RS64185B1 - Miševi koji eksprimiraju ograničeni repertoar lakog lanca imunoglobulina - Google Patents

Miševi koji eksprimiraju ograničeni repertoar lakog lanca imunoglobulina

Info

Publication number
RS64185B1
RS64185B1 RS20230350A RSP20230350A RS64185B1 RS 64185 B1 RS64185 B1 RS 64185B1 RS 20230350 A RS20230350 A RS 20230350A RS P20230350 A RSP20230350 A RS P20230350A RS 64185 B1 RS64185 B1 RS 64185B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
light chain
mouse
immunoglobulin
gene
Prior art date
Application number
RS20230350A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Babb
John Mcwhirter
Lynn Macdonald
Sean Stevens
Samuel Davis
David R Buckler
Karolina A Meagher
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US13/798,455 external-priority patent/US9796788B2/en
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS64185B1 publication Critical patent/RS64185B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST
[0001] Korišćen je genetski modifikovani miš koji izražava antitela koja imaju zajednički humani varijabilni/mišji ili pacovski konstantni laki lanac povezan sa različitim humanim varijabilnim/ mišjim konstantnim teškim lancima. Obezbeđen je postupak za izradu humanog bispecifičnog antitela iz genskih sekvenci humanog varijabilnog regiona B ćelija miša.
POZADINA
[0002] Antitela tipično sadrže homodimernu komponentu teškog lanca, gde je svaki monomer teškog lanca povezan sa identičnim lakim lancem. Antitela koja imaju heterodimernu komponentu teškog lanca (npr. bispecifična antitela) su poželjna kao terapeutska antitela. Međutim, izrada bispecifičnih antitela koja imaju pogodnu komponentu lakog lanca koja se može zadovoljavajuće povezati sa svakim od teških lanaca bispecifičnog antitela se pokazala problematičnom.
[0003] U jednom pristupu, laki lanac može biti izabran pregledom statističkih podataka o upotrebi za sve varijabilne domene lakog lanca, identifikujući najčešće korišćeni laki lanac u humanim antitelima, i in vitro uparivanje tog lakog lanca sa dva teška lanca različite specifičnosti.
[0004] U drugom pristupu, laki lanac može biti izabran posmatranjem sekvenci lakog lanca u biblioteci prikaza faga (npr. biblioteka prikaza faga koja sadrži sekvence varijabilnog regiona humanog lakog lanca, na primer, humana scFv biblioteka) i odabiranje najčešće korišćenog varijabilnog regiona lakog lanca iz biblioteke. Laki lanac se zatim može ispitati na dva različita teška lanca od interesa.
[0005] U drugom pristupu, laki lanac može biti izabran ispitivanjem biblioteke za prikazivanje faga od varijabilnih sekvenci lakog lanca, korišćenjem kao proba varijabilnih sekvenci teškog lanca za oba teška lanca od interesa. Laki lanac koji se udružuje sa varijabilnim sekvencama oba teška lanca, može biti izabran kao laki lanac za teške lance.
[0006] U drugom pristupu, kandidatski laki lanac može biti poravnat sa srodnim lakim lancima teških lanaca, a modifikacije su napravljene u lakom lancu kako bi se bliže podudarale karakteristike sekvence zajedničke za srodne lake lance oba teška lanca. Ako je potrebno da se slučajevi imunogenosti svedu na minimum, poželjno je da modifikacije rezultiraju sekvencama koje su prisutne u poznatim sekvencama humanog lakog lanca, tako da je malo verovatno da će proteolitička obrada generisati jedan T ćelijski epitop na osnovu parametara i metoda poznatih u struci za procenu verovatnoće imunogenosti (tj. in silico kao i vlažne analize).
[0007] Svi gore navedeni pristupi se oslanjaju na in vitro metode koje uključuju brojna a priori ograničenja, npr. identičnost sekvence, sposobnost povezivanja sa specifičnim prethodno odabranim teškim lancima, itd. Postoji potreba u struci za kompozicijama i metodama koje se ne oslanjaju na manipulisanje in vitro uslovima, ali koje umesto toga više angažuju biološki osetljive pristupe za izradu humanih proteina za vezivanje epitopa koji uključuju zajednički laki lanac.
KRATAK OPIS
[0008] U sadašnjem pronalasku su korišćeni genetski modifikovani miševi koji izražavaju varijabilne domene teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina, pri čemu miševi imaju ograničen varijabilni repertoar lakog lanca.
[0009] Sadašnji pronalazak obezbeđuje postupak za generisanje sekvence varijabilnog regiona teškog i/ili kapa lakog lanca humanog imunoglobulina koji obuhvata korake:
(a) imunizacije genetski modifikovanog miša sa antigenom, pri čemu genetski modifikovani miš generiše antitela kada se imunizuje sa antigenom, i gde genetski modifikovani miš ima genom germinativne linije koji sadrži:
(i) dva Vκ genska segmenta humanog imunoglobulina i pet Jκ genskih segmenata humanog imunoglobulina operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša ili pacova, gde su dva humana Vκ genska segmenta imunoglobulina humani Vκ1-39 i humani Vκ3-20, i pet humanih Jκ genskih segmenata imunoglobulina su humani Jκ1, humani Jκ2, humani Jκ3, humani Jκ4, i humani Jκ5; i (ii) jedan ili više nepreuređenih humanih VHgenskih segmenata imunoglobulina, jedan ili više nepreuređenih humanih DHgenskih segmenata imunoglobulina, i jedan ili više nepreuređenih JHgenskih segmenata humanog imunoglobulina operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša;
gde su nepreuređeni genski segmenti humanog teškog lanca i nepreuređeni genski segmenti humanog kapa lakog lanca miša u stanju da se preuređuju i kodiraju varijabilne domene humanog teškog lanca i varijabilne domene humanog kapa lakog lanca, tim redom, antitela, i gde miš ne sadrži endogeni Vκ genski segment koji je u stanju da se preuređuje da bi obrazovao sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, i
(b) određivanje sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i/ili kapa lakog lanca humanog imunoglobulina koja kodira varijabilni domen teškog i lakog lanca humanog imunoglobulina, tim redom, antitela koje se specifično vezuje za antigen i koje je generisano od strane genetski modifikovanog miša.
[0010] Sadašnji pronalazak dalje obezbeđuje postupak za generisanje sekvence varijabilnog domena teškog i/ili kapa lakog lanca humanog imunoglobulina koji obuhvata korake:
(a) imunizacije genetski modifikovanog miša sa antigenom od interesa, gde genetski modifikovani miš sadrži u svom genomu germinativne linije:
(i) tačno dva nepreuređena V к genska segmenta humanog imunoglobulina i pet nepreuređenih J к genskih segmenata humanog imunoglobulina operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša na endogenim lokusima kapa lakog lanca miša, gde su dva nepreuređena V к genska segmenta humanog imunoglobulina humani V к1-39 genski segment i humani V к3-20 genski segment, i pet nepreuređenih Jκ genskih segmenata humanog imunoglobulina su humani Jκ1, humani Jκ2, humani Jκ3, humani Jκ4, i humani Jκ5; i
(ii) jedan ili više nepreuređenih VHgenskih segmenata humanog imunoglobulina, jedan ili više nepreuređenih DHgenskih segmenata humanog imunoglobulina, i jedan ili više nepreuređenih JHgenskih segmenata humanog imunoglobulina operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša na endogenim lokusima teškog lanca miša;
gde su nepreuređeni genski segmenti teškog lanca i kapa lakog lanca humanog imunoglobulina genetski modifikovanog miša u stanju da se preuređuju i kodiraju varijabilne domene humanog teškog lanca i varijabilne domene humanog kapa lakog lanca, tim redom, antitela, i gde genetski modifikovani miš ne sadrži V к ili Jκ genske segmente endogenog imunoglobulina koji su u stanju da se preuređuju da bi obrazovali sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina; i
(b) određivanje sekvence varijabilnog domena teškog i/ili kapa lakog lanca humanog imunoglobulina antitela koje se specifično vezuje za antigen i koje je dobijeno od genetski modifikovanog miša.
[0011] Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje postupak za izradu antitela koji obuhvata: (1) eksprimiranje u pojedinačnoj ćeliji:
(a) prve sekvence nukleinske kiseline koja kodira prvi teški lanac imunoglobulina, pri čemu prva sekvenca nukleinske kiseline sadrži prvu sekvencu varijabilnog regiona humanog imunoglobulina operativno vezanu za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina, gde je prva sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina dobijena iz B ćelija genetski modifikovanog miša, gde je genetski modifikovani miš imunizovan sa prvim antigenom od interesa i genetski modifikovani miš sadržu u svom genomu germinativne linije:
(i) dva nepreuređena humana V к genska segmenta i pet nepreuređenih humanih J к genskih segmenata operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona lakog lanca, gde su dva nepreuređena humana V к genska segmenta humani V к1-39 genski segment i humani V к3-20 genski segment, i gde su pet nepreuređenih humanih J к genskih segmenata humani J к1 genski segment, humani J к2 genski segment, humani J к3 genski segment, humani J к4 genski segment, i humani J к5 genski segment; i (ii) jedan ili dva nepreuređena humana VHgenska segmenta, jedan ili više nepreuređenih humanih DHgenskih segmenata, i jedan ili više nepreuređenih humanih JHgenskih segmenata operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca miša;
gde su nepreuređeni genski segmenti humanog teškog lanca i nepreuređeni genski segmenti humanog kapa lakog lanca genetski modifikovanog miša u stanju da se preuređuju i kodiraju varijabilne domene humanog teškog lanca i varijabilne domene humanog kapa lakog lanca antitela, tim redom;
gde genetski modifikovani miš ne sadrži endogeni V к genski segment koji je u stanju da se preuređuje da bi obrazovao sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca; i
gde prva sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca kodira prvi varijabilni domen humanog teškog lanca koji, sa varijabilnim domenom kapa lakog lanca, prepoznaje prvi antigen; i
(b) druga sekvenca nukleinske kiseline koja kodira laki lanac imunoglobulina, druga sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu varijabilnog regiona humanog kapa lakog lanca operativno vezanu za sekvencu konstantnog regiona humanog lakog lanca, gde sekvenca varijabilnog regiona humanog kapa lakog lanca sadrži: humani V к1-39 genski segment, humani V к3-20 genski segment, ili njihovu somatski hipermutiranu verziju;
(2) održavanje ćelije pod uslovima dovoljnim da eksprimira potpuno humano antitelo; i (3) izolovanje antitela. Takođe se odnosi na biološki sistem za generisanje varijabilnog domena humanog lakog lanca koji se povezuje i eksprimira sa raznovrsnim repertoarom afinitetno sazrelih varijabilnih domena humanog teškog lanca. Takođe, odnosi se na postupke za izradu vezujućih proteina koji sadrže varijabilne domene imunoglobulina, koji obuhvataju imunizovane miševe koji imaju ograničeni repertoar imunoglobulinskog lakog lanca sa antigenom od interesa, i korišćenje genske sekvence varijabilnog regiona imunoglobulina iz miša u vezivnom proteinu koji specifično vezuje antigen od interesa. Metode uključuju postupke za izradu varijabilnih domena teškog lanca humanog imunoglobulina koji su pogodni za upotrebu u izradi multi-specifičnih antigen-vezujućih proteina.
[0012] Takođe se odnosi na genetski modifikovane miševe koji biraju pogodne afinitetno sazrele varijabilne domene humanog imunoglobulinskog teškog lanca, izvedene iz repertoara neuređenih genskih segmenata varijabilnog regiona humanog teškog lanca, pri čemu se afinitetno zreli varijabilni domeni humanog teškog lanca udružuju i eksprimiraju sa pojedinačnim varijabilnim domenom humanog lakog lanca izvedenog iz jednog genskog segmenta varijabilnog regiona humanog lakog lanca. Obezbeđeni su genetski modifikovani miševi koji predstavljaju izbor dva genska segmenta varijabilnog regiona humanog lakog lanca. Dva genska segmenta su humani V к1-39 i humani V к3-20.
[0013] Takođe se odnosi na genetski modifikovane miševe koji izražavaju ograničeni repertoar varijabilnih domena humanog lakog lanca, ili pojedinačni varijabilni domen humanog lakog lanca, iz ograničenog repertoara genskih segmenata varijabilnog regiona humanog lakog lanca. Miševi su genetski konstruisani da uključuju dva nepreuređena genska segmenta varijabilnog regiona humanog lakog lanca koji se reorganizuju tako da formiraju dva preuređena gena varijabilnog regiona lakog lanca koji eksprimiraju bilo koji ili oba od dva laka lanca. Preuređeni varijabilni domeni humanog lakog lanca su sposobni za uparivanja sa mnoštvom afinitetno sazrelih humanih teških lanaca izabranih od miša, pri čemu varijabilni regioni teškog lanca specifično vezuju različite epitope.
[0014] Takođe, određeni su genetski modifikovani miševi koji eksprimiraju ograničeni repertoar varijabilnih domena humanog lakog lanca, ili pojedinačni varijabilni domen humanog lakog lanca, iz ograničenog repertoara sekvenci varijabilnog regiona humanog lakog lanca. Takođe, određeni su miševi koji su genetski konstruisani da uključuju jednu sekvencu V / J humanog lakog lanca (ili dve V / J sekvence) koji eksprimiraju varijabilni region jednog lakog lanca (ili koji eksprimiraju bilo koji ili oba varijabilna regiona). Laki lanac koji sadrži varijabilnu sekvencu je sposoban za uparivanje sa mnoštvom humanih teških lanaca afinitetno sazrelih, klonalno odabranih od strane miševa, pri čemu varijabilni regioni teškog lanca specifično vezuju različite epitope.
[0015] Takođe, poziva se na genetski modifikovani miš koji sadrži pojedinačni genski segment varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina (VL) koji je sposoban da se reorganizuje sa humanim segmentom J gena (izabran iz jednog ili mnoštva JLsegmenata) i koji kodira humani VLdomen lakog lanca imunoglobulina. Genetski modifikovani miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži dva humana VLgenska segmenta, od kojih je svaki sposoban da se reorganizuje sa humanim J genskim segmentom (izabranim iz jednog ili mnoštva JLsegmenata) i koji kodira humani VLdomen od lakog lanca imunoglobulina. U nekim primerima, dva humana VLgenska segmenta su suprotstavljena u genomu miša. U nekim primerima dva humana VLgenska segmenta su na različitim lokusima (npr. heterozigota, koji sadrži prvi humani VLsegment na prvom alelu lakog lanca, i drugi humani VLsegment na drugom alelu lakog lanca, gde prvi i drugi humani VLsegmenti nisu identični) u genomu miša. Dva humana VLgenska segmenta su humani V к1 -39 genski segment i humani V к3-20 genski segment. Humani JLgen su humani J к1, J к2, J к3, J к4, J к5. Genetski modifikovani miš korišćen u pronalasku ne sadrži V к genski segment koji je u stanju da se preuređuje tako da obrazuje sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca. Na primer, u nekim izvođenjima, korišćeni genetski modifikovani miš sadrži genetsku modifikaciju koja inaktivira i / ili uklanja deo ili čitav endogeni VLgenski segment.
[0016] Izbrisan
[0017] Takođe je obezbeđen genetski modifikovani miš koji sadrži lokus lakog lanca imunoglobulina koji ne sadrži endogeni mišji genski segment VLkoji je sposoban za preuređivanje tako da obrazuje gen lakog lanca imunoglobulina, gde VLlokus sadrži jedan genski segment humanog VLkoji je sposoban za preuređivanje da kodira VLregion gena lakog lanca. U specifičnim primerima, humani VLgenski segment je humani V к1-39J к5 genski segment ili humani V к3-20J к1 genski segment. Takođe je određen genetski modifikovani miš koji sadrži VLlokus koji ne sadrži endogeni mišji VLgenski segment koji je sposoban da se reorganizuje da obrazuje gen lakog lanca imunoglobulina, pri čemu VLlokus ne sadrži više od dva humana VLgenska segmenta koji su sposobni za preuređivanje da kodiraju VLregion gena lakog lanca. Ne više od dva humana VLgenska segmenta su izabrana iz grupe koja se sastoji od humanog V к1-39 genskog segmenta, humanog V к3-20 genskog segmenta i njihove kombinacije. U nekim određenim primerima, ne više od dva humana VLgenska segmenta su humani V к1-39J к5 genski segment i humani V к3-20J к1 genski segment.
[0018] Takođe je obezbeđen genetski modifikovani miš koji sadrži pojedinačni preuređeni (V / J) varijabilni region humanog imunoglobulinskog lakog lanca (VL) (tj. VL/ JLregion) koji kodira humani VLdomen lakog lanca imunoglobulina. U drugom primeru, miš ne sadrži više od dva preuređena humana VLregiona koja su sposobna da kodiraju humani VLdomen lakog lanca imunoglobulina.
[0019] U jednom primeru, VLregion je preuređena humana sekvenca V к1-39 / J ili preuređena humana sekvenca V к3-20 / J. U jednom primeru, humani JLsegment preuređene VL/ JLsekvence je izabran od J к1, J к2, J к3, J к4, J к5. U specifičnom primeru, VLregion je humana sekvenca V к1-39J к5 ili humana sekvenca V к3-20J к1. Obezbeđeni miš ima i humanu sekvencu V к1-39J к5 i humanu sekvencu V к3-20J к1.
[0020] U jednoj realizaciji, humani VLgenski segment je operativno povezan sa humanom ili mišjom vodećom sekvencom. U jednom izvođenju, vodeća sekvenca je mišja vodeća sekvenca. U specifičnoj realizaciji, mišja vodeća sekvenca je mišja V к3-7 vodeća sekvenca. U specifičnoj realizaciji, vodeća sekvenca je operativno povezana sa neuređenim humanim VLgenskim segmentom.
[0021] U jednoj realizaciji, segment VLgena je operativno povezan sa sekvencom imunoglobulinskog promotera. U jednoj realizaciji, promoterska sekvenca je humana promoterska sekvenca. U specifičnoj realizaciji, promoter humanog imunoglobulina je humani V к3-15 promoter. U specifičnoj realizaciji, promoter je operativno vezan za neuređeni segment humanog VLgena.
[0022] U jednoj realizaciji, položaj lakog lanca sadrži vodeću sekvencu okruženu 5' (u odnosu na transkripcioni pravac VLgenskog segmenta) sa humanim imunoglobulinskim promoterom i okruženu 3' sa humanim VLgenskim segmentom koji se rearanžira sa humanim J segmentom i kodira VLdomen reverznog himernog lakog lanca koji sadrži endogeni konstantni region lakog lanca miša (CL). U specifičnoj realizaciji, VLgenski segment je na položaju V к miša, a mišji CLje mišji CK.
[0023] U jednom primeru, lokus lakog lanca sadrži vodeću sekvencu koja je okružena 5' (u odnosu na transkripcioni pravac VLgenskog segmenta) sa humanim imunoglobulinskim promoterom i okružena 3' sa preuređenim humanim VLregionom (VL/ JLsekvenca) i kodira VLdomen reverznog himernog lakog lanca koji sadrži endogeni konstantni region lakog lanca miša (CL). U specifičnom primeru, reorganizovana humana VL/ JLsekvenca je na mišjem lokusu kapa ( к), a mišji CL je mišji C к.
[0024] U jednoj realizaciji, VLlokus modifikovanog miša je lokus lakog lanca к, a lokus lakog lanca к sadrži jedan mišji к intronski inhenser, jedan mišji κ 3' inhenser, ili oba, intronski inhenser i 3' inhenser.
[0025] U jednoj realizaciji, u pronalasku korišćeni miš sadrži nefunkcionalni lokus imunoglobulinskog lakog lanca lambda (λ). U specifičnoj realizaciji, lokus lakog lanca λ sadrži deleciju jedne ili više sekvenci lokusa, pri čemu jedna ili više delecija čini lokus lakog lanca λ nesposobnim za reorganizovanje da obrazuje gen lakog lanca. U sledećoj realizaciji, obrisani su svi ili suštinski svi VLgenski segmenti lokusa lakog lanca λ.
[0026] U jednoj realizaciji, u pronalasku korišćeni miš pravi laki lanac koji sadrži somatski mutirani VLdomen izveden iz humanog VLgenskog segmenta. U jednoj realizaciji, laki lanac sadrži somatski mutirani VLdomen izveden iz humanog VLgenskog segmenta i mišji C к region. U jednoj realizaciji, miš ne eksprimira laki lanac λ.
[0027] U jednoj realizaciji, korišćeni genetski modifikovani miš je sposoban da somatski hipermutira sekvencu humanog VLregiona. U specifičnoj realizaciji, korišćeni miš sadrži ćeliju koja sadrži gen preuređenog lakog lanca imunoglobulina izveden iz humanog VLgenskog segmenta koji je sposoban da se reorganizuje i kodira VLdomen, a gen preuređenog imunoglobulinskog lakog lanca sadrži somatski mutirani VLdomen.
[0028] U jednoj realizaciji, u pronalasku korišćeni miš sadrži ćeliju koja eksprimira laki lanac koji sadrži somatski mutirani humani VLdomen povezan sa mišjim C к, pri čemu se laki lanac povezuje sa teškim lancem koji sadrži somatski mutirani VHdomen izveden iz humanog VHgenskog segmenta i gde teški lanac sadrži konstantni region teškog lanca miša (CH). U specifičnoj realizaciji, teški lanac sadrži mišji CH1, mišju šarku, mišji CH2 i mišji CH3. U specifičnoj realizaciji, teški lanac sadrži humani CH1, šarku, mišji CH2 i mišji CH3.
[0029] Korišćeni miš sadrži jedan ili više nepreuređenih humanih imunoglobulinskih VHgenskih segmenata, jedan ili više nepreuređenih humanih imunoglobulinskih DHgenskih segmenata, i jedan ili više nepreuređenih humanih imunoglobulinskih JHgenskih segmenata operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša. U jednoj realizaciji, miš sadrži zamenu endogenih mišjih VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VHgenskih segmenata, pri čemu su humani VHgenski segmenti operativno povezani sa mišjim genom CHregiona, tako da miš reorganizuje humane VHgenske segmente i eksprimira reverzni himerni imunoglobulinski teški lanac koji sadrži humani VHdomen i mišji CH. U jednoj realizaciji, zamenjeno je 90-100% neuređenih mišjih VHgenskih segmenata sa najmanje jednim neuređenim humanim VHgenskim segmentom. U specifičnoj realizaciji, svi ili suštinski svi endogeni mišji VHgenski segmenti su zamenjeni sa najmanje jednim neuređenim humanim VHgenskim segmentom. U jednoj realizaciji, zamena je sa najmanje 19, najmanje 39, ili najmanje 80 ili 81 neuređenih humanih VHgenskih segmenata. U jednoj realizaciji, zamena je sa najmanje 12 funkcionalnih nereorganizovanih humanih VHgenskih segmenata, najmanje 25 funkcionalnih nereorganizovanih humanih VHgenskih segmenata, ili najmanje 43 funkcionalnih nereorganizovanih humanih VHgenskih segmenta. U jednoj realizaciji, miš sadrži zamenu svih mišjih DHi JHsegmenta sa najmanje jednim neuređenim humanim DHsegmentom i najmanje jednim neuređenim humanim JHsegmentom. U jednoj realizaciji, najmanje jedan nereorganizovani humani DHsegment je izabran od 1-1, D1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27 i njihove kombinacije. U jednoj realizaciji, najmanje jedan nereorganizovani humani JHsegment je izabran od 1, 2, 3, 4, 5, 6 i njihove kombinacije. U specifičnoj realizaciji, jedan ili više humanih VHgenskih segmenata je izabrano od 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, 6-1 humanih VHgenskih segmenata i njihove kombinacije.
[0030] U jednoj realizaciji, korišćeni miš sadrži B ćeliju koja eksprimira vezivni protein koji specifično vezuje antigen od interesa, pri čemu vezivni protein sadrži laki lanac izveden iz reorganizovanja humanog V к1-39/J к5 ili reorganizovanja humanog V к3-20/J к1 i gde ćelija sadrži gen preuređenog teškog lanca imunoglobulina izveden iz preuređivanja humanih VHgenskih segmenata, odabranih od 1-69, 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, 4-59 i 5-51 segmenta gena. U jednoj realizaciji, jedan ili više humanih VHgenskih segmenata je preuređeno sa JHgenskim segmentom humanog teškog lanca izabranim od 1, 2, 3, 4, 5 i 6. U jednoj realizaciji, jedan ili više humanih VHi JHgenskih segmenata je preuređeno sa humanim DHgenskim segmentom izabranim od 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13 i 7-27. U specifičnoj realizaciji, gen lakog lanca ima 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više somatskih hipermutacija.
[0031] U jednoj realizaciji, korišćeni miš sadrži B ćeliju koja sadrži sekvencu gena preuređenog varijabilnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži VH/ DH/ JHregion, izabran od 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/ 4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/3, 3-30/3-3/4 , 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/ 6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-
1
59/3-22/3, 5-51/3-16/6, 5-51 /5-5/3, 5-51/6-13/5, 3-53/1-1/4, 1-69/6-6/5 i 1-69/6-13/4. U specifičnoj realizaciji, B ćelija eksprimira vezivni protein koji sadrži varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina fuzionisan sa konstantnim regionom mišjeg teškog lanca i varijabilni region lakog lanca humanog imunoglobulina fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca miša.
[0032] U jednoj realizaciji, preuređeni humani VLregion je humana V к1-39J к5 sekvenca, a miš eksprimira reverzni himerni laki lanac koji sadrži (i) jedan VLdomen izveden iz humane VL/ JLsekvence i (ii) jedan mišji CL; gde je laki lanac povezan sa reverznim himernim teškim lancem koji sadrži (i) jedan mišji CHi (ii) jedan somatski mutirani humani VHdomen izveden iz humanog VHgenskog segmenta izabranog od 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, jednog 6-1 humanog VHgenskog segmenta i njihove kombinacije. U jednoj realizaciji, miš eksprimira laki lanac koji je somatski mutiran. U jednoj realizaciji CLje jedan mišji C к. U specifičnoj realizaciji, humani VHgenski segment je izabran od 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 4-59, 5-51 i 1-69 genskog segmenta. U specifičnoj realizaciji, somatski mutirani humani VHdomen sadrži sekvencu izvedenu iz DHsegmenta izabranog od 1-1, 1-7, 2-8, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13 i 7-27. U specifičnoj realizaciji, somatski mutirani humani VHdomen sadrži sekvencu izvedenu iz JHsegmenta izabranog od 1, 2, 3, 4, 5 i 6. U specifičnoj realizaciji, somatski mutirani humani VHdomen je kodiran od strane preuređene humane VH/DH/JHsekvence izabrane od 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/ 4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/5-5/3, 1-69/6-6/5 i 1-69/6-13/4.
[0033] U jednoj realizaciji, preuređeni humani VLregion je humana V к3-20J к1 sekvenca, a miš eksprimira reverzni himerni laki lanac koji sadrži (i) jedan VLdomen izveden iz preuređene humane VL/ JLsekvence, i (ii) jedan mišji CL; gde je laki lanac povezan sa reverznim himernim teškim lancem koji sadrži (i) jedan mišji CH, i (ii) jedan somatski mutirani humani VHdobijen iz humanog VHgenskog segmenta izabranog od 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, jednog 6-1 humanog VHgenskog segmenta i njihove kombinacije. U jednoj realizaciji, miš eksprimira laki lanac koji je somatski mutiran. U jednoj realizaciji CLje mišji C к. U specifičnoj realizaciji, humani VHgenski segment je izabran od 3-30, 3-33, 3-53, 4-39 i 5-51 genskog segmenta. U specifičnoj realizaciji, somatski mutirani humani VHdomen sadrži sekvencu izvedenu iz DHsegmenta izabranog od 1-1, 1-7, 1-26, 2-15, 3-3, 3-16 i 6-13. U specifičnoj realizaciji, somatski mutirani humani VHdomen sadrži sekvencu izvedenu iz JHsegmenta izabranog od 3, 4, 5 i 6. U specifičnoj realizaciji, somatski mutirani humani VHdomen je kodiran od strane preuređene humane VH/DH/JHsekvence izabrane od 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/3, 3-33/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39 /1-26/3, 5-51/3-16/6, 5-51/6-13/5 i 3-53/1-1/4.
[0034] Takođe se odnosi na miša koji obuhvata i preuređenu humanu sekvencu V к1-39J к5 i preuređenu humanu sekvencu V к3-20J к1, a miš eksprimira reverzni himerni laki lanac koji sadrži (i) jedan VLdomen izveden iz humane sekvence V1-39J к5 ili humane sekvence V к3-20J к1, i (ii) jedan mišji CL; gde je laki lanac povezan sa reverznim himernim teškim lancem koji sadrži (i) jedan mišji CH, i (ii) jedan somatski mutirani humani VHdobijen iz humanog VHgenskog segmenta izabranog od 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, jednog 6-1 humanog VHgenskog segmenta, i njihove kombinacije. U jednom primeru, miš eksprimira laki lanac koji je somatski mutiran. U jednom primeru, CLje mišji C к.
[0035] U jednoj realizaciji, 90-100% endogenih neuređenih mišjih VHgenskih segmenata je zamenjeno sa najmanje jednim neuređenim humanim VHgenskim segmentom. U specifičnoj realizaciji, svi ili suštinski svi endogeni, neuređeni VHgenski segmenti miša su zamenjeni sa najmanje jednim neuređenim humanim VHgenskim segmentom. U jednoj realizaciji, zamena je sa najmanje 18, najmanje 39, najmanje 80, ili 81 ne nereorganizovanih humanih VHgenskih segmenata. U jednoj realizaciji, zamena je sa najmanje 12 funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata, najmanje 25 funkcionalnih neuređenih humanih VHgenskih segmenata, ili najmanje 43 neuređenih humanih VHgenskih segmenata.
[0036] U jednoj realizaciji, korišćeni genetski modifikovani miš je soja C57BL, u specifičnoj realizaciji izabran od C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. U specifičnoj realizaciji, genetski modifikovani miš je mešavina prethodno pomenutog soja 129 i prethodno pomenutog soja C57BL/6. U sledećoj specifičnoj realizaciji, miš je mešavina prethodno pomenutih sojeva 129, ili mešavina prethodno pomenutih sojeva BL/6. U specifičnoj realizaciji, soj 129 od mešavine je soj 129S6 (129/SvEvTac).
[0037] Takođe je opisan miš koji eksprimira reverzno himerno antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži mišji C к i somatski mutirani humani VLdomen izveden iz sekvence preuređenog humanogV к1-39J к5 ili sekvence preuređenog humanog V к3-20J к1, i teški lanac koji sadrži mišji CHi somatski mutirani humani VHdomen izveden iz humanog VHgenskog segmenta, izabranog od 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, i jednog 6-1 humanog VHgenskog segmenta, gde miš ne eksprimira potpuno mišje antitelo i ne eksprimira potpuno humano antitelo. U jednom primeru, miš sadrži lokus lakog lanca κ koji obuhvata zamenu endogenog mišjeg genskog segmenata lakog lanca κ sa rearanžiranom humanom sekvencom V к1-39J к5 ili rearanžiranom humanom sekvencom V к3-20J к1, a obuhvata zamenu svih ili u suštini svih endogenih mišjih VHgenskih segmenata sa kompletnim ili u suštini kompletnim repertoarom humanih VHgenskih segmenata.
[0038] Takođe je opisana populacija antigen-specifičnih antitela dobijenih od miša, kao što je ovde opisano, gde antitela sadrže gen lakog lanca izveden iz preuređivanja humanog V к1-39/J к5 ili preuređivanja humanog V к3-20/J к1, i pri čemu antitela sadrže gen preuređenog teškog lanca imunoglobulina, izveden iz preuređivanja humanog VHgenskog segmenta odabranog od 1-2, 1-3, 1-8, 1-18, 1-24, 1-46, 1-58, 1-69, 2-5, 2-26, 2-70, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33, 3-43, 3-48, 3-53, 3-64, 3-72, 3-73, 4-31, 4-34, 4-39, 4-59, 5-51, i jednog 6-1 humanog VHgenskog segmenta. U jednom primeru, jedan ili više humanih VHgenskih segmenata je preuređeno sa genskim segmentom humanog teškog lanca JHizabranog od 1, 2, 3, 4, 5 i 6. U specifičnom primeru, laki lanac ima 1, 2, 3, 4 ili 5 ili više somatskih hipermutacija.
[0039] U jednom primeru, laki lanac ima 1, 2, 3 ili 4 somatske hipermutacije. U jednom primeru, gen lakog lanca ima 1 ili 2 mutacije. U različitim primerima, gen lakog lanca je sposoban za nastajanje višestrukih mutacija duž njegove sekvence.
[0040] U jednom primeru, laki lanac je izveden iz preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i laki lanac ima najmanje jednu ili ne više od četiri somatske hipermutacije. U jednom primeru, laki lanac sadrži najmanje dve somatske hipermutacije. U jednom primeru, laki lanac sadrži najmanje tri somatske hipermutacije. U jednom primeru, laki lanac sadrži najmanje četiri somatske hipermutacije. U specifičnom primeru, najmanje jedna takva somatska hipermutacija je prisutna u jednom ili više okvirnih regiona (FWs) lakog lanca. U specifičnom primeru, najmanje jedna takva somatska hipermutacija je prisutna u jednom ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) lakog lanca. U specifičnom primeru, najmanje jedna takva somatska hipermutacija je prisutna u jednom ili više FW i / ili jednom ili više CDR regiona lakog lanca. U različitim primerima, okvirni regioni su izabrani iz okvira 1 (FW1),
1
okvira 2 (FW2), okvira 3 (FW3), i / ili njihove kombinacije. U različitim primerima, CDR regioni su odabrani od CDR1, CDR2, CDR3 i / ili njihove kombinacije.
[0041] U jednom primeru, teški lanac sadrži najmanje jednu mutaciju u jednom ili više FW-a ili jednom ili više CDR-a. U jednom primeru, teški lanac sadrži najmanje jednu mutaciju u jednom ili više FW-a i jednom ili više CDR regiona. U jednom primeru, teški lanac sadrži najmanje dve mutacije u jednom ili više FW-a i jednom ili više CDR regiona. U jednom primeru, teški lanac sadrži najmanje tri mutacije u jednom ili više FW-a i jednom ili više CDR-a. U jednom primeru, teški lanac sadrži najmanje četiri mutacije u jednom ili više FW-a i jednom ili više CDR-a. U jednom primeru, teški lanac sadrži najmanje pet ili više od pet mutacija u jednom ili više FW-a i jednom ili više CDR-a; u specifičnom primeru, teški lanac sadrži najmanje pet ili više od pet mutacija u dva FW-a; u specifičnom primeru, teški lanac sadrži najmanje pet ili više od pet mutacija u jednom FW i jednom CDR-u.
[0042] U jednom primeru, laki lanac je izveden iz preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 9% lakih lanaca izvedenih iz V к1-39/J к5 ima najmanje jednu mutaciju prisutnu u FW1; u jednom primeru, najmanje 9% lakih lanaca sadrži jednu mutaciju prisutnu u FW1. U jednom primeru, laki lanac je izveden iz preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 25% lakih lanaca izvedenih iz V к1-39/J к5 ima najmanje jednu ili ne više od dve mutacije prisutne u CDR1; u jednom primeru, najmanje 19% lakih lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u CDR1; u jednom primeru, najmanje 5% lakih lanaca ima dve mutacije prisutne u CDR1.
[0043] U jednom primeru, laki lanac je izveden iz preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 20% lakih lanaca izvedenih iz V к1-39/J к5 ima najmanje jednu ili ne više od tri mutacije prisutne u FW2; u jednom primeru, najmanje 17% lakih lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u FW2; u jednom primeru, najmanje 1% lakih lanaca ima dve mutacije prisutne u FW2; u jednom primeru, najmanje 1% lakih lanaca ima tri mutacije prisutne u FW2.
[0044] U jednom primeru, laki lanac je izveden iz preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 10% lakih lanaca izvedenih iz V к1-39/J к5 ima najmanje jednu ili ne više od dve mutacije prisutne u CDR2; u jednom primeru, najmanje 10% lakih lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u CDR2; u jednom primeru, najmanje 1% lakih lanaca ima dve mutacije prisutne u CDR2.
[0045] U jednom primeru, laki lanac je izveden iz preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 29% lakih lanaca izvedenih iz V к1-39/J к5 ima najmanje jednu ili ne više od četiri mutacije prisutne u FW3; u jednom primeru, najmanje 21% lakih lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u FW3; u jednom primeru, najmanje 5% lakih lanaca ima dve mutacije prisutne u FW3; u jednom primeru, najmanje 2% lakih lanaca ima tri mutacije prisutne u FW3; u jednom primeru, najmanje 2% lakih lanaca imaju četiri mutacije prisutne u FW3.
[0046] U jednom primeru, laki lanac je izveden iz preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 37% lakih lanaca izvedenih iz V к1-39/J к5 ima najmanje jednu ili ne više od četiri mutacije prisutne u CDR3; u jednoj primeru, najmanje 27% lakih lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u CDR3; u jednom primeru, najmanje 8% lakih lanaca ima dve mutacije prisutne u CDR3; u jednom primeru, najmanje 1% lakih lanaca ima tri mutacije prisutne u CDR3; u jednom primeru, najmanje 1% lakih lanaca ima četiri mutacije prisutne u CDR3.
[0047] Takođe je opisana populacija antigen-specifičnih antitela dobijenih od miša, kao što je ovde opisano, gde antitela sadrže laki lanac izveden od preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 9% lakih lanaca izvedenih od V к1-39/J к5 ima jednu ili više mutacija prisutnih u FW1, oko 25% lakih lanaca izvedenih iz V к1-39/J к5 ima jednu ili više mutacija prisutnih u CDR1, oko 20% lakih lanaca izvedenih iz V к1-39/J к5 ima jednu ili više mutacija prisutnih u FW2, oko 10% V к1-39/J к5-izvedenih lakih lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u CDR2, oko 29% lakih lanaca izvedenih iz V к1-39/J к5 ima jednu ili više mutacija prisutnih u FW3, i oko 37% lakih lanaca izvedenih iz V к1-39/J к5 ima jednu ili više mutacija prisutnih u CDR3.
[0048] U jednom primeru, laki lanac je izveden iz humanog V к1-39/J к5 preuređivanja i oko 35% teških lanaca ima najmanje jednu mutaciju prisutnu u FW1; u jednom primeru, najmanje 25% teških lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u FW1; u jednom primeru, najmanje 9% teških lanaca ima dve mutacije prisutne u FW1; u jednom primeru, najmanje 1% teških lanaca ima tri mutacije prisutne u FW1; u jednom primeru, najmanje 1% teških lanaca ima više od pet mutacija prisutnih u FW1.
[0049] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 92% teških lanaca ima najmanje jednu ili ne više od četiri mutacije prisutne u CDR1; u jednom primeru, najmanje 92% teških lanaca ima najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, ili najmanje četiri mutacije prisutne u CDR1; u jednom primeru, najmanje 26% teških lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u CDR1; u jednom primeru, najmanje 44% teških lanaca ima dve mutacije prisutne u CDR1; u jednom primeru, najmanje 19% teških lanaca ima tri mutacije prisutne u CDR1; u jednom primeru, najmanje 3% teških lanaca ima četiri mutacije prisutne u CDR1.
[0050] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 66% teških lanaca ima najmanje jednu ili ne više od tri mutacije prisutne u FW2; u jednom primeru, najmanje 66% teških lanaca ima najmanje jednu, najmanje dve, ili najmanje tri
1
mutacije prisutne u FW2; u jednom primeru, najmanje 35% teških lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u FW2; u jednom primeru, najmanje 23% teških lanaca ima dve mutacije prisutne u FW2; u jednom primeru, najmanje 8% teških lanaca ima tri mutacije prisutne u FW2.
[0051] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 70% teških lanaca ima najmanje jednu ili ne više od četiri mutacije prisutne u CDR2; u jednom primeru, najmanje 70% teških lanaca ima najmanje dve, najmanje tri, ili najmanje četiri mutacije prisutne u CDR2; u jednom primeru, najmanje 34% ima jednu mutaciju prisutnu u CDR2; u jednom primeru, najmanje 20% teških lanaca ima dve mutacije prisutne u CDR2; u jednom primeru, najmanje 12% teških lanaca ima tri mutacije prisutne u CDR2; u jednom primeru, najmanje 5% teških lanaca ima četiri mutacije prisutne u CDR2.
[0052] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 91% teških lanaca ima najmanje jednu ili do pet ili više mutacija prisutnih u FW3; u jednom primeru, najmanje 91% teških lanaca ima najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, ili najmanje pet ili više mutacija prisutnih u FW3; jednom primeru, najmanje 19% teških lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u FW3; u jednom primeru, najmanje 33% teških lanaca ima dve mutacije prisutne u FW3; u jednom primeru, najmanje 22% teških lanaca ima tri mutacije prisutne u FW3; u jednom primeru, najmanje 11% teških lanaca ima četiri mutacije prisutne u FW3; u jednom primeru, najmanje 7% teških lanaca ima pet ili više mutacija prisutnih u FW3.
[0053] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i oko 63% teških lanaca ima najmanje jednu ili ne više od dve mutacije prisutne u CDR3; u jednom primeru, najmanje 63% teških lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u CDR3; u jednom primeru, najmanje 54% teških lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u CDR3; u jednom primeru, najmanje 9% teških lanaca ima dve mutacije prisutne u CDR3.
[0054] Takođe je opisana populacija antigen-specifičnih antitela dobijenih od miša, kao što je ovde opisano, gde antitela sadrže laki lanac izveden od preuređivanja humanog V к1-39/J к5 i najmanje 35% teških lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u FW1, oko 92% teških lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u CDR1, oko 66% teških lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u FW2, oko 70% teških lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u CDR2, oko 91% teških lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u FW3, i oko 63% teških lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u CDR3.
[0055] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i gen lakog lanca ima najmanje jednu ili ne više od dve somatske hipermutacije; u jednom primeru, gen lakog lanca ima najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri ili više somatskih
1
hipermutacija. U specifičnom primeru, mutacije su prisutne u jednom ili više okvirnih regiona lakog lanca. U specifičnom primeru, mutacije su prisutne u jednom ili više CDR regiona lakog lanca. U specifičnom primeru, mutacije su prisutne u jednom ili više okvirnih regiona i / ili jednom ili više CDR regiona lakog lanca. U različitim primerima, okvirni regioni su izabrani iz okvira 1 (FW1), okvira 2 (FW2), okvira 3 (FW3) i / ili njihove kombinacije.
[0056] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i oko 10% od V к3-20/J к1-izvedenih lakih lanaca ima najmanje jednu mutaciju prisutnu u FW1; u jednom primeru, najmanje 10% lakih lanaca ima jednu mutaciju u FW1.
[0057] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i oko 53% lakih lanaca izvedenih od V к3-20/J к1 ima najmanje jednu ili ne više od dve mutacije prisutne u CDR1; u jednom primeru, najmanje 27% lakih lanaca ima jednu ili više mutacija u CDR1; u jednom primeru, oko 54% lakih lanaca ima jednu ili dve mutacije prisutne u CDR1.
[0058] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i oko 6% lakih lanaca izvedenih od V к3-20/J к1 ima najmanje jednu ili ne više od dve mutacije prisutne u FW2; u jednom primeru, najmanje 6% lakih lanaca ima najmanje jednu mutaciju prisutnu u FW2; u jednom primeru, najmanje 3% lakih lanaca ima jednu mutaciju prisutnu u FW2; u jednom primeru, najmanje 3% lakih lanaca ima dve mutacije prisutne u FW2.
[0059] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i najmanje oko 3% V к3-20/J к1-izvedenih lakih lanaca ima najmanje jednu mutaciju prisutnu u CDR2; u jednom primeru, najmanje 3% lakih lanaca ima jednu mutaciju u CDR2.
[0060] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i oko 17% ili više lakih lanaca izvedenih od V к3-20/J к1 ima najmanje jednu ili ne više od dve mutacije prisutne u FW3; u jednom primeru, najmanje 20% lakog lanca ima jednu mutaciju prisutnu u FW3; u jednom primeru, najmanje 17% lakih lanaca ima dve mutacije prisutne u FW3.
[0061] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i najmanje 43% lakih lanaca izvedenih od V к3-20/J к1 ima najmanje jednu mutaciju prisutnu u CDR3; u jednom primeru, najmanje 43% lakih lanaca ima jednu mutaciju u CDR3.
[0062] Takođe je opisana populacija antigen-specifičnih antitela dobijenih od miša, kao što je ovde opisano, gde antitela sadrže laki lanac izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i oko 10% od V к3-20/J к1-izvedenih lakih lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u najmanje, oko 53% lakih lanaca izvedenih iz V к3-20/J к1 ima jednu ili više mutacija prisutnih u CDR1, oko 6% lakih lanaca dobijenih od V к3-20/J к1 ima jednu ili više mutacija prisutnih u
1
FW2, oko 3% V к3-20/J к1-izvedenih lakih lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u CDR2, oko 37% lakih lanaca dobijenih od V к3-20/J к1 ima jednu ili više mutacija koje su prisutne u FW3, i oko 43% lakih lanaca dobijenih od V к3-20/J к1 ima jednu ili više mutacija prisutnih u CDR3.
[0063] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i oko 43% teških lanaca ima najmanje jednu ili ne više od dve mutacije prisutne u FW1; u jednom primeru, najmanje 41% teških lanaca ima najmanje jednu prisutnu mutaciju u FW1; u jednom primeru, oko 41% teških lanaca ima jednu prisutnu mutaciju u FW1; u jednom primeru, oko 2% teških lanaca ima dve prisutne mutacije u FW1.
[0064] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i oko 92% teških lanaca ima najmanje jednu ili ne više od četiri mutacije prisutne u CDR1; u jednom primeru, najmanje 43% teških lanaca ima najmanje jednu mutaciju prisutnu u CDR1; u jednom primeru najmanje 25% teških lanaca ima najmanje dve mutacije prisutne u CDR1; u jednom primeru, najmanje 15% teških lanaca ima najmanje 3 mutacije prisutne u CDR1; u jednom primeru, najmanje 10% teških lanaca ima 4 ili više mutacija prisutnih u CDR1.
[0065] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i oko 46% teških lanaca ima najmanje jednu ili ne više od tri mutacije prisutne u FW2; u jednom primeru, najmanje 34% teških lanaca ima najmanje jednu mutaciju prisutnu u FW2; u jednom primeru, najmanje 10% teških lanaca ima dve ili više mutacija prisutnih u FW2; u jednom primeru, najmanje 2% teških lanaca ima tri ili više mutacija prisutnih u FW2.
[0066] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i oko 84% teških lanaca ima najmanje jednu ili do pet ili više od pet mutacija prisutnih u CDR2; u jednom primeru, najmanje 39% teških lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u CDR2; u jednom primeru, najmanje 18% teških lanaca ima dve ili više mutacija prisutnih u CDR2; u jednom primeru, najmanje 21% teških lanaca ima tri ili više mutacija prisutnih u CDR2; u jednom primeru, najmanje 3% teških lanaca ima četiri ili više mutacija prisutnih u CDR2; u jednom primeru, najmanje 2% teških lanaca ima pet ili više mutacija prisutnih u CDR2.
[0067] U jednom primeru, laki lanac je izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i oko 92% teških lanaca ima najmanje jednu ili do pet ili više od pet mutacija prisutnih u FW3; u jednom primeru, najmanje 21% lakih lanaca ima najmanje jednu mutaciju prisutnu u FW3; u jednom primeru, najmanje 20% teških lanaca ima najmanje dve mutacije prisutne u FW3; u jednom primeru, najmanje 13% teških lanaca ima najmanje tri mutacije prisutne u FW3; u
1
jednom primeru, najmanje 20% teških lanaca ima najmanje četiri mutacije u FW3; u jednom primeru, najmanje 18% teških lanaca ima najmanje 5 mutacija u FW3.
[0068] U jednom primeru, laki lanac je dobijen reorganizovanjem humanog V к3-20/J к1 i oko 7% teških lanaca ima najmanje jednu prisutnu mutaciju u CDR3; u jednom primeru, oko 7% teških lanaca ima jednu mutaciju u CDR3.
[0069] Takođe je opisana populacija antigen-specifičnih antitela dobijenih od miša, kao što je ovde opisano, gde antitela sadrže laki lanac izveden od preuređivanja humanog V к3-20/J к1 i oko 43% teških lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u FW1, oko 92% teških lanaca imaju jednu ili više mutacija prisutnih u CDR1, oko 46% teških lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u FW2, oko 84% teških lanaca ima jednu ili više prisutnih mutacija u CDR2, oko 92% teških lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u FW3, i oko 7% teških lanaca ima jednu ili više mutacija prisutnih u CDR3.
[0070] Takođe se odnosi na miša koji eksprimira laki lanac imunoglobulina iz preuređene sekvence lakog lanca imunoglobulina, pri čemu je preuređena sekvenca lakog lanca imunoglobulina prisutna u germinativnoj liniji miša, pri čemu laki lanac imunoglobulina sadrži humanu varijabilnu sekvencu. U jednom primeru, germinativna linija miša sadrži preuređenu sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca koja je izvedena iz istog V segmenta i istog J segmenta kao i sve ne-surogatne sekvence lakog lanca prisutne u svakoj B ćeliji miša koje sadrže preuređenu sekvencu lakog lanca.
[0071] U jednoj realizaciji, germinativnoj liniji miša nedostaje funkcionalni genski segment nepreuređenog imunoglobulinskog lakog lanca V. U jednoj realizaciji, germinativnoj liniji miša nedostaje funkcionalni genski segment nepreuređenog imunoglobulinskog lakog lanca J.
[0072] U jednom primeru, germinativna linija miša ne sadrži više od jedne, više od dve, ili više od tri sekvence preuređenog (V / J) lakog lanca.
[0073] U jednom primeru, preuređena V / J sekvenca sadrži sekvencu lakog lanca κ. U specifičnom primeru, sekvenca lakog lanca κ je humana sekvenca lakog lanca κ. U specifičnom primeru, sekvenca lakog lanca κ je izabrana od humane sekvence Vκ1-39/J, humane sekvence Vκ3-20/J i njihove kombinacije. U specifičnom primeru, sekvenca lakog lanca κ je humana sekvenca Vκ1-39/Jκ5. U specifičnom primeru, sekvenca lakog lanca κ je humana Vκ3-20/Jκ1 sekvenca.
[0074] U jednoj realizaciji, korišćeni miš dalje sadrži u svojoj germinativnoj liniji sekvencu izabranu od mišjeg κ intronskog pojačivača 5' u odnosu na reorganizovanu sekvencu lakog lanca imunoglobulina, mišjeg κ 3' pojačivača i njihove kombinacije.
1
[0075] Korišćeni miš sadrži jedan ili više nepreuređenih humanih imunoglobulinskih VHgenskih segmenata, jedan ili više nepreuređenih humanih imunoglobulinskih DHgenskih segmenata, i jedan ili više nepreuređenih humanih imunoglobulinskih JHgenskih segmenata operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. U jednoj realizaciji, miš sadrži mnoštvo humanih VH, DHi JHgenskih segmenata. U specifičnoj realizaciji, humani VH, DHi JHgenski segmenti zamenjuju endogene mišje VH, DHi JHgenske segmente na endogenom lokusu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. U specifičnoj realizaciji, miš sadrži zamenu svih ili suštinski svih funkcionalnih mišjih VH, DHi JHgenskih segmenata sa svim ili suštinski svim funkcionalnim humanim VH, DHi JHgenskim segmentima.
[0076] U jednoj realizaciji, miš eksprimira laki lanac imunoglobulina koji sadrži konstantnu sekvencu miša. U jednoj realizaciji, miš eksprimira laki lanac imunoglobulina koji sadrži humanu konstantnu sekvencu.
[0077] U jednoj realizaciji, miš eksprimira teški lanac imunoglobulina koji sadrži mišju sekvencu izabranu od CH1 sekvence, sekvence šarke, CH2 sekvence, CH3 sekvence i njihove kombinacije.
[0078] U jednoj realizaciji, miš eksprimira teški lanac imunoglobulina koji sadrži humanu sekvencu izabranu od CH1 sekvence, sekvence šarke, CH2 sekvence, CH3 sekvence i njihove kombinacije.
[0079] U jednom primeru, preuređena sekvenca lakog lanca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša je na endogenom lokusu mišjeg imunoglobulinskog lakog lanca. U specifičnom primeru, preuređena sekvenca lakog lanca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša zamenjuje sve ili uglavnom sve mišje sekvence lakog lanca V i J na endogenom lokusu lakog lanca imunoglobulina miša.
[0080] Takođe se odnosi na miša koji sadrži populaciju B ćelija karakterisanu sa svakom B ćelijom koja sadrži sekvencu ne-surogatnog lakog lanca, čija sekvenca sadrži preuređeni gen lakog lanca koji je generisan iz jednog humanog genskog segmenta V i jednog humanog genskog segmenta J, gde je jedina varijabilna sekvenca lakog lanca u germinativnoj liniji miša reorganizovana sekvenca generisana iz pojedinačnog humanog V segmenta i pojedinačnog humanog J segmenta, i gde svaka B ćelija koja sadrži preuređeni gen lakog lanca dalje sadrži gen koji kodira varijabilni domen srodnog humanog teškog lanca, i pri čemu preuređeni gen lakog lanca sadrži najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, ili najmanje četiri somatske hipermutacije.
[0081] Takođe se odnosi na miša čija je populacija zrelih B ćelija karakterisana time što svaka zrela B ćelija sadrži sekvencu ne-surogatnog lakog lanca na svojoj površini, čija sekvenca
2
sadrži preuređeni gen lakog lanca koji je generisan preuređivanjem jednog od dva humana VLgenska segmenta i jednog od ne više od pet humanih JLgenskih segmenata, pri čemu je jedina varijabilna sekvenca lakog lanca (VLJLsekvenca) u germinativnoj liniji miša preuređena sekvenca koja je generisana kroz preuređivanje jednog od dva humana VLgenska segmenta i jednog od ne više od pet humanih JLgenskih segmenata, i gde svaka B ćelija koja sadrži gen preuređenog lakog lanca, dalje sadrži gen koji kodira varijabilni domen srodnog humanog teškog lanca, i gde gen preuređenog lakog lanca sadrži najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri ili pet ili više somatskih hipermutacija. U nekim primerima, gen preuređenog lakog lanca sadrži jednu, dve, tri, četiri ili pet somatskih hipermutacija. U nekim realizacijama, kao što je ovde opisano, miševi su imunizovani su antigenom od interesa, i u nekim primerima, zrela B ćelijska populacija je obogaćena sa B ćelijama koje vezuju antigen od interesa.
[0082] U nekim realizacijama, korišćen je miš čija je zrela B ćelijska populacija okarakterisana time što svaka zrela B ćelija sadrži sekvencu ne-surogatnog lakog lanca na svojoj površini, čija sekvenca sadrži preuređeni gen lakog lanca koji je generisan preuređivanjem jednog od dva humana VLgenska segmenta i jednog od 5 humanih JLgenskih segmenata, pri čemu se VLgenski segmenti u suštini sastoje od dva VLgenska segmenta koji nisu identični i VLlokus sadrži 5 humanih JLgenskih segmenata, i gde svaka B ćelija koja sadrži preuređeni gen lakog lanca dalje sadrži gen koji kodira srodni humani varijabilni domen teškog lanca, i gde reorganizovani gen lakog lanca sadrži najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, ili pet ili više somatskih hipermutacija. U nekim realizacijama, preuređeni gen lakog lanca sadrži jednu, dve, tri, četiri ili pet somatskih hipermutacija. U nekim realizacijama, kao što je ovde opisano, miševi su imunizovani sa antigenom od interesa, a u nekim realizacijama, populacija zrele B ćelije je obogaćena sa B ćelijama koje vezuju antigen od interesa.
[0083] Takođe se odnosi na pluripotentnu, indukovanu pluripotentnu ili totipotentnu ćeliju izvedenu iz miša, kao što je ovde opisano. U specifičnom primeru, ćelija je mišja embrionska matična (ES) ćelija.
[0084] U jednom primeru, prikazano je tkivo dobijeno od miša, kao što je ovde opisano. U jednom primeru, tkivo je dobijeno iz slezine, limfnog čvora ili koštane srži miša, kao što je ovde opisano.
[0085] Takođe se odnosi na nukleus izveden iz miša, kao što je ovde opisano. U jednom primeru, nukleus je iz diploidne ćelije koja nije B ćelija.
[0086 Takođe se odnosi na mišju ćeliju koja je izolovana iz miša, kao što je ovde opisano. U jednom primeru, ćelija je ES ćelija. U jednom primeru, ćelija je limfocit. U jednom primeru, limfocit je B ćelija. U jednom primeru, B ćelija eksprimira himerni teški lanac koji sadrži varijabilni domen izveden iz segmenta humanog gena; i laki lanac izveden iz preuređene humane Vκ1-39/J sekvence, preuređene humane Vκ3-20/J sekvence, ili njihove kombinacije; gde je varijabilni domen teškog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom i varijabilni domen lakog lanca je fuzionisan sa mišjim ili humanim konstantnim regionom.
[0087] Takođe se odnosi na hibridom, pri čemu je hibridom napravljen sa B ćelijom miša, kao što je ovde opisano. U specifičnom primeru, B ćelija je od miša, kao što je ovde opisano, koja je imunizovana sa imunogenom koji sadrži epitop od interesa, a B ćelija eksprimira vezivni protein koji vezuje epitop od interesa, vezivni protein ima somatski mutirani humani VHdomen i mišji CH, i ima humani VLdomen izveden iz preuređenog humanog Vκ1-39Jκ5 ili preuređenog humanog Vκ3-20Jκ1 i mišjeg CL.
[0088] Takođe se odnosi na mišji embrion, gde embrion sadrži donorsku ES ćeliju koja je izvedena od miša, kao što je ovde opisano.
[0089] Takođe je obezbeđen vektor za ciljanje, koji sadrži, od 5' do 3' u smeru transkripcije, u odnosu na sekvence mišjih homolognih krajeva 5' i 3' vektora, mišji homologni kraj 5', humani ili mišji imunoglobulinski promoter, humanu ili mišju lider sekvencu, i humani VLregion izabran od preuređenog humanog Vκ1-39Jκ5 ili preuređenog humanog Vκ3-20Jκ1, i 3' homologni kraj miša. U jednom primeru, homologni krajevi 5' i 3' ciljaju vektor prema sekvenci 5' u odnosu na sekvencu pojačivača koja je prisutna 5' i proksimalno prema Cκ genu miša. U jednom primeru, promoter je promoter segmenta gena humanog varijabilnog regiona humanog imunoglobulina. U specifičnom primeru, promoter je humani Vκ3-15 promoter. U jednom primeru, vodeća sekvenca je mišja vodeća sekvenca. U specifičnom primeru, vodeća sekvenca miša je Vκ3-7 vodeća sekvenca miša.
[0090] Takođe je obezbeđen vektor za ciljanje, kao što je gore opisano, ali umesto mišjeg homolognog kraja 5', humani ili mišji promoter je okružen 5' sa mestom za prepoznavanje rekombinaze specifične za mesto (SRRS), i umesto mišjeg homolognog kraja 3' humani VLregion je okružen 3' sa SRRS.
[0091] Takođe je obezbeđeno reverzno himerno antitelo dobijeno od strane miša, kao što je ovde opisano, gde reverzno himerno antitelo sadrži laki lanac koji sadrži humani VLi mišji CL, i teški lanac koji sadrži humani VHi mišji CH.
[0092] Sadašnji pronalazak obezbeđuje postupak za izradu antitela koji obuhvata:
(1) eksprimiranje u pojedinačnoj ćeliji:
(a) prve sekvence nukleinske kiseline koja kodira prvi teški lanac imunoglobulina, pri čemu prva sekvenca nukleinske kiseline sadrži prvu sekvencu varijabilnog domena teškog lanca humanog imunoglobulina koja je operativno vezana za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca humanog imunoglogulina, gde je prva sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina dobijena iz B ćelije genetski modifikovanog miša, gde je genetski modifikovani miš imunizovan sa prvim antigenom od interesa i genetski modifikovani miš sadrži u svom genomu germinativne linije:
(i) dva nepreuređena humana V к genska segmenta i pet nepreuređenih humanih J к genskih segmenata operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona lakog lanca, gde su dva nepreuređena humana V к genska segmenta humani V к1-39 genski segment i humani V к3-20 genski segment, i gde su pet nepreuređenih humanih J к genskih segmenata humani J к1 genski segment, humani J к2 genski segment, humani J к3 genski segment, humani J к4 genski segment, i humani J к5 genski segment; i
(ii) jedan ili više nepreuređenih humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više nepreuređenih humanih DHgenskih segmenata, i jedan ili više nepreuređenih humanih JHgenskih segmenata operativno vezanih za mišju sekvencu konstantnog regiona teškog lanca;
gde su nepreuređeni genski segmenti humanog teškog lanca i nepreuređeni genski segmenti humanog kapa lakog lanca genetski modifikovanog miša u stanju da se preuređuju i kodiraju varijabilne domene humanog teškog lanca i varijabilne domene humanog kapa lakog lanca antitela, tim redom;
gde genetski modifikovani miš ne sadrži endogeni V к genski segment koji je u stanju da preuređuje da bi obrazovao sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca; i
gde sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca kodira prvi varijabilni domen humanog teškog lanca koji, sa varijabilnim domenom kapa lakog lanca, prepoznaje prvi antigen; i
(b) druge sekvence nukleinske kiseline koja kodira laki lanac imunoglobulina, pri čemu druga sekvenca nukleinske kiseline sadrži sekvencu varijabilnog regiona kapa lakog lanca operativno vezanu za sekvencu konstatnog regiona humanog lakog lanca, gde sekvenca varijabilnog regiona humanog kapa kakog lanca sadrži: humani V к1-39 genski segment, humani V к3-20 genski segment, ili njihovu somatsku hipermutiranu verziju;
2
(2) održavanje ćelije pod uslovima dovoljnim za eksprimiranje potpuno humanog antitela; i
(3) izolovanje antitela.
U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za izradu antitela, koji obuhvata eksprimiranje u pojedinačnoj ćeliji (a) prve VHgenske sekvence imunizovanog miša, kao što je ovde opisano, fuzionisane sa humanom CHgenskom sekvencom; (b) VLgenske sekvence imunizovanog miša, kao što je ovde opisano, fuzionisane sa humanom CLgenskom sekvencom; i, (c) održavanje ćelije pod uslovima dovoljnim da eksprimira potpuno humano antitelo, i izolovanje antitela. U jednoj realizaciji, ćelija sadrži drugu VHgensku sekvencu od drugog imunizovanog miša, kao što je ovde opisano, fuzionisanu sa humanom CHgenskom sekvencom, prva VHgenska sekvenca kodira VHdomen koji prepoznaje prvi epitop, a druga VHgenska sekvenca kodira VHdomen koji prepoznaje drugi epitop, pri čemu prvi epitop i drugi epitop nisu identični.
[0093] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za izradu antitela, koji obuhvata izlaganje miša, kao što je ovde opisano, imunogenu koji sadrži epitop od interesa, održavanje miša pod uslovima dovoljnim za miša da generiše molekul imunoglobulina koji specifično vezuje epitop od interesa, i izolovanje molekula imunoglobulina koji specifično vezuje epitop od interesa; pri čemu protein za vezivanje epitopa sadrži teški lanac koji sadrži somatski mutirani humani VHi mišji CH, koji su povezani sa lakim lancem koji sadrži mišji CLi humani VLdobijen iz preuređenog humanog Vκ1-39Jκ5 ili preuređenog humanog Vκ3-20Jκ1.
[0094] Takođe se odnosi na ćeliju koja izražava protein za vezivanje epitopa, pri čemu ćelija sadrži: (a) humanu nukleotidnu sekvencu koja kodira humani VLdomen koji je izveden iz preuređenog humanog Vκ1-39Jκ5 ili preuređenog humanog Vκ3-20Jκ1, gde je humana nukleotidna sekvenca fuzionisana (direktno ili preko linkera) sa sekvencom cDNK konstantnog domena lakog lanca humanog imunoglobulina (npr. humana sekvenca DNK konstantnog domena κ); i (b) prvu humanu VHnukleotidnu sekvencu koja kodira humani VHdomen izveden iz prve humane VHnukleotidne sekvence, pri čemu je prva humana VHnukleotidna sekvenca fuzionisana (direktno ili preko linkera) sa sekvencom cDNK konstantnog domena humanog imunoglobulinskog teškog lanca; pri čemu protein za vezivanje epitopa prepoznaje prvi epitop. U jednom primeru, epitop-vezujući protein vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije nižom od 10<-6>M, nižom od 10<-8>M, nižom od 10<-9>M, nižom od 10<-10>M, nižom od 10<-11>M, ili nižom od 10<-12>M.
[0095] U jednom primeru, ćelija sadrži drugu humanu nukleotidnu sekvencu koja kodira drugi humani VHdomen, gde je druga humana sekvenca fuzionisana (direktno ili preko linkera) sa cDNK sekvencom konstantnog domena teškog lanca humanog imunoglobulina, i gde drugi humani VHdomen ne prepoznaje specifično prvi epitop (npr. pokazuje konstantu disocijacije od, npr. 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, ili višu), i pri čemu epitop-vezujući protein prepoznaje prvi epitop i drugi epitop, i pri čemu se prvi i drugi teški lanac imunoglobulina povezuju sa identičnim lakim lancem (a).
[0096] U jednoj realizaciji, drugi VHdomen vezuje drugi epitop sa konstantom disocijacije koja je niža od 10<-6>M, niža od 10<-7>M, niža od 10<-8>M, niža od 10<-9>M, niže od 10<-10>M, niža od 10<-11>M, ili niža od 10<-12>M.
[0097] U jednoj realizaciji, protein za vezivanje epitopa sadrži prvi imunoglobulinski teški lanac i drugi imunoglobulinski teški lanac, od kojih je svaki povezan sa identičnim lakim lancem izvedenim iz preuređenog humanog VLregiona izabranog od humanog Vκ1-39Jκ5 ili humanog Vκ3-20Jκ1, gde prvi imunoglobulinski teški lanac vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije u nanomolarnom do pikomolarnom opsegu, drugi imunoglobulinski teški lanac vezuje drugi epitop sa konstantom disocijacije u nanomolarnom do pikomolarnom opsegu, prvi epitop i drugi epitop nisu identični, prvi imunoglobulinski teški lanac ne vezuje drugi epitop ili vezuje drugi epitop sa konstantom disocijacije koja je slabija od mikromolarnog opsega (npr. milimolarni opseg), drugi imunoglobulinski teški lanac ne vezuje prvi epitop ili vezuje prvi epitop sa konstantom disocijacije koja je slabija od mikromolarnog opsega (npr. milimolarni opseg), a jedan ili više od VL, VHprvog teškog lanca imunoglobulina i VHdrugog teškog lanca imunoglobulina su somatski mutirani.
[0098] U jednoj realizaciji, prvi teški lanac imunoglobulina sadrži protein A-vezujući ostatak, a drugom teškom lancu imunoglobulina nedostaje protein A-vezujući ostatak.
[0099] U jednoj realizaciji, ćelija je izabrana od CHO, COS, 293, HeLa i retinalne ćelija koja eksprimira sekvencu virusne nukleinske kiseline (npr., PERC.6 ™ ćelija).
[0100] Takođe se odnosi na reverzno himerno antitelo, koje sadrži humani VHi konstantni domen teškog lanca miša, humani VLi konstantni domen lakog lanca miša, pri čemu je antitelo napravljeno postupkom koji obuhvata imunizaciju miša, kao što je ovde opisano, sa imunogenom koji sadrži epitop i antitelo specifično vezuje epitop imunogena sa kojim je miš bio imunizovan. U jednom slučaju, VLdomen je somatski mutiran. U jednom slučaju, VHdomen je somatski mutiran. U jednom slučaju, i VLdomen i VHdomen su somatski mutirani. U jednom slučaju, VLje povezan sa mišjim Cκ domenom.
[0101] Takođe se odnosi na miša, koji sadrži humane VHgenske segmente koji zamenjuju sve ili suštinski sve genske segmente mišjeg VHna lokusu endogenog mišjeg teškog lanca; ne više od jedne ili dve preuređene sekvence VL/ JLhumanog lakog lanca izabrane od preuređenog
2
Vκ1-39/J i preuređenog Vκ3-20/J ili njihove kombinacije, koje zamenjuju sve segmente gena lakog lanca miša; pri čemu su varijabilni genski segmenti humanog teškog lanca povezani sa mišjim konstantnim genom, a preuređene sekvence humanog lakog lanca su povezane sa humanim ili mišjim konstantnim genom.
[0102] Takođe se odnosi na miša koji sadrži humane imunoglobulinske VHgenske segmente koji zamenjuju sve ili uglavnom sve genske segmente VHmišjeg imunoglobulina na endogenom lokusu teškog lanca mišjeg imunoglobulina; ne više od dva nepreuređena humana imunoglobulinska VLgenska segmenta i dva ili više (npr.2, 3, 4 ili 5) nepreuređenih genskih segmenata JLhumanog imunoglobulina ili pet humanih imunoglobulinskih JLgenskih segmenata, zamenjujući sve segmente gena lakog lanca mišjeg imunoglobulina; pri čemu su humani imunoglobulinski VHgenski segmenti povezani sa konstantnim genom mišjeg imunoglobulina, a nepreuređeni humani imunoglobulinski VLi JLsegmenti gena su povezani sa humanim ili ne-humanim konstantnim genom imunoglobulina. U nekim primerima, nehumani konstantni gen je konstantni gen mišjeg imunoglobulina. U nekim realizacijama, nehumani imunoglobulinski konstantni gen je konstantni gen pacovskog imunoglobulina.
[0103] Takođe se odnosi na mišju ES ćeliju koja sadrži zamenu svih ili suštinski svih varijabilnih genskih segmenata teškog lanca miša sa varijabilnim genskim segmentima humanog teškog lanca, i ne više od jedne ili dve preuređene sekvence humanog lakog lanca VL/ JL, gde su varijabilni genski segmenti humanog teškog lanca povezani sa konstantnim genom mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca, i preuređene sekvence VL/ JLhumanog lakog lanca su povezane sa konstantnim genom lakog lanca mišjeg ili humanog imunoglobulina. U specifičnom slučaju, konstantni gen lakog lanca je mišji konstantni gen.
[0104] Takođe se odnosi na mišju ES ćeliju, koja sadrži zamenu svih ili suštinski svih genskih segmenata VHmišjeg imunoglobulina sa genskim segmenata VHhumanog imunoglobulina i ne više od dva nepreuređena humana imunoglobulinska VLgenska segmenta i 5 nepreuređenih humanih imunoglobulinskih JLgenskih segmenata, pri čemu su humani imunoglobulinski VHgenski segmenti povezani sa konstantnim genom teškog lanca mišjeg imunoglobulina, a nepreuređeni humani imunoglobulinski VLi JLsegmenti gena su povezani sa nehumanim ili humanim konstantnim genom imunoglobulinskog lakog lanca. U nekim određenim primerima, konstantni gen lakog lanca nehumanog imunoglobulina je konstantni gen mišjeg imunoglobulina. U nekim određenim slučajevima, miš sadrži pet nepreuređenih imunoglobulinskih JLgenskih segmenata.
[0105] Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one od referentne strukture sa SL. 19 u tome što je najmanje jedan, i u nekim slučajevima, svi
2
genski segmenti VLmiša su zamenjeni jednim genskim segmentom humanog VLili ne više od dva humana VLgenska segmenta. U nekim slučajevima, humani VLgenski segmenti miša su sposobni za preuređivanje do jednog od dva ili više humanih JLgenskih segmenata da bi kodirali imunoglobulinski VLdomen antitela. U nekim slučajevima, humani VLgenski segment(i) lokusa lakog lanca miša, kao što je ovde opisano, je/su operativno vezan(i) za dva ili više (npr., dva, tri, četiri ili pet) humanih JLgenskih segmenata.
[0106] Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one od referentne strukture sa SL. 19 u tome što on ne sadrži nukleotidnu sekvencu pre preuređivanja koja kodira endogeni VLgenski segment. Takođe je obezbeđen miš, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one referentne strukture sa SL.19 u tome što ne sadrži nukleotidnu sekvencu pre preuređivanja koja kodira endogeni JLgenski segment. Takođe je obezbeđen miš, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one od referentne strukture sa SL. 19 u tome što ne sadrži nukleotid pre preuređivanja koji kodira endogene VLi JLgenske segmente.
[0107] Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one iz referentne strukture sa SL. 19 u tome što ne sadrži nukleotidnu sekvencu nakon preuređivanja koja kodira endogeni VLgenski segment. Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one od referentne strukture sa SL.19 u tome da ne sadrži nukleotidnu sekvencu nakon preuređivanja koja kodira endogeni JLgenski segment. Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one od referentne strukture sa SL. 19 u tome da on ne sadrži nukleotidnu sekvencu nakon preuređivanja koja kodira endogene VLi JLgenske segmente.
[0108] Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one iz referentne strukture sa SL. 19 u tome da on sadrži ne više od dva humana VLgenska segmenta i dva ili više (npr., dva, tri, četiri ili pet) humanih JLgenskih segmenata pre preuređivanja. Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one iz referentne strukture sa SL.19 u tome što sadrži dva humana VLgenska segmenta i pet humanih JLgenskih segmenata pre preuređivanja.
[0109] Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one iz referentne strukture sa SL. 19 u tome što sadrži dva humana VLgenska segmenta i pet humanih JLgenskih segmenata nakon preuređivanja. Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one iz referentne strukture sa SL.19 u tome što sadrži dva humana VLgenska segmenta i pet humanih JLgenskih segmenata nakon preuređivanja.
2
[0110] Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one iz referentne strukture sa SL. 19 u tome što sadrži jedan humani VLgenski segment i pet ili manje (npr., 5, 4, 3, 2 ili 1) humanih JLgenskih segmenata nakon preuređivanja. Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one iz referentne strukture sa SL.19 u tome da sadrži jedan humani VLgenski segment i jedan, dva, tri, četiri ili pet humanih JLgenskih segmenata nakon preuređivanja.
[0111] U različitim realizacijama, humani VLi JLgenski segmenti su humani Vκ i Jκ genski segmenti. Humani Vκ segmenti su izabrani od humanog Vκ1 -39 genskog segmenta i humanog Vκ3-20 genskog segmenta. Humani Jκ genski segmenti su humani Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, i Jκ5.
[0112] Takođe se odnosi na miša, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura različita od one iz referentne strukture sa SL.19 u tome što sadrži strukturu koja je suštinski ista kao i struktura sa SL.1, SL.2, SL.3, ili SL.9 pre reorganizovanja. U nekim realizacijama, obezbeđen je miš, koji sadrži lokus lakog lanca čija je struktura identična strukturi sa SL.1, SL.2, SL.3 ili SL.9 pre reorganizovanja.
[0113] Takođe je opisan antigen-vezujući protein izrađen od strane miša, kao što je ovde opisano. U specifičnom primeru, antigen-vezujući protein sadrži varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina fuzionisan sa mišjim konstantnim regionom, i varijabilni region lakog lanca humanog imunoglobulina izveden iz Vκ1 -39 segmenta gena ili Vκ3-20 segmenta gena, gde je konstantni region lakog lanca mišji konstantni region.
[0114] Takođe se odnosi na potpuno humani protein za vezivanje antigena, izrađen od sekvence gena varijabilnog regiona imunoglobulina miša, kao što je ovde opisano, gde antigenvezujući protein sadrži potpuno humani teški lanac koji sadrži humani varijabilni region izveden iz sekvence miša, kao što je ovde opisano, i potpuno humani laki lanac koji sadrži Vκ1 -39 ili Vκ3-20. U jednom primeru, varijabilni region lakog lanca sadrži jednu do pet somatskih mutacija. U jednom primeru, varijabilni region lakog lanca je varijabilni region srodnog lakog lanca koji je uparen u B ćeliji miša sa varijabilnim regionom teškog lanca.
[0115] U jednom primeru, potpuno humani antigen-vezujući protein sadrži prvi teški lanac i drugi teški lanac, pri čemu prvi teški lanac i drugi teški lanac sadrže varijabilne regione koji nisu identični, nezavisno dobijeni od miša, kao što je ovde opisano, i gde se svaki od prvog i drugog teškog lanca eksprimira iz ćelije domaćina povezane sa humanim lakim lancem izvedenim iz Vκ1-39 genskog segmenta ili Vκ3-20 genskog segmenta. U jednom primeru, prvi teški lanac sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji specifično vezuje prvi epitop prvog antigena, a drugi teški lanac sadrži drugi varijabilni region teškog lanca koji specifično vezuje drugi epitop drugog antigena. U specifičnoj realizaciji, prvi antigen i drugi antigen su različiti.
2
U specifičnom primeru, prvi antigen i drugi antigen su isti, a prvi epitop i drugi epitop nisu identični; u specifičnoj realizaciji, vezivanje prvog epitopa od strane prvog molekula vezivnog proteina ne blokira vezivanje drugog epitopa od strane drugog molekula vezivnog proteina.
[0116] Takođe se odnosi na potpuno humani vezivni protein dobijen od humane imunoglobulinske sekvence miša, kako je ovde opisano, koja obuhvata prvi teški lanac imunoglobulina i drugi teški lanac imunoglobulina, gde prvi teški lanac imunoglobulina sadrži prvi varijabilni region koji nije identičan sa varijabilnim regionom drugog teškog lanca imunoglobulina, i pri čemu prvi teški lanac imunoglobulina sadrži determinantu za vezivanje proteina A divljeg tipa, a drugom teškom lancu nedostaje determinanta za vezivanje proteina A divljeg tipa. U jednom primeru, prvi imunoglobulinski teški lanac vezuje protein A pod izolacionim uslovima, a drugi teški lanac imunoglobulina ne vezuje protein A ili vezuje protein A najmanje 10 puta, sto puta ili hiljadu puta slabije nego što prvi imunoglobulinski teški lanac vezuje protein A, pod izolacionim uslovima. U specifičnom primeru, prvi i drugi teški lanci su IgG1 izotipa, pri čemu drugi teški lanac sadrži modifikaciju izabranu od 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), i njihove kombinacije, i pri čemu prvom teškom lancu nedostaje takva modifikacija.
[0117] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za izradu bispecifičnog antigen-vezujućeg proteina, koji obuhvata izlaganje prvog miša, kao što je ovde opisano, prvom antigenu od interesa koji sadrži prvi epitop, izlaganje drugog miša, kao što je ovde opisano, drugom antigenu od interesa koji sadrži drugi epitop, omogućavajući prvom i drugom mišu da svaki od njih povećava imunski odgovor prema antigenima od interesa, identifikujući kod prvog miša varijabilni region prvog humanog teškog lanca koji vezuje prvi epitop prvog antigena od interesa, identifikujući kod drugog miša varijabilni region drugog humanog teškog lanca koji vezuje drugi epitop drugog antigena od interesa, čineći prvi potpuno humani gen teškog lanca koji kodira prvi teški lanac koji vezuje prvi epitop prvog antigena od interesa, čineći drugi potpuno humani gen teškog lanca koji kodira drugi teški lanac koji vezuje drugi epitop drugog antigena od interesa, eksprimirajući prvi teški lanac i drugi teški lanac u ćeliji koja eksprimira jedan potpuno humani laki lanac izveden iz humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta da se obrazuje bispecifični antigen-vezujući protein, i da se izoluje bispecifični antigen-vezujući protein.
[0118] U jednoj realizaciji, prvi antigen i drugi antigen nisu identični.
[0119] U jednoj realizaciji, prvi antigen i drugi antigen su identični, a prvi epitop i drugi epitop nisu identični. U jednoj realizaciji, vezivanje varijabilnog regiona prvog teškog lanca za prvi epitop ne blokira vezivanje varijabilnog regiona drugog teškog lanca za drugi epitop.
2
[0120] U jednoj realizaciji, humani laki lanac kada je uparen sa prvim teškim lancem specifično vezuje prvi epitop prvog antigena i kada je uparen sa drugim teškim lancem specifično vezuje drugi epitop drugog antigena.
[0121] U jednoj realizaciji, prvi antigen je izabran od rastvorljivog antigena i antigena na površini ćelije (npr. tumorskog antigena), a drugi antigen sadrži receptor na površini ćelije. U specifičnoj realizaciji, receptor na površini ćelije je receptor imunoglobulina. U specifičnoj realizaciji, imunoglobulinski receptor je Fc receptor. U jednoj realizaciji, prvi antigen i drugi antigen su isti ćelijski površinski receptor, a vezivanje prvog teškog lanca za prvi epitop ne blokira vezivanje drugog teškog lanca za drugi epitop.
[0122] U jednoj realizaciji, varijabilni domen lakog lanca sadrži 2 do 5 somatskih mutacija. U jednoj realizaciji, varijabilni domen lakog lanca je somatski mutirani srodni laki lanac eksprimiran u B ćeliji prvog ili drugog imunizovanog miša, bilo sa prvim ili drugim varijabilnim domenom teškog lanca. U jednoj realizaciji, laki lanac ćelije sadrži sekvencu germinativne linije.
[0123] U jednoj realizaciji, prvi potpuno humani teški lanac nosi aminokiselinsku modifikaciju koja smanjuje njegov afinitet za protein A, a drugi potpuno humani teški lanac ne sadrži modifikaciju koja smanjuje njegov afinitet za protein A.
[0124] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za pripremu bispecifičnog antitela koje se specifično vezuje za prvi i drugi antigen, pri čemu postupak obuhvata (a) identifikovanje prve sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen prvog humanog teškog lanca (VH) koji je je specifičan za prvi antigen; (b) identifikovanje druge sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen drugog humanog teškog lanca (VH) koji je specifičan za drugi antigen; (c) obezbeđivanje treće sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region humanog lakog lanca (VL), koji kada je uparen sa VHregionom od (a) specifično vezuje prvi antigen, i kada je uparen sa VHregionom od (b) specifično vezuje drugi antigen; (d) kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži prvu, drugu i treću sekvencu nukleinske kiseline da omogući ekspresiju prvog i drugog humanog VHregiona i humanog VLregiona da se obrazuje bispecifično antitelo; i (d) obnavljanje pomenutog bispecifičnog antitela. U različitim aspektima, prvi i drugi antigeni su različiti jedan od drugog. U različitim aspektima, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline su izolovane iz imunizovanog miša koji eksprimira humani imunoglobulinski VLregion iz preuređene sekvence lakog lanca imunoglobulina, pri čemu je preuređena sekvenca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša.
[0125] U jednoj realizaciji, humani VLregion je izveden iz preuređene sekvence humanog lakog lanca koja sadrži humani Vκ1-39 genski segment ili humani Vκ3-20 genski segment. U specifičnoj realizaciji, preuređena sekvenca humanog lakog lanca je sekvenca germinativne linije (tj. ne sadrži somatsku hipermutaciju unutar sekvence V genskog segmenta).
[0126] U jednoj realizaciji, treća sekvenca nukleinske kiseline je izolovana iz miša koji eksprimira humani imunoglobulinski VLregion iz preuređene sekvence lakog lanca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša. U jednoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca imunoglobulina sadrži humani Vκ1-39 ili humani Vκ3-20 genski segment. U specifičnoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca imunoglobulina sadrži humani Vκ1-39 genski segment. U jednoj realizaciji, humani imunoglobulinski VLregion je eksprimiran iz modifikovanog endogenog lokusa imunoglobulinskog lakog lanca.
[0127] U jednoj realizaciji, prvi i drugi antigeni su prisutni na jednom molekulu. U jednoj realizaciji, prvi i drugi antigeni su prisutni na različitim molekulima. U različitim realizacijama, prva ili druga sekvenca nukleinske kiseline sadrži modifikaciju koja smanjuje afinitet kodiranog teškog lanca za protein A.
[0128] U jednoj realizaciji, prva ili druga sekvenca nukleinske kiseline sadrži preuređenu sekvencu varijabilnog regiona humanog teškog lanca koja sadrži genski segment humanog teškog lanca odabran od VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3- 21, VH3-23, VH3- 30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 i VH6-1. U specifičnoj realizaciji, segment gena teškog lanca je VH2-5, VH3-23 ili VH3-30.
[0129] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za dobijanje bispecifičnog antitela koje se specifično vezuje za prvi i drugi antigen, pri čemu postupak obuhvata (a) identifikovanje prve sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen prvog humanog teškog lanca (VH) koji je je specifičan za prvi antigen; (b) identifikovanje druge sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen drugog humanog teškog lanca (VH) koji je specifičan za drugi antigen; (c) obezbeđivanje treće sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region humanog lakog lanca (VL) izveden iz humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta koji, kada je uparen sa VHregionom od (a) specifično vezuje prvi antigen, i kada je uparen sa VHregionom od (b) specifično vezuje drugi antigen; (d) kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži prvu, drugu i treću sekvencu nukleinske kiseline da omogući ekspresiju prvog i drugog humanog VHregiona i humanog VLregiona da obrazuju bispecifično antitelo; i (d) ponovno dobijanje pomenutog bispecifičnog antitela. U različitim aspektima, prvi i drugi antigen su različiti jedan od drugog. U različitim aspektima, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline su izolovane iz imunizovanog miša koji eksprimira humani imunoglobulinski VLregion iz
1
preuređene sekvence imunoglobulina koja je izvedena iz humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta, gde je preuređeni humani Vκ1-39 ili Vκ3-30 genski segment u germinativnoj liniji miša.
[0130] U jednoj realizaciji, treća sekvenca nukleinske kiseline je sekvenca germinativne linije (tj. ne sadrži somatsku hipermutaciju unutar sekvence V genskog segmenta). U jednoj realizaciji, treća sekvenca nukleinske kiseline je izolovana iz miša koji eksprimira humani imunoglobulinski VLregion izveden iz humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta, iz preuređene sekvence lakog lanca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša. U specifičnoj realizaciji, treća sekvenca nukleinske kiseline sadrži dve do pet somatskih hipermutacija u regionu za određivanje komplementarnosti (CDR) i / ili okvirnom regionu (FWR). U jednoj realizaciji, humani imunoglobulinski VLregion je eksprimiran iz modifikovanog lokusa endogenog imunoglobulinskog lakog lanca.
[0131] U jednoj realizaciji, prvi i drugi antigeni su prisutni na jednom molekulu. U jednoj realizaciji, prvi i drugi antigeni su prisutni na različitim molekulima. U jednoj realizaciji, prva ili druga sekvenca nukleinske kiseline sadrži modifikaciju koja smanjuje afinitet kodiranog teškog lanca za protein A.
[0132] U jednoj realizaciji, prva ili druga sekvenca nukleinske kiseline sadrži preuređenu sekvencu varijabilnog regiona humanog teškog lanca koja sadrži genski segment humanog teškog lanca odabran od VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 i VH6-1. U specifičnoj realizaciji, genski segment teškog lanca je VH2-5, VH3-23 ili VH3-30.
[0133] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za izradu bispecifičnog antitela, koji obuhvata izlaganje miša antigenu od interesa, kao što je ovde opisano, omogućavajući mišu da povećava imunski odgovor prema antigenu od interesa, identifikujući prvi humani varijabilni region teškog lanca koji vezuje prvi epitop antigena od interesa, identifikujući drugi humani varijabilni region teškog lanca koji vezuje drugi epitop antigena od interesa, čineći prvi potpuno humani gen teškog lanca koji kodira prvi teški lanac koji vezuje prvi epitop antigena od interesa, čineći drugi potpuno humani gen teškog lanca koji kodira drugi teški lanac koji vezuje drugi epitop antigena od interesa, eksprimirajući prvi teški lanac i drugi teški lanac u ćeliji koja eksprimira jedan potpuno humani laki lanac izveden iz humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta da obrazuje bispecifično antitelo, i izolovanje bispecifičnog antigen-vezujućeg proteina.
2
[0134] U jednoj realizaciji, prvi epitop i drugi epitop nisu identični. U jednoj realizaciji, vezivanje varijabilnog regiona prvog teškog lanca za prvi epitop ne blokira vezivanje varijabilnog regiona drugog teškog lanca za drugi epitop. U jednoj realizaciji, prvi i drugi teški lanac su sposobni za istovremeno vezivanje i prvog i drugog epitopa.
[0135] U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo vezuje prvi i drugi epitop istovremeno. U jednoj realizaciji, bispecifično antitelo vezuje nezavisno prvi epitop i drugi epitop.
[0136] U jednoj realizaciji, odgovor vezivanja bispecifičnog antitela za antigen je oko 2 puta veći od odgovora vezivanja varijabilnog regiona prvog teškog lanca za antigen. U jednoj realizaciji, odgovor vezanja bispecifičnog antitela za antigen je oko 2 puta veći od odgovora vezivanja varijabilnog regiona drugog teškog lanca za antigen. U jednoj realizaciji, odgovor vezivanja bispecifičnog antitela za antigen je približno isti kao ili, približno, jednak odgovoru vezivanja varijabilnog regiona prvog teškog lanca i ili varijabilnog regiona drugog teškog lanca za antigen.
[0137] U jednoj realizaciji, antigen je izabran od rastvorljivog antigena, antigena na površini ćelije (npr. tumorskog antigena) i receptora na površini ćelije. U specifičnoj realizaciji, receptor na površini ćelije je imunoglobulinski receptor. U specifičnoj realizaciji, imunoglobulinski receptor je Fc receptor.
[0138] U jednoj realizaciji, varijabilni domen lakog lanca od lakog lanca sadrži 2 do 5 somatskih mutacija. U jednoj realizaciji, varijabilni domen lakog lanca je somatski mutirani srodni laki lanac, eksprimiran u B ćeliji imunizovanog miša ili sa prvim ili sa drugim varijabilnim domenom teškog lanca.
[0139] U jednoj realizaciji, prvi potpuno humani teški lanac nosi aminokiselinsku modifikaciju koja smanjuje njegov afinitet za protein A, a drugi potpuno humani teški lanac ne sadrži modifikaciju koja smanjuje njegov afinitet za protein A.
[0140] U različitim realizacijama, metode za izradu bispecifičnih antitela su poboljšane angažovanjem zajedničkog lakog lanca za uparivanje sa svakim od varijabilnih regiona teških lanaca iz bispecifičnih antitela. U različitim realizacijama, angažovanje zajedničkog lakog lanca, kao što je ovde opisano, smanjuje broj neodgovarajućih imunoglobulinskih vrsta kojima nedostaje bispecifičnost, u poređenju sa angažovanjem originalnih srodnih lakih lanaca. U različitim realizacijama, varijabilni regioni teških lanaca bispecifičnih antitela su identifikovani od monospecifičnih antitela koja sadrže zajednički laki lanac. U različitim realizacijama, varijabilni regioni teških lanaca bispecifičnih antitela, obuhvataju varijabilne genske segmente humanog teškog lanca koji su preuređeni in vivo, unutar mišjih B ćelija, koje su prethodno konstruisane da izraze ograničeni repertoar humanog lakog lanca, ili pojedinačni humani laki lanac srodan sa humanim teškim lancima i, kao odgovor na izlaganje antigenu od interesa, generiše repertoar himernog antitela koji sadrži mnoštvo varijabilnih regiona humanog teškog lanca koji su srodni sa jednim ili jednim od dva moguća varijabilna regiona humanog lakog lanca, pri čemu su himerna antitela specifična za antigen od interesa.
[0141] U različitim aspektima, obezbeđena je metoda za pripremu bispecifičnog antitela, bispecifično antitelo koje sadrži 1) prvi polipeptid i drugi polipeptid, pri čemu svaki od prvog i drugog polipeptida uključuje, multimerizacioni domen (npr. imunoglobulinski Fc domen) omogućavajući prvom i drugom polipeptidu da obrazuju dimer, a multimerizacioni domeni promovišu stabilnu interakciju između prvog i drugog polipeptida, a pri čemu jedan od multimerizacionih domena nosi aminokiselinsku modifikaciju koja smanjuje njegov afinitet za protein A, dok drugom domenu multimerizacije nedostaje modifikacija, 2) domen za vezivanje u svakom od prvog i drugog polipeptida, svaki vezivni domen sadrži varijabilni teški lanac i varijabilni laki lanac, pri čemu varijabilni laki lanac prvog polipeptida i varijabilni laki lanac drugog polipeptida ima zajedničku aminokiselinsku sekvencu, čija zajednička sekvenca ima identičnost aminokiselinske sekvence prema originalnom lakom lancu svakog od polipeptida od najmanje 80%, od najmanje 85%, poželjno najmanje 90%, poželjnije najmanje 95% i najpoželjnije 100% identičnosti sekvence. U različitim realizacijama, varijabilni laki lanac je izveden iz humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta. U različitim realizacijama, varijabilni laki lanac je jedna preuređena sekvenca humanog lakog lanca. U različitim realizacijama, varijabilni laki lanac je izolovan iz miša, kao što je ovde opisano.
[0142] U različitim realizacijama, metoda obuhvata korake (i) kultivisanja ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira prvi polipeptid, drugi polipeptid, i zajednički laki lanac, gde je nukleinska kiselina eksprimirana; i (ii) ponovno dobijanje bispecifičnog antitela iz kulture ćelije domaćina; u jednoj realizaciji, nukleinska kiselina koja kodira prvi polipeptid ili nukleinska kiselinu koja kodira drugi polipeptid, nosi aminokiselinsku modifikaciju koja smanjuje njen afinitet za protein A. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina koja kodira prvi polipeptid, drugi polipeptid i zajednički laki lanac je prisutna u pojedinačnom vektoru ili u odvojenim vektorima. U jednoj realizaciji, ćelija domaćina je korišćena za izradu bispecifičnog antitela prema prethodnom paragrafu.
[0143] U jednom aspektu, obezbeđena je metoda za pripremu bispecifičnog antitela, koja obuhvata (a) odabiranje prve nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region prvog humanog teškog lanca izolovanog iz miša, kao što je ovde opisano; (b) odabiranje druge nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region drugog humanog teškog lanca izolovanog od istog ili odvojenog miša, kao što je ovde opisano; (c) obezbeđivanje treće nukleinske kiseline koja
4
kodira varijabilni region humanog lakog lanca izolovanog od miša, kao što je ovde opisano ili izvedenog iz preuređenog varijabilnog regiona humanog lakog lanca, kao što je ovde opisano; (c) uvođenje u ćeliju domaćina prve, druge i treće nukleinske kiseline i kultivisanje ćelije domaćina tako da dolazi do ekspresije prve, druge i treće nukleinske kiseline; i (d) ponovno dobijanje bispecifičnog antitela obrazovanog iz ćelijske kulture.
[0144] U jednoj realizaciji, varijabilni regioni prvog i drugog humanog teškog lanca su somatski mutirani. U specifičnoj realizaciji, varijabilni regioni prvog i drugog humanog teškog lanca su nezavisno izvedeni iz preuređenog humanog VHgenskog segmenta izabranog od 1-2, 1-3, 1-8, 1-18, 1-24, 1-46, 1-58, 1-69, 2-5, 2-26, 2-70, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33, 3-43, 3-48, 3-53, 3-64, 3-72, 3-73, 4-31, 4-34, 4-39, 4-59, 5-51 i jednog 6-1 humanog VHgenskog segmenta. U jednoj realizaciji, varijabilni regioni prvog i drugog humanog teškog lanca su nezavisno izvedeni iz preuređenog humanog VHgenskog segmenta izabranog od 2-5, 3-30 i 3-23. U jednoj realizaciji, varijabilni region prvog humanog teškog lanca je izveden iz humanog VH2-5 genskog segmenta, a varijabilni region drugog humanog teškog lanca je izveden iz humanog VH3-30 genskog segmenta. U jednoj realizaciji, prvi varijabilni region humanog teškog lanca je izveden iz humanog VH3-30 genskog segmenta i drugi varijabilni region humanog teškog lanca je izveden iz humanog VH3-23 genskog segmenta. U jednoj realizaciji, varijabilni region prvog humanog teškog lanca je izveden iz humanog VH3-23 genskog segmenta i varijabilni region drugog humanog teškog lanca je izveden iz humanog VH3-30 genskog segmenta.
[0145] U jednoj realizaciji, prva ili druga nukleinska kiselina je modifikovana pre koraka (c), pri čemu je prva ili druga nukleinska kiselina modifikovana tako da ima smanjeni afinitet prema proteinu A.
[0146] U jednoj realizaciji, treća nukleinska kiselina je izolovana iz miša, kao što je ovde opisano. U jednoj realizaciji, treća nukleinska kiselina sadrži 2 do 5 somatskih mutacija. U jednoj realizaciji, treća nukleinska kiselina kodira varijabilni region humanog lakog lanca izveden iz humanog Vκ1-39 genskog segmenta. U jednoj realizaciji, treća nukleinska kiselina kodira varijabilni region humanog lakog lanca izveden iz humanog Vκ3-20 genskog segmenta.
[0147] U jednoj realizaciji, treća nukleinska kiselina je izvedena iz varijabilnog regiona preuređenog humanog lakog lanca. U jednoj realizaciji, varijabilni region preuređenog humanog lakog lanca sadrži sekvencu izvedenu iz humanog Vκ1-39 genskog segmenta ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta. U jednoj realizaciji, varijabilni region preuređenog humanog lakog lanca sadrži humanu sekvencu Vκ1-39 germinativne linije (tj. ne sadrži somatsku hipermutaciju unutar sekvence V genskog segmenta). U jednoj realizaciji, varijabilni region preuređenog humanog lakog lanca sadrži humanu Vκ3-20 sekvencu germinativne linije.
[0148] U različitim realizacijama, obezbeđena je metoda za pripremu bispecifičnog antitela koje inkorporira prvi humani teški lanac koji sadrži varijabilni domen izveden iz modifikovanog miša kome nedostaje sekvenca preuređenog humanog lakog lanca u njegovoj germinativnoj liniji, pri čemu je prvi humani teški lanac uparen sa srodnim humanim lakim lancem koji sadrži varijabilni region preuređenog humanog lakog lanca izveden iz humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta. U različitim realizacijama, drugi humani teški lanac sa različitom specifičnošću od prvog humanog teškog lanca je identifikovan iz imunizovanog miša, kao što je ovde opisano. Nukleinske kiseline koje kodiraju dva teška lanca i zajednički laki lanac su uvedene u ćeliju domaćina, kao što je opisano u prethodnim paragrafima, tako da dolazi do ekspresije sva tri lanca i bispecifično antitelo je obnovljeno iz ćelijske kulture.
[0149] U jednoj realizaciji, miš je imunizovan sa istim antigenom, korišćenim za generisanje varijabilnog domena prvog humanog teškog lanca. U jednoj realizaciji, miš je imunizovan sa različitim antigenom, korišćenim za generisanje varijabilnog domena prvog humanog teškog lanca.
[0150] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za odabiranje humanih teških lanaca koji se mogu uparivati sa jednim humanim lakim lancem da bi se dobilo bispecifično antitelo, uključujući nukleinske kiseline koje kodiraju bispecifično antitelo i ćeliju domaćina koja sadrži nukleinske kiseline.
[0151] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za povećanje količine željenog bispecifičnog antitela u ćelijskoj kulturi preko neželjenih proizvoda, kao što su monospecifična antitela, gde je jedan od teških lanaca bispecifičnog antitela modifikovan da smanjuje njegov afinitet za protein A.
[0152] Takođe je opisana izolovana ćelija domaćina, pri čemu ćelija domaćina sadrži (a) sekvencu prve nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region prvog humanog teškog lanca koji vezuje prvi antigen, pri čemu je sekvenca prve nukleinske kiseline izolovana iz miša imunizovanog sa prvim antigenom, koji eksprimira humani imunoglobulinski VLregion od sekvence preuređenog lakog lanca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša; (b) sekvencu druge nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region drugog humanog teškog lanca koji vezuje drugi antigen, pri čemu je sekvenca druge nukleinske kiseline izolovana iz miša imunizovanog sa drugim antigenom, koji eksprimira VLregion humanog imunoglobulina od sekvence preuređenog lakog lanca imunoglobulina u germinativnoj liniji miša; (c) sekvencu treće nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region humanog lakog lanca koji, kada je uparen sa varijabilnim regionom teškog lanca od (a), specifično vezuje prvi antigen, i kada je uparen sa varijabilnim regionom teškog lanca od (b) specifično vezuje drugi antigen.
[0153] U različitim aspektima, prvi i drugi antigeni su različiti jedan od drugog. U različitim aspektima, ekspresija sekvenci prve, druge i treće nukleinske kiseline dovodi do obrazovanja bispecifičnog antitela koje se specifično vezuje za prvi i drugi antigen.
[0154] U jednoj realizaciji, humani VLregion je izveden iz preuređene sekvence humanog lakog lanca koja sadrži humani Vκ1-39 genski segment ili humani Vκ3-20 genski segment. U specifičnoj realizaciji, preuređena sekvenca humanog lakog lanca je sekvenca germinativne linije (tj. ne sadrži somatsku hipermutaciju unutar varijabilnog domena). U jednoj realizaciji, treća sekvenca nukleinske kiseline je izolovana iz miša koji eksprimira humani imunoglobulinski VLregion iz preuređene sekvence lakog lanca imunoglobulina, pri čemu je preuređena sekvenca humanog lakog lanca prisutna u germinativnoj liniji miša. U jednoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca imunoglobulina sadrži humani Vκ1-39 genski segment ili humani Vκ3-20 genski segment. U specifičnoj realizaciji, humani Vκ1-39 genski segment ili humani Vκ3-20 genski segment sadrži najmanje jednu somatsku hipermutaciju u regionu za određivanje komplementarnosti (CDR) ili okvirnom regionu (FWR). U specifičnoj realizaciji, sekvence prve, druge i treće nukleinske kiseline su izolovane iz miša koji eksprimira humani imunoglobulinski VLregion izveden iz humanog Vκ1-39 ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta iz preuređene sekvence lakog lanca imunoglobulina, pri čemu je preuređena sekvenca lakog lanca imunoglobulina prisutna u germinativnoj liniji miša.
[0155] U različitim realizacijama, miš ne sadrži endogeni genski segment varijabilnog regiona lakog lanca koji je sposoban za preuređivanje da obrazuje laki lanac imunoglobulina.
[0156] U jednoj realizaciji, humani imunoglobulinski VLregion je eksprimiran iz modifikovanog lokusa endogenog imunoglobulinskog lakog lanca. U jednoj realizaciji, prvi i drugi antigeni su prisutni na jednom molekulu. U jednoj realizaciji, prvi i drugi antigeni su prisutni na različitim molekulima. U jednoj realizaciji, prva ili druga sekvenca nukleinske kiseline sadrži modifikaciju koja smanjuje afinitet kodiranog teškog lanca za protein A.
[0157] U jednoj realizaciji, sekvenca prve ili druge nukleinske kiseline sadrži sekvencu preuređenog varijabilnog regiona humanog teškog lanca koja sadrži genski segment humanog teškog lanca odabran od VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH439, VH4-59, VH5-51 i VH6-1. U specifičnoj realizaciji, genski segment teškog lanca je VH2-5, VH3-23 ili VH3-30.
[0158] Takođe je opisano antitelo ili bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni domen humanog teškog lanca izrađen u skladu sa pronalaskom. U drugom aspektu, obezbeđena je upotreba miša, kao što je ovde opisano, za izradu potpuno humanog antitela ili potpuno humanog bispecifičnog antitela.
[0159] U jednom aspektu, ovde opisani genetski modifikovani miš, embrion ili ćelija, sadrži lokus lakog lanca κ koji zadržava endogene regulatorne ili kontrolne elemente, npr. mišjeg κ intronskog inhensera, mišjeg κ 3' inhensera, ili oba, intronskog pojačivača i 3' pojačivača, pri čemu regulatorni ili kontrolni elementi olakšavaju somatsku mutaciju i sazrevanje afiniteta eksprimirane sekvence lokusa lakog lanca κ.
[0160] Takođe je obezbeđen miš koji sadrži B ćelijsku populaciju, karakterisanu time da poseduje imunoglobulinske lake lance izvedene iz ne više od jednog, ili ne više od dva, preuređena ili neuređena segmenta V i J gena lakog lanca imunoglobulina, pri čemu miš ispoljava odnos lakog lanca κ: λ koji je približno isti kao kod miša koji sadrži komplement divljeg tipa od segmenata V i J gena imunoglobulinskog lakog lanca.
[0161] U jednom slučaju, imunoglobulinski laki lanci su izvedeni iz ne više od jednog, ili ne više od dva, preuređena genska segmenta V i J lakog lanca imunoglobulina. U specifičnom slučaju, laki lanci su izvedeni iz ne više od jednog preuređenog segmenta V i J gena lakog lanca imunoglobulina. U jednom slučaju, imunoglobulinski laki lanci su generisani iz jednog od dva nepreuređena imunoglobulinska VLgenska segmenta i jednog od 1, 2, 3, 4 ili 5 imunoglobulinskih JLgenskih segmenata. U jednom primeru, laki lanci imunoglobulina su generisani iz jednog od dva neuređena imunoglobulinska VLgenska segmenta i jednog imunoglobulinskog JLgenskog segmenta.
[0162] Takođe je obezbeđen miš, kao što je ovde opisano, koji eksprimira laki lanac imunoglobulina dobijen od ne više od jedne, ili ne više od dve humane Vκ / Jκ sekvence, pri čemu miš sadrži zamenu svih ili suštinski svih endogenih mišjih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca sa jednim ili više humanih genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca, a miš ispoljava odnos (a) CD19<+>B ćelija koje izražavaju imunoglobulin koji ima laki lanac λ, prema (b) CD19<+>B ćelijama koje izražavaju imunoglobulin koji ima laki lanac κ, od oko 1 do oko 20.
[0163] U jednom primeru, miš izražava pojedinačni laki lanac κ izveden iz humane Vκ1-39Jκ5 sekvence, a odnos CD19<+>B ćelija koje izražavaju imunoglobulin koji ima laki lanac λ prema CD19<+>B ćelijama koje izražavaju imunoglobulin koji ima laki lanac κ je oko 1 do oko 20; u jednom primeru, odnos je oko 1 do najmanje oko 66; u specifičnoj realizaciji, odnos je oko 1 do 66.
[0164] Takođe se odnosi na miša koji eksprimira pojedinačni laki lanac κ izveden iz humane Vκ3-20Jκ5 sekvence, a odnos CD19<+>B ćelija koje eksprimiraju imunoglobulin koji ima laki lanac λ prema CD19<+>B ćelijama koje izražavaju imunoglobulin koji ima laki lanac κ je oko 1 do oko 20; u jednom primeru, odnos je oko 1 do oko 21. U specifičnim realizacijama, odnos je 1 do 20, ili 1 do 21.
[0165] Takođe je obezbeđen miš koji izražava laki lanac imunoglobulina čija je sekvenca identična onoj koja je postignuta preuređivanjem jednog od dva humana Vκ genska segmenta sa 1, 2, 3, 4 ili 5 humanih Jκ genskih segmenata.
[0166] U nekim realizacijama, obezbeđen je miš koji eksprimira laki lanac imunoglobulina generisan preuređivanjem dva humana Vκ genska segmenta i 5 humanih Jκ genskih segmenata, pri čemu miš sadrži zamenu svih ili suštinski svih endogenih imunoglobulinskih VHgenskih segmenata sa jednim ili više VHhumanog imunoglobulina, jednim ili više DH, i jednim ili više JHgenskih segmenata, a miš ispoljava odnos (a) B ćelija u koštanoj srži koje eksprimiraju imunoglobulin koji ima laki lanac λ, prema (b) B ćelijama u koštanoj srži koje eksprimiraju imunoglobulin koji ima laki lanac κ, od oko 1 do oko 15. U nekim realizacijama, preuređivanje uključuje humani Vκ1-39 genski segment. U nekim realizacijama, preuređivanje uključuje humani Vκ3-20 genski segment. U nekim realizacijama, zamena endogenih imunoglobulinskih VHgenskih segmenata je na endogenom imunoglobulinskom VHlokusu. U nekim realizacijama, dva humana Vκ genska segmenta su na endogenom lokusu Vκ imunoglobulina, a, u nekim realizacijama, dva humana Vκ genska segmenta zamenjuju sve ili suštinski sve mišje imunoglobulinske Vκ genske segmente. U nekim realizacijama, dva humana Vκ genska segmenta su na endogenom imunoglobulinskom Vκ lokusu, i, u nekim realizacijama, dva humana Vκ genska segmenta zamenjuju sve ili suštinski sve genske segmente Vκ i Jκ mišjeg imunoglobulina. Dva humana Vκ genska segmenta su operativno povezana sa 5 humanih Jκ genskih segmenata.
[0167] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku izražava laki lanac generisan preko preuređivanja humanog Vκ1-39 genskog segmenta ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta i 5 humanih Jκ genskih segmenata, a odnos nezrelih B ćelija u koštanoj srži koje eksprimiraju imunoglobulin koji ima laki lanac λ prema nezrelim B ćelijama koje eksprimiraju imunoglobulin koji ima laki lanac κ je oko 1 do oko 13.
[0168] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku izražava laki lanac generisan preuređivanjem humanog Vκ1-39 genskog segmenta ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta i 5 humanih Jκ genskih segmenata, a odnos zrelih B ćelija u koštanoj srži koje eksprimiraju imunoglobulin koji ima laki lanac λ l prema nezrelim B ćelijama koje eksprimiraju imunoglobulin koji ima laki lanac κ je oko 1 do oko 7.
[0169] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku izražava laki lanac generisan preko preuređivanja humanog Vκ1-39 genskog segmenta ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta i 5 humanih Jκ genskih segmenata, i ima pro B ćelijsku populaciju u koštanoj srži u opsegu od oko 2,5x10<4>do oko 1,5x10<5>ćelija, uključujući, na primer oko 2,5x10<4>, 3,0x10<4>, 3,5x10<4>, 4,0x10<4>, 4,5x10<4>, 5,0x10<4>, 5,5x10<4>, 6,0x10<4>, 6,5x10<4>, 7,0x10<4>, 7,5x10<4>, 8,0x10<4>, 8,5x10<4>, 9,0x10<4>, 9,5x10<4>, 1,0x10<5>, ili 1,5x10<5>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži pro B ćelijsku populaciju u koštanoj srži od oko 2,88x10<4>ćelija; u nekim realizacijama, miš prema sadašnjem pronalasku sadrži pro B ćelijsku populaciju u koštanoj srži od oko 6,42x10<4>ćelija; u nekim realizacijama, miš prema sadašnjem pronalasku sadrži pro B ćelijsku populaciju u koštanoj srži od oko 9,16x10<4>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži pro B ćelijsku populaciju u koštanoj srži od oko 1, 19x10<5>ćelija. Primeri pro B ćelija u koštanoj srži genetski modifikovanih miševa, kao što je ovde opisano, karakterisani su ekspresijom CD19, CD43, c-kit i / ili njihove kombinacije (npr. CD19<+>, CD43<+>, c-kit<+>).
[0170] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku eksprimira laki lanac generisan preuređivanjem humanog Vκ1-39 genskog segmenta ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta i 5 humanih Jκ genskih segmenata, i ima pre B ćelijsku populaciju u koštanoj srži u opsegu od oko 1x10<6>do oko 2x10<6>ćelija, uključujući, na primer, oko 1,0x10<6>, 1,1x10<6>, 1,2x10<6>, 1,3x10<6>, 1,4x10<6>, 1,5x10<6>, 1,6x10<6>, 1,7x10<6>, 1,8x10<6>, 1,9x10<6>, ili 2,0x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata populaciju pre B ćelija u koštanoj srži od oko 1,25x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju pre B ćelija u koštanoj srži od oko 1,46x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata populaciju pre B ćelija u koštanoj srži od oko 1,64x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalaska sadrži populaciju pre B ćelija u koštanoj srži od oko 2,03x10<6>ćelija. Primeri pre B ćelija u koštanoj srži genetski modifikovanih miševa, kao što je ovde opisano, karakterisani su ekspresijom CD19, CD43, c-kit i / ili njihove kombinacije (npr. CD19<+>, CD43-, c-kit-).
[0171] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku izražava laki lanac generisan preuređivanjem humanog Vκ1-39 genskog segmenta ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta i 5 humanih Jκ genskih segmenata, i ima nezrelu populaciju B ćelija u koštanoj srži u opsegu od oko 5x10<5>do oko 7x10<5>ćelija, uključujući, na primer, oko 5,0x10<5>, 5,1x10<5>,
4
5,2x10<5>, 5,3x10<5>, 5,4x10<5>, 5,5x10<5>, 5,6x10<5>, 5,7x10<5>, 5,8x10<5>, 5,9x10<5>, 6,0x10<5>, 6,1x10<5>, 6,2x10<5>, 6,3x10<5>, 6,4x10<5>, 6,5x10<5>, 6,6x10<5>, 6,7x10<5>, 6,8x10<5>, 6,9x10<5>, ili 7,0x10<5>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju nezrelih B ćelija u koštanoj srži od oko 5,33 x10<5>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju nezrelih B ćelija u koštanoj srži od oko 5,80x10<5>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju nezrelih B ćelija u koštanoj srži od oko 5,92x10<5>ćelija; u nekim realizacijama, miš sadrži populaciju nezrelih B ćelija u koštanoj srži od oko 6,67x10<5>ćelija. Primeri nezrelih B ćelija u koštanoj srži genetski modifikovanih miševa, kao što je ovde opisano su karakterisani ekspresijom IgM, B220 i / ili njihovom kombinacijom (npr. IgM<+>, B220<int>).
[0172] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku eksprimira laki lanac generisan preuređivanjem humanog Vκ1-39 genskog segmenta ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta i jednog od 5 humanih Jκ genskih segmenata, i ima zrelu populaciju B ćelija u koštanoj srži u opsegu od oko 3x10<4>do oko 1,5x10<5>ćelija, uključujući, na primer oko 3,0x10<4>, 3,5x10<4>, 4,0x10<4>, 4,5x10<4>, 5,0x10<4>, 5,5x10<4>, 6,0x10<4>, 6,5x10<4>, 7,0x10<4>, 7,5x10<4>, 8,0x10<4>, 8,5x10<4>, 9,0x10<4>, 9,5x10<4>, 1,0x10<5>, ili 1,5x10<5>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju zrelih B ćelija u koštanoj srži od oko 3,11x10<4>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju zrelih B ćelija u koštanoj srži od oko 1,09x10<5>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata populaciju zrelih B ćelija u koštanoj srži od oko 1,16x10<5>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata populaciju zrelih B ćelija u koštanoj srži od oko 1,44x10<5>ćelija. Primeri zrelih B ćelija u koštanoj srži genetski modifikovanih miševa, kao što je ovde opisano su karakterisani ekspresijom IgM, B220 i / ili njihove kombinacije (npr. IgM<+>, B220<hi>).
[0173] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku eksprimira laki lanac generisan preuređivanjem humanog Vκ1-39 genskog segmenta ili humanog Vκ3-20 genskog segmenta i 5 humanih Jκ genskih segmenata, i ima ukupnu populaciju B ćelija u koštanoj srži unutar opsega od oko 1x10<6>do oko 3x10<6>ćelija, uključujući, na primer oko 1,0x10<6>, 1,1x10<6>, 1,2x10<6>, 1,3x10<6>, 1,4x10<6>, 1,5x10<6>, 1,6x10<6>, 1,7x10<6>, 1,8x10<6>, 1,9x10<6>, 2,0x10<6>, 2,1x10<6>, 2,2x10<6>, 2,3x10<6>, 2,4x10<6>, 2,5x10<6>, 2,6x10<6>, 2,7x10<6>, 2,8x10<6>, 2,9x10<6>ili 2,0 x10° ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalaska obuhvata ukupnu populaciju B ćelija u koštanoj srži od oko 1,59x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži ukupnu populaciju B ćelija u koštanoj srži od oko 1,75x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži ukupnu populaciju B ćelija u koštanoj srži od oko 2,13x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži ukupnu populaciju B ćelija u koštanoj srži od oko 2,55x10<6>ćelija. Primeri ukupnih B ćelija u koštanoj srži genetski modifikovanih miševa, kao što je ovde opisano, okarakterisani su ekspresijom CD19, CD20 i / ili njihovom kombinacija (npr. CD19<+>).
[0174] Takođe je obezbeđen genetski modifikovani miš koji izražava pojedinačni preuređeni laki lanac κ, pri čemu miš sadrži funkcionalni lokus lakog lanca λ i pri čemu miš izražava B ćelijsku populaciju koja sadrži Igκ<+>ćelije koje eksprimiraju laki lanac κ izveden iz istog pojedinačnog preuređenog lakog lanca κ. U jednom slučaju, procenat Igκ<+>Igλ<+>B ćelija kod miša je približno isti kao kod miša divljeg tipa. U specifičnom slučaju, procenat Igκ<+>Igλ<+>B ćelija kod miša je oko 2 do oko 6 procenata. U specifičnom primeru, procenat Igκ<+>Igλ<+>B ćelija kod miša, pri čemu je pojedinačni preuređeni laki lanac κ izveden iz sekvence Vκ1-39Jκ5 je oko 2 do oko 3; u specifičnoj realizaciji, procenat je oko 2,6. U specifičnom slučaju, procenat Igκ<+>Ig λ<+>B ćelija kod miša, gde je pojedinačni preuređeni laki lanac κ izveden iz sekvence Vκ3-20Jκ1 je oko 4 do oko 8; u specifičnom slučaju, procenat je oko 6.
[0175] U nekim realizacijama, korišćen je genetski modifikovani miš koji izražava laki lanac imunoglobulina koji sadrži preuređenu sekvencu Vκ/Jκ humanog imunoglobulina, gde miš sadrži funkcionalni lokus imunoglobulinskog lakog lanca λ, i gde miš sadrži populaciju B ćelija slezine koja sadrži odnos Igλ<+>B ćelija prema Igκ<+>B ćelijama koji je oko 1 do oko 8; u nekim realizacijama, oko 1 do oko 5. Preuređena sekvenca Vκ/Jκ humanog imunoglobulina je generisana preuređivanjem jednog od dva humana imunoglobulinska Vκ genska segmenta i jednog od 5 humanih imunoglobulinskih Jκ genskih segmenata. U nekim realizacijama, preuređena sekvenca Vκ/Jκ humanog imunoglobulina je generisana preuređivanjem humanog imunoglobulinskog Vκ1-39 genskog segmenta i humanog imunoglobulinskog Jκ genskog segmenta odabranog od Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5 i njihove kombinacije. U nekim realizacijama, preuređena sekvenca humanog imunoglobulina Vκ/Jκ je generisana preuređivanjem humanog imunoglobulinskog Vκ3-20 genskog segmenta i humanog imunoglobulinskog Jκ genskog segmenta odabranog od Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5, i njihove kombinacije.
[0176] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju B ćelija slezine CD19<+>unutar opsega od oko 2x10<6>do oko 7x10<6>ćelija, uključujući, na primer oko 2,0x10<6>, 2,5x10<6>, 3,0x10<6>, 3,5x10<6>, 4,0x10<6>, 4,5x10<6>, 5,0x10<6>, 5,5x10<6>, 6,0x10<6>, 6,5x10<6>, ili 7,0 x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju B ćelija slezine CD19<+>od oko 2,74x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju B ćelija slezine CD19<+>od oko 4,30x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju B ćelija slezine CD19<+>od oko 5,53x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju B ćelija slezine CD19<+>od oko 6,18x10<6>ćelija.
[0177] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata populaciju slezinskih B ćelija CD19<+>, IgD<hi>, IgM<I0>u opsegu od oko 1x10<6>do oko 4x10<6>ćelija, uključujući, na primer oko 1,0x10<6>, 1,5x10<6>, 2,0x10<6>, 2,5x10<6>, 3,0x10<6>, 3,5x10<6>, 4,0x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži CD19<+>, IgD<hi>, IgM<Io>populaciju B ćelija slezine od oko 1,30x10<6>; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži CD19<+>, IgD<hi>, IgM<Io>populaciju B ćelija slezine od oko 2,13x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži CD19<+>, IgD<hi>, IgM<Io>populaciju B ćelija slezine od oko 3,15x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži CD19<+>, IgD<hi>, IgM<Io>populaciju B ćelija slezine od oko 3,93x10<6>ćelija.
[0178] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata populaciju B ćelija slezine CD19<+>, IgD<Io>, IgM<hi>B unutar ospega od oko 9x10<5>do oko 2x10<6>ćelija, uključujući, na primer oko 9,0x10<5>, 9,25x10<5>, 9,5x10<5>, 9,75x10<5>, 1,0x10<6>, 1,25x10<6>, 1,50x10<6>, 1,75x10<6>, 2,0x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju CD19<+>, IgD<Io>, IgM<hi>B ćelija slezine od oko 9,52x10<5>; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju B ćelija slezine CD19<+>, IgD<Io>, IgM<hi>od oko 1,23x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata populaciju B ćelija slezine CD19<+>, IgD<Io>, IgM<hi>od oko 1,40x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži populaciju B ćelija slezine CD19<+>, IgD<Io>, IgM<hi>od oko 1,42x10<6>ćelija.
[0179] U nekim realizacijama, korišćeni genetski modifikovani miš sadrži lokus lakog lanca κ imunoglobulina koji sadrži dva nepreuređena humana imunoglobulinska Vκ genska segmenta i 5 nepreuređenih humanih Jκ genskih segmenata, i pri čemu miš sadrži populaciju B ćelija periferne slezine koja sadrži prelazne (npr. T1, T2 i T3) B ćelijske populacije koje su približno iste kao i kod miša koji sadrži komplement divljeg tipa od V i J genskih segmenata imunoglobulinskog lakog lanca κ. Primeri prelaznih B ćelijskih populacija (npr., T1, T2 i T3) u slezini genetski modifikovanog miša, kao što je ovde opisano, okarakterisani su ekspresijom IgM, CD23, CD93, B220 i / ili njihove kombinacije.
[0180] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T1 B ćelijsku populaciju u slezini (npr., CD93<+>, B220<+>, lgM<hi>, CD23-) unutar opsega od oko 2x10<6>do oko 7x10<6>ćelija, uključujući, na primer, oko 2,0x10<6>, 2,5x10<6>, 3,0x10<6>, 3,5x10<6>, 4,0x10<6>, 4,5x10<6>, 5,0x10<6>, 5,5x10<6>, 6,0x10<6>, 6,5x10<6>, ili 7,0x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T1 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 2,16x10<6>ćelija; u
4
nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T1 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 3,63x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T1 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 3,91x10<6>; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T1 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 6,83x10<6>ćelija.
[0181] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T2 B ćelijsku populaciju u slezini (npr., CD93<+>, B220<+>, IgM<hi>, CD23<+>) unutar opsega od oko 1x10<6>do oko 7x10<6>ćelija, uključujući, na primer oko 1,0x10<6>, 1,5x10<6>, 2,0x10<6>, 2,5x10<6>, 3,0x10<6>, 3,5x10<6>, 4,0x10<6>, 4,5x10<6>, 5,0x10<6>, 5,5x10<6>, 6,0x10<6>, 6,5x10<6>, ili 7,0x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T2 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 1,30x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T2 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 2,46x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T2 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 3,24x10<6>; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T2 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 6,52x10<6>ćelija.
[0182] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T3 B ćelijsku populaciju u slezini (npr., CD93<+>, B220<+>, IgM<Io>, CD23<+>) unutar opsega od oko 1x10<6>do oko 4x10<6>ćelija, uključujući, na primer oko 1,0x10<6>, 1,5x10<6>, 2,0x10<6>, 2,5x10<6>, 3,0x10<6>, 3,5x10<6>, ili 4,0x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T3 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 1,08x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T3 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 1,35x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T3 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 3,37x10<6>; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata T3 B ćelijsku populaciju u slezini od oko 3,63x10<6>ćelija.
[0183] U nekim realizacijama, genetski modifikovani miš korišćen u sadašnjem pronalasku sadrži lokus lakog lanca κ imunoglobulina koji sadrži dva nereorganizovana humana imunoglobulinska Vκ genska segmenta i 5 nereorganizovanih humanih imunoglobulinskih Jκ genskih segmenata, i pri čemu miš sadrži populaciju B ćelija periferne slezine koja obuhvata granične zone i granične zone prekursorske B ćelijske populacije koje su približno iste kao miša koji sadrži komplement divljeg tipa imunoglobulinskih Vκ i Jκ genskih segmenata. Primerne populacije B ćelija marginalne zone u slezini genetski modifikovanog miša, kao što je ovde opisano, karakterisane su ekspresijom IgM, CD21/35, CD23, CD93, B220 i / ili njihove kombinacije.
[0184] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalaska obuhvata populaciju B ćelija marginalne zone u slezini (npr., CD93-, B220<+>, IgM<hi>, CD21/35<hi>, CD23-) unutar opsega od oko 1x10<6>do oko 3x10<6>ćelija, uključujući, na primer, oko 1,0x10<6>, 1,5x10<6>, 2,0x10<6>, 2,5x10<6>, ili 3,0x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalaska obuhvata populaciju B ćelija marginalne zone u slezini od oko 1,47x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalaska obuhvata populaciju B ćelija marginalne zone u slezini od oko 1,49x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalaska obuhvata populaciju B ćelija marginalne zone u slezini od oko 2,26x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalaska obuhvata populaciju B ćelija marginalne zone u slezini od oko 2,33x10<6>ćelija.
[0185] U nekim realizacijama, genetski modifikovan miš korišćen u sadašnjem pronalasku je miš koji sadrži lokus lakog lanca κ imunoglobulina koji sadrži dva nepreuređena humana imunoglobulinska Vκ genska segmenta i 5 nepreuređenih humanih imunoglobulinskih Jκ genskih segmenata, i pri čemu miš sadrži populaciju B ćelija periferne slezine koja sadrži (e) folikularnu (npr. FO-I i FO-II) B ćelijsku populaciju(e) koja je približno ista kao miša koji sadrži komplement divljeg tipa od imunoglobulinskih Vκ i Jκ genskih segmenata. Primeri folikularnih B ćelijskih populacija (npr., FO-I i FO-II) u slezini genetski modifikovanog miša, kao što je ovde opisano, karakterisane su ekspresijom IgM, IgD, CD21 / 35, CD93, B220 i / ili njihove kombinacije.
[0186] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata B ćelijsku populaciju u slezini folikularnog tipa 1 (npr., CD93-, B220<+>, CD21/35<int>, IgM<lo>, IgD<hi>) u okviru opsega od oko 3x10<6>do oko 1,5x10<7>ćelija, uključujući, na primer oko 3,0x10<6>, 3,5x10<6>, 4,0x10<6>, 4,5x10<6>, 5,0x10<6>, 5,5x10<6>, 6,0x10<6>, 6,5x10<6>, 7,0 x10<6>, 7,5x10<6>, 8,0x10<6>, 8,5x10<6>, 9,0x10<6>, 9,5x10<6>, 1,0x10<7>ili 1,5x10<7>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata B ćelijsku populaciju folikularnog tipa 1 u slezini od oko 3,57x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata B ćelijsku populaciju folikularnog tipa 1 u slezini od oko 6,31x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata B ćelijsku populaciju folikularnog tipa 1 u slezini od oko 9,42x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata B ćelijsku populaciju folikularnog tipa 1 u slezini od oko 1,14x10<7>ćelija.
[0187] U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata B ćelijsku populaciju folikularnog tipa 2 u slezini (npr., CD93-, B220<+>, CD21/35<int>, IgM<int>, IgD<hi>) u okviru opsega od oko 1x10<6>do oko 2,0x10<6>ćelija, uključujući, na primer, 1,0x10<6>, 1,25x10<6>, 1,5x10<6>, 1,75x10<6>, ili 2,0x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku
4
obuhvata B ćelijsku populaciju folikularnog tipa 2 u slezini od oko 1,14x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata B ćelijsku populaciju folikularnog tipa 2 u slezini od oko 1,45x10<6>ćelija; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata B ćelijsku populaciju folikularnog tipa 2 u slezini od oko 1,80x10<6>; u nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku obuhvata B ćelijsku populaciju folikularnog tipa 2 u slezini od oko od oko 2,06x10<6>ćelija.
[0188] U jednom aspektu, genetski modifikovani miš korišćen u sadašnjem pronalasku, gde miš eksprimira jedan rearanžirani laki lanac κ izveden iz humanog Vκ i Jκ genskog segmenta, pri čemu miš eksprimira B ćelijsku populaciju koja sadrži pojedinačni laki lanac κ izveden iz sekvence pojedinačnog preuređenog lakog lanca κ, gde genetski modifikovani miš nije bio učinjen otpornim na somatske hipermutacije. U jednoj realizaciji, najmanje 90% lakih lanaca κ eksprimiranih na B ćeliji miša ispoljava najmanje jednu do oko pet somatskih hipermutacija.
[0189] Takođe je obezbeđen genetski modifikovani miš koji je modifikovan da izražava pojedinačni laki lanac κ izveden iz sekvenci ne više od jedne, ili ne više od dve, preuređene sekvence lakog lanca κ, pri čemu miš ispoljava upotrebu lakog lanca κ koja je oko dva puta ili više, najmanje oko tri puta ili više, ili najmanje oko četiri puta ili više veća od upotrebe lakog lanca κ koji je ispoljen od strane miša divljeg tipa, ili veća od upotrebe lakog lanca κ ispoljenog od strane miša istog soja koji sadrži repertoar divljeg tipa od genskih segmentnih gena lakog lanca κ. U specifičnom slučaju, miš eksprimira pojedinačni laki lanac κ iz ne više od jedne preuređene sekvence lakog lanca κ. U još specifičnijem slučaju, preuređena sekvenca lakog lanca κ je izabrana iz sekvence Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1. U jednom slučaju, preuređena sekvenca lakog lanca κ je sekvenca Vκ1-39Jκ5. U jednom slučaju, preuređena sekvenca lakog lanca κ je sekvenca Vκ3-20Jκ1.
[0190] Takođe se odnosi na genetski modifikovanog miša koji izražava pojedinačni laki lanac κ izveden iz ne više od jedne, ili ne više od dve, preuređene sekvence lakog lanca κ, gde miš ispoljava upotrebu lakog lanca κ koja je oko 100 puta ili više, najmanje oko 200 puta ili više, najmanje oko 300 puta ili više, najmanje oko 400 puta ili više, najmanje oko 500 puta ili više, najmanje oko 600 puta ili više, najmanje oko 700 puta ili više, najmanje oko 800 puta ili više, najmanje oko 900 puta ili više, najmanje oko 1000 puta ili više veća od iste upotrebe lakog lanca κ ispoljene od strane miša koji nosi kompletan ili suštinski kompletan lokus humanog lakog lanca κ. U specifičnom slučaju, mišu koji nosi kompletan ili u suštini kompletan lokus humanog lakog lanca κ nedostaje funkcionalna neuređena sekvenca mišjeg lakog lanca κ. U specifičnom slučaju, miš eksprimira pojedinačni laki lanac κ iz ne više od jedne reorganizovane sekvence lakog lanca κ. U jednom sluičaju, miš sadrži jednu kopiju preuređene sekvence lakog
4
lanca κ (npr. heterozigot). U jednom slučaju, miš sadrži dve kopije preuređene sekvence lakog lanca κ (npr. homozigot). U još specifičnijoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca κ je izabrana od sekvence Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1. U jednoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca κ je sekvenca Vκ1-39Jκ5. U jednoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca κ je sekvenca Vκ3-20Jκ1.
[0191] Takođe se odnosi na genetski modifikovanog miša koji eksprimira pojedinačni laki lanac dobijen od ne više od jedne, ili ne više od dve reorganizovane sekvence lakog lanca, pri čemu laki lanac u genetički modifikovanom mišu ispoljava nivo ekspresije koji je najmanje 10 puta do oko 1000 puta, 100 puta do oko 1000 puta, 200 puta do oko 1000 puta, 300 puta do oko 1000 puta, 400 puta do oko 1000 puta, 500 puta do oko 1000 puta, 600 puta do oko 1 000 puta, 700 puta do oko 1000 puta, 800 puta do oko 1000 puta, ili 900 puta do oko 1000 puta viši od ekspresije istog preuređenog lakog lanca ispoljenog od strane miša koji nosi kompletan ili u suštini kompletan lokus lakog lanca. U jednom slučaju, laki lanac sadrži humanu sekvencu. U specifičnom slučaju, humana sekvenca je κ sekvenca. U jednom slučaju, humana sekvenca je λ sekvenca. U jednom slučaju, laki lanac je potpuno humani laki lanac.
[0192] U jednoj realizaciji, nivo ekspresije je karakterisan kvantitativnim određivanjem mRNK od transkriptovane sekvence lakog lanca, i njenim upoređivanjem sa transkriptovanom sekvencom lakog lanca miša koji nosi kompletan ili u suštini kompletan lokus lakog lanca.
[0193] Takođe se odnosi na genetski modifikovanog miša koji eksprimira pojedinačni laki lanac κ izveden iz ne više od jedne, ili ne više od dve, preuređene sekvence lakog lanca κ, pri čemu miš, nakon imunizacije sa antigenom, pokazuje serumski titar koji se može porediti sa mišem divljeg tipa koji je bio imunizovan sa istim antigenom. U specifičnom slučaju, miš eksprimira pojedinačni laki lanac κ od ne više od jedne preuređene sekvence lakog lanca κ. U jednom slučaju, serumski titar je okarakterisan kao ukupni imunoglobulin. U specifičnom slučaju, serumski titar je okarakterisan kao IgM specifični titar. U specifičnom slučaju, serumski titar je okarakterisan kao IgG specifični titar. U specifičnijoj realizaciji, preuređena sekvenca lakog lanca κ je izabrana od sekvence Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1. U jednom slučaju, preuređena sekvenca lakog lanca κ je sekvenca Vκ1-39Jκ5. U jednom slučaju, preuređena sekvenca lakog lanca κ je sekvenca Vκ3-20Jκ1.
[0194] Takođe se odnosi na genetski modifikovanog miša koji eksprimira populaciju antigenspecifičnih antitela, pri čemu svi imunoglobulinski laki lanci populacije antigen-specifičnih antitela obuhvataju varijabilni region humanog lakog lanca (VL) izveden iz istog pojedinačnog humanog VLgenskog segmenta i teški lanci imunoglobulina obuhvataju varijabilni region humanog teškog lanca (VH) izveden iz jednog od mnoštva humanih VHgenskih segmenata.
4
[0195] U različitim realizacijama, humani VHgenski segmenti su odabrani od VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51 i VH6-1.
[0196] U različitim realizacijama, isti pojedinačni genski segment humanog VLje izabran iz humanog Vκ1-39 genskog segmenta i humanog Vκ3-20 genskog segmenta. U različitim realizacijama, svi imunoglobulinski laki lanci obuhvataju genski segment (JL) humanog lakog lanca J izabran od Jκ i Jλ, segmenta gena. U specifičnoj realizaciji, humani JLgenski segment je izabran od humanog Jκ1 i Jκ5 genskog segmenta. U različitim realizacijama, mišu nedostaje sekvenca izabrana od VLgenskog segmenta mišjeg imunoglobulina, JLgenskog segmenta mišjeg imunoglobulina i njihove kombinacije. U različitim realizacijama, humani VLregion je operativno vezan za konstantni (CL) region humanog, mišjeg ili pacovskog imunoglobulinskog lakog lanca. U specifičnoj realizaciji, humani VLregion je operativno povezan sa Cκ regionom miša. U specifičnoj realizaciji, humani VLregion je operativno povezan sa Cκ regionom pacova.
[0197] U različitim realizacijama, humani VLregion je eksprimiran iz endogenog lokusa lakog lanca imunoglobulina. U različitim realizacijama, humani VHregion je operativno vezan za konstantni (CH) region humanog, mišjeg ili pacovskog teškog lanca imunoglobulina. U različitim realizacijama (CH) region obuhvata humanu sekvencu odabranu od CH1, šarke, CH2, CH3, CH4 i / ili njihove kombinacije. U različitim realizacijama, humani VHregion je eksprimiran iz endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina.
[0198] Takođe je obezbeđen genetski modifikovani miš koji eksprimira mnoštvo teških lanaca imunoglobulina povezanih sa jednim lakim lancem. U jednom slučaju, teški lanac sadrži humanu sekvencu. U različitim slučajevima, humana sekvenca je izabrana od varijabilne sekvence, CH1, šarke, CH2, CH3 i njihove kombinacije. U jednom slučaju, pojedinačni laki lanac sadrži humanu sekvencu. U različitim slučajevima, humana sekvenca je izabrana od varijabilne sekvence, konstantne sekvence i njihove kombinacije. U jednom slučaju, miš sadrži onesposobljeni endogeni imunoglobulinski lokus i eksprimira teški lanac i / ili laki lanac iz transgena ili ekstrahromozomalnog epizoma. U jednom slučaju, miš sadrži zamenu na endogenom mišjem lokusu nekih ili svih endogenih genskih segmenata teškog lanca miša (tj. V, D, J) i / ili nekih ili svih endogenih konstantnih sekvenci teškog lanca miša (npr., CH1, zglob, CH2, CH3, ili njihova kombinacija), i / ili neke ili sve endogene sekvence lakog lanca miša (npr., V, J, konstantan, ili njihova kombinacija), sa jednom ili više humanih imunoglobulinskih sekvenci.
4
[0199] U jednom aspektu, korišćen je miš pogodnan za izradu antitela koja imaju isti laki lanac, pri čemu su sva ili suštinski sva antitela napravljena u mišu eksprimirana sa istim lakim lancem. U jednoj realizaciji, laki lanac je eksprimiran iz lokusa endogenog lakog lanca.
[0200] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za izradu lakog lanca za humano antitelo, koji obuhvata dobijanje od miša, kao što je ovde opisano, sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca, i korišćenje sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca u izradi humanog antitela. U jednoj realizaciji, humano antitelo je bispecifično antitelo.
[0201] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za identifikovanje humanog varijabilnog domena teškog lanca koji je sposoban za vezivanje antigena od interesa sa konstruisanim lakim lancem, kao što je ovde opisano, pri čemu postupak sadrži obezbeđivanje varijabilnog domena teškog lanca izvedenog iz prvog antitela koji je sposoban za vezivanje antigena, popravljanje varijabilnog domena teškog lanca sa sekvencom lakog lanca germinativne linije i transfektovanje ćelije tako da je svaki eksprimiran da formira drugo antitelo, izlažući drugo antitelo antigenu, i merenjem vezivanja drugog antitela za antigen.
[0202] U jednoj realizacioji, laki lanac prvog antitela sadrži humanu sekvencu Vκ1-39. U jednoj realizaciji, laki lanac prvog antitela sadrži humanu sekvencu Vκ3-20. U jednoj realizaciji, sekvenca lakog lanca germinativne linije sadrži humanu sekvencu Vκ1-39 ili Vκ3-20. U različitim realizacijama, vezivanje drugog antitela za antigen je određeno poređenjem vezivanja prvog antitela sa antigenom.
[0203] Bilo koja od realizacija i aspekti koji su ovde opisani, mogu biti korišćeni zajedno jedni sa drugima, osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili očigledno iz konteksta. Druge realizacije će postati jasne onima koji su stručni u stanje tehnike iz pregleda sledećeg opisa.
KRATAK OPIS SLIKA
[0204]
SL. 1 ilustruje strategiju ciljanja za zamenu endogenih mišjih genskih segmenata varijabilnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca sa humanim genskim regionom Vκ1-39Jκ5.
SL. 2 ilustruje strategiju ciljanja za zamenu endogenih mišjih genskih segmenata varijabilnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca sa humanim genskim regionom Vκ3-20Jκ1.
SL. 3 ilustruje strategiju ciljanja za zamenu endogenih mišjih genskih segmenata
4
varijabilnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca sa humanim genskim regionom VpreB/Jλ5.
SL. 4 prikazuje procenat CD19<+>B ćelija (y-osa) iz periferne krvi za miševe divljeg tipa (WT), miševe homozigotne za konstruisani humani preuređeni region Vκ1-39Jκ5 lakog lanca (Vκ1-39Jκ5 HO) i miševe homozigotne za konstruisani humani preuređeni region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 (Vκ3-20Jκ1 HO).
SL. 5A prikazuje relativnu ekspresiju mRNK (y-osa) od lakog lanca izvedenog od Vκ1-39 u kvantitativnom PCR testu, upotrebom proba specifičnih za spajanje konstruisanog humanog preuređenog regiona lakog lanca Vκ1-39Jκ5 (proba za spajanje Vκ1-39Jκ5) i humanog Vκ1-39 genskog segmenta (proba Vκ1-39) kod miša homozigotnog za zamenu endogenih Vκ i Jκ genskih segmenata sa humanim Vκ i Jκ genskim segmentima (Hκ), divljeg tipa miša (WT), i miša heterozigotnog za konstruisani humani preuređeni region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 (Vκ1-39Jκ5 HET). Signali su normalizovani za ekspresiju mišjeg Cκ. N.D .: nije detektovano.
SL. 5B prikazuje relativnu ekspresiju mRNK (y-osa) lakog lanca izvedenog od Vκ1-39 u kvantitativnom PCR testu, upotrebom proba specifičnih za spajanje konstruisanog humanog preuređenog regiona lakog lanca Vκ1-39Jκ5 (proba za spajanje Vκ1-39Jκ5) i humanog Vκ1-39 genskog segmenta (proba Vκ1-39) u mišu homozigotnom za zamenu endogenih Vκ i Jκ genskih segmenata sa humanim Vκ i Jκ genskim segmentima (Hκ), kod miša divljeg tipa (WT), i mišu homozigotnom za konstruisani humani preuređeni region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 (Vκ1-39Jκ5 HO). Signali su normalizovani na ekspresiju mišjeg Cκ.
SL. 5C prikazuje relativnu ekspresiju mRNK (y-osa) lakog lanca izvedenog iz Vκ3-20 u kvantitativnom PCR testu, upotrebom proba specifičnih za spajanje konstruisanog humanog preuređenog regiona lakog lanca Vκ3-20Jκ1 (proba za spajanje Vκ3-20Jκ1) i humanog Vκ3-20 genskog segmenta (proba Vκ3-20) kod miša homozigotnog za zamenu endogenih Vκ i Jκ genskih segmenata sa humanim Vκ i Jκ genskim segmentima (Hκ), kod miša divljeg tipa (VT), i miša heterozigotnog (HET) i homozigotnog (HO) za konstruisani humani preuređeni region lakog lanca Vκ3-20Jκ1. Signali su normalizovani na ekspresiju mišjeg Cκ.
SL. 6A prikazuje IgM (levo) i IgG (desno) titar kod divljeg tipa (WT; N = 2) i miševa homozigotnih za konstruisani humani preuređeni region Vκ1-39Jκ5 lakog lanca (Vκ1-39Jκ5 HO; N = 2) imunizovanih sa ß-galatozidazom.
SL. 6B prikazuje titar ukupnog imunoglobulina (IgM, IgG, IgA) kod divljeg tipa (WT; N = 5) i miševa homozigotnih za konstruisani humani preuređeni region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 (Vκ3-20Jκ1 HO; N = 5) imunizovanih sa ß-galatozidazom.
SL. 7A prikazuje shemu monospecifičnih antitela (Roditeljsko-1 i Roditeljsko-2) i bispecifičnog antitela (bispecifično) konstruisanih od varijabilnih regiona teškog lanca od svakog roditeljskog monospecifičnog antitela. Zajednički varijabilni region lakog lanca (zatamnjeno) je naznačen u bispecifičnom antitelu.
SL. 7B prikazuje shematski prikaz za karakteristike vezivanja dva matična monoklonska antitela (Roditeljsko-1 i Roditeljsko-2) za antigen od interesa, kao i karakteristika vezivanja bispecifičnog antitela konstruisanog uparivanjem varijabilnih regiona teškog lanca od svakog monospecifičnog roditeljskog antitela sa zajedničkim lakim lancem. Naznačena je sposobnost bispecifičnog antitela da se vezuje za dva različita epitopa antigena od interesa ili odvojeno (dole levo) ili istovremeno (dole desno).
SL. 8 prikazuje grafičke barove vezivanja 300nM bispecifičnih (zatamnjeni barovi) i monospecifičnih (trakasti i sivi barovi) antitela za uhvaćenu površinu monomernog Antigena E u BIACORE ™ jedinicama (RU). Naznačena su monoklonsko roditeljsko-1 antitelo (P1 At), monoklonsko roditeljsko-2 (P2 At) i bispecifična antitela (BsAt).
SL. 9 prikazuje dva genetički modifikovana endogena lokusa imunoglobulinskog lakog lanca (npr. lakog lanca κ). Lokus na vrhu (DLC-5J) sadrži konstruisani humani fragment DNK (prugasta linija) koji sadrži dva humana Vκ genska segmenta i pet humanih Jκ genskih segmenata. Lokus na dnu (DLC-1J) sadrži konstruisani humani fragment DNK (trakasta linija) koji sadrži dva humana Vκ genska segmenta i jedan humani Jκ genski segment. Svaki lokus je sposoban za preuređivanje da obrazuje humani Vκ region operativno povezan sa endogenim konstantnim regionom lakog lanca (npr. Cκ). Prikazani su imunoglobulinski promoteri (strelica iznad lokusa), liderski egzoni (zatvorene strelice) i dva humana Vκ genska segmenta (otvorene strelice), svi okruženi ushodno (5') neomicinskom kasetom koja sadrži Frt rekombinaciona mesta. Rekombinacione signalne sekvence konstruisane sa svakim od humanih genskih segmenata (Vκ i Jκ) su označene otvorenim ovalima naporedo sa svakim segmentom gena.
SL. 10A, u gornjem panelu, prikazuje reprezentativne oblike dijagrama od koštane srži obojene za B i T ćelije (CD19<+>i CD3<+>, respektivno) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J). Donji panel prikazuje reprezentativne oblike dijagrama koštane srži zadržane na CD19<+>i obojene za ckit<+>i CD43<+>iz miša divljeg tipa (WT) i homozigotnоg miša za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J). Pro i Pre B ćelije su zabeležene na
1
konturama dijagrama donjeg panela.
SL. 10B prikazuje broj Pro (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i Pre (CD19<+>CD43<->ckit-) B ćelija u koštanoj srži sakupljenih iz femura miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J).
SL. 11A prikazuje reprezentativne oblike dijagrama od koštane srži sakupljene na singletima bojenim za imunoglobulin M (IgM) i B220 od miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J). Nezrele, zrele i pro / pre B ćelije su zabeležene na svakom od oblika dijagrama.
SL. 11B prikazuje ukupan broj B (CD19<+>), nezrelih B (B220<int>IgM<+>) i zrelih B (B220<hi>IgM<+>) ćelija u koštanoj srži izolovanih iz femura miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J).
SL. 12A prikazuje reprezentativne oblike dijagrama od koštane srži sakupljene na singletima obojenim za imunoglobulin M (IgM) i B220 iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J). Nezrele, zrele i pro / pre B ćelije su zabeležene na svakom od oblika dijagrama.
SL. 12B prikazuje reprezentativne oblike dijagrama od koštane srži sakupljene na nezrelim (B220<int>IgM<+>) i zrelim (B220<hi>IgM<+>) B ćelijama obojenim za ekspresiju Igλ i Igκ izolovanih iz femura miša divljeg tipa (WT) i homozigotnog miša za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J).
SL. 13A, u gornjem panelu, prikazuje reprezentativne oblike dijagrama splenocita sakupljenih na singletima i obojenim za B i T ćelije (CD19<+>i CD3<+>, respektivno) od miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J). Donji panel prikazuje reprezentativne konturne dijagrame splenocita sakupljene na CD19<+>i obojene za imunoglobulin D (IgD) i imunoglobulin M (IgM) iz miša divljeg tipa (WT) i homozigotnog miša za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J). Zrele (54 za WT, 56,9 za DLC-5J) i prelazne (23,6 za WT, 25,6 za DLC-5J) B ćelije su zabeležene na svakom od konturnih dijagrama.
SL. 13B prikazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija, tranzicionih B ćelija (CD19<+>IgM<hi>IgD<lo>) i zrelih B ćelija (CD19<+>IgM<lo>IgD<hi>) u sakupljenim slezinama od miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J).
SL. 14A prikazuje reprezentativne konturne dijagrame od Igλ<+>i Igκ<+>splenocita sakupljenih na CD19<+>od miša divljeg tipa (WT) i mišjeg homozigota za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J).
SL. 14B prikazuje ukupan broj B ćelija (CD19<+>), Igκ<+>B ćelija (CD19<+>Igκ<+>) i Igλ<+>B ćelija
2
(CD19<+>Igλ<+>) u sakupljenim slezinama od miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J).
SL. 15A prikazuje razvoj perifernih B ćelija kod miševa homozigotnih za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata. Prvi (krajnje levi) konturni dijagram prikazuje CD93<+>i B220<+>splenocite zaustavljene na CD19<+>koji ukazuju na nezrele (39,6) i zrele (57,8) B ćelije. Drugi (gornji srednji) oblik dijagrama prikazuje ekspresiju IgM<+>i CD23<+>u nezrelim B ćelijama ukazujući na T1 (33,7; IgD-IgM<+>CD21<lo>CD23-), T2 (21,2; IgD<hi>IgM<hi>CD21<mid>CD23<+>) i T3 (29,1) B ćelijske populacije. Treći (donji srednji) oblik dijagrama prikazuje ekspresiju CD21<+>(CD35<+>) i IgM<+>zrelih B ćelija, ukazujući na malu populaciju (14,8) koja dovodi do porasta B ćelija granične zone i druge populacije (70,5) koja dovodi do porasta folikularnih (FO) B ćelija. Četvrti (gornji desni) konturni dijagram prikazuje ekspresiju B220<+>i CD23<+>u zrelim B ćelijama, ukazujući na marginalnu zonu (90,5; MZ) i prekursora marginalne zone (7,3; IgM<hi>IgD<hi>CD21<hi>CD23<+>) B ćelijske populacije. Peti (donji desni) konturni dijagram prikazuje ekspresiju IgD<+>i IgM<+>u zrelim B ćelijama, ukazujući na FO-I (79,0; IgD<hi>IgM<lo>CD21<mid>CD23<+>) i FO-II (15,1; IgD<hi>IgM<hi>CD21<mid>CD23<+>) B ćelijske populacije. Prikazan je procenat ćelija unutar svakog zatvorenog regiona.
SL. 15B prikazuje razvoj perifernih B ćelija kod miševa divljeg tipa. Prvi (krajnje levi) konturni dijagram prikazuje CD93<+>i B220<+>splenocite sakupljene na CD19<+>koji ukazuju na nezrele (31,1) i zrele (64,4) B ćelije. Drugi (gornji srednji) konturni dijagram pokazuje ekspresiju IgM<+>i CD23<+>u nezrelim B ćelijama, ukazujući na T1 (28,5; IgD-IgM<+>CD21<lo>CD23-), T2 (28,7; IgD<hi>IgM<hi>CD21<mid>CD23<+>) i T3 (30,7) B ćelijske populacije. Treći (donji srednji) konturni dijagram prikazuje ekspresiju CD21<+>(CD35<+>) i IgM<+>zrelih B ćelija, ukazujući na malu populaciju (7,69) koja daje porast B ćelija marginalne zone i drugu populaciju (78,5) koja daje porast folikularnih (FO) B ćelija. Četvrti (gore desno) konturni dijagram prikazuje ekspresiju B220<+>i CD23<+>u zrelim B ćelijama, ukazujući na marginalnu zonu (79,9; MZ) i prekursora marginalne zone (19,4; IgM<hi>IgD<hi>CD21<hi>CD23+) populacije B ćelija. Peti (dole desno) konturni dijagram prikazuje ekspresiju IgD<+>i IgM<+>u zrelim B ćelijama, ukazujući na FO-I (83,6; IgD<hi>IgM<lo>CD21<mid>CD23<+>) i FO-II (13,1; IgD<hi>IgM<hi>CD21<mid>CD23<+>) B ćelijske populacije. Prikazan je procenat ćelija unutar svakog zatvorenog regiona.
SL. 16 prikazuje ukupan broj prelaznih, marginalne zone i folikularnih B ćelijskih populacija u sakupljenim slezinama miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za dva humana Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J).
SL. 17 prikazuje relativnu ekspresiju mRNK u koštanoj srži (y-osa) od Vκ3-20-izvedenih i Vκ1-39-izvedenih lakih lanaca u kvantitativnom PCR testu koristeći probe specifične za Vκ3-20 ili Vκ1-39 segmente gena kod miševa homozigotnih za zamenu endogenih Vκ i Jκ genskih segmenata sa humanim Vκ i Jκ genskim segmentima (Hκ), miševa divljeg tipa (WT), miševa homozigotnih za dva humana Vκ genska segmenta i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J) i miševa homozigotnih za dva humana Vκ genska segmenta i jedan humani Jκ genski segment (DLC-1J). Signali su normalizovani na ekspresiju mišjeg Cκ. ND: nije detektovano.
SL. 18 prikazuje relativnu ekspresiju mRNK u celokupnim slezinama (y-osa) od Vκ3-20-izvedenih i Vκ1-39-izvedenih lakih lanaca u kvantitativnom PCR testu upotrebom proba specifičnih za Vκ3-20 ili Vκ1-39 genske segmente kod miševa homozigotnih za zamenu endogenih Vκ i Jκ genskih segmenata sa humanim Vκ i Jκ genskim segmentima (Hκ), miševa divljeg tipa (WT), miševa homozigotnih za dva humana Vκ genska segmenta i pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J) i miševa homozigotnih za dva humana Vκ genska segmenta i jedan humani Jκ genski segment (DLC-1J). Signali su normalizovani na ekspresiju mišjeg Cκ. ND: nije detektovano.
SL. 19 prikazuje opštu ilustraciju rekombinacije genskih segmenta V i J alela lakog lanca imunoglobulina u mišu i strukture lokusa lakog lanca pre preuređivanja (vrh) i nakon preuređivanja (dno). Takvo preuređivanje, kao što je prikazano samo je jedno od nekoliko mogućih događaja preuređivanja.
DETALJAN OPIS
[0205] Ovaj pronalazak nije ograničen na posebne metode i opisane eksperimentalne uslove, pošto takve metode i uslovi mogu varirati. Takođe treba razumeti da se ovde korišćena terminologija koristi samo za opisivanje određenih realizacija, a nije namenjena da bude ograničavajuća, pošto je obim sadašnjeg pronalaska definisan patentnim zahtevima.
[0206] Ukoliko nije drugačije definisano, svi izrazi i fraze ovde korišćene obuhvataju značenja koja su izrazi i fraze postigli u struci, osim ako je suprotno jasno naznačeno ili jasno očigledno iz konteksta u kome se koristi izraz ili fraza. Mada se bilo koje metode i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, mogu koristiti u praksi ili ispitivanju sadašnjeg pronalaska, sada su opisane posebne metode i materijali.
[0207] Izraz "antitelo", kao što se ovde koristi, uključuje imunoglobulinske molekule koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana
4
disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i konstantni region teškog lanca (CH). Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) i konstantni region lakog lanca (CL). VHi VLregioni mogu dalje, biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti, nazvane regionima za određivanje komplementarnosti (CDR), rasute sa regionima koji su više konzervirani, nazvani okvirnim regionima (FR). Svaki VHi VLsadrže tri CDR regiona i četiri FR regiona, raspoređenih od amino završetka do karboksi završetka prema sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDR regioni teškog lanca, mogu biti skraćeni kao HCDR1, HCDR2 i HCDR3; CDR-ovi lakog lanca, mogu biti skraćeni kao LCDR1, LCDR2 i LCDR3. Izraz antitelo "visokog afiniteta" se odnosi na antitelo koje ima KDu odnosu na njegov ciljni epitop oko 10<-9>M ili nižu (npr., oko 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, ili oko 1 x 10<-12>M). U jednoj realizaciji, KDje izmerena pomoću površinske plazmonske rezonance, npr. BIACORE ™; u sledećoj realizaciji, KDje izmerena pomoću ELISA tehnike.
[0208] Izraz "bispecifično antitelo" se odnosi na antitelo sposobno za selektivno vezivanje dva ili više epitopa. Bispecifična antitela uključuju fragmente dva različita monoklonska antitela (Slika 7A) i generalno sadrže dva teška lanca koja nisu identična, izvedena iz dva različita monoklonska antitela, pri čemu svaki teški lanac specifično vezuje drugi epitop - ili na dva različita molekula (npr. različiti epitopi na dva različita imunogena; videti Sliku 7B, dole levo) ili na istom molekulu (npr., različiti epitopi na istom imunogenu; videti Sliku 7B, dole desno). Ako je bispecifično antitelo sposobno za selektivno vezivanje dva različita epitopa (prvog epitopa i drugog epitopa), afinitet prvog teškog lanca za prvi epitop će generalno biti najmanje jedan do dva ili tri ili četiri ili više redova veličine niži od afiniteta prvog teškog lanca za drugi epitop, i obrnuto. Epitopi koji su specifično vezani od strane bispecifičnog antitela, mogu biti na istom ili različitom cilju (npr., na istom ili različitom proteinu; videti sliku 7B). Primeri bispecifičnih antitela, uključuju ona sa prvim teškim lancem specifičnim za tumorski antigen i drugim teškim lancem specifičnim za citotoksični marker, npr., Fc receptor (npr. FcγRI, FcγRII, FcγRIII, itd.) ili T ćelijski marker (npr., CD3, CD28, itd.). Dalje, varijabilni region drugog teškog lanca može biti supstituisan sa varijabilnim regionom teškog lanca koji ima različitu željenu specifičnost. Na primer, bispecifično antitelo sa prvim teškim lancem specifičnim za tumorski antigen i drugim teškim lancem specifičnim za toksin može biti upareno tako da se toksin (npr. saporin, vinka alkaloid, itd.) isporuči u tumorsku ćeliju. Druga primerna bispecifičnih antitela uključuju, ona sa prvim teškim lancem specifičnim za aktivirajućeg receptora (npr., B ćelijskog receptora, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcαRI, receptora T ćelija, itd.) i drugim teškim lancem specifičnim za inhibitornog receptora (npr., FcγRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a, itd.). Takva bispecifična antitela mogu biti konstruisana za terapeutska stanja koja su povezana sa aktivacijom ćelija (npr. alergija i astma). Bispecifična antitela mogu biti izrađena, na primer, kombinovanjem teških lanaca koji prepoznaju različite epitope istog ili različitog imunogena (Slika 7B). Na primer, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijabilne sekvence teškog lanca koje prepoznaju različite epitope istog ili različitog imunogena, mogu biti fuzionisane sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju iste ili različite konstantne regione teškog lanca, i takve sekvence mogu biti eksprimirane u ćeliji koja eksprimira laki lanac imunoglobulina. Tipično, bispecifično antitelo ima dva teška lanca od kojih svaki ima tri CDR regiona teškog lanca, praćena pomoću (N-završetka do C-završetka) CH1 domena, spoja, CH2 domena i CH3 domena i imunoglobulinski laki lanac koji ili ne daje specifičnost vezivanja epitopa, ali se može povezati sa svakim teškim lancem, ili se može povezati sa svakim teškim lancem i može vezati jedan ili više epitopa vezanih pomoću regiona teškog lanca za vezivanje epitopa, ili se može povezati sa svakim teškim lancem i omogućiti vezivanje ili jednog ili oba teška lanca za jedan ili oba epitopa.
[0209] Izraz "ćelija" uključuje, bilo koju ćeliju koja je pogodna za ekspresiju rekombinantne sekvence nukleinske kiseline. Ćelije uključuju one od prokariota i eukariota (jednoćelijske ili višestruke ćelije), bakterijske ćelije (npr., sojeve E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., itd.), ćelije mikobakterija, ćelije gljivica, ćelije kvasca (npr., S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), biljne ćelije, ćelije insekata (npr., SF-9, SF-21, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), ne-humane životinjske ćelije, humane ćelije ili fuzije ćelija kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim primerima, ćelija je humana, majmunska, majmunska, hrčkova, pacovska ili mišja ćelija. U nekim primerima, ćelija je eukariotska i izabrana je od sledećih ćelija: CHO (npr., CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), retinalne ćelije, Vero, CV1, bubrežne (npr., HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (npr., BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalne), CV-1, U937, 3T3, L ćelije, C127 ćelije, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertolijeve ćelije, BRL 3A ćelije, HT1080 ćelije, mijelomske ćelije, tumorske ćelije i ćelijska linija je izvedena iz gore pomenute ćelije. U nekim realizacijama, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. ćelija retine koja eksprimira virusni gen (npr., PER.C6 ™ ćelija).
[0210] Fraza "region za određivanje komplementarnosti", ili izraz "CDR," uključuje aminokiselinsku sekvencu kodiranu sekvencom nukleinske kiseline imunoglobulinskih gena organizma, koja se normalno (tj. kod divljeg tipa životinje) pojavljuje između dva okvirna regiona, u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca imunoglobulinskog molekula (npr.
antitelo ili T ćelijski receptor). CDR može biti kodiran, na primer, sekvencom germinativne linije ili preuređenom ili neuređenom sekvencom, i, na primer, naivnom ili zrelom B ćelijom ili T ćelijom. CDR može biti somatski mutiran (npr., varira od sekvence kodirane u germinatiovnoj liniji životinje), humanizovan i / ili modifikovan sa aminokiselinskim supstitucijama, dodacima ili delecijama. U nekim okolnostima (npr. za CDR3), CDR regioni mogu biti kodirani od strane dve ili više sekvenci (npr. sekvence germinativne linije) koje nisu susedne (npr. u neuređenim sekvencama nukleinske kiseline), ali su susedne u sekvenci nukleinske kiseline B ćelije npr. kao rezultat spajanja ili povezivanja sekvenci (npr., V-D-J rekombinacija da obrazuje CDR3 teškog lanca).
[0211] Izraz "konzervativan", kada je korišćen za opisivanje konzervativne aminokiselinske supstitucije, uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka sa drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski promeniti funkcionalna svojstva proteina od interesa, na primer, sposobnost varijabilnog regiona da specifično vezuje ciljni epitop sa željenim afinitetom. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima, uključuju alifatične bočne lance, kao što su glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; alifatično-hidroksilne bočne lance, kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amid, kao što su asparagin i glutamin; aromatične bočne lance, kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; osnovne bočne lance, kao što su lizin, arginin i histidin; kiselinske bočne lance, kao što su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i bočne lance koji sadrže sumpor, kao što su cistein i metionin. Konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. U nekim realizacijama, konzervativna aminokiselinska supstitucija može biti supstitucija bilo kojeg nativnog ostatka u proteinu sa alaninom, kao što je korišćeno u, na primer, alanin skenirajućoj mutagenezi. U nekim realizacijаma, izvršena je konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 log-verovatnoj matrici opisanoj od strane Gonnet i sar. (1992) Iscrpna podudarnost celokupne baze podataka sekvence proteina, Science 256: 1443-45. U nekim realizacijama, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija, gde supstitucija ima vrednost koja nije negativna u PAM250 log-verovatnoj matrici.
[0212] U nekim realizacijama, položaji ostataka u imunoglobulinskom lakom lancu ili teškom lancu se razlikuju pomoću jedne ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. U nekim realizacijama, položaji ostataka u lakom lancu imunoglobulina ili njegovom funkcionalnom fragmentu (npr. fragment koji dozvoljava ekspresiju i sekreciju iz, na primer, B ćelija) nisu identični lakom lancu čija je aminokiselinska sekvenca ovde navedena, ali se razlikuju pomoću jedne ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija.
[0213] Fraza "epitop-vezujući protein" uključuje jedan protein koji ima najmanje jedan CDR i koji je sposoban za selektivno prepoznavanje epitopa, npr., sposoban je za vezivanje epitopa sa KDkoja je oko jedan mikromola ili niža (npr., KDkoja je oko 1 x 10<-6>M, 1 x 10<-7>M, 1 x 10<-8>M, 1 x 10<-9>M, 1 x 10<-10>M, 1 x 10<-11>M, ili oko 1 x 10<-12>M). Terapeutski epitop-vezujući proteini (npr., terapeutska antitela) često zahtevaju KDkoja je u nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu.
[0214] Fraza "funkcionalni fragment" uključuje, fragmente epitop-vezujućih proteina koji se mogu eksprimirati, izlučiti i specifično vezati za epitop sa KDu mikromolarnom, nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu. Specifično prepoznavanje uključuje posedovanje KDkoja je najmanje u mikromolarnom opsegu, nanomolarnom opsegu ili pikomolarnom opsegu.
[0215] Izraz "germinativna linija" uključuje referencu sa sekvencom imunoglobulinske nukleinske kiseline u ćeliji koja nije somatski mutirana, npr., ne-somatski mutirane B ćelije ili pre-B ćelije ili hematopoetske ćelije.
[0216] Izraz "teški lanac" ili "teški lanac imunoglobulina" uključuje sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma. Varijabilni domeni teškog lanca uključuju tri CDR-a teškog lanca i četiri FR regiona, osim ukoliko nije drugačije specifikovano. Fragmenti teških lanaca, uključuju CDR-ove, CDR-ove i FR-ove i njihove kombinacije. Tipični teški lanac ima, prateći varijabilni domen (od N-terminala do C-terminala), CH1 domen, zglob, CH2 domen i CH3 domen. Funkcionalni fragment teškog lanca uključuje fragment koji je sposoban da specifično prepoznaje epitop (npr., prepoznaje epitop sa KDu mikromolarnom, nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu), koji je sposoban za eksprimiranje i sekretovanje iz ćelije, i koji obuhvata najmanje jedan CDR.
[0217] Izraz "identitičnost" kada je korišćen u vezi sa sekvencom, uključuje identičnost, kao što je određeno brojnim različitim algoritmima poznatim u struci, koji mogu biti korišćeni za merenje identičnosti nukleotidne i / ili aminokiselinske sekvence. U nekim realizacijama koje su ovde opisane, identičnosti su određene korišćenjem ClustalW v.1.83 (sporog) poravnanja koristeći kaznu otvorene praznine od 10,0, kaznu produžene praznine od 0,1, i koristeći matricu sličnosti Gonneta (MACVECTOR ™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužina sekvenci poređena u odnosu na identičnost sekvenci zavisiće od određenih sekvenci, ali u slučaju konstantnog domena lakog lanca, dužinu treba da sadrži sekvenca dovoljne dužine da se uvije u konstantni domen lakog lanca koji je sposoban za samopovezivanje da obrazuje pravilan konstantni domen lakog lanca, npr. sposoban da obrazuje dva beta lista koji sadrže beta lance i koji je sposoban za interakciju sa najmanje jednim CH1 domenom čoveka ili miša. U slučaju CH1 domena, dužinu sekvence treba da sadrži sekvenca dovoljne dužine da se uvije u CH1 domen koji je sposoban da formira dva beta lista koja sadrže beta lance i koji je spospoban da stupi u interakciju sa najmanje jednim konstantnim domenom lakog lanca miša ili čoveka.
[0218] Fraza "molekul imunoglobulina" uključuje dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina. Teški lanci mogu biti identični ili različiti, a laki lanci mogu biti identični ili različiti.
[0219] Fraza "laki lanac" uključuje sekvencu lakog lanca imunoglobulina iz bilo kog organizma, i ukoliko nije drugačije specifikovano uključuje humane κ i λ lake lance i VpreB, kao i surogatne lake lance. Varijabilni domeni lakog lanca (VL) tipično uključuju, tri CDR-a lakog lanca i četiri okvirna (FR) regiona, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Generalno, laki lanac pune dužine uključuje, od amino terminusa do karboksilnog terminusa, jedan VLdomen koji uključuje FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 i konstantni domen lakog lanca. Laki lanci uključuju one, npr. koji ne vezuju selektivno bilo prvi ili drugi epitop selektivno vezan od strane epitop-vezujućeg proteina u kojem se pojavljuju. Laki lanci takođe, uključuju one koji vezuju i prepoznaju, ili pomažu teškom lancu sa vezivanjem i prepoznavanjem, jednog ili više epitopa selektivno vezanih od strane epitop-vezujućeg proteina u kojem se oni pojavljuju. Zajednički laki lanci su oni izvedeni iz preuređene humane sekvence Vκ1-39Jκ5 ili preuređene humane Vκ3-20Jκ1 sekvence, i uključuju somatski mutirane (npr. afinitetno zrele) verzije.
[0220] Izraz "mikromolarni opseg" je određen da označava 1-999 mikromolaran; izraz "nanomolarni opseg" je određen da označava 1-999 nanomolaran; izraz "pikomolarni opseg" je određen da označava 1-999 pikomolaran.
[0221] Fraza "somatski mutiran" uključuje pozivanje na sekvencu nukleinske kiseline iz B ćelije koja je bila podvrgnuta promeni klase, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline imunoglobulinskog varijabilnog regiona (npr. varijabilni domen teškog lanca ili uključujući CDR ili FR sekvencu teškog lanca) u B ćeliji promenjene klase nije identična sa sekvencom nukleinske kiseline u B ćeliji pre promene klase, kao što je, na primer, razlika u CDR ili okviru sekvence nukleinske kiseline između B ćelije koja nije podvrgnuta klasnom-prebacivanju i B-ćelije koja je bila podvrgnuta promeni klase. "Somatski mutiran" uključuje referencu na sekvence nukleinskih kiselina iz B ćelija koje su afinitetno zrele i koje nisu identične sa odgovarajućim sekvencama varijabilnog regiona imunoglobulina u B ćelijama koje nisu afinitetno sazrele (tj. sekvence u genomu ćelija germinativne linije). Fraza "somatski mutiran" takođe, uključuje referencu na sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona imunoglobulina iz B ćelije, nakon izlaganja B ćelije epitopu od interesa, pri čemu se sekvenca nukleinske kiseline razlikuje od odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline pre izlaganja B ćelije epitopu od interesa. Fraza "somatski mutiran" se odnosi na sekvence iz antitela koja su generisana u životinji, npr. miša koji ima sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona humanog imunoglobulina, u odgovoru prema imunogenom izazivanju, i koja su rezultat procesa selekcije koji su inherentno operativni kod takve životinje.
[0222] Izraz "nepreuređen", u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline, uključuje sekvence nukleinske kiseline koje postoje u germinativnoj liniji životinjske ćelije.
[0223] Fraza "varijabilni domen" uključuje, aminokiselinsku sekvencu lakog ili teškog lanca imunoglobulina (modifikovanog kao što se želi) koji sadrži sledeće regione aminokiselina, u sekvenci od N-terminala do C-terminala (osim ukoliko nije drugačije naznačeno): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
Univerzalni laki lanac
[0224] Prethodni pokušaji da se izrade korisni multispecifični epitop-vezujući proteini, npr. bispecifična antitela, sprečavani su različitim problemima koji često dele zajedničku paradigmu: in vitro selekciju ili manipulaciju sekvencama da racionalno konstruišu, ili da konstruišu putem pokušaja i greške, jedan pogodan format za uparivanje heterodimernog bispecifičnog humanog imunoglobulina. Nažalost, većina, ako ne i svi in vitro pristupi konstruisanja, obezbeđuju uglavnom ad hoc ispravke koje su pogodne, ako uopšte, za pojedinačne molekule. S druge strane, in vivo metode za angažovanje kompleksnih organizama da bi se izabrala odgovarajući parovi koji su sposobni da dovedu do humanih terapeutika nisu realizovane.
[0225] U struci su poznati miševi koji sadrže humane imunoglobulinske lokuse, varijabilne i konstantne regione slučajno ubačene u mišji genom. Početni sojevi takvih miševa su sadržali ograničeni broj genskih segmenata humanog imunoglobulina. Specifično, nekolicina sojeva koji sadrže humane imunoglobulinske segmente gena lakog lanca je sadržala ili jedan, tri ili četiri humana imunoglobulinska VLgenska segmenta i pet humanih imunoglobulinskih JLgenskih segmenata (Taylor i sar., 1992, Nucleic Acids Research 20 (23): 6287-6295; Fishwild i sar., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851, Lonberg i sar., 1994, Nature 368: 856-859; Green i sar., 1994, Nature Genetics 7: 13-21, Green i Jakobovits 1998, J. Exp. Med. 188(3): 483-495; Green 1999, J. Immunol. Methods 231: 11-23). Ovi miševi koji su sadržali samo nekoliko humanih imunoglobulinskih VLgenskih segmenata kao deo potpuno humanih transgena nasumično ubačenih u mišji genom, pokazali su kompromisni broj B ćelija, oštećeni razvoj B ćelija i druge imunološke nedostatke. Ekspresija humanih imunoglobulinskih VLgena, kao što je otkriveno površinskom ekspresijom humanog Cκ na B ćelijama, bila je niža od endogenog lakog lanca κ, u poređenju sa divljim tipom. Iznenađujuće, sadašnji pronalazak obezbeđuje miševe čiji broj B ćelija i razvoj je skoro divljeg tipa u pogledu kada su miševi konstruisani na lokusima endogenog imunoglobulinskog lakog lanca κ da sadrže ili jedan ili dva humana imunoglobulinska Vκ genska segmenta (npr. Primeri 2 i 14, Tabele 3, 25 i 26, i Slike 4, 10A-18). Dalje, u nekim realizacijama, miševi obezbeđeni prema sadašnjem pronalasku, sposobni su da generišu nekoliko visoko-afinitetnih reverznih himernih antitela koja sadrže humane VHi VLdomene u odgovoru na antigen, pri čemu svaki od VLdomena sadrži jedan od dva moguća humana VLgenska segmenta i jedan od pet mogućih humanih JLgenskih segmenata (npr. videti Primere 5-10, 12 i 14). Stoga, za razliku od preliminarnih sojeva miševa konstruisanih sa mini lokusima lakog lanca humanog imunoglobulina (tj. ograničenim brojem genskih segmenata humanog imunoglobulina), trenutno obezbeđeni konstruisani miševi koji sadrže ograničeni broj humanih imunoglobulinskih VLgenskih segmenata (dva) i 5 humanih imunoglobulinskih JLgenskih segmenata, iznenađujuće su ispoljili normalan broj B ćelija, normalnu ekspresiju lakog lanca imunoglobulina i normalan razvoj B ćelija. Dalje, takvi obezbeđeni miševi takođe, ne pokazuju smanjenu ili oslabljenu sposobnost da podignu robusne imunske odgovore prema višestrukim antigenima kao rezultat ograničenog repertoara imunoglobulinskog lakog lanca. Shodno tome, korišćeni su miševi koji sadrže humanizovani VLlokus koji sadrži dva nepreuređena humana imunoglobulinska VLgenska segmenta i 5 humanih imunoglobulinskih JLgenskih segmenta i koji ispoljavaju brojčanu populaciju B ćelija divljeg tipa, i ispoljavaju razvoj B ćelija divljeg tipa.
[0226] Generalno, prirodne mišje sekvence često nisu dobar izvor za humane terapijske sekvence. Najmanje iz tog razloga, generisanje varijabilnih regiona mišjeg teškog lanca imunoglobulina koji se uparuju sa zajedničkim humanim lakim lancem je ograničene praktične koristi. Više in vitro pokušaja konstruisanja bi se proširilo u procesu pokušaja i greške, da bi se pokušalo da se mišje varijabilne sekvence teškog lanca humanizuju, nadajući se da će zadržati specifičnost i afinitet epitopa, uz održavanje sposobnosti da se spoje sa zajedničkim humanim lakim lancem, sa neizvesnim ishodom. Na kraju takvog procesa, konačni proizvod može zadržati određenu specifičnost i afinitet, i povezati se sa zajedničkim lakim lancem, ali će na kraju imunogenost kod čoveka verovatno ostati veliki rizik.
[0227] Prema tome, pogodan miš za izradu humanih terapeutika bi uključio pogodno veliki repertoar genskih segmenata varijabilnog regiona humanog teškog lanca, umesto endogenih
1
genskih segmenata varijabilnog regiona teškog lanca miša. Segmenti gena varijabilnog regiona humanog teškog lanca treba da budu sposobni da se preuređuju i rekombinuju sa endogenim mišjim konstantnim domenom teškog lanca da obrazuju reverzni himerni teški lanac (tj. teški lanac koji sadrži humani varijabilni domen i mišji konstantni region). Teški lanac treba da bude sposoban za promenu klase i somatsku hipermutaciju, tako da je pogodan veliki repertoar varijabilnih domena teškog lanca dostupan za miša, da izabere onaj koji se može povezati sa ograničenim repertoarom varijabilnih regiona humanog lakog lanca.
[0228] Miš koji selektuje zajednički laki lanac za mnoštvo teških lanaca ima praktičnu korist. U različitim realizacijama, antitela koja se izražavaju kod miša, koja mogu da eksprimiraju samo zajednički laki lanac će imati teške lance koji mogu da se udružuju i eksprimiraju sa identičnim ili suštinski identičnim lakim lancem. Ovo je posebno korisno u izradi bispecifičnih antitela. Na primer, takav miš se može imunizovati sa prvim imunogenom da bi se generisala B ćelija koja eksprimira antitelo koje specifično vezuje prvi epitop. Miš (ili genetski isti miš) može biti imunizovan sa drugim imunogenom da bi se generisala B ćelija koja eksprimira antitelo koje specifično vezuje drugi epitop. Varijabilni regioni teškog lanca mogu biti klonirani iz B ćelija i eksprimirani sa istim konstantnim regionom teškog lanca, i istim varijabilnim regionom lakog lanca (npr. običan laki lanac) u ćeliji za izradu bispecifičnog antitela, gde je komponenta varijabilnog teškog lanca bispecifičnog antitela izabrana pomoću miša da bi se povezala i eksprimirala sa komponentom varijabilnog lakog lanca (ili običnog lakog lanca).
[0229] Pronalazači su konstruisali miša za generisanje lakih lanaca imunoglobulina koji će se pogodno upariti sa prilično različitom familijom teških lanaca, uključujući teške lance čiji varijabilni regioni odstupaju od sekvenci germinativne linije, npr. afinitetno zreli ili somatski mutirani varijabilni regioni. U različitim realizacijama, miš je osmišljen za uparivanje varijabilnih domena humanog lakog lanca sa humanim varijabilnim domenima teškog lanca koji sadrže somatske mutacije, čime se omogućava put do visoko afinitetnih vezujućih proteina, pogodnih za upotrebu kao humanih terapeutskih agenasa.
[0230] Genetski konstruisani miš, kroz dug i kompleksan proces selekcije antitela unutar organizma, pravi biološki odgovarajuće izbore u uparivanju raznovrsne kolekcije humanih varijabilnih domena teškog lanca sa ograničenim brojem opcija humanog lakog lanca. Da bi se ovo postiglo, miš je konstruisan tako da predstavlja ograničeni broj opcija varijabilnog domena humanog lakog lanca u sprezi sa širokom raznolikošću opcija varijabilnog domena teškog lanca. Nakon izazivanja sa imunogenom, miš maksimalno povećava broj rešenja u njegovom repertoaru da bi razvio antitelo prema imunogenu, ograničen u velikoj meri ili isključivo
2
brojem ili opcijama lakog lanca u njegovom repertoaru. U različitim realizacijama, ovo uključuje omogućavanje mišu da postigne pogodne i kompatibilne somatske mutacije varijabilnog domena lakog lanca koji će i pored toga biti kompatibilan sa relativno velikom raznovrsnošću varijabilnih domena humanog teškog lanca, uključujući posebno somatski mutirane varijabilne domene humanog teškog.
[0231] Da bi se postigao ograničen repertoar opcija lakog lanca, miš je konstruisan da prikazuje nefunkcionalnom ili suštinski nefunkcionalnom njegovu sposobnost da napravi, ili preuredi, prirodni varijabilni domen lakog lanca miša. Ovo se može postići, npr. brisanjem mišjih segmenata gena varijabilnog regiona lakog lanca. Endogeni mišji lokus, može zatim biti modifikovan egzogenim pogodnim genskim segmentom varijabilnog regiona humanog lakog lanca od izbora, koji je operativno povezan za endogeni konstantni domen lakog lanca miša, na takav način da se egzogeni humani segmenti gena varijabilnog regiona mogu kombinovati sa endogenim genom konstantnog regiona lakog lanca miša i obrazuju preuređeni reverzni himerni gen lakog lanca (humana varijabla, konstanta miša). U različitim realizacijama, varijabilni region lakog lanca je sposoban da bude somatski mutiran. U različitim realizacijama, da bi se maksimalno povećala sposobnost varijabilnog regiona lakog lanca da stekne somatske mutacije, odgovarajući inhenser(i) je(su) zadržan(i) u mišu. Na primer, u modifikovanju lokusa mišjeg lakog lanca κ da bi se zamenili endogeni mišji genski segmenti lakog lanca κ sa humanim genskim segmentima lakog lanca κ, mišji κ intronski inhenser i mišji κ 3' inhenser su funkcionalno održani ili neoštećeni.
[0232] Prema tome, sadašnji pronalazak koristi genetski modifikanog miša koji ima genom germinativne linije koji sadrži:
(i) dva humana Vκ genska segmenta immunoglobulina i pet humanih Jκ genskih segmenata imunoglobulina operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša ili pacova, gde su dva humana Vκ genska segmenta imunoglobulina humani Vκ1-39 i humani Vκ3-20, i pet humanih Jκ genskih segmenata imunoglobulina su humani Jκ1, humani Jκ2, humani Jκ3, humani Jκ4, i humani Jκ5; i (ii) jedan ili više nepreuređenih humanih VHgenskih segmenata imunoglobulina, jedan ili više nepreuređenih humanih DHgenskih segmenata imunoglobulina, i jedan ili više nepreuređenih humanih JHgenskih segmenata imunoglobulina operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša;
gde su nepreuređeni genski segmenti humanog teškog lanca i nepreuređeni genski segmenti humanog kapa lakog lanca miša u stanju da se preuređuju i kodiraju varijabilne domene humanog teškog lanca i varijabilne domene humanog kapa lakog lanca, tim redom, antitela, i gde miš ne sadrži endogeni Vκ genski segment koji je u stanju da se preuređuje da bi obrazovao sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca miša koja se obezbeđuje u njegovom genomu germinativne linije.
[0233] Takođe se odnosi na obezbeđenog genetski modifikovanog miša koji izražava ograničeni repertoar reverznih himernih (humanih varijabilnih, mišjih konstantih) lakih lanaca povezanih sa različitim reverznim himernim (humanim varijabilnim, mišjim konstantim) teškim lancima.
[0234] U različitim realizacijama, endogeni mišji genski segmenti lakog lanca κ su obrisani i zamenjeni sa dva preuređena regiona humanog lakog lanca, operativno vezana za endogeni mišji Cκ gen. U realizacijama za maksimalizovanje somatske hipermutacije preuređenog regiona humanog lakog lanca, održavani su mišji κ intronski inhenser i mišji κ 3' inhenser. U različitim realizacijama, miš takođe sadrži nefunkcionalni lokus lakog lanca λ, ili njegovo brisanje ili deleciju koja čini lokus nesposobnim da napravi laki lanac λ.
[0235] Takođe se odnosi na genetski konstruisanog miša koji, u različitim slučajevima sadrži lokus varijabilnog regiona lakog lanca kome nedostaju endogeni genski segmenti VLi JLlakog lanca miša i koji sadrži preuređeni varijabilni region humanog lakog lanca, u jednom slučaju preuređena humana VL/JLsekvenca, operativno vezana za mišji konstantni region, gde je mesto sposobno da se podvrgne somatskoj hipermutaciji, i gde lokus eksprimira laki lanac koji sadrži humanu VL/JLsekvencu vezanu za mišji konstantni region. Stoga, u različitim slučajevima, lokus sadrži mišji κ 3' pojačivač, koji je u korelaciji sa normalnim, ili kod divljeg tipa, nivoom somatske hipermutacije.
[0236] Genetski modifikovani miš u različitim realizacijama, kada je imunizovan sa antigenom od interesa generiše B ćelije koje pokazuju raznolikost preraspodela varijabilnih regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koji eksprimiraju i funkcionišu sa dva preuređena laka lanca, uključujući realizacije, gde dva laka lanca obuhvataju varijabilne regione humanog lakog lanca koji sadrže, na primer, 1 do 5 somatskih mutacija. U različitim realizacijama, tako eksprimirani humani laki lanci su sposobni da se udružuju i eksprimiraju sa bilo kojim varijabilnim regionom teškog lanca humanog imunoglobulina izraženim u mišu.
[0237] Pored genetski modifikovanih miševa koji sadrže ograničeni repertoar imunoglobulinskog lakog lanca (npr. dva humana VLgenska segmenta i pet humanih JLgenskih segmenata) kako je ovde opisano, takođe su ovde opisane druge genetski modifikovane ne-humane životinje koje sadrži pojedinačni humani VLgenski segment ili ne više od dva humana VLgenska segmenta. U nekim slučajevima, takve ne-humane životinje obuhvataju jedan pojedinačni preuređeni humani VLregion sastavljen od jedne preuređene
4
humane VLJLsekvence. U nekim slučajevima, takve ne-humane životinje obuhvataju ne više od dva humana VLgenska segmenta i dva ili više (npr. 2, 3, 4 ili 5 humanih JLgenskih segmenata. U različitim primerima, humani genski segmenti su operativno vezani za konstantni region lakog lanca koji nije humani, npr. konstantni region lakog lanca miša ili pacova.
[0238] Obezbeđena ne-humana životinja je miš. Za životinje koje nisu humane, gde pogodne genetski modifikovane ES ćelije nisu lako dostupne, koriste se druge metode za izradu životinja koje nisu humane i koje sadrže genetske modifikacije, kao što je ovde opisano. Takve metode uključuju, npr. modifikovanje genoma ćelija koje nisu embrionalne matične (npr., fibroblasta ili indukovane pluripotentne ćelije) i angažovanje prenosa jedra za prenos modifikovanog genoma u odgovarajuću ćeliju, npr. oocita, i gestiranje modifikovane ćelije (npr. modifikovanog oocita) u ne-humanoj životinji, pod odgovarajućim uslovima da se formira embrion.
[0239] [Izbrisan]
[0240] U nekim realizacijama, korišćeni miš je iz jednog soja C57BL izabran od C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. U nekim određenim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku je jedan soj 129 izabran iz grupe koja se sastoji od soja koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr., 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (videti, npr., Festing i sar., 1999, Mammalian Genome 10: 836; Auerbach i sar., 2000, Biotechniques 29 (5): 1024-1028, 1030, 1032). U nekim određenim realizacijama, genetski modifikovani miš korišćen u sadašnjem pronalasku je mešavina gore pomenutog soja 129 i gore pomenutog soja C57BL/6. U nekim određenim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalaska je mešavina prethodno pomenutih sojeva 129, ili mešavina prethodno pomenutih sojeva BL/6. U nekim određenim realizacijama, soj 129 mešavine, kao što je ovde opisan je 129S6 (129/SvEvTac) soj. U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalasku je BALB soja, npr. BALB/c soj. U nekim realizacijama, miš korišćen u sadašnjem pronalaska je mešavina BALB soja i drugog prethodno pomenutog soja.
[0241] [Obrisan]
Epitop-vezujući proteini koji vezuju više od jednog epitopa
[0242] Preparati i postupci koji su ovde opisani, mogu biti korišćeni za izradu vezujućih proteina koji vezuju više od jednog epitopa sa visokim afinitetom, npr. bispecifična antitela.
Prednosti pronalaska uključuju sposobnost da se izabere pogodno visoki vezujući (npr. afinitetno sazreli) teški lanac imunoglobulinskih lanaca od kojih će svaki biti povezan sa jednim lakim lancem.
[0243] Prijavljeno je nekoliko tehnika za izradu fragmenata bispecifičnih antitela iz rekombinantne ćelijske kulture. Međutim, sinteza i ekspresija bispecifičnih vezujućih proteina je problematična, delom zbog problema povezanih sa identifikacijom pogodnog lakog lanca koji može da se udružuje i izražava sa dva različita teška lanca, a delom zbog problema izolacije. U različitim realizacijama, preparati i postupci koji su ovde opisani, obezbeđuju prednost bispecifičnih antitela pune dužine koja ne zahtevaju posebnu modifikaciju(e) da bi se održala tradicionalna imunoglobulinska struktura povećanjem stabilnosti/interakcije komponenata (Slika 7A). U različitim realizacijama, takva modifikacija(e) se pokazala komplikovanom i služila je kao prepreka za razvoj tehnologije bispecifičnih antitela i njihovoj potencijalnoj upotrebi u lečenju za humane bolesti. Stoga, u različitim realizacijama, kroz obezbeđivanje prirodne imunoglobulinske strukture (tj. pune dužine) koja ima dodato svojstvo višestrukih specifičnosti, bispecifična antitela pune dužine održavaju njihove kritične efektorne funkcije koje nedostaju prethodnim bispecifičnim fragmentima, i dalje obezbeđuju terapeutike koji pokazuju važan farmakokinetički parametar dužeg poluživota.
[0244] Postupci i preparati ovde opisani, omogućavaju genetički modifikovanom mišu da izabere, drugačijim prirodnim procesima, jedan pogodan laki lanac koji može da se udružuje i eksprimira sa više od jednim teškim lancem, uključujući teške lance koji su somatski mutirani (npr. afinitetno sazreli). Humane VLi VHsekvence iz pogodnih B ćelija imunizovanih miševa, kao što je ovde opisano, koje eksprimiraju afinitetno sazrela antitela koja imaju reverzne himerne teške lance (tj. humani varijabilni i mišji konstantni), mogu biti identifikovane i klonirane u okviru ekspresionog vektora sa pogodnom sekvencom gena humanog konstantnog regiona (npr. jedan humani IgG1). Mogu biti pripremljena dva takva konstrukta, gde svaki konstrukt kodira humani varijabilni domen teškog lanca koji vezuje jedan različiti epitop. Jedan od humanih VLS (npr. humani V к1-39J к5 ili humani V к3-20J к1), u sekvenci germinativne linije ili iz B ćelije u kojoj je sekvenca somatski mutirana, može biti fuzionisan u okviru odgovarajućeg humanog konstantnog regiona gena (npr. humani к konstantni gen). Ova tri potpuno humana teška i laka konstrukta, mogu biti smeštena u pogodnoj ćeliji za ekspresiju. Ćelija će eksprimirati dve glavne vrste: homodimerni teški lanac sa identičnim lakim lancem i heterodimerni teški lanac sa identičnim lakim lancem. Da bi se omogućilo lako razdvajanje ovih glavnih vrsta, jedan od teških lanaca je modifikovan tako da se izostavi determinanta za vezivanje proteina A, što rezultira u različitom afinitetu homodimernog vezujućeg proteina iz heterodimernog vezujućeg proteina. Preparati i postupci koji se bave ovim pitanjem su opisani u prijavi USSN 12/832,838, podnetoj 25. juna 2010, pod naslovom "Lako izolovana bispecifična antitela sa formatom prirodnog imunoglobulina", objavljenom kao US 2010/ 0331527A1.
[0245] Takođe je opisan epitop-vezujući protein, gde su humane VLi VHsekvence izvedene od miševa koji su ovde opisani, koji su imunizovani sa antigenom koji sadrži epitop od interesa.
[0246] Takođe je opisan epitop-vezujući protein koji sadrži prvi i drugi polipeptid, prvi polipeptid koji sadrži, od N-terminala do C-terminala, prvi epitop-vezujući region koji selektivno vezuje prvi epitop, praćen sa konstantnim regionom koji sadrži prvi CH3 region humanog IgG izabran od IgGl, IgG2, IgG4, i njihove kombinacije; i drugi polipeptid koji sadrži, od N-završetka do C-završetka, drugi epitop-vezujući region koji selektivno vezuje drugi epitop, praćen konstantnim regionom koji sadrži drugi CH3 region humanog IgG izabranog od IgGl, IgG2, IgG4, i njihove kombinacije, pri čemu drugi CH3 region sadrži modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog CH3 domena za protein A.
[0247] U jednom slučaju, drugi CH3 region sadrži H95R modifikaciju (pomoću IMGT numerisanja egzona; H435R pomoću EU numerisanja). U drugom izvođenju, drugi CH3 region dalje sadrži Y96F modifikaciju (IMGT; Y436F pomoću EU).
[0248] U jednom slučaju, drugi CH3 region je iz modifikovanog humanog IgG1, i dalje sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I pomoću EU).
[0249] U jednom primeru, drugi CH3 region je iz modifikovanog humanog IgG2, i dalje sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N i V422I od strane EU).
[0250] U jednom primeru, drugi CH3 region je iz modifikovanog humanog IgG4, i dalje sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M , R409K, E419Q i V422I od strane EU).
[0251] Jedna metoda za izradu proteina za vezivanje epitopa, koji vezuje više od jednog epitopa je imunizovanje prvog miša u skladu sa pronalaskom sa antigenom koji sadrži prvi epitop od interesa, pri čemu miš sadrži lokus endogenog varijabilnog regiona imunoglobulinskog lakog lanca koji ne sadrži endogeni mišji VL, koji je sposoban za preuređivanje i obrazovanje lakog lanca, pri čemu je na lokusu varijabilnog regiona endogenog mišjeg imunoglobulinskog lakog lanca pojedinačni preuređeni humani VLregion operativno povezan sa endogenim mišjim genom konstantnog regiona lakog lanca, a preuređeni humani VLregion je izabran od humanog V к1-39J к5 i humanog V к3-20J к1 i endogeni mišji VHgenski segmenti su zamenjeni u celini ili delimično sa humanim VHgenskim segmentima, tako da su teški lanci imunoglobulina napravljeni od strane miša isključivo ili suštinski teški lanci koji sadrže humane varijabilne domene i mišje konstantne domene. Kada je imunizovan, takav miš će napraviti reverzno himerno antitelo, koje sadrži samo jedan od dva varijabilna domena humanog lakog lanca (npr. jedan od humanog V к1-39J к5 ili humanog V к3-20J к1). Jednom kada je identifikovana B ćelija koja kodira jedan VHkoji vezuje epitop od interesa, nukleotidna sekvenca VH(i, opciono, VL) može biti ponovo dobijena (npr. pomoću PCR-a) i klonirana u ekspresionom konstruktu u okviru sa pogodnim konstantnim domenom humanog imunoglobulina. Ovaj proces može biti ponovljen da bi se identifikovao drugi VHdomen koji vezuje drugi epitop, i druga VHgenska sekvenca može biti ponovo dobijena i klonirana u ekspresionom vektoru u okviru za drugi pogodni konstantni domen imunoglobulina. Prvi i drugi imunoglobulinski konstantni domeni, mogu biti istog ili različitog izotipa i jedan od konstantnih domena imunoglobulina (ali ne i drugi) može biti modifikovan, kao što je ovde opisano ili u US 2010/0331527 A1, a epitopvezujući protein može biti izražen u pogodnoj ćeliji i izolovan na osnovu njegovog različitog afiniteta za protein A, kao što je poređeno sa homodimernim epitop-vezujućim proteinom, npr. kao što je opisano u US 2010/0331527 A1.
[0252] U jednoj realizaciji, obezbeđen je postupak za izradu bispecifičnog proteina za vezivanje epitopa, koji obuhvata identifikovanje prve afinitetno sazrele (npr. sadrži jednu ili više somatskih hipermutacija) humane VHnukleotidne sekvence (VH1) od miša, kao što je ovde opisano, identifikovanje druge afinitetno sazrele (npr. sadrži jednu ili više somatskih hipermutacija) humane VHnukleotidne sekvence (VH2) od miša, kao što je ovde opisano, kloniranjem VH1 u okviru sa humanim teškim lancem kome nedostaje modifikacija determinante za protein A, kao što je opisano u US 2010/0331527A1 da obrazuje teški lanac 1 (HC1), kloniranjem VH2 u okviru sa humanim teškim lancem koji sadrži determinantu proteina A, kao što je opisano u US 2010/0331527A1 da obrazuje teški lanac 2 (HC2), uvođenjem vektora ekspresije koji sadrži HC1 i isti ili drugačiji ekspresioni vektor koji sadrži HC2 u ćeliju, pri čemu ćelija takođe, izražava laki lanac humanog imunoglobulina koji sadrži humani Vκ1-39/humani J к5 ili humani V к3-20/humani J к1 fuzionisan sa konstantnim domenom humanog lakog lanca, omogućavajući ćeliji da izražava bispecifični epitop-vezujući protein koji sadrži VHdomen kodiran pomoću VH1 i VHdomen kodiran pomoću VH2, i izolovanje bispecifičnog epitop-vezujućeg proteina na osnovu njegove diferencijalne sposobnosti da vezuje Protein A, u poređenju sa monospecifičnim homodimernim epitop-vezujućim proteinom. U specifičnoj realizaciji, HC1 je IgG1, a HC2 je IgG1 koji sadrži modifikaciju H95R (IMGT; H435R od strane EU) i dalje sadrži modifikaciju Y96F (IMGT; Y436F od strane EU). U jednoj realizaciji, VHdomen je kodiran od strane VH1, VHdomen je kodiran od strane VH2, ili su oba somatski mutirana.
Humani VH geni koji eksprimiraju sa zajedničkim humanim VL
[0253] Različiti humani varijabilni regioni od afinitetno sazrelih antitela pobuđenih protiv četiri različita antigena su izraženi ili sa njihovim srodnim lakim lancem, ili sa najmanje jednim od humanog lakog lanca izabranim od humanog V к1-39/J к5, humanog V к3-20/J к1, ili humanog VpreΒ/Jλ5 (videti Primer 1). Za antitela prema svakom od antigena, somatski mutirani teški lanci visokog afiniteta iz različitih familija gena su uspešno upareni sa reorganizovanim regionima humane germinativne linije V к1-39J к5 i V к3-20J к1 i sekretovani iz ćelija koje eksprimiraju teške i lake lance. Za V к1-39J к5 i V к3-20J к1, VHdomeni izvedeni iz sledećih genskih familija humanog VHizraženih povoljno: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51 i 6-1. Prema tome, miš koji je konstruisan da eksprimira ograničeni repertoar humanih VLdomena iz oba od V к1-39J к5 i V к3-20J к1 će generisati raznoliku populaciju somatski mutiranih humanih VHdomena iz VHlokusa, modifikovanog da zameni mišje VHgenke segmente sa humanim VHgenskim segmentima.
[0254] Miševi genetski konstruisani da eksprimiraju reverzne himerne (humani varijabilni, mišji konstantni) teške lance imunoglobulina, povezane sa pojedinačnim reorganizovanim lakim lancem (npr. V к1-39/J ili V к3-20/J), kada su imunizovani sa antigenom od interesa, generisali su B ćelije koje sadrže raznolikost humanih VHpreuređivanja i eksprimiraju različita antigen-specifična antitela visokog afiniteta sa različitim svojstvima u pogledu njihove sposobnosti da blokiraju vezivanje antigena za njegov ligand, i u odnosu na njihovu sposobnost da vezuju varijante antigena (videti primere 5 do 10).
[0255] Stoga, miševi i postupci koji su ovde opisani, korisni su u izradi i selekciji varijabilnih domena teškog lanca humanog imunoglobulina, uključujući somatski mutirane varijabilne domene humanog teškog lanca, koji su rezultat različitog preuređivanja, koji ispoljavaju široki varijetet afiniteta (uključujući ispoljavanje KDod oko nanomolarnog ili manje), široki varijetet specifičnosti (uključujući vezivanje za različite epitope istog antigena), i koji se udružuju i eksprimiraju sa istim ili suštinski istim varijabilnim regionom lakog lanca humanog imunoglobulina.
Potpuno humana bispecifična antitela koja imaju zajednički laki lanac
[0256] Kao prvi korak u različitim realizacijama, prva i druga sekvenca nukleinske kiseline od kojih svaka kodira varijabilne domene humanog teškog lanca (i bilo koje dodatne sekvence nukleinskih kiselina koje obrazuju bispecifično antitelo) su izabrane od roditeljskih monoklonskih antitela koja imaju željene karakteristike kao što su, na primer, sposobnost za vezivanje različitih epitopa (videti slike 7A i 7B), koja imaju različite afinitete, itd., normalno, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju humane varijabilne domene teškog lanca su izolovane iz imunizovanih miševa, kao što je ovde opisano, da bi se omogućilo spajanje sa humanim konstantnim regionima teškog lanca kako bi bili pogodni za humanu primenu. Dalje modifikacije sekvence(i), mogu biti napravljene uvođenjem mutacija koje dodaju dodatnu funkcionalnost bispecifičnom antitelu koja se može postići, što uključuje, na primer, povećanje serumskog poluživota (npr., videti US 7,217,797) i / ili povećanje ćelijski posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (npr., videti US 6,737,056). Uvođenje mutacija u konstantne regione antitela je poznato u tehnici. Dodatno, deo bispecifičnog antitela može biti napravljen rekombinantno u ćelijskoj kulturi, a drugi deo(-lovi) molekula, mogu biti dobijeni pomoću gore navedenih tehnika.
[0257] Opisano je nekoliko tehnika za proizvodnju antitela. Na primer, u različitim realizacijama, himerna antitela su proizvedena u miševima, kao što je ovde opisano. Antitela mogu biti izolovana direktno iz B ćelija imunizovanog miša (npr., videti U.S. 2007/ 0280945A1) i / ili B ćelije imunizovanog miša mogu biti korišćene za pravljenje hibridoma (Kohler i Milstein, 1975, Nature 256: 495-497). DNK koja kodira antitela (humane teške i / ili lake lance) miševa, kao što je ovde opisano, lako je izolovana i sekvencionirana korišćenjem konvencionalnih tehnika. Hibridom i / ili B ćelije izvedene od miševa, kao što je ovde opisano, služe kao poželjan izvor takve DNK. Jednom izolovana, DNK može biti postavljena u ekspresione vektore, koji se zatim transfektuju u ćelije domaćina koje inače ne proizvode imunoglobulinski protein, da bi se dobila sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. DNK se takođe može modifikovati, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za konstantne domene humanog teškog i lakog lanca umesto mišjih sekvenci.
[0258] U različitim realizacijama, nakon izolacije DNK i selekcije prve i druge sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju varijabilne domene prvog i drugog humanog teškog lanca koji imaju željene specifičnosti / afinitete, i treće sekvence nukleinske kiseline koja kodira domen humanog lakog lanca (preuređena sekvenca germinativne linije ili sekvenca lakog lanca izolovana iz miša, kao što je ovde opisano), tri sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju molekule su izražene da formiraju bispecifično antitelo, koristeći rekombinantne tehnike koje su široko dostupne u struci. Često, ekspresioni sistem od izbora će uključiti ekspresionog vektora ćelija sisara i domaćina, tako da je bispecifično antitelo na odgovarajući način glikozilovano (npr. u slučaju bispecifičnih antitela koja obuhvataju domene antitela koji su glikozilovani). Međutim, molekuli se takođe mogu proizvesti u prokariotskim ekspresionim sistemima. Normalno, ćelija domaćina će biti transformisana sa DNK koja kodira oba, prvi humani varijabilni domen teškog lanca, drugi humani varijabilni domen teškog lanca, domen humanog lakog lanca na jednom vektoru ili nezavisnim vektorima. Međutim, moguće je eksprimirati prvi humani varijabilni domen teškog lanca, drugi humani varijabilni domen teškog lanca i domen humanog lakog lanca (komponente bispecifičnog antitela) u nezavisnim ekspresionim sistemima i povezati izražene polipeptide in vitro. U različitim realizacijama, domen humanog lakog lanca sadrži sekvencu germinativne linije. U različitim realizacijama, domen humanog lakog lanca ne sadrži više od jedne, više od dve, više od tri, više od četiri, ili više od pet somatskih hipermutacija sa varijabilnom sekvencom lakog lanca od domena lakog lanca.
[0259] U različitim realizacijama, nukleinska kiselina(e) (npr. cDNK ili genomska DNK) koja kodira dva teška lanca i pojedinačni humani laki lanac je ubačena u replikabilni vektor za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) i / ili za ekspresiju. Dostupni su mnogi vektori i generalno obuhvataju, ali nisu ograničeni na, jedno ili više od sledećih: signalnu sekvencu, poreklo replikacije, jednog ili više markerskih gena, pojačivački element, promotera i sekvencu za završetak transkripcije. Svaka komponenta može biti izabrana pojedinačno ili na osnovu izbora ćelije domaćina ili drugih kriterijuma određenih eksperimentalno. Nekoliko primera od svake komponente je poznato u tehnici.
[0260] Vektori za ekspresiju i kloniranje, obično sadrže jednog promotera koji je prepoznat od strane organizma domaćina i operativno je povezan sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju svaku ili sve komponente bispecifičnog antitela. Veliki broj promotera prepoznatih od strane različitih potencijalnih ćelija domaćina je dobro poznat. Ovi promoteri su operativno vezani za DNK koje kodiraju bispecifično antitelo, uklanjanjem promotera iz izvorne DNK digestijom restrikcionog enzima i ubacivanjem izolovane promoterske sekvence u vektor.
[0261] Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćina (kvasci, gljive, insekti, biljke, životinje, ljudi ili nukleisane ćelije iz drugih višećelijskih organizama) mogu
1
takođe da sadrže sekvence neophodne za završetak transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupne iz 5' i, povremeno 3', neprevedenih regiona eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente koji su transkriptovani kao poliadenilovani fragmenti u neprevedenom delu mRNK koja kodira komponente bispecifičnog antitela. Pogodni ekspresioni vektori za različite realizacije, uključuju one koji obezbeđuju prolaznu ekspresiju DNK u ćelijama sisara koja kodira bispecifično antitelo. Generalno, prolazna ekspresija uključuje upotrebu ekspresionog vektora koji je sposoban da se efikasno replikuje u ćeliji domaćina, tako da ćelija domaćina akumulira mnogo kopija ekspresionog vektora i, zauzvrat, sintetiše visoke nivoe željenog polipeptida kodiranog od strane ekspresionog vektora. Prolazni ekspresioni sistemi, koji sadrže pogodan ekspresioni vektor i ćeliju domaćina, omogućavaju pogodnu pozitivnu identifikaciju polipeptida kodiranih od strane kloniranih DNK, kao i brzi skrining bispecifičnih antitela koja imaju željene specifičnosti vezivanja / afinitete ili željene karakteristike migracije gela u odnosu na roditeljska antitela koja imaju homodimere varijabilnih domena prvog ili drugog humanog teškog lanca.
[0262] U različitim varijantama, kada je DNK koja kodira komponente bispecifičnog antitela spojene u željenom vektoru (ima), kao što je gore opisano, oni su uvedeni u pogodnu ćeliju domaćina za ekspresiju i oporavak. Transfektovanje ćelija domaćina se može izvršiti korišćenjem standardnih tehnika koje su poznate u struci, koje odgovaraju odabranoj ćeliji domaćina (npr. elektroporacija, jezgrovita mikroinjekcija, bakterijska fuzija protoplasta sa intaktnim ćelijama, ili polikatjoni, npr. polibren, poliornitin, itd.).
[0263] Ćelija domaćina je izabrana, u različitim realizacijama, koja najbolje odgovara ekspresionom vektoru koji sadrži komponente i omogućava najefikasniju i povoljniju proizvodnju vrsta bispecifičnih antitela. Primeri ćelija domaćina za ekspresiju uključuju, one od prokariota i eukariota (jednoćelijske ili višestruke ćelije), bakterijske ćelije (npr., sojeve E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., itd.), mikobakterijske ćelije, ćelije gljivica, ćelije kvasaca (npr. S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), biljne ćelije, ćelije insekata (npr. SF-9, SF-21, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), nehumane životinjske ćelije, ljudske ćelije ili fuzije ćelija kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U različitim realizacijama, ćelija je ćelija čoveka, majmuna, majmuna, hrčka, pacova ili miša. U različitim realizacijama, ćelija je eukariotska ćelija izabrana od CHO (npr. CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), retinalne ćelije, Vero, CV1, bubrežne (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC5, Colo205, HB 8065, HL- 60, (npr., BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalna), CV-
2
1 , U937, 3T3, L ćelije, C127 ćelije, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertolijeve ćelije, BRL 3A ćelije, HT1080 ćelije, mijelomske ćelije, tumorske ćelije i jedne ćelijske linije izvedene iz gore pomenute ćelije. U različitim realizacijama, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. ćelija retine koja eksprimira jedan virusni gen (npr. PER.C6 ™ ćelija).
[0264] Ćelije domaćina sisara koje se koriste za proizvodnju bispecifičnog antitela, mogu biti kultivisane u različitim medijumima. Komercijalno dostupni medijum, kao što je Hamov F10 (Sigma), minimalni esencijalni medijum ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbeccols Modified Eagle’s Medium ((DMEM), Sigma) su pogodni za kultivisanje ćelija domaćina. Medijumi mogu biti dopunjeni, kao što je neophodno sa hormonima i / ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleozidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je GENTAMICIN ™), elementima u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja obično prisutna u krajnjim koncentracijama u mikromolarnom opsegu), i glukozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Bilo koji drugi dodaci, mogu takođe biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama, kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti. Uslovi kultivisanja, kao što su temperatura, pH i slično, su, u različitim realizacijama, oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćina izabranom za ekspresiju, i biće očigledni stručnjacima u tehnici.
[0265] Bispecifično antitelo je u različitim realizacijama obnovljeno iz medijuma za kulturu kao izlučeni polipeptid, iako se takođe može ponovo dobiti iz lizata ćelije domaćina kada se direktno proizvodi bez sekretornog signala. Ako je bispecifično antitelo vezano za membranu, može se osloboditi iz membrane, upotrebom pogodnog rastvora deterdženta (npr. Triton-X 100). Poželjno, bispecifična antitela koja su ovde opisana, uključuju upotrebu prvog imunoglobulinskog CH3 domena i drugog imunoglobulinskog CH3 domena, pri čemu se prvi i drugi imunoglobulinski CH3 domeni razlikuju jedan od drugog pomoću najmanje jedne aminokiseline, i pri čemu najmanje jedna aminokiselinska razlika smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za protein A, u poređenju sa bispecifičnim antitelom kome nedostaje aminokiselinska razlika (videti US 2010/0331527A1). U jednoj realizaciji, prvi imunoglobulinski CH3 domen vezuje Protein A i drugi imunoglobulinski CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje proteina A, kao što je H95R modifikacija (pomoću IMGT numerisanja eksona; H435R pomoću EU numeracije). Drugi CH3 može dalje da sadrži Y96F modifikaciju (pomoću IMGT; Y436F pomoću EU). Dalje modifikacije koje se mogu naći unutar drugog CH3 uključuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (pomoću IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I pomoću EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I pomoću EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, i V82I (pomoću IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I pomoću EU) u slučaju IgG4 antitela. Varijacije na formatu bispecifičnog antitela, gore opisane, razmatrane su unutar obima sadašnjeg pronalaska.
[0266] Zbog dvostruke prirode bispecifičnih antitela (tj., mogu biti specifična za različite epitope jednog polipeptida ili mogu da sadrže domene za vezivanje antigena specifične za više od jednog ciljnog polipeptida, videti Sliku 7B; videti takođe, npr., Tutt i sar., 1991, J. Immunol.
147:60-69; Kufer i sar., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238-244), ona nude mnoge korisne prednosti za terapeutsku primenu. Na primer, bispecifična antitela mogu biti korišćena za preusmerenu citotoksičnost (npr., za ubijanje tumorskih ćelija), kao adjuvansi za vakcinu, za isporuku trombolitičkih agenasa do ugrušaka, za konvertovanje enzimski aktiviranih prolekova na ciljnom mestu (npr., tumoru), za lečenje infektivnih bolesti, ciljanje imunskih kompleksa na receptorima na površini ćelija, ili za isporuku imunotoksina u tumorske ćelije.
[0267] Bispecifična antitela, ovde opisana, mogu takođe biti korišćena u nekoliko terapeutskih i ne-terapeutskih i / ili dijagnostičkih metoda ispitivanja, kao što su enzimski imunotestovi, imunotestovi na dva položaja, in vitro ili in vivo imunodijagnoza različitih bolesti (npr., raka), kompetitivni testovi vezivanja, direktni i indirektni sendvič testovi i imunoprecipitacioni testovi. Druge upotrebe za bispecifična antitela biće očigledne stručnjacima.
[0268] Sledeći primeri su obezbeđeni tako da opisuju za one prosečne stručnjake u ovoj oblasti tehnike kako da naprave i koriste postupke i kompozicije prema pronalasku, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju njihovim pronalaskom. Učinjeni su napori da se osigura tačnost u odnosu na brojeve koji se koriste (npr. količine, temperaturu, itd.), ali treba uzeti u obzir neke eksperimentalne greške i odstupanja. Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska težina je prosečna molekulska težina, temperatura je naznačena u Celzijusima, a pritisak je pri ili blizu atmosferskog.
PRIMERI
[0269] Sledeći primeri su obezbeđeni tako da opisuju za one prosečne stručnjake u ovoj oblasti tehnike kako da naprave i koriste postupke i kompozicije pronalaska, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Učinjeni su napori da se osigura tačnost u odnosu na brojeve koji se koriste (npr. količine, temperaturu, itd.), ali treba uzeti u obzir neke eksperimentalne greške i odstupanja. Ukoliko nije drugačije naznačeno,
4
temperatura je naznačena u Celzijusima, pritisak je na ili blizu atmosferskog, delovi su težinski delovi, a molekulska težina je prosečna molekulska težina.
Primer 1. Identifikacija humanih VH regiona koji se udružuju sa odabranim humanim VL regionima
[0270] Konstruisan je in vitro ekspresioni sistem da bi se odredilo da li jedan preuređeni laki lanac humane germinativne linije, može biti zajedno eksprimiran sa humanim teškim lancima iz antigen specifičnih humanih antitela.
[0271] Postupci za generisanje humanih antitela u genetički modifikovanim miševima su poznati (videti npr., US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®). Tehnologija VELOCIMMUNE® uključuje, generisanje genetski modifikovanog miša koji poseduje jedan genom koji sadrži varijabilne regione humanog teškog i lakog lanca koji su operativno povezani sa lokusima endogenog mišjeg konstantnog regiona, tako da miš proizvodi antitelo koje sadrži jedan humani varijabilni region i jedan mišji konstantni region u odgovoru prema stimulaciji antigenom. DNK koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela proizvedenih od VELOCIMMUNE® miša, su potpuno humana. U početku su izolovana himerna antitela visokog afiniteta koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kao što je niže opisano, antitela su karakterisana i odabrana za željene karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom da bi se dobilo potpuno humano antitelo koje sadrži ne-IgM izotip, na primer, divlji tip ili modifikovani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. Dok izabrani konstantni region može varirati u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike visokog afiniteta za vezivanje antigena i ciljne specifičnosti se nalaze u varijabilnom regionu.
[0272] VELOCIMMUNE® miš je imunizovan sa faktorom rasta koji promoviše angiogenezu (Antigen C) i antigen-specifična humana antitela su izolovana i sekvencionirana za upotrebu V gena, korišćenjem standardnih tehnika koje su poznate u struci. Izabrana antitela su klonirana na konstantne regione humanog teškog i lakog lanca i 69 teških lanaca je odabrano za uparivanje sa jednim od tri humana laka lanca: (1) srodni κ laki lanac povezan sa humanim κ konstantnim regionom, (2) preuređeni Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije povezan sa humanim κ konstantnim regionom, ili (3) preuređeni Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije povezan sa humanim κ konstantnim regionom. Svaki par teškog lanca i lakog lanca je kotransfektovan u CHO-K1 ćelijama, korišćenjem standardnih tehnika. Prisustvo antitela u supernatantu je detektovano pomoću anti-humanih IgG u ELISA testu. Titar antitela (ng / ml) je određen za svaki par teškog lanca / lakog lanca, a titri sa različitim preuređenim lakim lancima germinativne linije su bili poređeni sa titrima dobijenim sa molekulom roditeljskog antitela (tj. teškim lancem uparenim sa srodnim lakim lancem) i izračunat je procenat prirodnog titra (Tabela 1). VH: Varijabilni gen teškog lanca. ND: nije otkrivena ekspresija pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.
TABELA 1
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
[0273] U sličnom eksperimentu, VELOCIMMUNE® miševi su imunizovani sa nekoliko različitih antigena i izabrani teški lanci od antigen specifičnih humanih antitela su ispitivani na njihovu sposobnost da se uparuju sa različitim reorganizovanim lakim lancima humane germinativne linije (kao što je gore opisano). Antigeni koji su korišćeni u ovom eksperimentu uključili su enzim koji je uključen u homeostazu holesterola (Antigen A), serumski hormon koji je uključen u regulisanju homeostaze glukoze (Antigen B), faktor rasta koji promoviše angiogenezu (Antigen C) i receptor na površini ćelije (Antigen D). Antigen specifična antitela su izolovana iz miševa svake imunizacione grupe i varijabilni regioni teškog i lakog lanca su klonirani i sekvencionirani. Od sekvence teških i lakih lanaca, određena je upotreba V gena i odabrani teški lanci su upareni ili sa njihovim srodnim lakim lancem ili sa reorganizovanim regionom Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije. Svaki par teškog / lakog lanca je kotransfektovan u CHO-K1 ćelijama i prisustvo antitela u supernatantu je detektovano antihumanim IgG u ELISA testu. Titar antitela (μg/ml) je određen za svako uparivanje teškog lanca/lakog lanca, a titri sa različitim reorganizovanim lakim lancima humane germinativne linije su upoređivani sa titrima dobijenim sa molekulom roditeljskog antitela (tj., teški lanac uparen sa srodnim lakim lancem) i izračunat je procenat prirodnog titra (Tabela 2). VH: Varijabilni gen teškog lanca. Vκ: varijabilni gen κ lakog lanca. ND: nije otkrivena ekspresija pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.
TABELA 2
1
(nastavak)
2 (nastavak)
[0274] Rezultati dobijeni iz ovih eksperimenata pokazuju da su somatski mutirani, visoko afinitetni teški lanci iz različitih familija gena sposobni da se uparuju sa reorganizovanim regionima humane germinativne linije Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 i da budu sekretovani iz ćelije kao normalna molekula antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 1, titar antitela je povećan za oko 61% (42 od 69) teških lanaca kada su upareni sa preuređenim humanim Vκ1-39Jκ5 lakim lancem i oko 29% (20 od 69) teških lanaca kada su upareni sa preuređenim humanim Vκ3-20Jκ1 lakim lancem, u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskog antitela. Za oko 20% (14 od 69) teških lanaca, oba preuređena laka lanca humane germinativne linije su dala povećanje u ekspresiji, u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskog antitela. Kao što je prikazano u Tabeli 2, preuređeni region Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije daje povećanje ekspresije nekoliko teških lanaca specifičnih za niz različitih klasa antigena, u poređenju sa srodnim lakim lancem za roditeljska antitela. Titar antitela je povećan za više od dva puta za oko 35% (15/43) teških lanaca, u poređenju sa srodnim lakim lancem roditeljskih antitela. Za dva teška lanca (315 i 316), porast je bio veći od deset puta u poređenju sa roditeljskim antitelom. Unutar svih teških lanaca koji su pokazali povećanje ekspresije u odnosu na srodni laki lanac roditeljskog antitela, tri familijarna (VH3) teška lanca su više zastupljena u poređenju sa drugim genskim familijama varijabilnog regiona teškog lanca. Ovo pokazuje povoljan odnos humanih VH3 teških lanaca za uparivanje sa preuređenim lakim lancima humane germinativne linije Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1.
Primer 2. Generisanje lokusa preuređenog lakog lanca humane germinativne linije
[0275] Različiti ciljajući vektori preuređenog lakog lanca humane germinativne linije su izrađeni korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., US patent br. 6,586,251 i Valenzuela i sar. (2003) Visokoprolazni inženjering mišjeg genoma u kombinaciji sa analizom ekspresije visoke rezolucije, Nature Biotech. 21 (6): 652-659) za modifikovanje klonova 302g12 i 254m04 (Invitrogen) mišjeg genomskog bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC). Korišćenjem ova dva BAC klona, genomski konstrukti su konstruisani tako da sadrže jedan preuređeni region lakog lanca humane germinativne linije i ubačeni u endogeni lokus lakog lanca κ koji je prethodno modifikovan da izbriše endogene κ varijabilne i vezivne genske segmente.
[0276] Izgradnja vektora za ciljanje preuređenog lakog lanca humane germinativne linije. Tri različita reorganizovana regiona lakog lanca humane germinativne linije su napravljena, korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije koje su priznate u struci. Humani varijabilni genski segmenti koji su korišćeni za konstruisanje ova tri regiona su uključili preuređenu humanu sekvencu Vκ1-39Jκ5, preuređenu humanu sekvencu Vκ3-20Jκ1 i preuređenu sekvencu humanog V preβJλ5.
[0277] DNK segment koji sadrži ekson 1 (koji kodira vodećeg peptida) i intron 1 mišjeg Vκ3-7 gena je napravljen de novo sintezom DNK (Integrisane DNK Tehnologije). Deo 5' neprevedenog regiona do mesta prirodnog Blpl restrikcionog enzima je bio uključen. Eksoni humanih Vκ1-39 i Vκ3-20 gena su PCR amplifikovani iz humanih genomskih BAC biblioteka. Prednji prajmeri su imali 5' ekstenziju koja je sadržala spojno akceptorsko mesto introna 1 mišjeg Vκ3-7 gena. Reverzni prajmer koji je korišćen za PCR humane Vκ1-39 sekvence uključivao je produžetak koji kodira humani Jκ5, dok je reverzni prajmer koji je korišćen za PCR humane Vκ3-20 sekvence uključivao produžetak koji kodira humani Jκ1. Humana VpreBJλ5 sekvenca je napravljena de novo sintezom DNK (Integrisane DNK Tehnologije). Deo humanog Jκ-Cκ introna uključujući, mesto spoja donora je PCR amplifikovan iz plazmida pBS-296-HA18-PIScel. Prednji PCR prajmer je uključivao deo za kodiranje produžetka bilo sekvence humanog Jκ5, Jκ1 ili Jλ5. Reverzni prajmer je uključivao i Pl-Scel mesto, koje je prethodno konstruisano u intronu.
[0278] Mišji Vκ3-7 ekson 1/ intron 1, eksoni humanog varijabilnog lakog lanca i humani Jκ-Cκ intronski fragmenti su pripojeni zajedno pomoću preklapajuće ekstenzione PCR, digestirani sa Blpl i Pl-Scel, i ligirani u plazmidu pBS-296-HA18-PIScel koji sadrži promoter iz humanog Vκ3-15 varijabilnog segmenta gena. Loksigenovana higromicinska kaseta u plazmidu pBS-296-HA18-PIScel je zamenjena sa FRT-ovanom higromicinskom kasetom koja je okružena
4
Notl i Ascl položajima. Notl / PI-Scel fragment ovog plazmida je ligiran u modifikovani mišji BAC 254m04, koji je sadržao deo mišjeg Jκ-Cκ introna, mišjeg Cκ egzona i oko 75 kb genomske sekvence nishodno od mišjeg κ lokusa, koji je obezbedio 3' homologni kraj za homolognu rekombinaciju u mišjim ES ćelijama. Notl / Ascl fragment BAC je zatim ligiran u modifikovani mišji BAC 302g12, koji je sadržao FRTed neomicinsku kasetu i oko 23 kb genomske sekvence ushodno od endogenog κ lokusa za homolognu rekombinaciju u mišjim ES ćelijama.
[0279] Vektor za ciljanje reorganizovanog Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije (Slika 1). Položaji restrikcionih enzima su uvedeni na 5 'i 3' krajevima konstruisanog umetka lakog lanca, za kloniranje u vektor za ciljanje: Ascl položaj na 5' kraju i Pl-Scel položaj na 3' kraju. Unutar 5' Ascl položaja i 3' Pl-Scel položaja konstrukt za ciljanje od 5' do 3' je uključivao 5' homologni kraj koji sadrži sekvencu 5' do endogenog lokusa mišjeg lakog lanca κ dobijenog iz mišjeg BAC klona 302g12, FRTed gen neomicinske rezistencije, genomsku sekvencu uključujući humani Vκ3-15 promoter, vodeću sekvencu mišjeg Vκ3-7 varijabilnog genskog segmenta, sekvencu introna mišjeg Vκ3-7 varijabilnog segmenta gena, otvoreni okvir za čitanje od preuređenog regiona humane germinativne linije Vκ1-39Jκ5, genomsku sekvenca koja sadrži deo humanog Jκ-Cκ introna, i 3' homologni kraj koji sadrži sekvencu 3' endogenog mišjeg Jκ5 genskog segmenta dobijenog iz mišjeg BAC klona 254m04 (Slika 1, sredina). Geni i / ili sekvence ushodno od endogenog lokusa mišjeg lakog lanca κ i nishodno od većine 3' Jκ genskih segmenta (npr., endogeni 3' inhenser) su bili nemodifikovani od strane ciljnog konstrukta (videti Sliku 1). Sekvenca konstruisanog humanog Vκ1-39Jκ5 lokusa je prikazana u SEK ID BR: 1.
[0280] Ciljano ubacivanje preuređenog regiona Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije u BAC DNK je potvrđeno lančanom reakcijom polimeraze (PCR), korišćenjem prajmera lokalizovanih na sekvencama unutar reorganizovanog regiona lakog lanca humane germinativne linije. Ukratko, intronska sekvenca 3' za mišju Vκ3-7 lider sekvencu je potvrđena sa prajmerima ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEK ID BR: 2) i ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEK ID BR: 3). Otvoreni okvir za čitanje preuređenog regiona Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije je potvrđen sa prajmerima 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEK ID BR: 4) i 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEK ID BR: 5). Neomicinska kaseta je potvrđena sa prajmerima neoF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEK ID BR: 6) i neoR (GAACACGGCG GCATCAG; SEK ID BR: 7). Ciljana BAC DNK je zatim korišćena za elektroporaciju mišjih ES ćelija do kreiranih modifikovanih ES ćelija, za generisanje himernih miševa koji eksprimiraju preuređeni region Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije.
[0281] Pozitivni ES ćelijski klonovi su potvrđeni TAQMAN ™ skriningom i kariotipovanjem, koriščenjem proba specifičnih za konstruisani region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 ubačen u endogeni lokus. Ukratko, proba neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEK ID BR: 8) koja se vezuje unutar neomicin markerskog gena, proba ULC-m1 P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; SEK ID BR: 9) koja se vezuje unutar sekvence introna 3' za mišju Vκ3-7 vodeću sekvencu, i proba 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEK ID BR: 10) koja se vezuje unutar preuređenog otvorenog okvira za čitanje Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije. Pozitivni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju ženki miševa da bi se dobilo leglo mladunaca koji eksprimiraju region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 germinativne linije.
[0282] Alternativno, ES ćelije koje nose preuređeni region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 humane germinativne linije su transfektovane sa konstruktom koji izražava FLP kako bi se uklonila FRTed neomicinska kaseta uvedena pomoću konstrukta za ciljanje. Opciono, neomicinska kaseta je uklonjena odgajanjem do miševa koji eksprimiraju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, neomicinska kaseta je zadržana u miševima.
[0283] Vektor za ciljanje reorganizovanog Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije (Slika 2). Na sličan način, konstruisani lokus lakog lanca koji eksprimira preuređeni region Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije je izrađen korišćenjem konstrukta za ciljanje uključujući, od 5' do 3', homologni kraj 5' koji sadrži sekvencu 5' do endogenog mišjeg lokusa lakog lanca κ dobijenog iz mišjeg BAC klona 302g12, FRTed gen za neomicinsku rezistenciju, genomsku sekvencu, uključujući humanog Vκ3-15 promotera, vodeću sekvencu mišjeg Vκ3-7 varijabilnog genskog segmenta, sekvencu introna mišjeg Vκ3-7 varijabilnog genskog segmenta, otvoreni okvir za čitanje preuređenog regiona humane germinativne linije Vκ3-20Jκ1, genomsku sekvencu koja sadrži deo humanog Jκ-Cκ introna, i homologni kraj 3' koji sadrži sekvencu 3' endogenog mišjeg Jκ5 genskog segmenta dobijenog iz mišjeg BAC klona 254m04 (Slika 2, sredina). Sekvenca konstruisanog humanog Vκ3-20Jκ1 lokusa je prikazana u SEK ID BR: 11.
[0284] Ciljano ubacivanje preuređenog regiona humane germinativne linije Vκ3-20Jκ1 u BAC DNK je potvrđeno lančanom reakcijom polimeraze (PCR), korišćenjem prajmera lokalizovanih u sekvencama unutar preuređenog regiona lakog lanca humane germinativne linije Vκ3-20Jκ. Ukratko, intronska sekvenca 3' do mišje Vκ3-7 vodeće sekvence je potvrđena sa prajmerima ULC-m1F (SEK ID BR: 2) i ULC-m1R (SEK ID BR: 3). Otvoreni okvir čitanja preuređenog regiona humane germinativne linije Vκ3-20Jκ1 je potvrđen sa prajmerima 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEK ID BR: 12) i 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEK ID BR: 13). Neomicinska kaseta je potvrđena sa prajmerima neoF (SEK ID BR: 6) i neoR (SEK ID BR: 7). Ciljana BAC DNK je zatim korišćena za elektroporaciju mišjih ES ćelija do kreiranih modifikovanih ES ćelija, za generisanje himernih miševa koji eksprimiraju reorganizovani laki lanac Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije.
[0285] Pozitivni ES ćelijski klonovi su potvrđeni TAQMAN ™ skriningom i kariotipovanjem, koriščenjem proba specifičnih za konstruisani region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 ubačen u endogeni lokus lakog lanca κ. Ukratko, proba neoP (SEK ID BR: 8) koja se vezuje unutar neomicin markerskog gena, proba ULC-m1P (SEK ID BR: 9) koja se vezuje unutar mišje Vκ3-7 vodeće sekvence, i proba 1635h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEK ID BR: 14) koja se vezuje unutar otvorenog okvira za čitanje humanog Vκ3-20Jκ1. Pozitivni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju ženki miševa da bi se dobilo leglo mladunaca koji eksprimiraju region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije.
[0286] Alternativno, ES ćelije koje nose preuređeni region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 humane germinativne linije, mogu biti transfektovane sa konstruktom koji izražava FLP kako bi se uklonila FRT-ovana neomicinska kaseta uvedena pomoću konstrukta za ciljanje. Opciono, neomicinska kaseta može biti uklonjena odgajanjem do miševa koji izražavaju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, neomicinska kaseta je zadržana u miševima.
[0287] Reorganizovani vektor ciljanja VpreBJλ5 humane germinativne linije (Slika 3).
Na sličan način, konstruisani lokus lakog lanca koji eksprimira preuređeni region humane germinativne linije VpreBJλ5 je izrađen korišćenjem ciljnog konstrukta uključujući, od 5' do 3', homologni kraj 5' koji sadrži sekvencu 5' do endogenog mišjeg lokusa lakog lanca κ dobijenog iz mišjeg BAC klona 302g12, FRT-ovani gen neomicinske rezistencije, genomsku sekvencu uključujući humani Vκ3-15 promoter, vodeću sekvencu mišjeg Vκ3-7 varijabilnog genskog segmenta, intron sekvencu mišjeg Vκ3-7 varijabilnog genskog segmenta, otvoreni okvir za čitanje od preuređenog regiona humane germinativne linije VpreBJλ5, genomsku sekvencu koja sadrži deo humanog Jκ-Cκ introna, i 3' homologni kraj koji sadrži sekvencu 3' endogenog mišjeg Jκ5 segmenta gena dobijenog iz mišjeg BAC klona 254m04 (Slika 3, sredina). Sekvenca konstruisanog humanog VpreBJλ5 lokusa je prikazana u SEK ID BR: 15.
[0288] Ciljano ubacivanje preuređenog regiona humane germinativne linije VpreBJλ5 u BAC DNK je potvrđeno lančanom reakcijom polimeraze (PCR), korišćenjem prajmera lokalizovanih u sekvencama unutar reorganizovanog regiona lakog lanca VpreBJλ5 humane germinativne linije.
Ukratko, intron sekvenca 3' do mišje Vκ3-7 liderske sekvence je potvrđena sa prajmerima ULC-m1F (SEK ID BR: 2) i ULC-m1R (SEK ID BR: 3). Otvoreni okvir za čitanje preuređenog regiona VpreBJλ5 humane germinativne linije je potvrđen sa prajmerima 1616-h1F (TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEK ID BR: 16) i 1616-h1R (CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; SEK ID BR: 17). Neomicinska kaseta je potvrđena sa prajmerima neoF (SEK ID BR: 6) i neoR (SEK ID BR: 7). Ciljana BAC DNK je zatim korišćena za elektroporaciju mišjih ES ćelija do kreiranih modifikovanih ES ćelija, za generisanje himernih miševa koji eksprimiraju preuređeni laki lanac VpreBJλ5 humane germinativne linije.
[0289] Pozitivni ES ćelijski klonovi su potvrđeni TAQMAN ™ skriningom i kariotipovanjem, korišćenjem proba specifičnih za konstruisani VpreBJλ5 region lakog lanca umetnut u endogeni lokus lakog lanca κ. Ukratko, proba neoP (SEK ID BR: 8), koja vezuje unutar neomicin markerskog gena, proba ULC-m1P (SEK ID BR: 9), koja se vezuje unutar mišje IgVκ3-7 vodeće sekvence, i proba 1616h1P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEK ID BR: 18) koja se vezuje unutar humanog VpreBJλ5 otvorenog okvira za čitanje. Pozitivni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju ženki miševa da bi se dobilo leglo mladunaca koji eksprimiraju region lakog lanca germinativne linije.
[0290] Alternativno, ES ćelije koje nose preuređeni region lakog lanca VpreBJλ5 humane germinativne linije su transfektovane sa konstruktom koji eksprimira FLP da bi se uklonila FRT-ovana neomicinska kaseta uvedena pomoću ciljnog konstrukta. Opciono, neomicinska kaseta je uklonjena odgajanjem do miševa koji eksprimiraju FLP rekombinazu (npr. US 6,774,279) . Opciono, neomicinska kaseta je zadržana u miševima.
Primer 3. Generisanje miševa koji izražavaju pojedinačni reorganizovani humani laki lanac
[0291] Ciljane ES ćelije, gore opisane, korišćene su kao donorske ES ćelije i uvođene u mišji embrion od 8 ćelijskog stadijuma pomoću VELOCIMOUSE® metode (videti, npr., US patent br. 7,294,754 i Poueymirou i sar. 2007) F0 generacije miševa koji su u suštini u potpunosti izvedeni iz donorskih, genski ciljanih ES ćelija omogućavaju neposrednu fenotipsku analizu Nature Biotech.25(1): 91-99. VELOCIMICE® nezavisno nose konstruisani region lakog lanca humane germinativne linije Vκ1-39Jκ5, region lakog lanca Vκ3-20Jκ1 ili region lakog lanca VpreBJλ5, identifikovani su genotipizacijom pomoću modifikacije testa alela (Valenzuela i sar., Supra) koji detektuje prisustvo jedinstvenog reorganizovanog regiona lakog lanca humane germinativne linije.
[0292] Mladunci su genotipizovani i heterozigotno ili homozigotno mladunče za jedinstveni reorganizovani region lakog lanca humane germinativne linije je izabrano za karakterizaciju ekspresije reorganizovanog regiona lakog lanca humane germinativne linije.
[0293] Protočna citometrija. Ekspresija preuređenog regiona humanog lakog lanca u normalnom repertoaru antitela miševa zajedničkog lakog lanca, validirana je analizom imunoglobulinske κ i λ ekspresije u splenocitima i perifernoj krvi miševa zajedničkog lakog lanca. Ćelijske suspenzije iz sakupljenih slezina i periferne krvi divljeg tipa (n = 5), heterozigota Vκ1-39J κ 5 zajedničkog lakog lanca (n = 3), homozigota Vκ1-39Jκ5 zajedničkog lakog lanca (n = 3), heterozigota Vκ3-20Jκ1 zajedničkog lakog lanca (n = 2), i homozigota Vκ3-20Jκ1 zajedničkog lakog lanca (n = 2) miševa su napravljeni korišćenjem standardnih metoda i obojeni sa CD19<+>, Igλ<+>i Igκ<+>koriščenjem fluorescentno obeleženih antitela (BD Pharmigen).
[0294] Ukratko, 1x10<6>ćelija je inkubirano sa anti-mišjim CD16/CD32 (klon 2.4G2, BD Pharmigen) na ledu, tokom 10 minuta, praćeno obeležavanjem sa sledećim koktelom antitela, tokom 30 minuta na ledu: APC konjugovani anti-mišji CD19 (klon 1D3, BD Pharmigen), PerCP-Cy5.5 konjugovani anti-mišji CD3 (klon 17A2, BioLegend), FITC konjugovani antimišji Igκ (klon 187.1, BD Pharmigen), PE konjugovani anti-mišji Igλ (klon RML-42, BioLegend). Nakon bojenja, ćelije su isprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Prikupljanje podataka je izvedeno na LSRII protočnom citometru i analizirano sa FlowJo. Sakupljanje: ukupne B ćelije (CD19<+>CD3-), Igκ<+>B ćelije (Igκ<+>Igλ<->CD19<+>CD3-), Igλ<+>B ćelije (Igκ-Igλ<+>CD19<+>CD3-). Podaci prikupljeni iz uzoraka krvi i splenocita pokazali su slične rezultate. Tabela 3 prikazuje procenat pozitivnih CD19<+>B ćelija iz periferne krvi jednog reprezentativnog miša iz svake grupe koje su Igλ<+>, Igκ<+>, ili Igλ<+>Igκ<+>. Procenat CD19<+>B ćelija u perifernoj krvi divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih ili za Vκ1-39Jκ5 ili Vκ3-20Jκ1 zajednički laki lanac su prikazani na Slici 4.
TABELA 3
[0295] Ekspresija zajedničkog lakog lanca. Ekspresija svakog zajedničkog lakog lanca (Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1) je analizirana u heterozigotnim i homozigotnim miševima, korišćenjem kvantitativnog PCR testa (npr. TAQMAN ™).
[0296] Ukratko, CD19<+>B ćelije su prečišćene od slezina divljeg tipa, miševa homozigotnih za zamenu lokusa varijabilnog regiona mišjeg teškog lanca i lakog lanca κ sa odgovarajućim lokusima varijabilnog regiona humanog teškog lanca i lakog lanca κ (Ηκ), kao i miševa homozigotnih i heterozigotnih za svaki preuređeni region humanog lakog lanca (Vκ1-39Jκ5 ili Vκ3-20Jκ1), korišćenjem mišjih CD19 mikrozrnaca (Miltenyi Biotec) prema specifikacijama proizvođača. Ukupna RNK je prečišćena iz CD19<+>B ćelija korišćenjem RNeasy Mini kompleta (Qiagen) prema specifikacijama proizvođača i genomska RNK je uklonjena upotrebom tretmana DNKaze bez RNaze na koloni (Qiagen). 200 ng mRNK je reverznotranskriptovano u cDNK korišćenjem kompleta sinteze prvog lanca cDNK (Invitrogen) i dobijena cDNK je amplifikovana sa Taqman Universal PCR Master mešavinom (Applied Biosystems). Sve reakcije su izvedene korišćenjem ABI 7900 sistema za otkrivanje sekvence (Applied Biosystems), korišćenjem prajmera i Taqman MGB proba koje obuhvataju (1) Vκ-Jκ spoj za oba zajednička laka lanca, (2) sam Vκ gen (tj., Vκ1-39 i Vκ3-20), i (3) mišji Cκ region. Tabela 4 prikazuje sekvence prajmera i proba koje su korišćene za ovaj test. Relativna ekspresija je normalizovana na ekspresiju Cκ regiona miša. Rezultati su prikazani na Slikama 5A, 5B i 5C.
TABELA 4
(nastavak)
[0297] Antigen specifična antitela zajedničkog lakog lanca. Miševi sa zajedničkim lakim lancem koji nose ili Vκ1-39Jκ5 ili Vκ3-20Jκ1 zajednički laki lanac, na endogenom lokusu mišjeg lakog lanca κ, imunizovani su sa β-galaktozidazom i izmeren je titar antitela.
[0298] Ukratko, β -galaktozidaza (Sigma) je emulgovana u titermax adjuvansu (Sigma), prema uputstvima proizvođača. Divlji tip (n = 7), homozigoti Vκ1-39Jκ5 zajedničkog lakog lanca (n = 2) i homozigoti Vκ3-20Jκ1 zajedničkog lakog lanca (n = 5) su imunizovani subkutanom injekcijom sa 100 μg β-galaktozidaze/ Titermax. Miševi su podstaknuti subkutanom injekcijom dva puta, u razmaku od 3 nedelje, sa 50 μg β-galaktozidaze/Titermax. Nakon drugog pojačanja, krv je sakupljena od anesteziranih miševa koristeći retro-orbitalno krvarenje u epruvetama za separaciju seruma (BD Biosciences), prema uputstvima proizvođača. Za merenje anti-β galaktozidaznih IgM ili IgG antitela, ELISA ploče (Nunc) su obložene sa 1 μg/mL βgalaktozidaze preko noći na 4 ° C. Višak antigena je ispran pre blokiranja sa PBS-om sa 1% BSA, tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Serijska razblaženja seruma su dodata na ploče i inkubirana tokom jednog sata na sobnoj temperaturi pre pranja. Ploče su zatim inkubirane sa HRP konjugovanim anti-IgM (Southern Biotech) ili anti-IgG (Southern Biotech), tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Nakon drugog ispiranja, ploče su razvijene sa TMB supstratom (BD Biosciences). Reakcije su zaustavljene sa 1N sumpornom kiselinom, a OD450je očitan korišćenjem Victor X5 čitača ploče (Perkin Elmer). Podaci su analizirani sa GraphPad Prism i signal je izračunat kao razblaženje seruma koje je dva puta više od podloge. Rezultati su prikazani na Slikama 6A i 6B.
[0299] Kao što je prikazano u ovom Primeru, odnos κ/λ B ćelija u slezinskim i perifernim odeljcima Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 zajedničkog lakog lanca kod miševa je pokazao model blizu
1
divljeg tipa (Tabela 3 i Slika 4). Međutim, miševi VpreBJλ5 zajedničkog lakog lanca su pokazali manje perifernih B ćelija, od kojih oko 1-2% eksprimira konstruisani humani region lakog lanca (podaci nisu prikazani). Nivoi ekspresije Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1 reorganizovanih humanih regiona lakog lanca iz endogenog lokusa lakog lanca κ su bili povišeni, u poređenju sa endogenim lokusom lakog lanca κ koji sadrži kompletnu zamenu mišjih Vκ i Jκ genskih segmenata sa humanim Vκ i Jκ genskim segmentima (Slika 5A, 5B i 5C). Ekspresioni nivoi VpreBJλ5 reorganizovanog regiona humanog lakog lanca pokazuju sličnu visoku ekspresiju od endogenog lokusa lakog lanca κ i u heterozigotnim i homozigotnim miševima (podaci nisu prikazani). Ovo pokazuje da u direktnoj kompeticiji sa mišjim λ, κ, ili oba endogena lokusa lakog lanca, pojedinačna reorganizovana humana VL/JLsekvenca može dati bolji nivo ekspresije od divljeg tipa, iz endogenog lokusa lakog lanca κ i dovesti do povećanja frekvencije normalnih B ćelija slezine i krvi. Dalje, prisustvo konstruisanog lokusa lakog lanca κ koji ima bilo humanu Vκ1-39Jκ5 ili humanu Vκ3-20Jκ1 sekvencu je bio dobro tolerisan od strane miševa i čini se da funkcioniše na način divljeg tipa, tako što predstavlja značajan deo repertoara lakog lanca u humoralnim komponenta imunskog odgovora (Slika 6A i 6B).
Primer 4. Gajenje miševa koji izražavaju pojedinačni preuređeni laki lanac humane germinativne linije
[0300] Ovaj primer opisuje nekoliko drugih genetski modifikovanih mišjih sojeva koji se mogu uzgajati do bilo kojih od miševa zajedničkog lakog lanca, ovde opisanih, da bi se stvorili višestruki genetski modifikovani mišji sojevi koji sadrže višestruke genetski modifikovane imunoglobulinske lokuse.
[0301] Endogeni Igλ nokaut (KO). Da bi se optimizovala upotreba lokusa konstruisanog lakog lanca, miševi koji nose jedan od preuređenih regiona lakog lanca humane germinativne linije su gajeni do drugog miša koji sadrži deleciju u endogenom lokusu lakog lanca λ. Na ovaj način, dobijeno potomstvo će izraziti, kao njihov jedini laki lanac, preuređeni region lakog lanca humane germinativne linije, kao što je opisano u Primeru 2. Uzgajanje je izvršeno standardnim tehnikama koje su priznate u struci i, alternativno, komercijalnim odgajivačem (npr., The Jackson Laboratory). Mišji sojevi koji nose lokus konstruisanog lakog lanca i deleciju endogenog lokusa lakog lanca λ su ispitivani na prisustvo jedinstvenog regiona lakog lanca i odsustvo endogenih mišjih lakih lanaca λ.
[0302] Lokus humanizovanog endogenog teškog lanca. Miševi koji nose konstruisani lokus lakog lanca humane germinativne linije su uzgajani sa miševima koji sadrže zamenu
2
endogenog mišjeg varijabilnog lokusa gena teškog lanca sa humanim varijabilnim lokusom gena teškog lanca (videti US 6,596,541; VELOCIMMUNE® miš, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). VELOCIMMUNE® miš sadrži genom koji sadrži varijabilne regione humanog teškog lanca koji su funkcionalno povezani sa endogenim mišjim lokusima konstantnog regiona, tako da miš proizvodi antitela koja sadrže varijabilni region humanog teškog lanca i konstantni region teškog lanca miša, kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK koja kodira varijabilne regione teških lanaca antitela je izolovana i operativno povezana sa DNK koja kodira konstantne regione humanog teškog lanca. DNK je zatim izražena u ćeliji sposobnoj za izražavanje potpuno humanog teškog lanca antitela.
[0303] Dobijeni su miševi koji nose zamenu endogenog mišjeg VHlokusa sa humanim VHlokusom i jednim preuređenim VLregionom humane germinativne linije na endogenom lokusu lakog lanca κ. Reverzna himerna antitela koja sadrže somatski mutirane teške lance (humani VHi mišji CH) sa pojedinačim humanim lakim lancem (humani VLi mišji CL) su dobijena nakon imunizacije sa antigenom od interesa. Identifikovane su VHi VLnukleotidne sekvence B ćelija koje eksprimiraju antitela i potpuno humana antitela su napravljena fuzijom VHi VLnukleotidnih sekvenci sa humanim CHi CLnukleotidnim sekvencama u pogodnom ekspresionom sistemu.
Primer 5. Generisanje antitela od miševa koji izražavaju humane teške lance i jedan preuređeni region lakog lanca humane germinativne linije
[0304] Nakon gajenja miševa koji sadrže konstruisani humani region lakog lanca do različitih željenih sojeva koji sadrže modifikacije i delecije drugih endogenih Ig lokusa (kao što je opisano u Primeru 4), odabrani miševi mogu biti imunizovani sa antigenom od interesa.
[0305] Generalno, VELOCIMMUNE® miš koji sadrži jedan od preuređenih regiona lakog lanca humane germinativne linije je izazvan sa antigenom, a limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) su oporavljene iz seruma životinja. Limfatične ćelije su fuzionisane sa ćelijskom linijom mijeloma da bi se pripremile besmrtne ćelijske linije hibridoma, a takve ćelijske linije hibridoma su ispitane i odabrane da identifikuju hibridomske ćelijske linije koje proizvode antitela koja sadrže varijable humanog teškog lanca i preuređene lake lance humane germinativne linije koji su specifični za korišćenog antigena, za imunizaciju. DNK koje kodiraju varijabilne regione teških lanaca i lakog lanca su izolovane i povezane sa poželjnim izotipskim konstantnim regionima teškog lanca i lakog lanca. Zbog prisustva endogenih mišjih sekvenci i bilo kojih dodatnih cis-delujućih elemenata prisutnih u endogenom lokusu, pojedinačni laki lanac od svakog antitela može biti somatski mutiran. Ovo dodaje dodatnu raznolikost antigen-specifičnom repertoaru koji obuhavata jedan pojedinačni laki lanac i različite sekvence teškog lanca. Dobijene sekvence kloniranih antitela su zatim izražene u ćeliji, kao što je jedna CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira antigen-specifična himerna antitela ili varijabilne domene lakog i teškog lanca je identifikovana direktno iz antigenspecifičnih limfocita.
[0306] Početno su izolovana himerna antitela visokog afiniteta koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kao što je gore opisano, antitela su karakterisana i odabrana za željene karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantnim regionom da bi se generisalo potpuno humano antitelo koje sadrži jedan somatski mutirani humani teški lanac i jedan pokjedinačni laki lanac izveden iz reorganizovanog regiona lakog lanca humane germinativne linije prema pronalasku. Pogodni humani konstantni regioni uključuju, na primer divlji tip ili modifikovani IgG1 ili IgG4.
[0307] Odvojene kohorte VELOCIMMUNE® miševa koji sadrže zamenu endogenog mišjeg lokusa teškog lanca sa humanim VH, DHi JHgenskim segmentima i zamenu endogenog mišjeg lokusa lakog lanca κ ili sa konstruisanim regionom humanog lakog lanca germinativne linije Vκ1-39Jκ5 ili sa konstruisanim regionom humanog lakog lanca germinativne linije Vκ3-20Jκ1 (gore opisano) su bile imunizovane sa jednim humanim receptorskim proteinom na površini ćelije (Antigen E). Antigen E je primenjen direktno na zadnju šapu miševa sa šest uzastopnih injekcija svakih 3-4 dana. Dva do tri mikrograma Antigena E su pomešana sa 10 μg CpG oligonukleotida (Kat # tlrl-modn-ODN1826 oligonukleotid; InVivogen, San Diego, CA) i 25 μg Adju-Phos (aluminijum fosfatni gel adjuvans, Kat # H-71639 -250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Danska) pre injekcije. Ukupno šest injekcija je dato pre konačnog ukidanja antigena, koji je dat 3-5 dana pre žrtvovanja. Krvarenja nakon 4. i 6. injekcije su sakupljena i imunološki odgovor antitela je praćen standardnim antigen-specifičnim imuno testom.
[0308] Kada je postignut željeni imunski odgovor, splenociti su sakupljeni i fuzionisani sa mišjim mijelomskim ćelijama da bi se sačuvala njihova održivost i formirale ćelijske linije hibridoma. Hibridomske ćelijske linije su ispitane i odabrane da identifikuju ćelijske linije koje proizvode antigen E-specifična antitela zajedničkog lakog lanca. Korišćenjem ove tehnike dobijeno je nekoliko specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E (tj., antitela koja poseduju humane varijabilne domene teškog lanca, isti humani varijabilni domen lakog lanca i mišje konstantne domene).
4
[0309] Alternativno, antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E su izolovana direktno iz antigen-pozitivnih B ćelija bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u U.S.2007/0280945 A1. Koristeći ovu metodu, dobijeno je nekoliko potpuno humanih antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E (tj., antitela koja poseduju varijabilne domene humanog teškog lanca, bilo konstruisanog humanog regiona lakog lanca Vκ1-39Jκ5 ili konstruisanog humanog regiona lakog lanca Vκ3-20Jκ1 i humane konstantne domene).
[0310] Biološka svojstva primernih antitela protiv antigena E zajedničkog lakog lanca generisanih u skladu sa metodama iz ovog Primera, detaljno su opisana u odeljcima koji su niže navedeni.
Primer 6. Upotreba genskog segmenta teškog lanca u antigen-specifičnim antitelima zajedničkog lakog lanca
[0311] Da bi se analizirala struktura proizvedenih humanih antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E, klonirane su i sekvencionisane nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca antitela. Od sekvenci nukleinskih kiselina i predviđenih aminokiselinskih sekvenci antitela, identifikovana je upotreba gena za varijabilni region teškog lanca (HCVR) od izabranih antitela zajedničkog lakog lanca, dobijenih iz imunizovanih VELOCIMMUNE® miševa koji sadrže ili konstruisani humani region lakog lanca Vκ1-39Jκ5 ili konstruisani humani region lakog lanca Vκ3-20Jκ1. Rezultati su prikazani u tabelama 5 i 6, a oni pokazuju da miševi u skladu sa ovim pronalaskom generišu antigen-specifična antitela zajedničkog lakog lanca iz različitih genskih segmenata humanog teškog lanca, usled različitih preuređivanja, kada se koristi ili miš koji izražava laki lanac samo iz jednog humanog Vκ1-39-izvedenog ili jednog humanog Vκ3-20-izvedenog lakog lanca. Humani VHgenski segmenti od 2, 3, 4 i 5 familija su preuređeni sa različitim humanim DHsegmentima i humanim JHsegmentima da bi se dobila antigen-specifična antitela.
TABELA 5
(nastavak)
TABELA 6
Primer 7. Određivanje blokirajuće sposobnosti antigen-specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca pomoću LUMINEX ™ testa
[0312] Devedeset osam antitela zajedničkog humanog lakog lanca, potstaknutih protiv Antigena E je testirano na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje prirodnog liganda Antigena E (Liganda Y) za Antigen E, u testu na bazi zrnaca.
[0313] Ekstracelularni domen (ECD) antigena E je konjugovan sa dve oznake myc epitopa i oznakom 6X histidina (Antigen E-mmH) i kuplovan aminom za karboksilirane mikrosfere, pri koncentraciji od 20 μg/mL u MES puferu. Smeša je inkubirana tokom dva sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledila deaktivacija zrnaca sa 1 M Tris pH 8,0 praćeno ispiranjem u PBS-u sa 0,05% (v/v) Tween-20. Zrnca su zatim blokirana sa PBS-om (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrže 2% (m/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). U filter ploči sa 96 bazenčića, supernatanti koji sadrže antigen E-specifična antitela zajedničkog lakog lanca su razblaženi 1: 15 u puferu. Pripremljena je negativna kontrola koja sadrži jedan lažni supernatant sa istim komponentama medijuma kao za supernatant antitela. Zrnca obeležena antigenom E su dodata supernatantima i inkubirana preko noći na 4 ° C. Biotinilovani-Ligand Y protein je dodat do konačne koncentracije od 0,06 nM i inkubiran tokom dva sata na sobnoj temperaturi. Detekcija biotinilovanog-liganda Y vezanog za antigen E-myc-myc-6His obeležena zrnca je određena sa R-fikoeritrinom konjugovanim sa Streptavidinom (Moss Inc, Pasadena, MD) praćeno merenjem u LUMINEX ™ analizatoru na bazi protočne citometrije. Srednji intenzitet fluorescencije podloge (MFI) od uzorka bez liganda Y je oduzet od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat deljenjem pozadinski oduzete MFI od svakog uzorka sa podešenom negativnom kontrolnom vrednošću, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.
[0314] U sličnom eksperimentu, istih 98 antitela humanog zajedničkog lakog lanca potstaknutih protiv Antigena E je ispitivano na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje antigena E za zrnca obeležena sa ligandom Y.
[0315] Ukratko, ligand Y je aminski kuplovan sa karboksiliranim mikrosferama, pri koncentraciji od 20 μg/mL razblažen u MES puferu. Smeša je inkubirana dva sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je izvršena deaktivacija kuglica sa 1 M Tris pH 8, zatim ispiranjem u PBS sa 0,05% (v/v) Tween-20. Zrnca su zatim blokirana sa PBS-om (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrži 2% (m/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). U filter ploči sa 96 bazenčića, supernatanti koji sadrže antigen E-specifična antitela zajedničkog lakog lanca su razblaženi 1: 15 u puferu. Pripremljena je negativna kontrola koja sadrži jedan lažni supernatant sa istim komponentama medijuma kao za supernatant antitela. Dodat je biotinilovani antigen E-mmH do konačne koncentracije od 0,42 nM i inkubiran preko noći na 4 ° C. Zrnca obeležena ligandom Y su zatim dodata u smešu antitelo / antigen E i inkubirana dva sata na sobnoj temperaturi. Detekcija biotinilovanog antigena E-mmH vezanog za Ligand Y-kuglice je određena sa R-fikoeritrinom konjugovanim sa Streptavidinom (Moss Inc, Pasadena, MD) praćeno merenjem u LUMINEX ™ analizatoru baziranom na protočnoj citometriji. Srednja vrednost intenziteta fluorescencije podloge (MFI) od uzorka bez antigena E je oduzeta od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat tako što je pozadinski oduzeta MFI od svakog uzorka podeljena sa podešenom negativnom kontrolnom vrednošću, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.
[0316] Tabele 7 i 8 pokazuju procenat blokiranja za svih 98 antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E, ispitivanih u oba LUMINEX™ testa. ND: nije određeno pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.
TABELA 7
1 (nastavak)
11 (nastavak)
12 (nastavak)
TABELA 8
1
[0317] U prvom LUMINEX™ eksperimentu, gore opisanom, ispitivano je 80 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ 1-39Jκ5 konstruisani laki lanac, na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje liganda Y za kuglice obeležene Antigenom E. Od ovih 80 antitela zajedničkog lakog lanca, 68 je pokazalo > 50% blokiranja, dok je 12 pokazalo < 50% blokiranja
1 4
(6 pri 25- 50% blokiranja i 6 pri <25% blokiranja). Za 18 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ3-20Jκ1 konstruisani laki lanac, 12 je pokazalo> 50% blokiranja, dok je 6 pokazalo <50% blokiranja (3 pri 25-50% blokiranja i 3 pri <25% blokiranja) vezivanja liganda Y za zrnca obeležena Antigenom E.
[0318] U drugom eksperimentu LUMINEX ™ koji je gore opisan, istih 80 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ 1-39Jκ5 konstruisani laki lanac su ispitivana na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje antigena E za zrnca obeležena ligandom Y. Od ovih 80 antitela zajedničkog lakog lanca, 36 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 44 pokazalo <50% blokiranja (27 pri 25-50% blokiranja i 17 pri <25% blokiranja). Za 18 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ 3-20Jκ1 konstruisani laki lanac, 1 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 17 pokazalo <50% blokiranja (5 pri 25-50% blokiranja i 12 pri <25% blokiranja) vezivanja Antigena E za zrnca obeležena ligandom Y.
[0319] Podaci iz tabela 7 i 8 utvrđuju da su preuređivanja opisana u tabelama 5 i 6 generisala antitela zajedničkog lakog lanca, specifična protiv antigena E, koja su blokirala vezivanje liganda Y za njegov srodni receptor Antigen E sa različitim stepenom efikasnosti, što je u skladu sa antitelima zajedničkog lakog lanca protiv Antigena E iz Tabele 5 i 6 koja sadrže antitela sa preklapajućom i ne-preklapajućom specifičnošću epitopa u odnosu na Antigen E.
Primer 8. Određivanje sposobnosti blokiranja antigen-specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca pomoću ELISA
[0320] Antitela humanog zajedničkog lakog lanca potstaknuta protiv Antigena E su ispitivana na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje Antigena E za površinu obloženu Ligandom Y u ELISA testu.
[0321] Ligand Y je obložen na ploče sa 96 bazenčića, pri koncentraciji od 2 μg/mL, razblažen u PBS-u i inkubiran preko noći, praćeno ispiranjem četiri puta u PBS-u sa 0,05% Tween-20. Ploča je zatim blokirana sa PBS-om (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrži 0,5% (m/v) BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. U odvojenoj ploči, supernatanti koji sadrže anti-antigen E antitela zajedničkog lakog lanca su razblaženi 1:10 u puferu. Kao negativna kontrola je korišćen lažni supernatant sa istim komponentama antitela. Antigen E-mmH (gore opisan) je dodat u finalnoj koncentraciji od 0,150 nM i inkubiran tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Smeša antitelo/antigen E-mmH je zatim dodata na ploču koja sadrži ligand Y i inkubirana tokom jednog sata na sobnoj temperaturi. Detekcija antigena E-mmH vezanog za ligand Y je određena sa peroksidazom
1
rena (HRP) konjugovanim sa anti-Penta-His antitelom (Qiagen, Valencia, CA) i razvijena standardnim kolorimetrijskim odgovorom, korišćenjem tetrametilbenzidin (TMB) supstrata (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralisanog sumpornom kiselinom. Apsorbanca je očitana na OD450 tokom 0,1 sek. Apsorbanca podloge od uzorka bez Antigena E je oduzeta od svih uzoraka. Procenat blokiranja je izračunat deljenjem pozadinski-oduzete MFI od svakog uzorka sa podešenom negativnom kontrolnom vrednošću, množenjem sa 100 i oduzimanjem dobijene vrednosti od 100.
[0322] Tabele 9 i 10 prikazuju procenat blokiranja za svih 98 antitela zajedničkog lakog lanca protiv Antigena E ispitivanih u ELISA testu. ND: nije određeno pod trenutnim eksperimentalnim uslovima.
TABELA 9
1
(nastavak)
1
TABELA 10
Antitela zajedničkog lakog lanca
Vκ 3-20Jκ1
Antitelo % Blokiranja antigena E u Antitelo % Blokiranja antigena u rastvoru rastvoru
[0323] Kao što je opisano u ovom Primeru, 80 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ1-39Jκ5 konstruisani laki lanac su ispitivana na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje Antigena E za površinu obloženu Ligandom Y, 22 je pokazalo >50% blokiranja, dok je 58 pokazalo <50 % blokiranja (20 pri 25-50% blokiranja i 38 pri <25% blokiranja). Za 18 antitela zajedničkog lakog lanca koja sadrže Vκ 3-20Jκ1 konstruisani laki lanac, jedno je pokazalo > 50% blokiranja, dok je 17 pokazalo <50% blokiranja (5 pri 25-50% blokiranja i 12 pri <25% blokiranja) vezivanja Antigena E na površinu obloženu Ligandom Y.
[0324] Ovi rezultati su takođe u skladu sa antigen E-specifičnim bazenom antitela zajedničkog lakog lanca koji sadrži antitela sa preklapajućom i ne-preklapajućom specifičnošću epitopa u odnosu na Antigen E.
Primer 9. BIACORE ™ određivanje afiniteta za antigen specifična antitela zajedničkog lakog lanca
[0325] Konstante ravnoteže disocijacije (KD) za odabrane supernatante antitela su određene pomoću SPR (Površinske plazmonskle rezonance) korišćenjem BIACORE™ T100 instrumenta (GE Healthcare). Svi podaci su dobijeni korišćenjem HBS-EP (10mM Hepes, 150
1
mM NaCl, 0,3 mM EDTA, 0,05% surfaktant P20, pH 7,4) kao i pufera za proticanje i uzorkovanje, na 25 ° C. Antitela su uhvaćena iz uzoraka sirovog supernatanta na površini CM5 senzorskog čipa, prethodno derivatizovana sa anti-humanim Fc antitelima visoke gustine korišćenjem standardne hemije za kuplovanje amina. Tokom koraka hvatanja, supernatanti su injektovani duž anti-humane Fc površine, pri brzini protoka od 3 μL/min, za ukupno 3 minuta. Korak hvatanja je praćen injekcijom pufera za proticanje ili analita, u koncentraciji od 100 nM tokom 2 minuta, pri brzini protoka od 35 μL/min. Disocijacija antigena iz zarobljenog antitela je praćena tokom 6 minuta. Zarobljeno antitelo je uklonjeno kratkom injekcijom od 10 mM glicina, pH 1,5. Svi senzogrami su dvostruko referencirani oduzimanjem senzograma iz injektiranih pufera iz senzograma analita, čime se uklanjaju veštački proizvodi uzrokovani disocijacijom antitela sa površine za hvatanje. Podaci vezivanja za svako antitelo su bili prilagođeni modelu vezivanja 1: 1 sa masenim transportom, korišćenjem BIAcore T100 softvera za evaluaciju v2.1. Rezultati su prikazani u tabelama 11 i 12.
TABELA 11
1
(nastavak)
11 (nastavak)
TABELA 12
[0326] Afiniteti vezivanja antitela zajedničkog lakog lanca, koja sadrže reorganizovanja prikazana u tabelama 5 i 6 variraju, a skoro sva ispoljavaju KDu nanomolarnom opsegu. Podaci o afinitetu su u skladu sa antitelima zajedničkog lakog lanca koji nastaju iz kombinatorne asocijacije preuređenih varijabilnih domena opisanih u tabelama 5 i 6, koja su visoko afinitetna, klonalno selektovana i somatski mutirana. Zajedno sa prethodno prikazanim podacima, antitela zajedničkog lakog lanca opisana u tabelama 5 i 6, sadrže kolekciju različitih, visoko afinitetnih antitela koja ispoljavaju specifičnost za jedan ili više epitopa na antigenu E.
Primer 10. Određivanje specifičnosti vezivanja antigen-specifičnih antitela zajedničkog lakog lanca pomoću LUMINEX ™ testa
[0327] Odabrana antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E su ispitivana na njihovu sposobnost da se vezuju za ECD antigena E i ECD varijante antigena E, uključujući ortologa cynomolgous majmuna (Mf Antigen E), koji se razlikuje od humanog proteina u približno 10% svojih aminokiselinskih ostataka; delecionog mutanta Antigena E kome nedostaju poslednjih 10 aminokiselina iz C-terminalnog kraja ECD-a (Antigen E-ΔCT); i dva mutanta koji sadrže supstituciju alanina na mestima za koje se sumnja da stupaju u interakciju sa Ligandom Y (Antigen E-Ala1 i AntigenE-Ala2). Proteini antigena A su proizvedeni u CHO ćelijama i svaki sadrži myc-myc-His C-terminalnu oznaku.
[0328] Za studije vezivanja, Antigen E ECD protein ili varijantni protein (gore opisan) je uhvaćen inkubacijom iz 1 mL medijuma kulture, tokom 2 h na sobnoj temperaturi sa 1 x 10<6>mikrosfera (LUMINEX ™) zrnaca, kovalentno obloženih sa anti-myc monoklonskim antitelom (MAb 9E10, ćelijska linija hibridoma CRL-1729 ™; ATCC, Manassas, VA). Zrnca su zatim isprana sa PBS-om pre upotrebe. Supernatanti koji sadrže antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E su bili razblaženi 1: 4 u puferu i dodati u filterske ploče sa 96 bazenčića. Kao negativna kontrola je korišćen lažni supernatant bez antitela. Zrnca koje sadrže uhvaćene Antigen E proteine su zatim dodata uzorcima antitela (3000 zrnaca po bazenčiću) i inkubirana preko noći na 4 ° C. Sledećeg dana, zrnca uzorka su isprana i vezano antitelo zajedničkog lakog lanca je detektovano sa anti-humanim IgG antitelom konjugovanim sa R-fikoeritrinom. Intenzitet fluorescencije zrnaca (približno 100 izbrojanih zrnaca za svaki uzorak antitela koji se vezuje za svaki antigen E protein) je izmeren sa LUMINEX ™ analizatorom, baziranim na protočnoj citometriji, i zabeležen je srednji intenzitet fluorescencije (MFI) za najmanje 100 izbrojanih zrnaca po interakciji zrno/antitelo. Rezultati su prikazani u tabelama 13 i 14.
TABELA 13
11 (nastavak)
(nastavak)
11 (nastavak)
11
TABELA 14
11
[0329] Supernatanti antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E su ispoljili visoko specifično vezivanje za zrnca povezana sa Antigenom E-ECD. Za ova zrnca, lažni supernatant negativne kontrole je rezultirao zanemarljivim signalom (<10 MFI), kada je bio kombinovan sa uzorkom zrnca antigena E-ECD, dok su supernatanti koji sadrže antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E ispoljili snažan vezivni signal (prosečan MFI od 2627) za 98 supernatanata antitela; MFI > 500 za uzorke antitela 91/98).
[0330] Kao mera sposobnosti odabranih antitela zajedničkog lakog lanca protiv antigena E za identifikaciju različitih epitopa na ECD-u antigena E, određena su relativna vezivanja antitela za varijante. Sve četiri varijante antigena E su uhvaćene na zrncima anti-myc LUMINEX ™, kao što je gore opisano za studije vezivanja prirodnog antigena E-ECD, i određeni su relativni odnosi vezivanja (MFIvarijanta/ MFIAntigen E-ECD). Za 98 testiranih supernatanata antitela zajedničkog lakog lanca, prikazanih u tabelama 12 i 13, prosečni odnosi (MFIvarijanta/ MFIAntigen
E-ECD) su se razlikovali za svaku varijantu, verovatno odražavajući različite količine proteina zadržane na zrncima (prosečan odnos od 0,61, 2,9, 2,0 i 1, 0 za Antigen E-ΔCT, Antigen E-Ala1, Antigen E-Ala2, i Mf Antigen E, respektivno). Za svaku varijantu proteina, vezivanje za podgrupu od 98 ispitivanih antitela zajedničkog lakog lanca pokazalo je značajno redukovano vezivanje, ukazujući na osetljivost prema mutaciji koja karakteriše datu varijantu. Na primer, 19 uzoraka antitela zajedničkog lakog lanca vezanih za Mf Antigen E sa MFIvarijanta/ MFIAntigen
E-ECDod <8%. Pošto mnogi u ovoj grupi uključuju antitela visokog ili umereno visokog afiniteta (5 sa KD<5 nM, 15 sa KD<50 nM), verovatno je da niži signal za ovu grupu rezultira iz osetljivosti prema razlikama sekvence (epitopa) između nativnog antigena E-ECD i date varijante, pre nego od nižih afiniteta.
[0331] Ovi podaci dokazuju da antitela zajedničkog lakog lanca, opisana u tabelama 5 i 6 predstavljaju različitu grupu antitela zajedničkog lakog lanca, specifičnih za antigen-E koja specifično prepoznaju više od jednog epitopa na Antigenu E.
Primer 11. Menjanje lakog lanca u antitelima zajedničkih lakih lanaca
[0332] Teški lanci izabranih antigen-specifičnih antitela zajedničkih lakih lanaca su ispitivani na vezivanje za Antigen E, nakon popravljanja teških lanaca bilo sa germinativnom linijom Vκ 1-39Jκ5 ili germinativnom linijom Vκ 3-20Jκ1 konstruisanog lakog lanca (kao što je opisano u Primeru 1).
[0333] Ukratko, 247 teških lanaca od antigen E-specifičnih antitela zajedničkih lakih lanaca (Vκ1-39Jκ5 i Vκ3-20Jκ1) su transfektovani bilo sa germinativnom linijom Vκ1-39 ili
11
germinativnom linijom Vκ3-20 konstruisanog lakog lanca i ponovo ispitivani za vezivanje za Antigen E pomoću LUMINEX ™ testa (kao što je opisano u Primeru 7 i Primeru 10). Vezivanje za Antigen E je potvrđeno pomoću BIACORE ™ (kao što je opisano u Primeru 9). Rezultati su prikazani u tabeli 15.
[0334] Kao što je prikazano u ovom Primeru, dvadeset osam antitela zajedničkog lakog lanca specifičnih za Antigen E je bilo sposobno za vezivanje za Antigen E, kada su popravljena sa oblikom germinativne linije lakog lanca.
TABELA 15
Primer 12. Upotreba gena teškog lanca i učestalost somatske hipermutacije u antitelima zajedničkih lakih lanaca
[0335] Sekvence teških i lakih lanaca (> 6000) antitela, potstaknutih kod VELCOIMMUNE® miševa (npr., US 6,596,541 i US 7,105,348) su sastavljene sa sekvencama teškog i lakog lanca (> 600) antitela zajedničkog lakog lanca, dobijenim pomoću višestruke-antigenske imunizacione šeme koja koristi miševe konstruisanog lakog lanca (gore opisane), za upoređivanje korišćenja segmenta gena teškog lanca i učestalosti somatske hipermutacije od lanaca antitela.
[0336] Upotreba gena teškog lanca. Sekvence teških i lakih lanaca dobijene od VELCOIMMUNE® miševa koji sadrže zamenu endogenog mišjeg lokusa teškog lanca sa humanim VH, DHi JHgenskim segmentima i zamenu endogenog mišjeg lokusa lakog lanca κ bilo sa konstruisanim humanim regionom lakog lanca Vκ1-39Jκ5 germinativne linije ili sa konstruisanim humanim regionom lakog lanca Vκ3-20Jκ1 germinativne linije (kao što je opisano u Primeru 2) imunizovanih sa humanim receptorom na površini ćelije (Antigenom E), heterodimerom od dva humana glikoproteina ćelijske površine (Antigenom F), humanim receptorom citokina (Antigenom G) i antigenom za diferencijaciju humanog tumora (Antigenom H) su analizirani za korišćenje genskog segmenta teškog lanca i genski segmenti VHi JHsu registrovani. Rezultati su prikazani u tabelama 16 - 18. Procenti u tabelama 16 - 18
11
predstavljaju zaokružene vrednosti i u nekim slučajevima ne mogu biti jednake 100% kada se zbirno dodaju.
[0337] Tabela 16 prikazuje procenat korišćenja familije teških lanaca za antitela iz VELCOIMMUNE® miševa (VI), antitela iz VELCOIMMUNE® miševa koja imaju srodni Vκ1 - 39 laki lanac (VI - Vκ1-39), antitela iz Vκ1 - 39 konstruisanog lakog lanca miševa (Vκ1 -39), antitela iz VELCOIMMUNE® miševa koja imaju srodni Vκ3-20 laki lanac (VI - Vκ3-20), i antitela od Vκ3-20 konstruisanog lakog lanca miševa (Vκ3-20). Tabela 17 prikazuje procenat upotrebe VHi JHgena za antitela od VELCOIMMUNE® miševa (VI), antitela od VELCOIMMUNE® miševa sa srodnim Vκ1-39 lakim lancem (VI - Vκ1-39), antitela od miševa sa Vκ1-39 konstruisanim lakim lancem (Vκ1-39), antitela od VELCOIMMUNE® miševa sa srodnim Vκ3-20 lakim lancem (VI - Vκ3-20), i antitela od miševa sa Vκ3-20 konstruisanim lakim lancem (Vκ3-20). Tabela 18 prikazuje procenat korišćenja VHgena za antitela od miševa Vκ1-39 konstruisanog lakog lanca (Vκ1-39 Miševi) iz svake imunizacione grupe (Antigeni E, F, G i H) i procenat korišćenja VHgena za antitela od miševa konstruisanog lakog lanca Vκ3-20 (Vκ3-20 Miševi) iz odabranih imunizacionih grupa (Antigeni E i G).
[0338] Kao što je prikazano u ovom Primeru, korišćenje gena teškog lanca za antigene ispitivane kod miševa konstruisanog lakog lanca Vκ1-39Jκ5 je bilo karakterisano pomoću pretežnih podgrupa III familije VH(VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-20, VH3-23, VH3-30, VH3-33 i VH3-48). Značajno korišćenje drugih podgrupa familije VHje karakterisano korišćenjem VH1-18, VH1-69, VH2-5, VH4-59 i VH6-1. Za antigene ispitivane kod miševa konstruisanog lakog lanca Vκ3-20Jκ1, korišćenje gena teškog lanca je karakterisano pretežnim podgrupama III, IV i V familije VH(VH3-11, VH3-30, VH3-33, VH4-39, VH4-59 i VH5-51). Značajna upotreba drugih podgrupa VHfamilije je karakterisana upotrebom VH1-18, VH1-69, VH2-70 i VH6-1.
[0339] Učestalost somatske hipermutacije. Teški i laki lanci antitela pobuđenih kod VELCOIMMUNE® miševa i miševi konstruiosanog lakog lanca (gore opisani) su poravnani sa sekvencama germinativne linije, u skladu sa upotrebom gena teškog i lakog lanca prikazanom za svaki teški i / ili laki lanac. Izračunate su aminokiselinske promene za svaki okvirni region (FW) i region za određivanje komplementarnosti (CDR), za teški i laki lanac svake sekvence. Rezultati su prikazani u tabelama 19 - 22. Procenti u tabelama 21 - 24 predstavljaju zaokružene vrednosti i u nekim slučajevima ne mogu biti jednake 100% kada se dodaju zajedno.
[0340] Tabela 19 prikazuje broj promena aminokiselina (AA) zapaženih u svakom FW i CDR regionu teških lanaca antitela od VELCOIMMUNE® miševa, teških lanaca antitela od miševa
12
Vκ1-39 konstruisanog lakog lanca (Vκ1-39 Miševi) i teških lanaca antitela od miševa Vκ3-20 konstruisanog lakog lanca (Vκ3-20 Miševi). Tabela 20 prikazuje broj promena aminokiselina (AA) koje su uočene u svakom FW i CDR regionu lakih lanaca antitela od VELCOIMMUNE® miševa, lakog lanca antitela od Vκ1-39 konstruisanih miševa (Vκ1-39 Miševi) i lakog lanca antitela od Vκ3-20 konstruisanih miševa (Vκ3-20 Miševi). Tabela 21 prikazuje broj promena aminokiselina (AA) koje su uočene u svakom FW i CDR regionu teških lanaca antitela od miševa Vκ1-39 konstruisanog lakog lanca (Vκ1-39 Miševi) za odabrane imunizacione grupe (Antigeni E, F i H) ). Tabela 22 prikazuje broj promena aminokiselina (AA) koje su uočene u svakom FW i CDR regionu teških lanaca antitela od Vκ3-20 konstruisanog lakog lanca miševa (Vκ3-20 Miševi) za odabrane imunizacione grupe (Antigeni E i G).
TABELA 16
TABELA 17
(nastavak)
(nastavak)
TABELA 18
12 (nastavak)
TABELA 19
12
TABELA 20
12
TABELA 21
12
TABELA 22
Primer 13. Afinitet vezivanja bispecifičnih antitela koja imaju univerzalne lake lance
[0341] Potpuno humana bispecifična antitela su konstruisana od kloniranih humanih varijabilnih regiona teškog lanca od izabranih monospecifičnih anti-antigen E antitela zajedničkog lakog lanca (opisanih u Primeru 5), korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK koje su poznate u struci. Tabela 23 prikazuje uparivanje humanih teških lanaca (HC-1 i HC-2) od odabranih roditeljskih monospecifičnih antitela; svaki par je angažovan sa preuređenim humanim Vκ1-39/Jκ1 lakim lancem germinativne linije, za konstrukciju svakog bispecifičnog antitela.
12
[0342] Vezivanje bispecifičnih ili roditeljskih monospecifičnih anti-Antigen E antitela za ekstracelularni domen (ECD) Antigena E je određeno korišćenjem biosenzornog testa površinske plazmonske rezonance u realnom vremenu na BIACORE ™ 2000 instrumentu (GE Healthcare). CM5 BIACORE ™ senzorska površina derivatizovana sa anti-c-myc-specifičnim monoklonskim antitelom (Klon # 9E10), korišćenjem EDC-NHS hemije je korišćena za hvatanje C-terminalnog myc-myc-heksahistidinom obeleženog ECD od antigena E (AntigenE-mmh). Oko 190 RUs od antigenaE-mmh je uhvaćeno na površini senzora BIACORE ™, praćeno injekcijom koncentracija od 300nM i 50nM različitih bispecifičnih ili roditeljskih monospecifičnih antitela protiv antigena E, pri brzini protoka od 50 μl/min. Eksperiment je izveden na 25 ° C, u HBST puferu proticanja (0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCI, 3mM EDTA, 0,05% v/v Surfaktant P20). Količina vezivanja antitela za površinu AntigenE-mmh, pri koncentraciji od 300 nM je zabeležena tri sekunde pre kraja injekcije antitela i prikazana na dijagramu.
[0343] Tabela 24 i Slika 8 prikazuju odgovore vezivanja (BIACORE ™ jedinice; RU) primećene za svako bispecifično antitelo (BsAt) i monospecifično roditeljsko antitelo (PAt-1, PAt-2).Pošto je svako antitelo injektovano pod uslovima zasićenja preko identične površine AntigenE-mmh, odgovor vezivanja odražava stehiometriju vezivanja za svako antitelo koje se vezuje za površinu za hvatanje antigena.
[0344] Kao što je prikazano u ovom Primeru, zapaženi odgovor vezivanja za svako bispecifično antitelo je bio približno 2 puta veći od odgovora vezivanja za svako roditeljsko monospecifično antitelo (Tabela 24 i Slika 8), pokazujući funkcionalnu konstrukciju bispecifičnih antitela korišćenjem teških lanaca od antigen-specifičnih monoklonskskih antitela i zajednički laki lanac, gde se svaka Fab ruka u molekuli bispecifičnog antitela istovremeno vezuje za različite epitope na ekstracelularnom domenu receptora na površini ćelije (Antigen E; videti Sliku 7B, dole levo).
TABELA 23
12
TABELA 24
Primer 14. Generisanje i analiza miševa koji eksprimiraju dva humana laka lanca
[0345] Korišćenjem metoda, gore opisanih u Primeru 2, konstruisana su dva dodatna lokusa konstruisanog lakog lanca koji sadrže dva humana Vκ segmenta gena (npr., jedan humani Vκ1-39 i jedan humani Vκ3-20 genski segment) (Slika 9). Jedan lokus konstruisanog lakog lanca sadrži dva humana Vκ genska segmenta i pet humanih Jκ genskih segmenata u nepreuređenoj konfiguraciji (DLC-5J). Lokus drugog konstruisanog lakog lanca sadrži dva humana Vκ genska segmenta i jedan humani Jκ genski segment u nepreuređenoj konfiguraciji (DLC-1J). Za svaki od dva dodatna konstruisana lokusa lakog lanca, humani genski segmenti su bili okruženi 3' sa rekombinacionim signalnim sekvencama da bi se omogućilo in vivo preuređivanje humanih segmenata gena u B ćelijama.
[0346] Modifikovani BAC DNK klonovi, koji pojedinačno sadrže svaki od lokusa konstruisanog lakog lanca koji su operativno vezani za mišje sekvence (tj., ushodne i nishodne sekvence endogenog imunoglobulinskog lokusa lakog lanca κ) su bili potvrđeni pomoću PCR-a, korišćenjem prajmera lokalizovanih u sekvencama unutar lokusa svakog konstruisanog lakog lanca koji sadrže dva humana Vκ genska segmenta, praćeno elektroporacijom u ES ćelije da se stvore miševi koji eksprimiraju bilo koji od dva humana Vκ genska segmenta (kao što je gore opisano). Pozitivni klonovi ES ćelija koji sadrže bilo koji od gore opisanih lokusa konstruisanih lakih lanaca, potvrđeni su TAQMAN ™ skriningom i kariotipovanjem, upotrebom proba specifičnih za lokuse konstruisanog lakog lanca (kao što je gore opisano). Potvrđeni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni da se implantiraju ženke miševa da bi se dobilo leglo mladunaca, koji eksprimiraju humani varijabilni domen lakog lanca fuzionisan sa mišjim Cκ domenom, koji se ovde nazivaju kao miševi dvostrukog lakog lanca (DLC).
1
[0347] Alternativno, ES ćelije koje nose lokus projektovanog lakog lanca, mogu biti transfektovane sa konstruktom koji izražava FLP da bi se uklonila FRTed neomicinska kaseta uvedena ciljnim konstruktom. Opciono, neomicinska kaseta se uklanja uzgajanjem do miševa koji eksprimiraju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, neomicinska kaseta je zadržana u miševima.
[0348] Protočna citometrija. Populacije B ćelija i razvoj B ćelija u DLC miševima je validiran analizom protočne citometrije preparata splenocita i koštane srži. Ćelijske suspenzije homozigotnih miševa za dva humana Vκ genska segmenta i pet humanih Jκ genskih segmenata (n = 4), miševa homozigotnih za dva humana Vκ genska segmenta i jedan humani Jκ genski segment (n = 4), i divljeg tipa miševa (n = 4) su napravljene korišćenjem standardnih metoda (gore opisanih) i obojene sa fluorescentno obeleženim antitelima (kao što je opisano u Primeru 3).
[0349] Ukratko, 1 x 10<6>ćelija je inkubirano sa anti-mišjim CD16/CD32 (klon 2.4G2, BD Pharmigen) na ledu tokom 10 minuta, praćeno obeležavanjem sa sledećim koktelom antitela tokom 30 minuta na ledu: APC-H7 konjugovani anti-mišji CD19 (klon 1 D3, BD Pharmigen), Pacifički plavi konjugovani anti-mišji CD3 (klon 17A2, BioLegend), FITC konjugovani antimišji Igκ (klon 187.1, BD Pharmigen) ili anti-mišji CD43 (klon 1B11, BioLegend), PE konjugovani anti-mišji Igλ (klon RML-42, BioLegend) ili anti-mišji c-komplet (klon 2B8, BioLegend), PerCP-Cy5.5 konjugovani anti-mišji IgD (BioLegend), PE-Cy7 konjugovani antimišji IgM (klon II/41, eBioscience), APC konjugovani anti-mišji B220 (klon RA3-6B2, eBioscience). Nakon bojenja, ćelije su isprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Dobijanje podataka je izvedeno na LSRII protočnom citometru i analizirano sa FlowJo (Tree Star, Inc.). Zaustavljanje: ukupne B ćelije (CD19<+>CD3-), Igκ<+>B ćelije (Igκ<+>Igλ/ CD19<+>CD3-), Igλ<+>B ćelije (Igκ<->Igλ<+>CD19<+>CD3-). Rezultati za odeljak koštane srži su prikazani na Sl. 10A - Sl.
12B. Rezultati za odeljak slezine su prikazani na Sl.13A - Sl.16.
[0350] Kao što je prikazano u ovom Primeru, DLC-5J miševi su pokazali normalnu populaciju B ćelija u odeljcima slezine i koštane srži (Sl.10A - 16). DLC-5J miševi su pokazali nezrelu, zrelu i pre / pro B ćelijsku populaciju unutar odeljka koštane srži koji su suštinski isti kao što je primećeno kod divljih tipova legla. U stvari, DLC-5J lokus je bio u stanju da se takmiči sa endogenim lokusom lakog lanca λ da bi dao odnos κ: λ koji je suštinski isti kao onaj koji je primećen kod miševa divljeg tipa (Sl.14B). Takođe, DLC-5J miševi pokazuju normalan razvoj perifernih B ćelija, kao napredovanje B ćelija kroz različite stadijume u odeljku slezine (npr. nezreli, zreli, T1, T2 T3, prekursor marginalne zone, marginalna zona, folikularna-l, folikularna-II, itd.) pojavljujući se na način koji je suštinski isti kao što je primećeno kod
1 1
miševa divljeg tipa (Sl. 15A - 16). Nasuprot tome, DLC-1J miševi su pokazali manji ukupni broj B ćelija i povećano korišćenje lakog lanca λ u poređenju sa projektovanim lakim lancem κ (podaci nisu prikazani).
[0351] Dvostruka ekpresija lakog lanca. Ekspresija oba humana Vκ genska segmenta je analizirana kod homozigotnih miševa, korišćenjem kvantitativnog PCR testa, u skladu sa Primerom 3. Ukratko, CD19<+>B ćelije su prečišćene iz koštane srži i celih slezina od divljeg tipa miševa, miševa homozigotnih za zamenu varijabilnih lokusa mišjeg teškog lanca i lakog lanca κ sa odgovarajućim lokusima varijabilnog regiona humanog teškog lanca i lakog lanca κ (Hκ), kao i miševa homozigotnih za konstruisani lokus lakog lanca κ koji sadrže dva humana Vκ genska segmenta i bilo pet humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J) ili jedan humani Jκ genski segment (DLC-1J). Relativna ekspresija je normalizovana na ekspresiju mišjeg Cκ regiona (n = 3 do 5 miševa po grupi). Rezultati su prikazani na Sl.17 i Sl.18.
[0352] Ekspresija lakih lanaca koji sadrže preuređeni humani Vκ3-20 ili humani Vκ1-39 genski segment je detektovana i u koštanoj srži i slezini DLC-5J i DLC-1J miševa (Sl.17 i Sl.18). U odeljku koštane srži, ekspresija i humanih Vκ 3-20-izvedenih i humanih Vκ1-39-izvedenih lakih lanaca kod oba soja DLC miševa je bila značajno veća u poređenju sa miševima koji sadrže zamenu mišjeg Vκ i Jκ genskog segmenta sa odgovarajućim humanim Vκ i Jκ genskim segmentima (Hκ; Sl.17). Uočeno je da je ekspresija lakog lanca izvedenog od humanog Vκ3-20 približno šest puta (DLC-5J) do petnaest puta (DLC-1J) viša nego kod Hκ miševa. DLC-1J miševi su približno pokazali dvostruko višu ekspresiju lakih lanaca izvedenih od humanog Vκ3-20 od DLC-5J miševa u odeljku koštane srži. Uočeno je da je ekspresija lakog lanca izvedenog od humanog Vκ1-39 približno šest puta (DLC-5J) do trinaest puta (DLC-1J) viša nego kod Hκ miševa. DLC-1J miševi su približno pokazali dvostruko višu ekspresiju humanih Vκ1-39-izvedenih lakih lanaca od DLC-5J miševa u odeljku koštane srži.
[0353] U odeljku slezine, ekspresija i humanih Vκ3-20-izvedenih i humanih Vκ1-39-izvedenih lakih lanaca kod oba soja DLC miševa je bila značajno veća u poređenju sa Hκ miševima (Sl.
18). Zapaženo je da je ekspresija humanog Vκ3-20 izvedenog lakog lanca približno četiri puta (DLC-5J) i osam puta (DLC-1J) viša nego kod Hκ miševa. DLC-1J miševi su približno pokazali dvostruko višu ekspresiju lakih lanaca izvedenih iz humanog Vκ3-20 od DLC-5J miševa u odeljku slezine. Uočeno je da je ekspresija lakog lanca izvedenog od humanog Vκ1-39 približno četiri puta (DLC-5J) do pet puta (DLC-1J) viša nego kod Hκ miševa. DLC-1J miševi su pokazali sličnu ekspresiju humanih Vκ1-39-izvedenih lakih lanaca u poređenju sa DLC-5J miševima u odeljku slezine.
1 2
[0354] Korišćenje humanog VL/ JL u DLC-5J miševima. Miševi homozigotni za dva nereorganizovana humana Vκ genska segmenta i pet nereorganizovanih humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J) su analizirani za upotrebu humanog Vκ/Jκ genskog segmenta u B ćelijama slezine pomoću reverzne transkriptaze - lančane reakcije polimeraze (RT-PCR).
[0355] Ukratko, slezine homozigotnih miševa DLC-5J (n = 3) i miševa divljeg tipa (n = 2) su sakupljene i umrežene u 10 mL RPMI 1640 (Sigma) koji sadrži 10% toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma, korišćenjem zamrznutih staklenih ploča za stvaranje pojedinačnih ćelijskih suspenzija. Splenociti su peletirani centrifugiranjem (1200 obrtaja u minuti tokom pet minuta) i crvene krvne ćelije su lizirane u 5 mL ACK lizirajućeg pufera (GIBCO) tokom tri minuta. Splenociti su razblaženi sa PBS-om (Irvine Scientific), filtrirani sa 0,7 µm ćelijskim sitom i ponovo centrifugirani da peletiraju ćelije, praćeno resuspenzijom u 1 mL PBS-a.
[0356] RNK je izolovana iz peletiranih splenocita, korišćenjem AIIPrep DNK/RNA mini kompleta (Qiagen) prema specifikacijama proizvođača. RT-PCR je izveden na RNK splenocita korišćenjem 5' RACE (brza amplifikacija cDNK krajeva). Sistem sa prajmerima specifičnim za mišji Cκ gen prema specifikacijama proizvođača (Invitrogen). Prajmeri specifični za mišji Cκ gen su bili 3' mIgκC RACE1 (AAGAAGCACA CGACTGAGGC AC; SEK ID BR: 34) i mIgκC3'-1 (CTCACTGGAT GGTGGGAAGA TGGA; SEK ID BR: 35). PCR proizvodi su prečišćeni gelom i klonirani u pCR®2.1-TOPO® vektor (TOPO® TA Cloning® Kit, Invitrogen) i sekvencirani sa prednjim M13 (GTAAAACGAC GGCCAG; SEK ID BR: 36) i reverznim M13 (CAGGAAACAG CTATGAC; SEK ID BR: 37) prajmerima, lokalizovanim unutar vektora na lokacijama koje okružuju mesto kloniranja. Deset klonova iz svakog uzorka slezine je sekvencirano. Sekvence su upoređene sa mišjim i humanim imunoglobulinskim kompletima iz IMGT/V-QUEST referentnih direktorijumskih kompleta za određivanje upotrebe VK/Jκ. Tabela 25 prikazuje kombinacije VK/Jκ za odabrane klonove posmatrane u RT-PCR klonovima, iz svakog uzorka splenocita. Tabela 26 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanih Vκ/humanih Jκ i humanih Jκ/mišjih Cκ spojeva odabranih RT-PCR klonova iz DLC-5J homozigotnih miševa. Mala slova ukazuju na mutacije u aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog regiona ili ne-šablonske dodatke koji su rezultat N i / ili P adicija tokom rekombinacije.
[0357] Kao što je prikazano u ovom Primeru, miševi homozigotni za dva nepreuređena humana Vκ genska segmenta i pet nepreuređenih humanih Jκ genskih segmenata (DLC-5J) operativno vezani za mišji Cκ gen su sposobni da produktivno rekombinuju oba humana Vκ genska segmenta na višestruke humane Jκ genske segmente da proizvedu ograničeni repertoar imunoglobulinskog lakog lanca. Među preraspodelama u DLC-5J homozigotnim miševima
1
prikazanim u Tabeli 25, uočeni su jedinstveni humani Vκ/Jκ rearanžmani za Vκ1-39/Jκ2 (1), Vκ1-39/Jκ3 (1), Vκ3-20/Jκ1 (7), Vκ3-20 Jκ2 (4) i Vκ3-20/Jκ3 (1). Dalje, takva jedinstvena preraspodela je pokazala raznovrsnost spoja kroz prisustvo jedinstvenih aminokiselina unutar CDR3 regiona lakog lanca (Tabela 26) koje su rezultat bilo mutacije i / ili rekombinacije humanih Vκ i Jκ genskih segmenata tokom razvoja. Sva preuređivanja su pokazala funkcionalno očitavanje u mišji Cκ (Tabela 26).
[0358] Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da su miševi konstruisani da predstave izbor od ne više od dva humana VLgenska segmenta, od kojih su oba sposobna da se reorganizuju (npr., sa jednim ili više i, u nekim realizacijama, do pet humanih JLgenskih segmenata) i kodiranje humanog VLdomena lakog lanca imunoglobulina, poseduju broj B ćelija i razvoj koji je blizu divljeg tipa, u svim aspektima. Takvi miševi proizvode kolekciju antitela koja imaju imunoglobulinske lake lance, koji imaju jedan od dva moguća humana VLgenska segmenta prisutna u kolekciji. Ova kolekcija antitela je proizvedena od strane miša kao odgovor na izazivanje sa antigenom i povezana sa raznovrsnošću reverznih himernih (humanih varijabilnih / mišjih konstantih) teških lanaca.
TABELA 25
1 4
(nastavak)
TABELA 26
1 (nastavak)
1

Claims (12)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Postupak za generisanje sekvence varijabilnog regiona teškog i/ili kapa lakog lanca humanog imunoglobulina koji obuhvata korake:
(a) imunizacije genetski modifikovanog miša sa antigenom, gde genetski modifikovani miš generiše antitela kada se imunizuje sa antigenom, i gde genetski modifikovani miš ima genom germinativne linije koji sadrži:
(i) dva Vκ genska segmenta humanog imunoglobulina i pet Jκ genskih segmenata humanog imunoglobulina operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša ili pacova, gde su dva humana Vκ genska segmenta imunoglobulina humani Vκ1-39 i humani Vκ3-20, i pet humanih Jκ genskih segmenata imunoglobulina su humani Jκ1, humani Jκ2, humani Jκ3, humani Jκ4, i humani Jκ5; i
(ii) jedan ili više nepreuređenih humanih VHgenskih segmenata imunoglobulina, jedan ili više nepreuređenih humanih DHgenskih segmenata imunoglobulina, i jedan ili više nepreuređenih humanih JHgenskih segmenata imunoglobulina operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša;
gde su nepreuređeni genski segmenti humanog teškog lanca i nepreuređeni genski segmenti humanog kapa lakog lanca miša u stanju da se preuređuju i kodiraju varijabilne domene humanog teškog lanca i varijabilne domene humanog kapa lakog lanca, tim redom, antitela, i gde miš ne sadrži endogeni Vκ genski segment koji je u stanju da se preuređuje da bi obrazovao sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca, i (b) određivanje sekvence varijabilnog regiona teškog i/ili kapa lakog lanca humanog imunoglobulina koja kodira varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca humanog imunoglobulina, tim redom, antitela koje se specifično vezuje za antigen i koje je generisano od strane genetski modifikovanog miša.
2. Postupak za generisanje sekvence varijabilnog domena teškog i/ili kapa lakog lanca humanog imunoglobulina koji obuhvata korake:
(a) imunizacije genetski modifikovanog miša sa antigenom od interesa, pri čemu genetski modifikovani miš sadrži u svom genomu germinativne linije:
(i) tačno dva nepreuređena Vκ genska segmenta humanog imunoglobulina i pet nepreuređenih Jκ genskih segmenata humanog imunoglobulina operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša na endogenim lokusima kapa lakog lanca miša, gde su dva nepreuređena humana Vκ genska segmenta imunoglobulina humani Vκ1-39 genski segment i humani Vκ3-20 genski segment, i pet nepreuređenih humanih Jκ genskih segmenata imunoglobulina su humani Jκ1, humani Jκ2, humani Jκ3, humani Jκ4, i humani Jκ5; i
(ii) jedan ili više nepreuređenih humanih VHgenskih segmenata imunoglobulina, jedan ili više nepreuređenih humanih DHgenskih segmenata imunoglobulina, i jedan ili više nepreuređenih humanih JHgenskih segmenata imunoglobulina operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša na endogenim lokusima teškog lanca miša;
gde su nepreuređeni genski segmenti teškog lanca i kapa lakog lanca humanog imunoglobulina genetski modifikovanog miša u stanju da se preuređuju i kodiraju varijabilne domene humanog teškog lanca i varijabilne domene humanog kapa lakog lanca, tim redom, antitela, i gde genetski modifikovani miš ne sadrži endogeni Vκ ili Jκ genski segment imunoglobulina koji su u stanju da se preuređuju da bi obrazovali sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina, i
(b) određivanje sekvence varijabilnog domena teškog i/ili kapa lakog lanca humanog imunoglobulina antitela koje se specifično vezuje za antigen i koje je generisano od strane genetski modifikovanog miša.
3. Postupak prema zahtevu 2, gde određivanje sekvence varijabilnog domena teškog i/ili kapa lakog lanca humanog imunoglobulina obuhvata određivanje nukleotidne sekvence koja kodira sekvencu varijabilnog domena teškog i/ili kapa lakog lanca humanog imunoglobulina.
1
4. Postupak prema zahtevima 1 ili 2, gde genom germinativne linije genetski modifikovanog miša obuhvata redom: humani Vκ1-39 genski segment, humani Vκ3-20 genski segment, humani Jκ1 genski segment, humani Jκ2 genski segment, humani Jκ3 genski segment, humani Jκ4 genski segment, i humani Jκ5 genski segment.
5. Postupak prema zahtevima 1 ili 2, gde genetski modifikovani miš sadrži nefunkcionalni lokous λ lakog lanca imunoglobulina.
6. Postupak prema zahtevima 1 ili 2, gde genetski modifikovani miš ne sadrži endogeni VHgenski segment imunoglobulina miša koji je u stanju da se preuređuje da bi obrazovao varijabilni region teškog lanca imunoglobulina.
7. Postupak za izradu antitela koji obuhvata:
(1) eksprimiranje u pojedinačnoj ćeliji:
(a) prve sekvence nukleinske kiseline koja kodira prvi teški lanac imunoglobulina, pri čemu prva sekvenca nukleinske kiseline sadrži prvu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina operativno vezanu za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina, gde je prva sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina dobijena iz B ćelija genetski modifikovanog miša, gde je genetski modifikovani miš imunizovan sa prvim antigenom od interesa i genetski modifikovani miš sadrži u svom genomu gerimnativne linije:
(i) dva nepreuređena humana V к genska segmenta i pet nepreuređenih humanih J к genskih segmenata operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona lakog lanca, gde su dva nepreuređena humana V к genska segmenta humani V к1-39 genski segment i humani V к3-20 genski segment, i gde su pet nepreuređenih humanih J к genskih segmenata humani J к1 genski segment, humani J к2 genski segment, humani J к3 genski segment, humani J к4 genski segment, i humani J к5 genski segment; i
1
(ii) jedan ili više nepreuređenih humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više nepreuređenih humanih DHgenskih segmenata, i jedan ili više nepreuređenih humanih JHgenskih segmenata operatvno vezanih za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca miša;
gde su nepreuređeni genski segmenti humanog teškog lanca i nepreuređeni genski segmenti humanog kapa lakog lanca genetski modifikovanog miša u stanju da se preuređuju i kodiraju varijabilne domene humanog teškog lanca i varijabilne domene humanog kapa lakog lanca antitela, tim redom; gde genetski modifikovani miš ne sadrži endogeni V к genski segment koji je u stanju da se preuređuje da bi obrazovao sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca; i
gde prva sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca kodira prvi varijabilni domen humanog teškog lanca koji, sa varijabilnim domenom kapa lakog lanca, prepoznaje prvi antigen; i
(b) druga sekvenca nukleinske kiseline koja kodira laki lanac imunoglobulina, pri čemu druga sekvenca nukleinske kiseline sadrži sekvencu varijabilnog regiona humanog kapa lakog lanca operativno vezanu za sekvencu konstantnog regiona humanog lakog lanca, gde sekvenca varijabilnog regiona humanog kapa lakog lanca sadrži: humani V к1-39 genski segment, humani V к3-20 genski segment, ili njihovu somatski hipermutiranu verziju;
(2) održavanje ćelije pod uslovima dovoljnim da eksprimira potpuno humano antitelo; i
(3) izolovanje antitela.
8. Postupak prema zahtevu 7, gde su dva nepreuređena humana Vκ genska segmenta i pet nepreuređenih humanih Jκ genskih segmenata u genomu germinativne linije genetski modifikovanog miša operativno vezani za sekvencu konstantnog regiona κ lakog lanca miša.
9. Postupak prema zahtevu 7, gde su dva nepreuređena humana Vκ genska segmenta i pet nepreuređenih humanih Jκ genskih segmenata u genomu germinativne linije genetski modifikovanog miša prisutni na endogenom lokusu lakog lanca imunoglobulina.
10. Postupak prema zahtevu 7, gde genom germinativne linije gentski modifikovanog miša sadrži redom: humani Vκ1-39 genski segment, humani Vκ3-20 genski segment, humani Jκ1 genski segment, humani Jκ2 genski segment, humani Jκ3 genski segment, humani Jκ4 genski segment, i humani Jκ5 genski segment.
11. Postupak prema zahtevu 7, gde su jedan ili više nepreuređenih humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više nepreuređenih humanih DHgenskih segmenata, i jedan ili više nepreuređenih humanih JHgenskih segmenata u genomu germinativne linije genetski modifikovanog miša prisutni na endogenom lokusu teškog lanca imunoglobulina.
12. Postupak prema bilo kom od zahteva 7-11, gde ćelija sadrži treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira drugi teški lanac humanog imunoglobulina, pri čemu treća sekvenca nukleinske kiselina sadrži drugi varijabilni region humanog imunoglobulina operativno vezan za konstantni region teškog lanca humanog imunoglobulina, gde je druga sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina dobijena iz B ćelije drugog genetski modifikovanog miša, gde je drugi genetski modifikovani miš bio imunizovan sa drugim antigenom od interesa i drugi genetski modifikovani miš sadrži u svom genomu germinativne linije:
(i) dva nepreuređena humana V к genska segmenta i pet nepreuređenih humanih J к genskih segmenata operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona lakog lanca, gde su dva nepreuređena humana V к genska segmenta humani V к1-39 genski segment i humani V к3-20 genski segment, i gde pet nepreuređenih humanih J к genskih segmenata su humani J к1 genski segment, humani J к2 genski segment, humani J к3 genski segment, humani J к4 genski segment, i humani J к5 genski segment; i
(ii) jedan ili više nepreuređenih humanih VHgenskih segmenata, jedan ili više nepreuređenih humanih DHgenskih segmenata, i jedan ili više nepreuređenih humanih JHgenskih segmenata operativno vezanih za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca miša;
gde su nepreuređeni genski segmenti humanog teškog lanca i nepreuređeni genski segmenti humanog kapa lakog lanca genetski modifikovanog miša u stanju da se preuređuju i kodiraju varijabilne domene humanog teškog lanca i varijabilne domene humanog kapa lakog lanca antitela, tim redom;
gde genetski modifikovani miš ne sadrži endogeni V к genski segment koji je u stanju da se preuređuje da bi obrazovao sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca; i
gde druga sekvenca varijabilnog regiona humanog teškog lanca kodira drugi varijabilani domen humanog teškog lanca koji, sa varijabilnim domenom kapa lakog lanca, prepoznaje drugi antigen,
gde:
- prvi i drugi antigen su različiti;
- laki lanac imunoglobulina kodiran navedenom drugom sekvencom nukleinske kiseline, kada je uparen sa prvim teškim lancem humanog imunoglobulina, specifično vezuje prvi antigen, i kada je uparen sa drugim teškim lancem imunoglobulina specifično vezuje drugi antigen; i
- antitelo dobijeno postupkom je bispecifično antitelo.
RS20230350A 2013-03-13 2014-03-13 Miševi koji eksprimiraju ograničeni repertoar lakog lanca imunoglobulina RS64185B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/798,455 US9796788B2 (en) 2010-02-08 2013-03-13 Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
EP18210518.9A EP3501272B1 (en) 2013-03-13 2014-03-13 Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64185B1 true RS64185B1 (sr) 2023-05-31

Family

ID=50483561

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230350A RS64185B1 (sr) 2013-03-13 2014-03-13 Miševi koji eksprimiraju ograničeni repertoar lakog lanca imunoglobulina
RS20190467A RS58669B1 (sr) 2013-03-13 2014-03-13 Miševi koji eksprimiraju ograničeni repertoar lakog lanca imunoglobulina

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190467A RS58669B1 (sr) 2013-03-13 2014-03-13 Miševi koji eksprimiraju ograničeni repertoar lakog lanca imunoglobulina

Country Status (26)

Country Link
EP (4) EP4545567A3 (sr)
JP (4) JP6529957B2 (sr)
KR (2) KR102424756B1 (sr)
CN (2) CN108611369B (sr)
AU (3) AU2014244020B2 (sr)
BR (1) BR112015022034B1 (sr)
CA (1) CA2903698C (sr)
CY (1) CY1121545T1 (sr)
DK (2) DK3501272T5 (sr)
ES (3) ES2712207T3 (sr)
FI (1) FI3501272T3 (sr)
HR (2) HRP20190706T1 (sr)
HU (2) HUE044003T2 (sr)
IL (2) IL240563B (sr)
LT (2) LT2967013T (sr)
MX (3) MX377146B (sr)
PL (2) PL3501272T3 (sr)
PT (2) PT2967013T (sr)
RS (2) RS64185B1 (sr)
RU (1) RU2689664C2 (sr)
SG (2) SG10201801101QA (sr)
SI (2) SI2967013T1 (sr)
SM (2) SMT201900196T1 (sr)
TR (1) TR201901668T4 (sr)
WO (1) WO2014160202A1 (sr)
ZA (2) ZA201505835B (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
SMT202600080T1 (it) 2010-02-08 2026-03-09 Regeneron Pharma Topo con catena leggera comune
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
HUE047278T2 (hu) 2011-08-05 2020-04-28 Regeneron Pharma Humanizált univerzális könnyûláncú egerek
SG11201401181YA (en) 2011-10-17 2014-04-28 Regeneron Pharma Restricted immunoglobulin heavy chain mice
ME03551B (me) 2012-06-12 2020-07-20 Regeneron Pharma Humanizovane nehumane živoтinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog тeškog lanca
MY178882A (en) * 2013-02-20 2020-10-21 Regeneron Pharma Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
CA3124228C (en) 2014-03-21 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
CA2979702A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
KR20230006929A (ko) 2016-01-13 2023-01-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 조작된 중쇄 다양성 영역을 갖는 설치류
CA3076632A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen-binding molecules that bind a staphylococcus target antigen and a complement component and uses thereof
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
US12467062B2 (en) 2018-12-21 2025-11-11 Compass Therapeutics Llc Transgenic mouse expressing common human light chain
CA3125380A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus
BR112021016173A2 (pt) 2019-02-22 2021-11-03 Regeneron Pharma Roedor geneticamente modificado, métodos de produção de um roedor geneticamente modificado e de produção de um anticorpo anti-nav1.7, célula ou tecido isolado de roedor, linhagem celular imortalizada, embrião de roedor, construto de ácido nucleico de direcionamento, e, hibridoma
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
JP2023529846A (ja) 2020-06-02 2023-07-12 バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド 共通軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を有する遺伝子改変非ヒト動物
IL303865A (en) 2020-12-23 2023-08-01 Regeneron Pharma Methods for obtaining antibodies that bind transmembrane proteins and cells that produce them
CA3165366A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
CN114736927A (zh) * 2022-05-19 2022-07-12 东北大学 一种单抗克隆与表达载体的构建及应用
TW202430641A (zh) * 2023-01-18 2024-08-01 美商基利科學股份有限公司 人類免疫球蛋白二元輕鏈轉殖基因構築體及其用途
WO2026019824A1 (en) * 2024-07-16 2026-01-22 Gilead Sciences, Inc. Human immunoglobulin common light chain transgene constructs and uses thereof
CN121628915A (zh) * 2024-08-29 2026-03-10 上海泰槿生物技术有限公司 产生限制的免疫球蛋白轻链库的细胞、动物和方法

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7041871B1 (en) * 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
ES2473596T3 (es) * 2003-07-15 2014-07-07 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Loci de inmunoglobulina humanizada
ES2463476T3 (es) 2004-10-19 2014-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética
AU2007235496B2 (en) * 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
JP5307708B2 (ja) 2006-06-02 2013-10-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒトｉｌ−６受容体に対する高親和性抗体
ITMI20071522A1 (it) * 2007-07-27 2009-01-28 Areta Internat S R L Vaccino idiotipico
EP2147594B1 (en) * 2008-06-27 2013-11-13 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
JP5827127B2 (ja) * 2008-12-18 2015-12-02 エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム ヒト化抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物及びその使用
MY192182A (en) 2009-06-26 2022-08-04 Regeneron Pharma Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
US20120021409A1 (en) * 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US20130045492A1 (en) * 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
SMT202600080T1 (it) * 2010-02-08 2026-03-09 Regeneron Pharma Topo con catena leggera comune
PT3034608T (pt) * 2010-06-22 2019-05-28 Regeneron Pharma Ratinhos expressando uma cadeia leve híbrida de imunoglobulina com uma região variável humana
SMT201700023T1 (it) * 2010-08-02 2017-03-08 Regeneron Pharma Topi che producono proteine leganti vl
RU2460287C1 (ru) * 2011-03-29 2012-09-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) Трансгенная мышь, предназначенная для моделирования состояний, угрожающих развитием синдрома внезапной сердечной смерти при дистрофин-дефицитной кардиомиопатии
HUE047278T2 (hu) * 2011-08-05 2020-04-28 Regeneron Pharma Humanizált univerzális könnyûláncú egerek
GB201122047D0 (en) * 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014160202A4 (en) 2014-11-13
EP3501272B1 (en) 2023-03-01
SG11201506278RA (en) 2015-09-29
ZA201505835B (en) 2019-09-25
SI3501272T1 (sl) 2023-05-31
JP2016512034A (ja) 2016-04-25
AU2023202783A1 (en) 2023-05-25
BR112015022034B1 (pt) 2023-02-28
CA2903698A1 (en) 2014-10-02
PT3501272T (pt) 2023-03-29
DK2967013T3 (en) 2019-03-11
MX2020010837A (es) 2022-03-28
EP4218409A3 (en) 2023-08-30
FI3501272T3 (fi) 2023-04-06
HK1218493A1 (en) 2017-02-24
JP2019213549A (ja) 2019-12-19
AU2014244020B2 (en) 2020-06-04
AU2020203238B2 (en) 2023-04-13
IL280892B2 (en) 2023-05-01
PL2967013T3 (pl) 2019-07-31
CN108611369A (zh) 2018-10-02
NZ711776A (en) 2021-09-24
SI2967013T1 (sl) 2019-03-29
EP4545567A3 (en) 2025-08-13
RU2019115237A (ru) 2019-06-11
CY1121545T1 (el) 2020-05-29
CN105188357A (zh) 2015-12-23
TR201901668T4 (tr) 2019-02-21
EP4218409B1 (en) 2025-02-12
KR102295842B1 (ko) 2021-08-31
IL280892A (en) 2021-04-29
JP2019076109A (ja) 2019-05-23
EP2967013A1 (en) 2016-01-20
ES3013063T3 (en) 2025-04-10
AU2023202783B2 (en) 2026-02-12
LT3501272T (lt) 2023-03-27
MX2015012539A (es) 2016-06-28
AU2020203238A1 (en) 2020-06-11
JP2020182490A (ja) 2020-11-12
HUE061977T2 (hu) 2023-09-28
KR20210107911A (ko) 2021-09-01
ZA201805369B (en) 2021-08-25
JP6529957B2 (ja) 2019-06-12
BR112015022034A2 (pt) 2017-08-29
IL280892B1 (en) 2023-01-01
MX377146B (es) 2025-03-07
RU2689664C2 (ru) 2019-05-28
LT2967013T (lt) 2019-04-25
HRP20190706T1 (hr) 2019-10-18
EP4218409C0 (en) 2025-02-12
HUE044003T2 (hu) 2019-09-30
EP4545567A2 (en) 2025-04-30
JP7010902B2 (ja) 2022-02-10
SMT201900196T1 (it) 2019-05-10
DK3501272T5 (da) 2024-09-02
EP4218409A2 (en) 2023-08-02
EP3501272A1 (en) 2019-06-26
SMT202300112T1 (it) 2023-05-12
CN108611369B (zh) 2022-08-26
KR20150126871A (ko) 2015-11-13
ES2712207T3 (es) 2019-05-09
CN105188357B (zh) 2018-04-24
HRP20230490T1 (hr) 2023-08-04
IL240563B (en) 2021-03-25
PL3501272T3 (pl) 2023-07-03
RU2015143110A (ru) 2017-04-18
KR102424756B1 (ko) 2022-07-25
DK3501272T3 (da) 2023-04-03
MX391010B (es) 2025-03-21
IL240563A0 (en) 2015-09-24
RS58669B1 (sr) 2019-06-28
PT2967013T (pt) 2019-04-03
AU2014244020A1 (en) 2015-09-24
JP6790136B2 (ja) 2020-11-25
MX357308B (es) 2018-07-04
SG10201801101QA (en) 2018-04-27
ES2942413T3 (es) 2023-06-01
CA2903698C (en) 2023-02-28
EP2967013B1 (en) 2019-01-16
WO2014160202A1 (en) 2014-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2023202783B2 (en) Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US12389888B2 (en) Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
AU2016202488B2 (en) Common light chain mouse
NL2014775B1 (en) Common light chain mouse.
AU2013271737A1 (en) Methods for making fully human bispecific antibodies using a common light chain
HK40126399A (en) Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
HK40097135A (en) Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
HK40010381A (en) Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
HK40010381B (en) Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
NZ711776B2 (en) Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
HK1218493B (en) Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire