TR201901668T4 - Sınırlı bir immünoglobulin hafif zincir repertuvarını eksprese eden fareler. - Google Patents

Sınırlı bir immünoglobulin hafif zincir repertuvarını eksprese eden fareler. Download PDF

Info

Publication number
TR201901668T4
TR201901668T4 TR2019/01668T TR201901668T TR201901668T4 TR 201901668 T4 TR201901668 T4 TR 201901668T4 TR 2019/01668 T TR2019/01668 T TR 2019/01668T TR 201901668 T TR201901668 T TR 201901668T TR 201901668 T4 TR201901668 T4 TR 201901668T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
human
mouse
light chain
sequence
immunoglobulin
Prior art date
Application number
TR2019/01668T
Other languages
English (en)
Inventor
Babb Robert
Mcwhirter John
Macdonald Lynn
Stevens Sean
Davis Samuel
R Buckler David
A Meagher Karolina
J Murphy Andrew
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US13/798,455 external-priority patent/US9796788B2/en
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of TR201901668T4 publication Critical patent/TR201901668T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Genetiği değiştirilmiş bir fare sağlanmaktadır, burada fare, sınırlı sayıdaki hafif zincir değişken alanları ile karakterize edilen bir immünoglobulin hafif zincir repertuvarını eksprese etmektedir. İki insan hafif zincir değişken gen segmentine dair bir tercih sunan fareler sağlanmaktadır, böylelikle fare tarafından eksprese edilen immünoglobulin hafif zincirler, iki insan hafif zincir değişken gen segmentinden birini içermektedir. İnsan hafif zincir değişken bölgeleri de dahil olmak üzere burada açıklanan fare kullanılarak evrensel hafif zincirlere sahip bispesifik antikorların meydana getirilmesine yönelik yöntemler sağlanmaktadır. Multispesifik bağlama proteinleri, örneğin bispesifik antikorlar ve konak hücrelerinde kullanım için uygun olan insan değişken bölgelerinin meydana getirilmesine yönelik yöntemler sağlanmaktadır.

Description

TEKNIK ALAN Çesitli insan degisken/fare sabit agir zincirler ile iliskili bir ortak insan degisken/fare sabit hafif zincire sahip antikorlari eksprese eden, genetigi degistirilmis bir fare saglanmaktadir. Farenin B hücrelerinin insan degisken bölgesi gen sekanslarindan bir insan bispesifik antikorunun meydana getirilmesine yönelik bir yöntem saglanmaktadir. ONCEKI TEKNIK Antikorlar tipik olarak bir homodimerik agir zincir bileseni içermektedir, burada her bir agir zincir monomeri, özdes bir hafif zincir ile iliskilendirilmektedir. Bir heterodimerik agir zincir bilesenine sahip antikorlar (örnegin bispesifik antikorlar) terapötik antikorlar olarak kullanilabilmektedir. Ancak, bir bispesifik antikorun agir zincirlerinden her biri ile tatmin edici sekilde iliskilendirilebilen uygun bir hafif zincir bilesenine sahip bispesifik antikorlarin meydana getirilmesinin problemli oldugu kanitlanmistir. Bir yaklasimda, bir hafif zincir; tüm hafif zincir degisken alanlari için kullanim istatistiklerinin arastirilmasi, insan antikorlarinda en sik kullanilan hafif zincirin belirlenmesi ve bu hafif zincirin, farkli spesifiteye sahip iki agir zincir ile in vitro sekilde çiftlenmesi vasitasiyla seçilebilmektedir. Bir baska yaklasimda, bir hafif zincir; bir faj görüntüleme kütüphanesindeki (örnegin insan hafif zincir degisken bölge sekanslarini içeren bir faj görüntüleme kütüphanesi, örnegin bir insan scFv kütüphanesi) hafif zincir sekanslarinin gözlemlenmesi ve kütüphaneden en yaygin sekilde kullanilan hafif zincir degiskeninin seçilmesi vasitasiyla seçilebilmektedir. Ardindan hafif zincir, ilgili iki farkli agir zincir üzerinde test edilebilmektedir. Bir baska yaklasimda, bir hafif zincir; problar olarak ilgili her iki agir zincirin agir zincir degisken sekanslarini kullanarak hafif zincir degiskens ekanslarinin bir faj görüntüleme kütüphanesinin tahlil edilmesi vasitasiyla seçilebilmektedir. Her iki agir zincir degisken sekansi ile iliskilendirilen bir hafif zincir, agir zincirler için bir hafif zincir olarak seçilebilmektedir. Bir baska yaklasimda, bir aday hafif zincir, agir zincirlerin kognat hafif zincirleri ile hizalanabilmektedir ve her iki agir zincirin kognat hafif zincirleri bakimindan ortak olan sekans özelliklerinin daha iyi bir sekilde eslestirilmesi için hafif zincirde modifikasyonlar gerçeklestirilmektedir. Immünojenisite ihtimallerinin minimal hale getirilmesinin gerekmesi durumunda, modifikasyonlar tercihen bilinen insan hafif zincir sekanslarinda mevcut olan sekanslar ile sonuçlanmaktadir, böylelikle proteolitik prosesin; immünojenisite olasiliginin degerlendirilmesine yönelik teknikte bilinen yöntemler (yani in silico ve bunun yani sira islak tahliller) ve parametrelere dayanarak bir T hücresi epitopunu meydana getirmesi olasi olmamaktadir. Yukaridaki yaklasimlarin tamami, örnegin sekans özdesligi, spesifik ön-seçimli agir zincirler ile iliskilenme kapasitesi ve benzeri gibi birkaç a priori sinirlandirmasini içeren in vitro yöntemlere dayanmaktadir. In vitro kosullari manipüle etmeye dayanmayan, bunun yerine bir ortak hafif zincir içeren insan epitop baglama proteinlerinin meydana getirilmesine yönelik biyolojik olarak daha mantikli yaklasimlardan faydalanan bilesimler ve yöntemler bakimindan teknikte bir ihtiyaç mevcuttur. KISA AÇIKLAMA Insan immünoglobulin agir ve hafif zincir degisken alanlarini eksprese eden genetigi degistirilmis fareler saglanmaktadir, burada fareler, sinirli bir hafif zincir degilen repertuvarina sahiptir. Ozellikle, genomunda, bir fare veya siçan immünoglobulin hafif zincir sabit bölge sekansina faal olarak birlestirilen iki insan immünoglobulin VK geni segmenti ve bes insan immünoglobulin JK geni segmenti içeren bir fare saglanmaktadir, burada iki insan immünoglobulin VK geni segmenti, bir insan VK1-39 ve bir insan VK3-20idir ve bes insan immünoglobulin JK geni segmenti, insan JK1, insan JK2, hinsan JK3, insan JK4, ve insan JK5'tir; ve bir fare veya siçan immünoglobulin sabit bölge sekansina faal olarak birlestirilen bir veya daha fazla insan immünoglobulin VH geni segmenti, bir veya daha fazla insan immünoglobulin DH geni segmenti ve bir veya daha fazla insan immünoglobulin JH geni segmenti içermektedir; burada immünoglobulin insan geni segmentleri, bir antikorun insan immünoglobulin degisken alanlarini yeniden düzenleyebilmektedir ve kodlayabilmektedir ve ayrica burada fare, bir immünoglobulin hafif zincir degisken bölge sekansinin meydana getirilmesi için yeniden düzenleme gerçeklestirebilen bir endojen immünoglobulin VL geni segmenti içermemektedir. Ayrica, farenin bir izole hücresi de burada saglanmaktadir, burada (a)hücre bir embriyonik kök (ES) hücredir; veya (b)hücre bir B hücresidir. Ayrica, bu tür bir ES hücresini içeen bir fare embriyosu saglanmaktadir. Ayrica, saglanan B hücresi ile meydana getirilen bir hibridom da saglanmaktadir. ilaveten, asagidakilerin gerçeklestirilmesi için saglanan farenin kullanimi da burada saglanmaktadir: (a)bir antikorun meydana getirilmesi; ve/veya (b)bir insan immünoglobulin agir zincir degisken alanini kodlayan bir nükleik asit sekansinin belirlenmesi; ve/veya (c)bir insan bispesifik antikorunun meydana getirilmesi; ve/veya (d)bir insan immünoglobulin agir zincir degisken bölgesi geni segmentinin seçilmesi. Ayrica, ilgili bir antijeni baglayan bir antikorun meydana getirilmesine yönelik bir yöntem saglanmakta olup, asagidakileri içermektedir ilgili bir antijenin verildigi bir fareye bagisiklik kazandirilmasi, fareden bir immünoglobulin degisken bölge sekansinin elde edilmesi ve antijeni baglayan bir antikorun üretilmesi için immünoglobulin degisken bölge sekansinin kullanilmasi, tercihe burada yöntem asagidakileri içermektedir: bir tek hücre içerisinde asagidakilerin eksprese edilmesi: (a)bagisiklik kazandirilan farenin bir birinci insan immünoglobulin agir zincir degisken bölgesi sekansi, bruada insan immünoglobulin agir zincir degisken bölgesi sekansi, bir insan CH geni sekansi ile füzyonlanmaktadir; ve (b)bir insan immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesi sekansi, burada insan immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesi sekansi, bir insan immünoglobulin hafif zincir sabit bölge sekansi ile füzyonlanmaktadir; tamamen bir insan antikorunun eksprese edilmesi için yeterli kosullar altinda hücrenin tutulmasi; ve hücreden antikorun izole edilmesi. Ayrica, bir insan bispesifik antikorunun meydana getirilmesine yönelik bir yöntem saglanmaktadir, burada yöntem, saglanan fareye bagisiklik kazandirilmasini ve fareden B hücrelerinin insan immünoglobulin degisken bölge sekanslari kullanilarak bispesifik antikorun meydana getirilmesi, tercihen burada yöntem asagidakileri içermektedir: (a)saglanan farenin klonal sekilde seçilmis bir lenfositinin belirlenmesi, burada fareye bagisiklik kazandirilmistir ve ilgili bir antijene bir immün yanit gelistirmesine müsade edilmistir, burada lenfosit, ilgili antijeni spesifik olarak baglayan bir antikoru eksprese etmektedir; (b)lenfositten veya antikordan, ilgili antijeni spesifik olarak baglayan bir insan immünoglobulin agir zincir degisken alanini kodlayan bir nükleotit sekansinin elde edilmesi; ve (c)bir bispesifik antikor meydana getirilirlen (b)tnin nükleotit sekansinin kullanilmasi. Ayrica, bir antikorun üretilmesine yönelik bir yöntem saglanmakta olup, bir antijenin verildigi bir fareye bagisiklik kazandirilmasini ve antijene karsi fare tarafindan 'üretilen, elde edilen antikordan, bir insan immünoglobulin agir zincir degisken alani amino asit sekansinin veya kodlayici nükleotit sekansinin elde edilmesini ve bir antikor meydana getirilirken söz konusu insan immünoglobulin agir zincir degilen alani amino asit sekansindan veya kodlayici nükleik asit sekansindan yararlanilmasini içermektedir, tercihen burada yöntem ayrica asagidakileri içermektedir: (a)fareye bagisikligin kazandirildigi antikenin farkli epitoplarina karsi iki farkli antikordan, insan immünoglobulin agir zincir degisken alani amino asit sekansinin veya kodlayici n'ukleotit sekansinin belirlenmesi; veya (b)ayni fareye veya saglanan bir baska fareye farkli bir antijen ile bagisiklik kazandirilmasi, ardindan söz konusu farkli antijen bakimindan spesifik olan fare tarafindan üretilen bir antikordan, bir insan immünoglobulin agir zincir degisken alani amino asit sekansinin veya kodlayici nükleotit sekansinin belirlenmesi, burada yöntem ayrica, bir bispesifik antikorun meydana getirilmesi için iki farkli insan immünoglobulin agir zincir degisken alani amino asit sekansinin veya kodlayici n'ukleotit sekanslarinin kullanilmasini içermektedir. Ayrica, afinitesi amt'ur olan çesitli bir insan agir zincir degisken alani repertuvari ile iliskilendirilen veya eksprese edilen bir insan hafif zincir degisken alaninin meydana getririlmesi için bir biyolojik sisteme atifta bulunulmaktadir. Ayrica, immünoglobulin degisken alanlari içeren baglama proteinlerinin meydana getirilmesine yönelik yöntemler saglanmakta olup, sinirli bir imm'unoglobulin hafif zincir repertuvarina sahip farelere ilgiili bir antijen ile bagisiklik kazandirilmasi ve ilgili antijeni spesifik olarak baglayan bir baglama proteninde farenin bir immünoglobulin degisken bölge geni sekansinin kullanilmasini içermektedir. Yöntemler, multi-spesifik antijen baglama proteinlerinin meydana getirilmesinde kullanim için insan immünoglobulin agir zincir degisken alanlarinin meydana getirilmesine yönelik yönemleri kapsamaktadir. Ayrica, yeniden düzenlenmemis insan agir zincir degisken bölgesi gen segmentlerinin bir repertuvarindan türetilen uygun, mat'ur afiniteli insan immünoglobulin agir zincir degisken alanlarini seçen genetigi degistirilmis farelere atifta bulunulmaktadir, burada mati'ir afiniteli insan agir zincir degisken alanlari, bir insan hafif zincir degisken bölgesi geni segmentinden türetilen tek bir insan hafif zincir degisken alani ile iliskilendirilmektedir ve bunu eksprese etmektedir. Iki insan hafif zincir degisken bölgesi gen segmentine yönelik bir seçenek sunan genetigi degistirilmis fareler saglanmaktadir. Bu iki gen segmenti insan VK1-39 ve insan VK3-20'dir. Ayrica, insan hafif zincir degisken bölgesi geni segmentlerinin sinirli bir repetuarindan tek bir insan hafif zincir degisken alani veya insan hafif zincir degisken alanlarinin sinirli bir repertuvarini eksprese eden, genetigi degistirilmis fareler saglanmaktadir. Iki hafif zincirden birisini veya ikisini birden eksprese eden, yeniden düzenlenmis iki hafif zincir degisken bölgesi geninin meydana getirilmesi için yeniden düzenlenen, henüz yeniden düzenlenmemis iki insan hafif zincir degisken bölgesi geni segmentine sahip olmalari için farelerin genetigi degistirilmektedir. Yenidn düzenlenmemis insan hafif zincir degislen alanlari, fareler tarafindan seçilen matür afiniteli birden çok insan agir zinciri ile eslesebilmektedir, burada agir zincir degisken bölgeleri, farkli epitoplari spesifik olarak baglamaktadir. Ayrica, insan hafif zincir degisken bölgesi sekanslarinin sinirli bir repetuarindan tek bir insan hafif zincir degisken alani veya insan hafif zincir degisken alanlarinin sinirli bir repertuvarini eksprese eden, genetigi degistirilmis farelere atifta bulunulmaktadir. Ayrica, bir tek hafif zincirin bir degisken bölgesini eksprese eden (veya iki degisken bölgeden birini veya her ikisini eksprese eden) bir tek V/J insan hafif zincir sekansina (veya iki V/J sekansina) sahip olmasi için genetigi degistirilen farelere atifta bulunulmaktadir. Degisken sekansi içeren bir hafif zincir, fareler tarafindan klonal olarak seçilen mat'ür afiniteli birden çok insan agir zinciri ile eslesebilmektedir, burada agir zincir degisken bölgeleri farkli epitoplari Spesifik olarak baglamaktadir. Ayrica, bir insan J geni segmenti (bir veya birden çok JL segmentinden seçilen) ile yeniden düzenlenebilen ve bir immünoglobulin hafif zincirinin bir insan VL alanini kodlayabilen bir tek insan immünoglobulin hafif zincir degisken (VL) bölgesi gen segmenti içeren, genetigi degistirilmis bir fareye atifta bulunulmaktadir. Bir baska yönde, saglanan genetigi degistirilmis fare, iki insan VL gen segmenti içermekte olup, bunlardan her biri, bir insan Je geni segmenti (bir veya birden çok JL segmentinden seçilen) ile yeniden düzenlenebilmektedir ve bir immünoglobulin hafif zincirinin bir insan VL alanini kodlayabilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, bu iki insan VL geni segmenti, farenin genomunda yan yana koyulmaktadir. Iki insan VL gen segmenti, farenin genomunda farkli lokuslardadir (örnegin, bir birinci hafif zincir alelinde bir birinci insan VL segmenti ve bir ikinci hafif zincir alelinde bir ikinci insan VL segmenti içeren bir heterozigot, burada birinci ve ikinci insan VL segmentleri özdes degildir). Bazi yapilandirmalarda, bu iki insan VL geni segmenti, bir insan VK1-39 geni segmenti ve bir insan VK3-20 geni segmentidir. Bir yapilandirmada, insan JL geni segmenti, JK1, JK2, JK3, JK4, JK5 ve bunlarin ikili kombinasyonlarindan olusan gruptan seçilmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, saglanan genetigi degistirilmis fare, bir endojen VL gen segmenti içeren bir immünoglobulin hafif zinciri eksprese edememektedir. Ornegin, bazi yapilandirmalarda, saglanan genetigi degistirilmis bir fare, bir endojen Vi_ gen segmentinin tamamini veya bir kismini gideren ve/veya inaktive eden bir genetik modifikasyon içermektedir. Bir durumda, tek insan VL gen segmeni, JK1, JK2, JKS, Ji<4, ve JK5'ten seçilen bir insan JL gen segmenti ile faal olarak birlestirilmektedir, bruada tek insan VL gen segmenti, bir veya daha fazla insan JL gen segmentinden herhangi biri ile bir hafif zincir degisken bölgesi genini kodlayan bir sekansin meydana getirilmesi için yeniden düzenleme gerçeklestirebilmektedir. Ayrica, bir immünoglobulin hafif zincir geninin meydana getirilmesi için yeniden düzenleme gerçeklestirebilen bir endojen fare VL gen segmenti içermeyen bir immünoglobulin hafif zincir lokusu içeren, genetigi degistirilmis bir fareye referans verilmektedir, burada VL lokusu, bir hafif zincir geninin bir VL bölgesinin kodlanmasi için yeniden düzenleme gerçeklestirebilen bir tke insan VL gen segmenti içermektedir. Belirli durumlarda, insan VL gen segmenti, bir insan VK1-39JK5 gen segmenti veya bir insan VK3-20JK1 gen segmentidir. Ayrica, bir immünoglobulin hafif zincir geninin meydana getirilmesi için yeniden düzenleme gerçeklestirebilen bir endojen fare VL gen segmenti içermeyen bir VL lokusu içeren, genetigi degistirilmis bir fareye referans verilmektedir, burada VL lokusu, bir hafif zincir geninin bir VL bölgesinin kodlanmasi için yeniden düzenleme gerçeklestirebilen, sayisi ikiden daha fazla olmayan insan VL gen segmentleri içermektedir. Bazi belirli yapilandirmalarad, sayisi ikiden fazla olmayan insan VL gen segmentleri, bir insan VK1-39 gen segmenti, bir insan VK3-20 gen segmenti ve bunlarin bir kombinasyonundan olusan gruptan seçilmektedir. Bazi belirli yapilandirmalarad, sayisi ikiden fazla olmayan insan VL gen segmentleri, bir insan VK1- 39J K5 gen segmenti ve bir insan VK3-20JK1 gen segmentidir. Ayrica, bir immünoglobulin hafif zincirinin bir insan VL alanini kodlayan, yeniden düzenlenmis (V/J) tek bir insan immünoglobulin hafif zinciri degisken (VL) bölgesi (yani bir VL/JL bölgesi) içeren, genetigi degistirilmis bir fareye atifta bulunulmaktadir. Bir baska durumda, fare, bir immünoglobulin hafif zincirinin bir insan Vi_ alanini kodlayabilen, sayisi ikiden fazla olmayan, yeniden düzenlenmis insan VL bölgelerini içermektedir. Bir durumda, VL bölgesi, yeniden düzenlenmis bir insan VK1-39/J sekansi veya yeniden düzenlenmis bir insan VK3-20/J sekansidir. Bir durumda, yeniden düzenlenmis VL/JL sekansinin insan JL segmenti, JK1, JK2, JK3, JK4, ve JKSJten seçilmektedir. Belrili bir durumda, VL bölgesi, bir insan VK1-39JK5 sekansi veya bir insan VK3-20JK1 sekansidir. Saglanan fare, hem bir insan VK1-39JK5 sekansina hem de bir insan VK3-20JK1 sekansina sahiptir. Bir yapilandirmada, insan VL geni segmenti, bir insan veya fare öncü sekansi ile faal olarak birlestirilmektedir. Bir yapilandirmada, öncü sekans bir fare öncü sekansidir. Spesifik bir yapilandirmada, fare öncü sekansi bir fare VK3-7 öncü sekansidir. Belirli bir yapilandirmada, öncü sekans, yeniden düzenlenmemis bir insan VL geni segmenti ile faal olarak birlestirilmektedir. Bir yapilandirmada, VL geni segmenti, bir immünoglobulin promotör sekansi ile faal sekidle birlestirilmektedir. Bir yapilandirmada, promotör sekans bir insan promotör sekansidir. Belirli bir yapilandirmada, insan immünoglobulin promotörü, bir insan VK3- promotörüdür. Belirli bir yapilandirmada, promotör, yeniden düzenlenmemis bir insan VL geni segmenti ile faal olarak birlestirilmektedir. Bir yapilandirmada, hafif zincir Iokusu; bir endojen fare hafif zincir sabit bölgesi (CL) içeren bir ters kimetik hafif zincirin bir VL alanini kodlayan ve bir insan J segmenti ile yeniden düzenlenen bir insan VL gen segmenti ile yandan destekli 3* olan ve bir insan immünoglobulin promotörü ile yandan destekli 5' (bir VL gen segmentinin transkripsiyonel yönüne göre) olan bir öncü sekans içermektedir. Belirli bir yapilandirmada, VL geni fare VK Iokusundadir ve fare CL ise bir fare CKrsidir. Bir durumda, hafif zincir lokusu; bir insan immünoglobulin promotörü ile yandan destekli ' ve yeniden düzenlenmis bir insan VL bölgesi (VL/JL sekansi) ile yandan destekli 3, bir öncü sekansi içermektedir ve bir endojen fare hafif zincir sabit bölgesi (CL) içeren bir ters kimerik hafif zincirin bir VL alanini kodlamaktadir. Belirli bir durumda, yeniden düzenlenmis insan VL/JL sekansi, fare kappa (K) Iokusundadir ve fare CLrsi ise bir fare CK'sidir. Bir yapilandirmada, genetigi degistirilmis farenin VL lokusu, bir K hafif zincir Iokusudur ve K hafif zincir lokusu, bir fate K intronik artirici, bir dare K 3' artirici veya hem bir intronik artirici hem de bir 3, artirici içermektedir. Bir yapilandirmada, fare, islevsel olmayan bir immünoglobulin lambda (A) hafif zincir lokusu içermektedir. Belirli bir yapilandirmada, A hafif zincir Iokusu, Iokusun bir veya daha fazla sekansinin bir delesyonunu içermektedir, burada bir veya daha fazla delesyon, A hafif zincir lokusunu, bir hafif zincir geninin meydana getirilmesi için yeniden düzenlenemez hale getirmektedir. Bir baska yapilandirmada, A hafif zincir lokusunun VL gen segmentlerinin tamami veya neredeyse tamami silinmektedir. Bir yapilandirmada, fare, bir insan VL gen segmentinden türetilen somatik olarka mutasyona ugratilmis bir VL alani içeren bir hafif zinciri meydana getirmektedir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VL gen segmentinden türetilen somatik olarak muitasyona ugratilmis bir VL alani ve bir fare CK bölgesi içermektedir. Bir yapilandirmada, fare bir A hafif zincirini eksprese etmemektedir. Bir yapilandirmada, genetigi degistirilmis fare, insan VL bölgesi sekansini somatik olarak hipermutasyona ugratabilmektedir. Belirli bir yapilandirmada, fare, bir VL alanini yeniden düzenleyebilen ve kodlayabilen bir insan VL gen segmentinden türetilen, yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin hafif zincir içeren bir hücre içermektedir ve yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir geni, somatik olarak mutasyona ugratilmis bir VL alani Içermektedir. Bir yapilandirmada, fare, bir fare CK'SI ile birlestirilmis, somatik oalrak mutasyona ugratilmis bir insan VL alani içeren bir hafif zinciri eksprese eden bir hücre içermektedir, burada hafif zincir, bir insan VH gen segmentinden türetilen, somatik olarak mutasyona ugratilmis bir VH alani içeren bir hafif zincir ile iliskilenmektedir ve burada agir zincir, bir fare agir zincir sabit bölgesi (CH) içermektedir. Belirli bir yapilandirmada, agir zincir bir fare CH1, bir fare kivrimi, bir fare CH2 ve bir fare CH3 içermektedir. Belirli bir yapilandirmada, agir zincir bir finsan CH1, bir kivrim, bir fare CH2 ve bir fare CH3 içermektedir. Saglanan fare, bir fare veya siçan immünoglobulin sabit bölge sekansi ile faal olarak birlestirilen bir veya daha fazla insan immünoglobulin VH gen segmenti, bir veya daha fazla insan immünoglobulin DH gen segmenti ve bir veya daha fazla insan immünoglobulin JH gen segmenti içermektedir. Bir yapilandirmada, fare, bir veya daha fazla insan VH gen segmenti ile endojen fare VH gen segmentlerinin bir degisimini içermektedir, burada insan VH gen segmentleri, bir fare CH bölgesi geni ile faal olarak birlestirilmektedir, böylelikle fare, insan VH gen segmentlerini yeniden düzenlemektedir ve bir insan VH alani ve bir fare CH içeren bir ters kimerik immünoglobulin agir zincirini eksprese etmektedir. Bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmemis fare VH gen segmentlerinin %90 ila 100,ü, yeniden düzenlenmemis en az bir insan VH gen segmenti ile degistirilmektedir. Belirli bir yapilandirmada, endojen fare VH gen segmentlerinin tamami veya neredeyse tamami, yeniden düzenlenmemis en az bir insan VH gen segmenti ile degistirilmektedir. Bir yapilandirmada, replasman, en az 19, en az 39 veya en az 80 veya 81 yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmentleri ile gerçeklestirilmektedir. Bir yapilandirmada, replasman, en az 12 islevsel, yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti, en az 25 islevsel, yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti veya en az 43 islevsel, yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti ile gerçeklestirilmektedir. Bir yapilandirmada, fare, en az bir yeniden düzenlenmemis insan DH segmenti ve eb az bir yeniden düzenlenmemis insan JH segmenti ile tüm fare DH ve JH segmentlerinin bir replasmanini içermektedir. Bir yapilandirmada, en az bir yeniden düzenlenmemis insan DH segmenti, 1-1, D1-7, 1-26, kombinasyonundan seçilmektedir. Bir yapilandirmada, en az bir yeniden düzenlenmemis insan JH segmenti, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilmektedir. Spesifik bir yapilandirmada, en az bir insan VH segmenti, 1-2, 1-8, 1-24, -51, bir 6-1 insan VH gene segmenti ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilmektedir. Bir yapilandirmada, fare, ilgili bir antijeni spesifik olarak baglayan bir baglama proteinini eksprese eden bir B hücresini içermektedir, burada baglama proteini, bir insan VK1- 39/JK5 yeniden düzenlemesi veya bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden bir yeniden düzenlemesinden tüetilen, yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin agir zincir geni içermektedir. Bir yapilandirmada, bir veya daha fazla insan VH gen segmentleri, 1, 2, 3, 4, 5, ve 6*dan seçilen bir insan agir zincir JH gen segmenti ile yeniden düzenlenmektedir. Bir yapilandirmada, bir veya daha fazla insan VH ve JH gen 27iden seçilen bir insan DH gen segmenti ile yeniden düzenlenmektedir. Spesifik bir yapilandirmada, hafif zincir geni, 1, 2, 3, 4, veya 5 veya daha fazla somatik hipermutasyona sahiptir. bir immünoglobulin agir zincir degisken bölgesi geni sekansi içeren bir B hücresi içermektedir. Spesifik bir yapilanirmada, B hücresi, bir fare agir zincir sabit bölgesi ile füzyonlanan bir insan immünoglobulin agir zincir degisken bölgesi ve bir fare hafif zincir sabit bölgesi ile füzyonlanan bir insan immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesi içeren bir baglama proteinini eksprese etmektedir. Bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis insan VL bölgesi, bir insan VK1-39JK5 sekansidir ve fare, (i) insan VL/JL sekansindan türetilen bir VL akani ve (ii) bir fare CL'SI içeren bir ters kimerik hafif zinciri ekspresee etmektedir; burada hafif zincir, (i) bir fare kombinasyonundan seçilen bir insan VH gen segmentinden türetilen somatik olarak mutasyona ugratilmis bir insan VH alani içeren bir ters kimerik agir zincir ile iliskilendirilmektedir. Bir yapilandirmada, fare, somatik olarak mutasyon geçiren bir hafif zinciri eksprese etmektedir. Bir yapilandirmada, CL bir fare CKrdir. Spesifik bir gen segmentinden seçilmektedir. Spesifik bir yapilandirmada, somatik olarak 6-13, ve 7-27'den seçilen bir DH segmentinden türetilen bir sekans içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, somatik olarak mutasyona ugratilmis insan VH alani, 1, 2, 3, 4, 5, ve 6'dan seçilen bir JH segmentinden türetilen bir sekans içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, somatik olarak miutasyona ugratilmis insan VH alani, 2-5/6-6/1, 2- yeniden düzenlenmis bir insan VH/DH/JH sekansi tarafindan kodlanmaktadir. Bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis insan VL bölgesi, bir insan VK3-2OJK1 sekansidir ve fare, (i) insan VL/JL sekansindan türetilen bir VL alani ve (ii) bir fare CL'SI içeren bir ters kimerik hafif zinciri ekspresee etmektedir; burada hafif zincir, (i) bir fare kombinasyonundan seçilen bir insan VH gen segmentinden türetilen somatik olarak mutasyona ugratilmis bir insan VH'si içeren bir ters kimerik agir zincir ile iliskilendirilmektedir. Bir yapilandirmada, fare, somatik olarak mutasyon geçiren bir hafif zinciri eksprese etmektedir. Bir yapilandirmada, CL bir fare CK'SIdIl'. Spesifik bir segmentinden seçilmektedir. Spesifik bir yapilandirmada, somatik olarak mutasyona segmentinden türetilen bir sekans içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, somatik olarak mutasyona ugratilmis insan VH alani, 3, 4, 5, ve 6'dan seçilen bir JH segmentinden türetilen bir sekans içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, somatik düzenlenmis bir insan VH/DH/JH sekansi tarafindan kodlanmaktadir. Ayrica, hem yeniden düzenlenmis bir insan VK1-39JK5 sekansi hem de yeniden düzenlenmis bir insan VK3-20JK1 sekansi içeren bir fareye atifta bulunulmaktadir ve fare, (i) insan VK1-39JK5 sekansindan veya insan VK3-2OJK1 sekansindan türetilen bir VL alani ve (ii) bir fare CL'si içeren bir ters kimerik hafif zinciri eksprese etmektedir; segmenti ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilen bir insan VH gen segmentinden türetilen somatik olarak mutasyona ugratilmis bir insan VH'si içeren bir ters kimerik agir zincir ile iliskilendirilmektedir. Bir durumda, fare, somatik olarak mutasyona ugratilmis bir hafif zinciri eksprese etmektedir. Bir durumda, CL bir fare CK'sidir. Bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmemis fare VH gen segmentlerinin %90 ila 100%, yeniden düzenlenmemis en az bir insan VH gen segmenti ile degistirilmektedir. Spesifik bir yapilandirmada, endojen, yeniden düzenlenmemis fare VH gen segmentlerinin tamami veya neredeyse tamami, yeniden düzenlenmemis en az bir insan VH gen segmenti ile degistirilmektedir. Bir yapilandirmada, replasman, en az 18, en az 39 veya en az 80 veya 81 yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmentleri ile gerçeklestirilmektedir. Bir yapilandirmada, replasman, en az 12 islevsel, yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti, en az 25 islevsel, yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti veya en az 43 islevsel, yeniden düzenlenmemis insan VH gen segmenti ile gerçeklestirilmektedir. Bir yapilandirmada, genetigi degistirilmis fare, 057BL/A, C57BL/An, CS7BL/GrFa, C57BL susudur. Spesifik bir yapilandirmadai genetigi degistirilmis fare, yukarida bahsedilen bir 129 susu ve yukarida bahsedilen bir C578L/6 susunun bir karisimidir. Bir diger spesifik yapilandirmada, fare, yukarida bahsedilen 129 suslarinin bir karisimi veya yukarida bahsedilen BL/6 suslarinin bir karisimidir. Belirli bir yapilandirmada, karisimin Ayrica, yeniden düzenlenmis bir insan VK1-39JK5 sekansi veya yeniden düzenlenmis bir insan VK insan VK1-39JK5 sekansindan türetilen, somatik olarak mutasyona ugratilmis bir insan VL gen segmentinden seçilen bir insan VH gen segmentinden türetilen, somatik olarak mutasyona ugratilmis bir insan VH alani ve bir fare CH'SI içeren bir agir zincir içeren bir ters kimerik antikoru eksprese eden bir fare açiklanmaktadir, burada fare, tamamen bir fare antikorunu eksprese etmemektedir ve tamamen bir antikorunu da eksprese etmemektedir. Bir durumda, fare; yeniden düzenlenmis insan VK1-39JK5 sekansi veya yeniden düzenlenmis insan VK3-20JK1 sekansi ile endojen fare K hafif zincir gen segmentlerinin bir replasmanini içeren bir K hafif zincir Iokusu içermektedir ve insan VH gen segmentlerinin bir repertuvarinin tamami veya neredeyse tamami ile endojen fare VH gen segmentlerinin tamami veya neredeyse tamaminin bir replasmanini içermektedir. Ayrica, burada açiklanan bir fareden elde edilen antijene özgü antikorlarin bir popülasyonu burada açiklanmaktadir, burada antikorlar, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesi veya bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilen bir hafif segmentinden seçilen bir Insan VH gen segmentinn bir yeniden düzenlemesinden elde edilen, bir yeniden düzenlenmis immünoglobulin agir zincir geni içermektedir. Bir durumda, bir veya daha fazla insan VH gen segmentleri, 1, 2, 3, 4, 5, ve 6'dan seçilen bir insan agir zincir JH gen segmenti ile yeniden düzenlenmektedir. Spesifik bir durumda, hafif zincir, 1, 2, 3, 4, veya 5 veya daha fazla somatik hipermutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, 1, 2, 3, veya 4 somatik hipermutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir geni, 1 veya 2 mutasyona sahiptir. Çesitli yapilandirmalarda, hafif zincir geni, sekansi boyunca çoklu mutasyonlara ugrayabilmektedir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve hafif zincir, en az bir adet veya dörtten az olmayacak sekilde somatik hipermutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir en az iki somatik hipermutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, hafif zincir en az üç somatik hipermutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, hafif zincir en az dört somatik hipermutasyon içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, bu tür somatik hipermutasyonlardan en az biri, hafif zincirin bir veya daha fazla çerçeve bölgesinde (FW'Ier) mevcuttur. Spesifik bir yapilandirmada, bu tür somatik hipermutasyonlardan en az biri, hafif zincirin bir veya daha tamamlayicilik belirleme bölgesinde (CDR'ler) mevcuttur. Spesifik bir yapilandirmada, bu tür somatik hipermutasyonlardan en az biri, hafif zincirin bir veya daha fazla FWfsinde ve/veya bir veya daha fazla CDRsinde mevcuttur. Çesitli yapilandirmalarda, çerçeve bölgeleri, çerçeve 1 (FW1), çerçeve 2 (FW2), çerçeve 3 (FW3) ve/veya bunlarin bir kombinasyonundan seçilmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, CDR*Ier, CDR1, CDR2, CDR3 ve/veya bunlarin bir kombinasyonundan seçilmektedir. Bir yapilandirmada, agir zincir, bir veya daha fazla FW'de veya bir veya daha fazla CDR'de en az bir mutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, agir zincir, bir veya daha fazla FW*de ve bir veya daha fazla CDR'de en az bir mutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, agir zincir, bir veya daha fazla FWrde ve bir veya daha fazla CDR'de en az iki mutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, agir zincir, bir veya daha fazla FW'de ve bir veya daha fazla CDR'de en az 'üç mutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, agir zincir, bir veya daha fazla FW'de ve bir veya daha fazla CDR'de en az dört mutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, agir zincir bir veya daha fazla FW'de ve bir veya daha fazla CDRde en az bes veya besten daha fazla mutasyon içermektedir; spesifik bir yapilandirmada, agir zincir, iki FW'de en az bes veya besten daha fazla mutasyon içermektedir; spesifik bir yapilandirmada, agir zincir, bir Fwrde ve bir CDR'de en az bes veya besten daha fazla mutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK1-39/.JK5-t'urevli hafif zincirlerin yaklasik %9ru FW1'de mevcut olan en az bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %9ru FW'de mevcut bir mutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK1-39/JK5-t'urevli hafif zincirlerin yaklasik %25'i CDR1 'de mevcut olan en az bir adet veya ikiden fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %19'u CDR1'de mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %54 CDR1rde mevcut iki mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK1-39/JK5-turevli hafif zincirlerin yaklasik %20rsi FW2rde mevcut en az bir adet veya üçten fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %17'si, FW2'de mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %1'i, FW2'de mevcut iki mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirserin en az %1'i, FW25de mevcut üç mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK1-39/JK5-t'urevli hafif zincirlerin yaklasik %10,u CDR2'de mevcut olan en az bir adet veya ikiden fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %10'u CDR2'de mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %1'i CDR2'de mevcut iki mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK1-39/JK5-türevli hafif zincirlerin yaklasik %29'u FW3'te mevcut en az bir adet veya dörtten fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %21'i, FW3=te mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %5'i, FW3'te mevcut iki mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirserin en az %2'si, FW3'te mevcut üç: mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %2'si, FW3'te mevcut dört mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK1-39/JK5-t'urevli hafif zincirlerin yaklasik %37'si CDR3ite mevcut en az bir adet veya dörtten fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %27'si, CDRB'te mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %8ii, CDR3ite mevcut iki mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %1'i, CDR3'te mevcut 'üç mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %14, CDR3*te mevcut dört mutasyona sahiptir. Ayrica, burada açiklanan bir fareden elde edilen antijene özgü antikorlarin bir pop'ülasyonu burada açiklanmaktadir, burada antikorlar, bir insan VK1-39/JK5 düzenlemesinden elde edilen bir hafif zincir içermektedir ve VK1-39/JK5-t'ürevli hafif zincirlerin yaklasik %9'u, FW1'de mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir, VK1- 39/JK5-t'urevli hafif zincirlerin yaklasik %25'i, CDR11de mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir, VK1-39/JK5-türevli hafif zincirlerin yaklasik %20*si, FW2tde mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir, VK1-39/JK5 türevli hafif zincirlerin yaklasik zincirlerin yaklasik %29'u FW37te mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir ve VK1-39/JK5-türevli hafif zincirlerin yaklasik %37'si CDRSfte mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %35'i FW'l*de mevcut en az bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agirzincirlerin en az %25'i, FW1'de mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %9'u, FW1ide mevcut iki mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %17i, FW1'de mevcut üç mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %1'i, FW1'de mevcut besten fazla mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %92rsi CDR1rde mevcut en az bir adet veya dörtten fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %92isi, CDR1,de mevcut en az bir, en az iki, en az 'üç veya en az dört mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %26'si, CDR1'de mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %441), CDRiade mevcut iki mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %19'u, CDR1 'de mevcut 'üç mutasyona sahiptir, bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az 0/03'Ü, CDR1 'de mevcut dört mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %66=si FW2'de mevcut en az bir adet veya üçten fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %66tsi, FW2ide mevcut en az bir, en az iki, en az üç: veya en az dört mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %35'i,FW2'de mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %23'ü, FW2rde mevcut iki mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %8'i, FW2'de mevcut `üç mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %70ii CDR2'de mevcut en az bir adet veya dörtten fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %70'i, CDR2*de mevcut en az bir, en az iki, en az 'üç veya en az dört mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %34'Ü, CDR2'de mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %20'si, CDR2'de mevcut iki mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %12*si, CDR2'de mevcut üç mutasyona sahiptir, bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %54, CDR2'de mevcut dört mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %91ii FW3ite mevcut en az bir adet en fazla bes veya daha fazla mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %914, FW3tte mevcut en az bir, en az iki, en az 'üç, en az dört veya en az bes veya daha fazla mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %19tu, FW3rte mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %33'ü, FW3ite mevcut iki mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %2235i, FWS'te mevcut üç mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %11'i, FW3'te mevcut dört mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %7isi, FW3'te mevcut bes veya daha fazla mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK1-39/JK5 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %63"u CDR3,te mevcut en az bir adet veya ikiden daha fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, agirzincirlerin en az %631), CDR3Ste mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %54'ü, CDR3=te mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %9", CDRSite mevcut iki mutasyona sahiptir. Ayrica, burada açiklanan bir fareden elde edilen antijene özgü antikorlarin bir pop'ülasyonu burada açiklanmaktadir, burada antikorlar, bir insan VK1-39/JK5 düzenlemesinden elde edilen bir hafif zincir içermektedir ve agir zincirlerin yaklasik Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve hafif zincir geni, en az bir adet veya ikiden fazla olmayacak siekilde somatik hipermutsayonlara sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincir geni, en az iki, en az üç, en az dört veya daha fazla somatik hipermutasyona sahiptir. Spesifik bir yapilandirmada, mutasyonlar, hafif zincirin bir veya daha fazla çerçeve bölgesinde mevcuttur. Spesifik bir yapilandirmada, mutasyonlar, hafif zincirin bir veya daha fazla CDR bölgesinde mevcuttur. Spesifik bir yapilandirmada, mutasyonlar, hafif zincirin bir veya daha fazla çerçeve bölgesinde ve/veya bir veya daha fazla CDR bölgesinde mevcuttur. Çesitli yapilandirmalarda, çerçeve bölgeleri, çerçeve 1 (FW1), çerçeve 2 (FW2), çerçeve 3 (FW3) ve/veya bunlarin bir kombinasyonundan seçilmektedir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK3-20/JK1-t'L'irevli hafif zincirlerin yaklasik %10'u FW1ide mevcut olan en az bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %10'u FW'de Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK3-20/JK1-t'ürevli hafif zincirlerin yaklasik %53rü CDR1'de mevcut olan en az bir adet veya ikiden fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %27'si CDR1rde mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin yaklasik %54'Ü CDR1'de mevcut bir veya iki mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK3-20/JK1-türevli hafif zincirlerin yaklasik %ö'si FW2ide mevcut en az bir adet veya ikiden fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %ö'si, FW2rde mevcut en az bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %3"L'i, FW2'de mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %S'ü, FW2'de mevcut iki mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-2O/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK3-20/JK1-t`ürevli hafif zincirlerin yaklasik %31] CDR27de mevcut olan en az bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %3*'u CDRZide Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK3-2O/JK1-t'i'irevli hafif zincirlerin yaklasik %17 veya daha fazlasi, FW3ite mevcut olan en az bir adet veya ikiden fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %2095i FW3'te mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %17'si FW3tte mevcut iki mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve VK3-20/JK1-türevli hafif zincirlerin en az %43i'u CDR3'te mevcut olan en az bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin en az %431] CDRStte Ayrica, burada açiklanan bir fareden elde edilen antijene özgü antikorlarin bir popülasyonu burada açiklanmaktadir, burada antikorlar, bir insan VK3-20/JK1 düzenlemesinden elde edilen bir hafif zincir içermektedir ve VK3-20/JK1-t'urevli hafif zincirlerin yaklasik %10'u, mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir, VK3-20/JK1- türevli hafif zincirlerin yaklasik %53'1'1, CDR1*de mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir, VK3-20/.JK1-ti'irevli hafif zincirlerin yaklasik %6*si, FW2rde mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir, VK3-20/JK1 türevli hafif zincirlerin yaklasik %3'Ü CDR2*de mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir, VK3-20/JK1-t`urevli hafif zincirlerin yaklasik %37isi FW3°te mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir ve VK3-20/JK1- türevli hafif zincirlerin yaklasik %430 CDR33te mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %431] FW1'de mevcut en az bir adet veya ikiden daha fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %41*i, FW17de mevcut en az bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin yaklasik %41Ii, FW1,de mevcut bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin yaklasik %2*si, FW1ide mevcut iki mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %92'si CDR1'de mevcut en az bir adet veya dörtten fazla olmayacak sekilde mutasyonlara sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %43'1'1, CDR1'de mevcut en az bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %25'i, CDRlide mevcut en az iki mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %151i, CDRiide mevcut en az 3 mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %10'u, CDR1*de mevcut 4 veya daha fazla mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %46*si FW2'de mevcut en az bir adet veya agirzincirlerin en az %34"u, FW2'de mevcut en az bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %10'u, FW2'de mevcut iki veya daha fazla mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %2isi, FW2ide mevcut 'üç veya daha fazla mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %84"u CDR2'de mevcut en az bir adet veya en fazla bes veya besten fazla mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %39iu, CDR27de mevcut bir veya daha fazla mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %18'i, CDR2'de mevcut iki veya daha fazla mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %214, CDR2'de mevcut 'üç veya daha fazla mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %31), CDR2ide mevcut dört veya daha fazla mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %2'si, CDR2'de mevcut bes veya daha fazla mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %92"si FW39te mevcut en az bir adet veya en fazla bes veya besten daha fazla mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %214, FW3ite mevcut en az bir dört mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %20'si, FW3rte mevcut en az iki mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %131), FW3'te mevcut en az üç mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %ZO'SI, FW3fte mevcut en az dört mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, agir zincirlerin en az %18'i, FW3'te mevcut en az 5 mutasyona sahiptir. Bir yapilandirmada, hafif zincir, bir insan VK3-20/JK1 yeniden düzenlemesinden elde edilmektedir ve agir zincirlerin yaklasik %7'si CDR3'te mevcut olan en az bir mutasyona sahiptir; bir yapilandirmada, hafif zincirlerin yaklasik %7'si CDRS'te mevcut bir mutasyona sahiptir. Ayrica, burada açiklanan bir fareden elde edilen antijene 'özgü antikorlarin bir popülasyonu burada açiklanmaktadir, burada antikorlar, bir insan VK3-20/JK1 düzenlemesinden elde edilen bir hafif zincir içermektedir ve agir zincirlerin yaklasik Ayrica, yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin hafif zincir sekansindan bir immünoglobulin hafif zinciri eksprese eden bir fareye atifta bulunulmaktadir, burada yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir sekansi, farenin germ hattinda mevcuttur, burada immünoglobulin hafif zinciri, bir insan degisken sekansini içermektedir. Bir durumda, farenin germ hatti, yeniden düzenlenmis bir hafif zincir sekansi içeren farenin her B hücresinde mevcut olan tüm temsili olmayan hafif zincir sekanslari ile ayni V segmenti ve ayni J segmentinden elde edilen, yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin hafif zincir sekansi içermektedir. Bir yapilandirmada, farenin germ hattinda, islevsel, yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin hafif zincir V geni segmenti bulunmamaktadir. Bir yapilandirmada, farenin germ hattinda, islevsel, yeniden düzenlenmemis bir immünoglobulin hafif zincir J Bir durumda, farenin germ hatti, birden fazla olmayacak sekilde, ikiden fazla olmayacak sekilde veya üçten fazla olmayacak sekilde, yeniden düzenlenmis (V/J) hafif zincir sekanslari içermektedir. Bir durumda, yeniden düzenlenmis VIJ sekansi, bir K hafif zincir sekansi içermektedir. Spesifik bir durumda, K hafif zincir sekansi, bir insan K hafif zincir sekansidir. Spesifik bir durumda, K hafif zincir sekansi, bir insan VK1-39/J sekansi, bir insan VK3-20/J sekansi ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilmektedir. Spesifik bir durumda, K hafif zincir sekansi, bir insan VK1-39/JK5 sekansidir. Spesifik bir durumda, K hafif zincir sekansi, bir insan VK3-20/JK1 sekansidir. Bir yapilandirmada, fare, germ hattinda, ayrica, yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir sekansina göre bir fare K intronik artirici 5,, bir fare K 3, artirici ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilen bir sekans içermektedir. Bir yapilandirmada, fare, yeniden düzenlenmemis bir insan VH gen segmenti, yeniden düzenlenmemis bir insan DH gen segmenti, yeniden düzenlenmemis bir insan JH gen segmenti içermektedir, burada söz konusu VH, DH, ve JH gen segmentleri, bir agir zincir sabit gen sekansi ile faal sekilde birlestirilen bir immünoglobulin agir zincir degisken gekn sekansinin meydana getirilmesi için yeniden düzenleme gerçeklestirebilmektedir. Bir yapilandirmada, fare birden çok insan VH, DH, ve JH gen segmentleri içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, insan VH, DH, ve JH gen segmentleri, endojen fare immünoglobulin agir zincir lokusunda endojen fare VH, DH, ve JH gen segmentlerinin yerini almaktadir. Spesifik bir yapilandirmada, fare, islevsel insan VH, DH, ve JH gen segmentlerinin tamami veya neredeyse tamami ile islevsel fare VH, DH, ve JH gen segmentlerinin tamami veya neredeyse tamaminin bir replasmanini içermektedir. Bir yapilandirmada, fare, bir fare sabit sekansini içeren bir immünoglobulin hafif zinciri eksprese etmektedir. Bir yapilandirmada, fare, bir insan sabit sekansini içeren bir immünoglobulin hafif zincirini eksprese etmektedir. Bir yapilandirmada, fare, bir CH1 sekansi, bir kivrim sekansi, bir CH2 sekansi, bir CH3 sekansi ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilen bir fare sekansi içeren bir immünoglobulin agir zincirini eksprese etmektedir. Bir yapilandirmada, fare, bir CH1 sekansi, bir kivrim sekansi, bir CH2 sekansi, bir CH3 sekansi ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilen bir insan sekansi içeren bir immünoglobulin agir zincirini eksprese etmektedir. Bir durumda, farenin germ hattindaki yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir sekansi, bir endojen fare immünoglobulin hafif zincir lokusunda bulunmaktadir. Spesifik bir durumda, farenin germ gattindaki yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir sekansi, endojen fare immünoglobulin hafif zincir lokusunda fare hafif zincir V ve J sekanslarinin tamaminin veya neredeyse tamaminin yerini almaktadir. Ayrica, vekil olmayan bir hafif zincir sekansini içeren her bir B hücresi ile karakterize edilen bir B hücresi popülasyonu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bu sekans, bir tek insan V geni segmenti ve tek bir J geni segmentinden meydana getirilen, yeniden düzenlenmis bir hafif zincir geni içermektedir, burada farenin germ hattindaki tek hafif zincir degisken sekansi, tek insan V segmenti ve tek insan J segmentinden meydana getirilen, yeniden düzenlenmis bir sekanstir ve burada yeniden düzenlenmis hafif zincir genini içeren her bir B hücresi, ayrica, bir kognat insan agir zincir degisken alanini kodlayan bir gen içermektedir ve burada yeniden düzenlenmis hafif zincir geni, en az bir, en az iki, en az üç veya en az dört somatik hipetmutasyon içermektedir. Ayrica, matür B hücresi popülasyonunun, her bir matür B hücresinin, kendi yüzeyinde, vekil olmayan bir hafif zincir sekansi içermesi ile karakterize edildigi bir fareye atifta bulunulmakta olup, bu sekans, iki insan VL gen segmentinden birinin ve besten fazla olmayan insan JL gen segmentinden birinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilen, yeniden düzenlenmis bir hafif zincir geni içermektedir, burada farenin germ hattindaki tek hafif zincir degisken sekansi (VLJL sekansi), iki insan VL gen segmentinden birinin ve besten daha fazla olmayan JL gen segmentinden birinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilen, yeniden düzenlenmis bir sekanstir ve burada yeniden düzenlenmis hafif zincir genini içeren her bir B hücresi, ayrica, bir kognat insan agir zincir degisken alanini kodlayan bir gen içermektedir ve burada yeniden düzenlenmis hafif zincir geni, en az bir, en az iki, en az üç veya en az dört veya bes veya daha fazla somatik hipetmutasyon içermektedir. Bazi durumlarda, yeniden düzenlenmis bir hafif zincir geni, bir, iki, üç, dört veya bes somatik hipermutasyon içermektedir. Bazi yapilandirmalarda, burada açiklanan farelere, ilgili bir antijen ile bagisiklik kazandirilmistir ve bazi durumlarda, bir matür B hücresi popülasyonu, ilgili antijeni baglayan B hücreleri ile zenginlestirilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, matür B hücresi popülasyonunun, her bir matür B hücresinin, kendi yüzeyinde, vekil olmayan bir hafif zincir sekansi içermesi ile karakterize edildigi bir fareye atifta bulunulmakta olup, bu sekans, iki insan VL gen segmentinden birinin ve 5 insan JL gen segmentinden birinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilen, yeniden düzenlenmis bir hafif zincir geni içermektedir,burada VL gen segmentleri, esasen, birbirine özdes olmayan iki VL geninden olusmaktadir ve VL lokusu 5 insan JL gen segmenti içermektedir ve yeniden düzenlenmis hafif zincir genini içeren her bir B hücresi, ayrica, bir kognat insan agir zincir degisken alanini kodlayan bir gen içermektedir ve burada yeniden düzenlenmis hafif zincir geni, en az bir, en az iki, en az üç, en az dört veya bes veya daha fazla somatik hipetmutasyon içermektedir. Bazi yapilandirmalarda, yeniden düzenlenmis bir hafif zincir geni, bir, iki, üç, dört veya bes somatik hipermutasyon içermektedir. Bazi yapilandirmalarda, burada açiklanan farelere, ilgili bir antijen ile bagisiklik kazandirilmistir ve bazi yapilandirmalarda, bir matür B hücresi popülasyonu, ilgili antijeni baglayan B hücreleri ile zenginlestirilmektedir. Bir yönde, burada açiklanan bir fareden elde edilen bir pluripotent, indüklenmis pluripotent veya totipotent hücre saglanmaktadir. Belirli bir yapilandirmada, hücre bir fare embriyonik stem (ES) hücresidir. Bir yönde, burada açiklanan bir fareden elde edilen bir doku saglanmaktadir. Bir yapilandirmada, doku, burada açiklanan bir farenin dalagi, lenf nodülü veya kemik iliginden elde edilmektedir. Bir yönde, burada açiklanan bir fareden elde edilen bir nükleus saglanmaktadir. Bir yapilandirmada, nükleus, bir B hücresi olmayan bir diploid hücredendir. Bir yönde, burada açiklanan bir fareden izole edilen bir fare hücresi saglanmaktadir. Bir yapilandirmada, hücre bir ES hücresidir. Bir yapilandirmada, hücre bir Ienfosittir. Bir yapilandirmada, Ienfosit bir B hücresidir. Bir yapilandirmada, B hücresi, bir insan gen segmentinden elde edilen bir degisken alan içeren bir kimerik agir zinciri; yeniden düzenlenmis bir insan VK1-39/J sekansindan, yeniden düzenlenmis bir insan VK3-20/J sekansindan veya bunlarin bir kombinasyonundan elde edilen bir hafif zinciri eksprese etmektedir; burada agir zincir degisken alani, bir fare sabit bölgesine füzyonlanmaktadir ve hafif zincir degisken alani ise bir fare veya insan sabit bölgesine füzyonlanmaktadir. Bir yönde, b,r hibridom saglanmaktadir, burada hibridom, burada açiklanan bir farenin bir B hücresi ile meydana getirilmektedir. Spesifik bir yapilandirmada, B hücresi, ilgili bir epitop içeren bir immünojen ile bagisiklik kazandirilan, burada açiklanan bir faredendir ve B hücresi, ilgili epitopu baglayan bir baglama proteinini eksprese etmektedir, baglama proteini, somatik olarak mutasyona ugramis bir insan VH alani ve bir fare CHfsine sahiptir ve yeniden düzenlenmis bir insan VK1-39JK5 veya yeniden düzenlenmis bir insan VK3-20JK1'den elde edilen bir insan VL alanina ve bir fare Cusine sahiptir. Bir yönde, bir fare embriyosu saglanmaktadir, burada embriyo, burada açiklanan bir fareden elde edilen bir donör ES hücresi içermektedir. Ayrica, bir hedef vektörüne atifta bulunulmakta olup, vektörün 5' ve 3, fare homoloji kollarinin sekanslarina referansla transkripsiyonel yönde 5' ila 3' homoji kolundan, bir 5' fare homoloji kolu, bir insan veya fare immünoglobulin promotörü, bir insan veya fare öncü sekansi ve yeniden düzenlenmis bir insan VK1-39JK5 veya yeniden düzenlenmis bir insan VK3-20JK1'den seçilen bir insan Vi_ bölgesi ve bir 3' fare homoloji kolu içermektedir. Bir durumda, 5' ve 3, homoloji kollari, 5, te ve fare CK genine yakin bulunan bir artirici sekansa göre bir sekans 5' ye vektörü hedeflemektedir. Bir durumda, promotör, bir insan immünoglobulin degisken bölgesi gen segmenti promotörüdür. Spesifik bir durumda, promotör bir insan VK3-15 promotörüdür. Bir durumda, öncü sekans bir fare öncü sekansidir. Spesifik bir durumda, öncü sekans bir fare VK3-7 öncü sekansidir. Ayrica, yukarida açiklanan bir hedef vektörüne atifta bulunulmaktadir, ancak 5" fare homoloji kolundan ziyade, insan veya fate promotörü, bölgeye özgü bir rekombinaz tanima bölgesi (SRRS) ile 5, yandan desteklenmektedir ve 3' fare homoloji kolundan ziyade, insan VL bölgesi, bir SRRS ile 3, yandan desteklenmektedir. Ayrica, burada açiklanan bir fareden meydana getirilen bir ters kimerik antikora atifta bulunulmaktadir, burada ters kimerik antikor, bir insan VL ve bir fare CL içeren bir hafif zincir ve bir insan VH ve bir fare CH içeren bir agir zincir içermektedir. Bir yönde, bir antikorun meydana getirilmesi için bir yöntem saglanmakta olup, bir tek hücre içerisinde, (a) bir insan CH gen sekansi ile füzyonlanan, bagisiklik kazandirilmis bir farenin bir birinci VH gen sekansini; (b) bir insan CL gen sekansi ile füzyonlanan, bagisiklik kazandirilmis bir farenin bir VL gen sekansinin eksprese edilmesini; ve (c) hücrenin, tam insan bir antikorun eksprese edilmesi için yeterli kosullar altinda tutulmasini ve antikorun izole edilmesini içermektedir. Bir yapilandirmada, hücre, bir insan CH gen sekansi ile füzyonlanan, burada açiklandigi üzere bagisiklik kazandirilmis bir ikinci farenin bir ikinci VH gen sekansini içermektedir, birinci VH gen sekansii bir birinci epitopu taniyan bir VH alanini kodlamaktadir ve ikinci VH gen sekansi ise, bir ikinci epitopu taniyan bir VH alanini kodlamaktadir, burada birinci epitop ve ikinci epitop özdestir. Bir yönde, bir epitop baglama proteininin meydana getirilmesine yönelik bir yöntem saglanmakta olup, burada açiklanan bir farenin ilgili bir epitopu içeren bir immünojene maruz birakilmasini, farenin ilgili epitopu spesifik olarka baglayan bir immünoglobulin molekülünü meydana getirmesi için yeterli kosullar altinda farenin tutulmasini ve ilgili epitopu spesifik olarak baglayan immünoglobulin molekülünün izole edilmesini içermektedir, burada epitop baglama proteini, yeniden düzenlenmis bir insan VK1-39JK5 veya yeniden düzenlenmis bir insan VK3-20JK1rden elde edilen bir insan VL ve bir fare CL içeren bir hafif zincir ile iliskilendirilen, somatik olarak mutasyonlu bir insan VH ve bir fare CH içeren bir agir zincir içermektedir. Bir yönde, bir epitop baglama proteini eksprese eden bir hücre saglanmaktadir, burada hücre sunlari içermektedir: (a) yeniden düzenlenmis bir insan VK1-39JK5 veya yeniden düzenlenmis bir insan VK3-20JK1rden elde edilen bir insan VL alanini kodlayan bir insan nükleotit sekansi, burada insan nükleotit sekansi (dogrudan veya bir birlestirici vasitasiyla), bir insan immünoglobulin hafif zincir sabit alani cDNA sekansina füzyonlanmaktadir (örnegin bir insan K sabit alan DNA sekansi); ve (b) bir birinci insan VH nükleotits sekansindan elde edilen bir insan VH alanini kodlayan bir birinci insan Vi-i nükleotit sekansi, burada birinci insan VH nükleotit sekansi (dogrudan veya bir bielestirici vasitasiyla) bir insan immünoglobulin agir zincir sabit alan cDNA sekansina füzyonlanmaktadir; burada epitop baglama proteini bir birinci epitogu tanimaktadir. Bir yapilandirmada, epitop baglama proteini, 'lO'6 M'den daha az, I'lO'8 Miden daha az, 10'9 olan bir ayrisma sabiti ile birinci epitogu baglamaktadir. Bir yapilandirmada, hücre, bir ikinci insan VH alanini kodlayan bir ikinci insan nükleotit sekansi içermektedir, bruada ikinci insan sekansi (dogrudan veya bir birlestirici vasitasiyla), bir insan immünoglobulin agir zincir sabit alan cDNA sekansina füzyonlanmaktadir ve burada ikinci insan VH alani, birinci epitopu spesifik olarak tanimamaktadir (örnegin 10'6 M, 10'5 M, 10'4 M veya daha yüksek degerdeki bir ayrisma sabiti sergilemektedir) ve burada opitop baglama proteini birinci epitogu ve ikinci epitopu tanimaktadir ve burada birinci ve ikinci immünoglobulin agir zincirden her biri (a)*nin özdes bir hafif zinciri ile iliskilenmektedir. Bir yapilandirmada, ikinci VH alani, 10'6 M'den daha az, 10'1 M'den daha az, 10'8 M'den M*den daha az olan bir ayrisma sabiti ile ikinci epitogu baglamaktadir. Bir yapilandirmada, epitop baglama proteini bir birinci immünoglobulin agir zinciri ve bir ikinci immünoglobulin agir zinciri içermektedir, bunlardan her biri, bir insan VK1-39JK5 veya bir insan VK3-20JK1*den seçilen, yeniden düzenlenmis bir insan VL bölgesinden elde edilen özdes bir hafif zincir ile iliskilenmektedir, burada birinci immünoglobulin agir zincir, nanomolar ila pikomolar araligindaki bir ayrisma sabiti ile bir birinci epitopu baglamaktadir, ikinci immünoglobulin agir zinciri, nanomolar ila pikomolar araligindaki bir ayrisma sabiti ile bir ikinci epitopu baglamaktadir, birinci epitop ve ikinci epitop özdes degildir, birinci immünoglobulin agir zinciri ikinci epitopu baglamamaktadir veya mikromolar araliktan daha zayif olan (örnegin millimolar aralik) bir ayrisma sabiti ile ikinci epitopu baglamaktadir, ikinci immünoglobulin agir zincir birinci epitopu baglamamaktadir veya mikromolar araliktan daha zayif olan (örnegin millimolar aralik) bir ayrisma sabiti ile birinci epitopu baglamaktadir, VL, birinci immünoglobulin agir zincir zincirinin VH'si, ikinci immünoglobulin agir zincirinin VH'sinden bir veya daha fazlasi somatik olarka mutasyonludur. Bir yapilandirmada, birinci immünoglobulin agir zinciri, bir protein A baglama kalintisi içermektedir ve ikinci immünoglobulin agir zinciri ise protein A baglama kalintisi içermemektedir. Bir yapilandirmada, hücre CHO, 008, 293, HeLa ve bir viral nükleik asidi eksprese eden bir retinal hücreden (örnegin bir PERC.6TM hücresi) seçilmektedir. Ayrica, bir ters kimerik antikora atifta bulunulmakta olup, bir insan VH ve bir fare agir zincir sabit alani, bir insan VL ve bir fare hafif zincir sabit alani içermektedir, burada antikor, burada açiklanan bir fareye, bir epitop Içeren bir immünojen ile bagisiklik kazandirilmasini içeren bir proses ile meydana getirilmektedir ve antikor, fareye bagisikligin kazandirildigi immünojenin epitopunu spesifik olarak baglamaktadir. Bir durumda, VL alani somatik olarak mutasyonludur. Bir durumda, VH alani somatik olarak mutasyonludur. Bir durumda, hem VL alani hem de VH alani somatik olarkak mutasyonludur. Bir durumda, VL, bir fare CK alani ile birlestirilmektedir. Ayrica burada bir fareye atifta bulunulmakta olup, endojen fare agir zincir lokusunda VH gen segmentlerinin tamamini veya neredeyse tamamini degistiren insan VH gen segmentleri; yeniden düzenlenmis bir VK1-39/J ve yeniden düzenlenmis bir VK3-20/J veya bunun bir kombinasyonundan seçilen, bir veya ikiden daha fazla olmayan, yeniden düzenlenmis insan hafif zincir VL/Ji_ sekanslari, tüm care hafif zincir gen segmentlerinin yerini almaktadir; burada insan agir zincir degisken gen segmentleri, bir fare sabit geni ile birlestirilmektedir ve yeniden düzenlenmis insan hafif zincir sekanslari ise bir insan veya fare sabit geni ile birlestirilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, burada saglanan fare, endojen fare immünoglobulin agir zincir lokusunda fare immünoglobulin VH gen segmentlerinin tamaminin veya neredeyse tamaminin yerini alan insan immünoglobulin VH gen segmentleri içermektedir; ikiden fazla olmayan, yeniden düzenlenmemis iki immünoglobulin immünoglobulin VL gen segmentleri ve iki veya daha fazla (örnegin 2, 3, 4 veya 5) yeniden düzenlenmemis insan immünoglobulin JL gen segmentleri veya bes insan immünoglobulin JL gen segmenleri, tüm fare immünoglobulin hafif zincir gen segmentlerinin yerini almaktadir; burada insan imm'unoglobulin VH gen segmentleri, bir fare imm'L'inogIobulin sabit geni ile birlestirilmektedir ve yeniden düzenlenmemis insan immünoglobulin VL ve JL gen segmentleri ise bir insan veya insan olmayan immünoglobulin sabit geni ile birlestirilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, insan olmayan bir sabit gen, bir fare immünoglobulin sabit gendir. Bazi yapilandirmalarda, insan olmayan bir immunoglobulin sabit gen, bir siçan immünoglobulin sabit gendir. Ayrica, insan agir zincir degisken gen segmentleri ile, tüm veya neredeyse tüm fare agir zincir degisken gen segmentlerinin bir replasmanini ve bir veya ikiden daha fazla olmayan, yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir VL/JL sekanslarini içeren bir fare ES hücresine atifta bulunulmaktadir, burada insan agir zincir degisken gen segmentleri, bir fare imm'ünoglobulin agir zincir sabit geni ile birlestirilmektedir ve yeniden de'L'izenIenmis insan hafif zincir VL/Ji_ sekanslari ise bir fare veya insan immünoglobulin hafif zincir sabit geni ile birlestirilmektedir. Belirli bir durumda, hafif zincir sabit geni bir fare sabit genidir. düzenlenmemis insan immünoglobulin VL gen segmentleri ve iki veya daha fazla (örnegin 2, 3, 4 veya 5) yeniden düzenlenmemis insan immünoglobulin JL gen segmentleri ile tüm veya neredeyse tüm fare immünoglobulin VH gen segmentlerinin bir replasmanini içeren bir fare ES hücresine atifta bulunulmaktadir, burada insan imm'ünoglobulin VH gen segmentleri bir fare imm'ünoglobulin agir zincir sabit geni ile birlestirilmektedir ve yeniden düzenlenmemis insan immünoglobulin VL ve JL gen segmentleri ise insan olmayan veya insan imm'unoglobulin hafif zincir sabit geni ile birlestirilmektedir. Bazi belirli yapilandirmalarda, insan olmayan imm'unoglobulin hafif zincir sabit geni, bir fare immünoglobulin sabit genidir. Bazi belirli durumlarda, fare, yeniden düzenlenmemis bes immünoglobulin JL gen segmenti içermektedir. Ayrica, bir hafif zincir lokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; en az bir ve bazi durumlarda tüm fare VL gen segmentlerinin, bir insan VL gen segmenti veya ikiden fazla olmayan insan VL gen segmenti ile degistirilmesi bakimindan, Sekil 19rdaki referans yapisindan farklidir. Bazi durumlarda, bir farenin insan VL gen segmentleri, bir antikorun bir immünoglobulin VL alaninin kodlanmasi için iki veya daha fazla insan JL gen segmentlerinden birine yeniden düzenlenebilmektedir. Bazi durumlarda, burada açiklanan bir farenin bir hafif zincir lokusunun insan VL gen segmentleri, iki veya daha fazla (örnegin iki, üç, dört veya bes) insan JL gen segmentleri ile faal sekilde birlestirilebilmektedir. Ayrica, bir hafif zincir lokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; bir endojen VL gen segmentini kodlayan yeniden düzenlemeden önce bir nükleotit sekansi içermemesi bakimindan, Sekil 197daki referans yapidan farklidir. Ayrica, bir hafif zincir lokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; bir endojen JL gen segmentini kodlayan yeniden düzenlemeden önce bir nükleotit sekansi içermemesi bakimindan, Sekil 19'daki referans yapidan farklidir. Ayrica, bir hafif zincir lokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; bir endojen VL ve JL gen segmentlerini kodlayan yeniden düzenlemeden Önce bir n'ükleotit sekansi içermemesi bakimindan, Sekil 19*daki referans yapidan farklidir. Ayrica, bir hafif zincir lokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; bir endojen VL gen segmentini kodlayan yeniden düzenlemeden sonra bir nükleotit sekansi içermemesi bakimindan, Sekil 19*daki referans yapidan farklidir. Ayrica, bir hafif zincir lokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; bir endojen JL gen segmentini kodlayan yeniden düzenlemeden sonra bir n'ukleotit sekansi içermemesi bakimindan, Sekil 19'daki referans yapidan farklidir. Ayrica, bir hafif zincir lokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; bir endojen VL ve JL gen segmentlerini kodlayan yeniden düzenlemeden sonra bir nükleotit sekansi içermemesi bakimindan, Sekil 19*daki referans yapidan farklidir. Ayrica, bir hafif zincir Iokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; yeniden düzenlemeden önce ikiden fazla olmayan insan VL gen segmentlerini ve iki veya daha fazla (örnegin iki, 'üç, dört veya bes) insan JL gen segmentleri içermesi bakimindan, Sekil 19=daki referans yapisindan farklidir. Ayrica, bir hafif zincir lokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; yeniden düzenlemeden önce ikiden fazla olmayan insan VL gen segmentlerini ve bes insan JL gen segmentleri içermesi bakimindan, Sekil 19'daki referans yapisindan farklidir. Ayrica, bir hafif zincir lokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; yeniden düzenlemeden sonra ikiden fazla olmayan insan VL gen segmentlerini ve bes veya daha az (örnegin 5, 4, 3, 2, veya 1) insan .JL gen segmentleri içermesi bakimindan, Sekil 19=daki referans yapisindan farklidir. Ayrica, bir hafif zincir lokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; yeniden düzenlemeden sonra ikiden fazla olmayan insan VL gen segmentlerini ve bir, iki, üç, dört veya bes insan JL gen segmentleri içermesi bakimindan, Sekil 19'daki referans yapisindan farklidir. Ayrica, bir hafif zincir Iokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; yeniden düzenlemeden sonra bir insan VL gen segmentlerini ve bes veya daha az (örnegin 5, 4, 3, 2, veya 1) insan JL gen segmentleri içermesi bakimindan, Sekil 19'daki referans yapisindan farklidir. Ayrica, bir hafif zincir lokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; yeniden düzenlemeden sonra bir insan VL gen segmentlerini ve bir, iki, 'üç, dört veya bes insan JL gen segmentleri içermesi bakimindan, Sekil 19'daki referans yapisindan farklidir. Çesitli yapilandirmalardai insan VL ve JL gen segmentleri, insan VK ve JK gen segmentleridir. Insan VK segmentleri, bir insan VK1-39 gen segmenti ve bir insan VK3-20 gen segmentinden seçilmektedir. Insan JK gen segmentleri, insan JK1, JK2, JK3, JK4, ve JK5'tir. Ayrica, bir hafif zincir Iokusu içeren bir fareye atifta bulunulmakta olup, bunun yapisi; yeniden düzenlemeden önce Sekil 1, Sekil 2, Sekil 3 veya Sekil 9'daki yapinin büyük oranda aynisi olan bir yapi içermesi bakimindan, Sekil 19'daki referans yapisindan farklidir. Bazi yapilandirmalarda, bir hafif zincir lokusu içeren bir fare saglanmakta olup, bunun yapisi; yeniden düzenlemeden önce Sekil 1, Sekil 2, Sekil 3 veya Sekil 9'daki yapiya özdestir. Ayrica, burada açiklanan bir fare tarafindan meydana getirilen bir antijen baglama proteinine atifta bulunulmaktadir. Spesifik bir durumda, antijen baglama proteini, bir fare sabit bölgesi ile füzyonlanan bir insan immünoglobulin agir zincir degisken bölgesi ve bir VK1-39 gen segmenti veya bir VK3-20 gen segmentinden elde edilen bir insan immünoglobulin hafif zincir degisklen bölgesi içermektedir, burada hafif zincir sabit bölgesi bir fare sabit bölgesidir. Ayrica, burada açiklanan bir fareden bir immünoglobulin degisken bölgesi geni sekansindan meydana getirilen bir tam insan antijen baglama proteinine atifta bulunulmaktadir, burada antijen baglama proteini, burada açiklanan bir farenin bir sekansindan elde edilen bir insan degisken bölgesi içeren bir tam insan agir zinciri ve bir VK1-39 veya bir VK3-20 içeren bir tam insan hafif zincir içermektedir. Bir durumda, hafif zincir degisken bölgesi, bir ila bes somatik mutasyon içermektedir. Bir durumda, hafif zincir degisken bölgesi, agir zincir degisken bölgesi ile farenin bir B hücresinde eslestirilen bir kognat hafif zincir degisken bölgesidir. Bir durumda, tam insan antijen baglama proteini, bir birinci agir zincir ve bir ikinci agir zincir içermektedir, burada birinci agir zincir ve ikinci agir zincir, burada açiklanan bir fareden bagimsiz sekilde elde edilen, özdes olmayan degisken bölgeler içermektedir ve burada birinci ve ikinci agir zincirlerden her biri, bir VK1-39 gen segmentinden veya bir VK3-20 gen segmentinden elde edilen bir insan hafif zincir ile iliskilendirilen bir konak hücreden ekspresyon saglamaktadir. Bir durumda, birinci agir zincir, bir birinci antijenin bir birinci epitopunu spesifik olarak baglayan bir birinci agir zincir degisken bölgesi içermektedir ve ikinci agir zincir ise bir ikinci antijenin bir ikinci epitopunu spesifik olarak baglayan bir ikinci agir zincir degisken bölgesi içermektedir. Spesifik bir durumda, birinci antijen ve ikinci antijen farklidir. Spesifik bir yapilandirmada, birinci antijen ve ikinci antijen aynidir ve birinci epitop ve ikinci epitop ise özdes degildir; spesifik bir yapiladnirmada, baglama proteininin bir birinci molekülü tarafindan birinci epitopun baglanmasi, baglama proteininin bir ikinci molekül'u tarafindan ikinci epitopun baglanamsini engellememektedir. Ayrica, bir birinci immünoglobulin agir zincir ve bir ikinci immünoglobulin agir zincir içeren, burada açiklanan bir farenin bir insan imm'unoglobulin sekansindan elde edilen, tam insan baglama proteinine atifta bulunulmaktadir, burada birinci immünoglobulin agir zinciri, ikinci immünoglobulin agir zincirinin bir degisken bölgesine özdes olmayan bir birinci degisken bölge içermektedir ve burada birinci immünoglobulin agir zincir, bir yaban tipi protein A baglama determinanti içermektedir ikinci agir zincirde bir yaban tipi protein A baglama determinanti bulunmamaktadir. Bir yapilandirmada, birinci immünoglobulin agir zinciri, izolasyon kosullari altinda protein A'yi baglamaktadir ve ikinci immünoglobulin agir zinciri, protein A'yi baglamamaktadir ve protein A,yi, izolasyon kosullari altinda birinci imm'unoglobulin agir zincirinin protein Aryi baglamasindan en az 10 kat, yüz kat veya bin kat daha zayif baglamaktadir. Spesifik bir durumda, birinci ve ikinci agir zincirler IgG1 izotipleridir, burada ikinci agir zincir, 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), ve bunlarin bir kombinasyonun seçilen bir modifikasyon içermektedir ve burada birinci agir zincirde bu tür bir modifikasyon bulunmamaktadir. Bir yönde, bispesifik bir antijen-baglama proteininin meydana getirilmesine yönelik bir yöntem saglanmakta olup, burada açiklanan bir birinci farenin bir birinci epitop içeren ilgili bir birinci antijene maruz birakilmasini, burada açiklanan bir ikinci farenin bir ikinci epitop içeren ilgili bir ikinci antijene maruz birakilmasini, birinci ve ikinci farelerden her birini ilgili antijenlere yönelik her bir immün yanit gelistirmesine izin verilmesini, birinci farede, ilgili birinci antijenin birinci epitopunu baglayan bir birinci insan agir zincir degisken bölgesinin belirlenmesini, ikinci farede, ilgili ikinci antijenin ikinci epitopunu baglayan bir ikinci insan agir zincir degisken bölgesinin belirlenmesini, ilgili birinci antijenin birinci epitogunu baglayan bir birinci agir zinciri kodlayan bir birinci tam insan agir zincir geninin meydana getirilmesini, ilgili ikinci entijenin ikinci epitopunu baglayan bir ikinci agir zinciri kodlayan bir ikinci tam insan agir zincir geninin meydana getirilmesini, bir bispesifik antijen baglama proteininin meydana getirilmesi için bir insan VK1-39 veya bir insan VK3-20 gen segmentinden elde edilen bir tek tam insan hafif zinciri eksprese eden bir hücrede birinci agir zincir ve ikinci agir zincirin eksprese edilmesi ve bispesifik antijen baglama proteininin izole edilmesini içermektedir. Bir yapilandirmada birinci antijen ve ikinci antijen özdes degildir. Bir yapilandirmada birinci antijen ve ikinci antijen özdestir ve birinci epitop ve ikinci epitop ise özdes degildir. Bir yapilandirmada, birinci agir zincir degisken bölgesinin, birinci epitopa baglanmasi, ikinci agir zincir degisken bölgesinin ikinci epitopa baglanmasini engellememektedir. Bir yapilandirmada, birinci agir zincir ile eslestiginde insan hafif zinciri, birinci antijenin birinci epitopunu spesifik olarak baglamaktadir ve ikinci agir zincir ile eslestiginde ise ikinci antijenin ikinci epitopunu spesifik olarak baglamaktadir. Bir yapilandirmada, birinci antijen, çözüneiblir bir antijen ve bir hücre yüzeyi antijeni (örnegin bir tümör antijeni) arasindan seçilmektedir ve ikinci antijen bir hücre yüzeyi reseptörü içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, hücre yüzeyi reseptörü bir immünoglobulin reseptörüdür. Spesifik bir yapilandirmada, immünoglobulin reseptörü bir Fc reseptörüdür. Bir yapilandirmada, birinci antijen ve ikinci antijen ayni hücre yüzeyi reseptörüdür ve birinci agir zincirin birinci epitopa baglanmasi, ikinci agir zincirin ikinci epitopa baglanmasini engellememektedir. Bir yapilandirmadai hafif zincirinin hafif zincir degisken alani 2 ila 5 somatik mutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, hafif zincir degisken alani, birinci veya ikinci hafif zincir degislen alani ile bagisiklik kazandirilmis birinci veya ikinci farenin bir B hücresi üzerinde eksprese edilen, somatik olarak mutasyonlu bir kognat hafif zincirdir. Bir yapilandirmada, hücrenin hafif zinciri bir germ hatti sekansi içermektedir. Bir yapilandirmada, birinci tam insan agir zincir, afinitesini protein A'ya indirgeyen bir amino asit modifikasyonu tasimaktadir ve ikicni tam insan agir zincir, afinitesini protein A'ya indirgeyen bir modifikasyon tasimamaktadir. Bir yönde, bir birinci ve bir ikinci antijene spesifik olarak baglanan bir bispesifik antikorun hazirlanmasina yönelik bir yöntem saglanmaktadir, burada yöntem (a) birinci antijene özgü olan bir birinci insan agir zincir degisken (VH) alanini kodlayan bir birinci nükleik asit sekansinin belirlenmesini; (b) ikinci antijene özgü olan bir ikinci insan agir zincir degisken (VH) alanini kodlayan bir ikinci nükleik asit sekansinin belirlenmesini; (c) (a)'nin VH bölgesi ile eslestiginde birinci antijeni spesifik olarak baglayan ve (b),nin VH bölgesi Ile eslestiginde ikinci antijene spesifik olarak baglanan bir insan hafif zincir degiken (Vi.) bölgesini kodlayan bir üçüncü nükleik asit sekansinin sagsanmasini; (d) bispesifik antikorun meydana getirilmesi için birinci ve ikinci insan VH bölgeleri ve insan VL bölgesinin ekspresyonunun saglanmasi için birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asit sekanslarini içeren bir konak hücrenin kültürlenmesini; ve (d) söz konusu bispesifik antikorun geri kazanilmasini içermektedir. Çesitli yönlerde, birinci ve ikinci antijenler birbirinden farklidir. Çesitli yönlerde, birinci ve ikinci nükleik asit sekanslari, yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin hafif zincir sekansindan bir insan immünoglobulin VL bölgesini eksprese eden, bagisiklik kazandirilmis bir fareden izole edilmektedir, burada yeniden düzenlenmis immünoglobulin sekansi, farenin germ hattindadir. Bir yapilandirmada, insan VL bölgesi, bir insan VK1-39 gen segmenti veya bir insan VK3- gen segmenti içeren, yeniden düzenlenmis bir insan hafif zincir sekansindan elde edilmektedir. Spesifik bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis insan hafif zincir sekansi, bir germ hatti sekasinda bulunmaktadir (yani V gen segmenti sekansi içerisinde bir somatik hipermutasyon içermemektedir). Bir yapilandirmada, üçüncü nükleik asit sekansi, farenin germ hattinda yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin hafif zincir sekansindan bir insan immünoglobulin VL bölgesini eksprese eden bir fareden izole edilmektedir. Bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir sekansi, bir insan VK1-39 veya insan VK3-20 gen segmentini içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir sekansi, bir insan VK1-39 gen segmentini içermektedir. Bir yapilandirmada, insan immünoglobulin VL bölgesi, modifiye edilmis bir endojen immünoglobulin hafif zincir Iokusundan eksprese edilmektedir. Bir yapilandirmada, birinci ve ikinci antijenler bir molekül üzerinde mevcuttur. Bir yapilandirmada, birinci ve ikinci antijenler farkli moleküller üzerinde mevcuttur. Çesitli yapilandirmalarda, birinci veya ikinci nükleik asit sekansi, kodlanmis agir zincirin afinitesini protein A'ya indirgeyen bir modifikasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, birinci ve ikinci nükleik asit sekanslari, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18. insan agir zincir gen segmentini içeren, yeniden düzenlenmis bir insan agir zincir degisken bölgesi sekansini içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, agir zincir gen segmenti, VH2-5, VH3-23 veya VH3-30JdUI'. Bir yönde, bir birinci ve bir ikinci antijene spesifik olarak baglanan bir bispesifik antikorun hazirlanmasina yönelik bir yöntem saglanmaktadir, burada yöntem (a) birinci antijene özgü olan bir birinci insan agir zincir degisken (VH) alanini kodlayan bir birinci nükleik asit sekansinin belirlenmesini; (b) ikinci antijene özgü olan bir ikinci insan agir zincir degisken (VH) alanini kodlayan bir ikinci nükleik asit sekansinin belirlenmesini; (c) (a)'nin VH bölgesi ile eslestiginde birinci antijeni spesifik olarak baglayan ve (b)'nin VH bölgesi ile eslestiginde ikinci antijene spesifik olarak baglanan bir insan VK1-39 veya insan VK3-20 gen segmentinden edle edilen bir insan hafif zincir degiken (VL) bölgesini kodlayan bir üçüncü nükleik asit sekansinin sagsanmasini; (d) bispesifik antikorun meydana getirilmesi için birinci ve ikinci insan VH bölgeleri ve insan VL bölgesinin ekspresyonunun saglanmasi için birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asit sekanslarini içeren bir konak hücrenin kültürlenmesini; ve (d) söz konusu bispesifik antikorun geri kazanilmasini içermektedir. Çesitli yönlerde, birinci ve ikinci antijenler birbirinden farklidir. Çesitli yönlerde, birinci ve ikinci nükleik asit sekanslari, bir insan VK1-39 veya insan VK3-20 gen segmentinden elde edilen, yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin hafif zincir sekansindan bir insan immünoglobulin VL bölgesini eksprese eden, bagisiklik kazandirilmis bir fareden izole edilmektedir, burada yeniden düzenlenmis inasn VK1-39 veya VK3-30 gen segmenti, farenin germ hattindadir. Biryapilandirmada, üçüncü nükleik asit sekansi bir germ hatti sekansidir (yani V gen segmenti sekansi içerisinde bir somatik hipermutasyon içermemektedir). Bir yapilandirmada, üçüncü nükleik asit sekansi, farenin germ hattinda yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin hafif zincir sekansindan bir insan VK1-39 veya VK3-20 gen segmentinden elde edilen bir insan immünoglobulin VL bölgesini eksprese eden bir fareden izole edilmektedir. Spesifik bir yapilandirmada, üçüncü nükleik asit sekansi, bir tamamlayicilik belirleme bölgesinde (CDR) ve/veya bir çerçeve bölgesinde (FWR) iki ila bes somatik hipermutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, insan immünoglobulin VL bölgesi, modifiye edilmis bir endojen immünoglobulin hafif zincir lokusundan eksprese edilmektedir. Bir yapilandirmada, birinci ve ikinci antijenler bir molekül üzerinde mevcuttur. Bir yapilandirmada, birinci ve ikinci antijenler farkli moleküller üzerinde mevcuttur. Bir yapilandirmada, birinci veya ikinci nükleik asit sekansi, kodlanmis agir zincirin afinitesini protein Aiya indirgeyen bir modifikasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, birinci ve ikinci nükleik asit sekanslari, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, insan agir zincir gen segmentini içeren, yeniden düzenlenmis bir insan agir zincir degisken bölgesi sekansini içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, agir zincir gen segmenti, VH2-5, VH3-23 veya VH3-30*dur. Bir yönde, bispesifik bir antikorun meydana getirilmesine yönelik bir yöntem saglanmakta olup, birinci farenin ilgili antijenlere yönelik her bir immün yanit gelistirmesine izin verilmesini, birinci farede, ilgili birinci antijenin birinci epitopunu baglayan bir birinci insan agir zincir degisken bölgesinin belirlenmesini, ikinci farede, ilgili ikinci antijenin ikinci epitopunu baglayan bir ikinci insan agir zincir degisken bölgesinin belirlenmesini, ilgili birinci antijenin birinci epitopunu baglayan bir birinci agir zinciri kodlayan bir birinci tam insan agir zincir geninin meydana getirilmesini, ilgili ikinci antijenin ikinci epitopunu baglayan bir ikinci agir zinciri kodlayan bir ikinci tam insan agir zincir geninin meydana getirilmesini, bir bispesifik antikorun meydana getirilmesi için bir insan VK1-39 veya bir insan VK3-20 gen segmentinden elde edilen bir tek tam insan hafif zinciri eksprese eden bir hücrede birinci agir zincir ve ikinci agir zincirin eksprese edilmesi ve bispesifik antijen baglama proteininin izole edilmesini içermektedir. Bir yapilandirmada birinci epitop ve ikinci epitop ise özdes degildir. Bir yapilandirmada, birinci agir zincir degisken bölgesinin, birinci epitopa baglanmasi, ikinci agir zincir degisken bölgesinin ikinci epitopa baglanmasini engellememektedir. Bir yapilandirmada, birin ve ikinci agir zincirler, es zamanli olarak birinci ve ikinci epitoplari baglayabilmektedir. Bir yapilandirmada,bispesifik antikor, es zamanli olarak birinci ve ikinci epitoplari baglayabilmektedir. Bir yapilandirmada, bispesifik antikor, bagimsiz olarak birinci ve ikinci epitoplari baglayabilmektedir. Bir yapilandirmada, antijene karsi bispesifik antikorun baglama yaniti, antijene karsi birinci agir zincir degisken bölgesinin baglama yanitindan yaklasik 2 kat daha yüksektir. Bir yapilandirmada, antijene karsi bispesifik antikorun baglama yaniti, antijene karsi ikinci agir zincir degisken bölgesinin baglama yanitindan yaklasik 2 kat daha yüksektir. Bir yapilandirmada, antijene karsi bispesifik antikorun baglama yaniti, antijene karsi birinci agir zincir degisken bölgesi ve ikinci agir zincir degisken bölgesinin baglama yaniti ile ayniridr veya buna neredeyse esittir. Bir yapilandirmada, antijen, çözünebilir bir antijen, bir hücre yüzeyi antijeni (örnegin bir tümör antijeni) ve bir hücre yüzeyi reseptöründen seçilmektedir. Spesifik bir yapilandirmada, hücre yüzeyi reseptörü bir immünoglobulin reseptörüdür. Spesifik bir yapilandirmada, immünoglobulin reseptörü bir PC reseptörüdür. Bir yapilandirmadai hafif zincirinin hafif zincir degisken alani 2 ila 5 somatik mutasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, hafif zincir degisken alani, birinci veya ikinci hafif zincir degislen alani ile bagisiklik kazandirilmis farenin bir B hücresi üzerinde eksprese edilen, somatik olarak mutasyonlu bir kognat hafif zincirdir. Bir yapilandirmada, birinci tam insan agir zincir, afinitesini protein A'ya indirgeyen bir amino asit modifikasyonu tasimaktadir ve ikicni tam insan agir zincir, afinitesini protein A7ya indirgeyen bir modifikasyon tasimamaktadir. Çesitli yapilandirmalarda, bispesifik anitkorlarin meydana getirilmesine yönelik yöntemler, bispesifik antikorlarin her bir agir zincir degisken bölgesi ile eslesmesi için ortak bir hafif zincirin kullanilmasiyla gelistirilebilmektedir. çesitli yapilandirmalarda, burada açiklanan bir ortak hafif zincirin kullanilmasi, orijinal kognat hafif zincirlerinin kullanilmasina kiyasla, bispesifitesi eksik olan immünoglobulinlerin uygun olmayan türlerinin sayisini azaltmaktadir. Çesitli yapilandirmalarda, bispesifik antikorlarin agir zincir degisken bölgeleri, bir ortak hafif zincir içeren monospesifik antikorlardan saptanmaktadir. Çesitli yapilandirmalarda, bispesifik anitkorlarin agir zincir degisken bölgeleri, sinirli bir insan hafif zincir repertuvarini eksprese etmesi için önceden genetigi degistirilen fare B hücreleri içerisinde in vivo sekilde yeniden düzenlenen insan agir zincir degisken gen segmentlerini veya insan agir zincirler ile kognat olan bir tek insan hafif zinciri içermektedir ve ilgili bir antijen ile maruziyete yanit olarak, bir veya iki olasi insan hafif zincir degisken bölgelerinden biri ile kognat olan birden çok insan agir zincir degisken bölgesini içeren bir kimerik antikor repertuvarini meydana getirmektedir, burada kimerik antikorlar ilgili antijene özgütir. Çesitli yönlerde, bir bispesifik antikorun hazirlanmasina yönelik bir yöntem saglanmakta olup, bispesifik antikor 1) bir birinci polipeptit ve bir ikinci polipeptit içermektedir, burada birinci ve ikinci polipeptitlerden her biri, birinci ve ikinci polipeptitlerin bir dimer olusturmasini mümkün kilan bir multimerizasyon alani (örnegin bir immünoglobulin Fc alani) içermektedir ve multimerizasyon alanlari birinci ve ikinci polipeptitler arasinda stabil bir interaksiyonu saglamaktadir ve burada multimerizasyon alanlarindan biri, afinitesini protein A'ya indirgeyen bir amino asit modifikasyonu tasimaktadir ve diger multimerizasyon alani ise modifikasyonsuzdur, 2) birinci ve ikinci polipeptitlerden her birinde bir baglama alani içermektedir, her bir baglama alani bir degisken agir zincir ve bir degisken hafif zincir içermektedir, bruada birinci polipeptitin degisken hafif zinciri ve ikinci polipeptitin degisken hafif zinciri, ortak bir amino asit sekansina sahiptir, bu ortak sekans, her bir polipeptitin bir orijinal hafif zinciri ile en az %80, en az %85, tercihen en az %90, daha tercihen en az %95 ve en çok tercih edilecek sekilde %100 sekans özdegiligi degerindeki bir amino asit sekans özdesligine sahiptir. Çesitli yapilandirmalarda, degisken hafif zincir, bir insan VK1-39 veya bir insan VK3-20 gen segmentinden elde edilmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, degisken hafif zincir, yeniden düzenlenmis bir hafif zincir sekansidir. Çesitli yapilandirmalarda, degisken hafif zincir, burada açiklanan bir fareden izole edilmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, yöntem (i) birinci polipeptiti, ikinci polipeptiti ve ortak hafif zinciri kodlayan bir nükleik asit içeren bir konak hücrenin kültürlenmesi, burada nükleik asitin eksprese edilmesi; ve (ii) bispesifik antikorun konak hücre kültüründen geri kazanilmasi adimlarini içermektedir, bir yapilandirmada, birinci polipeptiti kodlayan nükleik asit veya ikinci polipeptiti kodlayan nükleik asit, afinitesini protein Arya indirgeyen bir amino asit modifikasyonu tasimaktadir. Bir yapilandirmadai birinci polipeptit, ikinci polipeptiti ve ortak hafif zinciri kodlayan nükleik asit, tek bir vektör içerisinde veya ayri vektörler içerisinde mevcuttur. Bir yapilandirmada, konak hücre, önceki paragrafa göre bir bispesifik antikorun meydana getirilmesi için kullanilmaktadir. Bir yönde, bir bispesifik anitkorun hazirlanmasina yönelik bir yöntem saglanmakta olup, (a) burada açiklanan bir fareden izole edilen bir birinci insan agir zincir degisken bölgesini kodlayan bir birinci nükleik asitin seçilmesini; (b) burada açiklanan fareden veya ayri bir fareden izole edilen bir ikinci agir zincir degisken bölgesini kodlayan bir ikinci nükleik asitin seçilmesi; (c) burada açiklanan bir fareden izole edilen veya burada açiklanan, yeniden düzenlenmis bir insan hafif zincir degisken bölgesinden elde edilen bir insan hafif zincir degisken bölgesini kodlayan bir üçüncü nükleik asitin saglanmasi; (o) bir konak hücre içerisine, birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asitlerin verilmesi ve konak hücrenin kültürlenmesi, böylelikle birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asitin ekspresyonunun meydana gelmesi; ve (d) hücre kültüründen olusturulan bispesifik anitkorun giderilmesini içermektedir. Bir yapilandirmada, birinci ve ikinci insna agir zincir degisken bölgeleri somatik olarak mutasyonludur. Spesifik bir yapilandirmada, birinci ve ikinci insan agir zincir degisken düzenlenmis bir insan VH gen segmentinden, bagimsiz sekilde, elde edilmektedir. Bir yapilandirmada, birinci ve ikinci insan agir zincir degisken bölgeleri, 2-5, 3-30 ve 3- 23*ten seçilen, yeniden düzenlenmis bir insan VH gen segmentinden, bagimsiz sekilde, elde edilmektedir. Bir yapilandirmada, birinci insan agir zincir degisken bölgesi, bir insan VH2-5 gen segmentinden elde edilmektedir ve ikinci insan agir zincir degisken bölgesi bir insan VH3-30 gen segmentinden elde edilmektedir. Bir yapilandirmada, birinci insan agir zincir degisken bölgesi, bir insan VH3-30 gen segmentinden elde edilmektedir ve ikinci insan agir zincir degisken bölgesi bir insan VH3-23 gen segmentinden elde edilmektedir. Bir yapilandirmada, birinci insan agir zincir degisken bölgesi, bir insan VH3-23 gen segmentinden elde edilmektedir ve ikinci insan agir zincir degisken bölgesi bir insan VH3-30 gen segmentinden elde edilmektedir. Bir yapiladnirmada, birinci veya ikinci nükleik asit, (c) adiminda önce modifiye edilmektedir, burada biirnci veya ikinci nükleik asit, protein A'ya indirgenmis bir afiniteye sahip olacagi sekilde modifiye edilmektedir. Bir yapilandirmada, üçüncü nükleik asit, burada açiklanan bir fareden izole edilmektedir. Bir yapilandirmada üçüncü nükleik asit 2 ila 5 somatik mutasyon içermektedir. Bir yapiladnirmada, üçüncü nükleik asit, bir insan VK1-39 gen segmentinden elde edilen bir insan hafif zincir degisken bölgeyi kodlamaktadir. Bir yapiladnirmada, üçüncü nükleik asit, bir insan VK3-20 gen segmentinden elde edilen bir insan hafif zincir degisken bölgeyi kodlamaktadir. Bir yapiladnirmada, üçüncü nükleik asit, yeniden düzenlenmis bir hafif zincir degisken bölgeden elde edilmektedir. Bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis insan hafif zincir degisken bölgesi, bir insan VK1-39 gen segmentinden veya bir insan VK3-20 gen segmentinden elde edilen bir sekans içermektedir. Bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis insan hafif zincir degisken bölgesi, bir germ hatti insan VK1-39 sekansi içermektedir (yani V gen segmenti sekansi içerisinde bir somatik hipermutasyon içermemektedir). Bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis insan hafif zincir degisken bölgesi, bir germ hatti insan VK3-20 sekansi içermektedir. Çesitli yapilandirmalarda, germ hattinda yeniden düzenlenmis bir insan hafif zincir sekansi olmayan bir modifiye fareden elde edilen bir degisken alan içeren bir birinci insan agir zinciri bünyesine dahil eden bir bispesifik anitkorun hazirlanmasina yönelik bir yöntem saglanmaktadir, burada birinci insan agir zinciri, bir insan VK1-39 veya bir insan VK3-20 gens egmentinden elde edilen, yeniden düzenlenmis bir insan hafif zincir degisken bölgesini içeren bir kognat insan hafif zincir ile eslesmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, birinci insan agir zincirden farkli bir spesifiteye sahip bir ikinci insan agir zinciri, burada açiklanan, bagisiklik kazandirilmis bir fareden belirlenmektedir. Iki hafif zinciri ve ortak hafif zinciri kodlayan nükleik asitler, önceki paragraflarda açiklandigi üzere bir konak hücreye verilmektedir, böylelikle üç zincirin tamaminin ekspresyonu meydana gelmektedir ve bispesifik antikor hücre kültüründen geri kazanilmaktadir. Bir yapilandirmada, fareye, birinci insan agir zincir degisken alaninin meydana getirilmesinde kullanilan antijen ile bagisiklik kazandirilmaktadir. Bir yapilandirmada, fareye, birinci insan agir zincir degisken alaninin meydana getirilmesinde kullanilan farkli bir antijen ile bagisiklik kazandirilmaktadir. Bir yönde, bir bispesifik antikorun meydana getirilmesi için bir tek insan hafif zinciri ile eslesebilen insan agir zincirlerinin seçilmesine yönelik yöntem burada saglanmakta olup, bispesifik antikoru kodlayan nükleik asitleri ve nükleik asitleri içeren bir konak hücreyi içermektedir. Bir yönde, monospesifik antikorlar gibi istenmeyen ürünler üzerinde bir hücre kültürü içerisinde, istenen bir bispesifik antikorun miktarinin artirilmasina yönelik bir yöntem saglanmaktadir, burada bispesifik antikorun agir zincirlerinden biri, afinitesinin protein A7ya indirgenmesi için modifiye edilmektedir. Ayrica, bir izole konak hücreye atifta bulunulmaktadir, burada konak hücre (a) bir birinci antijeni baglayan bir birinci insan agir zincir degisken bölgesini kodlayan bir birinci nükleik asit sekansi, bruada birinci nükleik asit sekansi, farenin germ hattinda, yeniden düzenlenmis bir hafif zincir sekansindan bir insan immünoglobulin VL bölgesini eksprese eden birinci antijen ile bagisiklik kazandirilan bir fareden izole edilmektedir; (b) bir ikicni antijeni baglayan bir ikinci insan agir zincir degisken bölgesini, kodlayan bir ikinci nükleik asit sekansi, burada ikinci nükleik asit sekansi, farenin germ hattinda, yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin hafif zincir sekansindan bir insan immünoglobulin VL bölgesini eksprese eden ikinci antijen ile bagisiklik kazandirilan bir fareden izole edilmektedir; (0) (a),nin agir zincir degisken bölgesi ile eslestiginde birinci antijeni spesifik olarak baglayan ve (b)*nin agir zincir degisken bölgesi ile eslestiginde ikinci antijene spesifik olarak baglanan bir insan hafif zincir degisken bölgesini kodlayan bir üçüncü nükleik asit sekansi. Çesitli yönlerde, birinci ve ikinci antijenler birbirinden farklidir. Çesitli yönlerde, birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asit sekanslarinin ekspresyonu, birinci ve ikinci antijenlere spesifik olarak baglanan bir bispesifik antikorun olusumuna yol açmaktadir. Bir yapilandirmada, insan VL bölgesi, bir insan VK1-39 gen segmenti veya bir insan VK3- gen segmenti içeren, yeniden düzenlenmis bir insan hafif zincir sekansindan elde edilmektedir. Spesifik bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis insan hafif zincir sekansi, bir germ hatti sekasidir (yani degisken alan içerisinde bir somatik hipermutasyon içermemektedir). Bir yapilandirmada, üçüncü nükleik asit sekansi, yeniden düzenlenmis bir hafif zincir sekansindan bir insan immünoglobulin VL bölgesini eksprese eden bir fareden izole edilmektedir, burada yeniden düzenlenmis insan hafif zincir sekansi, farenin germ hattinda mevcuttur. Bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir sekansi, bir insan VK1-39 gen segmenti veya bir insan VK3-2O gen segmentini içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, insan VK1- 39 gen segmenti veya insan VK3-2O gen segmenti, bir tamamlayicilik belirleme bölgesinde (CDR) veya bir çerçeve bölgesinde (FWR) en az bir somatik hipermutasyon içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, birinci, ikinci ve üçüncü nükleik asit sekansi, yeniden düzenlenmis bir immünoglobulin hafif zincir sekansindan bir insan VK1-39 veya VK3-20 gen segmentinden elde edilen bir insan immünoglobulin VL bölgesini eksprese eden bir fareden izole edilmektedir, burada yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir sekansi, farenin germ hattinda mevcuttur. Çesitli yapilandirmalarda, fare, bir immünoglobulin hafif zincirinin meydana getirilmesi için yeniden düzenlenebilen bir endojen hafif zincir degisken bölgesi gen segmentini içermemektedir. Bir yapilandirmada, insan immünoglobulin VL bölgesi, modifiye edilmis bir endojen immünoglobulin hafif zincir Iokusundan eksprese edilmektedir. Bir yapilandirmada, birinci ve ikinci antijenler bir molekül üzerinde mevcuttur. Bir yapilandirmada, birinci ve ikinci antijenler farkli moleküller üzerinde mevcuttur. Bir yapilandirmada, birinci veya ikinci nükleik asit sekansi, kodlanmis agir zincirin afinitesini protein A'ya indirgeyen bir modifikasyon içermektedir. Bir yapilandirmada, birinci veya ikinci nükleik asit sekanslari, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1- bir insan agir zincir gen segmentini içeren, yeniden düzenlenmis bir insan agir zincir degisken bölgesi sekansini içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, agir zincir gen segmenti, VH2-5, VH3-23 veya VH3-30'dur. Ayrica, bulusa göre meydana getirilen bir insan agir zincir degisken alani içeren bir antikor veya bir bispesifik antikora atifta bulunulmaktadir. Bir baska yönde bir tam insan antikorunun veya bir tam insan bispesifik antikorunun meydana getirilmesi için burada açiklanan bir farenin kullanimi saglanmaktadir. Bir yönde, burada açiklanan, genetigi degistirilmis bir fare, embriyo veya hücre, endojen düzenleyici veya kontrol elemanlarini, örnegin bir fare K intronik artirici, bir fare K 3' artirici veya hem bir intronik artirici hem de bir 3, artiriciyi tutan bir K hafif zincir Iokusu içermektedir, burada düzenleyici veya kontrol elemanalri, K hafif zincir lokusunun eksprese edilen bir sekansinin somatik mutasyonunu ve afinite matürasyonunu kolaylastimaktadir. Ayrica, birden daha fazla olmayan veya ikiden daha fazla olmayan, yeniden düzenlenmis veya yeniden düzenlenmemis immünoglobulin hafif zincir V ve J gen segmentlerindan elde edilen immünoglobulin hafif zincirlere sahip olmasiyla karakterize edilen bir B hücresi popülasyonu içeren bir fareye atifta bulunulmaktadir, burada fare, immünoglobulin hafif zincir V ve J gen segmentlerinin bir yaban tipi tamamlayicisini ieren bir fareninki ile neredeyse ayni olan bir K:A hafif zincir orani sergilemektedir. Bir durumda, immünoglobulin hafif zincirleri, birden fazla olmayan veya ikiden fazla olmayan, yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir V ve J gen segmentlerinden elde edilmektedir. Spesifik bir durumda, hafif zincirler, birden fazla olmayan yeniden düzenlenmis immünoglobulin hafif zincir V ve J gen segmentlerinden elde edilmektedir. Bir durumda, immünoglobulin hafif zincirleri, iki yeniden düzenlenmemis immünoglobulin VL gen segmentinden biri veya 1, 2, 3, 4 veya 5 immünoglobulin JL gen segmentinden birinden meydana getirilmektedir. Bir yapilandirmada, immünoglobulin hafif zincirleri, iki yeniden düzenlenmemis immünoglobulin VL gen segmentinden biri veya bir immünoglobulin .JL gen segmentinden meydana getirilmektedir. Ayrica, birden daha fazla olmayan veya ikiden daha fazla olmayan insan VK/JK sekanslarindan elde edilen bir immünoglobulin hafif zincirini eksprese eden, burada açiklanan bir fareye atifta bulunulmaktadir, burada fare, bir veya daha fazla insan agir zincir degisken bölgesi gen segmenti ile endojen fare agir zincir degisken bölgesi gen segmentlerinin tamami veya neredeyse tamaminin bir replasmanini icermektedir, ve fare (a) bir A hafif zincirine sahip bir immünoglobulini eksprese eden CD19+ B hücrelerinin, (b) bir K hafif zincirine sahip bir immünoglobulini eksprese eden CD'19+ B hücrelerine, yaklasik 1 ila yaklasik 20tlik bir oranini sergilemektedir. Bir durumda, fare, bir insan VK1-39JK5 sekansindan elde edilen bir tek K hafi zincirini eksprese etmektedir ve bir A hafif zincirine sahip bir immünoglobulini eksprese eden CD'IQ+ B hücrelerinin, bir K hafif zincirine sahip bir immünoglobulini eksprese eden CD19+ B hücrelerine orani yaklasik 1 ila yaklasik 20*dir; bir durumda, oran yaklasik 1 ila en az yaklasik 665dir; spesifik bir yapilandirmada oran yaklasik 1 ila 66'dir. Ayrica, bir insan VK3-20JK5 sekansindan elde edilen bir tek K hafi zincirini eksprese eden bir fareye atifta bulunulmaktadir ve bir A hafif zincirine sahip bir immünoglobulini eksprese eden CD19+ B hücrelerinin, bir K hafif zincirine sahip bir immünoglobulini eksprese eden CD19+ B hücrelerine orani yaklasik 1 ila yaklasik 20*dir; bir durumda, oran yaklasik 1 ila yaklasik 21tdir. Spesifik yapilandirmalarda, oran 1 ila 20 veya 1 ila 21idir. Ayrica, sekansinin, 1, 2, 3, 4, veya 5 insan JK gen segmentleri ile iki insan Vi< gen segmentinden birinin yeniden düzenlenmesiyle elde edilen sekansa 'özdes oldugu bir immünoglobulin hafif zinciri ekswprese eden bir fareye atifta bulunulmaktadir. Bazi yapilandirmalarda, saglanan fare, iki insan VK gen segmenti veya 5 insan JK gen segmentinin yeniden düzenlenmesinden meydana getirilen bir immünoglobulin hafif zinciri eksprese etmektedir, burada fare, endojen immünoglobulin VH gen segmentlerinin tamami veya neredeyse tamaminin, bir veya daha fazla insan immünoglobulin VH, bir veya daha fazla DH, ve bir veya daha fazla JH gen segmentleri ile bir replasmanini içermektedir ve fare, (a) bir A hafif zincirine sahip bir immünoglobulini eksprese eden kemik iligindeki B hücrelerinin, (b) bir K hafif zincirine sahip bir immünoglobulini eksprese eden kemik iligindeki B hücrelerine, yaklasik 1 la yaklasik 15ilik bir oranini sergilemektedir. Bazi yapilandirmalarda, yeniden düzenleme, bir insan VK1-39 gen segmenti içermektedir. Bazi yapilandirmalarda, yeniden düzenleme, bir insan VK3-20 gen segmenti içermektedir. Bazi yapilandirmalar, endojen immünoglobulin VH gen segmentlerinin replasmani, bir endojen immünoglobulin VH lokusundadir. Bazi yapilandirmalarda, iki insan VK gen segmenti, bir endojen immünoglobulin VK lokusundadir ve bazi yapilandirmalarda iki insan VK gen segmenti, fare immünoglobulin VK gen segmentlerinin tamaminin veya neredeyse tamaminin yerini almaktadir. Bazi yapilandirmalarda, iki insan VK gen segmenti, bir endojen immünoglobulin VK lokusundadir ve bazi yapilandirmalarda iki insan VK gen segmenti, fare immünoglobulin VK ve JK gen segmentlerinin tamaminin veya neredeyse tamaminin yerini almaktadir. Iki insan VK gen segmenti, 5 insan JK gen segmeni ile faal olarak birlestirilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, bir insan VK1-39 gen segmenti veya bir insan VK3-20 gen segmenti ve 5 insan JK gen segmentinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilen bir hafif zinciri eksprese etmektedir ve bir A hafif zincirine sahip bir immünoglobulini eksprese eden kemik iligindeki B hücrelerinin, bir K hafif zincirine sahip bir immünoglobulini eksprese eden kemik iligindeki B hücrelerine orani, Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, bir insan VK1-39 gen segmenti veya bir insan VK3-20 gen segmenti ve 5 insan JK gen segmentinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilen bir hafif zinciri eksprese etmektedir ve bir A hafif zincirine sahip bir immünoglobulini eksprese eden kemik iligindeki B hücrelerinin, bir K hafif zincirine sahip bir immünoglobulini ek3prese eden kemik iligindeki B hücrelerine orani, yaklasik 1 la yaklasik 7rdir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, bir insan VK1-39 gen segmenti veya bir insan VK3-20 gen segmenti ve 5 insan JK gen segmentinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilen bir hafif zinciri eksprese etmektedir ve yaklasik 2.5x104 ila B hücresi popülasyonuna sahiptir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2.88x104 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücre popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 6.42x104 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 9.16x104 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücre popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.19x105 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücresi popülasyonu içermektedir. Burada açiklanan genetigi degistirilmis farelerin kemik iligindeki örnek pro B hücreleri, CD19, CD43, c-kit ve/veya bunlarin bir kombinasyonunun (örnegin CD19*, CD43*, c-kit*) ekspresyonu ile karakterize edilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, bir insan VK1-39 gen segmenti veya bir insan VK3-20 gen segmenti ve 5 insan JK gen segmentinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilen bir hafif zinciri eksprese etmektedir ve yaklasik 1x106 ila kemik iliginde bir pro B hücresi popülasyonuna sahiptir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.25x106 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücre popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.46x106 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.64x106 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücre popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2.03x106 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücresi popülasyonu içermektedir. Burada açiklanan genetigi degistirilmis farelerin kemik iligindeki örnek pro B hücreleri, CD19, CD43i c-kit ve/veya bunlarin bir kombinasyonunun (örnegin CD19+, CD43', c-kit') ekspresyonu ile karakterize edilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, bir insan VK1-39 gen segmenti veya bir insan VK3-20 gen segmenti ve 5 insan JK gen segmentinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilen bir hafif zinciri eksprese etmektedir ve yaklasik 5x105 ila hücre araliginda, kemik iliginde bir pro B hücresi popülasyonuna sahiptir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 5.33x105 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücre popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 5.80x105 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 5.92x105 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücre popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 6.67x105 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücresi popülasyonu içermektedir. Burada açiklanan genetigi degistirilmis farelerin kemik iligindeki ornek pro B hücreleri lgM, 8220 ve/veya bunlarin bir kombinasyonunun (örnegin lgM*, BZ2OW) ekspresyonu ile karakterize edilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, bir insan VK1-39 gen segmenti veya bir insan VK3-20 gen segmenti ve 5 insan JK gen segmentinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilen bir hafif zinciri eksprese etmektedir ve yaklasik 3x104 ila hücresi popülasyonuna sahiptir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 3.11x104 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücre popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.09x105 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.16x105 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücre popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.44x105 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücresi popülasyonu içermektedir. Burada açiklanan genetigi degistirilmis farelerin kemik iligindeki ornek pro B hücreleri lgM, 8220 ve/veya bunlarin bir kombinasyonunun (örnegin lgM*, 8220'li) ekspresyonu ile karakterize edilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, bir insan VK1-39 gen segmenti veya bir insan VK3-20 gen segmenti ve 5 insan JK gen segmentinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilen bir hafif zinciri eksprese etmektedir ve yaklasik 1x106 ila araliginda, kemik iliginde bir pro B hücresi popülasyonuna sahiptir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.59x106 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücre popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.75x106 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2.13x106 hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücre popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2.55x10ö hücrelik kemik iligindeki bir pro B hücresi popülasyonu içermektedir. Burada açiklanan genetigi degistirilmis farelerin kemik iligindeki örnek pro B hücreleri CD19, CD2O ve/veya bunlarin bir kombinasyonunun (örnegin CD19*I) ekspresyonu ile karakterize edilmektedir. Ayrica, bir tek yeniden düzenlenmis K hafif zincirini eksprese eden, genetigi degistirilmis bir fareye atifta bulunulmaktadir, burada fare, bir islevsel A hafif zincir Iokusu içermektedir ve burada fare, yeniden düzenlenmis olan ayni tek K hafif zincirinden elde edilen bir K hafif zinciri eksprese eden IgK+ hücreleri içeren bir B hücresi popülasyonunu eksprese etmektedir. Bir durumda, faredeki ngtlgkt B hücrelerinin yüzdesi, bir yaban tipi faresindeki ile neredeyse aynidir. Spesifik bir durumda, faredeki IgK+IgA+ B hücreleirnin yüzdesi, yüzde yaklasik 2 ila yaklasik 6'dir. Spesifik bir durumda, yeniden düzenlenmis tek K hafif zincirinin bir VK1-39JK5 sekansindan elde edildigi bir faredeki yüzde yaklasik 2.6'dir. Spesifik bir durumda, yeniden düzenlenmis tek K hafif zincirinin bir VK3-20JK1 sekansindan elde edildigi bir faredeki IgK*Ig)\+ B hücrelerinin yüzdesi yaklasik 4 ila yaklasik 8tdir, bir spesifik yapilandirmada yüzde yaklasik 6*dir. Bazi yapilandirmalarda, yeniden düzenlenmis bir insan immünoglobulin VK/JK sekansi içeren bir immünoglobulin hafif zincirini eksprese eden, genetigi degistirilmis bir fare saglanmaktadir, burada fare, bir islevsel immünoglobulin A hafif zincir lokusu içermektedir ve burada fare, yaklasik 1 ile yaklasik 8 olan, lgA+ B hücrelerinin Ig)\+ B hücrelerine olan bir oranini içeren bir dalak B hücresi içermektedir; bazi yapilandirmalarda, oran yaklasik 1 ila yaklasik 5ttir. Yeniden düzenlenmis insan immünoglobulin VK/JK sekansi, iki insan immünoglobulin VK gen segmentinden biri ve 5 insan immünoglobulin JK gen segmentinden birinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, yeniden düzenlenmis insan immünoglobulin VK/JK sekansi,bir insan immünoglobulin VK1-39 gen segmenti ve JK1, JK2, JK3, JK4, JK5 ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilen bir insan immünoglobulin JK gen segmentinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, yeniden düzenlenmis insan immünoglobulin VK/JK sekansi,bir insan immünoglobulin VK3-20 gen segmenti ve JK1, JK2, JK3, JK4, JK5 ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilen bir insan immünoglobulin JK gen segmentinin yeniden düzenlenmesi vasitasiyla meydana getirilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2x106 ila yaklasik 7x106 dalak pro B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2.74x106 hücrelik bir CD19+ dalak pro B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 4.3Ox106 hücrelik bir CD19+ dalak pro B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 5.53x106 hücrelik bir CD19+ dalak pro B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 6.18x106 hücrelik bir CD19+ dalak pro B hücresi popülasyonu içermektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1x106 ila yaklasik 4x106 içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.30x106hücrelik bir CD19+, IgDhi, IgM'o dalak B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2.13x106 hücrelik bir CD19+, bulusun bir faresi, yaklasik 3.15x106 hücrelik bir CD19*, IgDhI, IgM'o dalak B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 3.93x106 hücrelik bir CD19*, lgDhi, lgM'° dalak B hücresi popülasyonu içermektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 9x105 ila yaklasik 2x10ö hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 9.52x105 hücrelik bir CD19+, lgD'O, Ith dalak B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.23x106 hücrelik bir CD19+, lgD'°, Ith dalak B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.40x106 hücrelik bir CD19+, bulusun bir faresi, yaklasik 1.42x106 hücrelik bir CD19+, lgD'°, Ith dalak B hücresi popülasyonu içermektedir. Bazi yapilandirmalarda, saglanan genetigi degistirilmis fare, yeniden düzenlenmemis iki insan immünoglobulin VK gen segmenti ve 5 yeniden düzenlenmemis insan JK gen segmenti içeren bir immünoglobulin K hafif zincir lokusu içermektedir, ve burada fare, immünoglobulin K hafif zincir V ve J gen segmentlerinin bir yaban tipi tamamlayicisini içeren bir fare ile neredeyse ayni olan geçici (örnegin T1, T2 ve T3) B hücresi popülasyonlari içeren bir periferal dalak B hücresi popülasyonu içermektedir. Burada açiklanan genetigi degistirilmis bir farenin dalagindaki 'Ornek geçici B hücresi kombinasyonunun ekspresyonu ile karakterize edilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2X106 ila yaklasik 7x106 T1 B hücresi popülasyonu (örnegin CD93+, B220+, IthI, CD23') içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2.16x106 hücrelik, dalakta bir T1 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 3.63x106 hücrelik dalakta, bir T1 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 3.91x106 hücrelik, dalakta bir T1 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 6.83x106 hücrelik, dalakta bir T1 B hücresi popülasyonu içermektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1X106 ila yaklasik 7x106 araliginda, dalakta bir T2 B hücresi popülasyonu (örnegin CD93*, 8220*, lthi, CD23*) içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.30x1066 hücrelik, dalakta bir T2 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2.46x106 hücrelik dalakta, bir T2 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 3.24x106 hücrelik, dalakta bir T2 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 6.52x106 hücrelik, dalakta bir T2 B hücresi popülasyonu içermektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1x106 ila yaklasik 4x106 CD93*, 82202 lgM'O, CD23+) içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.08x106 hücrelik, dalakta bir T3 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.35x106 hücrelik dalakta, bir T3 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 3.37x106 hücrelik, dalakta bir TS B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 3.63x106 hücrelik, dalakta bir T1 B hücresi popülasyonu içermektedir. Bazi yapilandirmalarda, saglanan genetigi degistirilmis fare, yeniden düzenlenmemis iki insan immünoglobulin VK gen segmenti ve 5 yeniden düzenlenmemis insan JK gen segmenti içeren bir immünoglobulin K hafif zincir Iokusu içermektedir, ve burada fare, immünoglobulin VK ve JK gen segmentlerinin bir yaban tipi tamamlayicisini içeren bir fare ile neredeyse ayni olan marjinal bölge içeren bir periferal dalak B hücresi popülasyonu ve marjinal bölge öncül B hücresi popülasyonlari içermektedir. Burada açiklanan genetigi degistirilmis bir farenin dalagindaki örnek marjinal bölge B hücresi kombinasyonunun ekspresyonu ile karakterize edilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1x106 ila yaklasik 13x106 hücre araliginda, dalakta bir marjinal bölge B hücresi popülasyonu (örnegin CD93', B220*, Ithi, CD21/35hi, CD23") içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.47x106 hücrelik, dalakta bir marjinal bölge B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.49x106 hücrelik dalakta, bir marjinal bölge B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2.26x106 hücrelik, dalakta bir marjinal bölge B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2.33x106 hücrelik, dalakta bir marjinal bölge B hücresi popülasyonu içermektedir. Ayrica, genetigi degistirilmis bir fareye atifta bulunulmaktadir, burada fare, yeniden düzenlenmemis iki insan immünoglobulin VK gen segmenti ve 5 yeniden düzenlenmemis insan JK gen segmenti içeren bir immünoglobulin K hafif zincir lokusu içermektedir, ve burada fare, immünoglobulin VK ve JK gen segmentlerinin bir yaban tipi tamamlayicisini içeren bir fare ile neredeyse ayni olan foliküler (örnegin FO-I ve FO-ll) B hücresi popülasyonlari içeren bir periferal dalak B hücresi popülasyonu içermektedir. Burada açiklanan genetigi degistirilmis bir farenin dalagindaki örnek foliküler B hücresi popülasyonlari (örnegin FO-I ve FO-ll), IgM, lgD, CD21/35, CD93, B220 ve/veya bunlarin bir kombinasyonunun ekspresyonu ile karakterize edilmektedir. (örnegin CD93', içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 3.57x106 hücrelik, dalakta bir foliküler tip 1 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 6.31x106 hücrelik dalakta, bir foliküler tip 1 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 9.42x106 hücrelik, dalakta bir foliküler tip 1 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1,14x107 hücrelik, dalakta bir foliküler tip 1 B hücresi popülasyonu içermektedir. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1x106 ila yaklasik 2x106 2.0x106 hücre araliginda, dalakta bir foliküler tip 2 B hücresi popülasyonu (örnegin CD93-, içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.14x106 hücrelik, dalakta bir foliküler tip 2 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.45x106 hücrelik dalakta, bir foliküler tip 2 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 1.8Ox"IO6 hücrelik, dalakta bir foliküler tip 2 B hücresi popülasyonu içermektedir; bazi yapilandirmalarda mevcut bulusun bir faresi, yaklasik 2.06x106 hücrelik, dalakta bir foliküler tip 2 B hücresi popülasyonu içermektedir. Ayrica, bir insan VK ve JK gen segmentinden elde edilen bir tek yeniden düzenlenmis K hafif zincirini eksprese eden, genetigi degistirilmis bir fare saglanmaktadir, burada fare, tek yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekasnindan elde edilen bir tek K hafif zinciri içeren bir B hücresi popülasyonunu eksprese etmektedir burada genetigi degistirilmis fare, somatik hipermutasyonlara dirençli hale getirilmemistir. Bir yapilandirmada, farenin bir B hücresi üzerinde eksprese edilen K hafif zincirlerin en az %90!i, en az bir ila yaklasik bes somatik hipermutasyon sergilemektedir. Ayrica, birden fazla olmayan veya ikiden fazla olmayani yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekanslarindan elde edilen bir tek k hafif zincirin eksprese edilmesi için modifiye edilen, genetigi degistirilmis bir fareye atifta bulunulmaktadir, burada fare, bir yaban tipi fare tarafindan sergilenen K hafif zincir kullanimindan veya K hafif zincir gen segmentlerinin bir yaban tipi repertuvarini içeren ayni susa sahip bir fare tarafindan sergilenen K hafif zincir kullanimindan yaklasik iki kat veya daha fazla, en az yaklasik üç kat veya daha fazla veya en az yaklasik dört kat veya daha fazla olan bir K hafif zincir kullanimi sergilemektedir. Belirli bir durumda, fare, yeniden düzenlenmis, birden fazla olmayan K hafif zincir sekansindan tek K hafif zincirini eksprese etmektedir. Daha spesifik bir durumda, yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekansi, bir VK1-39JK5 ve VK3- 20JK1 sekansindan seçilmektedir. Bir durumda, yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekansi bir VK1-39JK5 sekansidir. Bir durumda, yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekansi bir VK3-20JK1 sekansidir. Ayrica, birden fazla olmayan veya ikiden fazla olmayani yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekanslarindan elde edilen bir tek K hafif zincirini eksprese eden genetigi degistirilmis bir fareye atifta bulunulmaktadir, burada fare, bir tam veya neredeyse tam insan K hafif zincir lokusu tasiyan bir fare tarafindan sergilenen K hafif zincir kullanimindan, yaklasik 100-kat veya daha fazla, en az yaklasik 200-kat veya daha fazla, en az yaklasik 300-kat veya daha fazla, en az yaklasik 400-kat veya daha fazla, en az yaklasik 500-kat veya daha fazla, en az yaklasik (500-kat veya daha fazla, en az yaklasik 700-kat veya daha fazla, en az yaklasik 800-kat veya daha fazla, en az yaklasik 900-kat veya daha fazla, en az yaklasik 1000-kat veya daha fazla olan bir K hafif zincir kullanimi sergilemektedir. Spesifik bir durumda, bir tam veya neredeyse tam insan K hafif zincir lokusu tasiyan fare, bir islevsel, yeniden düzenlenmis fare K hafif zincir sekansina sahip degildir. Belirli bir durumda, fare, yeniden düzenlenmis, birden fazla olmayan K hafif zincir sekansindan tek K hafif zincirini eksprese etmektedir. Bir durumda, fare, yeniden düzenlenmis bir K hafif zinciri sekansinin (Örnegin bir heterozigot) bir kopyasini içermektedir. Bir durumda, fare, yeniden düzenlenmis bir K hafif zinciri sekansinin (örnegin bir homozigot) iki kopyasini içermektedir. Daha spesifik bir durumda, yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekansi, bir VK1-39JK5 ve VK3-20JK1 sekansindan seçilmektedir. Bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekansi bir VK1-39JK5 sekansidir. Bir yapilandirmada, yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekansi bir VK3-20JK1 sekansidir. Ayrica, birden fazla olmayan veya ikiden fazla olmayani yeniden düzenlenmis hafif zincir sekanslarindan elde edilen bir tek hafif zinciri eksprese eden genetigi degistirilmis bir fareye atifta bulunulmaktadir, burada genetigi degistirilmis faredeki hafif zincir, bir tam veya neredeyse tam hafif zincir lokusu tasiyan bir fare tarafindan sergilenen yeniden düzenlenmis hafif zincirin ekspresyonundan, en az 10 kat ila yaklasik 1,000 kat, yaklasik 1,000 kat daha yüksek olan bir ekspresyon seviyesi sergilemektedir. Bir durumda, hafif zincir bir insan sekansi içermektedir. Spesifik bir durumda, insan sekansi bir K sekansidir. Bir durumda, insan sekansi bir A sekansidir. Bir durumda, hafif zincir bir tam insan hafif zinciridir. Bir yapilandirmada, ekspresyon seviyesi, transkripsiyonu yapilmis hafif zincir sekansinin mRNA'sinin nicellestirilmesi ve bunun, bir tam evya neredeyse tam hafif zincir lokusu tasiyan bir farenin transkripsiyonu yapilmis hafif zincir sekansi ile karsilastirilmasi ile karakterize edilmektedir. Ayrica, birden fazla olmayan veya ikiden fazla olmayani yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekanslarindan elde edilen bir tek K hafif zincirini eksprese eden, genetigi degistirilmis bir fareye atif yapilmaktadir, burada fare, antijen ile bagisiklik kazandirilmasindan sonra, ayni antijen ile bagisiklik kazandirilan bir yaban tipi faresi ile kiyaslanabilir olan bir serum titresi sergilemektedir. Spesifik bir durumda, fare, yeniden düzenlenmis, birden fazla olmayan K hafif zincir sekansindan tek K hafif zincirini eksprese etmektedir. Bir durumda, serum titresi, toplam immünoglobulin olarak karakterize edilmektedir. Spesifik bir durumda. serum titresi, lgM spesifik titre olarak karakterize edilmektedir. Spesifik bir durumda, serum titresi, IgG spesifik titre olarak karakterize edilmektedir. Daha spesifik bir durumda, yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekansi, bir VK1-39JK5 ve VK3-20JK1 sekansindan seçilmektedir. Bir durumda, yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekansi bir VK1-39JK5 sekansidir. Bir durumda, yeniden düzenlenmis K hafif zincir sekansi bir VK3-20JK1 sekansidir. Ayrica, antijene 'Özgü antikorlarin bir popülasyonunu eksprese eden, genetigi degistirilmis bir fareye atif yapilmaktadir, burada antijene 'özgü antikorlarin popülasyonunun immünoglobulin hafif zincirlerinin tamami, ayni tek insan VL gen segmentinden elde edilen bir insan hafif zincir degisken (VL) bölgesi içermektedir ve immünoglobulin agir zincirler, birden çok insan VH gen segmentinden birinden elde edilen bir insan agir zincir degisken (VH) bölgesi içermektedir. Çesitli yapilandirmalarda, ayni tek insan VL gen segmenti, bir insan VK1-39 gen segmenti ve bir insan VK3-20 gen segmentinden seçilmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, immünoglobulin hafif zincirleirnin tamami, bir JK ve bir JA, gen segmentinden seçilen bir insan hafif zincir J (JL) gen segmenti içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, insan JL gen segmenti, bir insan JK1 ve bir JK5 gen segmentinden seçilmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, fare, bir fare immünoglobulin Vi_ gen segmenti, bir fare immünoglobulin JL gen segmenti ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilen bir sekansa sahip degildir. çesitli yapilandirmalarda, insan VL bölgesi, bir insan, fare veya siçan imm'unoglobulin hafif zincir sabit (CL) bölgesi ile faal olarak birlestirilmektedir. Spesifik bir yapilandirmada, insan Vi_ bölgesi, bir fare CK bölgesi ile faal sekilde birlestirilmektedr. Spesifik bir yapilandirmada, insan VL bölgesi, bir siçan CK bölgesi ile faal sekilde birlestirilmektedr. Çesitli yapilandirmalarda, insan VL bölgesi, bir endojen immünoglobulin hafif zincir fare veya siçan immünoglobulin hafif zincir sabit (CH) bölgesi ile faal olarak birlestirilmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, (CH) bölgesi, bir CH1, bir kivrim, bir CH2, bir CHS, bir CH4 ve/veya bunlarin bir kombinasyonundan seçilen bir insan sekansi içermektedir. Çesitli yapilandirmalarda, insan VH bölgesi, bir endojen imm'L'inoglobuIin hafif zincir Iokusundan eksprese edilmektedir. Ayrica, tek bir hafif zincir ile iliskilendirilen birden çok immünoglobulin agir zincir eksprese eden genetigi degistirilmis bir fareye atif yapilmaktadir. Bir durumda, agir zincir bir insan sekansi içermektedir. Çesitli yapilandirmalarda, insan sekansi, bir degisken sekansi, bir CH1, bir kivrim, bir CH2, bir CH3 ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilmektedir. Bir durumda, tek hafif zincir bir insan sekansi içermektedir. Çesitli durumlarda, insan sekansi, bir degisken sekans, bir sabit sekans ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilmektedir. Bir durumda, fare, etkisizlestirilmis bir endojen immünoglobulin Iokusu içermektedir ve bir transgen veya ekstrakrozomal epizomdan agir zincir ve/veya hafif zincir eksprese etmektedir. Bir durumda, fare, endojen fare agir zincir gen segmentlerinin (yani V, D, J) bazilari veya tamami ve/veya endojen fare agir zincir sabit sekanslardan (örnegin bir CH1, kivrim, CH2, CH3 veya bunlarin bir kombinasyonu) bazilari veya tamami ve/veya endojen fare hafif zincir sekanslarindan (örnegin V, J, sabit veya bunlarin bir kombinasyonu) bazilari veya tamaminin bir endojen fare Iokusunda, bir veya daha fazla insan immünoglobulin sekansi ile bir replasman içermektedir. Ayrica, ayni hafif zincirre sahip antikorlarin meydana getirilmesi için uygun olan bir fareye atif yapilmaktadir, burada farede meydana getirilen tüm veya neredeyse tüm antikorlar, ayni hafif zincir ile eksprese edilmektedir. Bir durumda, hafif zincir bir endojen hafif zincir Iokusundan eksprese edilmektedir. Bir yönde, bir insan antikoru için bir hafif zincirin meydana getirilmesine yönelik bir yöntem saglanmakta olup, burada açiklanan bir fareden, bir hafif zincir sekansi ve bir agir zincir sekansinin elde edilmesini ve bir insan antikoru meydana getirilirken hafif zincir sekansinin ve agir zincir sekansinin kullanilmasini içermektedir. Bir yapilandirmada, insan antikoru bir bispesifik antikordur. Bir yönde, burada açiklanan genetigi degistirilmis bir hafif zincir ile ilgili bir antijeni baglayabilen bir insan agir zincir degisken alaninin belirlenmesine yönelik bir yöntem saglanmaktadir, burada yöntem, antijeni baglayabilen bir birinci antikordan elde edilen bir agir zincir degisken alaninin saglanmasini, bir germ hatti sekansi ile agir zincir degisken alaninin onarilmasini ve her bir hücrenin bir ikinci antikorun olusturulmasi Için eksprese edilmesi amaciyla bir hücrenin transfekte edilmesini, ikinci antikorun antijene maruz birakilmasini ve ikinci antikorun antijene baglanisinin ölçülmesini içermektedir. Bir yapilsandirmada, birinci antikorun hafif zinciri bir insan VK1-39 sekansi içermektedir. Bir yapilsandirmada, birinci antikorun hafif zinciri bir insan VK3-2O sekansi içermektedir. Bir yapilandirmada, germ hatti hafif zincir sekansi bir insan VK1-39 veya VK3-20 sekansi içermektedir. Çesitli yapilandirmalarda, ikinci antikorun antijene baglanmasi, birinci antikorun antijene baglanmasinin karsilastirilmasiyla belirlenmektedir. Burada açiklanan herhangi bir yapilandirma veya yön, aksi belirtilmedikçe veya baglam gerektirmedikçe birlikte kullanilabilmektedir. Diger yapilandirmalar, asagidaki açiklamanin gözden geçirilmesiyle teknikte uzman kisiler için anlasilir olacaktir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI SEKIL 1, bir insan VK1-39JK5 gen bölgesi ile endojen fare immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesi gen segmentlerinin degistirilmesine yönelik bir hedefleme stratejisini göstermektedir. SEKIL 2, bir insan Vk3-20Jk1 gen bölgesi ile endojen fare immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesi gen segmentlerinin degistirilmesine yönelik bir hedefleme stratejisini göstermektedir. SEKIL 3, bir insan VpreB/JA5 gen bölgesi ile endojen fare immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesi gen segmentlerinin degistirilmesine yönelik bir hedefleme stratejisini göstermektedir. SEKIL 4, yaban tipi fareler (WT), tasarlanmisl bir insan yeniden düzenlenmis Vk1- 39Jk5 hafif zincir bölgesi (Vk1-39Jk5 HO) için homozigoz olan fareler ve tasarlanmis bir insan yeniden düzenlenmis VK3-20JK1 hafif zincir bölgesi (VK3-20JK1 HO) için homozigoz olan farelere yönelik periferal kandan CD19+ B hücrelerinin (y-ekseni) yüzdesini göstermektedir. SEKIL 5A, insan VK ve JKgen segmentleri (HK) ile endojen VK ve JK gen segmentlerinin bir replasmani için homozigoz olan bir farede, bir yaban tipi farede (WT) ve tasarlanmis bir insan yeniden düzenlenmis Vk1-39Jk5 hafif zincir bölgesi (Vk için heterozigoz olan bir farede, tasrlanmis bir insan yeniden düzenlenmis VK1-39JK5 hafif zincir bölgesi (VK1-39JK5 Birlesim Probu) ve insan Vk birlesimine özgü olan problar kullanilarak bir niceliksel PCR tahlilinde bir VK1-39-türevli hafif zincirin göreli mRNA ekspresyonunu (y-ekseni) göstermekedir. Sinyaller, fare CK'sinin ekspresyonuna normalize edilmektedir. N.D.: belirlenmemis. SEKIL 5B, insan VK ve JKgen segmentleri (HK) ile endojen VK ve JK gen segmentlerinin bir replasmani için homozigoz olan bir farede, bir yaban tipi farede (WT) ve tasarlanmis bir insan yeniden düzenlenmis VK1-39JK5 hafif zincir bölgesi (VK1-39JK5 HO) için homozigoz olan bir farede, tasarlanmis bir insan yeniden düzenlenmis VK1-39JK5 hafif zincir bölgesi (VK1-39JK5 Birlesim Probu) ve insan VK1-39 gen segmentinin (VK1-39 Prob) birlesimine özgü olan problar kullanilarak bir niceliksel PCR tahlilinde bir VK1-39-türevli hafif zincirin göreli mRNA ekspresyonunu (y-ekseni) göstermektedir. Sinyaller, fare CKisinin ekspresyonuna normalize edilmektedir. SEKIL 5C, insan VK ve JKgen segmentleri (HK) ile endojen VK ve JK gen segmentlerinin bir replasmani için homozigoz olan bir farede, bir yaban tipi farede (WT) ve tasarlanmis bir insan yeniden düzenlenmis VK3-2OJK1 hafif zincir bölgesi için heterozigoz (HET) ve homozigoz (HO) olan bir farede, tasarlanmis bir insan yeniden düzenlenmis Vk3-20JK1 hafif zincir bölgesi (VK3-20Jk1 Birlesim Probu) ve insan VK3-20 gen segmentinin (VK3-20 Prob) birlesimine özgü olan problar kullanilarak bir niceliksel PCR tahlilinde bir VK3-20-türevli hafif zincirin göreli mRNA ekspresyonunu (y-ekseni) göstermekedir. Sinyaller, fare CK'sinin ekspresyonuna normalize edilmektedir. SEKIL 6A, ß-galaktosidaz ile bagisiklik kazandirilan, tasarlanmis bir insan yeniden düzenlenmis VK1-39JK5 hafif zincir bölgesi (VK1-39JK5 HO; N=2) için homozigoz olan farelerde ve yaban tipinde (WT; N=2) IGM (sol) ve IGG (sag) titresini göstermektedir. SEKIL GB, ß-galaktosidaz ile bagisiklik kazandirilan, tasarlanmis bir insan yeniden düzenlenmis VK için homozigoz olan farelerde ve yaban tipinde (WT; N=5) toplam immünoglobulin (IGM, IGG, lGA) titresini göstermektedir. SEKIL 7A, her bir ebeveyn monospesifik antikorundan agir zincir degisken bölgekerinden olusturulan monospesifik antikorlarin (Ebeveyn 1 ve Ebeveyn 2) ve bir bispesifik antikorun (Bispesifik) bir sematigini göstermektedir. Bir ortak hafif zincir degisken bölgesi (koyulastirilmis), bispesifik antikorda gösterilmektedir. SEKIL 7B, ilgili bir abtijene yönelik iki ebeveyn monoklonal antikorunun (Ebeveyn 1 ve Ebeveyn 2) baglama özelliklerinin yani sira, ortak bir hafif zincir ile her bir monospesifik ebeveyn antikorundan agir zincir degisken bölgelerinin eslenmesinden olusturulan bir bispesifik antikorun baglama özelliklerine yönelik bir sematigi göstermektedir. Bispesifik antikorun iki ayri ilgili antijen epitopuna, ayri sekilde (sol alt) ve es zamanli olarak (sag alt) baglanma kapasitesi, gösterilmektedir. SEKIL 8, BIACORETM birimlerinde (RU), 300nM bispesfik (koyu çubuklar) ve monospesifik (izgili ve gri çubuklar) antikorlarinin, yakalanmis bir monomerik Antijen E yüzeyine, baglanmasinin bir çubuk grafigini göstermektedir. Monoklonak ebeveyn-1 antikoru (P1 Ab), monoklonal ebeveyn-2 (P2 Ab) ve bispesifik antikorlar (BsAb) belirtilmektedir. SEKIL 9 iki genetigi degistirilmis endojen immünoglobulin hafif zinciri (örnegin K hafif zincir) Iokuslarini göstermektedir. Üstteki Iokus (DLC-SJ), iki insan VKgen segmenti ve bes insan JKgen segmenti içeren, tasarlanmis bir insaN DNA fragmenti (kesikli çizgi) içermektedir. Alttaki Iokus (DLC-1 J), iki insan VK gen segmenti ve bir insan JK gen segmenti içeren, tasarlanmis bir insan DNA fragmeniti (kesikli çizgi) içermektedir. Her bir Iokus, bir endojen hafif zincir sabit bölgesine (örnegin bir CK) faal sekilde birlestirilen bir insan VK bölgesinin olusturulmasi iin yeniden düzenlenebilmektedir. immünoglobulin promotörleri (Iokus üzerindeki ok), öncü eksonlar (kapali oklar) ve iki insan VK gen segmenti (açik oklar) gösterilmekte olup, bunlarin hepsi, Frt rekombinasyon bölgeleri içeren bir neomisin kaseti tarafindna akis yukari (5*) sekilde yandan desteklenmektedir. Insan gen segmentlerinden (VK ve JK) her biri ile tasarlanan rekombinasyon sinyal sekanslari, her bir gen segmeni ile yan yana koyulan açik ovaller ile gösterilmektedir. SEKIL 10A, `üst panelde, bir yaban tipi fareden (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan bir fareden (DLC-5J) B ve T hücreleri (sirasiyla CD19+ ve CD3+) için Iekelenen kemik iliginin temsili kontur grafiklerini göstermektedir. Alt panel, bir yaban tipi fareden (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmenti için homozigoz olan bir fareden (DLC-5J) ckit+ ve CD43+ için Iekelenen ve CD19+ üzerinde geçitlenen kemik iliginin temsili kontur grafiklerini göstermektedir. Pro ve Pre B hücreleri, alt panelin kontur grafiklerinde belirtilmektedir. SEKIL 1GB, yaban tip fareler (WT) ve iki insan VK ve bes insan JKgen segmentleri için homozigoz olan farelerin (DLC-5J) uyluk kemiginden alinan kemik iligindeki Pro (CD19*CD43+ckit+) ve Pre (CD19+CD43- ckit-) B hücrelerinin sayisini göstermektedir. SEKIL 11A, bir yaban tipi fareden (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan bir fareden (DLC-5J) immünoglobulin M (IgM) ve 8220 için lekelenen tekliler üzerinde geçitlenen kemik iliginin temsili kontur grafiklerini göstermektedir. Matür olmayan, matür ve pro/pre B hücreleri kontur grafiklerinde belirtilmektedir. SEKIL 11B, yaban tip fareler (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan farelerin (DLC-5J) uyluk kemiginden izole edilen kemik iligindeki B (CD19*), matür olmayan B ( hücrelerinin sayisini göstermektedir. SEKIL 12A, bir yaban tipi fareden (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan bir fareden (DLC-5J) immünoglobulin M (IgM) ve 8220 için lekelenen tekliler üzerinde geçitlenen kemik iliginin temsili kontur grafiklerini göstermektedir. Matür olmayan, matür ve pro/pre B hücreleri kontur grafiklerinde belirtilmektedir. SEKIL 123, bir yaban tipi fareden (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan bir farenin (DLC-SJ) uyluk kemiginden izole edilen (BZ2OhIIgM+) B hücreleri 'üzerinde geçitlenen kemik iliginin temsili kontur grafiklerini göstermektedir. SEKIL 13A, üst panelde, bir yaban tipi fareden (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan bir fareden (DLC-5J) B ve T hücreleri (sirasiyla CD19+ ve CD3*) için Iekelenen ve tekiler üzerinde geçitlenen splenositlerin temsili kontur grafiklerini göstermektedir. 1alt panel, bir yaban tipi fareden (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan bir fareden (DLC-5J) immünoglobulin D (lgD) ve immünoglobulin M (IgM) için Iekelenen ve CD19+ üzerinde geçitlenen splenositlerin temsili kontur grafiklerini göstermektedir. Matür (WT için 54, DLC-5J için B hücreleri, kontur grafiklerinde belirtilmektedir. SEKIL 13B, yaban tip fareler (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan farelerden (DLC-5J) alinan dalaklardaki CD19+ B hücreleri, geçici B hücreleri (CD19+IthIlgD'°) ve matür B hücrelerinin (CD19*IgM'°lgDhI) toplam sayisini göstermektedir. SEKIL 14A, bir yaban tipi fare (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan bir fareye (DLC-5J) ait CD19* üzerinde geçitlenen lgA + ve ng+ splenositlerinin temsili kontur grafiklerini göstermektedir. SEKIL 14B, yaban tip fareler (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan farelerden (DLC-5J) alinan dalaklardaki B hücreleri (CD19*), göstermektedir. SEKIL 15A, iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan farelerde periferal B hücresi gelisimini göstermektedir. Birinci (en sol) kontur grafigi, CD19+ üzerinde geçitlenen CD93+ ve 8220+ splenositlerini göstermekte olup, matür olmayan (39.6) ve matür (57.8) B hücrelerine isaret etmektedir. Ikinci (üst orta) kontur grafigi, matür olmayan B hücrelerindeki IgM+ ve CD23+ ekspresyonunu Uçüncü (alt orta) kontur grafigi, matür olmayan B hücrelerindeki lgM+ ve CD23+ ekspresyonunu göstemekte olup, marjinal bölge B hücrelerini ortaya çikaran küçük bir popülasyona (14.8) ve foliküler (FO) B hücrelerini ortaya çikaran bir ikinci popülasyona (70.5) isaret etmektedir. Dördüncü (sag üst) kontur grafigi, matür B hücrelerindeki B220+ ve CD23+ ekspresyonunu göstermekte olup, marjinal bölge popülasyonlarina isaret etmektedir. Besinci (sag alt) kontur grafigi, matür B hücrelerindeki IgD+ ve lgM+ ekspresyonlarini göstermekte olup, FO-l (790; popülasyonlarina isaret etmektedir. Geçitlenmis her bir bölge içerisindeki hücrelerin yüzdeleri gösterilmektedir. SEKIL 158, yaban tipi farelerde periferal B hücresi gelisimini göstermektedir. Birinci (en sol) kontur grafigi, CD19+ üzerinde geçitlenen CD93+ ve 8220** splenositlerini göstermekte olup, matür olmayan (31.1) ve matür (64.4) B hücrelerine isaret etmektedir. Ikinci (üst orta) kontur grafigi, matür olmayan B hücrelerindeki lgM+ ve Üçüncü (alt orta) kontur grafigi, matür olmayan B hücrelerindeki lgM* ve CD23+ ekspresyonunu göstemekte olup, marjinal bölge B hücrelerini ortaya çikaran küçük bir popülasyona (7.69) ve foliküler (FO) B hücrelerini ortaya çikaran bir ikinci popülasyona (78.5) isaret etmektedir. Dördüncü (sag üst) kontur grafigi, matür B hücrelerindeki B220+ ve CD23* ekspresyonunu göstermekte olup, marjinal bölge popülasyonlarina isaret etmektedir. Besinci (sag alt) kontur grafigi, matür B hücrelerindeki IgD+ ve lgM+ ekspresyonlarini göstermekte olup, FO-I (836; popülasyonlarina isaret etmektedir. Geçitlenmis her bir bölge içerisindeki hücrelerin yüzdeleri gösterilmektedir. SEKIL 16, yaban tip fareler (WT) ve iki insan VK ve bes insan JK gen segmentleri için homozigoz olan farelerden (DLC-5J) alinan dalaklardaki geçici, merjinal bölge ve foliküler B hücresi popülayonlarinin toplam sayisini göstermektedir. SEKIL 17, endojen VK ve JK gen segmentlerinin insan VK ve JK gen segmentleri (HK) ile bir replasmani için homozigoz olan fareler, yaban tipi fareler (WT), iki insan VK gen segmenti ve bes insan JK gen segmenti için homozigoz olan fareler (DLC-5J) ve iki insan VK gen segmenti ve bir insan JK gen segmenti için homozigoz olan farelerdeki (DLC-1J) VK3-2O veya VK1-39 gen segmentlerine özgü problar kullanilarak, bir niceliksel PCR tahlilinde VK3-20-türevli ve VK1-39-türevli hafif zincirlerin kemik iligindeki (y-ekseni) göreli mRNA ekspresyonunu göstermektedir. Sinyaller, fare CKrnin ekspresyonuna normalize edilmektedir. ND: belirlenmemistir. SEKIL 18, endojen VK ve JK gen segmentlerinin insan VK ve JK gen segmentleri (HK) ile bir replasmani için homozigoz olan fareler, yaban tipi fareler (WT), iki insan VK gen segmenti ve bes insan JK gen segmenti için homozigoz olan fareler (DLC-5J) ve iki insan VK gen segmenti ve bir insan JK gen segmenti için homozigoz olan farelerdeki (DLC-1J) VK3-20 veya VK1-39 gen segmentlerine özgü problar kullanilarak, bir niceliksel PCR tahlilinde VK3-20-t'urevli ve VK1-39-türevli hafif zincirlerin tüm dalaklardaki (y-ekseni) göreli mRNA ekspresyonunu göstermektedir. Sinyaller, fare Ckrsinin ekspresyonuna normalize edilmektedir. ND: belirlenmemistir. SEKIL 19, bir farede bir immünoglobulin K hafif zincir alelinin bir V ve bir J gen segmeninin rekombimasyonu ve yeniden düzenlemeden önce (üst) ve yeniden düzenlemeden sonra (alt) hafif zincir Iokusunun yapisinin genel bir illüstrasyonunu göstermektedir. Gösterilen bu tür bir yeniden düzenleme, olasi birkaç yeniden düzenleme olaylarindan yalnizca biridir. AYRINTILI AÇIKLAMA Bu bulus, belirli yöntemler ve açiklanan deney kosullari ile sinirli degildir, zira bu tür yöntemler ve kosullar degiskenlik gösterebilmektedir. Burada kullanilan terminolojinin, yalnizca belirli yapilandirmalarin açiklanmasi amaciyla kullanildigi ve mevcut bulusun kapsami yalnizca ekli istemler ile belirlendiginden dolayi, sinirlandirici olmadigi anlasilacaktir. Aksi belirtilmedikçe, burada kullanilan tün terimler ve ifadeler, bunun aksi açik bir sekilde gösterilmedigi veya terimin veya ifadenin kullanildigi baglamdan açik bir sekilde anlasilmadigi sürece terimlerin ve ifadelerin teknikte kazandigi anlamlari kapsamaktadir. Burada açiklananlara benzer veya bunlarla esdegerde olan herhangi bir yöntem ve malzeme, mevcut bulusun uygulanmasinda veya test edilmesinde de kullanilabilmesine ragmen, belilri yöntemler ve malzemeler burada açiklanmaktadir. Burada kullanildigi 'üzere "antikor" terimi, dört polipeptit zinciri,dis`ulfür baglariyla birbirine baglanan iki agir (H) zincir ve iki hafif (L) zincir içeren immünoglobulin moleküllerini kapsamaktadir. Her bir agir zincir, bir agir zincir degisken (VH) bölgesini ve bir agir zincir sabit bölgesini (CH) içermektedir. Agir zincir degisken bölgesi 'üç alani, CH1, CH2 ve CH3, içermektedir. Her bir hafif zincir, bir agir zincir degisken (VL) bölgesini ve bir agir zincir sabit bölgesini (CL) içermektedir. VH ve VL bölgeleri, ayrica hiperdegiskenlik bölgelerine ayrilabilmektedir, bunlar tamamlayicilik belirleme bölgeleri (CDR) olarak adlandirilmaktadir, daha korumali olan, çerçeve bölgeler (FR) olarak adlandirilan bölgeler ile karistirilmaktadir. Her bir VH ve VL, yandaki sirada amino terminustan karboksi-terminusa dogru düzenlenen üç CDR ve dört FR içermektedir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (agir zincir CDR'ler HCDR1, HCDR2 ve HCDR3 olarak kisaltilabilmektedir; hafif zincir CDR'ler ise LCDRi, LCDR2 ve LCDR3 olarak kisaltilabilmektedir. "Yüksek afiniteli" antikor terimi, yaklasik 10-9 M veya daha M) olan hedef epitopuna göre bir Koiye sahip bir antikora isaret etmektedir. Bir yapilandirmada, KD yüzey plazmon rezonans, örnegin BIACORETM ile ölçülmektedir, bir baska yapilandirmada KD ELISA ile ölçülmektedir. antikora isaret etmektedir. Bispesifik antikorlar, iki farkli monoklonal antikorun fragmentlerini kapsamaktadir (Sekil 7A) ve genel olarak, iki farkli monoklonal antikordan elde edilen iki özdes olmayan agir zincir içermekte olup, her bir agir zincir, iki farkli molekül üzerinde (örnegin iki farkli immünojen üzerinde farkli epitoplar; bakiniz Sekil 78, sol alt) veya ayni molekül üzerinde (örnegin ayni immünojen üzerinde farkli epitoplar; bakiniz Sekil 78, sag alt) farkli bir epitopu baglamaktadir. Bir spesfik antikorun, iki farkli epitogu seçici bir sekilde baglayabilmesi durumunda (bir birinci epitop ve bir ikinci epitop), birinci epitopa yönelik birinci agir zincirin afinitesi genellikle ikinci epitopa yönelik birinci agir zincirin afinitesinden düsük olan en az bir ila iki veya üç iveya dört veya daha fazla olan büyüklük siralarinda olacaktir. Bispesifik antikor tarafindan spesifik olarak baglanan epitoplar, ayni veya farkli bir hedef üzerinde olabilmektedir (örnegin ayni veya farkli bir protein üzerinde; bakiniz Sekil YB). Ornek bispesifik antikorlar, bir tümör antijenine özgü olan bir birinci agir zincire ve sitotoksik isaretçi, örnegin bir PC reseptörü (örnegin FcyRI, Fclel, FcyRIII vb.) veya bir T hücresi isaretçisine (örnegin CD3, CD28, vb.) özgü olan bir ikinci agir zincire sahip olanlari kapsamaktadir. Dahasi, ikinci agir zincir degisken bölgesi, arzu edilen farkli bir spesifiteye sahip bir agir zincir degisken bölgesi ile ikame edilebilmektedir. Ornek bir tümör antijenine özgü olan bir birinci agir zincir ve toksine özgü olan bir ikinci agir zincire sahip bir bispesifik antikor, bir toksinin (örnegin saporin, vinka alkaloid, vb.) bir tümör hücresine tasinmasi için eslenebilmektedir. Diger örnek spesifik antikorlar, bir aktivasyon reseptörüne özgü olan bir birinci agir zincire (örnegin B hücresi reseptörü, Fcle, FcvRllA, FclellA, FcoiRl, T hücresi reseptörü, vb.) ve bir inhibitör reseptörüne (FcvRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a, vb.) özgü olan bir ikinci agir zincire sahip olanlari kapsamaktadir. Bu tür bispesifik antikorlar, hücre aktivasyonu ile iliskilendirilen terapötik kosullar (örnegin alerji veya astim) için olusturulabilmektedir. Bispesifik antikorlar, Örnegin, ayni veya farkli immünojenin farkli epitoplarini taniyan agir zincirlerin birlestirilmesi vasitasiyla meydana getirilebilmektedir (Sekil YB). Ornegin, ayni veya farkli immünojenin farkli epitoplarini taniyan agir zincir degisken sekanslari kodlayan nükleik asit sekanslar, ayni veya farkli agir zincir sabit bölgelerini kodlayan nükleik asit sekanslarina füzyonlanabilmektedir ve bu sekanslar, bir immünoglobulin hafif zinciri eksprese eden bir hücre içerisinde eksprese edilebilmektedir. Tipik bir bispesifik antikor, her birinin üç agir zincir CDR'si, ardindan (N-terminal ila C-terminal) bir CH1 alani, bir kivrim, bir CH2 alani ve bir CH3 alanina sahip oldugu iki agir zincire ve epitop baglama spesifitesini saglamayan ancak her bir agir zincir ile iliskilendirilebilen veya her bir agir zincir ile iliskilendirilebilen ve agir zincir epitop baglama bölgeleri tarafindan baglanan bir veya daha fazla epitopu baglayabilen veya er bir agir zincir ile iliskilendirilebilen ve bir veya her iki epitopa bir veya her iki agir zincirin baglanmasini saglayan bir immünoglobulin hafif zincirine sahiptir. olan herhangi bir hücreyi kapsamaktadir. Hücreler; prokaryotlar ve ökaryotlar (tek hücre veya çoklu hücre), bakteriyel hücreler (örnegin E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., vb. suslari), miyobakteri hücreleri, fungal hücreler, maya hücreleri (örnegin 8. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, vb.), bitki hücreleri, böcek hücreler, (örnegin SF-9, SF-21, bakülovirüs enfekteli böcek hücreleri, Trichoplusia ni, vb.), insan olmayan hayvan hücreleri, insan hücreleri veya örnegin hibridomlar veya kuadromalr gibi hücre füzyonlarini kapsamaktadir. Bazi durumlarda, hücre bir insan, maymun, sebek, hamster, siçan veya fare hücresidir. Bazi durumlarda, hücre ökaryotiktir ve su hücrelerden seçilmektedir: CHO (örnegin CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (örnegin CCS-7), retinal hücre, Vero, CV1, böbrek (örnegin, HEK293, 293 EBNA, MSR myeloma hücresi, tümör hücresi ve yukarida bahsedilen bir hücreden elde edilen bir hücre hatti. Bazi yapilandirmalarda, hücre, bir veya daha fazla viral gen, örnegin bir viral geni eksprese eden bir retinal hücre (örnegin bir PER.C6TM hücresi) içermektedir. molekülünün (örnegin bir antikor veya bir T hücresi reseptörü) bir hafif veya bir agir zincirinin bir degisken bölgesindeki iki çerçeve bölge arasinda ortaya çikan (yani bir yaban tipi hayvanda) organizmanin immünoglobulin genlerinin bir nükleik asit sekansi tarafindan kodlanan bir amino asit sekansini kapsamaktadir. Bir CDR, örnegin bir germ hatti sekansi veya yeniden düzenlenmis veya yeniden düzenlenmemis bir sekans tarafindan ve örnegin bir naif veya bir matür B hücresi veya bir T hücresi tarafindan kodlanabilmektedir. Bir CDR, somatik olarak mutasyona ugratilabilmektedir (örnegin bir hayvanin germ hattinda kodlanan bir sekanstan farkli olan), insanilestirilebilmektedir ve/veya amino asit ikameleri, katki maddeleri veya delesyonlar ile modifiye edilebilmektedir. Bazi durumlarda (örnegin bir CDR3 için), CDR'ler, örneüin sekanslarin uçlarinin birlestirilmesi ve baglanmasinin bir sonucu olarak (örnegin bir agir zincir CDR3'ün olusturulmasi Için V-D-J rekombinasyonu), komsu olmayan (örnegin yeniden düzenlenmemis bir nükleik asitte), ancak bir B hücresi nükleik asit sekansinda komsu olan iki veya daha fazla sekans (örnegin germ hatti sekanslari) tarafindan kodlanabilmektedir. Bir konservarif amino asit ikamesi açiklanirken kullanildiginda "konservatif" terimi, bir amino asit kalintisinin, benzer kimyasal özelliklere (örnegin yük veya hidrofobisite) sahip bir yan zincir R grubuna sahip bir baska amino asit kalintisi ile ikamesini kapsamaktadir. Genel olarak, konservatif amino asit kalintisi, bir ptoreinin islevsel özelliklerini, örnegin bir degisken bölgenin arzu edilen bi afiniteye sahip bir hedef epitopu spesifik olarak baglayabilme kapasitesini ciddi oranda degistirmeyecektir. Benzer kimyasal özelliklere sahip yan zincirleir olan amino asit gruplarinin örnekleri, glisin, alanin, valin, lösin ve izolösin gibi alifatik yan zincirler; serin ve treonin gibi alifatik hidroksil yan zincirler; asparajin ve glutamin gibi amit içeren yan zincirler; fenilalanin, tirozin ve triptofan gibi aromatik yan zincirler; lisin, arjinin ve histidin gibi bazik yan zincirler; aspartik asit ve glutamik asit gibi asidik yan zincirler; ve sistein ve metiyonin gibi sülfüt içerne yan zirleri kapsamaktadir. Konservatif amino asit ikame gruplari, örnegin valin/Iösin/izolösin, fenilalanin/tirozin, lisin/arjinin, alanin/valin, glutamat/aspartat ve asparajin/glutamini kapsamaktadir. Bazi yapilandirmalarda, bir konservatif amino asit ikamesi, örnegin alanin tarama mutajenezinde kullanildigi üzere alanin ile bir proteindeki herhangi bir natif kalintinin ikaesi olabilmektedir. Bazi yapilandirmalarda, bir konservatif ikame meydana getirilmekte olup, Gonnet ve meslektaslari (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45 referansinda açiklandigi üzere PAM250 Iog-olaslilik matrisinde bir pozitif degere sahiptir. Bazi yapilandirmalarda, ikame bir orta dereceli konservatif ikame olabilmektedir, nburada ikame, PAM250 log-olasilik matrisinde bir negatif degere sahiptir. Bazi yapilandirmalarda, bir immünoglobulin hafif zinciri veya agir zincirindeki kalinti pozisyonlari, bir veya daha fazla konservatif amino asit ikamesi bakimindan farklilik göstermektedir. Bazi yapilandirmalarda, bir immünoglobulin hafif zincir veya bunun islevsel bir fragmentindeki (örnegin bir B hücresinden ekspresyonu ve salgilanmayi saglayan bir fragment) kalinti pozisyonlari, amino asit sekansi burada listelenen bir hafif zincire özdes degildir, ancak bir veya daha fazla konservatif amino asit ikamesi bakimindan farklilik göstermektedir. sekilde taniyabilen, örnegin yaklasik bir mikromolar veya daha düsük degerdekli bir kapsamaktadir. Terapötik epitop baglama proteinleri (örnegin terapötik antikorlar), siklikla, nanomolar veya pikomolar aralikta olan bir KD gerektirmektedir. nanomolar veya pikomolar araliktaki bir Ko'ye sahip bir epitopa spesifik olarak baglanabilen epitop baglama proteinlerinin fragmentlerini kapsamaktadir. Spesifik tanima, en azindan mikromolar aralikta, nanomolar aralikta veya pikomolar aralikta olan bir Kurye sahipligi kapsamaktadir. somatik olmayan sekidle mutasyona ugramis bir B hücresi veya pre-B hücresi veya hematopoietik hücredeki bir immünoglobulin nükleik asit sekansina bir referansi kapsamaktadir. immünoglobulin agir zincir sabit bölgesini kapsamaktadir. Agir zincir degisken bölgeleri, aksi belirtilmedikçe üç agir zincir CDR ve dört FR bölgesini kapsamaktadir. Agir zincirlerin fragmentleri, CDR'Ier, CDR*ler ve FR'Ier ve bunlarin kombinasyonlarini kapsamaktadir. Tipik bir agir zincir, degisken alani takiben (N terminalden C terminale) bir CH1 alani, bir kivrim, bir CH2 alani ve bir CH3 alanina sahiptir. Bir agir zincirin bir islevsel fragmenti, bir epitopu spesifik olarak taniyabilen (örnegin mikromolar, nanomolar veya pikomolar araliktaki bir KD*ye sahip epitopu taniyabilen), bir hücreden ekspresyon ve salgilama yapabilen ve en az bir CDR içeren bir fragmenti kapsamaktadir. Sekans ile baglantili olarak kullanildiginda "özdeslik" kelimesi, nükleotit ve/veya amino asit özdesliginin ölçülmesi için kullanilabilen, teknikte bilinen birkaç farkli algoritma tarafinadn belirlenen özdesligi kapsamaktadir. Burada açiklanan bazi yapilandirmalarda, özeslikler, 10.0'lik bir açik bosluk kusurunun bulundugu 1.83 (yavas) hizalamali bir ClustalW v kullanilarak veya bir Gonnet benzerlik matrisi (MACVECTORTM 10.02, MacVector Inc., 2008) kullanilarak belirlenmektedir. Sekanslarin özdesliklerine göre kiyaslanan sekanslarin uzunlugu, belirli sekanslara bagli olacaktir, ancak bir hafif zincir sabit alan durumunda, uzunluk; bir kanonik hafif zincir sabit alaninin olusturulmasi için kendi kendine birlesebilen, örnegin beta sarmallar içeren iki beta plakasini olusturabilen ve bir isna veya bir frenin en az bir CH1 alani ile etkilesimde olabilen bir hafif zincir sabit alani halinde katlanmak için yeterli uzunluktaki bir sekansi içermelidir. Bir CH1 alani durumunda ise, sekansin uzunlugu; beta sarmallar içeren iki beta plaka olusturabilen ve bir fare veya bir insanin en az bir hafif zincir sabit alani ile etkilesimde olabilen bir CH1 alanina katlanmak için yeterli uzunluklari bir skansi içermelidir. hafif zincir içermektedir. Agir zincirler özdes veya farkli olabilmektedir ve hafif zincir özdes veya farkli olabilmektedir. içerebilmektedir ve aksi belirtilmedikçe vekil hafif zincirlerin yani sira insan K ve A hafif zincirlerini ve bir VpreB içermektedir. Hafif zincir degisken (VL) alanlar, tipik olarak, aksi belirtilmedikçe üç hafif zincir CDR ve dört çerçeve (FR) bölgesi içermektedir. Genel olarak, tam uzunluktaki bir hafif zincir, amino terminustan karboksil terminusa, FR1- CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 içeren bir VL alani ve bir hafif zincir sabit alani içermektedir. Hafif zincirler, örnegin ortaya çiktiklari epitop baglama proteini tarafindan seçici sekilde baglanan bir birinci veya bir ikinci epitopu seçici bir sekilde baglamayanlari kapsamaktadir. Hafif zincirler ayrica, ortaya çiktiklari epitop baglama proteini tarafindan seçici bir sekilde baglanan bir veya daha fazla epitopu baglayan veya taniyan veya bunlari baglamasi veya tanimasi için agir zinciri yönlendirenleri içermektedir. Ortak hafif zincirler, yeniden düzenlenmis bir insan VK1-39JK5 sekansi veya yeniden düzenlenmis bir insan VK3-20JK1 sekansindan elde edilenlerdir ve somatik olarak mutasyonlu (örnegin matür afiniteli) verisyonlari kapsamaktadir. nükleik asit sekansina referansi kapsamaktadir, burada sinifi-degistirilmis B hücresindeki bir immünoglobulin degisken bölgesinin nükleik asit sekansi (örnegin bir agir zincir degisken alani veya bir agir zincir CDR veya FR sekansi dahil), sinif degistirmeden önceki B hücresindeki nükleik asit ekansi ile özdes degildir, örnegin sinif degisimine ugramayan bir B hücresi ve sinif degisimine ugrayan bir B hücresi arasindaki bir CDR veya çerçeve nükleik asit sekansinda bir farklilik mevcuttur. immünoglobulin degisken bölge sekanslarina özdes olmayan matür afiniteli B hücrelerinden nükleik asit sekanslarina referansi kapsamaktadir (yani, germ hatti hücrelerinin genomundaki sekanslar). "Somatik olarak mutasyonlu" terimi, ayrica, B hücresinin ilgili bir epitopa maruz birakilmasindan sonra bir B hücresinden bir immünoglobulin degisken bölge nükleik sait sekansina bir referansi kapsamaktadir, burada nükleik asit sekansi, B hücresinin ilgili bir epitopa maruz birakilmasindan önce ilgili nükleik asit sekansindan farklidir. "Somatik olarak mutasyonlu" terimi, bir immünojen yüklemesine yanit olarak insan immünoglobulin degisken bölgesi nükleik asit sekansina sahip bir hayvanda, örnegin bir farede meydana getirilen ve bu tür bir hayvanda tabiati geregi operatif olan seleksiyon prosesinden kaynaklanan antikorlara ait sekanslara isaret etmektedir. Bir nükleik asit sekansina referansla "yeniden düzenlenmemis" terimi, bir hayvan hücresinin germ hattinda bulunan nükleik asit sekanslarini kapsamaktadir. belirtilmedikçe) yandaki amino asit bölgelerini içeren bir immünoglobulin hafif veya agir zincirinin (arzu edilen sekilde modifiye) bir amino asit sekansini kapsamaktadir: FR1, Evrensel Hafif Zincir Kullanisli multispesifik epitop baglama proteinlerinin, örnegin bispesifik antikorlarin meydana getirilmesine yönelik önceki çabalar, siklikla ortak bir paradigmayi paylasan birçokl problen tarafindan engellenmistir: bir heterodimerik bispesifik insan immünoglobulinin eslenmesi için uygun bir formatin, mantiksal olarak tasarlanmasi veya deneme-yanilma yoluyla tasarlanmasi için sekanslarin in vitro seleksiyonu veya manipülasyonu. Ne yazik ki, in vitro tasarim yaklasimlarinin tamami olmasa da çogu, Çogunlukla, hiç degilse bireysel moleküller için uygun olan ad hoc fiksler saglamaktadir. Diger yandan, insan terapötiklerine yol açabilen uygun eslesmelerin seçilmesi için kompleks organizmalarin kullanilmasina yönelik in vivo yöntemler taninmamistir. Fare genomuna rastgele yerlestirilen insan immünoglobulin Iokuslari, degisken ve sabit bölgeler içeren fareler teknikte bilinmektedir. Bu tür farelerin baslangiç suslari, sinirli sayida insan immünoglobulin gen segmentleri içermistir. Spesifik olarak, insan immünoglobulin hafif zincir gen segmentleri içeren suslar, bir, üç veya dört insan immünoglobulin VL gen segmenti ve bes insan immünoglobulin JL gen segmenti tam insan transgenlerinin bir kismi olarak birkaç insan immünoglobulin VL gen segmenti içeren bu fareler, kötülesmis B hücresi sayilari, bozulmus B hücresi gelisimi ve diger immün yetmezlikler sergilemistir. B hücreleri üzerinde insan CK*sinin yüzey ekspresyonu tarafindan belirlendigi üzere, insan immünoglobulin VL genlerinin ekspresyonu, yaban tip ile kiyaslandiginda endojen K hafif zincirden daha düsüktü. Sasirtici bir sekilde, mevcut bulus, fareler, bir veya iki insan immünoglobulin VK gen segmentlerini içermesi için endojen immünoglobulin K hafif zincir Iokuslarinda tasarlanandiginda, B hücresi sayilarinin ve gelisiminin neredeyse yaban tipi oldugu fareler saglamaktadir (örnegin yapilandirmalarda, mevcut bulus tarafindan saglanan fareler, antijene yanit olarak insan VH ve VL alanlari içeren birkaç yüksek afiniteli ters kimerik antikoru meydaba getirebilmektedir, burada VL alanlarindan her biri, iki olasi insan VL gen segmentinden birini ve bes olasi insan JL gen segmentinden birini içermektedir (örnegin bakiniz Ornekler 5 ila 10, 12 ve 14). Dolayisiyla, insan immünoglobulin hafif zincir mini Iokuslarii ile tasarlanan farelerin ön suslariin aksine (yani sinirli sayida insan immünoglobulin gen segmenti), burada saglanan, sinirli sayida insan immünoglobulin VL gen segmenti (iki) ve 5 insan immünoglobulin JL gen segmenti içeren tasarlanmis fareler, sasirtici bir sekilde, normal B hücresi sayilari, normal immünoglobulin hafif zincir ekspresyonu ve normal B hücresi gelisimi sergilemektedir. Dahasi, saglanan bu fareler ayrica, sinirli immünoglobulin hafif zincir repertuvarinin bir sonucu olarak çoklu antijenlere güçlü immün yanitlar vermeye yönelik azaltilmis veya zayiflamis bir yeti sergilememektedir. Bu baglamda, yensiden düzenlenmemis iki insan immünoglobulin VL gen segmenti ve 5 insan immünoglobulin JL gen segmenti içeren bir insanlastirilmis VL lokusu içeren ve yaban tipi B hücresi popülasyonu sergileyen ve yaban tipi B hücresi gelisimi sergileyen fareler saglanmaktadir. Dolayisiyla bir farenin germ hatti genomuna sunlar verilmektedir: bir fare veya siçan immünoglobulin hafif zincir sabit bölge sekansi ile faal olarak birlestirilen bes insan immünoglobulin JK gen segmenti ve iki insan immünoglobulin VK gen segmenti, burada iki insan immünoglobulin VK gen segmenti bir insan VK1-39 ve bir insan VK3-20'dir ve bes insan immünoglobulin JK gen segmenti ise insan JK1, insan JK2, insan JK3, insan JK4, ave insan JK5'III'; ve bir veya daha fazla insan immünoglobulin VH gen segmenti, bir veya daha fazla insan immünoglobulin DH gen segmenti; ve bir fare veya siçan immünoglobulin sabit bölge sekansina faal olarak birlestirilen bir veya daha fazla insan immünoglobulin JH gen segmenti; burada immunoglobulin insan geni segmentleri, bir antikorun insan immünoglobulin degisken alanlarini yeniden düzenleyebilmektedir ve kodlayabilmektedir ve ayrica burada fare, bir immünoglobulin hafif zincir degisken bölge sekansinin meydana getirilmesi için yeniden düzenleme gerçeklestirebilen bir endojen immünoglobulin VL geni segmenti içermemektedir. Genel olarak, natif fare sekanslari, insan terapötik sekanslari için genellikle iyi bir kaynak degildir. En azindan bu sebeple, bir ortak insan hafif zincir içi eslesen fare agir zincir immünoglobulin degisken bölgelerinin meydana getirilmesinin faydasi sinirlidir. Kesin olmayan bir çikti ile birlikte ortak insan hafif zinciri ile birlesme yetisi korunurken epitop spesifitesinin ve afinite korunurken, fare agir zincir degisken sekanslarinin insanlastirilmasinin denenlesi için bir deneme yanilma prosesinde in vitro tasarim çabalari daha da genisletilebilmektedir. Bu tür bir prosesin sonunda, nihai 'ürün, spesifite ve afinitenin bir kismini koruyabilmektedir ve ortak hafif zincir ile iliskilenebilmektedir, ancak bir insandaki nihai immünojenesitenin etkin bir risk Dolayisiyla, insan terapötiklerinin meydana getirilmesine yönelik uygun bir fare, endojen fare agir zincir degisken bölge gen segmentlerinin yerine insan agir zincir degisken bölge gen segmentlerinin uygun genislikteki bir repertuvarini içerebilmektedir. Insan agir zincir degisken bölge gen segmentleri, bir ters kimerik agir zincirin meydana getirilmesi için (yani bir insan degisken alani ve bir fare sabit bölgesi içeren bir agir zincir), bir endojen fare agir zincir sabir alanini yeniden düzenleyebilmelidir ve bununla yeniden birlesebilmelidir. Agir zincir, sinif degisimi ve somatik hipermutasyon kapasitesine sahip olmalidir, böylelikle agir zincir degisken alanlarin uygun sekilde genis bir repertuvari, insan hafif zincir degisken bölgelerinin sinirli repertuvari ile iliskilenebilen birinin seçilmesi bakimindan fare için uygundur. Birden çok agir zincir için bir ortak hafif zinciri seçen bir farenin pratik bir faydasi bulunmaktadir. Çesitli yapilandirmalarda, yalnizca bir ortak hafif zinciri eksprese edebilen bir farede ekspresyon gerçeklestiren antikorlar, bir özdes veya büyük oranda özdes hafif zincir ile iliskilenebilen ve bununla ekspresyon gerçeklestirebilen agir zincirlere sahip olacaktir. Bu, bispesifik antikorlar meydana getirilirken özellikle kullanislidir. Örnegin, bu tür bir fareye, bir birinci epitopu spesifik olarak baglayan bir antikoru eksprese eden bir B hücresinin meydana getirilmesi için bir birinci immünojen ile bagisiklik kazandirilabilemktedir. Fareye (veya genetik oalrak ayni olan bir fareye), ikinci epitopu spesifik olarak baglayan bir antikoru eksprese eden bir B hücresinin meydana getirilmesi için bir ikinci immünojen ile bagisiklik kazandirilabilmektedir. Degisken agir zincir bölgeleri B hücrelerinden klonlanabilmektedir ve bir bispesifik antikorun meydana getirilmesi için bir hücrede ayni agir zincir sabit bölgesi ve ayni degisken hafif zincir bölgesi (örnegin bir ortak hafif zincir) ile eksprese edilebilmektedir, burada bispesifik antikorun degisken agir zincir bileseni, degisken hafif zincir (veya ortak hafif zincir) bileseni ile iliskilendirilmesi ve ekspresyon gerçeklestirmesi için bir fare tarafindan seçilmistir. Bulus sahipleri, örnegin matür afiniteli veya somatik olarak mutasyonlu degisken bölgeler olmak üzere degisken bölgelerinin germ hatti sekanslarindan ayrildigi agir zincirler de dahil olmak üzere, agir zincirlerin oldukça çesitli bir ailesi için uygun sekilde eslesecek olan immünoglobulin hafif zincirlerin meydana getirilmesi için bir fare tasarlamislardir. Çesitli yapilandirmalarda, fare, somatik mutasyonlar içeren insan agir zincir degisken alanlari ile insan hafif zincir degisken alanlarinin eslestirilmesi, dolayisiyla insan terapötikleri olarak kullanim için uygun olan yüksek afiniteli baglama proteinlerine yönelik bir yolun saglanmasi için düzenlenmektedir. Bir organizma ile antikor seleksiyonuna yönelik uzun ve kompleks bir proses vasitasiyla genetigi degistirilen fare, insan agir zincir degisken alanlarinin çesitli bir koleksiyonu ile sinirli sayidaki insan hafif zincir opsiyonlarinin eslestirilmesinde biyolojik olarak uygun seçimler yapmaktadir. Bunun elde edilmesi için, çok çesitli insan agir zincir degisken alan opsiyonlari ile birlikte sinirli sayidaki insan hafif zincir degisken alan opsiyonlarinin sunulmasi için tasarlanmaktadir. Bir immünojen ile yüklemenin ardindan, fare, genis çapli olarak veya yalnizca repertuvarindaki hafif zincir opsitonlarinin sayisi ile sinirlandirilan immünojene yönelik bir antikorun gelistirilmesi için repertuvarindaki çözüm sayisini maksimuma çikarmaktadir. Çesitli yapilandirmalarda, bu, fareni;, özellikle somatik olarak mutasyonlu insan agir zincir degisken alanlari da dahil olmak üzere görece fazla çesitlilikteki insan agir zincir degisken alanlari ile uygumlu olacak olan hafif zincir degisken alaninin uygun ve uyumlu somatik mutasyonlarini elde etmesinin mümkün kilinmasini içermektedir. Hafif zincir opsiyonlarinin sinirli bir repertuvarinin elde edilmesi için, fare, bir natif fare hafif zincir degisken alanini meydana getirme veya yeniden düzenleme yetisinin islevsiz kilinmasi veya büyük oranda islevsiz kilinmasi için tasarlanmaktadir. Bu, örnegin farenin hafif zincir degisken bölge gen segmentlerinin silnmesiyle elde edilebilemektedir. Endojen fare lokusu, böylelikle; ekzojen insan degisken bölge segmentlerinin, endojen fare hafif zincir sabit bölge geni ile kombine edilebilecegi sekilde ve yeniden düzenlenmis bir ters kimerik hafif zincir geninin olusturulacagi sekilde (insan degisken, fare sabit), endojen fare hafif zincir sabit alani ile faal olarak birlestirilen, tercih edilen bir eksojen uygun insan hafif zincir degisken bölge gen segmenti vasitasiyla modifiye edilebilmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, hafif zincir degisken bölgesi, somatik olarka mutasyona ugrayabilmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, hafif zincir degisken bölgesinin somatik mutasyonlar kazanma kapasitesinin maksimize edilmesi için uygun artiricilar farede tutulmaktadir. Ornegin, endojen fare K hafif zincir gen segmentlerinin insan K hafif zincir gen segmentleri ile degistirilmesi için vir fare K hafif zincir lokusunun modifiye edilmesinde, fare K intronik artirici veya fare K 3, artirici, islevsel olarak korunmaktadir veya bozulmamaktadir. Genetigi degistirilmis bir fare saglanmakta olup, çesitli ters kimerik (insan degisken, fare sabit) agir zincirleri isle iliskilendirilen ters kimerik (insan degisken, fare sabit) hafif zincirlerin sinirli bir repertuvarini eksprese etmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, endojen fare K hafif zincir gen segmentleri silinmektedir ve endojen fare CK geni ile faal olarak birlestirilen iki yeniden düzenlenmis insan hafif zincir bölgesi ile degistirilmektedir. Yeniden düzenlenmis insan hafif zincir bölgesinin somatik hipermutasyonunun maksimize edilmesine yönelik yapilandirmalarda, fare K intronik artirici ve fare K 3' artirici korunmaktadir. Çesitli yapilandirmalarda, fare ayrica, islevsel olmayan bir A hafif zincir lokusu veya bunun bir delesyonu veya lokusun bir A hafif zincirini meydana getirememesini saglayan bir delesyon içermektedir. Ayrica, çesitli durumlarda, endojen fare hafif zincir VL ve JL gen segmentlerine sahip olmayan ve yeniden düzenlenmis bir insan hafif zincir degisken bölgesi, bir durumda bir fare sabit bölgesine faal olarak birlestirilen, yeniden düzenlenmis bir insan VL/JL sekansi içeren bir hafif zincir degisken bölge lokusunu içeren genetigi degistirilmis bir fareye atifta bulunulmaktadir, burada Iokus, somatik hipermutasyona ugrayabilmektedir ve burada Iokus, bir dare sabit bölgesi ile birlestirilen insan VL/JL sekansi içeren bir hafif zinciri eksprese etmektedir. Dolayisiyla, çesitli durumlarda, lokus, bir normal veya yaban tipi somatik hipermutasyon seviyesi ile iliskili olan bir fare K 3' artirici içermektedir. Ilgili bir antijen ile bagisiklik kazandirildiginda, iki hafif zincirin, örnegin 1 ila 5 somatik hipermutasyon içeren insan hafif zincir degisken bölgelerini içerdigi yapilandirmalar da dahil olmak üzere, çesitli yapilandirmalardaki genetigi degistirilmis fare, yeniden düzenlenmis iki hafif zinviri eksprese eden ve bununla islev gösteren insan immünoglobulin agir zincir degisken bölgelerinin çesitli yeniden düzenlemelerini sergileyen B hücrelerini meydana getirmektedir. Çesitli yapilandirmalarda, bu sekilde eksprese edilen insan hafif zincirleri, farede eksprese edilen herhangi bir insan immünoglobulin agir zincir degisken bölgesi ile iliskilenebilmektedir ve ekspresyon gerçeklestirebilmektedir. Sinirli immünoglobulin hafif zincir repertuvarini (örnegin bir tek insan VL gen segmenti veya ikiden fazla olmayan insan VL gen segmentleri ve bir insan JL gen segmenti veya opsiyonel olarak iki veya daha fazla insan Ji_ gen segmentleri) içeren, burada açiklanan genetigi degistirilmis farelere ilaveten, bir tek insan VL gen segmenti veya ikiden fazla olmayan insan VL gen segmentleri içeren genetigi degistirilmis, insan olmayan diger hayvanlar da burada açiklanmaktadir. Bazi durumlarda, bu tür insan olmayan hayvanlar, yeniden düzenlenmis bir insan VLJL sekansindan olusan bir tek yeniden düzenlenmis insan VL bölgesi içermektedir. Bazi durumlarda, bu tür insan olmayan hayvanlar, ikiden fazla olmayan insan VL gen segmentleri ve iki veya daha fazla (örnegin 2, 3, 4 veya 5 insan JL gen segmenti içermektedir. Çesitli durumlarda, insan gen segmentleri, bir insan olmayan hafif zincir sabit bölgesi, örnegin bir fare veya siçan hafif zincir sabit bölgesi ile faal olarak birlestirilmektedir. Saglanan insan olmayan hayvanlar bir faredir. Genetigi degistirilebilir uygun ES hücrelerinin kolaylikla erisilebilir olmadigi insan olmayan hayvanlar bakimindan, burada açiklanan genetik modifikasyonlari içeren, insan olmayan bir hayvanin meydana getirilmesi için diger yöntemler uygulanmaktadir. Bu tür yöntemler, örnegin ES olmayan bir genomun modifiye edilmesi (örnegin bir fibroblast veya bir indüklenmis pluripotent hücre) ve modifiye genomun uygun bir hücreye, örnegin bir oosite tasinmasi için nükleer tasimanin kullanilmasi ve bir embiyonun olusturulmasi için uygun kosullar altinda insan olmayan bir hayvanda modifiye hücrenin (örnegin modifiye oosit) gebe birakilmasini kapsamaktadir. Bazi yapilandirmalarda, saglanan fare, C57BL/A, CSTBL/An, C57BL/GrFa, 129 susudur (bakiniz, örnegin Festing ve meslektaslari, 1999, Mammalian Genome Belirli bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun genetigi degistirilmis bir faresi, yukarida bahsi geçen bir 129 susu ve yukarida bahsi geçen bir C578L/6 susunun bir karisimidir. Bazi belirli yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, yukarida bahsi geçen 129 suslarinin bir karisimi veya yukarida bahsi geçen BL/6 suslarinin bir karisimidir. Bazi belirli yapilandirmalarda, bruada açiklanan karisimin bir 129 susu, bir 12986 (129/8vEvTac) susudur. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, bir BALB susu, örnegin BALB/c susudur. Bazi yapilandirmalarda, mevcut bulusun bir faresi, bir BALB susu ve yukarida bahsi geçen bir baska susun bir karisimidir. Birden Fazla Epitopu Baglayan Epitop-baglama Proteinleri Burada açiklanan bilesimler ve yöntemler, yüksek afinite ile birden fazla epitopu baglayan baglama proteinlerinin, örnegin bispesifik antikorlarin meydana getirilmesi için kullanilabilmektedir. Bulusn avantajlari, yüksek baglamali (örnegin matür afiniteli) agir zincir immünoglobulin zincirlerinin uygun sekilde seçilebilmesini kapsamakta olup, bunlardan her biri tek bir hafif zincir ile iliskilenecektir. Rekombinant hücre kültüründen bispesifik antikor fragmentlerinin meydana getirilmesine yönelik çesitli teknikler rapor edilmistir. Ancak, bispesifik baglama proteinlerinin sentezi ve ekspresyonu, kismen, iki farkli agir zincir ile iliskilenebilen ve ekspresyon gerçeklestirebilen uygun bir hafif zincirin belirlenmesi ile iliskili sorunlardan dolayi ve kismen de izolasyon sorunlarindan dolayi promlemli olagelmistir. Çesitli yapilandirmalarda, burada açiklanan bilesenler ve yöntemler, bilesenlerin stabilite/interaksiyonunun artirilmasi vasitasiyla geleneksel immünoglobulin yapisinin korunmasi için özel modifikasyonlar gerektirmeyen tam uzunluktaki bispesifik antikorlara yönelik bir avantaj sunmaktadir (Sekil 7A). Çesitli yapilandirmalarda, bu tür modifikasyonlarin, elverissiz oldugu ve bispesifik antikor teknolojisinin gelisimi ve bunlarin insan gastaliginin tedavisinde kullanimi bakimindan bir engel olusturdugu kanitlanmistir. Dolayisiyla, çesitli yapilandirmalada, çoklu spesifitelerin birbirine eklenmis özelligine sahip dogal bir immünoglobulin yapisinin (yani tam uzunluktaki) saglanmasi vasitasiyla, tam uzunluktaki bispesifik antikorlar, önceki bispesifik fragmentlerin sahip olmadigi kritik efektör islevlerinin korumaktadir ve ilaveten, daha uzun bir yari ömrün önemli farmakokinetik parametresini sergileyen terapötikleri saglamaktadir. Burada açiklanan yöntemler ve bilesimler, genetigi degistirilmis bir farenin, dogal prosesler araciligiyla, somatik olarak mutasyonlu agir zincirler (örnegin matür afiniteli) de dahil olmak üzere birden fazla agir zincir ile iliskilenebilen ve ekspresyon gerçeklestirebilen uygun bir hafif zinciri seçmesini mümkün kilmaktadir. Burada açiklanan, ters kimerik agir zincirlere (yani insan degisken ve fare sabit) sahip matür afiniteli antikorlari eksprese eden, bagisiklik kazandirilmis farenin uygun B hücrelerinden insan VL ve VH sekanslari, uygun bir insan sabit bölge gen sekansi (örnegin bir insan IgG1) ile bir ekspresyon vektörü içerisinde, çerçeve içinde belirlenebilmektedir ve klonlanabilmektedir. Bu tür iki yapi hazirlanabilmektedir, burada her bir yapi, afrkli bir epitopu baglayan bir insan agir zincir degisken alanini kodlamakytadir. Sekansin somatik olarak mutasyonu oldugu bir B hücresinden veya germ hatti sekansi içerisinde bir insan VLS (örnegin insan VK1-39JK5 veya insan VK3- 20JK1), uygun bir insan sabit bölge genine (örnegin bir insan K sabit geni) çerçeve içinde füzyonlanabilmektedir. Bu üç tam insan agir ve hafif yapilari, ekspresyon için uygun bir hücre içerisinde koyulabilmektedir. Hücre iki ana türü eksprese edecektir: özes hafif zincire sahip bir homodimerik agir zincir ve özdes hafif zincire sahip bir heterodimerik agir zincir. Bu ana türlerin kolay sekidle ayrilmasinin saglanmasi bakiminda, agir zincirlerden biri, bir Protein A baglama determinantinin hariç birakilmasi için modifiye edilmektedir, böylelikle bu, bir heterodimerik baglama proteininden farkli olan bir homodimerik baglama proteini afinitesi ile sonuçlanmaktadir. Bu probleme yanit Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format," baslikli, 25 Haziran 2010'da dosyalanan USSN 12/832,838'de açiklanmaktadir. Ayrica, bir epitop baglama proteinine atifta bulunulmaktadir, burada insan VL ve VH sekanslari, ilgili bir epitop içeren bir antijen ile bagisiklik kazandirilmis olan, burada açiklanan farelerden elde edilmektedir. Ayrica, bir birinci ve bir ikinci polipeptit içeren bir epitop baglama proteinine atifta bulunulmaktadir, birinci polipeptit, N-terminalden C-terminale kadar, bir birinci epitopu seçici sekilde baglayan bir birinci epitop-baglama bölgesi, ardindan IgG1, IgGZ, IgG4 ve bunlarin bir kombinasyonundan seçilen bir insan IgG'nin bir birinci CH3 bölgesini içeren bir sabit bölge içermektedir; ve bir ikinci polipeptit, N-terminalden C-terminale kadar, bir ikinci epitopu seçici bir sekilde baglayan bir ikinci epitop baglama bölgesi, ardindan CH3 bölgesini içeren bir sabit bölge içermektedir, burada ikinci CH3 bölgesi, ikinci CH3 alaninin protein Aiya baglanmasini azaltan veya elimine eden bir modifikasyon içermektedir. Bir durumda, ikinci CH3 bölgesi, bir H95R modifikasyonu içermektedir (lMGT ekson numaralandirlmasiyla; H435R, EU numaralandirmasiyla). Bir baska yapilandirmada, ikinci CH3 bölgesi ayrica, bir Y96F modifikasyonu içermektedir (IMGT; Y436F, EU ile) Bir durumda, ikinci CH3 bölgesi, bir modifiye insan IgG1'dendir ve ayrica, D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, ve V82l'den olusan gruptan seçilen bir modifikasyon içermektedir Bir durumda, ikinci CH3 bölgesi, bir modifiye insan IgG2idendir ve ayrica, N44S, K52N, ve V82liden olusan gruptan seçilen bir modifikasyon içermektedir (lMGT; N384S, K392N, ve V422I, EU ile). Bir durumda, ikinci CHS bölgesi bir modifiye insan IgG4'tendir ve ayrica, Q15R, N44S, Birden fazla epitop baglayan bir epitop-baglama proteininin meydana getirilmesine yönelik bir yöntem, ilgili bir birinci epitop içeren bir antijen ile bulusa göre bir birinci fareye bagisiklik kazandirilmasidir, burada fare, bir hafif zinciri yeniden düzenleyebilen ve olusturabilen bir endojen fare VL içermeyen bir endojen imm'L'inoglobuIin hafif zincir degisken bölge lokusu içermektedir, burada endojen fare immünoglobulin hafif zincir degisken bölge Iokusunda, fare endojen hafif zincir sabit bölge geni ile faal sekilde birlestirilen bir tek yeniden düzenlenmis insan VL bölgesi bulunmaktadir ve yeniden düzenlenmis insan VL bölgesi, bir insan VK1-39JK5 ve bir insan VK3-20Jkirden seçilmektedir ve endojen fare VH gen segmentleri, insan VH gen segmentleri ile tamamen veya kismen degistirilmistir, böylelikle fare tarafindan meydana getirilen immünoglobulin agir zincirler, yalnzica veya büyük oranda, insan degisken alanlarini ve fare sabit alanlarini içeren agir zincirlerdir. Bagisiklik kazandirildiginda, bu tür bir fare, iki insan hafif zincir degisken alanindan yalnizca birini içeren (örnegin insan VK1-39JK5 veya insan VK3-20JK1rden biri) bir ters kimerik antikoru meydana getirecektir. Ilgili epitopu baglayan bir VH'yi kodlayan bir B hücresi belirlendiginde, VH'nin (ve opsiyonel olarak VL) nükleotit sekansi, geri çekilebilmektedir (örnegin PCR ile) ve uygun bir insan immünoglobulin sabit alani ile çerçeve içinde bir ekspresyon yapisi olarak klonlanabilmektedir. Bir ikinci epitopu baglayan bir ikinci VH alaninin belirlenmesi için bu proses tekrar edilebilmektedir ve bir ikinci VH gen sekansi geri çekilebilmektedir ve bir ikinci uygun immünoglobulin sabit alan ile çerçeve içinde bir ekspresyon vektörü olarak klonlanabilmektedir. Birinci ve ikinci immünoglobulin sabit alanlari, ayni veya farkli izotipe sahip olabilmektedir ve immünoglobulin sabit alanlarindan biri (digeri degil), edilebilmektedir ve epitop baglama proteini, uygun bir hücre içerisinde eksprese edilebilmektedir ve bir homodimerik epitop baglama proteinine kiyasla, örnegin US afinitesine dayanarak izole edilebilmektedir. Bir yapilandirmada, bir bispesifik baglama proteininin meydana getirilmesine yönelik bir yöntem saglanmakta olup, burada açiklanan bir fareden bir birinci matür afiniteli (örnegin bir veya daha fazla somatik hipermutasyon içeren) insan VH n'ukleotit sekansinin (VH1) belirlenmesini, burada açiklanan bir fareden bir ikinci matür afiniteli (örnegin bir veya daha fazla somatik hipermutasyon içeren) insan VH nükleotit sekansinin (VH2) belirlenmesini, agir zincir 1iin (HC1) olusturulmasi için US modifikasyonuna sahip olmayan bir insan agir zinciri ile çerçevei içinde Vi-i1iin dokümanda açiklanan bir Protein A-determinant modifikasyonunu Içeren bir insan agir zinciri ile çerçeve içinde VH2rnin klonlanmasini, HC1 içeren bir ekspresyon vektörünün ve HC2 içeren ayni veya farkli bir ekspresyon vektörünün bir hücreye verilmesini, burada hücre ayrica bir insan hafif zincir sabit alanina füzyonlanan bir insan VK1- 39/insan JK5 veya bir insan VK3-20/insan JK1 içeren bir insan immünoglobulin hafif zincirini eksprese etmektedir, VH1 tarafindan kodlanan bir VH alani ve VH2 tarafindan kodlanan bir VH alani içeren bir bispesifik epitop baglama proteinini hücrenin eksprese etmesine izin verilmesini ve bir monospesifik homodimerik epitop baglama proteinine kiyasla Protein Aiyi baglamaya yönelik farkli afinitesine dayanarak bispesifik epitop baglama proteininin izole edilmesini içermektedir. Spesifik bir yapilandirmada, HC1 bir lgG1rdir ve HC2 ise, H95R modifikasyonunu (IMGT; H435R, EU ile) ve ayrica Y96F modifikasyonunu (lMGT; Y436F, EU ile) içeren bir IgG1rdir. Bir yapilandirmada, VH1 tarafindan kodlanan VH alani ve VH2 tarafindan kodlanan VH alani veya her ikisi de somatik olarak mutasyonludur. Bir Ortak Insan Vi_"si ile Ekspresyon Gerçeklestiren Insan Vi-i Genleri Dört farkli antijene karsi büyütüien matür afiniteli antikorlara ait birçok insan degisken bölgesi, kognat hafif zincirleri ile veya bir insan VK1-39/JK5, insan VK3-20/JK1 veya insan VpreB/JASiten seçilen en az bir insan hafif zinciri ile eksprese edilmektedir (bakiniz Ornek 1). Her bir antijeye yönelik antikorlar için, farkli gen ailelerine ait somatik olarak mutasyonlu, yüksek afiniteli agir zincirler, yeniden düzenlenmis insan germ hatti VK1-39JK5 ve VK3-2OJK1 bölgeleri ile basarili sekilde eslesmistir ve agir ve hafif zincirleri eksprese eden hücrelerden salgilanmistir. VK1-39JK5 ve VK3-20JK1 için, su insan VH gen ailelerinden elde edilen VH alanlari istenen sekilde ekspresyon ikisinden insan VL alanlarinin sinirli bir repertuvarini eksprese etmesi için tasarlanan bir fare, fare VH gen segmentlerinin insan VH gen segmenleri ile degistirilmesi için modifiye edilen bir VH Iokusundan somatik olarak mutasyonlu insan VH alanlarinin çesitli bir popülasyonunu meydana getirecektir. Ilgili bir antijen ile bagisiklik kazandirildiginda, bir tek yeniden düzenlenmis hafif zincir (örnegin VK1-39/J veya bir VK3-20/J) ile iliskilendirilen ters kimerik (insan degisken, fare sabit) immünoglobulin agir Zincirlerini eksprese etmesi için geentigi degistirilen fareler, Çesitli insan VH yeniden düzenlemeleri içeren B hücrelerini meydana getirmistir ve antijenin Iigandina baglanmasini engelleme kapasitelerine göre ve antijen varyantlarini baglama kapasitelerine göre çesitli özelliklere sahip yüksek afiniteli antijene özgü çesitli antikorlari eksprese etmistir (bakiniz Ornek 5 ila 10). Dolayisiyla, burada açiklanan fareler ve yöntemler, genis çapta afiniteler sergileyen (yaklasik bir nanomolar veya daha az olan bir KD sergileyenler dahil), genis çapta spesifiteler (ayni antijenin farkli epitoplarina baglanma dahil) segileyen, ayni veya neredeyse ayni insan immünoglobulin hafif zincir degisken bölgesi ile iliskilenen ve bunu eksprese eden insan immünoglobulin agir zincir degisken alanlarinin seçilmesi veya meydana getirilmesinde faydalidir. Ortak bir Hafif Zincire Sahip Tam Insan Bispesifik Antikorlar Çesitli yapilandirmalarda bir birinci adim olarak, her birinin insna agir zincir degisken alanlarini kodladigi birinci ve ikinci nükleik asit sekanslari (ve bispesifik antikoru olusturan herhangi bir ilave nükleik asit sekansi), örnegin farkli epitoplari baglama kapasitesi (bakiniz Sekiller 7A ve 78), farkli afinitelere sahip olma ve benzeri gibi arzu edilen özelliklere sahip olan ebeveyn monoklonal antikorlardan seçilmektedir. Normalde, insana uygulama için uygun olmasi için insan agir zincir sabit bölgeleri ile füzyonlananmasinin mümkün kilinmasi için, insan agir zincir degisken alanlarini kodlayan nükleik asit sekanslari bagisiklik kazandirilan farelerden izole edilmektedir. Sekanslara yönelik diger modifikasyonlar, bispesifik antikora ilave islevsellik ekleyen mutasyonlarin verilmesiyle gerçeklestirilebilmekte olup, bunlar, örnegin serum yari ömrünün artirilmasini (örnegin bakiniz, U.S. 7,217,797) ve/veya antikora bagimli hücre aracili sitotoksisitenin artirilmasini (örnegin, bakiniz 6, 737, 056) kapsamaktadir. Antikorlarin sabit bölgelerine mutasyonlarin verilmesi teknikte bilinmektedir. ilaveten, bispesifik antikorun bir kismi hücre kültürü içerisinde rekombinant sekilde meydana getirilebilmektedir ve molekülün diger kisimlari ise yukarida bahsi geçen teknikler vasitasiyla gerçeklestirilebilmektedir. Antikorlarin üretilmesine yönelik çesitli teknikler açiklanmistir. Ornegin, çesitli yapilandirmalarda, kimerik antikorlar burada açiklanan sekilde farelerde üretilmektedir. Antikorlar dogrudan bagisiklik kazanmis bir farenin B hücrelerinden izole farenin B hücreleri, hibridomlarin meydana getirilmesi için kullanilabilmektedir (Kohler ve/veya hafif zincirler) kodlayan DNA, konvansiyonel teknikler kullanilarak kolaylikla izole edilmekte ve sekanslanmaktadir. Burada açiklanan fareden elde edilen Hibridom ve/veya B hücreleri, bu tür DNA için tercih edilen bir kaynak olarak islev görmektedir. Izole edildiginde, DNA ekspresyon vektörlerine yerlestirilebilmekte olup, ardindan bunlar, rekombinant konak hücrelerde monoklonal antikorlarin sentezinin saglanmasi için, immünoglobulin üretmeyen konak hücrelere transfekte edilmektedir. DNA ayrica, mirün sekanslarinin yerine insan agir ve hafif zinvir sabir alanlarina yönelik kodlama sekanslarinin ikame edilmesiyle modifiye edilebilemektedir. Çesitli yapilandirmalarda, DNA izolasyonundan ve istenen spesifitelere/afinitelere sahip birinci ve ikinci insan agir zincir degisken alanlarini kodlayan birinci ve ikinci nükleik asit sekanslarinin ve bir insan hafif zincir alanini kodlayan bir üçüncü nükleik asit sekansinin (bir germ hatti yeniden düzenlenmis sekans veya burada açiklanan bir fareden izole edilmis bir hafif zincir sekansi) seçilmesini takiben, molekülleri kodlayan üç nükleik asit sekansii teknikte fazlaca yaygin olan rekombinant teknikler kullanilarak bispesifik antikorun olusturulmasi için eksprese edilmektedir. Genelde, seçilen ekspresyon sistemi, bir memeli hücresi ekspresyon vektorüne ve konaga sahip olacaktir, böylelikle bispesifik antikor uygun sekilde glikozlanmaktadir (örnegin bispesifik antikorlarin glikozlanmis antikor alanlari içermesi durumunda). Ancak, moleküller ayrica prokaryotik ekspresyon sistemlerinde de üretilebilmektedir. Normalde, konak hücre, tek bir vektör üzerine veya bagimsiz vektörler üzerinde birinci insan agir zinvir degisken alani, ikinci insan agir zincir degisken alani ve insan hafif zincir alanini kodlayan DNA ile dönüstürülecektir. Ancak, bagimsiz ekspresyon sistemlerinde birinci insan agir zincir degisken alani, ikinci insan agir zincir degisken alani ve insan hafif zincir alaninin (bispesifik antikor bilesenleri) eksprese edilmesi ve eksprese edilmis polipeptitlerin in vitro birlestirilmesi mümkündür. Çesitli yapilandirmalarda, insan hafif zincir alani hafif zincir alaninin hafif zincir degisken sekansi ile birden fazla olmayan, ikiden fazla olmayan, üçten fazla olmayan, dörtten fazla olmayan veya besten fazla olmayan somatik hipermutasyonlar içermektedir. Çesitli yapilandirmalarda, iki agir zinciri ve tek insan hafif zincirini kodlayan nükleik asitler (örnegin cDNA veya genomik DNA), sonraki klonlamalar (DNA'nin çogaltilmasi) ve/veya ekspresyon için kopyalanabilen bir vektörün içerisine eklenmektedir. Birçok vektör kullanilabilir olup, bunlarla sinirli olmamak üzere genellikle yandakilerden bir veya daha fazlasini kapsamaktadir: bir sinyal sekansi, replikasyonun bir kaynagi, bir veya daha fazla isaretçi gen, bir artici eleman, bir promotör ve bir transkripsiyon sonlandirma sekansi. Her bilesen, bireysel olarak, veya deneysel olarak belirlenen bir konak hücresi seçimine veya diger kriterlere dayanarak seçilebilmektedir. Her bir bilesenin çesitli örnekleri teknikte bilinmektedir. Ekspresyon ve klonlama vektörleri genellikle, konak organizma tarafindan taninan ve bispesifik antikorun her bir bilesenini veya bilesenlerinin tamamini kodlayan nükleik asit sekanslarina faal olarak birlestirilen bir promotör içermektedir. Çesitli potansitel konak hücreler tarafindan taninan birçok sayida promotör bilinmektedir. Bu promotörler, restriksiyon enzim sindirimi vasitasiyla kaynak DNAJdan promotörün giderilmesi ve izole edilmis promotör sekansinin vektöre eklenmasi vasitasiyla bispesifik antikor kodlayici DNA ile faal olarak birlestirilebilmektedir. Okaryotik konak hücrelerde kullanilan ekspresyon vektörleri (maya, fungi, böcek, bitki, hayvan, insan veya diger çok hücreli organizmalardan nükleatli hücreler) ayrica mRNAinin stabilize edilmesi için ve transkripsiyonun sonlandirilmasi için gereken sekanslari da içerebilmektedir. Bu tür sekanslar, ökaryotik veya viral DNA'Iar veya cDNAilarin çevrilmemis bölgelerinin yaygin olarak 5' ve kimi zaman 3' ünde mevcuttur. Bu bölgeler, bispesifik anitkor bilesenlerini kodlayan mRNA'nin çevrilmemis kisminda poliadenillenmis fragmentler olarak transkripsiyonu yapilan nükleotit segmentleri içermektedir. Çesitli yapilandirmalara yönelik uygun ekspresyon vektörleri, bispesifik antikoru kodlayan DNArnin memli hücrelerinde geçici ekspresyonunu saglayanlari kapsamaktadir. Genel olarak, geçici ekSpresyon, bir konak hücre içerisinde etkin bir sekilde kopyalanabilen bir ekspresyon vektörünün kullanimini içermektedir, böylelikle konak hücre, ekspresyon vektörünün birçok kopyasini biriktirmektedir ve dolayisiyla ekspresyon vektörü tarafindan kodlanan, arzu edilen polipeptitin yüksek seviyelerini sentezlemektedir. Uygun bir ekspresyon vektörü ve bir konak hücre içeren geçici ekspresyon sistemleri, klonlanmis DNA'lar tarafindan kodlanmis polipeptitlerin uygun olarak pozitif sekilde belirlenmesini saglamasinin yani sira, birinci veya ikinci insan agir zincir degisken alanlarinin komodimerlerine sahip ebeveyn antikorlara göre arzu edilen baglama spesifitelerine/afinitelerine veya arzu edilen jel migrasyon özelliklerine sahip bispesifik antikorlarin hizlica taranmasini saglamaktadir. Çesitli yapilandirmalarda, bispesifik antikorun bilesenlerini kodlayan DNA yukarida açiklandigi üzere arzu edilen vektörler halinde birlestirildiginde, bunlar, ekspresyon ve egri kazanim için uygun bir konak hücreye verilmektedir. Konak hücrelerin transfekte edilmesi, seçilen konak hücreye uygun teknikte bilinen standart yöntemler kullanilarak gerçeklestirilebilmektedir (örnegin elektroporasyon, nükleer mikroenjeksiyon, intakt hücreler veya polikatyonlar, örnegin polibren, poliornitin, ve benzeri ile bakteriyel protoplast füzyon). Çesitli yapilandirmalarda, bilesenleri içeren ekspreston vektörüne en uyumlu olan ve bispesifik antikor türlerinin en etkili ve faydali üretimini mümkün kilan bir konak hücre seçilmektedir. Ekspresyona yönelik örnek konak hücreler prokaryotlar ve ökaryotlar (tek hücre veya çoklu hücre), bakteriyel hücreler (örnegin E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., vb. suslari), miyobakteri hücreleri, fungal hücreler, maya hücreleri (örnegin 8. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, vb.), bitki hücreleri, böcek hücreleri, (örnegin SF-9, SF-21, bakülovirüs enfekteli böcek hücreleri, Trichoplusia ni, vb.), insan olmayan hayvan hücreleri, insan hücreleri veya örnegin hibridomlar veya kuadromlar gibi hücre füzyonlarini kapsamaktadir. Çesitli yapilandirmalarda hücre bir insan, maymun, sebek, hamster, siçan veya fare hücresidir. Çesitli yapilandirmalarda, hücre, CHO (örnegin, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (örnegin CCS-7), BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, C, tümör hücresi ve yukarida bahsedilen bir hücreden elde edilen bir hücre hattindn seçilen ökaryotik hücredir. Çesitli yapilandirmalarda, hücre, bir veya daha fazla viral gen, örnegin bir viral geni eksprese eden bir retinal hücre (örnegin bir PER.06TM hücresi) içermektedir. Bispesifik antikorun üretilmesi için kullanilan memeli konak hücreleri, birçok ortamda kültürlenebilmektedir. Ham F10 (Sigma), Minimal Yeterli Ortam ((MEM), Sigma), RPMI- gibi piyasada mevcut ortamlar, konak hücrelerin kültürlenmesi için uygundur. Ortamlar, hormonlar ve/veya diger büyüme faktörleri (örnegin insülin, fransferrin veya epidermal büyüme faktörü), tuzlar (örnegin sodyum klorür, kalsiyum, magnezyum ve fosfat), tamponlar (örnegin HEPES), nükleositler (örnegin adenosin ve timidin), antibiyotikler (örnegin GENTAMYCINTM), iz elemanlari (mikromolar aralikta her zaman nihai konsantrasyonalrda bulunan inorganik bilesikler olarak tanimlanmaktadir) ve glukoz veya es degerdeki bir enerji kaynagi ile gerektiginde takviye göebilemtkedir. Diger herhangi bir takviye maddesi de teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen uygun konsantrasyonlarda eklenebilir. Sicaklik, pH ve benzeri gibi kültür kosullari, çesitli yapilandirmalarda, ekspresyon için seçien konak hücresi ile önceden kullanilan kosullardir ve teknikte uzman kisiler tarafindan bilinecektir. Bispesifik antikor, çesitli yapilandirmalarda, salgilanmis bir polipeptit olarak kültür ortamindan geri kazanilabilmektedir, ancak bu ayni zamanda, bir salgilayici sinyal olmaksizin dogrudan üretildiginde konak hücre lizastindan da geri kazanilabilmektedir. Bispesifik antikorun zara bagli olmasi durumunda, uygun bir kir sökücü çözelti (örnegin Triton-X 100) kullanilarak zardan salinabilmektedir. Tercihen, burada açiklanan bispesifik antikorlar, bir birinci immünoglobulin CH3 alani ve bir ikinci immünoglobulin CH3 alaninin kullanimini içermektedir, burada birinci ve ikinci immünoglobulin CH3 alanlari, en az bir amino asit bakimindan birbirinden farklidir ve burada en az bir amino asit farkliligi, spesifik antikorun Protein A'ya baglanmasini, amino asit farkliliginin numarali doküman). Bir yapilandirmada, birinci immünoglobulin CHS alani, Protein Aiyi baglamaktadir v ikinci immünoglobulin CH3 alani, bir H95R modifikasyonu gibi (IMGT ekson numaralandirmasi; H435R, EU numaralandirmasi ile) gibi Protein Aryi indirgeyen veya iptal eden bir mutasyon içermektedir. Ikinci CH3 ayrica, bir Y96F modifikasyonu içermektedir (IMGT; Y436F, EU ile). Ikinci CHS içerisinde bulunabilen diger durumunda. Yukarida açiklanan bi-spesifik antikor formatindaki varyasyonlar, mevcut bulusun kapsami içerisinde tasarlanmaktadir. Bispesifik antikorlarin ikili dogasindan ötürü (yani bir polipeptitin farkli epitoplarina özgü olabilmektedir veya birden fazla hedef polipeptite özgü antijen baglama alanlari içerebilmektedir, bakiniz Sekil YB; ayrica bakiniz, Örnegin Tutt ve meslektaslari, 1991, terapötik uygulama için birçok faydali avantaj sunmaktadir. Ornegin, bispesifik antikorlar, trombolitik ajanlarin pihtilara tasinmasi, bir hedef bölgede (örnegin bir tümör) enzim aktivasyonlu pro-ilaçlarin dönüstürülmesi için, bulasici hastaliklarin tedavi edilmesi için, hücre yüzeyi reseptörlerine immün komplekslerinin hedeflenmesi için veya tümör hücrelerine immünotoksinlerin tasinmasi için bir asi adjuvani olarak, yeniden yönlendirilmis sitotoksisite (örnegin tümör hücrelerinin öldürülmesi için) için kullanilabilmektedir. Burada açiklanan bispesifik antikorlar, ayrica, enzim immün tahlilleri, iki bölgeli immün tahminleri, çesitli hastaliklarin in vitro veya in vivo immün teshisi (örnegin kanser), kompetitif baglama tahlilleri, dogrudan veya dolayli sandviç tahlilleri ve immün çökeltim tahlilleri gibi bir çok terapötik ve terapötik olmayan ve/veya tanilayici tahlil yöntemlerinde kullanilabilmektedir. Bispesifik antikorlara yönelik diger kullanimlar ise teknikte uzman kisilerce bilinmektedir. Asagidaki örnekler, teknikte orta derecede uzman kisilere, bulusun yöntemlerinin ve bilesimlerinin nasil meydana getirildigini ve kullanildigini açiklamak için saglanmaktadir ve bulus sahiplerinin kendilerine ait olarak degerlendirdikleri bulusun kapsamini sinirlandirmasi amaçlanmamaktadir. Kullanilan sayilara göre (örnegin miktarlar, sicakliklar, vb.) kesinligin saglanmasi için çaba harcanmistir, ancak bazi deneysel hatalara veya sapmalara da izin verilebilmektedir. Aksi belirtilmedikçe, ölçekler agirlik cinsinden ölçeklerdir, moleküler agirlik ortalama moleküler agirliktir, sicaklik Celsius olarak belirtilmektedir ve basinç atmosferik basinçtadir veya buna yakindir. ÖRNEKLER Asagidaki örnekler, teknikte orta derecede uzman kisilere, bulusun yöntemlerinin ve bilesimlerinin nasil meydana getirildigini ve kullanildigini açiklamak için saglanmaktadir ve bulus sahiplerinin kendilerine ait olarak degerlendirdikleri bulusun kapsamini sinirlandirmasi amaçlanmamaktadir. Kullanilan sayilara göre (örnegin miktarlar, sicakliklar, vb.) kesinligin saglanmasi için çaba harcanmistir, ancak bazi deneysel hatalara veya sapmalara da izin verilebilmektedir. Aksi belirtilmedikçe, sicaklik Celsius olarak belirtilmektedir, basinç atmosferik basinçtadir veya buna yakindir, ölçekler agirlik cinsinden ölçeklerdir ve moleküler agirlik ortalama moleküler agirliktir. Ornek 1. Seçilmis insan vL Bölgeleri ile Iliskilendirilen insan ve Bölgelerinin Belirlenmesi Bir in vitro ekspresyon sistemi, bir tek yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincirinin, antijene özgü insan antikorlarindan insan agir zincirleri ile birlikte eksprese edilip edilmedigiin belirlenmesi için yapilandirilmistir. Genetigi degistirilmis farelerde insan antikorlarinin meydana getirilmesine yönelik yöntemler bilinmektedir (bakiniz, örnegin, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®). VELOCIMMUNE® teknolojisi, endojen fare sabit bölgesi lokuslari ile faal sekilde birlestirilen insan agir ve hafif zincir degisken bölgelerini içeren bir genoma sahip, genetigi degisdirilmis bir farenin meydana getirilmesini içermektedir, böylelikle fare, antijenik stimülasyona yanit olarak bir insan degisken bölegsi ve bir fare sabit bölgesi içeren bir antikoru üretmektedir. Bir VELOClMMUNE® faresinden üretilen antikorlarin agir ve hafif zincirlerinin degisken bölgelerini kodlayan DNA tam insandir. Baslangiçta, yüksek afiniteli kimerik antikorlar izole edilmekte olup, bunlar bir insan degisken bölgesine ve bir fare sabit bölgesine sahiptir. Asagida açiklandigi üzere, antikorlar, afinite, seçimlilik, epitop ve benzeri de dahil olmak üzere arzu edilen özellikler için karakterize edilmektedir ve seçilmektedir. Fare sabit bölgeleri, lgM olmayan bir izotop, örnegin yaban tipi veya modifiye IgG1, IgGZ, lgG3 veya IgG4 içeren bir tam insan antikorunun meydana getirilmesi için arzu edilen bir insan sabit bölgesi ile degistirilmektedir. Seçilen sabit bölge spesifik kullanima göre degisiklik gösterebilse de, yüksek afiniteli antijen baglama ve hedef spesifitesi özellikleri degisken bölgede bulunmaktadir. Bir VELOCIMMUNE® faresine, anjiyojenezi (Antijen C) tesvik eden bir büyüme faktörü ile bagisiklik kazandirilmaktadir ve antijene özgü insan antikorlari izole edilmistir ve teknikte bilinen standart teknikler kullanilarak V gen kullanimi için sekanslanmistir. Seçilen antikorlar, insan agir ve hafif zincir sabit bölgelerine klonlanmistir ve 69 agir zincir, üç insan hafif zincirinden biri ile esleme için seçilmistir: (1) bir insan K sabit bölgesi ile birlestirilen kognat, (2) bir insan K sabit bölgesi ile birlestirilen, yeniden düzenlenmis bir insan germ hatti VK1-39JK5 veya (3) bir insan K sabit bölgesi ile birlestirilen, yeniden düzenlenmis bir insan germ hatti VK3-20JK1. Her bir agir zincir veya hafif zincir çifti, standart teknikler kullanilarak CHO-K1 hücrelerinin içerisinde birlikte transfekte edilmistir. Süpernatantin içerisinde antikor mevcudiyeti, bir ELISA tahlilinde anti-insan IgG tarafindan saptanmistir. Antikor titresi (ng/ml), her bir agir zincir/hafif zincir çifti için belirlenmistir ve yeniden düzenlenmis farkli germ hatti hafif zincirlerine sahip titreler, parenteral antikor molekülü (yani kognat hafif zincir ile eslenen agir zincir) ile elde edilen titreler ile kiysalanmistir be natif titrenin yüzdesi hesaplanmistir (Tablo 1). VH: Agir zincir degisken gen. ND: mevcut deney kosullari altinda ekspresyon tespit edilmemistir. VH Antikor Titre (ng/mL) Natif Titre Yüzdesi 1-8 16 ND 13 - 81.8 - 34 9 ND 25.9 - Benzer bir deneyde, VELOCIMMUNE® farelerinei birkaç farkli antijen ile bagisiklik kazandirilmistir ve antijene Özgü insan antikorlarinin seçilmis agir zincirleri, farkli yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincirleri ile eslesme kapasitesi için test edilmistir (yukarida açiklandigi üzere). Bu deneyde kullanilan antijenler, kolesterol homeostazina katilsan bir enzim (Antijen A), glukoz homeostazinin regüle edilmesine katilan bir seum (Antijen B), anjiyojenezi tesvik eden bir büyüme faktörü (Antijen C) ve bir hücre yüzeyi reseptbrünü (Antijen D) içermistir. Antijene özgü antikorlar, her bir immünizasyon grubunun farelerinden izole edilmistir ve hafif zincir ve agir zincir degisken bölgeleri klonlanmistir ve sekanslanmistir. Agir ve hafif zincirlerin sekansindan, V gen kullanimi belirlenmistir ve seçilmis agir zincirler, kendi kognat hafif zinciri veya yeniden düzenlenmis bir insan germ hatti VK1-39JK5 bölgesi ile eslenmistir. Her bir agir/hafif zincir çifti CHO-K1 hücreleri içerisinde birlikte transfekte edilmistir ve süpernatantin içerisindeki antikor mevcudiyeti, bir ELISA tahlili içerisinde anti insan lgG vasitasiyla belirlenmistir. Antikor titresi (ug/ml), her bir agir zincir/hafif zincir çifti için belirlenmistir ve yeniden düzenlenmis farkli germ hatti hafif zincirlerine sahip titreler, parenteral antikor molekülü (yani kognat hafif zincir ile eslenen agir zincir) ile elde edilen titreler ile kiysalanmistir ve natif titrenin yüzdesi hesaplanmistir (Tablo 2). Vi-i: Agir zincir degisken gen. VK: K hafif zincir degisken gen. ND: mevcut deney kosullari altinda ekspresyon tespit edilmemistir. Titre (pg/ml) Naîif Tilre Yüzdesi Antijen Antikor VH Tek Basina VH + VK VH + VK1 Bu deneylerden elde edilen sonuçlar göstermektedir ki farkli gen ailelerine ait, somatik olarak mutasyonlu, yüksek afiniteli agir zincirleri yeniden düzenlenmis insan germ hatti VK1-39JK5 ve VK3-20JK1 bölgeleri ile eslesebilmektedir ve bir normal antikor molekülü olarak hücreden salgilanabilmektedir. Tablo 17de gösterildigi üzere, antikor titresi, yeniden düzenlenmis insan VK1-39JK5 hafif zinciri ile eslestiginde yaklasik %61 (42 ila 69) agir zincir kadar artmistir ve yeniden düzenlenen insan VK3-20JK1 hafif zinciri ile eslestiginde ise, parental entikorun kognat hafif zincirine kiyasla yaklasik %29 (20 ila 69) agir zincir kadar artmistir. Agir zincirlerin yaklasik %20*si (14 ila 69) için, yeniden düzenlenmis her iki insan germ hatti hafif zinciri, parental antikorun kognat hafif zinciri ile kiyaslandiginda ekspresyonda bir artisa yol açmistir. Tablo 2'de gösterildigi üzere, yeniden düzenlenmis insan germ hatti VK1-39JK5 bölgesi, parental antikorlarin kognat hafif zincirine kiyasla bir dizi farkli antijen sinifina özgü olan birkaç agir zincirin ekspresyonunda bir artisa yol açmistir. Antikor titresi, parental antikorlarin kognat hafif zincirine kiyasla agir zincirlerin yaklasik %351 (15/43) için iki kattan daha fazla artmistir. Iki agir zincir için (315 ve 316), artis, parental antikora kiyasla on kattan daha fazla olmustur. Parental antikorun kognat hafif zincirine göre ekspresyon artisi sergileyen tüm agir zincirler içerisinde, aile agaci (VH3) agir zincirleri, diger agir zincir degisken bölge gen ailelerine kiyasla fazlaca temsil edilmektedir. Bu, yeniden düzenlenmis germ hatti VK1-39JK5 ve VK3-20JK1 hafif zincirleri ile eslesmek üzere insan VH3 agir zincirlerinin uygun bir iliskisini göstermektedir. Ornek 2. Yeniden Düzenlenmis Bir Insan Germ Hatti Hafif Zincir Lokusunun Meydana Getirilmesi Çesitli yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zinciri hedefli vektörler, fare genomik Bakteriyel Yapay Kromozom (BAC) klonlarinin, 302912 ve , modifiye edilmesi için VELOCIGENE® teknolojisi kullanilarak (bakiniz örnegin throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6): 652-659 referansi). Bu iki BAC klonu kullanilarak, bir tek yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincir bölgesini içermeleri için genomik yapilar tasarlanmistir ve endojen K degisken ve katilimli gen segmentlerinin silinmesi için önceden modifiye edilen bir eklenti K hafif zincir Iokusuna verilmistir. Yeniden Düzenlenmis Insan Germ Hatti Hafif Zincir Hedefleme Vektörlerinin Olusturulmasi. Uç farkli yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincir bölgeleri, teknikte bilinen standart moleküler biyoloji teknikleri kullanilarakl meydana getirilmistir. Bu gç bölgenin olusturulmasi için kullanilan insan degisken gen segmentleri, yeniden düzenlenmis insan VK1-39JK5 sekansini, yeniden düzenlenmis bir insan VK3-20JK1 sekansini ve yeniden düzenlenmis bir insan VpreBJA5 sekansini içermistir. Fare VK3-7 geninin ekson 1 (öncü peptiti kodlayan) ve intron 1'ni içeren bir DNA segmenti, de novo DNA sentezi (Entegre DNA Teknolojileri) tarafindan meydana getirilmistir. Dogal olarak meydana gelen bir Blpl restriksiyon ensimi bölgesinin yukaridindaki 5i çevrilmemis bölgesinin bir kismi dahil edilmistir. Insan VK1-39 ve VK3- genlerinin eksonlari, insan genomik BAC kütüphanelerinden PCR ile çogaltilmistir. Ileri primerler, fare VK3-7 geninin intron 1iinin uç birlestirme alici bölgesini içeren bir 5, uzantisina sahipti. Insan VK1-39 sekansinin PCRisi için kullanilan ters primer, insan JK5'I kodlayan bir uzanti içermekteyken, insan VK3-2O sekansinin PCR'si için kullanilan ters primer ise insan JK1'i kodlayan bir uzanti içermistir. Insan VpreBJAS sekansi, de novo DNA sentezi vasitasiyla meydana getirilmistir (Entegre DNA Teknolojileri). Uç birlestirme donör bölgesini içeren insan `JK-CK intronunun bir bölümü, pBS-296-HA18- PISceI plazmidinden PCR ile yükseltilmistir. Ileri PCR primeri, bir insan JK5, JK1, veya JAS sekansindan birinin bir kismini kodlayan bir uzanti içermistir. Ters primer, önceden bir intronun içerisine tasarlanan bir Pl-Scel bölgesi içermistir. Fare VK3-7 ekseni/intron 1, insan degisken hafif zincir eksonlari ve insan JK-CK intron fragmentleri, kesisen uzanti PCR'si vasitasiyla birbirine dikilmistir, Blpl ve PI-Scel ile sindirilmistir ve insan VK3-15 degisken gen segmentinden promotörü içeren pBS-296- HA18-PISceI plazmidine Iigatlanmistir. PBS-296-HA18-PlScel plazmidi içerisindeki sivi oksijenli bir higromisin kaseti, Notl ve Ascl bölgeleri tarafindan yandan desteklenen bir FRTed higromisin kaseti ile degistirilmistir. Bu plazmidin NotI/PI-Scel fragmenti, fare ES hücrelerinde homolog rekombinasyon için bir 3' homoloji kolu saglayan, fare K lokusunun akis asagisindaki genomik sekansin yaklasik 75 kb*si, fare CK eksonu ve fare JK-CK intronunun bir kismini içeren, modifiye fare BAC 254m04'e Iigatlanmistir. Bu BACinin NotI/Ascl fragmenti, bunun ardindan, modifiye fare BAC 302g12*ye Iigatlanmis olup, bu bir FRTed neomisin kaseti ve fare ES hücrelerindeki homolog rekombinasyon için endojen K lokusunun akis yukarisindaki genomik sekansin yaklasik 23 kbrsini içermistir. Yeniden Düzenlenmis Insan Germ Hatti VK1-39JK5 Hedefleme Vektörü (Sekil 1). Restriksiyon enzimi bölgeleri, bir hedefleme vektörüne klonlama için, tasarlanmis bir hafif zincir eklentisinin 5, ve 3' uçlarina verilmistir: 5' ucunda bir Ascl bölgesi ve 3' ucunda bir Pl-Scel bölgesi. 5, Ascl bölgesi ve 3' Pl-Scel bölgesi Içerisinde, 5, ila 3' teki hedefleme yapisi; fare BAC klonu 302912iden elde edilen endojen fare K hafif zincir geni, insan VK3-15 promotörünü içeren bir genomik sekans, fare VK3-7 degisken gen segmentinin bir öncü sekansi, fare VK3-7 degisken gen segmentinin bir intron sekansi, yeniden düzenlenmis bir insan germ hatti VK1-39JK5 bölgesinin bir açik okuma çerçevesi, insan JK-CK intronunun bir bölümünü içeren bir genomik sekans ve fare BAC klonu 254m04rten elde edilen endojen fare JK5 gen segmentinin sekans 37 ünü içeren bir 3' homoloji kolu içermistir (Sekil 1, orta). Endojen fare K hafif zincir lokusunun akis yukarisindaki ve çogu 3' JK gen sementinin (örnegin endojen 3' artirici) akis asagisindaki genler ve/veya sekanslar, hedefleme yapisi vasitasiyla tersine modifiye edilmistir (bakiniz Sekil 1). Genetigi degistirilmis insan VK1-39JK5'In sekansi, SEKANS KIMLIK NUMARASIz1rde gösterilmektedir. BAC DNA içerisine yeniden düzenlenmis insan germ hatti VK1-39JK5 bölgesinin hedefli eklentisi, yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincir bölgesinin içerisindeki sekanslarda konumlandirilan primerler kullanilarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) vasitasiyla onaylanmistir. Kisacasi, fare VK3-7 öncü sekansina yönelik intron sekansi, primerler ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2) ve ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGAT-CA; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3) ile onaylanmistir. Yeniden düzenlenmis insan germ hatti VK1- 39JK5 bölgesinin açik okuma çerçevesi, primerler 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 4) ve 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5) ile onaylanmistir. Neomisin kaseti, primerler neoF (GGTGGAGAGG CTATTCGGC; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 6) ve neoR (GAACACGGCG GCATCAG; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7) ile onaylanmistir. Hedefli BAC DNA, bunun ardindan, yeniden düzenlenmis bir insan germ hatti VK1- 39JK5 bölgesini eksprese eden kimerik farelerin meydana getirilmesi için, olusturulmus modifiye ES hücrelerine fare ES hücrelerinin elektroporasyonu için kullanilmistir. Pozitif ES hücresi klonlari, endojen lokusun içerisine eklenen, tasarlanmis VK1-39JK5 hafif zincir bölgesine Özgü problar kullanilarak, TAQMANTM taramasi ve karyotipleme vasitasiyla onaylanmistir. Kisacasi, neomisin isaretçi geninin içerisinde baglanan prob neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8), fare VK3-7 öncü sekansina intron sekansi 3: içerisinde baglanan prob ULC-m1 P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 9) ve yeniden düzenlenmis insan germ hatti VK1-39JK5 açik okuma çerçevesi içerisinde baglanan prob 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10). Pozitif ES hücresi klonlari, bunun ardindan,germ hatti VK1-39JK5 hafif zincir bölgesini eksprese eden yavrularin dogmasina sebep olmak için disi farelerin implantasyonu için kullanilmistir. Alternatif olarak, yeniden düzenlenmis insan germ hatti VK1-39JK5 hafif zincir bölgesini tasiyan ES hücreleri, hedefleme yapisi tarafindan verilen FRTed neomisin kasetinin giderilmesi amaciyla, FLP eksprese eden bir yapi ile transfekte edilmistir. Tercihe bagli olaraki neomisin kaseti, FLP rekombinazini eksprese eden farelerin çogaltilmasiyla giderilmektedir (örnegin US 6,774,279). Tercihe bagli olarak, neomisin kaseti farelerde tutulmaktadir. Yeniden Düzenlenmis Insan Germ Hatti VK3-20JK1 Hedefleme Vektörü (Sekil 2). Benzer bir sekilde, yeniden düzenlenmis br insan germ hatti VK3-20JK1 bölgesini eksprese eden, tasarlanmis bir hafif zincir lokusu, bir hedefleme yapisi kullanilarak meydana getirilmis olup, bu, 5' ila 3, arasindan, fare BAC klonu 302912:den elde edilen endojen fare K hafif zincir lokusuna yönelik sekans 5' içeren bir 5' homoloji kolu, bir FRTed neomisin rezistans geni, insan VK3-15 promotörünü içeren bir genomik sekans, fare VK3-7 degisken gen segmentinn bir öncü sekansi, fare VK3-7 degisken gen segmentinin bir intron sekansi, yeniden düzenlenmis bir insan germ hatti VK3-20JK1 bölgesinin bir açik okuma çerçevesi, insan JK-CK intronun bir bölümünü içeren bir genomik sekans ve fare BAC klonu 254m04'ten elde edilen endojen fare JK5 gen segmentinin sekans 3' ünü içeren bir 3, homoloji kolu içermektedir (Sekil 2, orta). Tasarlanmis insan VK3-20JK1 Iokusunun sekansi, SEKANS KIMLIK NUMARASI:11ide gösterilmektedir. Yeniden düzenlenmis insan germ hatti VK3-20JK1 bölgesinin, BAC DNA'ya hedefli eklentisi, yeniden düzenlenmis insan germ hatti VK3-20JK1 hafif zincir bölgesi içerisindeki sekanslarda konumlandirilan primerler kullanilarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) vasitasiyla dogrulanmistir. Kisacasi, fare VK3-7 öncü sekansina yönelik intron sekansi 3', primerler ULC-mlF (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2) ve ULC- m1R (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3) ile onaylanmistir. Yeniden düzenlenmis insan germ hatti VK3-20JK1 bölgesinin açik okuma çerçevesi, primerler 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 12) ve 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 13) ile onaylanmistir. Neomisin kaseti, primerler neoF (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 6) ve neoR (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7) ile onaylanmistir. Hedefli BAC DNA, bunun ardindan, yeniden düzenlenmis bir insan germ hatti VK3-20JK1 bölgesini eksprese eden kimerik farelerin meydana getirilmesi için, olusturulmus modifiye ES hücrelerine fare ES hücrelerinin elektroporasyonu için kullanilmistir. Pozitif ES hücresi klonlari, endojen K hafif zincir Iokusunun içerisine eklenen, tasarlanmis VK3-20JK1 hafif zincir bölgesine özgü problar kullanilarak, TAQMANTM taramasi ve karyotipleme vasitasiyla onaylanmistir. Kisacasi, neomisin isaretçi geninin içerisinde baglanan prob neoP (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8), fare VK3-7 öncü sekansi içerisinde baglanan prob ULC-m1 P (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 9) ve insan VK3-20JK1 açik okuma çerçevesi içerisinde baglanan prob 1633h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 14). Pozitif ES hücresi klonlari, bunun ardindan, disi farelerin implantasyonu için kullanilmistir. Insan germ hatti VK3- 20JK1 hafif zincir bölgesini eksprese eden yavrularin dogumu. Alternatif olarak, insan germ hatti VK3-2OJK1 hafif zincir bölgesini tasiyan ES hücreleri, hedefleme yapisi tarafindan verilen FRTed neomisin kasetinin giderilmesi amaciyla, FLP eksprese eden bir yapi ile transfekte edilebilmektedir. Tercihe bagli olarak, neomisin kaseti, FLP rekombinazini eksprese eden fareler üretilerek giderilebilmektedir (örnegin US 6,774,279). Tercihe bagli olarak, neomisin kaseti farelerde tutulmaktadir. Yeniden Düzenlenmis Insan Germ Hatti VpreBJA5 Hedefleme Vektörü (Sekil 3). Benzer sekilde, yeniden düzenlenmis bir insan germ hatti VpreBJA5 bölgesini eksprese eden, tasarlanmis bir hafif zincir Iokusu, bir hedefleme yapisi kullanilarak meydana getirilmis olup, bu, 5' ila 3' arasindan, fare BAC klonu 302912'den elde edilen endojen fare K hafif zincir lokusuna yönelik sekans 5! içeren bir 5' homoloji kolu, bir FRTed neomisin rezistans geni, insan VK3-15 promotörünü içeren bir genomik sekans, fare VK3-7 degisken gen segmentinn bir öncü sekansi, fare VK3-7 degisken gen segmentinin bir intron sekansi, yeniden düzenlenmis bir insan germ hatti VpreBJA bölgesinin bir açik okuma çerçevesi, insan JK-CK intronun bir bölümünü içeren bir genomik sekans ve fare BAC klonu 254m04'ten elde edilen endojen fare JK5 gen segmentinin sekans 3: ünü içeren bir 3, homoloji kolu içermektedir (Sekil 3, orta). Tasarlanmis insan VpreBJAS BAC DNA içerisine yeniden düzenlenmis insan germ hatti VpreBJAS bölgesinin hedefli eklentisi, yeniden düzenlenmis insan germ hatti VpreBJAS bölgesi hafif zincir bölgesinin içerisindeki sekanslarda konumlandirilan primerler kullanilarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) vasitasiyla onaylanmistir. Kisacasi, fare VK3-7 öncü sekansina yönelik intron sekansi 3,, primerler ULC-m1 F (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 2) ve ULC-m1 R (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3) ile onaylanmistir. Yeniden düzenlenmis insan germ hatti VpreBJAS bölgesinin açik okuma çerçevesi, primerler 1616-h1F (TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 16) ve 1616-h1R (CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; SEKANS KIMLIK NUMARASI: 17) ile onaylanmistir. Neomisin kaseti, primerler neoF (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 6) ve neoR (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7) ile onaylanmistir. Hedefli BAC DNA, bunun ardindan, yeniden düzenlenmis bir insan germ hatti VpreBJAS bölgesini eksprese eden kimerik farelerin meydana getirilmesi için, olusturulmus modifiye ES hücrelerine fare ES hücrelerinin elektroporasyonu için kullanilmistir. Pozitif ES hücresi klonlari, endojen K hafif zincir Iokusunun içerisine eklenen, tasarlanmis VpreBJi\5 hafif zincir bölgesine özgü problar kullanilarak, TAQMANTM taramasi ve karyotipleme vasitasiyla onaylanmistir. Kisacasi, neomisin isaretçi geninin içerisinde baglanan prob neoP (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8), fare IgVK3-7 öncü sekansi içerisinde baglanan prob ULC-mlP (SEKANS KIMLIK NUMARASI: 9) ve insan VpreBJAS açik okuma çerçevesi içerisinde baglanan prob 1616h1P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEKANS KIMLIK NUMARASl: 18). Pozitif ES hücresi klonlari, bunun ardindan, bir germ hatti hafif zincir bölgesini eksprese eden yavrularin dogmasina sebep olmak için disi farelerin implantasyonu için kullanilmistir. Alternatif olarak, yeniden düzenlenmis insan germ hatti VpreBJAS hafif zincir bölgesini tasiyan ES hücreleri, hedefleme yapisi tarafindan verilen FRTed neomisin kasetinin giderilmesi amaciyla, FLP eksprese eden bir yapi ile transfekte edilmistir. Tercihe bagli olaraki neomisin kaseti, FLP rekombinazini eksprese eden farelerin çogaltilmasiyla giderilmektedir (örnegin US 6,774,279). Tercihe bagli olarak, neomisin kaseti farelerde tutulmaktadir. Ornek 3. Yeniden Düzenlenmis Bir Tek Insan Hafif Zincirini Eksprese Eeden Farelerin Meydana Getirilmesi Yukarida açiklanan hedefli ES hücreleri, donör ES hücreleri olarak kullanilmistir ve VELOCIMOUSE® yöntemi vasitasiyla 8-hücreli bir asamali fare embriyosuna verilmistir (bakiniz, örnegin 7,294,754 numarali US Patent Dokümani ve Poueymirou ve meslektaslari (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1): 91-99 referansi. Tasarlanmis bir insan germ hatti VK1-39JK5 hafif zincir bölgesi, bir VK3- 2OJK1 hafif zincir bölgesi veya bir VpreBJÄS hafif zincir bölgesini bagimsiz sekilde tasiyan VELOCIMICE®, özgün, yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincir bölgesinin mevcudiyetini saptayan bir aIeI tahlili modifikasyonu (Valenzuela ve meslektaslari, yukarida geçen) kullanilarak genotipleme vasitasiyla belirlenmistir. Yavrular genotiplenmistir ve özgün, yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincir bölgesi için heterozigoz veya homozigoz olan bir yavru, yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincir bölgesinin ekspresyonunun karakterize edilmesi için seçilmektedir. Akis Sitometrisi. Ortak hafif zincir farelerinin normal antikor repertuvarindaki yeniden düzenlenmis insan hafif zincir bölgesinin ekspresyonu, ortak hafif zincir farelerinin splenositlerindeki ve periferal kanindaki immünoglobulin K ve A ekspresyonunun analizi vasitasiyla geçerli kilinmistir. Yaban tipi (n=5), VK1-39JK5 ortak hafif zincir heterozigot heterozigot (n=2), ve VK3-20JK1 ortak hafif zincir homozigot (n=2) farelerinin periferal kani ve toplanmis dalaklarina ait hücre süspansiyonlari, standart yöntemler kullanilarak gerçeklestirilmistir ve floresanli sekilde isaretlenen antikorlar (BD Pharmigen) kullanilarak CD19& IgA+ ve IgK+ ile lekelenmistir. 2.4G2, BD Pharmigen) ile inkübe edilmistir, ardindan 30 dakika boyunca buz üzerinde su antikor kokteyli ile isaretlenmistir: APC konjüge anti-fare CD19 (klon 1D3, BD Pharmigen), PerCP-Cy5.5 konjüge anti-fare CD3 (klon 17A2, BioLegend), FITC konjüge anti-fare IgK (klon 187.1, BD Pharmigen), PE konjüge anti-fare IgA (klon RML-42, BioLegend). Lekelemenin ardindan, hücreler yikanmistir ve %2 formaldehit ile sabitlenmistir. Veri edinimi, bir LSRll akis sitometresi üzerinde gerçeklestirilmistir ve FlowJo ile analiz edilmistir. Geçitleme: toplam B hücresi (CD19+CD3-), IgK+ B hücreleri (ng+lg)\'CD19*CD3'), lgA* B hücreleri (IgK'IgA+CD19+CD3' ). Kan ve Splenosit numunelerinden toplanan veriler benzer sonuçlar sergilemistir. Tablo 3, lgAî Igi<+, veya hücrelerini ortaya koymaktadir. Yaban tipi (WT) ve VK1-39JK5 veya VK3-20JK1 ortak hafif zincir için homozigoz olan farelerden alinan periferal kandaki CD19+ B hücrelerinin yüzdesi, Sekil 4ite gösterilmektedir. Fare CD19* B hücreleri Yabani tip 4.8 93 0.53 VK3-20JK1 4.2 88 6 Ortak Hafif Zincir Ekspresyonu. Her bir ortak hafif zincirin (VK1-39JK5 ve VK3-20JK1) ekspresyonu, bir niceliksel PCR tahlili (örnegin TAQMANT'V') kullanilarak heterozigoz ve homozigoz farelerde analiz edilmistir. Kisacasi, imalatçinin talimatlarina göre fare CD19 Mikrobonxuklar (Miltenyi Biotec) kullanilarak, CD19+ B hücreleri; yaban tipi olan, fare agir zincir ve K hafif zincir degisken bölgesi Iokuslarinin ilgili bir insan agir zincir ve K hafif zincir degisken bölgesi Iokuslari (HK) ile bir replasman için homozigoz olan farelerin yani sira, yeniden düzenlenmis ger bir insan hafif zincir bölgesi (VK1-39JK5 veya VK3-20JK1) çin homozigoz ve heterozigoz olan farelerin dalaklarindan sflastirilmistir. Toplam RNA, imalatçinin talimatlarina göre RNeasy Mini kiti (Qiagen) kullanilarak CD19+ B hücrelerinden saflastirilmistir ve genomik RNA, sütun tedavisinde (Qiagen) bir RNazsiz DNaz kullanilarak giderilmistir. kullanilarak cDNA'ya ters transkripsiyonu yapilmistir ve elde edilen cDNA, Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) ile çogaltilmistir. Tüm reaksiyonlar ABI 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) kullanilarak, ve (1) her iki ortak hafif zincir için VK-JK birlesimini, (2) yalnizca VK genini (yani VK1-39 ve VK3-20) ve (3) fare CK bölgesini kapsayan Taqman MGB problari ve primlerler kullanilarak gerçeklestirilmistir. Tablo 4, bu tahlilde kullanilan primerlerin ve problarin sekanslarini ortaya koymaktadir. Göreli ekspresyon, fare CK bölgesinin ekspresyonuna normalize edilmistir. Sonuçlar Sekil 5A, SB ve 5Crde gösterilmektedir. Bölge Primer/Prob Tanimi (5-31) SEKNS KIMLIK NO: VK1-39JK5 Birlesim Yeri (Sens) AGCAGTCTGC AACCTGAAGA TTT 19 (Anti-sens) GTI'I'AATCTC CAGTCGTGTC CCTT 20 (Probe) CCTCCGATCA CCTTC 21 VK AAACCAGGGA AAGCCCCTAA 22 VK3-20JK1 Birlesim Yeri (Sens) CAGCAGACTG GAGCCTGAAG A 25 (Prob) TAGCTCACCT TGGACGTT 27 (Antivsens) GACCCACTGC CACTGAACCT 29 (Probe) CCACTGGCAT CCC 30 Fare CK (Sens) TGAGCAGCAC CCTCACGTT 31 (Prob) ACCAAGGACG AGTATGAA 33 Antijene Ozg'ü Ortak Hafif Zincir Antikorlari. Endojen fare K hafif zincir Iokusunda VK1-39Jk5 veya VK3-20Jk1 ortak hafif zincir tasiyan ortak hafif zincir farelerine, ß- galaktosidaz ile bagisiklik kazandirilmistir ve antikor titresi ölçülmüstür. Kisacasi, ß-galaktosidaz (Sigma), imalatçinin talimatlarina göre titremaks adjuvan (Sigma) içerisinde emülsiyonlastirilmistir. Yaban tipi (n=7), VK1-39Jk5 ortak hafif zincir galaktosidaz/Titremaksin subkütanöz enjeksiyonu vasitasiyla bagisiklik kazandirilmistir. Fareler iki kez, 3 hafta araliklarla, 50 ug ß-galaktosidaz/Tiremaks ile subkütanöz enjeksiyon vasitasiyla desteklenmistir. Ikinci desteklemeden sonra, imalatçinin talimatlarina göre, serum ayirici tüpler (BD Biosciences) içerisindeki bir retro-orbital kan kullanilarak anestezi altindaki farelerden kan alinmistir. Anti-ß-galaktosidaz lgM veya 4°Crde gece boyu kaplanmi stir. Fazlalik antijen, oda sicakliginda bir saat boyunca %1 BSA ile PBS vasitasiyla bloklamadan önce yikanmistir. Seri serum seyreltileri plakalara ilave edilmistir ve yikamadan önce oda sicakliginca bir saat boyunca inkübe edilmistir. Ardindan plakalar, oda sicakliginca bir saat boyunca HRP konjüge anti-lgM (Southern Biotech) veya anti-IgG (Southern Biotech) ile inkübe edilmistir. Bir baska yikamanin ardindan, plakalar TMB substrati (BD Biosciences) ile gelistirilmistir. Reaksiyonlar 1N sülfürik asit ile durdurulmustur ve bir Victor X5 Plate Reader (Perkin Elmer) kullanilarak OD450 okunmustur. Veriler GraphPad Prism ile analiz edilmistir ve sinyal, zeminden iki kat yukarida olan serumun seyreltisi olarak hesaplanmistir. Sonuçlar Sekil 6A ve ößrde gösterilmektedir. Bu Ornekite gösterildigi üzere, VK1-39JK5 ve VK3-20JK1 ORTAK HAFIF ZINCIRLI FARELERIN HEM DALAK HEM DE PERIFERAL BOLUMLERINDEKI K/AB hücrelerinin orani, neredeyse yaban tipi olan bir örüntü sergilemistir (Tablo 3 ve Sekil 4). VpreBJAS ortak hafif zincirli fare ise daha az periferal B hücresi sergilemis olup, bunun yaklasik %1 ila 2'si, tasarlanmis insan hafif zincir bölgesini eksprese etmektedir (veriler gösterilmemektedir). Endojen K hafif zincir Iokusundan VK1-39JK5 ve VK3-20JK1 yeniden düzenlenmis insan hafif zincir bölgelerinin ekspresyon seviyeleri, insan VK ve JK gen segmentleri ile fare VK ve JK gen segmentlerinin bir tam replasmanini içeren bir endojen K hafif zinvir lokusuna kiyasla yükseltilmistir (Sekil 5A, SB ve SC). VpreBJA5 yeniden düzenlenmis insan hafif zincir bölgesinin ekspresyon seviyeleri, hem heterozigoz hem de homozigoz farelerde endojen K hafif zincir Iokusundan benzer yüksek ekspresyon sergilemistir (veriler gösterilmemektedir). Bu göstermektedir ki fare Ä,K, veya her iki endojen hafif zincirli lokus ile dogrudan bir yarista, bir tek yeniden düzenlenmis insan VL/JL sekansi, endojen K hafif zincir zincir Iokusundan yaban tipi seviyeli ekspresyona kiyasla daha iyi verim saglayabilmektedir ve normal dalak ve kan B hücreleri sikligina yol açmaktadir. Dahasi, insan VK1-39JK5 veya insan VK3-20JK1 sekansina sahip, tasarlanmis bir K hafif zincir lokusunun mevcudiyeti, fareler tarafindan iyi bir sekilde tolere edilmistir ve immün yanitinin hümoral bileseninde hafif zincir repertuvarinin önemli bir bölümünü temsil ederek yaban tipi sekilde islev gördügü görülmektedir (Sekil 6A ve 68). Ornek 4. Yeniden Düzenlenmis Tek Bir Insan Germ Hatti Hafif Zincirini Eksprese Eden Farelerin Çogaltilmasi Bu Ornek, birçok genetigi degistirilmis immünoglobulin lokusunu barindiran birçok genetigi degistirilmis fare susunun olusturulmasi için burada açiklanan ortak hafif zincirli farelerden herhangi biri ile çogaltilabilen genetigi degistirilmis diger birkaç fare susunu açiklamaktadir. Endojen lgA Nakavt (K0). Tasarlanmis hafif zincir lokusunun kullaniminin optimize edilmesi için, yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincir bölgelerinden birini tasiyan farelerle, endojen A hafif zincir Iokusunda bir delesyon içeren bir baska fare çogaltilabilmekedir. Bu sekilde, elde edilen silsile, tek hafif zincirleri olarak, Ornek 2rde açiklandigi üzere yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincir bölgesini eksprese edecektir. Çogaltma, teknikte bilinen standartteknikler ile ve alternatif olarak ticari bir çogaltici (örnegin The Jackson Laboratory) ile gerçeklestirilmektedir. Tasarlanmis bir hafif zincir Iokusu ve endojen A hafif zincir lokusunun bir delesyonunu tasiyan fare suslari, özgün hafif zincir bölgesinin varligi ve endojen fare A hafif zincirlerinin yoklugu için taranmaktadir. Insanlastirilmis Endojen Agir Zincir Lokusu. Tasarlanmis bir insan germ hatti hafif zincir lokusu tasiyan fareler, minsan agir zincir degisken gen Iokusu ile endojen fare agir zincir degisken gen lokusunun bir replasmanini barindiran fareler ile çogaltilmistir (bakiniz US . VELOClMMUNE® faresi, endojen fare sabit bölgesi lokuslari ile faal sekilde birlestirilen insan agir zincir degisken bölgelerini içeren bir genom içermektedir, böylelikle fare, antijenik stimülasyona yanit olarak bir insan agir zincir degisken bölgesi ve bir fare agir zincir sabit bölgesi içeren bir antikoru üretmektedir. Bir VELantikorlarin agir zincirlerinin degisken bölgelerini kodlayan DNA izole edilmektedir ve insan agir zincir sabit bölgelerini kodlayan DNA ile faal sekilde birlestirilmektedir. Ardindan DNA, antikorun tam insan agir zincirini eksprese edebilen bir hücre içerisinde eksprese edilemktedir. Insan VH lokusu ile endojen fare VH Iokusunun bir replasmanini ve endojen K hafif zincir lokusundaki bir tek yeniden düzenlenmis insan germ hatti VL bölgesini tasiyan fareler elde edilmektedir. Bir tej insan hafif zinciri (insan VL ve fare CL) ile somatik olarak mutasyonlu agir zincirler (insan VH ve fare CH) içeren ters kimerik antikorlar, ilgili bir antijen ile bagisiklik kazandirma üzerine elde edilmektedir. Antikorlari eksprese eden B hücrelerinin VH ve VL nükleotit sekanslari belirlenmektedir ve tam insan antikorlari, VH ve VL nükleotit sekanslarinin, insan CH ve CL nükleoit sekanslarina uygun bir ekspresyon sistemi içeridinde füzyonlanmasi vasitasiyla meydana getirilmekedir. Ornek 5. Insan Agir Zincirlerini Eksprese Eden Fareler ve Yeniden Düzenlenmis Bir Insan Germ Hatti Hafif Zincir Bölgesinden Antikorlarin Meydana Getirilmesi Tasarlanmis insan hafif zincir bölgesini içeren farelerin, diger endojen lg Iokuslarinin modifikasyonlarini ve delesyonlarini içeren, arzu edilen çesitli suslar ile çogaltilmasindan sonra (Ornek 4'te açiklandigi üzere), seçilmis farelere, ilgili bir antijen ile bagisiklik kazandirilabilmektedir. Genel olarak, tek yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif zincir bölgelerinden birini içeren bir VELOCIMMUNE® faresi bir antijen ile yüklenmektedir ve lenfatik hücreler (B hücreleri gibi), hayvanlarin serumundan geri kazanilmaktadir. Lenfatik hücreler, ölümsüz hibridom hücre hatlarinin hazirlanmasi için bir myelom hücre hatti ile füzyonlanmaktadir ve bu tür hibridom hücreleri, insan agir zincir degiskenlerini ve immünizasyon için kullanilan antijene özgü yeniden düzenlenmis insan germ hatti hafif Zincirlerini içeren antikorlari üreten hibridom hücre hatlarinin belirlenmesi için taranmaktadir ve seçilmektedir. Agir zincir ve hafif zincirlerin degisken bölgelerini kodlayan DNA izole edilmektedir ve hafif zincir ve agir zincirin arzu edilen izotipik sabit bölgeleri ile birlestirilmektedir. Endojen fare sekanslarinin ve endojen lokusta mevcut olan herhangi bir ilave cis-eylemli elemanin varligindan dolayi, her bir antikorun tek hafif zinciri somatik olarak mutasyonlu olabilmektedir. Bu, bir tek hafif zincir ve çesitli agir zincir sekanslari içeren antijene özgü repertiara çesitlilik eklemektedir. Elde edilen klonlanmis antikor sekanslari, bunun ardindan, bir hücre içerisinde, örnegin bir CHO hücresi içerisinde eksprese edilmektedir. Alternatif olarak, antijene özgü kimerik antikorlari veya hagig ve agir zincirlerin degisken alanlarini kodlayan DNA, dogrudan antijene özgü Ienfositlerden saptanmaktadir. Baslangiçta, yüksek afiniteli kimerik antikorlar izole edilmekte olup, bunlar bir insan degisken bölgesine ve bir fare sabit bölgesine sahiptir. Asagida açiklandigi üzere, antikorlar, afinite, seçimlilik, epitop ve benzeri de dahil olmak üzere arzu edilen özellikler için karakterize edilmektedir ve seçilmektedir. Fare sabit bölgeleri; bulusun yeniden düzenlenmis bir insan germ hatti hafif zincir bölgesinden elde edilen tek bir hafif zincir ve somatik olarak mutasyonlu bir insan agir zincirini içeren tam insan antikorunun meydana getirilmesi için istenen bir insan sabit bölgesi ile degistirilmektedir. Uygun insan sabit bölgeleri örnegin yaban tipi veya modifiye IgG1 veya IgG4*ü kapsamaktadir. Insan VH, DH, ve JH gen segmentleri ile endojen fare agir zincir Iokusunun bir replasmanini ve tasarlanmis germ hatti VK1-39JK5 insan hafif zincir bölgesi veya tasarlanmis germ hatti VK3-20JK1 insan hafif zincir bölgesi (yukarida açiklanan) ile endojen fare K hafif zincir Iokusunun bir replasmanini içeren VELOCIMMUNE® farelerinin ayri kohortlarina, bir insan hücre yüzeyi reseptör proteini (Antijen E) ile bagisiklik kazandirilmistir. Antijen E, her 3 ila 4 günde bir alti ardisik enjeksiyon ile birlikte farelerin arka ayagi üzerine dogrudan uygulanmaktadir. Antijen E*nin iki ila üç mikroorganizmasi, enjeksiyondan önce, 10 ug CpG oligonükleotit (Kat # tIrI-modn - ODN1826 oligonükleotit; anivogen, San Diego, CA) ve 25 ug Adju-Phos (Alüminyum fosfat jeli adjuvani, Kat# H-71639-250; Brenntag Biosector, Fred-erikssund, Danimarka) ile karistirilmaktadir. Toplamda alti enjeksiyon, öldürmeden önce 3 ila 5 günde verilen nihai antijen geri çekmesinden önce verilmektedir. 4rüncü ve 6'inci enjeksiyondan sonraki kanlar toplanmaktadir ve antikor immün yaniti standart bir antijene özgü immün tahlili ile izlenmektedir. Istenen bir immün yaniti elde edildiiginde splenositler toplanmaktadir ve yasayabilirliklerinin korunmasi ve hibridom hücre hatlarinin olusturulmasi için fare miyelom hücreleri ile füzyonlanmaktadir. Hibridom hücre hatlari, Antijen E'ye özgü ortak hafif zincir antikorlarini üreten hücre hatlarinin belirlenmesi için taranmakta ve seçilmektedir. Bu teknik kullanilarak, birkaç anti-Antijen E'ye özgü ortak hafif zincir antikorlari (örnegin insan hafif zincir degisken alanlarina, ayni insan hafif zincir degisken alanina ve fare sabit alanlarina sahip antikorlar) elde edilmektedir. özellikle referans maksadiyla dahil edildigi üzere, anti-Antijen E ortak hafif zincir antikorlari, miyelom hücrelerine füzyonlama olmaksizin dogrudan antijen-pozitif B hücrelerinden izole edilmektedir. Bu teknik kullanilarak, birkaç tam insan anti-Antijen E ortak hafif zincir antikorlari (örnegin insan hafif zincir degisken alanlarina, bir tasarlanmis insan VK1-39JK5 hafif zincir veya bir tasarlanmis insan VK3-20JK1 hafif zincir bölgesine ve insan sabit alanlarina sahip antikorlar) elde edilmistir. Bu Ornek*in yöntemlerine göre meydana getrilen örnek anti-Antijen E ortak hafif zincir antikorlarinin biyolojik özellikleri, asagidaki bölümlerde ayrintili olarak açiklanmaktadir. Ornek 6. Antijene 'Ozgü Ortak Hafif Zincir Antikorlarinda Agir Zincir Gen Segmentinin Kullanimi Uretilen anti-Antijen E ortak hafif zincir antikorlarinin yapisinin analiz edilmesi için agir zincir antikor degisken bölgelerini kodlayan nükleik asitler klonlanmis ve sekanslanmistir. Antikorlarin nükleik asit sekanslarinadan ve öngörülmüs amino asit sekanslarindan, tasarlanmis insan VK1-39JK5 hafif zincir veya tasarlanmis insan VK3- 20JK1 hafif zincir bölgesini içeren, bagisiklik kazandirilmis VELOCIMMUNE® farelerinden elde edilen seçislmis ortak hafif zincir antikorlarinin agir zincir degisken bölgesi (HCVR) için gen kullanimi belirlenmistir. Sonuçlar Tablo 5 ve 6Jda gösterilmekte olup, bunlar, yalnizca bir insan VK1-39- veya bir insan VK3-20-türevli hafif zincirden bir hafif zincir eksprese eden bir fare kullanildiginda, bulusa göre farelerin, çesistli yeniden düzenlemelerden kaynakli olarak çesitli insan agir zincir gen segmentlerinden antijene özgü ortak hafif zincir antikorlarini ürettigini göstermektedir. 2, 3, 4, ve 5 ailelerinin insan VH gen segmentleri, antijene özgü antikorlarin elde edilmesi için birçok insan DH segmenti ve insan JH segmenti ile yeniden düzenlenmistir. VK1-39JK5 Ortak hafif Antikorlari Antikor Vi-i DH JH Antikor VH DH JH TABLO G VK3-20JK1 Antikor _ _ VH DH JH Antikor VH DH JH Ornek 7. LUMINEXTM Tahlili Vasitasiyla Antijene 'Ozg'ü Ortak Hafif Zincir Antikorlarinin Bloklama Yetisinin Belirlenmesi Antijen E*ye karisi yetistirilen doksan sekiz insan ortak hafif zincir antikoru, Antijen E'nin dogal Iigandinin (Ligand Y) boncuk bazli bir tahlilde Antijen E'ye baglanmasini bloklama yetisi için test edilmistir. Antijen Etnin hücre disi alani (ECD), MES tamponu içerisinde 20 pg/mLilik bir konsantrasyonda karboksilatli mikrosferler ile birlestirilen amin ve iki myc epitop etiketi ve bir 6X histidin etiketine (Antijen E-mmh) konjüge edilmistir. Karisim, oda sicakliginda iki saat boyunca ink'übe edilmistir, ardindan 1M Tris pH 8.0 ile boncuk deaktivasyonu gerçeklestirilmistir, ardindan hacim cinsinden %005 Tween-20 ile PBS içerisinde yikama gerçeklestirilmistir. Ardindan boncuklar, agirlik/hacim cinsinden %2 BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) içeren PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) ile bloklanmistir. 96-çukurcuklu bir filre plakasi içerisinde, Antijen E'ye Özgü ortak hafif zincir antikorlarini içeren süpernatantlar, tampon içerisinde 1:15 seyreltilmistir. Antikor süpernatanti ile ayni ortam bilesenlerine sahip bir yapay süpernatant içeren bir negatif kontrol hazirlanmistir. Antijen E isaretli boncuklar süpernatantlara ilave edilmistir ve gece boyunca 4"C'de inkübe edilmistir. Biyotinlenmis-Ligand Y proteini 0.06 nMilik bir nihai konsantrasyona ilave edilmistir ve oda sicakliginda iki saat boyunca inkübe edilmistir. Antijen E-myc-myc-6His isaretli boncuklara baglanan biyotinlenmis Ligan Y'nin saptanmasi, Streptavidine (Moss Inc, Pasadena, MD) konjüge edilen R-fikoeritrin ile belirlenmistir, ardindan bir LUMlNEXTM akis sitometresi bazli analizörde ölçüm gerçeklestirilmistir. Ligand Y'siz bir numunenin Arkaplan Ortalama Floresan Yogunlugu (MFl) tüm numunelerden çikarilmistir. Yüzde bloklama, her bir numunenin arkaplan- çikarilmis MFI'sinin uyarlanmis negatif kontrol degerine bölünmesi, 100 ile çarpilmasi ve elde edilen degerin 100'den çikarilmasiyla hesaplanmistir. Benzer bir deneyde, Antijen Eîye karisi yetistirilen 98 insan ortak hafif zincir antikoru, Antijen Etnin Ligand Y-isaretli boncuklara baglanmasini bloklama yetisi için test edilmistir. Kisacasi, Ligand Y, MES tamponu içerisinde seyreltilen 20 pg/mLilik bir konsantrasyonda karboksillenmis mikrosferlere baglanan amindi. Karisim, oda sicakliginda iki saat boyunca inkübe edilmistir, ardindan 1M Tris pH 8 ile boncuk deaktivasyonu gerçeklestirilmistir. ardindan hacim cinsinden %005 Tween-20 ile PBS içerisinde yikama gerçeklestirilmistir. Ardindan boncuklar, agirlik/hacim cinsinden %2 BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) içeren PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) ile bloklanmistir. 96-çukurcuklu bir filre plakasi içerisinde, Antijen E'ye özgü ortak hafif zincir antikorlarini içeren süpernatantlar, tampon içerisinde 1:15 seyreltilmistir. Antikor süpernatanti ile ayni ortam bilesenlerine sahip bir yapay süpernatant içeren bir negatif kontrol hazirlanmistir. Biyotinlenmis-Antijen E-mmH, 0.42 nMilik bir nihai konsantrasyona ilave edilmistir ve 4°Cide gece boyunca inkübe edilmistir. Ligand Y isaretli boncuklar, bunun ardindan,antikor/Antijen E karisimina ilave edilmistir ve oda sicakliginda iki saat boyunca inkübe edilmistir. Ligand Y- boncuklarina baglanan biyotinlenmis Antijen E-mmH'nin saptanmasi, Streptavidine (Moss Inc, Pasadena, MD) konjüge edilen R-Fikoeritrin ile belirlenmistir, ardindan bir LUMINEXTM akis sitometresi bazli analizörde ölçüm gerçeklestirilmistir. Antijen E=siz bir numunenin Arkaplan Ortalama Floresan Yogunlugu (MFI) tüm numunelerden çikarilmistir. Yüzde bloklama, her bir numunenin arkaplan-çikarilmis MFl'sinin uyarlanmis negatif kontrol degerine bölünmesi, 100 ile çarpilmasi ve elde edilen degerin 100*den çikarilmasiyla hesaplanmistir. Tablolar 7 ve 8, her iki LUMINEXTM tahlilinde de test edilen tüm 98 anti-Antijen E ortak hafif zincir antikorlarinin yüzde bloklamasini göstermektedir. ND: mevcut deney kosullari altinda tespit edilmemistir. VK1-39JK5 Antikor Antijen E-Etiketli Boncuklarin % Bloke Edilmesi Çözeltide Antijen E›nin % Bloke Edilmesi 29486 38.6 ND 29556 718 ND 29856 2.0 5.0 2997 93.4 ?0.6 29976 9.7 7.5 VK3-20JK1 Antikor Antijen E-Etiketli Boncuklarin % Bloke Edilmesi Çözeltide Antijen E'nin % Bloke 2974 12_4 2974G 17.6 2975 18.2 29756 19.5 2976 . 1.0 29766 20.4 Yukarida açiklanan birinci LUMINEXTM deneyinde, VK1-39JK5 tasarlanmis hafif zincir içeren 80 ortak hafif zincir antikoru, Ligand Y'nin Antijen E isaretli boncuklara baglanmasini bloke etmeye yönelik yetisi için test edilmistir. Bu 80 ortak hafif zincir antikorlari içerisinde, 681 %50 bloklama sergilerken, 12'si ise TR TR TR TR TR TR TR TR TR
TR2019/01668T 2013-03-13 2014-03-13 Sınırlı bir immünoglobulin hafif zincir repertuvarını eksprese eden fareler. TR201901668T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/798,455 US9796788B2 (en) 2010-02-08 2013-03-13 Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201901668T4 true TR201901668T4 (tr) 2019-02-21

Family

ID=50483561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/01668T TR201901668T4 (tr) 2013-03-13 2014-03-13 Sınırlı bir immünoglobulin hafif zincir repertuvarını eksprese eden fareler.

Country Status (26)

Country Link
EP (4) EP4545567A3 (tr)
JP (4) JP6529957B2 (tr)
KR (2) KR102424756B1 (tr)
CN (2) CN108611369B (tr)
AU (3) AU2014244020B2 (tr)
BR (1) BR112015022034B1 (tr)
CA (1) CA2903698C (tr)
CY (1) CY1121545T1 (tr)
DK (2) DK3501272T5 (tr)
ES (3) ES2712207T3 (tr)
FI (1) FI3501272T3 (tr)
HR (2) HRP20190706T1 (tr)
HU (2) HUE044003T2 (tr)
IL (2) IL240563B (tr)
LT (2) LT2967013T (tr)
MX (3) MX377146B (tr)
PL (2) PL3501272T3 (tr)
PT (2) PT2967013T (tr)
RS (2) RS64185B1 (tr)
RU (1) RU2689664C2 (tr)
SG (2) SG10201801101QA (tr)
SI (2) SI2967013T1 (tr)
SM (2) SMT201900196T1 (tr)
TR (1) TR201901668T4 (tr)
WO (1) WO2014160202A1 (tr)
ZA (2) ZA201505835B (tr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
SMT202600080T1 (it) 2010-02-08 2026-03-09 Regeneron Pharma Topo con catena leggera comune
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
HUE047278T2 (hu) 2011-08-05 2020-04-28 Regeneron Pharma Humanizált univerzális könnyûláncú egerek
SG11201401181YA (en) 2011-10-17 2014-04-28 Regeneron Pharma Restricted immunoglobulin heavy chain mice
ME03551B (me) 2012-06-12 2020-07-20 Regeneron Pharma Humanizovane nehumane živoтinje sa ograničenim lokusima imunoglobulinskog тeškog lanca
MY178882A (en) * 2013-02-20 2020-10-21 Regeneron Pharma Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
CA3124228C (en) 2014-03-21 2024-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
CA2979702A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
KR20230006929A (ko) 2016-01-13 2023-01-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 조작된 중쇄 다양성 영역을 갖는 설치류
CA3076632A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen-binding molecules that bind a staphylococcus target antigen and a complement component and uses thereof
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
US12467062B2 (en) 2018-12-21 2025-11-11 Compass Therapeutics Llc Transgenic mouse expressing common human light chain
CA3125380A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus
BR112021016173A2 (pt) 2019-02-22 2021-11-03 Regeneron Pharma Roedor geneticamente modificado, métodos de produção de um roedor geneticamente modificado e de produção de um anticorpo anti-nav1.7, célula ou tecido isolado de roedor, linhagem celular imortalizada, embrião de roedor, construto de ácido nucleico de direcionamento, e, hibridoma
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
JP2023529846A (ja) 2020-06-02 2023-07-12 バイオサイトジェン ファーマシューティカルズ （ベイジン） カンパニー リミテッド 共通軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を有する遺伝子改変非ヒト動物
IL303865A (en) 2020-12-23 2023-08-01 Regeneron Pharma Methods for obtaining antibodies that bind transmembrane proteins and cells that produce them
CA3165366A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
CN114736927A (zh) * 2022-05-19 2022-07-12 东北大学 一种单抗克隆与表达载体的构建及应用
TW202430641A (zh) * 2023-01-18 2024-08-01 美商基利科學股份有限公司 人類免疫球蛋白二元輕鏈轉殖基因構築體及其用途
WO2026019824A1 (en) * 2024-07-16 2026-01-22 Gilead Sciences, Inc. Human immunoglobulin common light chain transgene constructs and uses thereof
CN121628915A (zh) * 2024-08-29 2026-03-10 上海泰槿生物技术有限公司 产生限制的免疫球蛋白轻链库的细胞、动物和方法

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7041871B1 (en) * 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
ES2473596T3 (es) * 2003-07-15 2014-07-07 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Loci de inmunoglobulina humanizada
ES2463476T3 (es) 2004-10-19 2014-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Método para generar un ratón homocigótico para una modificación genética
AU2007235496B2 (en) * 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
JP5307708B2 (ja) 2006-06-02 2013-10-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒトｉｌ−６受容体に対する高親和性抗体
ITMI20071522A1 (it) * 2007-07-27 2009-01-28 Areta Internat S R L Vaccino idiotipico
EP2147594B1 (en) * 2008-06-27 2013-11-13 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
JP5827127B2 (ja) * 2008-12-18 2015-12-02 エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム ヒト化抗体を発現する非ヒトトランスジェニック動物及びその使用
MY192182A (en) 2009-06-26 2022-08-04 Regeneron Pharma Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
US20120021409A1 (en) * 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US20130045492A1 (en) * 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
SMT202600080T1 (it) * 2010-02-08 2026-03-09 Regeneron Pharma Topo con catena leggera comune
PT3034608T (pt) * 2010-06-22 2019-05-28 Regeneron Pharma Ratinhos expressando uma cadeia leve híbrida de imunoglobulina com uma região variável humana
SMT201700023T1 (it) * 2010-08-02 2017-03-08 Regeneron Pharma Topi che producono proteine leganti vl
RU2460287C1 (ru) * 2011-03-29 2012-09-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) Трансгенная мышь, предназначенная для моделирования состояний, угрожающих развитием синдрома внезапной сердечной смерти при дистрофин-дефицитной кардиомиопатии
HUE047278T2 (hu) * 2011-08-05 2020-04-28 Regeneron Pharma Humanizált univerzális könnyûláncú egerek
GB201122047D0 (en) * 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014160202A4 (en) 2014-11-13
EP3501272B1 (en) 2023-03-01
SG11201506278RA (en) 2015-09-29
ZA201505835B (en) 2019-09-25
SI3501272T1 (sl) 2023-05-31
JP2016512034A (ja) 2016-04-25
AU2023202783A1 (en) 2023-05-25
BR112015022034B1 (pt) 2023-02-28
CA2903698A1 (en) 2014-10-02
PT3501272T (pt) 2023-03-29
DK2967013T3 (en) 2019-03-11
MX2020010837A (es) 2022-03-28
EP4218409A3 (en) 2023-08-30
FI3501272T3 (fi) 2023-04-06
HK1218493A1 (en) 2017-02-24
JP2019213549A (ja) 2019-12-19
AU2014244020B2 (en) 2020-06-04
AU2020203238B2 (en) 2023-04-13
IL280892B2 (en) 2023-05-01
PL2967013T3 (pl) 2019-07-31
CN108611369A (zh) 2018-10-02
NZ711776A (en) 2021-09-24
SI2967013T1 (sl) 2019-03-29
EP4545567A3 (en) 2025-08-13
RU2019115237A (ru) 2019-06-11
CY1121545T1 (el) 2020-05-29
CN105188357A (zh) 2015-12-23
EP4218409B1 (en) 2025-02-12
KR102295842B1 (ko) 2021-08-31
IL280892A (en) 2021-04-29
JP2019076109A (ja) 2019-05-23
EP2967013A1 (en) 2016-01-20
ES3013063T3 (en) 2025-04-10
AU2023202783B2 (en) 2026-02-12
LT3501272T (lt) 2023-03-27
MX2015012539A (es) 2016-06-28
AU2020203238A1 (en) 2020-06-11
JP2020182490A (ja) 2020-11-12
HUE061977T2 (hu) 2023-09-28
KR20210107911A (ko) 2021-09-01
ZA201805369B (en) 2021-08-25
JP6529957B2 (ja) 2019-06-12
BR112015022034A2 (pt) 2017-08-29
IL280892B1 (en) 2023-01-01
MX377146B (es) 2025-03-07
RS64185B1 (sr) 2023-05-31
RU2689664C2 (ru) 2019-05-28
LT2967013T (lt) 2019-04-25
HRP20190706T1 (hr) 2019-10-18
EP4218409C0 (en) 2025-02-12
HUE044003T2 (hu) 2019-09-30
EP4545567A2 (en) 2025-04-30
JP7010902B2 (ja) 2022-02-10
SMT201900196T1 (it) 2019-05-10
DK3501272T5 (da) 2024-09-02
EP4218409A2 (en) 2023-08-02
EP3501272A1 (en) 2019-06-26
SMT202300112T1 (it) 2023-05-12
CN108611369B (zh) 2022-08-26
KR20150126871A (ko) 2015-11-13
ES2712207T3 (es) 2019-05-09
CN105188357B (zh) 2018-04-24
HRP20230490T1 (hr) 2023-08-04
IL240563B (en) 2021-03-25
PL3501272T3 (pl) 2023-07-03
RU2015143110A (ru) 2017-04-18
KR102424756B1 (ko) 2022-07-25
DK3501272T3 (da) 2023-04-03
MX391010B (es) 2025-03-21
IL240563A0 (en) 2015-09-24
RS58669B1 (sr) 2019-06-28
PT2967013T (pt) 2019-04-03
AU2014244020A1 (en) 2015-09-24
JP6790136B2 (ja) 2020-11-25
MX357308B (es) 2018-07-04
SG10201801101QA (en) 2018-04-27
ES2942413T3 (es) 2023-06-01
CA2903698C (en) 2023-02-28
EP2967013B1 (en) 2019-01-16
WO2014160202A1 (en) 2014-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2023202783B2 (en) Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
AU2016202488C1 (en) Common light chain mouse
KR102432611B1 (ko) 일반적인 경쇄 마우스
AU2012249953B2 (en) Non-human animals expressing antibodies having a common light chain
NL2014775B1 (en) Common light chain mouse.
KR20150023535A (ko) 공통 경쇄를 사용하여 완전한 인간 이중 특이적 항체를 만드는 방법
RU2812814C2 (ru) Мыши, экспрессирующие ограниченный репертуар легких цепей иммуноглобулина
AU2018201014A1 (en) Common light chain mouse