RS63565B1 - Antitela i postupci primene - Google Patents

Antitela i postupci primene

Info

Publication number
RS63565B1
RS63565B1 RS20220834A RSP20220834A RS63565B1 RS 63565 B1 RS63565 B1 RS 63565B1 RS 20220834 A RS20220834 A RS 20220834A RS P20220834 A RSP20220834 A RS P20220834A RS 63565 B1 RS63565 B1 RS 63565B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
klb
seq
antibodies
amino acid
Prior art date
Application number
RS20220834A
Other languages
English (en)
Inventor
Yongmei Chen
James Ernst
Hok Seon Kim
Junichiro Sonoda
Christoph Spiess
Scott Stawicki
Yan Wu
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52347471&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63565(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS63565B1 publication Critical patent/RS63565B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)

Description

OPIS
Oblast pronalaska
Ovaj pronalazak se odnosi na antitela koja se vezuju za beta-Klotho (KLB) i receptor faktora rasta fibroblasta 1 (FGFR1), i metode za njihovo korišćenje.
Osnova
Faktor rasta fibroblasta 21 (FGF21) i njegov najbliži FGF19 homolog su članovi superporodice FGF. FGF21 signalizacija zahteva izoforme FGF receptora (FGFR) i membranski vezan koreceptor Klotho-beta (KLB) (Ogawa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(18): 7432-37 (2007); US2010/0184665). Takođe se pokazalo da FGF19 signalizira putem FGFR izoformi u kompleksu sa KLB (Wu et al. J. Biol. Chem.282(40): 29069-29072 (2007)). Od 7 primarnih izoformi FGFR koje kodiraju vrste sisara (1b, 2b, 3b, 1c, 2c, 3c i 4), samo tri izoforme, FGFR1c, 2c i 3c, mogu da transdukuju signalizaciju od strane FGF19 i FGF21 kada ih veže koreceptor KLB, koji je pretežno izražen u jetri, masnom tkivu i pankreasu (Goetz i Mohammadi, Nature reviews. Molecular Cell Biology 14, 166-180 (2013)). Od ovih receptora, čini se da FGFR1c igra dominantnu ulogu u posredovanju metaboličkog efekta FGF21. Bez vezivanja za određenu teoriju, veruje se da FGF21 deluje tako što izaziva homodimerizaciju izoforme FGFR u prisustvu koreceptora KLB vezanog za membranu. Za razliku od drugih FGF liganda, FGF21 pokazuje veoma nizak afinitet prema bilo kom pojedinačnom FGFR. Međutim, vezivanjem sa visokim afinitetom za KLB putem C-terminalnog regiona repa FGF21 se uključuje u kompleks FGFR/KLB, što omogućava da FGF21 stupi u interakciju sa FGFR bez obzira na niski afinitet prema samom FGFR.
FGF21 je identifikovan kao potentni proteinski agens koji modifikuje bolest za preokretanje gojaznosti i dijabetesa tipa 2 kod modela bolesti životinja (Kharitonenkov et al. J. Clin. Invest.115(6): 1627-35 (2005)). Pokazano je da rekombinantni FGF21 smanjuje lipide u jetri, poboljšava osetljivost na insulin i normalizuje kontrolu glikemije kod miševa sa nedostatkom signalizacije leptina (ob/ob ili db/db) ili kod miševa hranjenih sa visokim sadržajem masti (HFD). Kod gojaznih i dijabetičnih rezus majmuna koji su svakodnevno lečeni rekombinantnim FGF21 takođe je primećeno smanjenje glukoze u krvi i poboljšanje različitih kardiovaskularnih faktora rizika. Pokazano je da FGF21 i FGF19 aktiviraju termogenu funkciju masnog tkiva pozitivnog na termogenin (uncoupling protein 1, UCP1) (smeđeg i bež masnog tkiva; BAT) kod gojaznih glodara (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 6018-6027 (2008); Fisher et al., Genes & Development 26, 271-281 (2012)).
Iako se klinička primena rekombinantnih analoga FGF21 ili FGF19 trenutno testira za upotrebu u lečenju metaboličke bolesti, njihov razvoj za terapeutsku intervenciju pokazao se izazovnim. Na primer, poluživot FGF21 u serumu tokom ~2 sata kod nehumanih primata je prekratak za praktičnu kliničku primenu i preostali FGF21 protein u cirkulaciji se može brzo deaktivirati proteolitičkim cepanjem. Pokušano je da se ova svojstva poboljšaju putem inženjeringa proteina, ali takve izmene mogu da povećaju imunogenost i druge štetne efekte specifične za izmene. Još jedan značajan izazov je mogućnost dugoročnih neželjenih efekata hronične terapije sa FGF21. Na primer, pokazalo se da FGF21 indukuje rezistenciju na jetreni hormon rasta putem indukcije SOCS2, inhibitora signalizacije receptora hormona rasta (Inagaki et al., Cell Metab. 8: 77-83 (2008)). Kod dece i odraslih, otpornost ili nedostatak hormona rasta su povezani sa niskom koštanom masom, a transgena prekomerna ekspresija FGF21 ili dvonedeljni tretman kod miševa sa rekombinantnim FGF21 dovodi do dramatičnog gubitka mineralne gustine kostiju. Još uvek se nije pokazalo da štetni efekti FGF21 koji su vezani za kosti mogu da se odvoje od korisnih metaboličkih efekata. Pored toga, transgena hiperprodukcija FGF19 može dovesti do hepatocelularne karcinogeneze aktiviranjem FGF receptora (FGFR) 4 (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Tomlinson et al., Endocrinology 143, 1741-1747 (2002); French et al., PLoS One 7, e36713 (2012)).
Rekombinantna monoklonska antitela (Ab) mogu da deluju kao snažan terapeutski modalitet zbog toga što mogu da obezbede odličnu ciljnu selektivnost, farmakokinetički profil i druga svojstva važna za farmaceutski agens (Chan i Carter, Nature reviews. Immunology 10, 301-316 (2010)). Na primer, pokazalo se da antagonist antitela specifičan za FGFR1c izaziva gubitak težine kod miševa i majmuna (WO2005/037235) i da je agonističko selektivno aktiviranje FGFR1c posredovano antitelom dovoljno za rekapitulaciju insulinske senzibilizacije putem FGF21 kod miševa sa dijabetesom (WO2012/158704; Wu et al. Science Translational Med. 3(113): 1-10 (2011)). Antitela koja se vezuju za kompleks KLB/FGFR1c su predložena kao aktivatori/terapeutski agensi (US 7,537,903; WO2011/071783; WO2012/158704). Ostali su istraživali dva alternativna pristupa za selektivno aktiviranje kompleksa FGFR1c/KLB, kao što je anti-KLB antitelo visokog afiniteta koje se naziva mimAb1 (Foltz et al. Sci. Transl. Med. 4: 162ra153 (2012)) i bispecifični anti-FGFR1/KLB Avimer polipeptid C3201 povezan sa humanim albuminom iz seruma (HSA) (US 8,372,952).
Zbog značajne uloge FGF19 i FGF21 u metabolizmu glukoze, ostaje potreba za razvojem terapeutskih molekula i metoda za modulaciju aktivnosti posredovanih FGF19 ili FGF21.
WO2012/158704 (Genentech Inc) od novembra 2012. godine opisuje bispecifična anti-KLB/FGFR1 antitela (strana 25, 110-11).
Smith et al. PLOS ONE, Vol 8, izdanje 4, April 2013, str. e61432, opisuje bispecifični protein (Avimer) koji može da se veže za FGFR1c i beta-Klotho koji je koristan u lečenju gojaznosti i dijabetesa kod majmuna cinomolgusa.
REZIME
Ovaj pronalazak pruža antitela koja se vezuju za KLB, antitela koja se vezuju za FGFR1 i bispecifična antitela koja se vezuju i za KLB i FGFR1, kao i metode za korišćenje istih. Ovaj pronalazak se delimično zasniva na otkriću bispecifičnih antitela koja se vezuju za KLB i za FGFR1, koja selektivno aktiviraju kompleks FGFR1c/KLB receptor i indukuju korisne promene u metabolizmu koje su očekivane od aktivnosti nalik na FGF21, uključujući gubitak težine i poboljšanje metabolizma glukoze i lipida, bez značajnog uticaja na jetru i bez gubitka koštane mase.
U određenim otelotvorenjima, antitelo je bispecifično antitelo. Na primer, bez ograničavanja, izolovano antitelo iz predmetnog pronalaska može da se veže za beta-Klotho (KLB) i za receptor 1 faktora rasta fibroblasta (FGFR1), pri čemu se antitelo vezuje za C-terminalni domen KLB. Na primer, bez ograničavanja, izolovano antitelo iz predmetnog pronalaska se vezuje za KLB i za FGFR1c. U određenim aspektima predmetnog pronalaska, antitelo se vezuje za KLB fragment uključujući aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 142). U određenim aspektima predmetnog pronalaska, antitelo se vezuje za epitop unutar fragmenta FGFR1 uključujući aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 143) ili
(SEQ ID NO: 144).
U određenim aspektima predmetnog otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića aktivira kompleks KLB/FGFR1c. U određenim otelotvorenjima, antitelo iz predmetnog otkrića smanjuje nivoe glukoze u krvi in vivo. U određenim otelotvorenjima, antitelo ne utiče značajno na gustinu kostiju. U određenim aspektima predmetnog otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića nema značajan uticaj na jetru. U određenim aspektima ovog otkrića, antitelo indukuje fosforilaciju ERK i MEK u jetri na značajno nižim nivoima od onih koje indukuje FGF21. U određenim aspektima ovog otkrića, antitelo se vezuje za KLB sa Kdod 10<-8>M do 10<-13>M. U određenim aspektima ovog otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može da se veže za protein FGFR1 sa Kdod 10<-8>M do 10<-13>M. U određenim aspektima ovog otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može da se veže za FGFR1c sa Kdod 10<-8>M do 10<-13>M. U određenim aspektima ovog otkrića, antitelo se vezuje za KLB sa Kd< 10 nM i za FGFR1c sa Kd>300 nM. U određenim aspektima ovog otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo može da uključuje anti-FGFR1 krak koji ima Kdod oko 10 nM do oko 10 µM.
U određenim otelotvorenjima, antitelo iz predmetnog otkrića se vezuje za epitop prisutan na KLB. Na primer, bez ograničavanja, predmetno otkriće pruža anti-KLB antitelo koje vezuje isti epitop kao antitelo prikazano na slikama 3A i B. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo iz predmetnog otkrića vezuje isti epitop kao 12A11 ili 8C5 antitelo. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo se vezuje za epitop unutar C-terminalnog domena KLB. U određenim aspektima ovog otkrića, anti-KLB antitelo se vezuje za fragment KLB koji se sastoji od aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 142).
U određenim otelotvorenjima, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića uključuje prvo antitelo ili njegov antigen vezujući deo, koji uključuje varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, u kom slučaju varijabilni region teškog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 128, a varijabilni region lakog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 130. U određenim otelotvorenjima, drugo antitelo ili njegov antigen vezujući deo uključuje varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, u kom slučaju varijabilni region teškog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 132, a varijabilni region lakog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 134.
U određenim otelotvorenjima, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića uključuje prvo antitelo ili njegov antigen vezujući deo, koji uključuje region teškog lanca i region lakog lanca, u kom slučaju region teškog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 129, a region lakog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 131. U određenim otelotvorenjima, drugo antitelo ili njegov antigen vezujući deo, uključuje region teškog lanca i region lakog lanca, u kom slučaju region teškog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 133, a region lakog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 135.
Predmetno otkriće dalje pruža anti-KLB antitelo koje uključuje: (a) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-15, (b) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 79-93 i (c) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16-31.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-15, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16-31 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 32-47.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo dalje obuhvata (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 48-62, (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 63-78 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 79-93.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44, (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 59, (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 75, i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 90.
U određenim otelotvorenjima, anti-KLB antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31, (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47, (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62, (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78, i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93.
U određenim otelotvorenjima, anti-KLB antitelo obuhvata (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128 i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 130. U određenim otelotvorenjima, antitelo obuhvata (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 129 i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 131.
U drugom aspektu, predmetno otkriće pruža anti-KLB antitelo koje obuhvata (a) varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 128, (b) varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 130 i (c) varijabilni region teškog lanca kao pod (a) i varijabilni region lakog lanca kao pod (b).
Predmetno otkriće dalje pruža antitela koja se vezuju za FGFR1, npr. FGFR1c. Na primer, bez ograničavanja, antitelo iz predmetnog otkrića sadrži varijabilni domen koji se vezuje za FGFR1. U određenim otelotvorenjima, antitelo se vezuje za fragment FGFR1 koji se sastoji od aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 143) ili (SEQ ID NO: 144). U određenim otelotvorenjima, antitelo obuhvata (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137, (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138, (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139, (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140, i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141. U određenim otelotvorenjima, antitelo obuhvata (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 132 i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134. U određenim otelotvorenjima, antitelo obuhvata (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133 i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135. U određenim aspektima opisa, antitelo iz predmetnog otkrića se vezuje za fragment FGFR1c koji se sastoji od aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 143) ili (SEQ ID NO: 144).
U određenim otelotvorenjima, antitelo iz predmetnog otkrića je monoklonsko antitelo. U pojedinim otelotvorenjima, antitelo je humano, humanizovano ili himerno antitelo. U određenim aspektima otkrića, antitelo ima smanjenu efektorsku funkciju.
U drugom aspektu, predmetno otkriće pruža izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo iz predmetnog otkrića. U određenim otelotvorenjima, predmetno otkriće pruža ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu iz predmetnog otkrića. U određenim otelotvorenjima, predmetno otkriće pruža metodu za proizvodnju antitela koja obuhvata uzgajanje ćelije domaćina iz predmetnog otkrića da bi se antitelo proizvodilo. U određenim otelotvorenjima, ova metoda dalje uključuje izolovanje antitela iz ćelije domaćina.
Ovo predmetno otkriće dalje pruža farmaceutsku formulaciju koja uključuje jedno ili više antitela iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. U određenim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija dalje sadrži dodatni terapeutski agens.
U drugom aspektu, predmetno otkriće pruža antitelo iz pronalaska za upotrebu kao lek. U određenim otelotvorenjima, antitelo služi za upotrebu u lečenju metaboličkih poremećaja, npr. gojaznosti, nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), dijabetesa tipa 2, dijabetesa koji nije tip 2, dijabetesa tipa 1, latentnog autoimunog dijabetesa (LAD) i dijabetesa mladih u zrelosti (MODY). U određenim otelotvorenjima, antitelo služi za upotrebu u lečenju dijabetesa tipa 2. U određenim otelotvorenjima, antitelo služi za upotrebu u lečenju gojaznosti. U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža antitelo za upotrebu u lečenju Barde-Bidlovog sindroma, Prader-Vilijevog sindroma, Alstromovog sindroma, Koenovog sindroma, Olbrajtove nasledne osteodistrofije (pseudohipoparatiroidizam), Karpenterovog sindroma, MOMO sindroma, Rubinštajn-Tajbijevog sindroma, fragilnog X sindroma i Borjeson-Forsman-Lemanovog sindroma. U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža antitelo za upotrebu u aktiviranju kompleksa receptora KLB/FGFR1, npr. kompleksa KLB/FGFR1c receptora.
U drugom aspektu, predmetno otkriće pruža upotrebu antitela, koje je ovde obelodanjeno, u proizvodnji leka za lečenje poremećaja metabolizma, npr.: sindroma policističnih jajnika (PCOS), metaboličkog sindroma (MetS), gojaznosti, nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), hiperlipidemije, hipertenzije, dijabetesa tipa 2, dijabetesa koji nije tip 2, dijabetesa tipa 1, latentnog autoimunog dijabetesa (LAD) i dijabetesa mladih u zrelosti (MODY), kao i starenja i srodnih bolesti kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i ALS. U određenim otelotvorenjima, poremećaj metabolizma je dijabetes tipa 2. U određenim otelotvorenjima, poremećaj metabolizma je gojaznost. U određenim aspektima otkrića, proizvodni se lek za aktiviranje kompleksa KLB/FGFR1c receptora.
U drugom aspektu, predmetno otkriće pruža postupak za lečenje pojedinca koji ima bolest izabranu iz grupe koju čine sindrom policističnih jajnika (PCOS), metabolički sindrom (MetS), gojaznost, nealkoholni steatohepatitis (NASH), nealkoholna bolest masne jetre (NAFLD), hiperlipidemija, hipertenzija, dijabetes tipa 2, dijabetes koji nije tip 2, dijabetes tipa 1, latentni autoimuni dijabetes (LAD) i dijabetes mladih u zrelosti (MODY), kao i starenje i srodne bolesti kao što je Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i ALS, pri čemu postupak obuhvata davanje pojedincu delotvorne količine jednog ili više antitela iz predmetnog otkrića. U određenim otelotvorenjima, bolest je dijabetes, npr. dijabetes tipa 2. U određenim otelotvorenjima, bolest je gojaznost. U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža metodu lečenja pojedinaca koji imaju bolest i/ili poremećaj izabran iz grupe koju čine Barde-Bidlov sindrom, Prader-Vilijev sindrom, Alstromov sindrom, Koenov sindrom, Olbrajtova nasledna osteodistrofija (pseudohipoparatiroidizam), Karpenterov sindrom, MOMO sindrom, Rubinštajn-Tajbijev sindrom, fragilni X sindrom i Borjeson-Forsman-Lemanov sindrom. U određenim otelotvorenjima, metoda dalje obuhvata primenu dodatnog terapeutskog agensa na pojedincu. U određenim aspektima otkrića, metoda koja koristi jedno ili više antitela iz predmetnog otkrića ne utiče na funkciju jetre kod pojedinca. U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža metodu za izazivanje gubitka težine koja se sastoji od davanja pojedincu delotvorne količine jednog ili više antitela iz predmetnog otkrića.
U drugom aspektu, predmetno otkriće pruža metodu za aktiviranje kompleksa KLB-FGFR1c receptora kod pojedinca koja se sastoji od davanja pojedincu delotvorne količine antitela iz predmetnog otkrića.
Kratak opis slika
Slika 1A prikazuje agonističku aktivnost anti-FGFR1 antitela i fragmenata antitela. Slika 1B prikazuje rezultate eksperimenata konkurencije vezivanja pomoću anti-FGFR1 antitela.
Slika 1C prikazuje aminokiselinske ostatke u FGFR1 koji su važni za vezivanje od strane anti-FGFR1 antitela iz predmetno prikazane problematike. Slika 1C obelodanjuje SEQ ID NO: 159, 159, 143 i 144, tim redosledom, kako se pojavljuju.
Slika 1D prikazuje rezultate mutageneze specifične za mesto za određivanje aminokiselinskih ostataka važnih za vezivanje anti-FGFR1 antitelima iz predmetnog pronalaska.
Slika 1E prikazuje rezultate mutageneze specifične za mesto za određivanje aminokiselinskih ostataka važnih za vezivanje anti-FGFR1 antitelima iz predmetnog pronalaska.
Slika 1F prikazuje ostatke važne za vezivanje na prostornom modelu FGFR1.
Slika 2A prikazuje afinitet dva anti-FGFR1 antitela prema FGFR1b i FGFR1c.
Slika 2B prikazuje vezivanje anti-FGFR1 antitela za razne FGFR.
Slika 2C prikazuje anti-FGFR1 antitelo koje je delovalo kao specifični agonist za FGFR1 u testu luciferaze zasnovanom na GAL-ELK1 (transkripcioni faktor 1 nalik na ETS) u L6 ćelijama.
Slika 2D prikazuje da je anti-FGFR1 antitelo delovalo kao specifični agonist za FGFR1 u testu luciferaze zasnovanom na GAL-ELK1 u HEK293 ćelijama.
Slika 2E prikazuje da anti-FGFR1 antitelo normalizuje nivoe glukoze u krvi kada se ubrizgava ob/ob miševima sa dijabetesom.
Slika 3A prikazuje sekvence varijabilnog regiona lakog lanca za 17 anti-KLB antitela. CDR L1 sekvence su, redom, SEQ ID NO: 48-62; CDR L2 sekvence su, redom, SEQ ID NO: 63-78; i CDH L3 sekvence su, redom, SEQ ID NO: 79-93. Sekvence varijabilnog regiona lakog lanca su, redom, SEQ ID NO: 111-127.
Slika 3B prikazuje sekvence varijabilnog regiona teškog lanca za 17 anti-KLB antitela. CDR H1 sekvence za antitela su, redom (11F1-8C5), SEQ ID NO: 1-15; CDR H2 sekvence su, redom, SEQ ID NO: 16-31; CDR H3 sekvence su, redom, SEQ ID NO: 32-47. Sekvence varijabilnog regiona teškog lanca za antitela su, redom, SEQ ID NO: 94-110.
Slika 4 prikazuje medijanu pomaka primećenu na FACS dijagramu u dozi od 0,8 µg/ml merenjem vezivanja raznih anti-KLB antitela za 293 ćelije koje eksprimiraju hKLB.
Slika 5 prikazuje relativno vezivanje različitih anti-KLB antitela za hKLB-ECD-HIS protein.
Slika 6A je šematski dijagram koji predstavlja antitela iz predmetnog pronalaska i model za formiranje KLB/FGFR1c bispecifičnog Ab kompleksa za aktiviranje signala.
Slika 6B prikazuje model formiranja FGFR1c-KLB-FGF21 kompleksa za aktiviranje signala.
Slika 6C prikazuje GAL-ELK1 test luciferaze aktivnosti FGF21 i bispecifičnog antitela (BsAb) 17 pomoću HEK293 ćelija sa nedostatkom FGFR1. Ćelije su transficirane da eksprimiraju naznačene receptore.
Slika 6D prikazuje vestern blot analizu primarnih humanih adipocita tretiranih naznačenim proteinom (FGF21 (100 nM) ili IgG (33 nM)) 1 sat. Uzorci su duplirani za svaki tretman.
Slika 7A prikazuje indukciju različitim bispecifičnim antitelima sa anti-FGFR1 i anti-KLB kracima u testu luciferaze zasnovanom na GAL-ELK1. Imajte u vidu da su bispecifična Ab sa krakom R1MAb1 pokazala značajnu aktivnost koja ne zavisi od KLB, verovatno zbog agonističke aktivnosti R1MAb1 Fab. Takva aktivnost nije primećena kod bispecifičnih Ab sa krakom R1MAb2 ili R1MAb3.
Slika 7B prikazuje da indukcija signalizacije različitim bispecifičnim antitelima sa anti-FGFR1 i anti-KLB kracima zavisi od FGFR1c i KLB.
Slika 7C prikazuje bispecifično antitelo sa anti-FGFR1 i anti-KLB kracima koje je indukovalo aktivnost luciferaze u zavisnosti od doze u ćelijama koje eksprimiraju rekombinantne hFGFR1c i hKLB, ali ne i u ćelijama koje ne eksprimiraju KLB.
Slika 8A je šematski prikaz tri varijante anti-KLB/anti-FGFR1c bispecifičnih antitela. Plava: čovek, a crvena: miš. Približan položaj lanca oligosaharida na N297 u (1) je označen sa ^. Verzije bez efektora ((2) i (3)) nemaju lance oligosaharida zbog mutacije N297G. Zvezdice u (2) označavaju približan položaj D265A mutacije. Takođe je prikazana orijentacija dugmeta u odnosu na rupicu. (1) predstavlja BsAb10; (2) predstavlja BsAb20 a (3) predstavlja BsAb17.
Slika 8B prikazuje MSD pERK test u primarnim humanim adipocitima tretiranim sa BsAb10 i njegovim derivatima, kontrolnim IgG ili FGF21 tokom 10 minuta. Podaci predstavljaju srednje vrednosti ± SEM (N=3). bFKB1 (1) predstavlja BsAb10; bFKB1 (2) predstavlja BsAb20 a bFKB1 (3) predstavlja BsAb17.
Slika 9A prikazuje GAL-ELK1 test luciferaze u ćelijama L6 mioblasta pacova. Ćelije su kotransficirane sa ekspresionim vektorom za naznačene receptore. Transficirane ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama BsAb10 ili pozitivne kontrole, FGF21, FGF19 ili R1MAb1, tokom 6 sati pre testa luciferaze.
Slika 9B prikazuje slične GAL-ELK1 testove luciferaze kao što je prikazano na Slici 9A. Transficirane L6 ćelije su tretirane kombinacijama FGF21 i BsAb17 kako je naznačeno. N=4.
Slika 9C prikazuje slične GAL-ELK1 testove luciferaze kao što je prikazano na Slici 9A. Transficirane L6 ćelije su tretirane kombinacijama FGF21 i BsAb17 kako je naznačeno. N=4.
Slika 9D prikazuje vezivanje anti-FGFR1 antitela i anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifičnih antitela, BsAB9 i BsAb10, za ćelije koje eksprimiraju KLB, FGFR1c ili oba.
Slika 10A prikazuje vezivanje bispecifičnog antitela sa anti-FGFR1 i anti-KLB kracima i anti-FGFR1 antitela za ćelije koje eksprimiraju FGFR1c, KLB ili oba.
Slika 10B prikazuje KdBsAb10 za vezivanje za HEK293 ćeliju koja eksprimira razne kombinacije humanog i mišjeg KLB/FGFR1.
Slika 11 prikazuje analizu vezivanja BsAb10 ili prethodno formiranih BsAb10/KLB kompleksa pri 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM za FGFR1-ECD-Fc fuzioni protein koji je imobilisan na čipu. Da bi se generisali prethodno formirani BsAb10/KLB kompleksi, BsAb10 i rekombinantni KLB-ECD protein su prethodno inkubirani u odnosu od 1:1. Ne zaboravite da je brzina disocijacije bila sporija sa BsAb10/KLB kompleksom nego sa samim BsAb10, i to samo kada je FGFR1c, ali ne i FGFR1b, uhvaćen na čipu, što ukazuje na formiranje ternarnog kompleksa.
Slika 12A je šematski prikaz dizajna TR-FRET eksperimenta.
Slika 12B prikazuje intenzitet TR-FRET na COS7 ćelijama koje eksprimiraju obeleženi FGFR1c protein označen sa SNAP sa neoznačenim KLB ili bez njega 15 minuta nakon dodavanja naznačenih liganda. BsAb17, FGF21, FGF1 i FGF2 su korišćeni pri 67 nM, 50 nM, 62,5 nM, odnosno 12 nM. Podaci predstavljaju intenzitet FRET pri 665 nm podeljen sa emisijom donora na 620 nm (FRET odnos) i srednju vrednost ± SEM tri nezavisna eksperimenta (N=3). p<0,05 (*), <0,01 (**), <0,0001 (***) u odnosu na PBS kontrolu.
Slika 13A prikazuje rezultate eksperimenata kako bi se utvrdilo koji deo KLB je važan za vezivanje dva anti-KLB antitela. Šematski prikaz strukture KLB proteina prikazan je na vrhu. Svaka traka predstavlja humani KLB, humani KLA, zečji KLB, KLB pacova, mišji KLB ili himerne konstrukte sa oznakom u boji. Sa desne strane je prikazano vezivanje KLBmAb1 i KLBmAb2 kontrole na osnovu FACS sa HEK293 ćelijama koje prolazno eksprimiraju svaki konstrukt. Imajte u vidu da se KLBmAb1 ne vezuje za zečji KLB, ali zamena fragmenta sa 34 aminokiseline (aminokiselina 805-838) odgovarajućom humanom sekvencom omogućava vezivanje.
Slika 13B prikazuje aminokiselinsku sekvencu segmenta pozicija 857-890 humanog KLB proteina sa signalnom sekvencom (koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci na pozicijama 805-838 KLB proteina koja ne uključuje signalnu sekvencu) i odgovarajuće sekvence kod raznih naznačenih vrsta. Slika 13B obelodanjuje SEQ ID NO: 160-164, tim redosledom, kako se pojavljuju.
Slika 14A prikazuje vezivanje FGF21 i FGF19 za BsAb10/KLB kompleks putem SPR. BsAb10 je uhvaćen na čipu, a KLB-ECD i FGF protein (pri 0,2, 0,8 ili 2 µM) ubrizgani su sekvencijalno.
Slika 14B prikazuje rezultate GAL-ELK1 testa luciferaze u ćelijama L6 mioblasta pacova. Ćelije su kotransficirane sa ekspresionim vektorom za FGFR4 i KLB. Transficirane ćelije su inkubirane sa različitim koncentracijama naznačenih proteina tokom 6 sati pre testa luciferaze.
Slika 14C prikazuje vestern blot analizu koja je izvedena za praćenje ERK fosforilacije u ćelijama H4IIE hepatoma. Imajte na umu da BsAb17 nije blokirao sposobnost FGF19 da aktivira FGFR4/KLB kompleks (slika 14B) ili da indukuje ERK fosforilaciju u ćelijama H4IIE hepatoma (slika 14C).
Slika 15A prikazuje nivoe glukoze u krvi (7. dan), % promene telesne težine (7. dan) i dnevni unos hrane (0-3. dan) mršavih C57BL/6 i db/db miševa (n=7) nakon jedne intraperitonealne (i.p.) injekcije BsAb17 ili IgG kontrole od 3 mg/kg (kod mršavih) ili 5 mg/kg (kod db/db).
Slika 15B prikazuje telesnu težinu i nivoe glukoze u krvi miševa gojaznih zbog ishrane (DIO), koji su primili i. p. injekcije naznačenog IgG (BsAb20) u dozi od 3 mg/kg 0. i 6. dana (strelice). N=9.
Slika 15C prikazuje rezultate testa tolerancije na glukozu sa istim miševima i antitelom korišćenim na slici 15B 14. dana.
Slika 15D prikazuje količinu jetrenih triglicerida i serumskih markera kod životinja prikazanih na slici 15B-C 17. dana.
Slika 15E prikazuje korišćenje glukoze u celom telu, mereno tokom hiperinsulinemijsko-euglikemijskog klampa kod DIO miševa 5 dana nakon jedne i. p. injekcije naznačenog IgG (BsAb17) u dozi od 10 mg/kg (N=12). Horizontalna osa predstavlja nivoe insulina u serumu. Strelice pokazuju pravac promena od bazalnih stanja do stanja stimulisanih insulinom. p<0,05 (*), <0,005 (**), <0,0001 (***) u odnosu na kontrolu.
Slika 15F prikazuje endogenu proizvodnju glukoze, merenu tokom hiperinsulinemijsko-euglikemijskog klampa kod DIO miševa 5 dana nakon jedne i. p. injekcije naznačenog IgG (BsAb17) u dozi od 10 mg/kg (N=12). Horizontalna osa predstavlja nivoe insulina u serumu. Strelice pokazuju pravac promena od bazalnih stanja do stanja stimulisanih insulinom. p<0,05 (*), <0,005 (**), <0,0001 (***) u odnosu na kontrolu.
Slika 15G prikazuje unos glukoze u tkivo stimulisan insulinom, mereno tokom hiperinsulinemijsko-euglikemijskog klampa kod DIO miševa 5 dana nakon jedne i. p. injekcije naznačenog IgG (BsAb17) u dozi od 10 mg/kg (N=12). p<0,05 (*), <0,005 (**), <0,0001 (***) u odnosu na kontrolu.
Slika 16A prikazuje N-terminalnu aminokiselinsku sekvencu mišjeg KFB proteina (SEQ ID NO: 165), a odgovarajuća aminokiselinska sekvenca kodirana Klb alelom kod KO miševa (SEQ ID NO: 166) takođe je prikazana. Pogrešna mutacija u Klb genu dovodi do pomeranja okvira nakon druge aminokiseline u KO alelu, kao što je prikazano crvenim slovima.
Slika 16B prikazuje ekspresiju KLB proteina u epididimalnom belom masnom tkivu kod divljih (+/+) i KLB nokaut (-/-) miševa.
Slika 16C pokazuje da je KLB važan za uticaj BsAb20 na metabolizam glukoze. Test tolerancije na glukozu (GTT) kod DIO miševa koji su primili četiri injekcije BsAb20 na nedeljnom nivou ili kontrolni IgG u dozi od 3 mpk. GTT je sproveden 23. dana, tri dana nakon poslednje injekcije. Miševi su bili na HFD tokom 20 nedelja pre GTT. *p<0,05.
Slika 16D prikazuje parametre seruma kod DIO miševa 7. dana nakon i. p. injekcije anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifičnog antitela ili R1MAb1 u dozi od 50 mg/kg ili vehikuluma. N=6.
Slika 17 prikazuje količinu FGF23 i neorganskog fosfora u serumu DIO miševa 7. dana nakon i. p. injekcije BsAb17 u dozi od 50 mg/kg. N=6. ***p<0,0005.
Slika 18A prikazuje količinu ekskurzije glukoze u arterijskoj krvi tokom klamp eksperimenta. DIO miševi su primili BsAb17 ili IgG kontrolu u dozi od 10 mg/kg 5 dana pre klamp eksperimenta.
Slika 18B prikazuje telesnu težinu na dan klamp eksperimenta.
Slika 18C prikazuje brzinu infuzije glukoze tokom klamp eksperimenta. p<0,05 (*), <0,001 (**) u odnosu na kontrolu.
Slika 19A prikazuje potrošnju energije (EE) (levo) i respiratorni količnik (RQ) (desno) DIO miševa koji su primili jednu i. p. injekciju u dozi od 10 mg/kg IgG u naznačeno vreme na 21-22°C. N=7.
Slika 19B prikazuje EE (gore) i RQ (dole) mršavih miševa koji su primili jednu i. p. injekciju u dozi od 10 mg/kg IgG u naznačeno vreme. Miševi su održavani na 21-22°C nakon čega je temperatura kaveza pomerena na termoneutralnost (29-30°C) 6 dana nakon injekcije IgG. N=6~7.
Slika 19C prikazuje unos fludezoksiglukoze (FDG) tkiva kod DIO miševa 40 sati nakon jedne i. p. injekcije naznačenog IgG u dozi od 10 mg/kg. N=8. Miševi nisu hranjeni tokom noći pre merenja unosa FDG.
Slika 19D prikazuje vestern blot analizu ingWAT sakupljenog 7. dana nakon jedne i. p. injekcije (BsAb17 ili IgG kontrole u dozi od 10 mg/kg) i hirurške implantacije osmotske pumpe (CL316,243 (0,75 nmol/h) ili vehikulum).
Slika 19E prikazuje ekspresiju Ucp1 iRNK u primarnim humanim potkožnim adipocitima tretiranim navedenim proteinom pri 30 nM tokom 48 sati. N=3.
Slika 19F prikazuje temperaturu telesnih organa DIO miševa koji su primili BsAb17 ili IgG kontrolu u dozi od 10 mg/kg. N=7~8.
Slika 19G prikazuje profil ekspresije gena u iBAT DIO miševa koji su primili jednu dozu IgG od 10 mg/kg i FGF21 b.i.d.2 mg/kg/dan ili kontrolni PBS tokom 5 dana. Navedeni su svi geni koji su se značajno razlikovali između BsAb17 i kontrole ili između FGF21 i kontrole.
Slika 19H prikazuje EE (levo) i RQ (desno) mršavih miševa koji su primili jednu i. p. injekciju anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifičnog antitela ili IgG kontrole u dozi od 10 mg/kg i hiruršku implantaciju osmotske pumpe (CL-316,243 pri 0,5 nmol/h ili vehikulum) 0. dana. Prikazane su srednje vrednosti tokom naznačenog perioda od 24 h.
Slika 20A prikazuje količinu VO2(gore), VCO2(sredina) i ukupni broj aktivnosti DIO miševa opisanih na Slici 19A. Vrednosti VO2i VCO2su normalizovane vrednostima telesne težine merene u vremenima označenim sa #. DIO miševi su primili BsAb17 ili IgG kontrolu u dozi od 10 mg/kg.
Slika 20B prikazuje količinu VO2(gore), VCO2(sredina) i ukupni broj aktivnosti DIO miševa opisanih na Slici 19B. Vrednosti VO2i VCO2su normalizovane vrednostima telesne težine merene u vremenima označenim sa #. DIO miševi su primili BsAb17 ili IgG kontrolu u dozi od 10 mg/kg.
Slika 21A prikazuje prosečnu EE vrednost u indirektnoj kalorimetriji. Veličina prosečnog povećanja je prikazana ispod grafikona. DIO 21°C: Prosečna vrednost EE tokom D3-D6 nakon injekcije IgG u eksperimentu prikazanom na slici 19A. Mršavi 21°C: Prosečna vrednost EE tokom D3-D6 nakon injekcije IgG u eksperimentu prikazanom na slici 19B. Mršavi nakon promene na 30°C: Prosečna vrednost EE tokom D6-D9 nakon injekcije IgG (tj.
3 dana nakon promene temperature) u eksperimentu prikazanom na slici 19B. DIO 30°C: Prosečna vrednost EE tokom D3-D6 nakon injekcije IgG kod DIO miševa aklimatizovanih na termoneutralnost.
Slika 21B prikazuje promene EE kod DIO miševa na termoneutralnosti. DIO miševi su aklimatizovani na termoneutralnost tokom 2 nedelje pre jedne i. p. injekcije (strelica) BsAb17 ili IgG kontrole u dozi od 10 mg/kg. N=3~4.
Slika 21C prikazuje prosečne EE i RQ kod DIO miševa na normalnoj laboratorijskoj temperaturi (21°C) tokom D3-5 nakon hirurške implantacije osmotske pumpe i injekcije leka. Tokom D0, miševi su primili i. p. injekciju BsAb17 ili IgG kontrole u dozi od 10 mg/kg. FGF21 grupa je takođe primila bolus i. p. injekciju FGF21 u dozi od 2 mg/kg tokom D0. Svakom mišu je takođe supkutano implantirana osmotska pumpa za infuziju FGF21 pri 60 pg/dan ili PBS kontrolu tokom DO. N=8~9. ** p<0,005.
Slika 22 prikazuje podatke prikazane na Slici 19F, ponovo prikazane da pokažu prilagođenu razliku temperature telesnih organa tokom studije, između DIO miševa koji su primili BsAb17 ili IgG kontrolu u dozi od 10 mg/kg. Crna linija je procenjena razlika, a plave linije su tačkasti intervali 95% pouzdanosti razlike. IgG je primenjen 13. dana (strelica). N=7~8.
Slika 23 prikazuje fosforilaciju ERK i MEK izazvanu pomoću FGF21 i BsAb20 u sličnoj meri u epididimalnoj masti, ingvinalnoj masti i međulopatičnoj smeđoj masti i pankreasu. Tkiva su sakupljena 1 sat (jetra, pankreas i epididimalno belo masno tkivo (eWAT)) ili 2 sata (iBAT ili ingWAT) nakon i. p. injekcije kod mršavih C57BL/6 miševa u dozi od 10 mg/kg (BsAb20) ili u dozi od 1 mg/kg (FGF21). Ukupni ERK i MEK služe kao kontrole primene.
Slika 24A prikazuje promene telesne težine i nivoe HMW adiponektina u serumu kod DIO miševa (N=6) koji su primili jednu i. p. injekciju BsAb17 u naznačenoj dozi (mg/kg).
Slika 24B prikazuje promene telesne težine i nivoe HMW adiponektina u serumu kod majmuna cinomolgusa (N=3) koji su primili jednu i. v. injekciju BsAb17 u naznačenoj dozi (mg/kg).
Slika 24C prikazuje EE DIO miševa (levo: wt i desno: KO adiponektin) koji su primili jednu i. p. injekciju naznačenog IgG (BsAb17) u dozi od 10 mg/kg (strelica). N=5~6.
Slika 24D prikazuje razne metaboličke parametre kod wt (+/+) i KO adiponektin (-/-) DIO miševa, koji su primili jednu i. p. injekciju naznačenog IgG (BsAb17) u dozi od 10 mg/kg. N=6. AUC: Područje ispod krive kod GTT ili ITT (T=0~2 sata). p<0,1 (#), <0,05 (*), <0,005 (**) u odnosu na kontrolu.
Slika 25 prikazuje ukupnu RNK koja je pripremljena od miševa opisanih na Slici 19G pomoću qPCR.
Slika 26 prikazuje nivo ERK fosforilacije pomoću BsAb17 u tkivima miševa. Tkiva su sakupljena 1 sat nakon i. p. injekcije BsAb17 ili IgG kontrole u dozi od 10 mg/kg kod mršavih C57BL/6 miševa i podvrgnuta su imunohistohemiji pomoću antitela specifičnog za fosforilovani ERK. Za svaku grupu su prikazane reprezentativne slike 2 životinje. (1) pankreas, (2) koronalni deo mozga koji sadrži suprahijazmatična jedra (strelica), (3) koronalni deo mozga koji sadrži područje postrema (trouglastu kolekciju obojenih ćelija) i centralni kanal (strelica) i (4) koronalni deo mozga koji sadrži medijanu eminencije (strelica). Ne zaboravite da je signal izazvan BsAb17 bio očigledan u acinarnim ćelijama pankreasa, ali nije bio očigledan ni u jednom od ispitivanih delova mozga.
Slika 27 prikazuje normalizaciju proliferacije hepatocita indukovane saHFD od strane BsAb20. Inkorporacija BrdU u jetri DIO miševa ili kontrolnih mršavih C57BL/6 miševa tretiranih sa BsAb20 (1 ili 3 mg/kg/nedeljno) ili IgG kontrolom (3 mg/kg/nedeljno) tokom 8 nedelja. * p<0,05 u odnosu na DIO miševe tretirane sa IgG (N=5~8).
Slika 28A je šematski prikaz eksperimenta prikazanog na Slici 28B. DIO miševi su primali BsAb20 (1 ili 3 mg/kg nedeljno) ili kontrolni IgG (1 mg/kg nedeljno) tokom 6 nedelja, kako je naznačeno. Kontrolni mršavi C57BL/6 miševi nisu tretirani.
Slika 28B prikazuje fenotip kosti nakon tretmana sa BsAb20. Femur i tibija su secirani i podvrgnuti µCT analizi. (N=7~8). Ne zaboravite da nije primećen nikakav negativan efekat na različite parametre kosti u trabekularnim i kortikalnim kostima sa mogućim izuzetkom debljine kortikalne kosti, koja je pokazala trend smanjenja pri tretmanu sa BsAb20 u dozi od 3 mg/kg/nedeljno, iako statistička značajnost nije dostignuta. Zbog toga što je prijavljeno smanjenje debljine kortikalne kosti bez uticaja na trabekularnu gustinu kostiju kod miševa sa ograničenim unosom kalorija (11), uočeni efekat može biti povezan sa gubitkom težine. p<0,001 (***), <0,01 (**), <0,05 (*), <0,1 (#), <0,2 ($) u odnosu na DIO miševe tretirane IgG kontrolom. N=7~8.
Slika 29 prikazuje nivoe kortikosterona kod miševa nakon tretmana sa BsAb17. Nivoi kortikosterona u serumu su mereni u Cajtgeberovom vremenu (ZT)=3 nakon eutanazije dekapitacijom. Kontrolni (CTRL) mršavi miševi nisu tretirani. Lipopolisaharid (LPS) je bio i.
p. ubrizgan mršavim miševima u dozi od 1 mg/kg 3 sata pre eutanazije (ZT=0) kao pozitivna kontrola (12). IgG je i. p. ubrzigan DIO miševima u dozi od 5 ili 25 mg/kg 5 dana pre eutanazije kako je naznačeno. Naznačena statistička analiza je sprovedena bez LPS grupe. N=12.
Slika 30 prikazuje vezivanje raznih bispecifičnih antitela sa anti-FGFR1 i anti-KLB kracima za ćelije koje eksprimiraju FGFR1c ili FGFR1c i KLB.
Slika 31 prikazuje vezivanje derivata YW182.5 i YW182.5 za FGFR1 proteine pomoću ELISA.
Detaljan opis
Detaljan opis ovog predmetnog pronalaska je, radi jasnoće, a ne radi ograničavanja, podeljen u sledeće pododeljke:
I. Definicije;
II. Antitela;
III. Metode upotrebe;
IV. Farmaceutske formulacije; i
V. Proizvodi.
I. Definicije
„Humani akceptorski okvir“ je za ovde navedene svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano u nastavku. Humani akceptorski okvir „dobijen od“ okvira humanog imunoglobulina ili humanog okvira konsenzusa može da sadrži istu aminokiselinsku sekvencu kao i ova dva okvira, ili može da sadrži izmene u aminokiselinskoj sekvenci. U određenim aspektima otkrića, broj izmena aminokiselina iznosi 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U određenim aspektima otkrića, humani akceptorski okvir VL po sekvenci je identičan sekvenci okvira VL humanog imunoglobulina ili sekvenci okvira humanog konsenzusa.
„Afinitet“ se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Aspekti predmetnog pronalaska dati kao specifična ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisani su u nastavku.
Termin „afinitetno zrelo“ antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.
Termin „Klotho-beta“, „KLB“ i „beta-Klotho“, kao što se ovde koristi, ukazuje na svaki nativni beta-Klotho koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi) ako nije drugačije naglašeno. Ovaj izraz se odnosi i na neobrađeni KLB „kompletne dužine“, kao i svaki oblik KLB koji je rezultat obrade u ćeliji. Izraz takođe obuhvata prirodno postojeće varijante KLB, npr. splajsovane ili alelne varijante. Neograničavajući primer humane KLB aminokiselinske sekvence ciljane antitelom iz predmetnog otkrića, isključujući signalnu sekvencu, je sledeći:
U određenim aspektima predmetnog pronalaska, KLB protein može da uključuje Nterminalnu signalnu sekvencu koja ima aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 145).
Termin „C-terminalni domen KLB“ se odnosi na karboksi-terminalni domen KLB sličan glikozidazi. Na primer, C-terminalni domen primera KLB proteina prikazanog u SEQ ID NO: 145 sadrži sledeću aminokiselinsku sekvencu:
( )
Termini „anti-KLB antitelo“ ili „antitelo koje se vezuje za KLB“ odnose se na antitelo koje je sposobno za vezivanje KLB sa dovoljnim afinitetom, tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens kada se cilja na KLB. U jednom aspektu otkrića, obim vezivanja anti-KLB antitela za nepovezani protein koji nije KLB manji je od oko 10% od vezivanja antitela za KLB, kako je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U određenim aspektima otkrića, antitelo koje se vezuje za KLB ima konstantu disocijacije (Kd) ≤ 1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo se vezuje za epitop KLB koji je očuvan među KLB različitih vrsta. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo se vezuje za epitop KLB koji se nalazi u C-terminalnom delu proteina.
Termin „receptor 1 faktora rasta fibroblasta“ ili „FGFR1“, kao što se ovde koristi, ukazuje na svaki nativni FGFR1 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađen FGFR1, „kompletne dužine“, kao i svaki oblik FGFR1 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata varijante FGFR1 koje se nalaze u prirodi, npr. splajsovane varijante ili alelne varijante, uključujući FGFR1c. Neograničavajući primer humane FGFR1c aminokiseline prikazan je u nastavku:
Termin „anti-FGFR1c antitelo“ odnosi se na antitelo koje može da veže FGFR1c sa dovoljnim afinitetom, tako da se antitelo može koristiti kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje FGFR1c. U jednom aspektu otkrića, obim vezivanja anti-FGFR1c antitela za nepovezani protein koji nije FGFR1c manji je od oko 10% od vezivanja antitela za FGFR1c, kako je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U određenim aspektima otkrića, antitelo koje se vezuje za FGFR1c ima konstantu disocijacije (Kd) ≤ 1 M, ≤ 100 mM, ≤ 10 mM, ≤ 1 mM, ≤ 100 µM, ≤ 10 µM, ≤ 1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM. U određenim aspektima otkrića, Kdantitela koje se vezuje za FGFR1c, koji je ovde obelodanjen, može biti 10<-3>M ili manje ili 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M. U određenim aspektima otkrića, anti-FGFR1c antitelo se vezuje za epitop FGFR1c koji je očuvan među FGFR1c različitih vrsta.
Termin „antitelo“ ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.
„Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri fragmenata antitela uključuju, bez ograničenja, Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab')2; dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr., scFv) i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
Izraz „antitelo koje se takmiči u vezivanju“ sa referentnim antitelom odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više. Primer konkurencije je opisan u „Antibodies“ Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).
Termin „himerno“ antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.
„Klasa“ antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se α, δ, ε, γ i μ.
Termin „citotoksični agens“ kao što se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva ćelijsku smrt ili uništenje. Citotoksični agensi uključuju, bez ograničenja, radioaktivne izotope (npr., At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr., metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malih molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante, kao i različite antitumorske ili antikancerogene agense opisane u nastavku.
Izraz „efektorske funkcije“ se odnosi na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, koje variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), vezivanje za Fc receptor, ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), fagocitozu, nishodnu regulaciju površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor) i aktivaciju B ćelija.
„Delotvorna količina“ agensa, npr. neke farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima delotvorna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata. Na primer, bez ograničavanja, „delotvorna količina“ može da se odnosi na količinu antitela, koja je ovde otkrivena, koja je u stanju da ublaži, smanji i/ili spreči simptome bolesti i/ili poremećaja, produži preživljavanje i/ili produži period do relapsa bolesti i/ili poremećaja.
Izraz „Fc region“ u ovom dokumentu se koristi da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U određenim aspektima predmetnog pronalaska, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, na C-terminalnom kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, numeracija aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što je opisano u: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
„Okvir“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Izrazi „antitelo pune dužine“, „netaknuto antitelo“ i „kompletno antitelo“ u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi, i odnose se na antitelo koje ima strukturu suštinski sličnu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je u ovom dokumentu definisano.
Termini „ćelija domaćin“, „linija ćelije domaćina“ i „kultura ćelije domaćina“, kako se ovde naizmenično koriste, ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji.
„Humano antitelo“ je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci antitela koju proizvodi čovek ili humana ćelija, ili ono dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla.
„Okvir humanog konsenzusa“ je okvir koji predstavlja najčešće aminokiselinske ostatke u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Po pravilu, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Po pravilu, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols.
1-3. U određenim aspektima predmetnog pronalaska, podgrupa za VL je podgrupa kapa I, prema gorenavedenom radu Kabat et al. U određenim aspektima predmetnog pronalaska, podgrupa za VH je podgrupa III, prema gorenavedenom radu Kabat et al.
„Humanizovano“ antitelo se odnosi na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke nehumanih HVR-ova i aminokiselinske ostatke humanih FR-ova. U određenim aspektima predmetnog pronalaska, humanizovano antitelo će suštinski sadržati sve od najmanje jednog varijabilnog domena, ili obično dva varijabilna domena, od kojih svi, ili suštinski svi HVR (npr., CDR) odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik“ antitela, npr. nehumanog antitela, odnosi se na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.
Termin „hipervarijabilni region“ ili „HVR“ kao što je ovde upotrebljen, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“) i formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje“) i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom („antigenski kontakti“). Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su numerisani prema radu Kabat et al, supra. U suštini, antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U ovom dokumentu, primeri za HVR uključuju:
(a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), i 96-101 (H3) (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987));
(b) CDR koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), i 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) kontakte antigena koji se javljaju na ostacima aminokiselina 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996)); i
(d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući aminokiselinske ostatke HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).
U određenim aspektima predmetnog pronalaska, HVR ostaci obuhvataju one identifikovane na Slici 3A ili Slici 3B ili negde drugo u specifikaciji.
„Imunokonjugat“ se odnosi na antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, ali bez ograničenja, citotoksični agens.
„Pojedinac“ ili „ispitanik“, kako se ovde naizmenično koristi, je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr., krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr., ljude i nehumane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr., miševe i pacove). U određenim aspektima predmetnog pronalaska, pojedinac ili ispitanik je čovek.
„Izolovano“ antitelo je ono koje je izdvojeno iz svog prirodnog okruženja. U određenim aspektima pronalaska, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99%, kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr., SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr., jonskom izmenom ili reversno-faznim HPLC postupkom). Za pregled metoda za procenu čistoće antitela, pogledajte npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
„Izolovana“ nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo“ (uključujući reference na specifično antitelo, npr. anti-KLB antitelo) odnosi se na jedan molekul ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj lokaciji ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
Termin „monoklonsko antitelo“, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sadrže ovu populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve varijante su obično prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Stoga reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao da podrazumeva zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa ovim predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na metodu hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke u kojima se koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
„Golo antitelo“ označava antitelo koje nije konjugovano sa heterolognim ostatkom (npr. citotoksičnim ostatkom) ili radiološkom oznakom. Golo antitelo može da bude prisutno u farmaceutskoj formulaciji.
„Nativna antitela“ ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena.
Termin „uputstvo za upotrebu“, kako se ovde koristi, koristi se da se ukaže na uputstvo koje se tipično nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.
„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, ne uzimajući u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene pomoću računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Računarski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.
U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što alternativno može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti aminokiselinske sekvence B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije objavljeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence dobijene su, kao što je opisano u prethodnom paragrafu, pomoću računarskog programa ALIGN-2.
Termin „farmaceutska formulacija“ se odnosi na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj sadrži bude delotvorna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
„Farmaceutski prihvatljiv nosač“, kako se ovde koristi, odnosi se na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
U smislu ovog dokumenta, „lečenje“ (i gramatički oblici ove reči, kao što je „lečiti“) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, i može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje stope napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U određenim aspektima otkrića, antitela iz predmetnog otkrića mogu da se koriste da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
Izrazi „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnose se na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji učestvuje u vezivanju antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela tipično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Videti, npr. Kindt et al. Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman and Co., strana 91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen radi pregledanja biblioteke komplementarnih VL odnosno VH domena. Videti, npr. Portolano et al., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Termin „vektor“, kao što se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori“.
II. Antitela
U jednom aspektu, pronalazak se delimično zasniva na otkriću bispecifičnih antitela koja se vezuju za KLB i za FGFR1c i selektivno aktiviraju kompleks FGFR1c/KLB receptora i indukuju korisne promene u metabolizmu koje su očekivane od aktivnosti kao što je FGF21, uključujući gubitak težine i poboljšanje metabolizma glukoze i lipida, bez značajnog uticaja na jetru i bez gubitka koštane mase.
U određenim otelotvorenjima, obezbeđena su antitela koja se vezuju za KLB. Predmetno otkriće dalje pruža anti-FGFR1 antitela, npr. anti-FGFR1c antitela. Predmetno otkriće dalje pruža bispecifična antitela koja se vezuju za KLB i za FGFR1 (ovde se pominju kao anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifična antitela). U određenim otelotvorenjima, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića se vezuje za KLB i za FGFR1c. U određenim aspektima otkrića, antitela iz predmetnog otkrića uključuju antitela koja ne blokiraju vezivanje i/ili interakciju FGF liganada, npr. FGF19 i FGF21, za KLB/FGFR1c kompleks.
U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića nema značajan uticaj na jetru, npr. funkcionisanje jetre. Bez ograničavanja na određenu teoriju, antitelo iz predmetnog otkrića ne dovodi do aktiviranja kompleksa FGFR1c/KLB receptora u jetri. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića ne moduliše aktivnost kompleksa FGFR/KLB receptora u jetri u poređenju sa modulacijom kompleksa FGFR/KLB receptora u jetri pomoću FGF21 proteina. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića ne dovodi do inhibicije FGFR4/KLB kompleksa i/ili ne dovodi do povećanja enzima jetre kao što su, bez ograničavanja, ALT, AST, ALP i GLDH. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića ne funkcioniše kao agonist kompleksa FGFR2c/KLB i/ili kompleksa FGFR3c/KLB u jetri, što može da dovede do aktivirane MAPK signalizacije i/ili izmenjene ekspresije Spry4 i Dusp6 u jetri. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića ne dovodi do aktiviranja MAPK signalizacije u jetri u poređenju sa aktiviranjem MAPK signalizacije FGF21 proteinom. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića ne funkcioniše kao agonist kompleksa FGFR4/KLB u jetri.
U određenim otelotvorenjima, antitelo iz predmetnog otkrića može biti humanizovano. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića obuhvata humani akceptorski okvir, na primer, okvir humanog imunoglobulina ili okvir humanog konsenzusa.
U određenim otelotvorenjima, antitelo iz predmetnog otkrića može biti monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može biti fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo ili F(ab’)2fragment. U određenim aspektima otkrića, antitelo je antitelo pune dužine, npr. netaknuto IgG1 antitelo ili antitelo neke druge klase ili izotipa, prema definiciji iz ovog dokumenta. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je detaljno opisano u Odeljcima 1-7 u nastavku.
Antitela iz predmetnog otkrića su korisna, npr. za dijagnozu ili lečenje metaboličkih poremećaja. Neograničavajući primeri metaboličkih poremećaja uključuju sindrom policističnih jajnika (PCOS), metabolički sindrom (MetS), gojaznost, nealkoholni steatohepatitis (NASH), nealkoholnu bolest masne jetre (NAFLD), hiperlipidemiju, hipertenziju, dijabetes tipa 2, dijabetes koji nije tip 2, dijabetes tipa 1, latentni autoimuni dijabetes (LAD) i dijabetes mladih u zrelosti (MODY), kao i starenje i srodne bolesti kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i ALS.
A. Primeri za anti-KLB antitela
U jednom aspektu, predmetno otkriće pruža izolovana antitela koja se vezuju za KLB protein. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo iz predmetnog otkrića se vezuje za C-terminalni domen KLB. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo iz predmetnog otkrića se vezuje za fragment KLB koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO: 142). U određenim aspektima otkrića, antitelo se vezuje za isti epitop kao i anti-KLB antitelo, npr. 8C5, koje je ovde opisano.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo iz predmetnog otkrića sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-15, npr. 12 ili 15; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 16-31, npr.28 ili 31; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 32-47, npr.44 ili 47; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 48-62, npr. 49 ili 62; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 63-78, npr. 75 ili 78 i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 79-93, npr.90 ili 93.
U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža anti-KLB antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 koji sadrži SEQ ID NO: 28; (c) HVR-H3 koji sadrži SEQ ID NO: 44; (d) HVR-L1 koji sadrži SEQ ID NO: 49; (e) HVR-L2 koji sadrži SEQ ID NO: 75 i (F) HVR-L3 koji sadrži SEQ ID NO: 90. U određenim otelotvorenjima, predmetno otkriće pruža anti-KLB antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2 koji sadrži SEQ ID NO 31; (c) HVR-H3 koji sadrži SEQ ID NO: 47; (d) HVR-L1 koji sadrži SEQ ID NO 62; (e) HVR-L2 koji sadrži SEQ ID NO: 78 i (F) HVR-L3 koji sadrži SEQ ID NO: 93.
Ovo predmetno otkriće dalje pruža anti-KLB antitelo koje sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 128. U određenim aspektima otkrića, VH sekvenca sa identičnošću od najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije kao što je obelodanjeno u nastavku), umetanja ili uklanjanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-KLB antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za KLB. U određenim aspektima otkrića, zamenjeno je, umetnuto i/ili uklonjeno ukupno 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO: 128. U određenim otelotvorenjima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Alternativno ili dodatno, anti-KLB antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO: 128, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence, kao što je obelodanjeno u nastavku. U određenim aspektima otkrića, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 31 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 47.
U drugom aspektu, predmetno otkriće pruža anti-KLB antitelo, pri čemu antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 130. U određenim aspektima otkrića, VL sekvenca sa identičnošću od najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), umetanja ili uklanjanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-KLB antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za KLB. U određenim aspektima otkrića, zamenjeno je, umetnuto i/ili uklonjeno ukupno 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO: 130. U određenim aspektima otkrića, supstitucije, umetanja ili uklanjanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Alternativno ili dodatno, anti-KLB antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO: 130, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U određenim aspektima otkrića, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 78 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 93.
Ovo predmetno otkriće dalje pruža anti-KLB antitelo, pri čemu antitelo sadrži VH kao u svakom gore navedenom otelotvorenju, i VL kao u svakom gore navedenom otelotvorenju. U određenim otelotvorenjima, antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 128, odnosno SEQ ID NO: 130, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo se vezuje za fragment KLB koji se sastoji od aminokiselinske sekvence
(SEQ ID NO: 142).
B. Primeri za anti-FGFR1 antitela
U jednom aspektu, ovo predmetno otkriće pruža izolovana antitela koja se vezuju za protein FGFR1. U određenim otelotvorenjima, anti-FGFR1 antitelo iz predmetnog otkrića se vezuje za FGFR1c. U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža anti-FGFR1 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži SEQ ID NO: 136; (b) HVR-H2 koji sadrži SEQ ID NO: 137; (c) HVR-H3 koji sadrži SEQ ID NO: 138; (d) HVR-L1 koji sadrži SEQ ID NO: 139; (e) HVR-L2 koji sadrži SEQ ID NO: 140 i (F) HVR-L3 koji sadrži SEQ ID NO: 141.
U određenim aspektima otkrića, anti-FGFR1 antitelo iz predmetnog otkrića sadrži sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 132. U određenim aspektima otkrića, VH sekvenca sa identičnošću od najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), umetanja ili uklanjanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-FGFR1 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za FGFR1. U određenim aspektima otkrića, zamenjeno je, umetnuto i/ili uklonjeno ukupno 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO: 132. U određenim aspektima otkrića, supstitucije, umetanja ili uklanjanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Alternativno ili dodatno, anti-FGFR1 antitelo sadrži VH sekvencu u SEQ ID NO: 132, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U određenim aspektima otkrića, VH sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od: (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 i (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138.
Predmetno otkriće dalje pruža anti-FGFR1 antitelo, pri čemu, antitelo sadrži varijabilni domen lakog lanca (VL) koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 134. U određenim aspektima otkrića, VL sekvenca sa identičnošću od najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sadrži supstitucije (npr. konzervativne supstitucije), umetanja ili uklanjanja u odnosu na referentnu sekvencu, ali anti-FGFR1 antitelo koje sadrži tu sekvencu zadržava sposobnost da se vezuje za FGFR1. U određenim aspektima otkrića, zamenjeno je, umetnuto i/ili uklonjeno ukupno 1 do 10 aminokiselina u SEQ ID NO: 134. U određenim aspektima otkrića, supstitucije, umetanja ili uklanjanja se dešavaju u regionima izvan HVR (tj. u FR). Alternativno ili dodatno, anti-FGFR1 antitelo sadrži VL sekvencu u SEQ ID NO: 134, uključujući posttranslacione modifikacije te sekvence. U posebnom aspektu otkrića, VL sadrži jedan, dva ili tri HVR izabrana od (a) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139; (b) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141.
U drugom aspektu, dato je anti-FGFR1 antitelo, pri čemu, antitelo sadrži VH kao u svakom gore navedenom otelotvorenju, i VL kao u svakom gore navedenom otelotvorenju. U određenim otelotvorenjima, anti-FGFR1 antitelo sadrži VH i VL sekvence u SEQ ID NO: 132, odnosno SEQ ID NO: 134, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci.
U određenim aspektima otkrića, FGFR1 antitelo iz predmetnog otkrića se vezuje za fragment FGFR1c koji se sastoji od aminokiselinske sekvence (SEQ ID NO: 143) ili (SEQ ID NO: 144).
C. Primeri za anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifična antitela
Predmetno otkriće dalje pruža bispecifična antitela koja se vezuju za KLB i za FGFR1 (tj. anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifična antitela). Bispecifično antitelo ima dve različite specifičnosti vezivanja, videti, npr. U.S. patente br. 5,922,845 i 5,837,243; Zeilder (1999) J. Immunol. 163:1246-1252; Somasundaram (1999) Hum. Antibodies 9:47-54; Keler (1997) Cancer Res. 57:4008-4014. Na primer, bez ograničavanja, predmetni pronalazak pruža bispecifična antitela koja imaju jedno mesto vezivanja (npr. mesto vezivanja antigena) za prvi epitop prisutan na KLB i drugo mesto vezivanja za drugi epitop prisutan na FGFR1. Na primer, bez ograničavanja, predmetno otkriće pruža antitelo čiji se jedan krak vezuje za KLB i sadrži bilo koju od ovde opisanih sekvenci anti-KLB antitela, a drugi krak se vezuje za FGFR1 i sadrži bilo koju od ovde opisanih sekvenci anti-FGFR1 antitela. U određenim otelotvorenjima, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića ima jedno mesto vezivanja za prvi epitop prisutan na KLB i drugo mesto vezivanja za drugi epitop prisutan na FGFR1c.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje je ovde obelodanjeno odnosi se na antitelo koje modulira aktivnost KLB/FGFR1c kompleksa. Na primer, bispecifično anti-KLB/anti-FGFR1 antitelo može da funkcioniše kao agonist i da aktivira KLB/FGFR1c kompleks. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo je antitelo koje povećava aktivnost KLB/FGFR1c kompleksa za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% , 70%, 80%, 90%, 99% ili 99,9%. U određenim aspektima otkrića, bispecifično anti-KLB/anti-FGFR1 antitelo može da bude antitelo koje dovodi do fosforilacije nishodnih ciljeva KLB/FGFR1c kompleksa, npr. MAPK i/ili ERK.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje je ovde opisano odnosi se na antitelo koje moduliše aktivnost kompleksa KLB/FGFR1c i ne blokira interakciju i/ili vezivanje nativnih FGF liganda, npr. FGF19 i FGF21, sa kompleksom KLB/FGFR1c. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje je ovde obelodanjeno odnosi se na antitelo koje ne blokira aktivnost i/ili vezivanje nativnih FGF liganda za FGF receptor u odsustvu KLB. Na primer, bez ograničavanja, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića ne blokira interakciju nativnih FGF liganda sa kompleksom FGFR1/KLA i/ili sa samim FGFR1. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje je ovde obelodanjeno odnosi se na antitelo koje ne blokira aktivnost i/ili vezivanje nativnih FGF liganda za KLB u odsustvu FGFR1. Na primer, bez ograničavanja, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića ne blokira interakciju nativnih FGF liganda sa kompleksom FGFR4/KLB, kompleksom FGFR2c/KLB i/ili kompleksom FGFR3c/KLB.
U određenim otelotvorenjima, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, npr. anti-KLB/anti-FGFR1c bispecifično antitelo, ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen, uključuje region teškog lanca i lakog lanca. U određenim aspektima otkrića, teški lanac pune dužine uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 129. U određenim aspektima otkrića, laki lanac pune dužine uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 131. U određenim otelotvorenjima, teški lanac pune dužine uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 129. U određenim otelotvorenjima, laki lanac pune dužine uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 131.
U određenim otelotvorenjima, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, npr. anti-KLB/anti-FGFR1c bispecifično antitelo, ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen, uključuje varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca. U određenim aspektima otkrića, varijabilni region teškog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 128. U određenim aspektima otkrića, varijabilni region lakog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 130. U određenim otelotvorenjima, varijabilni region teškog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 128. U određenim otelotvorenjima, varijabilni region lakog lanca uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 130.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-15, npr. 12 ili 15; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 16-31, npr.28 ili 31; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 32-47, npr.44 ili 47; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 48-62, npr. 49 ili 62; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 63-78, npr. 75 ili 78 i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 79-93, npr.90 ili 93.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, npr. anti-KLB/anti-FGFR1c bispecifično antitelo, sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 koji sadrži SEQ ID NO: 28; (c) HVR-H3 koji sadrži SEQ ID NO: 44; (d) HVR-L1 koji sadrži SEQ ID NO: 49; (e) HVR-L2 koji sadrži SEQ ID NO: 75 i (F) HVR-L3 koji sadrži SEQ ID NO: 90. U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža anti-KLB antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2 koji sadrži SEQ ID NO: 31; (c) HVR-H3 koji sadrži SEQ ID NO: 47; (d) HVR-L1 koji sadrži SEQ ID NO: 62; (e) HVR-L2 koji sadrži SEQ ID NO: 78 i (F) HVR-L3 koji sadrži SEQ ID NO: 93.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, npr. anti-KLB/anti-FGFR1c bispecifično antitelo, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži domene CDR1, CDR2 i CDR3 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži domene CDR1, CDR2 i CDR3. U određenim aspektima otkrića, CDR1 domen varijabilnog regiona teškog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 1-15. U određenim aspektima otkrića, CDR2 domen varijabilnog regiona teškog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu, sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 16-31. U određenim aspektima otkrića, CDR3 domen varijabilnog regiona teškog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu SEQ ID NO: 32-47. U određenim aspektima otkrića, CDR1 domen varijabilnog regiona lakog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu SEQ ID NO: 48-62. U određenim aspektima otkrića, CDR2 domen varijabilnog regiona lakog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu SEQ ID NO: 63-78. U određenim aspektima otkrića, CDR3 domen varijabilnog regiona lakog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu SEQ ID NO: 79-93.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, npr. anti-KLB/anti-FGFR1c bispecifično antitelo, sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži domene CDR1, CDR2 i CDR3 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži domene CDR1, CDR2 i CDR3. U određenim aspektima otkrića, CDR1 domen varijabilnog regiona teškog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 1-15.
U određenim aspektima otkrića, CDR2 domen varijabilnog regiona teškog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 16-31. U određenim aspektima otkrića, CDR3 domen varijabilnog regiona teškog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 32-47. U određenim aspektima otkrića, CDR1 domen varijabilnog regiona lakog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 48-62. U određenim aspektima otkrića, CDR2 domen varijabilnog regiona lakog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 63-78. U određenim aspektima otkrića, CDR3 domen varijabilnog regiona lakog lanca uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 79-93.
U određenim otelotvorenjima, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, npr. anti-KLB/anti-FGFR1c bispecifično antitelo, uključuje CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 15; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 31; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 47; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 62; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 78 i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 93.
U određenim otelotvorenjima, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo uključuje prvo antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen, i uključuje drugo antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen, gde se prvo antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen, vezuje za epitop prisutan na KLB, a drugo antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen, vezuje se za epitop prisutan na FGFR1, npr. FGFR1c. Na primer, bez ograničavanja, prvo antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen, može uključivati varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca; i drugo antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen, može uključivati varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca. U određenim aspektima otkrića, varijabilni region teškog lanca prvog antitela ili dela tog antitela koji se vezuje za antigen, uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 128. U određenim aspektima otkrića, varijabilni region lakog lanca prvog antitela ili delova tog antitela koji se vezuju za antigen, uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 130. U određenim aspektima otkrića, varijabilni region teškog lanca drugog antitela ili dela tog antitela koji se vezuje za antigen, uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 132. U određenim aspektima otkrića, varijabilni region lakog lanca drugog antitela ili delova tog antitela koji se vezuju za antigen, uključuje aminokiseline koje imaju sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 134.
U određenim aspektima otkrića, ovde je pruženo anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i anti-KLB antitelo. Na primer, u određenim aspektima otkrića pruženo je anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i anti-KLB antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 128 i VL sekvencu SEQ ID NO: 130. U određenim aspektima otkrića, pruženo je anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za fragment KLB koji se sastoji od aminokiselinske sekvence
(SEQ ID NO: 142).
U određenim aspektima otkrića, pruženo je anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za fragment KLB koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 142.
U određenim aspektima otkrića, ovde je pruženo anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i anti-KLB antitelo. Na primer, u određenim aspektima otkrića pruženo je anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i anti-KLB antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca pune dužine SEQ ID NO: 129 i sekvencu lakog lanca pune dužine SEQ ID NO: 131.
U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i ovde dato anti-FGFR1 antitelo. Na primer, u određenim aspektima otkrića pruženo je anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i anti-FGFR1 antitelo koje sadrži VH sekvencu SEQ ID NO: 132 i VL sekvencu SEQ ID NO: 134. U određenim aspektima otkrića, pruženo je anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za fragment FGFR1c koji sadrži aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO: 143) ili (SEQ ID NO: 144).
U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i ovde dato anti-FGFR1 antitelo. Na primer, u određenim aspektima otkrića pruženo je anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i anti-FGFR1 antitelo koje sadrži sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 133 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 135.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića se vezuje za fragment FGFR1c koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 143.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića se vezuje za fragment FGFR1c koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 144.
U određenim aspektima otkrića, pruženo je anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za fragment KLB koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 142 i vezuje se za fragment FGFR1c koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 143 ili 144.
U određenim aspektima otkrića, pruženo je anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje se vezuje za fragment KLB koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 142 i koje se vezuje za fragment FGFR1c koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 143 ili 144.
1. Afinitet antitela
U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može da ima konstantu disocijacije (Kd) ≤ 1 M, ≤ 100 mM, ≤ 10 mM, ≤ 1 mM, ≤ 100 µM, ≤ 10 µM, ≤ 1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može imati Kdod oko10<-3>ili manje, ili 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M.
U određenim aspektima ovog otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo može da uključuje anti-FGFR1 krak koji ima Kdod oko 10 nM do oko 10 µM. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo sa FGFR1 krakom koji ima nizak afinitet može da ublaži rizik od čvrstog vezivanja anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifičnog antitela za FGFR1 u odsustvu KLB i sprečavanja vezivanja i/ili aktiviranja FGFR1 putem drugih FGF liganda kao što su, bez ograničenja, FGF1, FGF2, FGF8 i FGF23. U određenim aspektima otkrića, FGFR1 krak sa niskim afinitetom može da dozvoli prisustvo viših nivoa anti-FGFR1 nečistoća kao što su, bez ograničenja, anti-FGFR1 polu-dugme antitela, nekovalentni anti-FGFR1 dimeri, kovalentni anti-FGFR1 dimeri i vrste sa velikom molekulskom masom, a da ne dovede do klinički značajnih neželjenih dejstava. Na primer, u određenim aspektima otkrića, približno 2% vrsta sa velikom molekulskom masom i 1,5% anti-FGFR1 poluantitela može biti prisutno u preparatu anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifičnog antitela iz predmetnog otkrića, a da ne dođe do štetnih bioloških efekata.
U određenom aspektu otkrića, Kdmože da se meri analizom vezivanja radioaktivno označenog antigena (RIA). U određenim aspektima otkrića, RIA može da se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, bez ograničavanja na bilo koji način, afinitet vezivanja Fab u rastvoru za antigen meri se uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (videti, npr. Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Radi utvrđivanja uslova za test, MICROTITER<®>ploče sa većim brojem bunarčića (Thermo Scientific) preko noći se oblažu sa 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonata (pH 9,6), a zatim se blokiraju pomoću 2% (m/V) albumina goveđeg seruma u PBS-u, tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23 °C). Na neupijajućoj ploči (Nunc br. 269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena je pomešano sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Željeni Fab je zatim inkubiran tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše su prenete na ploču za hvatanje i inkubirane su na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor se zatim uklanja, a ploča se ispira osam puta pomoću 0,1% polisorbata 20 (TWEEN-20<®>) u PBS-u. Kada se ploče osuše, dodato je 150 μl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20™; Packard), a zatim su ploče merene na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja odabrane su za primenu u testovima kompetitivnog vezivanja.
U određenim aspektima otkrića, Kdse može meriti pomoću BIACORE<®>testa površinske plazmonske rezonance. Na primer, bez ograničavanja na bilo koji način, analiza pomoću uređaja BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) obavljena je na 25°C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (RU). U određenim aspektima otkrića, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, Biacore, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS), prema uputstvu dobavljača. Antigen se razblažuje 10 mM natrijum acetatom, pH 4,8, do 5 µg/ml (~0,2 µM) pre injektovanja pri protoku od 5 µl/minutu da bi se postiglo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, injektuje se 1 M etanolamin da bi se blokirale grupe koje nisu reagovale. Za kinetička merenja, dvostruko serijsko razblaženje Fab (0,78 nM do 500 nM) injektuje se u PBS sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25 °C pri protoku od oko 25 µl/ min. Brzina asocijacije (kon) i brzina disocijacije (koff) izračunavaju se pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) može da se izračuna kao odnos koff/konVidite, npr. Chen et al., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili serija 8000 SLM-AMINCO™ spektrofotometra (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem.
2. Fragmenti antitela
U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, bez ograničenja, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv i scFv fragmente, kao i druge fragmente opisane u nastavku. Pregled fragmenata pojedinih antitela potražite u Hudson et al. Nat. Med.9:129-134 (2003). Pregled scFv fragmenata potražite, npr. u Pluckthün, u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore izdav., (Springer-Verlag, New York), str.269-315 (1994); videti takođe WO 93/16185; i U.S. patente br. 5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke epitopa koji vezuju receptore i koji imaju produžen poluživot in vivo, vidite u U.S. patentu br.5,869,046.
U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može biti dijatelo. Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Videti, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161;
Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u Hudson et al., Nat. Med.
9:129-134 (2003).
U nekim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može biti antitelo sa jednim domenom. Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U određenim aspektima otkrića, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; vidite, npr. U.S. patent br.6,248,516 B1).
Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
U određenim otelotvorenjima, antitelo iz predmetnog otkrića je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela su opisana npr. u U.S. patentu br.4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 81:6851-6855 (1984)). U određenim aspektima otkrića, himerno antitelo iz predmetnog otkrića sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U drugom primeru, himerno antitelo može biti antitelo „sa zamenjenom klasom“, kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela obuhvataju njihove antigen-vezujuće fragmente.
U određenim otelotvorenjima, himerno antitelo iz predmetnog otkrića može biti humanizovano antitelo. Najčešće, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Po pravilu, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U određenim aspektima otkrića, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.
Pregled humanizovanih antitela i metoda za njihovo dobijanje daje se npr. u Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) a dodatno su opisani npr. u Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); U.S. patentima br. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (gde se opisuje graftovanje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (gde se opisuje „preuređivanje površine“); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (gde se opisuje „mešanje FR“); i Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (gde se opisuje pristup „vođene selekcije“ kod mešanja FR).
Humani regioni okvira koji mogu da se koriste za humanizaciju obuhvataju, bez ograničavanja, regione okvira izabrane metodom „najboljeg slaganja“ (videti npr. Sims et al. J. imunol.151:2296 (1993)); regione okvira dobijene od sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti npr. Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) regione okvira ili regione okvira humanog embriona (pogledajte, npr., Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i regione okvira dobijene pregledanjem FR biblioteka (videti npr., Baca et al., J. Biol. Chem.272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
4. Humana antitela
U određenim otelotvorenjima, antitelo iz predmetnog otkrića može biti humano antitelo. Humana antitela se mogu dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) i u Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008).
Humana antitela se mogu dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili su nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su po pravilu inaktivirani. Pogledajte pregled metoda za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Videti takođe, npr. U.S. patente br.
6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju tehnologiju XENOMOUSE™; U.S. patent br. 5,770,429 koji opisuje tehnologiju HUMAB<®>; U.S. patent br. 7,041,870 koji opisuje tehnologiju K-M MOUSE<®>, i U.S. publikaciju patentne prijave br. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju VELOCIMOUSE<®>). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koje stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
Humana antitela se mogu takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (videti, npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boemer et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humanih B-ćelija takođe su opisana u Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje humanohumane hibridome). Tehnologija humanih hibridoma (tehnologija trioma) takođe je opisana u Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
5. Antitela dobijena iz biblioteka
Antitela iz predmetnog otkrića mogu da se izoluju pretraživanjem kombinatornih biblioteka u potrazi za antitelima sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u struci je poznat veliki broj metoda za stvaranje biblioteka prikaza faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih metoda daju npr. Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., izd., Human Press, Totowa, NJ, 2001) a dalje opisuju, npr. McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks i Bradbury, u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
Kod pojedinih metoda displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u bibliotekama faga, koje zatim mogu da se pretražuju prema antigen-vezujućem fagu, kao što opisuju Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). U određenim aspektima otkrića, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela su, na primer, sledeće: US Patent br.5,750,373, i US Patent Publication br. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.
Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
6. Multispecifična antitela
U određenim otelotvorenjima, antitelo iz predmetnog otkrića može biti multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita epitopa. U određenim aspektima otkrića, jedna od specifičnosti vezivanja je za epitop prisutan na KLB, a druga je za bilo koji drugi antigen. U određenim aspektima otkrića, jedna od specifičnosti vezivanja je za epitop prisutan na FGFR1, a druga je za bilo koji drugi antigen. U određenim aspektima otkrića, bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića može da veže epitop na KLB i može da veže epitop na FGFR1. U određenim aspektima otkrića, bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića može da veže epitop na KLB i može da veže epitop na FGFR1c. Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.
Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac koji imaju različite specifičnosti (videti Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J.10: 3655 (1991)), i inženjering „dugme u rupici“ (videti, npr. U.S. patent br.5,731,168). Multispecifična antitela mogu takođe da se dobiju dizajniranjem efekata elektrostatičkog upravljanja za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); ukrštanja dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr. U.S. patent br.
4,676,980, i Brennan et al. Science, 229: 81 (1985)); upotrebom leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti npr. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); upotrebom tehnologije „dijatela“ za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela (videti npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera (videti, npr. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i proizvodnjom trispecifičnih antitela kako opisuju, npr. Tutt et al. J. imunol.147: 60 (1991).
Ovde su takođe obuhvaćena konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „antitela hobotnice“ (videti npr. US 2006/0025576A1).
7. Varijante antitela
Ovaj predmetni pronalazak dalje pruža varijante aminokiselinskih sekvenci obelodanjenih antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, ali se ne ogranaičavaju na, uklanjanje, i/ili umetanje, i/ili supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija uklanjanja, ubacivanja i supstitucije može se napraviti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalno, tj. modifikovano antitelo ima željene karakteristike, npr. antigen vezujuće karakteristike.
a) Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja
U određenim aspektima otkrića, varijante antitela mogu da imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Neograničavajući primeri konzervativnih supstitucija su prikazani u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije“. Neograničavajući primeri značajnijih izmena su dati u Tabeli 1 pod naslovom „primeri supstitucija“ i, kako je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Aminokiselinske supstitucije mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvode ispitane na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšana citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) ili citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC).
Tabela 1
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca:
(1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju niza: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
U određenim aspektima predmetnog otkrića, nekonzervativne supstitucije zahtevaju zamenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
U određenim aspektima otkrića, jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela npr. humanizovanog ili humanog antitela. Po pravilu, nastale varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije, npr. poboljšanja, izvesnih bioloških osobina kao što su, bez ograničavanja: povećan afinitet, smanjena imunogenost, u odnosu na matično antitelo, i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Neograničavajući primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka je mutirano, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).
U određenim aspektima otkrića, izmene (npr. zamene) mogu se izvršiti u HVR-ima, npr. da bi se poboljšao afinitet antitela. Takve izmene mogu biti napravljene na „vrućim tačkama“ HVR, tj. na ostacima koje kodiraju kodoni koji učestalo trpe mutaciju tokom procesa somatskog sazrevanja (pogledajte, npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol.207:179-196 (2008)), i/ili ostacima koji su u kontaktu sa antigenom, pri čemu se nastala varijanta VH ili VL ispituje na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka opisano je npr. u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al. eds., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). U određenim aspektima otkrića afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost može da se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo kog od mnogobrojnih postupaka (npr. PCR sklone greškama, mešanjem lanaca ili mutagenezom usmerenom oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze sa alaninom ili modelovanja. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.
U određenim aspektima potkrića, supstitucije, umetanja ili uklanjanja se mogu desiti u jednom ili više HVR, dokle god takve izmene ne utiču značajno na smanjenje sposobnosti antitela da vezuje antigen. Na primer, u HVR regionima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje znatno ne umanjuju afinitet vezivanja. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U određenim aspektima otkrića varijanti VH i VL sekvenci datih iznad, svaki HVR je neizmenjen ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
Korisna metoda za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu se zove „ciljana mutageneza sa alaninom“, i opisali su je Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys, i glu) identifikuju se i menjaju neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen–antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci obuhvataju spajanje amino- i/ili karboksiterminalnog kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i ubacivanje u sekvencu jednog aminokiselinskog ostatka, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante molekula antitela sa umetanjem obuhvataju spajanje N-terminusa ili C-terminusa antitela sa enzimom (npr. za enzimsku terapiju prolekovima usmerenu na antitela (ADEPT)) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.
b) Varijante glikozilacije
U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može da se izmeni da bi se povećao ili smanjio stepen do kog je antitelo glikozilovano. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije na antitelu može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da se jedno ili više mesta glikozilacije dodaju ili uklone.
U određenim aspektima otkrića, kada antitelo sadrži Fc region, može biti izmenjen ugljovodonik vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Videti, npr. Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharidi mogu da sadrže različite ugljovodonike, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc u „osnovi“ biantenarne oligosaharidne strukture. U određenim aspektima otkrića, izmene oligosaharida u antitelu iz predmetnog otkrića mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.
U određenim aspektima otkrića, date su varijante antitela koja imaju ugljovodoničnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana za Fc region (direktno ili indirektno). Na primer, količina fukoze u takvom antitelu može biti od oko 1% do oko 80%, od oko 1% do oko 65%, od oko 5% do oko 65% ili od oko 20% do oko 40%, i vrednosti između.
U određenim aspektima otkrića, količina fukoze može da se odredi izračunavanjem prosečne količine fukoze u šećernom lancu na Asn297, u odnosu na zbir svih glikostruktura vezanih za Asn 297 (npr. kompleksne, hibridne strukture, ili strukture sa visokim sadržajem manoze), kao što je određeno MALDI-TOF masenom spektrometrijom, npr. kao što je opisano u WO 2008/077546. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji za ostatke Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi približno ± 3 aminokiseline ushodno ili nishodno od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takve varijante fukozilacije mogu da imaju poboljšanu ADCC funkciju. Videti, npr. US patentnu publikaciju br. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija vezanih za „defukozilovane“ varijante antitela ili varijante „sa manjkom fukoze“ su sledeći: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al.
Biotech. Bioeng.87: 614 (2004).
Defukozilovana antitela se mogu proizvesti u bilo kojoj ćelijskoj liniji kojoj nedostaje fukozilacija proteina. Neograničavajući primeri ćelijskih linija uključuju Lec13 CHO ćelije sa nedostatkom fukozilacije proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); US pat. prijava br. US 2003/0157108 Al, Presta, L; i WO 2004/056312 Al, Adams et al., posebno u primeru 11), i nokaut ćelijske linije, poput gena alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelija (videti npr. Yamane-Ohnuki, N. et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
Varijante antitela su dalje obezbeđene sa bisektovanim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektovan pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju. Neograničavajući primeri takvih varijanti antitela su opisani npr., u,WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US patentu br. 6,602,684 (Umana et al.); i US 2005/0123546 (Umana et al.). Takođe se obezbeđuju i varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane npr., u, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); i WO 1999/22764 (Raju, S.).
c) Varijante Fc regiona
U određenim aspektima predmetnog pronalaska, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region antitela iz ovog dokumenta, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više aminokiselinskih položaja.
U određenim aspektima otkrića, ovo predmetno otkriće pruža varijantu antitela koja ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što je čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, dok su pojedine efektorske funkcije (kao što su komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti se mogu sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema FcγR vezivanje (stoga, verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fc(RIII, dok monociti eksprimiraju Fc(RI, Fc(RII i Fc(RIII. Ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama je rezimirana u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. patentu br.5,500,362 (pogledajte, npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (videti Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu biti korišćeni neradioaktivni postupci analize (videti, npr. ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (Cell Technology, Inc. Mountain View, CA; i CYTOTOX 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi vezivanja C1q mogu takođe da se izvedu kako bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i da, stoga, nema CDC aktivnost. Videti, npr. ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO2006/029879 i WO2005/100402. Da bi se odredila komplementarna aktivacija, može da se obavi CDC test (videti, npr. Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. i M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću metoda poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol.18(12):1759-1769 (2006)). U određenim aspektima otkrića, mogu se napraviti izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) C1q vezivanje i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US patent br.6,194,551, WO 99/51642 i Idusogie et al. J. imunol.164: 4178-4184 (2000).
Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. patent br. 6,737,056). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA“ Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US patent br.7,332,581).
Opisane su pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. Videti, npr. U.S. patent br.6,737,056; WO 2004/056312 i Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
U određenim aspektima otkrića, varijanta antitela iz predmetnog otkrića sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).
U određenim aspektima otkrića, promena napravljena u Fc regionu antitela, na primer, bispecifično antitelo, koje je ovde obelodanjeno, može da proizvede varijantu antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za prenos majčinog IgG na fetus (Guyer et al., J. Immunol.117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol.24:249 (1994)), opisana su u US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br.7,371,826).
Videti takođe Duncan i Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. patent br.5,648,260; U.S. patent br.5,624,821; i WO 94/29351 koji se tiču drugih primera varijanti Fc regiona.
d) Varijante antitela konstruisane sa cisteinom
U određenim aspektima otkrića, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. „tioMAb“, kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjeno ostacima cisteina. U posebnim aspektima predmetnog pronalaska, supstituisani ostaci se javljaju na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linker-lek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je opisano ovde. U nekim aspektima predmetnog pronalaska, bilo koji ostatak ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti zamenjeni cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antitela konstruisana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u U.S. patentu br.7,521,541.
e) Derivati antitela
U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može se dalje modifikovati tako da sadrži dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i odmah dostupni. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, polimere rastvorljive u vodi. Neograničavajući primeri za hidrosolubilne polimere uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, kopolimere polipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
U određenim aspektima otkrića, dati su konjugati antitela i neproteinskog funkcionalnog ostatka koji se mogu selektivno zagrevati izlaganjem radijaciji. U jednom aspektu otkrića, neproteinski ostatak je ugljenična nanocevčica (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). U određenim aspektima otkrića, radijacija može biti bilo koje talasne dužine i uključuje, bez ograničenja, talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski funkcionalni ostatak na temperaturu na kojoj stradaju ćelije u blizini neproteinskog funkcionalnog ostatka antitela.
D. Metode proizvodnje antitela
Antitela koja su ovde obelodanjena mogu da se proizvedu pomoću bilo koje tehnike koja je dostupna ili poznata u struci. Na primer, ali bez ograničavanja, antitela mogu da se proizvedu pomoću rekombinantnih metoda i kompozicija, npr. kao što je opisano u U.S. patentu br.4,816,567. Detaljni postupci generisanja antitela su opisani u primerima ispod.
Ovaj predmetni pronalazak dalje pruža izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira ovde obelodanjeno antitelo. Na primer, izolovana nukleinska kiselina može da kodira aminokiselinsku sekvencu koja uključuje VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, npr. laki i/ili teški lanac antitela. U određenim otelotvorenjima, izolovana nukleinska kiselina može da uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO: 128 i/ili nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koji ima sekvencu datu u SEQ ID NO: 130.
U određenim aspektima otkrića, nukleinska kiselina može biti prisutna u jednom ili više vektora, npr. ekspresionih vektora. Kako se ovde koristi, termin „vektor“ se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Jedna vrsta vektora je „plazmid“, koji se odnosi na kružnu dvolančanu DNK u koju se mogu vezati dodatni DNK segmenti. Druga vrsta vektora je virusni vektor, pri čemu se dodatni DNK segmenti mogu vezati u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina u koju su uneseni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Ostali vektori (npr. neepizomalni vektori sisara) mogu se integrisati u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina i na taj način se replikovati zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori, ekspresioni vektori, sposobni su da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno vezani. Uopšteno, ekspresioni vektori koji se koriste u rekombinantnim DNK tehnikama su često u obliku plazmida (vektora). Međutim, predviđeno je da obelodanjeni predmetni pronalazak uključi takve oblike ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (npr. retrovirusi sa defektnom replikacijom, adenovirusi i adenoasocirani virusi) koji imaju ekvivalentne funkcije.
U određenim aspektima otkrića, nukleinska kiselina koja kodira antitelo iz predmetnog otkrića i/ili jedan ili više vektora koji sadrže nukleinsku kiselinu može se uvesti u ćeliju domaćina. U određenim aspektima otkrića, uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju može da se izvede bilo kojom poznatom metodom uključujući, bez ograničavanja, transfekciju, elektroporaciju, mikroinjekciju, infekciju virusnim ili bakteriofagnim vektorom koji sadrži sekvence nukleinske kiseline, ćelijsku fuziju, prenos gena posredovan hromozomima, transfer gena posredovan mikroćelijama, fuziju sferoplasta, itd. U određenim aspektima otkrića, ćelija domaćin može da uključuje, npr. transformisana je njime: (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U određenim aspektima otkrića, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr. Y0, NS0, Sp20 ćelija).
U određenim otelotvorenjima, metode proizvodnje anti-KLB antitela ili anti-FGFR1c mogu da uključuju uzgajanje ćelije domaćina, u koju je uvedena nukleinska kiselina koja kodira antitelo, pod uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina i/ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina. U određenim aspektima otkrića, antitelo se izoluje iz ćelije domaćina hromatografskim tehnikama.
Za rekombinantnu proizvodnju antitela iz predmetnog otkrića, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr. kako je gore opisano, može da se izoluje i ubaci u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćinu. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se selektivno vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija.
Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakteriji, videti, npr. U.S. patente br.
5,648,237, 5,789,199, i 5,840,523. (Takođe videti, Charlton, Methods in Molecular Biology, sveska 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), str. 245-254, gde je opisana ekspresija fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.
Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što dovodi do stvaranja antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Videti Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), i Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006). Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela takođe mogu biti izvedene od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela su takođe izvedene od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
U određenim aspektima otkrića, kao ćelije domaćini mogu da se koriste kulture biljnih ćelija. Videti, npr. US patente br.5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (koji opisuju tehnologiju PLANTIBODIES™ za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
U određenim aspektima otkrića, kao domaćini se takođe mogu koristiti ćelije kičmenjaka. Na primer, bez ograničavanja na bilo koji način, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Neograničavajući primeri ćelijskih linija sisara koje se koriste kao domaćini su: CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); bubrežna linija humanog embriona (293 ili 293 ćelije kao što su opisane, npr. u Graham et al., J. Gen Virol.36:59 (1977)); bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK); mišje Sertolijeve ćelije (TM4 ćelije kao što su opisane, npr. u Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma cerviksa (HELA); bubrežne ćelije psa (MDCK; ćelije jetre bufalo pacova (BRL 3A); ćelije pluća čoveka (W138); ćelije jetre čoveka (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT 060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr. u Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); MRC 5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub i sar., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma, kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, vidite, npr. Yazaki i Wu, Methods in Molecular Biology, sveska 248 (B.K.C. Lo, izd., Humana Press, Totowa, NJ), str.255-268 (2003).
U određenim aspektima otkrića, tehnike za dobijanje bispecifičnih i/ili multispecifičnih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac koji imaju različite specifičnosti (videti Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)), PCT patentnu prijavu br. WO 93/08829, i Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)) i inženjering „dugme u rupici“ (videti, npr. U.S. patent br.
5,731,168). Bispecifična antitela mogu takođe da se dobiju dizajniranjem efekata elektrostatičkog upravljanja za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004A1); ukrštanjem dva ili više antitela ili fragmenata (pogledajte, npr. US patent br.
4,676,980, i Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); pomoću leucinskih zatvarača, kako bi se proizvela bispecifična antitela (pogledajte, npr. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); primenom tehnologije „dijatela“ za dobijanje bispecifičnih fragmenata antitela (pogledajte, npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera (videti, npr. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i proizvodnjom trispecifičnih antitela kako opisuju, npr. Tutt et al. J. imunol. 147: 60 (1991).
Bispecifični i multispecifični molekuli iz predmetnog otkrića se takođe mogu napraviti pomoću hemijskih tehnika (videti, npr. Kranz (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 78:5807), tehnike „polidoma“ (videti, npr. U.S. patent 4,474,893) ili tehnike rekombinantne DNK. Bispecifični i multispecifični molekuli ovog obelodanjenog predmetnog pronalaska se takođe mogu pripremiti konjugovanjem specifičnosti vezivanja konstituenta, npr. specifičnosti vezivanja prvog epitopa i drugog epitopa, pomoću poznatih metoda i kako je ovde opisano. Na primer, bez ograničavanja, svaka specifičnost vezivanja bispecifičnog i multispecifičnog molekula može da se generiše posebno i zatim može da se konjuguje jedna sa drugom. Kada su specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, različiti agensi za spajanje ili unakrsno povezivanje mogu da se koriste za kovalentnu konjugaciju. Neograničavajući primeri agensa za unakrsno povezivanje uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) ciklohaksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC) (videti, npr. Karpovsky (1984) J. Exp. Med.160:1686; Liu (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Druge metode uključuju one koje opisuje Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) br. 78, 118-132; Brennan (1985) Science 229:81-83), Glennie (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Kada su specifičnosti vezivanja antitela (npr. dva humanizovana antitela), ta antitela se mogu konjugovati putem sulfhidrilnog vezivanja C-terminalnih regiona šarki dva teška lanca. U određenim aspektima otkrića, region šarke može da se modifikuje tako da pre konjugacije sadrži neparan broj sulfhidrilnih ostataka, npr. jedan.
U određenim aspektima otkrića, obe specifičnosti vezivanja bispecifičnog antitela mogu biti kodirane u istom vektoru i mogu biti eksprimirane i sastavljene u istoj ćeliji domaćinu. Ova metoda je posebno korisna kada je bispecifični i multispecifični molekul MAb x MAb, MAb x Fab, Fab x F(ab’)2ili ligand x Fab fuzioni protein. U određenim aspektima otkrića, bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića može biti jednolančani molekul, kao što je jednolančano bispecifično antitelo, jednolančani bispecifični molekul koji sadrži jedno jednolančano antitelo i determinantu vezivanja ili jednolančani bispecifični molekul koji se sastoji od dve vezujuće determinante. Bispecifični i multispecifični molekuli takođe mogu da budu jednolančani molekuli ili mogu da sadrže najmanje dva jednolančana molekula. Metode za pripremu bispecifičnih i multispecifičnih molekula su opisane, na primer, u U.S. patentu br.
5,260,203; U.S. patentu br.5,455,030; U.S. patentu br.4,881,175; U.S. patentu br.5,132,405; U.S. patentu br.5,091,513; U.S. patentu br.5,476,786; U.S. patentu br.5,013,653; U.S. patentu br. 5,258,498; i U.S. patentu br.5,482,858. Ovde su takođe obuhvaćena konstruisana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, (npr., mesta vezivanja epitopa) uključujući „antitela hobotnice“ (videti npr. US 2006/0025576A1).
Ovaj predmetni pronalazak dalje pruža trispecifična, npr., trifunkcionalna, antitela. Na primer, bez bilo kakvog ograničavanja, trispecifično antitelo iz predmetnog otkrića može da se veže za epitop prisutan na KLB, epitop prisutan na FGFR1 i epitop ili antigen prisutan na trećem proteinu, kao što je, bez ograničavanja, PCSK9, GCGR, AdipoR, ZnT8, ApoL1, MSTN, InsR ili FABP4, i/ili da vrši interakciju sa njim.
U određenim aspektima otkrića, životinjski sistem može da se koristi za proizvodnju antitela u skladu sa predmetnim otkrićem. Jedan životinjski sistem za pripremu hibridoma je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma kod miševa je veoma dobro uspostavljeni postupak. Protokoli imunizacije i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u struci. Partneri za fuziju (npr. ćelije mišjeg mijeloma) i postupci fuzije su takođe poznati (videti, npr. Harlow i Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York).
E. Testovi
Ovde navedena antitela iz predmetnog otkrića mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim osobinama i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova koji su poznati u struci i dati ovde.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može da se testira na aktivnost vezivanja antigena poznatim metodama, kao što je test imunosorbenta vezanog enzimom (ELISA), radioimunološki test (RIA) ili vestern blot test. Svaki od ovih testova generalno otkriva prisustvo kompleksa protein-antitelo od posebnog interesa pomoću obeleženog reagensa (npr. antitela) specifičnog za određeni kompleks. Na primer, kompleksi KLB-antitelo mogu da se otkriju putem, npr. antitela vezanog enzimom ili fragmenta antitela koji prepoznaje komplekse antitelo-KLB i koji se specifično vezuje za njih . Alternativno, kompleksi mogu da se otkriju korišćenjem bilo kog od niza drugih imunotestova. Na primer, antitelo može da bude radioaktivno obeleženo i može da se koristi u u radioimunološkom testu (RIA) (videti, npr. Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986). Radioaktivni izotop može da se otkrije na način kao što je korišćenje Gajgerovog brojača ili scintilacionog brojača ili putem autoradiografije.
U određenim aspektima otkrića, konkurentski testovi mogu da se koriste za identifikaciju antitela koje je konkurent anti-KLB antitelu iz predmetnog pronalaska, npr.
12A11 ili 8C5, u vezivanju za KLB. U određenim aspektima otkrića, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo 12a11 ili 8C5. Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u: Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ).
U neograničavajućem primeru za konkurentski test, imobilisani KLB može da se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za KLB (npr. 12A11 ili 8C5), i drugo neobeleženo antitelo, čija sposobnost da se takmiči sa prvim antitelom u vezivanju za KLB se ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani KLB je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije pod uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za KLB, višak nevezanog antitela se uklanja, i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisani KLB. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani KLB u test uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom oko vezivanja za KLB. Videti Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Testovi za merenje aktivnosti
Predmetno otkriće daje testove za identifikaciju anti-KLB antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može da uključuje, npr. aktiviranje kompleksa receptora KLB/FGFR1c. Takođe se obezbeđuju antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro. U određenim aspektima otkrića, testovi mogu da uključuju vezivanje antitela iz predmetnog otkrića za ćelije, npr.293T ćelije koje eksprimiraju KLB i analiziranje aktivnosti i/ili stanja fosforilacije jednog ili više nishodnih ciljeva kompleksa KLB-FGFR1c receptora, npr. ERK. U određenim aspektima otkrića, test može da uključuje primenu antitela iz predmetnog otkrića na ispitaniku, npr. životinji koja nije čovek, i analiziranje efekta koje antitelo ima na nivo glukoze kod ispitanika.
F. Imunokonjugati
Ovaj predmetni pronalazak takođe dalje pruža imunokonjugate koji sadrže ovde obelodanjeno antitelo, konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agensa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla ili njihovi fragmenti) ili radioaktivni izotopi. Na primer, antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen iz predmetnog pronalaska mogu da budu funkcionalno povezani (npr. hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim vezivanjem ili na neki drugi način) sa jednim ili više drugih vezujućih molekula, kao što je drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili mimetik vezivanja.
U određenim aspektima otkrića, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo vezano za jedan ili više lekova, uključujući, ali se ne ograničavajući na majtanzinoid (pogledajte U.S. patente br.5,208,020, 5,416,064 i Evropski patent EP 0425 235); auristatin kao što su funkcionalni ostaci leka monometilauristatina DE i DF (MMAE i MMAF) (pogledajte U.S. patente br. 5,635,483 i 5,780,588, i 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (pogledajte U.S. patente br. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, i 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); i Lode et al., Cancer Res.58:2925-2928 (1998)); antraciklin, kao što je daunomicin ili doksorubicin (videti Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem.45:4336-4343 (2002); i U.S. patent br. 6,630,579); metotreksat; vindesin; taksan kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.
U određenim aspektima otkrića, imunokonjugat sadrži antitelo, prema opisu iz ovog dokumenta, konjugovano sa enzimski aktivnim toksinom ili njegovim fragmentom, uključujući, bez ograničenja, A-lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A-lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A-lanac ricina, A-lanac abrina, A-lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine vinobojke (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje, kursin, krotin, inhibitor iz sapunjače, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.
U određenim aspektima otkrića, imunokonjugat sadrži antitelo, kao što je opisano u ovom dokumentu, konjugovano sa radioaktivnim atomom radi formiranja radiokonjugata. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Neograničavajući primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za otkrivanje, može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer tc99m ili I123, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznata kao magnetna rezonanca, MR), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih agensa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil)heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina može se dobiti na način opisan u radu Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ugljenikom-14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) primer je helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Videti WO94/11026. Linker može biti „raskidivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, mogu da se koriste kiselo-labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari i sar., Cancer Res.52:127-131 (1992); U.S. patent br.5,208,020).
Imunokonjugati ili ADC ovde izričito razmatraju, ali nisu ograničeni na takve konjugate pripremljene sa reagensima za unakrsne linkere koji uključuju, ali nisu ograničeni na BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. kod kompanije Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., SAD).
III. Metode upotrebe
Ovaj predmetni pronalazak dalje pruža metode za korišćenje obelodanjenih antitela, npr. anti-KLB/anti-FGFR1c bispecifičnog antitela. U određenim aspektima otkrića, postupci su usmereni na terapeutsku upotrebu ovde obelodanjenih antitela. U određenim aspektima otkrića, postupci su usmereni na upotrebu obelodanjenih antitela u metodama dijagnostike.
A. Metode dijagnostike i otkrivanja
U određenim aspektima otkrića, svako ovde obelodanjeno antitelo koje ima specifičnost prema KLB, npr. anti-KLB antitelo i/ili anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, opisano u prethodnom tekstu, može biti korisno za otkrivanje prisustva KLB u biološkom uzorku. U daljem aspektu, ovaj predmetni pronalazak pruža metode za dijagnostikovanje i/ili otkrivanje bolesti pomoću ovde obelodanjenih anti-KLB antitela ili anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifičnog antitela. Termin „otkrivanje“, kako se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju.
U određenim neograničavajućim aspektima otkrića, biološki uzorak uključuje, bez ograničenja, klinički uzorak, jednu ili više ćelija, ćelije u kulturi, ćelijske supernatante, ćelijske lizate i uzorke tkiva. Izvor uzorka može biti čvrsto tkivo (npr. iz svežeg, zamrznutog i/ili očuvanog organa, uzorak tkiva, biopsija ili aspirat) ili ćelije pojedinca. U određenim aspektima otkrića, biološki uzorak može uključivati jednu ili više ćelija i/ili tkiva iz jetre, npr. jetre ispitanika.
U određenim aspektima otkrića, pruženo je anti-KLB antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U daljem aspektu, data je metoda za detekciju prisustva KLB u biološkom uzorku. U određenim aspektima otkrića, metoda za dijagnostiku ili detekciju uključuje dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa antitelom koje vezuje epitop prisutan na KLB, kako je ovde opisano, pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje antitela za KLB i otkrivanje da li je kompleks formiran između antitela i KLB. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak, npr. imunofluorescencija ili vestern blot analiza. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitelo je upotrebljeno da se izaberu ispitanici podobni za terapiju anti-KLB antitelom, npr. kada KLB predstavlja biomarker za izbor pacijenata.
U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića, npr. anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, za upotrebu u opisanim postupcima, nema značajan uticaj na jetru, npr. funkciju jetre. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića ne moduliše aktivnost kompleksa FGFR/KLB receptora u jetri u poređenju sa modulacijom kompleksa FGFR/KLB receptora u jetri pomoću FGF21 proteina. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića ne dovodi do inhibicije FGFR4/KLB kompleksa i/ili ne dovodi do povećanja enzima jetre kao što su, bez ograničavanja, ALT, AST, ALP i GLDH. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića ne funkcioniše kao agonist kompleksa FGFR2c/KLB i/ili kompleksa FGFR3c/KLB u jetri, što može da dovede do aktivirane MAPK signalizacije i/ili izmenjene ekspresije Spry4 i Dusp6 u jetri. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića ne dovodi do aktiviranja MAPK signalizacije u jetri u poređenju sa aktiviranjem MAPK signalizacije FGF21 proteinom. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića ne funkcioniše kao agonist kompleksa FGFR4/KLB u jetri.
U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića, npr. anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, za upotrebu u opisanim postupcima uključuje antitela koja ne blokiraju vezivanje i/ili interakciju FGF liganda, npr. FGF19 i FGF21, sa kompleksom KLB/FGFR1c. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje je ovde opisano odnosi se na antitelo koje moduliše aktivnost kompleksa KLB/FGFR1c i ne blokira interakciju i/ili vezivanje nativnih FGF liganda, npr. FGF19 i FGF21, sa kompleksom KLB/FGFR1c. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje je ovde obelodanjeno odnosi se na antitelo koje ne blokira vezivanje i/ili aktivnost nativnih FGF liganda za FGF receptor u odsustvu KLB. Na primer, bez ograničavanja, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića ne blokira interakciju nativnih FGF liganda sa kompleksom FGFR1/KLA ili samim FGFR1. U određenim aspektima otkrića, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje je ovde obelodanjeno odnosi se na antitelo koje ne blokira vezivanje i/ili aktivnost nativnih FGF liganda za KLB u odsustvu FGFR1. Na primer, bez ograničavanja, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo iz predmetnog otkrića ne blokira interakciju nativnih FGF liganda sa kompleksom FGFR4/KLB, kompleksom FGFR2c/KLB i/ili kompleksom FGFR3c/KLB.
U određenim aspektima otkrića, anti-KLB antitela, anti-FGFR1c i/ili anti-KLB/anti-FGFR1, npr. anti-KLB/anti-FGFR1c, bispecifična antitela za upotrebu u opisanim metodama mogu biti obeležena. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno, kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake, kao i funkcionalne ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Neograničavajući primeri oznaka uključuju radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegove derivate, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (videti U.S. patent br.
4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindione, peroksidazu rena (HRP), alkalnu fosfatazu, βgalaktozidazu, glukoamilazu, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidaze ili mikroperoksidaze, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofaga, stabilne slobodne radikale, i slično.
B. Terapeutske metode
U određenim otelotvorenjima, jedno ili više antitela iz predmetnog pronalaska može da se koristi za lečenje bolesti i/ili poremećaja kod ispitanika. Na primer, bez bilo kakvog ograničavanja, bolest može biti metabolički poremećaj. Neograničavajući primeri za metaboličke poremećaje uključuju sindrom policističnih jajnika (PCOS), metabolički sindrom (MetS), gojaznost, nealkoholni steatohepatitis (NASH), nealkoholnu bolest masne jetre (NAFLD), hiperlipidemiju, hipertenziju, dijabetes tipa 2, dijabetes koji nije tip 2, dijabetes tipa 1, latentni autoimuni dijabetes (LAD) i dijabetes mladih u zrelosti (MODY). U određenim otelotvorenjima, poremećaj metabolizma je dijabetes tipa 2. U određenim otelotvorenjima, poremećaj metabolizma je gojaznost.
U određenim aspektima otkrića, jedno ili više antitela iz ovog predmetnog pronalaska može da se koristi za lečenje Barde-Bidlovog sindroma, Prader-Vilijevog sindroma, Alstromovog sindroma, Koenovog sindroma, Olbrajtove nasledne osteodistrofije (pseudohipoparatiroidizam), Karpenterovog sindroma, MOMO sindroma, Rubinštajn-Tajbijevog sindroma, fragilnog X sindroma i Borjeson-Forsman-Lemanovog sindroma. U određenim aspektima otkrića, jedno ili više antitela iz ovog predmetnog pronalaska može da se koristi za lečenje bolesti starenja i srodnih bolesti, kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i ALS.
U određenim aspektima otkrića, jedno ili više antitela iz ovog predmetnog pronalaska može da se koristi za lečenje bolesti srca, moždanog udara, srčanog udara, hiperinsulinemije, visokog krvnog pritiska, bolesti koronarnih arterija, migrene ili glavobolje direktno povezane sa gojaznošću ili kranijalnom hipertenzijom, kongestivne srčane insuficijencije, neoplazije, dislipidemije, anemije, bolesti žučne kese, osteoartritisa, degenerativnog artritisa, degenerativnog diska, degenerativne bolesti zglobova, zamene zglobova, ubrzane degenerativne bolesti zglobova, astme, ponovljene pneumonije, ponovljenog pleuritisa, ponovljenog bronhitisa, restriktivne bolesti pluća, gastroezofagealnog refluksa (gerd), viška dlaka na licu i telu (hirzutizma), osipa, hronične infekcije kože, prekomernog znojenja, česte infekcije kvascima, urinarne stresne inkontinencije, menstrualne nepravilnosti, hormonske abnormalnosti, policističnih jajnika, neplodnosti, karcinoma (npr. raka dojke, debelog creva i materice), apneje u snu, pseudotumora mozga, depresije, psihološke/seksualne disfunkcije, društvene diskriminacije i prerane smrti.
U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža antitelo za upotrebu u postupku lečenja. Na primer, bez bilo kakvog ograničavanja, predmetno otkriće pruža antitelo, npr. anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, za upotrebu u postupku lečenja ispitanika koji ima metabolički poremećaj, npr. PCOS, MetS, gojaznost, NASH, NAFLD, hiperlipidemiju, hipertenziju, dijabetes tipa 2, dijabetes koji nije tip 2, dijabetes tipa 1, LAD, MODI i bolesti starenja i srodne bolesti kao što su Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest i ALS, što uključuje primenu na pojedincu ovde obelodanjene delotvorne količine antitela. U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža antitelo, npr. anti-KLB/FGFR1 bispecifično antitelo, za upotrebu u postupku lečenja ispitanika koji ima bolest ili poremećaj opisan u prethodnom tekstu, što uključuje primenu na pojedincu delotvorne količine antitela.
U određenim otelotvorenjima, postupak može dalje da uključuje primenu delotvorne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa na ispitaniku. Neograničavajući primeri dodatnih terapeutskih agensa, npr. drugog terapeutskog agensa, opisani su u nastavku.
U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće dalje pruža metodu za izazivanje gubitka težine koja se sastoji od primene na pojedincu delotvorne količine jednog ili više antitela iz predmetnog otkrića, npr. anti-KLB/FGFR1 bispecifičinog antitela.
„Pojedinac“, „pacijent“ ili „ispitanik“, kako se ovde koristi naizmenično, odnosi se na sisara. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr., krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr., ljude i nehumane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr., miševe i pacove). U određenim aspektima predmetnog pronalaska, pojedinac ili ispitanik je čovek.
Ovaj predmetni pronalazak dalje pruža antitelo, npr. anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, za upotrebu u aktiviranju KLB/FGFR1c koreceptorskog kompleksa, npr. kod ispitanika. Na primer, bez bilo kakvog ograničavanja, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo može biti anti-KLB/anti-FGFR1c bispecifično antitelo. U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće pruža antitelo, npr. anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, za upotrebu u postupku aktiviranja KLB/FGFR1c koreceptorskog kompleksa kod ispitanika. U određenim aspektima otkrića, postupak uključuje primenu na ispitaniku delotvornog antitela radi aktiviranja KLB/FGFR1c receptorskog kompleksa.
Antitela iz predmetnog otkrića se mogu koristiti sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, bez bilo kakvog ograničavanja, antitelo iz predmetnog otkrića može da se primenjuje zajedno sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim agensom. U određenim aspektima otkrića, drugi/dodatni terapeutski agens može da uključuje antidijabetički agens, agens protiv gojaznosti ili lek za metabolička stanja kao što su, bez ograničavanja, antihipertenzivni lekovi i statini. Neograničavajući primeri za drugi/dodatni terapeutski agens uključuju metformin, pioglitazon, DPP4i, GLP1-analoge, sulfonilureu, insulin, analoge leptina i lorkaserin (npr. BELVIQ<®>).
Predmetno otkriće obezbeđuje upotrebu antitela, npr. anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifičnog antitela, u proizvodnji ili pripremi leka. U određenim aspektima otkrića, lek je namenjen za lečenje metaboličkog poremećaja, kao što je obelodanjeno u prethodnom tekstu. U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće obezbeđuje upotrebu antitela u proizvodnji leka za lečenje gojaznosti. U određenim aspektima otkrića, predmetno otkriće obezbeđuje upotrebu antitela u proizvodnji leka za lečenje dijabetesa tip 2. U određenim otelotvorenjima, postupak se dodatno sastoji od primene na ispitaniku delotvorne količine najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, npr. kao što je opisano ovde. U određenim aspektima otkrića, lek je namenjen za aktiviranje KLB/FGFR1c koreceptorskog kompleksa. U određenim aspektima otkrića, lek se može koristiti u metodi aktiviranja KLB/FGFR1c koreceptorskog kompleksa kod pojedinca koji se sastoji od primene na pojedincu količine leka koja je delotvorna za aktivaciju KLB/FGFR1c receptorskog kompleksa.
U određenim otelotvorenjima, antitelo za upotrebu u opisanim terapeutskim metodama može biti prisutno u farmaceutskoj kompoziciji. U određenim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija može da uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. U određenim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija može da uključuje jedno ili više antitela iz predmetnog otkrića.
Dodatno ili alternativno, farmaceutska kompozicija može da uključuje drugi terapeutski agens. Kada se jedno ili više otkrivenih antitela primenjuje sa drugim terapeutskim agensom, jedno ili više antitela i drugi terapeutski agens se mogu primeniti bilo kojim redosledom ili istovremeno. Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agensa obuhvaćeni u istoj ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela iz predmetnog otkrića može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili agenasa, istovremeno i/ili nakon njegove primene. U jednom aspektu otkrića, primena antitela iz predmetnog otkrića i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge.
Antitelo iz predmetnog otkrića (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje se može sprovesti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Antitela iz predmetnog otkrića biće formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto na koje se agens isporučuje, metod primene, raspored primene, i drugi faktori poznati lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agensa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Delotvorna količina takvih drugih agensa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su prethodno razmatrani. Oni se po pravilu koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela iz predmetnog otkrića (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agensa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitelo, kao i odluke nadležnog lekara. U određenim aspektima otkrića, antitelo iz predmetnog otkrića može da se primenjuje po potrebi. U određenim aspektima otkrića, antitelo može da se primenjuje na pacijentu jednom ili tokom serije tretmana. Na primer, bez bilo kakvog ograničavanja, antitelo i/ili farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo, kao što je ovde obelodanjeno, može se primeniti na ispitaniku dva puta dnevno, jednom dnevno, jednom u dva dana, jednom u tri dana, jednom u četiri dana, jednom u pet dana, jednom u šest dana, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom mesečno, jednom u dva meseca, jednom u tri meseca, jednom u šest meseci ili jednom godišnje.
U određenim aspektima otkrića, u zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr.0,1 mg/kg - 10 mg/kg) antitela može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, putem jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. U određenim aspektima otkrića, dnevna doza može biti veća od oko 100 mg/kg. U određenim aspektima otkrića, doza može da se podesi da bi se postigla koncentracija antitela u plazmi od 1-1000 µg/ml, a u nekim metodama od 25-300 µg/ml.
Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje bi po pravilu trebalo biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. U određenim aspektima otkrića, na pacijentu se može primeniti jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija). Alternativno, antitelo može da se primeni kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebna ređa primena. Doziranje i učestalost mogu da variraju u zavisnosti od poluživota antitela kod pacijenta. U određenim aspektima otkrića, takve doze mogu da se primenjuju povremeno, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent dobije od oko dve do oko dvadeset, ili, npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza.
U određenim aspektima otkrića, postupak može dalje da uključuje praćenje ispitanika i određivanje delotvornosti tretmana. Na primer, napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
IV. Farmaceutske formulacije
Ovaj predmetni pronalazak dalje pruža farmaceutske formulacije koje sadrže jedno ili više antitela, kao što je ovde obelodanjeno, sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. U određenim aspektima otkrića, farmaceutske kompozicije mogu da uključuju kombinaciju više (npr. dva ili više) antitela i/ili njihovih delova koji se vezuju za antigen iz ovog predmetnog pronalaska. U određenim aspektima otkrića, farmaceutska kompozicija iz predmetnog otkrića može da uključuje jedno ili više anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifičnih antitela.
U određenim otelotvorenjima, obelodanjene farmaceutske formulacije mogu da se pripremaju mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Na primer, bez bilo kakvog ograničavanja, formulacije liofilizovanih antitela su opisane u US patentu br. 6,267,958. U određenim aspektima otkrića, vodene formulacije antitela mogu da obuhvataju one opisane u US patentu br. 6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer. U određenim aspektima otkrića, antitelo može biti čistoće veće od oko 80%, veće od oko 90%, veće od oko 91%, veće od oko 92%, veće od oko 93%, veće od oko 94%, veće od oko 95%, veće od oko 96%, veće od oko 97%, veće od oko 98%, veće od oko 99%, veće od oko 99,1%, veće od oko 99,2%, veće od oko 99,3%, veće od oko 99,4%, veće od oko 99,5%, veće od oko 99,6%, veće od oko 99,7%, veće od oko 99,8% ili veće od oko 99,9%.
Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. komplekse Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri za farmaceutski prihvatljive nosače iz ovog dokumenta dalje uključuju sredstva za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedini primeri za sHASEGP i postupke primene, uključujući rHuPH20, opisani su u US patentnoj publikaciji br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Nosač može biti pogodan za intravensku, intramuskularnu, supkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr. putem injekcije ili infuzije). U zavisnosti od načina primene, aktivno jedinjenje, tj. anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, može biti obloženo materijalom da bi se jedinjenje zaštitilo od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu deaktivirati jedinjenje.
Farmaceutske kompozicije iz predmetnog otkrića takođe mogu da se primene u kombinovanoj terapiji, tj. u kombinaciji sa drugim agensima. U određenim aspektima otkrića, ovde obelodanjene farmaceutske kompozicije mogu takođe po potrebi da sadrže više od jednog aktivnog sastojka za određenu indikaciju koja se leči, na primer, one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. U određenim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija može da sadrži drugi aktivni sastojak za lečenje iste bolesti koja se leči prvim terapeutikom. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su delotvorne za nameravane svrhe. Na primer, bez bilo kakvog ograničavanja, formulacija iz predmetnog otkrića takođe može da sadrži više od jednog aktivnog sastojka po potrebi za određenu indikaciju koja se leči, poželjno sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno da se dodatno obezbedi drugi terapeutski lek koji je koristan za lečenje iste bolesti. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su delotvorne za nameravane svrhe.
Kompozicija iz ovog predmetnog otkrića može se primeniti različitim metodama poznatim u struci. Način i/ili režim primene variraju u zavisnosti od željenih rezultata. Aktivna jedinjenja mogu da se pripreme sa nosačima koji štite jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme za oslobađanje. Moguće je koristiti biorazgradive, biokompatibilne polimere, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Mnoge metode za pripremu ovakvih formulacija su opisane npr. u Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. U određenim aspektima otkrića, farmaceutske kompozicije su proizvedene pod uslovima dobre proizvođačke prakse (GMP) američke Uprave za hranu i lekove.
Takođe je moguće pripremiti preparate sa produženim oslobađanjem koji sadrže otkriveno antitelo. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr., filmovi ili mikrokapsule. U određenim aspektima otkrića, aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980).
Da bi se antitelo iz predmetnog otkrića primenilo određenim načinom primene, može biti neophodno da se jedinjenje obloži ili da se jedinjenje primeni istovremeno sa supstancom koja sprečava njegovu inaktivaciju. Na primer, jedinjenje se može dati ispitaniku u odgovarajućem nosaču, na primer, lipozomima, ili razblaživaču. Farmaceutski prihvatljivi razblaživači uključuju slane i vodene puferske rastvore. Lipozomi uključuju CGF emulzije voda-u-ulju-u-vodi kao i konvencionalne lipozome (Strejan et al.. (1984) J. Neuroimmunol.
7:27).
Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporalnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u struci. Osim ako se ne pokaže da je neki od konvencionalnih medijuma ili agensa nekompatibilan sa aktivnim sastojkom, njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama iz predmetnog otkrića se razmatra. Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu ugraditi u kompozicije.
Terapeutske kompozicije obično moraju biti sterilne, suštinski izotonične i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može da se formuliše kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželjno je u kompoziciju uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što je manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija kompozicija za injekcije može da se postigne uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearata i želatina.
Sterilni rastvori za injekcije mogu da se pripreme ugradnjom jednog ili više otkrivenih antitela u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim sastojkom ili kombinacijom sastojaka nabrojanih u prethodnom tekstu, po potrebi, nakon čega sledi sterilizaciona mikrofiltracija, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Obično se disperzije pripremaju ugrađivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni medijum za disperziju i potrebne druge sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnog praha za pripremu sterilnih rastvora za injekcije, poželjni postupak pripreme je vakuum sušenje (liofilizacija), kojim se dobija prah aktivnog sastojka, kao i ostalih poželjnih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog rastvora.
Terapeutske kompozicije se takođe mogu primenjivati pomoću medicinskih uređaja koji su poznati u struci. Na primer, terapeutska kompozicija iz predmetnog otkrića se može primeniti sa uređajem za hipodermičku injekciju bez igle, kao što su uređaji otkriveni, npr. u U.S. patentima br. 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824 ili 4,596,556. Primeri implantata i modula korisnih u ovom predmetnom otkriću uključuju: U.S. patent br. 4,487,603, koji otkriva implantabilnu mikroinfuzionu pumpu za izdavanje lekova kontrolisanom brzinom; U.S. patent br. 4,486,194, koji otkriva terapeutski uređaj za davanje lekova kroz kožu; U.S. patent br.4,447,233, koji otkriva pumpu za infuziju lekova za primenu leka preciznom brzinom infuzije; U.S. patent br.4,447,224, koji otkriva implantabilni infuzioni aparat sa promenljivim protokom za kontinuiranu isporuku leka; U.S. patent br.4,439,196, koji otkriva osmotski sistem za primenu leka koji ima višekomorne odeljke; i U.S. patent br.
4,475,196, koji otkriva osmotski sistem za primenu leka. Mnogi drugi takvi implantati, sistemi za primenu i moduli su poznati.
Za terapeutske kompozicije, formulacije iz predmetnog otkrića uključuju one podesne za oralnu, nazalnu, topikalnu (uključujući bukalnu i sublingvalnu), rektalnu, vaginalnu i/ili parenteralnu primenu. Formulacije mogu pogodno biti predstavljene u jediničnom doznom obliku, i mogu se dobiti bilo kojom postupkom dobro poznatim u farmaciji. Količina antitela koja se može kombinovati sa nosećom supstancom radi proizvodnje pojedinačnog doznog oblika variraće u zavisnosti od ispitanika koji se leči, kao i konkretnog načina primene. Količina antitela koja se može kombinovati sa nosećom supstancom radi proizvodnje pojedinačnog doznog oblika generalno će biti ona količina kompozicije koja daje terapeutski efekat. Obično, u opsegu od sto procenata, ta količina će varirati od oko 0,01 procenta do oko devedeset devet procenata aktivnog sastojka, od oko 0,1 procenta do oko 70 procenata ili od oko 1 procenta do oko 30 procenata.
Oblici doziranja za topikalnu ili transdermalnu primenu kompozicija iz predmetnog otkrića uključuju prahove, sprejeve, masti, paste, kreme, losione, gelove, rastvore, flastere i inhalatore. Aktivno jedinjenje se može mešati pod sterilnim uslovima sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, i sa bilo kojim konzervansima, puferima ili propelantima koji mogu biti potrebni.
Izrazi „parenteralna primena“ i „parenteralno primenjen“ označavaju načine primene koji nisu enteralna i topikalna primena, obično injekcijom, i uključuju, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, supkutanu, supkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
Ove farmaceutske kompozicije mogu takođe da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, kvašljivci, emulgatori i disperzivna sredstva. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se osigurati i postupcima sterilizacije, gore, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorbutanola, fenola, sorbinske kiseline, i slično. Takođe, može biti poželjno da se u kompozicije uključe izotonični agensi, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slično. Pored toga, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika se može postići uključivanjem agensa koja odlažu apsorpciju, kao što je aluminijum monostearat i želatin.
U određenim aspektima otkrića, kada se antitela iz predmetnog otkrića primenjuju kao farmaceutski proizvodi, na ljudima i životinjama, ona se mogu davati sama ili kao farmaceutska kompozicija koja sadrži, na primer, od oko 0,01% do oko 99,5% (ili oko 0,1 do oko 90%) antitela, ovde opisanog, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
V. Proizvodi
Predmetni pronalazak se dalje odnosi na proizvode koji sadrže supstance korisne za lečenje, sprečavanje i/ili dijagnozu poremećaja opisanih u prethodnom tekstu.
U određenim aspektima otkrića, proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Neograničavajući primeri odgovarajućih pakovanja uključuju boce, bočice, špriceve, kese za i.v. rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje može da sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom delotvoran u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju).
U određenim aspektima otkrića, najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo iz predmetnog pronalaska koje je sada obelodanjeno. Etiketa ili uputstvo za upotrebu mogu da ukazuju na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru.
U određenim aspektima otkrića, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo iz predmetnog otkrića; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. U određenim aspektima otkrića, proizvod može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje specifičnog stanja.
Alternativno ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži dodatno pakovanje, npr. drugo ili treće pakovanje, koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je, bez ograničavanja, bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor puferovan fosfatom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog aspekta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Sledeći primeri su samo ilustrativni za obelodanjeni predmetni pronalazak, i ne treba ih ni na koji način smatrati ograničenjima.
Primeri
Primer 1: Karakterizacija anti-FGFR1 agonističkih antitela
Tri anti-FGFR1 antitela izvedena iz faga, YW182.2 (ovde se takođe naziva „R1MAb1“), YW182.3 (ovde se takođe naziva „R1MAb2“) i YW182.5 (ovde se takođe naziva „R1MAb3“) prethodno su opisana (WO 2012/158704,)). Svako od tri antitela deluje kao snažan FGFR1-selektivni agonist i ispoljava svojstva senzibilizacije na insulin kod miševa.
Da bi se dalje razumela ova agonistička aktivnost, testirana je sposobnost Fab fragmenata ovih antitela da agonizuju FGFR1c. HEK293 ćelije su uzgajane u Dulbekovom modifikovanom Iglovom medijumu (DMEM) 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i prolazno transficirane ekspresionim vektorima koji kodiraju Renilla luciferazu (pRL-SV40, Promega), FGFR1c, aktivator transkripcije (pFA2-Elk1 ili pFA2-CREB, Stratagene), i reporter luciferaze svica vođen GAL4 vezujućim mestima (pFR-1uc, Stratagene), koristeći transfekcioni reagens FUGENE<®>HD (Roche). Sledećeg dana, transficirane ćelije su uzgajane još 6-8 sati u medijumu bez seruma i YW182.5 IgG i svaki od YW182.2, YW182.3 i YW182.5 je testiran u rastućim koncentracijama. Aktivnost ćelijske luciferaze je određena korišćenjem test sistema luciferaze DUAL-GLO<®>(Promega) i čitača multioznaka ENVISION<®>(PerkinElmer). Aktivnost luciferaze svica je normalizovana na koeksprimiranu aktivnost Renila luciferaze. Iznenađujuće, YW182.2 Fab, ali ne YW182.3 Fab ili YW182.5 Fab, pokazuje agonističku aktivnost (slika 1A).
Sl. 1B prikazuje eksperimente kompetitivnog vezivanja koji su izvedeni da bi se istražila osnova za razliku aktivacije FGFR1 pomoću YW182.2 Fab i YW182.3 Fab. YW182.2 je dalje okarakterisan u poređenju sa YW182.3, koji ima visok afinitet, i u poređenju sa anti-FGFR1 antitelom nižeg afiniteta, YW182.5. YW182.2 i YW182.3 su se takmičili sa YW182.5 u vezivanju za ekstracelularni domen (ECD) FGFR1, što ukazuje da sva 3 antitela prepoznaju preklapajući region FGFR1. Međutim, kao što je prikazano na sl. 1B, relativni afinitet YW182.5 bio je značajno slabiji (IC50> 30 puta) od onog kod YW182.2 i YW182.3.
Sl. 2A prikazuje afinitete vezivanja anti-FGFR1 antitela, YW182.2 i YW182.3, za FGFR1b i FGFR1c. Afinitet anti-FGFR1 antitela je određen da bi se procenilo da li razlike afiniteta anti-FGFR1 antitela objašnjavaju razlike uočene u agonističkoj aktivnosti. Afiniteti vezivanja Fab za FGFR1b ili FGFR1c pomoću instrumenta BIACORE<®>T100 izvedeni su kao što je opisano u Liang et al. J. Mol. Biol.366(3): 815-29 (2007), sa sledećim izmenama. Mišje antihumano Fc antitelo je prvo naneto na čip BIAcore sa karboksimetilovanim dekstranom CM5 putem direktnog vezivanja za slobodne amino grupe, prema postupku koji je opisao proizvođač. YW182.2 ili YW182.3 je zatim hvatano na biosenzorskim čipovima CM5 da se dobije oko 200 jedinica odgovora (RU). Merenja vezivanja su izvršena koristeći radni pufer sastavljen od 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% surfaktanta P20 (HBS-P pufer). Dvostruke serije razblaženja FGFR1c ECD-His proteina injektovane su u opsegu od 1,5-50 nM u HBS-P puferu pri protoku od 30 μl/minutu na 25°C. Brzine asocijacije (Kon, po mol/s) i brzine disocijacije (Koff, po s) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-jedan Lengmirovog modela vezivanja (Biacore Evaluation Software verzija 3.2). Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd, po molu) izračunata je kao odnos Koff/Kon. Kao što je prikazano na sl. 2A, primećeno je da su afiniteti YW182.2 i YW182.3 veoma slični, što ukazuje da afinitet ne može da objasni razliku između agonističkih aktivnosti dva antitela.
Sl. 2B prikazuje sposobnost YW182.5 (R1MAb3) da specifično interaguje sa FGFR1. Kao YW182.2 i YW182.3, YW182.5 je pokazao specifično vezivanje za FGFR1 pomoću ELISA (Sl.2B).
Sl. 2C prikazuje agonističku aktivnost YW182.5 za različite FGFR u ćelijama L6 koristeći GAL-ELK1 test (transkripcioni faktor 1 nalik na ETS) zasnovan na luciferazi. Za test luciferaze, HEK293T ili L6 ćelije pacova su prolazno transficirane ekspresionim vektorima koji kodiraju odgovarajuće receptore pod CMV-promoterom, Renila luciferazom (pRL-SV40, Promega), fuzijom aktivatora transkripcije GAL-ELK1 (pFA2-ELK1, Agilent) i reporterom luciferaze svica vođenim GAL4 vezujućim mestima (pFR-luc, Agilent), koristeći FuGENE HD transfekcioni reagens (Promega). Sledećeg dana, transficirane ćelije su uzgajane još 6-8 sati u medijumu na bazi DMEM bez seruma koji sadrži odgovarajuće proteinske ligande u različitim koncentracijama. Aktivnost ćelijske luciferaze je određena pomoću test sistema luciferaze Dual-Glo (Promega) i čitača multioznaka EnVision(PerkinElmer). Aktivnost luciferaze svica je normalizovana na koeksprimiranu aktivnost Renila luciferaze i prikazana kao srednja vrednost ±SEM. Slično kao YW182.2 i YW182.3, YW182.5 je delovao kao specifični agonist za FGFR1 u F6 ćelijama (Sl.2C).
Agonistička aktivnost YW182.5 je dalje testirana u ćelijama HEK293 korišćenjem testa luciferaze zasnovanog na GAF-EFK1 koji je opisan u prethodnom tekstu. Kao što je prikazano na slici 2D, YW182.5 je takođe delovao kao specifični agonist za FGFR1c u testu luciferaze zasnovanom na GAF-ELK1 u HEK293 ćelijama.
Slika 2E pokazuje efekat YW182.5 na nivoe glukoze u krvi na modelu miša sa dijabetesom. Da bi se odredili nivoi glukoze u krvi, miševi su kupljeni od Jackson Laboratory i održavani u objektu za životinje bez patogena na 21°C u standardnom ciklusu od 12 sati svetlosti/12 sati tame sa pristupom hrani (LABDIET<®>5010) i vodi ad libitum. db/db miševi u pozadini C57BLKS/J bili su ženke, a svi ostali miševi su bili mužjaci. Za ishranu sa visokim sadržajem masti korišćena je ishrana sa visokim sadržajem masti i ugljenih hidrata (Harlan Teklad TD.03584, 58,4% kalorija iz masti). Nivoi neorganskog fosfata i kalcijuma u serumu su određeni pomoću hemijskog analizatora COBAS INTEGRA<®>400 (Roche). Nivoi FGF23 u serumu su određeni pomoću ELISA (Immutopics). Nivo glukoze u krvi određivan je pomoću merača glukoze CONTOUR<®>(Bayer). Za analizu lipida u jetri korišćen je komplet za kvantifikaciju triglicerida (MBL International). Kolorimetrijskim testovima određivani su ukupni holesterol u serumu, trigliceridi, ß-hidroksibutirat (Thermo DMA) i slobodna masna kiselina (Roche). ELISA je korišćena za određivanje nivoa insulina u serumu (Crystal Chem), serumskog FGF23 (Immutopics), HMV adiponektina u mišjem serumu (Alpco) i HMV adiponektina u serumu majmuna (R&D systems). Kortikosteron je meren radioimunološkim testom (Vanderbilt Hormone Assay & Analytical Services Core). Svi miševi korišćeni za injekciju bili su stari oko 2-4 meseca, osim miševa sa nedostatkom klb, koji su korišćeni u određenim eksperimentima sa 7-8 meseci. Na sličan način kao YW182.2 i YW182.3, YW182.5 je normalizovao nivo glukoze u krvi kada je ubrizgan dijabetičkim ob/ob miševima (slika 2E).
Primer 2: Mapiranje epitopa anti-FGFR1 antitela
FGFR1 ECD se sastoji od tri Ig-slična domena koji se nazivaju D1 do D3. Kao što je prikazano na slici 1C, dva peptida koja se ne preklapaju (P26: (SEQ ID NO: 143) i P28: (SEQ ID NO: 144) prisutna su unutar D2 domena FGFR1 i ranije je identifikovano da se vezuju za YW182.2 i YW182.3 (WO 2012/158704).
Da bi se identifikovalo koji ostaci u ovim peptidima su najodgovorniji za vezivanje antitela, proteini FGFR1 pune dužine sa različitim supstitucijama alanina unutar identifikovanih regiona epitopa su eksprimirani u HEK293 ćelijama i testirani na vezivanje antitela pomoću vestern blot analize. Kao što je prikazano na slici 1D, supstitucija alanina u K175, K177, Y205, R208, eliminisala je vezivanje YW182.2 i YW182.5, bez uticaja na ekspresiju kao što je ispitano pomoću anti-FGFR1 na D1 domen (anti-D1). Vezivanje YW182.3 je ukinuto putem R208A, ali ne i supstitucijama K175, K177 ili Y205.
Sposobnost antitela da aktiviraju mutante FGFR1 sa supstitucijama alanina in vivo je testirana korišćenjem GAL-ELK1 testa opisanog iznad. Pronađeno je da je aktiviranje dobro korelisano sa svojstvima vezivanja ovih mutanata za svako anti-FGFR1 antitelo (Sl.1E). Ovi rezultati sugerišu da je sličan skup aminokiselina unutar D2 domena potreban za vezivanje YW182.2 i YW182.5, mada sa različitim afinitetom, dok je poseban skup aminokiselina u istom regionu važan za vezivanje YW182.3.
Kristalne strukture kompleksa FGFR ECD/FGF 2:2 su prethodno opisane (Plotnikov et al. Cell 98(5): 641-50 (1999)). U homodimernim strukturama FGFR1c ECD/FGF22:2, jedan D2 domen vrši interakciju sa drugim D2 domenom, pri čemu se svaki FGF2 vezuje za oba D2 domena sa dve strane da bi stabilizovao D2 dimer (sl. 1F). U ovim strukturama, supstitucije alanina važne za vezivanje YW182.2 i YW182.5 (K175, K177, Y205 i R208) nalaze se unutar D2 dimera. Zbog toga što YW182.2 Fab deluje kao agonist, ovo sugeriše da YW182.2 Fab može da se veže za dva D2 domena istovremeno sa strane da bi stabilizovao D2 dimer, u suštini delujući kao molekularni mimetik FGF liganda. Na osnovu analize supstitucije alanina, YW182.5 Fab se može vezati na sličan način, osim što je afinitet mnogo niži od YW182.2 Fab.
Primer 3: Izolacija i karakterizacija anti-KLB antitela
Balb/c miševi su imunizovani HEK293 ćelijama koje stabilno eksprimiraju hFGFR1c i hKLB protein. Slezine su sakupljene nakon 12 nedelja i stvoreni su hibridomi. Hibridomi koji proizvode anti-hKLB antitela su identifikovani FACS analizom pomoću ćelija HEK293 korišćenih za imunizaciju. Ukratko, 293 ćelije koje eksprimiraju hKLB, hFGFR1 ili oba, obojene su razblaženim supernatantom hibridoma, a PE-konjugovano kozje anti-mišje IgG antitelo (Jackson Labs) je FACS pufer (0,5% BSA u PBS). Isti FACS pufer je korišćen za pranje obojenih ćelija. Obojene ćelije su analizirane pomoću FACScan (Becton Dickinson) i softvera za analizu FlowJo FACS (Tree Star). kDNK koja kodira teški i laki lanac IgG je klonirana u ekspresione vektore. Svi molekuli rekombinantnih monoklonskih antitela proizvedeni su u prolazno transficiranim ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) i prečišćeni pomoću konvencionalne hromatografije na koloni.
Identifikovano je skoro 20 različitih hibridoma koji proizvode anti-KLB antitela. CDR sekvence lakog i teškog lanca za 16 ovih anti-KLB antitela su prikazane u Tabelama 2 i 3. Sekvence lakog lanca 16 ovih anti-KLB antitela zajedno sa 8C5 su prikazane na sl.3A (11F1, 6D12, 11D4, 8E1, 46C3, 8H7, 21H3, 25F7, 14E6, 14C6, 24A1, 5F8, 6C1, 12A1, 12B8, 14C10 i 8C5; SEQ ID NO: 111-127, tim redosledom).
Sekvence teškog lanca 16 ovih anti-KLB antitela zajedno sa 8C5 su prikazane na sl.3B (11F1, 6D12, 11D4, 8E1, 46C3, 8H7, 21H3, 25F7, 14E6, 14C6, 24A1, 5F8, 6C1, 12A1, 12B8, 14C10 i 8C5; SEQ ID NO: 94-110, tim redosledom).
Tabela 2. CDR H sekvence za mišja anti-KLB monoklonska antitela.
Tabela 3. CDR L sekvence za mišja anti-KLB monoklonska antitela.
Većina anti-KLB antitela dobijenih iz hibridoma zajedno sa jednim antitelom dobijenim od faga (oznaka Ph#5, koje je dobijeno spiranjem faga koristeći rekombinantni hKLB-ECD-HIS protein (R&D Systems)) rangirana je na osnovu uočene medijane pomeranja na FACS grafikonu pri 0,8 μg/ml merenjem vezivanja antitela za 293 ćelije koje eksprimiraju hKLB (Slika 4).
Pored toga, neka antitela su rangirana putem ELISA. Za ove eksperimente, korišćena su anti-KFB antitela koja su bila himerni rekombinantni IgG sa mišjim varijabilnim regionima i konstantnim regionima hIgG1 za merenje vezivanja za hKLB-ECD-HIS protein. Relativno vezivanje testiranih antitela je bilo slično osim za 14E6, za koji se činilo da se bolje vezuje pod uslovima ELISA testa nego u FACS analizi (Slika 5).
Primer 4: Vezivanje anti-KLB antitela za KLB
ELISA je korišćena za testiranje konkurencije između različitih anti-KFB antitela. U nekim eksperimentima, IgG antitela prečišćena iz supernatanta hibridoma koja odgovaraju 6D12, 8C5 i 11F1 su biotinilovana pomoću EZ-veze NHS-PEO kompleta za biotinilaciju čvrste faze (Pierce). Vezivanje za KLB-ECD-HIS protein je testirano pomoću HRP-konjugovanog streptavidina u prisustvu različitih koncentracija anti-KFB izvedenih iz hibridoma. U nekim eksperimentima, vezivanje rekombinantnog humanog IgG za KLB-ECD-HIS protein je testirano pomoću HRP-konjugovanog anti-humanog IgG (Jackson ImmunoResearch Inc.) u prisustvu različitih koncentracija anti-KLB izvedenih iz hibridoma. Primećeno je da se nijedan od 11F1, 11D4, 8E1 i 46C3 ne takmiči sa 6D12 u vezivanju (ostali nisu testirani u odnosu na 6D12). Anti-KLB antitela 14E6 i 12A11 se takmiče u vezivanju sa 8C5, ali 11D4 i 14C10 ne (ostali nisu testirani u odnosu na 8C5), a 11D4 se takmiči u vezivanju sa 11F1, ali 6D12, 8E1 i 46C3 (ostali nisu testirani u odnosu na 11F1).
Primer 5: Unakrsna reaktivnost anti-KLB antitela između vrsta
Unakrsna reaktivnost obelodanjenih anti-KLB antitela između vrsta je analizirana FACS analizom pomoću KFB cDNK miša, pacova, zeca, majmuna cinomolgus i rezus majmuna kloniranih u pRK vektore ekspresije sisara koji su prolazno transficirani u HEK293T ćelije. Eksprimirane polipeptidne sekvence ekstracelularnog domena KLB su sledeće:
Miš:
Pacov (+N-ter FLAG):
Majmun cinomolgus (+N-ter FLAG):
Kao što je prikazano u Tabeli 4, otkriveno je da se većina antitela, npr.6D12, 11D4 i 8E1, vezuju za KLB zeca, majmuna cinomolgus i rezus majmuna, i otkriveno je da se oko polovine anti-KLB antitela, npr.8C5, 14E6 i 14C6, vezuje za KLB miša i pacova.
Tabela 4. Vezivanje mišjih anti-KLB antitela za KLB različitih vrsta.
Primer 6: Mapiranje epitopa anti-KLB antitela
Kako bi se utvrdilo da anti-KLB antitela ne vezuju ekstracelularni domen (ECD) humanog alfa-Klotho (hKLA), korišćen je konstrukt sledeće sekvence:
Predviđena ekspresija polipeptidne sekvence (sa C-terminalnim (intracelularnim) FLAG):
KLA i KLB imaju dva domena slična glikozidazi, jedan N-terminalni i jedan C-terminalni. Kako bi se identifikovao region KLB prepoznat od strane anti-KLB antitela, hKLB, hKLA i himerni konstrukt koji sadrži N-terminalni domen hKLA sličan glikozidazi i C-terminalni domen hKLB sličan glikozidazi su klonirani u pCMV-Tag4A vektor ekspresije sisara (Agilent). N-terminalni i C-terminalni domeni hKLA i hKLB odgovaraju sekvencama iz SEQ ID NO: 151, odnosno SEQ ID NO: 145, tim redosledom, kao što je prikazano u Tabeli 5. N-terminalni domeni hKLA i hKLB su podeljeni u 5 segmenata, a C-terminalni domeni su podeljeni u 5 segmenata na osnovu homologije sekvence između dva proteina.
Tabela 5. Podsekvenca KLA i KLB.
Urađena je FACS analiza sa antitelima iz predmetnog otkrića, i primećeno je da oko polovine antitela prepoznaje N-terminalni domen hKLB sličan glikozidazi, dok druga prepoznaju domen sličan C-terminalnoj glikozidazi (Tabela 6). Kao što je prikazano u Tabeli 6, dva antitela koja su prepoznala N-terminalni domen hKLB vezana su za deo domena koji sadrži segment 1, dok su druga za vezivanje zahtevala samo segmente 2-5.
Tabela 6. Mapiranje vezivanja mišjih anti-KLB antitela.
Primer 7: Identifikacija bispecifičnih antitela koja specifično aktiviraju kompleks FGFR1c/KLB
Na osnovu sposobnosti R1MAb da aktiviraju FGFR1 kao Fab, molekul koji uključuje vezivanje R1MAb nižeg afiniteta za anti-KLB antitelo višeg afiniteta proizveden je da generiše anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo (sl.6A; WO2012/158704).
Bez vezivanja za određenu teoriju, predlaže se da aktiviranje posredstvom FGF21 deluje putem regrutovanja FGF21 u kompleks FGFR1c/KLB preko C-terminalnog KLB-vezujućeg repa, dok se determinante za FGFR-specifičnost nalaze u N-terminalnom regionu, koji se verovatno vezuje za FGFR putem interakcije niskog afiniteta (videti sl.6B) (Yie et al. FEBS Lett.583(1): 19-24 (2009)). Stoga, vezivanje R1MAb1 sa smanjenim afinitetom za anti-KLB antitelo visokog afiniteta kao bispecifično antitelo moglo bi da dovede do KLB-zavisnog FGFR1 agonista. Bez vezivanja za određenu teoriju, anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo koje uključuje FGFR1 krak niskog afiniteta, može da ublaži rizik da se anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo čvrsto vezuje za FGFR1 u odsustvu KLB i spreči vezivanje i/ili aktiviranje FGFR1 drugim FGF ligandima (npr. FGF1, FGF2, FGF8 i FGF23). Pored toga, FGFR1 krak sa niskim afinitetom može da dozvoli prisustvo viših nivoa anti-FGFR1 nečistoća kao što su, bez ograničenja, anti-FGFR1 polu-dugme antitela, nekovalentni anti-FGFR1 dimeri, kovalentni anti-FGFR1 dimeri i vrste sa visokom molekulskom masom, a da ne dovede do klinički značajnih neželjenih dejstava.
bFKB1, kako se ovde koristi, i uopšteno, odnosi se na bilo koje od nekoliko anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifičnih antitela koja su ovde obelodanjena. Detalji vezani za specifična anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifična antitela obelodanjena na slikama su opisani u nastavku. HEK293 ćelije su kotransficirane mešavinom četiri ekspresiona vektora koji kodiraju teške i lake lance anti-FGFR1 (YW182.2 (R1MAb1) i YW182.3 (R1MAb2)) i anti-KLB antitela opisana iznad. Teški lanac anti-FGFR1 i anti-KLB označeni su Flag peptidom i okt-histidinom tako da se heterodimerni IgG može prečistiti sekvencijalnim afinitetnim prečišćavanjem iz kondicioniranog medijuma. Delimično prečišćeni heterodimerni IgG su zatim analizirani u testu luciferaze zasnovanom na GAL-ELK1 da bi se identifikovali agonisti zavisni od KLB. Da bi se pogrešno uparivanje teških i lakih lanaca smanjilo na minimum, anti-FGFR1 je eksprimiran sa humanim Fab konstantnim regionom, a anti-KLB je eksprimiran sa mišjim Fab konstantnim regionom. IgG označeni kao bispecifični su prvobitno testirani u sirovom obliku pomoću 28 kombinacija 3 anti-R1MAb i 18 anti-KLB Ab (Tabela 7).
Sl. 7A prikazuje indukcione podatke za određene bispecifične kombinacije YW182.2 (R1MAb1), YW182.3 (R1MAb2) i YW182.5 (R1MAb3) sa 18C5, 12A11 i 14E6 u testu GAL-ELK1 luciferaze. U većini slučajeva, primećeno je da bispecifična antitela značajno bolje aktiviraju signalizaciju u ćelijama koje su koeksprimirale FGFR1c i KLB u odnosu na ćelije koje su eksprimirale samo FGFR1c, ali ne i KLB.
Na osnovu aktivnosti ovih antitela u ovim početnim eksperimentima, 8 reprezentativnih anti-KLB Ab (Ph#5, 8C5, 12A11, 14C10, 6D12, 11D4, 6C1 i, kao negativna kontrola, 14E6) korišćeno je za proizvodnju neoznačenih bispecifičnih antitela sa YW182.5 (pomoću prethodno opisane tehnologije dugme u rupici radi dalje karakterizacije (iznad, i, npr. Atwell, et al. FEBS Lett.583(1): 19-24 (2009)). Kao što je prikazano na sl. 8A, bispecifična antitela su proizvedena sa konstantnim regionom humanog IgG1 (divlji tip, sa efektorskom funkcijom (1)) i sa konstantnim regionom humanog IgG1 sa N297G mutacijom da bi se eliminisala efektorska funkcija (3) ili mišjim konstantnim regionom sa dvostrukim [D265G/N297G] mutacijama (DANG) za eliminisanje efektorske funkcije (2).
Tabela 7 u nastavku navodi razna bispecifična antitela koja su napravljena korišćenjem tehnologije dugme u rupici.
Tabela 7. Bispecifična anti-KLB/anti-FGFR1 antitela.
Korišćeni kontrolni izotip IgG je bio anti ambrozija (mišji IgG2a) ili anti-humani Her2 trastuzumab (humani IgG1). Fab fragmenti su eksprimirani u E. coli i prečišćeni konvencionalnom hromatografijom na koloni. Rekombinantni FGF21 je nabavljen od kompanije R&D systems (2539-FG/CF) osim testa za vezivanje radioaktivno obeleženog liganda, koji je sproveden sa jodiranim FGF21 kompanije Phoenix Pharmaceuticals i neobeleženim FGF21 proizvedenim u laboratoriji. Svaka od bispecifičnih kombinacija (osim negativne kontrole) pokazala je signalizaciju zavisnu od FGFR1c i KLB. Podaci za određene kombinacije su prikazani na sl. 7B. Pored toga, kombinacija anti-KLB krakova sa YW182.5 (R1MAb3) krakom pokazala je nižu pozadinsku signalizaciju u ćelijama koje su eksprimirale FGFR1c, ali ne i KLB.
Kao što je prikazano na slici 6C, aktivnost anti-KLB/anti-FGFR1c antitela (BsAb17) testirana je u HEK293 ćelijama sa nedostatkom FGFR1 koje eksprimiraju različite receptore.
HEK293T ćelije sa nedostatkom FGFR1 su generisane pomoću CRISPR-cas9 metode koristeći RNK vodiče. Uočeno je da anti-KLB/anti-FGFR1c antitelo indukuje aktivnost luciferaze u ćelijama koje koeksprimiraju rekombinantne hFGFR1c i hKLB (Sl.6C).
Slični rezultati su uočeni i za druga anti-KLB/anti-FGFR1c antitela. Kao što je prikazano na sl. 7C, prilikom testiranja luciferaze zasnovanog na GAL-ELK1 u HEK293 ćelijama koje eksprimiraju FGFR1c sa ili bez KLB, višestruke kombinacije bispecifičnih antitela anti-FGFR1 i anti-KLB krakova, npr. BsAb5, 6, 7, 8, 9, 10, indukovale su aktivnost luciferaze na način zavisan od doze u ćelijama koje eksprimiraju rekombinantne hFGFR1c i hKLB, ali ne u ćelijama koje ne eksprimiraju KLB. Rezultati ukazuju na to da ova bispecifična antitela deluju kao FGFR agonisti zavisni od KLB, baš kao i FGF21.
Takođe je testirana i sinergija anti-KLB/anti-FGFR1c antitela (BsAb17) sa FGF21. Kao što je prikazano na sl.9B, nije uočena sinergija između BsAb17 i FGF21 kada je koncentracija FGF21 postepeno povećavana i koncentracija BsAb17 je ostala nepromenjena.
Dodatno, kako se koncentracija anti-KLB/anti-FGFR1c antitela (BsAb17) postepeno povećavala, a koncentracija FGF21 je ostala nepromenjena, nije uočena sinergija između BsAb17 i FGF21 (Sl.9C).
Afinitet vezivanja u rastvoru (Kd) dva bispecifična antitela, BsAb10 i BsAb9, (zajedno sa hFGF21) za HEK293 ćelije koje eksprimiraju KLB ljudi, majmuna cinomolgus i miševa, humanog FGFR1c ili hFGFR1c i hKLB izmeren je testom vezivanja radioaktivno obeleženog liganda. Za test ćelijskog vezivanja radioaktivno obeleženog liganda, HEK293 ćelije koje stabilno koeksprimiraju KLB i/ili FGFR1c su stavljene na ploču sa 96 bunarčića pri gustini od 100.000 do 200.000 ćelija po 0,2 ml u puferu za vezivanje (DMEM sa 1% albumina goveđeg seruma (BSA), 50 mM HEPES, pH 7,2, 0,1% natrijum azida i 350 mM humanog IgG). U ćelije su dodate kompetitivne reakcione smeše od 50 µl koje sadrže fiksnu koncentraciju jodovanog FGF21 (Phoenix Pharmaceuticals) ili jodovanog BsAb, i serijski razblažene koncentracije neobeleženog FGF21 (Genentech) ili neobeleženog BsAb. Kompetitivne reakcije sa ćelijama su inkubirane 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon 2 sata inkubacije, kompetitivne reakcije su prenete na filter ploču Millipore Multiscreen i četiri puta isprane vezujućim puferom da bi se razdvojila slobodna od vezanih jodovanih FGF21 ili antitela. Filteri su prebrojani na gama brojaču Wallac Wizard 1470 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Podaci o vezivanju su ocenjeni pomoću softvera New Ligand (Genentech), koji koristi algoritam za postavljanje autora Munsona i Rodbarda (Munson i Rodbard Anal. Biochem. 107, 220-239 (1980)) za određivanje afiniteta vezivanja.
Kao što je prikazano u Tabeli 8, oba antitela su pokazala dobru reaktivnost na ćelije koje eksprimiraju samo KLB (u obrascu ukrštanja vrsta koji je u skladu sa ranijim uočenim rezultatima), ali oba su se mnogo slabije vezivala za ćelije koje eksprimiraju samo hFGFR1c i jače za ćelije koje eksprimiraju hKLB i hFGFR1c.
Tabela 8. Vezivanje bispecifičnih anti-KLB antitela za KLB/FGFR1 različitih vrsta.
Slika 9D prikazuje afinitet BsAb10 i BsAb9 prema HEK293 ćelijama koje stabilno eksprimiraju hKLB, hFGFR1c ili oba, u poređenju sa antitelom sa dva odgovarajuća anti-FGFR1-vezujuća kraka (YW182.5) pomoću FACS analize. Dobijeni su rezultati slični onima navedenim gore (Sl.9D).
Dalji eksperimenti su sprovedeni sa jednim bispecifičnim antitelom, BsAb10, koje ima YW182.5 kao anti-FGFR1 krak i 8C5 kao anti-KLB krak, i sa derivatima BsAb10 (BsAb11-20). Kako je prikazano na slici 6C, mišji receptori su eksprimirani u HEK293 ćelijama i pokazali su da u ovim ćelijama BsAb17 takođe indukuje aktivnost luciferaze, potvrđujući unakrsnu reaktivnost između vrsta ovog Ab.
BsAb10 je zatim testiran u L6 ćelijama mioblasta pacova kojima nedostaju endogeni KLB i FGFR, ali su transficirane da eksprimiraju hKLB i svaki od 5 izooblika hFGFR (Sl.9A). Utvrđeno je da BsAb10 indukuje aktivnost luciferaze samo u ćelijama koje eksprimiraju FGFR1c i KLB, što ukazuje da BsAb10 deluje kao specifični agonist za FGFR1c/KLB kompleks, ali ne i KLB u kompleksu sa drugim FGFR (Sl.9A). FGF21 i FGF19 su korišćeni kao kontrole za demonstraciju da FGF21 indukuje aktivnost luciferaze kada ćelije eksprimiraju kombinaciju KLB i bilo koje od FGFR1c, 2c ili 3c, a FGF19 indukuje aktivnost u ćelijama koje eksprimiraju kombinaciju KLB i FGFR4. Rekombinantni FGF21 je nabavljen od kompanije R&D systems (2539-FG/CF) osim testa za vezivanje radioaktivno obeleženog liganda, koji je sproveden sa jodiranim FGF21 kompanije Phoenix Pharmaceuticals i neobeleženim FGF21 koji su interno proizvedeni. cDNK koje kodiraju ekstracelularni domen (ECD) humanog FGFR1b, 1c, 2b, 2c, 3b, 3c i 4 su klonirane u ekspresioni vektor koji sadrži promoter citomegalovirusa (CMV) da bi se generisali humani FGFR-humani Fc himerni proteini ili Hisoznačeni FGFR proteini.
Međutim, kao što je gore opisano, matično anti-FGFR1c antitelo, R1MAb3 (YW182.5) BsAb10 iznenađujuće može da se veže za FGFR1b, izooblik FGFR1 koji ne reaguje sa KLB. Pored toga, R1MAb3 (YW182.5) može da aktivira FGFR1b u GAL-ELK1 testu u L6 ćelijama, što je suprotno od aktivnosti BsAb10 (videti sl. 2C i 2B).
Nadalje, kombinacija FGFR1b i KLB nije podržala aktiviranje putem BsAb10 (sl.9A). Bez vezivanja za određenu teoriju, ovi podaci sugerišu da je prisustvo prethodno formiranog kompleksa FGFR1/KLB preduslov za aktiviranje FGFR1 koje zavisi od KLB od strane BsAb10.
Primer 8: BsAb10 i njegovi derivati deluju kao molekularni mimetici FGF21 U daljim karakterizacijama BsAb10 i njegovih derivata (BsAb11-20) i FGF21 otkrivene su neke sličnosti i razlike. Da bi se odredio nivo fosforilacije MAPK signalnih intermedijera, ćelije su uzgajane u bazalnom medijumu preadipocita-2 koji sadrži FBS, L-glutamin i GA-1000. Kada su postali konfluentni, potkožni preadipociti (nabavljeni od kompanije Lonza) diferencirani su u medijumu za rast koji sadrži deksametazon, indometacin i 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX). Ćelije su diferencirane 14 dana za analizu genske ekspresije, a zatim dalje uzgajane dodatnih 48 sati sa naznačenim agonistima. Ćelije su diferencirane 10 dana za analizu MAPK signalizacije, uzgajane su u medijumu bez seruma 3 sata, a zatim dalje uzgajane dodatnih sat vremena sa naznačenim agonistima.
Kao što je prikazano na sl. 6D, BsAb10, BsAb17, BsAb20 i FGF21 su pokazali uporedivu aktivnost indukovanja fosforilacije MAPK signalnih intermedijera kao što su MEK i ERK u primarnim ljudskim adipocitima, koji predstavljaju relevantan tip ćelije za antidijabetičku aktivnost FGF21, kako je utvrđeno vestern blot analizom. Antitela korišćena za vestern blot analizu su nabavljena od kompanije Cell Signaling Technology: pFRS2a (T196) (br. 3864), pMEK1/2 (S217/221) (br. 9154), pERK1/2 (T202/204)(br. 4370), ERK1/2 (br.
4695), HSP90 (br. 4874), β-aktin (br. 5125), od kompanije Abcam: UCP1 (ab10983) ili od kompanije R&D Systems: KLB (AF2619).
Kao što je prikazano na sl. 8B, povećanje fosforilacije ERK, predstavljeno kao višestruka promena nivoa pERK, primećeno je u primarnim ljudskim adipocitima tretiranim sa BsAb10, BsAb17, BsAb20 ili FGF21.
Pored toga, profil afiniteta BsAb10 podseća na profil FGF21. Kada se testira putem FACS, BsAb10 je pokazao snažno vezivanje za ćelije koje eksprimiraju hKLB, bez obzira da li je FGFR1c koeksprimiran ili ne (sl.10A). Pomalo iznenađujuće, primećeno je veoma malo vezivanja BsAb10 kada ćelije eksprimiraju FGFR1c, ali ne i KLB, što ukazuje da je jednovalentni afinitet YW182.5 kraka izuzetno nizak (Sl.10A).
Kao što je prikazano na slici 10B, test radioaktivno obeleženog liganda je pokazao da je konstanta disocijacije (Kd) BsAb10 za ćelije koje eksprimiraju FGFR1c i KLB 2,3 nM, blizu 5,3 nM, što je uočeno za hFGF21 u sličnom formatu testa. Ove vrednosti su bile blizu uočenog EC50ovih molekula u GAL-ELK1 testu u HEK293 ćelijama (3,2 nM, odnosno 4,7 nM, za BsAb10 i FGF21. Kada ćelije eksprimiraju samo humani ili samo mišji KLB, Kdje 6,6 nM, odnosno 15,5 nM.
Zbog toga što je afinitet prema FGFR1 bio tako nizak, test radioaktivno obeleženog liganda nije mogao pouzdano da odredi KdBsAb10 za ćelije koje eksprimiraju samo FGFR1c, ali je procenjeno da je > 300 nM, kao što je prikazano na sl. 3B. Iz sličnog razloga, kinetika vezivanja BsAb10 za FGFR1 nije mogla biti pouzdano određena ni sa SPR.
Nadalje, interakcija između FGFR1c-ECD i KLB-ECD proteina je stabilizovana pomoću BsAb10 kao što je prethodno uočeno za FGF21, u skladu sa idejom da BsAb10 deluje kao FGFR1c-selektivni mimetik FGF-21 (sl.11) (Yie et al., Chemical Biology; Drug Design 79, 398-410 (2012)). Interakcija FGFR1/KLB/ BsAb10 je proučavana merenjima površinske plazmonske rezonance (SPR) na instrumentu PROTEON™ XPR36 (Bio-Rad Laboratories) na 25°C. FGFR1-HIS protein (20 µg/ml) na pH 4,5 je imobilisan pri površinskoj gustini (1000 RU) na aktiviranom GLC senzorskom čipu PROTEON™ pomoću standardnih postupaka spajanja amina kako je opisano od strane proizvođača. BsAb10 i/ili smeše BsAb10 i KLB-ECD 1:1 su ubrizgane pri 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM ili 200 nM u PBS-u koji sadrži 0,005% V/V TWEEN<®>-20, 0,3 M NaCl (pH 7,4) pri protoku od 80 µl/min i snimljeni su senzorgrami za faze asocijacije i disocijacije. Analiti su ubrizgavani 300 sekundi i ostavljeni da se odvoje tokom 600 sekundi. Podaci su referencirani sa međutačkama, obrađeni, i konstante disocijacije su izmerene pomoću softvera PROTEON™ Manager (verzija 3.0, Bio-Rad). Aktiviranje kompleksa FGFR1c/KLB od strane BsAb10 ukazuje na formiranje ternarnog kompleksa od strane FGFR1c-ECD, KLB-ECD i BsAb10.
Kao što je prikazano na Sl. 11, takođe je primećeno da BsAb10 formira ternarni kompleks sa rekombinantnim KLB-ECD i FGF21 ili FGF19. Interakcija BsAb10/KLB/FGF proučavana je putem merenja interferometrije bio-sloja (BLI) na instrumentu Octet RED (ForteBio) na 25°C. BsAb10 (20 µg/ml) sa pH 4,5 je imobilisan na aktiviranim biosenzorskim vrhovima reaktivnim na amin, kako je opisano od strane proizvođača. KLB-ECD (20 µg/ml) u PBS-u koji sadrži 0,005% V/V TWEEN<®>-20, 0,3 M NaCl (pH7,4) uhvaćen je na iste vrhove biosenzora i izmeren pomoću FGF21 (R&D Systems) na 0, 0,2, 0,8, ili 2 µM u istom puferu. Kvalitativni podaci su obrađeni softverom za prikupljanje podataka (ForteBio).
Sl. 12A prikazuje šemu eksperimenta vremenski razloženog prenosa fluorescentne rezonantne energije na ćelijskoj površini (TR-FRET) koji je sproveden. Za TR-FRET, COS7 ćelije su kotransficirane da eksprimiraju SNAP-označeni FGFR1 i neoznačeni KFB i zasejane na ploču sa 96 bunarčića sa belim dnom (Costar) sa 100.000 ćelija po bunarčiću. Transficirane ćelije su označene 24 sata nakon transfekcije sa 100 nM benzilgvanina konjugovanog sa donorom SNAP-Lumi4-Tb (Cisbio) i 1 µM benzil-gvanina konjugovanog sa akceptorom SNAPAlexa647 (NEB) tokom 1 h, na 37°C, 5% CO2. Nakon tri ispiranja, emisija Lumi4-Tb i TR-FRET signal su snimljeni na 620 nm i 665 nm, tim redosledom, tokom 400 ps nakon odlaganja od 60 ps nakon laserske ekscitacije na 343 nm koristeći čitač ploča Safire2 (Tecan) na t =0 i t=15 min nakon dodavanja liganda. Emisioni signal Alexa647 je detektovan na 682 nm nakon ekscitacije na 640 nm pomoću istog čitača ploča. Zatim je izračunat intenzitet FRET kao: (signal na 665 nm iz ćelija označenih SNAP-donorom i SNAP-akceptorom) - (signal na 665 nm iz iste serije transficiranih ćelija označenih samo SNAP-donorom i neoznačenih SNAP).
Kao što je prikazano na slici 12B, eksperiment sa TR-FRET ukazuje na to da i BsAb17 i FGF21 pojačavaju dimerizaciju FGFR1c-ECD kada je KFB takođe prisutan u ćeliji. Rezultati su prikazani kao odnos FRET: FRET intenzitet podeljen sa emisijom donora na 620 nm.
Pored toga, BsAb10 se vezuje za C-terminalnu polovinu KFB-ECD, dok se smatralo da se FGF21 i FGF19 vezuju za isto mesto na KLB u N-terminalnoj polovini (Goetz et al. Mol. Cell. Biol. 32(10): 1944-54 (2012); Foltz et al. Sci. Transl. Med. 4: 162ra153 (2012)), što sugeriše da bi epitop BsAb10 na KFB trebalo da se razlikuje od mesta vezivanja FGF21 i FGF19. Da bi se mapirao KFB epitop za BsAb10, vezivanje 8C5 (KLB-vezujući krak BsAb10) za seriju himernih antigena eksprimiranih u ćelijama HEK293. Svaka himera je konstruisana spajanjem humanog KLB i humanog Klotho alfa (KLA) proteina (50% identičnosti sa humanim KLB proteinima) ili KLB zeca (86% identičnosti sa humanim KLB). Kao što je rezimirano na Sl.13A, 8C5 vezuje C-terminalni domen KLB, posebno u regionu koji sadrži 34 aminokiseline u C-terminalnom domenu KLB SEQ ID NO: 142).
Kao što je prikazano na sl.13B, aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 142 može da odgovara aminokiselinama 857-890 proteina KLB koji uključuje signalnu sekvencu, npr. kao što je sekvenca od 52 aminokiseline koja ima sekvencu naznačenu u SEQ ID NO: 157 ili može da se odnosi na aminokiseline 805-838 proteina KLB koji ne uključuje signalnu sekvencu.
Uprkos sličnosti između FGF21 i BsAb10 i njegovih derivata u nishodnom delovanju, epitop BsAb10 na KLB se razlikuje od mesta vezivanja FGF21 i FGF19 (Sl.14A).
Sl. 14B prikazuje rezultate testa luciferaze GAL-ELK1 obavljenog u L6 ćelijama mioblasta pacova kotransficiranim sa FGFR4 i KLB i tretiranim samo sa FGF19 ili u kombinaciji sa anti-KLB/anti-FGFR1c antitelom (BsAb17). Kao što je prikazano na sl. 14B, predtretman sa BsAb17 takođe nije blokirao aktivnost FGF-19 u L6 ćelijama koje eksprimiraju kompleks FGFR4/KLB.
Pored toga, i kao što je prikazano na sl. 14C, predtretman sa BsAb17 nije blokirao aktivnost FGF-19 u ćelijama H4IIE hepatoma koje eksprimiraju FGFR4 i KLB. U prisustvu BsAb17, FGF19 je i dalje mogao da aktivira kompleks FGFR4/KLB da izazove fosforilaciju ERK (Sl. 14C). Ovi podaci ukazuju na to da otkriveno anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo, npr. anti-KLB/anti-FGFR1c bispecifično antitelo, ne ometa interakciju FGF-19 ili FGF21 sa kompleksom KLB/FGFR1c.
Primer 9: BsAb10 i njegovi derivati deluju kao FGF21 mimetik dugog dejstva in vivo
Unakrsna reaktivnost BsAb10 i njegovih derivata sa kompleksom mišjih receptora kao što je opisano u prethodnom tekstu (videti, npr. sl.6C i 10B) omogućila je testiranje njegove in vivo aktivnosti na modelima miša. Da bi se izbegla potencijalna toksičnost efektorske funkcije IgG, u BsAb20 je uvedena dvostruka mutacija [D265A/N297G] u Fc region, koja ukida vezivanje za FcgRs i regrutovanje imunoloških efektorskih ćelija. Pored toga, da bi se izbegla potencijalna toksičnost efektorske funkcije IgG, u BsAb17 je uvedena N297G u Fc region, koja ukida vezivanje za FcgRs i regrutovanje imunoloških efektorskih ćelija.
Kao što je prikazano na slici 15A, kada je i.p. ubrizgan db/db miševima sa dijabetesom u dozi od 5 mg/kg, BsAb17 je smanjio nivo glukoze u krvi u sličnoj meri bez uticaja na unos hrane ili telesnu težinu. Mršavi miševi C57BL/6 tretirani sa BsAb17 su pokazali smanjenu glukozu u krvi, ali nisu postigli toksičnu hipoglikemiju (Sl.15A).
Pored toga, kada je C57BL/6 miševima hranjenim hranom sa velikim sadržajem masti (gojaznost izazvana ishranom, DIO) ubrizgan BsAb17 u dozi od 3 mg/kg 0. i 6. dana, uočeno je značajno smanjenje gubitka težine i glukoze u krvi (Sl. 15B). Za ishranu sa visokim sadržajem masti korišćena je ishrana sa visokim sadržajem masti i ugljenih hidrata (Harlan Teklad TD.03584, 58,4% kalorija iz masti).
Kao što je prikazano na sl. 15C, uočeno je poboljšanje tolerancije na glukozu kod C57BL/6 miševa hranjenih hranom sa visokim sadržajem masti (gojaznost izazvana ishranom, DIO) kojima je ubrizgan BsAb17 u dozi od 3 mg/kg.
Smanjenje triglicerida u jetri, insulina u serumu, slobodne masne kiseline, triglicerida i ukupnog holesterola takođe je uočeno kod C57BL/6 miševa hranjenih hranom sa visokim sadržajem masti (gojaznost izazvana ishranom, DIO) kojima je ubrizgan BsAb17 u dozi od 3 mg/kg (Sl.15D). Slični rezultati su prethodno uočeni sa injekcijama FGF21.
Poseban eksperiment je sproveden na klb heterozigotnim miševima i homozigotnim miševima sa nedostatkom klb kako bi se utvrdilo da li poboljšanje tolerancije na glukozu primećeno nakon tretmana anti-KLB/anti-FGFR1c bispecifičnim antitelom zahteva funkcionalni KLB. Da bi se dobili miševi sa nedostatkom klb (KO), par Klb-specifične cinkove prst nukleaze (ZFN) nabavljen je od kompanije Sigma-Aldrich i korišćen za pronuklearnu mikroinjekciju prema utvrđenim metodama. ZFN par cilja sledeću Klb sekvencu u mišjem genomu (mesto presecanja malim slovima), a KO miševima nedostaje brisanje jednog bp (podebljano g) što izaziva pomeranje okvira:
(SEQ ID NO: 156). Slika 16A prikazuje N-terminalnu aminokiselinsku sekvencu mišjeg KLB proteina i odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu kodiranu klb alelom kod miševa sa nedostatkom klb.
Sl. 16B prikazuje rezultate vestern blot analize koja je izvedena kako bi se potvrdio nedostatak ekspresije KLB proteina kod miševa sa nedostatkom klb.
Kao što je prikazano na sl. 16C, BsAb20 je poboljšao toleranciju na glukozu kod klb heterozigotnih miševa, merenu testom tolerancije na glukozu (GTT), ali ne i kod homozigotnih miševa sa nedostatkom klb, što ukazuje na to da poboljšanja tolerancije na glukozu zahtevaju funkcionalni KLB. Za test tolerancije na glukozu (GTT), miševi nisu hranjeni preko noći i primili su i.p. injekciju rastvora glukoze u dozi od 2 g/kg.
Pored toga, za razliku od anti-FGFR1 R1Mab1, koji menja nivoe serumskog FGF23 i fosfora (Wu et al., Sci Transl Med 3, 113ra126 (2011) i Wu et al., PLoS One 8, e57322 (2013)), anti-KLB/anti-FGFR1 bispecifično antitelo nije uticalo na ove parametre seruma, što ukazuje na odsustvo KLB-nezavisne agonističke aktivnosti FGFR1 (Sl.16D).
Kao što je prikazano na slici 17, BsAb17 nije promenio nivoe FGF23 ili fosfora u serumu, koji su osetljivi markeri KLB-nezavisnog FGFR1. Delovanje insulina kod miševa tretiranih sa BsAb17 je mereno hiperinsulinemijsko-euglikemijskim klampom. Ukratko, miševi su primili anesteziju izoflurana, a leva zajednička karotidna arterija i desna jugularna vena su kateterizovane za uzorkovanje, odnosno infuziju. Slobodni krajevi katetera su tunelisani ispod kože do zadnjeg dela vrata gde su labavi krajevi katetera bili pričvršćeni za cevi napravljene od MICRO-RENATHANE<®>(OD 0,033 inča). Životinje su pojedinačno smeštene nakon operacije, i njihova telesna težina je beležena svakodnevno. Svi eksperimenti metabolizma su sprovedeni nakon 5-dnevnog postoperativnog perioda oporavka, i opisani su u prethodnom tekstu. Svesni, nesputani miševi su stavljeni u plastičnu posudu od 1 l obloženu prostirkom i nisu hranjeni od 7 ujutru (t=-300 min). Miševi su odmah spojeni na dvokanalni okretač od nerđajućeg čelika (Instech Laboratories) da bi se omogućila istovremena infuzija u jugularnu venu i uzorkovanje arterijske krvi. Miševi nisu tretirani, i bilo im je dozvoljeno da se slobodno kreću kako bi se eliminisao stres.2 sata pre početka klampa, bolus od 5 µCi [3-3H]-D-glukoze je dat u jugularnu venu (t=-120 min), nakon čega je usledila konstantna infuzija brzinom od 0,05 µCi/min. Nakon perioda uravnotežavanja od 2 h na t=0 min (tj. 5 h nehranjenja), uzet je osnovni uzorak arterijske krvi za merenje glukoze u krvi, [3-3H]-D-glukoze, hematokrita i insulina u plazmi. Zatim je započet hiperinsulinemijsko-euglikemijski klamp (4 mU/kg/min) od 145 min. [3-3H]-D-glukoza je dodata u promenljivu infuziju glukoze koja je korišćena za održavanje euglikemije a stalna infuzija [3-3H]-D-glukoze je prekinuta da bi se ograničila aktivnost specifična za arterijsku glukozu na konstantnom nivou. Crvena krvna zrnca miša donora na pozadini C57B1/6J su isprana i rekonstituisana u jednakoj zapremini 0,9% heparinizovanog fiziološkog rastvora (hematokrit ~50%) i infundovana brzinom od 4 µl/min tokom trajanja studije kako bi se zamenila krv uklonjena tokom studije. Uzorci arterijske krvi su uzimani na svakih deset minuta da bi se odredio nivo glukoze u krvi. Na t=80, 90, 100 i 120 min, uzeti su uzorci krvi za određivanje [3-3H]-D-glukoze. Na t=120 min, bolus od 13 µCi 2-dezoksi [14C] glukoze ([2-14C]DG) primenjen je u kateter u jugularnoj veni. Na t=122, 125, 130, 135 i 145 min uzorkovana je arterijska krv za određivanje glukoze u krvi, [3-3H]-D-glukoze u plazmi i [2-14C]DG. Koncentracija arterijskog insulina je merena na 100 i 120 min. Na t=145 min miševi su zatim primili anesteziju. Široki listoliki mišić, trbušasti mišić lista, beli površinski vastus lateralis (kvadriceps), jetra, srce, epididimalno i potkožno belo masno tkivo, smeđe masno tkivo i mozak su izrezani, odmah zamrznuti u tečnom azotu i čuvani na -70°C do buduće analize tkiva. Imunoreaktivni insulin je analiziran korišćenjem kompleta za radioimunološko testiranje pacova Linco (LincoResearch).
Za merenje [3-<3>H]-D-glukoze, uzorci plazme su deproteinizovani barijum hidroksidom (Ba(OH)2) i cink sulfatom (ZnSO4), osušeni, a radioaktivnost je određena pomoću tečnog scintilacionog brojanja. Izrezana tkiva su deproteinizovana perhlornom kiselinom, a zatim neutralisana na pH~7,5. Deo uzorka je prebrojan ([2-<14>C]DG i [2-<14>C]DG-Gfosfat ([2-<14>C]DGP), a deo je tretiran sa Ba(OH)2i ZnSO4i prebrojan je supernatant ([2-<14>C]DG). Nivoi radioaktivnosti [2-<14>C]DG i [2-<14>C]DG-fosfata ([2-<14>C]DGP) određeni su korišćenjem tečnog scintilacionog brojanja. Brzine protoka glukoze su procenjene pomoću jednačina nestacionarnog stanja uz pretpostavku zapremine distribucije (130 ml/kg). Klirens specifičan za tkivo (Kg) [2-<14>C]DG i indeks preuzimanja glukoze (Rg) izračunati su kao što je prethodno opisano (Kraegen, E.W. et al., Am. J. Physiol. 248, E353-362 (1985)): Kg=[2<14>C]DGPtkivo/AUC [2-<14>C]DGplazma, Rg=Kgx [glukoza]plazma, gde je [2-<14>C]DGPtkivo[2-<14>C]DGP radioaktivnost (dpm/g) u tkivu, AUC [2-<14>C]DGplazmaje površina ispod krive nestajanja [2-<14>C]DG plazme (dpm/ml/min), a [glukoza]plazmaje prosečan nivo glukoze u krvi (µg/µl) tokom eksperimentalnog perioda (t=102-125 min). Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM.
Kao što je prikazano na sl. 15E, koja prikazuje iskorišćenje glukoze u celom telu izmereno nakon jedne injekcije BsAb17 u dozi od 10 mg/kg, BsAb17 je poboljšao stopu iskorišćenja glukoze u celom telu koje je stimulisano insulinom.
Pored toga, i kao što je prikazano na slici 15F, BsAb17 je poboljšao insulinsku supresiju brzine proizvodnje endogene glukoze nakon jedne injekcije BsAb17 od 10 mg/kg. Ovi rezultati ukazuju na to da je jedna injekcija od 10 mg/kg BsAb17 kod DIO miševa 5 dana pre klampa značajno snizila koncentraciju glukoze i insulina nakon gladovanja.
Unos glukoze u tkivo (Rg) na kraju perioda stimulisanog insulinom je poboljšan u srcu, skeletnim mišićima, belom masnom tkivu (WAT) i interskapularnom BAT tkivu (iBAT), što ukazuje na insulinsku senzibilizaciju celog tela od strane BsAb17 (Sl.15G).
Kolebanje nivoa glukoze u arterijskoj krvi određeno je tokom eksperimenta sa klampom. Kao što je prikazano na Sl. 18A, kolebanje nivoa glukoze u arterijskoj krvi razlikovalo se kod miševa kojima je ubrizgan BsAb17 u odnosu na miševe kojima je ubrizgan kontrolni IgG tokom eksperimenta sa hiperinsulinemijsko-euglikemijskim klampom.
Takođe je određena razlika u težini miševa kojima je ubrizgan BsAb17 u odnosu na miševe kojima je ubrizgan kontrolni IgG. Kao što je prikazano na slici 18B, uočene promene koncentracija glukoze i insulina nisu praćene očiglednim gubitkom težine.
Brzina infuzije glukoze u stabilnom stanju je takođe analizirana nakon injekcije BsAb17. Kao što je prikazano na slici 18C, brzina infuzije glukoze u stacionarnom stanju je povećana za 64% nakon injekcije BsAb17. Ovi rezultati pokazuju da je BsAb17 poboljšao osetljivost celog tela na insulin kod DIO miševa čak i pre nego što gubitak težine postane očigledan.
Prethodne studije sa farmakološkim dozama FGF19 ili FGF21 pokazale su povećanu potrošnju energije (EE) (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 6018-6027 (2008); Wu et al., PLoS One 8, e57322 (2013); Lin et al., Cell Metab 17, 779-789 (2013)), stoga je obrazloženo da će se primetiti sličan efekat. Za izračunavanje EE i respiratornog koeficijenta (RQ) korišćene su sledeće jednačine. EE=VO2X(3,815+1,232xRQ), gde je (RQ=VCO2/VO2). Zaista, pojedinačna injekcija BsAb17 u DIO ili mršave miševe na normalnoj sobnoj temperaturi (21°C) dovela je do značajnog povećanja potrošnje O2(VO2), proizvodnje CO2(VCO2) i EE po injektovanoj životinji bez značajne promene broja aktivnosti (Sl.19A). Neočekivano, uočeno povećanje EE od 15-46% nije pratilo značajne promene respiratornog koeficijenta (RQ=VCO2/VO2) (Sl.19A).
Slično povećanje EE bez promene RQ izazvano je kontinuiranom infuzijom FGF21 u DIO miševe (Sl.21C).
Sl. 20A prikazuje količinu VO2, VCO2i broj ukupnih aktivnosti DIO miševa tretiranih jednom injekcijom BsAb17 na normalnoj sobnoj temperaturi.
Kao što je prikazano na slici 19B, povećanje EE je održano kada je temperatura kaveza bila povišena do termoneutralnosti (29-30°C), što sugeriše da se aktivacija smeđe masti indukovana putem BsAb17 ne oslanja na prilagodljivi termogeni unos iz simpatičkog nervnog sistema.
Sl. 20B prikazuje količinu VO2, VCO2i broj ukupnih aktivnosti DIO miševa tretiranih jednom injekcijom BsAb17 na normalnoj sobnoj temperaturi nakon čega je usledilo pomeranje temperature na termoneutralnost.
Povećanje EE je takođe bilo evidentno kada su DIO miševi aklimatizovani na termoneutralnu sobnu temperaturu (29-30°C) testirani tokom dve nedelje (Sl.21B).
Kao što je rezimirano na sl.21A, koja prikazuje prosečne vrednosti EE, promene EE su primećene kod mršavih i DIO miševa na normalnoj sobnoj temperaturi i kod mršavih i DIO miševa aklimatizovanih na termoneutralnu sobnu temperaturu.
Nasuprot tome, kontinuirana infuzija β3-specifičnog agonista adrenoceptora CL-316,243 izazvala je akutno povećanje EE i smanjenje RQ kao što je i očekivano (Sl. 19H). Kontinuirana infuzija FGF21 ili CL-316,243 je izvedena korišćenjem osmotske mini-pumpe (Alzet 2001) koja je supkutano implantirana. Dakle, EE izazvan putem BsAb17 i FGF21 je robustan, ali se čini da je selektivniji od drugih prethodno opisanih mehanizama aktiviranja BAT, kao što je primena simpatomimetika (norepinefrin ili β3-specifični agonist adrenoreceptora CL-316,243), srčanih natriuretskih peptida ili interleukina-4, koji prate promociju oksidacije lipida i redukciju RQ (Gerhart-Hines et al., Mol. Cell 44, 851-863 (2011); Mattsson et al., American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 299, E374-383 (2010); Nguyen et al., Nature 480, 104-108 (2011); Birkenfeld et al. Diabetes 57, 3199-3204 (2008); Bordicchia et al., J. Clin. Invest.122, 1022-1036 (2012); i de Souzaet al., Diabetes 46, 1257-1263 (1997)).
Bez vezivanja za određenu teoriju, nekoliko linija dokaza ukazuje na dominantnu ulogu aktiviranja BAT u metaboličkom delovanju BsAb17. Prvo, kao što je prikazano na slici 19C, injekcija BsAb17 je povećala unos 18F-fludezoksiglukoze (FDG) posebno u iBAT.
Drugo, jedna injekcija BsAb17 izazvala je ekspresiju proteina UCP1 u ingvinalnom VAT (ingVAT), što je indikativno za smeđe masno tkivo (Sl.19D).
Kao što je prikazano na sl. 19E, indukcija ekspresije UCP1 je takođe primećena u kultivisanim primarnim adipocitima tretiranim sa FGF21 ili BsAb17, što ukazuje na direktno dejstvo na zrele adipocite. Da bi se odredila ekspresija UCP1, ukupna RNK je korišćena za sintezu kDNK pomoću kompleta za sintezu kDNK SUPERSCRIPT<®>VILO (ABI). Za qPCR, uzorci su testirani u tri primerka u ViiA 7 PCR instrumentu u realnom vremenu (Applied Biosistems). Korišćena sonda za ispitivanje ekspresije gena Applied Biosistems prethodno dizajnirana za TAQMAN<®>, bila je UCP1 (Hs01027785_m1). Za svaki uzorak, normalizovana je zastupljenost iRNK na količinu TBP (Hs00427620_m1) i SDHA (Hs00188166_m1) transkripta.
Treće, telemetrijskim sistemom je uočeno povećanje unutrašnje telesne temperature u mirovanju nakon jedne injekcije BsAb17 koja je trajala ≥26 dana pre postepenog vraćanja na početnu vrednost (Sl.19F).
Sl. 22 prikazuje razliku u temperaturi unutrašnjih organa koje su uočene kod miševa posle jedne injekcije BsAb17 u poređenju sa miševima tretiranim IgG kontrolom. Temperatura unutrašnjih organa je praćena pomoću TA-F10 predajnika (Data Sciences International, DSI) koji je hirurški implantiran u peritonealnu šupljinu. Nakon oporavka od operacije, miševi su randomizovani u grupe na osnovu telesne težine i temperature unutrašnjih organa. Temperatura unutrašnjih organa i aktivnost su praćeni pomoću DSI implantabilnog telemetrijskog sistema.
Profili ekspresije gena su analizirani u iBAT DIO miševa koji su primili jednu injekciju BsAb17, FGF21 ili IgG kontrolu. Kao što je prikazano na sl. 19G, jedna injekcija BsAb17 izazvala je promene u ekspresiji iBAT gena koje liče na one kod injekcije FGF21 dva puta dnevno.
Konačno, kada su ubrizgani u C57BL/6 miševe, FGF21 i BsAb20 su indukovali ERK i MEK fosforilaciju u različitim masnim tkivima, uključujući iBAT i ingWAT (Sl.23).
U prethodnim studijama je sugerisano da adiponektin doprinosi punom delovanju FGF21 (Lin et al., Cell Metab 17, 779-789 (2013); Holland et al., Cell Metab 17, 790-797 (2013)). Zaista, pojedinačna injekcija BsAb17 kod DIO miševa je dovela do povećanja nivoa adiponektina velike molekulske mase (HMV) u serumu, sa povezanim gubitkom težine (Sl.
24A).
Slično tome, jedna injekcija BsAb17 kod mršavih majmuna cinomolgus (sl. 24B) dovela je do povećanja nivoa adiponektina velike molekulske mase (HMV) u serumu, sa povezanim gubitkom težine.
Kao što je prikazano na sl.24C, nakon jedne injekcije BsAb17, adiponektin (Adipoq) KO miševi na HFD su pokazali robustan odgovor u povećanju EE (povećanje od 25,3% u odnosu na povećanje od 20,9% kod wt miševa).
Pored toga, nakon jedne injekcije BsAb17, adiponektin (Adipoq) KO miševi na HFD su pokazali smanjenu telesnu težinu i nivoe triglicerida u jetri (sl.24D). Međutim, odgovor u toleranciji na glukozu, toleranciji na insulin, promeni insulina u serumu i različitim lipidima su bili donekle prigušeni kod KO miševa (sl. 24D), u skladu sa idejom da BsAb17 deluje kao mimetik FGF21 u regulisanju metabolizma hranljivih materija u celom telu putem funkcije adiponektina. Za određivanje tolerancije na insulin, miševi nisu hranjeni 4 sata, i i.p. im je injektovano 1 U/kg rastvora humanog insulina (Humulin R, Eli Lilly and Company).
Povećana receptorska selektivnost BsAb10 (videti sl. 9A) i prethodno opisana niska penetracija molekula IgG u mozak (Yu et al., Sci Transl Med 3, 84ra44 (2011)) predviđaju izmenjeni bezbednosni profil BsAb10 i njegovih derivata u poređenju sa FGF21 /19. U skladu sa niskim nivoom ekspresije FGFR1 u jetri, FGF21, ali ne i BsAb17, indukovao je ekspresiju iRNK klasičnih FGFR ciljnih gena Spry4 i Dusp6 u jetri (Sl.25).
BsAb17 ili BsAb20 je takođe doveo do povećanog fosfo-ERK signala u različitim masnim tkivima i acinarnim ćelijama pankreasa, ali ne i u jetri (Sl.23).
Slika 26 pokazuje da BsAb17 takođe ne povećava fosforilaciju ERK u različitim delovima mozga uključujući cirkumventrikularne organe, kao što je utvrđeno imunohistohemijom.
Pored toga, hronično lečenje DIO miševa sa BsAb20 tokom 8 nedelja smanjilo je broj BrdU+ ćelija u jetri na nivo mršavih C57BL/6 miševa, suprotno od onoga što se očekivalo za aktivnost sličnu FGF19 (sl. 27). Za inkorporaciju BrdU u jetri, miševima je intraperitonealno ubrizgano 100 mg/kg BrdU (BD Biosciences) 2 sata pre eutanazije. Anti-BrdU bojenje je izvedeno kako je opisano (Nicholes, K., et al. Am. J. Pathol.160, 2295-2307 (2002)) i BrdU pozitivni hepatociti su izbrojani korišćenjem automatizovanog sistema za analizu slika Ariol.
Izvršena je analiza kostiju miševa koji su tretirani anti-KLB/anti-FGFR1c antitelom. Sl.
28A daje šematski prikaz analize. Da bi se izvršila analiza kostiju, uzorci butne kosti su snimljeni pomoću SCANCO Medical (Baserdorf, Švajcarska) µCT40 sistemom za mikro snimanje koji radi sa nivoom energije rendgenske cevi od 70 keV i naponom od 114 mikroampera. Preseci slike susednih aksijalnih rezova su dobijene sa izotropnom veličinom voksela od 12 µm. Morfometrijska analiza trabekularne kosti unutar butne kosti je obavljena pomoću µCT40 softvera za procenu SCANCO Medical (Baserdorf, Švajcarska). Poluautomatizovano konturisanje je korišćeno za definisanje zapremine od interesa (VOI), koja se sastoji od sekundarne trabekularne kosti dorzalno od proksimalne ploče za rast femura i proteže se 1,5 mm distalno od primarne trabekularne kosti. Kortikalna kost je isključena postavljanjem granica VOI unutar unutrašnje granice kortikalne kosti. Pre segmentacije slike, ograničeni trodimenzionalni (3D) Gausov niskopropusni filter je primenjen na podatke slike za suzbijanje šuma (filter sigma=0,5, podrška filtera=1). Globalni prag (0,36 gHA/cm3) je primenjen da bi se izdvojila „binarizovana“ trabekularna struktura iz VOI. Prag trabekularne segmentacije je izabran vizuelnom inspekcijom rezultata segmentacije iz reprezentativnog podskupa uzoraka. Trabekularne strukturne karakteristike su kvantifikovane direktnom 3D morfometrijskom analizom. Prethodne studije su pokazale da je morfometrijska analiza trabekularne kosti mikrokompjuterskom tomografijom u dobroj korelaciji sa sličnim procenama napravljenim pomoću histomorfometrije.
Kao što je prikazano na slici 28B, hronični BsAb20 tretman DIO miševa tokom 6 nedelja doveo je do očekivanih promena u metaboličkim parametrima bez ikakvog negativnog signala u različitim parametrima kostiju u tibijalnim trabekularnim i femoralnim kortikalnim kostima na osnovu mikrokompjuterske tomografije.
Kao što je prikazano na slici 29, BsAb17 injekcija u DIO miševe nije povećala nivoe kortikosterona u serumu iznad kontrole. Hronični pozitivni energetski balans uobičajen u savremenom društvu pokreće pandemiju gojaznosti i povezane poremećaje metabolizma koje karakterišu otpornost na insulin, hiperinsulinemija, netolerancija na glukozu, hiperlipidemija i hepatosteatoza, što često dovodi do teških bolesti kao što su dijabetes tipa 2, ciroza, moždani udar i bolesti srca. U 2009. godini, prijavljeno je prisustvo UCP1-pozitivnog BAT kod odraslih osoba i njihov funkcionalni značaj u pokretanju EE putem disipacije toplote, što je izazvalo ogromno interesovanje za terapeutsku indukciju i aktiviranje BAT za lečenje gojaznosti i srodnih metaboličkih bolesti (Yoneshiro i Saito, Ann. Med., 1-9 (2014)).
Međutim, većina poznatih mehanizama koji aktiviraju BAT takođe indukuju lipolizu belog masnog tkiva, što može da ima negativan uticaj na kardiovaskularni ishod (Dong et al., Cell Metab. 18, 118-129 (2013)). Potrebno je napomenuti da BAT transplant povećava EE i indukuje gubitak težine bez promene RQ (Stanford et al., J. Clin. Invest.123, 215-223 (2013)). U tom pogledu, FGF21 i anti-FGFR1/KLB agonističko antitelo koje je ovde opisano predstavljaju jedinstven pristup za selektivno indukovanje termogenog odgovora u BAT bez promene RQ, čime se oponaša BAT transplantat, a ne nespecifična simpatoaktivacija. Pored toga, na osnovu onoga što je primećeno kod miševa, predviđeno je da aktiviranje kompleksa FGFR1c/KLB posredovano antitelima može da pruži bezbednije i efikasnije sredstvo za terapiju protiv gojaznosti i antidijabetičku terapiju, za razliku od aktivacije šireg FGFR/KLB kompleksa pomoću analoga FGF21 ili FGF19.
Primer 10: Humanizacija anti-KLB antitela 8C5
CDR lakog lanca miša 8C5 su kalemljeni u okvire humanog kapa2 i kapa4 lakog lanca. Pored primarnog grafta, u svakom slučaju su takođe generisane tačkaste mutacije tako da je položaj 4 lakog lanca pretvoren u leucin (označen kao „M4L“). Analiza je izvršena u cilju identifikacije najbolje eksprimiranih slučajeva i nije pokazala značajnu agregaciju. Slično tome, CDR teškog lanca su kalemljeni u okvire teškog lanca humanog IgG1 H1, H2, H3 i H4. Različiti ostaci u skeletima teškog lanca su mutirani na sledeći način: za H1 su uvedene sledeće promene: K71R, N73T i V78A (matični označen kao „KNV“ i konstrukt označen kao „RTA“); za H2 uvedena je sledeća promena: N73T (matični označen kao „KNV“ i konstrukt označen kao „KTV“); za H3 su uvedene sledeće promene: K71R i V78L (matični označen kao „KNV“ i konstrukt označen kao „RNL“; a za H4 su uvedene sledeće promene: K71V, N73T i V78F (matični označen kao „KNV“, a konstrukt označen kao „VTF“).
Proizvedena su antitela zasnovana na svim kombinacijama u paru od 4 laka lanca i 8 teških lanaca (za ukupno 32 antitela) i testirani su nivoi ekspresije i afinitet. Na osnovu ovih eksperimenata, laki lanac K4.M4L izveden iz 8C5 i teški lanac H3.KNV su pokazali najbolju kombinaciju nivoa ekspresije i željenog afiniteta.
Sekvence varijabilnih regiona 8C5.K4.M4L.H3.KNV i antitela pune dužine su sledeće: 8C5.K4.M4L.H3.KNV varijabilni region teškog lanca
Primer 11: Generisanje hibrida anti-FGFR1 antitela između YW182.3 i YW182.5 Otkriveno je da YW182.5, koji je bio anti-FGFR1 krak koji nije aktivirao kompleks KLB/FGFR1c u odsustvu anti-FGFR1 kraka, daje dobre rezultate kada se kombinuje sa 8C5, i ima triptofan na položaju 33 teškog lanca koji je podložan oksidaciji. YW182.2, koji izgleda da vezuje isti epitop kao YW182.5, takođe ima takav triptofan na položaju 33 teškog lanca. Na ovaj položaj je uvedeno nekoliko mutacija da bi se izbegao ovaj problem: za YW182.5 uvedeni su W33Y, W33H, W33F i W33L, a za YW182.2 uvedeni su W33Y i W33F. Iznenađujuće, uvedene mutacije su imale različit uticaj na dva antitela. U slučaju YW182.2, primećeno je da mutacije nisu značajno uticale na afinitet ili agonističku aktivnost za FGFR1, dok su za YW182.5 mutacije u velikoj meri smanjile afinitet i agonističku aktivnost za FGFR1 (videti, npr. Sl. 31). Zbog toga su izvedeni eksperimenti radi identifikovanja antitela sa mutacijama W33Y, ali sa afinitetom bližim afinitetu YW182.5 antitela koristeći dva pristupa.
U jednom pristupu, za sekvencu teškog lanca YW182.2 W33Y izvršeno je skeniranje alanina duž CDR3, mutirajući položaje 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a i 100b u alanin. Analiziran je afinitet nastalih antitela i identifikovana su ona koja su zadržala veoma visok afinitet YW182.2 W33 matičnog antitela (Tabela 9).
Tabela 9. Afinitet derivata YW182.2.
U drugom pristupu, CDR iz YW182.2 W33Y antitela (sa veoma visokim afinitetom) i YW182.5 W33Y antitela (skoro bez ikakvog vezivanja) mešani su i upareni. YW182.2 W33Y i YW182.5 W33Y antitela imaju identične sekvence CDR u lakom lancu (CDR-L1,
(SEQ ID NO: 139); CDR-L2, (SEQ ID NO: 140); i CDR-L3 (SEQ ID NO: 141) razlika u jednoj aminokiselini u CDR-H1 (YW182.2 W33Y CDR-H1, (SEQ ID NO: 152) i YW182.5 W33Y CDR-H1, (SEQ ID NO: 136)); tri različite aminokiseline u CDR-H2 ili blizu njega (YW182.2 W33Y CDR-H2,
(SEQ ID NO: 137 i YW182.5 W33Y,
(SEQ ID NO: 153)); i veoma različite CDR-H3 sekvence (YW182.2 W33Y,
(SEQ ID NO: 154) i YW182.5 W33Y GTDVMDY (SEQ ID NO: 138). Konstruisana su i testirana antitela sa teškim lancima zasnovana na svim mogućim kombinacijama CDR teškog lanca iz YW182.5 W33Y i YW182.2 W33Y (osam, uključujući dva matična antitela). Većina antitela je imala sličan afinitet, ali, iznenađujuće, jedna kombinacija je pokazala vezivanje koje je bilo skoro identično sa matičnim YW182.5 antitelom. Ovo antitelo ima CDR-H1 i CDR-H3 iz YW182.5 W33Y, ali CDR-H2 iz YW182.2 W33Y. Ovo antitelo je označeno kao „YW182.5 YGDY“ da predstavlja sledeće promene u sekvenci YW182.5: W33Y, A49G, A56D i D58Y.
Sekvence YW182.5 YGDY antitela su sledeće:
YW182.5_YGDY varijabilni region teškog lanca
YW182.5_YGDY teški lanac kompletne dužine
YW182.5_YGDY varijabilni region lakog lanca
Primer 12: Testiranje bispecifičnih antitela sa humanizovanim varijantama 8C5 i anti-FGFR1
Testirane su različite kombinacije bispecifičnih antitela 8C5.K4H3.M4L.KNV i različitih anti-FGFR1 krakova u testu luciferaze zasnovanom na GAL-ELK1 u HEK293 ćelijama koje eksprimiraju FGFR1c sa KLB ili bez njega. Kao što je ranije primećeno, svaka kombinacija bispecifičnih antitela indukovala je aktivnost luciferaze na način koji zavisi od doze u ćelijama koje eksprimiraju rekombinantne hFGFR1c i hKLB, ali ne u ćelijama bez ekspresije KLB (Sl.30). Ovi podaci potvrđuju da ove izmenjene varijante zadržavaju prednosti matičnih antitela, na primer, BsAb13. Afinitet vezivanja anti-KLB/anti-FGFR1 antitela koje ima humanizovani krak 8C5 (8C5.K4.M4L.H3.KNV) i YW182.5_YGDY krak za komplekse KLB/FGFR1c kod ljudi, majmuna cinomolgus i miševa na površini HEK293 ćelija, prikazan je u Tabeli 10.
Tabela 10. Afiniteti vezivanja.
Pored različitih aspekata prikazanog i zahtevanog otkrića, obelodanjeni predmetni pronalazak je takođe usmeren na druge aspekte otkrića koji imaju druge kombinacije karakteristika koje su ovde obelodanjene i tražene. Kao takve, posebne karakteristike koje su ovde predstavljene mogu međusobno da se kombinuju na druge načine u okviru otkrivenog predmeta tako da obelodanjeni predmetni pronalazak obuhvata bilo koju odgovarajuću kombinaciju karakteristika koje su ovde obelodanjene. Prethodni opis specifičnih aspekata obelodanjivanja predmetnog pronalaska predstavljen je u svrhu ilustracije i opisa. Nije predviđeno da bude iscrpan niti da ograniči obelodanjeni predmetni pronalazak na prikazane aspekte obelodanjivanja.
Stručnjacima će biti očigledno da mogu da se naprave različite izmene i varijacije kompozicija i metoda obelodanjenog predmetnog pronalaska.

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Izolovano monoklonsko bispecifično antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen, koje se vezuje za beta-Klotho (KLB) i receptor faktora rasta fibroblasta 1c (FGFR1c), koje sadrži:
(a) prvi krak koji sadrži:
(i) CDR1 domen varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 15, CDR2 domen varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 31, CDR3 domen varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 47, CDR1 domen varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 62, CDR2 domen varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 78 i CDR3 domen varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 93; i
(b) drugi krak koji sadrži:
(i) CDR1 domen varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 136, CDR2 domen varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 137, CDR3 domen varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 138, CDR1 domen varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 139, CDR2 domen varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 140 i CDR3 domen varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 141.
2. Izolovano bispecifično antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen prema zahtevu 1, koje je humano, humanizovano ili himerno antitelo.
3. Izolovano bispecifično antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu prvi krak sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 128 i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 130.
4. Izolovano bispecifično antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu prvi krak sadrži: (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 129 i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 131.
5. Izolovano bispecifično antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu drugi krak sadrži: (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 132 i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 134.
6. Izolovano bispecifično antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu drugi krak sadrži: (a) teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 133 i (b) laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 135.
7. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira bispecifično antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1-6.
8. Ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu iz zahteva 7.
9. Postupak za proizvodnju antitela, uključujući uzgajanje ćelije domaćina iz zahteva 8, tako da se proizvodi antitelo, opciono uz izolovanje antitela iz ćelije domaćina.
10. Farmaceutska formulacija koja sadrži bispecifično antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1-6 i farmaceutski prihvatljiv nosač, opciono dodatni terapeutski agens.
11. Izolovano bispecifično antitelo ili deo tog antitela koji se vezuje za antigen prema bilo kom od zahteva 1-6 za upotrebu u lečenju poremećaja izabranog iz grupe koja se sastoji od gojaznosti, nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), dijabetesa tip 2, dijabetesa koji nije tip 2, dijabetesa tip 1, latentnog autoimunog dijabetesa (LAD) i dijabetesa mladih u zrelosti (MODY).
12. Izolovano bispecifično antitelo za korišćenje prema zahtevu 11, gde je poremećaj dijabetes.
13. Izolovano bispecifično antitelo za korišćenje prema zahtevu 11, gde je poremećaj NASH.
RS20220834A 2013-12-23 2014-12-23 Antitela i postupci primene RS63565B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361920396P 2013-12-23 2013-12-23
US201462081435P 2014-11-18 2014-11-18
EP14827379.0A EP3086807B1 (en) 2013-12-23 2014-12-23 Antibodies and methods of use
PCT/US2014/072245 WO2015100366A1 (en) 2013-12-23 2014-12-23 Antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63565B1 true RS63565B1 (sr) 2022-10-31

Family

ID=52347471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220834A RS63565B1 (sr) 2013-12-23 2014-12-23 Antitela i postupci primene

Country Status (30)

Country Link
US (7) US9873748B2 (sr)
EP (2) EP3086807B1 (sr)
JP (4) JP6687533B2 (sr)
KR (3) KR20210144910A (sr)
CN (2) CN105939727B (sr)
AU (4) AU2014369872B2 (sr)
BR (1) BR112016013960B1 (sr)
CA (1) CA2929868C (sr)
CL (1) CL2016001592A1 (sr)
CR (1) CR20160338A (sr)
DK (1) DK3086807T3 (sr)
EA (1) EA036107B1 (sr)
ES (1) ES2926375T3 (sr)
HR (1) HRP20221088T1 (sr)
HU (1) HUE059701T2 (sr)
IL (3) IL245493B (sr)
LT (1) LT3086807T (sr)
MX (2) MX374976B (sr)
MY (1) MY194936A (sr)
NZ (1) NZ720765A (sr)
PE (1) PE20161152A1 (sr)
PH (1) PH12016500927A1 (sr)
PL (1) PL3086807T3 (sr)
PT (1) PT3086807T (sr)
RS (1) RS63565B1 (sr)
SG (2) SG10202007790WA (sr)
SI (1) SI3086807T1 (sr)
TW (2) TWI728373B (sr)
UA (1) UA120357C2 (sr)
WO (1) WO2015100366A1 (sr)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI728373B (zh) 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
RS60593B1 (sr) 2014-01-24 2020-08-31 Ngm Biopharmaceuticals Inc Antitela koja vezuju domen 2 beta-kloto i postupci za njihovu upotrebu
MX373805B (es) 2014-03-25 2020-03-24 Regeneron Pharma Agonistas de receptor fgf21 y usos del mismo.
CA2961439A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Genentech, Inc. Anti-fgfr2/3 antibodies and methods using same
US10800843B2 (en) 2015-07-29 2020-10-13 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Beta klotho-binding proteins
EP3331914A1 (en) * 2015-08-03 2018-06-13 Novartis AG Methods of treating fgf21-associated disorders
MX2018003536A (es) 2015-09-24 2018-08-01 Genentech Inc Metodos para el tratamiento de la epilepsia.
JP7027321B2 (ja) 2015-11-03 2022-03-01 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗ｃｄ３８抗体の皮下製剤及びその使用
WO2017079768A1 (en) * 2015-11-08 2017-05-11 Genentech, Inc. Methods of screening for multispecific antibodies
US11530277B2 (en) 2016-04-20 2022-12-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for making antibodies based on use of an expression-enhancing locus
BR112018071283A2 (pt) 2016-04-20 2019-02-12 Regeneron Pharma célula, conjunto de vetores para expressar uma proteína de ligação a antígeno biespecífica em uma célula, conjunto de vetores, método, e, método para produção de uma proteína de ligação a antígeno.
CA3052911A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Novartis Ag Fgf21 mimetic antibodies and uses thereof
IL268568B2 (en) 2017-02-10 2024-03-01 Mayo Found Medical Education & Res TRAILshort ANTIBODY AND METHODS OF USE
CN107966525B (zh) * 2017-11-06 2023-10-20 中国矿业大学(北京) 一种13co2量化脉冲标记植物的方法
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
AU2020379735A1 (en) 2019-11-05 2022-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. N-terminal SCFV multispecific binding molecules
BR112023022878A2 (pt) 2021-05-04 2024-01-23 Regeneron Pharma Agonistas do receptor fgf21 multiespecíficos e seus usos
WO2022270518A1 (ja) * 2021-06-21 2022-12-29 積水化学工業株式会社 受容体型チロシンキナーゼアゴニスト、細胞培養用培地組成物、及び未分化性維持組成物
WO2023046071A1 (zh) * 2021-09-23 2023-03-30 江苏恒瑞医药股份有限公司 抗klb抗体及用途
EP4458852A4 (en) * 2021-12-30 2026-04-15 Shanghai Jmt Bio Tech Co Ltd ANTI-KLOTHO ANTIBODY AND ITS USE
WO2025188901A1 (en) 2024-03-05 2025-09-12 Halozyme, Inc. Combination therapy with antibody-drug conjugates and hyaluronidases
CN119431588B (zh) * 2024-11-11 2026-08-11 北京春冠利亚生物技术有限公司 分离的免疫细胞的制备方法及其在治疗癌症中的应用

Family Cites Families (146)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
JPH02500329A (ja) 1987-05-21 1990-02-08 クリエイテイブ・バイオマリキユールズ・インコーポレーテツド ターゲット化多機能蛋白質
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
FI903489A7 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Yhden osan sisältävät ligandit, näitä ligandeja sisältävät reseptorit, menetelmiä niiden valmistamiseksi sekä ligandien ja reseptorien käytt ö
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
ATE139900T1 (de) 1992-11-13 1996-07-15 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
KR20000062345A (ko) 1996-12-26 2000-10-25 히라타 다다시 신규 폴리펩타이드, 신규 ｄｎａ 및 신규 항체
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
JP2002506353A (ja) 1997-06-24 2002-02-26 ジェネンテック・インコーポレーテッド ガラクトシル化糖タンパク質の方法及び組成物
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US20020012961A1 (en) 1999-04-15 2002-01-31 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor- 19
CA2307166A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
EP1032668B1 (en) 1997-11-25 2008-05-28 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor-19
WO1999029888A1 (en) 1997-12-05 1999-06-17 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
JP4334141B2 (ja) 1998-04-20 2009-09-30 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
FR2796073B1 (fr) 1999-07-07 2003-08-29 Centre Nat Rech Scient Anticorps anti-idiotypiques des facteurs de croissance des fibroblastes et leur utilisation comme medicaments
JP2001072607A (ja) 1999-09-03 2001-03-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規血管内皮機能改善法
CA2384089A1 (en) 1999-09-08 2001-03-15 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor-19 (fgf-19) nucleic acids and polypeptides and methods of use for the treatment of obesity
EP1210426A2 (en) 1999-09-10 2002-06-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Polymorphisms in a klotho gene
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Kyowa Kirin Co., Ltd. The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
JP2003516755A (ja) 1999-12-15 2003-05-20 ジェネンテック・インコーポレーテッド ショットガン走査、すなわち機能性タンパク質エピトープをマッピングするための組み合わせ方法
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
PT2857516T (pt) 2000-04-11 2017-08-28 Genentech Inc Anticorpos multivalentes e utilizações dos mesmos
KR100865801B1 (ko) 2000-08-29 2008-10-28 제넨테크, 인크. 암 치료의 효능을 증진시키는 방법
ATE453718T1 (de) 2000-08-29 2010-01-15 Genentech Inc Verfahren zur verbesserung von krebstherapie
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CN103333860B (zh) 2000-10-06 2015-07-08 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED ANTIBODY-DEPENDENT CELLULAR CYTOTOXICITY
PL213948B1 (pl) 2001-10-25 2013-05-31 Genentech Inc Kompozycje zawierajace glikoproteine, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca te glikoproteine, komórka gospodarza, sposób wytwarzania glikoproteiny, kompozycja do zastosowania do leczenia, zastosowanie kompozycji i zestaw zawierajacy kompozycje
EP1327443A1 (en) 2001-12-21 2003-07-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic or preventing agent for the diseases caused by a decrease in the expression level of the klotho protein
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
ES2363765T3 (es) 2002-01-31 2011-08-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Agonistas de fgfr.
WO2003085102A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in gdp-fucose transport
EP1498491A4 (en) 2002-04-09 2006-12-13 Kyowa Hakko Kogyo Kk METHOD FOR INCREASING THE ACTIVITY OF AN ANTIBODY COMPOSITION FOR BINDING TO THE FC GAMMA RECEPTOR IIIA
KR20050000380A (ko) 2002-04-09 2005-01-03 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 게놈이 개변된 세포
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
WO2003084570A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. DRUG CONTAINING ANTIBODY COMPOSITION APPROPRIATE FOR PATIENT SUFFERING FROM FcϜRIIIa POLYMORPHISM
JP2003334088A (ja) 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20050282733A1 (en) 2002-06-27 2005-12-22 Prins Johannes B Differentiation modulating agents and uses therefor
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
HUE035898T2 (en) 2002-12-16 2018-05-28 Genentech Inc Immunoglobulin variants and their applications
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
SI1680140T1 (sl) 2003-10-16 2011-08-31 Imclone Llc Inhibitorji receptorja-1 za fibroblastni rastni faktor in metode za zdravljenje z le-temi
HUE038955T2 (hu) 2003-11-05 2018-12-28 Roche Glycart Ag Antigén-kötõ molekulák fokozott Fc receptor-kötõ affinitással és effektor funkcióval
ES2605443T3 (es) 2003-11-06 2017-03-14 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de auristatina con anticuerpos anti-HER2 o anti-CD22 y su uso en terapia
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
WO2005066211A2 (en) 2003-12-19 2005-07-21 Five Prime Therapeutics, Inc. Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
WO2005100402A1 (en) 2004-04-13 2005-10-27 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
EP1789443A1 (en) 2004-09-02 2007-05-30 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
TR201808537T4 (tr) 2004-09-23 2018-07-23 Genentech Inc Sistein değiştirilmiş antikorlar ve konjugatlar.
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
JP2006158339A (ja) 2004-12-09 2006-06-22 Kyoto Univ βＫｌｏｔｈｏ遺伝子、Ｃｙｐ７ａ１遺伝子、及びそれらの利用
JP2008522617A (ja) 2004-12-14 2008-07-03 イーライ リリー アンド カンパニー 線維芽細胞成長因子２１の突然変異タンパク質
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP5209505B2 (ja) 2006-02-10 2013-06-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｆｇｆ１９抗体およびその使用方法
EP2016101A2 (en) 2006-05-09 2009-01-21 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
TW201446265A (zh) 2007-04-02 2014-12-16 建南德克公司 克羅梭（ｋｌｏｔｈｏ）ｂｅｔａ調節劑之用途
US8697369B2 (en) 2007-04-06 2014-04-15 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Method for screening a test substance for activating a receptor associated with FGF 21 activity
US7537903B2 (en) 2007-04-23 2009-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
EP2188310B1 (en) 2007-08-03 2017-02-08 Genentech, Inc. Humanized anti-fgf19 antagonists and methods using same
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
NZ592009A (en) 2008-10-10 2012-11-30 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
MX2012006397A (es) * 2009-12-02 2012-11-30 Amgen Inc PROTEINAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFR1C HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFR1C HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA.
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
WO2011130417A2 (en) * 2010-04-15 2011-10-20 Amgen Inc. HUMAN FGF RECEPTOR AND β-KLOTHO BINDING PROTEINS
CN103415300B (zh) 2010-07-20 2018-02-23 诺沃—诺迪斯克有限公司 N‑末端修饰的fgf21化合物
WO2012158704A1 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Genentech, Inc. Fgfr1 agonists and methods of use
US9574002B2 (en) 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
TWI728373B (zh) 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
RS60593B1 (sr) 2014-01-24 2020-08-31 Ngm Biopharmaceuticals Inc Antitela koja vezuju domen 2 beta-kloto i postupci za njihovu upotrebu

Also Published As

Publication number Publication date
NZ720765A (en) 2022-02-25
HUE059701T2 (hu) 2022-12-28
CN105939727A (zh) 2016-09-14
CN111499754A (zh) 2020-08-07
HRP20221088T1 (hr) 2022-11-11
KR20220100104A (ko) 2022-07-14
JP2024096690A (ja) 2024-07-17
JP6687533B2 (ja) 2020-04-22
US20180105605A1 (en) 2018-04-19
IL290547A (en) 2022-04-01
KR102329693B1 (ko) 2021-11-23
PT3086807T (pt) 2022-09-05
AU2021282496A1 (en) 2022-01-06
IL277633A (en) 2020-11-30
US20220064331A1 (en) 2022-03-03
US20150218276A1 (en) 2015-08-06
EP3086807B1 (en) 2022-07-13
EA036107B1 (ru) 2020-09-29
MX2016008196A (es) 2017-03-14
EA201691321A1 (ru) 2017-02-28
WO2015100366A1 (en) 2015-07-02
EP4219555A1 (en) 2023-08-02
KR20160102030A (ko) 2016-08-26
IL245493A0 (en) 2016-06-30
JP2022115981A (ja) 2022-08-09
MY194936A (en) 2022-12-27
CA2929868C (en) 2023-07-11
CL2016001592A1 (es) 2017-03-24
JP2020125299A (ja) 2020-08-20
AU2014369872A1 (en) 2016-06-02
SI3086807T1 (sl) 2022-10-28
BR112016013960A2 (pt) 2018-01-09
CN105939727B (zh) 2020-03-17
US20190177432A1 (en) 2019-06-13
LT3086807T (lt) 2022-09-26
TWI670283B (zh) 2019-09-01
BR112016013960B1 (pt) 2023-03-14
US9884919B2 (en) 2018-02-06
US10882921B2 (en) 2021-01-05
UA120357C2 (uk) 2019-11-25
US20160319038A1 (en) 2016-11-03
PH12016500927A1 (en) 2016-07-18
PE20161152A1 (es) 2016-11-08
SG10202007790WA (en) 2020-09-29
DK3086807T3 (da) 2022-09-19
TW201531483A (zh) 2015-08-16
JP2017502695A (ja) 2017-01-26
MX2020009634A (es) 2020-10-08
US9873748B2 (en) 2018-01-23
CA2929868A1 (en) 2015-07-02
US20250011471A1 (en) 2025-01-09
US20240026033A1 (en) 2024-01-25
AU2019204128B2 (en) 2021-05-13
TW202010754A (zh) 2020-03-16
AU2021215189B2 (en) 2021-09-23
AU2019204128A1 (en) 2019-07-04
TWI728373B (zh) 2021-05-21
AU2021215189A1 (en) 2021-09-02
MX374976B (es) 2025-03-06
AU2014369872B2 (en) 2019-03-14
ES2926375T3 (es) 2022-10-25
CR20160338A (es) 2016-09-05
KR20210144910A (ko) 2021-11-30
EP3086807A1 (en) 2016-11-02
IL245493B (en) 2020-10-29
PL3086807T3 (pl) 2022-10-03
IL277633B (en) 2022-03-01
US10246518B2 (en) 2019-04-02
SG11201605071XA (en) 2016-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240026033A1 (en) Antibodies and methods of use
CN103596980B (zh) Fgfr1激动剂及使用方法
JP2021184714A (ja) 多重特異性抗体のスクリーニング方法
HK40033268A (en) Antibodies and methods of use
HK1224927B (en) Antibodies and methods of use
HK1224927A1 (zh) 抗体及其使用方法