RS60841B1 - Novi modulatori i postupci primene - Google Patents

Novi modulatori i postupci primene

Info

Publication number
RS60841B1
RS60841B1 RS20201138A RSP20201138A RS60841B1 RS 60841 B1 RS60841 B1 RS 60841B1 RS 20201138 A RS20201138 A RS 20201138A RS P20201138 A RSP20201138 A RS P20201138A RS 60841 B1 RS60841 B1 RS 60841B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
ptk7
antibody
seq
residues
cells
Prior art date
Application number
RS20201138A
Other languages
English (en)
Inventor
Orit Foord
Scott J Dylla
Robert A Stull
Alex Bankovich
Alexandra Leida Liana Lazetic
Jeffrey Bernstein
Original Assignee
Abbvie Stemcentrx Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2011/050451 external-priority patent/WO2012031280A2/en
Application filed by Abbvie Stemcentrx Llc filed Critical Abbvie Stemcentrx Llc
Publication of RS60841B1 publication Critical patent/RS60841B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
[0001] Ova prijave se uopšteno odnosi na nove kompozicije i postupke njihove primene u prevenciji, lečenju ili ublažavanju hiperproliferativnih poremećaja i bilo koje njihovo širenje, recidiv, vraćanje ili metastaza. U širem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na primenu modulatora protein tirozin kinaze 7 (PTK7), uključujući anti-PTK7 antitela i spojene konstrukcije, za lečenje, dijagnozu ili profilaksu neoplastičnih poremećaja. Naročito poželjan slučaj predmetnog pronalaska obezbeđuje za primenu takvih PTK7 modulatora za imunoterapeutsko lečenje maligniteta koji sadrže redukciju u učestalost ćelije koja inicira tumor.
STANJE TEHNIKE
[0002] Diferencijacija matične i početne ćelije i proliferacija ćelije su normalni procesi koji kontinuirano deluju podržavajući rast tkiva tokom organogeneze i zamenu ćelija i popravljanje većine tkiva tokom života svih živih organizama. Odluke o diferencijaciji i proliferaciji često su pod kontrolom brojnih faktora i signala koji su uravnoteženi za održavanje odluka o sudbini ćelija i građu tkiva. Normalnu građu tkiva uglavnom održavaju ćelije koje reaguju na mikro-okruženje, koje regulišu deobu ćelija i sazrevanje tkiva. Prema tome, ćelijska proliferacija i diferencijacija se obično dešava samo po potrebi za zamenu oštećenih ili umirućih ćelija ili za rast. Nažalost, poremećaj ćelijske proliferacije i/ili diferencijacije može biti posledica nebrojenih faktora, na primer, nedovoljnog ili prevelikog broja različitih signalnih hemikalija, prisustvo izmenjenih mikrookolina, genetskih mutacija ili neke njihove kombinacije. Kada je normalna ćelijska proliferacija i/ili diferencijacija poremećena ili je na neki način poremećena, to može dovesti do različitih bolesti ili poremećaja, uključujući hiperproliferativne poremećaje, poput raka.
[0003] Konvencionalna lečenja raka uključuju hemoterapiju, radioterapiju, hirurgiju, imunoterapiju (npr., modifikatore biološkog odgovora, vakcine ili ciljane terapije) ili njihove kombinacije. Nažalost, veliki broj karcinoma ne reaguje ili minimalno reaguje na takva konvencionalna lečenja, ostavljajući malo mogućnosti za pacijente. Na primer, kod nekih pacijenata određeni kanceri pokazuju mutacije gena zbog kojih ne reaguju, uprkos opštoj efikasnosti odabranih terapija. Štaviše, u zavisnosti od vrste raka, neki dostupni tretmani, kao što je operacija, možda nisu alternativne mogućnosti. Ograničenja koja su svojstvena trenutnom standardu terapije za negu posebno su očita kada pokušavaju da se zbrinu pacijenti koji su bili podvrgnuti prethodnim tretmanima i koji su se nakon toga vratili. U takvim slučajevima neuspešni terapijski režimi i rezultirajuće pogoršanje pacijenta mogu doprineti uporni tumorima koji se često manifestuju kao relativna agresivna bolest koja se na kraju pokaže kao neizlečiva. Iako su se tokom godina postigla velika poboljšanja u dijagnozi i lečenju raka, ukupna stopa preživljavanja mnogih solidnih tumora ostala je uglavnom nepromenjena zbog neuspeha u postojećim terapijama za sprečavanje recidiva, vraćanja tumora i metastaza. Stoga ostaje izazov za razvoj ciljanije i snažnije terapije.
[0004] Jedno obećavajuće područje istraživanja uključuje upotrebu ciljanih terapija za pronalazak tumorskih "seed" ćelija za koje se čini da su podloga mnogih karcinoma. U tom cilju, za sada je poznato da većina solidnih tkiva sadrži odrasle matične ćelije koje žive u tkivu i stvaraju diferencirane ćelijske tipove koji čine većinu tog tkiva. Tumori koji nastaju u tim tkivima se slično sastoje od heterogene populacije ćelija koje takođe potiču iz matičnih ćelija, ali se značajno razlikuju u njihovoj ukupnoj proliferaciji i organizaciji. Iako je sve više prepoznato da većina tumorskih ćelija ima ograničenu sposobnost proliferacije, manjinska populacija ćelija raka (obično poznata kao matične ćelije raka ili CSC) ima ekskluzivnu sposobnost ekstenzivnog samoobnavljanja, omogućavajući tako svojstveni kapacitet obnavljanja tumora. Preciznije, hipoteza matičnih ćelija raka predlaže da postoji poseban podskup ćelija (odn. CSC) unutar svakog tumora (otprilike 0.1-10%) koji je sposoban neodređenog samo-obnavljanja i generisanja ćelija tumora progresivno ograničenih u svojstvu replikacije kao rezultat diferencijacije na tumorske ćelije potomke i, potom, na terminalno diferencirane ćelije tumora.
[0005] Poslednjih godina postalo je sve očiglednije da su ovi CSC (takođe poznati kao ćelije koje obnavljaju tumor ili TPC) mogle da budu otpornije na tradicionalne hemoterapijske agense ili zračenje i tako istraju nakon standardnih kliničkih terapija da kasnije podstaknu rast upornih tumora, sekundarnih tumora i uznapredovalih metastaze. U tom smislu matične ćelije raka su umešane u promociju migracionog i invazivnog potencijala različitih neoplazija. Štaviše, rastući dokazi upućuju na to da se putevi koji regulišu organogenezu i/ili samo obnavljanje matičnih ćelija normalnih rezidua tkiva deregulišu ili menjaju u CSC, što rezultira stalnim širenjem samoobnavljajućih ćelija raka i formiranjem tumora. Videti uopšteno Al-Hajj et al., 2004, PMID: 15378087; i Dalerba et al., 2007, PMID: 17548814.
[0006] Prema tome, efikasnost tradicionalnih, kao i novijih ciljanih metoda lečenja, očigledno je ograničena postojanjem i/ili pojavom rezistentnih ćelija raka koje su sposobne da okončaju karcinom čak i pored ovih različitih metoda lečenja. Huff et al., European Journal of Cancer 42: 1293-1297 (2006) i Zhou et al., Nature Reviews Drug Discovery 8: 806-823 (2009) .
[0007] Takva zapažanja su potvrđena stalnom nesposobnošću tradicionalnih agensa za uklanjanje da značajno povećaju preživljavanje pacijenata kada pate od solidnih tumora, i razvojem sve sofisticiranijeg razumevanja kako tumori rastu, ponavljaju se i metastaziraju. Shodno tome, nedavne strategije za lečenje neoplastičnih poremećaja prepoznale su važnost uklanjanja, iscrpljivanja, utišanja ili promovisanja diferencijacije ćelija koja prožima tumor kako bi se umanjila mogućnost recidiva ili metastaza tumora što dovodi do recidiva pacijenta.
[0008] Napori na razvoju takvih strategija uključili su nedavni rad koji uključuje netradicionalne modele ksenografta (NTX), pri čemu se primarni uzorci humanog solidnog tumora implantiraju i pasiraju isključivo u imunokompromitovane miševe. U brojnim vrstama karcinoma takve tehnike potvrđuju postojanje podpopulacije ćelija sa jedinstvenom sposobnošću da stvaraju heterogene tumore i podstiču njihov rast u nedogled. Kao što je prethodno hipotezirano, rad na NTX modelima je potvrdio da identifikovane CSC podpopulacije tumorskih ćelija izgledaju otpornije na debulking režim, kao što su hemoterapija i zračenje, potencijalno objašnjavajući razlike između stopa kliničkog odgovora i ukupnog preživljavanja. Nadalje, angažovanje NTX modela u istraživanjima CSC izazvalo je fundamentalnu promenu u otkrivanju lekova i predkliničkoj procjeni kandidata za lekove što može dovesti do terapije ciljane CSC-om koja ima veliki utjecaj na recidiv tumora i metastaze, poboljšavajući tako stope preživljavanja pacijenata. Iako je postignut napredak, glavni izazovi predstavljaju tehničke poteškoće povezane sa rukovanjem primarnog i/ili ksenograftnog tkiva tumora, zajedno sa nedostatkom eksperimentalnih platformi za karakterizaciju identiteta CSC i potencijala diferencijacije. Kao takva, ostaje velika potreba za selektivno ciljanje matične ćelije raka i razviju dijagnostička, profilaktička ili terapeutska jedinjenja ili metode koje se mogu koristiti u lečenju, prevenciji i/ili upravljanju hiperproliferativnim poremećajima.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0009] Pronalazak je definisan zahtevima.
[0010] Ovi i drugi ciljevi su obezbeđeni predmetnim pronalaskom koji, u širem smislu, se odnosi na postupke, jedinjenja, kompozicije i elemente proizvodnje koji mogu da se koriste u lečenju PTK7 povezanih poremećaja (npr., hiperproliferativni poremećaji ili neoplastični poremećaji). U tu svrhu, predmetni pronalazak pruža nove modulatore proteinske tirozin kinaze 7 (ili PTK7) koji efikasno ciljaju tumorske ćelije i/ili matične ćelije raka i mogu se koristiti za lečenje pacijenata koji pate od velikog broja malignih oboljenja. Kao što će ovde biti detaljnije diskutovano, trenutno postoji nekoliko poznatih PTK7 izoformi, a otkriveni modulatori poželjno sadrže ili su povezani sa jednim ili više istih. Štaviše, u određenim slučajevima otkriveni PTK7 modulatori mogu sadržati bilo koje jedinjenje koje prepoznaje, takmiči se, agonizuje, antagonizuje, deluje, vezuje ili povezuje sa PTK7 polipeptidom ili genom (ili njegovim fragmentom) i modulira, prilagođava, preuređuje, menja ili modifikuje uticaj PTK7 proteina na jednom ili više fizioloških puteva. Stoga, u širem smislu predmetni pronalazak je generalno usmeren na izolovane PTK7 modulatore i njihovu upotrebu. U poželjnim slučajevima, pronalazak je posebno usmeren na izolovane PTK7 modulatore koji sadrže antitela (odn., antitela koja se imunopreferencijalno vezuju, reaguju ili se povezuju sa najmanje jednom izoformom PTK7). Štaviše, kao što je detaljno prikazano u daljem tekstu, takvi modulatori se mogu koristiti za obezbeđivanje farmaceutskih kompozicija korisnih za profilaksu, dijagnostiku ili lečenje proliferativnih poremećaja.
[0011] U odabranim slučajevima pronalaska, PTK7 modulatori mogu sadržati PTK7 polipeptid ili njegove fragmente, bilo u izolovanom obliku ili spojeni ili povezani sa drugim delovima (npr., Fc-PTK7, PEG-PTK7 ili PTK7 povezani sa ciljanim ostatkom). U ostalim odabranim slučajevima, PTK7 modulatori mogu sadržavati PTK7 antagoniste koji će u svrhu trenutne primene smatrati bilo koji konstrukt ili jedinjenje koji prepoznaju, nadmeću, deluju, vezuju ili povezuju sa PTK7 i neutrališu, uklanjaju, smanjuju, senzibiliziraju, reprogramiraju, inhibiraju ili kontrolišu rast neoplastičnih ćelija uključujući ćelije koje iniciraju tumor. U poželjnim slučajevima PTK7 modulatori predmetnog pronalaska sadrže anti-PTK7 antitela ili njihove fragmente ili derivate za koje se neočekivano učini da utišavaju, neutrališu, redukuju, smanjuju, iscrpljuju, ublažavaju, smanjuju, reprogramiraju, eliminišu ili na drugi način inhibiraju sposobnost ćelija koje iniciraju tumor da se razmnožavaju, održavaju, šire se, razmnožavaju ili na neki drugi način olakšavaju preživljavanje, recidiv, regeneraciju i/ili metastazu neoplastičnih ćelija. U posebno poželjnim rešenjima, antitela ili imunoreaktivni fragmenti mogu biti povezani sa ili konjugovani sa jednim ili više agenasa protiv raka (npr. citotoksični agens).
[0012] U odabranim slučajevima kompatibilni PTK7 modulatori mogu sadržati antitelo koje ima varijabilnu regiion lakog lanca i varijabilnu region teškog lanca gde pomenuti varijabilni region lakog lanca sadrži amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identičnost prema amino kiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 i SEQ ID NO: 60 i gde navedenivarijabilni region teškog lanca sadrži amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identičnost prema amino kiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, i SEQ ID NO: 61.
[0013] Naravno, s obzirom na predmetni pronalazak, oni koji poznaju ovu oblaste mogu lako identifikovati CDR povezane sa svakom od gore navedenih varijabilnih regiona teškog i lakog lanca i upotrebiti te CDR sa izrađenim ili proizvedenim himernim, humanizovanim ili CDR graftovanim antitelima bez nepotrebnog eksperimentisanja. Kao takav, u odabranim slučajevima, ovaj pronalazak je usmeren na anti-PTK7 antitela koja sadrže jedan ili više CDR-ova iz sekvence varijabilnog regiona, kao što je prikazano na FIG.6A ili FIG.6B. U poželjnim slučajevima takva antitela će sadržati monoklonska antitela i, u još poželjnijim slučajevima će sadržati himerna, CDR graftovana ili humanizovana antitela. Kao što je detaljnije diskutovano u daljem tekstu, još neki slučajevi će sadržavati takva antitela konjugovana ili povezana sa jednim ili više citotoksičnih agenasa.
[0014] Prema tome, u drugim slučajevima trenutni pronalazak će sadržati humanizovani PTK7 modulator odabran iz grupe koja se sastoji od hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 i hSC6.58. Ostali slučajevi su usmereni na PTK7 modulator koji sadrži humanizovano antitelo pri čemu pomenuto humanizovano antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilnu region teškog lanca gde pomenuti varijabilni region lakog lanca sadrži amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identičnost prema amino kiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 i SEQ ID NO: 68 i gde navedeni varijabilni region teškog lanca sadrži amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identičnost prema amino kiselinskoj sekvenci izabranoj iz grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je navedeno u SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 i SEQ ID NO: 69.
[0015] Kao što je prethodno naznačeno, jedan aspekt pronalaska obuhvata neočekivanu povezanost PTK7 polipeptida sa matičnim ćelijama raka. Prema tome, u određenim drugim slučajevima pronalazak će sadržati PTK7 modulator koji smanjuje učestalost ćelija koje iniciraju tumor nakon davanja subjektu. Poželjno, smanjenje frekvencije će se odrediti upotrebom in vitro ili in vivo ograničavajuće analize razblaženja. U posebno poželjnim slučajevima takva analiza se može izvesti korišćenjem in vivo analize ograničavanja razblaživanja koja uključuje transplantaciju živih ćelija humanog tumora u imunokompromitovane miševe. Alternativno, analiza ograničavajućeg razblaživanja može se izvesti korišćenjem in vitro ograničavajuće razblažene analize koja sadrži ograničavanje taloženja razblaživanjem živih ćelija humanog tumora u in vitro uslovima podržavanja. U oba slučaja, analiza, izračunavanje ili kvantifikacija smanjenja učestalosti će po mogućnosti uključivati upotrebu Poissonove statistike distribucije za pružanje tačnog računanje.
Razumeće se da, iako su takve metode kvantifikacije poželjne, druga, manje radno intenzivna metodologija, kao što je protočna citometrija ili imunohistohemija, takođe se može koristiti za dobijanje željenih vrednosti i, shodno tome, izričito se predviđa da su u okviru trenutnog pronalaska. U takvim slučajevima, smanjenje učestalosti može se odrediti protočnom citometrijskom analizom ili imunohistohemijskim otkrivanjem površinskih markera tumorskih ćelija za koje se zna da se obogaćuju za ćelije koje iniciraju tumor.
[0016] Kao takav, u drugom poželjnom primeru predmetnog pronalaska sadrži postupak lečenja PTK7 povezanog poremećaja koji sadrži davanje terapeutski efikasne količine PTK7 modulatora subjektu kome je potrebno čime se smanjuje frekvencija ćelija koje iniciraju tumor. Poželjno poremećaj povezan sa PTK7 sadrži neoplastični poremećaj. Ponovo, smanjenje frekvencije ćelije koja inicira tumor poželjno će biti određeno upotrebom in vitro ili in vivo analize ograničavanja razblaživanja.
[0017] S tim u vezi, biće primetno da se predmetni pronalazak zasniva, bar delimično, nakon otkuića da su PTK7 imunogeni povezani sa ćelijama koje prožimaju tumor (odn., matičnim ćelijama raka) koje su uključene u etiologiju različitih neoplazija. Preciznije, trenutna primena neočekivano pokazuje da primena različitih primera PTK7 modulatora može da posreduje, smanjuje, iscrpljuje, inhibira ili eliminiše tumorigensku signalizaciju od strane ćelija koje iniciraju tumor (odn., smanjuje učestalost ćelija koje iniciraju tumor). Ova smanjena signalizacija, bilo iscrpljivanjem, neutralizacijom, redukcijom, eliminacijom, reprogramiranjem ili prigušivanjem ćelija koje iniciraju tumor ili modifikovanjem morfologije tumorskih ćelija (npr., indukovana diferencijacija, poremećaj niše), zauzvrat omogućava efikasnije lečenje PTK7 povezanih poremećaja inhibicijom tumorigeneze, održavanjem tumora, ekspanzijom i/ili metastazama i recidivom.
[0018] Pored već pomenute povezanosti sa matičnim ćelijama raka, postoje dokazi da PTK7 izoformi mogu biti uključeni u angiogenezu, migraciju endotelnih ćelija i specifične razvojne signalne kaskade koje su vezane za onkogenezu (odn., Wnt signalni putevi). Intervencija u takvim ćelijskim interakcijama, upotrebom ovde opisanih novih PTK7 modulatora, može na taj način poboljšati ili lečiti poremećaj više od jednog mehanizma (odn., zumor koji inicira redukciju ćelija i ometanje onkogene signalizacije puta) da bi se dobili aditivni ili sinergistički efekti. Još neki poželjni slučajevi mogu da iskoriste ćelijsku internalizaciju ćelijske površine PTK7 da bi dobili agens protiv raka posredovano modulatorom. S tim u vezi, biće poznato da predmetni pronalazak nije ograničen bilo kojim posebnim mehanizmom delovanja, već obuhvata široku upotrebu otkrivenih modulatora za lečenje poremećaja povezanih sa PTK7 (uključujući razne neoplazije).
[0019] Stoga, druge strane predmetnog pronalaska iskorišćavaju sposobnost otkrivenih modulatora da potencijalno poremete onkogeni put preživljavanja, istovremeno simulirajući ćelije koje iniciraju tumor. Takvi multiaktivni PTK7 modulatori (npr. PTK7 antagonisti) mogu se pokazati posebno efikasnim kada se koriste u kombinaciji sa standardnim antikancerogenim agensima ili agensima za debulking. Prema tome, poželjni slučajevi predmetnog pronalaska obuhvataju upotrebu otkrivenih modulatora kao anti-metastatskih agenasa za terapiju održavanja nakon početnih lečenja. Pored toga, dva ili više PTK7 antagonista (npr., antitela koja se specifično vezuju za dva diskretna epitopa na PTK7) mogu se koristiti u kombinaciji u skladu sa sadašnjim učenjima. Štaviše, kao što je detaljnije prikazano u daljem tekstu, PTK7 modulatori predmetnog pronalaska mogu se koristiti u konjugovanom ili nekonjugovanom stanju i, izborno, kao agens za osetljivost u kombinaciji sa različitim hemijskim ili biološkim agensima protiv raka.
[0020] Shodno tome, još jedan poželjni primer predmetnog pronalaska obuhvata postupak senzibilisanja tumora koji je subjekt za lečenje antikancerogenim agensom koji sadrži korak primene PTK7 modulatora na navedeni subjekat. Ostali slučajevi sadrže metodu za smanjivanje metastaza nakon lečenja koji uključuje davanje PTK7 modulatora subjektu kome je potreban. U naročito pogodnom aspektu pronalaska, PTK7 modulator će specifično rezultovati smanjenjem frekvencije ćelije koja inicira tumor onako kako je određeno upotrebom in vitro ili in vivo ograničavajućom razblaženom analizom.
[0021] Opširnije poželjni slučajevi pronalaska sadrže postupak lečenja poremećaja povezanog sa PTK7 kod subjekta kome je potreba, koji obuhvata korak davanja subjektu PTK7 modulatora. U posebno poželjnim slučajevima PTK7 modulator će biti povezan (npr., konjugovan) sa agensom protiv raka. U drugim slučajevima, PTK7 modulator će internalizovati prateći udruživanje ili vezivanje sa PTK7 na ili u blizini površine ćelije. Pored toga, korisni aspekti predmetnog pronalaska, uključujući bilo kakve poremećaje signalnih puteva i kolateralne koristi, mogu se postići bez obzira da li predmetno tkivo tumora pokazuje povišeni nivo PTK7 ili smanjene ili depresirane nivoe PTK7 u poređenju sa normalnim susednim tkivom.
[0022] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak će sadržati postupak lečenja subjekta koji pati od neoplastičnog poremećaja koji sadrži korak primene terapeutski efikasne količine od najmanje jednog internalizujućeg PTK7 modulatora. Poželjni slučajevi će obuhvatati davanje internalizujućih modulatora antitela pri čemu su, u ostalim odabranim slučajevima, internalizujući modulatori antitela konjugirani ili povezani sa citotoksičnim agensom.
[0023] Ostali slučajevi su usmereni na metodu lečenja subjekta koji pati od PTK7 povezanog poremećaja koji obuhvata korak primene terapeutski efikasne količine od najmanje jednog određujući PTK7 modulatora.
[0024] U još jednom primeru, predmetni pronalazak pruža metode održavajuće terapije u kojima su otkriveni efektori ili modulatori primenjeni tokom perioda vremena nakon inicijalne procedure (npr., hemoterapeutske, zračne ili hirurške) namenjene uklanjanju bar dela tumorske mase. Takvi terapijski režimi mogu se davati tokom nedelja, tokom meseci ili čak tokom godina u kojima PTK7 modulatori mogu delovati profilaktički kako bi inhibirali metastazu i/ili recidiv tumora. U još drugim slučajevima, otkriveni modulatori mogu se primenjivati zajedno sa poznatim režimima deblokiranja kako bi se sprečila ili usporila metastaza, održavanje ili recidivi tumora.
[0025] Dalje će se razumeti da PTK7 modulatori predmetnog pronalaska mogu biti proizvedeni i odabrani tako da reaguju sa pojedinačnom izoformom PTK7 ili odaberu nekoliko izoformi (odn., obezbeđeni varijantama spajanja) proteina ili, obrnuto, mogu sadržavati pan-PTK7 modulator koji reagira ili se povezuje sa nekim ili svim PTK7 izoformama (pet ih je trenutno identifikovano). Preciznije, kao što je ovde otkriveno, preferirani modulatori, kao što su antitela, mogu biti generisani i odabrani tako da reaguju sa domenima koji su izloženi pojedinačnim varijantama spajanja (npr., u određenim egzonskim spojnicama) ili sa Ig domenima koji su sačuvani u više ili svim PTK7 izoformama. Ovo je značajno u odnosu na ovaj pronalazak po tome što se određeni izoformi mogu poželjno eksprimirati na TIC i stoga mogu poslužiti kao terapeutski ciljevi za obezbeđivanje selektivnog smanjenja frekvencije tumorskih ćelija i/ili iscrpljivanja populacije matičnih ćelija raka.
[0026] Prema tome, u odabranom slučaju pronalazak sadrži pan-PTK7 modulator. U ostalim odabranim slučajevima, pronalazak sadrži PTK7 modulator koji se imunospecifično povezuje sa jednom ili više varijanti ili izoformnih spojnica. Poželjno, varijante spajanja mogu biti izabrane iz grupe koja se sastoji od izoforme a, izoforme b, izoforme c i izoforme d. U još drugim slučajevima, predmetni pronalazak sadrži postupak lečenja subjekta kome je to potrebno, uključujući primenu terapeutski efikasne količine pan-PTK7 modulatora. Ostali slučajevi sadrže postupak lečenja subjekta kome je potrebna, koji obuhvata primenu terapeutski efikasne količine PTK7 modulatora koja imunospecifično povezuje sa jednom ili više izoforma.
[0027] Pored terapeutskih upotreba koji su prethodno bili diskutovani, takođe će se primetiti da se modulatori predmetnog pronalaska mogu koristiti za dijagnostikovanje poremećaja povezanih sa PTK7 i, naročito, hiperproliferativnih poremećaja. U nekim slučajevima se modulator može davati subjektu i detektovati ili nadgledati in vivo. Stručnjaci će razumeti da takvi modulatori mogu biti obeleženi ili povezani sa markerima ili izveštačima, kao što je otkriveno u daljem tekstu i otkriveni pomoću bilo koje od niza standardnih tehnika (npr., MRI, CAT skan, PET skan, itd.).
[0028] Prema tome, u nekim slučajevima pronalazak će sadržati metodu dijagnostikovanja, otkrivanja ili nadgledanja poremećaja povezanog sa PTK7 in vivo kod subjekta kome je potreban, uključujući korak primene PTK7 modulatora.
[0029] U drugim slučajevima, modulatori se mogu koristiti u in vitro dijagnostičkoj sredini koristeći priznate postupke. Kao takav, poželjan primer sadrži metod dijagnostikovanja hiperproliferativnog poremećaja kod subjekta kome je potreban, a koji uključuje korake:
a. dobijanje uzorka tkiva od pomenutog subjekta;
b. kontaktiranje uzorka tkiva sa najmanje jednim PTK7 modulatorom; i
c. otkrivanje ili kvantifikovanje PTK7 modulatora povezanog sa uzorkom.
[0030] Takvi postupci se mogu lako uočiti u kombinaciji sa trenutnom primenom i mogu se lako izvesti korišćenjem opšte dostupne komercijalne tehnologije, kao što su automatski čitači ploča, namenski reporterski sistemi, itd. U odabranim slučajevima, PTK7 modulator će biti povezan sa ćelijama koje uvećavaju tumor u uzorak. U drugim poželjnim slučajevima, korak otkrivanja ili kvantifikacije će obuhvatati smanjenje frekvencije ćelije koja inicira tumor i njihovu detekciju. Štaviše, ograničavajuća analiza razblaživanja može se izvesti kao što je
1
ranije navedeno i poželjno će koristiti upotrebu Poissonove statistike distribucije za pružanje tačnog računanja smanjenja učestalosti.
[0031] Na sličan način, predmetni pronalazk takođe pruža setove koji su korisni u dijagnostici i praćenju PTK7 povezanih poremećaja, poput raka. U tu svrhu, predmetni pronalazak poželjno daje proizvodni proizvod koristan za dijagnostikovanje ili lečenje poremećaja povezanih sa PTK7, koji sadrže posudu koja sadrži PTK7 modulator i uputne materijale za upotrebu pomenutog PTK7 modulatora za lečenje ili dijagnostikovanje poremećaja povezanog sa PTK7.
[0032] Ostali poželjni slučajevi pronalaska takođe koriste svojstva otkrivenih modulatora kao instrumenta korisnog za identifikovanje, izolovanje, seciranje ili obogaćivanje populacija ili podpopulacija ćelija koje iniciraju tumor pomoću metoda kao što su protočna citometrijska analiza, fluorescentno sortiranje ćelija (FACS) ili laserom posredovana sekcija.
[0033] Kao takav, drugi poželjni primer predmetnog pronalaska usmeren je na metodu za identifikovanje, izolovanje, seciranje ili obogaćivanje populacije ćelija koje iniciraju tumor koji obuhvata korak kontakta navedenih ćelija koje iniciraju tumor sa PTK7 modulatorom.
[0034] Prethodno je kratak opis i stoga sadrži, po potrebi, pojednostavljenja, generalizacije i propuste detalja; prema tome, oni koji poznaju ovu oblast će uvideti da je sažetak samo ilustrativan i da nije predviđen ni na koji način da ga ograničava. Drugi aspekti, karakteristike i prednosti postupaka, kompozicija i/ili uređaja i/ili drugih predmeta opisanih ovde postaće Rčigledni u ovde navedenim učenjima. Kratak opis je dat da bi uveo izbor koncepata u pojednostavljenom obliku koji su dalje opisani u detaljnom opisu. Ovaj kratak opis ne želi da identifikuje ključne karakteristike ili suštinske karakteristike predmeta na koji se prijavljuje, niti se koristi kao pomoć u određivanju obima predmeta na koji se prijavljuje.
KRATAK OPIS SLIKA
[0035]
FIGS.1A - 1C prikazuje, respektivno, sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humani PTK7 (SEQ ID NO: 1), amino kiselinska sekvenca primerne humane PTK7 varijante (SEQ ID NO: 2) i FIG.1C prikazuje poravnate i oebeležene sekvence četiri prikazane izoforme PTK7 (SEQ ID NOS: 3-6) gde podvučeni deo u FIG.1A predstavlja PTK7-1 otvoreni ram za Rčitavanje, podvučeni deo u FIG.1B označava ekstraćelijski domen PTK7 kao što je deifinisano ovde i FIG.1C prikazuje proteinsko poravnavanje četiri poznata uzorna izoforme humanog PTK7 protein kao što je prijavljeno u Bazi podataka Gena NCBI (Proteinski pristupi: izoform a = NP_002812, izoform b = NP_690619; izoform c = NP_690620; izoform d = NP_690621) gde FIG.1C dalje otkriva motive peptide, "GxGxFGxV," "HRDLxxxN," i "SDVWSxG" kao SEQ ID NOS: 11-13, respektivno.
FIG.2 je grafički prikaz koji prikazuje genske ekspresione nivoe PTK7 kod neobrađenih (-) i kod miševa koji su tretirani irinotekanom (+) kao što je izmereno korišćenjem kompletnog transkriptnog sekvenciranja visoko obogaćene tumorske progenitorne ćelije (TProg), ćelije koja prožima tumor (TPC) i ne-tumorigenske populacije ćelija (NTG) dobijene iz podseta celog uzorka kolorektalnog tumora.
FIG.3 je grafički prikaz koji prikazuje relativne genske ekspresione nivoe humanog PTK7 kod visoko obogaćene tumorne progenitorne ćelije (TProg) i ćelije koja prožima tumor (TPC) populacije dobijene od miševa koji nose jedan od tri različita netradicionalna ksenografta (NTX) kolorektalne ili pankreasne ćelijske linije tumora, i normalizovani protiv neumorigenske (NTG) obogaćene ćelijske populacije, mereno kvantitativno RT-PCR.
FIGS.4A i 4B su grafički prikazi koji prikazuju relativne nivoe ekspresije gena humanog PTK7 mereno pomoću RT-PCR u uzorcima celog kolorektalnog tumora kod pacijenata sa stadijumom I-IV bolesti, normalizovanim u odnosu na srednju vrednost ekspresije u normalnom tkivu debelog creva i rektuma (FIG.4A) ili se podudaraju sa normalnim susednim tkivom (FIG.4B).
FIGS.5A i 5B su grafički prikazi koji pokazuju relativne ili apsolutne nivoe ekspresije gena humanih PTK7 gena merenih RT-PCR u celim uzorcima tumora (siva tačka) ili podudarni NAT (bele tačke) kod pacijenata sa jednom od osamnaest različitih čvrstih sastojaka tipovi tumora.
FIGS.6A i 6B obezbeđuju, u tabelarnom obliku, kontinuirane amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca određenog broja mišjih i humanizovanih oglednih PTK7 modulatora izolovanih, kloniranih i projektovanih kao što je opisano u ovde navedenim primerima.
FIGS.7A - 7E obezbeđuju, u grafičkim i tabelarnim prikazima, fiziohemijske karakteristike oglednih PTK7 modulatora u kojima FIG.7A prikazuje karakteristike vezivanja određenih modulatora u odnosu na mišji i ljudski PTK7, FIG.7B daje podatke o afinitetu, vezama i unakrsnoj reaktivnosti za odabrane modulatore, FIGS.7C i 7D pokazuju uporedne karakteristike vezivanja izabranog mišjeg modulatora i njegovog humanizovanog kolega i FIG.7E daje afinitet vezivanja za odabrane modulatore u odnosu na humani PTK7 i njegov mišji ortolog.
FIGS.8A - 8G prikazuju različite PTK7 konstrukcije u skladu sa trenutnim pronalaskom gde FIGS.8A - 8F daju amino kiselinske sekvence šest varijanti PTK7 modulatora u obliku IgPTK7-ECD konstrukata gde je deo izvanstanične domene svakog konstrukta raznolik i FIG.
8G šematski ilustruje sedam Ig domena ekstraćelijskog dela PTK7 zajedno sa vezanim regionima ELISA izvedenih nekoliko PTK7 modulatora, kako su označeni u zagradama. FIGS.9A-9E ilustruju nivoe ekspresije proteina PTK7 u različitim lizatima tumora i u NTX uzorcima gde FIG.9A - 9D prikazuju nivoe lizata tumora za različite tumore i stadijume bolesti u poređenju sa normalnim kontrolama susednih tkiva i FIG.9E daje histograme koji ilustruju bojenje ljudskih netradicionalnih ksenografta sa odabranim modulatorima gde je kontrolno bojenje (sivo) upoređeno sa bojenjem na ne-tumorogenim (isprekidanim) i sumnjivim populacijama matičnih ćelija raka (čvrst).
FIGS.10A-10E grafički ilustruju sposobnost odabranog modulatora trenutnog pronalaska da internalizuje nakon vezivanja sa PTK7 na ćelijskoj površini gde FIG.10C prikazuje fluorescentni pomak povezan sa uzornim modulatorom (odn., SC6.10.2 nazvanim H10 na FIG.10C) i FIG.10A i 10B predstavljaju kontrole, FIG.10D pokazuju da uzorni modulatori iz supernatanta hibridoma mogu biti pregledani na internalizaciju u poređenju sa pročišćenim kontrolama (SC6.2.35, SC6.10.2 i SC6.25.1 nazvani H2.35, H10.2 i H25.1 respektivno) i FIG.10E ilustruje obim internalizacije različitih modulatora (svaka tačka podataka predstavlja diskretni modulator) gde isprekidana linija označava pozadinski presek i broj PTK7 molekula koje ćelija internalizuje kao odgovor na događaj vezivanja crta se na osi y. FIGS.11A - 11D grafički ilustruju sposobnost otkrivenih modulatora da imunospecifično posreduju isporuku citotoksičnih agenasa i promovišu ubijanje ćelija pri čemu FIG.11A prikazuje upotrebu tri uzorna modulatora (SC6.2.35, SC6.10.2 i SC6.25.3 nazvani H2.35, H10.2 i H25.3 respektivno) kao ciljne grupe za usmeravanje citotoksičnih opterećenja na ćelije koje izražavaju PTK7 i gde su slike. FIGS.11B - 11D prikazuju sposobnost četiri dodatna ogledna modulatora da eliminišu tri diskretne ćelijske linije gde je na svakoj FIG. silazna krivulja prema dole ukazuje na ubijanje ćelija kroz internalizovani toksin.
FIG.12 svedoči sposobnost tri uzorna PTK7 modulatora da imunospecifično posreduju u isporuci citotoksičnih agenasa i na taj način smanje vitalnost tumorskih ćelija u različitim NTX ćelijskim linijama tumora.
FIGS.13A - 13C su indikativni za sposobnost otkrivenih modulatora da smanje učestalost ćelija koja prožimaju tumor i inhibiraju njihov tumorigenski potencijal gde FIGS.13A i 13B pokazuju da modulator (odn. SC6.2.35 sa SC6.H2) posredovao isporukom citotoksičnih agenasa utiče na održivost dve diskretne populacije NTX ćelija tumora dojke i FIG.13C prikazuje smanjenu tumorsku sposobnost tretiranih ćelijskih linija nakon implantacije u imunokompromitovane miševe.
FIG.14 demonstrira sposobnost oglednih humanizovanih PTK7 modulatora trenutnog pronalaska da efikasno posreduju imunospecifičnu isporuku i internalizaciju citotoksičnih agenasa u ćelije koje eksprimiraju PTK7.
1
DETALJAN OPIS PRONALASKA
I. Uvod
[0036] Iako se predmetni pronalazak može predstaviti u više različitih oblika, ovde su otkriveni njegovi specifični ilustrativni primeri koji predstavljaju primere pronalaska. Treba naglasiti da predmetni pronalazak nije ograničen na ilustrovana konkretna rešenja. Štaviše, bilo koji odlomci ovde korišćeni su samo u organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje opisane teme.
[0037] Kao što je ranije aludirano, iznenađujuće je utvrđeno da je ekspresija PTK7, uključujući različite izoforme, povezana sa neoplastičnim rastom i hiperproliferativnim poremećajima, te da takvi ligandi daju korisne markeri tumora koji se mogu iskoristiti u lečenju povezanih bolesti. Preciznije, otkriveno je da se PTK7 modulatori, kao što je ovde otkriveni, mogu korisno koristiti u dijagnostici, terapiji, lečenju ili prevenciji neoplastičnih poremećaja kod subjekata kojima je to potrebno. Shodno tome, iako će poželjni slučajevi pronalaska biti detaljnije razmatrani u daljem tekstu, posebno u kontekstu matičnih ćelija karcinoma i njihovih interakcija sa otkrivenim modulatorima, oni koji poznaju ovu oblast će znati da trenutni pronalazak nije ograničen takvim primernim slučajevima. Umesto toga, predmetni pronalazak je široko i izričito usmeren na PTK7 modulatore i njihovu upotrebu u dijagnozi, terapiji, lečenju ili sprečavanju različitih PTK7 povezanih ili posredovanih poremećaja, uključujući neoplastične ili hiperproliferativne poremećaje, bez obzira na određeni mehanizam delovanja ili posebno ciljana komponenta tumora.
[0038] Dalje će se razumeti da je, za razliku od različitih otkrića iz stanja tehnike, predmetni pronalazak u velikoj meri usmeren na imunospecifične modulatore različitih izoformi PTK7, a ne na opšte modulatore proteinske tirozin kinaze. To jest, iako je klasa receptora za proteinsku tirozin kinazu bila široko umešana u nekoliko vrsta poremećaja i uglavnom je ciljana na terapijsku intervenciju, PTK7 specifični modulatori su do sada privlačili manje pažnje. Delom to može proizići iz verovanja da je ometanje opšte PTK aktivnosti (posebno sa malim molekulama koji komuniciraju sa očuvanim kinaznim domenima) sa terapijskog stanovišta efikasnije jer će redukcija kinaze verovatno nadoknaditi bilo koji specifični antagonizam pojedinih članova klase. Štaviše, PTK7 navodno sadrži neaktivni domen kinaze (ili pseudokinazu domen) koji je možda obeshrabrio njegovu eksploataciju kao terapeutski cilj.
[0039] Suprotno tome, predmetni pronalazak obuhvata upotrebu imunospecifičnih modulatora koji preferirano reaguju sa jednom ili više izoformi PTK7 da bi se obezbedile terapeutske koristi. Kao što je kratko rečeno gore u određenim slučajevima, modulatori predmetnog pronalaska mogu se generisati i izabrati da se povežu sa jednom izoformom PTK7, dok u drugim slučajevima izabrani modulatori mogu reagovati sa više od jedne izoforme ili sa svim prepoznatim izoformama PTK7. U ovim poslednjim slučajevima, predmetni pronalazak može sadržati modulatore koji se povezuju ili reaguju sa više od jedne PTK7 izoforme i na taj način pružaju neočekivani aditivni ili sinergistički efekat koji može omogućiti smirivanje više od jednog PTK7 posredovanog puta.
[0040] Uopšteno, kako je pokazano u trenutnoj primeni, otkriveni imunospecifični PTK7 modulatori mogu se efikasno koristiti za ciljanje i eliminaciju ili na drugi način onesposobljavanje tumorigenskih ćelija i lečenje poremećaja povezanih sa PTK7 (npr., neoplazije). Kao što se ovde koristi, poremećaj povezan sa PTK7 označava bilo koji poremećaj ili bolest (uključujući proliferativne poremećaje) koji su obeleženi, dijagnostikovani ili identifikovani fenotipskom aberacijom ekspresije PTK7 tokom kursa ili etiologije bolesti ili poremećaja. S tim u vezi, fenotipska aberacija može, na primer, da sadrži povišen ili depresiran nivo ekspresije PTK7, nenormalnu ekspresiju PTK7 na određenom podesivom ćelijskoj populaciji ili nenormalnu ekspresiju PTK7 u neprimerenoj fazi ili fazi životnog ciklusa ćelije.
[0041] Pored opšte asocijacije o kojoj je gore govora, pronalazači su dalje otkrili do sada nepoznatu fenotipsku povezanost između odabranih ćelija koje iniciraju tumor (TIC) i PTK7. S tim u vezi, otkriveno je da odabrani TIC izražavaju povišen nivo PTK7 u poređenju sa normalnim ćelijama tkiva i ne-tumorgena (NTG), koji zajedno čine veliki deo solidnog tumora. Stoga, PTK7 izoforme sadrže markere koji su povezani sa tumorom (ili antigenima ili imunogenima) i za njih je pronađeno da pružaju efikasne agense za detekciju i supresiju TIC i pridružene neoplazije usled izmenjenih nivoa proteina na ćelijskim površinama ili u mikrookolini tumora. Preciznije, otkriveno je da PTK7 modulatori, uključujući imunoreaktivne antagoniste i antitela koja se povezuju ili reaguju sa proteinima, efikasno smanjuju Xčestalost ćelija koje iniciraju tumor i stoga su korisni u uklanjanju, iscrpljivanju, onesposobljavanju, smanjenju, promovisanju diferencijacije ili na drugi način sprečava ili ograničava sposobnost ovih ćelija koje iniciraju tumor da leže u stanju mirovanja i/ili nastavljaju da podstiču rast tumora, metastaze ili recidive kod pacijenta. Kao što je detaljnije diskutovano u daljem tekstu, podpopulacija TIC ćelijskih tumora sastoji se od ćelija koje perpetuiraju tumor (TPC) i visokoproliferativnih ćelija-predhodnika tumora (TProg).
1
[0042] S obzirom na ova otkrića, stručnjaci u ovoj oblasti će razumeti da predmetni pronalazak dalje omogućava PTK7 modulatore i njihovu upotrebu u smanjenju učestalosti ćelija koje iniciraju tumor. Kao što će detaljno biti objašnjeno u daljem tekstu, PTK7 modulatori pronalaska široko sadrže bilo koje jedinjenje koje prepoznaje, reaguje, takmiči se, antagonizuje, interakcije, vezuje, agonizuje ili se povezuje sa PTK7 ili PTK7 ili njihovim genima. Pomoću ovih interakcija, PTK7 modulatori smanjuju ili umerevaju frekvenciju ćelija koje iniciraju tumor. Ovde prikazani primeri modulatora sadrže nukleotide, oligonukleotide, polinukleotide, peptide ili polipeptide. U određenim poželjnim slučajevima izabrani modulatori će sadržavati antitela na PTK7 ili imunoreaktivne fragmente ili njihove derivate. Takva antitela mogu biti antagonističke ili agonističke prirode i opciono mogu biti konjugovana ili povezana sa citotoksičnim agensom. U drugim slučajevima, modulatori unutar trenutnog pronalaska će sadržati PTK7 konstrukt koji sadrži PTK7 izoformu ili njen reaktivni fragment. Biće poznato da takvi konstrukti mogu sadržati fuzijske proteine i mogu da uključuju reaktivne domene iz drugih polipeptida, kao što su imunoglobulini ili modifikatori biološkog odgovora. U još nekim aspektima, PTK7 modulator će sadržati sklop nukleinskih kiselina koji ima željene efekte na genomskom nivou. Ostali modulatori kompatibilni sa trenutnim Xčenjima biće detaljno diskutovani u nastavku.
[0043] Koji god oblik modulatora bude izabran, on će po mogućnosti biti u izolovanom i prečišćenom stanju pre uvođenja u subjekt. S tim u vezi, izolovani PTK7 modulator treba da se razume u širem smislu i u skladu sa standardnom farmaceutskom praksom, da podrazumeva bilo koji preparat ili kompoziciju koja sadrži modulator u stanju koji je bitno bez neželjenih kontaminanata (bioloških ili drugih). Kao što će detaljnije biti diskutovano, ovi preparati se mogu prečišćavati i formulisati po želji koristeći različite tehnike prepoznate u tehnici. Naravno, podrazumeva se da takvi izolovani preparati mogu biti namerno formulisani ili kombinovani sa inertnim ili aktivnim sastojcima, kako bi se poboljšali komercijalni, proizvodni ili terapeutski aspekti gotovog proizvoda i obezbedile farmaceutske kompozicije.
II. PTK7 Fiziologija
[0044] Protein tirozin kinaza (PTK7), takođe poznata kao karcinom debelog creva kinaza 4 (CCK4), je receptor tirozin kinaze originalno kloniran iz normalnih ljudskih melanocita (Lee et al., Oncogene 8(12), 1993) i odvojen od tkiva karcinoma debelog creva (Mossie et al., Oncogene 11(10), 1995). PTK7 gen je smešten na 6p21.1 -p 12.2. Iz testisa cDNK je klonirano pet spojnih izoformi humanog PTK7 (Jung, Ji et al., Biochim Biophys Acta 1579, 2002). Relativno obilje izofori u odnosu jedna prema drugoj razlikuje se između karcinomskih linija testisa i hepatoma ili debelog creva, ali funkcionalni značaj ovih izoformi, ako ih ima,
1
nije poznat. Bioinformatičke analize sugerisale su da miš može izraziti rastvorljivu Ptk7 izoformu iz alternativno spojenih mRNKs (Forrest, Taylor et al., Genome Biol 7, 2006). Za potrebe trenutne primene, podrazumevaće se da se izrazi "PTK7" i "CCK4" mogu koristiti naizmenično i uključuju varijante spajanja, izoforme, vrste ortologa i homologa humanog PTK7, osim ako drugačije diktiraju kontekstualna ograničenja. Dalje će se razumeti da se pojmovi mogu takođe odnositi na bilo koji derivat ili fragment prirodnog ili varijantnog oblika PTK7 koji sadrži epitop na koji se specifično može vezati PTK7 protein modulator (npr., antitelo ili imunoreaktivni fragment).
[0045] PTK7 protein pune dužine je transmembranski protein tipa I, sa 674 amino kiselinskim ekstraćelijskim domenom (ECD), praćen sa kratkim TM delom koji se proteže i 345 amino kiselinskim citoplazmatskim domenom. Kompletna sekvenca nukleinske kiseline uzornog izoforma humanog PTK7 (odn., varijanta transkripta PTK7-1) ima Genbank pristupni broj NM_002821 i predstavljen je na FIG.1A (SEQ ID NO: 1). Slično tome, primerna amino kiselinska sekvenca pune dužine PTK7-1 proteina prikazana je na FIG.1B (SEQ ID NO: 2). Imajte na umu da se PTK7 protein u SEQ ID NO: 2 razlikuje od produkta translacije podvučene sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 1 (odn., izoforma a kao što je prikazano u SEQ ID NO: 3) po tome što postoji tačka mutacije (L -> P) na poziciji 93 na FIG.1B. U pogledu na izoforme FIG.1C prikazuje označeno poravnavanje amino kiselinskih sekvenci četiri primerne izoforme PTK7 kao što je navedeno u Genbank (Pristupanje proteinu: izoforma a = NP_002812, SEQ ID NO: 3; izoforma b = NP_690619, SEQ ID NO: 5; izoforma c = NP_690620, SEQ ID NO: 6; izoforma d = NP_690621, SEQ ID NO: 4). Kao što je ranije aludirano na sekvencu koja ej postavljena u izoformi odgovaraju proizvodu translacije otvorenog okvira za čitanje iz PTK7 varijante 1, prikazanog na FIG.1A i najduži je oblik izoforme. Ostali izoformni slojevi kodiraju ekstaćelijske domene kojima nedostaju različiti Igcam domeni u odnosu na izoformu a, kao što je prikazano. Sve izoforme kodiraju isti unutarćelijski domen. Očuvani podmotivi u katalitičkom domenu protein serin/tirozin kinaze prikazani su ispod PTK7 poravnanja, kao i beleške o promenama PTK7 proteina za koji se smatra da njegov domen kinaze čini neaktivnim (npr., promene u poddomenima I i VII).
[0046] U svakom slučaju, zreli PTK7 ECD pune dužine sadrži sedam domena sličnih imunoglobulinu, dok je, kao što je prikazano na FIG.1C, različite varijante spajanja kodiraju PTK7 izoforme koje se razlikuju po svojoj ECD strukturi. Sve izoforme sadrže citoplazmatski domen sa značajnom homologijom u odnosu na opštu klasu tirozin kinaza. Međutim, PTK7 nema detektirajuću aktivnost tirozin kinaze i, kao takav, pripada podfamiliji pseudokinaza u kojima nekoliko amino kiselinskih promena u raznim konzerviranim poddomenama kinaze
1
dovodi do poremećaja vezivanja ATP (Kroiher et al. Bioessays 23(1), 2001). Konkretno, ključni ostaci u poddomenima I i VII se menjaju u PTK7 tako da bi se ugrozile direktne interakcije sa neprenosivim fosfatima ATP, kao i heliranje kofaktora Mg<2+>koji premošćuje ove fosfate (Hanks et al., Methods Enzymol 200, 1991).
[0047] Dalje će se razumeti PTK7 polipeptidi kompatibilni sa trenutnim pronalaskom mogu biti u obliku „zrelog“ proteina ili mogu biti deo većeg proteina, kao što je fuzioni protein. ýesto je korisno uključiti dodatnu sekvencu amino kiselina koja sadrži sekretorne ili vodeće sekvence, pre-, pro- ili prepro-protein sevencu, ili sekvencu koja pomaže u prečišćavanju, na primer, oznaku afiniteta, ali bez ograničenja, više ostataka histidina, oznaka FLAG, HA oznaka ili mic oznaka. Takođe se mogu koristiti i dodatni nizovi koji mogu obezbediti stabilnost tokom rekombinantne proizvodnje. Takve sekvence mogu biti opciono uklonjene po potrebi uključivanjem sekvence koja se može odcepiti kao dodatna sekvenca ili njen deo. Prema tome, PTK7 polipeptid, kao što je ovde definisano, može sadržati konstrukte spojene za prilagođavanje delova koji uključuju i druge polipeptide. Takve dodatne sekvence i oznake afiniteta dobro su poznate u stanju tehnike i mogu se proizvesti korišćenjem standardnih biohemijskih tehnika.
[0048] O biološkoj važnosti funkcije PTK7 uprkos neaktivnom domenu kinaze može se zaključiti iz prisustva sačuvanih ortologa od Hidra preko Drosophile do piletine i čoveka, za koje se analizom sekvenci predviđa da nemaju aktivnost kinaze (Kroiher et al., 2001). Na osnovu visoke očuvanosti specifičnog motiva TM domena povezanog sa sklonošću ka helikhelik asocijaciji i činjenice da RTK obično dimerizira kao odgovor na angažovanje liganda, sugerisano je da TM domen može posredovati dimerizacijom PTK7 (Kroiher et al., 2001). Kasnija studija ukazala je da PTK7 TM domen ne promoviše preferencijalno samopružanje (Kobus et al., Biochemistry 44(5), 2005), ali nije isključio heteromerne interakcije sa TM domenima drugih RTK-ova ili članova signalnog kompleksa. Zbog toga se ne očekuje da PTK7 pseudokinazni domen direktno prenosi signal, ali može komunicirati kao skela za druge molekule na signalnom putu ili može regrutovati druge tirozin kinaze (Kroiher et al., 2001).
[0049] Ljudski PTK7 se ne izražava u debelom crevu odraslih iako se izražava u fetalnom debelom crevu i različitim ćelijskim linijama koje potiču od karcinoma debelog creva (Mossie et al. supra, 1995), kao i kod metastatskog kolorektalnog karcinoma (Saha et al., Science 294(5545) 2001). Ostala normalna tkiva i ćelije za koje se izveštava da izražavaju PTK7 uključuju pluća, štitnjaču i jajnike (Mossie, Jallal et al.1995), CD4 nedavne timijske emigrantske T-ćelije (Haines et al., J Exp Med 206(2) 2009), i normalni mieloidni progenitori i
1
ćelije koštane srži CD34+CD38 (Prebet et al., Blood 116(13), 2010). U odnosu na kancerozna tkiva, ekspresija PTK7 takođe je pronađena u ćelijama karcinoma debelog creva (Mossie et al.1995); u AML uzorcima (Muller-Tidow, et al. Clin Cancer Res 10(4), 2004); u CD34- pre-TALL ćelijama (Shangguan et al., J Proteome Res 7(5) 2008) i kod karcinoma želuca (Gorringe et al., Genes Chromosomes Cancer 42(3), 2005). Zanimljivo je da je, iako je kloniran izvorno iz normalnih melanocita, PTK7 izgubljen u metastatskom melanomu (Easty et al., Int J Cancer 71(6), 1997). PTK7 se takođe može izgubiti kod određenih karcinoma dojke koji sadrže dele hromozoma 6p21 (Piao et al., Genes Chromosomes Cancer 30(2), 2001), iako je ekspresija promenljiva u ćelijskim linijama raka dojke (Su et al., J Cancer 12010). PTK7 je takođe izražen adenokarcinom pluća, gde su jači nivoi ekspresije korelirani sa povoljnijom prognozom kod ovih tumora (Endoh et al., J Clin Oncol 22(5), 2004). Fino mapiranje pojačanja regiona 6p12-p21 u osteosarkomima pokazalo je da povećanje broja kopija gena ne mora nužno rezultirati prekomernom ekspresijom PTK7, što je određeno qRT-PCR (Lu et al., Mol Cancer Res 6(6), 2008).
[0050] Ligandi ili ligandi za PTK7 nisu poznati, iako je PTK7 povezan sa različitim putevima biološke signalizacije i razvojnim procesima. Struktura proteina ECD domena slična imunoglobulinu sugeriše da može biti učesnik u ili senzor kontakta ćelija-ćelija i adhezije. Drosophila ortolog PTK7, OTK, povezan je sa plekinom kao potencijalnim ko-receptorom za signalizaciju semaforina tokom aksonskog vođenja (Winberg et al., Neuron 32(1), 2001). Nedavno je demonstrirana interakcija između PlexinA1 i PTK7 u Xenopusu (Wagner et al., Biochem Biophys Res Commun 402(2) 2010) dok je pokazano da ortolog pilića PTK7, KLG, deluje u interakciji sa PlexinA1 i Sema6D u kompleksu koji je važan za srčanu morfogenezu pilića ((Toyofuku et al., Genes Dev 18(4), 2004). Rastvorljivi PTK7 (sPTK7) korišćen je da pokaže ulogu PTK7 u angiogenezi izazvanoj VEGF-om, kao i u formiranju in vitro cevi, migraciji i invaziji humanih endotelnih ćelija (Shin et al., Biochem Biophys Res Commun 371(4), 2008). Miš PTK7 je takođe povezan sa procesima zarastanja epidermalnih rana, koji zahtevaju aktin reorganizaciju citoskeleta i migraciju ćelija (Caddy et al., Dev Cell 19(1), 2010).
[0051] U odnosu na specifične signalne kaskade, čini se da je PTK7 komponenta različitih Wnt signalnih staza koji su važni za razvoj (Puppo et al., EMBO Rep 12(1), 2010). Miševi koji ispoljavaju nultu ili teško hipomorfnu mutaciju u Ptk7 umiru perinatalno, pokazujući fenotipove koji su u skladu sa ulogom za PTK7 u putu planarne polarnosti ćelija (PCP) (Lu et al., Nature 430(6995), 2004). Slično tome, chuzhoi miševi koji sadrže mutirane PTK7 proteine sa umetanjem tri amino kiseline u ECD prikazuju PCP-defektne fenotipe (Paudyal, Damrau et al.2010). Pokazano je da mišji PTK7 genetski deluje sa drugim PCP genima,
1
uključujući Vangl2 (Lu et al., 2004), Celsr1 (Paudyal, Damrau et al.2010), Scrb1 and Grhl3 (Caddy et al., 2010). Matriks membranska metaloproteinaza tipa 1 (MT1-MMP) cepa PTK7 da bi se oslobodio rastvorljivi PTK7 (odn., sPTK7), i disregulacija ravnoteže MT1-MMP aktivnosti i proizvodnje sPTK7 dovodi do konvergentnih oštećenja ekstenzije kod zebra ribe, takođe u skladu sa ulogom za PTK7 u PCP putu (Golubkov et al., J Biol Chem 285(46), 2010). U Xenopus, pronađen je PTK7 u kompleksima sa dsh-om, a Wnt-receptor fz7 u nekanonskim Wnt signalnim putevima (Shnitsar et al., Development 135(24), 2008), dok interakcije između PTK7 i ȕ-katenin mogu se pokazati da dinamički utiču sa kanonskom Wnt signalizacijom u ćelijama miša (Puppo et al., 2010). Uz to, sačuvano mesto vezivanja TCF/LEF-faktora transkripcije u PTK7 promotoru sugeriše da je to gen za Wnt odgovor i može objasniti regulaciju povišenja PTK7 kod određenih kolorektalnih karcinoma, pošto su ovi tumori često disregulisani za signalizaciju Wnt putanje (Katoh, Int J Mol Med 20(3), 2007).
[0052] U okviru kanceroznih tkiva, pored potencijala da modulira Wnt puteve opisane gore, čini se da PTK prenosi pro-proliferaciju i anti-apoptotičke signale u HCT116 liniju karcinoma debelog creva, fenotipove koji mogu da se poništavaju rušenjem RNKi posredovanim PTK7 (Meng et al., PLoS One 5(11), 2010). PTK7 anti-apoptotički signali su prenosili otpornost na ubijanje ćelija posredovanih antraciklinom u eksplozijama AML, što se može obrnuti korišćenjem rastvorljivog PTK7-Fc proteina (Prebet et al., 2010). Prekomerna ekspresija PTK7 od strane specifičnih ćelija raka korišćena je u strategiji ciljanja isporuke daunorubicina u T-ALL ćelije u kulturi pomoću aptamera koji vezuju PTK7 i koji su kasnije internalizovani (Xiao et al., Chemistry 14(6), 2008).
[0053] Pored gore navedenih karakteristika, predmetni pronalazak pokazuje da je ekspresija PTK7 povišena u različitim ćelijskim populacijama koje iniciraju tumor. Uporedo sa istodobnom gornjom regulacijom PTK7 u bar nekim od ne-tumorigenskih ćelija u glomaznom tumoru, ovo povećava mogućnost da interakcije ligandskih receptora posredovanih PTK-om mogu pokrenuti kaskadne signalne kaskade povezane sa proliferacijom tumora, neoangiogenezom i/ili metastazama tumora. Iako ne žele da ih veže nijedna određena teorija, veruje se da PTK7 modulatori predmetnog pronalaska (posebno antagonistički ili neutrališući slučajevi) deluju, bar delimično, ili smanjujući ili eliminišući frekvenciju ćelije koja inicira tumor i ometa širenje tumora ili preživljavanje na drugačiji način od tradicionalnog terapijskog režima nege (npr., irinotekan), ili imunoterapeutskom signalizacijom ili isporukom korisnog tereta koji može ubiti ćelije koje eksprimiraju PTK7. Na primer, smanjenje aktivnosti matičnih ćelija raka antagoniziranjem PTK7 može uključivati jednostavno promovisanje proliferacije ćelija u lice hemoterapeutskim režimima koji eliminišu ćelije proliferacije, ili
2
induciranje diferencijacije ćelija koje iniciraju tumor tako da se njihovo samo obnavljanje (odn., neograničena proliferacija i održavanje kapaciteta multipotencija) gubi. Alternativno, u poželjnim slučajevima regrutovanje citotoksičnih T-ćelija u ćelije koje eksprimiraju PTK7, ili isporuka jakog toksina konjugovanog sa anti-PTK7 antitelom koje je moguće internalizovati, može selektivno ubiti TPC.
III. Tumorske Stalne ûelije
[0054] Za razliku od učenja iz prethodnog stanja tehnike, predmetni pronalazak obezbeđuje PTK7 modulatore koji su posebno korisni za ciljanje ćelija koje iniciraju tumor, a naročito tumorske stalne ćelije i tako olakšavaju lečenje, upravljanje ili sprečavanje neoplastičnih poremećaja. Tačnije, kao što je prethodno naznačeno, iznenađujuće je pronađeno da specifične podpopulacije tumorskih ćelija eksprimiraju PTK7 i mogu modifikovati lokalizovanu koordinaciju signala morfogena važnog za samo obnavljanje matičnih ćelija raka i opstanak ćelija. Stoga se u poželjnim slučajevima modulatori PTK7 mogu koristiti za smanjenje učestalosti ćelija koje iniciraju tumor u skladu sa sadašnjim učenjima i na taj način olakšati lečenje ili upravljanje hiperproliferativnim bolestima.
[0055] Kako što je ovde korišćeno, izraz ćelija koja inicira tumor (TIC) obuhvata i ćelije koje obnavljaju tumor (TPC; odn., matične ćelije raka ili CSC) i visoko proliferativne ćelije progenitorskog tumora (nazvane TProg), koje zajedno obično čine jedinstvenu podpopulaciju (odn., 0.1- 40%) velikog tumora ili mase. U svrhu trenutnog otkrivanja, pojmovi ćelije koje obnavljaju tumor i matične ćelije raka ili neoplastične matične ćelije su ekvivalentne i ovde se mogu koristiti naizmenično. Suprotno tome, TPC se razlikuju od TProg po tome što mogu u potpunosti rekapitulirati sastav tumorskih ćelija koje postoje unutar tumora i imaju neograničen kapacitet samoobnavljanja, kao što je prikazano nizom transplantacija (dva ili više prolaza kroz miševe) sa malim brojem izolovanih ćelija. Kao što će biti detaljnije diskutovano u daljem tekstu fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija (FACS) upotrebom odgovarajućih ćelijskih površinskih markera, pouzdana je metoda za izolovanje visoko obogaćenih ćelijskih podpopulacija (npr., > 99.5% čistoće) zahvaljujući, bar delimično, sposobnosti razlikovanja između pojedinačne ćelije i grupe ćelija (odn., dupli, itd.). Koristeći takve tehnike, pokazano je da kada se niski ćelijski broj visoko očišćenih TProg ćelija transplantuje u imunokompromitovane miševe, oni mogu podstaći rast tumora u primarnoj transplantaciji. Međutim, za razliku od prečišćenih podpopulacija TPC, TProg generisani tumori ne odražavaju u potpunosti roditeljski tumor u heterogenosti fenotipskih ćelija i prividno su neefikasni u ponovnom pokretanju serijske tumorigeneze u sledećim transplantacijama. Suprotno tome, podpopulacije TPC potpuno rekonstituišu ćelijsku heterogenost roditeljskih tumora i mogu efikasno inicirati tumore kada su serijski izolovane i transplantirane. Prema tome, oni koji poznaju ovu oblast će prepoznati da je konačna razlika između TPC i TProg, iako oba mogu biti tumor koji generiše u primarnim transplantacijama, jedinstvena sposobnost TPC da neprestano podstiče rast heterogenih tumora nakon serijske transplantacije kod malog broja ćelija. Drugi uobičajeni pristupi za karakterizaciju TPC uključuju morfologiju i ispitivanje ćelijskih površinskih markera, transkripcioni profil i odgovor na lek, mada se ekspresija markera može promeniti u uslovima kulture i prolaskom ćelijske linije in vitro.
[0056] Shodno tome, u svrhu predmetnog pronalaska tumorske stalne ćelije, poput normalnih matičnih ćelija koje podržavaju ćelijske hijerarhije u normalnom tkivu, pogodno su definisane njihovom sposobnošću da se samostalno obnavljaju u nedogled, održavajući sposobnost za multilineacijsku diferencijaciju. Tako su tumorske stalne ćelije sposobne da stvaraju i tumorigensko potomstvo (odn., ćelije koje iniciraju tumor: TPC i TProg) i netumorigenski (NTG) progeni. Kao što je ovde korišćeno, ne-tumorska ćelija (NTG) odnosi se na tumorsku ćeliju koja nastaje iz ćelija koje iniciraju tumor, ali sama nema sposobnost samo-obnavljanja ili generisanja heterogenih linija tumorskih ćelija koje čine tumor.
Eksperimentalno, NTG ćelije nisu sposobne za reproduktivno formiranje tumora kod miševa, čak i kada su presađene u velikom broju ćelija.
[0057] Kao što je naznačeno, TProg su takođe kategorisani kao ćelije koje iniciraju tumor (ili TIC) zbog ograničene sposobnosti generisanja tumora u miševima. TProg su potomci TPC i obično su sposobni za ograničen broj ne-samo-obnavljajućih podela ćelija. Štaviše, TProg ćelije se dalje mogu podeliti na rane tumorske progenitorne ćelije (ETP) i kasnije tumorske progenitorne ćelije (LTP), od kojih se svaka može razlikovati po fenotipu (npr., markerima ćelijske površine) i različitim kapacitetima za rekapitulaciju arhitekture tumorskih ćelija.
Uprkos takvim tehničkim razlikama, i ETP i LTP se razlikuju funkcionalno od TPC po tome što su uglavnom manje sposobni za serijsku rekonstituciju tumora prilikom presađivanja sa malim ćelijskim brojem i obično ne odražavaju heterogenost roditeljskog tumora. Bez obzira na prethodne razlike, takođe je pokazano da različite populacije TProg mogu, u retkim prilikama, steći sposobnost samo-obnove koja se obično pripisuje matičnim ćelijama i sama postaju TPC (ili CSC). U svakom slučaju, obe vrste ćelija koje iniciraju tumor su verovatno predstavljene u tipičnoj tumorskoj masi jednog pacijenta i podležu lečenju sa modulatorima kao što je ovde otkriveno. To jest, otkrivene kompozicije su uglavnom efikasne u smanjenju frekvencije ili promeni hemosenzitivnosti takvih PTK7 pozitivnih ćelija koje iniciraju tumor, bez obzira na konkretno rešenje ili smešu koja je predstavljena u tumoru.
[0058] U kontekstu predmetnog pronalaska, TPC su više tumorigenski, relativno mirniji i često hemorezistentniji od TProg (i ETP i LTP), NTG ćelija i ćelija koje potiču od tumora ne-TPC (npr., fibroblasti/stroma, endotelna i hematopoetskih ćelija) koje čine najveći deo tumora. S obzirom na to da su konvencionalne terapije i režimi u velikoj meri konstruisani kako da deblokiraju tumore, tako i napadaju brzo razmnožavajuće ćelije, TPC će verovatno biti otporniji na konvencionalne terapije i režime od brže proliferacije TProg i ostalih većih populacija tumorskih ćelija. Nadalje, TPC često izražava i druge karakteristike koje ih čine relativno hemorezistentnim na uobičajene terapije, poput povećane ekspresije transportera otpornosti na više lekova, poboljšanih mehanizama popravke DNK i anti-apoptotičkih proteina. Ova svojstva, od kojih svako doprinosi toleranciji lekova od strane TPC, predstavljaju ključni razlog za neuspeh standardnih režima lečenja u onkologiji da obezbede dugoročnu korist za većinu pacijenata sa uznapredovalom fazom neoplazije; odn., neuspeh u adekvatnom ciljanju i iskorenjivanju onih ćelija koje podstiču kontinuirani rast i recidiv tumora (odn. TPC ili CSC).
[0059] Za razliku od mnogih gore pomenutih tretmana iz stanja tehnike, nove kompozicije predmetnog pronalaska pogodno smanjuju učestalost ćelija koje iniciraju tumor nakon davanja subjektu bez obzira na oblik ili određeni cilj (npr., genetski materijal, PTK7 antitelo ili konstrukcija fuzije liganda) izabranog modulatora. Kao što je gore navedeno, smanjenje frekvencije ćelija koje inicira tumor može se dogoditi kao rezultat a) eliminacije, iscrpljivanja, senzibilizacije, utišanja ili inhibicije ćelija koje iniciraju tumor; b) kontrola rasta, ekspanzije ili recidiva ćelija koje iniciraju tumor; c) prekid inicijacije, širenja, održavanja ili proliferacije ćelija koje iniciraju tumor; ili d) na drugi način ometajući preživljavanje, regeneraciju i/ili metastazu tumorigenskih ćelija. U nekim primerima izvođenja, smanjenje frekvencije ćelija koje iniciraju tumor nastaje kao rezultat promene jednog ili više fizioloških puteva. Promena putanje, bilo smanjenjem ili eliminacijom ćelija koje iniciraju tumor ili promenom njihovog potencijala (npr., indukovana diferencijacija, poremećaj niše) ili na drugi način ometajući njihovu sposobnost da deluju, utiče na okruženje tumora ili druge ćelije, zauzvrat omogućava za efikasnije lečenje PTK7 povezanih poremećaja inhibiranjem tumorigeneze, održavanja tumora i/ili metastaza i recidiva.
[0060] Među metodama koje se mogu koristiti za procenu takvog smanjenja učestalosti ćelija koje iniciraju tumor je ograničavanje analize razblaženja bilo in vitro ili in vivo, a po mogućnosti je praćeno nabrajanjem pomoću Poissonove statistike distribucije ili procenom Xčestalosti unapred definisanih definitivnih događaja kao što je sposobnost da stvaraju tumore in vivo ili ne. Iako su takve ograničavajuće analize razblaživanja poželjne metode izračunavanja smanjenja frekvencije ćelija koje iniciraju tumor, druge, manje zahtevne
2
metode, takođe se mogu koristiti za efikasno određivanje željenih vrednosti, iako malo manje tačno, i u potpunosti su kompatibilne sa ovde navedenim učenjem. Prema tome, kao što će uvideti stručnjaci, takođe je moguće odrediti smanjenje frekvencija pomoću dobro poznatih protočnih citometrijskih ili imunohistohemijskih sredstava. Što se tiče svih gore navedenih metoda videti, na primer, Dylla et al.2008, PMCID: PMC2413402 & Hoey et al.2009, PMID: 19664991.
[0061] U vezi sa ograničenom analizom razblaživanja, in vitro nabrojavanje frekvencije ćelija koje iniciraju tumor može se izvršiti deponovanjem frakcionisanih ili nefrakcioniranih ćelija humanog tumora (npr. iz lečenih i nelečenih tumora) u uslove rasta in vitro koji podstiču formiranje kolonije. Na ovaj način ćelije koje formiraju koloniju mogu se nabrojiti jednostavnim brojenjem i karakterizacijom kolonija ili analizom koja se sastoji, na primer, odlaganjem humanih tumorskih ćelija u ploče u serijskim razblaženjima i obeležavanjem svake, bilo pozitivne ili negativne za formiranje kolonije najmanje 10 dana nakon zasejavanja. Eksperimenti ili analize razblaživanja in vivo ograničavanjem, koji su uglavnom tačniji u njihovoj sposobnosti da određuju frekvenciju ćelije koja inicira tumor, obuhvataju transplantaciju ćelija humanog tumora, bilo od nelečenih kontrolnih ili tretiranih uslova, na primer, u imunokompromitovane miševe u serijskim razblaženjima i naknadnim bodovanjem svakog miša ili kao pozitivan ili negativan za stvaranje tumora najmanje 60 dana nakon transplantacije. Derivacija vrednosti frekvencije ćelije ograničavanjem analize razblaživanja in vitro ili in vivo poželjno se vrši primenom Poissonove statistike raspodele na poznatu Xčestalost pozitivnih i negativnih događaja, pri čemu se obezbeđuje frekvencija događaja koji ispunjavaju definiciju pozitivnog događaja; u ovom slučaju kolonija, odnosno formiranje tumora.
[0062] Što se tiče ostalih metoda kompatibilnih sa predmetnim pronalaskom koje se mogu koristiti za izračunavanje frekvencije ćelija koje iniciraju tumor, najčešće uključuju merljive citometrijske tehnike protoka i postupke imunohistohemijskog bojanja. Iako nisu tako precizni kao tehnike analize ograničenog razblaživanja koje su opisane odmah gore, ovi postupci su mnogo manje naporni i daju razumne vrednosti u relativno kratkom roku. Stoga će biti poznato da iskusni stručnjak može da koristi određivanje profila protočnog citometrijskog ćelijskog površinskog markera koristeći jedno ili više antitela ili reagensa koji vezuju proteine ćelijske površine koji su poznati u tehnici za koje se zna da se obogaćuju za ćelije koje iniciraju tumor (npr., potencijalno kompatibilne markere kao što je navedeno u primeru 1 dole) i na taj način izmeriti nivoe TIC iz različitih uzoraka. U još jednoj kompatibilnoj metodi, stručnjak može da nabroji TIC frekvenciju in situ (npr., u delu tkiva) imunohistohemijom koristeći jedno ili više antitela ili reagensa koji su u stanju da vezuju proteine ćelijske površine za koje se misli da razgraničuju ove ćelije.
[0063] Korišćenjem bilo koje od gore navedenih metoda, tada je moguće kvantifikovati smanjenje frekvencije TIC (ili TPC u njemu) obezbeđenog otkrivenim PTK7 modulatorima (uključujući one konjugovane sa citotoksičnim agensima) u skladu sa ovde opisanim Xčenjima. U nekim slučajevima, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu smanjiti učestalost TIC (raznim gore pomenutim mehanizmima, uključujući eliminaciju, indukovanu diferencijaciju, poremećaj niše, prigušivanje itd.) za 10%, 15%, 20%, 25 %, 30% ili čak 35%. U ostalim slučajevima, smanjenje učestalosti TIC može biti oko 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ili 65%. U nekim slučajevima, otkrivena jedinjenja smanjuju učestalost TIC za 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili čak 95%. Naravno da će se razumeti da svako smanjenje učestalosti TIC verovatno rezultira odgovarajućim smanjenjem tumorske sposobnosti, upornosti, recidiva i agresivnosti neoplazije.
IV. PTK7 Modulatori
[0064] U svakom slučaju, predmetni pronalazak je usmeren na upotrebu PTK7 modulatora, uključujući PTK7 antagoniste, za dijagnostiku, terapiju, lečenje i/ili profilaksu različitih poremećaja, uključujući bilo koji od brojnih PTK7 povezanih maligniteta. Otkriveni modulatori mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa širokim spektrom antikancerogenih jedinjenja, kao što su hemoterapeutska ili imunoterapijska sredstva (npr., terapeutska antitela) ili modifikatori biološkog odgovora. U drugim odabranim slučajevima, dva ili više diskretnih PTK7 modulatora mogu se koristiti u kombinaciji da se obezbede pojačani anti-neoplastični efekti ili se mogu koristiti za pravljenje multispecifičnih konstrukcija.
[0065] U određenim slučajevima, PTK7 modulatori predmetnog pronalaska će sadržati nukleotide, oligonukleotide, polinukleotide, peptide ili polipeptide. Još je poželjnije da modulatori sadrže rastvorljivi PTK7 (sPTK7) ili njegovu formu, varijantu, derivat ili njegov fragment, uključujući, na primer, PTK7 fuzione konstrukcije (npr., PTK7-Fc, PTK7-ciljani deo itd.) Ili PTK7-konjugate (npr., PTK7-PEG, PTK7-citotoksični agens, PTK7-brm itd.). Takođe će se razumeti da u drugim slučajevima, PTK7 modulatori sadrže antitela ili imunoreaktivne fragmente ili njihove derivate. U posebno poželjnim slučajevima, modulatori predmetnog pronalaska će sadržati neutralizujuća antitela ili derivate ili njihove fragmente. U drugim slučajevima, PTK7 modulatori mogu sadržati internalizujuća antitela ili njihove fragmente. U drugim slučajevima, PTK7 modulatori mogu sadržati antitela koja iscrpljuju ili njihove fragmente. Štaviše, kao i sa gore pomenutim fuzionim konstruktima, ovi modulatori antitela
2
mogu biti konjugovani, povezani ili na bilo koji drugi način povezani sa odabranim citotoksičnim agensima, polimerima, modifikatorima biološkog odgovora (BRM) ili slično, kako bi se obezbedile usmerene imunoterapije sa različitim (i opciono višestrukim) mehanizmima delovanja. Kao što se gore navodi, antitela mogu biti pan-PTK7 antitela i povezana sa dve ili više PTK7 izoforme ili imunospecifična antitela koja selektivno reaguju sa jednom izoformom. U drugim slučajevima, modulatori mogu delovati na genetskom nivou i mogu sadržati jedinjenja kao antisens konstrukti, siRNK, mikro RNK i slično.
[0066] Dalje će se razumeti da otkriveni PTK7 modulatori mogu iscrpljivati, utišati, neutralizovati, eliminisati ili inhibirati rast, širenje ili preživljavanje tumorskih ćelija, naročito TPC-a, i / ili pridružene neoplazije, pomoću različitih mehanizama, uključujući agonizaciju ili antagonizaciju izabranih puteva ili eliminišući specifične ćelije u zavisnosti od, na primer, oblika PTK7 modulatora, bilo kojeg povezanog opterećenja ili doziranja i načina isporuke. Prema tome, iako su ovde opisani poželjni slučajevi usmereni na iscrpljivanje, inhibiciju ili utišavanje specifičnih podpopulacija tumorskih ćelija kao što su tumorske stalne ćelije, mora se naglasiti da su takvi primeri samo ilustrativni i ne ograničavaju u bilo kojem smislu.
Umesto navedenog u priloženim patentnim zahtevima, predmetni pronalazak je široko usmeren na PTK7 modulatore i njihovu upotrebu u lečenju, upravljanju ili profilaksi raznih hiperproliferativnih poremećaja povezanih sa PTK7, bez obzira na bilo koji određeni mehanizam ili ciljnu populaciju tumorskih ćelija.
[0067] U istom smislu, otkriveni primeri predmetnog pronalaska mogu sadržati jedan ili više PTK7 antagonista koji se povezuju sa PTK7. U tom cilju će se razumeti da PTK7 antagonisti predmetnog pronalaska mogu da sadrže bilo koji ligand, polipeptid, peptid, fuzioni protein, antitelo ili imunološki aktivan fragment ili njegov derivat koji prepoznaje, reaguje, veže, kombinuje, takmiči se, asocira ili na neki drugi način komunicira sa PTK7 proteinom ili njegovim fragmentom i eliminiše, utišava, redukuje, inhibira, ometa, obuzdava ili kontroliše rast ćelija koje iniciraju tumor ili drugih neoplastičnih ćelija, uključujući veliki tumor ili NTG ćelije. U odabranim slučajevima PTK7 modulatori sadrže PTK7 antagoniste.
[0068] Kao što je ovde korišćeno, antagonist se odnosi na molekul koji je sposoban da neutrališe, blokira, inhibira, ukida, redukuje ili ometa sa aktivnosti određenog ili specifičnog proteina, uključujući vezivanje receptora za ligande ili interakciju enzima sa supstratima. Uopšteno antagonisti pronalaska mogu sadržati antitela i fragmente koji vezuju antigen ili njihove derivate, proteine, peptide, glikoproteine, glikopeptide, glikolipide, polisaharide, oligosaharide, nukleinske kiseline, antisens konstrukte, siRNK, miRNK, bioorganske molekule, peptidomimetici i farmakopeuti njihove metabolite, transkripcijske i transkripcione
2
kontrolne sekvence i slično. Antagonisti takođe mogu da uključuju inhibitore malih molekula, fuzione proteine, molekule receptora i derivate koji se specifično vezuju za protein i tako izdvajaju njegovo vezaivanje za njegov supstratni cilj, antagonističke varijante proteina, antisens molekule usmerene na protein, RNA aptamere i ribocime protiv belančevina.
[0069] Kao što je ovde korišćeno i primenjeno na dva ili više molekula ili jedinjenja, termini prepoznati ili pridruženi biće označeni kao reakcija, vezivanje, specifično vezivanje, kombinacija, interakcija, veza, vezivanje, ujedinjavanje, koalescencija, pripajanje ili spajanje, kovalentno ili ne -kovalentno, molekula pri čemu jedan molekul deluje na drugi molekul.
[0070] Štaviše, kao što je pokazano u primerima ovde, neki modulatori humanog PTK7 mogu, u određenim slučajevima, uzajamno reagovati sa PTK7 od neke druge vrstea da nije čovek (na primer, miš). U drugim slučajevima, primerni modulatori mogu biti specifični za jedan ili više izoformi humanog PTK7 i neće pokazati unakrsnu reaktivnost sa PTK7 ortolozima drugih vrsta. Naravno, u kombinaciji sa ovde opisanim učenjima, ova rešenja mogu sadržati pan-PTK7 antitela koja se povezuju sa dve ili više izoformi iz jedne vrste ili antitela koja se isključivo povezuju sa jednom izoformom.
[0071] U svakom slučaju, kao što će biti detaljnije diskutovano u daljem tekstu, oni koji poznaju ovu oblast će znati da se otkriveni modulatori mogu koristiti u konjugovanom ili nekonjugovanom obliku. Odnosno, modulator može biti povezan sa ili konjugovan za (ili kovalentno ili nekovalentno) farmaceutski aktivnim jedinjenjima, modifikatorima biološkog odgovora, antikancerogenim agensima, citotoksičnim ili citostatskim agensima, dijagnostičkim komponentama ili biokompatibilnim modifikatorima. S tim u vezi, razumeće se da takvi konjugati mogu da sadrže peptide, polipeptide, proteine, fuzione proteine, molekule nukleinske kiseline, male molekule, mimetičke agense, sintetičke lekove, neorganske molekule, organske molekule i radioizotope. Pored toga, kao što je ovde naznačeno, izabrani konjugat može biti kovalentno ili nekovalentno povezan sa PTK7 modulatorom u različitim molarnim odnosima, u zavisnosti, bar delimično, od postupka koji se koristi za konjugaciju.
V. Antitela
a. Pregled
[0072] Kao što je ranije aludirano na posebno poželjne slučajeve predmetnog pronalaska koji sadrži PTK7 modulatore u obliku antitela koja se preferirano povezuju sa jednim ili više
2
izoformi PTK7. Izraz antitelo se koristi u najširem smislu i posebno obuhvata sintetička antitela, monoklonska antitela, oligoklonalna ili poliklonska antitela, multiklonska antitela, antitela rekombinantno proizvedena, antitela, multispecifična antitela, bispecifična antitela, monovalentna antitela, multivalentna antitela, humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, antitela graftovana CDR-om, primatizovana antitela, fragmenti Fab-a, fragmenti F(ab '), jednolančani FvFcs (scFvFc), jednolančana Fvs (scFv), anti-idiotipska (anti-Id) antitela i bilo koja druga imunološki aktivna antitela fragmente sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (tj. imunospecifičnu ili imunopreferencijalnu PTK7 asocijaciju ili vezivanje). U širem smislu, antitela predmetnog pronalaska uključuju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne fragmente molekula imunoglobulina, odn., molekule koji sadrže mesto vezivanja antigena, pri čemu se ti fragmenti mogu ili ne mogu spojiti sa drugim domenom imunoglobulina koji uključuje, ali nije ograničeno na, Fc region ili njegov fragment. Nadalje, kao što je ovde detaljnije prikazano, termini antitelo i antitela posebno uključuju Fc varijante kako je dole opisano, uključujući antitela pune dužine i varijantu Fc-Fusions koja obuhvata Fc region ili njihove fragmente, koji po izboru sadrže najmanje jednu modifikaciju amino kiselinskog ostatka i spojene su za imunološki aktivni fragment imunoglobulina.
[0073] Kao što je detaljnije prikazano u daljem tekstu, generički pojmovi antitelo ili imunoglobulin sadrže pet različitih klasa antitela koja se mogu biohemijski razlikovati i, zavisno od amino kiselinskog niza u konstantnom domenu njihovih teških lanaca, mogu se lako dodeliti odgovarajućoj klasi. Iz istorijskih razloga, glavne klase netaknutih antitela nazivaju se IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Kod ljudi, klase IgG i IgA mogu se dalje podeliti u prepoznate podklase (izotipove), odn., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2, u zavisnosti od strukture i određenih biohemijskih svojstava. Biće poznato da su IgG izotipovi kod ljudi imenovani po njihovom obilju u serumu, a IgG1 je najzastupljeniji.
[0074] Dok je svih pet klasa antitela (odn., IgA, IgD, IgE, IgG i IgM) i svih izotipi (odn., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), kao i njihove varijacije, u obimu predmetnog pronalaska, poželjna rešenja koja sadrže IgG klasu imunoglobulina će biti detaljno razmotrana isključivo u svrhu ilustracije.
[0075] S tim u vezi, humani IgG imunoglobulini sadrže dva identična laka polipeptidna lanca molekulske težine od približno 23000 Daltona, i dva identična teška lanca molekulske težine od 53000 do 70000 u zavisnosti od izotipa. Konstantni domeni teških lanaca koji odgovaraju različitim klasama antitela označeni su odgovarajućim malim grčkim slovomĮ, į, İ, Ȗ, i m, espektivno. Laki lanci antitela iz bilo koje vrste kralježnjaka mogu se dodeliti jednom od dva jasno različita tipa, nazvana kapa (ț) i lambda (Ȝ), na osnovu aminokiselinskih
2
sekvenci njihovih konstantnih domena. Stručnjaci će razumeti da su strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina dobro poznate.
[0076] ýetiri lanca su spojena disulfidnim vezama u Y konfiguraciji gde laki lanci nose teške lance koji počinju na početku Y i nastavljaju se kroz promenljivo područje do dvostrukih krajeva Y. Svaki lanac je povezan sa teškim lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom dok se dve disulfidne veze u zglobnom području pridružuju teškim lancima. Odgovarajući teški i laki lanci takođe imaju redovno raspoređene intra-lančane disulfidne mostove čiji se broj može razlikovati u zavisnosti od izotipa IgG.
[0077] Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH) praćeno sa većim brojem kontantnih domena. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen na njegovom frugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, i varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa promenljivim domenom teškog lanca. S tim u vezi, biće poznato da varijabilni domeni oba i lakog (VL) i teškog (VH) lančanog dela određuju prepoznavanje i specifičnost antigena. Suprotno tome, konstantne domene lakog lanca (CL) i teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) daju i regulišu važna biološka svojstva kao što su sekrecija, transplacentalna pokretljivost, poluživot cirkulacije, vezivanje komplementa i slično. Prema konvenciji, broj domena konstantnih regiona se povećava kako postaju udaljeniji od mesta vezivanja antigena ili amino-terminala antitela. Prema tome, amino ili N-kraj antitela sadrži promenljivo područje, a karboksi ili Cterminus sadrže konstantno područje. Stoga, CH3 i CLdomene zapravo sadrže karboksi-kraj teškog i lakog lanca.
[0078] Termin varijabla odnosi se na činjenicu da se određeni delovi promenljivih domena znatno razlikuju u nizu između imunoglobulina i ove vruće tačke u velikoj meri definišu karakteristike vezivanja i specifičnosti određenog antitela. Ova hipervarijabilna mesta manifestuju se u tri segmenta, poznata kao regioni za određivanje komplementarnosti (CDRs), u varijabilnim domenima lakog i teškog lanca. ýešće sačuvani delovi promenljivih domena koji spajaju CDR nazivaju se okvirna područja (FR). Tačnije, u monomernim IgG antitela koja se javljaju u prirodi, šest CDR prisutnih na svakom kraku antitela su kratke, neprekidne sekvence amino kiselina koje su posebno smeštene tako da formiraju mesto vezivanja antigena, jer antitelo pretpostavlja svoju trodimenzionalnu konfiguraciju u vodenoj sredini.
[0079] Okvirni regioni koji sadrže ostatak teških i lakih varijabilnih domena pokazuju manju intermolekularnu varijabilnost u amino kiselinskoj sekvenci. Umesto toga, okvirini regioni
2
uglavnom usvajaju ȕ-lisnu konformaciju, a CDR formiraju petlje koje se povezuju, a u nekim slučajevima čine i deo strukture ȕ lista. Stoga ovi okvirni regioni deluju kao skele koje omogućavaju postavljanje šest CDR u ispravnoj orijentaciji sa međulančanim, nekovalentnim interakcijama. Mesto vezivanja antigena formirano sa pozicioniranim CDR-om definiše površinu koja je komplementarna epitopu imunoreaktivnog antigena. Ova komplementarna površina promoviše nekovalentno vezivanje antitela za imunoreaktivni epitop antigena. Biće poznato da položaj i kompozicija CDR može lako identifikovati stručnjak ove oblasti koristeći definicije date u ovom dokumentu.
[0080] Kao što je diskutovano u više detalja u nastavku svi ili deo varijabilnih regiona teškog i lakog lanca mogu biti preporučeni ili konstruisani korišćenjem standardnih rekombinantnih u ekspresionih tehnika kako bi se obezbedila efektivna antitela. To jest, varijabilni region teškog ili lakog lanca iz prvog antitela (ili bilo koji njegov deo) može se mešati i uskladiti sa bilo kojim izabranim delom varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca iz drugog antitela. Na primer, u jednom primeru, celokupni varijabilni region lakog lanca koje sadrži tri CDR lakog lanca prvog antitela može biti upareno sa celim varijabilnim regijonom teškog lanca drugog CDR teškog lanca drugog antitela da bi se dobilo operativno antitelo. Pored toga, u drugim slučajevima, pojedinačni CDR teškog i lakog lanca izvedeni iz različitih antitela mogu se mešati i podudariti da bi se dobilo željeno antitelo koje ima optimizovane karakteristike. Prema tome, primerno antitelo može sadržavati tri CDR lakog lanca iz prvog antitela, dva CDR teškog lanca izvedena iz drugog antitela i treći CDR teškog lanca iz trećeg antitela.
[0081] Tačnije, u kontekstu predmetnog pronalaska, biće uočljivo da bilo koji od otkrivenih CDR teškog i lakog lanca izvedenih iz amino kiselinskih sekvenci mišjeg varijabilnog regiona, prikazanih na FIG.6A ili FIG.6B može biti preuređen na ovaj način kako bi se dobila optimizovana anti-PTK7 (npr. anti-hPTK7) antitela u skladu sa trenutnim učenjima. To jest, jedan ili više CDR izvedenih iz susednih amino kiselinskih sekvenci varijabilnih regiona lakog lanca, prikazanih na FIG.6A (SEKQ ID NOS: 20 - 60, parni brojevi) ili susednih amino kiselinskih sekvenci promenljivog regiona teškog lanca, prikazanih na FIG.6B (SEQ ID NOS: 21 - 61, neparni brojevi) može biti ugrađen u PTK7 modulator i, naročito u poželjnim slučajevima, u CDR graftovano ili humanizovano antitelo koje se imunospecifično povezuje sa jednom ili više PTK7 izoformi. Primeri amino kiselinskih sekvenci varijabilnih regiona lakog (SEQ ID NOS: 62 - 68, parnih brojeva) i teškog (SEQ ID NOS: 63 - 69, neparni brojevi) lanca takvih humanizovanih modulatora takođe su navedeni na FIG.6A i 6B. Uzeti zajedno, ove nove amino kiselinske sekvence prikazuju dvadeset i jedan mišji i četiri humanizovana primerna modulatora u skladu sa predmetnim pronalaskom. Štaviše, odgovarajuće sekvence nukleinskih kiselina svakog od dvadeset jednog primernog mišjeg modulatora i četiri humanizovana modulatora prikazana na FIG.6A i 6B su uključene u sekvencu listu koja je dodat u predmetnu prijavu (SEQ ID NOS: 120 - 169).
[0082] U svakom slučaju, brojevi ostataka regiona koji određuju komplementarnost mogu se definisati kao oni u Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.), naročito, ostaci 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) i 89-97 (CDR3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) i 95-102 (CDR3) u varijabilnom domenu teškog lanca. Imajte na umu da CDR se značajno razlikuju od antitela do antitela (i po definiciji neće pokazati homologiju sa Kabat konsenzusnim sekvencama). Maksimalno poravnavanje ostataka okvira često zahteva umetanje odstojničkih ostataka u sistem numerisanja da bi se koristilo za Fv region. Pored toga, identitet određenih pojedinačnih ostataka na bilo kom datom Kabat broju mesta može varirati od lanca antitela do lanca antitela zbog među vrsta ili alelnih divergencija. Videti takođe Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342, pp.877-883 (1989), MacCallum et al., J. Mol. Biol.262:732-745 (1996) i S. Dubel, ed., Handbook of Therapeutic Antibodies, 3rd ed., WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. (2007), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove amino kiselinskih ostataka kada se porede jedna sa drugom.
Amino kiselinski ostaci koji sadrže vezujuće regione ili CDR kao što je definisano u svakoj od gore navedenih referenci i navedeni su za upoređivanje u nastavku.
CDR Definitions
<1>Numeracija ostataka sledi nomenklaturi Kabat et al., supra
<2>Numeracija ostataka sledi nomenklaturi Chothia et al., supra
<3>Numeracija ostataka sledi nomenklaturi MacCallum et al., supra
[0083] Kao što je ovde diskutirano, stručnjak u oblasti može lako definisati, identifikovati i/ili nabrojati CDR kako su definisali Kabat i dr., Chothia et al. ili MacCallum et al. za svaku
1
odgovarajuću sekvencu teškog i lakog lanca prikazan na FIG.6A ili FIG.6B. Shodno tome, svaki od predmetnih CDR i antitela koja sadrže CDR definisane u svim takvim nomenklaturama izričito su uključene u opseg predmetnog pronalaska. Šire rečeno, izraz amino kiselinski ostatak varijabilnog regiona CDR uključuje amino kiseline u CDR kao što je identifikovano korišćenjem bilo koje metode zasnovane na sekvenci ili strukturi kao što je navedeno gore.
[0084] Kao što je ovde korišćeno, izraz amino kiselinski ostataci okvirnog varijabilnog regiona (FR) odnosi se na one amino kiseline u okvirnom regionu Ig lanca. Izraz okvirni region ili FR region, kako se ovde koristi, uključuje amino kiselinske ostatke koji su deo varijabilnog regiona, ali nisu deo CDR (npr., koristeći Kabat definiciju CDR). Zbog toga, okvir varijabilnog regiona predstavlja neprekidnu sekvencu dužine između oko 100-120 amino kiselina, ali uključuje samo one amino kiseline izvan CDR.
[0085] Za specifični primer varijabilnog regiona teškog lanca i za CDR kako je definisano od strane Kabat et al., okvirni region 1 odgovara domenu varijabilnog regiona koji obuhvata amino kiseline 1-30; okvirni region 2 odgovara domenu varijabilnog regiona koji obuhvata amino kiseline 36-49; okvirna region 3 odgovara domenu varijabilnog regiona koja obuhvata amino kiseline 66-94, a okvirni region 4 odgovara domenu varijabilnog regiona od amino kiselina 103 do kraja varijabilnog regiona. Okvirni regioni za laki lanac su na sličan način odvojeni od svakog varijabilnog regiona CDR lakog lanca. Slično tome, koristeći definiciju CDR od strane Chothia et al. (npr., CDR-L123-34, CDR-L250-56, CDR-L389-97; CDR-H1 26-32, CDR-H250-58, CDR-H395-102) ili McCallum et al. granice okvirnog regiona odvojene su odgovarajućim CDR terminima kao što je gore opisano.
[0086] Imajući na umu gore navedena strukturalna razmatranja, stručnjaci će razumeti da antitela iz predmetnog pronalaska mogu da sadrže bilo koje rešenje od niza funkcionalnih rešenja. U tom pogledu, kompatibilna antitela mogu sadržati bilo koja imunoreaktivna antitela (kao što je ovde definisan izraz) koji pruža željeni fiziološki odgovor kod subjekta. Dok se bilo koje od otkrivenih antitela može koristiti u vezi sa predmetnim učenjima, određena rešenja pronalaska će sadržati himerna, humanizovana ili humana monoklonska antitela ili imunoreaktivne fragmente istih. Ipak druga rešenja mogu, na primer, da sadrže homogene ili heterogene multimerne konstrukte, Fc varijante i konjugovana ili glikozilaciono izmenjena antitela. Štaviše, razumeće se da takve konfiguracije nisu međusobno isključive i da kompatibilna pojedina antitela mogu sadržati jedan ili više ovde opisanih funkcionalnih aspekata. Na primer, kompatibilno antitelo može sadržati jedno lančano dijatelo sa humanizovanim varijabilnim regionima ili potpuno humano antitelo IgG3 pune dužine sa Fc
2
modifikacijama koje menjaju obrazac glikozilacije tako da moduliraju poluživot u serumu. Druge primere rešenja su lako očigledna stručnjacima i mogu se lako uočiti kao da su u okviru pronalaska.
b. Stvaranje antitela
[0087] Kao što je dobro poznato, i prikazano u ovde prikazanim Primerima, razne domaće životinje, uključujući zečeve, miševe, pacove, itd., mogu se inokulirati i koristiti za obezbeđivanje antitela u skladu sa ovde opisanim učenjem. Poznate pomoćne supstance koje se mogu koristiti za povećanje imunološkog odgovora, u zavisnosti od inokulirane vrste uključuju, ali nisu ograničeni na, Freundove (kompletne i nepotpune), mineralne gelove kao što je aluminijum hidroksid, površinski aktivne supstance kao što su lizolecitin, pluronski polioli, poliani, peptidi, emulzije ulja, keyhole limpet hemocijanini, dinitrofenol i potencijalno korisne humane pomoćne supstance kao što su BCG (bacil Calmette-Guerin) i korinbakterium parvum. Takve pomoćne supstance mogu zaštititi antigen od brzog rasipanja izdvajanjem u lokalno ležište ili mogu sadržati supstance koje stimulišu domaćina na izlučivanje faktora koji su hemotaktični za makrofage i druge komponente imunog sistema. Poželjno, ako se daje polipeptid, raspored imunizacije će uključivati dve ili više primena polipeptida, raspoređenih tokom nekoliko nedelja.
[0088] Posle imunizacije životinje imunogenom PTK7 (npr., rastvorljivi PTK7 ili sPTK7) koji može da sadrži odabrane izoforme i/ili peptide, ili žive ćelije ili ćelijske preparate koji izražavaju željeni protein, antitela i/ili ćelije koje proizvode antitela mogu se dobiti od životinja koristeći tehnike priznate u tehnici. U nekim slučajevima, poliklonski serum koji sadrži antitela protiv PTK7 se dobija krvarenjem ili žrtvovanjem životinje. Serum se može koristiti u istraživačke svrhe u obliku dobijenom od životinje ili, alternativno, anti-PTK7 antitela mogu biti delimično ili u potpunosti prečišćena da bi se obezbedile imunoglobulinske frakcije ili homogeni preparati antitela.
c. Monoklonska antitela
[0089] Dok se poliklonska antitela mogu koristiti u kombinaciji sa određenim aspektima predmetnog pronalaska, poželjni slučajevi obuhvataju upotrebu PTK7 reaktivnih monoklonskih antitela. Kako se ovde koristi, termin monoklonsko antitelo ili mAb odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije osnovnih homogenih antitela, odn., pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju su identična, osim mogućih mutacija, npr., mutacije koje se javljaju u prirodi, a koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Prema tome, monoklonalni modifikator ukazuje na karakter antitela koji nije smeša diskretnih antitela i može se koristiti u kombinaciji sa bilo kojim tipom antitela. U određenim rešenjima, takvo monoklonalno antitelo uključuje antitelo koje sadrži polipeptidnu sekvencu koja se veže ili povezuje sa PTK7, pri čemu je polipeptidna sekvenca koja se veže za PTK7 dobijena postupkom koji uključuje izbor jedne ciljane polipeptidne sekvence koja se veže iz mnoštva polipeptidnih sekvenci.
[0090] U poželjnim slučajevima, ćelijske linije koje proizvode antitela se pripremaju iz ćelija izolovanih od imunizovane životinje. Posle imunizacije životinja se žrtvuje i limfni čvor i/ili B ćelije slezine se imortalizuju na način koji je dobro poznat u struci, kao što je prikazano u priloženim Primerima). Postupci imortalizacije ćelije uključuju, ali nisu ograničeni na, njihovu transfekciju sa onkogenima, njihovim inficiranjem sa onkogenim virusom i njihovim kultivisanjem pod uslovima koji se biraju za imortalizovane ćelije, podvrgavajući ih kancerogenim ili mutirajućim jedinjenjima, spajajući ih sa imortalizovanom ćelijom, npr., ćelija mijeloma, i inaktivirajući tumorski supresivni gen. Ako se koristi fuzija sa ćelijama mijeloma, ćelije mijeloma po mogućnosti ne izlučuju imunoglobulinske polipeptide (nesekretorna ćelijska linija). Kao što je navedeno u Primerima u nastavku, imortalizovane ćelije mogu biti pregledane korišćenjem PTK7 (uključujući odabrane izoforme) ili njihovim imunoreaktivnim delom. U poželjnom primeru, početni skrining se izvodi korišćenjem enzimski-povezane imunoanalize (ELISA) ili radioimunoanalize.
[0091] Uopšteno, diskretna monoklonska antitela koja su u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se pripremiti korišćenjem širokog spektra tehnika poznatih u tehnici, uključujući hibridome, rekombinantne tehnike, tehnologije prikazivanja faga, biblioteke kvasca, transgene životinje (npr., KsenoMouse® ili HuMAb Mouse®) ili neka kombinacija istih. Na primer, monoklonska antitela se mogu proizvesti korišćenjem hibridomskih tehnika kao što su gore opisane i detaljnije opisane u Harlov et al., Antitels: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988); Hammerling i dr., u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. I., 1981). Korišćenjem opisanih protokola, antitela se poželjno podižu kod sisara višestrukim potkožnim ili intraperitonealnim injekcijama relevantnog antigena i adjuvansa. Kao što je prethodno diskutovano, ova imunizacija uglavnom izaziva imuni odgovor koji uključuje proizvodnju antigen-reaktivnih antitela (koja mogu biti u potpunosti humana ukoliko je imunizovana životinja transgena) iz aktiviranih splenocita ili limfocita. Dok se dobijena antitela mogu prikupiti iz seruma životinje da bi se dobili poliklonski preparati, generalno je poželjnije izolovati pojedinačne limfocite iz slezine, limfnih čvorova ili periferne krvi da bi se dobili homogeni preparati monoklonskih antitela. Najčešće se limfociti dobijaju iz slezine i ovekoveče da bi se dobili hibridomi.
4
[0092] Na primer, kao što je ranije opisano, postupak selekcije može biti selekcija jedinstvenog klona iz velikog broja klonova, kao što je izvor hibridnih klonova, fagni klonovi, ili rekombinantni DNK klonovi. Treba da se shvati da odabrana PTK7 vezujuća sekvenca može dalje biti izmenjen, na primer, da se poboljša za ciljanje, humanizovanje ciljane vezujuće sekvence, da se poboljša njegova proizvodnja u ćelijsko kulturi, da se smanji njegova imunogensot in vivo, da se stvori multispecifično antitelo, itd., i da antitelo koje sadrži izmenjenu ciljnu vezujuću sekvencu takođe je monoklonsko antitelo ovog pronalaska. Za razliku od preparata za poliklonalna antitela, koji obično uključuju diskretna antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopi), svako monoklonsko antitelo monoklonskog preparata za antitelo je usmereno protiv pojedinačne determinante na antigenu. Pored svoje specifičnosti, preparati monoklonskih antitela su povoljni po tome što ih obično ne kontaminiraju drugi imunoglobulini koji mogu biti unakrsno reaktivni.
d. Himerna antitela
[0093] U drugom rešenju, antitelo pronalaska može sadržati himerna antitela izvedena iz kovalentno spojenih proteinskih segmenata iz najmanje dve različite vrste ili tipa antitela. Podrazumevaće se da je, kako se ovde koristi, izraz himerna antitela usmeren na konstrukcije u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od određene vrste ili pripadaju određenoj vrsti klasa antitela ili podklasa, dok je ostatak lanca (i) identičan ili homologan odgovarajućim nizovima antitela izvedenih iz druge vrste ili pripadaju drugoj klasi antitela ili podklasa, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok oni pokazuju željena biološka aktivnost (U.S. Pat. No.4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primernom rešenju, himerno antitelo prema učem+njima ovde može sadržati mišje VHand VLamino kiselinske sekvence i konstantne regione izvedeni iz humanog izvora. U drugim kompatibilnim rešenjima himerno antitelo predmetnog pronalaska može sadržati CDR graftovano ili humanizovano antitelo kao što je opisano ovde.
[0094] Uopšteno, cilj stvaranja himernog antitela je stvaranje himere u kome će se maksimizirati broj amino kiselina od željene predmetne vrste. Jedan primer je antitelo presađeno CDR, u kojem antitelo sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) određene vrste ili pripadaju određenoj klasi antitela ili podklasi, dok je/su ostatak lanca(aca) antitela identičan ili homologan odgovarajućoj sekvenci u antitelima dobijenim od druge vrste ili pripadaju drugoj klasi antitela ili podraklasi. Za upotrebu kod ljudi, varijabilni region ili izabrani CDR iz antitela glodara često se cepaju u humano antitelo, zamenjujući prirodne varijabilne regione ili CDR humanih antitela. Ovi konstrukti uglavnom imaju prednosti pružanja funkcija modulatora pune snage (npr., CDC, ADCC, itd.), istovremeno smanjujući neželjene imune odgovore na antitelo od strane subjekta.
e. Humanizovana antitela
[0095] Slično CDR graftovano antitelo je humanizovano antitelo. Uopšteno, humanizovano antitelo se proizvodi iz monoklonskog antitela podignutog u početku kod nehumane životinje. Kao što se ovde koristi, humanizovani oblici nehumanih (npr., mišjih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. U jednom aspektu, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (recipijent ili akceptorsko antitelo) u kome su ostaci iz CDR recipijentnog antitela zamenjeni ostacima iz CDR ne-humane vrste (antitelo donora), poput miša, pacova, zeca, ili nehumani primati koji imaju željenu specifičnost, afinitet i/ili sposobnost.
[0096] Uopšteno, humanizacija antitela obuhvata analizu homologije sekvenci i kanonskih struktura i antitela davaoca i primalaca. U izabranim rešenjima, prijemno antitelo može sadržati konsenzusne sekvence. Da bi se stvorili humani konsenzusni okviri, okviri iz nekoliko amino kiselinskih sekvenci teškog lanca ili lakog lanca mogu se poravnati tako da identifikuju konsenzusni niz amino kiselina. Štaviše, u mnogim slučajevima, jedan ili više okvirnih ostataka u varijabilnom domenu humanog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim nehumanim ostacima iz donatorskog antitela. Ove supstitucije okvira identifikovane su postupcima dobro poznatim u tehnici, npr., modelovanjem interakcija CDR i ostataka okvira kako bi se identifikovali ostaci okvira koji su važni za vezivanje antigena i poređenje sekvenci kako bi se identifikovali neobični ostaci okvira na određenim pozicijama. Takve supstitucije pomažu u održavanju odgovarajuće trodimenzionalne konfiguracije graftovanih CDR i često poboljšavaju beskonačnost u odnosu na slične konstrukcije bez supstitucije okvira. Pored toga, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u antitelu recipijenta ili u antitelu donora. Ove modifikacije se mogu izvršiti radi poboljšanja performansi antitela koristeći dobro poznate tehnike.
[0097] CDR graftovanja i humanizovana antitela su opisana, na primer, u U.S.P.Br.
6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089, i 5,530,101. Uopšteno, humanizovano antitelo će sadržati uglavnom sve od najmanje jednog i tipično dva varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR odgovaraju onim ne-humanim imunoglobulinima i svi ili suštinski svi regionalni regioni su oni iz humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo opciono će takođe sadržati bar deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), obično onog humanog imunoglobulina. Za više detalja, videti npr., Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). See also, e.g., Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol.
1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994); i U.S.P.Br.6,982,321 and 7,087,409. Još jedna metoda se naziva humaniranje i opisana je, na primer, u U.S.2005/0008625. Za potrebe predmetne prijave, termin humanizovana antitela će se držati tako da eksplicitno uključuje CDR graftovana antitela (odn. humana antitela koja sadrže jedan ili više graftovanih nehumanih CDR) bez ili minimalne supstitucije okvira.
[0098] Pored toga, ne-humano anti- PTK7 antitelo takođe se može modifikovati specifičnom delecijom epitopa humanih T ćelija ili deimunizacijom postupcima otkrivenim u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ukratko, varijabilni regioni teškog i lakog lanca antitela mogu se analizirati na peptide koji se vezuju za MHC klasu II; ovi peptidi predstavljaju potencijalne epitope T-ćelija (kao što je definisano u WO 98/52976 i WO 00/34317). Za detekciju potencijalnih epitopa T-ćelija, može se primeniti kompjuterski model modeliranja nazvanim navojem peptida, a osim toga, u bazi podataka humanih peptida vezanim za MHC klase II može se tražiti motivi prisutni u VHi VLsekvenci, kako je opisano u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ovi se motivi vezuju za bilo koji od 18 glavnih alotipa DR MHC klase II i tako čine potencijalne epitope T ćelija. Otkriveni potencijalni epitopi T-ćelija mogu se eliminisati supstitucijom malog broja amino kiselinskih ostataka u varijabilnim regionima, ili pojedinačnim supstitucijama amino kiselina. Koliko je moguće, vrši se konzervativna zamena. ýesto, ali ne isključivo, mogu se koristiti amino kiseline uobičajene za mesto u humanim sekvencama antitela. Nakon što se utvrde deimunizujuće promene, nukleinske kiseline koje kodiraju VHi VLmogu se konstruisati sa mutagenezom ili drugim sintetskim metodama (npr., sinteza de novo, zamena kaseta, i tako dalje). Mutagenizovana varijabilna sekvencija može, po izboru, da se stapa sa humanim konstantnim regionom.
[0099] U odabranim rešenjima, najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% ostataka humanizovaog antitelnog varijabilnog regiona će odgovarati onima iz parentalnog okvirnog regiona (FR) i CDR sekvenci. U drugim rešenjima, najmanje 85% ili 90% humanizovanih ostataka antitela će odgovarati onima iz parentalnog okvirnog regiona (FR) i CDR sekvenci. U sledećem poželjnom rešenju, više od 95% ostataka humanizovanih antitela će odgovarati onima iz parentalnog okvirnog regiona (FR) i CDR sekvenci.
[0100] Humanizovana antitela mogu se proizvesti korišćenjem uobičajenih molekularnih bioloških i biomolekularnih tehnika inženjeringa kao što je ovde opisano. Ovi postupci uključuju izolovanje, manipuliranje i ekspresiju sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju sve ili deo imunoglobulina Fv varijabilnog regiona iz najmanje jednog teškog ili lakog lanca. Izvori takve nukleinske kiseline su dobro poznati stručnjacima i, na primer, mogu se dobiti iz hibridoma, eukariotske ćelije ili faga koji proizvode antitelo ili imunoreaktivni fragment protiv unapred određenog cilja, kao što je gore opisano, iz gena imunoglobulina germline, ili iz sintetskih konstrukcija. Rekombinantna DNK koja kodira humanizovano antitelo može se zatim klonirati u odgovarajući ekspresioni vektor.
[0101] Na primer, humane germlinijske sekvence otkrivene su u Tomlinson, I. A. et al.
(1992) J. Mol. Biol.227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Bio.227:799-817; i Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14:4628-4638. V BASE direktorij pruža sveobuhvatan imenik sekvenci varijabilnih humanih imunoglobulina (Videti Retter et al., (2005) Nuc Acid Res 33: 671-674). Ove sekvence se mogu koristiti kao izvor humane sekvence, npr., za okvirne regione i CDR. Kao što je ovde izloženo, takođe se mogu koristiti i humani okvirni regioni, npr., kao što je opisano u U.S.P.N.6,300,064.
f. Humana antitela
[0102] Pored gore pomenutih antitela, stručnjaci u ovoj oblasti će razumeti da antitela predmetnog pronalaska mogu da sadrže u potpunosti humana antitela. U svrhu predmetne prijave, izraz humano antitelo sadrži antitelo koje poseduje amino kiselinsku sekvencu koja odgovara sekvenci antitela koju proizvodi čovek i/ili je napravljena korišćenjem bilo koje tehnike izrade humanih antitela koja su ovde otkrivena. Ova definicija humanog antitela izričito isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ostatke nehumanih antigen-vezujućih ostataka.
[0103] Humana antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u tehnici. Kao što je gore navedeno, tehnike prikazivanja faga mogu se koristiti za obezbeđivanje imunoaktivnih vezajućih regiona u skladu sa predmetnim učenjima. Prema tome, određeni primeri pronalaska pružaju postupke za proizvodnju anti-PTK7 antitela ili njegovih delova koji vezuju antigen koji sadrže korake sinteze biblioteke (poželjno ljudskih) antitela na fagu, skrining biblioteke sa izabranim PTK7 ili delom koji veže antitelo, od toga, izolovanjem faga koji veže PTK7 i dobijanjem imunoreaktivnih fragmenata iz faga. Na primer, jedan postupak za pripremu biblioteke antitela za upotrebu u tehnikama fagovog prikaza prikazuje korake imunizacije nehumane životinje koja sadrži humane ili nehumane lokise imunoglobulina sa odabranim PTK7 ili njegovim antigenim delom kako bi se stvorio imunološki odgovor, vađenje ćelija koje stvaraju antitela iz imunizovane životinje; izolovanje RNK koja kodira teške i lagane lance antitela pronalaska iz ekstrahiranih ćelija, reverzno prepisivanje RNK da bi se stvorila cDNK, amplifikovanje cDNK pomoću prajmera i ubacivanje cDNK u faktor vektora displeja tako da se antitela eksprimiraju na fagu. Preciznije, DNK koja kodira VHi VLdomene kombinuje se zajedno sa scFv vezom PCR i klonira u vektor fagemida (npr., P CANTAB 6 ili pComb 3 HSS). Vektor se tada može elektroporirati u E. coli i tada je E. coli inficiran pomočnim fagom. Fag koji se koristi u ovim postupcima je obično filamentozni fag koji uključuje fd i M13, a VHi VLdomeni su obično rekombinantno spojeni bilo sa fag gena III ili gena VIII.
[0104] Rekombinantna humana anti-PTK7 antitela pronalaska mogu biti izolovana ispitivanjem rekombinantne kombinatoričke biblioteke antitela pripremljena kao gore. U poželjnom rešenju, biblioteka je scFv fag displej biblioteka, generisana korišćenjem humanih VLi VHcDNK pripremljenih iz mRNK izolovane iz B ćelija. Postupci za pripremu i skrining ovih biblioteka su dobro poznate u struci, a setovi za generisanje fagonskih biblioteka su komercijalno dostupni (npr., the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, katalog br. 27-9400-01; i Stratagene SurfZAP™ phage display kit, katalog br.240612). Postoje i drugi postupci i reagensi koji se mogu koristiti u generisanju i skriningu biblioteka za prikaz antitela (videti, npr., U.S.P.N.5,223,409; PCT Objave Br. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J.12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol.226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res.19:4133-4137 (1991); i Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991).
[0105] Antitela koja proizvode naivne biblioteke (bilo prirodne ili sintetičke) mogu biti umerenog afiniteta (Kaod oko 10<6>do 10<7>M<-1>), ali sazrevanje afiniteta takođe se može oponašati in vitro konstrukcijom i ponovnim izborom iz sekundarnih biblioteka kao što je opisano u tehnici. Na primer, mutacija se može uvesti nasumično in vitro upotrebom polimeraze naklonjene greškama (prijavljeno u Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) u postupku Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) ili u postupku Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992). Pored toga, sazrevanje afiniteta može se izvesti nasumičnim mutiranjem jednog ili više CDR, npr., korišćenjem PCR sa prajmerima koji nose slučajne sekvence koje obuhvataju CDR od interesa, u odabranim pojedinačnim Fv klonovima i skriningu na klone višeg afiniteta. WO 9607754 opisao je postupak za indukciju mutageneze u regionu koji određuje komplementarnost imunoglobulinskog lakog lanca radi stvaranja biblioteke gena lakog lanca. Drugi efikasan pristup je rekombinacija VHili VLdomena odabranih faznim displejom sa repertoarima varijanti V domena koje se prirodno dobijaju od neimunizovanih davalaca i sita za veći afinitet u nekoliko rundi preusmeravanja lanca, kao što je opisano u Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Ova tehnika omogućava proizvodnju antitela i fragmenata antitela sa konstantom disocijacije Kd(koff/kon) od oko 10<-9>M ili manje.
[0106] Dalje će se primetiti da se slični postupci mogu koristiti koristeći biblioteke koje sadrže eukariotske ćelije (npr., kvas) koje izražavaju vezujuće parove na svojoj površini. Kao što je slučaj sa tehnologijom prikaza faga, eukariotske biblioteke se pretražuju na antigen od interesa (odn., PTK7), a ćelije koje eksprimiraju parove koji se vezuju za kandidate su izolovane i klonirane. Mogu se preduzeti koraci za optimizaciju bibliotetskog sadržaja i za sazrevanje afiniteta reaktivnih vezujućih parova. Videti, na primer, U.S.P.N.7,700,302 i U.S.S.N.12/404,059. U jednom rešenju, humano antitelo je odabrano iz fagne biblioteke, gde ta fagna biblioteka ekspresuje humana antitela (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci.95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (1991)). U drugim rešenjima humani vezujući parovi mogu biti izolovani iz biblioteke kombinatornih antitela generisanih u eukariotskim ćelijama kao što je kvas. Videti npr., U.S.P.N.7,700,302. Takve tehnike povoljno omogućavaju skrining velikog broja kandidatskih modulatora i omogućavaju relativno laku manipulaciju sa nizovima kandidata (npr., sazrevanjem afiniteta ili rekombinantnim pomeranjem).
[0107] Humana antitela se takođe mogu napraviti unošenjem humanog imunoglobulinskog lokusa u transgene životinje, npr., miševe kod kojih su endogeni imunoglobulinski geni delimično ili potpuno inaktivirani. Nakon izazova, posmatrano je stvaranje humanih antitela, što u velikoj meri podseća na ono što je viđeno kod ljudi, uključujući preuređivanje gena, sastavljanje i repertoar antitela. Ovaj pristup je opisan, na primer, u U.S.P.Br.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, i U.S.P.N 6,075,181 i 6,150,584 koji se odnosi na XenoMouse® tehnologiju zajedno sa sledećimnaučnim objavama: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996);
Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev.
Immunol.13:65-93 (1995). Alternativno, humano antitelo može da se pripremi imortalizacijom humanih B-limfocita koji proizvode antitelo usmereno na ciljani antigen (takvi
4
B limfociti se mogu oporaviti od osobe koja boluje od neoplastičnog poremećaja ili su imunizovani in vitro). Videti, npr., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991); i U.S.P.N.
5,750,373.
VI. Karakteristike Antitela
[0108] Bez obzira na način na koji je dobijen ili koji od gore pomenutih oblika modulator antitela uzima (npr., humanizovano, humano, itd.), poželjni primeri otkrivenih modulatora mogu pokazati različite karakteristike. S tim u vezi ćelije koje proizvode anti-PTK7 antitela (npr., hibridomi ili kolonije kvasca) mogu se odabrati, klonirati i dodatno pregledati za poželjne karakteristike, uključujući, na primer, snažan rast, visoku proizvodnju antitela i, kao što je detaljnije rečeno u daljem tekstu, poželjne karakteristike antitela. Hibridomi se mogu proširiti in vivo kod singenskih životinja, kod životinja kojima nedostaje imunološki sistem, npr., goli miševi, ili u ćelijskoj kulturi in vitro. Postupci selekcije, kloniranja i širenja hibridoma i/ili kolonija, od kojih svaki stvara diskretne vrste antitela, dobro su poznati onima koji su u struci.
a. Nutrlaizovanje antitela
[0109] U posebno poželjnim slučajevima, modulatori predmetnog pronalaska će sadržati neutrališuća antitela ili njihov derivat ili fragment. Izraz neutrališuće antitelo ili neutralizujući antagonist odnosi se na antitelo ili antagonist koji se vezuje za ili interakciju sa PTK7 molekulom i sprečava vezivanje ili povezivanje liganda na bilo koji vezujući partner i time prekida biološki odgovor (npr., fosforilaciju ili angiogenezu izazvanu VEGF), u suprotnom bi proizašla iz interakcije molekula. U proceni vezivanja i specifičnosti antitela ili imunološki funkcionalnog fragmenta ili njegovog derivata, antitelo ili fragment će u značajnoj meri inhibirati vezivanje liganda na njegov vezujući partner ili supstrat kada višak antitela smanjuje količinu vezujućeg partnera vezanog za ciljani molekul najmanje za oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ili više, mereno, na primer, fosforilacijom ili izabranim supstratima (Shin et al, Biochem i Biophis Res Com, vol.371: 4) ili u in vitro kompetitivnom ispitivanju vezivanja. Na primer, antitela na PTK7, na primer, neutralizujuće antitelo ili antagonist će po mogućnosti umanjiti sposobnost fosforilacije PTK7 u odnosu na određeni supstrat za najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% , 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ili više. Biće poznato da se ova umanjena aktivnost može direktno meriti korišćenjem tehnika priznatih u tehnici ili se može meriti uticajem koji će takvo smanjenje imati na sekundarne aktivnosti kao što je angiogeneza.
b. Internalizacija antitela
[0110] Dok dokazi ukazuju da PTK7 ili njegovi odabrani izoformi mogu biti prisutni u rastvorljivom obliku, najmanje neki PTK7 verovatno ostaje povezan sa ćelijskom površinom i na taj način omogućava internalizaciju otkrivenih modulatora. Prema tome, antitela protiv PTK7 ovog pronalaska mogu biti internalizovana, bar do neke mere, ćelijama koje eksprimiraju PTK7. Na primer, antitelo protiv PTK7 koje se vezuje za PTK7 na površini ćelije koja inicira tumor može biti internalizovana ćelijom koja inicira tumor. U posebno poželjnim rešenjima, takva anti- PTK7 antitela mogu da budu povezana sa ili konjugovana sa antikancerogenim agensima, kao što su citotoksični delovi koji ubijaju ćeliju nakon internalizacije.
[0111] Kao što je ovde korišćeno, anti- PTK7 antitelo koje se internalizuje je ono koje ćelija preuzima posle vezivanja na PTK7 povezano sa ćelijom sisara. Internalizaciono antitelo uključuje fragmente antitela, humana ili humanizovana antitela i konjugate antitela.
Internalizacija se može dogoditi in vitro ili in vivo. Za terapijske primene, internalizacija se može pojaviti in vivo. Broj internalizovanih molekula antitela može biti dovoljan ili dovoljan da ubije ćeliju koja eksprimira PTK7, naročito ćeliju koja inicira tumor koja izražava PTK7. U zavisnosti od potencijala antitela ili konjugata za antitelo, u nekim slučajevima je unos jednog molekula antitela u ćeliju dovoljan da ubije ciljnu ćeliju za koju se antitelo veže. Na primer, određeni toksini su veoma jaki u ubijanju tako da je internalizacija jedne molekule toksina konjugiranog u antitelo dovoljna da ubije tumorsku ćeliju. Da li anti-PTK7 antitelo internalizuje vezanjem PTK7 na ćeliji sisara, može se utvrditi različitim testovima, uključujući i one opisane u dole navedenim primerima (npr., Primeri 12 i 13). Postupci otkrivanja da li se antitelo internalizuje u ćeliju su takođe opisane u U.S.P.N.7,619,068.
c. Potrošnj antitela
[0112] U drugim poželjnim slučajevima, modulatori predmetnog pronalaska će sadržati potrošena antitela ili njihove derivate ili fragmente. Izraz potrošeno antitelo odnosi se na antitelo ili fragment koji se veže ili povezuje sa PTK7 na ili u blizini ćelijske površine i indukuje, promoviše ili izaziva smrt, nesposobnost ili eliminaciju ćelije (npr., citotoksičnošću koja zavisi od komplementa ili antitelom- zavisna ćelijska citotoksičnost). U nekim rešenjima koja su detaljnije razmatrana u nastavku izabrana potrošena antitela će biti povezana ili konjugovana sa citotoksičnim agensom. Poželjno, potrošeno antitelo biće u stanju da ukloni, onesposobi, eliminiše ili ubije najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ili 99% ćelija koje obnavljaju tumor u definisanoj ćelijskoj populaciji. U nekim rešenjima ćelijska populacija može da sadrži obogaćene, presečene, prečišćene ili izolovane ćelije koje traju. U drugim rešenjima ćelijska populacija može da sadrži čitave uzorke tumora ili heterogene ekstrakte tumora koji sadrže ćelije koje traju. Stručnjaci u ovoj oblasti će razumeti da se standardne biohemijske tehnike kao što je opisano u nastavku u navedenim primerima (npr., Primeri 13 i 14) mogu koristiti za nadgledanje i kvantifikaciju iscrpljivanja ćelija tumora ili ćelija koja prožimaju tumor u skladu sa ovde navedenim učenjima.
d. Epitopsko vezivanje
[0113] Dalje će se razumeti, otkrivena anti-PTK7 antitela će se povezati sa ili se na njih vezati za diskretne epitope ili determinante predstavljene odabranim ciljevima. Kako se ovde koristi, termin epitop odnosi se na onaj deo ciljanog antigena koji može da bude prepoznat i specifično vezan za određeno antitelo. Kad je antigen polipeptid kao što je PTK7, epitopi se mogu formirati i iz susednih amino kiselina i nekontigenih amino kiselina koje su smeštene tercijarnim savijanjem proteina. Epitopi nastali iz susednih amino kiselina obično se zadržavaju nakon denaturisanja proteina, dok se epitopi formirani tercijalnim savijanjem obično gube nakon denaturisanja proteina. Epitop obično uključuje najmanje 3, i češće, najmanje 5 ili 8-10 amino kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Preciznije, iskusni stručnjak će ceniti da termin epitop uključuje bilo koju proteinsku odrednicu koja je sposobna da se specifično vezuje za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor ili na drugi način u interakciji sa molekulom. Epitopske odrednice se uglavnom sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su amino kiseline ili bočni lanci ugljenih hidrata ili šećera i obično imaju specifične dimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Pored toga, epitop može biti linearan ili konformacijski. U linearnom epitopu sve tačke interakcije proteina i interaktivnog molekula (poput antitela) se javljaju linearno duž primarne amino kiselinske sekvence proteina. U konformacijskom epitopu tačke interakcije nastaju preko amino kiselinskih ostataka proteina koji se linearno odvajaju jedan od drugog.
[0114] Jednom kada se utvrdi željeni epitop na antigenu, moguće je generisati antitela na taj epitop, npr., imuniziranjem peptidom koji sadrži epitop koristeći tehnike opisane u predmetno pronalasku. Alternativno, tokom procesa otkrivanja, stvaranje i karakterizacija antitela mogu razjasniti informacije o poželjnim epitopima. Iz tih informacija, potom je moguće kompetitivno skenirati antitela za vezivanje na isti epitop. Pristup da se to postigne je sprovođenje studija konkurencije kako bi se pronašla antitela koja se kompetitivno vezuju, odn., antitela se takmiče za vezivanje na antigen. Opisan je postupak visokog protoka za binitiranje antitela na osnovu njihove unakrsne konkurencije WO 03/48731.
4
[0115] Kako se ovde koristi, termin biniranje se odnosi na postupak za grupisanje antitela na osnovu njihovih karakteristika vezivanja antigena. Dodeljivanje binova je donekle proizvoljno, zavisno od toga koliko su različiti ispitivani delovi vezivanja antitela testirani. Stoga, iako je ova tehnika korisno sredstvo za kategorizaciju antitela predmetnog pronalaska, binovi nisu uvek direktno u korelaciji sa epitopima, a takva početna određivanja vezivanja epitopa bi trebalo da budu dalje potvrđena drugom naučno priznatom metodologijom kao što je ovde opisano.
[0116] Pomoću ovog upozorenja može se utvrditi da li se izabrano primarno antitelo (ili njegov fragment) veže na isti epitop ili se ukršta za vezanje sa drugim antitelom korišćenjem postupaka poznatih u struci i prikazanih u ovde navedenim primerima. U jednom aspektu, jedno omogućava da se primarno antitelo pronalaska veže za PTK7 pod uslovima zasićenja, a zatim meri sposobnost sekundarnog antitela da se veže za PTK7. Ako je test antitelo sposobno da se veže za PTK7 istovremeno sa primarnim antitelom protiv PTK7, tada se sekundarno antitelo veže na epitop različit od primarnog antitela. Međutim, ako sekundarno antitelo ne može istovremeno da se veže za PTK7, tada se sekundarno antitelo veže za isti epitop, epitop koji se preklapa ili epitop koji je u neposrednoj blizini epitopa koji je vezan za primarno antitelo. Kao što je poznato u struci i detaljno je prikazano u dole navedenim Primerima, željeni podaci mogu se dobiti korišćenjem direktnog ili indirektnog radioimunoanalize čvrste faza (RIA), direktnog ili indirektnog imuno-ispitivanja čvrste faza (EIA), ispitivanja konkurencije sendvičem, Biacore ™ sistema (odn., površinska rezonanca plazmona - GE Healthcare), ForteBio® analizator (odn., interferometrija bio-sloja - ForteBio, Inc.) ili protočna citometrijska metodologija. Izraz površinska rezonanca plazmona, kako se ovde koristi, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu specifičnih interakcija u realnom vremenu otkrivanjem promena u koncentraciji proteina unutar matrice biosenzora. U posebno pogodnom slučaju, analiza se vrši korišćenjem Biacore ili ForteBio instrumenta kao što je pokazano u dole navedenim Primerima.
[0117] Izraz se takmiči kada se koristi u kontekstu antitela podrazumeva nadmetanje između antitela koja je određena testom u kojem antitelo ili imunološki funkcionalni fragment koji se testira sprečava ili inhibira specifično vezivanje referentnog antitela za uobičajeni antigen. Tipično, takva analiza uključuje upotrebu pročišćenog antigena vezanog na čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo koji od ovih, neobeleženi test imunoglobulin i obeleženi referentni imunoglobulin. Konkurentna inhibicija meri se određivanjem količine označenog vezivanja za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu testnog imunoglobulina. Obično je testni imunoglobulin prisutan u višku. Antitela koja su identifikovana analizom konkurencije (konkurentna antitela) uključuju antitela koja se vežu za isti epitop kao referentna antitela i antitela koja se vezuju za susedni epitop dovoljno proksimalna za epitop koji je vezan za referentno antitelo da bi se dogodila stericka prepreka. Dodatni detalji u vezi sa metodama za određivanje konkurentnog vezivanja dati su u ovde navedenim primerima. Obično, kada je konkurentsko antitelo prisutno u višku, ono će inhibirati specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen za najmanje 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ili 75% . U nekim slučajevima, vezivanje inhibira najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 97% ili više.
[0118] Pored specifičnosti epitopa, otkrivena antitela mogu se okarakterisati upotrebom niza različitih fizičkih karakteristika, uključujući, na primer, afinitete vezivanja, temperaturu topljenja (Tm) i izoelektrične tačke.
e. Vezujuće sposobnosti
[0119] U tom pogledu, predmetni pronalazak dalje obuhvata upotrebu antitela koja imaju visoki afinitet vezivanja za izabrani PTK7 ili, u slučaju pan-antitela, više od jedne vrste PTK7. Za antitelo pronalaska se kaže da specifično veže svoj ciljani antigen kada je konstanta disocijacije Kd(koff/kon) 10<-8>M. Antitelo specifično vezuje antigen sa visokim afinitetom kada Kdje 5x10<-9>M, i sa vrlo visokim afinitetom kada Kdje 5x10<-10>M. U jednom rešenju pronalaska, antitelo ima Kdod 10<-9>M i off-rate od oko 1x10<-4>/sec. U jednom rešenju pronalaska, off-rate je < 1x10<-5>/sec. U jednom rešenju pronalaska, antitela će se vezati za PTK7 sa Kdizmeđu oko 10<-8>M i 10<-10>M, a ipak u drugom rešenju vezaće se sa Kd 2x10<-10>M. Ostala odabrana rešenja predmetnog pronalaska sadrže antitela koja imaju konstantu disocijacije ili Kd(koff/kon) manje od 10<-2>M, manje od 5x10<-2>M, manje od 10<-3>M, manje od 5x10<-3>M, manje od 10<-4>M, manje od 5x10<-4>M, manje od 10<-5>M, manje od 5x10<-5>M, manje od 10<-6>M, manje od 5x10<-6>M, manje od 10<-7>M, manje od 5x10<-7>M, manje od 10<-8>M, manje od 5x10<-8>M, manje od 10<-9>M, manje od 5x10<-9>M, manje od 10<-10>M, manje od 5x10<-10>M, manje od 10<-11>M, manje od 5x10<-11>M, manje od 10<-12>M, manje od 5x10<-12>M, manje od 10<-13>M, manje od 5x10<-13>M, manje od 10<-14>M, manje od 5x10<-14>M, manje od 10<-15>M ili manje od 5x10<-15>M.
[0120] U specifičnim rešenjima, antitelo pronalaska koje se imunospecifično vezuje za PTK7 ima konstantnu brzinu asocijacije ili konrate (PTK7 (Ab) antigen (Ag)<k>
onĸAb-Ag) manje od 10<5>M<-1>s<-1>, manje od 2x10<5>M<-1>s<-1>, manje od 5x10<5>M<-1>s<-1>, manje od 10<6>M<-1>s<-1>, manje od 5x10<6>M<-1>s<-1>, manje od 10<7>M<-1>s<-1>, manje od 5x10<7>M<-1>s<-1>, ili manje od 10<8>M<-1>s<-1>.
[0121] U drugom rešenju, antitelo pronalaska koje se imunospecifično vezuje za PTK7 ima konstantnu brzine disasocijacije ili koffrate (PTK7 (Ab) antigen (Ag)<k>
offĸAb-Ag) manje od 10<-1>s<-1>, manje od 5x10<-1>s<-1>, manje od 10<-2>s<-1>, manje od 5x10<-2>s<-1>, manje od 10<-3>s<-1>, manje od
4
5x10<-3>s<-1>, manje od 10<-4>s<-1>, manje od 5x10<-4>s<-1>, manje od 10<-5>s<-1>, less than 5x10<-5>s<-1>, manje od 10<-6>s<-1>, manje od 5x10<-6>s<-1>, manje od 10<-7>s<-1>, manje od 5x10<-7>s<-1>, manje od 10<-8>s<-1>, manje od 5x10<-8>s<-1>, manje od 10<-9>s<-1>, manje od 5x10<-9>s<-1>ili manje od 10<-10>s<-1>.
[0122] U drugim odabranim rešenjima predmetnog pronalaska anti-PTK7 antitela će imati konstantnu afiniteta ili Ka(kon/koff) najmanje 10<2>M<-1>, najmanje 5x10<2>M<-1>, najmanje 10<3>M<-1>, najmanje 5x10<3>M<-1>, najmanje 10<4>M<-1>, najmanje 5x10<4>M<-1>, najmanje 10<5>M<-1>, najmanje 5x10<5>M<-1>, najmanje 10<6>M<-1>, najmanje 5x10<6>M<-1>, najmanje 10<7>M<-1>, najmanje 5x10<7>M<-1>, najmanje 10<8>M<-1>, najmanje 5x10<8>M<-1>, najmanje 10<9>M<-1>, najmanje 5x10<9>M<-1>, najmanje 10<10>M<-1>, najmanje 5x10<10>M<-1>, najmanje 10<11>M<-1>, najmanje 5x10<11>M<-1>, najmanje 10<12>M<-1>, najmanje 5x10<12>M<-1>, najmanje 10<13>M<-1>, najmanje 5x10<13>M<-1>, najmanje 10<14>M<-1>, najmanje 5x10<14>M<-1>, a najmanje 10<15>M<-1>ili najmanje 5x10<15>M<-1>.
f. Izoelektrične tačke
[0123] Pored gore navedenih osobina vezivanja, anti- PTK7 antitela i njihovi fragmenti, kao i svi polipeptidi, imaju Izoelektričnu tačku (pI), koja je opšte definisana kao pH pri kome polipeptid ne nosi ukupno naelektrisanje. U tehnici je poznato da je rastvorljivost proteina tipično najniža kada je pH rastvora jednak izelektričnoj tački (pI) proteina. Zbog toga je moguće optimiziovati rastvorljivost menjanjem broja i lokacije jonizujućih ostataka u antitelu za podešavanje pI. Na primer, pI polipeptida može se manipulisati pravljenjem odgovarajućih amino kiselinskih supstitucija (npr., zamenom naelektrisane amino kiseline kao što je lizin, za neispravan ostatak kao što je alanin). Bez želje da ih veže određena teorija, supstitucije amino kiselina antitelom koje rezultiraju promenama pI pomenutog antitela mogu poboljšati rastvorljivost i/ili stabilnost antitela. Stručnjak u oblasti će razumeti koje su supstitucije aminokiselina najprikladnije za određeno antitelo za postizanje željenog pI.
[0124] pI proteina može se odrediti raznim postupcima, uključujući, bez ograničenja, izoelektrično fokusiranje i različite kompjuterske algoritme (videti na primer Bjellkvist et al., 1993, Electrophoresis 14: 1023). U jednom rešenju, pI anti- PTK7 antitela prema pronalasku su veća od oko 6.5, oko 7.0, oko 7.5, oko 8.0, oko 8.5, ili oko 9.0. U drugom rešenju, pI anti-PTK7 antitela pronalaska su veća od 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 ili 9,0. U još jednom rešenju, supstitucije koje rezultiraju promenama u pI antitela pronalaska neće u značajnoj meri umanjiti njihov afinitet vezivanja za PTK7. Kao što je detaljnije prikazano u daljem tekstu, posebno se razmatra da supstitucija (i) Fc regije koja rezultira izmenjenim vezivanjem za FciR takođe može dovesti do promene pI. U poželjnom rešenju, supstitucija (i) Fc regiona se
4
posebno bira da bi se izvršila i željena promena u vezivanju FciR i bilo koja promena pI. Kao što je ovde korišćeno, vrednost pI je definisana kao pI dominantnog oblika naelektrisanja.
g. Termička stabilnost
[0125] Dalje će se razumeti da Tm domena Fab antitela može biti dobar pokazatelj termičke stabilnosti antitela i može dalje da daje naznaku roka trajanja. Tm je samo temperatura od 50% koja se odvija za određeni domen ili niz. Niži Tm ukazuje na veću agregaciju/manju stabilnost, dok viši Tm ukazuje na manju agregaciju/veću stabilnosti. Stoga su poželjna antitela ili fragmenti ili derivati sa višim Tm. Štaviše, korišćenjem tehnika priznatih u tehnici moguće je izmeniti sastav anti-PTK7 antitela ili njihovih domena radi povećanja ili optimizacije molekularne stabilnosti. Pogledajte, na primer, U.S.P.N.7,960,142. Prema tome, u jednom aspektu, Fab domena izabranog antitela ima vrednost Tm veću od najmanje 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C, 95°C, 100°C, 105°C, 110°C, 115°C ili 120°C. U drugom rešenju, Fab domen antitela ima vrednost Tm veću od najmanje oko 50°C, oko 55°C, oko 60°C, oko 65°C, oko 70°C, oko 75°C, oko 80°C, oko 85°C, oko 90°C, oko 95°C, oko 100°C, oko 105°C, oko 110°C, oko 115°C ili oko 120°C. Temperaturne termičkog topljenja (Tm) proteinskog domena (npr., Fab domen) mogu se meriti bilo kojim standardnim postupkom poznatim u oblasti, na primer, diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (videti, npr., Vermeer et al., 2000, Biophys. J.78:394-404; Vermeer et al., 2000, Biophys. J.79: 2150-2154).
VII. Fragmenti i derivati PTK7 Modulatora
[0126] Bez obzira da li agensi predmetnog pronalaska sadrže netaknute fuzijske konstrukcije, antitela, fragmente ili derivate, izabrani modulatori će reagovati, vezivati, kombinovati, kompleksirati, povezivati, priključiti, pridružiti, interakciju ili na bilo koji drugi način povezati sa PTK7 i na taj način obezbediti željeni anti-neoplastični efekti. Stručnjaci će razumeti da modulatori koji sadrže anti- PTK7 antitelo uzajamno deluju ili se povezuju sa PTK7 kroz jedno ili više mesta vezanja izraženih na antitelu. Preciznije, kako se ovde koristi, termin vezivnog mesta sadrži područje polipeptida koji je odgovoran za selektivno vezivanje na ciljani molekul od interesa (npr., enzim, antigen, ligand, receptor, supstrat ili inhibitor). Vezni domeni sadrže najmanje jedno vezivno mesto (npr., netaknuto IgG antitelo će imati dva vezna domena i dve vezne lokacije). Primeri vezujućih domena uključuju varijabilni domen antitiela, domen vezan za receptor ligand, domen koji veže receptor za ligand ili enzimatski domen. U svrhu ovog pronalaska, tipično aktivno područje PTK7 (npr., kao deo
4
Fc-PTK7 fuzionalnog konstrukta) može da sadrži vezivno mesto za supstrat ili promoviše fosforilaciju.
a. Fragmenti
[0127] Bez obzira koji oblik modulatora (npr., himerni, humanizovani itd.) je izabran za vežbanje pronalaska, biće poznato da se imunoreaktivni fragmenti istog mogu koristiti u skladu sa ovde navedenim učenjima. U najširem smislu, fragment antitela sadrži najmanje deo netaknutog antitela (npr., imunoglobulin koji se prirodno nalazi). Tačnije, termin fragment se odnosi na deo ili deo lanca antitela ili antitela (ili molekula PTK7 u slučaju fuzije Fc) koji sadrže manje amino kiselinskih ostataka od intakta ili kompletnog antitela ili lanca antitela. Izraz fragment koji se veže za antigen odnosi se na polipeptidni fragment imunoglobulina ili antitela koji se veže za antigen ili se takmiči sa intaktnim antitelom (odn., sa netaknutim antitelom iz koga su izvedeni) za vezivanje antigena (odn., specifično vezivanje). Kako se ovde koristi, termin fragment molekula antitela uključuje fragmente antitela koji vežu antigen, na primer, laki lanac antitela (VL), teški lanac antitela (VH), antitelo sa jednim lancem (scFv), F(ab')2fragment, Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment, fragmenti antitela s jednim domenom, antitela, linearna antitela, jednolančana molekula antitela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Slično tome, aktivni fragment PTK7 sadrži deo molekula PTK7 koji zadržava svoju sposobnost interakcije sa PTK7 supstratima ili receptorima i modifikuje ih na način sličan onom netaknutog PTK7 (na primer, fosforilacija - iako možda sa nešto manjom efikasnošću).
[0128] Oni koji poznaju ovu oblast će znati da se fragmenti mogu dobiti hemijskim ili enzimatskim tretmanom netaknutog ili kompletnog modulatora (npr., antitela ili lanca antitela) ili rekombinantnim sredstvima. S tim u vezi, dok su različiti fragmenti antitela definisani u smislu digestije netaknutog antitela, stručnjak će znati da se takvi fragmenti mogu sintetizovati de novo ili hemijski ili korišćenjem rekombinantne DNK metodologije. Prema tome, izraz antitela, kako se ovde koristi, eksplicitno uključuje antitela ili njihove fragmente ili njihove derivate ili proizvedene modifikacijom celih antitela ili sintetizovani de novo korišćenjem rekombinantnih DNK metodologija.
[0129] Tačnije, papainska digestija antitela stvara dva identična fragmenta koji se vezuju za antigen, nazvani Fab fragmenti, svaki sa jednim mestom za vezanje antigena, i rezidualni Fc fragment, čije ime odražava njegovu sposobnost lako kristalizacije. Tretmanom pepsina dobija se F(ab ́)2fragment koji ima dva mesta vezanja antigena i još uvek je sposoban za umrežavanje antigena. Fab fragment takođe sadrži konstantnu domenu lakog lanca i prvi
4
konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab-ovi fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata dodatkom nekoliko ostataka na karboksi kraju terminala CH1domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz zglobne regije antitela. Fab'-SH je ovde oznaka za Fab' u kojoj ostaci cisteina u konstantnim domenima nose najmanje jednu slobodnu tiolnu grupu. F(ab ́)2fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni u obliku parova Fab-ovih fragmenata koji između sebe imaju zglobne cisteine. Takođe su poznate i druge hemijske spojnice fragmenata antitela. Videti, npr., Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999), za detaljniji opis ostalih fragmenata antitela.
[0130] Dalje će se razumeti da je Fv fragment fragment antitela koji sadrži potpuno prepoznavanje i vezujuće mesto antigena. Ovaj region sastoji se od dimera jednog varijabilnog domena teškog i jednog lakog lanca u uskoj povezanosti, koji može biti kovalentan po prirodi, na primer u scFv. U ovoj konfiguraciji, tri CDR svakog promenljivog domena uzajamno deluju kako bi definisali mesto vezivanja antigena na površini VH-VLdimera. Kolektivno, šest CDR-ova ili njihov podskup daje antitelo specifičnosti vezivanja antigena. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koji sadrži samo tri CDR specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, iako obično sa nižim afinitetom od celog vezivnog mesta.
[0131] U drugim rešenjima, fragment antitela, na primer, onaj koji sadrži Fc region, zadržava bar jednu od bioloških funkcija koje su normalno povezane sa Fc regionom kada su prisutne u netaknutom antitelu, kao što je vezivanje FcRn, poluživotna modulacija antitela, ADCC funkcija i vezivanje komplementa. U jednom rešenju, fragment antitela je monovalentno antitelo koje ima in vivo poluživot bitno sličan netaknutom antitelu. Na primer, takav fragment antitela može sadržati krak koji veže antigen povezan na Fc sekvencu koja može in vivo stabilnosti da daje fragment.
b. Derivati
[0132] U drugom slučaju, dalje će se razumeti da modulatori pronalaska mogu biti monovalentni ili multivalentni (npr., bivalentni, trovalentni, itd.). Kao što je korišćeno ovde, termin valencija se odnosi na broj potencijalnih ciljanih (odn., PTK7) vezujućih mesta vezivanja povezanih sa antitelom. Svako ciljano vezujuće mesto specifično veže jedan ciljani molekul ili određeni položaj ili položaj na ciljani molekul. Kada antitelo predmetnog pronalaska sadrži više od jednog ciljanog vezujućeg mesta (multivalentno), svako ciljano vezujuće mesto može specifično da veže iste ili različite molekule (npr., može se vezati za različite ligande ili različite antigene, ili različite epitope ili položaje na isti antigen). Za
4
potrebe predmetnog pronalaska, predmetna antitela će imati prednost najmanje jednog vezujućeg mesta specifičnog za humani PTK7. U jednom rešenju, antitela predmetnog pronalaska će biti monovalentna u tome što će se svako vezujuće mesto molekula specifično vezati za jedan PTK7 položaj ili epitop. U drugim rešenjima, antitela će biti multivalentna jer sadrže više od jednog vezujućeg mesta, a različita vezujuća mesta specifično se pridružuju više od jednog položaja ili epitopa. U takvim slučajevima više epitopa može biti prisutno na odabranom PTK7 polipeptidu ili varijanti vrste, ili jedan epitop može biti prisutan na PTK7, dok drugi, različiti epitop može biti prisutan na drugom molekulu ili površini. Pogledajte, na primer, U.S.P.N.2009/0130105.
[0133] Kao što je korišćeno ovde, multivalentna antitela mogu se imunospecifično vezati za različite epitope željenog ciljanog molekula ili se imunospecifično vezati za ciljani molekul, kao i za heterologni epitop, poput heterolognog polipeptida ili čvrstog nosećeg materijala. Dok poželjna rešenja anti-PTK7 antitela vežu samo dva antigena (odn., bispecifična antitela), antitela sa dodatnim specifičnostima kao što su trispecifična antitela takođe su obuhvaćena predmetnim pronalaskom. Primeri bispecifičnih antitela uključuju, bez ograničenja, ona sa jednim račvanjem usmerenim protiv PTK7, a drugo račvanje usmereno protiv bilo kog drugog antigena (npr., marker ćelijskog modulatora). Postupci za dobijanje bispecifičnih antitela su poznati u stanju tehnike. Tradicionalna proizvodnja bispecifičnih antitela pune dužine zasniva se na koekspresiji dva imunoglobulinska para teški lanac - laki lanaca, pri čemu dva lanca imaju različite specifičnosti (Millstein et al., 1983, Nature, 305: 537-539). Drugi sofisticiraniji kompatibilni multispecifični konstrukti i postupci njihove izrade su prikazani u U.S.P.N.2009/0155255.
[0134] U još drugim rešenjima, varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (antitelo-antigen kombinujuća mesta) su spojeni u sekvence konstantnih domena imunoglobulina. Fuzija je poželjno sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži najmanje deo zglobnih, CH2i/ili CH3regiona. U jednom primeru, prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca prisutno je u najmanje jednom od fuzija. DNKs koji kodiraju fuzije teškog lanca imunoglobulina i, po želji, laki lanac imunoglobulina, ubačeni su u odvojene ekspresijske vektore, i kotransfektovani su u pogodan organizam domaćina. Ovo omogućava veliku fleksibilnost u podešavanju međusobnih proporcija tri fragmenta polipeptida u rešenjima kada nejednaki odnosi tri polipeptidna lanca koji se koriste u konstrukciji daju optimalne prinose. Međutim, moguće je umetati kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan ekspresijski vektor kada, ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u jednakim odnosima dovodi do visokih prinosa ili kada odnosi nemaju poseban značaj.
[0135] U jednom rešenju ovog pristupa, bispecifična antitela se sastoje od hibridnog imunoglobulinskog teškog lanca sa prvom vezujućom specifičnošću u jednom račvanju (npr., PTK7), i hibridnog imunoglobulina para teškog lanca-lakog lanca (pružajući drugu vezujuću specifičnost) u drugom račvanju. Otkriveno je da ova asimetrična struktura olakšava odvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija imunoglobulinskih lanaca, jer prisustvo lakog lanca imunoglobulina u samo jednoj polovini bispecifičnog molekula obezbeđuje lak način razdvajanja. Ovaj pristup je otkriven u WO 94/04690. Za više detalja generisanja bispecifičnih antitela videti, na primer, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210. Prema drugom pristupu opisanom u WO96/27011, par molekula antitela može se konstruisati da maksimizuje procenat heterodimera koji su dobijeni iz rekombinantne ćelijske kulture. Poželjan interfejs sadrži najmanje deo domena CH3u konstantnom domenu antitela. U ovom postupku, jedan ili više malih bočnih lanaca amino kiselina sa interfejsa prvog molekula antitela je zamenjeno sa većim bočnim lancima (npr., tirozin ili triptofan). Kompenzacijske šupljine jednake ili slične veličine kod velikih bočnih lanaca nastaju na interfejsu drugog molekula antitela zamenom velikih bočnih lanaca amino kiselina sa manjim (npr., alanina ili treonina). Ovo omogućava mehanizam za povećanje prinosa heterodimera u odnosu na druge neželjene krajnje proizvode kao što su homodimeri.
[0136] Bispecifična antitela takođe uključuju unakrsno povezana ili heterokonjugovana antitela. Na primer, jedan od antitela u heterokonjugatu može biti kuplovan za avidin, drugi za biotin. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju imuni sistem ćelija na neželjene ćelije (U.S.P.N.4,676,980), i za lečenje HIV infekcije (WO 91/00360, WO 92/200373, i EP 03089). Heterokonjugatna antitela mogu se dobiti korišćenjem bilo kog uobičajenog postupka unakrsnog vezivanja. Pogodni agensi za unakrsno vezivanje su dobro poznati u tehnici, i opisani su u U.S.P.N.4,676,980, zajedno sa većim brojem tehnika unakrsnog vezivanja.
VIII. PTK7 Modulatori - Konstantne Modifikacije Regiona
a. Fc region i Fc receptori
[0137] Pored različitih modifikacija, supstitucija, dodavanja ili brisanja promenljivog ili vezujućeg regiona otkrivenih modulatora (npr., Fc-PTK7 ili anti-PTK7 antitela) koje su gore navedeni, stručnjaci iz ove oblasti će ceniti da odabrani primeri predmetnog pronalaska takođe mogu sadržati supstitucije ili modifikacije konstantnog regiona (odn., Fc regiona). Preciznije, zamišljeno je da PTK7 modulatori pronalaska mogu između ostalog sadržati
1
jednu ili više dodatnih supstitucija amino kiselinskih ostataka, mutacija i/ili modifikacija koje rezultiraju jedinjenjem sa poželjnimm karakteristikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na: izmenjenu farmakokinetiku, povećanui poluživot u serumu, povećanje afiniteta vezivanja, smanjena imunogenost, povećana proizvodnja, izmenjeno vezivanje Fc liganda, pojačano ili smanjeno delovanje ADCC ili CDC, izmenjena veza glikozilacije i/ili disulfida i modifikovana specifičnost vezivanja. S tim u vezi, biće poznato da se ove Fc varijante mogu korisno koristiti za poboljšanje efikasnih anti-neoplastičnih svojstava otkrivenih modulatora.
[0138] Izraz Fc region ovde je korišćen da definiše C-terminalni region imunoglobulina lakog lanca, uključujući prirodnu sekvencu Fc regiona i varijantu Fc regiona. Iako granice Fc regiona imunoglobulinskog teškog lanca mogu varirati, humani IgG teški lanac Fc regiona obično je definisan da se proteže od amino kiselinskog ostatka na položaju Cys226, ili od Pro230, do njegovog karboksi terminusa. C-terminal lizin (ostatak 447 prema EU numerisanju sistema) Fc regiona može biti uklonjen, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela, ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela. Shodno tome, kompozicija netaknutih antitela može da sadrži populacije antitela sa uklonjenim svim ostacima K447, populacije antitela bez uklonjenih ostataka K447 i populacije antitela koja imaju mešavinu antitela sa i bez ostatka K447. Funkcionalni Fc region poseduje efektorsku funkciju priordne sekvence Fc regiona. Primerne efektorske funkcije uključuju Clq vezivanje; CDC; vezivanje Fc receptora; ADCC; fagocitoza; donja regulacija receptora ćelijske površine (npr., B ćelijski receptor; BCR), itd. Takve efektorske funkcije obično zahtevaju da se Fc region kombinuje sa vezujućim domenom (npr., varijabilni domen antitela) i može se proceniti korišćenjem različitih ispitivanja kako je otkriveno, na primer, u definicijama koje su ovde navedene.
[0139] Fc receptor ili FcR opisuje receptor koji se vezuje za Fc region antitela. U nekim rešenjima, FcR je prirodni humani FcR. U nekim rešenjima, FcR je jedan koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore FcȖRI, Fc.RII, i FcȖRIII podklase, uključujući alelne varijante i alternativno spojene oblike tih receptora. FcȖII receptori uključuju FcȖRIIA (aktivacioni receptor) i FcȖRIIB (inhibicioni receptor), koji imaju amino kiselinske sekvence koji se razlikuju prvenstveno u njihovim citoplazmatskim domenima. Aktivacioni receptor FcȖ RIIA sadrži imunoreceptor aktivacionog dela tirozinske osnove (ITAM) u njegovom citoplazmičnom domenu. Inhibicioni receptor FȖRIIB sadrži imunoreceptor aktivacionog dela tirozinske osnove (ITIM) u njegovom citoplasmičnom domenu, (videti, npr., Daeron, Annu. Rev. Immunol.15:203-234 (1997)). FcRs su pregledani, na primer, u Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); i de Haas et al., J. Lab. Clin. Med.126:330-41 (1995). Drugi FcRs, koji uključuju one koji će se
2
identifikovati u budućnosti, su obuhvaćeni izrazom FcR ovde. Izraz Fc receptor ili FcR takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji, u određenim slučajevima, je odgovoran za transfer majčinog IgGs u fetus (Guyer et al., J. Immunol.117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol.24:249 (1994)) i regulisanje homeostaze imunoglobulina. Postupci merenja vezivanja za FcRn su poznati (videti, npr., Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem.279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).
b. Fc funkcije
[0140] Kao što je korišćeno ovde komplementno zavisna citotoksičnost i CDC se odnose na lizing koji cilja ćelije u prisustvu komplementa. Aktivacioni put komplementa je zpočet vezivanjem prve komponente komplementnog sistema (C1q) za molekul, antitelo na primer, kompleksovan sa srodnim antigenom. Kako bi se procenila komplementna aktivacija, CDC analiza, npr. kao što je opisano u Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163, se može koristiti.
[0141] Dalje, ćelijski posredovana citotoksičnost zavisnog antitela ili ADCC odnosi se na oblik citotoksičnosti u kojem se izlučeni Ig vezuje na Fc receptore (FcRs) prisutni na određenim citotoksičnim ćelijama (npr., Prirodna ćelija Ubica (NK), neutrofili, i makrofagi) omogućavajući citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vezuju za ciljanu ćeliju koja nosi antigen i posle toga ubijaju ciljanu ćeliju sa citotoksinima. Specifična antitela visokog afiniteta IgG usmerena na citotoksične ćelije ciljaneog račvanja i apsolutno su potrebna za takvo ubijanje. Lizija ciljane ćelije je ekstraćelijska, zahteva direktan kontakt ćelija-ćelija, i ne uključuje komplementaciju.
[0142] Varijante PTK7 modulatora sa izmenjenim afinitetom vezanja za FcR ili ADCC aktivnost je ona koja ima ili pojačanu ili umanjenu aktivnost vezivanja FcR i/ili ADCC aktivnost u poređenju sa roditeljskim ili nemodifikovanim antitelom ili sa modulatorom koji sadrži prirodnu sekvencu Fc regiona. Varijanta modulatora koja pokazuje povećano vezivanje za FcR vezuje bar jedan FcR sa boljim afinitetom od roditeljskog ili nemodifikovanog antitela ili za modulator koji sadrži prirodnu sekvencu Fc regiona. Varijanta koja pokazuje smanjeno vezivanje za FcR, vezuje bar jedan FcR sa lošijim afinitetom od roditeljskog ili nemodifikovanog antitela ili za modulator koji sadrži prirodnu sekvencu Fc region. Takve varijante koje pokazuju smanjeno vezivanje za FcR mogu imati malo ili nimalo primetno vezivanje za FcR, npr., 0-20% vezivanja za FcR u poređenju sa prirodnom sekvencom IgG Fc regionom, npr. kao što je utvrđeno tehnikama koje su dobro poznate u tehnici.
[0143] Što se tiče FcRn, antitela predmetnog pronalaska takođe sadrže ili obuhvataju varijante Fc sa modifikacijama u konstantnom regionu koje obezbeđuju poluživot (npr., poluživot u serumu) kod sisara, po mogućnosti čoveka, duže od 5 dana, duže od 10 dana, duže od 15 dana, duže od 20 dana, duže od 25 dana, duže od 30 dana, duže od 35 dana, duže od 40 dana, duže od 45 dana, duže od 2 meseca, duže od 3 meseca, duže od 4 meseca ili duže od 5 meseci. Povećani poluživot antitela (ili molekula koji sadrže Fc) predmetnog pronalaska kod sisara, poželjno čoveka, dovodi do većeg serumskog titra pomenutih antitela ili fragmenata antitela kod sisara i na taj način smanjuje frekvenciju davanja pomenutih antitela ili fragmenata antitela i/ili smanjuje koncentraciju navedenih antitela ili fragmenata antitela koja se daju. Antitela koja imaju povećane in vivo polu-živote mogu se generisati tehnikama koje su poznate stručnjacima iz date oblasti. Na primer, antitela sa povećanim in vivo polu-životima mogu da se generišu modifikovanjem (npr., zamenom, brisanjem ili dodavanjem) ostataka amino kiselina koji su identifikovani kao uključeni u interakciju između Fc domena i FcRn receptora (videti, npr., Međunarodnu Objavu Br. WO 97/34631; WO 04/029207; U.S.P.N.6,737,056 o U.S.P.N.2003/0190311. Vezivanje za humani FcRn in vivo i serumski polu život humanih FcRn polipeptida sa visokim afinitetom vezivanja može se testirati, npr., kod transgenih miševa ili transficiranih humanih ćelijskih linija koje izražavaju humani FcRn, ili kod primata kojima su davani polipeptidi sa varijantom Fc regiona. WO 2000/42072 opisuje varijante antitela sa poboljšanim ili umanjenim vezivanjem za FcRns. Videti takođe, npr., Shields et al. J. Biol. Chem.9(2):6591-6604 (2001).
c. Glikozilaciona modifikacija
[0144] U još drugim rešenjima, obrasci glikozilacije ili kompozicije antitela pronalaska su modifikovani. Preciznije, poželjna rešenja predmetnog pronalaska mogu da sadrže jednu ili više inženjerskih glikoformi, odn., izmenjeni obrazac glikozilacije ili izmenjenu kompoziciju ugljenih hidrata koja je kovalentno vezana za molekul koji sadrži Fc region. Konstruisani glikoformi mogu biti korisni za različite svrhe, uključujući, ali bez ograničavanja na, pojačavanje ili smanjenje efektorskih funkcija, povećanje afiniteta antitela za ciljani antigen ili olakšavanje proizvodnje antitela. U slučajevima kada je poželjna smanjena efektorska funkcija, razumeće se da se molekul može konstruisati da se eksprimira u aglikoziliranom obliku. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu se izvršiti, na primer, promenom jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvenci antitela. Odnosno, jedna ili više supstitucija amino
4
kiselina mogu da se izvrše eliminacijom jednog ili više mesta za glikozilaciju varijabilnog regiona, čime se eliminiše glikozilacija na tom mestu (videti npr. U.S.P.Br.5,714,350 i 6,350,861. Suprotno tome, poboljšane efektorske funkcije ili poboljšano vezivanje može se preneti u molekul koji sadrži Fc sa inženjeringom na jedno ili više dodatnih mesta glikozilacije.
[0145] Dodatno ili alternativno, može se napraviti Fc varijanta koja ima izmenjenu kompoziciju glikozilacije, kao što je hipofukozilirano antitelo sa smanjenim količinama fukozilnih ostataka ili antitelo koje ima povećane bisekcije GlcNAc strukture. Pokazalo se da ovi i slični izmenjeni obrasci glikozilacije povećavaju ADCC sposobnost antitela. Konstruisani glikoformi mogu se generisati bilo kojim postupkom poznatom stručnjaku, na primer korišćenjem inženjerskih ili varijantnih ekspresijskih sojeva, sa koekspresijom sa jednim ili više enzima (na primer N-acetilglukozaminiltransferaza III (GnTI11)), sa ekspresijom molekula koji sadrži Fc region u različitim organizmima ili ćelijskim linijama različitih organizama ili modifikovanjem ugljenih hidrata posle izražavanja molekula koji sadrži Fc region. Videti, na primer, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem.277:26733-26740;
Umana et al. (1999) Nat. Biotech.17:176-1, as well as, European Patent No: EP 1,176,195; PCT Publications WO 03/035835; WO 99/54342, Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) U.S.P.N.
6,602,684; U.S.S.Ns.10/277,370; 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ technology (Biowa, Inc.); GlycoMAb™ glycosylation engineering technology (GLYCART biotechnology AG); WO 00061739; EA01229125; U.S.P.N.2003/0115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49.
IX. Ekspresija Modulatora
a. Pregled
[0146] DNK koja kodira željene PTK7 modulatore može se lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih postupaka (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Izolovane i subklonirane hibridomske ćelije (ili kolonije dobijene iz faga ili kvasca) mogu poslužiti kao poželjan izvor takve DNK ako je modulator antitelo. Po želji, nukleinska kiselina se može dalje manipulisati kako je ovde opisano da bi se stvorili agensi koji uključuju fuzione proteine ili himerna, humanizovana ili potpuno humana antitela. Tačnije, izolovana DNK (koja može biti modifikovana) može se koristiti za kloniranje sekvenci konstantnih i varijabilnih regiona za proizvodnju antitela kao što je opisano u U.S.P.Br.7,709,611.
[0147] Ovaj primerni postupak podrazumeva ekstrakciju RNK iz odabranih ćelija, konverziju u cDNK, i amplifikaciju PCR korišćenjem antitela specifičnih prajmera. Pogodni prajmeri su dobro poznati u stanju tehnike i, kao što je ovde prikazano, lako su dostupni iz brojnih komercijalnih izvora. Biće poznato da, za ekspresiju rekombinantnog humanog ili nehumanog antitela izolovanog skriningom kombinatoričke biblioteke, DNK koja kodira antitelo se klonira u rekombinantni ekspresioni vektor i uvodi u ćelije domaćina, uključujući ćelije sisara, ćelije insekata, ćelije biljaka, kvasca, i bakterije. U drugim slučajevima, modulatori su uvedeni u i ekspresovani sa simijskim COS ćelijama, NS0 ćelijama, ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelijama mijeloma koje inače ne proizvode željenu konstrukciju. Kao što će detaljnije biti objašnjeno u daljem tekstu, transformisane ćelije koje ekspresuju željeni modulator mogu se uzgajati u relativno velikim količinama da bi se obezbedile kliničke i komercijalne zalihe fuzijskog konstrukta ili imunoglobulina.
[0148] Da li je nukleinska kiselina koja kodira željeni deo PTK7 modulatora dobijena ili izvedena iz fage tehnologijom prikaza, biblioteke kvasca, tehnologije zasnovane na hibridomu, sintetički ili iz komercijalnih izvora, treba razumeti da predmetni pronalazak izričito obuhvata molekule i sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju PTK7 modulatore, uključujući fuzijske proteine i anti-PTK7 antitela ili antigenske vezujuće fragmente ili njihove derivate. Pronalazak dalje obuhvata nukleinske kiseline ili molekule nukleinske kiseline (npr., polinukleotide) koje se hibridizuju pod visokom strogošću, ili alternativno, pod uslovima hibridizacije srednjih ili nižih strogosti (npr., kao što je definisano u daljem tekstu), do polinukleotida komplementarni nukleinskim kiselinama koje imaju polinukleotidnu sekvencu koja kodira modulator pronalaska ili njegov fragment ili varijantu. Izraz molekul nukleinske kiseline ili izolovani molekul nukleinske kiseline, kako se ovde koristi, podrazumeva da obuhvata najmanje molekule DNK i molekule RNK. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančan ili dvolančan, ali je poželjna dvolančana DNK. Štaviše, predmetni pronalazak sadrži bilo koji nosač ili konstrukciju, koji uključuje takav modulator koji kodira polinukleotid uključujući, bez ograničenja, vektore, plazmide, ćelije domaćina, kosmide ili virusne konstrukte.
[0149] Izraz izolovana nukleinska kiselina znači da je nukleinska kiselina (i) amplificirana in vitro, na primer sa lančanom reakcijom polimeraze (PCR), (ii) rekombinantno dobijena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer cepanjem i gel-elektroforetskom frakcionacijom, ili (iv) sintetizovana, na primer hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja je dostupna za manipulaciju sa rekombinantnim DNK tehnikama.
[0150] Preciznije, nukleinske kiseline koje kodiraju modulator, uključuju jedan ili oba lanca antitela pronalaska, ili njegov fragment, derivat, mutein ili njegovu varijantu, polinukleotide dovoljne za upotrebu kao hibridizacione sonde, PCR prajmere ili sekvencirane prajmere za identifikaciju, analizu, mutiranje ili amplifikaciju polinukleotida koji kodira polipeptid, antisensne nukleinske kiseline za inhibiciju ekspresije polinukleotida, i komplementarne sekvence prethodnog su takođe obezbeđeni. Nukleinske kiseline mogu biti bilo koje dužine. Mogu biti, na primer, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 , 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 ili više nukleotida u dužinu i/ili mogu sadržati jednu ili više dodatnih sekvenci, na primer, regulatorne sekvence, i/ili biti deo veće nukleinske kiseline, na primer, vektor. Ove nukleinske kiseline mogu biti jedno-lančane ili dvo-lančane i mogu da sadrže RNA i/ili DNK nukleotide, i njihove veštačke varijante (npr., peptidne nukleinske kiseline). Nukleinske kiseline koje kodiraju modulatore pronalaska, uključujući antitela ili imunoreaktivne fragmente ili njihove derivate, poželjno su izolovane kao što je gore opisano.
b. Hibridizacija i Identitet
[0151] Kao što je naznačeno, pronalazak dalje obezbeđuje nukleinske kiseline koje se hibridizuju na druge nukleinske kiseline pod određenim uslovima hibridizacije. Postupci za hibridizaciju nukleinskih kiselina su dobro poznati u tehnici. Videti, npr., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Za svrhe predmetne prijave, umereno strogi uslov hibridizacije koristi rastvor za predhodno pranje koji sadrži 5x natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC), 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8,0), pufer za hibridizaciju od oko 50% formamida, 6xSSC i temperaturu hibridizacije od 55°C (ili druge slične rastvore hibridizacije, kao što su ona koja sadrže oko 50% formamida, sa temperaturom hibridizacije od 42°C) i uslovima pranja od 60°C, u 0.5xSSC, 0.1% SDS. Strogi uslov hibridizacije hibridizira u 6xSSC na 45°C, praćeno sa jednim ili više ispiranja u 0.1xSSC, 0.2% SDS na 68°C. Nadalje, stručnjak može da manipuliše hibridizacijom i/ili uslovima pranja da poveća ili smanji strogost hibridizacije tako da nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje su najmanje 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ili 99% identične jedni drugima obično ostaju hibridizirane jedni prema drugima. Uopšteno, za potrebe predmetnog pronalaska, izraz koji je u suštini identičan u pogledu na sekvencu nukleinskih kiselina može se tumačiti kao sekvenca nukleotida koji ima najmanje oko 85%, ili 90%, ili 95%, ili 97% identiteta sekvence za referentnu sekvencu nukleinske kiseline.
[0152] Osnovni parametri koji utiču na izbor uslova hibridizacije i smernice za osmišljavanje pogodnih uslova su postavljeni od strane, na primer, Sambrook, Fritsch, i Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11; and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4), i mogu ih lako odrediti oni koji imaju uobičajene veštine u tehnici na osnovu, na primer, dužine i/ili osnovne kompozicije nukleinske kiseline.
[0153] Dalje će se razumeti da nukleinske kiseline mogu, prema pronalasku, biti prisutne same ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama, koje mogu biti homologne ili heterologne. U poželjnim rešenjima, nukleinska kiselina je funkcionalno povezana sa sekvencama za kontrolu ekspresije koje mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na navedenu nukleinsku kiselinu. U tom kontekstu, izraz homologni znači da je nukleinska kiselina takođe funkcionalno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije prirodno a termin heterologna znači da nukleinska kiselina nije funkcionalno povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije prirodno.
c. Ekspresija
[0154] Nukleinska kiselina, kao što je nukleinska kiselina koja ekspresuje RNK i/ili protein ili peptid, i sekvenca za kontrolu ekspresije su funkcionalno povezani jedna sa drugom, ako su kovalentno povezane jedna za drugu na takav način da ekspresija ili transkripcija pomenute nukleinske kiseline je pod kontrolom ili pod uticajem pomenute sekvence za kontrolu ekspresije. Ako se nukleinska kiselina prevodi u funkcionalni protein, tada, sa kontrolnom sekvencom ekspresije koja je funkcionalno povezana sa kodirajućom sekvencom, indukcija navedene sekvence za kontrolu ekspresije rezultira transkripcijom navedene nukleinske kiseline, bez izazivanja pomeranja okvira u kodirajućoj sekvenci ili navedena kodirajuća sekvenca nije sposobna da se prevede u željeni protein ili peptid.
[0155] Izraz sekvenca za kontrolu ekspresije sadrži prema pronalasku promotore, mesta vezivanja ribozoma, pojačivače i druge kontrolne elemente koji regulišu transkripciju gena ili translaciju mRNK. U posebnim rešenjima pronalaska, sekvence za kontrolu ekspresije se mogu regulisati. Tačna struktura sekvence za kontrolu ekspresije može varirati u zavisnosti od vrste ili ćelijskog tipa, ali generalno sadrži 5'-netranskriptovane i 5'- i 3'-neprevedene sekvence koje su uključene u pokretanje transkripcije i prevođenja, odnosno, kao što su TATA kutija, preslikavanje sekvence, CAAT sekvenca, i slično. Tačnije, 5'-netranskriptovane sekvence za kontrolu ekspresije sadrže promotorski region koji uključuje promotorsku sekvencu za transkripcionu kontrolu funkcionalno povezane nukleinske kiseline. Sekvence za kontrolu ekspresije mogu takođe sadržati pojačivačke sekvence ili nizove aktivatora uzvodno.
[0156] Prema pronalasku, izraz promotor ili promotor region odnosi se na sekvencu nukleinskih kiselina koja je smeštena uzvodno (5 ') u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline koja se ekspresuje i kontroliše ekspresiju sekvence pružajući mesto za prepoznavanje i vezivanje za RNK-polimerazu. Promotorski region može da sadrži drugo mesto prepoznavanja i vezivanja za druge faktore koji učestvuju u regulaciji transkripcije gena. Promotor može kontrolisati transkripciju prokariotskog ili eukariotskog gena. Dalje, promotor može biti induciran i može pokrenuti transkripciju kao odgovor na indukcioni agens ili može biti konstitutivan ako transkripciju ne kontroliše indukcioni agens. Gen koji je pod kontrolom inducibilnog promotora ne eksprimira se ili se samo u maloj meri eksprimira ukoliko je indukcioni agens odsutan. U prisustvu indukcionog agensa, gen se uključuje ili se nivo transkripcije povećava. Ovo se, uglavnom, posreduje vezivanjem određenog faktora transkripcije.
[0157] Promoteri koji su poželjni u skladu sa pronalaskom uključuju promotore za SP6, T3 i T7 polimerazu, humani U6 RNA promotor, CMV promotor, i njihove veštačke hibridne promotore (npr. CMV) gde su deo ili delovi spojeni sa delom ili delovima promotora gena drugih ćelijskih proteina kao što su npr. humani GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza), i uključuje ili ne uključuje dodatni(e) intron(e).
[0158] Prema pronalasku, izraz ekspresija se koristi u njegovom opštem značenju i obuhvata proizvodnju RNK ili RNK i proteina/peptida. Takođe sadrži delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Dalje, ekspresija se može izvesti prelazno ili stabilno.
[0159] U poželjnom rešenju, molekul nukleinske kiseline je prema pronalasku prisutan u vektoru, gde je to prikladno, sa promotorom, koji kontroliše ekspresiju nukleinske kiseline. Izraz vektor se ovde koristi u svom najopširnijem značenju i obuhvata bilo koji posredni vektor za nukleinsku kiselinu koji omogućava da se ova nukleinska kiselina, na primer, uvede u prokariotske i/ili eukariotske ćelije i, gde je to prikladno, integriše u genom. Vektori ove vrste su po mogućnosti replicirani i/ili ekspresovano u ćelijama. Vektori mogu sadržati plazmide, fagemide, bakteriofage ili virusne genome. Izraz plazmid, kao što je ovde korišćen, uopšteno se odnosi na konstrukciju ekstrahromozomalnog genetskog materijala, obično kružnog DNK dupleksa, koji može da se replicira nezavisno od hromozomske DNK.
[0160] U praksi predmetnog pronalaska biće poznato da se opcionalno koriste mnoge uobičajene tehnike u molekularnoj biologiji, mikrobiologiji i rekombinantnoj DNK tehnologiji. Takve konvencionalne tehnike se odnose na vektore, ćelije domaćina i rekombinantne postupke kako je ovde definisano. Ove tehnike su dobro poznate i objašnjene su u, na primer, Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 and Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., supra Other useful references, e.g. for cell isolation and culture (e.g., for subsequent nucleic acid or protein isolation) include Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York and the references cited therein; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.; Gamborg and Phillips (Eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks (Eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, Fla. Postupci pravljenja nukleinskih kiselina (npr., in vitro amplifikacijom, prečišćavanjem iz ćelija, ili hemijskom sintezom), postupci za manipulaciju nukleinskim kiselinama (npr., mutageneza usmerena na mesto, digestijom restriktivnih enzima, ligacijom, itd.), i različiti vektori, ćelijske linije i slično korisni u manipulisanju i pravljenju nukleinskih kiselina opisani su u gore navedenim referencama. Pored toga, u osnovi bilo koji polinukleotid (uključujući npr., obeleženi ili biotinilirani polinukleotidi) može biti prilagođen ili standardno naručen iz bilo kojeg od različitih komercijalnih izvora.
[0161] Prema tome, u jednom aspektu, predmetni pronalazak pruža rekombinantne ćelije domaćina omogućujući rekombinantnu ekspresiju antitela pronalaska ili njegovih delova. Antitela koja se proizvode ekspresijom u takvim rekombinantnim ćelijama domaćina ovde se nazivaju rekombinantna antitela. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje progenske ćelije takvih ćelija domaćina, i antitela koja ih proizvode.
[0162] Izraz rekombinantna ćelija domaćina (ili jednostavno ćelija domaćin), kao što je ovde korišćeno, znači ćelija u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor. Treba shvatiti da rekombinantna ćelija domaćina i ćelija domaćin ne znači samo određenu ćeliju subjekta već i progen takve ćelije. Budući da se mogu dogoditi određene modifikacije u sledećim generacijama ili zbog mutacija ili uticaja okoline, takvo potomstvo u stvari ne može biti identično matičnoj ćeliji, ali je još uvek uključeno u opseg termina ćelije domaćina kao što je ovde korišćeno. Takve ćelije mogu sadržati vektor prema pronalasku kao što je gore opisano.
[0163] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pravljenje antitela ili njegovog dela kao što je ovde opisano. Prema jednom rešenju, navedeni postupak uključuje kultivaciju ćelije koja je transfektovana ili transformisana sa vektorom kao što je gore opisano, i povlaćenje antitela ili njegovog dela.
[0164] Kao što je navedeno gore, ekspresija antitela pronalaska (ili njegovog fragmenta ili varijante) poželjno sadrži vektor(e) ekspresije koji sadrže polinukleotid koji kodira željeno anti-PTK7 antitelo. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima mogu se koristiti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže antitela koja kodiraju sekvence i odgovarajuće transkripcijske i translacione kontrolne signale. Ovi postupci uključuju, na primer, in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike, i in vivo genetsku rekombinaciju. Rešenja pronalaska, prema tome, pružaju replicirajuće vektore koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira anti-PTK7 antitelo pronalaska (npr., celo antitelo, teški ili laki lanac antitela, varijabilni domen antitela teškog ili lakog lanca, ili njegov deo, ili CDR teškog ili lakog lanca, jednostruki lanac Fv, ili njegove fragmente ili varijante), operativno povezan sa promotorom. U poželjnim rešenjima, takvi vektori mogu da sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira teški lanac molekule antitela (ili njegov fragment), nukleotidnu sekvencu koja kodira laki lanac antitela (ili njegov fragment) ili teški i laki lanac.
[0165] Jednom kada su nukleotidi predmetnog pronalaska izolovani i modifikovani u skladu sa ovde opisanim učenjima, oni se mogu koristiti za proizvodnju odabranih modulatora, uključujući anti-PTK7 antitela ili njihove fragmente.
X. Proizvodnja i Prečišćavanje Modulatora
[0166] Koristeći tehnike molekularnoe biologije koje su poznate u tehnici i trenutnu metodologiju ekspresije proteina, mogu se proizvesti značajne količine željenih modulatora. Preciznije, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju modulatore, kao što su antitela dobijena i proizvedena kao što je gore opisano, mogu se integrisati u dobro poznate i komercijalno dostupne sisteme za proizvodnju proteina koji sadrže različite vrste ćelija domaćina da bi se obezbedile pretkliničke, kliničke ili komercijalne količine željenog farmaceutskog proizvoda. Biće poznato da su u poželjnim slučajevima molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju modulatore konstruisani u vektore ili ekspresione vektore koji omogućavaju efikasnu integraciju u odabranu ćeliju domaćina i naknadno visoke nivoe ekspresije željenog PTK7 modulatora.
1
[0167] Poželjno, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju PTK7 modulatore i vektore koji sadrže ove molekule nukleinske kiseline mogu se koristiti za transfekciju pogodne ćelije domaćina sisara, biljaka, bakterija ili kvasca, mada će se razumeti da se prokariotski sistemi mogu koristiti za proizvodnju modulatora. Transfekcija može biti sa bilo kojim poznatim postupkom za unošenje polinukleotida u ćeliju domaćina. Postupci za unošenje heterolognih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznati u tehnici i uključuju transfekciju posredovanu dekstranom, taloženje kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotida (i) u liposomima, i direktnu mikroinjekciju DNK u jezgro. Pored toga, molekuli nukleinske kiseline se mogu uvesti sa virusnim vektorima u ćelije sisara. Postupci transformacije ćelija sisara su dobro poznati u tehici. Videti, npr., U.S.P.Br.4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455. Dalje, postupci transformacije biljnih ćelija su dobro poznati u tehnici, uključujući, na primer, agrobakterijumiranu posredovanu transformaciju, biolističku transformaciju, direktno ubrizgavanje, elektroporaciju i virusnu transformaciju. Postupci transformacije ćelija bakterija i kvasca su takođe dobro poznati u tehnici.
[0168] Štaviše, ćelija domaćin može biti ko-transfektovana sa dva ekspresiona vektora pronalaska, na primer, prvi vektor koji kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugi vektor koji kodira polipeptid izveden iz lakog lanca. Dva vektora mogu sadržati identične selektivne markere koji omogućavaju suštinski jednaku ekspresiju polipeptida teškog i lakog lanca. Alternativno, može se koristiti jedan vektor koji kodira i može eksprimirati polipeptide teškog i lakog lanca. U takvim situacijama, laki lanac je poželjno postavljen ispred teškog lanca kako bi se izbegao višak teškog slobodnog teškog lanca. Sekvence kodiranja za teške i lake lance mogu sadržati cDNK ili genomski DNK.
a. Sistemi za ekspresiju domaćina
[0169] Različitosti sistema vektora ekspresije domaćina, mnogi komercijalno dostupni, kompatibilni su sa ovde opisanim učenjima i mogu se koristiti za ekspresiju modulatora pronalaska. Takvi sistemi ekspresije domaćina predstavljaju nosače pomoću kojih se kodirajuće sekvence od interesa mogu ekspresovati i naknadno prečistiti, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu, kada se transformišu ili transfektuju sa odgovarajućim nukleotidnim kodirajućim sekvencama, ekspresovati molekul pronalaska in situ. Takvi sistemi uključuju, ali nisu ograničeni na, mikroorganizme kao što su bakterija (npr., E. coli, B. subtilis, streptomices) transformisani sa rekombinantnim bakteriofagniom DNK, plazmidnom DNK ili ekspresionim vektorima kosmidne DNK koji sadrže modulatorne kodirajuće sekvence; kvasac (npr., Saccharomices, Pichia) transfektovan sa rekombinantnim vektorima
2
ekspresije kvasca koji sadrže modulatorne kodirajuće sekvence; sistem ćelijskih insekata zaražen sa vektorima ekspresije rekombinantnih virusa (npr., bakulovirus) koji sadrže modulatorne kodirajuće sekvence; sistem biljnih ćelija (npr., Nicotiana, Arabidopsis, vodena leća, kukuruz, pšenica, krompir, itd.) zaražen vektorima ekspresije rekombinantnih virusa (npr., virus mozaika karfiola, CaMV; duvanski mozaik virus, TMV) ili je transfektiran sa rekombinantnim ekspresionim vektorima plazmida (npr., Ti plazmid) koji sadrži modulatorne kodirajuće sekvence; ili ćelijskih sistema sisara (npr., COS, CHO, BHK, 293, 3T3 ćelije) koji sadrže konstrukcije rekombinantne ekspresije koje sadrže promotore izvedene iz genoma ćelija sisara (npr., metalotionenski promotor) ili iz virusa sisara (npr., kasni promotor adenovirusa; promotor virusa vakcinije 7.5K).
[0170] U bakterijskim sistemima, određeni broj ekspresionih vektora se može pogodno odabrati u zavisnosti od upotrebe namenjene za molekul koji se ekspresuje. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina takvog proteina, za generisanje farmaceutskih kompozicija modulatora, mogu biti poželjni vektori koji usmeravaju ekspresiju visokih nivoa proizvoda fuzijskih proteina koji se lako prečišćavaju. Takvi vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, vektor ekspresije E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO 1.2: 1791 (1983)), pri čemu se kodirajuća sekvenca može pojedinačno vezati za vektor u okviru lac Z kodirujućeg regiona tako da se stvara fuzijski protein; pIN vektori (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res.
13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem.24:5503-5509 (1989)); i slično. pGEX vektori se takođe mogu koristiti za ekspresiju stranih polipeptida kao fuzioni proteini sa glutation-5-transferazom (GST). Uopšteno, takvi fuzioni proteini su rastvorljivi i mogu se lako očistiti iz lizovanih ćelija sa adsorpcijom i vezati za kuglice matriksa glutation agaroze praćeno elucijom u prisustvu slobodnog glutationa. pGEX vektori su dizajnirani tako da uključuju mesta cepanja trombina ili faktora Xa proteaze, tako da se klonirani ciljani genski proizvod može osloboditi iz GST ostatka.
[0171] U sistemu insekata, virus nuklearne poliedroze Autographa californica (AcNPV) može se koristiti kao vektor za ekspresiju stranih gena. Virus raste u ćelijama Spodoptera frugiperda. Sekvence kodiranja mogu se klonirati pojedinačno u nebitnim regionima (na primer, polihedrin gen) virusa i staviti ih pod kontrolu AcNPV promotora (na primer, polihedrin promotor).
[0172] U ćelijama domaćina sisara, broj sistema ekspresije bazirani na virusu se može koristiti da se uvede željena nukleotidna sekvenca. U slučajevima kada se adenovirus koristi kao ekspresioni vektor, kodirajuća sekvenca koja nas zanima može se povezati za kontrolni kompleks transkripcije/prevođenja adenovirusa, npr., kasni promotor i tripartitni vodeća sekvenca. Ovaj himerni gen može se zatim umetnuti u genom adenovirusa in vitro ili in vivo rekombinacijom. Ubacivanje u nebitan region virusnog genoma (npr., region El ili E3) rezultiraće rekombinantnim virusom koji je održiv i sposoban da eksprimira molekulu u zaraženim domaćinima (npr., videti Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)). Specifični inicijacijski signali takođe se mogu zahtevati za efikasnu translaciju umetnutih kodirajućih sekvenci. Ovi signali uključuju ATG inicijacijski kodon i susedne sekvence. Nadalje, inicijacijski kodon mora biti u fazi sa okvirom za čitanje željene kodirajuće sekvence kako bi se osigurala translacija celog umetka. Ovi egzogeni translacioni kontrolni signali i inicijacijski kodoni mogu biti različitog porekla, i prirodni i sintetički.
Efikasnost ekspresije može se poboljšati uključivanjem odgovarajućih elemenata za pojačavanje transkripcije, terminatora transkripcije, itd. (videti, npr., Bittner et al., Methods in Enzymol.153:51-544 (1987)). Stoga su kompatibilne ćelijske linije sisara dostupne kao domaćini za ekspresiju dobro poznate u struci i uključuju mnogo besmrtnih ćelijskih linija dostupnih iz Američke kolekcije kultura tipova (ATCC). Oni između ostalog uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelije NS0, ćelije SP2, ćelije HEK-293T, ćelije slobodnog stila 293 (Life Technologies), ćelije NIH-3T3, ćelije HeLa, ćelije bubrega bebe hrčaka (BHK), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (COS), ćelije humanog hepatoćelijskog karcinoma (npr., Hep G2), A549 ćelije, i brojne druge ćelijske linije.
[0173] Za dugoročno je poželjna proizvodnja rekombinantnih proteina visokog prinosa sa stabilnom ekspresijom. Shodno tome, ćelijske linije koje stabilno izražavaju odabrani modulator mogu se konstruisati koristeći standardne tehnike prepoznate u tehnici. Umesto da se koriste ekspresioni vektori koji sadrže viralno poreklo replikacije, ćelije domaćini se mogu transformisati sa kontrolisanom DNK sa odgovarajućim elementima za kontrolu ekspresije (npr., promotor, pojačivač, sekvence, transkripcioni terminator, mesta poliadenilacije, itd.), i selektivnim markerom. Nakon uvođenja strane DNK, inženjerijskim ćelijama može se dozvoliti da rastu 1-2 dana u obogaćenom medijumu, a zatim će se prebaciti na selektivni medijum. Selektivni marker u rekombinantnom plazmidu daje otpornost na selekciju i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u svoje hromozome i rastu u obliku žarišta koje zauzvrat mogu biti klonirane i proširene u ćelijske linije. Ova metoda se može korisno koristiti za konstruisanje ćelijskih linija koje ekspresuju molekul. Takve konstruisane ćelijske linije mogu biti posebno korisne u skriningu i proceni kompozicija koje direktno ili indirektno komuniciraju sa molekulom.
[0174] Brojni selekcioni sistemi su dobro poznati u tehnici i mogu se koristiti uključujući, ali ne ograničavajući se na, virus herpes simpleksa timidin kinazu (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoksantineguanin fosforiboziltransferazu (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl.
4
Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), i adenin fosforiboziltransferazu (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) geni se mogu angažovati u tk-, hgprt- ili aprt- ćelijama, respektivno. Takođe, antimetabolitna rezistencija se može koristiti kao osnova selekcije za sledeće gene: dhfr, što pruža otpor metotreksatu (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, što pruža otpor mikofenolnoj kiselini (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, što pruža otpor aminoglikozidu G-418 (Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem.62: 191-217 (1993); TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993)); i higro, što pruža otpor higromicinu (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Postupci koji su obično poznati u oblasti rekombinantne DNK tehnologije mogu se rutinski primenjivati za izbor željenog rekombinantnog klona, a takvi postupci su opisani, na primer, u Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol.150:1 (1981). Biće poznato da jedan naročito poželjan način uspostavljanja stabilne ćelijske linije visokog prinosa sadrži sistem ekspresije gena glutamin sintetaze (GS sistem) koji pruža efikasan pristup za pojačavanje ekspresije pod određenim uslovima. O GS sistemu se raspravlja u celosti ili delom u vezi sa EP patentima 0216846, 0 256055, 0323997 i 0338841.
[0175] Pored toga, može se odabrati soj ćelije domaćina koji modulira ekspresiju umetnutih sekvenci, ili modifikuje i obrađuje genski proizvod na željeni način. Takve modifikacije (npr., glikozilacija) i prerada (npr., cepanje) proteinskih proizvoda mogu biti važne za funkciju i/ili prečišćavanje proteina. Različite ćelije domaćina imaju karakteristične i specifične mehanizme za post-translacijsku obradu i modifikaciju proteina i genskih proizvoda. Kao što je u poznato u tehnici odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina mogu se izabrati da se obezbedi željena modifikacija i obrada eksprimiranog polipeptida. U tom cilju, eukariotske ćelije domaćina koje poseduju ćelijsku mašineriju za pravilnu obradu primarnog transkripta, glikozilacije, i fosforilacije genskog proizvoda su posebno efikasne za upotrebu u predmetnom pronalasku. Shodno tome, naročito poželjne ćelije domaćina sisara uključuju, ali nisu ograničene na, CHO, VRLO, BHK, HeLa, COS, NS0, MDCK, 293, 3T3, V138, kao i ćelijske linije karcinoma dojke, kao što su, na primer, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O i T47D, i normalna ćelijska linija mlečnih žlezda, kao što su, na primer, CRL7O3O i HsS78Bst. U zavisnosti od modulatora i izabranog proizvodnog sistema, iskusni stručnjaci mogu lako odabrati i optimizirati odgovarajuće ćelije domaćina za efikasno izražavanje modulatora.
b. Hemijska sinteza
[0176] Pored gore pomenutih ćelijskih sistema domaćina, biće poznato da se modulatori pronalaska mogu hemijski sintetizovati korišćenjem tehnika poznatih u tehnici (npr., videti Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., and Hunkapiller, M., et al., 1984, Nature 310:105-111). Na primer, peptid koji odgovara polipeptidnom fragmentu pronalaska može se sintetizovati upotrebom peptidnog sintetizatora. Nadalje, po želji, neklasične amino kiseline ili hemijski analozi amino kiselina mogu se uvesti kao supstitucija ili dodavanje u polipeptidnu sekvencu. Neklasične amino kiseline uključuju, ali nisu ograničene na, D-izomere uobičajenih amino kiselina, 2,4-diaminobuternu kiselinu, a-amino izobuternu kiselinu, 4-aminobuternu kiselinu, Abu, 2-amino buternu kiselinu, g-Abu, e-Ahx, 6-amino heksanoična kiselina, Aib, 2-amino izobuterna kiselina, 3-amino propionska kiselina, ornitin, norleucin, norvalin, hidroksiprolin, sarkozin, citrulin, homocitrulin, cisteinska kiselina, t-butilglicin, t -butilalanin, fenilglicin, cikloheksilalanin, b-alanin, fluoro-amino kiseline, dizajnerske amino kiseline poput b-metil amino kiselina, Ca-metil amino kiselina, Na-metil amino kiselina, i amino kiselinskih analoga uopšte. Dalje, amino kiselina može biti D (dekstrorotarna) ili L (levorotarna).
c. Transgenski sistemi
[0177] PTK7 modulatori pronalaska takođe se mogu proizvesti transgenski kroz stvaranje sisara ili biljaka od interesa koji su transgeni za sekvencije teškog i lakog lanaca imunoglobulina (ili njihove fragmente ili derivate ili njihove varijante) i proizvodnju željenih jedinjenja u nadoknadivom obliku. U vezi sa transgenskom proizvodnjom kod sisara, anti-PTK7 antitela, na primer, mogu da se proizvedu, i izvuku iz, mleka koze, krave ili drugih sisara. Pogledati, npr., U.S.P.Br.5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 i 5,741,957. U nekim rešenjima, transgene ne-humane životinje koje sadrže humani imunoglobulinski lokus su imunizovane sa PTK7 ili njegovim imunogenim delom, kao što je gore opisano. Opisani su postupci za pravljenje antitela kod biljaka, npr., u U.S.P.Br.6,046,037 i 5,959,177.
[0178] U skladu sa ovde opisanim, ne-humane transgenske životinje ili biljke mogu se proizvesti unošenjem jednog ili više molekula nukleinske kiseline koja kodira PTK7 modulator pronalaska u životinji ili biljci standardnim transgenskim tehnikama. Videti Hogan i U.S. Pat. Br.6,417,429. Transgene ćelije koje se koriste za pravljenje transgenske životinje mogu biti embrionalne matične ćelije ili somatske ćelije ili oplođeno jaje. Transgeni nehumani organizmi mogu biti himerni, nehimerni heterozigoti, i nehimerni homozigoti. Videti, npr., Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); i Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). U nekim rešenjima, transgene ne-humane životinje imaju ciljano ometanje i zamenu ciljanjem konstrukcije koja kodira, na primer, teški lanac i/ili laki lanac od interesa. U jednom rešenju, transgene životinje sadrže i iskazuju molekule nukleinske kiseline koje kodiraju teške i lake lance koji se specifično vezuju za PTK7. Iako se anti-PTK7 antitela mogu napraviti u bilo kojoj transgenskoj životinji, u naročito poželjnim rešenjima ne-humane životinje su miševi, pacovi, ovce, svinje, koze, goveda ili konji. U drugim rešenjima, ne-humana transgena životinja izražava željeni farmaceutski proizvod u krvi, mleku, urinu, slini, suzama, sluzi i drugim telesnim tečnostima iz kojih se može lako dobiti koristeći priznate tehnike prečišćavanja.
[0179] Verovatno će da će modulatori, uključujući antitela, izraženi sa različitim ćelijskim linijama ili kod transgenskih životinja imati različite obrasce glikozilacije jedni od drugih. Međutim, svi modulatori kodirani sa molekulom nukleinske kiseline ovde navedeni, ili koji sadrže amino kiselinske sekvence koje su ovde date, deo su predmetnog pronalaska, bez obzira na stanje glikozilacije molekula, i uopšteno, bez obzira na prisustvo ili odsustvo posttranslacione modifikacije. Pored toga, pronalazak obuhvata modulatore koji su različito modifikovani tokom ili posle prevođenja, npr., glikozilacijom, acetilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom sa poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, povezivanjem sa molekulom antitela ili drugim ćelijskim ligandom, itd. Bilo koje brojne hemijske modifikacije se mogu izvesti sa poznatim tehnikama, uključujući, ali bez ograničenja, specifično hemijsko cepanje cijanogen bromidom, tripsinom, himotripsinom, papainom, V8 proteazom, NaBH4, acetilacijom, formilacijom, oksidacijom, redukcijom, metaboličkom sintezom u prisustvu tunikamicin, itd. Razne post-tralacione modifikacije su takođe obuhvaćene pronalaskom uključujući, na primer, N-vezane ili O-povezane lančane ugljene hidrate, obradu krajeva N-terminala ili C-terminala), vezivanje hemijskih ostataka na kosturu amino kiselina, hemijske modifikacije N-vezanih ili O-vezanih lančanih ugljenih hidrata, i dodavanje ili brisanje N-terminalnog mrtionin ostatka kao rezultat ekspresije prokariotske ćelije domaćina. Štaviše, kako je navedeno napred u tekstu i Primerima u nastavku polipeptidi takođe mogu da budu modifikovani sa detektibilniom etiketom, kao što je enzimska, fluorescentna, radioizotopska ili etiketa afiniteta kako bi se omogućila detekcija i izolacija modulatora.
d. Prečišćavanje
[0180] Jednom kada je modulator pronalaska proizveden rekombinantnom ekspresijom ili bilo kojom drugom ovde otkrivenom tehnikom, on se može prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici za prečišćavanje imunoglobulina ili, uopštenije, bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. U tom pogledu modulator može biti izolovan. Kako što je ovde korišćeno, izolovani PTK7 modulator je onaj koji je identifikovan i odvojen i/ili oporavljen iz komponente svog prirodnog okruženja. Kontaminantne komponente njegove prirodne sredine su materijali koji bi ometali dijagnostičku ili terapijsku upotrebu polipeptida i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvore. Izolovani modulatori uključuju modulator in situ unutar rekombinantnih ćelija zbog toga što bar jedna komponenta prirodnog okruženja polipeptida neće biti prisutna.
[0181] Kada se koriste rekombinantne tehnike, PTK7 modulator (npr. anti-PTK7 antitelo ili njegov derivat ili fragment) može se proizvesti intracelularno, u periplazmatskom prostoru, ili direktno izlučiti u medijum. Ako se željeni molekul proizvodi intracelularno, kao prvi korak, ostaci čestica, bilo ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, mogu se ukloniti, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Na primer, Carter, et al., Bio/Technology 10:163 (1992) opisuje postupak za izolovanje antitela koja se izlučuju u periplazmatski prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta se odmrzava u prisustvu natrijum acetata (pH 3.5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 minuta. ûelijski ostaci se mogu ukloniti centrifugiranjem. Tamo gde se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se obično prvo koncentrišu pomoću komercijalno dostupnog filtra za koncentraciju proteina, na primer, jedinice za ultrafiltraciju Amicon ili Millipore Pellicon.
Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka za inhibiranje proteolize, a antibiotici mogu biti uključeni da spreče rast slučajnih kontaminanata.
[0182] Modulator kompozicije (npr., Fc-PTK7 ili anti-PTK7 antitelo) pripremljen iz ćelija može se prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksilapatitske hromatografije, gel elektroforeze, dijalize, i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja. Prikladnost proteina A kao afiniteta liganda zavisi od vrste i izotipa bilo kojeg imunoglobulinskog Fc domena koji je prisutan u odabranom konstruktu. Protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela koja se zasnivaju na humanim IgG1, IgG2 ili IgG4 teškim lancima (Lindmark, et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)). Protein G se preporučuje za sve mišje izotipove i za humani IgG3 (Guss, et al., EMBO J 5:1567 (1986)). Matrica za koju je vezan afinitetni ligand je najčešće agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice kao što su staklo sa kontrolisanom porom ili poli(stirenedivinil)benzen omogućavaju brži protok i kraća vremena obrade nego što se to može postići sa agarozom.
Gde antitelo sadrži CH3 domen, Bakerbond ABX™ resin (J. T. Baker; Phillipsburg, N.J.) se koristi za prečišćavanje. Ostale tehnike za prečišćavanje proteina kao što su frakcionisanje na koloni za jonoizmenjivanje, taloženje etanolom, HPLC reverzne faze, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparinu, sefarozna hromatografija na anjonskoj ili kationskoj izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona sa poliaspartanskom kiselinom), hromatofokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijum sulfata su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koje se mora obnoviti. U posebno poželjnim slučajevima, modulatori predmetnog pronalaska će se prečistiti, bar delimično, koristeći afinitetnu hromatografiju Proteina A ili Proteina G.
XI. Konjugovani PTK7 Modulatori
[0183] Jednom kada su modulatori pronalaska prečišćeni prema ovde opisanim učenjima, oni mogu biti povezani, spojeni za, konjugovani za (npr., kovalentno ili nekovalentno) ili na bilo koji drugi način povezani sa farmaceutski aktivnim ili dijagnostičkim jedinicama ili biokompatibilnim modifikatorima. Kao što je ovde korišćen, izraz konjugat će se široko koristiti i smatra se da označava bilo koji molekul povezan sa otkrivenim modulatorima bez obzira na metod udruživanja. U tom pogledu će se razumeti da takvi konjugati mogu sadržati peptide, polipeptide, proteine, polimere, molekule nukleinske kiseline, male molekule, mimetske agense, sintetičke lekove, neorganske molekule, organske molekule i radioizotope. Štaviše, kao što je gore naznačeno, izabrani konjugat može biti kovalentno ili nekovalentno vezan sa modulatorom i ispoljavati različite molarne odnose, u zavisnosti, bar delimično, od postupka koji se koristi da bi se izvršila konjugacija.
[0184] U poželjnim slučajevima biće očigledno da modulatori pronalaska mogu biti konjugovani ili povezani sa proteinima, polipeptidima ili peptidima koji daju odabrane karakteristike (npr., biotoksini, biomarkeri, oznake za prečišćavanje, itd.). Uopšteno, u odabranim slučajevima, predmetni pronalazak obuhvata upotrebu modulatora ili njihovih fragmenata rekombinantno spojenih ili hemijski konjugovanih (uključujući i kovalentne i nekovalentne konjugacije) u heterologni protein ili polipeptid, pri čemu polipeptid sadrži najmanje 10, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90 ili najmanje 100 amino kiselina. Konstrukcija ne mora nužno biti direktno povezana, ali se može pojaviti preko vezanih sekvenci. Na primer, antitela se mogu koristiti za ciljanje heterolognih polipeptida na određene ćelijske tipove koji eksprimiraju PTK7, bilo in vitro ili in vivo, spajanjem ili konjugacijom modulatora predmetnog pronalaska za antitela specifična za određene ćelijske površinske receptore. Štaviše, modulatori spojeni ili konjugovani sa heterolognim polipeptidima takođe se mogu koristiti u imunološkom ispitivanju in vitro i mogu biti kompatibilni sa metodologijom pročišćavanja poznatom u tehnici. Videti npr., Međunarodnu objavu Br. WO 93/21232; evropski patent Br. EP 439,095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett.39:91-99; U.S. Pat. No.5,474,981; Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432; and Fell et al., 1991, J. Immunol.146:2446-2452.
a. Biokompatibilni modifikatori
[0185] U poželjnom primeru, modulatori pronalaska mogu biti konjugovani ili na neki drugi način povezani sa biokompatibilnim modifikatorima koji se mogu koristiti za podešavanje, promenu, poboljšanje ili umanjenje karakteristika modulatora po želji. Na primer, antitela ili spojeni konstrukti sa povećanim in vivo poluživotom mogu se generisati dodavanjem molekula polimera relativno velike molekulske težine kao što je komercijalno dostupan polietilen glikol (PEG) ili slični biokompatibilni polimeri. Stručnjaci u ovoj oblasti će razumeti da se PEG može dobiti u mnogo različitih molekulskih težina i molekulskih konfiguracija koje se mogu odabrati tako da antitelu daju specifična svojstva (npr. poluživot može biti prilagođen). PEG se može vezati za modulatore ili fragmente antitijela ili derivate sa ili bez multifunkcionalnog povezivača bilo putem mesta konjugacije PEG na N- ili C-terminus navedenih antitela ili fragmenata antitela ili preko epsilon-amino grupa prisutnih na lizinskim ostacima. Može se koristiti linearna ili razgranata derivatizacija polimera koja rezultira u minimalnom gubitku biološke aktivnosti. Stepen konjugacije može se pažljivo pratiti sa SDS-PAGE i masenom spektrometrijom kako bi se osigurala optimalna konjugacija PEG molekula sa molekulima antitela. Nereagovani PEG se može odvojiti od antitela-PEG konjugata pomoću, na primer, isključenja veličine ili jono-izmenljive hromatografije. Na sličan način, otkriveni modulatori mogu biti konjugovani sa albuminom kako bi se dobilo antitelo ili fragment antitela što stabilnijim in vivo ili imali duži poluživot in vivo. Učenja su opšte poznata u tehnici, videti npr., Međunarodne Objave Br. WO 93/15199, WO 93/15200, i WO 01/77137; i evropski patent Br.0413, 622. Ostali biokompatibilni konjugati su očigledni onima koji imaju uobičajenu veštinu i lako se mogu identifikovati u skladu sa ovde datim Xčenjima.
b. Dijagnostički ili detekcioni agensi
[0186] U drugim poželjnim slučajevima, modulatori predmetnog pronalaska, ili njihovi fragmenti ili derivati, su konjugovani sa dijagnostičkim ili detekcionim agensom, markerom ili reporterom koji može biti biološki molekul (npr., peptid ili nukleotid), mali molekul, fluorofor, ili radioizotop. Označeni modulatori mogu biti korisni za nadgledanje razvoja ili napredovanja hiperproliferativnog poremećaja ili kao deo kliničkog postupka testiranja za utvrđivanje efikasnosti određene terapije koja uključuje otkrivene modulatore (odn. teragnostiku) ili za određivanje budućeg toka lečenja. Takvi markeri ili reporteri takođe mogu biti korisni u prečišćavanju odabranog modulatora, odvajanju ili izolovanju TIC ili u pretkliničkim procedurama ili toksikološkim studijama.
[0187] Takva dijagnoza i detekcija može se postići spajanjem modulatora sa supstancama koje se mogu detektovati, uključujući, ali ne ograničavajući se na, različite enzime koji sadrže na primer peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, betagalaktozidazu ili acetilholinesterazu; prostetske grupe, kao što su, ali bez ograničenja, streptavidinlbiotin i avidin / biotin; fluorescentni materijali, kao što su, ali ne ograničavajući se na, umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocionat, rodamin, diklororiazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoetrinin; luminiscentni materijali, kao što je, ali ne ograničavajući se na, luminol; bioluminiscentni materijali, kao što su, ali nisu ograničeni na, luciferaza, luciferin i aekororin; radioaktivni materijali, kao što su jod, ali nisu ograničeni na njih (<131>I,<125>I,<123>I,<121>I,), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tritijum (<3>H), indijum (<115>In,<113>In,<112>In,<111>In,), i tehnetijum (<99>Tc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molibdenum (<99>Mo), ksenon (<133>Xe), fluor (<18>F),<153>Sm,<177>Lu,<159>Gd,<149>Pm,<140>La,<175>Yb,<166>Ho,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh,<97>Ru,<68>Ge,<57>C,<65>Zn,<85>Sr,<32>P,<153>Gd,<169>Yb,<51>Cr,<54>Mn,<75>Se,<113>Sn, i<117>Tin; metali koji emituju pozitron koristeći razne tomografije emisije pozitrona, neradioaktivni paramagnetski joni metala, i molekuli koji su radioobeleženi ili konjugovani sa određenim radioizotopima. U takvim slučajevima odgovarajuća metodologija otkrivanja je dobro poznata u tehnici i lako dostupna iz brojnih komercijalnih izvora.
[0188] Kao što je gore navedeno, u drugim slučajevima se modulatori ili njihovi fragmenti mogu spojiti u markirane sekvence, kao što je peptid ili fluorofor da bi se olakšalo prečišćavanje ili dijagnostičke procedure, kao što su imunohistohemija ili FAC. U poželjnim slučajevima, markerna amino kiselinska sekvenca je heksa-histidin peptid (SEQ ID NO: 7), kao što je oznaka data u pQE vektoru (Qiagen Inc.), između ostalih, od kojih su mnoge komercijalno dostupne. Kao što je opisano u Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, na primer, heksa-histidin omogućava pogodno pročišćavanje fuzionog proteina. Ostale peptidne oznake korisne za prečišćavanje uključuju, ali nisu ograničene na, hemaglutininska "HA" oznaka, koja odgovara epitopu dobijenom iz proteina hemaglutinina protiv gripa (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) i "flag" oznaka (U.S.P.Br.4,703,004).
c. Terapeutski Ostaci
1
[0189] Kao što je ranije aludirano na modulatore ili njihove fragmente ili derivate, takođe se mogu konjugirati, vezati ili spojiti za ili na bilo koji drugi način vezati sa terapijskim ostatkom kao što su agensi protiv raka, citotoksin ili citotoksični agens, npr., citostatski ili citocidni agens, terapeutski agens ili radioaktivni metalni jon, npr., alfa ili beta emiteri. Kao što je ovde korišćeno, citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens ili terapijski ostatak koji šteti ćelijama i može inhibirati rast ili preživljavanje ćelija. Primeri uključuju paklitaksel, citohalasin B, gramicidin D, etidijev bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin, majtansinoidi kao što je DM-1 i DM-1 (DM-1-immun, DM-1, DM-1, DM-1, DM-1, DM-1, DM-1, DM-1, DM-1, dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, puromicin, epirubicin i ciklofosfamid i njihovi analozi ili homolozi. Dodatni citotoksini sadrže auristatine, uključujući monometil auristatin E (MMAE) i monometil auristatin F (MMAF) (Seattle Genetics, Inc.), amanitine poput alfa-amanitina, beta-amanitina, gama-amanitina ili epsilon-amanitina (Heidelberg Pharma AG), manji žljebni vezujući agensi za DNK, kao što su derivati duokarmicina (Sintarga, BV) i modifikovani dimer pirolobenzodiazepini (PBDs, Spirogen, Ltd). Dalje, u jednom slučaju PTK7 modulatori predmetnog pronalaska mogu biti povezani sa molekulima koji se vezuju za anti-CD3 da bi regrutovali citotoksične T-ćelije i usmerili ih da ciljaju ćelije koje iniciraju tumor (BiTE tehnologija; videti npr. Fuhrmann, S. et. Al. Annual Meeting of AACR Apstrakt br.5625 (2010)).
[0190] Dodatna kompatibilni terapijski ostaci sadrže citotoksične agense koji uključuju, ali nisu ograničena na njih, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil decarbazin), alkilacione agense (npr., mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, carmustin (BCNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cisdihlorodiamin platinum (II) (DDP) cisplatin), antraciklini (npr., daunorubicin (bivši daunomicin) i doksorubicin), antibiotici (npr., daktinomicin (bivši aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), i anti-mitotski agensi (npr., vincristin i vinblastin). Opsežniji spisak terapijskih ostataka se može naći u PCT objavi WO 03/075957 i U.S.P.N.2009/0155255.
[0191] Odabrani modulatori mogu se takođe konjugovati sa terapijskim ostacima kao što su radioaktivni materijali ili makrociklički helatori korisni za konjugaciju radiometalnih jona (videti gore na primer radioaktivni materijali). U određenim slučajevima, makrociklični helator je 1,4,7,10-tetraazaciklododecan-N,N’,N",N"-tetrasirćetna kiselina (DOTA) koja se može vezati za antitelo preko vezujućeg molekula. Takvi vezujući molekuli su uobičajeno poznati u
2
tehnici i opisani su u Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res.4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem.10:553; and Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol.26:943.
[0192] Primerni radioizotopi koji mogu da budu kompatibilni sa ovim aspektom pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, jod (<131>I,<125>I,<123>I,<121>I,), ugljenik (<14>C), bakar (<62>Cu,<64>Cu,<67>Cu), sumpor (<35>S), tritijum (<3>H), indijum (<115>In,<113>In,<112>In,<111>In,), bizmut (<212>Bi,<213>Bi), tehnetijum (<99>Tc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molibden (<99>Mo), ksenon (<133>Xe), fluor (<18>F),<153>Sm,<177>Lu,<159>Gd,<149>Pm,<140>La,<175>Yb,<166>Ho,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh,<97>Ru,<68>Ge,<57>Co,<65>Zn,<85>Sr,<32>P,<153>Gd,<169>Yb,<51>Cr,<54>Mn,<75>Se,<113>Sn,<117>Tin,<225>Ac,<76>Br, i<211>At. Ostali radionuklidi su takođe dostupni kao dijagnostički i terapeutski agensi, posebno oni u energetskom opsegu od 60 do 4.000 keV. U zavisnosti od stanja koje treba lečiti i željenog terapijskog profila, stručnjaci mogu lako odabrati odgovarajući radioizotop za upotrebu sa otkrivenim modulatorima.
[0193] PTK7 modulatori predmetnog pronalaska mogu takođe biti konjugovani sa terapeutskim ostatkom ili lekom koji modifikuje dati biološki odgovor (npr., modifikatori biološkog odgovora ili BRM). Odnosno, terapeutski agensi ili delovi kompatibilni sa predmetnim pronalaskom ne smeju se smatrati ograničenim na klasične hemijske terapeutske agense. Na primer, u naročito poželjnim rešenjima, deo leka može biti protein ili polipeptid ili njegov fragment koji ima željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu da uključuju, na primer, toksin, kao što su abrin, ricin A, onkonaza (ili drugu citotoksičnu RNazu), pseudomonas egzotoksin, kolera toksin, ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora, Į-interferon, ȕ-interferon, faktor rasta nerva, faktor rasta koji potiče iz trombocita, aktivator plazminogena u tkivu, apoptotski agenst, npr., TNF- Į, TNF-ȕ, AIM I (videti, Međunarodnu Objavu Br. WO 97/33899), AIM II (videti, Međunarodnu Objavu Br. WO 97/34911), Fas Ligand (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567), i VEGI (videti, Međunarodnu Objavu Br. WO 99/23105), trombotični agens ili anti-angiogenski agens, npr., angiostatin ili endostatin; ili modifikator biološkog odgovora, kao što je, na primer, limfokin (npr., interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulisanja kolonije granulocitnih makrofaga („GM-CSF“) i faktor stimulacije kolonije granulocita („G-CSF“) ili faktor rasta (npr., hormon rasta („GH“)). Kao što je gore navedeno, u struci su poznati postupci za fuziju ili konjugaciju modulatora na polipeptidne ostatke. Pored prethodno objavljenih predmetnih referenci vidi, npr., U.S.P.Br.5,336,603; 5,622,929;
5,359,046; 5,349,053; 5,447,851, i 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; PCT Objave WO 96/04388 i WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng et al., 1995, J Immunol 154:5590; i Vil et al., 1992, PNAS USA 89:11337. Asocijacija modulatora sa ostatkom ne mora nužno biti direktna, ali može se dogoditi preko vezujućih sekvenci. Takvi vezujući molekuli su opšte poznati u tehnici i opisani u Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26:943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171.
[0194] Uopšteno, tehnike za konjugovanje terapeutskih ostataka ili citotoksičnih agenasa sa modulatorima su dobro poznate. Ostaci se mogu konjugovati sa modulatorima bilo kojom priznatom metodom, uključujući, ali ne ograničavajući se na aldehid/Schiff vezu, sulfidrilnu vezu, kiselina-labilnu vezu, cis-akonitilnu vezu, hidrazonsku vezu, enzimski razgradivu vezu (videti uopšteno Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171). Takođe videti, npr., Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc.1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc.1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev.
62:119. U poželjnim slučajevima, PTK7 modulator koji je konjugovan sa terapeutskim ostatkom ili citotoksičnim agensom može biti internalizovan sa ćelijom nakon vezivanja za molekul PTK7 povezan sa ćelijskom površinom i na taj način isporučiti terapeutski teret.
XII. Dijagnostikovanje i Skrining
a. Dijagnostikovanje
[0195] Kao što je naznačeno, predmetni pronalazak obezbeđuje in vitro ili in vivo postupke za detekciju, dijagnostikovanje il imonitoring hiperproliferativnih poremećaja i postupke skrininga ćelija iz pacijenata kako bi se identifikovale tumorigenske ćelije koje uključuju TPCs. Takvi postupci uključuju identifikaciju osobe koja ima rak za lečenje ili praćenje napredovanja karcinoma, uključujući kontakt pacijenta ili uzorka dobijenog od pacijenta sa odabranim PTK7 modulatorom kako je ovde opisano i otkrivanje prisustva ili odsustva ili nivoa povezanosti modulatora sa vezanim ili slobodnim PTK7 u uzorku. Kada modulator sadrži antitelo ili njegov imunološki aktivan fragment, povezanost sa određenim PTK7 u uzorku verovatno označava da uzorak može sadržati ćelije koje održavaju tumor (npr., matične ćelije karcinoma), što ukazuje da se osoba koja ima rak može efikasno lečiti PTK7 modulatorom kako je ovde opisano. Postupci mogu dalje sadržavati korak poređenja nivoa
4
vezivanja na kontroli. Suprotno tome, kada je izabrani modulator Fc-PTK7, osobine vezivanja izabranog PTK7 mogu se iskoristiti i nadgledati (direktno ili indirektno, in vivo ili in vitro) kada su u kontaktu sa uzorkom kako bi se pružile željene informacije. Druge dijagnostički ili terapijski postupci kompatibilni sa ovim učenjima dobro su poznati u tehnici i mogu se praktikovati koristeći komercijalne materijale kao što su namenski sistemi izveštavanja.
[0196] U posebno poželjnom slučaju, modulatori predmetnog pronalaska mogu se koristiti za otkrivanje i kvantifikovanje nivoa PTK7 u uzorku pacijenta (npr., plazma ili krv) koji se zauzvrat mogu koristiti za otkrivanje, dijagnostiku ili nadgledanje poremećaja povezanih sa PTK7, uključujući hiperproliferativne poremećaji. U srodnim slučajevima, modulatori predmetnog pronalaska mogu se koristiti za otkrivanje, nadgledanje i/ili kvantifikovanje cirkulišućih tumorskih ćelija bilo in vivo ili in vitro (videti, na primer, WO 2012/0128801). U još nekim drugim poželjnim slučajevima, tumorske ćelije koje cirkulišu mogu sadržati matične ćelije karcinoma.
[0197] Primerini kompatibiln postupci ispitivanja uključuju radioimunoanalize, enzimske imunoanalize, testove kompetitivnog vezivanja, fluorescentni imuno test, imunoblotski test, analizu Western Blota, testove protočne citometrije i ELISA testove. Uopšteno, detekcija PTK7 u biološkom uzorku ili merenje PTK7 enzimske aktivnosti (ili njegova inhibicija) može se postići primenom bilo kog testa poznatog u tehnici. Kompatibilne in vivo teragnostike ili dijagnostike mogu obuhvatati tehnike prepoznavanje slika ili tehnika kao što su magnetna rezonanca (MRI), kompjuterizovana tomografija (npr. CAT skeniranje), pozitronska tomografija (npr. PET skeniranje) radiografija, ultrazvuk itd. Stručnjaci iz ove oblasti lako će moći da prepoznaju i primene odgovarajuće tehnike detekcije, nadgledanja ili snimanja (koje često sadrže komercijalno dostupne izvore) zasnovane na etiologiji, patološkoj manifestaciji ili kliničkom napredovanju poremećaja.
[0198] U drugom slučaju, pronalazak pruža postupak za analizu progresije karcinoma i/ili patogeneze in vivo. U drugom slučaju, analiza progresije karcinoma i/ili patogeneze in vivo uključuje određivanje stepena progresije tumora. U drugom slučaju, analiza uključuje identifikaciju tumora. U drugom slučaju, analiza progresije tumora vrši se na primarnom tumoru. U drugom slučaju, analiza se vrši vremenom u zavisnosti od vrste raka kao što je poznato stručnjaku. U drugom slučaju, dalja analiza sekundarnih tumora poreklom iz metastazirajućih ćelija primarnog tumora analizira se in vivo. U drugom slučaju, analiziraju se veličina i oblik sekundarnih tumora. U nekim slučajevima se vrši dalja ex vivo analiza.
[0199] U drugom slučaju, pronalazak pruža postupak za analizu progresije karcinoma i/ili patogeneze in vivo, uključujući određivanje metastaza u ćelijama ili otkrivanje i kvantifikovanje nivoa cirkulišućih tumorskih ćelija. U još jednom slučaju, analiza ćelija metastaza uključuje određivanje progresivnog rasta ćelija na mestu koje je udaljeno od primarnog tumora. U drugom slučaju, mesto analize ćelijskih metastaza obuhvata put neoplastičnog širenja. U nekim slučajevima ćelije se mogu dispergovati krvnom vaskulaturom, limfom, unutar telesnih šupljina ili njihovih kombinacija. U drugom slučaju, analiza ćelijskih metastaza se vrši s obzirom na migraciju, širenje, ekstravazaciju, proliferaciju ili njihove kombinacije.
[0200] U određenim primerima, tumorigenske ćelije kod subjekta ili uzorka iz subjekta mogu se proceniti ili okarakterisati koristeći otkrivene modulatore pre terapije ili režima da bi se utvrdila osnovna linija. U drugim primerima, uzorak potiče od osobe koja je lečena. U nekim primerima uzorak je uzet od ispitanika najmanje oko 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 30, 60, 90 dana, 6 meseci, 9 meseci, 12 meseci ili > 12 meseci nakon što ispitanik započne ili prekine lečenje. U određenim primerima, tumorske ćelije se procenjuju ili karakterišu nakon određenog broja doza (npr., nakon 2, 5, 10, 20, 30 ili više doza terapije). U drugim primerima, tumorske ćelije se karakterišu ili procenjuju nakon 1 nedelje, 2 nedelje, 1 meseca, 2 meseca, 1 godine, 2 godine, 3 godine, 4 godine ili više nakon primanja jedne ili više terapija.
[0201] U drugom aspektu, i kao što je detaljnije razmotreno u nastavku, ovaj pronalazak pruža komplete za detekciju, praćenje ili dijagnostikovanje hiperproliferativnog poremećaja, identifikaciju osobe koja ima takav poremećaj za moguće lečenje ili praćenje napredovanja (ili regresije) poremećaja kod pacijenta, pri čemu komplet sadrži modulator kako je ovde opisano, i reagense za detekciju uticaja modulatora na uzorak.
b. Skrining
[0202] PTK7 modulatori i ćelije, kulture, populacije i kompozicije koje ih sadrže, uključujući i njihovo potomstvo, takođe se mogu koristiti za pregled ili identifikaciju jedinjenja ili agenasa (npr., lekova) koji utiču na funkciju ili aktivnost ćelija koje iniciraju tumor ili njihovih potomaka interakcija sa PTK7 (npr., njegov polipeptid ili genetske komponente). Pronalazak stoga dalje obezbeđuje sisteme i postupke za procenu ili identifikaciju jedinjenja ili agensa koji mogu uticati na funkciju ili aktivnost tumora koji iniciraju ćelije ili na njihovo potomstvo udruživanjem sa PTK7 ili njegovim supstratima. Takva jedinjenja i agensi mogu biti kandidati za lekove koji su, na primer, pregledani za lečenje hiperproliferativnog poremećaja. U jednom slučaju, sistem ili postupak sadrži ćelije koje iniciraju tumor koje pokazuju PTK7 i jedinjenje ili agens (npr., lek), pri čemu su ćelije i jedinjenje ili agens (npr., lek) u međusobnom kontaktu.
[0203] Pronalazak dalje obezbeđuje postupke skrininga i identifikovanja PTK7 modulatora ili agenasa i jedinjenja za promenu aktivnosti ili funkcije ćelija koje iniciraju tumor ili ćelija potomstva. U jednom slučaju, postupak uključuje kontakt ćelija koje iniciraju tumor ili njihovih potomaka sa test agensom ili jedinjenjem; i određivanje da li ispitivani agens ili jedinjenje modulira aktivnost ili funkciju ćelija koje iniciraju tumor povezan sa PTK7.
[0204] Ispitni agens ili jedinjenje koji moduliraju aktivnost ili funkciju PTK7 povezanih sa PTK7 ćelijama ili njihovim potomcima u populaciji identifikuju ispitni agens ili jedinjenje kao aktivni agens. Primer aktivnosti ili funkcije koja se može modulisati uključuju promene u ćelijskoj morfologiji, ekspresiji markera, diferencijaciju ili de-diferencijaciju, sazrevanje, proliferaciju, održivost, apoptozu ili ćelijsku smrt neuronske progenitorne ćelije ili njihovo potomstvo.
[0205] Kontaktiranje, kada se koristi u vezi sa ćelijama ili ćelijskom kulturom ili korakom ili postupkom postupka, znači direktnu ili indirektnu interakciju između kompozicije (npr., PTK7 povezane ćelije ili ćelijske kulture) i drugog referenciranog entiteta. Poseban primer direktne interakcije je fizička interakcija. Poseban primer indirektne interakcije je gde kompozicija deluje na posrednički molekul koji zauzvrat deluje na referentirani entitet (npr., ćelija ili ćelijska kultura).
[0206] U ovom aspektu pronalaska modulatori ukazuju na uticaj ili aktivnost ćelija koje iniciraju tumor ili potomstva na način kompatibilan sa detekcijom efekata na ćelijsku aktivnost ili funkciju za koje je utvrđeno da su relevantni za određeni aspekt (npr., metastaze ili proliferacija ) ćelija koje iniciraju tumor ili ćelije potomstva ovog pronalaska. Primerne aktivnosti i funkcije uključuju, ali se ne ograničavaju na, merenje morfologije, razvojne markere, diferencijacije, proliferacije, održivosti, ćelijskog disanja, aktivnosti mitohondrija, integriteta membrane ili ekspresije markera povezanih sa određenim uslovima. Shodno tome, jedinjenje ili agens (npr., kandidat za lek) može da se proceni zbog njegovog uticaja na ćelije koje iniciraju tumor ili ćelije potomstva, tako što se takvim ćelijama ili potomcima potomstva kontaktira sa jedinjenjem ili agensom i izmere bilo koje modulacije aktivnosti ili funkcije tumora pokretanje ćelija ili ćelija potomstva kao što je ovde otkriveno ili bi bilo poznato stručnim stručnjaku.
[0207] Postupci skrininga i identifikacije agenasa i jedinjenja uključuju one pogodni za skrining sa visokom propusnošću, koji uključuju niz ćelija (npr., mikroračuni) koje su postavljene ili smeštene, opciono na unapred određene lokacije ili adrese. Visokopropusne robotske ili ručne metode rukovanja mogu ispitivati hemijske interakcije i odrediti nivoe ekspresije mnogih gena u kratkom vremenskom periodu. Razvijene su tehnike koje koriste molekularne signale (npr., fluorofore) i automatizovane analize koje obrađuju informacije vrlo brzo (videti, npr., Pinhasov et al., Comb. Chem. High Throughput Screen.7:133 (2004)). Na primer, mikroračunska tehnologija se uveliko koristi za ispitivanje interakcija hiljada gena odjednom, istovremeno pružajući informacije za specifične gene (videti, npr., Mocellin and Rossi, Adv. Exp. Med. Biol.593:19 (2007)).
[0208] Takvi postupci skrininga (npr., visokopropusni) mogu brzo i efikasno identifikovati aktivne agense i jedinjenja. Na primer, ćelije mogu biti pozicionirane ili postavljene (previdetided) na posudu, epruvetu, elermajer, okrugli balon ili ploču (npr., pojedinačna ploča ili ploča sa više bunarčLća, kao što su 8, 16, 32, 64, 96 , 384 i 1536 ploča sa više bunarčLća ili posuda sa više bunarčLća), opciono na definisanim mestima, za identifikaciju potencijalno terapijskih molekula. Biblioteke koje se mogu pregledati uključuju, na primer, biblioteke malih molekula, biblioteke za prikaz faga, biblioteke za prikaz potpuno humanih antitela kvasca (Adimab, LLC), siRNK biblioteke i adenovirusni vektori transfekcije.
XIII. Farmaceutski Preparati i Terapeutske Primene
a. Formulacije i načini primene
[0209] U zavisnosti od oblika modulatora, zajedno sa bilo kojim opcionim konjugatom, načinom predviđene isporuke, bolešću koja se leči ili prati i brojnim drugim varijablama, kompozicije predmetnog pronalaska mogu se formulisati po želji koristeći tehnike priznate u tehnici. To jest, u različitim slučajevima predmetnog pronalaska kompozicije koje sadrže PTK7 modulatore formulisane su sa širokim spektrom farmaceutski prihvatljivih nosača (videti, npr., Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed., Pharmaceutical Press (2000)). Iz raznih komercijalnih izvora lako su dostupni različiti farmaceutski prihvatljivi nosači, koji uključuju nosače, adjuvanse i razblaživače. Štaviše, dostupan je i asortiman farmaceutski prihvatljivih pomoćnih supstanci, kao što su agensi za podešavanje pH i pufer, agensi za podešavanje toničnosti, stabilizatori, sredstva za vlaženje i slično. Neki neograničavajući uzorci nosača uključuju fiziološki rastvor, puferisani fiziološki rastvor, dekstrozu, vodu, glicerol, etanol i njihove kombinacije.
[0210] Naročito će biti poznato da se u nekim rešenjima terapeutske kompozicije pronalaska mogu primenjivati uredno ili sa minimumom dodatnih komponenti. Suprotno tome, PTK7 modulatori predmetnog pronalaska mogu opciono da budu formulisani tako da sadrže pogodne farmaceutski prihvatljive nosače koji sadrže ekscipijente i pomoćne supstance koji su dobro poznata u tehnici i koja su relativno inertne supstance koje olakšavaju primenu modulatora ili koje pomažu obradu aktivnih jedinjenja u preparatima koje su farmaceutski optimizovane za isporuku na mesto dejstva. Na primer, pomoćna supstanca može dati oblik ili konzistenciju ili delovati kao razblaživač za poboljšanje farmakokinetike modulatora.
Pogodne pomoćne supstance uključuju, ali se ne ograničavaju na agense za stabilizaciju, sredstva za vlaženje i emulgovanje, soli za različitu osmolarnost, agensi za inkapsulaciju, puferi i pojačivači prodiranja kroz kožu.
[0211] Otkriveni modulatori za sistemsku primenu mogu se formulisati za enteralnu, parenteralnu ili topikalnu primenu. Zaista, sve tri vrste formulacije mogu se istovremeno koristiti za postizanje sistemske primene aktivnog sastojka. Pomoćne supstance kao i formulacije za parenteralno i neparenteralno davanje lekova su date u Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000). Prikladne formulacije za parenteralnu primenu uključuju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku rastvorljivog u vodi, na primer, vodo rastvorljive soli. Pored toga, mogu se primeniti suspenzije aktivnih jedinjenja prema potrebi za uljaste suspenzije za injekcije. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači uključuju masna ulja, na primer, susamovo ulje, ili estere sintetičkih masnih kiselina, na primer, etil oleat ili trigliceride. Vodene suspenzije za injekcije mogu sadržati supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije i uključuju, na primer, natrijum karboksimetil celulozu, sorbitol i/ili dekstran. Opciono, suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore. Lipozomi se takođe mogu koristiti za kapsulaciju agensa za isporuku u ćeliju.
[0212] Prikladne formulacije za enteralnu primenu uključuju tvrde ili meke želatinske kapsule, pilule, tablete, uključujući obložene tablete, eliksire, suspenzije, sirupe ili inhalacije i njihove oblike sa kontrolisanim oslobađanjem.
[0213] Uopšteno, jedinjenja i kompozicije pronalaska, koje sadrže PTK7 modulatore, mogu se primenjivati in vivo, subjektu kojem je to potrebno, na različite načine, uključujući, ali bez ograničenja, oralno, intravenozno, intra-arterijsko, potkožno, parenteralno, intranazalno, intramuskularno, intrakardijalno, intraventrikularno, intratrahealno, bukalno, rektalno, intraperitonealno, intradermalno, topikalno, transdermalno i intratekalno, ili implantacijom ili inhalacijom. Predmetni sastavi mogu biti formulisani u preparate u čvrstom, polučvrstom, tečnom ili gasovitom obliku; uključujući, ali bez ograničenja, tablete, kapsule, praškove, granule, masti, rastvore, supozitorije, klistire, injekcije, inhalante i aerosole. Odgovarajuća formulacija i način primene mogu se odabrati prema predviđenoj primeni i terapijskom režimu.
b. Doziranje
[0214] Slično tome, određeni režim doziranja, odn. doza, vreme i ponavljanje, zavisiće od određenog pojedinca i njegove istorije bolesti. Empirijska razmatranja poput farmakokinetike (npr., poluvreme, stopa odobrenja, itd.) doprineće određivanju doziranja. Učestalost davanja može se odrediti i prilagoditi tokom terapije, a zasniva se na smanjenju broja hiperproliferativnih ili neoplastičnih ćelija, uključujući ćelije koje iniciraju tumor, održavanje redukcije takvih neoplastičnih ćelija, smanjenje proliferacije neoplastičnih ćelija ili odlaganje razvoj metastaza. Alternativno, formulacije sa kontinuiranim neprekidnim oslobađanjem predmetne terapijske kompozicije mogu biti prikladne. Kao što je navedeno u gornjem tekstu, u tehnici su poznate različite formulacije i uređaji za postizanje usporenog oslobađanja.
[0215] Sa terapijskog stanovišta, farmaceutske smeše se primenjuju u količini efikasnoj za lečenje ili profilaksu specifične indikacije. Terapeutski efikasna količina obično zavisi od težine subjekta koji se leči, njegovog fizičkog ili zdravstvenog stanja, obimnosti stanja koje treba lečiti ili starosti subjekta koji se leči. Uopšteno, PTK7 modulatori pronalaska mogu se primenjivati u količini u opsegu od oko 10 mg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine po dozi. U određenim slučajevima, PTK7 modulatori pronalaska mogu se primenjivati u količini u opsegu od oko 50 mg/kg telesne težine do oko 5 mg/kg telesne težine po dozi. U nekim drugim slučajevima, PTK7 modulator pronalaska može se primeniti u količini u opsegu od oko 100 mg/kg telesne mase do oko 10 mg/kg telesne težine po dozi. Opciono, PTK7 modulatori pronalaska mogu se primenjivati u količini u opsegu od oko 100 mg/kg telesne težine do oko 20 mg/kg telesne težine po dozi. Dalje, po izboru, PTK7 modulator pronalaska može se primeniti u količini u opsegu od oko 0.5 mg/kg telesne mase do oko 20 mg/kg telesne težine po dozi. U određenim slučajevima, jedinjenja predmetnog pronalaska su obezbeđena u dozi od najmanje oko 100 mg/kg telesne težine, najmanje oko 250 mg/kg telesne težine, najmanje oko 750 mg/kg telesne težine, najmanje oko 3 mg/kg telesna težina, primenjuje se najmanje oko 5 mg/kg telesne težine, najmanje oko 10 mg/kg telesne težine.
[0216] Ostali režimi doziranja mogu se predvideti u proračunima Područje Telesne Površine (Body Surface Area (BSA)), kako je otkriveno u U.S.P.Br.7,744,877. Kao što je dobro poznato u struci, BSA se izračunava na osnovu visine i težine pacijenta i pruža meru veličine subjekta predstavljene površinom njegovog tela. U odabranim slučajevima pronalaska pomoću BSA, modulatori se mogu primenjivati u dozama od 10 mg/m<2>do 800 mg/m<2>. U drugim poželjnim slučajevima, modulatori će se primenjivati u dozama od 50 mg/m<2>do 500 mg/m<2>, a još poželjnije u dozama od 100 mg/m<2>, 150 mg/m<2>, 200 mg/m<2>, 250 mg/m<2>, 300 mg/m<2>, 350 mg/m<2>, 400 mg/m<2>ili 450 mg/m<2>. Naravno da će se uvažiti da, bez obzira na to kako se doze računaju, višestruke doze se mogu davati tokom izabranog vremenskog perioda da bi se dobila apsolutna doza koja je znatno veća od pojedinačne primene.
[0217] U svakom slučaju, PTK7 modulatori se poželjno daju prema potrebi subjekata kojima je to potrebno. Utvrđivanje učestalosti davanja mogu izvršiti osobe koje su vešti u ovoj oblasti, kao što je lekar na osnovu razmatranja stanja koje se leči, starosti subjekta koji se leči, težine stanja koje se leči, opšteg zdravstvenog stanja subjekta koji se leči i slično.
Uopšteno, efektivna doza PTK7 modulatora se daje subjektu jednom ili više puta. Preciznije, efikasna doza modulatora daje se subjektu jednom mesečno, više od jednom mesečno ili manje od jednom mesečno. U određenim slučajevima, efektivna doza PTK7 modulatora može se primenjivati više puta, uključujući period od najmanje mesec dana, najmanje šest meseci ili najmanje godinu dana. U drugim slučajevima, nekoliko dana (2, 3, 4, 5, 6 ili 7), nekoliko nedelja (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) ili nekoliko meseci (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) može proći između administracije otkrivenih modulatora.
[0218] Doze i režimi mogu se takođe odrediti empirijski za otkrivene terapeutske kompozicije kod pojedinaca kojima je data jedna ili više primena. Na primer, pojedincima se mogu dati inkrementalne doze terapijske kompozicije proizvedenog kako je ovde opisano. Da bi se procenila efikasnost izabrane kompozicije, može se pratiti marker određene bolesti, poremećaja ili stanja kako je prethodno opisano. U slučajevima kada pojedinac ima rak, to uključuje direktno merenje veličine tumora palpacijom ili vizuelnim posmatranjem, indirektno merenje veličine tumora rendgenom ili drugim tehnikama snimanja; poboljšanje procenjeno direktnom biopsijom tumora i mikroskopskim ispitivanjem uzorka tumora; merenje indirektnog tumorskog markera (npr., PSA za rak prostate) ili antigena identifikovanog prema ovde opisanim metodama, smanjenje bola ili paralize; poboljšani govor, vid, disanje ili druge smetnje povezane sa tumorom; povećan apetit; ili povećanje kvaliteta života mereno prihvaćenim testovima ili produženjem preživljavanja. Stručnjaku će biti očigledno da će doziranje varirati u zavisnosti od osobe, vrste neoplastičnog stanja, stadija neoplastičnog
1
stanja, da li je neoplastično stanje počelo da metastazira na drugu lokaciju kod pojedinca i prošli i istodobni tretmani koji se koriste.
c. Kombinovane terapije
[0219] Kombinovane terapije predviđene pronalaskom mogu biti naročito korisne u smanjenju ili inhibiciji neželjene proliferacije neoplastičnih ćelija (npr., endotelne ćelije), smanjenju pojave raka, smanjenju ili sprečavanju ponovnog pojave raka ili smanjenju ili sprečavanju širenja ili metastaziranja karcinoma. U takvim slučajevima jedinjenja predmetnog pronalaska mogu funkcionisati kao senzibilizirajući ili hemosenzibilizujući agensi uklanjanjem TPC i održavanjem tumorske mase (npr., NTG ćelije) i omogućavaju efikasniju upotrebu sadašnjih standarda za uklanjanje debljine ili sredstava protiv raka. Odnosno, kombinovana terapija koja sadrži PTK7 modulator i jedan ili više agenasa protiv raka može se koristiti za smanjenje utvrđenog karcinoma, npr., smanjenje broja prisutnih ćelija karcinoma i/ili smanjenje opterećenja tumora, ili ublažavanje najmanje jedne manifestacije ili neželjenog efekta raka. Kao takva, kombinovana terapija se odnosi na primenu PTK7 modulatora i jednog ili više agenasa protiv raka koja uključuje, ali nije ograničena na, citotoksične agense, citostatike, hemoterapeutske agense, ciljane agense protiv raka, modifikatore biološkog odgovora, imunoterapeutske agense, vakcine protiv raka, antiangiogeni agense, citokini, hormonske terapije, terapija zračenjem i antimetastatički agense.
[0220] Prema prema postupcima predmentog pronalaska, nema zahteva da kombinovani rezultati dodaju efekte opažene kada se svako lečenje (npr., anti-PTK7 antitelo i agens protiv raka) sprovodi odvojeno. Iako su barem poželjni aditivni efekti, svako pojačano antitumorsko dejstvo iznad jedne od pojedinačnih terapija je korisno. Pored toga, pronalazak ne zahteva kombinovano lečenje da bi pokazao sinergističke efekte. Međutim, stručnjaci iz ove oblasti shvatiće da se kod određenih odabranih kombinacija koje sadrže poželjna ostvarenja može uočiti sinergizam.
[0221] Za praktikovanje kombinovane terapije u skladu sa pronalaskom, PTK7 modulator (npr., anti-PTK7 antitelo) u kombinaciji sa jednim ili više agenasa protiv raka može se primeniti kod subjekta kome je to potrebno na način efikasan da rezultira antikancerogenom aktivnošću u okviru subjekta. PTK7 modulator i agens protiv raka su obezbeđeni u količinama efikasnim i vremenski efikasnim, što rezultira njihovim kombinovanim prisustvom i njihovim kombiniranim delovanjem u tumorskom okruženju po želji. Da bi se postigao ovaj cilj, PTK7 modulator i agens protiv raka mogu se davati subjektu istovremeno, ili u
2
pojedinačnoj kompoziciji, ili u dve ili više različitih kompozicija koristeći isti ili različiti način primene.
[0222] Alternativno, modulator može prethoditi ili slediti lečenje antikancerogenim agensom, na primer, intervalima koji se kreću od minuta do nedelja. U određenim slučajevima kada se agens protiv raka i antitelo primenjuju odvojeno na subjekta, vremenski period između vremena svakog davanja je takav da agens protiv raka i modulator mogu da izvrše kombinovani efekat na tumor. U posebnom slučaju, predviđa se da se i agens protiv raka i PTK7 modulator primenjuju unutar otprilike 5 minuta do oko dve nedelje.
[0223] U drugim slučajevima, nekoliko dana (2, 3, 4, 5, 6 ili 7), nekoliko nedelja (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) ili nekoliko meseci (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) mogu proći između davanja modulatora i agensa protiv raka. PTK7 modulator i jedan ili više agenasa protiv raka (kombinovana terapija) mogu se primenjivati jednom, dva puta ili bar u vremenskom periodu dok se stanje ne leči, ublaži ili izleči. Poželjno je da se kombinovana terapija primenjuje više puta.
Kombinovana terapija može se primenjivati od tri puta dnevno do jednom u šest meseci. Davanje može biti prema rasporedu, kao što su tri puta dnevno, dva puta dnevno, jednom dnevno, jednom svaka dva dana, jednom svaka tri dana, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u mesecu, jednom u dva meseca, jednom u tri meseca , jednom na šest meseci ili se može primenjivati kontinuirano putem mini pumpe. Kao što je prethodno naznačeno, kombinovana terapija se može primenjivati oralnim, sluzničnim, bukalnim, intranazalnim, inhalacijskim, intravenskim, potkožnim, intramuskularnim, parenteralnim, intratumornim ili topikalnim putem. Kombinovana terapija se može primeniti na mestu udaljenom od mesta tumora. Kombinovana terapija će se primenjivati sve dok je tumor prisutan pod uslovom da kombinovana terapija uzrokuje da tumor ili rak prestanu da rastu ili da smanje težinu ili zapreminu.
[0224] U jednom slučaju, PTK7 modulator se daje u kombinaciji sa jednim ili više lekova protiv raka, za kratak ciklus lečenja subjekta kome je potrebno. Trajanje lečenja antitelom može varirati u zavisnosti od određenog agensa protiv raka koji se koristi. Pronalazak takođe podrazumeva prekidnu primenu ili dnevne doze podeljene u nekoliko delimičnih primena. Stručnjak će ceniti odgovarajuće vreme lečenja za određeni agens protiv raka, a pronalazak predviđa kontinuiranu procenu optimalnih rasporeda lečenja za svaki agens protiv raka.
[0225] Ova pronalazak razmatra najmanje jedan ciklus, poželjno više od jednog ciklusa tokom kojeg se primenjuje kombinovana terapija. Kvalifikovani stručnjak će proceniti odgovarajući vremenski period za jedan ciklus, kao i ukupan broj ciklusa i interval između ciklusa. Pronalazak predviđa kontinuiranu procenu optimalnih rasporeda lečenja za svaki modulator i agens protiv raka. Štaviše, pronalazak takođe predviđa više od jedne primene ili antitela na PTK7 ili agensa protiv raka. Modulator i agens protiv raka mogu se davati naizmenično, naizmenično u danima ili nedeljama; ili se može dati sekvenca lečenja antitelima, praćena jednim ili više lečenja terapijom agensa protiv raka. U svakom slučaju, kao što će razumeti stručnjaci sa uobičajenim veštinama, odgovarajuće doze hemoterapeutika će biti uglavnom oko onih koji su već primenjeni u kliničkim terapijama gde se hemoterapeutici daju sami ili u kombinaciji sa drugim hemoterapeuticima.
[0226] U drugom poželjnom slučaju, PTK7 modulatori predmetnog pronalaska mogu se koristiti u terapiji održavanja kako bi se smanjila ili eliminisala šansa za recidiv tumora nakon početne prezentacije bolesti. Poželjno je da se poremećaj leči i da se početna masa tumora eliminiše, smanji ili na neki drugi način poboljša, tako da je pacijent asimptomatski ili u remisiji. U tom trenutku subjektu se mogu dati farmaceutski efikasne količine otkrivenih modulatora jedan ili više puta, iako je malo ili uopšte nema naznaka bolesti korišćenjem standardnih dijagnostičkih postupaka. U nekim slučajevima efektori će se primenjivati po redovnom rasporedu tokom određenog vremenskog perioda. Na primer, PTK7 modulatori mogu se primenjivati nedeljno, svake dve nedelje, mesečno, svaka šest nedelja, svaka dva meseca, svaka tri meseca svaka šest meseci ili godišnje. S obzirom na ovde data učenja, stručnjak u ovoj oblasti mogao je lako da odredi povoljne doze i režime doziranja kako bi smanjio potencijal recidiva bolesti. Štaviše, takvi tretmani mogu se nastaviti tokom nedelja, meseci, godina ili čak neograničeno, u zavisnosti od odgovora pacijenta i kliničkih i dijagnostičkih parametara.
[0227] U još jednom poželjnom primeru, modulatori predmetnog pronalaska mogu se upotrebiti za profilaktičku sprečavanje ili smanjenje mogućnosti metastaziranja tumora posle postupka izlaganja. Kako se koristi u predmetnom pronalasku, postupak uklanjanja debljine je široko definisan i podrazumeva svaki postupak, tehniku ili metodu koji eliminiše, smanjuje, leči ili poboljšava tumor ili proliferaciju tumora. Primerni postupci uklanjanja debljine uključuju, ali nisu ograničeni na, hiruršku intervenciju, tretmane zračenjem (odn., zračenje zrakom), hemoterapiju ili ablaciju. U odgovarajuće vreme koje lako odredi stručnjak u pogledu predmetnog pronalaska, PTK7 modulatori se mogu primeniti na način koji predlažu klinički i dijagnostički ili terapeutski postupci za smanjenje metastaza tumora. Modulatori se mogu davati jedan ili više puta u farmaceutski efikasnim dozama kako je određeno korišćenjem standardnih tehnika. Poželjno je da režim doziranja bude praćen odgovarajućim dijagnostičkim ili nadzornim tehnikama koje omogućavaju da se po potrebi modifikuje.
4
d. Agensi protiv raka
[0228] Kao što je ovde korišćeno, pojam agens protiv raka označava bilo koji agens koji se može koristiti za lečenje ćelijskog proliferativnog poremećaja kao što je rak, uključujući citotoksične agense, citostatične agense, anti-angiogene agense, agense za debulking, hemoterapeutske agense, radioterapiju i radioterapijske agense, ciljani agensi protiv raka, modifikatori biološkog odgovora, antitela i imunoterapijske agense. Biće poznato da, u odabranim slučajevima kao što je gore navedeno, antikancerogeni agensi mogu da sadrže konjugate i mogu da budu povezana sa modulatorima pre primene.
[0229] Izraz citotoksični agens označava supstancu koja smanjuje ili inhibira funkciju ćelija i/ili uzrokuje uništavanje ćelija, odn. supstanca je toksična za ćelije. Obično, supstanca je prirodni molekul dobijen iz živog organizma. Primeri citotoksičnih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na toksine malih molekula ili enzimski aktivne toksine bakterija (npr., toksin difterije, endotoksin pseudoomonasa i egzotoksin, stafilokokni enterotoksin A), gljive (npr., Į-sarcin, restriktocin), biljke (npr., abrin, ricin, modecin, viscumin, antivirusni protein vinobojke, saporin, gelonin, momoridin, trihosantin, toksin ječma, proteini Aleurites fordii, proteini diantina, proteini Phitolacca mericana (PAPI, PAPII i PAP-S), Momordica charantia inhibitor, kurcin, krotin, inhibitor saponaria officinalis, gelonin, mitegelin, restocin, fenomicin, neomicin i trikoteceni) ili životinje, npr., citotoksične RNaze, kao što su ekstraćelijske pankreasne RNaze; DNaza I, uključujući fragmente i/ili njihove varijante.
[0230] Hemoterapeutski agens označava hemijsko jedinjenje koje nespecifično smanjuje ili inhibira rast, proliferaciju i/ili preživljavanje ćelija karcinoma (npr., citotoksični ili citostatski agensi). Takvi hemijski agensi su često usmerena na intraćelijske procese neophodne za rast ili podelu ćelija, i stoga su posebno efikasna protiv ćelija karcinoma, koje generalno brzo rastu i dele se. Na primer, vinkristin depolimeriše mikrotubule i na taj način sprečava ćelije da uđu u mitozu. Uopšteno, hemoterapeutski agensi mogu da uključe bilo koji hemijski agens koji inhibira ili je konstruisano da inhibira kancerogenu ćeliju ili ćeliju koja će verovatno postati kancerogena ili generisati tumorogeno potomstvo (npr. TIC). Takvi agensi se često daju, a često su najefikasnija u kombinaciji, npr., u formulaciji CHOP.
[0231] Primeri agenasa protiv raka koji se mogu koristiti u kombinaciji sa (ili konjugovani sa) modulatorima predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, alkilacione agense, alkil sulfonate, aziridine, etilenimine i metilamelamine, acetogenine, kamptotecin, briostatin, calistatin, CC-1065, kriptoficine, dolastatin, duocarmicin, eleuterobin, pankratistatin, sarkodictiin, spongistatin, nitrogen mustarde, antibiotike, enedin antibiotike, dinemicin, bisfosfonate, esperamicin, hromoprotein enedin antiobiotik hromofore, aklacinomisins, actinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicinie, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, Adriamycin® doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicine, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, potfiromicin, puromicin, helamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite, analoge folne kiseline, analoge purina, androgene, anti-adrenale, dopunjivače folne kiseline kao što je frolinska kislina, aceglaton, aldofosfamid glikozid, aminolevulinska kiselina, eniluracil, amsacrin, bestrabucil, bisantren, edatraksat, defofamin, demecolcin, diazihon, elfornitin, eliptinium acetat, epotilon, etoglucid, galijum nitrat, hidroksiurea, lentinan, lonidainin, maitansinoide, mitoguazon, mitoksantron, mopidanmol, nitraerin, pentostatin, fenamet, pirarubicin, losoksantron, podofillinska kiselina, 2- etilhidrazid, prokarbazin, PSK® polisaharid kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR), razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazihon; 2,2’,2"-trihlorotrietilamin; trihoteceni (naročito T-2 toksin, veracurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindesin; dacarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitosin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoide, hloranbucil; Gemzar® gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analoge platinuma, vinblastin; platinum; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vincristin; NAVELBINE® vinorelbin; novantron; teniposid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibandronat; irinotekan (Camptosar, CPT-11), topoizomeraza inhibitor RFS 2000; difluorometlilornitin (DMFO); retinoide; capecitabin; kombretastatin; leucovorin (LV); oksaliplatin; inhibitore PKCalpha, Raf, H-Ras, EGFR i VEGF-A koji smanjuju ćelijsku proliferaciju i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kog gore navedenog. Takođe u ovu definiciju su uključeni anti-hormonalni agensi koji deluju tako da regulišu ili inhibiraju hormonsko dejstvo na tumore kao što je anti-estrogeni i selektivni estrogen receptor modulatori (SERMs), inhibitori aromataze koji inhibiraju enzim aromataze, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnoj žlezdi, i anti-androgeni; kao i troksacitabin (1,3- dioksolan nukleozid citozin analog); antisensni oligonukleotidi; ribozomi kao što su VEGF ekspresioni inhibitor i HER2 ekspresioni inhibitor; vakcine, PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® topoizomerazni 1 inhibitor; ABARELIX® rmRH; Vinorelbine i Esperamicins i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog gore navedenog. Drugi slučajevi obuhvataju primenu imunoterapeutskih agenasa, kao što su antitela, odobreni za lečenje kancera, uključujući, ali nisu ograničeni na, rituksimab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamcin, alemtuzumab, ibritumomab tiuksetan, tositumomab, bevacizumab, cetuksimab, patitumumab, ofatumumab, ipilimumab i brentuksimab vedotin. Oni koji poznaju ovu oblast biće u stanju da lako identifikuju dodatne lekove protiv raka koji su kompatibilni sa ovde navedenim učenjem.
e. Terapija zračenjem
[0232] Predmetni pronalazak takođe predviđa kombinaciju PTK7 modulatora sa radioterapijom (odn., bilo koji mehanizam za lokalno indukovanje oštećenja DNK u ćelijama tumora, poput gama-zračenja, X-zraka, UV zračenja, mikrotalasa, elektronskih emisija i slično). Takođe se razmatra kombinovana terapija koja koristi usmerenu isporuku radioizotopa u ćelije tumora i može se koristiti u vezi sa ciljanim agensom protiv raka ili drugim agensima za ciljanje. Obično, terapija zračenjem se primenjuje u impulsima tokom perioda od oko 1 do oko 2 nedelje. Terapija zračenjem može se primenjivati kod osoba koje imaju rak glave i vrata oko 6 do 7 nedelja. Opciono, terapija zračenjem može se primenjivati kao pojedinačna doza ili u višestrukim, sekvencijalnim dozama.
f. Neoplastična stanja
[0233] Bez obzira da li se daju sami ili u kombinaciji sa agensima protiv raka ili radioterapijom, PTK7 modulatori predmetnog pronalaska su posebno korisni za opšte lečenje neoplastičnih stanja kod pacijenata ili subjekata koji mogu uključivati benigne ili maligne tumore (npr., bubrege, jetru, bubrege, bešike, dojke, želuca, jajnika, kolorektalne, prostate, pankreasa, pluća, štitaste žlezde, karcinoma jetre; sarkoma; glioblastoma; i raznih tumora glave i vrata); leukemije i limfoidni maligniteti; drugi poremećaji poput neuronskih, glijalnih, astrocitalnih, hipotalamičkih i drugih žlezdanih, makrofagalnih, epitelnih, stromalnih i blastokoeličnih poremećaja; i inflamatorni, angiogeni, imunološki poremećaji i poremećaji uzrokovani patogenima. Naročito poželjni ciljevi za lečenje terapijskim kompozicijama i postupcima predmetnog pronalaska su neoplastični uslovi koji sadrže čvrste tumore. U drugim poželjnim slučajevima, modulatori predmetnog pronalaska mogu se koristiti za dijagnozu, prevenciju ili lečenje hematoloških malignih oboljenja. Poželjno je da subjekat ili pacijent koji će se lečiti bude čovek, iako se, kako se ovde koristi, izrazi izričito drže da obuhvataju bilo koju vrstu sisara.
[0234] Preciznije, neoplastični uslovi koji se leče u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se odabrati iz grupe koja uključuje, ali nije ograničena na, tumore nadbubrežne žlezde, rak povezan sa AIDS, sarkom mekog dela mekog dela, astrocitne tumore, rak bešike (karcinom skvamoznih ćelija) i prelazni karcinom), rak kostiju (adamantinoma, aneurizmalne ciste kostiju, osteohondrom, osteosarkom), rak mozga i kičmene moždine, metastatski tumori mozga, rak dojke, tumori karotidnog tela, rak grlića materice, hondrosarkom, kordom, hromofobni karcinom bubrežnih ćelija, bistri karcinom ćelija, karcinom debelog creva, kolorektalni karcinom, kožni benigni fibrozni histiocitomi, desmoplastični tumori malih okruglih ćelija, ependimomi, Evingovi tumori, ekstraskeletni miksoidni hondrosarkom, fibrogeneza imperfekta kalijum, vlaknasta displazija kostiju, žučna kesa i žučni duktalni karcinom ćelijski tumori, karcinom glave i vrata, tumori ćelijskih otočLća, Kaposijev Sarcoma, bubreg rak (nefroblastoma, papilarni karcinom bubrežnih ćelija), leukemije, lipomi / benigni lipomatozni tumori, liposarkom / maligni lipomatozni tumori, rak jetre (hepatoblastoma, hepatocelularni karcinom), limfomi, karcinomi pluća (karcinom malih ćelija, karcinom velikih ćelija, karcinom velikih ćelija karcinom itd.), meduloblastom, melanom, meningiomi, multipla endokrina neoplazija, multipli mijelom, mijelodisplastični sindrom, neuroblastom, neuroendokrini tumori, rak jajnika, karcinomi pankreasa, papilarni karcinomi štitaste žlezde, paratiroidni tumori, dečiji rak, tumori perifernog nervnog nervnog obloga, phaeoma, phaeo tumori, rak prostate, postepeni otkriveni melanom, retki hematološki poremećaji, bubrežni metastatski rak, rabdoidni tumor, rabdomisarkom, sarkomi, rak kože, sarkomi mekih tkiva, skvamozni ćelijski karcinom, rak želuca, sinovijalni sarkom, rak testisa, karcinom timusa, timom, metastatski karcinom štitaste žlezde i rak materice (karcinom grlića materice, endometr ial karcinom i leiomiom). U određenim poželjnim rešenjima, ćelije raka su odabrane iz grupe čvrstih tumora, uključujući rak dojke, ne-sitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC), sitnoćelijski karcinom pluća, karcinom pankreasa, rak debelog creva, rak prostate, sarkome, bubrežni metastatski karcinom, metastatski karcinom štitne žlezde i bistri ćelijski karcinom.
[0235] Što se tiče hematoloških malignih oboljenja, dalje će se uvažiti da jedinjenja i postupci predmetnog pronalaska mogu biti posebno efikasni u lečenju različitih B-ćelijskih limfoma, uključujući limfom folikularnih ćelija niskog stepena/NHL (FCC), limfom plaštnih ćelija ( MCL), difuzni velikoćelijski limfom (DLCL), mali limfocitni (SL) NHL, srednji stepen/folikularni NHL, srednji stepen difuzni NHL, visokokvalitetni imunoblastični NHL, visoki stepen limfoblastičnog NHL, visoki stepen malih necepljenih ćelija NHL, glomazna bolest NHL, Valdenstromova makroglobulinemija, limfoplazmacitoidni limfom (LPL), limfom ćelijskih plašta (MCL), folikularni limfom (FL), difuzni limfom velikih ćelija (DLCL), limfom Burkitt (BL), limfomi povezani sa AIDS, monocitni limfom B ćelija, angioimunoblastična limfoadenopatija, mala limfocitna, folikularna, difuzna velika ćelija, difuzna mala cepana ćelija, velikoćelijski imunoblastični limfoblastom, mala, necepana, Burkittova i ne-Burkittova, folikularna, pretežno velika ćelija; folikularna, pretežno mala odcepljena ćelija; i folikularni, mešoviti mali odcepljeni i veliki ćelijski limfomi. Videti, Gaidono et al., "Lymphomas", IN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol.2: 2131-2145 (DeVita et al., eds., 5.sup.th ed.1997). Stručnjacima iz ove oblasti treba da bude jasno da će ovi limfomi često imati različita imena zbog promene sistema klasifikacije i da pacijenti koji imaju limfome klasifikovane pod različitim imenima mogu takođe imati koristi od kombinovanih terapijskih režima ovog pronalaska.
[0236] U još nekim poželjnim slučajevima, PTK7 modulatori se mogu koristiti za efikasno lečenje određenih mijeloidnih i hematoloških maligniteta, uključujući leukemije, kao što su hronična limfocitna leukemija (CLL ili B-CLL) ili akutna mijeloična leukemija AML. Takve leukemije su pretežno bolest starijih osoba koja počinje da raste u porastu nakon pedeset godina i dostiže vrhunac do kraja šezdesetih godina. CLL uglavnom uključuje proliferaciju neoplastičnih limfocita periferne krvi. Klinički nalaz CLL uključuje limfocitozu, limfadenopatlij, splenomegaliju, anemiju i trombocitopeniju. AML se naziva i akutna mijelogena leukemija, akutna mijeloblastna leukemija, akutna granulocitna leukemija i akutna nelimfocitna leukemija. Osnovna patofiziologija u AML sastoji se od sprečavanja sazrevanja ćelija koštane srži u najranijim fazama razvoja. U slučaju bilo kog od poremećaja, stručnjaci u ovoj oblasti mogu lako da izvuku režime lečenja s obzirom na predmetni pronalazak koristeći klinički prihvaćene postupke.
[0237] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje preventivno ili profilaktičko lečenje subjekata koji imaju benigne ili prekancerozne tumore. Ne veruje se da bilo koji određeni tip tumora ili neoplastičnog poremećaja treba izuzeti iz lečenja koristeći predmetni pronalazak. Međutim, vrsta tumorskih ćelija može biti relevantna za upotrebu pronalaska u kombinaciji sa sekundarnim terapijskim agensima, posebno hemoterapeutskim agensima i ciljanim agensima protiv raka.
[0238] Još drugi pogodni primeri predmetnog pronalaska obuhvataju upotrebu PTK7 modulatora za lečenje subjekata koji pate od čvrstih tumora. U takvim subjektima mnogi od ovih čvrstih tumora sadrže tkivo koje pokazuje različite genetske mutacije koje ih mogu Xčiniti posebno podložnim lečenju otkrivenim efektorima. Na primer, KRAS, APC i CTNNB1 i CDH1 mutacije su relativno česte kod pacijenata sa rakom debelog creva. Štaviše, pacijenti koji pate od tumora sa ovim mutacijama obično su najneotporniji na trenutne terapije; posebno oni pacijenti sa KRAS mutacijama. KRAS-aktivirajuće mutacije, koje obično rezultiraju zamenom pojedinačnih aminokiselina, takođe su uključene u druge teško lečive maligne bolesti, uključujući adenokarcinom pluća, mucinozni adenom i duktalni karcinom pankreasa.
[0239] Trenutno je najpouzdanije predviđanje da li će pacijenti sa rakom debelog creva odgovoriti na lekove koji inhibiraju EGFR ili VEGF, na primer, testiranje na određene KRAS „aktivirajuće“ mutacije. KRAS je mutiran u 35-45% karcinoma debelog creva, a pacijenti čiji tumori izražavaju mutirani KRAS ne reaguju dobro na ove lekove. Na primer, KRAS mutacije predviđaju nedostatak odgovora na terapiju panitumumabom i cetuksimabom kod raka debelog creva (Lievre et al. Cancer Res 66:3992-5; Karapetis et al. NEJM 359:1757-1765). Otprilike 85% pacijenata sa rakom debelog creva ima mutacije u genu APC (Markowitz & Bertagnolli. NEJM 361:2449-60), i više od 800 APC mutacija je okarakterisano kod pacijenata sa porodičnom adenomatoznom polipozom i rakom debelog creva. Većina ovih mutacija rezultira skraćenim APC proteinom sa smanjenom funkcionalnom sposobnošću da posreduje u uništavanju beta-katenina. Mutacije u genu beta-katenina, CTNNB1, takođe mogu rezultirati povećanom stabilizacijom proteina, što rezultira nuklearnim uvozom i naknadnom aktivacijom nekoliko onkogenih programa transkripcije, što je takođe mehanizam onkogeneze prouzrokovane neuspehom mutiranog APC da na odgovarajući način posreduje u beta-katenin uništavanje, što je potrebno da bi se održali programi normalne proliferacije i diferencijacije ćelija.
[0240] Gubitak ekspresije CDH1 (E-kadherin) je još jedna česta pojava kod kolorektalnog karcinoma, koja se često primećuje u naprednijim stadijumima bolesti. E-kadherin je centralni član adherinskih spojeva koji povezuju i organizuju ćelije u slojevima epitela.
Obično E-kadherin fizički izdvaja beta-katenin (CTNNB1) na plazma membrani; gubitak ekspresije E-kadherina u kolorektalnom karcinomu rezultira lokalizacijom beta-katenina u jezgru i transkripcionom aktivacijom puta beta-katenina/VNT. Aberantna beta-katenin/VNT signalizacija je od ključne važnosti za onkogenezu, a nuklearni beta-katenin je umešan u strogost raka (Schmalhofer et al., 2009 PMID 19153669). E-kadherin je potreban za ekspresiju i funkciju EphA2 poznatog partnera za vezivanje za PTK7 ligande u ćelijama epitela (Dodge Zantek et al., 1999 PMID 10511313; Orsulic S and Kemler R, 2000 PMID 10769210). Upotreba modulatora koji se vezuju za PTK7 ligande i agonije sa ili antagonizirajućim vezivanjem receptora može modifikovati, prekinuti ili poništiti proonkogene procese. Alternativno, PTK7 modulatori mogu preferencijalno da se vežu za ćelije tumora sa aberantnim PTK7 interakcijama na osnovu preferencija vezivanja PTK7 modulatora. Stoga pacijenti sa karcinomom koji imaju gore pomenute genetske osobine mogu imati koristi od lečenja pomenutim PTK7 modulatorima.
XIV. Artikli Proizvoda
[0241] Takođe su obezbeđena farmaceutska pakovanja i kompleti koji sadrže jedan ili više posuda, koji sadrže jednu ili više doza PTK7 modulatora. U određenim rešenjima, obezbeđena je jedinična doza u kojoj jedinična doza sadrži unapred određenu količinu smeše koja sadrži, na primer, anti-PTK7 antitelo, sa ili bez jednog ili više dodatnih agenasa.
Za druga rešenja, takva jedinična doza je isporučena u napunjenom špricu za injekciju za jednokratnu upotrebu. U još nekim rešenjima, kompozicija sadržana u jediničnoj dozi može sadržati fiziološki rastvor, saharozu ili slično; pufer, kao što je fosfat, ili slično; i/ili biti formulisani u stabilnom i efikasnom opsegu pH. Alternativno, u određenim rešenjima, kompozicija se može dobiti kao liofilizovani prah koji se može rekonstituisati dodavanjem odgovarajuće tečnosti, na primer, sterilne vode. U određenim poželjnim rešenjima, kompozicija sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju agregaciju proteina, uključujući, ali bez ograničenja, saharozu i arginin. Bilo koja etiketa na posudi, ili povezano sa njom, označava da se zatvorena kompozicija koristi za dijagnostikovanje ili lečenje stanja bolesti po izboru.
[0242] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplete za proizvodnju pojedinačnihdoznih ili višestrukih-doznih administrativnih jedinica PTK7 modulatora i, opciono, jednog ili više agenasa protiv raka. Komplet sadrži posudu i etiketu ili umetak pakovanja na ili povezan sa posudom. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, itd. Posude mogu da se formiraju od raznih materijala kao što su staklo ili plastika. U posudi se nalazi smeša koja je efikasna za lečenje stanja i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, posuda može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju). Takvi kompleti će uopšteno sadržati u pogodnoj posudi farmaceutski prihvatljivu formulaciju PTK7 modulatora i, opciono, jedan ili više agenasa protiv raka u istim ili različitim posudama. Kompleti mogu takođe sadržati druge farmaceutski prihvatljive formulacije, bilo za dijagnozu ili kombinovanu terapiju. Na primer, pored PTK7 modulatora pronalaska, takvi kompleti mogu sadržati bilo koji ili više opsega agenasa protiv raka kao što su hemoterapeutski ili radioterapeutski lekovi; anti-angiogeni agensi; antimetastatski agenasi; ciljani agensi protiv raka; citotoksični agensi; i/ili drugi agensi protiv raka. Takvi kompleti takođe mogu da obezbede odgovarajuće reagense za konjugaciju PTK7 modulatora sa antikancerogenim agensom ili dijagnostičkim agensom (npr., videti U.S.P.Br.7,422,739).
[0243] Preciznije, kompleti mogu imati jednu posudu koja sadrži PTK7 modulator, sa ili bez dodatnih komponenti, ili mogu imati različite posude za svaki željeni agens. Tamo gde su kombinovani terapeuti predviđeni za konjugaciju, jedan rastvor može biti prethodno pomešan, bilo u molarnoj ekvivalentnoj kombinaciji, bilo sa jednom komponentom koja prelazi drugu. Alternativno, PTK7 modulator i bilo koji opcioni agens protiv raka u kompletu mogu se držati odvojeno u različitim kontejnerima pre administracije pacijentu. Kompleti mogu takođe sadržati drugu/treću posudu za sadržanje sterilnog, farmaceutski prihvatljivog
1
pufera ili drugog razblaživača, poput bakteriostatske vode za injekcije (BVFI), fiziološkog rastvora pufernog fosfatom (PBS), Ringerovog rastvora i rastvora dekstroze.
[0244] Kada su komponente kompleta obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, tečni rastvor je poželjno vodeni rastvor, pri čemu je posebno poželjan sterilni vodeni rastvor. Međutim, komponente kompleta mogu biti u obliku sušenog praha. Kada su reagensi ili komponente obezbeđeni u obliku suvog praha, prah se može rekonstituisati dodatkom odgovarajućeg rastvarača. Predviđeno je da se rastvarač može obezbediti i u drugoj posudi.
[0245] Kao što je ukratko naznačeno gore, kompleti mogu takođe da sadrže sredstvo kojim se antitelo i bilo koja opcionalna komponenta daju životinji ili pacijentu, npr., jedna ili više igala ili šprica, ili čak kapaljka, pipeta ili druga slična naprava, iz koje se formulacija može ubrizgati ili uvesti u životinju ili naneti na bolesno područje tela. Kompleti predmetnog pronalaska takođe će obično uključivati sredstva za držanje bočica ili slično i druge komponente u neposrednoj blizini za komercijalnu prodaju, kao što su, npr., injekcione ili presovane plastične posude u koje se želje bočice i drugi aparati postavljaju i zadržavaju. Bilo koja etiketa ili uložak pakovanja ukazuje da se kompozicija PTK7 modulatora koristi za lečenje karcinoma, na primer raka debelog creva.
[0246] U drugim poželjnim slučajevima, modulatori predmetnog pronalaska mogu se koristiti zajedno sa dijagnostičkim ili terapijskim uređajima korisnim u dijagnostici ili lečenju proliferativnih poremećaja ili ih sadrže. Na primer, u poželjnom slučaju, jedinjenja i kompozicije predmetnog pronalaska mogu se kombinovati sa određenim dijagnostičkim uređajima ili instrumentima koji se mogu koristiti za otkrivanje, nadgledanje, kvantifikovanje ili profilisanje ćelija ili obeležavanje jedinjenja koja su uključena u etiologiju ili manifestaciju proliferativnih poremećaja. U posebno poželjnim slučajevima uređaji se mogu koristiti za otkrivanje, nadgledanje i/ili kvantifikovanje cirkulišućih tumorskih ćelija bilo in vivo ili in vitro (videti, na primer, WO 2012/0128801).
[0247] U još nekim poželjnim rešenjima, i kao što je gore diskutovano, tumorske ćelije koje cirkulišu mogu sadržati matične ćelije raka.
XV. Istraživački Reagensi
[0248] Drugi poželjni slučajevi pronalaska takođe koriste svojstva otkrivenih modulatora kao instrumenta korisnog za identifikovanje, izolovanje, sekcionisanje ili obogaćivanje populacija ili podpopulacija ćelija koje iniciraju tumor kroz metode kao što su protočna citometrija,
2
fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija (FACS), magnetno aktivirano sortiranje ćelija (MACS) ili laserski posredovano sečenje. Stručnjaci u ovoj oblasti shvatiće da se modulatori mogu koristiti u nekoliko kompatibilnih tehnika za karakterizaciju i manipulaciju TIC-om, uključujući matične ćelije karcinoma (npr., videti U.S.S.Ns.12/686,359, 12/669,136 i 12/757,649).
XVI. Ostalo
[0249] Ako ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički izrazi koji se koriste u vezi sa predmetnim pronalaskom imaće značenja koja obično razumeju oni koji imaju uobičajenu praksu u tehnici. Dalje, osim ako kontekstom nije drugačije određeno, pojmovi u jednini uključuju množinu, a pojmovi u množini uključuju jedninu. Preciznije, kako se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici jednine "a", "an" i "the" uključuju množinske reference, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca koja se odnosi na „a protein“ uključuje mnoštvo proteina; Pojam "a ćelija" uključuje mešavine ćelija, i slično. Pored toga, opsezi dati u opisu i priloženim zahtevima uključuju i krajnje tačke i sve tačke između krajnjih tačaka. Stoga, opseg od 2.0 do 3.0 uključuje 2.0, 3.0 i sve tačke između 2.0 i 3.0.
[0250] Uopšteno, nomenklatura koja se koristi u vezi sa tehnikama i ćelijskom kulturom, molekularnom biologijom, imunologijom, mikrobiologijom, genetikom i hemijom i hibridizacijom nukleinskih kiselina, kao što je ovde opisano, su one koje su dobro poznate i često se koriste u tehnici. Postupci i tehnike predmetnog pronalaska se uopšteno izvode prema konvencionalnim metodama dobro poznatim u tehnici i kako su opisane u raznim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane u kroz ceo predmetni opis, osim ako nije drugačije naznačeno. Videti, npr., Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002);
Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); and Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se izvode prema specifikacijama proizvođDča, što se obično izvodi u tehnici ili kako je ovde opisano. Nomenklatura koja se koristi u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije, i lekarske i farmaceutske hemije ovde opisane su one dobro poznate i najčešće korišćene u tehnici.
[0251] Štaviše, bilo koji odeljci ovde korišćeni su samo u organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje opisane teme.
PRIMERI
[0252] Predmetni pronalazak, ovako opšte opisan gore, lakše će se razumeti pozivanjem na sledeće primere koji su dati kao ilustracija i nisu namenjeni ograničavanju predmetnog pronalaska. Primeri nisu namenjeni predstavljanju da su eksperimenti u nastavku svi ili jedini izvedeni eksperimenti. Ako nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska težina je prosečna molekulska masa, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je u ili blizu atmosferskom.
Primer 1
Obogaćivanje ûelijskih Populacija koje Iniciraju Tumor
[0253] Da bi se okarakterisala ćelijska heterogenost čvrstih tumora kakvi postoje kod pacijenata sa rakom, razjašnjenje identiteta ćelija koje održavaju tumor (TPC; odn., matične ćelije raka: CSC) koristeći određene fenotipske markere i identifikacija klinički relevantnih terapijskih ciljeva, velika netradicionalna ksenograft (NTX) banka tumora je razvijena i održavana upotrebom tehnika priznatih u tehnici. Banka tumora NTX, koja se sastoji od velikog broja diskretnih ćelijskih linija tumora, razmnožavana je kod imunokompromitovanih miševa kroz više pasaža heterogenih tumorskih ćelija prvobitno dobijenih od brojnih pacijenata sa rakom koji su pogođeni raznim čvrstim malignim tumorima. Stalna dostupnost velikog broja diskretnih ranih prolaznih NTX tumorskih ćelijskih linija sa dobro definisanim linijama u velikoj meri olakšava identifikaciju i izolaciju TPC, jer omogućavaju reprodukovanu i ponovljenu karakterizaciju ćelija pročišćenih iz ćelijskih linija. Preciznije, izolovani ili prečišćeni TPC su najtačnije retrospektivno definisani u skladu sa njihovom sposobnošću da generišu fenotipski i morfološki heterogene tumore kod miševa koji rekapituliraju uzorak tumora pacijenta iz kojeg ćelije potiču. Prema tome, sposobnost korišćenja male populacije izolovanih ćelija za stvaranje potpuno heterogenih tumora kod miševa snažno ukazuje na činjenicu da izolovane ćelije sadrže TPC. U takvom radu upotreba minimalno prolaznih NTX ćelijskih linija u velikoj meri pojednostavljuje eksperimente in vivo i daje lako proverljive rezultate. Štaviše, NTX tumori u ranom prolazu takođe reaguju na terapijske agense kao što je irinotekan (odn. Camptosar®), koji pruža klinički važan uvid u osnovne mehanizme koji pokreću rast tumora, otpornost na trenutne terapije i recidiv tumora.
4
[0254] Kako su uspostavljene NTX ćelijske linije tumorskih ćelija, analizirani su fenotipovi tumorskih ćelija primenom protočne citometrije da bi se identifikovali diskretni markeri koji se mogu koristiti za karakterizaciju, izolovanje, prečišćavanje ili obogaćivanje ćelija koje iniciraju tumor (TIC) i odvajanje ili analiza TPC i TProg ćelija unutar takvih populacije. U vezi sa tim, pronalazači su koristili vlasničku platformu zasnovanu na platformi (odn. PhenoPrint™ Array) koja omogućava brzu karakterizaciju ćelija na osnovu ekspresije proteina i istovremenu identifikaciju potencijalno korisnih markera. PhenoPrint Arraiy je vlasnička proteomska platforma koja sadrži stotine diskretnih vezujućih molekula, mnogi dobijeni iz komercijalnih izvora, raspoređenih na ploči sa 96 bunarčLća, pri čemu svaki otvor sadrži različito antitelo u fluorescentnom kanalu ficoeritrina i više dodatnih antitela u različitim fluorohromima koji su raspoređeni u svim bunarima tanjir. Ovo omogućava određivanje nivoa ekspresije antigena od interesa u podpopulaciji odabranih tumorskih ćelija brzim uključivanjem relevantnih ćelija ili eliminacijom nerelevantnih ćelija putem nefikoeritrinskih kanala. Kada je PhenoPrint Array korišćen u kombinaciji sa tehnikama disocijacije, transplantacije i matičnih ćelija dobro poznatim u tehnici (Al-Hajj et al., 2004, Dalerba et al., 2007 and Dylla et al., 2008, all supra), bilo je moguće efikasno identifikovati relevantne markere i potom sa velikom efikasnošću izolovati i transplantirati specifične subpopulacije humanih tumorskih ćelija.
[0255] Shodno tome, uspostavljanjem različitih NTX ćelijskih linija tumora, što se uobičajeno radi kod humanih tumora kod miševa sa ozbiljnim kompromitovanim imunitetom, tumori su isečeni od miševa kada su dostigli 800 - 2.000 mm<3>, a ćelije su disocijalizovane u pojedinačne ćelijske suspenzije koristeći poznate tehnike enzimske digestije (Videti na primer U.S.P.Br.2007/0292414).
[0256] Podaci dobijeni iz ovih suspenzija primenom PhenoPrint Array pružaju i apsolutnu (po ćeliji) i relativnu (u odnosu na ostale ćelije u populaciji) površinsku ekspresiju proteina na bazi ćelije po ćeliji, što dovodi do složenije karakterizacije i stratifikacije ćelijskih populacija. Preciznije, upotreba PhenoPrint Array omogućila je brzu identifikaciju proteina ili markera koji su prospektivno razlikovali TIC ili TPC od masovnih NTG ćelija tumora i tumora stroma i, kada su izolovani od NTX tumorskih modela, omogućili su relativno brzu karakterizaciju podpopulacija tumorskih ćelija izražavajući različite nivoe specifičnih proteina na površini ćelija. Posebno, proteini sa heterogenom ekspresijom u populaciji tumorskih ćelija omogućavaju izolaciju i transplantaciju različitih, visoko očišćenih podpopulacija tumorskih ćelija koje eksprimiraju ili visoke i niske nivoe određenog proteina ili markera u miševima sa kompromitovanim imunološkim sistemom, olakšavajući procenu da li su TPC obogaćeni u jednoj ili drugoj podpopulaciji.
[0257] Izraz obogaćivanje koristi sinonimno sa izolovanjem ćelija i znači da je prinos (frakcija) ćelija jedne vrste povećan u odnosu na frakciju drugih vrsta ćelija u poređenju sa početnom ili početnom populacijom ćelija. Poželjno, obogaćivanje se odnosi na povećanje procenta za oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, za oko 50% ili više od 50% jedne vrste ćelije u populaciji ćelija, u poređenju sa početnom populacijom ćelija.
[0258] Ko što se ovde koristi, marker, u kontekstu ćelije ili tkiva, označava bilo koju karakteristiku u obliku hemijskog ili biološkog entiteta koja je identifikovana sa ili je posebno pronađena u ili na određenoj ćeliji, ćelijskoj populaciji ili tkivu, uključujući i one identifikovane u ili na populaciji tkiva ili ćelija zahvaćenom bolešću ili poremećajem. Kako se manifestuju, markeri mogu biti morfološke, funkcionalne ili biohemijske prirode. U poželjnim rešenjima, marker je ćelijski površinski antigen koji je različito ili preferirano izražen određenim tipovima ćelija (npr., TPC) ili ćelijama pod određenim uslovima (npr., tokom određenih tačaka životnog ciklusa ćelije ili ćelija u određenoj niši). Poželjno, takvi markeri su proteini, a još poželjnije poseduju epitop za antitela, aptamere ili druge molekule vezivanja koji su poznati u tehnici. Međutim, marker se može sastojati od bilo kog molekula koji se nalazi na površini ili unutar ćelije, uključujući, ali bez ograničenja, proteine (peptide i polipeptide), lipide, polisaharide, nukleinske kiseline i steroide. Primeri morfoloških karakteristika markera ili osobina uključuju, ali nisu ograničeni na, oblik, veličinu i odnos nuklearne i citoplazmatske mase. Primeri karakteristika ili osobina funkcionalnih markera uključuju, ali nisu ograničeni na, sposobnost prianjanja na određene podloge, sposobnost ugradnje ili izuzeća određenih boja, na primer, ali bez ograničenja na izuzeća lipofilnih boja, sposobnost migriranja pod određenim uslovima i sposobnost razlikovanja po određenim linijama. Markeri takođe mogu biti protein ekspresovan iz reporter gena, na primer reporter gen koji se ekspresuje u ćeliji kao rezultat uvođenja sekvence nukleinske kiseline koja kodira reporter gen u ćeliju i njegove transkripcije što rezultira proizvodnjom reporter proteina koji može se koristiti kao marker. Takvi reporter geni koji se mogu koristiti kao markeri su, na primer, ali bez ograničenja, enzimi fluorescentnih proteina, hromomerni proteini, geni rezistencije i slično.
[0259] U srodnom smislu, izraz fenotip markera u kontekstu tkiva, ćelije ili ćelijske populacije (npr., stabilni TPC fenotip) označava bilo koji marker ili kombinaciju markera koji se mogu koristiti za karakterizaciju, identifikaciju, odvajanje, izolovanje ili obogaćivanje određenog ćelija ili ćelijska populacija (npr., sa FACS). U specifičnim rešenjima, fenotip markera je fenotip površinske ćelije koji se može odrediti otkrivanjem ili identifikovanjem ekspresije kombinacije površinskih markera ćelije.
[0260] Stručnjaci u ovoj oblasti prepoznaće da su brojni markeri (ili njihovo odsustvo) povezani sa različitim populacijama matičnih ćelija karcinoma i da se koriste za izolovanje ili karakterizaciju podpopulacija tumorskih ćelija. U tom pogledu, primerni markeri matičnih ćelija raka obuhvataju OCT4, Nanog, STAT3, EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, transferrin receptor, JAM3, carboxypeptidase M, ADAM9, oncostatin M, Lgr5, Lgr6, CD324, CD325, nestin, Sox1, Bmi-1, eed, easyh1, easyh2, mf2, yy1, smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcEl, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WNT10B, WNT16, AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4) SLC7A8, IL1RAP, TEM8, TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A 11, PPAP2C, CAV1, CAV2, PTPN3, EPHA1, EPHA2, SLC1A1, CX3CL1, ADORA2A, MPZL1, FLJ10052, C4.4A, EDG3, RARRES1, TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1, IL1R1, OPN3, DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1, SLC19A2, ABCA1, PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB, LY6E, CELSR1, LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, ȕ-catenin, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, dekorin, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b, i CD49f. Videti, na primer, Schulenburg et al., 2010, PMID: 20185329, U.S.P.Br.7,632,678 i U.S.P.Br.2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 i 2011/0020221.
[0261] Biće zahvalno što su neki od ovih markera bili uključeni u gore opisan PhenoPrint Array.
[0262] Slično tome, neograničavajući primeri fenotipova ćelijske površine koji su povezani sa matičnim ćelijama raka određenih vrsta tumora obuhvataju CD44hiCD24low, ALDH+, CD133+, CD123+, CD34+CD38-, CD44+CD24-, CD46hiCD324+CD66c-, CD133+CD34+CD10-CD19-, CD138-CD34-CD19+, CD133+RC2+, CD44+Įȕ1 hiCD133+, CD44+CD24+ESA+, CD271+, ABCB5+ kao i drugepovršinske fenotipe matičnih ćelija raka koji su poznati u tehnici. Videti, na primer, Schulenburg et al., 2010, supra, Visvader et al., 2008, PMID: 18784658 i U.S.P.Br.2008/0138313.
[0263] Stručnjaci će razumeti da se fenotipovi markera, kao što su oni koji su prethodno navedeni, mogu koristiti zajedno sa standardnom protočnom citometrijskom analizom i tehnikama sortiranja ćelija za karakterizaciju, izolovanje, prečišćavanje ili obogaćivanje TIC i/ili TPC ćelija ili ćelijske populacije za dalju analizu. Interesantni u pogledu predmetnog pronalaska CD46, CD324 i, opciono, CD66c su ili visoko ili heterogeno ekspresovani na površini mnogih humanih kolorektalnih ("CR"), dojki ("BR"), ne-mailih ćelija pluća (NSCLC) , malih ćelija pluća (SCLC), pankreasa („PA“), prostate („PR“), bubrega („KDI“), melanoma („Mel“), jajnika („OV“) i raka glave i vrata („ HN ") tumorskih ćelija, bez obzira da li su uzorci tumora koji su analizirani primarni uzorci tumora pacijenta ili NTX tumori izvedeni iz pacijenta.
[0264] ûelije sa negativnom ekspresijom (odn., „-“) ovde su definisane kao one ćelije koje ekspresuju manje ili jednako 95. procentnu ekspresiju primećenu kod kontrolnog antitela izotipa u kanalu fluorescencije u prisustvu kompletnog obeležavanja koktela bojenjem antitela za druge proteine od interesa za dodatne kanale emisije fluorescencije. Stručnjaci u ovoj oblasti shvatiće da se ovaj postupak za definisanje negativnih događaja naziva "bojenje fluorescencijom minus jedan" ili "FMO". ûelije sa ekspresijom većom od 95. procentnom ekspresijom posmatranog antitela za kontrolu izotipa korišćenjem gore opisanog postupka bojenja FMO ovde su definisane kao „pozitivne“ (odn., Kao što je ovde definisano, postoje različite populacije ćelija koje se široko definišu kao „pozitivne“. Prvo, ćelije sa niskom ekspresijom (odn., "lo") generalno su definisane kao one ćelije sa posmatranom ekspresijom iznad 95. procenta koje se određuju korišćenjem FMO obojenja kontrolnim antitelom za izotip i unutar jedne standardne devijacije 95. procentne ekspresije posmatrane izotipskom kontrolom antitela koristeći gore opisani FMO postupak bojenja. ûelije sa "visokom" ekspresijom (odn. "hi") mogu se definisati kao one ćelije sa posmatranom ekspresijom iznad 95. procentne utvrđenom pomoću FMO bojenja sa izotipskim kontrolnim antitelom i većom od jedne standardne devijacije iznad 95. procentne ekspresije primećene kod izotipa kontrolisati antitela koristeći prethodno opisani postupak bojenja FMO. U drugim rešenjima 99. procentni se poželjno može koristiti kao tačka razgraničenja između negativnog i pozitivnog FMO bojenja, a u posebno poželjnim rešenjima procenat može biti veći od 99%.
[0265] Koristeći tehnike kao što su gore opisane za brzu identifikaciju i rangiranje antigena kolorektalnog tumora na osnovu intenziteta ekspresije i heterogenosti u nekoliko NTX tumora kod pacijenata sa kolorektalnim karcinomom, kandidatski TPC antigeni su dalje procenjeni upoređivanjem tumora sa normalnim susednim tkivom i zatim izabrani na osnovu, na najmanje delimično, na regulaciju nagore ili nadole određenog antigena u malignim ćelijama. Štaviše, sistematska analiza različitih markera na ćelijskoj površini radi njihove sposobnosti da se obogate za sposobnost transplantacije potpuno heterogenih tumora u miševe (odn., tumorogena sposobnost), a naknadna kombinacija ovih markera značajno je poboljšala rezoluciju metode i poboljšala sposobnost prilagoditi tehnike sortiranja ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS) radi identifikacije i karakterizacije izrazitih, visoko obogaćenih podpopulacija tumorskih ćelija koje su isključivo sadržale svu sposobnost stvaranja tumora nakon transplantacije (odn. ćelije koje iniciraju tumor).
[0266] Da ponovimo, termin ćelija koja inicira tumor (TIC) ili tumorogena (TG) ćelija obuhvata i tumorske perpetuirajuće ćelije (TPC; odn. matične ćelije raka) i visoko proliferativne tumorske progenitorne ćelije (TProg), koje zajedno uglavnom sadrže jedinstvenu podpopulaciju (odn.0.1 - 25%) bulk tumora ili mase; čije su karakteristike definisane gore. Većina tumorskih ćelija koje su okarakterisane na ovaj način su lišene ove sposobnosti stvaranja tumora, pa se stoga mogu okarakterisati kao ne-tumorogene (NTG). Iznenađujuće je primećeno da većina različitih markera identifikovanih korišćenjem vlasničkog PhenoPrint Array nije pokazala sposobnost obogaćivanja populacija ćelija koje iniciraju tumor u kolorektalnim tumorima pomoću standardnih FACS protokola, ali da bi se različite kombinacije markera mogle koristiti za identifikaciju dve podpopulacije ćelija koje iniciraju tumor: TPC i TProg. Stručnjaci u ovoj oblasti će prepoznati da je definitivna razlika između TPC i TProg, iako oba iniciraju tumor u primarnim transplantacijama, sposobnost TPC da neprekidno podstiče rast tumora nakon serijske transplantacije pri malom broju ćelija. Dalje, nije bilo poznato da su marker/proteini korišćeni u kombinaciji za obogaćivanje i za TPC i za TProg povezani sa ćelijama koje sadrže takvu aktivnost u bilo kom tkivu ili neoplazmi pre otkrića trenutnih pronalazača, mada su drugi definisali markere na ćelijskoj površini ili enzimsku aktivnost koja može slično. se koristi za obogaćivanje tumorskih ćelija (Dylla et al.2008, supra). Kao što je izloženo u nastavku, specifične podpopulacije tumorskih ćelija izolovane kombinacijama gore pomenutih kombinacija markera ćelijske površine su zatim analizirane korišćenjem celog transkriptoma sekvence sledeće generacije da bi se identifikovali i okarakterisali različito izraženi geni.
Primer 2
Izolacija i Analiza Uzoraka RNK iz Obogaćenih Tumora koji Iniciraju ûelijske Populacije
[0267] Utvrđena kolorektalna NTX linija tumora SCRX-CR4 je propuštena kao što je opisano u Primeru 1 i korišćena je za iniciranje tumora kod imunološki ugroženih miševa. Kada je prosečno opterećenje tumora dostiglo 300 m~m<3>, miševi su nasumično odabrani i tretirani sa 15 mg/kg irinotekana, 25 mg/kg gemcitabina, ili kontrolnim nosačem (PBS) dva puta nedeljno tokom perioda od najmanje dvadeset dana pre eutanazije. Tumori su zatim uklonjeni, a TPC, TProg i NTG ćelije, respektivno, su izolovane iz sveže resekovanih kolorektalnih NTX tumora i, slično, TG i NTG ćelije su izolovane iz tumora pankreasa NTX, uopšteno koristeći tehniku izloženu u Primeru 1. Tačnije, ćelijske populacije su izolovane sa FACS i odmah peletirane i lizirane u Qiagen RLTplus RNK puferu lizina (Qiagen, Inc.). Lizati su potom čuvani na -80 °C dok korišćenja. Po odmrzavanju, ukupna RNK je ekstrahovana pomoću izolacionog kompleta Qiagen RNeasi (Qiagen, Inc.) prema uputstvima prodavca i kvantifikovana na Nanodrop (Thermo Scientific) i Bioanalizer 2100 (Agilent Technologies) ponovo koristeći prodavčeve protokole i preporučena podešavanja instrumenta. Rezultujući ukupni RNK preparat bio je pogodan za genetsko sekvenciranje i analizu.
[0268] Ukupni uzorci RNK dobijeni iz odgovarajućih ćelijskih populacija izolovanih kao što je gore opisano iz miševa koji su tretirani nosačem ili hemoterapeutskim agensom su pripremljeni za celokupno sekvencioniranje sekvenci primenom Applied Biosistems SOLiD 3.0 (sekvenciranje pomoću Oligo ligacije/detekcije) platforme za sekvenciranje sledeće generacije (Life Technologies), počev od 5 ng ukupne RNK po uzorku. Podaci generisani na platformi SOLiD mapirali su 34.609 gena iz ljudskog genoma i uspeli su da otkriju PTK7, u nekoliko uzoraka.
[0269] Uopšteno, platforma za sekvenciranje sledeće generacije SOLiD3 omogućava paralelno sekvenciranje klonski amplifikovanih fragmenata RNK/DNK povezanih sa zrncima. Zatim se sekvencioniranje ligacijom sa obeleženom bojom oligonukleotida koristi za generisanje 50 baznih očitavanja svakog fragmenta koji postoji u uzorku sa ukupno većim od 50 miliona čitanja generišući mnogo tačniji prikaz ekspresije proteina u mRNK u genomu. Platforma SOLiD3 je u stanju da uhvati ne samo izraz, već SNPs, poznate i nepoznate alternativne događaje spajanja i potencijalno nova otkrića eksona zasnovana isključivo na pokrivenosti čitanja (očitavanja se mapiraju jedinstveno na genomske lokacije). Dakle, upotreba ove platforme sledeće generacije omogućila je utvrđivanje razlika u ekspresiji na nivou transkripta, kao i razlike ili preferencije za određene spojene varijante onih izraženih mRNK transkripata. Štaviše, analiza pomoću platforme SOLiD3 koja koristi modifikovani protokol celog transkriptoma iz Applied Biosystems zahtevala je samo približno 5 ng predamplifikacije početnog materijala. Ovo je značajno jer je ekstrakcija ukupne RNK iz sortiranih ćelijskih populacija gde je TPC podskup ćelija, na primer, znatno manji od broja the NTG ili zapreminskih tumora i time rezultira u vrlo malim količinama upotrebljivog polaznog materijala.
[0270] Duplikati sekvencioniranja podataka sa SOLiD3 platforme su normalizovani i transformisani i odnosi preklopa izračunati kao što je to uobičajena industrijska praksa. Kao što se vidi na FIG.2, nivoi ekspresije gena PTK7 (izraženi kao očitavanja na milion preslikanih u eksonima; RPM_ekson) izmereni su u odgovarajućim podpopulacijama
1
tumorskih ćelija SCRx-CR4. Analiza podataka pokazala je da je PTK7 bio regulisan na nivou transkripta između 2 - 4 preklopa preko populacije NTG, i 50 - 200% preko populacije TProg, kod miševa tretiranih nosačem, odnosno irinotekanom, respektivno.
[0271] Zapažanja koja su prethodno detaljisana pokazuju da je PTK7 ekspresija uopšteno povišena u TPC populacijama i sugeriše da PTK7 može igrati važnu ulogu u tumorigenezi i održavanju tumora, čineći tako zanimljiv cilj za imunoterapijske pristupe.
Primer 3
PCR Analiza u Realnom Vremenu PTK7 u Obogaćenom Tumoru koji je Iniciran ûelijskim Populacijama
[0272] Da bi se potvrdila diferencijalna ekspresija PTK7 uočena celim transkriptomskim sekvenciranjem u TPC populacijama naspram TProg i NTG ćelija kod raka debelog creva, i TG nasuprot NTG ćelijama kod karcinoma pankreasa, TaqMan® kvantitativni PCR u realnom vremenu korišćen je za merenje nivoa ekspresije gena u odgovarajućim populacijama ćelija izolovane od različitih NTX linija kao što je gore navedeno. Biće primljeno na znanje da takva PCR analiza u realnom vremenu omogućava direktnije i brže merenje nivoa ekspresije gena za diskretne ciljeve pomoću prajmera i skupova sondi specifičnih za određeni gen od interesa. TaqMan® kvantitativna PCR u realnom vremenu izvedena je na Applied Biosystems 7900HT Machine (Life Technologies), koja je korišćena za merenje PTK7 i PTK7 ekspresije gena u višestrukim populacijama ćelija NTX linija izvedenih od pacijenta i odgovarajućim kontrolama. Štaviše, analiza je sprovedena kako je navedeno u uputstvima isporučenim sa TaqMan Sistemom i koristeći komercijalno dostupne PTK7 i PTK7 setove prajmera/sonde (Life Technologies).
[0273] Kao što se vidi na FIG.3, sprovedeno je kvantitativno PCR ispitivanje ekspresije gena u realnom vremenu primenom NTG i TPC populacija izolovanih iz dve različite kolorektalne NTX tumorske linije (SCRX-CR4 i CR5) i linije tumora pankreasa (SCRX-PA3). Populacije TProg ćelija su takođe odvojene i analizirane na SCRk-CR4. Podaci izloženi na FIG.3 pokazuje da je PTK7 ekspresija gena povećana više nego dvostruko u kolorektalnom TPC, u poređenju sa NTG ćelijama iz istih tumora. PTK7 je takođe povišen više nego dvostruko u TPC kod miševa koji su lečeni irinotekanom i u populaciji TIC ćelija tumora pankreasa (npr. SCRx-PA3). Posmatranje povišene ekspresije PTK7 u NTX TPC preparatima u poređenju sa kontrolom NTG ćelija iz NTX tumora debelog creva i iz pankreasa, koristeći široko prihvaćenu metodologiju kvantitativnog PCR u realnom vremenu,
1 1
potvrđuje osetljivije podatke o sekvencioniranju celog transkriptoma SOLiD3 iz prethodnog Primera. Takvi nalazi dodatno podržavaju uočenu povezanost između nivoa ekspresije PTK7 i ćelija koje leže u osnovi tumorigeneze, rezistencije na terapiju i recidiva.
Primer 4
Ekspresija PTK7s u Nefrakcionisanim Uzorcima Kolorektalnog Tumora
[0274] U svetlu činjenice da je utvrđeno da je ekspresija gena PTK7 povišena u TPC populacijama iz kolorektalnih tumora u poređenju sa TProg i NTG ćelijama iz istih tumora, sprovedeni su eksperimenti da bi se utvrdilo da li je povišena ekspresija PTK7 takođe otkrivena u nefrakcionisanim uzorcima kolorektalnog tumora u odnosu na normalno susedno tkivo (NAT). Takođe su izvršena merenja da bi se utvrdilo kako se ekspresija PTK7 u tumorima poredi sa nivoima u normalnim uzorcima tkiva (NL).
[0275] Preciznije prilagođeni TumorScan qPCR (Origene Technologies) nizovi sa 384 bunarčXća koji sadrže 110 paciejntovih uzoraka tumora debelog creva u različitim fazama, normalno susedno tkivo, i 48 normalnih tkiva su konstruisani i proizvedeni upotrebom tehnika poznatih u tehnici. Koristeći procedure detaljno opisane u Primeru 3 i istim PTK7 specifičnim setovima prajmera/sondi, TaqMan® kvantitativni PCR u realnom vremenu je izveden u bunarčLćima prilagođenih ploča.
[0276] FIGS.E 4A i 4B prikazuju rezultate podataka o ekspresiji u grafičkom formatu normalizovanom u odnosu na srednju ekspresiju u normalnom tkivu debelog creva i rektuma. Tačnije, FIG.4A sumira podatke dobijene korišćenjem 168 uzoraka tkiva, dobijenih od 110 pacijenata sa rakom debelog creva u različitim fazama bolesti (I-IV), (od čega je 35 uzoraka tkiva normalno susedno (NAT) tkivo pacijenata sa rakom debelog creva) i 48 normalnih tkiva iz druge lokacije (NL tkivo). Na grafikonu su podaci iz svakog uzorka tkiva/pacijenta predstavljeni tačkom, a srednja geometrijska vrednost svake populacije označena na osi X predstavljena je linijom. Slično tome, FIG.4B sadrži podatke iz 24 uzorka kolorektalnog pacijenta koji se podudaraju dobijeni iz tumora (T) ili normalnog susednog tkiva (N) u različitim stadijumima bolesti (IIV). Ovde su ucrtani podaci predstavljeni na uzorku po uzorku sa vezom između odgovarajućeg tumora i normalnog susednog tkiva pojedinačnih pacijenata. Ekspresija PTK7 je očigledno veća u većini podudarnih tumora u odnosu na normalno susedno tkivo, a diferencijalna ekspresija u 3. i 4. fazi dostiže statističku značajnost (n 4, P 0.037).
1 2
[0277] Obe FIG.4A i 4B ukazuju da, u sve četiri predstavljene faze, je izražen nivo gena PTK7 povišen u većini kolorektalnih tumora i u odgovarajućim uzorcima tumora u odnosu na normalno susedno tkivo. Štaviše, srednja vrednost PTK7 ekspresije gena u bilo kojoj fazi karcinoma debelog creva izgleda da je povišena u odnosu na većinu normalnih tkiva koja su procenjena (FIG.4A). Ovi rezultati pokazuju da je ekspresija PTK7 povećana kod karcinoma debelog creva i, zajedno sa gornjim zapažanjima da je ekspresija PTK7 najveća u kolorektalnom TPC i TIC pankreasa, sugeriše da terapijsko ciljanje matičnih ćelija karcinoma koje eksprimiraju PTK7 može pružiti terapijsku korist pacijentima sa karcinomom.
Primer 5
Diferencijalna Ekspresija PTK7 u Primernim Uzorcima Tumora
[0278] Da bi se dalje procenila ekspresija gena PTK7 u dodatnim uzorcima tumora pacijenata sa kolorektalnim karcinomom i uzorcima tumora kod pacijenata kojima je dijagnostikovan 1 od 18 različitih tipova čvrstih tumora, Taqman® qRT-PCR je izveden pomoću TissueScan qPCR (Origene Technologies) nizova sa 384 bunarčLća, koji su bili fabrički prilagođeni kako je opisano u Primeru 4, ali uključujući uzorke čvrstih tumora iz osamnaest različitih vrsta tumora, a ne samo kolorektalne uzorke. Rezultati merenja su predstavljeni na FIGS.5A i 5B i pokazuju da je ekspresija gena PTK7 značajno povišena kod brojnih tipova čvrstih tumora.
[0279] S tim u vezi, FIGS.5A i 5B prikazuju relativni, odnosno apsolutni nivo ekspresije gena humanog PTK7 u celom uzorku tumora (sive tačke) ili odgovarajućem normalnom susednom tkivu (NAT; bele tačke) kod pacijenata sa jednim od osamnaest različitih tipova solidnih tumora. Na FIG.5A, podaci su normalizovani u odnosu na srednju vrednost ekspresije gena u NAT za svaki analizirani tip tumora. Na FIG.5B, apsolutna ekspresija PTK7 procenjena je u različitim tkivima/tumorima, pri čemu su podaci ucrtani kao broj ciklusa (Ct) potreban da bi se postigla eksponencijalna amplifikacija kvantitativnom PCR u realnom vremenu. Uzorcima koji nisu pojačani dodeljena je vrednost Ct od 45, što predstavlja poslednji ciklus pojačanja u eksperimentalnom protokolu. Svaka tačka predstavlja pojedinačni uzorak tkiva, a srednja vrednost je predstavljena crnom linijom.
[0280] Korišćenjem prilagođenog sklopljenog OriGene TissueScan niza, primećeno je da većina pacijenata kojima je dijagnostikovan rak debelog creva i većina pacijenata kojima je dijagnostikovan rak nadbubrežne žlezde, endometrijuma, jednjaka, jetre, štitaste žlezde i bešike ima značajno veću ekspresiju gena PTK7 u svojim tumorima u odnosu na NAT, što
1
sugeriše da bi PTK7 mogao igrati ulogu u tumorigenezi i/ili napredovanju tumora kod ovih tumora. Takođe je bilo podsetova pacijenata sa rakom pluća i prostate sa povišenom ekspresijom PTK7 u odnosu na NAT. Ono što je takođe bilo jasno iz ovih studija je da je ekspresija gena PTK7 uglavnom bila umerena u većini uzoraka NAT; sa najvećim izrazom zabeleženim u dojkama, grliću materice, jajnicima, pankreasu, testisima i bešici. Ponovo, ovi podaci sugerišu da je povišena ekspresija PTK7 indikativna i potencijalno dispozitivna u pogledu tumorigeneze ili perpetuacije tumora kod pacijenata sa odabranim hiperproliferativnim poremećajima.
Primer 6
Konstrukcija i Ekspresija PTK7 Imunogena
[0281] Da bi se generisali i okarakterisali određeni PTK7 modulatori u skladu sa predmetnim pronalaskom, konstruisana i ekspresovani su dva oblika PTK7 imunogena. U početku je komercijalni ekspresioni vektor, pCMV6-XL4-PTK7, kupljen od kompanije Origene, Inc. Potvrđena je sekvenca ORF pune dužine (podvučeni deo FIG.1A), a zatim subklonirana pomoću PCR na EcoRI i NotI mestima pCDH-EF1 -MCS-T2A-GFP lentivirusnog vektora (Szstem Biosciences). Ovaj lentivirusni vektor izražava protein PTK7 pune dužine spojen sa T2A ribosomskim preskočnim peptidom i GFP selektivnim markerom, omogućavajući multicistroničnu ekspresiju u transdukovanim ćelijama. Ovaj lentivirusni vektor je korišćen za transdukciju 293T ćelija ili BALB/c 3T3 ćelija prema standardnim protokolima. Pored toga, pCMV6-XL4-PTK7 je korišćen za privremenu ekspresiju proteina PTK7 na površini 293T ćelija 48 sati nakon transfekcije ćelija upotrebom polieteminina. Preparati membranske plazme su dobijeni od PTK7 ćelija koje previše eksprimiraju korišćenjem diferencijalnog centrifugiranja.
[0282] U drugim slučajevima, rastvorljivi PTK7 imunogeni su pripremljeni i ekspresovani pomoću ekspresionog vektora pEE12.4 (Lonza AG) u koji je deo PTK7 cDNA koji kodira ekstraćelijski domen (ECD) proteina, kodiran sekvencom označenom podvučenim amino kiselinama na FIG.1B). U prvom slučaju, ECD fragment je subkloniran u ramu nizvodno od IgK vodeće sekvence i uzvodno od 8xHis epitopske oznake (SEQ ID NO: 8). Rastvorljivi Hisoznačeni PTK7 ECD imunogen je proizveden privremenom transfekcijom CHO-KSV ćelija, a izlučeni protein prečišćen iz ćelijskog supernatanta primenom Ni-NTA smola i standardnih metoda (Qiagen Inc.). Pored gore pomenutog PTK7-ECD-His konstrukta, pripreme plazme i transfektovanih ćelija gore opisanih, takođe je generisan i eksprimiran Fc-PTK7-ECD konstrukt. Ovaj proces je pokrenut sa PCR amplifikacijom ECD fragmenta prikazanog na
1 4
FIG.1B koristeći visokokvalitetnu KOD Hot Start DNK polimerazu (EMD Chemicals). Prednji prajmer korišćen u ovoj PCR reakciji imao je PTK7 sekvencu:
GCCATTGTCTTCATCAAGCAGCC (SEQ ID NO: 9) i takođe je uključivao 5 ’HindIII restrikciono mesto i mišji IgG Kapa signalni peptid/vodeću sekvencu za izlučivanje proizvoda u supernatant kulture. Obrnuti prajmer koji se koristi za pojačavanje ovih konstrukcija imao je PTK7 sekvencu: CTGGATCATCTTGTAGGGGGGAG (SEQ ID NO: 10) i uključivao je 5 ’DraIII i BglII restrikciono mesto koje omogućava kloniranje uzvodno od humanog IgG2 Fc proteina koji je naručen kao sintetizovani gen (DNA 2.0 Inc.).
[0283] Amplifikovani ili subklonirani proizvodi su zatim premešteni u finalni ekspresioni vektor pEE12.4 (Lonza AG) koristeći HindIII i EcoRI restrikciona mesta, a vernost je potvrđena DNK sekvencioniranjem. Plazmidi su privremeno transfektovani u CHO-S ili 293T ćelije suspenzije i prečišćeni bilo kolonom afiniteta nikla za His-označeni protein ili Proteinom A za Fc fuzioni proizvod. Proizvodi su dalje prečišćeni hromatografijom za isključivanje veličine upotrebom Superdex200 kolone (GE Healthcare) u fosfatnom puferu fiziološkom rastvoru (PBS), pH 7.2, pri čemu je prečišćeni fuzijski protein kvantifikovan Bradfordovom metodom (Bradford, 1976: PMID 942051).
Primer 7
Generisanje anti-PTK7 Antitela Korišćenjem hPTK7 Imunogena
[0284] PTK-7 modulatori u obliku mišjih antitela su proizvedeni u skladu sa ovde navedenim Xčenjima inokulacijom, sa BALB/3T3 ili HEK 293 ćelijama, preko ekspresije hPTK7, hPTK7-His ili hPTK7-Fc proizvedene kako je navedeno u prethodnom Primeru. U tom pogledu tri soja ženskih miševa (svaki po: Balb/c, CD-1, FVB) su imunizovana preparatima gore pomenutih PTK7 imunogena. Svi miševi su imunizovani ubrizgavanjem u nogu sa 10 µg odabranog PTK7 konstrukta ili 1X10<6>ćelija u svakom slučaju emulgovani sa jednakom zapreminom TiterMax® ili alum adjuvansa.
[0285] Bilo FACS ili ELISA testovi u čvrstoj fazi korišćeni su za pretragu mišjih seruma na mišja IgG antitela specifična za humani PTK7. Za ELISAa, ploče su preko noći obložene PTK7-His u različitim koncentracijama u rasponu od 0.01-1 µg/ml u PBS. Posle ispiranja PBS-om koji sadrži 0.02% (v/v) Tween 20, bunarčLći su blokirani sa 3% (v/v) BSA u PBS ili 2% FCS u PBS, 200 µL/bunarčLću tokom 1 sata na ST. Razblaži rastvori mišjeg seruma inkubirana su na PTK7-His obloženim pločama na 50 µl/bunarčLću na ST tokom 1 sata. Ploče se isprane, a zatim inkubirane sa 50 µL/bunarčLću obeleženim HRP kozjim anti-mišjim
1
IgG razblažen 1:10,000 u 3% BSA-PBS ili 2% FCS u PBS tokom 1 sata na ST. Ploče su isprane i dodato je 100 µl/bunarčLću rastvora TMB supstrata (Thermo Scientific 34028) tokom 15 minuta na ST. Na kraju se dodaje jednaka zapremina 2M H2SO4da se zaustavi razvoj supstrata i analizira spektrofotometrom na OD 450.
[0286] Kao što je naznačeno, mišji serumi su takođe testirani na anti-PTK7 antitela pomoću FACS protiv ćelija tokom ekspresije humanog PTK7 ko-transdukovanog sa GFP. Ukratko, 1x10<5>BALB/3T3 ćelije po bunarčLću su transdukovane sa humanim PTK7 i GFP su inkubirani 30 minuta sa 100 ul miševog seruma razblaženog 1: 100 u PBS/2% FCS. ûelije su isprane PBS/2% FCS i zatim inkubirane sa 50 uL po uzorku DyeLight 649 obeleženim kozjim-anti-mišjim IgG, Fc fragmentom specifičnim sekundarnim razblaženjem 1:200 u PBS/2% FCS. Posle 15 minuta inkubacije ćelije su isprane 2 puta sa PBS/2% FCS i ponovo suspendovane u PBS/2% FCS sa DAPI i analizirane sa FACS.
[0287] Sera pozitivni imunizovani miševi su žrtvovani, a odvodni limfni čvorovi (poplitealni i ingvinalni, ako su uvećani) su secirani i korišćeni kao izvor za ćelije koje proizvode antitela. Suspenzija jednoćelijskih B ćelija (375x10<6>ćelija) je spojeno sa nesekretišućim P3x63Ag8.653 ćelijama mijeloma (ATCC # CRL-1580) u odnosu 1:1 sa elektrofuzijom. Elektrofuzija ćelija je izvedena korišćenjem BTX Hybrimmune Sistema ili ECM2001, (oba BTX Harvard aparati) prema uputstvima proizvođDča. Sledeće elektrofuzijske ćelije su resuspendovane u mediju za selekciju hibridoma dopunjenom medijumom Azaserin (Sigma # A9666) (DMEM (Cellgro cat # 15-017-CM) koji sadrži 15% fetalnog klona I seruma (Hyclone), 10% BM Condimed (Roche Applied Sciences) ), 1 mM natrijum piruvata, 4 mM L-glutamina, 100 IU penicilin-streptomicina, 50 µM 2-merkaptoetanola i 100 µM hipoksantina). Prvo fuziji ćelije su postavljene na 2x10<4>/bunarčLća u mikrotitarske ploče sa ravnim dnom, nakon čega je usledila dvonedeljna inkubacija u selektivnom HAT medijumu (Sigma, CRL P-7185). U drugoj fuziji, ćelije su postavljene posle fuzije u četiri T225 balona na 90 ml selekcionog medija po balonu. Zatim su baloni postavljeni 6-7 dana u vlažni inkubator od 37 °C koji sadrži 5% CO2i 95% vazduha.
[0288] Nakon rasta, biblioteka koja sadrži ćelije iz druge fuzije u T225s se sortira pomoću FACSAria I ćelijskog sortera i nanosi se na jednu ćeliju po bunarčLćui u Falcon ploči sa U dnom i sa 96 bunarčLća (obe BD Biosciences). Sve preostale neiskorišćene hibridoma ćelije biblioteke su zamrznute za buduće testiranje ako je potrebno. Odabrani hibridomi su zatim uzgajani u 200 uL medijuma za kulturu koji sadrži 15% fetalnog klona I seruma (Hyclone), 10% BM-Condimed (Roche Applied Sciences), 1 mM natrijum piruvata, 4 mM L-glutamina, 100 IU Penecillin-Streptamicin , 50 µM 2-merkaptoetanola i 100 µM hipoksantina. Posle 10-
1
14 dana rasta za obe fuzije na pločama sa 96 bunarčLća, supernatanti iz svakog bunarčLća su ispitani na antitela reaktivna za mišji PTK7 koristeći ELISA ili FACS analizu.
[0289] Ukratko, ploče sa 96 bunarčLća (VWR, 610744) presvučene su sa 1 µg/ml mišjeg PTK7-His u puferu natrijum karbonata preko noći na 4 °C. Ploče su isprane i blokirane sa 2% FCS-PBS tokom jednog sata na 37 °C i odmah upotrebljene ili čuvane na 4 °C.
Nerazblaženi supernatanti hibridoma inkubirani su na pločama jedan sat na ST. Ploče su isprane i sondirane sa HRP obeleženim kozjim anti-mišjim IgG razblaženim 1:10,000 u 1% BSA-PBS tokom jednog sata na ST. Posle inkubacije sa rastvorom supstrata, kao što je gore opisano, ploče su očitane na OD 450.
[0290] BunarčLći hibridoma sa pozitivnim rastom koji luče mišje imunoglobuline su takođe pregledani na specifičnost humanog PTK7 korišćenjem FACS analize slično onoj gore opisanoj. Ukratko, 1x10<5>po bunarčLću BALB/3T3 ćelija transdukovani sa humanim PTK7 i GFP su inkubirane 30 minuta sa supernatantom hibridoma od 25-100 uL. ûelije su isprane PBS/2% FCS dva puta, a zatim inkubirane sa 50 uL po uzorku DyeLight 649 obeleženim kozjim anti-mišjim IgG, Fc fragmentom specifičnim sekundarnim razblaženim 1:200 u PBS/2% FCS. Posle 15 minuta inkubacije ćelije su isprane 2 puta sa PBS/2% FCS i resuspendovane u PBS/2% FCS sa DAPI (Life Technologies) i analizirane od strane FACS. Za drugu fuziju nastali PTK7 specifični klonski hibridomi su prošireni i kriokonzervirani u CS-10 medijumu za zamrzavanje (Biolife Solutions) i skladišteni u tečnom azotu.
[0291] Za prvo fuzijsko subkloniranje je izvedeno na odabranim antigen pozitivnim bunarčLćima primenom ograničenog razblaživanja. Ploče su vizuelno pregledane na prisustvo rasta jedne kolonije i supernatanta iz bunarčLća jedne kolonije, a zatim su pregledane antigen-specifičnim ELISA i FACS potvrdom, kao što je gore opisano. Dobijene klonske populacije su proširene i kriokonzervirane u medijumu za zamrzavanje (90% FBS, 10% DMSO) i skladištene u tečnom azotu.
[0292] Za prvu fuziju izabrani su hibridomi koji izlučuju PTK7 iz pozitivnih bunarčLća (4 pogotka OD405 @20min> 0.75) za dalju karakterizaciju.
[0293] Druga fuzija zasejana preko 48 ploča (4608 bunarčLća) rezultiralo je približno 65% efikasnošću kloniranja sa stotinama pogodaka. Odabrani klonovi su obezbedili nekoliko desetina mišjih antitela koja su bila imunospecifična za humani PTK7, od kojih su neka ukrštala i sa mišjim PTK7.
1
Primer 8
Sekvencioniranje i Humanizacija PTK7 Modulatora
8(a) Sekvencioniranje:
[0294] Na osnovu gore navedenog, odabrani su brojni primeri jasnih monoklonskih antitela koja vezuju imobilizovana humana i antitela koja unakrsno reaguju sa mišem PTK7 sa Rčigledno visokim afinitetom za sekvencioniranje i dalju analizu. Kao što je prikazano tabelarno na FIGS.6A i 6B, analiza sekvence varijabilnih regiona lakog lanca (FIG.6A) i varijabilnih regiona teškog lanca (FIG.6B) iz odabranih monoklonskih antitela generisanih u Primeru 7, je potvrdila da su mnogi imali nove regione koji određuju komplementarnost i često su prikazivali nove VDJ postavke. Imajte na umu da regioni koji određuju komplementarnost prikazani na FIGS.6A i 6B su izvedeni iz VBASE2 analize.
[0295] Tačnije, FIG.6A prikazuje susedne amino kiselinske sekvence dvadeset i jednog novog mišjeg varijabilnog regiona lakog lanca iz anti-PTK7 antitela (SEQ ID NOS: 20 - 60, parni brojevi) i četiri humanizovana varijabilna regiona lakog lanca (SEQ ID NOS: 62 - 68, parni brojevi) izvedeni iz reprezentativnih mišjih lakih lanaca. Slično tome, FIG.6B prikazuje susedne amino kiselinske sekvence dvadeset i jednog novog mišjeg varijabilnog regiona teškog lanca (SEQ ID NOS: 21 - 61, neparni brojevi) iz istih anti-PTK7 antitela i četiri humanizovana varijabilna regiona teškog lanca (SEQ ID NOS: 63 - 69, neparni brojevi) od istih mišjih antitela kao i ona koja obezbeđuju humanizovane lake lance. Dakle, uzete zajedno FIGS.6A i 6B daju pribeležene sekvence dvadeset i jednog mišjeg anti-PTK7 antitela (nazvanih SC6.2.35, SC6.10.2, SC6.4.1, SC6.50.1, SC6.3, SC6.4, SC6.6, SC6.7, SC6.13, SC6.14, SC6.15, SC6.19, SC6.20, SC6.21, SC6.23, SC6.24, SC6.26, SC6.29, SC6.41, SC6.58 i SC6.59) i četiri humanizovana antitela (nazvani hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 i hSC6.58). Imajte na umu da oznake SC6.4.1 i SC6.4 samo odražavaju anomaliju imenovanja i da modulatori zapravo sadrže dva diskretna antitela sa novim sekvencama varijabilnog regiona teškog i lakog lanca.
[0296] Za potrebe predmetne prijave, SEQ ID NOS svakog određenog antitela su sekvencijalne. Prema tome, mAb SC6.2.35 sadrži SEQ ID NOS: 20 i 21 za varijabilne regione lakog i teškog lanca. U tom pogledu SC6.10.2 sadrži SEQ ID NOS: 22 i 23, SC6.4.1 sadrži SEQ ID NOS: 24 i 25, i tako dalje. Štaviše, odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline za svaku amino kiselinsku sekvencu antitela na FIG.6A i 6B su uključeni u predmetnu prijavu kao lista sekvenci koja je ovde dodata. Uključene sekvence nukleinske
1
kiseline sadrže SEQ ID NOS koje su sto puta veće od odgovarajuće amino kiselinske sekvence (teški ili laki lanac). Dakle, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju amino kiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca mAb SC6.2.35 (odn., SEQ ID NOS: 20 i 21) sadrže SEQ ID NOS: 120 i 121. Ostale sekvence nukleinskih kiselina antitela, uključujući one koje kodiraju humanizovane konstrukcije su slično numerisane.
[0297] Kao prvi korak u sekvencioniranju primernih modulatora odabranih ćelija hibridoma su lizirane u Trizol® reagensu (Life Technologies) za pripremu RNK. U tom pogledu između 10<4>i 10<5>ćelija je resuspendovano u 1 ml Trizola i snažno promućkano nakon dodavanja 200 µl hloroforma. Uzorci su zatim centrifugirani na 4 °C tokom 10 minuta, a vodena faza je premeštena u svežu epruvetu za mikrofugu gde je dodata jednaka zapremina izopropanola. Epruvete su ponovo snažno promućkane i ostavljene da se inkubiraju na sobnoj temperaturi 10 minuta pre nego što su 10 minuta centrifugirane na 4 °C. Dobijene RNK kuglice su isprane jednom sa 1 ml 70% etanola i kratko osušene na sobnoj temperaturi pre ponovnog suspendovanja u 40 µl vode tretirane DEPC. Kvalitet RNK preparata određen je frakcionisanjem 3 µl u 1% agaroznom gelu pre skladištenja na - 80 °C dok se ne koristi.
[0298] Varijabilni region Ig teškog lanca svakog hibridoma je pojačan upotrebom 5' prajmera koja sadrži trideset i dva mišija specifična vodeća sekvenciona prajmera, konstruisani tako da ciljaju kompletan VH repertoar, u kombinaciji sa 3' mišjim CȖ prajmerom specifičnim za sve miševe Ig izotipa.400 bp PCR fragment VH je sekvencionirano sa oba kraja primenom istih PCR prajmera. Slično tome, trideset i dve 5‘ Vk vodeća sekvenca prajmer smeša konstruisana da pojača svaku od porodica Vk miša u kombinaciji sa jednim reverznim prajmerom specifičnim za mišji kapa konstantni region sz korišćene za pojačavanje i sekvencioniranje lakog lanca kapa. VHi VLtranskripti su pojačani sa 100 ng ukupne RNK upotrebom lančane reakcije reverzne transkriptaze polimeraze (RT-PCR).
[0299] Ukupno je sprovedeno osam RT-PCR reakcija za svaki hibridom: četiri za V kapa laki lanac i četiri za V gama teški lanac (Ȗ1). Za pojačavanje je korišćen QIAGEN One Step RT-PCR komplet (Qiagen, Inc.). Ovaj komplet pruža kombinaciju Sensiscript i Omniscript reverznih transkriptaza, HotStarTak DNK polimeraze, dNTP smeše, pufera i Q-Rastvora, novog aditiva koji omogućava efikasno pojačavanje „teških“ (npr., bogatih GC) obrazaca. Ekstrahovani PCR proizvodi su direktno sekvencionirani pomoću specifičnih prajmera V regiona. Nukleotidne sekvence su analizirane pomoću IMGT za identifikaciju članova genske linije V, D i J gena sa najvišom homologijom sekvence. Izvedene sekvence su upoređene sa poznatim DNK sekvencama germ linija Ig V- i J-regiona korišćenjem V-BASE2 (Retter et al., supra) i poravnavanjem VHi VLgena sa bazom podataka mišjih germ linija.
1
[0300] Pripremljene su reakcione smeše koje su uključivale 3 µl RNK, 0.5 od 100 µM prajmera teškog lanca ili kapa lakog lanca, 5 µl 5X RT-PCR pufera, 1 µl dNTPs, 1 µl smeše enzima koja sadrži reverznu transkriptazu i DNK polimerazu, i 0.4 µl inhibitora ribonukleaze RNasin (Promega BioSystems.). Reakciona smeša sadrži sve reagense potrebne za reverznu transkripciju i PCR. Program termičkog ciklera je bio ST korak 50 °C tokom 30 minuta i 95 °C tokom 15 minuta, a zatim 30 ciklusa od (95 °C za 30 sekundi, 48 °C za 30 sekundi, 72 °C za 1,0 minuta). Tada je bila konačna inkubacija na 72 °C tokom 10 minuta.
[0301] Da bi se PCR proizvodi pripremili za direktno sekvencioniranje DNK, prečišćeni su pomoću QIAquick ™ PCR kompleta za prečišćavanje prema protokolu proizvođDča. DNK je eluirana iz centrifuge pomoću 50 µl sterilne vode, a zatim je sekvencirana direktno iz oba niza. Dobijene DNK sekvence su ponovo analizirane upotrebom VBASE2 (podaci nisu prikazani) da bi se dobili anotirane sekvence navedeni na FIGS.6A i 6B. Preciznije, kao što je gore pomenuto, izložene su označene amino kiselinske sekvence dvadeset jednog mišjeg varijabilnog regiona teškog i lakog lanca anti-PTK7 antitela na FIGS.6A i 6B.
8(b) Humanizacija:
[0302] ýetiri mišja antitela generisana u Primeru 7 su humanizovana pomoću graftovanja regiona koji određuje komplementarnost (CDR). Humani okviri za teške i lake lance izabrani su na osnovu sličnosti sekvenci i strukture s obzirom na funkcionalne gene humane generacije. U tom pogledu strukturna sličnost je procenjena upoređivanjem mišje kanonske CDR strukture sa ljudskim kandidatima sa istim kanonskim strukturama kako je opisano u Chothia et al. (supra).
[0303] Preciznije, mišja antitela SC6.23, SC6.24, SC6.41 i SC6.58 su humanizovana korišćenjem kompjuterizovane CDR metode graftovanja (Abisis Database, UCL Business Plc.) i standardnih tehnika molekularnog inženjeringa kako bi se dobili hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 i hSC6.58 modulatori. Regioni humanog okvira varijabilnih regiona izabrani su na osnovu njihove najviše homologije sekvence sa sekvencom okvira miša i njegove kanonske strukture. Za potrebe analize, dodeljivanje amino kiselina svakom od CDR domena je u skladu sa Kabat et al. numerisanje. Napravljeno je nekoliko varijanti humanizovanih antitela da bi se generisalo optimalno humanizovano antitelo sa humanizovanim antitelima koja generalno zadržavaju regione za određivanje komplementarnosti koji vežu antigen (CDR) od hibridoma miša u saradnji sa humanim okvirnim regionima. Na kraju je utvrđeno da se humanizovana SC6.23, SC6.24, SC6.41 i SC6.58 mAb vezuju za humani PTK7 antigen sa sličnim afinitetom sa njihovim mišjim kolegama, mereno pomoću Biacore sistema.
11
[0304] Postupci molekularnog inženjerstva sprovedeni su tehnikama priznatim u tehnici. U tom cilju ukupna mRNK je ekstrahovana iz hibridoma prema protokolu proizvođDča (Trizol® Plus RNA Purification System, Life Technologies). Specifična sekvenca 5‘ vodećeg prajmera sekvence, konstruisana da pojača svaki hibridom, korišćen je u kombinaciji sa 3 ’humanim &Ȗ1 prajmerom za pojačavanje i kloniranje varijabilnih regiona svakog humanizovanog antitela. Slično tome, 5’ Vk vodeća sekvenca konstruisana posebno za pojačavanje svakog od Vk regiona u kombinaciji sa jednim reverznim prajmerom specifičnim za humani kapa konstantni region korišćena je za pojačavanje i kloniranje kapa lakog lanca. Pojačani fragmenti su klonirani kao himerni humani gama1/kapa lanci i služili su kao referentna oznaka za svako humanizovano mAb.
[0305] Iz informacija o nukleotidnoj sekvenci dobijeni su podaci koji se odnose na segmente gena V, D i J teškog i lakog lanca SC6.23, SC6.24, SC6.41 i SC6.58. Na osnovu podataka o sekvencama konstruisani su novi kompleti prajmera specifični za vodeću sekvencu Ig VHi VKlanca antitela za kloniranje rekombinantnog monoklonskog antitela. Posle toga su V-(D)-J sekvence poravnate sa mišjim Ig germ linijskim sekvencama. Geni teškog lanca SC6.23 identifikovani su kao VH36096 (V), DSP2.3 (D) i JH3. Geni teškog lanca SC6.24 identifikovani su kao VHJ558 (V), DSP2.7 (D) i JH4. Geni teškog lanca SC6.41 identifikovani su kao IGHV14-4 (V), DFL16.1 (D) i JH2. Geni teškog lanca SC6.58 identifikovani su kao IGHV4-1 (V), DFL16.1 (D) i JH4. Sva četiri laka lanca bila su K klase. Geni lakih lanaca identifikovani su kao IGKV14-11 kopneni JK5 za SC6.23 mAb, IGKV3-5 i JK1 za SC6.24 mAb, IGKV2-137 i JK4 germ linijske sekvence za SC6.41 mAb i IGKV17-121 i JK4 germ linijske sekvence za SC6.58 kapa laki lanac. Ovi rezultati su sumirani u TABELI 1 neposredno ispod.
TABELA 1
[0306] Dobijene sekvence teškog i lakog lanca iz sva četiri klona su poravnate sa funkcionalnim sekvencama varijabilnog humanog regiona i pregledane su na homologiju i kanonsku strukturu. Rezultati analize teškog i lakog lanca prikazani su dole u TABELAMA 2 i 3 respektivno.
TABELA 2
TABELA 3
[0307] Kako su postupci odabira germ linije i CDR graftovanja obezbedili antitela koja su generalno zadržala svoje karakteristike vezivanja, očigledno je bilo malo potrebe za umetanjem mišjih ostataka u većinu konstrukata.
[0308] Kao što je prethodno navedeno amino kiselinskih sekvenci humanizovanih varijabilnih regiona te[kog lanca i humanizovanih kapa lakih lanaca za sva četiri antitela prikazani su na FIGS.6A i 6B (SEQ ID NOS: 62 - 69) i odgovarajućih sekvenci nukleinske kiseline (SEQ ID NOS: 162 -169) date su u priloženoj listi sekvenci.
[0309] Preciznije, amino kiselinske sekvence i odgovarajuće sekvence nukleinskih kiselina humanizovanog SC6.23 lakog lanca (SEQ ID NOS: 62 i 162) i humanizovanog teškog lanca (SEQ ID NOS: 63 i 163) prikazani su na FIGS.6A i 6B i u listi sekvenci. Slično tome, amino kiselinske sekvence i odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline humanizovanog SC6.24 lakog lanca (SEQ ID NOS: 64 i 164) i humanizovanog teškog lanca (SEQ ID NOS: 65 i 165) su prikazane na isti način. Još jedan slu;aj pronalaska ilustrovan je amino kiselinskim sekvencama i odgovarajućim sekvencama nukleinske kiseline humanizovanog SC6.41 lakog lanca (SEQ ID NOS: 66 i 166) i humanizovanog teškog lanca (SEQ ID NOS: 67 i 167). U još jednom slučaju prikazane su amino kiselinske sekvence i odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline humanizovanog SC6.58 lakog lanca (SEQ ID NOS: 68 i 168) i humanizovanog teškog lanca (SEQ ID NOS: 69 i 169). Kao što je prikazano u Primerima u nastavku, svako od gore pomenutih humanizovanih antitela funkcioniše kao efikasan PTK7 modulator u skladu sa učenjima ovde.
[0310] U svakom slučaju otkriveni modulatori su ekspresovani i izolovani upotrebom tehnika priznatih u tehnici. U tom cilju sintetički humanizovani varijabilni fragmenti DNK (Integrated DNA Technologies) oba teška lanca su klonirani u humani IgGl vektor ekspresije. Fragmenti varijabilnog lakog lanca su klonirani u humani vektor ekspresije C-kapa. Antitela su ekspresovana ko-transfekcijom teškog i lakog lanca u CHO ćelijama.
[0311] Preciznije, za proizvodnju antitela preduzeto je usmereno kloniranje proizvoda PCR od mišjeg i humanizovanog promenljivog gena u vektore ekspresije humanog imunoglobulina. Svi prajmeri korišćeni u PCR specifičnim za Ig gen uključivali su restrikciona mesta (AgeI i XhoI za IgH, XmaI i DraIII za IgK, što je omogućilo direktno kloniranje u vektore ekspresije koji sadrže humani IgG1, odnosno IGK konstantne regione, respektivno. Ukratko, PCR proizvodi su prečišćen Qiaquick PCR kompletom za prečišćavanje (Qiagen, Inc.) praćen digestijom sa Agel i XhoI (IgH), XmaI i DraIII (IgK). Digestirani PCR proizvodi su prečišćeni pre ligacije u vektore ekspresije. Reakcije ligacije su izvedene u ukupnoj zapremini od 10 µl sa 200 U T4-DNK Ligaze (New England Biolabs), 7.5 µl digestiranog i prečišćenog genski specifičnog PCR proizvoda i 25ng linearne vektorske DNK. Nadležne bakterije E. coli DH10B (Life Technologies) transformisane su putem toplotnog šoka na 42 °C sa 3 µl proizvoda za ligaciju i postavljeno na ampicilinske ploče (100 µg/ml). AgeI-EcoRI fragment VHregiona potom je umetnut na ista mesta ekspresionog vektora pEE6.4HuIgG1 (Lonza AG) dok je sintetički XmaI-DraIII VKumetak je kloniran u XmaI-DraIII mesta -odgovarajućeg pEE12.4Hu-Kapa ekspresijskog vektora.
[0312] ûelije koje proizvode humanizovana antitela nastale su transfekcijom HEK 293 ćelija sa odgovarajućim plazmidima korišćenjem 293fektina. U tom pogledu plazmidna DNK je prečišćena sa QIAprep Spin kolonama (Qiagen). ûelije humanog embrionalnog bubrega (HEK) 293T (ATCC br. CRL-11268) uzgajane su na pločama od 150 mm (Falcon, Becton Dickinson) pod standardnim uslovima u Dulbecco-ovom modifikovanom srednjem orlovskom medijumu (DMEM), dopunjenom sa 10% inaktiviranim toplotom FCS, 100 µg/ml streptomicina , 100 U/mL penicilina G (svi iz Life Technologies).
[0313] Za privremene transfekcije ćelije su uzgajane do 80% konfluentnosti. Jednake količine IgH i odgovarajuće DNK vektorskog lanca IgL (12.5 µg svake vektorske DNK) dodate su u 1.5 ml Opti-MEM izmešanog sa 50 µl HEK 293 transfekcionog reagensa u 1.5 ml opti-MEM. Smeša je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi i ravnomerno
11
raspoređena na pločicu za kulturu. Supernatanti su sakupljeni tri dana nakon transfekcije, zamenjeni sa 20 ml svežeg DMEM dopunjenog sa 10% FBS i ponovo sakupljeni 6. dana nakon transfekcije. Supernatanti kulture su očišćeni od ostataka ćelija centrifugiranjem na 800Xg tokom 10 minuta i čuvani na 4 °C. Rekombinantna himerna i humanizovana antitela prečišćena su sa kuglicama Proteina G (GE Healthcare).
Primer 9
Karakteristike PTK7 Modulatora
9(a) Uopštene karakteristike Modulatora
[0314] Razni postupci su korišćeni za analizu imunohemijskih karakteristika odabranih PTK7 modulatora (i mišjih i humanizovanih) generisanih kao što je gore navedeno. Konkretno, broj ovih antitela je okarakterisan kao afinitet, kinetika, vezivanje, i unakrsna reaktivnost u odnosu na homologe cinomolgusa i miša (npr., sa ForteBio). Reaktivnost modulatora je takođe merena Western blot-om primenom redukovanih i ne-redukovanih uzoraka kako bi se pružila određena indikacija da li su epitopi linearni ili ne. Pored podataka o vezivanju mišjeg i humanog antigena prikazanih na FIG.7A, rezultati karakterizacije antitela za odabrane mišje modulatore prikazani su u tabelarnom obliku na FIG.7B. Konačno, kao što je prikazano na FIG.7C - 7E afiniteti za odabrane miševe koji imaju humanizovane modulatore su izmereni korišćenjem analize bio-sloja interferometrije na ForteBio RED (ForteBio, Inc.) sa standardnom serijom koncentracije antigena. Uopšteno, odabrani modulatori su pokazali relativno visoke afinitete u nanomolarnom opsegu.
[0315] U skladu sa predmetnim pronalaskom afinitet modulatora izmeren je na tri načina kako bi se osigurala tačnost. Prvo, meren je signal vezivanja za fiksnu količinu antitela sondiranog protiv serijskih razblaženja antigena u ELISA da bi se utvrdila relativna aktivnost modulatora (podaci nisu prikazani). Drugo, afiniteti i kinetičke konstante koni koffizabranih efektora su zatim izmereni korišćenjem analize bio-sloja interferometrije na ForteBio RED (ForteBio, Inc.) sa standardnom serijom koncentracije antigena. Na kraju, afinitet izabranih modulatora izmeren je površinskom plazmonskom rezonancom (Biacore Sistem, GE Healthcare). Na osnovu standardne serije koncentracija antigena i korišćenjem modela vezivanja Langmuira u odnosu 1:1, određeni su Kdvezivanja antitela za antigen i kinetičke konstante koni koff(npr., videti FIGS.7C i 7E) upotrebom tehnika uobičajenih u tehnici.
Generalno odabrani efektori, bilo da su mišji ili humanizovani, pokazivali su relativno visoke afinitete u nanomolarnom opsegu. U tabeli na FIG.7B, gornji indeks B označava merenja afiniteta određeba na Biacore-u, dok gornji indeks F označava merenja određena na ForteBio.
[0316] Preliminarni rad je takođe izveden da bi se utvrdilo da li epitop prepoznat od PTK7 efektora sadrži susedne amino kiseline ili je formiran od ne-susednih amino kiselina u suprotnosti sa sekundarnom strukturom antigena. U tom pogledu, Western blot-ovi su vođeni pod redukcionim (npr., upotrebom 0.5M DTT) i neredukovanim uslovima. Preciznije, koristeći standardne tehnike elektroforeze dobro poznate u struci, PTK7 antigen u oba stanja je pokrenut na gelovima i upijan pre izlaganja odabranim modulatorima. Kao što je prikazano na FIG.7B testirana su dva PTK7 modulatora koji su očigledno reagovali samo sa antigenom tamo gde su disulfidne veze netaknute (NR). Preostali PTK7 modulatori nisu testirani na VWestern blot aktivnost.
[0317] Što se tiče spajanja antitela, korišćen je analizator ForteBio Octet Red96 (ForteBio, Inc.) prema uputstvima proizvođDča i u tehnici poznata sendvič metoda [Analytical Biochemistry 386: 172-180 (2009) za identifikovanje antitela koja se vezuju za ista ili različita ograđena mesta. Ukratko, antitelo (Ab1) je uhvaćeno na čip za hvatanje protiv miša pre nego što je upotrebljena visoka koncentracija nevezujućeg antitela od 15 ug/ml (100 nM) za blokiranje čipa i uspostavljanje osnovne linije. Monomerni rekombinantni hPTK7-His (izoforma a), kako je predviđeno u Primeru 6 (na 500 nM), zatim je zahvaćeno specifičnim antitelom (Ab1), a vrh je uronjen u bunarčLć sa istim antitelom (Ab1) kao kontrolom ili u bunar sa drugačijim antitelom (Ab2) gde su oba antitela na 4ug/mL (25nM). Ako je primećeno dodatno vezivanje sa novim antitelom, tada je utvrđeno da su Ab1 i Ab2 na različitom ograđenom mestu. Ako se nije desilo dalje vezivanje, slično kao kod kontrolne Ab1, tada je utvrđeno da je Ab2 na istom ograđenom mestu. Ovaj proces se može proširiti tako da se pregledaju velike biblioteke jedinstvenih antitela koristeći ceo red antitela koji predstavljaju jedinstvena ograđena mesta na ploči sa 96 bunarčLća. Primerni podataka za tri reprezentativna modulatora prikazani su na FIG.7A za humani i mišji PTK7 antigen. FIG.7A ilustruje da dok SC6.10.2 uopšte nije vezao miša, SC6.2.35 se vezao za oko 10% humanog i SC6.25.1 vezao za mišji PTK7-His sa identičnim afinitetom (napomena; antitela su označena kao H2.35, H10.2 i H25.1 na FIG.7A). Dalje je utvrđeno da je svako od ovih testiranih antitela boravilo na različitom ograđenom mestu. Na sličan način je izvršena analiza spajanja za devet dodatnih PTK7 modulatora sa rezultatima prikazanim na FIG.7B. Ovi podaci su identifikovali najmanje sedam različitih mesta vezivanja koje su prepoznali testirani modulatori. ND u tabelama ukazuje na to da podaci nisu utvrđeni.
11
[0318] Konačno, unakrsna reaktivnost u odnosu na homologe PTK7 cinomolgusa i miša procenjena je sa ForteBio koristeći seriju koncentracija koja sadrži rekombinantno eksprimovani monomerni antigen. Kao što je navedeno na FIG.7B, broj primera modulatora reagovao je sa mišjim PTK7, dok su sva antitela unakrsno reagovala sa izuzetno sličnim cinomolgusom PTK7.
9(b) Karakteristike Humanizovanog Modulatora
[0319] Koristeći tehnike date gore u ovom Primeru, analizirani su humanizovani konstrukti hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 i hSC6.58 da bi se utvrdile njihove karakteristike vezivanja. Pored toga, vezivanje humanizovanog antitela direktno je upoređeno sa roditeljskim mišjim antitelom za oba antitela da bi se identifikovale suptilne promene u konstantama brzine koje je doveo do procesa humanizacije.
[0320] Tačnije, afinitet mišjeg SC6.23 meren je pomoću Biacore-a koristeći površinsku plazmonsku rezonancu (SPR) da bi se dobili rezultati navedeni na FIG.7C. Na osnovu niza koncentracija od 25, 12,5 i 6.25 nM (generisanje krivih odozgo prema dole na FIGS.7C i 7D) i korišćenjem modela vezivanja Langmuira u odnosu 1: 1, procijenjeno je da će Kdvezivanja antitela za antigen iznositi 2.3 nM. Slični eksperimenti su zatim izvedeni sa humanizovanim SC6.23 konstruktom koji su pokazali ekvivalentne rezultate (FIG.7D) koji ukazuju da postupak humanizacije nije negativno uticao na afinitet. S tim u vezi, merenja su pokazala da je humanizovani konstrukt imao afinitet od 3.9 nM, što je dobro u prihvatljivim granicama za terapijska antitela. Slična merenja za svaki od humanizovanih konstrukata opisanih u Primeru 8 izložena su na FIG.7E i, zajedno sa ostalim tehnikama iznetim u ovom Primeru, pokazuju da otkriveni humanizovani PTK7 modulatori poseduju poželjne kvalitete za terapijska antitela.
Primer 10
Određivanje Epitopa Selektivnih PTK7 Modulatora
[0321] U cilju daljeg preciziranja podataka o spajanju i određivanja epitopskih regiona definisanih odabranim PTK7 modulatorima generisanim kako je gore navedeno, konstruisano je i izraženo nekoliko različitih varijanti PTK7 ECD. Preciznije, PTK7 delecijski mutanti su konstruisani pomoću prajmera koji su amplifikovali različite PTK7 Ig domene i fuzionisali ih sa BglII restrikcionim mestom uzvodno od humanog IgG2 Fc domena, poređanog kao sintetički gen (DNA 2.0). Ovi Fc fuzioni proteini su zatim klonirani u
11
ekspresioni vektor pEE12.4 (Lonza AG) koristeći HindIII i EcoRI restrikciona mesta.
Izolovane Plazmidne DNK bez endotoksina (Qiagen Inc.) su korišćene za transfekciju prilepljenih 293 ćelija korišćenjem 293Fectin (Life Technologies). Supernatanti iz 293 transformisanih ćelija su sakupljeni 72 sata nakon transfekcije. Konkretno, konstruisani su sledeći konstrukti za brisanje spojeni za Fc regijon:
1. PTK7 ECD Ig domeni 1-2 (SEQ ID NO: 70) FIG. 8A
2. PTK7 ECD Ig domeni 3-7 (SEQ ID NO: 71) FIG. 8B
3. PTK7 ECD Ig domeni 1-5 (SEQ ID NO: 72) FIG. 8C
4. PTK7 ECD Ig domeni 6-7 (SEQ ID NO: 73) FIG. 8D
5. PTK7 ECD Ig domeni 2-3 (SEQ ID NO: 74) FIG. 8E
6. PTK7 ECD Ig domeni 1-4 (SEQ ID NO: 75) FIG. 8F
7. PTK7 ECD Ig domeni 1-7 (SEQ ID NO: 3) FIG. 1C - ECD
[0322] Amino kiselinske sekvence za prvih šest od ovih konstrukata su prikazane na FIG. 8A-8F (sadrži izabrani PTK7 ECD zajedno sa Fc regionom). Sekvenca za sedmi konstrukt obuhvata ekstraćelijski domen izoforme a (SEQ ID NO: 3) kako je prikazano na FIG.1C spojen sa Fc domenom.
[0323] Korišćenjem ovih konstrukata testirano je nekoliko modulatora za njihovu sposobnost prepoznavanja PTK7 proteina sa delecijama definisanih Ig domena. Kroz ELISA test koji obuhvata upotrebu konstrukcija obrisanih domena i koji se pokreće pod standardnim uslovima. S tim u vezi, Fc fuzije PTK7 Ig domena zabeležene su na ELISA ploči presvučenoj sa kozjim anti-humanih IgG Fc specifičnim antitelom (Jackson Immunoresearch). Tada je otkrivena sposobnost svakog mišjeg anti-PTK7 antitela da veže različite delecione Fc fuzione proteine sa HRP-obeleženim kozjim anti-mišjim Fc specifičnim antitelom.
[0324] Korišćenjem ovog testa identifikovani su primerni modulatori koji su usmereni protiv određenih PTK7 Ig domena. Primer ELISA rezultata definiše svaki reprezentativni otkriveni epitop ili obrazac vezivanja i uključen je u TABELU 4 neposredno ispod.
TABELA 4
11
[0325] Monoklonska anti-PTK7 antitela očigledno prepoznaju nekoliko različitih epitopa na osnovu različitih obrazaca pozitivnog vezivanja u ELISA testu (Tabela 4 i FIG.8G). Imajte na umu da na FIG.8G modulatori su navedeni kao 6M, a SC6 i SC6.2.35 i SC6.10.2 kao H2.35 i H10.2. Nijedno antitelo se ne vezuje samo za epitop unutar Ig domena 6-7, ali ova dva domena mogu doprineti sekundarnoj/tercijarnoj strukturi Ig3-7 Fc fuzijskog konstrukta koji je bio vezan sa SC6.18 i SC6.31 (NIJE U TABELI). Štaviše, tri antitela (SC6.2.35, SC6.4.1 i SC6.10.2) prepoznaju epitop u prva četiri Ig domena i nijedno antitelo se ne vezuje za epitop unutar Ig domena 6-7. U prva četiri Ig domena SC6.2.35 se vezuje za epitop u domenima 1-2. SC6.4.1 prepoznaje epitop unutar granica Ig domena 2 i 3. Suprotno tome, SC6.10.2 deluje osetljivo na bilo koje delecije u prva četiri domena Ig, pa su stoga sva četiri domena slična Ig verovatno uključena u definisanje epitopa SC6.10.2. Slično tome, neka antitela vezana samo za konstrukciju pune dužine, Ig domeni 1-7, što ukazuje da su delecije Ig možda narušile neka mesta vezivanja ili sekundarnu strukturu ovih epitopa. FIG.8G daje šematski prikaz ovih obrazaca vezivanja, uključujući dodatna antitela i uporedive podatke koji pokazuju lokalizaciju vezivanja otkrivenih modulatora, gde su 7 Ig domeni PTK7 ECD predstavljeni u blokovskom obliku i zagrade se koriste za beleženje rasvetljene pozicije epitopa u okviru ovog ECD respektivnih anti-PTK7 antitela.
Primer 11
PTK7 Proteinska Ekspresija u Primernim Uzorcima Tumora
[0326] Nakon dokumentovanja povišenog nivoa ekspresije gena i generisanja antitela protiv PTK7 u prethodnim Primerima, traženi su dokazi za odgovarajuću ekspresiju PTK7 proteina u odabranim populacijama tumorskih pacijenata. S tim u vezi, obezbeđeni su nizovi proteinskih lizata karcinoma reverzne faze (ProteoScan™ Arrays; OriGene Technologies) koji sadrže 4 razblaženja 432 lizata tkiva iz 11 tipova tumora ili njihovo odgovarajuće normalno susedno tkivo, zajedno sa kontrolama koje se sastoje od HEK 293 ćelija bez ili sa TP53-prekomernom ekspresijom vođena sa egzogenim promotorom. Ekspresija PTK7 proteina u lizatima u ovom nizu otkrivena je korišćenjem mišjeg monoklonskog PTK7 antitela generisanog kako je prikazano u Primeru 7 i koje prepoznaje PTK7 protein sa Western Blot (npr. klon SC6.2.35). Reagense i protokole za kolorimetrijsku detekciju obezbedio je proizvođDč ProteoScan Arrays, mesta na proizvedenom nizu pretvorena su u digitalnu sliku
11
pomoću ravnog skenera koristeći BZScan2 Java Softver (INSERM-TAGC) za kvantifikovanje intenziteta tačke.
[0327] Rezultati takvih ispitivanja ukazuju da je ekspresija PTK7 proteina povećana u podgrupi melanoma, karcinoma pluća nedrobnoćelijskog karcinoma (NSCLC), karcinoma pluća malih ćelija (SCLC), uzoraka tumora izvedenih od raka debelog creva, pankreasa, dojke i jajnika . Primeri podataka iz ovih testova za odabrane tumore prikazani su na sl.9A-9D. Tačnije, Sl.9A pokazuje da se čini da je ekspresija proteina PTK7 značajno povišena u podskupini uzoraka kolorektalnog tumora; posebno kod pacijenata sa stadijumom IV u poređenju sa normalnim susednim tkivom ili tkivom tumora iz uzoraka dobijenih iz ranijih stadija bolesti. Kao što je prikazano na FIG.9B PTK7 proteinska ekspresija takođe je povišena u većini neuroendokriskih tumora pankreasa, kao i u podsetovima pacijenata sa karcinomom dojke (FIG.9C), odnosno jajnika (FIG.9D). Podaci su generisani kako je gore opisano i predstavljeni kao prosečni intenzitet piksela po tački (intenzitet tačke). Horizontalna crna traka u svakom uzorku predstavlja srednju vrednost za uzorke u svakoj odgovarajućoj kategoriji.
[0328] Ovi podaci podržavaju zapažanja u gornjim Primerima da je prekomerna ekspresija PTK7 povezana sa TIC i/ili TPC kod kolorektalnog karcinoma i može biti uključena u proliferaciju i/ili preživljavanje. S obzirom na prethodne Primere koji pokazuju: a) da je ekspresija gena PTK7 pretežno povezana sa subpopulacijom TPC ćelija u kolorektalnom karcinomu i subpopulacijom TG ćelija u tumorima pankreasa; b) da je ekspresija proteina PTK7 veća na subpopulaciji TIC ćelija; c) PTK7 ekspresiju proteina je povišena u celokupnim uzorcima tumora od raka debelog creva u kasnoj fazi; i d) opšte zapažanje je da su TIC češći u tumorima u kasnoj fazi, čini se da je PTK7 povezan sa onim ćelijama koje leže u osnovi rasta tumora, otpornosti na terapiju i recidivu tumora, što pojačava tvrdnju da PTK7 može igrati integralnu ulogu u podršci TPC i/ili TIC u gore pomenutim tumorima.
[0329] S obzirom na ove rezultate, ekspresija PTK7 je procenjena u populacijama netumorogenih (NTG) i matičnih ćelija karcinoma (CSC) ljudskih dojki (BR), pluća (LU), jajnika (OV), debelog creva (CR) i bubrega (KDI) ksenograft tumora primenom protočne citometrije. Kao što je izloženo u Primeru 1, populacije obogaćene NTG i CSC mogu se identifikovati, nadgledati i obogatiti upotrebom fenotipskih markera CD46<-/lo>CD324-, odnosno CD46<hi>CD324<+>. Shodno tome, humani tumorski ksenografti od imunokompromitovanih miševa su sakupljeni, razdvojeni i obojeni komercijalno dostupnim anti-CD46, anti-CD324 i anti-PTK7 (Miltenii Biotech) antitelima pre procene ekspresije PTK7 primenom protočne citometrije u CD46<-/lo>CD324<->NTG populacija i CD46<hi>CD324<+>CSC populacija. Preciznije,
11
analiza protočne citometrije sprovedena je korišćenjem standardnih tehnika na protočnom citometru BD FACSCanto™ II (BD Biosciences) sa izotipiranim i fluorescentnim minus jednim (FMO) kontrolama koje se koriste za potvrđivanje specifičnosti bojenja.
[0330] Rezultati za primerne uzorke tumora dojke, pluća, jajnika, debelog creva i bubrega prikazani su na FIG.9E, gde je kontrola izotipa označena punom sivom bojom, populacija ćelija NTG predstavljena je šrafiranom linijom, a populacija obogaćena CSC je puna linija. Podrazumevaće se da je, dok je površinsko bojenje PTK7 bilo relativno malo u NTG populacijama svakog od ovih tumora, površinsko bojenje PTK7 bilo znatno povišeno u populacijama obogaćenim CSC. Ovi rezultati su u međuvremenu potvrđeni (podaci nisu prikazani) upotrebom određenog broja otkrivenih modulatora i reprezentativni su za više od dvadeset pet testiranih jedinstvenih NTX linija (koje uključuju različite čvrste tumore).
[0331] Korelirani obrazac ekspresije PTK7 sa drugim površinskim markerima TPC dalje je funkcionalno razgraničen u studijama tumorogenosti kod NSCLC i karcinoma jajnika.
Populacije tumora PTK7<->i PTK7<+>izolovane su iz razdvojenih ksenograftova humanih tumora, obojenih kako je gore opisano, sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS), a ekvivalentni broj pomešan je sa Matrigelom (BD Biosciences) i supkutano transplantiran u miševe primaoce NOD/SCID. Dok PTK7-ćelije nisu uspele da proizvedu tumore kod primaoca miševa, PTK7<+>tumorske ćelije su konstantno proizvodile brzo rastuće tumore i sa NSCLC i sa karcinomima jajnika. Prema tome, u skladu sa ovde navedenim Xčenjima, PTK7 funkcionalno ocrtava TPC kod raka jajnika i NSCLC i pruža dodatne dokaze o korisnosti otkrivenih modulatora kao dijagnostički i terapeutski agensi.
Primer 12
Odabrani PTK7 Modulatori su Internalizovani sa K562 i G401 ûelijama
[0332] PTK7 modulatori iz hibridoma koji su generisani imunizacijom miševa kako je gore opisano pregledani su zbog njihove sposobnosti da se internalizuju u K562 i G401 ćelije.
[0333] S tim u vezi, K562 ćelije u početnoj koncentraciji od 106/mL (suspenzija pojedinačne ćelije) blokirane su sa Human TruStain (Biolegend, Inc., 422302) tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. ûelije su razblažene do 50x10<3>ćelija po reakciji. Duplikati uzoraka su bojeni 30 minuta na ledu sa supernatantom antitela u konačnoj zapremini od 50 uL, zatim isprani FACS medijumom za bojenje (FSM; 2% fetalnog goveđeg seruma/Hankov puferisani fiziološki rastvor/25mM HEPES [pH7.4]; Mediatech, Inc.) za uklanjanje nevezanih antitela.
12
Usledila je druga mrlja sa magarećim anti-mišjim Alexa647 (Life Technologies) tokom 30 minuta na ledu. ûelije su zatim ponovo isprane da se uklone nevezana antitela i uzorci su resuspendovani u internalizacionom medijumu (2% fetalni goveđi serum/Iscove-ov modifikovani medijum Dulbecco-a) i inkubirani u 5% CO2pri 37 °C (ili 4 °C za kontrolu) tokom 1 sata kako bi se omogućila internalizacija. Reakcija je zaustavljena prenošenjem uzoraka na led i dodavanjem ledeno hladnog FSM. Da bi se uklonilo bilo koje antitelo koje se nije internalizovalo i ostalo na površini ćelije, uzorci su obrađivani fiziološkim rastvorom u puferu sa niskim pH fosfata (PBS [pH2.0]) tokom 10 minuta na ledu. Nakon ovog koraka "kiselinske trake", uzorci su oprani sa FSM, resuspendovani u 150 uL FSM koji sadrže 2 ug/ml DAPI (Life Technologies) i analizirani na protočnom citometru BD FACS Canto. Svako povećanje fluorescencije u odnosu na ono otkriveno iz ćelija inkubiranih na ledu u ovom eksperimentu rezultat je sposobnosti internalizacije antitela, koja štiti fluorescentni molekul od skidanja sa površine ćelije tokom tretmana fosfatnim puferom sa niskim pH. Sve inkubacije su izvedene u medijumu za bojenje FACS, ukoliko nije drugačije naznačeno.
[0334] Prilikom skrininga pojedinačnih klonova supernatanta hibridoma koji sadrže PTK7 antitela koristeći prethodno opisani protokol kiselinske trake, nekoliko supernatanta je pokazalo pozitivan pomak u fluorescenciji u odnosu na neobojene ćelije i IgG negativna kontrolna antitela (FIGS.10A i 10B). Internalizacija antitela je primećena kod nekoliko anti-PTK7 antitela, kao što je prikazano sa sposobnošću ovih antitela da zaštite sekundarno antitelo Alexa647 od uklanjanja kiseline i što je rezultiralo pomeranjem fluorescencije udesno. Klon antitela SC6.10.2 (odn., H10 na FIG.10C) je primer tipične sposobnosti internalizacije anti-PTK7 antitelima sa ovom aktivnošću. U poređenju sa IgG kontrolama, približno 15% supernatanta koji sadrže antitela na PTK7 (4 od 27) izazvalo je internalizaciju. Korišćenjem K562 ćelija ovi podaci pokazuju da podaet antitela sposobnih da vežu PTK7 ECD angažuju antigen onako kako je predstavljen na ćelijama i sposobni su da se efikasno internalizuju.
[0335] Dalji dokazi koji ukazuju na to da otkriveni modulatori mogu da posreduju u internalizaciji u različitim primernim ćelijskim linijama prikazani su na FIG.10D. Preciznije, utvrđeno je da ćelijska linija glioblastoma (G401 Wilmove tumorske ćelije) izražava visok nivo PTK7 (podaci nisu prikazani), što sugeriše da je ova ćelijska linija možda osetljivija u odabranim uslovima ispitivanja i da stoga može efikasnije da identifikuje modulatore koji mogu indukovati internalizaciju. Uopšteno koristeći ove ćelije gore pomenutim postupkom kiselinske trake, pregledano je 170 jedinstvenih supernatanta hibridoma iz Primera 7 da bi se utvrdilo da li sadrže internalizujuća antitela. Prečišćena antitela SC6.2.35, SC6.10.2 i SC6.25.3 (označena sa H2.35, H10.2 i H25.3 na FIG.10D) koja su identifikovana na gore pomenutom ekranu korišćena su kao pozitivne kontrole (FIG.10D). Kapacitet internalizacije modulatora prisutnih u šest primernih supernatanta (identifikovanih oznakom bunarčLća) prikazani su odmah ispod kontrolnih. Ovom preciznijom analizom podaci pokazuju da su brojni modulatori obezbeđeni gore pomenutim postupkom imunizacije mogli da vežu PTK7 i internalizuju (što dokazuju 1A02, 1F02, 2A03 i 2F10), iako nisu svi klonovi (2F11 i 2F09) posedovali ovu sposobnost.
[0336] U još jednoj daljoj demonstraciji svojstava otkrivenih modulatora, utvrđeno je da se sva ekranizovana antitela koja su se na značajan način vezala za G401 ćelije donekle internalizuju (FIG.10E). Kao što je predstavljeno isprekidanom linijom na FIG.10E pozitivno bojenje ćelija je postavljeno na 4% na osnovu antitela za kontrolu izotipa miša koja su pokazala nespecifično bojenje 0-3% ćelija. Srednji fluorescentni intenzitet G401 ćelija obojenih svakim antitelom izmeren je nakon koraka kiselinske trake (odn., posle internalizacije) na 37 °C i 4 °C i interpoliran na relativan broj receptora po ćelijama koristeći 8-pik Rainbov perle (BD Spherotech # 559123) koji sadrže poznati broj fluorescentnih molekula. Brojevi internalizovanih receptora izračunati su oduzimanjem broja receptora dobijenih iz uzoraka koji su prolazili korak internalizacije na 4 °C (kontrola) od onog na 37 °C. Primećeno je da su PTK7 specifična antitela heterogena u svojoj sposobnosti da indukuju internalizaciju s obzirom na desetostruku razliku u broju internalizovanih receptora nezavisno od niva ćelijskog vezivanja (gornji desni kvadrant FIG.10E).
Primer 13
PTK7 Modulatori Olakšavaju Isporuku Citotoksičnih agenasa
[0337] Ciljanje citotoksičnog leka koji je stabilno povezan sa antitelom predstavlja osnaženi pristup antitelima koji bi mogao imati veliku terapijsku korist za pacijente sa čvrstim tumorima. Da bi se utvrdilo da li su gore opisana internalizujuća antitela specifična za PTK7 mogla da posreduju u isporuci citotoksičnog agensa u žive ćelije, izvršen je in vitro test ubijanja ćelija u kome je vezan streptavidin konjugovan sa proteinskim saporinom koji deaktivira ribozom (Advanced Targeting Systems) na biotinilovana PTK7 antitela, a sposobnost ovih saporinskih kompleksa da internalizuju i ubijaju ćelije izmerena je 72 sata kasnije merenjem vitalnosti ćelija.
[0338] Konkretno, 1x10<4>G401 Wilmove tumorske ćelije po bunarčLću su postavljene u ploče sa 96 bunarčLća. PTK7 modulatori u obliku antitela na PTK7, kao što je gore opisano, prečišćeni su od supernatanta, biotinilirani i zatim razblaženi na 20 mg/ml. Alikvot svakog antitela pomešan je u odnosu 1: 1 sa streptavidin-ZAP (napredni sistemi za ciljanje), vorteksovan 5 sekundi i zatim inkubiran na sobnoj temperaturi 1 sat. Zatim su napravljena tri dodatna serijska 10-puta razblaženja kompleksa antibodisaporina i 50 ul svake smeše dodato u ćelije koje sadrže G401. Smeša ćelija/antitelo-saporin je tada inkubirana na 37 °C/5% CO2tokom 24 sata. Posle ove inkubacije, ćelije su zavrtene u pločama sa 96 bunarčLća sa okruglim dnom, supernatant je uklonjen i u svaki bunarčLć je dodato 100 uL svežeg medijuma za kulturu. ûelije su zatim inkubirane dodatnih 72 sata pre nego što je izbrojan broj održivih ćelija upotrebom CellTiter-Glo (Promega Inc.) prema protokolu proizvođDča.
[0339] Korišćenjem gore opisanog testa ubijanja ćelija, pokazano je da internalizujući PTK7 modulatori koji sadrže antitela iz klonova SC6.2.35, SC6.10.2 i SC6.25.3 (označeni kao H2.35, H10.2 i - H25.3 na FIG.11A) posreduju saporin internalizacija toksina i ubijanje ćelija. Tačnije FIG.11A jasno pokazuju sposobnost ovih modulatora da utiču na ubijanje ćelija putem internalizacije posredovane PTK7, za razliku od nespecifičnog antitela za kontrolu izotipa (odn. MOPC). Takvi podaci pokazuju da su otkriveni modulatori imunospecifični za PTK7 i da su efikasno sposobni da posreduju u isporuci citotoksičnog korisnog tereta i ubiju PTK7 pozitivne ćelije povezivanjem ćelijske površine.
[0340] U produžetku gore pomenute analize ubijanja, demonstrirano je isporučivanje citotoksičnog korisnog tereta preko PTK7 specifičnih antitela koristeći još četiri uzorna modulatora (SC6.23, SC6.41, SC6.51 i SC6.58) sa SC6.10.2 koji se koristi kao pozitivna kontrola. U tu svrhu sledeći tipovi ćelija su postavljeni u ploče za kulturu tkiva sa 96 bunarčLća u njihovim odgovarajućim medijumima za kulturu (500 ćelija po bunarčLću) jedan dan pre dodavanja antitela i toksina: G401 ćelije Wilm tumora, HEK293T projektovane primenom retrovirusne transdukcije za ekspresiju PTK7 molekula na površini njihove ćelije (ovde označene kao 293.PTK7 ćelije) i HEK293T koji funkcionišu kao kontrola.
[0341] Za ovu analizu prečišćeni PTK7 modulatori u različitim koncentracijama dodati su u bunarčLće koji sadrže obložene ćelije. Nakon dodavanja modulatora, u bunarčLće je dodata fiksna količina anti-mišjeg IgG Fab fragmenta kovalentno vezana za saporin (Fab-ZAP, Advanced Targeting Systems, # IT-48) u koncentraciji od 4nM i kulture su inkubirane 72 h. Brojevi održivih ćelija određeni su kako je gore opisano pomoću CellTiter-Glo. Brojevi sirove luminiscencije korišćenjem kultura koje sadrže ćelije sa fragmentom saporin-Fab (ali bez modulatora) postavljeni su kao 100% referentne vrednosti, a svi ostali brojevi izračunati u skladu s tim (nazvano "Normalizovani RLU").
12
[0342] Koristeći ovu analizu, pokazano je da su sva testirana PTK7 antitela (ali ne i izotipska antitela za kontrolu) bila u stanju da ubiju ciljane ćelije (FIGS.11B - 11D) gde FIGS.11B, 11C i 11D ilustruju uticaj modulatora na ćelije G401, ćelije 293.PTK7 i HEK293T.
Podrazumevaće se da internalizacija i ubijanje posredovano modulatorom zavise od tipa ćelije (uporediti FIGS.11B - G401 ćelije i 11D - HEK293T ćelije), nivoa ekspresije PTK7 na ciljanim ćelijama (uporediti FIG.11C - 293.PTK7 ćelije i 11D - ćelije HEK293T) i unutrašnja sposobnost različitih modulatora da se internalizuju. Analiza dalje pokazuje da se internalizacija prvenstveno javlja zbog vezivanja PTK7-specifičnog antitela za ćelijsku površinu bez potrebe za dodatnim umrežavanjem. Na osnovu podataka korišćenih za generisanje kriva odgovora na dozu sa FIGS.11B - 11D (i slično izvedene vrednosti za dodatne modulatore - nisu prikazane) utvrđena je polumaksimalna efektivna koncentracija ("EC50") za svaki od testiranih kombinacija modulatora/ciljane ćelije. Preciznije, TABELA 5 neposredno ispod navodi EC50 (u pM) za trinaest modulatora, kako je utvrđeno za svaku od tri ciljane ćelije, koristeći test opisan odmah iznad. ND ukazuje na to da vrednost nije utvrđena.
TABELA 5 PTK7 Modulator Posredovan Dostavom Citotoksičnog Agensa
[0343] Iako su zabeležene neke varijacije u vezi sa ubijanjem među pojedinačnim modulatorima, postojali su neki opšti trendovi koji su vidljivi iz podataka u TABELI 5. S tim u vezi, modulatori su generalno bili efikasniji u posredovanju u ubijanju ćelija projektovanog PTK sa prekomernim izražavanjem 293 ćelija od bilo kojih G401 ćelija ili divlje vrste 293 ćelija. Interesantno je da su mnogi testirani modulatori bili relativno efikasni u posredovanju u ubijanju neinženjerskih G401 tumorskih ćelija za koje je poznato da eksprimiraju PTK7 na površini ćelije. Takvi ponovljivi rezultati su indikativni u pogledu terapijskog potencijala širokog spektra internalizovanih PTK7 modulatora kao što je ovde prikazano.
Primer 14
PTK7 Modulatori Olakšavaju Dostavu Citotoksičnih Agenasa Tumorskim ûelijama
[0344] Da bi potkrepili rezultate prethodnog primera i pokazali da PTK7 modulatori mogu da posreduju u internalizaciji toksina i ubijanju ćelija primarnih ćelija humanog tumora, NTX ćelije osiromašene lozom miša (odn., ćelije humanog tumora propagirane kao ksenografti niskog prolaza kod imunokompromitovanih miševa) su postavljene i naknadno izloženi anti-PTK7 antitelima i Fab-ZAP.
[0345] Konkretno, NTX tumori izvedeni iz pluća (LU), karcinoma jajnika (OV) i melanoma (SK) razdvojeni su u jednoćelijsku suspenziju i stavljeni na Primaria™ ploče (BD Biosciences) u medijume bez seruma koji su dopunjeni faktorima rasta koristeći uobičajenu stručnost tehnike koje favorizuju proliferaciju matičnih ćelija karcinoma. Posle 3-5 dana kulture na 37 °C/5% CO2/5% O2, ćelije su dovedene u kontakt sa izotipskim antitelom za kontrolu (IgG2a) ili jednim od tri mišja anti-PTK7 antitela (SC6.2.35, SC6.10.2 ili SC6.25.1 na 0.1 nM; - obeleženi SC6.H2, SC6.H10 i SC6.H25) i Fab-ZAP (na 40nM), kao što je uopšteno izloženo u prethodnom primeru. Potom je citotoksičnost saporina posredovana modulatorom procenjena kvantifikovanjem preostalog broja ćelija pomoću CellTiter Glo prema uputstvima proizvođDča 5-7 dana kasnije. Rezultati su normalizovani na neobrađene ćelije.
[0346] Kao što se vidi na FIG.12 izloženost svakom od testiranih modulatora (mada ne kontrola izotipa) rezultirala je smanjenim brojem održivih ćelija za sve tipove tumora. S tim u vezi, imaće na umu da količina ubijanja ćelija očigledno zavisi od specifične ćelijske linije tumora, kao i od određenog modulatora. Ovi podaci ukazuju na to da se modulatori predmetnog pronalaska mogu imunospecifično povezati sa različitim ćelijama koje eksprimiraju antigen iz različitih vrsta tumora, internalizovati i time posredovati u ubijanju
12
sastavnih ćelija. Štaviše, sposobnost otkrivenih modulatora da to učine u odnosu na NTX ćelijske linije kultiviranih pod uslovima koji favorizuju proliferaciju matičnih ćelija karcinoma kao što je prethodno opisano snažno ukazuje na njihovu sposobnost da selektivno eliminišu matične ćelije karcinoma.
Primer 15
PTK7 Modulatori Redukuju Matićne ûelije Tumorigenske ûelije
[0347] Da bi se dalje potvrdila sposobnost otkrivenih modulatora da smanje učestalost matičnih ćelija karcinoma i utiču na njihov tumorogeni potencijal, NTX ćelije tumora dojke su tretirane sa SC6.2.35 i potom implantirane u imunokompromitovane miševe.
[0348] S tim u vezi, dva NTX tumora izvedena od pacijenata sa rakom dojke (BR13 i BR64) razdvojena su i ćelije humanog tumora su kultivisane pod uslovima poznatim u struci za održavanje tumorogenih ćelija i tretirane PTK7 modulatorom (i kontrola izotipa) i Fab-ZAP kako je izloženo u prethodnom primeru. Citotoksičnost je zatim merena u smislu ćelijske održivosti pomoću Cell Titer Glo prema uputstvima proizvođDča četrnaest dana nakon tretmana. Ponovo su rezultati normalizovani na neobrađene ćelije.
[0349] Kao što se vidi na FIGS.13A i 13B, odnosno ćelije tumora dojke izvedene iz BR13 (FIG.13A) i iz BR64 (FIG.13B) su u velikoj meri eliminisane pomoću PTK7 modulatora posredovane imunospecifičnom asocijacijom i internalizacijom citotoksičnog agensa saporina. Preciznije, lečenje PTK7 modulatorom SC6.2.35 (SC6.H2) na 0.2 nM rezultirao je uklanjanjem približno 70-80% ćelija, dok ćelije lečene sa IgG2a kontrolom uglavnom nisu bile pogođene. Nalazi su u skladu sa rezultatima iz Primera 13 i dalje pokazuju široku primenljivost predmetnog pronalaska zasnovanog na sposobnosti otkrivenih modulatora da eliminišu ćelije koje održavaju tumor izvedene iz različitih tumora.
[0350] Da bi se potvrdilo da otkriveni modulatori eliminišu ćelije koje iniciraju tumor, tretirani preparati iz dve ćelijske linije raka dojke transplantirani su u miševe kako bi se utvrdilo da li ćelije koje iniciraju tumor ostaju žive. Preciznije, ćelije iz trostrukih bunarčLća su sakupljene nezavisno, isprane u PBS-u koji sadrži 2% BSA, resuspendovane u 100 ul i potom transplantirane u pojedinačne imunokompromitovane miševe, generalno koristeći postupke date u Primeru 1. Miševi su nadgledani nedeljno za rast tumora i bilo kojih tumora koji su nastali izmereni su za izračunavanje njihove zapremine. Samo miševi transplantirani sa ćelijama NTX BR13 i BR64 tretirani sa IgG kontrolom razvili su tumore, dok oni koji su
12
transplantirani sa ćelijama u kontaktu sa PTK7 modulatorima nisu. Ovi rezultati pokazuju da TIC eliminišu PTK7 modulatori koji mogu da posreduju u isporuci toksina (FIG.13C).
[0351] Pregled podataka pokazuje da implantacija živih ćelija preostalih nakon lečenja bilo koje ćelijske linije karcinoma dojke PTK7 modulatorom i saporinom ne rezultira stvaranjem tumora. Suprotno tome, kontrolne ćelije iz obe ćelijske linije raka dojke (odn., one koje su tretirane sa izotipskim kontrolnim antitelom) uspele su da ponovo pokrenu rast tumora nakon implantacije. Konkretno, dva od tri miša implantirana sa svakom kontrolnom ćelijskom linijom (BR22 i BR64) razvila su merljive tumore, što ukazuje da implantirane ćelije uključuju ćelije koje održavaju tumor. Još važnije, nemogućnost ćelija tretiranih modulatorom da formiraju tumore snažno implicira da ćelije koje su implantirane nisu uključivale ćelije koje održavaju tumor. Odnosno, verovatno je da je tretman kombinacijom PTK7 modulatora/saporina selektivno ciljao i eliminisao ćelije koje održavaju tumor u skladu sa predmetnim pronalaskom. U svakom slučaju ovi podaci pokazuju da je lečenje otkrivenim modulatorima efikasano u smanjenju tumorogenih potencijala tumorskih ćelija.
Primer 16
Humanizovani PTK7 Modulatori Posreduju Dostavu Citotoksičnih Agenasa
[0352] Kako će poželjni slučajevi predmetnog pronalaska verovatno koristiti humanizovane PTK7 modulatore u terapijskom podešavanju, izveden je rad da se pokaže da humanizovana antitela na PTK7 (proizvedena kako je prikazano u Primeru 8) funkcionišu kao efikasni medijatori ubijanja ćelija isporukom citotoksičnih agenasa.
[0353] Preciznije, tri primerna humanizovana PTK7 modulatora (hSC6.23, hSC6.58 i hSC6.24) su korišćena da posreduju u uvođenju citotoksičnog korisnog tereta i eliminišu tumorske ćelije u skladu sa ovde navedenim učenjima. Uopšteno, koristeći protokol izložen u Primeru 13 iznad, ćelije HEK293 projektovane da eksprimiraju PTK7 (odn., ćelije 293.PTK7) bile su izložene različitim koncentracijama izabranih modulatora i saporinom povezani sa anti-humanim Fab (Fab-ZAP human, Advanced Targeting Systems ). Nakon inkubacije, ćelije su isprane, a citotoksičnost saporina posredovan modulatorom je procenjena kvantifikovanjem preostalog broja ćelija pomoću CellTiter Glo prema uputstvima proizvođDča 5-7 dana kasnije. Rezultati su normalizovani na neobrađene ćelije i grafički su predstavljeni u FIG.14.
12
[0354] Ispitivanje krivih prikazanih na FIG.14 pokazuje da su sva tri testirana PTK7 modulatora bila vrlo efikasna u indukovanju internalizacije citotoksičnog korisnog tereta smanjujući održivost ćelija. S tim u vezi, svaki od modulatora obezbedio je 50% redukcije u ćelijskoj održivosti u koncentraciji između 1 i 10 pM i redukcije veće od 80% održivosti ćelije pri koncentraciji od 100 pM. Opet, u skladu sa predmetnim pronalaskom, ovi podaci ukazuju na visoko efikasne modulatore koji mogu imunospecifično da posreduju u isporuci citotoksičnih agenasa odabranim populacijama ćelija.
[0355] Shodno tome, predmetni pronalazak nije ograničen na određena rešenja koja su ovde detaljno opisana. Umesto toga, treba se pozvati na priložene patentne zahteve kao indikativne za obim i sadržaj pronalaska.
12
12
�
11
��
�
��
�
�
1
�
�
��
��
��
��
14
��
��
�
11
��
1
��
�
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
�
�
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2

Claims (19)

Patentni zahtevi
1. Himerno, CDR-graftovano, humanizovano ili rekombinovano humano antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment, koji se specifično veže za humani PTK7 i koji sadrži varijabilne regione lakog i teškog lanca, pri čemu:
(a) varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 24-34 SEQ ID NO: 62 za VLCDR1, ostaci 50-56 SEQ ID NO: 62 za VLCDR2, i ostaci 89-97 SEQ ID NO: 62 za VLCDR3, i varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 31-35 SEQ ID NO: 63 za VHCDR1, ostaci 50-65 SEQ ID NO: 63 za VHCDR2, i ostaci 95-102 SEQ ID NO: 63 za VHCDR3, pri čemu CDR brojanje je prema Kabat;
(b) varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 23-34 SEQ ID NO: 62 za VLCDR1, ostaci 50-56 SEQ ID NO: 62 za VLCDR2, i ostaci 89-97 SEQ ID NO: 62 za VLCDR3, i varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 26-32 SEQ ID NO: 63 za VHCDR1, ostaci 50-58 SEQ ID NO: 63 za VHCDR2, i ostaci 95-102 SEQ ID NO: 63 za VHCDR3, pri čemu CDR brojanje je prema Chothia; ili
(c) varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 30-36 SEQ ID NO: 62 za VLCDR1, ostaci 46-55 of SEQ ID NO: 62 za VLCDR2, i ostaci 89-96 of SEQ ID NO: 62 za VLCDR3, i varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 30-35 SEQ ID NO: 63 za VHCDR1, ostaci 47-58 SEQ ID NO: 63 za VHCDR2, i ostaci 93-101 SEQ ID NO: 63 za VHCDR3, pri čemu CDR brojanje je prema MacCallum.
2 Himerno, CDR-graftovano, humanizovano ili rekombinovano humano antitelo, ili njegov antigenski vezujući fragment, koji se specifično veže za humani PTK7 i koji sadrži varijabilne regione lakog i teškog lanca, pri čemu:
(a) varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 24-34 SEQ ID NO: 64 za VLCDR1, ostaci 50-56 SEQ ID NO: 64 za VLCDR2, i ostaci 89-97 SEQ ID NO: 64 za VLCDR3, i varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 31-35 SEQ ID NO: 65 za VHCDR1, ostaci 50-65 SEQ ID NO: 65 za VHCDR2, i ostaci 95-102 SEQ ID NO: 65 za VHCDR3, pri čemu CDR brojanje je prema Kabat;
(b) varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 23-34 SEQ ID NO: 64 za VLCDR1, ostaci 50-56 SEQ ID NO: 64 za VLCDR2, i ostaci 89-97 SEQ ID NO: 64 za VLCDR3, i varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 26-32 SEQ ID NO: 65 za VHCDR1, ostaci 50-58 SEQ ID NO: 65 za VHCDR2, i ostaci 95-102 SEQ ID NO: 65 za VHCDR3; pri čemu CDR brojanje je prema Chothia; ili
(c) varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 30-36 SEQ ID NO: 64 za VLCDR1, ostaci 46-55 SEQ ID NO: 64 a VLCDR2, i ostaci 89-96 SEQ ID NO: 64 za VLCDR3; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDRs postavljeni kao ostaci 30-35 SEQ ID NO: 65 za VHCDR1, ostaci 47-58 SEQ ID NO: 65 za VHCDR2, i ostaci 93-101 SEQ ID NO: 65 za VHCDR3; pri čemu CDR brojanje je prema MacCallum.
3. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema zahtevu 1 ili 2, koji sadrži:
(a) varijabilni region lakog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 60% identična sa SEQ ID NO: 62 i varijabilni region teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 60% identična sa SEQ ID NO: 63; ili
(b) varijabilni region lakog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 60% identična sa SEQ ID NO: 64 i varijabilni region teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 60% identična sa SEQ ID NO: 65.
4. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema zahtevu 1, koji sadrži varijabilni region lakog lanca posatvljen kao SEQ ID NO: 62, i varijabilni region teškog lanca postavljen kao SEQ ID NO: 63.
5. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema zahtevu 2, koji sadrži varijabilni region lakog lanca posatvljen kao SEQ ID NO: 64, i varijabilni region teškog lanca postavljen kao SEQ ID NO: 65.
6. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-5, koji je neutralizovano, iscrpljujuće antitelo, i/ili internalizovano antitelo.
7. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-6, koji se posebno vezuje za PTK7 izoformu odabran iz grupe koja se sastoji od izoforme a, izoforme b, izoforme c, i izoforme d.
8. Konjugat antitela koji sadrži antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-7, koje antitelo je konjugovano, povezano ili na neki drugi način povezano sa citotoksičnim agensom.
9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-7, ili konjugat antitela prema zahtevu 8.
10. Nukleinska kiselina koja kodira varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-7.
11. Vektor ili ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu prema zahtevu 10.
12. ûelija koja sadrži antitelo koje se specifično vezuje za humani PTK7, pri čemu ćelija sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju:
(a) varijabilni region lakog lanca postavljen kao SEQ ID NO: 62 i varijabilni region teškog lanca postavljen kao SEQ ID NO: 63; ili
(b) varijabilni region lakog lanca postavljen kao SEQ ID NO: 64 i varijabilni region teškog lanca postavljen kao SEQ ID NO: 65.
13. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-7 ili konjugat antitela prema zahtevu 8, za upotrebu kao farmaceutski proizvod.
14. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-7, za upotrebu u otkrivanju, dijagnostikovanju ili praćenju poremećaja povezanog sa PTK7 kod subjekta, pri čemu je poremećaj povezan sa PTK7 proliferativni poremećaj, koji je opciono neoplastični poremećaj koji sadrži čvrsti tumor, kao što su rak dojke, rak jajnika, kolorektalni rak, rak pankreasa, rak pluća ili rak kože.
15. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-7 ili konjugat antitela prema zahtevu 8, za upotrebu u lečenju poremećaja povezanih sa PTK7, pri čemu je poremećaj povezan sa PTK7 proliferativni poremećaj, koji je opciono neoplastični poremećaj sadrži solidan tumor, kao što su rak dojke, rak jajnika, kolorektalni rak, rak pankreasa, rak pluća ili rak kože.
16. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-7 ili konjugat antitela prema zahtevu 8, za upotrebu u smanjenju učestalosti ćelija koje iniciraju tumor kod subjekta.
2
17. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-7 za upotrebu u in vivo metodi otkrivanja, dijagnostikovanja ili praćenja poremećaja povezanog sa PTK7 kod subjekta, pri čemu je poremećaj povezan sa PTK7 proliferativni poremećaj, što je opciono neoplastični poremećaj koji sadrži solidan tumor, kao što su rak dojke, rak jajnika, kolorektalni rak, rak pankreasa, rak pluća ili rak kože.
18. In vitro postupak otkrivanja, dijagnostikovanja ili praćenja poremećaja povezanog sa PTK7 korišćenjem antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu je poremećaj povezan sa PTK7 proliferativni poremećaj, koji je opciono neoplastični poremećaj koji sadrži čvrsti tumor, kao što su rak dojke, rak jajnika, kolorektalni karcinom, pankreas, rak pluća ili rak kože.
19. Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment za primenu prema bilo kom od zahteva 14-15 ili 17 ili konjugat antitela za primenu prema zahtevu 15 ili postupak prema zahtevu 18, pri čemu poremećaj povezan sa PTK7 je rak.
RS20201138A 2011-02-18 2012-02-17 Novi modulatori i postupci primene RS60841B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161444614P 2011-02-18 2011-02-18
PCT/US2011/050451 WO2012031280A2 (en) 2010-09-03 2011-09-02 Identification and enrichment of cell subpopulations
PCT/US2012/025726 WO2012112943A1 (en) 2011-02-18 2012-02-17 Novel modulators and methods of use
EP12705776.8A EP2675827B1 (en) 2011-02-18 2012-02-17 Novel modulators and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60841B1 true RS60841B1 (sr) 2020-10-30

Family

ID=46672972

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201138A RS60841B1 (sr) 2011-02-18 2012-02-17 Novi modulatori i postupci primene

Country Status (32)

Country Link
US (3) US9409995B2 (sr)
EP (2) EP2675827B1 (sr)
JP (2) JP6296796B2 (sr)
KR (1) KR102022734B1 (sr)
CN (2) CN103547597B (sr)
AR (1) AR085281A1 (sr)
AU (3) AU2012219313C1 (sr)
BR (1) BR112013021134B1 (sr)
CA (1) CA2827637C (sr)
CO (1) CO6791571A2 (sr)
CY (1) CY1123551T1 (sr)
DK (1) DK2675827T3 (sr)
ES (1) ES2829206T3 (sr)
HR (1) HRP20201399T1 (sr)
HU (1) HUE050657T2 (sr)
IL (3) IL228018A (sr)
LT (1) LT2675827T (sr)
MX (1) MX356434B (sr)
MY (1) MY173880A (sr)
PE (2) PE20141028A1 (sr)
PH (2) PH12013501710A1 (sr)
PL (1) PL2675827T3 (sr)
PT (1) PT2675827T (sr)
RS (1) RS60841B1 (sr)
RU (2) RU2627176C2 (sr)
SA (1) SA112330278B1 (sr)
SG (2) SG192816A1 (sr)
SI (1) SI2675827T1 (sr)
SM (1) SMT202000556T1 (sr)
TW (2) TWI696635B (sr)
WO (1) WO2012112943A1 (sr)
ZA (1) ZA201306958B (sr)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130061340A1 (en) * 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
EP2611463A2 (en) 2010-09-03 2013-07-10 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US9778264B2 (en) 2010-09-03 2017-10-03 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
SA112330278B1 (ar) * 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
EP2729496B8 (en) 2011-07-06 2017-10-18 Genmab A/S Modulation of complement-dependent cytotoxicity through modifications of the c-terminus of antibody heavy chains
WO2014089493A1 (en) * 2012-12-07 2014-06-12 Vanderbilt University Antibodies against factor xii and uses thereof
EP3016983B1 (en) * 2013-07-04 2018-05-16 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. A new fusion protein to target and treat acute myloid leukemia cells
WO2015157976A1 (zh) * 2014-04-17 2015-10-22 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 细胞分析方法和系统、装置
US9777070B2 (en) * 2014-04-30 2017-10-03 Pfizer Inc Anti-PTK7 antibody-drug conjugates
BR112019019595A2 (pt) * 2017-03-23 2020-04-14 Univ Pennsylvania anticorpo, métodos para tratar uma doença ou distúrbio mediado pela via do complemento em um indivíduo e para reduzir a atividade de um sistema complemento de um indivíduo, e, célula
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
JP2021516045A (ja) 2018-02-28 2021-07-01 ファイザー・インク Ｉｌ−１５バリアントおよびその使用
SI3797121T1 (sl) 2018-05-23 2024-09-30 Pfizer Inc. Protitelesa, specifična za CD3, in njihova uporaba
MX2020012607A (es) 2018-05-23 2021-01-29 Pfizer Anticuerpos especificos para gucy2c y sus usos.
US12247084B2 (en) 2018-06-14 2025-03-11 2Seventy Bio, Inc. Anti-BCMA CAR antibodies, conjugates, and methods of use
WO2020014175A1 (en) * 2018-07-10 2020-01-16 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for analyzing immortalized megakaryocyte progenitor cell lines and platelet-like particles derived therefrom
WO2020095248A1 (en) 2018-11-07 2020-05-14 Crispr Therapeutics Ag Anti-ptk7 immune cell cancer therapy
WO2020128893A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Pfizer Inc. Combination treatments of cancer comprising a tlr agonist
US11339159B2 (en) 2019-07-17 2022-05-24 Pfizer Inc. Toll-like receptor agonists
US12545746B2 (en) 2019-12-16 2026-02-10 2Seventy Bio, Inc. Anti-BCMA car antibodies, conjugates, and methods of use
JP7369297B2 (ja) 2019-12-17 2023-10-25 ファイザー・インク Ｃｄ４７、ｐｄ－ｌ１に特異的な抗体、およびその使用
AU2020410418A1 (en) 2019-12-18 2022-06-09 Pfizer Inc. Once daily cancer treatment regimen with a PRMT5 inhibitor
WO2021168734A1 (zh) * 2020-02-27 2021-09-02 世延生医股份有限公司 基质金属蛋白酶1的单克隆抗体、其检测试剂盒及其检测方法
CA3174908A1 (en) 2020-03-09 2021-09-16 Pfizer Inc. Fusion proteins and uses thereof
CA3182887A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Pfizer Inc. Methods, therapies and uses for treating cancer
KR102678735B1 (ko) * 2020-07-16 2024-06-26 연세대학교 산학협력단 Ptk7에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
US12605433B2 (en) 2020-07-16 2026-04-21 Uif (University Industry Foundation), Yonsei University Antibody specifically binding to PTK7 and use thereof
TW202216779A (zh) 2020-07-17 2022-05-01 美商輝瑞股份有限公司 治療性抗體類和彼等之用途
WO2022053990A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Pfizer Inc. Methods, therapies and uses for treating cancer
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
WO2022153161A1 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Pfizer Inc. Treatment of cancer using a prmt5 inhibitor
CN115894696A (zh) * 2021-08-18 2023-04-04 和迈生物科技有限公司 抗ptk7单域抗体及其应用
WO2023108101A1 (en) * 2021-12-09 2023-06-15 Emory University Antibodies that inhibit glycoprotein ib-ix mediated platelet signaling and uses in managing bleeding conditions
WO2023218320A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Anti-lymphotoxin beta receptor antibodies and methods of use thereof
WO2023242769A1 (en) 2022-06-17 2023-12-21 Pfizer Inc. Il-12 variants, anti-pd1 antibodies, fusion proteins, and uses thereof
WO2024003773A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Pfizer Inc. 2,7-naphthyridine compounds as mastl inhibitors
MA71388A (fr) 2022-07-05 2025-04-30 Pfizer Inc. Composés pyrido[4,3-d]pyrimidines
GB202212077D0 (en) 2022-08-18 2022-10-05 Tribune Therapeutics Ab Agents that inhibit ccn ligand-induced signalling for treating disease
WO2024074977A1 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Pfizer Inc. Substituted 1 h-pyrazolo-pyridine and-pyrimidine compounds
AU2023360382A1 (en) * 2022-10-14 2025-04-24 Kyoto University Antibody and use thereof
CN120379671A (zh) 2022-10-18 2025-07-25 辉瑞公司 用于治疗癌症的化合物
WO2024105563A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Pfizer Inc. Substituted bicyclic pyridone derivatives
JP2026509932A (ja) * 2023-03-23 2026-03-25 バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド 抗体及びその使用
WO2024209339A1 (en) 2023-04-05 2024-10-10 Pfizer Inc. Pyrido[4,3-d]pyrimidine compounds
WO2024213979A1 (en) 2023-04-10 2024-10-17 Pfizer Inc. Pyrido[4,3-d]pyrimidine compounds
WO2024218686A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Pfizer Inc. Pyrido[4,3-d]pyrimidine compounds
WO2025032521A1 (en) 2023-08-10 2025-02-13 Pfizer Inc. Methods, therapies and uses for treating cancer
WO2025094035A1 (en) 2023-11-01 2025-05-08 Pfizer Inc. Toll-like receptor agonists and conjugates thereof
CN120098124A (zh) * 2023-12-05 2025-06-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗bdca-2抗体及其制备方法和应用
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
US12534529B1 (en) 2024-11-19 2026-01-27 Solve Therapeutics, Inc. PTK7-binding proteins

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4265551A (en) 1977-07-13 1981-05-05 U.S. Philips Corporation Drive for transporting and reversing an ink ribbon, and for withdrawing the printing head in printing devices
US4111824A (en) 1977-07-21 1978-09-05 Gulf Research & Development Co. Liquid dielectric composition based on a fraction derived from the alkylation product of benzene with ethylene
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
AU584417B2 (en) 1985-04-01 1989-05-25 Lonza Group Ag Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
DE69132709T2 (de) 1990-06-29 2002-06-20 Large Scale Biology Corp., Vacaville Melaninproduktion durch transformierte mikroorganismen
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
DE69123241T2 (de) 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
EP0575485A1 (en) 1991-03-01 1993-12-29 Dyax Corp. Process for the development of binding mini-proteins
DK0580737T3 (da) 1991-04-10 2004-11-01 Scripps Research Inst Heterodimere receptorbiblioteker ved anvendelse af phagemider
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
JPH08501085A (ja) 1992-08-26 1996-02-06 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 抗腫瘍剤としてのサイトカインｉｐ−１０の利用
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
MD1367C2 (ro) 1992-11-13 2000-11-30 Idec Pharmaceuticals Corporation Metode de tratament al limfomului celulelor B, anticorpi anti-CD20, hibridom.
DE69424687T2 (de) 1993-03-09 2000-09-07 Genzyme Corp., Cambridge Verfahren zur isolierung von proteinen aus milch
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
JPH10503371A (ja) 1994-07-29 1998-03-31 スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー 新規化合物
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
AU725609C (en) 1995-08-18 2002-01-03 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
WO1997034911A1 (en) 1996-03-22 1997-09-25 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule ii
WO1998052976A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
AU753157B2 (en) 1997-11-03 2002-10-10 Georgetown University Medical Center VEGI, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
WO2000034317A2 (en) 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Kyowa Kirin Co., Ltd. The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
EP2206720A1 (en) 2000-04-12 2010-07-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ES2639222T5 (es) 2000-10-06 2023-11-24 Kyowa Kirin Co Ltd Células que producen unas composiciones de anticuerpo
CA2424977C (en) 2000-10-06 2008-03-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7138496B2 (en) 2002-02-08 2006-11-21 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against human CXCR4
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
CA2467633C (en) 2001-12-03 2012-03-27 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
AU2003217930A1 (en) 2002-03-04 2003-09-22 Medimmune, Llc The prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents
GB0219776D0 (en) * 2002-08-24 2002-10-02 Oxford Glycosciences Uk Ltd A protein involved in carcinoma
WO2004028551A1 (en) 2002-09-24 2004-04-08 The Burnham Institute Novel agents that modulate eph receptor activity
WO2004029207A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Xencor Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2004072266A2 (en) 2003-02-13 2004-08-26 Kalobios Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
DK1633784T3 (da) 2003-05-09 2011-10-24 Diadexus Inc OVR110 antistofsammensætninger og -anvendelsesfremgangsmåder
RU2366716C2 (ru) * 2003-10-24 2009-09-10 Эсбатек Аг Способ идентификации и/или проверки ингибиторов рецепторных тирозинкиназ
MX2007001221A (es) 2004-08-04 2007-03-23 Amgen Inc Anticuerpos para proteina dickkopf-1 (dkk-1).
EP1778726A4 (en) 2004-08-16 2009-03-18 Medimmune Inc INTEGRIN ANTAGONISTS WITH IMPROVED ANTIBODY-DEPENDENT CELL-ASSAYED CYTOTOXICITY ACTIVITY
US8222253B2 (en) 2004-10-23 2012-07-17 Case Western Reserve University Peptide and small molecule agonists of EphA and their uses
US20090304721A1 (en) 2005-09-07 2009-12-10 Medlmmune, Inc Toxin conjugated eph receptor antibodies
US20070123448A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 The Hospital For Sick Children Novel chemical entities affecting neuroblastoma tumor-initiating cells
EA017812B1 (ru) * 2005-12-08 2013-03-29 Медарекс, Инк. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые связываются с протеинтирозинкиназой 7 ( ptk7) человека, и их применение
WO2007080457A2 (en) 2005-12-30 2007-07-19 Institut Gustave Roussy Use of inhibitors of scinderin and/or of ephrin-a1 for treating tumors
US8343461B2 (en) 2006-03-08 2013-01-01 Wake Forest University Health Sciences Molecular signature of cancer
KR101516823B1 (ko) 2006-03-17 2015-05-07 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 안정화된 폴리펩티드 조성물
EP2032694A4 (en) 2006-06-06 2010-09-15 Univ Tennessee Res Foundation COMPOSITIONS ENRICHED WITH NEOPLASTIC STEM CELLS AND THESE COMPREHENSIVE METHODS
ES2646545T3 (es) 2006-09-07 2017-12-14 Arthur E. Frankel Métodos y composiciones basadas en conjugados de toxina diftérica-interleucina-3
KR101523698B1 (ko) 2007-01-22 2015-05-29 마크로제닉스 웨스트 인코퍼레이티드 사람 암 줄기세포
WO2008149803A1 (ja) * 2007-06-06 2008-12-11 The University Of Tokyo 表面抗原マーカーを用いた急性リンパ性白血病における癌幹細胞の分離同定方法
WO2009012357A2 (en) 2007-07-17 2009-01-22 The General Hospital Corporation Methods to identify and enrich for populations of ovarian cancer stem cells and somatic ovarian stem cells and uses thereof
EP2022848A1 (en) 2007-08-10 2009-02-11 Hubrecht Institut A method for identifying, expanding, and removing adult stem cells and cancer stem cells
CA2697922A1 (en) 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
WO2009043051A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
WO2009070767A2 (en) * 2007-11-28 2009-06-04 Whitehead Institute For Biomedical Research Systemic instigation systems to study tumor growth or metastasis
JP2011505146A (ja) * 2007-11-30 2011-02-24 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー タンパク質チロシンキナーゼ７（ｐｔｋ７）を対象とするモノクローナル抗体−パートナー分子複合体
KR101123130B1 (ko) * 2008-03-17 2012-03-30 연세대학교 산학협력단 Ｐｔｋ７ 단백질의 기능 저해를 통한 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제
US8384551B2 (en) 2008-05-28 2013-02-26 MedHab, LLC Sensor device and method for monitoring physical stresses placed on a user
EP2207803B1 (en) * 2008-06-25 2013-05-01 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Cd9-specific human antibodies
US20100162416A1 (en) 2008-09-29 2010-06-24 Stemlifeline, Inc. Multi-stage stem cell carcinogenesis
JP2012514458A (ja) * 2008-12-31 2012-06-28 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 抗リンホトキシン抗体
KR20110108390A (ko) 2009-01-12 2011-10-05 신텔렉트 인코포레이티드 레이저로 매개된 박막 절개 및 세포 군체의 이동
US20110020221A1 (en) 2009-04-09 2011-01-27 The Johns Hopkins University Cancer stem cell expression patterns and compounds to target cancer stem cells
US10817851B2 (en) 2009-12-23 2020-10-27 Aristocrat Technologies Australia Pty Limited System and method for cashless gaming
FR2964148A1 (fr) 2010-08-30 2012-03-02 Peugeot Citroen Automobiles Sa Boite de degazage destinee au circuit de refroidissement d'un moteur thermique de vehicule automobile
WO2013119964A2 (en) 2012-02-08 2013-08-15 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US20130061340A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
US20130061342A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
EP2611463A2 (en) 2010-09-03 2013-07-10 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US9778264B2 (en) 2010-09-03 2017-10-03 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
EP2446895A1 (en) 2010-10-01 2012-05-02 Stemgen S.P.A. EPH receptor expression in tumor stem cells
SA112330278B1 (ar) * 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
AU2014312215B2 (en) 2013-08-28 2020-02-27 Abbvie Stemcentrx Llc Site-specific antibody conjugation methods and compositions
US9777070B2 (en) * 2014-04-30 2017-10-03 Pfizer Inc Anti-PTK7 antibody-drug conjugates
EP3209334A2 (en) 2014-10-20 2017-08-30 Igenica Biotherapeutics, Inc. Novel antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods of use
US11392902B2 (en) 2017-06-06 2022-07-19 United Parcel Service Of America, Inc. Systems, methods, apparatuses and computer program products for providing notification of items for pickup and delivery

Also Published As

Publication number Publication date
PL2675827T3 (pl) 2021-01-25
KR20140018905A (ko) 2014-02-13
IL263020A (en) 2018-12-31
BR112013021134B1 (pt) 2022-12-27
NZ615285A (en) 2015-09-25
EP3763388A1 (en) 2021-01-13
US9409995B2 (en) 2016-08-09
US20140105888A1 (en) 2014-04-17
IL254062B (en) 2018-11-29
SMT202000556T1 (it) 2020-11-10
PH12013501710A1 (en) 2013-10-07
IL228018A (en) 2017-09-28
TWI696635B (zh) 2020-06-21
EP2675827B1 (en) 2020-08-05
AU2019201258A1 (en) 2019-03-14
RU2627176C2 (ru) 2017-08-03
AR085281A1 (es) 2013-09-18
AU2012219313A1 (en) 2013-05-02
DK2675827T3 (da) 2020-09-07
JP2018104409A (ja) 2018-07-05
HRP20201399T1 (hr) 2020-11-27
TWI624476B (zh) 2018-05-21
ZA201306958B (en) 2022-03-30
IL254062A0 (en) 2017-10-31
RU2013141976A (ru) 2015-03-27
PE20181076A1 (es) 2018-07-04
US20180162952A1 (en) 2018-06-14
SG192816A1 (en) 2013-09-30
CN103547597A (zh) 2014-01-29
SI2675827T1 (sl) 2020-11-30
JP6296796B2 (ja) 2018-03-28
AU2012219313B2 (en) 2017-02-02
HUE050657T2 (hu) 2021-01-28
NZ708615A (en) 2017-02-24
CA2827637A1 (en) 2012-08-30
CN103547597B (zh) 2017-03-15
BR112013021134A8 (pt) 2017-07-11
AU2017202934A1 (en) 2017-05-25
KR102022734B1 (ko) 2019-09-19
CN107056945A (zh) 2017-08-18
US9914784B2 (en) 2018-03-13
EP2675827A1 (en) 2013-12-25
RU2017126476A (ru) 2019-01-31
CA2827637C (en) 2020-08-11
CY1123551T1 (el) 2022-03-24
MY173880A (en) 2020-02-26
WO2012112943A1 (en) 2012-08-23
SG10201603926SA (en) 2016-07-28
AU2012219313C1 (en) 2017-05-25
US20160272723A1 (en) 2016-09-22
IL228018A0 (en) 2013-09-30
TW201309729A (zh) 2013-03-01
SA112330278B1 (ar) 2015-10-09
BR112013021134A2 (pt) 2016-11-29
US10836831B2 (en) 2020-11-17
TW201800421A (zh) 2018-01-01
PE20141028A1 (es) 2014-08-30
LT2675827T (lt) 2020-10-26
PT2675827T (pt) 2020-10-29
MX356434B (es) 2018-05-29
ES2829206T3 (es) 2021-05-31
CO6791571A2 (es) 2013-11-14
PH12018500452A1 (en) 2019-11-18
JP2014511179A (ja) 2014-05-15
MX2013009541A (es) 2014-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10836831B2 (en) Anti-PTK7 antibodies and methods of use
US9969798B2 (en) Modulators and methods of use
EP2611464B1 (en) Novel modulators and methods of use
WO2012019061A2 (en) Novel effectors and methods of use
HK40044653A (en) Novel modulators and methods of use
HK1191031A (en) Novel modulators and methods of use
HK1191031B (en) Novel modulators and methods of use