RS62841B1 - Bcma i cd3 konstrukti antitela koji angažuju bispecifične t ćelije - Google Patents

Description

Opis

POZADINA

[0001] Molekuli dobijeni od bispecifičnog antitela kao što su BiTE® (bispecifični T ćelija uključeni) konstrukti antitela su rekombinantni proteinski konstrukti napravljeni od dva fleksibilno povezana vezujuća domena izvedena iz antitela. Jedan vezujući domen konstrukata BiTE® antitela je specifičan za odabrani površinski antigen povezan sa tumorom na ciljnim ćelijama; drugi vezujući domen je specifičan za CD3, podjedinicu kompleksa receptora T ćelija na T ćelijama. Svojim posebnim dizajnom, BiTE® konstrukti antitela su jedinstveno prilagođeni za prolazno povezivanje T ćelija sa ciljnim ćelijama i, u isto vreme, snažno aktiviranje inherentnog citolitičkog potencijala T ćelija protiv ciljnih ćelija. Važan dalji razvoj prve generacije konstrukata BiTE® antitela (videti WO 99/54440 i WO 2005/040220) razvijenih u klinici kao AMG 103 i AMG 110 bilo je obezbeđivanje konstrukta bispecifičnih antitela koji se vezuju za epitop nezavisan od konteksta na N-kraj lanca CD3ε (WO 2008/119567). BiTE® konstrukti antitela koji se vezuju za ovaj izabrani epitop ne pokazuju samo specifičnost među vrstama za čoveka i lanac CD3e Callithrix jacchus, Saguinus oedipus ili Saimiri sciureus, već i zbog prepoznavanja ovog specifičnog epitopa (umesto prethodno opisanih epitopa CD3 veziva u molekulima koji se angažuju na bispecifičnim T ćelijama), ne nespecifično aktiviraju T ćelije u istom stepenu kao što je primećeno za prethodnu generaciju antitela za angažovanje T ćelija. Ovo smanjenje aktivacije T ćelija je povezano sa manjom ili smanjenom redistribucijom T ćelija kod pacijenata, pri čemu je poslednje identifikovano kao rizik od neželjenih efekata.

[0002] Konstrukti antitela kao što su opisani u WO 2008/119567 će verovatno patiti od brzog uklanjanja iz tela; stoga, iako su u stanju da brzo dođu do većine delova tela, brzo se proizvode i lakše se rukuju, njihova primena in vivo može biti ograničena njihovom kratkom postojanošću in vivo. Produžena primena kontinuiranom intravenskom infuzijom korišćena je za postizanje terapijskih efekata zbog kratkog in vivo polu-raspada ovog malog, jednolančanog molekula. Međutim, takve kontinuirane intravenske infuzije se klasifikuju kao nezgodne za pacijente i, prema tome, u slučaju pogodnijih alternativnih pristupa lečenju, ometaju izbor jedinjenja za koje se pokazalo da je efikasnije u lečenju odgovarajuće bolesti. Stoga, postoji potreba u tehnici za bispecifičnim terapijskim lekovima koji zadržavaju sličnu terapijsku efikasnost, koji imaju format koji je jednostavan za proizvodnju i koji imaju povoljna farmakokinetička svojstva, uključujući duži polu-raspad.

[0003] Povećano vreme poluraspada je generalno korisno u in vivo primeni imunoglobulina, posebno antitela i posebno fragmenata antitela male veličine. Pristupi opisani u tehnici za postizanje takvog efekta obuhvataju fuziju malog konstrukta bispecifičnog antitela sa većim proteinima, koji poželjno ne ometaju terapeutski efekat BiTE®. Primeri za takav dalji razvoj uključivačnja bispecifičnih T ćelija obuhvataju bispecifične Fc-molekule, npr. opisano u US 2014/0302037, US 2014/0308285, WO 2014/144722, WO 2014/151910 i WO 2015/048272. Alternativna strategija je upotreba HSA spojenog sa bispecifičnim molekulom ili puka fuzija peptida koji vezuju humani albumin (videti npr. WO2013/128027, WO2014/140358).

[0004] BCMA (antigen sazrevanja B ćelija, TNFRSF17, CD269) je transmembranski protein koji pripada super porodici TNF receptora. Utvrđeno je da je marker B ćelija koji je neophodan za razvoj B ćelija i homeostazu (Schliemann i dr., (2001) Science 293 (5537):2111-2114) zbog njegove verovatno suštinske interakcije sa njegovim ligandima BAFF (B ćelija faktor aktiviranja, takođe označen kao TALL-1 ili TNFSF13B) i APRIL (ligand koji indukuje proliferaciju).

[0005] Ekspresija BCMA je ograničena na lozu B ćelija i uglavnom je prisutna na plazma ćelijama i plazmoblastima i donekle na memorijskim B ćelijama, ali je praktično odsutna na perifernim i naivnim B ćelijama. BCMA se takođe eksprimuje na ćelijama multiplog mijeloma (MM) i umešan je u leukemiju i limfome. Zajedno sa članovima svoje porodice TACI (transmembranski aktivator i interaktor ciklofilinskog liganda) i BAFF-R (receptor faktora aktivacije B ćelija, poznat i kao član superfamilije receptora faktora tumorske nekroze 13C), BCMA reguliše različite aspekte humoralnog imuniteta, razvoja B ćelija i homeostaze. Ekspresija BCMA se javlja prilično kasno u diferencijaciji B ćelija i doprinosi dugoročnom preživljavanju plazmoblasta i plazma ćelija u koštanoj srži. Ciljano brisanje BCMA gena kod miševa rezultira značajno smanjenim brojem dugovečnih plazma ćelija u koštanoj srži, što ukazuje na važnost BCMA za njihov opstanak.

[0006] U skladu sa ovim nalazom, BCMA takođe podržava rast i preživljavanje ćelija višestrukog mijeloma (MM). Novak i dr. otkrili su da MM ćelijske linije i sveže izolovane MM ćelije eksprimiraju BCMA i TACI protein na svojim ćelijskim površinama i da imaju promenljivu ekspresiju BAFF-R proteina na svojoj ćelijskoj površini (Novak i dr., (2004) Blood 103(2):689-694 ).

[0007] Multipli mijelom (MM) je drugi najčešći hematološki malignitet i čini 2% svih smrtnih slučajeva od raka. MM je heterogena bolest i uzrokovana je uglavnom translokacijama hromozoma, između ostalog t(11; 14), t(4; 14), t(8;14), del(13), i del(17). Pacijenti zahvaćeni MM mogu iskusiti različite simptome povezane sa bolešću zbog infiltracije koštane srži, razaranja kostiju, bubrežne insuficijencije, imunodeficijencije i psiho-socijalnog opterećenja dijagnoze raka.

[0008] Mijeloma je neizlečiva bolest koja obično prati recidivirajući tok, pri čemu je mnogim pacijentima (bodovima) potrebno više linija terapije. Ishodi u RRMM ostaju loši, posebno nakon neuspeha lečenja zasnovanog na inhibitorima proteazoma (PI) i/ili imunomodulatornim lekovima (IMiD).

[0009] MM je i dalje bolest koja se teško leči i ostaje neizlečiva. Obično sledi recidivirajući tok, sa mnogim pacijentima koji zahtevaju više linija terapije. Terapije kao što su hemoterapija i pristupi transplantaciji matičnih ćelija postaju dostupni i imaju poboljšane stope preživljavanja, ali često donose neželjene nuspojave. Do danas, dve najčešće korišćene opcije lečenja pacijenata sa multiplim mijelomom su kombinacije steroida, talidomida, lenalidomida, bortezomiba ili različitih citotoksičnih sredstava, a za mlađe pacijente koncepti hemoterapije visoke doze sa transplantacijom autolognih matičnih ćelija.

[0010] Većina transplantacija je autolognog tipa, odnosno koristi se sopstvene ćelije pacijenata. Ovakve transplantacije, iako nisu lekovite, pokazalo se da produžavaju život kod odabranih pacijenata. Mogu se izvoditi kao inicijalna terapija kod novo-dijagnostikovanih pacijenata ili u vreme relapsa. Ponekad se kod odabranih pacijenata može preporučiti više od jedne transplantacije za adekvatnu kontrolu bolesti. Transplantacija matičnih ćelija možda nije opcija za mnoge pacijente zbog starosti, prisustva druge ozbiljne bolesti ili drugih fizičkih ograničenja. Hemoterapija samo delimično kontroliše multipli mijelom, retko dovodi do potpune remisije. Ishodi kod relapsiranog refraktornog MM ostaju loši, posebno nakon neuspeha terapije inhibitorima proteazoma (PI) i/ili imunomodulatornim lekovima. Dakle, postoji hitna potreba za novim, inovativnim tretmanima.

[0011] Bellucci i dr. (Blood.2005, 15. maja;105(10)) identifikovali su BCMA-specifična antitela kod pacijenata sa multiplim mijelomom nakon što su primili infuzije limfocita donora. Serum ovih pacijenata je bio sposoban da posreduje u BCMA-specifičnoj ćelijskoj lizi putem ADCC i CDC i detektovan je samo kod pacijenata sa antitumorskim odgovorima (4/9), ali ne i kod pacijenata koji ne reaguju (0/6). Autori spekulišu da indukcija BCMA-specifičnih antitela doprinosi eliminaciji ćelija mijeloma i dugotrajnoj remisiji pacijenata. Ryan i dr. (Mol Cancer Ther. Novembar 2007;6(11):3009-18) izvestio je o stvaranju antagonističkog BCMA specifičnog antitela koje sprečava aktivaciju NF-κB koja je povezana sa moćnim signalnim putem za preživljavanje u normalnim i malignim B ćelijama. WO 2013/072406 obelodanjuje vezujuće molekule koji su najmanje bispecifični i sadrže prvi i drugi vezujući domen, pri čemu je prvi vezujući domen sposoban da se veže za epitopski klaster 3 BCMA, a drugi vezujući domen je sposoban da se veže za T ćeliju CD3 receptorski kompleks. WO 2014/122143 je usmeren na monoklonska antitela koja se specifično vezuju za BCMA. Dokument takođe uči da antitelo može biti bispecifično sa ili bez Fc, i da se može vezati za BCMA i CD3.

[0012] Uprkos činjenici da BCMA; BAFF-R i TACI, odnosno B ćelijski receptori koji pripadaju super familiji TNF receptora, i njihovi ligandi BAFF i APRIL podležu terapijama u borbi protiv raka i/ili autoimunih poremećaja, još uvek postoji potreba za dostupnim daljim opcijama za lečenje takvih zdravstvenih stanja. Jedan takav pristup je bispecifično antitelo izvedeno iz T ćelija.

REZIME

[0013] Svi formati koji produžavaju polu-raspad (HLE formati) bispecifičnih molekula koji se angažuju na T ćelijama opisani u tehnici, koji su uključivali hetero Fc (takođe označen kao heterodimerni Fc, hetFc ili hFc) format i fuziju humanog serumskog albumina (takođe označen kao HSA ili hALB), imali su individualne nedostatke kao što su nespecifična aktivacija T ćelija, aktivacija komplementa, nestabilnost ili farmakokinetički profil koji ne zadovoljava željeno produženje polu-raspada molekula. Stoga je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi format koji produžava polu-raspad BCMAkCD3 bispecifičnih molekula koji se angažuju na T ćelijama, koji prevazilazi najmanje jedan i, naravno, poželjno više od jednog od ovih pojedinačnih defekata uočenih za stanje tehnike molekula. Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje konstrukte antitela specifičnog Fc modaliteta koji se karakteriše time što obuhvata prvi domen koji se vezuje za BCMA, drugi domen koji se vezuje za vanćelijski epitop humanog i/ili Makaki CD3e lanca, i treći domen, koji je specifičan Fc modalitet kao što je definisano u patentnim zahtevima. Štaviše, pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira konstrukt antitela, vektor koji sadrži ovaj polinukleotid, ćelije domaćina koje eksprimiraju konstrukt i farmaceutski sastav koji sadrži iste kao što je definisano u patentnim zahtevima.

OPIS SLIKA

[0014]

Slika 1: Sl.1a prikazuje dijagram jednog otelotvorenja konstrukta antitela prema pronalasku. Sl.1b prikazuje heterodimerni konstrukt Fc antitela, a Sl.1c prikazuje konstrukt X-tela opisan u stanju tehnike. Navedeni naelektrisani parovi se uvode da bi se sprovela heterodimerizacija. Sl.1d prikazuje fuziju konstrukta antitela sa humanim serumskim albuminom (HSA/hALB).

Slika 2: Procena aktivacije T ćelije nezavisne od cilja pomoću konstrukata ciljnih A HLE BiTE® antitela.2(a) konstrukt antitela pronalaska u 48 h aktivacionom testu sa humanim PBMC (3x); HLE BiTE® serijska razblaženja (početak 20 nM; 1:5, 7x+prazno); bez/o ili sa blokiranjem FcR [10 mg/mL hulgG (Kiovog, Baxter)]; FACS merenje ekspresije CD69 i CD25 [nije prikazano] na CD4<+>, CD8<+>T ćelijama.2(b) Hetero-Fc konstrukt antitela u 48 h aktivacionom testu sa humanim PBMC i PBMC sa osiromašenim CD14<+>/CD33<+>ćelijama (3x); HLE BiTE® serijska razblaženja (početak 20 nM; 1:5, 7x+prazno); FACS merenje ekspresije CD69 i CD25 [nije prikazano] na CD4<+>, CD8<+>T ćelijama.

Slika 3: Procena aktivacije T ćelije nezavisne od cilja pomoću konstrukata HLE BiTE® antitela.3(a) Ciljani B konstrukt antitela pronalaska u 48 h aktivacionom testu sa humanim PBMC (3x); HLE BiTE® serijska razblaženja (početak 20 nM; 1:5, 7x+prazno); bez/o ili sa blokiranjem FcR [10 mg/mL hulgG (Kiovog, Baxter)]; FACS merenje ekspresije CD69 i CD25 [nije prikazano] na CD4<+>, CD8<+>T ćelijama.3(b) Ciljani B Hetero-Fc konstrukt antitela u 48 h aktivacionom testu sa humanim PBMC i PBMC sa osiromašenim CD14<+>/CD33<+>ćelijama (3x); HLE BiTE® serijska razblaženja (početak 20 nM; 1:5, 7x+prazno); FACS merenje ekspresije CD69 i CD25 [nije prikazano] na CD4<+>, CD8<+>T ćelijama.3(c) Ciljni B X-body konstrukt u 48-satnom testu aktivacije sa humanim PBMC i PBMC osiromašenim CD14<+>/CD33<+>ćelijama (3x); HLE BiTE® serijska razblaženja (početak 20 nM; 1:5, 7x+prazno); FACS merenje ekspresije CD69 i CD25 [nije prikazano] na CD4<+>, CD8<+>T ćelijama 3(d) - 3(f) Izolovani PBMC od tri različita zdrava humana donora su kultivisani sa rastućim koncentracijama HLE bispecifičnih konstrukata antitela specifičnih za cilj B tokom 48 sati. Ekspresija aktivacionog markera CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama određena je protočnom citometrijskom analizom korišćenjem PE-Cy7 konjugovanog mAb specifičnog za CD69.

Slika 4: Komplement C1q Vezivanje konstrukata BiTE® Fc fuzionih antitela. BiTE® Fc fuzioni konstrukti antitela (BiTE® jednolančani Fc (trougao), BiTE® hetero Fc (kvadrati), kanonski BiTE® (krug)) su obloženi na Makisorp ploči (u seriji razblaženja), pre inkubacije sa skupljenim ljudskim serumom i inkubacija sa poliklonalnim anti-humanim CC1q mišjim antitelom, vizuelizovanim kozjim antimišjim Fc-AP konjugatom.

Slika 5: Srednji PK profili dva različita BCMA ciljana konstrukta BiTE® antitela nakon primene jedne doze kod majmuna cinomolgus. Iz razloga uporedivosti, koncentracije u serumu su normalizovane na 15 µg/kg i naznačene u nmol.

Slika 6: Srednji PK profili devet različitih konstrukata BiTE® antitela, od kojih je svaki spojen sa scFc polu-raspadom koji produžava deo. Iz razloga uporedivosti, koncentracije u serumu su normalizovane na 15 µg/kg i naznačene u nmol.

Slika 7: Bispecifične scFc varijante D9F (SEQ ID NO:105), T2G (SEQ ID NO:106), D3L (SEQ ID NO:107), T7I (SEQ ID NO:108) i K6C (SEQ ID NO:109). Poželjni treći domen konstrukta antitela predmetnog pronalaska je treći domen obuhvaćen SEQ ID NO:105.

Slika 8: Određivanje vezivanja za humani FcRn zasnovano na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR). Konstrukti D9F, T2G, D3L, T7I i K6C su testirani na njihovu sposobnost vezivanja za humani FcRn u SPR (Biacore) eksperimentima. Maksimalno vezivanje tokom faze ubrizgavanja je mereno za sve konstrukte kao odgovarajuće jedinice odgovora (RU), što je ekvivalentno povećanju molekulske mase na CM5 čipu obloženom FcRn usled vezanog konstrukta. Svi konstrukti su mereni u duplikatima. Prosečne vrednosti duplih determinacija su prikazane na Slikama 8A i 8B.

Slika 9: Konstrukti D9F, T2G, D3L, T7I i K6C i humano IgG1-kappa antitelo MT201 su testirani na njihovu sposobnost vezivanja protiv humanog FcRn u SPR (Biacore) eksperimentima. Maksimalno vezivanje tokom faze ubrizgavanja je mereno za sve konstrukte kao odgovarajuće jedinice odgovora (RU), što je ekvivalentno povećanju molekulske mase na CM5 čipu obloženom FcRn usled vezanog konstrukta. Svi konstrukti su mereni u duplikatima. Prikazane su prosečne vrednosti dupliranih određivanja uključujući trake greške standardne devijacije.

DETALJNI OPIS

[0015] Pored značajno produženog polu-raspada konstrukata bispecifičnih antitela prema pronalasku, fuzija specifičnog Fc modaliteta je takođe odgovorna za iznenađujuće značajan uticaj na prvi i drugi vezujući domen konstrukta antitela prema pronalasku. Stoga, dok drugi modaliteti produžavanja polu-raspad konstrukta antitela koji angažuju T ćelije pokazuju individualne preferirane karakteristike, izbor sadašnjeg specifičnog Fc modaliteta omogućava obezbeđivanje bispecifičnih molekula koji obično pokazuju širok spektar preferiranih karakteristika robusnog molekularnog formata i, na taj način omogućavaju razvoj obećavajućih farmaceutskih sastava.

[0016] Dakle, predmetni pronalazak obezbeđuje jednolančanu konstrukciju antitela koja sadrži:

• prvi domen koji se vezuje za BCMA,

• drugi domen koji se vezuje za ekstracelularni epitop humanog i/ili Macaca CD3ε lanca; i

• treći domen koji sadrži dva polipeptidna monomera, od kojih svaki sadrži šarku, CH2 domen i CH3 domen, pri čemu su navedena dva polipeptidna monomera fuzionisana jedan sa drugim preko peptidnog veznika.

[0017] Termin "konstrukt antitela" se odnosi na molekul u kome je struktura i/ili funkcija zasnovana na strukturi i/ili funkciji antitela, npr., molekula imunoglobulina pune dužine ili celog molekula i/ili je/su izvučeni iz domena varijabilnog teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog lakog lanca (VL) antitela ili njegovog fragmenta. Konstrukt antitela je stoga sposoban da se vezuje za svoju specifičnu metu ili antigen. Dalje, domen vezivanja konstrukta antitela prema pronalasku obuhvata minimalne strukturne zahteve antitela koji omogućavaju vezivanje cilja. Ovaj minimalni zahtev može npr., biti definisan prisustvom najmanje tri CDR laka lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR teška lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona), poželjno svih šest CDR-ovi. Alternativni pristup za definisanje minimalnih zahteva za strukturom antitela je definicija epitopa antitela unutar strukture specifične mete, odnosno, proteinskog domena ciljnog proteina koji čini region epitopa (epitope klaster) ili pozivanjem na specifično antitelo koje se takmiči sa epitopom definisanog antitela. Antitela na kojima se zasnivaju konstrukti prema pronalasku uključuju na primer monoklonska, rekombinantna, himerna, deimunizovana, humanizovana i ljudska antitela.

[0018] Vezivni domen konstrukta antitela prema pronalasku može npr. obuhvataju iznad navedene grupe CDR. Poželjno, ovi CDR-ovi su sadržani u okviru varijabilnog regiona lakog lanca antitela (VL) i varijabilnog regiona teškog lanca antitela (VH); međutim, ne mora da sadrži oboje. Fd fragmenti, na primer, imaju dva VH regiona i često zadržavaju neku funkciju vezivanja antigena netaknutog domena za vezivanje antigena. Dodatni primeri za format fragmenata antitela, varijanti antitela ili vezujućih domena uključuju (1) Fab fragment, monovalentni fragment koji ima VL, VH, CL i CH1 domene; (2) F(ab')2fragment, bivalentni fragment koji ima dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (3) Fd fragment koji ima dva VH i CH1 domena; (4) Fv fragment koji ima VL i VH domene jednog kraka antitela, (5) dAb fragment (Ward i dr., (1989) Nature 341:544-546), koji ima VH domen; (6) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) i (7) jednolančani Fv (scFv), pri čemu je ovaj drugi poželjniji (na primer, izveden iz scFV-biblioteke). Primeri otelotvorenja konstrukata antitela prema pronalasku su npr. opisano u WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, WO 2014/144722, WO 2014/151910, i WO 2015/048272.

[0019] Takođe u okviru definicije „domena vezivanja“ ili „domena koji se vezuje“ su fragmenti antitela pune dužine, kao što su VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 ili "r IgG" ("pola antitelo"). Konstrukti antitela prema pronalasku takođe mogu da sadrže modifikovane fragmente antitela, takođe nazvane varijante antitela, kao što su scFv, di-scFv ili bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFab, jednolančana dijatela, tandem di-scFv, tandem tri-scFv, i jedno-domenska antitela kao što su nanotela ili antitela sa jednim varijabilnim domenom koja sadrže samo jedan varijabilni domen, koji može biti VHH, VH ili VL, koji specifično vezuju antigen ili epitop nezavisno od drugih V regiona ili domena.

[0020] Kako se ovde koristi, termini "jednolančana Fv", "jednolančana antitela" ili "scFv" odnose se na fragmente antitela jednog polipeptidnog lanca koji sadrže varijabilne regione i iz teškog i iz lakog lanca, ali nemaju konstantne regione. Generalno, jednolančano antitelo dalje sadrži polipeptidni veznik između VH i VL domena koji mu omogućava da formira željenu strukturu koja bi omogućila vezivanje antigena. Jednolančana antitela detaljno razmatra Pluckthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg i Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994). Poznati su različiti postupci za generisanje jednolančanih antitela, uključujući one opisane u pat. SAD br.4,694,778 i 5,260,203; Objava međunarodne prijave patenta br. WO 88/01649; Bird (1988) Science 242:423-442; Huston i dr. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Ward i dr. (1989) Nature 334:54454; Skerra i dr. (1988) Science 242:1038-1041. U specifičnim otelotvorenjima, jednolančana antitela takođe mogu biti bispecifična, multispecifična, ljudska i/ili humanizovana i/ili sintetička.

[0021] Štaviše, definicija pojma "konstrukt antitela" uključuje monovalentne, dvovalentne i polivalentne/multivalentne konstrukte i, prema tome, bispecifične konstrukte, koji se specifično vezuju za samo dve antigenske strukture, kao i polispecifične/multispecifične konstrukte, koji specifično vezuju više od dva antigena strukture, npr. tri, četiri ili više, kroz različite domene vezivanja. Štaviše, definicija pojma "konstrukt antitela" uključuje molekule koji se sastoje od samo jednog polipeptidnog lanca, kao i molekule koji se sastoje od više od jednog polipeptidnog lanca, koji lanci mogu biti ili identični (homodimeri, homotrimeri ili homo oligomeri) ili različiti (heterodimer, heterotrimer ili heterooligomer). Primeri za iznad identifikovana antitela i njihove varijante ili derivate opisani su između ostalog u Harlov and Lane, Antibodies a laboratorijski priručnik, CSHL Press (1988) i Using Antibodies: laboratorijski priručnik, CSHL Press (1999), Kontermann i Dubel, Antibodi Engineering, Springer, 2. izd.2010 i Mala, rekombinantna antitela za imunoterapiju, Cambridge Universiti Press 2009.

[0022] Termin "bispecifičan" kako se ovde koristi odnosi se na konstrukt antitela koji je "barem bispecifičan", tj., sadrži najmanje prvi vezujući domen i drugi vezujući domen, pri čemu se prvi vezujući domen vezuje za jedan antigen ili cilj (ovde: BCMA), a drugi vezujući domen se vezuje za drugi antigen ili cilj (ovde: CD3). Shodno tome, konstrukti antitela prema pronalasku sadrže specifičnosti za najmanje dva različita antigena ili mete. Na primer, prvi domen se poželjno ne vezuje za ekstracelularni epitop CD3ε jedne ili više vrsta kao što je ovde opisano. Termin "antigen površine ciljne ćelije" se odnosi na antigensku strukturu koju eksprimira ćelija i koja je prisutna na površini ćelije tako da je dostupna za konstrukt antitela

1

kao što je ovde opisano. To može biti protein, poželjno ekstracelularni deo proteina, ili struktura ugljenih hidrata, poželjno struktura ugljenih hidrata proteina, kao što je glikoprotein. Poželjno je da je to tumorski antigen. Termin "konstrukt bispecifičnog antitela" pronalaska takođe obuhvata multispecifične konstrukte antitela kao što su konstrukti trispecifičnih antitela, pri čemu poslednji uključuju tri vezujuća domena, ili konstrukte koji imaju više od tri (npr. četiri, pet...) specifičnosti.

[0023] S obzirom da su konstrukti antitela prema pronalasku (barem) bispecifični, oni se ne javljaju prirodno i značajno se razlikuju od proizvoda koji se javljaju u prirodi. Konstrukt "bispecifičnog" antitela ili imunoglobulin je stoga veštačko hibridno antitelo ili imunoglobulin koji ima najmanje dve različite strane vezivanja sa različitim specifičnostima. Konstrukti bispecifičnih antitela mogu se proizvesti raznim metodama uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab' fragmenata. Videti npr., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990).

[0024] Najmanje dva vezujuća domena i varijabilni domeni (VH/VL) konstrukta antitela iz predmetnog pronalaska mogu, ali ne moraju da sadrže peptidne veznike (spejser peptide). Termin "peptidni veznik " obuhvata u skladu sa ovim pronalaskom aminokiselinsku sekvencu pomoću koje se aminokiselinske sekvence jednog (varijabilnog i/ili vezujućeg) domena i drugog (varijabilnog i/ili vezujućeg) domena konstrukta antitela pronalaska. su međusobno povezani. Peptidni veznici se takođe mogu koristiti za spajanje trećeg domena sa drugim domenima konstrukta antitela prema pronalasku. Suštinska tehnička karakteristika takvog peptidnog veznika je da ne sadrži nikakvu aktivnost polimerizacije. Među pogodnim peptidnim veznicima su oni opisani u američkim patentima 4,751,180 i 4,935,233 ili WO 88/09344. Peptidni veznici se takođe mogu koristiti za vezivanje drugih domena ili modula ili regiona (kao što su domeni koji produžavaju polu-raspad) na konstrukt antitela prema pronalasku.

[0025] Konstrukti antitela iz predmetnog pronalaska su poželjno "konstrukti antitela generisani in vitro". Ovaj termin se odnosi na konstrukt antitela prema gornjoj definiciji gde se ceo ili deo varijabilnog regiona (npr., najmanje jedan CDR) generiše u selekciji ne-imunih ćelija, npr. in vitro prikaz faga, proteinski čip ili bilo koji drugi postupak u kome se sekvence kandidata mogu testirati na njihovu sposobnost da se vežu za antigen. Ovaj termin stoga poželjno isključuje sekvence nastale isključivo genomskim preuređivanjem u imunskoj ćeliji kod životinje. „Rekombinantno antitelo“ je antitelo napravljeno korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK ili genetskog inženjeringa.

[0026] Termin "monoklonsko antitelo" (mAb) ili konstrukt monoklonskog antitela kako se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih prirodnih mutacija i/ili post- modifikacije prevoda (npr., izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su protiv jedne antigenske strane ili determinante na antigenu, za razliku od konvencionalnih (poliklonalnih) preparata antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (ili epitopa). Pored svoje specifičnosti, monoklonska antitela imaju prednost po tome što se sintetišu kulturom hibridoma, pa stoga nisu kontaminirana drugim imunoglobulinima.

Modifikator "monoklonski" ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom.

[0027] Za pripremu monoklonskih antitela, može se koristiti bilo koja tehnika koja obezbeđuje antitela proizvedena kontinuiranim kulturama ćelijskih linija. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti mogu se napraviti hibridomskim postupkom kojeg su prvi opisali Koehler i dr., Nature, 256: 495 (1975), ili može biti napravljen postupkom rekombinantne DNK (videti, npr., patent SAD br.4,816,567). Primeri daljih tehnika za proizvodnju humanih monoklonskih antitela uključuju trioma tehniku, tehniku hibridoma B-ćelija (Kozbor, Immunologi Today 4 (1983), 72) i tehniku EBV-hibridoma (Cole i dr., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

[0028] Hibridomi se zatim mogu pregledati korišćenjem standardnih metoda, kao što su enzimski imunosorbentni test (ELISA) i analiza površinske plazmonske rezonance (BIACORE™), da bi se identifikovao jedan ili više hibridoma koji proizvode antitelo koje se specifično vezuje za određeni antigen. Bilo koji oblik relevantnog antigena može se koristiti kao imunogen, npr., rekombinantni antigen, oblici koji se javljaju u prirodi, bilo koja njihova varijanta ili fragmenti, kao i njihov antigenski peptid. Površinska plazmonska rezonanca koja se koristi u sistemu BIAcore može se koristiti za povećanje efikasnosti antitela faga koja se vezuju za epitop površinskog antigena ciljne ćelije (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105); Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

[0029] Drugi primerni metod za pravljenje monoklonskih antitela uključuje skrining biblioteka ekspresije proteina, npr., displej faga ili biblioteka za prikaz ribozoma. Prikaz faga je opisan, na primer, u Ladner i dr., patent SAD br.5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson i dr., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks i dr., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

[0030] Pored upotrebe biblioteka za prikaz, relevantni antigen se može koristiti za imunizaciju životinja koje nisu ljudi, na primer, glodara (kao što su miš, hrčak, zec ili pacov). U jednom otelotvorenju, životinja koja nije ljudska uključuje bar deo gena humanog imunoglobulina. Na primer, moguće je konstruisati sojeve miša sa nedostatkom proizvodnje mišjih antitela sa velikim fragmentima lokusa humanog Ig (imunoglobulina). Koristeći hibridomsku tehnologiju, mogu se proizvesti i odabrati antigen-specifična monoklonska antitela izvedena iz gena sa željenom specifičnošću. Videti npr., XENOMOUSE<™>, Green i dr. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, i WO 96/33735.

[0031] Monoklonsko antitelo se takođe može dobiti od ne-humane životinje, a zatim modifikovano, npr., humanizovano, deimunizovano, pretvoreno u himerično itd., korišćenjem tehnika rekombinantne DNK poznate u tehnici. Primeri modifikovanih konstrukata antitela uključuju humanizovane varijante nehumanih antitela, antitela „sazrela afinitetom“ (videti, npr., Hawkins i dr. J. Mol. Biol.254, 889-896 (1992) i Lovman i dr., Biochemistri 30, 10832-10837 (1991)) i mutanti antitela sa izmenjenim efektorskim funkcijama.(videti npr., patent SAD 5,648,260, Kontermann and Dübel (2010), loc. cit. i Little (2009), loc. cit.).

[0032] U imunologiji, sazrevanje afiniteta je proces kojim B ćelije proizvode antitela sa povećanim afinitetom za antigen tokom imunog odgovora. Uz ponovljeno izlaganje istom antigenu, domaćin će proizvoditi antitela sukcesivno većeg afiniteta. Kao i prirodni prototip, in vitro sazrevanje afiniteta zasniva se na principima mutacije i selekcije. Sazrevanje afiniteta in vitro je uspešno korišćeno za optimizaciju antitela, konstrukta antitela i fragmenata antitela. Nasumične mutacije unutar CDR-ova se uvode korišćenjem zračenja, hemijskih mutagena ili PCR-a sklon greškama. Pored toga, genetska raznolikost se može povećati mešanjem lanaca. Dva ili tri kruga mutacije i selekcije korišćenjem postupka prikaza kao što je prikaz faga obično rezultiraju fragmentima antitela sa afinitetima u niskom nanomolarnom opsegu.

1

[0033] Poželjni tip supstitucionih varijacija konstrukta antitela aminokiselina uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultujuća varijanta(e) odabrane za dalji razvoj će imati poboljšana biološka svojstva u odnosu na roditeljsko antitelo iz kojeg su generisano. Pogodan način za generisanje takvih supstitucionih varijanti uključuje sazrevanje afiniteta pomoću fagnog displeja. Ukratko, nekoliko hipervarijabilnih strana regiona (npr. 6-7 strana) su mutirane da bi se stvorile sve moguće supstitucije aminokiselina na svakoj strani. Tako generisane varijante antitela prikazane su na monovalentan način od filamentoznih čestica faga kao fuzije do proizvoda gena III M13 upakovanog u svaku česticu. Varijante prikazane fagom se zatim pregledaju na njihovu biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja) kao što je ovde obelodanjeno. Da bi se identifikovale kandidatske strane hipervarijabilnog regiona za modifikaciju, može se izvršiti mutageneza skeniranja alanina da bi se identifikovali ostaci hipervarijabilnog regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigenantitelo da bi se identifikovale kontaktne tačke između domena vezivanja i, na primer, humanog BCMA. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za zamenu prema tehnikama koje su ovde razrađene. Kada se takve varijante generišu, panel varijanti se podvrgava skriningu kao što je ovde opisano i antitela sa superiornim svojstvima u jednom ili više relevantnih testova mogu biti odabrana za dalji razvoj.

[0034] Monoklonalna antitela i konstrukti antitela predmetnog pronalaska posebno uključuju "himerična" antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od određene vrste ili pripadaju određenu klasu ili podklasu antitela, dok je ostatak lanca (lanaca) identičan ili homologan sa odgovarajućim sekvencama u antitelima koja potiču od druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, tako dugo pošto pokazuju željenu biološku aktivnost (patent SAD br.4,816,567; Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde uključuju "primitizovana" antitela koja sadrže sekvence za vezivanje antigena varijabilnog domena izvedene iz ne-humanog primata (npr., majmun iz starog sveta, majmun itd.) i sekvence ljudskog konstantnog regiona. Opisani su različiti pristupi za pravljenje himernih antitela. Videti npr., Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 81:6851 , 1985; Takeda i dr., Nature 314:452, 1985, Cabilly i dr., U.S. Patent No.4,816,567; Boss i dr., U.S. Patent No.

4,816,397; Tanaguchi i dr., EP 0171496; EP 0173494; i GB 2177096.

[0035] Antitelo, konstrukt antitela, fragment antitela ili varijanta antitela takođe mogu biti modifikovani specifičnim brisanjem epitopa humanih T ćelija (postupak koji se naziva "deimunizacija") postupcima obelodanjenim za primer u WO 98/52976 ili WO 00/34317. Ukratko, varijabilni domeni teškog i lakog lanca antitela mogu se analizirati na peptide koji se vezuju za MHC klase II; ovi peptidi predstavljaju potencijalne epitope T ćelija (kao što je definisano u WO 98/52976 i WO 00/34317). Za detekciju potencijalnih epitopa T ćelija, može se primeniti pristup kompjuterskog modeliranja koji se naziva "peptidni navoj", a pored toga, baza podataka vezanih peptida MHC klase II može se pretražiti za motive prisutne u VH i VL sekvencama, kao što je opisano u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ovi motivi se vezuju za bilo koji od 18 glavnih alotipova MHC klase II DR, i tako čine potencijalne epitope T ćelija. Otkriveni potencijalni epitopi T ćelija mogu se eliminisati supstitucijom malog broja aminokiselinskih ostataka u varijabilnim domenima, ili poželjno, supstitucijama jedne aminokiseline. Obično se vrše konzervativne supstitucije. Često, ali ne isključivo, može se koristiti aminokiselina zajednička za poziciju u sekvencama antitela humane germinalne linije. Sekvence humane germinalne linije su obelodanjenim npr. u Tomlinson, i dr. (1992) J. Mol. Biol.227:776-798; Cook, G.P. i dr. (1995) Immunol. Today Vol.16 (5): 237-242; i Tomlinson i dr. (1995) EMBO J.14: 14:4628-4638. V BASE direktorijum pruža sveobuhvatan direktorijum sekvenci varijabilnog regiona humanog imunoglobulina (sastavio Tomlinson, LA. i dr. MRC centar za proteinski inženjering, Kembridž, Velika Britanija). Ove sekvence se mogu koristiti kao izvor humane sekvence, na primer, za okvirne regione i CDR-ove. Konsenzus humani okvirni regioni se takođe mogu koristiti, na primer kao što je opisano u patentu SAD br.6,300,064.

[0036] "Humanizovana" antitela, konstrukti antitela, varijante ili fragmenti istih (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ili druge podsekvence antitela koje se vezuju za antigen) su antitela ili imunoglobulini uglavnom humanih sekvenci, koji sadrže (a) minimalna sekvenca(e) izvedena iz nehumanog imunoglobulina. Uglavnom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primaoca) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona (takođe CDR) primaoca zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog regiona neljudske (npr., glodar) vrste (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, hrčak ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ostacima koji nisu humani. Štaviše, "humanizovana antitela"

1

kako se ovde koriste mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu primaoca ni u antitelu donora. Ove modifikacije su napravljene da bi se dodatno poboljšao i optimizovao učinak antitela. Humanizovano antitelo takođe može da sadrži bar deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj humanog imunoglobulina. Za više detalja, videti Jones i dr., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann i dr., Nature, 332: 323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

[0037] Humanizovana antitela ili njihovi fragmenti mogu se generisati zamenom sekvenci varijabilnog domena Fv koje nisu direktno uključene u vezivanje antigena sa ekvivalentnim sekvencama iz humanih Fv varijabilnih domena. Primeri postupaka za generisanje humanizovanih antitela ili njihovih fragmenata su obezbeđeni od Morrison (1985) Science 229:1202-1207; od Oi i dr. (1986) BioTechniques 4:214; i od US 5,585,089; US 5693761; US 5693762; US 5859205; i US 6407213. Te postupke uključuju izolovanje, manipulaciju i ekspresiju sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju sve ili deo varijabilnih domena imunoglobulina Fv iz najmanje jednog teškog ili lakog lanca. Takve nukleinske kiseline se mogu dobiti iz hibridoma koji proizvodi antitelo protiv unapred određene mete, kao što je iznad opisano, kao i iz drugih izvora. Rekombinantna DNK koja kodira molekul humanizovanog antitela može se zatim klonirati u odgovarajući ekspresioni vektor.

[0038] Humanizovana antitela se takođe mogu proizvesti korišćenjem transgenih životinja kao što su miševi koji eksprimiraju humane teške i lake lance gene, ali nisu u stanju da eksprimiraju gene teškog i lakog lanca endogenog imunoglobulina miša. Vinter opisuje primer metode kalemljenja CDR-a koja se može koristiti za pripremu humanizovanih antitela opisanih ovde (patent SAD br.5,225,539). Svi CDR-ovi određenog humanog antitela mogu biti zamenjeni sa najmanje delom ne-humanog CDR-a, ili samo neki CDR-ovi mogu biti zamenjeni ne-humanim CDR-ovima. Potrebno je samo zameniti broj CDR-ova potrebnih za vezivanje humanizovanog antitela za unapred određeni antigen.

[0039] Humanizovano antitelo može biti optimizovano uvođenjem konzervativnih supstitucija, konsenzusnih supstitucija sekvenci, supstitucija zametne linije i/ili povratnih mutacija. Takvi izmenjeni molekuli imunoglobulina mogu biti napravljeni bilo kojom od nekoliko tehnika poznatih u tehnici (npr., Teng i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor i dr., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson i dr., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, i EP 239400).

1

[0040] Termin "humano antitelo", "konstrukt humanog antitela" i "domen za vezivanje čoveka" obuhvata antitela, konstrukcije antitela i vezujuće domene koji imaju regione antitela kao što su varijabilni i konstantni regioni ili domeni koji u suštini odgovaraju sekvencama humanog imunoglobulina zametne linije poznatim u tehnici, uključujući, na primer, one koje su opisali Kabat i dr. (1991) (loc. cit.). Ljudska antitela, konstrukti antitela ili vezujući domeni pronalaska mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane zametne linije (npr., mutacije uvedene nasumičnom ili bočno specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR, a posebno u CDR3. Humana antitela, konstrukti antitela ili vezujući domeni mogu imati najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili više položaja zamenjenih aminokiselinskim ostatkom koji nije kodiran sekvencom imunoglobulina humane germinalne linije. Međutim, definicija humanih antitela, konstrukcija antitela i vezujućih domena, kako se ovde koristi, takođe obuhvata „potpuno humana antitela“, koja uključuju samo ne-veštački i/ili genetski izmenjene humane sekvence antitela koje se mogu izvesti korišćenjem tehnologija ili sistema. kao što je Xenomaus. Poželjno, "potpuno humano antitelo" ne uključuje aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama humanog imunoglobulina germinalne linije.

[0041] U nekim otelotvorenjima, konstrukti antitela prema pronalasku su "izolovani" ili "suštinski čisti" konstrukti antitela. "Izolovani" ili "suštinski čisti", kada se koriste za opisivanje konstrukta antitela koji su ovde obelodanjeni, označava konstrukt antitela koji je identifikovan, odvojen i/ili izvučen iz komponente svog proizvodnog okruženja. Poželjno, konstrukt antitela je slobodan ili suštinski slobodan od svih drugih komponenti iz njegovog proizvodnog okruženja. Zagađujuće komponente njegovog proizvodnog okruženja, kao što su one koje su rezultat rekombinantnih transfektovanih ćelija, su materijali koji bi tipično ometali dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu polipeptida, i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvore. Konstrukti antitela mogu npr. čine najmanje oko 5%, ili najmanje oko 50% težine ukupnog proteina u datom uzorku.

Podrazumeva se da izolovani protein može činiti od 5% do 99,9% po masi ukupnog sadržaja proteina, u zavisnosti od okolnosti. Polipeptid se može napraviti u značajno višoj koncentraciji korišćenjem inducibilnog promotera ili promotera visoke ekspresije, tako da se pravi pri povećanim nivoima koncentracije. Definicija uključuje proizvodnju konstrukta antitela u širokom spektru organizama i/ili ćelija domaćina koji su poznati u tehnici. U poželjnim otelotvorenjima, konstrukt antitela će biti prečišćen (1) do stepena dovoljnog da se

1

dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence korišćenjem sekvenatora sa rotirajućim čašama, ili (2) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod neredukcionim ili redukujućim uslovima korišćenjem Coomassie plave ili, poželjno, srebrne boje. Obično, međutim, izolovani konstrukt antitela biće pripremljen najmanje jednim korakom prečišćavanja.

[0042] Termin "vezujući domen" karakteriše u vezi sa predmetnim pronalaskom domen koji se (specifično) vezuje za/interaguje sa/prepoznaje dati ciljni epitop ili datu ciljnu stranu na ciljnim molekulima (antigenima), ovde: BCMA i CD3, respektivno. Struktura i funkcija prvog vezujućeg domena (koji prepoznaje BCMA), a poželjno je i struktura i/ili funkcija drugog vezujućeg domena (koji prepoznaje CD3), zasnivaju se na strukturi i/ili funkciji antitela, npr. molekula imunoglobulina pune dužine ili celog i/ili su izvučeni iz domena varijabilnog teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog lakog lanca (VL) antitela ili njegovog fragmenta. Poželjno, prvi vezujući domen karakteriše prisustvo tri CDR laka lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR teška lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona). Drugi vezujući domen poželjno takođe sadrži minimalne strukturne zahteve antitela koji omogućavaju vezivanje cilja. Još poželjnije, drugi vezujući domen sadrži najmanje tri CDR laka lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR teška lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona). Predviđeno je da se prvi i/ili drugi vezujući domen proizvodi ili se može dobiti pomoću fag-displeja ili metoda skrininga biblioteke pre nego kalemljenjem CDR sekvenci iz prethodno postojećeg (monoklonalnog) antitela u skelu.

[0043] Prema predmetnom pronalasku, vezujući domeni su u obliku jednog polipeptida. Takvi polipeptidi mogu uključivati proteinske delove i neproteinske delove (npr. hemijske veznike ili hemijska sredstva za unakrsno povezivanje kao što je glutaraldehid). Proteini (uključujući njihove fragmente, poželjno biološki aktivne fragmente, i peptide, koji obično imaju manje od 30 aminokiselina) sadrže dve ili više aminokiselina povezanih jedna sa drugom preko kovalentne peptidne veze (koja rezultira lancem aminokiselina).

[0044] Termin "polipeptid" kako se ovde koristi opisuje grupu molekula, koja se obično sastoji iz više od 30 aminokiselina. Polipeptidi mogu dalje da formiraju multimere kao što su dimeri, trimeri i viši oligomeri, tj. koji se sastoje od više od jednog polipeptidnog molekula. Molekuli polipeptida koji formiraju takve dimere, trimere itd. mogu biti identični ili neidentični. Odgovarajuće strukture višeg reda takvih multimera se, prema tome, nazivaju

1

homo- ili heterodimeri, homo- ili heterotrimeri itd. Primer za hereteromultimer je molekul antitela, koji se, u svom prirodnom obliku, sastoji od dva identična laka polipeptidna lanca i dva identična teška polipeptidna lanca. Termini "peptid", "polipeptid" i "protein" takođe se odnose na prirodno modifikovane peptide/polipeptide/proteine kod kojih se modifikacija vrši npr. post-translacionim modifikacijama kao što su glikozilacija, acetilacija, fosforilacija i slično. "Peptid", "polipeptid" ili "protein" kada se ovde pominje može takođe biti hemijski modifikovan kao što je pegil. Takve modifikacije su dobro poznate u tehnici i opisane u nastavku.

[0045] Poželjno, vezujući domen koji se vezuje za BCMA i/ili domen vezivanja koji se vezuje za CD3ε je/su humani vezujući domeni. Antitela i konstrukti antitela koji sadrže najmanje jedan domen za vezivanje čoveka izbegavaju neke probleme povezane sa antitelima ili konstruktima antitela koji poseduju varijabilne i/ili konstantne regione koji nisu humani, kao što su glodari (npr. miš, pacov, hrčak ili zec). Prisustvo takvih proteina dobijenih od glodara može dovesti do brzog uklanjanja antitela ili konstrukta antitela ili može dovesti do stvaranja imunog odgovora na antitelo ili konstrukt antitela kod pacijenta. Da bi se izbegla upotreba antitela ili konstrukcija antitela dobijenih od glodara, humana ili potpuno humana antitela/konstrukti antitela mogu se generisati uvođenjem funkcije humanog antitela u glodara tako da glodar proizvodi potpuno humana antitela.

[0046] Sposobnost kloniranja i rekonstrukcije humanih lokusa veličine megabaze u IAC-ima i njihovog uvođenja u zametnu liniju miša pruža moćan pristup razjašnjavanju funkcionalnih komponenti veoma velikih ili grubo mapiranih lokusa, kao i generisanju korisnih modela ljudskih bolesti. Štaviše, upotreba takve tehnologije za supstituciju mišjih lokusa sa njihovim humanim ekvivalentima mogla bi da pruži jedinstven uvid u ekspresiju i regulaciju proizvoda ljudskih gena tokom razvoja, njihovu komunikaciju sa drugim sistemima i njihovo učešće u indukciji i progresiji bolesti.

[0047] Važna praktična primena takve strategije je "humanizacija" humoralnog imunog sistema miša. Uvođenje lokusa humanog imunoglobulina (Ig) u miševe kod kojih su endogeni Ig geni inaktivirani nudi mogućnost proučavanja mehanizama koji su u osnovi programirane ekspresije i sklapanja antitela, kao i njihove uloge u razvoju B-ćelija. Štaviše, takva strategija bi mogla da obezbedi idealan izvor za proizvodnju potpuno humanih monoklonskih antitela (mAbs) – važna prekretnica ka ispunjenju obećanja o terapiji

1

antitelima kod humanih bolesti. Očekuje se da će potpuno humana antitela ili konstrukti antitela minimizirati imunogene i alergijske odgovore svojstvene mišjim ili mAbs izvedenim iz miša i na taj način povećati efikasnost i bezbednost primenjenih antitela/konstrukta antitela. Može se očekivati da će upotreba potpuno humanih antitela ili konstrukta antitela obezbediti značajnu prednost u lečenju hroničnih i ponavljajućih humanih bolesti, kao što su inflamacija, autoimunost i rak, koji zahtevaju ponovljene primene jedinjenja.

[0048] Jedan pristup ka ovom cilju bio je da se konstruišu sojevi miševa kojima nedostaje proizvodnja mišjih antitela sa velikim fragmentima humanih Ig lokusa u očekivanju da će takvi miševi proizvoditi veliki repertoar humanih antitela u odsustvu mišjih antitela. Veliki humani Ig fragmenti bi očuvali veliki diverzitet varijabilnih gena, kao i pravilnu regulaciju proizvodnje i ekspresije antitela. Iskorišćavanjem mašinerije miša za diversifikaciju i selekciju antitela i nedostatak imunološke tolerancije na humane proteine, reprodukovani repertoar ljudskih antitela u ovim sojevima miševa treba da proizvede antitela visokog afiniteta protiv bilo kog antigena od interesa, uključujući humane antigene. Koristeći hibridomsku tehnologiju, mogu se lako proizvesti i odabrati antigen-specifična humana mAb sa željenom specifičnošću. Ova opšta strategija je demonstrirana u vezi sa stvaranjem prvih sojeva miša XenoMouse (videti Green i dr. Nature Genetics 7:13-21 (1994)). Sojevi XenoMouse su konstruisani sa veštačkim hromozomima kvasca (IAC) koji sadrže fragmente konfiguracije zametne linije veličine 245 kb i 190 kb lokusa humanog teškog lanca i lokusa kapa lakog lanca, koji su sadržali sekvence varijabilnog i konstantnog regiona jezgra.

Pokazalo se da je IACs koji sadrži humani Ig kompatibilan sa mišjim sistemom i za preuređivanje i za ekspresiju antitela i sposoban da zameni inaktivirane mišje Ig gene. Ovo je pokazano njihovom sposobnošću da indukuju razvoj B ćelija, da proizvedu ljudski repertoar potpuno humanih antitela nalik odraslima i da generišu antigen-specifična ljudska mAb. Ovi rezultati takođe sugerišu da uvođenje većih delova humanih Ig lokusa koji sadrže veći broj V gena, dodatne regulatorne elemente i konstantne regione humanog Ig može da rekapitulira u suštini pun repertoar koji je karakterističan za humani humoralni odgovor na infekciju i imunizaciju. Rad Green i dr. je nedavno proširen na uvođenje više od približno 80% repertoara humanih antitela kroz uvođenje IAC fragmenata veličine megabaze, konfiguracije germinalne linije, lokusa humanog teškog lanca i lokusa kapa lakog lanca, respektivno. Videti Mendez i dr. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

[0049] Proizvodnja miševa XenoMouse je dalje diskutovana i opisana u patentu SAD br.

2

6,673,986; 6.162.963; 6.150.584; 6.114.598; 6,075,181 i 5,939,598 kao i osnovne patentne prijave SAD i japanski patent br.3 068 180 B2, 3068 506 B2 i 3068 507 B2. Videti takođe Mendez i dr. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i Green i Jakobovits J. Exp. Med.188:483-495 (1998), EP 0463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310, i WO 03/47336.

[0050] U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International, Inc., su koristili pristup „minilokusa“. U pristupu minilokusa, egzogeni Ig lokus se oponaša kroz uključivanje delova (individualnih gena) iz Ig lokusa. Dakle, jedan ili više VH gena, jedan ili više DH gena, jedan ili više JH gena, mu konstantni region i drugi konstantni region (poželjno gama konstantni region) se formiraju u konstrukt za umetanje u životinju. Ovaj pristup je opisan u Pat. SAD br.5,545,807 do Surani i dr. i Pat. SAD br.5,545,806; 5,625,825; 5,625,126;

5,633,425; 5,661,016; 5,770,429; 5,789,650; 5,814,318; 5,877,397; 5,874,299; i 6,255,458 svaki Lonberg i Kay, Pat. SAD br.5,591,669 i 6,023.010 do Krimpenfort i Berns, pat. SAD br. 5,612,205; 5,721,367; i 5,789,215 do Berns i dr., i Pat. SAD br.5,643,763 do Choi i Dunn. Ovaj pristup je dalje opisan u GenPharm International Pat. SAD br.5,569,825;

5,789,650; 5,545,806; 5,661,016; 5,814,318; i 5,364,079, kao i osnovne američke patentne prijave. Videti takođe, EP 0546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO 98/24884 i Pat. SAD br.5,981,175. Videti dalje Taylor i dr. (1992), Chen i dr. (1993), Tuaillon i dr. (1993), Choi i dr. (1993), Lonberg i dr. (1994), Taylor i dr. (1994), i Tuaillon i dr. (1995), Fishwild i dr. (1996).

[0051] Kirin je takođe pokazao stvaranje humanih antitela od miševa u koje su, fuzijom mikro-ćelija, uvedeni veliki delovi hromozoma ili celi hromozomi. Videti publikacije Evropske patentne prijave br. EP 773288 i EP 843961. Xenerex Biosciences razvija tehnologiju za potencijalno stvaranje humanih antitela. U ovoj tehnologiji, SCID miševi se rekonstituišu sa ljudskim limfnim ćelijama, npr., B i/ili T ćelijama. Miševi se zatim imuniziraju antigenom i mogu stvoriti imuni odgovor protiv antigena. Videti pat. SAD. br.

5,476,996; 5,698,767; i 5,958,765.

[0052] Odgovori na humana anti-mišja antitela (HAMA) naveli su industriju da pripremi himerna ili na drugi način humanizovana antitela. Međutim, očekuje se da će se primetiti određeni odgovori humanih anti-himernih antitela (HACA), posebno kod hronične upotrebe antitela ili upotrebe više doza. Prema tome, bilo bi poželjno da se obezbede konstrukti antitela koji sadrže humani vezujući domen protiv BCMA i humani vezujući domen protiv CD3ε da bi se poništile zabrinutosti i/ili efekti HAMA ili HACA odgovora.

[0053] Termini „(posebno) se vezuje za“, (posebno) prepoznaje“, „je (posebno) usmereno na“ i „(posebno) reaguje sa“ znače u skladu sa ovim pronalaskom da vezujući domen interaguje ili specifično reaguje sa datim epitop ili datu ciljnu stranu na ciljnim molekulima (antigeni), ovde: BCMA i CD3ε, respektivno.

[0054] Termin "epitop" se odnosi na stranu na antigenu za koju se vezujući domen, kao što je antitelo ili imunoglobulin, ili derivat, fragment ili varijanta antitela ili imunoglobulina, specifično vezuje. "Epitop" je antigen i stoga se termin epitop ponekad ovde naziva i "antigenska struktura" ili "antigenska determinanta". Dakle, domen vezivanja je "strana interakcije antigena". Navedeno vezivanje/interakcija se takođe podrazumeva da definiše "specifično prepoznavanje".

[0055] "Epitopi" mogu da se formiraju i od susednih amino kiselina ili od ne-susednih aminokiselina suprotstavljenih tercijarnim savijanjem proteina. "Linearni epitop" je epitop gde primarna sekvenca aminokiselina sadrži prepoznati epitop. Linearni epitop tipično uključuje najmanje 3 ili najmanje 4, a češće, najmanje 5 ili najmanje 6 ili najmanje 7, na primer, oko 8 do oko 10 amino kiselina u jedinstvenoj sekvenci.

[0056] "Konformacioni epitop", za razliku od linearnog epitopa, je epitop u kome primarna sekvenca aminokiselina koje čine epitop nije jedina definišuća komponenta epitopa koji je prepoznat (npr., epitop u kome je primarna sekvenca amino kiselina nije neophodno prepoznati domenom za vezivanje). Tipično, konformacioni epitop sadrži povećan broj aminokiselina u odnosu na linearni epitop. Što se tiče prepoznavanja konformacionih epitopa, vezujući domen prepoznaje trodimenzionalnu strukturu antigena, poželjno peptid ili protein ili njihov fragment (u kontekstu ovog pronalaska, antigenska struktura za jedan od vezujućih domena se sastoji od protein površinskog antigena ciljne ćelije). Na primer, kada se proteinski molekul savije da bi formirao trodimenzionalnu strukturu, određene aminokiseline i/ili polipeptidna kičma koja formira konformacioni epitop postaju suprotstavljena omogućavajući antitelu da prepozna epitop. Postupke određivanja konformacije epitopa uključuju, ali nisu ograničene na, rendgensku kristalografiju, dvodimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonancu (2D-NMR) spektroskopiju i centrifugirano obeležavanje mesta i spektroskopiju elektronske paramagnetne rezonance (EPR).

[0057] Postupak za mapiranje epitopa je opisana u nastavku: ada se region (neprekidni deo aminokiselina) u humanom BCMA proteinu razmeni/zameni odgovarajućim regionom BCMA koji nije čovek i nije primat (npr., mišji BCMA, ali drugi kao što su piletina, pacov, hrčak, zec itd. takođe može biti zamislivo), očekuje se da će doći do smanjenja vezivanja domena vezivanja, osim ako domen vezivanja nije unakrsno reaktivan za BCMA koji nije human, a koji nije primat. Navedeno smanjenje je poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50%; poželjnije najmanje 60%, 70% ili 80%, a najpoželjnije 90%, 95% ili čak 100% u poređenju sa vezivanjem za odgovarajući region u humanom BCMA proteinu, pri čemu se vezuje za odgovarajući region kod čoveka BCMA protein je postavljen na 100%. Predviđeno je da se iznad pomenute humane BCMA/ne-humane BCMA himere eksprimiraju u CHO ćelijama. Takođe je predviđeno da su humane BCMA/ne-humane BCMA himere spojene sa transmembranskim domenom i/ili citoplazmatskim domenom različitog proteina vezanog za membranu kao što je EpCAM.

[0058] U alternativnom ili dodatnom postupku za mapiranje epitopa, može se generisati nekoliko skraćenih verzija humanog BCMA vanćelijskog domena da bi se odredio specifični region koji je prepoznat pomoću domena vezivanja. U ovim skraćenim verzijama, različiti ekstracelularni BCMA domeni/pod-domeni ili regioni se postepeno brišu, počevši od N-kraja. Predviđeno je da se skraćene BCMA verzije mogu eksprimirati u CHO ćelijama. Takođe je predviđeno da skraćene BCMA verzije mogu biti spojene sa transmembranskim domenom i/ili citoplazmatskim domenom različitog proteina vezanog za membranu kao što je EpCAM. Takođe je predviđeno da skraćene BCMA verzije mogu da obuhvataju domen signalnog peptida na svom N-terminusu, na primer signalni peptid izveden iz signalnog peptida teškog lanca IgG miša. Štaviše, predviđeno je da skraćene BCMA verzije mogu da obuhvate v5 domen na svom N-terminusu (prateći signalni peptid) što omogućava verifikaciju njihove ispravne ekspresije na površini ćelije. Očekuje se da će doći do smanjenja ili gubitka vezivanja kod onih skraćenih BCMA verzija koje više ne obuhvataju BCMA region koji je prepoznat od domena vezivanja. Smanjenje vezivanja je poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; poželjnije najmanje 60%, 70%, 80%, a najpoželjnije 90%, 95% ili čak 100%, pri čemu je vezivanje za ceo humani BCMA protein (ili njegov vanćelijski region ili domen) postavljeno na 100.

2

[0059] Dalji postupak za određivanje doprinosa specifičnog ostatka BCMA prepoznavanju konstruktom antitela ili vezujućim domenom je skeniranje alanina (videti npr. Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol.2001 Jun;5(3):302-7), gde je svaki ostatak koji se analizira zamenjen alaninom, npr. preko mutageneze usmerene na mesto. Alanin se koristi zbog svoje ne-glomazne, hemijski inertne, metil funkcionalne grupe koja ipak oponaša reference na sekundarnu strukturu koju poseduju mnoge druge aminokiseline. Ponekad se velike aminokiseline kao što su valin ili leucin mogu koristiti u slučajevima kada je poželjno očuvanje veličine mutiranih ostataka. Alaninsko skeniranje je zrela tehnologija koja se koristi dugo vremena.

[0060] Interakcija između domena vezivanja i epitopa ili regiona koji sadrži epitop implicira da domen vezivanja pokazuje značajan afinitet za epitop/region koji sadrži epitop na određenom proteinu ili antigenu (ovde: BCMA i CD3, respektivno) i, generalno, ne pokazuje značajnu reaktivnost sa proteinima ili antigenima koji nisu BCMA ili CD3. "Primetan afinitet" uključuje vezivanje sa afinitetom od oko 10<-6>M (KD) ili jačim. Poželjno, vezivanje se smatra specifičnim kada je afinitet vezivanja oko 10<-12>to 10<-8>M, 10<-12>to 10<-9>M, 10<-12>to 10<-10>M, 10<-11>do 10<-8>M, poželjno oko 10<-11>do 10<-9>M. Da li vezujući domen specifično reaguje ili se vezuje za metu može se lako testirati, između ostalog, upoređivanjem reakcije pomenutog vezujućeg domena sa ciljnim proteinom ili antigenom sa reakcijom pomenutog vezivanja domen sa proteinima ili antigenima koji nisu BCMA ili CD3. Poželjno je da se vezujući domen pronalaska suštinski ili suštinski ne vezuje za proteine ili antigene koji nisu BCMA ili CD3 (tj., prvi vezujući domen nije sposoban da se vezuje za proteine koji nisu BCMA, a drugi vezujući domen nije sposoban da se vezuje na proteine koji nisu CD3).

Predviđena je karakteristika konstrukata antitela prema predmetnom pronalasku da imaju superiorne karakteristike afiniteta u poređenju sa drugim HLE formatima. Takav superiorni afinitet, kao posledica, sugeriše produženi polu-raspad in vivo. Duži polu-raspad konstrukata antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom može smanjiti trajanje i učestalost davanja, što tipično doprinosi poboljšanoj saglasnosti pacijenata. Ovo je od posebnog značaja jer su konstrukti antitela iz predmetnog pronalaska posebno korisni za visoko oslabljene ili čak multi-morbidne pacijente sa rakom.

[0061] Termin "ne vezuje se u suštini/u suštini" ili "nije sposoban da se vezuje " znači da vezujući domen predmetnog pronalaska ne vezuje protein ili antigen osim BCMA ili CD3, tj., da ne pokazuje reaktivnost veću od 30%, poželjno ne više od 20%, poželjnije ne više od 10%, posebno poželjno ne više od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% sa proteinima ili antigenima koji nisu BCMA ili CD3, pri čemu se vezuju za BCMA ili CD3, respektivno, je podešen na 100%.

[0062] Veruje se da na specifično vezivanje utiču specifični motivi u aminokiselinskoj sekvenci domena vezivanja i antigena. Dakle, vezivanje se postiže kao rezultat njihove primarne, sekundarne i/ili tercijarne strukture, kao i kao rezultat sekundarnih modifikacija navedenih struktura. Specifična interakcija strane interakcije antigena sa njenim specifičnim antigenom može rezultirati jednostavnim vezivanjem navedene strane za antigen. Štaviše, specifična interakcija strane interakcije antigena sa njenim specifičnim antigenom može alternativno ili dodatno rezultirati inicijacijom signala, npr. usled indukcije promene konformacije antigena, oligomerizacije antigena itd.

[0063] Termin "varijabilna" se odnosi na delove domena antitela ili imunoglobulina koji pokazuju varijabilnost u svojoj sekvenci i koji su uključeni u određivanje specifičnosti i afiniteta vezivanja određenog antitela (tj. "varijabilni domen(i)"). Uparivanje varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL) zajedno formira jedno mesto za vezivanje antigena.

[0064] Varijabilnost nije ravnomerno raspoređena kroz varijabilne domene antitela; koncentrisan je u pod-domenima svakog od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca. Ovi pod-domeni se nazivaju "hipervarijabilni regioni" ili "regioni koji određuju komplementarnost" (CDR). Očuvaniji (tj., ne-hipervarijabilni) delovi varijabilnih domena nazivaju se „okvirnim“ regionima (FRM ili FR) i obezbeđuju skelu za šest CDR u trodimenzionalnom prostoru da formiraju površinu koja se vezuje za antigen. Svaki od varijabilnih domena teških i lakih lanaca koji se javljaju u prirodi se sastoji od četiri FRM regiona (FR1, FR2, FR3 i FR4), uglavnom usvajajući konfiguraciju β-listova, povezanih sa tri hipervarijabilna regiona, koji formiraju petlje koje se povezuju, a u nekim slučajevima i formiraju deo strukture β-lista. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini pomoću FRM i, sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca, doprinose formiranju strane koja se vezuje za antigen (videti Kabat i dr., loc. cit.).

[0065] Termini "CDR" i njegova množina "CDR" odnose se na region koji određuje komplementarnost od kojih tri čine vezujući karakter varijabilnog regiona lakog lanca (CDR-

2

L1, CDR-L2 i CDR-L3) i tri čine karakter vezivanja varijabilnog regiona teškog lanca (CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3). CDR sadrže većinu ostataka odgovornih za specifične interakcije antitela sa antigenom i stoga doprinose funkcionalnoj aktivnosti molekula antitela: oni su glavne determinante specifičnosti antigena.

[0066] Tačne definicije CDR granica i dužine podležu različitim sistemima klasifikacije i numerisanja. Na CDR se stoga može pozivati Kabat, Chothia, kontakt ili bilo koja druga definicija granica, uključujući ovde opisan sistem numerisanja. Uprkos različitim granicama, svaki od ovih sistema ima određeni stepen preklapanja u onome što čini takozvane „hipervarijabilne regione“ unutar varijabilnih sekvenci. CDR definicije prema ovim sistemima se stoga mogu razlikovati po dužini i graničnim oblastima u odnosu na susedni okvir okvira. Videti na primer Kabat (pristup zasnovan na varijabilnosti sekvenci među vrstama), Chothia (pristup zasnovan na kristalografskim ispitivanjima kompleksa antigenantitelo) i/ili MacCallum (Kabat i dr., loc. cit.); Chothia i dr., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; i MacCallum i dr., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Još jedan standard za karakterizaciju strane vezivanja antigena je definicija AbM koju koristi softver za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. Videti, npr., Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Laboratorijski priručnik za inženjering antitela (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). U meri u kojoj dve tehnike identifikacije ostataka definišu regione preklapanja, ali ne i identične regione, mogu se kombinovati da bi se definisao hibridni CDR. Međutim, preferira se numerisanje u skladu sa takozvanim Kabat sistemom.

[0067] Tipično, CDR-ovi formiraju strukturu petlje koja se može klasifikovati kao kanonska struktura. Termin "kanonska struktura" odnosi se na konformaciju glavnog lanca koju usvajaju petlje za vezivanje antigena (CDR). Iz uporednih strukturnih studija, otkriveno je da pet od šest petlji za vezivanje antigena imaju samo ograničen repertoar dostupnih konformacija. Svaka kanonska struktura se može okarakterisati torzionim uglovima polipeptidne kičme. Odgovarajuće petlje između antitela mogu, prema tome, imati vrlo slične trodimenzionalne strukture, uprkos velikoj varijabilnosti sekvence aminokiselina u većini delova petlji (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia i dr., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Štaviše, postoji veza između usvojene strukture petlje i aminokiselinskih sekvenci koje je okružuju. Konformacija određene kanonske klase određena je dužinom petlje i aminokiselinskim ostacima koji se

2

nalaze na ključnim pozicijama unutar petlje, kao i unutar očuvanog okvira (tj., izvan petlje). Dodeljivanje određenoj kanonskoj klasi se stoga može izvršiti na osnovu prisustva ovih ključnih aminokiselinskih ostataka.

[0068] Termin "kanonska struktura" takođe može uključiti razmatranje linearne sekvence antitela, na primer, kako je katalogizirao Kabat (Kabat i dr., loc. cit.). Kabat šema (sistem) numerisanja je široko prihvaćen standard za numerisanje aminokiselinskih ostataka varijabilnog domena antitela na konzistentan način i poželjna je šema primenjena u predmetnom pronalasku kao što je takođe pomenuto negde drugde. Dodatna strukturna razmatranja se takođe mogu koristiti za određivanje kanonske strukture antitela. Na primer, te razlike koje nisu u potpunosti odražene Kabatovim numerisanjem mogu se opisati numeracionim sistemom Chothia i dr. i/ili otkriveno drugim tehnikama, na primer, kristalografijom i dvo- ili trodimenzionalnim računarskim modeliranjem. Shodno tome, data sekvenca antitela može biti stavljena u kanonsku klasu koja omogućava, između ostalog, identifikaciju odgovarajućih sekvenci šasije (npr., na osnovu želje da se u biblioteku uključe različite kanonske strukture). Kabat numerisanje aminokiselinskih sekvenci antitela i strukturna razmatranja kako su opisali Chothia i dr., loc. cit. i njihove implikacije za konstruisanje kanonskih aspekata strukture antitela, opisane su u literaturi. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate u tehnici. Za pregled strukture antitela, pogledajte Antitela: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow i dr., 1988.

[0069] CDR3 lakog lanca i naročito CDR3 teškog lanca mogu predstavljati najvažnije odrednice u vezivanju antigena u varijabilnim regionima lakog i teškog lanca. U nekim konstruktima antitela čini se da je CDR3 teškog lanca glavni deo kontakta između antigena i antitela. Šeme selekcije in vitro u kojima sam CDR3 varira mogu se koristiti za promenu svojstava vezivanja antitela ili za određivanje koji ostaci doprinose vezivanju antigena.

Dakle, CDR3 je tipično najveći izvor molekularne raznovrsnosti unutar strane koja se vezuje za antitela. H3, na primer, može biti kratak od dva aminokiselinska ostatka ili veći od 26 aminokiselina.

[0070] U klasičnom antitelu ili imunoglobulinu pune dužine, svaki laki (L) lanac je vezan za težak (H) lanac jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca povezana jedan sa drugim jednom ili više disulfidnih veza u zavisnosti od Izotip H lanca. CH domen koji je

2

najbliži VH obično se označava kao CH1. Konstantni ("C") domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što su citotoksičnost zavisna od antitela, ćelijski posredovana citotoksičnost i aktivacija komplementa. Fc region antitela se nalazi unutar konstantnih domena teškog lanca i može na primer da stupi u interakciju sa Fc receptorima koji se nalaze na površini ćelije.

[0071] Sekvenca gena antitela nakon sklapanja i somatske mutacije je veoma raznolika, a procenjuje se da ovi različiti geni kodiraju 10<10>različitih molekula antitela (Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio i dr., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Shodno tome, imuni sistem obezbeđuje repertoar imunoglobulina. Termin "repertoar" se odnosi na najmanje jednu nukleotidnu sekvencu izvedenu u potpunosti ili delimično iz najmanje jedne sekvence koja kodira najmanje jedan imunoglobulin. Sekvenca(e) može biti generisana preraspoređivanjem in vivo V, D i J segmenata teških lanaca i V i J segmenata lakih lanaca. Alternativno, sekvenca(e) se može generisati iz ćelije kao odgovor na koju dolazi do preuređivanja, na primer, in vitro stimulacija. Alternativno, deo ili cela sekvenca(e) se mogu dobiti spajanjem DNK, sintezom nukleotida, mutagenezom i drugim metodama, videti, npr., patent SAD br.

5,565,332. Repertoar može uključivati samo jednu sekvencu ili može uključivati više sekvenci, uključujući one u genetski raznolikoj kolekciji.

[0072] Termin "Fc deo" ili "Fc monomer" označava u vezi sa predmetnim pronalaskom polipeptid koji sadrži najmanje jedan domen koji ima funkciju CH2 domena i najmanje jedan domen koji ima funkciju CH3 domena molekula imunoglobulina. Kao što je očigledno iz izraza "Fc monomer", polipeptid koji sadrži te CH domene je "polipeptidni monomer". Fc monomer može biti polipeptid koji sadrži najmanje fragment konstantnog regiona imunoglobulina, isključujući prvi konstantni region imunoglobulinskog domena teškog lanca (CH1), ali održava najmanje funkcionalni deo jednog CH2 domena i funkcionalni deo jedan CH3 domen, pri čemu je CH2 domen amino terminal za CH3 domen. U poželjnom aspektu ove definicije, Fc monomer može biti polipeptidni konstantni region koji sadrži deo Ig-Fc zglobnog regiona, CH2 region i CH3 region, pri čemu je zglobni region amino završetak za CH2 domen. Predviđeno je da zglobni region predmetnog pronalaska podstiče dimerizaciju. Takvi Fc polipeptidni molekuli se mogu dobiti digestijom papaina imunoglobulinskog regiona (naravno što rezultira dimerom dva Fc polipeptida), na primer, a ne ograničavanjem. U drugom aspektu ove definicije, Fc monomer može biti polipeptidni region koji sadrži deo CH2 regiona i CH3 regiona. Takvi Fc polipeptidni molekuli mogu se dobiti pepsin varenjem

2

molekula imunoglobulina, na primer, a ne ograničavanjem. U jednom otelotvorenju, polipeptidna sekvenca Fc monomera je u suštini slična Fc polipeptidnoj sekvenci: IgG1Fc region, IgG2Fc region, IgG3Fc region, IgG4Fc region, IgM Fc region, IgA Fc region, IgD Fc region i IgE Fc region. (Videti npr., Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)). Pošto postoje neke varijacije između imunoglobulina, i samo radi jasnoće, Fc monomer se odnosi na poslednja dva domena imunoglobulina konstantnog regiona teškog lanca IgA, IgD i IgG, i poslednja tri domena imunoglobulina konstantnog regiona teškog lanca IgE i IgM. Kao što je pomenuto, Fc monomer takođe može uključiti N-terminal sa fleksibilnim šarkama za ove domene. Za IgA i IgM, Fc monomer može uključivati J lanac. Za IgG, Fc deo obuhvata imunoglobulinske domene CH2 i CH3 i zglob između prva dva domena i CH2. Iako granice Fc dela mogu da variraju primer za Fc deo teškog lanca humanog IgG koji sadrži funkcionalnu šarku, CH2 i CH3 domen se može definisati npr. da obuhvata ostatke D231 (zglobnog domena - što odgovara D234 u tabeli 1 ispod) do P476, odnosno L476 (za IgG4) karboksil-terminusa CH3 domena, pri čemu je numeracija prema Kabatu. Dva Fc dela ili Fc monomera, koji su fuzionisani jedan sa drugim preko peptidnog veznika, definišu treći domen konstrukta antitela prema pronalasku, koji se takođe može definisati kao scFc domen.

[0073] U jednom otelotvorenju pronalaska, predviđeno je da scFc domen kako je ovde obelodanjeno, odnosno Fc monomeri spojeni jedan sa drugim, sadržani su samo u trećem domenu konstrukta antitela.

[0074] U skladu sa ovim pronalaskom, IgG zglobni region se može identifikovati analogno korišćenjem Kabat numeracije kao što je navedeno u Tabeli 1. U skladu sa iznad navedenim, predviđeno je da zglobni domen/region predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinske ostatke koji odgovaraju IgG1 sekvenci od D234 do P243 prema Kabat numeraciji. Takođe je predviđeno da zglobni domen/region predmetnog pronalaska sadrži ili se sastoji od IgG1 šarke sekvence DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:99) (koja odgovara istezanju od D234 do P243 kao što je prikazano u Tabeli 1 ispod - varijacije pomenute sekvence su takođe predviđene pod uslovom da zglobni region i dalje promoviše dimerizaciju). U poželjnom otelotvorenju pronalaska, mesto glikozilacije na Kabat poziciji 314 CH2 domena u trećem domenu konstrukta antitela je uklonjeno supstitucijom N314X, pri čemu je X bilo koja aminokiselina isključujući Q. Navedena supstitucija je poželjno supstitucija N314G. U poželjnijem otelotvorenju, pomenuti CH2 domen dodatno sadrži sledeće supstitucije (položaj prema Kabatu): V321C i R309C (ove zamene uvode cistein disulfidni most unutar domena na Kabat

2

pozicijama 309 i 321).

[0075] Takođe je predviđeno da treći domen konstrukta antitela prema pronalasku sadrži ili se sastoji od amino do karboksilnog reda: DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:99) (tj. šarka) -CH2-CH3-veznik- DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:99) (tj. šarka) -CH2-CH3. Peptidni veznik iznad pomenutog konstrukta antitela je u poželjnoj varijanti koju karakteriše aminokiselinska sekvenca Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, tj. Gly4Ser (SEQ ID NO:1), ili njihovi polimeri, tj.

(Gli4Ser)x, gde je x ceo broj od 5 ili veći (npr.5, 6, 7, 8 itd. ili veći), pri čemu je 6 poželjno ((Gly4Ser)6). Navedeni konstrukt može dalje da sadrži gore pomenute supstitucije N314X, poželjno N314G, i/ili dalje supstitucije V321C i R309C. U poželjnom otelotvorenju konstrukata antitela prema pronalasku kako je ovde ranije definisano, predviđeno je da se drugi domen vezuje za vanćelijski epitop humanog i/ili Macaca CD3ε lanca.

[0076] U daljim otelotvorenjima predmetnog pronalaska, zglobni domen/region obuhvata ili se sastoji od IgG2 podtipa šarke sekvence ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:100), IgG3 podtip šarke sekvence ELKTPLDTTHTCPRCP (SEQ ID NO:101) ili ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO:103), i/ili IgG4 podtip šarke sekvence ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:102). Sekvenca šarke podtipa IgG1 može biti sledeća: EPKSCDKTHTCPPCP (kao što je prikazano u Tabeli 1 i SEQ ID NO:104). Ovi zglobni regioni jezgra su stoga takođe predviđeni u kontekstu predmetnog pronalaska.

[0077] Lokacija i sekvenca IgG CH2 i IgG CD3 domena mogu se identifikovati analogno korišćenjem Kabat numeracije kao što je navedeno u Tabeli 2:

[0078] U jednom aspektu pronalaska, naglašeni podebljani aminokiselinski ostaci u CH3 domenu prvog ili oba Fc monomera su izbrisani.

[0079] Peptidni veznik, pomoću koga se polipeptidni monomeri („Fc deo“ ili „Fc monomer“) trećeg domena spajaju jedan sa drugim, poželjno sadrži najmanje 25 aminokiselinskih ostataka (25, 26, 27, 28, 29, 30 itd.). Još poželjnije, ovaj peptidni veznik sadrži najmanje 30 aminokiselinskih ostataka (30, 31, 32, 33, 34, 35 itd.). Takođe je poželjno da veznik sadrži do 40 aminokiselinskih ostataka, poželjnije do 35 aminokiselinskih ostataka, najpoželjnije tačno 30 aminokiselinskih ostataka. Poželjno otelotvorenje takvog peptidnog veznika karakteriše aminokiselinska sekvenca Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, tj. Gly4Ser (SEQ ID NO:1), ili njihovi polimeri, tj. (Gli4Ser)x, gde je x ceo broj od 5 ili veći (npr.6, 7 ili 8). Poželjno je da je ceo broj 6 ili 7, poželjnije je ceo broj 6.

[0080] U slučaju da se veznik koristi za spajanje prvog domena sa drugim domenom, ili prvog ili drugog domena sa trećim domenom, poželjno je da je ovaj veznik dovoljne dužine i sekvence da obezbedi da svaki od prvog i drugog domena može, nezavisno jedan od drugog, zadržavaju svoje diferencijalne specifičnosti vezivanja. Za peptidne veznike koji povezuju najmanje dva vezujuća domena (ili dva varijabilna domena) u konstruktu antitela prema pronalasku, poželjni su oni peptidni veznici koji sadrže samo nekoliko aminokiselinskih ostataka, npr.12 aminokiselinskih ostataka ili manje. Prema tome, poželjni su peptidni veznici od 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 aminokiselinskih ostataka. Predviđeni peptidni veznik sa manje od 5 aminokiselina sadrži 4, 3, 2 ili jednu aminokiselinu(e), pri čemu su poželjni

1

veznici bogati sa Gly. Poželjno otelotvorenje peptidnog veznika za fuziju prvog i drugog domena je prikazano u SEQ ID NO:1. Poželjno oličenje veznika peptidnog veznika za spajanje drugog i trećeg domena je (Gly)4-veznik, takođe nazvan G4-veznik.

[0081] Posebno poželjna "jedna" aminokiselina u kontekstu jednog od iznad opisanih "peptidnih veznika" je Gly. Shodno tome, pomenuti peptidni veznik se može sastojati od jedne aminokiseline Gly. U poželjnom otelotvorenju pronalaska peptidni veznik karakteriše aminokiselinska sekvenca Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, tj. Gly4Ser (SEQ ID NO:1), ili njihovi polimeri, tj. (Gli4Ser)x, gde je x ceo broj od 1 ili veći (npr.2 ili 3). Poželjni veznici su prikazani u SEQ ID NOs: 1 do 12. Karakteristike pomenutog peptidnog veznika, koje obuhvataju odsustvo promocije sekundarnih struktura, poznate su u tehnici i opisane su npr. u Dall'Ackua i dr. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle i dr. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) i Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Poželjni su peptidni veznici koji osim toga ne promovišu nikakve sekundarne strukture. Povezivanje navedenih domena jedan sa drugim može se obezbediti, na primer, genetskim inženjeringom, kao što je opisano u primerima. Metode za pripremu fuzionisanih i operativno povezanih bispecifičnih jednolančanih konstrukata i njihovo ekspresiju u ćelijama ili bakterijama sisara su dobro poznate u tehnici (npr. WO 99/54440 ili Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).

[0082] U poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela ili predmetnog pronalaska, prvi i drugi domen formiraju konstrukt antitela u formatu izabranom iz grupe koju čine (scFv)2, scFvjedno-domensko mAb, i oligomeri bilo kog od ovih formata.

[0083] Prema posebno poželjnom otelotvorenju, i kao što je dokumentovano u priloženim primerima, prvi i drugi domen konstrukta antitela prema pronalasku su „bispecifični jednolančani konstrukt antitela“, poželjnije bispecifični „jednolančani Fv“ (scFv). Iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani odvojenim genima, oni se mogu spojiti, korišćenjem rekombinantnih metoda, pomoću sintetičkog veznika - kao što je ranije opisano -što im omogućava da se naprave kao jedan proteinski lanac u koji VL i VH regioni uparuju da formiraju monovalentni molekul; videti npr., Huston i dr. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Ovi fragmenti antitela se dobijaju korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima u ovoj oblasti, a fragmenti se procenjuju za funkciju na isti način kao i antitela cele ili pune dužine. Jednolančani varijabilni fragment (scFv) je stoga fuzioni protein

2

varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i lakog lanca (VL) imunoglobulina, obično povezan sa kratkim peptidom veznikom od oko deset do oko 25 aminokiselina, poželjno oko 15 do 20 aminokiselina. Linker je obično bogat glicinom za fleksibilnost, kao i serinom ili treoninom za rastvorljivost, i može ili povezati N-terminus VH sa C-terminusom VL, ili obrnuto. Ovaj protein zadržava specifičnost originalnog imunoglobulina, uprkos uklanjanju konstantnih regiona i uvođenju *veznika.

[0084] Bispecifični jednolančani konstrukti antitela su poznati u tehnici i opisani su u WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Tehnike opisane za proizvodnju jednolančanih antitela (videti, između ostalog, Patent SAD 4,946,778, Kontermann i Dubel (2010), loc. cit. i Little (2009), loc. cit.) mogu se prilagoditi za proizvodnju jednolančanih konstrukcija antitela. posebno prepoznavanje izabrane mete.

[0085] Bivalentni (takođe zvani dvovalentni) ili bispecifični jednolančani varijabilni fragmenti (bi-scFvs ili di-scFvs koji imaju format (scFv)2mogu se konstruisati povezivanjem dva scFv molekula (npr. sa veznicima kao što je opisano ranije). Ako ova dva scFv molekula imaju istu specifičnost vezivanja, rezultujući (scFv)2molekul će se poželjno nazvati dvovalentnim (tj. ima dve valencije za isti ciljni epitop). Ako dva scFv molekula imaju različite specifičnosti vezivanja, rezultujući (scFv)2molekul će se poželjno nazvati bispecifičnim. Povezivanje se može izvršiti proizvodnjom jednog peptidnog lanca sa dva VH regiona i dva VL regiona, dajući tandem scFvs (videti npr. Kufer P. i dr., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). Druga mogućnost je stvaranje scFv molekula sa veznim peptidima koji su prekratki da bi se dva varijabilna regiona sklopila zajedno (npr. oko pet aminokiselina), primoravajući scFv da se dimerizuje. Ovaj tip je poznat kao dijatela (videti npr. Hollinger, Philipp i dr., (jul 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8).

[0086] U skladu sa predmetnim pronalaskom, bilo prvi, drugi ili prvi i drugi domen mogu da sadrže jedno-domensko antitelo, odnosno varijabilni domen ili bar CDR antitela sa jednim domenom. Antitela sa jednim domenom obuhvataju samo jedan (monomerni) varijabilni domen antitela koji je u stanju da se selektivno veže za specifični antigen, nezavisno od drugih V regiona ili domena. Prva jedno-domenska antitela su napravljena od antitela teškog lanca pronađenih u kamilama, a oni se nazivaju VHH fragmenti. Hrskavične ribe takođe imaju antitela teškog lanca (IgNAR) iz kojih se mogu dobiti jedno-domenska antitela nazvana VNAR fragmenti. Alternativni pristup je da se dimerni varijabilni domeni odvoje od uobičajenih imunoglobulina, npr. od ljudi ili glodara u monomere, čime se dobija VH ili VL kao jedan domen Ab. Iako se većina istraživanja jedno-domenskih antitela trenutno zasniva na varijabilnim domenima teškog lanca, pokazalo se i da se nanotela izvedena iz lakih lanaca specifično vezuju za ciljne epitope. Primeri jedno-domenskih antitela se nazivaju sdAb, nanotela ili antitela sa jednim varijabilnim domenom.

[0087] A (mAb sa jednim domenom)2je stoga konstrukt monoklonskog antitela sastavljen od (najmanje) dva monoklonska antitela sa jednim domenom, koja su pojedinačno odabrana iz grupe koju čine VH, VL, VHH i VNAR. Veznik je poželjno u obliku peptidnog veznika. Slično, "mAb sa jednim domenom scFv" je konstrukt monoklonskog antitela koji se sastoji od najmanje jednog antitela sa jednim domenom kao što je iznad opisano i jednog scFv molekula kao što je iznad opisano. Opet, veznik je poželjno u obliku peptidnog veznika.

[0088] Da li se konstrukt antitela takmiči za vezivanje sa drugim datim konstruktom antitela ili ne može se meriti u kompetetivnom testu kao što je kompetetivni ELISA ili kompetetivni test zasnovan na ćelijama. Mogu se koristiti i mikročestice (perle) spregnute sa avidinom. Slično ELISA ploči obloženoj avidinom, kada reaguje sa biotinilovanim proteinom, svaka od ovih kuglica se može koristiti kao supstrat na kome se može izvršiti analiza. Antigen je obložen na kuglicu, a zatim prethodno obložen prvim antitelom. Drugo antitelo se dodaje i određuje se svako dodatno vezivanje. Moguća sredstva za očitavanje uključuju protočnu citometriju.

[0089] T ćelije ili T limfociti su vrsta limfocita (sama vrsta belih krvnih zrnaca) koji igraju centralnu ulogu u ćelijski posredovanom imunitetu. Postoji nekoliko podskupova T ćelija, od kojih svaka ima različitu funkciju. T ćelije se mogu razlikovati od drugih limfocita, kao što su B ćelije i NK ćelije, prisustvom T ćelijskog receptora (TCR) na površini ćelije. TCR je odgovoran za prepoznavanje antigena vezanih za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i sastoji se iz dva različita proteinska lanca. U 95% T ćelija, TCR se sastoji od alfa (a) i beta (β) lanca. Kada se TCR angažuje sa antigenskim peptidom i MHC (peptid/MHC kompleks), T limfocit se aktivira nizom biohemijskih događaja

4

posredovanih povezanim enzimima, ko-receptorima, specijalizovanim molekulima adaptera i aktiviranim ili oslobođenim faktorima transkripcije.

[0090] Kompleks CD3 receptora je proteinski kompleks i sastoji se od četiri lanca. Kod sisara, kompleks sadrži CD3γ (gama) lanac, CD3δ (delta) lanac i dva CD3ε (epsilon) lanca. Ovi lanci se povezuju sa T ćelijskim receptorom (TCR) i takozvanim ζ (zeta) lancem da bi formirali CD3 kompleks T ćelijskog receptora i generisali aktivacioni signal u T limfocitima. CD3γ (gama), CD3δ (delta) i CD3ε (epsilon) lanci su visoko srodni proteini na površini ćelije iz superfamilije imunoglobulina koji sadrže jedan vanćelijski imunoglobulinski domen. Intracelularni repovi molekula CD3 sadrže jedan očuvani motiv poznat kao aktivacioni motiv zasnovan na imunoreceptoru tirozina ili skraćeno ITAM, koji je neophodan za signalni kapacitet TCR-a. Molekul CD3 epsilon je polipeptid koji je kod ljudi kodiran CD3E genom koji se nalazi na hromozomu 11. Najpoželjniji epitop CD3 epsilona se sastoji od aminokiselinskih ostataka 1-27 vanćelijskog domena humanog CD3 epsilona. Predviđeno je da konstrukti antitela prema predmetnom pronalasku tipično i povoljno pokazuju manje nespecifičnu aktivaciju T ćelija, što nije poželjno u specifičnoj imunoterapiji. Ovo znači smanjeni rizik od neželjenih efekata.

[0091] Preusmerena liza ciljnih ćelija putem regrutovanja T ćelija multispecifičnim, barem bispecifičnim, konstruktom antitela uključuje formiranje citolitičke sinapse i isporuku perforina i granzima. Angažovane T ćelije su sposobne za serijsku lizu ciljnih ćelija i na njih ne utiču imuni mehanizmi bekstva koji ometaju obradu i prezentaciju peptidnog antigena, ili klonsku diferencijaciju T ćelija; videti, na primer, WO 2007/042261.

[0092] Citotoksičnost posredovana konstruktima antitela prema pronalasku može se meriti na različite načine. Efektorske ćelije mogu biti npr. stimulisane obogaćene (humane) CD8 pozitivne T ćelije ili ne-stimulisane (humane) mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). Ako su ciljne ćelije makaki porekla ili eksprimiraju ili su transfektovane sa BCMA makaka koji je vezan prvim domenom, efektorske ćelije takođe treba da budu porekla makaka, kao što je T ćelijska linija makaka, npr.4119LnPx. Ciljne ćelije treba da eksprimiraju (barem vanćelijski domen) BCMA, npr. BCMA čoveka ili makaki. Ciljne ćelije mogu biti ćelijska linija (kao što je CHO) koja je stabilno ili prolazno transfektovana sa BCMA, npr. BCMA čoveka ili makaki. Alternativno, ciljne ćelije mogu biti BCMA pozitivna prirodna ekspresiona ćelijska linija kao što je ćelijska linija humanog multiplog mijeloma L363 ili NCI-H929. Obično se očekuje da vrednosti EC50budu niže sa ciljnim ćelijskim linijama koje eksprimiraju više nivoe BCMA na površini ćelije. Odnos efektora i ciljne ćelije (E:T) je obično oko 10:1, ali takođe može da varira. Citotoksična aktivnost konstrukata bispecifičnih antitela BCMAkCD3 može se meriti u testu oslobađanja<51>Cr (vreme inkubacije od oko 18 sati) ili u testu citotoksičnosti zasnovanom na FACS (vreme inkubacije od oko 48 sati).

Moguće su i modifikacije vremena inkubacije testa (citotoksična reakcija). Drugi postupci merenja citotoksičnosti su dobro poznate stručnjaku i obuhvataju MTT ili MTS testove, testove zasnovane na ATP uključujući bioluminiscentne testove, sulforhodamin B (SRB) test, VST test, klonogeni test i ECIS tehnologiju.

[0093] Citotoksična aktivnost posredovana konstruktima bispecifičnih antitela BCMAxCD3 iz predmetnog pronalaska se poželjno meri u testu citotoksičnosti zasnovanom na ćelijama. Takođe se može meriti u testu oslobađanja<51>Cr. Predstavljena je vrednošću EC50, koja odgovara polovini maksimalne efektivne koncentracije (koncentracija konstrukta antitela koja indukuje citotoksični odgovor na pola puta između početne i maksimuma). Poželjno je da vrednost EC50konstrukta bispecifičnih antitela BCMAkCD3 bude ≤5000 pM ili ≤4000 pM, poželjnije ≤3000 pM ili ≤2000 pM, još poželjnije ≤1000 pM ili ≤1000 pM ili ≤ ≤500 pM ili ≤500 pM pM, još poželjnije ≤200 pM, još poželjnije ≤100 pM, još poželjnije ≤50 pM, još poželjnije ≤20 pM ili ≤10 pM, a najpoželjnije ≤5 pM.

[0094] Iznad navedene vrednosti EC50mogu se meriti u različitim testovima. Stručnjak je svestan da se može očekivati da će vrednost EC50biti niža kada se stimulisane/obogaćene CD8<+>T ćelije koriste kao efektorske ćelije, u poređenju sa ne-stimulisanim PBMC. Štaviše, može se očekivati da su vrednosti EC50niže kada ciljne ćelije eksprimiraju veliki broj BCMA u poređenju sa pacovima sa niskom ciljnom ekspresijom. Na primer, kada se stimulisane/obogaćene humane CD8<+>T ćelije koriste kao efektorske ćelije (i BCMA transfektovane ćelije kao što su CHO ćelije ili BCMA pozitivne humane ćelijske linije se koriste kao ciljne ćelije), EC50vrednost konstrukta BCMAxCD3 bispecifičnog antitela je poželjno ≤1000 pM, poželjnije ≤500 pM, još poželjnije ≤250 pM, još poželjnije ≤100 pM, još poželjnije ≤50 pM, još poželjnije ≤10 pM, a najpoželjnije ≤5 pM. Kada se humani PBMC koriste kao efektorske ćelije, EC50vrednost konstrukta bispecifičnog antitela BCMAxCD3 je poželjno ≤5000 pM ili ≤4000 pM (posebno kada su ciljne ćelije BCMA pozitivne ljudske ćelijske linije), poželjnije ≤2000 pM (posebno kada su ciljne ćelije BCMA transfektovane ćelije kao što su CHO ćelije), poželjnije ≤1000 pM ili ≤500 pM, još poželjnije ≤200 pM, još poželjnije ≤150 pM, još poželjnije ≤100 pM, a najpoželjnije ≤50 pM ili niže. Kada se T ćelijska linija makaka kao što je LnPx4119 koristi kao efektorske ćelije, a BCMA transfektovana ćelijska linija makaka kao što su CHO ćelije se koristi kao ciljna ćelijska linija, EC50vrednost konstrukta bispecifičnog antitela BCMAxCD3 je poželjno ≤2000 pM ili ≤1500 pM, poželjnije ≤1000 pM ili ≤500 pM, još poželjnije ≤300 pM ili ≤250 pM, još poželjnije ≤100 pM, a najpoželjnije ≤50 pM.

[0095] Poželjno je da konstrukti bispecifičnih antitela BCMAxCD3 iz predmetnog pronalaska ne indukuju/posreduju u lizi ili suštinski ne indukuju/posreduju u lizi BCMA negativnih ćelija kao što su CHO ćelije, ili HL60, MES-SA ili SNU-16 ćelije. Termin "ne indukuju lizu", "ne indukuju suštinski lizu", "ne posreduju u lizi" ili "ne posreduju suštinski u lizi" znači da konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku ne indukuje ili posreduje lizu više od 30 %, poželjno ne više od 20%, poželjnije ne više od 10%, posebno poželjno ne više od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% BCMA negativnih ćelija, pri čemu liza BCMA pozitivne ljudske ćelijske linije postavljeno je na 100%. Ovo se obično odnosi na koncentracije konstrukta antitela do 500 nM. Stručnjak zna kako da izmeri lizu ćelija bez daljeg odlaganja. Štaviše, ova specifikacija podučava specifična uputstva kako da se izmeri ćelijska liza.

[0096] Razlika u citotoksičnoj aktivnosti između monomerne i dimerne izoforme pojedinačnih konstrukata bispecifičnih antitela BCMAxCD3 naziva se "jaz u potenciji". Ovaj jaz u potenciji može npr. izračunati kao odnos između EC50vrednosti monomernog i dimernog oblika molekula. Praznine u potenciji konstrukata bispecifičnih antitela BCMAxCD3 iz predmetnog pronalaska su poželjno ≤ 5, poželjnije ≤ 4, još poželjnije ≤ 3, još poželjnije ≤ 2 i najpoželjnije ≤ 1.

[0097] Prvi i/ili drugi (ili bilo koji dalji) vezujući domen(i) konstrukta antitela prema pronalasku je/su poželjno među-specifični za pripadnike reda primata sisara. CD3 vezujući domeni specifični za više vrsta su, na primer, opisani u WO 2008/119567. Prema jednom otelotvorenju, prvi i/ili drugi vezujući domen, pored vezivanja za humani BCMA i humani CD3, respektivno, takođe će se vezati za BCMA/CD3 primata uključujući (ali ne ograničavajući se na) nove svetske primate (kao što je Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus), primati starog sveta (kao što su babuni i makaki), giboni i neljudske hominine.

[0098] U jednom otelotvorenju konstrukta antitela prema pronalasku, prvi domen se vezuje za humani BCMA i dalje se vezuje za BCMA makaki, kao što je BCMA Macaca fascicularis, i poželjnije, za BCMA makaka eksprimiran na površinskim ćelijama makaki. Afinitet prvog domena za BCMA, poželjno za humani BCMA, poželjno je ≤100 nM ili ≤50 nM, poželjnije ≤25 nM ili ≤20 nM, poželjnije ≤15 nM ili ≤10 nM, još poželjnije 5. još poželjnije ≤2,5 nM ili ≤2 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije ≤06 nM, još poželjnije ≤0,5 nM, a najpoželjnije ≤0,4 nM. Afinitet se može meriti na primer u BIAcore testu ili u Scatchard testu. Drugi postupci određivanja afiniteta su takođe dobro poznati stručnjacima. Afinitet prvog domena za makaki BCMA je poželjno ≤15 nM, poželjnije ≤10 nM, još poželjnije ≤5 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije <0,5 nM, još poželjnije ≤0,1 nM, najpoželjnije ≤0,05 nM ili čak ≤0,01 nM.

[0099] Poželjno, jaz u afinitetu konstrukata antitela prema pronalasku za vezivanje BCMA makaka naspram humanog BCMA [ma BCMA : hu BCMA] (kako je određeno npr. BiaCore ili Scatchard analizom) je <100, poželjno <20, poželjnije <15, dalje poželjno <10, još poželjnije <8, poželjnije <6 i najpoželjnije <2. Poželjni rasponi za jaz afiniteta konstrukata antitela prema pronalasku za vezivanje BCMA makaka u odnosu na humani BCMA su između 0,1 i 20, poželjnije između 0,2 i 10, još poželjnije između 0,3 i 6, još poželjnije između 0,5 i 3 ili između 0,5 i 2,5, a najpoželjnije između 0,5 i 2 ili između 0,6 i 2.

[0100] Drugi domen konstrukta antitela prema pronalasku vezuje se za humani CD3 epsilon i/ili za Macaca CD3 epsilon. U poželjnom otelotvorenju, drugi domen se dalje vezuje za Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus CD3 epsilon. Callithrix jacchus i Saguinus oedipus su novi svetski primati koji pripadaju porodici Callitrichidae, dok je Saimiri sciureus novi svetski primat koji pripada porodici Cebidae.

[0101] Poželjno je za konstrukt antitela iz predmetnog pronalaska da drugi domen koji se vezuje za ekstracelularni epitop humanog i/ili Macaca CD3 epsilon lanca sadrži VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 odabran od:

(a) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:27 WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:28 WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:29 WO 2008/119567;

(b) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:117 WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:118 WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:119 WO 2008/119567; i

(c) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:153 WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:154 WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:155 WO 2008/119567.

[0102] U daljem poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela iz predmetnog pronalaska, drugi domen koji se vezuje za vanćelijski epitop humanog i/ili Macaca CD3 epsilon lanca obuhvata VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR- H3 izabrano iz:

(a) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:12 WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:13 WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:14 WO 2008/119567;

(b) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:30 WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:31 WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:32 WO 2008/119567;

(c) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:48 WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:49 WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:50 WO 2008/119567;

(d) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:66 WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:67 WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:68 WO 2008/119567;

(e) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:84 WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:85 WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:86 WO 2008/119567;

(f) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:102 WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:103 WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:104 WO 2008/119567;

(g) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:120 WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:121 WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:122 WO 2008/119567;

(h) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:138 WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:139 WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:140 WO 2008/119567;

(i) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:156 WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:157 WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:158 WO 2008/119567; i

(j) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:174 WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:175 WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:176 WO 2008/119567.

[0103] U poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela prema pronalasku, gore opisane tri grupe VL CDR-a su kombinovane sa gore opisanih deset grupa VH CDR-ova unutar drugog domena vezivanja da bi se formiralo (30) grupa, od kojih svaka sadrži CDR-L 1-3 i CDR-H 1-3.

[0104] Poželjno je za konstrukt antitela predmetnog pronalaska da drugi domen koji se vezuje za CD3 obuhvata VL region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO:17, 21, 35, 39, 53, 57, 71, 75, 89, 93, 107, 111, 125, 129, 143, 147, 161, 165, 179 ili 183 WO 2008/119567 ili kao što je prikazano SEQ ID NO:13.

[0105] Takođe je poželjno da drugi domen koji se vezuje za CD3 obuhvata VH region izabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO:15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ili 181 WO 2008/119567 ili kao što je prikazano SEQ ID NO:14.

[0106] Još poželjnije, konstrukt antitela iz predmetnog pronalaska karakteriše drugi domen koji se vezuje za CD3 koji sadrži VL region i VH region izabran iz grupe koju čine:

(a) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:17 ili 21 WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:15 ili 19 WO 2008/119567;

(b) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:35 ili 39 WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:33 ili 37 WO 2008/119567;

(c) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:53 ili 57 WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:51 ili 55 WO 2008/119567;

(d) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:71 ili 75 WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:69 ili 73 WO 2008/119567;

(e) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:89 ili 93 WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:87 ili 91 WO 2008/119567;

(f) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:107 ili 111 WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:105 ili 109 WO 2008/119567;

4

(g) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:125 ili 129 WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:123 ili 127 WO 2008/119567;

(h) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:143 ili 147 WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:141 ili 145 WO 2008/119567;

(i) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:161 ili 165 WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:159 ili 163 WO 2008/119567; i

(j) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:179 ili 183 WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:177 ili 181 WO 2008/119567.

[0107] Takođe poželjan u vezi sa konstruktom antitela iz predmetnog pronalaska je drugi domen koji se vezuje za CD3 koji sadrži VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:13 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:14.

[0108] U skladu sa poželjnim otelotvorenju konstrukta antitela iz predmetnog pronalaska, prvi i/ili drugi domen imaju sledeći format: Parovi VH regiona i VL regiona su u formatu jednolančanog antitela (scFv). VH i VL regioni su raspoređeni po redosledu VH-VL ili VL-VH. Poželjno je da je VH-region pozicioniran na N-terminalnom mestu veznik sekvence, a VL-region je pozicioniran na C-terminalnom mestu veznik sekvence.

[0109] Poželjno otelotvorenje iznad opisanog konstrukta antitela predmetnog pronalaska karakteriše drugi domen koji se vezuje za CD3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187 WO 2008/119567 ili kao što je prikazano SEQ ID NO:15.

[0110] Takođe je predviđeno da prvi vezujući domen konstrukta antitela prema pronalasku sadrži VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3, i VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-3 izabrane iz grupe koju čine:

(a) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:48, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:49, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:50, CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:45, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:46, i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:47;

(b) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:66, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:67, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:68, CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:63, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:64, i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:65; i

(c) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:84, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:85, CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:86, CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO:81, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO:82, i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO:83.

[0111] Dalje je predviđeno da prvi vezujući domen konstrukta antitela prema pronalasku sadrži VH region i VL region izabran iz grupe koju čine:

(a) VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:51 i VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:52;

(b) VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:57 i VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:58;

(c) VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:69 i VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:70;

(d) VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:75 i VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:76;

(e) VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:87 i VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:88; i

(f) VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO:93 i VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO:94.

[0112] Dalje je predviđeno da prvi vezujući domen konstrukta antitela prema pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO:53, 59, 71, 77, 89 ili 95.

[0113] Kovalentne modifikacije konstrukata antitela su takođe uključene u obim predmetnog pronalaska, i generalno se, ali ne uvek, vrše post-translaciono. Na primer, nekoliko tipova kovalentnih modifikacija konstrukta antitela se uvodi u molekul reakcijom specifičnih aminokiselinskih ostataka konstrukta antitela sa organskim derivatizujućim sredstvom koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili N- ili C-terminalnim ostacima.

[0114] Cisteinilnski ostaci najčešće reaguju sa α-haloacetatama (i odgovarajućim aminima), kao što su hlorosirćetna kiselina ili hloroacetamid, dajući karboksimetil ili karboksiamidometil derivate. Cisteinilnski ostaci se takođe prevode reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, α-bromo-β-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, phloromerkuribenzoatom, 2-hloromerkuri-4-nitrofenol ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol.

[0115] Histidilnski ostaci su derivatizovani reakcijom sa dietilpirokarbonatom pri pH 5,5-7,0, jer je ovo sredstvo relativno specifično za bočni lanac histidila. Para-bromofenacil bromid je takođe koristan; reakcija se poželjno izvodi u 0,1M natrijum kakodilata pri pH 6,0. Lizinilni i amino terminalni ostaci reaguju sa sukcinom ili drugim anhidridima karboksilne kiseline. Derivatizacija ovim sredstvima ima efekat preokretanja naelektrisanja lizinilnih ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže alfa-amino uključuju imidoestere kao što je metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hloroborohidrat; trinitrobenzensulfonična kiselina; O-metilizourea; 2,4-pentandion; i reakcija-katalizovana transaminazom sa glioksilatom.

[0116] Arginilni ostaci su modifikovani reakcijom sa jednim ili nekoliko uobičajenih reagensa, među kojima su fenilglioksal, 2,3-butanedion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatizacija ostataka arginina zahteva da se reakcija izvodi u alkalnim uslovima zbog visokog pKa guanidinske funkcionalne grupe. Dalje, ovi reagensi mogu reagovati sa grupama lizina kao i arginin epsilon-amino grupom.

[0117] Specifične modifikacije tirozilnih ostataka mogu da se izvrše, od posebnog interesa za uvođenje spektralnih oznaka u tirozilne ostatke reakcijom sa aromatičnim diazonijumjedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće se N-acetilimidizol i tetranitrometan koriste za formiranje O-acetil tirozilnih vrsta i 3-nitro derivata. Tirozilni ostaci su jodirani koristeći<125>I ili<131>I da se pripreme obeleženi proteini za upotrebu u radioimuno ispitivanju, pri čemu je hloraminski T postupak opisan iznad.

[0118] Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) selektivno su modifikovane reakcijom sa karbodiimidima (R'—N=C=N--R'), pri čemu su R i R' opciono različite alkilne grupe, kao što je 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil)karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonija-4,4-dimetilpentil)karbodiimid. Pored toga, ostaci aspartil i glutamil pretvaraju se u ostatke asparaginil i glutaminil reakcijom sa amonijum-jonima.

4

[0119] Derivatizacija bifunkcionalnim agensima je korisna za umrežavanje konstrukata antitela iz predmetnog pronalaska na matriks ili površinu nerastvorljive u vodi za upotrebu u različitim postupcima. Najčešće korišćena sredstva za umrežavanje uključuju, na primer, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estere, na primer, estere sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalne imidoestere, uključujući disukcinimidilne estere kao što je 3,3'-ditibiobis (sukcinimidilpropionat) i bifunkcionalni maleimidi, poput bis-N-maleimido-1,8-oktana. Derivatizaciona sredstva kao što su metil-3-[(p-azidofenit)ditio]propioimidat daju foto-aktivaciju međujedinjenja koja mogu da formiraju umrežene u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivne matrice nerastvorljive u vodi, kao što su ugljeni hidrati aktivirani cijanogen bromidom i reaktivni supstrati opisani u pat. SAD br.

3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 se koriste za imobilizaciju proteina.

[0120] Ostaci glutaminil i asparaginil često se deamidiraju u odgovarajuće ostatke glutamila i aspartila. Alternativno, ovi ostaci se deamiduju pod blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka spada u obim predmetnog pronalaska.

[0121] Ostale modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa ostataka serila ili treonila, metilaciju α-amino grupa lizina, arginina i histidinskih bočnih lanaca (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp.7986), acetilacija N-terminalnog amina i amidacija bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.

[0122] Druga vrsta kovalentne modifikacije konstrukta antitela uključen je u obim predmetnog pronalaska uključuje promenu obrasca glikozilacije proteina. Kao što je poznato u tehnici, obrasci glikozilacije mogu zavisiti i od redosleda proteina (npr., prisustva ili odsustva određenih aminokiselinskih ostataka glikozilacije, koji su navedeni u daljem tekstu), ili ćelije ili organizma domaćina u kojem se protein proizvodi. U nastavku su razmotreni pojedini sistem ekspresije.

[0123] Glikozilacija polipeptida je obično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na vezivanje ugljenih hidrata na bočni lanac ostatka asparagina. Tri-peptidne sekvence asparagin-X-serina i asparagin-X-treonina, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenog hidrata u bočni lanac asparagina. Prema tome, prisustvo bilo koje od ovih tri-peptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija odnosi se na vezanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se takođe može koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0124] Dodavanje mesta glikozilacije konstrukta antitela se vrši menjanjem sekvence aminokiselina tako da sadrži jednu ili više iznad opisanih sekvenci tri peptida (za mesta vezana za glikozilaciju sa N). Izmena se takođe može izvršiti dodavanjem ili zamenom jednog ili više ostataka serina ili treonina u početnoj sekvenci (za mesta vezana za O glikozilaciju). Zbog lakoće, aminokiselinska sekvenca konstrukta antitela se poželjno menja kroz promene na nivou DNK, posebno mutacijom DNK koja kodira polipeptid na unapred odabranim bazama tako da se generišu kodoni koji će se prevesti u željene aminokiseline.

[0125] Drugi način povećanja broja ugljenih hidrata na konstruktu antitela je hemijsko ili enzimsko spajanje glikozida sa proteinom. Ovi postupci su povoljni jer ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji domaćinu koja ima sposobnost glikozilacije za N- i O-vezanu glikozilaciju. U zavisnosti od korišćenog načina povezivanja, šećer (i) se mogu vezati za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što su cistein, (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su oni serina, treonina ili hidroksiprolina, (e) aromatski ostaci kao što su fenilalanin, tirozin ili triptofan, ili (f) amidna grupa glutamina. Ovi postupci su opisane u WO 87/05330, i u Aplin i Wriston, 1981, CRC Crit. Rev.

Biochem., pp.259-306.

[0126] Uklanjanje ugljenih hidrata prisutnih na početnom konstruktu antitela može se postići hemijski ili enzimski. Hemijska deglikosilacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluorometansulfonska kiselina ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovakav tretman rezultira deljenjem većine ili svih šećera, osim šećera koji povezuje (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), a polipeptid ostavlja netaknut. Hemijska deglikozilacija je opisana sa Hakimuddin i dr., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 i od Edge i dr., 1981, Anal.

Biochem. 118:131. Enzimsko deljenje delova ugljenohidrata na polipeptidima može se postići primenom različitih endo- i egzo-glikozidaza kako je opisano u Thotakura i dr., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. Glikozilacija na potencijalnim mestima glikozilacije može se sprečiti upotrebom jedinjenja tunikamicin kako je opisano u Duskin i dr., 1982, J. Biol.

4

Chem. 257:3105. Tunikamicin blokira stvaranje proteina-N-glikozidnih veza.

[0127] Druge modifikacije konstrukta antitela su takođe razmatrane ovde. Na primer, drugi tip kovalentne modifikacije konstrukta antitela obuhvata povezivanje konstrukta antitela sa različitim ne-proteinskim polimerima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, različite poliole kao što su polietilen glikol, polipropilen glikol, polioksialkileni ili kopolimeri polietilen polipropilen glikola glikol, na način dat u patentima SAD br.4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4.791.192 ili 4.179.337. Pored toga, kao što je poznato u tehnici, aminokiselinske supstitucije se mogu izvršiti na različitim pozicijama unutar konstrukta antitela, npr. kako bi se olakšalo dodavanje polimera kao što je PEG.

[0128] U nekim otelotvorenjima, kovalentna modifikacija konstrukata antitela prema pronalasku obuhvata dodavanje jedne ili više oznaka. Grupa za obeležavanje može biti spojena sa konstruktom antitela preko razdelnika različitih dužina da bi se smanjila potencijalna sterična smetnja. U struci su poznati razni postupci za obeležavanje proteina i mogu se koristiti u izvođenju predmetnog pronalaska. Termin "etiketa" ili "grupa za obeležavanje" odnosi se na bilo koju oznaku koja se može otkriti. Uopšteno govoreći, etikete spadaju u različite klase, u zavisnosti od analize u kojoj će se otkriti – sledeći primeri uključuju, ali nisu ograničeni na:

a) izotopske oznake, koje mogu biti radioaktivni ili teški izotopi, kao što su radioizotopi ili radionuklidi (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<89>Zr,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I)

b) magnetne oznake (npr. magnetne čestice)

c) redoks aktivne grupe

d) optičke boje (uključujući, ali ne ograničavajući se na, hromofore, fosfore i fluorofore) kao što su fluorescentne grupe (npr., FITC, rodamin, lantanidni fosfori), hemiluminiscentne grupe i fluorofori koji mogu biti ili "mali molekuli fluorescentnih molekula" ili fluorescentni fluorofori

e) enzimske grupe (npr. peroksidaza hrena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza) f) biotinilirane grupe

g) unapred određeni polipeptidni epitopi prepoznati od strane sekundarnog reportera (npr., sekvence para leucinskih patentnih zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domena za vezivanje metala, oznaka epitopa itd.)

[0129] Pod "fluorescentnom etiketom" podrazumeva se svaki molekul koji se može otkriti

4

preko svojih svojstvenih fluorescentnih svojstava. Pogodne fluorescentne etikete uključuju, ali nisu ograničene na, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, eritrozin, kumarin, metil-kumarin, pirin, malacitno zeleno, stilbene, Lucifer žuta, Cascade BlueJ, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPI FL, LC Red 640, Cy5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon zelena, Alexa-Fluor boje (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Aleka Fluor 546, Aleka Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633 , Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Kaskadno plava, Kaskadno žuta i R-fikoeritrin (PE) (Molekularne sonde, Eugene, OR), FITC, Rodamin i Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Pogodna optička bojila, uključujući fluorofore, opisana su u Priručniku za molekularne sonde Richarda P. Hauglanda.

[0130] Pogodne proteinaze fluorescentne etikete takođe uključuju, ali nisu ograničene na, zeleni fluorescentni protein, uključujući vrste GFP-a Renilla, Ptilosarcus ili Aekuorea (Chalfie i dr., 1994, Science 263:802805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank Accession Number U55762), plavi fluorescentni protein (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9;

Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim i dr., 1996, Curr. Biol.6:178182), pojačani žuti fluorescentni protein (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferaza (Ichiki i dr., 1993, J. Immunol. 150:54085417), β galaktozidaza (Nolan i dr., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

85:2603-2607) i Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, U.S. Patent Nos. 5,292,658; 5,418,155; 5,683,888; 5,741,668; 5,777,079; 5,804,387; 5,874,304; 5,876,995; 5.925.558).

[0131] Konstrukt antitela prema pronalasku može takođe da sadrži dodatne domene, koji su npr. pomaže u izolaciji molekula ili se odnosi na prilagođeni farmakokinetički profil molekula. Domeni korisni za izolaciju konstrukta antitela mogu se izabrati između peptidnih motiva ili sekundarno uvedenih delova, koji se mogu uhvatiti metodom izolacije, npr. izolacioni stub. Neograničavajuća ostvarenja takvih dodatnih domena obuhvataju peptidne motive poznate kao Mic-tag, HAT-tag, HA-tag, TAP-tag, GST-tag, hitin vezujući domen (CBD-tag), protein koji vezuje maltozu (MBP-tag) , Flag-oznaka, Strep- oznaka i njihove varijante (npr. Strepll-tag) i His-tag. Svi ovde obelodanjeni konstrukti antitela mogu da sadrže His-tag domen, koji je generalno poznat kao ponavljanje uzastopnih His ostataka u amino kiselinskoj sekvenci molekula, poželjno od pet, a poželjnije od šest His ostataka (heksa-histidin). His-oznaka može biti locirana npr. na N- ili C-terminalu konstrukta antitela,

4

poželjno je da se nalazi na C-terminalu. Najpoželjnije, heksa-histidinska oznaka (HHHHHH) (SEQ ID NO:16) je povezana preko peptidne veze za C-terminalu konstrukta antitela prema pronalasku. Pored toga, konjugovani sistem PLGA-PEG-PLGA može da se kombinuje sa poli-histidinskom oznakom za primenu sa produženim oslobađanjem i poboljšani farmakokinetički profil.

[0132] Takođe se razmatraju modifikacije aminokiselinske sekvence konstrukata antitela opisanih ovde. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva konstrukta antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci konstrukata antitela se pripremaju uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u nukleinsku kiselinu konstrukta antitela, ili sintezom peptida. Sve dole opisane modifikacije aminokiselinske sekvence treba da rezultiraju konstruktom antitela koji i dalje zadržava željenu biološku aktivnost (vezivanje za BCMA i CD3) nemodifikovanog roditeljskog molekula.

[0133] Termin "aminokiselina" ili "aminokiselinski ostatak" se obično odnosi na aminokiselinu koja ima svoju definiciju priznatu u struci, kao što je amino kiselina izabrana iz grupe koju čine: alanin (Ala ili A); arginin (Arg ili R); asparagin (Asn ili N); asparginova kiselina (Asp ili D); cistein (Cys ili C); glutamin (Gln ili Q); glutaminska kiselina (Glu ili E); glicin (Gly ili G); histidin (His ili H); izoleucin (He ili I): leucin (Leu ili L); lizin (Lys ili K); metionin (Met ili M); fenilalanin (Phe ili F); prolin (Pro ili P); serin (Ser ili S); treonin (Thr ili T); triptofan (Trp ili W); tirozin (Tyr ili Y); i valin (Val ili V), iako se po želji mogu koristiti modifikovane, sintetičke ili retke amino kiseline. Generalno, aminokiseline se mogu grupisati tako da imaju nepolarni bočni lanac (npr., Ala, Cis, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); negativno naelektrisani bočni lanac (npr., Asp, Glu); pozitivno naelektrisani bočni lanac (npr., Arg, His, Lys); ili nenaelektrisani polarni bočni lanac (npr., Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, i Tyr).

[0134] Aminokiselinske modifikacije uključuju, na primer, brisanje i/ili umetanje u i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci konstrukta antitela. Bilo koja kombinacija brisanja, umetanja i zamene dolazi do konačne konstrukcije, pod uslovom da konačna konstrukcija poseduje željene karakteristike. Promene aminokiselina takođe mogu da promene posttranslacione procese konstrukata antitela, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije.

4

[0135] Na primer, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselina mogu biti umetnute, supstituisane ili izbrisane u svaki od CDR (naravno, u zavisnosti od njihove dužine), dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili 25 aminokiselina mogu biti umetnute, supstituisane ili izbrisane u svakom od FR. Poželjno, insercije aminokiselinske sekvence u konstrukt antitela uključuju fuzije amino- i/ili karboksil-terminala u rasponu dužine od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ostataka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekvenciona umetanja pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka.

Odgovarajuće modifikacije se takođe mogu izvršiti unutar trećeg domena konstrukta antitela prema pronalasku. Inserciona varijanta konstrukta antitela prema pronalasku uključuje fuziju na N-terminalu ili na C-terminalu konstrukta antitela enzima ili fuziju sa polipeptidom.

[0136] Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju (ali nisu ograničena na) CDR teškog i/ili lakog lanca, posebno hipervarijabilne regione, ali se takođe razmatraju promene FR u teškom i/ili lakom lancu. Supstitucije su poželjno konzervativne supstitucije kao što je ovde opisano. Poželjno, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselina mogu biti supstituisane u CDR, dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili 25 aminokiselina mogu biti supstituisane u okvirnim regionima (FR), u zavisnosti od dužine CDR ili FR. Na primer, ako CDR sekvenca obuhvata 6 aminokiselina, predviđeno je da su jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina supstituisane. Slično, ako CDR sekvenca obuhvata 15 aminokiselina, predviđeno je da jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest od ovih aminokiselina budu supstituisane.

[0137] Koristan postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regiona konstrukta antitela koji su poželjne lokacije za mutagenezu naziva se „alaninska skenirajuća mutageneza“ kako su opisali Cunningham i Wells u Science, 244: 1081-1085 (1989). Ovde se identifikuje/se identifikuje ostatak ili grupa ciljnih ostataka unutar konstrukta antitela (npr. naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) i zamenjeni neutralnom ili negativno naelektrisanom amino kiselinom (najpoželjnije alanin ili polialanin ) da utiče na interakciju aminokiselina sa epitopom.

[0138] One lokacije aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije se zatim poboljšavaju uvođenjem daljih ili drugih varijanti na, ili za, mesta supstitucije. Stoga, dok je mesto ili region za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određen, priroda mutacije sama po sebi ne mora biti unapred određena. Na primer, da bi se analizirao

4

ili optimizovao učinak mutacije na datom mestu, skeniranje alanina ili nasumična mutageneza može da se sprovede na ciljnom kodonu ili regionu, a ekspresovane varijante konstrukta antitela se pregledaju za optimalnu kombinaciju željene aktivnosti. Tehnike izrade supstitucionih mutacija na unapred određenim mestima u DNK koja imaju poznatu sekvencu su dobro poznate, na primer, M13 mutageneza prajmera i PCR mutageneza. Skrining mutanata se vrši korišćenjem testova aktivnosti vezivanja antigena, kao što je vezivanje BCMA ili CD3.

[0139] Generalno, ako su aminokiseline supstituisane u jednom ili više ili u svim CDR teškog i/ili lakog lanca, poželjno je da tada dobijena "supstituisana" sekvenca bude najmanje 60% ili 65%, poželjnije 70% ili 75%, još poželjnije 80% ili 85%, a posebno poželjno 90% ili 95% identična "originalnoj" CDR sekvenci. To znači da zavisi od dužine CDR u kom stepenu je identičan „supstituisanoj“ sekvenci. Na primer, CDR koji ima 5 aminokiselina je poželjno 80% identičan svojoj supstituisanoj sekvenci da bi imao najmanje jednu supstituisanu amino kiselinu. Shodno tome, CDR konstrukta antitela mogu imati različite stepene identičnosti sa njihovim supstituisanim sekvencama, npr., CDRL1 može imati 80%, dok CDRL3 može imati 90%.

[0140] Poželjne supstitucije (ili zamene) su konzervativne supstitucije. Međutim, svaka supstitucija (uključujući ne-konzervativnu supstituciju ili jednu ili više od „primernih supstitucija“ navedenih u Tabeli 3, ispod) je predviđena sve dok konstrukt antitela zadrži svoju sposobnost da se vezuje za BCMA preko prvog domena i za CD3 epsilon preko drugog domena i/ili njegovih CDR-ova imaju identitet sa tada supstituisanom sekvencom (najmanje 60% ili 65%, poželjnije 70% ili 75%, još poželjnije 80% ili 85%, a posebno poželjno 90% ili 95 % identično „originalnoj“ CDR sekvenci).

[0141] Konzervativne supstitucije prikazane su u Tabeli 3 pod naslovom „poželjne supstitucije“. Ako takve supstitucije dovedu do promene biološke aktivnosti, onda se mogu uvesti značajnije promene, nazvane "primerne supstitucije" u Tabeli 3, ili kako je dalje opisano u nastavku u vezi sa klasama aminokiselina, a proizvodi se testiraju na željenu karakteristiku.

Tabela 3: Supstitucije aminokiseline

[0142] Značajne modifikacije u biološkim svojstvima konstrukta antitela iz predmetnog pronalaska se postižu odabirom supstitucija koje se značajno razlikuju po njihovom uticaju na održavanje (a) strukture polipeptidne kičme u oblasti supstitucije, na primer, kao ploča ili spiralna konformacija, (b) naelektrisanje ili hidrofobnost molekula na ciljnom mestu, ili (c) najveći deo bočnog lanca. Prirodno nastali ostaci su podeljeni u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca: (1) hidrofobnost: norleucin, met, ala, val, leu, ile; (2) neutralna hidrofilnost: cys, ser, thr, asn, gln; (3) kiselost: asp, glu; (4) bazičnost: his, lys, arg; (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i (6) aromatični: trp, tyr, phe.

[0143] Nekonzervativne supstitucije će podrazumevati supstituciju člana jedne od ovih klasa

1

za drugu klasu. Svaki ostatak cisteina koji nije uključen u održavanje pravilne konformacije konstrukta antitela može biti zamenjen, generalno serinom, radi poboljšanja oksidativne stabilnosti molekula i sprečavanja aberantnog umrežavanja. Nasuprot tome, cisteinska veza(e) može se dodati antitelu radi poboljšanja njegove stabilnosti (naročito ako je antitelo fragment antitela, poput fragmenta Fv).

[0144] Za aminokiselinske sekvence, identitet sekvencije i/ili sličnost se određuje korišćenjem standardnih tehnika poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, algoritam identiteta lokalne sekvence Smith and Waterman, 1981, Adv. prijava. Math. 2:482, algoritam za poravnavanje identiteta sekvence Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

48:443, the search for similarity method of Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, kompjuterizovane implementacije ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u softverskom paketu Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), Best Fit programski program koji opisuje Devereux i dr., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, po mogućnosti pomoću podrazumevanih podešavanja ili pregledom. Poželjno, procenat identiteta izračunava FastDB na osnovu sledećih parametara: kazna neusklađenosti od 1; kazna zazora od 1; kazna veličine zazora 0.33; i kazna pridruživanja od 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

[0145] Primer korisnog algoritma je PILEUP. PILEUP stvara više poravnanja sekvenci iz grupe srodnih sekvenci koristeći progresivne, parne poravnanja. Takođe može da crta drvo koje prikazuje odnose klastera koji se koriste za kreiranje poravnanja. PILEUP koristi pojednostavljenje postupaka progresivnog poravnanja Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol.

35:351-360; postupak je sličan kao što je opisano u Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Korisni PILEUP parametri, uključujući zadatu masu zazora 3.00, zadanu težinu zazora 0.10, i ponderisane krajnje praznine.

[0146] Drugi primer korisnog algoritma je BLAST algoritam, opisan u: Altschul i dr., 1990, J. Mol. Biol.215:403-410; Altschul i dr., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402; i Karin i dr., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:5873-5787. Posebno koristan BLAST program je WU-BLAST-2 program koji je dobijen od Altschul i dr., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 koristi nekoliko parametara pretraživanja, od kojih je većina

2

postavljena na zadate vrednosti. Podesivi parametri se postavljaju sa sledećim vrednostima: raspon preklapanja=1, frakcija preklapanja=0.125, prag reči (T)=II. Parametri HSP S i HSP S2 su dinamičke vrednosti i određuje ih sam program ovisno o sastavu određene sekvence i sastavu određene baze podataka protiv koje se pretražuje interesantni niz; međutim, vrednosti se mogu podesiti da povećaju osetljivost.

[0147] Dodatni koristan algoritam je razbijen BLAST kako je izvestio Altschul i dr., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. Zazor BLAST koristi BLOSUM-62 rezultate supstitucije; parametar praga T postavljen na 9; postupak sa dva pogotka za pokretanje nekorišćenih ekstenzija, punjenje dužine praznina od k košta 10+k; Xuje postavljen na 16, a Xgpostavljen na 40 za fazu pretrage baze podataka i na 67 za izlaznu fazu algoritama. Dostupni poravnanja pokreću se rezultatom koji odgovara oko 22 bita.

[0148] Generalno, homologija, sličnost ili identitet aminokiselina između pojedinačnih varijanti CDR-ova ili VH/VL sekvenci su najmanje 60% u odnosu na sekvence koje su ovde prikazane, a tipičnije sa poželjnim povećanjem homologija ili identiteta od najmanje 65% ili 70%, više poželjno najmanje 75% ili 80%, još poželjnije najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i skoro 100 %. Na sličan način, "procenat (%) identiteta nukleinske kiseline" u vezi sa sekvencom nukleinskih kiselina ovde vezanih proteina je definisan kao procenat nukleotidnih ostataka u kandidatskoj sekvenci koji su identični sa nukleotidnim ostacima kodiranja sekvencu konstrukta antigena. Specifični postupak koristi BLASTN modul WU-BLAST-2 podešen na zadate parametre, sa rasponom preklapanja i frakcijom preklapanja podešenim na 1 i 0.125, respektivno.

[0149] Generalno, homologija sekvence nukleinske kiseline, sličnost ili identitet između nukleotidnih sekvenci koje kodiraju pojedinačne varijante CDR ili VH/VL sekvenci i nukleotidnih sekvenci koje su ovde prikazane su najmanje 60%, a tipičnije sa poželjno povećanjem homologija ili identiteta od najmanje 65 %, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% i skoro 100%. Dakle, „varijanta CDR“ ili „varijanta VH/VL regiona“ je ona sa specificiranom homologijom, sličnošću ili identitetom sa roditeljskim CDR/VH/VL pronalaska, i deli biološku funkciju, uključujući, ali ne ograničavajući se na, najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% specifičnosti i/ili aktivnosti roditeljskog CDR ili VH/VL.

[0150] U jednom otelotvorenju, procenat identičnosti sa humanom germinalnom linijom konstrukata antitela prema pronalasku je ≥ 70% ili ≥ 75%, poželjnije ≥ 80% ili ≥ 85%, još poželjnije ≥ 90%, a najpoželjnije ≥ 91 %, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95% ili čak ≥ 96%.

Smatra se da je identitet genskih proizvoda germinalne linije humanih antitela važna karakteristika za smanjenje rizika od terapijskih proteina da izazovu imuni odgovor protiv leka kod pacijenta tokom lečenja. Hwang & Foote ("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) pokazuju da smanjenje ne-humanih delova konstrukata antitela leka dovodi do smanjenja rizika od indukovanja antitela protiv leka kod pacijenata tokom lečenja. Upoređivanjem velikog broja klinički procenjenih lekova za antitela i odgovarajućih podataka o imunogenosti, pokazuje se trend da humanizacija V-regiona antitela čini protein manje imunogenim (u proseku 5,1% pacijenata) od antitela koja nose nepromenjene ne-humane V regione (prosečno 23,59 % pacijenata). Viši stepen identičnosti sa humanim sekvencama je stoga poželjan za proteinske terapeutike zasnovane na V-regiji u obliku konstrukta antitela. Za ovu svrhu određivanja identiteta germinalne linije, V-regioni VL mogu se uskladiti sa sekvencama aminokiselina V segmenata humane germinalne linije i J segmenata (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) koristeći Vektorski NTI softver i aminokiselinska sekvenca izračunata deljenjem identičnih aminokiselinskih ostataka sa ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka VL u procentima. Isto može biti i za VH segmente (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) sa izuzetkom da VH CDR3 može biti isključen zbog njegove velike raznolikosti i nedostatka postojeće humane germinalne linije VH CDR3 partneri za poravnanje. Rekombinantne tehnike se zatim mogu koristiti za povećanje identiteta sekvence gena germinalne linije humanih antitela.

[0151] Dalje je predviđeno da se konstrukti BCMAxCD3 bispecifičnih antitela iz predmetnog pronalaska (u suštini) ne vezuju ili ne reaguju unakrsno sa humanim BAFF-R i/ili humanim TACI. Štaviše, predviđeno je da se konstrukti bispecifičnih antitela BCMAkCD3 iz predmetnog pronalaska ne vezuju (u suštini) za ili ne reaguju unakrsno sa makaki/kino BAFF-R i/ili makaki/kino TACI.

[0152] U sledećem otelotvorenju, konstrukti bispecifičnih antitela iz predmetnog pronalaska pokazuju visoke prinose monomera pod standardnim uslovima istraživačke skale, npr., u standardnom procesu prečišćavanja u dva koraka. Poželjno je da je prinos monomera

4

konstrukata antitela prema pronalasku ≥ 0,25 mg/L supernatanta, poželjnije ≥ 0,5 mg/L, još poželjnije ≥ 1 mg/L, a najpoželjnije ≥ 3 mg/L supernatanta.

[0153] Slično, prinos dimerne konstrukcije antitela je izoforma, a samim tim i procenat monomera (tj., monomer: (monomer+dimer)) konstrukata antitela se mogu odrediti.

Produktivnost monomernih i dimernih konstrukata antitela i izračunati procenat monomera mogu npr. može se dobiti u SEC koraku prečišćavanja supernatanta kulture iz standardizovane proizvodnje u istraživačkim razmerama u bocama na valjak. U jednom otelotvorenju, procenat monomera konstrukata antitela je ≥ 80%, poželjnije ≥ 85%, još poželjnije ≥ 90%, a najpoželjnije ≥ 95%.

[0154] U jednom otelotvorenju, konstrukti antitela imaju poželjnu stabilnost plazme (odnos EC50sa plazmom prema EC50bez plazme) od ≤ 5 ili ≤ 4, poželjnije ≤ 3,5 ili ≤ 3, još poželjnije ≤ 2,5 ili ≤ najpoželjnije ≤ 1,5 ili ≤ 1. Stabilnost u plazmi konstrukta antitela može se testirati inkubacijom konstrukta u humanoj plazmi na 37°C tokom 24 sata, nakon čega sledi određivanje EC50u testu citotoksičnosti oslobađanja<51>hroma. Efektorske ćelije u testu citotoksičnosti mogu biti stimulisane obogaćene humane CD8 pozitivne T ćelije. Ciljne ćelije mogu npr. biti CHO ćelije transfektovane humanim BCMA. Odnos efektora i ciljne ćelije (E:T) može se izabrati kao 10:1. Humana plazma koja se koristi za ovu svrhu se dobija iz krvi zdravih davalaca prikupljenih špricevima obloženim EDTA. Ćelijske komponente se uklanjaju centrifugiranjem, a gornja faza plazme se sakuplja i zatim spaja. Kao kontrola, konstrukti antitela se razblažuju neposredno pre eseja citotoksičnosti u medijumu RPMI-1640. Stabilnost plazme se izračunava kao odnos EC50 (posle inkubacije plazme) prema EC50 (kontrola).

[0155] Dalje je poželjno da je konverzija monomera u dimer konstrukata antitela prema pronalasku niska. Konverzija se može meriti pod različitim uslovima i analizirati ekskluzionom hromatografijom visokih performansi. Na primer, inkubacija monomernih izoformi konstrukata antitela može se izvesti 7 dana na 37°C i koncentracijama od npr.100 µg/ml ili 250 µg/ml u inkubatoru. Pod ovim uslovima, poželjno je da konstrukti antitela prema pronalasku pokazuju procenat dimera koji je ≤5%, poželjnije ≤4%, još poželjnije ≤3%, još poželjnije ≤2,5%, još poželjnije ≤2%, još poželjnije ≤1,5%, a najpoželjnije ≤1% ili ≤0,5% ili čak 0%.

[0156] Takođe je poželjno da konstrukti bispecifičnih antitela iz predmetnog pronalaska budu prisutni sa veoma niskom konverzijom dimera posle brojnih ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Na primer, monomer konstrukta antitela je podešen na koncentraciju od 250 µg/ml, npr. u puferu za generičku formulaciju i podvrgnut tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja (zamrzavanje na -80°C tokom 30 minuta, nakon čega sledi odmrzavanje 30 minuta na sobnoj temperaturi), nakon čega sledi SEC visokih performansi da bi se odredio procenat prvobitne konstrukcije monomernog antitela, koja je imala konvertovano u dimerni konstrukt antitela. Poželjno je da su procenti dimera konstrukata bispecifičnih antitela ≤5%, poželjnije ≤4%, još poželjnije ≤3%, još poželjnije ≤2,5%, još poželjnije ≤2%, još poželjnije ≤1,5%, i većina poželjno ≤1% ili čak ≤0,5%, na primer nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja.

[0157] Konstrukti bispecifičnih antitela iz predmetnog pronalaska poželjno pokazuju povoljnu termostabilnost sa temperaturama agregacije ≥45°C ili ≥50°C, poželjnije ≥52°C ili ≥54°C, još poželjnije ≥56°C ili ≥57°C , a najpoželjnije ≥58°C ili ≥59°C. Parametar termostabilnosti se može odrediti u smislu temperature agregacije antitela na sledeći način: Rastvor antitela u koncentraciji 250 µg/ml se prenosi u kivetu za jednokratnu upotrebu i stavlja u uređaj za dinamičko raspršivanje svetlosti (DLS). Uzorak se zagreva od 40°C do 70°C brzinom zagrevanja od 0,5°C/min uz konstantno dobijanje izmerenog radijusa.

Povećanje radijusa koje ukazuje na topljenje proteina i agregaciju se koristi za izračunavanje temperature agregacije antitela.

[0158] Alternativno, krive temperaturnog topljenja se mogu odrediti pomoću diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) da bi se odredila intrinzična biofizička stabilnost proteina konstrukata antitela. Ovi eksperimenti se izvode korišćenjem VP-DSC uređaja MicroCal LLC (Northampton, MA, U.S.A). Potrošnja energije uzorka koji sadrži konstrukt antitela se beleži od 20°C do 90°C u poređenju sa uzorkom koji sadrži samo pufer formulacije.

Konstrukti antitela su podešeni na konačnu koncentraciju od 250 µg/ml, npr. u SEC radnom baferu. Za snimanje odgovarajuće krive topljenja, ukupna temperatura uzorka se postepeno povećava. Na svakoj temperaturi T se beleži unos energije uzorka i referentni pufer za formulaciju. Razlika u preuzimanju energije Cp (kcal/mol/°C) uzorka minus referenca se prikazuje u odnosu na odgovarajuću temperaturu. Temperatura topljenja se definiše kao temperatura na prvom maksimumu uzimanja energije.

[0159] Konstrukti BCMAxCD3 bispecifičnih antitela prema pronalasku takođe imaju zamućenost (izmereno OD340 nakon koncentracije prečišćenog konstrukta monomernog antitela na 2,5 mg/ml i inkubacije preko noći) od ≤ 0,2, poželjno ≤ 0,15, poželjnije od ≤ 0,15.

0,12, još poželjnije od ≤ 0,1, a najpoželjnije od ≤ 0,08.

[0160] U sledećem otelotvorenju, konstrukt antitela prema pronalasku je stabilan na fiziološkom ili malo nižem pH, tj. oko pH 7,4 do 6,0. Što se konstrukt antitela tolerantniji ponaša pri ne-fiziološkom pH kao što je oko pH 6,0, to je veći oporavak konstrukta antitela eluiranog iz kolone za jonsku izmenu u odnosu na ukupnu količinu napunjenog proteina. Oporavak konstrukta antitela iz kolone jonske (npr., katjonske) izmene na oko pH 6,0 je poželjno ≥ 30%, poželjnije ≥ 40%, poželjnije ≥ 50%, još poželjnije ≥ 60%, još poželjnije ≥ 70% , još poželjnije ≥ 80%, još poželjnije ≥ 90%, još poželjnije ≥ 95%, a najpoželjnije ≥ 99%.

[0161] Dalje je predviđeno da konstrukti bispecifičnih antitela iz predmetnog pronalaska pokazuju terapeutsku efikasnost ili antitumorsku aktivnost. Ovo može npr. biti ocenjen u ispitivanju kako je obelodanjeno u sledećem primeru modela ksenografta humanog tumora u naprednoj fazi:

[0162] Prvog dana ispitivanja, 5×10<6>ćelija antigena humane ciljne ćelije (ovde: BCMA) pozitivna ćelijska linija raka se subkutano ubrizgava u desni dorzalni bok ženki NOD/SCID miševa. Kada srednja zapremina tumora dostigne oko 100 mm<3>, in vitro ekspandirane humane CD3 pozitivne T ćelije se transplantiraju u miševe injekcijom od oko 2×10<7>ćelija u peritonealnu šupljinu životinja. Miševi kontrolne grupe nosača 1 ne primaju efektorske ćelije i koriste se kao ne-transplantirana kontrola za poređenje sa kontrolnom grupom nosača 2 (koja prima efektorske ćelije) za praćenje uticaja samih T ćelija na rast tumora. Lečenje antitelima počinje kada srednja zapremina tumora dostigne oko 200 mm<3>. Srednja veličina tumora svake grupe tretmana na dan početka lečenja ne bi trebalo da se statistički razlikuje od bilo koje druge grupe (analiza varijanse). Miševi su tretirani sa 0,5 mg/kg/dan konstrukta BCMAxCD3 bispecifičnog antitela intravenskom bolus injekcijom tokom oko 15 do 20 dana. Tumori se mere kaliperom tokom ispitivanja, a napredak se ocenjuje među-grupnim poređenjem zapremine tumora (TV). Inhibicija rasta tumora T/C [%] je određena izračunavanjem TV kao T/C% = 100 × (medijan TV analizirane grupe)/(medijan TV kontrolne grupe 2).

[0163] Stručnjak zna kako da modifikuje ili prilagodi određene parametre ove studije, kao što su broj ubrizganih tumorskih ćelija, mesto injekcije, broj transplantiranih humanih T ćelija, količina konstrukata bispecifičnih antitela koji će se primeniti i vremenski okviri, dok još uvek dolazi do značajnog i ponovljivog rezultata. Poželjno je da T/C inhibicije rasta tumora [%] bude ≤ 70 ili ≤ 60, poželjnije ≤ 50 ili ≤ 40, još poželjnije ≤ 30 ili ≤ 20 i najpoželjnije ≤ 10 ili ≤ 5 ili čak ≤ 5.

[0164] Konstrukt antitela prema pronalasku je jednolančana konstrukcija antitela.

[0165] U poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela prema pronalasku, navedeni treći domen se sastoji od amino do karboksilnog reda:

šarka-CH2-CH3-veznik-šarka-CH2-CH3.

[0166] U jednom otelotvorenju pronalaska svaki od navedenih polipeptidnih monomera trećeg domena ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sekvenci izabranoj iz grupe koju čine: SEQ ID NO:17-24. U poželjnom otelotvorenju ili pronalasku svaki od navedenih polipeptidnih monomera ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:17-24.

[0167] Takođe, u jednom otelotvorenju pronalaska, CH2 domen jednog ili poželjno svakog (oba) polipeptidnih monomera trećeg domena sadrži cistein disulfidni most unutar domena. Kao što je poznato u tehnici, termin "cistein disulfidni most" se odnosi na funkcionalnu grupu sa opštom strukturom R-S-S-R. Veza se takođe naziva SS-veza ili disulfidni most i nastaje spajanjem dve tiolne grupe ostataka cisteina. Posebno je poželjno za konstrukt antitela prema pronalasku da se cisteini koji formiraju cistein disulfidni most u konstruktu zrelog antitela uvode u aminokiselinsku sekvencu CH2 domena koja odgovara 309 i 321 (Kabat numerisanje).

[0168] U jednom otelotvorenju pronalaska, mesto glikozilacije na Kabat poziciji 314 CH2 domena je uklonjeno. Poželjno je da se ovo uklanjanje mesta glikozilacije postigne supstitucijom N314X, pri čemu je X bilo koja aminokiselina isključujući Q. Navedena supstitucija je poželjno supstitucija N314G. U poželjnijem otelotvorenju, pomenuti CH2 domen dodatno sadrži sledeće supstitucije (položaj prema Kabatu) V321C i R309C (ove supstitucije uvode intradomenski cistein disulfidni most na Kabat pozicijama 309 i 321).

[0169] Pretpostavlja se da su poželjne karakteristike konstrukta antitela prema pronalasku upoređene npr. na konstrukt bispecifičnog heteroFc antitela poznat u tehnici (slika 1b) može biti, između ostalog, u vezi sa uvođenjem iznad opisanih modifikacija u CH2 domen. Prema tome, poželjno je za konstrukt pronalaska da CH2 domeni u trećem domenu konstrukta antitela prema pronalasku obuhvataju intradomenski cistein disulfidni most na Kabat pozicijama 309 i 321 i/ili mesto glikozilacije na Kabat poziciji 314 je uklonjene supstitucijom N314X kao što je iznad opisano, poželjno zamenom N314G.

[0170] U daljem poželjnom otelotvorenju pronalaska, CH2 domeni u trećem domenu konstrukta antitela iz pronalaska obuhvataju cistein disulfidni most unutar domena na Kabat pozicijama 309 i 321 i mesto glikozilacije na Kabat poziciji 314 je uklonjeno supstitucijom N314G. Najpoželjnije, polipeptidni monomer trećeg domena konstrukta antitela prema pronalasku ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:17 i 18.

[0171] U jednom otelotvorenju pronalazak obezbeđuje konstrukt antitela, gde:

(i) prvi domen sadrži dva varijabilna domena antitela, a drugi domen sadrži dva varijabilna domena antitela;

(ii) prvi domen sadrži jedan varijabilni domen antitela, a drugi domen sadrži dva varijabilna domena antitela;

(iii) prvi domen sadrži dva varijabilna domena antitela, a drugi domen sadrži jedan varijabilni domen antitela; ili

(iv) prvi domen sadrži jedan varijabilni domen antitela, a drugi domen sadrži jedan varijabilni domen antitela.

[0172] Shodno tome, prvi i drugi domen mogu biti vezujući domeni koji sadrže svaka dva varijabilna domena antitela kao što su VH i VL domen. Primeri takvih vezujućih domena koji sadrže dva varijabilna domena antitela gde su iznad opisani i obuhvataju npr. Fv fragmenti, scFv fragmenti ili Fab fragmenti opisani iznad. Alternativno, bilo jedan ili oba ta vezujuća domena mogu da sadrže samo jedan varijabilni domen. Primeri za takve domene za vezivanje jednog domena gde su iznad opisani i obuhvataju npr. nanotela ili antitela sa jednim varijabilnim domenom koja sadrže samo jedan varijabilni domen, koji može biti VHH, VH ili VL, koji specifično vezuju antigen ili epitop nezavisno od drugih V regiona ili domena.

[0173] U poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela prema pronalasku, prvi i drugi domen su fuzionisani sa trećim domenom preko peptidnog veznika. Poželjni peptidni veznik je iznad opisan i karakteriše ga aminokiselinska sekvenca Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, tj. Gly4Ser (SEQ ID NO:1), ili njihovi polimeri, tj. (Gli4Ser)x, gde je x ceo broj od 1 ili veći (npr.2 ili 3). Posebno poželjan veznik za fuziju prvog i drugog domena sa trećim domenom je prikazan u SEQ ID NO:1.

[0174] U poželjnom otelotvorenju, konstrukt antitela prema pronalasku karakteriše se da sadrži u redosledu amino do karboksila:

(a) prvi domen;

(b) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1-3;

(c) drugi domen;

(d) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1, 2, 3, 9, 10, 11 i 12;

(e) prvi polipeptidni monomer trećeg domena;

(f) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:5, 6, 7 i 8; i

(g) drugi polipeptidni monomer trećeg domena.

[0175] Konstrukt antitela iz predmetnog pronalaska sadrži prvi domen koji se vezuje za BCMA, poželjno za vanćelijski domen (ECD) BCMA. Podrazumeva se da izraz "vezivanje za vanćelijski domen BCMA", u kontekstu predmetnog pronalaska, podrazumeva da se domen vezivanja vezuje za BCMA eksprimiran na površini ciljne ćelije. Prvi domen prema pronalasku se stoga poželjno vezuje za BCMA kada je eksprimiran ćelijama ili ćelijskim linijama koje se prirodno eksprimiraju, i/ili ćelijama ili ćelijskim linijama transformisanim ili (stabilno/prolazno) transfektovanim sa BCMA. U poželjnom otelotvorenju, prvi vezujući domen se takođe vezuje za BCMA kada se BCMA koristi kao "cilja" ili "ligand" molekul u in vitro testu vezivanja kao što je BIAcore ili Scatchard. "Ciljna ćelija" može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija koja eksprimira BCMA na svojoj površini; poželjno je ciljna ćelija koja je deo humanog ili životinjskog tela, kao što je specifična BCMA koja eksprimira kancer ili tumorske ćelije.

[0176] Poželjno, prvi domen se vezuje za humani BCMA/BCMA ECD. Poželjna humana BCMA sekvenca je prikazana u SEQ ID NO:41, a poželjna humana BCMA ECD sekvenca je prikazana u SEQ ID NO:42. U daljem poželjnom otelotvorenju, vezuje se za BCMA/BCMA ECD makaki. Poželjna makaki BCMA sekvenca je prikazana u SEQ ID NO:43, a poželjna makaki BCMA ECD sekvenca je prikazana u SEQ ID NO:44. Prema najpoželjnijem otelotvorenju, prvi domen se vezuje i za BCMA/BCMA ECD čoveka i makaki. "BCMA vanćelijski domen" ili "BCMA ECD" se odnosi na BCMA region ili sekvencu koja je u suštini bez transmembranskih i citoplazmatskih domena BCMA. Stručnjak će razumeti da je transmembranski domen identifikovan za BCMA polipeptid iz ovog pronalaska identifikovan u skladu sa kriterijumima koji se rutinski primenjuju u tehnici za identifikaciju tog tipa hidrofobnog domena. Tačne granice transmembranskog domena mogu da variraju, ali najverovatnije za ne više od oko 5 aminokiselina na oba kraja domena koji je ovde posebno pomenut. Poželjna BCMA aminokiselinska sekvenca pune dužine je prikazana u SEQ ID NO:41. Željeni BCMA ECD je prikazan u SEQ ID NO:42.

[0177] Poželjni vezujući domeni koji se vezuju za BCMA su obelodanjeni u WO 2013/072406, WO 2013/072415 i WO 2014/140248. Bilo koji domen vezivanja za BCMA opisan u ovim aplikacijama može se koristiti u kontekstu predmetnog pronalaska.

[0178] U jednom aspektu pronalaska, konstrukt antitela se sastoji od amino prema karboksilnom redu:

(a) prvi domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:53, 59, 71, 77, 89 ili 95;

(b) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1-3;

(c) drugi domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187 WO 2008/119567, ili SEQ ID NO:15;

(d) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1, 2, 3, 9, 10, 11 i 12;

(e) prvi polipeptidni monomer trećeg domena koji ima polipeptidnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:17-24;

(f) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:5, 6, 7 i 8; i

1

(g) drugi polipeptidni monomer trećeg domena koji ima polipeptidnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:17-24.

[0179] U skladu sa ovim poželjnim otelotvorenjem, prvi i drugi domen koji su fuzionisani preko peptidnog veznika sa trećim domenom obuhvataju sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:53, 59, 71, 77, 89 ili 95. U jednom aspektu, konstrukt antitela prema pronalasku karakteriše aminokiselinska sekvenca izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO:55, 56, 61, 62, 73, 74, 79, 80, 91, 92, 97 i 98.

[0180] Pronalazak dalje obezbeđuje polinukleotid/molekul nukleinske kiseline koji kodira konstrukt antitela prema pronalasku. Polinukleotid je biopolimer sastavljen od 13 ili više nukleotidnih monomera kovalentno povezanih u lancu. DNK (kao što je cDNK) i RNK (kao što je mRNK) su primeri polinukleotida sa različitom biološkom funkcijom. Nukleotidi su organski molekuli koji služe kao monomeri ili podjedinice molekula nukleinske kiseline poput DNK ili RNK. Molekul nukleinske kiseline ili polinukleotid mogu biti dvolančani i jednolančani, linearni i kružni. Poželjno je sadržan u vektoru koji je poželjno sadržan u ćeliji domaćinu. Navedena ćelija domaćin je, npr. nakon transformacije ili transfekcije vektorom ili polinukleotidom pronalaska, sposobnim za ekspresiju konstrukta antitela. U tu svrhu, polinukleotid ili molekul nukleinske kiseline je operativno povezan sa kontrolnim sekvencama.

[0181] Genetski kod je skup pravila po kojima se informacije kodirane unutar genetskog materijala (nukleinske kiseline) prevode u proteine. Biološko dekodiranje u živim ćelijama se postiže ribozomom koji povezuje aminokiseline u redosledu koji je određen mRNK, koristeći tRNK molekule da nose aminokiseline i čitaju mRNK tri nukleotida istovremeno. Kod definiše kako sekvence ovih nukleotidnih tripleta, nazvanih kodoni, određuju koja će amino kiselina biti sledeća tokom sinteze proteina. Uz neke izuzetke, kodon od tri nukleotida u sekvenci nukleinske kiseline specificira jednu aminokiselinu. Pošto je velika većina gena kodirana potpuno istim kodom, ovaj konkretan kod se često naziva kanonskim ili standardnim genetskim kodom. Dok genetski kod određuje sekvencu proteina za dati region kodiranja, drugi genomski regioni mogu uticati na to kada i gde se ovi proteini proizvode.

[0182] Dalje, pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži polinukleotid/molekul nukleinske

2

kiseline prema pronalasku. Vektor je molekul nukleinske kiseline koji se koristi kao sredstvo za prenos (stranog) genetskog materijala u ćeliju. Termin „vektor“ obuhvata ― ali nije ograničen na ― plazmide, viruse, kozmide i veštačke hromozome. Generalno, projektovani vektori se sastoje od porekla replikacije, mesta za višestruko kloniranje i markera koji se može birati. Sam vektor je generalno nukleotidna sekvenca, obično DNK sekvenca koja sadrži insert (transgen) i veću sekvencu koja služi kao "glavni lanac" vektora. Moderni vektori mogu da obuhvataju i dodatne karakteristike pored transgenskog umetka i glavnog lanca: promoter, genetski marker, otpornost na antibiotike, gen reporter, sekvenca ciljanja, oznaka za prečišćavanje proteina. Vektori koji se nazivaju ekspresioni vektori (ekspresioni konstrukti) su specifično za ekspresiju transgena u ciljnoj ćeliji i generalno imaju kontrolne sekvence.

[0183] Termin "kontrolne sekvence" se odnose na sekvence DNK potrebne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, po izboru operatorsku sekvencu i mesto vezivanja ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotore, signale poliadenilacije i pojačivače.

[0184] Nukleinska kiselina je operativno povezana kada je stavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za pregled ili sekretornog vođu je operativno povezan sa DNK za polipeptid ako je izražen kao preprotein koji učestvuje u lučenju polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da dozvoljava prevođenje. Uopšteno, operativno povezani znači da su povezane DNK sekvence susedne, a u slučaju sekretornog vođe susedne i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju biti susedni. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim mestima ograničenja. Ako takva mesta ne postoje, sintetički oligonukleotidni adapteri ili veznici se koriste u skladu sa konvencionalnom praksom.

[0185] „Transfekcija“ je proces namernog uvođenja molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida (uključujući vektore) u ciljne ćelije. Termin se uglavnom koristi za ne-virusne postupke u eukariotskim ćelijama. Transdukcija se često koristi za opisivanje virusa posredovanog prenosa molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida. Transfekcija životinjskih ćelija obično uključuje otvaranje prolaznih pora ili „rupa“ u ćelijskoj membrani, kako bi se omogućilo uzimanje materijala. Transfekcija se može izvesti pomoću kalcijum fosfata, elektroporacijom, ceđenjem ćelije ili mešanjem katjonskog lipida sa materijalom da bi se proizveli lipozomi, koji se spajaju sa ćelijskom membranom i deponuju svoj teret unutra.

[0186] Termin "transformacija" se koristi da opiše ne-virusni prenos molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida (uključujući vektore) u bakterije, kao i u ćelije eukariota koji nisu životinjski, uključujući biljne ćelije. Transformacija je stoga genetska promena bakterijske ili ne-životinjske eukariotske ćelije koja je rezultat direktnog unosa kroz ćelijsku membranu(e) iz okoline i naknadnog ugradnje egzogenog genetskog materijala (molekula nukleinske kiseline). Transformacija se može izvršiti veštačkim sredstvima. Da bi se transformacija dogodila, ćelije ili bakterije moraju biti u stanju kompetentnosti, što se može pojaviti kao vremenski ograničen odgovor na uslove okoline kao što su gladovanje i gustina ćelija.

[0187] Štaviše, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina transformisanu ili transfektovanu sa molekulom polinukleotida/nukleinske kiseline ili sa vektorom pronalaska. Kako se ovde koristi, termini "ćelija domaćin" ili "ćelija primalac" imaju za cilj da uključe bilo koju pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može biti ili je/je bila primaoci vektora, egzogenih molekula nukleinske kiseline i polinukleotida koji kodiraju konstrukt antitela od sadašnji pronalazak; i/ili primaoci same konstrukcije antitela. Uvođenje odgovarajućeg materijala u ćeliju se vrši transformacijom, transfekcijom i slično. Termin "ćelija domaćin" je takođe namenjen da uključi potomstvo ili potencijalno potomstvo jedne ćelije. Pošto se određene modifikacije mogu desiti u narednim generacijama zbog prirodnih, slučajnih ili namernih mutacija ili zbog uticaja okoline, takvo potomstvo možda neće biti potpuno identično (po morfologiji ili genomskom ili totalnom DNK komplementu) roditeljskoj ćeliji, ali je i dalje uključeno u okvire termina kako se ovde koristi. Pogodne ćelije domaćini uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, a takođe uključuju, ali nisu ograničene na bakterije, ćelije kvasca, ćelije gljiva, biljne ćelije i životinjske ćelije kao što su ćelije insekata i ćelije sisara, npr., miša, pacova, makaka ili čoveka.

[0188] Konstrukt antitela prema pronalasku se može proizvesti u bakterijama. Posle ekspresije, konstrukt antitela prema pronalasku je izolovan iz paste ćelija E. coli u rastvorljivoj frakciji i može se prečistiti, npr., afinitetnom hromatografijom i/ili isključivanjem veličine. Konačno prečišćavanje se može izvesti slično postupku za

4

prečišćavanje antitela eksprimovanog npr., u CHO ćelijama.

[0189] Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne gljive ili kvasac su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za konstrukt antitela prema pronalasku.

Saccharomyces cerevisiae, ili obični pekarski kvas, najčešće se koristi među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćina. Međutim, veliki broj drugih rodova, vrsta i sojeva su obično dostupni i korisni ovde, kao što su Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces hosts such as K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans, i K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao Schwanniomyces occidentalis; i nitaste gljivice kao što su Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i Aspergillus domaćini kao što su A. nidulans i A. niger.

[0190] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju konstrukta glikozilovanog antitela prema pronalasku su izvedene iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakulovirusni sojevi i varijante i odgovarajuće dozvoljene ćelije domaćina insekata od domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (vinska mušica), and Bombyx mori. Različiti virusni sojevi za transfekciju su javno dostupni, npr., L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, a takvi virusi se mogu koristiti kao virus u skladu sa predmetnim pronalaskom, posebno za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

[0191] Kao domaćini se mogu koristiti i kulture biljnih ćelija pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, arabidopsisa i duvana. Vektori za kloniranje i ekspresiju korisni u proizvodnji proteina u kulturi biljnih ćelija su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Videti npr., Hiatt i dr., Nature (1989) 342: 76-78, Owen i dr. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko i dr. (1995) The Plant J 8: 745-750, and Fecker i dr. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

[0192] Međutim, interesovanje je najveće za ćelije kičmenjaka, a razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinska procedura. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham i dr. , J. Gen Virol.36 : 59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); Ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); mišje sertolijske ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CVI ATCC CCL 70); Ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL1587); ćelije karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); bubrežne ćelije psa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bizamskog pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije pluća čoveka (W138, ATCC CCL 75); ćelije ljudske jetre (Hep G2,14138065); tumor dojke kod miša (MMT 060562, ATCC CCL5 1); TRI ćelije (Mather i dr., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i humana hepatomska linija (Hep G2).

[0193] U sledećoj varijanti, pronalazak obezbeđuje proces za proizvodnju konstrukta antitela prema pronalasku, pri čemu navedeni proces obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju konstrukta antitela prema pronalasku i obnavljanje proizvedenog konstrukta antitela iz pronalaska kulture.

[0194] Kako se ovde koristi, termin "kultivisanje" se odnosi na in vitro održavanje, diferencijaciju, rast, proliferaciju i/ili razmnožavanje ćelija pod pogodnim uslovima u medijumu. Termin "ekspresija" uključuje bilo koji korak uključen u proizvodnju konstrukta antitela prema pronalasku uključujući, ali ne ograničavajući se na, transkripciju, posttranskripcionu modifikaciju, translaciju, post-translacionu modifikaciju i sekreciju.

[0195] Kada se koriste rekombinantne tehnike, konstrukt antitela se može proizvesti intracelularno, u periplazmatskom prostoru, ili direktno sekretovati u medijum. Ako se konstrukt antitelo proizvodi unutar ćelije, kao prvi korak, čestice čestica, bilo ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, uklanjaju se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter i dr., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisuju proceduru za izolovanje antitela koja se luče u periplazmatski prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta se odmrzava u prisustvu natrijum acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 minuta. Ostaci ćelija mogu se ukloniti centrifugiranjem. Tamo gde se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se generalno prvo koncentrišu korišćenjem komercijalno dostupnog filtera koncentracije proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltracione jedinice. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka za inhibiciju proteolize, a antibiotici mogu biti uključeni da bi se sprečio rast slučajnih kontaminanata.

[0196] Konstrukt antitela prema pronalasku pripremljen od ćelija domaćina može da se dobije ili prečisti korišćenjem, na primer, hidroksilapatit hromatografije, gel elektroforeze, dijalize i afinitetne hromatografije. Druge tehnike za prečišćavanje proteina, kao što su frakcionisanje na koloni za izmenjivanje jona, taloženje etanola, HPLC sa obrnutom fazom, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparinskoj SEPHAROSE<™>, hromatografiji na anjonskoj ili katjonoizmenjivačkoj smoli (kao što je kolona sa poliasparaginskom kiselinom), hromato-fokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijum sulfata su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koje treba izlučiti. Tamo gde konstrukt antitela prema pronalasku sadrži CH3 domen, Bakerbond ABX smolu (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) je koristan za prečišćavanje.

[0197] Afinitetna hromatografija je poželjna tehnika prečišćavanja. Matrica na koju je vezan afinitetni ligand je najčešće agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice, poput stakla sa kontrolisanim porama ili poli (stirendivinil) benzena, omogućavaju brže protoke i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom.

[0198] Kako se ovde koristi, termin "farmaceutski sastav" se odnosi na sastav koji je pogodan za davanje pacijentu, poželjno ljudskom pacijentu. Poželjno je za farmaceutski sastav pronalaska da homogenost konstrukta antitela bude ≥ 80%, poželjnije ≥ 81%,≥ 82%,≥ 83%,≥ 84%, ili ≥ 85%, dalje poželjno ≥ 86% ,≥87%,≥88%,≥89%, ili ≥90%, još bolje, ≥91%,≥92%,≥93%,≥94%, ili ≥95% i najpoželjnije ≥96%,≥ 97%, ≥ 98% ili ≥ 99%.

[0199] Kako se ovde koristi, termin "farmaceutski sastav" se odnosi na sastav koji je pogodan za davanje pacijentu, poželjno ljudskom pacijentu. Posebno poželjna farmaceutski sastav predmetnog pronalaska obuhvata jedan ili veći broj konstrukta(a) antitela prema pronalasku, poželjno u terapeutski efikasnoj količini. Poželjno, farmaceutski sastav dalje sadrži pogodne formulacije jednog ili više (farmaceutski efikasnih) nosača, stabilizatora, ekscipijenata, razblaživača, solubilizatora, surfaktanata, emulgatora, konzervansa i/ili adjuvansa.

Prihvatljivi sastojci sastava su poželjno netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama. Farmaceutski sastav pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na, tečne, smrznute i liofilizovane sastave.

[0200] Sastave pronalaska mogu sadržati farmaceutski prihvatljiv nosač. Generalno, kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" označava bilo koji i sve vodene i nevodene rastvore, sterilne rastvore, rastvarače, pufere, npr. rastvori fosfatnog pufera (PBS), voda, suspenzije, emulzije, kao što su emulzije ulje/voda, razne vrste sredstava za vlaženje, lipozomi, disperzioni medijumi i obloge, koji su kompatibilni sa farmaceutskom primenom, posebno sa parenteralnom primenom. Upotreba takvih medijuma i sredstava u farmaceutskim sastavima je dobro poznata u tehnici, a sastavi koji sadrže takve nosače mogu se formulisati dobro poznatim konvencionalnim postupcima.

[0201] Određena otelotvorenja obezbeđuju farmaceutske sastave koji sadrže konstrukt antitela prema pronalasku i još jedan ili više ekscipijenata kao što su oni ilustrativno opisani u ovom odeljku i negde drugde ovde. Ekscipijensi se u ovom pogledu mogu koristiti u širokom spektru svrha, kao što je prilagođavanje fizičkih, hemijskih ili bioloških svojstava formulacija, kao što je podešavanje viskoznosti, ili postupci pronalaska za poboljšanje efikasnosti ili za stabilizaciju takvih formulacije i procesi protiv razgradnje i kvarenja zbog, na primer, naprezanja koji se javljaju tokom proizvodnje, isporuke, skladištenja, pripreme pre upotrebe, davanja i nakon toga.

[0202] U određenim otelotvorenjima, farmaceutski sastav može da sadrži materijale za formulaciju u svrhu modifikacije, održavanja ili očuvanja, npr., pH, osmolarnosti, viskoziteta, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili prodiranje sastava (videti, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 18" izdanje, (AR Genrmo, ur.), 1990, Mack Publishing Company). U takvim otelotvorenjima, pogodni materijali za formulaciju mogu uključivati, ali nisu ograničeni na:

• aminokiseline kao što su glicin, alanin, glutamin, asparagin, treonin, prolin, 2-fenilalanin, uključujući naelektrisane aminokiseline, poželjno lizin, lizin acetat, arginin, glutamat i/ili histidin

• antimikrobna sredstva kao što su antibakterijska i antifungalna sredstva

• antioksidansi kao što su askorbinska kiselina, metionin, natrijum sulfit ili natrijum hidrogensulfit;

• puferi, puferski sistemi i puferska sredstva koji se koriste za održavanje sastava na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH; primeri pufera su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline, sukcinat, fosfat i histidin; na primer Tris pufer od oko pH 7,0-8,5;

ne-vodenih rastvarača kao što su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje, i injektabilni organski estri kao što je etil oleat;

vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući slanu i puferisanu podlogu.

biorazgradivi polimeri kao što su poliestri;

sredstva za punjenje poput manitola ili glicina;

sredstva za helatiranje kao što je etilendiamin tetra sirćetna kiselina EDTA; izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije;

sredstva za kompleksiranje poput kofeina, polivinilpirolidona, beta-ciklodekstrina ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrina)

punioci;

monosaharidi; disaharidi; i drugi ugljeni hidrati (kao što su glukoza, manoza, dekstrini); ugljeni hidrati mogu biti ne-redukujući šećeri, poželjno trehaloza, saharoza, oktansulfat, sorbitol ili ksilitol;

(niske molekularne mase ) proteini, polipeptidi ili proteinski nosači kao što su albumin u serumu čoveka ili goveda, želatin ili imunoglobulini, poželjno ljudskog porekla;

sredstva za bojenje i arome;

redukcioni agensi koji sadrže sumpor, kao što su glutation, tioktična kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol i natrijum tio sulfat

sredstva za razblaživanje;

sredstva za emulgovanje;

hidrofilni polimeri, poput polivinilpirolidona)

kontra-joni koji stvaraju sol kao što je natrijum;

konzervansi kao što su antimikrobna sredstva, antioksidansi, helatirajuća sredstva, inertni gasovi i slično; primeri su: benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid);

metalni kompleksi kao što su kompleksi Zn-proteina;

rastvarači i ko-rastvarači (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećeri i šećerni alkoholi, kao što su trehaloza, saharoza, oktansulfat, manitol, sorbitol ili ksilitol stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, mioinizitoza, galaktoza, laktitol, ribitol, mioinizitol, galaktitol, glicerol, ciklitoli (npr., inozitol), polietilen glikol; i polihidrični šećerni alkoholi;

• sredstva za suspendovanje;

• surfakanti ili sredstva za vlaženje kao što su pluronici, PEG, esteri sorbitana, polisorbati kao što su polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal; surfaktanti mogu biti deterdženti, poželjno sa molekulskom masom od >1,2 KD i/ili polietar, poželjno sa molekulskom masom >3 KD; neograničavajući primeri za poželjne deterdžente su Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 i Tween 85; neograničavajući primeri za poželjne polietre su PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 i PEG 5000;

• sredstva za povećanje stabilnosti poput saharoze ili sorbitola;

• sredstva za povećanje toničnosti kao što su halogenidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol;

• sredstva za parenteralnu isporuku uključujući rastvor natrijum hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, laktatnu Ringerovu ili fiksna ulja;

• sredstva za intravenoznu isporuku uključujući tečnosti i hranljive materije, dopune elektrolita (kao što su oni zasnovani na Ringerovoj dekstrozi).

[0203] Stručnjacima je očigledno da različiti sastojci farmaceutske sastave (npr., oni iznad navedeni) mogu imati različite efekte, na primer, i amino kiselina može delovati kao pufer, stabilizator i/ili antioksidant; manitol može delovati kao sredstvo za povećanje zapremine i/ili sredstvo za povećanje toničnosti; natrijum hlorid može delovati kao sredstvo za isporuku i/ili sredstvo za povećanje toničnosti; itd.

[0204] Predviđeno je da sastav pronalaska može da sadrži, pored polipeptida pronalaska koji je ovde definisan, još biološki aktivnih sredstava, u zavisnosti od nameravane upotrebe sastava. Takva sredstva mogu biti lekovi koji deluju na gastrointestinalni sistem, lekovi koji deluju kao citostatici, lekovi koji sprečavaju hiperurikemiju, lekovi koji inhibiraju imunoreakcije (npr. kortikosteroidi), lekovi koji moduliraju inflamatorni odgovor, lekovi koji deluju na cirkulatorni sistem i/ili agensi kao što su citokini poznati u umetnost. Takođe je predviđeno da se konstrukt antitela iz predmetnog pronalaska primenjuje u ko-terapiji, tj. u kombinaciji sa drugim lekom protiv raka.

[0205] U određenim otelotvorenjima, optimalni farmaceutski sastav će odrediti stručnjak u oblasti u zavisnosti, na primer, od predviđenog načina davanja, formata isporuke i željene doze. Videti, na primer, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. U određenim otelotvorenjima, takve smeše mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu in vivo oslobađanja i brzinu klirensa in vivo klirensa konstrukta antitela ovog pronalaska. U određenim otelotvorenjima, primarno sredstvo za prenošenje ili nosač u farmaceutskom sastavu može biti vodene ili nevodene prirode. Na primer, pogodan nosač ili nosač može biti voda za injekcije, fiziološki rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, možda dopunjena drugim materijalima uobičajenim u sastavima za parenteralno davanje. Neutralni fiziološki rastvor ili fiziološka otopina pomešani sa albuminom u serumu su još primer uzorka. U određenim otelotvorenjima, konstrukt antitela iz sastava pronalaska može se pripremiti za skladištenje mešanjem odabranog preparata koji ima željeni stepen čistoće sa opcionim sredstvima za formulaciju (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, supra) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim otelotvorenjima, konstrukt antitela prema pronalasku može biti formulisan kao liofilizat korišćenjem odgovarajućih ekscipijenasa kao što je saharoza.

[0206] Kada se razmatra parenteralna primena, terapeutske sastave za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu biti obezbeđene u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena koji sadrži željeni konstrukt antitela prema pronalasku u farmaceutski prihvatljivom sredstvu za prenošenje. Posebno pogodan nosač za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je konstrukt antitela prema pronalasku formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, pravilno očuvan. U određenim otelotvorenjima, preparat može da uključuje formulaciju željenog molekula sa sredstvom, kao što su injekcije za mikrosfere, bioerodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što je polilaktična kiselina ili poliglikolna kiselina), perle ili lipozomi, koji mogu obezbediti kontrolisanu ili održivu puštanje proizvoda koji se može isporučiti depo injekcijom. U određenim otelotvorenjima, hijaluronska kiselina se takođe može koristiti, što ima efekat unapređenja trajnog trajanja cirkulacije. U određenim otelotvorenjima, implantabilni uređaji za isporuku leka mogu se koristiti za uvođenje željenog konstrukta antitela.

[0207] Stručnjacima će biti očigledne dodatne farmaceutske sastave, uključujući formulacije koje uključuju konstrukt antitela prema pronalasku u formulacijama sa produženim ili

1

kontrolisanim isporukom/oslobađanjem. Tehnike za formulisanje niza drugih sredstava za kontinuiranu ili kontrolisanu isporuku, kao što su nosači lipozoma, bioerodibilne mikročestice ili porozne perle i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, na primer, Međunarodnu patentnu prijavu WO9315722, koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih sastava. Preparati sa odloženim oslobađanjem mogu da uključuju polupropusne polimerne matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr., filmova ili mikrokapsula. Matrice sa odloženim oslobađanjem mogu uključivati poliestere, hidrogelove, polilaktide (kako je obelodanjeno u Pat. SAD br.

3,773,919 i Evropska patentna prijava br. EP 058481), kopolimeri L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman i dr., 1983, Biopolymers 2:547556), poli (2-hidroksietilmetakrilat) (Langer i dr., 1981, J. Biomed. Mater. Res.15:167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98105), etilen vinil acetat (Langer i dr., 1981, supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibutirična kiselina (objava Evropske patentne prijave br. EP 133,988). Sastavi sa odloženim oslobađanjem mogu takođe da uključuju lipozome koji se mogu dobiti bilo kojim od nekoliko postupaka poznatih u struci. Videti npr., Eppstein i dr., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82:3688-3692; Objava Evropske patentne prijave br. EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

[0208] Konstrukt antitela takođe može biti zarobljen u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijskom polimerizacijom (na primer, hidroksimetilceluloza ili želatin-mikrokapsule i poli (metilmetacilat) mikrokapsule, respektivno), u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi), albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su obelodanjene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).

[0209] Farmaceutski sastavi koji se koriste za in vivo davanje se obično nude kao sterilni preparati. Sterilizacija se može postići filtracijom kroz sterilne membrane za filtriranje. Kada je sastav liofilizovan, sterilizacija pomoću ovog postupka može se sprovesti pre ili posle liofilizacije i rekonstitucije. Sastavi za parenteralno davanje mogu se čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Parenteralni sastavi se generalno stavljaju u ambalažu koja ima sterilni otvor za pristup, na primer, vreću za intravenski rastvor ili bočicu koja ima čep koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju.

[0210] Drugi aspekt pronalaska uključuje samo-puferirajuću konstrukciju antitela formulacija

2

pronalaska, koja se može koristiti kao farmaceutske sastave, kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 06138181A2. Na raspolaganju su razna izlaganja o materijalima za stabilizaciju i formulaciju proteina i metodama korisnim u ovom pogledu, kao što su Arakawa i dr., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res.

8(3): 285-91 (1991); Kendrick i dr., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution" u: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology.13: 61-84 (2002), i Randolph i dr., "Surfactant-protein interactions," Pharm Biotechnol.13: 159-75 (2002), videti posebno delove koji se odnose na ekscipijente i procese istih za samo-puferisane proteinske formulacije u skladu sa trenutnim pronalaskom, posebno u vezi sa proteinskim farmaceutskim proizvodima i procesima za veterinarsku i/ili medicinsku upotrebu kod ljudi.

[0211] Soli se mogu koristiti u skladu sa određenim otelotvorenjima pronalaska da bi se, na primer, prilagodila jonska snaga i/ili izotoničnost formulacije i/ili poboljšala rastvorljivost i/ili fizička stabilnost proteina ili drugog sastojka sastava u skladu sa pronalaskom. Kao što je dobro poznato, joni mogu stabilizovati izvorno stanje proteina vezujući se za naelektrisane ostatke na površini proteina i štiteći naelektrisane i polarne grupe u proteinu i smanjujući snagu njihovih elektrostatičkih interakcija, atraktivnih i odbojnih interakcija. Joni takođe mogu stabilizovati denaturisano stanje proteina vezujući se naročito za denaturisane peptidne veze (-CONH) proteina. Dalje, jonska interakcija sa naelektrisanim i polarnim grupama u proteinu takođe može smanjiti intermolekularne elektrostatičke interakcije i, na taj način, sprečiti ili smanjiti agregaciju i nerastvorljivost proteina.

[0212] Jonske vrste se značajno razlikuju u efektima na proteine. Razvijen je niz kategoričkih rangiranja jona i njihovih efekata na proteine koji se mogu koristiti u formulisanju farmaceutskih sastava u skladu sa pronalaskom. Jedan primer je serija Hofmajster, koja rangira jonske i polarne nejonske rastvorene supstance njihovim efektom na konformacionu stabilnost proteina u rastvoru. Rastvorne materije koje se stabilizuju nazivaju se „kosmotropnim“. Destabilizujuće rastvorne materije nazivaju se „haotropnim“. Kosmotropi se obično koriste u visokim koncentracijama (npr., > 1 molarni amonijum sulfat) za taloženje proteina iz rastvora („usoljenje“). Haotropi se obično koriste za denaturisanje i/ili za rastvaranje proteina („soljenje“). Relativna efikasnost jona na „usoljavanje“ i

„soljenje“ definiše njihov položaj u Hofmajsterovoj seriji.

[0213] Slobodne aminokiseline se mogu koristiti u formulacijama antitela prema pronalasku u skladu sa različitim otelotvorenjima pronalaska kao sredstva za povećanje zapremine, stabilizatori i antioksidansi, kao i za druge standardne upotrebe. Lizin, prolin, serin i alanin mogu se koristiti za stabilizaciju proteina u formulaciji. Glicin je koristan u liofilizaciji kako bi se osigurala pravilna struktura i svojstva kolača. Arginin može biti koristan za inhibiciju agregacije proteina, kako u tečnim, tako i u liofilizovanim formulacijama. Metionin je koristan kao antioksidans.

[0214] Polioli uključuju šećere, npr., manitol, saharozu i sorbitol i polihidrične alkohole, kao što su, na primer, glicerol i propilen glikol, i za svrhe ovde diskusije polietilen glikol (PEG) i srodne supstance. Polioli su kosmotropni. Oni su korisna sredstva za stabilizaciju u tečnim i liofilizovanim formulacijama za zaštitu proteina od procesa fizičke i hemijske razgradnje. Polioli su takođe korisni za prilagođavanje toničnosti formulacija. Među poliolima korisnim u odabranim otelotvorenjima pronalaska je manitol, koji se obično koristi da obezbedi strukturnu stabilnost kolača u liofilizovanim formulacijama. Osigurava strukturnu stabilnost kolača. Obično se koristi sa lioprotektantom, npr., saharozom. Sorbitol i saharoza su među poželjnim sredstvima za prilagođavanje toničnosti i kao stabilizatori za zaštitu od stresova smrzavanja i odmrzavanja tokom transporta ili pripreme rasutih materija tokom proizvodnog procesa. Smanjujući šećeri (koji sadrže slobodne aldehidne ili ketonske grupe), poput glukoze i laktoze, mogu glikolirati površinske ostatke lizina i arginina. Prema tome, oni generalno nisu među poželjnim poliolima za upotrebu u skladu sa pronalaskom. Pored toga, šećeri koji formiraju takve reaktivne vrste, kao što je saharoza, koja se hidrolizuje do fruktoze i glukoze pod kiselim uslovima, i posledično dovodi do glikacije, takođe nije među poželjnim poliolima u predmetnom pronalasku. PEG je koristan za stabilizaciju proteina i kao krioprotektant i u pronalasku se može koristiti u tom pogledu.

[0215] Ostvarenja konstrukta antitela formulacija pronalaska dalje sadrže surfaktante.

Molekuli proteina mogu biti podložni adsorpciji na površini i denaturaciji i posledičnoj agregaciji na interfejsima vazduh-tečnost, čvrsta-tečnost i tečnost-tečnost. Ovi efekti se generalno skaliraju obrnuto od koncentracije proteina. Ove štetne interakcije se generalno skaliraju obrnuto u odnosu na koncentraciju proteina i obično se pogoršavaju fizičkim mešanjem, poput onog generisanog tokom otpreme i rukovanja proizvodom. Surfaktanti se rutinski koriste za sprečavanje, minimiziranje ili smanjenje površinske adsorpcije. Korisni surfaktanti u pronalasku u ovom pogledu uključuju polisorbat 20, polisorbat 80, druge estere

4

masnih kiselina sorbitan polietoksilata i poloksamer 188. Surfaktanti se takođe često koriste za kontrolu konformacione stabilnosti proteina. Upotreba surfaktanta u ovom pogledu je specifična za proteine, jer će bilo koje dato površinski aktivno sredstvo stabilizovati neke proteine, a destabilizovati druge.

[0216] Polisorbati su podložni oksidativnoj razgradnji i često u isporuci sadrže dovoljne količine peroksida da izazovu oksidaciju bočnih lanaca ostataka proteina, posebno metionina. Shodno tome, polisorbate treba pažljivo koristiti, a kada se koriste, treba ih koristiti u najnižoj efikasnoj koncentraciji. S tim u vezi, polisorbati predstavljaju opšte pravilo da pomoćne supstance treba koristiti u najnižim efektivnim koncentracijama.

[0217] Ostvarenja konstrukta antitela formulacija pronalaska dalje sadrže antioksidanse. Do neke mere štetna oksidacija proteina može se sprečiti u farmaceutskim formulacijama održavanjem odgovarajućeg nivoa ambijentalnog kiseonika i temperature i izbegavanjem izlaganja svetlosti. Antioksidativni pomoćni sastojci se takođe mogu koristiti za sprečavanje oksidativne razgradnje proteina. Među korisnim antioksidantima u ovom pogledu su redukciona sredstva, sredstva za uklanjanje kiseonika/slobodnih radikala i helatnih sredstava. Antioksidanti za upotrebu u terapijskim formulacijama proteina u skladu sa pronalaskom su poželjno rastvorljivi u vodi i održavaju svoju aktivnost tokom roka trajanja proizvoda. EDTA je poželjni antioksidans u skladu sa pronalaskom u vezi s tim. Antioksidanti mogu oštetiti proteine. Na primer, redukciona sredstva, kao što je glutation naročito, mogu poremetiti intramolekularne disulfidne veze. Prema tome, antioksidanti za upotrebu u pronalasku su izabrani da, između ostalog, eliminišu ili dovoljno smanje mogućnost oštećenja proteina u formulaciji.

[0218] Formulacije u skladu sa pronalaskom mogu sadržati jone metala koji su proteinski kofaktori i koji su neophodni za formiranje kompleksa za koordinaciju proteina, kao što je cink neophodan za formiranje određenih suspenzija insulina. Joni metala takođe mogu inhibirati neke procese koji razgrađuju proteine. Međutim, joni metala takođe katalizuju fizičke i hemijske procese koji razgrađuju proteine. Joni magnezijuma (10-120 mM) mogu se koristiti za inhibiranje izomerizacije asparaginske kiseline u izoaspartansku kiselinu. Ca<+2>joni (do 100 mM) mogu povećati stabilnost humane deoksiribonukleaze. Mg<+2>, Mn<+2>i Zn<+2>, ipak mogu destabilizovati rhDNase. Slično, Ca<+2>i Sr<+2>može stabilizovati faktor VIII, može se destabilizovati Mg<+2>, Mn<+2>i Zn<+2>, Cu<+2>i Fe<+2>, a njegova agregacija može se povećati za jone Al<+3>.

[0219] Ostvarenja konstrukta antitela formulacija pronalaska dalje sadrže jedan ili više konzervansa. Konzervansi su neophodni pri razvoju parenteralnih formulacija sa više doza koje uključuju više ekstrakcija iz istog kontejnera. Njihova primarna funkcija je da inhibiraju rast mikroba i osiguraju sterilnost proizvoda tokom roka trajanja ili trajanja upotrebe leka. Uobičajeni konzervansi uključuju benzil alkohol, fenol i m-krezol. Iako konzervansi imaju dugu istoriju upotrebe sa parenteralima sa malim molekulima, razvoj formulacija proteina koji uključuju konzervanse može biti izazov. Konzervansi gotovo uvek imaju destabilizujući efekat (agregaciju) na proteine, a ovo je postalo glavni faktor u ograničavanju njihove upotrebe u formulacijama proteina sa više doza. Do danas je većina proteinskih lekova formulisana samo za jednokratnu upotrebu. Međutim, kada su moguće formulacije sa više doza, one imaju dodatnu prednost omogućavanja pogodnosti za pacijenta i povećane tržišne mogućnosti. Dobar primer je onaj humanog hormona rasta (hGH) gde je razvoj očuvanih formulacija doveo do komercijalizacije pogodnijih višenamenskih injekcionih olovaka.

Trenutno su na tržištu dostupna najmanje četiri takva olovka koja sadrže očuvane formulacije hGH. Norditropin (tečnost, Novo Nordisk), Nutropin AQ (tečnost, Genentech) & Genotropin (liofilizovani - dvokomorni uložak, Pharmacia & Upjohn) sadrže fenol dok je Somatrope (Eli Lilly) formulisan sa m-krezolom. Nekoliko aspekata treba uzeti u obzir tokom formulacije i razvoja sačuvanih oblika doziranja. Efikasna koncentracija konzervansa u leku mora biti optimizovana. To zahteva ispitivanje datog konzervansa u obliku doziranja sa opsezima koncentracija koji daju antimikrobnu efikasnost bez ugrožavanja stabilnosti proteina.

[0220] Kao što se može očekivati, razvoj tečnih formulacija koje sadrže konzervanse su izazovniji od liofilizovanih formulacija. Liofilizovani proizvodi mogu se liofilizovati bez konzervansa i rekonstituisati sa rastvaračem koji sadrži konzervans u vreme upotrebe. Ovo skraćuje vreme za koje je konzervans u kontaktu sa proteinima, značajno minimizirajući povezane rizike stabilnosti. Kod tečnih formulacija treba održavati efikasnost i stabilnost konzervansa tokom celog roka trajanja proizvoda (oko 18 do 24 meseci). Važno je napomenuti da efikasnost konzervansa treba pokazati u konačnoj formulaciji koja sadrži aktivni lek i sve pomoćne komponente.

[0221] Konstrukti antitela koji su ovde obelodanjeni mogu takođe biti formulisani kao imuno-lipozomi. "Lipozom" je mala vezikula sastavljena od različitih tipova lipida, fosfolipida i/ili surfaktanta koji je koristan za isporuku leka sisaru. Komponente lipozoma obično su raspoređene u dvoslojnoj formaciji, slično lipidnom rasporedu bioloških membrana. Lipozomi koji sadrže konstrukt antitela se pripremaju postupcima poznatim u tehnici, kao što je opisano u Epstein i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985);

Hwang i dr., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); Pat. SAD br.4,485,045 i 4,544,545; i WO 97/38731. Lipozomi sa produženim vremenom cirkulacije obelodanjeni su u patentu SAD br.5,013,556. Posebno korisni lipozomi mogu se proizvesti metodom isparavanja reverzne faze sa lipidnim sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se ekstrudiraju pomoću filtera definisane veličine pora da bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom. Fab' fragmenti konstrukta antitela iz predmetnog pronalaska mogu biti konjugovani sa lipozomima kao što je opisano u Martin i dr. J. Biol. Chem.257: 286-288 (1982) preko reakcije izmene disulfida. Hemoterapeutsko sredstvo je opciono sadržano u lipozomu. Videti Gabizon i dr. J. National Cancer Inst.81 (19) 1484 (1989).

[0222] Jednom kada je farmaceutski sastav formulisan, može se čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca, kristal ili kao dehidrirani ili liofilizovani prah. Takve formulacije se mogu čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr., liofilizovanom) koji je rekonstituisan pre davanja.

[0223] Biološka aktivnost farmaceutskog sastava koji je ovde definisana može se odrediti, na primer, testovima citotoksičnosti, kao što je opisano u sledećim primerima, u WO 99/54440 ili od strane Schlereth i dr. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). "Efikasnost" ili "in vivo efikasnost" kako se ovde koristi odnosi se na odgovor na terapiju farmaceutskim sastavom pronalaska, koristeći npr. standardizovani kriterijumi odgovora NCI. Uspeh ili in vivo efikasnost terapije korišćenjem farmaceutskog sastava pronalaska odnosi se na efikasnost sastava za njenu predviđenu namenu, tj. sposobnost sastava da izazove svoj željeni efekat, tj. iscrpljivanje patoloških ćelija, npr. tumorske ćelije. Efikasnost in vivo se može pratiti utvrđenim standardnim postupcima za odgovarajuće entitete bolesti uključujući, ali ne ograničavajući se na, broj belih krvnih zrnaca, diferencijale, fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija, aspiraciju koštane srži. Pored toga, mogu se koristiti različiti kliničkohemijski parametri specifični za bolest i druge utvrđene standardne postupke. Štaviše, kompjuterska tomografija, rendgenski snimak, nuklearna magnetna rezonantna tomografija (npr. za procenu odgovora zasnovanu na kriterijumima Nacionalnog instituta za rak [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Izveštaj sa međunarodne radionice za standardizaciju kriterijuma odgovora na ne-Hočkinove limfome. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol.1999 Apr;17(4):1244]), skeniranje pozitron-emisione tomografije, broj belih krvnih zrnaca, diferencijali, fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija, aspiracija koštane srži, biopsije/histologije limfnih čvorova i različiti parametri kliničke hemije specifični za limfom (parametri kliničke hemije dehidrogenaza) i druge utvrđene standardne postupke mogu se koristiti.

[0224] Drugi veliki izazov u razvoju lekova kao što je farmaceutski sastav pronalaska je predvidljiva modulacija farmakokinetičkih svojstava. U tom cilju, može se uspostaviti farmakokinetički profil kandidata za lek, tj. profil farmakokinetičkih parametara koji utiču na sposobnost određenog leka da leči dato stanje. Farmakokinetički parametri leka koji utiču na sposobnost leka za lečenje određene bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na: polu-raspad, volumen distribucije, metabolizam prvog prolaska kroz jetru i stepen vezivanja u krvnom serumu. Svaki od iznad navedenih parametara može uticati na efikasnost datog leka.

Predviđena je karakteristika konstrukata antitela iz predmetnog pronalaska sa specifičnim Fc modalitetom da oni podrazumevaju, na primer, razlike u farmakokinetičkom ponašanju. Konstrukt antitela sa produženim polu-raspadom prema predmetnom pronalasku poželjno pokazuje iznenađujuće produženo vreme zadržavanja in vivo u poređenju sa "kanonskim" ne-HLE verzijama pomenutog konstrukta antitela.

[0225] „Polu-raspad“ označava vreme u kome se 50% primenjenog leka eliminiše kroz biološke procese, npr. metabolizam, izlučivanje itd. Pod "metabolizmom prvog prolaza kroz jetru" podrazumeva se sklonost leka da se metaboliše pri prvom kontaktu sa jetrom, tj. tokom njegovog prvog prolaska kroz jetru. „Zapremina distribucije“ označava stepen zadržavanja leka u različitim delovima tela, kao npr. intracelularni i ekstracelularni prostori, tkiva i organi itd. i distribucija leka unutar ovih odeljenja. „Stepen vezivanja u krvnom serumu“ označava sklonost leka da interaguje sa proteinima krvnog seruma, kao što je albumin, i da se vezuje za njih, što dovodi do smanjenja ili gubitka biološke aktivnosti leka.

[0226] Farmakokinetički parametri takođe uključuju bioraspoloživost, vreme kašnjenja (Tlag), Tmax, stope apsorpcije, veći početak i/ili Cmax za datu količinu primenjenog leka.

"Bioraspoloživost" označava količinu leka u odeljku krvi. „Vreme kašnjenja“ označava vremensko kašnjenje između primene leka i njegovog otkrivanja i merljivosti u krvi ili plazmi. „Tmax“ je vreme nakon kojeg se postiže maksimalna koncentracija leka u krvi, a „Cmax“ je koncentracija u krvi koja se maksimalno dobija sa datim lekom. Na vreme dostizanja koncentracije leka u krvi ili tkivu koja je potrebna za njegovo biološko dejstvo utiču svi parametri. Farmakokinetički parametri konstrukata bispecifičnih antitela koji pokazuju specifičnost unakrsnih vrsta, koji se mogu odrediti u pretkliničkom testiranju na životinjama na primatima koji nisu šimpanze, kao što je iznad navedeno, takođe su navedeni, npr. u publikaciji Schleretha i dr. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

[0227] U poželjnom aspektu pronalaska, farmaceutski sastav je stabilna najmanje četiri nedelje na oko -20°C. Kao što je očigledno iz priloženih primera, kvalitet konstrukta antitela prema pronalasku u odnosu na kvalitet odgovarajućih konstrukata antitela stanja tehnike može se testirati korišćenjem različitih sistema. Smatra se da su ti testovi u skladu sa „ICH Harmonizovanim tripartitnim smernicama: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C and Specifications: Test procedures and Acceptance Criteria for Biotech Biotechnological/Biological Products Q6B" i stoga su izabrani da obezbede profil koji ukazuje na stabilnost koji obezbeđuje sigurnost da se detektuju promene u identitetu, čistoći i snazi proizvoda. Dobro je prihvaćeno da je termin čistoća relativan pojam. Zbog efekta glikozilacije, deamidacije ili drugih heterogenosti, apsolutnu čistoću biotehnološkog/biološkog proizvoda obično treba procenjivati više od jedne metode, a dobijena vrednost čistoće zavisi od postupka. U svrhu ispitivanja stabilnosti, ispitivanja čistoće treba da se fokusiraju na postupke za određivanje proizvoda razgradnje.

[0228] Za procenu kvaliteta farmaceutskog sastava koji sadrži konstrukt antitela prema pronalasku može se analizirati npr. analizom sadržaja rastvorljivih agregata u rastvoru (HMVS po isključenju veličine). Poželjno je da stabilnost tokom najmanje četiri nedelje na oko -20°C karakteriše sadržaj manji od 1,5% HMWS, poželjno manje od 1% HMWS.

[0229] Poželjna formulacija za konstrukt antitela kao farmaceutski sastav može npr. sadrže komponente formulacije kao što je opisano u nastavku:

• Formulacija A:

kalijum fosfat, L-arginin hidrohlorid, trehaloza dihidrat, polisorbat 80 na pH 6,0

[0230] Drugi primeri za procenu stabilnosti konstrukta antitela prema pronalasku u obliku farmaceutskog sastava dati su u priloženim primerima 4-12. U tim primerima otelotvorenjima konstrukata antitela prema pronalasku su testirane u odnosu na različite uslove stresa u različitim farmaceutskim formulacijama i rezultati su upoređeni sa drugim formatima koji produžavaju polu-raspad (HLE) bispecifičnog konstrukta antitela koji se angažuje na T ćelijama poznatim u tehnici. Generalno, predviđeno je da su konstrukti antitela obezbeđeni specifičnim Fc modalitetom u skladu sa predmetnim pronalaskom tipično stabilniji u širokom opsegu stresnih uslova kao što su temperatura i svetlosni stres, oba u poređenju sa konstruktima antitela koji su obezbeđeni sa različitim HLE formatima i bez bilo koji HLE format (tj. "kanonski" konstrukti antitela). Navedena temperaturna stabilnost može se odnositi i na sniženu (ispod sobne temperature uključujući smrzavanje) i na povećanu (iznad sobne temperature uključujući temperature do ili iznad telesne temperature) temperaturu. Kao što će stručnjak u ovoj oblasti priznati, takva poboljšana stabilnost u pogledu stresa, koja se teško može izbeći u kliničkoj praksi, čini konstrukt antitela bezbednijom jer će se u kliničkoj praksi pojaviti manje produkata razgradnje. Kao posledica, pomenuta povećana stabilnost znači povećanu bezbednost.

[0231] Jedno otelotvorenje obezbeđuje konstrukt antitela prema pronalasku ili konstrukt antitela proizveden u skladu sa procesom pronalaska za upotrebu u prevenciji, lečenju ili poboljšanju poremećaja B ćelija koji korelira sa ekspresijom BCMA ili prekomernom ekspresijom BCMA, poremećajem plazma ćelija i autoimunu bolest.

[0232] Ovde opisane formulacije su korisne kao farmaceutski sastavi u lečenju, poboljšanju i/ili prevenciji patološkog medicinskog stanja kao što je ovde opisano kod pacijenata kome je to potrebno. Termin "lečenje" se odnosi i na terapijski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Tretman uključuje primenu ili davanje formulacije na telo, izolovano tkivo ili ćeliju od pacijenta koji ima bolest/poremećaj, simptom bolesti/poremećaja ili predispoziciju ka bolesti/poremećaju, sa ciljem da se izlečiti, izlečiti, ublažiti, ublažiti, promeniti, izlečiti, poboljšati, poboljšati ili uticati na bolest, simptom bolesti ili predispoziciju prema bolesti.

[0233] Termin "poboljšanje", kako se ovde koristi, odnosi se na svako poboljšanje bolesnog stanja pacijenta koji ima bolest kao što je ovde navedeno u nastavku, davanjem konstrukta antitela prema pronalasku ispitaniku kome je to potrebno. Takvo poboljšanje se takođe može posmatrati kao usporavanje ili zaustavljanje progresije bolesti pacijenta. Termin "prevencija" kako se ovde koristi označava izbegavanje pojave ili ponovnog pojavljivanja kod pacijenta koji ima tumor ili kancer ili metastatski kancer kao što je navedeno u nastavku, davanjem konstrukta antitela prema pronalasku ispitaniku u potrebi za tim.

[0234] Termin "bolest" se odnosi na bilo koje stanje koje bi imalo koristi od lečenja konstruktom antitela ili farmaceutskim sastavom koji je ovde opisan. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti uključujući ona patološka stanja koja predisponiraju sisara na bolest o kojoj je reč.

[0235] "Neoplazma" je abnormalni rast tkiva, koji obično, ali ne uvek, formira masu. Kada se takođe formira masa, obično se naziva "tumor". Neoplazme ili tumori ili mogu biti benigni, potencijalno maligni (prekancerozni) ili maligni. Maligne neoplazme se obično nazivaju rakom. Obično napadaju i uništavaju okolno tkivo i mogu da formiraju metastaze, odnosno šire se na druge delove, tkiva ili organe tela. Dakle, pojam "metastatski kancer" obuhvata metastaze u drugim tkivima ili organima od one originalnog tumora. Limfomi i leukemije su limfoidne neoplazme. Za potrebe ovog pronalaska, oni su takođe obuhvaćeni terminima "tumor" ili "rak".

[0236] Termin "virusna bolest" opisuje bolesti, koje su rezultat virusne infekcije ispitanika.

[0237] Termin "imunološki poremećaj" kako se ovde koristi opisuje u skladu sa uobičajenom definicijom ovog termina imunološke poremećaje kao što su autoimune bolesti, preosetljivost, imuni nedostaci.

[0238] Kod poremećaja plazma ćelija, jedan klon plazma ćelija se nekontrolisano razmnožava. Kao rezultat, ovaj klon proizvodi ogromne količine jednog (monoklonalnog) antitela poznatog kao M-protein. U nekim slučajevima, kao što je kod monoklonskih gamopatija, proizvedeno antitelo je nekompletno, sastoji se samo od lakih ili teških lanaca. Ove abnormalne plazma ćelije i antitela koja proizvode obično su ograničeni na jedan tip.

[0239] Poželjno je da se poremećaj plazma ćelija bira iz grupe koju čine multipli mijelom, plazmacitom, leukemija plazma ćelija, makroglobulinemija, amiloidoza, Valdenstromova makroglobulinemija, plazmacitom solitarne kosti, ekstramedularni plazmacitom, teška bolest

1

plazmacirotoma, teška bolest plazmacirotomskog lanca tinjajući multipli mijelom.

Poremećaji B ćelija takođe mogu biti izabrani iz grupe koju čine B-ćelijski ne- Hočkinov limfom, hronična limfocitna leukemija i Hočkinov limfom.

[0240] Autoimuna bolest je, na primer, sistemski eritematozni lupus (SLE) ili reumatoidni artritis (RA).

[0241] Termini „ispitanik u potrebi“ ili oni „kojima je potrebno lečenje“ obuhvataju one koji već imaju poremećaj, kao i one kod kojih se poremećaj treba sprečiti. Ispitanik kome je potrebna ili "pacijent" uključuje ljude i druge subjekte sisara koji primaju bilo profilaktički ili terapeutski tretman.

[0242] Konstrukt antitela prema pronalasku će generalno biti dizajniran za specifične puteve i postupke primene, za specifične doze i učestalost primene, za specifične tretmane specifičnih bolesti, sa opsegom biodostupnosti i postojanosti, između ostalog. Materijali sastava su poželjno formulisani u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto primene.

[0243] Formulacije i sastavi stoga mogu biti dizajnirane u skladu sa pronalaskom za isporuku bilo kojim pogodnim putem davanja. U kontekstu ovog pronalaska, putevi primene uključuju, ali nisu ograničeni na

• lokalni putevi (kao što su epikutani, inhalacioni, nazalni, oftalmološki, aurikularni/auralni, vaginalni, mukozni);

• enteralni putevi (kao što su oralni, gastrointestinalni, sublingvalni, bukalni, rektalni); i

• parenteralni putevi (kao što su intravenski, intraarterijski, intraosealni, intramuskularni, intracerebralni, intracerebroventrikularni, epiduralni, intratekalni, subkutani, intraperitonealni, ekstra-amniotički, intraartikularni, intrakardijalni, intralezijski, intrauterini, intravezikalni, intravitrealni, transdermalni, intranazalni, transmukozni, intrasinovijalni, intraluminalni).

[0244] Farmaceutski sastavi i konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku su posebno korisni za parenteralnu primenu, npr., subkutanu ili intravensku isporuku, na primer injekcijom kao što je bolus injekcija, ili infuzijom kao što je kontinuirana infuzija.

Farmaceutski sastavi se mogu davati pomoću medicinskog uređaja. Primeri medicinskih

2

sredstava za davanje farmaceutskih sastava su opisani u patentima SAD br.4,475,196;

4,439,196; 4,447,224; 4,447,233; 4,486,194; 4,487,603; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 5,064,413; 5,312,335; 5,312,335; 5,383,851; i 5,399,163.

[0245] Posebno, predmetni pronalazak obezbeđuje neprekidnu primenu odgovarajućeg sastava. Kao neograničavajući primer, neprekidna ili suštinski neprekidna, tj. kontinuirana administracija se može ostvariti pomoću malog sistema pumpe koji pacijent nosi za merenje priliva terapeutskog sredstva u telo pacijenta. Farmaceutski sastav koji sadrži konstrukt antitela prema pronalasku može se primeniti korišćenjem pomenutih pumpnih sistema. Takvi sistemi pumpe su opšte poznati u struci, i obično se oslanjaju na periodičnu razmenu kertridža koji sadrže terapeutski agens koji se infundira. Kada se zameni kertridž u takvom sistemu pumpe, može doći do privremenog prekida inače neprekidnog protoka terapeutskog sredstva u telo pacijenta. U takvom slučaju, faza primene pre zamene kertridža i faza primene nakon zamene kertridža bi se i dalje smatrale u okviru značenja farmaceutskih sredstava i metoda pronalaska zajedno čine jednu "neprekidnu primenu" takvog terapeutskog sredstva.

[0246] Kontinuirano ili neprekidno davanje konstrukata antitela prema pronalasku može biti intravenozno ili subkutano putem uređaja za isporuku tečnosti ili malog sistema pumpe uključujući mehanizam za pokretanje tečnosti za izbacivanje tečnosti iz rezervoara i mehanizam za aktiviranje za aktiviranje pokretačkog mehanizma. Sistemi pumpe za subkutanu primenu mogu uključivati iglu ili kanilu za prodiranje u kožu pacijenta i unošenje odgovarajućeg sastava u telo pacijenta. Navedeni pumpni sistemi mogu biti direktno fiksirani ili pričvršćeni za kožu pacijenta nezavisno od vene, arterije ili krvnog suda, čime se omogućava direktan kontakt između sistema pumpe i kože pacijenta. Sistem pumpe može biti pričvršćen za kožu pacijenta od 24 sata do nekoliko dana. Sistem pumpe može biti male veličine sa rezervoarom za male zapremine. Kao neograničavajući primer, zapremina rezervoara za odgovarajuću farmaceutsku kompoziciju koja se primenjuje može biti između 0,1 i 50 ml.

[0247] Kontinuirana primena može takođe biti transdermalna putem flastera koji se nosi na koži i zamenjuje u intervalima. Stručnjak u ovoj oblasti je upoznat sa sistemima flastera za davanje lekova koji su pogodni za ovu svrhu. Treba napomenuti da je transdermalno davanje posebno pogodno za neprekidno davanje, pošto se razmena prvog iscrpljenog flastera može povoljno ostvariti istovremeno sa postavljanjem novog, drugog flastera, na primer na površinu kože neposredno pored prvog potrošenog flastera neposredno pre uklanjanja prvog iscrpljenog flastera. Ne pojavljuju se problemi prekida protoka ili prekida napajanja.

[0248] Ako je farmaceutski sastav liofilizovan, liofilizovani materijal se prvo rekonstituiše u odgovarajućoj tečnosti pre primene. Liofilizovani materijal može da se rekonstituiše u, na primer, bakteriostatskoj vodi za injekcije (BWFI), fiziološkom rastvoru, fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS) ili istoj formulaciji u kojoj je protein bio pre liofilizacije.

[0249] Sastavi ovog pronalaska se mogu davati subjektu u odgovarajućoj dozi koja se može odrediti npr. ispitivanjem povećanja doze primenom sve većih doza konstrukta antitela prema pronalasku koji pokazuje specifičnost među vrstama opisanu ovde na primate koji nisu šimpanze, na primer makaki. Kao što je iznad navedeno, konstrukt antitela prema pronalasku koji pokazuje specifičnost unakrsnih vrsta opisan ovde može povoljno da se koristi u identičnom obliku u pretkliničkom testiranju na primatima koji nisu šimpanze i kao lek kod ljudi. Režim doziranja će biti određen od strane praktičara i kliničkih faktora. Kao što je dobro poznato u medicini, doze za svakog pacijenta zavise od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, određeno jedinjenje koje se daje, pol, vreme i način primene, opšte zdravlje i drugi lekovi koji se daju istovremeno.

[0250] Termin "efikasna doza" ili "efikasna doza" je definisan kao količina dovoljna da se postigne ili bar delimično postigne željeni efekat. Termin "terapeutski efikasna doza" se definiše kao količina dovoljna da izleči ili bar delimično zaustavi bolest i njene komplikacije kod pacijenta koji već pati od bolesti. Količine ili doze efikasne za ovu upotrebu zavisiće od stanja koje se leči (indikacija), isporučenog konstrukta antitela, terapijskog konteksta i ciljeva, težine bolesti, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na terapeutsko sredstvo, put primene, veličinu (telesnu masu, telesnu površinu ili veličinu organa) i/ili stanje (starost i opšte zdravlje) pacijenta i opšte stanje pacijentovog sopstvenog imunog sistema. Odgovarajuća doza se može podesiti prema proceni lekara tako da se može primeniti pacijentu jednom ili u nizu davanja, a kako bi se postigao optimalni terapeutski efekat.

[0251] Tipična doza može da se kreće od oko 0,1 µg/kg do oko 30 mg/kg ili više, u zavisnosti od faktora navedenih iznad. U specifičnim otelotvorenjima, doza može da se kreće od 1,0 µg/kg do oko 20 mg/kg, opciono od 10 µg/kg do oko 10 mg/kg ili od 100 µg/kg do oko 5 mg/kg.

4

[0252] Terapeutski efikasna količina konstrukta antitela prema pronalasku poželjno rezultira smanjenjem ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanjem učestalosti ili trajanja perioda bez simptoma bolesti ili prevencijom oštećenja ili invaliditeta usled bolesti. Za lečenje bolesti koje su u korelaciji sa ekspresijom BCMA kao što je iznad opisano, terapeutski efikasna količina konstrukta antitela prema pronalasku, ovde: konstrukt anti-BCMA/anti-CD3 antitela, poželjno inhibira rast ćelija ili tumora za najmanje oko 20%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, na najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90% u odnosu na nelečene pacijente. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora može se proceniti na životinjskom modelu koji predviđa efikasnost

[0253] Farmaceutski sastavi se može primeniti kao jedini terapeutski lek ili u kombinaciji sa dodatnim terapijama kao što su terapije protiv raka po potrebi, npr. drugi proteinski i neproteinski lekovi. Ovi lekovi se mogu davati istovremeno sa kompozicijom koja sadrži konstrukt antitela prema pronalasku kako je ovde definisano ili odvojeno pre ili posle primene pomenutog konstrukta antitela u blagovremeno definisanim intervalima i dozama.

[0254] Termin "efikasna i netoksična doza" kako se ovde koristi odnosi se na podnošljivu dozu inventivnog konstrukta antitela koja je dovoljno visoka da izazove iscrpljivanje patoloških ćelija, eliminaciju tumora, smanjenje tumora ili stabilizaciju bolesti bez ili suštinski bez velikih toksičnih efekata. Takve efikasne i netoksične doze mogu se odrediti npr. ispitivanjima eskalacije doze opisanim u tehnici i treba da bude ispod doze koja izaziva ozbiljne neželjene efekte (toksičnost koja ograničava dozu, DLT).

[0255] Termin "toksičnost" kako se ovde koristi odnosi se na toksične efekte leka koji se manifestuju u neželjenim događajima ili teškim neželjenim događajima. Ovi neželjeni događaji mogu se odnositi na nedostatak podnošljivosti leka uopšte i/ili nedostatak lokalne tolerancije nakon primene. Toksičnost takođe može uključivati teratogene ili kancerogene efekte izazvane lekom.

[0256] Termin "bezbednost", "in vivo bezbednost" ili "podnošljivost" kako se ovde koristi definiše primenu leka bez izazivanja ozbiljnih neželjenih događaja neposredno nakon davanja (lokalna tolerancija) i tokom dužeg perioda davanja leka. „Bezbednost“, „bezbednost in vivo“ ili „podnošljivost“ mogu se proceniti npr. u redovnim intervalima tokom perioda lečenja i praćenja. Merenja uključuju kliničku evaluaciju, npr. manifestacije organa i skrining laboratorijskih abnormalnosti. Može se izvršiti klinička evaluacija i odstupanja od normalnih nalaza zabeležena/kodirana prema NCI-CTC i/ili MedDRA standardima. Manifestacije organa mogu uključiti kriterijume kao što su alergija/imunologija, krv/koštana srž, srčana aritmija, koagulacija i slično, kao što je navedeno npr. u Zajedničkim terminološkim kriterijumima za neželjene događaje v3.0 (CTCAE). Laboratorijski parametri koji se mogu testirati uključuju na primer hematologiju, kliničku hemiju, profil koagulacije i analizu urina i ispitivanje drugih telesnih tečnosti kao što su serum, plazma, limfoidna ili kičmena tečnost, tečnost i slično. Bezbednost se tako može proceniti npr. fizičkim pregledom, tehnikama snimanja (tj. ultrazvukom, rendgenom, CT skeniranjem, magnetnom rezonancom (MRI), drugim merama sa tehničkim uređajima (npr. elektrokardiogram), vitalnim znacima, merenjem laboratorijskih parametara i evidentiranjem neželjenih događaja. Na primer, neželjeni događaji kod primata koji nisu šimpanze u upotrebi i postupcima prema pronalasku mogu se ispitati histopatološkim i/ili histohemijskim postupcima.

[0257] Iznad navedeni pojmovi se takođe odnose na npr. u pretkliničkoj proceni bezbednosti farmaceutskih proizvoda dobijenih biotehnologijom S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997.

[0258] Konačno, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži konstrukt antitela prema pronalasku ili proizveden u skladu sa postupkom pronalaska, farmaceutski sastav pronalaska, polinukleotid pronalaska, vektor pronalaska i/ili ćeliju domaćina izum.

[0259] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin „komplet“ označava dve ili više komponenti – od kojih jedna odgovara konstruktu antitela, farmaceutskom sastavu, vektoru ili ćeliji domaćinu pronalaska – upakovane zajedno u kontejneru, primaocu ili inače. Komplet se stoga može opisati kao skup proizvoda i/ili pribora koji su dovoljni za postizanje određenog cilja, koji se može prodati kao jedna celina.

[0260] Komplet može da sadrži jednog ili više primalaca (kao što su bočice, ampule, kontejneri, špricevi, boce, kese) bilo kog odgovarajućeg oblika, veličine i materijala (poželjno vodootpornog, npr. plastike ili stakla) koji sadrže konstrukt antitela ili farmaceutski sastav leka predmetnog pronalaska u odgovarajućoj dozi za primenu (videti iznad). Komplet može dodatno da sadrži uputstva za upotrebu (npr. u obliku letaka ili uputstva za upotrebu), sredstva za davanje konstrukta antitela predmetnog pronalaska, kao što je špric, pumpa, infuzer ili slično, sredstva za rekonstituisanje konstrukta antitela prema pronalasku i/ili sredstva za razblaživanje konstrukta antitela prema pronalasku.

[0261] Pronalazak takođe obezbeđuje komplete za jedinicu za davanje jedne doze. Komplet pronalaska takođe može da sadrži prvog primaoca koji sadrži osušeni/liofilizovani konstrukt antitela i drugog primaoca koji sadrži vodenu formulaciju. U određenim otelotvorenjima predmetnog pronalaska, obezbeđeni su kompleti koji sadrže jednokomorne i višekomorne prethodno napunjene špriceve (npr., špriceve za tečnost i lio-špriceve).

[0262] Mora se napomenuti da, kako se ovde koriste, oblici jednine "a", "an" i "the" uključuju reference u množini, osim ako kontekst jasno ukazuje na drugačije. Tako, na primer, referenca na „reagens“ uključuje jedan ili više takvih različitih reagenasa, a referenca na „postupak“ uključuje referencu na ekvivalentne korake i postupke poznate onima koji su u proseku sposobni u tehnici i koji mogu da se modifikuju ili zamene ovde opisane postupke.

[0263] Ako nije drugačije naznačeno, pod pojmom "najmanje" koji prethodi nizu elemenata podrazumeva se svaki element u nizu. Stručnjaci u ovoj oblasti prepoznaće ili će moći da utvrde, koristeći samo rutinsko eksperimentisanje, mnoge ekvivalente ovde opisanih specifičnih primera pronalaska.

[0264] Termin "i/ili" gde god se koristi ovde uključuje značenje "i", "ili" i "svih ili bilo koje druge kombinacije elemenata povezanih ovim terminom".

[0265] Termin "oko" ili "približno" kako se ovde koristi znači unutar 20%, poželjno unutar 10%, a poželjnije unutar 5% date vrednosti ili opsega. Međutim, uključuje i konkretan broj, na primer, oko 20 uključuje 20.

[0266] Termin "manje od" ili "veće od" uključuje konkretan broj. Na primer, manje od 20 znači manje ili jednako. Slično, više od ili veće znači više od ili jednako, odnosno veće ili jednako.

[0267] Kroz ovu specifikaciju i zahteve koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „obuhvata“ i varijacije poput „uključuje“ i „sadrži“ podrazumevaće uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraci, ali ne i izuzeće bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Kada se ovde koristi termin "sadrži" može biti zamenjen terminom "sadrži" ili "uključuje" ili ponekad kada se ovde koristi terminom "imati".

[0268] Kada se ovde koristi, „sastoji se iz“ isključuje bilo koji element, korak ili sastojak koji nije naveden u elementu patentnog zahteva. Kada se ovde koristi, "sastoji se u suštini iz" ne isključuje materijale ili korake koji ne utiču materijalno na osnovne i nove karakteristike zahteva.

[0269] U svakom slučaju ovde bilo koji od termina „sastoji“, „koji se u suštini sastoji iz“ i „sastoji se iz“ može biti zamenjen sa bilo kojim od druga dva termina.

[0270] Trebalo bi razumeti da predmetni pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole, materijale, reagense i supstance, itd., koji su ovde opisani i kao takvi mogu da variraju. Terminologija koja se ovde koristi je samo u svrhu opisivanja određenih otelotvorenja i nije namenjena da ograniči obim predmetnog pronalaska, koji je definisan isključivo patentnim zahtevima.

[0271] Bolje razumevanje predmetnog pronalaska i njegovih prednosti biće dobijeno iz sledećih primera, koji su ponuđeni samo u ilustrativne svrhe. Primeri nemaju nameru da na bilo koji način ograniče obim predmetnog pronalaska. Primeri koji su opisani u nastavku mogu se izvesti na sličan način, tj. prateći iste protokole, sa drugim konstruktima bispecifičnih antitela prema pronalasku.

Primer 1: BiTE® indukovana ekspresija CD69 na T ćelijama u odsustvu ciljanih ćelija [0272] Izolovani PBMC od zdravih ljudskih donora su kultivisani sa povećanjem ciljnih B/CD3 ili Target A/CD3 HLE bispecifičnih konstrukta antitela tokom 48 h. Ekspresija aktivacionog markera CD69 na T ćelijama određena je imunološkim bojenjem i protočnom citometrijom i antigen specifičnim konjugatima mAb.

[0273] Aktivacija T ćelija nezavisna od cilja u smislu povećanja regulacije CD69 primećena je za sve anti-CDH 19 konstrukte, ali je bila najizraženija za heteroFc i molekule ukrštenog tela. Povećana regulacija CD69 anti-Target B-scFc desila se pri višim koncentracijama i amplituda je bila delimično niža u poređenju sa druga dva konstrukta zasnovana na Fc.

[0274] Za anti-Target A skoro nikakva ciljno nezavisna aktivacija T ćelija nije primećena za molekul koji sadrži scFc, dok je heteroFc konstrukcija indukovala snažnu regulaciju CD69 na T ćelijama površine ćelije u odsustvu ciljnih ćelija.

[0275] Ciljno nezavisna aktivacija T ćelija izazvana BiTE® konstruktima koji sadrže jedan lanac-Fc, ili hetero-Fc fuziju na C-terminusu procenjena je za sledeće konstrukte:

BiTE® konstrukcije (serijska razblaženja: 0,1 pM - 2 µM)

a. Cilj A-I2C scFc; 1,14 mg/mL;

b. Cilj A Hetero Fc; 1,02 mg/

Humane PBMC efektorske ćelije (3 donora; #065, #823, #836 (scFc) #401, #415, #433 (heteroFc); #590, #595, 598, #605 (X-body)).

[0276] Vreme inkubacije 48 h.

[0277] Određivanje ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama pomoću protočnog citometra i antigen-specifičnih konjugata mAb. Rezultate pogledajte na Slici 2.

[0278] Ciljno nezavisna aktivacija T ćelija izazvana konstruktima BiTE® antitela koji sadrže jednolančani-Fc, hetero-Fc ili unakrsnu fuziju na C-terminusu procenjena je za sledeće konstrukte:

BiTE® konstrukcije (serijska razblaženja: 0,1 pM - 2 µM)

c. Cilj B × I2C-scFc; 245,3 µg/mL (

d. Cilj B Hetero FC; 1 mg/mL

e. Cilj B poprečno-telo; 6,3 mg/mL

[0279] Humane PBMC efektorske ćelije (3 do 4 donora; #386, #392, #401 (scFc) #282, #284, #287 (heteroFc)).

[0280] Vreme inkubacije 48 h.

[0281] Određivanje ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama pomoću protočnog citometra i antigen-specifičnih konjugata mAb. Rezultate pogledajte na Slici 3.

[0282] Uočena je aktivacija T ćelija nezavisna od cilja u smislu regulacije CD69 za nekoliko bispecifičnih konstrukata testiranih u ovim testovima. Povećana regulacija CD69 je generalno bila izraženija za kanonske konstrukte BiTE® antitela, heteroFc i molekule unakrsnog tela u poređenju sa odgovarajućim scFc konstruktima. Povećana regulacija CD69 pomoću scFc konstrukata se generalno dešavala pri nešto višim koncentracijama, a amplituda je bila delimično niža u poređenju sa druga dva konstrukta zasnovana na Fc.

[0283] Za anti-Target B scFc konstrukt, nije primećena aktivacija T ćelija nezavisna od cilja, dok su heteroFc i X-body konstrukti indukovali snažnu regulaciju CD69 na površini ćelije T ćelija u odsustvu ciljnih ćelija.

[0284] Pored toga, nije primećena regulacija CD69 nezavisna od ciljne ćelije u testovima koji koriste anti-Target C i anti-Target G konstrukte. Zbog ekspresije mete na ćelijama mijeloidne loze, ove ćelije su uklonjene pre postavljanja testa. Ovi podaci ukazuju da bi interakcija Fc regiona bispecifičnih konstrukata sa ćelijama koje eksprimiraju FcγR mogla biti odgovorna za indukciju CD69 na T ćelijama nezavisnu od cilja.

[0285] Snažna regulacija CD69 na T ćelijama anti-Target H-scFc konstruktom u odsustvu tumorskih ćelija je posledica ekspresije Target H na T ćelijama.

Materijali i postupci

1. Cilj I

[0286] Ciljno nezavisna aktivacija T ćelija izazvana BiTE® molekulom koji sadrži jedan lanac-Fc za sledeći konstrukt:

1. BiTE<®>konstrukt antitela (serijska razblaženja: 1,3 pM ― 20 nM)

1. Cilj I-scFc

2. Humane PBMC efektorske ćelije (3 donora)

3. Vreme inkubacije 48 h

4. Protočna citometrijska analiza ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama korišćenjem PE-Cy7 konjugovanog mAb specifičnog za CD69.

2. Cilj D

[0287] Ciljno nezavisna aktivacija T ćelija izazvana BiTE® molekulima koji sadrže jednolančani-Fc, hetero-Fc ili unakrsnu fuziju na C-terminusu procenjena je za sledeće konstrukte:

1. BiTE<®>konstrukti antitela (serijska razblaženja: 1,3 pM ― 20 nM)

1. Cilj D-hetFc (hetero-Fc)

2. Cilj D-scFc

3. Cilj D-X-body (Cilj D poprečno-telo)

2. Humane PBMC efektorske ćelije (3 donora)

3. Vreme inkubacije 48 h

4. Protočna citometrijska analiza ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama korišćenjem PE-Cy7 konjugovanog mAb specifičnog za CD69.

3. Cilj C

[0288] Ciljno nezavisna aktivacija T ćelija izazvana BiTE® molekulima koji sadrže jednolančani-Fc, hetero-Fc ili unakrsnu fuziju na C-terminusu procenjena je za sledeće konstrukte:

1. BiTE<®>konstrukti antitela (serijska razblaženja: 1,3 pM ― 20 nM)

1. Cilj C-kanonski

2. Cilj C-scFc

3. Cilj C-hetFc

4. Cilj C-X-body

2. Humane PBMC efektorske ćelije (3 donora)

3. Vreme inkubacije 48 h

4. Protočna citometrijska analiza ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama korišćenjem PE-Cy7 konjugovanog mAb specifičnog za CD69.

4. Cilj B

[0289] Ciljno nezavisna aktivacija T ćelija izazvana BiTE® molekulima koji sadrže jednolančani-Fc, hetero-Fc ili unakrsnu fuziju na C-terminusu procenjena je za sledeće konstrukte:

1. BiTE<®>konstrukti antitela (serijska razblaženja: 1,3 pM ― 20 nM)

1. Cilj B-scFc

2. Cilj B-hetFc

3. Cilj B-X-body

2. Humane PBMC efektorske ćelije (3 donora)

1

3. Vreme inkubacije 48 h

4. Protočna citometrijska analiza ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama korišćenjem PE-Cy7 konjugovanog mAb specifičnog za CD69.

5. Cilj A

[0290] Ciljno nezavisna aktivacija T ćelija izazvana BiTE® molekulima koji sadrže jednolančani-Fc, hetero-Fc ili unakrsnu fuziju na C-terminusu procenjena je za sledeće konstrukte:

1. BiTE<®>konstrukti antitela (serijska razblaženja: 1,3 pM ― 20 nM)

1. Cilj A-scFc

2. Cilj A-hetFc

3. Cilj A-X-body

2. Humane PBMC efektorske ćelije (3 donora)

3. Vreme inkubacije 48 h

4. Protočna citometrijska analiza ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama korišćenjem PE-Cy7 konjugovanog mAb specifičnog za CD69.

6. Cilj F

[0291] Ciljno nezavisna aktivacija T ćelija izazvana BiTE® molekulima koji sadrže jednolančani-Fc ili hetero-Fc procenjena je za sledeće konstrukte:

1. BiTE<®>konstrukti antitela (serijska razblaženja: 1,3 pM ― 20 nM)

1. Cilj F-kanonski

2. Cilj F-scFc

3. Cilj F-hetFc

2. Humane PBMC efektorske ćelije (3 donora)

3. Vreme inkubacije 48 h

4. Protočna citometrijska analiza ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama korišćenjem PE-Cy7 konjugovanog mAb specifičnog za CD69.

7. Cilj E

[0292] Ciljno nezavisna aktivacija T ćelija izazvana BiTE® molekulima koji sadrže jednolančani-Fc ili hetero-Fc procenjena je za sledeće konstrukte:

1. BiTE<®>konstrukti antitela (serijska razblaženja: 1,3 pM ― 20 nM)

1. Cilj E-kanonski

2

2. Cilj E-scFc

3. Cilj E-hetFc

2. Humane PBMC efektorske ćelije (3 donora)

3. Vreme inkubacije 48 h

4. Protočna citometrijska analiza ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama korišćenjem PE-Cy7 konjugovanog mAb specifičnog za CD69.

8. Cilj H

[0293] Aktivacija T ćelija bez mete izazvana BiTE® molekulom koji sadrži jednolančani-Fc je procenjena za sledeći konstrukt:

1. BiTE<®>konstrukt antitela (serijska razblaženja: 1,3 pM ― 20 nM)

1. Cilj H-scFc

2. Humane PBMC efektorske ćelije (3 donora)

3. Vreme inkubacije 48 h

4. Protočna citometrijska analiza ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama korišćenjem PE-Cy7 konjugovanog mAb specifičnog za CD69.

9. Cilj G

[0294] Aktivacija T ćelija bez mete izazvana BiTE® molekulom koji sadrži jedan lanac-Fc je procenjena za sledeći konstrukt:

1. BiTE<®>konstrukt antitela (serijska razblaženja: 1,3 pM ― 20 nM)

1. Cilj G-scFc

2. Humane PBMC efektorske ćelije (3 donora; CD14<+>/CD33<+>ćelija iscrpljena)

3. Vreme inkubacije 48 h

4. Protočna citometrijska analiza ekspresije CD69 na CD4+ i CD8+ T ćelijama korišćenjem PE-Cy7 konjugovanog mAb specifičnog za CD69.

Primer 2:

[0295] Prečišćeni konstrukti BiTE® antitela su obloženi na Maxisorb ploči u opadajućoj koncentraciji (100 nM, 1:4 razblaženja). Posle 3x ispiranja sa PBS-T i blokiranja sa PBS/3% (e/v) BSA (60 min, 37°C), prikupljena ljudska plazma je inkubirana 60 min, 80 rpm na sobnoj temperaturi. Nakon 3x pranja, dodato je mišje monoklonsko antitelo specifično za humanu C1q podjedinicu A (CC1q) (Thermo MA1-83963, 1:500) tokom 60 min, 80 rpm, sobna temperatura, nakon opisanih koraka ispiranja, kozje anti-mišje Fc-POX mAb (1:5,000) je inkubirano 60 min, 80 rpm, sobna temperatura. Nakon dodatnog ispiranja, TMB supstrat je inkubiran i zaustavljen nakon kolorimetrijske reakcije dodavanjem H2SO4. Apsorpcija je određena na 450 nm.

[0296] Rezultat: Kao što je prikazano na Slici 4 pri visokim koncentracijama, BiTE® hetero Fc konstrukt (kvadrati) je pokazao veće signale vezivanja za humani CC1q u poređenju sa BiTE® jednolančanim Fc konstruktom (trougao). Kao negativna kontrola korišćen je kanonski BiTE® (krug), koji nije pokazao značajno vezivanje CC1q.

Primer 3: Farmakokinetika konstrukata BiTE® antitela spojenih sa modalitetima produženja polu-raspada

[0297] Različiti konstrukti BiTE® antitela koji se vezuju za cilj su fuzionisani sa četiri različita dela koji produžavaju polu-raspad. Sve različite HLE-varijante dostupne po BiTE® antitelu su testirane na cinomolgus majmunu u kontekstu farmakokinetičkih (PK) ispitivanja. Oni se kasnije nazivaju BiTE®-scFc, BiTE®-hetFc, BiTE®-HALB, BiTE®-Xbody, u skladu sa modalitetom produženja polu-raspada koji je vezan za ciljno vezivo. Ne-HLE BiTE® molekul je označen kao "kanonski" BiTE®. Odgovarajuća nomenklatura ovih molekula je ukratko sažeta u Tabeli 4 ispod.

Tabela 4 Nomenklatura jedinjenja jednokratnih doziranih BiTE® molekula

4

[0298] Molekuli BiTE® su davani kao intravenski bolus (jedinjenja 1b, 2a-d, 3a/b, 4a/b, 5a-5c, 7-9) i intravenska infuzija (jedinjenja 1a, 1c, 3c/d, 6a/b, svaki kao infuzija od 30 minuta). Molekuli BiTE® su davani u dozno linearnom, farmakokinetički relevantnom opsegu od 3 µg/kg do 6 µg/kg, 12 µg/kg i 15 µg/kg, respektivno. Jedinjenje 10a je primenjeno kao kratka intravenska bolus injekcija, kanonski konstrukt (jedinjenje 10b) kao kontinuirana intravenska infuzija. Da bi se uporedili farmakokinetički parametri za oba jedinjenja 10a i 10b, na Slici 5 za kanonski BCMA-BiTE® prikazana je samo terminalna faza koja počinje neposredno nakon završetka infuzije. Molekuli BCMA BiTE® su davani u dozi linearnom, farmakokinetički relevantnom opsegu od 15 µg/kg. Iz razloga uporedivosti, koncentracije u serumu prikazane na Slici 5 su normalizovane dozom i normalizovane molekulske mase (opisane u nmol). Za svako od iznad navedenih jedinjenja korišćena je grupa od najmanje dve do tri životinje. Uzeti su uzorci krvi i pripremljen serum za određivanje serumskih koncentracija. Nivoi antitela BiTE® u serumu mereni su imunotestom. Nivoi BCMA BiTE® u serumu su mereni korišćenjem imunoeseja koji koristi par anti-CD3 idiotipskih antitela za oblaganje i detekciju BiTE® molekula. Za određivanje PK parametara korišćeni su profili koncentracija-vreme u serumu. Odgovarajuća postavka ispitivanja je prilagođena karakteristikama BiTE® molekula: ili u trajanju od 1 ili 2 nedelje. Vremenske tačke za uzorkovanje krvi mogu malo da variraju i navedene su za obe postavke u Tabeli 5 u nastavku.

Tabela 5 Vremenske tačke uzimanja uzoraka krvi tokom PK ispitivanja. Vremenske tačke mogu varirati između pojedinačnih ispitivanja. Vremenske tačke označene zvezdicom bile su obavezne i zajedničke za sva ispitivanja

[0299] Farmakokinetika BiTE®-HLE molekula je prikazana kao primer u Tabeli 6. Svaka grupa jedinjenja označava isti BiTE® protein spojen sa scFc-, hetFc-, , HSA-(humani serum albumin, HALB) ili Poprečno-telo-Fc-format, ili ostavljen kao kanonski BiTE® molekul. Za sve proteine, nivoi u serumu su se kvantifikovali za sve vremenske tačke kod svih životinja nakon primene BiTE®-molekula. PK profili opisuju dvofazni, eksponencijalni pad nakon svake primene pojedinačnih test jedinica.

[0300] Farmakokinetički parametri su određeni korišćenjem standardnih postupaka nekompartmentalne analize (NCA). Koristeći ne-kompartmentalnu analizu, procenjeni su sledeći PK parametri: AUCinf(površina ispod krive koncentracije u serumu-vreme), Vss (volumen distribucije u stabilnom stanju), CL (sistemski klirens) i terminalni t1/2 (terminalno poluvreme). PK parametri za svako testirano jedinjenje su sumirani kao srednja vrednost od n=2 i n=3, respektivno, u Tabeli 6 ispod.

Tabela 6 Farmakokinetički parametri različitih HLE varijanti iz različitih BiTE®-ciljnih veziva kod majmuna cinomolgus.

[0301] Tipično, PK profil za kanonske BCMA-BiTE® molekule opisuje veoma strmo opadajući profil koncentracije u serumu povezan sa mehanizmom klirensa ovih kanonskih proteina. BiTE®-scFc sa produženim polu-životom koji cilja na BCMA pokazuje dvofazni, eksponencijalni pad nakon davanja pojedinačnih test jedinica kod cinomolgus majmuna.

[0302] Sve u svemu, BCMA-BiTE® molekul fuzionisan sa scFc HLE-modalitetom (Jedinjenje 10a) pokazuje srednju vrednost AUCinf od 18772 h*ng/mL, sistemsku vrednost klirensa od 0,8 mL/h/kg, kao i odgovarajuću zapreminu raspodela od 110 mL/kg. Jedinjenje 10b, kanonski BCMA sa produženim polu-životom koji cilja BiTE® pokazuje visok klirens od 62,6 mL/h/kg što dovodi do niske izloženosti serumu od 1677 h*ng/mL.

[0303] Razlike u farmakokinetičkom ponašanju dva različita testirana BCMA BiTE® modaliteta na sveobuhvatan način opisuju prednost produženog polu-raspada BCMA koji cilja na BiTE®-scFc u odnosu na odgovarajuću kanonsku verziju, posebno u pogledu vremena zadržavanja supstance u telu.

[0304] Sve u svemu, AUCinfza različita BiTE® ciljna veziva spojena sa ―scFc, ―hetFc, HAS ili Crossbody HLE modalitetom, respektivno, kretao se između 1971 h*ng/mL i 77271 h*ng/mL, u zavisnosti od BiTE® ciljni kontekst. Sve analizirane HLE fuzije su postigle sistemske vrednosti klirensa od 0,4 do 7,6 mL/h/kg. Odgovarajuće zapremine distribucije kretale su se između 68 i 540 mL/kg. Jedinjenje 3d, kanonsko jedinjenje 3 BiTE® ciljno vezivo sa produženim polu-raspadom, uključeno je kao referenca. BiTE® molekuli bez produženog polu-raspada pokazuju visoke klirense, nisku izloženost serumu i kao posledicu kratak terminalni polu-raspad. Poređenje terminalnog polu-raspada prema modalitetu je sažeto u Tabeli 7.

Tabela 7 Poređenje terminalnih polu-raspada prema modalitetima ispitanih kod majmuna cinomolgus.

[0305] Istražujući do četiri različita sastava koji produžavaju polu-raspad (HLE) po ciljanom BiTE®-u, postaje jasno da -scFc grupa pokazuje povećanje od t1/2u poređenju sa odgovarajućim drugim produžecima polu-raspada nakon davanja jedne male doze na 6, 10, 12 i 15 µg/kg (vidite Sliku 6).

Primer 4:

[0306] Preformulisane lekovite supstance koje sadrže prečišćeni Target A-hALB, Target A-hFc i Target A-scFc respektivno su zamenjeni puferom ultrafiltracijom/dijafiltracijom korišćenjem membrana sa graničnom molekulskom težinom (MWCO) od 10 kDa. Konačna formulacija je postignuta dodavanjem koncentrovanih osnovnih rastvora. Dobijene formulacije za svaki konstrukt su navedene u Tabeli 8. Ciljna koncentracija proteina bila je 1,0 mg/mL. Formulisani ciljni A konstrukti su napunjeni do 1 mL u staklene bočice tipa I koje su zapušene čepovima od butil gume i presvučene aluminijumskim zaptivkama.

Napunjene bočice su inkubirane na -20, 5, 25 i 37°C. Jedna bočica svake verzije je podvrgnuta pet ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja (F/T). Ciljana temperatura smrzavanja bila je -29°C. Ciljana temperatura odmrzavanja bila je 2°C. Brzina rampe bila je približno 0,3 K/min.

[0307] Vizuelne čestice su procenjene u skladu sa postupkom opisanim u Ph Eur 2.9.20 od strane obučenih operatera. Vizuelni broj čestica po bočici je prikazan u Tabeli 8. Broj vizuelnih (većih od 125 µm) proteinskih čestica bio je veći za Target A-hFc u poređenju sa Target A-hALB i Target A-scFc.

Tabela 8: Broj vizuelnih proteinskih čestica po bočici za uzorke pod stresom i bez stresa (T0) koji sadrže različite anti-Target A BiTE® konstrukcije sa produženim poluraspadom.

[0308] Iznad opisani uzorci su takođe analizirani hromatografijom ultra-visokih performansi (SE-UPLC) za isključivanje veličine da bi se kvantifikovao procentualni sadržaj vrsta visoke molekularne mase (HMWS). SE-UPLC je izveden na AcquityH-Class UPLC sistemu (Waters) korišćenjem Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mm kolone (Waters). Temperatura kolone je podešena na 25°C. Razdvajanje varijanti veličine je postignuto primenom izokratskog postupka sa brzinom protoka od 0,4 mL/min. Mobilna faza je sastavljena od 100 mM natrijum fosfata, 250 mM NaCl na pH 6,8. Ukupno vreme trajanja je 6,0 minuta. Uzorci su držani na 8°C u auto-sampleru do analize. Ubrizgana je ukupna količina od 3 µg proteina. Da bi se izbegao prenos, posle svakog uzorka je izvršena međuinjekcija sa 40% acetonitrila. Detekcija je zasnovana na emisiji fluorescencije (ekscitacija na 280 nm, emisija na 325 nm). Maksimalna integracija je izvedena korišćenjem Empower® softvera. Prijavljena je relativna površina ispod krive HMWS (Tabela 9).

[0309] Konstrukti zasnovani na Fc pokazali su niže sadržaje HMWS u varijanti formulacije G40MSuT nego u K60RTrT nezavisno od stanja stresa. Postalo je očigledno da Cilj A-scFc sadrži manje HMWS od Target A-hFc u G40MSuT i K60RTrT preparatima. Cilj A-scFc u svojoj preferiranoj formulaciji (G40MSuT) je bio manje sklon formiranju HMWS nego Cilj A-hALB formulisana u K60RTrT. U prethodnim eksperimentima ovaj pufer je pokazao poboljšani stabilizacijski potencijal za konstrukte zasnovane na hALB.

1

Tabela 9: Pregled sadržaja HMWS u preparatima pod stresom i bez stresa (T0) ciljnih A-hALB, -hFc i -scFc preparata utvrđenih preko SE-UPLC

[0310] Obilje hemijskih modifikacija nakon toplotnog stresa (inkubacija na 37°C) praćeno je mapiranjem peptida. Uzorci proteina su enzimski digestirani i rezultujući peptidi su razdvojeni hromatografijom reverzne faze. Eluat kolone je direktno ubrizgan u izvor jona masenog spektrometra za identifikaciju i kvantifikaciju peptida.

[0311] Da bi se postigla maksimalna pokrivenost, obavljena su dva odvojena enzimska digestija: jednom sa tripsinom i jednom sa himotripsinom. U svakom slučaju, proteini su denaturisani gvanidin hloridom, a zatim redukovani ditiotreitolom (DTT). Posle inkubacije u DTT, slobodni cisteinski ostaci su alkilovani dodatkom jodosirćetne kiseline. Uzorci su zatim zamenjeni puferom u 50 mM Tris pH 7,8 za varenje. Tripsin i himotripsin su dodati u odvojene reakcione epruvete u odnosu 1:10 (uzorak:enzim) svaka. Uzorci su digestirani 30 min na 37°C i reakcija je ugašena dodavanjem trifluorosirćetne kiseline.

[0312] Opterećenje od 5 µg svakog digestora je odvojeno ubrizgano u kolonu obrnute faze Zorbax SB-C18 (Agilent #859700-902) uravnoteženu u 0,1% (V/V) mravlje kiseline (FA).

156-minutni gradijent do 90% acetonitrila koji sadrži 0,1% FA je korišćen za eluiranje peptida direktno u izvor jona za elektrosprej Q-Exactive Plus masenog spektrometra (Thermo

1 1

Scientific). Podaci su prikupljeni u režimu zavisnom od podataka korišćenjem postupka od 12 najboljih u kojoj je kompletno skeniranje (rezolucija 70000; opseg skeniranja 200-2000 m/z) praćen je visokoenergetskom kolizionom disocijacijom (HCD) 12 najzastupljenijih jona (rezolucija 17500).

[0313] Peptidi su identifikovani na osnovu tačnog masenog i tandem masenog spektra korišćenjem internog softvera. Identifikacije su ručno verifikovane. Relativne količine modifikovanih i nemodifikovanih peptida su izračunate na osnovu količine jona korišćenjem Pinpoint softvera (Thermo Scientific).

[0314] Procenti hemijskih modifikacija regiona koji određuju komplement (CDRs) i dela produžetka poluživota (bilo hALB ili Fc) otkrivenih u ciljnim A-hALB, -hFc i - scFc preparatima dati su u Tabeli 10. Kada se uporede slični uslovi formulacije, postalo je očigledno da su u celini hemijske modifikacije najmanje zastupljene u scFc konstruktima.

Tabela 10: Pregled hemijskih modifikacija u preparatima pod stresom i bez stresa (T0) ciljanih A-hALB, -hFc i -scFc preparata utvrđenih mapiranjem peptida

1 2

1

Primer 5:

[0315] Ciljani A-hALB, -hFc, -scFc formulisani kao što je opisano u Primeru 4 su podvrgnuti eksperimentu sa skokom pH vrednosti. Koncentracija polaznih materijala bila je 1,0 mg/mL. Zapremina od 0,38 mL svakog početnog materijala je napunjena u staklenu bočicu. Posle predkondicioniranja na 37°C, rastvori su dodani 20-strukim fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) koji se sastojao od 0,090 M kalijum fosfata, 0,480 M natrijum fosfata (oba dvobazni), 0,052 M kalijum hlorida i NaCl 2,76 M. Spajk uzorci su inkubirani na 37°C dve nedelje. Nakon inkubacije, analizirani su pomoću SE-UPLC koristeći metodu opisanu u Primeru 4 i prijavljen je procentualni sadržaj HMWS (Tabela 11). Kada se uporede svi konstrukti formulisani u K60RTrT, sadržaj HMWS se povećao sledećim redosledom: hALB < scFc < hFc. Ciljani A-scFc je takođe pokazao niži sadržaj HMWS od ciljanog A-hFc kada je formulisan u G40MSuT.

Tabela 11: Pregled sadržaja HMWS u naglašenim (pH skok 2w 37°C) ciljanim preparatima A-hALB, -hFc i -scFc određenim putem SE-UPLC

Primer 6:

[0316] Ciljani A-hALB, -hFc i -scFc formulisani kao što je opisano u Primeru 4 su podvrgnuti stresu uz mešanje. Koncentracija polaznih materijala bila je 1,0 mg/mL.

Zapremina od 0,5 mL svakog rastvora je filtrirana kroz odgovarajući filter od 0,22 µm i napunjena u staklene bočice od 3cc. Bočice su stavljene u plastičnu kutiju kako bi se osiguralo da se bočice ne pomeraju unutar kutije tokom mešanja. Kutija je postavljena na orbitalni šejker. Uzorci su mešani na 500 rpm tokom 65 sati. Vizuelne čestice su procenjene u

1 4

skladu sa postupkom opisanom u Ph Eur 2.9.20. Postupci su sproveli obučeni operateri. Vizuelni broj čestica po bočici je prikazan u Tabeli 12. Vidljive proteinske čestice primećene su samo u ciljanim A-hFc preparatima.

Tabela 12: Broj vizuelnih proteinskih čestica po bočici u agitiranim uzorcima

[0317] Iznad navedeni uzorci su takođe analizirani hromatografijom ultra-visokih performansi isključenja veličine (SE-UPLC) da bi se kvantifikovao procentualni sadržaj vrsta visoke molekularne mase (HMWS). Primenjen je isti postupak kao što je opisano u Primeru 4. Sadržaj HMWS u protresanim uzorcima prikazan je u Tabeli 13. Formiranje HMWS bilo je najizraženije u ciljanom A-hFc kada se uporede preparati K60RTrT. HMWS su bili zastupljeniji u ciljani A-hFc nego u ciljani A-scFc.

Tabela 13: Pregled sadržaja HMWS u naglašenim (pH skok 2w 37°C) ciljanim preparatima A-hALB, -hFc i -scFc određenim putem SE-UPLC

Primer 7:

[0318] Ciljni A-hALB, -hFc i -scFc formulisani kao što je opisano u Primeru 4 bili su izloženi vidljivoj i UVA svetlosti (foto stres). Koncentracija proteina iznosila je 1 mg/mL u svim preparatima. Proteinski rastvori su filtrirani kroz filter sa veličinom pora 0,22 µm i napunjeni do 0,5 mL u staklenim bočicama tipa I. Ciljani A-hALB i -scFc su podvrgnuti dva različita testa uključujući 0,2 MLux vidljivo svetlo/25 W*h/m2 UVA svetlost i 1,2MLuk vidljivo svetlo/173 W*h/m2 respektivno. Ciljani A-hFc je podvrgnut dvama različitim

1

testovima uključujući 0,2 MLux vidljivo svetlo bez UVA svetlosti i 1,2 MLux vidljivo svetlo/30 W*h/m2 UVA svetlo. Temperatura u komori je podešena na 25°C. Nakon izlaganja svetlosti uzorci su analizirani vidljivom inspekcijom (Tabela 14), SE-UPLC (Tabela 15) i peptidnom mapom (Tabela 16). Iznad pomenuti postupci su izvedeni prema procedurama opisanim u Primeru 4. Iako su ciljani A-hALB i -scFc bili izloženi većim dozama UVA svetlosti, nisu primećene nikakve vidljive proteinske čestice, dok su uzorci ciljanih A-hFc pokazali jednu vidljivu proteinsku česticu po bočici za oba testa, bez obzira na formulaciju.

Tabela 14: Pregled broja vidljivih proteinskih čestica po bočici u ciljanim A-hALB, -hFc i -scFc preparatima utvrđenim nakon izlaganja svetlosti

[0319] HMWS se povećao sledećim redosledom ciljni A-hALB < -scFc < -hFc kada je protein formulisan u K60RTrT. HMWS se može smanjiti za konstrukte zasnovane na Fc kada se formuliše u G40MSuT. Međutim, HMWS su ponovo bili manje izraženi za ciljani A-scFc. Pokazalo se da je ciljni A-hFc posebno osetljiv na izlaganje UVA svetlosti.

Tabela 15: Pregled sadržaja HMWS u ciljanim A-hALB, -hFc i -scFc preparatima utvrđenim nakon izlaganja svetlosti preko SE-UPLC

1

[0320] Procenti hemijskih modifikacija regiona koji određuju komplement (CDRs) i dela produžetka poluživota (bilo hALB ili Fc) otkrivenih u ciljnim A-hALB, -hFc i - scFc preparatima dati su u Tabeli 16. Kada se uporede slični uslovi formulacije, postalo je očigledno da su u celini hemijske modifikacije najmanje zastupljene u scFc konstruktima.

Tabela 16: Pregled hemijskih modifikacija u ciljanim A-hALB, -hFc i -scFc preparatima utvrđenim nakon izlaganja svetlosti putem peptidnog mapiranja

1

Primer 8:

[0321] Ciljni A-hALB je formulisan u K60RTrT, a ciljni A-scFc je formulisan u G40MSuT prema proceduri opisanoj u Primeru 4. Koncentracije proteina su iznosile 0,05 mg/mL. Staklene (borosilikatne, tip I, 13 mm 3cc bočice iz Westa, br. art.68000375) i polipropilenske posude za testiranje (2 mL sa O-prstenom, npr. Sarstedt, art. br.72.694.005) su napunjene sa 500 µL testiranog rastvora. Testirani rastvor je ostavljen pet minuta u prvoj posudi za ispitivanje. Zatim je uzet alikvot od 150 µL za analizu. Preostali testni rastvor (350

1

µL) prenošen je uzastopno iz jedne test ambalaže u sledeću (ukupno pet ambalaža). U svakoj bočici rastvor je ostavljen pet minuta pre sledećeg prenosa. Isti vrh pipete je korišćen za svaki korak prenosa. Isti test je izveden korišćenjem polikarbonatnih boca od 30 mL (Nalgene, PCS-000295 sa zatvaračem, PP/20-415/ZTPE). Za ovaj tip ambalaže prva ambalaža je napunjena sa 5 mL. Nakon što je uzet alikvot od 150 µL, preostala zapremina je prebačena iz jedne test ambalaže u drugu (prema iznad opisanoj proceduri). Uzorci izvučeni iz ambalaže i #1 i #5 su analizirani pomoću SE-UPLC (postupak kao što je opisano u Primeru 4). Pored toga, detekcija proteina je sprovedena pomoću PDA detektora (280 nm) da bi se odredile koncentracije proteina. Procentualni oporavak proteina iz svakog test kontejnera je dat u Tabeli 17. Pokazalo se da je oporavak proteina bio izraženiji za ciljani A-scFc nego za ciljani A-hALB, bez obzira na tip ambalaže.

Tabela 17: Oporavak proteina iz različitih tipova ambalaža za ciljani A-hALB i -scFc određen od strane SE-UPLC

Primer 9:

[0322] Ciljni A-hALB je formulisan u K60RTrT, a ciljni A-scFc je formulisan u K60RTrT i G40MSuT prema proceduri opisanoj u Primeru 4. Koncentracija proteina iznosila je 1,0 mg/mL. 1950 µL svakog test rastvora je dodato sa 50 µL standardnog rastvora silicijuma od 1000 ppm (Specpure od AlfaAesar, Art. br.38717) što je rezultiralo povećanjem od 25 ppm. Kao kontrolni uzorak poslužio je test rastvor bez dodatka. Rastvor za testiranje kao i kontrolni uzorak punjeni su u staklene bočice od 3cc tipa I i inkubirani na 37°C tokom 24 sata. Svi uzorci su analizirani pomoću SE-UPLC prema postupku opisanoj u Primeru 4 da bi se kvantifikovala količina HMWS (Tabela 18). Kada su formulisani u K60RTrT, ciljani A-hALB i -scFc su pokazali slična povećanja HMWS-a nakon povećanja količine silicijuma.

1

Tabela 18: Pregled sadržaja HMWS u ciljanim A-hALB i -scFc preparatima utvrđenim putem SE-UPLC nakon dodavanja silicijuma od 25 ppm

Primer 10:

[0323] Prethodno formulisane lekovite supstance koje sadrže prečišćeni cilj C (cc)-hALB, cilj C (cc)-hFc i cilj C (cc)-scFc respektivno su zamenjeni puferom ultrafiltracijom/dijafiltracijom korišćenjem membrana sa graničnom molekulskom masom (MWCO) od 10 kDa. Konačna formulacija je postignuta dodavanjem koncentrovanih osnovnih rastvora. Dobijene formulacije za svaki konstrukt su navedene u Tabeli 19. Ciljna koncentracija proteina bila je 1,0 mg/mL. Formulisani ciljni (cc) konstrukti su napunjeni do 1 mL u staklene bočice tipa I koje su zapušene čepovima od butil gume i presvučene aluminijumskim zaptivkama.

Napunjene bočice su inkubirane na -20, 5, 25 i 37°C. Jedna bočica svake verzije je podvrgnuta pet ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja (F/T). Ciljana temperatura smrzavanja bila je -29°C. Ciljana temperatura odmrzavanja bila je 2°C. Brzina rampe bila je približno 0,3 K/min. Iznad opisani uzorci su takođe analizirani hromatografijom ultra-visokih performansi (SE-UPLC) za isključivanje veličine da bi se kvantifikovao procentualni sadržaj vrsta visoke molekularne mase (HMWS). SE-UPLC je izveden prema postupku opisanom u Primeru 4. Kada je formulisan u K60RTrT, HMWS se povećao sledećim redosledom u uzorcima bez stresa: scFc < hALB < hFc. Najmanje izraženo povećanje HMWS nakon stresa odmrzavanja uočeno je za scFc-konstrukt. Pokazalo se da je hFc-konstrukt najskloniji formiranju HMWS na -20°C. Sadržaj HMWS se povećao nakon četiri nedelje skladištenja na 5°C. Formiranje HMWS pod ovim uslovima bilo je izraženije za konstrukte zasnovane na Fc nego za konstrukte zasnovane na albuminu. U K60RTrT nije primećeno značajno povećanje HMWS na povišenim temperaturama skladištenja (25 i 37°C). Kada su formulisani u G40MSuT, svi konstrukti su otkrili sličan sadržaj HMWS u uzorcima bez stresa. Povećanje tokom odmrzavanja bilo je izraženije za konstrukte zasnovane na Fc u poređenju sa konstruktom na bazi albumina. U G40MSuT, hFc-konstrukcija je bila najmanje stabilna tokom skladištenja na -20°C. Značajna povećanja HMWS tokom skladištenja tečnosti primećena su samo za hALB-konstrukt.

11

Tabela 19: Pregled sadržaja HMWS u preparatima pod stresom i bez stresa (T0) ciljnih C (cc)-hALB, -hFc i -scFc preparata utvrđenih preko SE-UPLC

[0324] Obilje hemijskih modifikacija nakon toplotnog stresa (inkubacija na 37°C) je praćeno mapiranjem peptida prema postupku opisanoj u Primeru 4. Procenti hemijskih modifikacija regiona koji određuju komplement (CDR) otkrivenih u preparatima ciljanih C (cc)-hALB, -hFc i -scFc dati su u Tabeli 20. Sve u svemu, cilj C (cc)-scFc je pokazao najmanju količinu hemijskih modifikacija u CDR-ovima. Postalo je očigledno da su posebno deamidacije CDR najmanje izražene za scFc konstrukt.

Tabela 20: Pregled hemijskih modifikacija u preparatima pod stresom i bez stresa (T0) ciljanih C (cc)-hALB, -hFc i -scFc preparata utvrđenih mapiranjem peptida

Primer 11:

[0325] Ciljani C (cc)-hALB, -hFc i -scFC formulisani kao što je opisano u Primeru 4 su podvrgnuti eksperimentu sa skokom pH vrednosti. Koncentracija polaznih materijala bila je 1,0 mg/mL. Zapremina od 0,38 mL svakog početnog materijala je napunjena u staklenu bočicu. Posle predkondicioniranja na 37°C, rastvori su dodani 20-strukim fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) koji se sastojao od 0,090 M kalijum fosfata, 0,480 M natrijum fosfata (oba dvobazni), 0,052 M kalijum hlorida i NaCl 2,76 M. Spajk uzorci su inkubirani na 37°C dve nedelje. Nakon inkubacije, analizirani su pomoću SE-UPLC koristeći metodu opisanu u Primeru 4 i prijavljen je procentualni sadržaj HMWS (Tabela 21). Ciljani C (cc)-scFc konstrukti su pokazali najniži sadržaj HMWS nakon skoka pH u poređenju sa Ciljani C (cc)-hALB i -hFc, bez obzira na formulaciju.

Tabela 21: Pregled sadržaja HMWS u naglašenim (pH skok 2w 37°C) ciljanim preparatima C (cc)-hALB, -hFc i -scFc određenim putem SE-UPLC

Primer 12:

[0326] Ciljani C (cc)-hALB, -hFc i -scFc formulisani kao što je opisano u Primeru 4 su podvrgnuti stresu uz mešanje. Koncentracija polaznih materijala bila je 1,0 mg/mL.

Zapremina od 0,5 mL svakog rastvora je filtrirana kroz odgovarajući filter od 0,22 µm i napunjena u staklene bočice tipa 3cc. Bočice su stavljene u plastičnu kutiju kako bi se osiguralo da se bočice ne pomeraju unutar kutije tokom mešanja. Kutija je postavljena na orbitalni šejker. Uzorci su mešani na 500 rpm tokom 65 sati. Uzorci su analizirani pomoću SE-UPLC da bi se kvantifikovao procentualni sadržaj vrsta visoke molekularne težine (HMWS). Primenjen je isti postupak kao što je opisano u Primeru 4. Sadržaj HMWS u protresanim uzorcima prikazan je u Tabeli 22. Formiranje HMWS bilo je najmanje izraženo za Ciljani C (cc)-scFc u bilo kojoj formulaciji.

Tabela 22: Pregled sadržaja HMWS u naglašenim (pH skok 2w 37°C) ciljanim preparatima C (cc)-hALB, -hFc i -scFc određenim putem SE-UPLC

Primer 13:

[0327] Ciljni C (cc)-hALB, -hFc i -scFc formulisani kao što je opisano u Primeru 4 bili su izloženi vidljivoj i UVA svetlosti (foto stres). Koncentracija proteina iznosila je 1 mg/mL u svim preparatima. Proteinski rastvori su filtrirani kroz filter sa veličinom pora 0,22 µm i

11

napunjeni do 0,5 mL u staklenim bočicama tipa I. Ciljani C (cc)-hALB i -scFc su podvrgnuti dva različita testa uključujući 0,2 MLux vidljivo svetlo/25 W*h/m2 UVA svetlost i 1,2MLuk vidljivo svetlo/173 W*h/m2 respektivno. Ciljani C (cc)-hFc je podvrgnut dvama različitim testovima uključujući 0,2 MLux vidljivo svetlo bez UVA svetlosti i 1,2 MLux vidljivo svetlo/30 W*h/m2 UVA svetlo. Temperatura u komori je podešena na 25°C. Nakon izlaganja svetlosti uzorci su analizirani SE-UPLC (Tabela 23) i peptidnom mapom (Tabela 24). Iznad pomenuti postupci su izvedeni prema procedurama u Primeru 4. Uprkos većem intenzitetu UVA svetlosti primenjenom na Target C (cc)-scFc, ovaj konstrukt je bio stabilan u odnosu na formiranje HMWS. Nasuprot tome, Ciljani C (cc)-hFc i Target C (cc)-hALB su pokazali povećanje HMWS u uslovima Testa 2.

Tabela 23: Pregled sadržaja HMWS u ciljanim C (cc)-hALB, -hFc i -scFc preparatima utvrđenim nakon izlaganja svetlosti preko SE-UPLC

[0328] Ukupne hemijske modifikacije nakon izlaganja svetlosti bile su najmanje izražene za Ciljani C (cc)-scFc. Posebno su deamidacije CDR-a formirane u većoj meri u Ciljani C (cc)-hALB i Ciljani C (cc)-hFc. Kada se uporede konstrukti zasnovani na Fc, otkriveno je da je Ciljani C (cc)-scFc manje sklon hemijskim modifikacijama Fc dela iako je scFc konstrukt bio izložen većim dozama UVA svetlosti od hFc-konstrukta. Tabela 24 takođe navodi najzastupljenije hemijske modifikacije dela albumina u Ciljani C (cc)-hALB pokazujući da je deo koji produžava polu-raspad ovog konstrukta bio hemijski više degradiran od Fc delova Ciljani C (cc)-hFc i - scFc.

Tabela 24: Pregled hemijskih modifikacija u ciljanim C (cc)-hALB, -hFc i -scFc preparatima utvrđenim nakon izlaganja svetlosti putem peptidnog mapiranja

11

11 Primer 14

[0329] Ispitivani su različiti konstrukti BiTE® antitela dizajnirani za ciljanje na cilj F, uključujući produženi polu-raspad ciljanog F-a (ne HLE, kanonski), ciljni F-hALB i ciljni F-scFc. Ciljna koncentracija proteina bila je 1,0 mg/mL za hALB i scFc i 0,4 mg/mL za verziju koja nije HLE. Formulisani konstrukti BiTE® antitela su napunjeni do 1 mL u staklenim bočicama tipa I koje su zapušene čepovima od butil gume i presvučene aluminijumskim zaptivkama. Napunjene bočice su inkubirane na -20°C i 37°C (w/o i sa 25 ppm silicijuma koji je poznat po svom potencijalu da indukuje agregaciju proteina) tokom 4 nedelje. Gore navedeni konstrukti su takođe bili izloženi svetlosti (1,2 MLux vidljiva svetlost/173 W*h/m<2>UVA svetlost). Za lagani stres, temperatura komore je podešena na 25°C. Uzorci čuvani na -70°C služili su kao kontrole (T0).

[0330] Gore opisani uzorci analizirani su u duplikatima hromatografijom ultra-visokih performansi (SE-UPLC) za isključivanje veličine da bi se kvantifikovao procentualni sadržaj vrsta visoke molekularne težine (HMWS). SE-UPLC je izveden na Acquity H-Class UPLC sistemu (Waters) korišćenjem Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mm kolone (Waters).

Temperatura kolone je podešena na 25°C. Razdvajanje varijanti veličine je postignuto primenom izokratskog postupka sa brzinom protoka od 0,4 mL/min. Mobilna faza je sastavljena od 100 mM natrijum fosfata, 250 mM NaCl pH 6,8. Ukupno vreme trajanja je 6,0 minuta. Uzorci su držani na 8°C u auto-sampleru do analize. Ubrizgana je ukupna količina od 3 µg proteina. Da bi se izbegao prenos, posle svakog uzorka je izvršena međuinjekcija sa 40% ACN. Detekcija je zasnovana na fluorescenciji (ekscitacija na 280 nm, emisija na 325 nm). Maksimalna integracija je izvedena korišćenjem Empower® softvera. Prijavljena je relativna površina ispod krive HMWS (Tabela 25).

[0331] U uzorcima bez stresa, HMWS je najmanje izražen za scFc-konstrukt. Formiranje HMWS je isključivo primećeno tokom 4 nedelje skladištenja na -20°C. Sadržaj HMWS pod ovim uslovima raste sledećim redosledom scFc < hALB < ne HLE.

Tabela 25: Pregled sadržaja HMWS u preparatima pod stresom i bez stresa (T0) ciljanih F-ne HLE, -hALB i -scFc preparata utvrđenih putem SE-UPLC.

11

[0332] Pored toga, uzorci dobijeni toplotnim stresom u odsustvu i prisustvu silicijuma su procenjeni na obilje vidljivih čestica pomoću Microfluid Imaging (MFI) korišćenjem Flovcam od Fluid Imaging Technologies, Inc. Instrument je opremljen FC80FV protočnom ćelijom. Primenjeno je desetostruko optičko uvećanje. Pogodnost sistema je proverena vodom bez čestica. Primenjena je brzina automatske slike od 20 kadrova u sekundi. Tamni i svetli pragovi su postavljeni na 25 odnosno 20 piksela. Zapremina uzorka za jedno merenje iznosi ukupno 0,25 mL. Uzorci su mereni u tri primerka. Pre svakog trostrukog ponavljanja sistem je ispran sa 0,5 mL odgovarajućih rastvora uzoraka. Na početku i između svake tri kopije obavljeno je ispiranje sa 1,0 mL vode bez čestica. Procena podataka je izvršena pomoću softvera Visual Spreadsheet. Uzorci su mereni u tri primerka. Rezultati su prikazani u Tabeli 26.

[0333] Toplotni stres je doveo do formiranja nevidljivih čestica u preparatima koji ne sadrže HLE i hALB konstrukte. Nasuprot tome, scFc konstrukcija je ostala stabilna. Formiranje polu-vidljivih čestica nije podstaknuto dodatkom silicijuma nezavisno od prirode konstrukta BiTE® antitela.

Tabela 26: Procena polu-vidljivih čestica od strane MFI u Target F-non HLE (kanonski), - hALB, i ―scFc preparatima nakon toplotnog stresa u odsustvu i prisustvu silicijuma.

11

[0334] Uzorci toplotnog stresa su takođe analizirani hromatografijom sa slabom katjonskom razmenom (WCX) da bi se kvantifikovao procentualni sadržaj varijanti punjenja korišćenjem UPLC Aquity H klase od Waters. Primenjena je kolona Protein-Pak Hi Res CM 7 mm 4,6 x 100 mm (Waters, kat. br.186004929). Temperatura kolone je podešena na 30°C. Brzina protoka je podešena na 0,65 mL/min. Primenjeni gradijent je projektovan na sledeći način (Tabela 27). Temperatura autosamplera je održavana na 2-8°C.

Tabela 27: Gradijent primenjen za WCX hromatografiju

[0335] Ubrizgana je ukupna količina od 3 µg proteina. Detekcija je zasnovana na fluorescenciji (ekscitacija na 280 nm, emisija na 325 nm). Maksimalna integracija je izvedena korišćenjem Empower® softvera. Prikazane su relativne površine ispod krive glavnog maksimuma, kao i kiselih i baznih varijanti naelektrisanja (Tabela 28).

[0336] Toplotni stres je doveo do smanjenog procenta glavnog pika koji se morao pripisati pretežnom formiranju varijanti kiselog naelektrisanja. Gubitak u procentu glavnog maksimuma bio je najmanje izražen za scFc konstrukt (7,5%). U oba konstrukta formirane su osnovne varijante naelektrisanja sa produženim polu-raspadom nakon izlaganja svetlosti. Povećanje osnovnih varijanti naelektrisanja kretalo se između 5 i 6% kod hALB i scFc konstrukata.

11

Tabela 28: Procena varijanti naelektrisanja pomoću WCX hromatografije u preparatima Ciljanih F-ne HLE (kanonski), -hALB i ―scFc nakon stresa izazvanog toplotom i svetlom.

[0337] Pored toga, čistoća uzorka je kvantifikovana u uzorcima pod toplotnim i svetlosnim stresom korišćenjem testa mikrofluidne kapilarne elektroforeze natrijum dodecilsulfata (CE-SDS) zasnovanog na LabChip GXII sistemu (Perkin Elmer). Rastvor za denaturaciju uzorka je sastavljen od HT proteinskog ekspresnog pufera za uzorke (koji je obezbedio Perkin Elmer) sa dodatkom 34 mM ditiotreitola. Svaki uzorak je razblažen 1:8 sa denaturisanim rastvorom i zagrevan do 70°C tokom 10 minuta zajedno sa merdevinom za ekspres proteina.

35 µL vode za injekcije (WFI) je dodato u 40 µL denaturisanog uzorka. 120 µL WFI je dodato u 12 µL lestvica. Uzorci, merdevine, proteinski ekspresni pufer za ispiranje, gel boja i rastvor za odstranjivanje se prenose u odgovarajuće rezervoare. Uzorci se elektrokinetički učitavaju sa mikrotitarske ploče na čip integrišući odvajanje, bojenje, skidanje boje i detekciju proteina i njegovih varijanti veličine. Dobijeni elektroferogrami su procenjeni i prijavljene su promene u čistoći. Pregled procentualne čistoće otkrivene nakon stresa dat je u Tabeli 29 i upoređen sa uzorcima bez stresa (T0).

[0338] Zapažene su veće čistoće za hALB i scFc konstrukte u poređenju sa konstruktom koji nije HLE pod svim uslovima. Blago smanjenje čistoće u poređenju sa T0 detektovano je za hALB i scFc konstrukcije nakon toplotnog i svetlosnog stresa. Gubitak čistoće posle 4 nedelje skladištenja na 37°C iznosi ukupno 8,4% za hALB konstrukt i 6,6% za scFc konstrukt. Gubici pri izlaganju svetlosti bili su uporedivi između hALB i scFc.

12

Tabela 29: Pregled procentualne čistoće u napregnutim i nenapregnutim (T0) ciljnim F-ne HLE, -hALB i -scFc preparatima utvrđenim preko LabChip GXII (Caliper).

Primer 15

[0339] Formulisani su različiti konstrukti BiTE® antitela dizajnirani za ciljanje na cilj E uključujući Ciljani E-hALB i Ciljani E-scFc, respektivno. Ciljna koncentracija proteina bila je 1,0 mg/mL za oba konstrukta. Formulisani konstrukti BiTE® antitela su napunjeni do 1 mL u staklenim bočicama tipa I koje su zapušene čepovima od butil gume i presvučene aluminijumskim zaptivkama. Napunjene bočice su inkubirane na 37°C (Ciljani E-hALB) i 40°C (Ciljani E-scFc) tokom 4 nedelje. Uzorci čuvani na -70°C služili su kao kontrole (T0). Uzorci su analizirani pomoću SE-UPLC prema postupku opisanom u Primeru 13. Rezultati su prikazani u Tabeli 30.

[0340] ScFc konstrukt je pokazao smanjeni gubitak monomera (2,3%) nakon toplotnog stresa u poređenju sa hALB konstruktom (4,0%) iako je temperatura inkubacije bila nešto viša.

Tabela 30: Pregled procenta maksimuma monomera u napregnutim i nenapregnutim (T0) ciljnim E-hALB i ―scFc preparatima određenim putem SE-UPLC.

Primer 16

[0341] Ispitivani su različiti konstrukti BiTE® antitela dizajnirani za ciljanje na Ciljani I uključujući Ciljani I-Xbody i Ciljani I-scFc. Ciljna koncentracija proteina bila je 1,0 mg/mL. Formulisani konstrukti BiTE® antitela su napunjeni do 1 mL u staklenim bočicama tipa I koje su zapušene čepovima od butil gume i presvučene aluminijumskim zaptivkama.

Napunjene bočice su inkubirane na -20°C i 37°C tokom 4 nedelje. Pored toga, svi uzorci su bili izloženi 1,2 MLux vidljivoj svetlosti i 173 W*h/m<2>UVA svetlosti. Temperatura komore je podešena na 25°C. Uzorci čuvani na -70°C služili su kao kontrole (T0). Uzorci čuvani na -20 i -37°C analizirani su pomoću SE-UPLC prema postupku opisanom u Primeru 13.

Rezultati su prikazani u Tabeli 31.

[0342] ScFc konstrukt je sačuvao veći sadržaj monomera kada se čuva četiri nedelje na -20 odnosno 37°C u poređenju sa Xbody.

Tabela 31: Pregled sadržaja monomera u napregnutim i nenapregnutim (T0) Ciljanim I-Xbody i -scFc preparatima utvrđenim putem SE-UPLC.

[0343] Pored toga, uzorci bez stresa su procenjeni na obilje vidljivih čestica pomoću Microfluid Imaging (MFI) korišćenjem metode opisane u Primeru 13. Rezultati su prikazani u Tabeli 32. Preparat Ciljani I-scFc pokazao je značajno manje količine polu-vidljivih čestica u poređenju sa preparatom Ciljani I-Xbody . Ovo se odnosi na sve uključene frakcije veličine.

Tabela 32: Procena polu-vidljivih čestica od strane MFI u nenaglašenim Ciljanim I-Xbody i -scFc

[0344] Uzorci sa svetlosnog stresa su takođe analizirani hromatografijom sa slabom katjonom razmenom (WCX) da bi se kvantifikovao procentualni sadržaj varijanti punjenja korišćenjem UPLC Aquity H klase iz Waters prema postupku opisanom u Primeru 13. Prikazane su relativne površine ispod krive glavnog maksimuma, kao i kiselih i baznih varijanti naelektrisanja (Tabela 33).

[0345] ScFc konstrukt je pokazao poboljšanu stabilnost protiv izlaganja svetlosti u poređenju sa Xbody konstruktom na koji ukazuje manje izražen gubitak u glavnom maksimumu koji je iznosio 1,4% u poređenju sa 5,5% za Xbody konstrukt.

Tabela 33: Procena varijanti naelektrisanja pomoću WCX hromatografije u preparatima Ciljanih I-Xbody i -scFc nakon stresa izazvanog toplotom i svetlošću.

Primer 17: Hromatografija isključivanja veličine bispecifičnih scFc varijanti [0346] Konstrukti D9F, T2G, D3L, T7I i K6C (videti Sliku 7) su testirani na njihovo radno ponašanje hromatografijom za isključivanje veličine prema standardnim procedurama.

Detaljnije, definisana količina od 25 µg svakog konstrukta je puštena (pri 750 µl/min) u citratni lizinski pufer (10 mM i 75 mM, pH7) na Superdex 200 povećanje 10/300GL koloni na sobnoj temperaturi i OD 280 nm je zabeležen. Nakon toga, konstrukti su upoređeni po vremenu zadržavanja. Kao rezultat toga, konstrukt D9F pokazuje značajno odloženo eluiranje (Tabela 34) u poređenju sa T2G, D3L, T7I i K6C, što ukazuje na razliku u strukturi/rasporedu Fc domena. Ova razlika u vremenu zadržavanja bila je najznačajnija sa konstruktom T7I koji je imao neuparene cisteine u zglobnom regionu i vezu CH2 i CH2CH3 sa CH3 (18,98 min naspram 18,62 min, razlika od 0,36 min). Međutim, takođe je razlika u vremenu zadržavanja od 0,16 min između D9F i T2G značajna uzimajući u obzir odgovarajuće vreme zadržavanja BSA kontrole. BSA kontrola je pokazala vreme zadržavanja od 19,07 min za monomer i 16,82 min za dimer, pokazujući razliku od 2,25 min u vremenu zadržavanja za udvostručenu molekulsku masu. Dakle, kako konstrukti imaju samo strukturne razlike u Fc delu, razlika u vremenu zadržavanja od 0,16 minuta je značajna. Ukratko, konstrukt D9F je pokazao najduže vreme zadržavanja što ukazuje na najjače vezivanje. Ovaj zaključak dovodi do očekivanja da D9F ima i najduži polu-raspad in vivo.

Tabela 34

12

Primer 18: Određivanje vezivanja za humani FcRn zasnovano na površinskoj plazmonskoj rezonanci (FCGRT/B2M)

[0347] Svaki konstrukt D9F, T2G, D3L, T7I i K6C (slika 7) je testiran na njihovu sposobnost vezivanja protiv humanog FcRn u SPR (Biacore) eksperimentima prema standardnim procedurama. Detaljnije, CM5 senzorski čipovi (GE Healthcare) su imobilisani sa 450-500 RU FCGRT/B2M (ACRO Biosystems) korišćenjem Na acetatnog pufera pH 4,5 i tekućeg pufera koji se sastoji od 200 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM pH EDTA 6.0. Konstrukti su zatim ubrizgani u narednim serijama u dve koncentracije od 250 nM i 125 nM razblažene u 200 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, pH 6,0 i 36°C. Povezivanje je vršeno tokom 90 sekundi sa brzinom protoka od 30 µl/min nakon čega je usledila faza disocijacije tokom 90 sekundi pri brzini protoka od 30 µl/min u 200 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, pH 6,0 na 36°C. Sledeća regeneracija je urađena tokom 10 sekundi sa 30 µl/min sa 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA pH 7,4.

[0348] Maksimalno vezivanje tokom faze ubrizgavanja je mereno za sve konstrukte kao odgovarajuće jedinice odgovora (RU), što je ekvivalentno povećanju molekulske mase na CM5 čipu obloženom FcRn usled vezanog konstrukta. Svi konstrukti su mereni u duplikatima. Prosečne vrednosti duplih determinacija su prikazane na Slikama 8A i 8B, respektivno.

[0349] Kao rezultat toga, konstrukt D9F pokazuje značajno veće povećanje mase na CM5 čipu obloženom FcRn, u poređenju sa T2G, D3L, T7I i K6C, što ukazuje na jači afinitet vezivanja D9F za ljudski FcRn. Ovo zapažanje je primećeno za obe koncentracije odgovarajućih konstrukta.

[0350] Vezivanje za FcRn je posredovano preko Fc dela unutar konstrukta. Jače vezivanje za humani FcRn kao što je opisano u literaturi je pokazatelj dužeg polu-raspada in vivo zbog većeg intracelularnog spasavanja odgovarajućeg proteina i stoga smanjene stope degradacije. Iz tog razloga, jače vezivanje D9F za humani FcRn u poređenju sa drugim konstruktima čini ovaj molekul očigledno superiornijim kao osnovom za terapeutske molekule kako bi se omogućilo duže izlaganje potencijalnom leku kod pacijenta i manja učestalost primene leka.

Primer 19: Određivanje vezivanja za humani FcRn zasnovano na površinskoj plazmonskoj rezonanci (FCGRT/B2M)

[0351] Svaki konstrukti D9F, T2G, D3L, T7I i K6C i humano IgG1-kappa antitelo MT201 su testirani na njihovu sposobnost vezivanja protiv humanog FcRn u SPR (Biacore) eksperimentima prema standardnim procedurama. Detaljnije, CM5 senzorski čipovi (GE Healthcare) su imobilisani sa oko 350 RU FCGRT/B2M (ACRO Biosystems) korišćenjem Na acetatnog pufera pH 4,5 i tekućeg pufera koji se sastoji od 200 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM pH EDTA 6.0. Konstrukti i humana IgG1-kapa kontrola (MT201) su zatim ubrizgani u koncentraciji od 125 nM razblaženih u 200 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, pH 6,0 i 36°C. Povezivanje je vršeno tokom 90 sekundi sa brzinom protoka od 30 µl/min nakon čega je usledila faza disocijacije tokom 60 sekundi pri brzini protoka od 30 µl/min u 200 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, pH 6,0 na 36°C. Sledeća regeneracija je urađena tokom 10 sekundi sa 30 µl/min sa 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA pH 7,4.

[0352] Maksimalno vezivanje tokom faze ubrizgavanja je mereno za sve konstrukte kao odgovarajuće jedinice odgovora (RU), što je ekvivalentno povećanju molekulske mase na CM5 čipu obloženom FcRn usled vezanog konstrukta. Svi konstrukti su mereni u duplikatima. Prikazane su na Slici 9 prosečne vrednosti dupliranih određivanja uključujući trake greške standardne devijacije.

[0353] Kao rezultat toga, konstrukt D9F pokazuje značajno veće povećanje mase na CM5 čipu obloženom FcRn, u poređenju sa T2G, D3L, T7I i K6C, što ukazuje na jači afinitet vezivanja D9F za ljudski FcRn. Povećanje mase na CM5 čipu obloženom FcRn za D9F je dobro uporedivo sa povećanjem mase humanog IgG1-kappa kontrolnog antitela MT201, što ukazuje na uporedivo vezivanje konstrukta D9F za humani FcRn.

[0354] Vezivanje protiv FcRn je posredovano preko humanog IgG1 Fc dela unutar konstrukta. Jače vezivanje za humani FcRn kao što je opisano u tehnici je pokazatelj dužeg

12

polu-raspada in vivo zbog većeg intracelularnog spasavanja odgovarajućeg proteina i stoga smanjene stope degradacije. Iz tog razloga, jače vezivanje D9F za humani FcRn u opsegu humanog IgG1-kappa antitela (MT201), u poređenju sa drugim konstruktima čini ovaj molekul očigledno superiornijim kao osnovu za terapeutske molekule kako bi se omogućilo duže izlaganje potencijalu lek kod pacijenta, verovatno u opsegu punog humanog IgG1 antitela, i niža učestalost primene leka.

[0355] Sledeća tabela opisuje peptide i proteine koji imaju SEQ ID NO:1-109, kao i one sa SEQ ID NO:110-129, što odgovara sekvencama iz WO 2008/119567.

12

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Jednolančana konstrukcija antitela koja sadrži:

• prvi domen koji se vezuje za BCMA,

• drugi domen koji se vezuje za vanćelijski epitop humanog i/ili Macaca CD3ε lanca; i

• treći domen koji sadrži dva polipeptidna monomera, od kojih svaki sadrži šarku, CH2 domen i CH3 domen, pri čemu su navedena dva polipeptidna monomera fuzionisana jedan sa drugim preko peptidnog veznika.

2. Konstrukt antitela prema patentnom zahtevu 1, gde se navedeni treći domen sastoji od amino prema karboksilnom redu:

šarka-CH2-CH3-veznik-šarka-CH2-CH3.

3. Konstrukt antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde svaki od navedenih polipeptidnih monomera ima sekvencu aminokiselina koja je najmanje 90% identična sekvenci izabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO:17-24.

4. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde svaki od navedenih polipeptidnih monomera ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:17-24.

5. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde CH2 domen sadrži cistein disulfidni most unutar domena.

6. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde

(i) prvi domen sadrži dva varijabilna domena antitela, a drugi domen sadrži dva varijabilna domena antitela;

(ii) prvi domen sadrži jedan varijabilni domen antitela, a drugi domen sadrži dva varijabilna domena antitela;

(iii) prvi domen sadrži dva varijabilna domena antitela, a drugi domen sadrži jedan varijabilni domen antitela; ili

(iv) prvi domen sadrži jedan varijabilni domen antitela, a drugi domen sadrži jedan varijabilni domen antitela.

7. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde su prvi i drugi domen fuzionisani sa trećim domenom preko peptidnog veznika.

8. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji se sastoji od amino prema karboksilnom redu:

(a) prvi domen;

(b) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1-3;

(c) drugi domen;

(d) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1, 2, 3, 9, 10, 11 i 12;

(e) prvi polipeptidni monomer trećeg domena;

(f) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:5, 6, 7 i 8; i

(g) drugi polipeptidni monomer trećeg domena.

9. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji se sastoji od amino prema karboksilnom redu:

(a) prvi domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:53, 59, 71, 77, 89 ili 95;

(b) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1-3;

(c) drugi domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ

ID NO:110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124,

125, 126, 127, 128 ili 129, ili SEQ ID NO:15;

(d) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1, 2, 3, 9, 10, 11 i 12;

(e) prvi polipeptidni monomer trećeg domena koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:17-24;

(f) peptidni veznik koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:5, 6, 7 i 8; i

(g) drugi polipeptidni monomer trećeg domena koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:17-24.

10. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji ima sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:55, 56, 61, 62, 73, 74, 79, 80, 91, 92, 97 i 98.

11. Polinukleotid koji kodira konstrukt antitela kao što je definisano u bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

12. Vektor koji sadrži polinukleotid kao što je definisano u patentnom zahtevu 11.

13. Ćelija domaćina transformisana ili transfektovana polinukleotidom kao što je definisano u patentnom zahtevu 11 ili vektorom kao što je definisano u patentnom zahtevu 12.

14. Postupak za proizvodnju konstrukta antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, pri čemu navedeni proces obuhvata kultivisanje ćelije domaćina kao što je definisano u patentnom zahtevu 13 pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju konstrukta antitela kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 i vraćanje proizvedenog konstrukta antitela iz kulture.

15. Farmaceutski sastav koji sadrži konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, ili proizvedena prema postupku prema patentnom zahtevu 14.

16. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 15, koja je stabilna najmanje četiri nedelje na oko -20°C.

17. Konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 za upotrebu u prevenciji ili lečenju tumora ili autoimune bolesti.

18. Konstrukt antitela za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, gde je tumor izabran iz grupe koju čine multipli mijelom, plazmacitom, leukemija plazma ćelija, Valdenstromova makroglobulinemija, plazmacitom solitarne kosti, ekstramedularni plazmacitom, osteosklerotični mijelom, tinjajući multipli mijelom, B-ćelijski ne-Hočkinov limfom, hronična limfocitna leukemija i Hočkinov limfom.

14

19. Komplet koji sadrži konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, ili proizveden u skladu sa postupkom prema patentnom zahtevu 14, polinukleotid kao što je definisan u patentnom zahtevu 11, vektor prema patentnom zahtevu 12 i/ili ćeliju domaćina kako je definisano u patentnom zahtevu 13.