RS62258B1 - Bispecifična antitela specifična za pd1 i tim3 - Google Patents

Bispecifična antitela specifična za pd1 i tim3

Info

Publication number
RS62258B1
RS62258B1 RS20211031A RSP20211031A RS62258B1 RS 62258 B1 RS62258 B1 RS 62258B1 RS 20211031 A RS20211031 A RS 20211031A RS P20211031 A RSP20211031 A RS P20211031A RS 62258 B1 RS62258 B1 RS 62258B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
domain
amino acid
seq
acid sequence
antibody
Prior art date
Application number
RS20211031A
Other languages
English (en)
Inventor
Laura Codarri-Deak
Georg Fertig
Jens Fischer
Christian Klein
Viktor Levitski
Valeria Lifke
Mario Perro
Joerg Thomas Regula
Tilman Schlothauer
Stefan Seeber
Pablo Umaña
Ildiko Wuensche
Adrian Zwick
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS62258B1 publication Critical patent/RS62258B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

OPIS
OBLAST PRONALASKA
Pronalazak se odnosi na bispecifična antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, posebno za bispecifična antitela, naznačen time što se bispecifično antitelo vezuje za TIM3 sa nižim afinitetom vezivanja u poređenju sa vezivanjem za PD1. Pronalazak se dalje odnosi na postupke za proizvodnju ovih molekula i na postupke za njihovo korišćenje.
OSNOVA
Važnost imunološkog sistema u zaštiti od kancera se zasniva na njegovoj sposobnosti otkrivanja i uništavanja abnormalnih ćelija. Međutim, neke ćelije tumora mogu da pobegnu od imunološkog sistema stvarajući stanje imunosupresije (Zitvogel et al., Nature Reviews Immunology 6 (2006), 715–727). Jedan od primera mehanizma imunosupresije prisutnog kod domaćina koji nose tumore je promocija disfunkcije ili iscrpljivanja T ćelija. T ćelije su glavni fokus napora za terapijsku manipulaciju endogenim antitumorskim imunitetom zahvaljujući njihovoj sposobnosti selektivnog prepoznavanja peptida izvedenih iz proteina u svim ćelijskim odeljcima; njihova sposobnost da direktno prepoznaju i ubiju ćelije koje eksprimiraju antigen (pomoću CD8+ efektorskih T ćelija; takođe poznatih kao citotoksični T limfociti (CTL)) i njihova sposobnost da orkestriraju različite imunološke odgovore (pomoću CD4+ pomoćnih T ćelija), koji integrišu adaptivne i urođene efektorske mehanizme. Iscrpljene T ćelije ne uspevaju da se razmnožavaju i vrše efektorske funkcije kao što su citotoksičnost i lučenje citokina kao odgovor na stimulaciju antigenom. Dalja ispitivanja su utvrdila da iscrpljene T ćelije karakteriše neprekidna ekspresija inhibitornog molekula PD-1 (protein programirane ćelijske smrti 1) i da blokada interakcija PD-1 i PD-L1 (PD-1 ligand) može preokrenuti iscrpljivanje T ćelije i obnavljanje antigen-specifičnih odgovora T ćelije kod miševa zaraženih LCMV-om (Barber et al., Nature 439 (2006), 682-687). Međutim, ciljanje samog puta PD-1-PD-L1 ne rezultuje uvek preokretom iscrpljivanja T ćelija (Gehring et al., Gastroenterology 137 (2009), 682-690), što ukazuje da su drugi molekuli verovatno uključeni u iscrpljivanje T ćelija (Sakuishi, J. Experimental Med.207 (2010), 2187-2194).
TIM-3 je molekul koji je izvorno identifikovan kao selektivno eksprimiran na IFN- γlučenju Th1 i Tc1 ćelija (Monney iet al., Nature 415 (2002), 536-541). Interakcija TIM-3 sa njegovim ligandom, galektinom-9, pokreće ćelijsku smrt u TIM-3+ T ćelijama. Stoga, i TIM-3 i PD-1 mogu funkcionisati kao negativni regulatori odgovora T ćelija. Pokazalo se da TIM3 DK/25.08.2016. označava najviše potisnutu ili nefunkcionalnu populaciju CD8+ T ćelija u pretkliničkim modelima solidnog i hematološkog malignog oboljenja (Sakuishi, J. Experimental Med. 207 (2010), 2187-2194; Zhou, Blood 117 (2011), 4501-4510; Majeti R et al., PNAS, 106 (2009), 3396-3401). U ovim modelima, sve CD8+ TIM-3+ T ćelije koeksprimiraju PD1, a ove ćelije sa dvostrukom ekspresijom pokazuju veće nedostatke u napredovanju ćelijskog ciklusa i efektorskoj proizvodnji citokina [interleukin (IL)-2, TNF i IFN- γ] nego ćelije koje eksprimiraju samo PD1. Stoga, TIM-3 put može da sarađuje sa PD-1 putem da bi promovisao razvoj ozbiljnog disfunkcionalnog fenotipa u CD8+ T ćelijama u kanceru. Stoga se očekuje da će kombinovano ciljanje puteva TIM-3 i PD1 biti vrlo efikasno u kontroli rasta tumora.
TIM3 je humani protein koji pripada imunoglobulinskoj superfamiliji, a TIM familiji proteina. Kod ljudi, slično miševima, TIM-3 se eksprimira na T ćelijama, kao i na fagocitnim ćelijama, poput makrofaga i dendritskih ćelija. Vezivanje TIM3 za proteinski ligand (npr. galektin-9) može da inhibira Th1 odgovor mehanizmom indukcije apoptoze, i zbog toga da dovede do indukcije periferne tolerancije. Smanjenje ekspresije humanog TIM3 sa siRNK ili inhibicija humanog TIM3 blokirajućim antitelom povećava izlučivanje interferona alfa iz CD4 pozitivnih T ćelija, podržavajući inhibitorsku ulogu TIM3 u humanim T ćelijama. U fagocitima, TIM3 funkcioniše i kao receptor za prepoznavanje ćelija apoptoze. Analiza kliničkih uzoraka pacijenata sa autoimunom bolešću nije pokazala ekspresiju TIM3 u CD4 pozitivnim ćelijama. Konkretno, u klonovima T ćelija dobijenim iz cerebrospinalne tečnosti bolesnika sa multiplom sklerozom, nivo ekspresije TIM3 je bio niži, a nivo sekrecije IFN-gama viši od one kod klonova dobijenih od normalnih zdravih osoba (Koguchi K et al., J Exp Med. 203 (2006), 1413-1418). Postoje izveštaji o povezanosti TIM-3 sa alergijskim bolestima ili astmom (WO 96/27603 i W02003/063792).
Primeri anti-TIM3 monoklonskih antitela uključuju antihumano monoklonsko antitelo pacova TIM3 (klon 344823, proizvođača R&D Systems) i antihumano mišje monoklonsko antitelo TIM-3 (klon F38-2E2, proizvođača R&D Systems). W02013/06490 se odnosi na anti-TIM3 antitela koja pokazuju brzu internalizaciju i njihove imunokonjugate za lečenje kancera i smanjenje upale. US2012/189617 se odnosi na anti-TIM-3 antitela koja pokazuju veću efektorsku aktivnost, poput ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC aktivnost) za bolesti koje se odnose na humanu ćeliju koja eksprimira TIM3.
Programirani protein ćelijske smrti 1 (PD-1 ili CD279) je inhibitorski član familije CD28 receptora, koja takođe uključuje CD28, CTLA-4, ICOS i BTLA. PD-1 je receptor na ćelijskoj površini i eksprimira se na aktiviranim B ćelijama, T ćelijama i mijeloidnim ćelijama (Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Struktura PD-1 je monomerni transmembranski protein tipa 1, koji se sastoji od jednog vanćelijskog domena sličnog varijabilnom imunoglobulinu i citoplazmatskog domena koji sadrži imunoreceptorski inhibitorni motiv na bazi tirozina (ITIM) i imunoreceptorski motiv prekidača na bazi tirozina (ITSM). Aktivirane T ćelije privremeno eksprimiraju PD1, ali neprekidna hiperekspresija PD1 i njegovog liganda PDL1 podstiču iscrpljivanje imuniteta, što dovodi do perzistentnosti virusnih infekcija, evazije tumora, povećanih infekcija i smrtnosti. Ekspresija PD1 se indukuje prepoznavanjem antigena preko receptora T-ćelija, i njegova ekspresija se održava prvenstveno neprekidnom signalizacijom receptora T-ćelija. Nakon dužeg izlaganja antigenu, lokus PD1 ne uspeva ponovno da se remetiluje, što promoviše neprekidnu hiperekspresiju. Blokiranje PD1 puta može vratiti iscrpljenu funkcionalnost T-ćelija kod kancera i hroničnih virusnih infekcija (Sheridan, Nature Biotechnology 30 (2012), 729-730). Monoklonska antitela na PD-1 su opisana, na primer, u WO 2003/042402, WO 2004/004771, WO 2004/056875, WO 2004/072286, WO 2004/087196, WO 2006/121168, WO 2006/133396, WO 2007/005874, WO 2008/083174, WO 2008/156712, WO 2009/024531, WO 2009/014708, WO 2009/101611, WO 2009/114335, WO 2009/154335, WO 2010/027828, WO 2010/027423, WO 2010/029434, WO 2010/029435, WO 2010/036959, WO 2010/063011, WO 2010/089411, WO 2011/066342, WO 2011/110604, WO 2011/110621, WO 2012/145493, WO 2013/014668, WO 2014/179664 i WO 2015/112900.
Takođe je pokazano da blokiranje PD1 i TIM3 može obnoviti antibakterijske imunološke odgovore, na primer, kod pacijenata sa akutnim alkoholnim hepatitisom (AAH). Limfociti kod ovih pacijenata eksprimiraju visok nivo imunoloških inhibitornih receptora, proizvode niže nivoe interferona gama i povećavaju proizvodnju IL10 zbog hronične izloženosti endotoksinu. Ovi efekti se mogu poništiti blokiranjem PD1 i TIM3, koji povećavaju antimikrobne aktivnosti T ćelija i neutrofila (Markwick et al, Gastroenterology 148 (2015), 590–602).
Bispecifična antitela na TIM3 i PD1 za imunoterapiju u hroničnim imunološkim stanjima su već opisana u WO 2011/159877. Međutim, postoji potreba za obezbeđivanjem novih bispecifičnih antitela koja ne samo što se istovremeno vezuju za PD1 i TIM3 i stoga selektivno ciljaju T ćelije koje eksprimiraju PD1 i TIM3, već i izbegavaju blokiranje TIM3 na drugim ćelijama, kao što su urođene imunske ćelije, na primer, naivne dendritske ćelije (DC) i monociti. Bispecifična antitela iz predmetnog pronalaska ne samo što efikasno blokiraju PD1 i Tim3 na T ćelijama koje prekomerno eksprimiraju PD1 i TIM3, već su vrlo selektivna za ove ćelije, pa se na taj način mogu izbeći neželjeni efekti davanjem visoko aktivnih TIM3 antitela.
SAŽETAK PRONALASKA
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1, i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu
navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, ili
(b) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, ili
(c) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, ili
(d) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48, ili
(e) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49,
i navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24, ili
(b) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, ili
(c) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 je dvovalentno.
U drugom aspektu, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu se bispecifično antitelo vezuje za TIM3 sa malim afinitetom i za PD1 sa velikim afinitetom. U posebnom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu se bispecifično antitelo vezuje za TIM3 sa najmanje 50 puta manjim afinitetom vezivanja u poređenju sa vezivanjem za PD1, preciznije sa najmanje 100 puta manjim afinitetom vezivanja u poređenju sa vezivanjem za PD1. U jednom poželjnom otelotvorenju, afinitet vezivanja (KD) određuje se analizom površinske plazmonske rezonance (kao što je opisano npr. u primeru 12.)
Preciznije, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, i navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
U određenom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu se bispecifično antitelo vezuje za TIM3 sa najmanje 50 puta manjim afinitetom vezivanja u poređenju sa vezivanjem za PD1, preciznije sa najmanje 100 puta manjim afinitetom vezivanja u poređenju sa vezivanjem za PD1.
U daljem aspektu, bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 je humano, humanizovano ili himerno antitelo. Konkretno, to je humanizovano ili himerno antitelo.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu bispecifično antitelo sadrži Fc domen, prvi Fab fragment koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1, i drugi Fab fragment koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3.
Konkretno, Fc domen je domen IgG, preciznije Fc domen IgG1 ili Fc domen IgG4. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za Fc receptor, posebno za Fcγ receptor. Konkretno, Fc domen je podklasa humanog IgG1 sa aminokiselinskim mutacijama L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše asocijaciju prve i druge podjedinice Fc domena.
U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu prva podjedinica Fc domena sadrži dugme, a druga podjedinica Fc domena sadrži rupicu prema metodi dugme u rupici. U određenom aspektu, prva podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije S354C i T366W (EU numeracija), a druga podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S i Y407V (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U dodatnom aspektu, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu su u jednom od Fab fragmenata varijabilni domeni VL i VH zamenjeni jedan drugim, tako da je VH domen deo lakog lanca, a VL domen je deo teškog lanca. U određenom aspektu, bispecifično antitelo je jedno, pri čemu, u prvom Fab fragmentu koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1, varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim.
U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu, u jednom od Fab fragmenata u konstantnom domenu CL aminokiselina na poziciji 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), a u konstantnom domenu CHI aminokiseline na pozicijama 147 i 213 su nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U određenom aspektu, bispecifično antitelo je jedno, pri čemu je u drugom Fab fragmentu koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 konstantni domen CL aminokiselina na poziciji 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), a u konstantnom domenu CHI aminokiseline na pozicijama 147 i 213 su nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, koje sadrži
(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 50, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 52,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 51, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO:53, ili
(b) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 62, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 64,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 63, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO:65.
U određenom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, koje sadrži
(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53, ili
(b) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65.
Prema drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je polinukleotid koji kodira bispecifično antitelo kako je ovde prethodno opisano. Pronalazak dalje obezbeđuje vektor, posebno ekspresioni vektor, koji sadrži polinukleotid iz pronalaska i i prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina koja sadrži polinukleotid ili vektor iz pronalaska. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćina je eukariotska ćelija, posebno ćelija sisara.
U drugom aspektu, obezbeđen je postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 kao što je ovde opisano, obuhvatajući korake a) transformacije ćelije domaćina vektorima koji sadrže polinukleotide koji kodiraju navedeno bispecifično antitelo, b) uzgajanje ćelije domaćina pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog antitela i c) rekuperovanje bispecifičnog antitela iz kulture. Pronalazak takođe uključuje bispecifično antitelo koje je proizvedeno pomoću postupka iz ovog pronalaska.
Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, kao što je ovde opisano, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
Pronalaskom je takođe obuhvaćeno bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 kao što je ovde opisano, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo, koja se primenjuje kao lek.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 kao što je ovde opisano, ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifično antitelo, za upotrebu
i) u modulaciji imunoloških odgovora, kao što je obnavljanje aktivnosti T ćelije, ii) u stimulisanju imunološkog odgovora ili funkcije,
iii) u lečenju infekcija,
iv) u lečenju kancera,
v) u odlaganju napredovanja kancera,
vi) u produžavanju preživljavanja pacijenta koji boluje od kancera.
U jednom aspektu je dato bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 kao što je ovde opisano, ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifično antitelo, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U specifičnom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifično antitelo, za upotrebu u lečenju kancera. U daljem specifičnom aspektu, bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo, obezbeđeni su za upotrebu u modulaciji imunološkog odgovora. U drugom aspektu, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, ili farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo za upotrebu u lečenju hronične virusne infekcije.
Takođe je obezbeđena upotreba bispecifičnog antitela koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, kao što je ovde opisano, za proizvodnju leka za lečenje bolesti kod pojedinca kojem je to potrebno, posebno za proizvodnju leka za lečenje kancera, kao i postupak lečenja bolesti kod pojedinca, koji se sastoji od davanja spomenutom pojedincu terapeutski efikasne količine kompozicije koja sadrži bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, kao što je ovde opisano, u farmaceutski prihvatljivom obliku. U specifičnom aspektu, bolest je kancer. U drugom specifičnom aspektu, bolest je hronična virusna infekcija. U drugom aspektu, obezbeđen je postupak modulacije imunološkog odgovora kod pojedinca, koji se sastoji od davanja spomenutom pojedincu terapeutski efikasne količine kompozicije koja sadrži bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koji se specifično vezuje za TIM3, kao što je ovde opisano, u farmaceutski prihvatljivom obliku. U bilo kom od gore navedenih aspekata, pojedinac je poželjno sisar, naročito čovek.
Pronalazak takođe obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 kao što je ovde opisano, ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži bispecifično antitelo za upotrebu u prevenciji ili lečenju kancera, pri čemu se bispecifično antitelo daje u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom, zračenjem i/ili drugim agensima za upotrebu u imunoterapiji kancera.
Nadalje, obezbeđen je postupak za inhibiranje rasta tumorskih ćelija kod pojedinca koji se sastoji od davanja pojedincu delotvorne količine bispecifičnog antitela koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, kao što je ovde opisano, da inhibira rast tumorskih ćelija. Pojedinac je poželjno sisar, naročito čovek.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1: Blokada PD1 himernim PD1-0103 jako pojačava izlučivanje IFN-gama alogeno stimulisanim primarnim humanim T ćelijama.
Slika 2: Blokada PD1 himernim PD1-0103 sjako povećava izlučivanje
1
interferona gama (TFN- γ) alogeno stimulisanim primarnim humanim T ćelijama.
Slika 3: Blokada PD1 himernim PD1-0103 jako povećava izlučivanje faktora nekroze tumora alfa (TNF) alogeno stimulisanim primarnim humanim T ćelijama.
Slika 4: 4A) frekvencija CD4 T ćelija koje proizvode granzim B i 4B) Količina IFN- γ detektovana putem apsorbance (optička gustina, O.D.) u supernatantu MLR u prisustvu rastućih koncentracija različitih anti-PD-1 antitela
Slika 5: 5A) Uticaj blokade PD1/PD-L1 na reaktivaciju potisnutog signala receptora T ćelije u prisustvu različitih anti-PD-1 antitela 5B) Uticaj blokade PD1/PD-L1 na reaktivaciju potisnutog signala receptora T ćelije u prisustvu različitih anti-PD-1 antitela
Slika 6: Šema FRET testa za simultano vezivanje anti-PD1/Tim3 bispecifičnih antitela za rekombinantne ćelije
Slika 7: Indukcija FRET nakon lečenja / vezivanja različitih bispecifičnih PD1TIM3 antitela za ćelije koje eksprimiraju PD1 i TIM3: HEK293 ćelije, dvostruko transfeicirane sa PD1 SNAP Tim3 CLIP, obojene su sa 100 nM SNAP-Lumi4-Tb (Cisbio) i 100 nM Clip-Red (Cisbio) tokom 1 sata na 37° u puferu Tag-Lite (Cisbio). Nakon ispiranja, obeležene ćelije su inkubirane sa naznačenim bispecifičnim anti-PD1/Tim3 antitelima [0-10 nM] (humanizovane bispecifične varijante su prikazane na slici 7B) tokom 1 sata na 4 °C pre nego što je vremenski razložena fluorescencija izmerena na 665/620 nm na čitaču BMG Pherastar (prikazana je prosečna vrednost FRET signala /- SD [odnos 665/620 nm * 10.000], n=3). 7A: 1+1 formati (antitela PD1TIM3_0389 i PD1TIM3 0168) u poređenju sa konstruktima 2+2 (PD1TIM3_0358+ PD1TIM30359) 7B: humanizovane bispecifične varijante (PD1TIM30476 i PD1TIM3477).
Slika 8: FRET test za simultano vezivanje anti-PD1/TIM3 bispecifičnog antitela 1+1 PD1TIM3-0168: SNAP-označene PD1 i CLIP-označene TIM3 ćelije (kao što je prethodno opisano) označene su sa 100 nM SNAP-Lumi4-Tb i 100 nM Clip-Red. Nakon ispiranja, obeležene ćelije su inkubirane sa bispecifičnim anti-PD1/TIM3 antitelom br. 0168 [u naznačenim koncentracijama] tokom 1 sata na 4 °C pre nego što je vremenski razložena fluorescencija izmerena na 665/620 nm sa čitaču BMG Pherastar (crne linije). Da bi se podvukla specifičnost FRET signala indukovanog bispecifičnim antitelom, za konkurenciju je dodato ili anti-PD1 monoklonsko antitelo (br. 0165; slika 8A) ili antitelo koje blokira anti-TIM3 (br. 0018, slika 8B), što je rdovelo gotovo do potpunog sprečavanja FRET signala (sive krive). Lečenje samo anti-PD1 antitelom nije rdovelo do indukcije FRET (isprekidane linije, samo levi dijagram).
Slika 9A: Bispecifični 1+1 PD1TIM3-0389 pokazuje isti odnos vezivanja za pozitivne CD4+ T-ćelije (PD1+, TIM3+) kaoo himerni TIM3_0028 (chi0028) i humanizovani TIM3-0438 (0438), ali manje vezivanje za monocite, NK ćelije i CD3+ T-ćelije.
Slika 9B: Bispecifični 1+1 PD1TIM3-0389 pokazuju značajno povećanu MFI za vezivanje za pozitivne CD4+ T-ćelije (PD1+, TIM3+) u odnosu na himerni TIM3_0028 (chi0028) i humanizovani Tim3-0438 (0438).
Slika 9C: Bispecifični 1+1 PD1TIM3-0168 nema razlika u vezi sa vezivanjem za pozitivne CD4+ T-ćelije (PD1+, TIM3+) u odnosu na himerni TIM3 0018 (Tim3-chi0018) i humanizovani TIM3-0434 (0434).
Slika 9D: Bispecifični 1+1 PD1TIM3-0168 pokazuju samo neznatno povećanu MFI za vezivanje za pozitivne CD4+ T-ćelije (PD1+, Tim3+). Slika 9E i slika 9F: anti-TIM3 antitelo TIM3-0038 pokazuje vezivanje za monocite i CD4+ T-ćelije.
Slika 9G i slika 9H: Bispecifični 1+1 PD1TIM3-0166 (na bazi himernog PD1-0103//
Tim3-0038) pokazuje jako odloženo vezivanje za monocite (u poređenju sa matičnim anti-TIM3 antitelom TIM3_0038 vidi slike 4E i 4F), i zadržava jako vezivanje za CD4+ T-ćelije.
Slike od 10A do 10D: Bispecifični 1+1 PD1TIM3-0166 (na bazi himernog PD1-0103// TIM3-0038) pokazao je smanjenu internalizaciju u odnosu na bispecifični 2+2 PD1TIM3-0321 (takođe na bazi himernog PD1-0103// TIM3-0038, ali ima dva mesta vezivanja antigena za PD i dva za TIM3) i u poređenju sa matičnim antitelom TIM3-0038 na aktiviranim CD4+ T-ćelijama i na aktiviranim NK ćelijama
Slika 11A: Analiza tokom vremena pokazuje veću lokalizaciju membrane za bispecifična i PD1 antitela u poređenju sa intracelulernim grupisanjem TIM3 antitela.
Oznake antitela na slici TIM3 (chil8-A647 = himerni TIM3_0018 obeležen sa AlexaA647), a-TIM3 (chi28-A647 = himerni TIM3_0028 obeležen sa AlexaA647), Bispec (0168-A647 = 1+1 PD1TIM3_0168 (na bazi himernog PD1-0103 / TIM3-0018) obeležen sa AlexaA647) Bispec (0389-A647 = 1+1 PD1TIM3_0389 (na bazi himernog PD1-0103 / TIM3-0028) obeležen sa Alexa 647) i a-PD1 (0165-A488 = himerni PD1-0103 obeležen sa Alexa488). Anti-PD1 i bispecifični 1+1 PD1TIM3_0389 (Bispec 0389) pokazuju samo vrlo sporo internalizaciju, čak i nakon 3 h, dok je internalizacija za druge bispecifične 1+1 PD1TIM3_0168 (Bispec 0168) jača. Jaču internalizaciju je prikazao aTIM3 Ab 0028, a najveću internalizaciji je prikazao aTIM3-0018.
Slika 11B: Himerni PD1-0103 (aPD1-0165) pokazuje samo lošu internalizaciju, dok je visokoafinitetni himerni TIM3_0018 (aTim3-chi18) jako internalizovan nakon vezivanja TIM3, čak i nakon 15 minuta. Internalizacija himernog veziva malog afiniteta TIM3_0028 (aTIM3-chi28) je malo smanjena. Bispecifični 1+1 AB 0168 (sastavljen od visokoafinitetnog veziva aPD1-0165 i visokoafinitetnog aTIM3-0018) pokazuje smanjenu internalizaciju. Bispecifični 1+1 AB 0389 (sastavljen od himernog veziva velikog afiniteta PD1-0103 (aPD1-0165) i himernog niskoafinitetnog TIM3_0028 (aTIM3-0028) pokazuje vrlo jaknu smanjenu internalizaciju. To bi moglo biti zbog dvovalentnog vezivanja za PD1 i TIM3, gde visokoafinitetno vezivanje za PD1 zadržava antitelo na površini ćelije.
Slika 12A: Potentnost PD1-TIM3 bispecifičnog antitela 1+1 PD1TIM3_0168
(zasnovana na himernom PD1-0103 / TIM3-0018 (=AB 0168) u poređenju sa himernim PD1-0103 (=PD1-0165) i himernim TIM3_0018 (=TIM3-chi18) i njihove kombinacije
Slika 12B: Potentnost PD1-TIM3 bispecifičnog antitela 1+1 PD1TIM3_0389 (na bazi himernog PD1-0103 / TIM3-0028 (=Bispec AB 0389) u poređenju sa himernim PD1-0103 (=PD1-0165) i himernim TIM3_0028 (= TIM3-chi28) i njihovim kombinacijama
Slika 12C: Potentnost PD1-TIM3 bispecifičnog antitela 1+1 PD1-0103 /Ky8213 (na
1
bazi himernog PD1-0103 / i anti-TIM3 Ky8213 iz US20120189617 (vidi antitelo8213, npr. primer 33) proizvedenog analogno onome što je opisano u primeru 1 kao 1+1 CrossMab) u poređenju sa himernim PD1-0103 (=PD1-0165) i anti-TIM3-Ky8213 (iz US20120189617 (vidi antitelo 8213), npr. primer 33) i njihovim kombinacijama
Slika 12D: Potentnost PD1-TIM3 bispecifičnog antitela 1+1 PD1TIM3_0389 (na bazi himernog PD1-0103 / TIM3-0028 (=Bispec AB 0389 (1+1)) u poređenju sa PD1-TIM3 bispecifičnim antitelom 2+2 PD1TIM3_0358 na bazi himernog PD1-0103 / TIM3-0028 (=Bispec AB 0358 (2+2)), i himernog PD1-0103 (=PD1-0165) i himernog TIM3_0028 (=TIIM3-chi28) i njihovim kombinacijama
Slika 13: Lečenje sa PD1-TIM3 bispecifičnim antitelom 1+1 PD1TIM3_0476 značajno je povećalo sposobnost CD4 T ćelija da oslobađaju IFN-gama u poređenju sa lečenjem samo sa PD1 ili TIM3 antitelima, pa čak i u poređenju sa lečenjem kombinacijom matičnog antitela PD1_0376 i antitela TIM3_0438. CD4 T ćelije su uzgajane zajedno sa ćelijskom linijom tumora koja eksprimira MHCII. PD1-Tim3 bispecifično antitelo 1+1 PD1TIM3_0476 testirano je na PD1 antitela aPDl_0376, MDX-1106 (nivolumab) i MK-3475 (pembrolizumab), na antitela TIM3 aTIM3_0438 i Kyowa-8213 (kao što je objavljeno u WO 2011/155697) i na kombinacije anti-PD1 antitela aPDl-0376 i anti-TIM3 antitela aTIM3_0438.
Slike 14A i 14B: Rezultati eksperimenta o efikasnosti kojim se upoređuje PD1-TIM3 bispecifično antitelo 1+1 (0476) samo sa PD1 ili TIM3 antitelima na ženkama miševa sa potisnutim imunitetom (NOG) izazvanim MKN45 ćelijama i obezbeđenim PBMC-om od zdravog humanog donora prikazani su na slikama 14A i 14B. Grafikoni predstavljaju prosečnu vrednost veličine tumora (u lečenoj grupi), uključujući standardnu grešku prosečne veličine tumora u periodu od 30 dana. Krive sa ispunjenim krugom odgovaraju rastu veličine tumora bez lečenja (vehikulum). Na slici 14 A je prikazan rast tumora sa lečenjem nižim dozama (1,5 mg/kg antitela PD1_0376, 1,5 mg/kg nivolumaba, 1,5 mg/kg antitela TIM3_0438 ili 3 mg/kg bispecifičnog antitela 1+1 PD1TIM3_0476), na slici 14B je prikazan rast tumora u većim dozama (5 mg/kg antitela PD1_0376, 5 mg/kg nivolumaba, 5 mg/kg antitela Tim3_0438 ili 10 mg/kg bispecifičnog antitela 1+1 PD1TIM3_0476). DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije
Ukoliko nije drugačije definisano, tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što se tipično koristi u oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak. Za potrebe tumačenja ove specifikacije, sledeće definicije će se primenjivati, i kad god je to prikladno, pojmovi koji se koriste u jednini takođe će uključivati i množinu, i obrnuto.
Kako se ovde koristi, termin „antigen vezujući molekul” se u najširem smislu odnosi na molekul koji specifično vezuje antigensku determinantu. Primeri antigen vezujućih molekula su antitela, fragmenti antitela i skeletni proteini koji vezuju antigen.
Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela, uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, monospecifična i multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.
Termin „monoklonsko antitelo”, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja su sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu.
Termin „monospecifično“ antitelo, kako se ovde koristi, označava antitelo koje ima jedno ili više vezujućih mesta od kojih se svako vezuje za isti epitop istog antigena. Termin „bispecifično“ znači da je antitelo sposobno da se specifično veže za najmanje dve različite antigenske determinante, na primer, za dva mesta vezivanja od kojih je svako formirano parom varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH) i varijabilnog domena lakog lanca antitela (VL) vezanim za različite antigene ili za različite epitope na istom antigenu. Takvo bispecifično antitelo je formata 1+1. Ostali formati bispecifičnih antitela su 2+1 (koji sadrži dva mesta vezivanja za prvi antigen ili epitop i jedno mesto vezivanja za drugi antigen ili epitop), ili 2+2 format (koji sadrži dva mesta vezivanja za prvi antigen ili epitop i dva mesta vezivanja za drugi antigen ili epitop). Tipično, bispecifično antitelo sadrži dva mesta vezivanja antigena, od kojih je svako specifično za različitu antigensku determinantu.
1
Termin „valentno“, kako se koristi u okviru trenutne prijave, označava prisustvo određenog broja mesta vezivanja u antigen vezujućem molekulu. Kao takvi, termini „dvovalentni“, „četvorovalentni“ i „šestovalentni“ označavaju prisustvo dva mesta za vezivanje, četiri mesta za vezivanje, odnosno šest mesta za vezivanje u antigen vezujućem molekulu. Bispecifična antitela iz ovog pronalasku sa najmanje „dvovalentna“ i mogu biti „trovalentna“ ili „multivalentna“ (npr. „četvorovalentna“ ili „šestovalentna“). U određenom aspektu, antitela iz predmetnog pronalaska imaju dva ili više mesta vezivanja i bispecifična su. Odnosno, antitela mogu biti bispecifična čak i u slučajevima kada postoji više od dva mesta vezivanja (tj. kada je antitelo trovalentno ili multivalentno). Konkretno, pronalazak se odnosi na bispecifična dvovalentna antitela koja imaju jedno mesto vezivanja za svaki antigen za koji se specifično vezuju.
Termini „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi koji označavaju antitelo koje ima strukturusuštinski sličnu strukturi nativnog antitela. „Nativna antitela“ ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitom strukturm. Na primer, nativna antitela klase IgG su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva laka lanca i dva teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog kraja do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3), koji se takođe zovu konstantni regioni teškog lanca. Slično tome, od N- do C-terminusa, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni domen lakog lanca (CL), koji se takođe zove konstantni region lakog lanca. Teški lanac antitela se može svrstati u jedan od pet tipova, koji se zovu α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG), ili μ (IgM), od kojih se neki dalje dele u podtipove, npr. γ1 (IgG1), γ2 (IgG2), γ3 (IgG3), γ4 (IgG4), α1 (IgA1) and α2 (IgA2). Laki lanac antitela se može svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa ( κ) i lambda (�), na osnovu aminokiselinske sekvence svog konstantnog domena.
„Fragment antitela” ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab<1>, Fab’-SH, F(ab<1>)2; dijatela, trijatela, tetratela, kros-Fab fragmente; linearna antitela, jednolančane molekule antitela (npr. scFv); multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela i antitela sa jednim domenom. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson et al. Nat. Med. 9:129-
1
134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite npr. u Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore izd., Springer-Verlag, New York, str.
269-315 (1994); pogledajte takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab<1>)2 fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke epitopa za vezivanje receptora i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br. 5,869,046. Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična, pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U određenim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent br. 6,248,516 B1). Sem toga, fragmenti antitela obuhvataju jednolančane polipeptide koji imaju karakteristike VH domena, koji pre svega može da se sastavi sa VL domenom, ili VL domena, koji pre svega može da se sastavi sa VH domenom u funkcionalno antigen vezujuće mesto, i na taj način obezbedi antigen vezujuće svojstvo antitelu kompletne dužine. Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
Digestijom netaknutih antitela papainom dobijaju se dva identična antigen vezujuća fragmenta, koji se nazivaju „Fab“ fragmenti, od kojih svaki sadrži varijabilne domene teškog i lakog lanca, a takođe i konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Kako se ovde koristi, zato, termin „Fab fragment” se odnosi na fragment antitela koji obuhvata fragment lakog lanca koji sadrži VL domen i konstantni domen lakog lanca (CL), i VH domen i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po dodavanju nekoliko ostataka na karboksi terminusu CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona šarke antitela. Fab’-SH su Fab’ fragmenti, pri čemu, ostaci cisteina konstantnih domena nose slobodnu tiolnu grupu. Tretiranje pepsinom daje F(ab’)2fragment koji ima dva mesta za kombinovanje antigena (dva Fab fragmenta) i deo Fc regiona.
Termin „unakrsni Fab fragment“ ili „xFab fragment“ ili „krosover Fab fragment“ se odnosi na Fab fragment, pri čemu su ili varijabilni regioni ili konstantni regioni teškog i lakog lanca razmenjeni. Dva različita sastava lanaca krosover Fab molekula su moguća i sadržana u
1
bispecifičnim antitelima ovog pronalaska: Sa jedne strane, varijabilni regioni teškog i lakog lanca Fab su razmenjeni, tj. unakrsni molekul Fab sadrži peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona teškog lanca (CH1), i peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Ovaj krosover Fab molekul se takođe naziva CrossFab(<VLVH>). Sa druge strane, kada su konstantni regioni teškog i lakog lanca Fab razmenjeni, krosover Fab molekul sadrži peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona lakog lanca (CL), i peptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona teškog lanca (CH1). Ovaj krosover Fab molekul se takođe naziva CrossFab (<CLCH>1).
„Jednolančani fragment Fab“ ili „scFab“ je polipeptid koji se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena 1 antitela (CH1), varijabilnog domena lakog lanca antitela (VL), konstantnog domena lakog lanca antitela (CL) i linkera, pri čemu pomenuti domeni antitela i pomenuti linker imaju jedan od sledećih redosleda u smeru od N-kraja do C-kraja: a) VH-CH1-linker-VL-CL, b) VL-CL-linker-VH-CH1, c) VH-CL-linker-VL-CH1 ili d) VL-CH1-linker-VH-CL; i pri čemu je pomenuti linker polipeptid od najmanje 30 aminokiselina, poželjno između 32 i 50 aminokiselina. Navedeni jednolančani fragmenti Fab se stabilizuju prirodnom disulfidnom vezom između CL domena i CHI domena. Pored toga, ovi jednolančani molekuli Fab se mogu dalje stabilizovati stvaranjem međulančanih disulfidnih veza insercijom cisteinskih ostataka (npr. pozicija 44 u varijabilnom teškom lancu i pozicija 100 u varijabilnom lakom lancu prema Kabatovoj numeraciji).
„Krosover jednolančani fragment Fab“ ili „x-scFab“ je polipeptid koji se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena 1 antitela (CH1), varijabilnog domena lakog lanca antitela (VL), konstantnog domena lakog lanca antitela (CL) i linkera, pri čemu navedeni domeni antitela i navedeni linker imaju jedan od sledećih redosleda u smeru od N-kraja do C-kraja: a) VH-CL-linker-VL-CH1 i b) VL-CH1-linker-VH-CL; pri čemu VH i VL zajedno grade antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za antigen, i pri čemu je pomenuti linker polipeptid od najmanje 30 aminokiselina. Pored toga, ovi molekuli x-scFab se mogu dalje stabilizovati stvaranjem međulančanih disulfidnih veza insercijom cisteinskih ostataka (npr. pozicija 44 u varijabilnom teškom lancu i pozicija 100 u varijabilnom lakom lancu prema Kabatovoj numeraciji).
„Jednolančani varijabilni fragment (scFv)“ je fuzioni protein varijabilnih regiona teškog (VH) i lakog lanca (V<L>) antitela, povezan putem kratkog peptidnog linkera od deset do oko 25 aminokiselina. Linker je tipično bogat glicinom radi fleksibilnosti, kao i serinom ili
1
treoninom radi rastvorljivosti, i može povezati N-kraj Vh sa C-krajem V<L>, ili obrnuto. Ovaj protein zadržava specifičnost originalnog antitela, uprkos uklanjanju konstantnih regiona i uvođenju linkera. scFv antitela su, npr., opisana u Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96). Sem toga, fragmenti antitela obuhvataju jednolančane polipeptide koji imaju karakteristike VH domena, koji pre svega može da se sastavi sa VL domenom, ili VL domena, koji pre svega može da se sastavi sa VH domenom u funkcionalno antigen vezujuće mesto, i na taj način obezbedi antigen vezujuće svojstvo antitelu kompletne dužine.
„Skeletni proteini koji vezuju antigen“ poznati su u struci, na primer, fibronektin i dizajnirani ankirinski ponovljeni proteini (DARPin) korišćeni su kao alternativni skeleti za antigen vezujuće domene, pogledajte, npr. Gebauer i Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009) i Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008). U jednom aspektu ovog pronalaska, skeletni protein koji vezuje antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od CTLA-4 (Evibody), lipokalina (antikalin), molekula dobijenog od proteina A, kao što je Z-domen proteina A (afitela), A-domena (Avimer/maksitelo), transferina seruma (/ra//.s-body); dizajniranog ankirinskog ponovljenog proteina (DARPin), varijabilnog domena lakog lanca ili teškog lanca antitela (antitelo sa jednim domenom, sdAb),varijabilnog domena teškog lanca antitela (nanotelo, aVH), fragmenata VNAR, fibronektina (AdNektin), lektinskog domena C-tipa (tetranektin); varijabilnog domena novog antigen receptora beta-laktamaze (<FRAGMENTI>VNAR), humanog gama-kristalina ili ubikvitina (Affilin molekuli); domena Kunicovog tipa inhibitora humane proteaze, mikrotela kao što su proteini iz familije knotina, peptidnih aptamera i fibronektina (adnektin).
CTLA-4 (antigen 4 povezan sa citotoksičnim T limfocitom) je receptor familije CD28 koji se eksprimira uglavnom na CD4+ T-ćelijama. Njegov ekstracelularni domen ima savijanje Ig slično varijabilnom domenu. Petlje koje odgovaraju CDR-ima antitela se mogu supstituisati heterologom sekvencom da bi se dobila različita svojstva vezivanja. CTLA-4 molekuli dizajnirani da imaju različite specifičnosti vezivanja poznati su i pod nazivom evitela (npr. US7166697B1). Evitela su približno iste veličine kao izolovani varijabilni region antitela (npr. antitelo domena). Za dodatne detalje pogledajte Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001). Lipokalini su porodica ekstracelularnih proteina koji transportuju male hidrofobne molekule poput steroida, bilina, retinoida i lipida. Imaju čvrstu sekundarnu strukturu beta-listova sa velikim brojem petlji na otvorenom kraju konične strukture koja se može konstruisati za vezivanje na različite ciljne antigene. Antikalini su veličine između 160-180 aminokiselina, a izvedeni su iz lipokalina. Za više detalja vidite
1
Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US7250297B1 i US20070224633. Afitelo je skelet dobijen iz proteina A mikroorganizma Staphylococcus aureus koji se može dizajnirati da se vezuje za antigen. Domen se sastoji od trospiralnog snopa od oko 58 aminokiselina. Biblioteke su nastale randomizacijom površinskih ostataka. Za dodatne detalje vidite Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462 i EP 1641818A1. Avimeri su multidomenski proteini koji potiču iz porodice skeleta A domena. Nativni domeni od oko 35 aminokiselina usvajaju definisanu strukturu sa disulfidnim vezama. Raznolikost nastaje mešanjem prirodnih varijacija koje pokazuje porodica A-domena. Za dodatne detalje pogledajte Nature Biotechnology 23(12), 1556-1561 (2005) i Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (jun 2007). Transferin je monomerni transportni glikoprotein u serumu. Transferini se mogu dizajnirati za vezivanje različitih ciljnih antigena umetanjem peptidnih sekvenci u permisivnu površinsku petlju. Primeri za dizajnirane transferinske skelete uključuju transtelo. Za više detalja vidite J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999). Dizajnirani ankirinski ponovljeni proteini (DARPini) izvedeni su iz ankirina, što je porodica proteina koji posreduju u vezivanju proteina integralnih membrana za citoskelet. Jedno ponavljanje ankirina je motiv od 33 ostatka koji se sastoji od dve alfa spirale i beta okreta. Oni se mogu dizajnirati za vezivanje različitih ciljnih antigena randomizacijom ostataka u prvoj alfa spirali i beta okretu svakog ponavljanja. Njihovo vezujuće sučelje se može povećati povećanjem broja modula (metoda afinitetnog sazrevanja). Za više detalja vidite J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) i J. Mol. Biol.369, 1015-1028 (2007) i US20040132028A1.
Antitelo sa jednim domenom je fragment antitela koji se sastoji od jednog monomernog varijabilnog domena antitela. Prvi pojedinačni domeni su izvedeni iz varijabilnog domena teškog lanca antitela iz kamelida (nanotela ili VHH fragmenti). Nadalje, termin antitela sa jednim domenom uključuje autonomne fragmente humanog varijabilnog domena teškog lanca (aVH) ili VNARdobijene od morskih pasa. Fibronektin je skelet koji može da se dizajnira za vezivanje za antigen. Adnektini se sastoje od okosnice prirodnog niza aminokiselina 10. domena od 15 ponavljajućih jedinica humanog fibronektina tipa III (FN3). Tri petlje na jednom kraju .beta.-sendviča se mogu dizajnirati tako da adnektin može posebno da prepozna terapeutski cilj od interesa. Za dodatne detalje vidite Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005), US20080139791, W02005056764 i US6818418B1. Peptidni aptameri su kombinatorni molekuli za prepoznavanje koji se sastoje od proteina konstantnog skeleta, tipično tioredoksina (TrxA) koji sadrži ograničenu varijabilnu peptidnu petlju umetnutu na aktivno mesto. Za više detalja vidite Expert Opin. Biol. Ter.5, 783-797 (2005). Mikrotela su izvedena iz prirodnih mikroproteina dužine 25-50 aminokiselina koji sadrže 3-4 cisteinska
2
mosta - primeri za mikroproteine uključuju Kalata B1 i konotoksin i knotine. Mikroproteini imaju petlju koja se može dizajnirati da uključuje do 25 aminokiselina bez uticaja na ukupno savijanje mikroproteina. Za dodatne detalje o dizajniranim domenima knotina, pogledajte W02008098796.
„Antigen vezujući molekul koji se vezuje za isti epitop“ kao referentni molekul se odnosi na antigen vezujući molekul koji blokira vezivanje referentnog molekula za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentni molekul blokira vezivanje antigen vezujućeg molekula za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više.
Kako se ovde koristi, termin „antigen vezujuće mesto” se odnosi na deo deo molekula za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za antigensku determinantu. Još preciznije, termin „antigen vezujuće mesto” se odnosi na deo antitela koji sadrži oblast koja se specifično vezuje za deo antigena ili ceo antigen, i komplementaran je sa delom antigena ili celim antigenom. Kada je antigen veliki, antigen vezujući molekul može da se vezuje samo za naročiti deo antigena, a taj deo se naziva epitop. Antigen vezujuće mesto se može dobiti, na primer, pomoću jednog ili više varijabilnih domena (takođe se zovu varijabilni regioni). Poželjno, antigen vezujuće mesto sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH). U jednom aspektu, antigen vezujuće mesto se može vezati za svoj antigen i blokirati ili delimično blokirati njegovu funkciju. Antigen vezujuća mesta koja se specifično vezuju za PD1 ili TIM-3 uključuju antitela i fragmente od toga kako je ovde dalje definisano. Pored toga, antigen vezujuća mesta mogu da uključuju skeletne proteine koji vezuju antigen, npr. vezujuće domene koji su na bazi projektovanih ponovljenih proteina ili projektovanih ponovljenih domena (vidite npr. WO 2002/020565).
Kako se ovde koristi, termin „antigenska determinanta” je sinonim za „antigen” i „epitop”, i odnosi se na mesto (npr. susedni deo aminokiselina ili konformaciona konfiguracija sastavljena od različitih regiona nesusednih aminokiselina) na polipeptidnom makromolekulu za koji se vezuje antigen vezujući deo, formirajući antigen vezujući kompleks ostatak-antigen. Korisne antigenske determinante mogu se naći, na primer, na površinama tumorskih ćelija, na površinama ćelija inficiranih virusom, na površinama drugih obolelih ćelija, na površini imunih ćelija, slobodne u serumu u krvi i/ili u ekstracelularnoj matrici (ECM). Proteini koji su korisni kao antigeni mogu biti svi nativni oblici proteina koji potiču od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naznačeno. U konkretnom otelotvorenju, antigen je humani protein. Kada se ovde pominje specifični protein, termin obuhvata neprerađen protein "pune dužine", kao i bilo koji oblik proteina koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante proteina, npr. splajsovane ili alelne varijante.
Pod „specifičnim vezivanjem” podrazumeva se da je vezivanje selektivno za antigen, i može se razlikovati od neželjenih ili nespecifičnih interakcija. Sposobnost antigen vezujućeg molekula da se vezuje za specifični antigen može se meriti bilo putem testa sa enzimski vezanim imunosorbentom (ELISA) ili putem drugih tehnika poznatih stručnim licima, npr. tehnikom površinske plazmonske rezonance (SPR) (analizirana na instrumentu BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), i tradicionalnim testovima vezivanja (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). U jednom otelotvorenju, stepen vezivanja antigen vezujućeg molekula na nevezani protein je manji od oko 10% vezivanja antigen vezujućeg molekula za antigen kao što je mereno, npr. putem SPR. U određenim otelotvorenjima, molekul koje se vezuje za antigen ima konstantu disocijacije (Kd) < 1 μM, <100 nM, <10 nM, < 1 nM, <0,1 nM, < 0,01 nM, ili < 0,001 nM (npr. 10<-7>M ili manje, npr. od 10<-7>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).
„Afinitet” ili „afinitet vezivanja” odnosi se na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja” se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može se generalno predstaviti preko konstante disocijacije (Kd), koja predstavlja odnos konstante brzine disocijacije i konstante brzine asocijacije (koff, odnosno kon). Tako ekvivalentni afiniteti mogu da uključe različite konstante brzine, dokle god odnos konstanti brzine ostaje isti. Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Poseban postupak za merenje afiniteta je površinska plazmonska rezonanca (SPR).
Kako se ovde koristi, termin „veliki afinitet“ antitela se odnosi na antitelo koje ima Kd od 1CT<9>M ili manje, i još preciznije 10<-10>M ili manje, za ciljni antigen. Termin „mali afinitet“ antitela se odnosi na antitelo koje ima Kd od 10<-8>ili više.
Termin „afinitetno zrelo” antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.
Termini „bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3“, „bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za PD1 i TIM-3“, „bispecifični antigen vezujući molekul specifičan za PD1 i TIM-3” se ovde koriste naizmenično, i odnose se na bispecifično antitelo koje je sposobno da veže PD1 i TIM-3 sa dovoljnim afinitetom da antitelo bude korisno kao dijagnostičko i/ili terapeutsko sredstvo u ciljanju PD1 i TIM-3.
Termin „PD1“, je takođe poznat kao programirani protein ćelijske smrti 1, je membranski protein tipa 1 od 288 aminokiselina koji je prvi put opisan 1992. godine (Ishida et al., EMBO J., 11 (1992), 3887-3895). PD-1 je član proširene familije CD28/CTLA-4 regulatora T ćelija i ima dva liganda, PD-L1 (B7-H1, CD274) i PD-L2 (B7-DC, CD273). Struktura proteina uključuje ekstracelularni domen IgV praćen transmembranskim regionom i intracelularnim repom. Intracelularni rep sadrži dva mesta fosforilacije koja se nalaze u inhibitornom motivu na osnovu imunoreceptora tirozina i imunoreceptorski motiv prekidača na bazi tirozina, što sugeriše da PD-1 negativno reguliše TCR signale. Ovo je u skladu sa vezivanjem fosfataza SHP-1 i SHP-2 za citoplazmatski rep PD-1 nakon vezivanja liganda. Iako PD-1 nije eksprimiran na naivnim T ćelijama, on je pojačano regulisan prateći aktivaciju posredovanu receptorima T ćelija (TCR) i primećen je i na aktiviranim i iscrpljenim T ćelijama (Agata et al., Int. Immunology 8 (1996), 765-772). Ove iscrpljene T-ćelije imaju disfunkcionalni fenotip i nisu u stanju da pravilno reaguju. Iako PD-1 ima relativno širok obrazac ekspresije, njegova najvažnija uloga je verovatno koinhibitorni receptor na T ćelijama (Chinai et al, Trends in Pharmacological Sciences 36 (2015), 587-595). Trenutni terapeutski pristupi se stoga fokusiraju na blokiranje interakcije PD-1 sa njegovim ligandima kako bi se povećavao odgovor T ćelija. Termini „programirana smrt 1“, „programirana ćelijska smrt 1“, „protein PD-1“, „PD-1“, PD1, „PDCD1“, „hPD-1“ i „hPD-1“ se mogu koristiti naizmenično, i uključuju varijante, izooblike, homologe vrsta humanog PD-1 i analoge koji imaju najmanje jedan zajednički epitop s PD-1. Aminokiselinska sekvenca humanog PD1 je prikazana u UniProt-u (www.uniprot.org) pristupni br. Q15116 (SEQ ID NO:89).
Termini „anti-PD1 antitelo” i „antitelo koje sadrži antigen vezujuće mesto koje se vezuje za PD1” odnose se na antitelo koje je sposobno da vezuje PD1, posebno na PD1 polipeptid eksprimiran na ćelijskoj površini, sa dovoljnim afinitetom da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje PD1. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja anti-PD1 antitela za nepovezani protein koji nije PD1 je manji od oko 10% od vezivanja antitela za PD1 kao što je izmereno, npr. radioimunološkim testom (RIA) ili protočnom citometrijom (FACS) ili analizom površinske plazmonske rezonance korišćenjem biosenzornog sistema kao što je Biacore® sistem. U određenim otelotvorenjima, antigen-
2
vezujući protein koji se vezuje za humani PD1 ima KD vrednost afiniteta vezivanja za vezivanje za humani PD1 od < 1 μM, <100 nM, <10 nM, < 1 nM, <0,1 nM, < 0,01 nM, ili < 0,001 nM (npr. 10-8 M ili manje, npr. od 10-8 M do 10-13 M, npr., od 10-9 M do 10-13 M). U jednom poželjnom otelotvorenju, odgovarajuća KD vrednost afiniteta vezivanja je određena u testu površinske plazmonske rezonance korišćenjem ekstracelularnog domena (ECD) humanog PD1 (PD1-ECD) za afinitet vezivanja PD1. Termin „anti-PD1 antitelo“ takođe podrazumeva bispecifična antitela koja su sposobna da vežu PD1 i drugi antigen.
Termin „TIM3”, je skraćenica za „molekul 3 koji sadrži domen imunoglobina i mucina T ćelije ”, poznat i kao TIM-3, HAVCR2, KIM-3, TIMD3 i FLJ14428, i odnosi se na T pomoćnu ćeliju tipa 1-specifični proteini na ćelijskoj površini koji regulišu aktivaciju makrofaga i težinu upalnih stanja. TIM3 je takođe povezan sa kancerom, posebno sa matičnim ćelijama kancera. Nukleotidne i proteinske sekvence TIM3 su poznate za mnoge vrste. Na primer, sekvenca humanih aminokiselina se može naći pod pristupnim brojem Uniprot Q8TDQ0 (ID. BR. SEKV.:93). Ljudski protein karakteriše vanćelijski domen koji sadrži Ig sličan domen i domen mucina (koji dalje sadrže O-vezana i N-vezana mesta glikozilacije) koji sadrže približno aminokiseline 22-202, transmembranski domen (aminokiseline 203-223), i intracelularni (citoplazmatski) domen (aminokiseline 224-301). Za humani protein TIM3 prikazan kao SEQ ID NO: 93, ekstracelularni domen sadrži približno aminokiseline 22-202, transmembranski domen sadrži približno aminokiseline 203-223, a citoplazmatski domen sadrži približno aminokiseline 224-301. Termin „TIM3“ uključuje varijante, izooblike, homologe vrsta humanog TIM3 i analoge koji imaju najmanje jedan zajednički epitop sa TIM3.
Termini „anti-TIM3 antitelo” i „antitelo koje sadrži antigen vezujuće mesto koje se vezuje za TIM3” odnose se na antitelo koje je sposobno da vezuje TIM3, posebno na TIM3 polipeptid eksprimiran na ćelijskoj površini, sa dovoljnim afinitetom da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje TIM3. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja anti-TIM3 antitela za nepovezani protein koji nije TIM3 je manji od oko 10% od vezivanja antitela za TIM3 kao što je izmereno, npr. radioimunološkim testom (RIA) ili protočnom citometrijom (FACS) ili analizom površinske plazmonske rezonance korišćenjem biosenzornog sistema kao što je Biacore® sistem. U određenim otelotvorenjima, antigenvezujući protein koji se vezuje za humani TIM3 ima KD vrednost afiniteta vezivanja za vezivanje za humani TIM3 od < 1 μM, <100 nM, <10 nM, < 1 nM, <0,1 nM, < 0,01 nM, ili < 0,001 nM (npr. 10-8 M ili manje, npr. od 10-7 M do 10-13 M, npr., od 10-9 M do 10-13 M).
U jednom poželjnom otelotvorenju, odgovarajuća KD vrednost afiniteta vezivanja je određena u testu površinske plazmonske rezonance korišćenjem ekstracelularnog domena (ECD) humanog TIM3 (TIM3-ECD) za afinitet vezivanja TIM3. Termin „anti-TIM3 antitelo“ takođe podrazumeva bispecifična antitela koja su sposobna da vežu TIM3 i drugi antigen.
„Blokirajuće“ antitelo ili „antagonističko“ antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena za koji se vezuje. U nekim otelotvorenjima, blokirajuća antitela ili antagonistička antitela značajno ili u potpunosti inhibiraju biološku aktivnost antigena. Na primer, bispecifična antitela iz pronalaska blokiraju signalizaciju putem PD-1 i TIM-3 tako da obnavljaju funkcionalni odgovor T ćelija (npr. proliferaciju, proizvodnju citokina, ubijanje ciljnih ćelija) od nefunkcionalnog stanja do stimulacije antigenom.
Termin „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela koji je uključen u vezivanje antigen vezujućeg molekula za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela tipično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). Vidite, npr. Kindt et al., Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman and Co., str.91 (2007). Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti.
Termin „hipervarijabilni region” ili „HVR”, kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“). Generalno, nativna četvorolančana antitela sadrže šest regiona HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). Regioni HVR uglavnom sadrže aminokiselinske ostatke iz hipervarijabilnih petlji i/ili iz "regiona koji određuju komplementarnost" (CDR), gde ovi poslednji imaju najveću varijabilnost sekvence i/ili su uključeni u prepoznavanje antigena. Primeri za hipervarijabilne petlje dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3). (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Primeri za CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3) dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 24-34 na L1, 50-56 na L2, 89-97 na L3, 31-35B na H1, 50-65 na H2 i 95-102 na H3. (Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Hipervarijabilni regioni (HVR) se takođe pominju kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), i ti termini se podjednako odnose na delove varijabilnog regiona koji formiraju antigen vezujuće regione. Ovaj region opisali su Kabat et al., U.S. Dept, of Health and Human Services,
2
"Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) i Chothia et al., J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987), gde se ove definicije odnose na preklapanje ili podskupove aminokiselinskih ostataka kad se porede jedne sa drugima. I pored toga, namera je da primena bilo koje od ove dve definicije koje ukazuju na CDR antitela ili njihove varijante bude obuhvaćena terminom na način kako se on ovde definiše i koristi. Odgovarajući aminokiselinski ostaci koji obuhvataju CDR kao što je definisano u svakoj od gore citiranih referenci prikazani su dole u Tabeli A radi poređenja. Tačni brojevi ostataka koji sadrže konkretni CDR će varirati u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Stručna lica iz ove oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci sadrže konkretni CDR kada je data aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona datog antitela.
2
TABELA A. Definicije CDR<1>
<1>Numeracija svih definicija CDR-a u Tabeli A je u skladu sa konvencijama o numeraciji koje su izradili Kabat et al. (vidite dole).
<2>„AbM“ sa malim slovom „b“, kao što je korišćeno u Tabeli A, odnosi se na CDR-ove kao što je definisano pomoću softvera za modelovanje „AbM“ antitela centra Oxford Molecular.
Kabat et al. su takođe definisali sistem numeracije sekvenci varijabilnih regiona koji je primenljiv na bilo koje antitelo. Lice standardne stručnosti iz ove oblasti može nedvosmisleno da primeni ovaj sistem „Kabatove numeracije” na svaku sekvencu varijabilnog regiona, ne oslanjajući se ni na kakve eksperimentalne podatke osim na same sekvence. U smislu ovog dokumenta, „Kabatova numeracija” se odnosi na sistem numeracije koji su postavili Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, „Sequence of Proteins of Immunological Interest” (1983). Ako nije drugačije naglašeno, reference na numeraciju specifičnih položaja aminokiselinskih ostataka u varijabilnom regionu antitela su prema Kabatovom sistemu numeracije.
Sa izuzetkom CDR1 u VH, CDR generalno sadrže aminokiselinske ostatke koji formiraju hipervarijabilne petlje. CDR takođe sadrže „ostatke koji određuju specifičnost”, ili „SDR”, koji su ostaci koji stupaju u kontakt sa antigenom. SDR se nalaze u okviru regiona CDR koje se nazivaju skraćeni CDR, ili a-CDR. Primeri a-CDR regiona (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 i a-CDR-H3) dešavaju se na aminokiselinskim ostacima 31-34 kod L1, 50-55 kod L2, 89-96 kod L3, 31-35B kod H1, 50-58 kod H2 i 95-102 kod H3. (Pogledajte Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su nabrojani prema radu Kabat et al.
„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR
2
domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
„Okvir humanog akceptora” je za ovde navedene svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano u nastavku. Humani akceptorski okvir „dobijen od” humanog imunoglobulinskog okvira ili humanog okvira konsenzusa može da sadrži istu aminokiselinsku sekvencu kao i ova dva okvira, ili može da sadrži izmene u aminokiselinskoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima, broj aminokiselinskih izmena je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, VL humani akceptorski okvir je po sekvenci identičan sekvenci VL humanog imunoglobulinskog okvira ili humanog okvira konsenzusa.
Termin „himerno” antitelo ukazuje na antitelo u kome je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.
„Klasa” antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina se nazivaju α, δ, ε, γ i μ.
„Humanizovano“ antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od ne-humanih HVR-ova i aminokiselinske ostatke od humanih FR-ova. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR-ovi (npr. CDR), odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR-ovi, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik” antitela, npr. nehumanog antitela, odnosi se na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju. Drugi oblici "humanizovanih antitela" obuhvaćenih ovim pronalaskom su oni u kojima je konstantni region dodatno modifikovan ili promenjen u odnosu na onaj od originalnog antitela, da bi se generisale karakteristike u skladu sa pronalaskom, posebno u vezi sa vezivanjem C1q i/ili vezivanjem Fc receptora (FcR).
„Humano“ antitelo je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara
2
aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija ili ono dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla.
Termin „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja su sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Stoga reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao da podrazumeva zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na metodu hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke u kojima se koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
Termin „Fc domen“ ili „Fc region“ ovde se koristi da definiše C-terminalni region teškog lanca antitela koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. Posebno, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, na C-terminalnom kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. Aminokiselinske sekvence teških lanaca su uvek predstavljene sa C-terminalnim lizinom, međutim, u pronalazak su uključene varijante bez C-terminalnog lizina.
IgG Fc region sadrži IgG CH2 i IgG CH3 domen. „CH2 domen” Fc regiona humanog IgG tipično se proteže od aminokiselinskog ostatka približno na položaju 231 do aminokiselinskog ostatka približno na položaju 340. U jednom otelotvorenju, lanac ugljenih hidrata je povezan sa CH2 domenom. Ovde CH2 domen može biti CH2 domen nativne sekvence ili varijanta CH2 domena. „CH3 domen” obuhvata delove ostatka C-terminala u domenu CH2 u Fc regionu (tj. iz aminokiselinskog ostatka približno na položaju 341 na aminokiselinski ostatak približno na položaju 447 IgG). CH3 region ovde može biti CH3
2
domen nativne sekvence ili varijanta CH3 domena (npr. CH3 domen sa uvedenom „izbočinom“ („dugme“) u jednom lancu i odgovarajućom uvedenom „šupljinom“ („rupica“) u drugom lancu; vidi US patent br. 5,821,333). Ovakve varijante CH3 domena se mogu koristiti za promovisanje heterodimerizacije dva neidentična teška lanca antitela, kao što je ovde opisano. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numeracija ostataka aminokiselina u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se takođe zove EU indeks, kao što je opisano u Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sekvence proteina od interesa za imunologiju), 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Tehnologija „dugme u rupici“ opisana je npr. u US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Po pravilu, ova metoda podrazumeva uvođenje izbočine ("dugme") na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine (“rupice”) na interfejsu drugog polipetida, tako da se izbočina može uklopiti u šupljinu da bi se podstaklo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Izbočine su napravljene zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Odgovarajuće šupljine, iste ili slične veličine kao izbočine, stvaraju se na interfejsu drugog polipeptida, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjim (npr. alaninom ili treoninom). Izbočina i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za lokaciju, ili sintezom peptida. U jednom specifičnom aspektu modifikacija dugmeta sadrži aminokiselinsku supstituciju T366W u jednom od dve podjedinice Fc domena, a modifikacija rupice sadrži aminokiselinske supstitucije T366S, L368A i Y407V u drugoj od dve podjedinice Fc domena. U još jednom specifičnom otelotvorenju, podjedinica Fc domena koja sadrži modifikaciju dugmeta dodatno sadrži aminokiselinsku supstituciju S354C, a podjedinica Fc domena koja sadrži modifikaciju rupice, dodatno sadrži aminokiselinsku supstituciju Y349C. Uvođenje ova dva ostatka cisteina dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc regiona, što dodatno stabilizuje dimer (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).
"Region ekvivalentan Fc regionu imunoglobulina" nameravano uključuje prirodno postojeće alelne varijante Fc regiona imunoglobulina, kao i varijante koje imaju izmene koje izazivaju supstitucije, adicije ili uklanjanja, ali koje značajno ne smanjuju sposobnost imunoglobulina da posreduje u efektorskim funkcijama (kao što je ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela). Na primer, jedna ili više aminokiselina se može ukloniti sa N-kraja ili C-kraja Fc regiona imunoglobulina bez značajnog gubitka biološke funkcije. Takve varijante se mogu odabrati prema opštim pravilima poznatim u struci, tako da imaju minimalan efekat na aktivnost (vidi, npr., Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)).
Termin „efektorske funkcije“ ukazuje na one biološke aktivnosti koje mogu da se pripišu Fc regionu antitela, koji varira sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: Vezivanje C1q i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC), vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), sekreciju citokina, preuzimanje antigena posredstvom imunskog kompleksa od strane antigen prezentujućih ćelija, smanjenje regulacije površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.
„Aktivirajući Fc receptor” je Fc receptor koji nakon angažovanja Fc regiona antitela izaziva signalizirajuće događaje koji stimulišu receptorsku ćeliju da obavlja efektorske funkcije. Aktivirajući Fc receptori uključuju Fc γRIIIa (CD16a), Fc γRI (CD64), Fc γRIIa (CD32), i Fc αRI (CD89). Određeni aktivirajući Fc receptor je humani Fc γRIIIa (pogledati UniProt pristupni br. P08637, verzija 141).
Termin „peptidni linker” se odnosi na peptid koji sadrži jednu ili više aminokiselina, tipično oko 2 do 20 aminokiselina. Peptidni linkeri su poznati u struci ili su ovde opisani. Odgovarajući neimunogeni peptidni linkeri su, na primer, (G4S)n, (SG4)nili G4(SG4)npeptidni linkeri, pri čemu je „n“ generalno broj od 1 do 10, tipično od 2 do 4, naročito 2.
Termin „spojen“ ili „povezan“ podrazumeva da su komponente (npr. antigen vezujuće mesto i FC domen) povezane peptidnim vezama, bilo direktno ili preko jednog ili više peptidnih linkera.
Termin „aminokiselina“, kako se koristi u okviru ove primene, označava grupu prirodno prisutnih karboksi α-aminokiselina koje sadrže alanin (troslovni kod: ala, jednoslovni kod: A), arginin (arg, R), asparagin (asn, N), asparaginsku kiselinu (asp, D), cistein (cys, C), glutamin (gln, Q), glutaminsku kiselinu (glu, E), glicin (gly, G), histidin (his, H), izoleucin (ile, I), leucin (leu, L), lizin (lys, K), metionin (met, M), fenilalanin (phe, F), prolin (pro, P) serin (ser, S), treonin (thr, T), triptofan (trp, W), tirozin (tyr, Y) i valin (val, V).
„Procenat (%) identičnosti sekvence aminokiselina” u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida (proteina) definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve
1
konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN. Softver SAWI ili Megalign (DNASTAR). Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali. U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.
U određenim aspektima, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci bispecifičnih antitela iz pronalaska koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva bispecifičnih antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci bispecifičnih antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih
2
modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira molekule, ili putem sinteze peptida.
Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanje, i/ili umetanje, i/ili supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija uklanjanja, ubacivanja i supstitucije može se napraviti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen vezujuće karakteristike. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i okvire (FR-ove). Konzervativne supstitucije su date u Tabeli B pod naslovom „Poželjne supstitucije”, i dalje su opisane u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina (1) do (6). Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u željeni molekul i proizvodi ispitani na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.
TABELA B
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca:
(1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
Termin „varijante sekvenci aminokiselina“ uključuje značajne varijante gde postoje supstitucije aminokiselina u jednom ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antigen vezujućeg molekula (npr. humanizovano ili humano antitelo). Generalno, nastale varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matični antigen vezujući molekul i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antigen vezujućeg molekula. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan HVR ostatak ili više HVR ostataka je mutirano, i varijante antigen vezujućih molekula su izložene na fagu i ispitane u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja). U pojedinim otelotvorenjima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se mogu desiti u jednom ili više HVR regiona, dokle god takve izmene u značajnoj meri ne umanjuju sposobnost antigen vezujućeg molekula da vezuje antigen. Na primer, u HVR regionima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje znatno ne umanjuju afinitet vezivanja. Korisni postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu zove se „ciljana mutageneza sa alaninom”, a opisan je u radu Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao Arg, Asp, His, Lys i Glu) se identifikuju i zamene neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen–antigen vezujući molekul služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se
4
mogu pregledati da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci obuhvataju spajanje amino- i/ili karboksiterminalnog kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i ubacivanje u sekvencu jednog aminokiselinskog ostatka, ili većeg broja. Primeri za terminalna umetanja uključuju bispecifična antitela sa N-terminalnim metionil ostatkom. Ostale varijante umetanja molekula uključuju fuziju sa N- ili C-krajem u polipeptid, što povećava poluživot u serumu bispecifičnog antitela.
U određenim aspektima, bispecifična antitela iz ovog dokumenta su izmenjena da bi se povećao ili smanjio stepen do kog je antitelo glikozilovano. Varijante glikozilacije molekula se mogu pogodno dobiti izmenom aminokiselinske sekvence, tako da jedno ili više mesta glikozilacije nastane ili se ukloni, npr. ugljeni hidrati vezani za Fc domen mogu biti izmenjeni. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Videti npr. Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc na „bazi” biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, modifikacije oligosaharida u bispecifičnim antitelima iz predmetnog pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante sa određenim poboljšanim svojstvima. U jednom aspektu, date su varijante bispecifičnih antitela koje imaju strukturu ugljenog hidrata kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Takve varijante fukozilacije mogu poboljšati funkciju ADCC, vidi npr. US patentne publikacije br. US 2003/0157108 (Presta, L.) ili US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Dalje varijante bispecifičnih antitela iz pronalaska uključuju one sa bisektovanim oligosaharidima, npr., kod kojih je biantenarni oligosaharid povezan sa Fc regionom bisektovan pomoću GlcNAc. Takve varijante mogu imati smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu funkciju ADCC, videti, na primer, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US patent br. 6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al). Takođe su obezbeđene varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela bi mogle da poboljšaju funkciju CDC, i opisane su, npr. u WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
U određenim aspektima može biti poželjno stvoriti varijante dizajnirane sa cisteinom bispecifičnih antitela iz pronalaska, npr., „tioMAb“, u kojima su jedan ili više ostataka molekula supstituisani ostacima cisteina. U određenim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na molekulu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolne grupe se postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci leka ili funkcionalni ostaci linker-lek, da bi se dobio imunokonjugat. U određenim otelotvorenjima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antigen vezujući molekuli projektovani sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u U.S. Patentu br.7,521,541.
U pojedinim aspektima, ovde data bispecifična antitela se mogu dalje modifikovati da sadrže dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i koji su dostupni. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri za hidrosolubilne polimere uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, kopolimere polipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat bispecifičnog antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
U drugom aspektu, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom otelotvorenju, neproteinski ostatak je ugljenična nanocevčica (Ram, N.W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Radijacija može biti na bilo kojoj talasnoj dužini, i uključuje, ali nije ograničena na talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski ostatak na temperaturu na kojoj ćelije u blizini neproteinskog ostatka antitela bivaju ubijene.
„Imunokonjugat” je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterologih molekula, uključujući, bez ograničenja, citotoksični agens.
Termin „polinukleotid” odnosi se na izolovani molekul ili konstrukt nukleinske kiseline, npr. informacionu RNK (mRNK), viralno dobijenu RNK ili plazmidnu DNK (pDNK). Polinukleotid može sadržati konvencionalnu vezu fosfodiestra ili nekonvencionalnu vezu (npr. amidnu vezu, kao što je pronađeno u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK). Termin „molekul nukleinske kiseline” odnosi se na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr. fragmente DNK ili RNK, prisutne u polinukleotidu.
Pod „izolovanim” molekulom nukleinske kiseline ili polinukleotidom podrazumeva se molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svog izvornog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid sadržan u vektoru smatra se izolovanim u svrhe predmetnog pronalaska. Dalji primeri za izolovani polinukleotid uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterologim ćelijama domaćina ili prečišćene (delimično ili suštinski) polinukleotide u rastvoru. Izolovani polinukleotid uključuje molekul polinukleotida koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul polinukleotida, ali je molekul polinukleotida prisutan ekstrahromozomski ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro transkripte RNK, iz predmetnog pronalaska, kao i pozitivne i negativne lančane oblike, i dvolančane oblike. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku dalje uključuju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu da budu ili mogu da uključuju regulatorni element kao što je promoter, mesto vezivanja ribozoma ili terminator transkripcije.
Za nukleinsku kiselinu ili polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu, na primer, najmanje 95% „identičnu” referentnoj nukleotidnoj sekvenci iz predmetnog pronalaska, predviđeno je da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci, osim što polinukleotidna sekvenca može uključivati do pet tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid sa nukleotidnom sekvencom najmanje 95% identičnom referentnoj sekvenci nukleotida, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti uklonjeno ili supstituisano drugim nukleotidom, ili broj nukleotida do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može biti ubačen u referentnu sekvencu. Te izmene referentne sekvence mogu se desiti na 5' ili 3' terminalnim mestima referentne sekvence nukleotida ili bilo gde između tih terminalnih mesta, pojedinačno razbacane između ostataka u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa u referentnoj sekvenci. U praktičnom smislu, pomoću poznatih kompjuterskih programa (npr. ALIGN-2), kao što su oni gorenavedeni za polipeptide, može na konvencionalan način odrediti da li je neka konkretna polinukleotidna sekvenca najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična nukleotidnoj sekvenci iz predmetnog pronalaska.
Termin „ekspresiona kaseta” se odnosi na polinukleotid generisan rekombinantno ili sintetički, sa nizom specifičnih elemenata nukleinske kiseline koji omogućavaju transkripciju određene nukleinske kiseline u ciljnu ćeliju. Rekombinantna ekspresiona kaseta može se inkorporirati u plazmid, hromozom, mitohondrijsku DNK, plastidnu DNK, virus ili fragment nukleinske kiseline. Tipično, deo rekombinantne ekspresione kasete ekspresionog vektora sadrži, između ostalih sekvenci, sekvencu nukleinske kiseline koja se transkribuje i promoter. U određenim otelotvorenjima, ekspresiona kaseta prema pronalasku sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule iz ovog pronalaska ili njihove fragmente.
Termin „vektor” ili „ekspresioni vektor” je sinonim za „ekspresioni konstrukt” i odnosi se na molekul DNK koji se koristi za uvođenje i usmeravanje ekspresije specifičnog gena za koji je operativno povezan u ciljanu ćeliju. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Ekspresioni vektor iz predmetnog pronalaska sadrži ekspresionu kasetu. Ekspresioni vektori omogućavaju transkripciju velikih količina stabilne mRNK. Kada se ekspresioni vektor nađe unutar ciljne ćelije, molekul ribonukleinske kiseline ili protein koji je kodiran tim genom proizvodi se pomoću mehanizma ćelijske transkripcije i/ili translacije. U jednom otelotvorenju, ekspresioni vektor iz pronalaska sadrži ekspresionu kasetu koja sadrži polinukleotidne sekvence koje kodiraju bispecifične antigen vezujuće molekule iz pronalaska ili njihove fragmente.
Termini „ćelija domaćin”, „linija ćelije domaćina” i „kultura ćelija domaćina” koriste se naizmenično, i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, u koje spadaju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji. Ćelija domaćin je bilo koja vrsta ćelijskog sistema koji se može koristiti za dobijanje bispecifičnih antigen vezujućih molekula iz ovog pronalaska. Konkretno, ćelija domaćina je prokariotska ili eukariotska ćelija domaćin. Ćelije domaćini uključuju uzgajane ćelije, npr. uzgajane ćelije sisara, takve su CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mišjeg mijeloma, PER ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, ćelije kvasaca, ćelije insekata i biljne ćelije, da navedemo samo nekoliko, ali i ćelije koje se nalaze u transgenoj životinji, transgenoj biljci ili uzgajenom biljnom ili životinjskom tkivu.
„Efikasna količina” agensa se odnosi na količinu koja je neophodna da bi se dovelo do fiziološke promene u ćeliji ili tkivu na koji se primenjuje.
„Terapeutski efikasna količina” agensa, npr. farmaceutskog preparata, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Terapeutski efikasna količina agensa, na primer, eliminiše, smanjuje, odlaže, minimizuje ili sprečava štetne efekte bolesti.
„Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i primate koji nisu ljudi, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). Konkretno, pojedinac ili ispitanik je čovek.
Termin „farmaceutska kompozicija” odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
„Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens” odnosi se na sastojak farmaceutskog preparata koji nije aktivni sastojak i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens uključuje, ali nije ograničen na pufer, stabilizator ili konzervans.
Termin „uputstvo za upotrebu” koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.
Kako se ovde koristi, „lečenje” (i njegovi izvedeni oblici, kao što je „lečiti”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, a može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje stope napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U određenim otelotvorenjima, molekuli predmetnog pronalaska se primenjuju da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
Termin „kancer“, kao što se ovde koristi, odnosi se na proliferativne bolesti, uključujući limfome, limfocitne leukemije, kancer pluća, nemikrocelularni karcinom pluća (NSCL), bronhioalveolarni ćelijski kancer pluća, kancer kostiju, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kutani ili intraokularni melanom, kancer uterusa, kancer ovarijuma, rektalni kancer, kancer analnog regiona, kancer želuca, gastrični kancer, kancer kolona, kancer dojke, kancer uterusa, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom cerviksa, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodžkinovu bolest, kancer ezofagusa, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, kancer prostate, kancer bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, mezoteliom, hepatocelularni kancer, kancer žučnih puteva, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), tumore kičmenog stuba, gliom moždanog stabla, glioblastom multiforme, astrocitome, švanome, ependimone, meduloblastome, meningiome, karcinome skvamoznih ćelija, adenom hipofize i Juingov sarkom, uključujući refraktorne verzije svih gorenavedenih kancera, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih kancera.
Bispecifična antitela iz pronalaska
Pronalazak obezbeđuje nova bispecifična antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3, sa posebno povoljnim svojstvima kao što su produktivnost, stabilnost, afinitet vezivanja, biološka aktivnost, specifična ciljanja određenih T ćelija, ciljanje efikasnosti i smanjene toksičnosti. Konkretno, to su bispecifična antitela, pri čemu se bispecifično antitelo vezuje za PD1 sa velikim afinitetom i za TIM3 sa malim afinitetom.
A. Primeri za bispecifična antitela koja se vezuju za PD1 i TIM-3
U jednom aspektu, otkriće obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu
navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži VH domen koji sadrži
(i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37,
(ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38, i
(iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39; i
VL domen koji sadrži
(i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40;
(ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41, i
(iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; i
navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži
4
(a) VH domen koji sadrži
(i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1,
(ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, i
(iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3, i
VL domen koji sadrži
(i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO ili SEQ ID NO:11 ili SEQ ID NO:12,
(ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, i
(iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6; ili
(b) VH domen koji sadrži
(i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17,
(ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18, i
(iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i
VL domen koji sadrži
(i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20,
(ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21, i
(iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; ili
(c) VH domen koji sadrži
(i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:29,
(ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:30, i
(iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:31; i
VL domen koji sadrži
(i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:32,
(ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:33, i
(iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID. BR. SEKV.:34.
U određenom aspektu, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu
navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži VH domen koji sadrži
(i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37,
(ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38, i
(iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39; i
VL domen koji sadrži
(i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40;
(ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41, i
(iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; i
navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži VH domen koji sadrži
(i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1,
(ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, i
(iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; i
VL domen koji sadrži
(i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12,
(ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, i
(iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6.
U još jednom određenom aspektu, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu
navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži VH domen koji sadrži
(i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37,
(ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38, i
(iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39; i
VL domen koji sadrži
(i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40;
(ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41, i
(iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; i
navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži VH domen koji sadrži
(i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17,
(ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18, i
(iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i
VL domen koji sadrži
(i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20,
(ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21, i
(iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22.
U daljem aspektu, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu
navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, ili
(b) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, ili
(c) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, ili
(d) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48, ili
(e) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49,
i navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, ili
(b) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10, ili
(c) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, ili
(d) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16, ili
(e) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24, ili
(f) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, ili
(g) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, ili
(h) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 35 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 36.
U daljem aspektu, bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 je humano, humanizovano ili himerno antitelo. Konkretno, to je humanizovano antitelo.
4
U jednom aspektu, obezbeđeno je humanizovano bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu
navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, ili
(b) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, ili
(c) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48, ili
(d) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49,
i navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, ili
(b) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16, ili
(c) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, ili
(d) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28.
U određenom aspektu, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu
navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46,
i navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16 ili VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
Posebno, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu
navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži VH domen koji sadrži
(i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:37,
(ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:38, i
(iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:39; i
VL domen koji sadrži
(i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:40;
(ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:41, i
(iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:42; i
navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži VH domen koji sadrži
(i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:17,
(ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:18, i
(iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i
VL domen koji sadrži
(i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20,
(ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21, i
(iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22.
Preciznije, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 i SEQ ID NO:49, i navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
Konkretnije, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, i navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
U daljem aspektu, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen
4
vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48 i SEQ ID NO:49, i navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 je dvovalentno. To znači da bispecifično antitelo sadrži jedno antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i jedno antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 (format 1+1).
U drugom aspektu, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu se bispecifično antitelo vezuje za TIM3 sa malim afinitetom i za PD1 sa velikim afinitetom. U određenom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu se bispecifično antitelo vezuje za TIM3 sa najmanje 50 puta manjim afinitetom vezivanja u poređenju sa vezivanjem za PD1, preciznije sa najmanje 50 puta manjim afinitetom vezivanja u poređenju sa vezivanjem za PD1. U jednom poželjnom otelotvorenju, afinitet vezivanja (KD) se određuje analizom površinske plazmonske rezonance (kao što je opisano, npr., u primeru 12).
U jednom aspektu, tako je obezbeđeno bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu
navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sa velikim afinitetom sadrži
(a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, ili
(b) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, ili
(c) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji
4
sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, ili
(d) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48, ili
(d) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49,
i navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sa malim afinitetom sadrži
(a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24, ili
(c) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, ili
(d) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28.
U specifičnom aspektu, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sa velikim afinitetom sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, i navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sa malim afinitetom sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
U drugom aspektu, otkriće se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu bispecifično antitelo sadrži Fc domen, prvi Fab fragment koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugi Fab fragment koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3.
Konkretno, Fc domen je domen IgG, preciznije Fc domen IgG1 ili Fc domen IgG4. U drugom aspektu, otkriveno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, koje sadrži
(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 50, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 52,
4
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 51, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO:53, ili
(b) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 54, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 56,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 55, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO:57, ili
(c) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 58, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 60,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 59, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO:61, ili
(d) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 62, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 64,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 63, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO:65, ili
(e) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 66, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 68,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 67, i drugi laki lanac koji sadrži
4
aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO:69.
U određenom aspektu, otkriveno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, koje sadrži
(a) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 52,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 51, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:53, ili
(b) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 54, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 56,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 55, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:57, ili
(c) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 60,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:61, ili
(d) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65, ili
(e) prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 66, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68,
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 67, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69.
Preciznije, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, koje sadrži prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65.
U još jednom određenom aspektu, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku
4
sekvencu ID. BR. SEKV.: 66, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 68, drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 67, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:69.
U drugom aspektu, bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 je četvorovalentno. U jednom aspektu, bispecifično antitelo sadrži dva antigen vezujuća mesta koja se specifično vezuju za PD1 i dva antigen vezujuća mesta koja se specifično vezuju za TIM3 (format 2+2).
U jednom aspektu, bispecifično antitelo iz pronalaska sadrži
(a) dva laka lanca i dva teška lanca antitela koji sadrže dva Fab fragmenta koji sadrže antigen vezujuća mesta koja se specifično vezuju za TIM3, i
(b) dva dodatna Fab fragmenta koji sadrže antigen vezujuća mesta koja se specifično vezuju za PD1, pri čemu su navedeni dodatni Fab fragmeati povezani preko peptidnog linkera sa C-terminusom teških lanaca pod (a).
U konkretnom aspektu, peptidni linker je (G4S)4. U drugom aspektu, dva dodatna Fab fragmenta koji sadrže antigen vezujuća mesta koja se specifično vezuju za PD1 su ukršteni Fab fragmenti pri čemu su varijabilni domeni VL i VH zamenjeni jedan drugim, i lanci VL-CH su povezani preko peptidnog linkera sa C-terminusom teških lanaca pod (a).
U konkretnom aspektu, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, koje sadrži
(a) dva teška lanca, od kojih svaki sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 70, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 71, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:72, ili
(b) dva teška lanca, od kojih svaki sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 73, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 74, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:75, ili
(c) dva teška lanca, od kojih svaki sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 76, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 77, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:78.
Modifikacije Fc domena koje smanjuju vezivanje Fc receptora i/ili efektorsku funkciju
U određenim aspektima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region antitela iz ovog dokumenta, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. humani Fc region IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više mesta aminokiselina.
Sledeći odeljak opisuje poželjne aspekte bispecifičnih molekula koji vezuju antigen i sadrže modifikacije Fc domena koje smanjuju vezivanje Fc receptora i/ili efektorsku funkciju. U jednom aspektu, otkriće se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu Fc domen sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju vezivanje za Fc receptor, posebno za Fc γ receptor. Konkretno, Fc domen je potklase humanog IgG1 sa aminokiselinskim mutacijama L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Fc domen daje bispecifičnim antitelima iz pronalaska povoljne farmakokinetičke osobine, uključujući i dug poluživot u serumu, koji doprinosi dobroj akumulaciji u ciljnom tkivu i povoljnom odnosu distribucije tkivo-krv. Istovremeno, to može dovesti do nepoželjnog ciljanja bispecifičnih antitela iz pronalaska na ćelije koje eksprimiraju Fc receptore, a ne na željene ćelije koje nose antigene. Shodno tome, u konkretnim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnih antitela pokazuje smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG, posebno FC domenom IgG1 ili Fc domenom IgG4. Konkretnije, Fc domen je FC domen IgG1.
U jednom takvom aspektu, Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul iz pronalaska koji sadrži pomenuti Fc domen) pokazuje manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor, u poređenju sa nativnim Fc domenom IgG1 (ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom iz pronalaska koji sadrži nativni Fc domen) IgG1, i/ili manje od 50%, poželjno manje od 20%, poželjnije manje od 10%, a najpoželjnije manje od 5% efektorske funkcije, u poređenju sa nativnim Fc domenom IgG1 (ili bispecifičnim antigen vezujućim molekulom iz pronalaska koji sadrži Fc domen nativnog IgG1). U jednom aspektu, Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul iz pronalaska koji sadrži pomenuti Fc domen) se ne vezuje značajno za Fc receptor i/ili ne indukuje efektorsku funkciju. U određenom aspektu, Fc receptor je Fc γ receptor. U jednom aspektu, Fc receptor je humani Fc receptor. U jednom aspektu, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U konkretnom aspektu, Fc receptor je aktivirajući humani Fc γ receptor, konkretnije humani Fc γRIIIa, Fc γRI ili Fc γRIIa, najkonkretnije humani
1
Fc γRIIIa. U jednom aspektu, Fc receptor je inhibitorni Fc receptor. U specifičnom aspektu, Fc receptor je inhibitorni humani Fc γ receptor, konkretnije humani Fc γRIIB. U jednom aspektu, efektorska funkcija je jedna ili više od CDC, ADCC, ADCP i sekrecije citokina. U konkretnom aspektu, efektorska funkcija je ADCC. U jednom aspektu, domen Fc domena pokazuje suštinski sličan afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) u poređenju sa Fc domenom nativnog IgG1. Suštinski slično vezivanje za FcRn se postiže kada Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul iz pronalaska koji sadrži navedeni Fc domen) pokazuje afinitet vezivanja za FcRn veći od oko 70%, konkretno veći od oko 80%, konkretnije veći od oko 90% Fc domena nativnog IgG1 (ili bispecifičnog antigen vezujućeg molekula iz pronalaska koji sadrži Fc domen nativnog IgG1).
U konkretnom aspektu, Fc domen je konstruisan tako da ima smanjeni afinitet vezivanja za Fc receptor i/ili redukovanu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. U konkretnom aspektu, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula iz pronalaska sadrži jednu ili više aminokiselinskih mutacija koje smanjuju afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor i/ili efektorsku funkciju. Najčešće su jedna ili više aminokiselinskih mutacija prisutne u svakoj od dve podjedinice Fc domena. U jednom aspektu, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor. U drugom aspektu, aminokiselinska mutacija smanjuje afinitet vezivanja Fc domena za Fc receptor najmanje 2 puta, najmanje 5 puta ili najmanje 10 puta. U jednom aspektu, bispecifični antigen vezujući molekul iz pronalaska koji sadrži konstruisani Fc domen pokazuje manje od 20%, naročito manje od 10%, posebno manje od 5% afiniteta vezivanja za Fc receptor u poređenju sa bispecifičnim antitelima iz pronalaska koja sadrže nekonstruisani Fc domen. U konkretnom aspektu, Fc receptor je Fc γ receptor. U drugim aspektima, Fc receptor je humani Fc receptor. U jednom aspektu, Fc receptor je inhibitorni Fc receptor. U specifičnom aspektu, Fc receptor je inhibitorni humani Fc γ receptor, konkretnije humani Fc γRIIB. U nekim aspektima, Fc receptor je aktivirajući Fc receptor. U konkretnom aspektu, Fc receptor je aktivirajući humani Fc γ receptor, konkretnije humani Fc γRIIIa, Fc γRI ili Fc γRIIa, najkonkretnije humani Fc γRIIIa. Poželjno je da vezivanje za svaki od ovih receptora bude smanjeno. U nekim aspektima, afinitet vezivanja za komponentu komplementa, posebno afinitet vezivanja za C1q, takođe je smanjen. U jednom aspektu, afinitet vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) nije smanjen. Suštinski slično vezivanje za FcRn, tj. očuvanje afiniteta vezivanja Fc domena za navedeni receptor, postiže se kada Fc domen (ili bispecifični antigen vezujući molekul iz pronalaska sadrži pomenuti Fc domen) ima više od
2
oko 70% afiniteta vezivanja za FcRn nekonstruisanog oblika Fc domena (ili bispecifični antigen vezujući molekul iz pronalaska sadrži pomenuti nekonstruisani oblik Fc domena). Fc domen, ili bispecifični antigen vezujući molekul iz pronalaska koji sadrži navedeni Fc domen, može pokazivati više od oko 80%, a čak i više od oko 90% takvog afiniteta. U određenim otelotvorenjima, Fc domen bispecifičnog antigen vezujućeg molekula iz pronalaska je konstruisan tako da ima smanjenu efektorsku funkciju, u poređenju sa nekonstruisanim Fc domenom. Smanjena efektorska funkcija može da obuhvata, ali nije ograničena na, jedno ili više od sledećeg: smanjenu komplement zavisnu citotoksičnost (CDC), smanjenu ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), smanjenu ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP), smanjenu sekreciju citokina, smanjeno preuzimanje antigena posredstvom imunskog kompleksa od strane antigen-prezentujućih ćelija, smanjeno vezivanje za NK ćelije, smanjeno vezivanje za makrofage, smanjeno vezivanje za monocite, smanjeno vezivanje za polimorfonuklearne ćelije, smanjenu direktnu signalizaciju koja indukuje apoptozu, smanjenu zrelost dendritskih ćelija, ili smanjen prajming T ćelija.
Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br.
6,737,056). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581). Opisane su određene varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcRs (npr. U.S. Patent br.
6,737,056; WO 2004/056312, i Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem.276 (2001) 6591-6604).
U jednom aspektu, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji E233, L234, L235, N297, P331 i P329. U nekim aspektima, Fc domen sadrži aminokiselinske supstitucije L234A i L235A (“LALA”). U jednom takvom aspektu, Fc domen je Fc domen IgG1, konkretno Fc domen humanog IgG1. U jednom aspektu, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji P329. U još konkretnijem aspektu, aminokiselinska supstitucija je P329A ili P329G, konkretno P329G. U jednom otelotvorenju, Fc domen sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji P329 i drugu aminokiselinsku supstituciju odabranu iz grupe koju čine E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S. U konkretnijim otelotvorenjima, Fc domen obuhvata aminokiselinske mutacije L234A, L235A i P329G (“P329G LALA”). „P329G LALA“ kombinacija aminokiselinskih supstitucija skoro potpuno ukida vezivanje Fc γ receptora za Fc domen humanog IgG1, kako je opisano u PCT patentnoj prijavi br. WO 2012/130831 A1. Navedeni dokument takođe opisuje postupke za pripremu takvih mutiranih Fc domena i postupke za određivanje njegovih svojstava, kao što je vezivanje za Fc receptor ili efektorske funkcije. Takvo antitelo je IgG1 s mutacijama L234A i L235A ili sa mutacijama L234A, L235A i P329G (numeracija prema EU indeksu Kabata i sar, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
U jednom aspektu, bispecifično antitelo sadrži (svi položaji su prema Kabatovom EU indeksu) (i) homodimerni Fc-region potklase humanog IgG1 opciono sa mutacijama P329G, L234A i L235A, ili (ii) homodimerni Fc-region potklase humanog IgG4 opciono sa mutacijama P329G, S228P i L235E, ili (iii) homodimerni Fc-region potklase humanog IgG1 opciono sa mutacijama P329G, L234A, L235A, 1253A, H310A i H435A, ili opciono sa mutacijama P329G, L234A, L235A, H310A, H433A i Y436A, ili (iv) heterodimerni Fcregion u kojem jedan polipeptid Fc-regiona sadrži mutaciju T366W, a drugi polipeptid Fcregiona sadrži mutacije T366S, L368A i Y407 ili gde jedan polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366W i Y349C, a drugi polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366S, L368A, Y407V i S354C, ili gde jedan polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366W i S354C, a drugi polipeptid Fc regiona sadrži mutacije T366S, L368A, Y407V i Y349C, ili (v) heterodimerni Fc-region potklase humanog IgG1, pri čemu oba polipeptida Fc-regiona sadrže mutacije P329G, L234A i L235A, a jedan polipeptid Fc-regiona sadrži mutaciju T366W a drugi polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366S, L368A i Y407V, ili gde jedan polipeptid Fcregiona sadrži mutacije T366W i Y349C, a drugi polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366S, L368A, Y407V i S354C, ili pri čemu jedan polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366W i S354C, a drugi polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366S, L368A, Y407V i Y349C.
U jednom aspektu, Fc domen je Fc domen IgG4. U konkretnijem otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4 koji sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji S228 (Kabatova numeracija), konkretno aminokiselinsku supstituciju S228P. U još konkretnijem otelotvorenju, Fc domen je Fc domen IgG4 koji sadrži aminokiselinske supstitucije L235E i S228P i P329G. Ova aminokiselinska supstitucija smanjuje in vivo razmenu Fab kraka IgG4 antitela (vidi Stubenrauch et al., Drug Metabolism i Disposition 38, 84-91 (2010)). Zato je u jednom aspektu obezbeđeno bispecifično antitelo, koje sadrži (svi položaji su prema Kabatovom EU indeksu) heterodimerni Fc-region potklase humanog IgG4, pri čemu polipeptidi oba Fc-regiona sadrže mutacije P329G, S228P i L235E, i jedan polipeptid Fcregiona sadrži mutaciju T366W, a drugi polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366S, L368A
4
i Y407V, ili gde jedan polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366W i Y349C, a drugi polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366S, L368A, Y407V i S354C, ili gde jedan polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366W i S354C, a drugi polipeptid Fc-regiona sadrži mutacije T366S, L368A, Y407V i Y349C.
Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG-ova majke na fetus (Guyer, R.L. et al. J. Immunol. 117 (1976) 587-593, i Kim, J.K. et al. J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), opisana su u US 2005/0014934. Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br. 7,371,826). Vidi i Duncan, A.R. i Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; i WO 94/29351 za druge primere varijanti Fc-regiona.
Vezivanje za Fc receptore se može lako odrediti npr. testom ELISA ili površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) upotrebom standardnih instrumentata kao što je BIAcore instrument (GE Healthcare), a takvi Fc receptori se mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom. Ovde je opisan takav pogodan vezujući test. Alternativno, afinitet vezivanja Fc domena ili bispecifičnih antigen vezujućih molekula koji aktiviraju ćelije koji sadrže Fc domen za Fc receptore može se proceniti pomoću ćelijskih linija za koje je poznato da eksprimiraju određene Fc receptore, kao što su humane NK ćelije koje eksprimiraju Fc γIIIa receptor. Efektorska funkcija Fc domena, ili bispecifičnih antitela iz pronalaska koja sadrže Fc domen, može se izmeriti postupcima poznatim u struci. Ovde je opisan pogodan test za merenje ADCC. Drugi primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. Patentu br. 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) i Hellstrom et al, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); US Patent br. 5,821,337; Bruggemann et al, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Alternativno, mogu se koristiti neradioaktivni postupci analiza (videti, npr. ACTI ™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI)). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula se može odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je objavljeno u Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).
Modifikacije Fc domena koje podstiču heterodimerizaciju
Bispecifični antigen vezujući molekuli obuhvataju različita antigen vezujuća mesta, spojena sa jednom ili drugom od dve podjedinice Fc domena, stoga dve podjedinice Fc domena mogu biti sadržane u dva neidentična polipeptidna lanca. Rekombinantna koekspresija ovih polipeptida i naknadna dimerizacija dovode do nekoliko mogućih kombinacija dva polipeptida. Da bi se poboljšali prinos i čistoća bispecifičnih antitela iz pronalaska u rekombinantnoj proizvodnji, biće stoga korisno uvesti u Fc domen bispecifičnih antigen vezujućih molekula modifikaciju koja podstiče povezivanje željenih polipeptida.
Shodno tome, u određenim aspektima, otkriće se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše povezanost prve i druge podjedinice Fc domena. Mesto najveće proteinskoproteinske interakcije između dve podjedinice Fc domena humanog IgG nalazi se u CH3 domenu Fc domena. Stoga, u jednom aspektu pomenuta modifikacija se nalazi u CH3 domenu Fc domena.
U konkretnom aspektu, pomenuta modifikacija je takozvana modifikacija „dugme u rupici“, koja sadrži modifikaciju „dugmeta“ u jednoj od dve podjedinice Fc domena i modifikaciju „rupice“ u drugoj od dve podjedinice Fc domena. Stoga, otkriće se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu prva podjedinica Fc domena sadrži dugmad a druga podjedinica Fc domena sadrži rupice prema metodi dugme u rupici. U određenom aspektu, prva podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije S354C i T366W (EU numeracija), a druga podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S i Y407V (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Tehnologija „dugme u rupici“ opisana je npr. u US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) i Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). Po pravilu, ova metoda podrazumeva uvođenje izbočine ("dugme") na interfejsu prvog polipeptida i odgovarajuće šupljine (“rupice”) na interfejsu drugog polipetida, tako da se izbočina može uklopiti u šupljinu da bi se podstaklo formiranje heterodimera i sprečilo nastajanje homodimera. Izbočine su napravljene zamenom malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog polipeptida većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Odgovarajuće šupljine, iste ili slične veličine kao izbočine, stvaraju se na interfejsu drugog polipeptida, zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina manjim (npr. alaninom ili treoninom).
Shodno tome, u jednom aspektu, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena bispecifičnih antigen vezujućih molekula, aminokiselinski ostatak se zamenjuje aminokiselinskim ostatkom koji ima veći volumen bočnog lanca, čime se stvara izbočina u CH3 domenu prve podjedinice koja može da se uklopi u šupljinu u CH3 domenu druge podjedinice, a u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena aminokiselinski ostatak se zamenjuje aminokiselinskim ostatkom koji ima manji volumen bočnog lanca, čime se stvara šupljina u CH3 domenu druge podjedinice u koju može da se uklopi izbočina u CH3 domenu prve podjedinice. Izbočina i šupljina se mogu napraviti izmenom nukleinske kiseline koja kodira polipeptide, npr. mutagenezom specifičnom za lokaciju, ili sintezom peptida. U specifičnom aspektu, u CH3 domenu prve podjedinice Fc domena, treoninski ostatak na poziciji 366 zamenjen je triptofanskim ostatkom (T366W), i u CH3 domenu druge podjedinice Fc domena, tirozinski ostatak na poziciji 407 zamenjen je valinskim ostatkom (Y407V). U jednom aspektu, u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je treoninski ostatak na poziciji 366 zamenjen serinskim ostatkom (T366S) i leucinski ostatak na poziciji 368 je zamenjen alaninskim ostatkom (L368A).
U još jednom aspektu, u prvoj podjedinici Fc domena, dodatno je serinski ostatak na poziciji 354 zamenjen cisteinskim ostatkom (S354C), a u drugoj podjedinici Fc domena, dodatno je tirozinski ostatak na poziciji 349 zamenjen cisteinskim ostatkom (Y349C). Uvođenje ova dva ostatka cisteina dovodi do stvaranja disulfidnog mosta između dve podjedinice Fc domena, što dodatno stabilizuje dimer (Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15). U određenom aspektu, prva podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije S354C i T366W (EU numeracija), a druga podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S i Y407V (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Takođe, alternativno ili dodatno se mogu koristiti i druge tehnologije „dugme u rupici“ kao što su opisane u EP 1870 459. U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo sadrži mutacije R409D i K370E u CH3 domenu „lanca sa dugmetom“ i mutacije D399K i E357K u CH3 domenu „lanca sa rupicom“ (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, bispecifično antitelo sadrži mutaciju T366W u CH3 domenu „lanca sa dugmetom“ i mutacije T366S, L368A i Y407V u CH3 domenu „lanca sa rupicom“ i dodatno mutacije R409D i K370E u CH3 domenu „lanca sa dugmetom“ i mutacije D399K i E357K u CH3 domenu „lanca sa rupicom“ (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, bispecifično antitelo sadrži mutacije Y349C i T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C, T366S, L368A i Y407V u drugom od dva CH3 domena, ili multispecifično antitelo sadrži mutacije Y349C i T366W u jednom od dva CH3 domena i mutacije S354C, T366S, L368A i Y407V u drugom od dva CH3 domena i dodatno mutacije R409D i K370E u CH3 domenu „lanca sa dugmetom“ i mutacije D399K i E357K u CH3 domenu „lanca sa rupicom“ (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U alternativnom aspektu, modifikacija koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena sadrži modifikaciju koja posreduje u elektrostatičkim efektima upravljanja, na primer, kao što je opisano u publikaciji PCT WO 2009/089004. Po pravilu, ovaj postupak podrazumeva zamenu jednog ili više aminokiselinskih ostataka na interfejsu dve podjedinice Fc domena naelektrisanim aminokiselinskim ostacima, tako da formiranje homodimera postaje elektrostatički nepovoljno, a heterodimerizacija elektrostatički povoljna.
Osim tehnologije „dugme u rupici“, druge tehnike za modifikovanje CH3 domena teških lanaca multispecifičnih antitela radi sprovođenja heterodimerizacije su poznate u struci. Te tehnologije, posebno one opisane u WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954 i WO 2013/096291 se ovde razmatraju kao alternative tehnologiji „dugme u rupici“ u kombinaciji sa bispecifičnim antitelom.
U jednom aspektu, u bispecifičnom antitelu pristup opisan u EP 1870459 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. Ovaj pristup se zasniva na uvođenju naelektrisanih aminokiselina sa suprotnim naelektrisanjima na specifičnim aminokiselinskim pozicijama u međupovršini CH3/CH3 domena između oba, prvog i drugog teškog lanca.
Shodno tome, u ovom aspektu, u tercijarnoj strukturi multispecifičnog antitela CH3 domen prvog teškog lanca i CH3 domen drugog teškog lanca formiraju međupovršinu koja je locirana između odgovarajućih CH3 domena antitela, pri čemu odgovarajuće aminokiselinske sekvence CH3 domena prvog teškog lanca i aminokiselinske sekvence CH3 domena drugog teškog lanca obuhvataju skup aminokiselina koje su locirane u navedenoj međupovršini u tercijarnoj strukturi antitela, pri čemu iz skupa aminokiselina koje su locirane u međupovršini CH3 domena jednog teškog lanca, prva aminokiselina je supstituisana pozitivno naelektrisanom aminokiselinom, i iz skupa aminokiselina koje su locirane u međupovršini CH3 domena drugog teškog lanca, druga aminokiselina je supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom. Bispecifično antitelo prema ovom aspektu se ovde takođe naziva „CH3(+/-)-konstruisano bispecifično antitelo“ (pri čemu skraćenica „+/-“ označava suprotno naelektrisane aminokiseline koje su uvedene u odgovarajuće CH3 domene).
U jednom aspektu, u CH3 (+/-)-konstruisanom bispecifičnom antitelu, pozitivno naelektrisana aminokiselina je odabrana od K, R i H, a negativno naelektrisana aminokiselina je odabrana od E ili D.
U jednom aspektu, u CH3 (+/-)-konstruisanom bispecifičnom antitelu, pozitivno naelektrisana aminokiselina je odabrana od K i R, a negativno naelektrisana aminokiselina je odabrana od E ili D.
U jednom aspektu, u CH3 (+/-)-konstruisanom bispecifičnom antitelu, pozitivno naelektrisana aminokiselina je K, a negativno naelektrisana aminokiselina je E.
U jednom aspektu, u CH3 (+/-)-konstruisanom bispecifičnom antitelu, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina R na poziciji 409 je supstituisana sa D, i aminokiselina K na poziciji je supstituisana sa E, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina D na poziciji 399 je supstituisana sa K, i aminokiselina E na poziciji 357 je supstituisana sa K (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, pristup opisan u WO 2013/157953 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. U jednom otelotvorenju, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa K, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U drugom otelotvorenju, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa R i aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa R, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U drugom aspektu, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa R i aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa R, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Dodatno, najmanje jedna od sledećih supstitucija je sadržana u CH3 domenu drugog teškog lanca: aminokiselina Y na poziciji 349 je supstituisana sa E, aminokiselina Y na poziciji 349 je supstituisana sa D i aminokiselina L na poziciji 368 je supstituisana sa E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom otelotvorenju, aminokiselina L na poziciji 368 je supstituisana sa E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, pristup opisan u WO 2012/058768 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. U jednom aspektu, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa Y i aminokiselina Y na poziciji 407 je supstituisana sa A, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa A i aminokiselina K na poziciji 409 je supstituisana sa F (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U drugom otelotvorenju, kao dodatak prethodno navedenim supstitucijama, u CH3 domenu drugog teškog lanca najmanje jedna od aminokiselina na pozicijama 411 (originalno T), 399 (originalno D), 400 (originalno S), 405 (originalno F), 390 (originalno N) i 392 (originalno K) je supstituisana (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). Poželjne supstitucije su:
- supstitucija aminokiseline T na poziciji 411 aminokiselinom izabranom od N, R, Q, K, D, E i W (numeracija prema Kabatovom EU indeksu),
- supstitucija aminokiseline D na poziciji 399 aminokiselinom izabranom od R, W, Y i K (numeracija prema Kabatovom EU indeksu),
- supstitucija aminokiseline S na poziciji 400 aminokiselinom izabranom od E, D, R i K (numeracija prema Kabatovom EU indeksu),
- supstitucija aminokiseline F na poziciji 405 aminokiselinom izabranom od I, M, T, S, V i W (numeracija prema Kabatovom EU indeksu);
- supstitucija aminokiseline N na poziciji 390 aminokiselinom izabranom od R, K i D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu); i
- supstitucija aminokiseline K na poziciji 392 aminokiselinom izabranom od V, M, R, L, F i E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U drugom aspektu, bispecifično antitelo je konstruisano prema WO 2012/058768), tj. u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina L na poziciji 351 je supstituisana sa Y i aminokiselina Y na poziciji 407 je supstituisana sa A, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa V i aminokiselina K na poziciji 409 je supstituisana sa F (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U drugom otelotvorenju multispecifičnog antitela, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina Y na poziciji 407 je supstituisana sa A, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa A i aminokiselina K na poziciji 409 je supstituisana sa F (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U poslednjem prethodno pomenutom otelotvorenju, u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina K na poziciji 392 je supstituisana sa E, aminokiselina T na poziciji 411 je supstituisana sa E, aminokiselina D na poziciji 399 je supstituisana sa R i aminokiselina S na poziciji 400 je supstituisana sa R (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, pristup opisan u WO 2011/143545 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. U jednom aspektu, modifikacije aminokiselina u CH3 domenima oba teška lanca su uvedene na pozicijama 368 i/ili 409 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, pristup opisan u WO 2011/090762 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca bispecifičnog antitela. WO 2011/090762 se odnosi na modifikacije aminokiselina u skladu sa tehnologijom „dugme u rupici“ (KiH). U jednom otelotvorenju, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa W, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina Y na poziciji 407 je supstituisana sa A (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U drugom otelotvorenju, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina T na poziciji 366 je supstituisana sa Y, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina Y na poziciji 407 je supstituisana sa T (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, pristup opisan u WO 2009/089004 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca bispecifičnog antitela. U jednom otelotvorenju, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina K ili N na poziciji 392 je supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom (u jednom otelotvorenju sa E ili D, u jednom poželjnom otelotvorenju sa D), i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina D na poziciji 399, aminokiselina E ili D na poziciji 356 ili aminokiselina E na poziciji 357 je supstituisana pozitivno naelektrisanom aminokiselinom (u jednom otelotvorenju K ili R, u jednom poželjnom otelotvorenju sa K, u jednom poželjnom otelotvorenju, aminokiseline na pozicijama 399 ili 356 su supstituisane sa K) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom daljem otelotvorenju, pored prethodno pomenutih supstitucija, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina K ili R na poziciji 409 je supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom (u jednom otelotvorenju sa E ili D, u jednom poželjnom otelotvorenju sa D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U još daljem aspektu, pored prethodno pomenutih supstitucija ili alternativno njima, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina K na poziciji 439 i/ili aminokiselina K na poziciji 370 je nezavisno jedna od druge supstituisana negativno naelektrisanom aminokiselinom (u jednom otelotvorenju sa E ili D, u jednom poželjnom otelotvorenju sa D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, pristup opisan u WO 2007/147901 se koristi kao podrška heterodimerizaciji prvog teškog lanca i drugog teškog lanca multispecifičnog antitela. U jednom otelotvorenju, u CH3 domenu jednog teškog lanca aminokiselina K na poziciji 253 je
1
supstituisana sa E, aminokiselina D na poziciji 282 je supstituisana sa K i aminokiselina K na poziciji 322 je supstituisana sa D, i u CH3 domenu drugog teškog lanca aminokiselina D na poziciji 239 je supstituisana sa K, aminokiselina E na poziciji 240 je supstituisana sa K i aminokiselina K na poziciji 292 je supstituisana sa D (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
C-terminus teškog lanca bispecifičnog antitela kako je ovde objavljeno može biti kompletni C-terminus koji se završava aminokiselinskim ostacima PGK. C-terminus teškog lanca može biti skraćeni C-terminus u kojem su uklonjeni jedan ili dva ostatka C-terminalnih aminokiselina. U jednom poželjnom aspektu, C-terminus teškog lanca je skraćeni C-terminus koji se završava sa PG.
U jednom aspektu svih aspekata, kako je ovde objavljeno, bispecifično antitelo koje sadrži teški lanac uključujući C-terminalni CH3 domen, kako je ovde navedeno, sadrži C-terminalni dipeptid glicin-lizin (G446 i K447, numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U jednom otelotvorenju svih aspekata, kako je ovde objavljeno, bispecifično antitelo koje sadrži teški lanac uključujući C-terminalni CH3 domen, kako je ovde navedeno, sadrži C-terminalni ostatak glicina (G446, numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
Izmene u domenima Fab
U jednom aspektu, otkriće se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvi Fab fragment koji se specifično vezuje za PD1 i drugi Fab fragment koji se specifično vezuje za TIM3, pri čemu, u jednom od Fab fragmenata varijabilni domeni VH i VL ili konstantni domeni CH1 i CL su razmenjeni. Bispecifična antitela su pripremljena prema tehnologiji Crossmab.
Multispecifična antitela sa zamenom/razmenom domena u jednom vezujućem kraku (CrossMabVH-VL ili CrossMabCH-CL) detaljno su opisana u WO2009/080252 i Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191. Ona jasno smanjuju nastajanje sporednih proizvoda uzrokovano neslaganjem između lakog lanca prema prvom antigenu sa pogrešnim teškim lancem prema drugom antigenu (u poređenju sa pristupima bez takve razmene domena).
U određenom aspektu, otkriće se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvi Fab fragment koji se specifično vezuje za PD1 i drugi Fab fragment koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu, u jednom od Fab fragmenata varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim, tako da je VH domen deo lakog lanca, a VL domen je deo teškog lanca. U određenom aspektu, bispecifično antitelo je jedno, pri čemu, u prvom Fab fragmentu koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1, varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim.
2
U drugom aspektu, i da bi se dalje poboljšalo tačno uparivanje, bispecifično antitelo koje sadrži prvi Fab fragment koji se specifično vezuje za PD1 i drugi Fab fragment koji se specifično vezuje za TIM3, može da sadržti supstitucije različito naelektrisanim aminokiselinama (takozvani „naelektrisani ostaci“). Ove modifikacije se uvode u ukrštene ili neukrštene CH1 i CL domene.
U određenom aspektu, otkriće se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvi Fab fragment koji se specifično vezuje za PD1 i drugi Fab fragment koji se specifično vezuje za TIM3, pri čemu u jednom od Fab fragmenata u konstantnom domenu CL aminokiselina na poziciji 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), a u konstantnom domenu CH1 aminokiseline na pozicijama 147 i 213 su nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu). U određenom aspektu, bispecifično antitelo je jedno, pri čemu je u drugom Fab fragmentu koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 konstantni domen CL aminokiselina na položaju 124 nezavisno supstituisana lizinom (R), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), a u konstantnom domenu CH1 aminokiseline na položajima 147 i 213 su nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabat EU indeks).
U određenom aspektu, otkriće se odnosi na bispecifično antitelo koje sadrži prvi Fab fragment koji se specifično vezuje za PD1 i drugi Fab fragment koji se specifično vezuje za TIM3, pri čemu u jednom od CL domena aminokiselina na položaju 123 (EU numeracija) je zamenjena argininom (R) i aminokiselina na položaju 124 (EU numeracija) je supstituisana lizinom (R), i pri čemu, u jednom od CH1 domena aminokiseline na položaju 147 (EU numeracija) i na položaju 213 (EU numeracija) su zamenjene glutaminskom kiselinom (E). U određenom aspektu, bispecifično antitelo je jedno, pri čemu, u drugom Fab fragmentukoji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 aminokiselina na položaju 123 (EU numeracija) zamenena je argininom (R) i aminokiselina na položaju 124 (EU numeracija) supstituisana je lizinom (R), i pri čemu, u jednom od CH1 domena aminokiseline na položaju 147 (EU numeracija) i na položaju 213 (EU numeracija) zamenjene su glutaminskom kiselinom (E).
U daljem aspektu, bispecifično antitelo je dvovalentno antitelo koje sadrži
a) prvi laki lanac i prvi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za prvi antigen, i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu zamenjeni jedan drugim.
Antitelo pod a) ne sadrži modifikaciju kako je objavljeno pod b), i teški lanac i laki lanac pod a) su izolovani lanci.
U antitelu pod b), u lakom lancu varijabilni domen lakog lanca VL je zamenjen varijabilnim domenom teškog lanca VH navedenog antitela, i u teškom lancu varijabilni domen teškog lanca VH je zamenjen varijabilnim domenom lakog lanca VL navedenog antitela.
U jednom aspektu, (i) u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a), aminokiselina na poziciji 124 (numeracija prema Kabatu) supstituisana je pozitivno naelektrisanom aminokiselinom, i pri čemu, u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) aminokiselina na poziciji 147 ili aminokiselina na poziciji 213 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) supstituisana je negativno naelektrisanom aminokiselinom, ili (ii) u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b) aminokiselina na poziciji 124 (numeracija prema Kabatu) supstituisana je pozitivno naelektrisanom aminokiselinom, i pri čemu u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca pod b) aminokiselina na poziciji 147 ili aminokiselina na poziciji 213 (numeracija prema Kabatovom EU indeksu) zamenjena je negativno naelektrisanom aminokiselinom.
U drugom aspektu, (i) u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a), aminokiselina na poziciji 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom otelotvorenju nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), i pri čemu, u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) aminokiselina na poziciji 147 ili aminokiselina na poziciji 213 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), ili (ii) u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b), aminokiselina na poziciji 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu) (u jednom poželjnom otelotvorenju nezavisno lizinom (K) ili argininom (R)), i pri čemu, u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca pod b), aminokiselina na poziciji 147 ili aminokiselina na poziciji 213 je nezavisno supstituisana glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, u konstantnom domenu CL drugog teškog lanca, aminokiseline na poziciji 124 i 123 su supstituisane sa K (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, u konstantnom domenu CL drugog teškog lanca, aminokiselina na poziciji 123 je supstituisana sa R i aminokiselina na poziciji 124 je supstituisana sa K
4
(numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, u konstantnom domenu CH1 drugog lakog lanca, aminokiseline na poziciji 147 i 213 su supstituisane sa E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca, aminokiseline na poziciji 124 i 123 su supstituisane sa K, i u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca, aminokiseline na poziciji 147 i 213 su supstituisane sa E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca, aminokiselina na poziciji 123 je supstituisana sa R, i aminokiselina na poziciji 124 je supstituisana sa K, i u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca, aminokiseline na poziciji 147 i 213 su obe supstituisane sa E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, u konstantnom domenu CL drugog teškog lanca, aminokiseline na poziciji 124 i 123 su supstituisane sa K, i pri čemu, u konstantnom domenu CH1 drugog lakog lanca, aminokiseline na poziciji 147 i 213 su supstituisane sa E, i u varijabilnom domenu VL prvog lakog lanca, aminokiselina na poziciji 38 je supstituisana sa K, u varijabilnom domenu VH prvog teškog lanca, aminokiselina na poziciji 39 je supstituisana sa E, u varijabilnom domenu VL drugog teškog lanca, aminokiselina na poziciji 38 je supstituisana sa K, i u varijabilnom domenu VH drugog lakog lanca, aminokiselina na poziciji 39 je supstituisana sa E (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).
U jednom aspektu, bispecifično antitelo je dvovalentno antitelo koje sadrži a) prvi laki lanac i prvi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za prvi antigen, i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu, varijabilni domeni VL i VH drugog lakog lanca i drugog teškog lanca su zamenjeni jedan drugim, i pri čemu, konstantni domeni CL i CH1 drugog lakog lanca i drugog teškog lanca su zamenjeni jedan drugim.
Antitelo pod a) ne sadrži modifikaciju kako je objavljeno pod b), i teški lanac i laki lanac pod a) su izolovani lanci. U antitelu pod b) u lakom lancu varijabilni domen lakog lanca VL je zamenjen varijabilnim domenom teškog lanca VH navedenog antitela, i konstantni domen lakog lanca CL je zamenjen konstantnim domenom teškog lanca CH1 navedenog antitela; i u teškom lancu varijabilni domen teškog lanca VH je zamenjen varijabilnim domenom lakog lanca VL navedenog antitela, i konstantni domen teškog lanca CH1 je zamenjen konstantnim domenom lakog lanca CL navedenog antitela.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo je dvovalentno antitelo koje sadrži a) prvi laki lanac i prvi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za prvi antigen, i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac antitela koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu su konstantni domeni CL i CH1 drugog lakog lanca i drugog teškog lanca zamenjeni jedan drugim.
Antitelo pod a) ne sadrži modifikaciju kako je objavljeno pod b), i teški lanac i laki lanac pod a) su izolovani lanci. U antitelu pod b) u lakom lancu konstantni domen lakog lanca CL je zamenjen konstantnim domenom teškog lanca CH1 navedenog antitela, i u teškom lancu konstantni domen teškog lanca CH1 je zamenjen konstantnim domenom lakog lanca CL navedenog antitela.
U jednom aspektu, multispecifično antitelo je multispecifično antitelo koje sadrži a) antitelo kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen i sastoji se od dva teška lanca antitela i dva laka lanca antitela, i
b) jedan, dva, tri ili četiri jednolančana fragmenta Fab koji se specifično vezuju za jedan do četiri dalja antigena (tj. drugi i/ili treći i/ili četvrti i/ili peti antigen, poželjno se specifično vezuju za jedan dalji antigen, tj. drugi antigen),
pri čemu su pomenuti jednolančani fragmenti Fab pod b) spojeni sa pomenutim antitelom kompletne dužine pod a) putem peptidnog linkera na C- ili N-terminusu teškog ili lakog lanca pomenutog antitela kompletne dužine.
U jednom aspektu, jedan ili dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C terminusu teških ili lakih lanaca pomenutog antitela kompletne dužine.
U jednom aspektu, jedan ili dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C-terminusu teških lanaca pomenutog antitela kompletne dužine.
U jednom aspektu, jedan ili dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C-terminusu lakih lanaca pomenutog antitela kompletne dužine.
U jednom aspektu, dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C-terminusu svakog teškog ili lakog lanca pomenutog antitela kompletne dužine.
U jednom aspektu, dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C-terminusu svakog teškog lanca pomenutog antitela kompletne dužine.
U jednom aspektu, dva identična jednolančana fragmenta Fab koji se vezuju za drugi antigen su spojeni sa antitelom kompletne dužine putem peptidnog linkera na C-terminusu svakog lakog lanca pomenutog antitela kompletne dužine.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo je trovalentno antitelo koje sadrži
a) antitelo kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen i sastoji se od dva teška lanca antitela i dva laka lanca antitela,
b) prvi polipeptid koji se sastoji od
ba) varijabilnog domena teškog lanca (VH) antitela, ili
bb) varijabilnog domena teškog lanca (VH) antitela i konstantnog domena 1 (CH1) antitela,
pri čemu je navedeni prvi polipeptid spojen sa N-terminusom svog VH domena putem peptidnog linkera sa C-terminusom jednog od dva teška lanca navedenog antitela kompletne dužine,
c) drugi polipeptid koji se sastoji od
ca) varijabilnog domena lakog lanca (VL) antitela, ili
cb) varijabilnog domena lakog lanca (VL) antitela i konstantnog domena lakog lanca (CL) antitela,
pri čemu je navedeni drugi polipeptid spojen sa N-terminusom VL domena putem peptidnog linkera sa C-terminusom drugog od dva teška lanca navedenog antitela kompletne dužine, i
pri čemu varijabilni domen teškog lanca (VH) antitela prvog polipeptida i varijabilni domen lakog lanca (VL) antitela drugog polipeptida zajedno grade antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za drugi antigen.
U jednom aspektu, varijabilni domen teškog lanca (VH) antitela polipeptida pod b) i varijabilni domen lakog lanca (VL) antitela polipeptida pod c) su povezani i stabilizovani pomoću međulančanog disulfidnog mosta putem uvođenja disulfidne veze između sledećih pozicija:
(i) pozicije 44 varijabilnog domena teškog lanca i pozicije 100 varijabilnog domena lakog lanca, ili
(ii) pozicije 105 varijabilnog domena teškog lanca i pozicije 43 varijabilnog domena lakog lanca, ili
(iii) pozicije 101 varijabilnog domena teškog lanca i pozicije 100 varijabilnog domena lakog lanca (numeracija je uvek prema Kabatovom EU indeksu).
Tehnike uvođenja neprirodnih disulfidnih mostova za stabilizaciju opisane su npr. u WO 94/029350, Rajagopal, V., et al, Prot. Eng. (1997) 1453-1459; Kobayashi, H., et al., Nucl. Med. Biol. 25 (1998) 387-393; i Schmidt, M., et al, Oncogene 18 (1999) 1711-1721. U jednom otelotvorenju, opciona disulfidna veza između varijabilnih domena polipeptida pod b) i c) je između pozicije 44 varijabilnog domena teškog lanca i pozicije 100 varijabilnog domena lakog lanca. U jednom otelotvorenju, opciona disulfidna veza između varijabilnih domena polipeptida pod b) i c) je između pozicije 105 varijabilnog domena teškog lanca i pozicije 43 varijabilnog domena lakog lanca (numeracija uvek prema Kabatu). U jednom otelotvorenju, poželjno je trovalentno, bispecifično antitelo bez navedene opcione stabilizacije disulfidom između varijabilnih domena VH i VL fragmenata jednolančanog Fab.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo je trispecifično ili tetraspecifično antitelo, koje sadrži
a) prvi laki lanac i prvi teški lanac antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen; i
b) drugi (modifikovani) laki lanac i drugi (modifikovani) teški lanac antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu su varijabilni domeni VL i VH zamenjeni jedan drugim i/ili pri čemu su konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim, i
c) pri čemu, jedan do četiri antigen vezujuća peptida koji se specifično vezuju za jedan ili dva dalja antigena (tj. za treći i/ili četvrti antigen) spojen je putem peptidnog linkera sa C- ili N-terminusom lakih lanaca ili teških lanaca pod a) i/ili b).
Antitelo pod a) ne sadrži modifikaciju kako je objavljeno pod b), i teški lanac i laki lanac pod a) su izolovani lanci.
U jednom aspektu, trispecifično ili tetraspecifično antitelo sadrži pod c) jedan ili dva antigen vezujuća peptida koji se specifično vezuju za jedan ili dva dalja antigena.
U jednom aspektu, antigen vezujući peptidi su izabrani iz grupe scFv fragmenta i scFab fragmenta.
U jednom aspektu, antigen vezujući peptidi su scFv fragmenti.
U jednom aspektu, antigen vezujući peptidi su scFab fragmenti.
U jednom aspektu, antigen vezujući peptidi su spojeni sa C-terminusom teških lanaca pod a) i/ili b).
U jednom aspektu, trispecifično ili tetraspecifično antitelo sadrži pod c) jedan ili dva antigen vezujuća peptida koji se specifično vezuju za jedan dalji antigen.
U jednom aspektu, trispecifično ili tetraspecifično antitelo sadrži pod c) dva identična antigen vezujuća peptida koji se specifično vezuju za treći antigen. U jednom poželjnom otelotvorenju, dva takva identična antigen vezujuća peptida su spojena putem istog peptidnog linkera sa C-terminusom teških lanaca a) i/ili b). U jednom poželjnom otelotvorenju, dva identična antigen vezujuća peptida su ili scFv fragment ili scFab fragment.
U jednom aspektu, trispecifično ili tetraspecifično antitelo sadrži pod c) dva antigen vezujuća peptida koji se specifično vezuju za treći i četvrti antigen. U jednom otelotvorenju, oba navedena antigen vezujuća peptida su spojena putem istog peptidnog konektora sa C-terminusom teških lanaca pod a) i b). U jednom poželjnom otelotvorenju, navedena dva antigen vezujuća peptida su ili scFv fragment ili scFab fragment.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo je bispecifično, četvorovalentno antitelo koje sadrži
(a) dva laka lanca i dva teška lanca antitela koji se specifično vezuju za prvi antigen (i sadrži dva fragmenta Fab),
(b) dva dodatna fragmenta Fab antitela koji se specifično vezuju za drugi antigen, pri čemu su oba navedena dodatna fragmenta Fab spojeni putem peptidnog linkera sa C- ili N-terminusima teških lanaca pod a), i
pri čemu su u fragmentima Fab načinjene sledeće modifikacije
(i) u oba fragmenta Fab pod a), ili u oba fragmenta Fab pod b), varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim i/ili su konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim, ili
(ii) u oba Fab fragmenta pod a) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim, i konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim, i u oba Fab fragmenta pod b) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim, ili su konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim, ili
(iii) u oba Fab fragmenta pod a) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim, ili konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim, i u oba Fab fragmenta pod b) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim, i konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim, ili
(iv) u oba fragmenta Fab pod a) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim, i u oba fragmenta Fab pod b) konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim, ili
(v) u oba fragmenta Fab pod a) konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim, i u oba fragmenta Fab pod b) varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim.
U jednom aspektu, oba navedena dodatna fragmenta Fab su spojena putem peptidnog linkera bilo sa C-terminusima teških lanaca pod a) ili sa N-terminusima teških lanaca pod a).
U jednom aspektu, oba navedena dodatna fragmenta Fab su spojena putem peptidnog linkera sa C-terminusima teških lanaca pod a).
U jednom aspektu, oba navedena dodatna fragmenta Fab su spojena putem peptidnog konektora sa N-terminusima teških lanaca pod a).
U jednom aspektu, u fragmentima Fab se izvode sledeće modifikacije: u oba fragmenta Fab pod a), ili u oba fragmenta Fab pod b), varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim i/ili su konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo je četvorovalentno antitelo koje sadrži: a) (modifikovani) teški lanac prvog antitela koji se specifično vezuje za prvi antigen i sadrži prvi par domena VH-CH1, pri čemu je za C terminus navedenog teškog lanca spojen N-terminus drugog para domena VH-CH1 navedenog prvog antitela putem peptidnog linkera, b) dva laka lanca navedenog prvog antitela pod a),
c) (modifikovani) teški lanac drugog antitela koji se specifično vezuje za drugi antigen i sadrži prvi par domena VH-CL, pri čemu je za C-terminus navedenog teškog lanca spojen N-terminus drugog par domena VH-CL navedenog drugog antitela putem peptidnog linkera, i d) dva (modifikovana) laka lanca navedenog drugog antitela pod c), pri čemu oba sadrže par domena CL-CH1.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo sadrži
a) teški lanac i laki lanac prvog antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen, i
b) teški lanac i laki lanac drugog antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za drugi antigen, pri čemu je N-terminus teškog lanca povezan sa C-terminusom lakog lanca putem peptidnog linkera.
Antitelo pod a) ne sadrži modifikaciju kako je objavljeno pod b), i teški lanac i laki lanac su izolovani lanci.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo sadrži
a) antitelo kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen i sastoji se od dva teška lanca antitela i dva laka lanca antitela, i
b) Fv fragment koji se specifično vezuje za drugi antigen koji sadrži VH2 domen i VL2 domen, pri čemu su oba domena međusobno povezana disulfidnim mostom, pri čemu se samo VH2 domen ili VL2 domen fuzionišu preko peptidnog linkera sa teškim ili lakim lancem antitela pune dužine koji se specifično vezuje za prvi antigen.
U bispecifičnom antitelu, teški lanci i laki lanci pod a) su izolovani lanci.
U jednom aspektu, drugi od VH2 domena ili VL2 domena nije spojen putem peptidnog linkera sa teškim ili lakim lancem antitela kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen.
U svim aspektima kako je ovde objavljeno, prvi laki lanac sadrži VL domen i CL domen i prvi teški lanac sadrži VH domen, CH1 domen, region šarke, CH2 domen i CH3 domen.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo je trovalentno antitelo koje sadrži
a) dva fragmenta Fab koji se specifično vezuju za prvi antigen,
b) jedan fragment CrossFab koji se specifično vezuje za drugi antigen u kojem su CH1 i CL domen zamenjeni jedan drugim,
c) jedan Fc-region koji sadrži teški lanac prvog Fc-regiona i teški lanac drugog Fc regiona,
pri čemu je C-terminus CH1 domena dva fragmenta Fab povezan sa N-terminusom teškog lanaca polipeptida Fc-regiona, i pri čemu C-terminus CL domena fragmenta CrossFab je povezan sa N-terminusom VH domena jednog od Fab fragmenata.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo je trovalentno antitelo koje sadrži
a) dva fragmenta Fab koji se specifično vezuju za prvi antigen,
b) jedan fragment CrossFab koji se specifično vezuje za drugi antigen u kojem su CH1 i CL domen zamenjeni jedan drugim,
c) jedan Fc-region koji sadrži teški lanac prvog Fc-regiona i teški lanac drugog Fc regiona,
npri čemu je C-terminus CH1 domena prvog fragmenta Fab povezan sa N-terminusom jednog od teških lanaca polipeptida Fc regiona, i C-terminus CL domena fragmenta CrossFab je povezan sa N-terminusom drugog teškog lanca polipeptida Fc regiona, i pri čemu je C-terminus CH1 domena drugog fragmenta Fab povezan sa N-terminusom VH domena prvog fragmenta Fab ili sa N-terminusom VH domena fragmenta CrossFab.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo sadrži
a) antitelo kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen i sastoji se od dva teška lanca antitela i dva laka lanca antitela, i
b) Fab fragment koji se specifično vezuje za drugi antigen koji sadrži VH2 domen i VL2 domen koji sadrži fragment teškog lanca i fragment lakog lanca, pri čemu je u fragmentu lakog lanca varijabilni domen lakog lanca VL2 zamenjen varijabilnim domenom teškog lanca VH2 pomenutog antitela, i u fragmentu teškog lanca varijabilni domen teškog lanca VH2 je zamenjen varijabilnim domenom lakog lanca VL2 navedenog antitela
pri čemu je teški lanac fragmenta Fab umetnut između CH1 domena jednog od teških lanaca antitela kompletne dužine i odgovarajućeg Fc regiona antitela kompletne dužine, i N-
1
terminus lakog lanca fragmenta Fab je konjugovan sa C-terminusom lakog lanca antitela kompletne dužine koji je uparen sa teškim lancem antitela kompletne dužine u koji je umetnut teški lanac fragmenta Fab.
U jednom aspektu, bispecifično antitelo sadrži
a) antitelo kompletne dužine koje se specifično vezuje za prvi antigen i sastoji se od dva teška lanca antitela i dva laka lanca antitela, i
b) Fab fragment koji se specifično vezuje za drugi antigen koji sadrži VH2 domen i VL2 domen koji sadrže fragment teškog lanca i fragment lakog lanca, pri čemu je u fragmentu lakog lanca varijabilni domen lakog lanca VL2 zamenjen varijabilnim domenom teškog lanca VH2 navedenog antitela, i u fragmentu teškog lanca varijabilni domen teškog lanca VH2 je zamenjen varijabilnim domenom lakog lanca VL2 navedenog antitela, i pri čemu, C-terminus fragmenta teškog lanca Fab fragmenta je konjugovan sa N-terminusom jednog od teških lanaca antitela pune dužine, i C-terminus fragmenta lakog lanca Fab fragmenta je konjugovan sa N-terminusom lakog lanca antitela pune dužine koji se uparuje sa teškim lancem pune dužine antitela na koje je konjugovan fragment teškog lanca Fab fragmenta.
Polinukleotidi
Otkriće dalje obezbeđuje izolovane polinukleotide koji kodiraju bispecifično antitelo kao što je ovde opisano ili njegov fragment.
U određenim otelotvorenjima, polinukleotid ili nukleinska kiselina je DNK. U drugim otelotvorenjima, polinukleotid iz predmetnog pronalaska je RNK, na primer, u obliku informacione RNK (mRNK). RNK iz predmetnog pronalaska može biti jednolančana ili dvolančana.
B. Rekombinantni postupci
Ovde data bispecifična antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i smeša, npr., kako je opisano u U.S. Patentu br. 4,816,567. U jednom aspektu, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira bispecifično antitelo iz ovog dokumenta. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antigen vezujućih mesta koja se specifično vezuju za PD1 odnosno TIM-3 (npr. lake i/ili teške lance antitela). U daljem aspektu, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr. ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljem aspektu, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom aspektu, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL
2
antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom aspektu, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr. Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za dobijanje bispecifičnog antitela, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i eventualno izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).
Za rekombinantnu proizvodnju bispecifičnih antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3 kao što je ovde opisano, nukleinska kiselina koja kodira bispecifična antitela, npr., kako je gore opisano, izolovana je i umetnuta u jedan ili više vektora za dalje kloniranje i/ili ekspresiju u ćeliji domaćina. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se selektivno vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, videti npr., US 5,648,237, US 5,789,199 i US 5,840,523. (Videti takođe Charlton, KA, u: Methods in Molecular Biology, sveska 248, Lo, B.K.C. (izd.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), str.245-254, gde je opisana ekspresija fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.
Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do stvaranja antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Vidite Gerngross, T.U., Nat. Biotech.22 (2004) 1409-1414; i Li, H. et al. Nat. Biotech.24 (2006) 210-215.
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanih antitela su takođe izvedene iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Videti npr. US patente br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (gde se opisuje PLANTIBODIESTM tehnologija za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri ćelijskih linija sisara koje se koriste kao domaćini su: CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); bubrežna linija humanog embriona (293 ili 293 ćelije su opisane, npr. u Graham, F.L. et al. J. Gen Virol.36 (1977) 59-74); bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK); mišje sertolijeve ćelije (TM4 ćelije su opisane, npr. u Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma cerviksa (HELA); bubrežne ćelije psa (MDCK; ćelije jetre bufalo pacova (BRL3A); ćelije pluća čoveka (W138); ćelije jetre čoveka (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT 060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr. u Mather, J.P. et al. Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; MRC5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR-CHO ćelije (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); i ćelijske linije mijeloma poput Y0, NS0 i Sp2/0. Za pregled izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, vidite, npr. Yazaki, P. i Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, sveska 248, Lo, B.K.C. (izd.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), str.255-268.
C. Testovi
Bispecifična antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3, koja su ovde data, mogu se identifikovati, pregledati ili okarakterisati prema fizičko-hemijskim svojstvima i/ili biološkim aktivnostima pomoćurazličitih testova poznatih u struci.
1. Testovi za merenje afiniteta
Afinitet bispecifičnih antigen vezujućih molekula, antitela i fragmenata antitela koji je ovde obezbeđen za odgovarajuće antigene može se odrediti prema postupcima koji su navedene u primerima pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR), upotrebom standardnih instrumenata kao što je instrument Biacore® (GE Healthcare), i receptora ili ciljnih proteina, kakve je moguće dobiti rekombinantnom ekspresijom. Specifični ilustrativan primer otelotvorenja za merenje afiniteta vezivanja opisan je u primerima 1b, 5 ili 12. Prema jednom aspektu, KDse meri površinskom plazmonskom rezonancom pomoću mašine BIACORE® T100 (GE Healthcare) na 25 °C.
2. Testovi vezivanja i drugi testovi
4
U jednom aspektu, antitelo se testira na njegovu aktivnost vezivanja antigena, npr. poznatim postupcima kao što su ELISA, vestern blot, itd. Vezivanje bispecifičnih antitela koja su ovde data za odgovarajući rekombinantni antigen ili za ćelije koje eksprimiraju antigen može se proceniti pomoću ELISA testa, kako je opisano u primeru 12.
U drugom aspektu, otkriće obezbeđuje TR-FRET test na bazi ćelija kako bi se utvrdilo istovremeno vezivanje formata bispecifičnih antitela za dva različita receptora prisutna u jednoj ćeliji. Odabrana Tag-lite tehnologija je kombinacija klasičnog TR-FRET (vremenski razložen prenos fluorescentne rezonance energije) i SNAP-tag tehnologije (npr. New England Biolabs, CISBIO), koja omogućava da se antigeni prisutni na površini ćelije obeleže fluorescentnom donorskom ili akceptorskom bojom. Test je opisan u Primeru 13.
U daljem aspektu, mononuklearne ćelije sveže periferne krvi (PBMC) koriste se u testovima vezivanja kako bi se pokazalo vezivanje za različite mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), kao što su monociti, NK ćelije i T ćelije.
U drugom aspektu, testovi konkurentnosti se mogu koristiti za identifikovanje antitela koje se takmiči sa specifičnim antitelom ili antigen vezujućim mestom u vezivanju za cilj. U određenim otelotvorenjima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) koji je vezan bispecifičnim antitelom koje se sastoji od prvog antigen vezujućeg mesta koje se specifično vezuje za PD1 i drugog antigen vezujućeg mesta koje se specifično vezuje za TIM3 prema pronalasku. Detaljne primere postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo daje Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ).
U primeru kompetitivnog testa, imobilisani PD1 ili TIM3 se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za PD1 ili TIM3 i drugo neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za PD1 ili TIM3 ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani PD1 ili TIM3 su inkubirani u rastvoru koji sadrži prvo, obeleženo antitelo, ali ne i drugo, neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije, u uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za PD1 ili TIM3, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani PD1 ili TIM3. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani PD1 ili TIM3 u ispitivanom uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za PD1 ili TIM3. Videti Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual pogl.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
3. Testovi za merenje aktivnosti
U jednom aspektu, obezbeđeni su testovi za identifikaciju bispecifičnog antitela koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, koje ima biološku aktivnost. Biološka aktivnost može uključivati, npr. sposobnost da povećava aktivaciju i/ili proliferaciju različitih imunskih ćelija, posebno T-ćelija, sekreciju imunomodulišućih citokina kao što je IFN γ ili TNF-alfa, blokiranje PD1 puta, blokiranje TIM3 puta, ubijanje tumorskih ćelije. Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su obezbeđena.
U pojedinim aspektima, antitelo iz pronalaska je ispitano na takvu biološku aktivnost. U jednom aspektu, obezbeđen je test imunskih ćelija koji meri aktivaciju limfocita od jedne jedinke (donor X) do limfocita druge jedinke (donor Y). Mešana limfocitna reakcija (MLR) može da pokaže efekat blokiranja PD1 puta do efektorskih ćelija limfocita. T ćelije u ispitivanju su testirane na aktiviranje i izlučivanje IFN-gama u prisustvu ili odsustvu bispecifičnih antitela prema pronalasku. Test je detaljnije opisan u primeru 16.
D. Imunokonjugati
Otkriće takođe pruža imunokonjugate koji sadrže bispecifično antitelo iz pronalaska konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.
U jednom aspektu, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo vezano za jedan ili više lekova, uključujući, ali se ne ograničavajući na majtanzinoid (pogledajte U.S. Patent br. 5,208,020, 5,416,064 i European Patent EP 0 425 235 B1); auristatin kao što su funkcionalni ostaci leka monometilauristatin DE i DF (MMAE i MMAF) (pogledajte U.S. Patent br. 5,635,483 i 5,780,588, i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (pogledajte U.S. Patent br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); i Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); antraciklin, kao što je daunomicin ili doksorubicin (pogledajte Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem.16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); i U.S. patent br.6,630,579); metotreksat; vindesin; taksan kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano za enzimski aktivan toksin ili njegov fragment, uključujući, ali se ne ograničavajući na A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine vinobojke (Phytolaca americana) (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje (momordica charantia), kursin, krotin, inhibitor iz sapunjače (sapaonaria officinalis), gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano za radioaktivni atom, dajući radiokonjugat. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili 1123, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao snimanje magnetnom rezonancom, MR), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil)heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina može se dobiti kao što opisuju Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) primer je helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida za antitelo. Pogledajte WO94/11026. Linker može biti „raskidivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, kiselo-labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker sa disulfidom (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); U.S. Patent br.5,208,020).
Imunokonjugati ADC koji su ovde izričito razmatrani, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za biokonjugaciju, koji uključuju BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfoEMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., SAD).
E. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje
U određenim aspektima, bilo koje ovde obezbeđeno bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3 može biti korisno za otkrivanje prisustva PD1 i TIM3 u biološkom uzorku. Termin „detekcija“, kako se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U određenim otelotvorenjima, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo, kao što su matične ćelije kancera AML.
U jednom aspektu, dato je bispecifično antitelo za upotrebu u postupku dijagnoze ili detekcije. U sledećem aspektu, obezbeđen je postupak za detekciju prisustva PD1 i TIM3 u biološkom uzorku. U određenim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa bispecifičnim antitelom kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje bispecifičnog antitela za PD1 i TIM3, i detektovanje nastajanja kompleksa između bispecifičnog antitela i oba antigena. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo se koristi za odabiranje ispitanika koji ispunjavaju uslove za terapiju bispecifičnim antitelom, koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za antitelo TIM-3, npr. tamo gde su PD1 i TIM3 biomarkeri za odabiranje pacijenata.
U pojedinim aspektima, data su obeležena bispecifična antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i funkcionalne ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope 32P, 14C, 1251, 3H i 131I, fluorofore kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin / avidin, spin oznake, oznake bakteriofaga ili stabilni slobodni radikali.
F. Farmaceutske kompozicije, formulacije i načini primene
U daljem aspektu, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje sadrže bilo koje od ovde datih bispecifičnih antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3, npr. za upotrebu u bilo kojim dole navedenim terapeutskim postupcima. U jednom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koje od ovde datih bispecifičnih antitela i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. U drugom otelotvorenju, farmaceutska kompozicija uključuje bilo koje od ovde datih bispecifičnih antitela i najmanje jedno dodatno terapeutsko sredstvo, npr. kao što je dole opisano.
Farmaceutske kompozicije iz predmetnog otkrića obuhvataju terapeutski efektivnu količinu jednog ili više bispecifičnih antitela rastvorenih ili raspršenih u farmaceutski prihvatljivom ekscipijensu. Fraze „farmaceutski ili farmakološki prihvatljivo” odnose se na molekulske entitete i kompozicije koje su uglavnom netoksične za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, tj. ne dovode do neželjenih, alergijskih i drugih nepovoljnih reakcija kada se primene na životinjama, kao što je, na primer, čovek, po potrebi. Preparat farmaceutske kompozicije koji sadrži najmanje jedano bispecifično antitelo i, po potrebi, dodatni aktivni sastojak, biće poznat stručnjacima u ovoj oblasti u smislu predmetnog pronalaska, kao što je objašnjeno u Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izd. Mack Printing Company, 1990. Konkretno, preparati su liofilizovane formulacije ili vodeni rastvori. Kao što se ovde koristi, termin „farmaceutski prihvatljivi ekscipijens“ obuhvata bilo koje i sve rastvarače, pufere, disperzione agense, obloge, surfaktante, antioksidanse, konzervanse (npr. antibakterijske agense, antifungalne agense), izotonične agense, soli, stabilizatore i njihove kombinacije, kao što bi bilo poznato licu standardne stručnosti u ovoj oblasti.
Parenteralni preparati obuhvataju one namenjene primeni putem injekcija, npr. supkutano, intradermalno, intraleziono, intravenski, intraarterijski, intramuskularno, intratekalno ili intraperitonealno ubrizgavanje. Za injekciju, bispecifična antitela iz pronalaska mogu biti formulisana kao vodeni rastvori, poželjno fiziološki kompatibilni puferi, kao što je Henksov rastvor, Ringerov rastvor ili fiziološki slani pufer. Rastvor može da sadrži agense za formulisanje, kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno, bispecifična antitela mogu da budu u obliku praha za mešanje sa odgovarajućim nosačem, npr. sterilnom nepirogenom vodom, pre upotrebe. Sterilni injektabilni rastvori su pripremljeni mešanjem fuzionih proteina iz pronalaska u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvoru sa različitim drugim dolenavedenim sastojcima, po potrebi. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Uglavnom, disperzije se pripremaju mešanjem različitih sterilnih aktivnih sastojaka u sterilnom nosaču koji sadrži osnovni disperzioni medijum i/ili druge sastojke. U slučaju sterilnog praha za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, suspenzija ili emulzija, poželjni postupak pripreme je vakuum sušenje ili liofilizacija, kojima se dobija prah aktivnog sastojka, kao i ostalih poželjnih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog tečnog medijuma. Tečni medijum treba da bude odgovarajuće puferisan, ako je potrebno, a tečni diluent izotoničan pre ubrizgavanja sa odgovarajućom količinom soli ili glukoze. Kompozicija treba da bude stabilna u uslovima stvaranja i čuvanja, izolovana od kontaminirajućeg uticaja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice. Poželjno je da kontaminacija endotoksinom bude svedena na minimalni bezbedni nivo, na primer, manje od 0,5 ng/mg proteina. Odgovarajući farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil paraben ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinil pirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Suspenzije za vodene injekcije mogu da sadrže jedinjenja koja povećavaju viskozitet suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, dekstran, i slično. Po potrebi, suspenzija može da sadrži i odgovarajuće stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja i omogućavaju pripremu visokokoncentrovanih rastvora. Takođe, suspenzije aktivnih sastojaka mogu se pripremiti u obliku odgovarajućih injekcija uljane suspenzije. Odgovarajući lipofilni rastvarači ili vehikulumi obuhvataju masna ulja, kao što su susamovo ulje ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil oleati ili trigliceridi ili lipozomi.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su prikazane u Remington's Pharmaceutical Sciences (18. izd. Mack Printing Company, 1990). Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem obuhvataju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže polipeptid, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. film ili mikrokapsule. U posebnom primeru otelotvorenja, prolongirana apsorpcija kompozicije za ubrizgavanje može se izazvati upotrebom u kompozicijama agensa za odlaganje apsorpcije, kao što su aluminijum monostearat, želatin ili njihove kombinacije.
Primeri farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa ovde dalje obuhvataju agense za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Pojedini primeri za sHASEGP i postupke primene, uključujući rHuPH20, opisani su u US Patent Publication br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Primeri liofilizovanih formulacija antitela opisani su u US Patentu br. 6,267,958. Vodene formulacije antitela obuhvataju one opisane u US Patentu br. 6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Pored prethodno opisanih preparata, bispecifično antitelo se može formulisati i kao depo preparat. Takve dugodelujuće formulacije mogu se primeniti implantacijom (na primer, supkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Stoga se, na primer, bispecifična antitela mogu formulisati sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim supstancama (na primer, kao emulzija u odgovarajućem ulju) ili jonoizmenjivačkim smolama, ili kao slabo rastvorljivi derivati, na primer, kao slabo rastvorljiva so.
Farmaceutski preparati koji sadrže bispecifična antitela predmetnog pronalaska mogu se proizvesti pomoću konvencionalnih postupaka mešanja, rastvaranja, emulgovanja, inkapsuliranja ili liofilizacije. Farmaceutsi preparati mogu biti formulisane na konvencionalne načine pomoću jednog ili više fiziološki prihvatljivih nosača, diluenata, ekscipijenasa ili dodatnih sredstava koja olakšavaju obradu proteina u preparate koji se mogu koristiti u farmaceutske svrhe. Pravilna formulacija zavisi od izabranog načina primene.
Bispecifična antitela se mogu formulisati u kompoziciju u obliku slobodne kiseline ili baze, u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli su soli koje zadržavaju značajnu biološku aktivnost slobodne kiseline ili baze. U njih spadaju kisele
1
adicione soli, npr. one formirane sa slobodnim amino grupama proteinske kompozicije ili one formirane sa neorganskom kiselinom kao što je, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili organskim kiselinama poput sirćetne, oksalne, vinske ili bademove kiseline. Soli formirane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu se dobiti iz neorganskih baza, kao što su: natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe hidroksid, ili organskih baza, kao što je izopropilamin, trimetilamin, histidin ili prokain. Farmaceutske soli uglavnom budu rastvorljivije u vodi i drugim protičnim rastvaračima od odgovarajućih oblika slobodnih baza.
Preparat ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
G. Terapeutski postupci i kompozicije
Bilo koje ovde dato bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3 se može koristiti u terapeutskim postupcima.
Za upotrebu u terapeutskim postupcima, bispecifična antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3 kako je ovde prethodno definisano, mogu se formulisati, dozirati i primenjivati na način koji je usklađen sa dobrom medicinskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto na koje se agens daje, metod davanja, raspored davanja i drugi faktori poznati lekarima.
U jednom aspektu, data su bispecifična antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3 kako je ovde definisano za upotrebu kao lek. U daljim aspektima, data su bispecifična antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3 kako je ovde definisano, za upotrebu u lečenju bolesti, posebno za upotrebu u lečenju kancera. U određenim otelotvorenjima, data su bispecifična antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3 za upotrebu u postupku lečenja. U jednom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje bispecifična antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično
2
vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3, kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U određenim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje bispecifična antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3, za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima bolest koja podrazumeva davanje pojedincu terapeutski efikasne količine bispecifičnog antitela. U određenim otelotvorenjima, bolest koja se leči je kancer. U drugom aspektu, bolest koja se leči je hronična virusna infekcija kao HIV, HBV, HCV, HSV1, CMV, LCMV ili EBV. Ispitanik, pacijent ili „pojedinac“ kome treba lečenje tipično je sisar, konkretnije čovek.
U daljem aspektu, otkriće obezbeđuje upotrebu bispecifičnih antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3, kao što je ovde opisano, u proizvodnji ili pripremi leka za lečenje bolesti kod pojedinca kome je to potrebno. U jednom otelotvorenjua, lek je za upotrebu u postupku lečenja bolesti koji uključuje davanje pojedincu koji ima bolest terapeutski efikasne količine leka.
U određenim aspektima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj, konkretno kancer. Primeri za kancer uključuju kancer bešike, mozga, glave i vrata, pankreasa, pluća, dojke, jajnika, materice, grlića materice, kancer endometrijuma, kancer jednjaka, debelog creva, kolorektalni kancer, rektalni kancer, kancer želuca, kancer prostate, krvi, kože, karcinom skvamoznih ćelija, kancer kostiju i kancer bubrega. Ostali poremećaji proliferacije ćelija koji se mogu lečiti pomoću bispecifičnih antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3 prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, neoplazme locirane u: stomaku, kostima, dojkama, digestivnom sistemu, jetri, pankreasu, peritoneumu, endokrinim žlezdama (adrenalinskoj, paratiroidnoj, hipofizi, testisima, jajnicima, grudnoj, tiroidnoj žlezdi), očima, glavi i vratu, nervnom sistemu (centralnom i perifernom), limfnom sistemu, karlici, koži, mekom tkivu, slezini, grudnom košu i urogenitalnom sistemu. Obuhvaćena su i pretkancerozna stanja ili lezije i metastaze kancera. U određenim aspektima, kancer je odabran iz grupe koja obuhvata karcinom renalnih ćelija, karcinom kože, pluća, kolorektalni karcinom, karcinom dojke, mozga, glave i vrata. U daljim aspektima, kancer je odabran od karcinoma, limfoma (npr. Hodžkinov i non-Hodžkinov limfom), blastoma, sarkoma i leukemije. U drugom aspektu, kancer koji se leči je odabran od skvamoznih ćelija kancera, sitnoćelijskog kancera pluća, nesitnoćelijskog kancera pluća, adenokarcinoma pluća, skvamoznog karcinoma pluća, kancera peritoneuma, hepatocelularnog kancera, gastrointestinalnog kancera, kancera gušterače, glioma, kancera grlića materice, kancera jajnika, kancera jetre, kancera mokraćne bešike, hepatoma, kancera dojke, kancera debelog creva, kolorektalnog kancera, kancera endometrijuma ili materice, kancera pljuvačne žlezde, kancera bubrega, kancera jetre, kancera prostate, kancera vulve, kancera štitne žlezde, kancera jetre, leukemije i drugih limfoproliferativnih poremećaja, i raznih vrsta kancera glave i vrata.
U daljem aspektu, bolest koja se leči je hronična virusna infekcija. Termin „hronična virusna infekcija“ se odnosi na osobu koja je pogođena ili zaražena hroničnim virusom. Primeri za hronične virusne infekcije su virus humane imunodeficijencije (HIV), virusna infekcija hepatitisom B (HBV), virusna infekcija hepatitisom C (HCV), virus herpes simpleks 1 (HSV1), citomegalovirus (CMV), virus limfocitnog horiomeningitisa (LCMV) ili Epštajn-Barov virus (EBV).
Obučeni stručnjak zna da u mnogim slučajevima bispecifični molekul možda neće obezbediti lek, već samo delimično olakšanje. U nekim otelotvorenjima, fiziološka promena koja ima određene koristi takođe se smatra terapeutski korisnom. Stoga, u nekim otelotvorenjima, količina bispecifičnog molekula koja obezbeđuje fiziološku promenu smatra se „delotvornom količinom” ili „terapeutski delotvornom količinom”.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje bolesti kod pojedinca, koji se sastoji od davanja pomenutom pojedincu terapeutski delotvorne količine bispecifičnih antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3, iz predmetnog otkrića. U jednom otelotvorenju, kompozicija se daje pomenutom pojedincu i sadrži bispecifično antitelo iz pronalaska u farmaceutski prihvatljivom obliku. U određenim otelotvorenjima, bolest koja se leči je proliferativni poremećaj. U konkretnom otelotvorenju bolest je kancer. U određenim otelotvorenjima, postupak se dalje sastoji od primene terapeutski delotvorne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. antikancerogenog agensa, ako je lečena bolest kancer. U drugom aspektu, bolest je hronična virusna infekcija. Prema svim gorenavedenim otelotvorenjima, „pojedinac” može da bude sisar, poželjno čovek.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza bispecifičnih antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3 iz pronalaska (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim terapeutskim agensom ili više drugih dodatnih terapeutskih agensa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, načina primene, telesne težine pacijenta, vrste fuzionog proteina, težine i toka bolesti, bilo da se bispecifično antitelo primenjuje u preventivne ili
4
terapeutske svrhe, kao i od prethodne ili istovremene terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na fuzioni protein, i odluke nadležnog lekara. Lekar zadužen za primenu, u svakom slučaju, određuje koncentraciju aktivnih sastojaka u kompoziciji i odgovarajuću dozu (odgovarajuće doze) za svakog ispitanika. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3 kako je ovde definisano, primereno se daje pacijentu odjednom ili tokom niza tretmana. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 μg/kg do 15 mg/kg (npr.0,1 mg/kg – 10 mg/kg) bispecifičnog antitela je kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, bilo, na primer, putem jedne ili više primena, ili kontinualnom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može biti u rasponu od oko 1 μg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorenavedenih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Primer doze za bispecifično antitelo bi bio u opsegu od oko 0,005 mg/kg do oko 10 mg/kg. U drugim primerima, doza može da sadrži i od oko 1 μg/kg telesne težine, oko 5 μg/kg telesne težine, oko 10 μg/kg telesne težine, oko 50 μg/kg telesne težine, oko 100 μg/kg telesne težine, oko 200 μg/kg telesne težine, oko 350 μg/kg telesne težine, oko 500 μg/kg telesne težine, oko 1 mg/kg telesne težine, oko 5 mg/kg telesne težine, oko 10 mg/kg telesne težine, oko 50 mg/kg telesne težine, oko 100 mg/kg telesne težine, oko 200 mg/kg telesne težine, oko 350 mg/kg telesne težine, oko 500 mg/kg telesne težine, do oko 1000 mg/kg telesne težine ili više po primeni, i svaki raspon koji može da se dobije iz toga. U primerima raspona dobijenih iz ovde navedenih brojeva, može se primeniti raspon od oko 5 mg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine, oko 5 μg/kg telesne težine do oko 500 μg/kg telesne težine, itd. na osnovu gore opisanih brojeva. Stoga se jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može dati pacijentu. Takve doze se mogu primenjivati povremeno, npr., svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset ili npr. oko šest doza fuzionog proteina). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Bispecifična antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3 kako je ovde definisano, uopšteno će se koristiti u količini koja je delotvorna za postizanje nameravane svrhe. Za lečenje ili prevenciju stanja bolesti, bispecifična antitela iz pronalaska, ili njihove farmaceutske kompozicije, daju se ili primenjuju u terapeutski delotvornim količinama. Određivanje terapeutski delotvorne količine poznato je stručnim licima iz ove oblasti, naročito u smislu ovog detaljnog obrazloženja.
U pogledu sistemske primene, terapeutski delotvorna doza se može inicijalno proceniti putem in vitro testova, kao što su testovi na ćelijskoj kulturi. Zatim doza može biti formulisana prema životinjskom modelu kako bi se dostigao raspon koncentracija u krvotoku koji uključuje IC50, kao što je utvrđeno u kulturi ćelija. Takve informacije mogu da se koriste za preciznije utvrđivanje korisnih doza za ljude.
Inicijalne doze se takođe mogu proceniti na osnovu in vivo podataka, npr. životinjskih modela, uz pomoć tehnika koje su dobro poznate u struci. Lice standardne stručnosti iz ove oblasti može brzo da optimizuje davanje leka ljudima na osnovu podataka o životinjama.
Doza i interval primene se mogu pojedinačno podesiti kako bi se obezbedili nivoi bispecifičnog antitela u plazmi koji su dovoljni za održavanje terapeutskog dejstva. Uobičajena doza primene za pacijente putem injekcija ima raspon od oko 0,1 mg/kg/dan do 50 mg/kg/dan, tipično od oko 0,5 mg/kg/dan do 1 mg/kg/dan. Terapeutski delotvorni nivoi plazme se mogu dostići primenom višestrukih doza svakog dana. Nivoi u plazmi se mogu meriti, na primer, HPLC hromatografijom.
U slučajevima lokalne primene ili selektivnog unosa, delotvorna lokalna koncentracija bispecifičnog antitela ne mora da bude u vezi sa koncentracijom u plazmi. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da optimizuju terapeutski delotvornu lokalnu dozu bez nepotrebnog eksperimentisanja.
Terapeutski delotvorna doza ovde opisanih bispecifičnih antitela uopšteno obezbeđuje terapeutske koristi bez izazivanja značajne toksičnosti. Toksičnost i terapeutska efikasnost fuzionog proteina mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskoj kulturi ili eksperimentalnim životinjama. Testovi u kulturi ćelija i studije na životinjama mogu se koristiti za utvrđivanje LD50(doza koja je smrtonosna za 50% populacije) i ED50(doza terapeutski delotvorna za 50% populacije). Odnos toksičnih i terapeutskih dejstava doze predstavlja terapeutski indeks, koji se može izraziti kao odnos LD50/ED50. Poželjna su bispecifična antitela koji pokazuju visoke terapeutske indekse. U jednom otelotvorenju, bispecifično antitelo prema predmetnom pronalasku pokazuje visok terapeutski indeks. Podaci dobijeni iz testova kulture ćelija i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje raspona doza pogodnih za ljudsku upotrebu. Poželjno je da se doza nalazi u rasponu koncentracija u krvotoku koji uključuje ED50 sa malom toksičnošću ili bez toksičnosti. Doza može da varira u okviru raspona u zavisnosti od različitih faktora, npr. primenjeni oblik doze, način primene, stanje ispitanika, i slično. Tačnu formulaciju, način primene i dozu može izabrati lekar nakon uvida u stanje pacijenta (videti, npr., Fingl et al., 1975, u: The Pharmacological Basis of Therapeutics, gl.1, str.1.
Lekar zadužen za pacijente koji se leče bispecifičnim antitelom iz pronalaska zna kada i kako treba da okonča, prekine ili podesi primenu zbog toksičnosti, nepravilnog rada organa, i slično. Sa druge strane, lekar zna i da podesi lečenje na viši nivo, ako klinički odgovor nije adekvatan (isključujući toksičnost). Jačina primenjene doze radi kontrole bolesti menjaće se u skladu sa ozbiljnošću stanja koje se leči, načina primene, i slično. Ozbiljnost bolesti može se, na primer, oceniti standardnim postupcima prognostičke evaluacije. Takođe, doza i možda učestalost doze takođe će se menjati u zavisnosti od godina, telesne težine i odgovora pojedinačnih pacijenata.
Drugi agensi i tretmani
Bispecifična antitela koja sadrže prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM-3, kako je ovde prethodno opisano, može se primenjivati u kombinaciji sa jednim ili više drugih agensa u terapiji. Na primer, može biti primenjeno istovremeno uz najmanje jedan dodatni terapeutski agens. Termin „terapeutski agens” obuhvata sve agense koji se mogu primeniti za lečenje simptoma ili bolesti pojedinca kome treba lečenje. Takvi dodatni terapeutski agensi takođe mogu da sadrže bilo koji aktivni sastojak pogodan za određene indikacije koje se leče, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. U određenim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je još jedan antikancerogeni agens.
Takvi drugi agensi su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe. Delotvorna količina takvih drugih agensa zavisi od količine fuzionih proteina koji se koriste, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Antigen vezujući molekuli koji sadrže trimer liganda iz familije TNF se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1% do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agensa uključeni u istu kompoziciju, ili u različite kompozicije), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena bispecifičnog antitela može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili adjuvansa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene.
H. Proizvodi
U drugom aspektu, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje gore opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži kompoziciju koji je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom kompozicijom delotvorna u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje na TIM-3 kako je ovde prethodno definisano.
Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži bispecifično antitelo iz otkrića; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom otelotvorenju predmetnog pronalaska može dodatno da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje određenog stanja.
Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Tabela C (sekvence):
1
2
4
1
11 PRIMERI
U nastavku su dati primeri za postupke i preparate iz pronalaska.
Materijali i opšti postupci
Opšte informacije u vezi sa sekvencama nukleotida lakih i teških lanaca humanog imunoglobulina date su u: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Aminokiseline lanaca antitela su numerisane i navedene prema sistemima numeracije prema Kabatu (Kabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) kako je gore definisano.
Tehnike rekombinantne DNK
Standardni postupci su korišćeni za manipulaciju DNK, kako je opisano u Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagensi za molekularnu biologiju su korišćeni prema uputstvu proizvođača.
Genska sinteza
Željeni segmenti gena su pripremljeni od oligonukleotida napravljenih hemijskom sintezom. Segmenti gena dugi od 600 do 1800 baznih parova (bp), koji su bili okruženi pojedinačnim restriktivnim mestima cepanja endonukleazom, spojeni su pomoću žarenja i ligiranja oligonukleotida, uključujući PCR amplifikaciju, i potom klonirani preko označenih restriktivnih mesta npr. KpnI/SacI ili AscI/PacI u pGA4 klonirajući vektor na bazi pPCRScript (Stratagene). DNK sekvence potkloniranih genskih fragmenata su potvrđene sekvenciranjem DNK. Fragmenti za sintezu gena su naručeni prema datim specifikacijama u kompaniji Geneart (Regensburg, Nemačka).
Određivanje sekvence DNK
Sekvence DNK su određene dvolančanim sekvenciranjem izvršenim u kompaniji MediGenomix GmbH (Martinsried, Nemačka) ili Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Nemačka).
Analiza DNK i sekvenci proteina i upravljanje podacima o sekvenci Softverski paket GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) verzija 10.2 i Infomax Vector NT1 Advance suite verzija 8.0 su korišćeni za kreiranje sekvenci, mapiranje, analizu, označavanje i ilustraciju.
Ekspresioni vektori
Za ekspresiju opisanih antitela, primenjene su varijante ekspresionih plazmida za prolaznu ekspresiju (npr. u HEK293) ćelija na bazi organizacije kDNK sa CMV-Intron A
1 2
promoterom ili bez njega, ili genomske organizacije sa CMV promoterom.
Pored kasete za ekspresiju antitela, vektori su sadržali:
- mesto početka replikacije koje dozvoljava replikaciju ovog plazmida u E. coli, i - gen β-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin u E. coli.
Jedinica transkripcije gena antitela sastoji se od sledećih elemenata:
- jedinstvenog restrikcionog mesta (jednog ili više) na 5' kraju
- trenutnog ranog pojačivača i promotera iz humanog citomegalovirusa,
- praćenog sekvencom Intron A u slučaju organizacije kDNK,
- 5'-netranslatovanog regiona gena humanog antitela,
- signalnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca,
- lanca humanog antitela (divljeg tipa ili sa razmenom domena) bilo kao kDNK ili kao genomska organizacija sa organizacijom imunoglobulina ekson-intron
- 3' netranslatovanog regiona sa poliadenilacionom signalnom sekvencom, i
- jedinstvenog restrikcionog mesta na 3' kraju.
Fuzioni geni koji sadrže lance antitela kao što je opisano u nastavku generisani su pomoću PCR i/ili sinteze gena i sastavljeni poznatim rekombinantnim postupcima i tehnikama, povezivanjem odgovarajućih segmenata nukleinske kiseline, npr. upotrebom jedinstvenih restrikcionih mesta u odgovarajućim vektorima. Sekvence subklonirane nukleinske kiseline verifikovane su sekvenciranjem DNK. Za prolazne transfekcije su pripremljene veće količine plazmida putem pripreme plazmida iz transformisanih kultura E. coli (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).
Tehnike gajenja ćelija
Standardne tehnike gajenja ćelija su korišćene kako je opisano u Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. i Yamada, K.M. (izdav.), John Wiley & Sons, Inc.
Multispecifična antitela su eksprimirana prolaznom kotransfekcijom odgovarajućih ekspresionih plazmida u adherentno rastućem HEK293-EBNA ili u HEK29-F ćelijama koje rastu u suspenziji, kao što je opisano ispod.
Prolazne transfekcije u HEK293 sistemu
Sva antitela i bispecifična antitela su nastala prolaznom transfekcijom ćelija 293F upotrebom sistema Freestyle (ThermoFisher). Ovde su ćelije 293F kultivisane u medijumu F17, transficirane sa 293Free (Novagene) i hranjene nakon 4 sata sa 4 mM VPA i Feed 7 i 0,6% glukozom nakon 16 h. Dalje je korišćen Expi293F™ komplet za ekspresiju sistema
1
(ThermoFisher). Ovde su ćelije Expi293F™ kultivisane u Expi293™ medijumu za ekspresiju i transicirane pomoću ExpiFectamine™ 293 kompleta za transfekciju prema uputstvu proizvođača. Zbog poboljšane stabilnosti i čistoće i smanjene tendencije agregacije CrossMAb<Vh-VL>bispecifičnih antitela sa dodatno uvedenim naelektrisanim parovima aminokiselina u interfejs CH1/CL (za detalje pogledajte položaje u odgovarajućim sekvencama) nije bilo prilagođavanja odnosa plazmida. Zbog toga je relativni odnos plazmida od 1:1:1:1 za 1+1 CrossMab ili 1:1:1 za 2+2 CrossMab korišćen za kotransfekciju LC, HC, ukrštenih LC i ukrštenih HC plazmida. Supernatanti ćelija su sakupljeni nakon 7 dana i prečišćeni standardnim postupcima.
Određivanje proteina
Koncentracija proteina u prečišćenim antitelima i derivatima određena je merenjem optičke gustine (OD) na 280 nm, pomoću koeficijenta molarne ekstinkcije izračunatog na bazi aminokiselinske sekvence prema radu Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423.
Određivanje koncentracije antitela u supernatantima
Koncentracija antitela i derivata u supernatantima ćelijske kulture je određena imunoprecipitacijom sa protein A agaroznim perlicama (Roche). 60 µl protein A agaroznih perlica je isprano tri puta u TBS-NP40 (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl,1% Nonidet-P40). Nakon toga, 1-15 ml supernatanta ćelijske kulture je naneto na perlice protein A agaroze prethodno ekvilibrisane u TBS-NP40. Nakon inkubacije tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, perlice su isprane na koloni Ultrafree-MC-filter (Amicon) jednom sa 0,5 ml TBS-NP40, dva puta sa 0,5 ml 2x fosfatnog pufera (2xPBS, Roche) i četiri puta kratko sa 0,5 ml 100 mM Na citrata pH 5,0. Vezano antitelo je eluirano dodavanjem 35 µl NuPAGE® LDS pufera za uzorak (Invitrogen). Polovina uzorka je kombinovana sa NuPAGE® sredstvom za redukciju uzorka, odnosno ostavljena neredukovana, i zagrevana 10 min na 70 °C. Nakon toga, 5-30 µl je naneto na 4-12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen) (sa MOPS puferom za neredukovani SDS-PAGE i MES puferom sa NuPAGE® antioksidansom kao aditivom za radni pufer (Invitrogen) za redukovani SDS-PAGE) i obojeno bojom Coomassie Blue.
Koncentracija antitela i derivata u supernatantima ćelijske kulture je kvantitativno merena afinitetnom HPLC hromatografijom. Ukratko, supernatanti ćelijske kulture koji sadrže antitela i derivate koji se vezuju za protein A su naneti na kolonu Applied Biosystems Poros A/20 u 200 mM KH2PO4, 100 mM natrijum citrata, pH 7,4 i eluirani sa matrice pomoću 200 mM NaCl, 100 mM limunskom kiselinom, pH 2,5 na sistemu Agilent HPLC 1100. Eluirani protein je kvantifikovan UV apsorbancom i integracijom površine pikova.
1 4
Prečišćeno standardno IgG1 antitelo je služilo kao standard.
Alternativno, koncentracija antitela i derivata u supernatantima ćelijske kulture je merena pomoću sendvič IgG ELISA. Ukratko, mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića StreptaWell High Bind Strepatavidin A (Roche) obložene su sa 100 µl/bunarčiću biotinilovanog antihumanog IgG molekula za hvatanje F(ab’)2<h-Fc γ> BI (Dianova) pri 0,1 µg/ml tokom 1 sata na sobnoj temperaturi ili alternativno preko noći na 4 °C, i nakon toga tri puta isprane sa 200 µl/bunarčiću rastvora PBS, 0,05% Tween (PBST, Sigma). 100 µl/bunarčiću serije razblaženja u PBS-u (Sigma) odgovarajućih supernatanata ćelijskih kultura koje sadrže antitelo dodato je u bunarčiće i inkubirano 1-2 sata na mućkalici za mikrotitarske ploče na sobnoj temperaturi. Bunarčići su isprani tri puta sa 200 µl/bunarčiću PBST, i vezano antitelo je detektovano sa 100 µl F(ab‘)2<hFc γ>POD (Dianova) pri 0,1 µg/ml kao antitelom za detekciju tokom 1-2 sata na mućkalici za mikrotitarske ploče na sobnoj temperaturi. Nevezano antitelo za detekciju je isprano tri puta sa 200 µl/bunarčiću PBST, i vezano antitelo za detekciju je detektovano dodatkom 100 µl ABTS/bunarčiću. Određivanje apsorbance je izvršeno na spektrometru Tecan Fluor na talasnoj dužini merenja od 405 nm (referentna talasna dužina 492 nm).
Prečišćavanje proteina
Proteini su prečišćeni iz filtriranih supernatanta ćelijske kulture prema standardnim protokolima. Ukratko, antitela su naneta na kolonu Protein A sefaroze (GE Healthcare) i isprana sa PBS. Elucija antitela je obavljena na pH 2,8, a nakon toga je odmah usledila neutralizacija uzorka. Agregatni protein je odvojen iz monomernih antitela pomoću gel hromatografije (Superdex 200; GE Healthcare) u PBS-u ili u 20 mM histidina, 150 mM NaCl, pH 6,0. Frakcije monomernih antitela su sakupljene, koncentrovane (ako je potrebno) korišćenjem npr. centrifugalnog koncentratora MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO), smrznute i uskladištene na -20 °C ili -80 °C. Deo uzoraka je obezbeđen za naknadnu analizu proteina i analitičku karakterizaciju, npr. pomoću SDS-PAGE, gel hromatografije (SEC) ili masene spektrometrije.
SDS-PAGE
Unapred pripremljeni sistem gela NuPAGE® (Invitrogen) korišćen je prema uputstvu proizvođača. Konkretno, korišćeni su 10% ili 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS unapred pripremljeni gelovi (pH 6,4) i radni pufer NuPAGE® MES (redukovani gelovi, sa NuPAGE® antioksidansom aditivom za radni pufer) ili MOPS (neredukovani gelovi).
Analitička gel hromatografija
1
Gel hromatografija (size exclusion chromatography, SEC) za određivanje agregacije i oligomernog stanja antitela izvedena je HPLC hromatografijom. Ukratko, antitela prečišćena sa proteinom A su naneta na kolonu Tosoh TSKgel G3000SW u 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7,5 na sistemu Agilent HPLC 1100 ili na koloni Superdex 200 (GE Healthcare) u 2 x PBS na HPLC sistemu Dionex. Eluirani protein je kvantifikovan UV apsorbancom i integracijom površine pikova. Standard BioRad za gel filtraciju 151-1901 poslužio je kao standard.
Masena spektrometrija
Ovaj odeljak opisuje karakterizaciju multispecifičnih antitela sa VH/VL razmenom (VH/VL CrossMab) sa naglaskom na njihovu ispravnu strukturu. Očekivane primarne strukture analizirane su elektrosprej jonizacionom masenom spektrometrijom (ESI-MS) deglikozilovanih kompletnih CrossMab i deglikozilovanih/digestovanih plazminom ili alternativno deglikozilovanih/sa ograničenom digestijom LysC CrossMab.
VH/VL CrossMab su deglikozilovani N-glikozidazom F u fosfatnom ili Tris puferu na 37 °C do 17 h pri koncentraciji proteina od 1 mg/ml. Digestija plazminom ili sa ograničenim LysC (Roche) izvedena je sa 100 µg deglikozilovanih VH/VL CrossMab u Tris puferu pH 8 na sobnoj temperaturi tokom 120 sati, odnosno na 37 °C tokom 40 minuta. Pre masene spektrometrije, so je uklonjena iz uzoraka putem HPLC na koloni Sephadex G25 (GE Healthcare). Ukupna masa je određena preko ESI-MS na sistemu maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik) opremljenom TriVersa NanoMate izvorom (Advion).
Određivanje vezivanja i afiniteta vezivanja multispecifičnih antitela za odgovarajuće antigene pomoću površinske plazmonske rezonance (SPR) (BIACORE) Vezivanje generisanih antitela za odgovarajuće antigene ispitano je površinskom plazmonskom rezonancom pomoću instrumenta BIACORE (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Švedska). Ukratko, za merenja afiniteta, antitela kozjeg anti-humanog IgG, JIR 109-005-098, imobilisana su na CM5 čipu preko kuplovanja amina za prezentaciju antitela na odgovarajući antigen. Vezivanje je mereno u HBS puferu (HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl 0,005% Tween 20, pH 7,4), 25 °C (ili alternativno na 37 °C). Antigen (R&D Systems ili interno prečišćen) je dodat u različitim koncentracijama u rastvor. Asocijacija je merena injektovanjem antigena od 80 sekundi do 3 minuta; disocijacija je merena ispiranjem površine čipa HBS puferom tokom 3-10 minuta, i KD vrednost je određena pomoću 1:1 Lengmirovog modela vezivanja. Negativni kontrolni podaci (npr. krive pufera) oduzimaju se od krive uzorka radi korekcije pomaka osnovne linije sistema i smanjenja signala šuma. Odgovarajući Biacore softver za ocenjivanje korišćen je za analizu senzorgrama i za
1
izračunavanje podataka o afinitetu.
TIM3 antitela
Primer 1a: Generisanje anti-TIM3 antitela
Imunizacija miševa
NMRI miševi su imunizovani genetski, koristeći plazmidni ekspresioni vektor koji kodira humani Tim-3 kompletne dužine, intradermalnom primenom 100 ug vektorske DNK (plazmid 15304_hTIM3-f1), a zatim elektroporacijom (2 kvadratna impulsa od 1000 V/cm, trajanje 0,1 ms, interval 0,125 s; a zatim 4 kvadratna impulsa od 287,5 V/cm, trajanje 10 ms, interval 0,125 s. Miševi su primili 6 uzastopnih imunizacija 0, 14, 28, 42, 56, 70. i 84. dana. Krv je uzeta 36, 78. i 92. dana i pripremljen je serum koji je korišćen za određivanje titra pomoću ELISA tehnike (vidi dole). Životinje sa najvišim titrima su odabrane za pojačavanje 96. dana, intravenskom injekcijom 50 ug humane Fc himere rekombinantnog humanog Tim-3, i monoklonska antitela su izolovana tehnologijom hibridoma, fuzijom splenocita u ćelijsku liniju mijeloma 3 dana nakon pojačanja.
Određivanje titra u serumu (ELISA)
Humana himera rekombinantnog humanog Tim-3 Fc je imobilisana na Maxisorp ploči sa 96 bunarčića, sa 0,3 ug/ml, 100 µl/bunarčiću, u PBS-u, nakon čega je sledila blokada ploče 2% kroteinom C u PBS-u, 200 µl/bunarčiću; primena serijskih razblaženja antiseruma, u duplikatu, u 0,5% kroteinu C u PBS-u, 100 µl/bunarčiću; detekcija sa kozjim antimišjim antitelom konjugovanim sa HRP-om (Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16 000). Za sve korake, ploče su inkubirane 1 h na 37 °C. Između svih koraka, ploče su isprane 3 puta sa 0,05% Tween 20 u PBS-u. Signal je razvijen dodavanjem rastvorljivog supstrata BM Blue POD (Roche), 100 ul/bunarčiću; i zaustavljen dodavanjem 1 M HCl, 100 ul/bunarčiću. Apsorbanca je očitana na 450 nm, nasuprot 690 nm kao referenci. Titar je definisan kao razblaženje antiseruma koje daje polumaksimalni signal.
Example1b: Karakterizacija anti-TIM3 antitela
ELISA za TIM3
Nunc-Maxi SORP streptavidinske ploče (MicroCoat kat. br. 11974998/MC1099) obložene su sa 25 µl/bunarčiću Tim3-ECD-His-biotina (biotinilovan BirA ligazom) i inkubirane na RT tokom 1 h uz mućkanje pri rotaciji od 400 o/min. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST pufera), 25 μl uzoraka aTim3 ili razblaženog (koraci 1:2) referentnog antitela aTim3 F38-2E2 (Biolegend) je dodato i inkubirano 1 h na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST pufera), dodato je 25 µl/bunarčiću ovčjeg antimišjeg-POD (GE NA9310V) u razblaženju 1:9000 i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 1 h uz
1
mućkanje i rotaciju od 400 o/min. Posle ispiranja (4x90 μl/bunarčiću PBST pufera) dodato je 25 μl/bunarčiću TMB supstrata (Calbiochem, kat. br. CL07) i inkubirano do OD 1,5 - 2,5. Tada je reakcija zaustavljena dodavanjem 25 µl /bunarčiću 1 N rastvora HCl. Merenje je izvršeno na 370/492 nm.
Rezultati ELISA testa navedeni su kao vrednosti EC50[ng/ml] u zbirnoj Tabeli 1 u nastavku.
Ćelijska ELISA za TIM3
Adherentna CHO-K1 ćelijska linija stabilno transficirana plazmidom 15312_hTIM3-fl_pUC_Neo kodiranjem za humani Tim3 pune dužine i selekcijom sa G418 (marker otpornosti na neomicin na plazmidu) zasejana je u koncentraciji od 1,2x10E6 ćelija/ml na ploče sa ravnim dnom sa 384 bunarčića i uzgajana preko noći.
Sledećeg dana, dodato je 25 μl/bunarčiću uzorka Tim3 ili referentnog antitela za aTim3 F38-2E2 bez azida (Biolegend, 354004) i inkubirano 2 h na 4 °C (kako bi se izbegla internalizacija). Posle ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST (BIOTEK Washer: Prog. 29, µl x 90) ćelije su fiksirane izbacivanjem zaostalog pufera i dodavanjem 50 µl/bunarćiću 0,05% glutaraldehida: Razblaživanje 1:500 25% glutaraldehida (Sigma kat. br.: G5882) u 1xPBS-puferu i inkubirane 1 h na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST (BIOTEK Washer: Prog. 21, 3x90 GreinLysin) dodato je 25 μl/bunarčiću sekundarnog antitela za detekciju (ovčiji antimišji-POD; F(ab')2fragment povezan sa POD rena; GE NA9310), a nakon toga je obavljena inkubacija tokom 2 h na sobnoj temperaturi uz mućkanje pri rotaciji od 400 o/min. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST (BIOTEK Washer: Prog.
21, 3x90 GreinLysin), dodato je 25 μl/bunarćiću, TMB rastvora supstrata (Roche 11835033001) i vršena je inkubacija do OD 1,5-2,5. Tada je reakcija zaustavljena dodavanjem 25 μl/bunarčiću 1 N rastvora HCl. Merenje je izvršeno na 370/492 nm.
Rezultati ELISA za ćelije su navedeni kao vrednosti „EC50CHO-Tim3“ [ng/ml] u zbirnoj Tabeli 1 u nastavku.
1
Tabela 1: Afinitet vezivanja primera antitela (ELISA i BIACORE)
BIAcore karakterizacija antitela TIM3
Testovi zasnovani na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR) korišćeni su za određivanje kinetičkih parametara vezivanja između nekoliko mišjih vezivača Tim3 kao i komercijalnih referenci za vezivanje humanog Tim3. Zbog toga je anti-mišji IgG imobilisan vezivanjem amina za površinu (BIAcore) CM5 senzorskog čipa. Zatim su uzeti uzorci, a za njih je vezan monomerni hu/cy Tim3-ECD kao i Fc-označeni humani Tim3-ECD dimer. Površina senzorskog čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa analize. Konstanta ravnoteže KDje konačno dobijena uklapanjem podataka u model 1:1 Lengmirove interakcije.
Oko 12.000 jedinica odgovora (RU) 30 µg/ml antimišjeg IgG (GE Healthcare kat. br. BR-1008-38) vezano je za tačke 1,2,4 i 5 protočnih ćelija 1-4 (tačke 1,5 su aktivne, a tačke 2,4 su referentne tačke) CM5 senzorskog čipa u BIAcore B4000 na pH 5,0 pomoću kompleta za kuplovanje amina koji isporučuje GE Healthcare.
Pufer za uzorak i radni pufer je HBS-EP+ (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfaktant P20, pH 7,4). Temperatura protočne ćelije je podešena na 25 °C, a temperatura odeljka sa uzorkom na 12 °C. Sistem je prajmovan radnim puferom.
Uzorci su injektovani 30 sekundi sa koncentracijom od 200 µg/ml i vezani za tačke 1 i 5 svake protočne ćelije, što je omogućilo merenje osam uzoraka paralelno. Zatim je injektovan komplet različitih koncentracija (monomerni cino, monomerni humani i huFc sjedinjeni dimerni humani Tim3-ECD) u svaki uzorak tokom 240 s, nakon čega sledi vreme disocijacije od 30/1800 s. Svaki ciklus analize (uzimanje uzoraka, tačke 1 i 5-injekcija Tim3 ECD) se zatim regeneriše injekcijom glicina-HCl pH 1,7, dugom 30 sekundi. Protok je postavljen na 30 µl/min tokom celog perioda.
Konačno, dvostruki referentni podaci su uklopljeni u model Lengmirove
1
interakcije1:1 pomoću BIAcore B4000 softvera za procenu. Rezultujući afiniteti prema monomernom humanom, cino Tim3 i HuFc fuzionisanom dimernom humanom Tim3 su prikazani u tabeli 2a. Na afinitet prema Hu Tim3 dimeru najverovatnije utiče avidnost, i zato je prividno jači od afiniteta prema monomernom huTim3.
Tabela 2a: Afiniteti vezivanja određeni BIAcore-KD vrednostima dobijenim kinetičkim SPR merenjima. -n.f. znači da nije moguće postavljanje, najverovatnije zbog nevezivanja ili slabog vezivanja.
Određivanje afiniteta prema Tim3 pomoću SPR (himerna varijanta TIM3-0016 (0018) i humanizovane verzije)
Protein A je imobilisan vezivanjem amina za površinu (Biacore) CM5 senzorskog čipa. Uzorci su tada uhvaćeni i hu Tim3-ECD je vezan za njih. Površina senzorskog čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa analize. Konstanta ravnoteže i kinetičke konstante brzine konačno su dobijene prilagođavanjem podataka Lengmirovom modelu interakcije 1:1.
Oko 2000 jedinica odgovora (RU) od 20 µg/ml proteina A je vezano za tačke 1, 2, 4 i
11
5 svih protočnih ćelija CM5 senzorskog čipa na instrumentu Biacore B4000 pomoću kompleta za kuplovanje amina koji isporučuje GE Healthcare.
Pufer za uzorak i radni pufer je HBS-EP+ (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfaktant P20, pH 7,4). Temperatura protočne ćelije je podešena na 25 °C, a temperatura odeljka sa uzorkom na 12 °C. Sistem je prajmovan radnim puferom.
Različiti uzorci su injektovani u trajanju od 30 sekundi sa koncentracijom od 10 nM i vezani uzastopno za tačke 1 i 5 u svim protočnim ćelijama. Zatim je kompletan skup razblaženja monomernih humanih Tim3-ECD (600 nM, 200 nM, 66,7 nM, 2 x 22,2 nM, 7,4 nM, 2,5 nM i 2 x 0 nM) uzastopno injektovan u svaki uzorak u trajanju od 300 s. Nakon svakog injektovanja antigena usledilo je vreme disocijacije od 12 s/1000 s i dva koraka regeneracije od 30 s rastvorom glicin-HCl pH 1,5, od kojih je poslednji obuhvatao period stabilizacije nakon injektovanja od 20 sekundi.
Konačno, dvostruki referentni podaci su uklopljeni u Lengmirov model interakcije 1:1 koristeći Biacore B4000 softver za procenu. Rezultujuće vrednosti KDsu prikazane u Tabeli 2b.
Određivanje afiniteta prema Tim3 putem SPR ((himerni TIM3-0028 i humanizovane verzije))
Anti-humani Fc IgG je imobilisan vezivanjem amina za površinu (Biacore) CM5 senzorskog čipa. Uzorci su tada uhvaćeni i hu Tim3-ECD je vezan za njih. Površina senzorskog čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa analize. Konstanta ravnoteže i kinetičke konstante brzine konačno su dobijene prilagođavanjem podataka Lengmirovom modelu interakcije 1:1.
Oko 2500 jedinica odgovora (RU) od 10 µg/ml anti-humanog Fc IgG (GE Healthcare kat. br. BR-1008-39) vezano je za tačke 1, 2, 4 i 5 svih protočnih ćelija CM5 senzorskog čipa u Biacore B4000 instrumentu pomoću kompleta za kuplovanje amina koji isporučuje GE Healthcare.
Pufer za uzorak i radni pufer je HBS-EP+ (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfaktant P20, pH 7,4). Temperatura protočne ćelije je podešena na 25 °C, a temperatura odeljka sa uzorkom na 12 °C. Sistem je prajmovan radnim puferom.
Različiti uzorci su injektovani u trajanju od 30 sekundi sa koncentracijom od 10 nM i vezani uzastopno za tačke 1 i 5 u svim protočnim ćelijama. Zatim je kompletan skup razblaženja monomernih humanih Tim3-ECD (600 nM, 200 nM, 66,7 nM, 2 x 22,2 nM, 7,4 nM, 2,5 nM i 2 x 0 nM) uzastopno injektovan u svaki uzorak u trajanju od 300 s. Nakon svakog injektovanja antigena usledilo je vreme disocijacije od 12 s/700 s i dva koraka regeneracije od 30 s 3 M rastvorom MgCl2, od kojih poslednji sadrži „dodatno ispiranje posle injektovanja“ radnim puferom.
Konačno, dvostruki referentni podaci su uklopljeni u Lengmirov model interakcije 1:1 koristeći Biacore B4000 softver za procenu. Rezultujuće vrednosti K<D>su prikazane u Tabeli 2b.
Tabela 2b: Afiniteti vezivanja određeni BIAcore-KD vrednostima dobijenim kinetičkim SPR merenjima
Primer 2: Generisanje derivata anti-TIM3 antitela
Derivati himernih antitela
Himerna Tim3 antitela su generisana amplifikacijom varijabilnih regiona teškog i lakog lanca mišjih antitela anti-TIM3 Tim3-0016, varijante Tim3-0016 (0018), Tim3-0021, Tim3-0022, Tim3-0026, Tim3-0028, Tim3-0030, i Tim3-0033, Tim3-0038 putem PCR-a i njihovim kloniranjem u ekspresione vektore teškog lanca kao fuzione proteine sa humanim IgG1 skeletom / humanim CH1-šarka-CH2-CH3 sa LALA i PG mutacijama (leucin 234 u alanin, leucin 235 u alanin, prolin 329 u glicin) ukidajući efektorske funkcije i ekspresione vektore lakog lanca kao fuzione proteine za humani C-kapa. LC i HC plazmidi su zatim kotransficirani u HEK293 i prečišćeni nakon 7 dana iz supernatanta standardnim postupcima za prečišćavanje antitela.
Uklanjanje mesta glikozilacije NYT: Izmena 1 HVR-L1 položaja u Tim3-0016, varijanti Tim3_0016 (nazvana 0018 ili Tim3_0018) supstitucijom N sa Q ili S Mutacije u varijabilnom regionu lakog lanca u Tim3_0016 i varijanti Tim3_0016 (0018) generisane su in vitro mutagenezom koristeći „Quick Change Lightning komplet za mutagenezu dirigovanu mestom“ kompanije Agilent prema uputstvu proizvođača. Ovom metodom je asparagin (N) mesta glikozilacije sa motivom NYT u lakom lancu HVR-L1 (SEQ ID NO: 4) zamenjen glutaminom (Q) (što daje SEQ ID NO: 11 = Tim3_0016_HVR-L1 varijanta 1_NQ) ili, alternativno, asparagin (N) je zamenjen serinom (S) (što daje SEQ ID NO: 12 = Tim3_0016_HVR-Ll varijanta 2_NS). U oba je uspešno modifikovan motiv mesta glikozilacije NYT. LC i HC plazmidi, koji kodiraju varijante, zatim su kotransficirani u HEK293 i prečišćeni nakon 7 dana iz supernatanta standardnim postupcima za prečišćavanje antitela.
Generisani mutanti su testirani ELISA testom na humanom Tim3, ELISA testom na Tim3 cinomolgusa i ćelijskim ELISA testom na adhezivnim ćelijama CHO-K1 koje eksprimiraju humani Tim3 pune dužine.
Tabela 3:
Otkriveno je da svi generisani mutanti pokazuju čak funkcionalnije vezivanje za humani TIM3 (human), cino TIM3 (cyno) ili humani TIMR na CHO ćelijama nego matična antitela Tim3_0016 ili varijanta Tim3_0016 antitela Tim3_0018.
Humanizovani derivati antitela
Humanizacija VH i VL domena mišje anti-Tim3-0016 varijante (0018) i anti-Tim3_0028
Na osnovu aminokiselinske sekvence VH i VL domena a) anti-Tim3 antitela varijante Tim3_0016 (0018) (sa aminokiselinskim sekvencama 6 HVR-a, pri čemu su u lakom lancu
11
HVR-L1 varijanta 2_NS (uklanjanje mesta glikozilacije pomoću mutacije N u S) korišćena humanizovana anti-Tim3 antitela varijante Tim3-0433 i Tim3-0434 generisana i zasnovana na aminokiselinskom nizu VH i VL domena b) anti-Tim3 antitela Tim3_0028 generisane su humanizovane varijante anti-Tim3 antitela Tim3-0438 i Tim3-0443.
Humanizovane sekvence aminokiselina za varijabilne regione teškog i lakog lanca su prevedene natrag u DNK, i rezultujuće cDNK su sintetisane (GenArt) i zatim klonirane u ekspresione vektore teških lanaca kao fuzioni proteini sa humanim IgG1 skeletom/humanim CH1-šarka-CH2-CH3 sa LALA i PG mutacijama (leucin 234 u alanin, leucin 235 u alanin, prolin 329 u glicin) ukidajući efektorske funkcije ili u ekspresione vektore lakog lanca kao fuzione proteine za humani C-kapa. LC i HC plazmidi su zatim kotransficirani u HEK293 i prečišćeni nakon 7 dana iz supernatanta standardnim postupcima za prečišćavanje antitela. Dobijena humanizovana Tim3-antitela su imenovana kao što sledi:
Tabela 4: VH i VL sekvence humanizovanih antitela
Tabela 5: HVR sekvence humanizovanih antitela
Primer 3: Uticaj humanih anti-TIM-3 antitela na proizvodnju citokina u mešanoj limfocitnoj reakciji (MLR)
Mešana limfocitna reakcija je korišćena da se pokaže efekat blokiranja TIM-3 puta do efektorskih ćelija limfocita. T ćelije u ispitivanju su testirane na aktiviranje i lučenje IFN-gama u prisustvu ili odsustvu anti-TIM-3 mAb.
Humani limfociti su izolovani iz periferne krvi zdravog donora centrifugiranjem sa gradijentom gustine pomoću leukosepa (Greiner Bio One, 227288). Ukratko, heparinizovana krv je razblažena trostrukom zapreminom PBS-a, i 25 ml alikvota razblažene krvi je raslojeno u leukosep epruvetama od 50 ml. Posle centrifugiranja na 800 x g tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi (bez prekida), frakcije koje sadrže limfocite su sakupljene, isprane PBS-om i direktno korišćene u funkcionalnom testu ili ponovo suspendovane u medijumu za smrzavanje (10% DMSO, 90% FCS) sa 1,0E 07 ćelija/ml i skladištene u tečnom azotu. Odnos ciljne ćelije/ćelije respondera 1:1 korišćen je u testu MLR (tj. svaka MLR kultura je sadržala - 2,0E+05 PBMC svakog donora u ukupnoj zapremini od 200 pi. Anti-TIM3 monoklonska antitela Tim3_0016, varijanta Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028, Tim3_0030, Tim3_0033, Tim3_0038 i F38-2E2 (BioLegend) dodata su svakoj kulturi u različitim koncentracijama antitela. Nijedno antitelo ili antitelo za kontrolu izotipa nije korišćeno kao negativna kontrola, i rec hu IL-2 (20 EU/ml) je korišćen kao pozitivna kontrola. Ćelije su uzgajane 6 dana na 37 °C. Nakon 6. dana, uzeto je 100 pi medijuma iz svake kulture za merenje citokina. Nivo IFN-gama je izmeren korišćenjem kompleta OptEIA ELISA (BD Biosciences).
Rezultati su prikazani u Tabeli 6 (izlučivanje/oslobađanje IFN-g). Anti-TIM-3 monoklonska antitela podstiču aktivaciju T ćelija i lučenje IFN-gama na način zavisan od koncentracije. Anti-TIM3 antitela Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0028 i Tim3_0038 smanjuju oslobađanje inflamatornog citokina IFN-gama više nego F38-2E2 antitelo. Tim3_0016, varijanta Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0033 i Tim3_0038 su pokazali slično oslobađanje u poređenju sa antitelom F38-2E2. Nasuprot tome, kulture koje sadrže antitelo za kontrolu izotipa nisu pokazale povećanje sekrecije IFN-gama.
Tabela 6a: Procenat oslobađanja IFNgama antitela izazvanog Tim3 antitelom u odnosu na rec hu IL-2 (20 EU/ml) (= 100 %) kao pozitivnu kontrolu i bez antitela kao negativnu kontrolu
11
U daljim eksperimentima izmerene su EC50 vrednosti sledećih himernih i humanizovanih antitela (generisanih kako je gore opisano) u kombinaciji sa 0,1 µg/ml anti-PD1 mAb: himerno antitelo chi_Tim3_018 i njegove humanizovane verzije Tim3-433 i Tim3-434, himerno chi_Tim3_028 antitelo i njegove humanizovane verzije Tim3-438 i Tim3-443 su izmereni sa različitim smešama limfocita donora (D2 i D3, odnosno D1 i D5) Rezultati su prikazani u Tabeli 6b.
Tabela 6b: EC50indukovanih anti-Tim3 antitela (izlučivanje/oslobađanje IFN-g)
PD1 antitela
Primer 4: Generisanje anti-PD-1 antitela
Imunizacija miševa
NMRI miševi su imunizovani genetski, koristeći plazmidni ekspresioni vektor koji kodira humani PD-1 kompletne dužine, intradermalnom primenom 100 ug vektorske DNK (plasmid15300_hPD1-fl), a zatim elektroporacijom (2 kvadratna impulsa od 1000 V/cm, trajanje 0,1 ms, interval 0,125 s; a zatim 4 kvadratna impulsa od 287,5 V/cm, trajanje 10 ms, interval 0,125 s. Miševi su primili 6 uzastopnih imunizacija 0, 14, 28, 42, 56, 70. i 84. dana. Krv je uzeta 36, 78. i 92. dana i pripremljen je serum koji je korišćen za određivanje titra pomoću ELISA tehnike (vidi dole). Životinje sa najvišim titrima su odabrane za pojačavanje 96. dana, intravenskom injekcijom 50 ug humane Fc himere rekombinantnog humanog PD1, i monoklonska antitela su izolovana tehnologijom hibridoma, fuzijom splenocita u ćelijsku liniju mijeloma 3 dana nakon pojačanja.
Određivanje titra u serumu (ELISA)
Humana himera rekombinantnog humanog PD1 Fc je imobilisana na NUNC Maxisorp ploči sa 96 bunarčića, sa 0,3 ug/ml, 100 ul/bunarčiću, u PBS-u, nakon čega je sledila blokada ploče 2% kroteinom C u PBS-u, 200 ul/bunarčiću; primena serijskih
11
razblaženja antiseruma, u duplikatu, u 0,5% kroteinu C u PBS-u, 100 ul/bunarčiću; detekcija sa kozjim antimišjim antitelom konjugovanim sa HRP-om (Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16000). Za sve korake, ploče su inkubirane 1 sat na 37 °C. Između svih koraka, ploče su isprane 3 puta sa 0,05% Tween 20 u PBS-u. Signal je razvijen dodavanjem rastvorljivog supstrata BM Blue POD (Roche), 100 ul/bunarčiću; i zaustavljen dodavanjem 1 M HC1, 100 ul/bunarčiću. Apsorbanca je očitana na 450 nm, nasuprot 690 nm kao referenci. Titar je definisan kao razblaženje antiseruma koje daje polumaksimalni signal.
Primer 5: Karakterizacija anti-PD1 antitela / vezivanje anti-PD1 antitela za humani PD1
ELISA za hu PD1
Nunc maxisorp pločice presvučene streptavidinom (MicroCoat kat. br.11974998001) presvučene su sa 25 µl/bunarčiću biotinilovanog PD1-ECD-AviHis i inkubirane su na 4 °C preko noći. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 pi uzoraka anti PD1 ili referentnog antitela (humani anti PD1; Roche/mišji anti PD1; Biolegend; kat.
329912) i inkubirano je 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl/bunarčiću kozjeg antihumanog H+L-POD (JIR, JIR109-036-088)/ ovčjeg antimišjeg-POD (GE Healthcare; NA9310) u razblaženju 1:2000/1:1000 i inkubirano je 1 sat na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Nakon ispiranja (3x90 pl/bunarčiću sa PBST puferom) dodato je 25 μl/bunarčiću TMB supstrata (Roche, kat. br.11835033001) i vršena je inkubacija do OD 2-3. Merenje je izvršeno na 370/492 nm.
Rezultati ELISA testa su navedeni kao EC50-vrednosti [ng/ml] u zbirnim tabelama 7 i 8 u nastavku.
Ćelijska ELISA za PD1
Adherentna CHO-K1 ćelijska linija stabilno transficirana plazmidom 15311 hPD1 _fl_pUC_Neo kodiranjem za humani PD1 pune dužine i selekcijom sa G418 (marker otpornosti na neomicin na plazmidu) zasejana je u koncentraciji od 0,01x10E6 ćelija/bunarčiću na ploče sa ravnim dnom sa 384 bunarčića i uzgajana preko noći.
Sledećeg dana je dodato 25 µl/bunarčiću uzorka PD1 ili humanog anti PD1 (Roche)/mišjeg anti PD1 (Biolegend; kat.329912) referentnog antitela i inkubirano je 2 h na 4 °C (da bi se izbegla internalizacija). Nakon pažljivog ispiranja (1x90 µl/bunarčiću PBST) ćelije su fiksirane dodavanjem 30 µl/bunarčiću 0,05% glutaraldehida (Sigma, kat. br.: G5882, 25%) razblažene u 1xPBS-puferu i inkubirane 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST) dodato je 25 μl/bunarčiću sekundarnog antitela za
11
detekciju: kozjeg antihumanog H+L-POD (JIR, JIR109-036-088)/ovčjeg antimišjeg-POD (GE NA9310) nakon čega je sledio 1 h inkubacije na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST), dodat je rastvor supstrata TMB od 25 µ/bunarčiću (Roche 11835033001) i vršena je inkubacija do OD 1,0 - 2,0. Ploče su izmerene na 370/492 nm.
Rezultati ćelijskog testa ELISA su navedeni kao vrednosti „EC50 CHO-PD1“ [ng/ml] u zbirnoj tabeli 8 u nastavku.
ELISA za cino PD1
Nunc maxisorp pločice presvučene streptavidinom (MicroCoat kat. br.11974998001) presvučene su sa 25 µl/bunarčiću biotinilovanog cinoPD1-ECD-biotina i inkubirane su na 4 °C preko noći. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl uzoraka anti PD1 ili referentnog antitela (humanog anti PD1; Roche) i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl/bunarčiću kozjeg antihumanog H+L-POD (JIR, JIR109-036-088) u razblaženju 1:1000 i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST-puferom) dodato je 25 μl/bunarčiću TMB supstrata (Roche, 11835033001) i inkubirano je do OD 2 – 3. Merenje je izvršeno na 370/492 nm.
Rezultati ELISA testa su navedeni kao EC50-vrednosti [ng/ml] u zbirnoj Tabeli 7 i 8 u nastavku.
Test sa zamenom PD liganda 1
Nunc maxisorp pločice presvučene streptavidinom (MicroCoat kat. br.11974998001) presvučene su sa 25 µl/bunarčiću biotinilovanog PD1-ECD-AviHis i inkubirane su na 4 °C preko noći. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl uzoraka anti PD1 ili referentnog antitela (mišjeg anti PD1; Biolegend; kat.329912) i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl/bunarčiću PD-L1 (rekombinantnog humanog B7-H1/PD-L1 Fc himera; 156-B7, R&D) i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl/bunarčiću kozjeg antihumanog H+L-POD (JIR, 109-036-088) u razblaženju 1:1000 i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST-puferom) dodato je 25 μl/bunarčiću TMB supstrata (Roche, 11835033001) i inkubirano je do OD 2 – 3. Merenje je izvršeno na 370/492 nm.
Rezultati ELISA testa navedeni su kao vrednosti EC50[ng/ml] u zbirnoj Tabeli 7 u nastavku.
Test sa zamenom PD liganda 2
11
Nunc maxisorp pločice presvučene streptavidinom (MicroCoat kat. br.11974998001) presvučene su sa 25 µl/bunarčiću biotinilovanog PD1-ECD-AviHis i inkubirane su na 4 °C preko noći. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl uzoraka anti PD1 ili referentnog antitela (mišji anti huPD1; Roche) i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl/bunarčiću PD-L2 (rekombinantnog humanog B7-DC/PD-L2 Fc himera; 1224-PL-100, R&D) i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl/bunarčiću kozjeg antihumanog H+L-POD (JIR, 109-036-088) u razblaženju 1:2000 i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST-puferom) dodato je 25 μl/bunarčiću TMB supstrata (Roche, 11835033001) i inkubirano je do OD 2 – 3. Merenje je izvršeno na 370/492 nm.
Rezultati ELISA testa navedeni su kao vrednosti EC50[ng/ml] u zbirnoj Tabeli 7 u nastavku.
Mapiranje epitopa ELISA / test konkurentskog vezivanja
Nunc maxisorp ploče (Nunc kat. br. 464718) presvučene su sa sa 25 μl/bunarčiću antitela za hvatanje (kozjeg anti mišjeg IgG; JIR; 115-006-071) i inkubirane su 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 μl/bunarčiću) ploče su blokirane tokom 1 h sa 2% BSA koji sadrži PBS pufer, na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl mišjih anti PD1 uzoraka i inkubirani su 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) antitelo za hvatanje je blokirano sa 30 μl/bunarčiću mišjeg IgG (JIR; 015-000-003) tokom 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. U isto vreme, biotinilovani PD1-ECD-AviHis je predinkubiran sa drugim uzorkom antitela tokom 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Nakon ispiranja test ploče (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću), mešavina PD1 antitela je prebačena na test ploču i inkubirana je na sobnoj temperaturi 1 h, na mućkalici. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl/bunarčiću streptavidina POD (Roche, kat. br. 11089153001) u razblaženju 1:4000 i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST puferom) dodato je 25 μl/bunarčiću TMB supstrata (Roche, kat. br. 11089153001) i inkubirano je do OD 1,5 – 2,5. Merenje je izvršeno na 370/492 nm. Epitopske grupe su definisane hijerarhijskim grupisanjem prema referentnim antitelima.
11
Tabela 7: Vezivanje, inhibicija PD-L1 i grupe regiona epitopa primera antitela (ELISA)
Tabela 8: Biohemijsko i ćelijsko vezivanje humanizovanih PD1 antitela izvedenih iz matičnog mišjeg antitela PD1-0103 (ELISA).
Biacore karakterizacija humanizovanih anti-PD-1 antitela
Testovi zasnovani na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR) korišćeni su za određivanje kinetičkih parametara vezivanja između nekoliko mišjih vezivača PD1 kao i komercijalnih referenci za vezivanje humanog PD1. Zbog toga je antihumani IgG imobilisan vezivanjem amina za površinu (Biacore) CM5 senzorskog čipa. Uzorci su tada uhvaćeni i hu PD1-ECD je vezan za njih. Površina senzorskog čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa
12
analize. Konstanta ravnoteže i kinetičke konstante brzine konačno su dobijene prilagođavanjem podataka Lengmirovom modelu interakcije 1:1.
Oko 2000 jedinica odgovora (RU) od 20 µg/ml antihumanog IgG (GE Healthcare kat. br. BR-1008-39) vezano je na protočne ćelije 1 i 2 (alternativno: 3 i 4) CM5 senzorskog čipa u Biacore T200 na pH 5,0 korišćenjem kompleta za kuplovanje amina koji isporučuje GE Healthcare.
Pufer za uzorak i radni pufer je HBS-EP+ (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfaktant P20, pH 7,4). Temperatura protočne ćelije je podešena na 25 °C, a temperatura odeljka sa uzorkom na 12 °C. Sistem je prajmovan radnim puferom.
Uzorci su injektovani u trajanju od 20 sekundi sa koncentracijom od 10 nM i vezani su za drugu protočnu ćeliju. Zatim je injektovan kompletni skup humanih koncentracija PD1-ECD (144 nM, 48 nM, 16 nM, 5,33 nM, 1,78 nM, 0,59 nM, 0,20 nM i 0 nM) u svaki uzorak tokom 120 s, nakon čega je usledilo vreme disocijacije od 30/300 s i dva koraka regeneracije od 20 s sa 3 M MgCl2, od kojih poslednji sadrži „dodatno ispiranje nakon injektovanja“ sa radnim puferom.
Na kraju, dvostruki referentni podaci su uklopljeni u model 1:1 Lengmirove interakcije pomoću Biacore T200 softvera za procenu. Rezultujuće<VREDNOSTI>K<D>,<K>A<I K>Dsu prikazane u Tabeli 9.
Tabela 9: Kinetičke konstante brzine i konstanta ravnoteže za himerni PD1-0103 i humanizovana PD1-Ab određenih pomoću Biacore.
Kao što je prikazano u Tabeli 9, sve humanizovane verzije himernog PD1-0103 (za generisanje videti primer 6) pokazuju kinetička svojstva slična matičnim antitelima (himerni PD1-0103).
Kinetika
CM5 senzor serije S je ugrađen u sistem Biacore 4000 i tačke detekcije su hidrodinamički obrađene prema uputstvu proizvođača.
Poliklonsko zečje IgG antitelo <IgGFC γM>R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) imobilisano je sa 10000 Ru na tačkama detekcije 1 i 5 u protočnim ćelijama 1,2,3 i 4. Spajanje je obavljeno EDC/NHS hemijom prema uputstvu proizvođača. Preostale tačke u protočnim ćelijama su poslužile kao referenca. Pufer za uzorak je bio sistemski pufer dopunjen sa 1 mg/ml karboksimetil dekstrana.
U jednom otelotvorenju, test je vođen na 25 °C. U drugom otelotvorenju, test je vođen na 37 °C. 50 nM svakog mišjeg monoklonskog antitela je uhvaćeno na površini senzora injekcijom od 1 min pri 10 µl/min. Potom su odgovarajući antigeni injektovani u koncentracionim serijama od 100 nM, 2x 33 nM, 11 nM, 4 nM, 1 nM i sistemskom puferu 0 nM pri 30 μl/min tokom 4 min faze asocijacije. Disocijacija je praćena još 4 min. Sistem za hvatanje je regenerisan upotrebom injektovanja 10 mM glicina pH 1,5 pri 30 µl/min tokom 3 min. Relevantni kinetički podaci su izračunati pomoću Biacore softvera za ocenjivanje prema uputstvu proizvođača.
Mapiranje epitopa
Instrument Biacore 4000 je montiran sa Biacore CAP senzorom i pripremljen je prema preporukama proizvođača. Pufer za instrument je bio HBS-ET pufer (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% m/v Tween 20). Instrument je radio na 25 °C.
Svi uzorci su razblaženi u sistemskom puferu. Biotinilovani antigen PD1-ECD-AviHis od 35 kDa je uhvaćen pri 200 RU na površini senzora CAP injektovanjem tokom 1 min pri 30 µl/min u protočnim ćelijama 1, 2, 3 i 4, na tačkama 1 i 5. Tačke 2, 3 i 4 su poslužile kao referenca. U drugom otelotvorenju, biotinilovani antigen od 35 kDa PD1-ECD-AviHis je uhvaćen pri 200 RU na CAP senzoru na isti način.
Potom je injektovano primarno antitelo na 100 nM tokom 3 min pri 30 µl/min, nakon čega je usledilo injektovanje sekundarnog antitela na 100 nM tokom 3 min pri 30 µl/min. Primarno antitelo je injektovano do potpunog zasićenja površinski predstavljenog antigena. Na kraju faze injektovanja primarnog i sekundarnog antitela postavljene su tačke „Kasnog vezivanja“ (BL) za praćenje odgovora na vezivanje odgovarajućih antitela. Izračunat je molski odnos, količnik između odgovora na vezivanje sekundarnog antitela „BL2“ i odgovora primarnog antitela „BL1“. Molski odnos je korišćen kao indikator pristupačnosti antigena sekundarnom antitelu, kada je antigen već bio kompleksiran primarnim antitelom.
Kompleksi su u potpunosti uklonjeni sa površine senzora injektovanjem tokom 2 min pri 30 μl/min 2M gvanidin-HCL 250 mM NaOH pufera za regeneraciju prema preporuci proizvođača, nakon čega je usledilo injektovanje od 1 min pri 30 μl/min sistemskog pufera.
Primer 6: Uticaj različitih anti-PD-1 antitela na proizvodnju citokina u mešanoj limfocitnoj reakciji (MLR)
3A) Mešana limfocitna reakcija (MLR) je test imunih ćelija koji meri aktivaciju limfocita od jedne jedinke (donor X) do limfocita druge jedinke (donor Y). Mešana limfocitna reakcija je korišćena da se pokaže efekat blokiranja PD1 puta do efektorskih ćelija limfocita. T ćelije u ispitivanju su testirane na aktiviranje i njihovo lučenje IFN-gama u prisustvu ili odsustvu anti-PD1 mAb.
Da bi se izveo alogeni MLR, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) najmanje četiri zdrava donora nepoznatog tipa HLA su izolovane centrifugiranjem sa gradijentom gustine pomoću Leukosep epruveta (Greiner Bio One, 227 288). Ukratko, heparinizovani uzorci krvi su razblaženi trostrukom zapreminom PBS-a, i 25 ml alikvota razblažene krvi je raslojeno u leukosep epruvetama od 50 ml. Posle centrifugiranja na 800 x g tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi (bez prekida), frakcije koje sadrže limfocite su sakupljene, isprane PBS-om i direktno korišćene u funkcionalnom testu ili ponovo suspendovane u medijumu za smrzavanje (10% DMSO, 90% FCS) sa 1,0E 07 ćelija/ml i skladištene u tečnom azotu. Pojedinačne dvosmerne MLR reakcije su postavljene mešanjem PBMC od dva različita donora u odnosu 1:1 stimulator / reagujuća ćelija, a zajedničke kulture su rađene najmanje u dva primerka na pločicama sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, tokom 6 dana na 37 °C, 5% CO2, u prisustvu, ili bez, različitog opsega koncentracije prečišćenih anti-PD1 monoklonskih antitela PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103. Kao referentna anti-PD1 antitela, antitela koja sadrže VH i VL domene bilo nivoalumaba (poznatog i kao MDX-5C4 ili MDX-1106) ili pembrolizumaba (poznatog i kao MK-3475 ili Org 1.09A) sintetizovana su i klonirana sa skeletima humanog IgG1 (sa mutacijama L234A, L235A i P329G (Kabatov EU indeks)). Nijedno antitelo ili antitelo za kontrolu izotipa nije korišćeno kao negativna kontrola, i rec hu IL-2 (20 EU/ml) je korišćen kao pozitivna kontrola. Nakon 6 dana uzeto je 100 µl medijuma iz svake kulture za merenje citokina. Nivo IFN-gama je izmeren korišćenjem kompleta OptEIA ELISA (BD Biosciences).
Rezultati su prikazani u Tabeli 10 (izlučivanje/oslobađanje IFN-g). Anti-PD1 monoklonska antitela podstiču aktivaciju T ćelija i lučenje IFN-gama na način zavisan od koncentracije. Vrednost % povećanja sekrecije IFNg je izračunata u odnosu na IFN-g proizvodnju MLR bez dodavanja bilo kojeg blokirajućeg mAb (vrednost bazalne alogene stimulacije indukovane IFNg kao E-c) i MLR uz dodavanje 20 EU/ml rec hu IL-2 (pozitivna kontrola = 100% vrednost IFNg kao E+c) i izračunata je prema formuli: Rel. stimulacija [%] = ((Esampel - E-c)/(E+c - E-c)* 100
12
Tabela 10: Procenat izlučivanja IFN gama nakon alogene stimulacije i tretmana anti-PD-1 antitelom u poređenju sa efektom tretmana rekombinantnim humanim IL-2 (20 EU/ml) (= 100% porast) kao pozitivne kontrole
Nekoliko antitela koja blokiraju PD1, PD1-0050, PD1-0069, PD1-0073, PD1-0078, PD1-0098, PD1-0102, PD1-0103 je pokazalo snažnu imunomodulacionu aktivnost pojačavanjem izlučivanja interferona-gama (IFN-g) (podaci nisu prikazani za sva antitela).
3B) U daljem eksperimentu je procenjen himerni PD1-0103 (humani izotip IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G (Kabatov EU indeks)). Blokada PD1 himernim PD1-0103 jako pojačava izlučivanje IFN-gama alogeno stimulisanim primarnim humanim T ćelijama. Himerni PD1-0103 je potentniji od referentnih anti-PD1 antitela (vidi Sliku 1).
Za poređenje, referentna anti-PD1 antitela, antitela koja sadrže VH i VL domene bilo nivoalumaba (poznatog i kao MDX5C4 ili MDX-1106) i pembrolizumaba (poznatog i kao MK-3475 ili Org 1.09A) sintetizovana su i klonirana sa skeletima humanog IgG1 (sa mutacijama L234A, L235A i P329G (Kabatov EU indeks)).
3C) U dodatnim eksperimentima, imunomodulaciona aktivnost humanizovanih varijanti anti-PD-1 antitela PD1-0103 (humanizovana antitela PD1-0103-0312, PD1-0103-0314, na Slikama 2 i 3, vidi takođe u nastavku Primer 9) pod a) otpuštanje (izlučivanje) IFN b) otpuštanje (izlučivanje) TNF-alfa je procenjivano u MLR-u kako je gore opisano. Efekat himernog PD1-0103 antitela i njegovih humanizovanih verzija je upoređen sa referentnim anti-PD1 antitelima koja sadrže VH i VL domene bilo nivoalumaba (poznatog i kao MDX5C4 ili MDX-1106) i pembrolizumaba (poznatog i kao MK-3475 ili Org 1.09A) sa skeletima humanog IgG1 (sa mutacijama L234A, L235A i P329G (Kabatov EU indeks)). Nakon 6 dana MLR kulture uzeto je 50 µl supernatanta i izmereno je više citokina u jednoj kulturi korišćenjem Bio-Plex Pro™ testa za humani citokin Th1/Th2 (Bio-Rad Laboratories Inc.) (podaci nisu prikazani za sve citokine).
Himerno PD1-0103 antitelo i njegove humanizovane verzije (PD1-0103_0312 i PD1-0103_0314) bile su potentnije u odnosu na referentna anti-PD1 antitela u pojačavanju aktivacije T ćelije i izlučivanju IFN-gama (vidi Sliku 2).
Nadalje, himerno PD1-0103 antitelo i njegove varijacije humanizacije povećavaju izlučivanje faktora nekroze tumora alfa (TNF alfa) (vidi Sliku 3) i IL-12 (podaci nisu prikazani) ćelijama koje prezentuju antigen i povećavaju kapacitet monocita/makrofaga ili ćelija koje predstavljaju antigen da stimulišu T ćeliju.
Primer 7: Efekat blokade anti-PD-1 na citotoksično oslobađanje granzima B i izlučivanje IFN- γ humanim CD4 T ćelijama koje su uzgajane zajedno sa alogensm zrelim dendritskim ćelijama
Da bismo dalje istražili efekat tretmana anti-PD-1 u alogenom okruženju, razvili smo test u kojem se sveže prečišćene CD4 T ćelije zajedno uzgajaju tokom 5 dana u prisustvu alogenih zrelih dendritskih ćelija izvedenih iz monocita (mDC). Monociti su izolovani iz svežih PBMC nedelju dana pre, plastičnom adhezijom, praćeni uklanjanjem neprilepljenih ćelija. Zatim smo generisali nezrele DC iz monocita kultivišući ih 5 dana u medijima koji sadrže GM-CSF (50 ng/ml) i IL-4 (100 ng/ml). Da bismo podstakli sazrevanje iDC, dodali smo TNF-α, IL-1β i IL-6 (po 50 ng/ml) u podlogu za uzgajanje tokom dodatna 2 dana. Zatim smo procenili sazrevanje DC merenjem njihove površinske ekspresije glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (MHCII), CD80, CD83 i CD86 pomoću protočne citometrije (LSRFortessa, BD Biosciences).
Na dan minimalne reakcije mešanih limfocita (mMLR), CD4 T ćelije su obogaćene pomoću kompleta mikroperlica (Miltenyi Biotec) od 10<8>PBMC dobijenih od nepovezanog donora. Pre uzgajanja, CD4 T ćelije su obeležene sa 5 µM karboksifluorescein sukcinimidil estra (CFSE). Zatim je 10<5>CD4 T ćelija postavljeno na ploču sa 96 bunarčića zajedno sa zrelim alo-DC (5:1) u prisustvu ili odsustvu blokirajućeg anti-PD1 antitela (bilo PD1-0103, himernog PD1-0103 ili humanizovanih antitela PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, skraćeno 0312, 0313, 0314, 0315 na Slikama 4A i 4 B), u koncentraciji od 10 µg/ml, ako nije drugačije naznačeno na slikama.
Pet dana kasnije sakupili smo supernatante ćelijske kulture, koji su kasnije korišćeni za merenje nivoa IFN- γ pomoću ELISA (R&D systems), i ostavili smo ćelije na 37 °C dodatnih 5 sati u prisustvu inhibitora Golgi Plug (Brefeldin A) i Golgi Stop (Monensin). Ćelije su zatim isprane, obojene na površini antihumanim CD4 antitelima i Live/Dead fiksirajućom bojom Aqua (Invitrogen) pre fiksiranja / permeabilizacije puferom za fiksiranje / perm permeabilizaciju (BD Bioscience). Izveli smo intracelularno bojenje za granzim B (BD Bioscience), IFN-γ i IL-2 (oba od eBioscience).
12
Takođe smo testirali različite koncentracije humanizovanih varijanti PD1-0103 (humanizovana antitela PD1-0103-0312, PD1-0103-0313, PD1-0103-0314, PD1-0103-0315, skraćeno 0312, 0313, 0314, 0315 na slikama, vidi i Primer 9 u nastavku) i utvrđeno je da su podjednako dobri u jačanju granzima B i gama interferona. DP47 je nevezujući humani IgG sa mutacijom LALA u Fc delu kako bi se izbeglo prepoznavanje od strane Fc γR i korišćen je kao negativna kontrola. Rezultati su prikazani na Slikama 4A i 4 B.
Primer 8: Derivati himernih antitela
Himerna PD1 antitela su generisana amplifikacijom varijabilnih regiona teškog i lakog lanca anti-PD1 mišjih antitela PD1-0098, PD1-0103 putem PCR, i njihovim kloniranjem u ekspresione vektore teškog lanca kao fuzione proteine sa humanim IgG1 skeletom / humanim CH1-šarka-CH2-CH3 sa mutacijama L234A, L235A i P329G (Kabatov EU indeks)) (leucin 234 u alanin, leucin 235 u alanin, prolin 329 u glicin) ukidajući efektorske funkcije i ekspresione vektore lakog lanca kao fuzione proteine u humanom C-kapa. LC i HC plazmidi su zatim kotransficirani u HEK293 i prečišćeni nakon 7 dana iz supernatanta standardnim postupcima za prečišćavanje antitela. Himerna PD1-antitela su preimenovana u himerna chiPD1-0098 (chiPD1-0098) i himerna PD1-0103 (chiPD1-0103). Za poređenje, referentna anti-PD1 antitela, antitela koja sadrže VH i VL domene bilo nivoalumaba (poznatog i kao MDX-5C4 ili MDX-1106) i pembrolizumaba (poznatog i kao MK-3475 ili Org 1.09A) sintetizovana su i klonirana sa skeletima humanog IgG1 (sa mutacijama L234A, L235A i P329G (Kabatov EU indeks)).
Primer 9: Generisanje, ekspresija i prečišćavanje humanizovanih varijanti anti-PD1 antitela PD-0103 (huMab PD-0103) i karakterizacija
Humanizacija VH i VL domena mišjeg anti-PD1 antitela 0103
Na osnovu aminokiselinske sekvence mišjih VH i VL domena mišjeg anti-PD1 antitela PD1-0103 (SEQ ID NO: 43 i 44), generisane su varijante humanizovanih anti-PD1 antitela.
Humanizovana VH-varijanta se zasniva na humanoj germinativnoj liniji IMGT_hVH_3_23 u kombinaciji sa humanom germinativnom linijom J-elementa IGHJ5-01 sa nekoliko mutacija. (daje SEQ ID NO: 45).
Humanizovane varijante VL se zasnivaju na humanim germinativnim linijama IMGT_hVK_4_1, IMGT_hVK_2_30, IMGT_hVK_3_11 i IMGT_hVK_1_39 u kombinaciji sa humanom germinativnom linijom J-elementa IGKJ1-01. Različite mutacije su dale humanizovane varijante SEQ ID NO: 46 do SEQ ID NO: 49.
12
Humanizovane sekvence aminokiselina za varijabilne regione teškog i lakog lanca PD1-0103 su prevedene natrag u DNK, i rezultujuće cDNK su sintetisane (GenArt) i zatim klonirane u ekspresione vektore teškog lanca kao fuzioni proteini sa humanim IgG1 skeletom / humanim CH1-šarka-CH2-CH3 sa LALA i PG mutacijama (leucin 234 u alanin, leucin 235 u alanin, prolin 329 u glicin) ukidajući efektorske funkcije, ili u ekspresione vektore lakog lanca kao fuzione proteine u humani C-kapa. LC i HC plazmidi su zatim kotransficirani u HEK293 i prečišćeni nakon 7 dana iz supernatanta standardnim postupcima za prečišćavanje antitela. Dobijena humanizovana PD1-antitela su imenovana na sledeći način:
Tabela 11: VH i VL sekvence humanizovanih varijanti antitela PD1-0103
Tabela 12: HVR sekvence humanizovanih varijanti antitela PD1-0103
Varijante humanizovanih PD1-0103 antitela i matični himerni PD1-0103 su okarakterisani kao što je gore opisano. Rezultati su prikazani u Tabeli 13.
12
Tabela 13: Rezime rezultata za humanizovane varijante antitela PD1-0103 i matične himerne PD1-0103
Primer 10: Potencijal neutralizacije PD-1 antitela
Za ispitivanje potencijala neutralizacije generisanih PD-1 antitela u oponašanju restauracije potisnutog odgovora T ćelija in vitro, korišćen je komercijalno dostupan test reportera PD1/PD-L1 (Promega). Ovaj sistem se sastoji od PD1+NFAT Jurkatovih ćelija i PD-L1+CHO pandana, koji takođe daje signal za aktivaciju. U principu, reporterski sistem se zasniva na tri koraka: (1) Aktivacija NFAT posredstvom TCR, (2) inhibicija NFAT signala nakon aktivacije PD-1/PD-L1 osom i (3) oporavak NFAT signala antitelima koja blokiraju PD-1.
Materijal i postupci:
• PD-L1 medijum: PAN Biotech (kat. br. P04-03609); FBS (10%) i L-Gln (4 mM) • Test medijum: RPMI 1640 (kat. br. 31870; Invitrogen), 25 mM HEPES, 2 mM L-Gln, FBS (2%)
• Ćelije korišćene za ovaj test (oba tipa ćelija nabavljene od kompanije Promega): PD-L1+ CHO ćelije (serijski br.139147): 2-3x104 ćelija/96 bunarčića
PD-1+ NFAT Jurkatove ćelije (serijski br.133024: 3,5x104 ćelija/bunarčiću
12
Prvog dana PD-L1+ ćelije su odmrznute, zasejane u naznačenoj koncentraciji ćelija u gore pomenutom medijumu i uzgajane preko noći na 37°C i 5% CO2. Sledećeg dana, medijum je uklonjen i PD-L1+ ćelije su inkubirane sa pripremljenim antitelima u naznačenim koncentracijama (u test medijumu). Paralelno sa tim, PD-1+ NFAT Jurkatove ćelije su odmrznute, a gore navedeni brojevi ćelija su prebačeni i uzgajani zajedno sa PD-L1+ ćelijama. Nakon inkubacije od 6 sati na 37 °C i 5% CO2, supstrat Bio-Glo je zagrejan na sobnu temperaturu (1-2 sata pre dodavanja). Pločica sa ćelijskom kulturom je uklonjena iz inkubatora i podešena na sobnu temperaturu (10 min) pre nego što je dodato 80 μl rastvora Bio-Glo po bunarčiću, inkubirana je 5-10 min pre merenja luminescencije na čitaču Tecan Infinite prema preporuci proizvođača kompleta. Rezultati se mogu videti na Slikama 5A i 5 B, gde je prikazano obnavljanje PD-1/PD-L1 posredovane supresije NFAT signala različitim PD-1 antitelima nakon stimulacije TCR-om: Slika 5 A: Himerni PD1_0103 je pokazao reproduktivno superiorniji efekat u poređenju sa referentnim antitelom. Kao referenca, anti-PD1 antitelo koje sadrži VH i VL domene nivolumaba (poznatog i kao MDX-5C4 ili MDX-1106) sintetizovano je i klonirano sa skeletima humanog IgG1 (sa mutacijama L234A, L235A i P329G (Kabatov EU indeks)). Slika 5B: Četiri humanizovane varijante PD1_0103 su pokazale sličnu in vitro potentnost vodećem antitelu i takođe su bile malo superiornije od referentnog antitela.
Bispecifična PD1/TIM3 antitela
Primer 11A
Proizvodnja i ekspresija multispecifičnih antitela koja se vezuju za PD1 i TIM3 sa razmenom / zamenom VH/VL domena (CrossMAb<VH-VL>) u jednom vezujućem kraku i sa supstitucijama jednostruko naelektrisane aminokiseline u interfejsu CH1/CL
U jednom primeru, multispecifična antitela koja se vezuju za humani PD1 i humani TIM3 su generisana kao što je opisano u poglavlju sa opštim metodama, klasičnim tehnikama molekularne biologije, i privremeno su eksprimirane u 293F Expi293F ćelija kao što je gore opisano. Multispecifična 1+1 CrossMAb<Vh-Vl>antitela su takođe opisana u WO 2009/080252. Multispecifična antitela su izražena ekspresionim plazmidima koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju aminokiselinske sekvence prikazane u Tabeli 14a.
12
Tabela 14a: Aminokiselinske sekvence lakih lanaca (LC) i teških lanaca (HC), sa razmenom / zamenom domena VH/VL (1+1 CrossMAb<Vh-V>)
Za sve konstrukte, korišćena je heterodimerizaciona tehnologija dugme u rupici sa tipičnom supstitucijom dugmeta (T366W) u prvom CH3 domenu i odgovarajućim supstitucijama rupice (T366S, L368A i Y410V) u drugom CH3 domenu (kao i dva dodatna uvedena cisteinska ostatka S354C/Y349'C) (sadržanim u odgovarajućim sekvencama teškog lanca (HC) prikazanim gore).
Primer 11B
Proizvodnja i ekspresija multispecifičnih antitela koja se vezuju za PD1 i TIM3 sa razmenom / zamenom domena VH/VL (2+2 CrossMAb<Vh-VL>) u dva vezujuća kraka i sa supstitucijama jednostruko naelektrisanih aminokiselina u interfejsima CH1/CL U jednom primeru, multispecifična antitela koja se vezuju za humani PD1 i humani TIM3 su generisana kao što je opisano u poglavlju sa opštim metodama, klasičnim tehnikama molekularne biologije, i privremeno su eksprimirane u 293F Expi293F ćelija kao što je gore opisano. Multispecifična 2+2 CrossMAb<VH-VL>antitela su takođe opisana u WO 2010/145792. Multispecifična antitela su eksprimirana pomoću ekspresionih plazmida koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju aminokiselinske sekvence prikazane u Tabeli 14b.
Tabela 14b: Aminokiselinske sekvence lakih lanaca (LC) i teških lanaca (HC), sa razmenom / zamenom domena VH/VL (2+2 CrossMAb<Vh-VL>)
Primer 11C
Prečišćavanje i karakterizacija multispecifičnih antitela koja se vezuju za PD1 i TIM3
1
Multispecifična antitela koja su gore eksprimirana prečišćena su iz supernatanta kombinacijom protein A afinitetne hromatografije i gel hromatografije. Sva multispecifična antitela se mogu proizvesti u dobrim prinosima i stabilna su. Identitet dobijenih proizvoda je okarakterisan masenom spektrometrijom, a analitička svojstva, kao što je čistoća, pomoću SDS-PAGE, sadržaja monomera i stabilnosti
Masena spektrometrija
Očekivane primarne strukture analizirane su elektrosprej jonizacionom masenom spektrometrijom (ESI-MS) deglikozilovanih kompletnih CrossMab i deglikozilovanih/digestovanih plazminom ili alternativno deglikozilovanih/sa ograničenom digestijom LysC CrossMab.
VH/VL CrossMab su deglikozilovani N-glikozidazom F u fosfatnom ili Tris puferu na 37 °C do 17 h pri koncentraciji proteina od 1 mg/ml. Digestija plazminom ili sa ograničenim LysC (Roche) izvedena je sa 100 µg deglikozilovanih VH/VL CrossMab u Tris puferu pH 8 na sobnoj temperaturi tokom 120 sati, odnosno na 37 °C tokom 40 minuta. Pre masene spektrometrije, so je uklonjena iz uzoraka putem HPLC na koloni Sephadex G25 (GE Healthcare). Ukupna masa je određena preko ESI-MS na sistemu maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik) opremljenom TriVersa NanoMate izvorom (Advion).
Stabilnost multispecifičnih antitela
Da bi se procenila stabilnost konstrukata antitela, termička stabilnost kao i početna temperatura agregacije su procenjene prema sledećoj proceduri. Uzorci naznačenih antitela su pripremljeni u koncentraciji od 1 mg/ml u 20 mM histidinu/histidin hloridu, 140 mM NaCl, pH 6,0, preneti u niz mikrokiveta od 10 µl, i podaci o statičkom rasipanju svetlosti kao i podaci o fluorescenciji nakon ekscitacije laserom na 266 nm snimljeni su instrumentom Optim1000 (Avacta Inc.), dok su uzorci zagrevani brzinom od 0,1 °C/min od 25 °C do 90 °C.
Temperatura početka agregacije (Tagg) definisana je kao temperatura na kojoj intenzitet rasute svetlosti počinje da raste. Tačka topljenja (Tm) definisana je kao pregibna tačka na dijagramu zavisnosti intenziteta fluorescencije od talasne dužine. Rezultati su prikazani u Tabeli 15.
1 1
Tabela 15
Primer 12
Karakterizacija anti-PD1-TIM3 multispecifičnih antitela
Elisa sa vezivanjem
ELISA za hu PD1
Nunc maxisorp pločice presvučene streptavidinom (MicroCoat kat. br.11974998001) presvučene su sa 25 µl/bunarčiću biotinilovanog PD1-ECD-AviHis u koncentraciji od 500 ng/ml i inkubirane su na 4 °C preko noći. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl uzoraka anti PD1 antitela u rastućim koncentracijama i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl/bunarčiću kozjeg antihumanog H+L-POD (JIR, JIR109-036-098) u razblaženju 1:5000 i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Posle ispiranja (PBST puferom 3x90 μl/bunarčiću) dodato je 25 μl/bunarčiću TMB supstrata (Roche, 11835033001) i inkubirano je do OD 2-3. Merenje je izvršeno na 370/492 nm.
ELISA za hu Tim3
Nunc maxisorp pločice prevučene streptavidinom (MicroCoat kat. br. 11974998001) prevučene su sa 25 µl/bunarčiću biotinilovanog Tim3-ECD-AviHis u koncentraciji od 60 ng/ml i inkubirane su na 4 °C preko noći. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl uzoraka anti PD1 antitela u rastućim koncentracijama i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (PBST puferom 3x90 µl/bunarčiću) dodato je 25 µl/bunarčiću kozjeg antihumanog H+L-POD (JIR, JIR109-036-098) sa
1 2
razblaženjme od 1:5000 i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi, na mućkalici. Posle ispiranja (PBST puferom 3x90 μl/bunarčiću) dodato je 25 μl/bunarčiću TMB supstrata (Roche, 11835033001) i inkubirano je do OD 2 - 3. Merenje je izvršeno na 370/492 nm.
Rezultati ELISA testa su navedeni kao vrednosti EC50[nM] u Tabeli 16.
Tabela 16: Biohemijsko i ćelijsko vezivanje anti-PDl-TIM3 bispecifičnih antitela (ELISA)
Avidno vezivanje (tj. vezivanje sa oba kraka) može se detektovati za antitela koja su dvovalentna za Tim3 (himerni TIM3-0018, 2+2 PD1TIM3-0359, himerni TIM3-0028, 2+2 PD1TIM3-0358). Veće vrednosti EC50 za 1+1 CrossMabs su rezultat jednovalentnog (prema Tim3), neavidnog vezivanja za obloženi antigen. Efekti avidnosti nisu detektovani za PD1-vezivanje. Vrednosti EC50 su uporedive za dvovalentne i četvorovalentne formate.
Biacore vezivanje
Svojstva vezivanja antigena multispecifičnih antitela koja se vezuju za PD1 i TIM3
Vezivanje multispecifičnih antitela za njihove ciljne antigene, tj. PD1 i TIM3, procenjeno je pomoću Biacore®.
Vezivanje PD1 je procenjeno prema sledećoj proceduri:
Anti-humani Fc IgG je imobilisan vezivanjem amina za površinu (Biacore) CM5 senzorskog čipa. Uzorci su tada uhvaćeni i hu PD1-ECD je vezan za njih. Površina
1
senzorskog čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa analize. Konstanta ravnoteže i kinetičke konstante brzine konačno su dobijene prilagođavanjem podataka Lengmirovom modelu interakcije 1:1.
Oko 10.000 jedinica odgovora (RU) 20 µg/ml anti-humanog IgG (GE Healthcare kat. br. BR-1008-39) vezano je za sve protočne ćelije CM5 senzorskog čipa u Biacore T200 pomoću kompleta za kuplovanje amina koji isporučuje GE Healthcare. Pufer za uzorak i radni pufer je HBS-EP+ (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfaktant P20, pH 7,4). Temperatura protočne ćelije je podešena na 25 °C, a temperatura odeljka sa uzorkom na 12 °C. Sistem je prajmovan radnim puferom.
Različiti uzorci su injektovani u trajanju od 15 sekundi sa koncentracijom od 10 nM i vezani uzastopno za protočne ćelije 2, 3 i 4. Zatim je injektovan kompletni skup humanih koncentracija PD1-ECD (300 nM, 100 nM, 2 x 33,3 nM, 11,1 nM, 3,7 nM, 1,2 nM i 2x0 nM) u svaki uzorak tokom 300 s, nakon čega je usledilo vreme disocijacije od 10/600 s i dva koraka regeneracije od 30 s sa 3 M MgCl2, od kojih poslednji sadrži „dodatno ispiranje nakon injektovanja“ adnim puferom. Na kraju, dvostruki referentni podaci su uklopljeni u model 1:1 Lengmirove interakcije pomoću BIAcore T200 softvera za procenu. Rezultujuće vrednosti K<D>, kai kdsu prikazane u Tabeli 17.
Vezivanje TIM3 je procenjeno prema sledećoj proceduri:
Antihumani Fab IgG je imobilisan vezivanjem amina za površinu (Biacore) CM5 senzorskog čipa. Uzorci su tada uhvaćeni i hu Tim3-ECD je vezan za njih. Površina senzorskog čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa analize. Konstanta ravnoteže i kinetičke konstante brzine konačno su dobijene prilagođavanjem podataka Lengmirovom modelu interakcije 1:1.
Oko 10.000 jedinica odgovora (RU) 20 µg/ml antihumanog Fab IgG (GE Healthcare kat. br. 28-9583-25) vezano je za sve protočne ćelije CM5 senzorskog čipa u Biacore T200 pomoću kompleta za kuplovanje amina koji isporučuje GE Healthcare. Pufer za uzorak i radni pufer je HBS-EP+ (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfaktant P20, pH 7,4). Temperatura protočne ćelije je podešena na 25 °C, a temperatura odeljka sa uzorkom na 12 °C. Sistem je prajmovan radnim puferom.
Različiti uzorci su injektovani u trajanju od 30 sekundi sa koncentracijom od 10 nM i vezani uzastopno za protočne ćelije 2, 3 i 4. Zatim je injektovan kompletni skup humanih koncentracija Tim3-ECD (600 nM, 200 nM, 2 x 66,7 nM, 22,2 nM, 7,4 nM i 2 x 0 nM) u svaki uzorak tokom 200 s, nakon čega je usledilo vreme disocijacije od 10/600 s i dva koraka regeneracije od 30 s sa glicinom HCl pH 2,1, od kojih poslednji sadrži „dodatno ispiranje
1 4
nakon injektovanja“ radnim puferom. Na kraju, dvostruki referentni podaci su uklopljeni u model 1:1 Lengmirove interakcije pomoću Biacore T200 softvera za procenu. Rezultujuće vrednosti KD, kai kdsu prikazane u Tabeli 17.
Rezultati su navedeni u Tabeli 17.
Tabela 17: Afinitet prema PD1-Tim3 bispecifičnim antitelima
Sva testirana antitela se specifično vezuju za oba cilja, PD1 i TIM3, i pokazuju afinitet prema antigenu u nanomolskom rasponu.
Primer 13: FRET test za simultano vezivanje anti-PD1/Tim3 bispecifičnih antitela za rekombinantne ćelije
Ovaj primer opisuje razvoj TR-FRET testa zasnovanog na ćelijama kako bi se utvrdilo istovremeno vezivanje formata bispecifičnih antitela za dva različita receptora prisutna na jednoj ćeliji. Odabrana Tag-lite tehnologija je kombinacija klasičnog TR-FRET (vremenski razložen prenos fluorescentne rezonance energije) i SNAP-tag tehnologije (npr. New England Biolabs, CISBIO), koja omogućava da se antigeni prisutni na površini ćelije obeleže fluorescentnom donorskom ili akceptorskom bojom.
Cilj procene ove tehnologije
Cilj ovog testa je da demonstrira istovremeno vezivanje anti-PD1/Tim3 bispecifičnih antitela za ćelije koje eksprimiraju PD1 i Tim3 receptore kao rekombinantne fuzione proteine koji se sastoje od vanćelijskih domena (ECD) datog receptora i oznake za koju se fluorescentna boja može vezati. U prisustvu bispecifičnog antitela PD1-Tim3, koje može vezati oba označena receptora, proteini će doći u neposrednu blizinu kako bi omogućili prenos energije između dve FRET boje (vidi Sliku 6).
Generisanje rekombinantnih PD1<+>Tim3<+>HEK ćelija
Za generisanje DNK korišćeni su standardni postupci kao što je opisano u radu Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory
1
Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Za kloniranje PD1 i TIM3 varijanti SNAP ili CLIP je ubačen proksimalno na TM-region receptora i uklonjen je citoplazmatski domen, osim 7 aa, i zamenjen je flag-oznakom.
Prolazna transfekcija
HEK293 ćelije su kotransficirane reagensom za transfekciju 293free (Novagen) i Opti-MEM® I redukovanim serumskim medijumom (Life Technologies) u zapremini kulture od 30 ml, koristeći dva plazmida odjednom sa 15 µg ukupne količine DNK. Ukratko, ćelije HEK293 su privremeno transficirane sa sledećim plazmidima koji kodiraju fuzioni protein koji se sastoji od PD1 ili Tim3 ECD-a i SNAP ili CLIP oznake, kako je opisano na drugom mestu:
ID plazmida i referenca, npr. PD1-SNAP, Tim3-CLIP (kombinacija PD1-CLIP i Tim3-SNAP je takođe konstruisana i izražena, ali je dala samo niske FRET signale).
Plazmidi:
a) PD1-SNAP (u smeru 5’ do 3’):
- nukleinska kiselina koja kodira humani PD1-vanćelijski domen, uključujući signalni peptid (ostatak 1-170 SEQ ID NO: 89 (30),
- nukleinska kiselina koja kodira spejser GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- nukleinska kiselina koja kodira SNAP iz pSNAP-tag(T7)2 (bez N-terminalnog ostatka metionina) koja je mutirani oblik humanog gena za O6-alkilgvanin-DNK-alkiltransferazu (hAGT). (U poređenju sa divljim tipom hAGT, protein SNAP-oznake sadrži mutacije C26A, K125A, A127T, R128A, G131K, G132T, M134L, R135S, C150S, N157G, S159E i skraćen je nakon G182) (SEQ ID NO: 91),
- nukleinska kiselina koja kodira spejser GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- nukleinska kiselina koja kodira humani PD1-transmembranski i citoplazmatski domen (ostatak 171-191 SEQ ID NO: 89),
- nukleinska kiselina koja kodira spejser GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- nukleinska kiselina koja kodira Flag-oznaku (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 92).
b) Tim3-CLIP (u smeru 5’ do 3’):
- nukleinska kiselina koja kodira humani TIM3-vanćelijski domen, uključujući signalni peptid (ostatak 1-202 SEQ ID NO: 93)
- nukleinska kiselina koja kodira spejser GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- nukleinska kiselina koja kodira CLIP iz pCLIPf (bez N-terminalnog ostatka metionina) koja je mutirani oblik humanog gena za O6-alkilgvanin-DNK-alkiltransferazu (hAGT) (SEQ ID NO: 94),
1
- nukleinska kiselina koja kodira spejser GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- nukleinska kiselina koja kodira humani Tim3 transmembranski i citoplazmatski domen (ostatak 203-230 SEQ ID NO: 93)
- nukleinska kiselina koja kodira spejser GGGGS (SEQ ID NO: 90),
- nukleinska kiselina koja kodira Flag-oznaku (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 92).
Nakon transfekcije, ćelije su inkubirane u bocama za mućkanje do konačne upotrebe za FACS (24-48 sati nakon transfekcije) ili FRET eksperimente (nakon 48 sati).
Potvrda ekspresije PD1 i Tim3 na prolazno transficiranim ćelijama HEK293 (FACS)
24-48 sati nakon prolazne transfekcije ćelija Hek293, ćelije su analizirane na ekspresiju PD1 i Tim3: Obično je 1-3x105 pojedinačnih ili dvostruko transficiranih ćelija obojeno 30 minuta na ledu pri 10 μg/ml, isprano dva puta pomoću PBS/2% FCS i analizirano na FacsCanto II korišćenjem
• PD1-FITC Biolegend 329904, klon EH12.2H7) ili PD1-PE (R&D kat. br. FAB1086P) i/ili
• Tim3-PE (R&D FAB2365P klon 344823) i/ili
Opisno označavanje ćelija i FRET test sa bispecifičnim antitelima anti-PD1/Tim3 Opisno označavanje ćelija i FRET test sa bispecifičnim antitelima anti-PD1/Tim3: Transficirane ćelije su sedimentirane i resuspendovane u gustini od 1x106 ćelija/ml u Tag-lite puferu (Cisbio). Zatim, ćelije su obojene sa 100 nM SNAP-Lumi4-Tb (Cisbio) i 100 nM Clip-Red (Cisbio) tokom 1 sata na 37 °C u Tag-Lite puferu (Cisbio). Nakon ispiranja i resuspenzije u PBS/2% FCS, oko 50.000 ćelija (u zapremini od 50 μl) zasejano je u bele ploče sa ravnim dnom sa 96 bunarčića (Costar) pre kontrole (npr. pojedinačna specifičnost, referenca izotipa), ili su ćelijama dodavana bispecifična antitela u finalnoj koncentraciji od 0,001-10 nM. U nekim eksperimentima, matična monoklonska antitela su umrežena preko kozjeg antihumanog Fc (finalna koncentracija 20 nM, podaci nisu prikazani). Nakon inkubacije od 1 sata na 4 °C ili na sobnoj temperaturi, vremenski razložena fluorescencija je izmerena kao odnos 665/620 nm pomoću BMG čitača Pherastar ili Tecan Infinite M1000 Pro, koristeći standardna podešavanja koje nudi dobavljač. Po potrebi, ćelije obeležene sa SNAP-Lumi4-Tb i 100nM Clip-Red čuvane su na -80 °C ili u tečnom azotu, i sveže odmrznute za FRET eksperimente.
REZULTATI:
Karakterizacija različitih bispecifičnih antitela i formata antitela za simultano vezivanje i umrežavanje receptora kao što je prikazano FRET indukcijom.
1
HEK ćelije koje eksprimiraju PD1 i Tim su tretirane kako je gore opisano da bi se izmerio FRET signal nakon simultanog vezivanja receptora inkubacijom sa titrisanim količinama različitih bispecifičnih antitela (0,12-10 nM).
Sva bispecifična antitela indukovala su FRET signal u ćelijama koje eksprimiraju PD-1Tim3 na način koji zavisi od doze. Nije bilo dramatične razlike između 1+1 formata (antitela kat. br. 389 i 168) u poređenju sa 2+2 konstruktima (358+359), kao što se može videti na Slici 7A.
Pored toga, dva bispecifična formata zasnovana na humanizovanim PD1 Tim3 antitelima (kat. br. 476 i 477) takođe su procenjena zbog njihove sposobnosti da indukuju FRET u ćelijama nakon tretmana. Kao što je prikazano na Slici 7B, oba konstrukta su indukovala značajan FRET signal u PD1+Tim3+HEK ćelijama, podvlačeći istovremeno povezivanje na funkcionalan način.
Da bi se pokazala specifičnost FRET signala indukovanog istovremenim vezivanjem bispecifičnog antitela, za konkurenciju su dodati monoklonski IgG samo jedne specifičnosti.
SNAP-označene PD1 i CLIP-označene Tim3 ćelije (kao što je prethodno opisano) označene su sa 100 nM SNAP-Lumi4-Tb i 100 nM Clip-Red. Nakon ispiranja, obeležene ćelije su inkubirane sa bispecifičnim anti-PD1/Tim3 antitelom kat. br. 0168 [u naznačenim koncentracijama] tokom 1 h na 4 °C pre nego što je vremenski razložena fluorescencija izmerena na 665/620 nm pomoću BMG Pherastar čitača (crne linije). Da bi se podvukla specifičnost FRET signala nakon tretmana bispecifičnim antitelima, za konkurenciju je dodato anti-PD1 monoklonsko antitelo (kat. br. 0165; Slika 8A, siva kriva) ili anti TIM-3 monoklonsko antitelo (kat. br.0018, Slika 8B, siva kriva), što je dovelo gotovo do potpunog sprečavanja FRET signala. Matično (monospecifično) anti-PD-1 antitelo samo nije indukovalo FRET (isprekidane linije).
Indukcija FRET signala je takođe sprečena u prisustvu matičnog antitela Tim3 (0018; sive krive) dodatog paralelno bispecifičnom antitelu (Slika 8B).
Primer 14: Vezivanje antitela za različite mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC)
Test vezivanja
Sveže izolovane PBMC ili 3 dana poliklonski aktivirane (anti-CD3 vezana za ploču i rastvorljiva anti-CD28 antitela, po 1 ug/ml, oba od kompanije BD Pharmingen) CD4 T ćelije su obojene pomoću Alexa 647 direktno konjugovanim anti-TIM-3 ili anti-TIM-3/anti-PD-1 bispecifičnim antitelima tokom 1 sata na 4 °C. Ćelije su zatim isprane da bi se eliminisala
1
nevezana antitela i bojene površinskim markerima 30 minuta na 4 stepena C da bi se razlikovali monociti (CD14<+>(BD Pharmingen)), NK ćelije (CD16<+>(eBioscience), CD56<+>(BioLegend) i CD3-) i T ćelije (CD3<+>(eBioscience)) pre fiksiranja pomoću agensa za fiksiranje BD Cell Fix. Ćelije su nabavljene od LSRFortessa, BD Biosciences. Rezultati za bispecifična antitela u poređenju sa antitelima anti-Tim3 su prikazani na Slikama 9A do 9H.
Primer 15: Internalizacija
Primer 15A) Tri dana su poliklonski aktivirane CD4 T ćelije, prethodno uzgajane sa 1 mg/ml anti-CD3 vezanog na ploči i 1 mg/ml rastvorljivih anti-CD28 antitela, inkubirane u prisustvu bilo anti-TIM-3 ili anti-TIM-3/anti-PD-1 bispecifičnih antitela (u duplikatu) tokom 30 minuta na 4 °C. Ćelije su zatim oprane, podeljene u dve grupe, od kojih je jedna inkubirana dodatna 3 sata na 37 °C, a druga odmah obojena obeleženim sekundarnim antitelom (eBioscience) pre nego što je fiksirana agensom BD Cell Fix. Nakon 3 sata inkubacije, takođe je druga grupa ćelija obojena obeleženim sekundarnim antitelom pre fiksiranja.
Ćelije su procenjene na LSRFortessa (BD Biosciences) i upoređeni su nivoi ekspresije detektabilnih antitela na ćelijskoj površini između dve grupe. Rezultati su prikazani na Slikama 10A do 10D. Bispecifični 1+1 PD1TIM3-0166 (na bazi himernog PD1-0103/Tim3-0038) pokazao je smanjenu internalizaciju u odnosu na bispecifični 2+2 PD1TIM3-0321 (takođe na bazi himernog PD1-0103/Tim3-0038, ali ima dva mesta vezivanja antigena za PD i dva za TIM3) i u poređenju sa matičnim antitelom Tim3-0038 na aktiviranim CD4+ T-ćelijama i na aktiviranim NK ćelijama.
Primer 15B) Vizuelizacija lokalizacije i internalizacije antitela pomoću fluorescentne konfokalne mikroskopije
Aktivirane CD4-pozitivne ćelije su obojene sa CMFDA (molekulske sonde, Life technologies), osim kada su obojene antitelom a-PD1, i nanete su na okrugle pokrovne pločice tretirane poli-L-lizinom (Sigma). Ćelijama je ostavljeno 30 minuta da se prilepe na 37 °C pre fluorescentno obeleženih antitela (1 ug/ml: a-TIM3 (chi18-A647 = himerni Tim3_0018 obeležen sa AlexaA647), a-TIM3 (chi28-A647 = himerni Tim3_0028 obeležen sa AlexaA647), Bispec (0168-A647 = 1+1 PD1TIM30168 (na bazi himernog PD1-0103/Tim3-0018) obeležen sa AlexaA647) i Bispec (0389-A647 = 1+1 PD1TIM3_0389 (na bazi himernog PD1-0103/Tim3-0028) obeležen sa Alexa 647) i a-PD1 (0165-A488 = himerni PD1-0103 obeležen sa Alexa488) dodati su direktno u medijum za rast tokom različitog trajanja (15 min, 1 h, 2 h, 3 h). Hladni PBS (Lonza) korišćen je za prekidanje reakcije i za ispiranje nevezanih antitela. Ćelije su zatim fiksirane (BD Cytofix) tokom 20 minuta i isprane
1
dva puta puferom za ispiranje (BD pufer za bojenje). Nakon prenošenja pokrovnih pločica na suvu površinu, one su zatim postavljene na staklene slajdove sa medijumom za postavljanje (Fluoromount G, eBioscience) i pre snimanja držani su u mraku na 4 °C. Intenzitet fluorescentnog signala iz ROI membrane visoko ciljanih ćelija je podeljen sa intenzitetom fluorescentnog signala iz ROI citoplazme istih ćelija, što je dalo odnos prikazan na kutijastom dijagramu. Da bi se uporedili uzorci, korišćena je jednosmerna ANOVA analiza (* = p<0,05; **=p <0,001). Fluorescentna konfokalna mikroskopija je izvedena sa obrnutim LSM 700 kompanije Zeiss sa 60x uljanim objektivom. Slike su prikupljene pomoću Zen softvera (Zeiss)povezanog sa mikroskopom. Analiza slika je izvršena pomoću softvera Imaris (Bitplane; Oxford Instrument), a statistička analiza pomoću GraphPad Prism (Graphpad Software). Analiza tokom vremena pokazuje veću lokalizaciju u membrani i za bispecifična i za PD1 antitela u poređenju sa intracelularnim grupisanjem TIM3 antitela, i prikazana je na Slikama 11A i 11B. Anti-PD1 i Bispec 0389 pokazuju samo vrlo sporu internalizaciju, čak i nakon 3 h, dok je internalizacija za drugi Bispec 0168 jača. Jaču internalizaciju je prikazao aTim3 Ab 0028, a najveću internalizaciju je prikazao aTim3-0018.
Primer 16: Aktivacija T ćelija testom mešane limfocitne reakcije (MLR) Mešana limfocitna reakcija (MLR) je test imunih ćelija koji meri aktivaciju limfocita jedne jedinke (donor X) do limfocita druge jedinke (donor Y). Mešana limfocitna reakcija je korišćena da se pokaže efekat blokiranja PD1 puta do efektorskih ćelija limfocita. T ćelije u testu su testirane na aktiviranje i lučenje IFN-gama u prisustvu ili odsustvu anti-PD1/TIM3 bispecifičnih mAb.
Da bi se izveo alogeni MLR, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) najmanje četiri zdrava donora nepoznatog tipa HLA su izolovane centrifugiranjem sa gradijentom gustine pomoću Leukosep epruveta (Greiner Bio One, 227 288). Ukratko, heparinizovani uzorci krvi su razblaženi trostrukom zapreminom PBS-a, i 25 ml alikvota razblažene krvi je raslojeno u leukosep epruvetama od 50 ml. Posle centrifugiranja na 800 x g tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi (bez prekida), frakcije koje sadrže limfocite su sakupljene, isprane PBS-om i direktno korišćene u funkcionalnom testu ili ponovo suspendovane u medijumu za smrzavanje (10% DMSO, 90% FCS) sa 1,0E 07 ćelija/ml i skladištene u tečnom azotu. Pojedinačne dvosmerne MLR reakcije su postavljene mešanjem PBMC od dva različita donora u odnosu 1:1 stimulator / reagujuća ćelija, a zajedničke kulture su rađene u najmanje dva primerka na pločicama sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, tokom 6 dana na 37 °C, 5% CO2, u prisustvu, ili bez, različitog opsega koncentracije prečišćenih bispecifičnih PD1-TIM3 antitela ili njihovih matičnih monospecifičnih antitela (bilo samostalno ili u kombinaciji).
14
Nijedno antitelo ili antitelo za kontrolu izotipa nije korišćeno kao negativna kontrola, i rec hu IL-2 (20 EU/ml) je korišćen kao pozitivna kontrola. Nakon 6 dana uzeto je 100 µl medijuma iz svake kulture za merenje citokina. Nivo IFN-gama je izmeren korišćenjem kompleta OptEIA ELISA (BD Biosciences).
Rezultati su prikazani u Tabelama 18A do 18D (izlučivanje / oslobađanje IFN- γ). Bispecifična antitela PD1TIM3 podstiču aktivaciju T ćelija i lučenje IFN-gama na način zavisan od koncentracije. Vrednost % povećanja sekrecije IFN γ je izračunata u odnosu na IFN γ proizvodnju MLR bez dodavanja bilo kojeg blokirajućeg mAb (vrednost bazalne alogene stimulacije indukovane IFN γ kao E-c) i MLR uz dodavanje 20 EU/ml rec hu IL-2 (pozitivna kontrola = 100% vrednost IFN γ kao E+c) i izračunata je prema formuli: Rel. stimulacija [%] = ((Primer - E-c)/(E+c - E-c)* 100.
Izvedena su četiri odvojena eksperimenta:
U eksperimentu 1, procenjena je potentnost PD1-Tim3 bispecifičnog antitela 1+1 PD1TIM3_0168 (na bazi himernog PD1-0103 / Tim3-0018 (=AB 0168) u poređenju sa himernim PD1-0103 (=PD1-0165) i himernog Tim3_0018 (=Tim3-chi18) i njihove kombinacije. Rezultati su prikazani na Slici 12A i u Tabeli 18A.
Tabela 18A
U eksperimentu 2, procenjena je potentnost PD1-Tim3 bispecifičnog antitela 1+1 PD1TIM3_0389 (na bazi himernog PD1-0103 / Tim3-0028 (=Bispec AB 0389) u poređenju sa himernim PD1-0103 (=PD1-0165) i himernim Tim3_0028 (=Tim3-chi28) i njihove kombinacije. Rezultati su prikazani na Slici 12B i u Tabeli 18B.
Tabela 18B
U eksperimentu 3, procenjena je potentnost PD1-Tim3 bispecifičnog antitela 1+1 PD1-0103 /Ky8213 (na bazi himernog PD1-0103 / i antiTim3 Ky8213 iz US 2012/0189617 (vidi antitelo 8213, npr. primer 33) koje je proizvedeno analogno tome kao što je opisano u primeru 1, kao 1+1 CrossMab) u poređenju sa himernim PD1-0103 (=PD1-0165) i anti-TIM3-Ky8213 (iz US 2012/0189617 (vidi antitelo 8213), npr. primer 33) i njihovih kombinacija. Rezultati su prikazani na Slici 12C i u Tabeli 18C.
Tabela 18C
U eksperimentu 4, procenjena je potentnost PD1-Tim3 bispecifičnog antitela 1+1 PD1TIM3_0389 (na bazi himernog PD1-0103 / Tim3-0028 (=Bispec AB 0389 (1+1))) u poređenju sa PD1-TIM3 bispecifičnim antitelom 2+2 PD1TIM3_0358 na bazi himernog PD1-0103 / Tim3-0028 (=Bispec AB 0358 (2+2)), i himernog PD1-0103 (=PD1-0165) i himernog Tim3_0028 (=Tim3-chi28) i njihovih kombinacija. Rezultati su prikazani na Slici 12D i u Tabeli 18D.
Tabela 18D:
Tabela 19: Rezime zapaženih svojstava / rezultata:
Primer 17: Zajednička kultura antigen-specifičnih CD4 T ćelija sa B-limfoblastoidnom ćelijskom linijom ARH77
Da bismo istražili efekat anti-PD-1 blokade na CD4 T ćelije u prisustvu ćelijske linije tumora koja eksprimira MHCII, razvili smo test u kome se sveže prečišćene CD4 T ćelije uzgajaju zajedno 5 dana u prisustvu EBV-imortalizovane ćelijske linije limfoblasta B ćelija (ARH77). Na dan minimalne reakcije mešanih limfocita (mMLR), CD4 T ćelije su obogaćene pomoću kompleta mikroperlica (Miltenyi Biotec) od 10<8>PBMC-a dobijenih od
14
zdravog donora. Prethodna kultura, CD4 T ćelije, označena je sa 5 mM karboksifluorescein sukcinimidil estra (CFSE). Zatim je 10<5>CD4 T ćelija postavljeno na ploču sa 96 bunarčića zajedno sa B ćelijskom linijom (5:1) u prisustvu ili odsustvu blokirajućih anti-PD1 antitela (humanizovanih PD-1 0376, nivolumaba ili pembrolizumaba), anti-TIM3 antitela (humanizovanih anti-TIM3 0438 ili Kyowa-8213) ili anti-PD-1/TIM3 bispecifičnog antitela (humanizovani 0476) u koncentraciji od 10 µg/ml. Pet dana kasnije sakupili smo supernatante ćelijske kulture koji se koriste za merenje nivoa IFN- γ ELISA testom (R&D systems).
Kao što je prikazano na Slici 13, zanimljivo smo primetili da je tretman anti-PD-1 značajno povećao sposobnost CD4 T ćelija da proizvode IFN- γ u poređenju sa netretiranim CD4 T ćelijama (isprekidana linija). U ovom testu anti-PD-1 antitelo 0376 je podjednako sposobno kao i referentna antitela u indukovanju izlučivanja IFN- γ CD4 T ćelijama, dok samo anti-TIM3 antitelo 0438 ima samo marginalni efekat, čak i ako je jače od referentnog antitela Kyowa-8213.
Iznenađujuće je da je bispecifično antitelo 0476 bilo bolje od kombinacije matičnih antitela, samog anti-PD1 antitela 0376 i referentnih antitela u pokretanju IFN- γ sekrecije putem CD4 T ćelija (P < 0,01, jednosmerna ANOVA).
Primer 18: Povećana efikasnost PD1-TIM3 bispecifičnog antitela in vivo Ženke miševa sa potisnutim imunitetom (NOG), stare 6-8 nedelja na početku eksperimenata, supkutano su tretirane sa 10<6>MKN45 ćelija (ćelijska linija humanog karcinoma želuca, koja eksprimira visok nivo CEA) 0. dana, u prisustvu matrigela u odnosu 1:1. Sedmog dana su izolovani PBMC od zdravog humanog donora: humana heparinizovana krv je razblažena ~ 2:1 u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS) (Gibco) i prebačena u pripremljene Leucosep epruvete od 50 ml, svaka je sadržala 15 ml Histopaque-1077 (Sigma Aldrich). Nakon centrifugiranja (30 minuta, 450xg, na sobnoj temperaturi, bez kočenja), PBMC trake su sakupljene pipetom od 5 ml. Ćelije su prenete u epruvete od 50 ml i isprane PBS-om (centrifugiranje na 350xg, 10 min). Ponovljen je korak ispiranja (centrifugiranje na 300xg, 10 min). Nakon centrifugiranja (10 min, 350xg), ćelije su ponovo suspendovane u RPMI medijumu. 10<7>PBMC je injektovano intravenski u NOG miševe stvarajući mišji-humani himerni model. Desetog dana je započela nedeljna zakazana terapija (vehikulum ili tretman jedinjenjem odabranim od anti-PD1 (0376), nivolumaba, anti-TIM3 (0438) ili anti PD1-TIM3 (0476)) koja je data intraperitonealnom injekcijom. Tretman bispecifičnim antitelom PD1-Tim3 (sa 3 ili 10 mg/kg; otvoreni trougao) upoređen je sa ekvimolarnom (1,5 ili 5 mg/kg) koncentracijom pojedinačnog agensa PD1 antitela (0376), nivolumaba i Tim3 antitela (0438). Veličina tumora je merena pomičnim merilom u mm tokom 30 dana, na svaka 2-3 dana. Na Slikama 14A i 14B, merenja zapremine tumora su prikazana kao prosečna zapremina u grupi miševa.
Svi tretmani su pokazali sposobnost kontrole rasta tumora u poređenju sa grupom koja je tretirana vehikulumom. Inhibicija samo PD1 (pomoću PD1 antitela (0376) ili referentne vrednosti nivolumaba) i samo TIM3 antitela (0438), dovela je do slične efikasnosti kontrole rasta tumora. To pokazuje da je blokiranjem PD1 ili TIM3 moguće povećavati antitumorski odgovor. Međutim, može se primetiti povećanje inhibicije rasta tumora kada su PD1 i TIM3 vezani za bispecifično antitelo PD1-TIM3. Dok se pri niskoj koncentraciji ne može primetiti razlika u rastu tumora između bispecifičnog antitela i drugog tretmana, kod većih doza inhibicija PD1 i TIM3 tretmanom bispecifičnim antitelima PD1-TIM3 dovodi do snažne inhibicije rasta tumora.
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
�
1
�
1
11
12
�
14
�
1
1
1
�
1
11
12
1
14
1
1
�
1
1
1
11
��
1
��
1
1
1
�
�
2
21
22
2
��
�
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21

Claims (25)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3, pri čemu navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, ili
(b) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46, ili
(c) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, ili
(d) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48, ili
(e) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 49; i
navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži (a) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 23 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24, ili
(b) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26, ili
(c) VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28.
2. Bispecifično antitelo prema zahtevu 1, pri čemu
navedeno prvo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 46,
i navedeno drugo antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
3. Bispecifično antitelo prema zahtevima 1 ili 2, pri čemu, bispecifično antitelo je humanizovano antitelo.
4. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu, bispecifično antitelo sadrži Fc domen, prvi Fab fragment koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 i drugi Fab fragment koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3.
2 2
5. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu, Fc domen je IgG, konkretno Fc domen IgG1 ili Fc domen IgG4.
6. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu domen Fc sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina koje smanjuju vezivanje za Fc receptor, posebno za Fc γ receptor.
7. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 6, pri čemu, Fc domen je potklasa humanog IgG1 sa mutacijama aminokiselina L234A, L235A i P329G prema Kabatovoj EU numeraciji.
8. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu, Fc domen sadrži modifikaciju koja promoviše povezivanje prve i druge podjedinice Fc domena.
9. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu, prva podjedinica Fc domena sadrži dugmad, a druga podjedinica Fc domena rupice prema postupku dugme u rupici.
10. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu, prva podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije S354C i T366W (EU numeracija), i druga podjedinica Fc domena sadrži aminokiselinske supstitucije Y349C, T366S i Y407V prema Kabatovoj EU numeraciji.
11. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 10, pri čemu, u jednom od Fab fragmenata varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim, tako da je VH domen deo lakog lanca, a VL domen je deo teškog lanca.
12. Bispecifično antitelo prema zahtevu 11, pri čemu, u prvom Fab fragmentu koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za PD1 varijabilni domeni VL i VH su zamenjeni jedan drugim.
13. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 12, pri čemu, u jednom od Fab fragmenata u konstantnom domenu CL aminokiselina na poziciji 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) prema Kabatovom EU indeksu numeracije, i u konstantnom domenu CH1 aminokiseline na položajima 147 i 213 su nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) prema Kabatovom EU indeksu numeracije.
14. Bispecifično antitelo prema zahtevu 13, pri čemu, u drugom Fab fragmentu koji sadrži antigen vezujuće mesto koje se specifično vezuje za TIM3 konstantni domen CL aminokiselina na položaju 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatovom EU indeksu), i u konstantnom domenu CH1 aminokiseline na položajima 147 i 213 su nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) prema Kabatovoj EU numeraciji.
15. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 16, koje sadrži
prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 62, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 64, i
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 63, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO:65.
16. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 17, koje sadrži
prvi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.: 62, prvi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 64, i
drugi teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 63, i drugi laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:65.
17. Polinukleotid koji kodira bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 16.
18. Vektor, posebno ekspresioni vektor, koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 17.
19. Prokariotska ili eukariotska ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid prema zahtevu 17 ili vektor prema zahtevu 18.
20. Postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela prema zahtevima od 1 do 16, koji sadrži korake: a) transformisanja ćelije domaćina vektorima koji sadrže polinukleotide koji kodiraju navedeno bispecifično antitelo, b) kultivisanja ćelije domaćina pod uslovima pogodnim za ekspresiju bispecifičnog antitela i c) rekuperovanje bispecifičnog antitela iz kulture.
21. Farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 16 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
22. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 16, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 21, koji se primenjuju kao lek.
23. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 16, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 21, za upotrebu u prevenciji ili lečenju kancera.
24. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 16, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 21, za upotrebu u lečenju hronične virusne infekcije.
25. Bispecifično antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 16, ili farmaceutska
2 4
kompozicija prema zahtevu 21, za upotrebu u prevenciji ili lečenju kancera, pri čemu se bispecifično antitelo primenjuje u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom, zračenjem i/ili drugim agensima za upotreba u imunoterapiji kancera.
2
RS20211031A 2015-10-02 2016-09-29 Bispecifična antitela specifična za pd1 i tim3 RS62258B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15188036 2015-10-02
EP15188065 2015-10-02
EP16777648.3A EP3356411B1 (en) 2015-10-02 2016-09-29 Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
PCT/EP2016/073192 WO2017055404A1 (en) 2015-10-02 2016-09-29 Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62258B1 true RS62258B1 (sr) 2021-09-30

Family

ID=57083290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211031A RS62258B1 (sr) 2015-10-02 2016-09-29 Bispecifična antitela specifična za pd1 i tim3

Country Status (34)

Country Link
US (3) US10287352B2 (sr)
EP (2) EP3356411B1 (sr)
JP (2) JP6622392B2 (sr)
KR (2) KR102146319B1 (sr)
CN (2) CN108137699B (sr)
AU (1) AU2016329126B2 (sr)
CA (1) CA2992853A1 (sr)
CL (1) CL2018000502A1 (sr)
CO (1) CO2018000886A2 (sr)
CR (1) CR20180161A (sr)
CY (1) CY1124691T1 (sr)
DK (1) DK3356411T3 (sr)
ES (1) ES2886569T3 (sr)
HR (1) HRP20211357T1 (sr)
HU (1) HUE055407T2 (sr)
IL (1) IL257110B (sr)
LT (1) LT3356411T (sr)
MA (1) MA43028B1 (sr)
MX (2) MX376121B (sr)
MY (1) MY192202A (sr)
NZ (2) NZ739090A (sr)
PE (1) PE20180773A1 (sr)
PH (1) PH12018500635A1 (sr)
PL (1) PL3356411T3 (sr)
PT (1) PT3356411T (sr)
RS (1) RS62258B1 (sr)
RU (1) RU2729371C1 (sr)
SG (1) SG10202008325XA (sr)
SI (1) SI3356411T1 (sr)
SM (1) SMT202100506T1 (sr)
TW (1) TWI614269B (sr)
UA (1) UA124925C2 (sr)
WO (1) WO2017055404A1 (sr)
ZA (1) ZA201800534B (sr)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
WO2012116926A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding proteins
JP5768147B2 (ja) 2011-02-28 2015-08-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 一価抗原結合タンパク質
KR20160044060A (ko) 2013-10-11 2016-04-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 다중특이적 도메인 교환된 통상의 가변 경쇄 항체
US11933786B2 (en) 2015-03-30 2024-03-19 Stcube, Inc. Antibodies specific to glycosylated PD-L1 and methods of use thereof
CN114591433A (zh) 2015-07-13 2022-06-07 西托姆克斯治疗公司 抗pd-1抗体、可活化抗pd-1抗体及其使用方法
NZ739090A (en) 2015-10-02 2025-06-27 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
EP3370768B9 (en) 2015-11-03 2022-03-16 Janssen Biotech, Inc. Antibodies specifically binding pd-1 and their uses
MA43260A (fr) 2015-11-18 2018-09-26 Merck Sharp & Dohme Liants pd1 et/ou lag3
KR102809728B1 (ko) * 2015-12-02 2025-05-21 주식회사 에스티큐브 글리코실화된 pd-1에 대해 특이적인 항체 및 이의 사용 방법
TN2018000333A1 (en) 2016-04-12 2020-01-16 Symphogen As Anti-tim-3 antibodies and compositions
EP3243832A1 (en) * 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
EP3458485B1 (en) 2016-05-19 2021-12-29 The General Hospital Corporation Tethered interleukin-2 to its receptor il-2rbeta, a platform to enhance natural killer and regulatory t cell activity
TWI781934B (zh) 2016-05-27 2022-11-01 美商艾吉納斯公司 抗-tim-3抗體及其使用方法
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
MY200602A (en) 2016-07-14 2024-01-04 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against tim3 and uses thereof
CA3052357A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing multispecific antibodies
JP7148539B2 (ja) * 2017-04-03 2022-10-05 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 免疫抱合体
RU2761377C2 (ru) 2017-04-03 2021-12-07 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Иммуноконъюгаты антитела к pd-1 с мутантом il-2 или с il-15
EA201992350A1 (ru) 2017-04-05 2020-03-23 Симфоген А/С Комбинированные лекарственные средства, нацеленные на pd-1, tim-3 и lag-3
TWI690538B (zh) * 2017-04-05 2020-04-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 特異性結合至pd1至lag3的雙特異性抗體
JOP20190222A1 (ar) * 2017-04-11 2019-09-24 Zymeworks Inc الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لـ pd-l1 والمضادة لـ tim-3
EP3649155A1 (en) * 2017-07-06 2020-05-13 Merus N.V. Bispecific anti pd1-anti tim3 antibodies
CA3070295A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-tim-3 antibodies and uses thereof
EP3676616A1 (en) 2017-08-28 2020-07-08 Bristol-Myers Squibb Company Tim-3 antagonists for the treatment and diagnosis of cancers
KR20250078626A (ko) 2018-01-12 2025-06-02 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tim3에 대한 항체 및 그의 용도
US20210363242A1 (en) 2018-01-16 2021-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating cancer with antibodies against tim3
US12398209B2 (en) 2018-01-22 2025-08-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers with antagonistic anti-PD-1 antibodies
US20200354457A1 (en) * 2018-01-31 2020-11-12 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific antibodies comprising an antigen-binding site binding to lag3
CN110144011B (zh) * 2018-02-14 2020-06-23 上海洛启生物医药技术有限公司 针对t淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3的单域抗体
GB201803745D0 (en) 2018-03-08 2018-04-25 Ultrahuman Eight Ltd PD1 binding agents
GB201803746D0 (en) 2018-03-08 2018-04-25 Ultrahuman Eight Ltd PD1 binding agents
PE20210665A1 (es) 2018-03-23 2021-03-31 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra mica y/o micb y sus usos
CN111902428B (zh) * 2018-07-03 2023-11-10 上海健信生物医药科技有限公司 一种双特异性抗体及其用途
KR20210108421A (ko) * 2018-12-24 2021-09-02 사노피 돌연변이 Fab 도메인을 포함하는 다중특이성 결합 단백질
EP3906415B1 (en) * 2019-01-03 2026-04-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cd8+ t cell-dependent immune responses in subjects suffering from cancer
EP3947640A4 (en) 2019-04-02 2022-12-14 The Brigham & Women's Hospital, Inc. PROCEDURE FOR DETERMINING THE PROGRESSION OF PRIMARY MELANOMA
KR20220016155A (ko) 2019-05-30 2022-02-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 면역-종양학 (i-o) 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법
EP3977132A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
JP2022534967A (ja) 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 多腫瘍遺伝子シグネチャーおよびその使用
BR112021025462A2 (pt) 2019-06-19 2022-02-01 Hoffmann La Roche Métodos para produzir um anticorpo bivalente biespecífico e uma célula de mamífero recombinante, ácido desoxirribonucleico, uso de um ácido desoxirribonucleico, célula de mamífero recombinante e composição
JP7572977B2 (ja) 2019-06-19 2024-10-24 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 所定の構成の複数の発現カセットの標的化組込みによって多価の多重特異性抗体発現細胞を作製するための方法
GB201914747D0 (en) 2019-10-11 2019-11-27 Ultrahuman Eight Ltd PD1 and vegfr2 dual-binding agents
KR102536302B1 (ko) 2020-02-25 2023-05-26 국립암센터 Tim-3 에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도
PH12022552436A1 (en) * 2020-04-15 2024-01-03 Hoffmann La Roche Immunoconjugates
JP2023116826A (ja) * 2020-05-20 2023-08-23 中外製薬株式会社 抗原結合分子
CN113214396B (zh) * 2020-07-31 2022-04-19 北京市神经外科研究所 抗tim3的单链抗体及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途
AU2021334361A1 (en) 2020-08-31 2023-05-11 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and immunotherapy
US11865082B2 (en) 2020-09-09 2024-01-09 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy of PD-1-targeted IL-2 variant immunocytokines and antibodies against human PD-L1
CN112266899A (zh) * 2020-10-26 2021-01-26 北京卡替医疗技术有限公司 修饰的免疫细胞及其用途
US20220144956A1 (en) * 2020-11-06 2022-05-12 Xencor, Inc. HETERODIMERIC ANTIBODIES THAT BIND TGFbetaRII
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
JP2024501029A (ja) 2020-12-28 2024-01-10 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｐｄ１／ｐｄ－ｌ１抗体の皮下投与
SMT202500208T1 (it) 2020-12-28 2025-07-22 Bristol Myers Squibb Co Composizioni anticorpali e metodi per il loro uso
JP2024514530A (ja) 2021-04-02 2024-04-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 切断型ｃｄｃｐ１に対する抗体およびその使用
US20240391997A1 (en) * 2021-07-16 2024-11-28 Brightpath Biotherapeutics Co., Ltd. Anti-tim-3 antigen antibody or antibody derivative, and use thereof
US20230151095A1 (en) 2021-11-12 2023-05-18 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to b7h3 and nkg2d
EP4493575A1 (en) 2022-03-18 2025-01-22 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023215560A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Atoosa Corporation Tumor cell/immune cell multivalent receptor engager – bio-nanoparticle (timre-bnp)
EP4531916A1 (en) 2022-06-02 2025-04-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024102636A1 (en) 2022-11-07 2024-05-16 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to b7h3 and mica/b
JP2026505276A (ja) 2023-01-31 2026-02-13 ユニバーシティ オブ ロチェスター Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ感染症を治療するための免疫チェックポイント遮断療法
JP2026506893A (ja) 2023-02-23 2026-02-27 イムチェック セラピューティクス エスエーエス Ｂｔｎ３ａ活性化抗体と免役チェックポイント阻害剤の併用
KR20260035814A (ko) 2023-04-28 2026-03-13 젠코어 인코포레이티드 직교 다중체 단백질
US20240417472A1 (en) * 2023-05-23 2024-12-19 Medimmune, Llc PD-1/TIM-3 BINDING PROTEINS FOR TREATMENT OF NSCLC and cHL
CN121712571A (zh) 2023-08-15 2026-03-20 百时美施贵宝公司 陶瓷羟基磷灰石色谱流通法
WO2025077833A1 (en) * 2023-10-11 2025-04-17 Suzhou Neologics Bioscience Co., Ltd. Antibodies targeting tim-3 and pd-1 and uses thereof
US20250243279A1 (en) 2023-10-17 2025-07-31 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to nkp46 and mica/b
WO2025145207A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy of kras inhibitor and treg-depleting agent
WO2026076317A1 (en) 2024-10-04 2026-04-09 Xencor, Inc. Bispecific antibodies that bind to mica/b and cd3

Family Cites Families (204)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
MD1367C2 (ro) 1992-11-13 2000-11-30 Idec Pharmaceuticals Corporation Metode de tratament al limfomului celulelor B, anticorpi anti-CD20, hibridom.
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6066322A (en) 1995-03-03 2000-05-23 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of immune disorders
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
JP3920928B2 (ja) 1996-11-29 2007-05-30 アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ 移植片拒絶反応の防止法および普遍的遺伝子治療宿主細胞の生産法
JP4213224B2 (ja) 1997-05-02 2009-01-21 ジェネンテック，インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ATE296315T1 (de) 1997-06-24 2005-06-15 Genentech Inc Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
CN100427603C (zh) 1999-10-04 2008-10-22 麦迪卡格公司 调控外源基因转录的方法
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
ATE344801T1 (de) 1999-12-29 2006-11-15 Immunogen Inc Doxorubicin- und daunorubicin-enthaltende, zytotoxische mittel und deren therapeutische anwendung
CN101289511A (zh) 2000-04-11 2008-10-22 杰南技术公司 多价抗体及其应用
KR100919593B1 (ko) 2000-06-29 2009-09-29 아보트 러보러터리즈 이중 특이성 항체 및 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 조성물
DE60140474D1 (de) 2000-09-08 2009-12-24 Univ Zuerich Sammlung von proteinen mit sich wiederholenden sequenzen (repeat proteins), die repetitive sequenzmodule enthalten
EP2180044A1 (en) 2001-08-03 2010-04-28 GlycArt Biotechnology AG Antibody glycosylation variants having increased anti-body-dependent cellular cytotoxicity
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
WO2003042402A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Agents that modulate immune cell activation and methods of use thereof
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
AU2003303082B2 (en) 2002-01-30 2009-07-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods related to TIM-3, a Th1-specific cell surface molecule
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
ES2350687T3 (es) 2002-07-03 2011-01-26 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Composiciones de inmunopotenciación.
ES2533963T3 (es) 2002-10-10 2015-04-16 Merck Patent Gmbh Composiciones farmacéuticas dirigidas a receptores Erb-B1
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP3263596A1 (en) 2002-12-16 2018-01-03 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
CN1753912B (zh) 2002-12-23 2011-11-02 惠氏公司 抗pd-1抗体及其用途
US7563869B2 (en) 2003-01-23 2009-07-21 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to human PD-1
US7772188B2 (en) 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
AU2004210088A1 (en) 2003-02-06 2004-08-19 Micromet Ag Trimeric polypeptide construct to induce an enduring T cell response
FI1897548T4 (fi) 2003-02-28 2024-09-03 The Johns Hopkins University T-solujen säätely
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
AU2003272065A1 (en) 2003-04-03 2004-10-25 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Broad-spectrum in-vivo effective superantigen toxin antagonists based on the interaction between cd28 and the superantigen and uses thereof
US7993650B2 (en) 2003-07-04 2011-08-09 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for HER2
WO2005019255A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
NZ592039A (en) 2003-08-27 2013-03-28 Ophthotech Corp Combination therapy for the treatment of ocular neovascular disorders
ES2672640T3 (es) 2003-11-05 2018-06-15 Roche Glycart Ag Moléculas de unión a antígeno con afinidad de unión a receptores Fc y función efectora incrementadas
US7498298B2 (en) 2003-11-06 2009-03-03 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
CN1946417A (zh) 2003-12-05 2007-04-11 阿德内克休斯治疗公司 2型血管内皮生长因子受体的抑制剂
KR20050082389A (ko) 2004-02-18 2005-08-23 메덱스젠 주식회사 직렬 연쇄체를 갖는 면역접합체를 포함하는 장기이식합병증 치료용 약제학적 조성물
KR101270829B1 (ko) 2004-09-23 2013-06-07 제넨테크, 인크. 시스테인 유전자조작 항체 및 접합체
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
RU2494107C2 (ru) 2005-05-09 2013-09-27 Оно Фармасьютикал Ко., Лтд. Моноклональные антитела человека к белку программируемой смерти 1 (pd-1) и способы лечения рака с использованием анти-pd-1-антител самостоятельно или в комбинации с другими иммунотерапевтическими средствами
CN101355965A (zh) 2005-06-08 2009-01-28 达纳－法伯癌症研究院 通过抑制程序性细胞死亡1（pd-1）途经治疗持续性感染和癌症的方法及组合物
JP2006345852A (ja) 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corp 抗体複合体
CN104356236B (zh) 2005-07-01 2020-07-03 E.R.施贵宝&圣斯有限责任公司 抗程序性死亡配体1(pd-l1)的人单克隆抗体
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
WO2007062466A1 (en) 2005-11-29 2007-06-07 The University Of Sydney Demibodies: dimerisation-activated therapeutic agents
US8871912B2 (en) 2006-03-24 2014-10-28 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
WO2007146968A2 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
CN101490085A (zh) * 2006-06-12 2009-07-22 特鲁比昂药品公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
EP2102241A2 (en) 2006-12-15 2009-09-23 Ablynx N.V. Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system
CN103536915A (zh) 2006-12-27 2014-01-29 埃默里大学 用于治疗传染病和肿瘤的组合物和方法
EP1958957A1 (en) 2007-02-16 2008-08-20 NascaCell Technologies AG Polypeptide comprising a knottin protein moiety
US9244059B2 (en) 2007-04-30 2016-01-26 Immutep Parc Club Orsay Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
WO2009015917A2 (en) 2007-05-14 2009-02-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Dihydroquinone and dihydronaphthridine inhibitors of jnk
US8828666B2 (en) 2007-06-18 2014-09-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring bonding activity of antibody which mimics antibody-dependent cell medicated cytotoxic activity
HRP20131167T1 (hr) 2007-06-18 2014-01-03 Merck Sharp & Dohme B.V. Antitijela za humani receptor programirane smrti pd-1
US20090028857A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
US9243052B2 (en) 2007-08-17 2016-01-26 Daniel Olive Method for treating and diagnosing hematologic malignancies
EP2212350B1 (en) 2007-10-26 2013-08-28 Governing Council of the University of Toronto Treating chronic viral infection by targetting TIM-3
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
ES2563027T3 (es) 2008-01-07 2016-03-10 Amgen Inc. Método para fabricación de moléculas heterodímeras Fc de anticuerpos utilizando efectos de conducción electrostática
PT2242773T (pt) 2008-02-11 2017-09-15 Cure Tech Ltd Anticorpos monoclonais para o tratamento de tumores
WO2009114335A2 (en) 2008-03-12 2009-09-17 Merck & Co., Inc. Pd-1 binding proteins
KR101001360B1 (ko) 2008-06-16 2010-12-14 (주)기가레인 전자 기기의 접지에 전기적으로 연결되는 인쇄회로기판
DK2604693T3 (en) 2008-07-21 2016-05-30 Apogenix Gmbh Single-chain TNFSF molecules
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
WO2010098788A2 (en) 2008-08-25 2010-09-02 Amplimmune, Inc. Pd-i antagonists and methods for treating infectious disease
CN102203132A (zh) 2008-08-25 2011-09-28 安普利穆尼股份有限公司 Pd-1拮抗剂的组合物和使用方法
US8927697B2 (en) 2008-09-12 2015-01-06 Isis Innovation Limited PD-1 specific antibodies and uses thereof
JP5794917B2 (ja) 2008-09-12 2015-10-14 アイシス・イノベーション・リミテッドＩｓｉｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｌｉｍｉｔｅｄ Ｐｄ−１特異抗体およびその使用
KR101814408B1 (ko) 2008-09-26 2018-01-04 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 인간 항-ｐｄ-１, ｐｄ-ｌ１, 및 ｐｄ-ｌ2 항체 및 그의 용도
CA2744449C (en) 2008-11-28 2019-01-29 Emory University Methods for the treatment of infections and tumors
WO2010084999A1 (en) 2009-01-26 2010-07-29 Protegene, Inc. Immunosuppressive agents and prophylactic and therapeutic agents for autoimmune diseases
WO2010089411A2 (en) 2009-02-09 2010-08-12 Universite De La Mediterranee Pd-1 antibodies and pd-l1 antibodies and uses thereof
US20110313129A1 (en) 2009-02-11 2011-12-22 Life Technologies Corporation Large stokes shift dyes
PE20120591A1 (es) 2009-04-02 2012-05-23 Roche Glycart Ag Anticuerpos multiespecificos que comprenden anticuerpos de longitud completa y fragmentos fab de cadena sencilla
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
WO2011066342A2 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Amplimmune, Inc. Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2
CN102958942A (zh) 2009-12-29 2013-03-06 新兴产品开发西雅图有限公司 异二聚体结合蛋白及其应用
CA3083324A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 The Johns Hopkins University Compositions and methods for targeted immunomodulatory antibodies and fusion proteins
TW201134488A (en) 2010-03-11 2011-10-16 Ucb Pharma Sa PD-1 antibodies
CN102892786B (zh) 2010-03-11 2016-03-16 Ucb医药有限公司 Pd-1抗体
TWI426920B (zh) * 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
KR101385514B1 (ko) 2010-06-08 2014-04-16 주식회사 에스칩스 깊이 맵 정보를 이용한 입체 영상 변환 방법 및 장치
WO2011155607A1 (ja) 2010-06-11 2011-12-15 協和発酵キリン株式会社 抗ｔｉｍ－３抗体
JP2013532153A (ja) * 2010-06-18 2013-08-15 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド 慢性免疫病に対する免疫治療のためのｔｉｍ−３およびｐｄ−１に対する二重特異性抗体
UY33492A (es) 2010-07-09 2012-01-31 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
HUE036077T2 (hu) 2010-08-13 2018-06-28 Roche Glycart Ag Anti-FAP ellenanyagok és alkalmazásukra szolgáló eljárások
PL2635607T3 (pl) 2010-11-05 2020-05-18 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerowego z mutacjami w domenie FC
HUE029139T2 (hu) 2011-02-10 2017-02-28 Roche Glycart Ag Mutáns interleukin-2 polipeptidek
US8936661B2 (en) 2011-02-23 2015-01-20 Pecofacet (Us), Inc. Multi-stage filter element
SG10201602394QA (en) 2011-03-29 2016-05-30 Roche Glycart Ag Antibody FC Variants
US9822179B2 (en) 2011-04-01 2017-11-21 Universitat Stuttgart Recombinant TNF ligand family member polypeptides with antibody binding domain and uses therefor
KR101970025B1 (ko) 2011-04-20 2019-04-17 메디뮨 엘엘씨 Ｂ7-ｈ1 및 ｐｄ-1과 결합하는 항체 및 다른 분자들
US8841418B2 (en) 2011-07-01 2014-09-23 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to TIM3
FR2977674B1 (fr) 2011-07-06 2015-08-14 Cisbio Bioassays Methode amelioree de detection et/ou de quantification d'un analyte present a la surface d'une cellule
EP2543680A1 (en) * 2011-07-07 2013-01-09 Centre National de la Recherche Scientifique Multispecific mutated antibody Fab fragments
JP6240600B2 (ja) 2011-07-24 2017-11-29 キュアテク リミテッド ヒト化免疫モノクローナル抗体の変異体
SG2014012298A (en) 2011-08-11 2014-06-27 Medarex Llc Human antibodies that bind lymphocyte activation gene-3 (lag-3), and uses thereof
FR2980271B1 (fr) 2011-09-16 2013-10-11 Cisbio Bioassays Procede de determination de la glycosylation d'un anticorps
LT2794905T (lt) 2011-12-20 2020-07-10 Medimmune, Llc Modifikuoti polipeptidai, skirti bispecifinių antikūnų karkasams
JP2015507193A (ja) 2012-02-01 2015-03-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性結合物の結合パートナーを検出するための方法
JP5585973B2 (ja) 2012-03-22 2014-09-10 三井造船株式会社 Ｆｒｅｔ計測装置及びｆｒｅｔ計測方法
SI2838917T1 (sl) 2012-04-20 2019-11-29 Merus Nv Postopki in sredstva za produkcijo heterodimernih IG-podobnih molekul
CN110563850A (zh) 2012-04-30 2019-12-13 比奥孔有限公司 靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法
AR091649A1 (es) 2012-07-02 2015-02-18 Bristol Myers Squibb Co Optimizacion de anticuerpos que se fijan al gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
LT3495387T (lt) 2012-07-13 2021-11-25 Roche Glycart Ag Bispecifiniai anti-vegf / anti-ang-2 antikūnai ir jų panaudojimas akių kraujagyslių ligoms gydyti
AR092044A1 (es) 2012-08-07 2015-03-18 Roche Glycart Ag Inmunoterapia mejorada
CN105121630B (zh) 2012-10-03 2018-09-25 酵活有限公司 定量重链和轻链多肽对的方法
EA037554B1 (ru) 2013-03-15 2021-04-13 Глаксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед Анти-lag-3 связывающие белки
JP6742903B2 (ja) 2013-05-02 2020-08-19 アナプティスバイオ インコーポレイティッド プログラム死−１（ｐｄ−１）に対する抗体
CA2916681A1 (en) 2013-07-16 2015-01-22 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and tigit inhibitors
BR112016002614B8 (pt) 2013-08-08 2023-11-07 Hopitaux Paris Assist Publique Imunocitoquina e composição farmacêutica
SG11201601763SA (en) 2013-09-20 2016-04-28 Bristol Myers Squibb Co Combination of anti-lag-3 antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat tumors
US10570204B2 (en) * 2013-09-26 2020-02-25 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Methods for treating hematologic cancers
KR20160044060A (ko) 2013-10-11 2016-04-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 다중특이적 도메인 교환된 통상의 가변 경쇄 항체
MY184154A (en) 2013-12-12 2021-03-23 Shanghai hengrui pharmaceutical co ltd Pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
AU2014364606A1 (en) 2013-12-17 2016-07-07 Genentech, Inc. Combination therapy comprising OX40 binding agonists and PD-1 axis binding antagonists
RU2727639C2 (ru) 2014-01-15 2020-07-22 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Варианты fc-области с модифицированной способностью связываться с fcrn и с сохраненной способностью связываться с белком а
US10794898B2 (en) 2014-01-17 2020-10-06 Regents Of The University Of Minnesota High-throughput, high-precision methods for detecting protein structural changes in living cells
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
SG10201900002QA (en) 2014-01-24 2019-02-27 Dana Farber Cancer Institue Inc Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
EP3099716A1 (en) 2014-01-28 2016-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Anti-lag-3 antibodies to treat hematological malignancies
EP3099717B1 (en) 2014-01-31 2019-03-27 Novartis AG Antibody molecules to tim-3 and uses thereof
US20150259420A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Novartis Ag Antibody molecules to lag-3 and uses thereof
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
JP2017513901A (ja) 2014-04-25 2017-06-01 ジェネンテック， インコーポレイテッド トラスツズマブ−ｍｃｃ−ｄｍ１及びペルツズマブにより早期の乳癌を処置する方法
TWI693232B (zh) 2014-06-26 2020-05-11 美商宏觀基因股份有限公司 與pd-1和lag-3具有免疫反應性的共價結合的雙抗體和其使用方法
JO3663B1 (ar) 2014-08-19 2020-08-27 Merck Sharp & Dohme الأجسام المضادة لمضاد lag3 وأجزاء ربط الأنتيجين
CN105406978B (zh) 2014-09-16 2020-01-07 电信科学技术研究院 数据转发设备工作模式的配置方法及装置
EP3209688A1 (en) 2014-10-23 2017-08-30 Five Prime Therapeutics, Inc. Slamf1 antagonists and uses thereof
GB201419084D0 (en) 2014-10-27 2014-12-10 Agency Science Tech & Res Anti-PD-1 antibodies
PT3215532T (pt) 2014-11-06 2019-12-18 Hoffmann La Roche Anticorpos anti-tim3 e métodos de utilização
CR20170194A (es) 2014-11-14 2017-07-10 Hoffmann La Roche Moleculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de tnf
DK3221355T3 (da) 2014-11-20 2020-12-07 Hoffmann La Roche Kombinationsbehandling med T-celleaktiverende bispecifikke antigenbindende molekyler CD3 og folatreceptor 1 (FolR1) samt PD-1-aksebindende antagonister
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
EP3916017A1 (en) 2014-12-22 2021-12-01 PD-1 Acquisition Group, LLC Anti-pd-1 antibodies
MA41463A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Anaptysbio Inc Anticorps dirigés contre le gène d'activation 3 des lymphocytes (lag-3)
TWI773646B (zh) 2015-06-08 2022-08-11 美商宏觀基因股份有限公司 結合lag-3的分子和其使用方法
HK1254803A1 (zh) 2015-06-23 2019-07-26 Memorial Sloan Kettering Cancer Center 新型pd -1的免疫调节剂
CA2993177A1 (en) 2015-07-22 2017-01-26 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind lag3
KR20250073532A (ko) 2015-09-02 2025-05-27 이뮤텝 에스.에이.에스. 항-lag-3 항체
CN106559732A (zh) 2015-09-25 2017-04-05 中兴通讯股份有限公司 车联网通信处理方法和装置
NZ739090A (en) 2015-10-02 2025-06-27 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
CN108139394B (zh) 2015-10-02 2020-10-30 豪夫迈·罗氏有限公司 用于确定同时结合的基于细胞的fret测定法
CR20180151A (es) 2015-10-02 2018-05-25 Hoffmann La Roche Antcuierpos anti-pd1 y métodos de uso
WO2017060144A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory tnf receptor
JP6668468B2 (ja) 2015-11-03 2020-03-18 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｈｂｖキャプシドアセンブリ阻害剤とインターフェロンの併用療法
KR102809728B1 (ko) 2015-12-02 2025-05-21 주식회사 에스티큐브 글리코실화된 pd-1에 대해 특이적인 항체 및 이의 사용 방법
WO2017097728A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bridged piperidine derivatives
KR20180130541A (ko) 2016-03-29 2018-12-07 주식회사 에스티큐브앤컴퍼니 글리코실화된 면역체크포인트 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하는 방법
EP3455254B1 (en) 2016-05-11 2021-07-07 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
EP3243836A1 (en) 2016-05-11 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG C-terminally fused tnf family ligand trimer-containing antigen binding molecules
EP3243832A1 (en) 2016-05-13 2017-11-15 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
RU2761377C2 (ru) 2017-04-03 2021-12-07 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Иммуноконъюгаты антитела к pd-1 с мутантом il-2 или с il-15
JP7148539B2 (ja) 2017-04-03 2022-10-05 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 免疫抱合体
SI3606954T1 (sl) 2017-04-05 2022-10-28 F. Hoffmann - La Roche Ag Protitelesa proti LAG3
EP4368200A3 (en) 2017-04-05 2024-07-17 Boehringer Ingelheim International GmbH Anticancer combination therapy
EA201992350A1 (ru) 2017-04-05 2020-03-23 Симфоген А/С Комбинированные лекарственные средства, нацеленные на pd-1, tim-3 и lag-3
TWI690538B (zh) 2017-04-05 2020-04-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 特異性結合至pd1至lag3的雙特異性抗體

Also Published As

Publication number Publication date
CN114773481B (zh) 2025-04-29
JP2020058353A (ja) 2020-04-16
US11130810B2 (en) 2021-09-28
CN114773481A (zh) 2022-07-22
HUE055407T2 (hu) 2021-11-29
SI3356411T1 (sl) 2021-09-30
BR112018001530A2 (en) 2018-11-06
US12391757B2 (en) 2025-08-19
US20170114135A1 (en) 2017-04-27
ZA201800534B (en) 2023-07-26
EP3954709A1 (en) 2022-02-16
CO2018000886A2 (es) 2018-04-19
CN108137699A (zh) 2018-06-08
ES2886569T3 (es) 2021-12-20
HK1256365A1 (zh) 2019-09-20
PT3356411T (pt) 2021-08-30
KR102146319B1 (ko) 2020-08-25
IL257110A (en) 2018-03-29
LT3356411T (lt) 2021-09-10
SG10202008325XA (en) 2020-09-29
UA124925C2 (en) 2021-12-15
JP2018537950A (ja) 2018-12-27
EP3356411A1 (en) 2018-08-08
PL3356411T3 (pl) 2021-12-06
MX2020010382A (es) 2021-07-16
US20220259314A1 (en) 2022-08-18
NZ739090A (en) 2025-06-27
CA2992853A1 (en) 2017-04-06
MX2018003630A (es) 2018-08-01
RU2729371C1 (ru) 2020-08-06
AU2016329126A1 (en) 2018-02-15
PE20180773A1 (es) 2018-05-07
CN108137699B (zh) 2022-05-27
EP3356411B1 (en) 2021-06-30
CR20180161A (es) 2018-05-25
US10287352B2 (en) 2019-05-14
KR102431342B1 (ko) 2022-08-10
CY1124691T1 (el) 2022-07-22
SMT202100506T1 (it) 2021-11-12
CL2018000502A1 (es) 2018-07-27
AU2016329126B2 (en) 2023-04-13
KR20200099215A (ko) 2020-08-21
MA43028B1 (fr) 2021-09-30
HRP20211357T1 (hr) 2021-11-26
PH12018500635A1 (en) 2018-09-24
JP6622392B2 (ja) 2019-12-18
KR20180042417A (ko) 2018-04-25
MA43028A (fr) 2021-03-17
DK3356411T3 (da) 2021-09-06
US20190322748A1 (en) 2019-10-24
MY192202A (en) 2022-08-06
IL257110B (en) 2022-09-01
NZ779938A (en) 2025-06-27
WO2017055404A1 (en) 2017-04-06
MX376121B (es) 2025-03-07
TW201718660A (zh) 2017-06-01
TWI614269B (zh) 2018-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12391757B2 (en) Bispecific antibodies specific for PD1 and TIM3
EP3606955B1 (en) Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
CA3023393A1 (en) Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and pd1 binding moiety
US12611457B2 (en) Bispecific antibodies specifically binding to PD1 and LAG3
HK40074510A (en) Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
HK40074510B (zh) 对pd1和tim3特异性的双特异性抗体
HK40086795A (zh) 特异性结合pd1和lag3的双特异性抗体
HK1256365B (en) Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
BR112018001530B1 (pt) Anticorpo biespecífico, método para produzir o anticorpo biespecífico, composição farmacêutica e usos do anticorpo biespecífico ou da composição farmacêutica