RS61870B1 - Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz tnf familije - Google Patents

Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz tnf familije

Info

Publication number
RS61870B1
RS61870B1 RS20210600A RSP20210600A RS61870B1 RS 61870 B1 RS61870 B1 RS 61870B1 RS 20210600 A RS20210600 A RS 20210600A RS P20210600 A RSP20210600 A RS P20210600A RS 61870 B1 RS61870 B1 RS 61870B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
domain
binding molecule
Prior art date
Application number
RS20210600A
Other languages
English (en)
Inventor
Maria Amann
Peter Bruenker
Christina Claus
Koller Claudia Ferrara
Sandra Grau-Richards
Christian Klein
Viktor Levitski
Ekkehard Moessner
Joerg Thomas Regula
Pablo Umaña
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=54695680&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS61870(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS61870B1 publication Critical patent/RS61870B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2815—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Furniture Connections (AREA)
  • Connection Of Plates (AREA)

Description

OPIS
OBLAST PRONALASKA
Pronalazak se odnosi na nove antigen vezujuće molekule koji sadrže trimer liganda iz TNF familije, koji sadrže (a) najmanje jedan molekul Fab sposoban da se specifično vezuje za CD19, (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što
( ) prvi polipeptid sadrži CH1 ili CL domen i drugi polipeptid sadrži CL, odnosno CH1 domen, pri čemu je drugi polipeptid vezan za prvi polipeptid disulfidnom vezom između CH1 i CL domena, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa CH1 ili CL domenom peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezanu peptidnim linkerom sa CL ili CH1 domenom navedenog polipeptida, ili
( ) prvi polipeptid sadrži CH3 domen i drugi polipeptid sadrži CH3 domen, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa C-terminusom CH3 domena peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 i SEQ ID NO: 375 povezan peptidnim linkerom sa C-terminusom CH3 domena navedenog polipeptida, ili
( ) prvi polipeptid sadrži VH-CL ili VL-CH1 domen i drugi polipeptid sadrži VL-CH1 domen, odnosno VH-CL domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa VH ili VL peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezanu peptidnim linkerom sa VL ili VH navedenog polipeptida, i
(c) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju. Pronalazak se dalje odnosi na postupke za proizvodnju ovih molekula i na metode za njihovo korišćenje.
OSNOVA
Ligandi koji stupaju u interakciju sa molekulima TNF (faktor nekroze tumora) receptorske superfamilije imaju ključne uloge u organizovanju i funkciji imunog sistema. Iako regulišu uobičajene funkcije, kao što su imunski odgovori, hematopoeza i morfogeneza, ligandi iz TNF familije (nazivaju se i citokini) igraju ulogu u nastanku tumora, odbacivanju transplantata, septičkom šoku, virusnoj replikaciji, resorpciji kostiju, reumatoidnom artritisu i dijabetesu (Aggarwal, 2003). TNF familija liganda sadrži 18 gena koji kodiraju 19 transmembranskih proteina tipa II (tj. intracelularni N terminus i ekstracelularni C-terminus), koje karakteriše prisustvo očuvanog C-terminalnog domena nazvanog „TNF homologni domen” (THD). Ovaj domen je odgovoran za vezivanje receptora, i stoga je ključan za biološku aktivnost članova TNF familije liganda. Identičnost sekvenci između članova familije je ~20-30% (Bodmer, 2002). Članovi TNF familije liganda vrše svoju biološku funkciju kao samosastavljajući nekovalentni trimeri (Banner et al., Cell 1993, 73, 431-445). TNF familija liganda tako gradi trimer koji je sposoban za vezivanje i aktiviranje odgovarajućih receptora TNFR superfamilije.
4-1BB (CD137), član TNF superfamilije receptora, prvo je identifikovan kao molekul čija ekspresija je indukovana aktivacijom T-ćelija (Kwon and Weissman, 1989). Dalje studije su pokazale ekspresiju 4-1BB u T- i B-limfocitima (Snell et al. 2011; Zhang et al. 2010), NK-ćelijama (Lin et al.2008), NKT-ćelijama (Kim et al.2008), monocitima (Kienzle and von Kempis, 2000; Schwarz et al. 1995), neutrofilima (Heinisch et al. 2000), mastocitima (Nishimoto et al.2005) i dendritskim ćelijama, kao i u ćelijama nehematopoetskog porekla, kao što su endotelne ćelije i glatke mišićne ćelije (Broll et al. 2001; Olofsson et al. 2008). Ekspresija 4-1BB u različitim ćelijskim tipovima uglavnom može da se indukuje, i pokreću je različiti stimulatorni signali, kao što je aktiviranje T-ćelijskog receptora (TCR) ili B-ćelijskog receptora, kao i signalizacija indukovana putem kostimulatornih molekula ili receptora proinflamatornih citokina (Diehl et al.2002; von Kempis et al.1997; Zhang et al.2010).
Ekspresija 4-1BB liganda (4-1BBL ili CD137L) je ograničenija, i uočena je na profesionalnim antigen prezentujućim ćelijama (APC), poput B-ćelija, dendritskih ćelija (DC) i makrofaga. Inducibilna ekspresija 4-1BBL karakteristična je za T-ćelije, uključujući i αβ i γδ podskupove T-ćelija, i endotelne ćelije (pregled su dali Shao and Schwarz, 2011). Poznato je da signalizacija CD137 stimuliše sekreciju IFNγ i proliferaciju NK ćelija (Buechele et al., 2012; Lin et al., 2008; Melero et al., 1998), kao i da promoviše aktivaciju DC kao što je naznačeno njihovim produženim preživljavanjem i sposobnošću za izlučivanje citokina i ushodno regulisanje kostimulatornih molekula (Choi et al., 2009; Futagawa et al., 2002; Wilcox et al., 2002). Međutim, CD137 se najbolje može okarakterisati kao kostimulišući molekul koji moduliše TCR-indukovanu aktivaciju i u CD4+ i u CD8+ podskupovima T-ćelija. U kombinaciji sa TCR aktiviranjem, agonistička 4-1BB-specifična antitela pojačavaju proliferaciju T-ćelija, stimulišu sekreciju limfokina i smanjuju senzitivnost T-limfocita na aktivacijom indukovanu ćelijsku smrt (prikazano u Snell et al., 2011).
U skladu sa ovim kostimulatornim efektima 4-1BB antitela na T-ćelije in vitro, njihova primena kod miševa koji imaju tumor dovodi do snažnih antitumorskih dejstava u mnogim eksperimentalnim modelima tumora (Melero et al., 1997; Narazaki et al., 2010). Međutim, 4-1BB tipično pokazuje svoju potentnost kao antitumorski agens samo kada se primenjuje u kombinaciji sa drugim imunomodulišućim jedinjenjima (Curran et al., 2011; Guo et al., 2013; Morales-Kastresana et al., 2013; Teng et al., 2009; Wei et al., 2013), hemoterapeutskim reagensima (Ju et al., 2008; Kim et al., 2009), vakcinom specifičnom za tumor (Cuadros et al., 2005; Lee et al., 2011) ili radioterapijom (Shi and Siemann, 2006). Eksperimenti sa iscrpljivanjem in vivo pokazali su da CD8+ T-ćelije igraju najvažniju ulogu u antitumorskom dejstvu antitela specifičnih za 4-1BB. Međutim, zavisno od modela tumora ili kombinovane terapije, koja uključuje anti-4-1BB, prijavljeni su doprinosi drugih vrsta ćelija poput DC, ćelija NK ili CD4+ T-ćelija (Melero et al., 1997; Murillo et al., 2009; Narazaki et al., 2010; Stagg et al., 2011).
Pored direktnih efekata na različite podgrupe limfocita, 4-1BB agonisti mogu takođe da indukuju infiltraciju i zadržavanje aktiviranih T-ćelija u tumoru putem 4-1BB-posredovane ushodne regulacije intracelularnog adhezionog molekula 1 (ICAM1) i adhezionog molekula vaskularne ćelije 1 (VCAM1) na tumorskom vaskularnom endotelijumu (Palazon et al., 2011).
Aktivacija 4-1BB takođe može preokrenuti stanje anergije T-ćelija indukovano izlaganjem rastvorljivom antigenu koje može doprineti poremećaju imunološke tolerancije u mikrookruženju tumora, ili tokom hroničnih infekcija (Wilcox et al., 2004).
Čini se da imunomodulatorna svojstva 4-1BB agonističkih antitela in vivo zahtevaju prisustvo Fc-dela divljeg tipa na molekulu antitela, što implicira da je vezivanje Fc receptora važan događaj potreban za farmakološku aktivnost takvih reagensa, kao što je opisano za agonistička antitela specifična za ostale članove TNFR superfamilije koji indukuju apoptozu ili imaju imunomodulatorne osobine (Li and Ravetch, 2011; Teng et al., 2009). Međutim, sistemska primena 4-1BB-specifičnih agonističkih antitela sa funkcionalno aktivnim Fc domenom takođe indukuje ekspanziju CD8+ T-ćelija povezanih sa toksičnošću jetre (Dubrot et al., 2010) koja se smanjuje ili značajno poboljšava u odsustvu funkcionalnih Fc-receptora kod miševa. U kliničkim ispitivanjima na ljudima (ClinicalTrials.gov, NCT00309023), Fc-kompetentna 4-1BB agonistička antitela (BMS-663513) primenjena jednom na svake tri nedelje tokom 12 nedelja indukovala su stabilizaciju bolesti kod pacijenata sa melanomom, karcinomom jajnika ili karcinomom bubrežnih ćelija. Međutim, isto antitelo primenjeno u drugom ispitivanju (NCT00612664) izazvalo je hepatitis 4. stepena, što je dovelo do prekida ispitivanja (Simeone i Ascierto, 2012).
Zajedno, dostupni pretklinički i klinički podaci jasno pokazuju da postoji velika klinička potreba za efikasnim agonistima 4-1BB. Međutim, kandidati za lek nove generacije ne bi trebalo samo da efikasno deluju na 4-1BB na površini hematopoetskih i endotelnih ćelija, već i da budu sposobni da to postignu putem mehanizama različitih od vezivanja za Fc-receptore, kako bi se izbegla nekontrolisana neželjena dejstva. Ovo zadnje se može postići preferencijalnim vezivanjem i oligomerizacijom na ostacima koji su specifični za tumor ili povezani sa tumorom.
Napravljeni su fuzioni proteini sastavljeni od jednog ekstracelularnog domena 4-1BB liganda i jednolančanog fragmenta antitela (Mueller et al., 2008; Hornig et al., 2012), ili jednog 4-1BB liganda spojenog sa C-terminusom teškog lanca (Zhang et al, 2007). WO 2010/010051 otkriva nastajanje fuzionih proteina koji se sastoje od tri ektodomena TNF liganda koji su međusobno vezani i spojeni sa delom antitela.
Međutim, još uvek postoji potreba za novim antigen vezujućim molekulima koji sadrže kombinaciju ostatka sposobnog da se preferencijalno vezuje za ciljeve specifične za tumor ili ciljeve povezane sa tumorom, i ostatka koji je sposoban da gradi kostimulatorni trimer TNF liganda i koji ima dovoljno stabilnosti da bude farmaceutski koristan. Antigen vezujući molekuli iz predmetnog pronalaska sadrže oba ostatka, i iznenađujuće obezbeđuju trimerni i stoga biološki aktivan TNF ligand, iako je jedan od trimerizacionih ektodomena TNF liganda lociran na različitom polipeptidu od druga dva ektodomena TNF liganda molekula.
REZIME PRONALASKA
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19,
(b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što
(i) prvi polipeptid sadrži CH1 ili CL domen i drugi polipeptid sadrži CL, odnosno CH1 domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa CH1 ili CL domenom peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezanu peptidnim linkerom sa CL ili CH1 domenom navedenog polipeptida, ili (ii) prvi polipeptid sadrži CH3 domen i drugi polipeptid sadrži CH3 domen, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa C-terminusom CH3 domena peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezanu peptidnim linkerom sa C-terminusom CH3 domena navedenog polipeptida, ili
(iii) prvi polipeptid sadrži VH-CL ili VL-CH1 domen i drugi polipeptid sadrži VL-CH1 domen, odnosno VH-CL domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa VH ili VL peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezanu peptidnim linkerom sa VL ili VH navedenog polipeptida, i
(c) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju. U daljem aspektu, ektodomen člana TNF familije liganda sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:96.
Konkretnije, ektodomen člana TNF familije liganda sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:96.
U daljem aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer iz TNF familije liganda obuhvata
(a) najmanje jedan molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 i SEQ ID NO:99, i to što drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4.
U drugom aspektu, antigen vezujući molekul iz pronalaska koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži
(a) najmanje jedan molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19, i (b) prvi polipeptid koji sadrži CH1 ili CL domen, odnosno drugi polipeptid koji sadrži CL ili CH1 domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena,
i pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa CH1 ili CL domenom peptidnim linkerom, i to što drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezan peptidnim linkerom sa CL ili CH1 domenom navedenog polipeptida.
U jednom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19,
(b) prvi polipeptid koji sadrži CH1 domen, i drugi polipeptid koji sadrži CL domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena,
i pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa CH1 domenom peptidnim linkerom, i to što drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezan peptidnim linkerom sa CL domenom navedenog peptida.
U drugom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19,
(b) prvi polipeptid koji sadrži CL domen, i drugi polipeptid koji sadrži CH1 domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena,
i pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa CL domenom peptidnim linkerom, i to što drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezan peptidnim linkerom sa CH1 domenom navedenog polipeptida.
U posebnom aspektu, pronalazak se odnosi na antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kao što je prethodno definisano, pri čemu je peptidni linker (G4S)2, tj. peptidni linker SEQ ID NO: 13. U jednom aspektu, prvi peptidni linker je (G4S)2,drugi peptidni linker je (SEQ ID NO:57) i treći peptidni linker je (G4S)2. U drugom aspektu, prvi, drugi i treći peptidni linker je (G4S)2.
U daljem aspektu, Fc domen je IgG, konkretno Fc domen IgG1 ili Fc domen IgG4. Konkretnije, Fc domen je Fc domen IgG1. U jednom konkretnom aspektu, Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše asocijaciju prve i druge podjedinice Fc domena.
U drugom aspektu, pronalazak se bavi antigen vezujućim molekulom koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, kao što je ovde prethodno definisano, koji sadrži
(c) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju, pri čemu Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za Fc receptor, posebno za Fcγ receptor.
Konkretno, Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 234 i 235 (EU numeracija) i/ili 329 (EU numeracija) teških lanaca IgG. Konkretnije, obezbeđuje se antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema pronalasku koji sadrži Fc domen IgG1 sa aminokiselinskim supstitucijama L234A, L235A i P329G (EU numeracija).
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije , pri čemu antigen vezujući molekul sadrži
prvi teški lanac i prvi laki lanac, pri čemu oba sadrže molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19,
prvi peptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno prvim peptidnim linkerom fuzionisanog na svom C-terminusu preko drugog peptidnog linkera sa drugim teškim ili lakim lancem,
i drugi peptid koji sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 fuzionisan na svom C-terminusu trećim peptidnim linkerom sa drugim lakim, odnosno teškim lancem.
U drugom aspektu, obezbeđuje se antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je prvi peptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375, koji su povezani međusobno prvim peptidnim linkerom, fuzionisan na svom C-terminusu drugim peptidnim linkerom sa CH1 domenom koji je deo teškog lanca,
i drugi peptid koji sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375, fuzionisan je na svom C-terminusu trećim peptidnim linkerom sa CL domenom koji je deo lakog lanca.
U još jednom aspektu, obezbeđuje se antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je prvi peptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno prvim peptidnim linkerom fuzionisan na svom C-terminusu drugim peptidnim linkerom sa CL domenom koji je deo teškog lanca,
i drugi peptid koji sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 fuzionisan je na svom C-terminusu trećim peptidnim linkerom sa CH1 domenom koji je deo lakog lanca.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je prvi peptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno prvim peptidnim linkerom, fuzionisan na svom C-terminusu drugim peptidnim linkerom sa VH domenom koji je deo teškog lanca,
i drugi peptid koji sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375, fuzionisan je na svom C-terminusu trećim peptidnim linkerom sa VL domenom koji je deo lakog lanca.
Dalje se obezbeđuje antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je u CL domenu koji je susedan članu TNF familije liganda aminokiselina na poziciji 123 (EU numeracija) zamenjena argininom (R), a aminokiselina na poziciji 124 (EU numeracija) supstituisana lizinom (K), i pri čemu su u CH1 domenu koji je susedan članu TNF familije liganda aminokiseline na poziciji 147 (EU numeracija) i na poziciji 213 (EU numeracija) supstituisane glutaminskom kiselinom (E).
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
(a) molekul Fab koji je sposoban za specifično vezivanje za CD19, i
(b) drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 i SEQ ID NO:99, i
drugi laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4.
U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu antigen vezujući molekul karakteriše to da prvi polipeptid sadrži CH3 domen i drugi polipeptid sadrži CH3 domen, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID
1
NO:375 koji su povezani međusobno i sa C-terminusom CH3 domena peptidnim linkerom i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezan peptidnim linkerom sa C-terminusom CH3 domena navedenog polipeptida.
Konkretno, takav antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži dva ostatka sposobna za specifično vezivanje za CD19.
U jednom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19 sadrži VH domen koji sadrži (i) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 195 ili SEQ ID NO:252, (ii) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 196 ili SEQ ID NO:253, i (iii) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 197 ili SEQ ID NO:254, i VL domen koji sadrži (iv) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 198 ili SEQ ID NO:249, (v) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 199 ili SEQ ID NO:250, i (vi) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:200 ili SEQ ID NO:251.
U daljem aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19 sadrži varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201 i varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202 ili pri čemu Fab molekul za specifično vezivanje za FAP sadrži varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357 i varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358.
U jednom konkretnom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
(i) prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202, ili
prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358,
(ii) drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO:111 i SEQ ID NO: 113, i
(iii) drugi laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO: 112 i SEQ ID NO:114.
U drugom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
(i) prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202, ili
prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358,
(ii) drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 i SEQ ID NO: 173, i (iii) drugi laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 i SEQ ID NO: 174.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji sadrži dva ostatka sposobna za specifično vezivanje za CD19. Konkretno, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
(i) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:209, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:210, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, ili
(ii) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:213, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:214, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, ili
(iii) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:310, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279, ili
(iv) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:313, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:314, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279.
Prema drugom aspektu ovog pronalaska, obezbeđen je izolovani polinukleotid koji kodira antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kao što je ovde prethodno opisano. Pronalazak dalje obezbeđuje vektor, posebno ekspresioni vektor, koji obuhvata izolovani polinukleotid iz pronalaska i ćeliju domaćina koja obuhvata izolovani polinukleotid ili vektor iz pronalaska. U nekim realizacijama ćelija domaćina je eukariotska ćelija, posebno ćelija sisara.
U drugom aspektu, obezbeđen je postupak za proizvodnju antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema pronalasku, koji obuhvata korake (i) uzgajanja ćelije domaćina iz ovog pronalaska pod uslovima pogodnim za ekspresiju antigen vezujućeg molekula, i (ii) izolovanja antigen vezujućeg molekula. Pronalazak takođe uključuje antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije proizveden pomoću postupka iz ovog pronalaska.
Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutski preparat koji obuhvata antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
Pronalazak takođe obuhvata antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz ovog pronalaska ili farmaceutski preparat iz pronalaska namenjen za upotrebu kao lek. U jednom aspektu je obezbeđen antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema pronalasku, ili farmaceutski preparat prema pronalasku, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinaca kojima je to potrebno. U specifičnojrealizaciji, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema pronalasku, ili farmaceutski preparat prema pronalasku, za upotrebu u lečenju kancera.
Takođe je obezbeđena upotreba antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska u proizvodnji leka za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno, naročito u proizvodnji leka za lečenje kancera.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 prikazuje komponente za sastavljanje split trimernih humanih 4-1BB liganda. Slika (1A) prikazuje dimerni ligand koji je spojen na C-terminusu sa humanim CH1 ili CL domenom ili VL ili VH domenom, a Slika (1B) prikazuje monomerni ligand spojen sa humanim CL ili CH1 domenom ili VL ili VH domenom. Slika (1C) prikazuje dimerni ligand koji je spojen na N-terminusu sa humanim CH3 domenom, a Slika (1D) prikazuje monomerni ligand spojen na N-terminusu sa humanim CH3 domenom.
Slika 2 prikazuje konstrukte 1.1 do 1.10 antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL iz pronalaska. Priprema i proizvodnja ovih konstrukata opisana je u Primeru 1. VH i VL domeni su domeni anti-FAP antitela 28H1, debela crna tačka označava modifikaciju „dugme u rupici”. * simbolizuje aminokiselinske modifikacije u CH1 i CL domenu (takozvani naelektrisani ostaci).
Slika 3 prikazuje komponente za sastavljanje split trimernih mišjih 4-1BB liganda. Slika (3A) prikazuje dimerni ligand koji je spojen na C-terminusu sa mišjim CL domenom, a
1
Slika (3B) prikazuje monomerni ligand spojen na C-terminusu sa mišjim CH1 domenom. Komponente za sastavljanje FAP ciljanog split trimernog mišjeg 4-1BB liganda. Slika (3C) prikazuje sastavljene antigen vezujuće molekule koji sadrže trimer mišjeg 4-1BBL, kao što je detaljnije opisano u Primeru 1.3.
Slika 4 prikazuje konstrukte 2.1 do 2.6 antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL iz pronalaska. Priprema i proizvodnja ovih konstrukata opisana je u Primeru 2. VH i VL domeni su domeni anti-FAP antitela 4B9, debela crna tačka označava modifikaciju „dugme u rupici”. * simbolizuje aminokiselinske modifikacije u CH1 i CL domenu (takozvani naelektrisani ostaci).
Slika 5A i Slika 5B prikazuju „neciljane” varijante konstrukata 1.1 i 1.2 koje obuhvataju DP47 molekul Fab umesto anti-FAP molekula Fab. Molekuli su nazvani Kontrola A, odnosno Kontrola B. Priprema je opisana u Primeru 1.4. Slika 5C je crtež monomernog konstrukta 4-1BB Fc(kih), kako je pripremljen u Primeru 3.
Slika 6 se odnosi na vezivanje FAP-ciljanog Fc(kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (FAP split 4-1BBL trimer, puni krugovi) ili DP-47 neciljanog Fc(kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (DP47 split 4-1BBL trimer, prazni krugovi) za humane PMBC koji miruju (naivne) ili su aktivirani. Konkretno, vezivanje za mirujuće (naivne) ili aktivirane humane CD8+ T ćelije prikazano je na Slici (6A), za mirujuće (naivne) ili aktivirane humane CD4+ T ćelije na Slici (6B), i za mirujuće (naivne) ili aktivirane humane NK ćelije na Slici (6C). Prikazano je vezivanje kao medijana intenziteta fluorescencije (MFI) fikoeritrinom crvene makrofitske alge (R-PE) označenog fragmenta kozjeg IgG F(ab')2 specifičnog za antihumani IgG Fcγ, koji se koristi kao antitelo za sekundarnu detekciju. MFI je meren protočnom citometrijom, a osnovna vrednost korigovana oduzimanjem MFI slepe probe.
Vezivanje različitih FAP ciljanih ili neciljanih Fc(kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda za humane T ćelije koje eksprimiraju 4-1BB iz PHA-L i proleukinom prethodno aktiviranih i anti-humanih CD3/anti-humanih CD28 ponovo aktiviranih humanih PBMC prikazano je na Slici 7. Detektovano je vezivanje sa fragmentom R-fikoeritrin-fluorohrom konjugovanog anti humanog IgG Fcγ-specifičnog kozjeg F(ab')2. Prikazana je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata 1.1 do 1.10 iz primera 1. Radi boljeg prikaza, krive vezivanja su podeljene na četiri različite oznake sa konstruktom 1.1 (jednovalentni FAP-ciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih)) i kontrolom B (jednovalentni neciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih) sa CH-CL presekom i naelektrisanim ostacima) kao poredbene krive. Vezivanje je praćeno na CD3+ CD8+ T ćelijama (slika 7A) i CD3+ CD4+ T ćelijama (slika 7B). Nivo ekspresije 4-1BB na CD8 T ćelijama normalno je viši nego na CD4 T ćelijama. Sve verzije se vezuju sa prilično sličnim afinitetom za humani 4-1BB.
Slika 8 prikazuje vezivanje različitih Fc(kih) konstrukata FAP ciljanih ili neciljanih split trimernih humanih 4-1BB liganda za CD4+ ili CD8+ T ćelije iz svežih PBMC (slika 8A) ili za humane 4-1BB eksprimirajuće PHA-L i proleukinom prethodno aktivirane i anti-humane CD3/anti-humane CD28 ponovo aktiviranih humanih PBMC (slika 8B). Detektovano je vezivanje sa fragmentom R-fikoeritrin-fluorohrom konjugovanog anti humanog IgG Fcγ-specifičnog kozjeg F(ab')2. Prikazana je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) u odnosu na koncentraciji testiranih konstrukata 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 i 2.6 primera 2 i kontrolnih molekula kontrola B, kontrola C, kontrola E i kontrola F. Radi boljeg prikaza, krive vezivanja su podeljene na dve različite oznake sa konstruktom 2.1 (jednovalentni FAP ciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih)) i kontrolom B (jednovalentni neciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih) sa CH-CL presekom i naelektrisanim ostacima) kao poredbene krive. Vezivanje je praćeno na CD45+ CD3+ CD8+ T ćelijama (oznake na dnu) i CD45+ CD3+ CD4+ T ćelijama (oznake na vrhu). Nivo ekspresije 4-1BB na CD8 T ćelijama normalno je viši nego na CD4 T ćelijama. Svi konstrukti se vezuju sa prilično sličnim afinitetom za humani 4-1BB, dok dvovalentni konstrukt 2.3 i njegova neciljana kontrola C pokazuju niži MFI. To može biti posledica sternih smetnji vezivanju 4-1BB i/ili manjoj detekciji usled drugog antitela za detektovanje indukovanog Fc-konjugovanim split 4-1BB ligandom.
Na slici 9 prikazano je vezivanje FAP-ciljanih Fc(kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL liganda (FAP split 4-1BBL trimer, puni krugovi) ili DP47 neciljanih Fc(kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL liganda (DP47 split 4-1BBL trimer; prazni krugovi) na aktiviranim mišjim splenocitima. Konkretno, vezivanje za aktivirane mišje CD4+ T ćelije prikazano je na slici (9A), a za aktivirane mišje CD8+ T ćelije na slici (9B). Kao pozitivna kontrola korišćeno je anti-mišje CD137 specifično P329G LALA antitelo humanog IgG1 (klon Lob12.3)(trouglovi). Vezivanje je okarakterisano crtanjem MFI anti humanog Fcγ-specifičnog kozjeg F(ab')2fragmenta IgG obeleženog putem R-PE, koji je korišćen kao sekundarno detekciono antitelo u odnosu na koncentraciju u nM testiranog konstrukta split trimera 4-1BBL. MFI je meren protočnom citometrijom, a osnovna vrednost korigovana oduzimanjem MFI slepe probe.
Slika 10 prikazuje vezivanje Fc(kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL liganda (puni krugovi: Konstrukt 1.1 FAP-ciljani Fc(kih) fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda, prazni krugovi: DP47 neciljani Fc(kih)
1
fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda Kontrola A na humani melanom koji eksprimira aktivacioni protein fibroblasta (FAP)(A) ćelijska linija MV-3 i (B) ćelijska linija WM-266-4. Vezivanje je okarakterisano crtanjem MFI anti humanog Fcγ-specifičnog kozjeg F(ab')2fragmenta IgG obeleženog putem R-PE, koji se koristi kao sekundarno detekciono antitelo u odnosu na koncentraciju u nM testiranih konstrukata split 4-1BBL trimera. MFI je meren protočnom citometrijom, a osnovna vrednost korigovana oduzimanjem MFI slepe probe.
Na slici 11 je prikazano vezivanje različitih FAP-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda za MV-3 ćelije humanog melanoma (Slika 11A) i/ili NIH/3T3-huFAP klon 39 transfektovane ćelije fibroblasta embriona miša (Slika 11B) koje eksprimiraju humani FAP. Detektovano je vezivanje sa fragmentima R-fikoeritrin-fluorohrom ili fluorescein-fluorohrom konjugovanog anti humanog IgG Fcγ-specifičnog kozjeg F(ab')2. Prikazana je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata. Radi boljeg prikaza, krive vezivanja su podeljene na četiri (slika 11A) ili dve oznake (slika 11B), dok je konstrukt 1.1 (jednovalentni FAP ciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih)) korišćen kao poredbena kriva. Svi konstrukti se vezuju sa sličnim afinitetom za humani FAP, osim dvovalentnih FAP-ciljanih konstrukata (konstrukti 1.5, 1.7 i 1.8). Oni su pokazali sklonost ka nižim vrednostima EC50 i nižoj medijani intenziteta fluorescencije. To se može objasniti njihovim dvovalentnim ciljanjem (veća avidnost, manje molekula se može istovremeno vezati zbog popunjenosti dva epitopa što dovodi do nižeg MFI). Strukturne varijacije mogu takođe objasniti razliku između konstrukta 1.8 (potpuno dvovalentno ciljanje) i konstrukta 1.5 i 1.7 (samo delimično dvovalentno ciljanje).
Na slici 12 prikazano je vezivanje različitih FAP-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukta split trimernih humanih 4-1BB liganda 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 i 2.6 za MV-3 ćelije humanog melanoma (slika 12A) i ćelije WM-266-4 (slika 12B) koje eksprimiraju humani FAP. Detektovano je vezivanje sa fragmentima R-fikoeritrin-fluorohrom konjugovanog anti humanog IgG Fcγ-specifičnog kozjeg F(ab')2. Prikazana je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata. Radi boljeg prikaza, krive vezivanja su podeljene na dve oznake, dok je konstrukt 2.1 (jednovalentni FAP ciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih)) korišćen kao poredbena kriva. Svi konstrukti se vezuju sa sličnim afinitetom za humani FAP, osim dvovalentnog FAP ciljanog konstrukta 2.3. On je pokazao sklonost ka nižim vrednostima EC50 i nižoj medijani intenziteta fluorescencije. To se može objasniti njegovim dvovalentnim ciljanjem, što dovodi do veće avidnosti, ali manje
1
popunjenosti ili FAP molekula na ćelijskoj površini, što dovodi do nižeg MFI.
Slika 13 prikazuje vezivanje različitih FAP ciljanih ili neciljanih Fc(kih) konstrukata split trimernih mišjih 4-1BB liganda za CD4+ ili CD8+ T ćelije iz svežih splenocita (Slika 13A) ili za mišji 4-1BB koji eksprimira antimišja CD3/antimišja CD28 monoklonska agonistička antitela aktiviranih mišjih splenocita (slika 13B). Detektovano je vezivanje sa fragmentom FITC-fluorohrom konjugovanog anti mišjeg IgG Fcγ-specifičnog kozjeg F(abˋ)2. Prikazana je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata. Vezivanje je praćeno na CD3+ CD8+ T ćelijama (leva oznaka) i CD3+ CD4+ T ćelijama (desna oznaka). Nivo ekspresije 4-1BB na CD8 T ćelijama normalno je viši nego na CD4 T ćelijama. Svi konstrukti se vezuju sa prilično sličnim afinitetom za mišji 4-1BB.
Vezivanje različitih FAP ciljanih ili neciljanih Fc(kih) konstrukata split trimernih mišjih 4-1BB liganda za humane tumorske ćelije koje eksprimiraju FAP prikazano je na slici 14. Detektovano je vezivanje sa fragmentom FITC-fluorohrom konjugovanog anti mišjeg IgG Fcγ-specifičnog kozjeg F(abˋ)2. Prikazana je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata. Vezivanje je praćeno na MV-3 ćelijama (Slika 14A) i WM-266-4 ćelijama (slika 14B). FAP ciljani Fc (kih) konstrukti M.1 i M.2 split trimernih mišjih 4-1BB liganda vezuju se sa prilično sličnim afinitetom za FAP.
Na slici 15 prikazana je šema koja ilustruje opšti princip testa aktivnosti NFkB opisan u primeru 6.1 pomoću linije reporterskih ćelija. Prikazan je test aktivacije postavljen sa humanom 4-1BB eksprimirajućom HeLa linijom reporterskih ćelija. Umrežavanje 4-1BB eksprimirano na ćelijama reporterima indukuje aktivaciju NFκB i ekspresiju luciferaze posredovanu putem NFκB. Nakon lize ćelija, luciferaza može da katalizuje oksidaciju luciferina u oksiluciferin. Ova hemijska reakcija ima pozitivnu korelaciju sa jačinom ekspresije luciferaze posredovane putem NFκB, i može se meriti jačinom emisije svetlosti (jedinice oslobođene svetlosti). Odnos tumorskih ćelija koje eksprimiraju FAP u liniji reporterskih ćelija HeLa-huCD137-NFkB-luc je bio 5 prema 1.
Na slici 16 prikazano je da aktiviranje NFkB signalnog puta pomoću FAP-ciljanog Fc(kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (konstrukt 1.1) striktno zavisi od njegovog vezivanja za ciljne ćelije koje eksprimiraju FAP. Humane reporterske HeLa ćelije CD137 koje eksprimiraju NFκB uzgajane su zajedno sa naznačenim tumorskim ćelijama koje pokazuju različite nivoe FAP ekspresije ćelijske površine. Aktivnost luciferaze je procenjena kao što je opisano u primeru 6.1, nakon kultivacije ćelija u odsustvu ili prisustvu molekula koji sadrže 4-1BBL u naznačenim koncentracijama tokom 6 sati. Puni krugovi se odnose na konstrukt 1.1. Prazni krugovi se odnose na DP47 neciljani Fc(kih) fuzioni
1
antigen vezujući molekul koji sadrži trimer 4-1BB liganda (kontrola A). Ćelijska linija NIH/3T3-humani FAP klon 39 korišćena je kao ciljne ćelije na grafikonu (A), grafikon (B) pokazuje aktivaciju sa MV3 ćelijskom linijom kao ciljnim ćelijama, a grafikon (C) sa WM-266-4 ćelijskom linijom kao ciljnim ćelijama. Aktivnost je okarakterisana označavanjem jedinica oslobođene svetlosti (URL) izmerenih tokom 0,5 s u odnosu na koncentraciju u nM testiranih split 4-1BBL trimernih konstrukata. URL-ovi se emituju usled luciferazom posredovane oksidacije luciferina u oksiluciferin.
Slika 17 prikazuje ekspresiju i aktivnost luciferaze izazvane aktivacijom NFκB, mereno testom opisanim u primeru 6.1. Vrednosti oslobođene svetlosti u sekundi (CPS) merene su za 0,5 s/bunarčiću i nacrtane u odnosu na upotrebljenu koncentraciju FAP-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda. Humane HeLa-reporterske ćelije koje eksprimiraju 4-1BB inkubirane su tokom 6 h u odsustvu (slika 17A) ili prisustvu ćelijske linije humanog melanoma MV-3 koja eksprimira umreženi humani FAP (slika 17B) ili WM-266-4 (slika 17C). CPS su izmereni i označeni u odnosu na koncentracije različitih FAP-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda. Odnos ćelija je jedna humana HeLa reporterska ćelija koja eksprimira 4-1BB na pet tumorskih ćelija. Radi boljeg prikaza, krive aktivacije su podeljene na četiri različite oznake prikaza sa konstruktom 1.1 (jednovalentni FAP-ciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih)) i kontrolom B (jednovalentni neciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih) sa CH-CL presekom i naelektrisanim ostacima) kao poredbene krive. Slika 17A prikazuje aktiviranje bez umrežavanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju FAP, slika 17B prikazuje aktivaciju u prisustvu MV-3 tumorskih ćelija koje eksprimiraju umreženi FAP, i slika 17C prikazuje aktivaciju u prisustvu WM-266-4 ćelija tumora koje eksprimiraju umreženi FAP.
Slika 18 prikazuje ekspresiju i aktivnost luciferaze izazvane aktivacijom NFκB, kao što je izmereno za konstrukte iz primera 2. Jedinice oslobođene svetlosti (URL) merene su za 0,5 s/bunarčiću i nacrtane u odnosu na primenjenu koncentraciju FAP-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda. Humane HeLa-reporterske ćelije koje eksprimiraju 4-1BB inkubirane su tokom 6 h u odsustvu ili prisustvu ćelijske linije humanog melanoma MV-3 ili WM-266-4 koja eksprimira umreženi humani FAP. URL su izmerene i označene u odnosu na koncentracije različitih FAP-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 i 2.6 i kontrola B, C, E i F. Odnos ćelija je jedna HeLa reporterska ćelija koja eksprimira 4-1BB na pet tumorskih ćelija. Radi boljeg prikaza, krive aktivacije su podeljene na dve različite oznake prikaza sa konstruktom 2.1 (jednovalentni FAP-ciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih)).
1
Na slici 19 prikazan je test aktivacije uspostavljen sa T293-HEK linijom reporterskih ćelija koja eksprimira 4-1BB majmuna cinomolgus. Umrežavanje 4-1BB majmuna cinomolgus eksprimirano na reporterskim ćelijama indukuje aktivaciju NFκB i ekspresiju luciferaze posredovanu putem NFκB. Nakon lize ćelija, luciferaza može da katalizuje oksidaciju luciferina u oksiluciferin. Ova hemijska reakcija ima pozitivnu korelaciju sa jačinom ekspresije luciferaze posredovane putem NFκB, i može se meriti jačinom emisije svetlosti (jedinice oslobođene svetlosti).
Slika 20 prikazuje ekspresiju i aktivnost luciferaze izazvane aktiviranjem NFκB. Jedinice oslobođene svetlosti (URL) merene su za 0,5 s/bunarčiću i nacrtane u odnosu na primenjenu koncentraciju FAP-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda. T293-HEK-reporterske ćelije majmuna cinomolgus koje eksprimiraju 4-1BB inkubirane su 6 h u odsustvu ili prisustvu ćelijske linije humanog melanoma MV-3 ili WM-266-4 koja eksprimira umreženi humani FAP. URL su izmereni i označeni u odnosu na koncentracije različitih FAP-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda. Odnos ćelija je jedna T293-HEK reporterska ćelija koja eksprimira 4-1BB na pet MV-3 ili dve WM-266-4 ćelije. Radi boljeg prikaza, krive aktivacije su podeljene na dve različite oznake sa konstruktom 2.1 kao kao poredbenom krivom.
Slika 21: Ova shema ilustruje princip testa aktiviranja T-ćelija opisanog u primeru 6.3. Prikazana je šematska aktivacija ispitivanja postavljena sa HLA-A2-NLV specifičnim CD8 T ćelijama i NLV pulsnom HLA-A2+ FAP+ ćelijskom linijom MV-3 humanog melanoma u prisustvu različito titrisane koncentracije FAP-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda. Ćelije su inkubirane tokom 28 h, poslednja 4 h u prisustvu Golgi-Stop koji sadrži monesin. Odnos NLV-specifičnih CD8 T ćelija prema tumorskim ćelijama MV-3 je 1:8.
Slike 22A-E i 23A-E odnose se na ispitivanje aktivacije sa HLA-A2-NLV specifičnim CD8 T ćelijama i NLV pulsnom HLA-A2+ FAP+ ćelijskom linijom humanog melanoma MV-3 u prisustvu različito titrisane koncentracije različitih FAP-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda, kao što je pripremljeno u Primeru 1. Radi boljeg prikaza, krive ekspresije su podeljene na više različitih prikaza oznake sa konstruktom 1.1 (jednovalentni FAP ciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih)) i kontrolom B (jednovalentni neciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih)) kao poredbene krive. Rezultati su dobijeni u četiri nezavisna slična eksperimenta, i pokazuju da produžena sekrecija IFNg i ekspresija CD137 NLV-specifičnih CD8+ T ćelija striktno zavise od istovremene
1
aktivacije T-ćelija prepoznavanjem kompleksa NLV-HLA-A2 (signal 1) i 4-1BB-aktivacije FAP ciljanim humanim splitom 4-1BBL (signal 2). Efekat ushodne regulacije 4-1BB prikazan je na grafikonima na slici 22, dok je efekat ekspresije INFγ CD8+ T ćelija prikazan na grafikonima na Slici 23. Prikazana je uvek učestalost u procentu pozitivnih ćelija u ukupnoj populaciji CD8+ T ćelija. Sve FAP ciljane varijante indukovale su slično poboljšanje aktivacije NLV-peptidom aktiviranih CD8 T ćelija prikazano na Slici 22 kao ushodna regulacija 4-1BB (pozitivna povratna petlja) i na Slici 23 kao ekspresija IFNγ nakon 24 h stimulacije. Varijacije krivih leže u rasponu normalnog odstupanja greške, i nisu značajne.
Slike 24 i 25 odnose se na test aktivacije sa CD8 T ćelijama specifičnim za HLA-A2-NLV i NLV pulsnom HLA-A2+ FAP+ ćelijskom linijom humanog melanoma MV-3 u prisustvu različito titrisane koncentracije različitih FAP-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda iz primera 2. Radi boljeg prikaza, krive ekspresije su podeljene na dve različite oznake prikaza sa konstruktom 2.1 (jednovalentni FAP-ciljani split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih)) i kontrolom B kao poredbenim krivama. Svi FAP-ciljani split trimerni humani 4-1BB ligandi Fc (kih) konstrukata pokazuju slično poboljšanje aktivacije CD8 T ćelija specifičnih za HLA-A2-NLV-peptid prikazane na slici 24 kao ushodna regulacija 4-1BB (pozitivna povratna petlja) i na slici 25 kao ekspresija IFNg nakon 24 h stimulacije. Varijacije krivih leže u rasponu normalnog odstupanja greške, i nisu značajne.
Slika 26: Ova šema ilustruje eksperiment opisan u primeru 6.4.
Slika 27 prikazuje indukciju proliferacije CD8+ T ćelija. Prikazana je učestalost proliferacije CD8+ T ćelija u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata.
Slika 28A se odnosi na FK eksperiment sa jednom dozom konstrukta 1.2 i kontrole B kod zdravih NOG miševa. Pokazan je pad koncentracije konstrukta tokom vremena. Na slici 28B prikazani su rezultati FK eksperimenta sa jednom dozom konstrukta 2.1, 2.3, kontrole B i kontrole C kod NOG miševa sa tumorom humanizovanim matičnim ćelijama. Slika 28C se odnosi na FK eksperiment sa jednom dozom, koji poredi konstrukt 2.1 i 2.3 kod zdravih NOG miševa.
Na slici 29 prikazane su komponente za sastavljanje split-trimernih humanih 4-1BB liganda. Slika (29A) prikazuje dimerni ligand koji je spojen na C-kraju sa humanim CL domenom sa mutacijama E123R i Q124K (naelektrisani ostaci), a slika (29B) prikazuje monomerni 4-1BB ligand spojen sa humanim CH1 domenom sa mutacijama K147E i K213E (naelektrisani ostaci). Komponente za sastavljanje dvovalentnog CD19 ciljanog split trimernog
2
humanog 4-1BB liganda (71-254) antigen vezujućeg molekula (konstrukt 3.3). Slika (29C) prikazuje dimerni ligand spojen sa C-krajem lanca Fc sa rupom humanog IgG1. Slika (29D) prikazuje monomerni ligand spojen sa C-krajem humanog lanca Fc sa dugmetom humanog IgG1.
Slika 30 prikazuje CD19 ciljane antigen vezujuće molekule koji sadrže 4-1BBL trimer. Konstrukti 3.1 do 3.6 ovog pronalaska. Priprema i proizvodnja ovih konstrukata opisana je u Primeru 3. VH i VL domeni su domeni anti-CD19 antitela 8B8-018, debela crna tačka označava modifikaciju „dugme u rupici”. * simbolizuje aminokiselinske modifikacije u CH1 i CL domenu (takozvani naelektrisani ostaci).
Na slici 31A prikazana je strategija randomizacije za CDR regione matičnog klona 8B8. Prikazani su varijabilni domeni matičnog klona 8B8 i CDR regioni (uokvireni) prema Kabatovoj numeraciji. (X) predstavlja nasumične pozicije. Slika 31B prikazuje šematski opis strategija kreiranja biblioteke. Prikazana je strategija PCR amplifikacije i kloniranja koja se koristi za stvaranje biblioteke zasnovane na 8B8 sa A) randomizovanim regionima CDR1 i CDR2 u lakom i teškom lancu ili B) randomizovanim regionima CDR1 i CDR3 u lakom i CDR3 regionu u teškom lancu. Navedeni su odgovarajući enzimi korišćeni za kloniranje u fagemid.
Slika 32 prikazuje poravnavanje matičnog anti-CD19 klona 8B8 sa odabranim afinitetno sazrelim vezivačima. Prikazane su sekvence klona 8B8 i svi odabrani afinitetno sazreli vezivači. Uokvireni su CDR-i teških i lakih lanaca.
Slika 33 se odnosi na SPR analizu matičnog klona 8B8 i njegove afinitetno sazrele varijante. Prikazani su senzorgrami klona 8B8 i njegovih afinitetno sazrelih derivata koji nemaju žarišta LCDR1 N27d i N28.
Slika 34 prikazuje postavljanje testa za merenje istovremenog vezivanja CD19 ciljanog trimernog split 4-1BBL za hu4-1BB i huCD19 (Primer 8.2).
Grafikoni na slici 35 prikazuju istovremeno vezivanje CD19 ciljanih trimernih konstrukata 4-1BBL FC fuzionih antigen vezujućih molekula 3.1, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 i 4.4 (analit 1) za imobilisani humani 4-1BB i humani CD19 (analit 2).
Na slici 36 prikazano je vezivanje različitih CD19-ciljanih ili neciljanih Fc(kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda za CD4 i CD8 T ćelije koje eksprimiraju 4-1BB PHA-L i proleukinom prethodno aktivirane i anti-humane CD3/anti-humane CD28 ponovo aktiviranih humanih PBMC. Detektovano je vezivanje sa fragmentom R-fikoeritrin-fluorohrom konjugovanog anti humanog IgG Fcγ-specifičnog kozjeg F(abˋ)2. Prikazana je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata. Radi boljeg prikaza, krive vezivanja su podeljene na tri različite oznake sa konstruktom 3.4 i kontrolom F (kontrola izotipa huIgG1 P329G LALA) kao poredbenim krivama. Vezivanje je praćeno na CD45+ CD3+ CD8+ T ćelijama (slika 36A) i CD45+ CD3+ CD4+ T ćelijama (slika 36B). Nivo ekspresije 4-1BB na CD8 T ćelijama normalno je viši nego na CD4 T ćelijama. Svi konstrukti se vezuju sa približno sličnim afinitetom za humani 4-1BB.
Slika 37 prikazuje vezivanje CD19 ciljanog ili neciljanog Fc (kih) antigen vezujućih molekula split trimernog humanog 4-1BB liganda za humane CD19 eksprimirajuće ćelijske linije B ćelija limfoma: difuzni veliki ne-Hodžkinov B ćelijski limfom SU-DHL-8 (37A), akutna prekursorska limfoidna leukemija B ćelija Nalm6 (37B), difuzni limfom velikih ćelija limfoblasta Toledo (37C) i difuzni limfom velikih B ćelija OCI-Ly18 (37D). Detektovano je vezivanje sa fragmentima R-fikoeritrin-fluorohrom konjugovanog anti humanog IgG Fcγ-specifičnog kozjeg F(abˋ)2. Prikazana je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata. Radi boljeg prikaza, krive vezivanja su podeljene na tri različite oznake sa konstruktom 3.4 i kontrolom F (kontrola izotipa huIgGl P329G LALA) kao poredbenim krivama. Svi konstrukti se vezuju sa približno sličnim afinitetom za humani CD19.
Slika 38 se odnosi na ekspresiju i aktivnost luciferaze izazvanu NFκB-aktivacijom i aktivnost CD19-ciljanog ili neciljanog Fc (kih) antigen vezujućih molekula koji sadrži split trimerni humani 4-1BB ligand. Jedinice oslobođene svetlosti (URL) merene su za 0,5 s/bunarčiću i crtane u odnosu na korišćenu koncentraciju CD19-ciljanih ili neciljanih Fc(kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda 3.1 i 3.3 i kontrolnih molekula B i C. Humane HeLa-reporterske ćelije koje eksprimiraju 4-1BB su inkubirane 7,5 h u odsustvu prisustvu umreženih humanih-CD19 koji eksprimiraju SU-DHL-8 ili Pfajferove ćelije. URL su izmereni i označeni u odnosu na koncentracije različitih CD19-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda. Odnos ćelija je jedna HeLa reporterska ćelija koja eksprimira 4-1BB na 2,5 ili pet tumorskih ćelija.
Slika 39 prikazuje vezivanje različitih humanizovanih varijanti T84.66 IgG na ćelije humanog adenokarcinoma želuca koje eksprimiraju CEA. Na temelju podataka odabrana je humanizovana varijanta 1 radi uključivanja u CEA-ciljane Fc (kih) antigen vezujuće molekule koje sadrže trimerni humani 4-1BB ligand.
Slika 40 prikazuje CEA ciljane konstrukte antigen vezujućih molekula koji sadrže 4-1BBL trimer, 5.1 do 5.6 iz pronalaska. Priprema i proizvodnja ovih konstrukata opisana je u Primeru 11. VH i VL domeni su domeni anti-CEA antitela T84.66-LCHA, debela crna tačka označava modifikaciju „dugme u rupici”. * simbolizuje aminokiselinske modifikacije u CH1 i CL domenu (takozvani naelektrisani ostaci).
Slika 41A prikazuje šematski opis humanih NA3B3A2-avi His, antigena koji se koristi za procenu vezivanja CEA ciljanih Fc (kih) antigen vezujućih molekula koje sadrže trimerni split 4-1BBL. Slika 41B prikazuje postavljanje testa za merenje istovremenog vezivanja CEA ciljanog trimernog splita 4-1BBL za hu4-1BB i humani NA3B3A2 (Primer 12.1).
Grafikoni na slici 42 pokazuju istovremeno vezivanje konstrukata CEA ciljanih trimernih 4-1BBL Fc fuzionih antigen vezujućih molekula, 5.4, 5.6, 5.7 i 5.8 (analit 1) sa imobilisanim humanim 4-1BB i humanim NA3B3A2 (analit 2).
Vezivanje različitih CEA-ciljanih ili neciljanih Fc(kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda za CD4 i CD8 T ćelije koje eksprimiraju 4-1BB PHA-L i proleukinom prethodno aktivirane i anti-humane CD3/anti-humane CD28 ponovo aktiviranih humanih PBMC prikazani su na slici 43. Detektovano je vezivanje sa fragmentom R-fikoeritrin-fluorohrom konjugovanog anti humanog IgG Fcγ-specifičnog kozjeg F(abˋ)2. Prikazana je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata. Radi boljeg prikaza, krive vezivanja su podeljene na dve različite oznake sa konstruktom 5.4 i kontrolom F (kontrola izotipa huIgGl P329G LALA) kao poredbenim krivama. Vezivanje je praćeno na CD45+ CD3+ CD8+ T ćelijama (oznake na dnu) i CD45+ CD3+ CD4+ T ćelijama (oznake na vrhu). Nivo ekspresije 4-1BB na CD8 T ćelijama normalno je viši nego na CD4 T ćelijama. Svi konstrukti se vezuju sa približno sličnim afinitetom za humani 4-1BB.
Slika 44 prikazuje vezivanje CEA-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda za humani CEA koji eksprimira ćelijsku liniju ljudskog želuca MKN-45 (levo) i ćelijsku liniju ljudskog kolorektalnog adenokarcinoma LS180 (desno). Detektovano je vezivanje sa fragmentima R-fikoeritrin-fluorohrom konjugovanog anti humanog IgG Fcγ-specifičnog kozjeg F(abˋ)2. Prikazana je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata.
Slika 45 se odnosi na ekspresiju i aktivnost luciferaze izazvanu NFκB-aktivacijom i aktivnost CEA-ciljanog ili neciljanog Fc (kih) antigen vezujućih molekula koji sadrži split trimerni humani 4-1BB ligand. Jedinice oslobođene svetlosti (URL) merene su za 0,5 s/bunarčiću i predstavljene u odnosu na primenjenu koncentraciju CEA-ciljanih ili neciljanih Fc (kih) konstrukata split trimernih humanih 4-1BB liganda 5.4, 5.6, 5.7 i 5.8 i kontrolnih molekula. Humane HeLa-reporterske ćelije koje eksprimiraju 4-1BB inkubirane su tokom 6 h u odsustvu ili prisustvu ćelijske linije humanog kancera želuca MKN-45 koja eksprimira umreženi humani CEA. Odnos ćelija je jedna HeLa-reporterska ćelija koja eksprimira 4-1BB
2
na tri tumorske ćelije.
Na slikama 46A i 46B prikazane su komponente za sastavljanje jednovalentnog FAP ciljanog split trimernog humanog OX40 liganda (konstrukt 6.1). Slika 46A se odnosi na dimerni ligand spojen sa humanim IgG1-CL domenom, slika 46B se odnosi na monomerni ligand spojen sa humanim IgG1-CH1 domenom. Na slici 46C prikazan je FAP ciljani konstrukt 6.1 antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer OX40L. Na slici 46D prikazan je DP47 „neciljani“ humani IgG1 PGLALA (kontrola F).
Slika 47A prikazuje vezivanje FAP ciljanog split trimernog humanog Ox40L za FAP pozitivne WM-266-4 ćelije. WM-266-4 ćelije eksprimiraju visoke nivoe aktivacionog proteina humanog fibroblasta (huFAP). Samo FAP ciljani Fc (kih) konstrukti OX40 liganda (puni kvadrat), ali ne i kontrola 5 (puni romb) vezuju se za WM-266-4 ćelije. Prikazano je vezivanje kao medijana intenziteta fluorescencije (MFI) fluorescein izotiocijanatom (FITC) označenog antihumanog fragmenta kozjeg IgG F(abˋ)2 specifičnog za IgG Fcγ, koji se koristi kao antitelo za sekundarnu detekciju. MFI je meren protočnom citometrijom. Osa x pokazuje koncentraciju konstrukata antitela. Slika 47B prikazuje vezivanje FAP ciljanog Fc (kih) konstrukta OX4O liganda za humani FAP humani OX40 negativne A549 NucLight Red ćelije. FAP ciljani Fc (kih) konstrukt Ox40 liganda nije pokazao vezivanje za Ox40 negativne FAP negativne A549 ćelije tumora. Prikazano je vezivanje kao medijana intenziteta fluorescencije (MFI) FITC označenog antihumanog fragmenta kozjeg IgG F(abˋ)2 specifičnog za IgG Fcγ, koji se koristi kao antitelo za sekundarnu detekciju. MFI je meren protočnom citometrijom, a osnovna vrednost korigovana oduzimanjem MFI slepe probe.
Na slici 48A prikazano je vezivanje FAP-Ox40L za mirujuće i aktivirane humane CD4 T ćelije. Ox40 nije eksprimiran na mirujućim humanim CD4 T ćelijama (leva strana). U odsustvu humanih ćelija koje eksprimiraju Ox40 nije opaženo vezivanje (levi grafikoni). Nakon aktivacije humanih PBMC, Ox40 je ushodno regulisan na CD4+ T ćelijama (desna strana). FAP-Ox40L se vezao za Ox40+ aktivirane CD4 T ćelije. Prikazano je vezivanje kao medijana intenziteta fluorescencije (MFI) FITC označenog antihumanog fragmenta kozjeg IgG F(abˋ)2 specifičnog za IgG Fcγ, koji se koristi kao antitelo za sekundarnu detekciju. MFI je meren protočnom citometrijom, a osnovna vrednost korigovana oduzimanjem MFI slepe probe. Osa x pokazuje koncentraciju konstrukata antitela. Slika 48B pokazuje da Ox40 nije eksprimiran na mirujućim humanim CD8 T ćelijama (leva strana). U odsustvu humanih ćelija koje eksprimiraju Ox40 nije opaženo vezivanje (levi grafikoni). Nakon aktivacije humanih PBMC, Ox40 je ushodno regulisan na CD8+ T ćelijama (desna strana). Ekspresija Ox40 na humanim CD8+ T ćelijama je manja nego na CD4+ T ćelijama, i varira između donora i termina. Ekspresija Ox40 bila je niska na prikazanim CD8 T ćelijama. FAp-Ox40L se vezao za Ox40+ aktivirane CD8 T ćelije. Prikazano je vezivanje kao medijana intenziteta fluorescencije (MFI) FITC označenog antihumanog fragmenta kozjeg IgG F(abˋ)2 specifičnog za IgG Fcγ, koji se koristi kao antitelo za sekundarnu detekciju. MFI je meren protočnom citometrijom, a osnovna vrednost korigovana oduzimanjem MFI slepe probe. Osa x pokazuje koncentraciju konstrukata antitela
Na slici 49 prikazana je aktivacija NFκB signalnog puta od strane FAP ciljanog split trimernog humanog OX40L antigen vezujućeg molekula (FAP-OX40L) u HeLa_hOx40_NFkB_Lucl reporter ćelijama. Prikazana je aktivacija sa umrežavanjem (desni grafikon) ili bez (levi grafikon) umrežavanja sekundarnih antitela. Reporterske ćelije su kultivisane 5 sati u prisustvu FAP-OX40L u naznačenim koncentracijama sa umrežavanjem ili bez umrežavanja sekundarnog poliklonskog anti-huIgG1 Fcγ-specifičnog fragmenta F(ab)2 kozjeg IgG u odnosu 1:2. Aktivnost luciferaze je procenjena kao što je opisano u primeru 6.1. Aktivnost je okarakterisana predstavljanjem jedinica oslobođene svetlosti (URL) izmerenih tokom 0,5 s u odnosu na koncentraciju u nM testiranih konstrukata. URL-ovi se emituju usled luciferazom posredovane oksidacije luciferina u oksiluciferin.
Aktivacija NFκB od strane FAP-OX40L u HeLa_hOx40_NFkB_Lucl reporterskim ćelijama u prisustvu FAP pozitivnih ćelija prikazana je na slici 50A. Prikazana je aktivacija NFκB signalnog puta u reporterskim ćelijama pomoću FAP-OX40L u prisustvu niske FAP ekspresije koja eksprimira NIH-3T3 humane FAP ćelije (odnos 3 FAP+ tumorske ćelije prema 1 reporterskoj ćeliji). Aktivnost luciferaze posredovana putem NFκB je okarakterisana predstavljanjem jedinica oslobođene svetlosti (URL) izmerenih tokom 0,5 s u odnosu na koncentraciju u nM testiranih jedinjenja. URL-ovi se emituju usled luciferazom posredovane oksidacije luciferina u oksiluciferin. Vrednosti su ispravljene prema osnovnim vrednostima oduzimanjem URL-ova slepe kontrole. Radi boljeg poređenja, oblast ispod krive odgovarajućih predstavljenih krivih doza-odgovor kvantifikovana je kao marker za agonistički kapacitet svakog konstrukta. Poređenje je prikazano na slici 50B. Oblast je izračunata pomoću softvera GraphPad Prism. Vrednosti su ispravljene prema osnovnim vrednostima oduzimanjem vrednosti slepe kontrole.
Na slici 51 prikazana je OX40 posredovana kostimulacija suboptimalnim TCR aktiviranim humanim PBMC u mirovanju (Primer 15.5). Hiperumrežavanje FAP-Ox40L od strane sadašnjeg NIH/3T3-huFAP klona 39 ćelija snažno je promovisalo preživljavanje i proliferaciju u humanim CD4 i CD8 T ćelijama. Prikazan je broj događaja vitalnih CD4+ (levo) i CD8+ (desno) T ćelija. Oduzete su osnovne vrednosti uzoraka koji sadrže samo anti-humani
2
CD3 (klon V9, huIgG1), humani PBMC u mirovanju i NIH/3T3-huFAP klon 39. Tako, ovde je prikazan efekat pojačavanja kostimulacije OX40, ali ne i efekat suboptimalne anti-CD3 stimulacije same po sebi. Na slikama na dnu prikazano je spasavanje suboptimalne TCR stimulacije humanih PBMC u mirovanju sa FAP-Ox40L imobilisanom na ćelijskoj površini-proliferacijom.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije
Ako nije drugačije definisano, tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što se tipično koristi u oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak. Za potrebe tumačenja ove specifikacije, sledeće definicije će se primenjivati, i kad god je to prikladno, pojmovi koji se koriste u jednini takođe će uključivati i množinu, i obrnuto.
Kako se ovde koristi, termin „antigen vezujući molekul” se u najširem smislu odnosi na molekul koji specifično vezuje antigensku determinantu. Primeri antigen vezujućih molekula su antitela, fragmenti antitela i skeletni proteini koji vezuju antigen.
Kako se ovde koristi, termin „ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije” odnosi se na molekul polipeptida koji se specifično vezuje za antigensku determinantu. U jednom aspektu, antigen vezujući ostatak je sposoban da aktivira signalizaciju putem svog antigena ciljne ćelije. U posebnom aspektu, antigen vezujući ostatak je u stanju da usmeri entitet za koji je vezan (npr. trimerliganda iz TNF familije) na ciljno mesto, na primer na specifičan tip tumorskih ćelija ili stromu tumora koja nosi antigensku determinantu. Ostaci sposobni za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije uključuju antitela i njihove fragmente kako je ovde dalje definisano. Pored toga, ostaci sposobni za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije uključuju skeletne proteine koji vezuju antigen kako su ovde dalje definisani, npr. vezujuće domene koji su zasnovani na projektovanim ponovljenim proteinima ili projektovanim ponovljenim domenima (vidite npr. WO 2002/020565).
U odnosu na antitelo ili njegov fragment, termin „ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije” se odnosi na deo molekula koji obuhvata područje koje se specifično vezuje za deo ili celinu antigena, i komplementarno je delu ili celini antigena. Ostatak sposoban za specifično vezivanje antigena može biti obezbeđen, na primer, putem jednog ili više varijabilnih domena antitela (nazivaju se i varijabilni regioni antitela). Posebno, ostatak sposoban za specifično vezivanje antigena sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH).
Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela,
2
monospecifična i multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.
Termin „monoklonsko antitelo”, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja su sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu.
Termin „monospecifično” antitelo, kako se ovde koristi, označava antitelo koje ima jedno ili više vezujućih mesta od kojih se svako vezuje za isti epitop istog antigena. Termin „bispecifični” znači da je antigen vezujući molekul sposoban da se specifično vezuje za najmanje dve različite antigenske determinante. Tipično, bispecifični antigen vezujući molekul sadrži dva mesta vezivanja antigena, od kojih je svako specifično za različitu antigensku determinantu. U određenimrealizacijama, bispecifični antigen vezujući molekul je sposoban da istovremeno vezuje dve antigenske determinante, naročito dve antigenske determinante eksprimirane na dve različite ćelije.
Termin „valentno”, kako se koristi u okviru trenutne prijave, označava prisustvo određenog broja mesta vezivanja u antigen vezujućem molekulu. Kao takvi, termini „dvovalentni”, „četvorovalentni” i „šestovalentni” označavaju prisustvo dva mesta za vezivanje, četiri mesta za vezivanje, odnosno šest mesta za vezivanje u antigen vezujućem molekulu.
Termini „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi koji označavaju antitelo koje ima suštinski sličnu strukturu strukturi nativnog antitela. „Nativna antitela” ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna antitela IgG klase su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva laka lanca i dva teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N- do C-terminusa, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3), koji se takođe zovu konstantni regioni teškog lanca. Slično tome, od N- do C-terminusa, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni domen lakog lanca (CL), koji se takođe zove konstantni region lakog lanca.
2
Teški lanac antitela može se svrstati u jedan od pet tipova, koji se zovu α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), ili μ (IgM), od kojih se neki dalje dele u podtipove, npr. γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) i α2 (IgA2). Laki lanac antitela se može svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (k) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence svog konstantnog domena.
„Fragment antitela” ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; dijatela, trijatela, tetratela, kros-Fab fragmente; linearna antitela, jednolančane molekule antitela (npr. scFv) i antitela sa jednim domenom. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite npr. u Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg i Moore izd., Springer-Verlag, New York, str.269-315 (1994); pogledajte takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br.5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2 fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.
5,869,046. Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična, pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U određenimrealizacijama, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,248,516 B1). Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
Digestijom netaknutih antitela papainom dobijaju se dva identična antigen vezujuća fragmenta, koji se nazivaju „Fab” fragmenti, od kojih svaki sadrži varijabilne domene teškog i lakog lanca, a takođe i konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Kako se ovde koristi, dakle, termin „Fab fragment” se odnosi na fragment antitela koji obuhvata fragment lakog lanca koji sadrži VL domen i konstantni domen lakog lanca (CL), i VH domen i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata dodavanjem nekoliko ostataka na karboksi terminusu CH1 domena teškog lanca,
2
uključujući jedan ili više cisteina iz regiona šarke antitela. Fab’-SH su Fab’ fragmenti u kojima ostatak cisteina konstantnih domena nosi slobodnu tiolnu grupu. Tretiranje pepsinom daje F(ab')2fragment koji ima dva mesta za kombinovanje antigena (dva Fab fragmenta) i deo Fc regiona.
Termin „unakrsni Fab fragment” ili „xFab fragment” ili „krosover Fab fragment” odnosi se na Fab fragment, pri čemu su ili varijabilni regioni ili konstantni regioni teškog i lakog lanca razmenjeni. Dva različita sastava lanaca krosover Fab molekula su moguća i sadržana u bispecifičnim antitelima ovog pronalaska: Sa druge strane, varijabilni regioni teškog i lakog lanca Fab su razmenjeni, tj. unakrsni Fab molekul sadrži peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona teškog lanca (CH1), i peptidni lanac sastavljen od varijabilog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Ovaj krosover Fab molekul se takođe naziva CrossFab(VLVH). Sa druge strane, kada su konstantni regioni teškog i lakog lanca Fab razmenjeni, krosover Fab molekul sadrži peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona lakog lanca (CL), i peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona teškog lanca (CH1). Ovaj krosover Fab molekul se takođe naziva CrossFab(CLCH1).
„Jednolančani fragment Fab” ili „scFab” je polipeptid koji se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena 1 antitela (CH1), varijabilnog domena lakog lanca antitela (VL), konstantnog domena lakog lanca antitela (CL) i linkera, pri čemu pomenuti domeni antitela i pomenuti linker imaju jedan od sledećih redosleda u smeru od N-kraja do C-kraja: a) VH-CH1-linker-VL-CL, b) VL-CL-linker-VH-CH1, c) VH-CL-linker-VL-CH1 ili d) VL-CH1-linker-VH-CL; i pri čemu je pomenuti linker polipeptid od najmanje 30 aminokiselina, poželjno između 32 i 50 aminokiselina. Navedeni jednolančani fragmenti Fab se stabilizuju prirodnom disulfidnom vezom između CL domena i CH1 domena. Pored toga, ovi jednolančani molekuli Fab se mogu dalje stabilizovati stvaranjem međulančanih disulfidnih veza insercijom cisteinskih ostataka (npr. pozicija 44 u varijabilnom teškom lancu i pozicija 100 u varijabilnom lakom lancu prema Kabatovoj numeraciji).
„Krosover jednolančani fragment Fab” ili „x-scFab” je polipeptid koji se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena 1 antitela (CH1), varijabilnog domena lakog lanca antitela (VL), konstantnog domena lakog lanca antitela (CL) i linkera, pri čemu navedeni domeni antitela i navedeni linker imaju jedan od sledećih redosleda u smeru od N-kraja do C-kraja: a) VH-CL-linker-VL-CH1 i b) VL-CH1-linker-VH-CL; pri čemu VH i VL zajedno grade antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za antigen, i pri
2
čemu je pomenuti linker polipeptid od najmanje 30 aminokiselina. Pored toga, ovi molekuli x-scFab se mogu dalje stabilizovati stvaranjem međulančanih disulfidnih veza insercijom cisteinskih ostataka (npr. pozicija 44 u varijabilnom teškom lancu i pozicija 100 u varijabilnom lakom lancu prema Kabatovoj numeraciji).
„Jednolančani varijabilni fragment (scFv)” je fuzioni protein varijabilnih regiona teškog (VH) i lakog lanca (VL) antitela, povezan kratkim peptidnim linkerom od deset do oko 25 aminokiselina. Linker je tipično bogat glicinom radi fleksibilnosti, kao i serinom ili treoninom radi rastvorljivosti, i može povezati N-kraj VHsa C-krajem VL, ili obrnuto. Ovaj protein zadržava specifičnost originalnog antitela, uprkos uklanjanju konstantnih regiona i uvođenju linkera. scFv antitela su, npr., opisana u Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96). Sem toga, fragmenti antitela obuhvataju jednolančane polipeptide koji imaju karakteristike VH domena, koji pre svega može da se sastavi sa VL domenom, ili VL domena, koji pre svega može da se sastavi sa VH domenom u funkcionalno antigen vezujuće mesto, i na taj način obezbedi antigen vezujuće svojstvo antitelu kompletne dužine.
„Skeletni proteini koji vezuju antigen” poznati su u struci, na primer, fibronektin i dizajnirani ankirinski ponovljeni proteini (DARPin) korišćeni su kao alternativni skeleti za antigen vezujuće domene, vidite, npr. Gebauer i Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) i Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008). U jednom aspektu ovog pronalaska, skeletni protein koji vezuje antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od CTLA-4 (Evibody), lipokalina (antikalin), molekula dobijenog od proteina A, kao što je Z-domen proteina A (Affibody), A-domena (Avimer/Maxibody), transferina seruma (trans-telo); dizajniranog ankirinskog ponovljenog proteina (DARPin), varijabilnog domena lakog lanca ili teškog lanca antitela (antitelo sa jednim domenom, sdAb),varijabilnog domena teškog lanca antitela (nanotelo, aVH), VNARfragmenata, fibronektina (AdNektin), lektinskog domena C-tipa (tetranektin); varijabilnog domena novog antigen receptora beta-laktamaze (VNARfragmenti), humanog gama-kristalina ili ubikvitina (Affilin molecules); domena Kunicovog tipa inhibitora humane proteaze, mikrotela kao što su proteini iz familije knotina, peptidnih aptamera i fibronektina (adnektin).
CTLA-4 (antigen 4 povezan sa citotoksičnim T limfocitom) je receptor familije CD28 koji se eksprimira uglavnom na CD4+ T-ćelijama. Njegov ekstracelularni domen ima Ig nabor sličan varijabilnom domenu. Petlje koje odgovaraju CDR-ima antitela se mogu supstituisati heterologom sekvencom da bi se dobila različita svojstva vezivanja. CTLA-4 molekuli dizajnirani da imaju različite specifičnosti vezivanja poznati su i pod nazivom evitela (npr.
US7166697B1). Evitela su približno iste veličine kao izolovani varijabilni region antitela (npr. antitelo domena). Za dodatne detalje pogledajte Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001).
Lipokalini su porodica ekstracelularnih proteina koji transportuju male hidrofobne molekule poput steroida, bilina, retinoida i lipida. Imaju čvrstu sekundarnu strukturu beta-listova sa velikim brojem petlji na otvorenom kraju konične strukture koja se može konstruisati za vezivanje na različite ciljne antigene. Antikalini su veličine između 160-180 aminokiselina, a izvedeni su iz lipokalina. Za više detalja vidite Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 i US20070224633.
Afitelo je skelet dobijen iz proteina A mikroorganizma Staphylococcus aureus koji se može dizajnirati da se vezuje za antigen. Domen se sastoji od trospiralnog snopa od oko 58 aminokiselina. Biblioteke su nastale randomizacijom površinskih ostataka. Za dodatne detalje vidite Protein Eng. Des. Sel.17, 455-462 (2004) i EP1641818A1.
Avimeri su multidomenski proteini koji potiču iz porodice skeleta A domena. Nativni domeni od oko 35 aminokiselina usvajaju definisanu strukturu sa disulfidnim vezama. Raznolikost nastaje mešanjem prirodnih varijacija koje pokazuje porodica A-domena. Za dodatne detalje pogledajte Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) i Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (jun 2007).
Transferin je monomerni transportni glikoprotein u serumu. Transferini se mogu dizajnirati za vezivanje različitih ciljnih antigena umetanjem peptidnih sekvenci u permisivnu površinsku petlju. Primeri dizajniranih transferinskh skeleta uključuju trans-telo. Za više detalja vidite J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999).
Dizajnirani ankirinski ponovljeni proteini (DARPini) izvedeni su iz ankirina, što je porodica proteina koji posreduju vezivanje proteina integralnih membrana za citoskelet. Jedno ponavljanje ankirina je motiv od 33 ostatka koji se sastoji od dve alfa spirale i beta okreta. Oni se mogu dizajnirati za vezivanje različitih ciljnih antigena randomizacijom ostataka u prvoj alfa spirali i beta okretu svakog ponavljanja. Njihovo vezujuće sučelje se može povećati povećanjem broja modula (metoda afinitetnog sazrevanja). Za više detalja vidite J. Mol. Biol.
332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) i J. Mol. Biol.369, 1015-1028 (2007) i US20040132028A1.
Antitelo sa jednim domenom je fragment antitela koji se sastoji od jednog monomernog varijabilnog domena antitela. Prva antitela sa jednim domenom su izvedena iz varijabilnog domena teškog lanca antitela iz kamelida (nanotela ili VHH fragmenti). Nadalje, pojam antitela sa jednim domenom uključuje autonomne fragmente humanog varijabilnog domena teškog
1
lanca (aVH) ili VNARdobijene od morskih pasa.
Fibronektin je skelet koji može da se dizajnira za vezivanje na antigen. Adnektini se sastoje od okosnice prirodnog niza aminokiselina 10. domena od 15 ponavljajućih jedinica humanog fibronektina tipa III (FN3). Tri petlje na jednom kraju.beta.-sendviča se mogu dizajnirati tako da adnektin može posebno da prepozna terapeutski cilj od interesa. Za dodatne detalje vidite Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), US20080139791, WO2005056764 i US6818418B1.
Peptidni aptameri su kombinatorni molekuli za prepoznavanje koji se sastoje od proteina konstantnog skeleta, tipično tioredoksina (TrxA) koji sadrži ograničenu varijabilnu peptidnu petlju umetnutu na aktivno mesto. Za više detalja vidite Expert Opin. Biol. Ter. 5, 783-797 (2005).
Mikrotela su izvedena iz prirodnih mikroproteina dužine 25-50 aminokiselina koji sadrže 3-4 cisteinska mosta-primeri mikroproteina uključuju KalataBI i konotoksin i knotine. Mikroproteini imaju petlju koja se može dizajnirati da uključuje do 25 aminokiselina bez uticaja na ukupni nabor mikroproteina. Za dodatne detalje o dizajniranim domenima knotina, pogledajte WO2008098796.
„Antigen vezujući molekul koji se vezuje za isti epitop” kao referentni molekul se odnosi na antigen vezujući molekul koji blokira vezivanje referentnog molekula za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentni molekul blokira vezivanje antigen vezujućeg molekula za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više.
Termin „antigen vezujući domen” se odnosi na deo antigen vezujućeg molekula koji sadrži oblast koja se specifično vezuje za deo antigena ili ceo antigen, i komplementarna je sa delom antigena ili celim antigenom. Kada je antigen veliki, antigen vezujući molekul može da se veže samo za naročiti deo antigena, a taj deo se naziva epitop. Antigen-vezujući domen se može dobiti, na primer, pomoću jednog ili više varijabilnih domena (takođe se zovu varijabilni regioni). Poželjno, antigen vezujući domen sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH).
Kako se ovde koristi, termin „antigenska determinanta” je sinonim za „antigen” i „epitop”, i odnosi se na mesto (npr. susedni deo aminokiselina ili konformaciona konfiguracija sastavljena od različitih regiona nesusednih aminokiselina) na polipeptidnom makromolekulu za koji se vezuje antigen vezujući ostatak, formirajući antigen vezujući kompleks ostatak-antigen. Korisne antigenske determinante mogu se naći, na primer, na površinama tumorskih ćelija, na površinama ćelija inficiranih virusom, na površinama drugih obolelih ćelija, na površini imunih ćelija, slobodne u serumu u krvi i/ili u ekstracelularnoj matrici
2
(ECM). Proteini koji su korisni kao antigeni mogu biti svi nativni oblici proteina koji potiču od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naznačeno. U konkretnoj realizaciji, antigen je humani protein. Kada se ovde pominje specifični protein, termin obuhvata neprerađen protein „pune dužine”, kao i bilo koji oblik proteina koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante proteina, npr. splajsovane ili alelne varijante.
Pod „specifičnim vezivanjem” podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen, i može se razlikovati od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. Sposobnost antigen vezujućeg molekula da se vezuje za specifični antigen može se meriti bilo putem testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili putem drugih tehnika poznatih stručnim licima, npr. tehnikom površinske plazmonske rezonance (SPR) (analizirana na instrumentu BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). U jednoj realizaciji, stepen vezivanja antigen vezujućeg molekula na nevezani protein je manji od oko 10% vezivanja antigen vezujućeg molekula na antigen kao što je mereno, npr. putem SPR. U nekimrealizacijama, molekul koje se vezuje za antigen ima konstantu disocijacije (Kd) ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).
„Afinitet” ili „afinitet vezivanja” odnosi se na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja” se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može se generalno predstaviti preko konstante disocijacije (Kd), koja predstavlja odnos konstante brzine disocijacije i konstante brzine asocijacije (koff, odnosno kon). Tako ekvivalentni afiniteti mogu da uključe različite konstante brzine, dokle god odnos konstanti brzine ostaje isti. Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Poseban postupak za merenje afiniteta je Površinska plazmonska rezonanca (SPR).
„Antigen ciljne ćelije”, kako se ovde koristi, odnosi se na antigensku determinantu koja je predstavljena na površini ciljne ćelije, na primer, ćelija u tumoru, kao što je ćelija kancera ili ćelija tumorske strome. U određenimrealizacijama, antigen ciljne ćelije je antigen na površini tumorske ćelije. U jednom aspektu, antigen ciljne ćelije je odabran iz grupe koja se sastoji od proteina aktivacije fibroblasta (FAP), karcinoembrionskog antigena (CEA), hondroitin sulfatnog proteoglikana povezanog sa melonomom (MCSP), receptora epidermalnog faktora rasta (EGFR), CD19, CD20 i CD33. Konkretno, antigen ciljne ćelije je protein aktivacije fibroblasta (FAP).
Termin „protein aktivacije fibroblasta (FAP)”, takođe poznat kao prolil endopeptidaza FAP ili sepraza (EC 3.4.21), odnosi se na bilo koji nativni FAP iz bilo kojeg izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi), primata koji nisu ljudi (npr. majmuni cinomolgus), i glodara (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. Termin obuhvata neobrađen FAP, „kompletne dužine”, kao i svaki oblik FAP koji je rezultat obrade u ćeliji. Izraz takođe obuhvata prirodno postojeće varijante FAP-a, npr. splajsovane ili alelne varijante. U jednoj realizaciji, antigen vezujući molekul prema ovom pronalasku može se specifično vezivati za FAP čoveka, miša i/ili cinomolgusa. Aminokiselinska sekvenca humanog FAP prikazana je u UniProt (www.uniprot.org) pristupni br. Q12884 (verzija 149, SEQ ID NO: 20) ili NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2. Ekstracelularni domen (ECD) humanog FAP proteže se od položaja aminokiselina 26 do 760. Aminokiselinske i nukleotidne sekvence His-označenog humanog ECD FAP prikazane su u SEQ ID NO 15, odnosno 16. Aminokiselinska sekvenca mišjeg FAP prikazan je u UniProt pristupni br. P97321 (verzija 126, SEQ ID NO: 23) ili NCBI RefSeq NP_032012.1. Ekstracelularni domen (ECD) mišjeg FAP proteže se od položaja aminokiselina 26 do 761. SEQ ID NO 24 i 25 prikazuju aminokiselinsku, odnosno nukleotidnu sekvencu His-označenog mišjeg ECD FAP. SEQ ID NO 26 i 27 prikazuju aminokiselinsku, odnosno nukleotidnu sekvencu His-označenog ECD FAP cinomolgusa. Poželjno, anti-FAP vezujući molekul iz pronalaska vezuje se za ekstracelularni domen FAP. Primeri anti-FAP vezujućih molekula su opisani u međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 2012/020006 A2.
Termin „karcinoembrionski antigen (CEA)”, poznat i kao ćelijski adhezioni molekul 5 povezan sa karcinoembrionskim antigenom (CEACAM5), odnosi se na bilo koji nativni CEA iz bilo kojeg izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi), primata koji nisu ljudi (npr. majmuni cynomolgus) i glodara (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. Aminokiselinska sekvenca ljudskog CEA prikazana je u UniProt pristupni br. P06731 (verzija 151, SEQ ID NO: 28). CEA je dugo bio identifikovan kao antigen povezan sa tumorom (Gold i Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; BerinsteinN. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002). Prvobitno klasifikovan kao protein izražen samo u fetalnom tkivu, CEA je sada identifikovan u nekoliko normalnih tkiva odraslih osoba. Ova tkiva su pre svega epitelnog porekla, uključujući ćelije gastrointestinalnog, respiratornog i urogenitalnog trakta, i ćelije debelog creva, grlića materice, znojnih žlezda i prostate (Nap et al, Tumour Biol., 9(2-3): 145-53, 1988; Nap et al, Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992). Tumori epitelnog porekla, kao
4
i njihove metastaze, sadrže CEA kao antigen vezan za tumor. Iako prisustvo CEA samo po sebi ne ukazuje na transformaciju u kanceroznu ćeliju, distribucija CEA je indikativna. U normalnom tkivu, CEA se generalno izražava na apikalnoj površini ćelije (Hammarström S., Semin Cancer Biol.9(2):67-81 (1999)), što ga čini nepristupačnim antitelima u krvi. Za razliku od normalnog tkiva, CEA se obično eksprimira na celoj površini kanceroznih ćelija (Hammarström S., Semin Cancer Biol.9(2):67-81 (1999)). Ova promena ekspresionog šablona čini CEA dostupnim za vezivanje antitela u kancerogenim ćelijama. Pored toga, ekspresija CEA se povećava u kancerogenim ćelijama. Pored toga, povećana ekspresija CEA podstiče povećanje međućelijskih adhezija, što može dovesti do metastaze (Marshall J., Semin Oncol., 30 (Suppl 8): 30-6, 2003). Prevalencija ekspresije CEA u različitim tumorskim entitetima je generalno vrlo velika. U skladu sa objavljenim podacima, vlastite analize izvedene na uzorcima tkiva potvrdile su njegovu masovnu prevalenciju, sa oko 95% kod kolorektalnog karcinoma (CRC), 90%kod kancera pankreasa, 80% kod kancera želuca, 60% kod nemikrocelularnog kancera pluća (NSCLC, gde se koeksprimira sa HER3), i 40% kod karcinoma dojke; mala ekspresija pronađena je kod mikrocelularnog kancera pluća i glioblastoma.
CEA se lako razdvaja sa površine ćelije i uliva u krvotok iz tumora, bilo direktno ili putem limfnog sistema. Zbog ove osobine, nivo serumskog CEA se koristi kao klinički marker za dijagnozu kancera i skrining za ponovnu pojavu kancera, naročito kolorektalnog kancera (Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I, et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12(23):6985-6988, 2006).
Termin „hondroitin sulfatni proteoglikan povezan sa melanomom (MCSP)”, poznat i kao hondroitin sulfat proteoglikan 4 (CSPG4), odnosi se na bilo koji nativni MCSP iz bilo kojeg izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi), primata koji nisu ljudi (npr. majmuni cinomolgus) i glodara (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. Aminokiselinska sekvenca humanog MCSP prikazana je u UniProt pristupni br. Q6UVK1 (verzija 103, SEQ ID NO: 29). Termin „receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR)”, takođe nazvan protoonkogen c-ErbB-1 ili receptor tirozin-protein kinaze erbB-1, odnosi se na bilo koji nativni EGFR iz bilo kojeg izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi), primata koji nisu ljudi (npr. majmuni cinomolgus) i glodara (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. Aminokiselinska sekvenca humanog EGFR prikazana je u UniProt pristupni br. P00533 (verzija 211, SEQ ID NO: 30).
Termin „CD19” odnosi se na B-limfocitni antigen CD19, takođe poznat kao površinski antigen B-limfocita B4 ili površinski antigen T-ćelije Leu-12, i uključuje bilo koji nativni CD19 iz bilo kojeg izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi), primata koji nisu ljudi (npr. majmuni cinomolgus) i glodara (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. Aminokiselinska sekvenca humanog CD19 prikazana je u Uniprot pristupni br. P15391 (verzija 160, SEQ ID NO: 31). Termin obuhvata neobrađeni humani CD19 „pune dužine” kao i bilo koji oblik humanog CD19 koji nastaje obradom u ćeliji sve dok se antitelo kako je ovde opisano vezuje za njega. CD19 je strukturno različit receptor ćelijske površine eksprimiran na površini ljudskih B ćelija, uključujući, bez ograničenja, pre-B ćelije, B ćelije u ranom razvoju {tj. nezrele B ćelije), zrele B ćelije putem terminalne diferencijacije u ćelije plazme, i maligne B ćelije. CD19 se eksprimira kod većine pre-B akutnih limfoblastnih leukemija (ALL), ne-Hodžkinovih limfoma, B ćelijskih hroničnih limfocitnih leukemija (CLL), pro-limfocitnih leukemija, leukemija vlasastih ćelija, uobičajenih akutnih limfocitnih leukemija i nekih akutnih limfoblastnih leukemija nultih ćelija. Ekspresija CD19 na ćelijama plazme nadalje sugeriše da se može eksprimirati na tumorima diferenciranih B ćelija, kao što je multipli mijelom. Zato je antigen CD19 cilj imunoterapije kod lečenja ne-Hodžkinovog limfoma, hronične limfocitne leukemije i/ili akutne limfoblastične leukemije.
„CD20” se odnosi na B-limfocitni antigen CD20, poznat i kao član 1 podfamilije A koji obuhvata membranu 4 domena (MS4A1), površinski antigen B-limfocita B1 ili površinski antigen leukocita Leu-16, i uključuje bilo koji nativni CD20 iz bilo kojeg izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi), primata koji nisu ljudi (npr. majmuni cinomolgus) i glodara (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. Aminokiselinska sekvenca humanog CD20 prikazana je u Uniprot pristupni br. Pl1836 (verzija 149, SEQ ID NO: 32).
„CD33” se odnosi na površinki antigen mijeloidne ćelije CD33, poznat i kao SIGLEC3 ili gp67, i uključuje bilo koji nativni CD33 iz bilo kojeg izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi), primata koji nisu ljudi (npr. majmuni cinomolgus) i glodara (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. Aminokiselinska sekvenca humanog CD33 prikazana je u Uniprot pristupni br. P20138 (verzija 157, SEQ ID NO: 33).
Termin „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela koji je uključen u vezivanje antigen vezujućeg molekula za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela tipično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). Vidite, npr. Kindt et al., Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman and Co., str. 91 (2007). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti.
Termin „hipervarijabilni region” ili „HVR”, kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje”). Generalno, nativna četvorolančana antitela sadrže šest regiona HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). Regioni HVR uglavnom sadrže aminokiselinske ostatke iz hipervarijabilnih petlji i/ili iz „regiona koji određuju komplementarnost” (CDR), gde ovi poslednji imaju najveću varijabilnost sekvence i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Primeri hipervarijabilnih petlji dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3). (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Primeri CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3) dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 24-34 na L1, 50-56 na L2, 89-97 na L3, 31-35B na H1, 50-65 na H2 i 95-102 na H3. (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Hipervarijabilni regioni (HVR) se takođe pominju kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), i ti termini se podjednako odnose na delove varijabilnog regiona koji formiraju antigen vezujuće regione. Ovaj konkretni region opisan je u Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) i u Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987), gde se ove definicije odnose na preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka kad se porede jedne sa drugima. I pored toga, namera je da primena bilo koje od ove dve definicije koje ukazuju na CDR antitela ili njihove varijante bude obuhvaćena terminom na način kako se on ovde definiše i koristi. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR kao što je definisano u svakoj od gore citiranih referenci prikazani su dole u Tabeli A radi poređenja. Tačni brojevi ostataka koji sadrže konkretni CDR će varirati u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Stručna lica iz ove oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci sadrže konkretni CDR kada je data aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona datog antitela.
TABELA A. Definicije CDR<1>
<1>Numeracija svih definicija CDR-a u Tabeli A je u skladu sa konvencijama o numeraciji koje su izradili Kabat et al (vidite dole).
<2>„AbM” sa malim slovom „b”, kao što se koristi u Tabeli A, se odnosi na regione CDR kao što je definisano pomoću softvera za modelovanje „AbM” antitela centra Oxford Molecular.
Kabat et al su takođe definisali sistem numerisanja za sekvence varijabilnih regiona koji je primenljiv na bilo koje antitelo. Lice standardne stručnosti iz ove oblasti može nedvosmisleno da primeni ovaj sistem „Kabatove numeracije” na svaku sekvencu varijabilnog regiona, ne oslanjajući se ni na kakve eksperimentalne podatke osim na same sekvence. U smislu ovog dokumenta, „Kabatova numeracija” se odnosi na sistem numeracije koji su postavili Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, „Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983). Ako nije drugačije naglašeno, reference na numeraciju specifičnih položaja aminokiselinskih ostataka u varijabilnom regionu antitela su prema Kabatovom sistemu numeracije.
Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. CDR takođe sadrže „ostatke koji određuju specifičnost”, ili „SDR”, koji su ostaci koji stupaju u kontakt sa antigenom. SDR se nalaze u okviru regiona CDR koje se nazivaju skraćeni CDR, ili a-CDR. Primeri a-CDR regiona (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 i a-CDR-H3) dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 31-34 kod L1, 50-55 kod L2, 89-96 kod L3, 31-35B kod H1, 50-58 kod H2 i 95-102 kod H3. (Vidite Almagro i Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008).) Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su numerisani prema radu Kabat et al, supra.
Kako se ovde koristi, termin „afinitetno zreli” u kontekstu molekula koji vezuju antigen (npr. antitela) odnosi se na molekul koji vezuje antigen koji je izveden iz referentnog molekula koji vezuje antigen, npr. mutacijom, vezuje se za isti antigen, poželjno se vezuje za isti epitop, kao referentno antitelo; i ima veći afinitet prema antigenu od referentnog molekula koji vezuje antigen. Afinitetno sazrevanje generalno podrazumeva modifikaciju jednog ili više aminokiselinskih ostataka u jednom ili više CDR-ova molekula koji vezuje antigen. Tipično, afinitetno zreli molekul koji vezuje antigen vezuje se za isti epitop kao i molekul koji vezuje antigen iz početne reference.
„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
„Okvir humanog akceptora” je za ovde navedene svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano u nastavku. Humani akceptorski okvir „dobijen od” humanog imunoglobulinskog okvira ili humanog konsenzusnog okvira može da sadrži istu aminokiselinsku sekvencu kao i ova dva okvira, ili može da sadrži izmene u aminokiselinskoj sekvenci. U nekimrealizacijama, broj aminokiselinskih izmena je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekimrealizacijama, VL humani akceptorski okvir je po sekvenci identičan sekvenci VL humanog imunoglobulinskog okvira ili humanog konsenzusnog okvira.
Termin „himerno” antitelo ukazuje na antitelo u kome je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.
„Klasa” antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se α, δ, ε, γ i μ.
„Humanizovano” antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od ne-humanih HVR-ova i aminokiselinske ostatke od humanih FR-ova. U određenimrealizacijama, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR-ovi (npr. CDR-i), odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR-ovi, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik” antitela, npr. nehumanog antitela, odnosi se na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju. Drugi oblici „humanizovanih antitela” obuhvaćenih ovim pronalaskom su oni u kojima je konstantni region dodatno modifikovan ili promenjen u odnosu na onaj od originalnog antitela, da bi se generisale karakteristike u skladu sa pronalaskom, posebno u vezi sa vezivanjem C1q i/ili vezivanjem Fc receptora (FcR).
„Humano” antitelo je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija ili ono dobijeno iz ne-humanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla.
Termin „Fc domen” ili „Fc region” se ovde koristi da definiše C-terminalni region teškog lanca antitela koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. IgG Fc region sadrži IgG CH2 i IgG CH3 domen. „CH2 domen” humanog IgG Fc regiona tipično se proteže od aminokiselinskog ostatka na približno položaju 231 do aminokiselinskog ostatka na približno položaju 340. U jednoj realizaciji, lanac ugljenih hidrata je povezan sa CH2 domenom. Ovde CH2 domen može biti CH2 domen nativne sekvence ili varijanta CH2 domena. „CH3 domen” obuhvata delove ostatka C-terminala u domenu CH2 u Fc regionu (tj. iz aminokiselog ostatka približno na položaju 341 na aminokiselinski ostatak približno na položaju 447 IgG). CH3 region ovde može biti CH3 domen nativne sekvence ili varijanta CH3 domena (npr. CH3 domen sa uvedenom „izbočinom” („dugme”) u jednom lancu i odgovarajućom uvedenom „šupljinom” („rupica”) u drugom lancu; vidi US patent br. 5,821,333, koji je ovde izričito uključen referencom). Ovakve varijante CH3 domena se mogu koristiti za promovisanje heterodimerizacije dva neidentična teška lanca antitela, kako je ovde opisano. U jednoj realizaciji, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, na C-terminalnom kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje ostataka aminokiselina u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se takođe zove EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sekvence proteina od interesa za imunologiju), 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Tehnologija „dugme u rupici” opisana je npr. u US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Po pravilu, ova metoda podrazumeva uvođenje izbočine („dugme”) na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine („rupice”) na interfejsu drugog polipetida, tako da se izbočina može uklopiti u šupljinu da bi se podstaklo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Izbočine su napravljene zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Odgovarajuće šupljine, iste ili slične veličine kao izbočine, stvaraju se na interfejsu drugog
4
polipeptida, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjim (npr. alaninom ili treoninom). Izbočina i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za lokaciju, ili sintezom peptida. U jednom specifičnom aspektu modifikacija dugmeta sadrži aminokiselinsku supstituciju T366W u jednom od dve podjedinice Fc domena, a modifikacija rupice sadrži aminokiselinske supstitucije T366S, L368A i Y407V u drugoj od dve podjedinice Fc domena. U još jednoj specifičnoj realizaciji, podjedinica Fc domena koja sadrži modifikaciju dugmeta dodatno sadrži aminokiselinsku supstituciju S354C, a podjedinica Fc domena koja sadrži modifikaciju rupice, dodatno sadrži aminokiselinsku supstituciju Y349C. Uvođenje ova dva ostatka cisteina dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc regiona, što dodatno stabilizuje dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)). Numeracija je prema EU indeksu čiji su autori Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
„Region ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina” nameravano uključuje prirodno postojeće alelne varijante Fc regiona imunoglobulina, kao i varijante koje imaju izmene koje izazivaju supstitucije, adicije ili uklanjanja, ali koje ne smanjuju značajno sposobnost imunoglobulina da posreduje u efektorskim funkcijama (kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela). Na primer, jedna ili više aminokiselina može se ukloniti sa N-kraja ili C-kraja Fc regiona imunoglobulina bez značajnog gubitka biološke funkcije. Takve varijante se mogu odabrati prema opštim pravilima poznatim u struci, tako da imaju minimalan efekat na aktivnost (vidi, npr., Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)).
Termin „efektorske funkcije” ukazuje na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: Vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), sekreciju citokina, preuzimanje antigena posredstvom imunskog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjenje regulacije površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor) i aktivaciju B ćelija.
„Aktivirajući Fc receptor” je Fc receptor koji nakon angažovanja Fc regiona antitela izaziva signalizirajuće događaje koji stimulišu receptorsku ćeliju da obavlja efektorske funkcije. Aktivirajući Fc receptori uključuju FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) i FcαRI (CD89). Određeni aktivirajući Fc receptor je humani FcγRIlIa (pogledati UniProt pristupni br. P08637, verzija 141).
Termin „član TNF familije liganda” ili „ligand iz TNF familije” se odnosi na proinflamatorni citokin. Citokini uopšte, a posebno članovi TNF familije liganda, igraju presudnu ulogu u stimulisanju i koordinaciji imunskog sistema. Trenutno je identifikovano devetnaest citokina kao članova superfamije TNF liganda (faktora nekroze tumora) na osnovu sekvence, funkcionalnih i strukturnih sličnosti. Svi ovi ligandi su transmembranski proteini tipa II sa C-terminalnim ekstracelularnim domenom (ektodomen), N-terminalnim intracelularnim domenom i jednim transmembranskim domenom. C-terminalni ekstracelularni domen, poznat kao homologi domen TNF (THD), ima 20-30% identičnost aminokiselina između članova superfamilije, i odgovoran je za vezivanje na receptor. TNF-ektodomen je odgovoran i za to da TNF ligandi formiraju trimerne komplekse koji se prepoznaju po svojim specifičnim receptorima.
Članovi TNF familije liganda izabrani su iz grupe koja se sastoji od limfotoksina α (takođe poznatog i kao LTA ili TNFSF1), TNF (koji se takođe naziva TNFSF2), LTb (poznat i kao TNFSF3), OX40L (poznat i kao TNFSF4), CD40L (poznat i kao CD154 ili TNFSF5), FasL (poznat i kao CD95L, CD178 ili TNFSF6), CD27L (poznat i kao CD70 ili TNFSF7), CD30L (poznat i kao CD153 ili TNFSF8), 4-1BBL (poznat i kao TNFSF9), TRAIL (poznat i kao APO2L, CD253 ili TNFSF10), RANKL (poznat i kao CD254 ili TNFSF11), TWEAK (poznat i kao TNFSF12), APRIL (poznat i kao CD256 ili TNFSF13), BAFF (poznat i kao CD257 ili TNFSF13B), LIGHT (poznat i kao CD258 ili TNFSF14), TL1A (poznat i kao VEGI ili TNFSF15), GITRL (poznat i kao TNFSF18), EDA-A1 (poznat i kao ektodisplazin A1) i EDA-A2 (poznat i kao ektodisplazin A2). Termin se odnosi na bilo koji nativni ligand iz TNF familije iz bilo kojeg izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi), primata koji nisu ljudi (npr. majmuni cinomolgus) i glodara (npr. miševi i pacovi), osim ako nije drugačije naznačeno. U specifičnimrealizacijama pronalaska, član TNF familije liganda izabran je iz grupe koja se sastoji od OX40L, FasL, CD27L, TRAIL, 4-1BBL, CD40L i GITRL. U posebnoj realizaciji, član TNF familije liganda je odabran od 4-1BBL i OX40L.
Dodatne informacije, posebno sekvence, članova TNF familije liganda mogu se dobiti iz javno dostupnih baza podataka, kao što je Uniprot (www.uniprot.org). Na primer, humani TNF ligandi imaju sledeće aminokiselinske sekvence: humani limfotoksin α (UniProt pristupni br. P01374, SEQ ID NO:34), humani TNF (UniProt pristupni br. P01375, SEQ ID NO:35), humani limfotoksin β (UniProt pristupni br. Q06643, SEQ ID NO:36), humani OX40L (UniProt pristupni br. P23510, SEQ ID NO:37), humani CD40L (UniProt pristupni br. P29965, SEQ ID NO:38), humani FasL (UniProt pristupni br. P48023, SEQ ID NO:39), humani CD27L (UniProt pristupni br. P32970, SEQ ID NO:40), humani CD30L (UniProt pristupni br. P32971, SEQ ID NO:41), 4-1BBL (UniProt pristupni br. P41273, SEQ ID NO:42), TRAIL (UniProt pristupni br. P50591, SEQ ID NO:43), RANKL (UniProt pristupni br. O14788, SEQ ID NO:44), TWEAK (UniProt pristupni br. O43508, SEQ ID NO:45), APRIL (UniProt pristupni br. O75888, SEQ ID NO:46), BAFF (UniProt pristupni br. Q9Y275, SEQ ID NO:47), LIGHT (UniProt pristupni br. O43557, SEQ ID NO:48), TL1A (UniProt pristupni br. O95150, SEQ ID NO:49), GITRL (UniProt pristupni br. Q9UNG2, SEQ ID NO:50) i ektodisplazin A (UniProt pristupni br. Q92838, SEQ ID NO:51).
„Ektodomen” je domen membranskog proteina koji se proteže u vanćelijski prostor (tj. prostor izvan ciljne ćelije). Ektodomeni su tipično delovi proteina koji iniciraju kontakt sa površinama, što dovodi do transdukcije signala. Ektodomen člana TNF familije liganda, kako je ovde definisano, odnosi se na deo proteina TNF liganda koji se proteže u vanćelijski prostor (ekstracelularni domen), ali takođe uključuje kraće delove ili njihove fragmente koji su odgovorni za trimerizaciju i za vezivanje za odgovarajući TNF receptor. Izraz „ektodomen člana TNF familije liganda ili njegov fragment” se odnosi na ekstracelularni domen člana TNF familije liganda koji formira ekstracelularni domen ili na njegove delove koji su još uvek sposobni da se vežu za receptor (domen koji vezuje receptor).
Termin „kostimulatorni član TNF familije liganda” ili „kostimulatorni ligand iz TNF familije” odnosi se na podgrupu članova TNF familije liganda koji mogu da kostimulišu proliferaciju i proizvodnju citokina T-ćelija. Ovi ligandi iz TNF familije mogu da kostimulišu TCR signale nakon interakcije sa njihovim odgovarajućim receptorima TNF, a interakcija sa njihovim receptorima dovodi do regrutovanja faktora povezanih sa TNFR (TRAF), koji pokreću signalne kaskade koje dovode do aktivacije T-ćelija. Kostimulatorni ligandi iz TNF familije odabrani su iz grupe koja se sastoji od 4-1BBL, OX40L, GITRL, CD70, CD30L i LIGHT, tačnije kostimulatorni član TNF familije liganda izabran je od 4-1BBL i OX40L.
Kao što je prethodno opisano ovde, 4-1BBL je transmembranski protein tipa II i jedan član TNF familije liganda. Opisano je da 4-1BBL kompletne ili pune dužine koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 42 formira trimere na površini ćelija. Formiranje trimera je omogućeno specifičnim motivima ektodomena od 4-1BBL. Navedeni motivi su ovde označeni kao „region trimerizacije”. Aminokiseline 50-254 sekvence humanog 4-1BBL (SEQ ID NO: 52) formiraju ekstracelularni domen 4-1BBL, ali čak i njegovi fragmenti mogu formirati trimere. U specifičnim realizacijama pronalaska, termin „ektodomen 4-1BBL ili njegov fragment” odnosi se na polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:4 (aminokiseline 52-254 humanog 4-1BBL), SEQ ID NO: 1 (aminokiseline 71-254 humanog 4-1BBL), SEQ ID NO:3 (aminokiseline 80-254 humanog 4-1BBL) i SEQ ID NO:2
4
(aminokiseline 85-254 humanog 4-1BBL) ili polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:96 (aminokiseline 71-248 humanog 4-1BBL), SEQ ID NO:375 (aminokiseline 52-248 humanog 4-1BBL), SEQ ID NO:374 (aminokiseline 80-248 humanog 4-1BBL) i SEQ ID NO:373 (aminokiseline 85-248 humanog 4-1BBL), ali su takođe uključeni i ostali fragmenti ektodomena koji mogu da se trimerizuju.
Kao što je prethodno opisano, OX40L je drugi transmembranski protein tipa II i drugi član TNF familije liganda. Humani OX40L kompletne ili pune dužine ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 37. Aminokiseline 51-183 sekvence humanog OX40L (SEQ ID NO: 53) formiraju ekstracelularni domen OX40L, ali čak i njegovi fragmenti mogu formirati trimere. U specifičnimrealizacijama ovog pronalaska, termin „ektodomen OX40L ili njegov fragment” odnosi se na polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO:53 (aminokiseline 51-183 humanog OX40L) ili SEQ ID NO: 54 (aminokiseline 52-183 humanog OX40L), ali su ovde uključeni i drugi fragmenti ektodomena koji su sposobni za trimerizaciju.
Termin „peptidni linker” se odnosi na peptid koji sadrži jednu ili više aminokiselina, tipično oko 2 do 20 aminokiselina. Peptidni linkeri su poznati u struci ili su ovde opisani. Odgovarajući neimungeni peptidni linkeri su, na primer, G4S)n(SG4)nili G4(SG4)npeptidni linkeri, pri čemu je „n” obično broj između 1 i 10, obično između 1 i 4, naročito 2, tj. peptidi izabrani iz grupe koja se sastoji od (SEQ ID NO:
ali takođe
NO:58),
(SEQ ID NO:65). Peptidni linkeri od posebnog interesa su (G4S)1ili (SEQ ID NO: 128), (G4S)2ili
konkretnije (G4S)2ili
Termin „aminokiselina”, kako se koristi u okviru ove primene, označava grupu prirodno prisutnih karboksi α-aminokiselina koje sadrže alanin (troslovni kod: ala, jednoslovni kod: A), arginin (arg, R), asparagin (asn, N), asparaginsku kiselinu (asp, D), cistein (cys, C), glutamin (gln, Q), glutaminsku kiselinu (glu, E), glicin (gly, G), histidin (his, H), izoleucin (ile, I), leucin (leu, L), lizin (lys, K), metionin (met, M), fenilalanin (phe, F), prolin (pro, P) serin (ser, S), treonin (thr, T), triptofan (trp, W), tirozin (tyr, Y) i valin (val, V).
„Jednolančani fuzioni protein”, kako se ovde koristi, odnosi se na jednolančani polipeptid sastavljen od jednog ili dva ektodomena pomenutog člana TNF familije liganda spojenih sa delom antigen vezujuće grupe ili delom Fc. Fuzija se može dogoditi direktnim povezivanjem N ili C-terminalne aminokiseline antigen vezujuće grupe preko peptidnog linkera sa C- ili N-terminalnom aminokiselinom ektodomena navedenog člana TNF familije liganda.
Pod „spojenim” ili „povezanim” se podrazumeva da su komponente (npr. polipeptid i ektodomen pomenutog člana TNF familije liganda) povezane peptidnim vezama, bilo direktno ili preko jednog ili više peptidnih linkera.
„Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina” u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida (proteina) definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN. Softver SAWI ili Megalign (DNASTAR). Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali. U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem
4
programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinskih sekvenci A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinskih sekvenci B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.
U određenimrealizacijama, razmatraju se varijante sekvenci aminokiselina u ovde datim antigen vezujućim molekulima koji sadrže trimer TNF liganda. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke osobine antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer TNF liganda. Varijante aminokiselinskih sekvenci antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer TNF liganda mogu se dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira molekul, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanje, i/ili umetanje, i/ili supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija uklanjanja, ubacivanja i supstitucije može se napraviti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen vezujuće karakteristike. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i okvire (FR-ove). Konzervativne supstitucije su date u Tabeli B pod naslovom „Poželjne supstitucije”, i dalje su opisane u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina (1) do (6). Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u željeni molekul i proizvodi ispitani na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.
TABELA B
4
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca:
(1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, lle;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
Termin „varijante sekvenci aminokiselina” uključuje značajne varijante kod kojih postoje supstitucije aminokiselina u jednom ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antigen vezujućeg molekula (npr. humanizovano ili humano antitelo). Generalno, nastale varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matični antigen vezujući molekul i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antigen vezujućeg molekula. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti
4
stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan HVR ostatak ili više HVR ostataka je mutirano, i varijante antigen vezujućih molekula su izložene na fagu i ispitane u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja). U pojedinimrealizacijama, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se mogu desiti u jednom ili više HVR regiona, dokle god takve izmene u značajnoj meri ne umanjuju sposobnost antigen vezujućeg molekula da vezuje antigen. Na primer, u HVR regionima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje ne umanjuju znatno afinitet vezivanja. Korisni postupak za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu zove se „ciljana mutageneza sa alaninom”, a opisana je u radu Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U toj metodi, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao Arg, Asp, His, Lys i Glu) se identifikuju i zamene neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen–antigen vezujući molekul služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci obuhvataju spajanje amino- i/ili karboksi-terminalnog kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ostataka ili više, kao i ubacivanje u sekvencu jednog ili više aminokiselinskih ostataka. Primeri za terminalna umetanja uključuju antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sa N-terminalnim metionil ostatkom. Ostale varijante umetanja molekula uključuju fuziju sa N- ili C-krajem u polipeptid, što povećava poluživot u serumu antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije.
U nekimrealizacijama, ovde obezbeđeni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familijemenjaju se da bi povećali ili smanjili stepen glikozilacije antitela. Varijante glikozilacije molekula se mogu pogodno dobiti izmenom aminokiselinske sekvence, tako da jedno ili više mesta glikozilacije nastane ili se ukloni. Kada antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži Fc region, ugljeni hidrat koji je tu vezan se može izmeniti. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Videti npr. Wright et al TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da obuhvata različite
4
ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc na „bazi” biantenarne oligosaharidne strukture. U nekimrealizacijama, modifikacije oligosaharida u antigen vezujućem molekulu koji sadrži trimer liganda iz TNF familije mogu biti načinjene da bi se dobile varijante sa određenim poboljšanim svojstvima. U jednom aspektu, date su varijante antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije koje imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Takve varijante fukozilacije mogu poboljšati funkciju ADCC, vidi npr. US patentne publikacije br. US 2003/0157108 (Presta, L.) ili US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Dalje varijante antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iiz TNF familije iz pronalaska uključuju one sa bisektovanim oligosaharidima, npr., kod kojih je biantenarni oligosaharid povezan sa Fc regionom bisektovan pomoću GlcNAc. Takve varijante mogu imati smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu funkciju ADCC, vidite, na primer, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US patent br. 6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe su obezbeđene varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela bi mogle da poboljšaju funkciju CDC, i opisane su, npr. u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
U određenimrealizacijama može biti poželjno stvoriti varijante dizajnirane cisteinom antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska, npr., „tioMAb”, u kojima su jedan ili više ostataka molekula supstituisani ostacima cisteina. U određenimrealizacijama, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na molekulu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim delovima, kao što su funkcionalni delovi leka ili funkcionalni delovi linker-lek, da bi se dobio imunokonjugat. U pojedinimrealizacijama, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antigen vezujući molekuli projektovani sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u U.S. Patentu br.7,521,541.
U pojedinim aspektima, ovde dati antigen vezujući molekuli koji sadrži trimer liganda iz TNF familije se mogu dalje modifikovati da sadrže dodatne neproteinske ostatke koji su poznati u struci i dostupni su. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon,
4
poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, kopolimere polipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju se može odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati, i da li će derivat bispecifičnog antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd. U drugom aspektu, obezbeđeni su konjugati antitela i neproteinski ostatak koji se mogu selektivno zagrevati izlaganjem radijaciji. U jednomrealizaciji, neproteinski ostatak je ugljenična nanocevčica (Kam, N.W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Radijacija može biti na bilo kojoj talasnoj dužini, i uključuje, ali nije ograničena na talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski ostatak na temperaturu na kojoj ćelije u blizini neproteinskog ostatka antitela bivaju ubijene.
U još jednom aspektu, mogu se dobiti imunokonjugati ovde datih antigen vezujućih molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije. „Imunokonjugat” je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterologih molekula, uključujući, bez ograničenja, citotoksični agens.
Termin „polinukleotid” se odnosi na izolovani molekul ili konstrukt nukleinske kiseline, npr. informacionu RNK (mRNK), viralno dobijenu RNK ili plazmidnu DNK (pDNK). Polinukleotid može sadržati konvencionalnu vezu fosfodiestra ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što je pronađeno u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK). Termin „molekul nukleinske kiseline” se odnosi na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. fragmente DNK ili RNK, prisutne u polinukleotidu.
Pod „izolovanim” molekulom nukleinske kiseline ili polinukleotidom podrazumeva se molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog izvornog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid sadržan u vektoru smatra se izolovanim u svrhe predmetnog pronalaska. Dalji primeri izolovanog polinukleotida uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterologim ćelijama domaćina ili prečišćene (delimično ili suštinski) polinukleotide u rastvoru. Izolovani polinukleotid uključuje molekul polinukleotida koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul polinukleotida, ali je molekul polinukleotida prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro transkripte RNK, iz predmetnog pronalaska, kao i pozitivne i negativne lančane forme, i dvolančane forme. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku dalje uključuju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu biti ili mogu uključiti regulatorni element kao što je promoter, mesto vezivanja ribozoma ili terminator transkripcije.
Za nukleinsku kiselinu ili polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu, na primer, najmanje 95% „identičnu” referentnoj nukleotidnoj sekvenci iz predmetnog pronalaska, predviđeno je da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci, osim što polinukleotidna sekvenca može uključivati do pet tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom najmanje 95% identičnom referentnoj sekvenci nukleotida, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti uklonjeno ili supstituisano drugim nukleotidom, ili broj nukleotida do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti ubačen u referentnu sekvencu. Te izmene referentne sekvence mogu se desiti na 5' ili 3' terminalnim mestima referentne sekvence nukleotida ili bilo gde između tih terminalnih mesta, pojedinačno razbacane između ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa u referentnoj sekvenci. U praktičnom smislu, pomoću poznatih kompjuterskih programa (npr. ALIGN-2), kao što su oni gorenavedeni za polipeptide, može na konvencionalan način odrediti da li je neka konkretna polinukleotidna sekvenca najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci iz predmetnog pronalaska.
Termin „ekspresiona kaseta” se odnosi na polinukleotid generisan rekombinantno ili sintetički, sa nizom specifičnih elemenata nukleinske kiseline koji omogućavaju transkripciju određene nukleinske kiseline u ciljnu ćeliju. Rekombinantna ekspresiona kaseta može se inkorporirati u plazmid, hromozom, mitohondrijsku DNK, plastidnu DNK, virus ili fragment nukleinske kiseline. Tipično, deo rekombinantne ekspresione kasete ekspresionog vektora sadrži, između ostalih sekvenci, sekvencu nukleinske kiseline koja se transkribuje i promoter. U određenimrealizacijama, ekspresiona kaseta prema predmetnom pronalasku sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule iz ovog pronalaska ili njihove fragmente.
Termin „vektor” ili „ekspresioni vektor” je sinonim za „ekspresioni konstrukt” i odnosi se na molekul DNK koji se koristi za uvođenje i usmeravanje ekspresije specifičnog gena na koji je operativno povezan u ciljanu ćeliju. Ovaj termin obuhvata vektor kao
1
samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Ekspresioni vektor iz predmetnog pronalaska sadrži ekspresionu kasetu. Ekspresioni vektori omogućavaju transkripciju velikih količina stabilne mRNK. Kada se ekspresioni vektor nađe unutar ciljne ćelije, molekul ribonukleinske kiseline ili protein koji je kodiran tim genom proizvodi se pomoću mehanizma ćelijske transkripcije i/ili translacije. U jednoj realizaciji, ekspresioni vektor iz pronalaska sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule iz pronalaska ili njihove fragmente.
Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelije domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, u koje spadaju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji. Ćelija domaćin je bilo koja vrsta ćelijskog sistema koji se može koristiti za dobijanje bispecifičnih antigen vezujućih molekula iz ovog pronalaska. Ćelije domaćini uključuju uzgajane ćelije, npr. uzgajane ćelije sisara, takve su CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mišjeg mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, ćelije kvasaca, ćelije insekata i biljne ćelije, da navedemo samo nekoliko, ali i ćelije koje se nalaze u transgenoj životinji, transgenoj biljci ili uzgajenom biljnom ili životinjskom tkivu.
„Efikasna količina” agensa se odnosi na količinu koja je neophodna da bi se dovelo do fiziološke promene u ćeliji ili tkivu na koji se primenjuje.
„Terapeutski efikasna količina” agensa, npr. farmaceutskog preparata, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Terapeutski efikasna količina agensa na primer eliminiše, smanjuje, odlaže, minimizuje ili sprečava štetne efekte bolesti.
„Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i primate koji nisu ljudi, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). Konkretno, pojedinac ili ispitanik je čovek.
Termin „farmaceutski preparat” se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti
2
primenjena.
„Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens” se odnosi na sastojak farmaceutskog preparata koji nije aktivni sastojak i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens uključuje, ali nije ograničen na pufer, stabilizator ili konzervans.
Termin „uputstvo za upotrebu” koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.
Kako se ovde koristi, „lečenje” (i njegovi izvedeni oblici, kao što je „lečiti”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, a može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje stope napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekimrealizacijama, molekuli predmetnog pronalaska se primenjuju da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
Termin „kancer”, kao što se ovde koristi, odnosi se na proliferativne bolesti, uključujući limfome, karcinom, limfom, blastom, sarkom, leukemiju, limfocitne leukemije, kancer pluća, nemikrocelularni kancer pluća (NSCL), bronhioalveolarni ćelijski kancer pluća, kancer kostiju, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kutani ili intraokularni melanom, kancer uterusa, kancer ovarijuma, rektalni kancer, kancer analnog regiona, kancer želuca, gastrični kancer, kolorektalni kancer (CRC), kancer pankreasa, kancer dojke, trostruko negativni kancer dojke, kancer uterusa, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom cerviksa, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodžkinovu bolest, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, kancer prostate, kancer bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, mezoteliom, hepatocelularni kancer, kancer žučnih puteva, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), tumore kičmenog stuba, gliom moždanog stabla, glioblastom multiforme, astrocitome, švanome, ependimone, meduloblastome, meningiome, karcinome skvamoznih ćelija, adenom hipofize i Juingov sarkom, melanom, multipli mijelom, kancer B ćelija (limfom), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), leukemiju vlasastih ćelija, hroničnu mijeloblastnu leukemiju, uključujući refraktorne verzije svih gorenavedenih kancera, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih kancera.
Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije Ovo otkriće pruža nove antigen vezujuće molekule koji sadrže trimer liganda iz TNF familije sa posebno povoljnim svojstvima, kao što su produktivnost, stabilnost, afinitet vezivanja, biološka aktivnost, efikasnost ciljanja i smanjena toksičnost.
U prvom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment.
U posebnom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment, i
(c) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju. U posebnom aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije obuhvata (a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment, pri čemu član TNF familije liganda kostimuliše aktivaciju humanih T-ćelija.
U drugom posebnom aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži (a) najmanje jedan ostatak koji je sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije i
(b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF
4
familije liganda ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment, pri čemu su ektodomeni člana TNF familije liganda identični u svim slučajevima.
U daljem aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što
(i) prvi polipeptid sadrži CH1 ili CL domen i drugi polipeptid sadrži CL, odnosno CH1 domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njegove fragmente koji su povezani međusobno i sa CH1 ili CL domenom peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegovog fragmenta povezan peptidnim linkerom sa CL ili CH1 domenom navedenog polipeptida, ili
(ii) prvi polipeptid sadrži CH3 domen, i drugi polipeptid sadrži CH3 domen, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente koji su povezani međusobno i sa C-krajem CH3 domena peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment povezan preko peptidnog linkera sa C-krajem CH3 domena navedenog polipeptida, ili
(iii) prvi polipeptid sadrži VH-CL ili VL-CH1 domen i drugi polipeptid sadrži VL-CH1 domen, odnosno VH-CL domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njegove fragmente koji su povezani međusobno i sa VH ili VL peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegovog fragmenta povezan peptidnim linkerom sa VL ili VH navedenog polipeptida.
U posebnom aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži člana TNF familije liganda koji kostimuliše aktivaciju humane T-ćelije koja je odabrana između 4-1BBL i OX40L. Konkretnije, član TNF familije liganda je 4-1BBL.
U drugom aspektu, ektodomen člana TNF familije liganda sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375, naročito aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:96. U jednom aspektu, ektodomen člana TNF familije liganda ili njegov fragment sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:96, naročito aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:96. U posebnom aspektu, ektodomen člana TNF familije liganda ili njegov fragment sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96.
U daljem aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 i SEQ ID NO:99, i to što drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4. U posebnom aspektu, prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97 i drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:96.
U jednom aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu antigen vezujući molekul karakterište to što prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i to što drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6.
U daljem aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, i to što drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 183.
U još daljem aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu antigen vezujući molekul karkateriše to što prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97, i to što drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184 ili SEQ ID NO: 185.
U drugom aspektu, član TNF familije liganda je OX40L. U posebnom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu ektodomen člana TNF familije liganda sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53 ili SEQ ID NO:54, posebno aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53.
U jednom aspektu, otkriće se odnosi na antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 371 ili SEQ ID NO:372 i to što drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53, odnosno SEQ ID NO: 54.
U jednom aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, (b) prvi polipeptid koji sadrži CH1 ili CL domen, odnosno drugi polipeptid koji sadrži CL ili CH1 domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena,
i pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente koji su povezani međusobno i sa CH1 ili CL domenom peptidnim linkerom i to što drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment povezan peptidnim linkerom sa CL ili CH1 domenom navedenog polipeptida.
U jednom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, (b) prvi polipeptid koji sadrži CH1 domen, i drugi polipeptid koji sadrži CL domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena,
i pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente koji su povezani međusobno i sa CH1 domenom peptidnim linkerom i to što drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment povezan peptidnim linkerom sa CL domenom navedenog polipeptida.
U drugom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, (b) prvi polipeptid koji sadrži CL domen, i drugi polipeptid koji sadrži CH1 domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena,
i pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente koji su povezani međusobno i sa CL domenom peptidnim linkerom i to što drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment povezan peptidnim linkerom sa CH1 domenom navedenog polipeptida.
U drugom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije i
(b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment.
U još jednom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda izi TNF familije koji obuhvata
(a) više od jednog ostatka sposobnog za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment povezan peptidnim linkerom sa navedenim polipeptidom.
U jednom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) dva ostatka sposobna za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije i
(b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment.
U posebnom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom,
pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži CH3 domen, i drugi polipeptid sadrži CH3 domen, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente koji su povezani međusobno i sa C-krajem CH3 domena peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment povezan preko peptidnog linkera sa C-krajem CH3 domena navedenog polipeptida. Konkretno, takav antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži dva ostatka sposobna za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije.
U jednom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) dva ostatka sposobna za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije i
(b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom,
pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment,
pri čemu se dva ostatka sposobna za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije vezuju za dva različita antigena ciljne ćelije.
U daljem aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kako je ovde prethodno definisano, pri čemu je ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije izabran iz grupe koja se sastoji od antitela, fragmenta antitela i skeletnog proteina koji vezuje antigen.
U jednom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kako je ovde prethodno definisano, pri čemu je ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije izabran iz grupe koja se sastoji od fragmenta antitela, Fab molekula, krosover Fab molekula, jednolančanog Fab molekula, Fv molekula, scFv molekula, antitela sa jednim domenom, aVH i skeletnog proteina koji vezuje antigen. U jednom aspektu, ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije je aVH ili skeletni protein koji vezuje antigen. U jednom aspektu, ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije je skeletni protein koji vezuje antigen sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije.
Konkretno, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži jedan ili dva ostatka sposobna za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije.
U posebnom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je jedinica sposobna za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije Fab molekul ili ukršteni Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije. Konkretno, ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije je Fab sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije.
U daljem aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je peptid koji sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente međusobno povezane prvim peptidnim linkerom fuzionisan na svom C-terminusu sa CH1 domenom teškog lanca drugim peptidnim linkerom, i pri čemu je jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment fuzionisan na svom C-terminusu sa CL domenom na lakom lancu trećim peptidnim linkerom.
U drugom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je peptid koji sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente međusobno povezane prvim peptidnim linkerom fuzionisan na svom C-terminusu sa CL domenom teškog lanca drugim peptidnim linkerom, i pri čemu je jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment fuzionisan na svom C-terminusu sa CH1 domenom na lakom lancu trećim peptidnim linkerom.
U daljem aspektu, otkriće se bavi antigen vezujućim molekulom koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je peptid koji sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente međusobno povezane prvim peptidnim linkerom fuzionisan na svom C-terminusu sa CL domenom lakog lanca drugim peptidnim linkerom, i pri čemu je jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment fuzionisan na svom C-terminusu sa CH1 domenom teškog lanca trećim peptidnim linkerom.
U posebnom aspektu, otkriće se odnosi na antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kao što je gore definisano, pri čemu je peptidni linker (G4S)2. U jednom aspektu, prvi peptidni linker je (G4S)2(SEQ ID NO: 13), drugi peptidni linker je (SEQ ID NO:57), a treći peptidni linker je (G4S)2(SEQ ID NO: 13.). Posebno, pronalazak se odnosi na antigen vezujući molekul koji sadrži trimer TNF liganda kao što je gore definisano, pri čemu je prvi peptidni linker (G4S)2(SEQ ID NO: 13), drugi peptidni linker je (G4S)2(SEQ ID NO: 13), a treći peptidni linker je (G4S)2(SEQ ID NO: 13.).
U drugom aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kao što je prethodno gore definisano sadrži Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilno povezivanje.
Konkretno, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži (a) molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, pri čemu je teški lanac Fab spojen na C-kraju sa N-krajem CH2 domena u Fc domenu i (c) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju.
U daljem aspektu, Fc domen je IgG, konkretno Fc domen IgG1 ili Fc domen IgG4. Konkretnije, Fc domen je Fc domen IgG1. U jednom konkretnom aspektu, Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše asocijaciju prve i druge podjedinice Fc domena.
Modifikacije Fc domena koje smanjuju vezivanje Fc receptora i/ili efektorsku funkciju
Fc domen antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije sastoji se od para polipeptidnih lanaca koji sadrže domene teškog lanca molekula imunoglobulina. Na primer, Fc domen molekula imunoglobulina G (IgG) je dimer, čija svaka podjedinica sadrži konstantne domene IgG teškog lanca CH2 i CH3. Dve podjedinice Fc domena su sposobne za stabilno povezivanje jedne sa drugom.
Fc domen daje antigen vezujućim molekulima iz pronalaska povoljne farmakokinetičke osobine, uključujući i dug poluživot u serumu, koji doprinosi dobroj akumulaciji u ciljnom tkivu i povoljnom odnosu distribucije tkivo-krv. Istovremeno, to može dovesti do nepoželjnog ciljanja bispecifičnih antitela iz pronalaska na ćelije koje eksprimiraju Fc receptore, a ne na željene ćelije koje nose antigene. U skladu sa tim, u posebnim aspektima, Fc domen antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska ispoljava smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju u odnosu na Fc domen nativnog IgG1. U jednom aspektu, Fc se suštinski ne vezuje za Fc receptor i/ili ne indukuje efektorsku funkciju. U posebnom aspektu, Fc receptor je Fcγ receptor. U jednom aspektu, Fc receptor je humani Fc receptor. U specifičnom aspektu, Fc receptor je aktivirajući humani Fcγ receptor, konkretnije humani FcγRIIIa, FcγRI ili FcγRIIa, najkonkretnije humani FcγRIIIa. U jednom aspektu, Fc domen ne indukuje efektorsku funkciju. Smanjena efektorska funkcija može da obuhvata, ali nije ograničena na, jedno ili više od sledećeg: smanjenu komplement zavisnu citotoksičnost (CDC), smanjenu ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), smanjenu ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), smanjenu sekreciju citokina, smanjeno preuzimanje antigena posredstvom imunskog kompleksa od
1
strane antigen-prezentujućih ćelija, smanjeno vezivanje za NK ćelije, smanjeno vezivanje za makrofage, smanjeno vezivanje za monocite, smanjeno vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, smanjenu direktnu signalizaciju koja indukuje apoptozu, smanjenu zrelost dendritskih ćelija, ili smanjen prajming T ćelija.
U određenim aspektima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region ovde obezbeđenog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. humani Fc region IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više mesta aminokiselina.
U posebnom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment, i
(c) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju, pri čemu Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za Fc receptor, posebno za Fcγ receptor.
U jednom aspektu, Fc domen antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje smanjuju afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. Najčešće su jedna ili više aminokiselinskih mutacija prisutne u svakoj od dve podjedinice Fc domena. Konkretno, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji E233, L234, L235, N297, P331 i P329 (EU numeracija). Konkretno, Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije na pozicijama 234 i 235 (EU numeracija) i/ili 329 (EU numeracija) teških lanaca IgG. Konkretnije, obezbeđen je trimerni antigen vezujući molekul koji sadrži ligand iz TNF familije prema pronalasku koji sadrži Fc domen sa aminokiselinskim supstitucijama L234A, L235A i P329G („P329G LALA”, EU numeracija) u teškim lancima IgG. Supstitucije aminokiselina L234A i L235A odnose se na takozvanu LALA mutaciju. „P329G LALA” kombinacija aminokiselinskih supstitucija skoro potpuno ukida vezivanje Fcγ receptora za Fc domen humanog IgG1, kako je opisano u Međunarodnoj patentnoj prijavi Publ. br. WO 2012/130831 A1 koja takođe opisuje postupke za pripremu takvih mutantnih Fc domena i postupke za određivanje njihovih
2
svojstava, kao što su vezivanje za Fc receptore ili efektorske funkcije. „EU numeracija” se odnosi na numeraciju prema EU indeksu čiji su autori Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Fc domeni sa redukovanim vezivanjem Fc receptora i/ili efektorskom funkcijom uključuju one sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc domena 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br.6,737,056). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).
U drugom aspektu, Fc domen je Fc domen IgG4. IgG4 antitela pokazuju smanjen vezujući afinitet prema Fc receptorima i smanjene efektorske funkcije u poređenju sa IgG1 antitelima. U konkretnijem aspektu, Fc domen je Fc domen IgG4 koji sadrži aminokiselinsku supstituciju u položaju S228 (Kabatova numeracija), konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P. U specifičnijem aspektu, Fc domen je Fc domen IgG4 koji sadrži aminokiselinske supstitucije L235E i S228P i P329G (EU numeracija). Takvi mutantni Fc domeni IgG4 i njihova svojstva vezivanjag Fc receptora su takođe opisani u WO 2012/130831.
Mutantni Fc domeni se mogu pripremiti uklanjanjem, supstitucijom, umetanjem ili modifikacijom aminokiselina, uz upotrebu genetičkih ili hemijskih metoda dobro poznatih u struci. Genetički postupci mogu obuhvatiti mutagenezu specifičnu za mesto kodiranja DNK sekvence, PCR, sintezu gena i slično. Tačne promene nukleotida mogu se potvrditi, na primer, sekvenciranjem.
Vezivanje za Fc receptore se može lako odrediti npr. testom ELISA ili površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) upotrebom standardnih instrumentata kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare), a takvi Fc receptori se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom. Ovde je opisan takav pogodan vezujući test. Alternativno, afinitet vezivanja Fc domena ili bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju ćelije koji sadrže Fc domen za Fc receptore može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju određene Fc receptore, kao što su NK ćelije koje eksprimiraju FcγIIIa receptor.
Efektorska funkcija Fc domena, ili bispecifičnih antitela iz pronalaska koja sadrže Fc domen, može se izmeriti postupcima poznatim u struci. Ovde je opisan pogodan test za merenje ADCC-a. Drugi primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. patentu br. 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) i Hellstrom et al, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); US Patent br. 5,821,337; Bruggemann et al, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativno, za testove mogu da se koriste neradioaktivni postupci (pogledajte, na primer, ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); i CytoTox 96® neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula se može odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je objavljeno u Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
U nekimrealizacijama, vezivanje Fc domena za komponentu komplementa, posebno za C1q, je smanjeno. U skladu sa tim, u nekimrealizacijama, kada je Fc domen konstruisan da ima smanjenu efektorsku funkciju, pomenuta smanjena efektorska funkcija uključuje smanjeni CDC. Testovi vezivanja C1q se mogu obaviti da bi se utvrdilo da li su bispecifična antitela iz pronalaska sposobna da vezuju C1q i stoga imaju CDC aktivnost. Videti, npr. ELISA test C1q i C3c vezivanja u WO 2006/029879 i WO 2005/100402. Da bi se ocenila aktivacija komplementa, može se izvesti CDC test (videti, npr. Gazzano-Santoro et al, J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al, Blood 101, 1045-1052 (2003); i Cragg i Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).
U jednom konkretnom aspektu, Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše asocijaciju prve i druge podjedinice Fc domena.
Modifikacije Fc domena koje podstiču heterodimerizaciju
U jednom aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije obuhvata (a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom, i to što drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment i (c) Fc domen sačinjen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju, pri čemu Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstituicija koje smanjuju vezivanje za Fc receptor, naročito za Fcγ receptor. Tako, oni sadrže različite ostatke, spojene sa jednom ili drugom od dve podjedinice Fc domena koje su tipično sadržane u dva neidentična polipetidna lanca („teški lanci”). Rekombinantna koekspresija ovih polipeptida i naknadna dimerizacija dovode do nekoliko mogućih kombinacija dva polipeptida. Da bi se poboljšao prinos i čistoća antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije u rekombinantnoj proizvodnji, biće korisno da se u Fc domen antigen vezujućih
4
molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska uvede modifikacija koja promoviše povezivanje željenih polipeptida.
Shodno tome, Fc domen antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska sadrži modifikaciju koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena. Mesto najveće proteinsko-proteinske interakcije između dve podjedinice Fc domena humanog IgG nalazi se u CH3 domenu Fc domena. Tako, navedena modifikacija je posebno u CH3 domenu Fc domena.
U jednom posebnom aspektu, pomenuta modifikacija je takozvana modifikacija „dugme u rupici”, koja sadrži modifikaciju „dugmeta” u jednoj od dve podjedinice Fc domena i modifikaciju „rupice” u drugoj od dve podjedinice Fc domena. Stoga se, u posebnom aspektu, pronalazak odnosi na antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji je ovde prethodno opisan, a koji sadrži molekul IgG, pri čemu Fc deo prvog teškog lanca sadrži prvi modul za dimerizaciju i Fc deo drugog teškog lanca sadrži drugi modul za dimerizaciju koji omogućava heterodimerizaciju dva teška lanca molekula IgG, i prvi modul za dimerizaciju sadrži dugmad, a drugi modul za dimerizaciju sadrži rupice prema tehnologiji dugmeta u rupici.
Tehnologija „dugme u rupici” je opisana npr. u US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Po pravilu, ova metoda podrazumeva uvođenje izbočine („dugme”) na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine („rupice”) na interfejsu drugog polipetida, tako da se izbočina može uklopiti u šupljinu da bi se podstaklo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Izbočine su napravljene zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Odgovarajuće šupljine, iste ili slične veličine kao izbočine, stvaraju se na interfejsu drugog polipeptida, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjim (npr. alaninom ili treoninom).
U skladu sa tim, u posebnom aspektu, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska, aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice koja može da se pozicionira u šupljinu unutar CH3 domena druge podjedinice, i u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena aminokiselinski ostatak je zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina unutar CH3 domena druge podjedinice unutar koje izbočina unutar CH3 domena prve podjedinice može da se pozicionira.
Izbočina i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za lokaciju, ili sintezom peptida.
U specifičnom aspektu, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena, treoninski ostatak na poziciji 366 zamenjen je triptofanskim ostatkom (T366W), i u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, tirozinski ostatak na poziciji 407 zamenjen je valinskim ostatkom (Y407V). Konkretnije, u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je treoninski ostatak na poziciji 366 zamenjen serinskim ostatkom (T366S) i leucinski ostatak na poziciji 368 je zamenjen alaninskim ostatkom (L368A). Još konkretnije, u prvoj podjedinici Fc domena, dodatno je serinski ostatak na poziciji 354 zamenjen cisteinskim ostatkom (S354C), i u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je tirozinski ostatak na poziciji 349 zamenjen cisteinskim ostatkom (Y349C). Uvođenje ova dva cisteinska ostatka dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc domena. Disulfidni most dalje stabilizuje dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
U alternativnom aspektu, modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena sadrži modifikaciju koja posreduje u elektrostatičkim efektima upravljanja, na primer, kao što je opisano u publikaciji PCT WO 2009/089004. Po pravilu, ovaj postupak podrazumeva zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka na interfejsu dve podjedinice Fc domena naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, tako da formiranje homodimera postaje elektrostatički nepovoljno, a heterodimerizacija elektrostatički povoljna.
Modifikacije u CH1/CL domenima
Da bi se dodatno poboljšalo ispravno uparivanje, antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije mogu sadržati supstitucije različito naelektrisanih aminokiselina (tzv. „naelektrisani ostaci”). Ove modifikacije se uvode u ukrštene ili neukrštene CH1 i CL domene. U posebnom aspektu, pronalazak se odnosi na antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je u jednom CL domenu aminokiselina na položaju 123 (EU numeracija) zamenjena argininom (R) i aminokiselina na položaju 124 (EU numeracija) je supstituisana lizinom (K), i pri čemu su u jednom od CH1 domena aminokiseline na položaju 147 (EU numeracija) i na položaju 213 (EU numeracija) zamenjene glutaminskom kiselinom (E).
Konkretnije, pronalazak se odnosi na antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je u CL domenu koji je susedan članu TNF familije liganda aminokiselina na poziciji 123 (EU numeracija) zamenjena argininom (R) i aminokiselina na poziciji 124 (EU numeracija) je supstituisana lizinom (K), i pri čemu su u CH1 domenu koji je susedan članu TNF familije liganda aminokiseline na poziciji 147 (EU numeracija) i na poziciji 213 (EU numeracija) supstituisane glutaminskom kiselinom (E).
Posebni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije U drugom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
prvi teški lanac i prvi laki lanac, pri čemu oba sadrže molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije,
prvi peptid koji sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente međusobno povezane prvim peptidnim linkerom fuzionisan na svom C-terminusu preko drugog peptidnog linkera sa drugim teškim ili lakim lancem,
i drugi peptid koji obuhvata jedan ektodomen pomenutog člana TNF familije liganda spojenog na svom C-terminusu sa trećim peptidnim linkerom sa drugim lakim, odnosno teškim lancem.
U daljem aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je prvi peptid koji sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente međusobno povezane prvim peptidnim linkerom fuzionisan na svom C-terminusu sa drugim peptidnim linkerom sa CH1 domenom koji je deo teškog lanca, i drugi peptid koji sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment je fuzionisan na svom C-terminusu sa trećim peptidnim linkerom sa CL domenom koji je deo lakog lanca.
U još jednom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je prvi peptid koji sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente međusobno povezane prvim peptidnim linkerom fuzionisan na svom C-terminusu sa drugim peptidnim linkerom sa CL domenom koji je deo teškog lanca,
i drugi peptid koji sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment je fuzionisan na svom C-terminusu sa trećim peptidnim linkerom sa CH1 domenom koji je deo lakog lanca.
U daljem aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je prvi peptid koji sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente međusobno povezane prvim peptidnim linkerom fuzionisan na svom C-terminusu sa drugim peptidnim linkerom sa VH domenom koji je deo teškog lanca,
i drugi peptid koji sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment je fuzionisan na svom C-terminusu sa trećim peptidnim linkerom sa VL domenom koji je deo lakog lanca.
U jednom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je u CL domenu koji je susedan članu TNF familije liganda aminokiselina na poziciji 123 (EU numeracija) zamenjena argininom (R) i aminokiselina na poziciji 124 (EU numeracija) je supstituisana lizinom (K), i pri čemu su u CH1 domenu koji je susedan članu TNF familije liganda aminokiseline na poziciji 147 (EU numeracija) i na poziciji 213 (EU numeracija) supstituisane glutaminskom kiselinom (E). Ove modifikacije dovode do takozvanih naelektrisanih ostataka sa povoljnim svojstvima kojima se izbegavaju neželjeni efekti, kao što je, na primer, pogrešno uparivanje.
Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je antigen ciljne ćelije CD19
U posebnom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je antigen ciljne ćelije CD19.
U jednom aspektu, pronalazak pruža antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu ostatak sposoban za specifično vezivanje za CD19 sadrži VH domen koji sadrži (i) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 195 ili SEQ ID NO:252, (ii) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 196 ili SEQ ID NO:253, i (iii) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 197 ili SEQ ID NO:254, i VL domen koji sadrži (iv) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 198 ili SEQ ID NO:249, (v) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 199 ili SEQ ID NO:250, i (vi) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:200 ili SEQ ID NO:251.
U posebnom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska, pri čemu je ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD19 i sadrži VH domen koji obuhvata (i) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 195, (ii) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 196, i (iii) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 197 i VL domen koji sadrži (iv) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 198 (v) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 199 i (vi) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:200.
U daljem aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu je ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19 i sadrži VH domen koji obuhvata (i) CDR-H1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252, (ii) CDR-H2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:253 i (iii) CDR-H3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:254, i VL domen koji obuhvata (iv) CDR-L1 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:249, (v) CDR-L2 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:250 i (vi) CDR-L3 koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:251.
U drugom aspektu, ostatak sposoban da se specifično vezuje za CD19 sadrži varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:201 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:202.
U daljem aspektu, ostatak sposoban da se specifično vezuje za CD19 sadrži varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:357 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:358.
U jednom aspektu, ostatak sposoban za specifično vezivanje za CD19 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201 i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202 ili pri čemu ostatak sposoban za specifično vezivanje za CD19 sadrži varijabilni teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357 i varijabilni laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358.
U konkretnom aspektu, ostatak sposoban za specifično vezivanje za CD19 sadrži varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202. U drugom konkretnom aspektu, ostatak sposoban za specifično vezivanje za CD19 sadrži varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358.
U drugom aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202, i
(b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 i SEQ ID NO:99, i to što drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4.
U posebnom aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202, i
(b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97, i to što drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96.
U drugom aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358, i
(b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 i SEQ ID NO:99, i to što drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4.
U posebnom aspektu, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358, i
(b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97, i to što drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96.
U drugom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
prvi teški lanac i prvi laki lanac, pri čemu oba sadrže molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije,
drugi teški lanac koji obuhvata dva ektodomena članova TNF familije liganda ili njihove fragmente povezane međusobno prvim peptidnim linkerom koji je na svom C-kraju spojen drugim peptidnim linkerom sa CH1 domenom, i drugi laki lanac koji obuhvata jedan ektodomen pomenutog člana TNF familije liganda ili njegov fragment spojen je na njegovom C-terminusu trećim peptidnim linkerom na CL domenu, i pri čemu antigen vezujući molekul sadrži
(i) prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202, ili
prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358,
(ii) drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO:111 i SEQ ID NO: 113, i
(iii) drugi laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO: 112 i SEQ ID NO:114.
U daljem posebnom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
prvi teški lanac i prvi laki lanac, pri čemu oba sadrže molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije,
drugi teški lanac koji obuhvata dva ektodomena članova TNF familije liganda ili njihove fragmente povezane međusobno prvim peptidnim linkerom koji je na svom C-kraju spojen drugim peptidnim linkerom sa CL domenom, i drugi laki lanac koji obuhvata jedan ektodomen pomenutog člana TNF familije liganda ili njegov fragment spojen je na njegovom C-terminusu sa trećim peptidnim linkerom na CH1 domenu, i pri čemu antigen vezujući molekul sadrži
(i) prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202, ili
prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358,
(ii) drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 i SEQ ID NO: 173, i
1
(iii) drugi laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 i SEQ ID NO: 174.
Nadalje, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata
(a) najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom,
pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži CH3 domen, i drugi polipeptid sadrži CH3 domen, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njihove fragmente koji su povezani međusobno i sa C-krajem CH3 domena peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment povezan preko peptidnog linkera sa C-krajem CH3 domena navedenog polipeptida.
U posebnom aspektu, takav antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije sadrži dva ostatka sposobna za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije.
Konkretnije, takav antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije obuhvata
(i) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:209, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:210, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, ili
(ii) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:213, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:214, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, ili
(iii) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:310, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279, ili
(iv) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:313, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:314, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, izabran iz grupe koja se sastoji od:
a) molekula koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:205, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 116;
2
b) molekula koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:205, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118;
c) molekula koji obuhvata dva laka lanca koji obuhvataju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206, prvi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 209 i drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 210;
d) molekula koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:205, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120;
e) molekula koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:205, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174; i
f) molekula koji obuhvata dva laka lanca koji obuhvataju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206, prvi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 213 i drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 214.
Konkretno, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:205, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120.
U drugom aspektu, otkriće se odnosi na antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, izabran iz grupe koja se sastoji od:
a) molekula koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 116;
b) molekula koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 117, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118;
c) molekula koji obuhvata dva laka lanca koji obuhvataju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 358, prvi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 209 i drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 210;
d) molekula koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120;
e) molekula koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174; i
f) molekula koji obuhvata dva laka lanca koji obuhvataju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 358, prvi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 213, i drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 214.
Konkretno, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120.
Polinukleotidi
Otkriće dalje obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, kao što je ovde opisano, ili njegov fragment.
Izolovani polinukleotidi koji kodiraju antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije mogu da se eksprimiraju kao jedan polinukleotid koji kodira ceo antigen vezujući molekul, ili kao višestruki (npr. dva ili više) polinukleotidi koji su koeksprimirani. Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su koeksprimirani mogu se povezati, na primer, putem disulfidnih veza ili drugih sredstava, dajući funkcionalan antigen vezujući molekul. Na primer, deo lakog lanca imunoglobulina može biti kodiran zasebnim polinukleotidom iz dela teškog lanca imunoglobulina. Kad su koeksprimirani, teški lanac polipeptida će se povezati sa lakim lancem polipeptida kako bi formirali imunoglobulin.
U nekim aspektima, izolovani polinukleotid kodira ceo antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kao što je ovde opisano. Konkretno, izolovani polinukleotid kodira polipeptid sadržan u antigen vezujućem molekulu koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kao što je ovde opisano.
U jednom aspektu, predmetno otkriće je usmereno na izolovani polinukleotid koji
4
kodira antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, pri čemu polinukleotid sadrži (a) sekvencu koja kodira ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, (b) sekvencu koja kodira polipeptid koji sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom i (c) sekvencu koja kodira polipeptid koji sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment.
U drugom aspektu, obezbeđen je izolovani polinukleotid koji kodira antigen vezujući molekul koji sadrži trimer 4-1BB liganda, pri čemu polinukleotid sadrži (a) sekvencu koja kodira ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, (b) sekvencu koja kodira polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BBL ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom i (c) sekvencu koja kodira polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BBL ili njegov fragment.
U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja kodira polipeptid koji obuhvata dva fragmenta 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 90%, 95%, 98% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 96, i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira polipeptid koji obuhvata jedan fragment 4-1BBL koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 90%, 95%, 98% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je prikazana u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 96.
Nadalje, obezbeđen je izolovani polinukleotid koji kodira antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda OX40, pri čemu polinukleotid sadrži (a) sekvencu koja kodira ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, (b) sekvencu koja kodira polipeptid koji obuhvata dva ektodomena OX40L ili dva njegova fragmenta koji su međusobno vezani peptidnim linkerom i (c) sekvencu koja kodira polipeptid koji sadrži jedan ektodomen OX40L ili njegov fragment.
U drugom aspektu, obezbeđen je izolovani polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira polipeptid koji obuhvata dva fragmenta 4-1BBL koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 90%, 95%, 98% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO:53 ili SEQ ID NO:54, i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira polipeptid koji obuhvata jedan fragment 4-1BBL koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 90%, 95%, 98% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je prikazana u SEQ ID NO:53 ili SEQ ID NO:54.
U daljim aspektima, otkriće se odnosi na polinukleotide koji obuhvataju sekvencu koja je najmanje oko 90%, 95%, 98% ili 100% identična specifičnim sekvencama cDNK koje su ovde otkrivene. U određenom aspektu, pronalazak se odnosi na polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja je identična jednoj od specifičnih ovde otkrivenih sekvenci cDNK.
U drugim aspektima, molekul nukleinske kiseline sadrži ili se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu kako je data u bilo kom od SEQ ID NO: 5, 6, 97, 98, 99, 183, 184 ili 185. U sledećem aspektu, molekul nukleinske kiseline sadrži ili se sastoji od nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu kako je objavljeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 14, 15, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 173 ili 174.
U još nekim aspektima, molekul nukleinske kiseline sadrži ili se sastoji od nukleotidne sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 66, 67, 68, 69, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 137, 138, 141, 142, 143, 144, 146, 147, 150, 151, 152, 153, 162, 163, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 176, 177, 178, 203, 204, 207, 208, 211, 212, 215, 216, 273, 274, 277, 278, 281, 282, 285, 286, 289, 290, 293, 294, 297, 298, 301, 302, 305, 307, 308, 311, 312, 315, 316, 331, 332, 335, 336, 339, 340, 343, 344, 347, 348, 353 ili 354.
U određenim aspektima, polinukleotid ili nukleinska kiselina je DNK. U drugimrealizacijama, polinukleotid iz predmetnog pronalaska je RNK, na primer, u obliku informacione RNK (mRNK). RNK iz predmetnog pronalaska može biti jednolančana ili dvolančana.
Postupci rekombinacije
Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije iz ovog pronalaska mogu se dobiti, na primer, sintezom peptida u čvrstom stanju (npr. Merifildova sinteza u čvrstoj fazi) ili rekombinantnom proizvodnjom. Za rekombinantnu proizvodnju, jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije ili njegove polipeptidne fragmente, npr. kao što je gore opisano, izoluju se i ubacuju u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takav polinukleotid može biti lako izolovan i sekvenciran pomoću konvencionalnih procedura. U jednom aspektu pronalaska, obezbeđen je vektor, poželjno ekspresioni vektor, koji obuhvata jedan ili više polinukleotida iz pronalaska. Postupci koji su dobro poznati stručnim licima iz ove oblasti mogu se primeniti za konstrukciju ekspresionih vektora koji sadrže kodirajuću sekvencu antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije (fragment), uz odgovarajuće signale transkripcione/translacione kontrole. Ovi metodi uključuju in vitro rekombinacione DNK tehnike, tehnike za sintezu i in vivo rekombinaciju/genetičku rekombinaciju. Videti, na primer, tehnike opisane u Maniatiset al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N Y. (1989); i Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Ekspresioni vektor može biti deo plazmida, virusa, ili može biti fragment nukleinske kiseline. Ekspresioni vektor uključuje ekspresionu kasetu u koju je kloniran polinukleotid koji kodira antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije ili njegove polipeptidne fragmente (tj. kodirajući region) u operabilnoj asocijaciji sa promoterom i/ili drugim elementima kontrole transkripcije ili translacije. U smislu ovog dokumenta, „kodirajući region” je deo nukleinske kiseline koja se sastoji od kodona translatovanih u aminokiseline. Iako „stop kodon” (TAG, TGA ili TAA) nije translatovan u aminokiselinu, može se smatrati delom kodirajućeg regiona, ako je prisutan, ali sve ostale granične sekvence, kao što su promoteri, mesta vezivanja ribozoma, terminatori transkripcije, introni, 5' i 3' netranslatovane regije i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Dva ili više kodirajućih regiona mogu da se nalaze u jednom konstruktu polinukleotida, npr. u jednom vektoru ili u odvojenim konstruktima polinukleotida, npr. na odvojenim (različitim) vektorima. Štaviše, svaki vektor može da sadrži jedan kodirajući region ili može da sadrži dva ili više kodirajućih regiona, npr. vektor može da kodira jedan ili više polipeptida, koji su posttranslaciono ili kotranslaciono razdvojeni u krajnje proteine putem proteolitičkog cepanja. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina iz pronalaska mogu kodirati heterologe kodirajuće regione, spojene ili nespojene sa polinukleotidom koji kodira antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije ili njegove polipeptidne fragmente, ili njegove varijante ili derivate. Heterologni kodirajući regioni obuhvataju, bez ograničenja, specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen. Operabilna asocijacija se dešava kada se kodirajući region genskog proizvoda, npr. polipeptida, poveže sa jednom regulatornom sekvencom ili više regulatornih sekvenci, tako da postavi ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulatorne sekvence (ili sekvenci). Dva DNK fragmenta (kao što je kodirajući region polipeptida i asocirani promoter) su „funkcionalno povezani” ukoliko indukcija promoterske funkcije izaziva transkripciju mRNK koja kodira željeni genski proizvod i ako priroda veze između dva DNK fragmenta ne ometa sposobnost ekspresije regulatornih sekvenci da usmeravaju ekspresiju genskog proizvoda ili utiču na sposobnost transkripcije DNK obrasca. Stoga bi region promotera bio operabilno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid da je promoter sposoban za vršenje transkripcije te nukleinske kiseline. Promoter može da bude ćelijski specifičan promoter koji usmerava značajnu transkripciju DNK samo u predodređenim ćelijama. Drugi elementi koji kontrolišu transkripciju, pored promotera, na primer pojačivači, operatori, represori i signali okončanja transkripcije, mogu operabilno da se povežu sa polinukleotidom radi usmeravanja transkripcije specifične za određene ćelije.
Ovde su opisani odgovarajući promoteri i drugi regioni koje kontrolišu transkripciju. Veliki broj regiona koji kontrolišu transkripciju poznat je stručnim licima iz ove oblasti. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, regione koji kontrolišu transkripciju, i koji funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, bez ograničenja, segmenti za promociju i pojačavanje iz citomegalovirusa (npr. momentalni rani promoter u konjukciji sa intronom-A), virusa SV40 (npr. rani promoter) i retrovirusa (takav je, npr. Rausov sarkoma virus). Drugi regioni koji kontrolišu transkripciju obuhvataju one dobijene iz gena kičmenjaka, kao što su aktin, protein toplotnog stresa, goveđi hormon rasta i â-globin zeca, kao i druge sekvence sposobne za kontrolu ekspresije gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni odgovarajući regioni koji kontrolišu transkripciju uključuju promotere specifične za tkivo i pojačivače, kao i inducibilne promotere (npr. inducibilni promoteri tetraciklina). Slično tome, veliki broj elemenata koji kontrolišu translaciju poznat je stručnim licima iz ove oblasti. Ta grupa uključuje, bez ograničenja, mesta vezivanja ribozoma, kodone početka i kraja translacije i elemente dobijene iz viralnih sistema (naročito unutrašnje ribozomalno ulazno mesto ili IRES, poznato i kao CITE sekvenca). Transporter ekspresije može da sadrži i druge karakteristike kao što je mesto početka replikacije i/ili elemente integracije hromozoma, kao što su duga terminalna ponavljanja retrovirusa (LTR) ili invertovana terminalna ponavljanja (ITR) adenoasociranih virusa (AAV).
Kodirajući regioni polinukleotida i nukleinske kiseline iz predmetnog pronalaska mogu biti asocirani sa dodatnim kodirajućim regionima koji kodiraju sekretorne ili signalne peptide, koji usmeravaju sekreciju polipeptida kodiranih od strane polinukleotida iz predmetnog pronalaska. Na primer, ako je poželjna sekrecija antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, DNK koja kodira signalnu sekvencu može biti postavljena ushodno od nukleinske kiseline koja kodira antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz ovog pronalaska ili njegove polipeptidne fragmente. U skladu sa hipotezom signala, proteini koji se luče putem ćelija sisara imaju signalni peptid ili sekretornu vodeću sekvencu koja je isečena iz zrelog proteina nakon što je započet izvoz rastućeg lanca proteina širom endoplazmatičnog retikuluma. Lica standardne stručnosti iz ove oblasti su upoznata s tim da polipeptidi izlučeni iz ćelija kičmenjaka po pravilu imaju signalni peptid spojen za N-terminalni kraj polipeptida, koji je isečen iz translatovanog polipeptida radi stvaranja sekretornog ili „zrelog” oblika peptida. U određenimrealizacijama, izvorni signalni peptid, npr. koristi se teški lanac imunoglobulina ili laki lanac signalnog peptida, ili funkcionalni derivat te sekvence koja zadržava sposobnost usmeravanja izlučivanja polipeptida s kojim je funkcionalno asocirana. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara ili njegov funkcionalni derivat. Na primer, vodeća sekvenca divljeg tipa se može supstituisati vodećom sekvencom aktivatora plazminogena u ljudskom tkivu (TPA) ili β-glukuronidaze miša.
DNK koja kodira kratku sekvencu proteina koja bi se mogla koristiti za olakšanje kasnijeg prečišćavanja (npr. histidinski rep) ili kao pomoć u obeležavanju fuzionog proteina može biti uključena unutar ili na krajevima antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska ili njegove polipeptidne fragmente.
U daljem aspektu pronalaska, obezbeđena je ćelija domaćin koja obuhvata jedan takav polinukleotid iz pronalaska ili više njih. U određenimrealizacijama, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži jedan vektor iz pronalaska ili više njih. Polinukleotidi i vektori mogu da sadrže bilo koju od karakteristika, pojedinačno ili u kombinaciji, kao što je ovde opisano u vezi sa polinukleotidima odnosno vektorima. U jednom aspektu, ćelija domaćin sadrži (npr. njime je transformisana ili transficirana) vektor koji obuhvata polinukleotid koji kodira antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije (ili njegov deo). Kao što je korišćen ovde, termin „ćelija domaćin” se odnosi na bilo koji ćelijski sistem koji može biti projektovan da proizvodi fuzione proteina predmetnog pronalaska ili njihove fragmente. Ćelije domaćini pogodne za replikaciju i podržavanje ekspresije antigen vezujućih molekula su dobro poznate u struci. Takve ćelije mogu da budu transfektovane ili transdukovane u skladu sa određenim ekspresionim vektorom, i velike količine ćelija koje sadrže vektor mogu se uzgajati za zasejavanje velikih fermentora za dobijanje dovoljnih količina antigen vezujućih molekula za kliničku primenu. Odgovarajuće ćelije domaćini sadrže prokariotske mikroorganizme, kao što je E. coli ili različite eukariotske ćelije, kao što su jajne ćelije kineskog hrčka (CHO), ćelije insekata i slično. Na primer, polipeptidi se mogu proizvesti u bakterijama, naročito kada nije neophodna glikozilacija. Nakon ekspresije, polipeptid može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, a može i dalje da se prečišćava. Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju polipeptid, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do stvaranja polipeptida sa delimično ili potpuno humanim glikozilacionim obrascem. Videti Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), i Li et al, Nat Biotech 24, 210-215 (2006).
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju (glikozilovanih) polipeptida se takođe izvode iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Videti npr. US patente br.
5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (gde se opisuje PLANTTBODIES™ tehnologija za proizvodnju antitela u transgenim biljkama). Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Druge primere korisnih ćelijskih linija domaćina sisara predstavlja CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); linija bubrega humanog embriona (ćelije 293 ili 293T, kao što opisuju npr. Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), Sertolijeve mišje ćelije (TM4 ćelije kao što opisuje npr. Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK), ćelije jetre pacova (BRL3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije (kao što opisuju npr. Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)); MRC5 ćelije i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući dhfr-CHO ćelije (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su YO, NS0, P3X63 i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju proteina, vidi, npr., Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str. 255-268 (2003). Ćelije domaćini obuhvataju gajene ćelije, između ostalog, gajene ćelije sisara, ćelije kvasca, ćelije insekata, bakterijske ćelije i biljne ćelije, ali i ćelije sadržane u transgenim životinjama, transgenim biljkama ili gajenom biljnom ili životinjskom tkivu. U jednomrealizaciji, ćelija domaćin je eukariotska ćelija, poželjno ćelija sisara, kao što je jajna ćelija kineskog hrčka (CHO), humana embrionska ćelija bubrega (HEK) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U struci su poznate standardne tehnologije za ekspresiju stranih gena u ovim sistemima. Ćelije koje eksprimiraju polipeptide sa teškim ili lakim lancem imunoglobulina, mogu se projektovati tako da takođe eksprimiraju druge lance imunoglobulina na takav način da je eksprimirani proizvod imunoglobulin koji poseduje teški i laki lanac.
U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za proizvodnju antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije ili njegovih polipeptidnih fragmenata, pri čemu postupak uključuje kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži polinukleotide koji kodiraju antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska ili njegove polipeptidne fragmente, kao što je ovde dato, pod uslovima pogodnim za ekspresiju antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz ovog pronalaska ili njegovih polipeptidnih fragmenata, i izolovanje antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz ovog pronalaska ili njegovih polipeptidnih fragmenata iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelije domaćina).
U antigen vezujućem molekulu koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska, komponente (najmanje jedan ostatak sposoban za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije, jedan polipeptid koji sadrži dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njegove fragmente, i polipeptid koji sadrži jedan ektodomen navedenog člana TNF familije liganda ili njegov fragment) nisu genetski međusobno fuzionisane. Polipeptidi su konstruisani tako da su njihove komponente (dva ektodomena člana TNF familije liganda ili njegovi fragmenti i druge komponente kao što su CH i CL) međusobno fuzionisane direktno ili putem sekvence linkera. Kompozicija i dužina linkera se može odrediti u skladu sa postupcima dobro poznatim u struci, i njihova efikasnost se može ispitati. Primeri za sekvence linkera između različitih komponenata antigen vezujućih molekula iz pronalaska nalaze se u ovde navedenim sekvencama. Dodatne sekvence se takođe mogu uključiti radi pripajanja mesta cepanja za odvajanje pojedinačnih komponenti fuzionog proteina, ako je potrebno, na primer sekvenca za prepoznavanje endopeptidaze.
U određenimrealizacijama, ostaci sposobni za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije (npr. fragmenti Fab) koji čine deo antigen vezujućeg molekula sadrže najmanje varijabilni region imunolobulina koji se može vezati za antigen. Varijabilni regioni mogu da formiraju deo, ili da budu derivati antitela koja se nalaze ili ne nalaze u prirodi, i njihovi fragmenti. Postupci stvaranja poliklonskih antitela i monoklonskih antitela dobro su poznati u struci (videti, npr. Harlow and Lane, „Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Antitela koja se ne nalaze u prirodi mogu se izgraditi pomoću sinteze peptida na čvrstoj podlozi, mogu se proizvesti rekombinacijom (npr. kao što je opisano u U.S. patentu br.4,186,567) ili se mogu dobiti, na primer, skriningom kombinatornih kolekcija koje sadrže varijabilne teške i lake lance (videti, npr. U.S. Patent. br.5,969,108 McCafferty).
Bilo koja vrsta životinjskog imunoglobulina može se koristiti u pronalasku. Neograničavajući imunoglobulini korisni u ovom pronalasku mogu biti mišjeg, od primata ili ljudskog porekla. Ako je fuzioni protein namenjen za ljudsku upotrebu, himerni oblik imunoglobulina može da se koristi kada su konstantni regioni imunoglobulina humani. Humanizovani ili potpuno humani oblik imunoglobulina takođe se može dobiti u skladu sa postupcima poznatim u struci (videti, npr. U.S. Patent br.5,565,332, Winter). Humanizacija se može postići različitim metodama, uključujući, bez ograničenja, (a) graftovanje nehumanih (npr. donorskih antitela) CDR u humani (npr. antitelo primalac) okvir i konstantne regione sa
1
zadržavanjem ili bez zadržavanja kritičnih ostataka okvira (npr. onih koji su važni za održavanje dobrog afiniteta za vezivanje antigena ili funkciju antitela), (b) graftovanje samo nehumanih regiona koji određuju specifičnost (SDR ili α-CDR; ostaci ključni za interakciju antitelo-antigen) na humani okvir i konstantne regione, ili (c) transplantacija čitavih nehumanih varijabilnih domena, koji se „prekrivaju” sekcijom nalik na humanu tako što se zamenjuju površinski ostaci. Humanizovana antitela i postupci njihovog dobijanja razmotreni su u npr. Almagro i Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008), i dalje su opisani, npr. u Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., ProcNatl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); US patentima br. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., ProcNatl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison i Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (opisuje SDR (a-CDR) graftovanje); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (opisuje „vraćanje na površinu”); Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (opisuje „FR mešanje”); i Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) i Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (opisuje pristup „vođene selekcije” FR mešanju). Posebni imunoglobulini prema pronalasku su humani imunoglobulini. Humana antitela i humani varijabilni regioni mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela načelno su opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) i Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Humani varijabilni regioni mogu da formiraju deo ili da budu izvedeni iz humanih monoklonskih antitela dobijenih metodom hibridoma (videti npr. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str.51–63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Humana antitela i humani varijabilni regioni se mogu dobiti i primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov (videti, npr. Lonberg, Nat Biotech 23, 1117–1125 (2005). Humana antitela i humani varijabilni regioni se takođe mogu generisati izolovanjem sekvenci varijabilnog regiona Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla (videti npr., Hoogenboom et al Methods in Molecular Biology 178, 1–37 (O’Brien et al, izdav., Human Press, Totowa, NJ, 2001); i McCafferty et al, Nature 348, 552–554; Clackson et al, Nature 352, 624–628 (1991)). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti.
U određenim aspektima, ostaci sposobni za specifično vezivanje za antigen ciljne ćelije (npr. fragmenti Fab) sadržani u antigen vezujućim molekulima predmetnog pronalaska konstruisani su tako da imaju poboljšan afinitet vezivanja, na primer, prema postupcima
2
objavljenim u PCT publikaciji WO 2012/020006 (videti primere koji se odnose na afinitetno sazrevanje) ili US Pat. Appl. Publ. br.2004/0132066. Sposobnost antigen vezujućih molekula iz pronalaska da se vezuju za specifičnu antigensku determinantu može da se meri pomoću testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili drugih tehnika poznatih stručnom licu, npr. tehnikom površinske plazmonske rezonance (Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Kompetitivni testovi se mogu koristiti za identifikovanje antigen vezujućeg molekula koji se takmiči sa referentnim antitelom u pogledu vezivanja za određeni antigen. U određenimrealizacijama, takav konkurentski antigen vezujući molekul se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezao referentni antigen vezujući molekul. Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antigen vezujući molekul dati su u: Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). U primeru kompetitivnog testa, imobilisani antigen je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvi obeleženi antigen vezujući molekul koji se vezuje za antigen i drugi neobeleženi antigen vezujući molekul, čija sposobnost takmičenja sa prvim antigen vezujućim molekulom u pogledu vezivanja za antigen se ispituje. Drugi antigen vezujući molekul može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani antigen je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvi obeleženi antigen vezujući molekul, ali ne i drugi neobeleženi antigen vezujući molekul. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za antigen, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani antigen u test-uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugi antigen vezujući molekul takmiči sa prvim antigen vezujućim molekulom u pogledu vezivanja za antigen. Videti Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual pogl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije iz ovog pronalaska pripremljeni u skladu sa ovde navedenim uputstvom mogu se prečistiti tehnikama poznatim u struci, kao što su tečna hromatografija visokih performansi, jonska hromatografija, gel elektroforeza, afinitetna hromatografija, gel hromatografija, i slično. Stvarni uslovi korišćeni za prečišćavanje određenog proteina delimično će zavisiti od faktora kao što su ukupno naelektrisanje, hidrofobnost, hidrofilnost itd. i biće jasni stručnim licima iz ove oblasti. Za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom se može koristiti antitelo, ligand, receptor ili antigen za koji se vezuje antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije. Na primer, za prečišćavanje afinitetnom hromatografijom fuzionih proteina iz predmetnog pronalaska koristi se matrica sa proteinom A ili proteinom G. Afinitetna hromatografija pomoću sekvencijalnog proteina A ili G i na molekulskim sitima mogu se koristiti za izolaciju antigen vezujućeg molekula onako kako je opisano u Primerima. Čistoća antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije ili njegovih fragmenata može se utvrditi različitim analitičkim metodama poznatim u struci, uključujući gel elektroforezu, tečnu hromatografiju pod visokim pritiskom, i slično. Na primer, pokazalo se da su antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije, eksprimirani kako je opisano u primerima, netaknuti i pravilno sastavljeni, što je pokazano redukujućom i neredukujućom SDS-PAGE.
Testovi
Ovde navedeni antigen vezujući molekuli mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.
1. Testovi za merenje afiniteta
Afinitet antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji je ovde obezbeđen za odgovarajući TNF receptor se može odrediti prema postupcima koji su navedeni u primerima pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR), upotrebom standardnih instrumenata kao što je instrument BIAcore (GE Healthcare), i receptore ili ciljne proteine, kakve je moguće dobiti rekombinantnom ekspresijom. Afinitet antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema antigenu ciljne ćelije se takođe može odrediti pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR), upotrebom standardnih instrumenata kao što je instrument BIAcore (GE Healthcare), i receptore ili ciljne proteine, kakve je moguće dobiti rekombinantnom ekspresijom. Specifični ilustrativan primer otelotvorenja za merenje afiniteta vezivanja opisan je u primeru 4. Prema jednom aspektu, KDse meri površinskom plazmonskom rezonancom pomoću mašine BIACORE® T100 (GE Healthcare) na 25 °C.
2. Testovi vezivanja i drugi testovi
Vezivanje ovde datog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije za odgovarajuće ćelije koje eksprimiraju receptor može se proceniti korišćenjem ćelijskih linija koje eksprimiraju konkretni receptor ili ciljni antigen, na primer protočnom citometrijom (FACS). U jednom aspektu, sveže mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) koje eksprimiraju TNF receptor koriste se u testu vezivanja. Ove ćelije se koriste neposredno nakon izolovanja (naivne PMBC) ili nakon stimulacije (aktivirane PMBC). U drugom aspektu, aktivirani mišji splenociti (koji eksprimiraju TNF receptorski molekul) korišćeni su da se pokaže vezivanje antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije za
4
odgovarajuće ćelije koje eksprimiraju TNF receptor.
U daljem aspektu, ćelijske linije kancera koje eksprimiraju antigen ciljne ćelije korišćene su da se pokaže vezivanje antigen vezujućih molekula za antigen ciljne ćelije.
U drugom aspektu, testovi konkurentnosti se mogu koristiti za identifikovanje antigen vezujućeg molekula koji se takmiči sa specifičnim antitelom ili antigen vezujućim molekulom u vezivanju na ciljni, odnosno TNF receptor. U pojedinimrealizacijama, takav konkurentski antigen vezujući molekul se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo specifično anti-ciljno antitelo ili specifično anti-TNF receptorsko antitelo. Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u: Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, u Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
3. Testovi za merenje aktivnosti
U jednom aspektu, obezbeđeni su testovi za identifikovanje antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije koji se vezuju za specifični antigen ciljne ćelije i za specifični TNF receptor koji ima biološku aktivnost. Biološka aktivnost može uključivati npr. agonističku signalizaciju putem TNF receptora na ćelijama koje eksprimiraju antigen ciljne ćelije. Obezbeđeni su i antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije za koje je pomoću testova utvrđeno da imaju takvu biološku aktivnost in vitro.
U određenim aspektima, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije je testiran na takvu biološku aktivnost. Testovi za detekciju biološke aktivnosti molekula ovog pronalaska su opisani u primeru 6. Nadalje, testovi za detekciju lize ćelija (npr. merenjem otpuštanja LDH), indukovane kinetike apoptoze (npr. merenjem aktivnosti kaspaze 3/7) ili apoptoze (npr. pomoću TUNEL testa) dobro su poznati u struci. Pored toga, biološka aktivnost takvih kompleksa može se odrediti procenom njihovih efekata na preživljavanje, proliferaciju i sekreciju limfokina različitih limfocitnih podskupova poput NK ćelija, NKT-ćelija ili γδ T-ćelija, ili procenom njihove sposobnosti da modulišu fenotip i funkciju antigen prezentujućih ćelije, kao što su dendritske ćelije, monociti/makrofagi ili B-ćelije.
Farmaceutske kompozicije, formulacije i načini primene
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže bilo koji od ovde datih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije, npr. za upotrebu u bilo kom od donjih terapeutskih postupaka. U jednomrealizaciji, farmaceutski preparat uključuje bilo koji od ovde datih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. U drugomrealizaciji, farmaceutski preparat uključuje bilo koji od ovde datih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je dole opisano.
Farmaceutski preparati sadrže terapeutski delotvornu količinu jednog ili više antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije rastvorenih ili dispergovanih u farmaceutski prihvatljivom ekscipijensu. Fraze „farmaceutski ili farmakološki prihvatljivo” odnose se na molekulske entitete i preparate koji su uglavnom netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, tj. ne dovode do neželjenih, alergijskih i drugih nepovoljnih reakcija kada se primene na životinjama, kao što je, na primer, čovek, po potrebi. Priprema farmaceutskog preparata koja sadrži najmanje jedan antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije i, opciono, dodatni aktivni sastojak, biće poznata stručnim licima u ovoj oblasti u smislu predmetnog pronalaska, kao što je objašnjeno u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd. Mack Printing Company, 1990, što se uključuje ovde referencom. Konkretno, preparati su liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori. Kao što se ovde koristi, termin „farmaceutski prihvatljivi ekscipijens” obuhvata bilo koje i sve rastvarače, pufere, disperzione agense, obloge, surfaktante, antioksidanse, konzervanse (npr. antibakterijske agense, antifungalne agense), izotonične agense, soli, stabilizatore i njihove kombinacije, kao što bi bilo poznato licu standardne stručnosti u ovoj oblasti.
Parenteralni preparati obuhvataju one namenjene primeni putem injekcija, npr. supkutano, intradermalno, intraleziono, intravenski, intraarterijski, intramuskularno, intratekalno ili intraperitonealno ubrizgavanje. U pogledu injekcija, antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije iz pronalaska mogu biti formulisani kao vodeni rastvori, poželjno fiziološki kompatibilni puferi, kao što je Henksov rastvor, Ringerov rastvor, ili puferizovani fiziološki rastvor. Rastvor može da sadrži agense za formulisanje, kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno, fuzioni proteini mogu da budu u obliku praha za mešanje sa odgovarajućim nosačem, npr. sterilnom nepirogenom vodom, pre upotrebe. Sterilni injektabilni rastvori su pripremljeni mešanjem fuzionih proteina iz pronalaska u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvoru sa različitim drugim dolenavedenim sastojcima, po potrebi. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Uglavnom, disperzije se pripremaju mešanjem različitih sterilnih aktivnih sastojaka u sterilnom nosaču koji sadrži osnovni disperzioni medijum i/ili druge sastojke. U slučaju sterilnog praha za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, suspenzija ili emulzija, poželjni postupak pripreme je vakuum sušenje ili liofilizacija, kojima se dobija prah aktivnog sastojka, kao i ostalih poželjnih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog tečnog medijuma. Tečni medijum treba da bude odgovarajuće puferisan, ako je potrebno, a tečni diluent izotoničan pre ubrizgavanja sa odgovarajućom količinom soli ili glukoze. Kompozicija treba da bude stabilna u uslovima stvaranja i čuvanja, izolovana od kontaminirajućeg uticaja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Poželjno je da kontaminacija endotoksinom bude svedena na minimalni bezbedni nivo, na primer, manje od 0,5 ng/mg proteina. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil paraben ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinil pirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Suspenzije za vodene injekcije mogu da sadrže jedinjenja koja povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, dekstran, i slično. Po potrebi, suspenzija može da sadrži i odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja i omogućavaju pripremu visokokoncentrovanih rastvora. Takođe, suspenzije aktivnih sastojaka mogu se pripremiti u obliku odgovarajućih injekcija uljane suspenzije. Odgovarajući lipofilni rastvarači ili vehikulumi obuhvataju masna ulja, kao što su susamovo ulje ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil oleati ili trigliceridi ili lipozomi.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su prikazane u Remington's Pharmaceutical Sciences (18. izd. Mack Printing Company, 1990). Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem obuhvataju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže polipeptid, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule. U posebnom primeru otelotvorenja, prolongirana apsorpcija kompozicije za ubrizgavanje može se izazvati upotrebom u kompozicijama agensa za odlaganje apsorpcije, kao što su aluminijum monostearat, želatin ili njihove kombinacije.
Primeri farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa ovde dalje obuhvataju agense za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Pojedini primeri za sHASEGP i postupke primene, uključujući rHuPH20, opisani su u US Patent Publication br.2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Primeri liofilizovanih formulacija antitela opisani su u US Patentu br. 6,267,958. Vodene formulacije antitela obuhvataju one opisane u US Patentu br. 6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Pored prethodno opisanih preparata, fuzioni proteini se mogu formulisati i kao depo preparat. Takve dugodelujuće formulacije mogu se primeniti implantacijom (na primer, supkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Zato se, na primer, fuzioni proteini mogu formulisati sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim supstancama (na primer, kao emulzija u odgovarajućem ulju) ili jonoizmenjivačkim smolama, ili kao slabo rastvorljivi derivati, na primer, kao slabo rastvorljiva so.
Farmaceutski preparati koji sadrže fuzione proteine predmetnog pronalaska mogu se proizvesti pomoću konvencionalnih postupaka mešanja, rastvaranja, emulgovanja, inkapsuliranja ili liofilizacije. Farmaceutsi preparati mogu biti formulisane na konvencionalne načine pomoću jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, diluenata, ekscipijenasa ili dodatnih sredstava koja olakšavaju obradu proteina u preparate koji se mogu koristiti u farmaceutske svrhe. Pravilna formulacija zavisi od izabranog načina primene.
Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije mogu se formulisati u preparat u obliku slobodne kiseline ili baze, u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su soli koje zadržavaju značajnu biološku aktivnost slobodne kiseline ili baze. U njih spadaju kisele adicione soli, npr. one formirane sa slobodnim amino grupama proteinske kompozicije ili one formirane sa neorganskom kiselinom kao što je, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organskim kiselinama poput sirćetne, oksalne, vinske ili bademove kiseline. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu se dobiti iz neorganskih baza, kao što su: natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksid, ili organskih baza, kao što je izopropilamin, trimetilamin, histidin ili prokain. Farmaceutske soli uglavnom budu rastvorljivije u vodi i drugim protičnim rastvaračima od odgovarajućih oblika slobodnih baza.
Preparat ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
Terapeutski metodi i preparati
Bilo koji od antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije koji su ovde obezbeđeni može se koristiti u terapeutskim metodima.
Za upotrebu u terapeutskim metodima, ovde opisani antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije formulišu se, doziraju i primenjuju na način u skladu sa dobrom medicinskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto na koje se agens daje, metod davanja, raspored davanja i drugi faktori poznati lekarima.
U jednom aspektu, obezbeđeni su antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije koji se koriste kao lek. U daljim aspektima, obezbeđeni su antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije za upotrebu u lečenju bolesti, posebno za upotrebu u lečenju kancera. U određenim aspektima, obezbeđeni su antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije koji se koriste za određeni metod lečenja. U jednom aspektu, otkriće obezbeđuje antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U određenim aspektima, bolest koja se leči je kancer. Primeri kancera uključuju solidne tumore, kancer bešike, karcinom bubrežnih ćelija, kancer mozga, kancer glave i vrata, kancer pankreasa, kancer pluća, kancer dojke, kancer jajnika, kancer materice, kancer grlića materice, kancer endometrijuma, kancer jednjaka, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, kancer rektuma, kancer želuca, kancer prostate, kancer krvi, kancer kože, kancer skvamoznih ćelija, kancer kostiju i kancer bubrega, melanom, B-ćelijski limfom, B-ćelijsku leukemiju, ne-Hodžkinov limfom i akutnu limfoblastnu leukemiju. Shodno tome, obezbeđuje se antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kako je ovde opisan za lečenje kancera. Ispitanik, pacijent ili „pojedinac” kome treba lečenje tipično je sisar, konkretnije čovek.
U drugom aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kako je ovde opisan za upotrebu u lečenju zaraznih bolesti, posebno za lečenje virusnih infekcija. U daljem aspektu, obezbeđen je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kako je ovde opisan za upotrebu u lečenju autoimunih bolesti, kao što je, na primer, lupus.
U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije u proizvodnji ili pripremi leka za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U jednom aspektu, lek je namenjen za upotrebu u metodi lečenja bolesti koja podrazumeva davanje pojedincu koji ima bolest terapeutski efikasne količine leka. U određenimrealizacijama, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj, konkretno kancer. Shodno tome, u jednom aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije u proizvodnji ili pripremi leka za lečenje kancera. Primeri kancera uključuju solidne tumore, kancer bešike, karcinom bubrežnih ćelija, kancer mozga, kancer glave i vrata, kancer pankreasa, kancer pluća, kancer dojke, kancer jajnika, kancer materice, kancer grlića materice, kancer endometrijuma, kancer jednjaka, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, kancer rektuma, kancer želuca, kancer prostate, kancer krvi, kancer kože, karcinom skvamoznih ćelija, kancer kostiju i kancer bubrega, melanom, B-ćelijski limfom, B-ćelijsku leukemiju, ne-Hodžkinov limfom i akutnu limfoblastnu leukemiju. Stručno lice razume da u mnogim slučajevima antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije možda neće obezbediti lek, već samo delimično olakšanje. U nekim aspektima, fiziološka promena koja ima određene koristi takođe se smatra terapeutski korisnom. Stoga, u nekim aspektima, količina antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obezbeđuje fiziološku promenu smatra se „efikasnom količinom” ili „terapeutski efikasnom količinom”.
U daljem aspektu, otkriće se odnosi na upotrebu antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije kako je ovde opisan u proizvodnji ili pripremi leka za lečenje zaraznih bolesti, posebno za lečenje virusnih infekcija ili za lečenje autoimunih bolesti, na primer lupusa.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agensa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, načina primene, telesne težine pacijenta, vrste fuzionog proteina, težine i toka bolesti, da li se fuzioni protein primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, od prethodne ili istovremene terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na fuzioni protein i odluke nadležnog lekara. Lekar zadužen za primenu, u svakom slučaju, određuje koncentraciju aktivnih sastojaka u kompoziciji i odgovarajuću dozu (odgovarajuće doze) za svakog ispitanika. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko količina od 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr. 0,1 mg/kg-10 mg/kg) antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, bilo kao jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza fuzionog proteina navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,005 mg/kg do oko 10 mg/kg. U drugim primerima, doza može da sadrži i od oko 1 µg/kg telesne težine, oko 5 µg/kg telesne težine, oko 10 µg/kg telesne težine, oko 50 µg/kg telesne težine, oko 100 µg/kg telesne težine, oko 200 µg/kg telesne težine, oko 350 µg/kg telesne težine, oko 500 µg/kg telesne težine, oko 1 mg/kg telesne težine, oko 5 mg/kg telesne težine, oko 10 mg/kg telesne težine, oko 50 mg/kg telesne težine, oko 100 mg/kg telesne težine, oko 200 mg/kg telesne težine, oko 350 mg/kg telesne težine, oko 500 mg/kg telesne težine, do oko 1000 mg/kg telesne težine ili više po primeni, i svaki raspon dobijen iz toga. U primerima raspona dobijenih iz ovde navedenih brojeva, može se primeniti raspon od oko 5 mg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 5 μg/kg telesne težine do oko 500 μg/kg telesne težine, itd. na osnovu gore opisanih brojeva. Stoga se jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može dati pacijentu. Takve doze se mogu primenjivati povremeno, npr., svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od približno dve do približno dvadeset ili npr. približno šest doza fuzionog proteina). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije će se generalno koristiti u količini koja je efikasna za postizanje željene svrhe. Za primenu u lečenju ili prevenciji stanja bolesti, antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije ili njihove farmaceutske kompozicije, daju se ili primenjuju u terapeutski efikasnoj količini. Određivanje terapeutski efikasne količine poznato je stručnim licima iz ove oblasti, naročito u smislu ovog detaljnog obrazloženja.
U pogledu sistemske primene, terapeutski efikasna doza se može inicijalno proceniti
1
putem in vitro testova, kao što su testovi na ćelijskoj kulturi. Zatim doza može biti formulisana prema životinjskom modelu kako bi se dostigao raspon koncentracija u krvotoku koji uključuje IC50, kao što je utvrđeno kulturom ćelija. Takve informacije mogu da se koriste za preciznije utvrđivanje korisnih doza za ljude.
Inicijalne doze mogu se takođe proceniti na osnovu in vivo podataka, npr. životinjskih modela, uz pomoć tehnika koje su dobro poznate u struci. Lice standardne stručnosti iz ove oblasti može brzo da optimizuje davanje leka ljudima na osnovu podataka o životinjama.
Doza i interval primene se mogu pojedinačno podesiti kako bi se obezbedili nivoi antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije u plazmi koji su dovoljni za održavanje terapeutskog dejstva. Uobičajena doza primene za pacijente putem injekcija ima raspon od oko 0,1 mg/kg/dan do 50 mg/kg/dan, tipično od oko 0,5 mg/kg/dan do 1 mg/kg/dan. Terapeutski efikasni nivoi plazme mogu se dostići primenom višestrukih doza svakog dana. Nivoi u plazmi mogu se meriti, na primer, HPLC hromatografijom.
U slučajevima lokalne primene ili selektivnog unosa, efikasna lokalna koncentracija antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije ne mora da bude u vezi sa koncentracijom u plazmi. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da optimizuju terapeutski efikasnu lokalnu dozu bez nepotrebnog eksperimentisanja.
Terapeutski efikasna doza ovde opisanih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije uglavnom obezbeđuje terapeutske koristi bez izazivanja značajne toksičnosti. Toksičnost i terapeutska efikasnost fuzionog proteina mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskoj kulturi ili eksperimentalnim životinjama. Testovi kulture ćelija i studije na životinjama mogu se koristiti za utvrđivanje LD50(doza koja je smrtonosna za 50% populacije) i ED50(doza terapeutski efikasna za 50% populacije). Odnos toksičnih i terapeutskih dejstava doze predstavlja terapeutski indeks, koji se može izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjniji su antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije koji pokazuju velike terapeutske indekse. U jednoj realizaciji, antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije u skladu sa predmetnim pronalaskom pokazuje visok terapeutski indeks. Podaci dobijeni iz testova kulture ćelija i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje raspona doza pogodnih za ljudsku upotrebu. Poželjno je da se doza nalazi u rasponu koncentracija u krvotoku koji uključuje ED50sa malom količinom ili bez toksičnosti. Doza može da varira u okviru raspona u zavisnosti od različitih faktora, npr. primenjeni oblik doze, način primene, stanje ispitanika, i slično. Tačnu formulaciju, način primene i dozu može izabrati lekar nakon uvida u stanje pacijenta (videti, npr., Fingl et al., 1975, u: The Pharmacological Basis of Therapeutics, pogl. 1, str. 1, ovde
2
uključeno u celini puteme reference).
Lekar zadužen za pacijente koji se leče fuzionim proteinima iz pronalaska zna kada i kako treba da okonča, prekine ili podesi primenu zbog toksičnosti, nepravilnog rada organa, i slično. Sa druge strane, lekar zna i da podesi lečenje na viši nivo, ako klinički odgovor nije adekvatan (isključujući toksičnost). Jačina primenjene doze radi kontrole bolesti menjaće se u skladu sa ozbiljnošću stanja koje se leči, načina primene i slično. Ozbiljnost bolesti može se, na primer, oceniti standardnim postupcima prognostičke evaluacije. Takođe, doza i možda učestalost doze takođe će se menjati u zavisnosti od godina, telesne težine i odgovora pojedinačnih pacijenata.
Drugi agensi i tretmani
Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije mogu se primenjivati u kombinaciji sa jednim ili više drugih agenasa tokom terapije. Na primer, fuzioni protein predmetnog pronalaska može biti primenjen uz barem jedan dodatni terapeutski agens. Termin „terapeutski agens” obuhvata sve agense koji se mogu primeniti za lečenje simptoma ili bolesti pojedinca kome treba lečenje. Takvi dodatni terapeutski agensi takođe mogu da sadrže bilo koji aktivni sastojak pogodan za određene indikacije koje se leče, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. U određenimrealizacijama, dodatni terapeutski agens je još jedan antikancerogeni agens.
Takvi drugi agensi su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine fuzionih proteina koji se koriste, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz TNF familije se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1% do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa uključeni u istu kompoziciju ili u različite kompozicije) i odvojenu primenu, što znači da primena antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene.
Proizvodi
U drugom aspektu, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatomefikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedno aktivno sredstvo u preparatu je antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije ovog pronalaska.
Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa preparatom koji se u njemu nalazi, pri čemu preparat sadrži antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije; i (b) drugo pakovanje sa preparatom koji se u njemu nalazi, pri čemu preparat sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovomrealizaciji može dalje da sadrži uputstvo o proizvodu kojeoznačava da smeše mogu da se koriste za lečenje specifičnog stanja.
Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Tabela C (Sekvence):
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Aminokiseline lanaca antitela su numerisane i navedene prema EU sistemima numeracije prema Kabatu (Kabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) kako je gore definisano.
PRIMERI
U nastavku su dati primeri metoda i preparata predmetnog pronalaska. Podrazumeva se da mogu biti primenjena razne druge realizacije, na osnovu opšteg opisa koji je gore dat.
Tehnike rekombinantne DNK
Za manipulaciju DNK korišćeni su standardni postupci kao što je opisano u radu Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača. Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A. et al, (1991) Sequences of Proteins of
1 2
Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242.
Sekvenciranje DNK
Sekvence DNK su određene pomoću sekvenciranja dvostrukog lanca.
Genska sinteza
Željeni segmenti gena dobijeni su putem PCR pomoću odgovarajućih šablona, ili su sintetisani pomoću uređaja Geneart AG (Regensburg, Nemačka) iz sintetičkih oligonukleotida i PCR proizvoda pomoću automatizovane genske sinteze. U slučajevima kada nije bila dostupna tačna sekvenca gena, prajmeri oligonukleotida su dizajnirani na osnovu sekvenci najbližih homologa i geni su izolovani pomoću RT-PCR iz RNK koja potiče iz odgovarajućeg tkiva. Segmenti gena okruženi mestima cepanja jedinstvenom restrikcionom endonukleazom klonirani su u standardne klonirajuće/sekvencione vektore. DNK plazmida je prečišćena iz transformisane bakterije i koncentracija je određena UV spektroskopijom. DNK sekvenca subkloniranog genskog fragmenta je potvrđena sekvenciranjem DNK. Segmenti gena su dizajnirani sa pogodnim restrikcionim mestima da bi se omogućilo subkloniranje u odgovarajuće ekspresione vektore. Svi konstrukti su dizajnirani sa DNK sekvencom na 5' kraju koja kodira vodeći peptid koji cilja proteine za izlučivanje u eukariotskim ćelijama.
Tehnike gajenja ćelija
Standardne tehnike gajenja ćelija su korišćene kako je opisano u Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.
Prečišćavanje proteina
Proteini su prečišćeni iz filtriranih supernatanta ćelijske kulture prema standardnim protokolima. Ukratko, antitela su naneta na kolonu Protein A sefaroze (GE Healthcare) i isprana sa PBS. Elucija antitela je obavljena na pH 2,8, a nakon toga je odmah usledila neutralizacija uzorka. Agregatni protein je odvojen iz monomernih antitela pomoću gel hromatografije (Superdex 200; GE Healthcare) u PBS-u ili u 20 mM histidina, 150 mM NaCl, pH 6,0. Frakcije monomernih antitela su sakupljene, koncentrovane (ako je potrebno) korišćenjem npr. centrifugalnog koncentratora MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), smrznute i uskladištene na -20 °C ili -80 °C. Deo uzoraka je obezbeđen za naknadnu analizu proteina i analitičku karakterizaciju, npr. pomoću SDS-PAGE, gel hromatografije (SEC) ili masene spektrometrije.
SDS-PAGE
Unapred pripremljeni sistem gela NuPAGE® (Invitrogen) je korišćen prema uputstvu proizvođača. Konkretno, korišćeni su 10% ili 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS unapred
1
pripremljeni gelovi (pH 6,4) i radni pufer NuPAGE® MES (redukovani gelovi, sa NuPAGE® antioksidansom aditivom za radni pufer) ili MOPS (neredukovani gelovi).
Analitička gel hromatografija
Gel hromatografija (size exclusion chromatography, SEC) za određivanje agregacije i oligomernog stanja antitela izvedena je HPLC hromatografijom. Ukratko, antitela prečišćena sa proteinom A su naneta na kolonu Tosoh TSKgel G3000SW u 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7,5 na sistemu Agilent HPLC1100 ili na koloni Superdex 200 (GE Healthcare) u 2 x PBS na HPLC sistemu Dionex. Eluirani protein je kvantifikovan UV apsorbancom i integracijom površine pikova. Standard BioRad za gel filtraciju 151-1901 poslužio je kao standard.
Masena spektrometrija
Ovaj odeljak opisuje karakterizaciju multispecifičnih antitela sa VH/VL razmenom (VH/VL CrossMab) sa naglaskom na njihovu ispravnu strukturu. Očekivane primarne strukture analizirane su elektrosprej jonizacionom masenom spektrometrijom (ESI-MS) deglikozilovanih kompletnih CrossMab i deglikozilovanih/digestovanih plazminom ili alternativno deglikozilovanih/sa ograničenom digestijom LysC CrossMab.
VH/VL CrossMab su deglikozilovani N-glikozidazom F u fosfatnom ili Tris puferu na 37 °C do 17 h pri koncentraciji proteina od 1 mg/ml. Digestija plazminom ili sa ograničenim LysC (Roche) je izvedena sa 100 µg deglikozilovanih VH/VL CrossMab u Tris puferu pH 8 na sobnoj temperaturi tokom 120 sati, odnosno na 37 °C tokom 40 minuta. Pre masene spektrometrije, so je uklonjena iz uzoraka putem HPLC na koloni Sephadex G25 (GE Healthcare). Ukupna masa je određena preko ESI-MS na sistemu maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik) opremljenom TriVersa NanoMate izvorom (Advion).
Određivanje vezivanja i afiniteta vezivanja multispecifičnih antitela za odgovarajuće antigene pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR)(BIACORE) Vezivanje generisanih antitela za odgovarajuće antigene ispitano je površinskom plazmonskom rezonancom pomoću instrumenta BIACORE (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Švedska). Ukratko, za merenja afiniteta, antitela kozjeg anti-humanog IgG, JIR 109-005-098, imobilisana su na CM5 čipu preko kuplovanja amina za prezentaciju antitela na odgovarajući antigen. Vezivanje je mereno u HBS puferu (HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,005% Tween 20, pH 7,4), 25 °C (ili alternativno na 37 °C). Antigen (R&D Systems ili interno prečišćen) je dodat u različitim koncentracijama u rastvor. Asocijacija je merena injektovanjem antigena od 80 sekundi do 3 minuta; disocijacija je merena ispiranjem površine čipa HBS puferom tokom 3-10 minuta, i KD vrednost je određena pomoću 1:1 Lengmirovog
1 4
modela vezivanja. Negativni kontrolni podaci (npr. krive pufera) se oduzimaju od krive uzorka radi korekcije pomaka osnovne linije sistema i smanjenja signala šuma. Odgovarajući Biacore softver za ocenjivanje korišćen je za analizu senzorgrama i za izračunavanje podataka o afinitetu.
Primer 1
1.1 Priprema ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer humanog liganda 4-1BB
Različiti fragmenti DNK sekvence koji kodiraju deo ektodomena (aminokiseline 71-254, 52-254 i 80-254) humanog liganda 4-1BB sintetisani su u skladu sa P41273 sekvencom Uniprot baze podataka (SEQ ID NO: 42).
Kao komponente za sastavljanje antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije, polipeptid koji sadrži dva ektodomena liganda 4-1BB, razdvojena (G4S)2linkerima, i spojen sa humanim IgG1-CH1 ili CL domenom, kloniran je kako je prikazano na slici 1A (humani 4-1BB ligand, (G4S)2konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2konektor, humani CH1 ili CL), ili kako je prikazano na slici 1C (humani CH3, (G4S)2konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2konektor, humani 4-1BB ligand).
Polipeptid koji obuhvata jedan ektodomen 4-1BB liganda i spojen je sa humanim IgG1-CL ili CH1 domenom, kloniran je kao što je opisano na slici 1B (humani 4-1BB ligand, (G4S)2konektor, humani CL ili CH1), ili kao što je prikazano na slici 1D (humani CH3, (G4S)2konektor, humani 4-1BB ligand).
Polipeptidi su subklonirani u okviru sa CH2 i CH3 domenima teškog lanca humanog IgG1 sa opcionim peptidnim linkerima, na primer za konstrukt 1, polipeptid koji kodira dimerni 4-1BB ligand spojen sa humanim CH1 domenom, subkloniran je u okvir sa CH2 i CH3 domenima teškog lanca humanog IgG1 na dugmetu (Merchant, Zhu et al. 1998) pomoću linkera (G4S)2SEQ ID NO: 13 ili
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za protein aktivacije fibroblasta (FAP), tj.28H1, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice (Carter, J. Immunol. Methods (2001), 248, 7-15) ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1. Proizvodnja i priprema FAP vezivača opisana je u WO 2012/020006 A2, koji je ovde uključen putem reference.
Tabela 1 rezimira karakteristike proizvedenih konstrukata. Konstrukti 1 do 10 se razlikuju po svojoj geometriji, valenci za FAP, ektodomenu liganda 4-1BB, ukrštanju domena CH1 i CL (CrossMab tehnologija), mutacijama u CH1 i CL domenima i različitim peptidnim
1
linkerima u polipeptidu koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (monomerni lanac 4-1BBL).
Tabela 1: Karakteristike proizvedenih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije (FAP split 4-1BBL trimeri)
Kako bi se izbeglo pogrešno sparivanje, u većini konstrukata jedan par CH1 i CL domena je zamenjen jedan drugim (ukrštanje domena) kao što je opisano u WO 2009/080253 A1.
Kako bi se dodatno poboljšalo ispravno uparivanje, supstitucije aminokiselina sa različitim naelektrisanjem su uvedene u ukrštene ili neukrštene CH1 i CL domene kao naelektrisani ostaci u konstruktima 2 do 4 i 6 do 10. U humani CL domen su uvedene mutacije E123R i Q124K, dok su mutacije K147E i K213E klonirane u humani CH1 domen.
Za sve konstrukte je korišćena tehnologija heterodimerizacije dugmeta u rupici sa mutacijama S354C/T366W u CH3 domenu lanca dugmeta i odgovarajućim mutacijama Y349C/T366S/L368A/Y407V u CH3 domenu lanca rupice (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
1
Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca dugmeta i rupice kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u Međunarodnoj patentnoj prij. Publ. br. WO 2012/130831 A1.
Na primer, u konstruktu 1 kombinacija ligand-Fc lanac dugmeta koja sadrži mutacije S354C/T366W u prvom CH3 domenu, sa ciljanim anti-FAP-Fc lancem rupice koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V u drugom CH3 domenu omogućava generisanje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i FAP vezujući Fab (slika 2, grafikon 1.1).
Tabela 2 prikazuje sekvence cDNK i aminokiselina jednovalentnog FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (konstrukt 1.1).
Tabela 2: Sekvence FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani trimer 4-1BB liganda konstrukt 1.1
1
1
1
14
Tabela 3 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence sekvenci kiselina jednovalentnog FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (konstrukt 1.2) sa ukrštanjem CH1-CL i naelektrisanim ostacima.
Tabela 3: Sekvence FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani trimer 4-1BB liganda konstrukt 1.2
Tabela 4 prikazuje sekvence cDNK i aminokiselina jednovalentnog FAP ciljanog konstrukta 1.3 Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (FAP split trimer sa ukrštanjem CH1-CL u anti-FAP Fab i naelektrisani ostaci na 4-1BBL lancima).
Tabela 4: Sekvence FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani trimer 4-1BB liganda konstrukt 1.3
14
14
14
Tabela 5 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog FAP ciljanog konstrukta 1.4 Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (FAP split trimer sa anti-FAP Fab, monomerni 4-1BB ligand spojen sa lancem CH1 dugmeta i naelektrisani ostaci na lancima koji sadrže 4-1BBL).
Tabela 5: Sekvence FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani trimer 4-1BB liganda konstrukt 1.4
14
14
14
Tabela 6 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog FAP ciljanog konstrukta 1.5 Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (FAP split trimer sa 2 anti-FAP Fab molekula, dimernim odnosno monomernim 4-1BB ligandom spojenim sa C-krajem svakog teškog lanca ).
Tabela 6: Sekvence FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani trimer 4-1BB liganda konstrukt 1.5
1
11
12
1
Tabela 7 prikazuje cDNK i aminokiselinsku sekvencu jednovalentnog FAP ciljanog konstrukta 1.6 Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (FAP split trimer sa anti-FAP Fab, monomerni 4-1BB ligand spojen na CL* preko (G4S)linkera).
Tabela 7: Sekvence FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani trimer 4-1BB liganda konstrukt 1.6
1 4
Tabela 8 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog FAP ciljanog konstrukta 7 Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (FAP split trimer sa dvostrukim anti-FAP na N-kraju Fc lanca sa rupicom i naelektrisani ostaci na ukrštenim CH1 i CL spojenim sa 4-1BB ligandima).
Tabela 8: Sekvence FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani
1
trimer 4-1BB liganda konstrukt 1.7
1
1
Tabela 9 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog FAP ciljanog konstrukta 1.8 Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (FAP split trimer sa 4-1BB ligandima spojen sa anti-FAP CrossFab, sa naelektrisanim ostacima, na lancu dugmeta).
Tabela 9: Sekvence FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani trimer 4-1BB liganda konstrukt 1.8
1
1
1 Tabela 10 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog FAP ciljanog konstrukta 1.9 Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (52-254) (FAP split trimer sa 4-1BBL ektodomenskim aminokiselinama 52-254 i naelektrisanim ostacima na lancima liganda).
Tabela 10: Sekvence FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani trimer 4-1BB liganda konstrukt 1.9
1 1
12
Tabela 11 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog FAP ciljanog konstrukta 1.10 Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (80-254) (FAP split trimer sa 4-1BBL ektodomenskim aminokiselinama 80-254 i naelektrisanim ostacima na lancima liganda).
Tabela 11: Sekvence FAP-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani trimer 4-1BB liganda konstrukt 10
1
14
1
1.2 Proizvodnja FAP (28H1) ciljanih Fc fuzionih konstrukata split trimernih liganda 4-1BB
Sekvence koje kodiraju ciljani Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije klonirane su u plazmidni vektor, koji pokreće ekspresiju umetka iz MPSV promotera i sadrži sintetičku poliA sekvencu smeštenu na 3' kraju CDS. Uz to, vektor sadrži i EBV sekvencu OriP za epizomsko održavanje plazmida.
Ciljani Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije proizveden je kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija sa ekspresionim vektorima sisara pomoću polietilenimina. Ćelije su transfektovane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:1:1:1 (npr. „vektorski lanac dimernog liganda-(CH1 ili CL)-dugmeta”: „vektorski monomerni ligand fuzija-(CL ili CH1)”: „vektorski teški lanac anti-FAP Fab-rupice”: „vektorski laki lanac anti-FAP“) za konstrukte 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10. Za dvovalentni konstrukt 5, korišćen je odnos 1:1:1 („vektorski teški lanac rupice”: „vektorski teški lanac dugmeta”: „vektorski laki lanac anti-FAP”).
Za proizvodnju u bocama za mućkanje od 500 ml, 300 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 10 minuta na 210 x g, i supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori (200 µg ukupne DNK) su mešani u 20 ml CD CHO medijuma. Nakon dodavanja 540 µl PEI, rastvor je mešan na vorteksu tokom 15 sekundi, i zatim inkubiran 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml Excell medijuma dopunjenog sa 6 mM L-glutamina, 5 g/l PEPSOY i 1,2 mM valproinske kiseline, i ćelije su uzgajane tokom 24 sata. Dan nakon
1
transfekcije dodato je 12% hraniva 7 i glukoza (krajnja koncentracija 3 g/l). Nakon uzgajanja tokom 7 dana, supernatant je sakupljen centrifugiranjem 30-40 minuta na 400 x g. Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 µm), dodat je natrijum azid do krajnje koncentracije od 0,01% (m/V), i čuvan na 4 °C.
Ciljani Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekul koji sadrži trimer TNF liganda prečišćen je iz supernanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom upotrebom Proteina A, a zatim gel hromatografijom. Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu MabSelect Sure (CV = 5-15 ml, smola proizvođača GE Healthcare), ekvilibrisan puferom sa 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata (pH 7,5). Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 6 volumena kolone istog pufera. Vezani protein je eluiran korišćenjem linearnog gradijenta (20 CV) ili postepene elucije (8 CV) puferom sa 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina (pH 3,0). Za linearni gradijent je primenjena dodatna faza elucije sa 4 volumena kolone.
pH prikupljenih frakcija podešen je dodavanjem 1/10 (v/v) 0,5 M natrijum fosfata, pH 8,0. Protein je koncentrovan pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 20 mM histidina, 140 mM natrijum hlorida, 0,01% (v/v) Tween20, pH 6,0.
Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer TNF liganda analizirane su pomoću SDS-PAGE u prisustvu i odsustvu redukujućeg agensa (5 mM 1,4-ditiotreitol) i bojenjem sa Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen SAD) ili CE-SDS pomoću Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). Ukupni sadržaj u uzorcima je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisane u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/V) NaN3, pH 6,7 na 25 °C.
Tabela 12 rezimira prinos i konačni sadržaj monomera u FAP-ciljanim Fc (kih) fuzionim antigen vezujućim molekulima koji sadrže trimer 4-1BBL.
1
Tabela 12: Biohemijska analiza FAP (28H1) ciljanih Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL
1.3 Priprema ciljanih mišjih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
Slično ciljanim humanim Fc fuzionim antigen vezujućim molekulima koji sadrže trimer 4-1BB liganda, pripremljeni su FAP-ciljani mišji molekuli Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda.
DNK sekvenca koja kodira deo ektodomena (aminokiseline 104-309) mišjeg 4-1BB liganda sintetisana je prema Q3U1Z9-1 sekvenci Uniprot baze podataka (SEQ ID NO: 70). Za konstrukt M.1, cisteini na položajima 137, 160 i 246 su mutirani u serin standardnim PCR metodama, dok je za konstrukt M.2 cistein na položaju 160 mutiran u serin (C160S).
Mišji ligand je sastavljen kao što je opisano za humani 4-1BBL i kako je prikazano na slikama 3A i 3B. Dimerni 4-1BBL, odvojen (G4S)2linkerima, spojen je sa mišjim IgG1-CL domenom (slika 3A), a monomerni 4-1BBL je spojen sa mišjim IgG1-CH domenom (slika 3B). Polipeptid koji kodira dimerni 4-1BB ligand spojen sa mišjim CL domenom subkloniran je u okvir sa domenima CH2 i CH3 teškog lanca mišjeg IgG1 kako bi se izgradili konstrukti kao što je prikazano na slici 3C.
Za mišje konstrukte, mutacije Lys392Asp i Lys409Asp (DD) uvedene su u teški lanac
1
koji sadrži mišji 4-1BBL, a mutacije Glu356Lys i Asp399Lys (KK) uvedene su u teški lanac koji sadrži anti-FAP Fab radi dobijanja asimetričnih molekula (Gunasekaran K. et al., J Biol. Chem., 2010, Jun 18;285(25):19637-46).
Mutacije Asp265Ala i Pro329Gly (DAPG) uvedene su u konstantni region teških lanaca da bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore.
Tabela 13 prikazuje, redom, cDNK i aminokiselinske sekvence FAP ciljanog mišjeg Fc fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda konstrukt M.1.
Tabela 13: Sekvence FAP-ciljanog mišjeg konstrukta M.1
1
1
11
12
Tabela 14 prikazuje, redom, cDNK i aminokiselinske sekvence neciljanog (DP47) mišjeg Fc fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda kontrola M.1.
Tabela 14: Sekvence neciljane mišje kontrole M.1
1
14
Tabela 15 prikazuje cDNK i aminokiselinsku sekvencu FAP ciljanog mišjeg Fc fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda konstrukt M.2.
Tabela 15: Sekvence FAP-ciljanog mišjeg konstrukta M.2
1
1
1
Tabela 16 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence DP47 neciljanog mišjeg Fc fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda konstrukt kontrola M.2.
1
Tabela 16: Sekvence FAP-ciljane mišje kontrole M.2
Mišji Fc fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda proizvedeni su i prečišćeni kao što je prethodno opisano za humane 4-1BBL konstrukte.
Tabela 17 rezimira prinos i konačni sadržaj monomera u FAP ciljanom i neciljanom mišjem Fc fuzionom antigen vezujućem molekulu koji sadrži trimer 4-1BB.
Tabela 17: Sažetak proizvodnje FAP ciljanih i neciljanih mišjih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL
1
1.4 Priprema i prečišćavanje neciljanih humanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (kontrolni molekuli)
Kontrolni molekuli pripremljeni su kao što je gore opisano za FAP ciljane konstrukte 1 i 2, s jedinom razlikom da je anti-FAP vezivač (VH-VL) zamenjen kontrolnom germinativnom linijom, nazvanom DP47, koja se ne vezuje za antigen. Kontrola je neciljani jednovalentni split trimerni humani 4-1BB ligand Fc (kih) (kontrola A, slika 5A), a za kontrolu B, konstrukt takođe sadrži CH-CL ukrštanje sa naelektrisanim ostacima (slika 5B). Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca FAP vezivača zamenjen je onim iz kontrolne germinativne linije (DP47) i subkloniran u okviru bilo konstantnog teškog lanca rupice, bilo konstantnog lakog lanca humanog IgG1.
Neciljani Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda proizvedeni su kao što je gore opisano za FAP ciljane konstrukte. Ćelije su transfektovane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:1:1:1 („vektorski lanac dimernog liganda-CH1 ili CL*-dugmeta”: „vektorski monomerni ligand fuzija-CL ili CH1*”: „vektorski lanac DP47 Fab-rupice”: „vektorski laki lanac DP47”).
Tabela 18 prikazuje, redom, cDNK i aminokiselinske sekvence DP47-neciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda kontrola A. Tabela 18: Sekvence DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (DP47 split 4-1BBL trimer) kontrola A
1
11
Tabela 19 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence DP47-neciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda sa ukrštanjem CH1-CL
1 2
i naelektrisanim ostacima u kracima koji sadrže 4-1BB ligand (kontrola B).
Tabela 19: Sekvence DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (DP47 split 4-1BBL trimer) kontrola B
Tabela 20 rezimira prinos i sadržaj finalnog monomera DP47 neciljanih Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda.
Tabela 20: Karakteristike proizvodnje DP47 neciljanih Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL (kontrolni molekuli)
1
Primer 2
2.1 Priprema FAP (4B9) ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
Različiti fragmenti DNK sekvence koji kodiraju deo ektodomena (aminokiseline 71-254 i 71-248) humanog 4-1BB liganda sintetisani su prema sekvenci P41273 Uniprot baze podataka (SEQ ID NO: 42).
2.1.1 Priprema jednovalentnog FAP (4B9) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) sa ukrštenim CH1-CL domenima sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 2.1)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-254), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je kao što je prikazano na slici 1A: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL.
Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254) i spojen sa humanim IgG1-CH1 domenom, kloniran je kao što je opisano na slici 1B: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH.
Polipeptid koji kodira dimerni 4-1BB ligand spojen sa humanim CL domenom subkloniran je u okviru sa domenima teškog lanca CH2 i CH3 humanog IgG1 na dugmetu (Merchant, Zhu et al.1998) pomoću linkera (G4S)2, ili, alternativno,
Da bi se poboljšalo ispravno uparivanje, u ukrštene CH-CL uvedene su sledeće mutacije. U dimerni 4-1BB ligand spojen sa humanim CL uvedene su mutacije E123R i Q124K. U monomerni 4-1BB ligand spojen sa humanim CH1, mutacije K147E i K213E su klonirane u humani CH1 domen.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za protein aktivacije fibroblasta (FAP), klon 4B9, subkloniran je u okviru sa konstantnim
1 4
teškim lancem sa rupicom, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1.
Proizvodnja i priprema FAP vezivača opisana je u WO 2012/020006 A2, koji je ovde uključen putem reference.
Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca dugmeta i rupice kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u Međunarodnoj patentnoj prij. Publ. br. WO 2012/130831.
Za sve konstrukte je korišćena tehnologija heterodimerizacije dugmeta u rupici sa mutacijama S354C/T366W u lancu dugmeta i odgovarajućim mutacijama Y349C/T366S/L368A/Y407V u lancu rupice.
Kombinacija lanca dugmeta dimernog liganda-Fc koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog lanca anti-FAP-Fc rupice koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-FAP omogućava stvaranje heterodimera, koji obuhvata sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i FAP vezujući Fab (slika 4, konstrukt 2.1).
Tabela 21 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog FAP (4B9)-humanog 4-1BB liganda (71-254) Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži ukrštanje CH1-CL i naelektrisane ostatke (konstrukt 2.1).
Tabela 21: Sekvence jednovalentnog FAP (4B9) ciljanog humanog liganda 4-1BB (71-254) koji sadrži Fc (kih) fuzioni molekul konstrukt 2.1
1
1
2.1.2 Priprema jednovalentnog FAP (4B9) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) sa ukrštenim CH1-CL domenima bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 2.2)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-254), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je kao što je prikazano na slici 1A: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL.
Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254) i spojen sa humanim IgG1-CH1 domenom, kloniran je kao što je opisano na slici 1B: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH1.
Polipeptid koji kodira dimerni 4-1BB ligand spojen sa humanim CL domenom subkloniran je u okviru sa domenima teškog lanca CH2 i CH3 humanog IgG1 na dugmetu (Merchant, Zhu et al.1998) pomoću linkera (G4S)2 ili, alternativno,
1
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za protein aktivacije fibroblasta (FAP), klon 4B9, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem sa rupicom, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1.
Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca dugmeta i rupice kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore (WO 2012/130831).
Kombinacija lanca dimernog liganda-Fc dugmeta koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog lanca anti-FAP-Fc rupice koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-FAP omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i FAP vezujući Fab (slika 4, konstrukt 2.2).
Tabela 22 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog FAP (4B9)-humanog 4-1BB liganda (71-254) Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži ukrštanje CH1-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 2.2).
Tabela 22: Sekvence jednovalentnog FAP (4B9) ciljanog humanog liganda 4-1BB (71-254) koji sadrži Fc (kih) fuzioni molekul konstrukt 2.2
1
1
1
11 2.1.3 Priprema dvovalentnog FAP (4B9) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) sa dimernim i monomernim 4-1BB ligandima spojenim na C-terminusu svakog teškog lanca (konstrukt 2.3)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-254), razdvojena (G4S)2 linkerima, spojen je sa C-krajem Fc lanca sa rupicom humanog IgG1, kako je prikazano na slici 1C: rupica Fc humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254) i spojen je sa C-krajem Fc lanca dugmeta humanog IgG1, kako je opisano na Slici 1D: Fc dugme humani IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand.
Polipeptid koji kodira dimerni 4-1BB ligand subkloniran je u okviru na C-kraju domena CH2 i CH3 teškog lanca humanog IgG1 na rupici (Merchant, Zhu et al.1998) pomoću (G4S)2 konektora. Polipeptid koji kodira monomerni 4-1BB ligand subkloniran je u okviru na C-kraju domena CH2 i CH3 teškog lanca humanog IgG1 na dugmetu (Merchant, Zhu et al. 1998) pomoću (G4S)2konektora.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivača specifičnog za protein aktivacije fibroblasta (FAP), klon 4B9, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice, dugmeta, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1.
Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831.
Kombinacija anti-FAP huIgG1 lanca dimernog liganda rupice koja sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V, anti-FAP huIgG1 lanca monomernog liganda dugmeta koji sadrži mutacije S354C/T366W i anti-FAP lakog lanca omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i dva FAP vezujuća Fab (Slika 4, konstrukt 2.3) Tabela 23 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog FAP (4B9)-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda konstrukt 2.3 (FAP split trimer sa 2 anti-FAP Fab, dimernim, odnosno monomernim 4-1BB ligandom spojenim na C-kraju svakog teškog lanca).
Tabela 23: Sekvence dvovalentnog FAP (4B9) ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani ligand 4-1BB (71-254) konstrukt 2.3
1 2
1
��
1
2.1.4 Priprema jednovalentnog FAP (4B9) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) sa ukrštenim CH1-CL domenima sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 2.4)
1
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-248), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je kao što je prikazano na slici 1A: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-248) i spojen sa humanim IgG1-CH domenom, kloniran je kao što je opisano na slici 1B: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH.
Polipeptid koji kodira dimerni 4-1BB ligand spojen sa humanim CL domenom subkloniran je u okviru sa domenima teškog lanca CH2 i CH3 humanog IgG1 na dugmetu (Merchant, Zhu et al.1998) pomoću linkera (G4S)2 ili, alternativno, ( ). Da bi se poboljšalo ispravno uparivanje, u ukrštene CH-CL uvedene su sledeće mutacije. U dimernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CL, E123R i Q124K. U monomernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CH1, K147E i K213E.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za protein aktivacije fibroblasta (FAP), klon 4B9, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem sa rupicom, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1.
Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831.
Kombinacija lanca dimernog liganda-Fc dugmeta koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog lanca anti-FAP-Fc rupice koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-FAP omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i FAP vezujući Fab (Slika 4, konstrukt 2.4).
Tabela 24 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog FAP (4B9)-humanog 4-1BB liganda (71-248) Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži ukrštanje CH1-CL sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 2.4).
Tabela 24: Sekvence jednovalentnog FAP (4B9) ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadži humani ligand 4-1BB (71-248)konstrukt 2.4
1
1
1
2.1.5 Priprema jednovalentnog FAP (4B9) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) sa ukrštenim CH1-CL domenima bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 2.5)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-248), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je kao što je prikazano na slici 1A: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-248) i spojen sa humanim IgG1-CH domenom, kloniran je kao što je opisano na slici 1B: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH.
Polipeptid koji kodira dimerni 4-1BB ligand spojen sa humanim CL domenom
2
subkloniran je u okviru sa domenima teškog lanca CH2 i CH3 humanog IgG1 na dugmetu (Merchant, Zhu et al.1998) pomoću linkera (G4S)2 ili, alternativno, ( ).
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za protein aktivacije fibroblasta (FAP), klon 4B9, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem sa rupicom, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1.
Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831.
Kombinacija lanca dimernog liganda-Fc dugmeta koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog lanca anti-FAP-Fc rupice koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-FAP omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i FAP vezujući Fab (slika 4, konstrukt 2.5)
Tabela 25 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog FAP (4B9)-humanog 4-1BB liganda (71-248) Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži ukrštanje CH1-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 2.5).
Tabela 25: Sekvence jednovalentnog FAP (4B9) ciljanog humanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži ligand 4-1BB (71-248) konstrukt 2.5
2 1
22
2
2.1.6 Priprema dvovalentnog FAP (4B9) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) sa dimernim i monomernim 4-1BB ligandima spojenim na C-terminusu svakog teškog lanca (konstrukt 2.6)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-248), razdvojena (G4S)2 linkerima, spojen je sa C-krajem Fc lanca sa rupicom humanog IgG1, kako je prikazano na slici 1C: rupica Fc humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-248) i spojen je sa C-krajem Fc lanca dugmeta humanog IgG1, kako je opisano na Slici 1D: Fc dugme
2 4
humani IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand.
Polipeptid koji kodira dimerni 4-1BB ligand subkloniran je u okviru na C-kraju domena CH2 i CH3 teškog lanca humanog IgG1 na rupici (Merchant, Zhu et al.1998) pomoću (G4S)2 konektora. Polipeptid koji kodira monomerni 4-1BB ligand subkloniran je u okviru na C-kraju domena CH2 i CH3 teškog lanca humanog IgG1 na dugmetu (Merchant, Zhu et al. 1998) pomoću (G4S)2 konektora.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivača specifičnog za protein aktivacije fibroblasta (FAP), klon 4B9, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice, dugmeta, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1.
Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831.
Kombinacija anti-FAP huIgG1 lanca dimernog liganda rupice koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V, anti-FAP huIgG1 lanca monomernog liganda dugmeta koji sadrži mutacije S354C/T366W i anti-FAP lakog lanca omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i dva FAP vezujuća Fab (Slika 4, konstrukt 2.6).
Tabela 26 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog FAP (4B9)-ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda konstrukt 2.6 (FAP split trimer sa 2 anti-FAP Fab, dimernim, odnosno monomernim 4-1BB ligandom spojenim na C-kraju svakog teškog lanca).
Tabela 26: Sekvence dvovalentnog FAP (4B9) ciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humanig ligand 4-1BB (71-248) konstrukt 2.6
2
2
�
2
2.2 Priprema neciljanih humanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (kontrolni molekuli)
Dodatni kontrolni molekuli pripremljeni su kao što je opisano u primeru 1.4 iznad za kontrolu A i B. Dvovalentna varijanta kontrole C pripremljena je analogno dvovalentnom konstruktu 2.3 i 2.6, a jednovalentna varijanta kontrola E pripremljena je analogno konstruktu
2
2.5 (koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248)), sa jedinom razlikom da je anti-FAP vezivač (VH-VL) zamenjen kontrolnom germinativnom linijom, nazvanom DP47, koja se ne vezuje za antigen.
Tabela 27 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog DP47-neciljanog split trimernog 4-1BB liganda (71-254) Fc (kih) fuzionog molekula kontrola C. Tabela 28 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog DP47-neciljanog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) Fc (kih) fuzionog molekula kontrola E.
Tabela 27: Sekvence dvovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani ligand 4-1BB (71-254) kontrola C
21
21
Tabela 28: Sekvence jednovalentnog neciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži humani ligand 4-1BB (71-248) kontrola E
2.3 Priprema neciljanog humanog IgG1 kao kontrole F
Dodatni kontrolni molekul koji je korišćen u ispitivanjima bio je neciljani DP47, kontrolna germinativna linija, humani IgG1, koji sadrži mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala, da bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u međunarodnoj patentnoj prij. Publ. br. WO 2012/130831).
Tabela 29 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence cDNK i aminokiselinske sekvence neciljanog DP47 huIgG1 PGLALA (kontrola F).
Tabela 29: Sekvence neciljanog DP47 huIgG1 (kontrola F)
21
21
2.4 Proizvodnja jednovalentnih i dvovalentnih FAP (4B9) ciljanih Fc fuzionih konstrukata i kontrolnih molekula koji sadrže split trimerni 4-1BB ligand Kodirajuće sekvence ciljanog i neciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand klonirane su u plazmidni vektor koji pokreće ekspresiju umetka iz MPSV promotera i sadrži sintetičku polyA sekvencu smeštenu na 3' kraju CDS. Uz to, vektor sadrži i EBV sekvencu OriP za epizomsko održavanje plazmida.
Fc (kih) fuzioni molekul koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand proizveden je kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija sa ekspresionim vektorima sisara pomoću polietilenimina. Ćelije su transfektovane odgovarajućim ekspresionim vektorima. Za konstrukte 2.1, 2.2, 2.4 i 2.5 i odgovarajuće kontrolne molekule, korišćen je odnos 1:1:1:1 (npr. „vektorski lanac dugmeta dimernog liganda-CL”: „vektorski monomerni ligand fuzionij-CH1”: „vektorski anti-FAP Fab-lanac sa rupicom”: „vektorski laki lanac anti-FAP”). Za konstrukte 2.3 i 2.6 i njihov kontrolni molekul, uzet je odnos 1:1:1 („vektorski lanac Fc rupice dimernog liganda huIgG1”: „vektorski huIgG1 Fc lanac sa dugmetom monomernog liganda”: „vektorski anti-FAP laki lanac”). Humani IgG, korišćeni kao kontrola u testu, proizvedeni su kao i za bispecifične konstrukte (za transfekciju je korišćen samo vektor za laki i vektor za teški lanac.
Za proizvodnju u bocama za mućkanje od 500 ml, 300 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 10 minuta na 210 x g, i supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori (200 µg ukupne DNK) su mešani u 20 ml CD CHO medijuma. Nakon dodavanja 540 µl PEI, rastvor je mešan na vorteksu tokom 15 sekundi, i zatim inkubiran 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml Excell medijuma dopunjenog 6 mM L-glutaminom, 5 g/l PEPSOY i 1,2 mM valproinskom kiselinom, i ćelije su uzgajane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodato je 12% hraniva 7 i glukoza (krajnja konc.3 g/l). Nakon uzgajanja tokom 7 dana, supernatant je sakupljen centrifugiranjem 30-40 minuta na najmanje 400 x g. Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 µm), dodat je natrijum azid do krajnje koncentracije od 0,01% (m/V), i čuvan na 4 °C.
Ciljani i neciljani Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer TNF
21
liganda i humani IgG1 prečišćeni su iz supernanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom upotrebom Proteina A, a zatim gel hromatografijom. Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu MabSelect Sure (CV = 5-15 ml, smola proizvođača GE Healthcare), ekvilibrisan puferom sa natrijum fosfatom (20 mM), natrijum citratom (20 mM) (pH 7,5). Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 6 volumena kolone istog pufera. Vezani protein je eluiran korišćenjem linearnog gradijenta (20 CV) ili postepene elucije (8 CV) puferom sa 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina (pH 3,0). Za linearni gradijent je primenjena dodatna faza elucije sa 4 volumena kolone.
pH prikupljenih frakcija je podešen dodavanjem 1/10 (v/v) 0,5 M natrijum fosfata, pH 8,0. Protein je koncentrovan pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 20 mM histidina, 140 mM natrijum hlorida, 0,01% (v/v) Tween20, pH 6,0.
Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa ciljanog Fc (kih) fuzionog trimernog 4-1BB liganda analizirane su pomoću SDS-PAGE u prisustvu i odsustvu redukujućeg agensa (5 mM 1,4-ditiotreitol) i bojenjem sa Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen SAD) ili CE-SDS pomoću Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). Ukupni sadržaj u uzorcima je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisane u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/V) NaN3, pH 6,7 na 25 °C.
Tabela 30 rezimira prinos i finalni monomerni sadržaj FAP (4B9) ciljanih i neciljanih FC (kih) fuzionih antigen vazujućih molekula i kontrolnih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda.
Tabela 30. Biohemijska analiza FAP (4B9) ciljanih i neciljanih Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula i kontrolnih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
21
Primer 3
Priprema, prečišćavanje i karakterizacija 4-1BB
DNK sekvence koje kodiraju ektodomene 4-1BB čoveka, miša ili cinomolgusa (Tabela 31) subklonirane su u okviru domena teškog lanca CH2 i CH3 humanog IgG1 na dugmetu (Merchant et al. 1998). Uvedeno je mesto cepanja AcTEV proteaze između ektodomena antigena i Fc humanog IgG1. Oznaka Avi za usmerenu biotinilaciju uvedena je na C-terminusu antigen-Fc dugmeta. Kombinacija lanca sa dugmetom antigen-Fc regiona koji sadrži mutacije S354C/T366W, sa lancem sa rupicom Fc regionakoji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V omogućava stvaranje heterodimera koji uključuje jednu kopiju lanca koji sadrži 4-1BB ektodomen, čime se stvara monomerni oblik antigena vezanog za Fc (slika 5C). Tabela 32 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence antigen Fc-fuzionih konstrukata.
Tabela 31: Numeracija aminokiselina ektodomena antigene (ECD) i njihovo poreklo
Tabela 32: cDNK i aminokiselinske sekvence monomernih antigen Fc(kih) fuzionih molekula
21
22
Sve kodirajuće sekvence 4-1BB-Fc-fuzionog molekula su klonirane u plazmidni vektor, koji pokreće ekspresiju umetka iz MPSV promotera i sadrži sintetičku poliA signalnu sekvencu smeštenu na 3' kraju CDS. Uz to, vektor sadrži i EBV sekvencu OriP za epizomsko održavanje plazmida.
Za pripremu biotinilovanih monomernih antigen/FC fuzionih molekula, eksponencijalno rastuća suspenzija HEK293 EBNA ćelija je kotransfektovana sa tri vektora koji kodiraju dve komponente fuzionog proteina (lanci dugmeta i rupice) kao i BirA, enzim potreban za reakciju biotinilacije. Odgovarajući vektori korišćeni su u odnosu 2: 1: 0,05 („antigen ECD-AcTEV-Fc dugme”: „Fc rupica”: „BirA”).
Za proizvodnju proteina u boci za mućkanje od 500 ml, zasejano je 400 miliona ćelija HEK293 EBNA 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 g, i supernatant je zamenjen prethodno zagrejanim CD CHO medijumom. Ekspresioni vektori su ponovo suspendovani u 20 ml CD CHO medijuma koji sadrži 200 µg vektorske DNK. Nakon dodavanja 540 µl polietilenimina (PEI), rastvor je mešan na vorteksu tokom 15 sekundi, i zatim inkubiran 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml medijuma F17 i ćelije su uzgajane tokom 24 sata. Proizvodni medijum je dopunjen 5 µM kifunensinom. Dan nakon
22
transfekcije u kulturu je dodata 1 mM valproinska kiselina i 7% hraniva 1 sa suplementima. Nakon uzgajanja tokom 7 dana, ćelijski supernatant je sakupljen centrifugiranjem ćelija tokom 15 minuta na 210 g. Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 µm), dodat je natrijum azid do krajnje koncentracije od 0,01% (m/V), i čuvan na 4 °C.
Izlučeni proteini su prečišćeni iz supernatanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom, upotrebom proteina A, a zatim gel hromatografijom. Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu HiTrap ProteinA HP (CV = 5 ml, GE Healthcare), ekvilibrisan sa 40 ml 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, pH 7,5. Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 10 zapremina kolone pufera sa 20 mM natrijum fosfata, 20 mM natrijum citrata, 0,5 M natrijum hlorida (pH 7,5). Vezani protein je eluiran pomoću linearnog pH gradijenta natrijum hlorida (od 0 do 500 mM) ostvarenog na 20 zapremina kolone sa 20 mM natrijum citratom, 0,01% (V/V) Tween-20, pH 3,0. Kolona je zatim isprana sa 10 zapremina kolone 20 mM natrijum citrata, 500 mM natrijum hlorida, 0,01% (V/V) Tween-20, pH 3,0.
pH prikupljenih frakcija podešava se dodavanjem 1/40 (V/V) 2 M tris, pH 8,0. Protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 2 mM MOPS, 150 mM natrijum hlorida, 0,02% (m/V) natrijum azida pH 7,4.
Za određivanje afiniteta prema humanom receptoru, ektodomen humanog 4-1BB je takođe subkloniran u okviru sa avi i heksahistidinskom oznakom.
Proizvodnja proteina je izvedena kao što je gore opisano za Fc-fuzioni protein. Izlučeni proteini su prečišćeni iz supernatanata ćelijske kulture helatnom hromatografijom, a zatim gel filtracijom. Prvi hromatografski korak je izveden na kertridžu NiNTA Superflow (5 ml, Qiagen) uravnoteženom u 20 mM natrijum fosfatu, 500 nM natrijum hloridu, pH 7,4. Elucija je izvedena nanošenjem gradijenta preko 12 zapremina kolone od 5% do 45% elucionog pufera (20 mM natrijum fosfat, 500 nM natrijum hlorid, 500 mM imidazol, pH 7,4). Protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 75 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 2 mM MOPS, 150 mM natrijum hlorida, 0,02% (m/V) natrijum azida pH 7,4 (Tabela 33).
Tabela 33: Sekvence monomernog humanog 4-1BB His molekula
Primer 4
Biohemijska karakterizacija FAP ciljanog Fc fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda površinskom plazmonskom rezonancom Vezivanje FAP ciljanih Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda za rekombinantni 4-1BB procenjeno je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti obavljeni su na Biacore T100 na 25 °C sa HBS-EP kao radnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20, Biacore, Freiburg/Nemačka).
Avidnost interakcije između FAP ciljanih ili neciljanih Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda i rekombinantnog 4-1BB (humanog, cino i mišjeg) je određena kako je opisano u nastavku. Podaci su pokazali da se i ciljani Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda, kao i neciljani DP47 Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda vezuju sa uporedivim aviditetom za 4-1BB čoveka i cinomolgusa, ali zanemarljivo sa homologom miša.
Rekombinantni biotinilovani Fc (kih) fuzioni 4-1BB molekuli čoveka, cinomolgusa i miša su direktno spojeni na SA čip pomoću standardnog uputstva za spajanje (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 30 RU. FAP ciljani Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda ili DP47 neciljane kontrole propušteni su u rasponu koncentracije od 0,39 do 200 nM sa protokom od 30 µl/minutu kroz protočne ćelije tokom 120 sekundi. Disocijacija je praćena tokom 180 sekundi. Varijacije indeksa prelamanja
22
u rasutom stanju su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj praznoj protočnoj ćeliji.
Za merenje afiniteta, direktno spajanje oko 7200 rezonantnih jedinica (RU) antihumanog Fc specifičnog antitela izvedeno je na CM5 čipu pri pH 5,0, uz korištenje standardnog kompleta za spajanje amina (GE Healthcare). FAP ciljani ili neciljani Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda, pri 50 nM, snimani su pri protoku od 30 µl/min tokom 60 sekundi u protočnoj ćeliji 2. Serija razblaženja (1,95 do 1000 nM) humanog 4-1BB-avi-His propuštena je kroz obe protočne ćelije pri 30 µl/min tokom 180 s da bi se snimila faza asocijacije. Faza disocijacije je praćena tokom 180 s i aktivirana prebacivanjem sa uzorka rastvora na HBS-EP. Površina čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa dvostrukim injektovanjem od 60 s 10 mM glicin-HCl pH 2,1. Varijacije indeksa prelamanja u rasutom stanju korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji 1. Za interakciju između Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda i hu4-1BB avi His, konstante afiniteta su izvedene iz konstanti brzine prilagođavanjem Lengmirovoj krivoj vezivanja 1:1 pomoću softvera Biaeval (GE Healthcare).
Tabela 34: Prilagođavanje Lengmirovoj krivoj vezivanja 1:1 i konstante afiniteta
Primer 5
Funkcionalna karakterizacija ciljanog Fc fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda
5.1. Vezivanje za naivne u odnosu na aktivirane humane PMBC FAP ciljanih Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda Frakcije leukocita i trombocita su nabavljene iz centra za davanje krvi u Cirihu. Da bi se izolovale sveže mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), frakcija leukocita i trombocita je razređena istom zapreminom DPBS (Gibco proizvođača Life Technologies, kat. br. 14190 326). Polipropilenske epruvete za centrifugiranje od 50 ml (TPP, kat. br.91050) dopunjene su
22
sa 15 ml Histopaque 1077 (SIGMA Life Science, kat. br. 10771, polisaharoza i natrijum diatrizoat, podešen na gustinu od 1,077 g/ml) i razblaženi rastvor frakcija leukocita i trombocita raslojen je iznad Histopaque 1077. Epruvete su centrifugirane tokom 30 minuta na 400 x g. PBMC su zatim sakupljene sa međupovršine, isprane tri puta sa DPBS i ponovo suspendovane u T ćelijskom medijumu koji se sastoji od RPMI 1640 medijuma (Gibco proizvođača Life Technology, kat. br.42401-042) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Gibco proizvođača Life Technology, kat. br.16000-044, serija 941273, gama-ozračeni, bez mikoplazme i toplotno inaktiviran na 56 °C tokom 35 min), 1% (V/V) GlutaMAX-I (GIBCO proizvođač Life Technologies, kat. br.35050038), 1 mM natrijum piruvata (SIGMA, kat. br. S8636), 1% (V/V) MEM neesencijalnih aminokiselina (SIGMA, kat. br. M7145) i 50 µM β-merkaptoetanola (SIGMA, M3148).
PBMC su korišćeni direktno nakon izolacije ili stimulisani da indukuju ekspresiju 4-1BB na ćelijskoj površini T i NK ćelija uzgajanjem 4 dana u T ćelijskom medijumu sa dodatkom 200 U/ml proleukina (Novartis Pharma Schweiz AG, CHCLB-P-476-700-10340) i 2 µg/ml PHA-L (SIGMA kat. br. L2769) na ploči za uzgajanje tkiva sa 6 bunarčića, a zatim 1 dan na ploči za uzgajanje tkiva sa 6 bunarčića obloženoj sa 10 ug/ml antihumanog CD3 (klon OKT3, BioLegend, kat. br.317315) i 2 µg/ml antihumanog CD28 (klon CD28.2, BioLegend, kat. br.302928) u T ćelijskom medijumu na 37 °C i 5% CO2.
Da bi se utvrdilo vezivanje Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL za ljudske PBMC, 0,1 x 10<6>naivnih ili aktiviranih PBMC je dodato u svaki bunarčić ploče za ćelijske suspenzije sa 96 bunarčića okruglog dna (Greiner Bio-One, cellstar, kat. br.
650185). Ploče su centrifugirane 4 minuta na 400 x g i na 4 °C. Supernatant je odbačen. Nakon toga, ćelije su obojene u 100 µl/bunarčiću DPBS koji je sadržao razblaženi 1:1000 komplet LIVE/DEAD za fiksabilno bojenje mrtvih ćelija u plavo, za UV ekscitaciju (Life Technologies, molekulske sonde, L-23105) ili fiksabilnu boju za vijabilnost eF660 (eBioscience 65-0864-18) ili komplet LIVE/DEAD za fiksabilno bojenje mrtvih ćelija u zeleno (Life Technologies, molekulske sonde, L-23101) u trajanju od 30 minuta na 4 °C u mraku. Ako je DAPI korišćen kao boja za Live/Death, ovaj korak bojenja je preskočen. Ćelije su jednom isprane sa 200 µl hladnog FACS pufera (DPBS je dopunjen sa 2% (V/V) FBS, 5 mM EDTA pH 8 (Amresco, kat. br. E177) i 7,5 mM natrijum azidom (Sigma-Aldrich S2002).
Zatim je dodato 50 µl/bunarčiću hladnog FACS pufera na 4 °C koji sadrži različite titrisane koncentracije Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL, i ćelije su inkubirane tokom 120 minuta na 4 °C, isprane četiri puta sa 200 µl/bunarčiću FACS pufera na 4 °C i ponovo suspendovane. Ćelije su dalje obojene sa 50 µl/bunarčiću hladnog
22
FACS pufera na 4 °C koji je sadržao 0,67 µg/ml antihumanog CD3-PerCP-Cy5.5 (klon UCHT1, mišji IgG1κ, BioLegend, kat. br.300430) ili 0,16 µl antihumanog CD3-PE/Cy7 (klon SP34-2, mišji IgG1 κ, BD Pharmingen, kat. br. 557749, serija 33324597), 0,67 µg/ml antihumanog CD45-AF488 (klon HI30, mišji IgG1κ, BioLegend, kat. br. 304017) ili 0,12 µg/ml antihumanog CD56-FITC (klon NCAM16.2, mišji IgG2bκ, BD Pharmingen, kat. br.
345811) ili 1 µl antihumanog CD56-APC (klon B159, mišji IgG1 κ, BD Pharmingen, kat. br.
555518, serija 3098894), 0,25 µg/ml antihumanog CD4-BV421 (klon RPA-T4, mišji IgG1κ, BioLegend, kat. br. 300532) ili 0,23 µg/ml antihumanog CD4-BV421 (klon OKT4, mišji IgG2bκ, BioLegend, kat. br.317434), 0,25 µl antihumanog CD8a-APC (klon RPA-T8, mišji IgG1κ, BD Pharmingen, kat. br. 555369) ili 0,67 µl antihumanog CD8a-APC/Cy7 (klon RPA-T8, mišji IgG1κ, BioLegend, kat. br.301016) ili 0,83 ng/ml antihumanog CD8a-BV711 (klon RPA-T8, mišji IgG1κ, BD Pharmingen, kat. br. 301044) i 5 µg/ml PE-konjugovanog AffiniPure antihumanog kozjeg IgG F(ab')2 fragmenta specifičnog za Fcγ fragment IgG (Jackson ImmunoResearch, kat. br. 109116 098 ili 109116 170). Ćelije su isprane dva puta FACS puferom. Ako su ćelije obojene fiksabilnim bojama za vijabilnost, one su fiksirane sa 50 µl/bunarčiću DPBS koji sadrži 1% formaldehida (Sigma, HT501320-9.5L). Ćelije su ponovo suspendovane u FACS puferu i snimljene narednog ili istog dana pomoću 5-laserskog FSR-Fortessa (BD Bioscience sa softverom DIVA) ili 3-laserskog analizatora Miltenyi Quant 10 (Miltenyi Biotec) i Flow Jo (FlowJo X 10.0.7). Ako je DAPI bojenje korišćeno za detektovanje mrtvih ćelija, one su ponovo suspendovane u 80 µl/bunarčiću FACS pufera sa 0,2 µg/ml DAPI (Santa Cruz Biotec, kat. br. Sc-3598) i snimljene istog dana pomoću 5-laserskog LSR-Fortessa (BD Bioscience sa softverom DIVA).
Kao što je prikazano na Slici 6, ni FAP ciljani ni neciljani Fc fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda se nisu vezali za humane CD4+ T ćelije u mirovanju, i nisu pokazali uočljivo vezivanje za CD8+ T ćelije u mirovanju i NK ćelije. Nasuprot tome, oba konstrukta se snažno vezuju za aktivirane NK, CD8+ ili CD4+ T ćelije, iako su ove poslednje pokazale približno 10 puta manji intenzitet specifične fluorescencije u odnosu na NK ćelije i 20 puta smanjeni intenzitet specifične fluorescencije u odnosu na CD8+ T ćelije.
Slike 7A i 7B prikazuju vezivanje konstrukta 1.1 do 1.10 kao što su pripremljeni u primeru 1 za aktivirane humane CD3+ CD8+ T ćelije koje eksprimiraju 4-1BB, odnosno aktivirane humane CD3+ CD4+ T ćelije koje eksprimiraju 4-1BB. Tabela 35 pokazuje izmerene vrednosti EC50za konstrukte 1.1 do 1.10.
22
Tabela 35: Vezivanje za aktivirane humane CD3+ CD8+ T ćelije i CD3+ CD4+ T ćelije
Slike 8A i 8B prikazuju vezivanje konstrukata 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 i 2.6 kao što su pripremljeni u primeru 2 za CD4+ i CD8+ iz sveže ljudske krvi i za aktivirane 4-1BB-eksprimirajuće CD4+ T ćelije i CD8+ T ćelije. Gejtovi su postavljeni na žive CD45+ CD3+ CD4+ ili CD45+ CD3+ CD8+ T ćelije, i MFI PE-konjugovanog AffmiPure antihumanog kozjeg IgG F(ab')2 fragmenta specifičnog za Fcγ fragment IgG predstavljeni su u odnosu na titrisanu koncentraciju ciljanih split trimernih Fc fuzionih varijanti 4-1BB liganda. Tabela 36 prikazuje vrednosti EC50izmerene za konstrukte 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 i 2.6.
Tabela 36: Vezivanje za aktivirane CD4+ T ćelije koje eksprimiraju 4-1BB i CD8+ T ćelije
22
5.2 Vezivanje FAP ciljanog Fc fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda za aktivirane mišje splenocite
Mišje slezine su sakupljene u 3 ml PBS i suspenzija pojedinačnih ćelija je stvorena pomoću epruveta gentle MACS (Miltenyi Biotec kat. br. 130-096-334) i disocijatora gentleMACS Octo (Miltenyi Biotec). Nakon toga, splenociti su filtrirani kroz filtere za prethodno razdvajanje od 30 µm (Miltenyi Biotec kat. br.130-041-407) i centrifugirani 7 min na 350 x g i 4 °C. Supernatant je aspiriran, i ćelije su ponovo suspendovane u RPMI1640 medijumu sa dodatkom 10% (V/V) FBS, 1% (V/V) glutaMAX-I, 1 mM natrijum piruvatom, 1% (V/V) MEM neesencijalnim aminokiselinama, 50 µM β-merkaptoetanolom i 10% penicilinom-streptomicinom (SIGMA, kat. br. P4333). 10<6>ćelija/ml uzgajano je 2 dana na pločici za kulturu tkiva sa 6 bunarčića obloženom sa 10 µg/ml anti-mišjeg IgG CD3ε jermenskog hrčka (klon 145-2C11, BioLegend, kat. br. 100331) i 2 µg/ml anti-mišjeg IgG CD28 sirijskog hrčka (klon 37.51, BioLegend, kat. br.102102).
Aktivirani mišji splenociti su sakupljeni, isprani u DPBS-u, prebrojani i 0,1 x 10<6>ćelija je prebačeno u svaki bunarčić tretirane ploče koja nije za uzgajanje tkiva sa 96 bunarčića sa dnom u obliku slova U. Supernatant je uklonjen, i ćelije su obojene u 100 µl/bunarčiću DPBS koji je sadržao fiksabilnu boju za vijabilnost eF660 razblaženu 1:5000 (Bioscience, kat. br.
65-0864-18) tokom 30 minuta na 4 °C. Ćelije su isprane PBS-om i obojene u 50 ul FACS pufera koji sadrži različitu koncentraciju FAP ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (FAP split 4-1BBL trimer), neciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (DP47 split 4-1BBL trimer) ili anti-mišjeg CD137 humanog IgG1 P329G LALA mAb (klon Lob.12.3, BioXcell kataloški br.: BE0169). Ćelije su inkubirane tokom 120 minuta na 4 °C. Ćelije su isprane četiri puta FACS puferom i obojene u 50 µl/bunarčiću FACS pufera koji sadrži 10 µg/ml prečišćenog antimišjeg CD16/CD32 IgG pacova-Fc bloka (BD Pharmingen, kat. br. 553142, klon 2.4G2), 5 µg/ml antimišjeg CD8b pacova IgG2bκ-FITC (BioLegend, kat. br. 126606, klon YTS156.7.7), 0,67 µg/ml antimišjeg CD3 pacova IgG2bκ-APC-Cy7 (BioLegend, kat. br. 100222, klon 17A2),
2
0,67 µg/ml antimišjeg CD4 pacova IgG2bκ-PE-Cy7 (BioLegend, kat. br.100422, klon GK1.5), 2 µg/ml antimišjeg NK1.1 miša (C3H x BALB/c) IgG2aκ-PerCp-Cy5.5 (BioLegend, kat. br.
108728, klon PK136) i 10 µg/ml PE-konjugovanog AffmiPure poliklonskog antihumanog kozjeg IgG F(ab')2 fragmenta specifičnog za Fcγ fragment, minimalne unakrsne reaktivnosti na proteine seruma goveda, miša i zeca (Jackson ImmunoResearch, kat. br. 109-116-170) u trajanju od 30 minuta na 4 °C. Ćelije su isprane dva puta sa 200 µl/bunarčiću hladnog FACS pufera. Ćelije su fiksirane sa 50 µl/bunarčiću DPBS koji je sadržavao 1% formaldehida. Ćelije su ponovo suspendiovane u FACS puferu i snimljene sledećeg dana pomoću 5-laserskog LSR-Fortessa (BD Bioscience sa softverom DIVA).
Kao što je prikazano na slici 9, FAP ciljani Fc fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer hu4-1BB liganda (FAP split hu4-1BBL trimer) i neciljani Fc fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer hu4-1BB liganda (DP47 split hu4-1BBL trimer) ne vezuju se za mišji 4-1BB. Zbog toga se aktivnost ne može testirati na imunološki kompetentnim miševima. Za studije načina delovanja in vivo, moraju se koristiti humanizovani modeli miša kod imunološki nekompetentnih miševa ili surogati koji sadrže mišje trimere 4-1BBL kao što je prikazano na slici 3.
5.3 Vezivanje za tumorske ćelije koje eksprimiraju FAP
Kod testova vezivanja za ćelije koje eksprimiraju FAP, korišćena je ćelijska linija humanog melanoma MV-3 (vidi Ruiter et al., Int. J. Cancer 1991, 48(1), 85-91), WM-266-4 (ATTC CRL-1676) ili ćelijska linija NIH/3T3-huFAP klona 39. Da bi se stvorila poslednja ćelijska linija, NIH/3T3 ćelije su transfektovane humanim FAP (NIH/3T3-huFAP klon 39). Ćelije su generisane transfekcijom NIH/3T3 ćelija embrionskog fibroblasta miša (ATCC CRL-1658) sa ekspresijom pETR4921 plazmida koji kodira humani FAP pod CMV promoterom. Ćelije su održavane u prisustvu 1,5 µg/ml puromicina (InvivoGen, kat. br.: ant-pr-5). 0,1 x 10<6>tumorskih ćelija koje eksprimiraju FAP dodato je u svaki bunarčić ploča sa 96 bunarčića sa okruglim dnom za suspenzione ćelije (Greiner bio-one, cellstar, kat. br.
650185). Ćelije su jednom isprane sa 200 µL DPBS, i peleti su ponovo suspendovani. Dodato je 100 µl/bunarčiću hladnog DPBS pufera na 4 °C koji sadrži fiksabilnu boju za vijabilnost eFluor 450 razblaženu 1:5000 (eBioscience, kat. br. 65-0863-18) ili fiksabilnu boju za vijabilnost eFluor 660 (eBioscience, kat. br.65-0864-18), i ploče su inkubirane 30 minuta na 4 °C. Ćelije su jednom isprane sa 200 µl hladnog DPBS pufera na 4 °C i ponovo suspendovane u 50 µl/bunarčiću hladnog FACS pufera na 4 °C (DPBS je dopunjen sa 2% (V/V) FBS, 5 mM EDTA pH 8 (Amresco, kat. br. E177) i 7,5 mM natrijum azidom (Sigma-Aldrich S2002) koji sadrži različite koncentracije titrisanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže
2 1
trimer 4-1BBL, nakon čega sledi inkubacija 1 sat na 4 °C. Nakon ispiranja četiri puta sa 200 µl/bunarčiću, ćelije su obojene sa 50 µl/bunarčiću hladnog FACS pufera na 4 °C koji je sadržao 30 µg/ml FITC-konjugovanog AffiniPure antihumanog kozjeg F(ab')2fragmenta specifičnog za Fcγ fragment IgG (Jackson ImmunoResearch, kat. br. 109-096-098) ili 5 µg/ml PE-konjugovanog AffiniPure antihumanog kozjeg F(ab')2 fragmenta specifičnog za Fcγ fragment IgG (Jackson ImmunoResearch, kat. br. 109-116-098 ili 109-116-170) tokom 30 minuta na 4 °C. Ćelije su isprane dva puta sa 200 µl FACS pufera na 4 °C i zatim ponovo suspendovane u 50 µl/bunarčiću DPBS koji sadrži 1% formaldehid. Istog ili sledećeg dana, ćelije su ponovo suspendovane u 100 µl FACS pufera i snimljene korišćenjem 5-laserskog LSR-Fortessa (BD Bioscience sa softverom DIVA) ili 3-laserskog analizatora Miltenyi Quant 10 (Mitenyi Biotec) i Flow Jo (FlowJo X10.0.7).
Kao što je prikazano na slici 10, FAP ciljani Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekul koji sadrži trimer 4-1BB liganda (FAP split 4-1BBL trimer) konstrukt 1.1, ali ne neciljani konstrukt, koji sadrži Fab DP47 (DP47 split 4-1BBL trimer) kontrola A, efikasno se vezao za ćelije melanoma (10A) MV-3 koje eksprimiraju humani protein aktivacije fibroblasta (FAP) ili ćelije (10B) WM-266-4.
Slika 11A prikazuje vezivanje konstrukata 1.1 do 1.10 kako su pripremljeni u primeru 1 za ćelije humanog melanoma MV-3 koje eksprimiraju humani FAP, a na slici 11B predstavljeno je vezivanje konstrukta 1.1, 1.2, 1.3 i 1.5 za humani FAP koji eksprimira NIH/3T3-huFAP klon 39 transficiranih mišjih ćelija embrionskih fibroblasta. Tabela 37 pokazuje izmerene vrednosti EC50za konstrukte 1.1 do 1.10.
Tabela 37: Vezivanje za humane tumorske ćelije koje eksprimiraju FAP
2 2
Na slici 12 prikazano je vezivanje različitih FAP (4B9) ciljanih ili neciljanih split trimernih humanih 4-1BB liganada Fc (kih) konstrukata za ćelije humanog melanoma MV-3 koje eksprimiraju humani FAP (Slika 12A) i WM-266-4 ćelije (Slika 12B). Konstrukti 2.1, 2.3, 2.4, 2.5 i 2.6 su pripremljeni kako je opisano u primeru 2, a kontrole su pripremljene kao što je prethodno opisano. Gejtovi su postavljeni na žive ćelije tumora, i MFI PE-konjugovanog AffiniPure antihumanog kozjeg IgG F(ab')2 fragmenta specifičnog za Fcγ fragment IgG su predstavljeni u odnosu na titrisanu koncentraciju ciljanih split trimernih 4-1BB liganda Fc fuzionih konstrukata. Tabela 38 prikazuje vrednosti EC50kako su izmerene.
Tabela 38: Vezivanje za humane tumorske ćelije koje eksprimiraju FAP
5.4 Funkcionalna karakterizacija mišjih ciljanih Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
5.4.1 Vezivanje za aktivirane mišje splenocite
Mišje slezine su sakupljene u 3 ml PBS i suspenzija pojedinačnih ćelija je stvorena pomoću epruveta gentle MACS (Miltenyi Biotec kat. br. 130-096-334) i disocijatora gentleMACS Octo (Miltenyi Biotec). Nakon toga, splenociti su filtrirani kroz filtere za prethodno razdvajanje od 30 µm (Miltenyi Biotec kat. br. 130-041-407) i centrifugirani 7 minuta na 350 x g i 4 °C. Supernatant je aspiriran, i ćelije su ponovo suspendovane u RPMI1640 medijumu sa dodatkom 10% (V/V) FBS, 1% (V/V) glutaMAX-1, 1 mM natrijum piruvata, 1% (V/V) MEM neesencijalnih aminokiselina, 50 µM β-merkaptoetanola.
Kod vezivanja za sveže mišje splenocite, ćelije su korišćene direktno. Da bi se
2
indukovala ekspresija mišjeg 4-1BB na T ćelijama, mišji splenociti su aktivirani na sledeći način: 10<6>ćelija/ml uzgajano je 2 dana na pločici za kulturu tkiva sa 6 bunarčića obloženom sa 10 µg/ml anti-mišjeg IgG CD3ε jermenskog hrčka (klon 145-2C11, BioLegend, kat. br.
100331) i 2 µg/ml anti-mišjeg IgG CD28 sirijskog hrčka (klon 37.51, BioLegend, kat. br.
102102).
Prikupljeni su sveži mišji splenociti ili aktivirani mišji splenociti, isprani u DPBS (Gibco life technologies, kat. br.14190-136), prebrojani, i 0,1 x 10<6>ćelija je prebačeno u svaki bunarčić tretirane ploče koja nije za uzgajanje tkiva sa 96 bunarčića sa okruglim dnom (Greiner bio-one, cell star, kat. br. 650185). Supernatant je uklonjen, i ćelije su obojene u 100 ul/bunarčiću hladnog DPBS na 4 °C koji sadrži 1:1000 razblaženi LIVE/DEAD fiksabilni vodeni komplet za bojenje mrtvih ćelija (Life Technologies, L34957) tokom 30 minuta na 4 °C. Ćelije su isprane hladnim DPBS i obojene u 50 ul/bunarčiću hladnog FACS pufera (DPBS sa dodatkom 2% (V/V) FBS, 5 mM EDTA pH 8 (Amresco, kat. br. E177) i 7,5 mM natrijum azida (Sigma-Aldrich S2002)) koji sadrži različite koncentracije Fc(kih) fuzionih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda ili mišju IgG1 κ izotipsku kontrolu (BioLegend, kat. br.400153, klon MOPC-21). Ćelije su inkubirane 120 minuta na 4 °C, isprane četiri puta hladnim DPBS-om i obojene u 50 µl/bunarčiću hladnog FACS pufera koji sadrži 30 µg/ml FITC-konjugovanog antimišjeg kozjeg IgG F(ab')2 fragmenta specifičnog za Fcγ IgG (Jackson Immunoresearch, kat. br.115-096-071) tokom 30 minuta na 4 °C. Nakon toga, ćelije su isprane dva puta hladnim DPBS-om i obojene sa 50 µl/bunarčiću FACS pufera sa 10 µg/ml prečišćenog anti-mišjeg CD16/CD32 Fc bloka IgG pacova (BD Pharmingen, kat. br.553142, klon 2.4G2), 0,67 µg/ml anti-mišjeg CD8a-APC-Cy7 (BioLegend, kat. br. 100714, klon 53-6,7), 0,67 µg/ml anti-mišjeg CD3ε-PerCP-Cy5.5 (BioLegend, kat. br. 100328, klon 145-2C11), 0,67 µg/ml anti-mišjeg CD4 pacova IgG2bκ-PE-Cy7 (BioLegend, kat. br.100422, klon GK1,5) tokom 30 minuta na 4 °C. Ćelije su isprane dva puta sa 200 µl/bunarčiću hladnog DPBS, fiksirane sa 50 µl/bunarčiću DPBS koji sadrži 1% formaldehida i ponovo suspendovane u FACS puferu. Ćelije su snimljene upotrebom 3-laserskog analizatora MACSQuant 10 (Miltenyi Biotech) i Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC). Gejtovi su postavljeni na CD3<+>CD8<+>ili CD3<+>CD4<+>T ćelije, a medijana intenziteta fluorescencije (MFI) FITC-konjugovanog antimišjeg kozjeg IgG F(ab')2 specifičnog za Fc gama IgG analizirana je i normalizovana oduzimanjem MFI prazne kontrole (bez dodatka mišjeg Fc(kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda). MFI je predstavljen u odnosu na koncentracije upotrebljenih mišjih Fc(kih) fuzionih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda da se prikaže vezivanje za mišji 4-1BB ćelijski vezani molekul.
2 4
Kao što se može videti na slici 13, mišji 4-1BBL konstrukti M.1 i M.2, kao i odgovarajući kontrolni molekuli kontrola M.1 i kontrola M.2, vezuju se sa prilično sličnim afinitetom za mišji 4-1BB. Tabela 39 pokazuje vrednosti EC50izmerene za konstrukte M.1 i M.2 i kontrolne molekule.
Tabela 39: Vezivanje za aktivirane CD4+ T ćelije koje eksprimiraju 4-1BB i CD8+ T ćelije
5.4.2 Vezivanje za tumorske ćelije koje eksprimiraju FAP
Kod testova vezivanja za ćelije koje eksprimiraju FAP, korišćena je ćelijska linija humanog melanoma MV-3 (vidi Ruiter et al., Int. J. Cancer 1991, 48(1), 85-91) i WM-266-4 (ATTC CRL-1676) (anti-FAP specifični klon 28H1 je miš/čovek-unakrsno reaktivni).0,1 x 10<6>tumorskih ćelija koje eksprimiraju FAP dodato je u svaki bunarčić ploča sa 96 bunarčića sa okruglim dnom za suspenzione ćelije (Greiner bio-one, cellstar, kat. br. 650185). Ćelije su isprane jednom sa 200 µl hladnog DPBS, i peleti su ponovo suspendovani u 100 µl/bunarčiću hladnog DPBS pufera na 4 °C koji sadrži 1:1000 razblaženi LIVE/DEAD fiksabilni vodeni komplet za bojenje mrtvih ćelija (Life Technologies, L34957) i inkubirane tokom 30 minuta na 4 °C. Ćelije su jednom isprane sa 200 µl hladnog DPBS pufera i ponovo suspendovane u 50 µl/bunarčiću hladnog FACS pufera (DPBS sa dodatkom 2% (V/V) FBS, 5 mM EDTA pH 8 (Amresco, kat. br. E177) i 7,5 mM natrijum azida (Sigma-Aldrich S2002)) koji sadrži mišje Fc(kih) fuzione molekule koji sadrže trimer 4-1BB liganda u seriji koncentracija, a zatim inkubirane tokom 1 sata na 4 °C. Nakon ispiranja četiri puta sa 200 µl DPBS/bunarčiću, ćelije su obojene sa 50 µl/bunarčiću hladnog FACS pufera na 4 °C koji sadrži 30 µg/ml FITC-konjugovanog anti-mišjeg IgG Fc-gama-specifičnog kozjeg IgGF(ab')2 (Jackson Immunoresearch, kat. br.115-096-071) tokom 30 minuta na 4 °C. Ćelije su dva puta isprane sa 200 µl/bunarčiću hladnog DPBS pufera, fiksirane sa 50 µl/bunarčiću DPBS koji sadrži 1% formaldehida i ponovo suspendovane u FACS puferu. Ćelije su snimljene upotrebom
2
3-laserskog analizatora MACSQuant 10 (Miltenyi Biotech) i Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC). Gejtovi su postavljeni na žive ćelije, a medijana intenziteta fluorescencije (MFI) FITC-konjugovanog antimišjeg kozjeg IgG F(ab')2 specifičnog za Fc gama IgG analizirana je i normalizovana oduzimanjem MFI prazne kontrole (bez dodatka mišjeg Fc(kih) fuzionog molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda). MFI je predstavljen u odnosu na koncentraciju upotrebljenih mišjih Fc(kih) fuzionih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda da bi se prikazalo vezivanje za mišji 4-1BB ćelijski vezani molekul. Kao što se očekivalo, mišji 4-1BBL konstrukti M.1 i M.2 vezuju se sa prilično sličnim afinitetom za FAP, dok se kontrolni molekuli ne vezuju.
Na slici 14 prikazano je vezivanje FAP ciljanih ili neciljanih split trimernih mišjih 4-1BB liganada Fc (kih) konstrukata M.1 i M.2 za ćelije humanog melanoma MV-3 koje eksprimiraju humani FAP (Slika 14A) i WM-266-4 ćelije (Slika 14B). Tabela 40 prikazuje vrednosti EC50kako su izmerene.
Tabela 40: Vezivanje za humane tumorske ćelije koje eksprimiraju FAP
Primer 6
Biološka aktivnost ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
6.1. Aktivacija NF-κB u HeLa ćelijama koje eksprimiraju humani 4-1BB Generisanje HeLa ćelija koje eksprimiraju humani 4-1BB i NF-κB-luciferazu Ćelijska linija HeLa karcinoma grlića materice (ATCC CCL-2) transdukovana je plazmidom na osnovu ekspresionog vektora pETR10829, koji sadrži sekvencu humanog 4-1BB (Uniprot pristup Q07011) pod kontrolom CMV-promotera i gena otpornosti na puromicin. Ćelije su kultivisane u DMEM medijumu dopunjenom sa 10% (V/V) FBS, 1% (V/V) GlutaMAX-I i 3 µg/ml puromicina.
HeLa ćelije-transdukovane sa 4-1BB testirane su na ekspresiju 4-1BB protočnom citometrijom: 0,2x10<6>živih ćelija je ponovo suspendovano u 100 µl FACS pufera koji sadrži 0,1 µg PerCP/Cy5.5 konjugovanog antihumanog 4-1BB mišjeg IgG1κ klona 4B4-1
2
(BioLegend kat. br.309814) ili njegove izotipske kontrole (PerCP/Cy5.5 konjugovani klon IgG1κ mišje izotipske kontrole, MOPC-21, BioLegend kat. br.400150) i inkubirano 30 minuta na 4 °C. Ćelije su isprane dva puta FACS puferom, ponovo suspendovane u 300 µl FACS pufera koji sadrži 0,06 µg DAPI (Santa Cruz Biotec, kat. br. Sc-3598) i snimljene upotrebom 5-laserskog LSR-Fortessa (BD Bioscience, softver DIVA). Napravljena su ograničena razblaženja kako bi se stvorili pojedinačni klonovi kako je opisano: HeLa ćelije transdukovane humanim 4-1BB su ponovo suspendovane u medijumu do gustine od 10, 5 i 2,5 ćelija/ml, a 200 µl ćelijskih suspenzija preneto je na ploče sa 96 bunarčića okruglog dna tretirane kulturom tkiva (6 ploča/koncentraciji ćelija, TPP kat. br. 92697). Pojedinačni klonovi su sakupljeni, umnoženi i testirani na 4-1BB ekspresiju kako je gore opisano. Klon sa najvećom ekspresijom 4-1BB (klon 5) odabran je za naknadnu transfekciju ekspresionim vektorom NF-κB-luciferaze 5495p Translucent HygB. Vektor transficiranim ćelijama daje otpornost na higromicin B i sposobnost ekspresije luciferaze pod kontrolom elementa odgovora NF-κB (vektor okosnice Panomics, kat. br. LR0051 sa uvedenom otpornošću na HyB). Humane-4-1BB HeLa klon 5 ćelije uzgajane su do 70% konfluencije. Dodato je 50 µg (40 µl) linearizovanog (restriktivni enzimi Asel i SaiI) 5495p Tranlucent HygB ekspresionog vektora u sterilnu kivetu Gene Pulser/MicroPulser od 0,4 cm (Biorad, kat. br. 165-2081). Dodato je 2,5x10<6>ćelija humanog 4-1BB klona HeLa ćelija 5 u 400 µl DMEM medijuma bez suplemenata, i pažljivo je pomešano sa rastvorom plazmida. Transfekcija ćelija izvršena je totalnim sistemom Gene Pulser Xcell (Biorad, kat. br.165-2660) pri sledećim postavkama: eksponencijalni impuls, kapacitet 500 µF, napon 160 V, otpornost ∞. Odmah nakon impulsa, transfektovane ćelije su prebačene u bocu za uzgajanje tkiva od 75 cm<2>(TPP, kat. br.90075) sa 15 ml toplog DMEM medijuma na 37 °C sa dodatkom 10% (V/V) FBS i 1% (V/V) GlutaMAX-1. Sledećeg dana, dodat je medijum za uzgajanje koji sadrži 3 µg/ml puromicina i 200 µg/ml higromicina B (Roche, kat. br.
10843555001). Preživele ćelije su umnožene, i izvršeno je ograničeno razblaživanje kako je gore opisano da bi se stvorili pojedinačni klonovi.
Klonovi su testirani na ekspresiju 4-1BB kao što je gore opisano i na NF-κB-luciferaznu aktivnost kako sledi: Klonovi su sakupljeni u selekcionom medijumu i prebrojani su pomoću brojača ćelija Vi-cell xr 2.03 (Beckman Coulter, kat. br. 731050). Ćelije su postavljene na gustinu ćelija od 0,33x10<6>ćelija/ml, i 150 μl ove suspenzije ćelija je prebačeno u svaki bunarčić sterilne bele ploče za kuturu tkiva sa poklopcem sa 96 bunarčića ravnog dna (Greiner Bio-One, kat. br.655083) i - kao kontrola - na normalnu ploču za kuturu tkiva sa 96 bunarčića ravnog dna (TPP kat. br. 92096), kako bi se sledeći dan testiralo preživljavanje i gustina ćelija. Ćelije su inkubirane na 37 °C i 5% CO2preko noći. Sledećeg dana, 50 µl medijuma koji sadrži različite
2
koncentracije rekombinantnog humanog faktora nekroze tumora alfa (rhTNF-α, PeproTech, kat. br. 300-01A) dodato je u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića, što je dalo konačnu koncentraciju rhTNF-α od 100, 50, 25, 12,5, 6,25 i 0 ng/bunarčiću. Ćelije su inkubirane 6 sati na 37 °C i 5% CO2, a zatim isprane tri puta sa 200 µl/bunarčiću DPBS. Reporterski pufer za lizu (Promega, kat. br.: E3971) dodat je u svaki bunarčić (40 µl), i ploče su čuvane tokom noći na -20 °C. Sutradan, zamrznute ćelijske ploče i detekcioni pufer (Luciferase 1000 Assay System, Promega, kat. br. E4550) otopljeni su do sobne temperature. U svaki bunarčić je dodato 100 ul detekcionog pufera, i ploča je izmerena što je brže moguće pomoću čitača mikroploča SpectraMax M5/M5e i softvera SoftMax Pro (Molecular Devices). Izmerene jedinice oslobođene svetlosti za 500 ms/bunarčiću (URL-ovi) iznad kontrole (nije dodat rhTNF-α) uzete su kao aktivnost luciferaze. NF-κB-luc-4-1BB-HeLa klon 26 koji pokazuje najveću aktivnost luciferaze i značajan nivo ekspresije 4-1BB, i izabran je za dalju upotrebu.
Aktivacija NF-κB u Hela ćelijama koje eksprimiraju humani 4-1BB kokultivisan sa FAP-eksprimirajućim tumorskim ćelijama
NF-κB-luciferaza humane 4-1BB HeLa ćelije su sakupljene i ponovo suspendovane u DMEM medijumu sa dodatkom 10% (V/V) FBS i 1% (V/V) GlutaMAX-1 do koncentracije od 0,2 x 10<6>ćelija/ml.100 µl (2 x 10<4>ćelija) ove ćelijske suspenzije preneto je u svaki bunarčić sterilne bele ploče za uzgajanje tkiva sa poklopcem sa 96 bunarčića ravnog dna (greiner bio-one, kat. br.655083) i ploča je inkubirana na 37 °C i 5% CO2preko noći. Sledećeg dana, dodato je 50 µl medijuma koji sadrži titrisane koncentracije FAP ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (FAP split 4-1BBL trimer) ili DP47-neciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (DP47 split 4-1BBL trimer). FAP-eksprimirajuće tumorske ćelije (MV3, WM-266-4 ili NIH/3T3-huFAP klon 39) ponovo su suspendovane u DMEM medijumu sa dodatkom 10% (V/V) FBS i 1% (V/V) GlutaMAX-1 do koncentracije od 2 x 10<6>ćelija/ml.
Suspenzija FAP-eksprimirajućih tumorskih ćelija (50 µl, konačni odnos 1:5) ili samo medijum su dodati u svaki bunarčić, i ploče su inkubirane 6 sati na 37 °C i 5% CO2. Ćelije su isprane dva puta sa 200 µl/bunarčiću DPBS.40 µl sveže pripremljenog reporterskog pufera za lizu (Promega, kat. br.: E3971) dodato je u svaki bunarčić i ploča je čuvana preko noći na -20 °C. Sutradan, zamrznuta ćelijska ploča i detekcioni pufer (Luciferase 1000 Assay System, Promega, kat. br. E4550) odmrznuti su na sobnoj temperaturi. U svaki bunarčić je dodato 100 µl detekcionog pufera, a aktivnost luciferaze je izmerena što je brže moguće pomoću čitača mikroploča SpectraMax M5/M5e i softvera SoftMax Pro (Molecular Devices) za brojanje emisije svetlosti u URL-ima (jedinice oslobođene svetlosti za 0,5 s/bunarčiću), ili Victor31420
2
višeznačnog brojača čitača ploča (Perkin Elmer) i softvera Perkin Elmer 2030 Manager za brojanje svetlosne emisije kao broja u sekundi (CPS), i predstavljena u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata.
FAP ciljani Fc fuzioni antigen vezujući molekul koji sadrži trimer 4-1BB liganda (FAP split 4-1BBL trimer) pokrenuo je aktivaciju NFκB signalnog puta u reporterskoj ćelijskoj liniji u prisustvu tumorskih ćelija koje eksprimiraju FAP. Nasuprot tome, neciljana varijanta istog molekula nije uspela da pokrene takav efekat ni na jednoj od testiranih koncentracija (Slika 16). Ova aktivnost ciljanih 4-1BBL bila je strogo zavisna od ekspresije FAP na ćelijskoj površini tumorskih ćelija, jer se kultivacijom NF-kB reporterskih ćelijskih linija sa FAP-negativnim tumorskim ćelijama ne može otkriti aktivacija NF-kB čak ni u prisustvu FAP ciljanog Fc fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda. Aktivnosti izmerene za konstrukte 1.1 do 1.10 prikazane su na slici 17, a podaci izmereni za konstrukte 2.1, 2.4 i 2.5 prikazani su na slici 18.
6.2. Aktivacija NFκB u ćelijama HEK T293 koje eksprimiraju 4-1BB majmuna cinomolgusa
Genisanje HEK T293 ćelija koje eksprimiraju 4-1BB majmuna cinomolgusa i NFκB-luciferazu
Za proizvodnju čestica nalik na viruse (VLP) humani embrionski bubreg (HEK) T293/17 (ATCC CRL-11268) transficiran je primenom reagensa Lipofectamine® LTX sa reagensom PLUS™ (Life Technologies, kat. br. 15338100) sa vektorom pETR14372 koji kodira NFκB-luciferaza-IRIS-GFP kasetu reporter gena (NFκB-1uc-GFP) prema protokolu proizvođača. 6 sati kasnije izvršena je zamena DMEM-a 10% FBS medijumom, i VLP je skupljen 4 dana kasnije. Sveže HEK293T ćelije su transdukovane pri konfluenciji od 70-80% sa proizvedenim pETR14372-VLP i 4 µg/ml polibrena. Ćelije su uzgajane tokom 24 sata, i izvršena je zamena medijuma. Transdukovane HEK T293/17 ćelije su sakupljene, i izvršeno je ograničeno razblaživanje od 1 ćelije/bunarčiću da bi se pretražili stabilni pojedinačni klonovi. Pojedinačni klonovi su stimulisani sa 25 ng/ml TNF-α (PeproTech Inc., kat. br. 300-01 A) u medijumu, i tokom vremena su testirani na pozitivan GFP signal pomoću Incuyte Zoom fluorescentnog mikroskopskog sistema (Essen Bioscience). Nakon snimanja signala GFP, ćelije su testirane na aktivnost luciferaze pomoću Nano Glo luciferaznog kompleta (Promega, N1120) prema protokolu proizvođača. Aktivnost luciferaze izmerena je korišćenjem Victor3 1420 višeznačnog brojača čitača ploča (Perkin Elmer) i softvera Perkin Elmer 2030 Manager. Emisija svetlosti je određena u brojevima po sekundi (CPS) za 0,5 s/bunarčiću. Klon 61 je pokazao najveću ekspresiju GFP i luciferaze nakon aktiviranja TNF-α, i dalje je korišćen za
2
stvaranje reporterske ćelijske linije.
Kao što je prethodno opisano, novi VLP su proizvedeni korišćenjem vektora pETR14879 koji kodira 4-1BB majmuna cinomolgusa i otpornost na puromicin, a ćelijska linija HEK293T NFκB-fluc-GFP klon 61 transdukovana je pri konfluenciji od 70-80% sa proizvedenim pETR14879-VLP i 4 µg/ml polibrena. Ćelije su uzgajane tokom 24 sata, i izvršena je zamena medijuma. Četiri dana nakon transdukcije, ćelije su obojene PE-konjugovanim anti-humanim cinomolgus-unakrsno reaktivnim 4-1BB antitelom (mišji IgG1κ, klon MOPC-21, BioLegend, kat. br.309804) u DPBS koji sadrži 1% FBS, razvrstane su po FACS (ARIA, BD) i zasejane sa 5 ćelija/bunarčiću u DMEM-u koji je dopunjen 10% FBS medijumom koji sadrži 1 µg/ml puromicina (InvivoGen, kat. br. ant-pr). Uzgajani klonovi su testirani kao što je opisano na aktivnost GFP i luciferaze nakon stimulacije TNF-α i na visoku ekspresiju 4-1BB majmuna cinomolgusa putem protočne citometrije. Dvostruki pozitivni klonovi su odabrani i testirani na aktivnost luciferaze u prisustvu jednovalentnih FAP-ciljanih konstrukata 2.1 ili kontrole B i FAP eksprimirajućih MV-3 ili WM-266-4 ćelija. HEK T293/17-NF-κB-luc-GFP-cy4-1BB eksprimirajući klon 61-13 odabran je za upotrebu u svim daljim eksperimentima.
NFκB aktivacija HEK T293/17 reporterskih ćelija koje eksprimiraju 4-1BB majmuna cinomolgusa kokultivisanih sa FAP-eksprimirajućim tumorskim ćelijama
Ćelije HEK T293/17-NF-κB-luc-GFP-cy4-1BB eksprimirajućeg klona 61-13 su sakupljene i ponovo suspendovane u DMEM medijumu sa dodatkom 10% (V/V) FBS i 1% (V/V) GlutaMAX-I do koncentracije od 0,2 x 10<6>ćelija/ml.100 µl (2 x 10<4>ćelija) ove ćelijske suspenzije preneto je u svaki bunarčić sterilne bele ploče za uzgajanje tkiva sa poklopcem sa 96 bunarčića ravnog dna (greiner bio-one, kat. br.655083) i ploča je inkubirana na 37 °C i 5% CO2preko noći. Sledećeg dana dodato je 50 µl medijuma koji sadrži različite titrisane koncentracije FAP ciljanih ili neciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda. FAP-eksprimirajuće tumorske ćelije (MV3 i WM-266-4) su ponovo suspendovane u medijumu do koncentracije od 2 x 10<6>ćelija/ml. Suspenzija FAP-eksprimirajućih tumorskih ćelija (50 μl) dodata je u svaki bunarčić, i ploče su inkubirane 6 sati na 37 °C i 5% CO2. Principi eksperimenta prikazani su na Slici 19. Nakon inkubacije, ćelije su isprane tri puta sa 200 µl/bunarčiću DPBS. 40 µl sveže pripremljenog reporterskog pufera za lizu (Promega, kat. br.: E3971) dodato je u svaki bunarčić, i ploče su čuvane preko noći na -20 °C. Sutradan, zamrznute ćelijske ploče i detekcioni pufer (Luciferase 1000 Assay System, Promega, kat. br. E4550) odmrznuti su na sobnoj temperaturi. U svaki bunarčić je dodato 100 µl detekcionog pufera, i aktivnost luciferaze je izmerena što je brže moguće pomoću čitača mikroploča SpectraMax
24
M5/M5e (Molecular Devices) (vreme integracije 500 ms, bez filtera koji sakuplja sve talasne dužine). Emisija svetlosti je merena u jedinicama oslobođene svetlosti (URL) za 0,5 s/bunarčiću i predstavljena u odnosu na koncentraciju testiranih FAP ciljanih ili neciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda. Rezultati za konstrukte iz primera 2 prikazani su na slici 20.
6.3 Test na bazi antigen specifičnih CD8+ T ćelija
Izolacija i uzgajanje antigen specifičnih CD8 T ćelija
Sveža krv je dobijena od volontera inficiranog sa HLA-A2+ CMV. PBMC su izolovani kako je gore opisano. CD8 T ćelije su prečišćene iz PBMC upotrebom kompleta za negativnu selekciju za izolaciju humane CD8 T ćelije prema preporukama proizvođača (Miltenyi Biotec, kat. br.130-094-156). Deset miliona izolovanih CD8 T ćelija je ponovo suspendovano u 1 ml sterilnog DPBS uz dodatak 1% (V/V) FBS zajedno sa 50 µl PE-obeleženog HLA-A2-pentamera koji sadrži NLVPMVATV peptid dobijen od CMV (Prolmmune, kat. br. F008-2B) i inkubirano tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane dva puta sa 3 ml sterilnog DPBS sa 1% (V/V) FBS. Ćelije su ponovo suspendovane u 1 ml ćelijskog DPBS sa dodatkom 1% (V/V) FBS koji sadrži 1 µg/ml anti-humanog CD8-FITC (klon LT8, Abcam, kat. br. Ab28010) i inkubirane tokom 30 minuta na 4 °C. Ćelije su isprane dva puta, ponovo suspendovane do koncentracije od 5x10<6>ćelija/ml u DPBS sa dodatkom 1% (V/V) FBS i filtrirane kroz ćelijsku cediljku od najlonske mreže za prethodno razdvajanje od 30 µm (Miltenyi Biotec, kat. br.130-041-407). CD8+ T ćelije specifične za NLV peptid izolovane su sortiranjem FACS korišćenjem sortirača ćelija ARIA (BD Bioscience sa softverom DIVA) sa sledećim postavkama: mlaznica 100 µm i maska za sortiranje čistoće. Sortirane ćelije su sakupljene u polipropilensku epruvetu za centrifugiranje od 15 ml (TPP, kat. br. 91015) koja sadrži 5 ml RPMI 1640 medijuma sa dodatkom 10% (V/V) FBS, 1% (V/V) GlutaMAX-I i 400 U/ml proleukina. Sortirane ćelije su centrifugirane tokom 7 minuta na 350 x g na sobnoj temperaturi i ponovo suspendovane u istom medijumu do koncentracije od 0,53 x 10<6>ćelija/ml.
100 µl/bunarčiću ove ćelijske suspenzije dodato je u svaki bunarčić prethodno pripremljene ploče za punjenje.
PHA-L aktivirane ozračene alogene fider ćelije pripremljene su od PBMC kao što je prethodno opisano (Levitsky et al., 1998) i distribuirane na ploče sa 96 bunarčića sa 2x10<5>fider ćelija po bunarčiću.
Nakon jednog dana uzgajanja, 100 µl medijuma/bunarčiću uklonjeno je iz bunarčića koji sadrži sortirane CD8+ T-ćelije i zamenjen je novim RPMI1640 medijumom sa 10% (V/V) FBS i 1% (V/V) GlutaMAX-I i 400 U/ml proleukina, ovo je redovno ponavljano tokom uzgajanja (svaka 2-4 dana). Čim su ćelije počele da se razmnožavaju, prebačene su na ploču sa 24 bunarčića sa ravnim dnom za kulture tkiva (TPP, 92024). Ćelije su umnožene/podeljene i reaktivirane redovnom ponovnom pripremom novih fider ćelija.
Ispitivanje aktivacije antigen-specifičnih CD8+ T ćelija
MV3 ćelije su sakupljene i isprane sa DPBS, i 2 x 10<7>ćelija je ponovo suspendovano u 250 µl C razblaživača PKH-26 kompleta crvenog fluorescentnog ćelijskog linkera (Sigma, kat. br. PKH26GL).1 µl rastvora PKH26 za crveno bojenje je razblaženo sa 250 µl C razblaživača i dodato suspenziji MV3 ćelija koje su potom inkubirane 5 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Nakon toga je dodato 0,5 ml FBS, i ćelije su inkubirane 1 minut i jednom isprane T ćelijskim medijumom koji se sastojao od RPMI 1640 medijuma dopunjenog sa 10% (V/V) FBS, 1% (V/V) GlutaMAX-I, 1 mM natrijum piruvatom, 1% (V/V) MEM neesencijalnih aminokiselina i 50 µM β-merkaptoetanola.1 x 10<6>MV3 ćelija/ml je ponovo suspendovano u T ćelijskom medijumu i razdvojeno u tri epruvete. Sintetički NLVPMVATV peptid (dobijen od kompanije thinkpeptides) dodat je u finalnoj koncentraciji od 1x10<-9>M ili 1x10<-8>M, i ćelije su inkubirane tokom 90 minuta. MV3 ćelije su jednom isprane sa T ćelijskim medijumom i ponovo suspendovane do gustine od 0,5 x 10<6>ćelija/ml, distribuirane (100 µl/bunarčiću) u ploču za suspenziju ćelija sa 96 bunarčića sa okruglim dnom (Greiner bio-one, cellstar, kat. br.
650185) i inkubirane preko noći na 37 °C i 5% CO2. Principi eksperimenta prikazani su na Slici 21.
Sledećeg dana dodato je 50 µl/bunarčiću T ćelijskog medijuma koji sadrži različite titrisane koncentracije Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda. Sakupljene su NLV specifične CD8 T ćelije, dodat je CFDA-SE (5(6)-karboksifluorescein diacetat-N-sukcinimidil estar, SIGMA-Aldrich, kat. br.
21888-25MG-F) do konačne koncentracije od 40 nM, i ćelije su inkubirane uz rotaciju tokom 15 minuta na 37 °C. Označavanje je zaustavljeno dodavanjem FBS, ćelije su isprane i ponovo suspendovane u T ćelijskom medijumu do konačne koncentracije od 0,125 x 10<6>ćelija/ml. U svaki bunarčić je dodato 50 µl suspenzije CD8 T ćelija označenih pomoću CFSE (konačni odnos E:T = 1:8). Ćelijske ploče su inkubirane tokom 24 h, 50 µl/bunarčiću je uklonjeno i u svaki bunarčić je dodato 50 µl T ćelijskog medijuma koji sadrži 2,64 µl/ml Golgi stop (inhibitor transporta proteina koji sadrži monesin, BD Bioscience, kat. br.554724) (krajnja koncentracija 0,66 µl/ml). Ćelije su inkubirane 4 sata, a zatim su ploče isprane sa 200 µl/bunarčiću DPBS i obojene sa 100 µl/bunarčiću DPBS na 4 °C koji sadrži fiksabilnu boju za vijabilnost eF450 razblaženu 1:5000 (eBioscience, kat. br.65-0864) tokom 30 minuta na 4 °C. Ćelijske ploče su isprane sa 200 µl/bunarčiću DPBS nakon čega su obojene antitelom konjugovanim sa fluorescentnom bojom: antihumani CD137-PerCP/Cy5.5 (klon 4B4-1, mišji IgG1κ, BioLegend, kat. br.309814), antihumani CD8-BV605 (klon RPA-T8, mišji IgG1κ, BioLegend, kat. br. 301012) ili 0,67 µg/ml antihumanog CD8a-APC/Cy7 (klon RPA-T8, mišji IgG1κ, BioLegend, kat. br.301016) i antihumani CD25 PE/Cy7 (klon BC96, mišji IgG1κ, BioLegend, kat. br.302612). Nakon inkubacije tokom 30 minuta na 4 °C, ćelije su isprane dva puta sa 200 µl/bunarčiću FACS pufera, ponovo suspendovane u 50 µl/bunarčiću sveže pripremljenog FoxP3 Fix/Perm pufera (eBioscience kat. br.00-5123 i 00-5223) i inkubirane 30 min na 4 °C. Ploče su isprane dva puta sa 200 µl/bunarčiću permeabilizujućeg pufera (DPBS sa dodatkom 2% (V/V) FBS, 1% (m/V) saponina (Sigma Life Science, S7900) i 1% (m/V) natrijum azida (Sigma-Aldrich, S2002) i obojene sa 50 µl/bunarčiću permeabilizujućeg pufera (eBioscience, kat. br. 00-8333-56) koji sadrži 0,25 µg/ml antihumanog IFNγ-APC (klon B27, mišji IgG1κ, BioLegend, kat. br. 506510) ili 0,33 µg/ml antihumanog IFNγ-BV510 (klon 4S.B3, mišji IgG1κ, BioLegend, kat. br.502543). Ploče su inkubirane 1 sat na 4 °C i isprane dva puta sa 200 µl/bunarčiću permeabilizujućeg pufera. Za fiksaciju, dodato je 50 µl/bunarčiću DPBS koji sadrži 1% formaldehida. Istog ili sledećeg dana, ćelije su ponovo suspendovane u 100 µl/bunarčiću FACS pufera i snimljene pomoću 5-laserskog protočnog citometra Fortessa (BD Bioscience sa softverom DIVA) ili 3-laserskog analizatora Miltenyi Quant 10 (Miltenyi Biotec) i Flow Jo (FlowJo X10.0.7).
Kao što je prikazano na slikama 22 i 23 za konstrukte 1.1 do 1.10 i na slikama 24 i 25 za konstrukte 2.1, 2.3 i 2.4, antigen-specifične CD8+ T ćelije, ali ne i nestimulisani kontrolni uzorci, pokazale su povećane nivoe površinske ekspresije 4-1BB u prisustvu FAP ciljanog Fc fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (FAP split 4-1BBL trimer). Ovaj efekat 4-1BBL je zavisio od doze, i zahtevao je FAP ciljanje jer dodavanje neciljanog kontrolnog molekula nije uticalo na nivo ekspresije 4-1BB. Nadalje, T-ćelije aktivirane na višoj koncentraciji peptida (1x10<-8>M) pokazale su produženu sekreciju INFγ u prisustvu FAP ciljanog Fc fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (FAP split 4-1BBL trimer). Zbirno, ovi podaci pokazuju da antigen-ciljani Fc fuzioni antigen vezujući molekul koji sadrži trimer 4-1BB liganda modulira površinski fenotip i reaktivnost antigen specifičnih T-ćelija na način koji zavisi od ciljanja.
6.4 Poređenje ćelijskih ciljanih i neciljanih mišjih 4-1BBL Fc fuzionih antigen vezujućih molekula
Ciljani i neciljani mišji Fc fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda (FAP split mišji 4-1BBL trimer i DP47 split mišji 4-1BBL trimer) pripremljeni su kao što je opisano u primeru 1.3.
24
Radi poređenja bioaktivnosti ćelijski ciljanih i neciljanih mišjih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda, proliferacionom bojom eFlour670 označeni (eBioscience, kat. br. 65-0840-90) ili ljubičastom bojom za proliferaciju ćelija CellTrace označeni (Cell tracer, kat. br. C34557) sveži mišji splenociti kokultivisani su 3-4 dana na pločama za kulturu tkiva sa 96 bunarčića sa okruglim dnom (TTP, kat. br.92097) sa prianjajućim 50 Gy ozračenim NIH/3T3-huFAP klon 39 ćelijama (za generisanje vidite 5.3) u RPMI 1640 medijumu (Gibco, kat. br. 42401-042) sa dodatkom 10% (V/V) FBS, 1% (V/V) GlutaMAX-I, 1 mM natrijum piruvatom, 1% (V/V) MEM neesencijalnih aminokiselina i 50 µM β-merkaptoetanolom u prisustvu 0,5 µg/ml antimišjeg CD3 IgG sirijskog hrčka (klon 145-2C11, BD, kat. br. 553057) i naznačenog molekula kandidata za lek dodatog u rasponu koncentracija (Slika 26). Nakon tri ili četiri dana, ćelije su isprane FACS puferom i obojene tokom 30 min na 4 °C u 25 ul FACS pufera/bunarčiću koji sadrži antimišji CD8 ratIgG2a-BV711 (BioLegend, kat. br.100747, klon 53-6,7) i antimišji CD4 ratIgG2a-BV421 (BioLegend, kat. br. 100544, klon RM4-5) i 0,67 µg/ml antimišjeg CD137 (4-1BB) IgG-PE sirijskog hrčka (BioLegend, kat. br. 106106, klon 17B5) i antimišji CD25-PErCP-Cy5.5 ratIgG2b (BioLegend, kat. br. 1019112). Ćelije su isprane i inkubirane tokom 1 h na sobnoj temperaturi u pripremljenom puferu za fiksiranje/permeabilizaciju (Foxp3/komplet pufera za bojenje transkripcionog faktora, eBioscience, kat. br.00-5523-00). Ćelije su isprane dva puta sveže pripremljenim puferom za permeabilizaciju i obojene sa 25 µl/bunarčiću pufera za permeabilizaciju koji sadrži fluorescentno obeležena antitela na transkripcioni faktor citotoksičnog nasleđa Eomes, tj. antimišji Eomes ratIgG2a-AlexaFluor488 (eBioscience, kat. br. 534875, klon Dan11mag) i, ako CD137 nije obojen, na molekul citotoksičnog efektora granzim B, tj. antimišji ratIgG2a granzim B-PE (eBioscience, kat. br. 128822, klon 16G6) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Ćelije su zatim isprane dva puta, ponovo suspendovane u FACS puferu i snimljene upotrebom laserskog protočnog citometra Fortessa (BD Bioscience sa softverom DIVA) ili 3-laserskog analizatora MACSQuant 10 (Miltenyi Biotech) i Flow Jo v10.0.7 (FlowJo LLC). Gejtovi su postavljene na žive CD8+ T ćelije i CD4+ T ćelije i određena je frekvencija proliferacionih ćelija, kao i nivoi ekspresije CD25, Eomes i granzima B ili CD137. Frekvencija proliferacije i frekvencije i MFI aktivacionih markera predstavljeni su u odnosu na koncentraciju korišćenih mišjih Fc(kih) fuzionih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda radi prikaza funkcionalne aktivnosti. Kao što se može videti na slici 27, može se primetiti povećanje proliferacionih CD8+ T ćelija za konstrukte M.1 i M.2.
6.5 Promene na jetri kod miševa koji su tretirani antimišjim 4-1BB antitelom Lob 12.3 (muIgG1 Wt) ili konstruktom M.2
C57BL/6 miševi koji nose MC38-muFAP (model mišjeg kolorektalnog kancera) sc su tretirani jednom nedeljno u trajanju od 3 nedelje agonističkim antimišjim 4-1BB antitelima ciljanim na FAP (Studija efikasnosti 020-GA1401: „Eksperimenti za pokazivanje efikasnosti 4-1BB ciljane terapije u kombinaciji sa a-PD-L1 u modelu MC38−muFAP s.c. na C57B6 miševima”). Korišćena antitela su bila Lob 12.3 muIgG1 Wt (sa Fc „divljeg tipa”, klon Lob 12.3 dobijen od BioXcell kataloški br.: BE0169) ili konstrukt M.2 sa DAPG mutacijom (neaktivni Fc). Dva antitela su primenjivana jednom nedeljno tokom tri uzastopne nedelje. Četiri životinje/grupi su žrtvovane 7 dana nakon poslednjeg tretmana, a jetra mikroskopski ispitana.
Promene na jetri primećene su samo kod životinja koje su primale Lob 12.3 muIgG1 Wt, a sastoje se od žarišta hepatocelularne degeneracije sa akumulacijom F4/80 pozitivnih makrofaga i manje količine mešane populacije imflamatornih ćelija (uglavnom limfocita) koji često pokazuju vazocentričnu distribuciju. Primećene su povremene nekroze pojedinačne ćelije hepatocita, i perivaskularni mononuklearni ćelijski infiltrati u portalnim prostorima. Nisu zabeleženi nalazi povezani sa lečenjem u jetri životinja koje su primale konstrukt M.2 (Tabela 41).
Tabela 41: Učestalost histopatoloških nalaza (n=4/grupi)
Primećen je hepatitis, koji se pripisuje umrežavanju FcγRs u jetri, kod pacijenata lečenih urelumabom BMS-663513 (Ascierto P.A. et al.2010) i kod miša pri čemu se koristio surogat miša. Odsustvo nalaza na jetri kod životinja lečenih antitelom sa neaktivnim Fc podržava ovu hipotezu.
6.6 Određivanje farmakokinetičkih parametara humanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
Kako bi se ispitalo jesu li humani Fc fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda iz ovog pronalaska pogodni za farmaceutsku upotrebu, određeni su
24
farmakokinetički parametri (FK podaci) poput klirensa, volumena raspodele ili poluvremena eliminacije (t1/2) kod miševa. Tako su izvedeni sledeći eksperimenti:
Eksperiment A: Jednokratna FK doza konstrukta 1.2 i kontrole B kod zdravih NOG miševa
Ženke NOG miševa, prosečne starosti 8 do10 nedelja na početku eksperimenta (kupljene od kompanije Taconic, SOPF facility) su održavane u uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetlosti/12 h tame prema zavedenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti (P 2011128). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.
Sprovedena je farmakokinetička studija sa jednom dozom (SDPK) radi procene izloženosti konstrukta 1.2 i kontrole B. Davanje i.v. bolusa od 2,5 mg/kg primenjeno je na NOG miševima, i uzorci krvi su uzeti u odabranim vremenskim intervalima za farmakokinetičku procenu. Uzorci mišjeg seruma analizirani su pomoću ELISA. Biotinilovani humani 4-1BB, ispitivani uzorci, anti-huCH1 antitelo obeleženo digoksigeninom i anti-digoksigenin detekciono antitelo (POD) dodaju se postepeno na mikrotitarsku ploču sa 96 bunarčića obloženu streptavidinom i inkubiraju nakon svakog koraka 1 h na sobnoj temperaturi. Ploča se ispere tri puta nakon svakog koraka za uklanjanje nevezanih supstanci. Konačno, kompleks vezan za peroksidazu je vizuelizovan dodavanjem rastvora ABTS supstrata da se dobije obojeni proizvod reakcije. Intenzitet proizvoda reakcije koji je fotometrijski određen na 405 nm (sa referentnom talasnom dužinom na 490 nm) proporcionalan je koncentraciji analita u uzorku seruma. Raspon kalibracije standardne krive za konstrukt bio je 0,156 do 10 ng/ml, gde je 3 ng/ml donji limit kvantifikacije (LLOQ). Slika 28A prikazuje smanjenje koncentracije tokom vremena kao što je uočeno u ovom eksperimentu.
Eksperiment B: Pojedinačna FK doza konstrukta 2.1, 2.3, kontrole B i kontrole C u NOG miševima sa tumorom humanizovanim matičnim ćelijama
Farmakokinetička studija sa jednom dozom (SDPK) izvedena je radi procene izloženosti konstrukta 2.1, 2.3, kontrole B i kontrole C. Ženke NSG miševa sa prenetim humanim matičnim ćelijama nabavljene su od Jackson Laboratories. Miševi su održavani pod uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetla/12 h mraka prema dobijenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti (ZH193-2014). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo
24
zdravstveno stanje.
Humane MKN45 ćelije (humani karcinom želuca) originalno su dobijene od ATCC, i posle ekspanzije su deponovane u unutrašnjoj banci ćelija Glycart. Ćelije su kultivisane u DMEM-u koji sadrži 10% FCS. Ćelije su kultivisane na 37 °C u atmosferi zasićenoj vodom sa 5% CO2. In vitro pasaž 9 korišćen je za supkutanu injekciju, pri vijabilnosti od 97%. Humani fibroblasti NIH-3T3 konstruisani su u pogonu Roche Nutley tako da eksprimiraju humani FAP. Klon 39 korišćen je na in vitro pasažu broj 12 i pri vijabilnosti od 98%.50 mikrolitara ćelijske suspenzije (1x106 MKN45 ćelija+1x1063T3-huFAP) pomešano sa 50 mikrolitara matrigela ubrizgano je supkutano u bok anesteziranih miševa. I.v. bolusna primena od 10 mg/kg je primenjena na humanizovanim miševima kada je tumor dostigao prosečnu veličinu od 190 mm<3>. Uzorci krvi uzeti su u odabranim terminima za farmakokinetičku procenu. Uzorci mišjeg seruma analizirani su pomoću ELISA. Biotinilovani humani 4-1BB, ispitivani uzorci, anti-huCH1 antitelo obeleženo digoksigeninom i anti-digoksigenin detekciono antitelo (POD) dodati su postepeno na mikrotitarsku ploču sa 96 bunarčića obloženu streptavidinom i inkubirani nakon svakog koraka 1 h na sobnoj temperaturi. Ploča se ispere tri puta nakon svakog koraka za uklanjanje nevezanih supstanci. Konačno, kompleks vezan za peroksidazu je vizuelizovan dodavanjem rastvora ABTS supstrata da se dobije obojeni proizvod reakcije. Intenzitet proizvoda reakcije koji je fotometrijski određen na 405 nm (sa referentnom talasnom dužinom na 490 nm) proporcionalan je koncentraciji analita u uzorku seruma. Raspon kalibracije standardne krive za konstrukt bio je 0,156 do 10 ng/ml, gde je 3 ng/ml donji limit kvantifikacije (LLOQ). Slika 28B prikazuje smanjenje koncentracije konstrukata tokom vremena kao što je uočeno u ovom eksperimentu.
Eksperiment C: Jednokratna FK doza konstrukata 2.1 i 2.3 kod zdravih NOG miševa Ženke NOG miševa, prosečne starosti 8 do 10 nedelja na početku eksperimenta (kupljene od kompanije Taconic, SOPF facility) održavane su u uslovima bez specifičnog patogena, sa dnevnim ciklusima od 12 h svetlosti/12 h tame prema zavedenim smernicama (GV-Solas; Felasa; TierschG). Protokol eksperimentalne studije pregledale su i odobrile lokalne vlasti (P 2011128). Po dolasku, životinje su držane nedelju dana kako bi se privikle na novu okolinu i radi posmatranja. Redovno je praćeno njihovo zdravstveno stanje.
Sprovedena je farmakokinetička studija sa jednom dozom (SDPK) za procenu izloženosti konstrukta 2.1 i 2.3. Davanje i.v. bolusa od 2,5 mg/kg primenjeno je na NOG miševima, i uzorci krvi su uzeti u odabranim vremenskim intervalima za farmakokinetičku procenu. Uzorci mišjeg seruma analizirani su pomoću ELISA. Biotinilovani humani 4-1BB, ispitivani uzorci, anti-huCH1 antitelo obeleženo digoksigeninom i anti-digoksigenin
24
detekciono antitelo (POD) dodaju se postepeno na mikrotitarsku ploču sa 96 bunarčića obloženu streptavidinom i inkubiraju nakon svakog koraka 1 h na sobnoj temperaturi. Ploča se ispere tri puta nakon svakog koraka za uklanjanje nevezanih supstanci. Konačno, kompleks vezan za peroksidazu je vizuelizovan dodavanjem rastvora ABTS supstrata da se dobije obojeni proizvod reakcije. Intenzitet proizvoda reakcije koji je fotometrijski određen na 405 nm (sa referentnom talasnom dužinom na 490 nm) proporcionalan je koncentraciji analita u uzorku seruma. Raspon kalibracije standardne krive za konstrukt bio je 0,156 do 10 ng/ml, gde je 3 ng/ml donji limit kvantifikacije (LLOQ). Slika 28C prikazuje uočeno smanjenje koncentracije tokom vremena.
Testirani konstrukti 2.1 i 2.3 su dovoljno stabilni u organizmu i poseduju FK parametre u odgovarajućem rasponu za farmaceutski razvoj. Iz rezultata se takođe može zaključiti da je konstrukt 2.1 nešto stabilniji.
6.7 Prevalencija FAP kod humanih tumora
Prevalencija FAP u humanim tumorima procenjena je kao što je opisano u WO 2014/161845 kako bi se razumela moguća klinička primena FAP ciljanih konstrukata.
Pacovsko antihumano antitelo sepraza (IgG2a, klon D8) kompanije Vitatex (MABS1001) korišćeno je za imunobojenje sekcija od 2,5 µm od različitih indikacija tumora na Ventana Benchmark XT. Sekcije su podvrgnute standardnom CC1 tretmanu nakon čega je usledila inkubacija antitela 60' na 37 °C u koncentraciji od 5 µg/ml u razređivaču antitela Dako (S3022), i pozitivno bojenje je detektovano korišćenjem Ultraview DAB sistema za detekciju (Ventana br. 760-4456). Antitela sa podudarnim izotipom kompanije Abeam (ab 18450) korišćena su kao negativna kontrola. FAP+ stromalni infiltrat bio je prisutan u humanim tumorima različitih indikacija, uključujući karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC), karcinom dojke, kolorektalni kancer (CRC), kancer pankreasa (PAC), karcinom želuca, nemikrocelularni karcinom pluća (NSCLC) i mezoteliom, koji označavaju potencijalno zanimljive kliničke indikacije za FAP ciljane konstrukte (Tabela 42).
24
Tabela 42: Prevalencija FAP kod humanih tumora
Primer 7
7.1 Priprema CD19 (8B8-018) ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
7.1.1 Priprema, prečišćavanje i karakterizacija Fc fuzije antigena CD19 za kampanju displeja faga
Radi ekspresije i prečišćavanja CD19 ektodomena čoveka i cinomolgusa u monomernom stanju (za humani CD19 vidite SEQ ID NO: 31), odgovarajući fragment DNK spojen je sa humanim segmentom Fc gena IgG1 koji sadrži mutacije „dugmeta” (humani: SEQ ID NO: 186; cinomolgus: SEQ ID NO: 188) i transficiran je „Fc-rupicom” (SEQ ID NO: 86) parnjakom (Merchant et al., 1998). Mesto cepanja IgA (PTPPTP) uvedeno je između ektodomena antigena i Fc lanca dugmeta. Avi tag za usmerenu biotinilaciju uveden je na C-kraju lanca antigen-Fc dugme, i mutacije H435R i Y436F su uvedene u Fc rupice radi prečišćavanja (Jendeberg L. et al., J. Immunological method, 1997). Kombinacija lanca antigen-Fc dugme koji sadrži mutacije S354C/T366W (humani: SEQ ID NO: 187; cinomolgus: SEQ ID NO: 189) sa Fc lancem sa rupicom koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/ Y407V (SEQ ID NO: 90) omogućava stvaranje heterodimernog Fc fuzionog fragmenta koji uključuje jednu kopiju CD19 ektodomena (analogno sa 4-1BB konstruktom na slici 5C). Tabela 43
24
navodi cDNK i aminokiselinske sekvence Fc-fuzionog konstrukta antigena.
Tabela 43: cDNK i aminokiselinske sekvence monomernog Fc(kih) fuzionog molekula CD19 antigena čoveka i cinomolgusa
2
21
22
Za proizvodnju monomernih antigen/Fc fuzionih molekula, eksponencijalno rastuće suspendovane CHO ćelije kotransfektovane su sa dva plazmida koja kodiraju dve komponente fuzionog proteina (lanac dugmeta i rupice) pomoću standardnih postupaka.
Izlučeni protein je prečišćen iz supernatanta ćelijske kulture upotrebom afinitetne hromatografije sa proteinom A, zatim gel filtracijom. Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu MabSelect Sure zapremine kolone (CV)= 5-15 ml, smola proizvođača GE Healthcare), ekvilibrisan puferom sa natrijum fosfatom (20 mM), natrijum citratom (20 mM), 0,5 M natrijum hloridom (pH 7,5). Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 6 volumena kolone istog pufera. Vezani protein je eluiran pomoću linearnog gradijenta; korak 1, 10 CV od 0 do 60% elucionog pufera (pufer 20 mM natrijum citrat, 500 mM natrijum hlorid (pH 2,5)); korak 2, 2 CV od 60 do 100% elucionog pufera. Za linearni gradijent je primenjena dodatna faza elucije sa 2 volumena kolone 100% elucionim puferom.
pH prikupljenih frakcija podešava se dodavanjem 1/40 (V/V) 2 M tris, pH 8,0. Protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 2 mM MOPS, 150 mM natrijum hlorida, 0,02% (m/V) natrijum azida pH 7,4.
Tabela 44 rezimira prinos i sadržaj konačnog monomera monomernog CD19 antigen Fc (kih) fuzionog proteina čoveka i cinomolgusa.
2
Tabela 44 - Biohemijska analiza monomernog CD19 antigen Fc(kih) fuzionog proteina čoveka i cinomolgusa
Deo prečišćenog antigena je in vitro biotinilovan upotrebom standardnog reakcionog kompleta BirA biotin-protein ligaze (Avidity, kat. br. BirA500) prema uputstvu proizvođača. Stepen biotinilacije za fuziju koja sadrži humani CD19 bio je 94%, za odgovarajući 100% konstrukt CD19 cinomolgusa. Biotinilovani protein je tada korišćen za selekciju, skrining i karakterizaciju afinitetno sazrelih klonova dobijenih od 8B8 lišenih žarišta deamidacije N27d i N28.
7.1.2 Generisanje anti-CD19 klona 8B8-018
7.1.2.1 Imunizacija i nastajanje mišjih antihumanih CD19 antitela (hibridoma) Balb/c miševi su imunizovani šest puta i pojačani HEK293 ćelijama transficiranim sa CD19 (prosečna gustina receptora 35.000 po ćeliji). Imunski odgovor je praćen testiranjem uzoraka seruma ELISA testom CD19-ćelija na humanim NIH-3T3 ćelijama transficiranim sa CD19. Ćelije slezine miševa sa dovoljnim titrom antihumanog CD19 antitela su korišćene za imortalizaciju fuzionisanjem sa ćelijskom linijom mišjeg mijeloma P3X63 Ag8.653. Izvršene su tri fuzije i hibridomski supernatanti pretraženi ćelijskim ELISA testom na humanim CD19-transfektovanim NIH-3T3 ćelijama i testom vezivanja FACS upotrebom Daudi (CD19+) i CD19– ćelija radi pronalaženja antihumanih CD19 specifičniha antitela (videti primer 1 WO 2011/147834).
7.1.2.2 Skrining hibridoma i ćelijska biološka funkcionalna procena anti-CD19 antitela
Ćelijska-ELISA za skrining antitela na humani CD19
Ćelijska ELISA je primenjena za skrining hibridoma i za identifikovanje onih hibridoma koji luče antitela na humani-CD19. NIH3T3 ćelije transfektovane humanim CD19 su korišćene kao pozitivne ćelije, netransfektovane NIH3T3 ćelije su korišćene kao ćelije za negativnu kontrolu. Za procenu pozitivnih hibridoma, kvantifikovan je odnos OD između
2 4
transficiranih i netransficiranih NIH3T3 ćelija.
- Medijum za uzgajanje: DMEM sa velikim sadržajem glukoze (4,5 mg/ml), 10% FCS, Na-piruvat, NEAA, glutamin
- Antitela za pozitivnu kontrolu: anti CD19 monoklonsko antitelo (IgG1) Pharmingen kat. br.555409 c = 1 mg/ml
- Antitelo za detekciju: Kozji antimišji IgG (H+L) HRP konjugat Bio-Rad kat. br.
170-06516
- Razblaženje 1: 2000 u lx ELISA blokirajućem reagensu
- Ostali reagensi: Fibronektin Roche kat. br.838039 c = 1 mg/ml
- Glutardialdehid: 25% osnovni rastvor//agar kvaliteta za nauku br. R102 finalna koncentracija: 0,05% u PBS-u
- ELISA blokirajući reagens: 10x osnovni rastvor//Roche kat. br.1112589
- TMB supstrat: Roche kat. br.11432559
- Zaustavni rastvor: 1 M H2SO4
- BioRad kat. br.170-6516 Razblaženje 1: 2000 u 1x ELISA blokirajućem reagensu 1. dan:
- Fibronektinski premaz: 5 µg/cm<2>u PBS-u; ploča sa 96 bunarčića = 32 cm<2>; 160 µg/ploči u 6 ml
- PBS, 50 µl/bunarčiću
- inkubirati 45 min na RT, aspirirati rastvor za premazivanje
- Zasejati 1,25 x 104 ćelija/bunarčiću u 50 µl medijuma za uzgajanje na ploči sa 96 bunarčića
- inkubirati 40 sati na 37 °C
- dodati gornjoj polovini ploče: NIH3T3 ćelije koje eksprimiraju CD19
- dodati donjoj polovini ploče: netransfektovane NIH3T3 ćelije
3. dan:
- Dodavanje antitela za pozitivnu kontrolu ili uzoraka (supernatant ili mišji serum) u 50 µl medijuma za uzgajanje
- inkubirati 2 h na 4 °C
- Ukloniti medijum, fiksirati ćelije sa 100 µl glutardialdehida (0,05% u PBS-u) - Isprati dva puta sa 200 µl PBS
- Dodavanje anttitela za detekciju 1:2000, 50 µl/bunarčiću
- inkubirati 2 h na RT
2
- Isprati tri puta sa 200 µl PBS
- dodati 50 µl TMB, inkubirati 30 minuta na RT,
- prekinuti dodavanjem 25 µl 1 M H2SO4; očitati ekstinkciju na 450 nm/620 nm - Izračunavanje rezultata: odnos OD NIH3T3 CD19: OD netransficiranih NIH3T3 Odabrano antitelo je pokazalo specifično vezivanje za NIH3T3 ćelije transfektovane sa CD19 u poređenju sa netransfektovanim NIH3T3 ćelijama (vidi Primer 2 WO 2011/147834).
7.1.2.3 Humanizacija anti-CD19 antitela
Specifičnost vezivanja CD19 mišjeg antitela je preneta na humani akceptorski okvir da bi se eliminisali potencijalni problemi sa imunogenošću nastali od delova sekvenci koje ljudsko telo prepoznaje kao strane. To je učinjeno graftovanjem celih regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) mišjeg (donorskog) antitela na humani (akceptorski) okvir antitela, što se naziva CDR graftovanje ili humanizacija antitela.
Mišje aminokiselinske sekvence su poravnate sa kolekcijom gena humane germinativne linije antitela V, i razvrstane po identičnosti sekvence i homologosti. Pre odabira jedne konkretne akceptorske sekvence, moraju da se odrede takozvane kanonske strukture petlje antitela donora (Morea, V., et al. Methods,Methods, Vol 20, Issue 3 (2000) 267-279). Ove kanonske strukture petlje su određene vrstom ostataka prisutnih na takozvanim kanonskim pozicijama. Te pozicije se nalaze (delimično) izvan CDR regiona, i moraju da ostanu funkcionalno jednake u finalnom konstruktu kako bi se zadržala CDR konformacija matičnog (donorskog) antitela. Sekvenca humane germinativne linije VBASE_VH1_1 je izabrana kao akceptor za teški lanac i sekvenca VBASE_VK2_5 je izabrana za laki lanac.
7.1.2.4 Uklanjanje žarišta deamidacije
Otkriveno je da divlji tip humanizovanog antihumanog CD19 antitela ima tri žarišta deamidacije u HVR-L1: (SEQ ID NO: 190.). Dodatno je otkriveno da je u HVR-H2 prisutno dodatno žarište deamidacije: (SEQ ID NO: 191.). Kako bi se uticalo na žarište deamidacije u HVR-H2, uvedena je tačkasta mutacija N (Asn) u Q (Gln) na poziciji 64 (numeracija prema Kabatu). Shodno tome, antitelo kako je ovde objavljeno ima HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 192.).
Kako bi se uticalo na žarišta deamidacije u lakom lancu i dobilo humanizovano antihumano CD19 antitelo sa poboljšanom stabilnošću deamidacije, uvedene su individualne mutacije na Kabatovim pozicijama 27d, 27e, 28 i 29 i dvostruka mutacija na pozicijama 27e i 28 (numeracija prema Kabatu). Ukupno je dobijeno 9 varijanti (var.1 do var.9) humanizovanog antitela divljeg tipa (var.0) (videti Tabelu 45).
Tabela 45: Varijante humanizovanog CD19 antitela divljeg tipa
2
2
Otkriveno je da se sa samo jednom mutacijom na poziciji 27e prema Kabatu iz S (serin) u P (prolin) može uticati na sva žarišta deamidacije u HVR-L1. Ovo nije mutacija N (asparagin) ostatka sklonog deamidaciji već susednog ostatka.
Shodno tome, antitelo kako je ovde objavljeno ima HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 193.). U jednoj realizaciji, humanizovano antihumano antitelo CD19 sadrži HVR-L1 koji ima aminokiselinsku sekvencu
Pored toga, ova antitela održavaju unakrsnu reaktivnost na CD19 cinomolgusa kao što je prikazano u sledećoj tabeli 46.
Divlji tip humanizovanog antihumanog CD19 antitela (var.0) nakon prečišćavanja pokazuje približno 7,5% deamidacije. Nakon čuvanja dve nedelje na pH 7,4, količina deamidovanog antitela je povećana na oko 18,5%. Varijanta antitela sa mutacijom S27eP (var.5) pokazuje oko 2% deamidacije i 2% formiranja sukcinimida nakon prečišćavanja. Tokom dve nedelje čuvanja na pH 7,4, prisutno je samo oko 7,5% deamidovanog antitela. Var.
5 je nazvana klon 8B8-018, i izabrana je za pripremu CD19 ciljanih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer liganda iz TNF familije.
7.1.3 Priprema jednovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) sa ukrštenim CH1-CL domenima sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 3.1)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-254), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je kao što je prikazano na slici 29A: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254) i spojen sa humanim IgG1-CH domenom, kloniran je kao što je opisano na slici 29B: humani 4-1BB ligand, (G4S)2
2
konektor, humani CH.
Polipeptid koji kodira dimerni 4-1BB ligand spojen sa humanim CL domenom subkloniran je u okviru sa domenima teškog lanca CH2 i CH3 humanog IgG1 na dugmetu (Merchant, Zhu et al. 1998.). Da bi se poboljšalo ispravno uparivanje, u ukrštene CH-CL uvedene su sledeće mutacije. U dimernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CL, E123R i Q124K. U monomernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CH1, K147E i K213E.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CD19, klon 8B8-018, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem sa rupicom, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831.
Kombinacija lanca dimernog liganda-Fc dugmeta koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog anti-CD19-Fc rupica lanca koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-CD19 omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i CD19 vezujući Fab (Slika 30, konstrukt 3.1).
Tabela 47 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-254), koji sadrži ukrštene CH-CL i naelektrisane ostatke (konstrukt 3.1).
Tabela 47: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19 (8B8-018) ciljanog FC (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254) koji sadrži ukrštene CH-CL sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 3.1). * za naelektrisane ostatke
2
2
7.1.4 Priprema jednovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) sa ukrštenim CH1-CL domenima bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 3.2)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-254), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je analogno prikazanom na slici (29A), ali bez aminokiselinskih mutacija u CL domenu: humani 4-1BB ligand, (G4S)2
2 1
konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254), i spojen sa humanim IgG1-CH1 domenom, kloniran je analogno prikazanom na slici (29B), ali bez aminokiselinskih mutacija u CH1 domenu: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH1.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CD19, klon 8B8-018, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem sa rupicom, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1.
Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831. Kombinacija lanca dimernog liganda-Fc dugmeta koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog lanca anti-CD19-Fc sa rupicom koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-CD19 omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i CD19 vezujući Fab (Slika 30, konstrukt 3.2).
Tabela 48 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-254), koji sadrži ukrštene CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 3.2).
Tabela 48: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19 (8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254) koji sadrži ukrštene CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 3.2).
2 2
7.1.5 Priprema dvovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) (konstrukt 3.3) Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-254), razdvojena (G4S)2 linkerima, spojen je sa C-krajem Fc lanca sa rupicom humanog IgG1, kako je prikazano na slici 29C: Fc sa rupicom humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254) i spojen je sa C-krajem Fc lanca sa dugmetom humanog IgG1, kako je opisano na Slici 29D: Fc sa dugmetom humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koji kodira vezivač specifičan za
2
CD19, klon 8B8-018, subkloniran je u okviru bilo konstantnog teškog lanca sa rupicom, sa dugmetom ili konstantnog lakog lanca humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831. Kombinacija anti-CD19 huIgG1 lanca sa rupicom dimernog liganda koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V, anti-CD19 huIgG1 lanca sa dugmetom monomernog liganda koji sadrži mutacije S354C/T366W i anti-CD19 lakog lanca omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i dva CD19 vezujuća Fab (Slika 30, konstrukt 3.3).
Tabela 49 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-254) (konstrukt 3.3).
Tabela 49: Sekvence baznih parova dvovalentnog CD19 (8B8-018) ciljanog Fc (kih) PGLALA fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (konstrukt 3.3)
2 4
�
2
2 7.1.6 Priprema jednovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) sa ukrštenim CH1-CL domenima sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 3.4)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-248), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je analogno onom prikazanom na slici 29A: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-248) i spojen sa humanim IgG1-CH domenom, kloniran je analogno onom opisanom na slici 29B: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH.
Polipeptid koji kodira dimerni 4-1BB ligand spojen sa humanim CL domenom subkloniran je u okviru sa domenima teškog lanca CH2 i CH3 humanog IgG1 na dugmetu (Merchant, Zhu et al. 1998.). Da bi se poboljšalo ispravno uparivanje, u ukrštene CH-CL uvedene su sledeće mutacije. U dimernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CL, E123R i Q124K. U monomernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CH1, K147E i K213E.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CD19, klon 8B8-018, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem sa rupicom, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831. Kombinacija lanca sa dugmetom dimernog liganda-Fc koji sadrži mutacije S354C/T366W, monomerne fuzije CH1, ciljanog lanca sa rupicom anti-CD19-Fc koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-CD19 omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i CD19 vezujući Fab (slika 30, konstrukt 3.4).
Tabela 50 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-248), koji sadrži ukrštene CH-CL i naelektrisane ostatke (konstrukt 3.4).
Tabela 50: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) koji sadrži ukrštene CH-CL sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 3.4). * naelektrisani ostaci
2
2 7.1.7 Priprema jednovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) sa ukrštenim CH1-CL domenima bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 3.5)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-248), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je analogno prikazanom na slici (29A), ali bez aminokiselinskih mutacija u CL domenu: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-248), i spojen sa humanim IgG1-CH1 domenom, kloniran je analogno prikazanom na slici (29B), ali bez aminokiselinskih mutacija u CH1 domenu: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH1.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CD19, klon 8B8-018, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem sa rupicom, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831. Kombinacija lanca dimernog ligand-Fc lanca sa dugmetom koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog anti-CD19-Fc lanca sa rupicom koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i anti-CD19 lakog lanca omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i CD19 vezujući Fab (Slika 30, konstrukt 3.5).
Tabela 51 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-248) koji sadrži ukrštene CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 3.5).
Tabela 51: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19 (8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) koji sadrži ukreštene CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 3.5).
2
7.1.8 Priprema dvovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) (konstrukt 3.6) Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-248), razdvojena (G4S)2 linkerima, spojen je sa C-krajem Fc lanca sa rupicom humanog IgG1, kako je prikazano na slici
2 1
29C: Fc sa rupicom humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254) i spojen je sa C-krajem Fc lanca sa dugmetom humanog IgG1, kako je opisano na Slici 29D: Fc sa dugmetom humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koji kodira vezivač specifičan za CD19, klon 8B8-018, subkloniran je u okviru bilo konstantnog teškog lanca sa rupicom, sa dugmetom ili konstantnog lakog lanca humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831. Kombinacija anti-CD19 huIgG1 lanca sa rupicom dimernog liganda koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V, anti-CD19 huIgG1 lanca sa dugmetom monomernog liganda koji sadrži mutacije S354C/T366W i anti-CD19 lakog lanca omogućava stvaranje heterodimera, koji obuhvata sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i dva CD19 vezujuća Fab (Slika 30, konstrukt 3.6).
Tabela 52 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-248) (konstrukt 3.6).
Tabela 52 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CD19(8B8-018) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) (konstrukt 3.6)
2 2
�
24
7.2 Priprema CD19 (afinitetno sazrelih dobijenih od 8B8) ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda i odgovarajućih kontrolnih molekula
7.2.1 Generisanje afinitetno sazrelih dobijenih od 8B8 anti-CD19 vezivača bez žarišta
2
7.2.1.1 Odabir afinitetno sazrelih CD19-specifičnih antitela
Deamidacija ostataka asparagina na položajima 27d i 28, smeštenih u CDR1 lakog lanca humanizovanog klona 8B8, dovodi do značajnog smanjenja biološke aktivnosti. Stoga su generisane 2 biblioteke displeja faga u kojima su a) oba ostatka asparagina na pozicijama 27d i 28 eliminisana i b) dodatni CDR-ovi teškog i lakog lanca randomizovani kako bi se odabrale 8B8 varijante sa poboljšanim afinitetom.
7.2.1.2 Generisanje 8B8 biblioteka afinitetnog sazrevanja bez LCDR1 žarišta Generisanje afinitetno sazrelih antitela dobijenih od 8B8 bez mesta deamidacije N27d i N28, smeštenih u LCDR1, izvedeno je pomoću displeja faga, upotrebom standardnih protokola (Silacci et al., 2005). U prvom koraku, DNK sekvence VL i VH humanizovanog matičnog klona 8B8 (SEQ ID NO: 215 i SEQ ID NO: 216) klonirane su u naš fagemid koji je zatim korišćen kao obrazac za randomizaciju. U sledećem koraku stvorene su dve biblioteke za odabir povoljnih klonova pomoću displeja faga. Da bi se eliminisale prethodno pomenute pozicije žarišta, LCDR1 prajmer za randomizaciju (SEQ ID NO: 217), koji dozvoljava samo aminokiseline S T Q E na pozicijama 27d i 28, korišćen je za obe biblioteke. Biblioteka sazrevanja 1 je randomizovana u CDR1 i 2 i lakog i teškog lanca, dok je biblioteka sazrevanja 2 randomizovana u CDR1 i 3 lakog lanca i u CDR3 teškog lanca. Nasumični položaji u odgovarajućim CDR regionima prikazani su na Slici 31A. Za nastajanje biblioteke sazrevanja 1, randomizovane u CDR1 i 2 i lakog i teškog lanca, spojena su tri fragmenta pomoću „splajsovanja putem preklapajuće ekstenzije” (SOE) PCR i klonirani u vektor faga (Slika 31B). Sledeće kombinacije prajmera su korišćene za stvaranje fragmenata biblioteke: fragment 1 (LMB3 (SEQ ID NO: 222) i CD19 L1 reversno nasumično (SEQ ID NO: 217), fragment 2 (CD19 L2 direktno nasumično (SEQ ID NO: 218) i CD19 H1 reversno nasumično (SEQ ID NO: 219), i fragment 3 (CD19 H2 direktno nasumično (SEQ ID NO: 220) i CD19 H3 reversno konstantno (SEQ ID NO: 221) (tabela 53). Nakon sklapanja dovoljnih količina randomizovanog fragmenta pune dužine, on je digestovan sa NcoI/Nhel zajedno sa identično tretiranim akceptorskim vektorom fagemida. Trostruko veća količina molova umetka iz biblioteke je ligirana sa 10 µg fagemidnog vektora. Prečišćene ligacije su korišćene za 20 transformacija koje su dale 2 × 10 exp9 transformanata. Čestice fagemida koje pokazuju 8B8 biblioteku afinitetnog sazrevanja su regenerisane i prečišćene pomoću PEG/NaCl da bi se koristile u selekciji.
Generisanje druge biblioteke, randomizovane u CDR1 i 3 lakog lanca i u CDR3 teškog lanca, izvedeno je na sličan način. Sledeće kombinacije prajmera su korišćene za stvaranje fragmenata biblioteke: fragment 1 (LMB3 (SEQ ID NO: 222) i CD19 L1 reversno nasumično
2
(SEQ ID NO: 217), fragment 2 (CD19 L1 direktno konstantno (SEQ ID NO 223) i CD19 L3 reversno nasumično (SEQ ID NO 224), i fragment 3 (CD19 L3 direktno konstantno (SEQ ID NO: 225) i CD19 H3 reversno nasumično (SEQ ID NO: 226) (tabela 54). Nakon sklapanja dovoljnih količina randomizovanog fragmenta pune dužine, on je digestovan sa NcoI/KpnI zajedno sa identično tretiranim akceptorskim vektorom fagemida. Trostruko veća količina molova umetka iz biblioteke je ligirana sa 20 ug fagemidnog vektora. Prečišćene ligacije su korišćene za 40 transformacija koje su dale 2 × 10 exp9 transformanata. Čestice fagemida koje pokazuju 8B8 biblioteku afinitetnog sazrevanja su regenerisane i prečišćene pomoću PEG/NaCl da bi se koristile u selekciji.
Tabela 53: Prajmeri za 8B8 biblioteku afinitetnog sazrevanja i uklanjanja žarišta L1_L2/H1_H2
2
Tabela 54: Prajmeri za 8B8 biblioteku afinitetnog sazrevanja i uklanjanja žarišta L1_L3/H3
2
7.2.1.3 Odabir afinitetno sazrelih klonova dobijenih od 8B8 bez LCDR1 žarišta N27d i N28
Za odabir afinitetno sazrelih klonova bez LCDRI žarišta N27d i N28, izvedena su dva pristupa selekcije putem displeja faga:
U prvom pristupu, selekcija je izvršena na humanom CD19-Fc fuzionom proteinu upotrebom obe biblioteke displeja faga. Runde panovanja su izvedene u rastvoru prema sledećem obrascu: 1. vezivanje ~ 10<12>fagemidnih čestica za 30 nM biotinilovanog CD19-Fc proteina tokom 0,5 h u ukupnoј zapremini od 1 ml, 2. hvatanje biotinilovanih CD19-Fc proteina i specifično vezanih čestica faga dodavanjem 5,4 × 10<7>magnetnih perlica obloženih streptavidinom u trajanju od 10 min, 3. ispiranje perlica pomoću 5x 1 ml PBS/Tween20 i 5x 1 ml PBS, 4. eluiranje čestica faga dodavanjem 1 ml 100 mM TEA tokom 10 min i neutralizacija dodavanjem 500 ul 1M Tris/HCl pH 7,4, 5. ponovno inficiranje eksponencijalno rastućih TG1 bakterija E. coli, i 6. inficiranje pomoćnim fagom VCSM13 i zatim taloženje pomoću PEG/NaCl fagemidnih čestica koje će se koristiti u narednim selekcionim krugovima. Selekcije su izvedene u 3 kruga, upotrebom opadajuće koncentracije antigena (30x10<-9>M, 10x10<-9>M i
2
3x10<-9>M). U 2. i 3. krugu, hvatanje kompleksa antigen-fag obavljeno je korišćenjem neutravidinskih ploča umesto streptavidinskih perlica. Neutravidinske ploče su isprane 5x PBS/Tween20 i 5x PBS. U 3. krugu, neutravidinska ploča je inkubirana preko noći u 2 litra PBS-a za selekciju „povratne brzine” pre nego što je fag eluiran sa ploče. Nadalje, CD19-Fc protein cinomolgusa je korišćen u 2. krugu da bi se obogatili unakrsno reaktivni vezivači.
U drugom pristupu selekcije, panovanje faga je izvršeno na ćelijama koje prolazno eksprimiraju ili humani ili cinomolgusov CD19 ECD na ćelijskoj površini. Za prolaznu transfekciju HEK ćelija, stvoreni su ekspresioni plazmidi koji sadrže DNK sekvence (od 5' do 3') za sledeće proteinske segmente: Flag oznaka, SNAP oznaka, CD19 ECD bilo humanog porekla ili cinomolgusa, i transmembranski region receptora faktora rasta koji potiče iz trombocita (PDGFR) (SEQ ID NO: 227 i 228). Ekspresija odgovarajućih proteina (SEQ ID NO: 229 i 230) na ćelijskoj površini potvrđena je protočnom citometrijom upotrebom anti-Flag antitela za detekciju. Obe biblioteke su bile izložene u prvom krugu selekcije ćelijama koje eksprimiraju fuziju proteina CD19 čoveka ili cinomolgusa koji sadrži ECD. Za naredne runde panovanja, vrsta CD19 ECD je odgovarajuće izmenjena. Ćelije koje su prolazno transfektovane nebitnim membranskim proteinom korišćene su za prethodno čišćenje.
Runde panovanja su izvedene prema sledećem obrascu:
1. Transfekcija HEK ćelija sa konstruktima koji eksprimiraju ili CD19 ECD ili nebitni transmembranski protein prema standardnoj prethodno opisanoj proceduri,
2. Inkubacija ćelija ukupno 48 h na 37 °C u inkubatoru sa 5% CO2, 3. Izolacija ćelija centrifugiranjem (3 min na 250×g) i ponovna suspenzija 1×10E7 CD19 ECD-pozitivnih ćelija i 1×10E7 negativnih ćelija u PBS/5% BSA,
3. Prethodno prečišćavanje nespecifičnog faga inkubacijom biblioteke faga sa 1×107 CD19-negativnih ćelija 60 minuta na 4 °C pomoću lagano rotirajućeg rotatora epruveta,
4. Centrifugiranje ćelija na 250×g tokom 3 min i prenošenje supernatanta u čistu epruvetu i dodavanje 1×10E7 CD19-pozitivnih ćelija i inkubacija 60 minuta na 4 °C laganim okretanjem na rotatoru epruveta,
5. Ispiranje ćelija centrifugiranjem u trajanju od 1 minuta na 250×g, aspiracija supernatanta i ponovna suspenzija u 1 ml PBS (8 puta),
6. Eluiranje faga sa 1 ml 100 mM TEA, inkubacija tokom 5 minuta na RT i neutralizacija eluata sa 500 ul 1 M Tris-HCl, pH 7,6,
7. ponovna infekcija eksponencijalno rastućih bakterija E. coli TG1, i
8. infekcija pomoćnim fagom VCSM13 i zatim taloženje pomoću PEG/NaCl fagemidnih čestica koje će se koristiti u sledećim krugovima selekcije. Selekcije su izvedene u
2
3 kruga.
Kod oba pristupa za selekciju, putem ELISA su identifikovani specifični vezivači na sledeći način: 100 ul 30 nM biotinilovanog CD19-Fc proteina po bunarčiću naneto je na neutravidinske ploče. Dodati su bakterijski supernatanti koji sadrže Fab i detektovani su vezujući Fab preko Flag oznaka pomoću sekundarnog antitela anti-Flag/HRP.
Klonovi koji su bili pozitivni na ELISA testu na rekombinantni humani CD19, dodatno su testirani na ćelijskoj ELISA upotrebom ćelija koje su prolazno transfektovane humanim CD19 ekspresionim plazmidom koji sadrži ECD (SEQ ID NO: 227.). Ova analiza je izvedena na sledeći način: 48 h nakon transfekcije, HEK ćelije su sakupljene i centrifugirane na 250xg tokom 5 minuta. Ćelije su zatim ponovo suspendovane u ledeno hladnom PBS-u sa 2% BSA do 4 x 10<6>ćelija/ml i inkubirane 20 minuta na ledu da se blokiraju nespecifična mesta vezivanja.4 × 10<5>ćelija u 100 ul je distribuirano u svaki bunarčić ploča sa 96 bunarčića, i centrifugirano na 250xg i 4 °C tokom 3 min. Supernatant je usisan, i 50 ul bakterijskog supernatanta koji sadrži rastvorljive Fab fragmente je razblaženo sa 50 ul ledenog PBS/2% BSA, dodato na ploču, pomešano sa ćelijama, i inkubirano 1 h na 4 °C. Nakon toga, ćelije su isprane 3 puta ledeno hladnim PBS-om pre nego što je dodato 100 ul sa PBS 2% BSA po bunarčiću koji sadrži razblaženje 1:2000 anti-Fab-HRP antitela. Nakon vremena inkubacije od 1 h, ćelije su ponovo isprane 3 puta ledenim PBS-om. Za razvoj je dodato 100 ul supstrata „1-step ultra TMB-ELISA” po bunarčiću. Nakon inkubacije od 10 minuta, supernatant je prebačen na novu ploču sa 96 bunarčića koja sadrži 40 ul 1 M H2SO4 po bunarčiću, i apsorpcija je merena na 450 nM. Klonovi koji pokazuju značajne signale preko pozadine podvrgnuti su eksperimentu kinetičkog skrininga SPR analizom pmoću ProteOn XPR36.
7.2.1.4 Identifikovanje afinitetno sazrelih varijanti dobijenih od 8B8 pomoću SPR Kako bi se dodatno okarakterisali ELISA-pozitivni klonovi, povratna brzina je izmerena površinskom plazmonskom rezonancom i upoređena sa roditeljskim humanizovanim klonom 8B8.
Za ovaj eksperiment, 7000 RU poliklonskog antihumanog Fab antitela je imobilisano na svih 6 kanala GLM čipa putem kuplovanja amina (Na acetat pH 4,5, 25 μl/min, 240 s) (vertikalna orijentacija). Svaki bakterijski supernatant koji sadrži antitelo je filtriran i dvostruko razblažen PBS-om, a zatim injektovan tokom 360 s pri 25 µl/minutu kako bi se postigao nivo imobilizacije između 100 i 400 jedinica odgovora (RU) u vertikalnoj orijentaciji. Injektovanje monomernog CD19-Fc: Za jednokratna kinetička merenja, smer injektovanja je promenjen u horizontalnu orijentaciju, serije sa trostrukim razblaženjem prečišćenog monomernog CD19-Fc (različiti opseg koncentracija između 150 i 6 nM) injektovane su
2 1
istovremeno pri 50 μl/min duž odvojenih kanala 1-4, sa vremenom asocijacije od 180 s, i vremenom disocijacije od 300 s. Fc fragment humanog IgG (150 nM) injektovan je u kanal 5 kada je negativna kontrola specifičnog vezivanja za monomerni CD19-Fc pufer (PBST) ubrizgana duž šestog kanala da se dobije „linijska” slepa proba za referencu. Regeneracija je izvedena sa dva impulsa 10 mM glicina pH 1,5 i 50 mM NaOH tokom 30 s pri 90 ul/min (horizontalna orijentacija). Konstante brzine disocijacije (koff) izračunate su korišćenjem jednostavnog Lengmirovog modela vezivanja jedan prema jedan u softveru ProteOn Manager v3.1 istovremenim uklapanjem senzorgrama. Identifikovani su klonovi koji eksprimiraju Fab sa namanjim konstantama brzine disocijacije (Tabela 55). Napominjemo, konstante brzine disocijacije klonova 5A07 i 5B08 nisu mogle biti određene zbog neadekvatnog uklapanja. Ipak su izabrana oba klona jer su dobijeni rezultati sugerisali vrlo sporu disocijaciju. Varijabilni domeni odgovarajućih fagemida su sekvencionirani. Važno je da su oba ostatka asparagina u LCDR1 (pozicija 27d i 28) zamenjena serinom ili treoninom, pokazujući da su uklonjena oba mesta deamidacije. Rezultati su prikazani na Slici 32. CDR-i najboljih klonova su navedeni u Tabeli 56 (varijabilni regioni lakog lanca) i Tabeli 57 (varijabilni regioni teškog lanca) (klon 5H09: (SEQ ID NO: 231-236); klon 7H07: (SEQ ID NO: 237-242); klon 2B03: (SEQ ID NO: 243-248); klon 2B11: (SEQ ID NO: 249-254); klon 5A07: (SEQ ID NO: 255-260); klon 5B08: (SEQ ID NO: 261-266); klon 5D08: (SEQ ID NO: 267-272).
Tabela 55: Konstante disocijacije odabranih klonova dobijenih skrining analizom sa bakterijskim supernatantom
Tabela 56: CDR sekvence odabranih 8B8 lakih lanaca
2 2
Tabela 57: CDR sekvence odabranih 8B8 teških lanaca
7.2.2 Karakterizacija afinitetno sazrelih antitela dobijenih od 8B8
7.2.2.1 Kloniranje varijabilnih domena antitela u ekspresione vektore
Varijabilni regioni DNK sekvenci teških i lakih lanaca izabranih anti-CD19 vezivača subklonirani su u okviru bilo sa konstantnim teškim lancem, bilo sa konstantnim lakim lancem humanog IgG1. U teški lanac su uvedene mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u međunarodnoj patentnoj prij. Publ. br. WO 2012/130831 Al.
cDNK i aminokiselinske sekvence anti-CD19 IgG prikazane su u Tabeli 58, odnosno
2
Tabeli 59. Sve sekvence koje kodiraju antitelo klonirane su u ekspresioni vektor, koji pokreće transkripciju umetka himernim MPSV promoterom i sadrži sintetičku sekvencu polyA signala koja se nalazi na 3' kraju CDS. Uz to, vektor sadrži i EBV sekvencu OriP za epizomsko održavanje plazmida.
Tabela 58: cDNK i aminokiselinske sekvence anti-CD19 klona 8B8 u P329GLALA humanom IgG1 formatu
2 4
Tabela 59: cDNK i aminokiselinske sekvence afinitetno sazrelih anti-CD19 klonova u P329GLALA humanom IgG1 formatu
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
7.2.2.2 Određivanje afiniteta odabranih antitela putem SPR
Za tačno određivanje afiniteta pomoću SPR, odabrana anti-CD19 antitela proizvedena su kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija sa ekspresionim vektorima sisara upotrebom polietilenimina. Ćelije su transfektovane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:1
2
(„vektorski teški lanac”: „vektorski laki lanac”) prema standardnoj proceduri. 7 dana nakon transfekcije, izmeren je titar antitela u supernatantu i svi titri su uravnoteženi na 10 µg/ml.
Afinitet (KD) matičnog antitela 8B8, kao i njegovih derivata, izmeren je putem SPR korišćenjem instrumenta ProteOn XPR36 (Biorad) na 25 °C. 7000 RU poliklonskog antihumanog Fab antitela imobilisano je na svih 6 kanala GLM čipa kuplovanjem amina (Na acetat pH 4,5, 25 ul/min, 240 s) (vertikalna orijentacija). Svaki HEK supernatant koji sadrži antitelo je filtriran, razblažen pomoću PBST (10 mM fosfat, 150 mM natrijum hlorid pH 7,4, 0,005% Tween 20) do koncentracije od 10 ug/ml, a zatim je injektovan tokom 360 s pri 25 µl/minutu da se postigne nivo imobilizacije između 500 i 800 jedinica odgovora (RU) u vertikalnoj orijentaciji. Injektovanje monomernog CD19-Fc: Za jednokratna kinetička merenja, smer injektovanja je promenjen u horizontalnu orijentaciju, serije trostrukog razblaženja prečišćenog monomernog CD19-Fc (različiti opseg koncentracija između 150 i 6 nM) injektovane su istovremeno pri 50 µl/min duž odvojenih kanala 1-4, sa vremenom asocijacije od 180 d i vremenom disocijacije od 300 s. Fc fragment humanog IgG (150 nM) injektovan je u kanal 5 kao negativna kontrola za specifično vezivanje za monomerni CD19-Fc. Pufer (PBST) je injektovan duž šestog kanala da se dobije „linijska” slepa proba za referencu. Pregled odgovarajućih senzorgrama prikazan je na Slici 33. Regeneracija je izvedena sa dva impulsa 10 mM glicina pH 1,5 i 50 mM NaOH tokom 30 s pri 90 ul/min (vertikalna orijentacija). Konstante brzine asocijacije (kon) i konstante brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja pomoću softvera ProteOn manager verzija 3.1 simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) izračunata je kao odnos koff/kon. Sažetak kinetičkih i termodinamičkih podataka prikazan je u Tabeli 60. Konstanta disocijacije svih afinitetno sazrelih klonova poboljšana je u odnosu na njihov matični klon 8B8.
Tabela 60: Sažetak kinetičkih i termodinamičkih podataka za interakciju između anti-CD19 huIgG1 i humanog CD19
2
7.2.2.3 Priprema i prečišćavanje anti-CD19 IgG1 P329G LALA
Odabrana anti-CD19 antitela su proizvedena kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija sa ekspresionim vektorima sisara upotrebom polietilenimina. Ćelije su transfektovane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:1 („vektorski teški lanac”: „vektorski laki lanac”).
Za proizvodnju u bocama za mućkanje od 500 ml, 400 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Pre transfekcije, ćelije su centrifugirane 5 minuta na 210 x g, a supernatant je zamenjen prethodno zagrejanim CD CHO medijumom. Ekspresioni vektori (200 µg ukupne DNK) su mešani u 20 ml CD CHO medijuma. Nakon dodavanja 540 µl PEI, rastvor je mešan na vorteksu tokom 15 sekundi, i zatim inkubiran 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml medijuma F17 i ćelije su uzgajane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodata je 1 mM valproinska kiselina i 7% hraniva sa suplementima. Nakon kultivisanja tokom 7 dana, supernatant je sakupljen centrifugiranjem tokom 15 minuta pri 210 x g. Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 µm), dodat je natrijum azid do krajnje koncentracije od 0,01% (m/V), i čuvan na 4 °C.
Prečišćavanje molekula antitela iz supernanata ćelijske kulture izvršeno je afinitetnom hromatografijom upotrebom proteina A kao što je opisano gore za prečišćavanje fuzija Fc antigena. Ciljni protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 20 mM histidina, 140 mM NaCl pH 6,0.
Koncentracija proteina u prečišćenim proteinskim uzorcima određena je merenjem OD na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa antitela analizirani su pomoću CE-SDS u prisustvu i odsustvu redukujućeg agensa (Invitrogen, SAD) upotrebom LabChipGXII (Caliper). Ukupni sadržaj u uzorcima antitela je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisane u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/V) NaN3, pH 6,7 na 25 °C (Tabela 61).
2
Tabela 61: Biohemijska analiza anti-CD19 P329G LALA IgG1 klonova
Za pripremu bispecifičnih konstrukata odabran je klon 2B11, jer mu nedostaju tri žarišta deamidacije.
DNK sekvenca koja kodira deo ektodomena (aminokiseline 71-254 i 71-248) humanog 4-1BB liganda sintetisana je prema sekvenci P41273 Uniprot baze podataka.
7.2.3 Priprema jednovalentnog CD19 (8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) sa ukrštenim CH1-CL domenima sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 4.1)
Konstrukt 4.1 je pripremljen kao što je opisano za konstrukt 3.1 (Slika 30), ali upotrebom varijabilnog regiona DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CD19, klon 8B8-2B11.
Tabela 62 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-254), koji sadrži ukrštene CH-CL i naelektrisane ostatke (konstrukt 4.1).
Tabela 62: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254) koji sadrži ukrštene CH-CL sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 4.1). * za naelektrisane ostatke
2
2
7.2.4 Priprema jednovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) sa ukrštenim CH1-CL domenima bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 4.2)
Konstrukt 4.2 je pripremljen kao što je opisano za konstrukt 3.2 (Slika 30), ali upotrebom varijabilnog regiona DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CD19, klon 8B8-2B11.
Tabela 63 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-254), koji sadrži ukrštene CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 4.2).
Tabela 63: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19 (8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254) koji sadrži ukrštene CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 4.2).
1 7.2.5 Priprema dvovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) (konstrukt 4.3) Konstrukt 4.3 je pripremljen kao što je opisano za konstrukt 3.3 (Slika 30), ali upotrebom varijabilnog regiona DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CD19, klon 8B8-2B11.
Tabela 64 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CD19 (8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-254) (konstrukt 4.3).
Tabela 64: cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) PGLALA fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (konstrukt 4.3)
2
4
7.2.6 Priprema jednovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) sa ukrštenim CH1-CL domenima sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 4.4)
Konstrukt 4.4 je pripremljen kao što je opisano za konstrukt 3.4 (Slika 30), ali upotrebom varijabilnog regiona DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CD19, klon 8B8-2B11.
Tabela 65 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-248), koji sadrži ukrštene CH-CL i naelektrisane ostatke (konstrukt 4.4).
Tabela 65: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) koji sadrži ukrštene CH-CL sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 4.4). * naelektrisani ostaci
7.2.7 Priprema jednovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) sa ukrštenim CH1-CL domenima bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 4.5)
Konstrukt 4.5 je pripremljen kao što je opisano za konstrukt 3.5 (Slika 30), ali upotrebom varijabilnog regiona DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CD19, klon 8B8-2B11.
Tabela 66 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-248), koji sadrži ukrštene CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 4.5).
Tabela 66: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CD19 (8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) koji sadrži ukrštene CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 4.5).
7.2.8 Priprema dvovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) (konstrukt 4.6) Konstrukt 4.6 je pripremljen kao što je opisano za konstrukt 3.6 (Slika 30), ali upotrebom varijabilnog regiona DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CD19, klon 8B8-2B11.
Tabela 67 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CD19 (8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-248) (konstrukt 3.6).
Tabela 67 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CD19(8B8-2B11) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) (konstrukt 4.6)
1
11
12
7.3 Priprema neciljanog FC fuzionog split trimernog 4-1BB liganda i humanog IgG kao kontrolnih molekula
7.3.1 Priprema neciljanih humanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (kontrolni molekuli)
Ovi kontrolni molekuli pripremljeni su kao što je gore opisano za CD19 ciljani konstrukt 3.1 (nazvan kontrola B), 3.3 (nazvan kontrola C), 3.4 (nazvan kontrola D) i 3.5 (nazvan kontrola E) sa jedinom razlikom što je anti-CD19 vezivač (VH-VL) zamenjen
1
kontrolnom germinativnom linijom, nazvanom DP47, koja se ne vezuje za antigen (videti sliku 30).
Tabela 68 prikazuje, redom, cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254)koje sadrže ukrštene CH-CL sa naelektrisanim ostacima, kontrola B.
Tabela 69 prikazuje, redom, cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254), kontrola C.
Tabela 70 prikazuje, redom, cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) koje sadrže ukrštene CH-CL sa naelektrisanim ostacima, kontrola D.
Tabela 71 prikazuje, redom, cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) bez naelektrisanih ostataka u ukrštenim CH-CL, kontrola E.
Tabela 68: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog humanog 4-1BB liganda (71-254) sa ukrštenim CH-CL i sa naelektrisanim ostacima (kontrola B). * naelektrisani ostaci
Tabela 69: cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih)
14
fuzionog split trimernog humanog 4-1BB liganda (71-254) (kontrola C).
Tabela 70: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog humanog 4-1BB liganda (71-248) sa ukrštenim CH-CL i sa naelektrisanim ostacima (kontrola D). * naelektrisani ostaci
1
Tabela 71: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog humanog 4-1BB liganda (71-248)sa ukrštenim CH-CL i bez naelektrisanih ostataka (kontrola E).
7.3.2 Antitela kao kontrolni molekuli
Pripremljena su dva kontrolna humana IgG1 koja sadrže PGLALA.
Tabela 72 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence anti-CD19 huIgG1 PGLALA (klon 8B8-018), tj. kontrolu G.
Tabela 73 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence kontrolne germinativne linije DP47 huIgG1 PGLALA (kontrola F).
Tabela 72: cDNK i aminokiselinske sekvence anti-CD19 (8B8-018) huIgG1 PGLALA (kontrola G)
1
1
Tabela 73: cDNK i aminokiselinske sekvence kontrolne germinativne linije DP47 huIgG1 PGLALA (kontrola F)
7.4 Proizvodnja CD19 ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimerni 4-1BB ligand i njihovih kontrolnih molekula
Kodirajuće sekvence ciljanog i neciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand klonirane su u plazmidni vektor koji pokreće ekspresiju umetka iz MPSV promotera i sadrži sintetičku poly A sekvencu smeštenu na 3' kraju CDS. Uz to, vektor sadrži i EBV sekvencu OriP za epizomsko održavanje plazmida.
Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekul koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand proizveden je kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija sa ekspresionim vektorima sisara
1
upotrebom polietilenimina. Ćelije su transfektovane odgovarajućim ekspresionim vektorima. Za varijante 1,2,4,5 i njihove kontrole B, D i E, u odnosu 1:1:1:1 („vektorski lanac sa dugmetom dimernog liganda-CL”: „vektorski monomerni ligand fuzionij-CH1”: „vektorski anti-CD19 Fab lanac sa rupicom”: „vektorski anti-CD19 laki lanac”). Za varijantu 3, 6 i njihov kontrolni molekul, uzet je odnos 1:1:1 („vektorski huIgG1 Fc lanac sa rupicom dimernog liganda”: „vektorski huIgG1 Fc lanac sa dugmetom monomernog liganda”: „vektorski anti-CD19 laki lanac”). Humani IgG, koji su korišćeni kao kontrola u testu, proizvedeni su kao i za bispecifični konstrukt (za transfekciju je korišćen samo vektor za laki i vektor za teški lanac u odnosu 1:1).
Za proizvodnju u bocama za mućkanje od 500 ml, 300 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 10 minuta na 210 x g, i supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori (200 µg ukupne DNK) su mešani u 20 ml CD CHO medijuma. Nakon dodavanja 540 µl PEI, rastvor je mešan na vorteksu tokom 15 sekundi, i zatim inkubiran 10 minuta na sobnoj temperaturi.
Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml Excell medijuma dopunjenog sa 6 mM L-glutamina, 5 g/l PEPSOY i 1,2 mM valproinske kiseline, i ćelije su uzgajane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodato je 12% hraniva (aminokiselina i glukoza). Nakon uzgajanja tokom 7 dana, supernatant je sakupljen centrifugiranjem 30-40 minuta na najmanje 400 x g. Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 µm), dodat je natrijum azid do krajnje koncentracije od 0,01% (m/V), i čuvan na 4 °C.
Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekul koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand, kao i IgG, prečišćen je iz supernanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom upotrebom proteina A, a zatim gel hromatografijom. Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu Mab Select Sure (CV = 5-15 ml, smola proizvođača GE Healthcare), ekvilibrisan puferom sa natrijum fosfatom (20 mM), natrijum citratom (20 mM) (pH 7,5). Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 6 volumena kolone istog pufera. Vezani protein je eluiran korišćenjem linearnog gradijenta (20 CV) ili postepene elucije (8 CV) puferom sa 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina (pH 3,0). Za linearni gradijent je primenjena dodatna faza elucije sa 4 volumena kolone.
pH prikupljenih frakcija je podešen dodavanjem 1/10 (v/v) 0,5 M natrijum fosfata, pH 8,0. Protein je koncentrovan pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 20 mM histidina, 140 mM natrijum hlorida, 0,01% (v/v) Tween20, pH
1
Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa ciljanog trimernog Fc (kih) fuzionog 4-1BB liganda analizirane su pomoću SDS-PAGE u prisustvu i odsustvu redukujućeg agensa (5 mM 1,4-ditiotreitol) i bojenjem sa Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen SAD). Ukupni sadržaj antitela u uzorcima je analiziran pomoću analitičke kolone za ekskluzionu hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisane u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/V) NaN3, pH 6,7 na 25 °C.
Tabela 74 rezimira prinos i konačni sadržaj monomera u CD19 ciljanom Fc (kih) fuzionom antigen molekulu koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand.
Tabela 74: Biohemijska analiza CD19 ciljanog Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand
2
Tabela 75 rezimira prinos i konačni sadržaj monomera DP47 neciljanog Fc fuzionog split trimernog 4-1BB liganda, jednovalentnog (kontrola B, D i E) i dvovalentnog (kontrola C).
Tabela 75: Biohemijska analiza DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda
Tabela 76 rezimira prinos i konačni sadržaj monomera anti-CD19 (8B8-018) i germinativne linije DP47 humanog IgG1 PGLALA (kontrola F).
Tabela 76: Biohemijska analiza kontrolnog humanog IgG1 PGLALA
Primer 8
Funkcionalna karakterizacija CD19 ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
8.1. Površinska plazmonska rezonanca (afinitet)
Vezivanje CD19 ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže split trimerni 4-1BB ligand (konstrukti 3.4 i 3.6) za rekombinantne 4-1BB Fc (kih) i CD19
21
procenjeno je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti obavljeni su na Biacore T200 na 25 °C sa HBS-EP kao radnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20, Biacore, Freiburg/Nemačka).
Interakcija sa 4-1BB čoveka i cinomolgusa
Antihumano Fab antitelo (Biacore, Freiburg/Nemačka) direktno je povezano na CM5 čip pri pH 5,0 upotrebom standardnog kompleta za kuplovanje amina (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 8000 RU. CD19 ciljani Fc fuzioni molekuli split trimernog 4-1BB liganda su snimani tokom 60 sekundi pri 2 i 5 nM (takođe je injektovana kontrola D). Rekombinantni humani ili cinomolgusov 4-1BB avi His propušten je u rasponu koncentracija od 2,7 do 2000 nM (trostruko razblaživanje) sa protokom od 30 µl/minuti kroz protočnu ćeliju tokom 120 sekundi. Disocijacija je praćena tokom 180 sekundi. Varijacije indeksa prelamanja u rasutom stanju su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji. Ovde su antigeni prolazili iznad površine sa imobilisanim antihumanim Fab antitelom, na koju je injektovan HBS-EP, a ne CEA.
Interakcija sa humanim CD19
Antihumano Fab antitelo (Biacore, Freiburg/Nemačka) direktno je povezano na CM5 čip pri pH 5,0 upotrebom standardnog kompleta za kuplovanje amina (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije je bio oko 8000 RU. CD19 ciljani Fc fuzioni molekuli split trimernog 4-1BB liganda ili kontrolno antitelo (anti- CD19 (8B8-018) huIgG1 PGLALA) snimani su 60 sekundi pri 20 nM. Rekombinantni humani CD19-Fc(kih) propušten je u rasponu koncentracija od 7,8 do 500 nM (dvostruko razblaženje) sa protokom od 30 µl/minutu kroz protočne ćelije tokom 120 sekundi. Disocijacija je praćena 120/1800 sekundi. Varijacije indeksa prelamanja u rasutom stanju su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji. Ovde su antigeni prolazili iznad površine sa imobilisanim antihumanim Fab antitelom, na koju je injektovan HBS-EP, a ne CEA.
Kinetičke konstante su izvedene korišćenjem Biacore T200 softvera za procenu (vAA, Biacore AB, Uppsala/Švedska), radi podešavanja stopa jednačina za 1:1 Lengmirovo vezivanje numeričkom integracijom.
Bispecifični konstrukti 3.4, 3.6 i kontrola D vezuju se na sličan način za 4-1BB. Tabela 77 prikazuje srednje vrednosti sa standardnom devijacijom (u zagradama) za dva eksperimenta (pri upotrebi rastvora za snimanje konstrukta bilo pri 2 nM ili 5 nM). Bispecifični konstrukti 3.4 i 3.6 vezuju humani CD19 sa sličnim afinitetom kao IgG. Konstante afiniteta za interakciju određene su prilagođavanjem Lengmirovom vezivanju 1:1. Za merenja sa hu4-1BB i cy4-1BB prikazane su srednje vrednosti i standardna devijacija (u zagradama) (dva eksperimenta sa
22
rastvorom za snimanje od 2 ili 5 nM).
Tabela 77: Vezivanje CD19 ciljanog Fc fuzionog split trimernog 4-1BB liganda za rekombinantni humani (hu) 4-1BB, 4-1BB cinomolgusa (cy) i humani (hu) CD19.
8.2. Površinska plazmonska rezonanca (istovremeno vezivanje)
Sposobnost istovremenog vezivanja humanog 4-1BB Fc (kih) i humanog CD19 procenjena je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti obavljeni su na Biacore T200 na 25 °C sa HBS-EP kao radnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20, Biacore, Freiburg/Nemačka). Biotinilovani humani 4-1BB Fc (kih) je direktno povezan sa protočnom ćelijom senzorskog čipa
2
streptavidina (SA). Korišćeni su nivoi imobilizacije do 250 rezonantnih jedinica (RU).
CD19 ciljani trimerni split 4-1BBL konstrukti (konstrukti 3.1, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 4.4) su propušteni u rasponu koncentracija od 200 nM sa protokom od 30 µl/minut kroz protočne ćelije tokom 90 sekundi, i disocijacija je postavljena na nula sekundi. Humani CD19 je injektovan kao drugi analit sa protokom od 30 µl/minut kroz protočne ćelije tokom 90 sekundi pri koncentraciji od 500 nM (Slika 34A). Disocijacija je praćena 120 sekundi. Korigovane su varijacije indeksa prelamanja u rasutom stanju oduzimanjem odgovora dobijenog u referentnoj protočnoj ćeliji, gde nije imobilisan protein.
Kao što se može videti na grafikonima na Slici 35, svi bispecifični konstrukti mogu istovremeno da vežu humani 4-1BB i humani CD19.
Primer 9
Funkcionalna karakterizacija CD-19 ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
9.1. Vezivanje za aktivirane humane PMBC CD19 ciljanih Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
Za određivanje vezivanja Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL za humane PBMC, u ispitivanju su korišćene različite titrisane koncentracije CD-19 ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL, kao što je opisano u primeru 5.2.
Slike 36A i 36B prikazuju vezivanje konstrukata 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 i 3.6 kao što su pripremljeni u primeru 7 za aktivirane 4-1BB-eksprimirajuće CD4+ T ćelije, odnosno CD8+ T ćelije. Gejtovi su postavljeni na žive ćelije CD45+CD3+ CD4+ili CD45+ CD3+ CD8+ T, i MFI PE-konjugovanog AffiniPure antihumanog IgG kozjeg F(ab')2 fragmenta specifičnog za Fcγ fragment IgG su predstavljeni u odnosu na titrisanu koncentraciju ciljanih Fc fuzionih varijanti split trimernog 4-1BB liganda. Tabela 78 prikazuje vrednosti EC50izmerene za konstrukte 3.1, 3.3.3.4, 3.5 i 3.6 i kontrolne molekule.
Tabela 78: Vezivanje za aktivirane CD4+ T ćelije koje eksprimiraju 4-1BB i CD8+ T ćelije
24
9.2 Vezivanje za tumorske ćelije koje eksprimiraju CD19
Za ispitivanje vezivanja za tumorske ćelije koje eksprimiraju CD19 korišćene su sledeće humane ćelijske linije limfoma koje eksprimiraju CD19: ćelijska linija SU-DHL-8 (DSMZ ACC573) difuznog velikog ne-Hodžkinovog B ćelijskog limfoma (B-NHL), ćelijska linija akutne prekursorske limfoidne leukemije B ćelija Nalm6 (DSMZ ACC-128), ćelijska linija Toledo difuznog limfoma velikih ćelija limfoblasta (ATCC CRL-2631) i ćelijska linija difuznog limfoma velikih B ćelija OCI-Ly18 (DSMZ ACC-699). Testovi su izvedeni kao što je opisano za MV-3 i WM-266-4 tumorske ćelije koje eksprimiraju FAP u primeru 5.3.
Gejtovi su postavljeni na žive ćelije tumora, i MFI PE-konjugovanog AffiniPure antihumanog kozjeg IgG F(ab')2 fragmenta specifičnog za Fcγ fragment IgG su predstavljeni u odnosu na titrisanu koncentraciju ciljanih split trimernih 4-1BB liganda Fc fuzionih konstrukata.
Slika 37A prikazuje vezivanje konstrukata 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 i 3.6 kao što su pripremljeni u primeru 7.1 za ćelijsku liniju SU-DHL-8 difuznog velikog ne-Hodžkinovog B ćelijskog limfoma (B-NHL), a na slici 37B vezivanje konstrukata 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 i 3.6 za ćelijsku liniju akutne prekursorske limfoidne leukemije B ćelija Nalm6. Na slici 37C prikazano je vezivanje konstrukata 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 i 3.6 za ćelijsku liniju Toledo difuznog limfoma velikih ćelija limfoblasta, a na slici 37D prikazano je vezivanje konstrukata 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 i 3.6 za ćelijsku liniju difuznog limfoma velikih B ćelija OCI-Ly18. Tabela 79 prikazuje vrednosti EC50izmerene za konstrukte 3.1, 3.3, 3.4, 3.5 i 3.6 i kontrolne molekule.
Tabela 79: Vezivanje za tumorske ćelije koje eksprimiraju CD19
2
Primer 10
Biološka aktivnost CD19 ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
10.1. Aktivacija NF-κB u HeLa ćelijama koje eksprimiraju humani 4-1BB HeLa ćelije koje eksprimiraju humani 4-1BB i NF-κB-luciferazu generisane su kao što je opisano u Primeru 6.1.
Aktivacija NF-κB u Hela ćelijama koje eksprimiraju humane 4-1BB kokultivisane sa tumorskim ćelijama koje eksprimiraju CD19
NF-κB-luciferaza humane 4-1BB HeLa ćelije su sakupljene i ponovo suspendovane u DMEM medijumu sa dodatkom 10% (V/V) FBS i 1% (V/V) GlutaMAX-I do koncentracije od 0,2 x 10<6>ćelija/ml.100 µl (2 x 10<4>ćelija) ove ćelijske suspenzije preneto je u svaki bunarčić sterilne bele ploče za uzgajanje tkiva sa poklopcem sa 96 bunarčića ravnog dna (greiner bio-one, kat. br.655083) i ploča je inkubirana na 37 °C i 5% CO2preko noći. Sledećeg dana, dodato je 50 µl medijuma koji sadrži titrisane koncentracije CD19 ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (CD19 split 4-1BBL trimer) ili DP47-neciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (DP47 split 4-1BBL trimer). CD19-eksprimirajuće ćelijske linije B ćelijskog limfoma (ćelijska linija SU-DHL-8 (DSMZ ACC573) difuznog velikog ne-Hodžkinovog B ćelijskog limfoma (B-NHL) i humanog ne-Hodžkinovog B ćelijskog limfoma Fajfer (ATCC CRL-2632)) su ponovo suspendovane u DMEM medijumu sa dodatkom 10% (v/v) FBS i 1% (v/v) GlutaMAX-i do koncentracije od 2 x 10<6>ćelija/ml.
Suspenzija CD19-eksprimirajućih ćelija B ćelijskog limfoma (50 µl, konačni odnos 1:5) ili samo medijum su dodati u svaki bunarčić, i ploče su inkubirane 6 sati na 37 °C i 5% CO2. Ćelije su isprane dva puta sa 200 µl/bunarčiću DPBS. 40 µl sveže pripremljenog reporterskog pufera za lizu (Promega, kat. br.: E3971) dodato je u svaki bunarčić i ploča je čuvana preko noći na -20 °C. Sutradan, zamrznuta ćelijska ploča i detekcioni pufer (Luciferase
2
1000 Assay System, Promega, kat. br. E4550) odmrznuti su na sobnoj temperaturi. U svaki bunarčić je dodato 100 µl detekcionog pufera, a aktivnost luciferaze je izmerena što je brže moguće pomoću čitača mikroploča SpectraMax M5/M5e i softvera SoftMax Pro (Molecular Devices) za brojanje emisije svetlosti u URL-ima (jedinice oslobođene svetlosti za 0,5 s/bunarčiću), ili Victor31420 višeznačnog brojača čitača ploča (Perkin Elmer) i softvera Perkin Elmer 2030 Manager za brojanje svetlosne emisije kao broja u sekundi (CPS), i predstavljena u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata.
CD19 ciljani Fc fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda konstrukti 3.1 i 3.3 pokrenuli su aktivaciju NF-kB signalnog puta u reporterskoj ćelijskoj liniji u prisustvu ćelija B ćelijskog limfoma koje eksprimiraju CD19. Nasuprot tome, neciljani kontrolni molekuli nisu uspeli da pokrenu takav efekat ni na jednoj od testiranih koncentracija (Slika 38).
Primer 11
11.1 Priprema CEA (T84.66-LCHA) ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
11.1.1 Humanizacija anti-CEA klona T84.66
Nove humanizovane varijante mišjeg antitela T84.66 (Wagener et al., J Immunol 130, 2308 (1983), Neumaier et al., J Immunol 135, 3604 (1985)) razvijene su graftovanjem CDR-a na humani okvir germinativne linije akceptorske sekvence.
Humanizacija antitela nehumanog porekla sastoji se u osnovi od presađivanja CDR ostataka iz nehumanih antitela (donora) na okvir humanog (akceptorskog) antitela. Tipično se akceptorski okvir odabira poravnavanjem sekvence donora sa kolekcijom potencijalnih akceptorskih sekvenci i odabirom one koja ima ili razumnu homologost sa donorom, ili pokazuje slične aminokiseline na nekim položajima kritičnim za strukturu i aktivnost. U predmetnom slučaju, pretraga za okvirom akceptorskog antitela je obavljena poravnavanjem sekvence mišjeg T84.66 proteina (NCBI pristupni br: CAA36980 za teški lanac (SEQ ID NO:317), i CAA36979 (SEQ ID NO:318) za laki lanac) sa kolekcijom sekvenci humane germinativne linije i odabirom one humane sekvence koja je pokazala veliku identičnost sekvence. Ovde je sekvenca IGHV1-69*08 iz baze podataka IMGT odabrana kao akceptorska sekvenca okvira teškog lanca (IMGT pristup. br. Z14309, SEQ ID NO: 319) i sekvenca IGKV3-11*01 (IMGT pristup. br. X01668, SEQ ID NO: 320) odabrana je kao akceptor okvira za laki lanac. Na ta dva akceptorska okvira graftovana su tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR) mišjih teških i lakih varijabilnih domena. Pošto region okvira 4 (FR4) nije deo varijabilnog regiona germinativne linije gena V, poravnavanje za tu poziciju
2
izvršeno je pojedinačno. Za teški lanac odabrana je sekvenca JH4, a za laki lanac odabrana je sekvenca JK2.
11.1.2 Vezivanje različitih humanizovanih varijanti T84.66 IgG za ćelije Vezivanje različitih humanizovanih varijanti IgG T84.66 testirano je na ćelijama humanog adenokarcinoma želuca koje eksprimiraju CEA (MKN45, DSMZ ACC 409).
Ćelije su sakupljene, prebrojane, proverena im je vijabilnost, i ponovo su suspendovane sa 2 x 10<6>ćelija/ml u FACS puferu (100 µl PBS 0,1% BSA). 100 μl ćelijske suspenzije (koja sadrži 0,2 x 10<6>ćelija) inkubirano je na ploči sa 96 bunarčića sa okruglim dnom tokom 30 minuta na 4 °C sa rastućim koncentracijama CEA IgG (4 ng/ml−60 µg/ml), dva puta isprano hladnim PBS sa 0,1% BSA, ponovo inkubirano još 30 min na 4 °C sa PE-konjugovanim AffiniPure F(ab’)2 fragmentom kozjeg anti-humanog IgG Fcγ fragment specifičnog sekundarnog antitela (Jackson Immuno Research Lab PE br. 109-116-170), isprano dva puta hladnim PBS sa 0,1% BSA, i smesta analizirano pomoću FACS, pomoću FACS CantoII (softver FACS Diva). Krive vezivanja i vrednosti EC50 dobijene su i izračunate pomoću GraphPadPrism5.
Slika 39 prikazuje različit obrazac vezivanja odabranih humanizovanih varijanti T84.66 IgG za humani CEA, eksprimiran na MKN45 ćelijama. Na temelju izračunatih EC50 vrednosti vezivanja (Tabela 80), za dalju procenu odabrana je humanizovana varijanta 1. Tabela 80: Vezivanje različitih humanizovanih varijanti T84.66 IgG za ćelije (vrednosti EC50, na osnovu krivih vezivanja prikazanih na slici 39, izračunate pomoću Graph Pad Prism).
Humanizovana varijanta 1 se u nastavku naziva T84.66-LCHA. Aminokiselinske
2
sekvence njenih CDR-a i VH i VL, kao i aminokiselinske sekvence VH i VL domena matičnog himernog klona T84.66 prikazane su u Tabeli 81.
Tabela 81: Aminokiselinske sekvence varijabilnih domena CEA klona T84.66-LCHA i njegovog matičnog antitela T84.66
11.2 Priprema CEA (T84.66-LCHA) ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
Različiti fragmenti DNK sekvence koji kodiraju deo ektodomena (aminokiseline 71-254 i 71-248) humanog 4-1BB liganda sintetisani su prema sekvenci P41273 Uniprot baze
2
podataka (SEQ ID NO: 42).
11.2.1 Priprema jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) sa ukrštenim CH1-CL domenima sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 5.1) Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-254), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je kao što je prikazano na slici 29A: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254) i spojen sa humanim IgG1-CH domenom, kloniran je kao što je opisano na slici 29B: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH.
Da bi se poboljšalo ispravno uparivanje, u ukrštene CH-CL uvedene su sledeće mutacije. U dimernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CL, E123R i Q124K. U monomernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CH1, K147E i K213E.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CEA, klon T84.66-LCHA, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice ili konstantnim lakim lancem humanog IgGI. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831.
Kombinacija lanca sa dugmetom dimernog liganda-Fc koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog lanca sa rupicom anti-CEA-Fc koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-CEA omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i CEA vezujući Fab (Slika 40, konstrukt 5.1).
Tabela 82 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-254) sa ukrštenim CH-CL i naelektrisanim ostacima (konstrukt 5.1).
Tabela 82: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254) koji sadrži ukrštene CH-CL sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 5.1). * za naelektrisane ostatke
1
2
11.2.2 Priprema jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) sa ukrštenim CH1-CL domenima bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 5.2)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-254), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je analogno prikazanom na slici (29A), ali bez aminokiselinskih mutacija u CL domenu: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254), i spojen sa humanim IgG1-CH1 domenom, kloniran je analogno prikazanom na slici (29B), ali bez aminokiselinskih mutacija u CH1 domenu: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH1.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CEA, klon T84.66-LCHA, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1.
Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831. Kombinacija lanca sa dugmetom dimernog liganda-Fc koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog lanca sa rupicom anti-CEA-Fc koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-CEA omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i CEA vezujući Fab (Slika 40, konstrukt 5.2).
Tabela 83 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CEA (T84.66 - LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-254), koji sadrži ukrštene CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 5.2).
Tabela 83: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254) koji sadrži ukrštene CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 5.2)
11.2.3 Priprema dvovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) (konstrukt 5.3)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-254), razdvojena (G4S)2 linkerima, spojen je sa C-krajem Fc lanca sa rupicom humanog IgG1, kako je prikazano na slici 29C: Fc sa rupicom humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254) i spojen je sa C-krajem Fc lanca sa dugmetom humanog IgG1, kako je opisano na Slici 29D: Fc sa dugmetom humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CEA, klon T84.66-LCHA, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice, dugmeta ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se
4
ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831. Kombinacija anti-CEA huIgG1 lanca sa rupicom dimernog liganda koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V, anti-CEA huIgG1 lanca sa dugmetom monomernog liganda koji sadrži mutacije S354C/T366W i anti-CEA lakog lanca omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i dva CEA vezujuća Fab (Slika 40, konstrukt 5.3).
Tabela 84 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-254) (konstrukt 5.3).
Tabela 84: cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CEA(T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) PGLALA fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254) (konstrukt 5.3)
11.2.4 Priprema jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) sa ukrštenim CH1-CL domenima sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 5.4)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-248), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je analogno onom prikazanom na slici 29A: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-248) i spojen sa humanim IgG1-CH domenom, kloniran je analogno onom opisanom na slici 29B: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH.
Polipeptid koji kodira dimerni 4-1BB ligand spojen sa humanim CL domenom subkloniran je u okviru sa domenima teškog lanca CH2 i CH3 humanog IgG1 na dugmetu (Merchant, Zhu et al. 1998.). Da bi se poboljšalo ispravno uparivanje, u ukrštene CH-CL uvedene su sledeće mutacije. U dimernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CL, E123R i Q124K. U monomernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CH1, K147E i K213E.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CEA, klon T84.66-LCHA, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca dugmeta i rupice kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831. Kombinacija lanca sa dugmetom dimernog liganda-Fc koji sadrži mutacije S354C/T366W, monomerne fuzije CH1, ciljanog lanca sa rupicom anti-CD19-Fc koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-CD19 omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i CEA vezujući Fab (slika 40, konstrukt 5.4).
Tabela 85 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-248) sa ukrštenim CH-CL i naelektrisanim ostacima (konstrukt 5.4).
Tabela 85: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) koji sadrži ukrštanje CH-CL sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 5.4). * naelektrisani ostaci
4
11.2.5 Priprema jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) sa ukrštenim CH1-CL domenima bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 5.5) Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-248), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je analogno prikazanom na slici (29A), ali bez aminokiselinskih mutacija u CL domenu: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-248), i spojen sa humanim IgG1-CH1 domenom, kloniran je analogno prikazanom na slici (29B), ali bez aminokiselinskih mutacija u CH1 domenu: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH1.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CEA, klon T84.66-LCHA, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831. Kombinacija lanca sa dugmetom dimernog liganda-Fc koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog anti-CEA-Fc lanca sa rupicom koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-CEA omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i CD19 vezujući Fab (Slika 40, konstrukt 5.5).
Tabela 86 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-248), koji sadrži ukrštene CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 5.5).
41
Tabela 86: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) koji sadrži ukrštanje CH-CL bez naelektrisanih ostataka (konstrukt 5.5).
11.2.6 Priprema dvovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-248) (konstrukt 5.6)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-248), razdvojena (G4S)2 linkerima, spojen je sa C-krajem Fc lanca sa rupicom humanog IgG1, kako je prikazano na slici 29C: Fc sa rupicom humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor,
42
humani 4-1BB ligand. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254) i spojen je sa C-krajem Fc lanca sa dugmetom humanog IgG1, kako je opisano na Slici 29D: Fc sa dugmetom humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CEA, klon T84.66-LCHA, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice, dugmeta ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831. Kombinacija anti-CEA huIgG1 lanca sa rupicom dimernog liganda koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V, anti-CEA huIgG1 lanca sa dugmetom monomernog liganda koji sadrži mutacije S354C/T366W i anti-CEA lakog lanca omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i dva CEA vezujuća Fab (Slika 40, konstrukt 5.6).
Tabela 87 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-248) (konstrukt 5.6).
Tabela 87: cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) (konstrukt 5.6)
4
44
4
4
11.2.7 Priprema jednovalentnog CEA (T84.66) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) sa ukrštenim CH1-CL domenima sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 5.7)
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-254), odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je kao što je prikazano na slici
4
29A: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CL. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254) i spojen sa humanim IgG1-CH domenom, kloniran je kao što je opisano na slici 29B: humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani CH.
Da bi se poboljšalo ispravno uparivanje, u ukrštene CH-CL uvedene su sledeće mutacije. U dimernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CL, E123R i Q124K. U monomernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CH1, K147E i K213E.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CEA, klon T84.66, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831.
Kombinacija lanca dimernog liganda-Fc dugmeta koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog lanca anti-CD19-Fc rupice koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-CD19 omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i CEA vezujući Fab. Konstrukt 5.7 odgovara konstruktu 5.1, kao što je prikazano na Slici 40.
Tabela 88 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CEA (T84.66) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-254) sa ukrštenim CH-CL i naelektrisanim ostacima (konstrukt 5.7).
Tabela 88: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CEA (T84.66) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254) koji sadrži ukrštene CH-CL sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 5.7). * za naelektrisane ostatke
4
4
2.8 Priprema dvovalentnog CEA (T84.66) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda (71-254) (konstrukt 5.8) Polipeptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BB liganda (71-254), razdvojena (G4S)2 linkerima, spojen je sa C-krajem Fc lanca sa rupicom humanog IgG1, kako je prikazano na slici 29C: Fc sa rupicom humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand. Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen 4-1BB liganda (71-254) i spojen je sa C−terminusom Fc lanca sa dugmetom humanog IgG1, kako je opisano na slici 29D: Fc dugme humanog IgG1, (G4S)2 konektor, humani 4-1BB ligand.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za CEA, klon T84.66, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice, dugmeta ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831. Kombinacija anti-CEA huIgG1 lanca sa rupicom dimernog liganda koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V, anti-CEA huIgG1 lanca sa dugmetom monomernog liganda koji sadrži mutacije S354C/T366W i anti-CEA lakog lanca omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni 4-1BB ligand i dva CEA vezujuća Fab. Konstrukt 5.8 odgovara konstruktu 5.3, kao što je prikazano na Slici 40.
Tabela 89 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CEA (T84.66) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand (71-254) (konstrukt 5.8).
Tabela 89: cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog CEA(T84.66) ciljanog Fc (kih) PGLALA fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254) (konstrukt 5.8)
1
�
4
11.3 Priprema neciljanih Fc fuzionih molekula split trimernog 4-1BB liganda i humanog IgG kao kontrolnih molekula
11.3.1 Priprema neciljanih humanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (kontrolni molekuli)
Ovi kontrolni molekuli pripremljeni su kao što je gore opisano za CEA ciljani konstrukt 3.1 (nazvan kontrola B), 3.3 (nazvan kontrola C), 3.4 (nazvan kontrola D) i 3.5 (nazvan kontrola E) sa jedinom razlikom što je anti-CD19 vezivač (VH-VL) zamenjen kontrolnom germinativnom linijom, nazvanom DP47, koja se ne vezuje za antigen (videti sliku 40). cDNK i aminokiselinske sekvence kontrole B, jednovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254) koji sadrži ukrštene CH-CL sa naelektrisanim ostacima, prikazane su u Tabeli 68 gore (vidi primer 7.3.1). Tabela 69 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence dvovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-254), kontrola C. Tabela 70 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) koje sadrže ukrštene CH-CL sa naelektrisanim ostacima, kontrola D. Tabela 71 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda (71-248) bez naelektrisanih ostataka u ukrštenim CH-CL, kontrola E.
11.3.2 Antitela kao kontrolni molekuli
Dodatna kontrola koja se koristi u ispitivanjima, nazvana kontrola F, bila je kontrola neciljanog DP47, germinativne linije, humani IgG1, koji sadrži mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala, da bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore. cDNK i aminokiselinske sekvence kontrole F mogu se naći u Tabeli 73 gore.
11.4 Proizvodnja CEA ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže split trimerni 4-1BB ligand i njihovih kontrolnih molekula
Kodirajuće sekvence ciljanog i neciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand klonirane su u plazmidni vektor koji pokreće ekspresiju umetka iz MPSV promotera i sadrži sintetičku polyA sekvencu smeštenu na 3' kraju CDS. Uz to, vektor sadrži i EBV sekvencu OriP za epizomsko održavanje plazmida.
Fc (kih) fuzioni molekul koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand proizveden je kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija sa ekspresionim vektorima sisara pomoću polietilenimina. Ćelije su transfektovane odgovarajućim ekspresionim vektorima. Za varijante 1,2,4,5 i njihove kontrole B, D i E, u odnosu 1:1:1:1 („vektorski lanac sa dugmetom dimernog liganda-CL”: „vektorski monomerni ligand fuzionij-CH1”: „vektorski anti-CEA Fab-lanac sa rupicom”: „vektorski anti CEA laki lanac”). Za varijantu 3, 6 i njihov kontrolni molekul, uzet je odnos 1:1:1 („vektorski huIgG1 Fc lanac sa rupicom dimernog liganda”: „vektorski huIgG1 Fc lanac sa dugmetom monomernog liganda”: „vektorski anti CEA laki lanac”). Humani IgG, koji su korišćeni kao kontrola u testu, proizvedeni su kao i za bispecifični konstrukt (za transfekciju je korišćen samo vektor za laki i vektor za teški lanac u odnosu 1:1).
Za proizvodnju u bocama za mućkanje od 500 ml, 300 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 10 minuta na 210 x g, i supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori (200 µg ukupne DNK) su mešani u 20 ml CD CHO medijuma. Nakon dodavanja 540 µl PEI, rastvor je mešan na vorteksu tokom 15 sekundi, i zatim inkubiran 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml Excell medijuma dopunjenog sa 6 mM L-glutamina, 5 g/l PEPSOY i 1,2 mM valproinske kiseline, i ćelije su uzgajane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodato je 12% hraniva (aminokiselina i glukoza). Nakon uzgajanja tokom 7 dana, supernatant je sakupljen centrifugiranjem 30-40 minuta na najmanje 400 x g. Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 µm), dodat je natrijum azid do krajnje koncentracije od 0,01% (m/V), i čuvan na 4 °C.
Split trimerni 4-1BB ligand Fc (kih) fuzija, kao i IgG, prečišćena je iz supernanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom upotrebom proteina A, a zatim gel hromatografijom. Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu MabSelect Sure (CV = 5-15 ml, smola proizvođača GE Healthcare), ekvilibrisan puferom sa natrijum fosfatom (20 mM), natrijum citratom (20 mM) (pH 7,5). Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 6 volumena kolone istog pufera. Vezani protein je eluiran korišćenjem linearnog gradijenta (20 CV) ili postepene elucije (8 CV) puferom sa 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina (pH 3,0). Za linearni gradijent je primenjena dodatna faza elucije sa 4 volumena kolone.
pH prikupljenih frakcija je podešen dodavanjem 1/10 (v/v) 0,5 M natrijum fosfata, pH 8,0. Protein je koncentrovan pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 20 mM histidina, 140 mM natrijum hlorida, 0,01% (v/v) Tween20, pH 6,0.
Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer 4-1BB liganda analizirane su pomoću SDS-PAGE u prisustvu i odsustvu redukujućeg agensa (5 mM 1,4-ditiotreitol) i bojenjem sa Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen SAD) ili CE-SDS pomoću Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). Ukupni sadržaj u uzorcima je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisane u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/V) NaN3, pH 6,7 na 25 °C.
Tabela 90 rezimira prinos i konačni sadržaj monomera u CEA ciljanim Fc (kih) fuzionim antigen vezujućim molekulima koji sadrže split trimer 4-1BB liganda.
Tabela 90: Biohemijska analiza CEA ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda.
Tabela 91 rezimira prinos i konačni sadržaj monomera DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog molekula koji sadrži split trimerni 4-1BB ligand , i jednovalentnog (kontrola B, D i E) i dvovalentnog (kontrola C), kao i germinativne linije DP47 humanog IgG1 PGLALA (kontrola F).
Tabela 91: Biohemijska analiza DP47 neciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda
Primer 12
Funkcionalna karakterizacija CEA ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
12.1 Površinska plazmonska rezonanca (istovremeno vezivanje)
Proizvodnja hu NA3B3 A2 kao antigena za CEA ciljane trimerne split 4-1BBL konstrukte
Antigen korišćen za procenu vezivanja pomoću SPR na CEA bio je hibridni molekul sastavljen od A3 i B3 domena iz humanog CEACAM5 (CEA) i N i A2 domena humanog CEACAM1 (BGP1) slično onome koji je opisan za NABA (Durbin H. et al., Proc Natl Acad Sci USA.1994 May 10; 91(10): 4313-7). Ovde se antigen naziva NA3B3A2, a šematski opis se može naći na Slici 41A.
Tabela 92 prikazuje nukleotidne i aminokiselinske sekvence hu NA3B3A2-avi-His.
Tabela 92: Nukleotidne i aminokiselinske sekvence hu NA3B3A2-avi-His
Proizvodnja proteina je izvedena kao što je gore opisano za Fc-fuzioni protein (Primer 7.1.1). Izlučeni proteini su prečišćeni iz supernatanata ćelijske kulture helatnom hromatografijom, a zatim gel filtracijom. Prvi hromatografski korak je izveden na kertridžu NiNTA Superflow (5 ml, Qiagen) uravnoteženom u 20 mM natrijum fosfatu, 500 nM natrijum hloridu, pH 7,4. Elucija je izvedena nanošenjem gradijenta preko 12 zapremina kolone od 5% do 45% elucionog pufera (20 mM natrijum fosfat, 500 nM natrijum hlorid, 500 mM imidazol, pH 7,4).
Ciljni protein je koncentrovan i filtriran pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 75 (GE Healthcare) ekvilibrisanu sa 20 mM histidinom, 140 mM NaCl, 0,01% Tween-20 pH 6,0.
Tabela 93 rezimira prinos i konačni sadržaj monomera u humanom NA3B3A2-avi-His.
Tabela 93: Biohemijska analiza humanog NA3B3A2-avi-His
Kapacitet istovremenog vezivanja humanog 4-1BB Fc (kih) i humanog NA3B3A2 procenjen je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR). Svi SPR eksperimenti obavljeni su na Biacore T200 na 25 °C sa HBS-EP kao radnim puferom (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktant P20, Biacore, Freiburg/Nemačka). Biotinilovani humani 4-1BB Fc (kih) direktno je povezan sa protočnom ćelijom senzorskog čipa streptavidina (SA). Korišćeni su nivoi imobilizacije do 250 rezonantnih jedinica (RU).
CEA ciljani trimerni split 4-1BBL konstrukti (konstrukti 5.4, 5.6, 5.7 i 5.8) propušteni su u opsegu koncentracija od 200 nM sa protokom od 30 µl/minutu kroz protočne ćelije tokom 90 sekundi, i disocijacija je postavljena na nula sekundi. Humani NA3B3A2 je injektovan kao drugi analit sa protokom od 30 µl/minutu kroz protočne ćelije tokom 90 sekundi u koncentraciji od 500 nM (Slika 41B). Disocijacija je praćena tokom 120 sekundi. Varijacije u indeksu prelamanja u rasutom stanju su korigovane oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnoj protočnoj ćeliji, gde nije imobilisan protein.
Kao što se može videti na grafikonima na slici 42, svi bispecifični konstrukti mogu istovremeno da vežu humani 4-1BB i humani NA3B3A2.
12.2. Vezivanje CEA ciljanih Fc (kih) fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda za aktivirane humane PMBC
Za određivanje vezivanja Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL za humane PBMC, u ispitivanju su korišćene različite titrisane koncentracije CEA ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BBL, kao što je opisano u primeru 5.2.
Slika 43 prikazuje vezivanje konstrukata 5.4, 5.6, 5.7 i 5.8 kao što su pripremljeni u primeru 11 za aktivirane 4-1BB-eksprimirajuće CD4+ T ćelije, odnosno CD8+ T ćelije. Gejtovi su postavljeni na žive ćelije CD45+CD3+ CD4+ili CD45+ CD3+ CD8+ T, i MFI PE-konjugovanog AffiniPure antihumanog IgG kozjeg F(ab')2 fragmenta specifičnog za Fcγ fragment IgG su predstavljeni u odnosu na titrisanu koncentraciju ciljanih Fc fuzionih varijanti split trimernog 4-1BB liganda.
Tabela 94 prikazuje vrednosti EC50izmerene za konstrukte 5.4, 5.6, 5.7 i 5.8 i kontrolne molekule.
Tabela 94: Vezivanje za aktivirane CD4+ T ćelije koje eksprimiraju 4-1BB i CD8+ T ćelije
1
12.2 Vezivanje za tumorske ćelije koje eksprimiraju CEA
Za ispitivanje vezivanja tumorskih ćelija koje eksprimiraju CEA korišćene su sledeće humane ćelijske linije limfoma koje eksprimiraju CEA: CEA-eksprimirajuće ćelijske linije humanog kancera želuca MKN-45 (ATCC TCP-1008) i ćelijske linije humanog kolorektalnog adenokarcinoma LS180 (ATCC CL-187). Testovi su izvedeni kao što je opisano za MV-3 i WM-266-4 tumorske ćelije koje eksprimiraju FAP u primeru 5.3.
Gejtovi su postavljeni na žive ćelije tumora, i MFI PE-konjugovanog AffiniPure antihumanog kozjeg IgG F(ab')2 fragmenta specifičnog za Fcγ fragment IgG su predstavljeni u odnosu na titrisanu koncentraciju ciljanih split trimernih 4-1BB liganda Fc fuzionih konstrukata.
Slika 44 prikazuje vezivanje konstrukata 5.7 kao što su pripremljeni u primeru 11.2.7 za humani CEA koji eksprimira ćelijsku liniju ljudskog želuca MKN-45 (levo) i ćelijsku liniju ljudskog kolorektalnog adenokarcinoma LSI80 (desno). Tabela 95 prikazuje vrednosti EC50izmerene za humane CEA-eksprimirajuće ćelijske linije humanog kancera želuca MKN-45.
Tabela 95: Vezivanje za tumorske ćelije koje eksprimiraju CEA
Primer 13
Biološka aktivnost CEA ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda
13.1. Aktivacija NF-κB u HeLa ćelijama koje eksprimiraju humani 4-1BB HeLa ćelije koje eksprimiraju humani 4-1BB i NF-κB-luciferazu generisane su kao što je opisano u Primeru 6.1.
Aktivacija NF-κB u Hela ćelijama koje eksprimiraju humani 4-1BB kokultivisan sa humanim CEA-eksprimirajućim tumorskim ćelijama
NF-κB-luciferaza humane 4-1BB HeLa ćelije su sakupljene i ponovo suspendovane u DMEM medijumu sa dodatkom 10% (V/V) FBS i 1% (V/V) GlutaMAX-I do koncentracije od 0,2 x 10<6>ćelija/ml.100 µl (2 x 10<4>ćelija) ove ćelijske suspenzije preneto je u svaki bunarčić sterilne bele ploče za uzgajanje tkiva sa poklopcem sa 96 bunarčića ravnog dna (greiner
2
bio-one, kat. br.655083) i ploča je inkubirana na 37 °C i 5% CO2preko noći. Sledećeg dana, dodato je 50 µl medijuma koji sadrži titrisane koncentracije CEA ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (CEA split 4-1BBL trimer) ili DP47-neciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer 4-1BB liganda (DP47 split 4-1BBL trimer). CEA-eksprimirajuće tumorske ćelijske linije humanog karcinoma želuca MKN-45 (ATCC TCP-1008) su ponovo suspendovane u DMEM medijumu sa dodatkom 10% (V/V) FBS i 1% (V/V) GlutaMAX-I do koncentracije od 2 x 10<6>ćelija/ml.
Suspenzija CEA-eksprimirajućih ćelija B ćelijskog limfoma (50 µl, konačni odnos 1:5) ili samo medijum su dodati u svaki bunarčić, i ploče su inkubirane 6 sati na 37 °C i 5% CO2. Ćelije su isprane dva puta sa 200 µl/bunarčiću DPBS.40 µl sveže pripremljenog reporterskog pufera za lizu (Promega, kat. br.: E3971) dodato je u svaki bunarčić i ploča je čuvana preko noći na -20 °C. Sutradan, zamrznuta ćelijska ploča i detekcioni pufer (Luciferase 1000 Assay System, Promega, kat. br. E4550) odmrznuti su na sobnoj temperaturi. U svaki bunarčić je dodato 100 µl detekcionog pufera, a aktivnost luciferaze je izmerena što je brže moguće pomoću čitača mikroploča SpectraMax M5/M5e i softvera SoftMax Pro (Molecular Devices) za brojanje emisije svetlosti u URL-ima (jedinice oslobođene svetlosti za 0,5 s/bunarčiću), ili Victor3 1420 višeznačnog brojača čitača ploča (Perkin Elmer) i softvera Perkin Elmer 2030 Manager za brojanje svetlosne emisije kao broja u sekundi (CPS), i predstavljena u odnosu na koncentraciju testiranih konstrukata.
CEA-ciljani Fc fuzioni antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer 4-1BB liganda konstrukti 5.7 i 5.8 pokrenuli su aktivaciju NF-κB signalnog puta u reporterskoj ćelijskoj liniji u prisustvu ćelija ćelijske linije humanog karcinoma želuca MKN-45. Nasuprot tome, neciljani kontrolni molekuli nisu uspeli da pokrenu takav efekat ni na jednoj od testiranih koncentracija (Slika 45). Tabela 96 prikazuje odgovarajuće vrednosti EC50.
Tabela 96: Vezivanje za tumorske ćelije koje eksprimiraju CEA
Primer 14
14.1 Priprema FAP ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže trimer OX40 liganda
DNK sekvenca koja kodira deo ektodomena (aminokiseline 51-183) humanog OX40 liganda sintetisana je prema sekvenci P23510 Uniprot baze podataka. Da bi se smanjila heterogenost humanog Ox40 liganda usled glikozilacije, ostaci asparagina na položaju 90 i 114 mutirani su u asparaginsku kiselinu mutagenezom usmerenom na mesto (prema Compaan D.M., Hymowitz S.G., Structure (2006) 14(8), 1321-30).
Polipeptid koji sadrži dva ektodomena OX40 liganda, odvojena (G4S)2 linkerima i spojena sa humanim IgG1-CL domenom, kloniran je kao što je prikazano na slici 46A: humani OX40 ligand, (G4S)2 konektor, humani OX40 ligand, (G4S)2 konektor, humani CL.
Polipeptid koji sadrži jedan ektodomen OX40 liganda i spojen sa humanim IgG1-CH domenom, kloniran je kao što je opisano na slici 46B: humani OX40 ligand, (G4S)2 konektor, humani CH.
Da bi se poboljšalo ispravno uparivanje, u ukrštene CH-CL uvedene su sledeće mutacije. U dimernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CL, E123R i Q124K. U monomernom 4-1BB ligandu spojenom sa humanim CH1, K147E i K213E.
Proizvodnja i priprema FAP vezivača opisana je u WO 2012/020006 A2, koji je ovde uključen putem reference.
Varijabilni region DNK sekvenci teškog i lakog lanca koje kodiraju vezivač specifičan za FAP, klon 28H11, subkloniran je u okviru sa konstantnim teškim lancem rupice, ili konstantnim lakim lancem humanog IgG1. Mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala su uvedene u konstantni region teških lanaca sa dugmetom i rupicom kako bi se ukinulo vezivanje
4
za Fc gama receptore prema postupku opisanom u WO 2012/130831.
Kombinacija lanca sa dugmetom dimernog liganda-Fc koji sadrži mutacije S354C/T366W, fuzije monomera CH1, ciljanog lanca sa rupicom anti-FAP-Fc koji sadrži mutacije Y349C/T366S/L368A/Y407V i lakog lanca anti-FAP omogućava stvaranje heterodimera, koji uključuje sastavljeni trimerni OX40 ligand i FAP vezujući Fab (Slika 46C, konstrukt 6.1).
Tabela 97 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog CEA (T84.66-LCHA) ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni OX40 ligand (51-183) sa ukrštenim CH-CL i naelektrisanim ostacima (konstrukt 6.1).
Tabela 97: cDNK i aminokiselinske sekvence jednovalentnog FAP(28H1) ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog OX40 liganda koji sadrži ukrštanje CH-CL sa naelektrisanim ostacima (konstrukt 6.1). * za naelektrisane ostatke
14.2 Priprema neciljanog humanog IgG1 kao kontrole F
Kontrolni molekul koji je korišćen u ispitivanjima, nazvan kontrola F (Slika 46D), bio je neciljani DP47, kontrolna germinativna linija, humani IgG1, koji sadrži mutacije Pro329Gly, Leu234Ala i Leu235Ala, da bi se ukinulo vezivanje za Fc gama receptore prema postupku opisanom u Međunarodnoj patentnoj prij. Publ. br. WO 2012/130831). Njegova priprema je opisana u primeru 2.3, Tabela 29 prikazuje cDNK i aminokiselinske sekvence cDNK i aminokiselinske sekvence neciljanog DP47 huIgG1 PGLALA (kontrola F).
14.3 Proizvodnja FAP ciljanih Fc fuzionih antigen vezujućih molekula koji sadrže split trimerni OX40 ligand i njihovih kontrolnih molekula
Kodirajuće sekvence ciljanog i neciljanog Fc (kih) fuzionogsplit trimernog OX40 liganda klonirane su u plazmidni vektor koji pokreće ekspresiju umetka iz MPSV promotera i sadrži sintetičku polyA sekvencu smeštenu na 3' kraju CDS. Uz to, vektor sadrži i EBV sekvencu OriP za epizomsko održavanje plazmida.
Fc (kih) fuzioni split trimerni Ox40 ligand proizveden je kotransfekcijom HEK293-EBNA ćelija sa ekspresionim vektorima sisara pomoću polietilenimina. Ćelije su transfektovane odgovarajućim ekspresionim vektorima. Za varijante 1,2,4,5 i njihove kontrole B, D i E, u odnosu 1:1:1:1 („vektorski lanac sa dugmetom dimernog liganda-CL”: „vektorski monomerni ligand fuzionij-CH1”: „vektorski anti-FAP Fab-lanac sa rupicom”: „vektorski anti FAP laki lanac”). Za varijantu 3, 6 i njihov kontrolni molekul, uzet je odnos 1:1:1 („vektorski huIgG1 Fc lanac sa rupicom dimernog liganda”: „vektorski huIgG1 Fc lanac sa dugmetom monomernog liganda”: „vektorski anti FAP laki lanac”). Humani IgG, korišćeni kao kontrola u testu, proizvedeni su kao i za bispecifični konstrukt (za transfekciju je korišćen samo vektor za laki i vektor za teški lanac u odnosu 1:1).
Za proizvodnju u bocama za mućkanje od 500 ml, 300 miliona ćelija HEK293 EBNA je zasejano 24 sata pre transfekcije. Za transfekciju, ćelije su centrifugirane 10 minuta na 210 x g, i supernatant je zamenjen sa 20 ml prethodno zagrejanog CD CHO medijuma. Ekspresioni vektori (200 µg ukupne DNK) su mešani u 20 ml CD CHO medijuma. Nakon dodavanja 540 µl PEI, rastvor je mešan na vorteksu tokom 15 sekundi, i zatim inkubiran 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su pomešane sa rastvorom DNK/PEI, prebačene u bocu za mućkanje od 500 ml i inkubirane 3 sata na 37 °C u inkubatoru, u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, dodato je 160 ml Excell medijuma dopunjenog sa 6mM L-glutamina, 5 g/l PEPSOY i 1,2 mM valproinske kiseline, i ćelije su uzgajane tokom 24 sata. Dan nakon transfekcije dodato je 12% hraniva (aminokiselina i glukoza). Nakon uzgajanja tokom 7 dana, supernatant je sakupljen centrifugiranjem 30-40 minuta na najmanje 400 x g. Rastvor je sterilno filtriran (filter 0,22 µm), dodat je natrijum azid do krajnje koncentracije od 0,01% (m/V), i čuvan na 4 °C.
Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekul koji sadrži split trimerni OX40 ligand, kao i IgG, prečišćen je iz supernanata ćelijske kulture afinitetnom hromatografijom upotrebom proteina A, a zatim gel hromatografijom. Kod afinitetne hromatografije, supernatant je nanet na kolonu MabSelect Sure (CV = 5-15 ml, smola proizvođača GE Healthcare), ekvilibrisan puferom sa natrijum fosfatom (20 mM), natrijum citratom (20 mM) (pH 7,5). Nevezani protein je uklonjen ispiranjem sa najmanje 6 volumena kolone istog pufera. Vezani protein je eluiran korišćenjem linearnog gradijenta (20 CV) ili postepene elucije (8 CV) puferom sa 20 mM natrijum citrata, 100 mM natrijum hlorida, 100 mM glicina (pH 3,0). Za linearni gradijent je primenjena dodatna faza elucije sa 4 volumena kolone.
pH prikupljenih frakcija je podešen dodavanjem 1/10 (v/v) 0,5 M natrijum fosfata, pH 8,0. Protein je koncentrovan pre nanošenja na kolonu HiLoad Superdex 200 (GE Healthcare) ekvilibrisanu rastvorom 20 mM histidina, 140 mM natrijum hlorida, 0,01% (v/v) Tween20, pH 6,0.
Koncentracija proteina je određena merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence. Čistoća i molekulska masa ciljanog Fc (kih) fuzionog trimernog 4-1BB liganda analizirane su pomoću SDS-PAGE u prisustvu i odsustvu redukujućeg agensa (5 mM 1,4-ditiotreitol) i bojenjem sa Coomassie SimpleBlue™ SafeStain (Invitrogen SAD) ili CE-SDS pomoću Caliper LabChip GXII (Perkin Elmer). Ukupni sadržaj u uzorcima je analiziran pomoću analitičke kolone za gel hromatografiju TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) ekvilibrisane u radnom puferu 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-arginin monohidrohlorid, 0,02% (m/V) NaN3, pH 6,7 na 25 °C.
Tabela 98 rezimira prinos i konačni sadržaj monomera FAP ciljanog Fc (kih) fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži split trimerni Ox40 ligand i germinativne linije DP47 humanog IgG1 PGLALA (kontrola F).
Tabela 98: Biohemijska analiza CEA ciljanog Fc (kih) fuzionog split trimernog 4-1BB liganda.
Primer 15
Funkcionalna karakterizacija ciljanog Fc fuzionog antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer OX40 liganda
15.1 Vezivanje za humane tumorske ćelije koje eksprimiraju FAP
Vezivanje za površinu ćelije FAP testirano je korišćenjem ćelija WM-266-4 (ATCC CRL-1676). 0,5 x 105 WM-266-4 ćelija dodato je u svaki bunarčić ploča sa 96 bunarčića sa okruglim dnom za suspenzione ćelije (greiner bio-one, cellstar, kat. br. 650185). Ćelije su bojene tokom 120 minuta na 4 °C u mraku u 50 µl/bunarčiću hladnog FACS pufera na 4 °C (DPBS (Gibco proizvođača Life Technologies, kat. br. 14190 326) sa BSA (0,1% V/m, Sigma-Aldrich, kat. br. A9418) koji sadrži titrisane konstrukte anti-Ox40 antitela. Nakon trostrukog ispiranja sa viškom FACS pufera, ćelije su bojene tokom 45 minuta na 4 °C u mraku u 25 µl/bunarčiću hladnog FACS pufera na 4 °C koji sadrži fluorescein izotiocijanat (FITC)-konjugovani AffiniPure antihumani kozji IgG F(ab')2fragment specifičan za Fcγ fragment IgG (Jackson ImmunoResearch, kat. br.109 096 098).
Ploče su konačno ponovo suspendovane u 90 µl/bunarčiću FACS pufera koji sadrži 0,2 µg/ml DAPI (Santa Cruz Biotec, kat. br. Sc-3598) i snimljene istog dana pomoću 5-laserskog LSR-Fortessa (BD Bioscience sa softverom DIVA).
Kao što je prikazano na slici 47A, jednovalentni FAP(28H1) ciljani Fc (kih) fuzioni antigen vezujući molekul koji sadrži split trimerni Ox40 ligand (FAP-OX40L), ali ne i negativna kontrola F, efikasno se vezuje za humane ciljne ćelije koje eksprimiraju FAP. Vrednosti EC50 vezivanja za FAP pozitivni WM-266-4 bile su [6,9 nM],
15.2 Vezivanje za OX40 i FAP negativne ćelije tumora
Izostanak vezivanja za OX40 negativne FAP negativne ćelije tumora je testiran pomoću A549 NucLight™ crvenih ćelija (Essenbioscience, kat. br.4491) koje eksprimiraju NucLight Red fluorescentni protein ograničen na jedro kako bi se omogućilo razdvajanje od neobeleženih humanih FAP pozitivnih WM266-4 ćelija. Matične A549 (ATCC CCL-185) su transdukovane sa Essen CellPlayer NucLight Red lentivirusom (Essenbioscience, kat. br.4476; EF1α, puromicin) sa MOI od 3 (TU/ćeliji) u prisustvu 8 µg/ml polibrena nakon standardnog Essen protokola.
Smeša 5 x 104 neobeleženih WM266-4 ćelija i neobeleženih A549 NucLight™ crvenih ćelija u FACS puferu dodata je u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom za suspenzione ćelije, i test vezivanja je izveden kao što je opisano u odeljku 15.1.
Kao što je prikazano na slici 47B, FAP-OX40L se nije vezao za OX40 negativne FAP negativne ćelije humanog tumora.
15.3 Vezivanje za humane ćelije koje eksprimiraju OX40: naivni i aktivirani leukociti humane mononuklearne periferne krvi (PBMC)
Frakcije leukocita i trombocita su nabavljene iz centra za davanje krvi u Cirihu. Da bi se izolovale sveže mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), frakcija leukocita i trombocita je razređena istom zapreminom DPBS (Gibco proizvođača Life Technologies, kat. br. 14190 326). Polipropilenske epruvete za centrifugiranje od 50 ml (TPP, kat. br.91050) dopunjene su sa 15 ml Histopaque 1077 (SIGMA Life Science, kat. br. 10771, polisaharoza i natrijum diatrizoat, podešen na gustinu od 1,077 g/ml) i razblaženi rastvor frakcija leukocita i trombocita raslojen je iznad Histopaque 1077. Epruvete su centrifugirane 30 minuta pri 400 x g, na sobnoj temperaturi i sa malim ubrzanjem i bez prekida. Nakon toga, PBMC su sakupljene sa međupovršine, isprane tri puta sa DPBS i ponovo suspendovane u T ćelijskom medijumu koji se sastoji od RPMI 1640 medijuma (Gibco proizvođača Life Technology, kat. br.
42401-042) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Gibco proizvođača Life Technology, kat. br. 16000-044, serija 941273, gama-ozračeni, bez mikoplazme i toplotno inaktiviran na 56 °C tokom 35 min), 1% (V/V) GlutaMAX I (GIBCO proizvođač Life Technologies, kat. br.35050 038), 1 mM natrijum piruvata (SIGMA, kat. br. S8636), 1% (V/V) MEM neesencijalnih aminokiselina (SIGMA, kat. br. M7145) i 50 µM β-merkaptoetanola (SIGMA, M3148).
PBMC su korišćeni neposredno nakon izolacije (vezivanje za humane PBMC u
1
mirovanju) ili su stimulisani da prime snažnu ljudsku Ox40 ekspresiju na ćelijskoj površini T ćelija (vezivanje za aktivirane humane PBMC). Zbog toga su naivni PBMC kultivisani četiri dana u T ćelijskom medijumu sa dodatkom 200 U/ml proleukina (Novartis) i 2 ug/ml PHA-L (Sigma-Aldrich, L2769-10) na ploči za kulturu tkiva sa 6 bunarčića, a zatim preko noći, na prethodno obloženim pločama za kulturu tkiva sa 6 bunarčića [4 ug/ml] sa antihumanim CD3 (klon OKT3, eBioscience, kat. br.16-0037-85) i [2 ug/ml] antihumanim CD28 (klon CD28.2, eBioscience, kat. br.16-0289-85] u T ćelijskom medijumu sa dodatkom 200 U/ml proleukina na 37 °C i 5% CO2.
Za otkrivanje Ox40, pomešani su naivni humani PBMC i aktivirani humani PBMC. Kako bi se omogućilo razlikovanje naivnih od aktiviranih humanih PBMC, naivne ćelije su obeležene pre testa vezivanja primenom boje eFluor670 za proliferaciju ćelija (eBioscience, kat. br.65-0840-85).
Radi obeležavanja, ćelije su sakupljene, isprane prethodno zagrejanim (37 °C) DPBS i prilagođene gustini ćelija od 1 x 10<7>ćelija/ml u DPBS-u. Boja za proliferaciju ćelija eFluor670 (eBioscience, kat. br. 65-0840-85) dodata je suspenziji naivnih humanih PBMC u konačnoj koncentraciji od 2,5 mM i konačnoj gustini ćelija od 0,5 x 10<7>ćelija/ml u DPBS-u. Ćelije su zatim inkubirane 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Da bi se zaustavila reakcija označavanja, dodato je 4 ml toplotno inaktiviranog FBS, i ćelije su isprane tri puta T ćelijskim medijumom. Smeša dva prema jedan 1 x 10<5>humanih PBMC u mirovanju obeleženih pomoću eFluor670 i 0,5 x 10<5>neobeleženih aktiviranih humanih PBMC je zatim dodata u svaki bunarčić ploče za ćelijske suspenzije sa 96 bunarčića sa okruglim dnom (Greiner Bio-One, cellstar, kat. br.650185).
Ćelije su bojene tokom 120 minuta na 4 °C u mraku u 50 µl/bunarčiću hladnog FACS pufera na 4 °C koji sadrži titrisane konstrukte anti-Ox40 antitela. Nakon ispiranja tri puta sa viškom FACS pufera, ćelije su bojene 45 minuta na 4 °C u mraku u 25 µl/bunarčiću hladnog FACS pufera na 4 °C koji sadrži smešu fluorescentno označenog antihumanog CD4 (klon RPA-T4, mišji IgGl k, BioLegend, kat. br. 300532), antihumanog CD8 (klon RPa-T8, mišji IgG1k, BioLegend, kat. br. 3010441) i fluorescein izotiocijanat (FITC)-konjugovanog AffiniPure antihumanog kozjeg IgG F(ab')2 fragmenta specifičnog za Fcγ fragment IgG (Jackson ImmunoResearch, kat. br.109-096-098).
Ploče su konačno ponovo suspendovane u 90 μl/bunarčiću FACS pufera koji sadrži 0,2 μg/ml DAPI (Santa Cruz Biotec, kat. br. Sc-3598) i snimljene istog dana pomoću 5-laserskog LSR-Fortessa (BD Bioscience sa softverom DIVA).
Kao što je prikazano na Slikama 48A i 48 B, FAP-OX40L se nije vezao za humane
2
CD4+ T-ćelije ili CD8+ T-ćelije u mirovanju, koje su negativne za OX40. Nasuprot tome, FAP-OX40L se vezao za aktivirane CD8+ ili CD4+ T-ćelije, koje eksprimiraju OX40. Vezivanje za CD4+ T-ćelije bilo je mnogo jače od vezivanja za CD8+ T ćelije. Aktivirane humane CD8+ T ćelije eksprimiraju samo delić nivoa OX40 koji je detektovan na aktiviranim CD4+ T ćelijama. Nivoi ekspresije za OX40 zavise od kinetike i jačine stimulacije, a uslovi su ovde optimizovani za ekspresiju OX40 na CD4+ T ćelijama, ali ne i za CD8+ T ćelije. Tako, samo je mala ekspresija OX40 indukovana na CD8 T ćelijama. Vrednost EC50 vezivanja za pozitivne CD4+ ili CD8+ T ćelije za OX40 bila je [0,15 nM].
15.4 Aktivacija NFκB u HeLa ćelijama koje eksprimiraju humani OX40 i reporterski gen NFκB-luciferazu
Agonističko vezivanje Ox40 za njegov ligand indukuje nishodnu signalizaciju aktiviranjem nuklearnog faktora kapa B (NFκB) (A. D. Weinberg et al. J. Leukoc. Biol.2004, 75(6), 962-972). Rekombinantna reporterska ćelijska linija HeLa_hOx40_NFκB_Lucl generisana je da eksprimira humani Ox40 na svojoj površini. Uz to, ona obuhvata reporterski plazmid koji sadrži gen luciferaze pod kontrolom pojačavajućeg segmenta osetljivog na NFκB. Pokretanje Ox40 izaziva aktivaciju NFκB koja zavisi od doze, koja se translocira u jezgru, gde se vezuje za NFκB osetljivi pojačivač reporterskog plazmida kako bi se povećala ekspresija proteina luciferaze. Luciferaza katalizuje oksidaciju luciferina, dajući oksiluciferin koji emituje svetlost. To se može kvantifikovati luminometrom. Stoga je sposobnost različitih anti-Ox40 molekula da indukuju NFκB aktivaciju kod reporterskih ćelija HeLa_hOx40_NFkB_Lucl analizirana kao mera za bioaktivnost.
Prianjajuće HeLa_hOx40_NFkB_Lucl ćelije su sakupljene pomoću pufera za disocijaciju ćelija (Invitrogen, kat. br. 13151-014) 10 minuta na 37 °C. Ćelije su jednom isprane pomoću DPBS i prilagođene na gustinu ćelija od 1,33 x 10<5>u test medijumu koji sadrži MEM (Invitrogen, kat. br.22561-021), 10% (V/V) toplotno inaktivirani FBS, 1 mM natrijum piruvat i 1% (V/V) neesencijalnih aminokiselina. Ćelije su zasejane sa gustinom od 0,2*10<5>ćelija po bunarčiću na sterilnoj beloj ploči za uzgajanje tkiva sa poklopcem sa 96 bunarčića ravnog dna (greiner bio-one, kat. br. 655083) i držane su preko noći na 37 °C i 5% CO2u inkubatoru (Hera Cell 150).
Sledećeg dana, HeLa_hOx40_NFkB_Lucl su stimulisane tokom 5 sati dodavanjem test medijuma koji sadrži titrisani FAP-Ox40L ili negativnu kontrolu F. Za testiranje dejstva hiperumrežavanja na anti-Ox40 antitela, dodato je 25 µl/bunarčiću medijuma koji sadrži sekundarno antitelo antihumanog kozjeg IgG F(ab')2fragmenta specifičnog za Fcγ fragment IgG (Jackson ImmunoResearch, 109-006-098) u odnosu 1:2 (2 puta više sekundarnog antitela u odnosu na primarno antitelo). Nakon inkubacije, supernatant je usisan, i ploče su isprane dva puta pomoću DPBS. Kvantifikacija emisije svetlosti obavljena je pomoću sistema ispitivanja luciferaze 100 i reporterskog pufera za lizu (oba Promega, kat. br. E4550 i kat. br.: E3971) prema uputstvu proizvođača. Ukratko, ćelije su lizirane tokom 10 minuta na -20 °C dodatkom 30 ul po bunarčiću 1x pufera za lizu. Ćelije su odmrznute tokom 20 minuta na 37 °C, pre nego što je dodato 90 µl/bunarčiću dobijenog reagensa za ispitivanje luciferaze. Emisija svetlosti je smesta kvantifikovana pomoću SpectraMax M5/M5e čitača mikroploča (Molecular Devices, SAD) koji koristi integraciono vreme od 500 ms, bez ikakvog filtera za prikupljanje svih talasnih dužina. Emitovane relativne jedinice svetlosti (URL) korigovane su prema bazalnoj luminescenciji ćelija HeLa_hOx40_NFkB_Lucl i prikazane su u odnosu na logaritamske koncentracije primarnog antitela pomoću Prism4 (GraphPad Software, SAD). Krive su postavljene pomoću ugrađenog sigmoidnog odgovora na dozu.
Kao što je prikazano na Slici 49, ograničena aktivacija NFkB zavisna od doze već je indukovana dodatkom FAP-Ox40L (leva strana) u reportersku ćelijsku liniju. Hiperumrežavanje FAP-Ox40L sekundarnim antitelima koja su specifična za humani IgG povećalo je indukciju NFκB posredovane aktivacije luciferaze na način zavisan od koncentracije (desna strana).
Shodno tome, testirali smo NFkB aktivacioni kapacitet FAP-Ox40L hiperumrežavanjem konstrukata pomoću FAP+ tumorskih ćelijskih linija.
Testirana tumorska ćelijska linija je klon 39 NIH/3T3-huFAP. NIH/3T3-huFAP klon 39 nastao je transfekcijom ćelijske linije mišjeg embrionskog fibroblasta NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) ekspresionim vektorom pETR4921 da bi se eksprimirao huFAP ispod 1,5 µg/ml selekcije puromicina. Površinska ekspresija FAP je kvantifikovana pomoću Quifikit (Dako kat. br. K0078) prema uputstvu proizvođača. Primarno antitelo koje je korišćeno za detekciju ekspresije FAP na ćelijskoj površini bio je unakrsno reaktivni klon čoveka/miša F11-24 (mišji IgGI, Calbiochem, kat. br. OP188). Površinska ekspresija na NIH/3T3-huFAP klonu 39 bila je oko 90.000 huFAP po ćeliji.
Kao što je ovde već opisano, prijanjajuće ćelije HeLa_hOx40_NFκB_Lucl su uzgajane preko noći pri gustini ćelija od 0,2* 10<5>ćelija po bunarčiću, i stimulisane su 5 sati test medijumom koji sadrži titrisani FAP-Ox40L. Za testiranje efekta hiperumrežavanja putem vezivanja FAP ćelijske površine, 25 µl/bunarčiću medijuma koji sadrži FAP+ tumorske ćelije NIH/3T3-huFAP klon 39 kokultivisane su u odnosu 3 prema 1 (tri puta više FAP+ tumorskih ćelija nego reporter ćelija po bunarčiću). Aktivirani NFκB je kvantifikovan merenjem emisije svetlosti pomoću test sistema luciferaze 100 i reporterskog pufera za lizu (oba Promega, kat. br.
4
E4550 i kat. br.: E3971.
Kao što je prikazano na Slici 50A, prisustvo tumorskih ćelija koje eksprimiraju FAP snažno je povećalo indukciju NFκB-posredovane aktivacije luciferaze kada je dodat FAP-Ox40L. Površina ispod krive odgovarajućih prikazanih krivih doza-odgovor kvantifikovana je kao marker za agonistički kapacitet svakog konstrukta. Kao što je prikazano na Slici 50A, prisustvo FAP predstavljenog na ćelijskoj površini osiguralo je veće umrežavanje, i time bolje agonističko dejstvo FAP-Ox40L nego dodavanje Fc specifičnog sekundarnog antitela.
15.5 OX40 posredovana kostimulacija suboptimalno TCR aktiviranih humanih PBMC u mirovanju i hiperumrežavanje putem FAP ćelijske površine
U primeru 15.4 je pokazano da dodavanje FAP+ tumorskih ćelija može snažno da poveća NFkB aktivnost indukovanu FAP ciljanim OX40L u humanim Ox40 pozitivnim reporterskim ćelijskim linijama tako što pruža snažnu oligomerizaciju OX40 receptora. Slično tome, testirali smo konstrukte FAP-OX40L u prisustvu ćelija NIH/3T3-huFAP klona 39 zbog njihove sposobnosti spasavanja suboptimalnih TCR stimulacija humanih PBMC ćelija u mirovanju.
Humani PBMC preparati sadrže (1) Ox40 negativne CD4+ i CD8+ T ćelije u mirovanju i (2) antigen prezentujuće ćelije sa različitim molekulima Fc-γ receptora na njihovoj ćelijskoj površini, npr. B ćelije i monocite. Antihumano CD3 antitelo humanog IgG1 izotipa može da se veže svojim Fc delom za prisutne molekule Fc-γ receptora i da posreduje produženu TCR aktivaciju Ox40 negativnih CD4+ i CD8+ T ćelija u mirovanju. Te ćelije zatim počinju da eksprimiraju Ox40 u roku od nekoliko sati. Funkcionalna agonistička jedinjenja protiv Ox40 mogu da signaliziraju putem Ox40 receptora prisutnog na aktiviranim CD8+ i CD4+ T ćelijama, i da podrže TCR-posredovanu stimulaciju.
Humane PBMC u mirovanju obeležene sa CFSE stimulisane su pet dana suboptimalnom koncentracijom anti-CD3 antitela u prisustvu ozračenih ćelija FAP+ NIH/3T3-huFAP klona 39 i titrisane FAP-Ox40L. Efekti na preživljavanje i proliferaciju T-ćelija analizirani su praćenjem ukupnog broja ćelija i razblaživanjem CFSE u živim ćelijama protočnom citometrijom.
Ćelije mišjeg embrionalnog fibroblasta NIH/3T3-huFAP klon 39 (vidi Primer 15.4) sakupljane su pomoću pufera za disocijaciju ćelija (Invitrogen, kat. br.13151-014) tokom 10 minuta na 37 °C. Ćelije su isprane jednom pomoću DPBS. Ćelije NIH/3T3-huFAP klona 39 uzgajane su pri gustini od 0,2* 10<5>ćelija po bunarčiću u T ćelijskom medijumu na sterilnoj ploči za uzgajanje adhezivnog tkiva sa 96 bunarčića sa okruglim dnom (TPP, kat. br. 92097) preko noći na 37 °C i 5% CO2u inkubatoru (Hera Cell 150). Sledećeg dana su ozračene u xRay iradijatoru dozom od 4500 RAD kako bi se sprečio kasniji prekomerni rast humanih PBMC putem ćelijske linije tumora.
Humane PBMC su izolovane gradijentnim centrifugiranjem pomoću fikola, kako je opisano u primeru 15.3. Ćelije su zatim obeležene pomoću CFSE pri ćelijskoj gustini od 1x10<6>ćelija/ml sa CFDA-SE (Sigma-Aldrich, kat. br. 2188) u krajnjoj koncentraciji od [50 nM] tokom 10 minuta na 37 °C. Nakon toga, ćelije su isprane dva puta viškom DPBS koji sadrži FBS (10% V/V). Obeležene ćelije su mirovale u T-ćelijskom medijumu na 37 °C tokom 30 minuta. Nakon toga, nekonvertovani CFDA-SE je uklonjen putem dva dodatna koraka ispiranja dodatkom DPBS. CFSE obeležene mirujuće humane PBMC su dodate u svaki bunarčić, sa gustinom od 0,5 x 10<5>ćelija po bunarčiću. Antihumano CD3 antitelo (klon V9, humani IgG1, opisano u Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992) i US patentu br.
6,054,297) u konačnoj koncentraciji od [20 nM], i FAP-OX40L su dodati u navedenim koncentracijama. Ćelije su aktivirane tokom pet dana na 37 °C i 5% CO2u inkubatoru (Hera Cell 150). Ćelije su zatim površinski bojene antitelima konjugovanim sa fluorescentnom bojom, antihumanim CD4 (klon RPA-T4, BioLegend, kat. br. 300532) i CD8 (klon RPa-T8, BioLegend, kat. br. 3010441) tokom 20 minuta na 4 °C. Nakon koraka ispiranja FACS puferom, ćelije su ponovo suspendovane u 85 µl/bunarčiću FACS pufera i snimljene pomoću 5-laserskog protočnog citometra Fortessa (BD Bioscience sa softverom DIVA).
Kao što je prikazano na slici 51, hiperumrežavanje konstrukata FAP-OX40L od strane prisutnih ćelija NIH/3T3-huFAP klona 39 snažno je promovisalo proliferaciju (vidi grafikone „Događaji” na vrhu) i preživljavanje (vidi grafikone „proliferacija” na dnu) u TCR stimulisanim humanim CD4 i CD8 T ćelijama. U skladu sa nižom ekspresijom OX40 na humanim CD8+ T ćelijama, agonistički efekat FAP-OX40L bio je manje jak na CD8+ T ćelijama nego na CD4+ T ćelijama.
Literatura:
Ascierto, P. A., E. Simeone, M. Sznol, Y. X. Fu, and I. Melero (2010), Clinical experiences with anti-CD137 and anti-PDl therapeutic antibodies. Semin Oncol 37:508-516.
Aggarwal B.B. (2003), Signalling pathways of the TNF superfamily: a double-edged sword. Nat. Rev. Immunol. 3(9),745-56.
Banner D. et al. (1993), Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-human TNF beta complex: implications for TNF receptor activation. Cell 73, 431-445.
Bodmer J., Schneider P. and Tschopp, J. (2002), The molecular architecture of the TNF superfamily. Trends in Biochemical Sciences 27(1), 19-26.
Broll, K., Richter, G., Pauly, S., Hofstaedter, F., and Schwarz, H. (2001). CD137 expression in tumor vessel walls. High correlation with malignant tumors. Am J Clin Pathol 115, 543-549.
Buechele, C., Baessler, T., Schmiedel, B.J., Schumacher, C.E., Grosse-Hovest, L., Rittig, K., and Salih, H.R. (2012). 4-1BB ligand modulates direct and Rituximab-induced NK-cell reactivity in chronic lymphocytic leukemia. Eur J Immunol 42, 737-748.
Choi, B.K., Kim, Y.H, Kwon, P.M., Lee, S.C., Kang, S.W., Kim, M.S., Lee, M.J., and Kwon, B.S. (2009). 4-1BB functions as a survival factor in dendritic cells. J Immunol 182, 4107-4115.
Cuadros, C., Dominguez, A.L., Lollini, P.L., Croft, M., Mittler, R.S., Borgstrom, P., and Lustgarten, J. (2005). Vaccination with dendritic cells pulsed with apoptotic tumors in combination with anti-OX40 and anti-4-1BB monoclonal antibodies induces T cell-mediated protective immunity in Her-2/neu transgenic mice. Int J Cancer 116, 934-943.
Curran, M.A., Kim, M., Montalvo, W., Al-Shamkhani, A., and Allison, J.P. (2011). Combination CTLA-4 blockade and 4-1BB activation enhances tumor rejection by increasing T-cell infiltration, proliferation, and cytokine production. PLoS One 6, el9499.
Diehl, L., van Mierlo, G.J., den Boer, A.T., van der Voort, E., Fransen, M., van Bostelen, L., Krimpenfort, P., Melief, C.J., Mittler, R., Toes, R.E., and Offringa, R. (2002). In vivo triggering through 4-1BB enables Th-independent priming of CTL in the presence of an intact CD28 costimulatory pathway. J Immunol 168, 3755-3762.
Dubrot, J., Milheiro, F., Alfaro, C., Palazon, A., Martinez-Forero, I., Perez-Gracia, J.L., Morales-Kastresana, A., Romero-Trevejo, J.L., Ochoa, M.C., Hervas-Stubbs, S., et al. (2010). Treatment with anti-CD137 mAbs causes intense accumulations of liver T cells without selective antitumor immunotherapeutic effects in this organ. Cancer Immunol Immunother 59, Futagawa, T., Akiba, H., Kodama, T., Takeda, K., Hosoda, Y., Yagita, H., and Okumura, K. (2002). Expression and function of 4-1BB and 4-1BB ligand on murine dendritic cells. Int Immunol 14, 275-286.
Guo, Z., Cheng, D., Xia, Z., Luan, M., Wu, L., Wang, G., and Zhang, S. (2013). Combined TIM-3 blockade and CD137 activation affords the long-term protection in a murine model of ovarian cancer. J Transl Med 11, 215.
Heinisch, I.V., Daigle, I., Knopfli, B., and Simon, H.U. (2000). CD137 activation abrogates granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-mediated anti-apoptosis in neutrophils. Eur J Immunol 30, 3441-3446.
Hornig, N., Kermer, V., Frey, K., Diebolder, P., Kontermann, R.E., Mueller, D. (2012), Combination of a bispecific antibody and costimulatory antibody-ligand fusion proteins for targeted cancer immunotherapy. J. Immunother. 35, 418-429.
Ju, S.A., Cheon, S.H., Park, S.M., Tam, N.Q., Kim, Y.M., An, W.G., and Kim, B.S. (2008). Eradication of established renal cell carcinoma by a combination of 5-fluorouracil and anti-4-1BB monoclonal antibody in mice. Int J Cancer 122, 2784-2790.
Kienzle, G., and von Kempis, J. (2000). CD137 (ILA/4-1BB), expressed by primary human monocytes, induces monocyte activation and apoptosis of B lymphocytes. Int Immunol 12, 73-82.
Kim, D.H., Chang, W.S., Lee, Y.S., Lee, K.A., Kim, Y.K., Kwon, B.S., and Kang, C.Y. (2008). 4-1BB engagement costimulates NKT cell activation and exacerbates NKT cell ligand-induced airway hyperresponsiveness and inflammation. J Immunol 180, 2062-2068.
Kim, Y.H., Choi, B.K., Oh, H.S., Kang, W.J., Mittler, R.S., and Kwon, B.S. (2009). Mechanisms involved in synergistic anticancer effects of anti-4-1BB and cyclophosphamide therapy. Mol Cancer Ther 8, 469-478.
Kwon, B.S., and Weissman, S.M. (1989). cDNA sequences of two inducible T-cell genes. Proc Natl Acad Sci U S A 86, 1963-1967.
Lee, H., Park, H.J., Sohn, H.J., Kim, J.M., and Kim, S.J. (2011). Combinatorial therapy for liver metastatic colon cancer: dendritic cell vaccine and low-dose agonistic anti-4-1BB antibody costimulatory signal J Surg Res 169, e43-50.
Levitsky, V., de Campos-Lima, P.O., Frisan, T., and Masucci, M.G. (1998). The clonal composition of a peptide-specific oligoclonal CTL repertoire selected in response to persistent EBV infection is stable over time. J Immunol 161, 594-601.
Li, F., and Ravetch, J.V. (2011). Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies. Science 333, 1030-1034. Lin, W., Voskens, C.J., Zhang, X., Schindler, D.G., Wood, A., Burch, E., Wei, Y., Chen, L., Tian, G., Tamada, K., et al. (2008). Fc-dependent expression of CD137 on human NK cells: insights into "agonistic" effects of anti-CD137 monoclonal antibodies. Blood 112, 699-707.
Melero, I., Johnston, J.V., Shufford, W.W., Mittler, R.S., and Chen, L. (1998). NK1.1 cells express 4-1BB (CDwl37) costimulatory molecule and are required for tumor immunity elicited by anti-4-1BB monoclonal antibodies. Cell Immunol 190, 167-172.
Melero, I., Shuford, W.W., Newby, S.A., Aruffo, A., Ledbetter, J.A., Hellstrom, K.E., Mittler, R.S., and Chen, L. (1997). Monoclonal antibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicate established tumors. Nat Med 3, 682-685.
Merchant, A.M., Zhu, Z., Yuan, J.Q., Goddard, A., Adams, C.W., Presta, L.G., and Carter, P. (1998). An efficient route to human bispecific IgG. Nat Biotechnol 16, 677-681.
Morales-Kastresana, A., Sanmamed, M.F., Rodriguez, I., Palazon, A., Martinez-Forero, I., Labiano, S., Hervas-Stubbs, S., Sangro, B., Ochoa, C., Rouzaut, A., et al. (2013). Combined immunostimulatory monoclonal antibodies extend survival in an aggressive transgenic hepatocellular carcinoma mouse model. Clin Cancer Res 19, 6151-6162.
Mueller, D., Frey, K., Kontermann, R.E. (2008), A novel antibody-4-1BB1 fusion protein for targeted costimulation in cancer immunotherapy, J. Immunother. 31, 714-722.
Murillo, O., Dubrot, J., Palazon, A., Arina, A., Azpilikueta, A., Alfaro, C., Solano, S., Ochoa, M.C., Berasain, C., Gabari, I., et al. (2009). In vivo depletion of DC impairs the anti-tumor effect of agonistic anti-CD137 mAb. Eur J Immunol 39, 2424-2436.
Narazaki, H., Zhu, Y., Luo, L., Zhu, G., and Chen, L. (2010). CD137 agonist antibody prevents cancer recurrence: contribution of CD137 on both hematopoietic and nonhematopoietic cells. Blood 115, 1941-1948.
Nishimoto, H., Lee, S.W., Hong, H., Potter, K.G., Maeda-Yamamoto, M., Kinoshita, T., Kawakami, Y., Mittler, R.S., Kwon, B.S., Ware, C.F., et al. (2005). Costimulation of mast cells by 4-1BB, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, with the high-affinity IgE receptor. Blood 106, 4241-4248.
Olofsson, P.S., Soderstrom, L.A., Wagsater, D., Sheikine, Y., Ocaya, P., Lang, F., Rabu, C., Chen, L., Rudling, M., Aukrust, P., et al. (2008). CD137 is expressed in human atherosclerosis and promotes development of plaque inflammation in hypercholesterolemic mice. Circulation 117, 1292-1301.
Palazon, A., Teijeira, A., Martinez-Forero, I., Hervas-Stubbs, S., Roncal, C., Penuelas, I., Dubrot, J., Morales-Kastresana, A., Perez-Gracia, J.L., Ochoa, M.C., et al. (2011). Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res 71, 801-811.
Schwarz, H., Valbracht, J., Tuckwell, J., von Kempis, J., i Lotz, M. (1995). ILA, the human 4-1BB homologue, is inducible in lymphoid and other cell lineages. Blood 85, 1043-1052.
Shao, Z., and Schwarz, H. (2011). CD137 ligand, a member of the tumor necrosis factor family, regulates immune responses via reverse signal transduction. J Leukoc Biol 89, 21-29.
Shi, W., and Siemann, D.W. (2006). Augmented antitumor effects of radiation therapy by 4-1BB antibody (BMS-469492) treatment. Anticancer Res 26, 3445-3453.
Simeone, E., and Ascierto, P.A. (2012). Immunomodulating antibodies in the treatment of metastatic melanoma: the experience with anti-CTLA-4, anti-CD137, and anti-PD1. J Immunotoxicol 9, 241-247.
Snell, L.M., Lin, G.H., McPherson, A. J., Moraes, T.J., and Watts, T.H. (2011). T-cell intrinsic effects of GITR and 4-1BB during viral infection and cancer immunotherapy. Immunol Rev 244, 197-217.
Stagg, J., Loi, S., Divisekera, U., Ngiow, S.F., Duret, H., Yagita, H., Teng, M.W., and Smyth, M.J. (2011). Anti-ErbB-2 mAb therapy requires type I and II interferons and synergizes with anti-PD-1 or anti-CD137 mAb therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 7142-7147. Teng, M.W., Sharkey, J., McLaughlin, N.M., Exley, M.A., and Smyth, M.J. (2009). CDld-based combination therapy eradicates established tumors in mice. J Immunol 183, 1911-1920.
von Kempis, J., Schwarz, H., and Lotz, M. (1997). Differentiation-dependent and stimulus-specific expression of ILA, the human 4-1BB-homologue, in cells of mesenchymal origin. Osteoarthritis Cartilage 5, 394-406.
Wei, H., Zhao, L., Li, W., Fan, K., Qian, W., Hou, S., Wang, H., Dai, M., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E., and Guo, Y. (2013). Combinatorial PD-1 blockade and CD137 activation has therapeutic efficacy in murine cancer models and synergizes with cisplatin. PLoS One 8, e84927.
Wilcox, R.A., Chapoval, A.I., Gorski, K.S., Otsuji, M., Shin, T., Flies, D.B., Tamada, K., Mittler, R.S., Tsuchiya, H., Pardoll, DM., and Chen, L. (2002). Cutting edge: Expression of functional CD137 receptor by dendritic cells. J Immunol 168, 4262-4267.
Wilcox, R.A., Tamada, K., Flies, D.B., Zhu, G., Chapoval, A.I., Blazar, B.R., Kast, W.M., and Chen, L. (2004). Ligation of CD137 receptor prevents and reverses established anergy of CD8+ cytolytic T lymphocytes in vivo. Blood 103, 177-184.
Zhang, N., Sadun, R.E., Arias, R.S., Flanagan, M.L., Sachsman, S.M., Nien, Y, Khawli, L.A., Hu, P., Epstein, A.L. (2007). Targeted and untargeted CD137L fusion proteins for the immunotherapy of experimental solid tumors. Clin. Cancer Res.13, 2758-2767.
Zhang, X., Voskens, C.J., Sallin, M., Maniar, A., Montes, C.L., Zhang, Y., Lin, W., Li, G., Burch, E., Tan, M., et al. (2010). CD137 promotes proliferation and survival of human B cells. J Immunol 184, 787-795.
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
44
44
44
44
44
44
44
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4

Claims (23)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije koji obuhvata (a) najmanje jedan molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19,
(b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu antigen vezujući molekul, naznačen time, što
(i) prvi polipeptid sadrži CH1 ili CL domen i drugi polipeptid sadrži CL, odnosno CH1 domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa CH1 ili CL domenom peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezanu peptidnim linkerom sa CL ili CH1 domenom navedenog polipeptida, ili (ii) prvi polipeptid sadrži CH3 domen i drugi polipeptid sadrži CH3 domen, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa C-terminusom CH3 domena peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezanu peptidnim linkerom linkera sa C-terminusom CH3 domena navedenog polipeptida, ili
(iii) prvi polipeptid sadrži VH-CL ili VL-CH1 domen i drugi polipeptid sadrži VL-CH1 domen, odnosno VH-CL domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena, i pri čemu prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374 i SEQ ID NO: 375 koji su povezani međusobno i sa VH ili VL peptidnim linkerom, i pri čemu drugi polipeptid sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezanu peptidnim linkerom sa VL ili VH navedenog polipeptida, i
(c) Fc domen sastavljen od prve i druge podjedinice sposobne za stabilnu asocijaciju.
2. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu ektodomen 4-1BBL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:96.
3. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu ektodomen 4-1BBL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 96.
4. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 3, koji obuhvata
(a) najmanje jedan molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19, i (b) prvi i drugi polipeptid koji su međusobno vezani disulfidnom vezom, pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 i SEQ ID NO:99, i to što drugi polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:3 i SEQ ID NO:4.
5. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 4, koji obuhvata
(a) najmanje jedan molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19, i (b) prvi polipeptid koji sadrži CH1 ili CL domen, odnosno drugi polipeptid koji sadrži CL ili CH1 domen, pri čemu je drugi polipeptid povezan sa prvim polipeptidom disulfidnom vezom između CH1 i CL domena, i pri čemu je antigen vezujući molekul, naznačen time, što prvi polipeptid sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno i sa CH1 ili CL domenom peptidnim linkerom, i to što drugi polipeptid sadrži samo jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 povezan peptidnim linkerom sa CL ili CH1 domenom navedenog polipeptida.
6. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu je Fc domen IgG, konkretno Fc domen IgG1 ili Fc domen IgG4.
7. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu je Fc domen, Fc domen IgG1 koji obuhvata supstitucije aminokiselina na pozicijama 234 i 235 (EU numeracija) i/ili 329 (EU numeracija).
1
8. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
prvi teški lanac i prvi laki lanac, pri čemu oba sadrže molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19,
prvi peptid koji sadrži dva ektodomena 4-1BBL koji sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 koji su povezani međusobno prvim peptidnim linkerom fuzionisanog na svom C-terminusu preko drugog peptidnog linkera sa drugim teškim ili lakim lancem,
i drugi peptid koji sadrži jedan ektodomen navedenog 4-1BBL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO:374 i SEQ ID NO:375 fuzionisan na svom C-terminusu trećim peptidnim linkerom sa drugim lakim, odnosno teškim lancem.
9. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
(a) prvi teški lanac i prvi laki lanac, pri čemu oba sadrže molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19,
(b) drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 i SEQ ID NO: 99, i drugi laki lanac koji obuhvata izabranu aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4.
10. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz bilo kog od zahteva 1 do 9, pri čemu Fab molekul sposoban za specifično vezivanje za CD19 sadrži VH domen koji sadrži (i) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 195 ili SEQ ID NO:252, (ii) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 196 ili SEQ ID NO:253, i (iii) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 197 ili SEQ ID NO:254, i VL domen koji sadrži (iv) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 198 ili SEQ ID NO:249, (v) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 199 ili SEQ ID NO:250, i (vi) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:200 ili SEQ ID NO:251.
11. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz bilo kog od zahteva 1 do 10, pri čemu molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19 sadrži varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201 i varijabilni
2
laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202 ili pri čemu molekul Fab sposoban za specifično vezivanje za CD19 sadrži varijabilni teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357 i varijabilni laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358.
12. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
(i) prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202, ili
prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358,
(ii) drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO:111 i SEQ ID NO: 113, i
(iii) drugi laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112 i SEQ ID NO: 114.
13. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
(i) prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:201, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:202, ili
prvi teški lanac koji obuhvata VH domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:357, i prvi laki lanac koji obuhvata VL domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:358,
(ii) drugi teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 i SEQ ID NO: 173, i (iii) drugi laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120 i SEQ ID NO: 174.
14. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz bilo kog od zahteva 1 do 11 ili 13, koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:205, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120.
15. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije iz bilo kog od zahteva 1 do 11 ili 13, koji obuhvata prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:306, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 119, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120.
16. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 11, pri čemu antigen vezujući molekul obuhvata
(i) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:209, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:210, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, ili
(ii) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:213, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:214, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:206, ili
(iii) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:309, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:310, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279, ili
(iv) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:313, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:314, i dva laka lanca koja sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279.
17. Izolovani polinukleotid koji kodira antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 16.
18. Vektor, posebno ekspresioni vektor, koji sadrži izolovani polinukleotid prema zahtevu 16.
19. Ćelija domaćin koja sadrži izolovani polinukleotid prema zahtevu 17 ili vektor prema zahtevu 18.
20. Postupak za proizvodnju antigen vezujućeg molekula koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 16, koji obuhvata korake
(i) uzgajanja ćelije domaćina prema zahtevu 19 pod uslovima pogodnim za ekspresiju antigen vezujućeg molekula, i
(ii) izolovanje antigen vezujućeg molekula.
21. Farmaceutski preparat koji sadrži antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 16, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
22. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 16, ili farmaceutski preparat prema zahtevu 21, za primenu kao lek.
4
23. Antigen vezujući molekul koji sadrži trimer liganda iz TNF familije prema bilo kom od zahteva 1 do 16, ili farmaceutski preparat prema zahtevu 21, za upotrebu u lečenju kancera.
RS20210600A 2014-11-14 2015-11-13 Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz tnf familije RS61870B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14193260 2014-11-14
EP15183736 2015-09-03
EP15188142 2015-10-02
EP18207248.8A EP3489256B1 (en) 2014-11-14 2015-11-13 Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61870B1 true RS61870B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=54695680

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200473A RS60201B1 (sr) 2014-11-14 2015-11-13 Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda familije tnf
RS20210600A RS61870B1 (sr) 2014-11-14 2015-11-13 Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz tnf familije

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200473A RS60201B1 (sr) 2014-11-14 2015-11-13 Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda familije tnf

Country Status (29)

Country Link
US (6) US10392445B2 (sr)
EP (3) EP3224275B1 (sr)
JP (2) JP6873901B2 (sr)
KR (3) KR20250158074A (sr)
CN (4) CN108064237B (sr)
AU (3) AU2015345024B2 (sr)
CL (2) CL2017001000A1 (sr)
CO (1) CO2017003212A2 (sr)
CR (1) CR20170194A (sr)
DK (2) DK3489256T3 (sr)
EA (1) EA037557B1 (sr)
ES (2) ES2788979T3 (sr)
HR (2) HRP20200679T1 (sr)
HU (2) HUE054122T2 (sr)
IL (2) IL282922B (sr)
LT (2) LT3489256T (sr)
MA (2) MA53242A (sr)
MX (2) MX391388B (sr)
MY (1) MY191428A (sr)
PE (2) PE20170896A1 (sr)
PH (1) PH12017500892B1 (sr)
PL (2) PL3224275T3 (sr)
PT (1) PT3224275T (sr)
RS (2) RS60201B1 (sr)
SG (1) SG11201703597TA (sr)
SI (2) SI3489256T1 (sr)
TW (2) TWI713474B (sr)
UA (1) UA125577C2 (sr)
WO (1) WO2016075278A1 (sr)

Families Citing this family (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110229471A1 (en) 2008-11-26 2011-09-22 Cedars-Sinai Medical Center Methods of determining responsiveness to anti-tnf alpha therapy in inflammatory bowel disease
LT2961771T (lt) 2013-02-26 2020-03-10 Roche Glycart Ag Bispecifinės t ląstelę aktyvinančios antigeną surišančios molekulės, specifinės cd3 ir cea antigenams
KR20230109779A (ko) 2013-03-27 2023-07-20 세다르스-신나이 메디칼 센터 Tl1a 기능 및 관련된 신호전달 경로의 저해에 의한섬유증 및 염증의 완화 및 반전
EP3022295A4 (en) 2013-07-19 2017-03-01 Cedars-Sinai Medical Center Signature of tl1a (tnfsf15) signaling pathway
EP3224275B1 (en) 2014-11-14 2020-03-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
MA41460A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Oncomed Pharm Inc Agents de liaison à la tnfrsf et leurs utilisations
EP3973980A1 (en) 2015-03-31 2022-03-30 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
AR106188A1 (es) * 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
AU2016330807B2 (en) 2015-10-02 2023-08-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-human CD19 antibodies with high affinity
PE20180484A1 (es) * 2015-10-02 2018-03-07 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
WO2017055404A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
WO2017055314A1 (en) * 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
US10526413B2 (en) 2015-10-02 2020-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specific for OX40
CA3004830A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Opi Vi- Ip Holdco Llc Composition and methods for anti-tnfr2 antibodies
KR20180097615A (ko) 2016-01-08 2018-08-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd-1 축 결합 길항물질 및 항-cea/항-cd3 이중특이성 항체를 사용하는 cea-양성 암의 치료 방법
KR20240095481A (ko) 2016-03-17 2024-06-25 세다르스-신나이 메디칼 센터 Rnaset2를 통한 염증성 장 질환의 진단 방법
WO2017194442A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
EP3243836A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
EP3243832A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
WO2018073365A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing an immunoconjugate
KR20190082815A (ko) 2016-10-26 2019-07-10 세다르스-신나이 메디칼 센터 중화 항-tl1a 단일 클론 항체
AU2017380981B2 (en) * 2016-12-19 2025-01-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with targeted 4-1BB (CD137) agonists
KR102692708B1 (ko) * 2016-12-20 2024-08-07 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체 및 4-1bb(cd137) 작용물질의 병용 요법
WO2018127473A1 (en) 2017-01-03 2018-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
US11566060B2 (en) 2017-01-05 2023-01-31 Kahr Medical Ltd. PD1-CD70 fusion protein and methods of use thereof
CN110536693B (zh) 2017-01-05 2023-12-22 卡尔医学有限公司 Pd1-41bbl融合蛋白及使用其的方法
RU2769769C2 (ru) 2017-01-05 2022-04-05 Кахр Медикал Лтд. СЛИТЫЙ БЕЛОК SIRPα-4-1BBL И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
WO2018151820A1 (en) * 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
EP3601346A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
CN110573528B (zh) 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
MY201482A (en) 2017-04-03 2024-02-26 Hoffmann La Roche Immunoconjugates of an anti-pd-1 antibody with a mutant il-2 or with il-15
JP6997209B2 (ja) 2017-04-04 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ４０およびｆａｐに特異的に結合することができる新規な二重特異性抗原結合分子
EP4516809A3 (en) 2017-04-05 2025-09-03 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
EP3615564A1 (en) * 2017-04-24 2020-03-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibody immune cell inhibitor fusion proteins
WO2018226887A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Spark Therapeutics, Inc. ENHANCING AGENTS FOR IMPROVED CELL TRANSFECTION AND/OR rAAV VECTOR PRODUCTION
JP2021500902A (ja) * 2017-11-01 2021-01-14 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 新規ｔｎｆファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
EP3502140A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy of tumor targeted icos agonists with t-cell bispecific molecules
EA202091053A1 (ru) * 2018-01-15 2020-12-03 Ай-Маб Биофарма Юэс Лимитед Модифицированные c- и ch1-домены
EP3765489B1 (en) 2018-03-13 2024-10-16 F. Hoffmann-La Roche AG Therapeutic combination of 4-1bb agonists with anti-cd20 antibodies
TWI841551B (zh) * 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
SG11202007961QA (en) * 2018-04-13 2020-09-29 Hoffmann La Roche Her2-targeting antigen binding molecules comprising 4-1bbl
CN112585165B8 (zh) 2018-04-25 2025-02-14 普罗米修斯生物科学公司 优化的抗tl1a抗体
WO2020007817A1 (en) 2018-07-04 2020-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific agonistic 4-1bb antigen binding molecules
KR102945860B1 (ko) * 2018-07-11 2026-03-31 카 메디컬 리미티드 SIRPalpha-4-1BBL 변이체 융합 단백질 및 이의 사용 방법
EP3820887A4 (en) * 2018-07-11 2022-04-20 KAHR Medical Ltd. Pd1-4-1bbl variant fusion protein and methods of use thereof
WO2020070041A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-fap clone 212
TWI839395B (zh) * 2018-10-09 2024-04-21 瑞士商Ｎｕｍａｂ治療公司 靶向cd137的抗體及其使用方法
UA128001C2 (uk) * 2018-12-21 2024-03-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Націлені на пухлину агоністичні cd28-антигензв'язувальні молекули
WO2020245746A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Molecular Partners Ag Multispecific proteins
JP2022537670A (ja) * 2019-06-12 2022-08-29 オブシディアン セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃａ２の組成物および調整可能な制御方法
WO2020260327A1 (en) 2019-06-26 2020-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Mammalian cell lines with sirt-1 gene knockout
KR20220025848A (ko) 2019-06-26 2022-03-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 Cea 및 4-1bbl에 결합하는 항체의 융합
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
NZ787680A (en) 2019-10-24 2026-02-27 Cedars Sinai Medical Center Humanized antibodies to tnf-like ligand 1a (tl1a) and uses thereof
CN114929734A (zh) * 2020-01-09 2022-08-19 豪夫迈·罗氏有限公司 新型含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap
CN113234139A (zh) * 2020-04-17 2021-08-10 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 Tnfsf9基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
EP4149964A2 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Apogenix AG Multi-specific immune modulators
WO2021255155A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cd19
CR20230076A (es) 2020-07-10 2023-03-13 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a células cancerosas y dirigen radionucleótidos a dichas células
BR112023001209A2 (pt) * 2020-07-24 2023-02-14 Hoffmann La Roche Método para produzir um polipeptídeo de fusão-anticorpo-multímero
JP2024504931A (ja) 2021-01-12 2024-02-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がん細胞に結合し、放射性核種を前記細胞に標的化するスプリット抗体
CA3204291A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy
WO2022189377A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugates and fap/4-1bb binding molecules
WO2022243261A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Agonistic cd40 antigen binding molecules targeting cea
CA3219672A1 (en) * 2021-05-21 2022-11-24 Liang QU Anti-cea and anti-cd137 multispecific antibodies and methods of use
EP4347650A1 (en) * 2021-06-01 2024-04-10 Janssen Biotech, Inc. Anti-idiotypic antibodies against anti-cd79b antibodies
EP4148067A1 (en) * 2021-09-08 2023-03-15 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the expression of an antibody-multimer-fusion
EP4426735A1 (en) 2021-11-01 2024-09-11 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer using a hla-a2/wt1 x cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
WO2023088889A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Apogenix Ag CD137 ligands
WO2023088876A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Apogenix Ag Multi-specific immune modulators
WO2023110788A1 (en) 2021-12-14 2023-06-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using a hla-a2/mage-a4 x cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
CN114349869B (zh) * 2021-12-20 2023-09-26 上海恩凯细胞技术有限公司 一种双特异性的nk细胞激动剂及制备方法和应用
CN114426585B (zh) * 2022-02-15 2023-10-03 广东香雪干细胞再生医学科技有限公司 融合蛋白及其表达细胞株与应用
CN116462769A (zh) * 2022-04-02 2023-07-21 广东东阳光药业有限公司 一种嵌合受体及其应用
CN114805564B (zh) * 2022-06-10 2023-06-06 郑州大学 特异性识别SARS-CoV-2 S蛋白NTD区域的单克隆抗体及应用
IL319568A (en) 2022-09-15 2025-05-01 Avidicure Ip B V Multispecific antigen-binding proteins for NK cell stimulation and their uses
EP4612178A1 (en) 2022-11-03 2025-09-10 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy with anti-cd19/anti-cd28 bispecific antibody
CN116574189A (zh) 2023-01-30 2023-08-11 北京智仁美博生物科技有限公司 针对人il-36r和/或人il-1r3的多种抗体及其用途
JP2026510318A (ja) 2023-03-06 2026-04-02 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ／抗ＣＤ３抗体と腫瘍標的化４－１ＢＢアゴニストの併用療法
EP4680638A1 (en) 2023-03-13 2026-01-21 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment of cancer using an anti-hla-g/anti-cd3 bispecific antibody and a 4-1bb (cd137) agonist
CN118894934A (zh) 2023-05-05 2024-11-05 北京智仁美博生物科技有限公司 抗人il-15的抗体及其用途
CN119552258B (zh) 2023-09-01 2025-11-07 北京智仁美博生物科技有限公司 结合hla-a02/mage-a4复合体的多种抗体及其用途
TW202540200A (zh) 2023-12-01 2025-10-16 美商基利科學股份有限公司 抗ｆａｐ－ｌｉｇｈｔ融合蛋白及其用途
WO2025140212A1 (en) * 2023-12-26 2025-07-03 Laekna Therapeutics Shanghai Co., Ltd. Multispecific binding agents comprising anti-fibroblast activation protein (fap) antibodies and one or more monovalent ligand traps and uses thereof
WO2025191133A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Avidicure Ip B.V. Il-21 muteins, fusion proteins comprising the same and uses thereof
WO2025191139A1 (en) * 2024-03-15 2025-09-18 Avidicure Ip B.V. Conjugates of her2-specific antigen binding proteins and cytokines
WO2025191136A1 (en) 2024-03-15 2025-09-18 Avidicure Ip B.V. Muteins of 4-1bb ligand extracellular domain, fusion proteins comprising the same and uses thereof

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2388385B1 (fr) 1977-04-18 1982-01-08 Hitachi Metals Ltd Piece d'ornement fixee par des aimants permanents
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
AU759779B2 (en) 1997-10-31 2003-05-01 Genentech Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
DK1071700T3 (da) 1998-04-20 2010-06-07 Glycart Biotechnology Ag Glykosylerings-modifikation af antistoffer til forbedring af antistofafhængig cellulær cytotoksicitet
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
ES2248127T3 (es) 1999-10-04 2006-03-16 Medicago Inc. Metodo para regular la transcripcion de genes foraneos en presencia de nigtrogeno.
JP2003531588A (ja) * 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
EP1332209B1 (en) 2000-09-08 2009-11-11 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
NZ571596A (en) 2001-08-03 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7432063B2 (en) 2002-02-14 2008-10-07 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods for affinity maturation
US20070010658A1 (en) 2002-10-29 2007-01-11 Holtet Thor L Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
US20060235201A1 (en) 2003-02-06 2006-10-19 Roman Kischel Enduring T cell response
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
CA2531238C (en) 2003-07-04 2015-02-24 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for her2
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
US9296820B2 (en) 2003-11-05 2016-03-29 Roche Glycart Ag Polynucleotides encoding anti-CD20 antigen binding molecules with increased Fc receptor binding affinity and effector function
EP1711196A4 (en) 2003-12-05 2011-09-14 Bristol Myers Squibb Co INHIBITORS OF TYPE-2 VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR RECEPTORS
EP1740615B1 (en) 2004-03-31 2014-11-05 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
PT1737891E (pt) 2004-04-13 2013-04-16 Hoffmann La Roche Anticorpos anti p-selectina
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2013263717B2 (en) 2005-05-06 2016-05-19 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use
AU2011265482B2 (en) * 2005-05-06 2013-08-29 Providence Health & Services - Oregon Trimeric OX40L-immunoglobulin fusion protein and methods of use
EP1736482A1 (en) 2005-06-20 2006-12-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) Recombinant trimeric 4-1BBL
DE102005036542A1 (de) 2005-08-03 2007-02-08 Universität Stuttgart CTL-Prodrug
PL2383297T3 (pl) 2006-08-14 2013-06-28 Xencor Inc Zoptymalizowane przeciwciała ukierunkowane na CD19
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
EP2009022A1 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Apogenix GmbH Trimeric death ligands with enhanced activity (tenascin)
GB0718843D0 (en) 2007-09-26 2007-11-07 Cancer Rec Tech Ltd Materials and methods relating to modifying the binding of antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
ES2538122T3 (es) * 2008-07-21 2015-06-17 Apogenix Gmbh Moléculas de una sola cadena de TNFSF
EP2337795A2 (en) * 2008-10-01 2011-06-29 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cancer vaccines and immune monitoring
JP5764127B2 (ja) 2009-08-17 2015-08-12 ロシュ グリクアート アーゲー 標的化イムノコンジュゲート
CA2773515C (en) 2009-09-29 2015-04-28 Roche Glycart Ag Bispecific death receptor agonistic antibodies
CA3253628A1 (en) 2010-03-05 2025-11-29 The Johns Hopkins University Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
CA2806021C (en) 2010-08-13 2019-05-21 Roche Glycart Ag Anti-fap antibodies and methods of use
US8552024B2 (en) 2010-08-13 2013-10-08 Hoffman-La Roche Inc. Azacyclic compounds
SG192673A1 (en) 2011-02-10 2013-09-30 Roche Glycart Ag Mutant interleukin-2 polypeptides
ES2692268T5 (en) 2011-03-29 2025-02-26 Roche Glycart Ag Antibody fc variants
JP6047142B2 (ja) 2011-04-01 2016-12-21 ウニヴェルズィテート シュトゥットガルト 抗体結合ドメインを有する組換えｔｎｆリガンドファミリーメンバーポリペプチドおよびそれらの使用
JP2013055204A (ja) 2011-09-02 2013-03-21 Toshiba Corp 半導体記憶装置
PL3489254T3 (pl) 2012-04-30 2023-01-30 Biocon Limited Ukierunkowujące/immunomodulujące białko fuzyjne i sposoby jego otrzymywania
PE20150645A1 (es) 2012-08-08 2015-05-11 Roche Glycart Ag Proteinas de fusion de interleuquina 10 y usos de las mismas
WO2014116846A2 (en) * 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
LT2961771T (lt) * 2013-02-26 2020-03-10 Roche Glycart Ag Bispecifinės t ląstelę aktyvinančios antigeną surišančios molekulės, specifinės cd3 ir cea antigenams
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
WO2014180754A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Trimeric antigen binding molecules
WO2015117930A1 (en) 2014-02-06 2015-08-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukine 10 immunoconjugates
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
EA035419B9 (ru) 2014-05-29 2020-08-07 Мэкроудженикс, Инк. Триспецифичные связывающие молекулы и способы их применения
EP3148573A4 (en) 2014-05-29 2017-11-15 Medimmune, LLC Ox40l fusion proteins and uses thereof
EP3224275B1 (en) 2014-11-14 2020-03-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
EP3973980A1 (en) 2015-03-31 2022-03-30 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a trimeric tnf family ligand
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CN108290958B (zh) 2015-10-02 2021-12-28 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗体
AU2016330807B2 (en) 2015-10-02 2023-08-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-human CD19 antibodies with high affinity
WO2017055314A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-cd19xcd3 t cell activating antigen binding molecules
US10526413B2 (en) 2015-10-02 2020-01-07 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies specific for OX40
AU2016334623A1 (en) 2015-10-07 2018-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory TNF receptor
EP3231813A1 (en) 2016-03-29 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Trimeric costimulatory tnf family ligand-containing antigen binding molecules
WO2017194442A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
EP3243836A1 (en) 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
EP3482170B1 (en) 2016-07-08 2020-02-12 Roche Diagnostics GmbH Apparatus for processing a laboratory sample, laboratory automation system and method for pipetting a laboratory sample
AU2017380981B2 (en) 2016-12-19 2025-01-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with targeted 4-1BB (CD137) agonists
KR102692708B1 (ko) 2016-12-20 2024-08-07 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-cd20/항-cd3 이중특이성 항체 및 4-1bb(cd137) 작용물질의 병용 요법
WO2018127473A1 (en) 2017-01-03 2018-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-4-1bb clone 20h4.9
EP3601346A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
CN110573528B (zh) 2017-03-29 2023-06-09 豪夫迈·罗氏有限公司 针对共刺激性tnf受体的双特异性抗原结合分子
JP6997209B2 (ja) 2017-04-04 2022-02-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｃｄ４０およびｆａｐに特異的に結合することができる新規な二重特異性抗原結合分子
MY205342A (en) 2017-11-01 2024-10-16 Hoffmann La Roche Bispecific 2+1 contorsbodies
JP2021500902A (ja) 2017-11-01 2021-01-14 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 新規ｔｎｆファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
EP3765489B1 (en) 2018-03-13 2024-10-16 F. Hoffmann-La Roche AG Therapeutic combination of 4-1bb agonists with anti-cd20 antibodies
TWI841551B (zh) 2018-03-13 2024-05-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 使用靶向4-1bb (cd137)之促效劑的組合療法
SG11202007961QA (en) 2018-04-13 2020-09-29 Hoffmann La Roche Her2-targeting antigen binding molecules comprising 4-1bbl
WO2020007817A1 (en) 2018-07-04 2020-01-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel bispecific agonistic 4-1bb antigen binding molecules
CN112654641A (zh) 2018-10-01 2021-04-13 豪夫迈·罗氏有限公司 具有与cd40的三价结合的双特异性抗原结合分子
WO2020070041A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecules comprising anti-fap clone 212
JP7301155B2 (ja) 2019-04-12 2023-06-30 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト リポカリンムテインを含む二重特異性抗原結合分子
KR20220025848A (ko) 2019-06-26 2022-03-03 에프. 호프만-라 로슈 아게 Cea 및 4-1bbl에 결합하는 항체의 융합
CN114929734A (zh) 2020-01-09 2022-08-19 豪夫迈·罗氏有限公司 新型含有4-1bbl三聚体的抗原结合分子
AR121706A1 (es) 2020-04-01 2022-06-29 Hoffmann La Roche Moléculas de unión a antígeno biespecíficas dirigidas a ox40 y fap

Also Published As

Publication number Publication date
TW201629094A (zh) 2016-08-16
WO2016075278A1 (en) 2016-05-19
MY191428A (en) 2022-06-27
KR20230146133A (ko) 2023-10-18
TWI713474B (zh) 2020-12-21
EP3224275A1 (en) 2017-10-04
MX391388B (es) 2025-03-21
PE20221909A1 (es) 2022-12-23
US20220259326A1 (en) 2022-08-18
AU2015345024A1 (en) 2017-04-20
UA125577C2 (uk) 2022-04-27
ES2788979T3 (es) 2020-10-23
DK3489256T3 (da) 2021-05-25
EP3224275B1 (en) 2020-03-04
JP7184938B2 (ja) 2022-12-06
SG11201703597TA (en) 2017-06-29
PT3224275T (pt) 2020-05-04
HRP20210739T1 (hr) 2021-06-25
US11267903B2 (en) 2022-03-08
HUE054122T2 (hu) 2021-08-30
MX380253B (es) 2025-03-12
SI3489256T1 (sl) 2021-08-31
HK1255482A1 (zh) 2019-08-16
CL2019003728A1 (es) 2020-07-17
IL251317B (en) 2021-05-31
BR112017009006A2 (pt) 2018-04-10
LT3489256T (lt) 2021-06-10
TW202041527A (zh) 2020-11-16
EP3489256A1 (en) 2019-05-29
PE20170896A1 (es) 2017-07-12
EA201791057A1 (ru) 2017-10-31
US12441812B2 (en) 2025-10-14
MX2017006250A (es) 2017-11-17
PH12017500892B1 (en) 2023-08-18
KR20250158074A (ko) 2025-11-05
EP3738609A1 (en) 2020-11-18
US20190382507A1 (en) 2019-12-19
HUE049982T2 (hu) 2020-11-30
EA037557B1 (ru) 2021-04-14
CN108064237A (zh) 2018-05-22
CN120574325A (zh) 2025-09-02
PL3224275T3 (pl) 2020-09-07
AU2015345024B2 (en) 2020-10-15
US11306154B2 (en) 2022-04-19
CN108064237B (zh) 2022-02-11
RS60201B1 (sr) 2020-06-30
DK3224275T3 (da) 2020-05-04
IL282922B (en) 2022-08-01
JP2021097674A (ja) 2021-07-01
CA2963718A1 (en) 2016-05-19
EP3738609C0 (en) 2025-06-18
NZ767674A (en) 2024-07-05
IL251317A0 (en) 2017-05-29
TWI757803B (zh) 2022-03-11
KR102877243B1 (ko) 2025-10-29
US20160200833A1 (en) 2016-07-14
PH12017500892A1 (en) 2017-11-06
JP6873901B2 (ja) 2021-05-19
CR20170194A (es) 2017-07-10
NZ767672A (en) 2024-02-23
AU2022201144A1 (en) 2022-03-17
SI3224275T1 (sl) 2020-07-31
US10392445B2 (en) 2019-08-27
PL3489256T3 (pl) 2021-08-23
HRP20200679T1 (hr) 2020-07-24
CO2017003212A2 (es) 2017-09-20
US20250101135A1 (en) 2025-03-27
ES2871045T3 (es) 2021-10-28
IL282922A (en) 2021-06-30
MX2020012798A (es) 2022-04-07
KR20170085552A (ko) 2017-07-24
MA40882B1 (fr) 2020-05-29
NZ730933A (en) 2024-02-23
US20220259327A1 (en) 2022-08-18
MA40882A (fr) 2017-10-04
JP2018503356A (ja) 2018-02-08
AU2022201144B2 (en) 2025-03-06
EP3489256B1 (en) 2021-03-17
CN114634570A (zh) 2022-06-17
AU2020264337A1 (en) 2021-01-28
EP3738609B1 (en) 2025-06-18
CN113372434B (zh) 2024-06-04
LT3224275T (lt) 2020-05-25
KR102588377B1 (ko) 2023-10-12
US20200247904A1 (en) 2020-08-06
CN114634570B (zh) 2025-05-06
AU2020264337B2 (en) 2021-12-02
CN113372434A (zh) 2021-09-10
MA53242A (fr) 2021-06-23
CL2017001000A1 (es) 2018-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12441812B2 (en) Methods of treating cancer by administering tumor necrosis factor (TNF) family ligand trimer-containing antigen-binding molecules
US12202870B2 (en) Antigen binding molecules comprising a trimeric TNF family ligand and encoding polynucleotides thereof
EP3243836A1 (en) C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
CA2963718C (en) Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
HK40123770A (zh) 包含tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
HK40066761B (zh) 包含tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
HK40066761A (zh) 包含tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
HK40061781B (zh) 包含tnf家族配体三聚体的抗原结合分子
HK1255482B (en) Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
BR112017009006B1 (pt) Molécula de ligação, composição farmacêutica e uso da molécula de ligação