ES2934240T3 - Partículas de administración de tipo virión para moléculas de ARN autorreplicantes - Google Patents

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Abstract

La inmunización con ácido nucleico se logra mediante la administración de un ARN autorreplicante encapsulado dentro de una pequeña partícula. El ARN codifica un inmunógeno de interés y la partícula puede administrar este ARN imitando la función de administración de un virus de ARN natural. Por tanto, la invención proporciona una partícula que no es de virión para el suministro in vivo de ARN a una célula de vertebrado, en el que la partícula comprende un material de suministro que encapsula una molécula de ARN autorreplicante que codifica un inmunógeno. Estas partículas son útiles como componentes en composiciones farmacéuticas para inmunizar sujetos contra diversas enfermedades. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Partículas de administración de tipo virión para moléculas de ARN autorreplicantes
Campo técnico
La presente invención está en el campo de la administración no vírica de ARN autorreplicantes para inmunización.
Técnica anterior
La administración de ácidos nucleicos para inmunizar animales ha sido un objetivo durante varios años. Se han probado diversos enfoques, que incluyen el uso de ADN o ARN, de vehículos de administración víricos o no víricos (o incluso sin vehículo de administración, en una vacuna "desnuda"), de vectores replicantes o no replicantes, o de vectores víricos o no víricos.
Sigue existiendo una necesidad de vacunas de ácido nucleico adicionales y mejoradas y, en particular, de formas mejoradas de administración de vacunas de ácido nucleico.
Wilson et al., 1979, Cell, 17:1,77-84 describen la introducción mediada por lípido de ARN del virus de la poliomielitis en células.
Divulgación de la invención
Según la invención, la inmunización con ácido nucleico se logra administrando un ARN autorreplicante encapsulado dentro de una pequeña partícula que es un liposoma que comprende un lípido con un grupo de cabeza catiónico. El ARN codifica un inmunogén de interés que puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo contra un virus, una bacteria, un hongo, un parásito, un alérgeno o un antígeno de tumor, y la partícula puede administrar este ARN imitando la función de administración de un virus natural.
Por lo tanto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una partícula no de virión que no comprende una cápside de proteína, para la administración in vivo de ARN a una célula de vertebrado; en donde (a) la partícula se forma a partir de un material de administración de lípidos anfifílicos que pueden formar liposomas, y la partícula es un liposoma que comprende un lípido con un grupo de cabeza catiónico y que encapsula una molécula de ARN autorreplicante que codifica un inmunogén, en donde el inmunogén puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo contra un virus, una bacteria, un hongo, un parásito, un alérgeno o un antígeno de tumor; y en donde (bi) el ARN no incluye nucleótidos modificados, excepto cualquier estructura de caperuza en 5', o (bii) el ARN incluye una caperuza en 5' que comprende una 7-metilguanosina y los primeros 1, 2 o 3 ribonucleótidos en 5' están metilados en la posición 2' de la ribosa.
Estas composiciones farmacéuticas son para inmunizar sujetos contra diversas enfermedades. La combinación de utilización de una partícula no de virión para administrar un ARN autorreplicante proporciona una forma de provocar una respuesta inmunitaria fuerte y específica contra el inmunogén, mientras que administra solo una baja dosis de ARN. Además, estas partículas se pueden fabricar fácilmente a escala comercial.
La partícula
Las partículas de la invención son partículas no de virión, es decir, no son un virión. Por lo tanto, la partícula no comprende una cápside de proteína. Evitando la necesidad de crear una partícula de la cápside, la invención no requiere una estirpe celular de encapsidación, por lo que se permite un aumento de escala más fácil para la producción comercial y se minimiza el riesgo de que virus infecciosos peligrosos se produzcan involuntariamente. En lugar de encapsular el ARN en un virión, las partículas de la invención se forman a partir de un material de administración de lípidos anfifílicos que puede formar liposomas. Si la administración es por liposoma, el ARN se debe encapsular.
Por lo tanto, una partícula de la invención es un liposoma que encapsula una molécula de ARN autorreplicante que codifica un inmunogén que puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo contra un virus, una bacteria, un hongo, un parásito, un alérgeno o un antígeno de tumor. La partícula es preferentemente sustancialmente esférica. El ARN está encapsulado dentro del liposoma. Esto significa que el ARN en el interior de las partículas está separado (como en un virus natural) de cualquier medio externo por el material de administración, y se ha encontrado que la encapsulación protege el ARN de la digestión por RNasa. La encapsulación puede adoptar diversas formas. Por ejemplo, en algunas realizaciones (como en un liposoma unilaminar), el material de administración forma una capa externa alrededor de un núcleo que contiene ARN acuoso. Las partículas pueden incluir algún ARN externo (por ejemplo, sobre la superficie de las partículas), pero al menos la mitad del ARN (e idealmente todo él) está encapsulado. La encapsulación dentro de los liposomas es distinta de, por ejemplo, los complejos de lípido/ARN desvelados en la referencia 1.
Liposomas
Diversos lípidos anfifílicos pueden formar bicapas en un entorno acuoso para encapsular un núcleo acuoso que contiene ARN, como un liposoma. Estos lípidos tienen un grupo de cabeza catiónico. Lípidos adicionales pueden tener un grupo de cabeza hidrófilo aniónico o de ion bipolar. La formación de liposomas de fosfolípidos aniónicos se remonta a los años 60 y se han estudiado lípidos formadores de liposomas catiónicos desde los años 90. Algunos fosfolípidos son aniónicos, mientras que otros son de ion bipolar y otros son catiónicos. Las clases de fosfolípido adecuadas incluyen, pero no se limitan a, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas y fosfatidilgliceroles, y algunos fosfolípidos útiles se enumeran en la Tabla 1. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a, dioleoil trimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleiloxi-N,Ndimetil-3-aminopropano (DODMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Los lípidos de ion bipolar incluyen, pero no se limitan a, lípidos de ion bipolar de acilo y lípidos de ion bipolar de éter. Los ejemplos de lípidos de ion bipolar útiles son DPPC, DOPC y dodecilfosfocolina. Los lípidos pueden estar saturados o insaturados. Se prefiere el uso de al menos un lípido insaturado para preparar los liposomas. Si un lípido insaturado tiene dos colas, ambas colas pueden estar insaturadas, o pueden tener una cola saturada y una cola insaturada.
Las partículas liposómicas de la invención se pueden formar a partir de un único lípido o de una mezcla de lípidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de lípidos catiónicos (ii) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos catiónicos (iii) una mezcla de lípidos de ion bipolar y lípidos catiónicos o (iv) una mezcla de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos y lípidos de ion bipolar. Similarmente, una mezcla puede comprender lípidos tanto saturados como insaturados. Por ejemplo, una mezcla puede comprender DSPC (de ion bipolar, saturados), DlinDMA (catiónicos, insaturados) y/o DMG (aniónicos, saturados). Si se usa una mezcla de lípidos, no todos los lípidos del componente en la mezcla necesitan ser anfifílicos, por ejemplo, uno o más lípidos anfifílicos se pueden mezclar con colesterol.
La porción hidrófila de un lípido puede estar PEGilada (es decir, modificada por unión covalente de un polietilenglicol). Esta modificación puede aumentar la estabilidad y prevenir la adsorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, los lípidos se pueden conjugar con PEG usando técnicas, tales como las desveladas en la referencia 2 y 3. Se pueden usar diversas longitudes de PEG, por ejemplo, entre 0,5-8 kDa.
Una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol se usa en los ejemplos.
Las partículas liposómicas se dividen normalmente en tres grupos: vesículas multilaminares (MLV); vesículas unilaminares pequeñas (SUV); y vesículas unilaminares grandes (LUV). Las MLV tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimentos acuosos separados. Las SUV y LUV tienen una única bicapa que encapsula un núcleo acuoso; las SUV tienen normalmente un diámetro < 50 nm, y las LUV tienen un diámetro >50 nm. Las partículas liposómicas de la invención son idealmente LUV con un diámetro en el intervalo de 50­ 220 nm. Para una composición que comprende una población de LUV con diferentes diámetros: (i) al menos 80 % por número debe tener diámetros en el intervalo de 20-220 nm, (ii) el diámetro promedio (Zav, por intensidad) de la población está idealmente en el intervalo de 40-200 nm, y/o (iii) los diámetros deben tener un índice de polidispersidad <0,2. Se espera que los complejos de liposoma/ARN de referencia 1 tengan un diámetro en el intervalo de 600-800 nm y tengan una alta polidispersidad.
Se conocen bien en la técnica las técnicas para preparar liposomas adecuados, por ejemplo, véanse las referencias 4 a 6. Un método útil se describe en la referencia 7 e implica mezclar (i) una disolución etanólica de los lípidos (ii) una disolución acuosa del ácido nucleico y (iii) tampón, seguido de mezcla, equilibrado, dilución y purificación. Los liposomas preferidos de la invención son obtenibles por este proceso de mezcla.
El ARN
Partículas de la invención incluyen una molécula de ARN autorreplicante que (a diferencia del ARNip) codifica un inmunogén. El ARN no incluye nucleótidos modificados, excepto cualquier estructura de caperuza en 5', o incluye una caperuza en 5' que comprende una 7-metilguanosina y los primeros 1, 2 o 3 ribonucleótidos en 5' están metilados en la posición 2' de la ribosa. Después de la administración in vivo de las partículas, el ARN se libera de las partículas y se traduce en el interior de una célula para proporcionar el inmunogén in situ.
A diferencia de la referencia 13, el ARN en las partículas de la invención es autorreplicante. Una molécula de ARN autorreplicante (replicón) puede conducir, cuando se administra a una célula de vertebrado incluso sin proteínas, a la producción de múltiples ARN descendientes por transcripción de sí mismo (por una copia antisentido que genera de sí mismo). Una molécula de ARN autorreplicante es así normalmente una molécula de cadena que puede ser directamente traducida después de la administración a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que entonces produce tanto transcritos antisentido como sentido del ARN administrado.
Por lo tanto, el ARN administrado conduce a la producción de múltiples ARN descendientes. Estos ARN descendientes, así como los transcritos subgenómicos colineales, pueden ser traducidos ellos mismos para proporcionar la expresión in situ de un inmunogén codificado, o se pueden transcribir para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido que el ARN administrado que se traducen para proporcionar la expresión in situ del inmunogén. Los resultados globales de esta secuencia de transcripciones es una enorme amplificación en el número de ARN de replicón introducidos y, por lo tanto, el inmunogén codificado se convierte en un producto de polipéptido importante de las células.
Un sistema adecuado para lograr la autorreplicación de este modo es usar un replicón basado en alfavirus. Estos replicones son ARN de cadena que conducen a la traducción de una replicasa (o replicasa-transcriptasa) después de la administración a una célula. La replicasa se traduce como una poliproteína que se autoescinde para proporcionar un complejo de replicación que crea copias genómicas de cadena - del ARN administrado de la cadena . Estos transcritos de cadena - se pueden transcribir ellos mismos para dar copias adicionales del ARN parental de cadena y también para dar un transcrito subgenómico que codifica el inmunogén. La traducción del transcrito subgenómico conduce así a la expresión in situ del inmunogén por la célula infectada. Los replicones de alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus de Sindbis, un virus del bosque de Semliki, un virus de la encefalitis equina occidental, un virus de la encefalitis equina venezolana, etc. Se pueden usar secuencias de virus mutantes o no mutantes, por ejemplo, se ha usado el mutante de TC83 atenuado del VEEV en replicones [14].
Una molécula de ARN autorreplicante preferida codifica, por lo tanto, (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de ARN autorreplicante y (ii) un inmunogén. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, por ejemplo, que comprende una o más de las proteínas de alfavirus nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4.
Aunque los genomas de alfavirus naturales codifican proteínas estructurales de virión, además de la poliproteína no estructural de replicasa, se prefiere que las moléculas de ARN autorreplicantes de la invención no codifiquen proteínas estructurales de alfavirus. Por lo tanto, un ARN autorreplicante preferido puede conducir a la producción de copias de ARN genómico de sí mismo en una célula, pero no a la producción de viriones que contienen ARN. La incapacidad para producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfavirus no mutante, la molécula de ARN autorreplicante no se puede perpetuar en sí misma en forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para la perpetuación en virus no mutantes están ausentes de los ARN autorreplicantes de la invención y su lugar es tomado por gen(es) que codifican el inmunogén de interés, de forma que el transcrito subgenómico codifique el inmunogén en vez de las proteínas estructurales de virión del alfavirus.
Por lo tanto, una molécula de ARN autorreplicante útil con la invención puede tener dos marcos de lectura abiertos. El primer (5') marco de lectura abierto codifica una replicasa; el segundo (3') marco de lectura abierto codifica un inmunogén. En algunas realizaciones, el ARN puede tener marcos de lectura abiertos adicionales (por ejemplo, en la dirección 3'), por ejemplo, para codificar inmunógenos adicionales (véase a continuación) o para codificar polipéptidos accesorios.
Una molécula de ARN autorreplicante preferida tiene una caperuza en 5' (por ejemplo, una 7-metilguanosina). Esta caperuza puede potenciar la traducción in vivo del ARN. En algunas realizaciones, la secuencia de 5' de la molécula de ARN autorreplicante se debe seleccionar para garantizar la compatibilidad con la replicasa codificada.
Una molécula de ARN autorreplicante puede tener una cola de poli-A en 3'. También puede incluir una secuencia de reconocimiento de polimerasa de poli-A (por ejemplo, AAUAAA) cerca de su extremo 3'.
Las moléculas de ARN autorreplicantes pueden tener diversas longitudes, pero normalmente tienen 5000-25000 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 8000-15000 nucleótidos, o 9000-12000 nucleótidos. Por lo tanto, el ARN es más largo que el observado en la administración de ARNip.
Las moléculas de ARN autorreplicantes normalmente serán monocatenaria. Los ARN monocatenarios pueden iniciar, en general, un efecto adyuvante uniéndose a TLR7, TLR8, ARN helicasas y/o PKR. El ARN administrado en forma bicatenaria (ARNbc) puede unirse a TLR3, y este receptor también puede ser desencadenado por ARNbc que se forma ya sea durante la replicación de un ARN monocatenario o dentro de la estructura secundaria de un ARN monocatenario.
El ARN autorreplicante se puede preparar convenientemente por transcripción in vitro (IVT). La IVT puede usar un molde (ADNc) creado y propagado en la forma de plásmido en bacterias, o creado sintéticamente (por ejemplo, por síntesis de genes y/o métodos de manipulación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). Por ejemplo, se puede usar una ARN polimerasa dependiente de ADN (tal como las ARN polimerasas del bacteriófago T7, T3 o SP6) para transcribir el ARN autorreplicante de un molde de ADN. Se pueden usar reacciones de encapuchado y de adición de poli-A apropiadas según se requiera (aunque la poli-A del replicón está normalmente codificada dentro del molde de ADN). Estas ARN polimerasas pueden tener requisitos rigurosos para el (los) nucleótido(s) de 5' transcritos y en algunas realizaciones estos requisitos debe ser equiparados con los requisitos de la replicasa codificada, para garantizar que el ARN transcrito por IVT pueda funcionar eficientemente como un sustrato para su replicasa autocodificada.
Como se trata en la referencia 15, el ARN autorreplicante puede incluir (además de cualquier estructura de caperuza en 5') uno o más nucleótidos que tienen una nucleobase modificada. Por lo tanto, el ARN puede comprender m5C (5-metilcitidina), m5U (5-metiluridina), m6A (N6-metiladenosina), s2U (2-tiouridina), Um (2'-O-metiluridina), m1A (1-metiladenosina); m2A (2-metiladenosina); Am (2'-O-metiladenosina); ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenosina); i6A (N6-isopenteniladenosina); ms2i6A (2-metiltio-N6isopenteniladenosina); io6A (N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina); ms2io6A (2-metiltio-N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina); g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina); t6A (N6-treonilcarbamoiladenosina); ms2t6A (2-metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina); m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina); hn6A(N6.-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina); ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina); Ar(p) (2'-O-ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina); m1I (1-metilinosina); m'Im (1,2'-O-dimetilinosina); m3C (3-metilcitidina); Cm (2T-O-metilcitidina); s2C (2-tiocitidina); ac4C (N4-acetilcitidina); f5C (5-fonnilcitidina); m5Cm (5,2-0-dimetilcitidina); ac4Cm (N4-acetil-2'-O-metilcitidina); k2C (lisidina); m1G (1-metilguanosina); m2G (N2-metilguanosina); m7G (7-metilguanosina); Gm (2'-O-metilguanosina); m22G (N2,N2-dimetilguanosina); m2Gm (N2,2'-O-dimetilguanosina); m22Gm (N2,N2,2'-O-trimetilguanosina); Gr(p) (2'-O-ribosilguanosina (fosfato)); yW (wybutosina); o2yW (peroxiwybutosina); OHyW (hidroxiwybutosina); OHyW* (hidroxiwybutosina de baja modificación); imG (wyosina); mimG (metilguanosina); Q (queuosina); oQ (epoxiqueuosina); galQ (galtactosil-queuosina); manQ (manosil-queuosina); preQo (7-ciano-7-deazaguanosina); preQi (7-aminometil-7-deazaguanosina); G (arqueosina); D (dihidrouridina); m5Um (5,2'-O-dimetiluridina); s4U (4-tiouridina); m5s2U (5-metil-2-tiouridina); s2Um (2-tio-2'-O-metiluridina); acp3U (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina); ho5U (5-hidroxiuridina); mo5U (5-metoxiuridina); cmo5U (ácido uridina-5-oxiacético); mcmo5U (éster metílico del ácido uridina-5-oxiacético); chm5U (5-(carboxihidroximetil)uridina)); mchm5U (éster metílico de 5-(carboxihidroximetil)uridina); mcm5U (5-metoxicarbonil metiluridina); mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil-2-O-metiluridina); mcm5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina); nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridina); mnm5U (5-metilaminometiluridina); mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridina); mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridina); ncm5U (5-carbamoilmetiluridina); ncm5Um (5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina); cmnm5U (5-carboximetilaminometiluridina); cnmm5Um (5-carboximetilaminometil-2-L-O-metiluridina); cmnm5s2U (5-carboximetilaminometil-2-tiouridina); m62A (N6,N6-dimetiladenosina); Tm (2'-O-metilinosina); m4C (N4-metilcitidina); m4Cm (N4,2-O-dimetilcitidina); hm5C (5-hidroximetilcitidina); m3U (3-metiluridina); cm5U (5-carboximetiluridina); m6Am (N6,T-O-dimetiladenosina); rn62Am (N6,N6,O-2-trimetiladenosina); m2'7G (N2,7-dimetilguanosina); m2'2'7G (N2,N2,7-trimetilguanosina); m3Um (3,2T-O-dimetiluridina); m5D (5-metildihidrouridina); f5Cm (5-formil-2'-O-metilcitidina); m1Gm (1,2'-O-dimetilguanosina); m'Am (1,2-O-dimetiladenosina) irinometiluridina); tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridina)); imG-14 (4-demetilguanosina); imG2 (isoguanosina); o ac6A (N6-acetiladenosina), hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, derivados 7-sustituidos de la misma, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquil (C1-C6)-uracilo, 5-metiluracilo, 5-alquenil (C2-C6)-uracilo, 5-alquinil (C2-C6)-uracilo, 5-(hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-alquil (C1-C6)-citosina, 5-metilcitosina, 5-alquenil (C2-C6)-citosina, 5-alquinil (C2-C6)-citosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 7-deazaguanina, 8-azaguanina, 7-deaza-7-guanina sustituida, 7-deaza-7-alquinil (C2-C6)-guanina, 7-deaza-8-guanina, 8-hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,4-diaminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-azapurina, 7-deazapurina sustituida, 7-deaza-7-purina sustituida, 7-deaza-8-purina sustituida, o un nucleótido abásico. Por ejemplo, un ARN autorreplicante puede incluir una o más nucleobases de pirimidina modificadas, tales como restos de pseudouridina y/o 5-metilcitosina. En algunas realizaciones, sin embargo, el ARN incluye nucleobases no modificadas, y puede incluir nucleótidos no modificados, es decir, todos los nucleótidos en el ARN son ribonucleótidos A, C, G y U estándar (excepto cualquier estructura de caperuza en 5', que puede incluir una 7'-metilguanosina). En otras realizaciones, el ARN incluye una caperuza en 5' que comprende una 7'-metilguanosina, y los primeros 1, 2 o 3 ribonucleótidos en 5' pueden estar metilados en la posición 2' de la ribosa.
Un ARN usado con la invención incluye idealmente solo enlaces fosfodiéster entre nucleósidos, pero en algunas realizaciones puede contener enlaces fosforamidato, fosforotioato y/o metilfosfonato.
La cantidad de ARN por partícula puede variar, y el número de moléculas de ARN autorreplicantes individuales por partícula puede depender de las características de la partícula que se use. En general, una partícula puede incluir desde 1-500 moléculas de ARN. Para un liposoma, el número de moléculas de ARN es normalmente <50 por liposoma, por ejemplo, <20, <10, <5 o 1-4. Idealmente, una partícula incluye menos de 10 especies diferentes de ARN, por ejemplo, 5, 4, 3 o 2 especies diferentes; lo más preferentemente, una partícula incluye una única especie de ARN, es decir, todas las moléculas de ARN en la partícula tienen la misma secuencia y la misma longitud.
El inmunogén
Las moléculas de ARN autorreplicantes usadas con la invención codifican un inmunogén de polipéptido que provoca una respuesta inmunitaria contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito (o, en algunas realizaciones, contra un alérgeno; y en otras realizaciones, contra un antígeno de tumor). Después de la administración de las partículas el inmunogén se traduce in vivo y puede provocar una respuesta inmunitaria en el receptor. La respuesta inmunitaria puede comprender una respuesta de anticuerpos (normalmente que incluyen IgG) y/o una respuesta inmunitaria celular. El inmunogén de polipéptido provocará normalmente una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido bacteriano, vírico, fúngico o de parásito (o alérgeno o tumor) correspondiente, pero en algunas realizaciones el polipéptido puede actuar de mimótopo para provocar una respuesta inmunitaria que reconoce un sacárido bacteriano, vírico, fúngico o de parásito. El inmunogén normalmente será un polipéptido de superficie, por ejemplo, una adhesina, una hemaglutinina, una glucoproteína de la envoltura, una glucoproteína de la espícula, etc.
Las moléculas de ARN autorreplicantes pueden codificar un único inmunogén de polipéptido o múltiples polipéptidos. Los múltiples inmunógenos se pueden presentar como un único inmunogén de polipéptido (polipéptido de fusión) o como polipéptidos separados. Si los inmunógenos se expresan como polipéptidos separados, entonces uno o más de estos se pueden proporcionar con un IRES en la dirección 5' o un elemento promotor vírico adicional. Alternativamente, múltiples inmunógenos se pueden expresar a partir de una poliproteína que codifica inmunógenos individuales fusionados con una proteasa autocatalítica corta (por ejemplo, proteína del virus 2A de la glosopeda), o como inteínas.
A diferencia de las referencias 1 y 16, el ARN codifica un inmunogén que puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo contra un virus, una bacteria, un hongo, un parásito, un alérgeno o un antígeno de tumor. Para evitar dudas, la invención no engloba ARN que codifica una luciferasa de luciérnaga o que codifica una proteína de fusión de pgalactosidasa de E. colio que codifica una proteína verde fluorescente (GFP). Por tanto, el ARN no es ARN de timo de ratón total.
En algunas realizaciones, el inmunogén provoca una respuesta inmunitaria contra una de estas bacterias:
Neisseria meningitidis: inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, proteínas de la membrana, tales como adhesinas, autotransportadores, toxinas, proteínas de adquisición de hierro y proteína de unión al factor H. Una combinación de tres polipéptidos útiles se desvela en la referencia 17.
Streptococcus pneumoniae: inmunógenos de polipéptido útiles se desvelan en la referencia 18. Estos incluyen, pero no se limitan a, la subunidad de pilus RrgB, el precursor de beta-N-acetil-hexosaminidasa (spr0057), spr0096, la proteína de estrés general GSP-781 (spr2021, SP2216), la serina/treonina cinasa StkP (SP1732) y la adhesina de la superficie pneumocócica PsaA.
Streptococcus pyogenes: inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos desvelados en las referencias 19 y 20.
Moraxella catarrhalis.
Bordetella pertussis: inmunógenos de pertussis útiles incluyen, pero no se limitan a, la toxina o el toxoide de pertussis (PT), la hemaglutinina filamentosa (FHA), la pertactina y los aglutinógenos 2 y 3.
Staphylococcus aureus: inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos desvelados en la referencia 21, tales como una hemolisina, esxA, esxB, la proteína de unión a ferricromo (sta006) y/o la lipoproteína sta011.
Clostridium tetani: el inmunogén típico es el toxoide tetánico.
Corynebacterium diphtheriae: el inmunogén típico es el toxoide diftérico.
Haemophilus influenzae: inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos desvelados en las referencias 22 y 23.
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus agalactiae: inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos desvelados en la referencia 19.
Chlamydia trachomatis: inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, tipo OmpH, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA y MurG (por ejemplo, como se desvela en la referencia 24. LcrE
[25] y HtrA [26] son dos inmunógenos preferidos.
Chlamydia pneumoniae: inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos desvelados en la referencia 27.
Helicobacterpylorí: inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, CagA, VacA, NAP y/o ureasa [28].
Escherichia coli: inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, inmunógenos derivados de E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAggEC), E. coli difusamente adherente (DAEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli patógena extraintestinal (ExPEC) y/o E. coli enterohemorrágica (EHEC). Las cepas de ExPEC incluyen E. coli uropatógena (UPEC) y E. coli asociada a la meningitis/septicemia (MNEC). Los inmunógenos de polipéptido de UPEC útiles se desvelan en las referencias 29 y 30. Los inmunógenos de MNEC útiles se desvelan en la referencia 31. Un inmunogén útil para varios tipos de E. coli es AcfD [32].
Bacillus anthracis
Yersinia pestis: inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, los desvelados en las referencias 33 y 34. Staphylococcus epidermis
Clostridium perfringens o Clostridium botulinum
Legionella pneumophila
Coxiella burnetii
Brucella, tal como B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis, B. pinnipediae.
Francisella, tal como F. novicida, F. philomiragia, F. tularensis.
Neisseria gonorrhoeae
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi
Enterococcus faecalis o Enterococcus faecium
Staphylococcus saprophyticus
Yersinia enterocolitica
Mycobacterium tuberculosis
Rickettsia
Listería monocytogenes
Vibrio cholerae
Salmonella typhi
Borrelia burgdorferi
Porphyromonas gingivalis
Klebsiella
En algunas realizaciones, el inmunogén provoca una respuesta inmunitaria contra uno de estos virus:
Ortomixovirus: inmunógenos útiles pueden ser un virus de la gripe A, B o C, tales como la hemaglutinina, la neuraminidasa o las proteínas de la matriz M2. Si el inmunogén es una hemaglutinina del vírus de la gripe A, puede ser de cualquier subtipo, por ejemplo, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16.
Virus Paramyxovirídae: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de neumovirus (por ejemplo, virus respiratorio sincitial, RSV), rubulavirus (por ejemplo, virus de las paperas), paramixovirus (por ejemplo, virus paragripal), metaneumovirus y morbilivirus (por ejemplo, sarampión).
Poxviridae: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de ortopoxvirus, tales como Varióla vera, que incluyen, pero no se limitan a, Variola majory Variola minor.
Picornavirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de picornavirus, tales como enterovirus, rinovirus, heparnavirus, cardiovirus y aftovirus. En una realización, el enterovirus es un poliovirus, por ejemplo, un poliovirus de tipo 1, tipo 2 y/o tipo 3. En otra realización, el enterovirus es un enterovirus EV71. En otra realización, el enterovirus es un virus de Coxsackie A o B.
Bunyavirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un ortobunyavirus, tales como el virus de la encefalitis de California, un flebovirus, tal como el virus de la fiebre del valle del Rift, o un neurovirus, como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo
Heparnavirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un heparnavirus, tales como el virus de la hepatitis A (VHA).
Filovirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un filovirus, tal como el virus del Ébola (incluyendo un virus del Ébola de Zaire, Costa de Marfil, Reston o Sudán) o un virus de Marburgo.
Togavirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un togavirus, tales como un rubivirus, un alfavirus o un arterivirus. Esto incluye el virus de la rubeola.
Flavivirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un flavivirus, tales como el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), el virus del dengue (tipos 1, 2, 3 o 4), el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la selva de Kyasanur, el virus de la encefalitis del Nilo occidental, el virus de la encefalitis de San Luis, el virus de la encefalitis primaveroestival rusa, el virus de Powassan de la encefalitis.
Pestivirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un pestivirus, tales como la diarrea bovina vírica (BVDV), la peste porcina clásica (CSFV) o la enfermedad de la frontera (BDV).
Hepadnavirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un hepadnavirus, tales como el virus de la hepatitis B. Una composición puede incluir antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg).
Otros virus de la hepatitis: una composición puede incluir un inmunogén de un virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis delta, virus de la hepatitis E o virus de la hepatitis G.
Rabdovirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un rabdovirus, tales como un lisavirus (por ejemplo, un virus de la rabia) y vesiculovirus (VSV).
Caliciviridae: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Calciviridae, tales como el virus de Norwalk (norovirus) y los virus de tipo Norwalk, tales como el virus de Hawaii y el virus de las montañas nevadas.
Coronavirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un coronavirus del SARS, bronquitis infecciosa aviar (IBV), virus de la hepatitis de ratón (MHV) y virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV). El inmunogén de coronavirus puede ser un polipéptido de la espícula.
Retrovirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un oncovirus, un lentivirus (por ejemplo, VIH-1 o VIH-2) o un espumavirus.
Reovirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un ortoreovirus, un rotavirus, un orbivirus o un coltivirus.
Parvovirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados del parvovirus B19.
Virus del herpes: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un virus del herpes humano, tales como, a modo de ejemplo solo, virus del herpes simple (HSV) (por ejemplo, HSV tipos 1 y 2), virus de la varicela-zóster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), virus del herpes humano 6 (HHV6), virus del herpes humano 7 (HHV7) y virus del herpes humano 8 (HHV8).
Papovavirus: inmunógenos víricos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de virus del papiloma y virus del polioma. El virus del papiloma (humano) puede ser de serotipo 1,2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51,57, 58, 63 o 65, por ejemplo, de uno o más de serotipos 6, 11, 16 y/o 18.
Adenovirus: inmunógenos víricos incluyen los derivados del serotipo 36 de adenovirus (Ad-36).
En algunas realizaciones, el inmunogén provoca una respuesta inmunitaria contra un virus que infecta a los peces, tales como: virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV), virus de la enfermedad pancreática del salmón (SPDV), virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), virus del siluro del canal (CCV), virus de la enfermedad de linfocistis en los peces (FLDV), virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (NHI), herpesvirus de koi, virus de tipo picorna del salmón (también conocido virus de tipo picorna del salmón atlántico), virus del salmón del Atlántico (LSV), rotavirus del salmón del atlántico (ASR), virus de la enfermedad de la fresa de la trucha (TSD), virus del tumor del salmón coho (CSTV) o virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV).
Los inmunógenos fúngicos pueden derivar de dermatofitos, que incluyen: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum y/o Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi; los menos comunes son Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp., Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaría spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp. y Cladosporium spp.
En algunas realizaciones, el inmunogén provoca una respuesta inmunitaria contra un parásito del género Plasmodium, tal como P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. Por lo tanto, la invención se puede usar para inmunizar contra la malaria. En algunas realizaciones, el inmunogén provoca una respuesta inmunitaria contra un parásito de la familia Caligidae, particularmente los de los géneros Lepeophsusus y Caligus, por ejemplo, piojos de mar, tales como Lepeophsusus salmonis o Caligus rogercresseyi.
En algunas realizaciones, el inmunogén provoca una respuesta inmunitaria contra: alérgenos del polen (alérgenos de polen de árboles, hierbas, malas hierbas y céspedes); alérgenos de insectos o arácnidos (alérgenos inhalados, de saliva y veneno, por ejemplo, alérgenos de ácaros, alérgenos de cucarachas y mosquitos, alérgenos del veneno de himenópteros), alérgenos del pelo y la caspa de animales (de, por ejemplo, perros, gatos, caballos, ratas, ratones, etc.); y alérgenos de alimentos (por ejemplo, gliadina). Alérgenos del polen de árboles, céspedes y hierbas importantes son los que proceden de los órdenes taxonómicos de Fagales, Oleales, Pinales y platanaceae, que incluyen, pero no se limitan a, abedul (Betula), aliso (Alnus), avellano (Corylus), carpe (Carpinus) y olivo (Olea), cedro (Cryptomeria y Juniperus), plátano (Platanus), el orden de Poales que incluyen céspedes de los géneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale y Sorghum, los órdenes de Asterales y Urticales que incluyen hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros alérgenos de inhalación importantes son los de los ácaros del polvo doméstico del género Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaro de bodega, por ejemplo, Lepidoglyphys, Glycyphagus y Tyrophagus, los de cucarachas, mosquitos y pulgas, por ejemplo Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, y los de mamíferos, tales como perros, gatos y caballos, alérgenos de venenos incluidos los que proceden de insectos picadores o mordedores, tales como los del orden taxonómico de los himenópteros que incluyen abejas (Apidae), avispas (Vespidea) y hormigas (Formicoidae).
En algunas realizaciones, el inmunogén es un antígeno de tumor seleccionado de: (a) antígenos de cáncer de testículos, tales como NY-ESO-1, SSX2, SCP1, así como polipéptidos de las familias RAGE, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 y MAGE-12 (que se pueden usar, por ejemplo, para tratar melanoma, tumores de pulmón, cabeza y cuello, CPNMC, mama, gastrointestinal y de vejiga; (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado a diversos tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, de pulmón, de cabeza y cuello), p21/Ras (asociado a, por ejemplo, melanoma, cáncer pancreático y cáncer colorrectal), CDK4 (asociado a, por ejemplo, melanoma), MUM1 (asociado a, por ejemplo, melanoma), caspasa-8 (asociado a, por ejemplo, cáncer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado a, por ejemplo, cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta-catenina (asociado a, por ejemplo, melanoma), TCR (asociado a, por ejemplo, linfoma no Hodgkin de linfocitos T), BCR-abl (asociado a, por ejemplo, leucemia mielógena crónica), triosafosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27 y LDLR-FUT; (c) antígenos expresados en exceso, por ejemplo, galectina 4 (asociada a, por ejemplo, cáncer colorrectal), galectina 9 (asociada a, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (asociada a, por ejemplo, leucemia mielógena crónica), WT 1 (asociada a, por ejemplo, diversas leucemias), anhidrasa carbónico (asociada a, por ejemplo, cáncer renal), aldolasa A (asociada a, por ejemplo, cáncer de pulmón), PRAME (asociada a, por ejemplo, melanoma), HER-2/neu (asociada a, por ejemplo, cáncer de mama, colon, pulmón y de ovario), mamaglobina, alfa-fetoproteína (asociada a, por ejemplo, hepatoma), KSA (asociada a, por ejemplo, cáncer colorrectal), gastrina (asociada a, por ejemplo, cáncer pancreático y gástrico), proteína catalítica de la telomerasa, MUC-1 (asociada a, por ejemplo, cáncer de mama y de ovario), G-250 (asociada a, por ejemplo, carcinoma de células renales), p53 (asociada a, por ejemplo, cáncer de mama, de colon) y antígeno carcinoembrionario (asociado a, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cánceres del tubo gastrointestinal, tales como cáncer colorrectal); (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación de melanoma-melanocitos, tales como MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor de la hormona estimulante de melanocitos, tirosinasa, proteína-1/TRP1 y proteína 2/TRP2 relacionada con la tirosinasa (asociada a, por ejemplo, melanoma); (e) antígenos asociados a la próstata, tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados a, por ejemplo, cáncer de próstata; (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados a mieloma y linfomas de linfocitos B, por ejemplo). En ciertas realizaciones, los inmunógenos de tumor incluyen, pero no se limitan a, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos del virus del papiloma humano (VPH), que incluyen E6 y E7, antígenos del virus de la hepatitis B y C, antígenos del virus linfotrópico humano de linfocitos T, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2/ proteína asociada a la ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS y similares.
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas de la invención son para inmunizar sujetos contra diversas enfermedades. Estas composiciones normalmente incluirán un vehículo farmacéuticamente aceptable, además de las partículas. Una exhaustiva discusión de vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 35.
Una composición farmacéutica de la invención puede incluir uno o más inmunopotenciadores de molécula pequeña. Por ejemplo, la composición puede incluir un agonista de TLR2 (por ejemplo, Pam3CSK4), un agonista de TLR4 (por ejemplo, un fosfato de aminoalquilglucosaminida, tal como E6020), un agonista de TLR7 (por ejemplo, imiquimod), un agonista de TLR8 (por ejemplo, resiquimod) y/o un agonista de TLR9 (por ejemplo, IC31). Cualquier de dichos agonistas tiene idealmente un peso molecular de <2000 Da. El ARN está encapsulado, y en algunas realizaciones dicho(s) agonista(s) también están encapsulados con el ARN, pero en otras realizaciones no están encapsulados.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir las partículas en agua corriente (por ejemplo, agua para inyectables) o en un tampón, por ejemplo, un tampón fosfato, un tampón Tris, un tampón borato, un tampón succinato, un tampón histidina o un tampón citrato. Las sales tampón normalmente se incluirán en el intervalo 5­ 20 mM.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener un pH entre 5,0 y 9,5, por ejemplo, entre 6,0 y 8,0.
Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro sódico) para dar tonicidad. Una concentración de NaCl 10±2 mg/ml es típica, por ejemplo, aproximadamente 9 mg/ml.
Las composiciones de la invención pueden incluir quelantes de ion metálico. Estos pueden prolongar la estabilidad del ARN retirando iones que pueden acelerar la hidrólisis del fosfodiéster. Por lo tanto, una composición puede incluir uno o más de EDTA, EGTA, BAPTA, ácido pentético, etc. Dichos quelantes normalmente están presentes en entre 10-500 pM, por ejemplo, 0,1 mM. Una sal citrato, tal como citrato de sodio, también puede actuar de quelante, mientras que también proporciona ventajosamente actividad de tampón.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo, entre 240-360 mOsm/kg, o entre 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir uno o más conservantes, tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Se prefieren las composiciones sin mercurio, y se pueden preparar vacunas sin conservante.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente estériles.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente no pirógenas, por ejemplo, que contienen <1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y preferentemente <0,1 UE por dosis.
Las composiciones farmacéuticas de la invención están preferentemente libres de gluten.
Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar en forma de dosis unitaria. En algunas realizaciones, una dosis unitaria puede tener un volumen de entre 0,1-1,0 ml, por ejemplo, aproximadamente 0,5 ml.
Las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como disoluciones o suspensiones. La composición se puede preparar para administración pulmonar, por ejemplo, por un inhalador, usando un espray fino. La composición se puede preparar para administración nasal, ótica u ocular, por ejemplo, como espray o gotas. Los inyectables para administración intramuscular son típicos.
Las composiciones comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de partículas, así como cualquier otro componente, según se necesite. Por 'cantidad inmunológicamente eficaz' se indica que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y el estado físico del individuo que se va a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del doctor tratante de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos rutinarios. El contenido de partículas y ARN de las composiciones de la invención se expresará, en general, en términos de la cantidad de ARN por dosis. Una dosis preferida tiene <100 pg de ARN (por ejemplo, desde 10-100 pg, tal como aproximadamente 10 pg, 25 pg, 50 pg, 75 pg o 100 pg), pero la expresión se puede observar a niveles mucho más bajos, por ejemplo, <1 pg/dosis, <100 ng/dosis, <10 ng/dosis, <1 ng/dosis, etc. La invención también proporciona un dispositivo de administración (por ejemplo, jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dérmico, etc.) que contiene una composición farmacéutica de la invención. Este dispositivo se puede usar para administrar la composición a un sujeto vertebrado.
Las partículas de la invención no incluyen ribosomas.
Usos médicos
A diferencia de las partículas desveladas en la referencia 16, las composiciones farmacéuticas de la invención son para uso in vivo para provocar una respuesta inmunitaria contra un inmunogén de interés.
La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y preferentemente implica anticuerpos y/o inmunidad celular. Se puede producir una respuesta de refuerzo.
La invención también proporciona una composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para producir una respuesta inmunitaria en un vertebrado.
Produciendo una respuesta inmunitaria en el vertebrado por estos usos, el vertebrado se puede proteger contra diversas enfermedades y/o infecciones, por ejemplo, contra enfermedades bacterianas y/o víricas, como se trata anteriormente. Las composiciones son inmunogénicas, y son más preferentemente composiciones de vacuna. Las vacunas según la invención pueden o ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero normalmente serán profilácticas.
El vertebrado es preferentemente un mamífero, tal como un humano o un mamífero veterinario grande (por ejemplo, caballos, ganado vacuno, renos, cabras, cerdos). Si la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un lactante mayor o lactante menor) o un adolescente; si la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna prevista para niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc.
Las vacunas preparadas según la invención se pueden usar para tratar tanto niños como adultos. Por lo tanto, un paciente humano puede tener menos de 1 año, menos de 5 años, 1-5 años, 5-15 años, 15-55 años o al menos 55 años. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, >50 años, >60 años y preferentemente >65 años), los jóvenes (por ejemplo, <5 años), pacientes hospitalizados, trabajadores sanitarios, fuerzas armadas y personal militar, mujeres embarazadas, enfermos crónicos o pacientes inmunodeficientes. Sin embargo, las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos, y se pueden usar de forma más general en una población.
Las composiciones de la invención se administrarán, en general, directamente a un paciente. La administración directa se puede llevar a cabo por inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intradérmica, o al espacio intersticial de un tejido; a diferencia de la referencia 1, normalmente no se usa la inyección intraglosal con la presente invención). Las vías de administración alternativas incluyen rectal, oral (por ejemplo, comprimido, espray), bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, ótica, pulmonar u otra administración a la mucosa. La administración intradérmica e intramuscular son dos vías preferidas. La inyección puede ser por una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero alternativamente se puede usar la inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es 0,5 ml.
La invención se puede usar para provocar inmunidad sistémica y/o mucosa, preferentemente para provocar una inmunidad sistémica y/o mucosa potenciada.
La dosis puede ser por un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Las dosis múltiples se pueden usar en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización por refuerzo. En un programa de dosis múltiple, las diversas dosis puede ser administradas por las mismas vías o diferentes, por ejemplo, una inmunización parenteral y refuerzo mucoso, una inmunización mucosa y refuerzo parenteral, etc. Las dosis múltiples normalmente se administrarán separadas al menos 1 semana (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En una realización, las dosis múltiples se pueden administrar aproximadamente 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas después del nacimiento, por ejemplo a una edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, como se usa frecuentemente en el Programa expandido sobre inmunización ("EPI") de la Organización Mundial de la Salud. En una realización alternativa, se administran dos dosis primarias separadas aproximadamente dos meses, por ejemplo separadas aproximadamente 7, 8 o 9 semanas, seguido por una o más dosis de refuerzo aproximadamente 6 meses a 1 año después de la segunda dosis primaria, por ejemplo aproximadamente 6, 8, 10 o 12 meses después de la segunda dosis primaria. En una realización adicional, se administran tres dosis primarias separadas aproximadamente dos meses, por ejemplo separadas aproximadamente 7, 8 o 9 semanas, seguido por una o más dosis de refuerzo aproximadamente 6 meses a 1 año después de la tercera dosis primaria, por ejemplo aproximadamente 6, 8, 10 o 12 meses después de la tercera dosis primaria.
Realizaciones generales
En algunas realizaciones de la invención, el ARN no incluye nucleótidos modificados (véase anteriormente). En otras realizaciones, el ARN puede incluir opcionalmente al menos un nucleótido modificado, a condición de que también se requiera una o más de las siguientes características (ya desveladas anteriormente):
A. Si el ARN se administra con un liposoma, el liposoma comprende DSDMA, DODMA, DLinDMA y/o DLenDMA
B. Si el ARN está encapsulado en un liposoma, la porción hidrófila de un lípido en el liposoma está PEGilada.
C. Si el ARN está encapsulado en un liposoma, al menos el 80 % por número de los liposomas tiene diámetros en el intervalo de 20220 nm.
D. El ARN tiene una cola de poli-A en 3', y el inmunogén puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo contra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito.
E. El ARN se administra en combinación con un quelante de ion metálico con un sistema de administración que es liposomas.
Generalidades
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, las referencias 36-42, etc.
El término "que comprende" engloba "que incluye", así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.
El término "aproximadamente", en relación con un valor numérico x, es opcional y significa, por ejemplo, x ± 10 %.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Si es necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención.
Referencias a carga, a cationes, a aniones, a iones bipolares, etc., se consideran a pH 7.
TLR3 es el receptor del tipo toll 3. Es un receptor de membrana individual que desempeña una función clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR3 conocidos incluyen poli(I:C). "TLR3" es el nombre autorizado por el HGNC para el gen que codifica este receptor, y su ID de HGNC único es HGNC: 11849. La secuencia de RefSeq para el gen de TLR3 humano es GI:2459625.
TLR7 es el receptor del tipo toll 7. Es un receptor de membrana individual que desempeña una función clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR7 conocidos incluyen, por ejemplo, imiquimod. "TLR7" es el nombre autorizado por el HGNC para el gen que codifica este receptor, y su ID de HGNC único es HGNC: 15631. La secuencia de RefSeq para el gen de TLR7 humano es GI:67944638.
TLR8 es el receptor del tipo toll 8. Es un receptor de membrana individual que desempeña una función clave en el sistema inmunitario innato. Los agonistas de TLR8 conocidos incluyen, por ejemplo, resiquimod. "TLR8" es el nombre autorizado por el HGNC para el gen que codifica este receptor, y su ID de HGNC único es HGNC: 15632. La secuencia de RefSeq para el gen de TLR8 humano es GI:20302165.
La familia del receptor de tipo RIG-I ("RLR") incluye diversas ARN helicasas que desempeñan funciones clave en el sistema inmunitario innato [43]. RLR-1 (también conocido como RIG-I o gen I inducible por ácido retinoico) tiene dos dominios de reclutamiento de caspasa cerca de su extremo N. El nombre autorizado por el HGNC para el gen que codifica la helicasa de RLR-1 es "DDX58" (de polipéptido 58 de la caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp)) y el ID de HGNC único es HGNC:19102. La secuencia de RefSeq para el gen de RlR-1 humano es GI:77732514. RLR-2 (también conocido como MDA5 o gen 5 asociado a la diferenciación de melanoma) también tiene dos dominios de reclutamiento de caspasa cerca de su extremo N. El nombre autorizado por el HGNC para el gen que codifica la helicasa de RLR-2 es "IFIH1" (para el interferón inducido con el dominio 1 de helicasa C) y el ID de HGNC único es HGNC:18873. La secuencia de RefSeq para el gen de RLR-2 humano es GI: 27886567. RLR-3 (también conocido como LGP2 o Laboratorio de genética y fisiología 2) no tiene dominios de reclutamiento de caspasa. El nombre autorizado por el HGNC para el gen que codifica la helicasa de RLR-3 es "DHX58" (de polipéptido 58 de la caja DEXH (Asp-Glu-X-His)) y el ID de HGNC único es HGNC:29517. La secuencia de RefSeq para el gen de RLR-3 humano es GI: 149408121.
PKR es una proteína cinasa dependiente de ARN bicatenario. Desempeña una función clave en el sistema inmunitario innato. "EIF2AK2" (de factor 2-alfa cinasa 2 del inicio de la traducción de eucariotas) es el nombre autorizado por el HGNC para el gen que codifica esta enzima, y su ID de HGNC único es HGNC:9437. La secuencia de RefSeq para el gen de PKR humano es GI:208431825.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra un gel con ARN teñido. Los carriles muestran (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón después del tratamiento con RNasa (4) replicón encapsulado en liposoma (5) liposoma después del tratamiento con RNasa (6) liposoma tratado con RNasa, luego se somete a extracción con fenol/cloroformo.
La Figura 2 es una micrografía electrónica de liposomas.
La Figura 3 muestra la expresión de proteínas (como unidades relativas de luz, URL) en los días 1, 3 y 6 después de la administración de ARN como un replicón encapsidado en virión (cuadrados), ARN desnudo (triángulos), o como micropartículas (círculos).
La Figura 4 muestra un gel con ARN teñido. Los carriles muestran (1) marcadores (2) replicón desnudo (3) replicón encapsulado en liposoma (4) liposoma tratado con RNasa, luego se somete a extracción con fenol/cloroformo.
La Figura 5 muestra la expresión de proteínas en los días 1, 3 y 6 después de administración de ARN como un replicón encapsidado en virión (cuadrados), como ARN desnudo (diamantes), o en liposomas (+ = 0,1 gg, x = 1 gg).
La Figura 6 muestra la expresión de proteínas en los días 1, 3 y 6 después de la administración de cuatro dosis diferentes de ARN encapsulado en liposomas.
La Figura 7 muestra títulos de IgG anti-F en animales que recibieron replicón encapsidado en virión (VRP o VSRP), 1 gg de ARN desnudo y 1 gg de ARN encapsulado en liposomas.
La Figura 8 muestra títulos de IgG anti-F en animales que recibieron VRP, 1 gg de ARN desnudo, y 0,1 g o 1 gg de ARN encapsulado en liposomas.
La Figura 9 muestra títulos de anticuerpo neutralizante en animales que recibieron VRP o 0,1 g o 1 gg de ARN encapsulado en liposomas.
La Figura 10 muestra niveles de expresión después de la administración de un replicón como ARN desnudo (círculos), ARN encapsulado en liposomas (triángulo y cuadrado), o como un poliplejo (triángulo invertido).
La Figura 11 muestra títulos de IgG específicos de F (2 semanas después de la segunda dosis) después de la administración de un replicón como ARN desnudo (0,01-1 gg), ARN encapsulado en liposomas (0,01-10 gg), o encapsidado como un virión (VRP, 106 unidades infecciosas o UI).
La Figura 12 muestra títulos de IgG específicos de F (círculos) y títulos de PRNT (cuadrados) después de la administración de un replicón como aRn desnudo (1 gg), aRN encapsulado en liposomas (0,1 o 1 gg), o encapsidado como un virión (VRP, 106 UI). Los títulos en ratones intactos también se muestran. Las líneas continuas muestran medias geométricas.
La Figura 13 muestra la producción de citocina intracelular después de la reestimulación con péptidos sintéticos que representan a los principales epítopes en la proteína F, 4 semanas después de una segunda dosis. El eje y muestra el % de citocina+ de CD8+CD4-.
La Figura 14 muestra títulos de IgG específicos de F (media del log10 títulos ± desv. estándar) durante 63 días (Figura 14A) y 210 días (Figura 14B) después de la inmunización de terneros. Las tres líneas se distinguen fácilmente en el día 63 y son, de abajo a arriba: control negativo de PBS; ARN administrado en liposomas; y el producto "Triangle 4".
La Figura 15 muestra títulos de IgG en suero anti-VIH en respuesta a ARN desnudo ("ARN") o encapsulado en liposomas ("LNP"), o a ADN administrado por electroporación en el músculo.
La Figura 16 muestra títulos de IgG en 13 grupos de ratones. Cada círculo es un ratón individual, y las líneas continuas muestran medias geométricas. La línea horizontal de puntos es el límite de detección del ensayo. Los 13 grupos son, de izquierda a derecha, A a M, como se describe a continuación.
La Figura 17 muestra (A) IL-6 y (B) IFNa (pg/ml) liberado por pDC. Hay 4 pares de barras, de izquierda a derecha: control; inmunizados con ARN+DOTAP; inmunizados con ARN+lipofectamina; e inmunizados con ARN en liposomas. En cada par la barra negra es ratones naturales, gris es el mutante rsql.
MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
Replicones de ARN
A continuación se usan diversos replicones. En general, estos se basan en un genoma del alfavirus híbrido con proteínas no estructurales del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), una señal de encapsidación del virus de Sindbis y una 3' UTR del virus de Sindbis o un mutante de VEEV. El replicón tiene aproximadamente 10 kb de longitud y tiene una cola de poli-A.
El ADN de plásmido que codifica los replicones de alfavirus (denominados: pT7-mVEEV-FL.RSVF o A317; pT7-mVEEV-SEAP o A306; pSP6-VCR-GFP o A50) sirvió de molde para la síntesis de ARN in vitro. Los replicones contienen los elementos genéticos de alfavirus requeridos para la replicación de ARN, pero carecen de los que codifican productos génicos necesarios para el ensamblaje de partículas; las proteínas estructurales se sustituyen en su lugar por una proteína de interés (ya sea una indicadora, tal como SEAP o GFP, o un inmunogén, tal como la proteína F del RSV de longitud completa) y así los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas infecciosas. Un promotor de bacteriófago (T7 o SP6) en la dirección 5' del ADNc de alfavirus facilita la síntesis del ARN de replicón in vitro y una ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV) inmediatamente en la dirección 3' de la cola de poli(A) genera el extremo de 3' correcto mediante su actividad autoescisora.
Tras la linealización del ADN de plásmido en la dirección 3' de la ribozima de HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, se sintetizaron in vitro transcritos no iniciados usando la ARN polimerasa dependiente de ADN derivado del bacteriófago T7 o SP6. Las transcripciones se realizaron durante 2 horas a 37 °C en presencia de 7,5 mM (ARN polimerasa T7) o 5 mM (ARN polimerasa SP6) de cada uno de los trifosfatos de nucleósido (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion). Tras la transcripción, el molde de ADN se digirió con DNasa TURBO (Ambion). El ARN de replicón se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua sin nucleasa. El ARN sin caperuza se protegió postranscripcionalmente con enzima protectora de la variolovacuna (VCE) usando el sistema de protección ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies) como se indica en el manual de usuario; a los replicones protegidos de esta forma se les da el prefijo "v", por ejemplo, vA317 es el replicón A317 protegido por VCE. El ARN protegido postranscripcionalmente se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua sin nucleasa. La concentración de las muestras de ARN se determinó midiendo DO260nm. La integridad de los transcritos in vitro se confirmó por electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante.
Adsorción de PLG (ejemplo de referencia)
Se fabricaron micropartículas usando 500 mg de PLG RG503 (relación molar 50:50 de lactida/glicolida, MW ~30 kDa) y 20 mg de DOTAP usando un homogeneizador Omni Macro. La suspensión de partículas se agitó a 150 rpm durante la noche y entonces se filtró a través de un filtro estéril de 40 gm para el almacenamiento a 2-8 °C. El ARN autorreplicante se adsorbió a las partículas. Para preparar 1 ml de suspensión de PLG/ARN, el volumen requerido de suspensión de partículas de PLG se añadió a un vial y se añadió agua sin nucleada para llevar el volumen a 900 gl. Se añadió gota a gota 100 gl de ARN (10 gg/ml) a la suspensión de PLG, con agitación constante. Se incubó PLG/ARN a temperatura ambiente durante 30 min. Para 1 ml de suspensión reconstituida, se añadieron 45 mg de manitol, 15 mg de sacarosa y 250-500 gg de PVA. Los viales se congelaron a -80 °C y se liofilizaron.
Para evaluar la adsorción de ARN, se centrifugaron 100 gl de suspensión de partículas a 10.000 rpm durante 5 min y se recogió el sobrenadante. Se reconstituyó PLG/ARN usando 1 ml de agua sin nucleasa. A 100 gl de suspensión de partículas (1 gg de ARN), se añadió 1 mg de sulfato de heparina. La mezcla se agitó con vórtex y se dejó que sedimentara a temperatura ambiente durante 30 min para la desorción de ARN. Se centrifugó la suspensión de partículas y se recogió el sobrenadante.
Para la estabilidad de la RNasa, se incubó 100 gl de suspensión de partículas con 6,4 mUA de RNasa A a temperatura ambiente durante 30 min. La RNasa se inactivó con 0,126 mUA de proteinasa K a 55 °C durante 10 min. Se añadió 1 mg de sulfato de heparina para desorber el ARN, seguido de centrifugación. Las muestras de sobrenadante que contenían el ARN se mezclaron con colorante de carga de formaldehído, se calentaron a 65 °C durante 10 min y se analizaron usando un gel desnaturalizante al 1 % (460 ng de ARN cargado por carril).
Para evaluar la expresión, se inmunizaron ratones Balb/c con 1 gg de ARN en 100 gl de volumen de inyección intramuscular (50 gl/pata) en el día 0. Los sueros se recogieron en los días 1, 3 y 6. La expresión de proteínas se determinó usando un ensayo de quimioluminiscencia. Como se muestra en la Figura 3, la expresión fue mayor cuando el ARN se administró por PLG (triángulos) que sin cualquier partícula de administración (círculos).
Encapsulación liposómica
Se encapsuló el ARN en liposomas fabricados por el método de las referencias 7 y 44. Los liposomas se fabricaron con 10 % de DSPC (ion bipolar), 40 % de DlinDMA (catiónico), 48 % de colesterol y 2 % de DMG conjugado con PEG (2 kDa de PEG). Estas proporciones se refieren al % en moles en el liposoma total.
Se sintetizó DlinDMA (1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano) usando el procedimiento de la referencia 2. Se compró DSPC (1,2-diaestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) de Genzyme. El colesterol se obtuvo de Sigma-Aldrich. El DMG conjugado con PEG (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol), sal de amonio), DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano, sal de cloruro) y DC-col. (clorhidrato de 3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol) fueron de Avanti Polar Lipids.
Brevemente, los lípidos se disolvieron en etanol (2 ml), se disolvió un replicón de ARN en tampón (2 ml, citrato de sodio 100 mM, pH 6) y estos se mezclaron con 2 ml de tampón seguido por 1 hora de equilibrado. La mezcla se diluyó con 6 ml de tampón, luego se filtró. El producto resultante contuvo liposomas, con ~95 % de eficiencia de encapsulación.
Por ejemplo, en un método particular, se prepararon disoluciones madre de lípido nuevas en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DSPC, 27,8 mg de colesterol y 8,07 mg de PEG-DMG y se disolvieron en 7,55 ml de etanol. La disolución madre de lípidos recién preparada se balanceó suavemente a 37 °C durante aproximadamente 15 min para formar una mezcla homogénea. Entonces, se añadió 755 gl de la disolución madre a 1.245 ml de etanol para preparar una disolución madre de trabajo de lípidos de 2 ml. Esta cantidad de lípidos se usó para formar liposomas con 250 gg de ARN. También se prepararon 2 ml de una disolución de ARN de trabajo a partir de una disolución madre de ~1 gg/gl en tampón citrato 100 mM (pH 6). Se aclararon tres viales de vidrio de 20 ml (con barras de agitación) con disolución de RNase Away (Molecular BioProducts) y se lavaron con mucha agua MilliQ antes del uso para descontaminar los viales de RNasas. Uno de los viales se usó para la disolución de ARN de trabajo y los otros para recoger las mezclas de lípido y ARN (como se describe después). El lípido de trabajo y las disoluciones de aRn se calentaron a 37 °C durante 10 min antes ser cargadas en jeringas Luer-lock de 3 cm3. Se cargaron 2 ml de tampón citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cm3. Las jeringas que contenían ARN y los lípidos se conectaron a un mezclador en T (conexión PEEk™ de 500 gm de DI, Idex Health Science) usando tubo de FEP (etileno-propileno fluorado; todos los tubos de FEP usados tuvieron un diámetro interno de 2 mm y un diámetro externo de 3 mm; obtenidos de Idex Health Science). La salida de la mezcladora en T también fue tubo de FEP. La tercera jeringa que contenía el tampón citrato se conectó a un trozo separado de tubo. Todas las jeringas se accionaron entonces a un caudal de 7 ml/min usando una bomba de jeringa. Las salidas de tubo se situaron para recoger las mezclas en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). Se sacó la barra de agitación y la disolución de etanol/acuosa se dejó equilibrar hasta temperatura ambiente durante 1 h. Se cargaron 4 ml de la mezcla en una jeringa de 5 cm3, que se conectó a un trozo de tubo de FEP y en otra jeringa de 5 cm3 conectada a una longitud igual de tubo de FEP, se cargó una cantidad igual de tampón citrato 100 mM (pH 6). Las dos jeringas se accionaron a 7 ml/min de caudal usando la bomba de jeringa y la mezcla final se recogió en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). A continuación, la mezcla recogida de la segunda etapa de mezcla (liposomas) se pasó a través de una membrana Debeang Q (un soporte de intercambio aniónico que une y retira moléculas aniónicas, obtenido de Pall Corporation). Antes de usar esta membrana para los liposomas, se pasaron sucesivamente a través de ella 4 ml de NaOH 1 M, 4 ml de NaCl 1 M y 10 ml de tampón citrato 100 mM (pH 6). Los liposomas se calentaron durante 10 min a 37 °C antes de pasar a través de la membrana. A continuación, los liposomas se concentraron hasta 2 ml y se dializaron contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando filtración de flujo tangencial antes de recuperar el producto final. El sistema de TFF y las membranas de filtración de fibra hueca se compraron de Spectrum Labs (Rancho Dominguez) y se usaron según las recomendaciones del fabricante. Se usaron membranas de filtración de fibra hueca de polisulfona con un corte de 100 kD de tamaño de poro y área superficial de 8 cm2. Para los experimentos in vitro e in vivo, las formulaciones se diluyeron hasta la concentración de ARN requerida con IX PBS. Se desvelan a continuación métodos de fabricación de liposomas adicionales.
La Figura 2 muestra una micrografía electrónica de ejemplo de liposomas preparados por estos métodos. Estos liposomas contienen ARN encapsulado que codifica antígeno F del RSV de longitud completa. La dispersión dinámica de luz de un lote mostró un diámetro promedio de 141 nm (por intensidad) o 78 nm (por número).
El porcentaje de ARN encapsulado y la concentración de ARN se determinaron por el kit de reactivos de ARN Quant-iT RiboGreen (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. El patrón de ARN ribosómico proporcionado en el kit se usó para generar una curva patrón. Los liposomas se diluyeron 10x o 100x en tampón IX TE (del kit) antes de la adición del colorante. Por separado, los liposomas se diluyeron 10x o 100x en tampón IX TE que contenían 0,5 % de Triton X antes de la adición del colorante (para romper los liposomas y así para ensayar el ARN total). A partir de aquí se añadió una cantidad igual de colorante a cada disolución y luego se cargó por duplicado ~ 180 gl de cada disolución después de la adición de colorante en una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos. La fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) se leyó en un lector de microplacas. Todas las formulaciones de liposomas se administraron in vivo basándose en la cantidad de ARN encapsulado.
Se mostró que la encapsulación en liposomas protegía el ARN de la digestión con RNasa. Los experimentos usaron 3,8 mUA de RNasa A por microgramo de ARN, se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La RNasa se inactivó con la proteinasa K a 55 °C durante 10 minutos. Entonces se añadió una mezcla de muestra 1:1 v/v a 25:24:1 v/v/v, fenol:cloroformo:alcohol isoamílico, para extraer el ARN de los lípidos en la fase acuosa. Las muestras se mezclaron en vórtex durante algunos segundos y luego se dispusieron en una centrífuga durante 15 minutos a 12 krpm. Se retiró la fase acuosa (que contenía el a Rn) y se usó para analizar el ARN. Antes de la carga (400 ng de ARN por pocillo), todas las muestras se incubaron con colorante con carga de formaldehído, se desnaturalizaron durante 10 minutos a 65 °C y se enfriaron hasta temperatura ambiente. Se usaron marcadores Ambion Millennium para aproximar el peso molecular de la construcción de ARN.
El gel se pasó a 90 V. El gel se tiñó usando 0,1% de SYBR Gold según las recomendaciones del fabricante en agua por balanceo a temperatura ambiente durante 1 hora. La Figura 1 muestra que la RNasa digiere completamente el ARN en ausencia de encapsulación (carril 3). El ARN es indetectable después de la encapsulación (carril 4), y no se observa cambio si estos liposomas se tratan con RNasa (carril 4). Después de que los liposomas tratados con RNasa se sometieran a extracción con fenol, se observa ARN no digerido (carril 6). Incluso después de 1 semana a 4 °C, el ARN se podría observar sin fragmentación (Figura 4, flecha). La expresión de proteínas in vivo no cambió después de 6 semanas a 4 °C y un ciclo de congelación-descongelación. Por lo tanto, el ARN encapsulado en liposomas es estable.
Para evaluar la expresión in vivo del ARN, se codificó una enzima indicadora (SEAP; fosfatasa alcalina secretada) en el replicón, en vez de un inmunogén (ejemplo de referencia). Los niveles de expresión se midieron en sueros diluidos 1:4 en tampón de dilución IX Phospha-Light usando un sustrato de fosfato alcalino quimioluminiscente. Se inyectaron por vía intramuscular ratones BALB/c (5/grupo) de 8-10 semanas en el día 0, 50 gl por pata con 0,1 gg o 1 gg de dosis de ARN. El mismo vector también se administró sin los liposomas (en IX PBS sin RNasa) a 1 gg. También se probaron replicones encapsidados en viriones. Los replicones encapsidados en viriones usados en el presente documento (denominados "VRP") se obtuvieron por los métodos de la referencia 45, donde el replicón de alfavirus deriva del VEEV mutante o una quimera derivada del genoma de VEEV manipulado para contener la 3' UTR del virus de Sindbis y una señal de encapsidación (PS) del virus de Sindbis, encapsidada por su coelectroporación en células BHK con ARN auxiliares defectuosos que codifican la cápside del virus de Sindbis y genes de glucoproteína.
Como se muestra en la Figura 5, la encapsulación aumentó los niveles de SEAP en aproximadamente / log a la dosis de 1 gg, y en el día 6 la expresión de una dosis encapsulada de 0,1 gg se equiparó con los niveles observados con 1 gg de dosis no encapsulada. En el día 3, los niveles de expresión superaron los alcanzados con VRP (cuadrados). Por lo tanto, la expresión aumentó cuando el ARN se formuló en los liposomas con respecto al control de ARN desnudo, incluso a una dosis 10x más baja. La expresión también fue mayor con respecto al control de VRP, pero la cinética de expresión fue muy diferente (véase la Figura 5). La administración del ARN con electroporación produjo una elevada expresión con respecto al control de ARN desnudo, pero estos niveles fueron inferiores a con liposomas.
Experimentos de SEAP adicionales mostraron una clara respuesta a la dosis in vivo, con la expresión observada después de la administración de tan solo 1 ng de ARN (Figura 6). Los experimentos adicionales comparando la expresión de replicones encapsulados con desnudos indicaron que 0,01 pg de ARN encapsulado era equivalente a 1 pg de ARN desnudo. A una dosis de 0,5 pg de ARN el material encapsulado dio una expresión 12 veces más alta en el día 6; a niveles de 0,1 pg de dosis fue 24 veces más alta en el día 6.
En vez de mirar niveles promedio en el grupo, también se estudiaron animales individuales. Mientras que varios animales no respondieron a los replicones desnudos, la encapsulación eliminó los no respondedores.
Experimentos adicionales sustituyeron DlinDMA con DOTAP. Aunque los liposomas de DOTAP dieron mejor expresión que el replicón desnudo, fueron inferiores a los liposomas de DlinDMA (2 a 3 veces de diferencia en el día 1).
Para evaluar la inmunogenicidad in vivo se construyó un replicón para expresar proteína F de longitud completa del virus respiratorio sincitial (RSV). Este se administró desnudo (1 pg), encapsulado en liposomas (0,1 o 1 pg), o encapsidado en viriones (106 UI; "VRP") en los días 0 y 21. La Figura 7 muestra títulos de IgG anti-F 2 semanas después de la segunda dosis, y los liposomas potencian claramente la inmunogenicidad. La Figura 8 muestra títulos 2 semanas después, momento en el que no hubo diferencia estadística entre el ARN encapsulado a 0,1 pg, el ARN encapsulado a 1 pg, o el grupo de VRP. Los títulos de neutralización (medidos como el 60 % de reducción de placa, "PRNT60") no fueron significativamente diferentes en estos tres grupos 2 semanas después de la segunda dosis (Figura 9). La Figura 12 muestra tanto títulos de IgG como de PRNT 4 semanas después de la segunda dosis.
La Figura 13 confirma que el ARN provoca una robusta respuesta de linfocitos T CD8.
Experimentos adicionales compararon títulos de IgG específica de F en ratones que recibieron VRP, 0,1 pg de ARN encapsulado en liposomas, o 1 pg de ARN encapsulado en liposomas. Las relaciones de títulos (VRP: liposoma) en diversos momentos después de la segunda dosis fueron las siguientes:
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Por lo tanto, el ARN encapsulado en liposomas induce esencialmente la misma magnitud de respuesta inmunitaria que la observada con la administración de virión.
Experimentos adicionales mostraron respuestas de IgG específica de F superiores con una dosis de 10 pg, respuestas equivalentes para dosis de 1 pg y 0,1 pg, y una menor respuesta con una dosis de 0,01 pg. La Figura 11 muestra títulos de IgG en ratones que recibieron el replicón en forma desnuda a 3 dosis diferentes, en liposomas a 4 dosis diferentes, o como VRP (106 UI). La respuesta observada con 1 pg de ARN encapsulado en liposomas fue estadísticamente insignificativa (ANOVA) cuando se comparó con VRP, pero la mayor respuesta observada con 10 pg de ARN encapsulado en liposomas fue estadísticamente significativa (p<0,05) cuando se comparó con ambos de estos grupos.
Un estudio adicional confirmó que 0,1 pg de ARN encapsulado en liposomas dio respuestas de IgG anti-F mucho mayores (15 días después de la segunda dosis) que 0,1 pg de ADN administrado, e incluso fue más inmunogénico que 20 pg de ADN de plásmido que codifica el antígeno F, administrado por electroporación (Elgen™ DNA Delivery System, Inovio).
Los ratones mostraron pocos signos visuales de malestar (pérdida de peso, etc.) después de recibir replicón de ARN encapsulado en liposomas, aunque se observó una pérdida de peso transitoria del 3-4 % después de una segunda dosis de 10 pg de ARN. A diferencia, la administración de 10 pg de ADN encapsulado en liposoma condujo al 8­ 10 % de pérdida de peso.
Mecanismo de acción
Se obtuvieron células dendríticas de la médula ósea (pDC) de ratones naturales o la cepa mutante "Resq" (rsql). La cepa mutante tiene una mutación puntual en el extremo amino de su receptor TLR7 que suprime la señalización de TLR7 sin afectar la unión al ligando [46]. Las células se estimularon con ARN de replicón formulado con DOTAP, lipofectamina 2000 o en el interior de un liposoma. Como se muestra en la Figura 17, se indujeron IL-6 y INFa en linfocitos WT pero esta respuesta fue casi completamente suprimida en ratones mutantes. Estos resultados muestran que se requiere TLR7 para el reconocimiento de ARN en células inmunitarias, y que los replicones encapsulados en liposomas pueden hacer que las células inmunitarias secreten altos niveles de tanto interferones como citocinas proinflamatorias.
En general, se mostró que los replicones de ARN administrados en liposomas inducían varias citocinas del suero en el plazo de 24 horas desde la inyección intramuscular (IFN-a, IP-10 (CXCL-10), IL-6, KC, IL-5, IL-13, MCP-1 y MIP-a), mientras que solo MIP-1 fue inducido por ARN desnudo y el liposoma solo indujo solo IL-6.
Se mostró que el IFN-a contribuía a la respuesta inmunitaria al replicón que codifica RSV-F encapsulado en liposoma debido a que un anticuerpo anti-receptor IFNa (IFNAR1) redujo la IgG en suero específica de F una reducción de 10 veces después de 2 vacunaciones.
Se ha observado, en general, que los replicones de ARN administrados en liposomas provocan un perfil de subtipo IgG1:IgG2a equilibrado en ratones, algunas veces con una mayor relación IgG2a/IgG1 que la observada con a Dn electroporado o con inmunizaciones de proteína/MF59 (es decir, una respuesta inmunitaria de tipo Th1).
Métodos de fabricación de liposomas
En general, se han usado ocho métodos diferentes para preparar liposomas según la invención. Estos se denominan en el texto métodos (A) a (H) y se diferencian principalmente en relación con las etapas de filtración y de TFF. Los detalles son los siguientes:
(A) Se prepararon disoluciones madre de lípido nuevas en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DSPC, 27,8 mg de colesterol y 8,07 mg de PEG-DMG 2000 y se disolvieron en 7,55 ml de etanol. La disolución madre de lípidos recién preparada se balanceó suavemente a 37 °C durante aproximadamente 15 min para formar una mezcla homogénea. Entonces, se añadió 755 pl de la disolución madre a 1.245 ml etanol para preparar una disolución madre de lípidos de trabajo de 2 ml. Esta cantidad de lípidos se usó para formar liposomas con 250 pg de ARN. También se prepararon 2 ml de una disolución de ARN de trabajo a partir de una disolución madre de ~1 pg/pl en tampón citrato 100 mM (pH 6). Se aclararon tres viales de vidrio de 20 ml (con barras de agitación) con disolución RNase Away (Molecular BioProducts, San Diego, CA) y se lavaron con mucha agua MilliQ antes del uso para descontaminar los viales de RNasas. Uno de los viales se usó para la disolución de ARN de trabajo y los otros para recoger las mezclas de lípido y ARN (como se describe después). Las disoluciones de lípido y de ARN de trabajo se calentaron a 37 °C durante 10 min antes ser cargadas en jeringas Luer-lock de 3 cm3. Se cargaron 2 ml de tampón citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cm3. Las jeringas que contenían ARN y los lípidos se conectaron a un mezclador en T (conexión PEEk™ de 500 pm de DI, Idex Health Science, Oak Harbor, WA) usando tubo de FEP (etileno-propileno fluorado; todos los tubos de FEP usados tuvieron un diámetro interno de 2 mm x 3 mm de diámetro externo, suministrados por Idex Health Science). La salida de la mezcladora en T también fue tubo de FEP. La tercera jeringa que contenía el tampón citrato se conectó a un trozo separado de tubo de FEP. Todas las jeringas se accionaron entonces a un caudal de 7 ml/min usando una bomba de jeringa. Las salidas de tubo se situaron para recoger las mezclas en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). Se sacó la barra de agitación y la disolución de etanol/acuosa se dejó equilibrar hasta temperatura ambiente durante 1 h. Se cargaron 4 ml de la mezcla en una jeringa de 5 cm3, que se conectó a un trozo de tubo de FEP y en otra jeringa de 5 cm3 conectada a una longitud igual de tubo de FEP, se cargó una cantidad igual de tampón citrato 100 mM (pH 6). Las dos jeringas se accionaron a 7 ml/min de caudal usando la bomba de jeringa y la mezcla final se recogió en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). A continuación, la mezcla recogida de la segunda etapa de mezcla (liposomas) se pasó a través de una membrana Debeang Q (un soporte de intercambio aniónico que une y retira moléculas aniónicas, obtenido de Pall Corporation, AnnArbor, MI, EE. UU.). Antes de pasar los liposomas, se pasaron sucesivamente a través de la membrana Debeang 4 ml de NaOH 1 M, 4 ml de NaCl 1 M y 10 ml de tampón citrato 100 mM (pH 6). Los liposomas se calentaron durante 10 min a 37 °C antes de pasar a través de la membrana. A continuación, los liposomas se concentraron hasta 2 ml y se dializaron contra 10-15 volúmenes de IX PBS usando TFF antes de recuperar el producto final. El sistema de TFF y las membranas de filtración de fibra hueca se compraron de Spectrum Labs y se usaron según las recomendaciones del fabricante. Se usaron membranas de filtración de fibra hueca de polisulfona (número de pieza P/N: X1AB-100-20P) con un corte de 100 kD de tamaño de poro y área superficial de 8 cm2. Para los experimentos in vitro e in vivo, las formulaciones se diluyeron hasta la concentración de ARN requerida con IX PBS.
(B) Como el método (A), excepto que, después del balanceo, se añadieron 226,7 pl de disolución madre a 1,773 ml de etanol para preparar una disolución madre de lípidos de trabajo de 2 ml, modificándose así la relación lípido:ARN.
(C) Como el método (B), excepto que se omitió la filtración en Debeang, por lo que los liposomas fueron del vial de vidrio de 20 ml a la diálisis en TFF.
(D) Como el método (C), excepto que la TFF usó membranas de fibra hueca de poliétersulfona (PES) (número de pieza P-C1 -100E-100-01N) con un corte de 100 kD de tamaño de poro y área superficial de 20 cm2.
(E) Como el método (D), excepto que se usó una membrana Debeang, como en el método (A).
(F) Como el método (A), excepto que se omitió la filtración en Debeang, por lo que los liposomas pasaron del vial de vidrio de 20 ml a la diálisis en TFF.
(G) Como el método (D), excepto que se preparó una disolución de ARN de trabajo de 4 ml a partir de una disolución madre de ~ 1 gg/gl en tampón citrato 100 mM (pH 6). Entonces se prepararon cuatro viales de vidrio de 20 ml de la misma forma. Dos de ellos se usaron para la disolución de ARN de trabajo (2 ml en cada vial) y los otros para recoger las mezclas de lípido y ARN, como en (C). En vez de usar la mezcladora en T, jeringas que contenían ARN y los lípidos se conectaron a un Mitos Droplet junction Chip (un dispositivo microfluídico de vidrio obtenido de Syrris, número de pieza 3000158) usando tubo de PTFE (0,07 cm (0,03 pulgadas) de diámetro interno x 0,16 cm (1/16 pulgada) de diámetro externo) usando un conector de borde de 4 vías (Syrris). Dos corrientes de ARN y una corriente de lípido fueron conducidos por bombas de jeringa y la mezcla de la fase de etanol y acuosa se hizo en la unión X (100 gm x 105 gm) del chip. El caudal de las tres corrientes se mantuvo en 1,5 ml/min, por tanto la relación entre el caudal total acuoso y etanólico fue 2:1. La salida del tubo se situó para recoger las mezclas en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). Se sacó la barra de agitación y se dejó equilibrar la disolución de etanol acuosa hasta temperatura ambiente durante 1 h. Entonces se cargó la mezcla en una jeringa de 5 cm3, que se ajustó a otro trozo del tubo de PTFE; en otra jeringa de 5 cm3 con igual longitud de tubo de PTFE, se cargó un volumen igual de tampón citrato 100 mM (pH 6). Las dos jeringas accionaron un caudal de 3 ml/min usando una bomba de jeringa y la mezcla final se recogió en un vial de vidrio de 20 ml (mientras se agitaba). A continuación, los liposomas se concentraron hasta 2 ml y se dializaron contra 10-15 volúmenes de 1X PBS usando TFF, como en (D).
(H) Como el método (A), excepto que la disolución madre de lípidos de trabajo de 2 ml se preparó mezclando 120,9 gl de la disolución madre de lípidos con 1,879 ml de etanol. Por tanto, después de mezclar en la mezcladora en T los liposomas del vial de 20 ml, se cargaron en el casete de diálisis Pierce Slide-A-Lyser (Thermo Scientific, intensidad adicional, 0,5-3 ml de capacidad) y se dializó contra 400-500 ml de IX PBS durante la noche a 4 °C en un recipiente de plástico esterilizado en autoclave antes de recuperar el producto final.
Expresión de BHK
Se incubaron liposomas con diferentes lípidos con células BHK durante la noche y se evaluaron para la expresión de la potencia de proteínas. A partir de un nivel basal con lípido RV05, la expresión se pudo aumentar 18x añadiendo 10 % de 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPyPE) al liposoma, 10x añadiendo 10 % de 18:2 (cis) fosfatidilcolina y 900x en lugar de usar RV01.
En general, estudios in vivo mostraron que las colas de lípidos insaturados tienden a potenciar los títulos de IgG producidos contra antígenos codificados.
Inmunogenicidad de RSV
El replicón autorreplicante vA317 que codifica la proteína F del RSV se administró a ratones BALB/c, 4 o 8 animales por grupo, por vacunaciones intramusculares bilaterales (50 gl por pata) en los días 0 y 21 con el replicón (1 gg) solo o formulado como liposomas con DlinDMA ("RV01") o DOtAp ("Rv13"). Los liposomas RV01 tuvieron 40 % de DlinDMA, 10 % de DSPC, 48 % de colesterol y 2 % de PEG-DMG, pero con cantidades diferentes de ARN. Los liposomas RV13 tuvieron 40 % de DOTAP, 10 % de DPE, 48 % de colesterol y 2 % de PEG-DMG. Para comparación, ADN de plásmido desnudo (20 gg) que expresa el mismo antígeno RSV-F se administró o usando electroporación o con liposomas RV01 (10) (0,1 gg de ADN). Se usaron cuatro ratones como grupo de control intacto.
Los liposomas se prepararon por el método (D) o el método (B). Para algunos liposomas preparados por el método (D) se usó una cantidad doble o mitad de aRn. El diámetro de partículas promedio Z, el índice de polidispersidad y la eficiencia de encapsulación de los liposomas fueron los siguientes:
Figure imgf000019_0002
Se recogió suero para el análisis de anticuerpos en los días 14, 36 y 49. Los bazos se recogieron de ratones en el día 49 para el análisis de linfocitos T.
Los títulos de IgG en suero específica de F (GMT) fueron los siguientes:
RV Día 14 Día 36
Figure imgf000019_0001
Plásmido de ADN desnudo 439 6712
Figure imgf000020_0003
La proporción de linfocitos T que son positivos para las citocinas y específicos para el péptido F51-66 del RSV son los siguientes, que muestran solo cifras que son estadísticamente significativamente por encima de cero:
Figure imgf000020_0002
Por lo tanto, las formulaciones de liposoma potenciaron significativamente la inmunogenicidad con respecto a los controles de ARN desnudo, como se ha determinado por elevados títulos de IgG específica de F y frecuencias de linfocitos T. El ADN de plásmido formulado con liposomas, o administrado desnudo usando electroporación, fue significativamente menos inmunogénico que el ARN autorreplicante formulado en liposomas.
Las vacunas de ARN RV01 fueron más inmunogénicas que la vacuna RV13. RV01 tiene una amina terciaria en el grupo de cabeza con un pKa de aproximadamente 5,8, y también incluyen colas de alquilo insaturado. RV13 tiene colas de alquilo insaturado, pero su grupo de cabeza tiene una amina cuaternaria y es muy fuertemente catiónico.
Liposomas - requisito para la encapsulación
Para evaluar si el efecto observado en los grupos de liposomas era debido simplemente a los componentes del liposoma, o estaba asociado con la encapsulación, el replicón se administró en forma encapsulada (con dos protocolos de purificación diferentes, 0,1 pg de ARN), o se mezcló con los liposomas después de su formación (un "lipoplejo" no encapsulado, 0,1 pg de ARN), o como ARN desnudo (1 pg). La Figura 10 muestra que el lipoplejo dio los niveles de expresión más bajos, que muestra que la encapsulación de muestras es esencial para la potente expresión.
Experimentos adicionales usaron tres ARN diferentes: (i) replicón 'vA317' que expresa RSV-F, es decir, la glucoproteína de fusión superficial de RSV; (ii) replicón 'vA17' que expresa GFP; y (iii) 'vA336' que es defectuoso en la replicación y codifica GFP.
Los ARN se administraron o desnudos o con liposomas fabricados por el método (D). Los liposomas vacíos se fabricaron por el método (D) pero sin ARN. Cuatro formulaciones de liposomas tuvieron estas características:
Figure imgf000020_0001
Ratones BALB/c, 5 animales por grupo, se administraron con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 pl por pata) en los días 0 y 21 con:
Grupo 1 ARN de RSV-F autorreplicante desnudo (vA317, 0,1 pg)
Grupo 2 ARN de RSV-F autorreplicante (vA317, 0,1 pg) encapsulado en liposomas
Grupo 3 ARN de RSV-F autorreplicante (vA317, 0,1 pg) añadido a liposomas vacíos
Grupo 4 proteína de subunidad F (5 pg)
Se recogió suero para el análisis de anticuerpos en los días 14, 35 y 51. Se midieron los títulos de IgG en suero específicos específica de F (GMT); si un animal individual tuvo un título de <25 (límite de detección), se asignó un título de 5. Además, se recogieron los bazos de ratones en el día 51 para el análisis de linfocitos T, para determinar las células que eran positivas para citocinas y específicas para péptido F51 -66 del RSV (CD4+) o para péptidos F del RSV F85-93 y F249-258 (CD8+).
Los títulos de IgG fueron del siguiente modo en los 10 grupos y en ratones de control no inmunizados:
Figure imgf000021_0004
Los títulos de neutralización del suero del RSV en el día 51 fueron los siguientes:
Figure imgf000021_0005
Los animales que muestran linfocitos T esplénicos CD4+ específicos de F del RSV en el día 51 fueron los siguientes, donde se da un número (% de células positivas) solo si la respuesta estimulada estuvo estadísticamente significativamente por encima de cero:
Figure imgf000021_0003
Los animales que muestran linfocitos T esplénicos CD8+ específicos de F del RSV en el día 51 fueron los siguientes, donde se da un número solo si la respuesta estimulada estuvo estadísticamente significativamente por encima de cero:
Figure imgf000021_0002
Por lo tanto, la encapsulación de ARN dentro de los liposomas es necesaria para la alta inmunogenicidad, ya que una mezcla simple de ARN y los liposomas (grupo 3) no era inmunogénica (en realidad, menos inmunogénica que el ARN desnudo).
En otros estudios, los ratones recibieron diversas combinaciones de (i) replicón de ARN autorreplicante que codifica proteína F del RSV de longitud completa (ii) replicón de ARN autorreplicante que codifica GFP (iii) replicón de ARN que codifica GFP con una inactivación en nsP4 que elimina la autorreplicación (iv) proteína F del RSV de longitud completa. 13 grupos en total recibieron:
Figure imgf000021_0001
Los resultados en la Figura 16 muestran que las respuestas de IgG específica de F requirieron la encapsulación en el liposoma en vez de la mera coadministración (comparar los grupos C y D). Una comparación de grupos K, L y M muestra que el ARN proporcionó un efecto adyuvante contra la proteína coadministrada, y este efecto se observó tanto con ARN replicante como no replicante.
Inmunogenicidad de RSVen diferentes cepas de ratón
El replicón "vA142" codifica la glucoproteína de fusión (F) superficial natural de longitud completa del RSV, pero con el péptido de fusión delecionado, y el extremo 3’ se forma por escisión mediada por ribozima. Se probó en tres cepas de ratón diferentes.
Los ratones BALB/c se administraron con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 pl por pata) en los días 0 y 22. Los animales se dividieron en 8 grupos de prueba (5 animales por grupo) y un control intacto (2 animales): Al Grupo 1 se administró replicón desnudo (1 pg).
Al Grupo 2 se administró 1 pg de replicón administrado en liposomas "RV01 (37)" con 40 % de DlinDMA, 10 % de DSPC, 48 % de col., 2 % de DMG conjugado con PEG.
Al Grupo 3 se administró lo mismo que al grupo 2, pero a 0,1 pg de ARN.
Al Grupo 4 se administró 1 pg de replicón en liposomas "RV17(10)" (40 % de RV17 (véase anteriormente), 10 % de DSPC, 49,5 % de colesterol, 0,5 % de PEG-DMG).
Al Grupo 5 se administró 1 pg de replicón en liposomas "RV05(11)" (40 % de lípido RV07, 30 % de 18:2 de PE (DLoPE, 28 % de colesterol, 2 % de PEG-DMG).
Al Grupo 6 se administró 0,1 pg de replicón en liposomas "RV17(10)".
Al Grupo 7 se administró 5 pg de la proteína de subunidad F del RSV adyuvantada con hidróxido de aluminio. El Grupo 8 fue un control intacto (2 animales)
Los sueros se recogieron para el análisis de anticuerpos en los días 14, 35 y 49. Los GMT de IgG en suero específica de F fueron:
Figure imgf000022_0003
En el día 35, los títulos de IgG1 y IgG2a específicos de F (GMT) fueron los siguientes:
Figure imgf000022_0001
Los títulos de anticuerpo neutralizante en suero del RSV en los días 35 y 49 fueron los siguientes (los datos son 60 % de títulos de neutralización de reducción de la placa de conjuntos de 2-5 ratones, 1 conjunto por grupo):
Figure imgf000022_0002
Se recogieron los bazos en el día 49 para el análisis de linfocitos T. Las frecuencias netas promedio de linfocitos T positivos para citocinas específicas de F (CD4+ o CD8+) fueron las siguientes, que muestran solo cifras que estuvieron estadísticamente significativamente por encima de cero (específicas para los péptidos del RSV F51-66, F164-178, F309-323 para CD4+, o para los péptidos F85-93 y F249-258 para CD8+):
Figure imgf000022_0004
Figure imgf000023_0006
Se inmunizaron ratones C57BL/6 de la misma forma, pero un 9° grupo recibió VRP (1x106 UI) que expresan la glucoproteína de fusión superficial natural de longitud completa del RSV (deleción del péptido de fusión).
Los sueros se recogieron para el análisis de anticuerpos en los días 14, 35 y 49. Los títulos de IgG específicos de F (GMT) fueron:
Figure imgf000023_0004
En el día 35, los títulos de IgG1 y IgG2a específicos de F (GMT) fueron los siguientes:
Figure imgf000023_0005
Los títulos de anticuerpos neutralizantes en suero del RSV en los días 35 y 49 fueron los siguientes (los datos son 60 % de títulos de neutralización de reducción de placa de conjuntos de 2-5 ratones, 1 conjunto por grupo):
Figure imgf000023_0001
Se recogieron los bazos en el día 49 para el análisis de linfocitos T. Las frecuencias netas promedio de linfocitos T positivos para citocinas específicas de F (CD8+) fueron las siguientes, que muestran solo cifras que estuvieron estadísticamente significativamente por encima de cero (específicas para los péptidos del RSV F85-93 y F249-258):
Figure imgf000023_0008
Se inmunizaron nueve grupos de ratones C3H/HeN de la misma forma. Los títulos de IgG específicos de F (GMT) fueron:
Figure imgf000023_0003
En el día 35, los títulos de IgG1 y IgG2a específicos de F (GMT) fueron los siguientes:
Figure imgf000023_0002
Los títulos de anticuerpos neutralizantes en suero del RSV en los días 35 y 49 fueron los siguientes:
Figure imgf000023_0007
Por lo tanto, se probaron tres lípidos diferentes (RV01, RV05, RV17; pKa 5,8, 5,85, 6,1) en tres cepas de ratón endogámicas diferentes. Para las 3 cepas, RV01 fue más eficaz que RV17; para las cepas BALB/c y C3H RV05 fue menos eficaz que cualquiera de RV01 o RV17, pero fue más eficaz en la cepa B6. En todos los casos, sin embargo, los liposomas fueron más eficaces que dos nanoemulsiones catiónicas que se probaron en paralelo.
Inmunogenicidad del CMV
Se usaron liposomas RV01 con DLinDMA como lípido catiónico para administrar replicones de ARN que codifican glucoproteínas del citomegalovirus (CMV). El replicón "vA160" codifica glucoproteínas H y L de longitud completa (gH/gL), mientras que el replicón "vA322" codifica una forma soluble (gHsol/gL). Las dos proteínas están bajo el control de promotores subgenómicos separados en un único replicón; la coadministración de dos vectores separados, uno que codifica gH y uno que codifica gL, no dio buenos resultados.
Se administró a ratones BALB/c, 10 por grupo, vacunaciones intramusculares bilaterales (50 gl por pata) en los días 0, 21 y 42 con VRP que expresaban gH/gL (1x106 UI), VRP que expresan gHsol/gL (1x106 UI) y PBS como controles. Dos grupos de prueba recibieron 1 gg del replicón vA160 o vA322 formulado en liposomas (40 % de DlinDMA, 10 % de DSPC, 48 % de col., 2 % de PEG-DMG; preparados usando el método (D) pero con 150 gg de tamaño de lote de ARN).
Los liposomas vA160 tuvieron un diámetro Zav de 168 nm, un pdl de 0,144 y 87,4 % de encapsulación. Los liposomas vA322 tuvieron un diámetro Zav de 162 nm, un pdl de 0,131 y 90 % de encapsulación.
Los replicones fueron capaces de expresar dos proteínas a partir de un único vector.
Los sueros se recogieron para el análisis inmunológico en el día 63 (3wp3). Los títulos de neutralización del CMV (inversa de la dilución del suero que produce una reducción del 50 % en el número de focos de virus positivos por pocillo, con respecto a los controles) fueron los siguientes:
Figure imgf000024_0001
El ARN que expresa o una longitud completa o una forma soluble del complejo gH/gL del CMV provocó así altos títulos de anticuerpos neutralizantes, como se ensaya en células epiteliales. Los títulos promedio provocados por los ARN encapsulados en liposoma fueron al menos tan altos como para los VRP correspondientes.
Experimentos repetidos confirmaron que el replicón fue capaz de expresar dos proteínas a partir de un único vector. El replicón de ARN dio un título 3wp3 de 11457, en comparación con 5516 con VRP.
Experimentos adicionales usaron diferentes replicones, además de vA160. El replicón vA526 expresa el complejo pentamérico del CMV (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) bajo el control de tres promotores subgenómicos: el primero conduce la expresión de gH; el segundo conduce la expresión de gL; el tercero conduce la expresión de la poliproteína UL128-2A-UL130-2A-UL131, que contiene dos sitios de escisión 2A entre los tres genes UL. El replicón vA527 expresa el complejo pentamérico del CMV por tres promotores subgenómicos y dos IRES: el primer promotor subgenómico conduce la expresión de gH; el segundo promotor subgenómico conduce la expresión de gL; el tercer promotor subgenómico conduce la expresión de UL128; UL130 está bajo el control de un iRES del EMCV; UL131 está bajo el control de un IRES del EV71. Estos tres replicones se administraron por liposoma (método (H), con 150 gg de tamaño de lote) o por VRP.
Ratones BALB/c, 10 grupos de 10 animales, se administraron con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 gl por pata) en los días 0, 21 y 42 con:
Grupo 1 VRP que expresan gH FL/gL (1x106 UI)
Grupo 2 pentamérico, 2A VRP (1x105 UI)
Grupo 3 pentamérico, 2A VRP (1x106 UI)
Grupo 4 pentamérico, IRES VRP (1x105 UI)
Grupo 5 ARN autorreplicante vA160 (1 gg) formulado en liposomas
Grupo 6 ARN autorreplicante vA526 (1 gg) formulado en liposomas
Grupo 7 ARN autorreplicante vA527 (1 gg) formulado en liposomas
Grupo 8 ARN autorreplicante vA160 (1 pg) formulado en una nanoemulsión catiónica
Grupo 9 ARN autorreplicante vA526 (1 pg) formulado en una nanoemulsión catiónica
Grupo 10 ARN autorreplicante vA527 (1 pg) formulado en una nanoemulsión catiónica.
Se recogieron sueros para el análisis inmunológico en los días 21 (3wp1), 42 (3wp2) y 63 (3wp3).
Los títulos de neutralización en suero del CMV en los días 21,42 y 63 fueron:
Figure imgf000025_0002
Por lo tanto, el ARN autorreplicante se puede usar para expresar múltiples antígenos a partir de un único vector y para producir una respuesta inmunitaria potente y específica. El replicón puede expresar cinco antígenos (complejo pentamérico del CMV (gH-gL-UL128-UL130-UL-131) y producir una potente respuesta inmunitaria. El ARN autorreplicante administrado en liposomas fue capaz de provocar altos títulos de anticuerpo neutralizante, como se ensayó en células epiteliales, en todos los momentos de tiempo ensayados (3wp1, 3wp2 y 3wp3). Estas respuestas fueron superiores a las VRP correspondientes y a nanoemulsiones catiónicas.
Volumen de administración
La administración hidrodinámica emplea la fuerza generada por la rápida inyección de un gran volumen de disolución para vencer las barreras físicas de membranas celulares que previenen que compuestos grandes e impermeables a las membrana entren en las células. Se ha mostrado previamente que este fenómeno es útil para la administración intracelular de vacunas de ADN.
Un volumen de administración típico a ratón para inyección intramuscular es 50 pl en la pata trasera, que es un volumen relativamente alto para el músculo de la pata de un ratón. A diferencia, una dosis intramuscular humana de ~0,5 ml es relativamente pequeña. Si la inmunogenicidad en ratones fuera dependiente del volumen, entonces la eficacia de las vacunas de replicón podría ser debida, al menos en parte, a las fuerzas hidrodinámicas, que no sería alentador para el uso de las mismas vacunas en seres humanos y animales más grandes.
El replicón vA317 se administró a ratones BALB/c, 10 por grupo, por vacunaciones intramusculares bilaterales (5 o 50 por pata) en el día 0 y 21:
El Grupo 1 recibió el replicón desnudo, 0,2 pg en 50 pl por pata
El Grupo 2 recibió el replicón desnudo, 0,2 pg en 5 pl por para
El Grupo 3 recibió el replicón formulado en liposomas (0,2 pg, 50 pl por pata)
El Grupo 4 recibió el replicón formulado en liposomas (0,2 pg, 5 pl por pata)
Se recogió el suero para el análisis de anticuerpos en los días 14 y 35. Las GMT de IgG específicas de F fueron:
Figure imgf000025_0001
Por lo tanto, la inmunogenicidad del replicón formulado no varió según el volumen administrado, lo que indica que estas vacunas de ARN no se basan en la administración hidrodinámica para su eficacia.
Cinética de expresión (ejemplo de referencia)
Se usó un replicón de ARN autorreplicante ("vA311") que expresa un gen indicador de luciferasa (luc) para estudiar la cinética de expresión de proteínas después de la inyección. Ratones BALB/c, 5 animales por grupo, recibieron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 gl por pata) en el día 0 con:
el Grupo 1 ADN que expresa luciferasa, administrada usando electroporación (10 gg)
el Grupo 2 ARN autorreplicante (1 gg) formulado en liposomas
el Grupo 3 ARN autorreplicante (1 gg) formulado con una nanoemulsión catiónica
el Grupo 4 ARN autorreplicante (1 gg) formulado con una nanoemulsión catiónica
el Grupo 5 VRP (1x106 UI) que expresa luciferasa
Antes de la vacunación, los ratones se depilaron. Los ratones se anestesiaron (2 % de isoflurano en oxígeno), primero se retiró el pelo con una cuchilla eléctrica y luego el producto químico Nair. Los datos de bioluminiscencia se adquirieron entonces usando un sistema de obtención de imágenes Xenogen IVIS 200 (Caliper Life Sciences) en los días 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63 y 70. Cinco minutos antes de la obtención de imágenes, los ratones se inyectaron por vía intraperitoneal con 8 mg/kg de disolución de luciferina. Entonces, los animales se anestesiaron y se transfirieron al sistema de obtención de imágenes. Los tiempos de adquisición de imágenes se mantuvieron constantes, ya que la señal de bioluminiscencia se midió con un cámara de c Cd enfriada.
En términos visuales, se observó que las células que expresaban luciferasa siguieron principalmente en el sitio de inyección de ARN, y las imágenes de los animales después de retirar de cuádriceps no mostraron señal.
En términos cuantitativos, la expresión de luciferasa se midió como la radiancia promedio durante un periodo de 70 días (p/s/cm2/sr), y los resultados fueron los siguientes para los 5 grupos:
Figure imgf000026_0001
El ARN autorreplicante formulado con nanoemulsiones catiónicas mostró bioluminiscencia medible en el día 3, que alcanzó el máximo en el día 7 y luego se redujo hasta niveles de fondo en los días 28 a 35. Cuando se formuló en liposomas, el ARN mostró bioluminiscencia medible en el día 3, que alcanzó el máximo en el día 7 y se redujo hasta niveles de fondo en el día 63. El ARN administrado usando VRP mostró bioluminiscencia potenciada en el día 21 cuando se comparó con el ARN formulado, pero la expresión se redujo hasta niveles de fondo en el día 28. El ADN electroporado mostró el nivel más alto de bioluminiscencia en todos los puntos de tiempo medidos y los niveles de bioluminiscencia no se redujeron hasta niveles de fondo en los 70 días del experimento.
Vía de administración
El ARN encapsulado en liposomas que codifica gp140 del VIH se administró a ratones por vía intramuscular, por vía intradérmica o por vía subcutánea. Las tres vías condujeron a altos niveles de IgG en suero de anticuerpos específicos del VIH (Figura 15), superando los títulos observados en respuesta a ADN intramuscular electroporado.
Ratas algodonera
Se realizó un estudio en ratas algodoneras (Sigmodon hispidis) en lugar de ratones. A una dosis de 1 gg, la encapsulación en liposomas aumentó los títulos de IgG específica de F en 8,3 veces en comparación con el ARN desnudo y aumentó los títulos de PRNT en 9,5 veces. La magnitud de la respuesta de anticuerpos fue equivalente a la inducida por 5x106 UI de VRP. Tanto el ARN desnudo como el encapsulado en liposomas fueron capaces de proteger las ratas algodoneras de la exposición al RSV (1x105 unidades formadoras de placa), reduciendo la carga vírica pulmonar en al menos 3,5 logaritmos. La encapsulación aumentó la reducción en aproximadamente 2 veces.
Trabajo adicional en ratas algodoneras usó cuatro replicones diferentes: vA317 expresa RSV-F de longitud completa; vA318 expresa RSV-F truncado (retirado transmembrana y la cola citoplásmica); vA142 expresa RSV-F con su péptido de fusión delecionado; vA140 expresa el RSV-F truncado, también sin su péptido. A las ratas algodoneras, 4 a 8 animales por grupo, se les administró vacunaciones intramusculares (100 pl en una pata) en los días 0 y 21 con los cuatro replicones diferentes en dos dosis (1,0 y 0,1 pg) formulados en liposomas preparados por el método (D), pero con un tamaño de lote de ARN de 150 pg. Los grupos de control recibieron una vacuna de proteína de subunidad F del RSV (5 pg) adyuvantada con alumbre (8 animales/grupo), expresando las VRP el RSV-F de longitud completa (1x106 UI, 8 animales/grupo), o control intacto (4 animales/grupo). El suero se recogió para el análisis de anticuerpos en los días 0, 21 y 34.
Los títulos de IgG del suero específica de F y títulos de anticuerpo neutralizante del suero del RSV en el día 21 y 34 fueron:
Figure imgf000027_0001
Los cuatro replicones evaluados en este estudio (vA317, vA318, vA142, vA140) fueron inmunogénicos en ratas algodoneras cuando se administraron por liposoma, aunque los títulos de neutralización en suero fueron al menos diez veces inferiores a los inducidos por vacunas de proteína adyuvantada o por VRP. Las vacunas de liposoma/ARN provocaron IgG específicas de F en suero y anticuerpos neutralizantes contra RSV después de la primera vacunación, y una segunda vacunación reforzó la respuesta eficazmente. Los títulos de IgG específica de F después de la segunda vacunación con 1 pg de replicón fueron 2 a 3 veces superiores a después de la segunda vacunación con 0,1 pg de replicón. Los cuatro replicones provocaron títulos de anticuerpos comparables, sugiriendo que el RSV-F de longitud completa y truncado, cada uno con o sin el péptido de fusión, son similarmente inmunogénicos en ratas algodoneras.
Trabajo adicional en ratas algodoneras usó nuevamente los replicones vA317, vA318 y vA142. Las ratas algodoneras, 2-8 animales por grupo, se administraron con vacunaciones intramusculares (100 pl en una pata) en los días 0 y 21 con los replicones (0,1 o 1 pg) encapsulados en liposomas RV01 fabricados por el método (D), pero con 150 pg de tamaño de lote de ARN. Los grupos de control recibieron la vacuna de la proteína de subunidad RSV-F (5 pg) adyuvantada con alumbre o VRP que expresa RSV-F de longitud completa (1x106 UI, 8 animales/grupo). Todos estos animales recibieron una tercera vacunación (día 56) con la vacuna de la proteína de subunidad RSV-F (5 pg) adyuvantada con alumbre. Además, hubo un control intacto (4 animales/grupo). Además, un grupo adicional se administró con vacunaciones intramusculares bilaterales (50 pl por pata) en los días 0 y 56 con 1 pg de ARN de vA317 en liposomas, pero no recibieron una tercera vacunación con la vacuna de proteína de subunidad.
Se recogió suero para el análisis de anticuerpos en los días 0, 21,35, 56, 70, más los días 14, 28 y 42 para el grupo adicional. Los títulos de IgG en suero específica de F (GMT) fueron los siguientes:
Figure imgf000027_0002
Los títulos de neutralización en suero fueron los siguientes (60 % de títulos de neutralización de RSV para 2 conjuntos de 3-4 animales por grupo, GMT de estos 2 conjuntos por grupo):
Figure imgf000028_0001
Los títulos del suero y títulos neutralizantes para el grupo adicional fueron los siguientes:
Figure imgf000028_0002
Por lo tanto, los replicones se confirman como inmunogénicos en ratas algodoneras, provocando anticuerpos neutralizantes IgG específica de F en suero y contra el RSV después de la primera vacunación. Una segunda vacunación reforzó las respuestas eficazmente. Los títulos de IgG específica de F después de la segunda vacunación con 1,0 pg de replicón fueron 1,5 a 4 veces superiores a después de la segunda vacunación con 0,1 pg de replicón.
La tercera vacunación (proteína en el día 56) no reforzó los títulos en ratas algodoneras previamente vacunadas con la subunidad trimérica F alumbre, pero proporcionó un gran refuerzo para los títulos en ratas algodoneras previamente vacunadas con el replicón. En la mayoría de los casos, los títulos de neutralización en suero de RSV después de dos vacunaciones con replicón, seguido por refuerzos de proteína, fueron iguales o superiores a los títulos inducidos por dos o tres vacunaciones secuenciales con proteína.
Este estudio también evaluó la cinética de la respuesta de anticuerpos a 1,0 pg de vA317. Títulos de neutralización de IgG en suero específica de F y contra RSV inducidos por una única vacunación alcanzaron su pico alrededor del día 21 y se mantuvieron hasta al menos el día 56 (50-70 % de disminución en el título de IgG específica de F, poco cambio en el título de neutralización del RSV). Se administró una segunda vacunación homóloga a estos animales en el día 56, y se reforzaron los títulos de anticuerpos hasta un nivel al menos igual al logrado cuando la segunda vacunación se administró en el día 21.
Los experimentos adicionales implicaron una exposición vírica. El replicón vA368 codifica la glucoproteína de fusión de la superficie natural de longitud completa del RSV con el péptido de fusión delecionado, con la expresión conducida por el IRES de EV71. Las ratas algodoneras, 7 por grupo, se administraron con vacunaciones intramusculares (100 pl por pata) en los días 0 y 21 con vA368 en liposomas preparados por el método (H), 175 pg de tamaño del lote de ARN, o con VRP que tienen el mismo replicón. Un grupo de control recibió 5 pg de proteína adyuvantada con alumbre, y también se incluyó un grupo de control intacto.
Todos los grupos recibieron una exposición intranasal (i.n.) con 1x106 UFP de RSV cuatro semanas después de la inmunización final. El suero se recogió para el análisis de anticuerpos en los días 0, 21,35. Se midieron los títulos víricos en pulmón 5 días después de la exposición. Los resultados fueron los siguientes:
Figure imgf000028_0003
Por lo tanto, la vacuna de ARN redujo la carga vírica en pulmón en tres logaritmos, desde aproximadamente 106 UFP/g en ratas algodoneras de control no vacunadas, hasta menos de 103 UFP/g en ratas algodoneras vacunadas.
Estudio en mamíferos grandes
Se realizó un estudio en animales grandes en ganado vacuno. Se inmunizó a terneros (4-6 semanas, ~60-80 kg, 5 por grupo) con 66 pg de replicón vA317 que codificaba la proteína F del RSV de longitud completa en los días 0, 21, 86 y 146. Los replicones se formularon en el interior de liposomas. El PBS solo se usó como control negativo, y se usó una vacuna autorizada como control positivo ("Triangle 4" de Fort Dodge, que contiene virus muertos). Todos los terneros recibieron 15 pg de proteína F adyuvantada con la emulsión MF59 en el día 146. Una vaca se vacunó erróneamente con la vacuna equivocada en el día 86 en lugar de Triangle 4 y, por lo tanto, sus datos se excluyeron desde el día 100 en adelante.
Las vacunas de ARN codificaron F del RSV humano, mientras que la vacuna "Triangle 4" contiene F del RSV bovino, pero la proteína F del RSV está altamente conservada entre BRSV y HRSV.
Los liposomas se fabricaron por el método (E), excepto que se usó un tamaño de lote de ARN de 1,5 mg.
Los terneros recibieron 2 ml de cada vacuna experimental, administrada por vía intramuscular como 2x1 ml en cada lado del cuello. A diferencia, la vacuna "T riangle 4" se administró como una dosis única de 2 ml en el cuello.
Se recogió el suero para el análisis de anticuerpos en los días 0, 14, 21,35, 42, 56, 63, 86, 100, 107, 114, 121, 128, 135, 146, 160, 167, 174, 181, 188, 195 y 202. Si un animal individual tuvo un título inferior al límite de detección, se le asignó un título de 5.
La Figura 14A muestra títulos de IgG específica de F durante los primeros 63 días. El replicón de ARN fue inmunogénico en las vacas por liposomas, aunque dio menores títulos que la vacuna autorizada. Todas las vacas vacunadas mostraron anticuerpos específicos de F después de la segunda dosis, y los títulos fueron muy estables a partir del periodo de 2 a 6 semanas después de la segunda dosis (y fueron particularmente estables para las vacunas de ARN).
La Figura 14B muestra títulos de IgG en suero específica de F (GMT) durante 210 días, y los valores medidos hasta el día 202 fueron los siguientes:
Figure imgf000029_0001
Los títulos de anticuerpo neutralizante en suero contra el RSV fueron los siguientes:
Figure imgf000029_0002
El material usado para la segunda dosis de liposoma no se preparó nuevo, y el mismo lote de ARN mostró una disminución en la potencia en un estudio de inmunogenicidad en ratón. Por lo tanto, es posible que la vacuna hubiera sido más inmunogénica si el material fresco se hubiera usado para todas las vacunaciones.
Cuando se ensayó con complemento, los anticuerpos neutralizantes se detectaron en todas las vacas vacunadas. En este ensayo, todos los terneros vacunados tuvieron buenos títulos de anticuerpo neutralizante después de la segunda vacunación con ARN. Además, la vacuna de ARN provocó títulos de IgG en suero específica de F que se detectaron en algunos terneros después de la segunda vacunación y en todos los terneros después de la tercera.
El RSV-F adyuvantado con MF59 fue capaz de reforzar la respuesta de IgG en todos los terneros previamente vacunados, y de reforzar títulos de neutralización independientes del complemento de terneros previamente vacunados con ARN.
El estudio de viabilidad de vacunas de ARN en animales grandes es particularmente importante en vista de la pérdida en potencia observada previamente con vacunas basadas en ADN cuando se pasa de modelos de animales pequeños a animales más grandes y seres humanos. Una dosis típica para una vacuna de ADN de vaca sería 0,5­ 1 mg [47,48] y, por lo tanto, es muy alentador que respuestas inmunitarias se indujeran con solo 66 pg de ARN.
Tabla 1: Fosfolípidos útiles
DDPC 1,2-Didecanoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DEPA 1.2- Dierucoil-sn-glicero-3-fosfato DEPC 1.2- Erucoil-sn-glicero-3 -fosfatidilcolina
DEPE 1.2- Dierucoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DEPG 1.2- Dierucoil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac-(1 -glicerol...) DLOPC 1.2- Linoleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DLPA 1.2- Dilauroil-sn-glicero-3-fosfato
DLPC 1.2- Dilauroil-sn-glicero-3 -fosfatidilcolina
DLPE 1.2- Dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DLPG 1.2- Dilauroil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac-(1 -glicerol...) DLPS 1.2- Dilauroil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
DMG 1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DMPA 1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato
DMPC 1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DMPE 1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DMPG 1.2- Miristoil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac-(1 -glicerol...) DMPS 1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina DOPA 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfato
DOPC 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DOPE 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DOPG 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3 [fosfatidil-rac-(1 -glicerol...) DOPS 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
DPPA 1.2- Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato
DPPC 1.2- Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DPPE 1.2- Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DPPG 1.2- Dipalmitoil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac-(1 -glicerol...) DPPS 1.2- Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina DPyPE 1.2- Difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina DSPA 1.2- Diestearoil-sn-glicero- 3-fosfato
DSPC 1.2- Diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DSPE 1.2- Diestearpil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina DSPG 1.2- Diestearoil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac-(1 -glicerol...) DSPS 1.2- Diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilserina
EPC PC de huevo
HEPC PC de huevo hidrogenada
HSPC PC de soja hidrogenada de alta pureza
HSPC PC de soja hidrogenada
LYSOPC MIRÍSTICO 1 -Miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
LYSOPC PALMÍTICO 1 -Palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
LYSOPC ESTEÁRICO 1 -Stearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
MPPC de esfingomielina de la leche 1 -Miristoil-2-palmitoil-sn-glicero 3-fosfatidilcolina MSPC 1 -Miristoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina PMPC 1 -Palmitoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina POPC 1 -Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina POPE 1 -Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina POPG 1.2- Dioleoil-sn-glicero-3 [Fosfatidil-rac-(1 -glicerol)...] PSPC 1 -Palmitoil-2-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina SMPC 1 -Estearoil-2-miristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina SOPC 1 -Estearoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina SPPC 1 -Estearoil-2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende una partícula no de virión que no comprende una cápside de proteína, para la administración in vivo de ARN a una célula de vertebrado; en donde
(a) la partícula se forma a partir de un material de administración de lípidos anfifílicos que puede formar liposomas, y la partícula es un liposoma que comprende un lípido con un grupo de cabeza catiónico y que encapsula una molécula de ARN autorreplicante que codifica un inmunogén, en donde el inmunogén puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo contra un virus, una bacteria, un hongo, un parásito, un alérgeno o un antígeno de tumor; y en donde
(bi) el ARN no incluye nucleótidos modificados, excepto cualquier estructura de caperuza en 5', o (bii) el ARN incluye una caperuza en 5' que comprende una 7-metilguanosina y los primeros 1, 2 o 3 ribonucleótidos en 5' están metilados en la posición 2' de la ribosa.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde el liposoma tiene un diámetro en el intervalo de 50-220 nm.
3. La composición de cualquier reivindicación precedente, en donde el liposoma comprende un lípido con un grupo de cabeza de ion bipolar.
4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, en donde el liposoma comprende un lípido PEGilado, opcionalmente en donde el PEG tiene entre 0,5-8 kDa.
5. La composición de cualquiera de cualquier reivindicación precedente, en donde el uno o más de los lípidos se mezcla con colesterol.
6. La composición de cualquier reivindicación precedente, en donde la molécula de ARN autorreplicante codifica (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir el ARN de la molécula de ARN autorreplicante y (ii) un inmunogén.
7. La composición de la reivindicación 6, en donde la molécula de ARN tiene dos marcos de lectura abiertos, el primero de los cuales codifica una replicasa de alfavirus y el segundo que codifica el inmunogén.
8. La composición de cualquier reivindicación precedente, en donde la molécula de ARN tiene 5000-25000 nucleótidos de longitud.
9. La composición de cualquier reivindicación precedente, en donde el inmunogén puede provocar una respuesta inmunitaria in vivo contra:
(a) coronavirus, tales como un coronavirus del SARS, bronquitis infecciosa aviar (IBV), virus de la hepatitis de ratón (MHV) y virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV); (b) ortomixovirus, tales como virus de la gripe A, B y C; (c) virus respiratorio sincitial (RSV), tal como glucoproteína F del RSV; (d) virus del herpes, tales como virus del herpes simple (HSV), virus de la varicela zóster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), virus del herpes humano 6 (HHV6), virus del herpes humano 7 (HHV7) y virus del herpes humano 8 (HHV8); o (e) una bacteria.
10. La composición de cualquier reivindicación precedente, en donde el inmunogén es un polipéptido de superficie opcionalmente seleccionado de una glucoproteína de la espícula, una hemaglutinina, una glucoproteína de la envoltura o una adhesina.
11. La composición de la reivindicación 10, en donde el inmunogén es una glucoproteína de la espícula.
12. La composición de cualquier reivindicación precedente, para su uso en inmunizar un sujeto o para su uso en un método de producción de una respuesta inmunitaria protectora en un vertebrado.
13. La composición para su uso de la reivindicación 12, para su uso como una vacuna profiláctica para prevenir infección.
14. Un método de preparación de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende preparar liposomas mezclando (i) una disolución etanólica de los lípidos formadores de liposomas, (ii) una disolución acuosa del ARN y (iii) tampón, seguido por equilibrado, dilución y purificación; y formulación en una composición farmacéutica con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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