RS61204B1

RS61204B1 - Anti-pd-1 antitela

Info

Publication number: RS61204B1
Application number: RS20201518A
Authority: RS
Inventors: Daniel E H Afar; Fiona A Harding; Josue Samayoa
Original assignee: Abbvie Biotherapeutics Inc
Priority date: 2016-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2021-01-29
Also published as: HUE051700T2; BR112019004998A2; IL265179A; CR20190199A; PT3512547T; EP3512547A1; EP3512547B1; ES2837755T3; HRP20201993T1; US10730953B2; IL265179B2; CO2019003154A2; JP2019533989A; CA3035932A1; CN109789205B; CY1123642T1; CL2019003627A1; JP7079773B2; SI3512547T1; PL3512547T3

Description

Opis

1. UPUĆIVANJE NA SRODNE PRIJAVE

[0001] Ova prijava zahteva prvenstvo prema 35 USC § 119 (e) Privremene prijave SAD br.62 / 394,314, podnete 14. septembra 2016. godine, koja je sadržana ovde u celosti referentnim pozivanjem.

2. SPISAK SEKVENCI

[0002] Ova prijava sadrži listu sekvenaca koja je elektronski podneta u formatu ASCII i ovim putem uključena u celosti u referenci. Navedena ASCII kopija, nastala 10. avgusta 2017. godine, je pod nazivom 381493-327WO_SL.txt i veličine je 33.195 bajtova.

3.OBLAST TEHNIKE

[0003] Predmetna prijava odnosi se, između ostalog, na nova antitela anti-PD-1, uključujući kompozicije novih antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju antitela i metode njihovog pravljenja i upotrebe. Detaljno je u nastavku navedena da tehnička otkrića mogu u nekim pogledima prevazići otkrivanje pronalaska per se, a takođe mogu pružaiti tehničku podlogu za srodna tehnička dostignuća. Biće zahvalno što dodatni tehnički pružena pozadina nije namenjena definisanju pronalaska kao takvog (koji je definisan isključivo priloženim tvrdnje), već da se stavi u širi tehnički kontekst. Shodno tome, smatraće se da izrazi "ostvarenja", „aspekti“, „predmet“ odražavaju određene detalje obelodanjivanja, ali ukoliko se odnose na deo dodatnu tehničku pozadinu, nisu namenjeni definisanju kao dela predmeta pronalaska koji ne spada u obim priloženih zahteva.

4. STANJE TEHNIKE

[0004] Terapija raka sadrži širok spektar terapijskih pristupa, uključujući hirurgiju, zračenje i hemoterapiju. Dok različiti pristupi omogućavaju širok izbor dostupnih tretmana stručnom osoblju za lečenje raka, postojeća terapeutike ima brojne nedostatke, kao što je selektivnost uočavanja ćelija raka u odnosu na normalne, I razvoj otpora raka na tretmane.

[0005] Nedavni pristupi zasnovani na ciljanoj terapeutici, koji ometaju celularne procese ćelija raka preferencijalno nad normalnim ćelijama, doveli su do hemoterapeutskih režima sa manjim brojem neželjenih dejstava u poređenju sa neciljanim terapijama kao što je lečenje zračenjem.

[0006] Imunoterapija raka pojavila se kao perspektivni terapijski pristup koji dopunjuje postojece standarde nege. Videti, na primer, Miller, itd. Ćelija raka, 27, 439-449 (2015). Takvi imunoterapijski pristupi uključuju razvoj antitela korišćenih za modulaciju imunog sistema radi ubijanja ćelija raka.

[0007] Na primer, interakcija PD-1, površinskog receptora tipa I, sa bilo kojim od njegova dva liganda, PD-L1 ili PD-L2, rezultira dominantnim negativnim signalnim kontrolnim tačkama koji ograničavaju naknadnu celijsku aktivaciju antigena recepta. liganada za PD-1 se različito eksprimira na različitim tkivima i tipovima ćelija, uključujući ćelije imunog sistema koje prezentuje antigen, i povezuju se na mnogim otvorima tumorskih ćelija PD-L1. Ako je predložen mehanizam na tumoru da podriju zaštitne antitumorske imune od strane stranih domaćina. Antitela usmerena anti-PD-1 koja blokira u interakciji receptora sa bilo kojim od njegovih ligada rezultirala u inhibiciji od negativnog signalizacije. U vitro inhibici anti-PD-1 posredovanim kontrolnim tačkama signal je bio prikazan da rezultuje u dugotrajnom antigen-specifičnom aktivacija T ćelija. Pokazalo se da blokada PD-1 in vivo pojačava antitumorski imuni odgovor kako u modelima sintetičkih tumora miša, tako i u kliničkim ispitivanjima na ljudima.

[0008] Imunološki odgovori protiv tumore kod pacijenata sa čvrstim tumorima pojačani su lečenjem anti- PD-1. Postoji dva odobrena i plasirana na tržište antagonistična anti-PD-1 monoklonska antitela: nivoumab (OPDIVO®) i pembrolizumab (KEITRUDA®), odobrena u SAD-u i Evropskoj uniji za lečenje metastatičnog malignog melanoma ili malignog melanoma koji ne može da se ukloni operacijom I metastatičnog nemikrocelularnog karcinoma pluća. Lečenje pacijenata sa ovim agentima je rezultiralo antitumorskim odgovorima merenim pobošnjavanjem ili preživljavanjem bez progresije bolesti i / ili celokupnim preživljavanjem.

[0009] Nedavni neuspeh OPDIVO®-a da uspori napredovanje uznapredovalog karcinoma pluća u populaciji pacijenata koji nisu lečeni u kliničkom ispitivanju, u poređenju OPDIVO® sa konvencionalnim hemoterapijskim preparatima, stavlja akcenat na potrebu za alternativnim pristupima i dodatnim tretmanima kancera kao dodacima postojećih terapeutskih standarda nege.

5. KRATAK OPIS

[0010] U ovom izvođenju predmetnog pronalaska, obezbeđuju se anti-PD-1 antitela i njihovi fragmente vezivanja koji se posebno vezuju za PD-1. Sekvence aminokiselina primera CDR, kao i aminokiselinska sevenca VHi VLregiona teškog i lakog lanca uzornog anti-PD-1 antitela koji su obezbeđeni u detaljnom opisu dalje u tekstu. Antitela iz ovog teksta ometaju interakciju PD-1 receptora sa bilo kojim od njegovih liganada (PD-L1, SEK ID NO: 3; PD-L2, SEK ID NO: 4), zbog čega rezultiraju inhibicijskim negativnim signalizacijama i povećanjem adaptivnih imunoloških odgovora.

[0011] Anti-PD-1 antitela mogu da uključuju modifikacije i / ili mutacije koje menjaju osobenosti antitela, kao što su poćanje poluživota, povćanje ili smanjenje ADCC itd., kao što je poznato u tehnici.

[0012] Nukleinske kiseline sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju i anti-PD-1 antitela ovog opisa, kao i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Dodatno, prokariotske i eukarioti domaćinske ćelije transformisane sa vektorom koji sadrže jednu nukleotidnu sekvencu koja kodira obelodanjeno anti-PD-1 antitelo su opisana ovde u tekstu, kao i eukariotske (kao kod sisara) domaćinske ćelije napravljene za izražavanje nukleotidnih sekvenci. Metodi proizvodnje antitela, po kultivisanju domaćinskih ćelija i oporavka antitela su takođe obezbeđeni i prodiskutovani dalje u tekstu u delu detaljnog opisa.

[0013] U drugom aspektu, ovo izvođenje predmetnog pronalaska daje kompoziciju uključujući i ovde opisana anti- PD-1 antitela. Kompozicije generalno sadrže jedno ili više anti-PD-1 antitelo, kao opisano ovde, i / ILI njegove soli i jednu ili više pomoćnih sastojaka, nosača ili razblaživača.

[0014] Ovo otkriće pruža metode lečenja subjekata, kao što su ljudi, kojima je dijagnostikovana čvrsta supstanca tumor ili maligni tumor krvi sa antitelom anti- PD-1. Metoda generalno uključuje davanje subjektu količinu ovde opisanog antitela anti- PD-1 efikasna za pružanje terapijske koristi. Subjektu se može dijagnostikovati sa bilo kojim od brojnih solidnih tumora ili malignih tumora u krvi koji mogu biti novo dijagnostikovani, recidivni ili recidivni i vatrostalni. Antitelo anti-PD-1 se obično daje u obliku intravenske infuzije dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom u četiri nedelje, jednom u pet nedelja, jednom u šest nedelja, jednom u sedam nedelja ili jednom u osam nedelja.

[0015] Anti-PD-1 antitelo može se dati kao pojedinačno terapijsko sredstvo (monoterapija) ili kao dodatak drugim terapijskim agentima ili sa njima, tipično, ali ne obavezno ,sa onima koji se koriste za lečenje čvrstih tumore ili maligniteta krvi. Terapijska sredstva se obično koriste u korelaciji sa odobrenim dozama, načinima davanja i učestalošću primene, ali se mogu koristiti i u nižim dozama.

[0016] Anti-PD-1 antitela se mogu uneti na različite načine ili moduse primene, uključujući, ali bez ograničenja na, intravensku infuziju i / ili inekciju, intratomoralnu injekciju i potkožnu injekciju. Količina koja se primenjuje zavisi od načina davanja, režima doziranja, svih karcinoma koji se leče, stadijumi karcinoma koji se leče i drugim parametrim kao što su starost i težina pacijenta, kao što je već dobro poznato u ovoj struci. Konkretni uzorni rasporedi doziranja za koje se očekuje da će pružiti terapeutsku korist, opisani su u Detaljnom opisu.

6. KRATAK OPIS SLIKA

SLIKE 1A-1B prikazuju aminokiselinske sekvence humanog PD-1 (SEK ID NO: 1), mišjeg PD-1 (SEK ID NO: 2), humanog PD-L1 (SEK ID NO: 3) i humani PD-L2 (SEK ID NO: 4).1A prikazuje sekvence ljudi i miševa PD-1; 1B prikazuje sekvence humanih PD-L1 i PD-L2.

SLIKA.2 prikazuju aminokiselinske sekvence VHi VLregiona u primerima antitela anti- PD-1 iz ovog pronalaska.

SLIKE 3A-3C pokazuju efekte oksidativnih i promenljivih temperaturnih uslova na primer humanizovanih antitela Hu12A11.2b1 i njegove tačkaste mutacije na Kabatu 99 u CDR-H3. SLIKA.3A prikazuje vezivanje za PD-1 u Jurkat ćelijama Hu12A11.2b1 čuvan na -80, 5, 25 ili 40 ° C tokom 30 dana ili nakon što je podvrgnut oksidacionim uslovima (1% vodonik peroksid, "1% HP"; ili 1% terc-butil hidroperoksida, "1% TBHP"); SLIKA. 3B prikazuje vezivanje antitela anti-PD-1 Hu12A11,2b1, Hu12A11.2b2, Hu12A11.2b3 i Hu12A11.2b4; SLIKA.3C prikazuje vezivanje Hu12A11.2b4 za PD-1 u Jurkat ćelijama nakon inkubacije na -80, 5, 25 ili 40 ° C tokom 30 dana.

SLIKE 4A-4B pokazuju biološku aktivnost nivolumaba i Hu12A11.2b4 u mešovitom odgovoru leukocita (MLR) I testovi opoziva tetanusnog toksoidnog antigena. SLIKA 4A pokazuje poboljšanje nivoa IL-2 ili interferona-gama (IFN-i) nakon lečenje sa 10 mg / ml nivolumaba, Hu12A11.2b4 ili kontrolom izotipa u mešovitim kulturama leukocita. SLIKA 4B. Emisije 4B dozazavisni odgovor nivoalumaba, Hu12A11.2b4 ili kontrola izotipa na pojačanje IFN-γ u tetanusnom toksoidu test odgovora.

7. DETALJAN OPIS

[0018] U ovom izvođenju predmetnog pronalaska, sve se odnosi na antitela I njegove fragmente koji specifično vezuju anti- PD-1, kompozicije koje sadrže antitela, polinukleotide koji kodiraju anti-PD-1 antitela, domaće ćelije sposobne za proizvodnju antitela, i kompozicije I metode za pravljenje antitela I vezujuće fragmente, kao i različite metode koji koriste iste.

[0019] Kao što će biti cenjeno od strane kvalifikovanih stručnjaka, antitela su "modularna" po prirodi. Kroz ovo izvođenje predmetnog pronalaska, različite specifične realizacije različitih „moduli“koji sadrže antitela su ovde opisani. Kao specifični nespecifikovani primeri, opisani su različita specifična otelotvorenjaVHCDR-ova,VHlanaca, VLCDR-ova i VLlanaca. Namera je da se sva specifična otelotvorenja mogu kombinovati jedni sa drugim iako je svaka od specifičnih kombinacija eksplicitno opisana pojedinačno.

7.1 Skraćnice

<[>0020] Ovde su opisane antitele, vezujući fragmenti i polinukleotidi, koji su u mnogim realizacijama, opisani putem njihovih odgovorajućih polipeptidnih ili polinukleotidnih sevenci. Ako nije drugačije naznačeno, polipeptidne posledice su date u orijentaciji N →C; polinukleotidne sekvence u orijentaciji 5 '→ 3'. Za polipeptidne sekvence, - klasične tri ili jednoslovne skraćenice mogu se koristiti, za generalno kodirane aminokiseline, kao što je navedeno u Tabelama 1 u nastavku.

<[>0021] Određene sekvence su definisane strukturnim formulama koje određuju aminokiselinske ostatke koje pripadaju određenim klasama (npr. Alifatske, hidrofobne itd.). Različite klase kojima pripadaju genetski kodirane aminokiseline, kako se ovde koriste, zabeležene su u TABELI 2, dole. Neke aminokiseline mogu da pripadaju više klasa. Cisteinu, koji sadrži sulfidrilnu grupu, i prolinu, koji je konformaciono ograničen, nisu dodeljene klase.

<[>0022] Skraćenice korišćene za različita primerna antitela opisana ovde su prikazana u Tabeli 3, ispod:

7.2 Definicije

[0023] Ako ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički izrazi koji se koriste u vezi sa ovim izvođenjem predmetnog pronalaska, imaju značenja koja uobičajeno razumeju oni koji su stručni u ovoj oblasti.

7.3. Аnti-PD-1 аntitela i vezujući fragenti

[0024] U jednom aspektu, ovo izvođenje predmetnog pronalaska odnosi se na antitela i / ili njihove vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za programirani proteinski receptor ćelijske smrti 1 (PD1) receptor (takođe poznat kao PDCD1, CD279, PD1, SLEB2 ili SLE1).

[0025] Kako se ovde koristi, termin "antitelo" (Ab) odnosi se na molekul imunoglobulina koji se specifično vezuje za određeni antigen - ovde, PD-1. U nekim realizacijama, antitela anti-PD-1 iz ovog pronalaska vezuju se za humani PD-1 i na taj način modulira imuni sistem. Rezultat imunološkog sistema je citotoksičan za tumorske ćelije. Anti-PD- 1 antitela iz pronalaska sadrže regione koji određuju komplementarnost (CDR), takođe poznate kao hipervarijabilne regiona, i u lakom i u teškom lancu varijabilnih domena. Konzerviraniji delovi promenljive domeni se zovu okvir (FR). Kao što je poznato u struci, položaj / granica aminokiselina koja označava hipervarijabilnu

region antitela može varirati, u zavisnosti od konteksta i različitih definicija poznatih u tehnici. Neke pozicije unutar promenljivog domena mogu se posmatrati kao hibridne hipervarijabilne pozicije na taj način što se te pozicije mogu smatrati biti unutar hipervarijabilne regije prema jednom skupu kriterijuma, a smatra se da je izvan hipervarijabilne regije pod različitim skupom kriterijuma. Jedan ili više ovih položaja može se naći i u proširenim hipervarijabilnim regionima. Otkriće daje antitela koja sadrže modifikacije u ovim hibridnim hipervarijabilnim položajima. Promenljivi domeni nativni teški i laki lanci sastoje se od četiri FR regiona, uglavnom usvajanjem konfiguracije β-lista, povezane sa tri CDR-a, koje čine petlje koje povezuju i, u nekim slučajevima, čine deo strukture β-lista. CDR-ovi u svakom lancu se u neposrednoj blizini nalaze zajedno u FR regionima, a sa CDR-ovima iz drugog lanca doprinose stvaranju ciljnog mesta vezivanja antitela. Videti Kabat i sar., Sekvenci imunoloških proteina Interes (Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, Md.1987). Kako se ovde koristi, numerisanje imunoglobulinskih aminokiselina ostataka vrši se prema sistemu numerisanja ostataka imunoglobulinskih aminokiselina, Kabat et al. osim ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0026] Antitela iz pronalaska pronalaska mogu biti poliklonalna, monoklonska, genetski inženjerirana i / ili na neki drugi način modifikovane prirode, uključujući, ali bez ograničenja, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, pojedinačna lančana antitela, itd. U različitim realizacijama, antitela sadrže celo ili deo konstantnog regiona antitela.U nekim realizacijama, konstantni region je izotip odabran između: IgA (npr. IgA1 ili IgA2), IgD, IgE, IgG (npr. IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) i IgM. U specifičnim realizacijama, ovde opisana antitela sadrže IgG1. U drugim realizacijama, antitela anti-PD-1 sadrže IgG2. U još jednom izvođenju, antitela anti-PD-1 sadrže IgG4. Kako se ovde koristi, "konstantni region" antitela uključuje prirodni konstantni region, alotipove ili prirodni varijante, kao što su D356E i L358M, ili A431G u humanom IgG1. Videti, na primer, Jefferis i Lefranc, MAbs, 1 (4): 332-338 (Jul-avgust 2009.).

[0027] Stalni svetlosni region anti-PD-1 antitela može biti kapa (κ) laki region ili lambda (λ) region. A λ svetlosni region može biti bilo koji od poznatih podtipova, npr. λ1, λ2, λ3 ili λ4. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1sadrži kapa (κ) svetlosni region.

[0028] Termin "monoklonsko antitelo", kako se ovde koristi, nije ograničen na antitela proizvedena tehnologijom hibridoma. Monoklonsko antitelo je izvedeno iz jednog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski ili fagovski klon, bilo koja dostupna ili poznata sredstva u tehnici. Monoklonska antitela korisna u ovom otkriću mogu se pripremiti koristeći širok spektar tehnika poznatih u tehnici, uključujući upotrebu hibridoma, rekombinantnog i fag displeja tehnologije ili njihove kombinacije. U mnogim upotrebama ovog pronalaska, uključujući upotrebu in vivo anti-PD-1 mogu se pogodno koristiti antitela kod ljudi, himerna, humanizovana ili humana antitela.

[0029] Izraz "himerni" antitela koji se koristi u ovom dokumentu odnosi se na antitijelo koje imaju varijablusekvenceizvedeneizneljudskog imunoglobulina, kaošto su je pacov ili je miš antitela, i lj ud-skih imunoglobulina konstantne regije, obično biraju iz predloška ljudskog imunoglobulina. Postupci za proizvodnju himernihantitela poznati su u struci. Vidi, npr. Morrison, 1985, Science 229 (4719): 1202-7; Oi i sur., 1986, BioTechniques 4: 214-221; Gillies i dr., 1985, J. Immunol. Metode 125: 191-202; Američki patentni brojevi 5.807.715; 4,816,567; i 4.816.397.

[0030] "Humanizirani" oblici ne-humanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini koji sadrže minimalne sekvence izvedene iz ne-ljudskog imunoglobulina. U principu, humanizovana antitela će se sastojati od najmanje jedan, a obično dva varijabilna domene, u kojem sve ili pretezno sve od u CDR regije odgovaraju na one ne-ljudskog imunoglobulina i sve ili pretezno sve od FR područja su te sekvence ljudskog imunoglobulina. Humanizovana antitiela takođe se može sastojati od barem jednog dela nekog imunoglobulina konstantne regije (Fc), tipično je da od jednog ljudskog imunoglobulina konsenzusni sled. Metode za antitela humanizacije se primenjuju. Vidi npr. : Riechmann i sur., 1988, Nature 332: 323-7; Brojevi američkih patenata: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; i 6.180.370 za Queen et al. ; EP239400; PCT publ ikacija WO 91/09967; Američki patent br.5,225,539; EP592106; EP519596; Padlan,1991, Mol. Immunol., 28: 489-498; Studnicka i dr., 1994, Prot. Inž.7: 805-814; Roguška i dr., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.91: 969-973; i američki patent br. 5,565,332.

[0031] "Ljudska antitela" uključuje antitiela koje imaju na amino kiseline sekvenca od jednog ljudskog imunoglobulina i uključuju antitela izolovana od ljudskog imunoglobulina biblioteka ili od životinja transgenih za jedan ili više humanih imunoglobulina i da ne izražavaju endogenih imunoglobulina. Ljudska antitela mogu biti napravljen od različitih metoda poznatih u struci, uključujući metode prikaza pomoću biblioteka antitela izvedenih iz sekvenci humanog imunoglobulina. Vidi američke patente br.4,444,887 i 4,716,111; i PCT publikacije WO 98/4664 5; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; i WO 91/10741. Ljudska antitela se takođe mogu proizvesti pomoću transgenih miševa koji nisu sposobni da ekspresuju funkcionalne endogene imunoglobuline, ali koji mogu da eksprimiraju gen imunoglobulina. Vidi, npr., PCT publikacije WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; SAD patentnih brojeva 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5.545.806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; i 5,939,598. Pored toga, kompanije kao što su LakePharma, Inc. (Belmont, CA) ili Creative BioLabs (Shirley, NY) mogu se angažirati na pružanju humanih antitela usmjerenih na odabrani antigen koristeći tehnologiju sličnu gore opisanoj. Potpuno ljudska antitela koja prepoznaju odabrani epitop mogu se stvoriti tehnikom koja se naziva "vođena selekcija". U ovom pristupu, a odabrani nehumanih monoklonskih antitela, npr., A miš antitela, se koristi za vode vodič za odabir potpuno humanog antitela koje prepoznaje isti epitop (vidi, Jespers i sur., 1988, Biotehnologija 12: 899-903).

[0032] Antitela anti-PD-1 iz ovog pronalaska uključuju molekule antitela pune dužine (netaknute).

[0033] U nekim realizacijama, ovo otkriće takođe uključuje anti-PD-1 vezujuće fragmente koji su sposobni posebno obavezujući PD-1. Primeri fragmenata koji se vežu za antitela uključuju,na primer, ali bez ograničenja,Fab, Fab ', F (ab')2, Fv fragmenti, jednolančani Fv fragmenti i fragmenti pojedinačne domene.

[0034] Fab fragment sadrži konstantnu domenu lakog lanca i prvu konstantnu domenu (CH1) teškog lanca. Frab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata dodavanjem nekoliko ostataka na karboksilnom kraju teška lanca CH1 domene uključujući jedan ili više cisteini od antitela šarke regiji. F (ab') fragmenata se proizvodi dekolte od cvrstih obveznica u šarke cisteini od F(ab') 2 pepsin probave proizvoda. Dodatna hemikalija spojnice od antitela fragmenata su poznate i onim od običnih veština čl. Fab i F (ab ') 2 fragmenti nemaju na Fc fragment od jednog netaknutog antitela, očistiti i cirkulaciju od životinja, a može imati manje nespecifična tkiva vezivanja nego netaknuta antitela (vidi, npr Wahl et al, 1983, J. Nucl Med...24: 316).

[0035] "Fv" fragment je minimalni fragment antitela koji sadrži potpuno mesto za prepoznavanje i vezivanje cilja. Ovo se područje sastoji od dimera jedne teške i jedne varijabilne domene lakog lanca u uskoj, nekovalentnoj asocijaciji (VH– VLdimer). To je u ovom konfiguraciji da je tri CDR od svake varijabilne domene Interakcija da definišu, a cilj vezivanje jeste na površini sa VH– VLdimera. Često šest CDR daju meta vezivanje specifičnost da se antitela. Međutim, u nekim slučajevima, čak i jednu varijablu domena (ili pola FV sastoji samo tri CDR specifična za jedan target ) može imati sposobnost prepoznavanja i vezivanja cilja, iako sa manjim afinitetom od celog mesta vezivanja.

[0036] "Single-lanca Fv" ili "scFv"fragmenti antitela čine VHi VLdomena antitela, gde ovi domeni su prisutni u jedanom polipeptid lanacu. U sustini, u Fv polipeptid, i dalje sadrži jedan polipeptid vezu između VHi VLdomena koja omogućava da scFv formira željenu strukturu za ciljano vezivanje.

1

[0037] "Antitela sa jednim domenom" sastoje se od jednog VHi VLili VLdomena koji pokazuju dovoljan afinitet prema PD-1. U specifičnoj realizaciji, antitelo sa jednim domenom je kamelizovano antitelo (vidi, na primer, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231: 25-38).

[0038] Anti-PD-1 antitela iz ovog pronalaska uključuju derivatizovana antitela. Na primer, ali ne putem

ograničenja, derivatizovana antitela se obično modifikuju glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom,derivatizacija poznatim zaštitnim / blokirajućim grupama, proteolitičko cepanje, 0073 sa ćelijskim ligandom ili drugim protein. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može se izvršiti poznatim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na,

specifično hemijsko cepanje, acetilacija, formilacija, metabolička sinteza tunikamicina itd. Pored toga, derivat mogu sadržati jednu ili više neprirodnih aminokiselina, na primer, koristeći ambrk tehnologiju (videti, na primer, Volfson, 2006, Chem. Biol.13 (10): 1011-2).

[0039] Anti-PD-1 antitela ili fragmenti koji se vežu mogu biti antitela ili fragmenti čiji su sledovi modifikovani da promeni barem jednu biološku efektorsku funkciju posredovanu konstantnom regijom. Na primer, u nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 može se modifikovati da smanji barem jednu biološku efektorsku funkciju posredovanu konstantnom regijom u odnosu na nemodifikovano antitelo, npr. Smanjeno vezivanje za jedan ili više Fc receptora (Fc γ R), kao što su Fc γ RI, Fc γ RIIA, Fc γ RIIB, Fc γ RIIIA i / ili Fc γ RIIIB. Vezanje Fc γ R može se smanjiti mutiranjem segmenta konstantne regije imunoglobulina antitela u određenim regijama neophodnim za interakcije Fc γ R (vidi, npr. Canfield i Morrison, 1991, J. objašnjenje Med.173: 1483-1491; i Lund i dr., 1991, J. Immunol.147: 2657-2662). Smanjenje sposobnosti vezivanja Fc γ R antitela takođe može smanjiti druge efektorske funkcije koje se oslanjaju na Fc γ R interakcije, poput opsonizacije, fagocitoze i ćelijske citotoksičnosti zavisne od antigena ("ADCC").

[0040] Ovde opisana antitela anti-PD-1 ili vezujući fragment uključuju antitela koja su modifikovana

steknu ili poboljšaju barem jednu biološku efektorsku funkciju posredovanu konstantnim regionom u odnosu na nemodifikovano antitelo, npr. za poboljšanje FcγR interakcija (videti, npr., US patentnu prijavu br. 2006/0134709). Na primer, antitelo anti-PD-1 pronalaska može imati konstantni region koji vezuje FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA i / ili FcγRIIIB sa većim afinitet od odgovarajućeg konstantnog regiona divljeg tipa..

[0041] Prema tome, antitela iz pronalaska mogu imati promene u biološkoj aktivnosti koje rezultiraju povećanom ili smanjenom opsonizacija, fagocitoza ili ADCC. Takve promene su poznate u tehnici. Na primer, modifikacije u antitelima koji smanjuju aktivnost ADCC opisani su u američkom patentu br.5,834,597. Primerna varijanta spuštanja ADCC odgovara do "mutanta 3" (takođe poznatog kao "M3", prikazanog na slici 4 američkog patenta br.5,834,597) u kome su ostaci 234 i 237 (upotrebom EU brojevi) su zamenjeni alaninima. Varijacija mutanta 3 (takođe poznata kao "M3") može se koristiti u nekoliko izotipi antitela, npr. IgG2.

[0042] Dodatne supstitucije koje mogu modifikovati FcyR vezivanje i/ili efektorsku funkciju ADCC anti-PD-1 antitela uključuju zamenu K322A ili dvostruku zamenu L234A i L235A u Fc regiji. Vidi npr. Hezareh i dr. J. Virol., 75 (24): 12161-12168 (2001).

[0043] U nekim realizacijama, antitela anti-PD-1 iz pronalaska imaju nizak nivo fukoze ili mu nedostaju. Antitela kojima nedostaje fukoze korelirala su sa pojačanom ADCC aktivnošću, posebno u malim dozama antitela. Vidi Shields i dr., 2002, J. Biol. Chem.277: 26733-26740; Shinkawa i dr., 2003, J. Biol. Chem.278: 3466-73. Metode pripreme antitela bez fukoze uključuju rast na ćelijama mieloma YB2 / 0 štakora (ATCC CRL 1662). YB2/0 ćelije izražavaju nizak nivo FUT8 mRNA koja kodira α -1,6-fucosyltransferase, enzim neophodan za fucosylation polipeptida.

[0044] U anti-PD-1 antitela na otkrivanje može da obuhvataju modifikovani(ili varijanta) CH2 domene ili sve Fc domena koje sadrže amino kiseline zamena da je povećanje vezivanje za Fc γ RIIB i/ili smanjiti vezivanje za Fc γ RIIIA kao odnosu na vezivanje odgovarajućeg CH2 ili Fc regiona divljeg tipa. Varijanta CH2 ili varijanta Fc domena opisane su u U.S. Patent Appl. Br.

2014/0377253. A varijanta CH2 ili varijanta Fc domena obično uključuje jedan ili više zamena na poziciji 263, pozicija 266, stav 273, i položaj 305, pri čemu je numeracija od na ostatke Fc domena je da je u EU indeksa kao u Kabat. U nekim otelotvorenjima, na anti-PD-1 antitela čine jedan ili više izmena odabranih iz V263L, V266L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S, V273Y, V305K i V305W, u odnosu na divljeg tipa CH2 domena. U specifičnim otelotvorenjima, na jedan ili više zamena CH2 domena u izabrane iz V263L, V273E, V273F, V273M, V273S, i V273Y, u odnosu na u CH2 domenu od jednog ljudskog IgG 1. Na primer, u jednom ili više supstitucije od jednog IgG 1 CH2 domena može biti V273E. U drugoj specifičnoj izvedbi, na anti-PD-1 antitela,od pronalaska sadrži varijantu regije šarki IgG 1 koja sadrži aminokiselinsku supstituciju V263L.

[0045] Ostali primeri varijante CH2 ili varijante Fc domena koje mogu omogućiti povećano povezivanje za FcyRIIB i/ili smanjeno vezivanje za FcyRIIIA u odnosu na vezivanje odgovarajućeg CH2 ili Fc regiona divljeg tipa uključuju one pronađene u Vonderheide, et al. Clin. Cancer Res., 19 (5), 1035-1043 (2013), kao što su S267E ili S267E / L328F u humanom IgG 1.

[0046] Anti-PD-1 antitela ili fragmenti vezivanja koji sadrže konstantni region humanog IgG4 mogu sadržati mutaciju S228P, za koju se izveštava da sprečava razmenu Fab ruku. Videti, na primer, Silva, JP et al. Časopis za biološku hemiju, 290 (9), 5462-5469 (2015).

[0047] U nekim realizacijama, antitela anti-PD-1 ili fragmenti vezivanja uključuju modifikacije koje povećavaju ili smanjiti njihove afinitete vezivanja za fetalni Fc receptor, FcRn, na primer, mutiranjem konstante imunoglobulina segment regiona u određenim regionima koji su uključeni u FcRn interakcije (videti, na primer, WO 2005/123780). U određenim rešenjima, antitelo anti-PD-1 iz klase IgG je mutirano tako da bar jedan od aminokiselinskih ostataka 250, 314 I 428 konstantnog regiona teškog lanca supstituisan je sam, ili u bilo kojoj njihovoj kombinaciji, kao na položaju 250 i 428, ili na pozicijama 250 i 314, ili na pozicijama 314 i 428, ili na pozicijama 250, 314 i 428, sa pozicijama 250 a 428 specifična kombinacija. Za položaj 250, supstitutivni aminokiselinski ostatak može biti bilo koji aminokiselinski ostatak osim treonina, uključujući, ali bez ograničenja, alanin, cistein, asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, leucin, metionin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, valin, triptofan ili tirozin. Za položaj 314, supstitutivni aminokiselinski ostatak može biti bilo koji aminokiselinski ostatak osim leucina, uključujući, ali bez ograničenja na, alanin, cistein, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, metionin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, treonin, valin, triptofan ili tirozin. Za poziciju 428, supstitutivni aminokiselinski ostaci mogu biti bilo koji aminokiselinski ostaci osim metionina, uključujući, ali bez ograničenja, alanin, cistein, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, fenilalanin, glicin, histidin, izoleucin, lizin, leucin, asparagin, prolin, glutamin, arginin, serin, treonin, valin, triptofan ili tirozin. Primerna zamena za koju se zna da se modifikuje Fc efektorska funkcija je Fc supstitucija M428L, koja se može javiti u kombinaciji sa Fc supstitucijom T250K. Dodatne specifične kombinacije pogodnih zamena aminokiselina identifikovane su u Tabeli 1 američkog patenta br. 7,217,797. Takve mutacije povećavaju vezivanje za FcRn, što štiti antitelo od razgradnje i povećava njegov poluživot.

[0048] Anti-PD-1 antitijelo može imati jednu ili više aminokiselina umetnutih u jedan ili više njegovih CDR-ova, na primer kako je opisano u Jung i Plückthun, 1997, Protein Engineering 10: 9, 959-966; Yazaki i dr ., 2004, Protein Eng. De Sel.17 (5): 481- 9.Epub 2004.17. avgusta; i US Pat. Appl. Br.2007/0280931.

[0049] Anti-PD-1 antitela sa visokim afinitetom za humani PD-1 mogu biti poželjna za terapijsku i dijagnostičku upotrebu. Prema tome, ovo otkriće razmatra antitela koja imaju visok afinitet vezivanja za humani PD-1. U specifičnim realizacijama, antitela anti-PD-1 koja se vezuju za humani PD-1 sa afinitetom od najmanje oko 100 nM, ali mogu pokazivati viših afiniteta, na primer, najmanje oko 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM , 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0.01 nM, ili čak i više. U nekim otelotvorenjima na antitela vezanja humani PD-1 sa afinitet u rasponu od oko 13:00 do oko 100 nM, ili afinitet u rasponu između bilo koje od gore navedenih vrijednosti.

[0050] Afinitet antitela anti-PD-1 za humani PD-1 može se odrediti upotrebom tehnika koje su dobro poznate u struci ili su ovde opisane, kao što je, na primer, ali ne ograničavanjem, ELISA, izotermalna titraciona kalorimetrija (ITC) ), površinska plazmonska rezonanca ili test fluorescentne polarizacije.

[0051] Anti-PD-1 antitela obično sadrže težak lanac koji sadrži promenljivi region (VHi VL) koji ima tri komplementarnosti određivanje regiona ("CDR") koji su ovde navedeni (u redosledu N →

1

C) kao VHi VLCDR # 1, VHi VLCDR # 2 i VHi VLCDR # 3, i laki lanac koji sadrži promenljivi region (VL) koji ima tri ovde određena regiona koji određuju komplementarnost (u redosledu N → C) kao VLCDR # 1, VLCDR # 2 i VLCDR # 3. Aminokiselinske sekvence primernih CDR-a, kao I obezbeđene su aminokiselinske sekvence VHi VLregiona teškog i lakog lanca primernog anti-PD-1 ovde. Specifična ostvarenja antitela anti-PD-1 uključuju ove primerne CDR i / ili sekvence VHi VLi / ili VL,

kao i antitela koja se takmiče za vezivanje humanog PD-1 sa takvim antitelima.

[0052] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 je pogodno za davanje ljudima. U određenom ostvarenju, antitelo anti-PD-1 je humanizirano. U nekim realizacijama, aminokiselinski sekvenci CDR-a anti-PD- antitela su izabrani iz sledećih sekvenci:

[0053] Ovde su opisana konkretna primerna ostvarenja antitela anti-PD-1 sa gore navedenim CDR. U nekim Ostvarenja, antitelo anti-PD-1 ima CDR-ove SEK ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15 i 16. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 ima CDR-ove SEK ID NOS: 11, 12, 21, 14, 15 i 16. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo ima CDR-ove SEK ID NOS: 11, 12, 22, 14, 15 i 16. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 ima CDR-ovi SEK ID NOS: 11, 12, 23, 14, 15 i 16.

[0054] U nekim realizacijama, svaki CDR anti-PD-1 antitela, nezavisno od ostalih, izabran je da odgovara u nizu do odgovarajućeg CDR antitela navedenog u TABELI 3. U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo je IgG i ima VHi VLkoji odgovaraju sekvenci VHi VLantitela datih u TABELI 3.

[0055] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 sadrži VH lanac koji u sekvenci odgovara SEK ID NE: 31; i VLlanac koji odgovara sekvenci SEK ID NO: 41. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 sadrži VHlanac koji odgovara sekvenci SEK ID NO: 32; i VLlanac koji odgovara sekvenci SEK ID ID: 42. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 sadrži VHlanac koji odgovara sekvenci SEK ID NE: 33; i VLlanac koji odgovara sekvenci SEK ID NO: 42. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 sadrži VHlanac koji odgovara sekvenci SEK ID NO: 34; i VLlanac koji odgovara sekvenci SEK ID ID: 42. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 sadrži VHlanac koji odgovara sekvenci SEK ID NE: 35; i VL lanac koji odgovara sekvenci SEK ID NO: 42. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 sadrži VHlanac koji odgovara sekvenci SEK ID NO: 36; i VLlanac koji odgovara sekvenci SEK ID ID: 42.

[0056] Određene mutacije VHili VLsekvence u ovde opisanom antitelu anti-PD-1 razumeli bi osoba sposobna da priušti antitela anti-PD-1 u okviru otkrića. Mutacije mogu uključivati aminokiseline supstitucije, dodavanja ili brisanja iz VHili VLsekvence kao što je ovde opisano, zadržavajući značajnu anti-PD- 1 aktivnost. Shodno tome, u nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 sadrži VH sekvencu koja ima najmanje 85%, pri najmanje 90%, najmanje 93%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence sa VHsekvenca bilo kog od antitela prikazanih u TABELI 3. Antitelo anti-PD-1 može sadržati VHsekvencu koja ima do 8, do 7, do 6, do 5, do 4, do 3 ili do 2 mutacije u poređenju sa VHsekvencom bilo kog od antitela prikazana u TABELI 3. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 može sadržati VH sekvencu koja ima 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje ili 2 ili manje mutacija u poređenju sa VH sekvencom bilo kog od prikazanih antitela u TABELI 3. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 sadrži VLsekvencu koja ima najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 93%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sekvence sa VLsekvencom bilo kog od antitela prikazanih u TABELI 3. Antitelo anti-PD-1 može sadržati VLsekvencu koja ima do 8, naviše do 7, do 6, do 5, do 4, do 3 ili do 2 mutacije u poređenju sa VLsekvencom bilo kog od antitela prikazano u TABELI 3. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 može sadržati VLsekvencu koja ima 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje ili 2 ili manje mutacija u poređenju sa VLsekvencom bilo kog od antitela prikazanih u TABELI 3.

[ 0057] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema:

1

iz aminokiselina lakog lanca prema

gdje podcrtane aminokiseline predstavljaju CDR-ove, a ukočene aminokiseline predstavljaju konstantne regije.

[0058] Mogu se dogoditi post-translacijske modifikacije sekvenci anti-PD-1 antitela, poput cijepanja jednog ili više ( npr.1, 2, 3 ili više) aminokiselinskih ostataka na C-terminalnom kraju teški lanac antitela .

[0059] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 sadrži aminokiselinsku sekvencu teškog lanca prema:

i aminokiselinske sekvence lakog lanca prema:

1

ukojem je podvučena amino kiseline predstavljaju na CDR i na nakošen amino kiseline predsta vljaju je konstanta regijama.

[0060] Dodatne post-translacione modifikacije antitela anti-PD-1 mogu da uključuju glikozilaciju. Uobičajena dvogodišnja kompleksi se mogu sastojati od jezgrene strukture koja sadrži dva N-acetilglukozamina (GlcNAc), tri manoze, i dva GlcNAc ostatka koja su β-12 vezana za α-6 manozu i α-3 manozu da bi formirali dve antene. Jedan ili više fukoza (Fuc), galaktoza (Gal), glikoni sa visokim sadržajem manoze Man-5 ili Man-9, raspoređujući GlcNAc i sijalna kiselina, uključujući ostatke Nacetilneuraminske kiseline (NANA) ili N-glikolilneuraminske kiseline (NGNA), mogu biti pričvršćeni za jezgro. N-povezano glikoformi mogu da uključuju G0 (protein koji ima jezgru biantenarnu strukturu glikozilacije), G0F (fukozilirani G0), G0F GlcNAc, G1 (protein koji ima jezgru glikozilacione strukture sa jednim ostatkom galaktoze), G1F (fukozilirani G1), G2 (protein koji imaju jezgru glikozilacione strukture sa dva ostatka galaktoze) i / ili G2F (fukozilirani G2). U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 ima G0F glikan.

[0061] U nekim realizacijama, antitela anti-PD-1 se takmiče za vezivanje humanog PD-1 u in vitro testovima sa referentno antitelo. U nekim realizacijama, antitela anti-PD-1 se nadmeću za vezivanje humanog PD-1 na ćelije koje ekspresuju humani PD-1. Referentno antitelo može biti bilo koje od ovde opisanih antitela anti-PD-1. U nekim realizacijama, referentno antitelo je antitelo dato u TABELI 3. U određenim realizacijama odabrano je referentno antitelo od antitela miša 12A11 ("Mu12A11"). U nekim realizacijama, referentno antitelo je humanizovana verzija Mu12A11. U specifičnoj realizaciji, referentno antitelo je humanizovano antitelo 12A11.1b ("Hu12A11.1b") ili humanizovano antitelo antitelo 12A11.2b M99L ("Hu12A11.2b4").

[0062] U nekim realizacijama, antitela anti-PD-1 antagoniziraju, na primer, inhibiraju humani PD-1 (SEK ID NO: 1). PD-1 antagonizam receptora može se javiti nizom mehanizama, na primer, inhibicijom vezivanja PD-1 humanim PDL1 (SEK ID NO: 3) ili PD-L2 (SEK ID NO: 4).

[0063] Ovdje opisana antitela anti-PD-1 uglavnom se specifično vezuju za humani PD-1. Unakrsna reaktivnost antitela za vezivanje anti-PD-1 od drugih vrsta, na primjer od majmuna, npr. Majmuna cynomolgus, može ponuditi prednosti, kao što je sposobnost testiranja na biološkim aktivnostima na majmunskim životinjskim modelima. Takav modelska ispitivanja životinja može se koristiti za ekran anti-PD-1 antitela da odaberete svojstva se odnose na efikasnost, npr povoljan farmakokinetika, ili onih u vezi sa sigurnošću, npr. Smanjena toksičnost za jetru. U nekim realizacijama, antitela anti-PD-1 vezuju se za cynomolgus PD-1 kao i za humani PD-1.

[0064] Testovi za nadmetanje uključuju, ali nisu ograničeni na, imunološki test označen radioaktivnim materijalom (RIA), enzimski imunološki test (ELISA), sendvič ELISA, testove sortiranja ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS) i površinsku plazmonsku rezonancu testovi.

[0065] U provođenju testa kompeticije antitela između referentnog antitela i test antitela (bez obzira na vrstu ili izotip), prvo se referenca može označiti detektibilnom etiketom, poput

1

fluorofora, biotina ili enzima (ili čak radioaktivnog ) oznaka koja omogućava naknadnu identifikaciju. U ovom slučaju, ćelije izražavajući humani P D-1 inkubiraju sa neoznačeno test antitela, označen referentni antitela se dodaje, a intenzitet granica oznaka se mjeri. Ako se probno antitelo nadmeće sa označenim referentnim antitelom vezujući se za preklapajući epitop, Intenzitet 30 će biti smanjen u odnosu na kontrolnu reakciju koja se provodi bez test antitela.

[0066] U specifičnoj realizaciji ovog testa, prvo se određuje koncentracija obilježenog referentnog antitela koje daje 80% maksimalnog vezivanja ("konc.80% ") u uvjetima ispitivanja ( npr. Određena gustina ćelija) i kompetitivni test izveden sa 10X konc.80% neobeleženog test antitela i konc.80% obeleženih referentnih antitela.

[0067] Inhibicija se može izraziti kao konstanta inhibicije ili K i , koja se izračunava prema sljedećem formula:

gde je IC50 koncentracija test antitela koja daje 50% smanjenje vezivanja referentnog antitela i Kd je konstanta disocijacije referentnog antitela, mera njegovog afiniteta za humani PD-1. Antitela koja se takmiče sa ovde otkrivenim antitelima anti-PD-1 mogu imati Ki od 10 pM do 10 nM pod ovde opisanim uslovima ispitivanja.

[0068] U različitim realizacijama, smatra se da se test antitelo takmiči sa referentnim antitelom ako se smanji vezivanje referentnog antitela za najmanje oko 20% ili više, na primer, za najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili čak i više, ili u procentima u rasponu između bilo koje od prethodnih vrednosti, na referenci koncentracija antitela koja je 80% maksimalnog vezivanja u specifičnim uslovima ispitivanja koji se koriste i test antitelo koncentracija koja je 10 puta veća od referentne koncentracije antitela.

[0069] Specifični test i uslovi ispitivanja korisni za procenu da li se antitelo takmiči za vezivanje čoveka PD-1 sa referentnim antitelom kako je ovde opisano je dat u odeljku 8.1.5.

7.4. Polinukleotidi koji kodiraju antitela anti-PD-1, ekspresijski sistemi i metode stvaranja antitela

[0070] Ovo otkriće obuhvata molekule nukleinske kiseline koji kodiraju laki i teški lanac imunoglobulina geni za antitela anti-PD-1, vektori koji sadrže takve nukleinske kiseline i ćelije domaćina sposobne da proizvode anti-PD- 1 antitela iz pronalaska.

[0071] Anti-PD-1 antitelo iz ovog otkrića može se pripremiti rekombinantnom ekspresijom gena lakog i imunoglobulinskog teškog lanca u ćeliji domaćinu. Da bi se rekombinantno eksprimiralo antitelo, ćelija domaćin je transfektovana jednim ili više njih rekombinantni ekspresijski vektori koji nose fragmente DNK koji kodiraju laki i teški lanac imunoglobulina antitelo takvo da se laki i teški lanci eksprimiraju u ćeliji domaćina i, opciono, izlučuju u medijum u kojima se gaje ćelije

1

domaćina, iz kog medija se antitela mogu povratiti. Standardna rekombinantna DNK metodologije se koriste za dobijanje gena teških i lakih lanaca antitela, ugrađivanje ovih gena u rekombinantne ekspresijski vektori i uvode vektore u ćelije domaćina, kao što su oni opisani u Molekularnom kloniranju; Laboratorija Priručnik, drugo izdanje (Sambrook, Fritsch i Maniatis (ur.), Cold Spring Harbor, N. I., 1989), Trenutni protokoli u Molekularna biologija (Ausubel, F.M. et al., Ur., Greene Publishing Associates, 1989) i u američkom patentu br.4,816,397.

[0072] Da bi se generisale nukleinske kiseline koje kodiraju takva antitela anti-PD-1, fragmenti DNK koji kodiraju laku i tešku prvo se dobijaju lančani promenljivi regioni. Ove DNK se mogu dobiti amplifikacijom i modifikacijom zametne linije DNK ili cDNK koja kodira promenljive sekvence lakog i teškog lanca, na primer korišćenjem lančane reakcije polimeraze (PCR). DNK sekvence klica za gene gena promenljivog regiona teškog i lakog lanca su poznate u tehnici (videti, npr., baza podataka o sekvencama humanih zarodnih linija „ VBASE “; videti takođe Kabat, E. A. i sar., 1991, Sekuences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, američko Ministarstvo zdravlja i socijalnih usluga, publikacija NIH br.91-3242; Tomlinson i sar., 1992, J. Mol. Biol.22T: 116-198; i Cok i sar., 1994, Eur. J. Immunol.24: 827-836; sadržaj svakog od njih su ovde uključeni referencom).

[0073] Jednom kada se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju VHi VLsegmente povezane sa antitelom anti-PD-1, ova DNK fragmentima se može dalje manipulisati standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer za pretvaranje promenljive geni regiona do gena lanca antitela pune dužine, do gena fragmenta Fab ili do gena scFv. U ovim manipulacijama, a DNK fragment koji kodira VLili VHoperativno je povezan sa drugim fragmentom DNK koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Termin „operativno povezan“, kako se koristi u ovom kontekstu, treba da znači da su dva DNK fragmenta spojena tako da ostanu aminokiselinske sekvence kodirane sa dva DNK fragmenta u okviru.

[0074] Izolovana DNK koja kodira VHregion može se operativno pretvoriti u gen teškog lanca pune dužine povezivanje DNK koja kodira VHsa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2, CH3 i, opciono, CH4). Sekvence gena konstantnog regiona teškog lanca čoveka su poznate u struci (videti, npr. Kabat, E.A., i sar., 1991, Sekvence proteina od imunološkog interesa, peto izdanje, Ministarstvo zdravlja i zdravlja SAD Services, publikacija NIH br.91-3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardno PCR amplifikacija. Konstantni region teškog lanca može biti konstanta IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD region, ali u određenim rešenjima je IgG1ili IgG4. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, DNK koja kodira VHmože biti operativno povezan sa drugim molekulom DNK koji kodira samo konstantni region teškog lanca CH1.

[0075] Izolovana DNK koja kodira VLregion može se pretvoriti u gen lakog lanca pune dužine (kao i Fab gen lakog lanca) operativnim povezivanjem DNK koja kodira VLsa drugim molekulom DNK koji kodira konstantu lakog lanca region, CL. Sekvence gena konstantnog regiona lakog

1

lanca čoveka poznate su u struci (videti, na primer, Kabat, et al., 1991., Sekvence proteina od imunološkog interesa, peto izdanje, američko Ministarstvo zdravlja i socijalne zaštite, NIH Publication No. 91-3242) i fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR pojačanje. Konstantni region lakog lanca može biti kappa ili lambda konstantan region, ali u određenim rešenjima jeste kappa konstantni region. Da bi se stvorio scFv gen, fragmenti DNK koji kodiraju VHi VLoperativno su povezani drugi fragment koji kodira fleksibilni linker, npr. kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4~Ser)3(SEK ID NO: 5), takav da se VHi VLsekvence mogu izraziti kao susedni jednolančani protein, sa pridruženim VLi VHregionima pomoću fleksibilne veze (videti, na primer, Bird et al., 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferti i sar., 1990, Nature 348: 552-554).

[0076] Da bi se izrazila antitela anti-PD-1 otkrića, DNK koje kodiraju delimične ili pune dužine lake i teške lanci, dobijeni kako je gore opisano, ubacuju se u vektore ekspresije tako da su geni operativno povezani transkripcione i translacione sekvence upravljanja. U ovom kontekstu, termin „operativno povezan“ treba da to znači gen antitela je vezan u vektor tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence unutar vektora služe svojoj predviđenoj funkciji regulacije transkripcije i translacije gena antitela. Vektor izraza i kontrolne sekvence ekspresije su odabrane da budu kompatibilne sa korišćenom ćelijom domaćina ekspresije. Laki antitela gen lanca i gen teškog lanca antitela mogu se umetnuti u odvojene vektore ili, što je tipičnije, oba gena jesu umetnuta u isti ekspresijski vektor.

[0077] Geni antitela se ubacuju u ekspresijski vektor standardnim metodama (npr. Ligacijom komplementarnih restrikciona mesta na fragmentu i vektoru gena antitela ili podvezivanje tupih krajeva ako nema restrikcionih mesta). Pre do umetanja sekvenci lakog ili teškog lanca povezanih sa antitelom anti-PD-1, vektor ekspresije već može nositi sekvence konstantnog regiona antitela. Na primer, jedan pristup konverziji povezanog anti-PD-1 monoklonskog antitela VHi VLsekvence gena antitela pune dužine je njihovo umetanje u ekspresione vektore koji već kodiraju konstante teškog lanca, odnosno konstante lakog lanca, takve da je segment VHoperativno povezan CH segment (i) unutar vektora i VLsegment su operativno povezani sa CL segmentom unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresijski vektor može kodirati signalni peptid koji olakšava sekreciju lanac antitela iz ćelije domaćina. Gen lanca antitela može se klonirati u vektor tako da je signalni peptid je povezan u okviru sa amino završetkom gena lanca antitela. Signalni peptid može biti signal imunoglobulina peptid ili heterologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz neimunoglobulinskog proteina).

[0078] Pored gena lanca antitela, rekombinantni ekspresijski vektori iz ovog otkrića nose i regulator sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanca antitela u ćeliji domaćina. Termin „regulatorna sekvenca“ je namenjen da uključuje promotore, pojačivače i druge elemente za kontrolu ekspresije (npr. signale poliadenilacije) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena

2

lanca antitela. Takve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel, Technologi Ekpression Technologi: Methods in Enzimologi 185, Academic Press, S an Diego, CA, 1990. To će treba da cene stručnjaci u ovoj oblasti da dizajn ekspresijskog vektora, uključujući i odabir regulatornih sekvence mogu zavisiti od faktora kao što je izbor ćelije domaćina koja će se transformisati, nivo ekspresije proteina željeni itd. Pogodne regulatorne sekvence za ekspresiju ćelija domaćina sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju visoko nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, poput promotora i / ili pojačivača izvedenih iz citomegalovirusa (CMV) (kao što je CMV promoter / pojačivač), Simian Virus 40 (SV40) (kao što je SV40 promoter / pojačivač), adenovirus, (npr. glavni kasni promotor adenovirusa (AdMLP)) i polioma. Za dalji opis virusnih regulatornih elemenata, i njihove sekvence, videti, na primer, američki patent br.

5,168,062 od Stinskog, američki patent br. 4,510,245 od Bell et al., I Američki patent br.

4,968,615 od Schaffner i sar.

[0079] Pored gena lanca antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni vektori ekspresije otkrivanje može nositi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr. poreklo replikacije) i selektivni marker geni. Izbor marker gena olakšava odabir ćelija domaćina u koji je vektor uveden (videti npr. američke patente br.

4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, sve Akel et al. al.). Na primer, tipično selektivni marker gen daje rezistenciju na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, na ćeliji domaćinu u koju je vektor uveden. Pogodni selektivni marker geni uključuju dihidrofolat gen za reduktazu (DHFR) (za upotrebu u DHFR-ćelijama domaćinima sa selekcijom / amplifikacijom metotreksata) i neo gen (za selekciju G418). Za izražavanje lakih i teških lanaca, vektori ekspresije koji kodiraju teške a laki lanci se transformišu u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici pojma „transfekcija“ su namenjen da obuhvati širok spektar tehnika koje se obično koriste za uvođenje egzogene DNK u a prokariotske ili eukariotske ćelije domaćina, npr. elektroporacija, lipofekcija, taloženje kalcijum-fosfata, DEAE-dekstran transfekcija i slično.

[0080] Moguće je izraziti antitela iz otkrića bilo u prokariotskim ili u eukariotskim ćelijama domaćina. U određenim izvođenja, ekspresija antitela se vrši u eukariotskim ćelijama, npr. ćelijama domaćina sisara, optimalne sekrecije pravilno savijenog i imunološki aktivnog antitela. Uzorne ćelije domaćina sisara za ekspresiju rekombinanta antitela iz otkrića uključuju jajnik kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući DHFR-CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, koristi se sa DHFR markerom koji se može odabrati, npr., Kao opisano u Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159: 601-621), NSO ćelije mieloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Kada rekombinantni ekspresijski vektori koji kodiraju gene antitela uvode se u ćelije domaćina sisara, antitela su proizvedeno kultivisanjem ćelija domaćina tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćina ili izlučivanje antitela u medijum za kulturu u kome se gaje ćelije domaćina. Od antitela se može povratiti medijum za kulturu koristeći standardne metode prečišćavanja proteina. Ćelije domaćina se takođe mogu koristiti za proizvodnju netaknutih delova antitela, kao što su Fab fragmenti ili scFv molekuli. Podrazumeva se da su varijacije gore navedenog postupka unutar obim ovog otkrića. Na primer, može biti poželjno da se ćelija domaćina transformiše sa DNK koja kodira laki lanac ili teški lanac (ali ne oba) antitela anti-PD-1 iz ovog otkrića.

[0081] Tehnologija rekombinantne DNK takođe se može koristiti za uklanjanje neke ili celokupne DNK koja kodira jednu ili obe laki i teški lanci koji nisu neophodni za vezivanje za humani PD-1. Molekuli izraženi iz takvih okrnjenih DNK molekuli su takođe obuhvaćeni antitelima otkrića.

[0082] Za rekombinantnu ekspresiju antitela anti-PD-1 iz otkrića, ćelija domaćin može se kotransfektirati sa dva ekspresijska vektora otkrića, prvi vektor koji kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugi vektor koji kodira polipeptid izveden iz lakog lanca. Dva vektora mogu sadržati identične markere koji se mogu izabrati ili ih mogu svaki sadrži zasebni marker koji se može odabrati. Alternativno, može se koristiti jedan vektor koji kodira i teške I polipeptidi lakog lanca.

[0083] Jednom kada je dobijena nukleinska kiselina koja kodira jedan ili više delova antitela anti-PD-1, dalje ismene ili se mutacije mogu uvesti u kodirajuću sekvencu, na primer za generisanje nukleinskih kiselina koje kodiraju antitela sa različitim CDR sekvencama, antitela sa smanjenim afinitetom za Fc receptor ili antitela različitih podklasa.

[0084] Anti-PD-1 antitela iz otkrića takođe se mogu dobiti hemijskom sintezom (npr. Metodama opisano u Solid Phase Peptide Sinthesis, 2. izdanje, 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). Varijanta antitela mogu se generisati i pomoću ćelijske platforme (videti, na primer, Chu et al., Biochemia No.2, 2001 (Roche Molecular Biologicals) i Murrai et al., 2013, Current Opinion in Chemical Biologi, 17: 420-426).

[0085] Jednom kada se antitelo anti-PD-1 iz otkrića dobije rekombinantnom ekspresijom, može se prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u struci za prečišćavanje molekula imunoglobulina, na primer hromatografijom (npr. hionska razmena jona, afinitet i dimenzionisanje), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću ili bilo kojim drugim standardom tehnika za prečišćavanje proteina. Dalje, antitela anti-PD-1 iz ovog otkrića mogu se spojiti heterologne polipeptidne sekvence ovde opisane ili na drugi način poznate u tehnici da bi se olakšalo prečišćavanje

[0086] Jednom kada se antitelo anti-PD-1 iz otkrića dobije rekombinantnom ekspresijom, ono se može prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u struci za prečišćavanje molekula imunoglobulina, na primer, hromatografijom (npr. hromatografija zamene, afiniteta i dimenzionisanja kolone), centrifugiranjem, diferencijalnom rastvorljivošću ili bilo kojim drugim standardom tehnika za prečišćavanje proteina. Dalje, antitela anti-PD-1 iz ovog otkrića mogu se spojiti heterologne polipeptidne sekvence opisane ovde ili na drugi način poznate u struci da bi se olakšalo prečišćavanje. Jednom izolovano, antitelo anti-PD-1 se, po želji, može dalje prečišćavati, npr. Tečnošću visokih performansi hromatografija (videti npr. Fisher, Laboratorijske tehnike u biohemiji i molekularnoj biologiji, Vork and Burdon, izd., Elsevier, 1980), ili gel filtracionom hromatografijom na Superdek ™ 75 koloni (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Švedska).

7.5. Farmaceutske kompozicije

[0087] Ovde opisana antitela anti-PD-1 mogu biti u obliku kompozicija koja sadrže antitelo i jedan ili više nosača, pomoćnih supstanci i / ili razblaživača. Sastavi mogu biti formulisani za određenu upotrebu, kao na primer veterinarska ili farmaceutska upotreba kod ljudi. Oblik smeše (npr. Suvi prah, tečna formulacija, itd.) i pomoćne supstance, razblaživači i / ili nosači će zavisiti od nameravane upotrebe antitela i, za terapijska upotreba, način primene.

[0088] Za terapeutsku upotrebu, smeše se mogu isporučivati kao deo sterilne farmaceutske kompozicije koja uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovaj sastav može biti u bilo kom pogodnom obliku (u zavisnosti od željenog način primene kod pacijenta). Farmaceutska kompozicija može se primenjivati na pa cijenta na različite načine puteva kao što su oralno, transdermalno, subkutano, intranazalno, intravenozno, intramuskularno, intratumoralno, intratekalno, lokalno ili lokalno. Najprikladniji način primene u svakom slučaju zavisiće od određenog antitelo, subjekat i prirodu i težinu bolesti i fizičko stanje subjekta. Tipično, farmaceutska kompozicija će se primenjivati intravenozno ili subkutano.

[0089] Farmaceutske smeše mogu biti pogodno predstavljene u jediničnim doznim oblicima koji sadrže unapred određene količina ovde opisanog antitela anti-PD-1 po dozi. Količina antitela anti-PD-1 uključena u jediničnu dozu zavisiće od bolesti koja se leči, kao i od drugih faktora koji su dobro poznati u tehnici. Takve jedinične doze mogu biti u obliku liofilizovanog suvog praha koji sadrži količinu antitela pogodnu za jednokratnu primenu ili u oblik tečnosti. Jedinstveni dozni oblici suvog praha mogu se pakovati u kompletu sa špricem, odgovarajućom količinom razblaživača i / ili druge komponente korisne za administraciju. Jedinične doze u tečnom obliku mogu se prikladno isporučiti u obliku šprica napunjenog količinom antitela anti-PD-1 pogodnog za jednokratnu primenu.

[0090] Farmaceutske smeše se takođe mogu isporučivati u rasutom obliku koji sadrži količine antitela anti-PD-1 pogodan za više administracija.

[0091] Farmaceutske smeše mogu se pripremiti za skladištenje u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora mešanjem antitela željenog stepena čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijentima ili stabilizatori koji se tipično koriste u struci (svi su ovde navedeni kao "nosači"), tj. puferska sredstva, koja stabilizuju

agensi, konzervansi, izotonifikatori, nejonski deterdženti, antioksidanti i drugi dodaci. Vidiš, Remington's Farmaceutske nauke, 16. izdanje (Osol, izdanje 1980). Takvi aditivi ne bi trebalo da budu toksični za primaoce u doze i koncentracije koje se koriste. Puferska sredstva pomažu u održavanju pH u opsegu koji se približava fiziološkim uslovima. Oni mogu biti prisutan u širokom spektru koncentracija, ali će obično biti prisutan u koncentracijama u rasponu od oko 2 mM do oko 50 mM. Pogodna puferska sredstva za upotrebu sa ovim otkrićem uključuju i organske i

2

neorganske kiseline i njihove soli kao što su citratni puferi (npr. smeša mononatrijum citratdinatrijum citrat, limunska kiselina-trinatrijum citrate smeša, smeša limunske kiseline i mononatrijum citrata, itd.), sukcinatni puferi (npr. smeša jantarne kiseline i mononatrijum sukcinat, smeša jantarne kiseline i natrijum hidroksida, smeša jantarne kiseline i dinatrijum sukcinata itd.), puferi za tartarat (npr. smeša vinske kiseline i natrijum tartarata, smeša vinske kiseline i kalijum tartarata, smeša vinske kiseline i natrijum hidroksida, itd.), fosfatni puferi (npr. smeša fosforne kiseline i mononatrijum-fosfata, fosforna kiselina-dinatrijum-fosfat smeša, smeša mononatrijum fosfat-dinatrijum fosfat, itd.), puferi glukonata (npr. glukonska kiselina-natrijum smeša glukonata, smeša glukonske kiseline i natrijum hidroksida, smeša glukonske kiseline i kalijum glukonata itd.), oksalat pufer (npr. smeša oksalne kiseline i natrijum oksalata, smeša oksalne kiseline i natrijum hidroksida, oksalna kiselina i kalijum oksalat smeša, itd.), laktatni puferi (npr. smeša mlečne kiseline i natrijum laktata, smeša mlečne kiseline i natrijum hidroksida, kalijum mlečne kiseline smeša laktata itd.) i acetatni puferi (npr. mešavina sirćetne kiseline i natrijum acetata, sirćetna kiselina-natrijum hidroksid smeša itd.). Pored toga, fumaratni puferi, histidinski puferi i trimetilamin soli kao što su 2-amino-2- može se koristiti hidroksimetil-propan-1,3-diol (tj. Tris, THAM ili tris (hidroksimetil) aminometan).

[0092] Puferska sredstva pomažu u održavanju pH u opsegu koji se približava fiziološkim uslovima. Oni mogu biti prisutan u širokom spektru koncentracija, ali će obično biti prisutan u koncentracijama u rasponu od oko 2 mM do oko 50 mM. Pogodna puferska sredstva za upotrebu sa ovim otkrićem uključuju i organske i neorganske kiseline i njihove soli kao što su citratni puferi (npr. smeša mononatrijum citrat-dinatrijum citrat, limunska kiselina-trinatrijum citrat smeša, smeša limunske kiseline i mononatrijum citrata, itd.), sukcinatni puferi (npr. smeša jantarne kiseline i mononatrijum sukcinat, smeša jantarne kiseline i natrijum hidroksida, smeša jantarne kiseline i dinatrijum sukcinata itd.), puferi za tartarat (npr. smeša vinske kiseline i natrijum tartarata, smeša vinske kiseline i kalijum tartarata, smeša vinske kiseline i natrijum hidroksida, itd.), fosfatni puferi (npr. smeša fosforne kiseline i mononatrijum-fosfata, fosforna kiselinadinatrijum-fosfat smeša, smeša mononatrijum fosfat-dinatrijum fosfat, itd.), puferi glukonata (npr. glukonska kiselina-natrijum smeša glukonata, smeša glukonske kiseline i natrijum hidroksida, smeša glukonske kiseline i kalijum glukonata itd.), oksalat pufer (npr. smeša oksalne kiseline i natrijum oksalata, smeša oksalne kiseline i natrijum hidroksida, oksalna kiselina i kalijum oksalat smeša, itd.), laktatni puferi (npr. smeša mlečne kiseline i natrijum laktata, smeša mlečne kiseline i natrijum hidroksida, kalijum mlečne kiseline smeša laktata itd.) i acetatni puferi (npr. mešavina sirćetne kiseline i natrijum acetata, sirćetna kiselina-natrijum hidroksid smeša itd.). Pored toga, fumaratni puferi, histidinski puferi i trimetilamin soli kao što su 2-amino-2-može se koristiti hidroksimetil-propan-1,3-diol (tj. Tris, THAM ili tris (hidroksimetil) aminometan).

[0093] Izotoničari koji su ponekad poznati i kao „stabilizatori“ mogu se dodati kako bi se osigurala izotoničnost tečnih sastava prezentuje otkriće i uključuje polihidrične alkohole šećera, na primer trihidroksidne ili alkohole višeg šećera, kao što je glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol. Stabilizatori se odnose na široku kategoriju pomoćnih supstanci koje mogu biti u rasponu funkciju od glomaznog sredstva do aditiva koji solubilizuje terapijsko sredstvo ili pomaže u sprečavanju denaturacije ili pridržavanje zida kontejnera. Tipični stabilizatori mogu biti polihidrični šećerni alkoholi (gore nabrojani); amino kiseline kao što su arginin, lizin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, ornitin, leucin, 2-fenilalanin, glutaminskkiselina, treonin itd., organski šećeri ili šećerni alkoholi, kao što su laktoza, trehaloza, stahioza, manitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinozitol, galakititol, glicerol i slično, uključujući ciklitole kao što je inozitol; polietilen glikol; amino kiselina polimeri; redukcioni agensi koji sadrže sumpor, kao što su urea, glutation, tioktinska kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, α-monotioglicerol i natrijum tiosulfat; polipeptidi male molekulske težine (npr. peptidi sa 10 ostataka ili manje); hidrofilni polimeri, poput monosaharida polivinilpirolidona, kao što su ksiloza, manoza, fruktoza, glukoza; disaharidi kao što su laktoza, maltoza, saharoza i trehaloza; i trizahaharidi kao što je rafinoza; i polisaharidi kao što je dekstran. Stabilizatori mogu biti prisutni u količinama u rasponu od 0,5 do 10 težinskih% po težini antitela anti-PD-1.

[0094] Nejonski tenzidi ili deterdženti (takođe poznati kao „sredstva za vlaženje“) mogu se dodati da bi pomogli da se rastvori glikoproteina, kao i za zaštitu glikoproteina od agregacije izazvane agitacijom, što takođe omogućava formulaciju da bude izložen površini smicanja pod stresom bez izazivanja denaturacije proteina. Pogodne nejonske površinski aktivne supstance uključuju polisorbate (20, 80, itd.), poloksamere (184, 188 itd.) i pluronične poliole. Nejonske površinski aktivne supstance mogu biti prisutan u opsegu od oko 0,05 mg / ml do oko 1,0 mg / ml.

[0095] Specifično primerno ostvarenje vodenog sastava pogodnog za primenu putem intravenske infuzije sadrži 20 mg / ml antitela anti-PD-1 koje sadrži sekvencu teškog lanca sa SEK ID NO: 51 ili SEK ID NO: 52, i sekvenca lakog lanca SEK ID NO: 61, 15 mM histidina pH 5,7, 8,0% (m / v) saharoze i 0,05% (m / v) polisorbata 80. Sastav može biti u obliku liofilizovanog praha koji se nakon rekonstitucije sterilnom vodom ili drugim rastvor pogodan za injekcije ili infuzije (na primer, 0,9% fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, Ringerov rastvor u laktaciji itd.) obezbeđuje gornji vodeni sastav. Sastav ili druga izvođenja kompozicija takođe mogu biti u oblik šprica ili drugog uređaja pogodnog za injekcije i / ili infuzije napunjen sa odgovarajućom količinom smeše za jednokratnu primenu antitela anti-PD-1.

7.6. Metode upotrebe

7.6.1. Terapijska korist

[0096] Ovde dati podaci pokazuju da otkrivena antitela anti-PD-1 antagonizuju PD-1 u prisustvu ćelije karcinoma i vrše snažnu antikancerogenu aktivnost protiv karcinoma kao što su solidni tumori i maligni tumori krvi in vivo. Shodno tome, antitela anti-PD-1, fragmenti vezivanja i / ili

2

farmaceutske smeše koje sadrže anti-PD-1 antitela mogu se koristiti terapeutski za lečenje solidnih tumora ili malignih tumora u krvi.

[0097] U nekim realizacijama, postupak uključuje davanje humanom pacijentu koji ima solidan tumor u količini na antitelo anti-PD-1 koje antagonizira PD-1 i ubija ćelije tumora brzinom efikasnom da pruži terapijsku korist. Solidni tumori koji se mogu lečiti antitelom anti-PD-1 uključuju, ali nisu ograničeni na, rak nadbubrežne žlezde, bešiku karcinomi, rak kostiju, rak mozga, rak dojke (npr. trostruki negativni rak dojke), rak grlića materice, kolorektalni karcinom karcinomi, karcinomi endometrijuma, karcinomi jednjaka, oka, želuca, karcinomi glave i vrata, karcinomi bubrega (npr. napredni karcinom bubrežnih ćelija), karcinom jetre (npr. hepatocelularni karcinom, holangiokarcinom), karcinom pluća (npr. karcinom pluća nemelih ćelija, mezoteliom, rak pluća malih ćelija), rak glave i vrata, melanomi (npr. neopozivi ili metastatski melanom, uznapredovali maligni melanom), oralni rak, rak jajnika, rak penisa, rak prostate, rak pankreasa, rak kože (npr. karcinom Merkelovih ćelija), rak testisa, rak štitaste žlezde, karcinomi materice, vaginalni karcinomi i tumori sa dokazima o nedostatku popravljanja neusklađenosti DNK. Možda su karcinomi sastoji se od tumorskih ćelija koje eksprimiraju PD-L1 ili PD-L2, karcinoma koji se sastoje od tumorskih ćelija koje ne eksprimiraju PD-L1 ili PD-L2, ili karcinomi koji se sastoje od tumorskih ćelija, od kojih neke izražavaju PD-L1 ili PD-L2, a neke ne. Rak može biti novo dijagnostikovan i naivan za lečenje, ili može biti recidivan, vatrostalni ili recidivan i vatrostalni, ili metastatski oblik čvrstog tumora. U nekim realizacijama, solidni tumor se bira između karcinoma bešike, raka dojke, rak glave i vrata, rak bubrega, rak pluća, limfom, melanom i rak želuca. U nekim realizacijama, solidni tumor se bira između: melanoma (npr., neopozivi ili metastatski melanom), karcinoma pluća (npr., nemalog ćelijski rak pluća) i karcinom bubrežnih ćelija (npr. napredni karcinom bubrežnih ćelija). U nekim realizacijama, solidni tumor je odabran između trostrukog negativnog karcinoma dojke, karcinoma jajnika, hepatocelularnog karcinoma, karcinoma želuca, maloćelijskih pluća karcinom, mezoteliom, holangiokarcinom, karcinom Merkelovih ćelija i tumori sa dokazima o popravljanju DNK neusklađenosti nedostatak. U određenim realizacijama, melanom je BRAF V600 divlji tip neresektabilnog ili metastatskog melanoma. U u drugim određenim realizacijama, melanom je BRAF V600 pozitivan na mutaciju neresektabilan ili metastatski melanom. U u određenim rešenjima, rak pluća je metastatski karcinom pluća bez malih ćelija sa progresijom na platini ili nakon nje hemoterapija. U određenim realizacijama, rak pluća je lokalno uznapredovala ili metastatska pluća nemalih ćelija karcinom koji nije uspeo u terapiji zasnovanoj na platini i naivan je prema agensu za ciljanje PD-1. U određenim rešenjima glava i rak vrata je metastatski (diseminirani) skvamozni karcinom usne šupljine glave i vrata, orofarinksa, hipofarinksa i larinksa koji se lokalnim terapijama smatra neizlečivim. U određenim rešenjima, karcinom bubrežne ćelije je napredni karcinom bubrežnih ćelija koji je prethodno primio anti-angiogenu terapiju.

[0098] U nekim realizacijama, postupak otkrivanja uključuje davanje humanom pacijentu koji ima krv malignost količina anti-PD-1 antitela koje antagonizira PD-1 i ubija maligne ćelije brzinom

2

efikasnom za pružaju terapeutsku korist. Karcinomi se mogu sastojati od malignih ćelija koje eksprimiraju PD-L1 ili PD-L2, karcinome sastoje se od malignih ćelija koje ne eksprimiraju PD-L1 ili PD-L2, ili karcinoma koji se sastoje od malignih ćelija, neki od koji izražavaju PD-L1 ili PD-L2, a neki ne. Rak može biti novo dijagnostikovan i naivan za lečenje, ili može biti recidivan, vatrostalni ili recidivan i vatrostalni, ili metastatski oblik maligne bolesti krvi. Krv maligni tumori koji se mogu lečiti antitelom anti-PD-1 uključuju, ali nisu ograničeni na, mielome (npr. višestruke mijelom), limfomi (npr. Hodgkinov limfom, ne-Hodgkinov limfom, Valdenstromova makroglobulinemija, plašt ćelijski limfom), leukemije (npr. hronična limfocitna leukemija, akutna mijeloična leukemija, akutna limfocitna leukemija), i mijelodisplastični sindromi.

[0099] Kao što je gore diskutovano, trenutno otkrivena antitela anti-PD-1 moduliraju imunološki odgovor. Prema tome, pacijenti sa oštećenim imunološkim sistemom mogu biti isključeni iz lečenja. U nekim realizacijama, a pacijent je isključen nakon ispunjavanja jednog ili više sledećih kriterijuma: (1) Aktivna ili prethodno dokumentovana autoimuna bolest (uključujući, ali bez ograničenja, upalnu bolest creva, celijakiju, Vegenerov sindrom) u poslednje 2 godine. (Ispitanici sa atopijom ili astmom u detinjstvu, vitiligom, alopecijom, Hashimoto sindromom, Graveovom bolešću ili psorijazom nisu koji zahtevaju sistemski tretman (u poslednje 2 godine) nisu isključeni); (2) Istorija primarne imunodeficijencije, kosti transplantacija srži, hronična limfocitna leukemija, transplantacija čvrstih organa ili prethodna klinička dijagnoza tuberkuloza; (3) Istorija koagulopatije ili poremećaja trombocita; (4) Potvrđeni pozitivni rezultati ispitivanja za ljudsku imunodeficijenciju virusa (HIV) ili osobe sa hroničnim ili aktivnim hepatitisom B ili C. (Subjekti koji su u prošlosti imali hepatitis B ili C koji imaju dokumentovano izlečenje nakon antivirusne terapije); (5) Imunološki posredovana neurotoksičnost stepena ≥ 3 ili pneumonitis tokom primanja imunoterapije (uključujući, ali ne ograničavajući se na sredstva usmerena protiv CTLA-4, PD-L1 ili PD-1). Pored toga, bilo koji drugi prethodni stepen ≥ 3 imunološki posredovani neželjeni događaj tokom primanja imunoterapije koja se nije rešila ili postala asimptomatska u roku od 3 meseca; (6) Prijem žive, oslabljene vakcine u roku od 28 dana pre prve doze antitela anti-PD-1.

[0100] Anti-PD-1 antitelo iz otkrića može se primenjivati samostalno (monoterapija) ili kao dodatak ili sa druge terapije protiv raka i / ili ciljani ili neciljani agensi protiv raka. Kada se primenjuje kao anti-PD-1 monoterapija, može se koristiti jedno ili više antitela. Bez obzira da li se primenjuje kao monoterapija ili kao dodatak ili sa drugim terapijama ili agensima, primenjuje se količina antitela anti-PD-1 takva da je ukupan režim lečenja pruža terapeutsku korist.

[0101] Pod terapeutskom korist se podrazumeva da upotreba antitela anti-PD-1 za lečenje raka kod pacijenta rezultira bilo kojim pokazala kliničku korist u poređenju sa nijednom terapijom (kada je to prikladno) ili sa poznatim standardom nege. Klinička korist se može proceniti bilo kojim postupkom poznatim prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. U jednom aspektu, klinička korist je procenjuje se na osnovu stope objektivnog odgovora (ORR) (utvrđeno korišćenjem RECIST verzije 1.1), trajanja odgovora (DOR), preživljavanje bez progresije bolesti (PFS) i / ili celokupno

2

preživljavanje (OS). U nekim realizacijama, potpuni odgovor ukazuje terapijska korist. U nekim realizacijama delimični odgovor ukazuje na terapijsku korist. U nekim realizacijama, stabilan bolest ukazuje na terapijsku korist. U nekim realizacijama, povećanje ukupnog preživljavanja ukazuje na terapijsku korist. U nekim realizacijama, terapijska korist može predstavljati poboljšanje vremena do progresije bolesti i / ili poboljšanje simptoma ili kvaliteta života. U drugim realizacijama, terapijska korist se možda neće povećati period kontrole bolesti, već znatno smanjeni teret simptoma što rezultira poboljšanjem kvaliteta života. Kao što će biti očigledno stručnjacima, može se uočiti terapeutska korist samo korišćenjem antitela anti-PD-1 (monoterapija) ili kao dodatak drugim terapijama protiv raka ili sa njima, ili / ili ciljane ili neciljane agense protiv raka.

[0102] Tipično se terapijska korist procenjuje pomoću standardnih kliničkih testova dizajniranih za merenje odgovora na novi tretman za kancer. Da bi se procenile terapeutske prednosti anti-PD-1 antitela,, može se koristiti jedan ili kombinacija ovde opisanibh testova se može koristiti: (1) Kriterijumi evaluacije odgovora na solidni tumor (RECIST) verzija 1.1, (2) imunosrodnih RECIST (irRECIST), (3) u Istocna kooperativna onkološka grupa (ECOG) status performansa, (4) kriterijumi imunološki – povezanih odgovora (irRC), (5) bolest procenjiva evaluacijom tumorskih antigena, (6) potvrđena pacijenta prijavljenih skala ishoda i / ili (7) Kaplan-Meier-ove procene za sveukupno preživljenje i preživljenje bez progresije bolesti.

[0103] Procena promene opterećenja tumora je važna karakteristika kliničke procene terapeutike kancera. Smanjenje tumora (objektivni odgovor) i vreme za razvoj progresije bolesti važne su krajnje tačke u kliničkim ispitivanjima karcinoma. Standardizirani kriterijumi odgovora, poznati kao RECIST (kriterijumi za ocenu odgovora kod čvrstih tumora), objavljeni su 2000 godine. Ažuriranje (RECIST 1.1) objavljeno je 2009. Kriteriji za RECIST obično se obično koriste u kliničkim ispitivanjima u kojima je objektivni odgovor primarni kraj ispitivanja, kao i u istraživanjima gde je proceni stabilne bolesti, progresija tumora ili analize vreme do progresije se preduzimaju, jer su ovo merenje ishoda bazirane na proceni anatomičkih tereta tumora i izazova istog u procesu kliničkog ispitivanja. Tabela 4 daje definicije kriterijuma reakcije, koji se koriste da se utvrdi odgovor tumora na ispitivani lek , kao što su anti-PD 1 antitela opisana u ovom predmetnom pronalasku.

2

[0104] Sekundarne mere ishoda koje mogu biti od koristi za određivanje u terapeutske koristi anti-PD-1 antitela opisane ovde i koje uključuju, stopa objektivnog odgovora (ORR), Preživljavanje bez progresije bolesti (PFS), Sveukupno preživljavanje (OS), trajanje sveukupnog reakcije (DOR), dubina odgovora/reakcije (DpR). ORR je definiran kao i udeo učesnika koji postignu potpuni odgovor (CR) ili djelimični odgovor (PR). PFS se definiše kao vreme od datuma prve doza anti-PD-1 antitela do bilo progresije bolesti ili smrti, šta god se javi prvo. OS je definisan kao dužina vremena od bilo datuma postavljanja dijagnoze dili samog početka tretmana bolesti, a da su pacijeniti dijagnostikovaniu sa bolešću još uvek živi. DOR je definisan kao u vreme od učesnikovog početnog CR ili PR do vremena početka progresije bolesti. . DpR se definiše kao i procenat umanjenja tumora na tački maximalnog odgovora u poređenju sa osnovnim opterećenjem tumora. Klinička krajnja tačka za ORR I PFS može se utvrditi na temelju goreopisanih kriterijuma RECIST 1.1.

[0105] Dodatni kriterijumi koji se mogu koristiti za kliničku procenu, specifični za pacijente sa ka rcinomom koji se podvrgavaju imunološkoj terapiji uključuju standardizovane kriterijume RECIST-a koji se odnose na imuni sistem (irRECIST). Videti, npr., Nishino, M. et al. EUR. J. Radiol., 84 (7), strane 1259-1268 (2015. jul). Ove smernice su modifikovale gorepomenute kriterijume RECIST 1.1 uzimajući u obzir potencijalne imunološke efekte. U Tabeli 5 nalaze se definicije kriterijuma odgovora korištenih za određivanje objektivnih odgovora tumora na imunomodulatorni lek, kao što su ovde opisano antitelo anti-PD-1.

2

[0106] U ECOG Skale statusa performansa pokazane u Tabeli 6 korišćene za opisivanje nivoa funkcionisanja pacijenta u pogledu na njihovu sposobnost da se brinu o sebi, svakodnevne aktivnosti, i fizičke sposobnosti. skala je razvijena od strane i istočne kooperativne onkološke grupe (ECOG), koja je sada deo ECOG-ACRIN istraživačke grupe raka, i objavljena 1982 godine.

0107] Drugi set kriteruma koji se može koristiti za potpunu karakterizacijui utvrđivanje odgovora na imunoterapijska sredstva, kao što su terapije za rak n abazi antitela , je kriterijum za odgovore povezane sa imunitetom (irRC), koji je razvijen za merenje čvrstih tumora u 2009. godine, i ažuriran u 2013 (Wolchok, et al. Clin. Rak Res.2009; 15 (23): 7412-7420 i Nishino, et al Clin Cancer Res 2013; 19 (14): 3936-3943). Ažurirani kriterijumi irRC se obično koriste za procenu uticaja imunoterapijskog agensa, kao što je antitelo anti-PD-1 koje je opisano gore u tekstu , I definiše odgovore prema tabeli 7.

[0108] Tumorski antigeni koji se mogu koristiti za procenu terapijske koristi opisanih antitela anti-PD-1 ovde uključuju ApoE, CD11c, CD40, CD45 (PTPRC), CD49D (ITGA4), CD80, CSF1R, CTSD, GZMB, Li86, MS4A7, PIK3AP1, PIK3CD, CD74, CCL5, CCR5, CKSCL10, IFNG, IL10RA1, IL-6, ACTA2, COL7A1, LOKS, LRRC15, MCPT8, MMP10, NOG, SERPINE1, STAT1, TGFBR1, CTSS, PGF, VEGFA, C1KA, C1KB, ANGPTL4, EGLN, ANGPTL4, EGLN3, BNIP3, AIF1, CCL5, CKSCL10, CKSCL11, IFI6, PLOD2, KISS1R, STC2, DDIT4, OKS40, OKS40L, PFKFB3, PGK1, PDK1, AKR1C1, AKR1C2, CADM1, CDH11, COL6A3, CTGF, HMOKS1, KRT33A, LUM, VNT5A, IGFBP3, MMP14, CDCP1, PDGFRA, TCF4, TGF, TGFB1, TGFB2, CD11b, ADGRE1 (EMR1, F4 / 80), CD86, CD68, MHC-klasa II, CD3, HLA-DR, CD4, CD3, CD5, CD19, CD7, CD8, CD16, TCRαβ, TCRγδ, PD-1, PD-L1, CTLA-4, kisela fosfataza, ACTH, alkalna fosfataza, alfa-fetoprotein CA-125, CA15-3, CA19-9, CA-195, C-212, CA-549, kalcitonin, kateholamini, katepsin-D, CEA, ERBB2 (HER2 / neu), hromagranin-A, c-Mic, EGFR, ERA (test estrogenskog receptora), feritin, gastrin, 5-HIAA, hCG, alfa-HCG, beta-HCG, HVA, LDH1-5, NSE (neuron specifična enolaza), polipeptid pankreasa, PLAP, PLP, PRA (progesteron receptor A), proinsulin C-peptid, PSA, SMA, SCC, tiroglobulin, TDT, TPA i alfa-TSH. Ovi tumorski antigeni se mogu proceniti na nivou DNK, RNK ili proteina pomoću tehnika sekvenciranja DNK, RNK tehnike sekvenciranja, mikromrež genskog čipa, metode zasnovane na PCR, protočna citometrija ili metode imunohistohemije kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti.

[0109] Jedna primera terapijske koristi koja je rezultat upotrebe ovde opisanih antitela anti-PD-1 za lečenje čvrstih supstanci tumori, bilo da se daju kao monoterapija ili kao dodatak drugim

1

terapijama ili agensima ili zajedno sa njima, potpuni su odgovor. Sledeća primer terapijske koristi koja je rezultat upotrebe ovde opisanih antitela anti-PD-1 za lečenje čvrste supstance tumori, bilo da se daju kao monoterapija ili kao dodatak drugim terapijama ili agensima ili sa njima, delimičan je odgovor.Validirane skale ishoda o kojima izveštava pacijent takođe se mogu koristiti za označavanje odgovora koji pruža svaki pacijent kroz određeni sistem izveštavanja. Umesto da su usredsređeni na bolest, takve skale ishoda se tiču zadržana funkcija tokom upravljanja hroničnim stanjem. Jedan neograničavajući primer potvrđenog ishoda pacijenta skala je PROMIS® (Informativni sistem o merenju ishoda koji izveštava pacijent) od Sjedinjenih Država Instituti za zdravlje. Na primer, PROMIS® Instrument za fizičku funkciju za odrasle pacijente sa rakom može da proceni samoprijavljene mogućnosti funkcionisanja gornjih ekstremiteta (npr. spretnost), donjih ekstremiteta (npr. hodanje ili pokretljivost), i centralne regione (npr. pokretljivost vrata, leđa), i uključuje rutinske svakodnevne aktivnosti, poput trčanja. Kaplan-Meierove krive (Kaplan i Meier, J. Am. Stat. Assoc. 1958; 53 (282): 457-481) takođe se mogu koristiti za procenite celokupno preživljavanje i preživljavanje bez progresije bolesti kod pacijenata sa rakom koji su podvrgnuti terapiji anti-PD-1 antitelima u poređenje sa standardom nege.

7.6.2. Pomoćne terapije

[0112] Anti-PD-1 antitela mogu se koristiti kao dodatak ili sa drugim agensima ili tretmanima koji imaju antikancer svojstva. Kada se koriste kao dodatak, antitelo anti-PD-1 i druga sredstva mogu se formulisati zajedno u jednom, Kombinovana farmaceutska formulacija, ili se mogu formulisati i primeniti odvojeno, bilo na jednoj koordinisanoj režim doziranja ili na različite režime doziranja. Sredstva koja se daju kao dodatak antitelima anti-PD-1 ili sa njima će obično imati komplementarne aktivnosti sa antitelima anti-PD-1, tako da antitela i drugi agensi nemaju negativno utiču jedni na druge.

[0113] Sredstva koja se mogu koristiti zajedno sa antitelima anti-PD-1 uključuju, ali nisu ograničena na, alkilirajuće agense, inhibitori angiogeneze, antitela, antimetaboliti, antimitotici, antiproliferativi, antivirusna sredstva, inhibitori aurora kinaze, promoteri apoptoze (na primer, inhibitori porodice Bcl-2), aktivatori puta receptora smrti, inhibitori Bcr-Abl kinaze, BiTE (Bi-Specific T cell Engager) antitela, konjugati lekova antitela, modifikatori biološkog odgovora, Brutonov tirozin inhibitori kinaze (BTK), inhibitori kinaze zavisni od ciklina, inhibitori ćelijskog ciklusa, inhibitori ciklooksigenaze-2, DVD-ovi, inhibitori leukemije virusnog onkogenog homologa (ErbB2), inhibitori faktora rasta, protein toplotnog šoka (HSP) -90 inhibitori, inhibitori histonske deacetilaze (HDAC), hormonalne terapije, imunološki lekovi, inhibitori inhibitora apoptoze proteini (IAP), interkalirajući antibiotici, inhibitori kinaze, inhibitori kinezina, inhibitori Jak2, meta rapamicina kod sisara inhibitori, mikroRNK, mitogenom aktivirani inhibitori izvanstanične kinaze regulisane signalom, multivalentno vezivanje proteini, nesteroidni antiinflamatorni lekovi

2

(NSAID), poli ADP (adenozin difosfat) -riboza polimeraza (PARP) inhibitori, hemoterapeutici iz platine, inhibitori polo-slične kinaze (Plk), inhibitori fosfoinozitid-3-kinaze (PI3K), inhibitori proteasoma, analogi purina, analogi pirimidina, inhibitori tirozin kinaze receptora, biljka retinoidi / deltoidi alkaloidi, male inhibitorne ribonukleinske kiseline (siRNK), inhibitori topoizomeraze, inhibitori ubikvitin ligaze i slično, kao i kombinacije jednog ili više ovih sredstava.

[0114] BiTE antitela su bispecifična antitela koja usmeravaju T-ćelije da napadaju ćelije raka istovremeno povezujući dve ćelije. T-ćelija zatim napada ciljanu ćeliju karcinoma. Primeri antitela na BiTE uključuju adekatumumab (Micromet MT201), blinatumomab (Micromet MT103) i slično. Bez ograničenja teorijom, jednim od mehanizama pomoću kojih

T-ćelije izazivaju apoptozu ciljne ćelije karcinoma egzocitozom komponenata citolitičkih granula, koje uključuju perforin i granzim B.

[0115] SiRNA su molekuli koji imaju endogene baze RNK ili hemijski modifikovane nukleotide. Izmene ne ukidaju ćelijsku aktivnost, već daju povećanu stabilnost i / ili povećanu ćelijsku snagu. Primeri hemijske modifikacije uključuju fosforotioatne grupe, 2’-deoksinukleotid, 2’-OCH3-sadrže ribonukleotide, 2’- F-ribonukleotidi, 2’-metoksietil ribonukleotidi, njihove kombinacije i slično. SiRNA može varirati dužine (npr.10-200 bps) i strukture (npr. ukosnice, jednostruke / dvostruke niti, ispupčenja, urezi / neusaglašenosti) i obrađuju se u ćelijama da bi se obezbedilo aktivno utišavanje gena. Dvolančana siRNA (dsRNA) može imati isti broj nukleotida na svakom lancu (tupi krajevi) ili asimetrični krajevi (nadvišenja). Nadvišenje 1-2 nukleotida može biti prisutan na osećajnom i / ili antisense lancu, kao i prisutan na 5’- i / ili 3’-krajevima datog lanca.

[0116] Multivalentni vezujući proteini su vezujući proteini koji sadrže dva ili više mesta za vezivanje antigena. Multivalentni vezivni proteini su projektovani da imaju tri ili više mesta za vezivanje antigena i uglavnom se ne javljaju u prirodi antitela. Izraz "multispecifični vezujući protein" označava vezujući protein sposoban da veže dva ili više srodnih ili

nepovezani ciljevi. Proteini koji se vezuju za dvostruki promenljivi domen (DVD) su četverovalentni ili multivalentni vezivni proteini proteini koji sadrže dva ili više mesta za vezivanje antigena. Takvi DVD-ovi mogu biti monospecifični (tj. Sposobni za povezivanje jednog antigen) ili multispecifični (tj. sposobni da vežu dva ili više antigena). DVD proteini koji se sastoje od dva teška lančani DVD polipeptidi i dva laka lanca DVD polipeptida nazivaju se DVD Ig. Svaka polovina DVD-a Ig sadrži DVD polipeptid teškog lanca, DVD polipeptid lakog lanca i dva mesta za vezivanje antigena. Svaka veza lokacija sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca sa ukupno 6 CDR uključenih u antigen vezivanje po mestu vezivanja antigena. mafosfamid, melfalan, mitobronitol, mitolaktol, nimustin, azotni senf N-oksid, ranimustin, temozolomid, tiotepa, TREANDA® (bendamustin), treosulfan i trofosfamid.

Inhibitori angiogeneze uključuju, ali nisu ograničeni na, tirozin kinazu specifičnog za endotelijalni receptor (Tie-2) inhibitori, inhibitori receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), inhibitori receptora vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGF), inhibitori delta-sličnog liganda 4 (DLL4), inhibitori receptora faktora rasta insulina (IGFR-2), matriks metaloproteinaze- 2 (MMP-2) inhibitori, matriks metaloproteinaza-9 (MMP-9) inhibitori, receptor faktora rasta izveden iz trombocita (PDGFR) inhibitori, analozi trombospondina i inhibitori tirozin kinaze receptora vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGFR).

[0119] Konjugati lekova antitela uključuju, ali nisu ograničeni na one koji ciljaju c-Met kinazu (npr. ADC opisani u američkom patentu br. 7,615,529), LRRC15, CD30 (npr. ADCETRIS® (brentukimab vedotin)), CS1 (npr. ADC opisani u Američka publikacija br.20160122430), DLL3 (npr. Rovalpituzumab tesirin (ROVA-T)), HER2 (npr. KADCILA® (trastuzumab) emtansine)), EGFR (npr. ADC-ovi opisani u američkoj publikaciji br.20150337042) i receptor za prolaktin (npr. ADC-ovi opisano u američkoj publikaciji br.20140227294).

[0120] Antimetaboliti uključuju, ali nisu ograničeni na, ALIMTA® (dinatrijum pemetreksed, LI231514, MTA), 5-azacitidin, KSELODA® (kapecitabin), karmofur, LEUSTAT® (kladribin), klofarabin, citarabin, citarabin okfosfat, citozin arabinozid, decitabin, deferoksamin, doksifluridin, eflornitin, EICAR (5-etinil-1-β-D-ribofuranosilimidazol-4-karboksamid),

enocitabin, etnilcitidin, fludarabin, 5-fluorouracil sam ili u kombinaciji sa leukovorinom, GEMZAR® (gemcitabin), hidroksiurea, ALKERAN® (melfalan), merkaptopurin, 6-merkaptopurin ribozid, metotreksat, mikofenolski kiselina, nelarabin, nolatreksid, okfosfat, pelitreksol, pentostatin, raltitreksed, ribavirin, triapin, trimetreksat, S- 1, tiazofurin, tegafur, TS-1, vidarabin i UFT. Antivirusna sredstva uključuju, ali nisu ograničena na, ritonavir, aciklovir, cidofovir, ganciklovir, foskarnet, zidovudin, ribavirin,

i hidroksihlorokin. Inhibitori aurora kinaze uključuju, ali nisu ograničeni na, ABT-348, AZD-1152, MLN-8054, VKS-680, Aurora Aspecific inhibitori kinaze, inhibitori kinaze specifični za Aurora B i inhibitori pan-Aurora kinaze. Inhibitori proteina Bcl-2 uključuju, ali nisu ograničeni na, ABT-263 (navitoclak), AT-101 ((-) gosipol), GENASENSE ® (G3139 ili oblimersen (antisens oligonukleotid koji cilja Bel-2)), IPI-194, IPI-565, N- (4- (4 - ((4’-hloro (1,1’- bifenil) -2-il) metil) piperazin-1-il) benzoil) -4 - (((1R) -3- (dimetilamino) -1 - ((fenilsulfanil) metil) propil) amino) -3-nitrobenzensulfonamid), N- (4- (4 - ((2- (4-hlorofenil) -5,5-dimetil-1-cikloheks-1-en-1-il) metil) piperazin-1-il) benzoil) - 4 - ((1R) -3- (morfolin-4-il) -1 - ((fenilsulfanil) metil) propil) amino) -3 -((trifluorometil) sulfonil) benzensulfonamid,

venetoclak i GKS-070 (obatoclak). Inhibitori Bcr-Abl kinaze uključuju, ali nisu ograničeni na, DASATINIB® (BMS-354825) i GLEEVEC® (imatinib). Inhibitori BTK uključuju, ali nisu ograničeni na, ibrutinib i akalabrutinib.

[0126] CDK inhibitori uključuju, ali nisu ograničeni na, AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, flavopiridol, GPC-286199, MCS-5A, PD0332991, PHA-690509, seliciklib (CIC-202, R-roskovitin) i ZK- 304709.

[0127] Inhibitori COKS-2 uključuju, ali nisu ograničeni na, ABT-963, ARCOKSIA® (etorikoksib), BEKSTRA® (valdekoksib), BMS347070, CELEBREKS® (celekoksib), COKS-189 (lumirakoksib), CT-3, DERAMAKSKS® (derakoksib), JTE-522, 4-metil- 2- (3,4-dimetilfenil) -1- (4-sulfamoilfenil-1 H-pirol), MK-663 (etorikoksib), NS-398, parekoksib, RS-57067, SC- 58125, SD-

4

8381, SVT-2016, S-2474, T-614 i VIOKSKS® (rofekoksib).[0128] EGFR inhibitori uključuju, ali nisu ograničeni na, ABKS-EGF, anti-EGFR imunoliposome, EGF-vakcinu, EMD- 7200, ERBITUKS® (cetuksimab), HR3, IgA antitela, IRESSA® (gefitinib), TARCEVA® (erlotinib ili OSI-774), TAGRISSO ® (osimertinib), TP-38, fuzijski protein EGFR i TIKERB® (lapatinib).

[0128] EGFR inhibitori uključuju, ali nisu ograničeni na, ABX-EGF, anti-EGFR imunoliposome, EGF-vakcinu, EMD- 7200, ERBITUX® (cetuksimab), HR3, IgA antitela, IRESSA® (gefitinib), TARCEVA® ( erlotinib ili OSI-774), TAGRIS- SO® (osimertinib), TP-38, fuzijski protein EGFR i TYKERB® (lapatinib).

[0129] Inhibitori receptora ErbB2 uključuju, ali nisu ograničeni na, CP-724-714, C I-1033 (kanertinib), HERCEPTIN® (trastuzumab), TYKERB® (lapatinib), OMNITARG® (2C4, pertuzumab), TAK- 165, GW-572016 (ionafarnib), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (HER2 cjepivo), APC-8024 (HER-2 vakcina), anti-HER / 2neu bispecifično antitelo, B7.her2IgG3, AS HER2 trifunkcionalna bispecifična antitela, mAB AR-209 i mAB 2B-1.

[0130] Inhibitori histonske deacetilaze uključuju, ali nisu ograničeni na, depsipeptid, LAQ- 824, MS-275, trapoksin, suberoi lanilid hidroksamska kiselinu (SAHA), TSA i valproična kiselinu [0131] Inhibitori HSP-90 uključuju, ali nisu ograničeni na, 17-AAG-nab, 17-AAG, C NF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17- DMAG, geldanamicin, IPI-504, KOS- 953, MYCOGRAB® (ljudsko rekombinantno antitelo prema HSP-90), NCS-683664, PU24FC1, PU-3, radikicol, SNX-2112, STA-9090 i VER49009.

[0132] Inhibitori proteina apoptoze uključuju, ali nisu ograničeni na, HGS1029, GDC-0145, GDC-0152, LCL-161 i LBW-242.

[0133] Aktivatori puta receptora smrti uključuju, ali nisu ograničeni na, TRAIL, antitela ili druga sredstva koja ciljaju TRAIL ili receptore smrti ( npr. DR4 i DR5) kao što su Apomab, konatumumab, ETR2-ST01, GDC0145 (leksatumumab ), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 i trastuzumab.

[0134] Inhibitori kinesina uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore Eg5 kao što su AZD4877, ARRY-520; i inhibitore CENPE kao što je GSK923295A.

[0135] Inhibitori JAK-2 uključuju, ali nisu ograničeni na, CEP-701 (lesaurtinib), XL019 i INCB018424.

[0136] MEK inhibitori uključuju, ali nisu ograničeni na, ARRY-142886, ARRY-438162, PD-325901 i PD-98059.

[0137] Inhibitori mTOR uključuju, ali nisu ograničeni na njih, AP-23573, CCI-779, everolimus, RAD-001, rapamicin, temsirolimus, ATP-konkurentne TORC1 / TORC2 inhibitore, uključujući PI-103, PP242, PP30, i Torin 1.

[0138] Nesteroidni protivupalni lekovi uključuju, ali nisu ograničeni na, AMIGESIC® (salsalat), DOLOBID® (diflunisal), MOTRIN® (ibuprofen), ORUDIS® (ketoprofen), RELAFEN® (nabumeton), FELDENE® (piroksikam), ibu-profen kremu, ALEVE® (naproksen) i NAPROSYN® (naproksen), VOLTAREN® (diklofenak), INDOCIN® (indometacin), CLINORIL® (sulindak), TOLECTIN® (tolmetin), LODINE® (etodolac), TORADOL® (ketorolac) i DAYPRO® (oksaprozin).

[0139] PDGFR inhibitori uključuju, ali nisu ograničeni na, C-451, CP-673 i CP-868596.

[0140] Hemoterapeutici platine uključuju, ali nisu ograničeni na, cisplatin, ELOXATIN® (oksaliplatin) eptaplatin, loba-platina, nedaplatin, PARAPLATIN® (karboplatin), satraplatin i pikoplatin.

[0141] Inhibitori polo-slične kinaze uključuju, ali nisu ograničeni na, BI-2536.

[0142] Inhibitori fosfoinozitid-3 kinaze (PI3K) uključuju, ali nisu ograničeni na, vortmanin, LY294002, XL-147, CAL-120, ONC-21, AEZS-127, ETP-45658, PX-866, GDC-0941 , BGT226, BEZ235 i XL765.

[0143] Analozi trombospondina uključuju, ali nisu ograničeni na, ABT-510, ABT-567, ABT-898 i TSP-1.

[0144] VEGFR inhibitori uključuju, ali nisu ograničeni na, ABT-869, AEE-788, ANGIOZIME ™ (ribozim koji inhibira angiogeneza (Ribozime Pharmaceuticals (Boulder, CO) i Chiron (Emeriville, CA)), aksitinib (AG-13736), AZD-2171, CP-547,632, CIRAMZA® (ramucirumab), IM-862, MACUGEN® (pegaptamib), NEKSAVAR® (sorafenib, BAI43-9006), pazopanib (GV-786034), vatalanib (PTK-787, ZK-222584), SUTENT® (sunitinib, SU-11248), STIVARGA® (regorafenib), VEGF zamka i ZACTIMA ™ (vandetanib, ZD-6474).

[0145] Antibiotici uključuju, ali nisu ograničeni na, interkalirajuće antibiotike aklarubicin, aktinomicin D, amrubicin, annamicin, adriamicin, BLENOXANE® (bleomicin), daunorubicin, CAELYX® ili MYOCET® (liposomski doksorubicin), el-samitrucin, el-samitrucin epirbucin, glarbuicin, ZAVEDOS® (idarubicin), mitomicin C, nemorubicin, neokarzinostatin, peplomicin, pirarubicin, rebekamicin, stimalamer, streptozocin, VALSTAR® (valrubicin) i zinostatin.

[0146] Inhibitori topoizomeraze uključuju, ali nisu ograničeni na, aklarubicin, 9-aminokamptotecin, amonafid, amsa- krina, bekatekarin, belotekan, BN-80915, CAMPTOSAR® (irinotekan hidrohlorid), kamptotecin, CARDIOXANE® (deksrazoksin), diflomotekan, edotekarin, ELLENCE® ili PHARMORUBICIN® (epirubicin, etopozitamid-grozni hidroklorid, etopozitamidgrozni hidroksid , lurtotekan, mitoksantron, Onivyde ™ (liposomski irinotekan), oratecin, pirarbucin, piksantron, rubitekan, sobazoksan, SN-38, taflupozid i topotekan.

[0147] Antitela uključuju, ali nisu ograničena na, AVASTIN® (bevacizumab), CD40-specifična antitela, chTNT-1 / B, denosumaba, ERBITUX® (cetuksimab), HUMAX-CD4® (zanolimumab), antitela specifična za IGF1R, lintuzumab, specifična antitela na OX-40, PANOREX® (edrecolomab), RENCAREX® (WX G250), RITUXIMb® (rituximab), rituximab , traztuzumab, pertuzumab, VECTIBIX® (panitumumab) i CD20 antitela tipa I i II.

[0148] Hormonske terapije uključuju, ali nisu ograničene na, ARIMIDEKS® (anastrozol), AROMASIN® (eksemestan), arzoksifen, CASODEKS® (bikalutamid), CETROTIDE® (cetroreliks), degareliks, deslorelin, DESOPAN® (trilostan), deksametazon, DROGENIL® (flutamid), EVISTA® (raloksifen), AFEMA ™ (fadrozol), FARESTON® (toremifen),FASLODEKS® (fulvestrant), FEMARA® (letrozol), formestan, glukokortikoidi, HECTOROL® (dokserkalciferol), RENAGEL ® (sevelamer karbonat), lasofoksifen, leuprolid acetat, MEGACE® (megesterol), MIFEPREKS® (mifepriston), NILANDRON ™ (nilutamid), NOLVADEKS® (tamoksifen citrat), PLENAKSIS ™ (abarelik), prednizon, PROPECIA® (finasterid), rilostan, SUPREFACT® (buserelin), TRELSTAR® (luteinizujući hormon koji oslobađa hormon (LHRH)), VANTAS ® (implantat Histrelin), VETORIL® (trilostan ili modrastan) i ZOLADEKS® (fosrelin, goserelin).

[0149] Deltoidi i retinoidi uključuju, ali nisu ograničeni na, seokalcitol (EB1089, CB1093), leksakalcitrol (KH1060),

fenretinid, PANRETIN® (aliretinoin), ATRAGEN® (liposomski tretinoin), TARGRETIN® (beksaroten) i LGD-1550.

[0150] PARP inhibitori uključuju, ali nisu ograničeni na, ABT-888 (veliparib), KU-59436, AZD-2281 (olaparib), AG-014699

(rukaparib), MK4827 (niraparib), BMN-673 (talazoparib), iniparib, BSI-201, BGP-15, INO-1001 i ONO-2231.

Biljni alkaloidi uključuju, ali nisu ograničeni na, vinkristin, vinblastin, vindesin i vinorelbin.

[0152] Inhibitori proteasoma uključuju, ali nisu ograničeni na, VELCADE® (bortezomib), KIPROLIS® (karfilzomib), MG132, NPI-0052 i PR-171.

[0153] Primeri imunoloških lekova uključuju, ali nisu ograničeni na, interferone, inhibitore imunološke kontrolne tačke, kostimulatorne agensi i drugi agensi za jačanje imuniteta. Interferoni uključuju interferon alfa, interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon beta, interferon gama-la, ACTIMMUNE® (interferon gama-lb) ili interferon gama-nl, njihove kombinacije i slično. Inhibitori imunih kontrolnih punktova uključuju antitela koja ciljaju PD-L1 (npr. Durvalumab, atezolizumab, avelumab, MEDI4736, MSB0010718C i MPDL3280A) i CTLA4 (citotoksični limfocitni antigen 4; npr. ipilimumab, tremelimumab). Kostimulativna sredstva uključuju, ali nisu ograničena na, antitela protiv CD3, CD40, CD40L, CD27, CD28, CSF1R, CD137 (npr. Urelumab), B7H1, GITR, ICOS, CD80, CD86, OKS40, OKS40L, CD70, HLADR, LIGHT, LIGHT-R, TIM3, A2AR, NKG2A, KIR (npr. Lirilumab), TGF-β (npr. Fresolimumab) i njihove kombinacije. [0154] Ostali agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, ALFAFERONE® (IFN-α), BAM-002 (oksidisani glutation), BEROMUN® (tasonermin), BEKSKSAR® (tositumomab), CAMPATH® (alemtuzumab), dakarbazin, denileukin, epratuzumab, GRANOCITE® (lenograstim), lentinan, leukocit alfa interferon, imikvimod, vakcina protiv melanoma, mitumomab, molgramostim, MILOTARG ™ (gemtuzumab ozogamicin), NEUPOGEN® (filgrastim), OncoVAC-CL, OVAREKS® (oregovomab), pemtumomab (I-muHMFG1), PROVENGE® (sipuleucel-T), sargaramostim, sizofilan, teceleukin, THERACIS ® (Bacillus Calmette-Guerin), ubenimek, VIRULIZIN® (imunoterapeutski, Lorus Pharmaceuticals), Z-100 (specifičan Supstanca Maruiame (SSM), VF-10 (Tetrachlorodecaokide (TCDO)), PROLEUKIN® (aldesleukin), ZADAKSIN® (timalfasin), ZINBRITA® (postupak visokog prinosa daclizumaba) i ZEVALIN® (90I-Ibritumomab tiuketan).

[0155] Modifikatori biološkog odgovora su agensi koji modifikuju odbrambene mehanizme živih organizama ili biološke reakcije, kao što su preživljavanje, rast ili diferencijacija ćelija tkiva da bi ih usmerili da imaju antitumorsku aktivnost i uključuju, ali nisu ograničeni na, krestin, lentinan, sizofiran, picibanil PF-3512676 (CpG-8954) i ubenimek.

[0156] Analogi pirimidina uključuju, ali nisu ograničeni na, citarabin (ara C ili Arabinozid C), citozin arabinozid, doksifluridin, FLUDARA® (fludarabin), 5-FU (5-fluorouracil), floksuridin, GEMZAR® (gemcitabin), TOMUDEKS® (ratitreksed), i TROKSATIL ™ (triacetiluridin troksacitabin).

Analozi purina uključuju, ali nisu ograničeni na, LANVIS® (tioguanin) i PURINETHOL® (merkaptopurin). Antimitotički agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, batabulin, epotilon D (KOS-862), N- (2 - ((4-hidroksifenil) amino) piridin-3-il) -4-metoksibenzensulfonamid, iksabepilon (BMS 247550), TAKSOL® (paklitaksel), TAKSOTERE® (docetaksel), PNU100940 (109881), patupilon, KSRP-9881 (larotaksel), vinflunin i ZK-EPO (sintetički epotilon). Inhibitori ubikvitin ligaze uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore MDM2, kao što su nutlini, i inhibitore NEDD8 kao što je MLN4924.

[0160] Anti-PD-1 antitela se takođe mogu koristiti za poboljšanje efikasnosti terapije zračenjem. Primeri zračenja terapija uključuje spoljnu zračnu terapiju zračenjem, unutrašnju zračnu terapiju (tj. brahiterapiju) i sistemsko zračenje terapija.

[0161] Anti-PD-1 antitela mogu se davati kao dodatak ili sa drugim hemoterapeutskim agensima kao što je ABRAKSANE ™ (ABI-007), ABT-100 (inhibitor farnezil transferaze), ADVEKSIN® (vakcina Ad5CMV-p53), ALTOCOR® ili MEVACOR ® (lovastatin), AMPLIGEN® (poli I: poli C12U, sintetička RNK), APTOSIN® (egzizulind), AREDIA® (pamidronic kiselina), arglabin, L-asparaginaza, atamestan (1-metil-3,17-dion-androsta-1,4-dien), AVAGE® (tazaroten), AVE-8062 (derivat kombreastatina) BEC2 (mitumomab), kahektin ili kaheksin (faktor nekroze tumora), kanvaksin (vakcina), CEAVAC® (vakcina protiv raka), CELEUK® (celmoleukin), CEPLENE® (histamin dihidrohlorid), CERVARIKS® (čovek vakcina protiv papiloma virusa), CHOP® (C: CITOKSAN® (ciklofosfamid); H: ADRIAMICIN® (hidroksidoksorubicin); O: Vincristine (ONCOVIN®); P: prednizon), CIPAT ™ (ciproteron acetat), kombrestatin A4P, DAB (389) EGF (katalitički i domeni translokacije toksina difterije fuzionisani preko His-Ala veznika sa humanim epidermalnim faktorom rasta) ili TransMID 107R ™ (toksini difterije), dakarbazin, daktinomicin, 5,6-dimetilksanthenon-4-sirćetna kiselina (DMKSAA), eniluracil, EVIZON ™ (skvalaminski laktat), DIMERICINE® (losion za liposome T4N5), diskodermolid, DKS-8951f (egzatekan mezilat), enzastaurin, EP0906 (epitilon B), GARDASIL® (kvadrivalentni humani papiloma virus (tipovi 6, 11, 16, 18) rekombinantni vakcina), GASTRIMMUNE®, GENASENSE®, GMK (gangliozidna konjugovana vakcina), GVAKS® (vakcina protiv raka prostate), halofuginon, histrelin, hidroksikarbamid, ibandronska kiselina, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13-PE38KKR (cintredekin besudotok), IL-13-pseudomonas egzotoksin, interferon-α, interferon-γ, JUNOVAN ™ ili MEPACT ™ (mifamurtid), lonafarnib, 5,10-metilenetetrahidrofolat, miltefozin (heksadecilfosfoholin), NEOVASTAT® (AE-941), NEUTREKSIN® (trimetreksat glukuronat), NIPENT® (pentostatin), ONCONASE® (enzim ribonukleaze), ONCOPHAGE® (melanom tretman vakcinom), ONCOVAKS® (vakcina IL-2), ORATHECIN ™ (rubitekan), OSIDEM® (ćelijski lek na bazi antitela), OVAREKS® MAb (mišje monoklonsko antitelo), paklitaksel, PANDIMEKS ™ (aglikonski saponini iz ginsenga koji sadrže 20 (S) protopanakadiol (aPPD) i 20 (S) protopanakatriol (aPPT)), panitumumab, PANVAC®-VF (ispitivani rak) vakcina), pegaspargaza, PEG interferon A, fenoksodiol, prokarbazin, rebimastat, REMOVAB® (katumaksomab), REVLIMID ® (lenalidomid), RSR13 (efaproksiral), SOMATULINE® LA (lanreotid), SORIATANE® (acitretin), staurosporin (Streptomices staurospores), talabostat (PT100), TARGRETIN® (beksaroten), TAKSOPREKSIN® (DHA-paklitaksel), TELCITA ® (canfosfamid, TLK286), temilifen, TEMODAR® (temozolomid), tesmilifene, talidomid, THERATOPE® (STn-KLH), timitak (2-amino-3,4-dihidro-6-metil-4-okso-5- (4-piridiltio) hinazolin dihidrohlorid), TNFERADE ™ (adenovektor: nosač DNK koji sadrži gen za faktor nekroze tumoraα), TRACLEER® ili ZAVESCA® (bosentan), tretinoin (Retin-A), tetrandrin, TRISENOKS® (arsenov trioksid), VIRULIZIN®, ukrain (derivat alkaloida iz veća biljka celandina), vitaksin (antitela protiv alfavbeta3), KSCITRIN® (moteksafin gadolinijum), KSINLAI ™ (atrasentan), KSIOTAKS ™ (paklitaksel poliglumeks), IONDELIS® (trabektedin), ZD-6126, ZINECARD® (deksrazoksan), ZOMETA® (zolendronic kiselina) i zorubicin, kao i kombinacije bilo kog od ovih sredstava.

[0162] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 se daje kao dodatak ili sa konjugatom antitelolek ciljanje c-Met kinaze za lečenje karcinoma pluća nemelih ćelija, raka glave i vrata, raka gušterače, kolorektalne rak ili rak želuca.

[0163] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 se daje kao dodatak ili sa konjugatom antitelolek ciljanje LRRC15 za lečenje karcinoma pluća nemelih ćelija, raka glave i vrata, raka gušterače, sarkoma, trostrukog negativni rak dojke ili melanom.

[0164] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 se daje kao dodatak ili sa konjugatom antitelolek ciljanje EGFR za lečenje glioblastoma.

[0165] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 daje se kao dodatak ili sa konjugatom antitelaleka koji cilja CS1 za lečenje malignih tumora u krvi kao što je višestruki mijelom.

[0166] U nekim realizacijama, antitelo anti- PD-1 daje se kao dodatak ili sa konjugatom antitelolek ciljajući DLL3 za lečenje karcinoma pluća malih ćelija ili glioblastoma.

[0167] U nekim realizacijama, anti-PD-1 antitelo se daje dodatna ili sa anti-CD40 proteinom za liječenje glave i vrata rak pluća rak (kao štosu adenokarcinom, nemikrocelularni

karcinom pluća, mezotelioma, mali ćelijski rak pluća), melanom, rak jajnika ili rak gušterače .

[0168] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 daje se kao dodatak venetoklaksu ili sa njim za lečenje malignih tumora u krvi, kao što je hronična limfocitna leukemija.

[ 0169] U nekim realizacijama, antitelo anti- PD-1 daje se kao dodatak ibrutinibu ili sa njim za lečenje malignih tumora u krvi, poput hronične limfocitne leukemije, limfoma plaštnih ćelija ili Waldenströmove makroglobulinemije ili solidnog/čvrstog tumora.

[0170] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 daje se kao dodatak ipilimumabu ili s njim i konjugat antitela - leka koji cilja c-Met kinazu za lečenje karcinoma pluća bez malih ćelija.

[0171] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 daje se kao dodatak ipilimumabu ili sa njim i konjugat antitela i leka koji cilja LRRC15 za lečenje nemikrocelularnog karinoma pluća.

7.7. Doziranja i režimi primjene

[0172] Količina primenjenih antitela anti-PD-1 zavisiće od raznih faktora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, određenu vrstu solidnog/čvrstog tumora koji se leči, stadijuma solidnog/čvrstog tumora koji se leči, način davanja, učestalost primene, željena terapijska koristi i drugi parametri kao što su starost, težina i druge karakteristike pacijenta itd. Određivanje doza koje su efikasne za pružanje terapijske koristi za određene načine i učestalost primene u okviru je sposobnosti stručnjaka.

[0173] Doze efikasne za pružanje terapijske koristi mogu se inicijalno proceniti na in vivo životinjskim modelima ili klinički. U struci su poznati pogodni životinjski modeli za širok spektar bolesti.

[0174] Ovde otkrivena antitela anti-PD-1 mogu se davati bilo kojim putem koji odgovara stanju treba tretirati. U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 je bilo koje od humanizovanih antitela navedenih u TABELI 3. U specifična realizacija, antitelo anti-PD-1 ima težak lanac prema SEK ID NO: 51 ili SEK ID NO: 52, I laki lanac prema SEK ID NO: 61. Anti-PD-1 antitelo obično se daje parenteralno, tj. Infuzija, subkutano, intramuskularno, intravenozno (IV), intradermalno, intratekalno, bolus, intratumoralno ubrizgavanje ili epiduralno ((Shire i sar., 2004, J. Pharm. Nauke 93 (6): 1390-1402)). U jednom izvođenju, antitelo anti-PD-1 je obezbeđeno kao liofilizovano

prašak u bočici. Bočice mogu sadržavati 100 mg, 110 mg, 120 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg ili 400 mg anti- PD-1 antitelo. Pre primene, liofilizovani prah se rekonstituiše sa sterilnom vodom za injekcije (SVFI) ili drugi pogodan medijum za dobijanje rastvora koji sadrži 20 mg / ml antitela anti-PD-1. U nekim realizacijama, rezultujući rekonstituisani rastvor se dalje razblaži fiziološkim rastvorom ili drugim pogodnim medijumom za infuziju i daje se intravenozno infuzija dva puta na 7 dana, jednom na 7 dana, jednom na 14 dana, jednom na 21 dan, jednom na 28 dana, jednom svakih 35 dana, jednom u 42 dana, jednom u 49 dana ili jednom u 56 dana. U nekim realizacijama, za prvo ciklus, infuzija se dešava tokom 90 minuta. U nekim realizacijama, naknadne infuzije traju preko 60 minuta.

[0175] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 daje se kao IV infuzija jednom u 7 dana u dozi od 0,1 mg / kg, 0,5 mg / kg, 1,0 mg / kg, 2,0 mg / kg, 3,0 mg / kg , 4,0 mg / kg, 5,0 mg / kg, 6,0 mg / kg, 8,0 mg / kg ili 10,0 mg / kg.

4

[0176] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 daje se kao IV infuzija jednom u 14 dana u dozi od 0,1 mg / kg, 0,5 mg / kg, 1,0 mg / kg, 2,0 mg / kg, 3,0 mg / kg, 4,0 mg / kg, 5,0 mg / kg, 6,0 mg / kg, 8,0 mg / kg ili 10,0 mg / kg.

[0177] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 se daje kao IV infuzija jednom u 21 dan u 0,1 mg / kg, 0,5 mg / kg, 1,0 mg / kg, 2,0 mg / kg, 3,0 mg / kg, 4,0 mg / kg, 5,0 mg / kg, 6,0 mg / kg, 8,0 mg / kg ili 10,0 mg / kg.

[0178] U nekim realizacijama, antitelo anti-PD-1 se primenjuje kao IV infuzija jednom u 28 dana sa 0,1 mg / kg, 0,5 mg / kg, 1,0 mg / kg, 2,0 mg / kg, 3,0 mg / kg, 4,0 mg / kg, 5,0 mg / kg, 6,0 mg / kg, 8,0 mg / kg ili 10,0 mg / kg.

[0179] U jednom primernom ostvarenju, antitelo anti-PD-1 se koristi kao dodatak ipilimumabu (IERVOI®) za lečenje nedrobnoćelijski rak pluća. Anti-PD-1 antitelo se daje IV infuzijom jednom u 21 dan u dozi od 1,0 mg / kg ili 3,0 mg / kg. Ipilimumab se daje intravenoznom infuzijom u dozi od 1 mg / kg jednom u tri nedelje tokom četiri nedelje doze. Nakon poslednje doze ipilimumaba, antitelo anti-PD-1 se daje IV infuzijom jednom na 14 dana na 1,0 mg / kg ili 3,0 mg / kg. Dodatna terapija anti-PD-1 antitelima / ipilimumabom nastavlja se do bolesti progresiju ili je pacijent više ne toleriše.

[0180] U jednom primernom ostvarenju, antitelo anti-PD-1 se koristi kao dodatak ipilimumabu (IERVOI®) za lečenje nedrobnoćelijski rak pluća. Antitelo anti-PD-1 se daje IV infuzijom jednom na 14 dana u dozi od 1,0 mg / kg ili 3,0 mg / kg. Ipilimumab se daje intravenoznom infuzijom u dozi od 1 mg / kg jednom u šest nedelja tokom četiri doze. Dodatna terapija anti-PD-1 antitelima / ipilimumabom nastavlja se sve dok progresija bolesti ili je više ne toleriše strpljiv.

[0181] U jednoj primernoj realizaciji, antitelo anti-PD-1 se koristi kao dodatak ipilimumabu (YERVOY®) za lečenje nemikrocelularnog karcinoma Anti-PD-1 antitelo se daje preko IV infuziju svakih 14 dana na 1,0 mg / kg ili 3,0 mg / kg. Ipilimumab se daje intravenoznom infuzijom u dozi od 1 mg / kg svakih dvanaest sedmica tokom četiri doze. Dodatak terapiji anti-PD-1 antitela / ipilimumab se nastavlja sve do progresije bolesti ili dok pacijent više ne može da toleriše dodatak terapiji.

[0182] Kada se daju kao dodatak drugim agensima ili s njima, kao što su druga hemoterapeutska sredstva, antitela anti-PD-1 mogu se davati istim rasporedom kao i druga sredstva ili drugačijim rasporedom. Kada se daje prema istom rasporedu, anti-PD-1 može se davati pre, posle ili istovremeno sa drugim agensom. U nekim realizacijama gde se anti-PD-1 antitel daje kao dodatak da, ili sa, standardima nege, antitela anti- PD-1 može se inicirati pre početka standardne terapije, na primer na dan, nekoliko dana, sedmica, nekoliko sedmica, mesec ili čak nekoliko meseci pre početka standardne terapijske njege. U nekim realizacijama gde se primjenjuje kao dodatak , ili sa anti-PD-1 antitelom, standardima nege, anti-PD-1 antitelo se može biti uključiti nakon početka standardne terapije, na primer jedan dan, nekoliko dana, a danas, nekoliko sedmica, mesec dana ili čak nekoliko meseci nakon početka standardne terapije.

[0183] Kao što će ceniti stručnjaci u ovoj struci, preporučene doze za razna gore opisana sredstva možda će se trebati prilagoditi kako bi se optimizirao odgovor pacijenta i povećala terapijska korist.

8. PRIMERI

[0184] Sledeći primeri, koji ističu određene karakteristike i svojstva primena ovde opisanih antitela anti-PD-1, obezbeđeni su u svrhu ilustracije, a ne ograničenja.

Primer 1: Materijali i metode

8.1.1. Vezivanje antitela za humani PD-1 koji se vezuje za pločicu ELISA-om

[0185] Ploče sa imunolonom 4kHB sa 96 jažica prevučene su 1 ug / ml fuzije humanog PD-1 Fc na 4 ° C preko noći. Ploče su blokirani sa PBS koji sadrži 1% BSA tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim isprani tri puta sa PBS koji sadrži 0,1% Tveen 20 (PBST) pomoću pločaste podloške. Zatim su ploče obložene PD-1 inkubirane sa naznačenim koncentracijama antitela na sobnoj temperaturi (RT) tokom jednog sata. Ploče su isprane četiri puta sa PBST, a zatim inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi sa 100 ml kozjeg anti-humanog Fab fragmenta specifičnog biotina pripremljenog u razblaženje 1: 5000 u PBS koji sadrži 1% BSA. Ploče su isprane pet puta u PBST i 100 ml razblaženja 1: 1000 Streptavidin-HRP je dodat u svaku jažicu i inkubiran 30 minuta na RT. Ploče su isprane pet puta u PBST i u svaku jažicu je dodato 100 mL TMB One Componenta i inkubirano na sobnoj temperaturi dok se ne razvije boja (približno 5-10 minuta). Optička gustina (OD) očitana je na 650 nm primenom Spectromak190 (Molecular Devices).

8.1.2. Vezivanje antitela za humani PD-1 izražen na površini ćelije

[0186] PD-1 eksprimirajuće Jurkat ćelije su sakupljene iz čutura i resuspendovane do 2 k 106 ćelija / ml u PBS koji sadrži 1% BSA. 100 ml ćelija je dodato u ploču sa 96 jažica sa okruglim dnom koja sadrži 100 ml titriranog test antitela ili izotipa kontrola. Ćelije su inkubirane antitelima na sobnoj temperaturi tokom 25 minuta, a zatim isprane dva puta sa PBS koji sadrži 1% BSA. Kuglica ćelija je resuspendovana u 100 ml 1: 250 razblaženog sekundarnog antitela kozjeg antičoveka Fab PE. Posle 25 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, ćelije su isprane dva puta PBS-om koji sadrži 1% BSA i resuspendovane u 200 ml 1% BSA. Ćelije su analizirane pomoću protočnog citometra Becton Dickinson FACSCanto. Podaci su analizirani pomoću softvera BD FACSDiva (verzija 8.0.1).

8.1.3. Vezivanje antitela za pločicu vezanog Cinomolgus majmuanti-PD-1 ELISA-om

[0187] Imunolon 4kHB ploče sa 96 jažica obložene su fuzijom 1 mg / ml cinomolgus PD-1 Fc u DPBS na 4 ° C preko noći. Ploče su blokirane PBS-om koji sadrži 1% BSA tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim isprane tri puta sa PBST (PBS Tveen 200,1%) pomoću pločaste podloške. Zatim su ploče obložene PD-1 inkubirane sa naznačenim koncentracijama antitela na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Ploče su isprane četiri puta sa PBST i zatim inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi sa 100 ml specifičnog biotina Fab fragmenta kozjeg anti-humanog preparata pripremljenog u razblaženju 1: 5000 u PBS koji sadrži 1% BSA. Ploče su isprane pet puta u PBST i dodavano je 100 ml razblaženja Streptavidin-HRP u omjeru 1: 1000 svaki otvor i inkubiran 30 minuta na RT. Ploče su potom isprane pet puta u PBST i 100 ml TMB. U svaku jažicu dodata je po jedna komponenta i inkubirana na sobnoj temperaturi dok se ne razvije boja (približno 5-10 minuta). Optički gustina (OD) očitana je na 650 nm pomoću Spectromak190 (Molecular Devices).

8.1.4. Vezivanje antitela za aktivirane humane CD4 T ćelije

[0188] Mononuklearne ćelije periferne krvi čoveka (PBMC) izolovane su iz debelih kaputa kupljenih od Stanforda Centar za krv (Palo Alto, Kalifornija). Ukratko, mekani slojevi su razblaženi u omjeru 1: 1 sa PBS bez magnezijuma i kalcijuma. Razblažena krv (30 ml) je naslojena preko 15 ml 90% Ficoll-Pakue Plus pripremljenog u PBS bez magnezijuma i kalcijum sadržan u epruvetama SepMate. Epruvete su zavrtene na 1200 g tokom 10 minuta. Međufaza je sakupljena i opere se dva puta u 1k PBS. PBMC su kultivisani u 2 k 106 ćelija / ml tokom 48 sati u RPMI medijumu koji sadrži 10% HI FCS sa 1 mg / mL PHA i 50 U / mL rekombinantnog humanog IL-2. Ćelije su sakupljene, isprane i inkubirane antitelima na RT 25 minuta. Označene ćelije su isprane dva puta PBS-om koji sadrži 1% BSA. Ćelije su resuspendovane 100 mL PBS 1% BSA i razblaživanje 1: 250 PE konjugovanog kozjeg anti-humanog Fab fragmenta i anti-CD4-FITC su dodato. Posle 30 minuta, ćelije su isprane dva puta PBS-om koji sadrži 1% BSA i resuspendovane u 200 ml 1% BSA. Ćelije su analizirane pomoću protočnog citometra Becton Dickinson FACSCanto. Podaci su analizirani pomoću BD FACSDiva softver (verzija 8.0.1).

8.1.5. Afinitet vezivanja za PD-1 površinskom plazmonskom rezonancom

[0189] Kinetika vezivanja anti-PD-1 antitela za rekombinantni rastvorljivi PD-1 ECD (vanćelijski domen) je određena površinskim merenjima zasnovanim na rezonanci plazmona napravljenim na instrumentu Biacore T200 na 25 ° C pomoću pristup analizi hvatanja protiv Fc. Rekombinantni vanćelijski domeni humanog PD-1 (ostaci 1-167) i cinomolgusa PD-1 (ostaci 21-167) su kupljeni

4

od komercijalnog izvora i dalje prečišćeni gel filtracijom u 10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA. Priprema čipa i kinetička merenja vezivanja izvršena su u puferu za ispitivanje HBS-EP (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% Tveen 20). Za pripremu anti-Fc čipa za hvatanje, približno 2000 RU kozjih anti-humanih IgG Fc poliklonskih antitela razblaženih na 25 mg / mL u 10 mM natrijum acetata (pH 4,5), direktno je imobilisan preko CM5 biosenzorskog čipa pomoću standardnog kompleta za spajanje amina prema uputstva i postupci proizvođača. Nereagovani ostaci na površini biosenzora blokirani su etanolaminom. Za merenje kinetike vezivanja, svaki ciklus ispitivanja sadrži sledeće korake: (1) hvatanje testa antitelo samo na test površini; (2) ubrizgavanje analita (samo PD-1 ECD ili pufer) preko referentne i ispitne površine, 240 mL pri 80 mL / min, nakon čega je praćena disocijacija tokom 900 sekundi pri 80 mL / min: i (3) regeneracija zahvati površinu 10 mM glicin hidrohlorida, injekcije pH 1,5 preko referentne i ispitne površine. Tokom Analiza, sva merenja su referencirana samo na površini za hvatanje (tj. bez zarobljenog test antitela) i injekcije samo sa puferom korišćene su za dvostruko referenciranje. Koncentracija PD-1 injekcija kretala se od 900 nM do 11,1 nM u slučajnoj seriji od 3 puta razblaživanja. Podaci su obrađeni i globalno prilagođeni modelu vezivanja 1: 1 koristeći Biacore Softver za procenu T200 za određivanje konstanti kinetičke brzine vezivanja, ka (M-1 · sec-1) i kd (sec-1), i ravnoteže konstanta disocijacije KD (M).

8.1.6. Blokiranje interakcije PD-1 sa PD-L1 i PD-L2

[0190] Ljudske PD-1 koje eksprimiraju ćelije HEK 293G sakupljene su iz slivnih tikvica. Godine ćelije su resuspendovane PBS u koncentraciji od 2 k 106 ćelija / ml. Ćelije (1 k 105) su dodate u svaku jažicu donje ploče sa 96 jažica i ćelijama su blokirani 15 minuta na 4 ° C upotrebom humanog FcR bloka. U odvojenim pločama testirajte antitela i rešenja za kontrolu izotipa pripremljeni su korišćenjem trostrukog serijskog razblaženja početne koncentracije od 20 mg / ml. Ćelije su isprane u 1k PBS i 50 ml pripremljenih razblaženja antitela i 50 ml PD-L1 Hisoznačenih ili PD-L2 His-označenih liganada (10 mg / ml) su dodati na ploču koja sadrži ćelije. Ćelije su inkubirane na 4 ° C tokom 30 minuta i isprane dva puta sa 1k PBS. Anti-His APC antitelo (50 ml) pripremljeno u razblaženju od 1:50 u PBS je dodato u svaku jažicu i inkubirano 30 minuta na 4 ° C. Ćelije su isprane dva puta, resuspendovane u PBS i stečene na LSR II Fortessa (BD Biosciences, San Jose, CA).

8.1.7. Analiza alogene reakcije mešanih limfocita na čoveku (MLR) korišćenjem prečišćenih CD4 T ćelija i dendritičnih ćelija

[0191] Humani PBMC su izolovani iz širokih kaputa kupljenih od Stanford Blood Center (Palo Alto, CA). Ukratko, nabočni slojevi su razblaženi u omjeru 1: 1 sa PBS bez magnezijuma i kalcijuma. Razređena krv (30 ml) je naslojena 15 ml 90% Ficoll-Pakue Plus pripremljenog u PBS bez magnezijuma i kalcijuma sadržanih u epruvetama SepMate. Epruvete se vrte na 1200 g tokom 10 minuta. Interfaza je sakupljena i isprana dva puta u 1k PBS. Ćelije su bile resuspendovana u 1 k 108 po mL u AIM-V medijumu koji sadrži beta merkaptoetanol. Dendritičke ćelije (DC) su izvedene od negovanje PBMC-a koji lepe plastiku u bocama T75 u prisustvu 80 ng / mL GM-CSF i 50 ng / mL IL-4 tokom 7 dana. Na 5. dan, 50 pg / ml IL-1α i 200 pg / ml TNF-a je dodato u DC kulture. Dana 7, DC su sakupljeni iz čutura, zračeno 7,3 minuta pri 414 R / min i resuspendovano do konačne koncentracije od 1 k 105 ćelija / ml u kompletnom medijumu (RPMI sa L glutaminom koji sadrži 10% FBS, 1k nebitnih vitamina, 1% rastvor Pen / Strep, 1% natrijum piruvata, 1% HEPES). Alogene humane CD4 T ćelije su izolovane pomoću CD4 kompleta za izolaciju T ćelija. DC (1 k 104 / bunar) i prečišćene CD4 T ćelije (1 k 105 po jamici) dodane su u U donju ploču. Kontrola antitela ili izotipa (10 mg / ml) je bila dodata na ploču koja sadrži DC i T ćelije. Posle pet dana inkubacije, supernatant je sakupljen i analiziran za IL-2 i IFN-γ korišćenjem kompleta citometrijskih nizova zrna Milliplek. IFN-γ je meren korišćenjem BioRad Bioplek Sistem (Bioplek menadžer 6.0).

8.1.8. Odgovor opoziva antigena na tetanus toksoid

[0192] Humani PBMC su izolovani iz bufnih kaputa kupljenih od Stanford Blood Center-a, kao što je prethodno opisano. Ćelije su resuspendovane do krajnje koncentracije od 2 k 106 ćelija / ml u AIM-V medijumu koji sadrži beta merkaptoetanol. PBMC (2 k 105) su korišćeni po jažici sa 0,2 mg / ml tetanusnog toksoida. Antitelo je titrirano i ploče su inkubirane pet dana. Supernatanti su sakupljeni 5. dana i procenjeni na IFN-i pomoću Milliplek citometrijskog niza zrna. IFN-γ je meren korišćenjem BioRad Bioplek Sistem (Bioplek manager 6.0). Primer 2: Stvaranje i humanizacija mišjih antitela anti-PD-1 [0193] Miševi su imunizovani prema metodama poznatim u struci (E. Harlov, D. Lane. Antitelo: Laboratorija Priručnik, (Cold Spring Harbor Laboratori Press, Cold Spring Harbor, NI, 1998)). Izotip svakog monoklonskog antitela određen je pomoću miša za izotiranje miša (Roche). Klonovi hibridoma koji proizvode antitela od interesa su prečišćeni

i dalje karakteriše afinitet površinskom plazmonskom rezonancom i nadmetanjem liganda (ELISA). Kloniranje i konstruisanje ekspresijskog vektora postignuti su postupcima poznatim u struci za ekspresiju rekombinantnih monoklonskih antitela.

[0195] Humanizacija V regiona antitela izvedena je kako su opisali Kueen, C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.SAD, 1989; 86: 10029-10033). Kanonske strukture CDR-a određene su prema Huang i sar. (Metode, 2005; 36: 35-42). Ljudske promenljive sekvence klica sa istim ili najsličnijim CDR kanonskim strukturama su identifikovani i izabrani su odgovarajući sekvenci humanog VH, VLi J segmenta kako bi se obezbedili okviri za varijabilni region anti-PD-1. Na okvirnim pozicijama u kojima je računarski model sugerisao značajan kontakt sa CDR, aminokiseline iz mišjih anti-PD-1 V regiona bile su zamenjene originalnim humanim aminokiselinama kiseline (back-mutacije).

4

Puna aminokiselinska sekvenca VHi VLregiona primernih mišjih i humanizovanih antitela su prikazana na sl.2.

[0196] Anti-PD-1 mišje antitelo Mu12A11 je humanizovano prema gore opisanom postupku. Očovečeno verzije Mu12A11 VHbile su Hu12A11.1b VH i Hu12A11.2b VH. Hu12A11.1b VHje imao V VHH 7-4-1 okvirne regione, sa četiri zadnje mutacije V2I, M48V, F67L i A93T. Hu12A11.2b VHje imao VH 1-69 okvirne regione, sa sedam zadnje mutacije V2I, M48V, V67L, I69F, A71L, E73T i A93T. Bilo koja od dve humanizovane VHmože se kombinovati sa humanizovanim lakim lancem Hu12A11.1a VLkoji je imao VL2-28 okvirne regione, sa jednom zadnjom mutacijom od 12V.

Primer 3: Stabilnost antitela anti-PD-1

Stabilnost primernih antitela je određena merenjem PD-1 vezivanja antitela nakon tretmana pod oksidativnim ili promenljivim temperaturnim uslovima.

[0198] Procenom motiva odgovornosti identifikovan je konzervirani ostatak metionina na položaju Kabat 99 (M99) koji je za koje se veruje da su izloženi i rastvaračima i skloni deamidaciji. Uzorci matičnog antitela M99 Hu12A11.2b1 bili su izložen ubrzanim uslovima razgradnje da bi pojačao potencijalnu deamidaciju (slika 3A). Uzorci tretirani sa 1% vodonik-peroksida (1% HP) ili 1% tercbutil hidroperoksida (1% TBHP) pokazali su gubitak afiniteta vezivanja, što sugeriše potencijal za oksidaciju ostatka metionina-99. Skup antitela koji sadrže tačkaste mutacije na položaju Konstruisani su M99, uključujući izolevcin (M99I, Hu12A11.2b2 koji ima VHprema SEK ID NO: 34), valin (M99V, Hu12A11.2b3 sa VHprema SEK ID NO: 35) i leucin (M99L, Hu12A11.2b4 sa VHprema SEK ID NO: 36) mutacije. Varijante antitela su pregledane na vezivanje za humane PD-1 transfekovane Jurkat ćelije i Određene su vrednosti EC50 (slika 3B). Sva antitela koja sadrže mutaciju koja sadrže tri tačke vezana su za površinu ćelije PD-1 slično, ali antitelo na varijantu M99L pokazalo je veću aktivnost vezivanja u poređenju sa varijantama M99V ili M99I.

[0199] Utvrđeno je da varijanta M99L Hu12A11.2b4 zadržava potpuno vezujući kapacitet nakon ispitivanja temperaturne stabilnosti (SLIKA 3C). Inkubacija Hu12A11.2b4 na -80, 5, 25 ili 40 ° C nije dala značajan gubitak aktivnosti u smislu EC50 ili maksimalni intenzitet fluorescencije (MFI). Primer 4: Afinitet vezivanja anti-PD-1 antitela

[0200] Tabela 4-1 dole prikazuje podatke o afinitetu vezivanja in vitro primernog antitela Hu12A11.2b4 u poređenju sa literatura anti-PD-1 antitelo nivolumab pripremljeno prema postupcima pronađenim u američkom patentu br.9,073,994. Hu12A11.2b4 je pokazivao slična svojstva vezivanja za PD-1 u poređenju sa nivolumabom prema površinskom plazmonu rezonanca, ELISA test sa humanim (Hu) ili cinomolgus (Cino) PD-1, ili u humanim Jurkat ćelijama, mereno u testovi iz primera 1.

4

Primer 5: Biološka aktivnost antitela anti-PD-1 Hu12A11.2b4

[0201] Hu12A11.2b4 je procenjen na biološku aktivnost u brojnim testovima in vitro humanih ćelija opisanih u Primer 1. Kao što je prikazano u tabeli 5-1, Hu12A11.2b4 je demonstrirao 180 pM vezivanja za PD-1 u CD4 T ćelijama. Dodatno, pokazalo se da je anti-PD-1 aktivnost Hu12A11.2b4 posredovana barem delimično njegovom sposobnošću da blokira PD-L1 ili PD-L2 interakcija sa PD-1 prema proceni protočnom citometrijom. Ova biološka aktivnost bila je u skladu sa aktivnošću Hu12A11.2b4 u rekombinantnim Jurkat T ćelijama koje eksprimiraju gen luciferaze krijesnice pod kontrolom NFAT odgovora elementi sa konstitutivnim izrazom ljudskog PD-1 (Jurkat NFAT test).

[0202] Anti-PD-1 antitelo Hu12A11.2b4 dalje je pokazalo poboljšanje imunološkog odgovora in vitro testovi. Kao što je prikazano na sl.4A, tretman sa 10 mg / mL Hu12A11.2b4 u mešovitim kulturama leukocita uticao je na značajan porast IL-2 kao i porast IFN-i od oko 7,4 puta. SLIKA.

4B pokazuje da je Hu12A11.2b4 pokazivao tetanus odgovor na opoziv toksoida oko 6 puta u odnosu na tretman bez antitela pri 10 mg / ml, sa EC50 = 161 ng / ml.

[0203] In vitro biološka aktivnost primećena za Hu12A11.2b4 bila je slična onoj izmerenoj za korišćeni nivolumab u primeru 4. U odnosu na imunološki odgovor, uporedno antitelo nivolumab pokazalo je porast IFN-i od oko 5,6 puta u MLR, i odgovor opoziva tetanusnog toksoida od oko 6 puta u odnosu na tretman bez antitela pri 10 mg / ml, sa EC50 = 218 ng / mL.

4

�

1

2

4

1

�

4

Claims

Patentni zahtevi

1. Anti-humano PD-1 antitelo, pri čemu to antitelo obuhvata (i) promenljivi teški (VH) lanac koji obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR); i (ii) promenljivi laki (VL) lanac obuhvata tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR), pri čemu:

VH CDR#1 jeste GYTFTHYGMN (SEK ID BR:11);

VH CDR#2 jeste WVNTYTGEPTYADDFKG (SEK ID BR:12); VH CDR#3 jeste EGEGLGFGD (SEK ID BR:13);

VL CDR#1 jeste RSSQSIVHSHGDTYLE (SEK ID BR:14); VL CDR#2 jeste KVSNRFS (SEK ID BR:15); i

VL CDR#3 jeste FQGSHIPVT (SEK ID BR:16).

2. Anti-humano PD-1 antitelo iz patentnog zahteva 1, koje je humanizovano.

3. Anti-humano PD-1 antitelo iz patentnog zahteva 2, koje obuhvata promenljivi teški (VH) lanac koji po redosledu odgovara SEK ID BR:36; i promenljivi laki (VL) lanac koji po redosledu odgovara SEK ID BR:42.

4. Anti-humano PD-1 antitelo iz patentnog zahteva 3 koje je IgG1 i varijantni CH2 domen sa supstitucijama L234A i L235A aminokiseline.

5. Anti-humano PD-1 antitelo iz patentnog zahteva 3, koje je IgG4 i obuhvata varijantni Fc region sa supstitucijom S228P aminokiseline.

6. Anti-humano PD-1 antitelo iz patentnog zahteva 3 koje je IgG i obuhvata kapa laki konstantni region.

7, Anti-humano PD-1 antitelo iz patentnog zahteva 3 koje obuhvata teški lanac koji po redosledu odgovara SEK ID BR:51 or SEQ ID NO:52, i laki lanac koji po redosledu odgovara SEK ID BR:61.

8. Jedna ili više nukleinskih kiselina obuhvata sekvence nukleotida koje kodiraju anti-humano PD-1 antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 7.

9. Jedan ili više vektora koji obuhvataju jednu ili više nukleinskih kiselina iz patentnog zahteva 8.

10. Ćelija domaćin transformisana sa jednim ili više vektora iz patentnog zahteva 9, pri čemu je ćelija domaćin:

a) prokariotska; ili

b) eukariotska, opciono pri čemu je ćelija domaćin ćelija domaćina sisara.

11.Postupak proizvodnje anti-humanog PD-1 antitela, koji obuhvata: (a) kultivisanje ćelije domaćina iz patentnog zahteva 10 i (b) oporavljanje anti-humanog PD-1 antitela.

1