JPH07503132A - 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物 - Google Patents

異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物

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JPH07503132A JP5511191A JP51119193A JPH07503132A JP H07503132 A JPH07503132 A JP H07503132A JP 5511191 A JP5511191 A JP 5511191A JP 51119193 A JP51119193 A JP 51119193A JP H07503132 A JPH07503132 A JP H07503132A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 異種抗体を産生ずることができるトランスジェニック非ヒト動物技術分野 本発明は、異種抗体を産生ずることができるトランスジェニック非ヒト動物、そ のようなトランスジェニック動物を産生ずるのに使うトランスジエン（ｔｒａｎ ｓｇｅｎｅ）　、Ｖ　−Ｄ　−Ｊ組換えにおいて異種り遺伝子を機能的に再配列 させることのできるトランスジエン、異種抗体を産生ずることのできる不死化Ｂ 細胞、多数のイソタイプの異種抗体を産生せしめる方法およびそのためのトラン スジエン、内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現を不活性化または抑０制する方 法およびそのためのトランスジエン、生殖細胞系列の再配列された可変領域配列 に比較すると可変領域配列が体細胞変異を含んで成る異種抗体を産生せしめる方 法およびそのためのトランスジエン、並びにヒトー次配列を有する抗体を産生じ 且つヒト抗原に結合するトランスジェニック非ヒト動物に関する。
発明の背景 ヒトにおけるモノクローナル抗体の生体内治療および診断用途の開発に直面する 主な障害の１つは、非ヒト免疫グロブリンの本質的免疫原性である。例えば、免 疫寛容性のヒト患者に治療量の語歯類モノクローナル抗体を投与すると、患者は 藁歯類免疫グロブリン配列に対して抗体を産生じ、それらのヒト抗マウス抗体（ ＨＡＭＡ）は治療抗体を中和し、急性毒性を引き起こし得る。よって、前型な治 療および／または診断上の標的である特異的ヒト抗体と反応性であるヒト免疫グ ロブリンを作製することが望ましい。
モノクローナル抗体を作製するための現在の技術は、動物（通常はラットまたは マウス）を抗原に予備暴露するか、または抗原で感作せしめ、該動物からＢ細胞 を収得し、そしてハイブリドーマクローンのライブラリーを作製することを伴う 。ハイブリドーマ集団を抗原結合特異性（イディオタイプ）についてスクリーニ ングし、更に免疫グロブリンクラス（イソタイプ）についてもスクリーニングす ることにより、所望の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択することが 可能である。
しかしながら、モノクローナル抗体を作製する現行法を、ヒト抗原に対して結合 特異性を有するヒト抗体を産生せしめる目的に適用すると、ヒトは典型的には自 己抗原に対しては免疫応答を生じないであろうから、ヒト免疫グロブリンを産生 ずるＢリンパ球を得ることは深刻な妨げになる。
よって、ヒト抗原と特異的に反応するヒトモノクローナル抗体を作製する現行法 は明らかに不十分である。ハイブリドーマを作製するためのＢ細胞源として非ヒ ト種を使用する場合にも、真の自己抗原に対するモノクローナル抗体を作製する ことに同じ制限か当てはまる。
機能的異種免疫グロブリントランスジエンを含有するトランスジェニック動物の 作製は、自己抗原と反応する抗体を産生させることができる方法である。しかし ながら、療法上有用な抗体の発現、またはそのような抗体を産生ずるハイブリド ーマクローンを得るためには、トランスジェニック動物がＢリンパ球発生過程を 経て成熟することのできるトランスジェニックＢ細胞を産生じなければならない 。そのような成熟はトランスジェニックＢ細胞上の表面１ｇＭの存在を必要とす るか、療法利用には１ｇＭ以外のイソタイプが所望される。よって、機能的Ｖ− Ｄ−Ｊ再配列を受けて組換え多様性と接合多様性を生じることのできるトランス ジエンおよびそのようなトランスジエンを有する動物が要求される。更に、その ようなトランスジエンとトランスジェニック動物は、好ましくは、Ｂ細胞成熟に 必要とされる第一のイソタイプから優れた療法的効用を存する次なるイソタイプ へのイソタイプ転換を促進するシス作用性配列を含有する。
多数の実験は、Ｉｇｇ伝子再配列に必要な特異的ＤＮＡ配列を決定するためのト ランスフェクトされた細胞系の使用を報告している（ＬｅｗｉｓおよびＧｅ１ｌ ｅｒｔ　（１９８９）、　Ｃｅ１ｌ、　５９．５８５−５８８　）　、そのよう な報告は推定上の配列を同定し、そして再配列に使う組換え酵素へのそれらの配 列の近づきやすさくａｃｃｅｓｉｂｉｌｉｔｙ）が転写により変更されると結論 づけている（ＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓおよびＡｌｔ　（１９８５）、　Ｃｅ１ｌ 、　４０゜２７１−２８１　）。Ｖ　（Ｄ）Ｊ結合のための配列は、報告によれ ば、高度に保存されたほぼ回文式のヘプタマーと、１２または２３　ｂｐのいず れかのスペーサーにより隔てられたあまり保存されていない高ＡＴすられるとこ ろによれば、異なる長さのスペーサー領域を有する組換えシグナル配列を含む部 位の間でのみ起こる。
１ｇ遺遺伝子再刊は、組織培養細胞において研究されているが、トランスジェニ ックマウスでは詳しく研究されていない。マウス中に導入された再配列試験構成 物を記載している少数の報告が発表されているに過ぎないＣＢｕｃｈｉｎｉ　ら 、Ｎａｔｕｒｅ、　３２６：　４０９−４１１　（１９８７）（再配列されてい ないニワトリストランスジエン）　；　Ｇｏｏｄｈａｒｔら、ト重鎖）〕。しか しながら、そのような実験の結果は変動的であり、場合によって、トランスジエ ンの不完全なまたは最小の再配列を生じることがある。
更に、分子のＦｃ部分により抗体分子の多様な生物学的機能、例えばＦｃεを介 したマスト細胞または好塩基球との相互作用、およびＦｃμまたはＦｃγによる 補体の結合、が発揮され、イソタイプの変化により特定の特異性を有する機能的 に多様な抗体を生成せしめることか更に望ましい。
異種抗体の１または複数の鎖をコードするトランスジエンを含むトランスジェニ ック動物は作製されているけれども、好結果のイソタイプスイッチを受ける異種 トランスジエンについての報告は全くない。イソタイプをスイッチすることので きないトランスジェニック動物は単一のイソタイプの異種抗体を産生ずるものに 限定され、より詳しくは、Ｂ細胞成熟に不可欠であるイソタイプ、例えばＩｇＭ とおそら＜ＩｇＤを産生するものに限定され、それらの抗体は療法的効用が限定 され得る。
上記に基づくと、第二の種において産生される第一の種の遺伝子配列によってコ ードされる異種抗体を効率的に産生せしめる方法に対する要求が存在することは 明らかである。より詳しくは、組換え多様性に貢献するＤセグメントの全部また は一部を含む機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子再配列を受けることができる異種免疫グロ ブリントランスジエンおよびトランスジェニック動物に対する要求が当業界に存 在する。更に、（１）機能的なり細胞発達が起こり、そして（２）療法上有用な 異種抗体が産生されるようにＶ−Ｄ−Ｊ組換えとイソタイプスイッチングを支え ることかできるトランスジエンおよびトランスジェニック動物に対する要求か当 業界に存在する。抗体が設計される特定の種において療法または診断用のモノク ローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造することができるＢ細胞源に対す る要求も存在する。機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよび／またはイソタイプスイッチ ングを受けることができる異種免疫グロブリントランスジエンはそれらの要求を 満たすことができる。
上記目的に従って、異種抗体、例えばヒト抗体、を産生ずることができるトラン スジェニック非ヒト動物が提供される。
更に、異種抗体を発現することができるそのようなトランスジェニック動物から のＢ細胞であって、特定抗原に特異的なモノクローナル抗体の源を提供するため に不死化されている前記Ｂ細胞を提供することか本発明の目的である。
この上記目的に従って、そのような異種モノクローナル抗体を産生ずることがで きるハイブリドーマ細胞を提供することが本発明の更なる目的である。
更にまた、上述の非ヒトトランスジェニック動物の製造に有用な再配列されてい ないおよび再配列された異種免疫グロブリン重鎮および軽鎖トランスジエンを提 供することが本発明の目的である。
更にまた、トランスジェニック動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊す る方法を提供することが本発明の目的である。
更にまた、上述のトランスジェニック非ヒト動物において異種抗体産生を誘導す る方法を提供することが本発明の目的である。
本発明の更なる目的は、本発明の１または複数のトランスジエンを作製するため に使われる免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントレパートリ−を作製する方 法を提供することである。
上記の参考文献は、単に本出願の出願口より前のそれらの開示のために提供され る。本発明者らが先行発明によってそのような開示より以前は権利かないと認め ることと解釈してはならない。
発明の要約 異種抗体、例えばヒト抗体を産生ずることのできるトランスジェニック非ヒト動 物が提供される。そのような異種抗体は、［ｇＧｌ。
ＩｇＧ２．　ＩｇＧ３．１ｇＧ４．１ｇＭ、　ＩｇＡｌ、　１ｇＡ２．　ＩｇＡ 、、ｃ、　ＩｇＤまたはＩｇＥを含む様々なイソタイプのものであることができ る。そのようなトランスジェニック非ヒト動物が免疫応答を行うには、Ｂ細胞の 発達と抗原刺激成熟を果たすためにトランスジェニックＢ細胞および前Ｂ細胞が 表面結合型免疫グロブリン、特にＩｇＭ　（ことによるとＩｇＤ）イソタイプの ものを産生ずることが必要である。そのようなＩｇＭ　（またはＩｇＤ）表面結 合型免疫グロブリンの発現はＢ細胞発達の抗原刺激成熟期の間にのみ要求され、 一時期には一回スイッチしたイソタイプだけが産生されるが、成熟Ｂ細胞は他の イソタイプを産生し得る。
典型的には、Ｂ細胞系統の細胞は一時期に単一のイソタイプだけを産生ずるだろ うが、μ、（分泌型μ）およびμＭ　（膜結合型μ）型、並びにμおよびδ免疫 グロブリン鎖で天然に起こるような、シスまたはトランス二者択−ＲＮＡスプラ イシングは、単一細胞による複数のイソタイプの同時代発現をもたらし得る。従 って、複数のイソタイプの異種抗体、特に療法上有用なＩｇＧ、　ＩｇＡおよび １ｇＭイソタイプの異種抗体を産生せしめるためには、イソタイプスイッチング が起こることが必要である。そのようなイソタイプスイッチングは古典的クラス スイッチであってもよく、またはｌもしくは複数の非古典的イソタイプスイッチ 機構から生じてもよい。
本発明は、異種免疫グロブリントランスジエンおよびそのようなトランスジエン を有するトランスジェニック動物を提供し、ここで該トランスジェニック動物は イソタイプスイッチを受けることにより複数のイソタイプの異種抗体を産生ずる ことができる。古典的イソタイプスイッチは、トランスジエン中の少なくとも１ つのスイッチ配列領域を巻き込む組換え現象によって起こる。非古典的イソタイ プスイッチは、例えば、ヒトσμ配列とヒトΣμ配列の間の相同組換え（δ−関 連欠失）により起こり得る。別の非古典的スイッチ機構、例えば特にトランスジ エン問および／または染色体間組換えは、イソタイプスイッチを果たすことがで きる。そのようなトランスジエンおよびトランスジェニック動物は、抗原刺激型 Ｂ細胞成熟に必要である第一の免疫グロブリンイソタイプを産生じ、そして療法 的および／または診断的効用を有するｌまたは複数の第二の異種イソタイプをコ ードし産生ずるようにスイッチすることができる。
よって本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、−態様では、ヒト免疫グロブ リン遺伝子配列によりコードされ且つ高親和力で特異的ヒト抗原に結合するＩｇ Ｇ、　ｒｇＡおよび／または［ｇＥ抗体を産生ずることができる。
本発明は、様々なイソタイプの異種抗体を発現することのできるトランスジェニ ック動物からのＢ細胞にも関し、そのようなり細胞は、特定抗原に対して特異的 なモノクローナル抗体の源を提供するために不死化される。そのようなり細胞か ら誘導されたハイブリドーマ細胞は、そのような異種モノクローナル抗体の１つ の源として働くことかできる。
本発明は、上述の非ヒトトランスジェニック動物中でまたはそのようなトランス ジェニック動物から外植されたＢ細胞系統のリンパ球中で生体内イソタイプスイ ッチを受けることができる、再配列されていないおよび再配列された異種免疫グ ロブリン重鎮および軽鎖トランスジエンを提供する。そのようなイソタイプスイ ッチは自然に起こるか、またはトランスジェニック動物もしくは外植されたＢ細 胞系統リンパ球をイソタイプスイッチ促進剤、例えばＴ細胞由来のリンホカイン （例えばＩＬ−４およびＩＦＮγ）で処理することによって誘導することができ る。
更に、本発明は、上述のトランスジェニック非ヒト動物中での異種抗体産生を誘 導する方法を包含し、ここでそのような抗体は様々なイソタイプのものであるこ とができる。それらの方法は、異種抗体、特にスイッチされたイソタイプ（ｒｇ Ｇ、　ＩｇＡおよびｒｇＭ）の異種抗体の産生のためにトランスジェニック非ヒ ト動物において抗原刺激型免疫応答を生じさせることを含む。
本発明は、トランスジェニック動物中で産生される異種免疫グロブリンおよび前 記動物のＢ細胞から誘導されるモノクローナル抗体クローンが多様なイソタイプ のものであり得るように、トランスジエンがイソタイプスイッチを果たす配列を 含む方法を提供する。
本発明は更に、特定のイソタイプ間のスイッチが、生殖細胞免疫グロブリン遺伝 子座中で典型的に起こるよりもずっと高頻度もしくは低頻度でおこるかまたは異 なる時間順序で起こるように、トランスジエンのイソタイプスイッチを促進する 方法を提供する。スイッチ領域は、様々なＣＨ遺伝子から移植しそしてトランス ジエン構成物中の別のＣＨ遺伝子に連結せしめることができる。そのような移植 スイッチ配列は典型的には結合されたＣ８遺伝子とは独立的に機能し、そのため 、トランスジエン構成物中でのスイッチは結合されたスイッチ領域の元の機能で あろう。あるいはまた、スイッチ配列と共に、δ−結合欠失配列が様々なＣＨ遺 伝子に連結され、２つのδ−結合欠失配列の間の配列の欠失により非古典的スイ ッチを果たすことができる。よって、特定のＣＨ遺伝子が異なるスイッチ配列に 連結され、それによって天然に結合されたスイッチ領域を使用した時に起こるよ りも頻繁にスイッチされるトランスジエンを作製することができる。
本発明はまた、免疫グロブリントランスジエンを含有するトランスジェニック動 物においてトランスジエン配列のイソタイプスイッチか起こったかどうかを決定 する方法を提供する。
本発明は、その内の幾つかは生殖細胞の免疫グロブリン遺伝子座配列（欠失を含 んでもよい）のサブセットを含有する免疫グロブリントランスジエン構成物、お よび免疫グロブリントランスジエン構成物の作製方法を提供する。本発明は、免 疫グロブリントランスジエンの容易なりローニングと作製のための特別な方法で あって、２つのユニークＮｏｔ１部位により隣接されたユニークＸｈｏ　Ｉおよ び５ａｉｌ制限部位を使用するベクターを必要とする方法を包含する。
本発明のトランスジエンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連 結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡ を含んで成る重鎮トランスジエンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジエ ンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントお よび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。軽鎖お よび重鎮遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらか誘導され るトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェニ ック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎮および軽鎖遺伝子セグ メントをコードするＤＮＡに相当する。本発明の一観点によれば、個々の遺伝子 セグメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎮 をコードするようには再配列されていないようなトランスジエンが作製される。
そのような再配列されていないトランスジエンは、トランスジェニック非ヒト動 物が抗原に暴露されると、前記動物中での該遺伝子セグメントの組換え（機能的 再配列）並びに生成した再配列された免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の 発現を可能にする。
本発明の一観点によれば、異種重鎮および軽鎖免疫グロブリントランスジエンは 、再配列された異種ＤＮＡの比較的大きい断片を含んで成る。そのような断片は 、典型的には異種免疫グロブリン遺伝子座からのＣ，Ｊ（および重鎮の場合には Ｄ）セグメントの実質的部分を含む。加えて、そのような断片は可変遺伝子セグ メントの実質的部分も含んで成る。
一態様では、そのようなトランスジエン構成物は、調節配列、例えばプロモータ ー、エンハンサ−、クラススイッチ領域、組換えシグナル、異種ＤＮＡから誘導 された対応配列等を含んで成る。あるいは、そのような調節配列を、本発明に使 われる非ヒト動物と同一のまたは関連の種からのトランスジエン中に組み込むこ とができる。
例えば、トランスジェニックマウスに使うために、躇歯類免疫グロブリンエンハ ンサー配列を存するトランスジエン中にヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを 組み合わせることができる。
本発明の方法では、生殖細胞再配列されていない軽鎖および重鎮免疫グロブリン トランスジエン−即ちＤ細胞分化中にＶＤＪ結合を受けるもの−を抗原と接触せ しめ、二次レパートリ−Ｂ細胞における異種抗体の産生を誘導する。
本発明に使われる非ヒト動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊するベク ターおよび方法も本発明に包含される。そのようなベクターおよび方法は、トラ ンスジエン、好ましくはポジティブ−ネガティブ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−口ｅｇａ ｔｉｖｅ）選別ベクターを使用し、該ベクターは、それが本発明において使用す る非ヒト動物にとって内因性である重鎖および／または軽鎖免疫グロブリンをコ ードする遺伝子セグメントのクラスの機能的破壊を標的するように構成される。
そのような内因性遺伝子セグメントとしては、多様性領域、連結領域および定常 領域遺伝子セグメントが挙げられる。本発明のこの観点によれば、ポジティブ− ネガティブ選別ベクターを少なくとも１つの非ヒト動物の胎児性幹細胞と接触さ せた後、ポジティブ−ネガティブ選別ベクターが相同組換えによって非ヒト動物 のゲノム中に組み込まれている細胞を選択する。移植後、得られたトランスジェ ニック非ヒト動物は、該ベクターの相同組み込みの結果として、免疫グロブリン 媒介の免疫応答を開始することが実質的に不可能である。
そのような免疫不全非ヒト動物は、その後、免疫不全症の研究に使うことができ 、または異種免疫グロブリン重鎮および軽鎖トランスジエンの受容体として使う ことができる。
本発明はまた、内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊することなく、■または複 数の種の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用なベクター、方法および組 成物を提供する。そのような方法は、トランスジエンによってコードされるｌま たは複数の免疫グロブリン鎖の発現を許容しながら、トランスジエンによってコ ードされるｌまたは複数の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用である。
内因性免疫グロブリン鎖遺伝子座の遺伝的破壊とは異なり、免疫グロブリン鎖発 現の抑制は、破壊された内因性１ｇ遺伝子座についてホモ接合性であるトランス ジェニック動物の確立に必要である時間のかかる飼育を必要としない。内因性１ ｇ遺伝子破壊法に比較した時の抑制法の追加の利点は、ある態様では、個体動物 内で鎖抑制が可逆的であることである。例えば、Ｉｇ鎖抑制は、（１）内因性ｒ ｇＭｉ遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡをコードし 発現するトランスジエン、（２）内因性■ｇ鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダ イズするアンチセンスオリゴヌクレオチド、および（３）内因性Ｉｇ鎖ポリペプ チドに特異的に結合する免疫グロブリン、を使って達成することができる。
本明細書中に引用された参考文献は本出願の出願日より前にそれらの開示があっ たことを示すためだけに提供される。先行発明によって本発明者らがそのような 開示よりも先であるという権利を与えられることを認めるものと解釈してはなら ない。
図面の簡単な説明 図１は、再配列されていないゲノムＤＮＡ中および再配列された免疫グロブリン 重鎮遺伝子から発現されるｍＲＮＡ中の相補性決定領域ＣＤＲＩ、　ＣＤＲ２お よびＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＦＲＩ、　ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ ４を表す。
図２はヒトλ鎖遺伝子座を表す。
図３はヒトに鎖遺伝子座を表す。
図４はヒト重鎮遺伝子座を表す。
図５は、ヒトγ３およびγｌ定常領域を含有する２５　ｋｂ断片に次いでラット 鎖３′エンハンサー配列を含む７００　ｂｐ断片に連結された再配列された１ｇ Ｍ遺伝子を含有するトランスジエン構成物を表す。
図６は、生体内相同組換えによって軽鎖トランスジエンを形成させるために使う ことができる断片を表す、ヒトに鎖遺伝子座の制限地図である。
図７はｐＧＰ　Ｉの作製を示す。
図８はｐｃｐ　Ｉ中に含まれるポリリンカーの構成を示す。
図９は、本発明のヒト重鎮トランスジエンを作製するのに使う断片を示す。
図１０はｐＨＩＧ＋およびｐｃＯＮｌの作製を示す。
図１１は、ｐＲＥＧ２を形成させるためにｐＲＥ３　（ラットエンハンサ−３′ ）中に挿入されるヒトＣγｌ断片を示す。
図１２は　ｐＨｌＧ３’およびｐｃＯＮの作製を示す。
図１３は、本発明のトランスジエンの作製に使われるヒトＤ領域セグメントを含 む断片を示す。
図１４は、ｐＨｒＧ２　（Ｄセグメント含有プラスミド）の作製を示す。
図１５は、本発明のトランスジエンの作製に使われるヒトＪにおよびヒトＣに遺 伝子セグメントを包含する断片を示す。
図１６はｐＥμの構造を示す。
図１７はｐＫａｐＨの作製を示す。
図１８Ａ−１８Ｄは、マウスの内因性免疫グロブリン重鎮遺伝子座を機能的に破 壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。
図１９Ａ−１９Ｃは、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破 壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。
図２０　ａ　−ｅはに鎖標的用ベクターの構造を示す。
図２１ａ＝ｆはマウス重鎖標的用ベクターの構造を示す。
図２２はベクターｐＧＰｅの地図を示す。
図２３はベクターｐＪＭ２の構造を示す。
図２４はベクターｐｃＯＲ１の構造を示す。
図２５はｐ［ＧＭｌ、　ｐｉ（Ｃ１およびｐｉ（ｃ２のトランスジエン構成物を 示す。
図２６はｐγｅ２の構造を示す。
図２７はｐＶＧＥｌの構造を示す。
図２８はｐ）ｌｃｔ　トランスジェニックマウス中でのヒトＩｇ発現のアッセイ 結果を示す。
図２９はｐＪｃＫｌの構造を示す。
図３０は合成重鎮可変領域の作製を示す。
図３１は、重鎮小遺伝子座構成物ｐｌｃＩＬ、　ｐＨｃｌおよびｐＨＣ２の略図 である。
図３２は、重鎮小遺伝子座構成物ｐｌＧＧ１並びにに軽鎖小遺伝子座構成物ｐＫ ｃ１．　ｐＫＶｅｌおよびｐＫＣ２の略図である。
図３３は、機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するための方策を表す。
図３４は血清ＥＬＩＳＡ結果を表す。
図３５は、８匹のトランスジェニックマウスからの血清のＥＬＩＳＡアッセイの 結果を表す。
図３６はプラスミドｐＢｃＥ　ｌの略図である。
図３７は、ＫＬＨ−ＤＮＰ　（３７Ａ）　、ＫＬＨ（３７Ｂ）およびＢＳＡ−Ｄ ＮＰ　（３７Ｃ）に特異的なＩｇＧおよび１ｇＭレベルを測定することによる、 ＫＬＨ−ＤＮＰに対する本発明のトランスジェニックマウスの免疫応答を表す。
図３８は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトμ鎖を含んで成る抗 体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す；各パネルは、免疫処置後の指示日 においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。
図３９は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトγ鎖を含んで成る抗 体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す：各パネルは、免疫処置後の指示日 においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。
図４０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣｌトランス ジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の 無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジエン配列 （最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド 変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重＠ＣＤＲ Ｉ、　ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によっ てコードされないヌクレオチドは小文字で示されている。推定アミノ酸配列は、 慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
図４１は、ヒストグラム形式での図４０のデータを示す：推定アミノ酸残基位置 が縦座標として示され（左がアミノ末端方向であり、右がカルボキシ末端方向で ある）そして配列変異の頻度が横座標として示される。
図４２は、Ｖに遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．３と命名されたヒトＤＮ Ａ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖにコード領域推定アミノ酸配列も示される ；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に 示される。
図４３は、Ｖに遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．５と命名されたヒ）ＤＮ Ａ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖにコード領域推定アミノ酸配列も示される ；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に 示される。
図４４は、Ｖに遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．８と命名されたヒトＤＮ Ａ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖにコード領域推定アミノ酸配列も示される ；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に 示される。
図４５は、Ｖに遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．１５と命名されたヒトＤ ＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖにコード領域推定アミノ酸配列も示され る；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内 に示される。
図４６は、同時に注入された２つの重複断片の間での相同組換えによる軽鎖遺伝 子座の形成を示す。
表１はベクターｐＧＰｅの配列を示す。
表２は遺伝子Ｖ、４９．８の配列を示す。
表３は本発明のトランスジェニックマウスの血清中のヒトＩｇＭおよびｒｇＧの 検出を示す。
表４はＶＤＪ接合の配列を示す。
表５は、成人の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において見つかるＪセグメントに対す る、ｐＨｃｌ　）ランスジエンによってコードされる転写物中に組み込まれたＪ セグメントの分布を示す。
表６は、成人の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において見つかるＤセグメントに対す る、ｐＨｃｌ　）ランスジエンによってコードされる転写物中に組み込まれたＤ セグメントの分布を示す。
表７は、ｐＨｃｌ　トランスジェニックマウス中またはヒトＰＢＬ中のフレーム 内ＶＤＪ接合を有する転写物からのＣＤＲ３ペプチドの長さを示す。
表８は、ｐＨＣｌトランスジェニックマウスから分析された３ｏクローンのＶＤ Ｊ領域の推定アミノ酸配列を示す。
表９は、指摘の実験において使用したライン１１２のトランスジェニックマウス を示す；（＋）は各トランスジエンの存在を示し、（十干）は該動物がＪ、Ｄ突 出トランスジエンについてホモ接合性であることを示す。
詳細な説明 上述したように、有望な治療および／または診断上の標的である特異的ヒト抗原 と反応するヒト免疫グロブリンを製造することが望ましい。しかしながら、ヒト 抗原と特異的に結合するヒト免疫グロブリンは問題がある。
第一に、Ｂ細胞源として働く免疫処置動物が、与えられた抗原に対して免疫応答 を生じなければならない。動物が免疫応答を生じるには、与えられた抗原が外来 でなければならず、且つ動物が該抗原に寛容性でなければならない。よって、例 えばヒトタンパク質に結合するイディオタイプを有するヒトモノクローナル抗体 を製造しようと所望するならば、自己寛容性がヒトタンパク質に対する実質的な 免疫応答を生じるのを妨げるだろう。何故なら、免疫原性となり得る該抗原の唯 一のエピトープが、ヒト集団の中のタンパク質の多形性に由来するもの（同種異 系間エピトープ）であろうからである。
第二に、ハイブリドーマを形成させるためのＢ細胞の源として働く動物（−例で はヒト）が真正自己抗原に対して免疫応答を生じるならば、該動物において深刻 な自己免疫病が発生し得る。ハイブリドーマ用のＢ細胞源としてヒトを使う場合 には、そのような自己免疫化は現代の道徳的規範により非論理的であると見なさ れる。
ヒト抗原と特異的に反応するヒト抗体を得るのに利用することができる１つの方 法論は、本発明のヒト免疫グロブリントランスジエン構成物を含有するトランス ジェニックマウスの製造である。簡単に言えば、ヒト免疫グロブリン重鎮および 軽鎖遺伝子座の全部もしくは部分を含有するトランスジエン、またはヒト重鎮お よび軽鎖遺伝子座の必須機能要素を含んで成る合成「小遺伝子座Ｊ　（下記、並 びに１９９０年８月２９日に出願された同時係属米国出願第０７１５７４．７４ ８号および１９９０年８月３１日に出願された同第０７１５７５．９６２号、並 びに１９９１年８月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９１１０６１８５号中に記 載されている）を含有するトランスジエンを使ってトランスジェニック非ヒト動 物を作製する。そのようなトランスジェニック非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリ ン遺伝子によりコードされる免疫グロブリン鎖を産生ずる能力を有し、その上、 ヒト抗原に対して免疫応答を生じることができるだろう。よって、そのようなト ランスジェニック非ヒト動物は特定のヒト抗原と反応する免疫血清の源として働 くことができ、そのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞をミエローマ細 胞と融合せしめることにより、ヒト抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体 を分泌するハイブリドーマを製造することができる。
様々な形の免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの製造は 以前に報告されている。トランスジェニックマウスの製造には、再配列されたマ ウス免疫グロブリン重鎮または軽鎖遺伝子が使われている。加えて、μまたはγ １定常領域を含む機能的に再配列されたヒトＩｇ遺伝子がトランスジェニックマ ウス中で発現されている。しかしながら、トランスジエンが再配列されていｔ７ 、い（再配列されないＶ−Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊ）免疫グロブリン遺伝子を含んで 成る実験は変動的であり、場合によって、トランスジエンの不完全なまたは最少 の再配列を生じることがあった。しかし、トランスジエン中のＣ１Ｉ遺伝子間で の好結果のイソタイプスイッチを受ける再配列されたまたは再配列されていない 免疫グロブリントランスジエンの例は１つも報告されていない。
定義 本明細書中で使用する時、用語「抗体」は、少なくとも２本の同一の軽ポリペプ チド鎖と２本の同一の重ポリペプチド鎖を含んで成る糖タンパク質を言う。重お よび軽ポリペプチド鎖は各々、抗原と相互作用する結合ドメインを含む可変領域 （通常はポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含有する。重および軽ポリペプチ ド鎖は各々、ポリペプチド鎖の定常領域（通常はカルボキシ末端部分）も含んで 成り、その配列の一部は、免疫系の種々の細胞、成る種の食細胞および典型的補 体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織への免疫グロブリンの結合を媒介する 。
本明細書中で使用する時、「異種抗体」は、そのような抗体を産生ずるトランス ジェニック非ヒト生物に関連して定義される。それは、トランスジェニック非ヒ ト動物から成らない生物において見つかるものに対応するアミノ酸配列を有する かまたはＤＮＡ配列をコードする抗体である。
本明細書中で使用する時、［ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物体起源の 軽鎖と重鎮を有する抗体を言う。例えば、マウス軽鎖と会合されたヒト重鎮を有 する抗体はへテロハイブリッド抗体である。
本明細書中で使用する時、「イソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコード される抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧＯをＭ”　７）　、。
本明細書中で使用する時、［イソタイプスイッチ」は、抗体のクラスまたはイソ タイプが成るＩｇクラスから別のＩｇクラスのうちの１つへ変化する現象を言う 。
本明細書中で使用する時、「非スイッチイソタイプ」は、イソタイプスイッチが 起こらなかった時に産生される重鎮のクラスを言う。
非スイッチイソタイプをコードする６Ｍ遺伝子は、典型的には機能的に再配列さ れたＶＤＪ遺伝子のすぐ下流の最初のｃＨ遺伝子である。
本明細書中で使用する時、用語［スイッチ配列」は、スイッチ組換えを招くそれ らのＤＮＡ配列を言う。「スイッチ供与体」配列、典型的にはμスイッチ領域は 、スイッチ組換え中に欠失されるであろう定常領域の５′　（即ち上流）にある だろう。「スイッチ受容体」領域は、欠失されるであろう定常領域と代替定常領 域（例えばγ。
ε等）との間であろう。組換えが常に起こる特異部位は１つもないので、典型的 には最終遺伝子配列は構成物から予想不可能であろう。
本明細書中で使用する時、［グリコジル化パターン」は、タンパク質、より詳し くは免疫グロブリンタンパク質に共有結合している炭化水素単位のパターンとし て定義される。当業者が異種抗体のグリコジル化パターンをトランスジエンのｃ Ｈ遺伝子が由来する種よりも非ヒトトランスジェニック動物の種の中のグリコジ ル化パターンに一層類似していると認識するような時には、異種抗体のグリコジ ル化パターンは、非ヒトトランスジェニック動物の種によって産生される抗体上 に天然に存在するグリコジル化パターンと実質上類似していると特徴付けること ができる。
本明細書中で使用する時、［特異的結合Ｊは、抗体が（１）予め決定された抗原 に少なくともＩ　ＸＩＯ’　Ｍ−’の親和力で結合し、そして（２）予め決定さ れた抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合親和力よりも 少なくとも２倍大きい親和力で、予め決定された抗原に優先的に結合する性質を 言う。
本明細書中で使用する時「天然に存在する」という用語は、対象物に用いた時に 対象物が天然に見つけることができることを言う。
例えば、天然源から単離することができ且つ人間によって実験室で故意に変更さ れていない、生物体（ウィルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌ クレオチド配列は、「天然に存在する」ものである。
本明細書中で使用する時［再配列されたＪという用語は、■セグメントがそれぞ れ本質的に完全なＶＨまたはｖＬドメインをコードする構造においてＤ−Ｊまた はＪセグメントのすぐ近くに位置する重鎮または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の 配置を言う。再配列された免疫グロブリン遺伝子座は生殖細胞ＤＮＡとの比較に よって同定することかでき、再配列された遺伝子座は少なくとも１つのヘプタマ ー／ナノマー相同性要素を有するだろう。
■セグメントに関して本明細書中で使用する時、［再配列されていないＪまたは 「生殖細胞配置」なる用語は、ＤまたはＪセグメントのすぐ近くになるようにＶ セグメントが組換えられない配置を言う。
異種抗体を産生ずることのできるトランスジェニック非ヒト動物異種抗体レパー トリ−による外来抗原刺激に応答するトランスジェニック非ヒト動物のデザイン は、トランスジェニック動物の内部に含まれた異種免疫グロブリントランスジエ ンがＢ細胞発達経路を通して正しく機能することを必要とする。好ましい態様で は、異種重鎮トランスジエンの正しい機能がイソタイプスイッチを含む。従って 、イソタイプスイッチを生じ且つ下記のうちの１つまたは複数をもたらすように 本発明のトランスジエンが作製される：（１）高レベルで且つ細胞量特異的な発 現、（２）機能的な遺伝子再配列、（３）対立遺伝子排除の活性化およびそれに 対する応答、（４）十分な一層レパートリーの発現、（５）シグナル形質導入、 （６）体細胞高度突然変異（ｈｙｐｅｒ−ｍｕｔａｔｉｏｎ）　、および（７） 免疫応答の間のトランスジエン抗体遺伝子座の優性化。
下記開示から明らかなように、上記の基準の全てを満たす必要はない。例えば、 トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座が機能的に破壊される それらの態様では、トランスジエンは対立遺伝子排除を活性化する必要がない。
更に、トランスジエンが機能的に再配列された重鎖および／または軽鎖免疫グロ ブリン遺伝子を含んで成る態様ては、２番目の基準である機能的な遺伝子再配列 は、少なくとも既に再配列されているトランスジエンには不要である。分子免疫 学に関する背景については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕ口ｏ１ｏ−社、 第２版（１９８９）、　Ｐａｕｌ　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｅ、編、　Ｒａｖｅｎ　Ｐ ｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれ る。
本発明の一観点では、トランジェニック動物の生殖細胞（ジャームライン）中に 再配列された、再配列されていない、または再配列されたものと再配列されてい ないものとの組み合わせの、異種免疫グロブリン重鎮および軽鎖トランスジエン を含有する、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。重鎮トランスジエン の各々は少なくとも１つのＣＨ遺伝子を含んで成る。加えて、重鎮トランスジエ ンは、トランスジェニック動物のＢ細胞中で多数の６Ｍ遺伝子をコードする異種 トランスジエンのイソタイプスイッチを支持することかできる機能的イソタイプ スイッチ配列を含んでもよい。そのようなスイッチ配列は、トランスジエンＣＨ 遺伝子の源として働く種からの生殖細胞免疫グロブリン遺伝子座に天然に存在す るものであることができ、またはトランスジエン構成物を受け入れることになっ ている種（トランスジェニック動物）に存在するものから誘導することもできる 。例えば、トランスジェニックマウスを製造するのに使われるヒトトランスジエ ン構成物は、それがマウス重鎮遺伝子座中に天然に存在するものに類似したスイ ッチ配列を含むならば、より高頻度のイソタイプスイッチ現象をもたらすことが できる。というのは、恐らくマウススイッチ配列はマウススイッチレコンビナー ゼ酵素系が機能するように最適化されるが、一方ヒトスイッチ配列は最適化され ないだろうからである。スイッチ配列は、常用のクローニング法により単離しク ローニングすることができ、または免疫グロブリンスイッチ領域配列に関する発 表された配列情報に基づいてデザインした重複合成オリゴヌクレオチドから初め から合成することができる（Ｍｉｌｌｓら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 １８ニア３０５−７３１６（１９９１）　；　５ｉｄｅｒｒａｓら、Ｉｎｔｌ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、１：６３１−６４２　（１９８９）、これらは参考として本明 細書中に組み込まれる）。
上記トランスジェニック動物の各々について、機能的に再配列された異種重鎮お よび軽鎖免疫グロブリントランスジエンは、トランスジェニック動物の存意な率 （少なくとも１０パーセント）のＢ細胞中に検出される。
本発明のトランスジエンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連 結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡ を含んで成る重鎮トランスジエンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジエ ンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメントお よび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。軽鎖お よび重鎮遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが誘導され るトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェニ ック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎮および軽鎖遺伝子セグ メントをコードするＤＮＡに相当する。本発明の一観点によれば、個々の遺伝子 セグメントが再配列されておらず、即ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎮 をコードするようには再配列されていないようなトランスジエンが作製される。
そのような再配列されていないトランスジエンは、抗原に暴露されると、トラン スジェニック非ヒト動物内でＶ、　ＤおよびＪ遺伝子セグメントの組換え（機能 的再配列）を支持し、そして好ましくは結果として得られる再配列された免疫グ ロブリン重鎮中へのＤ領域遺伝子セグメントの全部または部分の組み込みを支持 する。
本発明の別の観点によれば、該トランスジエンは、再配列された「小遺伝子座」 を含んで成る。そのようなトランスジエンは、典型的にはＣ，ＤおよびＪセグメ ントの実質的部分並びにＶセグメントのサブセットを含んで成る。そのようなト ランスジエン構成物では、様々な調節配列、例えばプロモーター、エンハンサ− 、クラススイッチ領域、ＲＮ八へロセシング用のスプライス供与体およびスプラ イス受容体、組換えシグナル等は、異種ＤＮＡから誘導された対応配列を含んで 成る。あるいは、そのような調節配列を本発明に使われる非ヒト動物と同一のま たは関連の種からのトランスジエン中に組み込むことができる。例えば、トラン スジェニックマウスに使うために、トランスジエン中にヒト免疫グロブリン遺伝 子セグメントを薩歯類免疫グロブリンエンハンサー配列と組み合わせることがで きる。あるいは、トランスジエン中に合成調節配列を組み込むこともてき、この 場合、そのような合成調節配列は哺乳類のゲノム中に天然に存在することが知ら れている機能的ＤＮＡ配列とは相同でない。合成調節配列は共通規則に従ってデ ザインされ、例えば、スプライス受容体部位またはプロモーター／エンハンサ− モチーフの許容配列を特定するものである。
本発明はまた、重鎮および軽鎖トランスジエンを有する生殖細胞を含有するトラ ンスジェニック動物にも関し、ここで前記トランスジエンの一方は再配列された 遺伝子セグメントを含み、他方は再配列されていない遺伝子セグメントを含む。
好ましい態様では、再配列されたトランスジエンが軽鎖免疫グロブリントランス ジエンであり、再配列されていないトランスジエンが重鎮免疫グロブリントラン スジエンである。
抗体の構造および産生 全ての免疫グロブリンの基本構造は、２つの軽鎖ポリペプチドと２つの重鎮ポリ ペプチドとから成る単位に基づく。各軽鎖は、可変軽鎖領域および定常軽鎖領域 として知られる２つの領域を含んで成る。同様に、免疫グロブリン重鎮は、可変 重鎮領域および定常重鎮領域と呼ばれる２つの領域を含んで成る。
重鎖または軽鎖の゛定常領域は、重鎮または軽鎖定常領域遺伝子（Ｃ□）セグメ ントと呼ばれるゲノム配列によりコードされる。特定の重鎮遺伝子セグメントの 使用か免疫グロブリンのクラスを限定する。例えば、ヒトでは、μ定常領域遺伝 子セグメントが抗体の１ｇＭクラスを限定し、一方でγ、γ２．γ３または７４ 定常領域遺伝子セグメントが抗体のＩｇＧクラス並びにＩｇＧのサブクラスＩｇ Ｇ　＋〜ＩｇＧ４を限定する。同様に、α１またはα、定常領域遺伝子セグメン トの使用か抗体のＩｇＡクラス並びにＩｇＡ＋および１ｇＡ２サブクラスを限定 する。δおよびε定常領域遺伝子セグメントがそれぞれＩｇＤおよび［ｇＥ抗体 クラスを限定する。
重鎮および軽鎖免疫グロブリンの可変領域は、−緒になって抗体の抗原結合領域 を含む。広範囲の抗原を結合できるようにするために抗体のこの領域に多様性が 必要なため、初期または一部レパートリー可変領域をコードするＤＮＡは、特定 の可変領域遺伝子セグメントのファミリーに由来する多数の異なるＤＮＡセグメ ントを含んで成る。軽鎖可変領域の場合、そのようなファミリーは可変（Ｖ）遺 伝子セグメントと連結（Ｊ）遺伝子セグメントを含んで成る。よって、軽鎖の初 期可変領域は１つのＶ遺伝子セグメントと１つのＪ遺伝子セグメントによってコ ードされ、各セグメントはその生物のゲノムＤＮＡ中に含まれるＶおよびＪ遺伝 子セグメントのファミリーから選ばれる。重鎮可変領域の場合、重鎮の初期また は一部レパートリー可変領域をコードするＤＮＡは、１つの重鎖Ｖ遺伝子セグメ ント、１つの重鎮多様性（Ｄ）遺伝子セグメントおよび１つのＪ遺伝子セグメン トを含んで成り、各セグメントはゲノムＤＮＡ中の適当な免疫グロブリン遺伝子 セグメントのＶ、　ＤおよびＪファミリーから選ばれる。
抗体結合部位の形成に貢献する配列の多様性を増加させるために、重鎮トランス ジエンが再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子配列中にＤ領域の全部または部分を組み 込むことができる機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列を支持するシス作用性配列を含むこと が好ましい。典型的には、発現されたトランスジエンによってコードされる重鎮 （またはｍＲＮＡ）の少なくとも約１％がＶ領域中に認識可能なり領域配列を含 有する。
好ましくは、トランスジエンによってコードされるＶ領域の少なくとも約１０％ 、より好ましくは少なくとも約３０％、最も好ましくは５０％か認識可能なり領 域配列を含有する。
認識可能なり領域配列は一般に、重鎮トランスジエンのＤ領域遺伝子セグメント 中に存在する配列に相当する少なくとも約８個の連続するヌクレオチドおよび／ またはそのようなり領域ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列であ る。例えば、トランスジエンがＤ領域遺伝子ＤＨＱ５２を含むならば、■遺伝子 セグメント配列とＪ遺伝子セグメント配列の間のＶ領域中に配列５’　−ＴＡＡ ＣＴＧＧＧ−３’を含有するトランスジエンによってコードされる［ｌｌＲＮＡ は、Ｄ領域配列、特にＤＨＱ５２配列を含むものとして認識可能である。同様に 、例えば、トランスジエンがＤ領域遺伝子ＤＨＱ５２を含むならば、■遺伝子セ グメントアミノ酸配列とＪ遺伝子セグメントアミノ酸配列の間のＶ領域中に置か れたアミノ酸配列−ＤＡＦ−を含有するトランスジエンによってコードされる重 鎮ポリペプチドは、Ｄ領域配列、特にＤＨＱ５２配列を含むものとして認識可能 である。
しかしながら、体細胞突然変異またはＮ領域付加のために、幾つかのＤ領域は、 認識可能であるが連続するＤ領域配列と全く同一には一致しないことがある。例 えば、ヌクレオチド配列５’　−ＣＴＡＡＸＴＧＧＧＧ−３’　（ここでＸはＡ 、　ＴまたはＧであり、該配列は重鎖■領域中にあり、■領域遺伝子配列とＪ領 域遺伝子配列によって隣接されている）は、Ｄ　Ｈ５２配列５’　−ＣＴＡＡＣ ＴＧＧＧ−３’に相当すると認識され得る。同様に、例えば、■領域中にありそ してアミノ末端側でトランスジエンＶ遺伝子配列によってコードされるアミノ酸 配列により隣接されそしてカルボキシ末端側でトランスジエンＪ遺伝子配列によ ってコードされるアミノ酸配列により隣接されているポリペプチド配列−ＤＡＦ Ｄｉ、−ＤＹＦＤＹ−または−ＧＡＦＤ　Ｉ−は、Ｄ領域配列として認識され得 る。
従って、体細胞突然変異やＮ領域付加はトランスジエンＤ領域に由来する配列中 に変異をもたらし得るので、認識可能なり領域配列の存在を決定するための指標 として次の定義が与えられる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は次のよう な場合にＤ領域として認識可能である：（１）該配列がＶ領域中に存在し、一方 の側がＶ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）により隣接さ れており、そして他方の側がＪ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ 酸配列）により隣接されており、且つ（２）該配列が既知のＤ遺伝子配列（ヌク レオチド配列または推定アミノ酸配列）と実質的に同じであるかまたは実質的に 相同である場合。
ここで使用する用語「実質的な同一」は、ポリペプチド配列か参照配列に比較し て少なくとも５０％の配列一致を有し、核酸配列が参照配列に比較して少なくと も７０％の配列一致を有する、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の特徴 を表す。配列一致の％は、参照配列の合計３５％未満である小さな欠失または付 加を除いて計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば完全 なり遺伝子であってもよい；しかしながら、参照配列はポリヌクレオチドの場合 長さが少なくとも８ヌクレオチドであり、ポリペプチドの場合長さが少なくとも ３アミノ酸残基である。典型的には、参照配列は少な（とも８〜１２ヌクレオチ ドまたは少なくとも３〜４アミノ酸であり、好ましくは１２〜１５ヌクレオチド もしくはそれ以上または少なくとも５アミノ酸である。
ここで使用する用語「実質的な相同」は、ポリペプチド配列が参照配列に対して 少なくとも８０％の相同性を有する、ポリペプチド配列の性質を表す。配列相同 性の％は、同一アミノ酸または位置保存性アミノ酸置換を相同であるとして数え ることにより算出される。
位置保存性アミノ酸置換は、単一ヌクレオチド置換から生じ得るものである。単 一ヌクレオチド置換により最初のアミノ酸のコドンと二番目のアミノ酸のコドン が異なり得る場合、最初のアミノ酸が二番目のアミノ酸と置き換えられる。例え ば、配列−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−ン配列−ＡＡＡ−ＧＡＡ−ＡＧＡ −ＧＬＩＵ−は、わずか３つの置換変異（２つの元のコドンのうちの３つに単一 ヌクレオチド置換）を導入することによって−ＡＡＣ−ＧＡＣ−ＡＧＣ−ＧＬＩ Ｕ−に変異せしめることができるからである。
参照配列はより大きな配列のサブセット、例えば完全なり遺伝子であってもよい ；しかしながら、参照配列は長さが少なくとも４アミノ酸残基である。典型的に は参照配列は少なくとも５アミノ酸であり、好ましくは６アミノ酸またはそれ以 上である。
−次レパートリ− 重鎮および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮＡを作製する方法は、主 としてＢ細胞を発達させることに存する。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメン トの結合前、Ｖ、　Ｄ、Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、大部分、−次 しパートリーＢ細胞の前駆体中にＶ、　Ｄ、ＪおよびＣ遺伝子セグメントのクラ スターとして見つかる。通常、重鎮または軽鎖の遺伝子セグメントの全てが単一 の染色体上に比較的近くに密接して置かれている。様々な免疫グロブリン遺伝子 セグメントの組換え前のそのようなゲノムＤＮＡは、本明細書中［再配列されて いないＪゲノムＤＮＡと呼称される。Ｂ細胞分化の間に、Ｖ、　Ｄ、Ｊ　（また は軽鎖遺伝子の場合はＶとＪのみ）の適当なファミリーメンバーのいずれか１つ の遺伝子セグメントが組み換えられて機能的に再配列された重鎮および軽鎖免疫 グロブリン遺伝子を形成する。そのような機能的再配列は、機能的な可変領域を コードするＤＮＡを形成する可変領域セグメントの再配列である。この遺伝子セ グメント再配列過程は連続的であると思われる。最初に、重鎮Ｄ−Ｊ接合が作ら れ、次いで重鎖Ｖ−ＤＪ接合と軽鎖Ｖ−Ｊ接合が作られる。軽鎖および／または 重鎖中の機能的可変領域のこの初期形態をコードするＤＮＡは、［機能的に再配 列されたＤＮＡＪまたは「再配列されたＤＮＡＪ　と呼ばれる。重鎮の場合、そ のようなりＮＡは「再配列された重鎮ＤＮＡＪと呼ばれ、そして軽鎖の場合、そ のようなりＮＡは「再配列された軽鎖ＤＮＡＪと呼ばれる。本発明のトランスジ エンの機能的再配列を記述するためにも同様な用語が使われる。
機能的な重鎮および軽鎖可変領域を形成するための可変領域遺伝子セグメントの 組換えは、組換え応答能のあるＶ、　ＤおよびＪセグメントに隣接する組換えシ グナル配列（Ｒ３Ｓ）により媒介される。
組換えを指令するのに必要且つ十分なＲ３Ｓは、二分子対称ヘプタマー、高ＡＴ 人ナマー、および１２塩基対または２３塩基対のいずれかの中断スペーサー領域 を含んで成る。それらのシグナルは、Ｄ−Ｊ（またはＶ−Ｊ）組換えを行いそし て機能的に相互交換可能である異なる遺伝子座および種の間で保存されている。
Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒら（１９９０）、　５ｃｉｅｎｃｅ、２４８．１５１７−１ ５２３およびその中に引用された参考文献を参照のこと。配列ＣＡＣＡＧＴＧま たはその類似体を含んで成るヘプタマーの後に非保存性配列のスペーサー、次い で配列ＡＣＡＡＡＡＡＣＣまたはその類似体を有するノナマーが存在する。それ らの配列は、各ＶおよびＤ遺伝子セグメントのＪ側、即ち下流側上に見つかる。
生殖細胞型だおよびＪ遺伝子セグメントの直前に、再び２つの組換えシグナル配 列があり、最初にノナマーそして非保存性配列により隔てられて次にヘプタマー がある。ＶＬ、ｖＨまたはＤセグメントの後ろのヘプタマーおよびノナマー配列 は、それらが組み換わるＪＬ。
ＤまたはＪ、セグメントの前方のものと相補的である。ヘプタマーとノナマー配 列との間のスペーサーは１２塩基対の長さかまたは２２〜２４塩基対の長さかの いずれかである。
Ｖ、　ＤおよびＪセグメントの再配列に加えて、軽鎖のＶセグメントとＪセグメ ントとの間および重鎮のＤセグメントとＪセグメントとの間の可変的組換えによ って、免疫グロブリン重鎮および軽鎖の一次レパートリーにおいて更なる多様性 が生まれる。そのような様々な組換えは、そのようなセグメントが結合する正確 な場所の変位（ずれ）によって生成される。軽鎖におけるそのようなずれは、典 型的にはＶ遺伝子セグメントの最後のコドンの内部およびＪセグメントの最初の コドンの内部に起こる。同様な結合のずれは、重鎮染色体上ではＤセグメントと Ｊ、セグメントとの間に起こり、１０ヌクレオチドはどの多数に及ぶことがある 。更に、ＤセグメントとＪ。
セグメントとの間およびｖＨ上セグメントＤセグメントとの間に、ゲノムＤＮＡ によりコードされない幾つかのヌクレオチドが挿入されることがある。それらの ヌクレオチドの付加はＮ領域多様性として知られている。
ＶＪおよび／またはＶＤＪ再配列の後、再配列された可変領域遺伝子セグメント および再配列された可変領域の下流に置かれたｌまたは複数の定常領域遺伝子セ グメントの転写は、−次ＲＮＡ転写物を生成し、これが適当なＲＮＡスプライシ ングを受けると、全長の重鎮または軽鎖免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡを 生じる。そのような重鎮および軽鎖は、Ｂ細胞の経膜領域中への免疫グロブリン の挿入および／またはＢ細胞からの分泌を行うリーダー配列を含む。
このシグナル配列をコードするＤＮＡは、免疫グロブリン重鎮または軽鎖の可変 領域を形成するのに使うＶセグメントの第一エクソンの内部に含まれる。コード される免疫グロブリン重鎮および軽鎖ポリペプチド（これは互いとの適切な会合 によって抗体分子を形成する）を生成するｍＲＮＡの翻訳を調節するためにｍＲ ＮＡ中に適当な調節配列も存在する。
可変領域遺伝子セグメント中のそのような再配列およびそのような連結中に起こ り得る可変的組換えの最終結果は、−次抗体レパートリ−の生成である。一般に 、この段階まで分化された各Ｂ細胞は、単一の一次レパートリー抗体を産生ずる 。この分化過程の間に、機能的に再配列された［ｇ遺伝子内に含まれるもの以外 の遺伝子セグメントの機能的再配列を抑制する細胞現象が起こる。二倍体Ｂ細胞 がそのような単一特異性を維持する過程は、対立遺伝子排除と呼ばれる。
二次レバートリー 一次レパートリーを含んで成る配列の組の中からの免疫グロブリンを発現するＢ 細胞クローンは、外来抗原に応答させるのにすぐに利用できる。単純なＶＪおよ びＶＤＪ結合により生じる限定された多様性のため、いわゆる−次応答によって 産生される抗体は比較的低い親和性のものである。２つの異なる型のＢ細胞がこ の初期応答を作成するニー次抗体形成細胞の前駆体および二次レバトリーＢ細胞 の前駆体ＣＬｉｎｔｏｎら、Ｃｅ１ｌ、　５９：１０４９−１０５９　（１９８ ９）　）　。最初の型のＢ細胞は成る種の抗原に応答してＩｇＭ分泌性形質細胞 に成熟する。
他方のＢ細胞は、Ｔ細胞依存性成熟過程に入ることにより、抗原への初期暴露に 応答する。
抗原により感作されたＢ細胞クローンのＴ細胞依存性成熟の間に、細胞表面上の 抗体分子の構造が２つの経路で変化する。第一は、定常領域が非１ｇＭサブタイ プにスイッチし、そして可変領域の配列が多数の単一アミノ酸置換により変更さ れて一層高い親和性の抗体分子を生成することができる。
前に指摘したように、Ｉｇ重鎮または軽鎖の各可変領域は、抗原結合領域を含む 。二次応答の間の体細胞突然変異は、アミノ酸および核酸配列決定により、３つ の相補性決定領域（ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、これは超可変領域１． 　２または３とも呼ばれる）を含むＶ領域の至るところで起こることが決定され ているＣＫａｂａｔら、５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ　（１９９１）　Ｕ、Ｓ。
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉ ｃｅｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ：これは参考として本明細書中に組み 込まれる〕。ＣＤＲＩとＣＤＲ２は可変遺伝子セグメント内部に位置し、一方Ｃ ＤＲ３は大部分がＶ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントの間またはＶ、　Ｄ およびＪ遺伝子セグメントの間の組換えの結果である。ＣＤＲＩ、　２または３ を構成しない可変領域の部分は、一般に、ＦＲｌ、　ＰＲ２，ＦＲ３およびＦＲ ４と名付けられたフレームワーク領域と呼ばれる。図１を参照のこと。高度突然 変異の間に、再配列されたＤＮＡが変異されて異なる１ｇ分子を有する新しいク ローンを生じる。外来抗原に対して一層高い親和性を存するそれらのクローンが ヘルパーＴ細胞によって選択的に増大されて、発現抗体の親和力成熟を引き起こ す。クローン選択は、典型的にはＣＤＲＩ、　ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３ 領域中に新規変異を含むクローンの発現をもたらす。しかしながら、抗原結合領 域の特異性および親和性に影響を及ぼすようなそれらの領域の外側の変異も起こ る。
異種抗体を産生ずることができるトランスジェニック非ヒト動物本発明の１ｗ１ 点では、トランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも１つの本発明の免疫グロ ブリントランスジエン（後述）を非ヒト動物の接合子または初期胚中に導入する ことにより製造される。
本発明に有用である非ヒト動物は、一般に、免疫グロブリン遺伝子セグメントを 再配列して一次抗体応答を生せしめることができる任意の哺乳類を包含する。そ のような非ヒトトランスジェニック動物としては、例えば、トランスジェニック ブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニ ックウシ、および当業界で既知である他のトランスジェニック動物種、特に哺乳 動物種が挙げられる。特に好ましい非ヒト動物はマウスまたは薩歯類の他のメン バーである。
しかしながら、本発明はマウスの使用に限定されない。むしろ、−次および二次 抗体応答を開始することができる任意の非ヒト哺乳動物を使うことができる。そ のような動物としては、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ウシ、ヒツジおよ びブタの種、藁歯科の他のメンバー、例えばラット、並びにウサギおよびモルモ ットが挙げられる。特に好ましい動物はマウス、ラット、ウサギおよびモルモッ トであり、最も好ましくはマウスである。
本発明の一態様では、ヒトゲノム由来の様々な遺伝子セグメントが再配列されて いない形で重鎮および軽鎖トランスジエンに使われる。この態様では、そのよう なトランスジエンがマウスに導入される。軽鎖および／または重鎖トランスジエ ンの再配列されていない遺伝子セグメントは、マウスゲノム中の内因性免疫グロ ブリン遺伝子セグメントと識別可能である、ヒト種に同前のＤＮＡ配列を存する 。それらは生殖細胞やＢ細胞から成らない体細胞では再配列されていない形態で そしてＢ細胞では再配列された形態で容易に検出することができる。
本発明の別の態様では、トランスジエンは、再配列された重鎖および／または軽 鎖免疫グロブリントランスジエンを含んで成る。そのようなトランスジエンの機 能的に再配列されたＶＤＪまたはＶＪ上セグメント相当する特定セグメントは、 マウス中の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントから明らかに識別可能である 免疫グロブリンＤＮＡ配列を含む。
そういったＤＮＡ配列の相違は、マウスＢ細胞によりコードされるアミノ酸配列 に比較するとそのようなヒト免疫グロブリントランスジエンによりコードされる アミノ酸配列にも反映される。よって、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントに よりコードされる免疫グロブリンエピトープに特異的な抗体を使って、本発明の トランスジェニック非ヒト動物において、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を検 出することができる。
ヒトまたは他の種由来の再配列されていないトランスジエンを含有するトランス ジェニックＢ細胞は、適当な遺伝子セグメントを機能的に組換えると、機能的に 再配列された軽鎖および重鎮可変領域を形成する。そのような再配列されたトラ ンスジエンによりコードされる抗体は、本発明を実施するのに用いる非ヒト動物 中で通常遭遇するものとは異種であるＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列を存す ることは容易に明らかであろう。
再配列されていないトランスジエン 本明細書中で使用する時、［再配列されていない免疫グロブリン重鎮トランスジ エン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの多様性遺伝子セグメ ント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコ ードするＤＮＡを含んで成る。前記重鎮トランスジエンの各遺伝子セグメントは 、前記トランスジエンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫グロブリン 重鎮遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導されるか、またはそれに相当 する配列を有する。同様に、本明細書中で使用する時、［再配列されていない免 疫グロブリン軽鎖トランスジエン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント 、１つの連結遺伝子セグメントおよび少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメン トをコードするＤＮＡを含んで成る。ここで、前記軽鎖トランスジエンの各遺伝 子セグメントは、前記軽鎖トランスジエンが導入される非ヒト動物から成らない 種の免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導されるか 、またはそれに相当する配列を有する。
本発明のこの観点でのそのような重鎮および軽鎖トランスジエンは、再配列され ていない形態で上述の遺伝子セグメントを含有する。
即ち、重鎮トランスジエン中のＶ、　ＤおよびＪセグメントの間および軽鎖トラ ンスジエン中のＶとＪセグメントの間には、適当な組換えシグナル配列（Ｒ３Ｓ ）が置かれる。加えて、そのようなトランスジエンは、定常領域遺伝子セグメン トをＶＪまたはＶＤＪ再配列された可変領域と結合するための適当なＲＮＡスプ ライシングシグナルも含む。
複数のＣ領域遺伝子セグメント、例えばヒトゲノムからのＣμおよびＣ７１を含 む重鎖トランスジエン内でのイソタイプスイッチを促進するために、各定常領域 遺伝子セグメントの上流で且つ可変領域遺伝子セグメントの下流に、免疫グロブ リンクラススイッチ、例えばＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチを考慮した前 記定常領域間の組換えを可能にするため、下記に説明するような「スイッチ」領 域が組み込まれる。そのような重鎮および軽鎖免疫グロブリントランスジエンは 、可変領域遺伝子セグメントの上流に置かれたプロモーター領域を含む転写調節 配列（典型的にはＴＡＴＡモチーフを含む）も含有する。プロモーター領域は、 下流配列に作用可能に連結されると該下流配列の転写を指令することができるＤ ＮＡ配列として大体定義することができる。プロモーターは、効率的転写を指令 するために連結された追加のシス作用性配列の存在を必要とすることがある。更 に好ましくは、繁殖不能性転写物の転写に関係する他の配列が含まれる。繁殖不 能性転写物の発現に関係する配列の例は、本明細書中に組み込まれる）を包含す る、発表文献中に見つけることができる。それらの配列は、典型的にはスイッチ 領域のすぐ上流の少なくとも約５０　ｂｐ　、好ましくはスイッチ領域の上流の 少なくとも約２００　ｂｐ、より好ましくはスイッチ領域の少なくとも約２００ 〜１０００　ｂｐまたはそれ以上を含む。適当な配列はヒトＳγｌ、Ｓγ２゜Ｓ ｒ１．　Ｓｒ１．　Ｓα１．　Ｓα２およびＳεスイッチ領域のすぐ上流に存在 するが、ヒトＳγｌおよびＳγ３スイッチ領域のすぐ上流の配列が好ましい。特 に、インターフェロン（Ｉ　ＦＮ）誘導性転写調節要素、例えばＩＦＮ誘導性エ ンハンサ−がトランスジエンスイッチ配列のすぐ上流に含まれるのが好ましい。
プロモーターに加えて、主にＢ系列細胞中で機能する他の調節配列が使われる。
例えば、軽鎖トランスジエン上の好ましくはＪセグメントと定常領域遺伝子セグ メントとの間に置かれた軽鎖エンハンサ−配列は、トランスジエンの発現を増強 し、それによって対立遺伝子排除を促進するために使われる。重鎮トランスジエ ンの場合、調節エンハンサ−も使われる。そのような調節配列は、トランスジエ ンの転写および翻訳を最大にし、その結果対立遺伝子排除を誘導しそして比較的 高いレベルのトランスジエン発現を提供するために用いられる。
上述のプロモーターおよびエンハンサ−調節配列は包括的に記載されているけれ ども、そのような調節配列は非ヒト動物に対して異種であることができ、異種ト ランスジエン免疫グロブリン遺伝子セグメントが得られるゲノムＤＮＡから誘導 することができる。あるいは、そのような調節遺伝子セグメントは、重鎮および 軽鎖トランスジエンを含む、非ヒト動物または密接に関連した種のゲノム中の対 応する調節配列から誘導される。
好ましい態様では、遺伝子セグメントはヒトから誘導される。そのようなｆｌお よび軽鎖トランスジエンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、そのよう な動物に投与される特異抗原に対して１ｇ介在型免疫応答を開始することができ る。そのような動物中では異種ヒト抗体を産生ずることのできるＢ細胞が産生さ れる。不死化後、および適当なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）　、例えばハイブ リドーマの選択後、治療用ヒトモノクローナル抗体の源が提供される。
そういったヒトＭａｂは、ヒトに療法的に投与した時に実質的に減少された免疫 原性を有する。
好ましい態様はヒト遺伝子セグメントを含む重鎮および軽鎖トランスジエンの作 製を開示するけれども、本発明はそれに限定されない。この点に関しては、本明 細書中に記載される教示は、ヒト以外の種からの免疫グロブリン遺伝子セグメン トの使用に合わせて容易に改変できると理解すべきである。例えば、本発明の抗 体によるヒトの療法的処置に加えて、適切な遺伝子セグメントによりコードされ た療法的抗体を用いて獣医科学において使用するためのモノクローナル抗体を生 成せしめることができる。
再配列されたトランスジエン 別の態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物の生 殖細胞中に機能的に少なくとも１つの再配列された異種重鎮免疫グロブリントラ ンスジエンを含有する。そのような動物は上述のような再配列された重鎮トラン スジエンを発現する一部しパートリーＢ細胞を含有する。そのようなり細胞は、 好ましくは、抗原と接触すると体細胞突然変異を受け、該抗原に対して高い親和 性を特異性を有する異種抗体を形成することができる。前記再配列されたトラン スジエンは、少なくとも２つのＣＨ遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配 列を含むだろう。
本発明はまた、重鎮および軽鎖トランスジエンを存する生殖細胞を含み、前記ト ランスジエンのうちの一方が再配列された遺伝子セグメントを含み、他方が再配 列されていない遺伝子セグメントを含む、トランスジェニック動物にも関する。
そのような動物では、重鎖トランスジエンが少なくとも２つの０Ｍ遺伝子とイソ タイプスイッチに必要な関連配列を有するだろう。
本発明は更に、本発明のトランスジエンにおいて使うことができる合成可変領域 遺伝子セグメントレパートリ−を作製する方法にも関する。該方法は、免疫グロ ブリンＶセグメントＤＮＡの集団を作製することを含んで成る。ここで前記Ｖセ グメントＤＮＡの各々は免疫グロブリン■セグメントをコードし、そして各末端 に制限エンドヌクレアーゼの開裂認識部位を含む。免疫グロブリン■セグメント ＤＮＡの前記集団は、その後、鎖状に連結されて合成免疫グロブリンＶセグメン トレパートリ−を形成する。そのような合成可変領域重鎮トランスジエンは、少 なくとも２つのＣＨ遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を有するだろ う。
イソタイプスイッチ Ｂリンパ球の発達過程において、該細胞は、生産的に再配列されたＶｌｌおよび ■、領領域よって決定される結合特異性を有するｒｇＭを最初に産生ずる。続い て、各Ｂ細胞とその子孫の細胞が同しＬおよびＨＩＩＶ領域を有する抗体を合成 するが、それらはＨ鎖のイソタイプをスイッチすることができる。
μまたはδ定常領域の使用は、大部分は、ＩｇＭおよびＩｇＤを単−細胞中で同 時発現できるようにする、交互スプライシングによって決定される。その他の重 鎮イソタイプ（γ、αおよびε）は、遺伝子再配列現象かＣμおよびＣδエクソ ラン欠失させた後で本質的にのみ発現される。この遺伝子再配列過程はイソタイ プスイッチと呼ばれ、典型的には各重鎮遺伝子（δを除く）のすぐ上流に置かれ たいわゆるスイッチセグメントの間での組換えによって起こる。個々のスイッチ セグメントは長さが２〜１０　ｋｂであり、主として短い反復配列から成る。組 換えの正確な位置は個々のクラススイッチ現象ごとに異なる。ｃＤＮＡ由来のＣ Ｈプローブを用いるサザンプロット法または溶液ハイブリダイゼーション速度論 を使った実験は、スイッチが細胞からのＣＨ配列の消失に関係し得ることを確証 した。
μ遺伝子のスイッチ（Ｓ）領域、Ｓμは、コード配列の約１〜２ｋｂ５’側に位 置し、そして（ＧＡＧＣＴ）、　（ＧＧＧＧＴ）の形の配列の多数の縦列反復か ら成る。ここでｎは通常２〜５であるが、１７はどの大きさに及ぶことができる 。（Ｔ、　Ｎ１ｋａｉｄｏら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９訂８４５−８４８（１９８ １）を参照のこと。〕 他のＣ）ｌ遺伝子の５′にも、数キロ塩基対に及ぶ同様な内部反復性スイッチ配 列が見つかっている。Ｓα領域は配列決定されており、縦列に反復したｓｏ　ｂ ｐの相同性単位から成ることが判明した。一方、Ｓ　ｔａ＋　Ｓ　＊ｂおよびＳ ｓは全て、互いに非常に類似している反復した４９　ｂｐの相同性単位を含む（ Ｐ、　５ｚｕｒｅｋら、Ｊ、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．１３５：６２０−６２６　（ １９８５）およびＴ、　Ｎ１ｋａｉｄｏら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｎ＋、２ ５７：７３２２−７３２９　（１９８２）を参照のこと；これらは参考として本 明細書中に組み込まれる〕。全ての配列決定されたＳ領域は、Ｓμ遺伝子の基本 的反復配列であるペンタマーＧＡＧＣＴおよびＧＧＧＧＴの多数の存在を含む（ Ｔ、　Ｎ１ｋａｉｄｏら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５７：　７３２２− ７３２９　（１９８２）　；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕　； 他のＳ領域では、それらのペンタマーはＳμのようには正確に縦列に反復されて いないが代わりに大きな反復単位中に埋もれている。Ｓγ、領域は追加の高次構 造を存し、即ち、２つの直接反復配列が４９　ｂｐの縦列反復の２つのクラスタ ーの各々に隣接する（Ｍ、Ｒ，Ｍｏｗａｔｔら、Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ。
１３６：　２６７４−２６８３　（＋９８６）を参照のこと；これは引用して本 明細書中に組み込まれる〕。
ヒトＨ＆ＪＩ遺伝子のスイッチ領域はそれらのマウス同族体に非常に類似してい ることがわかっている。実際、０Ｍ遺伝子の５′側のヒトクローンとマウスクロ ーンの間の類似性はＳ領域に限られることがわかっており、これは、それらの領 域の生物学的重要性を確証する事実である。
μ遺伝子とα遺伝子の間のスイッチ組換えは複合ＳμｍＳα配列をもたらす。典 型的には、組換えが常に起こるような特異部位はＳμ領域中にも他のＳ領域中に も存在しない。
一般に、Ｖ−Ｊ組換えの酵素的機構とは異なり、スイッチ機構は、明らかに生殖 細胞Ｓ前駆体の反復相同領域の種々の整列を適応させることができ、次いて該配 列を異なる位置で一直線上に連結するこ７７・６７３４−６７３８　（１９８０ ）を参照のこと：これらは参考として本明細書中に組み込まれる。〕 特定のイソタイプへのスイッチを選択的に活性化する機構の詳細は未知である。
リンホカインやサイトカインのような外因性影響物質はイソタイプ特異的レコン ビナーゼを増加調節するかもしれないか、この酵素機構はあらゆるイソタイプへ のスイッチを触媒し、そして特異性かこの酵素機構の標的を特定のスイッチ領域 に向けることにある可能性もある。
Ｔ細胞由来のリンホカイン＋Ｌ−４およびＩＦＮγは、幾つかのイソタイプの発 現を特異的に促進することが証明されている：　ＩＬ−４はＩｇＭ。
ＩｇＧ　２ａ、ＩｇＧ　２ｂおよびＩｇＧ３発現を減少させ、１ｇＥおよび■ｇ ｃｔ発現を増加させる；　ＩＦＮγはＩｇＧ２ａ発現を選択的に刺激し拮抗する −（１９８７）　；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。
スイッチに関するＴ細胞作用に関係する実験のほとんどは、特定のスイッチ組換 えを有する細胞において観察される増加が事前スイッチされた細胞または事前傾 倒された細胞の選択を反映し得る可能性を無視することができなかった。しかし 、最もありそうな説明（よリンホカインが実際にスイッチ組換えを促進するとい うものである。
クラススイッチの誘導は、スイッチセグメントの上流で始まる繁殖不能転写物（ ｓｔｅｌｉｌｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）に関係があるらしい（Ｌｕｔｚｅｋｅ ｒは参考として本明細書中に組み込まれる）。例えば、観察されるＩＬ−４によ るγｌ繁殖不能転写物の誘導およびＩＦＮγによる阻害は、ＩＬ−４がＢ細胞中 での１１へのクラススイッチを促進し、ＩＰＮγがγ１発現を阻害するという観 察結果と一致する。従って、繁殖不能転写物の転写に影響を及ぼす調節配列の包 含は、イソタイブスイ・ソチの速度にも影響を及ぼし得る。例えば、特定の繁殖 不能転写物の転写を増加せしめることが、典型的には近隣のスイッチ配列を伴う イソタイプスイッチ組換えの頻度を増加させると期待できる。
それらの理由により、トランスジエンがイソタイプに使用する予定の各スイッチ 領域の約１〜２　ｋｂ上流以内に転写調節配列を含むことが望ましい。それらの 転写調節配列は、好ましくはプロモーターとエンハンサ−要素を含み、より好ま しくはスイッチ領域と生来関連している（即ち生殖細胞配置で存在する）５′隣 接（即ち上流）領域を含む。この５′隣接領域は、典型的には長さが少なくとも ５０ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約２００ヌクレオチド、より好 ましくは少なくとも５００−１０００ヌクレオチドである。
１つのスイッチ領域からの５′隣接配列をトランスジエン構成物用の別のスイッ チ領域に作用可能に連結させることができる（例えば、ヒトＳγｌスイッチから の５′隣接配列をＳα１スイツチのすぐ上流に融合させることができる）けれど も、成る態様では、トランスジエン構成物中に含まれる各スイッチ領域が、天然 に存在する生殖細胞配置においてすぐ上流に存在する５′隣接配列を有すること が好ましい。
トランスジエン機能のための重要な必要条件は、広範囲の抗原に対して二次免疫 応答を開始させるのに十分な程度に多様である一部抗体レパートリーの作製であ る。再配列された重鎮遺伝子は、シグナルペプチドエクソン、可変領域エクソン 、および各々が数個のエクソンによりコードされる多ドメイン定常領域の縦列整 列領域から成る。定常領域遺伝子の各々は異なる免疫グロブリンクラスの定常部 分をコードする。Ｂ細胞発達の間に、定常領域に近いＶ領域が欠失されて新規重 鎮クラスの発現をもたらす。各重鎮クラスについては、ＲＮＡスプライシングの 別パターンが経膜型と分泌型の両方の免疫グロブリンをもたらす。
ヒト重鎮遺伝子座は、２　Ｍｂにわたる約２００個のＶ遺伝子セグメント、約４ ０　ｋｂにわたる約３０個のＤ遺伝子セグメント、３　ｋｂの範囲内に密集した ６個のＪセグメント、および約３００　ｋｂにわたる９個の定常領域遺伝子セグ メントから成る。全遺伝子座は、染色体１４の長い方の腕の遠位部公約２．５Ｍ ｂに及ぶ（図４）。
Ｂ、遺伝子断片トランスジエン 好ましい態様では、免疫グロブリン重鎮および軽鎖トランスジエンは、ヒト由来 の再配列されていないゲノムＤＮＡを含んで成る。
重鎮の場合、好ましいトランスジエンは６７０〜８３０　ｋｂの長さを有するＮ ｏｔｌ断片を含んで成る。この断片の長さは、３′制限部位が実際にマツピング されていないため、不明瞭である。しかしながら、αｌとφα遺伝子セグメント との間にあることが知られている。この断片は、６つの既知ｖＨソファリーの全 部のメンバー、ＤおよびＪ遺伝子セグメント、並びにμ、δ、γ３．γ１および α１定常領域を含む。Ｂｅｒｍａｎら、ＥＭＢＯＪ、７：７２７−７３８　（１ ９８８）。このトランスジエンを含有するトランスジェニックマウス系は、Ｂ細 胞の発達に必要とされる重鎖クラス（ｒｇＭ）を正しく発現し、そしてほとんど の抗原に対して二次応答を開始せしめのに十分な程多数のレパートリ−と共に、 少なくとも１つのスイッチされた重鎮クラス（ＩｇＧ、）を発現する。
２、軽鎖トランスジエン ヒト軽鎖遺伝子座からの必要な遺伝子セグメントおよび調節配列を全て含有する ゲノム断片を同様に作製することができる。そのような構成物は本実施例中に記 載のようにして作製される。
Ｃ９生体内組換えにより細胞内的に作製されるトランスジエン単−ＤＮＡ断片上 の重鎮遺伝子座の全部または一部分を単離する必要はない。例えば、ヒト免疫グ ロブリン重鎮遺伝子座からの６７０−８３０　ｋｐ　Ｎｏｔ　Ｉ断片は、トラン スジエン作製（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）の間に非ヒト動物の生体内で形成さ せることができる。そのような生体内トランスジエン作製は、２以上の重複する ＤＮＡ断片を非ヒト動物の胎児性核に導入することにより行われる。ＤＮＡ断片 の重複部分は、実質的に相同であるＤＮＡ配列を有する。胎児性核内に含まれる レコンビナーゼに暴露されると、重複しているＤＮＡ断片が適切な方向において 相同的に組み換わって６７０−８３０　ｋｂのＮｏｔＩ重鎖断片を形成する。
生体内トランスジエン作製は、そのサイズのために現存の技術による作製または 操作が困難であるかまたは不可能である多数の免疫グロブリントランスジエンを 形成せしめるのに使うことができると理解すべきである。例えば、生体内トラン スジエン作製は、ＹＡＣベクター（Ｍｕｒｒａｙおよび５ｚｏｓｔａｋ、Ｎａｔ ｕｒｅ　３０５：１８９−１９３　（１９８３））により操作することができる ＤＮＡ断片よりも大きい免疫グロブリントランスジエンを作製するのに有用であ る。そのような生体内トランスジエン作製は、トランスジェニック非ヒト動物か ら成らない種の実質的に完全な免疫グロブリン遺伝子座を非ヒト動物中に導入す る場合にも使うことができる。
ゲノム免疫グロブリントランスジエンを形成させることに加えて、実施例に記載 の如く　「小遺伝子座」　トランスジエンを形成させるのにも生体内相同組換え を使うことができる。
生体内トランスジエン作製を利用する好ましい態様では、各々の重複するＤＮＡ 断片は、好ましくは第一のＤＮＡ断片の末端部分と第二のＤＮＡ断片の末端部分 の間で重複する実質的に相同なりＮＡ配列を存する。ＤＮＡ断片のそのような重 複部分は、好ましくは約５００ｂｐ〜約２０００　ｂｐ、最モ好ましく　ｌｔｌ 、Ｏｋｂ　〜２．Ｏｋｂを含む。生体内でトランスジエンを形成させるための重 複ＤＮＡ断片の相同組換えは、１９９２年３月１９日に公開された「哺乳類細胞 における相同性組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　 ｉｎ　Ｍ−劇ｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ）と称するＰＣＴ公開Ｗ０９２１０３９１７に 更に詳しく記載されている。
Ｄ、小遺伝子座トランスジエン 本明細書中で使用する時、［免疫グロブリン小遺伝子座」なる用語は、通常は約 １５０　ｋｂ未満、典型的には約２５〜１００　ｋｂのＤＮＡ配列であって、前 記ＤＮＡ配列が少なくとも１つの実質的不連続性（例えば、相同ゲノムＤＮＡ配 列に関して、通常は少なくとも約２〜５ｋｂ、好ましくは１０〜２５　ｋｂまた はそれ以上の欠失）を有するような、次のものを各々少なくとも１つ含むＤＮＡ 配列を言う二機能的可変（Ｖ）遺伝子セグメント、機能的連結（Ｊ）領域セグメ ント、少なくとも１つの機能的定常（Ｃ）領域遺伝子セグメント、および重鎮小 遺伝子座の場合には、機能的多様性（Ｄ）領域セグメント。軽鎖小遺伝子座トラ ンスジエンは、長さが少なくとも２５　ｋｂ　、典型的には５０〜８０　ｋｂで あるだろう。重鎮トランスジエンは、スイッチ領域に作用可能に連結された２つ の定常領域を有する、典型的には約７０〜８０　ｋｂ　、好ましくは少なくとも 約６０　ｋｂの長さであろう。更に、小遺伝子座の個々の要素は好ましくは生殖 細胞（ジャームライン）配置にあり、そして小遺伝子座の該要素により完全にコ ードされる多様な抗原特異性を有する機能的抗体分子を発現するように、トラン スジェニック動物の前駆体Ｂ細胞において遺伝子再配列を受けることができる。
更に、少なくとも２つのＣ□遺伝子と必要なスイッチ配列とを含んで成る重鎮小 遺伝子座は、典型的には、異なる免疫グロブリンクラスの機能的抗体分子が生成 されるように、イソタイプスイッチを受けることができる。そのようなイソタイ プスイッチは、トランスジェニック非ヒト動物内に存在するＢ細胞中で生体内で 起こるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から外植されたＢ細胞系列の培 養細胞中で起こり得る。
他の好ましい態様では、免疫グロブリン重鎮および軽鎖トランスジエンはＶ、、 ＤおよびＪ、遺伝子セグメントを各々１つまたは複数並びにＣＩ４遺伝子を２つ 以上含んで成る。適当なタイプの遺伝子セグメントの少なくとも１つが小遺伝子 座トランスジエンに組み込まれる。重鎮トランスジエンのＣ１ｌセグメントに関 しては、トランスジエンが少なくとも１つのμ遺伝子セグメントと、少なくとも １つの他の定常領域遺伝子セグメント、より好ましくはγ遺伝子セグメント、最 も好ましくはγ３またはγ１遺伝子セグメントとを含むことが好ましい。この優 先性は、コードされる免疫グロブリンのＩｇＭ形とＩｇＧ形の間のクラススイッ チおよび分泌形の高親和性非１ｇＭ免疫グロブリンの産生を考慮したものである 。他の定常領域遺伝子セグメント、例えばＩｇＤ、　ＩｇＡおよびＩｇＥの産生 をコードするものも使うことができる。
当業者は、重鎖ＣＨ遺伝子の発生の順序が該Ｃ１Ｉ遺伝子の供与体として働く種 の生殖細胞において見つかる天然に存在する空間的順序とは異なるであろうトラ ンスジエンも作製するだろう。
更に、当業者は、１つの種の複数の個体からＣＨ遺伝子を選択することかでき（ 例えば、同種異系Ｃ１４遺伝子）、そしてイソタイプスイッチを受けることがで きる過剰のＣ１ｌ遺伝子として前記遺伝子をトランスジエン中に組み込むことが できる。次いで、結果として生じたトランスジエン非ヒト動物は、成る態様では 、トランスジエンＣＨ遺伝子を得た前記種に象徴されるアロタイプの全てを包含 する様々なりラスの抗体を生産することができる。
更にまた、当業者は、異なる種からＣＨ遺伝子を選択してトランスジエン中に組 み込むことができる。各０８遺伝子と共に機能的スイッチ配列が含まれるか、使 用するスイッチ配列は必ずしもＣ１ｌ遺伝子の隣に天然に存在するものである必 要はない。種間のＣＨ遺伝子組み合わせは、様々な種からの０８遺伝子に相当す る多様なりラスの抗体を産生ずることのできるトランスジェニック非ヒト動物を もたらすだろう。種間ＣＨトランスジエンを含有するトランスジェニック非ヒト 動物は、獣医学用のモノクローナルを産生ずるハイブリドーマを作製するための Ｂ細胞の源として働くことができる。
ヒトの重鎖Ｊ領域セグメントは、３ｋｂのＤＮＡ長さにおいて密集した６個の機 能的Ｊセグメントと３個の偽遺伝子を含んで成る。それか比較的小さいサイズで あることとそれらのセグメントがμ遺伝子およびδ遺伝子の５′部分と一緒に単 一の２３　ｋｂ　５Ｆｉｌ／５ｐｅｌ断片として単離できることＣ５ａｄｏら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。
１５４：２４６−２７１　（１９８８）　；これは参考として本明細書中に組み 込まれる〕を仮定すれば、小遺伝子座構成物において全部のＪ領域遺伝子セグメ ントを使うことが好ましい。更に、この断片はμ遺伝子とδ遺伝子の間の領域に 広がるため、μ発現に必要とされるシス結合した３′調節要素の全部を含むこと が適当である。更に、この断片は完全なＪ領域を含むため、重鎮エンハンサ−と μスイッチ領域を含むＣＭｉｌｌｓ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３０６：８０９　（１ ９８３）　；　ＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓおよびＡｌｌ。
Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、４：３３９−３６８　（１９８６）；これ らは参考として本明細書中に組み込まれる）。それは、ＶＤＪ結合を開始させて 一層しパートリーＢ細胞を形成させる転写開始部位も含む（Ｙａｎｃｏｐｏｕｌ ｏｓおよびＡｌｔ、Ｃｅ１１　４０：２７１−２８１　（１９８５）　；これは 参考として本明細書中に組み込まれる〕。あるいは、２３　ｋｂ　５ｆｉｌ／５ ｐｅｌ断片の代わりに、Ｄ領域の一部を含む３６　ｋｂ　Ｂｓ５ｌ（ＩＩ／Ｓｐ ｅ［断片を使うことができる。そのような断片の使用は、効率的Ｄ−Ｊ結合を促 進させる５′隣接配列の量を増加させる。
ヒトＤ領域は、縦列に結合した４または５個の相同な９　ｋｂの歪領域から成る （Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ　２９４：６３１−６３５　（１９８ １））　、各歪領域は１０個までの個々のＤセグメントを含む。それらのセグメ ントの一部はマツピングされており、それを図４に示す。２つの異なる方策を使 って小遺伝子座り領域を作製する。第一の方策は、１つまたは２つの反復り歪領 域を含む短いＤＮＡの連続鎖の中に置かれたそれらのＤセグメントのみを使うも のである。候補となるのは、１２個の個々のＤセグメントを含む単一の１５　ｋ ｂ断片である。ＤＮＡのこの断片は２つの連続するＥｃｏＲＩ断片から成り、そ して完全に配列決定されているＣ　Ｉｃｈｉｈａｒａら、ＥＭＢＯ、Ｊ、　７： ４１４１−４１５０　（１９８８））　、　１２のＤセグメントが一層レパート リーに十分であろう。しかしながら、Ｄ領域の分散性質かあるとすれば、別の方 策は、幾つかの不連続り断片含有断片を一緒に連結して、より多数のセグメント を有する一層小型のＤＮＡ断片を作製することである。例えば、特徴的な隣接ノ ナマーまたはヘプタマー配列（前傾）の存在により、および文献への参照により 、追加のＤセグメント遺伝子を同定することができる。
重鎮小遺伝子座トランスジエンを作製するのには、少なくとも１つ、好ましくは 複数のＶ遺伝子セグメントが使われる。隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列 されたまたは再配列されていないＶセグメントは、［異種性抗体を生産すること ができるトランスジェニック非−ヒト動物Ｊ　（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｎｏｎ −Ｈｕｍａｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａｐａｂｌｅ　ｏｆＰｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｈｅ ｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　Ａｒｔｉｂｏｄｉｅｓ）と称する。　１９９２年３月１ ９日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９２１０３９１８に記載の通りに単離すること ができる。
隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列されたまたは再配列されていないＶセグ メント、Ｄセグメント、ＪセグメントおよびＣ遺伝子は、１９９２年３月１９日 １：公開されたＰＣＴ公開ＷＯ９２１０３９１８１：記載の通りに単離すること ができる。
小遺伝子座軽鎖トランスジエンは、ヒトλまたはに免疫グロブリン遺伝子座から 同様にして作製することができる。すなわち、例えば、複数のＤＮＡ断片、少な くとも２つ、３つまたは４つのＤＮＡ断片から、Ｖ、　Ｄ、Ｊおよび定常領域配 列（各配列はヒト遺伝子配列に実質的に相同である）をコードする、例えば約７ ５ｋｂの、免疫グロブリン重鎮小遺伝子座トランスジエン構成物を形成せしめる ことができる。好ましくは、前記配列は転写調節配列に作用可能に連結され、そ して再配列を受けることができる。２以上の適当に置かれた定常領域配列（例え ばμおよびγ）およびスイッチ領域では、スイッチ組換えも起こる。典型的な軽 鎖トランスジエン構成物は、１９９０年８月２９日出願の同時係属出願ＵＳＳＮ 　０７１５７４．７４８に記載の通りに、ヒトＤＮＡに実質的に相同であり且つ 再配列を受けることのできる複数のＤＮＡ断片から同様に形成せしめることがで きる。
理想的には、クラススイッチを受けることになっているトランスジエン構成物は 、繁殖不能転写物を調節するのに必要なシス作用性配列の全てを含むべきである 。天然に存在するスイッチ領域並びに上流のプロモーターおよび調節配列（例え ばＩＦＮ誘導性要素）は、イソタイプスイッチを受けることができるトランスジ エン構成物中に含まれる好ましいシス作用性配列である。スイッチ領域、好まし くはヒトγｌスイッチ領域のすぐ上流の少なくとも約５０塩基対、好ましくは少 なくとも約２００塩基対、より好ましくは少な（とも５００〜ｌ０００塩基対ま たはそれ以上の配列が、スイッチ配列、好ましくはヒトγｌスイッチ配列に作用 可能に連結されるだろう。更に、スイッチ領域は、特定のスイッチ領域の隣に天 然には存在しないＣＨ遺伝子の上流に（且つ近隣に）連結せしめることができる 。例えば、限定のつもりでないか、ヒトγｌスイッチ領域をヒトα２Ｃ，遺伝子 の上流に連結してもよく、またはマウスγｌスイッチ領域をヒトＣＨ遺伝子に連 結してもよい。
トランスジェニックマウスにおいて非古典的イソタイプスイッチ（例えばδ−関 連欠失）を得るための別法は、ヒトμ遺伝子に隣接相同組換えはＩｇＤ型のみの Ｂ細胞においてμ遺伝子を欠失せしめる。
重鎮トランスジエンは、次の式によって表すことができる：（Ｖ、）、（Ｄ）、 （ＪＨ）、−（Ｓ、）、−（ＣＩ）、−［（Ｔ）−（ＳＡ）、−（Ｃ２）］。
上式中、 ｖ８は重鎮可変領域遺伝子セグメントであり、Ｄは重鎮Ｄ（多様性）領域遺伝子 セグメントであり、Ｊ、は重鎖Ｊ（連結）領域遺伝子セグメントであり、Ｓｏは イソタイプスイッチが起こるようなＳ、受容体領域セグメントとの組換え現象に 参加することのできる供与体領域セグメントであり、 Ｃ１はＢ細胞発達において使われるイソタイプ（例えばμまたはδ）をコードす る重鎮定常領域遺伝子セグメントであり、Ｔは少なくともプロモーターを含有す るシス作用性転写調節領域セグメントであり、 ＳＡはイソタイプスイッチが起こるような選択されたＳ、供与体領域セグメント との組換え現象に参加することのできる受容体領域セグメントであり、 Ｃ１はμ以外のイソタイプ（例えばγ３．γ７．γ３．γ４．α１゜Ｃ２，ε） をコードする封鎖定常領域遺伝子セグメントであり、ｘ、ｙ、ｚ、　ｍ、ｎ、ｐ およびｑは整数であり、Ｘは１〜１ｏｏ１ｎは０〜ｌ０１ｙは１〜５０、ｐは１ −１０．２は１〜５０Ｓｑは０〜５０１ｍは０〜ＩＯである。典型的には、トラ ンスジエンがイソタイプスイッチを受けることができる時、ｑは少なくとも１で あり、ｍは少なくともｌであり、ｎは少なくともｌであり、そしてｍはｎと等し いかまたはそれより大きくなければならない。
Ｖ、、Ｄ、Ｊ、、ＳＤ、Ｃ，、Ｔ、ＳＡおよびＣｔ’ｔ’グメントは様々な種、 好ましくは哺乳動物種、より好ましくはヒトおよびマウス生殖細胞ＤＮＡから選 択することができる。
Ｖ８セグメントは、ヒト生殖細胞中に天然に存在するＶ、セグメント、例えば■ １４１ｆｉ＋から選択することができる。典型的には、約２個のＶ。セグメント 、好ましくは約４個、より好ましくは少なくとも約１０個のＶＨ上セグメント含 まれる。
典型的には少なくとも１個のＤセグメントが含まれるが、好ましくは少なくとも １０個のＤセグメントが含まれ、態様によっては、１０個以上のＤセグメントが 含まれる。幾つかの好ましい態様はヒトＤセグメントを含む。
典型的には少なくとも１個のＪ、Ｉセグメントがトランスジエンに含まれるが、 約６個のＪ、セグメントを含むことが好ましく、幾つかの好ましい態様は約６個 以上のＪ、セグメントを含み、非ヒトＪ８セグメントを１つも含まない。
Ｓ０セグメントは該トランスジエンのＳＡ上セグメントの組換え現象に参加する ことができる供与体領域である。古典的なイソタイプスイッチでは、Ｓｏおよび ＳＡ領領域Ｓμ、Ｓγｌ＋　Ｓγｉｔ　Ｓγ、。
Ｓｒ１．Ｓα、Ｓα、およびＳεといったスイッチ領域である。好ましくは、ス イッチ領域はマウスまたはヒトであり、より好ましくはＳ。がヒトまたはマウス Ｓμであり、ＳＡがヒトまたはマウスＳ７１である。非古典的イソタイプスイッ チ（δ関連欠失）では、ＳｏおよびＳＡ領領域、好ましくはヒトμ遺伝子に隣接 する４００塩基対の直接反復配列である。
Ｃ１セグメントは、典型的にはμまたはδ遺伝子であり、好ましくはμ遺伝子で あり、より好ましくはヒトまたはマウスμ遺伝子である。
Ｔセグメントは、典型的には天然に存在する（即ち生殖細胞）スイッチ領域に隣 接する５′隣接配列を含む。Ｔセグメントは典型的には長さが少なくとも約５０ ヌクレオチド、好ましくは長さか少なくとも約２００ヌクレオチド、より好まし くは長さが少なくとも５００〜１０００ヌクレオチドである。好ましくはＴセグ メントは、生殖細胞配置においてヒトまたはマウススイッチ領域のすぐ上流に存 在する５′隣接配列である。前記Ｔセグメントが動物の生殖細胞に天然に存在し ないシス作用性転写調節配列（例えばウィルスのエンハンサ−およびプロモータ ー、例えばＳＶ４０、アデノウィルス、および真核細胞に感染する他のウィルス 中に見つかるもの）を含んでもよいことは当業者にとって明白である。
Ｃ，セグメントは、典型的にはγ１．γ２．γ３．γ４．α１．α２またはεＣ １１遺伝子であり、好ましくはそれらのイソタイプのヒトＣＨ遺伝子であり、よ り好ましくはヒトγ１またはγ、遺伝子である。様々な種からの下流（スイッチ される）イソタイプ遺伝子としてマウスγ２．およびγ、を使ってもよい。重鎮 トランスジエンが免疫グロブリン重鎮小遺伝子座を含む場合、該トランスジエン の全長は典型的には１５０キロ塩基対米満てあろう。
一般に、該トランスジエンは、生来の重鎖Ｉｇ遺伝子座以外のものであるだろう 。例えば、不必要な領域の欠失または他の種からの対応領域との置換が存在する だろう。
トランスジェニック非ヒト動物におけるイソタイプスイッチの発生は、当業界で 公知である任意の方法によって同定することができる。好ましい態様としては次 のものが挙げられ、それらは単独でまたは組み合わせて使用される。
■、　δ以外の少なくとも１つのトランスジエン下流ＣＨ遺伝子に相同である配 列とトランスジエンＶ、−Ｄ、−Ｊ、再配列された遺伝子に相同である隣接配列 とを含有するｍＲＮＡ転写物の検出：そのような検出はノーザンハイブリダイゼ ーション、Ｓｌ　ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＰＣＲ増幅、ｃＤＮＡクローニン グまたはその他の方法によることかできる。
Ｚ　トランスジェニック動物の血清中の、または該トランスジェニック動物のＢ 細胞から作製したハイブリドーマ細胞の培養上溝中の、下流ＣＨ遺伝子によりコ ードされる免疫グロブリンタンパク質の検出。ここで免疫化学的方法により、そ のようなタンパク質が機能的可変領域を含んで成ることを証明することもできる 。
３、トランスジェニック動物のＢ細胞からのＤＮＡ中の、またはハイブリドーマ 細胞からのゲノムＤＮＡ中の、該トランスジエン中のイソタイプスイッチの発生 と一致するＤＮＡ再配列の検出。そのような検出はサザンブロットハイプリダイ ゼーション、ＰＣＲ増幅、ゲノムクローニングまたは他の方法によって達成する ことができる。
４、　イソタイプスイッチの他の徴候、例えば繁殖不能転写物の産生、スイッチ に関与する特徴的な酵素の産生（例えば［スイッチレコンビナーゼ」）、あるい は現行技術によって検出、測定または観察され得る他の徴候の同定。
各々のトランスジェニック系列はトランスジエンの異なる組み込み部位とトラン スジエン挿入断片の潜在的に異なる縦列整列を表し、そしてトランスジエンと隣 接ＤＮＡ配列の各々の異なる配置は遺伝子発現に影響を与え得るため、高レベル のヒト免疫グロブリン、特にＩｇＧイソタイプのものを発現し、且つ最少コピー 数の該トランスジエンを合作するマウスの系統を同定しそれを使用することが好 ましい。単一コピーのトランスジェニック動物は、起こり得る不完全な対立遺伝 子発現の問題を最少にする。トランスジエンは典型的には宿主染色体ＤＮＡ中、 最も普通には生殖細胞ＤＮＡ中に組み込まれ、そしてその後の生殖細胞系列トラ ンスジェニック飼育用動物の飼育によって繁殖される。しかしながら、実施者は 、適宜および所望により、当業界において既知であるかまたは後に開発される他 のベクターおよびトランスジェニック法に置換することができる。
Ｇ、内因性免疫グロブリン遺伝吊鎖の機能的破壊好結果に再配列された免疫グロ ブリン重鎮および軽鎖トランスジエンの発現は、トランスジェニック非ヒト動物 中の内因性免疫グロブリン遺伝子の再配列を抑制することにより優性作用を有す ると予想される。しかしながら、内因性抗体を欠く非ヒト動物を生成せしめる別 の方法は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を突然変異せしめることによるもので ある。胎児性幹細胞技術および相同組換えを使って、内因性免疫グロブリンレパ ートリ−を容易に排除することができる。下記はマウス免疫グロブリン遺伝子座 の機能的破壊を説明する。しかしながら、開示されるベクターおよび方法は、他 の非ヒト動物における使用に合わせて容易に改変することができる。
簡単に言えば、この技術は、生殖細胞組織に分化することができる多分化能性細 胞系における、相同組換えによる遺伝子の不活性化を包含する。マウス免疫グロ ブリンの変更コピーを含むＤＮＡ構成物を胎児性幹細胞の核に導入する。その細 胞の一部において、導入されたＤＮＡマウス遺伝子の内因性コピーと組み換わり 、それを変更コピーで置き換える。新たに操作された遺伝的損傷を含む細胞を宿 主マウス胚に注入し、それを受容体の雌に再移植する。それらの胚の一部が変異 細胞系に完全に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに発達する。従って、キ メラマウスを交配することにより、導入された遺伝的損傷を含むマウスの新規系 列を獲得することが可能である（Ｃａｐｅｃｃｈｉ　（１９８９）　５ｃｉｅｎ ｃｅ、２４４．１２８８−１２９２により概説されている）。
マウスλ遺伝子座は免疫グロブリンのわずか５％に寄与するため、重鎮および／ またはに軽鎖遺伝子座の不活性化で十分である。それらの遺伝子座の各々を破壊 するのには３つの方法があり、Ｊ領域の欠失、Ｊ−Ｃイントロンエンハンサ−の 欠失、および終結コドンの導入による定常領域コード配列の破壊である。ＤＮＡ 構成物デザインの見地から、最後の方法の選択が最も簡単である。μ遺伝子の排 除はＢ細胞の成熟を破壊し、それによっていずれかの機能的重鎮セグメントにク ラススイッチすることを防ぐ。それらの遺伝子座を破壊（ノックアウト）する方 策を下記に概説する。
マウスμおよびに遺伝子を破壊するためには、Ｊａｅｎｉｓｃｈおよび共同研究 者ＣＺｉ　ｊｌｓｔｒａら（１９８９）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３４２．４３５− ４３８）によりマウスβ２ミクログロブリン遺伝子の好結果の破壊に使われたデ ザインを基にした標的ベクターを用いる。プラスミドｐＭｃｒｎｅｏからのネオ マイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を標的遺伝子のコード領域中に挿入する。ｐＭｃ Ｉｎｅｏ挿入断片はｎｅｏ発現を指令するのにハイブリッドウィルスプロモータ ー／エンハンサ−配列を使う。このプロモーターは胎児性幹細胞中で活性である 。従って、破壊（ノックアウト）構成物の組込みのための選択マーカーとしてｎ ｅｏを使うことができる。
ランダム挿入現象に対する陰性選択マーカーとしてＨ３Ｖチミジンキナーゼ（ｔ ｋ）遺伝子を該構成物の末端に付加する（Ｚｉ　ｊｌｓｔｒａら、前掲）。
重鎮遺伝子座を破壊するための好ましい方策はＪ領域の削除である。この領域は マウスではかなり小さく、わずか１．３ｋｂに及ぶ。遺伝子標的ベクターを作製 するために、分泌されるＡ定常領域エクソンの全部を含む１５　ｋｂのＫｐｎ　 Ｉ断片をマウスゲノムライブラリーから単離する。１．３ｋｂのＪ領域をｐＭｃ ｌｎｅｏからの１．１ｋｂ挿入断片により置き換える。次いで該Ｋｐｎ　Ｉ断片 の５′末端にＨ３Ｖ　ｔｋ遺伝子を付加する。相同組換えによるこの構成物の正 しい組込みは、ｎｅｏ遺伝子によるマウスＪ、領域の置換をもたらすだろう。ｎ ｅｏ遺伝子を基にしたプライマーとＤ領域中のＫｐｎ　Ｉ部位の５′のマウス配 列に相同のプライマーとを使って、ＰＣＨにより組換え体をスクリーニングする 。
あるいは、μ遺伝子のコード領域を破壊することにより重鎮遺伝子座を破壊（ノ ックアウト）する。このアプローチは、上記のアプローチで使ったものと同じ１ ５　ｋｂのＫｐｎ　Ｉ断片を必要とする。
ρＭＣＩｎｅｏからの１．１ｋｂ挿入断片をエクソン■中のユニークＢａｍＨ１ 部位のところに挿入し、そしてＨＳＫ　ｔｋ遺伝子を３’ＫｐｎＩ末端に付加す る。ｎｅｏ挿入断片の片側における二重交差（これはｔｋ遺伝子を削除する）を 選択する。それらは、選択されたクローンのプールからＰＣＲ増幅により検出さ れる。ＰＣＲプライマーの一方はｎｅｏ配列に由来し、そして他方は標的ベクタ ーの外側のマウス配列に由来する。マウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊 は実施例に記載される。
Ｇ、内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現の抑制内因性１ｇ遺伝子座の機能的破 壊に加えて、内因性Ｉｇ遺伝子座の発現を防ぐ別の方法は抑制である。内因性１ ｇ遺伝子の抑制は、１または複数の組み込まれたトランスジエンから産生される アンチセンスＲＮＡにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、および／ またはＩまたは複数の内因性Ｉｇｌに特異的な抗血清の投与により達成すること ができる。
アンチセンスポリヌクレオチド 特定の遺伝子の発現を部分的または全体的に破壊するためにアンチセンスＲＮＡ 　トランスジエンを使うことができる（Ｐｅｐｉｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ 　３５５：　７２５　；　Ｈｅ１ｅｎｅ、　Ｃ，およびＴｏｕｌｍｅ、　Ｊ、　 （１９９０）　Ｂｉｏｃｈｉ−ｍｉｃａ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　１０４ ９：　９９　；　５ｔｏｕｔ、　Ｊ、およびＣａ５ｋｅｙ、　Ｔ。
（１９９０）Ｓｏｍａｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅｔ、１６：　３６９ 　；　Ｍｕｎｉｒら（１９９０）Ｓｏｍａｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．　Ｇｅｎｅ ｔ、１６：　３８３　；これらの各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕 。
［アンチセンスポリヌクレオチド」は、（１）参照配列、例えば内因性■ｇのＣ ８またはＣ１領域配列の全部または一部に相補的であり、且つ（２）相補的な標 的配列、例えば染色体遺伝子座またはＩｇ　ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズ するポリヌクレすチドである。そのような相補的アンチセンスポリヌクレオチド は、関連する標的配列への特異的ハイブリダイゼーションが該ポリヌクレオチド の機能的性質として保持される限り、ヌクレオチド置換、付加、欠失または転位 を含んでもよい。相補的アンチセンスポリヌクレオチドとしては、個々のｍＲＮ Ａ種に特異的にハイブリダイズしそして該ｍＲＮＡ種の転写および／またはＲＮ Ａプロセシングおよび／またはコードされるポリペプチドの翻訳を防ぐことがで きる、可溶性アンチセンスＲＮＡまたは５６　（１９９０）　；　Ｈｏｒｃｅｎ ｂｅｒｇら、ＷＯ９１／１１５３５　、ｔｌ、ｓ、ｓ、Ｎ　Ｏ了１５３０．１６ ５（「新規ヒトＣＲ［ＰＴＯ遺伝子Ｊ　）；　ＷＯ９１１０９８６５、１ＶＯ９ １１０４７５３；　ＷＯ９０／１３６４１およびＥＰ　３８６５６３　、これら の各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。アンチセンス配列は、長さが 少なくとも約１５の連続ヌクレオチド、より好ましくは長さが約３０以上の連続 ヌクレオチドの少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子配列に相補的であるポリ ヌクレオチド配列である。しかしながら、成る態様では、アンチセンスポリヌク レオチドの特性として特異的ハイブリダイゼーションが保持される限り、アンチ センス配列は相補的免疫グロブリン遺伝子配列に比較して置換、付加または欠失 を有することができる。
一般的に、アンチセンス配列は、免疫グロブリン鎖をコードするか、またはＤＮ Ａ再配列後に免疫グロブリン鎖をコードする潜在能力を存する内因性免疫グロブ リン遺伝子配列に相補的である。ある場合には、免疫グロブリン遺伝子配列に一 致するセンス配列が特に転写を妨害することによって発現を抑制する働きをする ことがある。
従ってアンチセンスポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドの産生を阻 害する。この点に関して、■または複数の内因性１ｇ遺伝子座の転写および／ま たは翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドは、内因性１ｇ遺伝子座によ りコードされる免疫グロブリン鎖を産生ずる非ヒト動物の能力および／または特 異性を変更することができる。
アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフエクタント細胞またはトランスジ ェニック細胞中、例えば個体の造血幹細胞集団の全部または一部を再構成するの に使われるトランスジェニック多分化能性造血幹細胞中、あるいはトランスジェ ニック非ヒト動物中で異種発現カセットから生産され得る。あるいは、アンチセ ンスポリヌクレオチドは、試験管内では培地中または生体内では循環系もしくは 間質液中のいずれかの外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含んで 成ることができる。外部環境中に存在する可溶性アンチセンスオリゴヌクレオチ ドは、細胞質に接近しそして特定のｍＲＮＡ種の翻訳を阻害することが証明され ている。ある態様では、アンチセンスポリヌクレオチドがメチルホスホネート成 分を含んで成るか、あるいはホスホロチオネートまたはＯ−メチルリボヌクレオ チドを使用してもよく、そしてキメラオリゴヌクレオチドを使用してもよいＣＤ ａｇｌｅら（１９９０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８：　４７ ５１）　ｏある用途には、アンチセンスオリゴヌクレオチドはポリアミド核酸を ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹを参照のこと 。
１または複数の配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを使って、転写、 ＲＮＡプロセシング、および／または同起源のｍＲＮＡ種の翻訳を阻害し、それ によってコードされる各ポリペプチドの量を減少させる。そのようなアンチセン スポリヌクレオチドは、生体内で１または複数の内因性Ｉｇ遺伝子座の形成を阻 害することにより治療機能を提供することができる。
可溶性アンチセンスポリヌクレオチドとしてまたはアンチセンストランスジエン から転写されたアンチセンスＲＮＡとしてのいずれにせよ、本発明のアンチセン スポリヌクレオチドは、生体内の生理的状態において内因性Ｉｇ配列に優先的に ハイブリダイズするように選択される。最も典型的には、選択されたアンチセン スポリヌクレオチドは、本発明の重鎮または軽鎖トランスジエンによりコードさ れる異種１ｇ配列にそれほど多くはハイブリダイズしないだろう（即ち、アンチ センスオリゴヌクレオチドは約２５〜３５％以上トランスジエンＩｇｆ発現を阻 害しないであろう）。
抗血清抑制 内因性１ｇ鎖発現の部分的または完全な抑制は、マウスに１または複数の内因性 １ｇ鎖に対する抗血清を注入することにより達成す８１：２１１；これは参考と して本明細書中に組み込まれる〕。抗血清は、ｌまたは複数の内因性１ｇ鎖とは 特異的に反応するが本発明の１ｇトランスジエンによりコードされる異種Ｉｇ鎖 とは最少の反応性を有するかまたは全く反応性を持たないように選択される。よ って、Ｗｅｉｓｓら（前掲）のものにより代表されるようなスケジュールに従っ た選択抗血清の投与は、内因性１ｇ鎖発現を抑制するが本発明のトランスジエン によりコードされる１または複数の異種Ｉｇ鎖の発現を許容する。
核酸 「実質的相同性」なる用語は、２つの核酸またはデザインしたその配列を最適に 整列しそして比較した時に、少なくとも約８０％のヌクレオチド、通常は少なく とも約９０％〜９５％、より好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％のヌク レオチドが同一であることを指摘する。
あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下でその鎖の相補体 にハイブリダイズする時、実質的相同性か存在する。
核酸は完全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製されたもしくは実質 的に純粋な形で、存在することができる。核酸は、標準技術により、例えばアル カリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣ１バンド沈降、カラムクロマトグラフィー、アガロー スゲル電気泳動および当業界で公知の他の方法により、他の細胞成分または他の 汚染物、例えば他の細胞性核酸もしくはタンパク質から分離精製された時、「単 離されＪまたは［実質的に純粋にされ」る。Ｆ、　Ａｕ５ｕｂｅｌら編、Ｃｕｒ ｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　 Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉ ｅｎｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８７）を参照のこと。
本発明の核酸組成物は、遺伝子配列を提供するための標準技術に従って、しばし ばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは混合物のいずれかからの生来の配列（修飾され た制限部位等を除く）を変異せしめることができる。コード配列については、そ れらの変異は、所望であればアミノ酸配列に影響してもよい。特に生来のＶ、Ｄ 、Ｊ、定常。
スイッチおよび他の本明細書中に記載のそのような配列に実質的に相同であるか またはそれから誘導されるＤＮＡ配列が考えられる（ここで、「誘導される」と は、ある配列が別の配列と同一であるかまたは変更されていることを指摘する） 。
核酸はそれが別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、「作用可能に連結される 」という。例えば、プロモーターまたはエンハンサ−がコード配列の転写に作用 するならば、それらはコード配列に作用可能に連結されている。転写調節配列に ついては、作用可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列が連続であって、 そして２種のタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、連続であ って且つ読み枠内であることを意味する。スイッチ配列については、作用可能に 連結されるとは、該配列がスイッチ組換えを行うことができることを意味する。
特定の好ましい態様 本発明の好ましい態様は、実施例５．　６．　８または１４に記載の軽鎖トラン スジエンの単一コピーを含有する動物と交配させた実施例１２に記載のトランス ジエン（例えばｐＨｃｌまたはｐＨＣ２）の少なくとも１回のコピー、典型的に は２〜ＩＯ回のコピー、時には２５〜５０回以上のコピーを含有する動物、並び に実施例ＩＯに記載のＪ、欠失動物から繁殖させた子孫である。動物はそれらの ３つの特性について同型接合に交配される。そのような動物は次の遺伝子型を有 する：再配列されていないヒト重鎮小遺伝子座（実施例１２に記載）の単一コピ ー（染色体の一倍体１組あたり）、再配列されたヒトに軽鎖構成物（実施例Ｉ４ に記載）の単一コピー（染色体の一倍体１組あたり）、および機能的Ｊ、Ｉセグ メントの全部を除去する各内因性マウス重鎮遺伝子座のところの欠失（実施例１ ０に記載）。そのような動物は、Ｊ、セグメントの欠失について同型接合である マウスと交配させる（実施例１０）と、Ｊ□欠失について同型接合でありそして ヒト重鎮および軽鎖構成物については半接合である子孫を生産する。生じた動物 に抗原を注入し、それらの抗原に対するヒトモノクローナル抗体の産生に使う。
そのような動物から単離されたＢ細胞は、それらが各遺伝子の単一コピーのみを 含むため、ヒト重鎮および軽鎖に関して単一特異性である。更に、それらはヒト またはマウス重鎮に関して単一特異性であろう。というのは、実施例９および１ ２に記載のようにして導入されたＪ、領域に広がる欠失によって、両方の内因性 マウス重鎮遺伝子コピーが非機能的であるためである。更に、Ｂ細胞の実質的部 分はヒトまたはマウス軽鎖に関して単一特異性であろう。何故なら、再配列され たヒトに軽鎖遺伝子の単一コピーの発現が、Ｂ細胞の実質的部分における内因性 マウスにおよびλ鎖遺伝子の再配列を対立的におよび同位的に排除するだろうか らである。
好ましい態様のトランスジェニックマウスは、理想的には生来のマウスのものと 実質的に同じである、有意なレパートリ−を有する免疫グロブリン産生を示すだ ろう。例えば、内因性１ｇ遺伝子が不活性化されている態様では、総免疫グロブ リンレベルは約０．１−１０■／　ｍｌ血清、好ましくは０．５〜５■／　ｍｌ 、理想的には少なくとも約１．０■／ｙｄの範囲であろう。ＩｇＭからＩｇＧに スイッチすることができるトランスジエンをトランスジェニックマウスに導入し た時、血清ＩｇＧ対１ｇＭの成熟マウス比は好ましくは約１０：１である。もち ろん、ＩｇＧ対１ｇＭ比は、未成熟マウスではずっと低いだろう。一般に、牌臓 およびリンパ節Ｂ細胞の約ｌＯ％より多く、好ましくは４０〜８０％が、もっば らヒト［ｇＧタンパク質のみを発現する。
レパートリ−は理想的には非トランスジェニックマウス中にしめされるものとほ ぼ等しく、通常は少なくとも約１０％はど高く、好ましくは２５〜５０％または それ以上高いだろう。マウスゲノム中に導入される異なるＶ、ＪおよびＤ領域の 数に主として依存して、通常少なくとも約１０００種の異なる免疫グロブリン（ 理想的にはＩｇＧ）、好ましくは１０’〜１０＠またはそれ以上の免疫グロブリ ンが産生されるだろう。それらの免疫グロブリンは、典型的には、高抗原性タン パク質の約半分またはそれ以上を認識するだろう。抗原性タンパク質としては、 ハトチトクロームＣ、ニワトリリゾチーム、アメリカヤマゴボウのマイトジェン （ＰＷＭ）　、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン、インフルエンザ赤 血球凝集素、スタフィロコッカスプロティンＡ１マツコウクジラミオグロビン、 インフルエンザノイラミニダーゼおよびλリプレッサータンパク質が挙げられる がそれに限定されない。上記免疫グロブリンの幾つかは、予め選択された抗様々 な重鎮または軽鎖遺伝子セグメントを含むトランスジエンの再配列の前に、それ らの遺伝子セグメントは、例えばハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ配列決定 により、トランスジェニック動物以外の生物種に由来するものであると容易に同 定することができる。
上記に本発明のトランスジェニック動物の好ましい態様を記載したけれども、他 の態様は本明細書の開示により、そしてより特定的には実施例に記載のトランス ジエンにより定義される。トランスジェニック動物の４つのカテゴリーが定義さ れ得る：■、再配列されていない重鎮免疫グロブリントランスジエンと再配列さ れた軽鎖免疫グロブリントランスジエンとを含有するトランスジェニック動物。
■、再配列されていない重鎮免疫グロブリントランスジエンと再配列されていな い軽鎖免疫グロブリントランスジエンとを含有するトランスジェニック動物。
■、再配列された重鎮免疫グロブリントランスジエンと再配列されていない軽鎖 免疫グロブリントランスジエンとを含有するトランスジェニック動物。
■、再配列された重鎮免疫グロブリントランスジエンと再配列された軽鎖免疫グ ロブリントランスジエンとを含有するトランスジェニック動物。
トランスジェニック動物の上記カテゴリーの好ましい優先順序は、内因性軽鎖遺 伝子（または少なくともに遺伝子）が相同組換え（または他の方法）により破壊 されている場合にはＩＩ＞　Ｉ　＞ＩＩＩ＞ＩＶであ実施例 方法および材料 トランスジェニックマススは、ｌ（ｏｇａｎら、“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　 ｔｈｅＭｏｕｓｅεｍｂｒｙｏ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ ”、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　（これは 参考として本明細書中に組み込まれる）に従って誘導される。
胎児性幹細胞は、発表された方法に従って操作される（Ｔｅｒａｔｏ−ｃａｒｃ ｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　：　ａ　 ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ。
Ｅ、Ｊ、　ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＪｉ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇ ｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，、１９８７：畜牛に組み込まれる〕。
ＤＮＡクローニング方法は、Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃ１ｏｎ４ｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、　１９８ ９．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｐｒ ｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、　（これは参考 として本明細書中に組み込まれる）に従って実施される。
オリゴヌクレオチドは、製造業者により与えられた規格書に従っテＡｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのオリゴヌクレオチド合成装置上で合成される。
ハイブリドーマ細胞および抗体は、”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、　ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ　Ｌａｎｅａｉ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　（１９８ ８）　（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って操作される。
この実施例は、マウスの接合子中にマイクロインジェクトされるヒトゲノム重鎮 免疫グロブリントランスジエンのクローニングとマイクロインジェクションを記 載する。
Ｍａｒｚｌｕｆｆ、　Ｗ、Ｆ、ら、　”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　 Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　：　Ａ　Ｐｒａ−ｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ” 、　Ｂ、Ｄ、　ＨａｍｍｅｓおよびＳ、Ｊ、　）Ｉｉｇｇｉｎｓ編、　８９−１ ２９頁。
ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ　（１９８５）により記載されたようにし て、新鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離された核（またはＰＢＳで洗浄 したヒト精母細胞）を低融点アガロース母材中に埋め込み、ＥＤＴＡとプロテイ ナーゼにで溶解せしめて高分子量ＤＮＡを暴露させ、このＤＮＡを次いでＭ、　 ＦｉｎｎｅｙによりＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　（Ｆ、　Ａｕ５ｕｂｅｌら編、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ 　＆　５ｏｎｓ、増補４版、　１９８Ｂ。
第２．５．１章）中に記載された通りにアガロース中で制限酵素ＮｏｔＩで消化 する。
次いでＮｏｔＩ消化されたＤＮＡを−Ａｎａｎｄ、　Ｒ，ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ １ｄｓルドゲル電気泳動により分画する。ＮｏｔＩ断片に富む画分をサザンブロ ットハイプリダイゼーションによりアッセイし、この断片によりコードされるｌ または複数の配列を検出する。そのような配列は、重ＩＩＤセグメント、Ｊセグ メント、μおよびγｌ定常領域と一緒に６種のｖＨソファリーの全部の代表物を 含む〔この断片は、Ｂｅｒｍａｎら（１９８８）前掲により１（ｅＬａ細胞から ６７０　ｋｂ断片として同定されているが、本発明者らはヒト胎盤および精子Ｄ ＮＡからは８３０　ｋｂ断片としてであることを発見した〕。このＮｏｔＩ断片 を含む両分（図４参照）をプールし、そして酵母細胞中のベクターｐＹＡＣＮＮ のＮｏｔＩ部位にクローニングする。プラスミドｐＹＡＣＮＮは、ｐＹＡＣ−４ Ｎｅｏ　（Ｃｏｏｋ、　Ｈ。
ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：１１８１７　（１９８８）　）を ＥｃｏＲＩで消化しそしてオリゴヌクレオチド５’　−ＡＡＴ　ＴＧＣＧＧＣＣ ＧＣ−３’の存在下で連結せしめることにより調製する。
は参考として本明細書中に組み込まれる）により記載されたようにして、重鎖Ｎ ｏｔＩ断片を含むＹＡＣクローンを単離する。Ｍ、　Ｆｉｎｎｅｙ（前掲）によ り記載されたパルスフィールドゲル電気泳動により、高分子量酵母ＤＮＡからク ローン化ＮｏｔＩ挿入断片を単離する。１ｍＭのスペルミンの添加によりこのＤ ＮＡを凝縮させ、上述の単細胞胚の核に直接マイクロインジェクトする。
実施例２ 生体内相同組換えにより形成されるゲノムに軽鎖ヒトＩｇ）ランスジ９６７７　 （１９８７）に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
全てのＣに、３′エンハンサ−１全てのＪセグメントおよび少なくとも５つの異 なる■セグメントを含む４５０　ｋｂ（７）Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉ断片を実 施例１に記載の如く単離し、そして単一の細胞胚の核の中にマイクロインジェク トする。
前記成分の全部と少なくとも２０個多いＶセグメントとを含む７５０ｋｐ　Ｍｌ ｕ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉ断片を実施例１に記載の如く単離し、そしてＢｓ５Ｈ■で 消化して約４００　ｋｂの断片を生成せしめる。
４５０　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉ断片と約４００　ｋｂ　Ｍｌｕ　ｌ− Ｂｓ５ＨＩ［断片は、Ｂｓ５ＨＩＩ制限部位とＸｈｏ　Ｉ制限部位とにより限定 される配列重複を有する。
マウス接合子のマイクロインジェクションによるそれらの２断片の相同組換えは 、４５０　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　／　Ｎｏｔ　Ｉ断片（実施例２）中に見ツカるも のよりも少なくとも１５〜２０個追加のＶセグメントを含むトランスジエンをも たらす。
ｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩ　とｓｔｙ＋で消化し、下記のオリゴヌクレオチドと 連結せしめることにより、図８に記載の制限部位を有する１４７塩基対の挿入断 片を含むｐＧｐ　ｌを作製する。それらのオリゴの概括的重複は図９にも示され る。
オリゴヌクレオチドは下記のものである：オリゴー１　５　’　−ＣＴＴ　ＧＡ Ｇ　ＣＣＣＧＣＣＴＡＡ　ＴＧＡ　ＧＣＧ　ＧＧＣＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＧ　ＣＡ Ｔ　ＡＣＴ　ＧＣＧ　ＧＣＣ−３’オリゴー２　５　’　−ＧＣＡ　ＡＴＧ　Ｇ ＣＣＴＧＧ　ＡＴＣＣＡＴ　ＧＧＣＧＣＧ　ＣＴＡ　ＧＣＡＴＣＧ　ＡＴＡ　Ｔ ＣＴ　ＡＧＡ　ＧＣＴ　ＣＧＡ　ＧＣＡ　−３’オリゴー３　５　’　−ＴＧＣ ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣＣＣＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣＡＡＧ　ＣＴＴＡＣＧ 　ＣＧＴ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＣＴ　−３’オリゴー４　５　’ 　−ＡＡＴ　ＴＡＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＡＣＴＡＧ　ＴＡＣＧＣＧ　ＴＡＡ　 ＧＣＴＴＧＧ　ＴＡＣＣＣＧ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　−３’オリゴー５　５　’　− ＣＡＧ　ＡＴＣＴＧＣＡＴＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＴＡＧ　ＡＴＡ　ＴＣＧＡ ＴＧ　ＣＴＡ　ＧＣＧ　ＣＧＣＣＡＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣ−３’オリゴ−６５’　 −ＡＧＧ　ＣＣＡ　ＴＴＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＧＣＡ　ＡＡＡ 　ＡＡＡＡＧＣＣＣＧ　ＣＴＣＡＴＴ　ＡＧＧ　ＣＧＧ　ＧＣＴ　−３’このプ ラスミドは、マイクロインジェクション用のベクター配列から単離することがで きる大挿入断片を構築するための、稀少な切断性Ｎｏｔ１部位により隣接された 大きなポリリンカーを含む。このプラスミドは、ｐＵＣ系プラスミドに比べて比 較的低コピー数であるｐＢＲ３２２に由来する（ｐＧＰｌは複製開始点の近くに Ｉ）ＢＲ３２２コピー数調節領数音保持している）。低コピー数は挿入配列の潜 在的毒性を減少させる。加えて、ｐＧＰｌは、アンピシリン耐性遺伝子と前記ポ リリンカーとの間に挿入された、ｔｒｐＡ由来の強力な転写ターミネータ−配列 （Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、　Ｇ、Ｅ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ　７８：４１８０（１９８１））も含む。これは、アンピシリンプロ モーターから起こる読み通し転写を防ぐことにより、成る種の挿入断片に関係す る毒性を減少させる。
プラスミドｐＰＧ２は、ポリリンカー中に追加の制限部位（ＳｆｉＩ）を導入す るようにｐｃｐ　＋から誘導される。ｐｃｐ　１をＭｌｕｌとＳｐｅ　Ｉで消化 し、該プラスミドのポリリンカ一部分の中の認識配列を切除する。
このように消化されたｐＧＰ　１に次のアダプターオリゴヌクレオチドを連結せ しめてｐＧＰ２を作製する。
５’　ＣＧＣＧＴＧ　ＧＣＣＧＣＡ　ＡＴＧ　ＧＣＣＡ　３’５’　ＣＴＡ　Ｇ ＴＧ　ＧＣＣＡＴＴ　ＧＣＧ　ＧＣＣＡ　３’ｐＧＰ２はＭｌｕＩ部位とＳｐｅ 　Ｉ部位の間に置かれた追加の５ｆｉＩ部位を含むこと以外はｐｃｐｔと同じで ある。これは挿入断片を５ｆｉＩで並びにＮｏｔＩで完全に切除することを可能 にする。
Ｂ、ｆｌＲＥ３（ラットエンハンサ−３′）の作製ラット定常領域の下流に置か れたエンハンサー配列を重鎖構成物鎖領域３′エンハンサ−を単離し、クローニ ングする。次のオリゴヌクレオチド： ５’　ＣＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＡＴＣＡＧＴ　ＡＣＣＴＧＡ　ＡＡＣ ＡＧＧ　ＧＣＴ　ＴＧＣ３’５’　ＧＡＧ　ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＧＡＣＣ ＴＧ　ＧＡＧ　ＣＡＣＡＣＡ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＴＣＣ３’を使って、ラットＩ ＧＨ３’エンハンサー配列をＰＣＲ増幅せしめる。
こうして形成された３′エンハンサーをコードする二本鎖ＤＮＡを１３ａｍＨＩ 　と５ｐｈｌで切断し、ＢａｍＨＩ／Ｓｐ旧で切断されたｐＧＰ２中にクローニ ングしてｐＲＥ３　（ラットエンハンサ−３′）を得る。
Ｃ，ヒトＪ−μ領域のクローニング この領域の実質的部分を、λフナージ挿入断片から単離された２以上の断片を組 み合わせることによりクローニングする。図９を参照のこと。
オリゴヌクレオチドＧＧＡ　ＣＴＧ　ＴＧＴ　ＣＣＣＴＧＴ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　 ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＡＴＧＴＣＴ　ＧＧＧ　ＧＣＣＡＡＧを使って、全部のヒトＪ セグメントを含む６．３ｋｂ細畜牛に組み込まれる〕をヒトゲノムＤＮＡライブ ラリーから単離する。
オリゴヌクレオチドＣＡＣＣＡＡ　ＧＴＴ　ＧＡＣＣＴＧ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　Ｃ ＡＣＡＧＡ　ＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＴＡ　ＴＧＡを使って、エンハンサ−、スイ ッチおよび定常領域コードエクソンを含む隣接の１０　ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩＩ／ ＢａｍＨＩ断片ＣＹａｓｕｉら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　１ｍｎ＋ｕｎｏ１．　１９： １３９９−１４０３　（１９８９）　）を同様にして単離する。
プローブとしてクローンｐＭＵＭ挿入断片（ｐＭＵＭは、μ膜エクラン１オリゴ ヌクレオチド：　ＣＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴ　Ｃ ＡＴ　ＣＧＴＣＣＴ　ＣＴＴ　ＣＣＴ　ＣＣＴを使ってヒトゲノムＤＮＡライブ ラリーから単離された４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／旧ｎｄｌＩ［断片である）を使っ て隣接の３’１．５ｋｂＢａｍＨ１断片を同様に単離し、モしてｐＬＩｃ１９中 にクローニングする。
ｐｃ、ｐ　ｌをＢａｍＨｔとＢｇｌＩ［で消化した後、子ウシ腸アルカリホスフ ァターゼで処理する。
図９からの断片（ａ）および（ｂ）を前記消化ｐＧＰｌ中にクローニングする。
次いで５　’　Ｂａｍｔ（１部位がＢａｍ１ｌ　Ｉ／　Ｂｇ　Ｉ　ＩＩ融合によ り破壊されるように置かれたクローンを単離する。それをｐＭＵと命名する（図 １０参照）。
１１Ｍ［ＪをＢａｍ旧で消化し、図９からの断片（Ｃ）を挿入する。旧ｎｄｌＩ ［消化により方向性を確認する。生じたプラスミドｐＨｌＧ１　（図１０）は、 ＪおよびＣμ上セグメントコードする１８　ｋｂ挿入断片を含有する。
Ｄ、Ｃμ領領域クローニング ｐＧＰ　１をＢａｍＨＩ　と旧口ｄＩＩＩて消化し、次いで子ウシ腸アルカリホ スファターゼで処理する（図１４）。このように処理された図１４の断片（ｂ） および図１４の（Ｃ１を、ＢａｍＨ［／　１１　ｉ　ｎｄ　ｍで切断したｐＧＰ ｌ中にクローニングする。ＨｉｎｄＩ［Ｉ消化により断片（Ｃ）の正しい方向を 確認し、Ｃμ領領域コードする１２　ｋｂ挿入断片を含むｐｃＯＮｌを得る。
ｐＨＩＧＩは、ＮｏｔＩ部位により隣接されたポリリンカー中に５ｆｉＩ３’部 位と５ｐｅＩ５’部位を育する１８　ｋｂ挿入断片内にＪセグメント、スイッチ およびμ配列を含む故に、再配列されたＶＤＪセグメントに使われるだろう。ｐ ＣＯＮＩはγ領域を欠き１２　ｋｂ挿入断片のみを含むこと以外はｐＨｌＧ１　 と同じである。再配列されたＶＤＪセグメントを含む断片の作製におけるｐｃＯ Ｎｌの使用については後で記載する。
Ｅ、γ−１定常領域のクローニング（ｐＲＥＧ２）ヒトＣγ領域のクローニング は図１６に描写される。
Ｙａｍａｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８６：２１５２−２１５６　（１９８６）は、組込み時に部分的に削除された トランスジエン構成物からの膜結合ヒトγ−１の発現を報告している。彼らの結 果は、３　’　Ｂａｍ８１部位が、５　ｋｂ未満のＶ−Ｃイントロンを有する経 膜再配列されそしてスイッチされたγ遺伝子コピーを含む配列の輪郭となること を指摘している。従って、再配列されていないスイッチされていない遺伝子では 、最初のγ−１定常エクソンの５′末端から５　ｋｂ未溝のところで始まる配列 中にスイッチ領域全体が含まれる。従ってそれは５　’　５．３　ｋｂ　Ｈｉｎ ｄＩ［Ｉ断片中に含まれる（Ｅｌｌｉｓｏｎ、　Ｊ、Ｗ、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ。
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０：４０７１−４０７９　（１９８２）　；これは参考 として本明細書中に組み込まれる）　ｏ　Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ら、Ｃｅ１ｌ　 ２９＋６７１−６７９　（１９８２）　（これは参考として本明細書中に組み込 まれる）もまた、この断片がスイッチ配列を含むことを報告しており、この断片 と７．７　ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ［−Ｂａｍ旧断片とを合わせると我々がトランスジ エン構成物に必要とする配列の全部を含むに違いない。イントロン配列は、特定 遺伝子のイントロン中に存在する少な（とも１５の連続ヌクレオチドのヌクレオ チド配列である。
γ−１の第三エクソン（Ｃ，３）に特異的である次のオリゴヌクレオチドを使っ て、γ−１領域を含むファージクローンを同定し単離する。
５’　ＴＧＡ　ＧＣＣＡＣＧ　ＡＡＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＡＧＧＴＣＡ　ＡＧＴ　 ＴＣＡ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＡＣＧ　ＴＧＧ　３　’７．７　ｋｂ　ＨｉｎｄｎＩ −Ｂｇ１１１断片（図１１中の断片（ａ））を旧ｎｄｌ［／ＢｇｌＩ［で切断さ れたｐＲＥ３中にクローニングしてｐＲＥＧｌを作製する。上流の５．３　ｋｂ 　Ｈｉｎｄｌｌ［断片（図１１中の断片（ｂ））をＨｉｎｄｌｌ［消化されたｐ ＲＥＧｌ中にクローニングしてｐＲＥＧ２を作製する。ＢａｍＨＩ／　Ｓｐｅ　 Ｉ消化により正しい方向を確かめる。
Ｆ、ＣγとＣμの結合 上述したプラスミドル旧Ｇ１はヒトＪセグメントとＣμ定常領域エクソンを含む 。Ｃμ定常領域遺伝子セグメントを含むトランスジエンを提供するために、ｐｉ （ｒＧｌを５ｆｉＩで消化した（図１０）。プラスミドｐＲＥＧ２も５ｆｉＩで 消化し、ヒトＣγエクソンとラット３′エンハンサ−配列を含む１３．５ｋｂ挿 入断片を得た。それらの配列を連結スミドｐＨｌＧ３’を作製したく図１２）。
ｐｃＯＮｌを５ｆｉＩで消化し、そしてｐＲＥＧ２をＳｆｉ　Ｉで消化して得ら れたヒトＣγ領域とラット３′エンハンサ−とを含む５ｆｉＩ断片と連結せしめ ることにより、ヒトＣμおよびヒトＣγｌをコードするかＪセグメントを含まな い第二のプラスミドを作製する。得られたプラスミドｐｃＯＮ　（図１２）は、 ヒトＣμ、ヒトγｌおよびラット３′エンハンサ−配列を有する２６　ｋｂのＮ ｏｔＩ／５ｐｅＩ挿入断片を含有する。
Ｇ、　Ｄセグメントのクローニング ヒトＤセグメントをクローニングするための方策は図１３に描写される。Ｄセグ メントを含むヒトゲノムライブラリーからのファージ４１５０　（１９８８）　 ）に特異的なプローブを使って同定しそして単離する。
次のオリゴヌクレオチドを使用する。
ＤＸＰＩ　：　５　’　−ＴＧＧ　ＴＡＴ　ＴＡＣＴＡＴ　ＧＧＴ　ＴＣＧ　Ｇ ＧＧ　ＡＧＴ　ＴＡＴ　ＴＡＴ　ＡＡＣＣＡＣＡＧＴ　ＧＴＣ−３’ ＤＸＰ４　二　５　’　−ＧＣＣＴＧＡ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＧＣＣＴＣＡ　ＧＧ Ｇ　ＣＡＣＡＧＴ　ＧＧＧ　ＣＡＣＧＧＡ　ＣＡＣＴＧＴ　−３’ ＤＮ４　：　５　’　−ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＴＧＴ　ＴＴＡ　Ｇ ＧＡ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣＣＧＣＡＣＣＴ　ＧＡＣＡＣＣ−３’ オリゴＤＸＰ　１を使って同定されたファージクローンから、ＤＬＲＩ。
ＤＸＰＩ、　ＤＸＰ’ｌおよびＤＡＩを含む５．２　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ断片（図 １３中の断片（ｂ））を単離する。
オリゴＤＸＰ４を使って同定されたファージクローンから、ＤＸＲ４゜ＤＡ４お よびＤＫ４を含む３．２　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ断片（図１３中の断片（Ｃ））を単 離する。
図１３中の断片（ｂｌ、　（Ｃ）およびｆｄ）を結合し、ｐＧＰｌのＸｂａＩ／ ＸｈｏＩ部位中にクローニングして、１０．６ｋｂ挿入断片を含むｐＨｌＧ２を 形成せしめる。
このクローニングは連続的に行われる。まず、図１３の５．２ｋｂ断片（ｂｌと 図１３の２．２ｋｂ断片（ｄ）を子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そ してＸｈｏ　Ｉ　ｌ！−Ｘｂａ　Ｉで消化されたｐｃｐｔ中にクローニングする 。
生じたクローンを該５．２ｋｂおよび２．２ｋｂ挿入断片を用いてスクリーニン グする。５．２ｋｂおよび２．２ｋｂ挿入断片での試験に陽性であるそれらのク ローンの半分が、ＢａｍＨＩ消化により確かめると正しい方向で５．２ｋｂ挿入 断片を有する。次いで図１３の３．２　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ断片を、断片（ｂｌと （ｄ）を含むこの中間プラスミド中にクローニングし、ｐＨｌＧ２を形成せしめ る。このプラスミドは、ユニーク５’５ｆｉＩ部位とユニークａ’５ｐｅｒ部位 を有するポリリンカー中にクローニングされた多様性セグメントを含む。完全な ポリリンカーはＮｏｔＩ部位により隣接される。
Ｈ１重鎮小遺伝子座の作製 下記は、ｌまたは複数のＶ上セグメントを含むヒト重鎮小遺伝う座の作製を説明 する。
Ｎｅｗｋ　ｉ　ｒｋ　ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、８１：１５１１−１５ １８　（１９８８）　（これ（ユ参考として本明細書中に組み込まれる）のハイ ブリドーマ中に金目れるＶセグメントとして同定されたものに相当する再配列さ れていない■セグメントを、次のオリゴヌクレオチド：５’　−ＧＡＴ　ＣＣＴ 　ＧＧＴ　ＴＴＡ　ＧＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＧＧＡＴ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＣＡＣＣ ＣＣＴＧＴ　ＧＴＣ−３’を使って単離する。
再配列されていない■セグメントの制限地図を調べて、消化すると３′および５ ′隣接配列と一緒に再配列されていないＶセグメントを含む約２ｋｂの長さを存 するＤＮＡ断片を提供するユニーク制限部位を同定する。５′開始配列はプロモ ーターおよび他の調節配列を含み、一方３′隣接配列はＶ−ＤＪ結合に必要な組 換え配列を提供するだろう。この約３．０ｋｂＶセグメント挿入断片をｐＧＢ２ のポリリンカー中にクローニングし、ｐＶ旧を形成せしめる。
ｐＶ旧を５ｆｉＩで消化し、得られた断片をｐＨｌＧ２の５ｆｉＩ部位にクロー ニングしてｐ）Ｉ［Ｇ５’を作製する。ｐＨｌＧ２はＤセグメントのみを含むの で、生成したｐＨｌＧ５’プラスミドはＤセグメントと一緒に単一の■セグメン トを含む。ｐＨｌＧ５中に含まれる挿入断片のサイズは、１０．６　ｋｔ＋　＋ Ｖ上セグメント入断片のサイズである。
ＮｏｔＩとＳｐｅ　Ｉでの消化によりｐＨＩＧ５から挿入断片を切り出す。
Ｊ、　ｃμおよびＣ７１セグメントを含むｐＨＩＯ３’をＳｐｅ　Ｉ　、！＝Ｎ ｏｔ　Ｉで消化し、そして上記配列とラット３′エンハンサ−とを含む３ｋｂ断 片を単離する。それらの２断片を一緒にして、Ｎｏｔ　Ｉで消化されたｐｃｐ　 ｌ中に連結せしめ、■セグメント、９つのＤセグメント、６つの機能的なＪセグ メント、ｃμ、Ｃγおよびラット３′エンハンサ−を含むｐｉ（ＩＧを作製する 。この挿入断片のサイズは約４３　ｋｂ　＋Ｖセクメント挿入断片のサイズであ る。
■、相同組換えによる重鎮小遺伝子座の作製前の章で指摘したように、ｐＨＩＧ の挿入断片は単一のＶセグメントを使用すると約４３〜４５　ｋｂである。この 挿入断片サイズは、プラスミドベクター中に容易にクローニングすることができ る限界かまたはそれに近い。より多数のＶセグメントの使用に備えるために、接 合子またはＥＳ細胞内での相同組換えによってラット３′エンハンサ−配列、ヒ トＣμ、ヒトＣγｌ、ヒトＪセグメント、ヒトＤセグメントおよび多数のヒトＶ セグメントを含むトランスジエンを形成する、重複ＤＮＡ断片の生体内相同組換 えを下記に記載する。
ヒトＪセグメントを含む６．３　ｋｂ　ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄｌＩ［断片（図９ 中の断片（ａ）を参照のこと）を、次のアダプター：５’　ＧＡＴ　ＣＣＡ　Ａ ＧＣＡＧＴ　３’５’　ＣＴＡ　ＧＡＣＴＧＣＴＴＧ　３’５’　ＣＧＣＧＴＣ ＧＡＡ　ＣＴＡ　３’５’　ＡＧＣＴＴＡ　ＧＴＴ　ＣＧＡ　３’を使って、Ｍ ｌｕＩ／５ｐｅＩで消化された１）ＨＩＧ５’中にクローニングする。
生成したプラスミドをｐｌ（ＩＧ５’０　（重複）と命名する。このプラスミド 中に含まれる挿入断片はヒトＶ、　ＤおよびＪセグメントを含む。
ｐＶ）ＩＩからの単−Ｖセグメントが使われる時１．この挿入断片のサイズは約 １７　ｋｂ　＋２　ｋｂである。この挿入断片を単離し、そしてヒトＪ。
ｃμ、γ１およびラット３′エンハンサ−配列を含むｐ）ｌ　ＩＧ３　’からの 挿入断片と組み合わせる。再挿入断片は、２つのＤＮＡ断片の間の約６．３ｋｂ の重複部分に備えるヒトＪ配列を含む。これらをマウス接合子中に同時注入する と、生体内相同組換えが起こり、ｐ）ＩＩＧ中に含まれる挿入断片と同等のトラ ンスジエンを生成する。
このアプローチは生体内で形成されるトランスジエン中への多数のＶセグメント の付加に備える。例えば、単一のＶセグメントをｐＦ（ＩＧ５　’中に組み込む 代わりに、（１）単離されたゲノムＤＮＡ１２）ゲノムＤＮＡから誘導された連 結ＤＮＡ、または（３）合成■セグメントレパートリ−をコードするＤＮＡ、上 に含まれる多数のＶセグメントをｐＨｌＧ２の５ｆｉＩ部位にクローニングして ｐＨｌＧ５中　Ｖ、を作製する。
次いて図９のＪセグメント断片（ａｌをｐＨ［０５’　Ｖ、中にクローニングし 、そして挿入断片を単離する。この挿入断片は、ｐＨｌＧ３　’から単離した挿 入断片上に含まれるＪセグメントと重複するＪセグメントと多数のＶセグメント を含むようになる。これをマウス接合子の核中に同時注入すると、相同組換えが 起こり、多数のＶセグメントおよび多数のＪセグメント、多数のＤセグメント、 Ｃμ領領域Ｃγｌ領域（全てヒト由来）並びにラット３′エンハンサ−配列をコ ードするトランスジエンを生成する。
ｐＥμＩの作製は図１６に描写される。オリゴ：５’　ＧＡＡ　ＴＧＧ　ＧＡＧ 　ＴＧＡ　ＧＧＣＴＣＴ　ＣＴＣＡＴＡ　ＣＣＣＴＡＴ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＣＴ Ｇ　ＡＣＴ　３　’を使ってファージクローンから６７８　ｂｐのＸｂａ　Ｉ　 −ＥｃｏＲＩ断片（Ｊ。
Ｂａｎｅｒｊｉ　ら、劇旦　３３ニア２９−７４０　（１９８３）　）において マウス重鎮エンハンサ−を単離する。
このＥμ断片を、ＥｃｏＲｒ部位の平滑末端フィルインにより、ＥｃｏＲＶ／Ｘ ｂａＩ消化されたｐＧｐ　ｌ中にクローニングする。生じたプラスミドをｐＥμ ｌと命名する。
Ｂ、に軽鎖小遺伝子座の作製 に構成物は、少なくとも１つのヒトＶにセグメント、５つのヒトＪにセグメント 全部、ヒトＪ−Ｃにエンハンサー、ヒトに定常領域エクソン、および理想的には ヒト３′にエンハンサ−を含む（Ｋ。
Ｍｅｙｅｒら、ＥＭＢＯＪ、　紅１９５９−１９６４　（１９８９））　。マウ スのにエンハンサ−はＣにから９　ｋｂ下流である。しかしながら、ヒトではま だ同定されていない。加えて、該構成物はマウス重鎖Ｊ−Ｃμエンハンサ−の１ コピーも含む。
この小遺伝子座は次の４つの成分断片から作製される：（ａ）マウス遺伝子座と の類推によりヒトＣにエクソンと３′ヒトエンハンサ−とを含む１６　ｋｂ　Ｓ ｍａＩ断片；（ｂ）５つのＪセグメント全部を含む５′隣接５　ｋｂ　ＳｍａＩ 断片：（Ｃ）　ｐ　Ｅμｌから単離されたマウス重鎮イントロンエンハンサ−（ この配列は、Ｂ細胞発達のできるだけ初期に軽鎖構成物の発現を誘導するために 含まれる。重鎮遺伝子は軽鎖遺伝子よりも初期に転写されるため、この重鎮エン ハンサ−はおそらくイントロンにエンハンサ−よりも早い段階で活性であろう。
）；および（ｄ）　１または複数のＶセグメントを含む断片。
この構成物の調製は次の通りである。ヒト胎盤ＤＮＡをＳｍａ　Ｉで消化し、電 気泳動によりアガロース上で分画する。同様に、ヒト胎盤ＤＮＡをＢａｍ旧で消 化し、電気泳動により分画する。Ｓｍａ［で消化したゲルから１６　ｋｂ画分を 単離し、同様にＢａｍＨ［で消化したＤＮＡを含むゲルから１１　ｋｂ領領域単 離する。
１６　ｋｂ　ＳｍａＩ画分を、Ｘｈｏ　Ｉで消化されＸｈｏＩ制限消化生成物を フィルインするためにフレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼで処理されているラムダ ＦＩＸ　ＩＩ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏ ｒｎｉａ）中にクローニングする。１６　ｋｂ　Ｓｍａ　Ｉ画分の連結はＳｍａ 　Ｉ部位を破壊するがＸｈｏ　Ｉ部位はそのまま残す。
１１　ｋｂ　Ｂａｍ８１画分を、クローニング前にＢａｍ旧で消化したラムダＦ ＩＸ　ＩＩ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　、Ｉｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏ ｒｎｉａ）中にクローニングする。
各ライブラリーからのクローンを、Ｃに特異的オリゴ：５’　ＧＡＡ　ＣＴＧ　 ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＣＡＣＣＡＴ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＴＣＴ　ＴＣＣＣＧ ＣＣＡＴ　ＣＴＧ　３’を用いて探査する。
ＣにがＳｍａ　Ｉに隣接するように、１６　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ挿入断片をＸｈｏ 　Ｉで切断されたｐ［Ｅμｍ中にサブクローニングする。生じたプラスミドをｐ Ｋａｐｌ　と命名する。
上記Ｃに特異的オリゴヌクレオチドを用いてλＥＭＢＬ３／Ｂａｍ旧ライブラリ ーを探査し、１１　ｋｂクローンを同定する。５　ｋｂ　ＳｍａＩ断片（図２０ の断片（ｂ））をサブクローニングし、次いでＳｍａ　Ｉで消化されたｐＫａｐ ｌ中に挿入する。正しい方向のＪセグメント、ＣにおよびＥμエンハンサ−を含 むそれらのプラスミドをｐＫａｐ２と命名する。
その後、ｌまたは複数のＶにセグメントをｐＫａｐ２のＭｌｕ　Ｉ中にサブクロ ーニングし、ヒトＶにセグメント、ヒトＪにセグメント、ヒトＣにセグメントお よびヒトＥμエンハンサ−をコードするプラスミドｐＫａｐｔ（を生せしめる。
ｐＫａｐ）（をＮｏｔ　Ｉで消化することによりこの挿入断片を切り出し、そし てアガロースゲル電気泳動により精製する。こうして精製された挿入断片を上述 の如くマウス接合子の前核中にマイクロインジェクトする。
Ｃ１生体内相同組換えによるに軽鎖小遺伝子座の作製Ｉｆ　ｋｂ　ＢａｍＨＩ断 片を、その３′末端が５ｆｉＩ部位の方に向くように、ＢａｍＨＩで消化された ｐＧＰＩ中にクローニングする。生じたプラスミドをｐＫＡＰｉｎｔと命名する 。ｐＫＡＰｉｎｔ中のＢａｍ旧部位とＳｐｅ　Ｉ部位との間のポリリンカー中に １または複数のＶにセグメントを挿入してｐＫａｐＨＶを作製する。ｐＫａｐＨ Ｖの挿入断片をＮｏｔＩでの消化により切り出し、そして精製する。ｐＫａｐ２ からの挿入断片をＮｏｔＩでの消化により切り出し、精製する。それらの２断片 の各々は、ｐＫａｐＨＶからの断片が、ｐＫａｐ２から得られる挿入断片中に含 まれる５　ｋｂ　Ｓｍａ　Ｉ断片と実質的に相同であるＪにセグメントを含む５ ｋｂのＤＮＡ配列を含むという点で、相同性領域を含有する。それ故に、それら の挿入断片は、マウス接合子中にマイクロインジェクトされると相同組換えして 、Ｖに、ＪにおよびＣにをコードするトランスジエンを形成することができる。
実施例６ 免疫グロブリンに軽鎖遺伝子の再配列され発現されるコピーに相当するゲノムク ローンの単離 この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細胞からの免疫グロブリン に軽鎖遺伝子のクローニングを記載する。そのような細胞は、与えられた免疫グ ロブリン遺伝子の多数の対立遺伝子を含み得る。例えば、ハイブリドーマは４コ ピーのに軽鎖遺伝子を含み、その２コピーは融合相手の細胞系からのものであり 、２コピーは着目の免疫グロブリンを発現するもとのＢ細胞からのものである。
それらの４コピーのうち、数個が再配列することができるという事実にもかかわ らず、ただ１つだけが着目の免疫グロブリンをコードする。この実施例に記載の 手順は、に軽鎖の発現コピーの選択的クローニングを考慮したものである。
Ａ、二本鎖ｃＤＮＡ ヒトハイブリドーマもしくはリンパ腫からの細胞、または細胞表面形態もしくは 分泌形態またはその両形態のに軽鎖含有１ｇＭを合成する他の細胞系を、ボＩＪ Ａ’ＲＮＡの単離に使用する。次いで該ＲＮＡを、逆転写酵素を使ったオリゴｄ Ｔ開始ｃＤＮＡの合成に使用する。次いで一本鎖ｃＤＮＡを単離し、ポリヌクレ オチドターミナルトランスフエラーセ酵素を使って３′末端にＧ残基を付加する 。次いでＧ末端が付けられた一本ｉＪｌ　ｃＤＮＡを精製し、そしてプライマー として次のオリゴヌクレオチド： ５’　−ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＣＡＣＴＧＡ　ＣＡＴ　ＡＣＴ　ＧＧＣＡＴＧ　ＣＣ ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’を使った第二鎖合成（ＤＮＡポリメラーゼ酵素によ り触媒される）のための鋳型として用いる。
二本１ｃＤＮＡを単離し、発現される免疫グロブリン分子の重鎮および軽鎖をコ ードするｍＲＮＡの５′末端のヌクレオチド配列を決定するために使用する。次 いで、それらの発現される遺伝子のゲノムクローンを単離する。発現される軽鎖 遺伝子のクローニング方法は、下記のＢ部に要約される。
Ｂ　顎坦 Ａ部に記載された二本鎖ｃＤＮＡを変性せしめ、次のオリゴヌクレオチドブライ マー： ５’　−ＧＴＡ　ＣＧＣＣＡＴ　ＡＴＣＡＧＣＴＧＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＣＡ 　ＴＣＡ　ＧＡＴＧＧＣＧＧＧ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　Ｇ ＧＴ　ＧＣＡ−３’を使った第３巡目のＤＮＡ合成のための鋳型として使用する 。
このプライマーは、に軽鎖情報の定常部分に特異的な配列（ＴＣＡＴＣＡ　ＧＡ Ｔ　ＧＧＣＧＧＧ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＧＧＴ　ＧＣＡ 　）並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使 うことかできるユニーク配列（ＧＴＡ　ＣＧＣＣＡＴ　ＡＴＣＡＧＣＴＧＧ　Ａ ＴＧ　ＡＡＧ　’）　ヲ含む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドブラ イマー＝５’　−ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＣＡＣＴＧＡ　ＣＡＴ　ＡＣＴ　ＧＧＣＡＴ Ｇ　−３’５’　−ＧＴＡ　ＣＧＣＣＡＴ　ＡＴＣＡＧＣＴＧＧ　ＡＴＧ　ＡＡ Ｇ　−３’を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。
ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動により精製し、そしてプライマーとして次 のオリゴヌクレオチド：５’　−ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＣＡＣＴＧＡ　ＣＡＴ　ＡＣ Ｔ　ＧＧＣＡＴＧ　−３’を使うジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使 用する。
次いで、該配列の最初の４２ヌクレオチドを使って、免疫グロブリン情報が転写 された遺伝子を単離するためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成 ４２ヌクレオチドセグメントを、以後０−カッパと称することにする。
［ｇ発現細胞系から単離しそして個別におよびＳｍａ　Ｉを含む幾つかの異なる 制限エンドヌクレアーゼと対に組み合わせて消化したＤＮＡのサザンプロットを 、。Ｐ標識したユニークオリゴヌクレオチド〇−カッパを用いて探査する。ユニ ーク制限エンドヌクレアーゼ部位は、再配列されたＶセグメントの上流に同定さ れる。
次いで１ｇ発現細胞系からのＤＮＡｔ−ＳｍａＩおよび第二の酵素（Ｖセグメン トの内側にＳｍａ　Ｉ部位がある場合にはＢａｍＨＩまたはＫｐｎｌ）て切断す る。いずれかの生成した非平滑末端を７４　ＤＮＡポリメラーゼ酵素で処理し、 平滑末端化ＤＮＡ分子を与える。次いで制限部位をコードするリンカ−（断片中 にどの部位が存在しないかに応じてＢａｍＨＩ、　ＥｃｏＲＩまたはＸｈｏ　Ｉ 　）を付加し、そして対応するリンカ−酵素で切断してＢａｍ）（１，ＥｃｏＲ ｒまたはＸｈｏ　Ｉ末端を有するＤＮＡ断片を与える。次いで該ＤＮＡをアガロ ースゲル電気泳動によりサイズ分画し、発現されるＶセグメントを包含するＤＮ Ａ断片を含む画分をラムダＥＭＢＬ３またはラムダＦＩＸ　（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）中にクローニングする。
ユニークプローブ０−カッパを使って、■セグメント含有クローンを単離する。
陽性クローンからＤＮＡを単離し、そしてｐＫａｐｌのポリリンカー中にサブク ローニングする。生じたクローンをｐＲＫＬと命名する。
実施例７ 免疫グロブリン重鎖μ遺伝子の再配列され発現されるコピーに相当するゲノムク ローンの単離 この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細胞からの免疫グロブリン 重鎖μ遺伝子のクローニングを記載する。この実施例に記載の手順は、μ重鎖遺 伝子の発現コピーの選択的クローニングを考慮したものである。
上述した如く、二本鎖ｃＤＮＡを調製し単離する。この二本鎖ｃＤＮＡを変性せ しめ、次のオリゴヌクレオチドプライマｍ：５’　−ＧＴＡ　ＣＧＣＣＡＴ　Ａ ＴＣＡＧＣＴＧＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣＧＡＧ　ＧＧＧ　 ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＴＧＧ　ＧＧＣＧＧＡ　ＴＧＣ−３’を使った３巡目 のＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。
このプライマーは、μ重鎖情報の定常部分に特異的な配列（ＡＣＡＧＧＡ　ＧＡ ＣＧＡＧ　ＧＧＧ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＴＧＧ　ＧＧＣＧＧＡ　ＴＧＣ） 並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして使うこ とができるユニーク配列（ＧＴＡ　ＣＧＣＣＡＴ　ＡＴＣＡＧＣＴＧＧ　ＡＴＣ ＡＡＧ　）を含む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドブライマー：５ ’　−ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＣＡＣＴＧＡ　ＣＡＴ　ＡＣＴ　ＧＧＣＡＴＧ　−３’ ５’　−ＧＴＡ　ＣＴＣＣＡＴ　ＡＴＣＡＧＣＴＧＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　−３’ を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。
ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動により精製し、そしてプライマーとして次 のオリゴヌクレオチド：５’　−ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＣＡＣＴＧＡ　ＣＡＴ　ＡＣ Ｔ　ＧＧＣＡＴＧ　−３’を使ったジデオキシ配列決定反応のための鋳型として 使用する。
次いで、該配列の最初の４２ヌクレオチドを使って、免疫グロブリン情報が転写 された遺伝子を単離するためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成 ４２ヌクレオチドセグメントを、以後〇−ミューと称することにする。
１ｇ発現細胞系から単離しそして個別におよびＭｌｕｌ　（ＭｌｕＩは、Ｊ・時 グメントとμＣＨＩとの間を開裂する稀少切断性酵素である）を含む幾つかの異 なる制限エンドヌクレアーゼと対に組み合わせて消化したＤＮＡのサザンプロッ トを、ｓａｐ標識したユニークオリゴヌク１．７オチド０−ミューを用いて探査 する。ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位は、再配列されたＶセグメントの上 流に同定される。
次いでｒｇ発現細胞系からのＤＮＡをＭｌｕ　Ｉと第二の酵素で切断する。次い でＭｌｕ　ＩまたはＳｐｅ　Ｉアダプターリンカ−を末端に連結せしめ、切断し て上流部位をＭｌｕ　ＩまたはＳｐｅ　Ｉに変換する。次いで該ＤＮＡをアガロ ースゲル電気泳動によりサイズ分画し、発現されるＶセグメントを包含するＤＮ Ａ断片を含む両分をプラスミドｐｃｐｌ中に直接クローニングする。ユニークプ ローブ０−ミューを使ってＶセグメント含有クローンを単離し、その挿入断片を Ｍｌｕ　ＩでまたはＭｌｕＩ／５ｐｅＩで切断されたプラスミドｐｃＯＮ２中に サブクローニングする。生じたクローンをｐＲＭＧＨと命名する。
に軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡファージラ イブラリーをスクリーニングし、Ｊに−Ｃ領域に及ぶクローンを単離した。Ｊに ｌを含む５．７　ｋｂ　Ｃ１ａ　Ｉ　／　Ｘｈｏ　Ｉ断片をＪに２−５とＣにを 含む１３　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ断片と一緒にｐＧＰｌｄ中にクローニングし、そし てプラスミドｐＫＣ，ｌｏｒを作製するのに使った。このプラスミドは、４．５ ｋｂの５′隣接配列と９　ｋｂの３′隣接配列と共に、Ｊ／Ｃ１−５、にインロ トンエンハンサーおよびＣにを含有する。それはＶセグメントのクローニング用 のユニークな５’ＸｈｏＩ部位と追加のシス作用性調節配列の挿入用のユニーク な３’５ａｌＩ部位も有する。
Ｖに遺伝子 Ｖに軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡファージ ライブラリーをスクリーニングし、ヒトＶにセグメントを含むクローンを単離し た。ＤＮＡ配列分析により機能的Ｖセグメントを同定した。それらのクローンは 、ＴＡＴＡボックス、リーダーと可変性ペプチド（２つのシスティン残基を含む ）をコードする転写解読枠、スプライス配列、および組換えヘプタマー−１２ｂ スペーサー−ノナマー配列を含有する。該クローンのうちの３つをマツピングし 、配列決定した。該クローンのうちの２つ、６５．５と６５．８が機能的であり 、それらがＴＡＴＡボックス、リーダーと可変性ペプチド（２つのシスティン残 基を含む）をコードする転写解読枠、スプライス配列、および組換えヘプタマー −１２ｂスペーサー−ノナマー配列を含有すると思われる。３つめのクローン６ ５．４は、非規準的組換えヘプタマーを含むことからＶにＩ偽遺伝子をコードす ると忠われる。
Ｖｋｌｌ＋ファミリー遺伝子をコードする機能的クローンのうちの１つＶＭ　６ ５−８を使って軽鎖小遺伝子座構成物を作製した。
１）ＫＣＩ Ｖに６５−８を含む７．５　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　／　Ｓａｔ　Ｉ断片をｐＫｃｏ ｒの５’ＸｈｏＩ部位に挿入することにより、に軽鎖小遺伝子座ｐＫｃ１　（図 ３２）を作製した。注入前にＮｏｔＩての消化により該トランスジエン挿入断片 を単離した。
精製した挿入断片を、受精した（Ｃ５７ＢＬ／６　Ｘ　ＣＢＡ）　Ｆ　２マウス 胚の前核中にマイクロインジェクトし、次いでＨｏｇａｎら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｏｆＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ、１９８６ ．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ）に記載の通りに、生存している胚を偽妊娠雌に移した。注入された 胚から発育したマウスを、尾部ＤＮＡのサザンプロット分析によりトランスジエ ン配列の存在について分析した。既知量のクローン化ＤＮＡを含有する対照標準 に比較したバンド強度により、トランスジエンコピー数を評価した。それらの動 物から血清を単離し、そしてＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ　（Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　１９８８．　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）により記載された通りに、トランスジエンによりコードされ るヒト１ｇにタンパク質の存在についてＥＬＩＳＡにより分析した。
マイクロタイタープレートウェルをヒトＩｇに（クローン６Ｅ１゜＃０１７３． 　ＡＭＡＣＩｎｃ、、　Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、　ＭＥ　）　、ヒトＩｇＭ　（ク ローンＡＦ６゜＃０２８５．　ＡＭＡＣＩｎｃ、、　Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、　Ｍ ＩＥ　）およびヒトｔｇＧ１　（クローンＪＬ５１２．　＃０２８０．ＡＭＡＣ Ｉｎｃ、、　Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、　ＭＥ　）に特異的なマウスモノクローナル 抗体でコーティングした。血清試料を該ウェル中に系列希釈し、そしてマウス免 疫グロブリンとの交差反応性を最少にするために予備吸着されているアフィニテ ィー精製済アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇ（多価）を使って特定の 免疫グロブリンの存在を検出した。
図３５は、８匹のマウス（１，Ｄ、　＃６７６、６７４．６７３．６７０．６６ ６、６６５゜６６４および４９６）からの血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を示 す。それらのマウスの最初の７匹はｐＫｃｌ　）ランスジエン挿入断片が注入さ れた胚から発育し、そして８番目のマウスはｐＨ０１トランスジエン（前記）の マイクロインジェクションにより生まれたマウスに由来する。
ｐＫＣ１注入胚からの７匹のマウスのうちの２匹（［、Ｄ、　＃６６６と６６４ ）は、ＤＮＡサザンプロット分析により分析するとトランスジエン挿入断片を含 んでおらず、５匹（ＣＤ、　＃６７６、６７４．６７３．６７０および６６５） は該トランスジエンを含んでいた。ｐＫｃｌ　）ランスジエン陽性動物の一匹を 除（全てが検出可能なレベルのヒトＩｇにタンパク質を発現し、残りの一匹の非 発現性動物はＤＮＡサザンプロット分析に基づくと遺伝的モザイクであるらしい 。ｐｉ（Ｃ１陽性トランスジェニックマウスはヒトＩｇＭとＩｇＧ１を発現する がＩｇにを発現せず、これは該アッセイに使用する試薬の特異性を証明する。
ＫＣ２ Ｖ／Ｃ６５，５を含む８　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　／ＳａＬ　Ｉ断片を９ＫＣ１（７ ）　５　’　Ｘｈｏ　Ｉ部位に挿入することにより、に軽鎖小遺伝子座ｐＫＣ２ を作製した。２つのＶにセグメントを含む生成トランスジエン挿入断片をマイク ロインジェクション前にＮｏｔＩでの消化により単離した。
ＫＶｅ２ この構成物は、Ｊにの５′に１．２ｋｂの追加配列を含みそしてＶに６５．８の ３′の４．５ｋｂの配列を欠いていること以外は、ｐＫｃｌと同じである。該構 成物は更に、マウス重鎖Ｊ−ｍイントロンエンハンサ−（Ｂａｎｅｒｊｉ　ら、 Ｃｅ１ｌ　３３ニア２９−７４０　（１９８２）　）を含む０．９　ｋｂ　Ｘｂ ａ　Ｉ断片と、下流に挿入されたヒト重ｔｌＪ−ｍイントロンエンハンサ−（ｔ （ａｙｄａｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３０７：３３４−３４０　（１９８４））を含 む１，４　ｋｂ　Ｍｌｕ　Ｉ　−旧ｎｄｌＩ［断片を含有する。この構成物を、 対立遺伝子排除とイソタイプ排除を果たす軽鎖小遺伝子座の初期再配列を開始す る可能性について試験する。異なるエンハンサ−１即ちマウスまたはラットの３ ′にまたは重鎮エンハンサ−（ＭｅｙｅｒおよびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ、　ＥＭＢ ＯＪ、８：１９５９−１９６４　（１９８９）　；　Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎら、Ｎ ａｔｕｒｅ　３４４：１６５−１６８　（１９９０）　；これらは参考として本 明細書中に組み込まれる〕を有する類似構成物を作製することができる。
再配列された軽鎖トランスジエン ヒトＢ細胞ＤＮＡからＰＣＲにより増幅され機能的に再配列された軽鎖遺伝子を 再構成するためにに軽鎖発現カセットをデザインした。方策を図３３に示す。Ｐ ＣＲ増幅させた軽鎖遺伝子を、に軽鎖遺伝子６５．５から単離した３、７ｋｂの ５′隣接配列を含むベクターｐＫＳｎｘ中にクローニングする。次いで、Ｊに２ −４、Ｊにイントロンエンハンサ−１Ｃにおよび９　ｋｂの下流配列を含むベク ターｐＫ３１ｓのユニークＸｈｏ　Ｉ部位中に、５′転転写節配列に融合させた ＶＪ上セグメントクローニングする。生じたプラスミドは、再構成された機能的 に再配列されたに軽鎖トランスジエンを含有し、このトランスジエンは胚へのマ イクロインジェクションのためにＮｏｔ　Ｉで切り出すことができる。該プラス ミドは追加のシス作用性調節配列の挿入のために３′末端にユニーク５ａｌＩ部 位も含有する。
ヒト牌臓ゲノムＤＮＡ由来の再配列されたに軽鎖遺伝子を増幅せしめるのに２つ の合成オリゴヌクレオチド（ｏ−１３０，ｏ−１３１）を使った。オリゴヌクレ オチドｏ−１３０（ｇｇａ　ｃｃｃ　ａｇａ　（ｇ、ｃ）ｇｇ　ａａｃ　ｃａｔ 　ｇｇａａ（ｇ、　ａ）（ｇ、　ａ、　ｔ、　ｃ）　）は、Ｖに■ファミリー軽 鎖遺伝子の５′領域に相補的でありそしてリーダー配列の最初のＡＴＣと重複し ている。
オリゴヌクレオチドｏ−１３１（ｇｔｇ　ｃａａ　ｔｃａ　ａｔｔ　ｃｔｃ　ｇ ａｇ　ｔｔｔ　ｇａｃ　ｔａｃａｇａ　ｃ　）は、Ｊにｌの約１５０ｂｐ３’よ りの配列に相補的であり、イＸｈｏ　Ｉ部位を含む。それらの２つのオリゴヌク レオチドは、Ｊに１セグメントに連結された再配列されたＶに■遺伝子に相当す るヒト牌１１！１ＤＮＡからの０．７ｋｂのＤＮＡ断片を増幅する。ＰＣＲ増幅 されたＤＮＡをＮｃｏ　ＩとＸｈｏ　Ｉで消化し、個々のＰＣＲ生成物をプラス ミドｐＮＮＯａ中にクローニングした。５つのクローンのＤＮＡ配列を決定する と、機能的ＶＪ連結（転写解読枠）を有する２つのクローンが同定された。追加 の機能的に再配列された軽鎖クローンも収集される。機能的に再配列されたクロ ーンは上記軽鎖発現カセット（図３３）中に個別にクローニングすることができ る。再配列された軽鎖構成物を用いて生産されたトランスジェニックマウスを重 鎮小遺伝子座トランスジェニックマウスと交配せしめることにより、−次レパー トリ−の多様性の全てが重鎮により与えられる完全にヒトの抗体のスペクトルを 発現するマウス株を生産することができる。
軽鎖多様性の１つの起源は体細胞突然変異からであることかできる。
全ての軽鎖が様々な異なる重鎮と結合する能力に関して同等であるわけではない ので、各々が異なる軽鎖構成物を含有する異なるマウス株を生成せしめ試験する ことができる。この方策の利点は、再配列されていない軽鎖小遺伝子座の使用と は反対に、容易に重鎮と対を作りすぐに重量ＶＤＪ連結か起こるような軽鎖を有 することから生まれる軽鎖対立遺伝子およびイソタイプ排除の増加である。この 組み合わせは、完全にヒトの抗体を発現するＢ細胞の頻度の増加をもたらし、か くしてヒト１ｇ発現性ハイブリドーマの単離を容易にすることができる。
プラスミドｐＩＧＭＩ、　ｐＨＣｌ、　ｐｌＧＨｌ、　ｐＫｃｌおよびｐＫＣ２ のＮｏｔＩ挿入断片をアガロースゲル電気泳動によりベクター配列から単離した 。精製されたそれらの挿入断片を、受精した（Ｃ５７ＢＬ／６　ｘ　ＣＢＡ）　 Ｆ２マウスの前核中にマイクロインジェクトし、そしてＨｏｇａｎらにより記載 された通りに［Ｈｏｇａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎ ｇ　ｔｈｅ　ＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８６））　、生存してい る胚を偽妊娠雌中に移した。
実施例９ 相同組換えによるマウスに軽鎖遺伝子の不活性化この実施例は、胎児性幹（ＥＳ ）細胞中での相同組換えによるマウス内因性に遺伝子座の不活性化に次いで、不 活性化されたに対立遺伝子を存する標的ＥＳ細胞を初期マウス胚（胚盤胞）中に 注入することによるマウス生殖細胞系中への変異遺伝子の導入を記載する。
方策は、Ｊに遺伝子とＣにセグメントに及ぶ遺伝子座の４．５ｋｂセグメントが 削除されそして選択マーカーｎｅｏにより置き換えられているマウスに遺伝子座 に相同なりＮＡ配列を含むベクターを用いた相同組換えによりＪに遺伝子とＣに 遺伝子を欠失せしめることである。
に標的ベクターの作製 プラスミドｐＧＥＭ７（ＫＪＩ）　（Ｍ、Ａ、　Ｒｕｄｎｉｃｋｉ、　Ｗｈｉｔ ｅｈｅａｄ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）は、クローニングベクター７２ｆ（＋）中の マウスホスホグリセレートキナーゼ（ｐｇｋ）プロモーター（Ｘｂａ　Ｉ　／Ｔ ａｑ　Ｉ断片；Ａｄｒａ、　Ｃ，Ｎ、ら、Ｇｅｎｅ　６０：６５−７４　（１９ ８７）　）の転写調節下に、トランスフェクトされたＥＳ細胞の薬剤選択に使う ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含む。
このプラスミドは、マウスｐｇｋ遺伝子の３′領域に由来する、ｎｅ。
遺伝子にとって異種のポリアデニル化部位（ＰｖｕＩ［／　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ断片 ；Ｂｏｅｒ、　Ｐ、Ｈ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２８ ：２９９−３０８　（１９９０）　）　も含む。このプラスミドをに標的ベクタ ーの作製のための出発点として使った。第一段階はｎｅｏ発現カセットの３′の に遺伝子座に相同な配列を挿入することであった。
Ｃに遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ：５　’　−ＧＧＣＴＧＡ 　ＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴ　ＡＴＣＣＡＴ　ＣＴＴ　ＣＣＣＡＣＣＡＴ ＣＣＡＧ　−３’ とＪに遺伝子セグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ二５　’　−Ｃ ＴＣＡＣＧ　ＴＴＣＧＧＴ　ＧＣＴ　ＧＧＧ　ＡＣＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　 ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣＧＴＡＡＧ　−３’ を使って、肝臓ＤＮＡから誘導されたゲノムファージライブラリーから、マウス に鎖配列（図２０ａ）を単離した。
陽性ファージクローンから２断片において、即ち１．２　ｋｂ　ＢｇｌＩ［／Ｓ ａｃ　Ｉ断片と６．８　ｋｂ　５ａｃＩ断片として、マウスＣにセグメントの３ ′に及ぶ８　ｋｂ　Ｂｇｌ　ＩＩ　／　Ｓａｃ　Ｉ断片を単離し、それをＢｇｌ 　ＩＩ　／　Ｓａｃ　Ｉで消化されたｐＧＥＭ（ＫＪＩ）中にサブクローニング し、プラスミドｐＮＥＯ−に３　’を作製した（図２０ｂ）。
Ｊに領域の５′に及ぶ１．２　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／　ｓｐｈ　Ｉ断片も陽性ファ ージクローンから単離した。この断片のＳｐｈ　Ｉ部位にｓｐｈ　Ｉ　／　Ｘｂ ａ　Ｉ　／Ｂｇｌ　ＩＩ　／　ＥｃｏＲ１了ダブターを連結せしめ、生じたＥｃ ｏＲＩ断片をｎｅｏ遺伝子および下流の３′に配列と同じ５′→３′方向で、Ｅ ｃｏＲＩで消化されたｐＮＥｏ−に３’　に連結せしめ、ｐＮＥＯ−に５’３’ 　（図２０Ｃ）を作製した。
次いで、Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３虹３４８−３５２　（１９８８ ）　（これは参考として本明細書中に組み込まれる）により記載されたようにし て、相同組換え体を有するＢＳクローンの富化に備えるために、該構成物中に単 純ヘルペスウィルス（Ｈ３Ｖ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を含めた。プラ スミドｐＧＥＭ７（ＴＫ）からＨ３Ｖ　ＴＫカセットを得た。このカセットは、 ｐＧＥＭ７（ＫＪＩ）について上述したのと同様に、マウス１ビｋプロモーター とポリアデニル化配列とにより隣接されたＨ３Ｖ　ＴＫ遺伝子の構造配列を含む 。９ＧＢＭ７（ＴＫ）のＥｃｏＲ（部位をＢａｍ１（Ｉ部位に変更し、そしてＴ ＫカセットをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片として切り出し、ｐＧＰｌｂ中に サブクローニングしてｐＧＰｌｂ−ＴＫを作製した。このプラスミドをＸｈｏ　 Ｉ部位のところで線状化し、Ｊにの５′からのゲノム配列とＣにの３′からのゲ ノム配列とにより隣接されたｎｅｏ遺伝子を含む、ｐＮＥＯ−に５’　３°由来 のＸｈｏ　Ｉ断片をｐＧＰｌｂ−ＴＫ中に挿入し、標的ベクターＪ／ＣＫｌ　（ 図２０ｄ）を作製した。Ｊ／ＣＫｌを用いた相同組換え後のゲノムに遺伝子座の 推定構造を図２０ｅに示す。
に対立遺伝子の標的不活性化によるＢＳ細胞の作製および分析使用したＥＳ細胞 は、本質的には記載された通りに（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｅ。
Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｅ、Ｊ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（Ｏｘｆｏｒｄ：　ＩＲＬ　 Ｐｒｅｓｓ）　７１−１１２頁（１９８７））　、分裂上不活性な５ＮＬ７６／ ７支持細胞層（ＭＣＭａｈＯｎおよびない。特異的な標的変異を有するＢＳ細胞 からマウス系統をうまく作製できるのは、ＢＳ細胞の多分化能性（即ち、宿主胚 盤胞中に注入されれば、胚形成に参加することができ且つ生じた動物の生殖細胞 に貢献することができるそれらの能力）に依存している。
任意の与えられたＢＳ細胞系の多分化能性は、培養時間およびそれに取り払った 注意によって異なり得る。多分化能性についての唯一の決定的アッセイは、使用 することになっているＢＳ細胞の特定集団かＥＳゲノムの生殖細胞伝達を行うこ とができるキメラ体を生成することができるかどうかを決定することである。こ の理由により、遺伝子標的の前に、ＡＢ−１細胞の親集団の一部をＣ５７Ｂ１／ ６Ｊ胚盤胞中に注入し、該細胞がキメラマウスを生成できるかどうか、およびそ れらのキメラ体の大部分がＥＳゲノムを子孫に伝達できるかどうかを確かめる。
に鎖不活性化ベクターＪ／ＣＫｌをＮｏｔＩで消化し、そして記載された方法（ Ｈａｓｔｙ、　Ｐ、Ｒ，ら、Ｎａｔｕｒｅ　３５虹２４３−２４６　（１９９１ ））によりＡＢ−１細胞中にエレクトロボレートせしめた。エレクトロボレート された細胞を１００　ｍ皿上に２〜５Ｘ１０’細胞／皿の密度で塗抹した。
２４時間後、Ｇ４１８　（２００ｔｔｇ／ｍｌの活性成分）およびＦＩＡＵ　（ ０，５μＭ）を培地に添加し、１０〜１１日に渡り薬剤耐性クローンを発達させ た。
クローンを採取し、トリプシン処理し、２部分に分け、更に増殖させた。次いで 、各クローンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配列との 間の相同組換えについて分析した。
サザンブロットハイプリダイゼーションによりＤＮＡ分析を行った。記載の如＜ 　（Ｌａｉｒｄ、　Ｐ、Ｗ、ら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１９：４２ ９３（１９９１））クローンからＤＮＡを単離し、Ｘｂａ　Ｉで消化し、そして 標特的プローブとして図２０ｅに指摘の８００　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断 片を用いて探査した。このプローブは野生型遺伝子座中の３．７　ｋｂ　Ｘｂａ Ｉ断片、および標的ベクターと相同組換えされた遺伝子座中の標徴的な１．８ｋ ｂバンドを検出した（図２０８およびｅを参照のこと）。サザンプロット分析に よりスクリーニングした９０１個のＧ４ｔ８およびＦＩＡＵ耐性クローンのうち 、７つのクローンがに遺伝子のうちの１つへの相同組換えを示す１．８　ｋｂ　 ＸｂａＩバンドを表した。それらの４つのクローンを更にＢｇｌＩＩ、　５ａｃ ＩおよびＰｓｔＩ酵素で消化し、に遺伝子のうちの１つに該ベクターが相同的に 組み込まれたことを確認した。標徴的８００　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａ　Ｉ断 片（プローブＡ）を用いて探査すると、野生型ＤＮＡのＢｇｌＩＩ、　５ａｃＩ およびＰｓｔＩ消化物がそれぞれ４，１．５．４゜および７ｋｂの断片を生成し 、一方探的されたに対立遺伝子の存在はそれぞれ２．４．７．５および５．７ｋ ｂの断片により指摘された（図２０ａおよびｅを参照のこと）。Ｘｂａ　Ｉ消化 物により検出された７つの陽性クローンの全てが、に軽鎖のところでの相同組換 えに標徴的である前の章で記載した標的されたＢＳクローンのうちの５つを、記 載の如＜　（Ｂｒａｄｌｅｙ、Ａ、、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎ ｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ ｐｐｒｏａｃｈ、　Ｅ、Ｊ、　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（Ｏｘｆｏｒｄ：　［ＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、　１１３−１５１頁（１９８７））　Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ胚盤胞中 に注入し、そして偽妊娠雌の子宮に移し、注入ＥＳ細胞から誘導された細胞と宿 主の胚盤胞との混合物に由来するキメラマウスを作製する。黒ｃ）Ｃ５７Ｂ１／ ６Ｊ背景上において、ＵＳ細胞系由来のアグーチ皮膜着色の量により、キメラ体 へのＢＳ細胞の貢献の程度を外観的に同定する。標的クローンの胚盤胞注入から 得られた子孫のほぼ半分がキメラであり（即ち、アグーチ並びに黒い着色を示し た）、それらの大部分が皮膜着色への過剰のＥＳ細胞の貢献（７０％以上）を示 した。ＡＢＩ　ＥＳ細胞はＸＹ細胞系であり、それらの高率キメラ体の大部分が 、コロニー形成された雄ＢＳ細胞による雌胚の性転換のために雄であった。雄の キメラをＣ５７ＢＬ／６Ｊと交配させ、ＵＳゲノムの生殖細胞伝達の指標である 優性のアグーチ皮膜色の存在について子孫を観察する。それらのクローンのうち の２つからのキメラ体が一貫してアグーチ子孫を生産した。
に遺伝子座の唯一のコピーが注入ＥＳクローンに標的されたので、各アグーチ子 孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを５０％有した。尾部生検試料からのＢｇｌ 　Ｉ［消化ＤＮＡのサザンプロット分析により、標的ＢＳクローンの同定に用い たプローブ（プローブＡ、図２０ｅ）を使って、標的遺伝子のスクリーニングを 行った。予想通り、アグーチ子孫の約５０％が４．１ｋｂの野生型バンドに加え て２．４ｋｂのノ１イプリダイズするＢｇｌＩ［バンドを示した。この結果は、 標的されたに遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。
該変異に対して同型接合性のマウスを生成せしめるために、異型接合体同士を交 配し、そして上述のようにして子孫のに遺伝子型を決定した。予想通り、異型接 合体交配から３つの遺伝子型が誘導された：２コピーの正常に遺伝子座を有する 野生型マウス、１コピーの標的に遺伝子と１つのＮＴに遺伝子を有する異型接合 体、およびに変異に対して同型接合性であるマウス。それらの後者のマウスから のに配列の欠失は、Ｊにに特異的なプローブ（プローブＣ１図２０ａ）を使った サザンブロットハイプリダイゼーションにより確認した。該Ｊにプローブのハイ ブリダイゼーションは異型接合性子孫と野生型子孫からのＤＮＡ試料に観察され たが、一方で同型接合体には全くハイブリダイゼーションシグナルが検出されな かった。これは、標的変異の結果としての欠失によりに遺伝子座の両方のコピー が不活性化されている新規マウス株の発生を証明する。
実施例１Ｏ 相同組換えによるマウス重鎮遺伝子の不活性化この実施例は、胎児性幹（ＢＳ） 細胞中での相同組換えによる内因性マウス免疫グロブリン重鎮遺伝子の活性化を 記載する。方策は、Ｊ□領領域削除されそして選択マーカー遺伝子ｎｅｏにより 置き換えられている重鎮配列を含むベクターとの相同組換えにより内因性重鎖Ｊ セグメントを欠失せしめることである。
重鎮標的ベクターの作製 Ｊ、４特異的オリゴヌクレオチドプローブ：５’　−ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＣＴＡ　 ＴＧＧ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＧＧＧ　ＧＴＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　Ｔ ＣＡＣＣＧ　−３’ を使って、Ｄ３　ＥＳ細胞系ＣＧｏｓｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ。
肚鉦紅　蔓：９０６５−９０６９　（１９８６）　）から誘導されたゲノムファ ージライブラリーから、Ｊ、領域を含むマウス重鎮配列（図２１ａ）を単離した 。
Ｊ、領域に及ぶ３．５ｋｂのゲノム５ａｃＩ／５ｔｕＩ断片を陽性ファージクロ ーンから単離し、それを５ａｃＩ／ＳｍａＩで消化されたｐＵｃ１８中にサブク ローニングした。生じたプラスミドをｐｕｃ１８　ＪＨと命名した。
トランスフェクトされたＢＳ細胞の薬剤選別に用いるネオマイシン耐性遺伝子（ ｎｅｏ）は、プラスミドｐＧＥＭ７　（ＫＪＩ）の修復変形から誘導された。文 献中の報告ＣＹｅｎｏｆｓｋｉら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。
８７：　３４３５−３４３９　（１９９０））は、９６８Ｍ７　（ＫＪＩ）中に 使用されるｎｅｏ遺伝子の源として働いたｐＭｃｌｎｅｏ　（Ｔｈｏｍａｓおよ びＣａｐｐｅｃｈｉ、　Ｃｅ１ｌ　５１：５０３−５１２　（１９８７））を含 む幾つかの常用の発現ベクターのｎｅｏコード配列の点変異を証明している。こ の変異はｎｅｏ遺伝子産物の活性を減少させるが、該変異を含む制限断片を野生 型ｎｅｏクローンからの対応配列と置き換えることにより修復された。９６８Ｍ ７　（ＫＪＩ）中のＨｉｎｄＩＩ［部位を合成アダプターの付加によって５ａｌ Ｉ部位に変更し、そしてＸｂａｌ／５ａｌＩでの消化によりｎｅｏ発現カセット を切り出した。
次いでｎｅｏ断片の両端をＤＮＡｐｏｌＩのフレノウ形での処理により平滑末端 化し、ｐＵｃ１８　Ｊ、のＮａｅ　Ｉ部位中にサブクローニングし、プラスミド ｐＵｃ１８　Ｊ　ｎ−ｎｅＯ（図２１ｂ）を作製した。
標的ベクターの更なる作製は、プラスミドｐＧＰｉｂの誘導体において行った。
ｐＧＰＩｂを制限酵素Ｎｏｔｌで消化し、アダプターとして次のオリゴヌクレオ チド： ５’　−ＧＧＣＣＧＣＴＣＧ　ＡＣＧ　ＡＴＡ　ＧＣＣＴＣＧ　ＡＧＧ　ＣＴＡ 　ＴＡＡ　ＡＴＣＴＡＧ　ＡＡＧＡＡＴ　ＴＣＣＡＧＣＡＡＡ　ＧＣＴ　ＴＴＧ 　ＧＣ−３’と連結せしめた。
生じたプラスミド（ｐＧＥＴと命名）を使ってマウス免疫グロブリン重鎮標的構 成物を構築した。
Ｍａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３飢３４８−３５２　（１９８８）により 記載されたようにして、相同組換え体を有するＥＳクローンの富化に備えるため に、該構成物中に単純ヘルペスウィルス（ｌ（ＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ） 遺伝子を含めた。プラスミドｐＧＥＭ（ＴＫ）からＥｃｏＲＩ　とＨｉｎｄｌｌ Ｉでの消化によりＨＳＶ　ＴＫ遺伝子を得た。このＴＫ　ＤＮＡ断片をｐＧＭＴ のＥｃｏＲ１部位と旧ｎｄＩ［Ｉ部位との間にサブクローニングし、プラスミド ｐＧＭＴ−ＴＫ（図２１　ｃ　）を作製した。
標的配列に対する広範な相同性領域を提供するために、陽性ゲノムファージクロ ーンからＸｈｏ　ＩでのＤＮＡの限定消化およびＸｂａ　Ｉでの部分消化により 、Ｊ、領域の５′に位置する５、９ｋｂのゲノムＸｂａＩ／ＸｈｏＩ断片を誘導 した。図２１ａに示されるように、このＸｂａ　Ｉ部位はゲノムＤＮＡ中には存 在せず、むしろ陽性ファージクローン中のクローン化ゲノム重鎖挿入断片にすぐ に隣接するファージ配列から誘導される。この断片をＸｂａＩ／ＸｈｏＩで消化 されたｐＧＭＴ−ＴＫ中にサブクローニングし、プラスミドｐＧＭＴ−ＴＫ−Ｊ 、　５°（図２１ｄ）を作製した。
作製の最終段階は、ｎｅｏ遺伝子および隣接するゲノム配列を含むｐＵｃ１８　 Ｊ　Ｈ−ｎｅＯからの２．８　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片の切除を含んだ。この断片 をクレノウボリメラーゼにより平滑末端にし、同様に平滑末端化されたｐＧＭＴ −ＴＫ−Ｊ　Ｈ５’のＸｈｏ　Ｉ部位中にサブクローニングした。生じた構成物 Ｊ。Ｋｏｌ（図２１ｅ）は、Ｊ、遺伝子座を隣接する６、９ｋｂのゲノム配列を 含み、ｎｅｏ遺伝子が中に挿入されているＪ、領域に及ぶ２．３ｋｂの欠失を存 する。図２１ｆは、標的用構成物との相同組換え後の内因性重鎮遺伝子の構造を 示す。
実施例１１ 標的されたＢＳ細胞の生産および分析 本質的には記載された通りに（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｅ、Ｊ、（１９８７）　 Ｔｅｒａｔｏ−ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ 　Ｃｅ１ｌｓ゛Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ。
Ｅ、Ｊ、　Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（Ｏｘｆｏｒｄ二ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、　７ １−１１２頁）、分裂上不活性な５ＮＬ７６／７支持細胞層（ＭｃＭａｈｏｎお よびＢｒａｄｌｅｙ、　Ｃｅ１ｌ　６２：１０７３−１０８５　（１９９０）） 　上テＡＢ−Ｉ　ＥＳ細胞を増殖させた。前の実施例に記載した通り、標的指向 性構成物Ｊ。ＫＯＩにょるＥＳ細胞のエレクトロポレーションの前に、εＳゲノ ムの生殖細胞伝達能力を存することが証明されたＡＢ−１由来のキメラの作製に より、ＢＳ細胞の多分化能性を決定した。
重鎮不活性化ベクターＪＪＯＩをＮｏｔＩで消化し、そして記載された方法ＣＨ ａｓｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３５０：　２４３−２４６　（１９９１）　）によ りＡＢ−１細胞中にエレクトロボレートせしめた。エレクトロボレートされた細 胞を１００　ｒｒｍ皿上に１〜２Ｘ１０”細胞７皿の密度で塗抹した。２４時間 後、Ｇ４１８　（２００ｔｒｒｇ／ｍｌの活性成分）およびＦＩＡＵ　（０，５ ｍＭ）を培地に添加し、８〜ｌＯ日間に渡り薬剤耐性クローンを発達させた。ク ローンを採取し、トリプシン処理し、２部分に分け、更に増殖させた。
次いで、各クローンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配 列との間の相同組換えについて分析した。
サザンブロットハイプリダイゼーションによりＤＮＡ分析を行った。記載の如＜ 　（Ｌａｉｒｄら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１９：４２９３　（１９ ９１））クローンからＤＮＡを単離し、Ｓｔｕ　Ｉで消化し、そしてプローブＡ として図２１ｆに示される５００　ｂｐ　１ＥｃｏＲＩ／５ｔｕＩ断片を用いて 探査した。このプローブは野生型遺伝子座中の４，７　ｋｂ　５ｔｕＩ断片を検 出し、一方で３　ｋｂバンドは標的指向ベクターと内因性配列の相同組換えに標 徴的である（図２１ａおよびｆを参照のこと）。サザンブロットハイプリダイゼ ーションによりスクリーニングした５２５個のＧ４１８およびＦＩＴＵ二重耐性 クローンのうち、１２個が標的指向ベクターとの組換えに標微的な３　ｋｂ断片 を含むことがわかった。それらのクローンがＪ、遺伝子座のところに期待の標的 現象（図２１ｆに示されるような）を示すことは、Ｈｉｎｄｎ［、Ｓｐｅ　Ｉお よびＨｐａ　Ｉでの更なる消化により確認された。旧ｎｄＩ［Ｉ、Ｓｐｅ　Ｉお よびＨｐａ　Ｉで消化されたＤＮＡのサザンプロットへのプローブＡ（図２１ｆ 参照）のハイブリダイゼーションは、野生型遺伝子座についてはそれぞれ２．３ 　ｋｂ、　＞　１０　ｋｂおよび＞１０ｋｂのバンドをもたらし、一方探的され た重鎮遺伝子座についてはそれぞれ５．３　ｋｂ、　３．８　ｋｂおよび１．９ ｋｂのバンドが予想される（図２１ｆ参照）。Ｓｔｕ　Ｉ消化物により検出され た１２個の陽性クローンの全てが、標的Ｊ、遺伝子に標徴的な推定Ｈｉｎｄｌ［ Ｉ、Ｓｐｅ　Ｉおよび１ＩｐａＩバンドを示した。加えて、ｎｅｏ−特異的プロ ーブ（プローブＢ、図２１　ｆ　）を使った１２個のクローン全てのＳｔｕ　Ｉ 消化物のサザンプロット分析は３ｋｂの推定断片のみを生じ、それらのクローン か各々標的指向ベクターの単一コピーを合作することを証明した。
Ｊ、欠失を有するマウスの作製 前の章で記載した標的されたＥＳクローンのうちの３つを解凍し、ＩＲＬ　Ｐｒ ｅｓｓ）、　＋１３−１５１頁（１９８７））　Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ胚盤胞中に注 入し、そして偽妊娠雌の子宮に移した。黒色Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ背景上において、 ＥＳ細胞系由来のアグーチ皮膜着色の量から、キメラ体へのＥＳ細胞の貢献の程 度を外観的に同定する。２つの標的クローンの胚盤胞注入から得られた子孫のほ ぼ半分がキメラであり（即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した）、３つ目の標 的クローンはキメラ動物を生じなかった。それらのキメラ体の大部分が皮膜着色 へのＢＳ細胞のかなりの貢献度（７０％以上）を示した。ＡＢＩ　ＥＳ細胞はＸ Ｙ細胞系であり、キメラ体の大部分は、コロニー形成された雌胚が雄ＥＳ細胞に より性転換されたために雄であった。雄キメラをＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌と交配させ 、ＥＳゲノムの生殖細胞伝達の標徴である優性のアグーチ皮膜色の存在について 子孫を観察する。それらのクローンのうちの両方からのキメラ体か一貫してアグ ーチ子孫を生産した。重鎮遺伝子座の唯一のコピーが注入ＥＳクローン中に標的 されたので、各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを５０％有した。
尾部生検試料からのＳｔｕ　Ｉ消化ＤＮＡのサザンプロット分析により、標的Ｂ Ｓクローンの同定に用いたプローブ（プローブＡ、図２１ｆ　）を使って、標的 遺伝子のスクリーニングを行った。予想通り、アグーチ子孫の約５０％が４．７ ｋｂの野生型バンドに加えて約３　ｋｂのハイブリダイズするＳｔｕ　Ｉバンド を示した。この結果は、標的されたＪ、遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。
該変異に対して同型接合のマウスを作製するために、異型接合体同士を交配し、 そして上述のようにして子孫の重鎮遺伝子型を決定した。予想通り、異型接合体 交配から３つの遺伝子型が誘導された２コピーの正常Ｊ、遺伝子座を有する野生 童マウス、該遺伝子の１つの標的コピーと１つの正常コピーを有する異型接合体 、およびＪＨ変異に対して同型接合であるマウス。それらの後者のマウスからの Ｊ、配列の欠失は、Ｊ、に特異的なプローブ（プローブＣ１図２１ａ）を使った サザンブロットハイプリダイゼーションにより確認した。
異型接合性子孫と野生型子孫からのＤＮＡ試料において４．７ｋｂ断片へのＪ、 プローブのハイブリダイゼーションが観察されたが、一方てＪ。変異体同型接合 体からの試料には全くシグナルが検出されなかった。これは、Ｊ、配列の欠失に より重鎮遺伝子の両方のコピーか変異されている新規マウス株の生成を証明する 。
プラスミドｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩとｓｔｙ工で消化し、そして次のオリゴヌ クレオチド・ オリゴ−４２５’　−ｃａａ　ｇａｇ　ｃｃｃ　ｇｃｃ　ｔａａ　ｔｇａ　ｇｃ ｇ　ｇｇｃ　ｔｔｔ　ｔｔｔｔｔｇ　ｃａｔ　ａｃｔ　ｇｃｇ　ｇｅｅ　ｇｅｔ 　−３’オリゴ−４３５’　−ａａｔ　ｔａｇ　ｃｇｇ　ｃｃｇ　ｃａｇ　ｔａ ｔ　ｇｃａ　ａａａ　ａａａ　ａｇｅｃｃｇ　ｃｔｃ　ａｔｔ　ａｇｇ　ｅｇｇ 　ｇｅｔ　−３’と連結せしめた。
生じたプラスミドｐＧＰ１ａを、稀少切断性制限酵素ＮｏｔＩにより切除するこ とができる非常に大型ＤＮＡ構成物をクローニングするために改変する。それは 、ｔｒｐＡ遺伝子に由来する強力な転写終結シグナル（Ｃｈｒｉｓｔｉｅら、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７８：４１８０　（ １９８１））の下流に（アンピシリン耐性遺伝子ＡｍｐＲに関して）　ＮｏｔＩ 制限部位を含む。この終結シグナルは、ＡｍｐＲ遺伝子からの読み通し転写を排 除することにより、ＮｏｔＩ部位中に挿入されるコード配列の潜在的毒性を低下 させる。加えて、このプラスミドは、Ｉ）ＢＲ３２２コピー数調節領域を保持し ているためにｐＵＣプラスミドに比較して低コピー数である。この低コピー数も 挿入配列の潜在的毒性を更に低下させ、そしてＤＮＡ複製による大型挿入断片に 対する選択を減少させる。
ベクターｐｃｐｘｂ、　ｐｃｐｉｃ、　ｐＧＰｌｄおよびｐＧＰｌｆはｐＧＰＩ ａから誘導され、そして異なるポリリンカークローニング部位を含む。そのポリ リンカー配列を下記に与える。
ＧＩＩＣ ｐＧＰｌｆｆｉ それらの各プラスミドは大型トランスジエン挿入断片の作製に利用することがで き、該挿入断片はＮｏｔＩで切り出すことができ、その結果トランスジエンＤＮ Ａをマイクロインジェクション前にベクター配列から精製することができる。
２、ｐＧＰｌｂ ｐＧＰｌａをＮｏｔＩで消化し、そして次のオリゴヌクレオチドニオすゴ−４７ ５’　−ｇｇｃ　ｃｇｃ　ａａｇ　ｃｔｔ　ａｃｔ　ｇｅｔ　ｇｇａ　ｔｃｃ　 ｔｔａ　ａｔｔａａｔ　ｃｇａ　ｔａｇ　ｔｇａ　ｔｃｔ　ｃｇａ　ｇｇｃ　− ３’オリゴ−４３５’　−ｇｇｃ　ｃｇｃ　ｅｔｃ　ｇａｇ　ａｔｃ　ａｃｔ　 ａｔｃ　ｇａｔ　ｔａａ　ｔｔａａｇｇ　ａｔｅ　ｃａｇ　ｃａｇ　ｔａａ　ｇ ｅｔ　ｔｇｃ　−３’と連結せしめた。
生じたプラスミドｐＧＰ１ｂは、ＮｏｔＩにより隣接された短いポリリンカー領 域を含む。これは、ＮｏｔＩにより切除することができる大型挿入断片の作製を 容易にする。
３・　匹な 次のオリゴヌクレオチド： オリゴ−４４５’　−ｃｔｃ　ｃａｇ　ｇａｔ　ｃｃａ　ｇａｔ　ａｔｃ　ａｇ ｔ　ａｃｃ　ｔｇａ　ａａｃａｇｇ　ｇｃｔ　ｔｇｃ　−３’ オリゴ−４５５’　−ｅｔｃ　ｇａｇ　ｃａｔ　ｇｃａ　ｃａｇ　ｇａｃ　ｃｔ ｇ　ｇａｇ　ｃａｃ　ａｃａｃａｇ　ａｃｔ　ｔｃｃ　−３’ を使って、ポリメラーゼ連鎖反応技術によりラット肝臓ＤＮＡ由来どム１６５− １６８　（１９９０））を増幅せしめた。
増幅生成物をＢａｍ旧とＳｐｈ　ｒで消化し、そしてＢａｍＨＩ／　Ｓｐｈ　Ｉ で消化されたｐＮＮＯ３（ｐＮＮＯ３は、記載順に次の制限部位：　Ｎｏｔ　Ｉ 　、　ＢａｍＨＩ。
ｊ４ｃｏＩ、　Ｃ１ａＩ、　ＥｃｏＲＶ、　Ｘｂａｌ、　５ａｅＩ、　Ｘｈｏｌ 、　５ｐｈ１．　ＰｓｔＩ、　ＢｇｌＩＩ。
ｒ、ｃｏＲＩ、　ＳｍａＩ、　Ｋｐｎｌ、　ｔ（ｉｎｄｌｌＩおよびＮｏｔＩを 有するポリリンカー（含むｐＵＣ山来のプラスミドである）中にクローニングし た。生じたプラスミドｐＲＥ３をＢａｍ旧とＨｉｎｄＩ［Ｉで消化し、そしてう ・ソト１ｇ重鎮３′エンハンサ−を含む挿入断片を、ＢａｍＨＩ／　Ｈｉｎｄｌ ｌＩで消化されたｐＧＰ　Ｉ　ｂ中にクローニングした。生じたプラスミドｐＧ Ｐｅ　（図２２および表１）は、配列をクローニングすることができそして次い でＮｏｔＩ消化によって３′エンハンサ−と−緒に切り出すことができる幾つか のユニーク制限部位を含有する。
表１　ベクターｐＧＰｅの配列 Ｂ、　ＩＢＭを発現する小遺伝子座トランスジエンｐｌＧＭ１の作製ファージベ クターλＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７　（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、。
Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）中にクローニングしたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライ ブラリーを、ヒト重鎖Ｊ領域特異的オリゴヌクレオチド：オリゴ−１５’　−ｇ ｇａ　ｃｔｇ　ｔｇｔ　ｃｃｃ　ｔｇｔ　ｇｔｇ　ａｔｇ　ｃｔｔ　ｔｔｇ　ａ ｔｇｔｃｔ　ｇｇｇ　ｇｃｃ　ａａｇ　−３’を用いてスクリーニングし、そし てファージクローンλ１．３を単離した。６つのＪセグメント全部並びにＤセグ メントＤＨＱ５２および重ｆＪＩＪ−μイントロンエンハンサ−を含む、６　ｋ ｂのＨｉｎｄＩ［［／　Ｋｐｎ　Ｉ断片をこのクローンから単離した。同じライ ブラリーをヒトμ特異的オリゴヌクレオチド： オリゴ−２５’　−ｃａｃ　ｃａａ　ｇｔｔ　ｇａｃ　ｃｔｇｃｃｔ　ｇｇｔ　 ｃａｃ　ａｇａ　ａｃｔｇａＣＣａＣｃｔａ　ｔｇａ　−３’ を用いてスクリーニングし、ファージクローンλ２．１を単離した。
μスイッチ領域およびμ定常領域エクソンの全部を含む、ＩＯ，５ｋｂのｔ（ｉ ｎｄＩＩＩ／Ｘｈｏ　Ｉ断片をこのクローンから単離した。それらの２断片を、 ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩで消化されたｐＮＮＯ３と一緒に連結せしめ、プラスミド９ ＪＭＩを得た。
２、ｐＪＭ２ ファージクローンλ２．１から４　ｋｂのＸｈｏ　Ｉ断片を単離した。該断片は 、ある種のＩｇＤ発現Ｂ細胞中でのμ遺伝子のδ関連欠失に関与するいわゆるΣ μ要素（Ｈ，Ｙａｓｕｉら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９：１３９９ （１９８９）　；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕を含む、ｐＪＭ ｌの配列のすぐ下流の配列を含有する。この断片をＤＮＡポリメラーゼＩのフレ ノウ断片で処理し、モしてＸｈｏ　Ｉで切断されフレノウで処理されたｐＪＭｌ と連結せしめる。生じたプラスミドｐＪＭ２　（図２３）は、内部のＸｈｏ　Ｉ 部位を失っているが、フレノウ酵素による不完全な反応の結果として３’Ｘｈｏ Ｉを保持している。ｐＪＭ２は完全なヒトＪ領域、重鎖Ｊ−μイントロンエンハ ンサー・、μスイッチ領域およびμ定常領域エクソン全部、並びにμ遺伝子のδ 関連欠失に関与する２つの０．４ｋｂの直接反復σμおよびΣμを含有する。
３、Ｄ領域クローンの単離およびｐＤ旧の作製次のヒトＤ領域特異的オリゴヌク レオチド：オリゴ−４５’　−ｔｇｇ　ｔａｔ　ｔａｃ　ｔａｔ　ｇｇｔ　ｔｃ ｇｇｇｇａｇｔ　ｔａｔ　ｔａｔａａｃ　ｃａｃ　ａｇｔ　ｇｔｃ　−３’を用 いて、ヒト胎盤ゲノムライブラリーをＤ領域クローンについてスクリーニングし た。ファージクローンλ４．１とλ４．３を単離した。
Ｄ要素Ｄ　Ｋ　Ｉ　Ｉ　ｎ　ｓ　＋およびＤＭｔ　（Ｙ、　Ｉｃｈｉｈａｒａら 、ＥＭＢＯＪ、　７：　４１４１（１９８８））を含む５．５ｋｂのＸｈｏ　Ｉ 断片をファージクローンλ４．１から単離した。Ｄ要素Ｄ　ＬＲＩ　Ｉ　Ｄｘｐ ＋　＋　Ｄｘｐ’＋およびＤＭｔを含む上流の隣接５．２　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ断 片をファージクローンλ４．３から単離した。それらのＤ領域Ｘｈｏ　Ｉ断片の 各々をプラスミドベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　 Ｗｌ）の５ａｌＩ部位中にクローニングし、２配列を結合するＸｈｏ　Ｉ部位を 破壊した。次いで上流断片をＸｈｏ　ＩとＳｍａ　１で切り出し、下流断片をＥ ｃｏＲＶとＸｈｏ　Ｉで切り出した。得られた単離断片を５ａｌＩで消化された ｐＳＰ２と一緒に連結せしめ、プラスミドルＤ旧を与えた。Ｉ）Ｄ旧は、少なく とも７つのＤセグメントを含みＸｈｏＩ（５’）およびＥｃｏＲＶ　（３’　） で切り出すことができるｌ００６ｋｂの挿入断片を含有する。
４、ｐｃＯＲｌ プラスミドｐＪＭ２をＡｓｐ７１８　（Ｋｐｎ　Ｉのアイソシゾマー）で消化し 、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片を用いて突出末端をフィルインし た。次いで生じたＤＮＡをＣ１ａＩで消化し、挿入断片を単離した。この挿入断 片をｐＤＨｌのＸｈｏ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＶ挿入断片およびＸｈｏ　Ｉ　／Ｃ１ ａＩ消化ｐＧＰｅと連結せしめ、ｐｃＯＲｌを作製した（図２４）。
５、ｐＶＨ２５１ ２つのヒト重鎮可変領域セグメントＶ、２５１とＶｎ　１０５　（Ｈｕｍｐｈｒ ｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３３１：４４６　（１９８８））を含む１０．３ｋｂ のゲノムＨｉｎｄｌＩ［断片をｐＳＰ７２中にサブクローニングし、プラスミド ｐＶＨ２５１を与えた。
６、ｐｌＧＭｌ プラスミドｐｃＯＲ１をＸｈｏ　Ｉで部分消化し、そしてｐＶＨ２５１の単離Ｘ ｈｏＩ／５ａｌＩ挿入断片を上流のＸｈｏ　Ｉ部位にクローニングし、プラスミ ドｐｌＧＭ１　（図２５）を作製した。ｐｌＧＭｌは、下記の配列要素の全部が ＮｏｔＩでの消化によりベクター配列を含まない単一断片において単離すること ができそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトすることができるように 、２つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８つのヒトＤセグメント、 ６つのヒトＪ、セグメント全部、ヒトμエンハンサ−、ヒトσμ要素、ヒトμス イッチ領域、ヒトμコードエクソン全部およびヒトＥμ要素を、ラット重鎮３′ エンハンサ−と共に含有する。
次のヒトＩｇＧ定常領域遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド：オリゴ−２９５ ’　−ｃａｇ　ｃａｇ　ｇｔｇ　ｃａｃ　ａｃｅ　ｃａａ　ｔｇｃ　ｃｃａ　ｔ ｇａ　ｇｃｃＣａｇ　ａＣａ　ｃｔｇ　ｇａｃ　−３’を用いてヒトゲノムライ ブラリーをスクリーニングした。ファージクローンλ２９．４とλ２９．５を単 離した。γスイッチ領域を含むファージクローンλ２９．４の４　ｋｂ　Ｈｉｎ ｄＩ［Ｉ断片を使って、ファージベクターラムダＦＩＸＴＭＩＩ　（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）中にクローニングされたヒト胎盤ゲ ノムＤＮＡライブラリーを探査した。ファージクローンλＳｇ１．１３を単離し た。異なるγクローンのサブクラスを決定するために、鋳型として上記３つのフ ァージクローンの各々のサブクローンを使ってそしてプライマーとして次のオリ ゴヌクレオチド：オリゴ−６７５’　−ｔｇａ　ｇｅｅ　ｃａｇ　ａｃａ　ｃｔ ｇ　ｇａｃ　−３’を使って、ジデオキシ配列決定反応を実施した。
ファージクローンλ２９．５とλＳγ１．１３は両方ともγｌサブクラスである と決定された。
２、ｐ７ｅｌ γ１コード領域を含むファージクローンλ２９．５の７．８　ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ ｌＩ断片をｐＵｃ１８中にクローニングした。生じたプラスミドｐｔ、’ｒｔを Ｘｈｏ　Ｉで消化し、フレノウ断片で処理し、そして再連結せしめて内部Ｘｈｏ 　Ｉ部位を破壊した。生じたクローンｐＬＴ１ｘｋを旧ｎｄＩＩ［で消化し、挿 入断片を単離し、ｐＳＰ７２中にクローニングしてプラスミドクローンｐＬＴ１ ｘｋｓを作製した。ポリリンカーＸｈｏ　Ｉ部位とヒト配列由来のＢａｍ旧部位 のところでのｐＬＴｌ　ｘｋｓの消化は、γｌ定常領域コードエクソンを含む７ ．６ｋｂ断片を与えた。この７．６　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　／　Ｂａｍ旧断片を、 ファージクローンλ２９．５からの隣接の下流４．５　ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片と 一緒に、Ｘｈｏ　Ｉ　／　ＢａｍＨＩて消化されたｐＧＰｅ中にクローニングし 、プラスミドｐγｅｌを作製した。ｐγｅ１は、ラット重鎮３′エンハンサ−に 連結された、５　ｋｂの下流配列と共にγｌ定常領域コードエクソンの全部を含 有する。
３・　Ｉ）７ｅ２ γ１スイッチ領域とスイッチ前繁殖不能転写物（ｓｔｅｒｉｌｅ　ｔｒａｎｓ− ｃｒｉｐｔ）　ＣＰ、　５ｉｄｅｒａｓら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｒｍ ｍｕｎｏｌ、　貝６３１　（１９８９））の第一エクソンとを含む５．３ｋｂの ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片をファージクローンλＳ７１．１３から単離し、そして挿入 断片の５′末端の近隣にポリリンカーＸｈｏ　Ｉ部位を有するｐｓＰ７１中にク ローニングし、プラスミドクローンＩ）Ｓγｌｓを作製した。ｐｓ７ｔｓのＸｈ ｏＩ／５ａｌＩ挿入断片をＸｈｏｌで消化されたｐｒｅｌ中にクローニングし、 プラスミドクローンｐ７ｅ２を作製した（図２６）。ｐγｅ２は、ラット重鎮３ ′エンハンサ−に連結された、下流の５　ｋｂ配列と共に、γｌ定常領域コード エクソン全部並びに上流のスイッチ領域および繁殖不能転写物エクソンを含有す る。
４・　凹 プラスミドｐｌＧＭ１をＸｈｏ　Ｉで消化し、４３　ｋｂ挿入断片を単離し、そ してＸｈｏ　Ｉで消化されたｐγｅ２中にクローニングし、プラスミド１）ＨＣ Ｉを作製した（図２５）。ｐＨｃｌは、下記の配列要素の全部がＮｏｔＩての消 化によりベクター配列を含まない単一断片において単離しそしてマウス胚の前核 中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製することができる ように、ラット重鎮３′エンハンサ−と共に、２つの機能的ヒト可変領域セグメ ント、少なくとも８つのヒトＤセグメント、６つのヒトＪ。セグメント全部、ヒ トＪ−μエンハンサ−、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエク ソン全部、ヒトΣμ要素、およびヒトγｌ定常領域（関連のスイッチ領域および 繁殖不能転写物関連エクソンを含む）を含有する。
ヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーラムダＦＩＸ”　ＩＩ　（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ。
Ｌａ　、Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を、次のヒトＶＨＩ　ファミリー特異的オリゴヌ クレオチド： オリゴ−４９５’　−ｇｔｔ　ａａａ　ｇａｇ　ｇａｔ　ｔｔｔ　ａｔｔ　ｃａ ｃ　ｃｃｃ　ｔｇｔ　ｇｔｃｅｔｃ　ｔｃｃ　ａｃａ　ｇｇｔ　ｇｔｃ　−ａ’ を用いてスクリーニングした。
ファージクローンλ４９．８を単離し、そして可変セグメントＶＨ４９，８を含 む６．　ｌ　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ断片をｐＮＮＯ３中にサブクローニングしくポリ リンカ−Ｃ１ａＩ部位がＶＨ４９，８の下流にそしてポリリンカーＸｈｏ　Ｉ部 位が上流にくるように）、プラスミドｐＶ８４９．８を作製した。この挿入断片 のｓｏｏ　ｂｐ領領域配列決定すると、Ｖ）１４９．８は転写解読枠並びに完全 なスプライシングシグナルおよび組換えシグナルを有することがわかり、よって 該遺伝子が機能的であることを指摘する（表２）。
■ｐ工〃ｓσ：Ｘ石便π葛でＩに犯ス刀工にχτ９ＣカＡｆｆＴＧ’ｌｒＧ　Ｃ −Ｃ１，ＴＣπｍｍＡＫＩ？ｌ”！５−６　ＱＱＱ・ゴよＧ、Ａにλα’ＣｒＧ 工にスτ品ｐｍ、ｔｖ二詰罫コ〇、〜−９１５０Ｃ；；Ｌ”□’Ｄ＞ＴＡ　ＣＡ ＴＥゞｒＡ１１ＴＧＧ　ＴＧ：ｅ八　□　ＡＣＡ！ｔｃｃ−ｆＲ；Ｔ　２００ａ 四Ｃ二と羽口；”９？””９９　’；”＝Ｃ二ｑ其しｔａＮＵ臼ｑａ　ｇｇａ： ｖｔｔａ＝ｃ　３５０沼ニ；ユニＧｒＴＴＡＴＴＡＧＧ＝ス鳩＝３πｘＮ蔀Ｔ　 工コスｎＴＡ８００７１６””７　辺 表２　ヒトＶ、、Ｉファミリー遺伝子Ｖ　、４９．８の配列２、　■Ｌ プラスミドＩ）ＵＣｌ３中にサブクローニングされたヒトＶＭ　ＩＶ　’、：； 　ｙζリー遺伝子Ｖ）Ｉ　４−２１　（１，５ａｎｚら、ＥＭＢＯＪ、　８：　 ３７４１　（１９８９〕）を２む４　ｋｂ　ＸｂａＩゲノム断片をＳｍａ　Ｉと ＨｉｎｄｌＩ［で切り出し、ポリシラーゼ■のフレノウ断片で処理した。平滑末 端化された断片を、Ｃ１ａｌで消化されフレノウで処理されたｐＶＨ４９，８中 にクローニングした。
生じたプラスミドｐＶ２は、挿入断片の３′末端のユニークＳａｌ　Ｉ部位およ び５′末端のユニークＸｈｏ　Ｉ部位を使って、同じ方向で■旧−２１の上流に 連結された、ヒト重鎮遺伝子ＶＨ４９，８を含む。
３、ｐＳγｌ−５゛ 近隣の上流３．１　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ断片と一緒に０．７　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ　 ／　ＨｉｎｄｌｌＩ断片（プラスミドｐγｅ２中の５．３ｋｂγｌスイッチ領域 含有断片のすぐ上流で且つそれに隣接した配列を表す）をファージクローンλＳ ｇ１．１３から単離し、そしてＨｉｎｄｌｌ［／ＸｂａＩで消化されたｐＵｃ１ ８ベクター中にクローニングした。生じたプラスミドｐＳγｌ−５′は、γｌイ ソタイプにスイッチする前のＢ細胞中に見つかる繁殖不能転写物（ｓｔｅｒｉｌ ｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）　ＣＰ、５ｉｄｅｒａｓら、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ ｏｎａｌ　［ｍｍｕｎｏｌ、。
貝６３１　（１９８９）　）の開始部位の上流の配列を表す３．８ｋｂ挿入断片 を含む。該転写物はイソタイプスイッチの開始に関係があり、そして上流のシス 作用性配列はしばしば転写調節に重要であるので、繁殖不能転写物の正しい発現 および関連するスイッチ組換えを促進するためにそれらの配列かトランスジエン 構成物中に含まれる。
４、　９ＶＧＥｌ ｐＳγｌ−５゛挿挿入片をＳｍａ　ＩとＨｉｎｄＩ［Ｉで切り出し、フレノウ酵 素で処理し、そして次のオリゴヌクレオチドリンカー：５’　−ＣＣｇ　ｇｔｃ 　ｇａｃ　ｃｇｇ　−３’と連結せしめた。この連結生成物をＳａｌ　Ｉで消化 し、５ａｌＩで消化されたｐＶ２に連結せしめた。生じたプラスミドｐＶＰは、 ２つの機能的ヒト可変遺伝子セグメントＶＨ４９，８とＶＢ２−２１　（表２参 照）の下流に連結された３、８ｋｂのγ１スイッチ５′隣接配列を含む。５ａｌ Ｉでの部分消化およびＸｈｏ　Ｉでの完全消化の後、アガロースゲル上での１５ ｋｂ断片の精製により、ｐＶＰ挿入断片を単離する。次いで該挿入断片をｐγｅ ２のＸｈｏ　Ｉ部位中にクローニングし、プラスミドクローンｐＶＧＥｌ　（図 ２７）を作製する。ｐＶＧＥｌは、ヒトγ１定常遺伝子および関連のスイッチ領 域の上流に２つのヒト重鎮可変遺伝子セグメントを含有する。可変領域と定常領 域との間のユニーク５ａｌＩ部位を用いて、Ｄ、Ｊおよびμ遺伝子セグメントを クローニングすることができる。γＩ遺伝子の３′末端にラット重鎮３′エンハ ンサ−が連結され、そして挿入断片全体はＮｏｔＩ部位により隣接される。
５・　餅賂 プラスミドクローンｐＶＧＥ］をＳａ夏■で消化し、ｐｒｃＭｔのＸｈｏ　Ｉ挿 入断片をその中にクローニングした。生じたクローンｐＨＣ２（図２５）は、４ つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８つのＤセグメント、６つのヒ トＪ、セグメント全部、ヒトＪ−μエンハンサ−、ヒトσμ要素、ヒトμスイッ チ領域、ヒトμコードエクソン全部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ１定常領域（ 繁殖不能転写物開始部位の上流の４　ｋｂ隣接配列と共に、関連のスイッチ領域 と繁殖不能転写物関連エクソンを含む）を含有する。それらのヒト配列は、前記 配列要素全部をＮｏｔｌての消化によりベクター配列を含まない単一鎖上に単離 しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物 を生せしめることができるように、ラット重１Ｎ３′エンハンサ−に連結される 。該挿入断片の５′末端のユニークＸｈｏ　１部位を使って、追加のヒト可変遺 伝子セグメントをその中にクローニングし、この重鎮小遺伝子座の組換え多様性 を更に増大させることができる。
Ｅ、）ランスジェニックマウス プラスミドｐｌＧＭｌおよびｐＨｃｌのＮｏｔＩ挿入断片をアガロースゲル電気 泳動によりベクター配列から単離した。精製された挿入断片を、受精した（Ｃ５ ７ＢＬ／６　ｘ　ＣＢＡ）　Ｆ２マウスの胚の前核中にマイクロインジェクトし 、そして生存している胚を、Ｈｏｇａｎらにより記載された通りに（Ｂ、　Ｈｏ ｇａｎ、　Ｆ、　Ｃｏ５ｔａｎｔｉｎｉおよびＥ、　Ｌａｃｙ、　Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｏｆＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ、１９ ８６．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ）偽妊娠した雌に移した。注入された胚から発育したマウスを、尾 部ＤＮＡのサザンプロット分析によりトランスジエン配列の存在について分析し た。既知量のクローン化ＤＮＡを含有する対照標準物に比較したバンド強度によ り、トランスジエンコピー数を評価した。３〜８週齢において、それらの動物か ら血清を単離し、そしてＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ　（Ｅ、　Ｈａｒｌｏｗお よびり、　Ｌａｎｅ。
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　１９８ ８．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ）により記載されたように、トランスジエンによりコードされるヒト ＩｇＭおよび１ｇＧ１の存在についてＥＬＩＳＡによりアッセイした。マイクロ タイタープレートのウェルを、ヒトＩｇＭに特異的なマウスモノクローナル抗体 （クローンＡＦ６．１０２８５．　ＡＭＡＣ。
Ｉｎｃ、　Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、　ＭＥ）およびヒトＩｇＧに特異的なマウスモ ノクローナル抗体（クローンＪＬ５１２．　＃０２８０．　ＡＭＡＣ，Ｉｎｃ、 　Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、　ＭＥ）によりコーティングした。該ウェル中に血清試 料を連続的に希釈し、予備吸着させることによってマスウ免疫グロブリンとの交 差反応性を最小限にしたアフィニティー単離されたアルカリホスファターゼ接合 ヤギ抗ヒトＩｇ（多価）を用いて、特異的免疫グロブリンの存在を検出した。表 ３と図２８は、プラスミド１）ＨＣＩのトランスジエン挿入断片を注入した胚か ら発育した２匹の動物の血清中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧ　＋の存在についての ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。このアッセイにより試験した対照の非トラン スジェニックマウスは全て、ヒト［ｇＭおよびＩｇＧの発現について陰性であっ た。ｐｌＧＭＩ　Ｎｏｔ　Ｉ挿入断片を含有する２系統のマウス（系統＃６と１ ５）はヒトＩｇＭを発現するがヒトＩｇＧ１を発現しない。我々はｐＨｃ１挿入 断片を含む６つの系のマウスを試験した。その結果、４系統（系＃２６．３８． ５７および１２２）がヒトＩｇＭとヒトＩｇＧ１の両方を発現し、２系統のマウ ス（系統１１１９および２１）は検出可能なレベルのヒト免疫グロブリンを発現 しなかった。ヒト免疫グロブリンを発現しなかったｐｉ（ＣＩ　）ランスジェニ ックマウスは、マイクロインジェクトした胚から直接発育したものであり、該ト ランスジエンの存在についてモザイクであり得る、いわゆるＧ。マウスであった 。サザンプロット分析は、それらのマウスの多くが細胞あたり該トランスジエン の１つまたは少数のコピーを含むことを示した。ｌ）ｒＧＭｌ　１−ランスジェ ニック動物の血清中のヒトＩｇＭ、並びにＩ）ＨＣＩ　）ランスジェニック動物 の血清中のヒトＩｇＭとＩｇＧ１の検出は、トランスジエン配列がＶＤＪ連結、 転写およびイソタイプスイッチを指令することにおいて正しく機能しているとい う証拠を提供する。１匹の動物（＃Ｉ８）は、サザンプロット分析によりトラン スジエンについて陰性であり、検出可能レベルのヒトＩｇＭまたはＩｇＧ１を全 く示さなかった。２番目の動物（＃３８）は、サザンブロツティングによりアッ セイすると該トランスジエンの約５コピーを含んでおり、そして検出可能レベル のヒトＩｇＭとＩｇＧ１の両方を示した。トランスジエンを注入した胚から発育 した１１匹の動物についてのＥＬＩＳＡアッセイの結果を下表（表３）に要約す る。
」 ＥＬＩＳＡアッセイによるトランスジェニック動物の血清中のヒトＩｇＭおよび ＩｇＧ１の検出注入した　細胞あたりのおよその 動物＃トランスツエン　トランスジエンコピー数　ヒ　トＩｇＭ　ヒ　トＩｇＧ １６　ｐｌＧＭｌ　１　＋＋　− ７ｐｌＧＭｌ　０　−　− ９　ｐｌＧＭｌ　０　−　− １０　ｐｌＧＭｌ　０　−　− １２　ｐ［ＧＭｌ　０　−　− １５　ｐＩＧＭＩ　１０　＋＋　− １８ｐＨｃｌ　０　−　− ２６　ｐＨｃｌ　２　＋＋＋ ３８　ｐＨｃｌ　５　＋＋　＋ 表３は、組み込まれたトランスジエンＤＮＡの存在と血清中のトランスジエンに よりコードされる免疫グロブリンとの間の相関関係を示す。ｐ）ＩＣＩ　）ラン スジエンを含むことがわかった動物のうちの２匹は、検出可能なレベルのヒト免 疫グロブリンを発現しなかった。
それらは共に低コピー動物であり、該トランスジエンの完全なコピーが含まれて いないか、または該動物が遺伝的モザイクを有している（動物＃２１について評 価された細胞あたりくｌコピーにより指摘される）ことがあり、そしてトランス ジエン含有細胞が造血系統に移っていない場合がある。あるいは、トランスジエ ンがそれらの発現に至らないゲノム領域中に組み込まれている場合がある。９１ ０Ｍｌトランスジェニック動物の血清中のヒトＩｇＭの検出、並びにｌｌＨＣｌ 　）ランスジェニック動物の血清中のヒト［ｇＭとＩｇＧ　１の検出は、トラン スジエン配列がＶＤＪ結合、転写およびイソタイプスイッチを指令する上で正し く機能することを指摘する。
Ｆ、　ｃＤＮＡクローン ＶＤＪ連結およびクラススイッチ、並びにＢ細胞発達および対立遺伝子排除にお けるトランスジエンがコードするヒトＢ細胞レセプターの関与に関するｐＨｌｊ 　）ランスジエンの機能性を評価するために、トランスジェニックマウス牌１１ ｍＲＮＡから誘導した免疫グロブリンｃＤＮＡクローンの構造を調べた。Ｄおよ びＪセグメント用法、Ｎ領域の付加、ＣＤＲ３の長さ分布、並びに機能的ｍＲＮ Ａ分子をもたらす接合部の頻度に焦点を合わせて、該トランスジエンによりコー ドされる重鎮の総合的多様性を調べた。ＶＨＩ０５とＶＨ２５１を組み込んだＩ ｇＭおよびＩｇＧをコードする転写物を調べた。
第１１週の雄第二世代５７系ｙＩｊｐＨＣ１）ランスジェニックマウスからポリ アデニル化ＲＮＡを単離した。このＲＮＡを使ってオリゴｄＴ開始一本１１ｃＤ ＮＡを合成した。次いで得られたｃＤＮＡを、次の４つの合成オリゴヌクレオチ ドをプライマーとして使った４つの各ＰＣＲ増幅反応のための鋳型として使用し た：　ＶＨ２５１特異的オリゴ−１４９ｅｔａｇｃｒ　ｃｇａ　ｇｔｃ　ｃａａ 　ｇｇａ　ｇｔｃ　ｔｇｔ　ｇｃｃ　ｇａｇ　ｇｔｇ　ｃａｇ　ｃｔｇ　（ｇ、 ａ、　ｔ、ｃ）　；ＶＨＩ０５特異的オリゴ−＋５０　ｇｔｔ　ｇｃｔ　ｃｇａ 　ｇｔｇ　ａａａ　ｇｇｔ　ｇｔｃ　ｃａｇ　ｔｇｔｇａｇ　ｇｔｇ　ｃａｇ　 ｃｔｇ　（ｇ、ａ、ｔ、ｃ）　；　ヒト７１特異的オリゴ−１５１ｇｇｃｇｅｔ 　ｃｇａ　ｇｔｔ　ｃｃａ　ｃｇａ　ｃａｃ　ｃｇｔ　ｃａｃ　ｅｇｇ　ｔｔｃ 　；およびヒトμ特異的オリゴ−１５２ＣＣｊ　ｇＣｔ　ｃｇａ　ｇｇｃ　ａｇ ｅ　ｃａａ　ｃｇｇ　ｃｃａ　ｃｇｃ　ｔｇｃ　ｔｃｇ　ｏ反応１はプライマー ｏ−１４９とｏ−１５１を使ってＶＨ２５１−７１転写物を増幅せしめ、反応２ はブライ７−０−１４９とｏ−１５２を使ってＶＨ２５１−ｔｔ転写物を増幅せ しめ、反応３はプライマーｏ−１５０とｏ−１５１を使ってＶＨ１０５−７１転 写物を増幅せしめ、そして反応３はプライマーｏ−１５０とｏ−１５２を使って ＶＨ１０５−μ転写物を増幅せしめた。得られた０、５ｋｂのＰＣＲ産物をアガ ロースゲルから単離した。対応するＥＬＩＳＡデータ（図３４）と一致して、μ 転写物産物はγ転写物産物よりも豊富であった。ＰＣＲ産物をＸｈｏ　Ｉで消化 し、プラスミドｐＮＮＯ３中にクローニングした。４つのＰＣＲ増幅の各々から の９個のクローンのミニブレブから二本鎖プラスミドＤＮＡを単離し、そしてジ デオキシ配列決定反応を実施した。該クローンのうちの２つがＤまたはＪセグメ ントを含まない欠失体であることがわかった。それらは正常のＲＮＡスプライシ ング生成物からは誘導することができなかったので、おそら＜ＰＣＲ増幅中に導 入された欠失から生じたのであろう。該ＤＮＡ試料のうちの１つは、２つの個々 のクローンの混合物であることがわかり、そして他の３つのクローンは読み取り 可能なりＮＡ配列を生成しなかった（おそら＜ＤＮＡ試料が十分に純粋でなかっ たためであろう）。残りの３０個のクローンからのＶＤＪ接合部のＤＮＡ配列を 表４にまとめた。各配列はユニークであり、遺伝子再配列の単一経路が優性でな いこと、またはトランスジエン発現性Ｂ細胞の単一クローンが優性でないことを 示す。どの２配列も類似していないという事実は、免疫グロブリンの莫大な多様 性が２個のＶセグメント、１０個のＤセグメントおよび６個のＪセグメントのみ を含む小型の小遺伝子座から発現され得るという暗示でもある。
該トランスジエン中に含まれるＶセグメントの両方、６個のＪセグメントの全部 および１０個のＤセグメントの７個がＶＤＪ接合部に使われる。加えて、両定常 領域遺伝子（μとγｌ）が転写物中に含まれる。ＶＨ１０５プライマーは実施し た反応においてＶＨ１０５に特異的であることがわかった。従って、反応３およ び４からのクローンの多くかＶＨ２５１転写物を含んでいた。更に、連結反応３ のＰＣＲ産物、・いら単離されたクローンは１ｇＧよりもむしろＩｇＭをコード することがわかった：しかしながら、これは、ＤＮＡを同一ゲｒｂ　Ｌ″ｃｃ噌 離、′、−め、反応４からのＰＣＲ産物による汚染を表すかもしれなし・。成人 末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から免疫グロブリン重鎮配列を増幅−・土しめそして ＶＤＪ接合部のＤＮＡ配列を決定した同様な実験か、細菌Ｙａｍａｄａらにより 報告された（Ｊ、　Ｅｘｔ）、　Ｍｅｄ、１７３：３９５−４０７　（１９９１ ）　；こわは参考として本明細書中に組み込まれる〕。このヒトＰＢＬからのデ ータをｐＨｃｌ　トランスジェニックマウスからの我々のデータと比較した。
表４ Ｇ、Ｊセグメント選択 表５は、成人ＰＢＬ免疫グロブリン転写物中に見つかるＪセグメントに対して、 ｐＨｃｌ　）ランスジエンによりコードされる転写物中に取り込まれるＪセグメ ントの分布を比較した。それらの分布プロフィールは非常に類似しており、両系 ともＪ４セグメントが優性セグメントであり、次いでＪ６セグメントが優性であ る。Ｊ２はヒトＰＢＬ中およびトランスジェニック動物中で最も稀なセグメント である。
使用％（±３％） １００％　１００％ Ｈ，Ｄセグメント選択 ｙａｍａａａらにより分析されたクローンの４９％（８２のうち４０）が、ｐＨ ｃｌ　）ランスジエン中に含まれるＤセグメントを含んでいた。他の１１クロー ンは、該著者らにより既知Ｄセグメントのいずれにも指定されなかった配列を含 んだ。それらの指定されなかった１１個のクローンのうちの２つは、ｐＨｃＩ構 成物中に含まれるＤＩＲ２セグメントの逆位から誘導されるようだ。Ｉｃｈｉｈ ａｒａら［：ＥＭＢＯＪ、　７：　４１４１　（１９８８））により予想されモ して５ａｎｚ　（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４７：１７２０−１７２９　（１９ ９１））により観察されたこの機構を、ＹａｍａｄａらＵ、　ＢＸＩｌ、　Ｍｅ ｄ、皿３９５−４０７　（１９９１））は考慮に入れなかった。表５は、ｐＨｃ ｌ　）ランスジェニックマウスについてのＤセグメント分布とＹａｍａｄａらに よりヒトＰＢＬ転写物について観察されたものとの比較である。Ｙａｍａｄａら のデータを、ＤＩＲ２使用を包含しそしてｐＨｃｌ　）ランスジエン中にないＤ セグメントを除外するように再編集した。表６は、Ｄセグメント組み込みの分布 がトランスジェニックマウスとヒトＰＢＬとにおいて非常に類似していることを 証明する。２つの優性なヒトＤセグメントＤＸＰ’　１　とＤＮＩは、トランス ジェニックマウス中にも高頻度で見つかる。２つの分布間の最も大きな相違点は 、ヒトに比べてトランスジェニックマウス中でのＤＨＱ５２の高頻度である。Ｄ ＨＱ５２の高頻度はヒト胎児肝臓中のＤセグメント分布を思い出させる。５ａｎ ｚは重鎮転写物の１４％がＤＨＱ５２配列を含んだことを報告している。ｐＨｃ ｌ中に見つからないＤセグメントを分析から除外すれば、５ａｎｚにより分析さ れた胎児転写物の３１％がＤＨＱ５２を含んでいる。これは、本発明者らがｐＨ ｃｌ　トランスジェニックマウス中に観察した２７％と同等である。
表６ 使用％（±３％） ＤＸＰ　１　３　６ ＤＸＰ’　ｌ　２５　１９ ＤＮ　１　１２　２２ ＤＬＲ２３４ ＤＩ１０５２　２６　２ １００％　１００％ １、ＶＤＪ接合部の機能性 表７は、ｐ）ＩｃＩ　）ランスジェニック動物から分析された３０個のクローン からのＶＤＪ領域の推定アミノ酸配列を示す。翻訳配列は、３０個のＶＤＪ接合 部のうちの２３個（７７％）が可変セグメントとＪセグメントに関して枠内（ｉ ｎ−ｆｒａｍｅ）であることを示す。
表７ Ｖ−Ｄ−Ｊ接合部の機能性 ＦＲＥ　口Ｒ３ＦＲ４ ！１／？Ｃニニ：５１Ｊ＆−Ｉ？ＯＪｌ？ｎシー＾ａｒ；／５ＳＪＬＳ１１（３ ｖ）ｌ二：：？Ｊａ＝＋２でｒττｒτ−Ｈａすｘ＝、”ｓＳλＳフｘＡｖｓｏ 二ｚ；工？’ｔＪ５＠？ｏＩＲ１！”Ｉ）：＝、−一諷Ｓ１１■−コＦ’Ｆ？！ 　／ＩＣ！ｔ　ｉＪ？’ｉ　Ｊ、’　ＴＩ　’ｎｎコミ　ｍ　ｗｍシＳ■εソ麗 ズニ１：フココπτ【＾鼠プクＩ−ロ入ｒ口１１　ｖＷ２５Ｌ：舅＝２ｆｆｌ＋ ｉ　＝線Ｍ℃Ｍ１ｆ＠　ｇＬニル’６２；５軌　フコエ　−、　。
＝　ｎａ＝：　−工１１　？ｃ３ＪＬ　ゴ１　−　−り＝＝〒ｎぶ工縞、コ°１ ｎロｊｌ；二ｕｘａｕ丁＋＝ｍｍ二　■コ１　ｅｃｒ’：　：４　ｕ　Ｔｅ驕　 Ｑｎ評ｍｎπ　戒心＝；了Ｗ冨工嬬：、２Ｗコ１０フ；１−τＣ＆ｌσｍコｍｗ τＺＷ−Ｗ１０幻長５藝　Ｒコ＾　σ口π丁ｎ口（〃４＋４　ｖｃじ１０１−Ｊ ≦鴎　ηコニ １３ｖｅツ１０１電；４π　哀コ息 −ｆ’ＩＷＩ口５（ＥＦ”−：コｉ、ｙｅｉａ！　■ロツ１ｍコーＪ４ヤ　罫コ ニ ：ｎ　ｗ１ａ＋ロ　ニｆｉＴｌコ累 ２５　ＶＩＣＯ！ＩｎＦＩＪ４ｍ　’ｒｃ５ｎＬ　Ｏ！１ｌＬＴｃ２ＸＩ７ｒ′ ｎ　ｖｃｏｓ調α日ｎ−　■コ１　冨口孔１■にツ　■αＵコＣＬＪＡ＋ａ　’ ！ｔツエ２５　ＶＩｉｌｊ５ｍ　５４．　’！ｔツＣコ１紘■ＷＷ　埴Ｃコｌコ 賦４２Ｊ４義　°冨ツ直　σ−Ｘ「Ｊ、　ＣＤＲ３の長さ分布 表８は、ｐＨｃ＋　トランスジェニックマウス中の枠内ＶＤＪ接合部を有する転 写物からのＣＤＲ３ペプチドの長さをヒトＰＢＬ中のそれと比較したものである 。ヒトＰＢＬデータは同じ＜　Ｙａｍａｄａらから得られたものである。両分布 は類似しているが、トランスジェニックマウスの分布はヒトＰＢＬから観察され たものよりもわずかに小さいＣＤＲ３ペプチドの方に偏っていた。トランスジェ ニックマウスにおけた平均サイズと実質的に同じである。
存在率（±３％） ９〜１２　ノ１８　４１ １３〜１８　２６　３７ １００％　１００％ ファージベクターλＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７　（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｉｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）中にクローニングされた２種のヒト 白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサ−を 含むλ１．３の１　ｋｂ　Ｐａｃ　Ｉ　／　Ｈｉｎｄｎ［断片を用いてスクリー ニングする。陽性クローンを、次のｖＨ特異的オリゴヌクレオチド二ニオゴ−７ ５’　−ｔｅａ　ｇｔｇ　ａａｇ　ｇｔｔ　ｔｃｃ　ｔｇｃ　ａａｇ　ｇｃａ　 ｔｃｔ　ｇｇａｔａｃ　ａｃｃ　ｔｔｃ　ａｃｅ　−３’オリゴ−８５’　−ｔ ｃｃ　ｃｔｇ　ａｇａ　ｃｔｃ　ｔｃｃ　ｔｇｔ　ｇｃａ　ｇｃｃ　ｔｃｔ　ｇ ｇａｔｔｃ　ａｃｅ　ｔｔｃ　ａｇｔ　−３’の混合物とのハイブリダイゼーシ ョンについて試験する。
■プローブとＪ−μプローブの両方とハイブリダイズするクローンを単離し、そ して再配列されたＶＤＪセグメントのＤＮＡ配列を機能的ＶＪ上セグメント含む 断片（転写解読枠およびスプライスシグナル）を、プラスミド由来のＸｈｏ　１ 部位が挿入断片配列の５′末端に隣接するように、プラスミドベクターｐＳＰ７ ２中にサブクローニングする。機能的ＶＤＪセグメントを含むサブクローンをＸ ｈｏ　ＩとＰａｃ　Ｉ　（Ｐａｃ　ＩはＪ−μイントロンエンハンサー近（の部 位を認識する稀少な切断酵素である）で消化し、そして挿入断片をＸｈｏ　Ｉ　 ／Ｐａｃ　Ｉで消化されたｐＨＣ２中にクローニングし、機能的ＶＤＪセグメン ト、Ｊ−μイントロンエンハンサー１μスイッチ要素、μ定常領域コードエクソ ンおよびγ１定常領域（これは繁殖不能転写物関連配列、γ１スイッチおよびコ ードエクソンを含む）を存するトランスジエン構成物を作製する。上述したよう に、このトランスジエン構成物をＮｏｔＩで切り出し、そしてマウス胚の前核中 にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。
実施例１４ １．　プラスミドベクターｐＧＰｌｃ プラスミドベクターｐＧＰ１ａをＮｏｔＩで消化し、そして次のオリゴマクレオ チド： オリゴ−８１５’　−ｇｇｃ　ｃｇｃ　ａｔｅ　ｃｃｇ　ｇｇｔ　ｃｔｃ　ｇａ ｇ　ｇｔｃ　ｇａｃ　ａａｇｃｔｔ　ｔｃｇ　ａｇｇ　ａｔｃ　ｃｇｃ　−ｓ’ オリゴ−８２５’　−ｇｇｃ　ｃｇｃ　ｇｇａ　ｔｃｃ　ｔｃｇ　ａａａ　ｇｅ ｔ　ｔｇｔ　ｃｇａ　ｃｃｔＣｇａ　ｇａＣＣＣｇｇｇａ　ｔｇｃ　−３’をそ の中に連結せしめる。生じたプラスミドｐＧＰ１ｃは、ＮｏｔＩ部位により隣接 されたＸｍａ　Ｉ　、　Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、　ＨｉｎｄＩ［Ｉおよ びＢａｍＨＩ制限部位を有するボリリノン力−を含む。
２　プラスミドベクターｐＧＰＩｄ プラスミドベクターｐＧＰ１ａをＮｏｔＩで消化し、そして次のオリゴヌクレオ チド： オリゴ−８７５’　−ｇｇｃ　ｃｇｃ　ｔｇｔ　ｃｇａ　ｃａａ　ｇｅｔ　ｔａ ｔ　ｃｇａ　ｔｇｇ　ａｔｅｅｔｃ　ｇａｇ　ｔｇｃ　−３’ オリゴ−８８５’　−ｇｇｃ　ｃｇｃ　ａｃｔ　ｃｇａ　ｇｇａ　ｔｃｃ　ａｔ ｅ　ｇａｔ　ａａｇ　ｃｔｔｇｔｃ　ｇａｃ　ａｇｃ　−３’ をその中に連結せしめる。生じたプラスミドｐｃｐｌｄは、ＮｏｔＩ部位により 隣接されたＳａｌ　Ｉ　、　ＨｉｎｄｌＩｌ、　Ｃ１ａ　Ｉ　、　ＢａｍＨおよ びＸｈｏ　Ｉ制限部位を有するポリリノンカーを含む。
Ｂ、ＪにおよびＣにクローンの単離 ファージベクターλＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７　（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、。
Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ　）中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡ ライブラリーを、ヒトに軽鎖Ｊ領域特異的オリゴヌクレオチド：オリゴ−３６５ ’　−ｃａｃ　ｃｔｔ　ｃｇｇ　ｃｃａ　ａｇｇ　ｇａｃ　ａｃｇ　ａｃｔ　ｇ ｇａ　ｇａｔｔａａ　ａｃｇ　ｔａａ　ｇｃａ　−３’を用いてスクリーニング し、そしてファージクローン１３６．２と１３ｏ。
を単離する。１３６．２からＪに１セグメントを含む７．４　ｋｂ　Ｘｈａ　７ 断片を単離し、プラスミドｐＮＮＯａ中にサブクローニングしてグラスミ１゛ク ローン９３６．２を作製する。Ｃに遺伝子セグメントと共に、工にセＣ゛メント ２〜５を含む近隣の１３　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ断片をファージクローン１３６、５ から単離し、そしてプラスミドｐＮＮＯａ中にサブクローニングしてプラスミド クローン９３６．５を作製する。それら２つのクローンを一緒にすると、Ｊにｌ の７．２ｋｂ上流で始まりＣにの９　ｋｂ上下流終わる領域に及ぶ。
Ｃ９再配列された軽鎖トランスジエンの作製１、　再配列された可変セグメント を発現させるためのＣにベクター１ＣＫＩ Ｃに遺伝子を含むプラスミドクローンｐ３６．５の１３　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ断片 を、９　ｋｂの下流配列と一緒に、該挿入断片の５′末端がプラスミドＸｈｏＩ 部位に隣接した状態で、プラスミドベクターｐＧＰｌｃの５ａｌＩ部位中にクロ ーニングする。生じたクローンｐＣＫ１は、再配列されたＶＪにセグメントを含 むクローン化断片をユニーク５’ＸｈｏＩ部位に収容することができる。次いで 該トランスジエンをＮｏｔＩで切り出し、ゲル電気泳動によってベクター配列か ら精製する。得られたトランスジエン構成物は、ヒトＪ−Ｃにイントロンエンハ ンサ−を含むであろうし、ヒト３′にエンハンサ−を含むことができる。
Ｚ　再配列された可変セグメントを発現させるための重鎮エンハンサ−含有Ｃに ベクター１）ＣＮ３ 片をｐＵＣ１８中にサブクローニングし、プラスミドｐＪＨ２２，１を作製した 。このプラスミドをＳｐｈ　ｒにより線状化し、フレノウ酵素を用いて末端をフ ィルインした。フレノウ処理されたＤＮＡを次いでＨｉｎｄ■て消化し、そして ヒト重鎖μイントロンエンハンサ−ＣＨａｙｄａｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３０７： ３３４−３４０　（１９８４））を含むファージクローンλ１．３（前の実施例 ）のＭｌｕＩ（フレノウ）　／Ｈｉｎｄｌ［断片をそれと連結した。
生じたプラスミドｐＭＨＥｌは、両者が単一のＢａｍＨ１／　Ｈｉｎｄｌ［断片 上に切除されるように、ｐＵＣ１８中に一緒に連結されたマウスとヒトの重鎖μ イントロンエンハンサ−から成る。この２．３ｋｂ断片を単離し、ｐＧＰｌｃ中 にクローニングして１１ＭＨＥ２を作製する。ｐＭＨＥ２を５ａｌＩで消化し、 ｐ３６．５の１３　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ挿入断片をその中にクローニングする。生 じたプラスミドｐＣＫ２は、マウスとヒトの重ＩＪ−μイントロンエンハンサ− がトランスジエン挿入断片の３′末端に融合していること以外は、ｐｃＫｌと同 一である。最終トランスジエンの発現を調節するために、異なるエンハンサ−１ 即ちマウスまたはラットの３′を使って類似構成物を作製することができる。
３、　再配列されたに軽鎖可変セグメントの単離ファージベクターλＥＭＢＬ３ ／ＳＰ６／Ｔ７　（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｉｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）中にクローニングされた２つのヒト 白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、９３６．５の３．５　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　 ／　Ｓｍａ　Ｉ断片を含むヒトに軽鎖Ｊ領域を用いてスクリーニングした。陽性 クローンを、次のＶに特異的オリゴヌクレオチド：オリゴ−６５５’　−ａｇｇ 　ｔｔｃ　ａｇｔ　ｇｇｃ　ａｇｔ　ｇｇｇ　ｔｃｔ　ｇｇｇ　ａｃａ　ｇａｃ ｔｔｃ　ａｃｔ　ｃｔｃ　ａｃｅ　ａｔｅ　ａｇｅ　−３’とのハイブリダイゼ ーションについて試験した。■プローブとＪプローブの両方とハイブリダイズし たクローンを単離し、そして再配列されたＶＪにセグメントのＤＮＡ配列を決定 する。
４、　再配列されたヒト軽鎖構成物を含有するトランスジェニックマウスの作製 機能的ＶＪ上セグメント含む断片（転写解読枠およびスプライススゲナル）をベ クターｐｃＫ１およびｐＣＫ２のＸｈｏ　Ｉ部位中にサブクローニングし、再配 列されたに軽鎖トランスジエンを作製する。ＮｏｔＩでの消化により該トランス ジエン構成物をベクター配列から単離する。アガロースゲル上で精製した挿入断 片をマウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを 作製する。ヒトに鎖を発現している動物を、重鎮小遺伝子を含有するトランスジ ェニック動物（実施例１４）と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを作る 。
ＶＪに組合せの全部が、広域スペクトルの種々の重＊ＶＤＪ組合せと安定な重鎖 −軽鎖複合体を形成できるわけではないので、それぞれ異なる再配列されたＶＪ にクローンを使って幾つかの異なる軽鎖トランスジエン構成物を作製し、そして 重鎮小遺伝子座トランスジエンを発現するマウスと交配させる。二重トランスジ ェニック（重鎮構成物と軽鎖構成物の両方）動物から、末梢血、牌臓およびリン パ節リンパ球を単離し、ヒトおよびマウスの重鎮および軽鎖免疫グロブリンに特 異的な蛍光抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）て染 色し、そしてＦＡＣ３ｃａｎ分析装置（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　 Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ。
ＣＡ）を使ってフローサイトメトリーにより分析する。最大数のＢ細胞の表面上 に最高レベルのヒト重鎖／軽鎖複合体を生じ且つ免疫細胞区分に悪影響を与えな い（ＢおよびＴ細胞サブセット特異的抗体を用いたフローサイトメトリー分析に よりアッセイした時）再配列された軽鎖トランスジエン構成物を、ヒトモノクロ ーナル抗体の産生のために選択する。
Ｄ、再配列されていない軽鎖小遺伝子座トランスジエンの作製１、小遺伝子座ト ランスジエンを作製するためのＪに、Ｃに含有ベクターｐＪｃＫ１ ９３６、５の＋３　ｋｂのＣに含有Ｘｈｏ　Ｉ挿入断片をフレノウ酵素で処理し 、ＨｉｎｄｌｌＩで消化されフレノウ処理されたプラスミドｐＧＰｌｄ中にクロ ーニングする。挿入断片の５′末端がベクター由来のＣｌａＩ部位に隣接するよ うなプラスミドクローンを選択する。生じたプラスミド９３６．５−１ｄをＣ１ ａＩで消化し、フレノウで処理する。ｐ３６．２のＪ／Ｃ１含有７．４　ｋｂ　 Ｘｈｏ　Ｉ挿入断片をフレノウで処理し、モしてＣ１ａＩで消化されフレノウ処 理されたｐ３６．５−１ｄ中にクローニングする。９３６．２挿入断片がｐ３６ ．５挿入断片と同じ方向にあるクローンを選択する。
このクローンｐＪｃＫ１　（図３４）は、７．２ｋｂの上流配列および９　ｋｂ の下流配列と一緒に、完全なヒトＪに領域およびＣに領域を含む。該挿入断片は ヒトＪ−Ｃにイントロンエンハンサ−も含み、ヒト３′にエンハンサ−を含むこ ともある。該挿入断片は、追加の３′隣接配列、例えば重鎮または軽鎖エンハン サ−をクローニングする目的でユニーク３’５ａｌＩ部位により隣接される。ユ ニークＸｈｏ　Ｉ部位は、再配列されていない■に遺伝子セグメント中でクロー ニングする目的で該挿入断片の５′末端に置かれる。ユニーク５ａｌＩおよびＸ ｈｏ　Ｉ部位は、最終のトランスジエン構成物をベクター配列がら単離するため に使われるＮｏｔＩ部位により隣接される。
Ｚ　再配列されていないＶに遺伝子セグメントの単離およびヒト１ｇ軽鎖タンパ ク質を発現するトランスジェニック動物の作製Ｖに特異的オリゴヌクレオチドで あるオリゴ−６５（上述）を使って、ファージベクターλＥＭＢＬ３／ＳＰ６／ Ｔ７　（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｉｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ　）中にクローニングされたヒト胎盤 ゲノムＤＮＡを探査する。生じたクローンからの可変遺伝子セグメントを配列決 定し、機能的と思われるクローンを選択する。機能性を判断するための基準は、 転写解読枠、完全なスプライス受容体および供与体配列、並びに完全な組換え配 列を含むことである。選択された可変遺伝子セグメントを含むＤＮＡ断片をプラ スミドｐＪｃＫ１のユニークＸｈｏ　Ｉ部位にクローニングし、小遺伝子座構成 物を作製する。
得られたクローンをＮｏｔＩで消化し、挿入断片を単離し、そしてマウス胚の前 核中にマイクロインジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。それらの 動物のトランスジエンは、Ｂ細胞発達の際にＶ−Ｊ結合を受けるであろう。ヒト に鎖を発現する動物を、重鎮小遺伝子座を含有するトランスジェニック動物と交 配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを得る。
この実施例は、接合子中へのマイクロインジェクションまたはＥＳ細胞中への組 み込みによりマウス生殖細胞中に導入される、ヒトゲノム重鎮免疫グロブリント ランスジエンのクローニングを記載する。
Ｍａｒｚｌｕｆｆ、Ｗ、Ｆ、ら、（１９８５）　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　 ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　：　ＡＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ ｈ、　Ｂ、Ｄ、　ＨａｍｍｅｓおよびＳ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ編、　８９−１ ２９頁、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄにより記載されたようにして、新 鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離された核（またはＰＢＳで洗浄したヒ ト精母細胞）を０．５％低融点アガロースブロック中に埋め込み、そして核につ いては５００ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１％ＳＤＳ中の１■／−のブロティナーゼＫに より、精器細胞については５００ｍ１ｔＥＤＴＡ、　１％ＳＤＳ、　１０ｍＭ　 ＤＴＴ中の１■／ｍ／のブロティナーゼＫにより、５０℃にて１８時間溶解せし める。該ブロックを４０℃ｇ／ｍｌのＰＭＳＦ／ＴＥ中で５０℃にて３０分間イ ンキュベートすることにより、ブロティナーゼＫを不活性化する。次いてＭ、　 ＦｉｎｎｅｙによりＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ、　Ａｕ５ｕｂｅｌ　ら編、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅ ｙ　＆　５ｏｎｓ、増補４．１９８８．例えば第２、５．１章）中に記載された ように、アガロース中で該ＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで消化する。
ＮｏｔＩで消化したＤＮＡを、次いでＡｎａｎｄら、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ。
１７：３４２５−３４３３　（１９８９）により記載されたようにパルスフィー ルドゲル電気泳動により分画する。ＮｏｔＩ断片に富む両分をサザンハイブリダ イゼーションによりアッセイし、この断片によってコードされるｌまたは複数の 配列を検出する。そのような配列は、重鎖Ｄセグメント、Ｊセグメントおよびγ ｌ定常領域と共に６つのｖＨソファリー全部の代表物を含む〔この断片は、Ｂｅ ｒｍａｎら（１９８８）、前掲によればＨｅＬａ細胞から６７０　ｋｂ断片とし て同定されているけれども、本発明者らはそれがヒト胎盤および精子ＤＮＡから のは８３０　ｋｂ断片であることを発見した〕。このＮｏｔＩ断片を含む両分（ 図４参照）を記載の如＜　（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　２： ６５−７１　（１９９０））ベクターｐＹＡＣＮＮのＮｏｔＩ部位中に連結せし める。プラスミドｐＹＡＣＮＮは、ｐＹＡｃｎｅｏ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）をＨ ｃｏＲＩで消化しそしてオリゴヌクレオチド５’　−ＡＡＴ　ＴＧＣＧＧＣＣＧ Ｃ−３’の存在下で連結せしめることにより、調製される。
Ｔｒａｖｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ ６：５８９８−５９０２　（１９８９）により記載された通りに、重鎮ＮｏｔＩ 断片を含むＹＡＣベクターを単離する。クローン化されたＮｏｔＩ挿入断片を、 Ｍ、　Ｆｉｎｎｅｙ　（前掲）により記載されたようなパルスフィールドゲル電 気泳動により高分子量酵母ＤＮＡから単離する。１ｍＭスペルミンの添加により ＤＮＡを濃縮し、上述した通り単細胞胚の核に直接マイクロインジェクトする。
あるいは、ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動により単（１９９１））によ りＥＳ細胞中に導入するか、またはＹＡＣをスフェロプラスト融合によりＢＳ細 胞中に導入する。
Ｖ、６、Ｄセグメント、Ｊセグメント、μ定常領域および一部のγ定常領域を含 むヒトゲノムＤＮＡの８５　ｋｂ　Ｓｐｅ　Ｉ断片は、本質的には実施例１に記 載した通りのＹＡＣクローニングによって単離された。生殖細胞型可変領域由来 の断片、例えば多コピーのｖ１〜■。
を含む上記の６７０−８３０　ｋｂ　Ｎｏｔ　Ｉ断片の上流の５７０　ｋｂ　Ｎ ｏｔ　Ｉ断片、を含有するＹＡＣを上述の如く単離する。ＣＢｅｒｍａｎら（１ ９８８）、前掲は、各々か多数のＶセグメントを含有する２つの５７０　ｋｂ　 Ｎｏｔ　Ｉ断片を検出した。〕この２断片を実施例１に記載の如くマウス単細胞 胚の核中に同時注入する。
典型的には、２つの異なるＤＮＡ断片の同時注入は、染色体内の同一部位のとこ ろへの両断片の組込みをもたらす。従って、該２断片各々の少なくともｌコピー を含む生じたトランスジェニック動物の約５０％が、定常領域含有断片の上流に 挿入されたＶセグメント断片を有する。それらの動物のうち、８５　ｋｂ　Ｓｐ ｅ　Ｉ断片の位置に関する５７０　ｋｂ　Ｎｏｔ　Ｉ断片の方向性に依存して、 約５０％がＤＮＡ逆位によりＶ−ＤＪ結合を行い、そして約５０％が欠失により Ｖ−ＤＪ結合を行うだろう。生じたトランスジェニック動物からＤＮＡを単離し 、そしてサザンブロットハイプリダイゼーションにより両方のトランスジエンを 含んでいることが示された動物（詳しくは、多数のヒト■セグメントとヒト定常 領域遺伝子の両方を含む動物）を、標準技術に従って、ヒト免疫グロブリンを発 現する能力について試験する。
実施例１７ 着目の抗原を使って、次の遺伝的特性＝９Ｊ、の欠失（実施例１０）については 内因性重鎮遺伝子座中の同型接合性；再配列されて（ないヒト重鎮小遺伝子座ト ランスジエン（実施例５および１４）の単一　コピーについては半接合性；およ び再配列されたヒトに軽鎖トランスジエン（実施例６および１４）の単一コピー については半接合性、免疫化スケジュールの後、牌臓を取り出し、牌細胞を使っ てハイブリドーマを調製する。着目の抗原と反応性である抗体を分泌する個々の ハイブリドーマクローンからの細胞を使ってゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤ ＮＡの試料を、ユニークな６塩基附記列を認識する幾つかの異なる制限酵素で消 化し、そしてアガロースゲル上で分画する。サザンブロットハイプリダイゼーシ ョンを使って２〜１０ｋｂ範囲内の２つのＤＮＡ断片を同定する。該断片の一方 は、再配列されたヒト重鎖ＶＤＪ配列の単一コピーを含み、もう一方は再配列さ れたヒト軽鎖ＶＪ配列の単一コピーを含む。それらの２断片をアガロースゲル上 でサイズ分画し、ｐＵｃ１８中に直接クローニングする。
クローン化された挿入断片を、定常領域配列を含む重鎮および軽鎖発現カセット 中にそれぞれサブクローニングする。
プラスミドクローンｐγｅｌ　（実施例１２）を重鎮発現カセットとして使用し 、再配列されたＶＤＪ配列をＸｈｏ　Ｉ部位中にクローニングする。プラスミド クローンＩＩＣＫＩを軽鎖発現カセットとして使用し、再配列されたＶＪ配列を Ｘｈｏ　Ｉ部位中にクローニングする。生じた７０−ンを一緒に使ってＳＰ０細 胞をトランスフェクトせしめ、着目ｂ’ｙいは、上述のン゛ローン化ハイブリト ーマ細胞からｍＲＮ　Ａを単離し、ｃＤＮＡを合成するのに使う。発現されるヒ ト重鎖および軽鎖ＶＤＪおよびＶＪ配列を、次いでＰＣＲにより増幅し、クロー ニングする（、１．　Ｗ、Ｌａｒｒｉｃｈら（１９８９）　Ｂｉｏｌ、　Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ、　７：９３４−９３８　）。
それらのクローンのヌクレオチド配列を決定した後、同じポリペプチドをコード するオリゴヌクレオチドを合成し、モしてＣ，Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：５４５４−５４５８　（１９８ ９）により記載されたようにして合成発現ベクターを作製する。
複合抗原によるトランスジェニック動物の免疫化成の実験は、トランスジェニッ ク動物がヒト赤血球上の抗原のような複合抗原により好結果に免疫化することが でき、そして正常マウスにおいて観察される応答速度論に類似した速度論で応答 することができることを証明する。
血液細胞は一般に適当な免疫原であり、赤血球と白血球の表面上には多数の異な る型の抗原を含んで成る。
ヒト血液による免疫化 一人の提供者からのヒト血液のチューブを収集し、機能的に破壊された内因性重 鎮遺伝子座（Ｊ、Ｄ）を有し且つヒト重鎮小遺伝子構成物（ＨＣＩ）を含有する トランスジェニックマウスを免疫化するのに使った。それらのマウスを系１１２ と命名する。血液を洗浄し、５０ｉのハンクス溶液中に再懸濁し、　ｌＸｌ０” 細胞／ｒｎｌに希釈した。次いで２８ゲージの針とｌｃｃの注射器を使って０． ２１ｎｌ（２ＸｌＯ７細胞）を腹腔内注射した。この免疫化プロトコールを６週 間に渡りほぼ毎週繰り返した。眼窩後方出血から採血し、血清を収集し、それを 特異抗体について試験することにより、血清抗体価をモニタリングした。免疫前 出血を対照として取った。まさしく最後の免疫化の時、血清またはハイブリドー マを得るためにそれらの動物を犠牲にする３日前に、ハイブリドーマの生産を増 大させるために尾部静脈内へのｌＸｌ０”細胞による免疫化を１回行った。
マウス＃　２３４３と２３４８は所望の表現型を有する二重鎮破壊背景上のヒト 重鎮小遺伝子トランスジェニック。
ハイブリドーマの作製 上述の通り免疫化された約１６週齢のトランスジェニックマウス（表９）のマウ ス牌細胞を非分泌性ＨＡ　Ｔ感受性ミエローマ細胞系Ｘ６３　Ａｇ８．６５３か ら成る融合相手と融合せしめることにより、ハイブリドーマを作製した。ハイブ リドーマクローンを培養し、血液細胞抗原に対して特異的な結合親和性を有する 免疫グロブリンを含有するハイブリドーマ上清を、例えばフローサイトメトリー により、同定した。
フローサイトメトリー フローサイトメトリーを使って血清とハイブリドーマ上清を試験した。提供者か らの赤血球をハンクス溶液中で４回洗浄し、５０．０００個の細胞を１．１−の ポリプロピレン微小管中に入れた。細胞をハイブリドーマからの上溝または抗血 清と共に染色媒質〔フェノールレッドまたはビオチン（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃ）　、３％新生ウシ血清、０．１％ナトリウムアジドを含まないＩ ＸＲＰＭＩ培地〕中で氷上で３０分間インキュベートした。対照は他の遺伝子型 を有する同腹マウスから成った。次いで細胞を５ｏｒｖａｌｌ　ＲＴ６００Ｂ中 で１００Ｏｒｐｍで５〜ｌｏ分間４°Ｃにて遠心することにより洗浄した。細胞 を２回洗浄した後、蛍光生成試薬を使って細胞表面上の抗体を検出した。２種類 のモノクローナル試薬を使って試験した。１つはＦＩＴＣで標識されたマウス抗 ヒトμ重鎖抗体（Ｐｈａｒｍａｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）であり 、もう１つはＰＥて標識されたラット抗マウスに軽鎖抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉ ｃｋｅｎｓｏｎ。
Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、　ＣＡ）であった。それらの試薬は両方とも同様な結果を与 えた。全血（赤血球と白血球）および白血球のみを標的細胞として使用した。両 方の組が陽性結果を与えた。
トランスジェニックマウスおよび同腹対照の血清を提供者からの赤血球または他 の個体からの白血球のいずれかと共にインキュベートし、洗浄し、次いで抗ヒト ＩｇＭ　ＦＩＴＣ標識抗体により発色させ、フローサイトメーター中で分析した 。結果は、ヒト小遺伝子座についてトランスジェニックであるマウス（マウス２ ３４３および２３４８）からの血清がヒト１ｇＭ反応性を示し、−万全ての同腹 動物（２３４４゜２３４５、２３４６．２３４７）からの血清は該反応性を示さ なかった。正常マウス血清（ＮＳ）とリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）を負の対 照として使用した。赤血球は未濾過であり、白血球はリンパ球のみを含むように 濾過された。比較を与えるためにＸ軸とｙ軸上に線が引かれている。融合体２３ ４８からの１００の上清に関してフローサイトメトリーを実施した。４つの上清 か血球細胞抗原に対する陽性反応性をＡ、アンチセンス配列配列の発現用のベク ター！、　クローニングベクターｐｃｐｌｈの作製ベクターｐＧＰ１ｂ　（前の 実施例に記載）をＸｈｏ　ＩとＢａｍＨで消化し、そして次のオリゴヌクレオチ ド： ５’　−ｇａｔ　ｃａｔ　ｃｇａ　ｇａｃ　ｃａｇ　ｇｔａ　ｃｃａ　ｇａｔ　 ｃｔｔ　ｇｔｇ　ａａｔ　ｔｃｇ　−３’５’　−ｔｃｇ　ａｃｇ　ａａｔ　ｔ ｃａ　ｃａａ　ｇａｔ　ｃｔｇ　ｇｔａ　ｃｃｔ　ｇｇｔ　ｅｔｃ　ｇａｇ　− ３’と連結せしめてプラスミドｐＧＰ１ｈを作製した。このプラスミドは、次の 制限部位：　Ｎｏｔｌ、　ＥｃｏＲｌ、　ＢｇｌＩｌ、　Ａｓｐ７１８．　Ｘｈ ｏＩ、　ＢａｍＨＩ。
ＨｉｎｄＩ［、ＮｏｔＩを含むポリリンカーを含有する。
２、　９ＢｃＥｌの作製 プロモーター−リーダー配列エクソン、第一イントロンおよびヒトＶ、、−Ｖフ ァミリー免疫グロブリン可変遺伝子セグメントの第二エクソンの一部を含む、ｐ ＶＨ２５１（前の実施例に記載）の０．８ｋｂＸｂａ　Ｉ　／　Ｂｇｌ　ＩＩ断 片を、Ｘｂａ　Ｉ　／　Ｂｇｌ　Ｉｆで消化したベクターｐＮＮＯａ中に挿入し てプラスミドｐＶＨ２５１Ｎを作製した。
ヒト成長ホルモン遺伝子（ｈＧＨ；　Ｓｅｅｂｕｒｇ　（１９８２）　ＤＮＡ　 １：２３９−２４９）のコードエクソンを含む２．２　ｋｂ　ＢａｍＨＩ／Ｅｃ ｏＲＩ　ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ／　ＥｃｏＲＩて消化したｐＧＨ１ｈ中にク ローニングした。生じたプラスミドをＢａｍＨで消化し、そしてｐＶＨ２５ＩＮ のＢａｍＨ［／　ＥｃｏＲＩ断片をｈＧＨ遺伝子と同じ方向において挿入し、プ ラスミドｐＶｈｇｈを作製した。
マウス重１ｉＪ−ｕイントロンエンハンサ−ＣＢａｎｅｒｊｉ　ら（１９８３） Ｃｅｌｌ　３３ニア２９−７４０）を含むマウスゲノムＤＮＡの０．９　ｋｂ　 Ｘｂａ　Ｉ断片をｐＵｃ１８中にサブクローニングしてプラスミドｐＪＨ２２， １を作製した。
このプラスミドをＳｐｈ　Ｉで直鎖状にし、末端をフレノウ酵素でフィルインし た。次いでフレノウ処理したＤＮＡをＨｉｎｄｌｌＩで消化し、そしてヒト重ｆ ｆ１Ｊ−μイントロンエンハンサ−（Ｈａｙｄａｙら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ 　３０７：３３４−３４０　）を含むファージクローンλ１．３（上記実施例） の１．４　ｋｂ　Ｍｌｕｌ　（フレノウ）　／ＨｉｎｄＩＩ［断片をそれと連結 せしめた。得られたプラスミドｐＭＨＥ１は、単一のＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｎ［ 断片において切り出すことができるようにｐＵｃ１８中に一緒に連結されたマウ スおよびヒトの重ＩＪ−μイントロンエンハンサ−から成る。
ｐＭＨＥｌのＢａｍＨＩ／　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ断片をＢａｍＨＩ／　ＨｉｎｄＩ［ Ｉで切断されたｐＶｈｇｈ中にクローニングし、Ｂ細胞発現ベクターｐＢｃＥ１ を作製した。このベクター（図３６に描写）はユニークＸｈｏ　ＩおよびＡｓｐ ７１８クローニング部位を含存し、その中にアンチセンスＤＮＡ断片をクローニ ングすることができる。それらのアンチセンス配列の発現は、上流の重鎮プロモ ーター−エンハンサ−組み合わせにより指令され、下流のｈＧＨ遺伝子配列はイ ントロン配列に加えてトランスジエン構成物の発現を促進するポリアデニル化配 列を提供する。ｐＢｃＥｌから作製されたアンチセンストランスジエン構成物は ＮｏｔＩでの消化によりベクター配列から分離することができる。
Ｂ、　１ｇＭアンチセンストランスジエン構成物下記オリゴヌクレオチド： ５’　−ｃｇｃ　ｇｇｔ　ａｃｅ　ｇａｇ　ａｇｔ　ｃａｇ　ｔｃｃ　ｔｔｃ　 ｃｃａ　ａａｔ　ｇｔｃ　−３’５’　−ｃｇｃ　ｃｔｃ　ｇａｇ　ａｃａ　ｇ ｅｔ　ｇｇａ　ａｔｇ　ｇｇｃ　ａｃａ　ｔｇｃ　ａｇａ　−３’を、基質とし てマウス膵臓ｃＤＮＡを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるマウスＩ ｇＭ定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られた０、３ｋ ｂのＰＣＲ産物をＡｓｐ７１８とＸｈｏ　Ｉで消化し、そしてＡｓｐ７１８／　 Ｘｈｏ　Ｉで消化したｐＢｃＥｌ中にクローニングしてアンチセンストランスジ エン構成物ｐＭＡＳ　１を作製した。ｐＭＡｓｌの精製済ＮｏｔＩ挿入断片を、 単独でまたは１もしくは複数の別のトランスジエン構成物と組み合わせて、半日 マウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製 した。この構成物はマウスＩｇＭのｍＲＮＡとハイブリダイズするＢ細胞中のＲ ＮＡ転写物を発現し、よってマウス１ｇＭタンパク質の発現をダウンレギュレー ションする。ｐＭＡｓｌ　とｐＨｃｌのようなヒト重鎮トランスジエン小遺伝子 座とを含有する二重トランスジェニックマウス（両構成物の同時注入によるかま たは一部トランスジェニックマウスの交配により作製される）は、ヒト重鎮小遺 伝子座のみについてトランスジェニックであるマウスよりも高い比率のＢ細胞上 に、ヒトトランスジエンによってコードされる１ｇレセプターを発現するだろう 。ヒト対マウスＩｇレセプター発現細胞の比は、一部はＢ細胞の分化と発展を促 進する因子および細胞に対する２集団間の競争のためである。
１ｇレセプターはＢ細胞発達において重要な役割を果たすので、表面上に減少し たレベルのＩｇＭを発現する（マウスＩｇ特異的アンチセンスダウンレギュレー ・シ３ンのため）マウスＩｇレセプター発現Ｂ細胞も、ヒトレセプターを発現す る細胞も競争しないだろう。
Ｃ，Ｉｇにアンチセンストランスジエン構成物取の２つのオリゴヌクレオチド： ５’　−ｃｇｃ　ｇｇｔ　ａｃｅ　ｇｃｔ　ｇａｔ　ｇｅｔ　ｇｃａ　ｃｃａ　 ａｃｔ　ｇｔａ　ｔｃｃ　−３’５’　−ｃｇｃ　ｅｔｃ　ｇａｇ　ｃｔａ　ａ ｃａ　ｃｔｃ　ａｔｔ　ｃＣｔ　ｇｔｔ　ｇａａ　ｇｃｔ　−３’を、基質どし てマウス膵臓ｃＤＮＡを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるマウスＩ ｇに定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られた０、３ｋ ｂのＰＣＲ産物をＡｓｐ７１８とＸｈｏ　Ｉで消化し、そしてＡｓｐ７１８／　 Ｘｈｏ　Ｉで消化したｐＢｃＥｌ中にクローニングしてアンチセンストランスジ エン構成物ｐＫＡｓ１を作製した。ｐＭＡｓｌの精製済ＮｏｔＩ挿入断片を、単 独でまたは１もしくは複数の別のトランスジエン構成物と組み合わせて、半日マ ウス胚の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジエニ・ツクマウスを作製 した。この構成物はマウスＩｇにｍＲＮＡとハイブリダイズするＢ細胞中のＲＮ Ａ転写物を発現し、よってｐＭＡｓｌについて上述したのと同様にマウスＩｇに タンパク質の発現をダウンレギュレーションする。
実施例１９ この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおける好結果の免疫化と免 疫応答を証明する。
マウスの免疫化 １分子あたり４００以上のジニトロフェニル基と結合させたアオガイヘモシア＝ ン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　 （ＫＬＨ−ＤＮＰ）を以前発表された方法（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　［ｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ、　Ｌ、　ＨｕｄｓｏｎおよびＦ、Ｃ，Ｈａｙ、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ 　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ出版、第９頁、　１９８０年）に従ってミョウバン沈澱 させた。ミョウバン沈澱させたＫＬＨ−ＤＮＰ　４００μｇを１００μｌのリン 酸塩緩衝化塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中の臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム １００μｇと一緒に各マウスに腹腔内注射した。６日後に眼窩後洞出血により血 清試料を収集した。
血清中のヒト抗体反応性の分析 間接エンザイムリンクドイムノソルベントアツセイ（ＥＬＩＳＡ）を使って抗体 の反応性および特異性を評価した。免疫原による抗体誘導を分析するために幾つ かの標的抗原を試験した。タンパク質成分に対する反応性の同定にはアオガイヘ モシアニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）　、／％ブテンおよび／または修飾アミノ 基に対する反応性の同定にはウシ血清アルブミン、そして全免疫原に対する反応 性の同定にはＫＬＩ（−ＤＮＰを使用した。抗原へのヒト抗体結合は、マウス免 疫グロブリンとの交差反応性を全く持たないＩｇＭおよび＋ｇｃサブクラスに特 異的な酵素接合体により検出した。簡単に言えば、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのタン パク質を３７°Ｃにて一晩乾燥することによりマイクロタイタープレートを抗原 コーティングした。ＰＢＳ、５％ニワトリ血清、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０中に 希釈した血清試料をウェル中で室温にて１時間インキュベートし、次いで同希釈 剤中の抗ヒトＩｇＧ　ＦｃおよびＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’　）　−西洋ワサビペルオ キシダーゼまたは抗ヒトＩｇＭ　Ｐｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼと共にイン キュベートした。室温で１時間後、ＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏ ｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の添加により酵素活性を評価し、３０分後に４１ ５−４９０　ｎｍで読み取った。
トランスジェニックマウス中の免疫応答におけるヒト重鎮の関与図３７は、ＫＬ Ｈ−ＤＮＰによる免疫化に対する３匹の同腹子マウスの応答を表す。第１２９６ 号のマウスは再配列されていないヒト１ｇＭおよびＩｇＧトランスジエンを有し 、マウスＩｇ重鎮破壊について同型接合性であった。第１２９９号のマウスは無 破壊の背景上にトランスジエンを有し、１３０１号のマウスはそれらの遺伝子組 のいずれも遺伝しなかった。別の同腹子である第１２９７号のマウスはヒトトラ ンスジエンを有し、マウス重鎮破壊に関して半接合性であった。それを非免疫化 対照として実験に組み入れた。
結果は、ヒトＩｇＧと［ｇＭ応答は両方ともタンパク質への接合という状況にお いてハブテンに対して発生したことを証明する。ヒトＩｇＭはＫＬＨに対しても 発生したか、この時点ては存意なレベルのヒ）ＩｇＧは存在しなかった。同じマ ウスからの免疫前血清試料では、同じ標的抗原に対するヒト抗体の力価は有意で なかった。
実施例２０ この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおけるヒト抗原による好結 果の免疫化および免疫応答を証明し、モしてヒトトランスジエンの可変領域配列 中に無作為でない体細胞変異が起こることを証明する。
ヒト糖タンパク質抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎮を含んＣ成る抗体応答の 証明 この実験に使用するトランスジェニックマウスは、機能的内因性（マウス）重鎮 生産の欠失をもたらすＪ領域のところへのトランスジエンの導入（前掲）により 作製された機能的に破壊されたマウス免疫グロブリン重鎮遺伝子座について同型 接合性であった。該トランスジェニックマウスは、少なくとも１つの完全な再配 列されていないヒト重鎮小遺伝子座トランスジエン（ＨＣＩ　、前掲）も含み、 該トランスジエンは単一の機能的ｖＨ遺伝子（Ｖ、　２５１　）　、ヒトμ定常 領域遺伝子、およびヒトγ１定常領域遺伝子を含んで成る。ヒト免疫グロブリン トランスジエン産物を発現することが示されたトランスジェニックマウス（前掲 ）をヒト抗原による免疫化のため選択し、トランスジェニックマウスがヒト抗原 免疫化に対して免疫応答を生じる能力を有することを証明した。ＨＣｌ−２６系 統のマウス３匹とＨＣｌ−５７系統のマウス３匹（前掲）にヒト抗原を注射した 。
ミョウバン上に不溶化された精製済ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）１００μｇを不 完全フロインドアジュバント中で０日目に注射し、次いで更に７．１４．２１お よび２８日目に不完全フロインドアジュバント中のミョウバン沈澱ＣＥＡを毎週 注射した。ＣＥＡの注射前の各日に眼窩後方出血により血清試料を収集した。各 グループ中の３匹のマウスの各々から同容量の血清を分析用にプールした。
マイクロタイタープレート上に固定化したヒトＣＥＡに結合したヒトμ鎖含有免 疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンをＥＬＩＳＡアッセイにより測 定した。ヒトμ鎖合作免疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンについ てのＥＬＩＳＡアッセイの結果をそれぞれ図３８および３９に示す。７日目まで は両系統について有意なヒトμ鎖Ｉｇ抗体価が検出され、約２１Ｂ１まで上昇が 観察された。ヒトγ鎖Ｉｇについては、有意な抗体価は遅れ、前者がＨＣｌ−５ ７系統て１４日目そして後者はＨＣｌ−２６系統で２１日目に明らかになった。
ヒトγ鎖Ｉｇの抗体価は、実験の間じゅう時間と共に増加を示し続けた。観察さ れたヒトμ鎖１ｇ応答は、平坦域に達した後、遅れて発生する上昇し続けるγ鎖 応答と組み合わせると、親和性の成熟に伴って観察されるパターンに特徴的であ る。２１日目の試料の分析は、無関係の抗原であるアオガイヘモシアニン（ＫＬ Ｈ）に対する反応性の欠失を示した。これは、抗体応答か特異的な形でＣＥＡに 対して向けられたことを指摘する。
それらのデータは、再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子座に関してト ランスジェニックである動物が、（１１ヒト抗原（例えばヒト糖タンパク質、Ｃ ＥＡ）に対して応答でき、（２）観察されたμからγへのクラススイッチにより 例示されるようなイソタイプスイッチ（クラススイッチ）を受けることができ、 そして（３）それらの体液性免疫応答における親和性の成熟の特徴を表すことを 示す。一般に、それらのデータは、（１１ヒト［ｇ）ランスジェニックマウスか 異種抗体を誘導する能力を有すること、（２）単一のトランスジエン重鎖可変領 域が限定抗原に対して応答する能力を有すること、（３）−次および二次応答形 成に典型的な時期に渡る応答速度論、（４１１ｇＭからＩｇＧへの、トランスジ エンによってコードされる体液性免疫応答のクラススイッチ、および（５）トラ ンスジェニック動物がヒト抗原に対してヒト配列抗体を産生ずる能力を有するこ とを指摘する。
ヒト重鎮トランスジエン小遺伝子座における体細胞変異の証明ＨＣＩ　トランス ジエンの多重コピーを含有するＨＣｌ−５７系統のトランスジェニックマウスを 免疫グロブリン重鎖欠失マウスと交配させ、ＨＣｌトランスジエンを含み且つ内 因性マウス重鎮の両対立遺伝子に破壊を含むマウスを得た（前掲）。それらのマ ウスは、マウスにおよびλ軽鎖と共にヒトμおよびγ１重鎖を発現する（前掲） 。それらのマウスのうちの１匹を、１．５力月の期間に渡る反復腹腔内注射によ り、ヒト癌胎児性抗原に対して高度免疫化した。このマウスを犠牲にし、膵臓、 鼠径部および腸間膜のリンパ節、並びにバイヤー環からリンパ系細胞を単離した 。該細胞を合わせ、全ＲＮＡを単離した。該ＲＮＡから第−鎖ｃＤＮＡを合成し 、次の２つのオリゴヌクレオチドプライマｍ： １４９　５’　−ｅｔａ　ｇｔｃ　ｃｇａ　ｇｔｃ　ｃａａ　ｇｇａ　ｇｔｃ　 ｔｇｔ　ｇｅｅ　ｇａｇ　ｇｔｇ　ｃａｇ　ｃｔｇ（ｇ／ａ／ｌ／ｃ）　−３’ １５１　５’−ｇｇｃ　ｇｅｔ　ｃｇａ　ｇｔｔ　ｃｃａ　ｃｇａ　ｃａｃ　ｃ ｇｔ　ｃａｃ　ｃｇｇ　ｔｔｃ　−３’を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として 使用した。
それらのプライマーはＶＨ２５１／γｌ　ｃＤＮＡ配列を特異的に増幅する。
増幅された配列をＸｈｏ　Ｉで消化し、ベクターｐＮＮＯａ中にクローニングし た。２３個のランダムクローンの挿入断片のＤＮＡ配列を図４０に示す：生殖細 胞配列からの配列変異が指摘され、ドツトは配列が生殖細胞と同じであることを 示す。ＶＨ２５１トランスジエンの生殖細胞配列と該ｃＤＮＡ配列との比較は、 クローンのうちの３個が完全に未変異であり、他の２３個は体細胞変異を含むこ とを明らかにした。３個の未変異配列のうちの１つは枠外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒ ａｍｅ）　ＶＤＪ連結に由来する。特定の位置において観察された体細胞変異は 、ヒトリンパ球において観察されたものと同様な頻度で且つ同様な分布パターン で起こる（Ｃａｉ　ら（１９９２）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１７６：１０７ ３；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。体細胞変異の総体的頻度は 約１９６である；しかしながら、ＣＤＲＩ内の頻度は約５％にまで及び、抗原結 合に影響を及ぼすアミノ酸変化への選択を指摘する。これは、ヒト重鎖配列の抗 原指令型親和性成熟を証明する。
実施例２１ この実施例は、組み換わると完全なヒト軽鎖率遺伝子座トランスジエンを形成す る２つの別々のポリヌクレオチドを同時導入することによる、好結果のトランス ジエンの形成を証明する。
２つの重複ＤＮＡ断片の同時注入による再配列されていない軽鎖率Ｖに特異的オ リゴヌクレオチドであるオリゴ−６５（５°−ａｇｇ　ｔｔｃａｇｔ　ｇｇｃ　 ａｇｔ　ｇｇｇ　ｔｃｔ　ｇｇｇ　ａｃａ　ｇａｃ　ｔｔｃ　ａｃｔ　ｅｔｃ　 ａｃｃ　ａｔｅ　ａｇｃ　−３’　）を使って、７フ一ジベクターλＥＭＢＬ３ ／ＳＰ６／Ｔ７　（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ−ｏｒｉｅｓ、　Ｉｎ ｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）中にクローニングされたヒト胎盤ゲノム ＤＮＡライブラリーを探査した。陽性ファージクローンからの■にセグメントを 含有するＤＮＡ断片をプラスミドベクター中にサブクローニングした。得られた クローンからの可変遺伝子断片を配列決定し、機能的であると思われるクローン を選択した。機能性を判断する基準は次のものを含む：転写解読枠、完全なスプ ライス受容体および供与体配列、並びに完全な組換え配列。この方法により単離 された４つの異なるプラスミドクローンからの４つの機能的Ｖに遺伝子セグメン ト（ｖｋ６５．３．　ｖｋ６５．５．　ｖｋ６５．８およびｖｋ６５．１５　） のＤＮＡ配列を図４１〜４４に示す。４つのプラスミドクローンｐ６５．３ｆ。
ｐ６５．５ｇｌ、　ｐ６５．８および９６５．１５ｆ）を下記に説明する。
（１ａ）　ｐ６５．３ｆ ファージクローンλ６５．３の３　ｋｂ　ＸｂａＩ断片を、ベクター由来の５ａ ｌＩ部位が該挿入断片の３′末端に近位になり且つベクター由来のＢａｍ８１部 位が該挿入断片の５′末端に近位になるようにｐＵｃ１９中にサブクローニング した。このクローンの３　ｋｂ　ＢａｍＨＩ／Ｓａｌ　Ｉ挿入断片をｐａｐ　ｌ 　ｆ中にサブクローニングして９６５．３ｆを得た。
（１ｂ）　Ｉ）６５．５ｇｌ ファージクローンλ６５．５の６．８　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片を、ベクター由来 のＸｈｏ　Ｉ部位が該挿入断片の５′末端に近位になり且つベクター由来の５ａ ｌＩ部位が該挿入断片の３′末端に近位になるようにｐＧＰｌｆ中にサブクロー ニングした。得られたプラスミドをｐ６５．５ｇｌ　と命名した。
（１ｃ）　ｐ６５．８ ファージクローンλ６５．８の６．５　ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ断片をｐＳＰ７２ 中にクローニングしてｐ６５．８を得た。
（１ｄ）　ｐ６ｓ、ｔｓｒ ファージクローンλ６５，１６の１０　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片をｐＵｃ１８中に サブクローニングしてプラスミド１）６５．１５．３を作製した。該プラスミド 挿入断片中の■に遺伝子セグメントを４．６　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ［ 小断片にマツピングし、これをｐＧＰｌｆ中にサブクローニングした。得られた クローンｐ６５．１５ｆは、挿入断片の５′および３′末端にそれぞれユニーク Ｘｈｏ　Ｉ部位および５ａｌＩ部位が置かれている。
２．９に■４ ｐ６５．８のＸｈｏＩ／５ａｉｌ挿入断片をｐ６５．１５ｆのＸｈｏ　Ｉ部位中 にクローニングしてプラスミドｐＫＶ２を作製した。ｐ６５．５ｇｌ　）Ｘｈｏ 　Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉ挿入断片をｐＫＶ２のＸｈｏ　１部位中にクローニングし てｐＫＶ３を作製した。
ｐＫＶ３のＸｈｏＩ／５ａｌＩ挿入断片をｐ６５．３ｆのＸｈｏ　Ｉ部位中にク ローニングしてプラスミドｐＫＶ４を作製した。このプラスミドは、４つの機能 的Ｖに遺伝子セグメントを含む単一の２１　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉ 挿入断片を含有する。ＮｏｔＩを使って挿入断片全体を切り出すことができる。
（３ａ）　ｐＫｃｏｒ ヒトゲノムＤＮＡファージスクローンに由来する２つのＸｈｏ　Ｉ断片をプラス ミドベクター中にサブクローニングした。第一の断片である１３　ｋｂのＪに２ −Ｊに５／Ｃに含有断片をフレノウ酵素で処理し、そして旧ｎｄＩ［Ｉで消化さ れフレノウ処理されたプラスミドｐＧＰｌｄ中にクローニングした。挿入断片の ５′末端がベクター由来のＣｌａＩ部位に近いプラスミドクローン（１）Ｋ−３ １）を選択した。第二のＸｈｏ　Ｉ断片である、Ｊにｌを含有する７、４ｋｂの ＤＮＡ断片を、３′挿挿入片Ｘｈｏ　Ｉ部位がベクタ−５ａｌＩ部位への連結に より破壊されるように、ＸｈｏＩ／５ａｌＩで消化されたｐＳＰ７２中にクロー ニングした。得られたクローンｐ３６．２ｓは、Ｊｔｃｌの４．５ｋｂ上流に挿 入断片由来のＣｌａＩ部位、およびＪにｌとＪに２の間に天然に存在するＸｈｏ Ｉ部位の少し下流にポリリンカー由来のＣｌａＩ部位を含有する。このクローン をＣ１ａＩで消化して４．７ｋｂ断片を遊離せしめ、該断片を正しい５′→３′ 方向において、Ｃ１ａＩで消化されたＩ）Ｋ−３１中にクローニングし、全部で ５個のヒトＪ　ｔ＝　ｔ−グメント、ヒトイントロンエンハンサ−１Ｃに、４． ５ｋｂの５′隣接配列を含有するプラスミドを作製した。このプラスミドｐＫｃ ｏｒは、挿入断片のそれぞれ５′および３′側にユニークな隣接Ｘｈｏ　Ｉ部位 および５ａｌＩ部位を含有する。
（３ｂ）　ｐＫｃｏｒＢ ヒト３′にエンハンサ−を含有する４　ｋｂ　Ｂａｍ旧断片（Ｊｕｄｄｅ、　Ｊ 、Ｇ。
およびＭａｘ、　Ｅ、Ｅ、、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１２：５２０６ 　（１９９２）　；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕を、５′末端 がベクターのＸｈｏ　Ｉ部位に近位になるようにｐｃｐ　Ｉ　ｆ中にクローニン グした。得られたプラスミド１）２４８ｆをＸｈｏＩで切断し、ｐＫｃｏｒの１ ７．７　ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉ断片を該エンハンサ−断片と同じ方 向でその中にクローニングした。
得られたプラスミドｐＫｃｏｒＢは、該挿入断片の５′および３′末端にそれぞ れユニークＸｈｏ　ＩおよびＳａ目部位を含有する。
（３ｃ）　ｐＫＣＩＢ ｐＫｃｏｒＢのＸｈｏＩ／５ａｌＩ挿入断片をｐ６５．３ｆの５ａｌＩ部位の中 にクローニングして軽鎖率遺伝子座トランスジエンプラスミドｐＫｃＩＢを作製 した。このプラスミドは、５個のＪにセグメント、ヒトイントロンエンハンサ− 、ヒトＣに、およびヒト３′にエンハンサ−を含有する。この２５　ｋｂ挿入断 片全体をＮｏｔＩ消化により単離することがプラスミドｐＫＶ４とｐＫｃＩＢか らの２つのＮｏｔＩ挿入断片を各々２．５μｇ／ｄの濃度でマイクロインジェク ション緩衝液中に混合し、そして上記実施例に記載のようにして半日マウス胚の 前核中に同時注入した。生成したトランスジエン動物は、２断片が一緒に組み込 まれたトランスジエン挿入断片（Ｃｏ４と命名、図４５に示した組換えの生成物 ）を含有する。ｐに■４挿挿入片の３′の３　ｋｂとｐＫｃＩＢ挿入断片の５′ の３　ｋｂは全く同じである。幾つかの組み込み現象は３ｋｂの共通配列に渡っ て２断片の間で相同組換えが起こったことを表す。Ｃｏ４は遺伝子座はトランス ジェニックマウス中のヒト配列軽鎖のレパートリ−の発現を指令するだろう。
本発明の好ましい態様の今までの記載は、例示および説明のために与えられる。
それらは排他的であるつもりはなく、また本発明を正確な開示形態に制限するつ もりはない。上記教示に照らして多数の改良および変更か可能である。
本明細書中の全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の刊行物または特許 出願が明確に且つ個別に参考として本明細書中に組み込まれると指摘されたかの ように、参考として本明細書中に組み込まれる。
本発明を理解の明確化の目的で例示によって幾分詳細に記載してきたが、請求の 範囲内で幾つかの変更および改良を行えることは明らかであろう。
ＦＩＧ、ブ ＦＩＧ、　２ ａ５Ｐ！！’ｊ　７５０Ｋｂ　ＩＭｂ　２５ＫｂＦＩＧ、　３ ＦＩＧＵＲＥＳ Ｘｔ’ＩＯＩ　Ｎｏｔ　Ｉ ＦＩＧＵＲＥ　６ オワ」−１オリ」−２オリゴ−３ ＦＩＧＵＲＥ　８ ０ＭＬＩＭ挿入部 ６．３ＫｂＢａｍＳｌ／Ｈ＋ｎ０ｌｌｌ　１ＯＫｂＨｉｎｏｌｌＩ／ＢａｍＨ１ １５ＫｂＢａｍＨｌヒトＵ遺イ云座 ＦＴＧＵＲＥ　９ ヒトＣ７１ｉＰｉ伝子 Ｈｅｎ○１！１　ヨｇｌ　Ｉｆ　ＨｉｎＤ　Ｉｌｌ　３ｇ１＋ｌ−一−−−−− −−−−−−−−−−ヨーー−ヨーＣＨ，Ｈｃｔ−＋、　ＣＨ，工Ｍ ＨｉｎＤ　ｌ１ｌ ＦＩＧＵＲＥ　１１ ３１．５　Ｋｂ　Ｎｏｔ　ｌ／Ｓｏｅ　＋挿入部ＦＩＧＵＲＥ　１２ ＦＴＧＵＲＥ　１４ Ｓｍａｒ　Ｓｍａｒ ４Ｋ　〇に ５　Ｋｌ）　Ｓｍａ　ｌ　１６　Ｋｌ：＋　Ｓｍａ　１ＦＩＧＵＲＥ　１５ ＦＩＧＵＲＥ　１６ マウス玉鎖遺伝座 Ｓｐｈ　ｌ　Ｎａｅ　＋ ＦＩＧＵＲＥ　１８ａ ｏＧＫＮｅ。
（Ａ＞ ＦＩＧＵＲＥ　１８ｂ ５口１１ Ｓｏｎ　ｌ／Ｎａｅ　１ ＦＩＧＵＲＥ　１８ｃ 三ＣＯ日１　Ｈ＋ｎＣＩ　ＩＩＩ ＦＩＧＵＲＥ　１８ｄ マウスカッパー遺伝子 Ｂ（１＋　Ｉ＋ ＦＩＧＵＲＥ　１９ａ ＦＩＧＵＲＥ　１９ｂ ＢＳ５？ｌ　１１ ＦＩＧＵＲＥ　１９ｃ ｏ　ｔｕ　Ｌ 特表千７−５０３１３２　（４７） ＦＩＧＵＲＥ　２２ 希釈 ＦＩＧＵＲＥ　２８ ＦＩＧＵＲＥ　２９ □　オリゴ（ｄＣ）及びオリゴ６９（二よるＰＣＲｉｌ！１４４↓　第１ノゴｒ ＣＪによるプライマー伸長↓　オリゴｒＤｊＩこよるプライマー伸長ｉ　オリゴ ｒ［Ｊ及びオリゴ［ＦＪによるＰＣ＋（増幅コンカテネートライブラリー 合成重鎮可変領域の合成 ＦＩＧＵＲＩｌ、、　３０ ＦＩＧ［３３ ＦＩＧ、　３４ マウス１１　６７６６７４６７３６７０６６６６６５６６４４９Ｇ遺伝子型　Ｋ ＣＩＫＣＩ）ＣＩＫＣＩ　−ＫＣＩ　−１（ＣＩＦＩＧＵＲＥ３５ ヒトｍｕＩフハフリー　ヒｌ−ｍｕＩンハンリー　＠　ＶＭ　２％　＋　ヒト成 長ボルモンＦＩＧＵＲＥ　３６ ＫＬＨ−ＤＮＰ ＦＩＧ、　３７ａ ＢＳＡ−ＤＮＰ ＦＩＧ、　３７ｃ ヒトＣＥＡへのヒトＭｕ重鎖の応答のＥＬ　Ｉ　ＳＡによる測定ＦＩＧＵＲＥ３ ９ ヒトＣＥＡへのヒトガンマ−重鎮の応答のＥＬＩＳＡによるｆｆ１ｌｌ定、、、 、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、Ｇ、、、、、、、 、、、　−Ｒ ＦＩＧ、　４０ｄ ＡＴＧＴＡＴｒＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＹＹＣＡＲ −口−ＣＧＡＴＣＴＣＴＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴ ＣＴＣＣＴＣＡＧＰＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳ 、、、、、、Ｔ、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、 、、、、、、。
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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ。
ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ。
Ｃ３，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎ。
、ＮＺ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＡ、ＵＳ

Claims (65)

    【特許請求の範囲】
  1. １．単離された免疫グロブリン重鎖トランスジェンであって、次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、 ｘ，ｙ，ｚ，ｍ，ｎ，ｐおよびｑは整数であり、ｘは２〜１００、ｎは１〜１０ 、ｙは２〜５０、ｐは１〜１０、ｚは１〜５０、ｑは０〜５０、そしてｍは０〜 １０である） のＤＮＡ配列を含んで成るポリヌクレオチドの少なくとも１つの組み込まれたコ ピーを含有するトランスジェニック非ヒト動物のＢ細胞において発現される前記 免疫グロブリン重鎖トランスジェン。
  2. ２．前記ポリヌクレオチドが、機能的に再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ配列中に組み込 まれ得る少なくとも１つの異種Ｄ遺伝子セグメントを含んで成る、請求項１のト ランスジェン。
  3. ３．前記異種ＤＮＡセグメントが少なくとも１つのヒトＤ遺伝子を含んで成る、 請求項１のトランスジェン。
  4. ４．前記ポリヌクレオチドがヒトμＣＨ遺伝子セグメントとヒトγ１ＣＨ遺伝子 セグメントを含んで成る、請求項１のトランスジェン。
  5. ５．ｑが少なくとも１であり、ｍが少なくとも１であり、ｎが少なくとも１であ り、そして前記ポリヌクレオチドが生殖細胞スイッチ配列のすぐ上流の少なくと も約５０塩基対のセグメントを含んで成る、請求項１のトランスジェン。
  6. ６．前記ポリヌクレオチドがヒト生殖細胞γ１スイッチ配列のすぐ上流の約２０ ０塩基対の配列を含んで成る、請求項１のトランスジェン。
  7. ７．前記ＳＤセグメントがγ１スイッチ配列である、請求項１のトランスジェン 。
  8. ８．前記ポリヌクレオチドがヒト生殖細胞γ１スイッチ配列の上流の約２００塩 基対を含んで成り、そして前記２００塩基対がヒトγ１スイッチ配列に作用可能 に連結される、請求項１のトランスジェン。
  9. ９．前記Ｄ領域が異種Ｄ遺伝子のみを含んで成る、請求項１のトランスジェン。
  10. １０．前記Ｄ領域がヒトＤ遺伝子のみを含んで成る、請求項９のトランスジェン 。
  11. １１．前記ポリヌクレオチドが生体内で機能的に再配列され、認識可能なＤ領域 遺伝子配列を含む再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子セグメントを生じる、請求項１ のトランスジェン。
  12. １２．前記非ヒト動物の生殖細胞中に請求項１のトランスジェンを含んで成るト ランスジェニック非ヒト動物。
  13. １３．前記トランスジェンが再配列されている、請求項１２のトランスジェニッ ク非ヒト動物。
  14. １４．前記トランスジェンが再配列されていない、請求項１２のトランスジェニ ック非ヒト動物。
  15. １５．前記Ｂ細胞が異種抗体を産生する、請求項１４のトランスジェニック非ヒ ト動物。
  16. １６．前記Ｂ細胞が複数のイソタイプの異種抗体の集団を産生する、請求項１５ のトランスジェニック非ヒト動物。
  17. １７．前記トランスジェンがＶＨ，Ｄ，ＪＨおよびＣＨ領域をコードする、請求 項１２のトランスジェニック非ヒト動物。
  18. １８．前記非ヒト動物が■歯類である、請求項１２のトランスジェニック非ヒト 動物。
  19. １９．前記動物の血清が、認識可能なＤ領域遺伝子配列を含むヒト抗体を含んで 成る、請求項１２のトランスジェニック非ヒト動物。
  20. ２０．前記動物の少なくとも１つのリンパ球が異種免疫グロブリン鎖をコードす るｍＲＮＡを含有する、請求項１２のトランスジェニック非ヒト動物。
  21. ２１．前記ｍＲＮＡが認識可能なＤ領域遺伝子配列を含有する、請求項２０のト ランスジェニック非ヒト動物。
  22. ２２．前記ｍＲＮＡが機能的に再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ配列を含有する、請求項 ２１のトランスジェニック非ヒト動物。
  23. ２３．前記トランスジェニック動物が、ヒト配列μ鎖を含んで成り且つ抗原に特 異的に結合する異種抗体を含んで成る、請求項１２のトランスジェニック非ヒト 動物。
  24. ２４．ヒト配列γ鎖を含んで成り且つ抗原に特異的に結合する異種抗体を更に含 んで成る、請求項２３のトランスジェニック非ヒト動物。
  25. ２５．前記抗原がヒト抗原である、請求項２４のトランスジェニック非ヒト動物 。
  26. ２６．前記ヒト抗原がＣＥＡまたはヒト血液細胞抗原である、請求項２５のトラ ンスジェニック非ヒト動物。
  27. ２７．前記トランスジェニック動物が、免疫グロブリントランスジェンによりコ ードされる可変領域のＣＤＲ領域中にクラスターを形成した体細胞変異を有する ｍＲＮＡ種の集団を含有するリンパ系組織を更に含んで成る、請求項１のヒトト ランスジェンを含んで成るトランスジェニック非ヒト動物。
  28. ２８．前記免疫グロブリントランスジェンがＨＣＩに相当する重鎖小遺伝子座で ある、請求項２７のトランスジェニック非ヒト動物。
  29. ２９．Ｂ細胞を不死化することができる第二の細胞と融合されたトランスジェニ ック非ヒトＢ細胞を含んで成るハイプリドーマであって、前記非ヒト動物にとっ て異種であるモノクローナル抗体を産生する前記ハイプリドーマ。
  30. ３０．前記異種抗体が、認識可能なＤ領域遺伝子配列を含むヒト重鎖を含んで成 る、請求項２９のハイプリドーマ。
  31. ３１．前記Ｂ細胞がマウス起源のものである、請求項２９のハイプリドーマ。
  32. ３２．前記モノクローナル抗体が少なくとも１×１０７Ｍ−１の親和力でヒト抗 原に結合する、請求項２９のハイプリドーマ。
  33. ３３．請求項２９のハイプリドーマにより産生されるヒトモノクローナル抗体。
  34. ３４．検出可能な異種抗体を含んで成る血清を有し且つ少なくとも１つの抑制さ れた内因性免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニック非ヒト動物。
  35. ３５．トランスジェニック非ヒト動物から異種免疫グロブリンを生産せしめる方 法であって、ここで前記動物は少なくとも１つの請求項１のトランスジェンの生 殖細胞コピーを含んで成るゲノムを有し、内因性免疫グロブリン遺伝子座を抑制 し；該動物を予め選択された抗原と接触せしめ；そして前記異種免疫グロブリン を収集する； ことを含んで成る方法。
  36. ３６．前記抑制がアンチセンスポリヌクレオチドにより引き起こされる、請求項 ３５に記載の方法。
  37. ３７．前記アンチセンスポリヌクレオチドが組み込まれたアンチセンストランス ジェンから転写される、請求項３６に記載の方法。
  38. ３８．前記アンチセンストランスジェンの転写が、第二の配列に連結されたアン チセンス配列を含有する転写物を生成する、請求項３７に記載の方法。
  39. ３９．前記非ヒト動物が、少なくとも１つの軽鎖免疫グロブリントランスジェン の生殖細胞コピーを含んで成るゲノムを有する、請求項３７に記載の方法。
  40. ４０．トランスジェニック非ヒト動物において少なくとも１つの内因性免疫グロ ブリン遺伝子座を抑制する方法であって、アンチセンストランスジェンを非ヒト 動物に導入し、アンチセンストランスジェンを有する非ヒトトランスジェニック 動物を作製し；前記アンチセンストランスジェンから生体内でアンチセンスＲＮ Ａを転写し； 前記アンチセンスＲＮＡを、内因性免疫グロブリン配列を含むポリヌクレオチド にハイブリダイズせしめ；そして内因性免疫グロブリン鎖の発現を抑制する段階 を含んで成る方法。
  41. ４１．前記アンチセンストランスジェンが、内因性κ鎖免疫グロブリン遺伝子配 列に相同であるヌクレオチド配列を含有する、請求項４０に記載の方法。
  42. ４２．前記アンチセンストランスジェンが、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子配 列に相同であるヌクレオチド配列を含有する、請求項４０に記載の方法。
  43. ４３．内因性免疫グロブリン遺伝子を不活性化する方法であって、標的指向ベク ターを内因性免疫グロブリン遺伝子中に組み込み；そして 組み込まれた標的指向ベクターを有する細胞について選択する段階を含んで成る 方法。
  44. ４４．前記組み込まれた標的指向ベクターのコピーを有する非ヒト動物の系統を 作製する段階を更に含んで成る、請求項４３に記載の方法。
  45. ４５．前記内因性免疫グロブリン遺伝子が軽鎖遺伝子である、請求項４３に記載 の方法。
  46. ４６．前記軽鎖遺伝子がκ軽鎖遺伝子である、請求項４５に記載の方法。
  47. ４７．前記内因性免疫グロブリン遺伝子が重鎖遺伝子である、請求項４３に記載 の方法。
  48. ４８．前記内因性免疫グロブリン遺伝子がマウス免疫グロブリン遺伝子である、 請求項４３に記載の方法。
  49. ４９．前記非ヒト動物がマウスである、請求項４４に記載の方法。
  50. ５０．前記マウスが請求項１のヒト免疫グロブリントランスジェンを更に含んで 成る、請求項４９に記載の方法。
  51. ５１．前記細胞が胎児性幹細胞である、請求項４３に記載の方法。
  52. ５２．不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子を有する非ヒト動物を作製す る方法であって、 請求項４４の方法により作製された非ヒト動物の系統を繁殖させ；そして 不活性化された免疫グロブリン遺伝子について同型接合性である個々の非ヒト動 物子孫を同定する 段階を含んで成る方法。
  53. ５３．前記子孫が１つの不活性化された重鎖免疫グロブリン遺伝子と少なくとも １つの不活性化された軽鎖免疫グロブリン遺伝子を有する、請求項５２に記載の 方法。
  54. ５４．不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック 非ヒト動物。
  55. ５５．組み込まれた標的指向ベクターが生殖細胞ＤＮＡ中に存在する、請求項５ ４の非ヒト動物。
  56. ５６．軽鎖免疫グロブリン遺伝子が不活性化されている、請求項５５の非ヒト動 物。
  57. ５７．重鎖免疫グロブリン遺伝子が不活性化されている、請求項５５の非ヒト動 物。
  58. ５８．少なくとも１つの不活性化された内因性免疫グロブリン遺伝子について同 型接合性である、請求項５５の非ヒト動物。
  59. ５９．免疫グロブリン遺伝子配列と実質的に同じであるポリヌクレオチド配列に 相補的であるヌクレオチド配列を含んで成るアンチセンストランスジェン。
  60. ６０．請求項５９のアンチセンストランスジェンを有するトランスジェニック非 ヒト動物。
  61. ６１．機能的に破壊された内因性重鎖遺伝子座と異種免疫グロブリン重鎖トラン スジェンを含んで成るトランスジェニック非ヒト動物であって、抗原による免疫 化の後で抗体応答を生じるトランスジェニック非ヒト動物。
  62. ６２．前記機能的に破壊された内因性重鎖遺伝子座がＪＨ領域相同組換え破壊物 であり、前記異種免疫グロブリン重鎖トランスジェンがＨＣＩヒト小遺伝子トラ ンスジェンであり、そして前記抗原がヒト抗原である、請求項６１のトランスジ ェニック非ヒト動物。
  63. ６３．前記抗体応答が、ヒトμ鎖含有免疫グロブリンとヒトγ鎖含有免疫グロブ リンを含んで成る抗体集団を含んで成る、請求項６１のトランスジェニック非ヒ ト動物。
  64. ６４．前記異種抗体が、ＣＤＲに密集している可変領域中の体細胞変異を含む異 種免疫グロブリンの集団を含んで成る、請求項６３のトランスジェニック非ヒト 動物。
  65. ６５．前記抗原が、ヒト血液細胞表面抗原、ＫＬＨおよびヒトＣＥＡから成る群 より選択される、請求項６３のトランスジェニック非ヒト動物。
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