RS63202B1

RS63202B1 - Automatizovani postupci, moduli, instrumenti i sistemi za obradu ćelija

Info

Publication number: RS63202B1
Application number: RS20220453A
Authority: RS
Inventors: Don Masquelier; Phillip Belgrader; Jorge Bernate; Ryan Gill; Kevin Ness
Original assignee: Inscripta Inc
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-30
Publication date: 2022-06-30
Also published as: AU2021212069A1; US20190002814A1; US20190292536A1; US20210284994A1; US10647982B1; US10329559B1; EP3848459A1; US20220195512A1; EP3645719B1; RU2021123421A; JP2020530979A; EP4270012A2; EP3645719A1; KR102424850B1; US11597921B2; IL271196B; RU2020103731A; US20200332285A1; SMT202200316T1; RU2020103731A3

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] U narednom tekstu biće opisani određeni predmeti i postupci za svrhe uvoda i upoznavanja sa stanjem tehnike. Ništa ovde sadržano ne treba tumačiti kao „priznanje“ prethodnog stanja tehnike.

Podnosilac prijave izričito zadržava pravo da dokaže, gde je to prikladno, da predmeti i postupci na koje se ovde poziva ne predstavljaju prethodno stanje tehnike prema važećim zakonskim odredbama.

[0002] Uređivanje genoma sa sintetičkim nukleazama je postupak u kom se promene nukleinskih kiselina vrše u genomu živog organizma. Određene nukleaze stvaraju dvolančane prekide specifične za mesto u ciljanim regionima u genomu, koji se mogu popraviti nehomolognim spajanjem na kraju ili homolognom rekombinacijom, što rezultuje ciljanim uređivanjima. Ove postupci, međutim, nisu kompatibilni sa automatizacijom zbog niske efikasnosti i izazova sa transformacijom ćelija, merenjem uzgoja i odabirom ćelija. Štaviše, tradicionalni stoni uređaji ne moraju nužno da se skaliraju i integrišu dobro u automatizovani, modularni sistem. Postupci i sistemi za kreiranje populacija uređenih ćelija stoga ostaju glomazni, i izazovi uvođenja višestrukih krugova uređivanja korišćenjem rekurzivnih tehnika ograničili su prirodu i složenost ćelijskih populacija koje se mogu kreirati.

[0003] US 2013/0005025 opisuje postupke za uvođenje više nukleinskih kiselina u ćeliju korišćenjem automatizovanog sistema koji uključuje posudu, kao što su epruveta za mikrofugiju, test epruveta, kiveta, mikroskopska pločica itd. koje sadrže ćeliju.

[0004] Stoga postoji potreba za automatizovanim instrumentima, sistemima i postupcima za uvođenje sastavljenih nukleinskih kiselina i drugih bioloških molekula u žive ćelije na automatizovan način gde se uređene ćelije mogu koristiti za dalje eksperimentisanje van automatizovanog instrumenta.

SAŽETAK ILUSTRATIVNIH OTELOTVORENJA

[0005] U određenim otelotvorenjima, automatizovani postupci se koriste za nukleazom-usmereno uređivanje genoma jednog ili više ciljanih genomskih regiona u više ćelija, gde se postupci izvode u automatizovanim multi-modularnim instrumentima za uređivanje ćelija. Ove postupci se mogu koristiti za generisanje biblioteka živih ćelija od interesa sa željenim uređivanjima genoma. Automatizovani postupci koje se sprovode korišćenjem automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija koje su ovde opisane mogu se koristiti sa različitim tehnikama za nukleazom-usmereno uređivanje genoma, i mogu se koristiti sa ili bez upotrebe jednog ili više selektivnih oznaka.

[0006] Predmetno obelodanjenje stoga pruža, u odabranim otelotvorenjima, module, instrumente i sisteme za automatizovano multi-modularno uređivanje ćelija, uključujući nukleazom-usmereno uređivanje genoma. Druga specifična otelotvorenja automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija predmetnog obelodanjenja dizajnirana su za rekurzivno uređivanje genoma, npr., sekvencijalno uvođenje višestrukih uređivanja u genome unutar jedne ili više ćelija populacije ćelija kroz dve ili više operacija uređivanja unutar instrumenata.

[0007] Dakle, ovde su pružena otelotvorenja automatizovanog multi-modularnog instrumenta za uređivanje ćelija koje sadrži: kućište konfigurisano da sadrži sve ili neke od modula; posuda konfigurisana za prijem ćelija; jedna ili više posuda konfigurisana za prijem nukleinske kiseline; modul za transformaciju konfigurisan da uvede nukleinske kiseline u ćelije; modul za oporavak koji je konfigurisan za prijem ćelija iz modula za transformaciju i da omogući ćelijama da se oporave nakon transformacije ćelije u modulu za transformaciju; modul za nukleazom-usmereno uređivanje konfigurisan da omogući uvedenim nukleinskim kiselinama da uređuju nukleinske kiseline u ćelijama; i procesor konfigurisan da upravlja automatizovanim multi-modularnim instrumentom za uređivanje ćelija na osnovu korisničkog unosa i/ili izbora unapred programirane rutine; robotski sistem rukovanja za premeštanje materijala do ili između modula; i koji se sastoji od automatizovanog sistema za rukovanje tečnostima za premeštanje tečnosti direktno bez intervencije korisnika iz jednog od modula za oporavak, modula za transformaciju ili modula za nukleazomusmereno uređivanje u drugi modul za oporavak, modul za transformaciju ili modul za nukleazom-usmereno uređivanje.

[0008] U nekim aspektima, nukleinske kiseline u jednoj ili više posuda sadrže kičmu i kasetu za uređivanje, a automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija dalje sadrži modul za sastavljanje nukleinske kiseline. U nekim aspektima, modul za sastavljanje nukleinske kiseline se sastoji od magneta, a u nekim aspektima, modul za sastavljanje nukleinske kiseline je konfigurisan da izvrši sastavljanje pomoću jedne ne reakcije. U drugim aspektima, modul za sastavljanje nukleinske kiseline je konfigurisan da izvrši postupak amplifikacije i/ili ligacije.

[0009] U nekim aspektima automatizovanog multi-modularnog instrumenta za uređivanje ćelija, modul za uređivanje i modul za oporavak su kombinovani.

[0010] U nekim aspektima, automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija može dalje da sadrži modul za uzgoj konfigurisan da uzgaja ćelije, i u nekim implementacijama, modul za uzgoj meri optičku gustinu ćelija koje se uzgajaju, bilo kontinuirano ili u intervalima. U nekim implementacijama, procesor je konfigurisan da prilagodi uslove uzgoja u modulu za uzgoj tako da ćelije dostignu ciljanu optičku gustinu za vreme koje zahteva korisnik. Dalje, u nekim otelotvorenjima, korisnik može primati obaveštenja u vezi sa procesom uzgoja.

[0011] U nekim aspektima, automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija sadrži kertridž za reagens gde se posuda konfigurisana za prijem ćelija i jedna ili više posuda konfigurisanih za prijem nukleinskih kiselina nalaze unutar kertridža za reagens. Dalje, kertridž za reagens može takođe da sadrži neke ili sve reagense potrebne za uređivanje ćelija. U nekim implementacijama, reagensi sadržani u kertridžu za reagens mogu se locirati pomoću rutine koju čita procesor, i u nekim implementacijama, kertridž za reagens uključuje reagense i nalazi se u kompletu.

[0012] U nekim aspektima, modul za transformaciju automatizovanog multi-modularnog instrumenta za uređivanje ćelija sadrži uređaj za elektroporaciju; a u nekim implementacijama, uređaj za elektroporaciju je uređaj za protočnu elektroporaciju.

[0013] Neki aspekti automatizovanog multi-modularnog instrumenta za uređivanje ćelija dalje obuhvataju modul za filtriranje konfigurisan da razmenjuje tečnosti i/ili koncentriše ćelije. U specifičnim aspektima, sistem filtriranja se takođe može koristiti kako bi ćelije bile elektrokompetentne.

[0014] U drugim slučajevima, pružen je automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija, gde automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija sadrži kućište konfigurisano za smeštaj nekih ili svih modula; posudu konfigurisana za prijem ćelija; najmanje jedan rezervoar konfigurisan za prijem kičme nukleinske kiseline i kasete za uređivanje; modul za sastavljanje nukleinske kiseline konfigurisan za a) sastavljanje kičme i kasete za uređivanje, i b) uklanjanje soli sastavljenih nukleinskih kiselina nakon sastavljanja; modul za uzgoj konfigurisan da uzgaja ćelije i meri optičku gustinu (OD) ćelija; modul za filtriranje konfigurisan da koncentriše ćelije i učini ćelije elektrokompetentnim; modul za transformaciju koji sadrži protočni elektroporator za uvođenje sastavljenih nukleinskih kiselina u ćelije; kombinovani modul za oporavak i uređivanje konfigurisan da omogući ćelijama da se oporave nakon elektroporacije u modulu za transformaciju i da omogući sastavljenim nukleinskim kiselinama da uređuju nukleinske kiseline u ćelijama; i procesor konfigurisan da upravlja automatizovanim multi-modularnim instrumentom za uređivanje ćelija na osnovu korisničkog unosa i/ili odabira odgovarajućeg rutine kontrolera.

[0015] U nekim implementacijama, automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija pruža kertridž za reagens koji se sastoji od više rezervoara reagensa, uređaja za elektroporaciju i rutine koju procesor može da pročita za doziranje reagensa koji se nalazi u više rezervoara reagensa i kontroliše uređaj za protočnu elektroporaciju.

[0016] U nekim aspektima, modul za uzgoj uključuje rotirajuću bočicu za uzgoj sa kontrolisanom temperaturom, sklop motora za okretanje bočice, spektrofotometar za merenje, na primer, OD u bočici, i procesor za prihvatanje unosa od korisnika i kontrolu brzine uzgoja ćelija. Modul za uzgoj može automatski da meri OD ćelija koje se uzgajaju u rotirajućoj bočici za uzgoj kontinuirano ili u određenim intervalima i da kontroliše uzgoj ćelija do ciljanog OD i ciljanog vremena koje odredi korisnik. To jest, postupci i uređaji koji su ovde opisani pružaju povratnu spregu koja prati uzgoj ćelija u realnom vremenu i prilagođava temperaturu rotirajuće bočice za uzgoj u realnom vremenu kako bi se dostigao ciljani OD za ciljano vreme koje je odredio korisnik.

[0017] U nekim aspektima automatizovanog multi-modularnog instrumenta za uređivanje ćelija, modul za transformaciju se sastoji od uređaja za protočnu elektroporaciju, gde uređaj za protočnu elektroporaciju sadrži ulaz i ulazni kanal za uvođenje uzorka ćelija i sastavljenih nukleinskih kiselina u uređaji za protočnu elektroporaciju; izlaz i izlazni kanal za izlaz elektroporisanog uzorka ćelija iz uređaja za protočnu elektroporaciju; kanal za protok koji se ukršta sa i nalazi između ulaznog i izlaznog kanala; i dve ili više elektroda, gde su dve ili više elektroda postavljene u kanalu za protok između preseka kanala za protok sa prvim ulaznim kanalom i preseka kanala za protok sa izlaznim kanalom, u fluidnoj vezi sa uzorkom ćelija u kanalu za protok, i konfigurisan da primeni električni impuls ili električne impulse na uzorak ćelija. U specifičnim aspektima, protok kroz uređaj za elektroporaciju može da sadrži dva ili više kanala za protok paralelno.

[0018] Takođe su opisani sistemi za korišćenje automatizovanog multi-modularnog instrumenta za uređivanje ćelija za implementaciju operacija uređivanja genoma unutar ćelija. Ovi sistemi mogu opciono da uključuju jedan ili više interfejsa između instrumenta i drugih uređaja ili posuda za pripremu ćelija, pripremu nukleinske kiseline, odabir populacija uređenih ćelija, funkcionalnu analizu populacija uređenih ćelija, skladištenje populacija uređenih ćelija i slično.

[0019] Pored toga, opisani su postupci za korišćenje automatizovanog multi-modularnog instrumenta za uređivanje ćelija. U nekim postupcima, elektrokompetentne ćelije se pružaju direktno u instrument, poželjno sa željenom optičkom gustinom, i prenose se u modul za transformaciju. U nekim postupcima, ćelije se prenose u modul za uzgoj, gde se uzgajaju do željene optičke gustine. Ćelije se zatim prenose iz bočice za uzgoj u modul za filtriranje gde se koncentrišu i opciono postaju elektrokompetentne. Ćelije se zatim prenose u modul za transformaciju.

[0020] U nekim aspektima, sastavljene kasete nukleinske kiseline se pružaju direktno u instrument i prenose se u modul za transformaciju. U nekim aspektima, nukleinske kiseline, kao što je vektorska kičma i jedna ili više kaseta za uređivanje oligonukleotida, prenose se u modul za sastavljanje nukleinske kiseline bilo istovremeno ili uzastopno sa uvođenjem ili pripremom ćelije. U ovom aspektu, nukleinske kiseline se sastavljaju, uklanjaju se soli (npr. putem razmene tečnosti ili osmoze) i prenose u modul za transformaciju kako bi se elektroporisale u elektrokompetentne ćelije. Elektroporacija ili transfekcija se odvija u modulu za transformaciju, zatim se ćelije prenose u modul za oporavak/uređivanje koji opciono uključuje odabir ćelija koje sadrže jedno ili više uređivanja genoma. Nakon oporavka/uređivanja/odabira, ćelije se mogu preuzeti i direktno koristiti za istraživanje ili sačuvati za dalja istraživanja, ili se može izvesti još jedan krug (ili više krugova) uređivanja genoma ponavljanjem koraka uređivanja unutar instrumenta.

[0021] Takođe su opisane biblioteke ćelija kreirane korišćenjem automatizovanog multi-modularnog instrumenta za uređivanje ćelija za nukleazom-usmereno uređivanje genoma, gde instrument sadrži: kućište; posudu konfigurisana za prijem ćelija i jedne ili više racionalno dizajniranih nukleinskih kiselina koje sadrže sekvence za olakšavanje događaja nukleazom-usmerenog uređivanja genoma u ćelijama; modul za transformaciju za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije; modul za uređivanje koji omogućava da se događaji nukleazom-usmerenog uređivanja genoma dešavaju u ćelijama, i procesor konfigurisan da upravlja automatizovanim multi-modularnim instrumentom za uređivanje ćelija na osnovu korisničkog unosa, gde događaji nukleazom-usmerenog uređivanja genoma kreirani od strane automatizovanog instrumenta rezultuju bibliotekom ćelija koja se sastoji od pojedinačnih ćelija sa racionalno dizajniranim uređenjima.

[0022] U nekim slučajevima, biblioteka ćelija sadrži biblioteku ćelija mutageneze zasićenja. U nekim slučajevima, biblioteka ćelija sadrži biblioteku ćelija zamene promotera. U drugim slučajevima, biblioteka ćelija sadrži biblioteku ćelija zamene terminatora. U drugim slučajevima, biblioteka ćelija sadrži biblioteku ćelija zamene sa jednim nukleotidnim polimorfizmom (SNP). U drugim slučajevima, biblioteka ćelija sadrži biblioteku ćelija zamene promotera.

[0023] U nekim implementacijama, biblioteka se sastoji od najmanje 100.000 uređenih ćelija, a u nekim drugim implementacijama biblioteka se sastoji od najmanje 1.000.000 uređenih ćelija.

[0024] U nekim implementacijama, nukleazom-usmereno uređivanje genoma je RNG-usmereno uređivanje genoma. U poželjnom slučaju, instrument je konfigurisan za upotrebu inducibilne nukleaze. Nukleaza može biti, npr., hemijski indukovana, virusno indukovana, indukovana svetlom, temperaturom ili toplotom.

[0025] U nekim implementacijama, instrument pruža multipleksno uređivanje genoma više ćelija u jednom ciklusu. U nekim slučajevima, instrument ima mogućnost da uređuje genom od najmanje 5 ćelija u jednom ciklusu. U drugim slučajevima, instrument ima mogućnost da uređuje genom od najmanje 100 ćelija u jednom ciklusu. U drugim slučajevima, instrument ima mogućnost da uređuje genom od najmanje 1000 ćelija u jednom ciklusu. U drugim slučajevima, instrument ima mogućnost da uređuje genom od najmanje 10.000 ćelija u jednom ciklusu. U određenim slučajevima, automatizovani multi-modularni instrumenti za uređivanje ćelija imaju mogućnost da uređuju genom od najmanje 10<4>, 10<5>, 10<6>10<7>, 10<8>, 10<9>, 10<10>, 10<11>, 10<12>, 10<13>, 10<14>ili više ćelija u jednom ciklusu.

[0026] Broj genomskih mesta u populaciji ćelija koja se mogu ciljati za uređivanje u jednom ciklusu može biti između 2-10.000.000.

[0027] U nekim slučajevima koji uključuju rekurzivno uređivanje, automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija omogućava uvođenje dva ili više uređivanja genoma u ćelije, gde se po jedno uređivanje genoma dodaje genomima populacije ćelija za svaki ciklus. Shodno tome, u nekim slučajevima, automatizovani multi-modularni instrumenti za uređivanje ćelija prema predmetnom pronalasku korisni su za uzastopno pružanje dva ili više uređivanja po ćeliji u populaciji ćelija po ciklusu, tri ili više uređivanja po ćeliji u populaciji ćelija, pet ili više uređivanja po ćeliji u populaciji, ili 10 ili više uređivanja po ćeliji u jednom ciklusu za ćelijsku populaciju.

[0028] U specifičnim slučajevima, automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija je u stanju da pruži efikasnost uređivanja od najmanje 10% ćelija uvedenih u modul za uređivanje po ciklusu, poželjno efikasnost uređivanja od najmanje 20% ćelija uvedenih u modul za uređivanje po ciklusu, poželjnije efikasnost uređivanja od najmanje 25% ćelija uvedenih u modul za uređivanje po ciklusu, još poželjnije efikasnost uređivanja od najmanje 30% ćelija uvedenih u modul za uređivanje automatizovanog multimodularnog instrumenta za uređivanje ćelija po ciklusu, i još poželjnije efikasnost uređivanja od najmanje 40% ćelija uvedenih u modul za uređivanje po ciklusu i još poželjnije 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više ćelija uvedenih u modul za uređivanje po ciklusu.

[0029] Ostale karakteristike, prednosti i aspekti biće detaljnije opisani u nastavku.

KRATAK OPIS SLIKA

[0030] Prateće slike, koji su uključene i čine deo specifikacije, ilustruju jedno ili više otelotvorenja i, zajedno sa opisom, objašnjavaju ova otelotvorenja. Prateće slike nisu nužno date u razmeri. Sve dimenzije vrednosti ilustrovane na pratećim grafikonima i slikama služe samo u svrhu ilustracije i mogu ali ne moraju predstavljati stvarne ili željene vrednosti ili dimenzije. Gde je primenljivo, neke ili sve karakteristike možda neće biti ilustrovane kako bi se pomoglo u opisu osnovnih karakteristika. Na slikama:

Slike 1A i 1B prikazuju planski pogled i pogled u perspektivi primera otelotvorenja automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija za multipleksovano uređivanje genoma više ćelija korišćenjem zamenjivih kertridža kao dela instrumenta.

Slike 2A i 2B prikazuju bočni i prednji poglede na automatizovani multi-modulrani instrument za obradu ćelija na Slikama 1A i 1B.

Slike 2C i 2D prikazuju drugi primer šasije automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija.

Slike 3A-3C prikazuju pogled sa strane, presek i pogled u perspektivi primera modula za ispiranje ćelija i/ili koncentracije za upotrebu u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija.

Slika 4 prikazuje primer kombinacije modula za sastavljanje nukleinske kiseline i modula za prečišćavanje za upotrebu u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija.

Slika 5A prikazuje primer ugrađenog modula za elektroporaciju za upotrebu u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija.

Slike 5B i 5C prikazuju primer modula za protočnu elektroporaciju za jednokratnu upotrebu za upotrebu u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija.

Slike 6A-6B prikazuju primer kertridža za pranje za upotrebu u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija.

Slike 6C-6E prikazuje primer kertridža za reagens za upotrebu u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija.

Slike 7A-7C pružaju funkcionalni blok dijagram i dva pogleda iz perspektive primera modula za filtriranje za upotrebu u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija.

Slika 7D je pogled iz perspektive primera filter kertridža za upotrebu u automatizovanom multimodularnom instrumentu za obradu ćelija.

Slike 8A-8F prikazuju primere modula za uzgoj ćelija za upotrebu u automatizovanom multimodularnom instrumentu za obradu ćelija.

Slika 9 je dijagram toka primera postupka za automatizovanu multi-modularnu obradu ćelija.

Slika 10A je dijagram toka prvog primera toka rada za automatizovanu obradu bakterijskih ćelija pomoću automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija.

Slika 10B je dijagram toka drugog primera toka rada za automatizovanu obradu bakterijskih ćelija pomoću automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija.

Slika 10C je dijagram toka primera toka rada za automatizovanu ćelijsku obradu ćelija kvasca pomoću automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija.

Slika 11 ilustruje primer grafičkog korisničkog interfejsa za davanje instrukcija i primanje povratnih informacija od automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija.

Slika 12A je funkcionalni blok dijagram sistema drugog primera otelotvorenja automatizovanog multimodularnog instrumenta za obradu ćelija za multipleksno uređivanje genoma više ćelija.

Slika 12B je funkcionalni blok dijagram sistema još jednog primera otelotvorenja automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija za rekurzivno, multipleksno uređivanje genoma više ćelija.

Slika 13 je primer kontrolnog sistema za upotrebu u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija.

DETALJAN OPIS ILUSTRATIVNIH OTELOTVORENJA

[0031] Opis dat u nastavku u vezi sa priloženim crtežima treba da bude opis različitih, ilustrativnih otelotvorenja predmetne materije. Specifične karakteristike i funkcionalnosti su opisane u vezi sa svakim ilustrativnim otelotvorenjem; međutim, stručnjacima će biti očigledno da se obelodanjena otelotvorenja mogu praktikovati bez svake od tih specifičnih karakteristika i funkcionalnosti.

[0032] Praksa tehnika opisanih ovde može koristiti tehnike navedene kod Green, i dr., Eds. (1999), Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); Weiner, Gabriel, Stephens, Eds. (2007), Genetic Variation: A Laboratory Manual; Dieffenbach, Dveksler, Eds. (2003), PCR Primer: A Laboratory Manual; Bowtell i Sambrook (2003), Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis; Sambrook i Russell (2006), Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual; i Green i Sambrook, (Molecular Cloning: A Laboratory Manual.4th, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2014); Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) W.H. Freeman, New York N.Y.; Gait, „Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach“ 1984, IRL Press, London; Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry treće izdanje, W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.; i Berg i dr. (2002) Biochemistry, peto izdanje, W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.

[0033] Treba imati na umu da, kako se koristi i ovde u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju reference za množinu osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na „oligo“ se odnosi na jedan ili više oligoa koji služe istoj funkciji, na „postupke“ uključuje upućivanje na ekvivalentne korake i postupke poznate stručnjacima, i tako dalje. To jest, osim ako je izričito drugačije naznačeno, kako se oblici jednine ovde koriste uključuju oblike množine. Pored toga, treba razumeti da izrazi kao što su „levo“, „desno“, „gore“, „dole“, „prednji“, „pozadi“, „bočno“, „visina“, „dužina“, „širina“, „gornji“, „donji“, „unutrašnji“, „spoljašnji“, „unutarnji“, „spoljni“ koji se ovde mogu koristiti opisuju samo referentne tačke i ne ograničavaju nužno otelotvorenja predmetnog obelodanjenja na bilo koju određenu orijentaciju ili konfiguraciju. Štaviše, izrazi kao što su „prvi“, „drugi“, „treći“ itd., samo identifikuju jedan od brojnih delova, komponenti, koraka, operacija, funkcija i/ili referentnih tačaka kako je ovde obelodanjeno, i takođe i ne ograničavaju nužno otelotvorenja predmetnog obelodanjenja na bilo koju konfiguraciju ili orijentaciju.

[0034] Štaviše, izrazi „približno“, „otprilike“, „manji“ i slični izrazi

generalno se odnose na raspone koji uključuju identifikovanu vrednost unutar margine od 20%, 10% ili

poželjno 5% u određenim otelotvorenjima, i bilo koje vrednosti između njih.

[0035] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi korišćeni ovde imaju isto značenje koje uobičajeno razume stručnjak iz oblasti kojoj predmetno obelodanjenje pripada.

[0036] Kada je naveden raspon vrednosti, podrazumeva se da je svaka međuvrednost, između gornje i donje granice tog raspona i bilo koje druge navedene ili međuvrednosti u tom navedenom rasponu, obuhvaćena predmetnim obelodanjenjem. Gornje i donje granice ovih manjih raspona mogu nezavisno biti uključene u manje raspone, i takođe su obuhvaćene u okviru obelodanjenja, podložno bilo kojoj posebno isključenoj granici u navedenom rasponu. Kada navedeni raspon uključuje jedno ili oba ograničenja, rasponi koji isključuju oba navedena ograničenja su takođe uključeni u obelodanjenje.

[0037] Referenca u celoj specifikaciji na „jedno otelotvorenje“ ili „otelotvorenje“

znači da je određena karakteristika, struktura ili karakteristika opisana u vezi sa otelotvorenjem uključena u najmanje jednu varijantu obelodanjenja predmetne materije. Prema tome, pojavljivanje fraza „u jednom otelotvorenju“ ili „u otelotvorenju“ na različitim mestima u specifikaciji ne odnosi se nužno na istu varijantu.

[0038] Dalje, posebne karakteristike, strukture ili karakteristike mogu se kombinovati na bilo koji pogodan način u jednom ili više otelotvorenja. Dalje, predviđeno je da otelotvorenja obelodanjenja predmetne materije obuhvataju njegove modifikacije i varijacije.

Uvod i pregled

[0039] U odabranim otelotvorenjima, ovde opisani automatizovani multi-modulrani instrumenti za uređivanje ćelija, sistemi i postupci mogu se koristiti u multipleksnom uređivanju genoma u živim ćelijama, kao i u postupcima za konstruisanje biblioteka populacija uređenih ćelija. Ovde obelodanjeni automatizovani multi-modularni instrumenti za uređivanje ćelija mogu se koristiti sa različitim tehnikama za uređivanje genoma, i posebno sa nukleazom-usmerenim uređivanjem genoma. Automatizovani multi-modularni instrumenti za uređivanje ćelija predmetnog obelodanjenja pružaju nove postupke za uvođenje sekvenci nukleinskih kiselina koje ciljaju na genomska mesta za uređivanje genoma živih ćelija, uključujući postupke za konstruisanje biblioteka koje se sastoje od različitih klasa uređivanja genoma za kodirajuće regione, nekodirajuće regione, ili oboje. Automatizovani multi-modularni instrumenti za uređivanje ćelija posebno su pogodni za uvođenje uređivanja genoma u više ćelija u jednom ciklusu, čime se generišu biblioteke ćelija koje imaju jedno ili više uređivanja genoma na automatizovan, multipleksan način. Automatizovani multimodularni instrumenti za uređivanje ćelija takođe su pogodni za uvođenje dva ili više uređivanja, na primer, uređenja različitih ciljanih genomskih mesta u pojedinačnim ćelijama populacije ćelija. Bilo jedno ili više, ova uređivanja genoma su poželjno racionalno dizajnirana uređenja; odnosno nukleinske kiseline koje su dizajnirane i kreirane da uvedu specifična uređenja u ciljane regione unutar genoma ćelije. Sekvence koje se koriste za olakšavanje događaja uređivanja genoma uključuju sekvence koje pomažu u vođenju razdvajanja nukleaze, uvođenju uređivanja genoma u region od interesa, i/ili oboje. Ove sekvence takođe mogu uključiti uređenje regiona genoma ćelije kako bi se omogućilo praćenje specifične racionalno dizajnirana uređenja u genomu ćelije. O takvim postupcima uvođenja uređenja u ćelije ima reči u, npr. SAD patentu br. US 9,982,278, pod nazivom „CRISPR enabled multiplexed genome engineering,“ od Gill i dr., i SAD patentu br.

10,017,760, prijava serijski br.15/632,222, pod nazivom „Methods for generating barcoded combinatorial libraries,“ od Gill i dr.

[0040] Takve nukleinske kiseline i oligonukleotidi (ili „oligoni“) imaju za cilj da uključe, ali nisu ograničeni na, polimerni oblik nukleotida koji može imati različite dužine, uključujući ili dezoksiribonukleotide ili ribonukleotide, ili njihove analoge. Nukleinske kiseline i oligonukleotidi za upotrebu u ilustrativnim otelotvorenjima mogu biti modifikovani na jednom ili više položaja kako bi se poboljšala stabilnost uvedena tokom hemijske sinteze ili naknadne enzimske modifikacije ili kopiranja polimerazom. Ove modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, uključivanje jedne ili više alkilovanih nukleinskih kiselina, zaključanih nukleinskih kiselina (LNA), peptidnih nukleinskih kiselina (PNA), fosfonata, fosfotioata u oligomer. Primeri modifikovanih nukleotida obuhvataju, ali nisu ograničeni na 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-hlorouracil, 5-jodouracil, hipoksantin, ksantin, 4-acetilcitozin, 5-(karboksihidroksilmetil)uracil, 5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin, 5-karboksimetilaminometiluracil, dihidrouracil, beta-D-galaktozilkjuozine, inozin, N6-izopenteniladenin, 1-metilguanin, 1-metilinozin, 2,2-dimetilguanin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, 3-metilcitozin, 5-metilcitozin, N6-adenin, 7-metilguanin, 5-metilaminometiluracil, 5-metoksiaminometil-2-tiouracil, beta-D-manosilkjuozin, 5'-metoksikarboksimetiluracil, 5-metoksiuracil, 2-metiltio-D46-izopenteniladenin, uracil-5-oksisirćetna kiselina (v), vibutoksozin, pseudouracil, kjuozin, 2-tiocitozin, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, uracil-5-oksisirćetna kiselina metilester, uracil-5-oksisirćetna kiselina (v), 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboksipropil) uracil, (acp3)w, i 2,6-diaminopurin. Molekuli nukleinske kiseline takođe mogu biti modifikovani u baznom delu, šećernoj grupi ili fosfatnoj osnovi.

Nukleazom-usmereno uređivanje genoma

[0041] U odabranim otelotvorenjima, ovde opisani automatizovani multi-modularni instrumenti za uređivanje ćelija koriste sistem za nukleazom-usmereno uređivanje genoma. Postoji više različitih sistema zasnovanih na nukleazama za uređivanje genoma organizma, i svaki se može koristiti u pojedinačnom sistemu za uređivanje, u sekvencijalnim sistemima za uređivanje (npr., koristeći različite nukleazomusmerene sisteme uzastopno da pruže dva ili više uređivanja genoma u ćeliji) i/ili rekurzivne sisteme za uređivanje, (npr. korišćenje jednog nukleazom-usmerenog sistema za uvođenje dva ili više uređivanja genoma u ćeliju). Primeri sistema za nukleazom-usmereno uređivanje genoma opisani su ovde, iako bi stručnjak nakon čitanja predmetnog obelodanjenja prepoznao da su drugi enzimom-usmereni sistemi uređivanja takođe korisni u automatizovanim multi-modularnim instrumentima za uređivanje ćelija u ilustrativnim otelotvorenjima.

[0042] Treba napomenuti da automatizovani sistemi kako su ovde izloženi mogu da koriste nukleaze za razdvajanje genoma i uvođenje uređenja u ciljani genomski region korišćenjem instrumenta obelodanjenja.

[0043] U posebnim aspektima ilustrativnih otelotvorenja, sistem za uređivanje nukleaze je inducibilni sistem koji omogućava kontrolu vremena uređivanja. Inducibilni sistem može uključivati inducibilno eksprimiranje nukleaze, inducibilno eksprimiranje uređivačkih nukleinskih kiselina ili oboje. Sposobnost modulacije aktivnosti nukleaze može smanjiti razdvajanje van cilja i olakšati precizno dizajniranje genoma. Brojni različiti inducibilni sistemi se mogu koristiti sa automatizovanim multi-modularnim instrumentima za uređivanje ćelija predmetnog obelodanjenja, kao što će biti očigledno stručnjaku nakon čitanja predmetnog obelodanjenja.

[0044] U određenim aspektima, razdvajanje pomoću nukleaze se takođe može koristiti sa automatizovanim multi-modularnim instrumentima za uređivanje ćelija ilustrativnih otelotvorenja kako bi se odabrale ćelije sa uređivanjima genoma u ciljanom regionu. Na primer, ćelije koje su bile podvrgnute uređivanju genoma koje uklanja određeno mesto za prepoznavanje nukleaze (npr. putem homologne rekombinacije) mogu da se izaberu korišćenjem automatizovanih instrumenata i sistema za multi-modularno uređivanje ćelija ilustrativnih otelotvorenja tako što se ćelije izlažu nukleazi nakon takvog uređenja. DNK u ćelijama bez uređivanja genoma će se razdvojiti i kasnije će imati ograničen rast i/ili će propasti, dok ćelije koje su dobile uređivanja genoma koje uklanja mesto za prepoznavanje nukleaze neće biti pod uticajem naknadnog izlaganja nukleazi.

[0045] Ako ćelija ili populacija ćelija uključuje nukleazu vođenu nukleinskom kiselinom koja kodira DNK koja je indukovana molekulom induktora, nukleaza će biti eksprimirana samo u prisustvu molekula induktora. Alternativno, ako ćelija ili populacija ćelija uključuje nukleazu vođenu nukleinskom kiselinom koja kodira DNK koja je potisnuta molekulom represora, nukleaza će biti eksprimirana samo u odsustvu molekula represora.

[0046] Na primer, opisani su inducibilni sistemi za uređivanje pomoću RNK-vođene nukleaze, koji koriste hemijsku indukciju da ograniče privremenu izloženost ćelija RNK-vođenoj nukleazei. (Publikacija SAD patentnih prijava 2015/0291966 A1 od Zhang i dr., pod nazivom „Inducible DNA Binding Proteins and Genome Perturbation Tools and Applications Thereof,“ podnesena 23. januara 2015; pogledati takođe inducibilne lentivirusne vektore eksprimiranja dostupne od Horizon/Dharmaeon. Lafayette, CO. Za dodatne tehnike, pogledati npr. CampbelL Targeting protein function: the expanding toolkit for conditional disruption Biochem J., 473(17): 2573-2589 (2016).

[0047] U drugim primerima, virusom-inducibilna nukleaza može da se koristi za indukciju uređivanja gena u ćelijama. Pogledati, npr. Dong, Establishment of a highly efficient virus-inducible CRISPR/Cas9 system in insect cells, Antiviral Res., 130:50-7 (2016). U drugom primeru, za inducibilno eksprimiranje nukleinskom kiselinom-usmerenih nukleaza, varijante se mogu uključiti i isključiti u ćelijama sisara sa 4-hidroksitamoksifenom (4-HT) spajanjem nukleaze sa domenom estrogenskog receptora koji vezuje hormon (ERT2). (Liu, i dr.. Nature Chemical Biology, 12:980-987 (2016) i pogledati Publikaciju međunarodne prijave patenta WO 2017/078631 A1 od Tan, pod nazivom „Chemical-Inducible Genome Engineering Technology,“ podnesena 7. novembra 2016.

[0048] Pored toga, razvijen je niz kontrolnih sistema za regulaciju gena za kontrolisano eksprimiranje gena u ćelijama, kako prokariotskim tako i eukariotskim. Ovi sistemi uključuju sistem za aktivaciju transkripcije kontrolisan tetraciklinom (Tet-On/Tet-Off, Clontech, Inc. (Palo Alto, CA), Lac Switch Inducible sistem (SAD patent br.4,833,080 od Brent i dr., pod nazivom „Regulation of eucaryotic gene expression“), sistem eksprimiranja ekdizonom-inducibilnog gena (No i dr., Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice, PNAS, 93(8):3346-3351 (1996)), i kumati sistem za prebacivanje gena (Mullick, i dr., The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells, BMC Biotechnology, 6:43 (2006)).

[0049] Ćelije koje se mogu uređivati korišćenjem automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija u ilustrativnim otelotvorenjima uključuju bilo koju prokariotsku, arhealnu ili eukariotsku ćeliju. Na primer, prokariotske ćelije za upotrebu sa ovim ilustrativnim otelotvorenjima mogu biti gram pozitivne bakterijske ćelije, npr. Bacillus subtilis, ili gram negativne bakterijske ćelije, npr. E. coli ćelije. Eukariotske ćelije za upotrebu sa automatizovanim multi-modularnim instrumentima za uređivanje ćelija u ilustrativnim otelotvorenjima obuhvataju sve biljne ćelije i bilo koje životinjske ćelije, npr. ćelije gljivica, ćelije insekata, ćelije vodozemaca, ćelije nematoda ili ćelije sisara.

Uređivanje genoma cinkov prst nukleazom

[0050] U odabranim otelotvorenjima, ovde opisani automatizovani instrumenti za multi-modularno uređivanje ćelija vrše uređivanje genoma cinkov prst nukleazom. Cinkov prst nukleaze (ZFN) su veštački restrikcioni enzimi koji se stvaraju spajanjem vezujućeg domena DNK cinkovog prsta sa domenom razdvajanja DNK. Domeni cinkovog prsta mogu se konstruisati tako da ciljaju specifične regione u genomu organizma. (Urnov i dr., Nature Reviews Genetics, 11:636-646 (2010); Publikacija međunarodne prijave patenta WO 2003/087341 A2 od Carroll i dr., pod nazivom „Targeted Chromosomal Mutagenesis Using Zinc Finger Nucleases,“ podnesena 22. januara 2003). Koristeći endogenu mašineriju organizma za popravku DNK, ZFN se mogu koristiti za precizno menjanje ciljanog regiona genoma. ZFN se mogu koristiti za onemogućavanje dominantnih mutacija kod heterozigotnih pojedinaca stvaranjem dvolančanih prekida („DSB“) u DNK u mutantnom alelu koji će, u odsustvu homolognog šablona, biti popravljen nehomolognim spajanjem krajeva (NHEJ). NHEJ popravlja DSB spajanjem dva kraja i obično ne proizvodi mutacije, pod uslovom da je rez čist i nekomplikovan. (Durai i dr., Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells, Nucleic Acids Res., 33(18):5978-90 (2005)). Ovaj mehanizam popravke se može koristiti za izazivanje grešaka u genomu putem indela ili hromozomskog preuređivanja, često čineći genske proizvode kodirane na toj lokaciji nefunkcionalnim.

[0051] Alternativno, DNK se može uvesti u genom u prisustvu egzogenih dvolančanih DNK fragmenata korišćenjem popravke zavisne od homologije (HDR). Zavisnost HDR od homologne sekvence za popravku DSB može se iskoristiti umetanjem željene sekvence unutar sekvence koja je homologna bočnim sekvencama DSB koja, kada se koristi kao šablon od strane HDR sistema, dovodi do stvaranja željenih promena unutar genomskog regiona od interesa.

[0052] Više parova ZFN se takođe može koristiti za potpuno uklanjanje čitavih velikih segmenata genomske sekvence (Lee i dr., Genome Res., 20 (1): 81-9 (2009); i Publikacija SAD patentnih prijava 2011/0082093 A1 od Gregory i dr. pod nazivom „Methods and Compositions for Treating Trinucleotide Repeat Disorders,“ podnesena 28. jula 2010). Prošireni CAG/CTG ponovljeni traktovi su genetska osnova za više od deset naslednih neuroloških poremećaja uključujući Hantingtonovu bolest, miotonsku distrofiju i nekoliko spinocerebelarnih ataksija. U ljudskim ćelijama se pokazalo da ZFN mogu usmeriti DSB na CAG ponavljanja i smanjiti ponavljanje sa dugih patoloških dužina na kratke, manje toksične dužine (Mittelman, i dr., Zinc-finger directed double-strand breaks within CAG repeat tracts promote repeat instability in human cells, PNAS USA, 106 (24): 9607-12 (2009); i Publikacija SAD patentnih prijava 2013/0253040 A1 od Miller i dr. pod nazivom „Methods and Compositions for Treating Huntington's Disease,“ podnesena 28. februara 2013).

Uređivanje genoma meganukleazom

[0053] U odabranim otelotvorenjima, automatizovano multi-modularno uređivanje ćelija, moduli, instrumenti i sistemi opisani ovde, vrše uređivanje genoma meganukleazom. Meganukleaze su identifikovane 1990-ih, i kasniji rad je pokazao da su one posebno obećavajuće oruđe za uređivanje genoma, jer su u stanju da efikasno indukuju homolognu rekombinaciju, generišu mutacije u kodirajućim ili nekodirajućim regionima genoma i menjaju okvire čitanja genoma od regiona kodiranja genoma. (pogledati, npr. Epinat, i dr., A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in eukaryotic cells, e.g., yeast and mammalian cells, Nucleic Acids Research, 31(11): 2952-2962; i SAD patent br.8,921,332 od Choulika i dr. pod nazivom „Chromosomal Modification Involving the Induction of Double-stranded DNA Cleavage and Homologous Recombination at the Cleavage Site,“ objavljen 30. decembra 2014.) Visoka specifičnost meganukleaza daje im visok stepen preciznosti i mnogo manju toksičnost za ćelije od drugih restrikcionih enzima koji se javljaju u prirodi.

Uređivanje efektorskom nukleazom sličnom aktivatoru transkripcije

[0054] U odabranim otelotvorenjima, ovde opisani moduli, instrumenti i sistemi za automatizovano multimodularno uređivanje ćelija, vrše uređivanje efektorskom nukleazom sličnom aktivatoru transkripcije.

Efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) su restrikcioni enzimi koji se mogu konstruisati da preseku specifične sekvence DNK. Nastaju spajanjem TAL efektorskog domena za vezivanje DNK sa domenom razdvajanja DNK (nukleaza koja seče DNK lance). Efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) mogu se konstruisati da se vežu za praktično bilo koju željenu sekvencu DNK, tako da kada se kombinuju sa nukleazom, DNK se može preseći na specifičnim mestima. (Pogledati, npr. Miller, i dr., A TALE nuclease architecture for efficient genome editing, Nature Biotechnology, 29 (2): 143-8 (2011); Boch, Nature Biotech.,TALEs of genome targeting, 29(2): 135-6 (2011); Publikacija međunarodne prijave patenta WO 2010/079430 A1 od Bonas i dr. pod nazivom „Modular DNA-binding Domains and Methods of Use,“ podnesena 12. januara 2010; Publikacija međunarodne prijave patenta WO 2011/072246 A2 od Voytas i dr. pod nazivom „TAL Effector-Mediated DNA Modification,“ podnesena 10. decembra 2010).

[0055] Poput ZFN, TALEN mogu uređivati genome indukujući DSB. TALEN-kreirani DSB specifični za mesto na ciljanim regionima se popravljaju putem NHEJ ili HDR, što rezultuje ciljanim uređenjima genoma. TALEN se mogu koristiti za uvođenje indela, preuređivanja ili za uvođenje DNK u genom preko NHEJ u prisustvu egzogenih dvolančanih fragmenata DNK.

Uređivanje RNK-vođenom nukleazom (RGN)

[0056] U određenim aspektima, uređivanje genoma automatizovanim multi-modularnim instrumentima za uređivanje ćelija u ilustrativnim otelotvorenjima koriste tehnike grupisanih, redovno raspoređenih kratkih palindromskih ponavljanja (CRISPR), u kojima se RNK-vođene nukleaze (RGN) koriste za uređivanje specifičnih ciljanih regiona u genomu organizma. Dostavljanjem RGN kompleksa sa sintetičkom vodič RNK

1

(gRNK) u ćeliju, genom ćelije može biti isečen na željenom mestu, omogućavajući uređenja ciljanog regiona genoma. Vodeća RNK pomaže RGN proteinima da prepoznaju i preseku DNK ciljanog regiona genoma. Manipulisanjem nukleotidnom sekvencom vodeće RNK, RGN sistem bi mogao biti programiran da cilja bilo koju sekvencu DNK za razdvajanje.

[0057] RGN sistem koji se koristi sa automatizovanim multi-modularnim instrumentima za uređivanje ćelija u ilustrativnim otelotvorenjima može da izvrši uređivanje genoma korišćenjem bilo kog RNA-vođenog sistema nukleaze sa mogućnošću isecanja i lepljenja na željeni ciljani genomski region. U određenim aspektima, RNK-vođen sistem nukleaze može da koristi dva odvojena molekula RNK kao gRNK, na primer, CRISPR RNK (crRNK) i transaktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNK). U drugim aspektima, gRNK može biti jedna gRNK koja uključuje i crRNK i tracrRNK sekvence.

[0058] U određenim aspektima, uređivanje genoma uvodi željenu promenu DNK u ciljani region i uklanja region proto-spejser motiva (PAM) iz ciljanog regiona, čime se onemogućava bilo kakvo dodatno uređivanje genoma u tom ciljanom regionu, na primer, nakon izlaganja RNK-vođenoj nukleazi kompleksiranoj sa sintetičkom gRNK komplementarnom ciljanom regionu. U ovom aspektu, prvi događaj uređivanja može biti, npr., događaj RNG-usmerenog uređivanja genoma ili događaj homologne rekombinacije, i ćelije koje imaju željeno uređenje mogu biti izabrane korišćenjem RGN kompleksa sa sintetičkom gRNK komplementarnom ciljanom regionu. Ćelije koje nisu bile podvrgnute prvom događaju uređivanja biće isečene i stoga neće nastaviti da budu održive prema odgovarajućim kriterijumima odabira. Ćelije koje sadrže željenu mutaciju neće biti isečene, jer više neće sadržati neophodno PAM mesto, i nastaviće da rastu i razmnožavaju se u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za uređivanje ćelija.

[0059] Kada se RGN proteinski sistem koristi za odabir, potrebna je prvenstveno aktivnost sečenja; stoga RNK-vođen proteinski sistem nukleaze može biti bilo isti kao onaj koji se koristi za uređivanje, ili može biti RGN proteinski sistem koji je efikasan u sečenju korišćenjem određenog PAM mesta, ali ne mora nužno da bude efikasan u uređivanju na mestu. Jedan važan aspekt nukleaze koja se koristi za odabir je prepoznavanje PAM mesta koje je zamenjeno korišćenjem pristupa uređivanja iz prethodne operacije uređivanja genoma.

Uređivanje genoma homolognom rekombinacijom

[0060] U drugim aspektima, uređivanje genoma automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija u ilustrativnim otelotvorenjima može da koristi postupke homologne rekombinacije uključujući cre-lox tehniku i FRET tehniku. Homologna rekombinacija specifična za mesto razlikuje se od opšte homologne rekombinacije po tome što su kratke specifične DNK sekvence, koje su potrebne za prepoznavanje rekombinaze, jedina mesta na kojima se rekombinacija dešava. Rekombinacija specifična za mesto zahteva specijalizovane rekombinaze da prepoznaju mesta i katalizuju rekombinaciju na ovim mestima. Pokazalo se da brojni rekombinacioni sistemi koji su izvedeni iz bakteriofaga i kvasca, od kojih svaki sadrži rekombinazu i specifična srodna mesta, rade u eukariotskim ćelijama u svrhu integracije DNK i stoga su primenljivi za upotrebu u predmetnom pronalasku, i ovo uključuje bakteriofag PI Cre/lox, FLP-FRT sistem kvasca i Dre sistem familije tirozinskih rekombinaza specifičnih za mesto. Takvi sistemi i postupci upotrebe opisani su, na primer, u SAD patentima br.7,422,889; 7,112,715; 6,956,146; 6,774,279; 5,677,177; 5,885,836; 5,654,182; i 4,959,317, koji govore o postupcima korišćenja takvih rekombinaza. Poznato je da drugi sistemi familije tirozina, kao što su bakteriofagna lambda Int integraza, HK2022 integraza, i pored toga sistemi koji pripadaju zasebnoj serinskoj porodici rekombinaza, kao što su integraze bakteriofaga phiC31, R4Tp901, rade u ćelijama sisara koristeći svoja odgovarajuća mesta rekombinacije, i takođe su primenjivi za upotrebu u predmetnom pronalasku. Primeri metodologije za homolognu rekombinaciju su opisani u SAD patentima br.6,689,610; 6,204,061; 5,631,153; 5,627,059; 5,487,992; i 5,464,764

Arhitektura instrumenta

[0061] Slike 1A i 1B prikazuju primer automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija 100 koji koristi izvorne materijale zasnovane na kertridžima (npr., reagensi, enzimi, nukleinske kiseline, rastvori za ispiranje, itd.). Instrument 100, na primer, može biti dizajniran kao stoni instrument za upotrebu u laboratorijskom okruženju. Instrument 100 može da sadrži mešavinu elemenata za višekratnu upotrebu i jednokratnu upotrebu za otelotvorenje različitih stepenastih operacija u sprovođenju automatizovanog razdvajanja genoma i/ili uređivanja u ćelijama. Izvorni materijali zasnovani na kertridžima, na primer, mogu biti pozicionirani u određenim oblastima na ploči 102 instrumenta 100 radi pristupa robotskom instrumentu za rukovanje 108. Kao što je ilustrovano na Slici 1B, ploča 102 može da sadrži zaštitni odvod tako da se zagađivači koji se prosipaju, kaplju ili prelivaju iz bilo kog od modula instrumenta 100 nalaze unutar ivice zaštitnog odvoda.

[0062] Prelazeći na Sliku 1A, instrument 100, u nekim implementacijama, uključuje kertridž za reagens 104 za uvođenje uzoraka DNK i drugih izvornih materijala u instrument 100, kertridž za pranje 106 za uvođenje eluenta i drugih izvornih materijala u instrument 100 i robotski sistem za rukovanje 108 za premeštanje materijala između modula (na primer, moduli 110a, 110b i 110c), posude za kertridže (na primer, posude za kertridže 104 i 106) i jedinice za skladištenje (npr. jedinice 112, 114, 116 i 118) instrumenta 100 kako bi izvršio automatizovano razdvajanje i/ili uređivanje genoma. Po završetku obrade ulaznih ćelija 106, u nekim otelotvorenjima, izlazne ćelije mogu biti prenete pomoću robotskog instrumenta za rukovanje 108 u jedinicu za skladištenje ili posudu smeštenu u, na primer, kertridž za reagens 104 ili kertridž za pranje 106 za privremeno skladištenje i kasnije preuzimanje.

[0063] Robotski sistem za rukovanje 108, na primer, može uključivati pumpu za izbacivanje vazduha 120 za prenos tečnosti iz različitih izvora materijala u kertridžima 104, 106 do različitih modula 110 i u jedinicu za skladištenje, koja može biti posuda u kertridžu za reagens 104 ili kertridžu za pranje 106. U drugim otelotvorenjima, robotski sistem za rukovanje 108 može uključivati glavu za hvatanje i postavljanje (nije ilustrovano) za prenos kontejnera sa izvornim materijalima (npr. cevi ili bočice) iz kertridža za reagens 104 i/ili kertridža za pranje 106 na različite module 110. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više kamera ili drugih optičkih senzora (nisu prikazani) potvrđuju pravilno kretanje i položaj robotskog uređaja za rukovanje duž portala 122.

[0064] U nekim otelotvorenjima, robotski sistem za rukovanje 108 koristi vrhove za prenos za jednokratnu upotrebu pružene u dovodu vrhova za prenos 116 (npr. nosač vrhova za pipete) za prenos izvornih materijala, reagensa (npr. sastavljanje nukleinske kiseline) i ćelija unutar instrumenta 100. Korišćeni transfer vrhovi 116, na primer, mogu biti odbačeni u jedinici za čvrsti otpad 112. U nekim implementacijama, jedinica za čvrsti otpad 112 sadrži pokretač za uklanjanje cevi, vrhova, bočica i/ili filtera sa glave za hvatanje i postavljanje robotskog sistema za rukovanje 108. Na primer, kao što je ilustrovano, robotski sistem za rukovanje 108 uključuje glavu za prikupljanje filtera 124.

[0065] U nekim otelotvorenjima, instrument 100 uključuje kivete elektroporatora sa kapalicama koje se povezuju sa pumpom za istiskivanje vazduha 120. U nekim otelotvorenjima, ćelije i reagens se usisavaju u kivetu za elektroporaciju kroz kapalicu, i kiveta se pomera u jedan ili više modula 110 od instrument 100.

[0066] U nekim implementacijama, instrumentom 100 upravlja sistem za obradu 126 kao što je sistem za obradu 1310 na Slici 13. Sistem za obradu 126 može biti konfigurisan da upravlja instrumentom 100 na osnovu korisničkog unosa. Na primer, korisnički unos može da primi instrument 100 preko kontrolnog displeja ekrana osetljivog na dodir 128. Sistem za obradu 126 može da kontroliše vreme, trajanje, temperaturu i druge operacije različitih modula 110 instrumenta 100. Prelazeći na Sliku 1B, sistem za obradu 126 može biti povezan na izvor napajanja 150 za rad instrumenta 100.

[0067] Vraćajući se Slici 1A, kertridž za reagens 104, kao što je ilustrovano, uključuje šesnaest rezervoara (matricu od 5 X 3 rezervoara, plus dodatni rezervoar) i modul za transformaciju protoka (uređaj za elektroporaciju) 110c. Kertridž za pranje 106 može biti konfigurisan za prijem velike cevi ili rezervoara za skladištenje, na primer, rastvora za pranje, ili rastvora koji se često koriste tokom iterativnog procesa. Dalje, u nekim otelotvorenjima, kertridž za pranje 106 može da sadrži niz manjih epruveta, bočica ili rezervoara za zadržavanje manjih zapremina, npr. izvornog medijuma, kao i posudu ili skladište za uređivane ćelije. Na primer, kertridž za pranje 106 može biti konfigurisan da ostane na mestu kada se dva ili više kertridža reagensa 104 uzastopno koriste i zamenjuju. Iako su kertridž za reagens 104 i kertridž za pranje 106 prikazani na Slici 1A kao odvojeni kertridži, u drugim otelotvorenjima, sadržaj kertridža za pranje 106 može da se ugradi u kertridž za reagens 104. U daljim otelotvorenjima, tri ili više kertridža se mogu ubaciti u automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija 100. U određenim otelotvorenjima, kertridž za reagens 104, kertridž za pranje 106 i druge komponente modula 110 u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija 100 su upakovane zajedno u komplet.

[0068] Kertridži za pranje i reagens 104, 106, u nekim implementacijama, su kompleti za jednokratnu upotrebu koji su pruženi za upotrebu u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija 100. Na primer, korisnik može da otvori i postavi svaki od kertridža za reagens 104 i kertridža za pranje 106 u okviru šasije automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija pre aktiviranja ćelijske obrade. Primeri šasije su detaljnije razmotreni u nastavku u vezi sa Slikama 2A do 2D.

[0069] Komponente kertridža 104, 106, u nekim implementacijama, označene su mašinski čitljivim oznakama, kao što su bar kodovi, za prepoznavanje od strane robotskog sistema za rukovanje 108. Na primer, robotski sistem za rukovanje 108 može da skenira kontejnere unutar svakog od kertridža 104, 106 za potvrdu sadržaja. U drugim implementacijama, mašinski čitljive oznake mogu biti označene na svakom kertridžu 104, 106, i sistem za obradu automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija 100 može da identifikuje mapu uskladištenih materijala na osnovu mašinski čitljivih oznaka.

[0070] Prelazeći na Slike 6A-6B, u nekim otelotvorenjima, kertridž za pranje 106 je kertridž za pranje 600 koji uključuje par velikih boca 602, komplet od četiri male epruvete 604 i veliku epruvetu 606 koja se drži u telu kertridža 608. Svaka od boca 602 i epruvete 604, 606, u nekim otelotvorenjima, su zapečaćene folijom koja se može probiti za pristup automatizovanom sistemu za rukovanje tečnostima, kao što su kapalica ili pipetor. U drugim otelotvorenjima, svaka od boca 602 i epruvete 604, 606 uključuje zaptivku za pristup. Vrh svake od boca 602 i epruvete 604, 606, u nekim otelotvorenjima, označen je mašinski čitljivim oznakama (nije ilustrovano) za automatsku identifikaciju sadržaja.

[0071] U nekim otelotvorenjima, svaka velika boca 602 sadrži rastvor za pranje. Rastvori za pranje mogu biti isti ili drugačiji rastvori za pranje. U nekim primerima, rastvori za pranje mogu da sadrže, na primer, pufer, pufer i 10% glicerola, 80% etanola.

[0072] U nekim otelotvorenjima, poklopac 610 pričvršćuje boce 602 i epruvete 604, 606 unutar tela kertridža 608. Prelazeći na Sliku 6B, poklopac 610 može da sadrži otvore za pristup svakoj od boca 602 i epruvete 604, 606. Dalje, poklopac 610 može da sadrži mašinski čitljive oznake 612 za identifikaciju tipa kertridža (npr. pristup mapi sadržaja kertridža). Alternativno, svaki otvor može biti posebno označen sa pojedinačnim sadržajem.

[0073] Prelazeći na Slike 6C-E, u nekim implementacijama, kertridž za reagens 104 je kertridž za reagens 620 koji uključuje komplet od šesnaest malih epruveta ili bočica 626 (a-p) i modul za elektroporaciju 624 koji se nalazi u telu kertridža 622. Svaki od malih epruvete ili bočice 626, u nekim otelotvorenjima, zapečaćene su folijom koja se može probiti za pristup automatizovanom sistemu za rukovanje tečnošću, kao što je kapalica ili pipetor. U drugim otelotvorenjima, svaka od malih epruveta ili bočica 626 uključuje zaptivku za pristup. Vrh svake od malih epruveta ili bočica 626, u nekim otelotvorenjima, označen je mašinski čitljivim oznakama (nije ilustrovano) za automatsku identifikaciju sadržaja. Mašinski čitljive oznake mogu uključivati bar kod, QR kod ili drugo mašinski čitljivo kodiranje. Druga automatizovana sredstva za identifikaciju određenog kontejnera mogu uključivati kodiranje bojama, prepoznavanje simbola (npr. tekst, slika, ikonica, itd.) i/ili prepoznavanje oblika (npr. relativni oblik kontejnera). Umesto da budu obeleženi na samom sudu, u nekim otelotvorenjima, gornja površina tela kertridža i/ili poklopac kertridža mogu da sadrže mašinski čitljive oznake za identifikaciju sadržaja. Male epruvete ili bočice mogu biti iste veličine. Alternativno, višestruke zapremine epruveta ili bočica mogu biti pružene u kertridžu za reagens 620. U ilustrativnom primeru, svaka epruveta ili bočica može biti dizajnirana da sadrži između 2 i 20 mL, između 4 i 10 mL, ili oko 5 mL.

[0074] U ilustrativnom primeru, male epruvete ili bočice 626 mogu da sadrže po jedan naredni materijal: vektorsku kičmu, oligonukleotide, reagense za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline, uzorak ćelija koji daje korisnik, agens induktora, magnetne perle u puferu, etanol, antibiotik za odabir ćelija, reagense za eluiranje ćelija i nukleinske kiseline, uljni sloj, druge reagense i medijume za uzgoj i/ili oporavak ćelija.

[0075] U nekim otelotvorenjima, poklopac 628 pričvršćuje male epruvete ili bočice 626 unutar tela kertridža 622. Prelazeći na Sliku 6D, poklopac 628 može da sadrži otvore za pristup svakoj od malih epruveta ili bočica 626. Tri velika otvora 632 su istaknuta podebljanom (npr. plavom) trakom kako bi se označili položaji za dodavanje materijala koje dostavlja korisnik. Materijali koje dostavlja korisnik, na primer, mogu uključivati vektorsku kičmu, oligonukleotide i uzorak ćelija. Dalje, poklopac 610 može da sadrži mašinski

1

čitljive oznake 630 za identifikaciju tipa kertridža (npr., pristup mapi sadržaja kertridža). Alternativno, svaki otvor može biti posebno označen sa pojedinačnim sadržajem. U nekim implementacijama, kako bi se osiguralo pozicioniranje materijala koji dostavlja korisnik, bočice ili epruvete predviđene za punjenje u laboratorijskom okruženju mogu imati jedinstvene oblike ili veličine tako da se bočica ili epruveta sa uzorkom ćelije uklapaju samo u otvor za uzorak ćelija, u bočicu za oligonukleotide ili se epruveta uklapa samo u otvor oligonukleotida, i tako dalje.

[0076] Vraćajući se Slici 1A, takođe je ilustrovan robotski sistem za rukovanje 108 uključujući portal 122. U nekim primerima, robotski sistem za rukovanje 108 može uključivati automatizovani sistem za rukovanje tečnostima kao što su oni koje proizvodi Tecan Group Ltd. iz Mannedorfa, Švajcarska, Hamilton Company iz Rena, NV (pogledati, npr. WO2018015544A1 od Ott, pod nazivom „Uređaj za pipetiranje, sistem za obradu tečnosti i postupak za rad sistema za obradu tečnosti“), ili Beckman Coulter, Inc. iz Fort Kolinsa, Kolorado (pogledati, npr. US20160018427A1 od Striebl i dr., pod nazivom „Postupci i sistemi za kontrolu cevi i detekciju nivoa tečnosti“). Robotski sistem za rukovanje 108 može uključivati pipetor za istiskivanje vazduha 120. Kertridži za reagens 104, 106 omogućavaju posebno laku integraciju sa instrumentima za rukovanje tečnostima robotskog sistema za rukovanje 108, kao što je pipetor za istiskivanje vazduha 120. U nekim otelotvorenjima, samo pipetor za istiskivanje vazduha 120 se pomera pomoću portala 122, i različiti moduli 110 i kertridži 104, 106 ostaju nepokretni. Vrhovi za pipete 116 mogu biti pruženi za upotrebu sa pipetorom za pomeranje vazduha 120.

[0077] U nekim otelotvorenjima, automatizovani mehanički sistem kretanja (pokretač) (nije prikazan) dodatno snabdeva kontrolu kretanja XY ose ili kontrolu kretanja XYZ ose za jedan ili više modula 110 i/ili kertridža 104, 106 automatizovanog multi-modularnog sistema za obradu ćelija 100. Korišćeni vrhovi pipete 116, na primer, mogu da budu postavljeni od strane robotskog sistema za rukovanje u odlagalište otpada 112. Na primer, aktivni modul može da se podigne kako bi došao u kontaktno-dostupno pozicioniranje sa robotskim sistemom za rukovanje ili, obrnuto, da se spusti nakon korišćenja kako bi se izbegao uticaj na robotski sistem za rukovanje jer robotski sistem za rukovanje premešta materijale u druge module 110 u okviru automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija 100.

[0078] Automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija 100, u nekim implementacijama, uključuje modul za protočnu elektroporaciju 110c uključen u kertridž za reagens 104. Protočni konekcioni most 132 za elektroporaciju je, na primer, uključen sa uređajem za protočnu elektroporaciju nakon što se ćelije i nukleinske kiseline prenesu u uređaj putem ulaznog kanala. Most 132 pruža i zaptivanje nepropusno za tečnost i električnu vezu sa elektrodama, kao i kontrolu za sprovođenje elektroporacije unutar modula za elektroporaciju 110c. Na primer, konekcioni most za elektroporaciju 132 može biti povezan sa kontrolama za protočnu elektroporaciju 134 unutar elektronskog stalka 136 automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija 100.

[0079] U nekim implementacijama, automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija 100 uključuje dualne module za uzgoj ćelija 110a, 110b. Moduli za uzgoj ćelija 110a, 110b, kao što je ilustrovano, uključuju rotirajuću bočicu za uzgoj ćelija 130a, 130b. Najmanje jedan od modula za uzgoj ćelija 110a, 110b može dodatno da sadrži integrisani modul za filtriranje (nije ilustrovan). U alternativnim otelotvorenjima, modul za filtriranje ili modul za pranje i koncentraciju ćelija može umesto toga biti odvojen od modula za uzgoj ćelija 110a, 110b (npr., kao što je opisano u vezi sa modulom uzgoja ćelija 1210a i modulom za filtriranje 1210b na Slikama 12A i 12B). Moduli uzgoja ćelija 110a, 110b, na primer, mogu da sadrže karakteristike i funkcionalnosti o kojima se govori u vezi sa modulom za uzgoj ćelija 800 na Slici 8A-F.

[0080] Deo za filtriranje jednog ili oba modula za uzgoj ćelija 110a, 110b, u nekim otelotvorenjima, koristi zamenjive filtere uskladištene u kaseti za filtere 118. Na primer, robotski sistem za rukovanje može uključivati glavu za prikupljanje filtera 124 za podizanje i aktiviranje filtera za upotrebu sa jednim ili oba modula za uzgoj ćelija 110a, 110b. Glava za prikupljanje filtera prenosi filter u modul za uzgoj, pipetira ćelije iz modula za uzgoj, zatim pere i čini ćelije elektrokompetentnim. Medijum iz ćelija i tečnosti za pranje se odlažu u modul za otpad 114.

[0081] U nekim implementacijama, automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija 100 uključuje funkciju sastavljanja nukleinske kiseline i prečišćavanja (npr. modul za sastavljanje nukleinske kiseline) za kombinovanje materijala pruženih u kertridžu za reagens 104 u sastavljenu nukleinsku kiselinu za uređivanje ćelija. Dalje, operacija desalinifikacije ili prečišćavanja prečišćava sastavljene nukleinske kiseline i uklanja soli iz pufera tako da se nukleinske kiseline efikasnije elektroporišu u ćelije. Funkcija sastavljanja i prečišćavanja nukleinske kiseline može uključivati reakcionu komoru ili posudu za epruvetu (nije prikazano) i magnet (nije prikazano).

[0082] Iako je primer instrumenta 100 ilustrovan kao da uključuje određeni raspored modula 110, ova implementacija je samo u ilustrativne svrhe. Na primer, u drugim otelotvorenjima, više ili manje modula 110 može biti uključeno u instrument 100, i različiti moduli mogu biti uključeni, kao što je, na primer, modul za fuziju ćelija za proizvodnju hibridoma i/ili modul za proizvodnju proteina. Dalje, određeni moduli se mogu replicirati u okviru određenih otelotvorenja, kao što su duplirani moduli uzgoja ćelija 110a, 110b na Slici 1A.

[0083] U nekim otelotvorenjima, ćelije se modifikuju pre uvođenja u automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija. Na primer, ćelije se mogu modifikovati korišćenjem λ crvenog sistema za zamenu ciljanog gena sa genom otpornosti na antibiotike, obično za kanamicin ili hloramfenikol. (pogledati Datsenko i Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, PNAS USA, 97(12):6640-5 (2000); SAD patent br.6,509,156 B1 od Stewart i dr. pod nazivom „DNA Cloning Method Relying on the E. coli recE/recT Recombination System,“ objavljen 21. januara 2003.) U nekim otelotvorenjima, ćelije su možda već bile transformisane ili transficirane vektorom koji sadrži kasetu eksprimiranja za nukleazu. U drugom primeru, željeno uređenje gena može biti uvedena u ćelijsku populaciju pre uvođenja u automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija (npr. korišćenjem homologijom-usmerene popravke), i sistem koji se koristi za odabir ovih uređenja koristi nukleaze i/ili dodajte dodatna uređenja u populaciji ćelija.

[0084] Slike 2A do 2D ilustruju primere šasija 200 i 230 za upotrebu u desktop verzijama automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija. Na primer, šasije 200 i 230 mogu imati širinu od oko 24-48 inča, visinu od oko 24-48 inča i dubinu od oko 24-48 inča. Svaka od šasija 200 i 230 može biti dizajnirana da sadrži više modula i materijala za jednokratnu upotrebu koji se koriste u automatizovanoj obradi ćelija. Dalje, svaka šasija 200 i 250 može da montira robotski sistem za rukovanje za premeštanje materijala između modula.

[0085] Slike 2A i 2B prikazuju prvi primer šasije 200 automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija. Kao što je ilustrovano, šasija 200 uključuje poklopac 202 koji ima ručku 204 i šarke 206 za podizanje poklopca 202 i pristup unutrašnjosti šasije 200. Rešetka za hlađenje 214 može omogućiti protok vazduha preko unutrašnjeg ventilatora (nije prikazano). Dalje, šasija 200 se podiže pomoću podesivih nogu 220. Noge 220, na primer, mogu da pruže dodatni protok vazduha ispod šasije 200. Kontrolno dugme 216, u nekim otelotvorenjima, omogućava automatsko pokretanje i zaustavljanje obrade ćelije sa jednim dugmetom u okviru šasije 200.

[0086] Unutar šasije 200, u nekim implementacijama, robotski sistem za rukovanje 208 je postavljen duž portala 210 iznad kertridža 212a, 212b i modula. Kontrolna kola, cevi za rukovanje tečnostima, kontrole vazdušnih pumpi, ventili, termalne jedinice (npr. jedinice za grejanje i hlađenje) i drugi kontrolni mehanizmi, u nekim otelotvorenjima, smešteni su ispod ploče šasije 200, u oblasti kontrolne kutije 218.

[0087] Iako nije ilustrovan, u nekim otelotvorenjima, ekran za prikaz može biti postavljen na prednju stranu šasije 200, na primer pokrivajući deo poklopca 202. Ekran može da pruži informacije korisniku u vezi sa statusom obrade automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija. U drugom primeru, ekran za prikaz može prihvatiti unose od korisnika za sprovođenje obrade ćelije.

[0088] Slike 2C i 2D prikazuju drugi primer šasije 230 automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija. Šasija 230, kao što je ilustrovano, uključuje providna vrata 232 sa šarkom 234. Na primer, vrata se mogu pomerati ulevo od stranice kako bi omogućila pristup radnom delu šasije. Korisnik, na primer, može da otvori providna vrata 232 kako bi ubacio materijale, kao što su kertridži za reagense i kertridži za pranje, u šasiju 230.

[0089] U nekim otelotvorenjima, prednja strana šasije 230 dalje uključuje ekran (npr., uređaj za ekran osetljiv na dodir) 236 ilustrovan desno od vrata 232. Ekran 236 može da pruži informacije korisniku u vezi sa statusom obrade automatizovanog multi-modularnog instrument za obradu ćelija. U drugom primeru,

1

ekran 236 može prihvatiti unose od korisnika za sprovođenje obrade ćelije.

[0090] Rešetka za vazduh 238 na desnoj strani šasije 230 može da pruži protok vazduha unutar radnog područja (npr. iznad ploče) šasije 230 (npr. iznad ploče). Druga rešetka za vazduh 240 sa leve strane šasije 230 može da pruži protok vazduha unutar oblasti kontrolne kutije 242 (npr. ispod ploče) šasije 230. Iako nije ilustrovano, u nekim otelotvorenjima, noge kao što su noge 220 od šasije 200 mogu da podigne šasiju 230 iznad radne površine, pružajući dalji protok vazduha.

[0091] Unutar šasije 230, u nekim implementacijama, robotski sistem za rukovanje 248 je raspoređen duž portala 250 iznad kertridža 252a, 252b, zaliha materijala 254a, 254b (npr. vrhovi pipete i filteri) i modula 256 (dualne bočice za uzgoj). Kontrolna kola, cevi za rukovanje tečnostima, kontrole vazdušnih pumpi, ventili i drugi kontrolni mehanizmi, u nekim otelotvorenjima, smešteni su ispod ploče šasije 230, u oblasti kontrolne kutije 242.

[0092] U nekim otelotvorenjima, jedinica za tečni otpad 246 je montirana na levi spoljašnji zid šasije 230. Jedinica za tečni otpad 246, na primer, može da se montira spolja na šasiju 230 kako bi se izbegla potencijalna kontaminacija i kako bi se pružilo brzo pražnjenje i zamena jedinica za tečni otpad 246.

modul za sastavljanje nukleinske kiseline

[0093] Određena otelotvorenja automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija prema predmetnom pronalasku uključuju modul za sastavljanje nukleinske kiseline unutar instrumenta. modul za sastavljanje nukleinske kiseline je konfigurisan da prihvati nukleinske kiseline neophodne za olakšavanje željenih događaja uređivanja genoma. Modul za sastavljanje nukleinske kiseline takođe može biti konfigurisan da prihvati odgovarajuću vektorsku kičmu za sastavljanje vektora i naknadnu transformaciju u ćelije od interesa.

[0094] Generalno, izraz „vektor“ se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, molekule nukleinske kiseline koji su jednolančani, dvolančani ili delimično dvolančani; molekuli nukleinske kiseline koji uključuju jedan ili više slobodnih krajeva, koji su bez slobodnih krajeva (npr. kružni); molekule nukleinske kiseline koji uključuju DNK, RNK ili oboje; i druge varijante polinukleotida poznatih u struci. Jedan tip vektora je „plazmid“, koji se odnosi na kružnu dvolančanu DNK petlju u koju se mogu ubaciti dodatni DNK segmenti, kao što je standardna tehnika molekularnog kloniranja. Drugi tip vektora je virusni vektor, gde su DNK ili RNK sekvence izvedene iz virusa prisutne u vektoru za pakovanje u virus (npr. retrovirusi, replikacioni defektni retrovirusi, adenovirusi, adenovirusi sa defektnom replikacijom i adeno-povezani virusi). Virusni vektori takođe uključuju polinukleotide koje virus prenosi za transfekciju u ćeliju domaćina. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Drugi vektori (npr. neepizomalni vektori sisara) su integrisani u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i na taj način se repliciraju zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori su sposobni da usmeravaju eksprimiranje gena za koje su operativno povezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „vektori eksprimiranja“. Uobičajeni vektori eksprimiranja koji su korisni u tehnikama rekombinantne DNK su često u obliku plazmida. Dalja diskusija o vektorima je data ovde.

[0095] Rekombinantni vektori eksprimiranja mogu uključivati nukleinsku kiselinu u obliku pogodnom za transformaciju, i za neke sekvence nukleinskih kiselina, translaciju i eksprimiranje nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu, što znači da rekombinantni vektori eksprimiranja uključuju jedan ili više regulatornih elemenata - koji mogu biti odabrani na osnovu ćelija domaćina koje će se koristiti za eksprimiranje - koje su operativno povezane sa sekvencom nukleinske kiseline koja se eksprimira. U okviru rekombinantnog vektora eksprimiranja, „operativno povezan“ znači da je nukleotidna sekvenca od interesa povezana sa regulatornim elementima na način koji omogućava transkripciju, i za neke sekvence nukleinske kiseline, translaciju i eksprimiranje nukleotidne sekvence (npr. u sistemu in vitro transkripcije/translacije ili u ćeliji domaćinu kada se vektor uvodi u ćeliju domaćina). Odgovarajući postupci rekombinacije i kloniranja su obelodanjeni u SAD patentnoj prijavi ser. br.10/815,730, pod nazivom „Recombinational Cloning Using Nucleic Acids Having Recombination Sites“ objavljenoj 2. septembra 2004 kao US 2004-01711 A1.

[0096] U nekim slučajevima, regulatorni element je operativno povezan za jedan ili više elemenata ciljanog

1

sistema nukleaze tako da pokreće transkripciju, i za neke sekvence nukleinske kiseline, translaciju i eksprimiranje jedne ili više komponenti ciljanog sistema nukleaze.

[0097] U nekim slučajevima, vektor može da sadrži regulatorni element koji je operativno povezan za polinukleotidnu sekvencu koja kodira nukleazu vođenu nukleinskom kiselinom. Polinukleotidna sekvenca koja kodira nukleazu vođenu nukleinskom kiselinom može biti optimizovana kodonom za eksprimiranje u određenim ćelijama, kao što su prokariotske ili eukariotske ćelije. Eukariotske ćelije mogu biti ćelije kvasca, gljiva, algi, biljne, životinjske ili ljudske ćelije. Eukariotske ćelije mogu biti one ili izvedene iz određenog organizma, kao što je sisar, uključujući, ali ne ograničavajući se na čoveka, miša, pacova, zeca, psa ili sisara koji nije čovek, uključujući primate. Dodatno ili alternativno, vektor može uključiti regulatorni element koji je operativno povezan sa polinukleotidnom sekvencom, koji, kada se transkribuje, formira vodič RNK.

[0098] modul za sastavljanje nukleinske kiseline može se konfigurisati da izvodi širok spektar različitih tehnika sastavljanja nukleinske kiseline na automatizovan način. Tehnike sastavljanja nukleinske kiseline koje se mogu izvesti u modulu za sastavljanje nukleinske kiseline obelodanjenih automatizovanih instrumenata za multi-modularno uređivanje ćelija uključuju, ali nisu ograničene na, one postupke sastavljanja koji koriste restrikcione endonukleaze, uključujući PCR, BioBrick sklop (SAD patent 9,361,427 od Hillson pod nazivom „Scar-less Multi-part DNA Assembly Design,“ objavljen 7. juna 2016), kloniranje IIS tipa (npr. GoldenGate sklop; Publikacija evropske patentne prijave EP 2395087 A1 od Weber i dr. pod nazivom „System and Method of Modular Cloning,“ podnesena 6. jula 2010), i ciklusna reakcija ligaze (de Kok S, Rapid and Reliable DNA Assembly via Ligase Cycling Reaction, ACS Synth Biol., 3(2):97-106 (2014); Engler, i dr., PLoS One, A One Pot, One Step, Precision Cloning Method with High Throughput Capability, 3(11):e3647 (2008); SAD patent br.6,143,527 od Pachuk i dr. pod nazivom „Chain Reaction Cloning Using a Bridging Oligonucleotide and DNA Ligase,“ objavljen 7. novembra 2000). U drugim slučajevima, tehnike sastavljanja nukleinskih kiselina koje se izvode pomoću obelodanjenih automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija zasnovane su na preklapanjima između susednih delova nukleinskih kiselina, kao što su Gibson Assembly<®>, CPEC, SLIC, Ligase Cycling itd. Dodatni postupci sastavljanja uključuju popravku praznina u kvascu (Bessa, Improved gap repair cloning in yeast: treatment of the gapped vector with Taq DNA polymerase avoids vector self-ligation, Yeast, 29(10):419-23 (2012)), kloniranje prolaza (Ohtsuka, Lantibiotics: mode of action, biosynthesis and bioengineering, Curr Pharm Biotechnol, 10(2):244-51 (2009); SAD patent br.5,888,732 od Hartley i dr., pod nazivom „Recombinational Cloning Using Engineered Recombination Sites,“ objavljen 30. marta 1999; SAD patent br.6,277,608 od Hartley i dr. pod nazivom „Recominational Cloning Using Nucleic Acids Having Recombination Sites,“ objavljen 21. avgusta 2001), i kloniranje posredovano topoizomerazom (Udo, An Alternative Method to Facilitate cDNA Cloning for Expression Studies in Mammalian Cells by Introducing Positive Blue White Selection in Vaccinia Topoisomerase I-Mediated Recombination, PLoS One, 10(9):e0139349 (2015); SAD patent br.6,916,632 B2 od Chestnut i dr. pod nazivom „Methods and Reagents for Molecular Cloning,“ objavljen 12. jula 2005). Ove i druge tehnike sastavljanja nukleinskih kiselina su opisane kod, npr. Sands i Brent, Overview of Post Cohen-Boyer Methods for Single Segment Cloning and for Multisegment DNA Assembly, Curr Protoc Mol Biol., 113:3.26.1-3.26.20 (2016); Casini i dr., Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly, Nat Rev Mol Cell Biol., (9):568-76 (2015); Patron, DNA assembly for plant biology: techniques and tools, Curr Opinion Plant Biol., 19:14-9 (2014)).

[0099] Sastavljanje nukleinske kiseline je kontrolisano temperaturom u zavisnosti od tipa sastava nukleinske kiseline koji se koristi u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za uređivanje ćelija. Na primer, kada se PCR koristi u modulu za sastavljanje nukleinske kiseline, modul će imati sposobnost termocikliranja omogućavajući da se temperature menjaju između denaturacije, kalemljenja i ekstenzije. Kada se postupci sastavljanja na jednoj temperaturi koriste u modulu za sastavljanje nukleinske kiseline, modul će imati mogućnost da dostigne i zadrži temperaturu koja optimizuje specifičan proces sastavljanja koji se izvodi. Ove temperature i trajanje održavanja ovih temperatura mogu se odrediti unapred programiranim skupom parametara koje izvršava računarska rutina, ili ih ručno kontroliše korisnik koristeći procesni sistem automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija.

[0100] U jednom aspektu, modul za sastavljanje nukleinske kiseline je modul za obavljanje sastavljanja pomoću jedne, ne reakcije, kao što je ona ilustrovana na Slici 4. Modul za izotermno sastavljanje je konfigurisan da izvrši postupak molekularnog kloniranja korišćenjem jedne, izotermne reakcije. Određeni

1

postupci izotermnog sastavljanja mogu istovremeno kombinovati do 15 fragmenata nukleinske kiseline na osnovu identiteta sekvence. Postupak sastavljanja pruža, u nekim slučajevima, nukleinske kiseline koje treba sastaviti i koje uključuju približno 20-40 preklapanja baza sa susednim fragmentima nukleinske kiseline. Fragmenti su pomešani sa koktelom od tri enzima - egzonukleaza, polimeraza i ligaza - zajedno sa komponentama pufera. Pošto je proces izoterman i može se izvesti postupkom od 1 ili 2 koraka koristeći jednu reakcionu posudu, izotermne reakcije sastavljanja su idealne za upotrebu u automatizovanom multimodularnom instrumentu za obradu ćelija. Postupak od 1 koraka omogućava sastavljanje do pet različitih fragmenata korišćenjem izotermnog procesa u jednom koraku. Fragmenti i glavna mešavina enzima se kombinuju i inkubiraju na 50°C do jednog sata. Za stvaranje složenijih konstrukcija sa do petnaest fragmenata ili za ugradnju fragmenata od 100 bp do 10 kb, obično se koristi postupak od 2 koraka, gde reakcija od 2 koraka zahteva dva odvojena dodavanja glavne smeše; jedno za korak egzonukleaze i kalemljenja i drugo za korake polimeraze i ligacije.

[0101] Slika 4 ilustruje primer modula za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline 400 sa integrisanim prečišćavanjem. Modul za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline 400 uključuje komoru 402 koja ima pristupnu zaptivku 404 za prenošenje tečnosti u i iz modula za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline 400 (npr. preko pipete ili kapalice). U nekim otelotvorenjima, pristupna zaptivka 404 je povezana sa zamenjivom bočicom koja je postavljena unutar komore 402. Na primer, korisnik ili robotski sistem za manipulaciju mogu da postave bočicu unutar modula za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline 400 radi obrade.

[0102] Komora 402 deli kućište 406 sa otpornim grejačem 408. Kada se uzorak unese u komoru 402 modula za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline 400, otporni grejač 408 se može koristiti za zagrevanje sadržaja komore 402 do željene temperature. Podizanje temperature se može podesiti na osnovu sadržaja komore 402 (npr. materijali koji se dopremaju kroz pristupnu zaptivku 404 preko pipetor ili kapalica jedinice robotskog manipulacionog sistema). Procesni sistem automatizovanog multi-modularnog sistema za obradu ćelija može odrediti ciljanu temperaturu i plan podizanja temperature. Podizanje temperature i ciljana temperatura mogu se kontrolisati praćenjem termičkog senzora kao što je termistor 410 uključen u kućište 406. U posebnom otelotvorenju, otporni grejač 408 je dizajniran da održava temperaturu unutar kućišta 406 između 20° i 80°C. °C, između 25° i 75°C, između 37° i 65°C, između 40° i 60°C, između 45° i 55°C ili poželjno oko 50°C.

Modul za prečišćavanje

[0103] U nekim otelotvorenjima, kada je modul za sastavljanje nukleinske kiseline uključen u automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija, instrument takođe može da sadrži modul za prečišćavanje za uklanjanje neželjenih komponenti smeše sastavljanja nukleinskih kiselina (npr. soli, minerali) i, u određenim otelotvorenjima, za koncentrovanje sastavljene nukleinske kiseline. Primeri postupka za razmenu tečnosti nakon sastavljanja nukleinske kiseline uključuju magnetne perle (npr. SPRI ili Dynal (Dynabeads) kompanije Invitrogen Corp. iz Karlsbada, Kalifornija), perle od silicijum dioksida, silicijumske spiralne kolone, staklene perle, taloženje (npr. korišćenjem etanola ili izopropanola), alkalnu lizu, osmotsko prečišćavanje, ekstrakciju butanolom, tehnike odvajanja na bazi membrane, filtriranje itd.

[0104] U jednom aspektu, modul za prečišćavanje pruža filtriranje, npr. ultrafiltriranje. Na primer, dostupan je niz mikrokoncentratora opremljenih anizotropnim, hidrofilno generisanim celuloznim membranama različite poroznosti. (pogledati, na primer, Millipore SCX mikrokoncentratore koji se koriste kod Juan, Li-Jung, i dr. "Histone deacetylases specifically down-regulate p53-dependent gene activation." Journal of Biological Chemistry 275.27 (2000): 20436-20443.). U drugom primeru, prečišćavanje i koncentracija uključuju dovođenje u dodir tečnog uzorka koji uključuje sastavljene nukleinske kiseline i jonsku so sa razmenjivačem jona koji uključuje nerastvorljivu fosfatnu so, uklanjanje tečnosti i eluiranje nukleinske kiseline iz razmenjivača jona.

[0105] U specifičnom aspektu modula za prečišćavanje, SPRI perle se mogu koristiti gde se 0,6 ~ 2,0x zapremine SPRI perli može dodati pri sastavljanju nukleinske kiseline. Proizvod sastavljanja nukleinske kiseline se vezuje za SPRI perle, i SPRI perle se peletiraju automatskim postavljanjem magneta blizu epruvete, posude ili komore u kojoj se nalazi pelet. Na primer, 0,6-2,0x zapremine SPRI perli može se dodati pri sastavljanju nukleinske kiseline. SPRI perle, na primer, mogu se isprati etanolom, i vezani proizvod sastavljanja nukleinske kiseline je eluiran, npr., u vodi, Tris puferu ili 10% glicerola.

1

[0106] U specifičnom aspektu, magnet je povezan sa linearnim aktuatorom koji postavlja magnet. U nekim implementacijama, modul za sastavljanje nukleinske kiseline je kombinovani modul za sastavljanje i prečišćavanje dizajniran za integrisano sastavljanje i prečišćavanje. Na primer, kao što je gore razmatrano u vezi sa modulom za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline, kada protekne dovoljno vremena da se odigra izotermna reakcija sastavljanja nukleinske kiseline, sadržaj komore 402 (npr. reagensi za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline i nukleinske kiseline), u nekim otelotvorenjima, kombinuju se sa magnetnim perlama (nisu prikazane) kako bi se aktivirao proces prečišćavanja. SPRI perle u puferu se isporučuju u sadržaj modula za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline, na primer, pomoću robotskog sistema za rukovanje. Nakon toga, solenoid 412 je, u nekim otelotvorenjima, pokrenut od strane magneta kako bi pobudio magnetne perle koje se nalaze u komori 402. Solenoid, u konkretnom primeru, može da izvrši između magnetne vučne sile od 2 funte i vučne sile od 5 funti, ili približno 4 funte magnetne vučne sile na magnetne perle unutar komore 402. Sadržaj komore 402 se može inkubirati dovoljno vremena da se sastavljeni vektor i oligonukleotidi vežu za magnetne perle.

[0107] Nakon vezivanja, u nekim implementacijama, vezana smeša izotermnog sastavljanja nukleinskih kiselina (npr. reagensi za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline sastavljeni vektor i oligonukleotidi) se uklanja iz modula za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline i nukleinske kiseline vezane za nekoliko kuglica se peru jednom do nekoliko puta sa 80% etanola. Jednom isprane, nukleinske kiseline vezane za kuglice se eluiraju u pufer i prenose u modul za transformaciju.

[0108] U nekim otelotvorenjima, bočica je zaključana na položaju u komori 402 za obradu. Na primer, korisnik može pritisnuti bočicu iza otvora u komori 402 dizajniranom da zadrži bočicu nakon dodira sa pipetorom ili kapalicom. U drugom primeru, korisnik može da uvrne bočicu u položaj, tako da zahvati izbočinu u odgovarajućem kanalu i spreči kretanje nagore. Senzor položaja (nije prikazan) može osigurati povlačenje bočice. Senzor položaja je, u određenom otelotvorenju, magnetni senzor koji detektuje zahvat između dela komore 402 i bočice. U drugim otelotvorenjima, senzor položaja je optički senzor koji detektuje prisustvo bočice u uvučenom položaju. U otelotvorenjima koje koriste kanal i izbočinu, mehanički prekidač pritisnut izbočinom može detektovati zahvatanje bočice.

Modul za uzgoj

[0109] Kako se nukleinske kiseline sastavljaju, ćelije se mogu uzgajati u pripremi za uređivanje. Uzgoj ćelija se može pratiti optičkom gustinom (npr. na OD 600 nm) koja se meri u modulu za uzgoj, i petlja povratne sprege se koristi za podešavanje uzgoja ćelija tako da se postigne ciljani OD za ciljano vreme. Druge mere gustine ćelije i fiziološkog stanja koje se mogu meriti uključuju, ali nisu ograničene na, pH, rastvoreni kiseonik, oslobođene enzime, akustička svojstva i električna svojstva.

[0110] U nekim aspektima, modul za uzgoj uključuje epruvetu za kulturu u šejkeru ili vortekseru koja se ispituje spektrofotometrom ili fluorimetrom. Šejker ili vortekser mogu da zagreju ili hlade ćelije, a uzgoj ćelija se prati merenjem apsorbancije ili fluorescencije u realnom vremenu. U jednom aspektu, ćelije se uzgajaju na 25°C-40°C do OD600 apsorbancije od 1-10 OD. Ćelije se takođe mogu uzgajati na temperaturama od 25°C-35°C, 25°C-30°C, 30°C-40°C, 30°C-35°C, 35°C-40°C, 40°C-50°C, 40°C-45°C ili 44°C-50°C. U drugom aspektu, ćelije se indukuju zagrevanjem na 42°C-50°C ili dodavanjem indukcionog agensa. Ćelije se takođe mogu indukovati zagrevanjem u rasponu od 42°C-46°C, 42°C-44°C, 44°C-46°C, 44°C-48°C, 46°C-48°C, 46°C-50°C ili 48°C-50°C. U nekim aspektima, ćelije su ohlađene na 0°C -10°C nakon indukcije. Ćelije se takođe mogu hladiti do temperaturnih raspona od 0°C -5°C, 0°C -2°C, 2°C -4°C, 4°C -6°C, 6°C -8°C, 8°C -10°C ili 5°C -10°C nakon indukcije.

[0111] Slika 8A prikazuje jednu varijantu rotirajuće bočice za uzgoj 800 za upotrebu sa uređajem za uzgoj ćelija, kao što je uređaj za uzgoj ćelija 850 ilustrovan na Slici 8B-C. Rotirajuća bočica za uzgoj 800, u nekim implementacijama, je providni kontejner sa otvorenim krajem 804 za primanje tečnog medijuma i ćelija, gde centralni deo bočice 806 definiše primarni kontejner za uzgajanje ćelije, sužen-do-stegnut region 818 definiše najmanje jednu putanju svetlosti 808, 810, zatvoreni kraj 816 i mehanizam za uključivanje pogona 812. Rotirajuća bočica za uzgoj 800 može imati centralnu uzdužnu osu 820 oko koje se bočica 800 rotira, a putanje svetlosti 808, 810 mogu uglavnom biti normalni na uzdužnu osu bočice. U nekim primerima, prva putanja svetlosti 810 može biti pozicionirana u donjem stegnutom delu suženog-do-stegnutog regiona 818. Mehanizam za uključivanje pogona 812, u nekim otelotvorenjima, ulazi u vezu sa pogonskim mehanizmom

1

(npr. aktuatorom, motorom (nije prikazano) za rotaciju bočice 800. Pogon može da sadrži pogonsko vratilo 874 za pogonski motor 864 (Slika 8D).

[0112] U nekim otelotvorenjima, rotirajuća bočica za uzgoj 800 uključuje drugu putanju svetlosti 808, na primer, u gornjem suženom regionu suženog-do-stegnutog regiona 818. U nekim primerima, zidovi koji definišu gornji suženi region suženog-do-stegnutog regiona 818 za drugu putanju svetlosti 808 mogu biti postavljen pod širim uglom u odnosu na uzdužnu osu 820 od zidova koji definišu donji stegnuti deo suženogdo-stegnutog regiona 810 za prvu putanju svetlosti 810. Obe putanje svetlosti 808, 810, na primer, mogu da se postave u oblast rotirajuće bočice za uzgoj 800 koja je stalno ispunjena ćelijskom kulturom (ćelije medijum za uzgoj) i na koju ne utiče brzina rotacije bočice za uzgoj 800. Kao što je ilustrovano, druga putanja svetlosti 808 je kraća od prve putanje svetlosti 810 što omogućava osetljivo merenje vrednosti optičke gustine (OD) kada su OD vrednosti ćelijske kulture u bočici na visokom nivou (npr. kasnije u procesu uzgoja ćelija), dok prva putanja svetlosti 810 omogućava osetljivo merenje OD vrednosti kada su OD vrednosti ćelijske kulture u bočici na nižem nivou (npr. ranije u procesu uzgoja ćelija).

[0113] Rotirajuća bočica za uzgoj 800 može biti višekratna, ili poželjno, rotirajuća bočica za uzgoj je jednokratna. U nekim otelotvorenjima, rotirajuća bočica za uzgoj 800 je potrošna i može se predstaviti korisniku prethodno napunjena medijumom za uzgoj, gde je bočica 800 zapečaćena na otvorenom kraju 804 sa zaptivačem od folije. Rotirajuća bočica za uzgoj napunjena medijumom upakovana na takav način može biti deo kompleta za upotrebu sa samostalnim uređajem za uzgoj ćelija ili sa modulom za uzgoj ćelija koji je deo automatizovanog multi-modularnog sistema za obradu ćelija. Kako bi uneo ćelije u bočicu, korisnik treba samo da pipetira željenu zapreminu ćelija i da koristi vrh pipete da probije zaptivač od folije na bočici 800. Alternativno, naravno, automatizovani instrument može da prenese ćelije iz, npr. kertridža za reagens, u bočicu za uzgoj. medijum za uzgoj se može pružiti u bočici za uzgoj ili se takođe može preneti iz kertridža za reagens u bočicu za uzgoj pre dodavanja ćelija. Otvoreni kraj 804 može da sadrži produženu ivicu 802 kako bi se preklopio i zahvatio sa uređajem za uzgoj ćelija 850 (Slike 8B-C). U automatizovanim instrumentima, rotirajuća bočica za uzgoj 800 može biti označena bar kodom ili drugim sredstvom za identifikaciju koje može da pročita skener ili kamera koja je deo sistema za obradu 1310 kao što je ilustrovano na Slici 13.

[0114] U nekim primenama, zapremina rotirajuće bočice za uzgoj 800 i zapremina ćelijske kulture (uključujući medijum za uzgoj) mogu značajno da variraju, ali zapremina rotirajuće bočice za uzgoj 800 treba da bude dovoljno velika za ćelijsku kulturu u bočici za uzgoj 800 kako bi se dobila odgovarajuća aeraciju dok se bočica 800 rotira. U praksi, zapremina rotirajuće bočice za uzgoj 800 može da se kreće od 1-250 ml, 2-100 ml, od 5-80 ml, 10-50 ml ili od 12-35 ml. Isto tako, zapremina ćelijske kulture (ćelije medijum za uzgoj) treba da bude odgovarajuća da omogući odgovarajuću aeraciju u rotirajućoj bočici za uzgoj 800. Prema tome, zapremina ćelijske kulture treba da bude približno 10-85% zapremine bočice za uzgoj 800, ili 15-80% zapremine bočice za uzgoj, ili 20-70%, 30-60%, ili 40-50% zapremine bočice za uzgoj. U jednom primeru, za bočicu za uzgoj od 35 ml 800, zapremina ćelijske kulture bi bila od oko 4 ml do oko 27 ml.

[0115] Rotirajuća bočica za uzgoj 800 je, u nekim otelotvorenjima, proizvedena od biokompatibilnog providnog materijala - ili je bar deo bočice 800 uključujući putanje svetlosti providan. Pored toga, materijal od kog je napravljena rotirajuća bočica za uzgoj 800 treba da bude u stanju da se ohladi na oko 0 °C ili niže i zagreje na oko 75 °C ili više, kao što je oko 2 °C ili na oko 70 °C, oko 4 °C ili do oko 60°C, ili oko 4°C ili do oko 55°C kako bi uslovi bili adekvatni i za testove ćelija zasnovane na temperaturi i za dugotrajno skladištenje na niskim temperaturama. Dalje, materijal koji se koristi za proizvodnju bočice je poželjno sposoban da izdrži temperature do 55°C bez deformacije tokom centrifugiranja. Pogodni materijali uključuju staklo, polivinil hlorid, polietilen, poliamid, polietilen, polipropilen, polikarbonat, poli(metil metakrilat) (PMMA), polisulfon, poliuretan i kopolimere ovih i drugih polimera. Poželjni materijali uključuju polipropilen, polikarbonat ili polistiren. U nekim otelotvorenjima, rotirajuća bočica za uzgoj 800 je jeftino proizvedena, na primer, injekcionim oblikovanjem ili ekstruzijom.

[0116] Slika 8B ilustruje pogled odozgo na rotirajuću bočicu za uzgoj 800b, koja je alternativna implementacija rotirajuće bočice za uzgoj 800. U nekim primerima, bočica 800b može uključivati jednu ili više lopatica 822 pričvršćenih na unutrašnju površinu koja je ispupčena ka centru bočice 800b. Bočica 800b prikazana na Slici 8B uključuje tri lopatice 822 koje su u suštini podjednako raspoređene oko periferije

2

bočice 800b, ali u drugim primerima, bočica 800b može da sadrži dve, četiri ili više lopatica 822. Lopatice, u nekim implementacijama, pružaju visoko mešanje i aeraciju unutar bočica 800b koje se rotiraju unutar uređaja za uzgoj ćelija, što olakšava uzgoj mikroba.

[0117] Slike 8C-D ilustruju prikaze primera uređaja za uzgoj ćelija 850 koji prima rotirajuću bočicu za uzgoj 800. U nekim otelotvorenjima, uređaj za uzgoj ćelija 850 se rotira da zagreje ili ohladi ćelije ili uzgoj ćelija unutar bočice 800 do unapred određenog temperaturnog raspona. U nekim implementacijama, rotirajuća bočica za uzgoj 800 može biti postavljena unutar glavnog kućišta 852 sa produženom ivicom 802 bočice 800 koja se proteže pored gornje površine glavnog kućišta 852. U nekim aspektima, produžena ivica 802 pruža površinu za hvatanje preko koje korisnik ubacuje ili izvlači bočicu 800 iz glavnog kućišta 852 uređaja 850. Pored toga, kada je potpuno umetnuta u glavno kućište 852, donja površina produžene ivice 802 naslanja se na gornju površinu glavnog kućišta 852. U nekim primerima, glavno kućište 852 uređaja za uzgoj ćelija 850 je tako dimenzionirano da se spoljne površine rotirajuće bočice za uzgoj 800 naslanjaju se na unutrašnje površine glavnog kućišta 852 čime se bočica 800 učvršćuje unutar glavnog kućišta 852. U nekim primenama, uređaj za uzgoj ćelija 850 može uključivati krajnja kućišta 854 postavljena na svakoj strani glavnog kućišta 854 i donje kućište 856 postavljeno na donji kraj glavnog kućišta 852. U nekim primerima, donje kućište 856 može da sadrži prirubnice 858 koje se mogu koristiti za pričvršćivanje uređaja za uzgoj ćelija 850 na mehanizam za kontrolu temperature (npr. grejanje/hlađenje) ili drugu strukturu kao što je šasija automatizovanog sistema za obradu ćelija.

[0118] Kao što je prikazano na Slici 8D, uređaj za uzgoj ćelija 850, u nekim implementacijama, može uključivati gornji ležaj 860 i donji ležaj 862 postavljene u glavno kućište 852 koji podržavaju vertikalno opterećenje rotirajuće bočice za uzgoj 800 koja je umetnuta u glavno kućište 852. U nekim primerima, uređaj za uzgoj ćelija 850 može takođe da sadrži primarni optički port 866 i sekundarni optički port 868 koji su poravnati sa prvom putanjom svetlosti 810 i drugom putanjom svetlosti 808 bočice 800 kada se umetnu u glavno kućište 852. U nekim primerima, primarni i sekundarni optički portovi 866, 868 su praznine, otvori ili delovi glavnog kućišta napravljeni od providnih materijala koji dozvoljavaju svetlosti da prođe kroz bočicu 800 kako bi se izvršila OD merenja uzgoja ćelija. Pored optičkih portova 866, 868, uređaj za uzgoj ćelija 850 može uključivati emisionu ploču 870 koja pruža jedan ili više izvora osvetljenja za putanje svetlosti i detektorsku ploču 872 koja detektuje svetlost nakon što svetlost prođe kroz tečnost ćelijske kulture u rotirajućoj bočici za uzgoj 800. U jednom primeru, izvori osvetljenja raspoređeni na emisionoj ploči 870 mogu uključivati emisione diode (LED) ili fotodiode koje pružaju osvetljenje na jednoj ili više ciljanih talasnih dužina srazmerno medijumu za uzgoj koji se obično koristi u ćelijske kulture (bilo da su, na primer, ćelije sisara, bakterijske ćelije, životinjske ćelije, ćelije kvasca).

[0119] U nekim implementacijama, emisiona ploča 870 i/ili detektorska ploča 872 su komunikaciono spojene preko žičane ili bežične veze sa sistemom za obradu (npr., sistem za obradu 126, 1220, 1310) koji kontroliše talasnu dužinu izlazne svetlosti od strane emisione ploče 870 i prima i obrađuje osvetljenje koje se detektuje na detektorskoj ploči 872. Daljinski kontrolisana emisiona ploča 870 i detektorska ploča 872, u nekim aspektima, omogućavaju sprovođenje automatizovanih OD merenja tokom uzgoja ćelija. Na primer, sistem za obradu 126, 1220 može da kontroliše periodičnost sa kojom se vrše OD merenja, koja mogu biti u unapred određenim intervalima ili kao odgovor na zahtev korisnika. Dalje, sistem za obradu 126, 1220 može da koristi podatke senzora primljene od detektorske ploče 872 da izvrši OD merenja u realnom vremenu i prilagodi uslove uzgoja ćelija (npr. temperatura, brzina/smer rotacije).

[0120] U nekim otelotvorenjima, donje kućište 856 može da sadrži pogonski motor 864 koji generiše rotaciono kretanje koje uzrokuje da se rotirajuća bočica za uzgoj 800 okreće unutar uređaja za uzgoj ćelija 850. U nekim otelotvorenjima, motor 864 može da sadrži pogonsko vratilo 874 koje uključuje donji kraj rotirajuće bočice za uzgoj 800. Motor 864 koji generiše rotaciono kretanje za rotirajuću bočicu za uzgoj 800 je, u nekim otelotvorenjima, pogonski DC motor brushless jednosmernog tipa sa ugrađenim kontrolama pogona koje se mogu konfigurisati da održavaju broj obrtaja u minuti (o/min) između 0 i oko 3000 o/min. Alternativno, mogu se koristiti drugi tipovi motora kao što su koračni, servo ili brushed DC motori. Opciono, motor 864 takođe može imati kontrolu pravca da bi omogućio preokret smera rotacije, i tahometar za detekciju i izveštavanje o stvarnom broju obrtaja u minuti. U drugim primerima, motor 864 može da generiše oscilirajuće kretanje menjanjem smera rotacije na unapred određenoj frekvenciji. U jednom primeru, bočica 800 se rotira u svakom smeru po jednu sekundu brzinom od 350 RPM. Motor 864, u nekim implementacijama, je komunikativno povezan preko žičane ili bežične komunikacione mreže sa sistemom za obradu (npr., sistem za obradu 126, 1220) koji je konfigurisan da kontroliše rad motora 864, što može uključivati izvršavanje protokola programiranih u procesor i/ili pruženih korisničkim unosom, na primer kao što je opisano u vezi sa kontrolerom modula 1330 na Slici 13. Na primer, i motor 864 može biti konfigurisan da menja brzinu i/ili smer rotacije bočice 800 kako bi izazvao aksijalnu precesiju ćelijske kulture čime se poboljšava mešanje u cilju sprečavanja agregacije ćelija i povećanja aeracije. U nekim primerima, brzina ili smer rotacije motora 864 mogu da variraju na osnovu podataka senzora optičke gustine primljenih sa detektorske ploče 872.

[0121] U nekim otelotvorenjima, glavno kućište 852, krajnja kućišta 854 i donje kućište 856 uređaja za uzgoj ćelija 856 mogu biti proizvedeni od robusnog materijala uključujući aluminijum, nerđajući čelik i druge toplotno provodne materijale, uključujući plastiku. Ove strukture ili njihovi delovi se mogu kreirati različitim tehnikama, na primer, izradom metala, injekcionim oblikovanjem, stvaranjem strukturnih slojeva koji su spojeni, itd. Dok se u nekim primerima rotirajuća bočica za uzgoj 800 višekratna, u drugim otelotvorenjima, bočica 800 je poželjno je jednokratna. Druge komponente uređaja za uzgoj ćelija 850, u nekim aspektima, su poželjno višekratne i mogu da funkcionišu kao samostalni stoni uređaj ili kao modul u automatizovanom sistemu za obradu ćelija sa više modula.

[0122] U nekim implementacijama, sistem za obradu koji je komunikativno povezan sa modulom za uzgoj ćelija može biti programiran sa informacijama koje će se koristiti kao „praznina“ ili kontrola za uzgoj ćelijske kulture. „Praznina“ ili kontrola, u nekim primerima, su posuda koja sadrži samo medijum za uzgoj ćelija, koji daje 100% propustljivosti i 0 OD, dok ćelijski uzorci odbijaju zrake svetlosti i imaće niži procenat propustljivosti i veći OD. Kako ćelije rastu u medijumu i postaju gušće, propustljivost se smanjuje i OD se povećava. Procesor modula za uzgoj ćelija, u nekim implementacijama, može biti programiran da koristi vrednosti talasne dužine za praznine srazmerne medijumu za uzgoj koji se tipično koristi u ćelijskoj kulturi (bilo da su, na primer, ćelije sisara, ćelije bakterija, ćelije životinja, ćelije kvasca). Alternativno, drugi spektrofotometar i posuda mogu biti uključeni u modul za uzgoj ćelija, gde se drugi spektrofotometar koristi za očitavanje praznina u određenim intervalima.

[0123] Slika 8E ilustruje drugi tip uređaja za uzgoj ćelija 880 koji koristi tresenje, a ne rotaciju, kako bi kontrolisao temperaturu i podstakao mešanje i aeraciju unutar bočice za uzgoj ćelija 890 (Slika 8F). Uređaj za uzgoj ćelija 880, u nekim primerima, je manje veličine od konvencionalnih stonih šejkera za integraciju u automatizovane sisteme za obradu ćelija sa više modula. U nekim implementacijama, uređaj za uzgoj ćelija 880 uključuje kućište 884 koje prima bočicu za uzgoj ćelija 890. Uređaj za uzgoj ćelija 880 može, u nekim primerima, da sadrži sklop motora koji se nalazi ispod bočice 890 koji generiše kružno kretanje bočice 890 na osnovu brzine motora. U jednom primeru, bočica 890 kruži u horizontalnoj ravni pri 600 do 900 o/min, na primer pri 750 o/min, što je znatno brže od većih stonih šejkera koji kruže na oko 250 o/min. U nekim aspektima, kretanje tresenja se generiše u najmanje jednoj horizontalnoj ravni. U nekim primerima, bočica za uzgoj ćelija 890 koja se koristi sa uređajem za uzgoj ćelija sa tresenjem 880 je cev sa konusnim dnom koja je suštinski slična bočici koja se koristi u konvencionalnom stonom šejkeru. Slično rotirajućem uređaju za uzgoj ćelija 850, uređaj za uzgoj ćelija 880 može da sadrži ploču za osvetljenje 870 i detektorsku ploču 872 za automatska OD merenja tokom uzgoja ćelija. U nekim primerima, izvor svetlosti 882 može biti povezan sa uređajem za uzgoj ćelija 880 koji generiše osvetljenje koje se meri detektorskom pločom, koja se u nekim primerima nalazi ispod bočice 890 ili na suprotnoj strani bočice 890 od izvora svetlosti 882.

[0124] Kako bi se smanjila pozadinske ćelije koje nisu dobile uređivanja genoma, modul za uzgoj takođe može dozvoliti proces odabira kako bi se obogatile uređene ćelije. Na primer, uvedena nukleinska kiselina može uključiti gen koji daje rezistenciju na antibiotike ili drugu selektivnu oznaku. Naizmenično uvođenje selektivnih oznaka za sekvencijalne runde uređivanja takođe može eliminisati pozadinu neuređenih ćelija i omogućiti višestrukim ciklusima automatizovanog multi-modularnog instrumenta za uređivanje ćelija da odabira ćelije koje imaju sekvencijalna uređivanja genoma.

[0125] Pogodni geni otpornosti na antibiotike uključuju, ali nisu ograničeni na, gene kao što su gen otpornosti na ampicilin, gen otpornosti na tetraciklin, gen otpornosti na kanamicin, gen otpornosti na neomicin, gen otpornosti na kanavanin, gen otpornosti na blasticidin, gen otpornosti na higromicin, gen otpornosti na puromicin i gen otpornosti na hloramfenikol. U nekim otelotvorenjima, uklanjanje pozadinskih mrtvih ćelija je potpomognuto upotrebom litičkih pojačivača kao što su deterdženti, osmotski stres, temperatura, enzimi, proteaze, bakteriofagi, redukcioni agensi ili haotropi. U drugim otelotvorenjima, uklanjanje ćelija i/ili razmena medijuma se koristi za smanjenje pozadinskih mrtvih ćelija.

Modul za pranje i/ili koncentraciju ćelija

[0126] Modul za pranje i/ili koncentraciju ćelija može da koristi bilo koji postupak za razmenu tečnosti u ćelijskom okruženju i može da koncentriše ćelije ili da im dozvoli da ostanu u suštinski istoj ili većoj zapremini tečnosti kao što se koristi u modulu za sastavljanje nukleinske kiseline. Dalje, u nekim aspektima, procesi koji se izvode u modulu za pranje ćelija takođe čine ćelije elektrokompetentnim, na primer, upotrebom glicerola u pranju.

[0127] Brojni različiti postupci mogu se koristiti za pranje ćelija, uključujući prečišćavanje gradijentom gustine, dijalizu, kolone za jonsku razmenu, filtriranje, centrifugiranje, razblaživanje i upotrebu perli za prečišćavanje.

[0128] U nekim aspektima, modul za pranje i/ili koncentraciju ćelija koristi uređaj za centrifugiranje. U drugim aspektima, modul za pranje i/ili koncentraciju ćelija koristi modul za filtriranje. U drugim aspektima, perle su povezane sa delovima koji se vezuju za površinu ćelije. Ovi delovi uključuju, ali nisu ograničeni na antitela, lektine, aglutinin pšeničnih klica, mutirane lizozime i ligande.

[0129] U drugim aspektima, ćelije su projektovane da budu magnetizovane, omogućavajući magnetima da peletiraju ćelije nakon koraka pranja. Mehanizam magnetizacije ćelije može uključivati, ali nije ograničen na eksprimiranje proteina feritina.

[0130] Modul za pranje i/ili koncentraciju ćelija je, u nekim implementacijama, modul sklopa centrifuge. Prelazeći na Slike 3A-C, u nekim implementacijama, modul sklopa centrifuge 300 uključuje gornja vrata 302 dizajnirana za aktiviranje pomoću robotskog sistema za rukovanje (nije prikazano) za isporuku materijala za sastavljanje nukleinske kiseline (npr. oligoi, vektorske kičme, enzimi, itd.) do jedne ili više bočica 304a, b smeštenih u korpama za bočice 306a, b povezane sa rotorom 308. U nekim otelotvorenjima, robotski sistem za rukovanje isporučuje bočice 304a, b modulu sklopa centrifuge 300. U drugim otelotvorenjima, korisnik odlaže bočice 304a, b unutar korpi za bočice 306a, b. Korpe 306a, b su u nekim otelotvorenjima povezane sa rotorom 308 preko zglobne veze tako da se korpe 306a,b mogu naginjati ka napolje tokom rotacije. U drugim otelotvorenjima, pozicija korpi 306a,b je fiksirana.

[0131] Modul sklopa centrifuge 300 je, u nekim otelotvorenjima, klimatski kontrolisan. Na primer, unutrašnjom temperaturom se može upravljati pomoću namotaja za hlađenje 310 i izolacije 312. Dovodni i povratni vodovi 314 rashladne tečnosti mogu pumpati rashladnu tečnost do rashladnih namotaja 310, čime se hladi komora 316 modula sklopa centrifuge 300. U nekim primerima, modul sklopa centrifuge 300 može biti dizajniran da hladi komoru 316 do između 0° i 10°C, između 2° i 8°C, i najpoželjnije na oko 4°C. Dalje, može se pružiti kontrola kondenzacije kako bi se ograničila vlažnost u komori 316. Kontrola klime se, u nekim otelotvorenjima, postavlja kroz sistem za obradu automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija. Na primer, sistem za obradu može da usmeri signale na interfejse kola 320.

[0132] U nekim otelotvorenjima, motor 318 rotaciono pokreće rotor 308. Ubrzanje i usporavanje motora 318, i samim tim i rotora 308, može da se kontroliše pomoću sistema za obradu automatizovanog multimodularnog instrumenta za obradu ćelija. Kao što je ilustrovano, senzor pokreta 322 (npr. akcelerometar ili žiroskop) je postavljen na osnovu motora 318 da nadgleda parametre rotacije. Alternativno, senzor pokreta (nije ilustrovan) kao što su akcelerometar ili žiroskop može biti postavljen unutar komore 316 za praćenje parametara rotacije. Sistem za obradu, na primer, može da nadgleda signale sa senzora pokreta i analizira uslove kako bi izvršio sigurnosno isključenje ako je rotacija izvan parametara. U ilustrativnoj varijanti, krak rotora može biti dizajniran da se rotira do 10000 obrtaja u minuti (o/min), do 8000 o/min, ili do oko 6500 o/min. Sistem za obradu može da modifikuje brzinu rotacije na osnovu materijala koji se dostavljaju modulu sklopa centrifuge 300.

[0133] Modul za pranje i/ili koncentraciju ćelija, u nekim implementacijama, je modul za filtriranje.

Prelazeći na Sliku 7A, blok dijagram ilustruje primere funkcionalnih jedinica modula za filtriranje 700. U nekim implementacijama, glavna kontrola 702 modula za filtriranje 700 uključuje prvu pumpu za tečnost 704a za unos tečnosti za pranje 706 i drugu pumpu za tečnost 704b za uklanjanje tečnog otpada do jedinice

2

za tečni otpad 708 (npr., kao što je jedinica za tečni otpad 114 na Slici 1A ili jedinica za tečni otpad 1228 na Slikama 12A i 12B). Senzor protoka 712 se može postaviti na konektor 714 na jedinici za tečni otpad 708 kako bi nadgledao oslobađanje tečnog otpada iz modula za filtriranje. Ventil 716 (trosmerni ventil kao što je ilustrovano) može biti postavljen na konektoru 718 za tečnost za pranje 716 kako bi se selektivno povezao tečnost za pranje 716 i modul za filtriranje 700.

[0134] Modul za filtriranje 700, u nekim otelotvorenjima, uključuje filterski razvodnik 720 za filtriranje i koncentrisanje uzorka ćelije. Filterski razvodnik 720 može da sadrži jedan ili više temperaturnih senzora 722 i senzora pritiska 724 za praćenje protoka i temperature tečnosti za pranje i/ili tečnog otpada. Senzori 722, 724 se, u nekim otelotvorenjima, nadgledaju i analiziraju pomoću sistema za obradu automatizovanog sistema za obradu ćelija u više režima, kao što je sistem za obradu 1310 na Slici 13. Filterski kolektor 720 može da sadrži jedan ili više ventila 726 za usmeravanje protoka tečnosti za pranje i/ili tečnog otpada. Sistem za obradu automatizovanog multi-modalnog instrumenta za obradu ćelija, na primer, može da aktivira ventile u skladu sa skupom uputstava za usmeravanje filtriranja od strane modula za filtriranje 700.

[0135] Modul za filtriranje 700 uključuje najmanje jedan filter 730. Primeri filtera pogodnih za upotrebu u modulu za filtriranje 700 obuhvataju membranske filtere, keramičke filtere i metalne filtere. Filter se može koristiti u bilo kom obliku; filter može na primer biti cilindričan ili u suštini ravan. Filter izabran za datu operaciju ili dati tok rada, u nekim otelotvorenjima, zavisi od tipa toka rada (npr. bakterijski, kvasac, virusni, itd.) ili količine materijala koji se obrađuje. Na primer, dok su ravni filteri relativno niske cene i često se koriste, filteri sa većom površinom, kao što su cilindrični filteri, mogu prihvatiti veće brzine protoka. U drugom primeru, šuplji filteri mogu pokazati niže stope obnavljanja kada se obrađuju male količine uzorka (npr. manje od oko 10 ml). Na primer, za upotrebu sa bakterijama, može biti poželjno da filter koji se koristi bude membranski filter, posebno filter od šupljih vlakana. Pod pojmom „šuplje vlakno“ podrazumeva se cevasta membrana. Unutrašnji prečnik cevi, u nekim primerima, iznosi najmanje 0,1 mm, poželjnije najmanje 0,5 mm, najpoželjnije najmanje 0,75 mm, i poželjno je da unutrašnji prečnik cevi iznosi najviše 10 mm, poželjnije najviše 6 mm, najpoželjnije najviše 1 mm. Moduli za filtriranje koji imaju šuplja vlakna su komercijalno dostupni od različitih kompanija, uključujući G.E. Life Sciences (Marlborough, MA) i InnovaPrep (Drexel, MO) (pogledati, npr. US20110061474A1 od Page i dr., pod nazivom „Liquid to Liquid Biological Particle Concentrator with Disposable Fluid Path“).

[0136] U nekim implementacijama, modul za filtriranje 700 uključuje sredstvo za izbacivanje filtera 728 (npr. aktuator) za izbacivanje filtera 730 nakon upotrebe. Na primer, korisnik ili robotski sistem za rukovanje može da gurne filter 730 u položaj za upotrebu tako da filter bude zadržan na razvodniku filtera 720 tokom filtriranja. Nakon filtriranja, kako bi se uklonio korišćeni filter 730, aktuator za izbacivanje filtera 728 može izbaciti filter 730, oslobađajući filter 730 tako da korisnik ili robotski sistem za rukovanje mogu da uklone korišćeni filter 730 iz modula za filtriranje 700. Korišćeni filter 730, u nekim primerima, može da se odloži unutar jedinice za čvrsti otpad 112 na Slikama 1A-1B, jedinice za čvrsti otpad 1218 na Slikama 12A i 12B, ili vraćen u filter uložak 740, kao što je ilustrovano na Slici 7D.

[0137] Prelazeći na Sliku 7D, u nekim implementacijama, filteri 730 pruženi u filter kertridžu 740 smeštenom unutar šasije automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija se transportuju do modula za filtriranje 700 pomoću robotskog sistema za rukovanje (npr. robotski sistem za rukovanje 108 opisan u vezi sa Slikama 1A i 1B, ili robotski sistem za rukovanje 1218 na Slikama 12A i 12B) i postavljen unutar modula za filtriranje 700 pre upotrebe.

[0138] Modul za filtriranje 700, u nekim implementacijama, zahteva periodično čišćenje. Na primer, sistem za obradu može upozoriti korisnika kada je potrebno čišćenje preko korisničkog interfejsa automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija i/ili putem bežičnih sredstava za razmenu poruka (npr. tekstualne poruke, e-pošte i/ili aplikacije ličnog računarskog uređaja). Filter za dekontaminaciju, na primer, može da se stavi u modul za filtriranje 700, i modul za filtriranje 700 može da se očisti rastvorom za pranje i/ili mešavinom alkohola.

[0139] U nekim implementacijama, modul za filtriranje 700 je u tečnoj vezi sa kertridžom za pranje 710 (kao što je kertridž za pranje 600 na Slici 6A) koji sadrži tečnost za pranje 716 preko konektora 718. Na primer, nakon pozicioniranja od strane korisnika kertridža za pranje 710 unutar šasije automatizovanog multimodularnog instrumenta za obradu ćelija, konektor 718 se može spojiti sa donjim ulazom kertridža za pranje 710, stvarajući prolaz tečnosti između tečnosti za pranje 716 i modula za filtriranje 700.

[0140] Prelazeći na Slike 7B i 7C, u nekim implementacijama, modul za filtriranje sa dvostrukim filterom 750 uključuje dvostruke filtere 752, 754 raspoređene preko duplih rezervoara za pranje 754. Na primer, svaki filter može biti filter sa šupljim jezgrom od vlakana koji ima pore od .45 um i površinu veću od 85 cm<2>. Rezervoari za pranje 754, u nekim primerima, mogu biti zapremine 50 mL, 100 mL ili preko 200 mL. U nekim otelotvorenjima, rezervoari za pranje 754 su smešteni u kertridž za pranje 756, kao što je kertridž za pranje ili reagens 600 na Slici 6A.

[0141] Sistem za obradu automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija, u nekim implementacijama, kontroliše aktiviranje dvostrukih filtera 752 u X (horizontalnom) i Z (vertikalno) pravcu kako bi se filteri 752a, 752b postavili u rezervoare za pranje 754. U konkretnom primeru, dvostruki filteri 752 mogu da se pomeraju zajedno duž X ose, ali imaju nezavisan raspon kretanja duž Z ose.

[0142] Kao što je ilustrovano, dvostruki filteri 752 modula za filtriranje 750 su povezani sa telom vitke ruke 758. U nekim otelotvorenjima, sve pumpe i ventili modula za filtriranje 750 mogu biti udaljeni od tela 758 (npr. unutar poda šasije automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija). Na ovaj način, modul za filtriranje 750 može da zameni mnogo veće konvencionalne komercijalne module za filtriranje.

[0143] Dalje, u nekim otelotvorenjima, modul za filtriranje 750 je u tečnoj vezi sa sistemom za prečišćavanje otpada koji je dizajniran da otpusti tečni otpad u jedinicu za skladištenje tečnog otpada, kao što je jedinica za skladištenje 708 na Slici 7A ili jedinica za skladištenje tečnog otpada 114 na Slici 1A ili 1228 na Slici 12A i 12B.

Modul za transformaciju

[0144] Modul za transformaciju može da primeni bilo koju ćelijsku transformaciju ili tehniku transfekcije koje rutinski koriste stručnjaci u veštinama transfekcije, transformacije i mikrofluidike. Transformacija se može odvijati u epruvetama za mikrofugiranje, epruvetama, kivetama, pločama sa više komorica, mikrovlaknima i instrumentima za protok. Temperatura i kontrola modula za transformaciju mogu se kontrolisati korišćenjem sistema za obradu kao što je sistem za obradu 1310 na Slici 13, sa kontrolama koje postavlja korisnik i/ili putem računarske rutine koja se dostavlja sistemu za obradu.

[0145] Namera je da se transformacija uključi u različite tehnike priznate u struci za uvođenje sekvence egzogene nukleinske kiseline (npr., DNK) u ciljanu ćeliju, a izraz „transformacija“ kako se ovde koristi uključuje sve tehnike transformacije i transfekcije. Takve postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, elektroporaciju, lipofekciju, optoporaciju, injekciju, mikrotaloženje, mikroinjekciju, lipozome, bombardovanje česticama, sonoperaciju, laserski indukovanu poraciju, transfekciju perli, zajedničko taloženje kalcijum fosfata ili kalcijum hlorida, ili DEAE-dekstran-posredovanu transfekciju. Ćelije se takođe mogu pripremiti za apsorpciju vektora korišćenjem, na primer, ispiranja saharoze ili glicerola. Pored toga, mogu se koristiti hibridne tehnike koje iskorišćavaju mogućnosti mehaničkih i hemijskih postupaka transfekcije, npr., magnetofekcija, metodologija transfekcije koja kombinuje hemijsku transfekciju sa mehaničkim postupcima. U drugom primeru, katjonski lipidi se mogu primeniti u kombinaciji sa genskim pištoljima ili elektroporatorima. Pogodni materijali i postupci za transformaciju ili transfekciju ciljanih ćelija mogu se naći, npr kod Green i Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2014).

[0146] Medijum ili pufer koji se koriste za suspendovanje ćelija i materijala (reagensa) koji se elektroporiše u ćelije za proces elektroporacije može biti medijum ili pufer uključujući, ali ne ograničavajući se na, MEM, DMEM, IMDM, RPMI, Henskov, PBS ili Ringerov rastvor, gde se medijum može pružiti u kertridžu za reagens kao deo kompleta. Za elektroporaciju većine eukariotskih ćelija, medijum ili pufer obično sadrže soli za održavanje odgovarajućeg osmotskog pritiska. Soli u medijumu ili puferu takođe čine medijum provodnim. Za elektroporaciju veoma malih prokariotskih ćelija kao što su bakterije, ponekad se koristi voda ili 10% glicerola kao medijum niske provodnosti kako bi se omogućila veoma visoka jačina električnog polja. U tom slučaju, naelektrisani molekuli koji se isporučuju i dalje čine medijum na bazi vode provodnijim od ćelijskih membrana na bazi lipida, i medijum se i dalje može grubo smatrati provodnim, posebno u poređenju sa ćelijskim membranama.

[0147] Jedinjenje koje se elektroporira u ćelije po izboru može biti bilo koje jedinjenje za koje je poznato da

2

je korisno za elektroporaciju, kao što su nukleinske kiseline, oligonukleotidi, polinukleotidi, DNK, RNK, peptidi, proteini i mali molekuli kao što su hormoni, citokini, hemokini, droge, ili prekursori lekova.

[0148] Važno je koristiti napon dovoljan za postizanje elektroporacije materijala u ćelije, ali ne prevelik napon jer će prevelika snaga smanjiti vitalnost ćelije. Na primer, za elektroporaciju suspenzije ljudske ćelijske linije, potrebno je 200 volti za uzorak od 0,2 ml u kiveti sa razmakom od 4 mm sa eksponencijalnim pražnjenjem iz kondenzatora od oko 1000 µF. Međutim, ako se ista ćelijska suspenzija od 0,2 ml stavi u dužu posudu sa razmakom elektroda od 2 cm (5 puta udaljenosti između kivete), potreban napon iznosio bi 1000 volti, ali je potreban kondenzator od samo 40 µF (1/25 od 1000 µF) jer električna energija iz kondenzatora prati jednačinu:

gde je E električna energija, U je napon i C je kapacitivnost. Stoga je visokonaponski impulsni generator zapravo jednostavan za proizvodnju jer mu je potreban mnogo manji kondenzator za skladištenje slične količine energije. Slično, ne bi bilo teško generisati druge talasne oblike viših napona.

[0149] Uređaji za elektroporaciju prema pronalasku mogu omogućiti visoku stopu transformacije ćelije u relativno kratkom vremenskom periodu. Brzina transformacije ćelije zavisi od tipa ćelije i broja ćelija koje se transformišu. Na primer, za E. coli, uređaji za elektroporaciju mogu da pruže brzinu transformacije ćelije od 1 do 10<10>ćelije u sekundi, 10<4>do 10<7>u sekundi, 10<5>do 10<8>u sekundi, ili 10<6>do 10<9>u sekundi. Uređaji za elektroporaciju takođe omogućavaju transformaciju serija ćelija u rasponu od 1 ćelije do 10<10>ćelija u jednoj proceduri transformacije pomoću uređaja.

[0150] Efikasnost transformacije korišćenjem uređaja za elektroporaciju prema pronalasku može dovesti do toga da najmanje 10% ćelija bude dovoljno porirano da omogući isporuku biološkog molekula. Poželjno, efikasnost transformacije korišćenjem uređaja za elektroporaciju prema pronalasku može rezultovati u najmanje 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 75 %, 80%, 85%, 90%, 95% ili više ćelija je dovoljno porirano da omogući isporuku biološkog molekula.

[0151] U nekim otelotvorenjima, elektroporacija se izvodi u kiveti, komorici, cevi, komori, protočnoj ćeliji, kanalu ili vrhu pipete. U drugim otelotvorenjima, kiveta, komorica, cev ili komora se pune i prazne sa dna. U nekim otelotvorenjima, kiveta sadrži kapalicu povezanu sa dnom.

[0152] Slika 5A prikazuje primer uređaja za elektroporaciju sa jednom jedinicom 500 (modul za elektroporaciju) uključujući, od vrha do dna, kućište 502 koje obuhvata zahvatni element 504 konfigurisan da zahvati pipetu kao što je automatska pipeta za izbacivanje vazduha (nije prikazana) i filter 506. Pored kućišta 502, postoji deo kivete za elektroporaciju 510 uređaja za elektroporaciju 500, uključujući elektrode 512, i zidove 514 komore za elektroporaciju 516. Komora, u nekim primerima, može da se kreće između 0,01-100 mm širine, 1-5.000 mm visine i 1-20.000 µl zapremine; između 0,03-50 mm širine, 50-2.000 mm visine i 500-10.000 µl zapremine; ili između 0,05-30 mm širine, 2-500 mm visine i 25-4.500 µl zapremine.

[0153] U nekim otelotvorenjima, prvi rezervoar 508 se može postaviti između filtera 506 i komore za elektroporaciju 516, gde je prvi rezervoar u fluidnoj vezi sa elektroporacionom komorom 516 i pruža prazno skladište za bilo koji ćelijski uzorak koji se može uzeti nakon komore za elektroporaciju 516. Prvi rezervoar 508, u nekim primerima, može da se kreće između 0,1-150 mm širine, 0,1-250 mm visine i 0,5-10,000 µl zapremine; između 0,3-100 mm širine, 30-150 mm visine i 20-4.000 µl zapremine; ili između 0,5-100 mm širine, 0,5-100 mm visine i 5-2.000 µl zapremine.

[0154] U nekim implementacijama, uređaj za elektroporaciju 500 može dodatno uključiti još jedan rezervoar 524 u fluidnoj vezi sa prvim rezervoarom 508 (kroz filter 506). Drugi rezervoar 524 se može postaviti između filtera 506 i zahvatnog elementa 504 da zaštiti pipetu od kontaminacije bilo kojom tečnošću koja može da prođe pored filtera 506. Drugi rezervoar 524, u nekim primerima, može da se kreće između 0,1-250 mm širine, 0,2-1000 mm visine i 0,1-2,500 µl zapremine; između 0,1-150 mm širine, 50-400 mm visine i 1-1.000 µl zapremine; ili između 0,2-100 mm širine, 0,5-200 mm visine i 2-600 µl zapremine.

[0155] U nekim otelotvorenjima, kapalica 518 je u fluidnoj vezi sa komorom za elektroporaciju 516 i spojen je sa komorom za elektroporaciju, gde kapalica 518 ima kraj proksimalni 520 u odnosu na komoru za elektroporaciju 516 i kraj distalni 522 od komore za elektroporaciju 516. Distalni kraj 522 kapalice 518 može

2

omogućiti uzimanje i doziranje uzorka ćelije iz uređaja za elektroporaciju 500. kapalica 518 je, u nekim otelotvorenjima, deo robotskog sistema za manipulaciju. kapalica 518, u nekim primerima, može biti napravljen od plastike kao što su polivinil hlorid, polietilen, poliamid, polietilen, polipropilen, akrilonitril butadien, polikarbonat, polietereteketon (PEEK), polisulfon i poliuretani, ko-polimeri i drugi polimer (kao što je stakleni kapilar) i metalne cevi kao što su aluminijum, nerđajući čelik ili bakar. Primeri materijala uključuju kristalni stiren i ciklične olefinske kopolimere. PEEK je poželjna plastika s obzirom da je niske cene i lako se proizvodi. kapalica 518, u nekim primerima, može da se kreće između 0,02-2,000 mm širine, 0,25-2,000 mm visine i 1-2,000 µl zapremine; između 0,02-1.250 mm širine, 250-1.500 mm visine i 1,5-1.500 µl zapremine; ili između 0,02-10 mm širine, 4,0-1,000 mm visine i 2,5-1,000 µl zapremine.

[0156] Kućište 502 i zahvatni element 504 uređaja za elektroporaciju 500, u nekim primerima, mogu biti napravljeni od silikona, smole, polivinilhlorida, polietilena, poliamida, polietilena, polipropilena, akrilonitril butadiena, polikarbonata, polietereteketona (PEEK), polisulfona i poliuretana i kopolimeri ovih i drugih polimera. Slično, zidovi 512 komore za elektroporaciju, u nekim primerima, mogu biti napravljeni od silikona, smole, stakla, staklenih vlakana, polivinilhlorida, polietilena, poliamida, polietilena, polipropilena, akrilonitril butadiena, polikarbonata, polietereteketona (PEEK), polisulfona i poliuretana, kopolimera ovih i drugih polimera. Primeri materijala uključuju kristalni stiren i ciklične olefinske kopolimere. Ove strukture ili njihovi delovi mogu se kreirati različitim tehnikama, na primer, injekcionim oblikovanjem, stvaranjem strukturnih slojeva koji se spajaju, itd. Polikarbonatni i ciklični olefinski polimeri su poželjni materijali.

[0157] Komora za elektroporaciju 516 je, u nekim otelotvorenjima, generalno cilindričnog oblika. U drugim otelotvorenjima, komora za elektroporaciju 516 može biti pravougaona, konična ili kvadratna.

[0158] Filter 506 može biti napravljen, u nekim primerima, od porozne plastike, hidrofobnog polietilena, pamuka ili staklenih vlakana. Poželjno, filter 506 je sastavljen od jeftinog materijala kao što je porozna plastika. Filter može da se kreće između 0,2-500 mm širine, 0,2-500 mm visine i 1-3.000 µl zapremine; između 0,3-250 mm širine, 20-200 mm visine i 50-2.500 µl zapremine; ili između 0,5-150 mm širine, 0,2-80 mm visine i 10-2.000 µl zapremine.

[0159] Zahvatni element 504 je konfigurisan da ima dimenziju koja je kompatibilna sa uređajem za rukovanje tečnostima koji se koristi u instrumentu za elektroporaciju.

[0160] Komponente uređaja za elektroporaciju mogu biti proizvedene odvojeno i zatim sastavljene, ili određene komponente uređaja za elektroporaciju mogu biti proizvedene ili oblikovane kao jedna celina, sa drugim komponentama koje se dodaju nakon oblikovanja. Na primer, kapalica, zidovi za elektroporaciju i kućište mogu biti proizvedeni ili oblikovani kao jedna celina, sa elektrodama, filterom, zahvatnim elementom koji se kasnije dodaju jednoj celini kako bi se formirao modul za elektroporaciju. Slično, zidovi i kućište za elektroporaciju mogu biti proizvedeni kao jedna celina, sa kapalicom, elektrodama, filterom, spojnim elementom koji se dodaju modulu za elektroporaciju nakon oblikovanja. Moguće su i druge kombinacije integrisanih i neintegrisanih komponenti.

[0161] Elektrode 512 se mogu formirati od metala, kao što su bakar, titanijum, aluminijum, mesing, srebro, rodijum, zlato ili platina, ili grafit, koji mogu da izdrže primenu električnog polja. Na primer, primenjeno električno polje može uništiti elektrode napravljene od metala kao što je aluminijum. Ako se želi višekratna upotreba uređaja za elektroporaciju, ploče elektroda mogu biti premazane metalima otpornim na elektrohemijsku koroziju. Provodni premazi poput plemenitih metala, na primer zlata, mogu se koristiti za zaštitu ploča elektroda. U konkretnom primeru, kiveta za elektroporaciju može da sadrži prvu metalnu elektrodu i drugu metalnu elektrodu napravljenu od titanijuma prekrivenog slojem zlata. Suprotno tome, ako je uređaj za elektroporaciju 500 dizajniran za jednokratnu upotrebu, mogu se koristiti jeftiniji metali kao što je aluminijum.

[0162] U jednom otelotvorenju, rastojanje između elektroda može iznositi između 0,3 mm i 10 mm. U drugom otelotvorenju, rastojanje između elektroda može iznositi između 1 mm i 20 mm, ili 1 mm do 10 mm, ili 2 mm do 5 mm. Unutrašnji prečnik komore za elektroporaciju može iznositi između 0,1 mm i 10 mm. Kako bi se izbegli različiti intenziteti polja između elektroda, elektrode treba da budu raspoređene paralelno sa konstantnim rastojanjem jedna od druge po celoj površini elektroda. Poželjno, prva metalna elektroda i druga metalna elektroda su razdvojene na rastojanju od 2-4 mm u paralelnom rasporedu sa varijacijama u

2

rastojanju manjim od /-20 µm. Štaviše, površina elektroda treba da bude što glatkija bez rupica ili vrhova. Poželjne su elektrode koje imaju hrapavost Rz od 1 do 10 µm. U drugim otelotvorenjima, uređaj za elektroporaciju uključuje najmanje jednu dodatnu elektrodu koja primenjuje potencijal uzemljenja na, na primer, deo kapalica uređaja za elektroporaciju.

[0163] Iako je ilustrovan kao uređaj 500 sa jednom jedinicom, u drugim otelotvorenjima, modul za elektroporaciju uključuje više jedinica za elektroporaciju. Svaka jedinica za elektroporaciju može biti konfigurisana za elektroporaciju zapremine uzorka ćelija od 1 µl do 20 ml. Na primer, različiti zapreminski kapaciteti jedinica za elektroporaciju mogu biti dostupni u uređaju za elektroporaciju sa više jedinica.

[0164] U modulu za elektroporaciju sa više jedinica, u nekim otelotvorenjima, elektrode su nezavisni, samostalni elementi. U drugim otelotvorenjima, uređaj za elektroporaciju sa više jedinica može da sadrži elektrode raspoređene tako da kivete za elektroporaciju u susednim jedinicama za elektroporaciju dele elektrode. Takvi uređaji za elektroporaciju sa više jedinica mogu uključivati, na primer, 2 ili više jedinica za elektroporaciju, 4 ili više jedinica za elektroporaciju, 8 ili više jedinica za elektroporaciju, 16 ili više jedinica za elektroporaciju, 32 ili više jedinica za elektroporaciju, 48 ili više jedinica za elektroporaciju, 64 ili više jedinica za elektroporaciju, ili čak 96 ili više jedinica za elektroporaciju, poželjno u automatizovanom uređaju. Kada se koristi više paralelnih uređaja, u svakoj jedinici se obično koriste slične zapremine.

[0165] Iako su dati primeri dimenzija, dimenzije će, naravno, varirati u zavisnosti od zapremine uzorka ćelije i kontejnera koji se koriste da sadrže ćelije i/ili materijal koji se elektroporiše.

[0166] U poželjnim otelotvorenjima, modul za transformaciju uključuje najmanje jedan uređaj za elektroporaciju koji ima kućište sa komorom za elektroporaciju, prvu elektrodu i drugu elektrodu konfigurisane da zahvate generator električnih impulsa. U nekim implementacijama, uređaji za protočnu elektroporaciju su konfigurisani da se spajaju sa zamenjivim kertridžom kao što su kertridži 104, 106 na Slici 1A (npr. modul za transformaciju 110c), kojim se električni kontakti spajaju sa elektrodama uređaja za elektroporaciju. U određenim otelotvorenjima, uređaji za elektroporaciju se mogu autoklavirati i/ili biti za jednokratnu upotrebu, pakovani su sa reagensima u kertridžu za reagens i/ili se mogu ukloniti iz kertridža za reagens. Uređaj za elektroporaciju može biti konfigurisan za elektroporaciju zapremine uzorka ćelija između 1 µl do 2 ml, 10 µl do 1 ml, 25 µl do 750 µl ili 50 µl do 500 µl. Ćelije koje se mogu elektroporisati pomoću obelodanjenih uređaja za elektroporaciju obuhvataju ćelije sisara (uključujući ljudske ćelije), biljne ćelije, kvasce, druge eukariotske ćelije, bakterije, arheje i druge tipove ćelija.

[0167] Kertridži za reagens za upotrebu u automatizovanim sistemima za obradu ćelija sa više modula (npr. kertridž 104 na Slici 1A), u nekim otelotvorenjima, uključuju jedan ili više uređaja za elektroporaciju (npr. modul za elektroporaciju 110c na Slici 1A), poželjno protočne preko uređaja za elektroporaciju. Slika 5B je pogled u perspektivi odozdo na komplet 530 od šest zajedno spojenih uređaja za elektroporaciju (npr. jedinica ili modula) 532a-f koji mogu biti deo kertridža za reagens, a Slika 5C je pogled odozgo na isto. Kertridž može da sadrži jednu do šest ili više jedinica za protočnu elektroporaciju 532a-f raspoređenih na jednom supstratu 534. Svaka od šest jedinica za protočnu elektroporaciju 532a-f ima odgovarajuće otvore 536a-f koji definišu ulaze za uzorke ćelije i komorice 538a -f (pogledati Sliku 5C) koji definišu izlaze uzoraka ćelija. Dodatno, kao što se vidi na Slici 5B, svaka jedinica za elektroporaciju 532a-f uključuje odgovarajući ulaz 540a-f, odgovarajući izlaz 542a-f, odgovarajući kanal za protok 544a-f i dve elektrode 546a-f sa obe strane suženja u odgovarajućem kanalu za protok 544a- f svake jedinice za protočnu elektroporaciju 532a-f.

[0168] Jednom kada se proizvede šest jedinica za elektroporaciju 532a-f, u nekim otelotvorenjima, one se mogu razdvojiti jedna od druge duž linija razdvajanja koje odvajaju svaku jedinicu od susedne jedinice (tj. „razbiti“) i koristiti jedna po jedna ili, alternativno u drugim otelotvorenjima, dve ili više jedinica za elektroporaciju 532a-f mogu da se koriste paralelno, u kom slučaju te dve ili više jedinica poželjno ostaju povezane duž linija razdvajanja.

[0169] Uopšteno govoreći, mikrofluidna elektroporacija koja koristi ćelijsku suspenziju zapremine manje od približno 10 ml i samo 1 (µl-omogućava precizniju kontrolu nad procesom transfekcije ili transformacije i dozvoljava fleksibilnu integraciju sa drugim alatima za obradu ćelija u poređenju sa uređajima za elektroporaciju veće razmere. Mikrofluidna elektroporacija stoga pruža jedinstvene prednosti za, na primer,

2

transformaciju, obradu i analizu jedne ćelije, konfiguracije uređaja za elektroporaciju sa više jedinica i integrisanu, automatsku, multi-modularnu obradu i analizu ćelija.

[0170] Uređaji za protočnu elektroporaciju uključeni u kertridže za reagens mogu postići visokoefikasnu ćelijsku elektroporaciju sa niskom toksičnošću. U specifičnim otelotvorenjima uređaja za protočnu elektroporaciju prema pronalasku, nivo toksičnosti transformacije rezultuje u više od 10% vitalnih ćelija nakon elektroporacije, poželjno više od 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili čak 95% vitalnih ćelija nakon transformacije, u zavisnosti od tipa ćelije i nukleinskih kiselina koje se unose u ćelije.

[0171] Nakon transformacije, ćelijama se dozvoljava da se oporave pod uslovima koji promovišu proces uređivanja genoma koji se odvija kao rezultat transformacije i eksprimiranja uvedenih nukleinskih kiselina u ćelije.

Postupak za automatizovanu multi-modularnu obradu ćelija

[0172] Slika 9 je dijagram toka primera postupka 900 za korišćenje automatizovanog multi-modularnog sistema za obradu ćelija kao što su sistemi ilustrovani na Slikama 1A-1B i 12A-12B. Sistem za obradu na Slici 13, na primer, može da usmerava fazu obrade postupka 900. Na primer, softverska rutina može da identifikuje podešavanja za svaku fazu obrade i uputstva za kretanje robotskog sistema za rukovanje da izvrši radnje postupka 900. U nekim slučajevima, softverska rutina instrukcija može biti identifikovana pomoću kertridža koji se isporučuje automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija. Na primer, kertridž može da sadrži mašinski čitljive oznake, kao što je bar kod ili QR kod, uključujući identifikaciju računarske rutine uskladištene u memoriji automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija (npr., kao što je memorija 1302 na Slici 13). U drugom primeru, kertridž može da sadrži računarsku rutinu za preuzimanje ugrađenu u mašinski čitljive oznake kao što je oznaka radio frekvencije (RF). U drugim slučajevima, korisnik može da identifikuje računarsku rutinu, na primer preuzimanjem računarske rutine putem žičane ili bežične veze na sistem za obradu automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija ili izborom uskladištene računarske rutine preko korisničkog interfejsa automatizovanog multimodularnog instrumenta za obradu ćelija. U konkretnom primeru, automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija može da sadrži interfejs ekrana osetljivog na dodir za podnošenje korisničkih podešavanja i aktiviranje obrade ćelije.

[0173] U nekim implementacijama, postupak 900 počinje sa prenosom ćelija u modul za uzgoj (902). Modul za uzgoj, na primer, može biti modul za uzgoj 800 opisan u vezi sa Slikama 8A do 8F. U konkretnom primeru, sistem za obradu 120 može usmeriti robotski sistem za rukovanje 108 da prenese ćelije 106 u modul za uzgoj 110a, kao što je opisano u vezi sa Slikama 12A i 12B. U drugom primeru, kao što je opisano u vezi sa Slikom 1A, ćelije se mogu preneti iz jednog od kertridža 104, 106 u module za uzgoj 110a, 110b pomoću robotskog sistema za rukovanje 108. U nekim otelotvorenjima, bočica za uzgoj može sadržati medijum za uzgoj i biti isporučena, npr., kao deo kompleta. U drugim otelotvorenjima, bočica za uzgoj može biti napunjena medijumom koji se prenosi, na primer, preko uređaja za rukovanje tečnostima, iz kontejnera za reagens.

[0174] U nekim slučajevima, pre prenosa ćelija (npr. iz kertridža za reagens 104 ili iz bočice dodate instrumentu), mašinski čitljive oznake mogu da se skeniraju na bočici ili drugom kontejneru koji se nalazi na mestu određenom za ćelije kako bi se potvrdilo da su bočica ili kontejner označeni da sadrže ćelije. Dalje, mašinski čitljive oznake mogu ukazivati na tip ćelija koje se pružaju instrumentu. Tip ćelija, u nekim otelotvorenjima, može dovesti do toga da instrument odabere određenu računarsku rutinu za obradu (npr. serija uputstava za robotski sistem rukovanja i podešavanja i aktiviranje različitih modula).

[0175] U nekim implementacijama, ćelije se uzgajaju u modulu za uzgoj do željene optičke gustine (904). Na primer, sistem za obradu 126 na Slikama 1A-1B ili sistem za obradu 1220 na Slikama 12A-B može da upravlja podešavanjem temperature modula za uzgoj 110a za inkubaciju ćelija tokom ciklusa uzgoja. Sistem za obradu 126, 1220 može dalje da prima signale senzora od modula za uzgoj 110a, 110b koji ukazuju na optičku gustinu i analizira signale senzora da bi nadgledao uzgoj ćelija. U nekim slučajevima, korisnik može podesiti parametre uzgoja za upravljanje uzgojem ćelija. Na primer, temperatura i stepen agitacije ćelija. Dalje, u nekim slučajevima, korisnik može primati obaveštenja u vezi sa procesom uzgoja. Obaveštenja, u

2

nekim primerima, mogu uključivati poruku predstavljenu na korisničkom interfejsu automatizovanog multimodularnog sistema za obradu ćelija, tekstualnu poruku na broj mobilnog telefona korisnika, poruku e-pošte na nalog e-pošte ili poruku prenetu na aplikaciji koja se izvršava na prenosivom elektronskom uređaju (npr. mobilni telefon, tablet itd.). Reagujući na poruke, u nekim slučajevima, korisnik može da izmeni parametre, kao što je temperatura, kako bi prilagodio uzgoj ćelija. Na primer, korisnik može da podnese ažurirane parametre preko korisničkog interfejsa automatizovanog multi-modularnog sistema za obradu ćelija ili preko aplikacije prenosivog računarskog uređaja u vezi sa automatizovanim multi-modularnim sistemom za obradu ćelija, kao što je korisnički interfejs 1100 na Slici 11.

[0176] Iako je opisano u odnosu na optičku gustinu, u drugim implementacijama, uzgoj ćelija unutar modula za uzgoj može se pratiti korišćenjem različite mere gustine ćelije i fiziološkog stanja, kao što su, u nekim primerima, pH, rastvoreni kiseonik, oslobođeni enzimi, akustična svojstva i električna svojstva.

[0177] U nekim implementacijama, nakon dostizanja željene optičke gustine (904), ćelije se prenose iz modula za uzgoj u modul za filtriranje ili modul za pranje i koncentraciju ćelija (906). Robotski sistem za rukovanje 108 na Slikama 1A- -1B ili 1208 na Slikama 12A-12B, na primer, može da prenese ćelije iz modula za uzgoj 1210a u modul za filtriranje 1210b. Modul za filtriranje, na primer, može biti dizajniran tako da ćelije budu elektrokompetentne. Dalje, modul za filtriranje može biti konfigurisan da smanji zapreminu ćelijskog uzorka na zapreminu prikladnu za elektroporaciju. U drugom primeru, modul za filtriranje može biti konfigurisan da ukloni neželjene komponente, kao što su soli, iz uzorka ćelije. U nekim slučajevima, robotski sistem za rukovanje 108 prenosi rastvor za pranje u modul za filtriranje 1210b za pranje ćelija.

[0178] U nekim implementacijama, ćelije su postale elektrokompetentne i eluirane u modulu za filtriranje ili modulu za pranje i koncentraciju ćelija (908). Ćelije se mogu eluirati korišćenjem rastvora za pranje. Na primer, ćelije se mogu eluirati korišćenjem reagenasa iz zaliha reagensa. Modul za filtriranje ili modul za pranje i koncentraciju ćelija, na primer, može biti sličan modulu za filtriranje 700 ilustrovanom na Slikama 7A i 7B. Kao što je gore razmatrano, brojni različiti postupci mogu se koristiti za pranje ćelija, uključujući prečišćavanje gradijentom gustine, dijalizu, kolone za jonsku razmenu, filtriranje, centrifugiranje, razblaživanje i upotrebu perli za prečišćavanje. U nekim aspektima, modul za pranje i koncentraciju ćelija koristi uređaj za centrifugiranje. U drugim aspektima, modul za filtriranje koristi instrument za filtriranje. U drugim aspektima, perle su povezane sa delovima koji se vezuju za površinu ćelije. Ovi delovi uključuju, ali nisu ograničeni na antitela, lektine, aglutinin pšeničnih klica, mutirane lizozime i ligande. U drugim aspektima, ćelije su projektovane da budu magnetizovane, omogućavajući magnetima da peletiraju ćelije nakon koraka pranja. Mehanizam magnetizacije ćelije može uključivati, ali nisu ogranučeni na eksprimiranje proteina feritina.

[0179] U nekim slučajevima, rastvor za pranje se prenosi u modul za filtriranje pre eluiranja. Robotski sistem za rukovanje 108 na Slikama 12A-12B, na primer, može preneti rastvor za pranje iz bočice ili kontejnera koji se nalazi na mestu određenom za rastvor za pranje. Pre prenošenja rastvora za pranje, mašinski čitljive oznake mogu da se skeniraju na bočici ili drugom kontejneru ili rezervoaru koji se nalazi na mestu određenom za rastvor za pranje kako bi se potvrdio sadržaj bočice, kontejnera ili rezervoara. Dalje, mašinski čitljive oznake mogu ukazivati na vrstu rastvora za pranje koji se pruža instrumentu. Tip rastvora za pranje, u nekim slučajevima, može dovesti do toga da sistem odabere određenu računarsku rutinu za obradu (npr. podešavanja i aktivacija modula za filtriranje koji odgovaraju određenom rastvoru za pranje).

[0180] U drugim slučajevima, ćelije se eluiraju u modulu za pranje ćelija u kertridžu za pranje. Na primer, eluirane ćelije mogu biti sakupljene u praznom sudu kertridža za pranje 106 ilustrovanog na Slici 1A, i robotski sistem za rukovanje 108 može preneti medijum iz kertridža za reagens 104 (ili reagens kertridža za pranje 10b) u eluirane ćelije.

[0181] Kada ćelije postanu elektrokompetentne i suspendovane u odgovarajućoj zapremini kao što je 50 µL do 10 mL, ili 100 µL do 80 mL, ili 150 µL do 8 mL, ili 250 µL do 7 mL, ili 500 µL, ili 750 µL do 5 mL za transformaciju pomoću modula za filtriranje (906), u nekim implementacijama, ćelije se prenose u modul za transformaciju (918). Robotski sistem za rukovanje 108 na Slikama 1A-1B, na primer, može da prenese ćelije iz modula za filtriranje u modul za transformaciju 110c. Modul za filtriranje može biti fizički povezan sa modulom za transformaciju, ili ovi moduli mogu biti odvojeni. U jednom otelotvorenju kao što je instrument 100 na Slici 1A sa materijalima zasnovanim na kertridžima, ćelije se mogu eluirati u rezervoar unutar kertridža, kao što je kertridž za reagens 104, pre prenošenja u modul za transformaciju.

[0182] U nekim implementacijama, nukleinske kiseline se pripremaju izvan automatizovanog multimodularnog instrumenta za obradu ćelija. Na primer, korisnik može uključiti sastavljeni vektor ili drugo sastavljanje nukleinske kiseline kao reagens pre pokretanja procesa transformacije i drugih procesa u postupku 900.

[0183] Međutim, u drugim primenama, nukleinske kiseline se pripremaju pomoću automatizovanog multimodularnog instrumenta za obradu ćelija. Deo narednih koraka 910 do 916 se, u nekim otelotvorenjima, izvodi paralelno sa delom koraka 902 do 908. Najmanje deo narednih koraka se, u nekim otelotvorenjima, izvodi pre i/ili posle koraka 902 do 908.

[0184] U nekim otelotvorenjima, nukleinske kiseline kao što su uređujući oligonukleotid i vektorska kičma, kao i, u nekim primerima, enzimi i druge reakcione komponente prenose se u modul za sastavljanje nukleinske kiseline (910). modul za sastavljanje nukleinske kiseline može biti konfigurisan da izvodi jednu ili više od velikog broja različitih tehnika sastavljanja nukleinske kiseline na automatizovan način. Tehnike sastavljanja nukleinske kiseline koje se mogu izvesti u modulu za sastavljanje nukleinske kiseline mogu uključivati, ali nisu ograničene na, one postupke sastavljanja koje koriste restrikcione endonukleaze, uključujući PCR, BioBrick sastavljanje, kloniranje tipa IIS (npr. GoldenGate sastavljanje) i reakcija ciklusa ligaze. U drugim primerima, modul za sastavljanje nukleinske kiseline može da izvede tehniku sastavljanja zasnovanu na preklapanjima između susednih delova nukleinskih kiselina, kao što je Gibson Assembly<®>, CPEC, SLIC, ciklus ligaze itd. Dodatni primeri postupaka sastavljanja koje može da izvede modul za sastavljanje nukleinske kiseline uključuju popravku pukotina u kvascu, kloniranje prolaza i kloniranje posredovano topoizomerazom. modul za sastavljanje nukleinske kiseline, na primer, može biti modul za sastavljanje nukleinske kiseline 400 opisan u vezi sa Slikom 4. U konkretnom primeru, sistem za obradu 120 može usmeriti robotski sistem za rukovanje 1208 da prenese nukleinske kiseline 1206 do modula za sastavljanje nukleinske kiseline 1210e, kao što je opisano u vezi sa Slikom 12B. U drugom primeru, kao što je opisano u vezi sa Slikom 1A, nukleinske kiseline se mogu preneti iz jednog od kertridža 104, 106 u modul za sastavljanje nukleinske kiseline pomoću robotskog sistema za rukovanje 108.

[0185] U nekim slučajevima – pre prenosa svakog od uzoraka nukleinske kiseline, enzima i drugih reakcionih komponenti – mašinski čitljive oznake mogu da se skeniraju na bočicama ili drugim kontejnerima koji se nalaze na mestima određenim za ove materijale kako bi se potvrdilo da su bočice ili kontejneri označeni da sadrže predviđeni materijal. Dalje, mašinski čitljive oznake mogu ukazivati na tip jednog ili više uzoraka nukleinske kiseline, enzima i drugih reakcionih komponenti koje su pružene instrumentu. Tipovi materijala, u nekim slučajevima, mogu dovesti do toga da instrument odabere određenu računarsku rutinu za obradu (npr. serija uputstava za robotski sistem rukovanja da identifikuje dalje materijale i/ili podešavanja i aktiviranje modula za sastavljanje nukleinske kiseline).

[0186] U nekim slučajevima, modul za sastavljanje nukleinske kiseline se kontroliše temperaturom u zavisnosti od tipa sastava nukleinske kiseline koji se koristi. Na primer, kada se PCR koristi u modulu za sastavljanje nukleinske kiseline, modul može imati sposobnost termocikliranja omogućavajući temperaturama da kruže između denaturacije, kalemljenja i ekstenzije. Kada se postupci sastavljanja na jednoj temperaturi koriste u modulu za sastavljanje nukleinske kiseline, modul može imati mogućnost da dostigne i zadrži temperaturu koja optimizuje specifični proces sastavljanja koji se izvodi.

[0187] Kontrolom temperature, u nekim slučajevima, upravlja sistem za obradu automatizovanog multimodularnog instrumenta za obradu ćelija, kao što je sistem za obradu 1310 na Slici 13. Ove temperature i trajanje održavanja temperatura mogu se odrediti unapred programiranim skupom parametara (npr. identifikovani u okviru računarske rutine za obradu ili u drugom memorijskom prostoru dostupnom sistemu za obradu), ili ručno kontrolisani od strane korisnika kroz povezivanje sa sistem obrade.

[0188] Kada protekne dovoljno vremena da se odigra reakcija sastavljanja, u nekim implementacijama, sastavljanje nukleinske kiseline se prenosi u modul za prečišćavanje (914). Sistem za obradu, na primer, može da prati tajming reakcije sastavljanja na osnovu jednog ili više od tipova reakcije, tipa materijala i korisničkih podešavanja koja su data automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija.

1

Robotski sistem za rukovanje 108 na Slikama 1A-1B ili 12A-12B, na primer, može da prenese sastavljanje nukleinske kiseline u modul za prečišćavanje preko interfejsa za kapalica ili pipetor. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje 108 na Slikama 1A-1B ili 12A-12B može da prenese bočicu koja sadrži sastavljanje nukleinske kiseline iz komore modula sastava nukleinske kiseline u komoru modula za uklanjanje soli/prečišćavanja.

[0189] U nekim implementacijama, sastavljanje nukleinske kiseline se desalinifikuje i eluira na modulu za prečišćavanje (916). Modul za prečišćavanje, na primer, može ukloniti neželjene komponente mešavine sastava nukleinske kiseline (npr. soli, minerali, itd.). U nekim slučajevima, modul za prečišćavanje koncentriše sastavljene nukleinske kiseline u manju zapreminu od zapremine sastava nukleinske kiseline. Primeri postupaka za razmenu tečnosti nakon sastavljanja nukleinske kiseline uključuju magnetne perle (npr. SPRI ili Dynal (Dynabeads) kompanije Invitrogen Corp. iz Karlsbada, Kalifornija), perle od silicijumdioksida, silicijumske spiralne kolone, staklene perle, taloženje (npr. korišćenjem etanola ili izopropanola), alkalnu lizu, osmotsko prečišćavanje, ekstrakciju butanolom, tehnike separacije zasnovane na membrani, filtriranje itd. Na primer, može se koristiti jedan ili više mikrokoncentratora opremljenih anizotropnim, hidrofilno generisanim celuloznim membranama različitih poroznosti. U drugom primeru, modul za desalinifikaciju/prečišćavanje može obraditi tečni uzorak koji uključuje nukleinsku kiselinu i jonsku so dovođenjem u dodir smeše sa jonskim izmenjivačem koji uključuje nerastvorljivu fosfatnu so, uklanjanjem tečnosti i eluiranjem nukleinske kiseline iz izmenjivača jona.

[0190] U ilustrativnom slučaju, sastavljanje nukleinske kiseline može da se kombinuje sa magnetnim perlama, kao što su SPRI perle, u komori modula za prečišćavanje. sastavljanje nukleinske kiseline može da se inkubira na podešenoj temperaturi dovoljno vremena da se sastavljanje nukleinske kiseline veže za magnetne kuglice. Nakon inkubacije, magnet se može uključiti u blizini komore tako da se sastavljanje nukleinske kiseline može oprati i eluirati. Ilustrativni primer ovog procesa je razmatran u vezi sa kombinacijom modula za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline i prečišćavanje na Slici 4.

[0191] Kada je sastavljanje nukleinske kiseline eluiran, sastavljanje nukleinske kiseline se, u nekim implementacijama, prenosi u modul za transformaciju (918). Robotski sistem za rukovanje 108 na Slikama 1A-1B ili 12A-12B, na primer, može da prenesu sastavljanje nukleinske kiseline u modul za transformaciju preko interfejsa kapalice ili pipetora do, na primer, modula elektroporatora zasnovanog na kiveti ili modula za protočni elektroporator, kao što je opisano iznad. Na primer, desalinifikovane sastavljene nukleinske kiseline, tokom transfera, mogu da se kombinuju sa elektrokompetentnim ćelijama iz koraka 908. U drugim otelotvorenjima, modul za transformaciju može da prihvati svaku od elektrokompetentnih ćelija i sastavljanje nukleinske kiseline odvojeno i omogući mešanje (npr. otvori jedan ili više kanala kako bi se kombinovali materijali u zajedničkoj komori).

[0192] Ćelije se mogu transformisati u modulu za transformaciju (920). Transformacija može uključivati bilo koju tehniku priznatu u struci za uvođenje sekvence egzogene nukleinske kiseline (npr. DNK) u ciljanu ćeliju (bilo transformaciju ili transfekciju), uključujući, u nekim primerima, elektroporaciju, lipofekciju, optoporaciju, injekciju, mikrotaloženje, mikroinjekciju, lipozome, bombardovanje česticama, sonoporaciju, laserski indukovanu poraciju, transfekciju perli, zajedničko taloženje kalcijum fosfata ili kalcijum hlorida ili transfekcija posredovanu DEAE dekstranom. U nekim otelotvorenjima, mogu se koristiti hibridne tehnike koje iskorišćavaju mogućnosti mehaničkih i hemijskih postupaka transfekcije, kao što je magnetofekcija, metodologija transfekcije koja kombinuje hemijsku transfekciju sa mehaničkim postupcima. U drugom primeru, katjonski lipidi se mogu primeniti u kombinaciji sa genskim topovima ili elektroporatorima.

[0193] U nekim implementacijama, modul za transformaciju koristi elektroporaciju da pokrene uzimanje DNK materijala. Pufer ili medijum se mogu preneti u modul za transformaciju i dodati ćelijama tako da ćelije mogu biti suspendovane u puferu ili medijumu koji je povoljan za preživljavanje ćelija tokom elektroporacije. Pre prenosa pufera ili medijuma, mašinski čitljive oznake mogu da se skeniraju na bočici ili drugom kontejneru ili rezervoaru koji se nalazi na položaju određenom za pufer ili medijum kako bi se potvrdio sadržaj bočice, kontejnera ili rezervoara. Dalje, mašinski čitljive oznake mogu ukazivati na tip bafera ili medijuma koji je pružen instrumentu. Tip bafera ili medijuma, u nekim otelotvorenjima, može prouzrokovati da instrument odabere određenu računarsku rutinu za obradu (npr. podešavanja i aktivacija modula za transformaciju koji je odgovarajući za određeni bafer ili medijum). Za elektroporaciju bakterijskih

2

ćelija, medijumi niske provodnosti, kao što su rastvori vode ili glicerola, mogu se koristiti za smanjenje proizvodnje toplote prolaznom visokom strujom. Za ćelije kvasca može se koristiti rastvor sorbitola. Za elektroporaciju ćelija sisara, ćelije mogu biti suspendovane u visoko provodnom medijumu ili puferu, kao što su MEM, DMEM, IMDM, RPMI, Henkov, PBS, HBSS, HeBS i Ringerov rastvor. U konkretnom primeru, robotski sistem za rukovanje 108 može da prenese rastvor pufera u modul za transformaciju 110c iz jednog od kertridža 104, 106. Modul za transformaciju, na primer, može biti modul za elektroporaciju, kao što su opisani moduli za elektroporaciju u vezi sa Slikama 5A i 5B. Kao što je opisano u vezi sa Slikom 1A i Slikom 5B, modul za transformaciju može biti modul za protočnu elektroporaciju za jednokratnu upotrebu 110c koji je opremljen kertridžom 104 na Slici 1A.

[0194] U nekim implementacijama, modul za transformaciju dalje priprema ćelije za unos nukleinske kiseline. Na primer, bakterijske ćelije se mogu tretirati ispiranjem saharoze ili glicerola pre dodavanja nukleinskih kiselina, i ćelije kvasca mogu se tretirati rastvorom litijum acetata, ditioteitola (DTT) i TE pufera. U drugim otelotvorenjima koja uključuju pripremu ćelija za unos nukleinske kiseline, modul za filtriranje ili drugi odvojeni modul (npr. modul za pranje ćelija) može pripremiti ćelije za ažuriranje nukleinske kiseline.

[0195] Jednom transformisane, ćelije se prenose u drugi modul za uzgoj/oporavak/uređivanje (922).

Robotski sistem za rukovanje 108 na Slikama 1A-1B ili 12A-12B, na primer, može da prenese transformisane ćelije u drugi modul za uzgoj kroz kapalicu ili pipetor interfejs. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje 108 od 1A-1B ili 12A-12B može da prenese bočicu koja sadrži transformisane ćelije iz komore modula za transformaciju u komoru drugog modula za uzgoj.

[0196] Drugi modul za uzgoj, u nekim otelotvorenjima, deluje kao modul za oporavak, omogućavajući ćelijama da se oporave od procesa transformacije. U drugim otelotvorenjima, ćelije se mogu pružiti u odvojenom modulu za oporavak pre nego što se transportuju do drugog modula za uzgoj. Tokom oporavka, drugi modul za uzgoj omogućava transformisanim ćelijama da usvoje i, u određenim aspektima, integrišu uvedene nukleinske kiseline u genom ćelije. Drugi modul za uzgoj može biti konfigurisan da inkubira ćelije na bilo kojoj temperaturi koju definiše korisnik, optimalnoj za uzgoj ćelija, poželjno 25°, 30° ili 37° C.

[0197] U nekim otelotvorenjima, drugi modul za uzgoj se ponaša kao modul za odabir, birajući transformisane ćelije na osnovu antibiotika ili drugog reagensa. U jednom primeru, proteinski sistem RNK-vođene nukleaze (RGN) se koristi za odabir za razdvajanje genoma ćelija koje nisu dobile željeno uređivanje. RGN proteinski sistem koji se koristi za odabir može biti isti ili drugačiji kao RGN koji se koristi za uređivanje. U primeru agensa za odabir antibiotika, antibiotik se može dodati drugom modulu za uzgoj kako bi se aktivirao odabir. Pogodni geni otpornosti na antibiotike uključuju, ali nisu ograničeni na, gene kao što su gen otpornosti na ampicilin, gen otpornosti na tetraciklin, gen otpornosti na kanamicin, gen otpornosti na neomicin, gen otpornosti na kanavanin, gen otpornosti na blasticidin, gen otpornosti na higromicin, gen otpornosti na puromicin ili gen otpornosti na hloramfenikol. Robotski sistem za rukovanje 108 na Slikama 1A-1B ili 12A-12B, na primer, može da prenese antibiotik u drugi modul za uzgoj kroz kapalicu ili pipetor interfejs. U nekim otelotvorenjima, uklanjanje pozadinskih mrtvih ćelija je potpomognuto upotrebom litičkih pojačivača kao što su deterdženti, osmotski stres hipnotičkim pranjem, temperatura, enzimi, proteaze, bakteriofagi, redukcioni agensi ili haotropi. Sistem za obradu 1310 na Slici 13, na primer, može da promeni promenljive okoline, kao što je temperatura, kako bi izazvao odabir, dok robotski sistem za rukovanje 108 na Slikama 1A-1B ili 12A-12B može da isporuči dodatne materijale (npr. deterdžente, enzime, redukcione agense, itd.) kako bi pomogao odabir. U drugim otelotvorenjima, uklanjanje ćelija i/ili razmena medijuma filtriranjem se koriste za smanjenje pozadinskih mrtvih ćelija.

[0198] U daljim otelotvorenjima, pored ili kao alternativa primeni odabira, drugi modul za uzgoj služi kao modul za uređivanje, omogućavajući uređivanje genoma u transformisanim ćelijama. Alternativno, u drugim otelotvorenjima ćelije se nakon oporavka i odabira (ako se vrši) prenose u poseban modul za uređivanje. Kao modul za uređivanje, drugi modul za uzgoj indukuje uređivanje genoma ćelija, na primer, eksprimiranjem uvedenih nukleinskih kiselina. Eksprimiranje nukleaze može uključivati jednu ili više hemijskih, svetlosnih, virusnih ili temperaturnih indukcija. Drugi modul za uzgoj, na primer, može biti konfigurisan da zagreva ili hladi ćelije tokom procesa indukcije temperature. Na konkretnoj ilustraciji, ćelije se mogu indukovati zagrevanjem na 42°C-50°C. Nakon ilustracije, ćelije se zatim mogu ohladiti na 0-10°C posle indukcije. U primeru hemijske ili virusne indukcije, agens za indukciju može se preneti u drugi modul za uzgoj kako bi se indukovalo uređivanje. Ako je inducibilna nukleaza uvedena u ćelije, tokom uređivanja, inducibilna nukleaza se indukuje uvođenjem molekula induktora, kao što je molekul induktora 1224 opisan u vezi sa Slikom 12A. Indukcioni agens ili molekul induktora se, u nekim implementacijama, prenose u drugi modul za uzgoj pomoću robotskog sistema za rukovanje 108 na Slikama 1A-1B ili 12A-12B (npr. kroz pipetor ili kapalica interfejs).

[0199] U nekim implementacijama, ako nije potrebno dodatno uređivanje ćelija (924), ćelije se mogu preneti iz modula za uzgoj ćelija u jedinicu za skladištenje radi kasnijeg uklanjanja iz automatizovanog multimodularnog sistema za obradu ćelija (926). Jedinica za skladištenje, na primer, može uključivati jedinicu za skladištenje 114 na Slikama 12A-12B. Robotski sistem za rukovanje 108 na Slikama 1A-1B ili 12A-12B, na primer, može da prenese ćelije u jedinicu za skladištenje 114 preko interfejsa kapalice ili pipetora. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje 108 na Slikama 1A-1B ili 12A-12B može da prenese bočicu koja sadrži ćelije iz komore drugog modula za uzgoj u bočicu ili epruvetu unutar jedinice za skladištenje.

[0200] U nekim implementacijama, ako se želi dodatno uređivanje ćelija (924), ćelije se mogu preneti na isti ili drugi modul za filtriranje i učiniti elektrokompetentnim (908). Dalje, u nekim slučajevima, novi sastavljeni uzorak nukleinske kiseline može u ovom trenutku biti pripremljen pomoću modula za sastavljanje nukleinske kiseline. Pre rekurzivnog uređivanja, u nekim slučajevima, automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija može zahtevati dodatne materijale (npr. zamenske kertridže) koje dostavlja korisnik.

[0201] Koraci mogu biti isti ili različiti tokom drugog kruga uređivanja. Na primer, u nekim slučajevima, nakon naknadnog izvršenja koraka 904, selektivni medijum za uzgoj se prenosi u modul za uzgoj kako bi se omogućio izbor uređenih ćelija iz prvog kruga uređivanja. Robotski sistem za rukovanje 108 na Slici 1A-B ili 12A-B, na primer, može da prenese selektivni medijum za uzgoj iz bočice ili kontejnera u kertridž za reagens koji se nalazi na položaju određenom za selektivni medijum za uzgoj. Pre prenosa selektivnog medijuma za uzgoj, mašinski čitljive oznake mogu da se skeniraju na bočici ili drugom kontejneru ili rezervoaru koji se nalazi na položaju određenom za selektivni medijum za uzgoj kako bi se potvrdio sadržaj bočice, kontejnera ili rezervoara. Dalje, mašinski čitljivi pokazatelji mogu ukazivati na vrstu selektivnog medijuma za uzgoj koji se pruža instrumentu. Tip selektivnog medijuma za uzgoj, u nekim slučajevima, može dovesti do toga da instrument odabere određenu računarsku rutinu za obradu (npr. podešavanja i aktivacija modula za uzgoj odgovarajućeg za određeni selektivni medijum za uzgoj). Konkretni primeri rekurzivnih tokova uređivanja su opisani u vezi sa Slikama 10A do 10C.

[0202] U nekim implementacijama, postupak 900 se može vremenski odrediti da zahteva materijale i/ili završen ciklus uređivanja u koordinaciji sa rasporedom korisnika. Na primer, automatizovani instrument za obradu ćelija sa više modula može da pruži korisniku mogućnost da zakaže završetak jednog ili više ciklusa obrade ćelije (npr. jedne ili više rekurzivnih uređenja) tako da se postupak 900 primenjuje sa ciljem da se završi u korisnikovo željeno vreme. Planiranje vremena, na primer, može se postaviti preko korisničkog interfejsa, kao što je korisnički interfejs 1316 na Slici 13. U kokretnoj ilustraciji, korisnik može da podesi završetak prvog ciklusa na 16:00 tako da korisnik može da isporuči dodatne kertridže materijala automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija kako bi omogućio obradu preko noći u drugom krugu uređivanja ćelija.

[0203] U nekim implementacijama, kroz postupak 900, automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija može upozoriti korisnika na njegov trenutni status. Na primer, korisnički interfejs 1316 na Slici 13 može predstavljati grafičku indikaciju trenutne faze obrade. U konkretnom primeru, prednja strana automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu poziva može biti prekrivena korisničkim interfejsom (npr. ekranom osetljivim na dodir) koji predstavlja animiranu grafiku koja prikazuje trenutni status obrade ćelija. Korisnički interfejs može dalje da prikaže bilo koje korisničke i/ili podrazumevane postavke povezane sa trenutnom fazom obrade (npr. podešavanje temperature, podešavanje vremena, itd.).

[0204] Iako je ilustrovan kao konkretna serija operacija, u drugim slučajevima, više ili manje koraka može biti uključeno u postupak 900. Na primer, u nekim slučajevima, pre uključivanja u svaki krug uređivanja, sadržaj rezervoara, kertridža i/ ili se bočice mogu pregledati kako bi se potvrdilo da su odgovarajući materijali dostupni za nastavak obrade. Na primer, u nekim slučajevima, jedan ili više senzora za obradu

4

slike (npr. skeneri bar kodova, kamere, itd.) mogu potvrditi sadržaj na različitim lokacijama unutar kućišta automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija. U jednom primeru, višestruki slikovni senzori mogu biti raspoređeni u kućištu automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija, gde je svaki senzor slike konfigurisan da detektuje jedan ili više materijala (npr. mašinski čitljive oznake kao što su bar kodovi ili QR kodovi, oblici/veličine materijala itd.). U drugom primeru, najmanje jedan senzor slike može biti pomeren od strane robotskog sistema za rukovanje na više lokacija kako bi se detektovao jedan ili više materijala. U daljim slučajevima, jedan ili više senzora težine mogu detektovati prisustvo ili odsustvo materijala za jednokratnu upotrebu ili zamenjivih materijala. U ilustrativnom primeru, držač vrha pipete 116 može da sadrži senzor težine koji detektuje da li su vrhovi ubačeni u region ili ne. U drugom ilustrativnom primeru, optički senzor može otkriti da je nivo tečnog otpada dostigao granični nivo, koji zahteva odlaganje pre nastavka obrade ćelije. Zahtevi za dodatnim materijalima, uklanjanjem otpada materijala ili drugim korisničkim intervencijama (npr., ručno čišćenje jednog ili više elemenata, itd.), u nekim implementacijama, predstavljeni su na grafičkom korisničkom interfejsu automatizovanog multimodularnog instrumenta za obradu ćelija. Automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija, u nekim implementacijama, obaveštava korisnika o zahtevima za nove materijale ili druge ručne intervencije, na primer preko softverske aplikacije, e-pošte ili tekstualne poruke.

Tokovi rada za obradu ćelija u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija

[0205] Automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija je dizajniran za obavljanje različitih tokova rada za obradu ćelija koristeći iste module. Na primer, izvorni materijali, u pojedinačnim kontejnerima ili u obliku kertridža, mogu da se razlikuju i odgovarajuća uputstva (npr. softverska rutina) mogu biti odabrana u skladu sa tim, koristeći istu osnovnu instrumentaciju i robotski sistem rukovanja; to jest, sistem za obradu ćelija sa više modula može biti konfigurisan za obavljanje više različitih tokova rada za obradu uzoraka ćelija i različitih tipova uzoraka ćelija. U nekim slučajevima, isti tok rada se može izvoditi iterativno kako bi se rekurzivno uredio uzorak ćelija. U drugim slučajevima, uzorak ćelija se rekurzivno uređuje, ali tok rada može da se menja od iteracije do iteracije.

[0206] Slike 10A do 10C ilustruju primere tokova rada koji se mogu izvoditi korišćenjem automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija uključujući dva modula za uzgoj ćelija 1002, 1008, dva modula za filtriranje 1004 i 1010 i modul za protočnu elektroporaciju 1006. Iako su opisani kao zasebni moduli za uzgoj 1002, 1008 i moduli za filtriranje 1004, 1010, svaki umesto toga može biti dizajniran kao dvostruki modul. Na primer, dvostruki modul za uzgoj, uključujući module za uzgoj 1002 i 1008, može uključivati dvostruke rotirajuće bočice za uzgoj koje dele neka kola, kontrole i izvor napajanja i smeštene u istom kućištu. Slično, dvostruki modul za filtriranje može uključivati module za filtriranje 1004 i 1010, uključujući dva odvojena filtera i cevi za dovod tečnosti, ali će dele kola, kontrole, izvor napajanja i kućište. Moduli 1002, 1004, 1006, 1008 i 1010, na primer, mogu biti deo instrumenta 100 opisanog u vezi sa Slikama 1A i 1B.

[0207] Prelazeći na Sliku 10A, dijagram toka ilustruje prvi tok rada za uređivanje genoma bakterije 1000 koji uključuje dve faze obrade koje imaju identične korake obrade, što rezultuje u dva uređenja u ćelijskom materijalu 1012. Svaka faza može da funkcioniše na osnovu različitog kertridža izvornih materijala. Na primer, prvi kertridž može uključivati prvu oligo biblioteku 1014a i prvu sgRNK kičmu 1016a. Drugi kertridž, uveden u automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija između faza obrade ili pre obrade, ali u različitom položaju od prvog kertridža, može uključivati drugu oligo biblioteku 1014b i drugu sgRNK kičmu 1016b. Svaki kertridž se može smatrati „kertridžom bibiloteke“ za pravljenje biblioteke uređenih ćelija. Ćelijski materijal 1012, u nekim slučajevima, je uključena u prvi kertridž biblioteke. Ćelijski materijal 1012 se može isporučiti u okviru kompleta koji uključuje dva kertridža. Alternativno, korisnik može dodati kontejner (npr. bočicu ili epruvetu) ćelijskog materijala 1012 u kupljeni kertridž.

[0208] Tok rada 1000 se, u nekim slučajevima, izvodi na osnovu računarske rutine koju izvršava sistem za obradu automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija, kao što je sistem za obradu 1310 na Slici 13. Računarskoj rutini se, u prvom primeru, može pristupiti preko mašinski čitljive oznake ili oznake dodate prvom kertridžu. U nekim slučajevima, svaka faza obrade se izvodi pomoću posebne računarske rutine. Na primer, svaki kertridž može da sadrži indikaciju računarske rutine ili samu računarsku rutinu za obradu sadržaja kertridža.

[0209] U nekim implementacijama, prva faza počinje uvođenjem ćelijskog materijala 1012 u prvi modul za uzgoj 1002 za inokulaciju, uzgoj i praćenje (1018a). U jednom primeru, robotski sistem za rukovanje dodaje bočicu sa ćelijskim materijalom 1012 u medijum koji se nalazi u rotirajućoj bočici za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje pipetira ćelijski materijal 1012 iz prvog kertridža i dodaje ćelijski materijal 1012 u medijum sadržan u rotirajućoj bočici za uzgoj. U ovom trenutku ćelije su možda održavane na temperaturi od 4°C. U konkretnom primeru, 20 ml ćelijskog materijala se može uzgajati u rotirajućoj bočici za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002 na temperaturi od 30°C do OD od 0,50. Ćelijski materijal 1012 dodat prvom modulu za uzgoj 1002 može se pratiti tokom vremena dok se ne primeti 0,50 OD putem automatizovanog praćenja bočice za uzgoj. Praćenje može biti periodično ili kontinuirano. Ovo može potrajati, na primer, oko 900 minuta (procenjeno), iako tačno vreme zavisi od detektovanja željene OD.

[0210] U nekim implementacijama, nakon uzgoja ćelija do željene OD, induktor se dodaje prvom modulu za uzgoj 1002 za indukciju ćelija. U konkretnom primeru može se dodati 100 µl induktora, i modul za uzgoj 1002 može dovesti temperaturu smeše do 42°C i držati 15 minuta.

[0211] Ćelijski materijal 1012 se, nakon uzgoja i indukcije, prenosi u prvi modul za filtriranje 1004, u nekim implementacijama, kako bi ćelije bile elektrokompetentne (1020a) i kako bi se smanjila zapremina ćelija za transformaciju. U jednom primeru, robotski sistem za rukovanje pomera bočicu sa ćelijskim materijalom 1012 iz rotirajuće bočice za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002 do držača bočice prvog modula za filtriranje 1004. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje pipetira ćelijski materijal 1012 iz rotirajuće bočice za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002 i isporučuje ga prvom modulu za filtriranje 1004. Na primer, vrh za pipetiranje za jednokratnu upotrebu koji se koristi za prenošenje ćelijskog materijala 1012 u prvi modul za uzgoj 1002 može se koristiti za prenos ćelijskog materijala 1012 od prvog modula za uzgoj 1002 do prvog modula za filtriranje 1004. U nekim slučajevima, pre prenošenja ćelijskog materijala 1012 iz prvog modula za uzgoj 1002 u prvi modul za filtriranje 1004, prvi modul za uzgoj 1002 se hladi na 4 °C tako da se ćelijski materijal 1012 na sličan način smanjuje na ovu temperaturu. U konkretnom primeru, temperatura prvog modula za uzgoj 1002 može da se smanji na oko 4°C tokom perioda od oko 8 minuta, i modul za uzgoj 1002 može da drži temperaturu na 4°C oko 15 minuta kako bi se pružilo smanjenje temperature ćelijskog materijala 1012.

[0212] Pre prenosa ćelijskog materijala, u nekim otelotvorenjima, filter prvog modula za filtriranje 1004 se prethodno ispere pomoću rastvora za pranje. Rastvor za pranje, na primer, može se isporučiti u kertridžu za pranje, kao što je kertridž 1006 opisan u vezi sa Slikom 1A. Prvi modul za filtriranje 1004, na primer, može biti tečno povezan sa rastvorom za pranje kertridža za pranje, kao što je opisano u vezi sa Slikom 7A.

[0213] Prvi modul za filtriranje 1004, na primer, može biti deo dvostrukog modula za filtriranje kao što je modul za filtriranje 750 opisan u vezi sa Slikama 7B i 7C. U konkretnom primeru, prvi modul za filtriranje 1004 može se održavati na 4°C tokom procesa pranja i eluiranja dok se ćelijski materijali prebacuju između bočice za eluiranje i prvog modula za filtriranje 1004.

[0214] U nekim implementacijama, nakon što ćelije postanu elektrokompetentne na modulu za filtriranje 1004, ćelijski materijal 1012 se prenosi u modul za transformaciju 1006 (npr. modul za protočnu elektroporaciju) radi transformacije. U jednom primeru, robotski sistem za rukovanje pomera bočicu sa ćelijskim materijalom 1012 iz držača bočice prvog modula za filtriranje 1004 u rezervoar modula za elektroporaciju 1006. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje pipetira ćelijski materijal 1012 iz prvog modula za filtriranje 1002 ili privremenog rezervoara i isporučuje ga prvom modulu za filtriranje 1004. U konkretnom primeru, 400 µl koncentrovanog ćelijskog materijala 1012 iz prvog modula za filtriranje 1004 prenosi se u rezervoar za mešanje pre prenošenja u modul za transformaciju 1006. Na primer, ćelijski materijal 1012 se može preneti u rezervoar u kertridžu za mešanje sa sastavljenim nukleinskim kiselinama, i zatim preneti pomoću robotskog sistema za rukovanje korišćenjem vrha pipete. U konkretnom primeru, modul za transformaciju se održava na 4 °C. Ćelijski materijal 1012 može se transformisati, u ilustrativnom primeru, za oko četiri minuta.

[0215] Dok se ćelije uzgajaju i/ili postaju elektrokompetentne, u nekim implementacijama, prva oligo biblioteka 1014a i sgRNK kičma 1016a se sastavljaju korišćenjem procesa izotermnog sastavljanja nukleinske kiseline kako bi se stvorile sastavljene nukleinske kiseline u glavnoj mešavini izotermnog sastavljanja nukleinske kiseline (1022a). Sastavljene nukleinske kiseline mogu biti stvorene u nekom trenutku tokom prvih koraka obrade 1018a, 1020a prve faze toka rada 1000. Alternativno, sastavljene nukleinske kiseline mogu biti stvorene pre početka prvog koraka obrade 1018.

[0216] U nekim slučajevima, nukleinske kiseline se sastavljaju korišćenjem modula za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija. Na primer, robotski sistem za rukovanje može dodati prvu oligo biblioteku 1014a i sgRNK kičmu 1016a iz posude biblioteke u kertridžu za reagens u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija u modul za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline (nije ilustrovan), kao što je npr. modul za sastavljanje nukleinske kiseline 1210g opisan u vezi sa Slikom 12B. Mešavina sastava nukleinske kiseline, na primer, može uključivati u konkretnom primeru 50 µl Gibson Assembly<®>Master Mix, 25 µl vektorske kičme 1016a i 25 µl oligo 1014a. Modul za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline može se držati na sobnoj temperaturi. Proces sastavljanja može trajati oko 30 minuta.

[0217] U drugim slučajevima, nukleinske kiseline se sastavljaju spolja u multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija i dodaju kao izvorni materijal. Na primer, bočica ili epruveta sastavljenih nukleinskih kiselina može se dodati u kertridž za reagens pre aktiviranja prvog koraka 1018a obrade ćelije. U konkretnom primeru, pruženo je 100 µl sastavljenih nukleinskih kiselina.

[0218] U nekim implementacijama, sastavljene nukleinske kiseline se prečišćavaju (1024a). Sastavljene nukleinske kiseline, na primer, mogu se preneti pomoću robotskog sistema za rukovanje iz modula za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline u modul za prečišćavanje (nije prikazan), kao što je modul za prečišćavanje 1210h sa Sl.12B. U drugim slučajevima, modul za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline može da sadrži karakteristike prečišćavanja (npr. kombinacija modula za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline i za prečišćavanje). U daljim slučajevima, sastavljene nukleinske kiseline se prečišćavaju spolja u multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija i dodaju kao izvorni materijal. Na primer, bočica ili epruveta sa prečišćenim sastavljenim nukleinskim kiselinama može se dodati u kertridž za reagens sa ćelijskim materijalom 1012 pre aktiviranja prvog koraka 1018a ćelijske obrade.

[0219] U konkretnom primeru, prečišćeno je 100 µl sastavljenih nukleinskih kiselina u mešavini za izotermno sastavljanje nukleinskih kiselina. U nekim slučajevima, magnetne kuglice se dodaju modulu za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline, na primer, 180 µl magnetnih kuglica u tečnoj suspenziji se može dodati modulu za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline pomoću robotskog sistema za rukovanje.

Magnet koji je funkcionalno povezan sa modulom za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline može se aktivirati i uzorak isprati u 200 µl etanola (npr. robotski sistem za rukovanje može preneti etanol u modul za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline). Tečni otpad iz ove operacije se u nekim slučajevima prenosi u posudu za otpad u kertridžu (npr. robotskim sistemom za rukovanje koristeći isti vrh pipete koji se koristi za prenošenje etanola). U ovom trenutku, desalinifikovane sastavljene nukleinske kiseline mogu se preneti u kontejner za držanje, kao što je rezervoar kertridža. Desalinifikovane sastavljene nukleinske kiseline mogu se držati, na primer, na temperaturi od 4 °C dok ćelije ne budu spremne za transformaciju. U konkretnom primeru, 100 µl sastavljenih nukleinskih kiselina može se dodati u 400 µl koncentrovane ćelijskog materijala 1012 u rezervoaru za mešanje pre prenošenja u modul za transformaciju 1006. U nekim slučajevima, proces prečišćavanja može trajati oko 16 minuta.

[0220] U nekim otelotvorenjima, sastavljene nukleinske kiseline i ćelijski materijal 1012 se dodaju u modul za protočnu elektroporaciju 1006 i ćelijski materijal 1012 se transformiše (1026a). Robotski sistem za rukovanje, na primer, može da prenese mešavinu ćelijskog materijala 1012 i sastavljenih nukleinskih kiselina u modul za protočnu elektroporaciju 1006 iz rezervoara za mešanje, na primer, korišćenjem vrha pipete ili kroz prenošenje bočice ili epruvete. U nekim slučajevima, ugrađeni modul za protočnu elektroporaciju kao što su moduli za protočnu elektroporaciju 500 na Slici 5A se koriste za transformaciju ćelijskog materijala 1012. U drugim slučajevima, modul za elektroporaciju zasnovan na kertridžima kao što je modul za protočnu elektroporaciju 530 na Slici 5B koristi se za transformaciju ćelijskog materijala 1012. Modul za elektroporaciju 1006, na primer, može da se drži na temperaturi od 4 °C. Proces elektroporacije, u ilustrativnom primeru, može trajati oko četiri minuta.

[0221] Transformisani ćelijski materijal 1012 se, u nekim implementacijama, prenosi u drugi modul za uzgoj 1008 za oporavak (1028a). U konkretnom primeru, transformisane ćelije prolaze kroz proces oporavka u drugom modulu za uzgoj 1008 na temperaturi od 30 °C. Transformisane ćelije, na primer, mogu da se drže u drugom modulu za uzgoj 1008 oko sat vremena radi oporavka.

[0222] U nekim primenama, selektivni medijum se prenosi u drugu bočicu za uzgoj (nije ilustrovano), i ćelije se ostavljaju da inkubiraju u daljem vremenskom periodu u procesu odabira. U ilustrativnom primeru, antibiotik se može preneti u drugu bočicu za uzgoj, i ćelije mogu inkubirati dodatna dva sata na temperaturi od 30 °C.

[0223] Nakon oporavka, ćelije mogu biti spremne ili za još jedan krug uređivanja ili za skladištenje u posudi, na primer, za dalje eksperimente koji se sprovode van okruženja za automatizovanu obradu ćelija.

Alternativno, deo ćelija se može preneti u jedinicu za skladištenje kao izlaz biblioteke ćelija, dok se drugi deo ćelija može pripremiti za drugi krug uređivanja.

[0224] U nekim implementacijama, u pripremi za drugu rundu uređivanja, transformisane ćelije se prenose u drugi modul za filtriranje 1010 za razmenu medijuma i filtriranje (1030a). Pre prenosa transformisanog ćelijskog materijala, u nekim otelotvorenjima, filter drugog modula za filtriranje 1004 se prethodno ispere pomoću rastvora za pranje. Rastvor za pranje, na primer, može se isporučiti u kertridžu za pranje, kao što je kertridž 1006 opisan u vezi sa Slikom 1A. Drugi modul za filtriranje 1010, na primer, može biti tečno povezan sa rastvorom za pranje kertridža za pranje, kao što je opisano u vezi sa Slikom 7A.

[0225] Drugi modul za filtriranje 1010, na primer, može biti deo dvostrukog modula za filtriranje kao što je modul za filtriranje 750 opisan u vezi sa Slikama 7B i 7C. U konkretnom primeru, drugi modul za filtriranje 1010 se može održavati na 4°C tokom procesa ispiranja i eluiranja dok se prenosi ćelijski materijal između bočice za eluiranje i drugog modula za filtriranje 1010. Rezultat ovog procesa filtriranja, u konkretnom primeru, deponuje se u bočicu ili epruvetu da sačeka dalju obradu, na primer, transfer u modul za transformaciju. Bočica ili epruveta se mogu čuvati u skladištu na temperaturi od 4 °C.

[0226] Prva faza obrade može se odvijati tokom jednog dana. U ilustrativnim slučajevima, procenjuje se da će prva faza obrade trajati manje od 19 sati (npr. oko 18,7 sati). U ovom trenutku u toku rada 1000, u nekim implementacijama, novi materijali se ručno dodaju automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija. Na primer, može se dodati novi kertridž za reagens. Dalje, novi kertridž za pranje, zamenski filteri i/ili zamenski vrhovi pipete mogu se dodati automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija u ovom trenutku. Dalje, u nekim slučajevima, modul filtera može biti podvrgnut procesu čišćenja i/ili jedinice čvrstog i tečnog otpada mogu biti ispražnjene u pripremi za narednu rundu obrade. U drugim slučajevima, kertridži za reagense mogu pružiti reagense za dva ili više ciklusa uređivanja.

[0227] U nekim implementacijama, drugi krug uređivanja uključuje iste module 1002, 104, 1006, 1008 i 1010, iste korake obrade 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028 i 1030 i isti temperaturni i vremenski raspon, kao prva faza obrade koja je opisana iznad. Na primer, druga oligo biblioteka 1014b i druga sgRNK kičma 1016b mogu se koristiti za uređivanje transformisanih ćelija na skoro isti način kao što je opisano iznad. Iako je ilustrovan kao dvostepeni proces, u drugim otelotvorenjima, do dve, četiri, šest, osam ili više rekurzija mogu da se sprovedu kako bi se nastavilo da se uređuju iste ćelije 1012.

[0228] U drugim otelotvorenjima, prelazeći na Sliku 10B, tok rada 1040 uključuje iste module 1002, 1004, 1006, 1008 i 1010, kao i iste korake obrade 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028 i 1030 za prvu fazu procesa. Međutim, za razliku od toka rada 1000 na Slici 10A, druga faza toka rada 1040 na Slici 10B uključuje korake očvršćavanja. „Očvršćavanje“ je proces u kome se vektor - na primer vektor za uređivanje korišćen u prethodnom krugu uređivanja, „pogonski“ vektor koji sadrži sekvencu eksprimiranja za nukleazu, ili oba -eliminišu iz transformisanih ćelija. Očvršćavanje se može postići, npr., razdvajanjem vektora za uređivanje korišćenjem plazmida za očvršćavanje, čime se vektor za uređivanje i/ili motor čine nefunkcionalnim (primer je prikazan u toku rada na Slici 10b); razblaživanje vektora u populaciji ćelija putem uzgoja ćelije (to jest, što više ciklusa uzgoja ćelije prolaze, manje ćerki će zadržati vektore za uređivanje ili pogonske vektore) (nije prikazano), ili korišćenjem npr. poreklo replikacije osetljivo na toplotu na vektoru za uređivanje ili pogonskom vektoru (nije prikazano). U jednom primeru, „plazmid za očvršćavanje“ može biti sadržan u kertridžu za reagens automatizovanog instrumenta, ili dodat ručno u instrument pre druge faze obrade. Kao i kod toka rada 1000, u nekim slučajevima, tok rada 1040 se izvodi na osnovu računarske rutine koju izvršava sistem za obradu automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija, kao što je sistem za obradu 1310 na Slici 13. Računarskoj rutini, u prvom primeru, može se pristupiti preko mašinski čitljive oznake ili oznake dodate prvom kertridžu. U nekim slučajevima, svaka faza obrade se izvodi pomoću posebne računarske rutine. Na primer, svaki kertridž može da sadrži indikaciju računarske rutine ili samu računarsku rutinu za obradu sadržaja kertridža. Na ovaj način, na primer, druga faza, koja uključuje kertridž za očvršćavanje, može da se izvede korišćenjem računarske rutine dizajnirane za podešavanja (npr. temperature, vremena, količine materijala, itd.) prikladna za očvršćavanje. Uslovi očvršćavanja će zavisiti od mehanizma koji se koristi za očvršćavanje; odnosno, u ovom primeru, kako plazmid za očvršćavanje razdvaja plazmid za uređivanje i/ili pogonski plazmid.

[0229] U nekim implementacijama, druga faza toka rada 1040 počinje primanjem prvo uređenih ćelija iz prve faze toka rada 1040 u prvom modulu za uzgoj 1002. Na primer, prvo uređene ćelije su možda uređivane korišćenjem ćelijskog materijala 1042, oligo biblioteke 1044 i sgRNK kičme 1046 primenom koraka 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1028 i 1030 kao što je opisano u vezi sa tokom rada 1000 na Slici 10A. Prvo uređena ćelija 1042, na primer, može se preneti u prvi modul za uzgoj 1002 pomoću robotskog sistema za rukovanje. U jednom primeru, robotski sistem za rukovanje dodaje bočicu prvo uređene ćelije 1042 u rotirajuću bočicu za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje pipetira prvo uređeni ćelijski materijal 1042 iz posude za jedinicu za skladištenje i dodaje ćelijski materijal 1042 u rotirajuću bočicu za uzgoj. U ovom trenutku ćelije su možda održavane na temperaturi od 4°C.

[0230] U nekim implementacijama, prvo uređene ćelije se inokulišu, uzgajaju i nadgledaju u prvom modulu za uzgoj 1002 (1018d). U konkretnom primeru, alikvot prvo uređenog ćelijskog materijala 1042 može se preneti u rotirajuću bočicu za uzgoj koja sadrži, na primer, 20 mL medijuma za uzgoj na temperaturi od 30°C do OD od 0,50. Ćelijski materijal 1042 dodat prvom modulu za uzgoj 1002 može se pratiti tokom vremena sve dok se 0,50 OD ne primeti putem automatizovanog praćenja. Praćenje može biti periodično ili kontinuirano. Ovo može potrajati, na primer, oko 900 minuta (procenjeno), iako tačno vreme zavisi od obelodanjenja željene OD.

[0231] U nekim implementacijama, nakon uzgoja do željene OD, induktor se dodaje prvom modulu za uzgoj 1002 za indukciju ćelija. U konkretnom primeru može se dodati 100 µl induktora, i modul za uzgoj 1002 može dovesti temperaturu smeše do 42°C i držati 15 minuta.

[0232] Prvo uređena ćelijska masa 1042, nakon uzgoja i indukcije, prenosi se u prvi modul za filtriranje 1004, u nekim implementacijama, da bi prvo uređene ćelije bile elektrokompetentne (1020d). U jednom primeru, robotski sistem za rukovanje pomera bočicu sa prvim uređenim ćelijskim materijalom 1042 iz rotirajuće bočice za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002 u držač bočice prvog modula za filtriranje 1004. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje pipetira prvo uređeni ćelijski materijal 1042 iz rotirajuće bočice za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002 i isporučuje je u prvi modul za filtriranje 1004. Na primer, vrh za pipetiranje za jednokratnu upotrebu koji se koristi za prenošenje prvo uređenog ćelijskog materijala 1042 u prvi modul za uzgoj 1002 može se koristiti za prenos ćelijskog materijala 1042 iz prvog modula za uzgoj 1002 u prvi modul za filtriranje 1004. U nekim slučajevima, pre prenosa ćelijski materijal 1042 iz prvog modula za uzgoj 1002 u prvi modul za filtriranje 1004, prvi modul za uzgoj 1002 se ohladi na 4 °C tako da se ćelijski materijal 1042 na sličan način smanjuje na ovu temperaturu. U konkretnom primeru, temperatura prvog modula za uzgoj 1002 može da se smanji na oko 4 °C tokom perioda od oko 8 minuta, i modul za uzgoj 1002 može da drži temperaturu na 4 °C oko 15 minuta da bi pružio smanjenje temperatura ćelijskog materijala 1012.

[0233] Pre prenošenja prvog uređenog ćelijskog materijala 1042 u modul za filtriranje, u nekim otelotvorenjima filter prvog modula za filtriranje 1004 se prethodno ispere pomoću rastvora za pranje.

Rastvor za pranje, na primer, može se isporučiti u kertridžu za pranje, kao što je kertridž 1006 opisan u vezi sa Slikom 1A. Prvi modul za filtriranje 1004, na primer, može biti tečno povezan sa rastvorom za pranje kertridža za pranje, kao što je opisano u vezi sa Slikom 7A.

[0234] Prvi modul za filtriranje 1004, na primer, može biti deo dvostrukog modula za filtriranje kao što je modul za filtriranje 750 opisan u vezi sa Slikama 7B i 7C. U konkretnom primeru, prvi modul za filtriranje 1004 može se održavati na 4°C tokom procesa pranja i eluiranja dok se ćelijski materijali prebacuju između bočice za eluiranje i prvog modula za filtriranje 1004.

[0235] U nekim implementacijama, nakon pretvaranja prvo uređenih ćelija u elektrokompetentne na modulu za filtriranje 1004 (1020d), prvo uređena ćelija 1042 se prenosi u modul za transformaciju 1006 (npr. modul za protočnu elektroporaciju) radi transformacije. U jednom primeru, robotski sistem za rukovanje pomera bočicu sa ćelijskim materijalom 1042 iz držača bočice prvog modula za filtriranje 1004 u rezervoar modula za elektroporaciju 1006. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje pipetira ćelijski materijal 1042 iz prvog modula za filtriranje 1002 ili privremenog rezervoara i isporučuje ga prvom modulu za filtriranje 1004. U konkretnom primeru, 400 µl koncentrovanog ćelijskog materijala 1042 iz prvog modula za filtriranje 1004 se prenosi u rezervoar za mešanje pre prenošenja u modul za transformaciju 1006. Na primer, ćelijski materijal 1042 može se preneti u rezervoar u kertridžu za mešanje sa plazmidom za očvršćavanje 1050, zatim pomešati i preneti pomoću robotskog sistema za rukovanje korišćenjem vrha pipete. U konkretnom primeru, modul za transformaciju 1006 se održava na 4 °C. Ćelijski materijal 1042 može se transformisati, u ilustrativnom primeru, za oko četiri minuta.

[0236] Transformisani ćelijski materijal 1042 se, u nekim implementacijama, prenosi u drugi modul za uzgoj 1008 za oporavak/očvršćavanje (1028d). U konkretnom primeru, 20 ml transformisanih ćelija prolazi kroz proces oporavka u drugom modulu za uzgoj 1008 na temperaturi od 30 °C. Transformisane ćelije, na primer, mogu da se drže u drugom modulu za uzgoj 1008 oko sat vremena radi oporavka. Ako se želi još jedan krug uređivanja, prvi plazmid ili vektor za uređivanje se očvršćavaju. Ako drugi krug uređivanja nije poželjan, prvi plazmid za uređivanje i pogonski plazmid se mogu očvrsnuti.

[0237] Nakon oporavka i očvršćavanja, ćelije mogu biti spremne ili za još jedan krug uređivanja ili za skladištenje kako bi se koristile u daljim istraživanjima izvan automatizovanog instrumenta za obradu ćelija. Na primer, deo ćelija se može preneti u jedinicu za skladištenje kao izlaz biblioteke ćelija, dok se drugi deo ćelija može pripremiti za drugi krug uređivanja.

[0238] U nekim implementacijama, u pripremi za drugu rundu uređivanja, transformisane ćelije se prenose u drugi modul za filtriranje 1010 za razmenu medijuma i filtriranje (1030d) koji sadrži glicerol za pretvaranje ćelija u elektrokompetentne. Pre prenosa transformisanog ćelijskog materijala, u nekim otelotvorenjima, filter drugog modula za filtriranje 1004 se prethodno ispere pomoću rastvora za pranje. Rastvor za pranje, na primer, može biti isporučen u kertridžu za pranje, kao što je kertridž 1006 opisan u vezi sa Slikom 1A. Drugi modul za filtriranje 1010, na primer, može biti tečno povezan sa rastvorom za pranje kertridža za pranje, kao što je opisano u vezi sa Slikom 7A.

[0239] Drugi modul za filtriranje 1010, na primer, može biti deo dvostrukog modula za filtriranje kao što je modul za filtriranje 750 opisan u vezi sa Slikama 7B i 7C. U konkretnom primeru, drugi modul za filtriranje 1010 se može održavati na 4°C tokom procesa ispiranja i eluiranja dok se ćelijski materijali prenose između bočice za eluiranje i drugog modula za filtriranje 1010. Rezultat ovog procesa filtriranja, u konkretnom primeru, su elektrokompetentne ćelije deponovane u bočici ili epruveti da čekaju dalju obradu. Bočica ili epruveta se mogu čuvati u skladištu na temperaturi od 4 °C.

[0240] Prelazeći na Sliku 10C, dijagram toka ilustruje tok rada kvasca 1060 koji uključuje dve faze obrade koje imaju identične korake obrade, što rezultuje sa dva uređivanja ćelijskog materijala 1062. Svaka faza može da funkcioniše na osnovu različitog kertridža izvornih materijala. Na primer, prvi kertridž može uključivati prvu oligo biblioteku 1070a i prvu sgRNK kičmu 1072a. Drugi kertridž, uveden u automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija između faza obrade ili pre obrade, ali u drugom položaju od prvog kertridža, može uključivati drugu oligo biblioteku 1070b i drugu sgRNK kičmu 1072b. Svaki kertridž se može smatrati „kertridžom biblioteke“ za pravljenje biblioteke uređenih ćelija. Alternativno, korisnik može dodati kontejner (npr., bočicu ili epruvetu sa ćelijskim materijalom 1062a u svaki od kupljenih kertridža uključenih u komplet za ćelije kvasca.

[0241] Tok rada 1060 se, u nekim slučajevima, izvodi na osnovu računarske rutine koju izvršava sistem za obradu automatizovanog multi-modularnog sistema za obradu ćelija, kao što je sistem za obradu 1310 na Slici 13. Računarskoj rutini, u prvom primeru, može se pristupiti preko mašinski čitljive oznake ili oznake dodate prvom kertridžu. U nekim otelotvorenjima, svaka faza obrade se izvodi korišćenjem posebne računarske rutine. Na primer, svaki kertridž može da sadrži indikaciju računarske rutine ili samu računarsku rutinu za obradu sadržaja kertridža.

4

[0242] U nekim implementacijama, prva faza počinje uvođenjem ćelijskog materijala 1062 u prvi modul za uzgoj 1002 radi inokulacije, uzgoja i praćenja (1018e). U jednom primeru, robotski sistem za rukovanje dodaje bočicu sa ćelijskim materijalom 1062 u rotirajuću bočicu za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje pipetira ćelijski materijal 1062 iz prvog kertridža i dodaje ćelijski materijal 1062 u rotirajuću bočicu za uzgoj. U ovom trenutku ćelije su možda održavane na temperaturi od 4°C. U konkretnom primeru, 20 ml ćelijskog materijala može da se uzgaja u rotirajućoj bočici za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002 na temperaturi od 30°C do OD od 0,75. Ćelijski materijal 1012 koji je dodat prvom modulu za uzgoj 1002 može se automatski pratiti tokom vremena unutar modula za uzgoj 1002 sve dok se 0,75 OD ne primeti putem automatizovanog praćenja. Monitoring može biti periodičan ili kontinuiran.

[0243] U nekim implementacijama, može se koristiti inducibilni sistem eksprimiranja. Dakle, nakon uzgoja do željene OD, induktor se dodaje prvom modulu za uzgoj 1002 radi indukcije ćelija. Induktor može biti mali molekul ili razmena medijuma u medijum sa drugačijim šećerom kao što je galaktoza.

[0244] Ćelijski materijal 1062, nakon uzgoja i indukcije, prenosi se u prvi modul za filtriranje 1004, u nekim otelotvorenjima, za razmenu medijuma (1064a). U jednom primeru, robotski sistem za rukovanje pomera bočicu sa ćelijskim materijalom 1062 iz rotirajuće bočice za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002 do držača bočice prvog modula za filtriranje 1004. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje pipetira ćelijski materijal 1062 iz rotirajuće bočice za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002 i isporučuje ga prvom modulu za filtriranje 1004. Na primer, vrh za pipetiranje za jednokratnu upotrebu koji se koristi za prenošenje ćelijskog materijala 1062a u prvi modul za uzgoj 1002 može se koristiti za prenos ćelijskog materijala 1062 od prvog modula za uzgoj 1002 do prvog modula za filtriranje 1004. U nekim otelotvorenjima, pre prenošenja ćelijskog materijala 1062 iz prvog modula za uzgoj 1002 u prvi modul za filtriranje 1004, prvi modul za uzgoj 1002 se ohladi na 4 °C tako da se ćelijski materijal 1062 na sličan način smanjuje do ovo temperaturu. U konkretnom primeru, temperatura prvog modula za uzgoj 1002 može da se smanji na oko 4 °C tokom perioda od oko 8 minuta, a modul za uzgoj 1002 može da drži temperaturu na 4 °C oko 15 minuta kako bi osigurao smanjenje temperature ćelijskog materijala 1062. Tokom razmene medijuma, u ilustrativnom primeru, 0,4 ml 1M sorbitola se može dodati ćelijskom materijalu 1062.

[0245] Pre prenosa ćelijskog materijala 1062, u nekim otelotvorenjima, filter prvog modula za filtriranje 1004 se prethodno ispere pomoću rastvora za pranje. Rastvor za pranje, na primer, može biti isporučen u kertridžu za pranje, kao što je kertridž 1006 opisan u vezi sa Slikom 1A. Prvi modul za filtriranje 1004, na primer, može biti tečno povezan sa rastvorom za pranje kertridža za pranje, kao što je opisano u vezi sa Slikom 7A.

[0246] Prvi modul za filtriranje 1004, na primer, može biti deo dvostrukog modula za filtriranje kao što je modul za filtriranje 750 opisan u vezi sa Slikama 7B i 7C. U konkretnom primeru, prvi modul za filtriranje 1004 može se održavati na 4°C tokom procesa pranja i eluiranja dok se ćelijski materijali prebacuju između bočice za eluiranje i prvog modula za filtriranje 1004.

[0247] Posle operacije razmene medijuma, u nekim implementacijama, ćelijski materijal 1062 se prenosi nazad u prvi modul za uzgoj 1002 radi kondicioniranja (1066a). U jednom primeru, robotski sistem za rukovanje pomera bočicu sa ćelijskim materijalom 1062 od prvog modula za filtriranje 1004 do prvog modula za uzgoj 1002. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje pipetira ćelijski materijal 1062 iz prvog modula za filtriranje 1004 i isporučuje ga u rotirajuću bočicu za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002. Tokom kondicioniranja, na primer, 5 ml DTT/LIAc i 80 mM sorbitola se može dodati ćelijskom materijalu 1062. Na primer, robotski sistem za rukovanje može da prenese DTT/LIAc i Sorbitol, pojedinačno ili istovremeno, do prvog modula za uzgoj 1002. Ćelijski materijal 1062 se može mešati sa DTT/LIAc i sorbitolom, na primer, rotacijom rotirajuće bočice za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002. Tokom kondicioniranja, ćelijski materijal 1062 može se održavati na temperaturi od 4°C.

[0248] U nekim otelotvorenjima, nakon kondicioniranja, ćelijski materijal 1062 se prenosi u prvi modul za filtriranje 1004 radi pranja i pripreme ćelija (1068). Na primer, ćelije se mogu učiniti elektrokompetentnim u ovom koraku. U jednom primeru, robotski sistem za rukovanje pomera bočicu sa ćelijskim materijalom 1062 iz rotirajuće bočice za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002 do držača bočice prvog modula za filtriranje 1004. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje pipetira ćelijski materijal 1062 iz rotirajuće bočice za uzgoj prvog modula za uzgoj 1002 i isporučuje je u prvi modul za filtriranje 1004.

[0249] Pre prenosa ćelijskog materijala, u nekim otelotvorenjima, filter prvog modula za filtriranje 1004 se prethodno ispere pomoću rastvora za pranje. Rastvor za pranje, na primer, može se isporučiti u kertridžu za pranje, kao što je kertridž 1006 opisan u vezi sa Slikom 1A. Prvi modul za filtriranje 1004, na primer, može biti tečno povezan sa rastvorom za pranje kertridža za pranje, kao što je opisano u vezi sa Slikom 7A. U drugim slučajevima, za postizanje elektrokompetentnosti koristi se isti filter kao filter koji se koristi za razmenu medijuma u koraku 1064a. U nekim otelotvorenjima, 1M sorbitol se koristi da ćelije kvasca postanu elektrokompetentne.

[0250] U nekim implementacijama, nakon što se postigne elektrokompetentnost na modulu za filtriranje 1004, ćelijski materijal 1062 se prenosi u modul za transformaciju 1006 (npr. modul za protočnu elektroporaciju) radi transformacije. U jednom primeru, robotski sistem za rukovanje pomera bočicu sa ćelijskim materijalom 1062 iz držača bočice prvog modula za filtriranje 1004 u rezervoar modula za elektroporaciju 1006. U drugom primeru, robotski sistem za rukovanje pipetira ćelijski materijal 1062 iz modula za filtriranje 1004 ili privremenog rezervoara i isporučuje ga prvom modulu za filtriranje 1004. U konkretnom primeru, 400 µl koncentrovanog ćelijskog materijala 1062 iz prvog modula za filtriranje 1004 prenosi se u rezervoar za mešanje pre prenošenja u modul za transformaciju 1006. Na primer, ćelijski materijal 1062 se može preneti u rezervoar u kertridžu za mešanje sa komponentama nukleinske kiseline (kičma i uređujući oligonukleotid), zatim pomešati i preneti pomoću robotskog sistema za rukovanje korišćenjem vrha pipete. Pošto su kičma (vektor) i oligonukleotid za uređivanje sastavljeni u ćelijama (in vivo), modul za sastavljanje nukleinske kiseline nije neophodna komponenta za uređivanje kvasca. U konkretnom primeru, modul za transformaciju se održava na 4 °C.

[0251] U nekim otelotvorenjima, nukleinske kiseline koje treba da se sastave i ćelijski materijal 1062 se dodaju u modul za elektroporaciju 1006, i ćelijski materijal 1062 se transformiše (1026e). Robotski sistem za rukovanje, na primer, može da prenese mešavinu ćelijskog materijala 1062e i sastava nukleinske kiseline u modul za protočnu elektroporaciju 1006 iz rezervoara za mešanje, na primer, korišćenjem vrha pipete ili kroz prenošenje bočice ili epruvete. U nekim otelotvorenjima, ugrađeni modul za protočnu elektroporaciju kao što su moduli za protočnu elektroporaciju 500 na Slici 5A se koristi za transformaciju ćelijskog materijala 1062e. U drugim otelotvorenjima, modul za elektroporaciju zasnovan na kertridžima, kao što je modul za protočnu elektroporaciju 530 na Slici 5B, koristi se za transformaciju ćelijskog materijala 1062e. Modul za elektroporaciju 1006, na primer, može da se drži na temperaturi od 4 °C.

[0252] Transformisani ćelijski materijal 1062e se, u nekim implementacijama, prenosi u drugi modul za uzgoj 1008 za oporavak (1028a). U konkretnom primeru, 20 ml transformisanih ćelija prolazi kroz proces oporavka u drugom modulu za uzgoj 1008.

[0253] U nekim implementacijama, selektivni medijum, npr. auksotrofni medijum za uzgoj ili medijum koji sadrži lek, prenosi se u drugu bočicu za uzgoj (nije ilustrovano), i ćelije se ostavljaju da se inkubiraju u daljem vremenskom periodu u procesu odabira. U ilustrativnom primeru, antibiotik se može preneti u drugu bočicu za uzgoj, i ćelije mogu inkubirati dodatna dva sata na temperaturi od 30 °C.

[0254] Nakon oporavka, ćelije mogu biti spremne za još jednu rundu uređivanja ili za skladištenje u biblioteci ćelija. Na primer, deo ćelija može biti prenet u jedinicu za skladištenje kao izlaz biblioteke ćelija (1076a), dok se drugi deo ćelija može pripremiti za drugi krug uređivanja (1078a). Ćelije se mogu čuvati, na primer, na temperaturi od 4 °C.

[0255] U nekim implementacijama, u pripremi za drugi krug uređivanja, transformisane ćelije se prenose u drugi modul za filtriranje 1010 za razmenu medijuma (1078a). Pre prenosa transformisanog ćelijskog materijala 1062a, u nekim otelotvorenjima, filter drugog modula za filtriranje 1004 se prethodno ispere pomoću rastvora za pranje. Rastvor za pranje, na primer, može biti isporučen u kertridžu za pranje, kao što je kertridž 1006 opisan u vezi sa Slikom 1A. Drugi modul za filtriranje 1010, na primer, može biti tečno povezan sa rastvorom za pranje kertridža za pranje, kao što je opisano u vezi sa Slikom 7A.

[0256] Drugi modul za filtriranje 1010, na primer, može biti deo dvostrukog modula za filtriranje kao što je modul za filtriranje 750 opisan u vezi sa Slikama 7B i 7C. U konkretnom primeru, drugi modul za filtriranje 1010 može se održavati na 4°C tokom procesa ispiranja i eluiranja dok se ćelijski materijal prenosi između bočice za eluiranje i drugog modula za filtriranje 1010.

[0257] U nekim implementacijama tokom procesa filtriranja, enzimski preparat se dodaje da lizira ćelijske zidove ćelijskog materijala 1062a. Na primer, litički enzim kvasca kao što je Zylomase<®>može se dodati za lizu ćelijskih zidova. Litički enzim kvasca, u konkretnom primeru, može da se inkubira u ćelijskoj bazi 1026a između 5-60 minuta na temperaturi od 30 °C. Rezultat ovog procesa filtriranja se, u konkretnom primeru, deponuje u bočicu ili epruvetu kako bi sačekao dalju obradu. Bočica ili epruveta se mogu čuvati u skladištu na temperaturi od 4 °C.

[0258] Prva faza obrade može se odvijati tokom jednog dana. U ovoj tački toka rada 1060, u nekim implementacijama, novi materijali se ručno dodaju automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija. Na primer, može se dodati nova ćelijski materijal 1062b i novi kertridž za reagens. Dalje, novi kertridž za pranje, zamenski filteri i/ili zamenski vrhovi pipete mogu se dodati u automatizovani sistem za obradu ćelija sa više modula u ovom trenutku. Dalje, u nekim slučajevima, modul filtera može biti podvrgnut procesu čišćenja i/ili jedinice čvrstog i tečnog otpada mogu biti ispražnjene u pripremi za narednu rundu obrade.

[0259] U nekim implementacijama, drugi krug uređivanja uključuje iste module 1002, 104, 1006, 1008 i 1010, iste korake obrade 1018, 1064, 1066, 1026, 1028 i 1076 i/ili 1078 (npr. temperature, vremenski rasponi, itd.) kao prva faza obrade koja je opisana iznad. Na primer, druga oligo biblioteka 1070b i druga sgRNK kičma 1072b mogu se koristiti za uređivanje kombinacije transformisanih ćelija na skoro isti način kao što je opisano iznad. Iako je ilustrovan kao dvostepeni proces, u drugim otelotvorenjima, do dve, tri, četiri, šest, osam ili više rekurzija mogu se sprovesti kako bi se nastavilo sa uređivanjem ćelijskog materijala 1062.

[0260] Naredni primeri ilustruju upotrebu instrumenta obelodanjenja.

Primer I: Potpuno automatizovano singlepleksnog RGN-usmereno uređivanje

[0261] Singlepleksno automatizovano uređivanje genoma korišćenjem MAD7 nukleaze uspešno je izvedeno pomoću automatizovanog multi-modularnog instrumenta obelodanjenja. Pogledati SAD patent br.

9,982,279.

[0262] ampR plazmidna kičma i lacZ_F172<∗>kaseta za uređivanje sastavljeni su koristeći Gibson Assembly<®>u „vektor za uređivanje“ u modulu za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline koji je uključen u automatizovani instrument. lacZ_F172 funkcionalno obara lacZ gen. „lacZ_F172<∗>“ ukazuje da se uređenje dešava na 172. ostatku u lacZ aminokiselinskoj sekvenci. Nakon sastavljanja, proizvod je desalinifikovan u modulu za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline koristeći AMPure perle, ispran sa 80% etanola i eluiran u puferu. Sastavljen vektor za uređivanje i elektrokompetentne E. Coli ćelije spremne za rekombinaciju su prebačeni u modul za transformaciju radi elektroporacije. Modul za transformaciju se sastojao od ADP-EPC kivete. Pogledati, npr., SAD patent br.62/551069. Ćelije i nukleinske kiseline su kombinovane i ostavljene da se mešaju 1 minut, i elektroporacija je izvedena za 30 sekundi. Parametri za pulsiranje bili su: napon 2400 V; dužina, 5 ms; interval, 50 ms; broj impulsa, 1; polaritet, . Parametri za prenos impulsa bili su: napon, 150 V; dužina, 50 ms; interval, 50 ms; broj impulsa, 20; polaritet, /-. Posle elektroporacije, ćelije su prebačene u modul za oporavak (drugi modul za uzgoj) i ostavljene da se oporave u SOC medijumu koji sadrži hloramfenikol. Karbenicilin je dodat medijumu nakon 1 sata, i ćelije su ostavljene da se oporave još 2 sata. Nakon oporavka, ćelije su držane na 4°C dok ih korisnik ne oporavi.

[0263] Nakon automatizovanog procesa i oporavka, alikvot ćelija je postavljen na MacConkey agar bazu sa dodatkom laktoze (kao supstrata šećera), hloramfenikola i karbenicilina i uzgajan dok se ne pojave kolonije. Bele kolonije su predstavljale funkcionalno uređene ćelije, ljubičaste kolonije su predstavljale ćelije koje nisu uređene. Svi transferi tečnosti su obavljeni pomoću automatizovanog uređaja za rukovanje tečnostima automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija.

[0264] Rezultat automatizovane obrade bio je da je približno 1,0E<-03>ukupnih ćelija transformisano (uporedivo sa konvencionalnim rezultatima), i efikasnost uređivanja iznosila je 83,5%. Uređivanje lacZ_172 u belim kolonijama potvrđeno je sekvenciranjem uređenog regiona genoma ćelija. Dalje, koraci automatizovane obrade ćelije su posmatrani na daljinu preko veb kamere i poslate su tekstualne poruke kako bi se ažurirao status automatizovane procedure obrade.

4

Primer II: Pokreni potpuno automatizovano rekurzivno uređivanje

[0265] Rekurzivno uređivanje je uspešno postignuto korišćenjem automatizovanog multi-modularnog sistema za obradu ćelija. ampR plazmidna kičma i lacZ-V10<∗>kaseta za uređivanje sastavljeni su koristeći Gibson Assembly<®>u „vektor za uređivanje“ u modulu za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline koji je uključen u automatizovani sistem. Slično lacZ_F172 uređivanju, lacZ_V10 uređivanje funkcionalno izbacuje lacZ gen. „ lacZ_V10“ označava da se uređivanje dešava na aminokiselinskom položaju 10 u aminokiselinskoj sekvenci lacZ. Nakon sastavljanja, proizvod je desalinifikovan u modulu za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline korišćenjem AMPure perlica, ispran sa 80% etanola i eluiran u puferu. Prvi sastavljen vektor za uređivanje i elektrokompetentne E. Coli ćelije spremne za rekombinaciju prebačeni su u modul za transformaciju radi elektroporacije. Modul za transformaciju se sastojao od ADP-EPC kivete. Ćelije i nukleinske kiseline su kombinovane i ostavljene da se mešaju 1 minut, i elektroporacija je izvedena za 30 sekundi. Parametri za pulsiranje bili su: napon 2400 V; dužina, 5 ms; interval, 50 ms; broj impulsa, 1; polaritet, . Parametri za prenosne impulse bili su: napon, 150 V; dužina, 50 ms; interval, 50 ms; broj impulsa, 20; polaritet, /-. Posle elektroporacije, ćelije su prebačene u modul za oporavak (drugi modul za uzgoj) koji je ostavljen da se oporavi u SOC medijumu koji sadrži hloramfenikol. Karbenicilin je dodat medijumu nakon 1 sata, i ćelije su uzgajane još 2 sata. Ćelije su zatim prebačene u modul centrifuge i zatim je izvršena razmena medijuma. Ćelije su resuspendovane u TB koji sadrži hloramfenikol i karbenicilin, gde su ćelije uzgajane do OD600 od 2,7, zatim koncentrovane i učinjene elektrokompetentnim.

[0266] Tokom uzgoja ćelija, pripremljen je drugi vektor za uređivanje u modulu za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline. Drugi vektor za uređivanje sadržao je gen otpornosti na kanamicin, i kaseta za uređivanje je sadržala galK I145<∗>uređenje. Ako uspe, galK I145<∗>uređenje pruža ćelijama sposobnost da apsorbuju i metabolišu galaktozu. Uređenje koje pravi galK I154<∗>kaseta uvodi stop kodon na 154. aminokiselinski ostatak, menjajući aminokiselinu tirozina u stop kodon. Ovo uređenje čini proizvod galK gena nefunkcionalnim i sprečava ćelije da budu u stanju da metabolišu galaktozu. Nakon sastavljanja, drugi proizvod vektora za uređivanje je desalinifikovan u modulu za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline korišćenjem AMPure kuglica, ispran sa 80% etanola i eluiran u puferu. Drugi sastavljen vektor za uređivanje i elektrokompetentne E. Coli ćelije (koje su transformisane sa i odabrane za prvi vektor za uređivanje) prebačeni su u modul za transformaciju za elektroporaciju, koristeći iste parametre kao što je opisano iznad. Posle elektroporacije, ćelije su prebačene u modul za oporavak (drugi modul za uzgoj), ostavljene da se oporave u SOC medijumu koji sadrži karbenicilin. Nakon oporavka, ćelije su držane na 4°C dok se ne oporave, nakon čega je alikvot ćelija postavljen na LB agar sa dodatkom hloramfenikola i kanamicina. Kako bi se kvantifikovale i lacZ i galK uređenja, replike peč ploča su generisane na dva tipa medijuma: 1) MacConkey baza agara sa dodatkom laktoze (kao supstrat šećera), hloramfenikola i kanamicina, i 2) MacConkey baza agara dopunjena galaktozom (kao šećerni supstrat), hloramfenikol i kanamicin. Svi transferi tečnosti su obavljeni pomoću automatizovanog uređaja za rukovanje tečnostima automatizovanog multi-modularnog sistema za obradu ćelija.

[0267] U ovom eksperimentu rekurzivnog uređivanja, 41% pregledanih kolonija imalo je i lacZ i galK uređivanja, čiji su rezultati bili uporedivi sa efikasnošću dvostrukog uređivanja dobijenom korišćenjem „stonog“ ili ručnog pristupa.

Alternativne otelotvorenja arhitekture instrumenata

[0268] Slike 12A i 12B ilustruju primer alternativnih otelotvorenja automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija za otelotvorenje automatizovane obrade ćelija, npr., uređivanje kod više ćelija u jednom ciklusu. Na primer, automatizovani multi-modularni instrumenti za uređivanje ćelija mogu biti desktop instrumenti dizajnirani za upotrebu u laboratorijskom okruženju. Automatizovani multimodularni instrumenti za uređivanje ćelija mogu da sadrže mešavinu elemenata za višekratnu upotrebu i jednokratnu upotrebu za otelotvorenje različitih višestepenih operacija u sprovođenju automatizovanog razdvajanja genoma i/ili uređivanja u ćelijama.

[0269] SLIKA 12A je blok dijagram instrumenta prvog primera 1200 za izvođenje automatizovane obrade ćelije, npr., uređivanje u više ćelija u jednom ciklusu u skladu sa obelodanjenjem. U nekim implementacijama, instrument 1200 uključuje ploču 1202, posudu za reagens materijal 1204 za uvođenje komponenti uzorka DNK u instrument 1200, posudu za ćelijski materijal 1206 za uvođenje ćelija u instrument 1200 i robotski sistem za rukovanje 1208 za kretanje materijala između modula (na primer, moduli 1210a, 1210b, 1210c, 1210d) posude (na primer, posude 1204, 1206, 1212, 1222, 1224 i 1226) i jedinice za skladištenje (npr., jedinice od 121, 121, 121, 128 instrumenta 1200 za izvođenje automatizovane obrade ćelija. Po završetku obrade ulaznih ćelija 1206, u nekim otelotvorenjima, izlazne ćelije 1212 mogu biti prenete od strane sistema za rukovanje robotom 1208 u jedinicu za skladištenje 1214 za privremeno skladištenje i kasnije preuzimanje.

[0270] Robotski sistem za rukovanje 1208, na primer, može uključivati pumpu za izbacivanje vazduha za prenošenje tečnosti iz različitih izvora materijala u različite module 1210 i jedinicu za skladištenje 1214. U drugim otelotvorenjima, robotski sistem za rukovanje 1208 može uključivati glavu za hvatanje i postavljanje na prenosne kontejnere izvornih materijala (npr. epruveti) iz kertridža sa materijalom (nije ilustrovan, razmatran u vezi sa Slikom 1A) u različite module 1210. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više kamera ili drugih optičkih senzora (nije prikazano) potvrđuju pravilno kretanje i položaj portala.

[0271] U nekim otelotvorenjima, robotski sistem za rukovanje 1208 koristi vrhove za jednokratnu upotrebu koji se nalaze u vrhu za prenos 1216 za prenos izvornih materijala, reagensa 1204 (npr. sastavljanje nukleinske kiseline) i ćelija 1206 unutar instrumenta 1200. Korišćeni vrhovi za prenos 1216, na primer, mogu se odbaciti u jedinicu za čvrsti otpad 1218. U nekim implementacijama, jedinica za čvrsti otpad 1218 sadrži pokretač za uklanjanje epruveti sa glave za hvatanje i postavljanje robotskog sistema za rukovanje 1208.

[0272] U nekim otelotvorenjima, instrument 1200 uključuje kivete elektroporatora sa kapalicama koje se povezuju sa pumpom za istiskivanje vazduha. U nekim implementacijama, ćelije 1206 i reagens 1204 se usisavaju u kivetu za elektroporaciju kroz kapalicu, i kiveta se pomera u jedan ili više modula 1210 instrumenta 1200.

[0273] U nekim implementacijama, instrumentom 1200 upravlja sistem za obradu 1220 kao što je sistem za obradu 1310 na Slici 13. Sistem za obradu 1220 može biti konfigurisan da upravlja instrumentom 100 na osnovu korisničkog unosa. Sistem za obradu 1220 može kontrolisati tajming, trajanje, temperaturu i druge operacije različitih modula 1210 instrumenta 1200. Sistem za obradu 1220 može biti povezan na izvor napajanja (nije prikazan) za rad instrumenta 1200.

[0274] U nekim otelotvorenjima, instrument 1200 uključuje modul za transformaciju 1210c za uvođenje, npr., u kontekstu uređivanja, nukleinskih kiselina u ćelije 1206. Na primer, robotski sistem za rukovanje 1208 može da prenese reagens 1204 i ćelije 1206 u modul za transformaciju 1210c. Modul za transformaciju 1210 može da sprovodi bilo koju ćelijsku transformaciju ili tehniku transfekcije koje rutinski koriste stručnjaci iz oblasti transfekcije, transformacije i mikrofluidike. Namera je da se transformacija uključi u različite tehnike priznate u struci za uvođenje sekvence egzogene nukleinske kiseline (npr. DNK) u ciljanu ćeliju, uključujući te tehnike transformacije i transfekcije. Takve postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, elektroporaciju, lipofekciju, optoporaciju, injekciju, mikrotaloženje, mikroinjekciju, lipozome, bombardovanje česticama, sonoporaciju, laserski indukovanu poraciju, transfekciju zrna, zajedničko taloženje kalcijum fosfata ili kalcijum hlorida ili transfekcija posredovana DEAE-dekstranom.

Transformacija se može odvijati u epruvetama za mikrofugiranje, epruvetama, kivetama, pločama sa više komorica, mikrovlaknima ili instrumentima za protok. Sistem za obradu 1220 može kontrolisati temperaturu i rad modula za transformaciju 1210c. U nekim implementacijama, sistem za obradu 1270 utiče na rad modula za transformaciju 1210c prema jednoj ili više varijabilnih kontrola koje postavlja korisnik.

[0275] U nekim implementacijama, modul za transformaciju 1210c je konfigurisan da pripremi ćelije za preuzimanje vektora povećanjem ćelijske kompetencije pomoću rastvora za prethodnu obradu, 1222, na primer, pranjem saharozom ili glicerolom. Pored toga, mogu se koristiti hibridne tehnike koje iskorišćavaju mogućnosti mehaničkih i hemijskih postupaka transfekcije, na primer magnetofekcija, metodologija transfekcije koja kombinuje hemijsku transfekciju sa mehaničkim postupcima. U drugom primeru, katjonski lipidi se mogu primeniti u kombinaciji sa genskim topovima ili elektroporatorima. Pogodni materijali i postupci za transformaciju ili transfekciju ciljanih ćelija mogu se naći kod, npr Green i Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2014), i drugim laboratorijskim priručnicima.

4

[0276] Nakon transformacije, u nekim implementacijama, ćelije se mogu preneti u modul za oporavak 1210d. U nekim otelotvorenjima, modul za oporavak 1210d je kombinacija modula za oporavak i modula za indukciju uređivanja. U modulu za oporavak 1210d, ćelijama se može dozvoliti da se oporave, eksprimiraju nukleinske kiseline i, u sistemu inducibilne nukleaze, nukleaza se uvodi u ćelije, na primer, pomoću vremenski kontrolisane indukcije, kao što su, u nekim primerima, hemijska, svetlosna, virusna ili temperaturna indukcija ili uvođenje molekula induktora 1224 za eksprimiranje nukleaze.

[0277] Nakon uređivanja, u nekim implementacijama, ćelije se prenose u jedinicu za skladištenje 1214, gde se ćelije mogu čuvati kao izlaz ćelije 1212 sve dok se ćelije ne uklone radi daljeg proučavanja ili preuzimanja uređene populacije ćelija, npr., biblioteke uređenih ćelija.

[0278] U nekim implementacijama instrument 1200 je dizajniran za rekurzivno uređivanje genoma, gde se višestruka uređenja sekvencijalno uvode u genome unutar ćelija populacije ćelija. U nekim implementacijama, zaliha reagensa 1204 se dopunjava pre pristupanja izlaznim ćelijama 1212 iz jedinice za skladištenje za rekurzivnu obradu. U drugim implementacijama, višestruke zalihe reagensa 1204 i/ili njihove velike količine mogu biti uvedene u instrument 1200 tako da interakcija korisnika nije nužno potrebna pre narednog ciklusa obrade.

[0279] Deo izlaznih ćelija 1212a se, u nekim otelotvorenjima, prenosi u automatizovani modul za uzgoj ćelija 1210a. Na primer, mogu se preneti sve izlazne ćelije 1212a, ili se može preneti samo alikvot tako da instrument zadržava inkrementalno modifikovane uzorke. Modul za uzgoj ćelija 1210a, u nekim implementacijama, meri OD ćelija tokom uzgoja kako bi se osiguralo da su u željenoj koncentraciji pre indukcije uređivanja. Druge mere gustine ćelija i fiziološkog stanja koje se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničene na, pH, rastvoreni kiseonik, oslobođene enzime, akustička svojstva i električna svojstva.

[0280] Kako bi se smanjile pozadinske ćelije koje nisu dobile uređivanja genoma, u nekim otelotvorenjima, modul za uzgoj 1210a vrši proces odabira kako bi obogatio uređene ćelije koristeći selektivni medijum za uzgoj 1226. Na primer, uvedena nukleinska kiselina može da uključi gen koji pruža rezistenciju na antibiotike ili neki drugu selektivnu oznaku. U nekim implementacijama, višestruki selektivni geni ili oznake 1226 mogu biti uvedeni u ćelije tokom rekurzivnog uređivanja. Na primer, naizmenično uvođenje selektivnih oznaka za sekvencijalne runde uređivanja može eliminisati pozadinske neuređene ćelije i omogućiti višestrukim ciklusima instrumenta 1200 da selektuju ćelije koje imaju sekvencijalna uređivanja genoma. Pogodni geni otpornosti na antibiotike uključuju, ali nisu ograničeni na, gene kao što su gen otpornosti na ampicilin, gen otpornosti na tetraciklin, gen otpornosti na kanamicin, gen otpornosti na neomicin, gen otpornosti na kanavanin, gen otpornosti na blasticidin, gen otpornosti na higromicin, gen otpornosti na puromicin, nd gen otpornosti na hloramfenikol.

[0281] Iz modula za uzgoj 1210a, ćelije se mogu preneti u modul za filtriranje 110b. Modul za filtriranje 1210b ili, alternativno, modul za pranje i koncentraciju ćelija, može omogućiti razmenu medijuma. U nekim otelotvorenjima, uklanjanje pozadinskih mrtvih ćelija je potpomognuto upotrebom litičkih pojačivača kao što su deterdženti, osmotski stres, temperatura, enzimi, proteaze, bakteriofagi, redukcioni agensi ili haotropi. U drugim otelotvorenjima, uklanjanje ćelija i/ili razmena medijuma se koristi za smanjenje pozadinskih mrtvih ćelija. Otpadni proizvod iz modula za filtriranje 1210b se, u nekim otelotvorenjima, sakuplja u jedinici za tečni otpad 1228.

[0282] Posle filtriranja, ćelije se mogu predstaviti modulu za transformaciju 1210c, i zatim modulu za oporavak 1210d i konačno jedinici za skladištenje 1214 kao što je opisano iznad.

[0283] Prelazeći na Sliku 12B, slično Sl.12A, drugi primer instrumenta 1240 za otelotvorenje automatizovanog razdvajanja genoma i/ili uređivanja u više ćelija u jednom ciklusu uključuje špil 1202, posudu sa reagens materijalom 1204 za uvođenje jedne ili više komponenti nukleinske kiseline u instrument 1240, posudu sa ćelijskim materijalom 1206 za uvođenje ćelija u instrument 1240 i robotski sistem za rukovanje 1208 za premeštanje materijala između modula (na primer, moduli 1210a, 1210b, 1210c, 1210f 1210g, 1210m i 1210h), posude 12 na primer, 120 posuda 1212, 1214, 1224, 1242, 1244 i 1246) i jedinice za skladištenje (npr. jedinice 1214, 1216, 1218 i 1228) instrumenta 1240 za obavljanje automatizovane obrade ćelije. Po završetku obrade snabdevanja ćelijama 1206, u nekim otelotvorenjima, izlaz ćelije 1212 može biti prenet od strane sistema za rukovanje robotom 1208 u jedinicu za skladištenje 1214 za privremeno

4

skladištenje i kasnije preuzimanje.

[0284] U nekim otelotvorenjima, robotski sistem za rukovanje 1208 koristi vrhove za jednokratnu upotrebu koji su pruženi u vrhu za prenos 1216 za prenos izvornih materijala, vektorsku kičmu 1242, uređujuće oligoe 1244, reagens 1204 (npr. za sastavljanje nukleinske kiseline, prečišćavanje nukleinske kiseline elektrokompetentne ćelije, itd.), i ćelije 1206 unutar instrumenta 1240, kao što je opisano u vezi sa Slikom 12A.

[0285] U drugim otelotvorenjima, instrument 1240 uključuje kivete elektroporatora sa kapalicama koje se povezuju sa pumpom za istiskivanje vazduha. U nekim implementacijama, ćelije 1206 i reagens 1204 se usisavaju u kivetu za elektroporaciju kroz kapalicu, i kiveta se pomera u jedan ili više modula 1210 instrumenta 1240.

[0286] Kao što je opisano u vezi sa Slikom 12A, u nekim implementacijama, instrumentom 1240 upravlja procesni sistem 1220, kao što je sistem za obradu 1310 na Slici 13.

[0287] Instrument 1240, u nekim otelotvorenjima, uključuje modul za sastavljanje nukleinske kiseline 1210g, i u određenim primerima automatizovane instrumente za obradu ćelija sa više modula, gde modul za sastavljanje nukleinske kiseline 1210g može da uključi u nekim otelotvorenjima izomerno sastavljanje nukleinske kiseline. Kao što je opisano iznad, modul za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline je konfigurisan da izvrši Gibson Assembly<®>postupak molekularnog kloniranja.

[0288] U nekim otelotvorenjima, nakon sastavljanja nukleinskih kiselina, nukleinske kiseline (npr., u primeru izotermnog sastavljanja nukleinske kiseline, mešavina za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline (nukleinske kiseline reagensi za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline) se prenosi u modul za prečišćavanje 1210h. Ovde se uklanjaju neželjene komponente mešavine nukleinskih kiselina (npr. soli, minerali) i, u određenim otelotvorenjima, sastavljene nukleinske kiseline se koncentrišu. Na primer, u ilustrativnoj varijanti, u modulu za prečišćavanje 1210h, mešavina za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline može se kombinovati sa puferom bez soli i magnetnim perlama, kao što su magnetne perle sa reverzibilnom imobilizacijom u čvrstoj fazi (SPRI) ili AMPure perle. Mešavina za izotermno sastavljanje nukleinske kiseline može da se inkubira dovoljno vremena (npr.30 sekundi do 10 minuta) kako bi se se sastavljene nukleinske kiseline vezale za magnetne perle. U nekim otelotvorenjima, modul za prečišćavanje uključuje magnet konfigurisan da zahvati magnetne perle. Magnet se može uključiti tako da se supernatant može ukloniti iz vezanih sastavljenih nukleinskih kiselina i tako da se vezane sastavljene nukleinske kiseline mogu isprati sa, npr., 80% etanola. Ponovo, magnet se može aktivirati i 80% rastvor za pranje etanolom je uklonjen. Magnetne kuglice/sastavljene nukleinske kiseline se mogu ostaviti da se osuše, zatim se sastavljene nukleinske kiseline mogu eluirati i magnet se može ponovo aktivirati, ovog puta da se sekvestraju perle i da se ukloni supernatant koji sadrži eluirane sastavljene nukleinske kiseline. Sakupljene nukleinske kiseline se zatim mogu preneti u modul za transformaciju (npr., elektroporator u poželjnom otelotvorenju). Modul za transformaciju možda već sadrži elektrokompetentne ćelije nakon prenosa.

[0289] U nekim otelotvorenjima, instrument 1240 uključuje modul za transformaciju 1210c za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije 1206, kao što je opisano u vezi sa Slikom 12A. Međutim, u ovom slučaju, sastavljene nukleinske kiseline 1204, izlaz iz modula za prečišćavanje 1210h, prenose se u modul za transformaciju 1210c radi kombinovanja sa ćelijama 1206.

[0290] Nakon transformacije u modulu za transformaciju 1210c, u nekim implementacijama, ćelije se mogu preneti u modul za oporavak 1210m. U modulu za oporavak 1210e, ćelijama se može dozvoliti da se oporave, eksprimiraju nukleinske kiseline i, u sistemu inducibilne nukleaze, nukleaza se indukuje, npr., pomoću vremenski kontrolisane indukcije kao što je, u nekim primerima, hemijska, svetlosna, virusna ili temperaturna indukcija ili uvođenje molekula induktora za eksprimiranje nukleaze.

[0291] Nakon oporavka, u nekim implementacijama, ćelije se prenose u modul za uređivanje 1210f. Modul za uređivanje 1210f pruža odgovarajuće uslove da izazove uređivanje genoma ćelija, na primer, kroz eksprimiranje uvedenih nukleinskih kiselina i indukciju inducibilne nukleaze. Ćelije mogu uključivati inducibilnu nukleazu. Nukleaza može biti, u nekim primerima, hemijski indukovana, biološki indukovana (npr., preko inducibilnog promotera), virusno indukovana, svetlom indukovana, temperaturno indukovana i/ili toplotno indukovana unutar modula za uređivanje 1210f.

4

[0292] Nakon uređivanja, u nekim implementacijama, ćelije se prenose u jedinicu za skladištenje 1214 kao što je opisano u vezi sa Slikom 12A.

[0293] U nekim implementacijama, instrument 1240 je dizajniran za rekurzivno uređivanje genoma, gde se višestruke uređenja sekvencijalno uvode u genome unutar ćelija populacije ćelija. U nekim implementacijama, zaliha reagensa 1204 se dopunjava pre pristupanja izlaznim ćelijama 1212 iz jedinice za skladištenje radi rekurzivne obrade. Na primer, dodatna vektorska kičma 1242 i/ili uređujući oligoi 1244 se mogu uvesti u instrument 1240 za sastavljanje i pripremu preko modula za sastavljanje nukleinske kiseline 1210g i modula za prečišćavanje 1210h. U drugim implementacijama, višestruke zapremine vektorske kičme 1242 i/ili uređujući oligoi 1244 mogu biti uvedeni u instrument 140 tako da interakcija korisnika nije nužno potrebna pre narednog ciklusa obrade. Za svaki naredni ciklus, vektorska kičma 1242 i/ili uređujući oligoi 1244 se mogu promeniti. Nakon pripreme sastava nukleinske kiseline, sastavljanje nukleinske kiseline može biti pružen u zalihi reagensa 1204 ili drugom regionu skladištenja.

[0294] Deo izlaza ćelije 1212a se, u nekim otelotvorenjima, prenosi u automatski modul za uzgoj ćelija 1210a, kao što je razmatrano u vezi sa Slikom 12A.

[0295] Kako bi se smanjile pozadinske ćelije koje nisu dobile uređivanja genoma, u nekim otelotvorenjima, modul za uzgoj 1210a izvodi proces odabira za obogaćivanje uređenih ćelija korišćenjem selektivnog medijuma za uzgoj 1226, kao što je razmatrano u vezi sa Slikom 12A.

[0296] Iz modula za uzgoj 1210a, ćelije se mogu preneti u modul za filtriranje 1210b, kao što je razmatrano u vezi sa Slikom 12A. Kao što je ilustrovano, eluant iz izvora za eluiranje 1246 (npr. pufer, glicerol) se može preneti u modul za filtriranje 1210b radi razmene medijuma.

[0297] Nakon filtriranja, ćelije mogu biti predstavljene modulu za transformaciju 1210c radi transformacije, i zatim modulu za oporavak 110m i modulu za uređivanje 1210f i konačno jedinici za skladištenje 1214 kao što je detaljno opisano iznad.

[0298] U nekim otelotvorenjima, automatizovani instrumenti za obradu ćelija sa više modula na Slikama 12A i/ili 12B sadrže jedan ili više zamenjivih kertridža sa materijalom i robotski sistem za rukovanje, kao što je razmatrano u vezi sa Slikom 1A i 1B. Svaki kertridž može sadržati jednu ili više mešavina nukleinskih kiselina, oligonukleotida, vektora, medijuma za uzgoj, agensa za odabir (npr. antibiotike), indukcionog agensa, reagensa za prečišćavanje nukleinske kiseline kao što su perle za reverzibilnu imobilizaciju čvrste faze (SPRI), etanol i 10% glicerol.

[0299] Iako su primeri instrumenata 1200, 1240 ilustrovani kao da uključuju određeni raspored modula 1210, ovi aranžmani su samo u ilustrativne svrhe. Na primer, u drugim otelotvorenjima, više ili manje modula 1210 može biti uključeno u svaki od instrumenata 1200, 1240. Takođe, različiti moduli mogu biti uključeni u instrument, kao što je, na primer, modul koji olakšava fuziju ćelija za pružanje, npr., hibridoma, modul koji amplifikuje nukleinske kiseline pre sastavljanja, i/ili modul koji olakšava eksprimiranje i/ili sekreciju proteina. Dalje, određeni moduli 1210 se mogu replicirati u okviru određenih otelotvorenja, kao što su duplirani moduli za uzgoj ćelija 110a, 110b na Slici 1A. Svaki od instrumenata 1200 i 1240, u drugom primeru, može biti dizajniran da prihvati kertridž sa medijima kao što su kertridži 104 i 106 na Slici 1A. Moguće su dalje modifikacije.

Kontrolni sistem za automatizovani instrument za obradu ćelija sa više modula

[0300] Prelazeći na Sliku 11, snimak ekrana ilustruje primer grafičkog korisničkog interfejsa (GUI) 1100 za povezivanje sa automatizovanim multi-modularnim instrumentom za obradu ćelija. Interfejs, na primer, može biti predstavljen na ekranu 236 na Slikama 1C i 2D. U jednom primeru, GUI 1100 može biti predstavljen procesnim sistemom 1310 na Slici 13 na ekranu osetljivom na dodir 1316.

[0301] U nekim implementacijama, GUI 1100 je podeljen na niz panela za unos informacija i podataka, kao što je panel za protokol 1102, panel za temperaturu 1106, panel za elektroporaciju 1108 i panel za uzgoj ćelija 1110. Mogući su dodatni paneli. Na primer, u nekim otelotvorenjima GUI 1100 uključuje panel za svaki modul, kao što je, u nekim primerima, jedan ili više modula za sastavljanje nukleinske kiseline, modul za prečišćavanje, modul za uzgoj ćelija, modul za filtriranje, modul za transformaciju, modul za uređivanje i modul za oporavak. Niži paneli na GUI 1100, u nekim otelotvorenjima, predstavljaju module primenljive na

4

trenutni tok rada (npr., kao što je izabrano u panelu protokola 1102 ili kako je naznačeno u panelu računarske rutine učitane preko interfejsa računarske rutine (nije ilustrovano)). U nekim otelotvorenjima, funkcija skrolovanja ili paginacija mogu omogućiti korisniku da pristupi dodatnim oknima koji nisu ilustrovani na snimku ekrana na Slici 11.

[0302] GUI 1100, u nekim otelotvorenjima, uključuje seriju kontrola 1120 za pristup različitim ekranima kao što je ilustrovani snimak ekrana (npr. korišćenjem kućne kontrole 1120a). Na primer, izborom kontrole za uređivanje 1120b, korisniku se može pružiti opcija da pruži jedan, dva ili niz koraka obrade ćelije. Izborom kontrole računarske rutine 1120c, korisniku se može pružiti prilika da doda novu računarsku rutinu za obradu ili izmeni postojeću računarsku rutinu za obradu. Korisnik u nekim otelotvorenjima može da izabere pomoćnu kontrolu 1120d da dobije dalje informacije u vezi sa karakteristikama GUI 1100 i automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija. U nekim implementacijama, korisnik bira kontrolu podešavanja 1120e za pristup opcijama podešavanja za željene procese i/ili GUI 1100, kao što su, u nekim primerima, vremenska zona, jezik, jedinice, opcije pristupa mreži,. Kontrola napajanja 1120f, kada je izabrana, omogućava korisniku da isključi automatizovani multi-modularni instrument za obradu ćelija.

[0303] Prelazeći na panel protokola 1102, u nekim implementacijama, korisnik bira protokol (npr. računarsku rutinu ili radni tok) za izvršenje od strane automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija unosom protokola u polje za unos protokola 1112 (ili, alternativno, iz padajućeg menija). U drugim otelotvorenjima, protokol se može izabrati preko posebnog ekrana korisničkog interfejsa, kome se pristupa, na primer, izborom kontrole računarske rutine 1120b. U drugom primeru, automatizovani instrument za obradu ćelija sa više modula može izabrati protokol i predstaviti ga u polju za unos protokola 1112. Na primer, sistem za obradu automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija može da skenira mašinski čitljive oznake postavljene na jednom ili više kertridža umetnutih u automatizovani multimodularni instrument za obradu ćelija kako bi se odredio odgovarajući protokol. Kao što je ilustrovano, izabran je protokol „Microbe_Kit1 (1.0.2)“, koji može odgovarati kompletu kertridža i druge opreme za jednokratnu upotrebu kupljene za upotrebu sa automatizovanim multi-modularnim instrumentom za obradu ćelija.

[0304] U nekim implementacijama, panel protokola 1102 dalje uključuje kontrolu pokretanja 1114a i kontrolu zaustavljanja 1114b za kontrolu izvršenja protokola predstavljenog u polju za unos protokola 1112. GUI 1100 može biti pružen na interfejsu ekrana osetljivog na dodir, na primer, gde dodir izbor početne kontrole 1114a pokreće obradu ćelije, a izbor kontrole zaustavljanja 1114b zaustavlja obradu ćelije.

[0305] Prelazeći na panelu statusa pokretanja 1104, u nekim implementacijama, grafikon 1116 ilustruje faze obrade protokola identifikovane u panelu protokola 1102. Na primer, deo završetka pokretanja 1118a je ilustrovan plavom bojom, dok je deo trenutne faze 1118b ilustrovan zelenom bojom, a sve greške 1118c su označene oznakama koji se protežu od tačke u vremenu duž toka dela završetka 1118a pokretanja gde se greška dogodila. Region poruke 1118d predstavlja procenat završenog pokretanja, procenat završene faze i ukupan broj grešaka. U nekim otelotvorenjima, nakon odabira grafikona 1116, korisniku može biti predstavljeno više detalja u vezi sa statusom pokretanja, kao što je, u nekim primerima, identifikacija tipa greške, naziv trenutne faze obrade (npr., sastavljanje nukleinske kiseline, prečišćavanje, uzgoj ćelija, filtriranje, transformacija, oporavak, uređivanje, itd.), i spisak faza obrade u okviru serije. Dalje, u nekim otelotvorenjima, poruka o vremenu završetka rada ukazuje na datum i vreme kada se procenjuje da će otelotvorenje biti završeno. Pokretanje, u nekim primerima, može ukazivati na proces uređivanja jedne ćelije ili na seriju rekurzivnih procesa uređivanja ćelija zakazanih za izvršenje bez intervencije korisnika. U nekim otelotvorenjima (nije prikazano), okvir statusa rada 1104 dodatno ilustruje procenjeno vreme u kom će biti potrebna intervencija korisnika (npr., zamena kertridža, odlaganje čvrstog otpada, odlaganje tečnog otpada, itd.).

[0306] U nekim implementacijama, okvir statusa pokretanja 1104 uključuje kontrolu pauze 1124 za pauziranje obrade ćelije. Korisnik može da izabere da pauzira trenutno pokretanje, na primer, da ispravi identifikovanu grešku ili da izvrši ručnu intervenciju kao što je uklanjanje otpada.

[0307] panel temperature 1106, u nekim otelotvorenjima, ilustruje seriju ikonica 1126 sa odgovarajućim porukama 1128 koje ukazuju na podešavanja temperature za različite uređaje automatizovanog multimodularnog instrumenta za obradu ćelija. Ikonice, s leva na desno, mogu predstavljati modul za

4

transformaciju 1126a (npr. kertridž za protočnu elektroporaciju povezan sa kertridžom za reagens 110c na Slici 1A ili uređaje za protočnu elektroporaciju 534 na Slici 5B), modul za prečišćavanje 1126b, prvi modul za uzgoj 1126c, drugi modul za uzgoj 1126d i modul za filtriranje 1126e. Odgovarajuće poruke 1128a-e identifikuju trenutnu temperaturu, nisku temperaturu i visoku temperaturu odgovarajućeg modula (npr. za ovu fazu ili ovaj rad). Prilikom izbora jedne od ikonica 1126, u nekim otelotvorenjima, može se pregledati grafički prikaz temperature vremena.

[0308] Ispod panela temperaturnog, u nekim implementacijama, niz panela identifikuje trenutni status određenog broja modula. Na primer, okvir za elektroporaciju 1108 predstavlja status modula za transformaciju, dok okvir za uzgoj ćelija 1110 predstavlja status modula za uzgoj. U nekim otelotvorenjima, ovde predstavljeni paneli identifikuju status trenutno operativnog modula (npr. modul uključen u obradu ćelije u trenutnoj fazi) kao i status svih modula koji su već korišćeni tokom trenutnog pokretanja (kao što je ilustrovano, na primer, u panelu statusa pokretanja 1104). Informacije o prošlom statusu, na primer, mogu predstavljati korisniku informacije u vezi sa parametrima korišćenim u prethodnim fazama obrade ćelije.

[0309] Prelazeći na panel elektroporaciju 1108, u nekim implementacijama, prikazani su operativni parametri 1130a od volti, miliampera i džula. Dodatno, statusna poruka 1132a može identifikovati dodatne informacije u vezi sa funkcionisanjem modula za transformaciju, kao što je, u nekim primerima, status greške, preostalo vreme za obradu ili sadržaj modula (npr. materijali dodati modulu). U nekim implementacijama, ikonica 1134a iznad statusne poruke 1132a biće predstavljena u aktivnom režimu (npr. šareno, „osvetljeno“, podebljano, itd.) kada se odgovarajući modul aktivno obrađuje. Izbor ikonice 1134a, u nekim otelotvorenjima, izaziva predstavljanje grafičkog prikaza detaljnih informacija u vezi sa operativnim parametrima 1130a.

[0310] Prelazeći na panel uzgoja ćelija 1110, u nekim implementacijama, prikazani su operativni parametri 1130b za OD i sati uzgoja. Pored toga, statusna poruka 1132b može da identifikuje dodatne informacije u vezi sa funkcionisanjem modula za uzgoj, kao što je, u nekim primerima, status greške, preostalo vreme za obradu ili sadržaj modula (npr. Materijali dodati modulu). U nekim implementacijama, ikonica 1134b iznad statusne poruke 1132b biće predstavljena u aktivnom režimu (npr. šareno, „osvetljeno“, podebljano, itd.) kada se odgovarajući modul aktivno obrađuje. Izbor ikonice 1134b, u nekim otelotvorenjima, izaziva predstavljanje grafičkog prikaza detaljnih informacija u vezi sa operativnim parametrima 1130b.

[0311] Zatim, opis hardvera primera sistema za obradu i okruženje za obradu prema primernim otelotvorenjima opisani su sa referencom na Sliku 13. Na Slici 13, sistem za obradu 1310 uključuje CPU 1308 koji obavlja deo gore opisanih procesa. Na primer, CPU 1308 može upravljati fazama obrade postupka 900 na Slici 9 i/ili tokovima rada na Slici 10A-C. Podaci procesa i, računarske rutine, uputstva i/ili korisnička podešavanja mogu biti uskladišteni u memoriji 1302. Ovi procesni podaci i, računarske rutine, uputstva i/ili korisnička podešavanja takođe mogu biti uskladišteni na disku medijuma za skladištenje 1304 kao što je prenosiva memorija (npr. USB drajv, optički disk, itd.) ili se mogu čuvati na daljinu. Na primer, podaci o procesu i, računarske rutine, uputstva i/ili korisnička podešavanja mogu biti uskladišteni na lokaciji dostupnoj sistemu za obradu 1310 preko mreže 1328. Dalje, napredovanja koja se zahtevaju nisu ograničena formom računarski čitljivog medija na kom se čuvaju uputstva postupka pronalaska. Na primer, uputstva mogu biti uskladištena u FLASH, RAM, ROM memoriji ili bilo kom drugom uređaju za obradu informacija sa kojim sistem za obradu 1310 komunicira, kao što je server, računar, pametni telefon ili drugi ručni računarski uređaj.

[0312] Dalje, komponente zahtevanog unapređenja mogu biti pružene kao pomoćna aplikacija, pozadinski demon ili komponenta operativnog sistema, ili njihova kombinacija, koji se izvršavaju zajedno sa CPU 1308 i operativnim sistemom kao što je sa drugim računarskim sistemima poznatim stručnjacima.

[0313] CPU 1308 može biti ARM procesor, sistem-na-čipu (SOC), mikroprocesor, mikrokontroler, procesor digitalnih signala (DSP), ili može biti drugi tip procesora koje bi stručnjak prepoznao. Dalje, CPU 1308 se može implementirati kao više procesora koji rade paralelno kako bi izvršili uputstva procesa pronalaska opisanih iznad.

[0314] Sistem za obradu 1310 je deo okruženja za obradu 1300. Sistem za obradu 1310 na Slici 13 takođe uključuje mrežni kontroler 1306 za povezivanje sa mrežom 1328 za pristup dodatnim elementima unutar okruženja za obradu 1300. Kao što se može proceniti, mreža 1328 može biti javna mreža, kao što je Internet, ili privatna mreža kao što je LAN ili WAN mreža, ili bilo koja njihova kombinacija i takođe može uključivati PSTN ili ISDN podmreže. Mreža 1328 može biti bežična kao što je ćelijska mreža uključujući EDGE, 3G i 4G bežične ćelijske sisteme. Bežična mreža takođe može biti Wi-Fi, Bluetooth ili bilo koji drugi poznati oblik komunikacije.

[0315] Sistem za obradu 1310 dalje uključuje I/O interfejs opšte namene 1312 koji se povezuje sa korisničkim interfejsom (npr. ekranom osetljivim na dodir) 1316, jednim ili više senzora 1314 i jednim ili više perifernih uređaja 1318. Periferni I/O uređaji 1318 mogu uključivati, u nekim primerima, sistem za video snimanje, sistem za snimanje zvuka, mikrofon, spoljni uređaji za skladištenje i/ili spoljni sistem zvučnika. Jedan ili više senzora 1314 može uključivati jedan ili više od žiroskopa, akcelerometra, senzora gravitacije, linearnog akcelerometra, globalnog sistema pozicioniranja, skenera bar koda, skenera QR koda, RFID skenera, monitora temperature i sistema osvetljenja ili elementa osvetljenja.

[0316] Kontrolor skladištenja opšte namene 1324 povezuje disk medijuma za skladištenje 1304 sa komunikacionom magistralom 1340, kao što je paralelna magistrala ili serijska magistrala kao što je univerzalna serijska magistrala (USB), ili slično, za međusobno povezivanje svih komponenti sistema za obradu. Opis opštih karakteristika i funkcionalnosti kontrolera skladištenja 1324, mrežnog kontrolera 1306 i I/O interfejsa opšte namene 1312 je ovde izostavljen radi kratkoće pošto su ove karakteristike poznate.

[0317] Sistem za obradu 1310, u nekim otelotvorenjima, uključuje jedan ili više ugrađenih i/ili perifernih senzora 1314. Senzori 1314, na primer, mogu biti ugrađeni direktno u unutrašnju elektroniku i/ili kućište automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu. Deo senzora 1314 može biti u direktnom fizičkom kontaktu sa I/O interfejsom 1312, na primer, preko žice; ili u bežičnom kontaktu, na primer, preko Bluetooth, Wi-Fi ili NFC veze. Na primer, bežični komunikacioni kontroler 1326 može omogućiti komunikaciju između jednog ili više bežičnih senzora 1314 i I/O interfejsa 1312. Štaviše, jedan ili više senzora 1314 mogu biti u indirektnom kontaktu, npr. preko posredničkih servera ili uređaja za skladištenje koji se nalaze u mreži 1328; ili u (žičnom, bežičnom ili indirektnom) kontaktu sa akumulatorom signala negde unutar automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija, koji je zauzvrat u (žičnom ili bežičnom ili indirektnom) kontaktu sa I/O interfejsom 1312.

[0318] Grupa senzora 1314 koja komunicira sa I/O interfejsom 1312 može se koristiti u kombinaciji za prikupljanje datog tipa signala sa više mesta u cilju generisanja potpunije mape signala. Jedan ili više senzora 1314 koji komuniciraju sa I/O interfejsom 1312 mogu se koristiti kao komparator ili element za verifikaciju, na primer za filtriranje, poništavanje ili odbijanje drugih signala.

[0319] U nekim otelotvorenjima, okruženje za obradu 1300 uključuje računarski uređaj 1338 koji komunicira sa sistemom za obradu 1310 preko kontrolera bežičnih komunikacija 1326. Na primer, kontroler bežičnih komunikacija 1326 može omogućiti razmenu e-poruka, tekstualnih poruka i/ili softverske aplikacije upozorenja namenjena pametnom telefonu ili drugom ličnom računarskom uređaju korisnika.

[0320] Okruženje za obradu 1300, u nekim implementacijama, uključuje robotski sistem za rukovanje materijalom 1322. Sistem za obradu 1310 može uključivati kontroler robota 1320 za izdavanje kontrolnih signala za aktiviranje elemenata robotskog sistema za rukovanje materijalom, kao što je manipulisanje položajem portala, spuštanje ili podizanje kapalice ili elementa pipetora, i/ili aktiviranje pumpi i ventila da izazove prenos tečnosti između kapalice/pipetora i različitih sudova (npr. komora, bočica, itd.) u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za obradu ćelija. Kontroler robota 1320, u nekim primerima, može uključivati hardverski drajver, element firmvera i/ili jedan ili više algoritama ili softverskih paketa za povezivanje sistema za obradu 1310 sa robotskim sistemom za rukovanje materijalom 1322.

[0321] U nekim implementacijama, okruženje za obradu 1310 uključuje jedan ili više interfejsa modula 1332, kao što je, u nekim primerima, jedan ili više interfejsa senzora, interfejsa za kontrolu snage, interfejsa ventila i pumpe, i/ili interfejsa aktuatora za aktiviranje i kontrolu obrade svakog modula automatizovanog multi-modularnog sistema obrade. Na primer, interfejsi modula 1332 mogu uključivati interfejs aktuatora za pogonski motor 864 rotirajućeg uređaja za uzgoj ćelija 850 (Slika 8D) i interfejs senzora za detektorsku ploču 872 koji detektuje optičku gustinu uzgoja ćelija unutar rotirajuće bočice za uzgoj 800. Kontroler modula 1330 je, u nekim otelotvorenjima, konfigurisan za povezivanje sa interfejsima modula 1332.

1

Kontroler modula 1330 može uključivati jedan ili više kontrolera (npr. verovatno jedan kontroler po modulu, iako neki moduli mogu da dele jedan kontroler). Kontroler modula 1330, u nekim primerima, može da sadrži hardverski drajver, element firmvera i/ili jedan ili više algoritama ili softverskih paketa za povezivanje sistema za obradu 1310 sa interfejsima modula 1332.

[0322] Procesno okruženje 1310, u nekim implementacijama, uključuje sistem upravljanja toplotom 1336 za kontrolu klimatskih uslova unutar kućišta automatizovanog multi-modularnog sistema za obradu. Sistem za upravljanje toplotom 1336 može dodatno da kontroliše klimatske uslove unutar jednog ili više modula automatizovanog multi-modularnog instrumenta za obradu ćelija. Sistem za obradu 1310, u nekim otelotvorenjima, uključuje kontroler temperature 1334 za povezivanje sa sistemom upravljanja toplotom 1336. Kontroler temperature 1334, u nekim primerima, može uključivati hardverski drajver, element firmvera i/ili jedan ili više algoritama ili softverskih paketa za povezivanje sistema za obradu 1310 sa sistemom upravljanja toplotom 1336.

Proizvodnja biblioteka ćelija korišćenjem automatizovanih postupaka uređivanja, modula, instrumenata i sistema

[0323] U jednom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža automatizovane postupke uređivanja, module, instrumente i automatizovane instrumente za multi-modularno uređivanje ćelija za kreiranje biblioteke ćelija kojima variraju eksprimiranje, nivoi i/ili aktivnost RNK i/ili proteina od interesa u različitim tipove ćelija koristeći različite strategije uređivanja, kao što je detaljnije opisano. Shodno tome, obelodanjenje je namenjeno da pokrije biblioteke uređenih ćelija koje su kreirane automatizovanim postupcima uređivanja, automatizovanim multi-modularnim instrumentima za uređivanje ćelija predmetnog obelodanjenja. Ove biblioteke ćelija mogu imati različite ciljane izmene, uključujući ali ne ograničavajući se na obaranje gena, ubacivanje gena, umetanje, brisanje, izmene pojedinačnih nukleotida, kratke izmene ponavljanja u tandemu, pomeranje okvira, ekspanziju tripleta kodona i slično u ćelijama različitih organizama. Ove izmene mogu biti usmerene na kodirajuće ili nekodirajuće regione genoma, i poželjno je da su racionalno dizajnirane.

[0324] U drugim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovane postupke uređivanja, automatizovane instrumente za multi-modularno uređivanje ćelija za kreiranje biblioteke ćelija kojima variraju DNK-povezani procesi. Na primer, biblioteka ćelija može uključivati pojedinačne ćelije koje imaju izmene na mestima vezivanja DNK kako bi ometale DNK vezivanje regulatornih elemenata koji moduliraju eksprimiranje odabranih gena. Pored toga, biblioteke ćelija mogu uključivati izmene u genomskoj DNK koje utiču na ćelijske procese kao što su formiranje heterohromatina, rekombinacija klase prekidača i VDJ rekombinacija.

[0325] U specifičnim aspektima, biblioteke ćelija se kreiraju korišćenjem višestrukog uređivanja pojedinačnih ćelija unutar populacije ćelija, gde se više ćelija u populaciji ćelija uređuju u jednom krugu uređivanja, tj. višestruke promene unutar ćelija biblioteke ćelija dešavaju se u jednom automatizovanom radu. Biblioteke koje se mogu kreirati u jednoj multipleksnoj automatizovanoj operaciji mogu sadržati 500 uređenih ćelija, 1000 uređenih ćelija, 2000 uređenih ćelija, 5000 uređenih ćelija, 10.000 uređenih ćelija, 50.000 uređenih ćelija, 100.000 uređenih ćelija, 200.000 uređenih ćelija, 300.000 uređenih ćelija, 400.000 uređenih ćelija, 500.000 uređenih ćelija, 600.000 uređenih ćelija, 700.000 uređenih ćelija, 800.000 uređenih ćelija, 900.000 uređenih ćelija, 1.000.000 uređenih ćelija, 2.000.000 uređenih ćelija, 3.000.000 uređenih ćelija, 4.000.000 uređenih ćelija, 5.000.000 uređenih ćelija, 6.000.000 uređenih ćelija, 7.000.000 uređenih ćelija, 8.000.000 uređenih ćelija, 9.000.000 uređenih ćelija, 10.000.000 uređenih ćelija ili više.

[0326] U drugim specifičnim aspektima, biblioteke ćelija se kreiraju korišćenjem rekurzivnog uređivanja pojedinačnih ćelija unutar populacije ćelija, gde se izmene dodaju pojedinačnim ćelijama u dva ili više krugova uređivanja. Upotreba rekurzivnog uređivanja rezultuje spajanjem dva ili više uređivanja koje ciljaju dva ili više mesta u genomu u pojedinačnim ćelijama biblioteke. Biblioteke koje se mogu kreirati u automatizovanoj rekurzivnoj operaciji mogu sadržati 500 uređenih ćelija, 1000 uređenih ćelija, 2000 uređenih ćelija, 5000 uređenih ćelija, 10.000 uređenih ćelija, 50.000 uređenih ćelija, 100.000 uređenih ćelija, 200.000 uređenih ćelija, 300.000 uređenih ćelija, 400.000 uređenih ćelija, 500.000 uređenih ćelija, 600.000 uređenih ćelija, 700.000 uređenih ćelija, 800.000 uređenih ćelija, 900.000 uređenih ćelija, 1.000.000 uređenih ćelija, 2.000.000 uređenih ćelija, 3.000.000 uređenih ćelija, 4.000.000 uređenih ćelija, 5.000.000 uređenih ćelija, 6.000.000 uređenih ćelija, 7.000.000 uređenih ćelija, 8.000.000 uređenih ćelija, 9.000.000

2

uređenih ćelija, 10.000.000 uređenih ćelija ili više.

[0327] Primeri neautomatizovanih strategija za uređivanje koje se mogu modifikovati na osnovu predmetne specifikacije kako bi se koristili automatizovani sistemi mogu se naći u, npr. SAD patentima br.8,110,360, 8,332,160, 9,988,624, 20170316353, i 20120277120.

[0328] U specifičnim aspektima, rekurzivno uređivanje se može koristiti prvo za kreiranje fenotipa ćelije, a zatim se kasnije runde uređivanja koriste za preokretanje fenotipa i/ili ubrzavanje drugih svojstava ćelije.

[0329] U nekim aspektima, biblioteka ćelija sadrži izmene za stvaranje neprirodnih amino kiselina u ćeliji.

[0330] U specifičnim aspektima, obelodanjenje pruža biblioteke uređenih ćelija koje imaju izmene u jednom ili više regulatornih elemenata kreiranih korišćenjem postupaka automatizovanog uređivanja, automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija predmetnog obelodanjenja. Izraz „regulatorni element“ se odnosi na molekule nukleinske kiseline koji mogu uticati na transkripciju i/ili translaciju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom okruženju i/ili kontekstu. Ovaj izraz ima za cilj da uključi sve elemente koji promovišu ili regulišu transkripciju i stabilnost RNK uključujući promotere, osnovne elemente potrebne za osnovnu interakciju RNK polimeraze i transkripcionih faktora, uzvodne elemente, pojačivače i elemente odgovora (pogledati, npr. Lewin, „Genes V“ (Oxford University Press, Oxford) pages 847-873). Primeri regulatornih elemenata u prokariotima uključuju, ali nisu ograničeni na, promotere, sekvence operatera i mesta vezivanja ribozoma. Regulatorni elementi koji se koriste u eukariotskim ćelijama mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, promotere, pojačivače, izolatore, signale spajanja i signale poliadenilacije.

[0331] Poželjno, uređena biblioteka ćelija uključuje racionalno dizajnirane izmene koje su dizajnirane na osnovu predviđanja strukture proteina, eksprimiranja i/ili aktivnosti u određenom tipu ćelije. Na primer, racionalni dizajn može biti zasnovan na biofizičkom modelu uređivanja genoma u celom sistemu sa određenom regulacijom nukleaze i gena kako bi se predvidelo kako različiti parametri uređivanja uključujući eksprimiranje i/ili vezivanje nukleaze, uslove uzgoja i druge eksperimentalne uslove, kolektivno kontrolišu dinamiku uređivanja nukleaze. pogledati, npr. Farasat i Salis, PLoS Comput Biol., 29:12(1):e1004724 (2016).

[0332] U jednom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža kreiranje biblioteke uređenih ćelija sa različitim racionalno dizajniranim regulatornim sekvencama kreiranim korišćenjem instrumenata za automatizovano uređivanje, sistema i postupak pronalaska. Na primer, uređena biblioteka ćelija može uključiti populacije prokariotskih ćelija stvorene korišćenjem skupa konstitutivnih i/ili inducibilnih promotera, sekvenci pojačivača, sekvenci operatera i/ili mesta vezivanja ribozoma. U drugom primeru, uređena biblioteka ćelija može uključiti eukariotske sekvence stvorene korišćenjem skupa konstitutivnih i/ili inducibilnih promotera, sekvenci pojačivača, sekvenci operatora i/ili različitih Kozak sekvenci za eksprimiranje proteina od interesa.

[0333] U nekim aspektima, obelodanjenje pruža biblioteke ćelija koje uključuju ćelije sa racionalno dizajniranim izmenama koje sadrže jednu ili više klasa izmena u sekvencama od interesa u celom genomu organizma. U specifičnim aspektima, obelodanjenje pruža biblioteke ćelija koje uključuju ćelije sa racionalno dizajniranim izmenama koje sadrže jednu ili više klasa izmena u sekvencama od interesa u podskupu genoma. Na primer, biblioteka ćelija može uključivati ćelije sa racionalno dizajniranim izmenama koje sadrže jednu ili više klasa izmena u sekvencama od interesa širom egzoma, npr. svaki ili većina otvorenih okvira za čitanje genoma. Na primer, biblioteka ćelija može uključivati ćelije sa racionalno dizajniranim izmenama koje sadrže jednu ili više klasa izmena u sekvencama od interesa širom kinoma. U još jednom primeru, biblioteka ćelija može uključivati ćelije sa racionalno dizajniranim izmenama koje sadrže jednu ili više klasa izmena u sekvencama od interesa širom sekretoma. U drugim aspektima, biblioteka ćelija može uključivati ćelije sa racionalno dizajniranim izmenama kreiranim za analizu različitih izoforma proteina kodiranih unutar egzoma, i biblioteke ćelija mogu biti dizajnirane da kontrolišu eksprimiranje jedne ili više specifičnih izoforma, na primer, za analizu transkriptoma.

[0334] Važno je da u određenim aspektima biblioteke ćelija mogu da sadrže izmene korišćenjem randomizovanih sekvenci, na primer, randomizovanih sekvenci promotera, kako bi se smanjila sličnost između eksprimiranja jednog ili više proteina u pojedinačnim ćelijama unutar biblioteke. Dodatno, promoteri u biblioteci ćelija mogu biti konstitutivni, inducibilni ili oboje kako bi omogućili jako i/ili titrabilno eksprimiranje.

[0335] U drugim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovane postupke uređivanja, automatizovane instrumente za multi-modularno uređivanje ćelija za kreiranje biblioteke ćelija koja sadrži izmene za identifikaciju optimalnog eksprimiranja odabranog genskog cilja. Na primer, proizvodnja biohemikalija putem metaboličkog inženjeringa često zahteva eksprimiranje enzima puta, i najbolji proizvodni prinosi se ne postižu uvek najvećom količinom enzima ciljanog puta u ćeliji, već pre finim podešavanjem nivoa eksprimiranja pojedinačnih enzima i srodnih regulatornih proteina i/ili puteva. Slično, nivoi eksprimiranja heterolognih proteina ponekad se mogu eksperimentalno podesiti za optimalne prinose.

[0336] Najočigledniji način na koji transkripcija utiče na nivoe eksprimiranja gena je kroz brzinu Pol II inicijacije, koja se može modulirati kombinacijama snage promotera ili pojačivača i faktora transaktivacije (Kadonaga, i dr., Cell, 116(2):247-57 (2004). Kod eukariota, stopa elongacije takođe može odrediti obrasce eksprimiranja gena utičući na alternativno spajanje (Cramer i dr., PNAS USA, 94(21): 11456-60 (1997). Neuspela terminacija na genu može poremetiti eksprimiranje nizvodnih gena smanjenjem pristupačnosti promotera za Pol II (Greger, i dr., 2000 PNAS USA, 97(15):8415-20 (2000). Ovaj proces, poznat kao transkripciona interferencija, posebno je relevantan kod nižih eukariota, jer oni često imaju blisko raspoređene gene.

[0337] U nekim slučajevima, predmetno obelodanjenje pruža postupke za optimizaciju transkripcije ćelijskih gena. Transkripcija gena je rezultat nekoliko različitih bioloških fenomena, uključujući inicijaciju transkripcije (regrutovanje RNKp i formiranje transkripcionog kompleksa), elongaciju (sinteza/produženje lanca) i terminaciju transkripcije (RNKp odvajanje i završetak).

Mesto-specifična mutageneza

[0338] Biblioteke ćelija se mogu kreirati korišćenjem automatizovanih postupaka za uređivanje, modula, instrumenata i sistema koji koriste mesto-specifičnu mutagenezu, tj. kada se sekvenca aminokiselina proteina ili druga genomska karakteristika može promeniti namerno i precizno mutacijom proteina ili genomske karakteristike. Ove ćelijske linije mogu biti korisne za različite svrhe, na primer, za određivanje funkcije proteina unutar ćelija, identifikaciju enzimskih aktivnih mesta unutar ćelija i dizajn novih proteina. Na primer, mesto-specifična mutageneza može se koristiti na multipleksan način za zamenu jedne aminokiseline u sekvenci proteina za drugu amino kiselinu sa različitim hemijskim svojstvima. Ovo omogućava da se odredi efekat racionalno dizajnirane ili nasumično generisane mutacije u pojedinačnim ćelijama unutar populacije ćelija. pogledati, npr. Berg, i dr. Biochemistry, Sixth Ed. (New York: W.H. Freeman and Company) (2007).

[0339] U drugom primeru, izmene se mogu izvršiti na pojedinačnim ćelijama u biblioteci ćelija radi zamene aminokiselina na mestima vezivanja, kao što je supstitucija jedne ili više aminokiselina na mestu vezivanja za protein radi interakcije unutar proteinskog kompleksa ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u enzimskim džepovima koji mogu da prime kofaktor ili ligand. Ova klasa izmena omogućava kreiranje specifičnih manipulacija proteinom za merenje određenih osobina jednog ili više proteina, uključujući interakciju sa drugim kofaktorima, ligandima, itd. unutar proteinskog kompleksa.

[0340] U daljim primerima, različiti tipovi uređivanja se mogu napraviti na pojedinačnim ćelijama unutar biblioteke ćelija korišćenjem mesto-specifične mutageneze za proučavanje lokusa kvantitativnih osobina eksprimiranja (eQTL). eQTL je lokus koji objašnjava delić genetske varijanse fenotipa eksprimiranja gena. Biblioteke pronalaska bi bile korisne za procenu i povezivanje eQTL sa stvarnim bolesnim stanjima.

[0341] U specifičnim aspektima, izmene koje se unose u biblioteke ćelija obelodanjenja mogu biti napravljene korišćenjem racionalnog dizajna zasnovanog na poznatim ili predviđenim strukturama proteina. pogledati, npr. Chronopoulou EG i Labrou, Curr Protoc Protein Sci.; Chapter 26:Unit 26.6 (2011). Takva mesto-specifična mutageneza može da pruži pojedinačnim ćelijama unutar biblioteke jedno ili više mestospecifičnih uređivanja, i poželjno dva ili više mesto-specifičnih uređivanja (npr. kombinatorne izmene) unutar populacije ćelija.

[0342] U drugim aspektima, biblioteke ćelija prema pronalasku su kreirane korišćenjem „skeniranja“ kodonskih mesto-specifičnih mutacija svih ili suštinski svih kodona u kodirajućem regionu gena. Na ovaj način, pojedinačne izmene specifičnih kodona mogu se ispitati za gubitak funkcije ili dobijanje funkcije na

4

osnovu specifičnih polimorfizama u jednom ili više kodona gena. Ove biblioteke mogu biti moćno sredstvo za određivanje koje genetske promene su tihe ili uzročne za određeni fenotip u ćeliji ili populaciji ćelija. Izmene kodona mogu biti generisane nasumično ili mogu biti racionalno dizajnirane na osnovu poznatih polimorfizama i/ili mutacija koje su identifikovane u genu koji se analizira. Štaviše, korišćenje ovih tehnika na dva ili više gena u jednom putu u ćeliji može odrediti potencijalne protein:protein interakcije ili redundancije u ćelijskim funkcijama ili putevima.

[0343] Na primer, skeniranje alanina se može koristiti za određivanje doprinosa specifičnog ostatka stabilnosti ili funkciji datog proteina. pogledati, npr. Lefèvre, i dr., Nucleic Acids Research, Volume 25(2):447-448 (1997). Alanin se često koristi u ovoj tehnici skeniranja kodona zbog svoje neobimne, hemijski inertne, metil funkcionalne grupe koja može da oponaša preferencije sekundarne strukture koje poseduju mnoge druge aminokiseline. Skeniranje kodona se takođe može koristiti da se utvrdi da li bočni lanac specifičnog ostatka igra značajnu ulogu u funkciji i/ili aktivnosti ćelije. Ponekad se druge aminokiseline kao što su valin ili leucin mogu koristiti u stvaranju biblioteka ćelija za skeniranje kodona ako je potrebno očuvanje veličine mutiranih ostataka.

[0344] U drugim specifičnim aspektima, biblioteke ćelija se mogu kreirati korišćenjem automatizovanih postupaka za uređivanje, automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija prema pronalasku kako bi se odredilo aktivno mesto proteina kao što je enzim ili hormon, i kako bi se razjasnio mehanizam delovanja jednog proteina ili više ovih proteina u biblioteci ćelija. Mesto-specifična mutageneza povezana sa studijama molekularnog modeliranja može se koristiti za obelodanjenje strukture aktivnog mesta enzima i posledično njegovog mehanizma delovanja. Analiza ovih biblioteka ćelija može da pruži razumevanje uloge specifičnih aminokiselinskih ostataka na aktivnim mestima proteina, u dodirima između podjedinica proteinskih kompleksa, u intracelularnom prometu i stabilnosti/poluživotu proteina u različitim genetskim sredinama.

Mutageneza zasićenja

[0345] U nekim aspektima, biblioteke ćelija kreirane korišćenjem postupaka automatizovanog uređivanja, automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija predmetnog obelodanjenja, mogu biti zasićene biblioteke mutageneze, u kojima je jedan kodon ili skup kodona nasumično raspoređen da proizvede sve moguće aminokiseline na položaju određenog ili određenih gena od interesa. Ove biblioteke ćelija mogu biti posebno korisne za generisanje varijanti, na primer, za usmerenu evoluciju. Pogledati, npr. Chica, i dr., Current Opinion in Biotechnology 16 (4): 378-384 (2005); i Shivange, Current Opinion in Chemical Biology, 13 (1): 19-25.

[0346] U nekim aspektima, izmene koje sadrže različite degenerisane kodone mogu se koristiti za kodiranje skupova amino kiselina u pojedinačnim ćelijama u bibliotekama. Pošto su neke aminokiseline kodirane sa više kodona od drugih, tačan odnos aminokiselina ne može biti jednak. U određenim aspektima, koriste se ograničeniji degenerisani kodoni. 'NNK' i 'NNS' imaju prednost kodiranja svih 20 aminokiselina, ali i dalje kodiraju stop kodon 3% vremena. Alternativni kodoni kao što su 'NDT', 'DBK' u potpunosti izbegavaju stop kodone i kodiraju minimalni skup aminokiselina koje još uvek obuhvataju sve glavne biofizičke tipove (anjonske, katjonske, alifatične hidrofobne, aromatične hidrofobne, hidrofilne, male).

[0347] U specifičnim aspektima, u procesu uređivanja mutageneze zasićenja koristi se neredundantna mutageneza zasićenja, u kojoj se najčešće korišćen kodon za određeni organizam.

Zamene i lestvice promotera

[0348] Jedan mehanizam za analizu i/ili optimizaciju eksprimiranja jednog ili više gena od interesa je stvaranje biblioteke ćelija „zamene promotera“, u kojoj ćelije sadrže genetske izmene koje imaju specifične promotere povezane sa jednim ili više gena od interesa. Shodno tome, biblioteke ćelija kreirane korišćenjem postupaka, automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija prema pronalasku mogu biti biblioteke ćelija zamene promotera, koje se mogu koristiti, npr., za povećanje ili smanjenje eksprimiranja gena od interesa za optimizaciju metaboličkog ili genetskog puta. U nekim aspektima, biblioteka ćelija zamene promotera može se koristiti za identifikaciju povećanja ili smanjenja eksprimiranja gena koji utiče na vitalnost ili održivost ćelije, na primer, gen koji kodira protein koji utiče na brzinu uzgoja ili ukupno zdravlje ćelija. U nekim aspektima, biblioteka ćelija zamene promotera može da se koristi za kreiranje ćelija koje imaju zavisnosti i logiku između promotera kako bi se stvorile mreže sintetičkih gena. U nekim aspektima, zamene promotera se mogu koristiti za kontrolu ćelija-ćelija komunikacije između ćelija i homogenih i heterogenih (kompleksna tkiva) populacija u prirodi.

[0349] Biblioteke ćelija mogu da koriste bilo koji dati broj promotera koji su grupisani zajedno na osnovu pokazivanja raspona eksprimirajućih snaga i bilo kog datog broja ciljanih gena. Lestvica promoterskih sekvenci varira eksprimiranje najmanje jednog lokusa pod najmanje jednim uslovom. Ova lestvica se zatim sistematski primenjuje na grupu gena u organizmu koristeći automatizovane postupke uređivanja, automatizovane multi-modularne instrumente za uređivanje ćelija predmetnog obelodanjenja.

[0350] U specifičnim aspektima, biblioteka ćelija formirana korišćenjem procesa automatizovanog uređivanja, modula i sistema predmetnog obelodanjenja uključuje pojedinačne ćelije koje su reprezentativne za dati promoter koji je operativno povezan sa jednim ili više ciljanih gena od interesa u inače identičnoj genetskoj pozadini. Primeri neautomatizovanih strategija uređivanja koje se mogu modifikovati kako bi se koristili automatizovani sistemi mogu se naći u, npr. SAD patentu br.9,988,624.

[0351] U specifičnim aspektima, biblioteka ćelija zamene promotera proizvodi se uređivanjem skupa ciljanih gena koji će biti operativno povezani sa unapred odabranim skupom promotera koji deluju kao „lestvice promotera“ za eksprimiranje gena od interesa. Na primer, ćelije se uređuju tako da se jedan ili više pojedinačnih gena od interesa uređuju da budu operativno povezani sa različitim promoterima u lestvici promotera. Kada endogeni promoter ne postoji, njegova sekvenca nije poznata, ili je prethodno promenjena na neki način, pojedinačni promoteri lestvice promotera mogu se ubaciti ispred gena od interesa. Ove proizvedene biblioteke ćelija imaju pojedinačne ćelije sa pojedinačnim promoterom lestvice koji je operativno povezan sa jednim ili više ciljanih gena u inače identičnom genetskom kontekstu.

[0352] Promoteri se generalno biraju tako da rezultuju promenljivim eksprimiranjem u različitim lokusima, i mogu uključivati inducibilne promotere, konstitutivne promotere ili oboje.

[0353] Skup ciljanih gena uređenih pomoću lestvice promotera može uključiti sve ili većinu otvorenih okvira čitanja (ORF) u genomu, ili odabrani podskup genoma, npr. ORF od kinoma ili sekretoma. U nekim aspektima, ciljani geni mogu uključiti kodirajuće regione za različite izoforme gena, i biblioteke ćelija mogu biti dizajnirane za eksprimiranje jednu ili više specifičnih izoforma, na primer, za analizu transkriptoma korišćenjem različitih promotera.

[0354] Skup ciljanih gena takođe mogu biti geni za koje se zna ili se sumnja da su uključeni u određeni ćelijski put, npr. regulatorni put ili signalni put. Skup ciljanih gena može biti ORF koji se odnosi na funkciju, u odnosu na prethodno demonstrirane korisne izmene (prethodne zamene promotera ili prethodne zamene SNP), algoritamskim odabirom zasnovanim na epistatičkim interakcijama između prethodno generisanih izmena, drugim kriterijumima odabira zasnovanim na hipotezama u vezi sa korisnim ORF za cilj, ili putem slučajnog odabira. U specifičnim otelotvorenjima, ciljani geni mogu da sadrže gene koji ne kodiraju proteine, uključujući nekodirajuće RNK.

[0355] Uređivanje drugih funkcionalnih genetskih elemenata, uključujući elemente izolatora i druge elemente genomske organizacije, takođe može da se koristi za sistematsko variranje nivoa eksprimiranja skupa ciljanih gena, i može se uvesti korišćenjem postupaka, automatizovanih multi-modularnih instrumenata za uređivanje ćelija predmetnog obelodanjenja. U jednom aspektu, populacija ćelija se uređuje korišćenjem lestvice sekvenci pojačivača, bilo samih ili u kombinaciji sa odabranim promoterima ili lestvicom promotera, kako bi se stvorila biblioteka ćelija koja ima različite izmene u ovim elementima pojačivača. U drugom aspektu, populacija ćelija je uređena korišćenjem lestvice sekvenci vezivanja ribozoma, bilo samih ili u kombinaciji sa odabranim promoterima ili lestvicama promotera, kako bi se stvorila biblioteka ćelija koja ima različite izmene u ovim sekvencama vezivanja ribozoma.

[0356] U drugom aspektu, populacija ćelija je uređena kako bi se omogućilo vezivanje različitih mRNK i/ili sekvenci koje stabilizuju ili destabilizuju proteine na 5' ili 3' kraju, ili na bilo kojoj drugoj lokaciji, transkripta ili proteina.

[0357] U određenim aspektima, populacija ćelija prethodno uspostavljene ćelijske linije može se uređivati korišćenjem automatizovanih postupaka za uređivanje, modula, instrumenata i sistema predmetnog obelodanjenja kako bi se kreirala biblioteka ćelija za poboljšanje funkcije, zdravlja i/ili održivosti ćelija. Na primer, mnogi industrijski sojevi koji se trenutno koriste za proizvodnju velikih razmera su razvijeni korišćenjem procesa nasumične mutageneze iterativno tokom perioda od mnogo godina, ponekad decenija. Neželjene neutralne i štetne mutacije su uvedene u sojeve zajedno sa korisnim promenama, i tokom vremena to je rezultovalo sojevima sa nedostatkom ukupne robusnosti i ključnim osobinama kao što su stope uzgoja. U drugom primeru, ćelijske linije sisara nastavljaju da mutiraju kroz prolazak ćelija tokom perioda vremena, i na sličan način ove ćelijske linije mogu postati nestabilne i dobiti osobine koje su nepoželjne. Postupci automatizovanog uređivanja, automatizovani multi-modularni instrumenti za uređivanje ćelija predmetnog obelodanjenja mogu koristiti strategije uređivanja kao što su SNP i/ili STR zamena, kreiranje indela ili druge tehnike za uklanjanje ili promenu neželjenih sekvenci genoma i/ili uvođenje novih sekvenci genoma kako bi se otklonili nedostaci uz zadržavanje poželjnih svojstava ćelija.

[0358] Kada se koristi rekurzivno uređivanje, uređivanje u pojedinačnim ćelijama u biblioteci uređenih ćelija može uključiti uključivanje „mesta za sletanje“ na ektopičnom mestu u genomu (npr. CarT lokus) radi optimizacije eksprimiranja, stabilnosti i/ili kontrole.

[0359] U nekim slučajevima, svaka proizvedena biblioteka koja sadrži pojedinačne ćelije koje sadrže jedno ili više uređivanja (bilo uvođenje ili uklanjanje) kultiviše se i analizira prema jednom ili više kriterijuma (npr. proizvodnja hemikalije ili proizvoda od interesa). Ćelije koje poseduju specifične kriterijume se zatim povezuju, ili dovode u korelaciju, sa jednim ili više određenih uređivanja u ćeliji. Na ovaj način se može odrediti efekat date izmene na bilo koji broj genetskih ili fenotipskih osobina od interesa. Identifikacija višestrukih uređivanja povezanih sa konkretnim kriterijumima ili poboljšanom funkcionalnošću/robustnošću može dovesti do ćelija sa veoma poželjnim karakteristikama.

Knock-out ili knock-in biblioteke

[0360] U određenim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovane postupke za uređivanje, module, instrumente i sisteme za kreiranje biblioteke ćelija koje imaju „knock-out“ (KO) ili „knock-in“ (KI) uređivanja različitih gena od interesa. Dakle, obelodanjenje ima za cilj da pokrije biblioteke uređenih ćelija stvorene automatizovanim postupcima uređivanja, automatizovanim multi-modulranim instrumentim za uređivanje ćelija u skladu sa obelodanjenjem koji imaju jednu ili više mutacija koje uklanjaju ili smanjuju eksprimiranje odabranih gena od interesa za ispitivanje efekta ove izmene o funkcionisanju gena u pojedinačnim ćelijama unutar biblioteke ćelija.

[0361] biblioteke ćelija se mogu kreirati korišćenjem ciljanog gena KO (npr. putem umetanja/brisanja) ili KO (npr. putem homologijom-usmerene popravke). Na primer, prekidi dvostrukog lanca se često popravljaju preko nehomolognog kraja koji spaja put popravke DNK. Poznato je da je popravka sklona greškama, pa se stoga mogu uvesti umetanja i brisanja koja mogu poremetiti funkciju gena. Poželjno je da su izmene racionalno osmišljene da specifično utiču na gene od interesa, i pojedinačne ćelije mogu biti stvorene sa KI ili KI jednog ili više lokusa od interesa. Ćelije koje imaju KO ili KI od dva ili više lokusa od interesa mogu se kreirati korišćenjem automatizovanog rekurzivnog uređivanja obelodanjenja.

[0362] U specifičnim aspektima, KO ili KI biblioteke ćelija se kreiraju korišćenjem simultanog multipleksnog uređivanja ćelija unutar populacije ćelija, i više ćelija u populaciji ćelija se uređuju u jednom krugu uređivanja, tj. višestrukim promenama u ćelijama biblioteke ćelija u jednoj automatizovanoj operaciji. U drugim specifičnim aspektima, biblioteke ćelija se kreiraju korišćenjem rekurzivnog uređivanja pojedinačnih ćelija unutar populacije ćelija, i rezultuju spajanjem višestrukih izmena dva ili više mesta u genomu u pojedinačne ćelije.

Zamene SNP ili kratkih tandemskih ponavljanja

[0363] U jednom aspektu, biblioteke ćelija se kreiraju korišćenjem automatizovanih postupaka za uređivanje, automatizovanih instrumenata za multi-modularno uređivanje ćelija predmetnog obelodanjenja sistematskim uvođenjem ili zamenom polimorfizama pojedinačnih nukleotida („SNP“) u genome pojedinačnih ćelija kako bi se stvorila biblioteka ćelija „zamene SNP“. U nekim otelotvorenjima, postupci zamene SNP prema predmetnom pronalasku uključuju i dodavanje korisnih SNP i uklanjanje štetnih i/ili neutralnih SNP.

Zamene SNP mogu ciljati kodirajuće sekvence, nekodirajuće sekvence ili oboje.

[0364] U drugom aspektu, biblioteka ćelija se kreira korišćenjem postupaka automatizovanog uređivanja, modula, instrumenata, instrumenata i sistema obelodanjenja sistematskim uvođenjem ili zamenom kratkih tandemskih ponavljanja („STR“) u genome pojedinačnih ćelija kako bi se stvorila biblioteka ćelija „zamene STR“. U nekim otelotvorenjima, postupci zamene STR prema predmetnom obelodanjenju uključuju i dodavanje korisnih STR i uklanjanje štetnih i/ili neutralnih STR. Zamene STR mogu ciljati kodirajuće sekvence, nekodirajuće sekvence ili oboje.

[0365] U nekim slučajevima, zamena SNP i/ili STR koja se koristi za kreiranje biblioteke ćelija je multipleksna, i više ćelija unutar populacije ćelija se uređuju u jednom krugu uređivanja, tj. višestruke promene unutar ćelija biblioteke ćelija u jednoj automatizovanoj operaciji. U drugim slučajevima, zamena SNP i/ili STR koja se koristi za kreiranje biblioteke ćelija je rekurzivna i rezultuje spajanjem višestrukih korisnih sekvenci i/ili uklanjanjem štetnih sekvenci u pojedinačnim ćelijama. Višestruke promene mogu biti ili određeni skup definisanih promena ili delimično randomizovana, kombinatorna biblioteka mutacija. Uklanjanje štetnih mutacija i konsolidacija korisnih mutacija može pružiti trenutna poboljšanja u različitim ćelijskim procesima. Uklanjanje genetskog opterećenja ili konsolidacija korisnih promena u soj bez genetskog opterećenja takođe pruža novu, robusnu polaznu tačku za dodatnu nasumične mutageneze koja može omogućiti dalja poboljšanja.

[0366] Zamena SNP prevazilazi fundamentalna ograničenja pristupa nasumične mutageneze jer to nije slučajni pristup, već sistematsko uvođenje ili uklanjanje pojedinačnih mutacija kroz ćelije.

Uređivanje mesta splajsovanja

[0367] Splajsovanje RNK je proces tokom kog se introni izrezuju a eksoni spajaju kako bi se stvorila mRNK koja se prevodi u protein. Precizno prepoznavanje signala spajanja od strane ćelijske mašinerije je ključno za ovaj proces. Shodno tome, u nekim aspektima, populacija ćelija je uređena korišćenjem sistematskog uređivanja poznatih i/ili predviđenih mesta donora i/ili akceptora splajsovanja u različitim lokusima kako bi se stvorila biblioteka varijanti mesta splajsovanja različitih gena. Takvo uređivanje može pomoći da se razjasni biološka relevantnost različitih izoformi gena u ćelijskom kontekstu. Sekvence za racionalni dizajn mesta spajanja različitih regiona kodiranja, uključujući stvarne ili predviđene mutacije povezane sa različitim poremećajima kod sisara, mogu se predvideti korišćenjem tehnika analize kao što su one koje se nalaze kod Nalla i Rogan, Hum Mutat, 25:334-342 (2005); Divina, i dr., Eur J Hum Genet, 17:759-765 (2009); Desmet, et el., Nucleic Acids Res, 37:e67 (2009); Faber, i dr., BMC Bioinformatics, 12(suppl 4):S2 (2011).

Razmene start/stop kodona i ugradnja analoga nukleinskih kiselina

[0368] U nekim aspektima, predmetno obelodanjenje predviđa kreiranje biblioteka ćelija korišćenjem automatizovanih postupaka za uređivanje, modula, instrumenata i sistema obelodanjenja, gde se biblioteke kreiraju zamenom varijanti start i stop kodona u celom genomu organizma ili za odabrani podskup kodirajućih regiona u genomu, npr. kinomom ili sekretom. U biblioteci ćelija, pojedinačne ćelije će imati jedan ili više start ili stop kodona koji zamenjuju prirodni start ili stop kodon za jedan ili više gena od interesa.

[0369] Na primer, tipični start kodoni koje koriste eukarioti su ATG (AUG), a prokarioti najviše koriste ATG (AUG), zatim GTG (GUG) i TTG (UUG). Biblioteka ćelija može uključivati pojedinačne ćelije koje imaju supstitucije za prirodne start kodone za jedan ili više gena od interesa.

[0370] U nekim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom start kodona ATG sa TTG ispred odabranih gena od interesa. U drugim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom ATG start kodona sa GTG. U drugim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom GTG start kodona sa ATG. U drugim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom GTG start kodona sa TTG. U drugim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom TTG start kodona sa ATG. U drugim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom TTG start kodona sa GTG.

[0371] U drugim primerima, tipični stop kodoni za S. cerevisiae i sisare su TAA (UAA) i TGA (UGA), respektivno. Tipičan stop kodon za monokotiledonske biljke je TGA (UGA), dok insekti i E. coli obično koriste TAA (UAA) kao stop kodon (Dalphin. i dr., Nucl. Acids Res., 24: 216-218 (1996)). Biblioteka ćelija može uključivati pojedinačne ćelije koje imaju supstitucije za prirodne stop kodone za jedan ili više gena od interesa.

[0372] U nekim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom TAA stop kodona sa TAG. U drugim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom TAA stop kodona sa TGA. U drugim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom TGA stop kodona sa TAA. U drugim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom TGA stop kodona sa TAG. U drugim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom TAG stop kodona sa TAA. U drugim aspektima, ovaj pronalazak podučava automatizovano kreiranje biblioteke ćelija zamenom TAG stop kodona sa TGA.

Zamene i lestvice terminatora

[0373] Jedan mehanizam za identifikaciju optimalne terminacije prethodno splajsovanog mRNK od jednog ili više gena od interesa je stvaranje biblioteke ćelija „zamene terminatora“, u kojoj ćelije sadrže genetske izmene koje imaju specifične terminatorske sekvence povezane sa jednim ili više gena od interesa. Shodno tome, biblioteke ćelija kreirane korišćenjem postupaka, modula, instrumenata i sistema predmetnog obelodanjenja mogu biti zamene terminatorskih ćelija, koje se mogu koristiti, na primer, da utiču na stabilnost mRNK oslobađanjem transkripata sa mesta sinteze. U drugim otelotvorenjima, biblioteka ćelija zamene terminatora može da se koristi za identifikaciju povećanja ili smanjenja efikasnosti transkripcione terminacije, i time i akumulacije nevezane pre-mRNK (npr. West i Proudfoot, Mol Cell.; 33(3-9); 354-364 (2009) i/ili obrada 3' kraja (npr., West, i dr., Mol Cell.29(5):600-10 (2008)). U slučaju kada je gen povezan sa više mesta terminacije, uređivanja mogu da uređuju kombinaciju uređivanja više terminatora koji su povezani sa genom. Dodatne aminokiseline se takođe mogu dodati na krajeve proteina kako bi se odredio efekat na dužinu proteina na terminatore.

[0374] Biblioteke ćelija mogu da koriste bilo koji broj izmena terminatora koji su izabrani za lestvicu terminatora na osnovu ispoljavanja niza aktivnosti i bilo kog datog broja ciljanih gena. Lestvica terminatorskih sekvenci varira eksprimiranje najmanje jednog lokusa pod najmanje jednim uslovom. Ova lestvica se zatim sistematski primenjuje na grupu gena u organizmu koristeći automatizovane postupke uređivanja, module, instrumente i sisteme obelodanjenja.

[0375] U nekim aspektima, predmetno obelodanjenje predviđa kreiranje biblioteka ćelija korišćenjem postupaka automatizovanog uređivanja, modula, instrumenata i sistema obelodanjenja, gde su biblioteke kreirane da uređuju signale terminatora u jednom ili više regiona u genomu u pojedinačnim ćelijama biblioteke. Transkripciona terminacija kod eukariota funkcioniše preko signala terminatora koje prepoznaju proteinski faktori povezani sa RNK polimerazom II. Na primer, biblioteka ćelija može da sadrži pojedinačne eukariotske ćelije sa izmenama u genima koji kodiraju faktor specifičnosti poliadenilacije (CPSF) i faktor stimulacije razdvajanja (CstF) i/ili proteine koji kodiraju gen regrutovane od strane CPSF i CstF faktora za mesta terminacije. Kod prokariota, dva glavna mehanizma, nazvana Rho-nezavisna i Rho-zavisna terminacija, posreduju u terminaciji transkripcije. Na primer, biblioteka ćelija može da sadrži pojedinačne prokariotske ćelije sa uređivanjima u genima koji kodiraju proteine koji utiču na vezivanje, efikasnost i/ili aktivnost ovih terminalnih puteva.

[0376] U određenim aspektima, predmetno obelodanjenje pruža postupke odabira terminacionih sekvenci („terminatora“) sa optimalnim svojstvima. Na primer, u nekim otelotvorenjima, predmetno obelodanjenje pruža postupke za uvođenje i/ili uređivanje jednog ili više terminatora i/ili generisanje varijanti jednog ili više terminatora unutar ćelije domaćina, koji pokazuju raspon aktivnosti. Određena kombinacija terminatora može se grupisati zajedno kao lestvica terminatora, i biblioteke ćelija predmetnog obelodanjenja uključuju pojedinačne ćelije koje su reprezentativne za terminatore koji su operativno povezani sa jednim ili više ciljanih gena od interesa u inače identičnoj genetskoj pozadini. Primeri neautomatizovanih strategija za uređivanje koje se mogu modifikovati kako bi se koristili automatizovani instrumenti mogu se naći u, npr. SAD patentima br.9,988,624 od Serber i dr., pod nazivom „Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform“.

[0377] U specifičnim aspektima, biblioteka ćelija zamene terminatora se proizvodi uređivanjem skupa ciljanih gena koji će biti operativno povezani sa unapred odabranim skupom terminatora koji deluju kao „lestvica terminatora“ za eksprimiranje gena od interesa. Na primer, ćelije se uređuju tako da je endogeni promoter operativno povezan sa pojedinačnim genima od interesa, uređuju se sa različitim promoterima u lestvici promotera. Kada endogeni promoter ne postoji, njegova sekvenca je nepoznata ili je prethodno na neki način promenjena, pojedinačni promoteri lestvice promotera mogu se umetnuti ispred gena od interesa. Ove proizvedene biblioteke ćelija imaju pojedinačne ćelije sa pojedinačnim promoterom lestvice koji je operativno povezan sa jednim ili više ciljanih gena u inače identičnom genetskom kontekstu. Lestvica terminatora o kojoj je reč je tada povezana sa datim genom od interesa.

[0378] Lestvica terminatora se može koristiti da se uopštenije utiče na terminaciju svih ili većine ORF u genomu, ili odabranog podskupa genoma, na primer, ORF od kinoma ili sekretoma. Skup ciljanih gena takođe mogu biti geni za koje se zna ili se sumnja da su uključeni u određeni ćelijski put, npr. regulatorni put ili signalni put. Skup ciljanih gena može biti ORF koji se odnosi na funkciju, u odnosu na prethodno demonstrirana korisna uređivanja (prethodne zamene promotera ili prethodne zamene SNP), algoritamskim odabirom zasnovanim na epistatičkim interakcijama između prethodno generisanih izmena, drugim kriterijumima odabira zasnovanim na hipotezama u vezi sa korisnim ORF. za ciljanje, ili putem slučajnog odabira. U specifičnim otelotvorenjima, ciljani geni mogu da sadrže gene koji ne kodiraju proteine, uključujući nekodirajuće RNK.

Claims

Patentni zahtevi

1. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija koji se sastoji od:

kućišta (100) konfigurisanog za smeštaj svih ili nekih modula;

posude (626a) konfigurisane za prijem ćelija;

jedne ili više posuda (626b) konfigurisanih za prijem nukleinskih kiselina;

modula za transformaciju (110c) konfigurisanog da uvede nukleinske kiseline u ćelije; modula za oporavak (110a, 110b) konfigurisanog za prijem ćelija iz modula za transformaciju i da omogući ćelijama da se oporave nakon transformacije ćelije u modulu za transformaciju; modula za nukleazom-usmereno uređivanje (922) konfigurisanog da omogući uvedenim nukleinskim kiselinama da uređuju nukleinske kiseline u ćelijama; i

procesora (126) konfigurisanog da upravlja automatizovanim multi-modularnim instrumentom za uređivanje ćelija na osnovu korisničkog unosa i/ili izbora unapred programirane računarske rutine;

robotskog sistema za rukovanje (108) za premeštanje materijala do ili između modula; koji se sastoji od automatizovanog sistema za rukovanje tečnostima (120) za premeštanje tečnosti direktno bez intervencije korisnika iz jednog od modula za oporavak, modula za transformaciju ili modula za nukleazom-usmereno uređivanje u drugi modul za oporavak, modul za transformaciju ili modul za nukleazom-usmereno uređivanje.

2. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 1, gde nukleinske kiseline u jednoj ili više posuda obuhvataju kičmu i kasetu za uređivanje, a automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija dalje sadrži modul za sastavljanje nukleinskih kiselina.

3. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 1, gde automatizovani sistem za rukovanje tečnošću sadrži kapalicu (518) ili pipetor.

4. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 2, gde je modul za sastavljanje nukleinske kiseline (400) konfigurisan da izvodi izotermno sastavljanje nukleinske kiseline.

5. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 1, gde su modul za uređivanje i modul za oporavak kombinovani u jedan modul.

6. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 1, koji dalje sadrži modul za uzgoj (850) konfigurisan da uzgaja ćelije, opciono gde modul za uzgoj meri optičku gustinu ćelija koje se uzgajaju, opciono gde je modul za uzgoj konfigurisan da meri optičku gustinu ćelija koje se kontinuirano uzgajaju.

7. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 6, gde je procesor konfigurisan da prilagodi uslove uzgoja u modulu za uzgoj tako da ćelije dostignu ciljanu optičku gustinu za vreme koje zahteva korisnik.

8. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 1, gde se posuda konfigurisana za prijem ćelija i jedna ili više posuda konfigurisanih za prijem nukleinskih kiselina nalaze u kertridžu za reagens (104), opciono gde se neki ili svi reagensi potrebni za uređivanje ćelija se primaju putem kertridža za reagens.

9. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 8, gde se reagensi sadržani u kertridžu za reagens mogu locirati pomoću računarske rutine koju čita procesor.

10. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 9, gde kertridž za reagens uključuje reagense i pružen je u kompletu.

11. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 1, gde modul za transformaciju sadrži uređaj za elektroporaciju (500), opciono gde uređaj za elektroporaciju jeste uređaj za protočnu elektroporaciju.

12. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 1, koji dalje sadrži modul za filtriranje (700) konfigurisan da koncentriše ćelije i učini ćelije elektrokompetentnim.

13. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 1, koji se dalje sastoji od:

modula za sastavljanje nukleinske kiseline konfigurisanog za sastavljanje kičme i kasete za uređivanje, gde je modul za sastavljanje nukleinske kiseline konfigurisan da prihvata i sastavlja nukleinske kiseline kako bi omogućio željene događaje uređivanja genoma u ćelijama; i modula za uzgoj konfigurisanog da uzgaja ćelije;

i gde:

modul za transformaciju sadrži elektroporator za uvođenje sastavljenih nukleinskih kiselina u ćelije; i

automatizovani sistem za rukovanje tečnostima bez intervencije korisnika premešta tečnosti direktno iz jednog od modula za sastavljanje nukleinske kiseline, modula za transformaciju ili modula za nukleazom-usmereno uređivanje u drugi modul za sastavljanje nukleinske kiseline, modul za transformaciju ili modul za nukleazom-usmereno uređivanje.

14. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 1, koji dalje sadrži najmanje jedan kertridž za reagens koji sadrži reagense za izvođenje uređivanja ćelija u automatizovanom multi-modularnom instrumentu za uređivanje ćelija, opciono gde su posude za ćelije i nukleinske kiseline raspoređene unutar kertridža za reagens.

15. Automatizovani multi-modularni instrument za uređivanje ćelija prema patentnom zahtevu 1, koji se dalje sastoji od:

modula za sastavljanje nukleinske kiseline konfigurisanog za a) sastavljanje kičme i kasete za uređivanje, i b) desalinifikaciju sastavljenih nukleinskih kiselina nakon sastavljanja; modula za uzgoj konfigurisanog da uzgaja ćelije;

modula za filtriranje konfigurisanog da koncentriše ćelije i učini ćelije elektrokompetentnim; i kombinovanog modul za oporavak i nukleazom-usmereno uređivanje koji je konfigurisan da omogući ćelijama da se oporave nakon elektroporacije u modulu za transformaciju i da omogući nukleinskim kiselinama da uređuju ćelije;

i gde:

modul za transformaciju sadrži protočni elektroporator za uvođenje sastavljenih nukleinskih kiselina u ćelije; i

automatizovani sistem za rukovanje tečnostima premešta tečnosti direktno bez intervencije korisnika iz jednog od modula za uzgoj, modula za filtriranje, modula za transformaciju ili modula za kombinovani oporavak i nukleazom-usmereno uređivanje u drugi modul za uzgoj, modul za filtriranje, modul za transformaciju ili modul za kombinovani oporavak i nukleazom-usmereno uređivanje.