini koji sadrže Fc delove (i oligomere koji su od njih formirani) nude prednost lakog pročišćavanja afinitetnom hromatografijom na koloni Protein A ili Protein G.

[0115] Jedan odgovarajući Fc polipeptid, opisan u PCT prijavi WO 93/10151, je jednolančani polipeptid koji se proteže od N-terminalnog zglobnog regiona do izvornog C-završetka Fc regiona humanog IgG antitela. Drugi korisni Fc polipeptid je Fc mutein opisan u U.S. Patent 5,457,035 i u Baum i dr., 1994, EMBO J.

13:3992-4001. Aminokiselinska sekvenca ovog muteina je identična sekvenci izvorne Fc sekvence predstavljene u WO 93/10151, osim što je aminokiselina 19 promenjena iz Leu u Ala, aminokiselina 20 je promenjena iz Leu u Glu, a aminokiselina 22 je promenjena iz Gly u Ala. Mutein pokazuje smanjeni afinitet prema Fc receptorima.

[0116] U drugim otelotvorenjima, varijabilni deo teškog i lakog lanca ST2 antitela može biti supstituisan za promenljivi deo teškog i lakog lanca antitela.

[0117] Drugi postupak za proizvodnju oligomernih derivata ST2 antitela uključuje upotrebu leucinskog zatvarača. Domeni leucinskih zatvarača su peptidi koji promovišu oligomerizaciju proteina u kojima se nalaze. Leucinski zatvarači prvobitno su identifikovani u nekoliko proteina koji vezuju DNK (Landschulz i dr., 1988, Science 240:1759), i od tada su pronađeni u različitim proteinima. Među poznatim leucinskim zatvaračima su prirodni peptidi i njihovi derivati koji dimeriziraju ili trimeriziraju. Primeri domena leucinskih zatvarača koji su pogodni za proizvodnju rastvorljivih oligomernih proteina su opisani u PCT prijavi WO 94/10308, i leucinski zatvarač izveden iz proteina D surfaktanta pluća D (SPD) opisanog u Hoppe i dr., 1994, FEBS Letters 344:191. Upotreba modifikovanog leucinog zatvarača koji omogućava stabilnu trimerizaciju heterolognog proteina spojenog sa njim je opisana u Fanslow i dr., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. U jednom pristupu, rekombinantni fuzioni proteini koji sadrže fragment ST2 antitela ili derivat spojen sa peptidom leucinskog zatvarača se eksprimiraju u odgovarajućim ćelijama domaćina, a rastvorljivi fragmenti ili derivati oligomernih ST2 antitela se formiraju iz supernatanta kulture.

[0118] Kovalentne modifikacije proteina koji se vezuje za antigen su uključene u opseg predmetnog pronalaska i uglavnom se rade, ali ne uvek, posle translaciono. Na primer, nekoliko vrsta kovalentnih modifikacija proteina koji se vezuje za antigen uvodi se u molekulu reakcijom specifičnih aminokiselinskih ostataka proteina koji se vezuje za antigen sa organskim derivatima koji mogu da reaguju sa odabranim bočnim lancima ili sa N- ili C-terminalni ostaci.

[0119] Cisteinilnski ostaci najčešće reaguju sa α-haloacetatama (i odgovarajućim aminima), kao što su hlorosirćetna kiselina ili hloroacetamid, dajući karboksimetil ili karboksiamidometil derivate. Cisteinilnski ostaci se takođe prevode reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, α-bromo-β-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, p-hloromerkuribenzoatom, 2-hloromerkuri-4-nitrofenol ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol.

[0120] Ostaci histidila su derivatizovani reakcijom sa dietilpirokarbonatom pri pH 5.5-7.0, jer je ovo sredstvo relativno specifično za bočni lanac histidila. Para-bromofenacil bromid je takođe koristan; reakcija se poželjno izvodi u 0.1M natrijum-kakodilata pri pH 6.0.

[0121] Lizinilni i amino terminalni ostaci reaguju sa sukcinom ili drugim anhidridima karboksilne kiseline. Derivatizacija ovim sredstvima ima efekat preokretanja naelektrisanja lizinilnih ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže alfa-amino uključuju imidoestere kao što je metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hloroborohidrat; trinitrobenzensulfonična kiselina; O-metilizourea; 2,4-pentandion; i reakcija-katalizovana transaminazom sa glioksilatom.

[0122] Arginilni ostaci su modifikovani reakcijom sa jednim ili nekoliko uobičajenih reagensa, među kojima su fenilglioksal, 2,3-butanedion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatizacija ostataka arginina zahteva da se reakcija izvodi u alkalnim uslovima zbog visokog pKaguanidinske funkcionalne grupe. Dalje, ovi reagensi mogu reagovati sa grupama lizina kao i arginin epsilon-amino grupom.

1

[0123] Specifične modifikacije tirozilnih ostataka mogu da se izvrše, od posebnog interesa za uvođenje spektralnih oznaka u tirozilne ostatke reakcijom sa aromatičnim diazonijum-jedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće se N-acetilimidizol i tetranitrometan koriste za formiranje O-acetil tirozilnih vrsta i 3-nitro derivata. Tirozilni ostaci su jodovani koristeći<125>I ili<131>I da se pripreme obeleženi proteini za upotrebu u radioimuno ispitivanju, pri čemu je hloraminski T postupak opisan iznad.

[0124] Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) selektivno su modifikovane reakcijom sa karbodiimidima (R'-N=C=N-R'), pri čemu su R i R' opciono različite alkilne grupe, kao što je 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil)karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonija-4,4-dimetilpentil)karbodiimid. Pored toga, ostaci aspartil i glutamil pretvaraju se u ostatke asparaginil i glutaminil reakcijom sa amonijum-jonima.

[0125] Derivatizacija bifunkcionalnim sredstvima je korisna za umrežavanje proteina koji se vezuju za antigen u matricu ili površinu nerastvorljivu u vodi za upotrebu u različitim postupcima. Najčešće korišćena sredstva za umrežavanje uključuju, na primer, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estere, na primer, estere sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalne imidoestere, uključujući disukcinimidilne estere kao što je 3,3'-ditibiobis (sukcinimidilpropionat) i bifunkcionalni maleimidi, poput bis-N-maleimido-1,8-oktana. Derivatizaciona sredstva kao što su metil-3-[(p-azidofenit)ditio]propioimidat daju fotoaktivaciju međujedinjenja koja mogu da formiraju umrežene u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivne matrice nerastvorljive u vodi, kao što su ugljeni hidrati aktivirani cijanogen bromidom i reaktivni supstrati opisani u SAD. Pat. br. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 se koriste za imobilizaciju proteina.

[0126] Ostaci glutaminil i asparaginil često se deamidiraju u odgovarajuće ostatke glutamila i aspartila. Alternativno, ovi ostaci se deamiduju pod blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka spada u obim predmetnog pronalaska.

[0127] Ostale modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa ostataka serila ili treonila, metilaciju α-amino grupa lizina, arginina i histidinskih bočnih lanaca (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), acetilacija N-terminalnog amina i amidacija bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.

[0128] Druga vrsta kovalentne modifikacije proteina koji vezuje antigen uključen je u obim predmetnog pronalaska uključuje promenu obrasca glikozilacije proteina. Kao što je poznato u tehnici, obrasci glikozilacije mogu zavisiti i od redosleda proteina (npr., prisustva ili odsustva određenih aminokiselinskih ostataka glikozilacije, koji su navedeni u daljem tekstu), ili ćelije ili organizma domaćina u kojem se protein proizvodi. U nastavku su razmotreni pojedini sistem ekspresije.

[0129] Glikozilacija polipeptida je obično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na vezivanje ugljenih hidrata na bočni lanac ostatka asparagina. Tri-peptidne sekvence asparagin-X-serina i asparagin-X-treonina, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenog hidrata u bočni lanac asparagina. Prema tome, prisustvo bilo koje od ovih tri-peptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija odnosi se na vezanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se takođe može koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0130] Dodavanje mesta glikozilacije proteinu koji se vezuje za antigen povoljno se vrši menjanjem sekvence aminokiselina tako da sadrži jednu ili više iznad opisanih sekvenci tri peptida (za mesta vezana za glikozilaciju sa N). Izmena se takođe može izvršiti dodavanjem ili zamenom jednog ili više ostataka serina ili treonina u početnoj sekvenci (za mesta vezana za O glikozilaciju). Radi jednostavnosti, redosled aminokiselina koji se veže za antigen poželjno je izmenjen promenama na nivou DNK, naročito mutiranjem DNK koja kodira ciljni polipeptid u prethodno odabranim bazama, tako da se stvaraju kodoni koji će prevesti u željene aminokiseline.

[0131] Drugo sredstvo za povećanje broja ugljenih hidratnih ostataka na proteinu koji se vezuje za antigen je hemijskim ili enzimatskim spajanjem glikozida sa proteinom. Ovi postupci su povoljni jer ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji domaćinu koja ima sposobnost glikozilacije za N- i O-vezanu glikozilaciju. U zavisnosti od korišćenog načina povezivanja, šećer (i) se mogu vezati za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što su cistein, (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su oni serina, treonina ili hidroksiprolina, (e) aromatski ostaci kao što su fenilalanin, tirozin ili triptofan, ili (f) amidna grupa glutamina. Ovi postupci su opisan u WO 87/05330 objavljenom 11. septembra, 1987, i u Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306.

[0132] Uklanjanje ostataka ugljenih hidrata prisutnih na početnom proteinu koji se vezuje za antigen može se

1

izvršiti hemijski ili enzimski. Hemijska deglikosilacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluorometansulfonska kiselina ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovakav tretman rezultira deljenjem većine ili svih šećera, osim šećera koji povezuje (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), a polipeptid ostavlja netaknut. Hemijska deglikosilacija je opisana sa Hakimuddin i dr., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 i od Edge i dr., 1981, Anal. Biochem.118:131. Enzimsko deljenje delova ugljenohidrata na polipeptidima može se postići primenom različitih endo- i egzo-glikozidaza kako je opisano u Thotakura i dr., 1987, Meth. Enzymol.138:350. Glikozilacija na potencijalnim mestima glikozilacije može se sprečiti upotrebom jedinjenja tunikamicin kako je opisano u Duskin i dr., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. Tunikamicin blokira stvaranje proteina-N-glikozidnih veza.

[0133] Druga vrsta kovalentne modifikacije proteina koji vezuje antigen uključuje povezivanje proteina koji se vezuje za antigen sa različitim neproteinoznim polimerima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, razne poliole, kao što su polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksialkileni, na način koji je naveden u SAD. Pat. br.4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337. Pored toga, kao što je poznato u tehnici, aminokiselinske supstitucije mogu se izvršiti na različitim položajima unutar proteina koji se veže za antigen da bi se olakšalo dodavanje polimera kao što je PEG.

[0134] U nekim otelotvorenjima, kovalentna modifikacija proteina koji se veže za antigen prema pronalasku sadrži dodavanje jedne ili više oznaka.

[0135] Termin "grupa za označavanje" označava bilo koju etiketu koja se može otkriti. Primeri pogodnih grupa za obeležavanje uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotopi ili radionuklidi (npr.<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I),fluorescentne grupe (npr., FITC, rodamin, lantanoidni fosfor), enzimske grupe (npr., peroksidaza hrena, b-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminiscentne grupe, biotinil grupe ili unapred određeni polipeptidni epitopi prepoznati od strane sekundarnog izveštača (npr. sekvence para leucinog zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, epitop oznake). U nekim otelotvorenjima, grupa za obeležavanje je povezana sa proteinom koji se vezuje za antigen preko razmaknutih krakova različitih dužina da bi se smanjila potencijalna sterična prepreka. U struci su poznati razni postupci za obeležavanje proteina i mogu se koristiti u izvođenju predmetnog pronalaska.

[0136] Generalno, oznake spadaju u različite klase, zavisno od testa u kojem će biti otkrivene: a) izotopske oznake, koje mogu biti radioaktivni ili teški izotopi; b) magnetne oznake (npr. magnetne čestice); c) redoks aktivne grupe; d) optičke boje; enzimske grupe (npr. peroksidaza hrena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza); e) biotinilirane grupe; i f) unapred određeni polipeptidni epitopi prepoznati od strane sekundarnog reportera (npr., sekvence para leucinskih patentnih zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domena za vezivanje metala, oznaka epitopa itd.). U nekim otelotvorenjima, grupa za obeležavanje je povezana sa proteinom koji se vezuje za antigen preko razmaknutih krakova različitih dužina da bi se smanjila potencijalna sterična prepreka. U struci su poznati razni postupci za obeležavanje proteina i mogu se koristiti u izvođenju predmetnog pronalaska.

[0137] Specifične oznake uključuju optičke boje, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hromofore, fosfore i fluorofore, s tim što su potonji u mnogim slučajevima specifični. Fluorofori mogu biti fluori „malih molekula“ ili proteinski fluori.

[0138] Pod "fluorescentnom etiketom" podrazumeva se svaki molekul koji se može otkriti preko svojih svojstvenih fluorescentnih svojstava. Pogodne fluorescentne etikete uključuju, ali nisu ograničene na, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, eritrozin, kumarin, metil-kumarine, pirin, malacitno zeleno, stilbene, Lucifer žuta, Cascade BlueJ, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPI FL, LC Red 640, Cy5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon zelena, Alexa-Fluor boje (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Aleka Fluor 546, Aleka Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633 , Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Kaskadno plava, Kaskadno žuta i R-fikoeritrin (PE) (Molekularne sonde, Eugene, OR), FITC, Rodamin i Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5. 5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Pogodna optička bojila, uključujući fluorofore, opisana su u Priručniku za molekularne sonde Richarda P. Hauglanda.

[0139] Pogodne proteinaze fluorescentne oznake takođe uključuju, ali nisu ograničene na, zeleni fluorescentni protein, uključujući vrste GFP-a Renilla, Ptilosarcus ili Aekuorea (Chalfie i dr., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank Accession Number U55762), plavi fluorescentni protein (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc.1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim i dr., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), pojačani žuti fluorescentni protein (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferaza (Ichiki i dr., 1993, J. Immunol.150:5408-5417), β galaktozidaza (Nolan i dr., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) i Renilla

2

(WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, U.S. Patent Nos. 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558).

[0140] Ovde su opisani primeri vezujućih proteina antigena imaju svojstva zasnovana na različitom epitopu na ST2 vezanom proteinom koji vezuje antigen. Termin "epitop" označava aminokiseline ciljnog molekula koji su u kontaktu sa proteinom koji vezuje antigen, npr., antitelom, kada je antigen vezujući protein vezan za ciljni molekul. Epitop može biti susedni ili ne-susedni (npr., (I) u jednolančanom polipeptidu, aminokiselinski ostaci koji nisu susedni jedni s drugima u polipeptidnoj sekvenci, ali koji su u kontekstu ciljnog molekula povezani antigenom vezujući protein ili (ii) u multimerni receptor koji sadrži dve ili više pojedinačnih komponenti, npr. ST2 i AcP, aminokiselinski ostaci su prisutni na jednoj ili više pojedinačnih komponenti, ali su još uvek vezani za antigen vezujući protein. Determinanti epitopa mogu da uključuju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, šećerni bočni lanci, fosforil ili sulfonil grupe, i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Generalno, antigen vezujući proteini, specifični za određeni ciljni molekul, preferencijalno će prepoznati epitop na ciljnom molekulu u složenoj smeši proteina i/ili makromolekula.

[0141] Postupci za karakterizaciju epitopa vezanog proteinom koji se vezuje za antigen dobro su poznati u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, korpu (unakrsna konkurencija) (Miller i dr "Epitope binning of murine monoclonal antibodies by a multiplexed pairing assay" J Immunol Methods (2011) 365, 118-25), peptidno mapiranje (npr., PEPSPOT™) (Albert i dr "The B-cell Epitope of the Monoclonal Anti-Factor VIII Antibody ESH8 Characterized by Peptide Array Analysis" 2008 Thromb Haemost 99, 634-7), postupci mutageneze kao što su himere (Song i dr "Epitope Mapping of Ibalizumab, a Humanized Anti-CD4 Monoclonal Antibody with Anti-HIV-1 Activity in Infected Patients" J. Virol. (2010) 84, 6935-6942), alaninsko skeniranje Cunningham and Wells "High-resolution epitope mapping of HGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis" Science (1989) 244, 1081- 1085), argininsko skeniranje (Lim i dr "A diversity of antibody epitopes can induce signaling through the erythropoietin receptor" Biochemistry (2010) 49, 3797-3804), postupci HD razmene (Coates i dr "Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry" Rapid Commun. Masena spek. (2009) 23639-647), NMR postupci unakrsnog zasićenja (Morgan i dr "Precise epitope mapping of malaria parasite inhibitory antibodies by TROSY NMR cross-saturation" Biochemistry (2005) 44, 518-23), i kristalografija (Gerhardt i dr "Structure of IL-17A in complex with a potent, fully human neutralizing antibody" J. Mol. Biol (2009) 394, 905-21). Postupci se razlikuju u nivou detalja koji daju u vezi sa aminokiselinama koje sadrže epitop.

[0142] Proteinski vezujući proteini uključuju one koji imaju prekrivajući epitop sa ovde opisanim primernim proteinom koji vezuje antigen, na primer, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab30, Ab32 ili Ab33. U određenim primerima, antigen vezujući protein ima identičan epitop kao i primerni proteini koji vezuju antigen. U drugim primerima, antigen vezujući protein vezuje samo podskup istih aminokiselina kao primereni protein koji vezuje antigen.

[0143] U određenim primerima, protein ST2 koji vezuje antigen ima identičan ili se preklapa epitop kao Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab30, Ab32 ili Ab33 i sadrži a) laki lanac varijabilnog domena koji ima najmanje 90% identiteta, najmanje 95% identiteta ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:164, ili SEQ ID NO:165; b) varijabilni domen teškog lanca koji ima najmanje 90% identiteta, najmanje 95% identiteta ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci datoj u SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146, ili SEQ ID NO:147; ili c) promenljivi domen lakog lanca a) i promenljivi domen teškog lanca b).

[0144] U određenim primerima, vezujući protein ST2 antigena ima identičan ili preklapajući epitop kao Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab30, Ab32 ili Ab33 i sadrži laki lanac varijabilni domen koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan sekvenci aminokiselina navedenom u SEQ ID NO:95 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:29; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:96 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:30; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:97 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:31; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:98 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:32; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:99 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:33; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:100 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:34; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:101 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:35; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:102 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:36; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:103 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:37; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:104 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:38; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:105 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:39; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:163 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:145; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:164 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:146; i oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95%, ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:165 i varijabilnom domenu teškog lanca koji ima najmanje 90%, najmanje 95% ili je identičan aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:147.

[0145] U određenim primerima, vezujući protein ST2 antigena ima identičan ili preklapajući epitop kao Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab30, Ab32 ili Ab33 i sadrži a) laki lanac varijabilnog domena koji nema više od deset ili ne više od pet dodataka, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:164, ili SEQ ID NO:165; b) varijabilni domen teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:146, ili SEQ ID NO:147; ili c) promenljivi domen lakog lanca a) i promenljivi domen teškog lanca b).

[0146] U određenim primerima, vezujući protein ST2 antigena ima identičan ili preklapajući epitop kao Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab30, Ab32 ili Ab33 i sadrži varijabilni domen lakog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija aminokiselina, delecija ili supstitucija iz aminokiselinske sekvence navedenih u SEQ ID NO:95 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet dodataka aminokiselina, delecije ili supstitucije iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:29; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:96 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:30; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:97 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:31; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:98 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:32; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:99 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:33; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:100 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:34; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:101 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:35; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:102 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:36; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:103 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:37; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:104 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:38; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:105 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:39; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:163 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:145; oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:164 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:146; i oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca koji ne sadrži više od deset ili ne više od pet aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija iz sekvence aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:165 i varijabilnog domena teškog lanca koji nema više od deset ili ne više od pet adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina iz aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:147.

[0147] U određenim primerima, vezujući protein ST2 ima identičan ili preklapajući epitop kao Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab30, Ab32 ili Ab33 i sadrži varijabilni domen lakog lanca koji sadrži a) LCDR1 koji nema više od tri aminokiselinske adicije, delecije ili supstitucije iz sekvence LCDR1 navedene u SEQ ID NO:106; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:117; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:128; b) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 navedene u SEQ ID NO:107; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:118; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:129; c) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 utvrđene u SEQ ID NO:108; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:119; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:130; d) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 utvrđene u SEQ ID NO:109; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:120; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:131; e) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 utvrđene u SEQ ID NO:110; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije

2

aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:121; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:132; f) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 utvrđene u SEQ ID NO:111; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:122; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:133; g) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 utvrđene u SEQ ID NO:112; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:123; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:134; h) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 utvrđene u SEQ ID NO:113; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:124; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:135; i) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 utvrđene u SEQ ID NO:114; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:125; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:136; j) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 utvrđene u SEQ ID NO:115; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:126; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:137; k) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 utvrđene u SEQ ID NO:116; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:127; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:138; l) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 navedene u SEQ ID NO:166; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:169; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:172; m) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 navedene u SEQ ID NO:167; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:170; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:173; ili n) LCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR1 navedene u SEQ ID NO:168; LCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR2 navedene u SEQ ID NO:171; i LCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence LCDR3 navedene u SEQ ID NO:174; i varijabilni domen teškog lanca koji sadrži o) HCDRl koji nema više od tri aminokiselinske adicije, delecije ili supstitucije iz HCDR1 sekvence navedene u SEQ ID NO:40; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:51; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:62; p) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:41; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:52; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:63; q) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:42; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:53; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:64; r) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:43; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:54; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:65; s) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:44; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:55; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:66; t) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:45; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:56; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:67; u) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:46; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:57; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:68; v) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:47; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:58; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:69; w) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:48; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:59; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:70; x) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:49; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:60; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:71; y) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:50; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:61; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:72; z) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:148; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:151; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:154; aa) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:149; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:152; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:155; ili b) HCDR1 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR1 navedene u SEQ ID NO:150; HCDR2 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR2 navedene u SEQ ID NO:153; i HCDR3 koji nema više od tri adicije, delecije ili supstitucije aminokiselina iz sekvence HCDR3 navedene u SEQ ID NO:156.

[0148] Poželjni proteini koji se vezuju za antigen ST2, opisani odmah iznad, uključuju one koji sadrže varijabilni domen lakog lanca a) i varijabilni domen teškog lanca o); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca b) i varijabilni domen teškog lanca p); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca c) i varijabilni domen teškog lanca q); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca d) i varijabilni domen teškog lanca r); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca e) i varijabilni domen teškog lanca s); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca f) i varijabilni domen teškog lanca t); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca g) i varijabilni domen teškog lanca u); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca h) i varijabilni domen teškog lanca v); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca i) i varijabilni domen teškog lanca w); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca j) i varijabilni domen teškog lanca x); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca k) i varijabilni domen teškog lanca y); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca l) i varijabilni domen teškog lanca z); oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca m) i varijabilni domen teškog lanca aa); i oni koji sadrže varijabilni domen lakog lanca n) i varijabilni domen teškog lanca bb);

[0149] Antigen vezujući proteini i koji imaju identičan epitop ili epitop koji se preklapaju često će se međusobno nadmetati za vezivanje za antigen. Dakle, u određenim primerima, ovde opisan antigen vezujući protein unakrsno se takmiči sa Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab30, Ab32 ili Ab33. "Unakrsno nadmetati" ili "unakrsno nadmetanje" znači da se antigen vezujući proteini nadmeću za isti epitop ili vezujuće mesto na metu. Takva konkurencija se može odrediti testom u kojem referentni protein koji vezuje antigen (npr., antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen) sprečava ili inhibira specifično vezivanje proteina koji se vezuje za ispitivanje antigena i obrnuto. Brojni tipovi kompetitivnih testova vezivanja mogu se koristiti za utvrđivanje da li se testirani molekul nadmeće sa referentnim molekulom za vezivanje. Primeri testova koji se mogu primeniti uključuju direktni ili indirektni radioimunološki test u čvrstoj fazi (RIA), direktni ili indirektni imunološki test u čvrstoj fazi (EIA), test konkurencije u sendvičima (videti, npr.., Stahli i dr. (1983) Methods in Enzymology 9:242-253), biotin-avidin EIA u čvrstoj fazi (videti, npr., Kirkland i dr., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619), direktno obeležen test čvrstog faza, sendvič test sa direktnom oznakom krute faze, Luminex (Jia i dr "A novel method of Multiplexed Competitive Antibody Binning for the characterization of monoclonal antibodies" J. Immunological Methods (2004) 288, 91-98) i površinska plazmonska rezonanca ((Song i dr "Epitope Mapping of Ibalizumab, a Humanized Anti-CD4 Monoclonal Antibody with Anti-HIV-1 Activity in Infected Patients" J. Virol. (2010) 84, 6935-6942). Primer primere određivanja unakrsne konkurencije opisan je u Primeru 5. Obično, kada je kompetitivni protein za vezivanje antigena prisutan u višku, on će inhibirati vezivanje referentnog proteina koji se vezuje za antigen za najmanje

2

50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ili 75%. U nekim slučajevima, vezivanje se inhibira najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više.

[0150] Ab2 vezuje humani i cio ST2 sa visokim afinitetom i blokira vezanje IL-33 na ST2, blokirajući tako ST2 signalizaciju posredovanu od IL-33. Antitela sa identičnim, sličnim ili preklapajućim se epitopima sa Ab2 mogu deliti ove jedinstvene karaktere. U poželjnim primerima, ST2 antigen vezujući protein se unakrsno nadmeće sa Ab2 za vezivanje za ST2. Primeri proteina koji vezuju antigen ST2 koji se međusobno nadmeću sa Ab2 uključuju Abl, Ab3, Ab5, Ab7, Ab8 i Ab30 (videti Primer 5). Ako pokušavate da pronađete antitela koja se vezuju za preklapajući, sličan ili identičan epitop kao Ab2, može se prikazati jedno ili više antitela za unakrsnu konkurenciju sa Ab2. Štaviše, kada se prave varijante antitela koje ukršta u reakciju sa Ab2, može se prikazati takva antitela da bi se utvrdilo da li je unakrsna konkurencija održavana posle varijacije, što sugeriše da epitop varijante nije značajno promenjen od matičnog molekula. Zbog toga, u određenim primerima, aplikacija opisuje varijante antitela koja se međusobno konkurišu Ab2 za vezivanje na ST2.

[0151] Pored međusobnog nadmetanja, antitela sa preklapajućim se sličnim ili identičnim epitopima mogu slično uticati i na mutagenezu ST2. Određene mutacije mogu inhibirati vezivanje antitela; drugi mogu poboljšati ili aktivirati vezivanje. U Primeru 11, skeniranje mutageneze arginina/alanina izvršeno je na delu vanćelijskog domena ST2 i utvrđen je efekat na ogledna antitela. Predmetnim obelodanjivanjem obuhvaćeni su proteini koji se vezuju za ST2, sa karakteristikama koje utiču na sličan način kao primerno antitelo na mutagenezu.

[0152] U određenim primerima, vezivanje ST2 antigen vezujućeg proteina inhibira se jednom mutacijom u ST2, pri čemu je pojedinačna mutacija izabrana iz grupe koja se sastoji od L14R, I15R, S33R, E43R, V47R, A62R, G65R, T79R, D92R, D97R , V104R, G138R, N152R i V176R. U poželjnim primerima, bilo koja od dve ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više, šest ili više, sedam ili više, osam ili više devet ili više, deset ili više, ili sve pojedinačne mutacije grupe pojedinačno inhibiraju vezivanje ST2 vezujućeg proteina. U drugim primerima, vezivanje ST2 antigen vezujućeg proteina aktivira se jednom mutacijom u ST2, pri čemu je pojedinačna mutacija izabrana iz grupe koja se sastoji iz L53R, R72A i S73R. U poželjnim primerima, sve pojedinačne mutacije grupe pojedinačno aktiviraju vezanje proteina za vezivanje ST2. U poželjnim primerima, ST2 antigen vezujući protein deli atribute Ab2 i inhibira se bilo kojim od L14R, I15R, S33R, E43R, V47R, A62R, G65R, T79R, D92R, D97R, V104R, G138R, N152R i V176R i aktivira bilo koji od L53R, R72A, S73R.

[0153] Drugi postupak za karakterizaciju antitela na osnovu njegovog epitopa je amidna razmena vodonika/deuterijuma (HDX). HDKS se široko koristi za proučavanje konformacije i dinamike proteina, interakcija proteina-liganda i interakcija proteina i proteina (Zhang i Smith 1993, Engen i Smith 2001). Masena spektrometrijska detekcija pruža moćno sredstvo za određivanje obim razmene, jer zamena jednog vodonika deuterijumom dovodi do povećanja mase od 1 Da za svaku razmenu. Obim HDX može se lako meriti na nivou peptida analizom proteolitičkog digestija proteina tečnom hromatografijom u kombinaciji sa tandemskom masenom spektrometrijom pod kontrolisanim uslovima (Engen i Smith 2001, Baerga-Ortiz, Hughes i dr.2002, Codreanu, Ladner i dr.2002, Hamuro, Coales i dr.2006, Coales, Tuske i dr.2009, Zhang, Zhang i dr.2012).

[0154] Poređenje profila antigena HDX između proteotličkih digestija ST2 sa odsustvom i prisustvom antitela (slobodno u odnosu na vezano stanje) može otkriti mesta interakcije. Specifično, kada se antitelo vezuje na ST2, amidni hidrogeni dostupni u rastvoru u slobodnom ST2 mogu postati zaštićeni i kao rezultat toga primećuju se sporije razmene. Stoga su regioni koji su stekli manje deuterijuma u prisustvu antitela nego u njegovom odsustvu potencijalno vezujući epitopi. Kada su epitopi određeni, uzimaju se u obzir i drugi faktori, uključujući brzinu razmene u slobodnom stanju, znanje o strukturi proteina antigena, kao i rezultati drugih napora za mapiranje epitopa.

[0155] Vezivanje Ab2 na ST2 analizirano je HDX kao što je opisano u Primeru 12. Analiza je pokazala da se Ab2 vezuje/menja kursni deo dela ST2 strukture koji sadrži aminokiseline 33-44 i 88-94 aminokiselina 19-322 od SEQ ID NO:1 (aminokiseline 15-26 i 70- 76 zrelih ST2, respektivno). Antitela sa preklapajućim epitopima, sličnim ili identičnim epitopima kao što je Ab2, takođe će se vezati/izmeniti brzinu razmene aminokiselina unutar 33-44 i 88-94 od SEQ ID NO:1. U određenim primerima, protein koji vezuje ST2, npr. antitelo, štiti bilo koju od aminokiselina 33-44 iz SEQ ID NO:1 kada je vezan za ST2 i analiziran pomoću HDX. U drugim primerima, bilo koja od aminokiselina 88-94 je zaštićena. Oba ukazuju na delimično preklapanje vezivanja epitopa sa Ab2. U poželjnim primerima zaštićeni su bilo koji od 33-44 i bilo koji od 88-94. U određenim primerima, protein koji vezuje ST2, npr. antitelo, štiti sve aminokiseline 33-44 iz SEQ ID NO:1 kada je vezan za ST2 i analiziran pomoću HDX. U drugim primerima, sve aminokiseline 88-94 su zaštićene. Oba ukazuju na sličan epitop za vezivanje sa Ab2. U poželjnim primerima su zaštićeni i svi od 33-

2

44 i svi od 88-94, što ukazuje na identičan ili gotovo identičan epitop kao Ab2.

[0156] Vezivanje Ab2 za ST2 dalje je analizirano korišćenjem rendgenske kristalografije. Rendgenska kristalografija je bila u skladu sa HDX analizom. Interfejs između Ab i antigena može se odrediti/definisati na više načina. U Primeru 13, interfejs je određen korišćenjem razlike u izloženosti rastvarača i rastojanja. ST2 ostaci koji su unutar interfejsa sa Ab2 kako je određeno razlikama izloženosti rastvaraču ili udaljenosti manjoj od 5A su (što odgovara položaju u zrelom ST2 (nedostaje vodeća sekvenca)) K1, F2, P19, R20, Q21, G22, K23, Y26, I70, V71, R72, S73, P74, T75, F76, N77, R78, T79, i Y81. U određenim primerima, ST2 vezujući protein formira interfejs sa ST2 koji se preklapa sa onim Ab2, uključujući one gde bilo koji od K1, F2, P19, R20, Q21, G22, K23, Y26, I70, V71, R72, S73, P74, T75, F76, N77, R78, T79, ili Y81 su unutar interfejsa. U nekim primerima, protein koji vezuje ST2 formira interfejs sa ST2 gde su P19, R20, Q21, G22, K23 i/ili Y26 unutar interfejsa. U drugim primerima, 170, V71, R72, S73, P74, T75, F76, N77, R78, T79, i/iliY81 su unutar interfejsa. U poželjnim primerima, K1, F2, P19, R20, Q21, G22, K23, Y26, I70, V71, R72, S73, P74, T75, F76, N77, R78, T79, i Y81 su unutar interfejsa.

[0157] Kristalna struktura ukazivala je da određeni aminokiselinski ostaci formiraju vodonične veze ili mostove soli sa aminokiselinama sa Ab2. Ti ostaci uključuju K1, R20, K23, Y26, T75, N77, R78, i T79. U određenim primerima, protein koji se vezuje za antigen ST2 formira vodonične veze ili slani most sa jednim ili više Kl, R20, K23, Y26, T75, N77, R78 i T79.

[0158] Kristalna struktura dalje daje informacije o tome koji ostaci Ab2 tvore interfejs sa ST2. Sl.10 označava ostatke u promenljivom regionu lakog lanca i promenljivom regionu teškog lanca koji čine vezu sa ST2. Takođe su navedeni ostaci koji formiraju vodonične veze ili mostove soli sa aminokiselinama u ST2. Ove informacije mogu da se koriste za dizajniranje varijanti Ab2, uključujući one koje sadrže promenljive domene koji imaju 90% identiteta, 95% identiteta i 10 ili manje umetanja, delecija i/ili supstitucija unutar promenljivog domena lakog lanca ili teškog lanca Ab2. Neko će možda želeti da održi aminokiseline u interfejsu, istovremeno menjajući ostatke koji nisu na interfejsu. Stoga, može se konstruisati i stvoriti varijante Ab2 koji imaju jednu ili više aminokiselinskih dodataka, supstitucija i/ili delecija unutar jednog ili više CDR-ova Ab2 koji održavaju vezivanje za ST2.

[0159] U nekim primerima, protein koji vezuje ST2 sadrži varijantu promenljivog regiona lakog lanca Ab2 (SEQ ID NO:96) gde su D28, I29, S30, N31, Y32, Y49, D50, N53, E55, T56, D91, D92, N93 , F94 i/ili L96 ostaju nepromenjeni ili sadrže konzervativnu supstituciju istih, i/ili varijantu Ab2 promenljivog regiona teškog lanca (SEQ ID NO:30) gde su V33, 150, D57, R59, H99, G100, T101, S102 , S103, D104, Y105 i/ili Y106 ostaju nepromenjeni ili sadrže konzervativnu mutaciju. U poželjnim primerima, D28, N31, D50, N53, E55, D91 i D92 promenljivog regiona lakog lanca ostaju nepromenjeni, a S102, S103, D104 i Y105 teškog lanca ostaju nepromenjeni.

Polinukleotidi koji kodiraju ST2 antigen vezujuće proteine

[0160] U okviru pronalaska obuhvaćene su nukleinske kiseline koje kodiraju antitela koja vezuju ST2 antigen prema patentnim zahtevima. Ovde opisane nukleinske kiseline uključuju one koje kodiraju primer ovde opisanih lakih i teških lanaca.

[0161] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab 1 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:73.

[0162] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab2 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:74.

[0163] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab3 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:75.

[0164] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab4 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:76.

[0165] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab5 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:77.

[0166] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab6 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:78.

[0167] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab7 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:79.

2

[0168] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab8 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:80.

[0169] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab9 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:81.

[0170] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab10 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:82.

[0171] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab11 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:83.

[0172] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab30 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 157.

[0173] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab32 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:158.

[0174] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab33 LC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:159.

[0175] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab1 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:7.

[0176] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab2 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:8.

[0177] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab3 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:9.

[0178] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab4 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10.

[0179] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab5 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:11.

[0180] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab6 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12.

[0181] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab7 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:13.

[0182] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab8 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:14.

[0183] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab9 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:15.

[0184] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab10 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:16.

[0185] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab11 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:17.

[0186] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab30 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:139.

[0187] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab32 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:140.

[0188] Primer nukleinske kiseline koja kodira Ab33 HC je nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO:141.

[0189] Aspekti pronalaska uključuju polinukleotidne varijante (npr., zbog degeneracije) koje kodiraju aminokiselinske sekvence prema patentnim zahtevima.

[0190] Predmetno obelodanjivanje uključuje niz primera uključujući, ali ne ograničavajući se na sledeće.

[0191] Izolovani polinukleotid, pri čemu pomenuti polinukleotid kodira jedan ili više polipeptida koji sadrže

2

aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine:

A.

1. sekvenca promenljivog domena lakog lanca koja je najmanje 90% identična sekvenci promenljivog domena lakog lanca navedena u SEQ ID NO:95-105, 163-165;

2. sekvenca promenljivog domena teškog lanca koja je najmanje 90% identična sekvenci promenljivog domena teškog lanca navedena u SEQ ID NO:29-39, 145-147;

3. promenljivi domen lakog lanca (1) i promenljivi domen teškog lanca (2); i

B. varijabilni domen lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, CDR3 i/ili varijabilni domen teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, CDR3 koji su isti ili se razlikuju ne više od ukupno tri adicije, supstitucije aminokiselina i/ili delecije iz svakog CDR-a iz sledećih sekvenci:

1. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:106), CDR2 (SEQ ID NO:117), CDR3 (SEQ ID NO:128) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:40), CDR2 (SEQ ID NO:51), CDR3 (SEQ ID NO:62) Ab1; 2. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:107), CDR2 (SEQ ID NO:118), CDR3 (SEQ ID NO:129) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:41), CDR2 (SEQ ID NO:52), CDR3 (SEQ ID NO:63) Ab2; 3. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:108), CDR2 (SEQ ID NO:119), CDR3 (SEQ ID NO:130) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:42), CDR2 (SEQ ID NO:53), CDR3 (SEQ ID NO:64) Ab3; 4. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:109), CDR2 (SEQ ID NO:120), CDR3 (SEQ ID NO:131) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:43), CDR2 (SEQ ID NO:54), CDR3 (SEQ ID NO:65) Ab4; 5. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:110), CDR2 (SEQ ID NO:121), CDR3 (SEQ ID NO:132) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:44), CDR2 (SEQ ID NO:55), CDR3 (SEQ ID NO:66) Ab5; 6. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:111), CDR2 (SEQ ID NO:122), CDR3 (SEQ ID NO:133) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:45), CDR2 (SEQ ID NO:56), CDR3 (SEQ ID NO:67) Ab6; 7. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:112), CDR2 (SEQ ID NO:123), CDR3 (SEQ ID NO:134) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:46), CDR2 (SEQ ID NO:57), CDR3 (SEQ ID NO:68) Ab7; 8. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:113), CDR2 (SEQ ID NO:124), CDR3 (SEQ ID NO:135) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:47), CDR2 (SEQ ID NO:58), CDR3 (SEQ ID NO:69) Ab8; 9. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:114), CDR2 (SEQ ID NO:125), CDR3 (SEQ ID NO:136) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:48), CDR2 (SEQ ID NO:59), CDR3 (SEQ ID NO:70) Ab9; 10. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:115), CDR2 (SEQ ID NO:126), CDR3 (SEQ ID NO:137) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:49), CDR2 (SEQ ID NO:60), CDR3 (SEQ ID NO:71) AblO; 11. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:116), CDR2 (SEQ ID NO:127), CDR3 (SEQ ID NO:138) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:50), CDR2 (SEQ ID NO:61), CDR3 (SEQ ID NO:72) Ab11; 12. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:166), CDR2 (SEQ ID NO:169), CDR3 (SEQ ID NO:172) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:148), CDR2 (SEQ ID NO:151), CDR3 (SEQ ID NO:154) Ab30; 13. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:167), CDR2 (SEQ ID NO:170), CDR3 (SEQ ID NO:173) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:149), CDR2 (SEQ ID NO:152), CDR3 (SEQ ID NO:155) Ab32; i

14. laki lanac CDR1 (SEQ ID NO:168), CDR2 (SEQ ID NO:171), CDR3 (SEQ ID NO:174) ili teški lanac CDR1 (SEQ ID NO:150), CDR2 (SEQ ID NO:153), CDR3 (SEQ ID NO:156) Ab33.

[0192] U poželjnim primerima, polipeptid kodiran od izolovane nukleinske kiseline je komponenta proteina koji vezuje ST2.

[0193] Nukleotidne sekvence koje odgovaraju ovde opisanim sekvencama aminokiselina, koje se koriste kao sonde ili prajmeri za izolaciju nukleinskih kiselina ili kao sekvence za pretragu u bazi podataka, mogu se dobiti "povratnim prevodom" iz aminokiselinskih sekvenci ili identifikacijom regiona identiteta aminokiselina sa polipeptidima za koje je identifikovana kodirajuća DNK sekvenca. Poznati postupak lančane reakcije polimerazom (PCR) može se koristiti za izolovanje i amplifikaciju DNK sekvence koja kodira proteine koji se vezuju za ST2 antigen ili željenu kombinaciju fragmenata proteina polipeptida koji vezuju antigen.

2

Oligonukleotidi koji definišu željene završetke kombinacije fragmenata DNK koriste se kao 5' i 3' prajmeri. Oligonukleotidi mogu dodatno da sadrže mesta prepoznavanja restrikcionih endonukleaza, kako bi se olakšalo umetanje pojačane kombinacije fragmenata DNK u ekspresijski vektor. PCR tehnike su opisane u Saiki i dr., Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu i dr., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp.189-196; i PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis i dr., eds., Academic Press, Inc. (1990).

[0194] Molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku uključuju DNK i RNK u jednolančanom i dvolančanom obliku, kao i odgovarajuće komplementarne sekvence. DNK uključuje, na primer, cDNK, genomsku DNK, hemijski sintetizovanu DNK, DNK pojačanu PCR-om i njihove kombinacije. Molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku uključuju gene pune dužine ili molekule cDNK, kao i kombinaciju njihovih fragmenata. Nukleinske kiseline pronalaska su poželjno izvedene iz humanih izvora, ali pronalazak takođe uključuje one izvedene iz ne-humanih vrsta.

[0195] „Izolovana nukleinska kiselina“ je nukleinska kiselina koja je odvojena od susednih genetskih sekvenci prisutnih u genomu organizma iz kojeg je nukleinska kiselina izolovana, u slučaju nukleinskih kiselina izolovanih iz prirodnih izvora. U slučaju nukleinskih kiselina sintetizovanih enzimski iz obrasca ili hemijski, kao što su PCR proizvodi, molekule cDNK ili oligonukleotidi, na primer, podrazumeva se da su nukleinske kiseline nastale takvim procesima izolovane nukleinske kiseline. Izolovani molekul nukleinske kiseline odnosi se na molekul nukleinske kiseline u obliku odvojenog fragmenta ili kao komponenta većeg konstrukta nukleinske kiseline. U jednom poželjnom otelotvorenju, nukleinske kiseline u osnovi nemaju zagađivački endogeni materijal. Molekul nukleinske kiseline je poželjno izveden iz DNK ili RNK izolovane najmanje jednom u suštinski čistom obliku i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i oporavak njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci standardnim biohemijskim postupcima (kao što su one opisane u Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Takve sekvence su poželjno obezbeđene i/ili konstruisane u obliku otvorenog okvira za čitanje neprekidnog unutrašnjim neprevedenim sekvencama ili intronima koji su obično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence neprevedene DNK mogu biti prisutne 5' ili 3' iz otvorenog okvira za čitanje, pri čemu iste ne ometaju manipulaciju ili izražavanje kodirajućeg regiona.

[0196] Ovde su takođe opisane nukleinske kiseline koje hibridizuju u umereno strogim uslovima, i poželjnije vrlo stroge uslove, nukleinskim kiselinama koje kodiraju proteine koji vezuju ST2 antigen kako je ovde opisano. Osnovni parametri koji utiču na izbor uslova hibridizacije i smernice za stvaranje pogodnih uslova dati su u Sambrook,, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11; i Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel i dr., eds., John Wiley & Sons, Inc., delovi 2.10 i 6.3-6.4), i mogu ih lako odrediti oni koji imaju uobičajenu veštinu u stanju tehnike na osnovu, na primer, dužine i/ili baznog sastava DNK. Jedan način postizanja umereno strogih uslova uključuje upotrebu rastvora za prethodno ispiranje koji sadrži 5 x SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), pufer za hibridizaciju od oko 50% formamida, 6 x SSC i temperaturu hibridizacije od oko 55 stepeni C (ili druge slične rastvore hibridizacije, kao što je ona koja sadrži oko 50% formamida, sa temperaturom hibridizacije od oko 42 stepena C) i uslovi ispiranja od oko 60 stepeni C, u 0.5 x SSC, 0.1% SDS. Uopšteno, veoma strogi uslovi su definisani kao uslovi hibridizacije kao iznad, ali sa ispiranjem na približno 68 stepeni C, 0.2 x SSC, 0.1% SDS. SSPE (1xSSPE je 0,15M NaCl, 10 mM NaH2PO 4, i 1.25 mM EDTA, pH 7.4) može se supstituisati SSC (1xSSC je 0,15M NaCl i 15 mM natrijum citrata) u hibridizaciji i odbojnici za pranje; pranje se vrši 15 minuta nakon završetka hibridizacije. Treba shvatiti da se temperatura pranja i koncentracija soli za pranje mogu podesiti po potrebi da se postigne željeni stepen strogosti primenom osnovnih principa koji regulišu reakcije hibridizacije i dupleks stabilnosti, kao što su poznati stručnjacima i opisano dalje u daljem tekstu (videti, npr., Sambrook i dr., 1989). Kada se hibridizuje nukleinska kiselina sa ciljanom nukleinskom kiselinom nepoznate sekvence, pretpostavlja se da je hibridna dužina hibridizujuće nukleinske kiseline. Kada su nukleinske kiseline poznate sekvence hibridizovane, dužina hibrida može se odrediti poravnavanjem sekvenci nukleinskih kiselina i identifikovanjem regiona ili područja optimalne komplementarnosti sekvenci. Temperatura hibridizacije za hibride za koje se očekuje da će biti dužina manja od 50 parova baza trebala bi biti 5 do 10 stepeni C niža od temperature topljenja (Tm) hibrida, pri čemu se Tm određuje prema sledećim jednačinama. Za hibride dužine manje od 18 osnovnih parova, Tm (stepeni C) = 2(# od A T baze) 4(# od #G C baze). Za hibride dužine iznad 18 baznih parova, Tm (stepeni C) = 81.5 16.6(log10[Na<+>]) 0.41(% G C) - (600/N), gde je N broj baza u hibridu, a [Na<+>] je koncentracija natrijumovih jona u puferu za hibridizaciju ([Na<+>] za 1xSSC = 0.165M). Poželjno je da svaka takva hibridizujuća nukleinska kiselina ima dužinu koja iznosi najmanje 15 nukleotida (ili još poželjnije najmanje 18 nukleotida, ili najmanje 20 nukleotida, ili najmanje 25 nukleotida, ili najmanje 30 nukleotida, ili najmanje 40 nukleotida, ili najpoželjnije najmanje 50 nukleotida) ili najmanje 25% (poželjnije najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, a najpoželjnije najmanje 80%) dužine nukleinske kiseline predmetni pronalazak sa kojim se hibridizuje i ima najmanje 60% identiteta sekvence (poželjnije najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%, i najpoželjnije najmanje 99.5%) sa nukleinskom kiselinom predmetnog pronalaska sa kojom se hibridira, gde je identitet sekvence određen upoređivanjem sekvenci hibridizujućih nukleinskih kiselina kada su poravnate tako da se maksimizuje preklapanje i identitet dok se minimalizuju praznine u sekvencama kako je detaljnije opisano iznad.

[0197] Varijante prema pronalasku se obično pripremaju specifičnom mutagenezom nukleotida na mestu u DNK koja kodira protein koji vezuje antigen, koristeći kasetnu ili PCR mutagenezu ili druge tehnike dobro poznate u struci, da bi se proizvela DNK koja kodira varijantu, a zatim ekspresijom rekombinanta DNK u ćelijskoj kulturi kako je ovde navedeno. Međutim, fragmenti proteina koji vezuju antigen sadrže varijante CDR-a sa oko 100-150 ostataka mogu se pripremiti in vitro sintezom koristeći utvrđene tehnike. Varijante obično pokazuju istu kvalitativnu biološku aktivnost kao prirodni analog, npr. vezivanje za ST2, mada se takođe mogu odabrati varijante koje imaju modifikovane karakteristike, kao što će biti detaljnije dato u nastavku.

[0198] Kao što će znati stručnjaci, zbog degeneracije genetskog koda, može da se napravi izuzetno veliki broj nukleinskih kiselina, koje kodiraju CDR (teški i laki lanci ili druge komponente proteina koji se vezuje za antigen) ovde opisani. Dakle, identifikujući određenu aminokiselinsku sekvencu, stručnjaci u ovoj oblasti mogu da naprave bilo koji broj različitih nukleinskih kiselina, jednostavnom modifikacijom sekvence jednog ili više kodona na način koji ne menja aminokiselinsku sekvencu kodiranog proteina.

[0199] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ekspresione sisteme i konstrukcije u obliku plazmida, ekspresionih vektora, transkripcionih ili ekspresionih kaseta koje sadrže najmanje jedan polinukleotid prema patentnim zahtevima. Pored toga, pronalazak obezbeđuje ćelije domaćina koje sadrže takve ekspresione sisteme ili konstrukte.

[0200] Tipično, ekspresioni vektori koji se koriste u bilo kojoj ćeli domaćini će sadržati sekvence za održavanje plazmida i za kloniranje i ekspresiju egzogenih nukleotidnih sekvenci. Takve sekvence, koje se u određenim otelotvorenjima zajednički nazivaju „bočne sekvence“, obično uključuju jednu ili više sledećih nukleotidnih sekvenci: promoter, jedna ili više pojačivačkih sekvenci, poreklo replikacije, sekvenca prekida transkripcije, kompletna intronska sekvenca koja sadrži mesto spajanja donatora i akceptora, sekvencu koja kodira vodeću sekvencu za izlučivanje polipeptida, mesto vezivanja ribozoma, sekvencu poliadenilacije, region poli-veznika za umetanje nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji treba da se ekspresuje i element koji se može odabrati, marker. O svakoj od ovih sekvenci govori se u nastavku.

[0201] Po izboru, vektor može da sadrži „kodirajuću“ sekvencu kodiranja, tj. oligonukleotidni molekul smešten na 5' ili 3' kraju ST2 kodirajuće sekvence proteina ST2; sekvenca oligonukleotida kodira poliHis (kao što je hexaHis), ili drugu „oznaku“ kao što su FLAG, HA (hemaglutinin virus gripa) ili myc, za koje postoje komercijalno dostupna antitela. Ova oznaka se obično spaja sa polipeptidom nakon ekspresije polipeptida i može da posluži kao sredstvo za afinitetno prečišćavanje ili detekciju proteina koji vezuje ST2 antigen iz ćelije domaćina. Prečišćavanje afiniteta može se postići, na primer, hromatografijom na koloni korišćenjem antitela protiv oznake kao matrice afiniteta. Po želji, oznaka se može naknadno ukloniti iz prečišćenog proteina koji vezuje ST2 antigen na različite načine, kao što je korišćenje određenih peptidaza za deljenje.

[0202] Flankirajuće sekvence mogu biti homologne (tj., od iste vrste i/ili soja kao i ćelija domaćina), heterologne (tj. od vrste koja nije vrsta ćelije domaćina ili soj), hibridne (tj. kombinacija bočnih sekvenci više nego jedan izvor), sintetičke ili izvorne. Kao takav, izvor bočne sekvence može biti bilo koji prokariotski ili eukariotski organizam, bilo koji organizam kičmenjaka ili beskičmenjaka ili bilo koja biljka, pod uslovom da bočna sekvenca funkcioniše u mašineriji ćelije domaćina i da je može aktivirati.

[0203] Bočne sekvence korisne u vektorima predmetnog pronalaska mogu se dobiti bilo kojim od nekoliko dobro poznatih postupaka. Tipično, bočne sekvence ovde korisne prethodno su identifikovane mapiranjem i/ili restrikcionom digestijom endonukleaze i na taj način se mogu izolovati iz odgovarajućeg izvora tkiva korišćenjem odgovarajućih restrikcionih endonukleaza. U nekim slučajevima može biti poznata puna nukleotidna sekvenca bočne sekvence. Ovde se bočna sekvenca može sintetizovati upotrebom ovde opisanih postupaka za sintezu ili kloniranje nukleinske kiseline.

1

[0204] Bez obzira da li je poznat ceo ili samo deo bočne sekvence, može se dobiti upotrebom lančane reakcije polimeraze (PCR) i/ili skriningom genomske biblioteke pogodnom sondom, kao što je oligonukleotidni i/ili fragment bočne sekvence, iz iste ili druge vrste. Ako bočna sekvenca nije poznata, fragment DNK koji sadrži bočnu sekvencu može biti izolovan iz većeg dela DNK koji može sadržavati, na primer, kodirajuću sekvencu ili čak neki drugi gen ili gene. Izolacija se može postići restrikcionom digestijom endonukleaze da bi se proizveo odgovarajući fragment DNK, nakon čega sledi izolacija prečišćavanjem agaroznim gelom, Qiagen® hromatografijom na koloni (Chatsworth, CA) ili drugim postupcima poznatim stručnjaku. Izbor pogodnih enzima za postizanje ove svrhe biće lako očigledan prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.

[0205] Poreklo replikacije je tipično deo onih komercijalno kupljenih prokariotskih vektora ekspresije, a poreklo pomaže u pojačavanju vektora u ćeliji domaćinu. Ako izabrani vektor ne sadrži poreklo mesta replikacije, može se hemijski sintetizovati na osnovu poznate sekvence i povezati u vektor. Na primer, poreklo replikacije iz plazmida pBR322 (New England Biolabs, Beverli, MA) pogodno je za većinu gram negativnih bakterija i različitog virusnog porekla (npr., SV40, polioma, adenovirus, virus vezikularnog stomatitusa (VSV) ili papiloma virusi kao što su HPV ili BPV) korisni su za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Generalno, poreklo replikacione komponente nije potrebno za vektore ekspresije sisara (na primer, poreklo SV40 se često koristi samo zato što sadrži i rani promoter virusa).

[0206] Terminalna sekvenca transkripcije se obično nalazi 3' do kraja regiona za kodiranje polipeptida i služi za završetak transkripcije. Obično je završna sekvenca transkripcije u prokariotskim ćelijama fragment bogat G-C-om praćen poli-T sekvencom. Iako se sekvenca lako klonira iz biblioteke ili čak komercijalno kupuje kao deo vektora, ona se takođe može lako sintetizovati upotrebom postupaka za sintezu nukleinske kiseline, kao što su ovde opisane.

[0207] Markerski gen koji se može odabrati, kodira protein koji je potreban za opstanak i rast ćelije domaćina koja se uzgaja u podlozi za selektivnu kulturu. Tipični selekcioni marker geni kodiraju proteine koji (a) pružaju rezistenciju na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, tetraciklin ili kanamicin za prokariotske ćelije domaćina; (b) dopunjuju auksotrofne nedostatke ćelije; ili (c) snabdevaju kritičnim hranljivim sastojcima koji nisu dostupni iz složenih ili definisanih podloga. Specifični markeri koji se mogu izabrati su gen rezistencije na kanamicin, gen rezistencije na ampicilin i gen rezistencije na tetracikline. Povoljno je da se gen otpornosti na neomicin takođe može koristiti za selekciju u prokariotskim i eukariotskim ćelijama domaćina.

[0208] Drugi genetički odabrani geni mogu se koristiti za pojačavanje gena koji će biti eksprimiran. Amplifikacija je postupak u kojem se geni koji su potrebni za proizvodnju proteina kritičnog za rast ili preživljavanje ćelija ponavljaju u tandemu unutar hromozoma uzastopnih generacija rekombinantnih ćelija. Primeri pogodnih markera za odabir za ćelije sisara uključuju dihidrofolat reduktazu (DHFR) i gene bez timidin kinaze bez promotora. Transformanti ćelija sisara se stavljaju pod selekcioni pritisak pri čemu su samo transformanti jedinstveno prilagođeni da prežive zahvaljujući selektivnom genu koji je prisutan u vektoru. Selekcioni pritisak se nameće kultivacijom transformisanih ćelija pod uslovima u kojima se koncentracija selekcionog sredstva u medijumu sukcesivno povećava, što dovodi do amplifikacije selektivnog gena i DNK koji kodira drugi gen, kao što je antitelo koje vezuje antigen. koji se vezuje za ST2 polipeptid. Kao rezultat, povećane količine polipeptida, poput proteina koji se vezuje za ST2, sintetišu se iz amplificirane DNK.

[0209] Mesto vezivanja ribozoma je obično neophodno za pokretanje translacije rnRNK i karakteriše ga sekvenca Shine-Dalgarno (prokarioti) ili Kozak sekvenca (eukarioti). Element se obično nalazi 3' do promotora i 5' kodirajuće sekvence polipeptida koji treba eksprimirati. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više kodirajućih regiona mogu biti operativno povezani sa unutrašnjim mestom vezivanja ribozoma (IRES), omogućavajući prevod dva otvorena okvira za čitanje iz jednog RNK transkripta.

[0210] U nekim slučajevima, na primer gde je glikozilacija poželjna u sistemu ekspresije eukariotske ćelije domaćina, može se manipulisati različitim pre- ili posledicama da bi se poboljšala glikozilacija ili prinos. Na primer, neko može da izmeni mesto cepanja peptidaze određenog signalnog peptida ili da dodaje prosekvence, koje takođe mogu uticati na glikozilaciju. Konačni proteinski proizvod može imati na položaju -1 (u odnosu na prvu aminokiselinu zrelog proteina) jednu ili više dodatnih aminokiselina koje nastaju ekspresijom, a koje možda nisu u potpunosti uklonjene. Na primer, konačni proteinski proizvod može imati jedan ili dva aminokiselinska ostatka koja se nalaze na mestu deljenja peptidaze, vezana za amino-kraj. Alternativno, upotreba nekih mesta deljenja enzima može rezultirati u neznatno skraćenom obliku željenog polipeptida, ako se enzim preseca na takvoj oblasti unutar zrelog polipeptida.

[0211] Vektori ekspresije i kloniranja predmetnog pronalaska će obično sadržati promoter koji je prepoznat od strane organizma domaćina i koji je operativno povezan sa molekulom koji kodira antigen ST2 vezujući

2

protein. Promotori su ne prepisane sekvence smeštene uzvodno (tj.5') do početnog kodona strukturnog gena (obično unutar oko 100 do 1000 bp) koji kontrolišu transkripciju strukturnog gena. Promoteri su konvencionalno grupisani u jednu od dve klase: inducibilni promoteri i konstitutivni promoteri. Inducibilni promoteri pokreću povećane nivoe transkripcije iz DNK pod njihovom kontrolom kao odgovor na neke promene u uslovima kulture, kao što su prisustvo ili odsustvo hranljivih sastojaka ili promena temperature. Konstitutivni promoteri, s druge strane, uniformno prepisuju gen za koji su operativno povezani, odnosno sa malo ili nimalo kontrole nad ekspresijom gena. Veliki broj promotera, prepoznat od različitih potencijalnih ćelija domaćina, dobro je poznat. Pogodni promoter je operativno povezan sa DNK koji kodira teški ili laki lanac koji sadrži protein ST2 antigen koji se vezuje za pronalazak uklanjanjem promotera iz izvorne DNK restriktivnim varenjem enzima i ubacivanjem željene promoterske sekvence u vektor.

[0212] Pogodni promoteri za upotrebu sa domaćinima kvasca takođe su dobro poznati u tehnici. Poboljšivači kvasca se povoljno koriste sa promotorima kvasca. Pogodni promotori za upotrebu sa ćelijama domaćina sisara su dobro poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na, one dobijene iz genoma virusa kao što su virus poliome, virus ptica kukica, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), virus papiloma goveda, virus sarkoma ptičice, citomegalovirus, retrovirusi, virus hepatitisa-B i najpoželjnije Simian Virus 40 (SV40). Ostali pogodni promoteri sisara uključuju heterologne promotere sisara, na primer, promotere toplotnog šoka i promoter aktina.

[0213] Dodatni promoteri koji mogu biti od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na: SV40 rani promoter (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); CMV promoter (Thomsen i dr., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A.81:659-663); promoter sadržan u 3' dugom terminalnom ponavljanju virusa sarkoma Rous (Yamamoto i dr., 1980, Cell 22:787-797); promoter herpes timidin kinaze (Wagner i dr., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

78:1444-1445); promoter i regulatorne sekvence metalotionin gena Prinster i dr., 1982, Nature 296:39-42); i prokariotski promoteri kao što je beta-laktamaza promoter (Villa-Kamaroff i dr., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.75:3727-3731); ili tac promoter (DeBoer i dr., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.80:21-25). Takođe su zanimljivi sledeći regioni za kontrolu transkripcije životinja, koji pokazuju specifičnost tkiva i koji su korišćeni kod transgenskih životinja: kontrolni region gena elastaze I koji je aktivan u acinarnim ćelijama pankreasa (Swift i dr., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz i dr., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.

50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); region za kontrolu gena za insulin koji je aktivan u beta ćelijama pankreasa (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); kontrolni region gena za imunoglobulin koji je aktivan u limfoidnim ćelijama (Grosschedl i dr., 1984, Cell 38:647-658; Adames i dr., 1985, Nature 318:533-538; Alexander i dr., 1987, Mol. Cell. Biol.7:1436-1444); region za kontrolu virusa tumora dojke miša koji je aktivan u testisima, dojkama, limfoidnim i mastocitima (Leder i dr., 1986, Cell 45:485-495); region za kontrolu gena albumina koji je aktivan u jetri (Pinkert i dr., 1987, Genes and Devel. 1 :268-276); alfa-fetoprotein gen za kontrolu gena koji je aktivan u jetri (Krumlauf i dr., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer i dr., 1987, Science 253:53-58); alfa 1-antitripsin kontrolni region koji je aktivan u jetri (Kelsey i dr., 1987, Genes and Devel.1:161-171); region za kontrolu gena beta-globina koji je aktivan u mijeloidnim ćelijama (Mogram i dr., 1985, Nature 315:338-340; Kollias i dr., 1986, Cell 46:89-94); region za kontrolu gena osnovnog proteina mijelina koji je aktivan u ćelijama oligodendrocita u mozgu (Readhead i dr., 1987, Cell 48:703-712); miozinlaki lanac-2 gen za kontrolu regiona koji je aktivan u skeletnom mišiću (Sani, 1985, Nature 314:283-286); i region kontrole gena za gonadotropni oslobađajući hormon koji je aktivan u hipotalamusu (Mason i dr., 1986, Science 234:1372-1378).

[0214] Sekvenca pojačivača može se umetnuti u vektor kako bi se povećala transkripcija DNK koja kodira laki lanac ili teški lanac koji sadrži ST2 protein koji vezuje antigen prema pronalasku od strane viših eukariota. Pojačivači su elementi DNK koji deluju na cis, obično dužine oko 10-300 bp, i koji deluju na promoter da bi povećali transkripciju. Poboljšivači su relativno orijentacioni i nezavisno od položaja, jer su pronađeni na položajima 5' i 3' prema jedinici transkripcije. Poznato je nekoliko pojačivačkih sekvenci dostupnih iz sisara (npr., globin, elastaza, albumin, alfa-feto-protein i inzulin). Međutim, obično se koristi pojačivač virusa. SV40 pojačivač, pojačivač citomegalovirusnog ranog promotera, pojačivač poliome i pojačivač adenovirusa poznati su u oblasti primera za poboljšanje elemenata za aktiviranje eukariotskih promotera. Iako pojačivač može biti smešten u vektoru bilo 5' ili 3' do kodirajuće sekvence, on se obično nalazi na mestu 5' od promotera. Sekvenca koja kodira odgovarajuću izvornu ili heterolognu signalnu sekvencu (vodeća sekvenca ili signalni peptid) može se ugraditi u ekspresijski vektor, da bi se promovisalo vanćelijsko lučenje antitela. Izbor signalnog peptida ili vođe zavisi od vrste ćelija domaćina u kojima će antitelo biti proizvedeno, a heterologna signalna sekvenca može zameniti izvornu signalnu sekvencu. Primeri signalnih peptida koji su funkcionalni u ćelijama domaćina sisara uključuju sledeće: signalna sekvenca za interleukin-7 (IL-7) opisana u patentnu SAD br. 4,965,195; signalna sekvenca za receptor za interleukin-2 opisana u Cosman i dr., 1984, Nature 312:768; signalni peptid receptora za interleukin-4 opisan u EP Patent br.0367566; opisan u signalnom peptidu receptora interleukin-1 tipa i Patent SAD br.4,968,607; signalni peptid receptora interleukin-1 tipa II opisan u EP Patent br.0460 846.

[0215] Vektor može sadržati jedan ili više elemenata koji olakšavaju ekspresiju kada je vektor integrisan u genom ćelije domaćina. Primeri uključuju element EASE (Aldrich i dr.2003 Biotechnol Prog.19:1433-38) i region za pričvršćivanje matrice (MAR). MAR posreduju u strukturnoj organizaciji hromatina i mogu izolovati integrisani vektor od efekta „položaja“. Stoga su MAR posebno korisni kada se vektor koristi za stvaranje stabilnih transfektanata. U oblasti tehnike su poznate brojne prirodne i sintetičke nukleinske kiseline, npr., Pat. SAD br.6,239,328; 7,326,567; 6,177,612; 6,388,066; 6,245,974; 7,259,010; 6,037,525; 7,422,874; 7.129.062.

[0216] Ekspresijski vektori prema pronalasku mogu se konstruisati od polaznog vektora, kao što je komercijalno dostupan vektor. Takvi vektori mogu ili ne moraju sadržati sve željene bočne sekvence. Tamo gde jedna ili više bočnih sekvenci koje su ovde opisane već nisu prisutne u vektoru, mogu se pojedinačno dobiti i povezati u vektor. Postupci koji se koriste za dobijanje svake bočne sekvence dobro su poznati stručnjaku u ovoj oblasti.

[0217] Nakon što je vektor konstruisan i molekul nukleinske kiseline koji kodira laki lanac, teški lanac ili laki lanac i teški lanac koji sadrži sekvencu koja vezuje ST2 antigen je umetnut na odgovarajuće mesto vektora, može se ubaciti dovršeni vektor u pogodnu ćeliju domaćina za amplifikaciju i/ili ekspresiju polipeptida. Transformacija vektora ekspresije za protein ST2 koji vezuje antigen u odabranu ćeliju domaćina može se postići poznatim postupcima , uključujući transfekciju, infekciju, ko-taloženje kalcijum-fosfata, elektroporaciju, mikroinjekciju, lipofekciju, transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom ili druge poznate tehnike. Odabrani postupak će delom biti funkcija vrste ćelije domaćina koja će se koristiti. Ovi postupci i drugi pogodni postupci dobro su poznati stručnjaku i navedeni su, na primer, u Sambrook i dr., 2001, supra.

[0218] Ćelija domaćin, kada je kultivisana u odgovarajućim uslovima, sintetiše protein koji vezuje ST2 antigen i koji se naknadno može prikupiti iz medijuma za kulturu (ako ga ćelija domaćin izlučuje u podlogu) ili direktno iz ćelije domaćina koji ga proizvodi (ako se ne luči). Izbor odgovarajuće ćelije domaćina zavisiće od različitih faktora, kao što su željeni nivoi ekspresije, modifikacije polipeptida koji su poželjni ili potrebni za aktivnost (kao što je glikozilacija ili fosforilacija) i lakoća savijanja u biološki aktivni molekul. Ćelija domaćina može biti eukariotska ili prokariotska.

[0219] Ćelijske linije sisara dostupne kao domaćini za ekspresiju dobro su poznate u tehnici i uključuju, ali nisu ograničene na ovekovečene ćelijske linije dostupne iz Američke zbirke tipičnih kultura (ATCC) i bilo koje ćelijske linije korišćene u ekspresionom sistemu poznatom u struci. se koristi za pravljenje rekombinantnih polipeptida predmetnog pronalaska. Generalno, ćelije domaćina se transformišu sa rekombinantnim ekspresijskim vektorom koji sadrži DNK koja kodira željeni polipeptid anti-ST2 antitela. Među ćelijama domaćinima koje se mogu koristiti su prokarioti, kvasci ili više eukariotske ćelije. Prokarioti uključuju gram negativne ili gram-pozitivne organizme, na primer E. coli ili bacile. Više eukariotske ćelije uključuju ćelije insekata i utvrđene ćelijske linije porekla sisara. Primeri pogodnih ćelijskih linija domaćina sisara uključuju COS-7 liniju ćelija bubrega majmuna (ATCC CRL 1651) (Gluzman i dr., 1981, Cell 23:175), L ćelije, 293 ćelije, C127 ćelije, 3T3 ćelije (ATCC CCL 163), ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili njihovi derivati poput Veggie CHO i srodnih ćelijskih linija koje rastu u podlozi bez seruma(Rasmussen i dr., 1998, Cytotechnology 28: 31), HeLa ćelije, ćelijske linije BHK (ATCC CRL 10) i ćelijska linija CVI/EBNA izvedene iz ćelijske linije bubrega afričkog zelenog majmuna (ATCC CCL 70) kako je opisano u McMahan i dr., 1991, EMBO J.10: 2821, ćelije humanog embrionalnog bubrega kao što su 293, 293 EBNA ili MSR 293, humane epidermalne A431 ćelije, humane ćelije Colo205, druge transformisane ćelijske linije primata, normalne diploidne ćelije, sojevi ćelija izvedeni iz in vitro kulture primarnog tkiva, primarni eksplantati, HL-60 , U937, HaK ili Jurkat ćelije. Po želji, ćelijske linije sisara kao što su HepG2/3B, KB, NIH 3T3 ili S49, na primer, mogu se koristiti za ekspresiju polipeptida kada je poželjno da se polipeptid koristi u različitim testovima za transdukciju signala ili reporter. Alternativno, moguće je proizvesti polipeptid u nižim eukariotima poput kvasca ili u prokariotima kao što su bakterije. Pogodni kvasci uključuju Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, sojeve Kluyveromyces, Candida ili bilo koji soj kvasca koji je sposoban da ekspresuje heterologne polipeptide. Pogodni sojevi bakterija uključuju Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ili bilo koji bakterijski soj sposoban da ekspresuje heterologne polipeptide. Ako je polipeptid napravljen od kvasca ili bakterija, možda će biti poželjno modifikovati polipeptid koji se u njemu proizvodi, na primer fosforilacijom ili glikozilacijom odgovarajućih mesta, kako bi se dobio funkcionalni polipeptid. Takve kovalentne vezanosti mogu se izvršiti poznatim hemijskim ili enzimatskim postupcima. Polipeptid se takođe može proizvesti operativnim povezivanjem izolovane nukleinske kiseline

4

ovog pronalaska sa pogodnim kontrolnim sekvencama u jednom ili više ekspresionih vektora insekata, i korišćenjem sistema za ekspresiju insekata. Materijali i postupci za sisteme ekspresije bakulovirusa/ćelija insekata komercijalno su dostupni u obliku kompleta, na primer, Invitrogen, San Diego, CA, SAD. (MaxBac® komplet), i takvi postupci su dobro poznati u stanju tehnike, kao što je opisano u Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), i Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Sistemi za prevođenje bez ćelija takođe se mogu koristiti za proizvodnju polipeptida koristeći RNK dobijene iz ovde prikazanih konstrukata nukleinske kiseline. Odgovarajući vektori kloniranja i ekspresije za upotrebu sa ćelijskim domaćinima bakterija, gljivica, kvasca i sisara opisani su od strane Pouwels i dr. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985). Ćelija domaćin koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu pronalaska, poželjno operativno povezana sa najmanje jednom kontrolnom sekvencom ekspresije, je "rekombinantna ćelija domaćina".

[0220] U određenim otelotvorenjima, ćelijske linije mogu biti odabrane određivanjem koje ćelijske linije imaju visok nivo ekspresije i konstitutivno proizvode proteine koji vezuju antigen sa svojstvima vezivanja ST2. U još jednom otelotvorenju, može se odabrati ćelijska linija iz B ćelijske loze koja ne stvara sopstveno antitelo, ali ima sposobnost stvaranja i sekrecije heterolognog antitela.

ST2 antigen vezujući proteini ćelijske deplecije

[0221] U poželjnim primerima, ovde opisani protein za vezivanje antigena ST2 vezuje ST2 i inhibira vezivanje IL-33, čime smanjuje signalizaciju posredovanu IL-33 u ćelijama koje eksprimiraju ST2. U određenim primerima, međutim, ST2 protein koji vezuje antigen vezuje ST2 i cilja na ćeliju koja eksprimira ST2 radi iscrpljivanja. Naravno, ST2 protein koji vezuje antigen može da inhibira vezivanje IL-33 i cilja ST2 ćeliju radi iscrpljivanja.

[0222] Proteini koji vezuju ST2 antigen koji iscrpljuju ćelije su posebno korisni za lečenje bolesti povezanih sa prekomernom ekspresijom ST2, npr. inflamatorne bolesti ili tumora koji eksprimira ST2. Metode ciljanja ćelija sa proteinima koji vezuju antigen, npr. antitela, dobro su poznata u stanju tehnike. Primeri otelotvorenja su razmatrani u nastavku.

Konjugati antitelo-lek

[0223] Otelotvorenja pronalaska uključuju konjugate lekova sa antitelima (ADC). Generalno, ADC sadrži antitelo konjugovano sa hemoterapeutskim sredstvom, npr. citotoksičnim sredstvom, citostatikom, toksinom ili radioaktivnim sredstvom. Molekul veznika se može koristiti za konjugaciju leka sa antitelom. Širok spektar linkera i lekova korisnih u ADC tehnologiji poznat je u tehnici i može se koristiti u otelotvorenjima predmetnog pronalaska. (Videti US20090028856; US2009/0274713; US2007/0031402; WO2005/084390; WO2009/099728; US5208020; US5416064; US5475092; 5,585,499; 6,436,931; 6,372,738; i 6340701). Veznici

[0224] U određenim otelotvorenjima, ADC sadrži veznik koji se sastoji iz jedne ili više komponenti veznika. Primerni sastojci veznika uključuju 6-maleimidokaproil, maleimidopropanoil, valin-citrulin, alaninfenilalanin, p-aminobenziloksikarbonil i one koji su rezultat konjugacije sa reagensima veznika, uključujući, ali bez ograničenja, N-sukcinimidil 4-(2-piridiltio)pentanoat ("SPP"), N-sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1 karboksilat ("SMCC", ovde takođe označen kao "MCC"), i N-sukcinimidil (4-jodo-acetil) aminobenzoat ("SIAB ").

[0225] Veznici mogu biti "deljivi" veznik ili "nedeljiv" veznik (Ducry and Stump, Bioconjugate Chem.2010, 21, 5-13) Deljivi veznici dizajnirani su da oslobađaju lek kada su podvrgnuti određenim faktorima okoline, npr., kada su internalizovani u ciljnu ćeliju. Deljivi veznici uključuju veznike labilne na kiselinu, veznike osetljive na proteazu, fotolabilne veznike, dimetil veznik ili veznik koji sadrži disulfid. Nedeljivi veznici imaju tendenciju da ostanu kovalentno povezani sa najmanje jednom aminokiselinom antitela i leka nakon internalizacije i razgradnje unutar ciljne ćelije. Primerni nedeljivi veznik je MCC.

Lekovi

[0226] U određenim otelotvorenjima, antitelo je konjugovano sa hemoterapeutskim sredstvom. Primeri hemoterapeutika uključuju alkilaciona sredstva, kao što su tiotepa i ciklofosfamid (CYTOXAN.TM.); alkil sulfonati kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini, kao što su benzodopa, karbokuon, meturedopa i uredopa; etilenimini i metilamelamini, uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenini (posebno bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analogni topotekan); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegove sintetičke analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); kriptoficini (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CBI-TMI); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotne iperiti kao što su hlorambucil, hlomafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil senf; nitrosuree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotici, kao što su enediine antibiotici (npr., kaliheamicin, posebno kaliheamicin. gama1 i kaliheamicin teta I, videti, npr., Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994); dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodni hromoproteini enedin antibiotički hromofori), aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin; hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolinodoksorubicin i deoksi doksorubicin, ezoksidoksorubicin, ester mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tuberkidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti, poput metotreksata i 5-fluorouracila (5-FU); analozi folne kiseline, kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinski analogi, kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideokuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU; androgeni, poput kalusterona, dromostanolon propionata, epitiostanola, mepitiostan, testolakton; antiadrenali, kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljač folne kiseline, kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatreksat; defofamin; demekolcin; diazikuon; elfomitin; eliptinijum acetat; epotilon; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; majtansinoidi, kao što su majtansin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK.RTM.; razoksan; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikuon; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; trioteceni (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindesin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoidi, npr. paklitaksel (TAXOL.TM., Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i doketaksel (TAXOTERE.RTM., Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); hlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novantron; teniposid; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilomitin (DMFO); retinoinska kiselina; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od iznad navedenih. Takođe su u ovu definiciju uključeni anti-hormonski agensi koji deluju da regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumore, kao što su anti-estrogeni, uključujući na primer tamoksifen, raloksifen, aromatazu koja inhibira 4(5)-imidazol, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LI117018, onapriston i toremifen (Fareston); i anti-androgeni, kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; siRNK i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od iznad navedenih. Ostali hemoterapeutski agensi koji se mogu koristiti sa predmetnim pronalaskom obelodanjeni su u objavi SAD br.20080171040 ili objavi SAD br.20080305044.

[0227] Smatra se da antitelo može biti konjugovano sa dva ili više različitih hemoterapeutskih sredstava ili farmaceutski sastav može sadržati smešu antitela gde je komponenta antitela identična, osim što je konjugovana sa drugim hemoterapeutskim sredstvom. Ovakva otelotvorenja mogu biti korisna za ciljanje više bioloških puteva sa ciljanom ćelijom.

[0228] U poželjnim otelotvorenjima, ADC sadrži antitelo konjugovano na jedan ili više majtansinoidnih molekula, koji su mitotski inhibitori koji deluju inhibiranjem tubulinske polimerizacije. Majtansinoidi, uključujući različite modifikacije, su opisani u Pat. SAD br. 3,896,111; 4,151,042; 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 4,371,533; i WO 2009/099728. Delovi majtansinoidnih lekova mogu se izolovati iz prirodnih izvora, proizvesti rekombinantnom tehnologijom ili pripremiti sintetički. Primerni majtansinoidi uključuju C-19-dehloro (pat. SAD br.4256746), C-20-hidroksi (ili C-20-demetil) /- C-19-dehloro (Pat. SAD br.4307016 i 4361650), C-20-demetoksi (ili C-20-aciloksi (-OCOR), /- dehloro (Pat. SAD br. 4294757), C-9-SH (Pat. SAD br.

4,424,219), C-14-alkoksimetil (demetoksi/CH2OR) (Pat. SAD br. 4,331,598), C-14-hidroksimetil ili aciloksimetil (CH2OH ili CH2OAc) (Pat. SAD br. 4,450,254), C-15-hidroksi/aciloksi (Pat. SAD br.

4,364,866), C-15-metoksi (Pat. SAD br. 4,313,946 i 4,315,929), C-18-N-demetil (Pat. SAD br. 4,362,663 i 4,322,348), i 4,5-deoksi (Pat. SAD No.4,371,533).

[0229] Kao položaj povezivanja mogu se koristiti različiti položaji na majtanzinoidnim jedinjenjima, u zavisnosti od vrste željene veze. Na primer, za formiranje esterske veze, položaj C-3 koji ima hidroksilnu grupu, položaj C-14 modifikovan hidrozimetilom, položaj C-15 modifikovan hidroksil grupom i položaj C-20 koji ima hidroksil grupu su svi pogodni (pat. SAD. br.5208020, RE39151, i 6913748; patentna prijava SAD. obj. Nos.20060167245 i 20070037972, i WO 2009099728).

[0230] Poželjni majtansinoidi uključuju one koji su u struci poznati kao DM1, DM3, i DM4 (Pat. SAD prijava. obj. Nos.2009030924 i 20050276812).

[0231] ADC koji sadrže majtansinoide, postupci pravljenja takvih ADC i njihova terapijska upotreba su obelodanjeni u patentu SAD br. 5208020 i 5416064, Pat. SAD prijava. obj. br. 20050276812, i WO 2009099728. Veznici koji su korisni za pravljenje majtansinoidnih ADC-ova su poznati u stanju tehnike (Pat. SAD br. 5208020 i Pat. SAD prijava. obj. Nos. 2005016993 i 20090274713). Majtansinoid AD koji sadrže SMCC veznik mogu se pripremiti kako je obelodanjeno u Pat. objavi SAD br.2005/0276812.

Antitela poboljšana funkcijom efektora

[0232] Jedna od funkcija Fc dela antitela je da komunicira sa imunološkim sistemom kada antitelo vezuje cilj. Ovo se smatra „efektorskom funkcijom“. Komunikacija dovodi do ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), ćelijske fagocitoze zavisne od antitela (ADCP) i/ili komplementarne zavisne citotoksičnosti (CDC). ADCC i ADCP se posreduju vezivanju Fc na Fc receptore na površini ćelija imunološkog sistema. CDC je posredovan vezivanjem Fc za proteine sistema komplementa, npr., Clq.

[0233] IgG podklase variraju u svojoj sposobnosti da posreduju efektorske funkcije. Na primer, IgG1 je mnogo superiorniji od IgG2 i IgG4 u posredovanju ADCC i CDC. Prema tome, u otelotvorenjima gde je ćelija koja eksprimira ST2 ciljana za uništavanje, bilo bi poželjno antitelo protiv ST2 IgGl.

[0234] Efektorska funkcija antitela može se povećati ili smanjiti uvođenjem jedne ili više mutacija u Fc. Otelotvorenja pronalaska uključuju proteine koji vezuju antigen, na primer, antitela, koja imaju Fc konstruiran da poveća efektorsku funkciju (SAD 7,317,091 i Strohl, Curr. Opin. Biotech., 20:685-691, 2009). Primerni molekuli IgG1 Fc koji imaju povećanu efektorsku funkciju uključuju (na osnovu šeme numerisanja Kabat) oni koji imaju sledeće zamene:

S239D/I332E

S239D/A330S/I332E

S239D/A330L/I332E

S298A/D333A/K334A

P247I/A339D

P247I/A339Q

D280H/K290S

D280H/K290S/S298D

D280H/K290S/S298V

F243L/R292P/Y300L

F243L/R292P/Y300L/P396L

F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L

G236A/S239D/I332E

K326A/E333A

K326W/E333S

K290E/S298G/T299A

K290N/S298G/T299A

K290E/S298G/T299A/K326E

K290N/S298G/T299A/K326E

[0235] Sledeća otelotvorenja ovog pronalaska uključuju proteine koji vezuju antigen, na primer, antitela, koja imaju Fc konstruisan da smanji funkciju efektora. Primerni molekuli Fc koji imaju smanjenu efektorsku funkciju uključuju (na osnovu šeme numerisanja Kabat) oni koji imaju sledeće zamene:

N297A (IgG1)

L234A/L235A (IgG1)

V234A/G237A (IgG2)

L235A/G237A/E318A (IgG4)

H268Q/V309L/A330S/A331S (IgG2)

C220S/C226S/C229S/P238S (IgG1)

C226S/C229S/E233P/L234V/L235A (IgG1)

L234F/L235E/P331S (IgG1)

S267E/L328F (IgG1)

[0236] Drugi postupak povećanja efektorske funkcije proteina koji sadrže IgG Fc je smanjenje fukozilacije Fc. Uklanjanje jezgra fukoze iz dvojakih oligosaharida složenog tipa prikačenih za Fc znatno je povećalo ADCC efektorsku funkciju bez promene vezivanja antigena ili CDC efektorske funkcije. Poznato je nekoliko načina za smanjenje ili ukidanje fukozilacije molekula koji sadrže Fc, npr., antitela. Oni uključuju rekombinantnu ekspresiju u određenim ćelijskim linijama sisara, uključujući FUT8 ćelijsku liniju izbacivanja, varijantu CHO linije Lec13, ćelijsku liniju hibroma štakora YB2/0, ćelijsku liniju koja sadrži malu interferirajuću RNK, posebno protiv FUT8 gena, i ćelijsku liniju koja koeksprimira β- 1,4-N-acetilglukozaminiltransferaza III i Goldžijeva α-manosidaza II. Alternativno, molekul koji sadrži Fc može da se eksprimira u ćeliji ne-sisara kao što je biljna ćelija, kvasac ili prokariotska ćelija, npr., E. coli. Prema tome, u određenim otelotvorenjima, sastav sadrži antitelo, na primer, Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10 ili Ab11 koje imaju smanjenu fukozilaciju ili joj uopšte nedostaje fukozilacija.

Farmaceutski sastavi

[0237] Patentna prijava takođe opisuje farmaceutski sastav koji sadrži terapeutski efikasnu količinu jednog ili više proteina koji vezuju antigen zajedno sa farmaceutski efikasnim razblaživačima, nosačem, rastvorom, emulgatorom, konzervansom i/ili adjuvansom. U određenim primerima, antigen vezujući protein je antitelo. Farmaceutski sastavi uključuju, ali nisu ograničene na, tečne, smrznute i liofilizovane sastave.

[0238] Poželjno je da materijali za formulaciju nisu toksični za primaoce u upotrebljenim dozama i koncentracijama. U specifičnim primerima, obezbeđeni su farmaceutski sastavi koji sadrže terapeutski efikasnu količinu proteina koji se vezuje za ST2, npr., antitelo koje vezuje ST2.

[0239] U određenim primerima, farmaceutski sastav može da sadrži materijale za formulaciju za modifikovanje, održavanje ili očuvanje, na primer, pH, osmolarnosti, viskoziteta, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili otpuštanja, adsorpcije ili penetracije sastava. U takvim otelotvorenjima, pogodni materijali za formulacije uključuju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin, prolin ili lizin); antimikrobna sredstva; antioksidanti (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogensulfit); puferi (kao što su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline); sredstva za punjenje (poput manitola ili glicina); helatorska sredstva (kao što je etilendiamin tetra sirćetna kiselina (EDTA)); sredstva za kompleksiranje (poput kofeina, polivinilpirolidona, beta-ciklodekstrina ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrina); punioci; monosaharidi; disaharidi; i drugi ugljeni hidrati (kao što su glukoza, manoza, dekstrini); proteini (kao što su albumin u serumu, želatina ili imunoglobulini); bojila, sredstva za poboljšanje ukusa i razređivanje; sredstva za emulgovanje; hidrofilni polimeri (poput polivinilpirolidona); polipeptidi niske molekularne mase; kontra-joni koji stvaraju so (kao što je natrijum); konzervansi (kao što su benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarači (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerni alkoholi (kao što su manitol ili sorbitol); sredstva za suspendovanje; surfakanti ili sredstva za vlaženje (kao što su pluronici, PEG, esteri sorbitana, polisorbati kao što su polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); sredstva za povećanje stabilnosti (poput saharoze ili sorbitola); sredstva za povećanje toničnosti (kao što su halogenidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol); sredstva za prenošenje; razblaživači; ekscipijensi i/ili farmaceutski adjuvansi. Videti, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

[0240] U određenim primerima, optimalni farmaceutski sastav će odrediti stručnjak u oblasti u zavisnosti, na primer, od predviđenog načina davanja, formata isporuke i željene doze. Videti, na primer, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. U određenim primerima, takve smeše mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu in vivo oslobađanja i brzinu klirensa in vivo klirensa antigen vezujućeg proteina ovog pronalaska. U određenim primerima, primarno sredstvo za prenošenje ili nosač u farmaceutskom sastavu može biti vodene ili nevodene prirode. Na primer, pogodan nosač ili nosač može biti voda za injekcije, fiziološki rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, možda dopunjena drugim materijalima uobičajenim u sastavima za parenteralno davanje. Neutralni fiziološki rastvor ili fiziološka otopina pomešani sa albuminom u serumu su još primer uzorka. U specifičnim primerima, farmaceutski sastavi sadrže Tris pufer sa oko pH 7.0-8.5, ili acetat pufer od oko pH 4.0-5.5, i mogu dalje da sadrže sorbitol ili odgovarajuću zamenu za njega. U određenim primerima, sastavi proteina koji se vezuju za ST2 mogu se pripremiti za skladištenje mešanjem odabranog sastava željenog stepena čistoće sa opcionim formulacionim sredstvima (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) u obliku liofilizovane grudve ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim primerima, proizvod proteina koji vezuje ST2 za antigen može se formulisati kao liofilizat koristeći odgovarajuće pomoćne supstance kao što je saharoza.

[0241] Ovde opisani farmaceutski sastavi mogu se odabrati za parenteralno davanje. Alternativno, sastavi se mogu odabrati za inhalaciju ili za isporuku kroz digestivni trakt, kao što je oralno. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih sastava je u okviru veštine tehnike. Komponente formulacije su poželjno prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto davanja. U određenim otelotvorenjima, puferi se koriste za održavanje sastava na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH, tipično u opsegu pH od oko 5 do oko 8.

[0242] Kada se razmatra parenteralno davanje, terapeutski sastavi mogu se obezbediti u obliku peroralnu prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena koji sadrži željeni protein koji vezuje ST2 antigen u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Naročito pogodno sredstvo za parenteralno ubrizgavanje je sterilna destilovana voda u kojoj je protein ST2 koji vezuje antigen formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, pravilno očuvan. U određenim primerima, preparat može da uključuje formulaciju željenog molekula sa sredstvom, kao što su injekcije za mikrosfere, bioerodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što je polilaktična kiselina ili poliglikolna kiselina), perle ili lipozomi, koji mogu obezbediti kontrolisanu ili održivu puštanje proizvoda koji se može isporučiti depo injekcijom. U određenim primerima, hijaluronska kiselina se takođe može koristiti, što ima efekat unapređenja trajnog trajanja cirkulacije. U određenim primerima, uređaji za isporuku implantata leka mogu se koristiti za uvođenje željenog proteina koji vezuje antigen.

[0243] Farmaceutski sastavi se mogu formulisati za inhalaciju. U ovim primerima, proteini koji vezuju ST2 antigen su povoljno formulisani kao suvi prah za udisanje. U konkretnim primerima, rastvori za inhalaciju proteina koji vezuju ST2 antigen mogu takođe biti formulisani sa potisnim gasom za isporuku aerosola. U određenim primerima, rastvori se mogu raspršiti. Stoga su postupci pulmonarnog davanja i formulacije dalje opisane u međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US94/001875, koja opisuje pulmonarnu isporuku hemijski modifikovanih proteina.

[0244] Takođe se razmatra da se formulacije mogu davati oralno. Proteini koji vezuju ST2 na ovaj način mogu se formulisati sa nosačima ili bez njih koji se uobičajeno koriste u mešanju čvrstih oblika doziranja kao što su tablete i kapsule. U određenim primerima, kapsula može biti dizajnirana da oslobađa aktivni deo formulacije na mestu u gastrointestinalnom traktu kada je bioraspoloživost povećana, a pred-sistemska degradacija smanjena. Mogu se uključiti dodatna sredstva koja olakšavaju apsorpciju proteina koji vezuje ST2 antigen. Takođe se mogu koristiti razblaživači, arome, voskovi sa niskom tačkom topljenja, biljna ulja, maziva, sredstva za suspendovanje, sredstva za raspadanje tableta i veziva.

[0245] Dodatni farmaceutski sastavi biće očigledni stručnjacima, uključujući formulacije koje uključuju proteine koji vezuju ST2 antigen u formulacijama sa odloženom ili kontrolisanom isporukom. Tehnike za formulisanje niza drugih sredstava za kontinuiranu ili kontrolisanu isporuku, kao što su nosači lipozoma, bioerodibilne mikročestice ili porozne perle i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, na primer, međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/US93/00829, koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih sastava. Preparati sa odloženim oslobađanjem mogu da uključuju polupropusne polimerne matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr., filmova ili mikrokapsula. Matrice sa odloženim oslobađanjem mogu uključivati poliestere, hidrogelove, polilaktide (kako je obelodanjeno u Pat. SAD br. 3,773,919 i Evropska patentna prijava br. EP 058481), kopolimeri L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman i dr., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli (2-hidroksietil-metakrilat) (Langer i dr., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech.

12:98-105), etilen vinil acetat (Langer i dr., 1981, supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibutirična kiselina (objava Evropske patentne prijave br.. EP 133,988). Sastavi sa odloženim oslobađanjem mogu takođe da uključuju lipozome koji se mogu dobiti bilo kojim od nekoliko postupaka poznatih u struci. Videti npr., Eppstein i dr., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; Objava Evropske patentne prijave br. EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

[0246] Farmaceutski sastavi koji se koriste za in vivo davanje se obično nude kao sterilni preparati. Sterilizacija se može postići filtracijom kroz sterilne membrane za filtriranje. Kada je sastav liofilizovan, sterilizacija pomoću ovog postupka može se sprovesti pre ili posle liofilizacije i rekonstitucije. Sastavi za parenteralno davanje mogu se čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Parenteralni sastavi se generalno stavljaju u ambalažu koja ima sterilni otvor za pristup, na primer, vreću za intravenski rastvor ili bočicu koja ima čep koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju.

[0247] Aspekti obelodanjivanja uključuju samopuferirajuće ST2 antigen-vezujuće proteinske formulacije, koje se mogu koristiti kao farmaceutski sastavi, kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 06138181A2 (PCT/US2006/022599).

[0248] Kao što je prethodno razmatrano, određeni primeri pružaju proteinske sastave za proteine koji vezuju ST2, naročito farmaceutske sastave za proteine koji se vezuju za ST2, koji pored ST2 sadrže i jedan ili više ekscipijenasa kao što su oni ilustrativno opisani u ovom odeljku i na drugom mestu. Ekscipijensi se u ovom pogledu mogu koristiti u širokom spektru svrha, kao što je prilagođavanje fizičkih, hemijskih ili bioloških svojstava formulacija, kao što je podešavanje viskoznosti, ili postupci pronalaska za poboljšanje efikasnosti ili za stabilizaciju takvih formulacije i procesi protiv razgradnje i kvarenja zbog, na primer, naprezanja koji se javljaju tokom proizvodnje, isporuke, skladištenja, pripreme pre upotrebe, davanja i nakon toga.

[0249] Na raspolaganju su razna izlaganja o materijalima za stabilizaciju i formulaciju proteina i metodama korisnim u ovom pogledu, kao što su Arakawa i dr., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick i dr., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution," u: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), i Randolph i dr., "Surfactant-protein interactions," Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), naročito u delovima koji se odnose na ekscipijense i postupke istih za samopuferirajuće proteinske formulacije u skladu sa trenutnim otkrićem, posebno u pogledu proteinskih farmaceutskih proizvoda i postupaka za veterinarsku i/ili humanu medicinsku upotrebu.

[0250] Soli se mogu koristiti u skladu sa određenim primerima za, na primer, podešavanje jonske snage i/ili izotoničnosti formulacije i/ili za poboljšanje rastvorljivosti i/ili fizičke stabilnosti proteina ili drugog sastojka sastava u skladu sa obelodanjivanjem.

[0251] Kao što je dobro poznato, joni mogu stabilizovati izvorno stanje proteina vezujući se za naelektrisane ostatke na površini proteina i štiteći naelektrisane i polarne grupe u proteinu i smanjujući snagu njihovih elektrostatičkih interakcija, atraktivnih i odbojnih interakcija. Joni takođe mogu stabilizovati denaturisano stanje proteina vezujući se naročito za denaturisane peptidne veze (-CONH) proteina. Dalje, jonska interakcija sa naelektrisanim i polarnim grupama u proteinu takođe može smanjiti intermolekularne elektrostatičke interakcije i, na taj način, sprečiti ili smanjiti agregaciju i nerastvorljivost proteina.

[0252] Jonske vrste se značajno razlikuju u efektima na proteine. Razvijen je niz kategoričkih rangiranja jona i njihovih efekata na proteine koji se mogu koristiti u formulisanju farmaceutskih sastava u skladu sa pronalaskom. Jedan primer je serija Hofmeister, koja rangira jonske i polarne nejonske rastvorene supstance njihovim efektom na konformacionu stabilnost proteina u rastvoru. Rastvorne materije koje se stabilizuju nazivaju se „kosmotropnim“. Destabilizujuće rastvorne materije nazivaju se „haotropnim“. Kosmotropi se obično koriste u visokim koncentracijama (npr., > 1 molarni amonijum sulfat) za taloženje proteina iz rastvora („usoljenje“). Haotropi se obično koriste za denaturisanje i/ili za rastvaranje proteina („soljenje“). Relativna efikasnost jona na „usoljavanje“ i „soljenje“ definiše njihov položaj u Hofmajsterovoj seriji.

[0253] Slobodne aminokiseline se mogu koristiti u formulacijama proteina koji vezuju ST2 kao sredstvo za povećanje volumena, stabilizatori i antioksidanti, kao i za druge standardne namene. Lizin, prolin, serin i alanin mogu se koristiti za stabilizaciju proteina u formulaciji. Glicin je koristan u liofilizaciji kako bi se osigurala pravilna struktura i svojstva kolača. Arginin može biti koristan za inhibiciju agregacije proteina, kako u tečnim, tako i u liofilizovanim formulacijama. Metionin je koristan kao antioksidans.

[0254] Polioli uključuju šećere, npr., manitol, saharozu i sorbitol i polihidrične alkohole, kao što su, na primer, glicerol i propilen glikol, i za svrhe ovde diskusije polietilen glikol (PEG) i srodne supstance. Polioli su kosmotropni. Oni su korisna sredstva za stabilizaciju u tečnim i liofilizovanim formulacijama za zaštitu proteina od procesa fizičke i hemijske razgradnje. Polioli su takođe korisni za prilagođavanje toničnosti formulacija.

[0255] Među poliolima koji su ovde korisni je manitol, koji se obično koristi za osiguravanje strukturne stabilnosti kolača u liofilizovanim formulacijama. Osigurava strukturnu stabilnost kolača. Obično se koristi sa lioprotektantom, npr., saharozom. Sorbitol i saharoza su među poželjnim sredstvima za prilagođavanje toničnosti i kao stabilizatori za zaštitu od stresova smrzavanja i odmrzavanja tokom transporta ili pripreme rasutih materija tokom proizvodnog procesa. Smanjujući šećeri (koji sadrže slobodne aldehidne ili ketonske grupe), poput glukoze i laktoze, mogu glikolirati površinske ostatke lizina i arginina. Prema tome, oni generalno nisu među poželjnim poliolima za upotrebu u skladu sa obelodanjivanjem. Pored toga, šećeri koji formiraju takve reaktivne vrste, kao što je saharoza, koja se hidrolizuje do fruktoze i glukoze pod kiselim

4

uslovima, i posledično dovodi do glikacije, takođe nije među poželjnim poliolima u ovom obelodanjivanju. PEG je koristan za stabilizaciju proteina i kao krioprotektant i ovde se može koristiti u tom pogledu.

[0256] Primeri ST2 formulacija proteina koji vezuju antigen dalje sadrže površinski aktivne supstance. Molekuli proteina mogu biti podložni adsorpciji na površini i denaturaciji i posledičnoj agregaciji na interfejsima vazduh-tečnost, čvrsta-tečnost i tečnost-tečnost. Ovi efekti se generalno skaliraju obrnuto od koncentracije proteina. Ove štetne interakcije se generalno skaliraju obrnuto u odnosu na koncentraciju proteina i obično se pogoršavaju fizičkim mešanjem, poput onog generisanog tokom otpreme i rukovanja proizvodom.

[0257] Surfaktanti se rutinski koriste za sprečavanje, minimiziranje ili smanjenje površinske adsorpcije. Korisni surfaktanti u pronalasku u ovom pogledu uključuju polisorbat 20, polisorbat 80, druge estere masnih kiselina sorbitan polietoksilata i poloksamer 188.

[0258] Surfaktanti se takođe često koriste za kontrolu konformacione stabilnosti proteina. Upotreba surfaktanta u ovom pogledu je specifična za proteine, jer će bilo koje dato površinski aktivno sredstvo stabilizovati neke proteine, a destabilizovati druge.

[0259] Polisorbati su podložni oksidativnoj razgradnji i često u isporuci sadrže dovoljne količine peroksida da izazovu oksidaciju bočnih lanaca ostataka proteina, posebno metionina. Shodno tome, polisorbate treba pažljivo koristiti, a kada se koriste, treba ih koristiti u najnižoj efikasnoj koncentraciji. S tim u vezi, polisorbati predstavljaju opšte pravilo da pomoćne supstance treba koristiti u najnižim efektivnim koncentracijama.

[0260] Primeri proteinskih formulacija za ST2 koje vezuju antigen dalje sadrže jedan ili više antioksidanata. Do neke mere štetna oksidacija proteina može se sprečiti u farmaceutskim formulacijama održavanjem odgovarajućeg nivoa ambijentalnog kiseonika i temperature i izbegavanjem izlaganja svetlosti. Antioksidativni pomoćni sastojci se takođe mogu koristiti za sprečavanje oksidativne razgradnje proteina. Među korisnim antioksidantima u ovom pogledu su redukciona sredstva, sredstva za uklanjanje kiseonika/slobodnih radikala i helatnih sredstava. Antioksidanti za upotrebu u terapijskim formulacijama proteina u skladu sa pronalaskom su poželjno rastvorljivi u vodi i održavaju svoju aktivnost tokom roka trajanja proizvoda. EDTA je poželjni antioksidans u skladu sa obelodanjivanjem u vezi s tim.

[0261] Antioksidanti mogu oštetiti proteine. Na primer, redukciona sredstva, kao što je glutation naročito, mogu poremetiti intramolekularne disulfidne veze. Prema tome, antioksidanti za upotrebu ovde su izabrani da, između ostalog, eliminišu ili dovoljno smanje mogućnost oštećenja proteina u formulaciji.

[0262] Formulacije u skladu sa obelodanjivanjem mogu sadržati jone metala koji su proteinski ko-faktori i koji su neophodni za formiranje kompleksa za koordinaciju proteina, kao što je cink neophodan za formiranje određenih suspenzija insulina. Joni metala takođe mogu inhibirati neke procese koji razgrađuju proteine. Međutim, joni metala takođe katalizuju fizičke i hemijske procese koji razgrađuju proteine.

[0263] Joni magnezijuma (10-120 mM) mogu se koristiti za inhibiranje izomerizacije asparaginske kiseline u izoaspartansku kiselinu. Ca<+2>joni (do 100 mM) mogu povećati stabilnost humane deoksiribonukleaze. Mg<+2>, Mn<+2>i Zn<+2>, ipak mogu destabilizovati rhDNase. Slično, Ca<+2>i Sr<+2>može stabilizovati faktor VIII, može se destabilizovati Mg<+2>, Mn<+2>i Zn<+2>, Cu<+2>i Fe<+2>, a njegova agregacija može se povećati za jone Al<+3>.

[0264] Primeri ST2 formulacija proteina koji vezuju antigen dalje sadrže jedan ili više konzervansa. Konzervansi su neophodni pri razvoju parenteralnih formulacija sa više doza koje uključuju više ekstrakcija iz istog kontejnera. Njihova primarna funkcija je da inhibiraju rast mikroba i osiguraju sterilnost proizvoda tokom roka trajanja ili trajanja upotrebe leka. Uobičajeni konzervansi uključuju benzil alkohol, fenol i m-krezol. Iako konzervansi imaju dugu istoriju upotrebe sa parenteralnim sa malim molekulima, razvoj formulacija proteina koji uključuju konzervanse može biti izazov. Konzervansi gotovo uvek imaju destabilizujući efekat (agregaciju) na proteine, a ovo je postalo glavni faktor u ograničavanju njihove upotrebe u formulacijama proteina sa više doza. Do danas je većina proteinskih lekova formulisana samo za jednokratnu upotrebu. Međutim, kada su moguće formulacije sa više doza, one imaju dodatnu prednost omogućavanja pogodnosti za pacijenta i povećane tržišne mogućnosti. Dobar primer je onaj humanog hormona rasta (hGH) gde je razvoj očuvanih formulacija doveo do komercijalizacije pogodnijih višenamenskih injekcionih olovaka. Trenutno su na tržištu dostupna najmanje četiri takva olovka koja sadrže očuvane formulacije hGH. Norditropin (tečnost, Novo Nordisk), Nutropin AQ (tečnost, Genentech) & Genotropin (liofilizovani - dvokomorni uložak, Pharmacia & Upjohn) sadrže fenol dok je Somatrope (Eli Lilly) formulisan sa m-krezolom.

[0265] Nekoliko aspekata treba uzeti u obzir tokom formulacije i razvoja sačuvanih oblika doziranja. Efikasna koncentracija konzervansa u leku mora biti optimizovana. To zahteva ispitivanje datog konzervansa u obliku doziranja sa opsezima koncentracija koji daju antimikrobnu efikasnost bez ugrožavanja stabilnosti proteina.

[0266] Kao što se moglo očekivati, razvoj tečnih formulacija koje sadrže konzervanse su izazovniji od liofilizovanih formulacija. Liofilizovani proizvodi mogu se liofilizovati bez konzervansa i rekonstituisati sa rastvaračem koji sadrži konzervans u vreme upotrebe. Ovo skraćuje vreme za koje je konzervans u kontaktu sa proteinima, značajno minimizirajući povezane rizike stabilnosti. Kod tečnih formulacija treba održavati efikasnost i stabilnost konzervansa tokom celog roka trajanja proizvoda (.oko. 18 do 24 meseca). Važno je napomenuti da efikasnost konzervansa treba pokazati u konačnoj formulaciji koja sadrži aktivni lek i sve pomoćne komponente.

[0267] Formulacije proteina koji vezuju ST2 za antigen generalno će biti dizajnirane za specifične puteve i postupke davanja, za određene doze primene i učestalost primene, za specifične tretmane specifičnih bolesti, između ostalog i u rasponima biodostupnosti i postojanosti. Stoga se formulacije mogu dizajnirati za isporuku bilo kojim pogodnim putem, uključujući, ali ne ograničavajući se na oralno, slušno, oftalmički, rektalno i vaginalno, i parenteralnim putevima, uključujući intravensku i intraarterijsku injekciju, intramuskularnu injekciju i potkožnu injekciju.

[0268] Jednom kada je farmaceutski sastav formulisan, može se čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca, kristal ili kao dehidrirani ili liofilizovani prah. Takve formulacije se mogu čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr., liofilizovanom) koji je rekonstituisan pre davanja. Predmetna prijava takođe opisuje komplete za proizvodnju jedinice za davanje u jednoj dozi. Svaka od ovih garnitura može sadržati i prvu posudu koja ima osušeni protein i drugu posudu koja ima vodenu formulaciju. U određenim primerima su obezbeđeni kompleti koji sadrže jednostruke i višekomorne unapred napunjene špriceve (npr., tečne špriceve i liošpriceve).

[0269] Terapeutski efikasna količina farmaceutskog sastava koji sadrži proteine koji vezuju ST2 će zavisiti, na primer, od terapijskog konteksta i ciljeva. Stručnjak u ovoj oblasti shvatiće da će odgovarajući nivoi doziranja za lečenje varirati u zavisnosti, delimično, od isporučenog molekula, indikacije za koju se koristi protein koji vezuje ST2 antigen, načina davanja i veličine (telesne težine), telesna površina ili veličina organa) i/ili stanje (starost i opšte zdravstveno stanje) pacijenta. U određenim primerima, kliničar može titrirati doziranje i modifikovati način davanja kako bi postigao optimalni terapeutski efekat. Tipična doza može biti u rasponu od oko 0.1 µg/kg do oko 30 mg/kg ili više, u zavisnosti od iznad pomenutih faktora. U konkretnim primerima, doza može biti u rasponu od 1.0 µg/kg do oko 20 mg/kg, po izboru od 10 µg/kg do oko 10 mg/kg ili od 100 µg/kg do oko 5 mg/kg.

[0270] Terapeutski efikasna količina proteina koji vezuje ST2 antigen poželjno rezultira smanjenjem ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanjem učestalosti ili trajanja perioda bez simptoma bolesti ili prevencijom oštećenja ili invaliditeta usled obolevanja od bolesti.

[0271] Farmaceutski sastavi se mogu davati pomoću medicinskog uređaja. Primeri medicinskih sredstava za davanje farmaceutskih sastava su opisani u patentima SAD br. 4,475,196; 4,439,196; 4,447,224; 4,447, 233; 4,486,194; 4,487,603; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 5,064,413; 5,312,335; 5,312,335; 5,383,851; i 5,399,163.

Postupci dijagnostikovanja ili lečenja bolesti ili poremećaja povezanih sa ST2

[0272] Ovde opisani proteini koji vezuju ST2 za antigen su posebno korisni za otkrivanje ST2 u biološkom uzorku. U određenim primerima, biološki uzorak dobijen od pacijenta kontaktira se sa proteinom koji vezuje ST2 antigen. Zatim se otkriva vezivanje proteina koji vezuje ST2 za antigen za ST2 da bi se utvrdilo prisustvo ili relativna količina ST2 u uzorku. Takvi postupci mogu biti korisne u dijagnozi ili određivanju pacijenata koji su podložni lečenju proteinom koji vezuje ST2 antigen.

[0273] U određenim primerima, protein ST2 koji vezuje antigen se koristi za dijagnozu, otkrivanje ili lečenje autoimunog ili inflamatornog poremećaja. U lečenju autoimunih ili inflamatornih poremećaja, protein ST2 koji vezuje antigen može ciljati ST2-eksprimirajuće ćelije imunog sistema radi uništavanja i/ili može blokirati interakciju ST2 sa IL-33.

[0274] Poremećaji koji su povezani sa signalizacijom posredovanom sa IL-33 posebno su podložni lečenju sa jednim ili više proteina koji vezuju ST2 antigen koji je ovde obelodanjen. Takvi poremećaji uključuju, ali nisu ograničeni na, upale, autoimune bolesti, paraneoplastične autoimune bolesti, zapaljenje hrskavice, fibrotičnu bolest i/ili degradaciju kostiju, artritis, reumatoidni artritis, juvenilni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, pauciartikularni juvenilni reumatoidni artritis, poliartikularni juvenilni reumatoidni artritis, sistemski početak juvenilnog reumatoidnog artritisa, juvenilni ankilozirajući spondilitis, juvenilni enteropatski artritis, juvenilni reaktivni artritis, juvenilni Retorov sindrom, SEA sindrom (seronegativnost, entozopatija, sindrom artropatije), juvenilni reumatoidni artritis, juvenilni psoriatični artritis, juvenilna skleroderma, juvenilni sistemski eritemski lupus, juvenilni vaskulitis, pauciartikularni reumatoidni artritis, poliartikularni reumatoidni artritis, sistemski reumatoidni artritis, ankilozirajući spondilitis, enteropatski artritis, reaktivni sindrom, Retorov reaktivni artritis, SEA sindrom (seronegativnost, entozopatija, sindrom artropatije), dermatomiozitis, psorijatični artritis, skleroderma, sistemski eritematozni lupus, vaskulitis, miolitis, polimolitis, dermatomiolitis, poliartritis nodosa, Vegenerova granulomatoza, arteritis, skleroderma, skleroza, primarna bilijarna skleroza, sklerozirajući holangitis, Sjogrenov sindrom, psorijaza, psorijaza plaka, gutana psorijaza, inverzna psorijaza, pustulozna psorijaza, eritrodermična psorijaza, dermatitis, atopijski dermatitis, ateroskleroza, lupus, Stilov sistem, lupus, mijastenija gravis, inflamatorna bolest creva (IBD), Kronova bolest, ulcerozni kolitis, celijakija, multipla skleroza (MS), astma, HOBP,, rinosinusitis, rinosinusitis sa polipima, eozinofilni ezofogitis, eozinofilni bronhitis, Giljеn Bаrеоva bolest, dijabetes melitus tipa I, tiroiditis (npr., Grejvsova bolest), Adisonova bolest, Rejonov fenomen, autoimunski hepatitis, GVHD, odbacivanje transplantacije, oštećenje bubrega i slično.

[0275] U poželjnim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje antitelo pronalaska za upotrebu u lečenju autoimunog ili inflamatornog poremećaja, pri čemu je autoimuni ili inflamatorni poremećaj astma, atopijski dermatitis, hronična opstruktivna plućna bolest, psorijaza, plućna fibroza, sistemski eritematozni lupus, inflamatorna bolest creva, reumatoidni artritis, skleroza, Vegenerova granulomatoza, Behčetova bolest, kardiovaskularne bolesti, rinosinusitis, nosna polipoza ili eozinofilni bronhitis.

[0276] U određenim primerima kako je ovde obelodanjeno, protein koji vezuje ST2 antigen se koristi za dijagnozu, otkrivanje ili lečenje karcinoma ili tumorogenog poremećaja. U lečenju karcinoma ili tumorogenog poremećaja, protein ST2 koji vezuje antigen može ciljati ćelije koje eksprimiraju ST2 radi uništavanja i/ili može blokirati interakciju ST2 sa IL-33, smanjujući tako signalizaciju posredovanu IL-33. Na primer, visoko rastvorljiva ekspresija ST2 povezana je sa poboljšanim preživljavanjem kod pacijenata sa rakom dojke. (Prechtel i dr, Lab Invest (2001) 81:159-165) Pošto se rastvorljivi ST2 vezuje i blokira signalizaciju posredovanu IL-33, smatra se da bi proteini koji vezuju ST2 antigen koji blokiraju signalizaciju posredovani IL-33 bili korisni u promociji poboljšanog preživljavanja kod pacijenata sa rakom dojke. Rak ili tumorogeni poremećaji koji se mogu dijagnostifikovati, otkriti ili lečiti proteinom koji veže ST2 antigen uključuju, ali nisu ograničeni na, solidne tumore, generalno, rak pluća, rak jajnika, rak dojke, rak prostate, rak endometrijuma, rak bubrega, rak jednjaka , rak pankreasa, skvamozni karcinom, uvealni melanom, rak grlića materice, kolorektalni rak, bešika, mozak, pankreas, glava, vrat, jetra, leukemija, limfom i Hodgkinova bolest, multipli mijelom, melanom, rak želuca, astrocitni rak, stomak i plućni adenokarcinom.

[0277] Proteini koji vezuju antigen mogu se koristiti za inhibiranje rasta tumora, napredovanje i/ili metastaze. Takva inhibicija se može pratiti primenom različitih postupaka. Na primer, inhibicija može rezultirati smanjenom veličinom tumora i/ili smanjenjem metaboličke aktivnosti unutar tumora. Oba ova parametra mogu se meriti, na primer, MRI ili PET skeniranjem. Inhibicija se takođe može pratiti biopsijom da bi se utvrdio nivo nekroze, smrt tumorskih ćelija i nivo vaskularnosti unutar tumora. Obim metastaza može se pratiti pomoću poznatih postupaka.

PRIMERI

[0278] Sledeći primeri, kako stvarni, tako i proročki, dati su u svrhu ilustracije određenih otelotvorenja ili karakteristika predmetnog pronalaska i nisu namenjeni ograničavanju njegovog obima.

PRIMER 1: ST2 antitela su efikasna u životinjskom modelu astme

[0279] Ovaj primer pokazuje da je davanje antitela koja vezuju ST2 i inhibiraju signalizaciju posredovanu IL-33 efikasno u životinjskom modelu inflamatorne bolesti, tj., astme. Neutralizirajući mišji ST2 mAb (ST2 surogat mAb) inhibirao je aktivnost egzogenog davanja IL-33 in vivo. Miševima je dato 200 ng rekombinantnog mišjeg IL-33 intranazalno dva sata nakon intravenske injekcije 100 ug anti-ST2 mAb. Sutradan su pomoću ELISA izmerene koncentracije IL-5 tečnosti za bronhoalveolarno ispiranje (BALF). Početne koncentracije IL-5 su dobijene iz BALF miševa lečenih fiziološkim rastvorom pre izazivanja fiziološkim rastvorom. Maksimalne koncentracije BALF IL-5 dobijene su od miševa tretiranih izotipom kontrolom Ig koji su bili podvrgnuti izazvanju sa IL-33. U poređenju sa tretmanom izotipa sa kontrolinim Ig, tretman sa ST2 mAb značajno je inhibirao IL-33-indukovani IL-5 u BALF-u i sojeva BALB/c i C57BL/6 miša (SL.1).

4

[0280] ST2 surogat mAb bio je efikasan u modelu astme izazvanom alergenom od bubašvaba (CRA), kod miševa tretiranih sa ST2 antitelima koji su imali znatno manje BALF eozinofila nego kod miševa tretiranih sa izotipom Ig. BALB/c miševi su izazvani sa 100 µg CRA dana 1, 3, 6, 8, 10 i 13. Miševima je ubrizgano 250 µg ili anti-ST2 mAb ili izotipa Ig kontrolnih dana u danima 0, 7 i 13, a dan 13 ubrizgavanja antitela dogodio se pre konačnog intranazalnog izazivanja CRA.14. dana miševi su anestezirani i podvrgnuti ispiranju pluća. Popisane su populacije BALF ćelija, a tretman sa anti-ST2 mAb rezultirao je prisustvom znatno manje ukupnih BALF ćelija, a eozinofili su činili značajno pogođenu ćelijsku populaciju (SL.2).

PRIMER 2: Proizvodnja antitela na ST2 korišćenjem platforme Xenomouse®

[0281] Stvaranje potpuno humanih antitela usmerenih na humani ST2 izvršeno je primenom tehnologije XENOMOUSE® (patent SAD br., 6,114,598; 6,162,963; 6,833,268; 7,049,426; 7,064,244; Green i dr., 1994, Nature Genetics 7:13-21; Mendez i dr., 1997, Nature Genetics 15:146-156; Green and Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med.188:483-495, Kellermann and Green, 2002, Current Opinion in Biotechnology, 13:593-597

[0282] Imunizacija životinja XMG2K, XMG4K i XMG4KL XENOMOUSE® sprovedene su ili polipeptidom koji sadrži vanćelijski domen humanog ST2 fuzionisan sa Fc domenom humanog antitela ili humanim fuzionim proteinom ST2-Fc složenim sa humanim IL-33. Pogodna količina imunogena (tj., deset µg/miš rastvorljivog ST2) je korišćena za početnu imunizaciju XENOMOUSE® životinja prema postupcima obelodanjenim u patentnoj prijavi SAD ser. br. 08/759,620, podnetoj 3. decembra, 1996 i međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 98/24893, objavljenoj 11. juna, 1998 i WO 00/76310, objavljenoj 21. decembra, 2000. Posle početne imunizacije, naknadne pojačane imunizacije imunogena (pet µg/mišu ili rastvorljivog ST2 ili ST2/IL33 kompleksa) primenjene su po rasporedu i tokom trajanja potrebnog da se indukuje odgovarajući titar antitela na ST2 kod miševa. Titri su određeni pogodnim postupkom, na primer ELISA ili sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FAC).

[0283] Identifikovane su životinje koje pokazuju odgovarajuće titre, a limfociti su dobijeni odvodnim limfnim čvorovima i po potrebi udruženi za svaku kohortu. Limfociti su razdvojeni od limfoidnog tkiva mlevenjem u pogodnom medijumu (na primer, medijumu Dulbecco modifikovan Eagle-a; DMEM; koji se mogu dobiti od Invitrogen, Carlsbad, CA) za oslobađanje ćelija iz tkiva i suspendovani u DMEM. B ćelije su odabrane i/ili proširene upotrebom odgovarajućih postupaka i fuzionisane sa odgovarajućim fuzionim partnerom, na primer, nesekretornim ćelijama mijeloma P3X63Ag8.653 (American Type Culture Collection CRL 1580; Kearney i dr, J. Immunol.123, 1979, 1548-1550), koristeći tehnike poznate u tehnici.

[0284] U jednom postupku fuzije limfociti su pomešani sa fuzionim ćelijama partnera u razmeri 1:4. Smeša ćelija je lagano peletirana centrifugiranjem na 400 x g tokom 4 minuta, supernatant je pretočen i ćelijska smeša je nežno pomešana (na primer, upotrebom pipete od 1 mL). Fuzija je indukovana PEG/DMSO (polietilen glikol/dimetil sulfoksid; dostupno u Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 1 mL na milion limfocita). PEG/DMSO se polako dodaje uz lagano mešanje tokom jednog minuta, nakon čega sledi minut mešanja. IDMEM (DMEM bez glutamina; 2 mL na milion B ćelija), zatim je dodato tokom 2 minuta uz lagano mešanje, praćeno dodatnim IDMEM (8 mL na milion B-ćelija) koji je dodat tokom 3 minuta.

[0285] Spojene ćelije su lagano peletirane (400 x g 6 minuta) i resuspendovane u 20 mL medija za selekciju (DMEM koji sadrži azaserin i hipoksantin [HA] i druge dopunske materijale po potrebi) na milion B-ćelija. Ćelije su inkubirane 20-30 minuta na 37°C, a zatim su ponovo suspendovane u 200 mL podloge za selekciju i kultivisane tri do četiri dana u bocama T175 pre nanošenja u 96 udubljenja.

[0286] Ćelije su raspodeljene u ploče sa 96 udubljenja primenom standardnih tehnika kako bi se maksimizovala mogućnost kloniranja nastalih kolonija. Posle nekoliko dana kulture, supernatanti su sakupljeni i podvrgnuti testovima skrininga. Supernatanti hibridoma generisani od miševa imuniziranih sa kompleksom ST2-Fc/IL33, pregledani su testom na bazi ELISA, izvedenim primenom polistirenskih ELISA ploča sa 96 udubljenja pasivno presvučenih preko noći na 4°C sa 0.5 ug/ml ST2-Flag/njegovog kompleksa na humani IL-33. Da bi se odredilo specifično vezivanje za ST-2, izveden je drugi ELISA ekran upotrebom polistirenskih ploča sa 96 udubljenja pasivno presvučenih preko noći na 4°C sa 10 ug/ml neutravidina. Ploče su zatim isprane i napunjene sa 0.5 ug/mL biotinilovanog humanog IL33. Ovaj ELISA ekran identifikovao je preko 1200 specifičnih veziva za anti-ST2.

[0287] Supernatanti hibridoma generisani od miševa imuniziranih rastvorljivim ST2-Fc pregledani su na antitela specifična za ST2 pomoću Fluorometric Microvolume Assay Technology (FMAT) skriningom protiv rekombinantnih HEK293T ćelija koje su privremeno transfektovane humanim ST2 pune dužine i kontraskriningom protiv transfektovanih ćelija HEK293T . Ukratko, ćelije su posejane u FMAT ploče sa 384 udubljenja u zapremini od 40 ul/udubljenju sa gustinom od 6,000 ST2 pozitivnih ćelija/udubljenju i 14,000 lažno transfekovanih ST2 negativnih ćelija/udubljenju. Zatim je dodat supernatant hibridoma i ostavljen je da se vezuje 1 sat na sobnoj temperaturi, praćen ispiranjem i sekundarnom detekcijom korišćenjem anti-humanog Fc-Cy5 sekundarnog antitela. Ovaj FMAT ekran identifikovao je preko 2200 anti-ST2 specifičnih veziva iz hibridoma generiranih od miševa imunizovanih vanćelijskim domenom ST2.

[0288] Ovaj kombinovani panel od 3400 anti-ST2 specifičnih hibridoma supernatanta je zatim dalje okarakterisan za sposobnost funkcionalnog antagoniziranja ST2 signalizacije korišćenjem Interferon-y testa oslobađanja citokina. Ukratko, ili prečišćene mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMNC) ili prečišćene NK ćelije su posejane u ploče za kulturu tkiva sa 96 udubljenja i stimulisane humanim IL-33 i IL-12, indukujući oslobađanje interferona-gama u supernatantu. Nivoi interferona-gama u supernatantu su kvantifikovani i direktno su povezani sa signalizacijom zavisnom od Il-33/ST2. Koristeći ovaj biotest, uzorci hibridoma su testirani na sposobnost blokiranja oslobađanja interferona-gama kroz blokadu signalnog puta ST2. Ovaj ekran je identifikovao 578 supernatanta hibridoma generisanih imunizacijom ST2-Fc koji su inhibirali oslobađanje interferona-gama za više od 80%. Pored toga, identifikovano je 505 hibridomskih supernatanta generisanih iz imunizacije kompleksa ST2Fc/IL-33 koji inhibiraju oslobađanje interferona-gama za više od 70%.

[0289] Ovaj panel od 1083 supernatanta hibridoma je zatim okarakterisan za unakrsno reaktivno vezivanje za miša i majmuna cinomolgus ST2, za rangiranje relativnog afiniteta ograničenim antigenom ELISA, za blokiranje biohemijskih receptora/liganda pomoću ELISA i za endogeno vezivanje pomoću FAC pomoću ćelijskih linija. Podaci generisani u ovim sekundarnim testovima korišćeni su za diversifikaciju velikog panela u 2 seta od 40 linija hibridoma koji su unapređeni u podkloniranje, proširivanje i prečišćavanje.

PRIMER 3: KDodređivanja

[0290] U ovom primeru je utvrđen afinitet antitela koja se vezuju za ST2. Procene površinske plazmonske rezonance izvršene su korišćenjem optičkog biosenzora Proteon XPR-36 opremljenog čipom GLC senzora (Bio-Rad). Analiza biosenzora je sprovedena na 25 °C u HBS-EP+ (IX) puferskom sistemu (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.0 mM EDTA, 0.05% Surfaktant P20, GE Healthcare). Svi reagensi su držani na 8 °C pre injekcije.

[0291] Kozji anti-humani IgG (specifičan za Fc fragment, Jackson ImmunoResearch) imobilizovan je na površinu senzora u vertikalnom smeru pomoću standardne aminske spojnice na trake 1-6 (∼4000 RU) a zatim blokiran etanolaminom. Antitela su uhvaćena (∼40-100 RU) u vertikalnom smeru do traka 1-5. Vertikalna traka 6 je ostala prazna i korišćena u referentne svrhe. Podaci su prikupljeni u grupama od 15 antitela (tri seta od 5).

[0292] ST2 reagensi (humani ili cino) pripremljeni su u puferu koji teče do koncentracije od 25 nM, a zatim su razblaženi 3 puta do 309 pM. Jednom injekcijom u horizontalnom smeru isporučena je puna serija koncentracija svakog molekula ST2, upotrebom pufera za popunjavanje niza od šest uzoraka i obezbeđivanje prazne linije za dvostruko referenciranje podataka o odgovoru. Brzine udruživanja (3 minuta) i disocijacije (30 minuta) praćene su brzinom protoka od 100 uL/min.

[0293] Površina je regenerisana brzinom protoka od 100 uL/min sa 10 mM glicina (pH 1.5, 30 uL).

[0294] Podaci su korigovani na osnovnoj liniji, obrezani, poravnati, referenca oduzeta (interspot), a zatim uklopljeni u model vezivanja 1:1 pomoću ProteOn Manager-a (verzija 2.1.2.05). Rezultati su prikazani u Tabeli 4.

Tabela 4

4

[0295] Afinitet dodatnih antitela određen je pomoću malo modifikovanog plazmonskog protokola rezonancije. Procene površinske plazmonske rezonance za antitela Ab1, Ab2, Ab3 i Ab4 sprovedene su na 25°C pomoću Biacore 3000 instrumenta (Biacore International AB, Uppsala, Švedska) opremljenog CM5 senzorskim čipom. Anti-Fcy antitela za hvatanje su kovalentno imobilisana u dve protočne ćelije na CM4 čipu primenom standardne hemijske sprege sa HBS-EP ((10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfaktant P20, GE Heathcare ) kao aktivni pufer. Ukratko, svaka protočna ćelija je aktivirana smešom 1:1 (v/v) od 0.1 M NHS i 0.4 M EDC. AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcg Fragment Specifično antitelo (Jackson ImmunoResearch Inc. West Grove, PA) pri 30 ug/ml u 10 mM natrijum acetata, pH 5.0, imobilisano je sa ciljnim nivoom od 3,000 RU na dve protočne ćelije. Preostale reaktivne površine deaktivirane su injekcijom 1 M etanolamina. Pufer koji je radio je zatim prebačen na HBS-EP 0.1 mg/ml BSA za sve preostale korake.

[0296] Sva antitela su pripremljena u puferu za punjenje u tri primerka i razblažena trostruko i ubrizgana tako da je trominutna injekcija sa 10 µl/min preko ispitne ćelije rezultirala približno 75 - 90 jedinica odgovora antitela zarobljenih na površini probne ćelije protoka. Na površini kontrolne protočne ćelije nije zabeleženo nijedno antitelo. Humani ili cino ST2 u različitim koncentracijama (200 nM - 0.0914 nM), zajedno sa praznim puferima preleteni su preko dve protočne ćelije. Korišćena je brzina protoka od 50 ul/min i dvominutna faza pridruživanja praćena fazom disocijacije od četiri minute. Posle svakog ciklusa površine su obnovljene injekcijom od 50 uL 10 mM glicina pH 1.5. Potom su sveža antitela uhvaćena u test protočnoj ćeliji da bi se pripremila za sledeći ciklus. Odvojen eksperiment duge disocijacije (60 minuta) izveden je u tri primerka pri koncentraciji od 200 nM.

[0297] Podaci su dvostruko referencirani oduzimanjem odgovora kontrolne površine da bi se uklonile promene indeksa prelamanja mase, a zatim oduzimanjem prosečnog praznog odziva pufera da bi se uklonili sistematski artefakti iz eksperimentalnih protočnih ćelija. Podaci ST2 su obrađeni i globalno se uklapaju u model interakcije 1:1 sa lokalnim Rmax u softveru za procenu BIA v 4.1. (Biacore International AB, Uppsala, Švedska). Konstante asocijacije (ka) i disocijacije (kd) su određene i korišćene za izračunavanje konstante

4

ravnoteže disocijacije (KD). Konstante stope disocijacije i konstante ravnoteže disocijacije za Ab1, Ab2, Ab3 i Ab4 su sumirane u Tabeli 5.

Tabela 5

PRIMER 4: pH-osetljivo vezivanje antitela

[0298] Terapijska antitela koja se smanjuju afinitet pri niskom pH za svoje ciljeve mogu imati poboljšana PK svojstva koja će im omogućiti da se daju ređe ili u nižim dozama. (Nat Biotechnol. 201028(11):1203-7 T. Igawa i dr Recikliranje antitela inženjerskim vezivanjem antigena zavisno od pH poboljšava trajanje neutralizacije antigena) Do toga dolazi usled ciljnog oslobađanja antitela pri niskom pH lizozoma, nakon čega sledi ciljana degradacija i reciklaža antitela.

[0299] Biosenzorna analiza pH osetljivog vezivanja antitela Ab1, Ab2, Ab3 i Ab4 izvedena je na Biacore 4000. Postavljanje je bilo slično Primeru 3, gde su sprovedena KDmerenja ovih antitela, osim što su podaci bili pogodni za duplikat injekcije pojedinačne koncentracije od 2.46 nM α-ST2 antitela. Brzine udruživanja (5 minuta) pri pH 7.4 i stope disocijacije (10 minuta) pri pH 5.5 i 7.4 praćene su pri brzini protoka od 30 uL/min. Podaci o oduzetim referencama odgovarali su modelu 1:1 u uređaju za pročišćavanje. Nekoliko antitela je pokazalo dramatično brže smanjenje brzine pri nižim pH, kao što je prikazano u Tabeli 6.

Tabela 6

PRIMER 5: Unakrsna konkurencija antitela

[0300] Uobičajeni način karakterizacije epitopa je kroz eksperimente nadmetanja. Za antitela koja se međusobno nadmeću može se smatrati da vezuju isto mesto na meti. Ovaj primer opisuje postupak određivanja konkurencije za vezivanje za ST2 i rezultate postupka kada se primenjuje na brojna ovde opisana antitela.

[0301] Eksperimenti za spajanje mogu se izvoditi na više načina, a korišćena metoda može imati uticaja na rezultate ispitivanja. Zajedničko ovim postupcima je da je ST2 obično vezano jednim referentnim antitelom, a sondirano drugim. Ako referentno antitelo sprečava vezivanje antitela za sondu, tada se kaže da su antitela u istoj korpi. Redosled upotrebe antitela je važan. Ako se antitelo A koristi kao referentno antitelo i blokira vezivanje antitela B, obrnuto nije uvek tačno: antitelo B koje se koristi kao referentno antitelo neće nužno blokirati antitelo A. Ovde su u igri brojni faktori: vezivanje antitela može prouzrokovati konformacione promene u cilju koje sprečavaju vezivanje drugog antitela, ili epitopi koji se preklapaju, ali se međusobno ne zatvaraju u potpunosti, mogu omogućiti da drugo antitelo i dalje ima dovoljno interakcija visokog afiniteta sa ciljem dozvoljavaju vezivanje. Generalno, ako se primeti nadmetanje u bilo kom redosledu, kaže se da se antitela međusobno povezuju, i ako se oba antitela mogu međusobno blokirati, verovatno je da se epitopi u potpunosti preklapaju.

4

[0302] Za ovaj primer, korišćena je modifikacija postupka Multiplexed Binning koju su opisali Jia, i dr (J. Immunological Methods, 288 (2004) 91-98). Korišćena je rastvorljiva ST2-ZASTAVA His. Svaki kod zrna kuglica Luminex presvučenih streptavidinom (Luminek, #L100-L1XX-01, XX navodi kod zrna) inkubiran je u 100ul biotiniliranog monovalentnog antitela IgG za hvatanje IgG od 6pg/zrno (BD Pharmingen, #555785) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi u mraku, a zatim isprati 3x sa PBSA, fosfatnim puferom (PBS) plus 1% goveđeg serumskog albumina (BSA). Svaka šifra zrna je inkubirana sa 100 ul 1:10 razblaženog anti-ST2 antitela (Coating Antitelo) tokom 1 sata, a zatim isprana. Zrnca su objedinjena, a zatim naneta na filter ploču sa 96 udubljenja (Millipore, #MSBVN1250). U pola udubljenja je dodato 100 ul 2ug/ml ST2, a u drugu polovinu pufer i inkubirano 1 sat, a zatim oprano. 100 ul anti-ST2 antitela za razblaživanje 1:10 (Detection Ab) je dodato u jedno udubljenje sa ST2 i u jednu bez ST2, inkubirano 1 sat, a zatim oprano. Irelevantni humani IgG (Jackson, #009-000-003) kao i stanje bez antitela (slepo) vođeni su kao negativne kontrole. U svako udubljenje je dodato 20ul PE-konjugovanog monovalentnog miš-anti-humanog IgG (BD Pharmingen, #555787) i inkubirano 1 sat, a zatim oprano. Zrnca su resuspendovana u 75ul PBSA i prikupljeno je najmanje 100 događaja/kuglica na BioPlex instrumentu (BioRad).

[0303] Srednji fluorescentni intenzitet (MFI) para antitela bez ST2 oduzet je od signala odgovarajuće reakcije koja sadrži ST2. Da bi se par antitela mogao smatrati istovremeno povezanim, a samim tim i u različitim korpama, vrednost reakcije morala je da zadovolji dva kriterijuma: 1) vrednosti su morale biti 2 puta veće od obloženog antitela uparenog samo sa sobom, irelevantnog ili slepe, što je najviše bilo, i 2) vrednosti su morale biti veće od signala detekcionog antitela prisutnog sa irelevantnim ili prazno premazana perla. Pronađene su najmanje tri korpe, kao što je prikazano u Tabeli 7 ispod.

PRIMER 6: Analize blokiranja IL-33

[0304] Mehanizam delovanja ST2 antitela istražen je pomoću dva AlphaScreens. U kombinaciji, testovi su korišćeni da bi se utvrdilo da li antitela mogu da inhibiraju vezu IL-33 sa ST2 ili, nasuprot tome, ako antitela mogu specifično da blokiraju povezanost ko-receptora ST2 i AcP, a da istovremeno dozvoljavaju IL-33 da se poveže sa ST2. AlphaScreen je akronim za ekran za pojačani luminiscentni homogeni test.

4

[0305] Na prvom ekranu, antitela su procenjena na sposobnost blokiranja povezanosti između IL-33 i ST2. Ovim ispitivanjem izmerena je sposobnost antitela na ST2 da blokiraju povezanost biotinilovanog humanog IL-33 (u kombinaciji sa zrnom donora Streptavidina) sa humanim ST2 označenim 6xhistidine (u kombinaciji sa zrnom akceptor Ni-helata). Alfa-zaslon IL-33/ST2 je sproveden primenom reakcija od 40 ul u ploči sa pola površine od 96 udubljenja (Perkin Elmer). Pufer za ispitivanje koji je korišćen za oba AlphaScreens sadržao je 40mM HEPES (pH=7.4), 1mM CaCl2, 0.1% BSA, 0.05% Tween-20 i 100mM NaCl. Svaki test dobro je sadržavao 0.3 nM biotiniliranog humanog IL-33, 0.3 nM humanog ST2-FH (FH označava FLAG i 6xHistidine oznake), 10 ug/ml perla obloženih streptavidinom (Perkin Elmer, Waltham, MA), 10 ug/ml Ni-helata obložene akceptorske kuglice (Perkin Elmer) i 12.5 ug/ml anti-ST2 Ab. Posle dodavanja svih komponenata za ispitivanje, ploče su inkubirane preko noći u mraku na sobnoj temperaturi. Sledećeg dana ploče su pročitane na 2103 čitaču Envision sa više etiketa (Perkin Elmer). Lasersko pobuđivanje zrnaca davaoca na 680 nm korišćeno je za generisanje reaktivnog kiseonika koji bi mogao pokrenuti luminiscentnu/fluorescentnu kaskadu u akceptorskim zrncima koja su bila u neposrednoj blizini zbog međudejstva zrna povezanih proteina što je rezultiralo emisijom svetlosti koja je detektovana na 570nm.

[0306] U drugom testu, antitela su procenjena na sposobnost inhibicije IL-33 posredovane asocijacije ST2 sa ko-receptorima AcP. Ovim testom se meri sposobnost antitela na ST2 da blokiraju IL-33 posredovanu asocijaciju biotinilovanog humanog ST2-Fc (u kombinaciji sa zrnom donora Streptavidina) sa humanim AcP označenim 6xhistidinom (u kombinaciji sa zrnom akceptora Ni-helata). ST2/AcP AlphaScreen je sproveden u reakcijama od 8 ul u optiplatu sa 384 udubljenja (Perkin Elmer). Svaki test dobro je sadržao 5nM humanog IL-33, 5nM biotiniliranog humanog ST2-Fc, 5nM humanog AcP-FH, 10ug/ml donorske kuglice obložene streptavidinom, 10ug/ml prihvatne perlice obložene Ni-helatom i 12.5ug/ml anti-ST2 Ab. Posle dodavanja svih komponenata za ispitivanje, ploče su inkubirane preko noći u mraku na sobnoj temperaturi. Sledećeg dana ploče su očitane na čitaču više oznaka 2103 Envision (Perkin Elmer) koristeći iste parametre kao iznad za prvi test.

[0307] Rezultati dva Alfa ekrana predstavljeni su u Tabeli 8 u nastavku. Inhibicija svakog antitela je predstavljena kao procenat inhibicije signala u AlphaScreen korišćenjem datog antitela u koncentraciji od 12.5 ug/ml u odnosu na signal u testu kada nijedno antitelo nije bilo uključeno u bunar. Neka antitela inhibiraju interakciju ST2 i IL-33 potpunije nego što inhibiraju interakciju ST2/IL-33/AcP, a neka antitela inhibiraju interakciju ST2/IL-33/AcP potpunije od interakcije ST2 i IL-33. Sva antitela inhibirala su interakciju IL-33 sa ST2 za najmanje 50%.

Tabela 8

PRIMER 7: In vitro humani biološki IL-33 test

[0308] Primeri ST2 humanih mAb testirani su na biološkom testu na čoveku koristeći prečišćene CD4+ T ćelije dobijene od različitih davalaca stimulisanih humanim IL-33 i humanim IL-2. Postupak ispitivanja je sledeći. Ćelije se seju sa 250,000 ćelija po udubljenju u zapremini od 60 ul u ploči sa okruglim dnom od 96 udubljenja. Posle predinkubacije, dodajte 30 ul 4x smeše huIL-2 huIL-33 u svako udubljenje. Ukupna zapremina u ploči sa okruglim dnom sa 96 udubljenja je 120 ul. Započnite antitela sa 20 ug/ml i napravite razblaženja 1:3 da biste dobili krivu od 10 tačaka. Napravite 4x u 30 ul. Posle predinkubacije Abs sa ćelijama, dodajte 30 ul 4x smeše huIL-2 huIL-33 u svako udubljenje.37°C, 5% CO2 na 48 sati. Sakupite supernatante. Analizirati inhibiciju IL-5 pomoću huIL-5 ELISA.

4

[0309] Slika 3 prikazuje ST2 mAb u inhibiciji humane IL-33-indukovane proizvodnje IL-5 iz CD4+ T ćelija od različitih davalaca. Linija (-) prikazuje pozitivnu kontrolnu vrednost humanog IL-33 u kombinaciji sa humanim IL-2 bez inhibicije. (+++) prikazuje pozitivnu kontrolnu vrednost humanog IL-2. Red (--) prikazuje kontrolnu vrednost podloge. Humane CD4+ T ćelije su prethodno inkubirane 30 minuta sa anti-ST2 mAb, a zatim stimulisane 48 sati sa humanim IL-33 (4 ng/ml) i humanim IL-2 (10 ng/ml). Sl. 3 pokazuje da su ST2 antitela sposobna da inhibiraju humani IL-33-indukovanu aktivaciju ST2, kako je utvrđeno proizvodnjom IL-5 iz CD4+ T ćelija. ST2 antitela su mogla da antagonizuju IL-33 indukovanu proizvodnju IL-5 iz CD4+ T ćelija sa IC50 od približno <100 nM. Tabela 9 prikazuje reprezentativne vrednosti IC50.

Tabela 9

PRIMER 8: Test za oslobađanje IFNγ majmuna Cinomolgus CD4+

[0310] Mononuklearne ćelije periferne krvi majmuna Cinomolgus (PBMC) obogaćene su kiselom citratnom dekstrozom (ACD) tretiranom normalnom donatorskom perifernom krvlju ISOLYMPH (Gallard-Schlesinger Industries, Plainview, NY) gradijent centrifugiranjem. Naknadna izolacija CD4+ T ćelija cinomolgus majmuna izvedena je pomoću izolacionog pribora Miltenyi Bioteca za CD4+ T ćelije cinomolgus majmuna. Izolovane cino CD4+ T ćelije (2x10<5>ćelija/udubljenju u pločama sa 96 udubljenja) inkubirane su prečišćenim monoklonskim antitelima u različitim koncentracijama tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim stimulisane sa IL-33 (10 ng/mL), IL-2 (10 ng/mL) i IL-12p70 (50ng/mL) tokom osamdeset i četiri sata. Dobijeni supernatanti kulture CD4+ T ćelijskih majmuna cinomolgus majmuna su zatim analizirani na prisustvo IFNγ majmuna cinomolgus pomoću ELISA (primeri podataka dati su u Tabeli 10). Snaga prečišćenih monoklonskih antitela određena je u testu oslobađanja CDN+ T ćelije IFNγ majmuna cinomolgus kod tri odvojena davaoca.

Tabela 10

PRIMER 9: Test oslobađanja humanog eozinofila IL-8

[0311] Humani eritrociti i granulociti obogaćeni su iz heparinizovane periferne krvi normalnog davaoca pomoću gradijentne centrifuge ISOLYMPH (Gallard-Schlesinger Industries, Plainview, NY). Eritrociti su uklonjeni upotrebom pufera za liziranje ACK (Gibco, Carlsbad, CA). Naknadna izolacija eozinofila je izvedena pomoću Miltenyi Biotec kompleta za izolaciju eozinofila. Izolovani eozinofili (2x10<5>ćelija/udubljenju u pločama sa 96 udubljenja) su inkubirani sa ne-klonskim ili klonskim supernatantima u nekoliko razblaženja ili prečišćenim monoklonskim antitelima u različitim koncentracijama tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim stimulisani sa IL-33 (2 ng/mL ) i IL-3 (100 ng/ml) tokom tri dana. Dobijeni supernatanti eozinofilne kulture bez ćelija su zatim analizirani na prisustvo IL-8 pomoću ELISA. Primeri podataka prikazani su u Tabeli 11. Jačina prečišćenih monoklonskih antitela određena je u testu oslobađanja eozinofila IL-8 od tri odvojena davaoca.

Tabela 11

PRIMER 10: Potencija antitela na ST2 u poređenju sa komercijalno dostupnim antitelima Odziv doze humanog IL-33 u testu na humanim NK ćelijama

[0312] Primarne CD56-pozitivne humane NK ćelije (5 x 10e4 ćelije) tretirane su humanim IL-12 (1 ng/ml) plus rastuće količine humanog IL-33, kao što je prikazano na SL. 4. Dvadeset dva sata kasnije, supernatanti bez ćelija su sakupljeni i izmereni za koncentraciju IFN-γ pomoću komercijalnog testa (R&D Systems). 10 ng/mL IL-33 je korišćeno kao stimulativna doza za inhibiciju ST2 antitela.

Inhibicija antitela na aktivnost IL-33

[0313] Humane NK ćelije su stimulisane kao iznad. Trideset minuta pre dodavanja IL-33 i IL-12, ST2 antitela su dodavana ćelijama u koncentracijama kao što je prikazano na SL. 5. Dvadeset dva sata nakon IL-33 tretmana, supernatanti bez ćelija su sakupljeni i izmereni za koncentraciju IFN-γ pomoću komercijalnog testa (R&D Systems). Imena klonova navedena su za komercijalno dostupna antitela. Samo Ab2 je u potpunosti inhibirao IL-33-zavisni odgovor IFN-γ i bio je znatno snažniji od bilo kog komercijalno dostupnog antitela huST2. Vrednost IC50 koja odgovara svakom antitelu prikazana je u Tabeli 12.

Tabela 12

PRIMER 11: Alanin/arginin skenirajuća mutageneza ST2

[0314] Ovaj primer karakteriše ST2 antitela na osnovu efekta mutageneze ST2 na njihovu sposobnost da vezuju cilj. Prethodni podaci o vezivanju ukazivali su da su ST2 domeni 1 i 2 primarno odgovorni za vezivanje antitela za panel antitela analiziranih ST2 skenirajućom mutagenezom u ovom Primeru. Kao takvi, samo su domeni 1 i 2 (D1D2) ST2 strukturno razmatrani u kontekstu pune dužine ST2 u dizajnu mesta mutacije.

[0315] Iz koordinata modela ST2 i IL-33 dobijene su koordinate Lingel i dr., Structure (London, England: 1993). Elsevier Ltd 17, 1398-410. Dostupnost ST2 rastvarača po ostatku bočnog lanca izračunata je u Molecular Operating Environment (Molecular Operating Environment (MOE), 2011.10; Chemical Computing Group Inc., 1010 Sherbooke St. West, Suite #910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2011.). Ove vrednosti pristupačnosti rastvarača su zatim korišćene za odabir površinskih ostataka D1D2 za mutagenezu, tako što su prvo izabrani svi ostaci D1D2 sa bočnom lančanom izloženošću od najmanje 10 A<2>ili ostacima glicina sa ukupnom izloženošću od najmanje 10 A<2>. Uklonjeni su ostaci glicina sa pozitivnim uglom Phi, kao i ostaci prolina, jer mutacije na takvim položajima imaju veću verovatnoću da iskrive lokalnu strukturu proteina. Ostaci cisteina su takođe uklonjeni iz izbora da bi se održale disulfidne veze. Ostatak A82 je uklonjen nakon vizuelnog pregleda. Ovim postupkom dobijena je lista od 140 ostataka za mutagenezu. Svi ostaci su mutirani na arginin, osim argininskih i lizinskih ostataka, koji su mutirani na alanin.

[0316] Svi mutirani konstrukti roditeljskog His-Avi-označenog ST2 vanćelijskog domena (ECD), u pTT5 vektoru, eksprimirani su u prolazno transfektovanim 293-6E ćelijama suspenzije (NRCC) u pločama sa 24

1

udubljenja. In-vivo biotinilacija je postignuta ko-transfekcijom BiR A u pTT5 vektoru. Supernatanti su dijalizovani sa PBS da bi se uklonio višak biotina.

[0317] BioPlex test vezivanja se koristi za merenje vezivanja anti-ST2 antitela za tačkaste mutacije ST2. Biotinilirani mutanti su vezani za 80 zrnaca zrna obloženih streptavidinom (Luminex, # L100-L1XX-01, XX navodi kod zrna).80 kodova zrna dozvoljavalo je multipleksiranje dva skupa od 70 mutanata za ukupno 140. Svaki set je sadržavao 6 roditeljskih kontrola, 3 nebitne kontrole proteina i 1 prazan. Vezivanje antitela za mutirani protein upoređivano je sa vezivanjem antitela za roditelje.

[0318] 100 ul razblaženja ST2 mutanata 1:7, roditeljskog i kontrolnog ili nikakvog proteina prethodno vezanog na zrnca je isprano 5X sa PBS 1% BSA, objedinjeno i podeljeno u filter ploču sa 96 udubljenja (Millipore), a zatim ponovo oprano. U tri duplikata dodana su 100ul antitela na ST2 antitela u trostrukim razblaženjima, inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi i isprano. U svako udubljenje je dodato 100ul razblaženja 1:500 razblaženog PE-konjugovanog anti-humanog IgG Fc (Jackson, #109-116-170), inkubirano 0.5 sata i oprano. Zrnca su resuspendovana u 75 ul, mućkana najmanje 3 minuta i pročitana na BioPlex.

[0319] Pre pokretanja testa vezivanja, sproveden je validacioni eksperiment da bi se procenila varijabilnost „regiona zrna“ do „regiona zrna“ (B-B). U eksperimentu za validaciju, sva zrna su konjugovane sa istim kontrolnim proteinom divljeg tipa. Prema tome, razlika između regiona kuglica nastala je zbog čisto B-B varijanse i nije bila zbunjena razlikom između divljeg tipa i mutiranih proteina. Titracija antitela je izvedena sa dvanaest replikacija u različitim udubljenjima.

[0320] Cilj ove statističke analize bio je da proceni B-B varijabilnost procenjenih EC50 krivih vezivanja. Procenjena standardna devijacija B-B (SD) je zatim korišćena za izgradnju intervala poverenja EC50 divljih vrsta i mutiranih proteina tokom eksperimenata upoređivanja krivih.

[0321] Četiri parametarska logistička modela ugrađena je u podatke vezivanja za svaki region zrna. Dobijena datoteka „sumout.xls“, koja sadrži rezultate kontrole kvaliteta krivih (QC) i procene parametara za vrh (maks.), dno (min.), Hillslope (nagib) i prirodni logaritam EC50 (xmid) krivih, je korišćena kao sirovi podaci za analizu. Varijabilnost B-B za svaki parametar je zatim procenjena uklapanjem modela mešovitih efekata primenom SAS PROC MIXED postupka. U analizu su uključene samo krive sa „dobrim“ QC statusom. Konačni model mešovitog efekta obuhvatio je samo rezidualne (tj. pojedinačne regione zrna) kao slučajni efekat. Srednja vrednost najmanje kvadrata (LS-srednja vrednost) za svaki parametar takođe je procenjena modelom mešovitog efekta. B-B SD izračunat je uzimajući kvadratni koren B-B varijanse. Takođe je izračunata promena nabora između LS-srednje 2SD i LS-srednje - 2SD, koje predstavljaju približno gornji i donji 97.5 percentila populacije.

[0322] Da bi se identifikovali mutanti koji nisu dali puno odgovora u odnosu na kontrolu WT, za svako antitelo, mutanti kod kojih je mak (MFI) manji od 30% od max(MFI) za WT kontrolu identifikuju se i označavaju kao Hitmax.

[0323] Upoređene su EC50 krive vezivanja mutanata i krive vezivanja divljeg tipa. Statistički značajne razlike identifikovane su kao pogoci za dalje razmatranje. Krive sa zastavicama „nofit“ ili „badfit“ su isključene iz ove analize.

[0324] U poređenju sa procenama EC50 uzimaju se u obzir dva izvora varijacija, odstupanje od prilagođavanja krive i varijacija zrnca. Divlji tipovi i mutanti bili su povezani sa različitim perlicama, pa je njihova razlika pomešana sa razlikom u zrnima. Varijacija uklapanja krive procenjuje se standardnom greškom procena dnevnika EC50. Varijacija kuglica-kuglica eksperimentalno se određuje pomoću eksperimenta gde su kontrole divljeg tipa bile povezane sa svakom kuglicom. Varijacija kuglica u procenama EC50 krive vezivanja divljeg tipa iz ovog eksperimenta koristi se za procenu varijacije kuglica u trenutnom eksperimentu mapiranja.

[0325] Poređenja dva EC50 (u logaritamskoj skali) vrše se pomoću Studentovog t-testa. T-statistika izračunava se kao odnos između delte (apsolutne razlike između procena EC50) i standardne devijacije delte. Varijansa delta procenjuje se zbirom tri komponente, procenom varijanse EC50 za krive mutanta i divljeg tipa u nelinearnoj regresiji i dvostrukom varijansom varijable zrno-zrno procenjenom iz zasebnog eksperimenta. Množitelj od dva za varijansu zrna kuglica nastaje zbog pretpostavke da i mutant i perlice divljeg tipa imaju istu varijansu.

[0326] Stepen slobode standardne devijacije delte izračunat je pomoću približavanja Satterthwaite-a (1946).

[0327] Pojedinačne p-vrednosti i intervali pouzdanosti (95% i 99%) izvedeni su na osnovu Studentove t raspodele za svako poređenje.

2

[0328] U slučaju višestrukih kontrola divljeg tipa, primenjen je konzervativan pristup izborom kontrole divljeg tipa koja je bila najsličnija mutantu, tj., odabirom onih sa najvećim p-vrednostima.

[0329] Prilagođavanje množine je važno za kontrolu lažno pozitivnih rezultata istovremeno sprovodeći veliki broj testova. Za ovu analizu su primenjena dva oblika prilagođavanja množine: kontrola porodične greške (FWE) i kontrola stope lažnih otkrića (FDR). FWE pristup kontroliše verovatnoću da jedan ili više pogodaka nisu stvarni; FDR pristup kontroliše očekivani udeo lažno pozitivnih među odabranim pogocima. Prvi pristup je konzervativniji i manje moćan od drugog. Za oba pristupa dostupno je mnogo postupaka, za ovu analizu smo izabrali Hochbergov (1988) postupak za FWE analizu i Benjamini-Hochbergovu (1995) FDR postupak za FDR analizu. Prilagođene vrednosti p za oba pristupa izračunavaju se ili za svako antitelo ili za ceo test.

[0330] Mutant je izabran kao efekat prema sledećim kriterijumima ako: 1) za tog mutanta su vraćeni rezultati lošeg uklapanja ili nikakvi rezultati, 2) mutant je izabran za kriterijume hitmax, 3) porodična greška pValue bila je manja od 0.01 ili 4) vrednost Bmax bila je veća od 200% od roditeljske. Pogodak je označen kao inhibitor ako je efekat smanjio Bmax ili povećao vrednost EC50, pogodak je označen kao aktivator ako je povećao Bmax ili smanjio vrednost EC50. 8 mutacija je isključeno sa liste pogođenih zbog njihovog uticaja na >90% testiranih antitela, a to su: K37A, R46A, D63R, V71R, G106R, K112A, N132R, Q137R i Y141R.

[0331] Rezultati analize dati su u Tabelama 13 i 14.

PRIMER 12: Analiza razmene vodonika/deuterijuma (HDX)

[0332] U ovom Primeru, Ab2 je vezan za ST2 i utvrđen je efekat vezivanja na HDX.

[0333] Rastvorljivi protein ST2 (domeni 1-3 koji sadrže aminokiseline 19-322 iz SEQ ID NO:1) sa FLAG-oznakom i His-oznakom na C-terminusu privremeno je eksprimiran u ćelijama sisara 293-6E i prečišćen pomoću IMAC (afinitetna hromatografija sa imobilizovanim metalnim jonima) i dalje prečišćena preparativnom SEC (ekskluziona hromatografija). Protein je zatim koncentrovan na 3.5 mg/ml ultrafiltracijom. ST2 antitelo Ab2 je eksprimirano u projektovanim CHO-CS9 ćelijama i prečišćeno afinitetnom hromatografijom proteina A praćeno preparativnom SEC. Analitički SEC je korišćen da bi se utvrdilo da je molarni odnos antitelo:antigen 0.75:1.00 optimalan kako bi se osiguralo da je protein ST2 u potpunosti vezan za antitelo. I slobodni ST2 protein i kompleks antigen-antitelo čuvani su u PBS puferu, pH 7.2.

[0334] Eksperiment HDX izveden je na automatizovanom HDX sistemu (Zhang, Zhang i dr.

4

2012). 2012). Ukratko, postupak razmene H/D započinje razblaživanjem 5 uL bilo slobodnog rastvora ST2 proteina (3.5 mg/ml) ili kompleksa ST2-antitela (sa koncentracijom jST2 od 3.5 mg/ml, odnos antigen: antitelo 1:0.75) u 25 uL D2O pufera u 100 mM PBS, pH 7.2, koji je pripremljen rastvaranjem PBS tablete u D2O vodi, na 25 °C. Reakcija razmene je ostavljena da inkubira za različito trajanje obeležavanja (30 sekundi, 2, 8, 30 minuta i 2, 8 sata) za svaki HDX eksperiment, a reakcija obeležavanja je ugašena mešanjem 20 µL rastvora za obeležavanje sa 80 µL pufera za gašenje/denaturaciju/redukciju (7.25 M uree i 625 mM tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP), 0.45 M glicina, pH 2.7) na 1 °C.

[0335] Alikvota od 40 µL ugašenog rastvora je prebačena u rastvor od 120 µL 0.4 mg/ml svinjskog pepsina (Sigma, St. Louis, MO). Rastvor za varenje se odmah ubrizga u petlju uzorka na 1 °C i ostavi 6 minuta za potpuno varenje. Dalje, sažetak je odvojen kolonama C18 (3 kolone u nizu, BEH C18, 2.1 mm x 5 mm, Waters Corp., Milford, MA). HPLC razdvajanje je izvedeno na 1°C sa 5-minutnim ACN gradijentom od 1-40%. LC eluent je analiziran Orbitrap Elite masenim spektrometrom (Thermo Scientific, San Jose, CA) u eksperimentu LC-MS/MS koji zavisi od podataka.

[0336] Označavanje deuterijuma, gašenje, proteolitičko varenje i injekcija su izvedeni na LEAP HD-X PAL sistemu kontrolisanom od LEAP Shells (LEAP Technologies, Carrboro, NC).

[0337] Eksperimenti su ponovljeni tri puta, au svakom eksperimentu svaka vremenska tačka je ponovljena dva puta. Uzorcima je dodata standardna smeša peptida kako bi se pratila i ispravila varijabilnost povratne razmene. Smeša sadrži ova tri peptida: bradikinin, angiotenzin I i leucin enkefalin. Specijalno dizajnirani tetrapeptid PPPI (sintetizovao AnaSpec, Fremont, CA) korišćen je kao drugi interni standard za minimiziranje varijabilnosti od puštanja do puštanja. Varenje ST2 proteina bez razmene H/D takođe je analizirano kao kontrola.

[0338] Dobijene datoteke podataka obrađene su programom MassAnalyzer (Zhang, Zhang i dr.

2012). 2012). Softver identifikuje peptide iz sažetka antigena, izračunava kurs svakog peptida, ispravlja informacije o povratnoj razmeni dobijene iz internih standarda i uklapa podatke u model koji daje zaštitne faktore za svaki ostatak.

[0339] Poređenje profila razmene između slobodnog ST2 i ST2 proteina vezanog za antitela otkrilo je dva regiona od interesa i mogao bi biti potencijalni epitop. Dva regiona u sekvenci ST2 su prečišćena do IVRCPRQGKPSY (aminokiseline 33-44 iz SEQ ID NO:1 odgovarajuće aminokiselinama 15-26 zrelog ST2) i IVRSPTF (aminokiseline 88-94 iz SEQ ID NO:1 u skladu sa aminokiseline 70-76 zrelih ST2) višestruko preklapanim peptidima. Ovi regioni su bili manje zaštićeni kada je ST2 u slobodnom stanju, dok kurs dramatično opada nakon vezivanja ST2 i antitela. Dalje, na osnovu ST2 modela homološke strukture prikazanog na Slici 6, ova dva niza zauzimanja zauzimaju slična prostorna mesta na spoljnoj površini proteina. Ovi rezultati navode na zaključak da su dva peptida uključena u vezivanje između proteina Ab2 i ST2.

PRIMER 13: Kristalografija rendgenskim zračenjem

[0340] U ovom Primeru, kristalna struktura kompleksa sc-dsFv fragmenta Ab2 i ST2 daje specifične aminokiselinske ostatke u interfejsu interakcije.

[0341] Ab2 sc-dsFv je eksprimiran u BL21 (DE3)ćelijama zvezdanog oblika. Ukratko, Ab2 sc-dsFv sadrži promenljivi domen teškog lanca povezan veznikom (G4S)3sa varijabilnim domenom lakog lanca. Da bi se molekul dalje stabilizovao, u molekul je projektovana disulfidna veza mutiranjem na cistein položaju 44 varijabilnog regiona teškog lanca i položaju 101 varijabilnog regiona lakog lanca. Protein je eksprimiran kao inkluziono telo. Inkluziono telo je rastvoreno i ponovo sastavljeno. Protein je dalje prečišćen na koloni za izuzeće veličine (SEC) i jonoizmenjivačkoj koloni MonoQ, a zatim poliran na SEC.

[0342] ST2 je eksprimiran u 293S ćelijama. Protein je prečišćen pomoću Ni-afinitetne kolone i deglikozilisan sa EndoH. Proteini su dalje prečišćeni na SEC.

[0343] Kompleks Ab2 sc-dsFv i ST2 nastao je mešanjem Ab2 sc-dsFv i viška ST2. Kompleks je prečišćen na SEC i koncentrovan na 12 mg/ml za kristalizaciju. Kompleks proteina je kristalizovan u 32-36% PEG400 i 0.1 M Hepes, pH 7.5-8.5, na 16 °C postupkom difuzije pare u sedećoj kapi.

[0344] Skup podataka sa rezolucijom od 1.9 A prikupljen je u Advanced Light Source, Lawrence Berkeley National Lab (Berkeley, CA). Podaci su obrađeni pomoću MOSFLM (Leslie, 1992) i skalirani SCALA-om u programskom paketu CCP4 (Collaborative Computational Project, No 4. (1994)). Struktura je rešena postupkom molekularne zamene sa programom PHASER (McCoy i dr., 2007) korišćenjem D1D2 domena objavljene strukture IL-1RII (pdb kod: 3O4O) i promenljivi domen Fab strukture Ab2 kao modeli pretraživanja. Prečišćavanje iterativne strukture i izrada modela izvršeni su pomoću REFMAC5 (Murshudov i sar., 1997) i COOT (Emsley i Covtan, 2004).

[0345] Analiza interfejsa je izvršena sa programima PISA, AREAMOL i NCONTACT u CCP4 paketu. Slike su pripremljene pomoću Pimola (The PyMOL Molecular Graphics System. Schrodinger).

[0346] Kristalna struktura ST2/Ab2 sc-dsFv kompleksa rešena je do rezolucije 1.9 Å. U asimetričnoj jedinici postoje dva nezavisna para ST2/Ab2 sc-dsFv kompleksa (SL.7). Svaki kompleks se sastoji od jednog molekula ST2 i jednog fragmenta Ab2 sc-dsFv. Molekul ST2 je napravljen od dva domena slična IgG (D1 i D2 domen). Ab2 Fv domen koristi svih šest CDR petlji teškog i lakog lanca za interakciju sa molekulom ST2 (SL.8). Za ST2, dve petlje (petlja BC i petlja FG) i N-terminal ST2 vrše direktne interakcije sa antitelom. Ukupna površina sa zakopanim rastvaračem između ST2 i Ab2 sc-dsFv je 1803 Å<2>.

[0347] Interfejs između ST2 i Ab2 je veoma naelektrisan. ST2 poseduju grupu osnovnih ostataka (Lys i Arg) u D1 domenu. Ovaj površinski flaster sa pozitivnim nabojem dopunjuje negativno naelektrisani flaster na Ab2 formiran od skup kiselih ostataka (Asp i Glu) u CDR regionima (SL.9).

[0348] Za definisanje ostataka na interfejsu korišćena su dva različita postupka. U prvom postupku, ostaci na površini su definisani pomoću razlike u izloženosti rastvarača. Računa se površina rastvarača dostupna svakom ostatku u ST2 (ili Ab2 sc-dsFv) u kompleksu i upoređuje se sa površinom dostupnoj rastvaraču odgovarajućih ostataka u ST2 (ili Ab2 sc-dsFv) uklonjenih iz kompleksa. Sve aminokiseline sa razlikom većom od 10% navedene su u Tabeli 15, odnosno Tabeli 16 za ST2 i Ab2. Razlike u površinskoj izloženosti Arg72 i Tyr81 iz ST2 su manje od 10%. Međutim, inspekcija složene strukture otkrila je da oba ostatka formiraju vodonik-veze posredovane vodom sa ostacima teškog lanca Ab2 i stoga su uključeni u spisak.

[0349] U drugom postupku su izabrani ostaci na interfejsu koji imaju najmanje jedan atom na unapred definisanoj udaljenosti od njegovog partnerskog proteina. Dve granate su definisane na osnovu različitog graničnog preseka.

[0350] Ljuska jezgra uključuje sve ostatke na rastojanju do 5.0 Å.

[0351] Granična ljuska uključuje sve ostatke sa rastojanjem dužim od 5.0 Å, ali kraćim od 8.0 Å.

[0352] Kompletna lista aminokiselinskih ostataka u svakoj ljusci za ST2, teški i laki lanac Ab2 prikazani su u Tabelama 17, 18 i 19, respektivno. Za ostatke koji čine vodoničnu vezu ili mostove soli sa partnerskim proteinom, vrsta specifičnih interakcija označena je u zagradama nakon ostatka (HB za vodoničnu vezu i SB za slani most).

[0353] Epitopski ostaci koji su definisani razlikama u izloženosti rastvarača poklapaju se sa ostacima glavnih grupa interakcija definisanim graničnim rastojanjem. Tabela 20 navodi sve parove vodoničnih veza i mostova soli unutar interfejsa.

[0354] Područja epitopa ST2 dobijena HDX-MS analizom primera 12 potvrđena su podacima kristalografije. Dva epitopa (15-26 i 70-76) iz HDX identifikovana su kao epitopi u podacima kristalografije veće rezolucije. Konkretno, utvrđeno je da su Arg20, Gly22, Lys23 i Tyr26, kao i Thr75, blizu antitela na rastojanju manjem od 3.4 Å. Dodatni ostaci za koje je utvrđeno da imaju rastojanje do antitela između 3.4 i 5 Å (Pro19, Gln21, Ile70, Val71, Arg72, Ser73 Pro74 i Phe76) takođe su pokriveni HDX epitopima.

[0355] Sve u svemu, rezultati su potvrdili da su regioni epitopa ST2 dobijeni i iz HDX-MS i iz kristalografije dosledni. BC petlja i FG petlja u domenu 1 (pogledajte podatke o kristalografiji) su glavna mesta interakcije.

REFERENCE

[0356]

Ali, M., G. Zhang, i dr. (2009). "Investigations into the role of ST2 in acute asthma in children." Tissue Antigens 73(3): 206-212.

Beltran, C. J., L. E. Nunez, i dr. (2010). "Characterization of the novel ST2/IL-33 system in patients with inflammatory bowel disease." Inflamm Bowel Dis 16(7): 1097-1107.

Brunner, M., C. Krenn, i dr. (2004). "Increased levels of soluble ST2 protein and IgG1 production in patients with sepsis and trauma." Intensive Care Med 30(7): 1468-1473.

Buysschaert, I. D., V. Grulois, i dr. (2010). "Genetic evidence for a role of IL33 in nasal polyposis." Allergy 65(5): 616-622.

Castano R, B. Y., Mfuna Endam L, Desrosiers M (2009). "Evidence of association of Interleukin 1 receptor-like 1 gene polymorphisms with surgery unresponsive Chronic Rhinosinusitis." American Journal of Rhinology in press(NA): NA.

Gudbjartsson, D. F., U. S. Bjornsdottir, i dr. (2009). "Sequence variants affecting eosinophil numbers associate with asthma and myocardial infarction." Nat Genet 41(3): 342-347.

Hacker, S., C. Lambers, i dr. (2009). "Increased soluble serum markers caspase-cleaved cytokeratin-18, histones, and ST2 indicate apoptotic turnover and chronic immune response in COPD." J Clin Lab Anal 23(6): 372-379.

Kuroiwa, K., T. Arai, i dr. (2001). "Identification of human ST2 protein in the sera of patients with autoimmune diseases." Biochem Biophys Res Commun 284(5): 1104-1108.

1

Manetti, M., L. Ibba-Manneschi, i dr. (2009). "The IL-1-like cytokine IL-33 and its receptor ST2 are abnormally expressed in the affected skin and visceral organs of patients with systemic sclerosis." Ann Rheum Dis.

Marvie, P., M. Lisbonne, i dr. (2009). "Interleukin-33 overexpression is associated with liver fibrosis in mice and humans." J Cell Mol Med.

Matsuyama, Y., H. Okazaki, i dr. (2010). "Increased levels of interleukin 33 in sera and synovial fluid from patients with active rheumatoid arthritis." J Rheumatol 37(1): 18-25.

Miyagaki, T., M. Sugaya, i dr. (2011). "High Levels of Soluble ST2 and Low Levels of IL-33 in Sera of Patients with HIV Infection." J Invest Dermatol 131(3): 794-796.

Moffatt, M. F., I. G. Gut, i dr. (2010). "A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma." N Engl J Med 363(13): 1211-1221.

Mok, M. Y., F. P. Huang, i dr. (2010). "Serum levels of IL-33 and soluble ST2 and their association with disease activity in systemic lupus erythematosus." Rheumatology (Oxford) 49(3): 520-527.

Neill, D. R., S. H. Wong, i dr. (2010). "Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity." Nature 464(7293): 1367-1370.

Oshikawa, K., K. Kuroiwa, i dr. (2001). "Elevated soluble ST2 protein levels in sera of patients with asthma with an acute exacerbation." Am J Respir Crit Care Med 164(2): 277-281.

Oshikawa, K., K. Kuroiwa, i dr. (2001). "Acute eosinophilic pneumonia with increased soluble ST2 in serum and bronchoalveolar lavage fluid." Respir Med 95(6): 532-533.

Palmer, G., D. Talabot-Ayer, i dr. (2009). "Inhibition of interleukin-33 signaling attenuates the severity of experimental arthritis." Arthritis Rheum 60(3): 738-749.

Pastorelli, L., R. R. Garg, i dr. (2010). "Epithelial-derived IL-33 and its receptor ST2 are dysregulated in ulcerative colitis and in experimental Th1/Th2 driven enteritis." Proc Natl Acad Sci U S A 107(17): 8017-8022.

Plager, D. A., J. C. Kahl, i dr. (2010). "Gene transcription changes in asthmatic chronic rhinosinusitis with nasal polyps and comparison to those in atopic dermatitis." PLoS ONE 5(7): e11450.

Prefontaine, D., S. Lajoie-Kadoch, i dr. (2009). "Increased expression of IL-33 in severe asthma: evidence of expression by airway smooth muscle cells." J Immunol 183(8): 5094-5103.

Prefontaine, D., J. Nadigel, i dr. (2010). "Increased IL-33 expression by epithelial cells in bronchial asthma." J Allergy Clin Immunol 125(3): 752-754.

Pushparaj, P. N., H. K. Tay, i dr. (2009). "The cytokine interleukin-33 mediates anaphylactic shock." Proc Natl Acad Sci U S A 106(24): 9773-9778.

Reijmerink, N. E., D. S. Postma, i dr. (2008). "Association of IL1RL1, IL18R1, and IL18RAP gene cluster polymorphisms with asthma and atopy." J Allergy Clin Immunol 122(3): 651-654 e658.

Sakashita, M., T. Yoshimoto, i dr. (2008). "Association of serum interleukin-33 level and the interleukin-33 genetic variant with Japanese cedar pollinosis." Clin Exp Allergy 38(12): 1875-1881. Shah, R. V. and J. L. Januzzi, Jr. (2010). "ST2: a novel remodeling biomarker in acute and chronic heart failure." Curr Heart Fail Rep 7(1): 9-14.

Shimizu, M., A. Matsuda, i dr. (2005). "Functional SNPs in the distal promoter of the ST2 gene are associated with atopic dermatitis." Hum Mol Genet 14(19): 2919-2927.

Sponheim, J., J. Pollheimer, i dr. (2010). "Inflammatory bowel disease-associated interleukin-33 is preferentially expressed in ulceration-associated myofibroblasts." Am J Pathol 177(6): 2804-2815. Tajima, S., K. Oshikawa, i dr. (2003). "The increase in serum soluble ST2 protein upon acute exacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis." Chest 124(4): 1206-1214.

Theoharides, T. C., B. Zhang, i dr. (2010). "IL-33 augments substance P-induced VEGF secretion from human mast cells and is increased in psoriatic skin." Proc Natl Acad Sci U S A 107(9): 4448-4453. Verri, W. A., Jr., A. T. Guerrero, i dr. (2008). "IL-33 mediates antigen-induced cutaneous and articular

2

hypernociception in mice." Proc Natl Acad Sci U S A 105(7): 2723-2728.

Wu, H., I. Romieu, i dr. (2010). "Evaluation of candidate genes in a genome-wide association study of childhood asthma in Mexicans." J Allergy Clin Immunol 125(2): 321-327 e313.

Xu, D., H. R. Jiang, i dr. (2008). "IL-33 exacerbates antigen-induced arthritis by activating mast cells." Proc Natl Acad Sci U S A 105(31): 10913-10918.

Yanaba, K., A. Yoshizaki, i dr. (2011). "Serum IL-33 levels are raised in patients with systemic sclerosis: association with extent of skin sclerosis and severity of pulmonary fibrosis." Clin Rheumatol.

Zhang, Z.; Zhang, A. and Xiao, G.; "Improved Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry Plateform with Fully Automated Data Processing", Analytical Chemistry, 2012, 84(11), 4942-9

Zhang Z, Smith DL. Protein Sci.1993; 2: 522.

Engen JR, Smith DL. Anal. Chem.2001; 73: 256A.

Codreanu SG, Ladner JE, Xiao G, Stourman NV, Hachey DL, Gilliland GL, Armstrong RN. Biochemistry 2002; 41: 15161.

Hamuro Y, Coales SJ, Morrow JA, Molnar KS, Tuske SJ, Southern MR, Griffin PR. Protein Sci.2006; 15: 1.

Baerga-Ortiz A, Hughes CA, Mandell JG, Komives EA. Protein Sci.2002; 11: 1300.

Coales, SJ. i dr. Rapid Commun. Masena spek.2009; 23: 639-647.

CCP4 (Collaborative Computational Project, No 4. (1994). The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-763.

Emsley, P., and Cowtan, K. (2004). Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126-2132.

Leslie, A.G.W. (1992). Recent changes to the MOSFLM package for processing film and image plate data Joint CCP4 ESF-EAMCB Newsletter on Protein Crystallography 26.

McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., and Read, R.J. (2007). Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography 40, 658-674.

Murshudov, G.N., Vagin, A.A., and Dodson, E.J. (1997). Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53, 240-255.

The PyMOL Molecular Graphics System. Schrodinger, L.

Baerga-Ortiz, A., C. A. Hughes, J. G. Mandell and E. A. Komives (2002). "Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein." Protein Sci.11(6): 1300-1308.

Coales, S. J., S. J. Tuske, J. C. Tomasso and Y. Hamuro (2009). "Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry." Rapid Commun. Masena spek.23(5): 639-647.

Codreanu, S. G., J. E. Ladner, G. Xiao, N. V. Stourman, D. L. Hachey, G. L. Gilliland and R. N. Armstrong (2002). "Local Protein Dynamics and Catalysis: Detection of Segmental Motion Associated with Rate-Limiting Product Release by a Glutathione Transferase." Biochemistry 41(51): 15161-15172. Engen, J. R. and D. L. Smith (2001). "Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS." Anal. Chem.73(9): 256A-265A.

Hamuro, Y., S. J. Coales, J. A. Morrow, K. S. Molnar, S. J. Tuske, M. R. Southern and P. R. Griffin (2006). "Hydrogen/deuterium-exchange (H/D-Ex) of PPARy LBD in the presence of various modulators." Protein Sci.15(8): 1883-1892.

Zhang, Z. and D. L. Smith (1993). "Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: A new tool for protein structure elucidation." Protein Sci.2(4): 522-531.

Zhang, Z., A. Zhang and G. Xiao (2012). "Improved Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry Platform with Fully Automated Data Processing." Analytical Chemistry 84(11): 4942-4949.

4

�

2

4

1

2

4

1

2

4

1

11

12

�

14

�

1

1

1

1

11

11

11

11

11

11

11

12

12

12

12

12

12

12

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

14

��

��

14

��

14

14

1

11

12

1

14

1

1

1

�

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo koje se vezuje za ST2 antigen koji ima aminokiselinsku sekvencu 19-556 iz SEQ ID NO:1, pri čemu navedeno antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena lakog lanca, kao što je navedeno u SEQ ID NO:96 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog domena teškog lanca kako je navedeno u SEQ ID NO:30,

pri čemu antitelo inhibira vezivanje humanog ST2 za humani IL-33 i gde antitelo smanjuje humani IL-33 posredovani signal ST2 u humanim ćelijama koje eksprimiraju ST2.

2. Izolovano antitelo prema patentnom zahtevu 1, gde je antitelo humano antitelo.

3. Izolovano antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, koje je odabrano iz IgG1 antitela, IgG2 antitela, IgG3 antitela i IgG4 antitela.

4. Izolovano antitelo prema patentnom zahtevu 2, koje sadrži laki lanac i teški lanac, pri čemu laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:85, a teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:19.

5. Farmaceutski sastav koji sadrži terapeutski efikasnu količinu antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 i farmaceutski efikasan razblaživač.

6. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4.

7. Rekombinantna ćelija domaćina koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 6, koja je operativno povezana sa promoterom.

8. Rekombinantna ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 7, gde ćelija domaćin luči antitelo koje se vezuje za ST2.

9. Rekombinantna ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8, gde je ćelija sisarskog porekla, opciono gde je ćelija jajnika ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).

10. Postupak za stvaranje antitela koji se vezuje za ST2, gde postupak sadrži:

a) kultivisanje rekombinantne ćelije domaćina prema bilo kom od patentnih zahteva 8-9; i b) izolovanje antitela iz pomenute kulture.

11. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 za upotrebu u lečenju autoimunog ili inflamatornog poremećaja, pri čemu je autoimuni ili inflamatorni poremećaj astma, atopijski dermatitis, hronična opstruktivna bolest pluća, psorijaza, plućna fibroza, sistemski eritematozni lupus, inflamatorna bolest creva, reumatoidni artritis, skleroza, Vegenerova granulomatoza, Behčetova bolest, kardiovaskularne bolesti, rinosinusitis polipoza, ili eozinofilni bronhitis.

12. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, gde antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca kako je navedeno u SEQ ID NO:85 i aminokiselinsku sekvencu teškog lanca kako je navedeno u SEQ ID NO:19.

13. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 11 ili 12, gde je autoimuni ili inflamatorni poremećaj astma ili hronična opstruktivna plućna bolest.