RS55260B1 - Čestice slične virionu za dopremanje samoreplicirajućih rnk molekula - Google Patents

Čestice slične virionu za dopremanje samoreplicirajućih rnk molekula

Info

Publication number
RS55260B1
RS55260B1 RS20160879A RSP20160879A RS55260B1 RS 55260 B1 RS55260 B1 RS 55260B1 RS 20160879 A RS20160879 A RS 20160879A RS P20160879 A RSP20160879 A RS P20160879A RS 55260 B1 RS55260 B1 RS 55260B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rna
virus
liposomes
liposome
immunogen
Prior art date
Application number
RS20160879A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew Geall
Christian Mandl
Derek O'hagan
Manmohan Singh
Original Assignee
Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44629863&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS55260(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Glaxosmithkline Biologicals Sa filed Critical Glaxosmithkline Biologicals Sa
Publication of RS55260B1 publication Critical patent/RS55260B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Description

OBLAST TEHNIKE
[0001JOvaj pronalazak je u oblasti ne-virusnog dopremanja samoreplicirajućih RNK za imunizaciju.
OSNOVAPRONALASKA
[0002]Dopremanje nukleinskih kiselina za imunizaciju životinja bio je višegodišnji cilj. Testirani su različiti pristupi, uključujući upotrebu DNK ili RNK, virusnih ili ne-virusnih nosača za dopremanje (ili čak bez nosača za dopremanje, u "goloj" vakcini), replicirajućih ili ne-replicirajućih vektora, ili virusnih ili ne-virusnih vektora. Zhou et al. (Human Gene Therapv, 1999, vol. 10, no. 16, p. 2719-2724) i Saeki et al. (Human Gene Therapv, 1997, vol. 8, no. 17, p. 2133-2141) koristili su HVJ-lipozome, koji sadrže proteinski kapsid. Levine et al. (Nature Immunologv, 2004, vol. 5, no. 5, p. 460-464) objavili su pakovanje RNK replikona u virione. Mockev et al. (Cancer Gene Therapv, 2007, vol. 14, no. 9, p. 802-814) i Martinon et al.
(European Journal of Immunologv, 1993, vol. 23, no. 7, p. 1719-1722) dopremaju iRNK ali ne samoreplicirajuću RNK. Cannon et al. (DNA and Cell Biologv, 2002, vol. 21, no. 12, p. 953-961) objavljuju podatke o RNK spakovanoj u virione, korišćene u golom obliku, ili apsorbovane na čestice zlata.
[0003]Ostaje potreba za dodatnim i poboljšanim vakcinama sa nukleinskim kiselinama i, naročito, za poboljšane načine dopremanja vakcina sa nukleinskim kiselinama.
OPIS PRONALSKA
[0004]Prema pronalasku, imunizacija nukleinskom kiselinom je postignuta dopremanjem samoreplicirajuće RNK inkapsulirane unutar male čestice. RNK kodira imunogen od interesa, i čestica može dopremiti ovu RNK imitiranjem funkcije dopremanja prirodnog virusa.
[0005]Stoga pronalazak obezbeđuje ne-virionsku česticu koja ne sadrži proteinski kapsid, zain vivodopremanje RNK u ćeliju kičmenjača, gde je čestica lipozom i sadrži materijal za dopremanje koji inkapsulira samoreplicirajući RNK molekul koji kodira imunogen, gde je imunogen površinski polipeptid i može izazvati imuni odgovorin vivoprotiv bakterije, virusa, gljive ili parazita, i RNK ne uključuje modifikovane nukleotide, i izborno uključuje 5' kep strukturu. Ove čestice su korisne kao komponente u farmaceutskim kompozicijama za imunizaciju subjekata protiv različitih bolesti. Kombinacija korišćenja ne-virionske čestice da dopremi samoreplicirajuću RNK obezbeđuje način da se izazove snažan i specifičan imuni odgovor protiv imunogena uz dostavljanje samo niske doze RNK. Dodatno, ove čestice se mogu lako proizvesti u komercijalnim razmerama.
Čestica
[0006] Čestice pronalaska su ne-virionske česticetj.nisu virion. Stoga čestica ne sadrži proteinski kapsid. Izbegavanjem potrebe da se stvori čestica kapsida, pronalazak ne zahteva ćelijsku liniju za pakovanje, time omogućavajući lakše povećanje proizvodnje do komercijalnog nivoa i minimizovanje rizika da se opasni infektivni virusi proizvedu greškom.
[0007] Umesto inkapsuliranja RNK u virion, čestice pronalaska se formiraju od materijala za dopremanje. Različiti materijali su pogodni za formiranje čestica koje mogu dopremiti RNK u ćeliju kičmenjakain vivo.Materijali za dopremanje od naročitog interesa su amfifilni lipidi koj mogu formirati lipozome. Gde je dopremanje sa lipozomom, RNK treba da bude inkapsulirana.
[0008] Stoga jedan primer izvođenja čestice pronalaska sadrži lipozom koji inkapsulira samoreplicirajući RNK molekul koji kodira imunogen, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Cestice su poželjno u značajnoj meri sferične.
[0009] RNK je inkapsulirana unutar čestica (čestica je lipozom). Ovo znači daje RNK unutar čestica (kao i u prirodnom virusu) odvojena od bilo kojeg spoljašnjeg medijuma sa materijalom za dopremanje, i nađeno je da inkapsuliranje zaštićuje RNK od digestije sa RNazom. Inkapsulacija može biti u različitom obliku. Na primer, u nekim primerima izvođenja (kao u unilamelarnom lipozomu) materijal za dopremanje formira spoljašnji sloj oko vodenog jezgra koje sadrži RNK. Čestice mogu uključiti neku eksternu RNK( npr.na površini čestica), ali najmanje polovina RNK (i idealno sva) je inkapslirana. Inkapsuliranje unutar lipozoma razlikuje se od, na primer, kompleksa lipid/RNK opisanih u referenci 1.
[0010]Različiti amfiflni lipidi mogu oblikovati dvosloje u vodenoj sredini da bi inkapsulirali vodeno jezgro koje sadrži RNK kao lipozom. Ovi lipidi mogu imati anjonsku, katjonsku cviterjonsku hidrofilnu "glavu". Formiranje lipozoma od anjonskih fosfolipida datira iz 1960-ih, a lipozomi formirani od katjonskih lipida proučavani su od 1990-ih. Neki fosfolipidi su anjonski dok su drugi cviterjonski i drugi su katjonski. Pogodne klase fosfolipida uključuju, ali nisu ograničene na, fosfatidiletanolamine, fosfatidilholine, fosfatidilserine, i fosfatidil-glicerole, i neki korisni fosfolipidi su navedeni u Tabeli 1. Korisni katjonski lipidi uključuju, ali nisu ograničeni na, dioleoil trimetilamonijum propan (DOTAP), 1,2-disteariloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DSDMA), l,2-dioleiloksi-N,Ndimetil-3-aminopropan (DODMA), 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan (DLenDMA). Cviterjonski lipidi uključuju, ali nisu ograničeni na, acil cviterjonske lipide i etar cviterjonske lipide. Primeri korisnih cviterjonskih lipida su DPPC, DOPC i dodecilfosfoholin. Lipidi mogu biti zasićeni ili nezasićeni. Poželjno je korišćenje najmanje jednog nezasićenog lipida za pripremanje lipozoma. Ukoliko nezasićeni lipid ima dva repa, oba repa mogu biti nezasićena, ili mogu imati jedan zasićeni rep i jedan nezasićeni rep.
[0011]Lipozomalne čestice pronalaska mogu se formirati iz pojedinačnog lipida ili iz smeše lipida. Smeša može sadržati (i) smešu anjonskih lipida (ii) smešu katjonskih lipida (iii) smešu cviterjonskih lipida (iv) smešu anjonskih i katjonskih lipida (v) smešu anjonskih lipida i cviterjonskih lipida (vi) smešu cviterjonskih lipida i katjonskih lipida ili (vii) smešu anjonskih lipida, katjonskih lipida i cviterjonskih lipida. Slično tome, smeša može sadržati i zasićene i nezasićene lipide. Na primer, smeša može sadržati DSPC (cviterjonski, zasićeni), DlinDMA (katjonski, nezasićeni), i/ili DMG (anjonski, zasićeni). Gde je korišćena smeša lipida, ne moraju sve lipidne komponente biti amfifilne npr. jedan ili više amfifilnih lipida može se pomešati sa holesterolom.
[0012]Hidrofilni deo lipida može biti PEGilovan( tj.modifikovan kovalentnim vezivanjem polietilen glikola). Ova modifikacija može povećati stabilnost i sprečiti nespecifičnu apsorpciju lipozoma. Na primer, lipidi mogu biti konjugovani sa PEG korišćenjem tehnika kao što su one opisane u referencama 2 i 3. Mogu se koristiti PEG različite dužine, npr. između 0.5-8kDa.
[0013]Smeša DSPC, DlinDMA, PEG-DMG i holesterola je korišćena u primerima.
[0014]Lipozomalne čestice su obično podeljene u tri grupe: multilamelarne vezikule (MLV); male unilamelarne vezikule (SUV); i velike unilamelarne vezikule (LUV). MLV imaju višestruke dvosloje u svakoj vezikuli, formirajući nekoliko zasebnih vodenih odeljaka. SUV i T JTV imain ieHan Hvn«1ni Vnii inVanuulira vnrlpnn ip7(jrir S1TTV tinir^nn imain nrernit <S(lnm i LUV imaju prečnik >50nm. Lipozomalne čestice pronalaska su idealno LUV sa prečnikom u opsegu od 50-220nm. Za kompoziciju koja sadrži populaciju LUV sa različitim prečnicima: (i) najmanje 80% u odnosu na broj treba da ima prečnike u opsegu od 20-220nm, (ii) prosečan prečnik (Zav, po intenzitetu) populacije je u opsegu od 40-200nm, i/ili (iii) prečnici treba da imaju indeks polidisperzije <0.2. Očekuje se da kompleksi lipozom/RNK iz reference 1 imaju prečnik u opsegu od od 600-800nm i da imaju visoku polidisperziju.
[0015]Tehnike za pripremanje pogodnih lipozoma su dobro poznate u tehnici npr. videti reference 4 do 6. Jedan koristan postupak je opisan u referenci 7 i uključuje mešanje (i) etanolnog rastvora lipida (ii) vodenog rastvora nukleinske kiseline i (iii) pufera, nakon čega sledi mešanje, ekvilibrisanje, razblaživanje i prečišćavanje. Poželjni lipozomi pronalaska mogu se dobiti ovim procesom stvaranja smeše.
RNK
[0016]Čestice pronalaska uključuju samoreplicirajući RNK molekul koji (za razliku od siRNK) kodria imunogen. Nakonin vivoprimene čestica, RNK se oslobađa iz čestica i prenosi unutar ćelije da bi se obezbedio imunogenin situ.
[0017]Za razliku od reference 13, RNK u česticama pronalaska je samoreplicirajuća. Samoreplicirajući RNK molekul (replikon) može, kada je dopremljen u ćeliju kičmenjaka čak i bez bilo kog proteina, dovesti do proizvodnje višestrukih kćerki RNK putem sopstvene transkripcije (preko antisens kopije koju stvara od same sebe). Samoreplicirajući RNK molekul je stoga tipično molekul +-lanca koji se može direktno translatirati nakon dopremanja ćeliji, i ovu translacija obezbeđuje RNK-zavisna RNK polimeraza koja zatim proizvodi i antisens i sens transkripte od dopremljene RNK. Stoga dopremljena RNK dovodi do proizvodnje višestrukih kćerki RNK. Ove kćerke RNK, kao i kolinerani subgenomski transkripti, mogu same sebe translatirati da bi obezbediliin situekspresiju kodiranog imunogena, ili se mogu transkribovati da bi se obezbedili dodatni transkripti sa istim sensom kao dopremljena RNK koje su translatirane da bi se obezbedilain situekspresija imunogena. Ukupni rezultati ove sekvence transkripcija su ogromna amplifikacija u broju introdukovanih replikona RNK i tako da kodirani imunogen postaje glavni polipeptidni proizvod ćelija.
[0018]Jedan pogodan sistem za postizanje samoreplikacije na ovaj način je korišćenje replikona na osnovu alfavirusa. Ovi replikoni su RNK +-lanca što dovodi do translacije replikaze (ili replikaza-transkriptaze) nakon dopremanja u ćeliju. Replikaza se translatira kao poliprotein koji se auto-iseca da bi obezbedio replikacioni kompleks koji stvara genomske kopije —lanca dopremljene RNK +-lanca. Ovi transkripti —lanca mogu se sami transkribovati da bi dali dalje kopije roditeljske +-lančane RNK i takođe dali subgenomski transkript koji kodira imunogen. Translacija subgenomskog transkripta stoga dovodi doin situekspresije imunogena od strane inficirane ćelije. Pogodni alfavirus replikoni mogu koristiti replikazu iz Sindbis virusa, Semliki forest virusa, virusa istočnog konjskog encefalitisa, virusa Venecuelanskog konjskog encefalitisa,itđ.Mogu se koristiti nutantne ili sekvence divljeg tipa virusa,npr.atenuirani TC83 mutant VEEV korišćen je u replikonima [14].
[0019]Poželjni samoreplicirajući RNK molekul stoga kodira (i) RNK-zavisnu RNK polimerazu koja može transkribovati RNK iz samoreplicirajućeg RNK molekula i (ii) imunogen. Polimeraza može biti replikaza alfavirusa npr. da sadrži jedan ili više proteina alfavirusa nsPl, nsP2, nsP3 and nsP4.
[0020]Dok prirodni genomi alfavirusa kodiraju strukturne proteine viriona dodatno ne-strukturnom poliproteinu replikaze, poželjno je da samoreplicirajući RNK molekuli pronalaska ne kodiraju strukturne proteine alfavirusa. Stoga poželjna samoreplicirajuća RNK može voditi do proizvodnje sopstvenih kopija genomske RNK u ćeliji, ali ne do proizvodnje viriona koji sadrže RNK. Nesposobnost proizvodnje ovih viriona znači da, za razliku od alfavirusa divljeg tipa, samoreplicirajući RNK molekul ne može perpetuirati u infektivnom obliku. Strukturni proteini alfavirusa koji su neophodni za perpetuaciju kod virusa divljeg tipa odsutni su kod samoreplicirajućih RNK pronalaska i njihovo mesto je preuzeto od strane gena(ili više njh) koji kodira imunogen od interesa, tako da subgenomski transkript kodira imunogen pre nego strukturne proteine viriona alfavirusa.
[0021]Stoga samoreplicirajući RNK molekul koristan u pronalasku može imati dva otvorena okvira čitanja. Prvi (5') otvoreni okvir čitanja kodira replikazu; drugi (3') otvoreni okvir čitanja kodira imunogen. U nekim primerima izvođenja RNK može imati dodatne( npr.nishodne) otvorene okvire čitanja npr. da kodiraju dodatne imunogene (videti u nastavku) ili da kodiraju pomoćne polipeptide.
[0022]Poželjni samoreplicirajući RNK molekul ima 5' kep( npr.7-metilguanozin). Ovaj kep može poboljšatiin vivotranslaciju RNK. U nekim primerima izvođenja 5' sekvenca samoreplicirajućeg RNK molekula mora biti izabrana da bi se osigurala kompatibilnost sa kodiranom replikazom.
[0023]Samoreplicirajući RNK molekul može imati 3' poli-A rep. On takođe može uključiti poli-A sekvencu koju prepoznaje polimeraza( npr.AAUAAA) blizu njegovog 3' kraja.
[0024]Samoreplicirajući RNK molekuli mogu imati različite dužine ali su tipično dugački 5000-25000nukleotida npr.8000-15000 nukleotida, ili 9000-12000 nukleotida. Stoga je RNK duža od one u siRNK dopremanju.
[0025]Samoreplicirajući RNK molekuli će tipično biti jednolančani. Jednolančane RNK mogu generalno inicirati ađuvantski efekat vezivanjem za TLR7, TLR8, RNK helikaze i/ili PKR. RNK dopremljena u dvolančanom obliku (dsRNA) može se vezati za TLR3, i ovaj receptor takođe može biti aktiviran sa dsRNA koja je formirana ili tokom replikacije jednolančane RNK ili unutar sekundarne strukture jednolančane RNK.
[0026]Samoreplicirajuća RNK se može pogodno pripremitiin vitrotranskripcijom (IVT). IVT može koristiti (cDNK) šablon stvoren i propagiran u plazmidnom obliku u bakteriji, ili se može stvoriti sintetički (na primer genskom sintezom i/ili postupcima lančane reakcije polimeraze (PCR)). Na primer, DNK-zavisna RNK polimeraza (kao što su bakteriofag T7, T3 ili SP6 RNK polimeraze) mogu se koristiti da se transkribuje samoreplicirajuća RNK iz DNK šablona. Odgovarajuće reakcije kepiranja i dodavanja poli-A mogu se koristiti po potrebi (iako je poli-A replikona obično kodirana unutar DNK šablona). Ove RNK polimeraze mogu imati stringentne zahteve za transkribovani 5' nukleotid(e) i u nekim primerima izvođenja ovi zahtevi se moraju poklopiti sa zahtevima kodirane replikaze, da bi se osiguralo da IVT-transkribovana RNK može efikasno funkcionisati kao supstrat za njenu samo-kodiranu replikazu.
[0027]RNK ne uključuje modifikovane nukleotidetj.svi nukleotidi u RNK su standardni A, C, G i U ribonukleotidi (izuzev bilo koje 5' kep strukture, koja može uključiti 7'-metilguanozin). U nekim primerima izvođenja, RNK može uključivati 5' kep koji sadrži 7'-metilguanozin, i prva 1, 2 ili 3 5' ribonukleotida mogu biti metilovana na 2' poziciji riboze.
[0028]RNK korišćena u pronalasku idealno uključuje samo fosfodiestarske veze između nukleozida, ali u nekim primerima izvođenja može sadržati fosforamidatne, fosfortioatne, i/ili metilfosfonatne veze.
[0029]Količina RNK po čestici može varirati, i broj pojedinačnih samoreplicirajućih RNK molekula po čestici može zavisiti od karakteristika korišćene čestice. Generalno, čestica može uključiti od 1-500 RNK molekula. Za lipozom broj RNK molekula je tipično <50 po lipozomu npr. <20, <10, <5, ili 1-4. Za polimernu mikročesticu broj RNK molekula zavisiće od prečnika čestice ali može biti <50 po čestici( npr.<20, <10, <5, ili 1-4) ili od 50-200 po čestici. Idealno, čestica uključuje manje od 10 različitih vrsta RNKnpr.5,4, 3, ili 2 različite vrste; najpoželjnije, čestica uključuje pojedinačnu RNK vrstutj.svi RNK molekuli u čestici imaju istu sekvencu i istu dužinu.
Imunogen
[0030]Samoreplicirajući RNK molekuli korišćeni sa pronalaskom kodiraju polipeptidni imunogen. Nakon primene čestica imunogen je translatiranin vivoi može izazvati imuni odgovor kod primaoca protiv bakterije, virusa, gljive ili parazita (i, u nekim primerima izvođenja, protiv alergena; i u drugim primerima izvođenja, protiv tumor antigena). Imuni odgovor može sadržati odgovor antitela (obično uključujući IgG) i/ili ćelijski posredovan imuni odgovor. Polipeptidni imunogen će tipično izazvati imuni odgovor koji prepoznaje odgovarajući bakterisjki, virusni, gljivični ili parazitski (ili alrgenski ili tumorski) polipeptid, ali u nekim primerima izvođenja polipeptid može delovati kao mimotop da izazove imuni odgovor koji prepoznaje bakterijski, virusni, gljivični ili parazitski saharid. Imunogen je površinski polipeptid npr. adhezin, hemaglutinin, glikoprotein omotača, glikoprotein trna,itd.
[0031]Samoreplicirajući RNK molekuli mogu kodirati pojedinačni polipeptidni imunogen ili višestruke polipeptide. Višestruki imunogeni mogu biti prikazani kao pojedinačni polipeptdni imunogen (fuzioni polipeptid) ili kao posebni polipeptidi. Ukoliko su imunogeni eksprimirani kao posebni polipeptidi onda jedan ili više ovih može biti obezbeđeno sa ushodnim IRES ili dodatnim virusnim promotorskim elementom. Alternativno, višestruki imunogeni mogu biti eksprimirani od poliproteina koji kodira pojedinačne imunogene fuzionisane sa kratkom autokatalitičkom proteazom( npr.2A protein virusa slinavke i šapa), ili kao inteini.
[0032]Za razliku od referenci 1 i 16, RNK kodira imunogen. Za izbegavanje sumnje, pronalazak ne uključuje RNK koja kodira luciferazu svica ili koja kodira fuzioni proteinE. coli(3-galaktozidaze ili koja kodira zeleni fluorescentni protein (GFP). Takođe, RNK nije ukupna RNK timusa miša.
[0033]U nekim primerima izvođenja imunogen izaziva imuni odgovor protiv jedne od ovih bakterija:Neisseria meningitidis:korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, proteine membrane kao što su adhezini, autotransporteri, toksini, proteini za usvajanje gvožđa, i faktor H vezujući protein. Kombinacija tri korisna polipeptida je opisana u referenci 17.Streptococcus pneumoniae:korisni polipeptidni imunogeni su opisani u referenci 18. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, RrgB pilus subjedinicu, prekursor beta-N-acetil-heksozaminidaze (spr0057), spr0096, opšti protein stresa GSP-781 (spr2021, SP2216), serin/treonin kinaza StkP (SP 1732), i pneumokokni površinski adhezin PsaA.Streptococcus pyogenes:korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide opisane u referencama 19 i 20.
Moraxella catarrhalis.
Bordetella pertussis:korisni pertuzis imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, pertuzis toksin ili toksoid (PT), filamentozni hemaglutinin (FHA), pertaktin, i aglutinogene 2 i 3.Staphylococcus aureus:Korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide opisane u referenci 21, kao što je hemolizin, esxA, esxB, ferihrom-vezujući protein (sta006) i/ili staOll lipoprotein.
Clostridium tetani:tipični imunogen je toksoid tetanusa.
Cornynebacterium diphtheriae:tipični imunogen je toksoid difterije.
Haemophilus influenzae:korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide opisane u referencama 22 i 23.
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus agalactiae:korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide opisane u referenci 19.
Chlamydia trachomatis:korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, PepA, LcrE, ArU, DnaK, CT398, OmpHlike, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA i MurG{ npr.kao što je opisano u referenci 24. LcrE [25] i HtrA [26] su dva poželjna imunogena.
Chlamydia pneumoniae:korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide opisane u referenci 27.
Helicobacter pylori:korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, CagA, VacA, NAP, i/ili ureaza [28].
Escherichia coli:korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, imunogene izvedene iz enterotoksigeneE. coli(ETEC), enteroagregativneE. coli(EAggEC), difuzno adhezivneE. coli(DAEC), enteropatogeneE. coli(EPEC), ekstraintestinalne patogeneE. coli(ExPEC) i/ili enterohemoragičneE. coli(EHEC). ExPEC sojevi uključuju uropatogeneE. coli(UPEC) i meningitis/sepsa-povezaneE. coli(MNEC). Korisni UPEC polipeptidni imunogeni su opisani u referencama 29 i 30. Korisni MNEC imunogeni su opisani u referenci 31. Korisni imunogen za nekolikoE. colitipova je AcfD [32].
Bacillus anthracis
Yersiniapestis:korisni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one opisane u referencama 33 i 34.
Staphylococcus epidermis
Clostridium perfringensiliClostridium botulinums
Legionella pneumophila
Coxiella burnetii
Brucella,kaošto je B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis, B. pinnipediae.
Francisella,kaošto je F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis.
Neisseria gonorrhoeae
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi
Enterococcus faecalisiliEnterococcus faecium
Staphylococcus saprophyticus
Yersinia enterocolitica
Mycobacterium tuberculosis
Rickettsia
Listeria monocytogenes
Vibrio cholerae
Salmonella typhi
Borrelia burgdorferi
Porphyromonas gingivalis
Klebsiella
[0034]U nekim primerima izvođenja imunogen izaziva imuni odgovor protiv jednog od ovih virusa:Orthomyxovirus:korisni imunogeni mogu biti od influenca A, B ili C virusa, kao što je hemaglutinin, neuraminidaza ili matriksni M2 proteini. Gde je imunogen hemaglutinin influenca A virusa on može biti iz bilo kod podtipa npr. Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11,H12, H13, H14,H15 ili H16.Paramyxoviridaevirusi: virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Pneumovirusa( npr.respiratorni sincicijelni virus, RSV), Rubulavirusa( npr.virus zauški), Paramiksovirusa( npr.parainfluenca virus), Metapneumovirusa i Morbilivirusa( npr.male boginje).Poxviridae:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene izOrthopoxviruskao što jeVariola vera,uključujući, ali se ne ograničavajući na,Variola majoriVariola minor. Picornavirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Pikornavirusa, kao što su Enterovirusi, Rinovirusi, Heparnavirus, Kardiovirusi i Aftovirusi. U jednom primeru izvođenja, entero virus je polio virus npr. poliovirus tipa 1, tipa 2 i/ili tipa 3. U sledećem primeru izvođenja, entero virus je EV71 entero virus. U sledećem primeru izvođenja, enterovirus je koksaki A ili B virus.Bunyavirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene izOrthobunyavirus,kao što su virus Kalifornija encefalitisa,Phlebovirus,kao što je virus groznice doline Rift, iliNeurovirus,kao što je virusKrimsko- Kongo hemoragične groznice. Heparnavirus, :virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Heparnavirus, kao što je hepatitis A virus (HAV).Filovirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz filovirusa, kao što je Ebola virus (uključujući Zair, Obala Slonovače, Reston ili Sudan ebolavirus) ili Marburg virus.Togavirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Togavirusa, kao što je Rubivirus, Alfavirus, ili Arterivirus. Ovo uključuje virus rubeole.Flavivirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Flavivirus, kao što je virus encefalitisa koji se prenosi krpeljem (TBE), Denga (tip 1, 2, 3 ili 4) virus, virus žute groznice, virus japanskog encefalitisa, Kvasanur Forest Virus, virus encefalitisa zapadnog Nila, virus St. Louis encefalitisa, virus Ruskog prolećno-letnjeg encefalitisa, virus Powassan encefalitisa.
Pestivirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Pestivirus, kao što je goveđa virusna dijareja (BVDV), klasična svinjska groznica (CSFV) ili granična bolest
(BDV).
Hepadnavirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Hepadnavirus, kao što je Hepatitis B virus. Kompozicija može uključivati površinski antigen hepatitis B virusa (HBsAg).
Drugi virusi hepatitisa:Kompozicija može uključivati imunnogen iz hepatitis C virusa, delta hepatitis virusa, hepatitis E virusa, ili hepatitis G virusa.
Rhabdovirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Rhabdovirus, kao što je Lvssavirus( npr.virus besnila) i Vesiculovirus (VSV).
Caliciviridae:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Calciviridae, kao što je Norvvalk virus (Norovirus), i Norvvalk-slični virusi, kao što je Hawaii virus i virus snežne planine.
Coronavirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz SARS coronavirus, ptičijeg infektivnog bronhitisa (IBV), virusa mišjeg hepatitisa (MHV), i prenosivog svinjskog virusa gastroenteritisa (TGEV). Coronavirus imunogen može biti polipeptid trna.
Retrovirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Oncovirus, Lentivirus( npr.HIV-1 ili HIV-2) ili Spumavirus.
Reovirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Orthoreovirus, Rotavirus, Orbivirus, ili Coltivirus.
Parvovirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Parvovirus B19.
Herpesvirus:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz humanog herpesvirusa, kao što je, samo kao primer, Herpes Simplex virusi (HSV)( npr.HSV tipa 1 i 2), varičela-zoster virus (VZV), Epštajn-Bar virus (EBV), citomegalovirus (CMV), humani herpesvirus 6 (HHV6), humani herpesvirus 7 (HHV7), i humani herpesvirus 8 (HHV8).Papovaviruses:virusni imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, one izvedene iz Papilomavirusa i Poliomavirusa. (Humani) papilomavirus može biti serotipa 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 ili 65 npr. iz jednog ili više serotipova 6, 11, 16 i/ili 18.
Adenovirus:Virusni imunogeni uključuju one izvedene iz adenovirusa serotipa 36 (Ad-36).
[0035] U nekim primerima izvođenja, imunogen izaziva imuni odgovor na virus koji inficira ribe, kao što je: virus infektivne anemije lososa (ISAV), virus pankreasne bolesti lososa (SPDV), virus infektivne nekroze pankreasa (IPNV), virus kanalskog soma (CCV), virus riblje limfocistične bolesti (FLDV), virus infektivne hematopoetičke nekroze (IHNV), koi herpesvirus, pikorna-slični virus lososa (takođe poznat kao pikorna-slični virus atlantskog lososa), virus landlocked lososa (LSV), rotavirus atlanrtskog lososa (ASR), trout strawberry disease virus (TSD), virus tumora srebrnog lososa (CSTV), ili virus hemoragične septikemije
(VHSV).
[0036] Gljivični imunogeni mogu se izvesti iz Dermatophvtes, uključujući:Epidermophyton
floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum
equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum,
Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton naegnini,
Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum,
Trichophvton schoenleini, Trichophvton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum
var. album, var. discoides, var. ochraceum,Trichophvton violaceum,i/iliTrichophyton faviforme;ili odAspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus
nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus,
Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida
glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida
parahvsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi,
Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcusneoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae,
Microsporidia, Encephalitozoonspp.,Septata intestinalisiEnterocvtozoon bieneusi;manje uobičajene suBrachiolaspp,Microsporidiumspp.,Nosemaspp.,Pleistophoraspp.,Trachipleistophoraspp.,VittaformasppParacoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii,
Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii,
Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon
beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp.,
iVangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor
spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp,
Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp,
Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp,iCladosporium spp.
[0037] U nekim primerima izvođenja imunogen izaziva imuni odgovor protiv parazitskog oblika iz rodaPlasmodium,kao što jeP. falciparum, P. vivax, P. malariaeiliP. ovale.Stoga se pronalazak može koristiti za imunizaciju protiv malarije. U nekim primerima izvođenja imunogen izaiva imuni odgovor protiv parazita iz familijeCaligidae,naročito one iz rodovaLepeophtheirusiCaligus npr.morski račići kao što suLepeophtheirus salmonisiliCaligus
rogercresseyi.
[0038] U nekim primerima izvođenja imunogen izaziva imuni odgovor protiv: polenskih alergena (polenski alergeni drveća, zeljastih biljaka, korova i trava); alergeni insekata ili arahnida (inhalatorni, pljuvačni i alergeni otrova, npr. alergeni krpelja, alergeni bubašvaba i mušica, alergeni otrova opnokrilaca); alergeni životinjske dlake i peruti (iznpr.psa, mačke, konja, pacova, miša,Ud.) ;i alergeni hrane( npr.gliadin). Važni polenski alergeni od drveća, trava i zeljastih biljaka su takvi koji su poreklom iz taksonomskih redova Fagales, Oleales, Pinales i platanaceae uključujući, ali se ne ograničavajući na, brezu (Betula), jovu (Alnus), lešnik (Corvlus), grab (Carpinus) i maslinu (Olea), kedar (Crvptomeria i Juniperus), platan (Platanus), red Poales uključujući trave roda Lolium, Phleum, Poa, Cvnodon, Dactvlis, Holcus, Phalaris, Secale, i Sorghum, redove Asterales i Urticales uključujući zeljaste biljke iz redova Ambrosia, Artemisia, i Parietaria. Drugi važni inhalacioni alergeni su oni iz kućnih grinja iz roda Dermatophagoides i Euroglvphus, skladišne grinjenpr.Lepidoglyphys, Glycyphagus i Tvrophagus, oni iz bubašvaba, mušica i muva,npr.Blatella, Periplaneta, Chironomus i Ctenocepphalides, i one iz sisara kao što su mačka, pas i konj, alergeni otrova uključujući takve kao što su poreklom od insekata koji ubadaju ili grizu iz taksonomskog reda Hvmenoptera uključujući pčele( Apidae),ose( Vespidea),i mrave( Formicoidae).
[0039]U nekim primerima imunogen je tumor antigen izabran od: (a) antigena kancera testisa kao što je NYESO-l, SSX2, SCP1 kao i polipeptida iz familije RAGE, BAGE, GAGE i MAGE, na primer, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, i MAGE-12 (koji se može koristiti, na primer, za melanom, tumore pluća, glave i vrata, NSCLC, dojke, gastrointestinalne, i tumore bešike; (b) mutiranih antigena, na primer, p53 (povezan sa različitim solidnim tumorima,npr.,kolorektalni, kancer pluća, glave i vrata), p21/Ras (povezan sa,npr.,melanomom, kancerom pankreasa i kolorektalnim kancerom), CDK4 (povezan sa,npr.,melanomom), MUM1 (povezan sa,npr.,melanomom), kaspaza-8 (povezan sa,npr.,kancerom glave i vrata), CIA 0205 (povezan sa,npr.,kancerom bešike), HLA-A2-R1701, beta katenin (povezan sa,npr.,melanoma), TCR (povezan sa,npr.,T-ćelijskim ne-Hodgkin limfomom), BCR-abl (povezan sa,npr.,hroničnom mijelogenom leukemijom), triozafosfat izomeraza, KIA 0205, CDC-27, i LDLR-FUT; (c) prekomerno eksprimiranih antigena, na primer, Galektin 4 (povezan sa,npr.,kolorektalnim kancerom), Galektin 9 (povezan sa,npr.,Hodgkin bolešću), proteinaza 3 (povezana sa,npr.,hroničnom mijelogenom leukemijom), WT 1 (povezan sa,npr.,različitim leukemijama), karbonska anhidraza (povezana sa,npr.,kancerom bubrega), aldolaza A (povezana sa,npr.,kancerom pluća), PRAME (povezan sa,npr.,melanomom), HER-2/neu (povezan sa,npr., kanceromdojke, debelog creva, pluća i jajnika), mamaglobin, alfa-fetoprotein (povezan sa,npr.,hepatomom), KSA (povezan sa,npr.,kolorektalnim kancerom), gastrin (povezan sa,npr.,kancerom pankreasa i želuca), telomeraza katalitički protein, MUC-1 (povezan sa,npr.,kancerom dojke i jajnika), G-250 (povezan sa,npr.,karcinomom ćelija bubrega), p53 (povezan sa,npr.,kancerom dojke, debelog creva), i karcinoembrionalni antigen (povezan sa,npr.,kancerom dojke, pluća, i kancerima gastrointestinalnog trakta kao što je kolorektalni kancer); (d) zajednički antigen, na primer, melanom melanocite antigeni diferencijacije kao što su MART-l/Melan A, gplOO, MC1R, receptor za melanocite-stimulišući hormon, tirozinaza, tirozinazi srodni protein-1/TRPI i tirozinaza srodni protein-2/TRP2 (povezan sa,npr.,melanomom); (e) antigeni povezani sa prostatom kao što su PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, povezan sa,npr.,kancerom prostate; (f) idiotipovi imunoglobulina (povezan sa mijelomom i B ćelijskim limfomom, na primer). U određenim primerima izvođenja, tumor imunogeni uključuju, ali nisu ograničeni na, p 15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYLRAR, antigene Epštajn Bar virusa, EBNA, antigene humanog papilomavirusa (HPV), uključujući E6 i E7, antigene virusa hepatitisa B i C, humane antigene T-ćelijskog limfotropnog virusa, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23Hl, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, pl6, TAGE, PSCA, CT7,43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29VBCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, M0V18, NB/70K, NY-C0-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (Mac-2 vezujući protein/ciklofilin C-povezani protein), TAAL6, TAG72, TLP, TPS, i slično.
Farmaceutske kompozicije
[0040JČestice pronalaska su korisne kao komponente u farmaceutskim kompozicijama za imunizaciju subjekata protiv različitih bolesti. Ove kompozicije će tipično uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač kao dodatak česticama. Temeljna diskusija farmaceutski prihvatljvih nosača je dostupna u referenci 35.
[0041]Farmaceutska kompozicija pronalaska može uključiti jedan ili više imunopotencijatora malih molekula. Na primer, kompozicija može uključivati TLR2 agonist (npr. Pam3CSK4), TLR4 agonist( npr.aminoalkil glukozaminid fosfat, kao što je E6020), TLR7 agonist( npr.imihimod), TLR8 agonist( npr.rezihimod) i/ili TLR9 agonist( npr.IC31). Bilo koji takav agonist idealno ima molekulsku težinu od <2000Da. Gde je RNK inkapsulirana, u nekim primerima izvođenja takav agonist(i) su takođe inkapsulirani sa RNK, ali u drugim primerima izvođenja nisu inkapsulirani.
[0042]Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu uključiti čestice u običnoj vodi( npr.w.f.i.) ili u puferunpr.fosfatnom puferu, Tris puferu, boratnom puferu, sukcinatnom puferu, histidinskom puferu, ili citratnom puferu. Puferske soli će tipično biti uključene u 5-20mM opsegu.
[0043]Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu imati pH između 5.0 i 9.5npr.između 6.0 i 8.0.
[0044]Kompozicije pronalaska mogu uključiti natrijumove soli( npr.natrijum hlorid) da bi se dobila toničnost. Koncentracija od 10±2 mg/ml NaCl je tipičnanpr.oko 9 mg/ml.
[0045]kompozicije pronalska mogu uključiti helatore metalnih jona. Oni mogu produžiti RNK stabilnost uklanjanjem jona koji mogu ubrzati hidrolizu fosfodiestra. Stoga kompozicija može uključiti jedan ili više od EDTA, EGTA, BAPTA, pentetinska kiselina,Ud.Takvi helatori su tipično prisutni u između 10-500mMnpr.O.lmM. Citratna so, kao što je natrijum citrat, može takođe delovati kao helator, dok se takođe pogodno obezbeđuje puferska aktivnost.
[0046]Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu imati osmolalnost od između 200 mOsm/kg i 400 mOsm/kg,npr.između 240-360 mOsm/kg, ili između 290-310 mOsm/kg.
[0047]Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu uključiti jedan ili više konzervansa, kao što je tiomersal ili 2-fenoksietanol. Poželjne su kompozicije bez žive, i mogu se pripremiti vakcine bez konzervansa.
[0048]Farmaceutske kompozcije pronalaska su poželjno sterilne.
[0049]Farmaceutske kompozicije pronalska su poželjno ne-pirogene npr. sadrže <1 EU (endotoksin jedinica, standardna mera) po dozi, i poželjno <0.1 EU po dozi.
[0050]farmaceutske kompozicije pronalaska su poželjno bez glutena.
[0051]Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu biti pripremljene u jediničnom doznom obliku. U nekim primerima izvođenja jedinična doza može imati zapreminu od između 0.1-1 .Omi npr. oko 0.5ml.
[0052]Kompozicije mogu biti pripremljene kao injektabilne, bilo kao rastvori ili suspenzije. Kompozicija može biti pripremljena za primenu na plućanpr.putem inhalatora, korišćenjem finog spreja. Kompozicija se može pripremiti za nazalnu, auralnu ili okularnu primenunpr.kao sprej ili kapi. Injekcije za intramuskularnu primenu su tipične.
[0053]Kompozicije sadrže imunološki efikasnu količinu čestica, kao i bilo koje druge komponente, po potrebi. Pod 'imunološki efikasnom količinom', podrazumevano je da primena te količine na individuu, bilo u pojedinačnoj dozi ili kao deo serije, je efikasna u tretmanu ili prevenciji. Ova količina varira u zavisnosti od zdravlja i fizičke kondicije individue koja se tretira, starosti, taksonomske grupe individue koja se tretira( npr.ne-humani primat, primat,itd.),kapaciteta imunog sistema individue da sintetiše antitela, stepena željene zaštite, formulacije vakcine, procene medicinske situacije od strane odgovornog lekara, i drugih relevantnih faktora. Očekuje se da će količina biti u relativno širokom opsegu koji se može odrediti preko rutinskih proba. Cestice i RNK sadržaj kompozcija pronalaska će generalno biti izražena u odnosu na količinu RNK po dozi. Poželjna doza ima has <100ug RNK( npr.od 10-100)j,g, kao što je oko 10|ug, 25|ug, 50|a.g, 75|ug ili 100|ug), ali se može videti ekspresija na mnogo nižim nivoima npr. <lug/doza, <100ng/doza, <10ng/ doza, <lng/doza,itd.
[0054]Pronalazak takođe obezbeđuje uređaj za dopremanje( npr.špric, nebulizator, sprej, inhalator, dermalni flaster,itd.)koji sadrži farmaceutsku kompoziciju pronalaska. Ovaj uređaj se može koristiti za primenu kompozicije na kičmenjačkog subjekta.
[0055]Čestice pronalaska ne uključuju ribozome.
Postupci za tretman i medicinska upotreba
[0056]Za razliku od čestica opisanih u referenci 16, čestice i farmaceutske kompozicije pronalaska su zain vivoupotrebu za izazivanje imunog odgovora protiv imunogena od interesa.
[0057]Pronalazak obrzbeđuje česticu ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu u postupku za izazivanje imunog odgovora kod kičmenjaka koji sadrži primenu efikasne količine čestice ili farmaceutske kompozicije pronalaska. Imuni odgovor je zaštitni i poželjno uključuje antitela i/ili ćelijski posredovan imunitet. Postupak može izazvati buster odgovor.
[0058]Izazivanje imunog odgovora kod kičmenjaka sa ovim upotrebama i postupcima, kičmenjak može biti zaštićen protiv različitih bolesti i/ili infekcijanpr.protiv bakterijskih i/ili virusnih bolesti kao što je prethodno razmatrano. Čestice i kompozicije su imunogene, i poželjnije su kompozicije vakcine. Vakcine prema pronalasku mogu biti ili profilaktičke( tj.da spreče infekciju) ili terapeutske( tj.da tretiraju infekciju), ali će tipično biti profilaktičke.
[0059]Kičmenjak je poželjno sisar, kao što je čovek ili veliki veterinarski sisar( npr.konji, stoka, jeleni, koze, svinje). Gde su vakcine za profilaktičku upotrebu, čovek je poželjno dete( npr.dete ili odojče) ili tinejdžer; gde je vakcina za terapeutsku upotrebu, čovek je poželjno tinejdžer ili odrasla osoba. Vakcina nameravana za decu može se takođe primeniti na odrasle osobenpr.da bi se procenila bezbednost, doza, imunogenost,itd.
[0060]Vakcine pripremljene prema pronalasku mogu se koristiti da se tretiraju i deca i odrasli. Stoga humani pacijent može biti star manje od 1 godine, manje od 5 godina, 1-5 godina, 5-15 godina, 15-55 godina, ili najmanje 55 godina. Poželjni pacijenti za primanje vakcine su starije osobe( npr.<>50 godina starosti, >60 godina starosti, i poželjno >65 godina), mladi{ npr.<5 godina starosti), hospitalizovani pacijenti, zdravstveni radnici, naoružani službenici i vojno osoblje, trudnice, hronični bolesnici, ili pacijenti sa imunodeficijencijom. Međutim, vakcine nisu samo pogodne za ove grupe, i mogu se koristiti u opštijem slučaju u populaciji.
[0061]Kompozicije pronalaska će se generalno primenjivati direktno na pacijenta. Direktno dopremanje se može postići parenteralnom injekcijom( npr.potkožno, intraperitonealno, intravenski, intramuskularno, intradermalno, ili u intersticijalni prostor tkiva; za razliku od reference 1, intraglosalna injekcija se tipično ne koristi sa ovim pronalaskom). Alternativni putevi primene uključuju rektalnu, oralnu( npr.tableta, sprej), bukalnu, sublingvalnu, vaginalnu, topikalnu, transdermalnu ili transkutanu, intranazalnu, okularnu, auralnu, plućnu ili drugu mukozalnu primenu. Intradermalna i intramuskularna primena su dva poželjana puta. Injekcija može biti preko igle( npr.hipodermalne igle), ali se može alternativno koristiti injekcija bez igle. Tipična intramuskularna doza je 0.5 ml.
[0062]Pronalazak se može koristiti da izazove sistemski i/ili mukozalni imunitet, poželjno da izazove pojačani sistemski i/ili mukozalni imunitet.
[0063]Doza može biti šema sa pojedinačnom dozom ili šema sa više doza. Višestruke doze se mogu koristiti u šemi primarne imunizacije i/ili u šemi buster imunizacije. U šemi višestruke doze mogu se dati različite doze istim ili različitim putemnpr.parenteralna prva i mukozaqlna buster, mukozalna prva i parenteralni buster,itd.Višestruke doze će tipično biti primenjene najmanje u razmaku od 1 nedelje( npr.oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 6 nedelja, oko 8 nedelja, oko 10 nedelja, oko 12 nedelja, oko 16 nedelja,itd.).U jednom primeru izvođenja, višestruke doze se mogu primeniti oko 6 nedelja, 10 nedelja i 14 nedelja nakon rođenja, npr. na starosti od 6 nedelja, 10 nedelja i 14 nedelja, kao što je često korišćeno u World Health Organisation's Expanded Program on Immunisation ("EPI"). U alternativnom primeru izvođenja, dve primarne doze su primenje sa oko dva meseca razmaka, npr. oko 7, 8 ili 9 nedelja razmaka, nakon čega slede jedna ili više buster doza oko 6 meseci do 1 godine nakon druge primarne doze, npr. oko 6, 8, 10 ili 12 meseci nakon druge primarne doze. U sledećem primeru izvođenja, tri primarne doze su primenjene sa razmakom od oko dva meseca, npr. oko 7, 8 ili 9 nedelja razmaka, nakon čega sledi jedna ili više buster doza oko 6 meseci do 1 godine nakon tri primarne doze, npr. oko 6, 8, 10, ili 12 meseci nakon treće primarne doze.
Opšte
[0064]Izvođenje ovog pronalaska će upotrebiti, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke hernije, biohemije, molekularne biologije, imunologije i farmakologije, unutar mogućnosti tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti,npr.,reference 36-42,itd.
[0065] Termin "sadrži" obuhvata "uključuje" kao i "sastoji se"npr.kompozicija koja "sadrži" X može se sastojati isključivo od X ili može uključiti nešto dodatnonpr.X + Y.
[0066]Termin "oko" u odnosu na numeričku vrednost x je izborna i znači, na primer, jc±10%.
[0067]Reč "u značajnoj meri" ne isključuje "kompletno"npr.kompozicija koja " u značajnoj meri bez" Y može biti kompletno bez Y. Gde je neophodno, reč "u značajnoj meri" može biti izostavljena iz definicije pronalaska.
[0068]Reference na naelektrisanje, katjone, anjone, cviterjone,itd.,uzete su na pH 7.
[0069] TLR3 je Toll-slični receptor 3. To je pojedinačni transmembranski receptor koji igra ključnu ulogu u urođenom imunom sistemu. Poznati TLR3 agonisti uključuju poli(LC). "TLR3" je odobreno HGNC ime za gen koji kodira ovaj receptor, i njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC: 11849. RefSeq sekvenca za humani TLR3 gen je GL2459625.
[0070]TLR7 je Toll-slični receptor 7. To je pojedinačni transmembranski receptor koji igra ključnu ulogu u urođenom imunom sistemu. Poznati TLR7 agonisti uključujunpr.imihimod. "TLR7" je odobreno HGNC ime za gen koji kodira ovaj receptor, i njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC:15631. RefSeq sekvenca za humani TLR7 gen je GL67944638.
[0071] TLR8 je Toll-slični receptor 8. To je pojedinačni transmembranski receptor koji igra ključnu ulogu u urođenom imunom sistemu. Poznati TLR8 agonists uključujunpr.resihimod. "TLR8" je odobreno HGNC ime za gen koji kodira ovaj receptor, i njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC:15632. RefSeq sekvenca za humani TLR8 gen je Gl:20302165.
[0072] Porodica RIG-I-sličnog receptora ("RLR") uključuje različite RNK helikaze koje igraju ključnu ulogu u urođenom imunom sistemu [43]. RLR-1 (takođe poznat kao RIG-I ili retinoinska kiselina inducibilni gen I) ima dva domena za regrutovanje kaspaze blizu njegovog N-terminusa. Odobreno HGNC ime za gen koji kodira RLR-1 helikazu je "DDX58" (za DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) boks polipeptid 58) i jedinstveni HGNC ID je HGNC: 19102. RefSeq sekvenca za humani RLR-1 gen je GL77732514. RLR-2 (takođe poznat kao MDA5 ili gen 5 povezan sa diferencijacijom melanoma) takođe ima dva domena za regrutovanje kaspaze blizu njegovog N-terminusa. Odobreno HGNC ime za gen koji kodira RLR-2 helikazu je "IFIH1"
(za interferon indukovan sa helikaza C domenom 1) i jedinstveni HGNC ID je HGNC: 18873. RefSeq sekvenca za humani RLR-2 gen je GI: 27886567. RLR-3 (takođe poznat kao LGP2 ili laboratorija za genetiku i fiziologiju 2) nema domene za regrutovanje kaspaze. Odobreno HGNC ime za gen koji kodira RLR-3 helikazu je "DHX58" (za DEXH (Asp-Glu-X-His) boks polipeptid 58) i jedinstveni HGNC ID je HGNC:29517. RefSeq sekvenca za humani RLR-3 genjeGL-149408121.
[0073] PKR je dvolančana RNK-zavisna protein kinaza. Ona igra ključnu ulogu u urođenom imunom sistemu. "EIF2AK2" (za faktor 2-alfa kinaze 2 inicijacije eukariotske translacije) je odobreno HGNC ime za gen koji kodira ovaj enzim, i njegov jedinstveni HGNC ID je HGNC:9437. RefSeq sekvenca za humani PKR gen je GL208431825.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0074] Slika 1 prikazuje gel sa obojenom RNK. Staze prikazuju (1) markere (2) goli replikon (3) replikon nakon tretmana sa RNazom (4) replikon inkapsuliran u lipozom (5) lipozom nakon tretmana sa RNazom (6) lipozom tretiran sa RNazom zatim podvrgnut fenol/hloroform ekstrakciji.
Slika 2 je elektronska mikrografija lipozoma.
Slika 3 prikazuje ekspresiju proteina (kao relativne svetlosne jedinice, RLU) na dane 1, 3 i 6 nakon dopremanja RNK kao replikon spakovan u virion (kvadrati), gola RNK (trouglovi), ili mikročestice (krugovi).
Slika 4 prikazuje gel sa obojenom RNK. Staze prikazuju (1) markere (2) goli replikon (3) replikon inkapsuliran u lipozom (4) lipozom tretiran sa RNazom zatim podvrgnut fenol/hloroform ekstrakciji.
Slika 5 prikazuje ekspresiju proteina na dane 1, 3 i 6 nakon dopremanja RNK kao replikona spakovanog u virion (kvadrati), kao gola RNK (dijamanti), ili u lipozomima (+ = O.ljiig, x = l?g).
Slika 6 prikazuje ekspresiju proteina na dan 1, 3 i 6 nakon dopremanja četiri različite doze lipozom-inkapsulirane RNK.
Slika 7 prikazuje anti-F IgG titre kod životinja koje primaju replikom spakovan u virion (VRP ili VSRP), 1 |ag gole RNK, i 1 |ug lipozom-inkapsulirane RNK.
Slika 8 prikazuje anti-F IgG titre kod životinja koje primaju VRP, 1 |ug gole RNK, i O.lg ili 1 |tig lipozom-inkapsulirane RNK.
Slika 9 prikazuje titre neutralizujućih antitela kod životinja koje primaju VRP ili O.lg ili 1 ug lipozom-inkapsulirane RNK.
Slika 10 prikazuje ekspresione nivoe nakon dopremanja replikoma kao gole RNK (krugovi), lipozom-inkapsulirane RNK (trougao & kvadrat), ili kao lipopleks (invertovani trougao). Slika 11 prikazuje titre F-specifičnih IgG (2 nedelje nakon druge doze) nakon dopremanja replikona kao gole RNK (0.01-1 jj,g), lipozom-inkapsulirane RNK (0.01-10|ug), ili spakovane kao virion (VRP, 10<6>infektivnih jedinica ili IU).
Slika 12 prikazuje titre F-specifičnih IgG (krugovi) i titre PRNT (kvadrati) nakon dopremanja replikona kao gole RNK (1 |ug), lipozom-inkapsulirane RNK (0.1 ili 1 |iig), ili spakovane u virionu (VRP, IO<6>IU). Titri kod naivnih miševa su takođe prikazani. Pune linije prikazuju geometrijske sredine.
Slika 13 prikazuje proizvodnju intracelularnog citokina nakon restimulacije sa sintetičkim peptidima koj predstavljaju glavne epitope u F proteinu, 4 nedelje nakon druge doze. y-osa prikazuje % citokina + CD8+CD4-.
Slika 14 prikazuje titre F-specifičnih IgG (srednja vrednost log 10 titara ± std dev) tokom 63 dana (Slika 14A) i 210 dana (Slika 14B) nakon imunizacije teladi. Tri linije se lako razlikuju na dan 63 i, od dna do vrha su: PBS negativna kontrola; lipozom-dopremljena RNK; i "Triangle 4" proizvod.
Slika 15 prikazuje anti-HIV serum IgG titre kao odgovor na golu ("RNK") ili lipozom-inkapsuliranu ("LNP") RNK, ili na DNK dopremljenu elektroporacijom u mišić.
Slika 16 prikazuje IgG titre kod 13 grupa miševa. Svaki krug je individualni miš, i pune linije pokazuju geometrijske sredine. Tačkasta horizontalna linija je granica detekcije testa. 13 grupa su, sleva na desno, A do M kao što je prethodno opisano.
Slika 17 prikazuje (A) IL-6 i (B) IFNa (pg/ml) oslobođeno od pDC. Postoje 4 para stubića, sleva na desno: kontrola; imunizovani sa RNK+DOTAP; imunizovani sa RNA+lipofektamin; i imunizovani sa RNK u lipozomima. U svakom paru crni stubići su miševi divljeg tipa, sivo jersqlmutant.
NAČINI ZA IZVOĐENJE PRONALASKA
RNK replikoni
[0075] Različiti replikoni su korišćeni u nastavku. Generalno zasnovani su na hibridnom alfavirusnom genomu sa ne-strukturnim proteinima iz virusa venecuelanskog konjskog encefalitisa (VEEV), signala za pakovanje iz sindbis virusa, i 3' UTR iz Sindbis virusa ili VEEV mutanta. Replikon je oko lOkb dugačak i ima poli-A rep.
[0076] Plazmidna DNK koja kodira alfavirus replikone (označeni: pT7-mVEEV-FL.RSVF ili A317; pT7-mVEEV-SEAP ili A306; pSP6-VCR-GFP ili A50) služila je kao šablon za sintezu RNKin vitro.Replikoni su sadržali genetičke elemente alfavirusa potrebne za RNK replikaciju, ali su im nedostajali oni proizvodi kodirajućih gena neophodni za sastavljanje čestica; strukturni proteini su umesto toga zamenjeni sa proteinom od interesa (bilo reporter, kao što je SEAP ili GFP, ili imunogen, kao što je RSV F protein pune dužine) tako da su replikoni nesposobni da indukuju stvaranje infektivnih čestica. Bakteriofag (T7 ili SP6) promoter ushodno od cDNK alfavirusa olakšava sintezu RNK replikonain vitroi ribozim delta virusa hepatitisa (HDV) neposredno nishodno od poli(A)-repa stvara korektni 3'-kraj preko njegove samo-isecajuće aktivnosti.
[0077] Nakon linearizacije plazmidne DNK nishodno od HDV ribozima sa pogodnom restrikcionom endonukleazom, "run-off' transkripti su sintetisani in vitro korišćenjem T7 ili SP6 bakteriofag DNK-zavisne RNK polimeraze. Transkripcije su izvedene 2 časa na 37°C u prisustvu 7.5 mM (T7 RNK polimeraze) ili 5 mM (SP6 RNK polimeraze) svakog od nukleozid trifosfata (ATP, CTP, GTP i UTP) praćenjem uputstava obezbeđenih od strane proizvođača (Ambion). Nakon transkripcije šablonska DNK je digestovana sa TURBO Dnase (Ambion). Replikon RNK je istaložena sa LiCl i rekonstituisana u vodi bez nukleaze. Nekepovana RNK je kepovana post-transkripciono sa Vaccinia Capping Enzvme (VCE) korišćenjem ScriptCap m7G Capping Svstem (Epicentre Biotechnologies) kao što je navedeno u priručniku; replikonima kepovanim na ovaj način dat je prefiks "v" npr. vA317 je A317 replikon kepovan sa VCE. Post-transkripciono kepovana RNK je istaložena sa LiCl i rekonstituisana sa vodom bez nukleaze. Koncentracija RNK uzoraka je određena merenjem OD260nm. Integritetin vitrotranskripata je potvrđen denaturacionom elektroforezom na agaroznom gelu.
PLG apsorpcija ( referentniprimer)
[0078] Mikročestice su napravljene korišćenjem 500mg PLG RG503 (50:50 laktid/glikolid molarnog odnosa, MW~30kDa) i 20mg DOTAP korišćenje Omni Macro Homogenizer. Suspenzija čestica je šejkirana na 150rpm preko noći i zatim filtrirana kroz 40um sterilni filter za skladištenje na 2-8 °C. Samoreplicirajuća RNK je apsorbovana na česticama. Da bi se pripremilo 1 mL PLG/RNK suspenzije neophodna zapremina PLG suspenzije čestica dodata je u vijalicu i dodata je voda bez nukleaze da bi se postigla zapremina od 900uL. lOOmL RNK (10 )j,g/mL) dodato je u kapima PLG suspenziji, uz konstantno šejkiranje. PLG/RNK je inkubirana na sobnoj temperaturi 30 min. 1 mL rekonstituisane suspenzije, 45mg manitola, 15mg saharoze i dodato je 250-500 |ug PVA. Vijalice su zamrznute na -80°C i liofilizovane.
[0079] Da bi se procenila RNK apsorpcija, 100 uE suspenzije čestice je centri fugi rano na 10,000 rpm 5 min i sakupljen je supernatant. PLG/RNK je rekonstituisana korišćenjem lmL vode bez nukelaze. U 100 uE suspenzije čestica (1 |Ltg RNK), dodato je lmg heparin sulfata. Smeša je vorteksovana i ostavljena na sobnoj temperaturi 30 min za desorpciju RNK. Suspenzija čestica je centrifugirana i sakupljen je supernatant.
[0080] Za stabilnost RNaze, 100 uL supsenzija čestica je inkubirana sa 6.4mAU RNaze A na sobnoj temperaturi 30 min. Rnazaje inaktivirana sa 0.126mAU Proteinaze Kna 55°C 10 min. Dodat je lmg heparin sulfata za desorpciju RNK nakon čega je izvršeno centrifugiranje. Uzorci supernatanta koji su sadržali RNK pomešani su sa formaldehidna marker boja, zagrejani na 65°C 10 min i analizirani korišćenjem 1% denaturišućeg gela (460ng RNK napunjeno po stazi).
[0081] Da bi se procenila ekspresija, Balb/c miševi su imunizovani sa l)j,g RNK u lOOuL zapremine za intramuskularno injektiranje (50uX/nozi) na dan 0. Serumi su sakupljeni na dane 1, 3 i 6. Ekspresija proteina je određena korišćenjem testa hemiluminescencije. Kao što je prikazano na Slici 3, ekspresija je bila viša kada je RNK dopremljena sa PLG (trouglovi) nego bez bilo kakve čestice za dopremanje (krugovi).
Lipozomalna inkapsulacija
[0082]RNK je inkapsulirana u lipozomima napravljenim postupkom iz referenci 7 i 44. Lipozomi su napravljeni od 10% DSPC (cviterjonski), 40%> DlinDMA (katjonski), 48% holesterola i 2% PEG-konjugovanog DMG (2kDa PEG). Ove proporcije se odnose na % mola u ukupnom lipozomu. [00831DlinDMA (l,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan) je sintetisan korišćenjem procedure iz reference 2. DSPC (l,2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfoholin) je kupljen od Genzvme. Holesterol je dobijen od Sigma-Aldrich. PEG-konjugovani DMG (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol), amonijum so), DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan, hloridna so) i DC-hol (3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetan)-karbamoil]holesterol hidrohlorid) bili su od Avanti Polar Lipids.
[0084]Ukratko, lipidi su rastvoreni u etanolu (2ml), RNK replikon je rastvoren u puferu (2ml, lOOmM natrijum citrata, pH 6) i pomešani su sa 2ml pufera nakon čega je sledio 1 čas ekvilibrisanja. Smeša je razblažena sa 6ml pufera a zatim je filtrirana. Rezultujući proizvod je sadržao lipozome, sa~95% efikasnošću inkapsulacije.
[0085]Na primer, u jednom naročitom postupku, sveži lipidni stok rastvori su pripremljeni u etanolu. 37 mg DlinDMA, 11.8 mg DSPC, 27.8 mg holesterolu i 8.07 mg PEG-DMG je izmereno i rastvoreno u 7.55 mL etanola. Sveže pripremljeni lipidni stok rastvor je nežno mešan na rokeru na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim, 755 uE stoka je dodato u 1.245 mL etanola da bi se napravio radni lipidni stok rastvor od 2 mL. Ova količina lipida je korišćena za formiranje lipozoma sa 250 ug RNK. 2 mL radnog rastvora RNK je takođe pripremljeno od stok rastvora~lug/mL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Tri 20 mL staklene vijalice (sa šipkama za mešanje) su isprane sa Rnase Away rastvorom (Molecular BioProducts) i isprane sa puno MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale vijalice od RNaze. Jedna od vijalica je korišćena kao RNK radni rastvor, a ostale za sakupljanje smeše lipida i RNK (kao što je kasnije opisano). Radni rastvori lipida i RNK zagrejani su na 37°C 10 min pre nego što su napunjeni u 3cc luer-lok špriceve. 2 mL citratnog pufera (pH 6) je napunjeno u drugi 3 cc špric. Spricevi sa RNK i lipidima su povezani sa T mikserom (PEEK™ 500 um ID junction, Idex Health Science) korišćenjem FEP cevčica (fluorovani etilenpropilen; sve korišćene FEP cevčice imale su 2mm unutrašnji prečnik i 3mm spoljašnji prečnik; dobijene od Idex Health Science). Izlaz iz T miksera je takođe bio sa FEP cevčicama. Treći špric sa citratnim puferom povezan je za poseban deo cevčica. Svi špricevi su zatim pokrenuti na stopi protoka od 7 mL/min korišćenjem pumpe za špric. Izlazi cevi su postavljeni tako da sakupljaju smeše u 20 mL staklenu vijalicu (uz mešanje). Stap za mešanje je izvađen i dozvoljeno je da se etanol/vodeni rastvor uravnoteži do sobne temperature 1 č. 4 ml smeše je napunjeno u 5 cc špric, koji je povezan sa delom FEP cevčica i u drugi 5 cc špric povezan sa FEP cevčicama iste dužine, napunjena je jednaka količina od 100 mM citratnog pufera (pH 6). Dva šprica su pokrenuta na stopi protoka od 7mL/min korišćenjem pumpe za špric i finalna smeša je sakupljena u 20 mL staklene vijalice (uz mešanje). Sledeće, smeša sakupljena iz drugog koraka mešanja (lipozomi) je provedena kroz Mustang Q membranu (anjon-izmenjivačka podloga koja vezuje i uklanja anjonske molekule, dobijenu od Pali Corporation). Pre korišćenja ove membrane za lipozome, kroz nju je sukcesivno propuštano 4 mL 1 M NaOH, 4 mL 1 M NaCl i 10 mL 100 mM citratnog pufera (pH 6). Lipozomi su zagrevani 10 min na 37°C pre propuštanja kroz membranu. Sledeće, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizirani preko 10-15 zapremina IX PBS korišćenjem filtracije tangencijalnog protoka pre rekuperovanja finalnog proizvoda. TFF sistem i membrane za filtriranje sa šupljim vlaknima kupljene su od Spectrum Labs (Rancho Dominguez) i korišćene su prema uputstvima proizvođača. Korišćene su polisulfonske filtracione membrane sa šupljim vlaknima sa porama za maksimalnu veličinu od 100 kD i 8 cm<2>površine. Zain vitroiin vivoeksperimentalne formulacije su razblažene do zahtevane koncentracije RNK sa IX PBS. Dodatni postupci za proizvodnju lipozoma dati su u nastavku.
[0086]Slika 2 prikazuje primer elektronske mikrografije lipozoma pripremljenih ovim postupcima. Ovi lipozomi sadrže inkapsuliranu RNK koja kodira RSV F antigen pune dužine. Dinamičko rasipanje svetlajedne serije je pokazalo prosečni prečnik od 141nm (po intenzitetu) ili 78nm (po broju).
[0087]Procenat inkapsulirane RNK i koncentracija RNK određene su sa Quant-iT RiboGreen RNA kompletom reagensa (Invitrogen), prateći uputstva proizvođača. Standard ribozomalne RNK obezbeđen u kompletu korišćen je za stvaranje standardne krive. Lipozomi su razblaženi 10x ili 100x u IX TE puferu (iz kompleta) pre dodavanja boje. Zasebno, lipozomi su razblaženi 10x ili 100x u IX TE puferu koji sadrži 0.5% Triton X pre dodavanja boje (da bi se disruptovali lipozomi i stoga da se testira ukupna RNA). Nakon toga je dodata jednaka količina boje u svaki rastvor i zatim je~180 uL svakog rastvora nakon dodavanja boje napunjen u duplikatu u 96 komornu ploču za kulturu tkiva. Fluorescencija (Ex 485 nm, Em 528 nm) je očitavana na čitaču za mikroploče. Sve formulacije lipozoma su doziranein vivona osnovu inkapsulirane količine
RNK.
[0088]Pokazano je da inkapsulacija u lipozome štiti RNK od digestije sa RNazom. Eksperimenti su koristili 3.8mAU Rnaze A po mikrogramu RNK, inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi. RNaza je inaktivirana sa Proteinazom K na 55°C 10 minuta. 1:1 v/v smeše uzorka prema 25:24:1 v/v/v, fenol:hloroform:izoamil alkohol je zatim dodato da bi se ekstrahovala RNK iz lipida u vodenu fazu. Uzorci su mešani vorteksovanjem nekoliko sekundi i zatim su stavljeni u centrifugu 15 minuta na 12k RPM. Vodena faza (koja sadrži RNK) uklonjena je i korišćena za analizu RNK. Pre punjenja (400 ng RNK po komorici) svi uzorci su inkubirani sa formaldehidnom marker bojom, denaturisani 10 minuta na 65°C i ohlađeni do sobne temperature. Ambion Millennium markeri su korišćeni da bi se aproksimirala molekulska težina RNK konstrukta. Gel je pušten na 90 V. Gel je obojen korišćenjem 0.1% SYBR gold prema uputstvima proizvođača u vodi na rokeru na sobnoj temperaturi 1 čas. Slika 1 prikazuje da RNaza potpuno razlaže RNK u odsustvu inkapsulacije (staza 3). RNK se ne može detektovati nakon inkapsulacije (staza 4), i nije uočena promena ukoliko se ovi lipozomi tretiraju sa RNzom (staza 4). Nakon što su RNaza-tretirani lipozomi podvrgnuti ekstrakciji sa fenolom, uočena je nedigestovana RNK (staza 6). Čak i nakon 1 nedelje na 4°C RNK se mogla uočiti bez ikakve fragmentacije (Slika 4, strelica). Ekspresija proteinain vivobila je nepromenjena nakon 6 nedelja na 4 °C i jednog ciklusa zamrzavanja i odmrzavanja. Stoga je lipozom-inkapsulirana RNK stabilna.
[0089] Da bi se procenilain vivoekspresija RNK reporter enzim (SEAP; sekretovana alkalna fosfataza) kodirana je u replikonu, umesto imunogena. Ekspresioni nivoi su mereni u serumu razblaženom 1:4 u IX Phospha-Light puferu za razblaživanje korišćenjem hemiluminescentnog supstrata alkalne fosfataze. 8-10 nedelja stari BALB/c miševi (5/grupi) intramuskularno su injektirani na dan 0, 50ul po nozi sa O.lug ili lug dozom RNK. Isti vektor je takođe primenjen bez lipozoma (u IX PBS bez RNaze) na 1 ug. Replikoni spakovani u virionu su takođe testirani. Replikoni spakovani u virionu koji su ovde korišćeni (označeni kao "VRPs") dobijeni su postupcima iz reference 45, gde je replikon alfavirusa izveden iz mutanta VEEV ili himere izvedene iz genoma VEEV konstruisane tako da sadrži 3' UTR Sindbis virusa i signal za pakovanje Sindbis virusa (PS), spakovane njihovom ko-elektroporacijom u BHK ćelije sa defektnim helper RNK koje kodiraju gene kapsida i glikoproteina Sindbis virusa.
[0090] Kao što je prikazano na Slici 5, inkapsulacija je povećala SEAP nivoe okoVi logna lug dozi, i na dan 6 ekspresija od O.lug enkapsulirane doze poklapala se sa nivoima uočenim sa 1 ug neinkapsulirane doze. Na dan 3 ekspresioni nivoi su prevazišli one postignute sa VRPs (kvadrati). Takva ekspresija povećala se kada je RNK formulisana u lipozomima u odnosu na kontrolu sa golom RNK, čak i na 10x nižoj dozi. Ekspresija je takođe bila viša u odnosu na VRP kontrolu, ali je kinetika ekspresije bila veoma različita (videti Sliku 5). Dopremanje RNK elektroporacijom rezultovalo je u povećanoj ekspresiji u odnosu na kontrolu sa golom RNK, ali su ovi nivoi bili niži nego sa lipozomima.
[0091]Dalji SEAP eksperimenti su pokazali jasan odgovor na dozuin vivo,sa uočenom ekspresijom nakon dopremanja čak i tako male količine kao što je lng RNK (Slika 6). Dalji eksperimenti poređenja ekspresije iz inkapsuliranih i golih replikona ukazali su daje 0.01 ug inkapsulirane RNK bio ekvivalentan sa 1 ug gole RNK. Na 0.5 ug dozi RNK inkapsulirani materijal davao je 12-puta višu ekspresiju na dan 6; na 0.1 ug dozi nivoi su bili 24-puta viši na dan 6.
[0092]Umesto posmatranja prosečnih nivoa u grupi, takođe su proučavane pojedinačne životinje. Dok nekoliko životinja nije imalo odgovor na gole replikone, inkapsulacija je eliminisala životinje bez odgovora.
[0093] Dalji eksperimenti su zamenili DlinDMA sa DOTAP. Iako su DOTAP lipozomi dali bolju ekspresiju od golog replikona, bili su inferiorni u odnosu na DlinDMA lipozome (2- do 3-struka razlika na dan 1).
[0094]Da bi se procenilain vivoimunogenost replikon je konstruisan tako da eksprimira F protein pune dužine iz respiratornog sincicijelnog virusa (RSV). Dopremljen je kao go (1 ug), inkapsuliran u lipozomima (0.1 ili 1 ug), ili spakovan u virione (10<6>IU; "VRP") na dane 0 i 21. Slika 7 prikazuje anti-F IgG titre 2 nedelje nakon druge doze, i lipozomi jasno poboljšavaju imunogenost. Slika 8 prikazuje titre 2 nedelje kasnije, do kada nije bilo statističke razlike između inkapsulirane RNK na 0.1 ug, inkapsulirane RNK na 1 ug, ili VRP grupe. Neutralizacioni titri (mereni kao 60% redukcije plaka, "PRNT60") nisu bili značajno različiti u ove tri grupe 2 nedelje nakon druge doze (Slika 9). Slika 12 prikazuje i IgG i PRNT titre 4 nedelje nakon druge doze.
[0095]Slika 13 potvrđuje da RNK izaziva robusni CD8 T ćelijski odgovor.
[0096]Dalji eksperimenti su poredili F-specifične IgG titre kod miševa koji su primili VRP, 0.1 ug lipozom-inkapsulirane RNK, ili 1 ug lipozom-inkapsulirane RNK. Odnosi titara (VRP: lipozom) u različita vremena nakon druge doze bili su kao što sledi:
[0097]Stoga lipozom-inkapsulirana RNK indukuje suštinski istu veličinu imunog odgovora kao što je uočeno sa dopremanjem viriona.
[0098]Dalji eksperimenti su pokazali superiorne F-specifične TgG odgovore sa 10 ug dozom, ekvivalentne odgovore za 1 ug i 0.1 ug doze, i niži odgovor sa 0.01 ug dozom. Slika 11 prikazuje IgG titre kod miševa koji primaju replikon u golom obliku na 3 različite doze, u lipozomima na 4 različite doze, ili kao VRP (IO<6>RJ). Odgovor uočen sa 1 ug lipozom-inkapsuliranom RNK nije bio statistički značajan (ANOVA) u poređenju sa VRP, ali je viši odgovor uočen sa 10 ug lipozom-inkapsulirane RNK bio je statistički značajan (p<0.05) u poređenju sa obe ove grupe.
[0099]Dalja studija potvrdila je da je 0.1 ug lipozom-inkapsulirane RNK dalo mnogo više anti-F IgG odgovore (15 dana nakon druge doze) nego 0.1 ug dopremljene DNK, i čak je bila imunogenija od 20 ug plazmidne DNK koja kodira F antigen, dopremljene elektroporacijom (Elgen™ DNA Deliverv Svstem, Inovio).
[0100]Miševi su pokazivali nekoliko vizuelnih znakova poremećaja (gubitak težine,itd.)nakon primanja lipozom-inkapsuliranog RNK replikona, iako je prolazni gubitak težine od 3-4% uočen nakon druge doze od 10 ug RNK. Nasuprot tome, dopremanje 10 ug lipozom-inkapsulirane DNK dovelo je do 8-10% gubitka težine.
Mehanizam dejstva
[0101]Dendritske ćelije izvedene iz kostne srži (pDC) dobijene su iz miševa divljeg tipa ili "Resq"( rsql)mutantnog soja. Mutantni soj ima tačkastu mutaciju na amino terminusu njegovog TLR7 receptora koji prekida TLR7 signalizaciju bez uticaja na vezivanje Uganda [46]. Ćelije su stimulisane sa replikonom RNK formulisanom sa DOTAP, lipofektaminom 2000 ili unutar lipozoma. Kao što je prikazano na Slici 17, IL-6 i INFa su indukovani u WT ćelijama ali je ovaj odgovor skoro kompletno ukinut kod mutantnih miševa. Ovi rezultati prikazuju da je TLR7 neophodan za prepoznavanje RNK u imunim ćelijama, i da lipozom-inkapsulirani replikoni mogu izazvati da imune ćelije izlučuju visoke nivoe i interferona i proinflamatornih citokina.
[0102]Generalno, pokazano je da lipozom-izvedeni RNK replikoni indukuju nekoliko serumskih citokina u okviru 24 časa od intramuskularne injekcije (IFN-a, IP-10 (CXCL-10), IL-6, KC, IL-5, IL-13, MCP-1, i MIP-a), dok je samo MIP-1 indukovan sa golom RNK i sam lipozom je indukovao samo IL-6.
[0103]Pokazano je da IFN-a doprinosi imunom odgovoru na lipozom-inkapsulirani RSV-F-kodirajući replikon jer je anti-IFNa receptor (IFN ARI) antitelo dovelo do 10-strukog smanjenja F-specifičnog serumskog IgG nakon 2 vakcinacije.
[0104]Generalno je uočeno da lipozom-dopremljeni RNK replikoni izazivaju balansirani profil IgGl:IgG2a podtipa kod miševa, ponekad sa višim IgG2a/IgGl odnosom od onog uočenog sa elektroporisanom DNK ili sa protein/MF59 imunizacijama( tj.Thl-tip imunog odgovora).
Postupci proizvodnje lipozoma
[0105]Generalno, korišćeno je osam različitih postupaka za pripremanje lipozoma prema pronalasku. Ovi su označeni u tekstu kao postupci (A) do (H) i uglavnom se razlikuju u odnosu na korake filtracije i TFF. Detalji su kao što sledi: (A) Sveži lipidni stok rastvori u etanolu su pripremljeni. 37 mg DlinDMA, 11.8 mg DSPC, 27.8 mg holesterola i 8.07 mg PEG DMG 2000 su izmereni i rastvoreni u 7.55 mL etanola. Sveže pripremljeni lipidni stok rastvor je nežno mešan na rokeru na 37°C oko 15 min da bi se formirala homogena smeša. Zatim, 755 uL stoka je dodato u 1.245 mL etanola da bi se napravio radni lipidni stok rastvor od 2 mL. Ova količina lipida je korišćena za formiranje lipozoma sa 250 ug RNK. 2 mL radnog rastvora RNK je takođe pripremljeno iz stok rastvora od~1 ug/mL u 100 mM citratnom puferu (pH 6). Tri 20 mL staklene vijalice (sa šipkama za mešanje) su isprane sa Rnase Away rastvorom (Molecular BioProducts, San Diego, CA) i isprane sa puno MilliQ vode pre upotrebe da bi se dekontaminirale vijalice od RNaze. Jedna od vijalica je korišćena kao RNK radni rastvor a ostale za sakupljanje smeše lipida i RNK (kao što je kasnije opisano). Radni rastvori lipida i RNK zagrejani su na 37°C 10 min pre nego što su napunjeni u 3cc luer-lok špriceve. 2 mL citratnog pufera (pH 6) je napunjeno u drugi 3 cc špric. Špricevi sa RNK i lipidima su povezani sa T mikserom (PEEK™ 500 um ID junction, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) korišćenjem FEP cevčica (fluorovani etilenpropilen; sve korišćene FEP cevčice imale su 2mm unutrašnji prečnik x 3mm spoljašnji prečnik; dobijene od Idex Health Science). Izlaz iz T miksera je takođe bio sa FEP cevčicama. Treći špric sa citratnim puferom povezan je za poseban deo cevčica. Svi špricevi su zatim pokrenuti na stopi protoka od 7 mL/min korišćenjem pumpe za špric. Izlazi cevi su postavljeni tako da sakupljaju smeše u 20 mL staklenu vijalicu (uz mešanje). Štap za mešanje je izvađen i dozvoljeno je da etanol/vodeni rastvor uravnoteži do sobne temperature 1 č. 4 ml smeše je napunjeno u 5 cc špric, koji je povezan sa delom FEP cevčica i u drugi 5 cc špric povezan sa FEP cevčicama iste dužine, napunjena je jednaka količina od 100 mM citratnog pufera (pH 6). Dva šprica su pokrenuta na stopi protoka od 7mL/min korišćenjem pumpe za špric i finalna smeša je sakupljena u 20 mL staklene vijalice (uz mešanje). Sledeće, smeša sakupljena iz drugog koraka mešanja (lipozomi) je provedena kroz Mustang Q membranu (anjon-izmenjivačka podloga koja vezuje i uklanja anjonske molekule, dobij en od Pali Corporation, AnnArbor, MI, USA). Pre korišćenja ove membrane za lipozome, kroz Mustang membranu je sukcesivno propuštano 4 mL 1 M NaOH, 4 mL 1 M NaCl i 10 mL 100 mM citratnog pufera (pH 6). Lipozomi su zagrevani 10 min na 37°C pre propuštanja kroz membranu. Sledeće, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizirani preko 10-15 zapremina IX PBS korišćenjem filtracije tangencijalnog protoka pre rekuperovanja finalnog proizvoda. TFF sistem i membrane za filtriranje sa šupljim vlaknima kupljene su od Spectrum Labs i korišćene su prema uputstvima proizvođača. Korišćene su polisulfonske filtracione membrane sa šupljim vlaknima (broj dela P/N: X1AB-100-20P) sa porama za maksimalnu veličinu od 100 kD i 8 cm<2>površine. Zain vitroiin vivoeksperimentalne formulacije su razblažene do zahtevane koncentracije RNK sa IX PBS.
(B) Kao postupak (A) izuzev što, nakon mešanja na rokeru, 226.7 uL stoka je dodato u 1.773 mL etanola da bi se napravio radni lipidni stok rastvor od 2 mL, čime se modifikuje lipid:RNK
odnos.
(C) Kao postupak (B) izuzev što je izostavljena Mustang filtracija, tako da su lipozomi išli od 20 mL staklene vijalice u TFF dijalizu. (D) Kao postupak (C) izuzev što su za TFF korišćene polietarsulfon (PES) membrane sa šupljim vlaknima (broj dela PCI-100E-100-0IN) sa porama za maksimalnu veličinu od 100 kD i 20
cm<2>površine.
(E) Kao postupak (D) izuzev što je korišćena Mustang membrana, kao u postupku (A).
(F) Kao postupak (A) izuzev što je izostavljena Mustang filtracija, pa su lipozomi od 20 mL
staklene vijalice išli na TFF dijalizu.
(G) Kao postupak (D) izuzev što je 4 mL radnog rastvora RNK pripremljeno od stok rastvora od~1 ug/mL u 100 mM citratnog pufera (pH 6). Onda je pripremljeno četiri 20 mL staklene
vijalice na isti način. Dve od njih su korišćene za radni rastvor RNK (2 mL u svakoj vijalici) a druge za sakupljanje smeša lipida i RNK, kao u (C). Umesto korišćenja T miksera, špricevi sa RNK i lipidima su povezane sa Mitos Droplet junction Chip (stakleni mikrofluidni uređaj dobijen od Svrris, Part no. 3000158) korišćenjem PTFE cevčica (0.03 inča unutrašnji prečnik x 1/16 inča spoljašnji prečnik) korišćenjem "4-way edge" konektora (Svrris). Dva RNK toka i jedan lipidni tok su vođeni špric pumpama i mešanje etanolne i vodene faze je urađeno na X spoju (100 mm x 105 mm) čipa. Stopa protoka sva tri toka održavana je na 1.5 mL/min, stoga je odnos ukupne vodene prema etanolnoj stopi protoka bio 2:1. Izlaz cevčice je postavljen tako
da sakuplja smeše u 20 mL staklene vijalice (uz mešanje). Štap za mešanje je izvađen i dozvoljeno je ekvilibrisanje etanolnog/vodenog rastvora do sobne temperature 1 č. Zatim je smeša napunjena u 5 cc špric, koji je postavljen u drugi deo PTFE cevčica; u drugi 5 cc špric jednake dužine PTFE cevčica, napunjena je jednaka zapremina 100 mM citratnog pufera (pH 6). Dva šprica su pokrenuta sa 3mL/min stopom protoka korišćenjem pumpe za špric i finalna smeša je sakupljena u 20 mL staklenu vijalicu (uz mešanje). Sledeće, lipozomi su koncentrovani do 2 mL i dijalizirani sa 10-15 zapremina IX PBS korišćenjem TFF, kao u (D).
(H) Kao postupak (A) izuzev što je 2mL radnog lipidnog stok rastvora napravljeno mešanjem 120.9 uL lipidnog stoka sa 1.879 mL etanola. Takođe, nakon mešanja u T mikseru lipozomi iz
20mL vijalice su napunjeni u Pierce Slide-A-Lyzer Dialvsis Cassette (Thermo Scientific, ekstra snaga, 0.5-3 mL kapacitet) i dijalizirani sa 400-500 mL IX PBS preko noći na 4°C u autoklavom sterilizovanom plastičnom kontejneru pre rekuperacije finalnog proizvoda.
BHK ekspresija
[0106]Lipozomi sa različitim lipidima su inkubirani sa BHK ćelijama preko noći i procenjeni u odnosu na potencijal za ekspresiju proteina. Od bazalne vrednosti sa RV05 lipidna ekspresija se mogla povećati 18x dodavanjem 10% l,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina(DPyPE) lipozomu, 10x dodavanjem 10%> 18:2 (cis) fosfatidilholina, i 900x umesto toga korišćenjem RV01.
[0107]Generalno, in vivo studije su pokazale da nezasićeni lipidni repovi teže da povećaju IgG titre nastale protiv kodiranih antigena.
RSV imunogenost
[0108]vA317 samoreplicirajući replikon koji kodira RSV F protein primenjen je na BALB/c miševe, 4 ili 8 životinja po grupi, bilateralnim intramuskularnim vakcinacijama (50 uL po nozi) na dane 0 i 21 sa replikonom (1 ug) samim ili formulisanim kao lipozomi sa DlinDMA ("RV01") ili DOTAP ("RV13"). RV01 lipozomi su imali 40% DlinDMA, 10%. DSPC, 48%. holesterola i 2% PEG-DMG, ali sa različitim količinama RNK. RV13 lipozomi imali su 40% DOTAP, 10% DPE, 48% holesterola i 2% PEG-DMG. Za poređenje, gola plazmidna DNK (20 ug) koja eksprimira isti RSVF antigen dopremljena je ili korišćenjem elektroporacije ili sa RV01(10) lipozomima (0.1 ug DNA). Četiri miša su korišćena kao naivna kontrolna grupa.
[0109]Lipozomi su pripremljeni postupkom (D) ili postupkom (B). Za neke lipozome napravljene postupkom (D) dupla ili polovina količine RNK je korišćena. Z dijametar prosečne veličine čestice, indeks polidisperzije i efikasnost inkapsulacije lipozoma bili su kao što sledi:
[0110]Serum je sakupljen za analizu antitela na dane 14, 36 i 49. Jetre su sakupljene od miševa na dan 49 za analizu T ćelija.
[0111] F-specifični serumski IgG titri (GMT) bili su kao što sledi:
[0112]Proporcija T ćelija koje su citokin pozitivne i specifične za RSV F51-66 peptid su kao što sledi, prikazujući samo cifre koji su statistički značajno iznad nule:
[0113]Stoga su formulacije lipozoma značajno poboljšale imunogenost u odnosu na kontrole sa golom RNK, kao što je određeno poverćanim F-specifičnim IgG titrima i frekvencijama T ćelija. Plazmidna DNK formulisana sa lipozomima, ili dopremljena gola korišćenjem elektroporacije, bila je značajno manje imunogena od lipozom-formulisane samoreplicirajuće
RNK.
[0114]RV01 RNK vakcine su bile imunogenije od RV13 vakcine. RV01 je imao tercijarni amin u grupi na glavi sa pKa od oko 5.8, i takođe uključuju nezasićene alkil repove. RV13 ima nezasićene alkil repove ali grupa na glavi ima kvaternerni amin i veoma je snažan katjon.
Lipozomi — uslovi za inkapsulaciju
[0115]Da bi se procenilo da li je efekat uočen u grupama lipozoma samo usled komponenti lipozoma, ili je povezan sa inkapsulacijom, replikon je primenjen u inkapsuliranom obliku (sa dva različita protokola prečišćavanja, O.lug RNK), ili pomešan sa lipozomima nakon njihovog formiranja (ne-inkapsulirani "lipopleks", O.lug RNK), ili gola RNK (lug). Slika 10 prikazuje da je lipopleks dao najniže nivoe ekspresije, pokazujući da je inkapsulacija esencijalna za potentnu ekspresiju.
[0116]Dodatni eksperimenti koristili su tri dodatne RNK: (i) 'vA317' replikon koji eksprimira RSV-Ftj.površinski fuzioni glikoprotein RSV; (ii) 'vA17' replikon koji eksprimira GFP; i (iii) 'vA336' koji je replikaciono defektan i kodira GFP.
[0117]RNK su dopremljene bilo gole ili sa lipozomima napravljenim postupkom (D). Prazni lipozomi su napravljeni postupkom (D) ali bez bilo koje RNK. Četiri lipozomske formulacije imale su ove karakteristike:
[0118]BALB/c miševima, 5 životinja po grupi, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 mL po nozi) na dane 0 i 21 sa:
Grupa 1 gola samoreplicirajuća RSV-F RNK (vA317, O.lug)
Grupa 2 samoreplicirajuća RSV-F RNK (vA317, 0.1 ug) inkapsulirana u lipozome
Grupa 3 samoreplicirajuća RSV-F RNK (vA317, 0.1 ug) dodatna u prazne lipozome
Grupa 4 protein F subjedinice (5 ug)
[01191Serum je sakupljen za analizu antitela na dane 14, 35 i 51. F-specifični serum IgG titri (GMT) su mereni; ukoliko je pojedinačna životinja imala titar od <25 (granica detekcije), dodeljen joj je titar od 5. Dodatno, jetre su sakupljene od miševa na dan 51 za analizu T ćelija, da bi se odredile ćelije koje su citokin pozitivne i specifične za RSV F51-66 peptid (CD4+) ili za RSV F peptide F85-93 i F249-258 (CD8+).
[0120]IgG titri su bili kao što sledi u 10 grupa i kod neimunizovanih kontrolnih miševa:
[0121]RSV serum neutralizacioni titri na dan 51 bili su kao što sledi:
[0122]Životinje koje pokazuju RSV F-specifične CD4+ T ćelije slezine na dan 51 bile su kao što sledi, gde je broj (% pozitivnih ćelija) dat samo ukoliko je stimulisani odgovor statistički značaino iznad nule:
[0123]Životinje koje pokazuju RSV F-specifične CD8+ T ćelije slezine na dan 51 bile su kao što sledi, gde je broj (% pozitivnih ćelija) dat samo ukoliko je stimulisani odgovor statistički značajno iznad nule:
[0124]Stoga je inkapsuliranje RNK unutar lipozoma neophodno za visoku imunogenost, jer prosta smeša RNK i lipozoma (grupa 3) nije imunogena (ustvari, manje imunogena od gole
RNK).
[0125] U drugim studijama miševi su primili različite kombinacije (i) samoreplicirajućeg RNK replikona koji kodira RSV F protein pune dužine (ii) samoreplicirajućeg GFP-kodirajućeg RNK replikona (iii) GFP-kodirajućeg RNK replikona sa nokautom u nsP4 koji eliminiše samoreplikaciju (iv) RSV F-protein pune dužine. Dobij eno je ukupno 13 grupa:
[0126]Rezultati na Slici 16 prikazuju da su F-specifični IgG odgovori zahtevali inkapsulaciju u lipozom pre nego samo istovremno dopremanje (uporediti grupe C & D). Poređenje grupa K, L i M prikazuje da je RNK obezbedila ađuvantni efekat protiv istovremeno dopremljenog proteina, i ovaj efekat je uočen i sa replicirajućom i sa ne-replicirajućom RNK.
RSV imunogenost u različtim mišjim sojevima
[0127]Replikon "vA142" kodira površinski fuzioni (F) glikoprotein divljeg tipa pune dužine RSV ali sa deletiranim fuzionim peptidom, i 3' kraj je formiran ribozim-posredovanim cepanjem. Testiranje kod tri različita mišja soja.
[0128]BALB/c miševima je data bilateralna intramuskularna vakcinacija (50 uL po nozi) na dane 0 i 22. Životinje su podeljene u 8 test grupa (5 životinja po grupi) i naivna kontrola (2 životinje):
Grupi 1 je dat goli replikon (1 ug).
Grupi 2 je dat lug replikon dopremljenu lipozomima "RV01(37)" sa 40% DlinDMA, 10% DSPC, 48% hol, 2% PEG-konjugovanog DMG.
Grupi 3 je dato isto kao grupi 2, ali na O.lug RNK.
Grupi 4 je dat lug replikon u "RV17(10)" lipozomima (40% RV17 (videti prethodno), 10% DSPC, 49.5% holesterol, 0.5% PEG-DMG).
Grupa 5 je bila lug replikon u "RV05(11)" lipozomima (40% RV07 lipid, 30% 18:2 PE (DLoPE, 28% holesterol, 2% PEG-DMG).
Grupi 6 je dato O.lug replikona u "RV17(10)" lipozomima.
Grupi 7 je dato 5ug proteina RSV-F subjedinice sa aluminijum hidroksidom kao ađuvantom. Grupa 8 je bila naivna kontrola (2 životinje).
[0129]Serumi su sakupljeni za analizu antitela na dane 14, 35 i 49. F-specifična serum TgG GMTs su bila:
[0130]Na dan 35 F-specifični IgGl i IgG2a titri (GMT) bili su kao što sledi:
[0131]Titri RSV serum neutrališućih antitela na dane 35 i 49 bili su kao što sledi (podaci su za neutralizacione titre pula od 2-5 miševa, 1 pul po grupi sa 60% smanjenja plaka):
[0132]Slezine su sakupljene na dan 49 za analizu T ćelija. Prosečne neto frekvencije F-specifičnih citokin-pozitivnih T ćelija (CD4+ ili CD8+) bile su kao što sledi, prikazujući samo cifre koje su statistički značajno iznad nule (specifičnih za RSV peptide F51-66, F164-178, F309-323 za CD4+, ili za peptide F85-93 i F249-258 za CD8+):
C57BL/6 miševi su imunizovani na isti način, ali je grupa 9 primila VRPs (1x106 IU) koji eksprimira površinski fuzioni glikoprotein divljeg tipa RSV pune dužine (delecija fuzionog peptida).
[0133]Serum je sakupljen za analizu antitela na dane 14, 35 & 49. F-specifični IgG titri (GMT) bili su:
[0134]Na dan 35 F-specifični IgGl i lgG2a titri (GMT) bili su kao što sledi:
[0135]Titri RSV serum neutrališućih antitela na dane 35 i 49 bili su kao što sledi (podaci su za neutralizacione titre pula od 2-5 miševa, 1 pul po grupi, sa 60% smanjenja plaka):
[0136]Jetre su sakupljene na dan 49 za analizu T ćelija. Prosečne neto frekvencije F-specifičnih citokin-pozitivnih T ćelija (CD8+) bile su kao što sledi, prikazujući samo cifre koje su statistički značajno iznad nule (specifičnih za RSV peptide F85-93 i F249-258):
[0137]Devet grupa C3H/HeN miševa je imunizovano na isti način. F-specifični IgG titri (GMT) bili su:
[0138]Na dan 35 F-specifični IgGl i IgG2a titri (GMT) bili su kao što sledi:
[0T39]Titri RSV serum neutrališućih antitela na dane 35 i 49 bili su kao što sledi:
[0140]Stoga tri različita lipida (RV01, RV05, RV17; pKa 5.8, 5.85, 6.1) testirana su u tri različita inbredna soja miševa. Za sva 3 soja RV01 je bio efikasniji od RV17; za BALB/c i C3H sojeve RV05 je bio manje efikasan i odRVOl ili RV17, ali je bio efikasniji kodB6 soja. U svim slučajevima, međutim, lipozomi su bili efikasniji od dve katjonske nanoemulzije koje su paralelno testirane.
CMV imunogenost
[0141]RV01 lipozomi sa DLinDMA kao katjonskim lipidom korišćeni su za dopremanje RNK replikona koji kodira glikoproteine citomegalovirusa (CMV). "vA160" replikon kodira glikoproteine H i L (gH/gL) pune dužine, dok replikon "vA322" kodira rastvorljivi oblik (gHsol/gL). Dva proteina su pod kontrolom zasebnih subgenomskih promotora u jednom replikonu; ko-primena dva zasebna vektora, jednog koji kodira gH i jednog koji kodira gL, nije dala dobre rezultate.
[0142]BALB/c miševima, 10 po grupi, date su bilateralne intramuslukarne vakcine (50 uL po nozi) na dane 0, 21 i 42 sa VRPs koji eksprimira gH/gL (1x106 IU), VRPs koji eksprimira gHsol/gL (1x106 IU) i PBS kao kontrole. Dve test grupe primile su lug vA160 ili vA322 replikona formulisanog u lipozomima (40% DlinDMA, 10%. DSPC, 48%. hol, 2% PEG-DMG; napravljeni korišćenjem postupka (D) ali sa 150ug RNK veličinom serije).
[0143]vA160 lipozomi imali su Zav prečnik od 168nm, pdl 0.144, i 87.4% inkapsulacije. vA322 lipozomi imali su Zav prečnik od 162nm, pdl 0.131, i 90%. inkapsulacije.
[0144]Replikoni su mogli da eksprimiraju dva proteina iz pojedinačnog vektora.
[0145]Serumi su sakupljeni za imunološku analizu na dan 63 (3wp3). CMV neutralizacioni titri (recipročna vrednost razređenja seruma koja proizvodi 50% smanjenje u broju pozitivnih virusnih fokusa po komorici, u odnosu na kontrolu) bili su kao što sledi:
[0146]RNK koja eksprimira ili u punoj dužini ili rastvorljivi oblik CMV gH/gL kompleksa tako je izazvala visoke titre neutrališućih antitela, kao što je testirano na epitelijalnim ćelijama. Prosečni titri izazvani sa lipozom-inkapsuliranim RNK bili su najmanje visoki kao odgovarajući VRPs.
[0147]Ponovljeni eksperimenti su potvrdili je replikon bio sposoban da eksprimira dva proteina iz jednog vektora. RNK replikon je dao 3wp3 titar od 11457, u poređenju sa 5516 sa VRP.
[0148]Dalji eksperimenti koristili su različite replikone kao dodatak vA160. vA526 replikon eksprimira CMV pentamerni kompleks (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) pod kontrolom tri subgenomska promotora: prvi vodi ekspresiju gH; drugi vodi ekspresiju gL; treći vodi ekspresiju UL128-2A-UL130-2AUL131 poliproteina, koji sadrži dva 2A mesta cepanja između tri UL gena. vA527 replikon eksprimira CMV pentamerni kompleks preko tri subgenomska promotora i dva IRESs: prvi subgenomski promotor vodi ekspresiju gH; drugi subgenomski promotor vodi ekspresiju gL; treći subgenomski promotor vodi ekspresiju UL128; UL130 je pod kontrolom EMCV IRES; ULI31 je pod kontrolom EV71 IRES. Ova tri replikona su dopremljena lipozomom (postupak (H), sa 150ug veličinom serije) ili sa VRPs.
[0149]BALB/c miševima, 10 grupa od 10 životinja, date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 uL po nozi) na dane 0, 21 i 42 sa:
Grupa 1 VRP koji eksprimiraju gH FL/gL (1x106 IU)
Grupa 2 pentamerni, 2A VRP (1x105 RJ)
Grupa 3 pentamerni, 2A VRP (1x106 RJ)
Grupa 4 pentamerni, IRES VRP (1x105 IU)
Grupa 5 samoreplicirajući RNK vA160 (lug) formulisan u lipozomima
Grupa 6 samoreplicirajući RNK vA526 (lug) formulisan u lipozomima
Grupa 7 samoreplicirajući RNK vA527 (lug) formulisan u lipozomima
Grupa 8 samoreplicirajući RNK vA160 (lug) formulisan u katjonskoj nanoemulziji
Grupa 9 samoreplicirajući RNK vA526 (lug) formulisan u katjonskoj nanoemulziji
Grupa 10 samoreplicirajući RNK vA527 (lug) formulisan u katjonskoj nanoemulziji.
[0150]Serumi su sakupljeni za imunološku analizu na dane 21 (3wpl), 42 (3wp2) i 63 (3wp3).
[0151]CMV serum neutrališući titri na dane 21, 42 i 63 bili su:
[0152]Stoga se samoreplicirajuća RNK može koristiti da eksprimira višestruke antigene iz jednog vektora i da izazove potentni i specifični imuni odgovor. Replikon može eksprimirati pet antigena (CMV pentamerni kompleks (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) i može izazvati potentni imuni odgovor. Samoreplicirajuća RNK dopremljena u liposomima bila je sposobna da izazove visoke titre neutrališućeg antitela, kao što je testirano na epitelijalnim ćelijama, testirano u svim vremenskim tačkama (3wpl, 3wp2, and 3wp3). Ovi odgovori bili su superiorni u odnosu na odgovarajuće VRP i katjonske nanoemulzije.
Dopremljena zapremina
[0153]Hidrodinamično dopremanje koristi silu stvorenu rapidnom injekcijom velike zapremine rastvora da bi se prevazišle fizičke prepreke ćelijskih membrana koje sprečavaju velika i membranski nepropustljiva jedinjenja da ulaze u ćelije. Prethodno je pokazano da je ovaj fenomen koristan za intracelularno dopremanje DNK vakcina.
[0154]Tipična dopremljena zapremina intramuskularne injekcije za miša je 50 ul u zadnju nogu, što je relativno velika zapremina za mišić noge miša. Nasuprot tome, humana intramuskularna doza od~0.5ml je relativno mala. Ukoliko bi imunogenost kod miša bila zavisna od zapremine onda bi efikasnost vakcine sa replikonom bila usled, bar delimično, hidrodinamičkih sila, što ne bi ohrabrivalo upotrebu istih vakcina kod ljudi i većih životinja.
[0155]vA317 replikon je dopremljen BALB/c miševima, 10 po grupi, bilateralnim intramuskularnim vakcinacijama (5 ili 50 po nozi) na dan 0 i 21:
Grupa 1 primila je goli replikon, 0.2ug sa 50 mL po nozi
Grupa 2 primila je goli replikon, 0.2 ug sa 5 mL po nozi
Grupa 3 primila je lipozom-formulisani replikon (0.2 ug, 50 mL po nozi)
Grupa 4 primila je lipozom-fomrulisani replikon (0.2 ug, 5 mL po nozi)
[0156]Serum je sakupljen za analizu antitela na dane 14 i 35. F-specifični IgG GMTs su bili:
[0157]Stoga imunogenost formulisanog replikona nije varirala u odnosu na dopremljenu zapreminu, na taj način dokazujući da ove RNK vakcine ne zavise od hidrodinamičnog dopremanja za njihovu efikasnost.
Kinetika ekspresije
[0158]Samoreplicirajući RNK replikon ("vA311") koji eksprimira luciferaza reporter gen (luc) korišćen je za proučavanje kinetike ekspresije proteina nakon injekcije. BALB/c miševi, 5 životinja po grupi, primili su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 uL po nozi) na dan 0 sa: Grupa 1 DNK koja eksprimira luciferazu, dopremljena korišćenjem elektroporacije (10 ug) Grupa 2 samoreplicirajuća RNK (1 ug) formulisana u lipozomima
Grupa 3 samoreplicirajuća RNK (lug) formulisana sa katjonskom nanoemulzijom
Grupa 4 samoreplicirajuća RNK (lug) formulisana sa katjonskom nanoemulzijom
Grupa 5 VRP (1x106 IU) koji eksprimira luciferazu
[0159]Pre vakcinacije miševi su depilirani. Miševi su anestezirani (2% izoflurana u kiseoniku), dlaka je prvo uklonjena sa električnim žiletom zatim hemijski sa Nair. Podaci bioluminescencije su zatim dobij eni sa Xenogen IVIS 200 imaging svstem (Caliper Life Sciences) na dane 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63 i 70. Pet minuta pre slikanja miševima je intraperitonealno injektirano 8 mg/kg rastvora luciferina. Životinje su zatim anestezirane i prenete na sistem za slikanje. Vremena slikanja su održavana konstantnim jer je bioluminescentni signal meren sa hlađenom CCD kamerom.
[0160] U vizuelnom smislu, uočeno je da ćelije koje eksprimiraju luciferazu ostaju primarno na mestu injekcije RNK, i životinje slikane nakon uklanjanja kvadricepsa nisu pokazivale signal.
[0161] U kvantitativnom smislu, ekspresija luciferaze je merena kao prosečna radijansa tokom perioda od 70 dana (p/s/cm<2>/sr), i rezultati su bili kao što sledi za 5 grupa:
[0162] Samoreplicirajuća RNK formulisana sa katjonskim nanoemulzijama pokazala je merljivu bioluminescenciju na dan 3, sa najvećom vrednošću na dan 7 i zatim smanjenom do bazalnog nivoa do dana 28 do 35. Kada je formulisana u lipozome RNK je prikazala merljivu bioluminescenciju na dan 3, sa najvećom vrednošću na dan 7 i zatim smanjenom do bazalnog nivoa do dana 63. RNK dopremljena korišćenjem VRP pokazala je poboljšanu bioluminescenciju na dan 21 u poređenju sa formulisanom RNK, ali se ekspresija smanjila do bazalnih nivoa do dana 28. Elektroporisana DNK pokazala je najviši nivo bioluminescencije u svim merenim vremenskim tačkama i nivoi bioluminescencije nisu se smanjili do bazalnih nivoa unutar 70 dana eksperimenta.
Put dopremanja
[0163] Lipozom-inkapsulirana RNK koja kodira HIV gpl40 dopremljena je miševima intramuskularno, intradermalno, ili potkožno. Sva tri puta dovela su do visokih nivoa IgG HIV-specifičnih antitela u serumu (Slika 15), prevazilazeći titre uočene kao odgovor na elektroporisanu intramuskularno primenjenu DNK.
Pam učni pacovi
[0164]Studija je izvedena na pamučnim pacovima( Sigmodon hispidis)umesto na miševima. Na dozi od 1 ug imkapsulacija u lipozomu povećala je F-specifične IgG titre 8.3-puta u poređenju sa golom RNK i povećala PRNT titre 9.5-puta. Jačina odgovora antitela bila je jednaka onoj indukovanoj sa 5xl0<6>IU VRP. I gola i lipozom-inkapsiulirana RNK bile su sposobne da zaštite pamučne pacove od RSV imunizacije (lxl0<5>plak formirajućih jedinica), smanjujući plućno virusno opterećenje najmanje za 3.5 log. Inkapsuliranje je povećalo redukciju oko 2-puta.
[0165]U daljem radu na pamučnim pacovima korišćena su četiri različita replikona: vA317 eksprimira RSV-F pune dužine; vA318 eksprimira isečeni (transmembranski i citoplazmatski rep uklonjeni) RSV-F; vA142 eksprimira RSV-F sa delecijom njegovog fuzionog peptida; vA140 eksprimira isečeni RSV-F takođe bez njegovog peptida. Pamučnim pacovima, 4 do 8 životinja po grupi, data je intramuskularna vakcinacija (100 uL u jednu nogu) na dane 0 i 21 sa četiri različita replikona sa dve doze (1.0 i O.lug) formulisane u lipozomima napravljenim sa postupkom (D), ali sa 150 ug RNK veličinom serije. Kontrolne grupe su primile vakcinu sa proteinom RSVF subjedinice (5 ug) sa stipsom kao ađuvantom (8 životinja/grupi), VRP koji eksprimira RSV-F pune dužine (lxl0<6>IU, 8 životinja/grupi), ili naivnu kontrolu (4 životinja/grupi). Serum je sakupljen za analizu antitela na dane 0, 21 i 34.
[0166]F-specifični serum IgG titri i titri RSV serum neutrališućih antitela na dan 21 i 34 bili su:
[0167]Sva četiri replikona procenjena u ovoj studiji (vA317, vA318, vA142, vA140) bili su imunogeni kod pamučnih pacova kada su dopremljeni sa lipozomom, iako su serumski neutralizacioni titri bili najmanje desetostruko niži od onih indukovanih sa ađuvantim proteinskim vakcinama ili sa VRP. Lipozom/RNK vakcine izazvale su serum F-specifična IgG i RSV neutrališuća antitela nakon prve vakcinacije, a druga vakcinacija je efikasno podigla odgovor. F-specifični IgG titri nakon druge vakcinacije sa lug replikona bili su 2- do 3-puta veći nego nakon druge vakcinacije sa 0.1 ug replikonom. Četiri replikona su izazvala uporedive titre antitela, sugerišući da su RSV-F pune dužine i isečeni, svaki sa ili bez fuzionog peptida, slično imunogeni kod pamučnih pacova.
[0168]U daljem radu na pamučnim pacovima ponovo su korišćeni vA317, vA318 i vA142 replikoni. Pamučnim pacovima, 2-8 životinja po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 uL u jednu nogu) na dane 0 i 21 sa replikonima (0.1 ili lug) inkapsulirane u RV01 lipozomima napravljenim postupkom (D) ali sa 150ug RNK veličinom serije. Kontrolne grupe su primile vakcinu sa proteinom subjedinice RSV-F (5 ug) sa stipsom kao ađuvantom ili sa VRP koji eksprimiraju RSV-F pune dužine (lxl0<6>IU, 8 životinja/grupi). Sve ove životinje su primile treću vakcinaciju (dan 56) sa vakcinom proteina subjedinice RSV-F (5 ug) sa stipsom kao ađuvantom. Dodatno postojala je naivna kontrola (4 životinje/grupi). Dodatno, dodatnoj grupi date su bilateralne intramuskularne vakcinacije (50 uL po nozi) na dane 0 i 56 sa lug vA317 RNK u lipozomima, ali nisu primili treću vakcinaciju sa vakcinom sa proteinom subjedinice.
[0169]Serum je sakupljen za analizu antitela na dane 0, 21, 35, 56, 70, plus dane 14, 28 & 42 za dodatnu grupu. F-specifični serumski IgG titri (GMT) bili su kao što sledi:
[0170]Serum neutrališući titri su bili kao što sledi (60% RSV neutrališućih titara za 2 pula od 3-4 životinje po grupi, GMT od ova 2 pula po grupi):
[0171]Serum titri i neutrališući titri za dodatnu grupu bili su kao što sledi:
[0172]Stoga su replikoni potvrđeni kao imunogeni kod pamučnih pacova, izazivajući serum F-specifične IgG i RSV neutrališuća antitela nakon prve vakcinacije. Druga vakcinacija efikasno je podigla odgovore. F-specifični IgG titri nakon druge vakcinacije sa 1.0 ug replikona bili su 1.5 do 4-puta viši nego nakon druge vakcinacije sa 0.1 ug replikonom.
[0173]Treća vakcinacija (protein na dan 56) nije podigla titre kod pamučnih pacova prethodno vakcinisanih sa F trimer subjedinicom + stipsa, ali je obezbedila veliko povećanje titara kod pamučnih pacova prethodno vakcinisanih sa replikonom. U većini slučajeva RSV serum neutralizacioni titri nakon dve vakcinacije sa replikonima praćeno sa busterom sa proteinom bili su jednaki ili veći od titara indukovanih sa dve ili tri sekvencijalne vakcinacije sa proteinom.
[0174]Ova studija je takođe procenjivala kinetiku odgovora antitela na 1.0 ug vA317. F-specifična serum IgG i RSV neutralizacioni titri indukovani pojedinačnom vakcinacijom dostigli su najveću vrednost oko dana 21 i održani su najmanje na dan 56 (50-70% opadanje F-specifičnog IgG titra, mala promena u RSV neutralizacionom titru). Homologa druga vakcinacija data je ovim životinjama na dan 56, i povećala je titre antitela do nivoa najmanje jednakog onom postignutom kada je druga vakcinacija primenjena na dan 21.
[0175]Dalji eksperimenti uključivali su virusnu imunizaciju. vA368 replikon kodira površinski glikoprotein RSV pune dužine divljeg tipa kod koga je fuzioni peptid deletiran, pri čemu je ekspresija vođena sa EV71 IRES. Pamučni pacovi, 7 po grupi, date su intramuskularne vakcinacije (100 uL po nozi) na dane 0 i 21 sa vA368 u lipozomima pripremljenim postupkom (H), 175 ug RNK veličinom serije, ili sa VRP sa istim replikonom. Kontrolna grupa je primila 5ug proteina sa stipsom kao ađuvantom, a takođe je uključena i naivna kontrolna grupa.
[0176]Sve grupe su intranazalno imunizovane (i.n.) sa lxl0<6>PFU RSV četiri nedelje nakon finalne imunizacije. Serum je sakupljen za analizu antitela na dane 0, 21, 35. Virusni titri u plućima mereni su 5 dana nakon imunizacije. Rezultati su bili kao što sledi:
[01771Stoga RNK vakcina je smanjila virusno opterećenje pluća sa preko tri log, od oko IO<6>PFU/g kod nevakcinisanih kontrolnih pamučnih pacova do manje od 10<3>PFU/g kod vakcinisanih pamučnih pacova.
Studija na velikim sisarima
[0178]Studija na velikim životinjama izvedena je na kravama. Telad (4-6 nedelja stara,~60-80 kg, 5 po grupi) imunizovani su sa 66ug replikona vA317 koji kodira RSV F protein pune dužine na dane 0, 21, 86 i 146. Replikoni su formulisani unutar lipozoma. Sam PBS korišćen je kao negativna kontrola, a licencirana vakcina je korišćena kao pozitivna kontrola ("Triangle 4" od Fort Dodge, sa ubijenim virusom). Sva telad je primila 15ug F proteina sa MF59 emulzijom kao ađuvantom na dan 146. Jedna krava je greškom vakcinisana sa pogrešnom vakcinom na dan 86 umesto sa Triangle 4 tako da su njeni podaci isključeni od dana 100 nadalje.
[0179]RNK vakcine su kodirale humani RSV F dok "Triangle 4" vakcina sadrži goveđi RSV F, ali je RSV F protein visoko konzervativan između BRSV i HRSV.
[0180]Lipozomi su napravljeni postupkom (E), izuzev što je korišćena 1.5 mg RNK veličina serije.
[0181]Telad su primila 2ml svake eksperimentalne vakcine, primenjene intramuskularno kao 2xlml sa svake strane vrata. Nasuprot tome, "Triangle 4" vakcina je datakao pojedinačna doza od 2ml u vrat.
[0182]Serum je sakupljen za analizu antitela na dane 0, 14, 21, 35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 181, 188, 195, i 202. Ukoliko je pojedinačna životinja imala titar ispod granice detekcije dodeljen joj je titar 5.
[0183]Slika 14A prikazuje F-specifične IgG titre tokom prvih 63 dana. RNK replikon je bio imunogen kod krava preko lipozoma, iako je dao niže titre od licencirane vakcine. Sve vakcinisane krave pokazivale su F-specifična antitela nakon druge doze, i titri su bili veoma stabilni u periodu od 2 do 6 nedelja nakon druge doze (i bili su naročito stabilni za RNK vakcine).
[0184]Slika 14B prikazuje F-specifične serum IgG titre (GMT) tokom 210 dana, i izmerene vrednosti do dana 202 bile su kao što sledi:
[0185]Serumski titri RSV neutralizujućih antitela bili su kao što sledi:
[0T86]Materijal korišćen za drugu lipozomsku dozu nije bio sveže pripremljen, i isti lot RNK pokazivao je smanjenje potencije u studiji imunogenosti kod miša. Stoga je moguće da bi vakcina bila imunogenija ukoliko je korišćen sveži materijal za sve vakcinacije.
[0187]Kada se testiranje vršilo sa komplementom, neutralizujuća antitela su otkrivena kod svih vakcinisanih krava. U ovom testu, sva vakcinisana telad imala su dobre titre neutralizujućih antitela nakon druge RNK vakcinacije. Dodatno, RNK vakcina je izazvala F-specifične serumske IgG titre koji su detektovani kod nekoliko teladi nakon druge vakcinacije i kod svih teladi nakon treće.
[0188]RSV-F sa MF59 kao ađuvantom bio je sposoban da poveća IgG odgovor kod svih prethodno vakcinisanih teladi, i da poveća komplement-nezavisne neutralizujuće titre teladi prethodno vakcinisanih sa RNK.
[0189]Dokaz koncepta RNK vakcina kod velikih životinja je naročito važan u smislu gubitka potencije ranije uočenog sa DNK-zasnovanim vakcinama pri prelasku sa modela malih životinja na velike životinje i ljude. Tipična doza za DNK vakcinu za krave bila bi 0.5-1 mg [47,48] i zato je veoma ohrabrujuće da su imuni odgovori izazvani samo sa 66 ug RNK.

Claims (13)

1. Ne-virionska čestica koja ne sadrži proteinski kapsid, zain vivodopremanje RNK u ćeliju kičmenjaka, gde (a) čestica je lipozom i sadrži materijal za dopremanje koji inkapsulira samoreplicirajući RNK molekul koji kodira imunogen, gde je imunogen površinski polipeptid i može izazvati imuni odgovorin vivoprotiv bakterije, virusa, gljive ili parazita, i (b) RNK ne uključuje modifikovane nukleotide, i izborno uključuje 5' kep.
2. Čestica prema patentnom zahtevu 1, gde lipozom sadrži lipid sa katjonskom prednjom grupom.
3. Čestica prema patentnom zahtevu 1, gde lipozom sadrži lipid sa cviterjonskom "glavom".
4. Čestica prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde lipozom ima prečnik u opsegu od 50-220nm.
5. Čestica prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde samoreplicirajući RNK molekul kodira (i) RNK-zavisnu RNK polimerazu koja može izvršiti transkripciju RNK iz samoreplicirajućeg molekula RNK molekul i (ii) imunogen.
6. Čestica prema patentnom zahtevu 5, gde je polimeraza replikaza alfa virusa.
7. Čestica prema patentnom zahtevu 5 ili patentnom zahtevu 6, gde RNK molekul ima dva otvorena okvira čitanja, od kojih prvi kodira replikazu alfavirusa i od kojih drugi kodira imunogen.
8. Čestica prema patentnom zahtevu 7, gde RNK molekul ima dodatne otvoreene okvire čitanja, koji na primer dodatno kodiraju imunogene ili pomoćne polipeptide.
9. Čestica prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je RNK molekul dugačak 5000-25000 nukleotida.
10. Čestica prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde imunogen može izazvati imuni odgovorin vivoprotiv: (a) glikoproteina F respiratornog sincicijelnog virusa; (b) virusa koji inficira ribe, kao što je virus infektivne anemije lososa (ISAV), virus pankreasne bolesti lososa (SPDV), virus pankreasne nekroze (IPNV), virus kanlskog soma (CCV), virus limfocistične bolesti riba (FLDV), virus infektivne hematopoetske nekroze (IHNV), koi herpesvirus, picorna-sličan virus (takođe poznat kao picorna-sličan virus atlantskog lososa), virus "landlocked" lososa (LSV), rotavirus atlantskog lososa (ASR), virus strawberry disease pastrmke (TSD), virus tumora srebrnog lososa (CSTV), i virusa virusne hemoragične septikemije (VHSV); (c) ortomiksovirusa, kao što je influenca A, B i C virus; ili (d) herpesvirusa, kao što su herpes simplex virusi (HSV), varičela-zoster virus (VZV), Epštajn-Bar virus (EBV), citomegalovirus (CMV), humani herpesvirus 6 (HHV6), humani herpesvirus 7 (HHV7), i humani herpesvirus 8 (HHV8).
11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži česticu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.
12. Uređaj za dopremanje koji sadrži farmaceutsku kompoziciju iz patentnog zahteva 11.
13. Cestica prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu, ili uređaj za dopremanje prema patentnom zahtevu 12, za upotrebu u postupku za izazivanje zaštitnog imunog odgovora kod kičmenjaka, koji sadrži korak primene na kičmenjaka efikasne količine pomenute čestice, ili pomenute farmaceutske kompozicije.
RS20160879A 2010-07-06 2011-07-06 Čestice slične virionu za dopremanje samoreplicirajućih rnk molekula RS55260B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36182810P 2010-07-06 2010-07-06
PCT/US2011/043103 WO2012006376A2 (en) 2010-07-06 2011-07-06 Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
EP11741348.4A EP2590676B1 (en) 2010-07-06 2011-07-06 Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55260B1 true RS55260B1 (sr) 2017-02-28

Family

ID=44629863

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160879A RS55260B1 (sr) 2010-07-06 2011-07-06 Čestice slične virionu za dopremanje samoreplicirajućih rnk molekula
RS20221148A RS63817B1 (sr) 2010-07-06 2011-07-06 Čestice za isporuku slične virionu za molekule samoreplicirajuće rnk

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20221148A RS63817B1 (sr) 2010-07-06 2011-07-06 Čestice za isporuku slične virionu za molekule samoreplicirajuće rnk

Country Status (22)

Country Link
US (2) US11291635B2 (sr)
EP (4) EP4005592B1 (sr)
JP (1) JP6061849B2 (sr)
CN (2) CN106421773A (sr)
AU (1) AU2011276232B2 (sr)
BR (1) BR112013000392B8 (sr)
CA (1) CA2804494A1 (sr)
CY (1) CY1118080T1 (sr)
DK (1) DK2590676T3 (sr)
ES (2) ES2934240T3 (sr)
FI (1) FI4005592T3 (sr)
HR (2) HRP20221522T1 (sr)
HU (2) HUE060788T2 (sr)
LT (2) LT4005592T (sr)
MX (1) MX342608B (sr)
PL (2) PL4005592T3 (sr)
PT (2) PT2590676T (sr)
RS (2) RS55260B1 (sr)
RU (1) RU2013104890A (sr)
SI (2) SI2590676T1 (sr)
SM (2) SMT202200500T1 (sr)
WO (1) WO2012006376A2 (sr)

Families Citing this family (208)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2591114B1 (en) 2010-07-06 2016-06-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunisation of large mammals with low doses of rna
NZ606591A (en) 2010-07-06 2015-02-27 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
MX342608B (es) 2010-07-06 2016-10-06 Novartis Ag * Particulas de suministro similares a viriones para moleculas de arn de autorreplicacion.
ES2646669T3 (es) 2010-07-06 2017-12-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de aumento de una respuesta inmunitaria mediante el suministro de ARN
ES2557382T3 (es) 2010-07-06 2016-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomas con lípidos que tienen un valor de pKa ventajoso para el suministro de ARN
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
SI4043040T1 (sl) * 2010-08-31 2023-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
LT4226941T (lt) 2010-08-31 2025-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2012051211A2 (en) * 2010-10-11 2012-04-19 Novartis Ag Antigen delivery platforms
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
RU2013154295A (ru) 2011-06-08 2015-07-20 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. КОМПОЗИЦИИ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ И СПОСОБЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ мРНК
ES2795110T3 (es) 2011-06-08 2020-11-20 Translate Bio Inc Lípidos escindibles
EP4115875A1 (en) * 2011-07-06 2023-01-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
MX350258B (es) 2011-07-06 2017-08-31 Novartis Ag Emulsiones cationicas de aceite en agua.
JP6059220B2 (ja) 2011-07-06 2017-01-18 ノバルティス アーゲー 核酸を含む水中油型エマルジョン
EP2729165B1 (en) 2011-07-06 2017-11-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
MX366055B (es) * 2011-08-31 2019-06-26 Novartis Ag Liposomas pegilados para admistracion de acido ribonucleico (arn) que codifica para inmunogeno.
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DE19216461T1 (de) 2011-10-03 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
RU2014118727A (ru) * 2011-10-11 2015-11-20 Новартис Аг Рекомбинантные самореплицирующиеся полицистронные молекулы рнк
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
CN104411338A (zh) 2012-04-02 2015-03-11 现代治疗公司 用于产生与人类疾病相关的生物制剂和蛋白质的修饰多核苷酸
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
EP2858679B2 (en) 2012-06-08 2024-06-05 Translate Bio, Inc. Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
CN109045294A (zh) * 2013-01-10 2018-12-21 思齐乐 流感病毒免疫原性组合物及其应用
AU2013374345A1 (en) 2013-01-17 2015-08-06 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
EP2968391A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
DK2970948T3 (en) 2013-03-15 2019-04-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa METHODS OF RNA PURIFICATION
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
CA2917348A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
EP3041934A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
WO2015126477A1 (en) * 2013-11-08 2015-08-27 Tyrx, Inc. Polymeric drug delivery system for treating surgical complications
EP3798229A1 (en) * 2014-03-25 2021-03-31 Yale University Uses of parasite macrophage migration inhibitory factors
PL4023249T3 (pl) 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
EP2974739A1 (en) 2014-07-15 2016-01-20 Novartis AG RSVF trimerization domains
MX384992B (es) 2014-06-13 2025-03-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Combinaciones inmunógenas.
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
EP3061826A1 (en) 2015-02-27 2016-08-31 Novartis AG Flavivirus replicons
CN108064176A (zh) 2015-04-22 2018-05-22 库瑞瓦格股份公司 用于治疗肿瘤疾病的含有rna的组合物
MA42502A (fr) 2015-07-21 2018-05-30 Modernatx Inc Vaccins contre une maladie infectieuse
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
EP3359670B2 (en) 2015-10-05 2024-02-14 ModernaTX, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
JP7384512B2 (ja) * 2015-10-22 2023-11-21 モデルナティエックス インコーポレイテッド 広域インフルエンザウイルスワクチン
AU2016342376A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Sexually transmitted disease vaccines
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
EA201891000A1 (ru) * 2015-10-22 2018-12-28 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Вакцина против респираторно-синцитиального вируса
EP3365009A4 (en) * 2015-10-22 2019-07-03 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST HERPES SIMPLEX VIRUS
WO2017070601A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Nucleic acid vaccines for varicella zoster virus (vzv)
AU2016342045A1 (en) * 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
PL3386484T3 (pl) 2015-12-10 2022-07-25 Modernatx, Inc. Kompozycje i sposoby dostarczania środków terapeutycznych
LT3394030T (lt) 2015-12-22 2022-04-11 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
PL3394093T3 (pl) 2015-12-23 2022-05-16 Modernatx, Inc. Metody stosowania polinukleotydów kodujących ligand ox40
MA43587A (fr) 2016-01-10 2018-11-14 Modernatx Inc Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4
BR112018014109A2 (en) 2016-01-11 2018-12-11 Verndari, Inc. microneedle compositions and methods of using them
WO2017162265A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Trans-replicating rna
WO2017201342A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
BE1024796B9 (fr) 2016-06-02 2019-01-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Constructions antigeniques du virus zika
WO2018060288A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
GB201616904D0 (en) 2016-10-05 2016-11-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
MA46766A (fr) 2016-11-11 2019-09-18 Modernatx Inc Vaccin antigrippal
WO2018091540A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Zika viral antigen constructs
WO2018107088A2 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
TW202428301A (zh) 2017-02-28 2024-07-16 法商賽諾菲公司 治療性rna
WO2018170256A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
EP4186888B1 (en) 2017-03-15 2025-11-26 ModernaTX, Inc. Compound and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS Vaccine
WO2018170270A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (vzv) vaccine
WO2018170322A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
WO2018170245A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
EP3634449A4 (en) 2017-05-08 2021-03-17 Gritstone Oncology, Inc. ALPHAVIRUS NEOANTIGEN VECTORS
JP7285220B2 (ja) 2017-05-18 2023-06-01 モデルナティエックス インコーポレイテッド 連結したインターロイキン－１２（ｉｌ１２）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子
US11485972B2 (en) 2017-05-18 2022-11-01 Modernatx, Inc. Modified messenger RNA comprising functional RNA elements
EP3638292A1 (en) 2017-06-14 2020-04-22 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
FI3638776T3 (fi) 2017-06-14 2025-12-09 Univ Dresden Tech Menetelmiä ja välineitä genomien geneettiseen muokkaamiseen hyödyntäen suunnittelu-DNA:ta rekombinoivia entsyymejä
WO2018232120A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
CN111163799A (zh) 2017-07-28 2020-05-15 扬森疫苗与预防公司 用于异源repRNA免疫接种的方法和组合物
CA3073020A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
EP3675817A1 (en) 2017-08-31 2020-07-08 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
WO2019055807A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZIKA VIRUS
EP3461497A1 (en) 2017-09-27 2019-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Viral antigens
EP3714045A1 (en) 2017-11-22 2020-09-30 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits for the treatment of propionic acidemia
US11939601B2 (en) 2017-11-22 2024-03-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase for the treatment of phenylketonuria
CA3079428A1 (en) 2017-11-22 2019-05-31 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of urea cycle disorders
EA202091517A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и устройство для доставки вакцин против вируса гепатита b (hbv)
US11021692B2 (en) 2017-12-19 2021-06-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Hepatitis B virus (HBV) vaccines and uses thereof
EA202091516A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и композиции для индукции иммунного ответа против вируса гепатита b (hbv)
BR112020012361A2 (pt) 2017-12-20 2020-11-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. constructos de antígeno do vírus epstein-barr
MX2020007077A (es) 2018-01-04 2020-10-28 Iconic Therapeutics Inc Anticuerpos anti-factor tisular, conjugados anticuerpo-farmaco y metodos relacionados.
MA51523A (fr) 2018-01-05 2020-11-11 Modernatx Inc Polynucléotides codant pour des anticorps anti-virus du chikungunya
EP3746090A4 (en) 2018-01-29 2021-11-17 ModernaTX, Inc. RSV RNA Vaccines
CA3100050A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Lupagen, Inc. Systems and methods for closed loop, real-time modifications of patient cells
WO2019226650A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Modernatx, Inc. Delivery of dna
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
US20220184185A1 (en) 2018-07-25 2022-06-16 Modernatx, Inc. Mrna based enzyme replacement therapy combined with a pharmacological chaperone for the treatment of lysosomal storage disorders
US12083174B2 (en) 2018-08-17 2024-09-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions and uses thereof
WO2020047201A1 (en) 2018-09-02 2020-03-05 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding very long-chain acyl-coa dehydrogenase for the treatment of very long-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency
WO2020056155A2 (en) 2018-09-13 2020-03-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex e1-alpha, e1-beta, and e2 subunits for the treatment of maple syrup urine disease
MX2021003015A (es) 2018-09-13 2021-07-15 Modernatx Inc Polinucleotidos que codifican glucosa-6-fosfatasa para el tratamiento de la glucogenosis.
JP2022500444A (ja) 2018-09-14 2022-01-04 モダーナティエックス・インコーポレイテッドModernaTX, Inc. クリグラー−ナジャー症候群の治療のためのウリジン二リン酸グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドａ１をコードするポリヌクレオチド
CA3113025A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Peg lipids and uses thereof
WO2020061295A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
WO2020061367A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2020061457A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
EP3856233A1 (en) 2018-09-27 2021-08-04 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
CN113966221B (zh) * 2019-03-08 2026-03-31 麻省理工学院 合成溶瘤lnp复制子rna和用于癌症免疫治疗的用途
US12070495B2 (en) 2019-03-15 2024-08-27 Modernatx, Inc. HIV RNA vaccines
JP2022532078A (ja) 2019-05-08 2022-07-13 アストラゼネカ アクチボラグ 皮膚及び創傷のための組成物並びにその使用の方法
MX2021014525A (es) 2019-05-30 2022-03-17 Gritstone Bio Inc Adenovirus modificados.
EP3986460A2 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and anti-pd-1 antibody
US20250041386A1 (en) 2019-06-18 2025-02-06 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Recombinant Interleukin 12 Construct and Uses Thereof
KR20220042116A (ko) 2019-06-18 2022-04-04 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니 B형 간염 바이러스(HBV) 백신 및 HBV-타케팅 RNAi의 조합
KR20220041080A (ko) 2019-06-18 2022-03-31 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니 B형 간염 바이러스(hbv) 백신 및 항-pd-1 또는 항-pc-l1 항체의 조합
WO2020255010A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of recombinant interleukin 12 construct and hepatitis b virus (hbv) vaccines
WO2020255062A1 (en) 2019-06-20 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Lipid nanoparticle or liposome delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines
US20220273789A1 (en) 2019-07-21 2022-09-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Therapeutic viral vaccine
CA3155015A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Carbonate containing lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
AU2020350759A1 (en) 2019-09-19 2022-03-31 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
CR20220220A (es) 2019-11-18 2022-09-20 Janssen Biotech Inc Vacunas basadas en calr y jak2 mutantes y sus usos
BR112022017852A2 (pt) 2020-03-09 2022-11-01 Dynavax Tech Corp Vacinas para herpes zoster compreendendo um agonista de tlr9
AU2021236068A1 (en) 2020-03-09 2022-10-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inducing immune responses
WO2021209970A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sars cov-2 spike protein construct
EP4153223A1 (en) * 2020-05-20 2023-03-29 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Immunogenic compositions and uses thereof
EP4158005A1 (en) 2020-06-01 2023-04-05 ModernaTX, Inc. Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof
WO2021245611A1 (en) 2020-06-05 2021-12-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified betacoronavirus spike proteins
WO2022002783A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
EP4175664A2 (en) 2020-07-06 2023-05-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses
IL299571A (en) 2020-07-08 2023-02-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Rna replicon vaccines against hbv
ES3054438T3 (en) 2020-07-16 2026-02-03 Acuitas Therapeutics Inc Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
CN116438308A (zh) 2020-08-06 2023-07-14 磨石生物公司 多表位疫苗盒
EP4196128A4 (en) 2020-08-14 2024-06-12 Arcturus Therapeutics, Inc. METHOD FOR FREEZE DILIZATION OF LIPID NANOPARTICLES
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
WO2022104131A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
TW202245809A (zh) 2020-12-18 2022-12-01 美商詹森藥物公司 用於治療b型肝炎病毒感染之組合療法
CA3171051A1 (en) * 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration
EP4267593A2 (en) 2020-12-23 2023-11-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Self-amplifying messenger rna
WO2022146654A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Transcription activator-like effector nucleases (talens) targeting hbv
EP4032546A1 (en) 2021-01-20 2022-07-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Therapeutic viral vaccine
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
US20240216288A1 (en) 2021-03-24 2024-07-04 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding propionyl-coa carboxylase alpha and beta subunits and uses thereof
US20240207374A1 (en) 2021-03-24 2024-06-27 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding glucose-6-phosphatase and uses thereof
WO2022204370A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles and polynucleotides encoding ornithine transcarbamylase for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
WO2022204390A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles containing polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase and uses thereof
US20240226025A1 (en) 2021-03-24 2024-07-11 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase for the treatment of methylmalonic acidemia
CA3212653A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
WO2022248353A1 (en) 2021-05-24 2022-12-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
EP4352247A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Release assay for determining potency of self-amplifying rna drug product and methods for using
EP4355882A2 (en) 2021-06-15 2024-04-24 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression
WO2022271776A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding uridine diphosphate glycosyltransferase 1 family, polypeptide a1 for the treatment of crigler-najjar syndrome
US20240350410A1 (en) 2021-08-16 2024-10-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Freeze-drying of lipid nanoparticles (lnps) encapsulating rna and formulations thereof
EP4387596A1 (en) 2021-08-16 2024-06-26 GlaxoSmithKline Biologicals SA Low-dose lyophilized rna vaccines and methods for preparing and using the same
WO2023020992A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020993A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020994A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
CA3229889A1 (en) 2021-09-03 2023-03-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Substitution of nucleotide bases in self-amplifying messenger ribonucleic acids
WO2023056044A1 (en) 2021-10-01 2023-04-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of fibrosis and/or cardiovascular disease
CN115960922A (zh) * 2021-10-09 2023-04-14 吴可行 自复制rna分子设计及其应用
EP4433584A1 (en) 2021-11-15 2024-09-25 Technische Universität Dresden Site-specific recombinases for efficient and specific genome editing
CA3242402A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
US20250221931A1 (en) 2022-03-25 2025-07-10 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding fanconi anemia, complementation group proteins for the treatment of fanconi anemia
WO2023198815A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Sequential administration of adenoviruses
WO2023218420A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Mrna compositions for inducing latent hiv-1 reversal
WO2023221938A1 (zh) * 2022-05-16 2023-11-23 上海行深生物科技有限公司 蛋白包裹自复制rna及其制备方法
WO2023233290A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Rnai agents targeting pd-l1
WO2023242817A2 (en) 2022-06-18 2023-12-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2
WO2024026254A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for temporal control of expression
AU2023353931A1 (en) 2022-09-26 2025-03-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
CN120548367A (zh) 2022-11-18 2025-08-26 波士顿大学董事会 自复制rna及其用途
WO2024133160A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis b compositions
WO2024160936A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rna formulation
GB202302092D0 (en) 2023-02-14 2023-03-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Analytical method
WO2024197033A1 (en) 2023-03-21 2024-09-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding relaxin for the treatment of heart failure
EP4698641A1 (en) 2023-04-17 2026-02-25 Technische Universität Dresden Körperschaft des öffentlichen Rechts Novel recombinase enzymes for site-specific dna-recombination
AU2024260120A1 (en) 2023-04-27 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
WO2024223724A1 (en) 2023-04-27 2024-10-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
EP4704816A1 (en) 2023-05-03 2026-03-11 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis
EP4480490A1 (en) 2023-06-23 2024-12-25 Medizinische Hochschule Hannover Brick1 for use in treating myocardial diseases
WO2025011529A2 (en) 2023-07-07 2025-01-16 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna vaccines for seasonal flu and methods of uses
CN116726036B (zh) * 2023-07-27 2025-12-26 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 Nm107在抗传染性胰脏坏死病毒中的应用
WO2025045142A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Shanghai Circode Biomed Co., Ltd. Circular rna encoding vegf polypeptides, formulations, and methods of uses
AU2024332500A1 (en) 2023-09-01 2026-03-19 Seamless Therapeutics Gmbh Method for the production of a target-specific large serine recombinase
WO2025072482A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Modernatx, Inc. Immunoglobulin a protease polypeptides, polynucleotides, and uses thereof
US20250145973A1 (en) 2023-10-16 2025-05-08 Technische Universität Dresden Körperschaft Des Öffentlichen Rechts Conditioned dna modifying enzyme comprising heterologous dna binding domain
WO2025132839A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
GB202404607D0 (en) 2024-03-29 2024-05-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNA formulation
WO2025229572A1 (en) 2024-05-01 2025-11-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Epstein-barr virus antigen-encoding messenger ribonucleic acid and antigen protein vaccines
WO2025255199A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Modernatx, Inc. Argininosuccinate synthase 1 and argininosuccinate lyase polypeptides and polynucleotides and uses thereof
US20260002204A1 (en) 2024-06-07 2026-01-01 Technische Universität Dresden Körperschaft Des Öffentlichen Rechts Method for producing spacer-specific dna recombining enzymes
WO2026022363A1 (en) 2024-07-25 2026-01-29 Technische Universität Dresden Körperschaft Des Öffentlichen Rechts Modifying nucleic acid sequences having asymmetric target sites
CN120310792B (zh) * 2025-02-27 2026-01-30 复旦大学附属肿瘤医院 一种帽非依赖的线性mRNA表达系统及其应用

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090406A (en) 1984-04-12 2000-07-18 The Liposome Company, Inc. Potentiation of immune responses with liposomal adjuvants
US5140086A (en) 1988-11-25 1992-08-18 Weyerhaeuser Company Isocyanate modified cellulose products and method for their manufacture
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5693535A (en) 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
US5750390A (en) 1992-08-26 1998-05-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of diseases caused by expression of the bcl-2 gene
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
EP0786522A2 (en) 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
EP1624068A1 (en) 1993-06-01 2006-02-08 Life Technologies Inc. Genetic immunization with cationic lipids
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US6264957B1 (en) * 1995-09-27 2001-07-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Product of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
CA2259179C (en) 1996-07-03 2008-09-23 University Of Pittsburgh Emulsion formulations for hydrophilic active agents
CN1138533C (zh) 1996-09-13 2004-02-18 利普森有限公司 脂质体
US7384923B2 (en) 1999-05-14 2008-06-10 Lipoxen Technologies Limited Liposomes
US6395302B1 (en) 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
AU733310C (en) 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US6060308A (en) 1997-09-04 2000-05-09 Connaught Laboratories Limited RNA respiratory syncytial virus vaccines
US6009406A (en) 1997-12-05 1999-12-28 Square D Company Methodology and computer-based tools for re-engineering a custom-engineered product line
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
WO2000000616A2 (en) 1998-06-29 2000-01-06 U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases Marburg virus vaccines
ES2238799T3 (es) 1999-09-09 2005-09-01 Curevac Gmbh Transferencia de arn-m.
EP1222289B1 (en) 1999-10-20 2008-04-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them
US8541008B2 (en) * 1999-11-19 2013-09-24 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Pharmaceutical compositions and methods to vaccinate against candidiasis
US20030212022A1 (en) * 2001-03-23 2003-11-13 Jean-Marie Vogel Compositions and methods for gene therapy
US7149665B2 (en) 2000-04-03 2006-12-12 Browzwear International Ltd System and method for simulation of virtual wear articles on virtual models
EP1287015A1 (en) 2000-04-18 2003-03-05 Human Genome Sciences, Inc. Extracellular matrix polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP2004502415A (ja) 2000-07-03 2004-01-29 カイロン　エセ．ピー．アー． Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫化
AU2001290520A1 (en) 2000-08-01 2002-02-13 The Johns Hokpins University Intercellular transport protein linked to an antigen as a molecular vaccine
ES2260291T3 (es) 2000-09-28 2006-11-01 Chiron Corporation Microparticulas para la administracion de acidos nucleicos heterologos.
CA2881568C (en) 2000-10-27 2019-09-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
US7731975B2 (en) 2001-01-31 2010-06-08 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Chimeric filovirus glycoprotein
WO2002061113A2 (en) * 2001-02-01 2002-08-08 The Johns Hopkins University Nucleic acid derived vaccine that encodes an antigen linked to a polypeptide that promotes antigen presentation
US20030040498A1 (en) 2001-03-14 2003-02-27 Ansardi David Calvert Oncolytic RNA replicons
US20030077251A1 (en) 2001-05-23 2003-04-24 Nicolas Escriou Replicons derived from positive strand RNA virus genomes useful for the production of heterologous proteins
ES2340499T3 (es) 2001-06-05 2010-06-04 Curevac Gmbh Arnm de antigeno tumoral estabilizado con un contenido de g/c aumentado.
WO2003018054A1 (en) 2001-08-31 2003-03-06 Chiron Srl. Helicobacter pylori vaccination
ES2330202T5 (es) * 2001-09-06 2014-01-20 Alphavax, Inc. Sistemas vectores basados en replicones de alfavirus
AU2003211103A1 (en) 2002-02-13 2003-09-04 Northeastern University Intracellular delivery of therapeutic agents
DE10207177A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Fakultativ kationische Lipide
EP1519714B1 (en) 2002-06-28 2010-10-20 Protiva Biotherapeutics Inc. Method and apparatus for producing liposomes
BR0314236A (pt) 2002-09-13 2005-08-09 Replicor Inc Formulação de oligonucleotìdeo, composição farmacêutica, kit, composto antiviral, preparação de oligonucleotìdeo e métodos para seleção de um oligonucleotìdeo antiviral para uso como um agente antiviral, para profilaxia ou tratamento de uma infecção viral em um paciente, para tratamento profilático de câncer causado por oncovìrus, para identificação de um composto que altera a ligação de um oligonucleotìdeo a pelo menos um componente viral, para purificação da ligação de oligonucleotìdeos a pelo menos um componente viral e para enriquecimento de oligonucleotìdeos a partir de um agrupamento de oligonucleotìdeos
DK2311848T3 (da) 2002-12-23 2013-10-14 Vical Inc Kodon-optimerede polynukleotidbaserede vacciner mod human cytomegalovirus-infektion
WO2004069148A2 (en) 2003-02-04 2004-08-19 Bar-Ilan University Snornai-small nucleolar rna degradation by rna interference in trypanosomatids
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
EP1637144A4 (en) 2003-05-30 2010-01-13 Nippon Shinyaku Co Ltd OLIGONUCLEIC ACID CONTAINING COMPOSITE AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE SAME
MXPA05013260A (es) 2003-06-26 2006-03-09 Chiron Corp Composiciones inmunogenicas para chlamydia trachomatis.
US7368537B2 (en) * 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
CA2532228C (en) 2003-07-16 2017-02-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
ES2505695T3 (es) 2003-07-31 2014-10-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Composiciones inmunógenas para Streptococcus pyogenes
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
CN1989250B (zh) 2004-05-18 2013-11-20 阿尔法瓦克斯公司 Tc-83衍生的甲病毒属载体、颗粒和方法
JP5331340B2 (ja) 2004-05-18 2013-10-30 バイカル インコーポレイテッド インフルエンザウィルスワクチン組成物、及びその使用方法
EP2848692B1 (en) 2004-05-21 2017-08-16 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Alphavirus vectors for influenza virus vaccines
JP4764426B2 (ja) 2004-06-07 2011-09-07 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド カチオン性脂質および使用方法
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
US20060051405A1 (en) * 2004-07-19 2006-03-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions for the delivery of therapeutic agents and uses thereof
JP5086082B2 (ja) 2004-10-01 2012-11-28 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル Ｃ型肝炎ウイルス複製系
EP1812056B1 (en) * 2004-11-15 2013-08-07 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Immunogenic compositions containing anthrax antigen, biodegradable polymer microparticles, and polynucleotide-containing immunological adjuvant
JP2008530245A (ja) 2005-02-18 2008-08-07 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 尿路病原性菌株由来の抗原
SI1858920T1 (sl) 2005-02-18 2016-07-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Proteini in nukleinske kisline iz escherichia coli, povezane z meningitisom/sepso
US20080138431A1 (en) 2005-03-02 2008-06-12 James Edward Eyles Pharmaceutical Composition
EP1871888A4 (en) 2005-03-30 2013-08-21 Novartis Vaccines & Diagnostic HAEMOPHILUS INFLUENZAE OF TYPE B
US7618393B2 (en) 2005-05-03 2009-11-17 Pharmajet, Inc. Needle-less injector and method of fluid delivery
RU2007146137A (ru) 2005-05-12 2009-06-27 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс, Инк. (Us) Иммуногенные композиции на основе chlamydia trachomatis
US8703095B2 (en) 2005-07-07 2014-04-22 Sanofi Pasteur S.A. Immuno-adjuvant emulsion
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
CA2626253A1 (en) 2005-10-18 2007-04-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
JP2007112768A (ja) 2005-10-24 2007-05-10 Kyoto Univ 肝指向性リポソーム組成物
EP1954306A2 (en) 2005-10-25 2008-08-13 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Compositions comprising yersinia pestis antigens
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
EP2586790A3 (en) 2006-08-16 2013-08-14 Novartis AG Immunogens from uropathogenic Escherichia coli
CA2689042A1 (en) 2007-02-16 2008-08-28 Merck & Co., Inc. Compositions and methods for potentiated activity of biologicaly active molecules
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
HUE040417T2 (hu) 2007-05-04 2019-03-28 Marina Biotech Inc Aminosavlipidek és alkalmazásuk
DE102007029471A1 (de) 2007-06-20 2008-12-24 Novosom Ag Neue fakultativ kationische Sterole
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
GB0717187D0 (en) 2007-09-04 2007-10-17 Novartis Ag Compositions comprising yersinia pestis antigens
CA2704153A1 (en) 2007-09-26 2009-04-02 Vanderbilt University Vaccine for rsv and mpv
AU2008338803B2 (en) 2007-11-26 2015-02-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Methods of generating alphavirus particles
WO2009086558A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
WO2009111088A2 (en) 2008-01-02 2009-09-11 The Johns Hopkins University Antitumor immunization by liposomal delivery of vaccine to the spleen
ITMI20081249A1 (it) 2008-07-09 2010-01-09 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogeni di escherichia coli con solubilità migliorata.
WO2009109860A2 (en) 2008-03-06 2009-09-11 Novartis Ag Mutant forms of chlamydia htra
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
WO2009132206A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Liquidia Technologies, Inc. Compositions and methods for intracellular delivery and release of cargo
US20100040650A1 (en) * 2008-05-30 2010-02-18 Crowe Jr James E Virus-Like paramyxovirus particles and vaccines
EP2130912A1 (en) 2008-06-04 2009-12-09 Institut für Viruskrankeiten und Immunprophylaxe Pestivirus replicons providing an RNA-based viral vector system
CL2008002322A1 (es) 2008-08-07 2009-06-05 Univ Concepcion Formulacion farmaceutica veterinaria que comprende un sistema vectorial viral constituido por una particula recombinante de arn que codifica una cu/zn superoxido dismutasa de la bacteria patogena de bovinos brucella abortus, y al menos un alfavirus arn perteneciente a la familia del virus semliki forest (sfv), util como vacuna.
CA2740000C (en) 2008-10-09 2017-12-12 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
JP6046348B2 (ja) 2008-11-18 2016-12-14 タケダ ヴァクシーンズ， インコーポレイテッド Ｒｓｖｆｖｌｐならびにその製造および使用の方法
EP3263128A3 (en) 2009-04-14 2018-01-24 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Compositions for immunising against staphylococcus aureus
WO2011000107A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
EP2450031B1 (en) 2009-07-02 2018-08-29 Konica Minolta Holdings, Inc. Method for producing liposomes by two-stage emulsification method using outer aqueous phase containing specific dispersing agent, method for producing liposome dispersion or dry powder thereof using the method for producing liposomes, and liposome dispersion or dry powder thereof produced thereby
CA2766907A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
CA2768186A1 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Novartis Ag Rsv f protein compositions and methods for making same
US8277919B2 (en) 2009-07-23 2012-10-02 VMO Systems, Inc. Reflective coating for an optical disc
CA2769670C (en) 2009-07-31 2018-10-02 Ethris Gmbh Rna with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
CN107028886A (zh) * 2009-11-04 2017-08-11 不列颠哥伦比亚大学 含有核酸的脂质粒子及相关的方法
US20110112353A1 (en) 2009-11-09 2011-05-12 Circulite, Inc. Bifurcated outflow cannulae
EP3318248B1 (en) 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
CA3009891C (en) 2009-12-23 2020-09-15 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
MX342608B (es) 2010-07-06 2016-10-06 Novartis Ag * Particulas de suministro similares a viriones para moleculas de arn de autorreplicacion.
EP2591114B1 (en) 2010-07-06 2016-06-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunisation of large mammals with low doses of rna
NZ606591A (en) 2010-07-06 2015-02-27 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
ES2557382T3 (es) 2010-07-06 2016-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomas con lípidos que tienen un valor de pKa ventajoso para el suministro de ARN
ES2646669T3 (es) 2010-07-06 2017-12-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de aumento de una respuesta inmunitaria mediante el suministro de ARN
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
SI4043040T1 (sl) 2010-08-31 2023-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
LT4226941T (lt) * 2010-08-31 2025-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui
MX2013002332A (es) 2010-08-31 2013-03-18 Novartis Ag Lipidos apropiados para suministro liposomal del arn que codifica la proteina.
EP4115875A1 (en) 2011-07-06 2023-01-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
MX366055B (es) 2011-08-31 2019-06-26 Novartis Ag Liposomas pegilados para admistracion de acido ribonucleico (arn) que codifica para inmunogeno.

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011276232A1 (en) 2013-02-21
EP2590676B1 (en) 2016-08-17
PT4005592T (pt) 2022-12-30
PL4005592T3 (pl) 2023-02-06
CA2804494A1 (en) 2012-01-12
MX2013000089A (es) 2013-02-27
MX342608B (es) 2016-10-06
JP2013533747A (ja) 2013-08-29
US20130195968A1 (en) 2013-08-01
HRP20221522T1 (hr) 2023-02-17
CN103052400B (zh) 2016-11-16
SMT202200500T1 (it) 2023-01-13
HRP20161352T1 (hr) 2016-12-02
AU2011276232B2 (en) 2016-01-14
SI2590676T1 (sl) 2016-11-30
EP3115061A1 (en) 2017-01-11
PT2590676T (pt) 2016-11-04
BR112013000392B8 (pt) 2022-10-04
US11291635B2 (en) 2022-04-05
HUE031485T2 (en) 2017-07-28
CY1118080T1 (el) 2017-06-28
EP2590676A2 (en) 2013-05-15
BR112013000392A2 (pt) 2021-05-25
ES2934240T3 (es) 2023-02-20
CN103052400A (zh) 2013-04-17
RS63817B1 (sr) 2023-01-31
LT2590676T (lt) 2016-10-25
SMT201600386B (it) 2017-01-10
SI4005592T1 (sl) 2023-03-31
WO2012006376A3 (en) 2012-04-19
EP4005592B1 (en) 2022-10-12
BR112013000392B1 (pt) 2022-07-12
PL2590676T3 (pl) 2017-02-28
US20220192997A1 (en) 2022-06-23
FI4005592T3 (fi) 2023-01-13
JP6061849B2 (ja) 2017-01-18
EP4005592A1 (en) 2022-06-01
DK2590676T3 (en) 2016-10-24
ES2600892T3 (es) 2017-02-13
LT4005592T (lt) 2023-01-10
WO2012006376A2 (en) 2012-01-12
EP4180057A1 (en) 2023-05-17
HUE060788T2 (hu) 2023-04-28
RU2013104890A (ru) 2014-08-20
CN106421773A (zh) 2017-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220323354A1 (en) Vaccine for eliciting immune response comprising lipid nanoparticles and rna comprising segment encoding an immunogen
US20220192997A1 (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
AU2018204178B2 (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding RNA
EP2729126B1 (en) Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
HK40071976B (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40088259A (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40071976A (en) Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
HK40085250A (en) Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
HK40068455A (en) Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
HK40087666A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40082652A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40079415A (en) Small liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
HK40085616A (en) Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules