RS64295B1 - Antigen vezujući proteini za proprotein konvertazu subtilizin keksin tip 9 (pcsk9) - Google Patents

Antigen vezujući proteini za proprotein konvertazu subtilizin keksin tip 9 (pcsk9)

Info

Publication number
RS64295B1
RS64295B1 RS20230403A RSP20230403A RS64295B1 RS 64295 B1 RS64295 B1 RS 64295B1 RS 20230403 A RS20230403 A RS 20230403A RS P20230403 A RSP20230403 A RS P20230403A RS 64295 B1 RS64295 B1 RS 64295B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
pcsk9
antigen binding
antibody
examples
antigen
Prior art date
Application number
RS20230403A
Other languages
English (en)
Inventor
Simon Mark Jackson
Nigel Pelham Clinton Walker
Derek Evan Piper
Bei Shan
Wenyan Shen
Joyce Chi Yee Chan
Chadwick Terence King
Randal Robert Ketchem
Christopher Mehlin
Teresa Arazas Carabeo
Quiong Cao
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39951467&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS64295(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of RS64295B1 publication Critical patent/RS64295B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/405—Indole-alkanecarboxylic acids; Derivatives thereof, e.g. tryptophan, indomethacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na antigen vezujuće proteine koji se vezuju za proprotein konvertazu subtilizin keksin tip 9 (PCSK9), i postupke za upotrebu i pripremanje tih antigen vezujućih proteina.
POZADINA
[0002] Proprotein konvertaza subtilizin keksin tip 9 (PCSK9) je serin proteaza uključena u regulisanje nivoa proteina lipoprotein receptora male gustine (LDLR) (Horton et al., 2007;
Seidah i Prat, 2007). In vitro eksperimenti pokazali su da dodavanje PCSK9 HepG2 ćelijama smanjuje nivoe LDLR na površini ćelije (Benjannet et al., 2004; Lagace et al., 2006; Maxwell et al., 2005; Park et al., 2004). Eksperimenti sa miševima pokazali su da povećanje nivoa PCSK9 proteina smanjuje nivoe LDLR proteina u jetri (Benjannet et al., 2004; Lagace et al., 2006;
Maxwell et al., 2005; Park et al., 2004), dok PCSK9 nokaut miševi imaju povećane nivoe LDLR u jetri (Rashid et al., 2005). Pored toga, identifikovane su različite humane PCSK9 mutacije koje rezultiraju bilo u povećanju ili u smanjenju nivoa LDL plazme (Kotowski et al., 2006; Zhao et al., 2006). Pokazano je da je PCSK9 u direktnoj interakciji sa LDLR proteinom, putem endocitoziranja zajedno sa LDLR, i da koimunofluorescira sa LDLR putem endosomalne putanje (Lagace et al., 2006). Štaviše, otkriveno je da se PCSK9 vezuje za EGFa domen unutar LDLR (Zhang et al., 2007). Nije zapažena razgradnja LDLR od strane PCSK9, a mehanizam kojim snižava vanćelijske nivoe LDLR proteina je neizvestan. Selektivna inhibicija PCSK9 gena kod miševa sa hiperlipidemijom korišćenjem antisens oligonukleotida (ASO) dovela je do značajnih smanjenja PCSK9 mRNK nivoa u jetri, uz istovremena smanjenja ukupnog holesterola i LDL (Graham et al., 2007).
[0003] PCSK9 je prohormon-proprotein konvertaza u subtilizin (S8) familiji serin proteaza (Seidah et al., 2003). Ljudi imaju devet prohormon-proprotein konvertaza koje mogu biti podeljene između S8A i S8B podfamilija (Rawlings et al., 2006). Furin, PC1/PC3, PC2, PACE4, PC4, PCS/PC6 i PC7/PC8/LPC/SPC7 su klasifikovani u podfamiliju S8B. Kristalne i NMR strukture različitih domena iz furina miševa i PC1 ukazuju na subtilizin-slične pro- i katalitičke domene, a P domen direktno C-terminala na katalitički domen (Henrich et al., 2003; Tangrea et al., 2002). Na osnovu sličnosti aminokiselinske sekvence unutar ove podfamilije, predviđa se da svih sedam članova imaju iste strukture (Henrich et al., 2005). SKI-1/S1P i PCSK9 klasifikovani su u podfamiliju S8A. Upoređivanja sekvenci sa ovim proteinima takođe ukazuju na prisustvo subtilizin-slične pro- i katalitičke domene (Sakai et al., 1998; Seidah et al., 2003; Seidah et al., 1999). U ovim proteinima C-terminal aminokiselinske sekvence do katalitičkog domena više je promenljiv i ne ukazuje na prisustvo P domena.
[0004] Prohormon-proprotein konvertaze se iskazuju kao zimogeni i razvijaju se višefaznim postupkom. Funkcija pro-domena u ovom postupku je dvostruka. Pro-domen prvo deluje kao pratilac i neophodan je za ispravno nizanje katalitičkog domena (Ikemura et al., 1987). Kada se katalitički domen naniže, dolazi do autokatalize između prodomena i katalitičkog domena . Posle ove početne reakcije cepanja, pro-domen ostaje vezan za katalitički domen gde on zatim deluje kao inhibitor katalitičke aktivnosti (Fu et al., 2000). Kada su uslovi odgovarajući , razvijanje se odvija sa drugim katalitičkim događajem na mestu unutar pro-domena (Anderson et al., 1997). Nakon ovog drugog događaja cepanja, dolazi do disocijacije pro-domena i katalitičkog domena, što dovodi do aktivne proteaze.
[0005] Autokataliza PCSK9 zimogena odigrava se između Gln152 i Ser153 (VFAQ|SIP) (Naureckiene et al., 2003), i pokazano je da je potrebna za sopstveno lučenje iz ćelija (Seidah et al., 2003). Drugi autokatalitički događaj na mestu unutar pro-domena PCSK9 nije zapažen. Prečišćeni PCSK9 sastoji se od dve vrste koje mogu biti razdvojene neredukujućim SDS-PAGE; pro-domen na 17 Kd, a katalitički plus C-terminal domeni na 65 Kd. Nije izolovan PCSK9 bez svog inhibitornog pro-domena, a merenja katalitičke aktivnosti PCSK9 bila su promenljiva (Naureckiene et al., 2003; Seidah et al., 2003).
SUŠTINA PRONALASKA
[0006] Ovaj pronalazak odnosi se na monoklonalna antitela ili njihove antigen vezujuće fragmente za upotrebu u lečenju ili prevenciji hiperholesterolemije ili bolesti ateroskleroze povezane sa povišenim nivoima holesterola u serumu; ili za upotrebu u redukovanju rizika od povratka kardiovaskularnog događaja povezanog sa povišenim nivoima holesterola u serumu, kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima. Monoklonalna antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti vezuju se za katalitički domen PCSK9 proteina aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, i sprečavaju ili redukuju vezivanje PCSK9 za LDLR. Bilo koje upućivanje na (izolovano) antitelo koje vezuje protein, a koje se pominje u nastavku, podrazumeva se da se odnosi na monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment.
SUŠTINA DODATNIH TEHNIČKIH INFORMACIJA
[0007] Tehničko otkrivanje dato u nastavku može u nekim aspektima prevazići obim ovog pronalaska koji je definisan priloženim patentnim zahtevima. Elementi otkrivanja koji ne spadaju unutar obima patentnih zahteva obezbeđeni su radi informisanja.
[0008] Takođe je ovde opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje PCSK9 koji obuhvata: A) jedan ili više komplementarno određujućih regiona teškog lanca (CDRH) odabranih iz grupe koja se satoji od: (i) CDRH1 iz CDRH1 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60; (ii) CDRH2 iz CDRH2 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60; (iii) CDRH3 iz CDRH3 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60; i (iv) CDRH iz (i), (ii), i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, isključenja ili uključenja od ne više od 4 aminokiseline; B) jedan ili više komplementarno određujućih regiona lakog lanca (CDRL) odabranih iz grupe koja se satoji od: (i) CDRL1 z CDRL1 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46; (ii) CDRL2 iz CDRL2 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46; (iii) CDRL3 iz CDRL3 u sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46; i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, isključenja ili uključenja od ne više od 4 aminokiseline; ili C) jedan ili više CDRH teškog lanca iz A) i jedan ili više CDRL lakog lanca iz B). U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein obuhvata najmanje jedan CDRH iz A) i najmanje jedan CDRL iz B). U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein obuhvata najmanje dva CDRH iz A) i najmanje dva CDRL iz B). U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein obuhvata pomenute CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3. U nekim primerima, CDRH iz A) odabran je iz najmanje jedne od grupe koju čine: (i) CDRH1 aminokiselinska sekvenca odabrana od CDRH1 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 67, 79, 89, i 49; (ii) CDRH2 aminokiselinska sekvenca odabrana od CDRH2 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 67, 79, 89, i 49; (iii) CDRH3 aminokiselinska sekvenca odabrana od CDRH3 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 67, 79, 89, i 49; i (iv) CDRH iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, isključenja ili uključenja od ne više od 2 aminokiseline. Dodatno, CDRL iz B) odabran je najmanje iz jedne grupe koju čine: (i) CDRL1 aminokiselinska sekvenca odabrana od CDRL1 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 12, 35, 32, i 23; (ii) CDRL2 aminokiselinska sekvenca odabrana od CDRL2 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 12, 35, 32, i 23; (iii) CDRL3 aminokiselinska sekvenca odabrana od CDRL3 u sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 12, 35, 32, i 23; i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, isključenja ili uključenja ne više od 2 aminokiseline; ili C) jedan ili više CDRH teškog lanca iz A) i jedan ili više CDRL lakog lanca iz B. U nekim primerima, CDRH iz A) bira se iz najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRH1 aminokiselinske sekvence iz CDRH1 aminokiselinske sekvence u SEQ ID NO: 67; (ii) CDRH2 aminokiselinske sekvence iz CDRH2 aminokiselinske sekvence u SEQ ID NO: 67; (iii) CDRH3 aminokiselinske sekvence iz CDRH3 aminokiselinske sekvence u SEQ ID NO: 67; i (iv) CDRH iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, isključenja ili uključenja ne više od 2 aminokiseline; pomenuti CDRL iz B) bira se iz najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRL1 aminokiselinske sekvence iz CDRL1 aminokiselinske sekvence u SEQ ID NO: 12; (ii) CDRL2 aminokiselinske sekvence iz CDRL2 aminokiselinske sekvence u SEQ ID NO: 12; (iii) CDRL3 aminokiselinske sekvence iz CDRL3 aminokiselinske sekvence u SEQ ID NO: 12; i (iv) CDRL iz (i), (ii) i (iii) koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, isključenja ili uključenja ne više od 2 aminokiseline; ili C) jedan ili više CDRH teškog lanca iz A) i jedan ili više CDRL lakog lanca iz B). U nekim primerima, antigen vezujući protein obuhvata A) CDRH1 iz CDRH1 sekvence u SEQ ID NO: 67, CDRH2 iz CDRH2 sekvence u SEQ ID NO: 67, i CDRH3 iz CDRH3 sekvence u SEQ ID NO: 67, i B) CDRL1 iz CDRL1 sekvence u SEQ ID NO: 12, CDRL2 iz CDRL2 sekvence u SEQ ID NO: 12, i CDRL3 iz CDRL3 sekvence u SEQ ID NO: 12. U nekim primerima, antigen vezujući protein obuhvata varijabilni region teškog lanca (VH) koji ima najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa aminokiselinskom sekvencom odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60, i/ili varijabilni region lakog lanca (VL) koji ima najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa aminokiselinskom sekvencom odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. U nekim primerima, VH ima najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa aminokiselinskom sekvencom odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60, i/ili VL ima najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa aminokiselinskom sekvencom odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. U nekim primerima, VH je odabrano iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60, i/ili VL je odabrano iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46.
[0009] Ovde je, takođe, opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje PCSK9, gde antigen vezujući protein obuhvata: A) jedan ili više CDR teškog lanca (CDRH) izabranih između najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRH1 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa CDRH1 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60; (ii) CDRH2 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa CDRH2 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60; i (iii) CDRH3 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa CDRH3 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60; B) jedan ili više CDR lakog lanca (CDRL) odabranih od najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRL1 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa CDRL1 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46; (ii) CDRL2 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa CDRL2 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46; i (iii) CDRL3 sa najmanje 80% sekvencijalnog identiteta sa CDRL3 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46; ili C) jedan ili više CDRH teškog lanca iz A) i jedan ili više CDRL lakog lanca iz B). U nekim primerima, antigen vezujući protein obuhvata: A) jedan ili više CDRH odabranih od najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRH1 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa CDRH1 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60; (ii) CDRH2 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa CDRH2 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60; i (iii) CDRH3 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa CDRH3 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60; B) jedan ili više CDRL odabranih između najmanje jednog uz grupe koju čine: (i) CDRL1 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa CDRL1 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46; (ii) CDRL2 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa CDRL2 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46; i (iii) CDRL3 sa najmanje 90% sekvencijalnog identiteta sa CDRL3 u jednoj od sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46; ili C) jedan ili više CDRH teškog lanca iz A) i jedan ili više CDRL lakog lanca iz B).
[0010] Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje PCSK9, pri čemu antigen vezujući protein obuhvata: A) komplementarno određujući region teškog lanca (CDRH) izabran od najmanje jednog iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRH3 odabranog od CDRH3 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 67, 79, i 49, (ii) CDRH3 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH3 iz (i) po aminokiselinskoj adiciji, deleciji ili supstituciji ne više od dve aminokiseline; i (iii) X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO: 404), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine D, A, R, i bez aminokiseline, X2je odabrano iz grupe koju čine Y, I, G, i bez aminokiseline, X3je odabrano iz grupe koju čine D, A, G, i bez aminokiseline, X4je odabrano iz grupe koju čine F, A, L, i bez aminokiseline, X5je odabrano iz grupe koju čine W, L, A, i bez aminokiseline, X6je odabrano iz grupe koju čine S, Y, A, i bez aminokiseline, X7je odabrano iz grupe koju čine A, Y, R, i bez aminokiseline, X8je odabrano iz grupe koju čine Y, P, i bez aminokiseline, X9je odabrano iz grupe koju čine Y, G, i bez aminokiseline, X10je odabrano iz grupe koju čine D, G, i bez aminokiseline, X11je odabrano iz grupe koju čine A, M, i bez aminokiseline, X12je odabrano iz grupe koju čine F, D, i bez aminokiseline, X13je odabrano iz grupe koju čine D, V, i bez aminokiseline, X14je odabrano iz grupe koju čine V i bez aminokiseline; B) komplementarno određujući region lakog lanca (CDRL) izabran od najmanje jednog iz grupe koja se sastoji od: (i) CDRL3 odabranog od CDRL3 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 12, 35, i 23, (ii) CDRL3 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL3 iz (i) po aminokiselinskoj adiciji, deleciji ili supstituciji ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRL3 aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine: X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO: 405), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine Q i G, X2je odabrano iz grupe koju čine S, T, A, i bez aminokiseline, X3je odabrano iz grupe koju čine Y, bez aminokiseline, i W, X4je odabrano iz grupe koju čine D i bez aminokiseline, X5je odabrano iz grupe koju čine S i bez aminokiseline, X6je odabrano iz grupe koju čine S i bez aminokiseline, X7je odabrano iz grupe koju čine L, T, i bez aminokiseline, X8je odabrano iz grupe koju čine ni jedna aminokiselina, A, i S, X9je odabrano iz grupe koju čine ni jedna aminokiselina, G, A, i V, X10je odabrano iz grupe koju čine ni jedna aminokiselina, S, Y, i V, X11je odabrano iz grupe koju čine ni jedna aminokiselina i V.
[0011] Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji obuhvata laki lanac koji ima sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koju čine: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 46 i neka njihova kombinacija.
[0012] U nekim primerima, antigen vezujući protein specifično se vezuje za epitop koji je vezan najmanje jednim od ovde opisanih antigen vezujućih proteina. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein dalje obuhvata teški lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, 60, i neka njihova kombinacija. U nekim pprimerima, aminokiselinska sekvenca AVP-a bira se iz grupe koju čine SEQ ID NO: 12, 35, 23, i neke njihove kombinacije. U nekim primerima, teški lanac AVP-a obuhvata CDRH3 iz SEQ ID NO: 67, CDRH2 iz SEQ ID NO: 67, i CDRH1 iz SEQ ID NO:67, a pomenuti laki lanac obuhvata CDRL3 iz SEQ ID NO: 12, CDRL2 iz SEQ ID NO: 12, i CDRL1 iz SEQ ID NO: 12. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein je monoklonalno antitelo, ili neki fragment antitela. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein je Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2fragment, Fv fragment, dijatelo, ili jednolančani molekul antitela. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein je humano antitelo. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein je monoklonalno antitelo. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein je IgG1-, IgG2- IgG3- ili IgG4-tipa. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein je IgG4- ili IgG2-tipa. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein vezuje se za markirnu grupu. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein je u kompeticiji za vezivanje za PCSK9 sa nekim ovde opisanim antigen vezujućim proteinom. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein redukuje vezivanje PCSK9 za LDLR. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein snižava količinu prisutnog LDL-a u subjektu kada mu se daje. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein snižava količinu holesterola u serumu prisutnog u subjektu kada se daje tom subjektu. U nekim primerima, izolovani antigen vezujući protein povećava količinu LDLR-a prisutnog u subjektu kada se daje tom subjektu.
[0013] Ovde je takođe opisan vektor koji obuhvata ovde opisan molekul nukleinske kiseline. Ovde je takođe opisana ćelija domaćina koja obuhvata ovde opisani molekul nukleinske kiseline.
[0014] U nekim aspektima, izolovani isolated antigen vezujući protein je u kompeticiji za vezivanje za PCSK9 sa ovde opisanim antigen vezujućim proteinom.
[0015] Ovde je takođe opisan molekul nukleinske kiseline koji enkodira ovde odgovarajuće opisan antigen vezujući protein.
[0016] U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija obuhvata najmanje jedan antigen vezujući protein za ovde opisanu upotrebu.
[0017] Ovde je takođe opisan postupak za lečenje ili prevenciju stanja povezanih sa povišenim nivoima holesterola u serumu pacijenta, obuhvatajući davanje pacijentu kome je to potrebno efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina.
[0018] Takođe je ovde opisan postupak za inhibiranje vezivanja PCSK9 za LDLR kod subjekta, koji obuhvata davanje efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog antigen vezujućeg proteina.
[0019] U nekim slučajevima, antigen vezujući protein selektivno se vezuje za PCSK9, gde se antigen vezujući protein vezuje za PCSK9 sa Kdkoja je manja od 100 pM.
[0020] Ovde je, takođe, opisan postupak za lečenje ili prevenciju stanja povezanih sa povišenim nivoima holesterola u serumu subjekta, gde postupak obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina.
[0021] Ovde je, takođe, opisan postupak za snižavanje nivoa holesterola u serumu subjekta, pri čemu postupak obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina.
[0022] Takođe je ovde opisan postupak za snižavanje nivoa holesterola u serumu subjekta, pri čemu postupak obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina, simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina.
[0023] Takođe je ovde opisan postupak za povećavanje nivoa LDLR proteina kod subjekta, gde postupak obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog odve opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina.
[0024] Ovde je, takođe, opisan postupak za povećavanje nivoa LDLR proteina kod subjekta, gde postupak obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina.
[0025] U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija obuhvata AVP za ovde opisanu primenu i agens koji podiže dostupnost nivoa LDLR proteina. U nekim primerima, agens koji podiže dostupnost LDLR proteina obuhvata statin. U nekim primerima, statin se bira iz grupe koju čine atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rozuvastatin, simvastatin, i neku njihovu kombinaciju.
[0026] Ovde je, takođe, opisan postupak pripreme ovde opisanog antigen vezujućeg proteina, koji obuhvata fazu pripremanja pomenutog antigen vezujućeg proteina iz ćelije domaćina koja sekretuje pomenuti antigen vezujući protein.
[0027] U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija obuhvata najmanje jedan antigen vezujući protein pogodan za upotrebu kao što je ovde opisano i farmaceutski prihvatljivi ekscipijens. U nekim primerima, ova farmaceutska kompozicija dalje obuhvata dodatni aktivni agens. U nekim primerima, pomenuti dodatni aktivni agens bira se iz grupe koju čine radioizotop, radionuklid, toksin, ili terapeutska ili hemoretapeutska grupa.
[0028] Ovde je, takođe, opisan postupak za lečenje ili prevenciju stanja vezanog za povišeni nivo holesterola u serumu pacijenta. Postupak obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog antigen vezujućeg proteina. U nekim primerima, to stanje je hiperholesterolemija.
[0029] Ovde je, takođe, opisan postupak za inhibiranje vezivanja PCSK9 za LDLR kod pacijenta, koja obuhvata davanje efektivne količine najmanje jednog odgovarajućeg antigen vezujućeg proteina kakav je ovde opisan.
[0030] U nekim primerima, antigen vezujući protein vezuje se za PCSK9 sa Kdkoja je manja od 100 pM. U nekim primerima, antigen vezujući protein se vezuje sa Kdkoja je manja 10 pM. U nekim primerima, antigen vezujući protein vezuje se sa Kdkoja je manja od 5 pM.
[0031] Ovde je, takođe, opisan postupak za lečenje ili prevenciju stanja povezanog sa povišenim nivoima holesterola u serumu subjekta, gde pomenuti postupak obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efektivne količine namanje jednog izolovanog antigen vezujućeg proteina kakav je ovde opisan simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina. U nekim primerima, agens koji podiže dostupnost LDLR proteina obuhvata statin. U nekim primerima, taj statin bira se iz grupe koju čine atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rozuvastatin, simvastatin, i neka njihova kombinacija.
[0032] Ovde je, takođe, opisan postupak za snižavanje nivoa holesterola u serumu subjekta. Taj postupak obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog ovde opisanog izolovanog antigen vezujućeg proteina.
[0033] Ovde je, takođe, opisan postupak za snižavanje nivoa holesterola u serumu subjekta, koji obuhvata davanje subjektu efektivne količine najmanje jednog izolovanog antigen vezujućeg proteina, kako je ovde opisano, simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina. U nekim primerima, agens koji podiže dostupnost LDLR proteina obuhvata statin. U nekim primerima, taj statin bira se iz grupe koju čine atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rozuvastatin, simvastatin, i neka njihova kombinacija.
[0034] Ovde je, takođe, opisan postupak za povećavanje nivoa LDLR proteina kod subjekta putem davanja subjektu efektivne količine najmanje jednog ovde izolovanog antigen vezujućeg proteina kako je ovde opisano.
[0035] Ovde je, takođe, opisan postupak za povećavanje nivoa LDLR proteina kod subjekta putem davanja subjektu efektivne količine najmanje jednog izolovanog antigen vezujućeg proteina, kako je ovde opisano, simultano ili sekvencijalno sa agensom koji podiže dostupnost LDLR proteina. U nekim primerima, agens koji podiže dostupnost nivoa LDLR proteina obuhvata statin. U nekim primerima, taj statin bira se iz grupe koju čine atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rozuvastatin, simvastatin, i neka njihova kombinacija.
[0036] Ovde je, takođe, opisano neutralizujuće antitelo koje se vezuje za PCSK9 i redukuje receptor lipoproteina niske gustine (LDLR) snižavajući efekat PCSK9 na LDLR. U nekim primerima, to antitelo specifično se vezuje za PCSK9. U nekim primerima, to antitelo se vezuje za katalitički domen PCSK9. U nekim primerima, to antitelo se vezuje za epitop unutar ostataka 31-447 SEQ ID NO: 3. U nekim primerima, to antitelo se vezuje za PCSK9 koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična SEQ ID NO: 3.
[0037] U nekim primerima, kada se antigen vezujući protein veže za PCSK9, to antitelo se pozicionira 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, ili C378. U nekim primerima, antitelo se pozicionira 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, ili Q382. U nekim primerima, to antitelo se pozicionira 5 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih sotataka PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, ili S381. U nekim primerima, to antitelo se pozicionira 5 angstrema ili manje od najmanje dva od sledećih sotataka PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, ili S381. U nekim primerima, to antitelo je 5 angstrema ili manje od najmanje četiri od sledećih ostataka PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, ili S381. U nekim primerima, to antitelo je pozicionirano 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, ili Q387. U nekim primerima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, ili G384. U nekim primerima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje dva od sledećih ostataka PCSK9: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, ili G384. U nekim primerima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje četiri od sledećih ostataka PCSK9: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383,ili G384. U nekim primerima, to antitelo je pozicionirano 8 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, ili C378. U nekim primerima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, ili F379. U nekim primerima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje dva od sledećih ostataka PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, ili F379.
U nekim primerima, to antitelo je pozicionirano 5 angstrema ili manje od najmanje četiri od sledećih ostataka PCSK9: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, ili F379.
[0038] Ovde je, takođe, opisano neutralizujuće antitelo koje se vezuje za PCSK9, pri čemu se to antitelo vezuje za PCSK9 i smanjuje izglednost da se PCSK9 veže za LDLR.
[0039] Ovde je, takođe, opisano izolovano antitelo ili antigen vezujući molekul koji blokira antitelo za PCSK9 prilikom vezivanja unutar 8 angstrema ostatka PCSK9. U nekim primerima, ostatak PCSK9 je odabran od najmanje jednog od sledećih PCSK9 ostataka: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, ili C378.
[0040] U nekim primerima, izolovano antitelo ili antigen vezujući molekul vezuje se za PCSK9 na poziciji koja se preklapa sa pozicijom na kojoj se LDLR vezuje za PCSK9. U nekim primerima, pozicija na kojoj se LDLR vezuje za PCSK9 uključuje najmanje jedan aminokiselinski ostatak odabran iz grupe koju čine: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, i S381.
[0041] U nekim primerima, antitelo ili antigen vezujući molekul smanjuje izglednost da će se EGFa vezati za PCSK9 unutar 8 angstrema od najmanje jednog od sledećih ostataka PCSK9: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, 1368, G370, A371, S373, S376, ili Q382.
[0042] U nekim primerima, antitelo, antigen vezujući protein ili antigen vezujući molekul vezuje se za površinu PCSK9 koja se preklapa sa površinom na kojoj se vezuje EGFa, vezuje Ab 21B12, i/ili vezuje 31H4. U nekim primerima, antitelo, antigen vezujući protein ili antigen vezujući molekul vezuje se za PCSK9 na način koji je sličan onom prikazanom u priloženim crtežima.
[0043] U nekim aspektima, izolovani antigen vezujući protein za ovde opisanu primenu vezuje se za PCSK9 protein iz SEQ ID NO: 1, pri čemu je vezivanje između pomenutog izolovanog antigen vezujućeg proteina i varijantnog PCSK9 proteina manje od 50% od vezivanja između izolovanog antigen vezujućeg proteina i PCSK9 proteina iz SEQ ID NO: 1 i/ili SEQ ID NO: 303. U nekim primerima, varijantni PCSK9 protein obuhvata najmanje jednu mutaciju ostatka na položaju odabranom iz grupe koju čine ili koja obuhvata 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554, kako je prikazano u SEQ ID NO: 1. U nekim primerima, najmanje ta jedna mutacija odabrana je iz grupe koja obuhvata ili koju čine R207E, D208R, E181R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, i E582R. U nekim primerima, najmanje ta jedna mutacija odabrana je iz grupe koju čine D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, i Q554R.
[0044] U nekim aspektima, antigen vezujući protein, za ovde opisanu upotrebu, vezuje se za PCSK-9 protein iz SEQ ID NO: 303 na prvi način i vezuje se za varijantu PCSK9 na drugi način. Varijanta PCSK9 ima najmanje jednu tačkastu mutaciju na položaju odabranom iz grupe koja obuhvata ili koju čine: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554 iz SEQ ID NO: 303 i /ili SEQ ID NO: 1. U nekim primerima, prvi način obuhvata prvi EC50, prvi Bmax, ili prvi EC50 i prvi Bmax. U nekim primerima, drugi način obuhvata drugi EC50, drugi Bmax, ili drugi EC50 i drugi Bmax.
Vrednost za prvi način različit je od vrednosti za drugi način. U nekim primerima, prvi način obuhvata prvi EC50, dok drugi način uključuje drugi EC50, a gde se tačkasta mutacija bira iz grupe koja se sastoji od ili obuhvata: R207E, D208R, E181R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, i E582R. U nekim primerima, prvi EC50 je najmanje za 20% različit od drugog EC50. U nekim primerima, prvi EC50 je najmanje za 50% različit od drugog EC50. U nekim primerima, drugi EC50 ima veću numeričku vrednost od prvog EC50. U nekim primerima, prvi EC50 određen je multipleksnim ogledom vezivanja kuglice. U nekim primerima, drugi EC50 je veći od 1 um. U nekim primerima, prvi način obuhvata prvi Bmax, a drugi način obuhvata drugi Bmax koji je različit od prvog Bmax. Varijanta PCSK9 ima najmanje jednu tačkastu mutaciju odabranu iz grupe koja se sastoji od ili obuhvata: D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, i Q554R. U nekim primerima, drugi Bmax je oko 10% prvog Bmax. U nekim primerima, prvi Bmax je najmanje 20% različit od drugog Bmax. U nekim primerima, prvi Bmax je najmanje 50% različit od drugog Bmax.
[0045] U nekim aspektima, ovaj pronalazak obuhvata izolovani antigen vezujući protein koji se vezuje za PCSK9 protein iz SEQ ID NO: 3 za ovde opisanu primenu, pri čemu epitop antigen vezujućeg proteina uključuje najmanje jednu od sledećih aminokiselina iz SEQ ID NO: 1: 207, 208, 181, 185, 439, 132, 351, 390, 413, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, i 337.
[0046] U nekim aspektima, izolovani neutralizujući antigen vezujući protein, za ovde opisanu upotrebu, vezuje se za PCSK9 protein obuhvatajući sekvencu amino kieline iz SEQ ID NO: 1, pri čemu neutralizujući antigen vezujući protein umanjuje LDLR efekat snižavanja PCSK9 na LDLR. U nekim primerima, antigen vezujući protein je LDLR kompetitivni neutralizujući antigen vezujući protein.
[0047] U nekim aspektima, izolovani antigen vezujući protein, za ovde opisanu primenu, obuhvata: A) CDRH1 iz CDRH1 sekvence u SEQ ID NO: 49, CDRH2 iz CDRH2 sekvence u SEQ ID NO: 49, i CDRH3 iz CDRH3 sekvence u SEQ ID NO: 49, i B) CDRL1 iz CDRL1 sekvence u SEQ ID NO:23, CDRL2 iz CDRL2 sekvence u SEQ ID NO:23, i CDRL3 iz CDRL3 sekvence u SEQ ID NO:23.
[0048] Ovde je, takođe, opisana kompozicija koja obuhvata kristalizovani PCSK9 protein i antigen vezujući protein koji se vezuje za PCSK9. Ova kompozicija obuhvata kristalizovani PCSK9 protein takav da se trodimenzionalna struktura PCSK9 proteina može odrediti do rezolucije od oko 2.2 angstrema ili boljoj. U nekim primerima, antigen vezujući protein je antitelo ili njegov fragment.
[0049] Ovde je, takođe, opisan kristalizovan PCSK9 protein i najmanje jedna sekcija EGFa LDLR proteina, gde je EGFa sekcija LDLR proteina vezana od strane PCSK9 proteina, pri čemu je pomenuti kristalizovani PCSK9 protein takav da se trodimenzionalna struktura PCSK9 proteina može utvrditi do rezolucije od oko 2.2 angstrema ili boljoj. U nekim primerima, molekulski model nalazi se na kompijuterski čitljivom medijumu.
[0050] Ovde je, takođe, opisana primena antigen vezujućeg proteina kakav je ovde opisan, za pripremanje medikamenta za snižavanje holesterola u serumu.
[0051] Ovde je, takođe, opisana primena antigen vezujućeg proteina kakav je ovde opisan, za pripremanje medikamenta za lečenje ili prevenciju stanja povezanog sa povišenim nivoima holesterola u serumu subjekta.
[0052] Ovde je, takođe, opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje PCSK9, pri čemu antigen vezujući protein obuhvata: A) komplementarno određujući region teškog lanca (CDRH) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRH1 odabran od CDRH1 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 67, 79, 89, i 49, (ii) CDRH1 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH1 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRH1 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(SEQ ID NO: 406), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine G, X2je odabrano iz grupe koju čine Y, F, i G, X3je odabrano iz grupe koju čine T i S, X4je odabrano iz grupe koju čine L i F, X5je odabrano iz grupe koju čine T, S, i N, X6je odabrano iz grupe koju čine S i A, X7je odabrano iz grupe koju čine Y i F, X8je odabrano iz grupe koju čine G, S, i Y, X9je odabrano iz grupe koju čine I, M, i W, X10je odabrano iz grupe koju čine S, N i H, B) komplementarno određujući region lakog lanca (CDRL) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRL1 odabran od CDRL1 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 12, 32, 35, i 23, (ii) CDRL1 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL3 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRL1 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO: 407), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine T i bez aminokiseline, X2je odabrano iz grupe koju čine G i S, X3je odabrano iz grupe koju čine S, T, i G, X4je odabrano iz grupe koju čine S, X5je odabrano iz grupe koju čine S, X6je odabrano iz grupe koju čine N, D, i S, X7je odabrano iz grupe koju čine I, V, i N, X8je odabrano iz grupe koju čine G i I, X9je odabrano iz grupe koju čine A i G, X10je odabrano iz grupe koju čine G, Y, S, i N, X11je odabrano iz grupe koju čine Y i N, X12je odabrano iz grupe koju čine D, S, T, i F, X13je odabrano iz grupe koju čine V, X14je odabrano iz grupe koju čine S, N, i H. Stručnjak u ovoj oblasti znaće da pojedinačni AVP ili antitelo može da zadovolji jednu ili više od gorepomenutih opcija i da i dalje bude pogodan za upotrebu prema ovom pronalasku.
[0053] Ovde je, takođe, opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje PCSK9, pri čemu antigen vezujući protein obuhvata: A) komplementarno određujući region teškog lanca (CDRH) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine sledeći: (i) CDRH2 odabran od CDRH2 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 67, 79, 89, i 49, (ii) CDRH2 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH2 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRH2 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(SEQ ID NO: 408), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine W, S, L i bez aminokiseline, X2je odabrano iz grupe koju čine V, I, i E, X3je odabrano iz grupe koju čine S, W, i I, X4je odabrano iz grupe koju čine F, S, i N, X5je odabrano iz grupe koju čine Y, S, D, i H, X6je odabrano iz grupe koju čine N, S, i G, X7je odabrano iz grupe koju čine S i G, X8je odabrano iz grupe koju čine N, Y, D, i R, X9je odabrano iz grupe koju čine T, I, i E, X10je odabrano iz grupe koju čine N, S, Y, i D, X11je odabrano iz grupe koju čine Y, X12je odabrano iz grupe koju čine A i N, X13je odabrano iz grupe koju čine Q, D, i P, X14je odabrano iz grupe koju čine K i S, X15je odabrano iz grupe koju čine L, i V, X16je odabrano iz grupe koju čine Q i K, X17je odabrano iz grupe koju čine G i S, B) komplementarno određujući region lakog lanca (CDRL) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine sledeći: (i) CDRL2 odabran od CDRL3 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 12, 32, 35, i 23, (ii) CDRL2 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL3 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRL2 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO: 409), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine G, E, S, i D, X2je odabrano iz grupe koju čine N, V, i Y, X3je odabrano iz grupe koju čine S i N, X4je odabrano iz grupe koju čine N, Q, i K, X5je odabrano iz grupe koju čine R, X6je odabrano iz grupe koju čine P, X7je odabrano iz grupe koju čini S.
[0054] Ovde je, takođe, opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje PCSK9, pri čemu antigen vezujući protein obuhvata: A) komplementarno određujući region teškog lanca (CDRH) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine sledeći: (i) CDRH3 odabran od CDRH3 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 67, 79, 89, i 49, (ii) CDRH3 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH3 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRH3 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO: 410), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine D, i bez aminokiseline, X2je odabrano iz grupe koju čine Y, A, i bez aminokiseline, X3je odabrano iz grupe koju čine D, I, i bez aminokiseline, X4je odabrano iz grupe koju čine F, A, i bez aminokiseline, X5je odabrano iz grupe koju čine W, A, i bez aminokiseline, X6je odabrano iz grupe koju čine S, L, i bez aminokiseline, X7je odabrano iz grupe koju čine A, Y, G, i bez aminokiseline, Xs je odabrano iz grupe koju čine Y, Q, i bez aminokiseline, X9je odabrano iz grupe koju čine G, Y, i L, X10je odabrano iz grupe koju čine Y, D, i V, X11je odabrano iz grupe koju čine G, A, i P, X12je odabrano iz grupe koju čine M i F, X13je odabrano iz grupe koju čine D, X14je odabrano iz grupe koju čine V i Y, i B) komplementarno određujući region lakog lanca (CDRL) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine sledeći: (i) CDRL3 odabran od CDRL3 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 12, 32, 35, i 23, (ii) CDRL3 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL3 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRL3 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO: 411), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine Q, A, G, i bez aminokiseline, X2je odabrano iz grupe koju čine S, V, T, i bez aminokiseline, X3je odabrano iz grupe koju čine Y, N, i W, X4je odabrano iz grupe koju čine S i D, X5je odabrano iz grupe koju čine S, Y, i D, X6je odabrano iz grupe koju čine S i T, X7je odabrano iz grupe koju čine L i S, X8je odabrano iz grupe koju čine S, T, i N, X9je odabrano iz grupe koju čine G, S, i A, X10je odabrano iz grupe koju čine S, M, W, i Y, i X11je odabrano iz grupe koju čini V. U nekim primerima, bilo koja od gorepomenutih aminokiselina može da se zameni konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom.
[0055] Ovde je, takođe, opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje PCSK9, pri čemu antigen vezujući protein obuhvata A) komplementarno određujući region teškog lanca (CDRH) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine (i) CDRH1 odabran od CDRH1 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, i 58, (ii) CDRH1 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH1 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRH1 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(SEQ ID NO: 412), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine G, P, i A, X2je odabrano iz grupe koju čine Y, W, F, T, i S, X3je odabrano iz grupe koju čine T, P, S i A, C, V, L, i I, X4je odabrano iz grupe koju čine L, F, I, V, M, A, i Y, X5je odabrano iz grupe koju čine T, P, S, i A, X6je odabrano iz grupe koju čine S, T, A, i C, X7je odabrano iz grupe koju čine Y, W, F, T, i S, X8je odabrano iz grupe koju čine G, P, i A, X9je odabrano iz grupe koju čine I, L, V, M, A, i F, X10je odabrano iz grupe koju čine S, T, A, i C, B) komplementarno određujući region lakog lanca (CDRL) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRL1 odabran od CDRL1 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, i 24, (ii) CDRL1 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL3 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRL1 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO: 413), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine T i S, X2je odabrano iz grupe koju čine G, P, i A, X3je odabrano iz grupe koju čine T, i S, X4je odabrano iz grupe koju čine S N, T, A, C, i Q, X5je odabrano iz grupe koju čine S, T, A, i C, X6je odabrano iz grupe koju čine D, i E, X7je odabrano iz grupe koju čine V, I, M, L, F, i A, X8je odabrano iz grupe koju čine G, P, i A, X9je odabrano iz grupe koju čine G, A, R, P, V, L, I, K, Q, i N, X10je odabrano iz grupe koju čine Y, W, F, T, i S, X11je odabrano iz grupe koju čine N, i Q, X12je odabrano iz grupe koju čine Y, S, W, F, T, A, i C, X13je odabrano iz grupe koju čine V, I, M, L, F, i A, X14je odabrano iz grupe koju čine S, T, A, i C.
[0056] Ovde je, takođe, opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje PCSK9, pri čemu antigen vezujući protein obuhvata: A) komplementarno određujući region teškog lanca (CDRH) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRH2 odabran od CDRH2 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, i 58, (ii) CDRH2 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH2 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRH2 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17, (SEQ ID NO: 414), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine W, Y, i F, X2je odabrano iz grupe koju čine V, I, M, L, F, i A, X3je odabrano iz grupe koju čine S, T, A, i C, X4je odabrano iz grupe koju čine A, F, V, L, I, Y, i M, X5je odabrano iz grupe koju čine Y, W, F, T, i S, X6je odabrano iz grupe koju čine N i Q, X7je odabrano iz grupe koju čine G, P, i A, X8je odabrano iz grupe koju čine N, i Q, X9je odabrano iz grupe koju čine T, i S, X10je odabrano iz grupe koju čine N, i Q, X11je odabrano iz grupe koju čine Y, W, F, T, i S, X12je odabrano iz grupe koju čine A, V, L, i I, X13je odabrano iz grupe koju čine Q, E, N, i D, X14je odabrano iz grupe koju čine K, R, Q, i N, X15je odabrano iz grupe koju čine L, F, V, I, M, A, i Y, X16je odabrano iz grupe koju čine Q, i N, X17je odabrano iz grupe koju čine G, P, i A, B) komplementarno određujući region lakog lanca (CDRL) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRL2 odabran od CDRL3 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, i 24, (ii) CDRL2 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL3 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRL2 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO: 415), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine E, i D, X2je odabrano iz grupe koju čine V, I, M, L, F, i A, X3je odabrano iz grupe koju čine S, T, A, i C, X4je odabrano iz grupe koju čine N, i Q, X5je odabrano iz grupe koju čine R, K, Q, i N, X6je odabrano iz grupe koju čine P, i A, X7je odabrano iz grupe koju čine S, T, A, i C.
[0057] Ovde je, takođe, opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje PCSK9, pri čemu antigen vezujući protein obuhvata: A) komplementarno određujući region teškog lanca (CDRH) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine (i) CDRH3 odabran od CDRH3 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, i 58, (ii) CDRH3 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRH3 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRH3 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO: 416), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine G, P, A i bez aminokiseline, X2je odabrano iz grupe koju čine Y, W, F, T, i S, X3je odabrano iz grupe koju čine G, V, P, A, I, M, L, i F, X4je odabrano iz grupe koju čine M, L, F, i I, X5je odabrano iz grupe koju čine D, i E, X6je odabrano iz grupe koju čine V, I, M, L, F, i A, B) komplementarno određujući region lakog lanca (CDRL) odabran od najmanje jednog iz grupe koju čine: (i) CDRL3 odabran od CDRL3 u okviru sekvenci odabranih iz grupe koju čine SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, i 24, (ii) CDRL3 koji se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od CDRL3 iz (i) aminokiselinskom adicijom, delecijom ili supstitucijom ne više od dve aminokiseline; i (iii) CDRL3 aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koju čine X1X2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO: 417), pri čemu je X1odabrano iz grupe koju čine S, N, T, A, C, i Q, X2je odabrano iz grupe koju čine S, T, A, i C, X3je odabrano iz grupe koju čine Y, W, F, T, i S, X4je odabrano iz grupe koju čine T, i S, X5je odabrano iz grupe koju čine S, T, A, i C, X6je odabrano iz grupe koju čine S, T, A, i C, X7je odabrano iz grupe koju čine N, S, Q, T, A, i C, X8je odabrano iz grupe koju čine M, V, L, F, I, i A, X9je odabrano iz grupe koju čine V, I, M, L, F, i A.
KRATAK OPIS CTREŽA
[0058]
FIG. 1A prikazuje aminokiselinsku sekvencu zrele forme PCSK9 sa podvučenim pro-domenom. FIG. 1B1-1B4prikazuju aminokiselinske sekvence i nukleinske kiseline PCSK9 sa podvučenim pro-domenom i signalnom sekvencom u podebljanoj štampi.
FIG. 2A-2D su tabele poređenja sekvenci različitih lakih lanaca različitih antigen vezujućih proteina. FIG.2C nastavak sekvence započete na FIG.2A. FIG.2D nastavak sekvence započete na FIG.2B.
FIG. 3A-3D su tabele poređenja sekvenci različitih teških lanaca različitih antigen vezujućih proteina. FIG.3C nastavak sekvence započete na FIG.3A. FIG.3D nastavak sekvence započete na FIG.3B.
FIG. 3E-3JJ prikazuju aminokiselinske sekvence i nukleinske kiseline za varijabilne domene nekih primera antigen vezujućih proteina.
FIG. 3KK prikazuje aminokiselinske sekvence za različite konstantne domene.
FIG. 3LL-3BBB prikazuju aminokiselinske sekvence i nukleinske kiseline varijabilnih domena nekih primera antigen vezujućih proteina.
FIG. 3CCC-3JJJ su tabele poređenja sekvenci različitih teških i lakih lanaca nekih primera antigen vezujućih proteina.
FIG. 4A je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za humani PCSK9.
FIG. 4B je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za humani PCSK9.
FIG. 4C je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za makaki PCSK9.
FIG. 4D je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za makaki PCSK9.
FIG. 4E je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za mišiji PCSK9.
FIG. 4F je kriva vezivanja antigen vezujućeg proteina za mišiji PCSK9.
FIG. 5A prikazuje rezultate SDS PAGE eksperiementa koji uključuje PCSK9 i različite antigen vezujuće proteine, koji prikazuje relativnu čistoću i koncentraciju proteina.
FIG. 5B i 5C prikazuje grafikone biacore ogleda ravnoteže rastvora za 21B12.
FIG. 5D prikazuje grafikon kinetika iz biacore ogleda hvatanja.
FIG. 5E prikazuje bar grafikon koji prikazuje bining rezultate za tri AVP-a.
FIG. 6A kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31H4 IgG2 za PCSK9 u in vitro PCSK9: LDLR ogledu vezivanja.
FIG. 6B kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31H4 IgG4 za PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR ogledu vezivanja.
FIG. 6C kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21B12 IgG2 za PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR ogledu vezivanja.
FIG. 6D kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21B12 IgG4 za PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR ogledu vezivanja.
FIG. 7A kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31H4 IgG2 u ogledu ćelijskog LDL unosa, koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK9.
FIG. 7B je kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 31H4 IgG4 u ogledu ćelijskog LDL unosa, koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK9.
FIG. 7C je kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21B12 IgG2 u ogledu ćelijskog LDL unosa koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK9.
FIG. 7D je kriva inhibicije antigen vezujućeg proteina 21B12 IgG4 u ogledu ćelijskog LDL unosa, koja prikazuje efekat AVP da redukuje unos LDL blokirajućih efekata PCSK9.
FIG. 8A je grafikon koji prikazuje sposobnost smanjivanja serum holesterola AVP 31H4 kod miševa, promene u odnosu na IgG kontrolne tretirane miševe (* p< 0,01).
FIG. 8B je grafikon koji prikazuje sposobnost smanjivanja serum holesterola AVP 31H4 kod miševa, promene u odnosu na vreme = nula časova (# p, 0,05).
FIG. 8C je grafikon koji prikazuje efeakt AVP 31H4 na nivoe HDL holesterola kod C57B1/6 miševa (* p< 0,01).
FIG. 8D je grafikon koji prikazuje efekat AVP 31H4 na nivoe HDL holesterola kod C57Bl/6 miševa (# p< 0,05).
FIG. 9 prikazuje western blot analizu sposobnosti AVP 31H4 da poveća LDLR protein u jetri koji je prisutan posle različitih vremenskih tačaka.
FIG. 10A je grafikon koji prikazuje sposobnost antigen vezujućeg proteina 31H4 da smanji ukupni serum holesterol kod divljih miševa, relativno.
FIG. 10B je grafikon koji prikazuje sposobnost antigen vezujućeg proteina 31H4 da smanji HDL kod divljih miševa.
FIG. 10C je grafikon koji prikazuje sposobnost smanjivanja serum holesterola različitih antigen vezujućih proteina 31H4 i 16F12.
FIG. 11A pokazuje protokol unosa za testiranje trajanja i sposobnosti smanjivanja serum holesterola antigen vezujućih proteina.
FIG. 11B je grafikon koji prikazuje rezultate protokola u FIG.11A.
FIG. 12A prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 21B12 u HepG2 ćelijama.
FIG. 12B prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 31H4 u HepG2 ćelijama.
FIG. 12C prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 25A7.1, neneutrališuće antitelo, (nasuprot "25A7" neutrališućem antitelu) u HepG2 ćelijama.
FIG. 12D prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 21B12 u HepG2 ćelijama sa prekomernom ekspresijom PCSK9.
FIG. 12E prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 31H4 u HepG2 ćelijama sa prekomernom ekspresijom PCSK9.
FIG. 12F prikazuje LDLR nivoe kao odgovor na kombinaciju statina i AVP 25A7.1, neneutrališuće antitelo, (nasuprot "25A7" neutrališućem antitelu) u HepG2 ćelijama sa prekomernom ekspresijom PCSK9.
FIG. 13A prikazuje različite lake lance aminokiselinskih sekvenci različitih AVP za PCSK9. Tačke (.) označavaju da nema aminokiseline.
FIG. 13B prikazuje kladogram lakog lanca za različite AVP za PCSK9.
FIG. 13C prikazuje različite teške lance aminokiselinskih sekvenci različitih AVP za PCSK9. Tačke (.) označavaju da nema aminokiseline.
FIG. 13D prikazuje dendrogram teškog lanca za različite AVP za PCSK9.
FIG. 13E prikazuje poređenje lakih i teških CDR-ova i oznake grupa od kojih se dobija konsenzus.
FIG. 13F prikazuje konsenzus sekvence Grupa 1 i 2.
FIG. 13G prikazuje konsenzus sekvence Grupa 3 i 4.
FIG. 13H prikazuje konsenzus sekvence Grupa 1 i 2. Tačke (.) označavaju identične ostatke. FIG. 13I prikazuje konsenzus sekvence Grupe 2. Tačke (.) označavaju identične ostatke.
FIG. 13J prikazuje konsenzus sekvence Grupa 3 i 4. Tačke (.) označavaju identične ostatke.
FIG. 14A je grafikon koji prikazuje in vivo sposobnost smanjivanja LDL različitih AVP (pri 10 mg/kg).
FIG. 14B je grafikon koji prikazuje in vivo sposobnost smanjivanja LDL različitih AVP (pri 30 mg/kg).
FIG. 15A i FIG.15B su tabele poređenja sekvenci različitih lakih lanaca različitih primera antigen vezujućih proteina. FIG.15B nastavak sekvence započete u FIG.15A.
FIG. 15C i FIG.15D su tabele poređenja sekvenci različitih lakih lanaca različitih primera antigen vezujućih proteina. FIG.15D nastavak sekvence započete u FIG.15C.
FIG. 16A je prikaz gela korišćenog da se testira sposobnost Ab 21B12 da se veže za ProCat ili VD delove PCSK9.
FIG. 16B je prikaz gela korišćenog da se testira sposobnost Ab 31H4 da se veže za ProCat ili VD delove PCSK9.
FIG. 17 je prikaz strukture PCSK9 i EGFa dela LDLR.
FIG. 18A je prikaz strukture PCSK9 i 31H4 Ab.
FIG. 18B je prikaz strukture PCSK9 i 31H4 Ab.
FIG. 19A je prikaz strukture PCSK9, 31H4 Ab, i 21B12 Ab.
FIG. 19B je prikaz strukture PCSK9 i 21B12 Ab.
FIG. 20A je prikaz strukture PCSK9 i EGFa iz LDLR prekrivenog strukturom antitela 31H4 i 21B12 vezanih za PCSK9.
FIG. 20B je prikaz strukturnog modela PCSK9 i LDLR.
FIG. 20C je prikaz strukturnog modela PCSK9 i LDLR iz alternativne perspektive.
FIG. 20D je prikaz strukturnog modela PCSK9 i LDLR sa uključenim strukturnim predstavljanjem 31H4 i 21B12.
FIG. 20E je prikaz strukturnog modela u FIG.20D, rotiranog za 90 stepeni oko ubeležene ose. FIG. 20F je prikaz strukturnog modela u FIG.20D, rotiranog za 180 stepeni oko ubeležene ose. FIG. 21A je prikaz strukture PCSK9 i 31A4.
FIG. 21B je prikaz strukture PCSK9 i 31A4.
FIG. 21C je prikaz strukture PCSK9 i 31A4.
FIG. 21D je prikaz strukturnog modela cele dužine PCSK9 i 31A4.
FIG. 22 je set AVP sekvenci koje identifikuju različite razlike između humanih AVP sekvenci i AVP sekvenci koje su odgajene u E. coli i upotrebljene za kristalne strukture.
FIG. 23 je tabela različitih bining rezultata.
FIG. 23A je prvi deo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.
FIG. 23B je drugi deo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.
FIG. 23C je treći deo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.
FIG. 23D je četvrti deo tabele koji prikazuje različite bining rezultate.
FIG. 24A je prikaz western blota pod ne-redukovanim uslovima.
FIG. 24B je prikaz western blota pod redukovanim uslovima.
FIG. 25A je prikaz pokrovne površine PCSK9.
FIG. 25B je prikaz pokrovne površine PCSK9.
FIG. 25C je prikaz pokrovne površine PCSK9.
FIG. 25D je prikaz pokrovne površine PCSK9.
FIG. 25E je prikaz pokrovne površine PCSK9.
FIG. 25F je prikaz pokrovne površine PCSK9.
FIG. 26 je poređenje sekvence PCSK9 aminokiselinske sekvence i svih ostataka koji su mutirali u PCSK9 varijantama radi ispitivanja epitopa različitih antitela.
FIG. 27A prikazuje 21B12 pogođeni epitop, kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9, sa 21B12.
FIG. 27B prikazuje 31H4 pogođeni epitop, kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9, sa 31H4 i 21B1.
FIG. 27C prikazuje 31A4 pogođeni epitop, kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9, sa 31H4 i 21B12.
FIG. 27D prikazuje 12H11 pogođeni epitop, kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9, sa 31H4 i 21B12.
FIG. 27E prikazuje 3C4 pogođeni epitop, kako je mapirano na kristalnoj strukturi PCSK9, sa 31H4 i 21B12.
FIG. 28A je grafikon koji ilustruje sposobnost vezivanja različitih AVP za različite delove PCSK9.
FIG. 28B je grafikon koji ilustruje sposobnost vezivanja različitih AVP za različite delove PCSK9.
FIG. 28C je grafikon koji poredi sposobnost vezivanja LDLR od strane dva AVP.
FIG. 28D je grafikon koji poredi aktivnost ćelijskog unosa LDL od strane dva AVP.
DETALJNI OPIS
[0059] Tehničko otkrivanje dato u nastavku može u nekim aspektima prevazići obim ovog pronalaska, koji je definisan priloženim patentnim zahtevima. Elementi ovog otkrivanja koji ne spadaju unutar obima patentnih zahteva obezbeđeni su radi informisanja.
[0060] Kao što će biti prihvaćeno od stručnjaka, u svetlu ovog otkrivanja, menjanje interakcija između PCSK9 i LDLR može povećati količinu LDLR koja je dostupna za vezivanje za LDL, što povratno smanjuje količinu LDL u serumu kod subjekta, rezultirajući redukcijom nivoa holesterola u serumu subjekta. Kao takvi, antigen vezujuću proteini za PCSK9 mogu da se koriste u različitim postupcima i kompozicije za lečenje subjekata sa povišenim nivoima holesterola u serumu, koji su pod rizikom od povišenih nivoa holesterola u serumu, ili onih koji mogu imati koristi od redukcije nivoa holesterola u serumu. Prema tome, različiti postupci i tehnike za snižavanje, održavanje, ili prevenciju povećanja holesterola u serumu su takođe ovde opisane.
[0061] Ovaj pronalazak odnosi se na monoklonalno antitelo ili neki njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povezanih sa povišenim nivoima holesterola u serumu kod subjekta kao što je određenije definisano u priloženim patentnim zahtevima. Određenije, ovaj pronalazak u jednom aspektu odnosi se na monoklonalno antitelo ili neki njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u lečenju ili prevenciji hiperholesterolemije, ili bolesti ateroskleroze povezane sa povišenim nivoima holesterola u serumu, ili za upotrebu u redukovanju rizika od povratka kardiovaskularnog događaja povezanog sa povišenim nivoima holesterola u serumu, pri čemu se monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje za katalitički domen PCSK9 proteina aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, i sprečava ili redukuje vezivanje PCSK9 za LDLR. Poželjno, subjekat koji se leči je humani subjekat.
[0062] U nekom drugom aspektu, monoklonalno antitelo ili njegov fragment antitela za upotrebu kao što je definisano ovde, daje se zajedno sa najmanje jednim drugim agensom za snižavanje holesterola. U nekim primerima, najmanje jedan drugi agens za snižavanje holesterola je statin, pri čemu je, opciono, statin izabran iz grupe koju čine atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rozuvastatin, i simvastatin.
[0063] U nekim primerima, monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment odabran je iz grupe koju čine humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, rekombinantno antitelo, antigen vezujući fragment antitela, jednolančano antitelo, dijatelo, Fab fragment, F(ab)2 fragment, IgG1 antitelo, IgG2 antiteloy, IgG3 antitelo, i IgG4 antitelo ili neki njegov fragment antitela.
[0064] U nekim primerima, monoklonalno antitelo ili njegov fragment antitela vezuje se za PCSK9 varijantu koja ima D374Y tačkastu mutaciju. U nekim primerima, monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje se za PCSK9 sa Kdkoja je manja od 1 nM, manja od 100 pM, manja od 10 pM, ili manja od 5 pM. U drugim primerima, monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može da blokira vezivanje D374Y PCSK9 za LDLR sa IC50manjom od 1 µM, 1000 nM do 100 nM, 100 nM do 10 nM, 10 nM do 1 nM, 1000 pM do 500 pM, 500 pM do 200 pM, manjom od 200 pM, 200 pM do 150 pM, 200 pM do 100 pM, 100 pM do 10 pM, ili 10 pM do 1 pM.
[0065] Da bi bilo pogodnije, sledeća poglavlja generalno ističu različita značenja termina koji se ovde koriste. Sledeći ovu diskusiju, generalni aspekti koji razmatraju antigen vezujuće proteine su diskutovani, za kojim slede specifični primeri koji prikazuju karakteristike različitih pogodnih antigen vezujućih proteina i kako se oni mogu upotrebiti.
Definicije
[0066] Termin „proprotein konvertaza subtilizin keksin tip 9" ili „PCSK9" odnosi se na polipeptid kao što je izneto u SEQ ID NO: 1 i/ili 3 ili njegove fragmente, kao i srodne polipeptide, koji uključuju, ali nisu ograničeni na, alelske varijante, spojene varijante, izvedene varijante, supstitucione varijante, delecione varijante, i/ili insercione varijante uključujući adiciju N-terminalnog metionina, fuzione polipeptide, i interspecijske homologe. U određenim primerima, PCSK9 polipeptid uključuje terminalne ostatke, kao što su, ali bez ograničenja na, ostatke vodećih sekvenci, ciljne ostatke, amino terminalne metionin ostatke, lizin ostatke, tag ostatke i/ili ostatke fuzionog proteina. „PCSK9" se takođe označava i kao FH3, NARC1, HCHOLA3, proprotein konvertaza subtilizin/keksin tip 9, i neuralna apoptozis regulisana konvertaza 1. PCSK9 gen kodira proprotein konvertaza protein koji pripada podporodici proteinaze K porodice sekretorne subtilaze. Termin „PCSK9" označava i proprotein i produkt koji je generisan nakon autokatalisanja proproteina. Kada je iznet samo autokatalizovani produkt (kao što se to odnosi na antigen vezujući protein koji se selektivno vezuje za isečeni PCSK9), protein se može označiti kao "zreo", „rascepljen", „proizveden" ili „aktivn" PCSK9. Kada je izneta samo neaktivna forma, protein se može označiti kao „neaktivan", "pro-oblik", ili „neproizveden" oblik PCSK9. Termin PCSK9 onako kako se ovde koristi takođe uključuje alele koji se prirodno javljaju, kao što su mutacije D374Y, S127R i F216L. Termin PCSK9 takođe obuhvata PCSK9 molekule koji inkorporiraju post-translacione modifikacije sekvence PCSK9 aminokiseline, kao što su PCSK9 sekvence koje su glikozilirane, PEGilirane, PCSK9 sekvence iz kojih je isečena signalna sekvenca, PCSK9 sekvence iz kojih je isečen pro domen isečen iz katalitičkog domena ali nije odvojen od katalitičkog domena (npr., FIG.1A i 1B).
[0067] Termin „PCSK9 aktivnost" uključuje bilo koji biološki efekt PCSK9. U određenim primerima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da intereauguje ili se vezuje za supstrat ili receptor. U nekim primerima, aktivnost PCSK9 je predstavljena sa sposobnošću PCSK9 da se vezuje za LDL receptor (LDLR). U nekim primerima, PCSK9 se vezuje za i katalizuje reakciju koja uključuje LDLR. U nekim primerima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da izmeni (npr., redukuje) dostupnost LDLR. U nekim primerima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da poveća količinu LDL kod subjekta. U nekim primerima, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da smanji količinu LDLR koja je dostupna da se vezuje za LDL. U nekim primerima, ,,PCSK9 aktivnost" uključuje bilo koju biološku aktivnost koja je nastala od signaliranja PCSK9. Primerne aktivnosti uključuju, ali nisu ograničene na, PCSK9 vezivanje za LDLR, PCSK9 enzimsku aktivnost koja iseca LDLR ili druge proteine, PCSK9 vezivanje za druge proteine koji nisu LDLR koje olakšava PCSK9 delovanje, PCSK9 izmene APOB sekreciju (Sun X-M i sar, "Dokazi efekata mutantnog PCSK9 na sekreciju apoliproteina B kao slučaj neuobičajeno snažne dominantne hiperholesterolemije, Human Molecular Genetics 14: 1161-1169, 2005 i Ouguerram K i sar, "Metabolizam apolipoproteina B100 u autozomalno-dominantnoj hiperholesterolemije vezanoj za mutacije u PCSK9, Arterioscler thromb Vasc Biol. 24: 1448-1453, 2004), PCSK9-ovu ulogu u regeneraciji jetre i diferenciranju neuronskih ćelija (Seidah NG i sar, "Sekretorni proprotein konvertaza neuralno apoptozis-regulisana konvertaza 1 (NARC-1): Regeneracija jetre i diferencijacija neurona" PNAS 100: 928-933, 2003), i PCSK9ova uloga u hepatičnom metabolizmu glukoze (Costet i sar., "Hepatična ekspresija PCSK9 je regulisana statusom ishrane preko insulina i sterol regulatornog element-vezujućeg proteina 1c" J. Biol. Chem.281(10):6211-18, 2006).
[0068] Termin „hiperholesterolemija", onako kako se ovde koristi, odnosi se na stanje u kojem su nivoi holesterola povišeni iznad željenog nivoa. U nekim primerima, to znači da su nivoi holesterola u serumu povišeni. U nekim primerima, željeni nivo uzima u obzir različite „faktore rizika“ koji su poznati stručnjaku (i koji su opisani ili izneti ovde referencom).
[0069] Termin „polinukleotid" ili „nukleinska kiselina" uključuje i pojedinačne jedno-lančane i dvo-lančane nukleotidne polimere. Nukleotidi koji obuhvataju polinukleotid mogu biti ribonukleotidi ili deoksiribonukleotidi ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Pomenute modifikacije uključuju modifikacije baza kao što su derivati inozina, modifikacije riboze kao što je 2',3'-dideoksiriboza, i modifikacije internukleotidne veze kao što su fosfortioat, fosforditioat, fosforselenoat, fosfordiselenoat, fosforanilotioat, fosforaniladat i fosforamidat.
[0070] Termin „oligonukleotid" označava polinukleotid koji obuhvata 200 ili manje nukleotida. U nekim primerima, oligonukleotidi su 10 do 60 baza u dužinu. U drugim primerima, oligonukleotidi su 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do 40 nukleotida u dužinu. Oligonukleotidi mogu biti jednolančani ili dvolančani, npr., za upotrebu u konstrukciji mutantnog gena. Oligonukleotidi mogu biti sens ili antisens oligonukleotidi. Oligonukleotid može uključiti obeleživač, uključujući radioobeleživač, fluorescentni obeleživač, hapten ili antigeni obeleživač, za oglede detekcije. Oligonukleotidi se mogu upotrebiti, na primer, kao PCR prajmeri, prajmeri za kloniranje ili hibridizacione probe.
[0071] „Izolovani molekul nukleinske kiseline" označava genomsku DNK ili RNK, mRNK, cDNK, ili sintetičko poreko ili neku njihovu kombinaciju koja nije vezana sa svim ili delom od polinukleotida u kojem je izolovani polinukleotid nađen u prirodi, ili je vezan za polinukleotid za koji nije vezan u prirodi. Za potrebe ovog pronalaska, trebalo bi da se shvati da „molekul nukleinske kiseline obuhvata" određenu nukleotidnu sekvencu koja ne obuhvata intaktne hromozome. Izolovanii molekuli nukleinske kiseline „obuhvatajući" specifične sekvence nukleinske kiseline mogu uključiti, u dodatku na specifične sekvence, kodirajuće sekvence sve do deset ili čak do dvadeset drugih proteina ili njihovih delova, ili mogu uključiti operativno vezane regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju kodirajućeg regiona navedenih sekvenci nukleinske kiseline, i/ili mogu uključiti verktor sekvence.
[0072] Sem ako je određeno drugačije, kraj s leve strane bilo koje jedno-lančane sekvence ovde je 5' kraj; pravac sa leve strane sekvenci dvo-lančanog polinukleotida je označen kao 5' pravac. Pravac od 5' do 3' dodavanja nastajućih RNK transkripata je označen kao transkripcioni pravac; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK transkript koje su 5' do 5' kraj RNK transkripta su označene kao „uzvodne sekvence"; regioni sekvence na lancu DNK koji imaju istu sekvencu kao RNK transkript koje su 3' do 3' kraj RNK transkripta su označene kao „nizvodne sekvence".
[0073] Termin „kontrolna sekvenca" odnosi se na polinukleotidnu sekvencu koja može uticati na ekspresiju i procesovanje kodirajućih sekvenci za koje je vezana. Priroda takvih kontrolnih sekvenci može zavisiti od organizma domaćina. U određenim primerima, kontrolne sekvence za prokariote mogu uključiti promotor, mesto vezivanja ribozoma, i sekvencu prekidanja transkripcije. Na primer, kontrolne sekvence za eukariote mogu uključiti promotore koji obuhvataju jedno ili mnoštvo mesta prepoznavanja za transkripcione faktore, sekvence pojačivače transkripcije, i sekvencu prekidanja transkripcije. „Kontrolne sekvence" mogu uključiti vodeće sekvence i/ili fuzione partner sekvence.
[0074] Termin „vektor" označava bilo koji molekul ili entitet (npr., nukleinsku kiselinu, plazmid, bakteriofag ili virus) upotrebljen da se prenese informacija koja kodira protein u ćeliju domaćina.
[0075] Termin „ekspresioni vektor" ili „ekspresioni konstrukt" odnosi se na vektor koji je pogodan za transformaciju ćelije domaćina i koji sadrži sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju i/ili kontrolišu (zajedno sa ćelijom domaćinom) ekspresiju jednog ili više heterolognih kodirajućih regiona operativno vezanih za njih. Ekspresioni konstrukt može uključiti, ali nije ograničen na, sekvence koje utiču ili kontrolišu transkripciju, translaciju, i, ako su prisutni introni, deluju na uplitanje RNK kodirajućeg regiona koji je tu operativno vezan.
[0076] Onako kako se ovde koristi, „operativno vezani" znači da su komponente na koje je termin primenjen u vezi koja im omogućuje da obave svoje bitne funkcije pod pogodnim uslovimna. Na primer, kontrolna sekvenca u vektoru koji je „operativno vezan" za sekvencu koja kodira protein je tu vezan tako da se ekspresija sekvence koja kodira protein postigne pod uslovima koji su saglasni sa transkripcionom aktivnošću kontrolnih sekvenci.
[0077] Termin „ćelija domaćin" označava ćeliju koja je bila transformisana, ili je sposobna da se transformiše, sa sekvencom nukleinske kiseline i na taj način eksprimira gen za koji postoji interes. Termin uključuje potomstvo roditeljske ćelije, bez obzira da li je potomstvo identično u morfološkom ili genetičkom smislu u odnosu na originalnu roditeljsku ćeliju, sve dok je gen za koji postoji interes prisutan.
[0078] Termin „transfekcija" znači uzimanje strane ili egzogene DNK od strane ćelije, i ćelija je „transfektovana" kada je egzogena DNK uvedena unutar ćelijske membrane. Jedan broj tehnika transfekcije je dobro poznat u oblasti i dat je ovde u pronalasku. Vidi, npr., Graham i sar., 1973, Virology 52:456; Sambrook i sar., 2001, Molekularno kloniranje: Laboratorijski praktilum, supra; Davis i sar., 1986, Osnovni metodi u molekularnoj biologiji, Elsevier; Chu i sar., 1981, Gene 13:197. Takve tehnike se mogu upotrebiti da se uvede jedan ili više egzogenih DNK grupa u pogodne ćelije domaćine.
[0079] Termin „transformacija" odnosi se na promenu u genetičkim karakteristikama ćelije i ćelija je transformisana kada je modifikovana tako da sadrži novu DNK ili RNK. Na primer, ćelija je transformisana kada je genetički modifikovana u odnosu na svoje nativno stanje putem uvođenja novog genetičkog materijala preko transfekcije, transdukcije, ili drugih tehnika. Nakon transfekcije ili transdukcije, transformišuća DNK se može rekombinovati sa onom u ćeliji putem fizičke integracije u hromozom ćelije, ili se može održavati prolazno kao epizomalni element bez da bude replikovan, ili se može replikovati nezavisno kao plazmid. Smatra se da je ćelija „stabilno transformisana“ kada je DNK replikovana sa deobom ćelije.
[0080] Termin „polipeptid" ili „protein" označava makromolekul koji ima aminokiselinsku sekvencu nativnog proteina, a to je, protein produkovan od ćelije koja se javlja u prirodi i koja nije rekombinantna; ili je produkovan od strane genetički-konstrisane ili rekombinantne ćelije, i sadrži molekule koji imaju aminokiselinsku sekvencu nativnog proteina, ili molekule koji imaju delecije od, adicije na, i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina od nativne sekvence. Termin takođe uključuje polimere aminokiseline u kojima su jedna ili više aminokiselina hemijski analozi odgovarajućih aminokiselina ili polimera koji se javljaju u prirodi. Termini „polipeptid" i „protein" specifično obuhvataju PCSK9 antigen vezujuće proteine, antitela, ili sekvence koje imaju delecije od, adicije na, i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina od antigen-vezujućeg proteina. Termin „polipeptidni fragment" odnosi se na polipeptid koji ima amino-terminalnu deleciju, karboksil-terminalnu deleciju, i/ili internu deleciju u poređenju sa nativnim proteinom potpune dužine. Takvi fragmenti mogu takođe sadržati modifikovane aminokiseline u poređenju sa nativnim proteinom. U određenim primerima, fragmenti su dugački oko pet do 500 aminokiselina. Na primer, fragmenti mogu biti dugački najmanje 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ili 450 aminokiselina. Korisni polipeptidni fragmenti uključuju imunološki funkcionalne fragmente antitela, uključujući domene vezivanja. U slučaju PCSK9-vezujućeg antitela, korisni fragmenti uključuju ali nisu ograničeni na CDR region, varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca, deo lanca antitela ili samo njegov varijabilni region uključujući dva CDR-a, i tome slično.
[0081] Termin „izolovani protein" kada je upotrebljen označava da je subjektov protein (1) bez najmanje nekih drugih proteina sa kojima se uobičajeno nalazi, (2) u osnovi je bez drugih proteina iz istog izvora, npr., od iste vrste, (3) eksprimiran od strane ćelije kod različitih vrsta, (4) izdvojen od najmanje oko 50 posto od polinukleotida, lipida, ugljovodonika, ili drugih materijala sa kojima je vezan u prirodi, (5) operativno je vezan (sa kovalentnom ili nekovalentnom interakcijom) sa polipeptidom sa kojim nije vezan u prirodi, ili (6) ne javlja se u prirodi. Tipično, „izolovani protein" se sastoji od najmanje oko 5%, od najmanje oko 10%, od najmanje oko 25%, od najmanje oko 50% od datog uzorka. Genomska DNK, cDNK, mRNK ili druge RNK, sintetičkog porekla, ili bilo koja njihova kombinacija mogu kodirati takav izolovani protein. Poželjno je izolovani protein gotovo u potpunosti bez proteina ili polipeptida ili drugih zagađivača sa kojima se nalazi u prirodnoj sredini i koji će se uplitati u njegovu terapeutsku, dijagnostčku, profilaktičku, istraživačku ili drugu upotrebu.
[0082] Termin „aminokiselina" uključuje njeno normalno značenje u ovoj oblasti.
[0083] „Varijanta" polipeptida (npr., antigen vezujući protein, ili antitelo) obuhvata aminokiselinsku sekvencu u kojoj su jedan ili više ostataka aminokiseline ubačeni u, delecirani iz i/ili supstituisani iz aminokiselinske sekvence u drugu polipeptidnu sekvencu. Varijante uključuju fuzione proteine.
[0084] Termin „identičnost" odnosi se na vezu između sekvenci dva ili više polipeptidna molekula ili dva ili više molekula nukleinske kiseline, kao što je određeno poklapanjem i poređenjem sekvenci. „Procenat identičnosti" označava procenat identičnih ostataka između aminokiselina ili nukleotida u poređenim molekulima i izračunat je na osnovu veličine najmanjeg molekula koji je poređen. Za ta izračunavanja, prekidi u poklapanjima (ako ih ima) su poželjno uključeni posebnim matematičkim modelom ili računarskim programom (tj., „algoritmom"). Metodi koji se mogu upotrebiti da se izračuna identičnost preklopljenih nukleinskih kiselina ili polipeptida uključuju one koji su opisani u Računarska molekularna biologija, (Lesk, A. M., izd.), 1988, New York: Oxford University Press; Bioračunarska informatika i genomski projekti, (Smith, D. W., izd.), 1993, New York: Academic Press; Računarska analiza podataka o sekvencama, Deo I, (Griffin, A. M., i Griffin, H. G., izd.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Analiza sekvence u molekularnoj biologiji, New York: Academic Press; Priručnik za analizu sekvence, (Gribskov, M. i Devereux, J., izd.), 1991, New York: M. Stockton Press; i Carillo i sar., 1988, SIAM J. Applied Math.48:1073.
[0085] U izračunavanju procenta identičnosti, sekvence koje se porede su tipično preklopljene na način koji daje najveće poklapanje između sekvenci. Jedan primer računarskog programa koji se može upotrebiti da se odredi procenat identičnosti je GCG programski paket, koji uključuje GAP (Devereux i sar., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). računarski algoritam GAP je upotrebljen da se preklope dva polipeptida ili polinukleotida za koje treba da se odredi procenat identičnosti sekvence. Sekvence su preklopljene radi optimalnog poklapanja njihove odgovarajuće aminokiseline ili nukleotida („poklopljeni interval", kao što je to određeno sa algoritmom). Kazna koja nastaje zbog gapa (koja je izračunata kao 3x prosečna dijagonala, pri čemu je „prosečna dijagonala" prosek dijagonale matrice poređenja koja je upotrebljena; „dijagonala" je suma ili broj pridodat svakom savršenom poklapanju aminokiseline sa određenom matricom za poređenje) i gap proširena kazna (koja je obično 1/10 puta gap kazne otvaranja), kao i matrice za poređenje kao što su PAM 250 ili BLOSUM 62 su upotrebljene zajedno sa algoritmom. U određenim primerima, standardna komparaciona matrica (vidi, Dayhoff i sar., 1978, Atlas sekvence proteina i struktura 5:345-352 za PAM 250 komaparacionu matricu; Henikoff i sar., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 za BLOSUM 62 komaparacionu matricu) je takođe upotreblje od strane algoritma.
[0086] Primeri parametara koji se mogu upotrebiti u određivanju procenta identičnosti za polipeptidne ili nukleotidne sekvence koristeći GAP program su sledeći:
• Algoritam: Needleman i sar., 1970, J. Mol. Biol.48:443-453
• Komaparaciona matrica: BLOSUM 62 od Henikoff i sar.1992, supra
• Gap kazna: 12 (ali bez kazne za krajnje gapove)
• Kazna za dužinu gapa: 4
• Prag sličnosti: 0
[0087] Određene šeme preklapanja za poklapanje dve aminokiselinske sekvence mogu rezultirati poklapanjem samo kratkog regiona dve sekvence, i taj mali poklopljeni region može imati vrlo visoku identičnost sekvence čak i ako nema značajne veze između pune dužine dve sekvence. Prema tome, odabrani metod preklapanja (GAP program) može se doterati ako se to želi da bi to rezultiralo poklapanjem koje ima interval od najmanje 50 ili drugi broj kontinuiranih aminokiselina ciljnog polipeptida.
[0088] Onako kako se ovde koriste, dvadeset konvencionalnih (npr., koje se javljaju prirodno) aminokiselina i njihove skraćenice slede konvencionalnu upotrebu. Vidi Imunologija-Sinteza (2. izdanje, E. S. Golub i D. R. Gren, izd., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline) od dvadeset konvencionalnih aminokiselina, ne prirodne aminokiseline kao što su α-, α-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, laktonska kiselina, i druge nekonvencionalne aminokiseline mogu biti takođe odgovarajuće komponente za polipeptide pogodne za upotrebu prema ovom pronalasku. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju: 4-hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetilizin, ε-N-acetillizn, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i imino kiseline (npr., 4-hidroksiprolin). U obeležavanju polipeptida koje se ovde koristi, pravac sa leva je amino terminalni pravac a pravac s desna je karboksi-terminalni pravac, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.
[0089] Slično tome, sem ako je naznačeno drugačije, pravac sa levog kraja sekvence jednolančanog polinukleotida je 5' kraj i; pravac sa leva sekvenci dvo-lančanog polinukleotida je označen kao 5' pravac. Pravac od 5' do 3' dodavanja nascentnog RNK transkripta je naznačeno kao pravac transkripcije; regioni sekvence na lancu DNK koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 5' prema 5' kraju RNK transkripta su označeni kao „uzvodne sekvence"; regioni sekvence lanca DNK koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 3' prema 3' kraju RNK transkripta naznačeni su kao „nizvodne sekvence."
[0090] Konzervativne supstitucije aminokiseline mogu obuhvatiti ostatke aminokiselina koje se ne javljaju prirodno, koje su tipično inkorporirane putem hemijske sinteze peptida pre nego sa sintezom u biološkim sistemima. Oni uključuju peptidomimetike i druge reverzne ili invertovane oblike grupa aminokiselina.
[0091] Ostaci koji se prirodno javljaju mogu se podeliti u klase na osnovu uobičajenih karakteristika bočnog lanca:
1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) kisele: Asp, Glu;
4) bazne: His, Lyz, Arg;
5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i
6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
Na primer, ne-konzervativne supstitucije mogu uključiti razmenu jednog broja jedne od tih klasa za članove druge klase. Takvi supstituisani ostaci se mogu uvesti, na primer, u regione humanog antitela koja su homologna sa ne-humanim antitelima, ili u ne-homologe regione molekula.
[0092] U pravljenju promena antigen vezujući protein ili PCSK9 protein, prema određenim primerima, mora da se uzme u obzir hidropatični indeks aminokiseline. Svakoj aminokiselini je pripisan hidropatični indeks na osnovu njene hidrofobnosti i karakteristika naelektrisanja. Oni su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9); i arginin (-4.5).
[0093] Važnost hidropatičnog indeksa aminokiseline u davanju interaktivne biološke funkcije proteina je shvaćena u oblasti. Kyte i sar., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Poznato je da određene aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama koje imaju sličan hidropatični indeks ili rezultat i još uvek zadržavaju sličnu biološku aktivnost. U pravljnju promena zasnovanih na hidropatičnom indeksu, u određenim primerima, supstitucija aminokiselina čiji hidropatični indeksi su u okviru ±2 je uključena. U određenim primerima, oni koji su u okviru ±1 su uključeni, i u određenim primerima, oni koji su u okviru ±0.5 su uključeni.
[0094] Takođe je shvaćeno u ovoj oblasti da supstitucija sličnih aminokiselina može efikasno da se obavi na osnovu hidrofilnosti, posebno gde je biološki funkcionalni protein ili peptid tako kreiran namenjen za upotrebu u imunološkim primerima, kao što je to u ovoj situaciji. U određenim primerima, najveća lokalna prosečna vrednost hidrofilnosti proteina, koja je vođena sa hidrofilnošću susednih aminokiselina, u korelaciji je sa njenom imunogenošću i antigenošću, tj., sa biološkim karakteristikama proteina.
[0095] Sledeće vrednosti hidrofilnosti pridodate su tim ostacima aminokiselina: arginin (+3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.0 ± 1); glutamat (+3.0 ± 1); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (-0.5 ± 1); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistein (-1.0); metionin (-1.3); valin (-1.5); leucin (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5) i triptofan (-3.4). Pri pravljenju promena zasnovanih na sličnim vrednostima hidrofilnosti, u određenim primerima, supstitucija aminokiselina čije vrednosti hidrofilnosti su u okviru ±2 su uključene, u određenim primerima, one čije vrednosti hidrofilnosti su u okviru ±1 su uključene, u određenim primerima, one koje su u okviru ±0.5 su uključene. Neko može takođe da identifikuje epitope iz primarnih aminokiselinskih sekvenci na osnovu hidrofilnosti. Ovi regioni su takođe označeni kao „epitopni regioni jezgra."
[0096] Primerne supstitucije aminokiselina su iznete u Tabeli 1.
TABELA 1
Supstitucije aminokiselina
[0097] Termin „derivat" odnosi se na molekul koji uključuje hemijske druge modifikacije, a ne insercije, delecije, ili supstitucije aminokiselina (ili nukleinskih kiselina). U određenim primerima, derivati obuhvataju kovalentne modifikacije, uključujući, ali bez ograničenja na, hemijsko vezivanje sa polimerima, lipidima, ili drugim organskim ili neorganskim grupama. U određenim primerima, hemijski modifikovan antigen vezujući protein može imati veći polu-život cirkulisanja od antigen vezujućeg proteina koji nije hemijski modifikovan. U određenim primerima, hemijski modifikovan antigen vezujući protein može imati poboljšan kapacitet ciljanja za željene ćelije, tkiva, i/ili organe. U nekim primerima, izvedeni antigen vezujući protein je kovalentno modifikovan da uključi jedan ili više u vodi rastvorljivih pričvršćenja polimera, uključujući, ali bez ograničenja na, polietilen glikol, polioksietilen glikol, ili polipropilen glikol. Vidi, npr., U.S. Patent br: 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 i 4,179,337. U određenim primerima, izvedeni antigen vezujući protein obuhvata jedan ili više polimera, uključujući, ali bez ograničenja na, monometoksi-polietilen glikol, dekstran, celulozu, ili druge ugljovodonične zasnovane polimere, poli-(N-vinil pirolidon)-polietilen glikol, propilen glikol homopolimere, polipropilen oksid/etilen oksid ko-polimer, polioksietilirane poliole (npr., glicerol) i polivinil alkohol, kao i mešavine takvih polimera.
[0098] U određenim primerima, derivat je kovalentno modifikovan polietilen glikolom (PEG) podjedinicama. U određenim primerima, jedan ili više u vodi rastvorljivih polimera je vezan na jdenoj ili više specifičnih pozicija, na primer, amino terminusu, derivata. U određenim primerima, jedan ili više u vodi rastvorljivih polimera je po principu slučajnosti pričvršćen za jedan ili više bočnih lanaca derivata. U određenim primerima, PEG je upotrebljen da poboljša terapeutski kapacitet za antigen vezujući protein. U određenim primerima, PEG je upotrebljen da poboljša terapeutski kapacitet za humanizovano antitelo. Određeni takvi metodi su diskutovani u, na primer, u U.S. Patentu br.6,133,426.
[0099] Analozi peptida se uobičajeno koriste u farmaceutskoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa karakteristikama analoga u odnosu na one od templet peptida. Ovi tipovi ne-peptidnih jedinjenja su označeni terminom „peptidni mimetici" ili „peptidomimetici". Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber & Freidinger, TINS, str.392 (1985); i Evans i sar., J. Med. Chem., 30:1229 (1987). Takva jedinjenja su često razvijena uz pomoć kompjuterizovanog molekularnog modelovanja. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima mogu se upotrebiti da se produkuje sličan terapeutski ili profilaktički efekat. Generalno su peptidomimetici strukturno slični paradigmi polipeptida (tj., polipeptida koji ima biohemijsku karakteristiku ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo, ali ima jednu ili više peptidnih veza po potrebi zamenjenih sa vezom odabranom od: --CH2NH--, --CH2S--, -CH2CH2--, --CH=CH-(cis i trans),--COCH2--, -CH(OH)CH2--, i --CH2SO--, sa metodima koji su dobro poznati u oblasti. Sistematska supstitucija jedne ili više aminokiselina konsenzus sekvence sa D-aminokiselinom istog tipa (npr., D-lizin na mestu L-lizina) može se upotrebiti u određenim primerima da se generišu još stabilniji peptidi. Sem toga, napregnuti peptidi koji obuhvataju konsenzus sekvencu ili gotovo u potpunosti identičnu varijaciju konsenzus sekvence mogu se generisati putem metoda poznatih u praksi (Rizo i Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992); na primer, putem dodavanja internih ostataka cisteina sposobnih da formiraju intramolekularne disulfidne mostove koji ciklizuju peptid.
[0100] Termin „koji se prirodno javlja" onako kako se koristi kroz prijavu u vezi sa biološkim materijalima kao što su polipeptidi, nukleinske kiseline, ćelije domaćina, i tome slično, odnosi se na materijale koji se nalaze u prirodi ili u obliku materijala koji je nađen u prirodi.
[0101] „Antigen vezujući protein" („AVP") onako kako je ovde upotrebljen označava bilo koji protein koji vezuje određeni ciljni antigen. U trenutnoj prijavi, određeni ciljni antigen je PCSK9 protein ili njegov fragment. „Antigen vezujući protein" uključuje ali nije ogrničen na antitela i njegove vezujuće delove, kao što su imunološki funkcionalni fragmenti. Peptitela su drugi primer antigen vezujućih proteina. Termin „imunološki funkcionalni fragment" (ili jednostavno „fragment") antitela ili imunoglobulinski lanac (težak ili laki lanac) antigen vezujući protein, onako kako se ovde koristi, je vrsta antigen vezujućeg proteina koji obuhvata deo (bez obzira kako je taj deo dobijen ili sintetisan) antitela kojem nedostaju najmanje neke aminokiseline prisutne u lancu pune dužine ali koja su još uvek sposobna da se specifično vezuju za antigen. Takvi fragmenti su biološki aktivni u tome što se oni vezuju za ciljni antigen i mogu biti u kompeticiji sa drugim antigen vezujućim proteinima, uključujući intaktna antitela, za vezivanje na dati epitop. U nekim primerima, fragmenti su neutralizujući fragmenti. U nekim primerima, fragmenti mogu blokirati ili redukovati verovatnoću interakcije između LDLR i PCSK9. U jednom aspektu, takav fragment će zadržati najmanje jedan CDR prisutan u lakom ili teškom lancu pune dužine, i u nekim primerima će obuhvatati pojedinačni teški lanac i/ili laki lanac ili njegov deo. Ovi biološki aktivni fragmenti mogu se produkovati pomoću tehnika rekombinantne DNK, ili se mogu produkovati enzimatskim ili hemijskim isecanjem antigen vezujućih proteina, uključujući intaktna antitela. Imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, dijatelo (teški lanac varijabilnog domena na istom polipeptidu kao i laki lanac varijabilnog domena, vezan preko kratkog peptidnog veznika koji je prekratak da dozvoli sparivanje između dva domena na istom lancu), Fab', F(ab')2, Fv, domen antitela i pojedinačnilanac antitela, i mogu biti izvedeni iz bilo kog sisarskog izvora, uključujući ali bez ogrničenja na čoveka, miša, pacova, kamilu ili zeca. Dalje je zamišljeno da funkcionalni deo antigen vezujućih proteina otkrivenih ovde, na primer, jedan ili više CDR-ova, mogu biti kovalentno vezni za drugi protein ili za mali molekul da se kreira terapeutski agens usmeren na određenu metu u telu, koji poseduje bifunkcionalne terapeutske karakteristike, ili ima produženi polu-život u serumu. Kao što će biti prihvaćeno od stručnjaka, antigen vezujući protein može uključiti neproteinske komponente. U nekim poglavljima ovog pronalaska, primeri AVP su ovde opisani u terminima „broj/slovo/broj" (npr., 25A7). U tim slučajevima, tačno ime označava specifično antitelo. To jest, AVP nazvan 25A7 nije neophodno isti kao antitelo nazvano 25A7.1, (sem ako su oni eksplicitno izneti kao isti u specifikaciji, npr., 25A7 i 25A7.3). Kao što će to stručnjak shvatiti, LDLR nije antigen vezujući protein i vezujuće podsekcije LDLR nisu antigen vezujući proteini, npr., EGFa. Drugi molekuli kroz koje PCSK9 signalira in vivo nisu antigen vezujući proteini.
[0102] Određeni antigen vezujući proteini opisani ovde su antitela ili su izvedeni od antitela. U određenim primerima, struktura polipeptida antigen vezujućih proteina je zasnovana na antitelima, uključujući, ali bez ograničenja na, monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domen antitela, sintetička antitela (ponekad ovde naznačena kao „mimetici antitela"), himerična antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuziona antitela (ponekad ovde naznačena kao „konjugati antitela"), i njihovi fragmenti, respektivno. U nekim primerima, AVP obuhvata ili se sastoji od avimera (čvrsto vezujućih peptida). Ovi raznovrsni antigen vezujući proteini su ovde dalje opisani.
[0103] „Fc" region obuhvata dva teška lanca fragmenata obuhvatajući CH1 i CH2 domene antitela. Dva teška lanca fragmenata drže se zajedno sa dve ili više disulfidnih veza i sa hidrofobnim interakcijama CH3 domena.
[0104] „Fab fragment" obuhvata jedan laki lanac i CH1 i varijablne regione jednog teškog lanca. Teški lanac Fab molekula ne može formirati disulfidnu vezu sa molekulom drugog teškog lanca.
[0105] „Fab' fragment" obuhvata jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži VH domen i CH1 domen i takođe region između CH1 i CH2 domena, tako da međulančana disulfidna veza može da se formira između dva teška lanca dva Fab' fragmenta da se formira F(ab')2molekul.
[0106] „F(ab')2fragment" sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže deo konstantnog regiona između CH1 i CH2 domena, tako da je međulančana disulfidna veza formirana između dva teška lanca. F(ab')2fragment je, prema tome, komponovan od dva Fab' fragmenta koji se drže zajedno sa disulfidnom vezom između dva teška lanca.
[0107] „Fv region" obuhvata varijabilne regione i od teških i od lakih lanaca, ali mu nedostaju konstantni regioni.
[0108] „Jedno-lančana antitela" su Fv molekuli u kojima su varijabilni regioni teških i od lakih lanaca povezani sa fleksibilnim veznikom da formiraju pojedinačni polipeptidni lanac, koji formira antigen vezujući region. Jedno lančana antitela su detaljno diskutovana u međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 88/01649 i Patentnoj prijavi Sjedinjenih Država br. 4,946,778 i br.
5,260,203.
[0109] „Domen antitela" je imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više VHregiona su kovalentno vezana sa peptidnim veznikom da se kreira bivalentni domen antitela. Dva VHregiona bivalentnog domena antitela mogu ciljati iste ili različite antigene.
[0110] „Bivalent antigen vezujući protein" ili „bivalentno antitelo" obuhvata dva antigen vezujuća mesta. U nekim slučajevima, dva vezujuća mesta imaju iste antigen specifikacije. Bivalent antigen vezujući proteini i bivalent antitela mogu biti bispecifična, vidi, infra. Bivalent antitelo koje nije „višestruko specifično" ili „višestruko funkcionalno" antitelo, u određenim primerima, tipično se podrazumeva da ima identično svako mesto svog vezivanja.
[0111] „Višestruko specifični antigen vezujući protein" ili „višestruko specifično antitelo" je ono koje cilja više od jednog antigena ili epitopa.
[0112] „Bispecifični", „dvostruko-specifični" ili "bifunkcionalni" antigen vezujući protein ili antitelo je hibridni antigen vezujući protein ili antitelo, respektivno, koje ima dva različita antigen vezujuća mesta. Bispecifični antigen vezujući proteini i antitela su vrsta višestruko specifičnih antigen vezujućih proteinskih antitela i mogu se produkovati putem mnoštva metoda uključujući, ali bez ograničenja na, fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Vidi, npr., Songsivilai i Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny i sar., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Dva mesta vezivanja bispecifičnog antigen vezujućeg proteina ili antitela će se vezati za dva različita epitopa, koji mogu da se nađu na istim ili različitim proteinskim metama.
[0113] Za antigen vezujući protein kaže se da „specifično vezuje" svoj ciljni antigen kada je konstanta disocijacije (Kd) ≤10<-7>M. AVP specifično vezuje antigen sa „visokim afinitetom" kada je Kd≤5 × 10<-9>M, i sa „vrlo visokim afinitetom" kada je Kd≤5× 10<-10>M. U jednom primeru, AVP ima Kdod ≤10<-9>M. U jednom primeru, disocijacija je <1 × 10<-5>. U drugim primerima, AVP će se vezati za humani PCSK9 sa Kdod između oko 10<-9>M i 10<-13>M, u još jednom drugom primeru, AVP će se vezati sa Kd≤5 × 10<-10>. Kao što će to biti shvaćeno od stručnjaka, u nekim primerima, neki ili svi antigen vezujući fragmenti mogu se specifično vezati za PCSK9.
[0114] Antigen vezujući protein je „selektivan" kada se vezuje za jednu metu mnogo čvršće nego što se vezuje za drugu metu.
[0115] „Antigen vezujući region" podrazumeva protein, ili deo proteina, koji specifično vezuje specifični antigen (npr., paratop). Na primer, onaj deo antigen vezujućeg proteina koji sadrži ostatke aminokiseline koji intereaguju sa antigenom i donose antigen vezujućem proteinu njegovu specifičnost i afinitet za antigen je označen kao „antigen vezujući region". Antigen vezujući region tipično uključuje jedan ili više „komplementarno vezujućih regiona" („CDR"). Određeni antigen vezujući regioni takođe uključuju jedan ili više „skeletnih" regiona. „CDR" je aminokiselinska sekvenca koja doprinosi specifičnosti vezivanja antigena i afinitetu. „Skeletni" regioni mogu doprinositi u održavanju odgovarajuće konformacije CDR-ova da se pokrene vezivanje između antigen vezujućeg regiona i antigena. Strukturno, skeletni regioni se mogu locirati u antitelima izmđu CDR-ova. Primeri skeleta i CDR regiona prikazani su u FIG.2A-3D, 3CCC-3JJJ, i 15A-15D. U nekim primerima, sekvence za CDR-ove za laki lanac antitela 3B6 su sledeće: CDR1 TLSSGYSSYEVD (SEQ ID NO: 279); CDR2 VDTGGIVGSKGE (SEQ ID NO: 280); CDR3 GADHGSGTNFVVV (SEQ ID NO: 281), i FR-ove su sledeće: FR1 QPVLTQPLFASASLGASVTLTC (SEQ ID NO: 282); FR2 WYQQRPGKGPRFVMR (SEQ ID NO: 283); FR3 GIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC (SEQ ID NO: 284); i FR4 FGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 285).
[0116] U određenim aspektima, ovde su opisani rekombinantni antigen vezujući proteini koji vezuju PCSK9, na primer humani PCSK9. U tom kontekstu, „rekombinantni antigen vezujući protein" je protein napravljen koristeći rekombinantne tehnike, tj., preko ekspresije rekombinantne nukleinske kiseline kao što je to ovde opisano. Metodi i tehnike za proizvodnju rekombinantnih proteina su dobro poznate u oblasti.
[0117] Termin „antitelo" odnosi se na intaktni imunoglobulin bilo kog izotopa, ili njegovog fragmenta koji može biti u kompeticiji sa intaktnim antitelom za specifično vezivanje za ciljni antigen, i uključuje, za , himerična, humanizovana, potpuno humana, i bispecifična antitela. „Antitelo" je vrsta antigen vezujućeg proteina. Intaktno antitelo će generalno obuhvatati najmanje dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, ali u nekim slučajevima može uključiti manje lanaca kao što je kod antitela koja se prirodno javljaju kod kamelida koja mogu obuhvatati samo teške lance. Antitela mogu se izvesti samo iz jednog izvora, ili mogu biti „himerična", što znači da različiti delovi antitela mogu biti izvedeni iz dva različita antitela kao što je dalje opisano dole. Antigen vezujući proteini, antitela, ili vezujući fragmenti mogu se produkovati u hibridomima, tehnikama rekombinantne DNK, ili enzimskim ili hemijskim isecanjem intaktnih antitela. Sem ako je naznačeno drugačije, termin „antitelo" uključuje, u dodatku na antitela koja obuhvataju dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, derivate, varijante, fragmente, i njihove mutacije, čiji primeri su opisani dole. Sem toga, osim ako su eksplicitno isključena, antitela uključuju monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domene antitela, sintetička antitela (ponekad ovde označena kao „mimetici antitela"), himerična antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuziona antitela (ponekad ovde označena kao „konjugovana antitela"), i njihove fragmente, respektivno. U nekim primerima, termin takođe obuhvata peptitela.
[0118] Strukturne jedinice antitela koja se prirodno javljaju tipično obuhvataju tetramer. Svaki takav tetramer tipično je komponovan od dva identična para polipeptidnih lanaca, svaki par ima jedan pune dužine „laki“ (u nekim primerima, oko 25 kDa) i jedan pune dužine „teški“ lanac (u određenim primerima, oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca tipično uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina koje su tipično odgovorne za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca tipično definiše konstantni region koji može biti odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci su tipično klasifikovani kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci tipično su klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa, ili epsilon, i definišu izotop antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, i IgE, respektivno. IgG ima nekoliko podklasa, uključujući, ali bez ograničenja na, IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. IgM ima podklase uključujući, ali bez ograničenja na, IgM1 i IgM2. IgA je slično podeljen u podklase uključujući, ali bez ograničenja na, IgA1 i IgA2. U okviru lakih i teških lanaca pune dužine, tipično su varijabilni i konstantni regioni spojeni sa „J" regionom od oko 12 ili više aminokiselina, sa teškim lancem koji takođe uključuje „D" region od oko 10 ili više aminokiselina. Vidi, npr., Osnovna imunologija, pog. 7 (Paul, W., izd., 2, izd. Raven Press, N.Y. (1989)). Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac tipično formiraju antigen vezujuće mesto.
[0119] Varijabilni regioni tipično pokazuju neku generalnu strukturu od relativno kozerviranih skeletnih regiona (FR) spojenih zajedno sa tri hiper varijabilna regiona, takođe nazvana komplementarno determinišući regioni ili CDR-ovi. CDR-ovi od dva lanca od svakog para tipično su poravnati sa skeletnim regionima, koji mogu omogućiti vezivanje za specifični epitop. Od N-terminalnog do C-terminalnog, varijabilni regioni i lakog i teškog lanca tipično obuhvataju domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu je tipično u skladu sa definicijama Kabat sekvenci proteina od imunološkog interesa (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia i sar., Nature, 342:878-883 (1989).
[0120] U određenim primerima, teški lanac antitela vezuje se za antigen u odsustvu antitela lakog lanca. U određenim primerima, laki lanac antitela vezuje se za antigen u odsustvu antitela teškog lanca. U određenim primerima, antitelo vezujući region vezuje se za antigen u odsustvu antitela lakog lanca. U određenim primerima, antitelo vezujući region vezuje se za antigen u odsustvu antitela teškog lanca. U određenim primerima, pojedinačni varijabilni region specifično se vezuje za antigen u odsustvu drugog varijabilnog regiona.
[0121] U određenim primerima, definitivni nacrt CDR i identifikacija ostataka koji obuhvataju vezujuće mesto antitela je obavljena putem rešavanja strukture antitela i/ili sa rešavanjem strukture kompleksa antitelo-veznik. U određenim primerima, koja mogu biti obavljena sa bilo kojom od mnoštva tehnika poznatih stručnjaku, kao što je kristalografija X-zracima. U određenim primerima, mogu se upotrebiti različiti metodi analize da se identifikuju ili učine približnim CDR regioni. Primeri takvih metoda uključuju, ali nisu ograničeni na, Kabat definiciju, Chothia definiciju, AbM definiciju i kontaktnu definiciju.
[0122] Kabat definicija je standard za numerisanje ostataka u antitelu i tipično se upotrebljava da se identifikuju CDR regioni. Vidi, npr., Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28: 214-8 (2000). Chothia definicija je slična Kabat definiciji, ali Chothia definicija uzima u obzir pozicije određenih strukturnih petlji regiona. Vidi, npr., Chothia i sar., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia i sar., Nature, 342: 877-83 (1989). AbM definicija koristi integrisane nastavke računarskih programa produkovanih od strane Oxford Molecular Group koja modelira strukturu antitela. Vidi, npr., Martin i sar., Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989); "AbM™, kompjuterski program za modeliranje varijabilnih regiona antitela", Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd. AbM definicija modeluje tercijarnu strukturu antitela za primarnu sekvencu koristeći kombinaciju baza podataka znanja i ab initio metode, kao što su oni opisani od strane Samudrala i sar., "Ab initio predviđanje strukture proteina pomoću pristupa kombinovane hijerarhije" u PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198 (1999). Kontaktna definicija je zasnovana na analizi dostupnih kompleksnih kristalnih struktura. Vidi, npr., MacCallum i sar., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996).
[0123] Prema konvenciji, CDR regioni u teškom lancu su tipično označeni kao H1, H2, i H3 i numerisani su uzastopno u pravcu od amino kraja do karboksi kraja. CDR regioni u lakom lancu su tipično označeni kao L1, L2, i L3 numerisani su uzastopno u pravcu od amino kraja do karboksi kraja.
[0124] Termin „laki lanac" uključuje laki lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu sekvencu varijailnog regiona da obezbede specifično vezivanje. Laki lanac pune dužine uključuje domen varijabilnog regiona, VL, i domen konstantnog regiona, CL. Domen varijabilnog regiona lakog lanca je na amino-kraju polipeptida. Laki lanci uključuju kapa lance i lambda lance.
[0125] Termin „teški lanac" uključuje teški lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljnu sekvencu varijabilnog regiona da obezbede specifično vezivanje. Teški lanac pune dužine uključuje domen varijabilnog regiona, VH, i tri domena konstantnog regiona, CH1, CH2, i CH3. VHdomen je na amino-kraju polipeptida, i CHdomeni su na karboksi-kraju, sa CH3 koji je najbliže karboksi-kraju polipeptida. Teški lanci mogu biti od bilo kog izotopa, uključujući IgG (uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 podtipove), IgA (uključujući IgA1 i IgA2 podtipove), IgM i IgE.
[0126] Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo tipično je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita teška/laka para lanaca i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela mogu se produkovati mnoštvom tehnika, uključujući, ali bez ograničenja na, fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Vidi, npr., Songsivilai i sar., Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelny i sar., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992).
[0127] Neke vrste sisara takođe produkuju antitela koja imaju samo jedan teški lanac.
[0128] Svaki pojedinačni imunoglobulinski lanac je tipično sastavljen od nekoliko „imunoglobulinkih domena", od kojih se svaki sastoji od približno 90 do 110 aminokiselina i ima karakteristike uvijene šeme. Ovi domeni su osnovne jedinice od kojih su komponovana antitela polipeptida. Kod ljudi, IgA i IgD izotipovi sadrže četiri teška lanca i četiri laka lanca; IgG i IgE izotipovi sadrže dva teška lanca i dva laka lanca; i IgM izotip sadrži pet teških lanaca i pet lakih lanaca. C region teškog lanca tipično obuhvata jedan ili više domena koji mogu biti odgovorni za efektorsku funkciju. Broj domena konstantnog regiona teškog lanca zavisiće od izotipa. IgG teški lanci, na primer, sadrže tri domena C regiona poznatih kao CH1, CH2 i CH3. Antitela koja su obezbeđena mogu imati bilo koji od tih izotipova i podtipova. U određenim primerima, anti-PCSK9 antitelo pogodno za upotrebu prema ovom pronalasku je od IgG2 ili IgG4 podtipa.
[0129] Termin „varijabilni region" ili „varijabilni domen" odnosi se na deo lakih i/ili teških lanaca antitela, tipično uključujući približno amino-kraj 120 do 130 aminokiselina u teškom lancu i oko 100 do 110 amino terminalnih aminokiselina u lakom lancu. U određenim primerima, varijabilni regioni različitih antitela ekstenzivno se razlikuju u aminokiselinskoj sekvenci čak i među antitelima od iste vrste. Varijabilni region antitela tipično određuje specifičnost određenog antitela za njegovu metu.
[0130] Termin „neutralizujući antigen vezujući protein" ili „neutralizujuće antitelo" odnosi se na antigen vezujući protein ili antitelo, respektivno, koje se vezuje za veznik i sprečava ili redukuje biološki efekat tog veznika. To se može uraditi, na primer, putem direktnog blokiranja mesta vezivanja na vezniku ili putem vezivanja za veznik i menjajući sposovnost veznika da se veže putem indirektnih načina (kao što je strukturno ili energetsko menjanje u vezniku). U nekim primerima, termin može takođe označiti antigen vezujući protein koji sprečava protein za koji je vezan da obavi biološku funkciju. U procenjivanju vezivanja i/ili specifičnosti antigen vezujućeg proteina, npr., antitela ili njegovog imunološki funkcionalnog fragmenta, antitelo ili fragment mogu gotovo u potpunosti inhibirati vezivanje veznika za njegovog partnera vezivanja kada višak antitela redukuje količinu partnera za vezivanje za veznik za najmanje oko 1-20, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-98%, 98-99% ili više (kao što je mereno u in vitro ogledu kompetitivnog vezivanja). U nekim primerima, u slučaju PCSK9 antigen vezujućih proteina, kao što je neutralizujući molekul može se smanjiti sposobnost PCSK9 da vezuje LDLR. U nekim primerima, sposobnost neutralizovanja je okarakterisana i/ili opisana preko ogleda kompeticije. U nekim primerima, sposobnost neutralizovanja je opisana u terminima IC50ili EC50vrednosti. U nekim primerima, AVP 27B2, 13H1, 13B5 i 3C4 su ne-neutralizujući AVP, 3B6, 9C9 i 31A4 su slabo neutralizujući, i preostali AVP u Tabeli 2 su snažni neutralizatori. Antitela ili antigen vezujući proteini pogodni za upotrebu prema ovom pronalasku neutralizuju putem vezivanja za PCSK9 i sprečavanja PCSK9 da se vezuje za LDLR (ili redukujući sposobnost PCSK9 da se vezuje za LDLR). Ovde su takođe opisana antitela ili AVP koji neutralizuju putem vezuvanja za PCSK9, i dok još uvek omogućuju da se PCSK9 vezuje za LDLR, sprečavaju ili redukuju PCSK9-posredovanu degradaciju LDLR. Prema tome, takav neutralizujući AVP ili antitelo može još uvek dozvoliti PCSK9/LDLR vezivanje, ali će sprečiti (ili redukovati) uzastopno PCSK9 uključeno degradiranje LDLR.
[0131] Termin „meta" odnosi se na molekul ili deo molekula sposoban da se vezuje sa antigen vezujućim proteinom. U nekim primerima, meta može imati jedan ili više epitopa. U određenim primerima, cilj je antigen. Upotreba „antigen" u frazi „antigen vezujući protein" jednostavno označava da sekvenca proteina koja obuhvata antigen može biti vezana sa antitelom. U tom kontekstu, ona ne zahteva da protein bude strani ili da je sposoban da indukuje imuni odgovor.
[0132] Termin „u kompeticiji" kada se koristi u kontekstu antigen vezujućih proteina (npr., neutralizujućih antigen vezujućih proteina ili neutralizujućih antitela) koja su u kompeticiji za isti epitop označava kompeticiju između antigen vezujućih proteina kao što je određeno sa ogledom u kojem je antigen vezujući protein (npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalan fragment) bio testiran da li sprečava ili inhibira (npr., redukuje) specifično vezivanje referentnog antigen vezujućeg proteina (npr., veznik, ili referentno antitelo) za uobičajeni antigen (npr., PCSK9 ili njegov fragment). Brojni tipovi ogleda kompetitivnog vezivanja mogu se upotrebiti da se odredi da li je neki antigen vezujući protein u kompeticiji sa drugim, na primer: direktni ili indirektni radioimuno ogled čvrste faze (RIA), direktni ili indirektni enzimski imuno ogled čvrste faze (EIA), sendvič ogled kompeticije (vidi, npr., Stahli i sar., 1983, Metodi u enzimologiji 9: 242-253); direktni biotin-avidin čvrste faze EIA (vidi, npr., Kirkland i sar., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) direktni ogled obeležavanja čvrste faze, direktni sendvič ogled obeležavanja čvrste faze (vidi, npr Harlow i Lane, 1988, Antitela, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); direktni ogled obeležavanja čvrste faze RIA koristeći I-125 obeleživač (vidi, npr., Morel i sar., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); direktni biotin-avidin čvrste faze EIA (vidi, npr., Cheung, i sar., 1990, Virology 176:546-552); i direktni obeleženi RIA (Moldenhauer i sar., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Tipično, takav ogled uključuje upotrebu vezivanja prečišćenog antigena za čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo šta od toga, neobeleženi test antigen vezujući protein i obeleženi referentni antigen vezujući protein. Kompetitivna inhibicija je merena putem određivanja količine vezivanja obeleživača za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu test antigen vezujućeg proteina. Uobičajeno je test antigen vezujući protein prisutan u višku. Antigen vezujući proteini identifikovani sa ogledom kompeticije (kompeticija antigen vezujućih proteina) uključuje vezivanje antigen vezujućih proteina za isti epitop kao i referentni antigen vezujući proteini i vezivanje antigen vezujućih proteina za susedni epitop dovoljno proksimalno u odnosu na epitop vezan sa referentnim antigen vezujućim proteinom da se javi sterična prepreka. Dodatni detalji koji se odnose na metode za određivanje kompetitivnog vezivanja su obezbeđeni ovde u primerima. Obično, kada je kompetitivni antigen vezujući protein prisutan u višku, on će inhibirati (npr., redukovati) specifično vezivanje za referentni antigen vezujući protein za uobičajeni antigen za najmanje 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ili 75% ili više. U nekim slučajevima, vezivanje je inhibirano za najmanje 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, ili 97% ili više.
[0133] Termin „antigen" odnosi se na molekul ili deo molekula sposoban da se veže sa selektivno vezujućim agensom, kao što je antigen vezujući protein (uključujući, npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalni fragment). U nekim primerima, antigen je sposoban da se upotrebi u životinji da se produkuju antitela sposobna da se vezuju za taj antigen. Antigen može posedovati jedan ili više epitopa koji su sposobni da intereaguju sa različitim antigen vezujućim proteinima, npr., antitelima.
[0134] Termin „epitop" uključuje bilo koju determinantu sposobnu da se vezuje sa antigen vezujućim proteinom, kao što je antitelo ili za T-ćelijski receptor. Epitop je region antigena koji je vezan sa antigen vezujućim proteinom koji cilja antigen, i kada je antigen protein, uključuje specifične aminokiseline koje direktno kontaktiraju antigen vezujući protein. Najčešće, epitopi se nalaze na proteinima, ali u nekim slučajevima mogu se smestiti na drugu vrstu molekula, kao što su nukleinske kiseline. Determinante epitopa mogu uključiti hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonile grupe, i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Generalno, antitela specifična za određeni ciljni antigen će preferentno prepoznati epitop na ciljnom antigenu u kompleksnoj mešavini proteina i/ili makromolekula.
[0135] Onako kako se ovde koristi, „gotovo u potpunosti čist" znači da je opisani tip molekula preovlađujuće prisutan tip, a to je, na molarnoj osnovi mnogo učestaliji nego bilo koji drugi tip u istoj mešavini. U određenim primerima, gotovo u potpunosti čist molekul je kompozicija u kojoj tip objekta obuhvata najmanje 50% (na molarnoj osnovi) od svih prisutnih makromolekularnih tipova. U drugim primerima, gotovo u potpunosti čista kompozicija će obuhvatati najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% od svih makromolekularnih tipova prisutnih u kompoziciji. U drugim primerima, ciljni tip je prečišćen do esencijalne homogenosti pri čemu kontaminirani tipovi ne mogu da se detektuju u kompoziciji putem konvencionalnih metoda detekcije i, prema tome se kompozicija sastoji od pojedinačno detektabilnih makromolekularnih tipova.
[0136] Termin „agens" se koristi ovde da naznači hemijsko jedinjenje, mešavinu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala.
[0137] Onako kako se koriste ovde, termini „obeleživač" ili „obeleženi" odnosi se na inkorporaciju detektabilnog markera, npr., putem inkorporacije radioobeležene aminokiseline ili pričvršćenja za polipeptid biotin grupa koje se mogu detektovati markiranim avidinom (npr., fluorescentni marker koji sadrži streptavidin ili enzimatskom aktivnošću koja se može detektovati sa optičkim ili kolorimetrijskim metodima). U određenim primerima, obeleživač ili marker može takođe biti terapeutski. Različiti metodi obeležavanja polipeptida i glikoproteina poznati su u oblasti i mogu se upotrebiti. Primeri obeleživača za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne obeleživače (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfor), enzimatske obeleživače (npr., peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalina fosfataza), hemiluminescentne, biotinil grupe, prethodno određene polipeptidne epitope prepoznate od strane sekundarnog reportera (npr., leucin ziper par sekvence, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni koji vezuju metal, tagovi epitopa). U određenim primerima, obeleživači su pričvršćeni sa razdvajajućim granama različitih dužina da se redukuju potencijalne sterične prepreke.
[0138] Termin „biološki uzorak", onako kako se ovde koristi, uključuje, ali bez ograničenja na, bilo koju količinu supstance od žive stvari ili prethodno žive stvari. Takve žive stvari uključuju, ali nisu ograničene na, ljude, miševe, majmune, pacove, zečeve, i druge životinje. Takve supstance uključuju supstance, ali bez ograničenja na, krv, serum, urin, ćelije, organe, tkiva, kosti, kostnu srž, limfne čvorove, i kožu.
[0139] Termin „kompozicija farmaceutskog agensa" (ili agens ili lek) onako kako se ovde koristi odnosi se na hemijsko jedinjenje, kompoziciju, agens ili lek sposoban da indukuje željeni terapeutski efekt kada se daje na odgovarajući način pacijentu. Nije neophodan više nego jedan tip sastojka.
[0140] Termin „terapeutski efektivna količina" odnosi se na količinu PCSK9 antigen vezujućeg proteina koja je određena da produkuje terapeutski odgovor kod sisara. Takve terapeutski efektivne količine se mogu lako potvrditi od strane stručnjaka.
[0141] Termin „modulator", onako kako se ovde koristi, je jedinjenje koje menja ili zamenjuje aktivnost ili funkciju molekula. Na primer, modulator može uzrokovati povećanje ili smanjenje u magnitudi određene aktivnosti ili funkcije molekula u poređenju sa magnitudom aktivnosti ili funkcije zapaženom u odsustvu modulatora. U određenim primerima, modulator je inhibitor, koji smanjuje magnitudu najmanje jedne aktivnosti ili funkcije molekula. Određene primerne aktivnosti ili funkcije molekula uključuju, ali nisu ograničene na, afinitete vezivanja, enzimatsku aktivnost, i transdukciju signala. Određene primerne inhibicije uključuju, ali nisu ograničene na, proteine, peptide, antitela, peptitela, ugljovodonike ili male organske molekule. Peptitela su opisana u, npr., U.S. Patent br.6,660,843 (koji odgovara PCT prijavi br. WO 01/83525).
[0142] Termini „pacijent" i "subjekat" se koriste naizmenično i uključuju humane i ne-humane životinjske subjekte kao i one sa formalno dijagnostifikovanim poremećajima, one bez formalno prepoznatih poremećaja, one koji primaju medicinsku negu, one koji su pod rizikom da razviju poremećaje, itd.
[0143] Termin „tretiranje" i „tretman" uključuju terapeutske tretmane, profilaktičke tretmane, i primene u kojima neko redukuje rizik da će subjekat razviti poremećaj ili drugi faktor rizika. Tretman ne zahteva kompletno lečenje poremećaja i obuhvata slučajeve u kojima neko redukuje simptome ili istaknute faktore rizika.
[0144] Termin „sprečava" ne zahteva 100% eliminaciju mogućnosti ili događaja. Radije, on označava da je verovatnoća odigravanja događaja redukovana u prisustvu jedinjenja ili metoda.
[0145] Standardne tehnike se mogu upotrebiti za rekombinantnu DNK, sinteze oligonukleotida, i kulturu tkiva i transformaciju (npr., elektroporaciju, lipofekciju). Enzimatske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu se izvesti prema upotstvima proizvođača ili kao što se to uobičajeno obavlja u praksi ili je opisan ovde u pronalasku. Sledeće tehnike i procedure mogu se generalno izvesti prema konvencionalnim metodima dobro poznatim u praksi i kao što je opisano u različitim opštim i više specifičnim referencama koje su citirane i diskutovane kroz predmetnu prijavu. Vidi, npr., Sambrook i sar., Molekularno kloniranje: laboratirijski priručnik (2. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Sem ako su obezbeđene specifične definicije, nomenklature koje su upotrebljene u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitička hemija, sintetička organska hemija, i medicinska i farmaceutska hemija koje su opisane ovde su one dobro poznate i uobičajeno upotrebljene u praksi. Standardne tehnike se mogu upotrebiti za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije, i isporuku, i tretman pacijenata.
Antigen vezujući proteini za PCSK9
[0146] Proprotein konvertaza subtilizin keksin tip 9 (PCSK9) je serin proteaza uključena u regulciju nivoa niske gustine lipoproteinskog receptora (LDLR) proteina (Horton i sar., 2007; Seidah i Prat, 2007). PCSK9 je prohormon-proprotein konvertaza u subtilizin (S8) porodici serin proteaza (Seidah i sar., 2003). Primerna humana PCSK9 aminokiselinska sekvenca je prezentovana kao SEQ ID NO: 1 i 3. u FIG. 1A (opisuje „pro" domen proteina kao što je podvučeno) i FIG. 1B (prikazuje signalnu sekvencu podebljano i pro domen podvučen). Primerna humana PCSK9 kodirajuća sekvenca je predstavljena kao SEQ ID NO: 2 (FIG. 1B). Onako kako je ovde opisano, PCSK9 proteini mogu takođe uključiti fragmente pune dužine PCSK9 proteina. Struktura PCSK9 proteina je nedavno bila razrešena od strane dve grupe (Cunningham i sar., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, i Piper i sar., Structure, 15:1-8, 2007). PCSK9 uključuje signalnu sekvencu, N-terminalni prodomen, subtilizin-nalik katalitički domen i C-terminalni domen.
[0147] Antigen vezujući proteini (AVP) koji vezuju PCSK9, uključujući humani PCSK9, su opisani ovde. U nekim primerima, opisani antigen vezujući proteini su polipeptidi koji obuhvataju jedan ili više komplementarnih determinišućih regiona (CDR), kao što su ovde opisani. U nekim antigen vezujućim proteinima, CDR su ugrađeni u „skeletni" region, koji orijentiše CDR(ove) tako da je dostignuta odgovarajuća antigen vezjuća karakteristika CDR(ova). Antigen vezujući proteini koji su ovde opisani mogu interferirati sa, blokirati, redukovati ili modulisati interakciju između PCSK9 i LDLR. Takvi antigen vezujući proteini su označeni kao "neutralizujući." U nekim primerima, vezivanje između PCSK9 i LDLR može se još uvek odigrati, čak i ako je antigen vezujući protein neutralizujući i vezan za PCSK9. Na primer, u nekim slučajevima, AVP sprečava ili redukuje sporedne uticaje PCSK9 na LDLR bez blokiranja LDLR mesta vezivanja na PCSK9. Tako, u nekim primerima, AVP moduliše ili menja sposobnost PCSK9 da rezultira degradacijom LDLR, a da ne mora da spreči interakcije vezivanja između PCSK9 i LDLR. Takvi AVP mogu biti specifično opisani kao „nekompetitivno neutrališući" AVP. Neutralizujući AVP pogodan za upotrebu prema ovom pronalasku vezuje se za PCSK9 na lokaciji i/ili na način koji sprečava PCSK9 da se vezuje za LDLR. Takvi AVP mogu biti specifično opisani kao „kompetitivno neutralizujući" AVP. Oba od gornjih neutralizatora mogu rezultovati velikom količinom slobodnog LDLR koji je prisutan u subjektu, koji rezultira sa više LDLR vezanog za LDL (redukujući na taj način količinu LDL kod subjekta). U odgovoru, to rezultira redukcijom u količini holesterola u serumu prisutnog kod subjekta.
[0148] U nekim primerima, antigen vezujući proteini obezbeđeni ovde su sposobni da inhibiraju PCSK9-posredovanu aktivnost (uključujući vezivanje). U nekim primerima, antigen vezujući proteini koji se vezuju za te epitope inhibiraju, inter alia, interakcije između PCSK9 i LDLR i druge fiziološke efekte posredovane sa PCSK9. U nekim primerima, antigen vezujući proteini su humani, kao što su potpuno humana antitela za PCSK9.
[0149] AVP se vezuje za katalitički domen PCSK9. U nekim primerima, AVP se selektivno vezuje za zreli oblik PCSK9. AVP se vezuje na katalitički domen na takav način da PCSK9 ne može da se veže ili se veže sa istom efikasnošću kao za LDLR.
[0150] Antigen vezujući proteini koji su ovde opisani višestruko su korisni. Neki od antigen vezujućih proteina, za , su korisni u ogledu specifičnog vezivanja, afinitetnog prečišćavanja PCSK9, u određenim humanim PCSK9 ili njegovim veznicima i u ogledima skrininga da se identifikuju drugi antagonisti PCSK9 aktivnosti. Neki od antigen vezujućih proteina su korisni za inhibiciju vezivanja PCSK9 za LDLR, ili inhibiranje PCSK9-posredovanih aktivnosti.
[0151] Antigen vezujući proteini mogu se upotrebiti u mnoštvu terapeutskih primena, kao što je ovde objašnjeno. Na primer, PCSK9 antigen vezujući proteini su korisni za tretiranje stanja vezanih sa PCSK9, kao što su poremećaji vezani sa holesterolom (ili poremećaji vezani sa holesterolom u serumu") kao što je hiperholesterolemija, kao što je ovde dalje opisano. Druge upotrebe ovde opisanih antigen vezujućih proteina uključuju, na primer, dijagnozu PCSK9-vezanih bolesti ili stanja i skrining oglede da se odredi prisustvo ili odsustvo PCSK9. Neki od antigen vezujućih proteina opisanih ovde su korisni u tretiranju posledica, simptoma, i/ili patologija vezanih sa aktivnošću PCSK9.
[0152] U nekim primerima, antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni obuhvataju jedan ili više CDR (npr., 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 CDR). U nekim primerima, antigen vezujući protein obuhvata (a) polipeptidnu strukturu (b) jedan ili više CDR koji su ubačeni u i/ili spojeni sa polipeptidnom strukturom. Polipeptidna struktura može imati mnoštvo različitih oblika. Na primer, ona može biti, ili obuhvatiti, skelet antitela koja se prirodno javljaju, ili njihov fragment ili njegovu varijantu, ili mogu biti kompletno sintetičke prirode. Primeri različitih polipeptidnih struktura su opisani dalje dole.
[0153] U određenim primerima, polipeptidna struktura ovde opisanih antigen vezujućih proteina je antitelo ili je izvedena od antitela, uključujući, ali bez ograničenja na, monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domene antitela, sintetička antitela (ponekad označena ovde kao „mimetici antitela"), himerična antitela, humanizovana antitela, fuziona antitela (ponekad označena ovde kao „konjugati antitela"), i delove ili fragmente od svakog, respektivno. U nekim slučajevima, antigen vezujući protein je imunološki fragment antitela (npr., Fab, Fab', F(ab')2, ili scFv). Različite strukture su dalje ovde opisane i definisane.
[0154] Antigen vezujući proteini pogodni za upotrebu prema ovom pronalasku specifično i/ili selektivno se vezuju za humani PCSK9 kao što je prikazano na FIG. 1A (SEQ ID NO: 1). U nekim primerima, antigen vezujući protein specifično i/ili selektivno se vezuje za humani PCSK9 protein koji ima i/ili obuhvata ostatke 153-692 od SEQ ID NO: 3. U nekim primerima, AVP se specifično i/ili selektivno vezuju za humani PCSK9 koji ima i/ili obuhvata ostatake 31-152 od SEQ ID NO: 3. U nekim primerima, antigen vezjući protein specifično se vezuje za najmanje jedan fragment od PCSK9 proteina i/ili protein PCSK9 pune dužine, sa ili bez signalne sekvence.
[0155] Antigen vezujući protein pogodan za upotrebu prema ovom pronalasku može inhibirati, interferirati sa, ili modulisati jednu ili više bioloških aktivnosti PCSK9. U nekim primerima, antigen vezujući protein vezuje se specifično za humani PCSK9 i/ili gotovo u potpunosti inhibira vezivanje humanog PCSK9 za LDLR za najmanje oko 20%-40%, 40-60%, 60-80%, 80-85%, ili više (na primer, putem merenja u in vitro ogledu kompetitivnog vezivanja). Neki od antigen vezujućih proteina koji su ovde opisani su antitela. U nekim primerima, AVP ima Kdmanje od (vezuje se mnogo čvršće) od 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>, 10<-12>, 10<-13>M. U nekim primerima, AVP ima IC50za blokiranje vezivanja LDLR za PCSK9 (D374Y, varijnta visokog afiniteta) od manje od 1 mikroM, 1000 nM do 100 nM, 100 nM do 10 nM, 10nM do 1 nM, 1000pM do 500pM, 500 pM do 200 pM, manje od 200 pM, 200 pM do 150 pM, 200 pM do 100 pM, 100 pM do 10 pM, 10 pM do 1 pM.
[0156] Jedan primer IgG2 konstantnog domena teškog lanca od anti-PCSK9 antitela pogodnog za upotrebu prema ovom pronalasku ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 154, FIG.3KK.
[0157] Jedan primer IgG4 konstantnog domena teškog lanca od anti-PCSK9 antitela pogodnog za upotrebu prema ovom pronalasku ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 155, FIG.3KK.
[0158] Jedan primer kapa konstantnog domena lakog lanca anti-PCSK9 antitela ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 157, FIG.3KK.
[0159] Jedan primer lambda konstantnog domena lakog lanca od anti-PCSK9 antitela ima aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 156, FIG.3KK.
[0160] Varijabilni regioni imunoglobulinskih lanaca generalno pokazuju istu ukupnu strukturu, obuhvatajući relativno konzerviran region kostura (FR) spojen sa tri hipervarijabilna regiona, mnogo češće nazvana „komplemetarni determinišući regioni " ili CDR. CDR od dva lanca od svakog teškog lanca/laki lanac para spomenutih gore tipično su poravnati sa regionima kostura da formiraju strukturu koja se vezuje specifično sa specifičnim epitopom na ciljnom proteinu (npr., PCSK9). Od N-kraja do C-kraja, varijabilni regioni lakog i teškog lanca koji se prirodno javljaju i jedni i drugi tipično konformiraju sa sledećim redosledom elemenata: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Pronađen je sistem numerisanja za dodeljivanje brojeva aminokiselinama koje zauzimaju pozicije na svakom od tih domena. Ovaj sistem numerisanja je definisan u Kabatovom Sekvence proteina od imunološkog interesa (1987 i 1991, NIH, Bethesda, MD), ili Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia i sar., 1989, Nature 342:878-883.
[0161] Razni varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca su ovde opisani i prikazani na FIG.
2A-3JJ i 3LL-3BBB. U nekim primerima, svaki od tih varijabilnih regiona može se pričvrstiti za gornji teški i laki lanac konstantnog regiona da formira kompletno antitelo teškog i lakog lanca, respektivno. Dalje, svaka od tako generisanih sekvenci teškog i lakog lanca može se kombinovati da formira kompletnu strukturu antitela.
[0162] Specifični primeri nekih od varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela koja su obezbeđena i njihove odgovarauće aminokiselinske sekvence su sumarizovane u TABELI 2.
TABELA 2
Primerni varijabilni regioni teškog i lakog lanaca
[0163] Ponovo, svaki od primernih varijabilnih teških lanaca nabrojan u Tabeli 2 može se kombinovati sa bilo kojim od primernih varijabilnih lakih lanaca prikazanih u Tabeli 2 da se formira antitelo. Tabela 2 prikazuje primerno sparivanje lakih i tečkih lanaca nađeno kod nekoliko antitela koja su ovde otkrivena. U nekim situacijama, antitela uključuju najmanje jedan varijabilni teški lanac i jedan varijabilni laki lanac od onih nabrojanih u Tabeli 2. U drugima, antitelo sadrži dva identična laka lanca i dva identična teška lanca. Kao jedan primer, antitelo ili antigen vezujući protein može uključiti teški lanac i laki lanac, dva teška lanca, ili dva laka lanca. U nekim primerima, antigen vezujući protein obuhvata (i/ili se sastoji od) 1, 2, i/ili 3 teška i/ili laka CDR od najmanje jedne od sekvenci nabrojanih u Tabeli 2 (CDR za sekvence su podvučeni u FIG. 2A-3D, i drugim primerima u FIG. 3CCC-3JJJ i 15A-15D). U nekim primerima, svih 6 CDR (CDR1-3 od lakog (CDRL1, CDRL2, CDRL3) i CDR1-3 od teškog (CDRH1, CDRH2, i CDRH3)) su deo AVP. U nekim primerima, 1, 2, 3, 4, 5, ili više CDR su uključeni u AVP. U nekim primerima, jedan teški i jedan laki CDR od CDR u sekvenci u Tabeli 2 je uključen u AVP (CDR za sekvence u Tabeli 2 su podvučeni u FIG.2A-3D). U nekim primerima, dodatne sekcije (npr., kao što je prikazano u FIG. 2A-2D, 3A-3D, i drugi primeri u 3CCC-3JJJ i 15A-15D) su takođe uključeni u AVP. Primeri CDR i FR za teške i lake lance zabeleženi u Tabeli 2 su podvučeni u FIG. 2A-3D (i drugim primerima u FIG. 3CCC-3JJJ i 15A-15D). Opcione varijabilne sekvence lakog lanca (uključujući CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, i FR4) mogu se izabrati od sledećih: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. Opcione varijabilne sekvence teškog lanca (uključujući CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, i FR4) mogu se izabrati od sledećih: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60. U nekim od zapisa na FIG.2A-3D, varijacije sekvenci ili alternativne veze od CDR i FR su identifikovane. Ove alternative su identifikovane sa "v1" sledeći AVP ime. Pošto je većina ovih alternativa minorna u prirodi, samo delovi sa razlikama su prikazani u tabeli. Shvaćeno je da je preostali deo lakog ili teškog lanca isti kao što je prikazano za osnovni AVP u drugim panelima. Prema tome, na primer, 19H9v1 u FIG. 2C ima isti FR1, CDR1, i FR2 kao 19H9 u FIG. 2A pošto je jedina razlika zabeležena u FIG. 2C. Za tri sekvence nukleinske kiseline (AVP 26E10, 30B9, i 31B12), obezbeđene su dodatne alternativne sekvence nukleinske kiseline na slikama. Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, nije potrebno da se više nego jedna takva sekvenca upotrebi u kreiranju antitela ili AVP. I sakako, u nekim primerima, samo jedan ili nijedan od specifičnih teških ili lakih lanaca nukleinskih kiselina mora da bude prisutan.
[0164] U nekim primerima, AVP je kodiran sa sekvencom nukleinske kiseline koja može kodirati bilo koju sekvencu proteina iz Tabele 2.
[0165] U nekim primerima, AVP se selektivno vezuje za oblik PCSK9 koji se vezuje za LDLR (npr., autokatalizovani oblik molekula).
[0166] U nekim slučajevima, antitelo se selektivno vezuje za varijantu PCSK9 proteina, npr., D374Y preko divljeg tipa PCSK9. U nekim slučajevima, ova antitela se vezuju za varijantu najmanje dva puta jaču od divljeg tipa, i poželjno 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000, 1000-10000 puta ili više za mutantni nego za divlji tip (kao što je mereno preko Kd). U nekim slučajevima, antitelo selektivno inhibira varijantu D374Y PCSK9 od intereagovanja sa LDLR preko divljeg tipa PCSK9-ova sposobnost da intereaguje sa LDLR. U nekim slučajevima, ova antitela blokiraju sposobnost varijante da se vezuje za LDLR mnogo jače od sposobnosti divljeg tipa npr., najmanje dva puta jače od divljeg tipa, i poželjno 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000 puta ili više mutant nego divlji tip (kao što je mereno preko IC50). U nekim primerima, antitelo se vezuje za i neutralizuje i divlji tip PCSK9 i varijantne oblike PCSK9, kao i D374Y na sličnim nivoima. U nekim primerima, antitelo se vezuje za PCSK9 da se spreče varijante LDLR u vezivanju za PCSK9. U nekim primerima, varijante LDLR su najmanje 50% identične humanom LDLR. Napomenuto je da su varijante LDLR poznate stručnjacima (npr., Brown MS i sar., "kalcijumski kavezi, kisela kupatila i reciklirajući receptori" Nature 388: 629-630, 1997). U nekim primerima, AVP može podići nivoe efektivnosti LDLR u heterozigotnoj porodičnoj hiperholesterolemiji (gde je prisutan gubitak funkcije varijante LDLR).
[0167] U nekim primerima, AVP se vezuje za (ali ne blokira) varijante PCSK9 koje su najmanje 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili više procenata identične obliku PCSK9 prikazanom u FIG. 1A i/ili FIG. 1B. U nekim primerima, AVP se vezuje za (ali ne blokira) variante PCSK9 koje su najmanje 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili više procenata identične zrelom obliku PCSK9 prikazanom u FIG. 1A i/ili FIG. 1B. U nekim primerima, AVP se vezuje za i sprečava varijante od PCSK9 koje su najmanje 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili više procenata identične obliku PCSK9 prikazanom u FIG.1A i/ili FIG. 1B od intereagovanja sa LDLR. U nekim primerima, AVP se vezuje za i sprečava varijante PCSK9 koje su najmanje 50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili više procenta identične zrelom obliku PCSK9 prikazanom u FIG. 1B od intereagovanja sa LDLR. U nekim primerima, varijanta PCSK9 je humana varianta, kao što je varijanta na poziciji na 474, E620G, i/ili E670G. U nekim primerima, aminokiselina na poziciji 474 je valin (kao i kod drugih ljudi) ili treonin (kao što je kod makakija i miša). Pošto su podaci unakrsne reaktivnosti ovde predstavljeni smatra se da će predmentna antitela lako da se vezuju za gornje varijante.
[0168] U nekim primerima, AVP se vezuje za epitop koji je vezan sa jednim ili više antitela opisanih u Tabeli 2. U nekim primerima, antigen vezujući proteini vezuju se za specifično konformaciono stanje PCSK9 tako da spreče da PCSK9 intereaguje sa LDLR.
Humanizovani antigen vezujući proteini (npr., antitela)
[0169] Kao što je ovde opisano, antigen vezujući protein za PCSK9 može obuhvatiti humanizovano antitelo i/ili njegov deo. Važna praktična primena takve strategije je "humanizacija" mišjeg humoralnog imunog sistema.
[0170] U određenim primerima, humanizovano antitelo je gotovo u potpunosti ne-imunogeno kod ljudi. U određenim primerima, humanizovano antitelo ima gotovo u potpunosti isti afinitet za metu kao antitelo iz druge vrste od koje je izvedeno humanizovano antitelo. Vidi, npr., U.S. Patent 5,530,101, U.S. Patent 5,693,761; U.S. Patent 5,693,762; U.S. Patent 5,585,089.
[0171] U određenim primerima, identifikovane su aminokiseline varijabilnog domena antitela koje mogu biti modifikovane bez umanjivanja prirodnog afiniteta domena vezivanja antigena dok se istovremeno redukuje njegova imunogenost. Vidi, npr., U.S. Patent br. 5,766,886 i 5,869,619.
[0172] U određenim primerima, modifikacija antitela metodama poznatim u oblasti je tipično dizajnirana tako da se postigne povećani afinitet vezivanja za metu i/ili da se redukuje imunogenost antitela u primaocu. U određenim primerima, humanizovana antitela su modifikovana da se eliminišu mesta glikozilacije sa ciljem da se poveća afinitet antitela za njegov srodni antigen. Vidi, npr., Co i sar., Mol. Immunol., 30:1361-1367 (1993). U određenim primerima, tehnike kao što je "ponovno oblikovanje", "hiperhimerizacija," ili "oblaganje/obnavljanje površine" su upotrebljene da se produkuju humanizovana antitela. Vidi, npr., Vaswami i sar., Annals of Allergy, Asthma, & Immunol. 81:105 (1998); Roguska i sar., Prot. Engineer., 9:895-904 (1996); i U.S. Patent br.6,072,035. U određenom takvim primerima, takve tehnike tipično redukuju imunogenost antitela putem redukovanja broja stranih ostataka, ali ne sprečavaju anti-idiotipne i anti-alotipne odgovore praćene ponovljenim davanjem antitela. Određeni drugi metodi za redukovanje imunogenosti su opisani, npr. u Gilliland i sar., J. Immunol., 62(6): 3663-71 (1999).
[0173] U određenim slučajevima, humanizacija antitela rezultira gubitkom kapaciteta vezivanja antigena. U određenim primerima, humanizovana antitela su „ponovo mutirana". U određenim takvim primerima, humanizovano antitelo je mutirano tako da uključi jedan ili više ostataka aminokiseline nađene u donorskom antitelu. Vidi, npr., Saldanha i sar., Mol Immunol 36:709-19 (1999).
[0174] U određenim primerima, komplementarni determinišući regioni (CDR) varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela za PCSK9 mogu se graftovati u skeletne regione (FR) iz iste, ili druge vrste. U određenim primerima, CDR varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela za PCSK9 mogu se graftovati u konsenzus humanih FR. Da se kreiraju konsenzus humani FR, u određenim primerima, FR iz humanih sekvenci aminokiselina teških ili lakih lanaca su poravnati da se identifikuju sekvence konsenzus aminokiseline. U određenim primerima, FR antitela za PCSK9 teški ili laki lanac su zamenjeni sa FR iz različitog teškog ili lakog lanca. U određenim primerima, retke aminokiseline u FR teških i lakih lanaca antitela za PCSK9 nisu zamenjene, dok je ostatak FR aminokiselina zamenjen. Retke aminokiseline su specifične aminokiseline koje su na pozicijama na kojima se one ne nalaze uobičajeno u FR. U određenim primerima, graftovani varijabilni regioni od antitela za PCSK9 mogu se upotrebiti sa konstantnim regionom koji je različit od konstantnog regiona od antitela za PCSK9. U određenim primerima, graftovani varijabilni regioni su deo pojedinačnog lanca Fv antitela. CDR graftovanje je opisano u, npr., u U.S. Patent br. 6,180,370, 6,054,297, 5,693,762, 5,859,205, 5,693,761, 5,565,332, 5,585,089, i 5,530,101, i u Jones i sar., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann i sar., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen i sar., Science, 239:1534-1536 (1988), Winter, FEBS Letts., 430:92-94 (1998).
Humani antigen vezujući proteini (npr., antitela)
[0175] Kao što je ovde opisano, antigen vezujući protein koji se vezuje za PCSK9 može obuhvatati humano (tj., potpuno humano) antitelo i/ili njegov deo. U određenim primerima, ovde su opisane nukleotidne sekvence koje kodiraju, i aminokiselinske sekvence obuhvataju, teški ili laki lanac imunoglobulinskih molekula, posebno sekvence koje odgovaraju varijabilnim regionima. U određenim primerima, opisane su sekvence koje odgovaraju komplementarnom determinišućem regionu (CDR), specifično od CDR1 do CDR3. Ovde je takođe opisana ćelijska linija hibridoma koja eksprimira takav imunoglobulinski molekul ili monoklonalno antitelo. U određenim primerima, ćelijska linija hibridoma je odabrana od najmanje jedne od ćelijskih linija opisanih u Tabeli 2, npr., 21B12, 16F12 i 31H4. U određenim primerima, obezbeđeno je prečišćeno humano monoklonalno antitelo za humani PCSK9.
[0176] Neko može konstruisati mišje sojeve deficijentne za produkciju mišjeg antitela sa velikim fragmentima humanog Ig lokusa u predviđanju da će taj miš produkovati humana antitela u odsustvu mišjih antitela. Veliki humani Ig fragmenti mogu sačuvati veliku varijabilnu gensku raznovrsnost kao i odgovarajuću regulaciju produkcije antitela i ekspresije. Putem eksploatisanja mišje mašinerije za raznovrsnost antitela i selekciju i nedostatak imunoološke tolerantnosti na humane proteine, repertoar reprodukovanih humanih antitela u tim mišjim sojevima može dati visok afinitet potpuno humanih antitela protiv bilo kog antigena za koji postoji zainteresovanost, uključujući humane antigene. Koristeći tehnologiju hibridoma, antigen-specifični humani MAb sa opisanom specifičnošću mogu se produkovati i odabrati. Određeni primerni metodi su opisani u WO 98/24893, U.S. Patentu br.5,545,807, EP 546073, i EP 546073.
[0177] U određenim primerima, neko može upotrebiti konstantne regione od drugih vrsta koje nisu humane zajedno sa humanim varijabilnim regionom(ima).
[0178] Sposobnost da se klonira i rekonstruiše humani lokus megabazne veličine u veštačkim hromozomima kvasca (YAC) i da se oni unesu u mišju germinativnu liniju obezbeđuje pristup rasvetljavanju funkcionalnih komponenti vrlo velikih ili grubo mapiranih lokusa kao i generisanje korisnih modela humanih bolesti. Sem toga, upotreba takve tehnologije za supstituciju mišjeg lokusa sa njegovim humanim ekvivalentima može obezbediti uvid u ekspresiju i regulaciju produkata humanog gena tokom razvića, njihove komunikacije sa drugim sistemima, i njihovo uključivanje u indukciju i progresiju bolesti.
[0179] Humana antitela izbegavaju neke od problema vezanih sa antitelima koja poseduju mišje ili pacovske varijabilne i/ili konstantne regione. Prisustvo takvih mišjih ili pacovskih izvedenih proteina može dovesti do brzog ćišćenja antitela ili može voditi do generisanja imunog odgovora protiv antitela od strane pacijenta. Sa ciljem da se izbegne upotreba mišjih ili pacovskih izvedenih antitela, potpunih humanih antitela može se generisati kroz uvođenje lokusa funkcionalnog humanog antitela u glodara, drugog sisara ili životinju tako da glodar, drugi sisar ili životinja produkuju potpuna humana antitela.
[0180] Humanizovana antitela su ona antitela koja, dok inicijalno polaze od aminokiselinskih sekvenci koje sadrže, a koje nisu humane, imaju najmanje neke od tih ne humanih aminokiselinskih sekvenci antitela zamenjene sa sekvencama humanog antitela. To je u kontrastu sa humanim antitelima, u kojima je antitelo kodirano (ili sposobno da bude kodirano) sa genima koje poseduje čovek.
Varijante antigen vezujućih proteina
[0181] Druga antitela, koja su opisana ovde, su varijante AVP nabrojanih gore formiranih sa kombinacijom ili pod delovima varijabilnih teških i varijabilnih lakih lanaca prikazanih u Tabeli 2 i obuhvataju varijabilne lake i/ili varijabilne teške lance koji imaju svaki najmanje 50%, 50-60, 60-70, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-99%, ili više 99% identiteta sa aminokiselinskim sekvencama od sekvenci iz Tabele 2 (ili cela sekvenca ili poddeo sekvence, npr., jedan ili više CDR). U nekim slučajevima, takva antitela uključuju najmanje jedan teški lanac i jedan laki lanac, dok u drugim varijantni oblici sadrže dva identična laka lanca i dva identična teška lanca (ili njihove pddelove). U nekim primerima, poređenje sekvence u FIG.2A-3D (i 13A-13J i drugim primerima u 15A-15D) mogu se upotrebiti sa ciljem da se identifikuju delovi antitela koji se mogu modifikovati zapažanjem onih varijanti koje pogađaju vezivanje i onih varijanti za koje se pokazuje da ne utiču na vezivanje. Na primer, poređenjem sličnih sekvenci, neko može identifikovati te delove (npr., određene aminokiseline) koji se mogu modifikovati i kako se mogu modifikovati a da još uvek zadrže (ili poboljšaju) funkcionalnost AVP. U nekim primerima, varijante AVP uključuju one konsenzus grupe i sekvence prikazane u FIG. 13A, 13C, 13F, 13G, 13H, 131 i/ili 13J i varijacije su omogućene na pozicijama identifikovanim kao varijable na slikama. CDR prikazani u FIG. 13A, 13C, 13F, i 13G su definisani na osnovu hibridne kombinacije iz Chothia metoda (zasnovanog na lokaciji strukturne petlje regiona, vidi, npr., „Standardne konformacije za kanoniske strukture imunoglobulina", Bissan Al-Lazikani, Arthur M. Lesk i Cyrus Chothia, Journal of Molecular Biology, 273(4): 927-948, 7 November (1997)) i Kabat metoda (zasnovanog na varijabilnosti sekvence, vidi, npr., Sekvence proteina od imunološkog interesa, peto izdanje. NIH Publikacija br. 91-3242, Kabat i sar., (1991)). Svaki ostatak određen sa bilo kojim metodom je uključen u konačnu listu CDR ostataka (i predstavljen na FIG..13A, 13C, 13F, i 13G). CDR u FIG.13H, 13I, i 13J su dobijeni sa samim Kabat metodom. Sem ako je određeno drugačije, definisane konsenzus sekvence, CDR, i FR u FIG. 13H-13J će definisati i kontrolisati zabeležene CDR i FR za iznete AVP u FIG. 13.
[0182] Antigen vezujući protein kao što je ovde opisan može da obuhvata teški lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci odabranoj od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60. U određenim primerima, antigen vezujući protein, kao što je ovde opisan, obuhvata teški lanac koji obuhvata varijabilni region, koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu aminokiselinskoj sekvenci odabranoj od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60. U određenim primerima, antigen vezujući protein, kao što je ovde opisan, obuhvata teški lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci odabranoj od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60.
[0183] U nekim primerima, antigen vezujući protein kao što je ovde opisan obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična sa jednim ili više CDR od CDR u najmanje jednoj od sekvenci od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60. U nekim primerima, prisutno je 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 CDR (svaki je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identičan sa gornjim sekvencama).
[0184] U nekim slučajevima, antigen vezujući protein kao što je ovde opisan obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična sa jednim ili više FR od FR u najmanje jednoj sekvenci od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60. U nekim primerima, prisutno je 1, 2, 3, ili 4 FR (svaki je u najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identičan sa gornjim sekvencama).
[0185] U određenim slučajevima, antigen vezujući protein kao što je opisan ovde obuhvata laki lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. U određenim slučajevima, antigen vezujući protein kao što je opisan ovde obuhvata laki lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. U određenim slučajevima, antigen vezujući protein kao što je opisan ovde obuhvata laki lanac koji obuhvata varijabilni region koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 99% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46.
[0186] U nekim slučajevima, antigen vezujući protein kao što je ovde opisan obuhvata sekvencu koja je u najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična sa jednim ili više CDR od CDR u najmanje jednoj od sekvenci od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. U nekim primerima, prisutno je 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 CDR (svaki je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identičan gornjim sekvencama).
[0187] U nekim slučajevima, antigen vezujući protein kao što je ovde opisan obuhvata sekvencu koja je u najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična sa jednim ili više FR od FR u najmanje jednoj od sekvenci od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. U nekim primerima, prisutno je 1, 2, 3, ili 4 FR (svaki je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identičan gornjim sekvencama).
[0188] U svetlu ovog pronalaska, stručnjak će biti u stanju da odredi pogodne varijante od AVP kao što su ovde dalje iznete koristeći dobro poznate tehnike. U određenim primerima, stručnjak može identifikovati pogodna područja molekula koja mogu biti promenjena bez uništavanja aktivnosti sa ciljnim regionima za koje se ne veruje da su važni za aktivnost. U određenim primerima, neko može identifikovati ostatke i delove molekula koji su konzervirani među sličnim polipeptidima. U određenim primerima, čak i područja koja mogu biti važna za biološku aktivnost ili strukturu mogu biti predmet konzervativnih supstitucija aminokiselina bez uništavanja biološke aktivnosti ili bez štetnih uticaja na polipeptidnu strukturu.
[0189] Sem toga, stručnjak može sagledati studije struktra-funkcija identifikujući ostatke u sličnim polipeptidima koji su važni za aktivnost ili strukturu. U svetlu takvih poređenja, neko može predvideti važnost ostataka aminokiseline u proteinu koji odgovaraju ostacima aminokiseline koji su važni za aktivnost ili strukturu u sličnim proteinima. Stručnjak može tragati za hemijski sličnim supstitucijama aminokiselina za takve predviđene važne ostatke aminokiseline.
[0190] Stručnjak može takođe analizirati tro-dimenzionalnu strukturu i aminokiselinsku sekvencu u odnosu na tu strukturu u sličnim AVP. U svetlu takve informacije, stručnjak može predvideti poklapanje ostataka aminokiseline antitela u odnosu na njegovu tro-dimenzionalnu strukturu. U određenim primerima, stručnjak može izabrati da ne napravi radikalne promene ostataka aminokiseline predviđenih da budu na površini proteina, pošto takvi ostaci mogu biti uključeni u važne interakcije sa drugim molekulima. Štaviše, stručnjak može generisati test varijante koje sadrže supstituciju pojedinačne aminokiseline na svakom željenom ostatku aminokiseline. Varijante mogu zatim da se pregledaju koristeći oglede aktivnosti poznate stručnjku. Takve varijante se mogu upotrebiti da se sakupe informacije o pogodnim varijantama. Na primer, ako neko otkrije da promena u određeni ostatak aminokiseline rezultira uništenjem, neželjenim redukovanjem, ili nepogodnom aktivnosti, varijante sa takvom promenom mogu se izbeći. Drugim rečima, na osnovu informacija sakupljenih iz takvih rutinskih eksperimenata, stručnjak može lako odrediti aminokiseline gde dalje supstitucije treba da se izbegnu bilo same ili u kombinaciji sa drugim mutacijama.
[0191] Jedan broj naučnih publikacija je posvećen predviđanu sekundarne strukture. Vidi Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou i sar., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou i sar., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou i sar., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou i sar., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 i Chou i sar., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Štaviše, računarski programi su trenutno dostupni da pomognu u predviđanju sekundarne strukture. Jedan metod u predviđanju sekundarne strukture je zasnovan na modeliranju homologije. Na primer, dva polipeptida ili proteina koji imaju identičnost sekvence veću od 30%, ili sličnost veću od 40% često imaju slične strukturne topologije. Skorašnji rast baze podataka za strukturne proteine (PDB) obezbedio je povećanu mogućnost predviđanja sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj zavoja u strukturi polipeptida ili proteina. Vidi Holm i sar., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Sugerisano je (Brenner i sar., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) da postoji ograničeni broj zavoja u datom polipeptidu ili proteinu i da jednom kada kritični broj struktura bude razrešen, predviđanja strukture će postati dramatično više pouzdana.
[0192] Dodatni metodi za predviđanje sekundarne strukture uključuju „zavijanje" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl i sar., Structure, 4(1):15-19 (1996)), „analizu profila" (Bowie i sar., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov i sar., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov i sar., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84(13):4355-4358 (1987)), i „evoluciono vezivanje" (Vidi Holm, supra (1999), i Brenner, supra (1997)).
[0193] U određenim primerima, varijante antigen vezujućeg proteina uključuju glikozilaciju varijanti u kojoj je broj i/ili tip mesta glikozilacije izmenjen u poređenju sa aminokiselinskim sekvencama roditeljskog polipeptida. U određenim primerima, varijante proteina obuhvataju veći ili manji broj N-vezanih mesta glikozilacije od nativnog proteina. N-vezano mesto glikozilacije je okarakterisano sa sekvencom: Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, gde ostatak aminokiseline označen kao X može biti bilo koji ostatak aminokiseline sem prolina. Supstitucija ostataka amino kiseline da se kreira ta sekvenca obezbeđuje potencijalno novo mesto za dodavanje N-vezanog ugljovodoničnog lanca. Alternativno, supstitucije koje eliminišu tu sekvencu će ukloniti postojeći N-vezani ugljovodonični lanac. Takođe je obezbeđen rearanžman N-vezanih ugljovodoničnih lanaca u kojima N-vezana mesta glikozilacije (tipično ona koja se prirodno javljaju) su eliminisana i kreirano je jedno ili više novih N-vezanih mesta. Dodatne poželjne varijante antitela uključuju varijante cisteina u kojima su jedan ili više cisteinskih ostataka delecirani iz ili supstituisani sa drugom aminokiselinom (npr., serin) u poređenju sa roditeljskom aminokiselinskom sekvencom. Varijante cisteina mogu biti korisne kada antitela moraju da se ponovo uviju u biološki aktivnu komformaciju kao što je nakon izolacije nerastvorljivih inkluzionih tela. Varijante cisteina generalno imaju manje ostataka cisteina od nativnog proteina, i tipično imaju isti broj da minimizuju interakcije koje nastaju zbog nesparenih cisteina.
[0194] Prema određenim primerima, supstitucije aminokiselina su one koje: (1) redukuju suspektnost na proteolizu, (2) redukuju suspektnost na oksidaciju, (3) menjaju afinitet vezivanja za formiranje proteinskih kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja, i/ili (4) donose ili modifikuju druge fizikohemijske ili funkcionalne karakteristike takvih polipeptida. Prema određenim primerima, pojedinačne ili višestruke supstitucije aminokiseline (u određenim ostvarenjima, konzervativne supstitucije aminokiseline) mogu se napraviti u sekvenci koja se prirodno javlja (u određenim primerima, u delu polipeptida izvan domena formiranja intermolekularnih kontakata). U određenim primerima, konzervativna supstitucija aminokiseline tipično ne može da gotovo u potpunosti promeni strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr., zamena aminokiseline ne bi trebalo da ima tendenciju da razbije spiralu koja se javlja u roditeljskoj sekvenci, ili raskine druge tipove sekundarne strukture koja karakteriše roditeljsku sekvencu). Primeri u oblasti prepoznatljivih polipeptida sekundarnih i tercijernih struktura opisani su u Proteini, strukture i molekularni principi (Creighton, Ed., W. H. Freeman i Company, New York (1984)); Uvod u strukturu proteina (C. Branden & J. Tooze, izd., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton i sar., Nature, 354:105 (1991).
[0195] U nekim slučajevima, varijante su varijante sekvenci nukleinske kiseline od AVP ovde otkrivenih. Stručnjak će prihvatiti da gornja diskusija može da se upotrebi za identifikovanje, procenu, i/kreiranje varijanti AVP proteina i takođe za sekvence nukleinske kiseline koje mogu kodirati te varijante proteina. Prema tome, ovde su, takođe, opisane sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju te varijante proteina (kao i sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju AVP u Tabeli 2, ali su različite od onih koje su ovde eksplicitno otkrivene). Na primer, AVP varijanta može imati najmanje 80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-97, 97-99 ili više identičnosti sa najmanje jednom sekvencom nukleinske kiseline opisanom u SEQ ID NO: 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 ili najmanje jedan do šest (i različiti broj njihovih kombinacija) od CDR(ova) kodiranih sa sekvencom nukleinske kiseline u SEQ ID NO: 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, i 151.
[0196] U nekim slučajevima, antitelo (ili sekvenca nukleinske kiseline koja ga kodira) je varijanta ako sekvenca nukleinske kiseline koja kodira određeni AVP (ili sekvenca nukleinske kiseline sama po sebi) može selektivno hibridizovati za bilo koju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira proteine u Tabeli 2 (kao što je, ali bez ograničenja na SEQ ID NO: 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, i 151) pod strogim uslovima. U jednom , pogodni umereno strogi uslovi uključuju prethodno ispiranje u rastvoru 5XSSC; 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0); hibridizovanje na 50° C, -65° C, 5xSSC, preko noći ili, u slučaju homologije među vrstama, na 45° C sa 0.5xSSC; praćenog sa dva puta ispiranjem na 65° C tokom 20 minuta sa svakim od 2x, 0.5x i 0.2xSSC koji sadrži 0.1% SDS. Takve hibridizujuće DNK sekvence su takođe opisane, pošto su nukleotidne sekvence koje, zbog degeneracije koda, kodiraju polipeptid antitela koji je kodiran sa sekvencom hibridizujuće DNK i aminokiselinske sekvence koje su kodirane sa sekvencama tih nukleinskih kiselina. U nekim slučajevima, varijante CDR uključuju sekvence nukleinske kiseline i aminokiselinske sekvence kodirane od strane onih sekvenci, koje hibridizuju sa jednim ili više CDR u okviru sekvenci zabeleženih gore (pojedinačni CDR mogu se lako odrediti u svetlu FIG.2A-3D, i drugih primera u FIG. 3CCC-3JJJ i 15A-15D). Fraza „selektivno hibridizuje" u ovom kontekstu odnosi se na detektabilno i selektivno vezivanje. Polinukleotidi, oligonukleotidi i njihovi fragmenti, koji su ovde opisani, selektivno hibridizuju sa lancima nukleinske kiseline u uslovima hibridizacije i ispiranja koji minimizuju prihvatljive količine detektabilnog vezivanja za nespecifične nukleinske kiseline. Uslovi visoke strogoće mogu se upotrebiti da se dostignu uslovi selektivne hibridizacije kao što su poznati u oblasti i ovde diskutovani. Generalno, homologija sekvence nukleinske kiseline između polinukleotida, oligonukleotida, i fragmenata kao što su ovde opisani i sekvence nukleinske kiseline za koju postoji zainteresovanost biće najmanje 80%, ili još tipičnije sa poželjno rastućim homologijama od najmanje 85%, 90%, 95%, 99%, i 100%. Dve aminokiselinske sekvence su homologne ako postoji delimična ili kompletna identičnost između tih sekvenci. Na primer, 85% homologije znači da je 85% aminokiselina identično kada se dve sekvence preklope radi maksimalnog poklapanja. Gapovi (u bilo kojoj od dve sekvence koje su preklopljene) su omogućeni da bi se maksimizovalo poklapanje; dužine gapova od 5 ili manje su poželjnije sa 2 ili manje što je još poželjnije. Alternativno i poželjno, dve sekvence proteina (ili polipeptidne sekvence izvedene od njih od najmanje 30 aminokiselina u dužinu) su homologne, kao što je taj termin ovde upotrebljen, ako imaju rezultat poklapanja od najviše 5 (u standardnim jedinicama devijacije) koristeći program ALIGN sa mutacionom matricom podataka i gap kaznom od 6 ili više. Vidi Dayhoff, M. O., u Atlas sekvenci proteina i strukture, str. 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) i Supplement 2 tog volumena, str. 1-10. Dve sekvence ili njihovi delovi su mnogo poželjnije homologni ako su njihove aminokiseline više od ili jednake 50% identične kada su optimalno preklopljene koristeći ALIGN program. Termin „ogovara tome" ovde se koristi da označi da je polinukleotidna sekvenca homologna (tj., je identična, ali ne striktno evolutivno srodna) celom ili delu referentne polinukleotidne sekvence, ili da je polipeptidna sekvenca identična referentnoj polipeptidnoj sekvenci. Nasuprot tome, termin „komplementarna sa" se ovde koristi tako da označi da je komplementarna sekvenca homologna svim delovima referentne polinukleotidne sekvence. Radi ilustrovanja, nukleotidna sekvenca „TATAC" odgovara referentnoj sekvenci „TATAC" i komplementarna je referentnoj sekvenci „GTATA".
Priprema antigen vezujućih proteina (npr., antitela)
[0197] U određenim slučajevima, antigen vezujući proteini (kao što su antitela) produkovani su putem imunizacije sa antigenom (npr., PCSK9). U određenim primerima, antitela se mogu produkovati putem imunizacije sa PCSK9 pune dužine, rastvorljivim oblikom PCSK9, samim katalitičkim domenom, zrelim oblikom PCSK9 prikazanim na FIG.1A, rascepljenom varijantom od PCSK9, ili njegovim fragmentom. U određenim primerima, ovde opisani antitela mogu biti poliklonalna ili monoklonalna, i/ili mogu biti rekombinantna antitela. U određenim primerima, antitela kao što su opisana ovde su humana antitela pripremljena, na primer, putem imunizacije transgenih životinja sposobnih da produkuju humana antitela (vidi, na primer, PCT publikovanu patentnu prijavu br. W093/12227).
[0198] U određenim primerima, mogu se upotrebiti određene strategije da se manipulišu bitne karakteristike antitela, kao što je afinitet antitela za njegovu metu. Takve strategije uključuju, ali nisu ograničene na, upotrebu za mesto specifične ili slučajne mutageneze polinukleotidnih molekula koji kodiraju antitelo da se generiše varijanta antitela. U određenim primerima, takvo generisanje je praćeno pregledanjem za varijante antitela koje pokazuju željenu promenu, npr., povećan ili smanjen afinitet.
[0199] U određenim primerima, ostaci aminokiseline naciljani u mutagenim strategijama su oni u CDR. U određenim primerima, aminokiseline u regionima kostura varijabilnih domena su ciljevi. U određenim primerima, pokazano je da takvi regioni kostura doprinose karakteristikama vezivanja za metu u određenim antitelima. Vidi, npr., Hudson, Curr. Opin. Biotech., 9:395-402 (1999) i reference u njemu.
[0200] U određenim slučajevima, manje ili više efektivno pregledane biblioteke varijanti antitela su produkovane pomoću slučajne restrikcije ili mutageneze usmerene na mesto do hipermutacionih mesta u CDR, koji su mesta koja odgovaraju područjima sklonim da mutiraju tokom mutacionih procesa somatičnih afiniteta. Vidi, npr., Chowdhury & Pastan, Nature Biotech., 17: 568-572 (1999) i reference koje su tu. U određenim primerima, određeni tipovi DNK elemenata mogu se upotrebiti da se identifikuju hiper-mutacina mesta uključujući, ali bez ograničenja na, određene direktne i invertovane ponovke, određene konsenzus sekvence, određene sekundarne strukture, i određene palindrome. Na primer, takvi DNK elementi koji se mogu upotrebiti da se identifikuju hiper-mutacina mesta uključuju, ali bez ograničenja na, tetrabazne sekvence koje sadrže purin (A ili G), praćene sa guaininom (G), praćene sa pirimidinom (C ili T), praćene sa bilo adenozinom ili timidinom (A ili T) (tj., A/G-G-C/T-A/T). Drugi primer DNK elementa koji se može upotrebiti da se identifikuju hiper-mutacina mesta je serin kodon, A-G-C/T.
Priprema potpuno humanih AVP (npr., antitela)
[0201] U određenim slučajevima, tehnika izlaganja faga je upotrebljena da se generišu monoklonalna antitela. U određenim slučajevima, takve tehnike produkuju potpuno humana monoklonalna antitela. U određenim primerima, polinukleotid koji kodira pojedinačni Fab ili Fv fragment antitela je eksprimiran na površini čestica faga. Vidi, npr., Hoogenboom i sar., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks i sar., J Mol Biol 222: 581 (1991); U.S. Patent br. 5,885,793. U određenim primerima, fagovi su „skrinovani" da se identifikuju fragmenti onih antitela koji imaju afinitet za metu. Tako, određeni takvi procesi mimikriraju imunu selekciju kroz izložene repertoare fragmenata antitela na površini filamentoznog bakteriofaga, i uzastopnu selekciju faga sa njihovim vezivanjem za metu. U određenim takvim procedurama, visoki afinitet fragmenata funkcionalno neutralizujućih antitela su izolovana. U određenim takvim primerima (diskutovanim dole mnogo detaljnije), kompletni repertoar gena humanih antitela je kreiran kloniranje prirodno rearanžiranih humanih V gena iz limfocita periferne krvi. Vidi, npr., Mullinax i sar., Proc Natl Acad Sci (USA), 87: 8095-8099 (1990).
[0202] Prema određenim slučajevima, antitela kao što su ovde opisana su pripremljena putem upotrebe transgenog miša koji ima značajan deo humanog antitela koji produkuje genom koji je ubačen ali koji je učinjen deficijentnim u produkciji endogenih, mišjih antitela. Takvi miševi, su zatim, sposobni da produkuju humane imunoglobulinske molekule i antitela i deficijentni su u produkciji mišjih molekula imunoglobulina i antitela. Tehnologije koje su upotrebljene da se dostigne taj rezultat su otkrivene u patentima, prijavama i referencama koje su prikazane ovde u specifikaciji. U određenim primerima, neko može upotrebiti metode kao što su oni otkriveni u PCT publikovanoj prijavi br. WO 98/24893 ili u Mendez i sar., Nature Genetics, 15:146-156 (1997).
[0203] Generalno, potpuno humani monoklonalni AVP (npr., antitela) specifična za PCSK9 mogu se produkovati na sledeći način. Transgeni miševi koji sadrže gene humanog imunoglobulina su imunizovana sa antigenom za koji postoji interes, npr. PCSK9, dobijene su limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) od miševa sa određenim antitelom. Takve obnovljene ćelije su fuzionisane sa ćelijskom linijom mieloidnog tipa da se pripreme besmrtne ćelijske linije hibridoma, i u takvim ćelijskim linijama hibridoma je rađen skrining i selektovane su da se identifikuju ćelijske linije hibridoma koje produkuju antitela specifična za antigen za koji postoji interes. U određenim primerima, obezbeđena je produkcija ćelijske linije hibridoma koja produkuje antitela specifična za PCSK9.
[0204] U određenim slučajevima, potpuno humana antitela produkovana su izlaganjem humanih splenocita (B ili T ćelije) antigenu in vitro, i zatim rekonstituisanjem izloženih ćelija kod imunokompromitovanog miša, npr., SCID ili nod/SCID. Vidi, npr., Brams i sar., J.Immunol. 160: 2051-2058 (1998); Carballido i sar., Nat. Med., 6: 103-106 (2000). U određenim takvim pristupima, engraftovanje humanog fetalnog tkiva u SCID miševe (SCID-hu) rezultira dogotrajnom hematopoezom i razvićem humane T-ćelije. Vidi, npr., McCune i sar., Science, 241:1532-1639 (1988); Ifversen i sar., Sem. Immunol., 8:243-248 (1996). U određenim slučajevima, humoralni imuni odgovor kod takvih himeričnih miševa je zavisan od zajedničkog razvitka humanih T-ćelija u životinji. Vidi, npr., Martensson i sar., Immunol., 83:1271-179 (1994). U određenim pristupima, humani limfociti periferne krvi su transplantirani u SCID miševe. Vidi, npr., Mosier i sar., Nature, 335:256-259 (1988). U određenim takvim slučajevima, kada su takve transplantirane ćelije tretirane ili sa agensom za započinjanje, kao što je Staphylococcal Enterotoxin A (SEA), ili sa anti-humanim CD40 monoklonalnim antitelima, detektovan je viši nivo produkcije B ćelija. Vidi, npr., Martensson i sar., Immunol., 84: 224-230 (1995); Murphy i sar., Blood, 86:1946-1953 (1995).
[0205] Prema tome, u određenim slučajevima, potpuna humana antitela se mogu produkovati ekspresijom rekombinantne DNK u ćeliji domaćina ili ekspresijom u hibridoma ćelijama. U drugim slučajevima, antitela se mogu produkovati koristeći tehnike izlaganja faga opisane ovde.
[0206] Antitela koja su ovde opisana pripremljena su kroz upotrebu XenoMouse<®>tehnologije, kao što je ovde opisano. Takvi miševi, onda, su sposobni da produkuju molekule humanog imunoglobulina i antitela i deficijentni su u odnosu na produkciju molekula mišjeg imunoglobulina i antitela. Za ostvarenje toga upotrebljene su tehnologije koje su otkrivene u patentima, prijavama i referencama ovde prikazanim u pozadini poglavlja. Posebno, međutim, poželjni primer transgene produkcije miševa i njihovih antitela je otkriveno u U.S. patentnoj prijavi serijski br.08/759,620, podnetoj 3. decembra, 1996 i međunarodnoj patentnoj prijavi WO 98/24893, publikovanoj 11. juna, 1998 i WO 00/76310, publikovanoj 21. decembra, 2000. Vidi takođe Mendez i sar., Nature Genetics, 15:146-156 (1997).
[0207] Kroz upotrebu takve tehnologije, produkovana su potpuno humana monoklonalna antitela za mnoštvo antigena. U osnovi, XenoMouse<®>linije miševa su imunizovane sa antigenom za koji postoji interes (npr. PCSK9), limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) su izdvojene iz hiperimunzovanih miševa, i obnovljeni limfociti su fuzionisani sa ćelijskom linijom mieloidnog-tipa da se pripremi besmrtna ćeljska linija hibridoma. Ove ćelijske linije hibridoma su skrinovane i selektovane da se identifikuje ćelijska linija hibridoma koja produkuje antitela specifična za antigen za koji postoji interes. Ovde su obezbeđeni metodi za produkciju višestrukih ćelijskih linija hibridoma koje produkuju antitela specifična za PCSK9 􀁋 Dalje je ovde obezbeđena karakterizacija antitela produkovanih od takvih ćelijskih linija, uključujuću analizu nukleotida i aminokiselinske sekvence od teškog i lakog lanca takvih antitela.
[0208] Produkcija XenoMouse<®>sojeva miševa je dalje diskutovana i istaknuta u U.S. Patentnoj prijavi serijski br. 07/466,008, podnetoj 12 januara, 1990, 07/610,515, podnetoj 8 novembra, 1990, 07/919,297, podnetoj 24 jula, 1992, 07/922,649, podnetoj 30 jula, 1992, 8/031,801, podnetoj 15 marta, 1993, 08/112,848, podnetoj 27 avgusta, 1993, 08/234,145, podnetoj 27 aprila, 1994, 08/376,279, podnetoj 20 januara, 1995, 08/430, 938, podnetoj 27 aprila, 1995, 08/464,584, podnetoj 5 juna, 1995, 08/464,582, podnetoj 5 juna, 1995, 08/463,191, podnetoj 5 juna, 1995, 08/462,837, podnetoj 5 juna, 1995, 08/486,853, podnetoj 5 juna, 1995, 08/486,857, podnetoj 5 juna, 1995, 08/486,859, podnetoj 5 juna, 1995, 08/462,513, podnetoj 5 juna, 1995, 08/724,752, podnetoj 2 oktobra, 1996, 08/759,620, podnetoj 3 decembra, 1996, U.S. publikacije 2003/0093820, podnetoj 30 novembra, 2001 i U.S. Patent br. 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, i 5,939,598 i Japanski Patent br. 3 068 180 B2, 3068 506 B2, i 3068 507 B2. Vidi takođe Evropski Patent br., EP 0 463 151 B1, stipendija publikovan 12 juna, 1996, Internatcionalnu patentnu prijavu br., WO 94/02602, publikovanu 3 februara, 1994, Internatcionalnu patentnu prijavu br., WO 96/34096, publikovanu 31 oktobra, 1996, WO 98/24893, publikovanu 11 juna, 1998, WO 00/76310, publikovanu 21 decembra, 2000.
[0209] U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International, Inc., su koristili „minilokus" pristup. U mini lokus pristupu, egzogeni Ig lokus je mimikriran kroz inkluziju komada (individualnih gena) iz Ig lokusa. Prema tome, jedan ili više VHgena, jedan ili više DHgena, jedan ili više JHgena, mu konstantni region, i obično sekundarni konstantni region (poželjno gama konstantni region) su formirani u konstrukt za inserciju u životinju. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patentu br. 5,545,807 od Surani i sar. i U.S. Patent br. 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, i 6,255,458 svaki od Lonberg & Kay, U.S. Patent br. 5,591,669 i 6,023.010 od Krimpenfort & Berns, U.S. Patent br. 5,612,205, 5,721,367, i 5,789,215 od Berns i sar., i U.S. Patent br.
5,643,763 od Choi & Dunn, i GenPharm International U.S. Patentna prijava serijski br.
07/574,748, podneta 29 avgusta, 1990, 07/575,962, podneta 31 avgusta, 1990, 07/810,279, podneta 17 decembra, 1991, 07/853,408, podneta 18 marta, 1992, 07/904,068, podneta 23 juna, 1992, 07/990,860, podneta 16 decembra, 1992, 08/053,131, podneta 26 aprila, 1993, 08/096,762, podneta 22 jula, 1993, 08/155,301, podneta 18 novembra, 1993, 08/161,739, podneta 3 decembra, 1993, 08/165,699, podneta 10 decembra, 1993, 08/209,741, podneta 9 marta, 1994. Vidi takođe Evropski Patent br. 0 546 073 B1, Internacionalnu patentnu prijavu br. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO 98/24884 i U.S. Patent br.5,981,175. Vidi dalje Taylor i sar., 1992, Chen i sar., 1993, Tuaillon i sar., 1993, Choi i sar., 1993, Lonberg i sar., (1994), Taylor i sar., (1994), i Tuaillon i sar., (1995), Fishwild i sar., (1996).
[0210] Kirin je takođe pokazao generisanje humanih antitela od miševa u kojima, kroz mikroćelijsku fuziju uvedeni veliki delovi hromozoma, ili celi hromozomi. Vidi Evropsku patentnu prijavu br. 773288 i 843961. Sem toga generisani su KM™ miševi, koji su rezultat ukrštanja Kirin Tc miševa sa Medarex minilokus (Humab) miševima. Ovi miševi poseduju humani IgH transhromozom od Kirin miševa i kapa lanac transgena od Genpharm miševa (Ishida i sar., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).
[0211] Humana antitela mogu se takođe izvesti pomoću in vitro metoda. Pogodni primeri uključuju ali nisu ograničeni na izlaganje faga (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (ranije Proliferon), Affimed) ribozom displej (CAT), kvasac displej, i tome slično.
[0212] U nekim primerima, antitela koja su ovde opisana poseduju teške lance humanog IgG4 kao i teške lance IgG2. Antitela takođe mogu biti od drugih humanih izotipova uključujući IgG1. Antitela su posedovala visoke afinitete, tipično su posedovali Kd od oko 10<-6>do oko 10<-13>M ili niže, kada se meri različitim tehnikama.
[0213] Kao što će biti prihvaćeno, antitela se mogu eksprimirati u drugim ćelijskim linijama koje nisu ćelijske linije hibridoma. Sekvence koje kodiraju određena antitela mogu se upotrebiti da se transformiše pogodna sisarska ćelija domaćin. Transformacija se može obaviti bilo kojim poznatim metodom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukovanje ćelije domaćina sa virusom (ili vektorom) ili putem procedura transfekcije poznatih u oblasti, kao što je dato u primerima u U.S. Patentima br. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455. Procedura transformacije koja je upotrebljena zavisiće od domaćina koji se transformiše. Metodi za uvođenje heterolognih polipeptida u sisarske ćelije su dobro poznati u oblasti i uključuju transfekciju posredovanu sa dekstranom, taloženje kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu sa polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsulaciju polinukleotida u lipozomima, i direktnu mikroinjekciju DNK u jedro.
[0214] Sisarske ćelijske linije koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u praksi i uključuju mnoge besmrtne ćelijske linije dostupne od American Type Culture Collection (ATCC), uključujući ali bez ograničenja na ćelije ovarijuma kinskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), humane epitelijalne ćelije bubrega 293, i jedan broj drugih ćelijskih linija. Posebno poželjne ćelijske linije, koje se radije koriste, su odabrane kroz određivanje koje ćelijske linije imaju visoke nivoe ekspresije i produkuju antitela sa odgovarajućim PCSK9 karakteristikama vezivanja.
[0215] U određenim primerima, antitela i/ili AVP su produkovani sa najmanje jednim od sledećih hibridoma: 21B12, 31H4, 16F12, i bilo kog drugog hibridoma nabrojanog u Tabeli 2 ili otkrivenog u primerima. U određenim primerima, antigen vezujući proteini vezuju se za PCSK9 sa konstantom disocijacije (KD) manjom od približno 1 nM, npr., 1000 pM do 100 pM, 100 pM do 10 pM, 10 pM to 1 pM, i/ili 1 pM do 0.1 pM ili manje.
[0216] U određenim primerima, antigen vezujući proteini obuhvataju molekul imunoglobulina od najmanje jednog od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, Ig E, IgA, IgD, i IgM izotipa. U određenim primerima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i/ili humani teški lanac. U određenim primerima, teški lanac je od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, ili IgM izotipa. U određenim primerima, antigen vezujući proteini su klonirani za ekspresiju u sisarskim ćelijama. U određenim primerima, antigen vezujući proteini obuhvataju drugi konstantni region, a ne konstantni regioni od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, i IgM izotipa.
[0217] U određenim primerima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani lambda laki lanac i humani IgG2 teški lanac. U određenim primerima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani lambda laki lanac i humani IgG4 teški lanac. U određenim primerima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani lambda laki lanac i humani IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD ili IgM teški lanac. U drugim primerima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgG2 teški lanac. U određenim primerima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgG4 teški lanac. U određenim primerima, antigen vezujući proteini obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD ili IgM teški lanac. U određenim primerima, antigen vezujući proteini obuhvataju varijabilne regione antitela vezane za konstantni region koji nije ni konstantan region za IgG2 izotip, niti je konstantni region za IgG4 izotip. U određenim primerima, antigen vezujući proteini su klonirani radi ekspresije u sisarskim ćelijama.
[0218] U određenim primerima, konzervativne modifikacije teških i lakih lanaca antitela od najmanje jednog od linija hibridoma: 21B12, 31H4 i 16F12 (i odgovarajuće modifikacije za kodirajuće nukleotide) će produkovati antitela za PCSK9 koja imaju funkcionalne i hemijske karakteristike slične onima od antitela za linije hibridoma: 21B12, 31H4 i 16F12. Nasuprot tome, u određenim primerima, bitne modifikacije u funkcionalnim i/ili hemijskim karakteristikama antitela za PCSK9 mogu se obaviti putem selekcije supstitucija u aminokiselinskoj sekvenci teških i lakih lanaca koje se značajno razlikuju u njihovom efektu na održavanje (a) strukture molekularnog kostura u području supstitucije, na primer, kao pločasta ili spiralna konformacija, (b) naelektrisanja ili hidrofobičnosti molekula na ciljnom mestu, ili (c) mase bočnog lanca.
[0219] Na primer, „konzervativne supstitucije aminokiselina" mogu uključiti supstitucije nativnih ostataka aminokiseline sa ne-nativnim ostatkom tako da ima malo ili nema efekta na polaritet ili naelektrisanje ostataka aminokiseline na toj poziciji. Sem toga, bilo koji nativni ostatak u polipeptidu može takođe biti supstituisan sa alaninom, kao što je bilo prethodno opisano za „alanin skening mutagenezu“.
[0220] Željene supstitucije aminokiselina (bilo da su konzervativne ili ne-konzervativne) mogu se odrediti od strane stručnjaka u trenutku kada su takve supstitucije poželjne. U određenim primerima, supstitucije aminokiselina mogu se upotrebiti da se identifikuju važni ostaci od antitela za PCSK9, ili da se poveća ili smanji afinitet antitela za PCSK9 kao što je ovde opisano.
[0221] U određenim slučajevima, antitela pogodna za upotrebu prema ovom pronalasku mogu se eksprimirati u drugim ćelijskim linijama u odnosu na ćelijske linije hibridoma. U određenim primerima, sekvence koje kodiraju određena antitela mogu se uzeti za transformaciju pogodnih sisarskih ćelija domaćina. Prema određenim slučajevima, transformacija se može obaviti sa bilo kojim poznatim metodom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukovanje ćelije domaćina sa virusom (ili vektorom) ili putem procedura transfekcije poznate u oblasti, kao što je dato primerima u U.S. Pat. br. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455. U određenim slučajevima, procedura transformacije koja je upotrebljena zavisiće od domaćina koji treba da se transformiše. Metodi za uvođenje heterologih polipeptida u sisarske ćelije su dobro poznati u praksi i uključuju, ali nisu ograničeni na, transfekciju posredovanu sa dekstranom, taloženje kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu sa polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsulaciju polinukleotida u lipozomima, i direktnu mikroinjekciju DNK u jedro.
[0222] Sisarske ćelijske linije koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u oblasti i uključuju, ali nisu ograničene na, mnoge besmrtne ćelijske linije dostupne od American Type Culture Collection (ATCC), uključujući ali bez ograničenja na ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), i jedan broj drugih ćelijskih linija. U određenim primerima, ćelijske linije se mogu odabrati putem određivanja koja ćelijska linija ima više nivoe ekspresije i produkuje antitela sa konstitutivnim HGF karakteristikama vezivanja. Odgovarajući ekspresioni vektori za sisarske ćelije domaćine su dobro poznati.
[0223] U određenim slučajevima, antigen vezujući proteini kao što su ovde opisani obuhvataju jedan ili više polipeptida. U određenim slučajevima, bilo koji od mnoštva ekspresionih vektora/sistema domaćina može se upotrebiti da se eksprimiraju molekuli polinukleotida koji kodiraju polipeptide koji obuhvataju jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP. Takvi sistemi uključuju ali nisu ograničeni na, mikroorganizme, kao što su bakterije transformisane sa rekombinantnim bakteriofagom, plazmid, ili kozmid DNK ekspresione vektore; kvasac transformisan sa ekspresionim vektorima kvasca; ćelijske sisteme insekata inficirane sa ekspresionim vektorima virusa (npr., bakulovirus); biljne sisteme ćelija transfektovane sa ekspresionim vektorima virusa (npr., mozaični virus karfiola, CaMV, mozaični virus duvana, TMV) ili transformisan sa bakterijskim ekspresionim vektorima (npr., Ti ili pBR322 plazmid); ili životinjskim ćelijskim sistemima.
[0224] U određenim slučajevima, polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti, ili sam AVP, je rekombinantno eksprimiran u kvascu. Određeni, takvi slučajevi, koriste komercijalno dostupne ekspresione sisteme, npr., Pichia Expression System (Invitrogen, San Diego, CA), prateći uputstva proizvođača. U određenim slučajevima, takav sistem se zasniva na pre-pro-alfa sekvenci da usmeri sekreciju. U određenim slučajevima, transkripcija inserta je vođena sa promoterom alkohol oksidaze (AOX1) nakon indukcije sa metanolom.
[0225] U određenim slučajevima, izlučeni polipeptid obuhvata jednu ili više AVP komponenti ili je sam AVP prečišćen iz medijuma za rast kvasca. U određenim slučajevima, metodi koji su upotrebljeni da se prečiste polipeptidi iz medijuma za rast kvasca su isti kao oni koji su upotrebljeni da se prečiste polipeptidi iz bakterijskih i sisarskih supernatanta.
[0226] U određenim slučajevima, nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti, ili je sam AVP, je klonira u ekspresioni vektor bakulovirusa, kao što je pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). U određenim primerima, takav vektor se može upotrebiti u skladu sa uputstvima proizvođača (PharMingen) da se inficiraju ćelije Spodoptera frugiperda u sF9 medijum bez proteina i da se produkuje rekombinantni polipeptid. U određenim primerima, polipeptid je prečišćen i koncentrovan iz takvog medijuma upotrebom heparin-Sefaroza kolone (Pharmacia).
[0227] U određenim slučajevima, polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP je eksprimiran u insektskom sistemu. Određeni insektski sistemi za ekspresiju polipeptida su dobro poznati stručnjacima u oblasti. U jednom takvom sistemu, Autographa californica jedarni polihedrozis virus (AcNPV) je upotrebljen kao vektor da se eksprimiraju strani geni u ćelijama Spodoptera frugiperda ili u larvama Trichoplusia. U određenim primerima, molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid može se ubaciti u neesencijalni gen virusa, na primer, unutar polihedrin gena, i staviti pod kontrolu promotara za taj gen. U određenim primerima, uspešna insercija molekula nukleinske kiseline učiniće neesencijalni gen inaktivnim. U određenim primerima, ta inaktivacija rezultira detektabilnim karakteristikama. Na primer, inaktivacija polihedrin gena rezultira produkcijom virusa koji nemaju proteinski omotač.
[0228] U određenim slučajevima, mogu se upotrebiti rekombinantni virusi da se inficiraju ćelije S. frugiperda ili larve Trichoplusia. Vidi, npr., Smith i sar., J. Virol., 46: 584 (1983); Engelhard i sar., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 91: 3224-7 (1994).
[0229] U određenim slučajevima, polipeptidi koji obuhvataju jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP napravljen u bakterijskim ćelijama produkovani su kao nerastvorljiva inkluziona tela u bakterijama. U određenim slučajevima, ćelije domaćina koje obuhvataju takva inkluziona tela sakupljeni su centrifugiranjem; isprani u 0.15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA; i tretirani sa 0.1 mg/ml lizozima (Sigma, St. Louis, MO) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. U određenim slučajevima, lizat je izbistren sonikacijom, i ćelijski ostatak je istaložen centrifugiranjem tokom 10 minuta na 12000 X g. U određenim slučajevima, talog koji je sadržao polipeptid je resuspendovan u 50 mM Tris, pH 8, i 10 mM EDTA; izliven preko 50% glicerola; i centrifugiran tokom 30 minuta na 6000 X g. U određenim slučajevima, taj talog se može resuspendovati u standardnom fosfatnom puferizovanom slanom rastvoru (PBS) bez Mg<++>i Ca<++>. U određenim slučajevima, polipeptid je dalje prečišćen putem frakcionisanja resuspendovanog taloga u denaturišućem SDS poliakrilamid gelu (Vidi, npr., Sambrook i sar., supra). U određenim primerima, takav gel može se potopiti u 0.4 M KCl da se vizualizuje protein, koji se može iseći i elektroisprati u gel-tekućem puferu koji nema SDS. Prema određenim slučajevima, Glutamil-S-Transferaza (GST) fuzioni protein je produkovan u bakteriji kao rastvorljivi protein. U određenim slučajevima, takav GST fuzioni protein je prečišćen koristeći GST Purification Module (Pharmacia).
[0230] U određenim slučajevima, poželjno je da se „ponovo uviju" određeni polipeptidi, npr., polipeptidi koji obuhvataju jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP. U određenim primerima, takvi polipeptidi su produkovani koristeći određene rekombinantne sisteme diskutovane ovde. U određenim primerima, polipeptidi su „ponovo uvijeni" i/ili oksidisani da formiraju željenu tercijarnu strukturu i/ili da generišu disulfidne veze. U određenim slučajevima, takve strukture i/ili veze su vezane sa određenim biološkim aktivnostima polipeptida. U određenim slučajevima, ponovno uvijanje je ostvareno koristeći bilo koju od brojnih procedura poznatih u oblasti. Primerni metodi uključuju, ali nisu ograničeni na, izlaganje rastvorljivog polipeptidnog agensa do pH tipično iznad 7 u prisustvu haotropičnog agensa. Primerni haotropični agens je guanidin. U određenim slučajevima, rastvor za ponovno uvijanje/oksidaciju takođe sadrži redukcioni i oksidacioni oblik tog redukcionog agensa. U određenim slučajevima, redukcioni agens i njegov oksidacioni oblik prisutni su u odnosu koji će generisati određeni redoks potencijal koji omogućuje da se dogodi disulfidno pomeranje. U određenim slučajevima, takvo pomeranje uključuje formiranje cisteinskih mostova. Primerni redoks parovi uključuju, ali nisu ograničeni na, cistein/cistamin, glutation/ditiobisGSH, bakar hlorid, ditiotreitol DTT/ditian DTT, i 2-merkaptoetanol (bME)/ditio-bME. U određenim slučajevima, upotrebljen je korastvarač da se poveća efikasnost ponovnog uvrtanja. Primerni korastvarači uključuju, ali nisu ograničeni na, glicerol, polietilen glikol različitih molekulskih težina, i arginin.
[0231] U određenim slučajevima, neko gotovo u potpunosti prečišćava polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP. Određene tehnike prečišćavanja proteina poznate su stručnjacima u oblasti. U određenim slučajevima, prečišćavanje proteina uključuje sirovo frakcionisanje polipeptidnih frakcija iz ne-polipeptidnih frakcija. U određenim primerima, polipeptidi su prečišćeni koristeći hromatografiju i/ili elektroforetske tehnike. Primerni metodi prečišćavanja uključuju, ali nisu ograničeni na, taloženje sa amonijum sulfatom; taloženje sa PEG; imuno taloženje; toplotnu denaturaciju praćenu sa centrifugiranjem; hromatografiju, uključujući, ali bez ograničenja na, afinitetnu hromatografiju (npr., Protein-A-Sefaroza), jono izmenjivačku hromatografiju, ekskluzionu hromatografiju, i hromatografiju reverzne faze; gel filtraciju; hidroksiapatitnu hromatografiju; izoelektrično fokusiranje; poliakrilamidnu gel elektroforezu; i kombinacije takvih i drugih tehnika. U određenim slučajevima, polipeptid je prečišćen sa brzom hromatografijom tečnog proteina ili sa tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom (HPLC). U određenim primerima, koraci prečišćavanja mogu se promeniti ili se određeni koraci mogu izostaviti, a da to rezultira još uvek pogodnim metodom za preparaciju gotovo u potpunosti prečišćenog polipeptida.
[0232] U određenim slučajevima, neko kvantifikuje stepen prečišćavanja preparata polipeptida. Određeni metodi za kvantifikovanje stepena prečišćavanja poznati su stručnajku. Određeni primerni metodi uključuju, ali nisu ograničeni na, određivanje specifične aktivnosti vezivanja preparata i procenjivanje količine polipeptida u preparaciji sa SDS/PAGE analizom. Određeni primerni metodi za procenu količine prečišćavanja polipeptidne preparcije obuhvataju izračunavanje aktivnosti vezivanja preparata i poređenje aktivnosti vezivanja inicijalnog ekstrakta. U određenim primerima, rezultati takvog izračunavanja su izneti kao „savijeno prečišćavanje." Jedinice koje su upotrebljene da se predstavi količina aktivnosti vezivanja zavise od određenog ogleda koji je izveden.
[0233] U određenim slučajevima, polipeptid koji obuhvata jednu ili više AVP komponenti ili sam AVP je delimično prečišćen. U određenim slučajevima, delimično prečišćavanje može se obaviti korišćenjem manje koraka prečišćavanja ili korišćenjem različitih oblika iste opšte šeme prečišćavanja. Na primer, u određenim slučajevima, katjon-izmenjivačka kolonska hromatografija izvedena koristeći HPLC aparat će generalno rezultirati u većem „savujajućem prečišćavanju" nego kad ista tehnika koristi sistem hromatografije niskog-pritiska. U određenim slučajevima, metodi koji rezultiraju nižim stepenom prečišćavanja mogu biti korisni u totalnom obnavljanju polipeptida, ili u održavanju aktivnosti vezivanja peptida.
[0234] U određenim slučajevima, elektroforetska migracija polipeptida može varirati, nekad značajno, u okviru različitih uslova SDS/PAGE. Vidi, npr., Capaldi i sar., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425 (1977). Biće shvaćeno da pod različitim uslovima elektroforeze, očigledne molekulske težine prečišćenog ili delimično prečišćenog polipeptida mogu biti različite.
Primerni epitopi
[0235] Ovde su opisani epitopi za koje se anti-PCSK9 antitela vezuju. U nekim slučajevima, epitopi koji su vezani za antitela pronalaska su posebno korisni. U nekim slučajevima, korisni su antigen vezjući proteini koji se vezuju za bilo koji od epitopa koji su vezani za ovde opisana antitela. U nekim slučajevima, posebno su korisni epitopi vezani sa bilo kojim od antitela pobrojanih u Tabeli 2 i FIG. 2 i 3. U nekim slučajevima, epitop je jedan od katalitičkih domena PCSK9.
[0236] U određenim slučajevima, PCSK9 epitop može se upotrebiti da se spreči (npr., redukuje) vezivanje anti-PCSK9 antitela ili antigen vezujućeg proteina za PCSK9. U određenim slučajevima, PCSK9 epitop može se upotrebiti da smanji vezivanje anti-PCSK9 antitela ili antigen vezujućeg proteina za PCSK9. U određenim slučajevima, PCSK9 epitop može se upotrebiti da gotovo u potpunosti inhibira vezivanje anti-PCSK9 antitela ili antigen vezujućeg proteina za PCSK9.
[0237] U određenim slučajevima, PCSK9 epitop može se upotrebiti da izoluje antitela ili antigen vezujuće proteine koji se vezuju za PCSK9. U određenim slučajevima, PCSK9 epitop može se upotrebiti da generiše antitela ili antigen vezujuće proteine koji se vezuju za PCSK9. U određenim primerima, PCSK9 epitop ili sekvenca koja obuhvata PCSK9 epitop može se upotrebiti kao imunogen da generiše antitela ili antigen vezujuće proteine koji se vezuju za PCSK9. U određenim slučajevima, PCSK9 epitop može se davati životinji, i antitela koja se vezuju za PCSK9 se nakon toga mogu dobiti iz životinje. U određenim slučajevima, PCSK9 epitop, ili sekvenca koja obuhvata PCSK9 epitop, mogu se upotrebiti da interferiraju sa normalnom PCSK9-posredovanom aktivnošću, kao što je vezivanje PCSK9 sa LDLR.
[0238] U nekim slučajevima, antigen vezujući proteini otkriveni ovde vezuju se specifično za N-terminalni prodomen, subtilizin-nalik katalitičkom domenu i/ili C-terminalnom domenu. U nekim primerima, antigen vezujući protein vezuje se za supstrat-vezujuće udubljenje od PCSK-9 (opisano u Cunningham i sar.).
[0239] U nekim slučajevima, domen(i)/region(i) koji sadrže ostatke koji su u kontaktu sa ili su zatrpani od strane antitela mogu se identifikovati putem mutiranja specifičnih ostataka u PCSK9 (npr., antigen divljeg tipa) i odrediti da li antigen vezujući protein može da veže mutirani ili varijantu PCSK9 proteina. Putem pravljenja jednog broja pojedinačnih mutacija, mogu se identifikovati ostaci koji imaju direktnu ulogu u vezivanju ili koji su dovoljno blizu antitelu tako da mutacija može uticati na vezivanje između antigen vezujućeg proteina i antigena. Na osnovu znanja o tim aminokiselinama, domen(i) ili region(i) antigena koji sasdrže ostatke u kontaktu sa antigen vezujućim proteinom ili pokrivene sa antitelom mogu se razjasniti. Takav domen može uključiti vezivanje epitopa antigen vezujućeg proteina. Jedan specifični primer ovog generalnog pristupa koristi arginin/glutaminska kiselina protokol skeniranja (vidi, npr., Nanevicz, T., i sar., 1995, J. Biol. Chem., 270:37, 21619-21625 i Zupnick, A., i sar., 2006, J. Biol. Chem., 281:29, 20464-20473). Generalno, arginin i glutaminske kiseline su supstituisani sa (tipično pojedinačno) aminokiselinom u polipeptidu divljeg tipa zato što su te aminokiseline naelektrisane i ogromne i, prema tome, imaju potencijal da raskinu vezivanje između antigen vezujućeg proteina i antigena u regionu antigena, gde je uvedena mutacija. Arginini koji postoje u antigenu divljeg tipa su zamenjeni sa glutaminskom kiselinom. Dobijeno je mnoštvo takvih pojedinačnih mutanata i sakupljeni rezultati vezivanja su analizirani da se odredi koji ostaci deluju na vezivanje.
[0240] Primer 39 opisuje jedno takvo skeniranje arginin/glutaminske kiseline PCSK9 za PCSK9 antigen vezujuće proteine koji su ovde obezbeđeni. Serija mutantnih PCSK9 antigena je kreirana, tako da svaki mutantni antigen ima pojednačnu mutaciju. Vezivanje svakog mutantnog PCSK9 antigena sa različitim PCSK9 AVP je mereno i poređeno sa sposobnošću odabranih AVP da vezuju divlji tip PCSK9 (SEQ ID NO: 303).
[0241] Izmena (na primer, redukcija ili povećanje) u vezivanju između antigen vezujućeg proteina i varijante PCSK9, onako kako je ovde upotrebljena, znači da postoji promena u afinitetu vezivanja (npr., kao što je mereno poznatim metodama kao što je Biacore testiranje ili ogled zasnovan na perlici opisan dole u primerima), EC50, i/ili naelektrisanje (na primer, redukcija) u ukupnom kapacitetu vezivanja antigen vezujućeg proteina (na primer, kao što je evidentirano sa smanjenjem u Bmax u plotu koncentracija antigen vezujućeg proteina u odnosu na koncentraciju antigena). Značajna izmena u vezivanju označava da je mutirani ostatak direktno uključen u vezivanje za antigen vezujući protein, ili je u neposrednoj blizini vezanom proteinu, kada je vezujući protein vezan za antigen.
[0242] U nekim primerima, značajna redukcija u vezivanju znači da je afinitet vezivanja, EC50, i/ili kapacitet između antigen vezujućeg proteina i mutantnog PCSK9 antigena redukovan za više od 10%, više od 20%, više od 40 %, više od 50 %, više od 55 %, više od 60 %, više od 65 %, više od 70 %, više od 75 %, više od 80 %, više od 85 %, više od 90% ili više od 95% u odnosu na vezivanje između antigen vezujućeg proteina i divljeg tipa PCSK9 (npr., prikazano u SEQ ID NO: 1 i/ili SEQ ID NO: (303). U određenim primerima, vezivanje je redukovano ispod detektabilnih ograničenja. U nekim primerima, značajna redukcija u vezivanju je evidentirana kada je vezivanje antigen vezujućeg proteina za varijantu PCSK9 proteina imanje od 50% (na primer, manje od 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% ili 10%) od vezivanja zapaženog između antigen vezujućeg proteina i divljeg tipa PCSK9 proteina (na primer, protein od SEQ ID NO: 1 i/ili SEQ ID NO: (303). Takvo merenje vezivanja može se obaviti koristeći mnoštvo ogleda vezivanja poznatih u oblasti. Specifičan primer jednog takvog ogleda je opisan u Primeru 39.
[0243] U nekim primerima, obezbeđeni su antigen vezujući proteini koji pokazuju značajno niže vezivanje za varijantu PCSK9 proteina u kojem je ostatak u divljem tipu PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303 supstituisan sa argininom ili glutaminskom kiselinom. U nekim primerima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano ili povećano za varijantu PCSK9 proteina koja ima bilo koju, ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili 244) od sledećih mutacija: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, i Q554R u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U kratkoj napomeni upotrebljenoj ovde, format je: ostatak divljeg tipa: pozicija u polipeptidu: mutantni ostatak, sa numerisanjem ostataka kao što je naznačeno u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303.
[0244] U nekim slučajevima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, ili više) mutacija na sledećim pozicijama: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim primerima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano, ili povećano, za mutant PCSK9 koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, ili više) mutacija na sledećim pozicijama: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303). U nekim slučajevima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je gotovo u potpunosti redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, ili više) mutacija na sledećim pozicijama: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554, u okviru SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303.
[0245] U nekim slučajevima, vezivanje AVP je značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, itd.) od sledećih mutacija: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, i Q554R u okviru SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303, u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303).
[0246] U nekim slučajevima, vezivanje AVP je značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, itd.) od sledećih mutacija: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, i E582R u okviru SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303, u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303). U nekim slučajevima, vezivanje je redukovano. U nekim primerima, zapažena je redukcija u vezivanju kao promena u EC50. U nekim slučajevima, promena u EC50 je povećanje numeričke vrednosti EC50 (i, prema tome, smanjenje vezivanja).
[0247] U nekim slučajevima, vezivanje AVP je značajno redukovano ili povećano za mutant PCSK9 proteina koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, itd.) od sledećih mutacija: D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, i Q554R u okviru SEQ ID NO: 1, u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303). U nekim primerima, vezivanje je redukovano. U nekim slučajevima, redukcija u vezivanju je zapažena kao promena u Bmax. U nekim slučajevima, pomak u Bmax je redukcija maksimalnog signala generisanog sa AVP. U nekim slučajevima, da bi aminokiselina bila deo epitopa, Bmax je redukovan za najmanje 10%, na primer, redukcija na bilo koju od sledećih količina: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, ili 100 procenata može, u nekim primerima, naznačiti da je ostatak ili njegov deo epitop.
[0248] Iako su varijantni oblici koji su samo nabrojani izneti u odnosu na divlji tip sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303, biće prihvaćeno da u alelskoj varijanti PCSK9 aminokiselina na identičnoj poziciji može da se razlikuje. Antigen vezujući proteini koji pokazuju značajno niže vezivanje za takve alelske oblike PCSK9 su takođe predviđeni. Shodno tome, u nekim slučajevima, bilo koje od gornjih varijanti može se uporediti sa alelskom sekvencom, pre nego sa čistom sekvencom divljeg tipa prikazanoj na FIG.1A.
[0249] U nekim slučajevima, vezivanje antigen vezujućeg proteina je značajno redukovano za varijantu PCSK9 proteina u kojoj je ostatak na odabranoj poziciji u divljem tipu PCSK9 proteina mutiran u bilo koji drugi ostatak. U nekim slučajevima, ovde opisane zamene arginin/glutaminska kiselina upotrebljene su da se identifikuju pozicije. U nekim slučajevima, alanin je upotrebljen da se identifikuju pozicije.
[0250] Kao što je zabeleženo gore, ostaci direktno uključeni u vezivanje, ili pokriveni antigen vezujućim proteinom mogu se identifikovati iz rezultata skeniranja. Ovi ostaci mogu, prema tome, obezbediti naznaku za regione domena od SEQ ID NO: 1 (ili SEQ ID NO: 303 ili SEQ ID NO: 3) koji sadrže region(e) vezivanja za koji se antigen vezujući proteini vezuju. Kao što se može videti iz rezultata sumarizovanih u Primeru 39, u nekim primerima antigen vezujući protein vezuje se za domen koji sadrži najmanje jednu od aminokiselina: 207, 208, 185, 181, 439, 132, 351, 390, 413, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313 i 337 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim primerima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od aminokiselina 207, 208, 185, 181, 439, 132, 351, 390, 413, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313 i 337 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303.
[0251] U nekim primerima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od aminokiselina 162, 164, 167, 207 i/ili 208 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim primerima, više nego jedan (npr., 2, 3, 4, ili 5) od identifikovanih ostataka su deo regiona koji je vezan sa AVP. U nekim primerima, AVP je u kompeticiji sa AVP 21B12.
[0252] U nekim primerima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od aminokiselina 185 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim primerima, AVP je u kompeticiji sa AVP 31H4.
[0253] U nekim primerima, antigen vezujući protein vezuje se za region koji sadrži najmanje jednu od aminokiselina 123, 129, 311, 313, 337, 132, 351, 390, i/ili 413 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim primerima, više nego jedan (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili 9) od identifikovanih ostataka je deo regiona koji se vezuje sa AVP. U nekim primerima, AVP je u kompeticiji sa AVP 12H11.
[0254] U nekim primerima, antigen vezujući protein se vezuje za gore pomenute regione u okviru fragmenta ili pune dužine sekvence od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U drugim primerima, antigen vezujući proteini vezuju se za polipeptide koji se sastoje od tih regiona. Pozivanje na „SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303" označava da jedna ili obe od tih sekvenci mogu biti upotrebljene ili relevantne. Fraza ne naznačava da samo jedna treba da bude upotrebljena.
[0255] Kao što je primećeno gore, gornje opisne napomene su specifične za pozicije aminokiselina za pozivom na SEQ ID NO: 1. Međutim, generalno kroz prijavu, napomene su napravljene za Pro/Cat domen koji počinje na poziciji 31, koji je obezbeđen u SEQ ID NO: 3. Kao što je dole naznačeno, SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 303 nemaju signalnu sekvencu PCSK9. Kao takvo, bilo kakvo poređenje između tih različitih otkrića mora uzeti u obzir tu razliku u numerisanju. Konkretno, bilo koja pozicija aminokiseline u SEQ ID NO: 1, će odgovarati poziciji aminokiseline 30 aminokiselina dalje u proteinu u SEQ ID NO: 3. Na primer, pozicija 207 iz SEQ ID NO: 1, odgovara poziciji 237 iz SEQ ID NO: 3 (puna dužina sekvence, i sistem numerisanja upotrebljen u predmetnom pronalasku generalno). Tabela 39.6 ističe kako gore pomenute pozicije, koje se odnose na SEQ ID NO: 1 (i/ili SEQ ID NO: 303) odgovaraju SEQ ID NO: 3 (koji uključuje signalnu sekvencu). Prema tome, bilo koje od gore pomenutih primera koji su opisani u odnosu na SEQ ID NO: 1 (i/ili SEQ ID NO: 303), opisani su u vezi sa SEQ ID NO: 3, prema pomenutim odgovarajućim pozicijama.
[0256] U nekim primerima, AVP 21B12 se vezuje za epitop uključujući ostatke 162-167 (npr., ostatke D162-E167 od SEQ ID NO: 1). U nekim primerima, AVP 12H11 se vezuje za epitop koji uključuje ostatke 123-132 (npr., S123-T132 od SEQ ID NO: 1). U nekim primerima, AVP 12H11 se vezuje za epitop koji uključuje ostatke 311-313 (npr., A311-D313 od SEQ ID NO: 1). U nekim primerima, AVP se mogu vezati za epitop koji uključuje bilo koji od tih lanaca sekvenci.
Kompeticioni antigen vezujući proteini
[0257] Ovde su takođe opisani antigen vezujući proteini koji su u kompeticiji sa jednim od primernih antitela ili funkcionalnih fragmenata koji se vezuju za epitop ovde opisan za specifično vezivanje za PCSK9. Takvi antigen vezujući proteini mogu se takođe vezati za isti epitop kao jedan od ovde datih primerom antigen vezujućih proteina, ili preklapajući epitop. Za antigen vezujuće proteine i fragmente koji su u kompeticiji sa, ili se vezuju za isti epitop, kao primerni antigen vezujući proteini očekivano je da pokazuju slične funkcionalne karakteristike. Primerni antigen vezujući proteini i fragmenti uključuju one opisane gore, uključujući one sa teškim i lakim lancima, domenima varijabilnog regiona i CDR uključene u TABELU 2 i/ili FIG.
2-3 i 15. Prema tome, kao specifičan primer, antigen vezujući proteini koji su opisani ovde uključuju one koji su u kompeticiji sa antitelom ili antigen vezujućim proteinom koji ima:
(a) svih 6 od CDR pobrojanih za antitelo nabrojano u FIG.2-3 i 15;
(b) VH i VL pobrojanih za antitelo nabrojano u Tabeli 2; ili
(c) dva laka lanca i dva teška lanca kao što je određeno za antitelo nabrojano u Tabeli 2. Određene terapeutske upotrebe i farmaceutske kompozicije
[0258] U određenim primerima, PCSK9 aktivnost je u korelaciji sa jednim brojem humanih bolesnih stanja. Na primer, u određenim primerima, previše ili premalo PCSK9 aktivnosti je u korelaciji sa određenim stanjima, kao što je hiperholesterolemija. Prema tome, u određenim slučajevima, modulirajuća aktivnost PCSK9 može biti terapeutski korisna. U određenim primerima, neutralizujući antigen vezujući protein za PCSK9 upotrebljen je da se moduliše najmanje jedna PCSK9 aktivnost (npr., vezivanje za LDLR). Takvim se postupcima mogu tretirati i/ili soprečiti i/ili redukovati rizik od poremećaja koji su u vezi sa povišenim nivoima holesterola u serumu ili u kojima su značajni povišeni nivoi holesterola.
[0259] Kao što će biti očigledno stručnjaku, u svetlu predmetnog pronalaska, poremećaji koji se odnose na, uključuju, ili mogu biti pod uticajem variranja holesterola, LDL, ili LDLR nivoa mogu se tretirati različitim primerima antigen vezujućih proteina. U nekim primerima, „poremećaj vezan za holesterol" (koji uključuje „poremećaje vezane za holesterol u serumu") uključuje bilo koji ili više od sledećih: hiperholesterolemiju, srčane bolesti, metaboličke sindrome, dijabetes, koronarne srčane bolesti, šlog, kardiovaskularne bolesti, Alchajmerovu bolest i generalnu dislipidemiju, koje se mogu manifestovati, na primer, sa povišenim ukupnim holesterolom u serumu, povišenim LDL, povišenim trigliceridima, povišenim VLDL, i/ili nižim HDL. Neki neograničavajući primeri primarnih i sekundarnih dislipidemija koje se mogu tretirati koristeći AVP, bilo samog, bilo u kombinaciji sa jednim ili više drugih agenasa uključuju metabolički sindrom, dijabetes melitus, porodičnu kombinovanu hiperlipidemiju, porodičnu hipertrigliceridemiju, porodične hiperholesterolemije, uključujući heterozigotnu hiperholesterolemiju, homozigotnu hiperholesterolemiju, porodični defektivni apoplipoprotein B-100; poligensku hiperholesterolemiju; bolest uklanjanja ostatka, hepatičnu deficijenciju lipaze; dislipidemiju sekundarnu u odnosu na bilo koju od sledećih: dijetarnu indiskreciju, hipotiroidizam, lekove uključujući estrogensku i progestinsku terapiju, beta-blokere i tiazid diuretike; nefrotični sindrom, hronično otkazivanje bubrega, Kušing-ov sindrom, primarni biliarni cirozis, bolest čuvanja glikogena, hepatom, holestazis, akromegalija, insulinom, deficijencija izolovanog hormona rasta i alkohol-indukovanu hipertrigliceridemiju. AVP može takođe biti koristan u sprečavanju ili tretiranju bolesti ateroskleroze, kao što su, na primer, koronarne bolesti srca, bolest koronarne arteruje, bolest periferne arterije, šlog (ishaemični i hemoragični), angina pektoris, ili cerebrovaskularne bolesti i akutni koronarni sindrom, infarkt miokarda. U nekim primerima, AVP je koristan u redukovanju rizika od: nefatalnog srčanog napada, fatalnog i nefatalnog šloga, određenih tipova hirurgije srca, hospitalizacije zbog otkazivanja srca, bola u grudima kod pacijenata sa bolestima srca, i/ili kardiovaskularnih događaja zbog ustanovljavanja bolesti srca kao što je pre srčanog udara, pre hirurgije srca, i/ili bola u grudima sa dokazima zapušenih arterija. U nekim primerima, AVP i postupci se mogu upotrebiti da se redukuje rizik od povratka kardovaskularnih događaja.
[0260] Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, bolesti ili poremećaji koji se generalno razmatraju (ili zbog tretiranja ili zbog preventive) kroz upotrebu statina mogu takođe imati koristi od primene instant antigen vezujućih proteina. Sem toga, u nekim primerima, poremećaji ili bolesti koji mogu imati koristi od prevencije sinteze holesterola ili povećne ekspresije LDLR mogu se takođe tretirati različitim primerima antigen vezujućih proteina. Sem toga, kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka u oblasti, upotreba anti-PCSK9 antitela može biti posebno korisna u tretmanu dijabetesa. Nije samo dijabetes faktor rizika za koronarnu bolest srca, već insulin povećava ekspresiju PCSK9. To znači da, ljudi sa dijabetesom imaju podignute nivoe lipida u plazmi (što može biti vezano sa visokim nivoima PCSK9) i mogu imati koristi od snižavanja tih nivoa. To je generalno diskutovano mnogo detaljnije u Costet i sar. („Ekspresija hepatičnog PCSK9 je regulisana putem nutricionog statusa preko sterol regulatornih elementvezujućih proteina 1C", J. Biol. Chem., 281: 6211-6218, 2006).
[0261] U nekim slučajevima, antigen vezujući protein je davan onima koji imaju diabetes melitus, abdominalni aortni aneurizam, aterosklerozis i/ili perifernu vaskularnu bolest sa ciljem da se smanje nivoi holesterola u serumu do sigurnijeg raspona. U nekim primerima, antigen vezujući protein je davan pacijentima koji su pod rizikom da razviju bilo koji od ovde pomenutih poremećaja. U nekim primerima, AVP se daju subjektima koji puše, imaju hipetenziju ili porodičnu istoriju ranih srčanih napada.
[0262] U nekim primerima, subjektima se daje AVP ako imaju umeren rizik ili viši od 2004 NCEP ciljeva tretmana. U nekim primerima, subjektima se daje AVP ako je subjektov nivo LDL holesterola više od 160 mg/dl. U nekim primerima, AVP se daje ako je subjektov nivo LDL holesterola viši od 130 (i oni imaju umereni ili srednje visok rizik prema 2004 NCEP ciljevima tretmana). U nekim ostvarenjima, AVP se daje ako je subjektov nivo LDL holesterola viši od 100 (i oni imaju visok ili vrlo visok rizik prema 2004 NCEP ciljevima tretmana).
[0263] Lekar će biti u stanju da odabere odgovarajuće naznake za tretman i ciljne nivoe lipida u zavisnosti od individualnog profila određenog pacijenta. Jedan dobro-prihvaćeni standard za vođenje tretmana hiperlipidemije je Treći izveštaj nacionalnog edukacionog programa za holesterol (NCEP) Ekspertski panel na detekciji, evaluaciji, i treatmanu visokog krvnog holesterola kod odraslih (Adult Treatment Panel III) Konačni izveštaj, National Institutes of Health, NIH Publication br.02-5215 (2002).
[0264] U nekim primerima, antigen vezujući proteini za PCSK9 su upotrebljeni da se smanji količina aktivnosti PCSK9 od abnormalno visokog nivoa ili čak normalnog nivoa. U nekim primerima, antigen vezujući proteini za PCSK9 su upotrebljeni da se tretira ili spreči hiperholesterolemija i/ili u pripremanju medikamenata za to i/ili za druge poremećeje vezane sa holesterolom (kao što su oni koji su zabeleženi ovde). U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9 je upotrebljen da se tretiraju ili spreče stanja kao što je hiperholesterolemija u kojoj je aktivnost PCSK9 normalna. U takvim stanjima, na primer, redukcija aktivnosti PCSK9 do ispod normalnog može obezbediti terapeutski efekt.
[0265] U nekim primerima, više nego jedan antigen vezujući protein za PCSK9 je upotrebljen da se moduliše aktivnost PCSK9.
[0266] U određenim primerima, opisani su postupci za lečenje poremećaja povezanog sa holesterolom, kao što je hiperholesterolemija, koji obuhvataju davanje terapeutski efektivne količine jednog ili više antigen vezujućih proteina za PCSK9 i drugog terapeutskog agensa.
[0267] U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje sam. U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje pre davanja najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje konkurentno sa davanjem najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje uzastopno sa davanjem najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. U drugim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9 se daje pre davanja najmanje jednog drugog terapeutskog agensa. Terapeutski agensi (osim od antigen vezujućih proteina), uključuju, ali nisu ograničeni na, najmanje jedan drugi holesterolsnižavajući (serum i/ili ukupni telesni holesterol) agens ili izvesni agens. U nekim primerima, za agens koji povećava ekspresiju LDLR, zapaženo je da povišava nivoe HDL u serumu, snižava nivoe LDL ili snižava nivoe triglicerida. Primerni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, statine (atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rozuvastatin, simvastatin), nikotinska kiselina (Niacin) (NIACOR, NIASPAN (sporo oslobađajući niacin), SLO-NIACIN (sporo oslobađajući niacin)), Fibrična kiselina (LOPID (Gemfibrozil), TRICOR (fenofibrat), Bile kiselina sekvestranti (QUESTRAN (holestiramin), kolesevelam (WELCHOL), COLESTID (colestipol)), inhibitori apsorpcije holesterola (ZETIA (ezetimib)), kombinovana nikotinska kiselina sa statinom (ADVICOR (LOVASTATIN i NIASPAN), kombinovani statin sa inhibitorom apsorpcije (VYTORIN (ZOCOR i ZETIA) i/ili lipid modifikujući agens. U nekim primerima, AVP je kombinovan sa PPAR gama agonstima, PPAR alfa/gama agonisti, inhibitori skvalen sintaze, CETP inhibitori, anti-hipertenzivi, antidijabetički agensi (kao što su sulfonil uree, insulin, GLP-1 analozi, DDPIV inhibitori), ApoB modulatori, MTP inhibitori i/ili tretmani obliteralne arterioskleroze. U nekim primerima, AVP je kombinovan sa agensom koji povišava nivo LDLR proteina kod subjekta, kao što su statini, određeni citokini kao što je onkostatin M, estrogen, i/ili određeni biljni sastojci kao što je berberin. U nekim primerima, AVP je kombinovan sa agensom koji povišava nivoe holesterola u serumu kod subjekta (kao što su određeni anti-psihotički agensi, određeni inhibitori HIV proteaze, faktori ishrane kao što je visoka fruktoza, saharoza, holesterol ili određene masne kiseline i određeni jedarni receptor agonisti i antagonisti za RXR, RAR, LXR, FXR). U nekim primerima, AVP je kombinovan sa agensom koji povišava nivo PCSK9 kod subjekta, kao što su statin i/ili insulin. Kombinacija ova dva može omogućiti da neželjeni sporedni efekti drugih agensa budu umanjeni sa AVP. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, u nekim primerima, AVP je kombinovan sa drugim agensom/jedinjenjem. U nekim primerima, AVP i drugi agens se daju konkurentno. U nekim primerima, AVP i drugi agens se ne daju istovremeno, sa AVP koji se daje pre ili nakon davanja agensa. U nekim primerima, subjekat prima i AVP i drugi agens (koji povišava nivo LDLR) tokom istog perioda prevencije, javljanja poremećaja, i/ili perioda lečenja.
[0268] Farmaceutske kompozicije kao što su opisane ovde mogu se davati u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovano sa drugim agensima. U određenim primerima, kombinovana terapija obuhvata antigen vezujući protein sposoban za vezivanje PCSK9 pogodan za upotrebu prema ovom pronalasku, u kombinaciji sa najmanje jednim antiholesterolskim agensom. Agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, in vitro sintetički pripremljene hemijske kompozicije, antitela, antigen vezujuće regione, i njihove kombinacije i konjugate. U određenim primerima, agens može delovati kao agonist, antagonist, alosterični modulator, ili toksin. U određenim primerima, agens može delovati tako da inhibira ili stimuliše svoju metu (npr., aktivacija ili inhibicija receptora ili enzima), i tako podstiče povećanu ekspresiju LDLR ili smanjuje nivoe holesterola u serumu.
[0269] U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se davati pre, u konkurenciji sa, konkurentno sa, i nakon tretmana sa agensom koji snižava holesterol (serumski i/ili ukupni holesterol). U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se davati profilaktički da se spreči ili umanji razvoj hiperholesterolemije, bolesti srca, dijabetesa, i/ili bilo kojeg od poremećaja vezanih sa holesterolom. U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9 može se davati za tretman postojećeg stanja hiperholesterolemije. U nekim primerima, AVP odlaže početak poremećaja i/ili simptoma vezanih sa poremećajem. U nekim primerima, AVP je obezbeđen subjektu kojem nedostaju bilo kakvi simptomi bilo kojeg poremećaja vezanih za holesterol ili njihov podskup.
[0270] U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9 je upotrebljen sa određenim terapeutskim agensima da se tretiraju različiti poremećaji vezani za holesterol, kao što je hiperholesterolemija. U određenim primerima, u svetlu stanja i željenog nivoa tretmana, mogu se davati dva, tri ili više agenasa. U određenim primerima, takvi agensi se mogu obezbediti zajedno sa inkluzijom u istoj formulaciji. U određenim primerima, takav agens(i) i antigen vezujući protein za PCSK9 mogu se obezbediti zajedno sa inkluzijom u istoj formulaciji. U određenim primerima, takav agens se može formulisati odvojeno i obezbediti zajedno sa inkluzijom u kitu za tretman. U određenim primerima, takvi agensi i antigen vezujući proteini za PCSK9 mogu se formulisati odvojeno i obezbediti zajedno sa inkluzijom u kitu za tretman. U određenim primerima, takvi agensi se mogu obezbediti odvojeno. U određenim primerima, kada se daju putem genske terapije, geni koji kodiraju proteinske agense i/ili antigen vezujući protein za PCSK9 mogu se uključiti u isti vektor. U određenim primerima, geni koji kodiraju proteinske agense i/ili antigen vezujući protein za PCSK9 mogu biti pod kontrolom istog promotorskog regiona. U određenim primerima, geni koji kodiraju proteinske agense i/ili antigen vezujući protein za PCSK9 mogu biti u odvojenim vektorima.
[0271] Ovde su takođe obezbeđene farmaceutske kompozicije koje obuhvataju antigen vezujući protein za PCSK9 pogodan za upotrebu prema ovom pronalasku zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem, rastvaračem, emulgatorom, sredstvom za čuvanje i/ili adjuvansom.
[0272] Takođe su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje obuhvataju antigen vezujući protein za PCSK9 pogodan za upotrebu prema ovom pronalasku i terapeutski efektivnu količinu najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem, rastvaračem, emulgatorom, sredstvom za čuvanje i/ili adjuvansom.
[0273] Antigen vezujući protein za PCSK9 pogodan za upotrebu prema ovom pronalasku može se upotrebiti sa najmanje jednim terapeutskim agensom za zapaljenja. Antigen vezujući protein za PCSK9 pogodan za upotrebu prema ovom pronalasku može se upotrebiti sa najmanje jednim terapeutskim agensom za imuni poremećaj. Primerni terapeutski agensi za zapaljenja i imune poremećaje uključuju, ali nisu ograničeni na, ciklooksigenazu tipa 1 (COX-1) i ciklooksigenazu tipa 2 (COX-2) inhibitore malih molekula modulatora od 38 kDa mitogen-aktivirane protein kinaze (p38-MAPK); male molekule modulatore intraćelijskih molekula uključenih u zapaljenske puteve, pri čemu takvi intraćelijski molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na, jnk, IKK, NF-κB, ZAP70, i lck. Određeni primerni terapeutski agensi za zapaljenja su opisani, npr., u C.A. Dinarello & L.L. Moldawer Prozapaljenski i antizapaljenski citokini u reumatoidnom artritisu: Primeri za kliničare Treće izdanje (2001) Amgen Inc. Thousand Oaks, CA.
[0274] U ovom kontekstu, u određenim slučajevima, farmaceutske kompozicije mogu uključivati više od jednog različitog antigen vezujućeg proteina za PCSK9. U određenim slučajevima, farmaceutske kompozicije će uključiti više od jednog različitog antigen vezujućeg proteina za PCSK9, pri čemu antigen vezujući proteini za PCSK9 vezuju više od jednog epitopa. U nekim slučajevima, različiti antigen vezujući proteini neće biti u komprticiji sa nekim drugim za vezivanja za PCSK9. U nekim slučajevima, bilo koji antigen vezujući proteini prikazani u Tabeli 2 i FIG.2 i/ili 3 mogu se kombinovati zajedno u farmaceutskim kompozicijama kao što su ovde opisane.
[0275] Prihvatljivi materijali za formulaciju poželjno su netoksični za primaoce u upotrebljenim dozama i koncentracijama. U nekim slučajevima, formulacioni materijal(i) su za s.c. i/ili I.V. davanje. U određenim primerima, farmaceutska kompozicija može sadržati formulacione materijale za modifikovanje, održavanje ili čuvanje, na primer, pH, osmoznost, viskoznost, bistrina, boja, izotoničnost, miris, sterilnost, stabilnost, stopa rastvaranja ili oslobađanja, apsorpcija ili prodiranje kompozicije. U određenim primerima, pogodni formulacioni materijali uključuju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobijalne agense; antioksidanse (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogensulfit); pufere (kao što su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline); agense povećanja mase (kao što su manitol ili glicin); helatirajuće agense (kao što su etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); agense kompleksovanja (kao što su kafein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin); popunjivače; monosaharide; disaharide; i druge ugljovodonike (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); proteine (kao što su serum albumin, želatin ili imunoglobulini); agense za bojenje, ukus i razblaživanje; agense za emulzifikovanje; hidrofilne polimere (kao što je polivinilpirolidon); polipeptide niže molekulske težine; kounterione koji formiraju soli (kao što je natrijum); sredstva za čuvanje (kao što su benzalkonijum hlorid, benzoična kiselina, salicilna koselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbična koselina ili vodonik peroksid); rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerne alkohole (kao što su manitol ili sorbitol); agense za suspendovanje; površinska sredstva ili agense za vlaženje (kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao što je polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); agense za pojačavanje stabilnosti (kao što su saharoza ili sorbitol); agense za pojačanje toničnosti (kao što su alkalni metal halidi, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol); nosače za isporuku; razblaživače; ekscipijense i/ili farmaceutska pomoćna sredstva. (Remingtonove farmaceutske nauke, 18. izdanje, A.R. Gennaro, izd., Mack Publishing Compani (1995). U nekim slučajevima, formulacija obuhvata PBS; 20mM NaOAC, pH 5.2, 50mM NaCl; i/ili 10mM NAOAC, pH 5.2, 9% saharozu.
[0276] U određenim slučajevima, antigen vezujući protein za PCSK9 i/ili terapeutski molekul je vezan za nosač koji produžuje polu-život poznat u praksi. Takvi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol, glikogen (npr., glikozilacija AVP), i dekstran. Takvi nosači su opisani, npr., u U.S. prijavi serijski br. 09/428,082, sada US Patent br. 6,660,843 i publikovana PCT prijava br. WO 99/25044.
[0277] U određenim primerima, optimalna farmaceutska kompozicija će biti određena od strane stručnjaka nakon, na primer, namenjene putanje davanja, formata isporuke i željene doze. Vidi, na primer, Remingtonove farmaceutske nauke, supra. U određenim primerima, takve kompozicije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, stopu oslobađanja in vivo i stopu bistrenja in vivo antitela pogodnih za upotrebu prema ovom pronalasku.
[0278] U određenim primerima, primarno sredstvo ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može biti ili vodene ili ne vodene prirode. Na primer, u određenim primerima, pogodno sredstvo ili nosač može biti voda za injekcije, fiziološki slani rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, po mogućnosti snabdevena drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralno davanje. U nekim primerima, slani rastvor obuhvata izotonični fosfatni puferizovani slani rastvor. U određenim primerima, neutralni puferizovani slani rastvori ili slani rastvori pomešani sa serum albuminom su dalje primerna sredstva. U određenim primerima, farmaceutske kompozicije obuhvataju Tris pufer od oko pH 7.0-8.5, ili sirćetni pufer od oko pH 4.0-5.5, koji može dalje uključiti sorbitol ili njegovu pogodnu zamenu. U određenim primerima, kompozicija koja obuhvata antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, može se pripremiti za čuvanje mešanjem odabrane kompozicije koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim formulacionim agensom (Remingtonove farmakološke nauke, supra) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim primerima, kompozicija koja obuhvata antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, može biti formulisana kao liofilizat koristeći odgovarajuće ekscipijense kao što je saharoza.
[0279] U određenim primerima, farmaceutska kompozicija može se odabrati za parenteralnu isporuku. U određenim primerima, kompozicije se mogu odabrati za inhalaciju ili za isporuku kroz digestivni trakt, kao što je oralno. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija je u okviru sposobnosti određenog stručnjaka.
[0280] U određenim primerima, formulacione komponente su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto davanja. U određenim primerima, koriste se puferi da se održi kompozicija na fiziološkom pH ili neznatno nižem pH, obično u rasponu pH od oko 5 do oko 8.
[0281] U određenim primerima, kada je razmatrano parenteralno davanje, terapeutska kompozicija može biti u obliku bez pirogena, parenteralno prihvatljivi vodeni rastvor obuhvata željeni antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez dodatnih terapeutskih agensa, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U određenim primerima, nosač za parenteralne injekcije je sterilna destilovana voda u koju je antigen vezjući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, sačuvan na odgovarajući način. U određenim primerima, priprema može uključiti formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su injektabilne mikrosfere, bio-erodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što su polilaktonska kiselina ili poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi, koji mogu obezbediti kontrolisano ili odloženo oslobađanje produkta koji se onda može isporučiti preko depot injekcije. U određenim primerima, hijaluronska kiselina može takođe da se upotrebi, i može efekat pokretanja odloženog trajanja u cirkulaciji. U određenim primerima, mogu se upotrebiti implantabilne naprave za isporuku leka da se uvede željeni molekul.
[0282] U određenim primerima, farmaceutska kompozicija se može formulisati za inhalaciju. U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, može se formulisati kao suvi prah za inhalaciju. U određenim primerima, inhalacioni rastvor obuhvata antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, koji se može formulisati sa propelantom za isporuku sa aerosolom. U određenim primerima, rastvori mogu biti nebulizovani. Plućno davanje je dalje opisano u PCT prijavi br. PCT/US94/001875, koja opisuje plućnu isporuku hemijski modifikovanih proteina.
[0283] U određenim primerima, predviđeno je da se formulacija može davati oralno. U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, koji se daje na taj način može se formulisati sa ili bez tih nosača uobičajeno koristeći pravljenje čvrstih doznih oblika kao što su tablete i kapsule. U određenim primerima, kapsule se mogu dizajnirati tako da oslobode aktivni deo formulacije u određenoj tački u gastrointestinalnom traktu kada je biodostupnost maksimizovana a pre-sistemska degradacija je minimizovana. U određenim primerima, najmanje jedan dodatni agens može se uključiti da olakša apsorpciju antigen vezujućeg proteina za PCSK9 i/ili bilo koje dodatne terapeutske agense. U određenim primerima, razblaživači, agensi za ukus, voskovi za tačku topljenja, ulja povrća, lubrikanti, agensi za suspendovanje, agensi za dezintegraciju tableta, i veziva se mogu takođe upotrebiti.
[0284] U određenim primerima, farmaceutska kompozicija može uključiti efektivnu količinu antigen vezujućeg proteina za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, u mešavini sa ne-toksičnim ekscipijensima koji su pogodni za pripremanje tableta. U određenim primerima, putem rastvaranja tableta u sterilnoj vodi, ili drugom odgovarajućem nosaču, mogu se pripremiti rastvori u jediničnom doznom obliku. U određenim primerima, pogodni ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza, ili kalcijum fosfat; ili agensi za vezivanje, kao što su skrob, želatin, ili akacija; ili agensi za podmazivanje kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina, ili talk.
[0285] Dodatne farmaceutske kompozicije biće očigledne stručnjacima, uključujući formulacije koje uključuju antigen vezujuće proteine za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, u formulacijama za odloženu, ili kontrolisanu ispruku. U određenim primerima, tehnike za formulisanje mnoštva drugih načina za odloženu ili kontrolisanu ispruku, kao što su nosači lipozoma, bio-razgradljive mikročestice ili porozne perlice ili depo injekcije, su takođe poznati stručnjacima. Vidi, na primer, PCT prijavu br. PCT/US93/00829 koji opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih kompozicija. U određenim primerima, preparati sa odloženim oslobađanjem mogu uključiti polupropustljive matrice polimera u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmova, ili mikrokapsula. Matrice za odloženo oslobađanje mogu uključiti poliestre, hidrogelove, polilaktide (U.S.
3,773,919 i EP 058,481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat (Sidman i sar., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroksietil-metakrilat) (Langer i sar., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) i Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etilen vinil acetat (Langer i sar., supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibutiričnu kiselinu (EP 133,988). U određenim primerima, kompozicije sa odloženim oslobađanjem mogu takođe uključiti lipozome, koji se mogu pripremiti sa bilo kojim od nekoliko metoda poznatih u oblasti. Vidi, npr., Eppstein i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.
[0286] Farmaceutska kompozicija koja treba da se koristi za davanje in vivo tipično je sterilna. U određenim primerima, to se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. U određenim primerima, u kojima se kompozicija liofilizuje, sterilizacija koja koristi ovaj metod može se izvesti bilo pre, ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. U određenim primerima, kompozicija za parenteralno davanje može se čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. U određenim primerima, parenteralne kompozicije generalno su stavljene u kontejner koji ima sterilni ulazni pristup, na primer, vrećica za intravenski rastvor ili vijal koji ima zapušač koji se može probušiti hipodermalnom injekcionom iglom.
[0287] U određenim primerima, jednom kada je farmaceutska kompozicija formulisana, ona se može čuvati u sterilnim vijalima kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta materija ili kao dehidrirani ili liofilizirani prah. U određenim primerima, takve formulacije mogu se čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu (npr., liofiliziranom) koji se rekonstituiše pre davanja.
[0288] U određenim primerima, obezbeđeni su kitovi za produkciju pojedinačne dozne jedinice. U određenim primerima, kit može sadržati i prvi kontejner koji ima osušeni protein i drugi kontejner koji ima vodenu formulaciju. U određenim primerima uključeni su kitovi koji obuhvataju pojedinačne i višekomorne prethodno napunjene spriceve (npr., špriceve sa tečnošću i liošpriceve).
[0289] U određenim primerima, efektivna količina farmaceutske kompozicije koja ouhvata antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, koja treba da se upotrebi terapeutski zavisiće, na primer, od terapeutskog konteksta i ciljeva. Stručnjak će shvatiti da odgovarajući dozni nivoi za tretman, prema određenim primerima, će prema tome varirati zaviseći, delom od isporučenog molekula, indikacije za koju je antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, bio upotrebljen, načina davanja, i veličine (telesne težine, površine tela ili veličine organa) i/ili kondicije (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta. U određenim primerima, kliničar može titrovati dozu i modifikovati način davanja da dobije optimalni terapeutski efekat. U određenim primerima, tipična doza može biti u rasponu od oko 0.1 µg/kg pa sve do oko 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od faktora spomentutih gore. U određenim primerima, doziranje može biti u rasponu 0.1 µg/kg sve do 100 mg/kg; ili 1 µg/kg sve do oko 100 mg/kg; ili 5 µg/kg sve do oko 100 mg/kg.
[0290] U određenim primerima, frekvenca doziranja će uzeti u obzir farmakokinetičke parametre antigen vezujućeg proteina za PCSK9 i/ili bilo koje dodatne terapeutske agense u upotrebljenoj formulaciji. U određenim primerima, kliničar će davati kompoziciju sve dok nije dostignuta doza koja dostiže željeni efekat. U određenim primerima, kompozicija može, prema tome, da se daje kao pojedinačna doza, ili kao dve ili više doza (koje mogu ili ne mogu sadržati istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija preko implantacione naprave ili katetera. Dalje usavršavanje odgovarajuće doze radi se rutinski od strane stručnjaka i u obimu je zadataka koji im se rutinski zadaju. U određenim primerima, odgovarajuće doziranje može se potvrditi kroz upotrebu odgovarajućih podataka doznog odgovora. U nekim primerima, količina i frekvenca davanja može uzeti u obzir željeni nivo holesterola (serum i/ili ukupni) koji treba da se dobije i subjektove trenutne nivoe holesterola, nivoe LDL, i/ili nivoe LDLR, koji se svi mogu dobiti metodima koji su dobro poznati stručnjacima.
[0291] U određenim primerima, način davanja farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim postupcima, npr. oralno, putem intravenske injekcije, intraperitonealno, intracerebralno (intra-parenhimalno), intracerebroventrikularno, intramuskularno, subkutano, intra-okularno, intraarterijalno, intraportalno, ili intralezionim načinima; sa sistemima za odloženo oslobađanje ili sa implantacionim napravama. U određenim primerima, kompozicije se mogu davati sa bolus injekcijom ili kontinuirano sa infuzijom, ili sa implantacionom napravom.
[0292] U određenim primerima, kompozicija se može davati lokalno preko implantacije membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na koji je željeni molekul bio apsorbovan ili inkapsuliran. U određenim primerima, gde se koristi naprava za implantaciju, naprava se može implantirati u bilo koje stabilno tkivo ili organ, i isporuka željenog molekula može biti preko difuzije, bolusa za vremensko oslobađanje, ili kontinuirano davanje.
[0293] U određenim primerima, može biti poželjno da se upotrebi farmaceutska kompozicija koja obuhvata antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, na ex vivo način. U takvim primerima, ćelije, tkiva i/ili organi koji su uklonjeni iz pacijenta su izloženi farmaceutskim kompozicijama koje sadrže antigen vezujući protein za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa, nakon čega ćelije, tkiva i/ili organi su uzastopno implantirani nazad u pacijenta.
[0294] U određenim primerima, antigen vezujući protein za PCSK9 i/ili ili bilo koji dodatni terapeutski agensi mogu se isporučiti putem implantiranja određenih ćelija koje su bile konstruisane genetičkim inžinjeringom, koristeči metode kao što su oni koji su ovde opisani, da se eksprimiraju i izlučuju određeni polipeptidi. U određenim primerima, takve ćelije mogu biti životinjske ili humane ćelije, i mogu biti autologne, heterologne, ili ksenogenične. U određenim primerima, ćelije mogu biti besmrtne. U određenim primerima, sa ciljem da se smanji šansa za imunološki odgovor, ćelije mogu biti inkapsulirane da se izbegne infiltracija okolnih tkiva. U određenim primerima, materijali za inkapsulaciju su tipično biokompatibilni, polu-permeabilni polimerični omotači ili membrane koji omogućuju oslobađanje proteinskog produkta(ata) putem sprečavanja destrukcije ćelija od strane pacijentovog imunog sistema ili sa drugim štetnim faktorima iz okolnih tkiva.
[0295] Zasnovano na sposobnosti AVP da značajno neutralizuju aktivnost PCSK9 (kao što je dole prikazano u Primerima), ovi AVP će imati terapeutske efekte u lečenju i prevenciji simptoma i stanja koji nastaju od PCSK9-posredovane aktivnosti, kao što je hiperholesterolemija.
PRIMERI
[0296] Primeri koji slede, uključujući izvedene eksperimente i dobijene rezultate, obezbeđeni su samo sa svrhom ilustracije i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće za predmentni pronalazak koji je definisan patentnim zahtevima.
PRIMER 1
Imunizacija i titrovanje
Generisanje anti-PCSK9 antitela i hibridoma
[0297] Antitela zrele forme PCSK9 (prikazano kao sekvencа u FIG. 1A, sa podvučenim prodomenom), su odgajena u XenoMouse<®>miševima (Abgenix, Fremont, CA), а to su miševi koji sarže humane imunoglobulinske gene. Dve grupe XenoMouse<®>miševa, grupa 1 i 2, su korišćeni za proizvodnju antitela za PCSK9. Grupa 1 uključuje miševe XenoMouse<®>soja XMG2-KL, koji proizvode u celini humana IgG2κi IgG2λ antitela. Grupa 1 miševa je imunizovana sa humanim PCSK9. PCSK9 je pripremljen standardnim rekombinantnim tehnikama upotrebom sekvence iz GenBank sa referencom (NM_174936). Grupa 2 je uključila miševe XenoMouse<®>soja XMG4KL, koji proizvode u celini humana IgG4κi IgG4λ antitela. Miševi grupe 2 su takođe imunizovani sa humanim PCSK9.
[0298] U miševe iz ovih grupa su ubrizgani antigeni jedanaest puta, prema protokolu iz Tabele 3. U inicijalnoj imunizaciji, u svakog miša je ubrizgano ukupno 10 µg antigena isporučenih intraperitonealno u stomak. Uzastopna povećanja su 5ug doza i metod ubrizgavanja se kolebao između intraperitonealnog ubrizgavanja u abdomen i subkutanog ubrizgavanja u bazu repa. Za intraperitonealno ubrizgavanje antigen je pripreman kao emulzija sa TiterMax<®>Gold (Sigma, Cat # T2684) i za subkutana ubrizgavanja antigen je mešan sa Alum (aluminijum fosfatom) i CpG oligo. U ubrizgavanju 2 preko 8 i 10, u svakog miša je ukupno ubrizgano 5 µg antigena u adjuvansnom alum gelu. Finalno ubrizgavanje 5 µg antigena po mišu je isporučeno u Fosfo puferizovanom slanom rastvoru i isporučeno na 2 mesta 50% IP u stomak i 50% SQ u bazu repa. Program imunizacije je sumarizovan u Tabeli 3, dole prikazanoj.
TABELA 3
[0299] Protokol korišćen za titar XenoMouse životinja je bio sledeći: Costar 3368 medijum vezujuće ploče bile su presvučene sa neutravadinom @ 8ug/ml (50ul/bunarčić) i inkubirane na 4 °C u 1XPBS/0.05% azidu preko noći. Isprane su pomoću TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom. Ploče su blokirane upotrebom 250ul 1XPBS/1% mleka i inkubirane tokom najmanje 30 minuta na ST. Blok je ispran korišćenjem TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom. Neko je zatim hvatao b-humane PCSK9 @ 2ug/ml u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca2+ (razblaživač ogleda) 50ul/bunarčiću i inkubirao tokom 1č na ST. Zatim su isprane koristeći TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom. Za primarna antitela, serum je titrovan 1:3 u duplikatu od 1:100. Ovo je obavljeno u razblaživaču ogleda 50ul/bunarčiću i inkubirano tokom 1č na ST. Potom su isprane koristeći TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom. Sekundarno antitelo bilo je kozije anti Humano IgG Fc HRP @ 400 ng/ml u razblaživaču ogleda 50ul/bunarčiću. Ovo je inkubirano tokom 1č na ST. Ovo je zatim isprano korišćenjem TiterTek 3-cikusa ispiranja sa RO vodom i nežno osušeno na papirnom ubrusu. Za supstrat je korišćen jedan-korak TMB rastvor (Neogen, Leksington, Kentaki) (50ul/bunarčić) i dozvoljeno je da se razvije tokom 30 min na ST.
[0300] Protokoli praćeni u ELISA ogledu bio je sledeći: za uzorake koji su sadržali b-PCSK9 a bez V5His taga, primenjen je sledeći protokol: Primenjene su Costar 3368 medijum vezujuće ploče (Corning Life Sciences). Ploče su presvučene sa neutravadinom na 8 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azidu, (50 µl/bunarčić). Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane korišćenjem Titertek M384 ispirača ploča (Titertek, Huntsville, AL). Obavljena su 3-ciklusa ispiranja. Ploče su blokirane sa 250 µl 1XPBS/1% mleka i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su potom isprane upotrebom M384 ispirača ploča. Obavljena su 3-ciklusa ispiranja. Hvatanje je bilo b-hu PCSK9, bez V5 taga, i dodano je 2 µg/ml u 1XPBS/1% mleko/10mM Ca<2+>(40 µl/bunarčić). Ploče su zatim inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Obavljena su 3-ciklusa ispiranja. Serumi su titrovani 1:3 u duplikatu od 1:100, i sirovi H je bio slepa proba za serum. Titrovanje je obavljeno u razblaživaču za ogled, u zapremini od 50 µl/bunarčiću. Ploče su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Dalje je obavljeno 3-ciklusno ispiranje. Kozji i humani anti humani IgG Fc HRP na 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1% mleko/10mM Ca<2+>(50 µl/bunarčić) je dodan u ploču i inkubirano je 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane još jednom, koristeći 3-ciklusno ispiranje. Ploče su zatim osušene sa papirnim ubrusima. Konačno, 1 korak TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 µl/bunarčić) je dodan u ploču i ugašen sa 1N hlorovodoničnom kiselinom (50 µl/bunarčić) nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča.
[0301] Pozitivne kontrole za detekciju vezivanja PCSK9 u pločama bile su rastvorljivi LDL receptor (R&D Systems, Cat #2148LD/CF) i poliklonalno zečije anti-PCSK9 antitelo (Caymen Chemical #10007185) titrovano 1:3 u duplikatu od 3 µg/ml u razblaživaču za ogled. LDLR je detektovan sa kozjim anti LDLR (R&D Systems, Cat #AF2148) i zečjim anti kozjim IgGFc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml; zečje polikolonalno je detektovano sa kozjim anti-zec IgG Fc u koncentraciji od 400 ng/ml u razblaživaču za ogled. Negativne kontrole su bili čisti XMG2-KL i XMG4-KL serum titrovan 1:3 u duplikatu od 1:100 u razblaživaču za ogled.
[0302] Za uzorke koji su obuhvatali b-PCSK9 sa V5His tagom upotrebljen je sledeći protokol: upotrebljene su Costar 3368 ploče sa medijumom za vezivanje (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom na 8 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azid, (50 µl/bunarčić). Ploče su bile inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek M384 ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Obavljeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 250 µl od 1XPBS/1% mleka i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći M384 ispirač ploča. Obavljeno je 3-ciklusno ispiranje. Hvatanje je bilo b-hu PCSK9, sa V5 tagom, i dodano je na 2 µg/ml u 1XPBS/1% mleko/10mM Ca<2+>(40 µl/bunarčić). Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Obavljeno je 3-ciklusno ispiranje. Serum je titrovan sa 1:3 u duplikatu od 1:100, i sirovi H je bio slepa proba za serum. Titrovanje je obavljeno u razblaživaču za ogled, pri zapremini od 50 µl/bunarčić. Ploče su inkubirane 1 čas na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći M384 ispirač ploča koji radi koristeći 3-ciklusno ispiranje. Kozji anti humani IgG Fc HRP na 400 ng/ml u 1XPBS/1% mleko/10mM Ca<2+>je dodan na 50 µl/bunarčić u ploči i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo jednom isprane, koristeći 3-ciklusno ispiranje. Ploče su zatim osušene sa papirnim ubrusima. Konačno, 1 korak TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 µl/bunarčiću) je dodan ploči i ploča je ugašena sa 1N hlorovodoničnom kiselinom (50 µl/ bunarčiću) nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm koristeći Titertek čitać ploča.
[0303] Pozitivna kontorola LDLR, zečji anti-PCSK9 titrovan 1:3 u duplikatu iz 3 µg/ml u razblaživaču za ogled. LDLR detekcija sa kozjim anti-LDLR (R&D Systems, Cat #AF2148) i zečjim anti-koza IgG Fc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml; zečji poli detektovan sa kozjim antizec IgG Fc u koncentraciji od 400 ng/ml u razblaživaču za ogled. Humani anti-His 1.2,3 i anti-V5 1.7.1 titrovani u 1:3 u duplikatu od 1 µg/ml u razblaživaču za ogled; oba detektovana sa kozjim anti-humani IgG Fc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml u razblaživaču za ogled. Negativna kontrola bio je čisti XMG2-KL i XMG4-KL serum titrovan 1:3 u duplikatu od 1:100 u razblaživaču za ogled.
[0304] Titrovi antitela protiv humanog PCSK9 testirani su sa ELISA ogledom za miševe imunizovane sa rastvorenim antigenom kao što je opisano. Tabela 4 sumarizuje podatke ELISA i ukazuje da su postojali neki miševi koji su bili specifični za PCSK9. Vidi, npr., Tabelu 4. Prema tome, na kraju programa imunizacije, 10 miševa (podebljano u Tabeli 4) su odabrani za žetvu, i izolovane su splenocite i limfociti iz slezina i limfnih čvorova respektivno, kao što je ovde opisano.
TABELA 4
Sažetak ELISA rezultata
PRIMER 2
Oporavak limfocita, izolacije B-ćelija, fuzije i i generisanje hibridoma
[0305] Ovaj primer ističe kako su imune ćelije oporavljene i kako su generisani hibridomi. Odabrani imunizovani miševi su žrtvovani pomoću cervikalne dislokacije i drenirani limfni čvorovi su prikupljeni i sjedinjeni iz svakog kohorta. B ćelije su izdvojene iz limfnog tkiva usitnjavanjem u DMEM da se oslobode ćelije iz tkiva, i ćelije su suspendovane u DMEM. Ćelije su izbrojane, i 0.9 ml DMEM na 100 milona limfocita je dodano u talog ćelija da se ćelije lagano, ali kompletno resduspenduju.
[0306] Limfociti su pomešani sa ćelijama ne-sekretornog mijeloma P3X63Ag8.653 nabavljenim od ATCC, cat.# CRL 1580 (Kearney i sar., (1979) J. Immunol. 123, 1548-1550) u odnosu od 1:4. Mešavina ćelija je lagano istaložena centrifugiranjem na 400 x g 4 min. Nakon dekantovanja supernatanta, ćelije su lagano pomešane koristeći pipetu od 1 ml. Prethodno zagrejani rastvor PEG/DMSO od Sigma (cat# P7306) (1 ml na milion B-ćelija) je dodavan polako uz nežno protresanje tokom 1 min, a zatim 1 min mešanja. Prethodno zagrejani IDMEM (2 ml na milion B-ćelija) (DMEM bez glutamina, L-glutamina, pen/strep, MEM ne-esencijalne aminokiseline (sve od Invitrogena), je zatim dodavan tokom 2 minuta uz nežno mućkanje. Konačno je prethodno zagrejani IDMEM (8 ml na 10<6>B-ćelija) dodavan tokom 3 minuta.
[0307] Fuzionisane ćelije su oborene dole 400 x g 6 min i resuspendovane u 20 ml selektivnog medijuma (DMEM (Invitrogen), 15 % FBS (Hyclone), snabdevenim sa L-glutaminom, pen/strep, MEM ne-esencijalnim aminokiselinama, natrijum piruvatom, 2-Merkaptoetanolom (sve od Invitrogena), HA-Azaserine Hypoxanthine i OPI (oksalacetat, piruvat, goveđi insulin) (oba od Sigma) i IL-6 (Boehringer Mannheim)) na milion B-ćelija. Ćelije su bile inkubirane tokom 20-30 min na 37<o>C i zatim resuspendovane u 200 ml selekcionog medijuma i kultivisane tokom 3-4 dana u T175 flaskovima pre stavljanja u ploče sa 96 bunarčića. Prema tome, proizvedeni su hibridomi koji su produkovali antigen vezujuće proteine za PCSK9.
PRIMER 3
Selekcija PCSK9 antitela
[0308] Dati primer ističe kako su okarakterisani i odabrani različiti PCSK9 antigen vezujući proteini. Procenjeno je vezivanje odabranih antitela (produkovanih iz hibridoma proizvedenih u primerima 1 i 2) za PCSK9. Selekcija antitela je zasnovana na podacima vezivanja i inhibicije PCSK9 vezivanja za LDLR i afiniteta. Vezivanje za rastvorljivi PCSK9 je analizirano sa ELISA, kao što je opisano dole. BIAcore® (površinska plazmon rezonanca) je upotrebljen da se kvantifikuje afinitet vezivanja.
Primarni skrining
[0309] Obavljen je primarni skrining za antitela koja se vezuju za divlji tip PCSK9. Primarni skrining je izveden na dve žetve. Primarni skrining je obuhvatao ELISA ogled i bio je izveden koristeći sledeći protokol:
[0310] Upotrebljene su Costar 3702 medijum vezujuće ploče sa 384 bunarčića (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom u koncentraciji od 4 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azid, u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane. Ponovo je izvedeno 3-ciklusno ispiranje. Uhvaćeni uzorak je biotiniliran-PCSK9, bez V5 taga, i dodan je u 0.9 µg/ml u 1XPBS/1% mleko/10mM Ca<2+>u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. 10 µl supernatanta je preneto u 40 µl od 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2+>i inkubirano 1.5 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. 40 µl/bunarčić kozjeg anti-humani IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2+>je dodan ploči i inkubiran 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane još jednom, koristeći 3-ciklusno ispiranje. Konačno je ploči dodan 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) i gašenje sa 40 µl/bunarčić od 1N hlorovodonične kiseline je izvedeno nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča.
[0311] Primarni skrining rezultirao je sa ukupno 3104 antigen specifičnih hibridoma koji su identifikovani iz dve žetve. Na osnovu najviših ELISA OD, 1500 hibridoma po žetvi je bilo uspešno od ukupno 3000 pozitivnih.
Konfirmacioni skrining
[0312] 3000 pozitivnih je ponovo skrinovano na vezivanje za to divlji tip PCSK9 da se potvrdi da su stabilni hibridomi ustanovljeli. Skrining je izveden na sledeći način: upotrebljene su Costar 3702 medijum vezujuće ploče sa 384 bunarčiča (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom na 3 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azid u zapremini od 40 µl/bunarčiću. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći M384 ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Uhvaćeni uzorak bio je b-PCSK9, bez V5 taga, i dodan je u 0.9 µg/ml u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2+>u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći 3-ciklusno ispiranje. 10 µl supernatanta je preneto u 40 µl od 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2+>i inkubirano 1.5 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. 40 µl/bunarčić od koza anti-humani IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2+>je dodan ploči, i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane ponovo još jednom, koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. Konačno, 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodan ploči i ugašen sa 40 µl/bunarčić od 1N hlorovodonične kiseline nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča. Ukupno 2441 pozitivnih se ponovilo u drugom skriningu. Ova antitela su zatim upotrebljena u uzastopnim skrininzima.
Skrining mišje unakrsne-reaktivnosti
[0313] Panel hibridoma je skrinovan na unakrsnu reaktivnost za mišji PCSK9 da bi bili sigurni da antitela mogu da se vezuju i za humani i za mišji PCSK9. Upotrebljen je sledeći protokol u pregledu unakrsne reaktivnosti: upotrebljene su Costar 3702 medijum vezujuće ploče sa 384 bunarčića (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom na 3 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azid u zapremini od 40 µl /bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izveden je 3-ciklus ispiranja. Uhvaćeni uzorak je biotinilran-mišji PCSK9, i dodan je u 1 µg/ml u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2+>u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje.50 µl supernatanta je preneto u ploče i inkubirano 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim ponovo isprane koristeći 3-ciklusno ispiranje. 40 µl/bunarčić kozjeg anti-humani IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2+>je dodano ploči i ploča je inkubirana tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane još jednom, koristeći 3-ciklusno ispiranje. Konačno, 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodan ploči i ugašen sa 40 µl/bunarčić 1N hlorovodonične kiseline nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča. Zapaženo je da 579 antitela unakrsno reaguje sa mišjim PCSK9. Ta antitela su zatim upotrebljena u uzastopnim skrininzima.
Skrining D374Y mutantnog vezivanja
[0314] D374Y mutacija u PCSK9 je dokumentovana u humanoj populaciji (npr., Timms KM i sar, „Mutacija PCSK9 uzrokuje autozomalno-dominantnu hiperholesterolemiju u Utah pedigreu", Hum. Genet. 114: 349-353, 2004). Sa ciljem da se odredi da li su antitela bila specifična za divlji tip ili se takođe vezuju za D374Y od PCSK9, uzorci su zatim skrinovani na vezivanje za mutantnu PCSK9 sekvencu koja obuhvata mutaciju D374Y. Protokol za skrining je bio sledeći: u skriningu su upotrebljene Costar 3702 medijum vezujuće ploče sa 384 bunarčića (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa neutravadinom na 4 µg/ml u 1XPBS/0.05% Azid u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći . Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su obavije ne sa biotinilranim humanim PCSK9 D374Y u koncentraciji od 1 µg/ml u 1XPBS/1%mleko/10mMCa<2+>i inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Kasnije je istrošeni suprnatant kulture hibridoma razblažen sa 1:5 u PBS/mleko/Ca<2+>(10 ml plus 40 ml) i inkubiran tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje je 40 µl/bunarčić zečji anti-humani PCSK9 (Cayman Chemical) i humani anti-His 1.2.3 1:2 na 1ug/ml u 1XPBS/1%mleko/10mMCa<2+>titrovan na ploče, koje su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. 40 µl/bunarčić od kozjeg anti-humani IgG Fc HRP u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2+>je dodano u ploču i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. 40 µl/bunarčić od kozjeg anti-zec IgG Fc HRP u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2+>je dodano u ploču i ploča je inkubirana 1 čas na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Konačno, 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodan u ploču i ugašen sa 40 µl/bunarčić sa 1N hlorovodoničnom kiselinom nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča. Preko 96% pozitivnih hitova divljeg PCSK9 je takođe vezalo PCSK9.
Skrining velikog obima blokiranja veznika receptora
[0315] Za skrinovanje antitela koja blokiraju vezivanje PCSK9 za LDLR, razvijen je ogled koristeći D374Y PCSK9 mutant. Mutant je upotrebljen u ovom ogledu zato što ima viši nivo afiniteta vezivanja za LDLR omogućujući da se razvije mnogo osetljiviji ogled blokiranja veznika receptora. Upotrebljen je sledeći protokol u skriningu blokiranja veznika receptora: upotrebljene su Costar 3702 medijum vezujuće ploče od 384 bunarčića (Corning Life Sciences) u skriningu. Ploče su obavijene sa kozjim anti-LDLR (R&D Cat #AF2148) u 2 µg/ml u 1XPBS/0.05%Azid u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1% mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Uhvaćeni uzorak je bio LDLR (R&D, Cat #2148LD/CF), i dodan je u 0.4 µg/ml u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2+>u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa i 10 minuta na sobnoj temperaturi. Istovremeno, 20 ng/ml biotiniliranog humanog D374Y PCSK9 je inkubirano sa 15 mikrolitara istrošenog supernatanta hibridoma u Nunc polipropilen pločama i koncentracija istrošenog supernatanta je razblažena 1:5. Ploče su zatim pre-inkubirane tokom oko 1 časa i 30 minuta na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje.50 µl/bunarčić od preinkubirane mešaviine je preneto u LDLR obavijene ELISA ploče i inkubirano tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Da se detektuje LDLR-vezivanje b-PCSK9, u ploče je dodano 40 µl/bunarčić streptavidin HRP na 500 ng/ml u razblaživaču za ogled. Ploče su inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Konačno, 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodano u ploče i ugašeno sa 40 µl/bunarčić sa 1N hlorovodoničnom kiselinom nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča. Skrining je identifikovao 384 antitela koja blokiraju interakciju između PCSK9 i LDLR bunarčića, 100 antitela je snažno blokiralo interakciju (OD < 0.3). Ova antitela su inhibirala interakciju vezivanja PCSK9 i LDLR više od 90% (više od 90% inhibicije).
Ogled vezivanja veznika receptora na blokirani podskup
[0316] Ogled veznika receptora je zatim ponovljen koristeći mutantni enzim na 384 članom podskupu neutralizatora identifikovanih u prvom ogledu velikog obima inhibicije veznika receptora. Isti protokol je upotrebljen u skriningu ogleda 384 članog podskupa blokera kao što je obavljeno u skriningu velikog obima inhibicije veznika receptora. Ovaj ponovljeni skrining je potvrdio početne skrining podatke.
[0317] Ovaj skrining podskupa 384 člana identifikovao je 85 antitela koja su blokirala interakciju između PCSK9 mutantnog enzima i LDLR više od 90%.
Ogled vezivanja veznika receptora blokera koji vezuju divlji tip PCSK9 ali ne i D374Y mutant [0318] U početnom panelu 3000 supova bilo je 86 antitela za koja je pokazano da se specifično vezuju za divlji tip PCSK9 a ne za huPCSK9(D374Y) mutant. Tih 86 supova je testirano na sposobnost da blokira divlji tip PCSK9 vezivanja za LDLR receptor. Upotrebljen je sledeći protokol: u skriningu su upotrebljene Costar 3702 medijum vezjuće ploče od 384 bunarčića (Corning Life Sciences). Ploče su obavijene sa anti-His 1.2.3 u 10 µg/ml u 1XPBS/0.05% Azid u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su inkubirane na 4 °C preko noći. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1%mleko i inkubirane približno 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. LDLR (R&D Systems, #2148LD/CF ili R&D Systems, #2148LD) je dodan u 5 µg/ml u 1XPBS/1%mleko/10mM Ca<2+>u zapremini od 40 µl/bunarčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Dalje su ploče bile isprane koristeći Titertek ispirač ploča koji operiše koristeći 3-ciklusno ispiranje. Istovremeno, biotinilirani humani PCSK9 divljeg tipa je pre-inkubiran sa istrošenim supernatantom hibridoma u Nunc polipropilen pločama. 22 µl sup hibridoma je preneto u 33ul od b-PCSK9 u koncentraciji od 583 ng/ml u 1XPBS/1%mleko/10mMCa<2+>, dajući konačnu b-PCSK9 koncentraciju = 350 ng/ml i istrošeni supernatant u konačnom razblaženju od 1:2.5. Ploče su bile pre-inkubirane tokom približno 1 časa i 30 minuta na sobnoj temperaturi.50 µl/bunarčić od pre-inkubirane mešavine je preneto na LDLR uhvaćene ELISA ploče i inkubirano tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. 40 µl/bunarčić streptavidin HRP na 500 ng/ml u razblaživaču za ogled je dodano u ploče. Ploče su inkubirane tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane koristeći Titertek ispirač ploča. Izvedeno je 3-ciklusno ispiranje. Konačno, 40 µl/bunarčić od One-step TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodano u ploču i ugašeno sa 40 µl/bunarčić sa 1N hlorovodoničnom kiselinom nakon 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su očitani odmah na 450 nm koristeći Titertek čitač ploča.
Rezultati skrininga
[0319] Na osnovu rezultata opisanih ogleda, identifikovano je nekoliko linija hibridoma koje produkuju antitela sa smanjenim interakcijama sa PCSK9. Upotrebljeno je ograničavajuće razblaživanje da se izoluje značajan broj klonova od svake linije. Klonovi su označeni prema broju linije hibridoma (npr. 21B12) i broju klona (npr. 21B12.1). Generalno nisu detektovane razlike među razlilčitim klonovima određene linije putem ovde opisanog funkcionalnog ogleda. U nekoliko slučajeva, klonovi su identifikovani od određene linije koja se ponašala drugačije u funkcionalnom ogledu, na primer, nađeno je da 25A7.1 ne blokira PCSK9/LDLR ali je bio 25A7.3 (označen ovde kao 25A7) neutralizujući. Izolovani klonovi su svaki prošireni u 50-100 ml hibridoma medija i ostavljeni da rastu do iscrpljivanja, (tj., manje od oko 10% vijabilnosti ćelija). Koncentracija i potentnost antitela za PCSK9 u supernatantima tih kultura je određena sa ELISA i sa in vitro funkcionalnim testiranjem, kao što je ovde opisano. Kao rezultat ovde opisanog skrininga, identifikovani su hibridomi sa najvišim titrom antitela za PCSK9. Odabrani hibridomi su prikazani na FIG.2A-3D i u Tabeli 2.
PRIMER 4.1
Produkcija humanog 31H4 IgG4 antitela iz hibridoma
[0320] Ovaj primer generalno opisuje kako je jedan od antigen vezujućih proteina proizveden od linije hibridoma. Produkcioni rad je upotrebio 50 ml generisanog iscrpljenog supernatanta praćenog sa prečišćavanjem proteina A. Integra produkcija je korišćena za povećanje količine i izvedena je kasnije. Linija hibridoma 31H4 je odgajena u T75 flaskovima u 20 ml medija (Integra Media, Table 5). Kada je hibridom bio gotovo tečan u T75 flaskovima, on je prenet u Integra flask (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90005).
[0321] Integra flask je flask za ćelijsku kulturu koji je podeljen membranom u dve komore, malu komoru i velku komoru. Zapremina od 20-30 ml hibridoma ćelija u minimumu ćelijske gustine od 1×10<6>ćelija po ml od 31H4 linije hibridoma je stavljena u malu komoru Integra flaska u Integra medijumu (vidi Tabelu 5 za komponente Integra medijuma). Integra medijum sam (1L) je stavljen u veliku komoru Integra flaska. Membrana koja razdvaja dve komore je propusna za hranjive sastojke male molekulske težine ali je nepropusna za ćelije hibridoma i za antitela koja produkuju te ćelije. Prema tome, hibridoma ćelije i antitela koja produkuju te hibridoma ćelije su zadržana u maloj komori.
[0322] Nakon jedne nedelje, medijum je uklonjen iz obe komore Integra flaskova i zamenjen sa svežim Integra medijumom. Sakupljeni medijumi iz malih komora su zadržani odvojeno. Nakon druge nedelje rasta, medijumi iz male komore su ponovo sakupljeni. Sakupljeni medijumi iz 1 nedelje iz linije hibridoma su kombinovani sa sakupljenim medijumima iz 2 nedelje iz linije hibridoma. Nastao sakupljeni uzorak medijuma iz hibridoma linije je oboren da se uklone ćelije i ostatak (15 minuta na 3000rpm) i nastali supernatant je filtriran (0.22um). Pročišćeni uslovni medijumi su napunjeni u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijumi se mogu prvo koncentrovati a zatim napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena sa ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Vezana antitela proteina na Protein A koloni su obnovljena sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM Citrat, pH 3.0). Sakupljeni antigeni proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjeni su sa hromatografijom ekskluzije veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na na anjon zamenjujućoj smoli kao što je Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 31H4 proteine su Q-Sepharose HP na pH 7.8-8.0. Antitelo je isprano sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolona.
TABELA 5
Sastav medijuma
PRIMER 4.2
Produkcija rekombinantnih 31H4 humanih IgG2 antitela iz transfektovanih ćelija
[0323] Ovaj primer ističe kako su 31H4 IgG2 antitela produkovana iz transfektovanih ćelija.293 ćelije za prolaznu ekspresiju CHO ćelije za stabilnu ekspresiju su transfektovane sa plazmidima koji kodiraju teške i lake lance 31H4. Uslovni medijum iz transfektovanih ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum se može prvo koncentrovati pa onda napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na anjon zamenjujućoj smoli kao što je Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 31H4 proteine su Q-Sepharose HP na pH 7.8-8.0. Antitelo je isprano sa NaCl gradijent od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolone.
PRIMER 5
Produkcija humanih 21B 12 IgG4 antitela iz hibridoma
[0324] Ovaj primer ističe kako je antitelo 21B 12 IgG4 produkovano iz hibridoma. Hibridom linija 21B12 je odgajena u T75 flaskovima u medijumu (Integra Media, Tabela 5). Kada su hibridomi postali gotovo tečni u T75 flaskovima, oni su transformisani u Integra flaskovima (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90005).
[0325] Integra flask je flask za ćelijsku kulturu koji je podeljen membranom u dve komore, malu komoru i velku komoru. Zapremina od 20-30 ml hibridoma ćelija u minimumu ćelijske gustine od 1×10<6>ćelija po ml od 31H4 linije hibridoma je stavljena u malu komoru Integra flaska u Integra medijumu (vidi Tabelu 5 za komponente Integra medija). Integra medijum sam (1L) je stavljen u veliku komoru Integra flaska. Membrana koja razdvaja dve komore je propusna za hranjive sastojke male molekulske težine ali je nepropusna za ćelije hibridoma i za antitela koja produkuju te ćelije. Prema tome, hibridoma ćelije i antitela koja produkuju te hibridoma ćelije su zadržana u maloj komori. Nakon jedne nedelje, medijumi su uklonjeni iz obe komore Integra flaskova i zamenjeni sa Integra medijumom. Sakupljeni medijumi iz malih komora su zadržani odvojeno. Nakon druge nedelje rasta, medijumi iz malih komora su ponovo sakupljeni. Sakupljeni medijum iz 1 nedelje iz linije hibridoma je kombinovan sa sakupljenim medijumom iz 2 nedelje od hibridoma linije. Nastali sakupljeni uzorci medijuma iz linije hibridoma su oboreni da se uklone ćelije i otpad (15 minuta na 3000 rpm) i nastali supernatant je filtriran (0.22 µm). Izbistreni uslovni medijumi su napunjeni u Protein A Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum je prvo koncentrovan i onda napunjen u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena sa ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjeni su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na anjon zamenjujućoj smoli kao što je Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 21B12 proteine su Q-Sepharose HP na pH 7.8-8.0. Antitelo je isprano sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolone.
PRIMER 6
Produkcija humanih 21B 12 IgG2 antitela iz transfektovanih ćelija
[0326] Ovaj primer ističe kako je antitelo 21B 12 IgG2 produkovano iz transfektovanih ćelija. Ćelije (293 ćelija za prolaznu ekspresiju i CHO ćelija za stabilnu ekspresiju) su transfektovane sa plazmidima koji kodiraju teške i lake lance 21B12. Uslovni medijum iz hibridoma ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum se može prvo koncentrovati pa onda napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolona (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na na anjon zamenjujućoj smoli kao što je SP-Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 21B12 proteine su SP-Sepharose HP na pH 5.2. Antitela su isprana sa 25 kolonskim zapreminama pufera koji sadrži NaCl gradijent od 10 mM-500 mM u 20 mM natrijum acetatnog pufera.
PRIMER 7
Produkcija humanih 16F12 IgG4 antitela iz hibridoma
[0327] Ovaj primer ističe kako je antitelo 16F12 IgG4 produkovano iz hibridoma. Linija hibridoma 16F12 je odgajena u T75 flaskovima u mediju (vidi Tabelu 5). Kada su hibridomi postali gotovo tečni u T75 flaskovima, oni su transformisani u Integra flaskovima (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90005).
[0328] Integra flask je flask za ćelijsku kulturu koji je podeljen membranom u dve komore, malu komoru i velku komoru. Zapremina od 20-30 ml hibridoma ćelija u minimumu ćelijske gustine od 1×10<6>ćelija po ml od 31H4 linije hibridoma je stavljena u malu komoru Integra flaska u Integra medijumu (vidi Tabelu 5 za komponente Integra medijuma). Integra medijum sam (1L) je stavljen u veliku komoru Integra flaska. Membrana koja razdvaja dve komore je propusna za hranjive sastojke male molekulske težine ali je nepropusna za ćelije hibridoma i za antitela koja produkuju te ćelije. Prema tome, hibridoma ćelije i antitela koja produkuju te hibridoma ćelije su zadržana u maloj komori.
[0329] Nakon jedne nedelje, medijumi su uklonjeni iz obe komore Integra flaskova i zamenjeni sa Integra medijumom. Sakupljeni medijumi iz malih komora su zadržani odvojeno. Nakon druge nedelje rasta, medijumi iz malih komora su ponovo sakupljeni. Sakupljeni medijum iz 1 nedelje iz linije hibridoma je kombinovan sa sakupljenim medijumom iz 2 nedelje od hibridoma linije. Nastali sakupljeni uzorci medijuma iz linije hibridoma su oboreni da se uklone ćelije i otpad (15 minuta na 3000 rpm) i nastali supernatant je filtriran (0.22 µm). Izbistreni uslovni medijumi su napunjeni u Protein A Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum je prvo koncentrovan i onda napunjen u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena sa ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na anjon zamenjujućoj smoli kao što je Q Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 16F12 proteine su Q Sepharose HP na pH 7.8-8.0. Antitela su isprana sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapreminama kolona.
PRIMER 8
Produkcija humanih 16F12 IgG2 antitela od transfektovanih ćelija
[0330] Ovaj primer ističe kako je antitelo 16F12 IgG2 produkovano iz transfektovanih ćelija. Ćelije (293 ćelije za prolaznu ekspresiju i CHO ćelije za stabilnu ekspresiju) su transfektovane sa plazmidima koji kodiraju teške i lake lance 16F12. Uslovni medijum iz hibridoma ćelija je oporavljen uklanjanjem ćelija i otpada. Pročišćeni uslovni medijum je napunjen u Protein A-Sepharose kolonu. Po potrebi, medijum se može prvo koncentrovati pa onda napuniti u Protein A Sepharose kolonu. Ne-specifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim ispiranjem sa PBS. Antitela vezana za proteine na Protein A koloni sa standardnim kiselim ispiranjem antitela sa Protein A kolonom (kao što je 50 mM citrat, pH 3.0). Sakupljena anatitela proteina u Protein A Sepharose skupu uklonjena su sa hromatografijom isključivanja veličine ili vezivanjem sa jono izmenjivačkom hromatografijom na anjon zamenjujućoj smoli kao što je SP Sepharose smola. Specifični IEX uslovi za 16F12 proteine su SP-Sepharose HP na pH 5.2. Antitela su isprana sa 25 kolonskim zapreminama pufera koji sadrži NaCl gradijent od 10 mM-500 mM u 20 mM natrijum acetatnog pufera.
PRIMER 9
Analiza sekvence teških i lakih lanaca antitela
[0331] Sekvence nukleinske kiseline i aminokiseline za lake i teške lance gornjih antitela određene su sa Sanger (dideoksi) nukleotidnim sekvenciranjem. Aminokiselinske sekvence su zatim izvedene za sekvence nukleinske kiseline. Sekvence nukleinske kiseline za varijabilne regione su prikazane u FIG.3E-3JJ.
[0332] cDNK sekvence za lambda laki lanac varijabilnog regiona od 31H4, 21B12, i 16F12 su određene i obelodanjne kao SEQ ID NO: 153, 95, i 105 respektivno.
[0333] cDNK sekvence za teški lanac varijabilnog regiona od 31H4, 21B12, i 16F12 su određene i obelodanjene kao SEQ ID NO: 152, 94, i 104 respektivno.
[0334] Lambda laki lanac konstantni region (SEQ ID NO: 156), i IgG2 i IgG4 teški lanac konstantni region (SEQ ID NO: 154 i 155) su prikazani u FIG.3KK.
[0335] Određene su polipeptidne sekvence predviđene od svake od tih cDNK sekvenci. Predviđene polipetidne sekvence za varijabilne regione lambda lakog lanca od 31H4, 21B12, i 16F12 su predviđene i obelodanjene u SEQ ID NO: 12, 23, i 35 respektivno, konstantni region lambda lakog lanca (SEQ ID NO: 156), varijabilni regioni teškog lanca 31H4, 21B12, i 16F12 su predviđeni i obelodanjeni kao (SEQ. ID NO. 67, 49, i 79 respektivno. IgG2 i IgG4 konstantni regioni lambda teškog lanca (SEQ ID NO: 154 i 155).
[0336] FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 deobe su prikazane u FIG 2A-3D.
[0337] Na osnovu podataka o sekvenci, određeni su geni germinativne linije iz kojih su svaki varijabilni region teškog lanca ili lakog lanca izvedeni. Identitet gena germinativne linije je naznačen u susedstvu odgovarajuće linije hibridoma u FIG. 2A-3D i svaka je predstavljena sa SEQ ID NO. FIG. 2A-3D takođe opisuju sekvence određenih aminokiselina za dodatna antitela koja su okarakterisana.
PRIMER 8
Određivanje izoelekričnih tačaka tri antitela
[0338] Teorijski pI-ovi antitela zasnovanih na aminokiselinskoj sekvenci su određeni da imaju vrednosti 7.36 za 16F12; 8.47 za 21B 12; i 6.84 za 31H4.
PRIMER 9
Karakterizacija vezivanja antitela za PCSK9
[0339] Pošto je identifikovan broj antitela koja se vezuju za PCSK9, upotrebljeno je nekoliko pristupa da se kvantifikuje i dalje okarakteriše priroda vezivanja. U jednom aspektu studije, obavljena je Biacore analiza afiniteta. U drugom aspektu studije obavljena je KinExA<®>analiza afiniteta. Upotrebljeni uzorci i puferi u ovim studijama su dole prikazani u Tabeli 6.
TABELA 6
Merenje afiniteta BIAcore<®>
[0340] BIAcore® (naprava za površinsku rezonancu plazmona, Biacore, Inc., Piscataway, NJ) analiza afiniteta za 21B12 antitela za PCSK9 opisana u Primeru je izvedena prema uputstvima proizvođača.
[0341] Ukratko, eksperimenti površinske rezonance plazmona izvedeni su koristeći Biacore 2000 optičke biosenzore (Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Svako pojedinačno anti-PCSK9 antitelo je imobilizirano u istraživačkom-stepenu CM5 biosenzor čipu putem amin-sjedinjavanja u nivoima koji daju maksimum odgovora vezivanja komponente (Rmax) ne više od 200 jedinica rezonanse (RU). Koncentracija PCSK9 proteina je menjana u 2-strukim intervalima (komponenta) i injektovana je preko imobilizirane površine antitela (u stopi protoka od 100 µl/min tokom 1.5 minuta). Svež HBS-P pufer (pH 7.4, 0.01 M Hepes, 0.15 M NaCl, 0.005% površinsko sredstvo P-20, Biacore) snabdeven sa 0.01% BSA je upotrebljen kao pufer za vezivanje. Afiniteti vezivanja svakog anti-PCSK9 antitela su izmereni u odvojenim eksperimentima protiv svakog od humanih, mišjih, i rezus majmuna PCSK9 proteina na pH 7.4 (upotrebljene koncentracije bile su 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, i 0 nM).
[0342] Sem toga, takođe su izmereni afiniteti vezivanja antitela za humani PCSK9 pri pH 6.0 sa pH 6.0 HBS-P puferom (pH 6.0, 0.01 M Hepes, 0.15 M NaCl, 0.005% površinsko sredstvo P-20, Biacore) snabdevenim sa 0.01% BSA. Dobijeni signal vezivanja je proporcionalan slobodnom PCSK9 u rastvoru. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) je dobijena putem nelinearne regresione analize kompetitivnih krivi koristeči dvostruku krivu modela homogenog vezivanja na jednom mestu (KinExA® softver, Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID) (n=1 za 6.0 pH tura).
Interesantno je da se pokazalo da antitela pokazuju čvršći afinitet vezivanja pri nižem pH (kada je Kd bio 12.5, 7.3, i 29 pM za 31H4, 21B12, i 16F12 respektivno).
[0343] Parametri kinetike vezivanja antitela uključujući ka(konstanta stope vezivanja), kd(konstanta stope disocijacije), i KD(konstanta ravnotežne disocijacije) su određeni koristeći BIA procenu 3.1 računarski program (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ). Niža konstanta ravnotežne disocijacije ukazuje na viši afinitet antitela za PCSK9. KDvrednosti određene sa BIAcore<®>analizom afiniteta predstavljene su u Tabeli 7.1, prikazanoj dole.
TABELA 7.1
Tabela 7.2 prikazuje koni koffstope.
TABELA 7.2
Merenje afiniteta KinExA®
[0344] KinExA® (Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID) analiza afiniteta 16F12 i 31H4 je obavljena prema uputstvima proizvođača. Ukratko, Reach-Gel™ (6x) (Pierce) su pre-obavijene sa humanim, V5-tagovanim rezus ili His-tagovanim mišjim PCSK9 proteinima i blokirani sa BSA. 10 ili 100 pM od svakog antitela 16F12 ili antitela 31H4 i jedan od PCSK9 proteina su zatim inkubirani sa različitim koncentracijama (0.1 pM - 25 nM) od PCSK9 proteina na sobnoj temperaturi tokom 8 časova pre nego što su propušteni kroz PCSK9-obavijene perle. Količina perla-vezanih 16F12 ili 31H4 je kvantifikovana sa fluorescentno (Cy5) obeleženim kozjim antihumanim IgG (H+L) antitelom (Jackson Immuno Research). Signal vezivanja je proporcionalan koncentraciji slobodnog 16F12 ili 31H4 u ravnoteži vezivanja. Konstanta ravnotežne disocijacije (KD) je dobijena putem nelinearne regresivne analize kompetitivnih krivi koristeći dvostruku krivu modela homogenog vezivanja na jednom mestu. KinExA® Pro softver je upotrebljen u analizi. Krive vezivanja generisane u ovoj analizi su predstavljene kao FIG.4A-4F.
[0345] I 16F12 i 31H4 antitela pokazala su sličan afinitet za humani i od rezus majmuna PCSK9, ali približno 10-250 puta manji afinitet za mišji PCSK9. Od dva testirana antitela koristeći KinExA<®>sistem, antitelo 31H4 je pokazalo viši afinitet i za humani i od rezus majmuna PCSK9 sa 3 i 2 pM KD, respektivno.16F12 je pokazao neznatno slabiji afinitet pri 15pM KDza humani PCSK9 i 16 pM KDza rezus majmuna PCSK9.
[0346] Rezultati KinExA<®>analize afiniteta sumirani su u Tabeli 8.1 prikazanoj dole.
TABELA 8.1
[0347] Sem toga, SDS PAGE je pokrenut da se proveri kvalitet i kvantitet uzoraka i prikazan je na FIG. 5A. cPCSK9 je pokazao oko 50% manje na gelu i takođe na osnovu koncentracije aktivnog vezivanja izračunate iz KinExA® ogleda. Prema tome, KDod mAbs do cPCSK9 je doterana kao 50% od aktivnog u prisutnom cPCSK9.
[0348] BIAcore rastvor ogleda ravnotežnog vezivanja je upotrebljen da se izmere Kd vrednosti za AVP 21B12.21B12.1 je pokazao mali signal koristeći KinExA ogled, prema tome, primenjen je biacore rastvor ogled ravnoteže. Pošto nije zapaženo značajno vezivanje na vezivanju antitela za imobilisanu površinu PCSK9, 21B12 antitelo je imobilisano protokom ćelija 4 od CM5 čipom koristeći amin sjedinjavanje sa gustinom oko 7000 RU. Protok ćelija 3 je upotrebljen kao pozadinska kontrola. 0.3, 1, i 3 nM od humanog PCSK9 ili od rezus majmuna PCSK9 su pomešani sa serijskim razblaženjima od 21B12.1 uzoraka antitela (u rasponu od 0.001 ~ 25 nM) u PBS plus 0.1mg/ml BSA, 0.005% P20. Vezivanje slobodnog PCSK9 u mešanim rastvorima je mereno putem ubrizgavanja preko 21B12.1 površine antitela. 100% PCSK9 signala vezivanja na površinu 21B12.1 je određeno u odsustvu mAb u rastvoru. Smanjen PCSK9 odgovor vezivanja sa rastućim koncentracijama od mAb ukazalo je na vezivanje PCSK9 za mAb u rastvoru, što je blokiralo PCSK9 da se veže za imobilizovanu peptidnu površinu. Plotovanjem PCSK9 signala vezivanja u odnosu na koncentracije mAb, izračunat je KDiz tri seta krivih (0.3, 1 i 3nM fiksirana PCSK9 koncentracija) koristeći model homogenog vezivanja na jednom mestu u KinExA Pro™ softveru. Iako cPCSK9 ima nižu koncentraciju proteina zapaženu iz KinExA ogleda i SDS-gela, njegova koncentracija nije ovde doterana pošto koncentracija od cPCSK9 nije upotrebljena za izračunavanje KD. Rezultati su prikazani u Tabeli 8.2 niže i FIG.5B-5D. FIG.5B prikazuje rezultate iz ogleda ravnotežnog rastvora za tri različite koncentracije hPCSK9 za hPCSK9. FIG. 5C prikazuje slični set rezultata za mPCSK9. FIG. 5D prikazuje rezultate iz gornjeg biacore ogleda hvatanja.
TABELA 8.2
PRIMER 10
Bining epitopa
[0349] Kompeticiona ELISA je upotrebljena za bining anti-PCSK9 antitela. Ukratko, da bi se odredilo da li dva antitela pripadaju istom epitop binu, jedno od antitela (mAb1) je prvo obavijeno na ELISA ploču (NUNC) u 2 µg/ml putem inkubacije preko noći. Ploča je zatim isprana i blokirana sa 3% BSA. U međuvremenu, 30 ng/ml biotiniliranog hPCSK9 je inkubirano sa drugim antitelom (mAb2) tokom 2 časa na sobnoj temperaturi. Mešavina je primenjena na obavijeni mAb1 i inkubirana tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. ELISA ploča je zatim isprana i inkubirana sa Neutravidin-HRP (Pierce) na razblaženjima od 1:5000 tokom 1 časa. Nakon drugog ispiranja, ploča je inkubirana sa TMB supstratom i signal je detektovan na 650 nm koristeći Titertek čitač ploča. Antitela sa istim profilima vezivanja su grupisana zajedno u isti epitop bin. Rezultati studija biniga antitela predstavljeni su u Tabeli 8.3.
TABELA 8.3
[0350] Dodatno ispitivanje bininga epitopa izvedeno je koristeći BIAcore. Tri mAb, 16F12, 21B12 i 31H4, su imobilisani na protoku ćelija 2, 3 i 4 sa gustinom oko 8000 RU.5 nM PCSK9 od čoveka, miša i rezus majmuna su ubrizgani preko površina mAb da se dostigne oko 100 do 500 RU. 10nM mAbova su ubrizgani preko površine PCSK9. Zatim je zabeleženo vezivanje tri mAb za tri različita PCSK9 proteina preko tri mAb.
[0351] Ako dva mAb imaju slični epitop na antigenu, mAb 1 neće pokazati vezivanje za antigen koji je već vezan za mAb 2. Ako dva mAb imaju različite epitope na antigenu, mAb1 će pokazati vezivanje za antigen vezan za mAb2. FIG. 5E prikazuje te epitop bining rezultate u obliku grafikona za tri mAb na humanom PCSk9. Sličan obrazac je zapažen za mPCSK9 i cPCSK9. Kao što je prikazano na grafikonu, 16F12 i 31H4 izgleda da dele sličan epitop, dok 21B12 izgleda da ima različit epitop.
PRIMER 11
Efikasnost 31H4 i 21B12 u blokiranju vezivanja D374Y PCSK9/LDLR
[0352] Ovaj primer obezbeđuje IC50 vrednosti za dva antitela u blokiranju sposobnosti PCSK9 D374Y da se vezuje za LDLR. Providne ploče sa 384 bunarčića (Costar) obavijene su sa 2 mikrograma/ml kozjeg anti-LDL receptor antitela (R&D Systems) razblaženog u puferu A (100 mM natrijum kakodilat, pH 7.4). Ploče su snažno isprane sa puferom A i zatim blokirane tokom 2 časa sa puferom B (1% mleko u puferu A). Nakon ispiranja, ploče su inkubirane tokom 1.5 časa sa 0.4 mikrograma/ml od LDL receptora (R&D Systems) razblaženog u puferu C (pufer B snabdeven sa 10 mM CaCl2). Istovremeno sa ovom inkubacijom, 20 ng/ml biotiniliranog D374Y PCSK9 je inkubirano sa različitim koncentracijama 31H4 IgG2, 31H4 IgG4, 21B12 IgG2 ili 21B12 IgG4 antitela, koje je razblaženo u puferu A, ili samom puferu A (kontrola). Ploče koje su sadržale LDL receptor su isprane i biotinilirane D374Y PCSK9/antitelo mešavina je preneta u njih i inkubirana tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Vezivanje biotiniliranog D374Y za LDL receptor je detektovano inkubacijom sa streptavidin-HRP (Biosource) na 500 ng/ml u puferu C praćenog sa TMB supstratom (KPL). Signal je ugašen sa 1N HCl i apsorbanca je očitana na 450 nm.
[0353] Rezultati ovog vezivanja prikazani su na FIG. 6A-6D. Sumarizovano, IC50vrednosti su određene za svako antitelo i nađeno je da su bile 199 pM za 31H4 IgG2 (FIG. 6A), 156 pM za 31H4 IgG4 (FIG.6B), 170 pM za 21B12 IgG2 (FIG.6C), i 169 pM za 21B12 IgG4 (FIG.6D).
[0354] Antitela su takođe blokirala vezivanje divljeg tipa PCSK9 za LDLR u tom ogledu.
PRIMER 12
Ogled uzimanja LDL od strane ćelije
[0355] Ovaj primer pokazuje sposobnost različitih antigen vezjućih proteina da redukuju uzimanje LDL od strane ćelija. Humane HepG2 ćelije su zasejane u crne ploče sa prozirnim sa 96-bunarčića (Costar) u koncentraciji od 5×10<5>ćelija po bunarčiću DMEM medijumu (Mediatech, Inc) snabdevenim sa 10% FBS i inkubirane na 37 °C (5% CO2) preko noći. Da se formira kompleks PCSK9 i antitelo, 2 µg/ml od D374Y humanog PCSK9 je inkubirano sa različitim koncentracijama antitela razblaženim u puferu za uzimanje (DMEM sa 1% FBS) ili samom puferu za uzimanje (kontrola) tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja ćelija sa PBS, mešavina D374Y PCSK9/antitelo je preneta u ćelije, a nakon toga u LDL-BODIPY (Invitrogen) razblaženim u puferu za uzimanje u konačnoj koncentraciji od 6 µg/ml. Nakon inkubacije tokom 3 časa na 37 °C (5% CO2), ćelije su snažno isprane sa PBS i fluorescentni signal ćelije je detektovan sa Safire™ (TECAN) na 480-520nm (ekscitacija) i 520-600nm (emisija).
[0356] Rezultati ogleda ćelijskog uzimanja prikazani su na FIG. 7A-7D. Sumarizovano, IC50vrednosti su određene za svako antitelo i nađeno je da su bile 16.7 nM za 31H4 IgG2 (FIG.7A), 13.3 nM za 31H4 IgG4 (FIG. 7B), 13.3 nM za 21B12 IgG2 (FIG. 7C), i 18 nM za 21B12 IgG4 (FIG. 7D). Ovi rezultati pokazuju da primenjeni antigen vezujući proteini mogu redukovati efekat PCSK9 (D374Y) da blokira LDL uzimanje od strane ćelija Antitela su takođe blokirala efekat divljeg tipa PCSK9 u ovom ogledu.
PRIMER 13
Efekat snižavanja holesterola u serumu sa 31H4 antitelom u 6. danu studije
[0357] Sa ciljem da se proceni snižavanje ukupnog holesterola u serumu (TC) u divljem tipu (WT) miševa putem terapije antitelom protiv PCSK9 proteina, izvedena je sledeća procedura.
[0358] Mužjaci WT miševa (C57BL/6 soj, starosti 9-10 nedelja, 17-27 g) dobijeni od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) hranjeni su normalnom hranom (Harland-Teklad, Diet 2918) tokom trjanja eksperimenta. Miševima je davano ili anti-PCSK9 antitelo 31H4 (2 mg/ml u PBS) ili kontrolni IgG (2 mg/ml u PBS) u nivoima od 10mg/kg kroz repnu venu miša pri T=0. Ne tretirani miševi su takođe postavljeni sa strane kao prirodna kontrolna grupa. Dozirane grupe i vreme žrtvovanja su prikazani u Tabeli 9.
TABELA 9
[0359] Miševi su žrtvovani sa CO2 asfihijacijom u prethodno određenim vremenskim tačkama prikazanim u Tabeli 9. Sakupljena je krv preko vena cava u eppendorf tube i ostavljena je da se zgrušava na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Uzorci su zatim oboreni u stonoj centrifugi na 12000xg tokom 10 minuta da se razdvoji serum. Ukupni holesterol u serumu i HDL-C su mereni koristeći Hitachi 912 klinički analizator i Roche/Hitachi TC i HDL-C kitove.
[0360] Rezultati eksperimenta su prikazani na FIG. 8A-8D. Sumarizovano, miševi kojima je davano antitelo 31H4 pokazali su smanjenje nivoa holesterola u serumu tokom trajanja eksperimenta (FIG. 8A i FIG. 8B). Sem toga, zapaženo je da su miševi takođe pokazali smanjenje nivoa HDL (FIG. 8C i FIG. 8D). Za FIG. 8A i FIG. 8C, procenat promene u odnosu na kontrolu IgG u istoj vremenskoj tački (*P<0.01, # P<0.05). Za FIG. 8B i FIG 8D, procenat promene u odnosu na ukupni holesterol u serumu i nivoe HDL merene kod prirodnih životinja na t=0 č (*P<0.01, # P<0.05).
[0361] U odnosu na snižavanje nivoa HDL, napomenuto je da će stručnjak shvatiti da smanjenje HDL kod miševa nije znak da će se smanjenje HDL dogoditi kod ljudi i jednostavno dalje reflektuje da su nivoi holesterola u serumu u organizmu smanjeni. Primećeno je da miševi transportuju glavninu serum holesterola u česticama lipoproteina visoke gustine (HDL) koje su različite kod ljudi koji nose glavninu serum holesterola na LDL česticama. Kod miševa merenje ukupnog serum holesterola najbliže prati nivo serum HDL-C. Mišji HDL sadrži apolipoprotein E (apoE) koji je veznik za LDL receptor (LDLR) i omogućuje mu da se očisti od LDLR. Prema tome, isptivanje HDL je odgovarajući indikator za pvaj primer, kod miševa (uz razumevanje da smanjenje u HDL nije očekivano za ljude). Na primer, humani HDL, nasuprot tome, ne sadrži apoE i nije veznik za LDLR. Pošto PCSK9 povećavaju ekspresiju LDLR kod miša, jetra može očistiti više HDL i, prema tome, sniziti nivoe serum HDL-C.
PRIMER 14
Efekat antitela 31H4 na nivoe LDLR u studiji od 6 dana
[0362] Ovaj primer pokazuje da antigen vezujući protein menja nivo LDLR kod subjekta, kao što je predviđeno, tokom vremena. Western blot analiza izvedena je sa ciljem da potvrdi efekat antitela 31H4 na nivoe LDLR.50-100 mg tkiva jetre dobijenog od žrtvovanih miševa opisanih u Primeru 13 je homogenizovano u 0.3 ml RIPA pufera (Santa Cruz Biotechnology Inc.) koji je sadržao kompletan inhibitor proteaze (Roche). Homogenat je inkubiran na ledu tokom 30 minuta i centrifugiran da se istaloži ćelijski otpad. Koncentracija proteina u supernatantu je merena koristeći reagense za BioRad protein ogled (BioRad laboratorije).100µg proteina je denaturisano na 70 °C tokom 10 minuta i odvojeno na 4-12% Bis-Tris SDS gradijent gelu (Invitrogen). Proteini su preneti u 0.45 µm PVDF membrane (Invitrogen) i blokirani u puferu za ispiranje (50mM Tris PH7.5, 150mM NaCL, 2mM CaCl2i 0.05% Tween 20) koji je sadržao 5% nemasnog mleka tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Blot je zatim proban sa kozjim anti-miš LDLR antitelom (R&D system) 1:2000 ili anti-ß aktin (sigma) 1:2000 tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Blot je ispran snažno i inkubiran sa goveđim anti-koza IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) 1:2000 ili kozjim anti-miš IgG-HRP (Upstate) 1:2000. Nakon 1 časa inkubacije na sobnoj temperaturi, blot je potpuno ispran i imuno reaktivne trake su detektovane koristeći ECL plus kit (Amersham biosciences). Western blot je pokazao povećanje u nivoima LDLR proteina u prisustvu antitela 31H4, kao što je prikazano na FIG.9.
PRIMER 15
Efekat snižavanja holesterola u serumu od antitela 31H4 u studiji od 13 dana
[0363] Sa ciljem da se proceni snižavanje ukupnog serum holesterola (TC) u miševima divljeg tipa (WT) preko terapije antitelom protiv PCSK9 proteina u studiji od 13 dana, izvedena je sledeća procedura.
[0364] Mužjaci WT miševa (C57BL/6 soj, starosti 9-10 nedelja, 17-27 g) dobijeni od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) normalno su hranjeni (Harland-Teklad, Diet 2918) tokom trajanja eksperimenta. Miševima je davano ili anti-PCSK9 antitelo 31H4 (2 mg/ml in PBS) ili kontrolni IgG (2 mg/ml in PBS) u nivou od 10 mg/kg kroz repnu venu miša na T=0. Prirodni miševi su takođe stavljeni sa strane kao prirodna kontrolna grupa.
[0365] Grupe doza i vreme žrtvovanja prikazani su u Tabeli 10. Životinje su žrtvovane i isečene su im jetre i pripremljene kao u Primeru 13.
TABELA 10
[0366] Kada je eksperiment od 6 dana proširen do studije od 13 dana, zapažen je isti efekat snižavanja serum holesterola kao i u studiji od 6 dana takođe i u studiji od 13 dana. Određenije, životinje dozirane sa 10 mg/kg pokazale su 31 % smanjenje u serum holesterolu 3 dana, što se postupno vratilo na pre-dozne nivoe u 13 danu. FIG.10A prikazuje rezultate ovog eksperimenta. FIG. 10C prikazuje rezultate ponavljanja gornje procedure sa 10mg/kg dozom od 31H4, i sa drugim antitelom, 16F12, takođe na 10mg/kg. Dozne grupe i vreme žrtvovanja su prikazani u Tabeli 11.
TABELA 11
[0367] Kao što je prikazano na FIG.10C i 16F12 i 31H4 su rezultirali sa značajnim i suštinskim smanjenjem ukupnog serum holesterola nakon samo jedne doze i obezbedili su korist tokom preko jedne nedelje (10 dana ili više). Rezultati iznete studije od 13 dana bili su konzistentni sa rezultatima prvog od 13 dana studije, sa zapaženim smanjenjem u nivoima serum holesterola od 26% u danu 3. Za FIG. 10A i FIG. 10B, procenat promene je u odnosu na kontrolni IgG u istoj vremenskoj tački (*P<0.01). Za FIG.10C, procenat promene je u odnosu na kontrolni IgG u istoj vremenskoj tački (*P<0.05).
PRIMER 16
Efekat antitela 31H4 na nivoe HDL u studiji od 13 dana
[0368] Nivoi HDL za životinje u Primeru 15 su takođe ispitani. Nivoi HDL se smanjuju kod miševa. Još određenije, životinje dozirane sa 10 mg/kg pokazale su 33% smanjenje u nivoima HDL 3 dana, što se postupno vratilo na pre-dozne nivoe u danu 13. FIG.10B prikazuje rezultate eksperimenta. Postojalo je smanjenje u nivoima HDL od 34% u danu 3. FIG. 10B prikazuje rezultate ponovljenog eksperimenta 13 dana.
[0369] Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, iako će antitela snižavati mišji HDL, ne očekuje se da se to dešava kod ljudi zbog razlika u HDL kod ljudi i drugih organizama (kao što su miševi). Prema tome, smanjenje u mišjem HDL nije indikativno za smanjenje u humanom HDL.
PRIMER 17
Ponovljeno davanje antitela produkuje kontinuirane koristi od antigen vezujućih peptida [0370] Sa ciljem da se verifikuje da se rezultati dobijeni u Primerima gore mogu produžiti u dalje koristi sa dodatnim dozama, ponovljeni su eksperimenti iz Primera 15 i 16 sa procedurom doziranja prikazanom na FIG. 11A. Rezultati su prikazani na FIG. 11B. Kao što se može videti na grafikonu u FIG.11B, dok su oba seta miševa pokazali značajno smanjenje u ukupnom serum holesterolu zato što su svi miševi primili početnu injekciju 31H4 antigen vezujućeg proteina, miševi koji su primili dodatnu injekciju 31H4 AVP pokazali su kontinuiranu redukciju ukupnog serum holesterola, dok su oni koji su primili samo kontrolnu injekciju eventualno pokazali povećanje ukupnog serum holesterola. Za FIG. 11, procenat promene u odnosu na prirodne životinje na t=0 časova (∗P<0.01, ∗∗P <0.001).
[0371] Rezultati iz ovog primera pokazuju da, za razliku od drugih postupaka tretmana holesterola, u kojima ponovljena primena dovodi do redukcije u efikasnosti zbog bioloških doterivanja kod subjekta, predmetni pristup ne izgleda da pati od toga tokom vremena koje je ispitano. Štaviše, ovo sugeriše da povratak nivoa ukupnog serum holesterola ili HDL holesterola na polaznu osnovu, zapažen u prethodnim primerima, nije rezultat neke otpornosti na tretman koji je razvijen od strane subjekta, već pre od iscrpljivanja dostupnosti antitela kod subjekta.
PRIMER 18
Mapiranje epitopa humanih anti PCSK9 antitela
[0372] Ovaj primer ističe metode za određivanje koji su ostaci u PCSK9 uključeni u formiranje dela epitopa za antigen vezujuće proteine ovde obelodanjene za PCSK9.
[0373] Sa ciljem da se odrede epitopi za koje se određeni AVP pogodni za upotrebu prema ovom pronalasku vezuju, epitopi AVP mogu da se mapiraju koristeći sintetičke peptide izvedene od specifične sekvence PCSK9 peptida.
[0374] Peptidna područja SPOT (Sigma Genosys) mogu se upotrebiti da se ispituju molekularne interakcije humanih anti-PCSK9 antitela sa njihovim peptidnim epitopom. SPOT tehnologija je zasnovana na sintezi peptida čvrste faze u formatu pogodnom za sistematsku analizu epitopa antitela. Sinteza uobičajene matrice oligopeptida dostupna je komercijalno od strane Sigma-Genosys. Može se dobiti peptidna matrica preklopljenih oligopeptida izvedenih iz aminokiselinske sekvence od PCSK9 peptida. Matrica može sadržati seriju od 12-mer peptida kao tačaka na polipropilenskom membranskom listu. Peptidna matrica može obuhvatiti celu dužinu zrele sekvence PCSK9. Svaki uzastopni peptid može se predstaviti sa 1 ostatkom od prethodnog, dajući uklopljenu, preklapajuću biblioteku matrica oligopeptida. Membrana koja nosi peptide može reagovati sa različitim anti-PCSK9 antitelima (1 mikrogram/ml). Vezivanje mAb za peptide vezane za membranu može se proceniti sa imuno ogledom vezanim za enzime koristeći HRP-konjugovano sekundarno antitelo, a nakon toga sa pojačanom hemiluminescencijom (ECL).
[0375] Sem toga, funkcionalni epitopi mogu se mapirati sa kombinatornim skeniranjem alanina. U tom procesu može se upotrebiti kombinatorna alanin-skening strategija da se identifikuju aminokiseline PCSK9 proteina koje su neophodne za interakciju sa anti-PCSK9 AVP. Da se to postigne, može se upotrebiti drugi set SPOT matrica za skeniranje alanina. Panel varijantnih peptida sa supstitucijama alanina u svakom od 12 ostataka može se skenirati kao i gore. To će omogućiti da epitopi za AVP za humani PCSK9 budu mapirani i identifikovani.
[0376] U alternativnom načinu, pod uslovom da je moguće da je epitop konformacioni, mogu se upotrebiti kombinacija skeniranja alanina i/ili skeniranja arginina, kokristalizacije antitela FAB/PCSK9, i ograničene proteolize/LC-MS (tečna hromatografija masenog spek.) da se identifikuju epitopi.
PRIMER 19
Upotreba PCSK9 antitela za tretman poremećaja vezanih sa holesterolom
[0377] Humani pacijent koji pokazuje poremećaj vezan za holesterol (u kojem redukcija u holesterolu (kao što je serum holesterol) može biti korisna) je primio terapeutski efektivnu količinu PCSK9 antitela, 31H4 (ili, na primer, 21B12 ili 16F12). U određenim periodima vremena tokom tretmana, pacijent je posmatran da se odredi da li su simptomi poremećaja opali. Nakon tretmana, nađeno je da pacijent koji je prolazio kroz tretman sa PCSK9 antitelom ima redukovane nivoe serum holesterola, u poređenju sa pacijentima koji nisu tretirani.
PRIMER 20
Upotreba PCSK9 antitela za tretman hiperholesterolemije
[0378] Humani pacijent koji pokazuje simptome hiperholesterolemije je tretiran sa terapeutski efektivnom količinom PCSK9 antitela, kao što je 31H4 (ili, na primer, 21B12 ili 16F12). U određenim periodima vremena tokom tretmana, pacijent je posmatran da se odredi da li je opao nivo serum holesterola. Nakon tretmana, nađeno je da pacijent koji je primio tretman sa PCSK9 antitelima ima redukovane nivoe serum holesterola u poređenju sa pacijentima sa artritisom koji nisu primili tretman.
PRIMER 21
Upotrebe PCSK9 antitela za prevenciju koronarnih srčanih bolesti i/ili povratnih kardiovaskularnih događaja
[0379] Identifikovan je humani pacijent koji je pod rizikom da razvije koronarnu srčanu bolest. Pacijentu je davana terapeutski efektivna količina PCSK9 antitela, kao što su 31H4 (ili, na primer, 21B12 ili 16F12), bilo sami, konkurentno ili uzastopno sa statinom, npr., simvastatinom. U određenim periodima vremena tokom tretmana, humani pacijent je praćen da se odredi da li su se pacijentovi ukupni nivoi serum holesterola promenili. Tokom preventivnog tretmana, nađeno je da pacijent koji je primio tretman sa PCSK9 antitelima ima redukovan serum holesterol smanjujući tako njegov rizik od koronarne srčane bolesti ili povratka kardiovaskularnih događaja u poređenju sa pacijentima koji nisu primili tretman.
PRIMER 22
Upotreba PCSK9 antitela kao dijagnostičkog agensa
[0380] Enzim-vezani imunosorbent ogled (ELISA) za detekciju PCSK9 antigena u uzorku može se upotrebiti da se dijagnostifikuju pacijenti koji pokazuju visoke nivoe produkcije PCSK9. U tom ogledu, bunarčići mikrotitar ploče, kao što je mikrotitar ploča sa 96-bunarčića ili mikrotitar ploča sa 384-bunarčića, su apsorbovani nekoliko časova sa prvim potpuno humanim monoklonalnim antitelom usmernim protiv PCSK9. Imobilizirano antitelo služi kao antitelo za zarobljavanje za bilo koji PCSK9 koji može biti prisutan u test uzorku. Bunarčići su isprani i tretirani sa agensom za blokiranje kao što je protein mleka ili albumin da se spreči nespecifična apsorpcija na sastojak.
[0381] Nakon toga, bunarčići su tretirani sa test uzorkom suspektnim da sadrži PCSK9, ili sa rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Takav uzorak može biti, na primer, uzorak seruma od pacijenta koji je pod sumnjom da ima nivoe antigena u cirkulaciji koji se smatraju dijagnostičkim za patologiju.
[0382] Nakon ispiranja test uzorka ili standarda, bunarčići su tretirani sa drugim potpuno humanim monoklonalnim PCSK9 antitelom koje je obeleženo konjugovanjem sa biotinom. Takođe se može upotrebiti monoklonalno ili mišje ili poreklom od druge vrste. Obeleženo PCSK9 antitelo služi kao antitelo za detekciju. Nakon ispiranja viška sekundarnog antitela, bunarčići su tretirani sa avidin-konjugovanom peroksidazom rena (HRP) i pogodnim hromogenim supstratom. Koncentracija antigena u test uzorcima je određena putem poređenja sa standardnom krivom razvijenom iz standardnih uzoraka.
[0383] Ovaj ELISA ogled obezbeđuje visoku specifičnost i vrlo osetljiv ogled za detekciju PCSK9 antigena u test uzorku.
Određivanje koncentracije PCSK9 proteina kod subjekata
[0384] Sendvič ELISA može kvantifikovati nivoe PCSK9 u humanom serumu. Dva potpuno humana monoklonalna PCSK9 antitela iz sendvič ELISA, prepoznaju različite epitope na PCSK9 molekulu. Alternativno mogu da se upotrebe monoklonalna antitela miša ili ona poreklom od druge vrste. ELISA je izvedena na sledeći način: 50 µL PCSK9 antitela za hvatanje u puferu za obavijanje (0.1 M NaHCO3, pH 9.6) u koncentraciji od 2 µg/mL je obavijeno na ELISA ploče (Fisher). Nakon inkubacije na 4° C preko noći, ploče su tretirane sa 200 µL pufera za blokiranje (0.5% BSA, 0.1% Tween 20, 0.01% Timerosal u PBS) tokom 1 časa na 25° C. Ploče su isprane (3x) koristeći 0.05% Tween 20 u PBS (puferu za ispiranje, WB). Normalni ili serumi pacijenta (Clinomics, Bioreclaimation) su razblaženi u puferu za blokiranje koji je sadržao 50% humanog seruma. Ploče su inkubirane sa uzorcima seruma preko noći na 4° C, isprane sa WB, i zatim inkubirane sa 100 µL/bunarčić od biotiniliranog detekcionog PCSK9 antitela tokom 1 časa na 25° C. Nakon ispiranja, ploče su inkubirane sa HRP-Streptavidinom tokom 15 minuta, isprane kao i prethodno, i zatim tretirane sa 100 µL/bunarčić od ofenilenediamina u H2O2(Sigma rastvor za razvijanje) za generisanje boje. Reakcija je zaustavljena sa 50 µL/bunarčić od H2SO4(2M) i analizirana koristeći ELISA čitač ploča na 492 nm. Koncentracija PCSK9 antigena u uzorcima seruma je izračunata putem poređenja razblaženja prečišćenog PCSK9 antigena koristeći program fitovanja četvoro parametarske krive.
Određivanje koncentracije PCSK9 varijante proteina kod subjekata
[0385] Koraci istaknuti gore mogu se izvesti koristeći antitela koja su zabeležena ovde i koja se vezuju i za divlji tip PCSK9 i varijantu PCSK9 (D374Y). Dalje se mogu upotrebiti antitela koja se vezuju za divlji tip ali ne i za mutant (ponovo koristeći slični protokol kao što je istaknut gore) da se odredi da li je PCSK9 prisutan kod subjekta divlji tip ili je D374Y varijanta. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati koji su pozitivni za obe ture biće divlji tip, dok će oni koji su pozitivni za prvu turu, ali ne i za drugu turu antitela, uključivati D374Y mutaciju. Postoje visoke frekvence mutacija u populaciji koje su poznate i mogu imati koristi posebno od agensa kao što su AVP obelodanjeni ovde.
PRIMER 23
Upotreba PCSK9 antigen vezujućeg proteina za prevenciju hiperholesterolemije
[0386] Humani pacijent koji je pod rizikom da razvije hiperholesterolemiju je identifikovan preko analize porodične istorije i/ili stila života, i/ili trenutnih nivoa holesterola. Subjektu je regularno davana (npr., jednom nedeljno) terapeutski efektivna količina PCSK9 antitela, 31H4 (ili, na primer, 21B12 ili 16F12). U određenim vremenskim periodima tokom tretmana, pacijent je praćen da se odredi da li su se nivoi serum holesterola smanjili. Nakon tretmana, nađeno je da subjekti koji su prošli kroz preventivni tretman sa PCSK9 antitelima imaju snižene nivoe serum holesterola, u poređenju sa subjektima koji nisu tretirani.
PRIMER 24
PCSK9 AVP dalje regulišu LDLR u prisustvu statina
[0387] Ovaj primer pokazuje da AVP za PCSK9 produkuju dalje povećanje dostupnosti LDLR kada se upotrebe u prisustvu statina, pokazujući da se dalje koristi mogu postići kombinovanom upotrebom ova dva.
[0388] HepG2 ćelije su zasejane u DMEM sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i odgajene do -90% konfluence. Ćelije su tretirane sa naznačenim količinama mevinolina (statin, Sigma) i PCSK9 AVP (FIG. 12A-12C) u DMEM sa 3% FBS tokom 48 časova. Pripremljeni su ukupni ćelijski lizati. 50 mg ukupnih proteina je razdvojeno sa gel elektroforezom i preneto na PVDF membranu. Imunoblotovi su obavljeni koristeći zec anti-humani LDL receptor antitelo (Fitzgerald) ili zec anti-humana b-aktin antitela. Pojačani hemiluminescentni rezultati su prikazani na gornjim panelima FIG. 12A-12C. Intenziteti traka su kvantifikovani sa ImageJ sovtverom i normalizovani sa b-aktinom. Relativni nivoi LDLR su prikazani na panelima FIG.
12A-12C. AVP 21B12 i 31H4 su PCSK9 neutralizujuća antitela, dok 25A7.1 nije neutralizujuće antitelo.
[0389] Takođe su kreairane HepG2-PCSK9 ćelije. One su bile stabilna HepG2 ćelijska linija transfektovana sa humanim PCSK9. Ćelije su zasejane u DMEM sa 10% goveđim fetalnim serumom (FBS) i rasle do -90% konfluence. Ćelije su tretirane sa naznačenim količinama mevinolina (Sigma) i PCSK9 AVP (FIG. 12D-12F) u DMEM sa 3% FBS tokom 48 časova. Pripremljeni su ukupni ćelijski lizati. 50 mg ukupnih proteina je razdvojeno sa gel elektroforezom i preneto u PVDF membranu. Imunoblotovi su obavljeni koristeći zec antihumani LDL receptor antitelo (Fitzgerald) ili zec anti-humani b-aktin antitelo. Pojačani hemiluminescentni rezultati su prikazani na gornjim panelima. Intenziteti traka su kvantifikovani sa ImageJ softverom i normalizovani sa b-aktinom.
[0390] Kao što se može videti u rezultatima prikazanim na FIG. 12A-12F, povećane količine normalizujućeg antitela i povećane količine statina generalno rezultiraju povećanjem nivoa LDLR. Ovo povećanje u efektivnosti za povećane nivoe AVP je posebno evidentno u FIG.12D-12F, u kojima su ćelije takođe bile transfektovane sa PCSK9, omogućujući AVP da demonstriraju efektivnost u većem obimu.
[0391] Interesantno je da se, kao što je pokazano u rezultatima u poređenju FIG.12D-12F prema 12A-12C, uticaj koncentracija AVP na nivoe LDLR povećao dramatično kada je PCSK9 bio produkovan od strane ćelija. Sem toga, jasno je da neutralizovanje AVP (21B 12 i 31H4) rezultira većim povećanjem nivoa LDLR, čak i u prisustvu statina, nego za 25A7.1 AVP (neneutralizator), pokazujući da se mogu postići dodatne koristi od uporebe i statina i AVP za PCSK9.
PRIMER 25
Konsenzus sekvence
[0392] Konsenzus sekvence su određene koristeći standardnu filogenetsku analizu CDR koji odgovaraju VHi VLod anti-PCSK9 AVP. Konsenzus sekvence su određene održavajući CDR pripojene u okviru iste sekvence koja odgovara VHili VL. Ukratko, aminokiselinske sekvence koje odgovaraju celim varijabilnim domenima ili od VHili od VLsu pretvorene u FASTA formatirajući radi jednostavnosti u procesovanju komparativnih poklapanja i predviđanja filogeneze. Dalje su regioni skeleta ovih sekvenci zamenjeni sa veštačkom veznom sekvencom ("bbbbbbbbbb" čuvara mesta, ne-specifični konstrukt nukleinske kiseline) tako da samo ispitivanje CDR može da se obavi bez uvođenja pozicije bilo koje aminokiseline otežavajući neravnotežu zbog koincidentnih događaja (npr., kao što su ne srodna antitela koja slučajno dele uobičajeni nasledni skelet germinativne linije) održavajući još uvek CDR zajedno u okviru iste sekvence koja odgovara VHili VL. VHili VLsekvence ovog formata bile su zatim podvrgnute poklapanju radi utvrđivanja sličnosti koristeći program koji koristi standardni ClutalW-like algoritam (vidi, Thompson i sar., 1994, Nucleic Acids Res.22:4673-4680). Kazna stvaranja gapa od 8.0 je upotrebljena zajedno sa kaznom za proširivanje gapa od 2.0. Ovaj program takođe generiše filograme (ilustracije filogenetskog stabla) zasnovane na poklapanjima sličnosti sekvenci koristeći ili UPGMA (neuravnotežene grupe sparivanja koristeći aritmetičke srednje vrednosti) ili Neighbor-Joining metode (vidi, Saitou i Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4:406-425) da se konstruiše i ilustruje sličnost i udaljenost grupe sekvenci preko poređenja dužine grana i grupisanja. Oba metoda su produkovala slične rezultate ali UPGMA-izvedena stabla su definitivno upotrebljena kao metod koji koristi jednostavnije i mnogo konzervativnije pretpostavke. UPGMA-izvedena stabla su generisana tamo gde je za slične grupe sekvenci definisano da imaju manje od 15 supstitucija na 100 ostataka (vidi, legendu na ilustraciji drveta radi skaliranja) među pojedinačnim sekvencama u okviru grupe i upotrebljene su da se definiše kolekcija konsenzus sekvenci. Rezultati poređenja su prikazani na FIG. 13A-13J. U FIG. 13E, grupe su bile odabrane tako da su sekvence u lakom lancu te klade takođe klade u teškom lancu i imaju manje od 15 supstitucija.
[0393] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati predstavljeni na FIG. 13A-13J predstavljaju veliku količinu pokazatelja o tome koje su određene aminokiseline važne (na primer, one aminokiseline koje su konzervirane) i za koje pozicije aminokiseline je verovatno da će biti izmenjene (na primer, one pozicije koje imaju različite aminokiseline za različite AVP).
PRIMER 26
Mišji model za PCSK9 i AVP sposobnost snižavanja LDL in vivo
[0394] Za generisanje miša koji prekomerno eksprimira humani PCSK9, tri nedelje stari WT C57Bl/6 miševi su injektirani u repnu venu davanjem različitih koncentracija adeno vezanog virusa (AAV), rekombinantno modifkovani da eksprimira humani PCSK9, da odredi korektni titar koji će obezbediti povećanje LDL-holesterola koje se može meriti kod miševa. Koristeći ovaj određeni virus koji eksprimira humani PCSK9, određeno je da će 4.5 x 10E12 pfu od virusa rezultirati sa nivoom LDL-holesterola od približno 40mg/dL u cirkulišućoj krvi (normalni nivoi LDL kod WT miševa su približno 10 mg/dL). Nađeno je da su nivoi humanog PCSK9 kod tih životinja približno 13ug/mL. Generisana je kolonija miševa koristeći ove injekcione kriterijume.
[0395] Jednu nedelju nakon injekcije, miševi su procenjeni na nivoe LDL-holesterola, i po principu slučajnosti podeljeni u različite grupe za tretman. Životinje su zatim tretirane, putem injekcije u repnu venu, pojedinačne bolus injekcije ili od 10mg/kg ili 30mg/kg od 16F12, 21B12, ili 31H4 antigen vezujućih proteina. IgG2 AVP je davan u odvojenim grupama životinja kao doznih kontrola. Podgrupe životinja (n=6-7) su zatim eutanizovane 24 i 48 časova nakon AVP davanja. Nije bilo efekta na nivoe LDL-holesterola nakon IgG2 davanja u bilo kojoj dozi. I 31H4 i 21B 12 su pokazali značajno snižavanje LDL-holesterola do i uključujući 48 časova naknadnog davanja, u poređenju sa IgG2 kontrolom (prikazano na FIG. 14A i 14B u dve različite doze).
16F12 pokazuje intermedijerne odgovore snižavanja LDL-holesterola, sa nivoima koji se vraćaju na polaznu liniju približno od 40mg/dL u 48 časovnim vremenskim tačkama. Ovi podaci su konzistentni sa podacima in vitro vezivanja (Biacore i Kinexa), koji pokazuju ekvivalentne afinitete vezivanja koji su blizu između 31H4 i 21B 12, a i manji afinitet od 16F12 za humani PCSK9.
[0396] Kao što se može videti u rezultatima, ukupni holesterol i HDL-holesterol su redukovani sa PCSK9 AVP u modelu (i ukupno HDL-C su podignuti gore kod WT miševa zahvaljujući prekomernoj ekspresiji PCSK9). Dok izgleda da se snižavanje holesterola u ovom modelu dešava tokom realtivno kratkog perioda vremena, veruje se da je to zbog nivoa humanog PCSK9 koji je prisutan, što je suprafiziološki visoko u ovom modelu. Sem toga, pošto je ekspresija vođena sa AAV, ne postoji regulacija ekspresije PCSK9. U ovim slikama, (*) označava P<0.05, i (**) označava P<0.005 u poređenju sa nivoima LDL-holesterola zapaženim u IgG2 kontroli injektovanih životinja u istoj tački vremena. Nivo od 13 mikrograma/ml u serumu humanog PCSK9 kod miševa odgovara približno 520-puta povećanju iznad endogenih nivoa kod mišjeg PCSK9 (~ 25 ng/ml), i približno 75-puta povećanje iznad prosečnog humanog nivoa u serumu (~ 175 ng/ml). Prema tome, antigen vezujući proteini bi trebalo da su čak još više efikasni kod ljudi.
[0397] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, gornji rezultati pokazuju da prikladnost mišjeg modela za testiranje antigen vezujućih proteina na sposobnost da izmene serum holesterol kod subjekta. Stručnjak će takođe prepoznati da je upotreba mišjeg HDL da se prate nivoi serum holesterola kod miša, i ako korisna za praćenje nivoa serum holesterola kod miša, nije indikativna za uticaj AVP na humani HDL kod ljudi. Na primer, Cohen i sar. („Variranje sekvence u PCSK9, niski LDL, i zaštita protiv koronarne bolesti srca", N Engl J Med, 354:1264-1272, 2006) su pokazali da nedostatak bilo kakvog efekta od nivoa PCSK9 na gubitak funkcije mutacija na humanom HDL. Prema tome, stručnjak će prihvatiti da sposobnost AVP da snižava mišji HDL (kojem nedostaje LDL) nije indikativna za sposobost AVP da snižavaju humani HDL. I ustvari, kao što je prikazano od strane Cohen-a, to nije verovatno da se dogodi za neutralizujuća antitela kod ljudi.
PRIMER 27
31H4 i 21B12 se vezuju za ProCat region PCSK9
[0398] Ovaj primer opisuje jedan metod za određivanje gde se različita antitela vezuju za PCSK9.
[0399] ProCat (31-449 od SEQ ID NO: 3) ili V domen (450-692 od SEQ ID NO: 3) od PCSK9 proteina je kombinovan bilo sa antitelom 31H4 ili sa 21B12. Uzorci su analizirani sa nativnim PAGE radi formiranja kompleksa. Kao što se može videti na FIG.16A i FIG.16B, gel pomaci su bili prisutni za ProCat / 31H4 i ProCat / 21B12 uzorke, pokazujući da se antitela vezuju za ProCat domen.
PRIMER 28
LDLR EGFa domen se vezuje za katalitički domen PCSK9
[0400] Ovaj primer predstavlja rešenu kristalnu strukturu PCSK9 ProCat (31-454 od SEQ ID NO: 3) vezanu za LDLR EGFa domen (293-334) na 2.9 Å rezolucije (za koju su uslovi opisani dole u Primerima).
[0401] Prikaz strukture PCSK9 vezanog za EGFa je dat na FIG. 17. Kristalna struktura (i njen opis na FIG.17) otkrivaju da se EGFa domen od LDLR vezuje za katalitički domen od PCSK9. Sem toga, izgleda da se interakcija PCSK9 i EGFa dešava preko površine PCSK9 koja je između ostataka D374 i S153 u strukturi prikazanoj na FIG.17.
[0402] Specifični ostaci aminokiselina jezgra PCSK9 interakcione površine vezuju se sa LDLR EGFa domenom definisani kao PCSK9 ostaci koji su unutar 5 Å od EGFa domena. Ostaci jezgra su sledeći: S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, i S381.
[0403] Granični PCSK9 ostaci aminokiseline od interakcione veze sa LDLR EGFa domenom su definisani kao PCSK9 ostaci koji su 5-8 Å od EGFa domena. Granični ostaci su sledeći: W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, i Q382. Ostaci koji su podvučeni su gotovo ili kompletno pokriveni u okviru PCSK9.
[0404] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati iz ovog primera pokazuju gde ineterreaguju PCSK9 i EGFa. Prema tome, antitela koja ineterreaguju sa, ili blokiraju bilo koji od tih ostataka, mogu biti korisna antitela koja inhibiraju interakciju između PCSK9 i EGFa domena od LDLR (i/ili LDLR generalno). U nekim primerima, antitela koja, kada se vežu za PCSK9, ineterreaguju sa ili blokiraju bilo koji od gornjih ostataka su u okviru 15-8, 8, 8-5, ili 5 angstrema od gornjih ostataka i predviđena su da obezbede korisnu inhibiciju vezivanja PCSK9 za LDLR.
PRIMER 29
31H4 intereaguje sa ostacima aminokiseline i od pro- i od katalitičkih domena PCSK9
[0405] Ovaj primer predstavlja kristalnu strukturu pune dužine PCSK9 (N533A mutant iz SEQ ID NO: 3) vezanu za Fab fragment od 31H4, određenu do rezolucije 2.3 Å (za koju su uslovi opisani u Primerima dole). Ova struktura, prikazana u FIG. 18A i 18B, pokazuje da se 31H4 vezuje za PCSK9 u regionu katalitičkog mesta i pravi kontakt sa ostacima aminokiseline i iz prodomena i katalitičkog domena.
[0406] Prikazana struktura takođe omogućuje nekom da identifikuje specifične ostatke aminokiseline jezgra PCSK9 za interakcionu među vezu od 31H4 sa PCSK9. To je definisano kao ostaci koji su u okviru 5 Å od 31H4 proteina. Ostaci jezgra su sledeći: W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, i G384.
[0407] Strukture su takođe upotrebljene za identifikaciju graničnih ostataka aminokiseline PCSK9 za interakciju sa vezom sa 31H4. Ti ostaci bili su PCSK9 ostaci koji su bili 5-8 Å od 31H4 proteina. Granični ostaci su sledeći: K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, i Q387. Ostaci aminokiseline koji su kompletno pokriveni u PCSK9 proteinu su podvučni.
[0408] Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, FIG. 18B prikazuje interakciju između CDR na antigen vezujućem proteinu i PCSK9. Kao takav, model omogućuje stručnjaku da identifikuje ostatke i/ili CDR koji su posebno važni u paratopu, i koji su ostaci manje kritični za paratop. Kao što se može videti na FIG.18B, teški lanci CDR1, CDR2, i CDR3 su najdirektnije uključeni u vezivanje antigen vezujućih proteina za epitop, sa CDR iz lakog lanca koji su relativno daleko od epitopa. Zbog toga, vrlo je verovatno da su moguće veće varijacije u lakim lancima CDR bez prekomernog ometanja vezivanja antigen vezujućih proteina za PCSK9. U nekim primerima, ostaci u strukturama koji direktno intereaguju su konzervirani (ili alternativno konzervativno zamenjeni) dok ostaci koji ne intereaguju direktno jedan sa drugim mogu biti zamenjeni u većem obimu. Tako, stručnjak, na osnovu datih tehnika, može predvideti koji ostaci i područja antigen vezujućih proteina mogu da se variraju bez prekomernog ometanja sposobnosti antigen vezujućih proteina da se vezuju za PCSK9. Na primer, oni ostaci koji su locirani bliže PCSK9 kada je antigen vezujući protein vezan za PCSK9 su oni koji verovatno igraju mnogo važniju ulogu u vezivanju antigen vezujućeg proteina za PCSK9. Kao i gore, ti ostaci se mogu podeliti na one koji su u okviru 5 angstrema od PCSK9 i one koji su između 5 i 8 angstrema. Specifični ostaci aminokiseline jezgra 31H4 interakcione veze sa PCSK9 su definisani kao 31H4 ostaci koji su u okviru 5 Å od PCSK9 proteina. Za teški lanac, ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: T28, S30, S31, Y32, S54, S55, S56, Y57, I58, S59, Y60, N74, A75, R98, Y100, F102, W103, S104, A105, Y106, Y107, D108, A109, i D111. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: L48, S51, Y93, i S98. Za teški lanac, oni ostaci koji su u okviru 5-8 Å od PCSK9 proteina uključuju sledeće: G26, F27, F29, W47, S50, I51, S52, S53, K65, F68, T69, I70, S71, R72, D73, K76, N77, D99, D101, F110, i V112. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5-8 angstrema od PCSK9 uključuju A31, G32, Y33, D34, H36, Y38, I50, G52, N55, R56, P57, S58, D94, S95, S96, L97, G99 i S100.
[0409] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati iz Primera 29 pokazuju gde antitela za PCSK9 mogu intereagovati na PCSK9 i da pri tome još uvek blokiraju PCSK9 od intereagovanja sa EGFa (i prema tome LDLR). Prema tome, antigen vezujući proteini koji intereaguju sa bilo kojim od tih ostataka PCSK9, ili koji blokiraju bilo koji od tih ostataka (npr., od drugih antigen vezujućih proteina koji se vezuju za te ostatke), mogu biti korisni kao antitela koja inhibiraju interakciju PCSK9 i EGFa (i prema tome LDLR). Prema tome, u nekim primerima, antigen vezujući proteini koji intereaguju sa bilo kojim od gonjih ostataka ili intereaguju sa ostatcima koji su u okviru 5 Å od gornjih ostataka su predviđeni da obezbede korisnu inhibiciju PCSK9 vezivanja za LDLR. Slično tome, antigen vezujući proteini koji blokiraju bilo koji od gornjih ostataka (koji se mogu odrediti, na primer, preko ogleda kompeticije) takođe mogu biti korisni za inhibiciju PCSK9/LDLR interakcije.
PRIMER 30
21B12 vezuje se za katalitički domen PCSK9, ima udaljeno mesto vezivanja od 31H4 i može se vezati za PCSK9 istovremeno sa 31H4
[0410] Ovaj primer predstavlja kristalnu strukturu PCSK9 ProCat (31-449 od SEQ ID NO: 3) vezanu za Fab fragmente od 31H4 i 21B12, određene na rezoluciji od 2.8 Å (za koju su uslovi opisani u Primerima dole). Kristalna struktura, opisana u FIG. 19A i FIG. 19B, pokazuje da 31H4 i 21B12 imaju udaljena mesta vezivanja na PCSK9 i da se oba antigen vezujuća proteina mogu vezati za PCSK9 istovremeno. Struktura pokazuje da 21B12 intereaguje sa ostacima aminokiseline od katalitičkog domena PCSK9. U toj strukturi, interakcija između PCSK9 i 31H4 je slična onoj koja je zapažena gore.
[0411] Specifični ostaci aminokiseline jezgra PCSK9 interakcione veze sa 21B12 su definisani kao PCSK9 ostaci koji su u okviru 5 Å od 21B12 proteina. Ostaci jezgra su sledeći: S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, i F379.
[0412] Granični ostaci aminokiseline PCSK9 interakcione veze sa 21B12 su definisani kao PCSK9 ostaci koji su bili 5-8 Å od 21B12 proteina. Granični ostaci su sledeći: I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, i C378. Ostaci aminokiseline koji su gotovo ili kompletno pokriveni u okviru PCSK9 proteina su podvučeni.
[0413] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, FIG. 19B prikazuje interakciju između CDR na antigen vezujućem proteinu i PCSK9. Kao takav, model omogućuje stručnjaku da identifikuje ostatke i/ili CDR koji su posebno važni za paratope i koji su ostaci manje kritični za paratop. Kao što se može videti u strukturi, pokazuje se da teški lanac CDR2 i laki lanac CDR1 blisko intereaguju sa epitopom. Dalje, se pokazuje da teški lanac CDR1, teški lanac CDR3 i laki lanac CDR3, blisko intereaguju sa epitopom, ali ne i blisko sa prvim setom CDR. Konačno se pokazuje da je laki lanac CDR2 na nekoj distanci od epitopa. Prema tome je vrovatno da je veća varijacija CDR moguća bez prekomernog ometanja vezivanja sa antigen vezujućim proteinom za PCSK9. U nekim primerima, ostaci u strukturama koji direktno intereaguju su konzervisani (ili alternativno konzervativno zamenjeni) dok ostaci koji ne intereaguju direktno jedan sa drugim mogu biti menjani u većem obimu. Prema tome, stručnjak u oblasti, na osnovu prisutnih tehnika, može predvideti koji ostaci i područja antigen vezujućih proteina mogu da se variraju bez prekomernog ometanja sposobnosti antigen vezujućih proteina da se vezuju za PCSK9. Na primer, oni ostaci koji su bliže PCSK9 kada se antigen vezujući protein vezuje za PCSK9 su oni koji verovatno igraju mnogo važniju ulogu u vezivanju antigen vezujućeg proteina za PCSK9. Kao i gore, ti ostaci se mogu podeliti na one koji su u okviru 5 angstrema od PCSK9 i one koji su između 5 i 8 angstrema. Specifični ostaci aminokiseline jezgra 21B12 interakcione veze sa PCSK9 su definisani kao 21B12 ostaci koji su u okviru 5 Å od PCSK9 proteina. Za teški lanac, ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: T30, S31, Y32, G33, W50, S52, F53, Y54, N55, N57, N59, R98, G99, Y100, i G101. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5 angstrema uključuju sledeće: G30, G31, Y32, N33, S34, E52, Y93, T94, S95, T96, i S97. Za teški lanac, ostaci koji su u okviru 5-8 Å od PCSK9 proteina uključuju sledeće: T28, L29, I34, S35, W47, V51, G56, T58, Y60, T72, M102, i D103. Za laki lanac, oni ostaci koji su u okviru 5-8 angstrema od PCSK9 uključuju sledeće: S26, V29, V35, Y51, N55, S92, M98, i V99.
[0414] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati iz Primera 30 pokazuju gde antigen vezujući proteini za PCSK9 mogu intereagovati na PCSK9 i još uvek blokirati PCSK9 od intereagovanja sa EGFa (i na taj način sa LDLR). Prema tome, antigen vezujući proteini koji intereaguju sa bilo kojim od ostataka PCSK9 ili koji blokiraju bilo koji od tih ostataka mogu biti korisni za antitela koja inhibiraju interakcije PCSK9 i EGFa (i na taj način LDLR). Prema tome, u nekim primerima, antitela koja intereaguju sa bilo kojim od gornjih ostataka ili intereaguju sa ostacima koji su u okviru 5 Å od gornjih ostataka su predviđeni da obezbede korisnu inhibiciju vezivanja PCSK9 za LDLR. Slično tome, antigen vezujući proteini koji blokiraju bilo koji od gornjih ostataka (koji se mogu odrediti, na primer, preko ogleda inhibicije) mogu biti korisni za inhibiciju interakcije PCSK9/LDLR.
PRIMER 31
Interakcija između EGFa, PCSK9 i antitela
[0415] Struktura ternarnog kompleksa (PCSK9 / 31H4 / 21B12) iz gornjeg primera je položena na PCSK9 / EGFa strukturu (određenu kao što je opisano u Primeru 28) i rezultirala je kombinacijom prikazanom na FIG. 20A. Ta slika pokazuje područja na PCSK9 koja se mogu uspešno naciljati da inhibiraju interakciju PCSK9 sa EGFa. Ta slika pokazuje da se i 31H4 i 21B12 delimično poklapaju sa pozicijom EGFa domena od LDLR i sterično interferiraju sa njegovim vezivanjem za PCSK9. Sem toga, kao što se može videti u strukturama, 21B12 direktno intereaguje sa podsetom ostataka aminokiseline koji su specifično uključeni u vezivanje za LDLR EGFa domen.
[0416] Kao što je pomenuto gore, analiza kristalnih struktura identifikovala je specifične aminokiseline uključene u interakciju između PCSK9 i partner proteina (jezgro i granični regioni veze na PCSK9 površini) i prostornih zahteva tih partner proteina da intereaguju sa PCSK9. Strukture sugerišu načine da se inhibira interakcija između PCSK9 i LDLR. Prvo, kao što je primećeno gore, vezivanje agensa za PCSK9 gde deli ostatke zajedničke sa mestom vezivanja za EGFa domen od LDLR, inhibiraće interakciju između PCSK9 i LDLR. Drugo, agens koji se vezuje uobičajeno spolja od ostataka može sterično interferirati sa EGFa domenom ili regionima od LDLR koji su ili N- ili C-terminal prema EGFa domenu da se spriči interakcija između PCSK9 i LDLR.
[0417] U nekim primerima, ostaci koji su ukljućeni i u EGFa vezivanje i koji su blizu područja gde se gore pomenuti antigen vezujući proteini vezuju su posebno korisni za manipulisanje sa PCSK9 vezivanjem za LDLR. Na primer, ostaci aminokiseline između veza obično i u regionu jezgra i graničnom regionu za različite partnere vezivanja su nabrojani u Tabeli 12 dole. Ostaci aminokiseline kompletno pokriveni sa PCSK9 proteinom su podvučeni.
Tabela 12
[0418] Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, u nekim primerima, antigen vezujući proteini vezuju se za i/ili blokiraju najmanje jedan od gore pomenutih ostataka.
PRIMER 32
Strukturne interakcije LDLR i PCSK9
[0419] Model pune dužine PCSK9 vezivanja za punu dužinu predstavljenog LDLR je napravljen koristeći PCSK9 ProCat (31-454 od SEQ ID NO: 3)/EGFa kompleksne strukture. Struktura pune dužine PCSK9<1>(Piper, D.E. i sar. Kristalna struktura PCSK9: regulator plazma LDL-holesterola.
Structure 15, 545-52 (2007)) je položena na PCSK9 ProCat 31-454 od kompleksa i strukture LDLR u njegovoj niskoj pH konformaciji (Rudenko, G. i sar. Struktura LDL receptora izvanćelijskog domena pri endozomalnom pH. Science 298, 2353-8 (2002)) je položena na EGFa domen iz kompleksa. Prikazi modela dati su na FIG.20B i 20C. EGFa domen je naznačen sa okruženjem na slici. Te slike pokazuju regione LDLR izvan neposrednog domena vezivanja EGFa koji leži u neposrednoj blizini PCSK9. FIG. 20D-20F prikazuju gornju interakciju, zajedno sa prezentacijom mreže površine antitela 31H4 i 21B12 iz tri različita ugla. Kao što je jasno iz opisa, ne samo da antitela mogu da intereaguju i/ili interferiraju sa interakcijom LDLR sa PCSK9 na aktuelnom mestu vezivanja, nego izgleda da i druge sterične interakcije mogu da se takođe pojave.
[0420] U svetlu gornjih rezultata, jasno je da antigen vezujući proteini koji se vezuju za PCSK9 mogu takođe inhibirati interakciju između PCSK9 i LDLR sukobljavanjem sa različitim regionima LDLR (ne samo na mestu na kojem intereaguju LDLR i PCSK9). Na primer, može se sukobiti sa ponovkom 7 (R7), EGFb domen, i/ili β-propeler domen.
Antigen vezujući molekuli koji se vezuju za ili blokiraju interakciju EGFa sa PCSK9
[0421] Kao što će biti shvaćeno od strane stručnjaka, Primeri 28-32, i njihove prateće slike, obezbeđuju detaljan opis kako i gde EGFa intereaguje sa PCSK9 i kako dva predstavnika neutralizujućih antigen vezujućih proteina, 21B12 i 31H4 intereaguju sa PCSK9 i produkuju njihov neutralizujući efekat. Tako će, stručnjak biti u stanju da identifikuje antigen vezujuće molekule koji mogu slično da redukuju vezivanje između EGFa (uključujući LDLR) i PCSK9 pomoću identifikovanja drugih antigen vezujućih molekula koji se vezuju na ili blizu najmanje jedne od istih lokacija na PCSK9. I dok su odgovarajuće lokcije (ili epitopi) na PCSK9 identifikovani na slikama i u ovom opisu, takođe može biti korisno da se opišu ta mesta kao da su u okviru seta distanci od ostataka koji su bili identifikovani toliko blizu EGFa mesta vezivanja. U nekim primerima, antigen vezujući molekul će se vezati za ili u okviru 30 angstrema od jednog ili više od sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEQ ID NO: 3): S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, Q382, W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, Q387, S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, ili C378. U nekim primerima, antigen vezujući molekul vezuje se u okviru 30 angstrema od jednog ili više sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEQ ID NO: 3): S153, I154, P155, R194, D238, A239, I369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, S381, W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, I368, G370, A371, S373, S376, ili Q382. U nekim primerima, antigen vezujući molekul će se vezati za ili u okviru 30 angstrema od jednog ili više sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEQ ID NO: 3): W72, F150, A151, Q152, T214, R215, F216, H217, A220, S221, K222, S225, H226, C255, Q256, G257, K258, N317, F318, T347, L348, G349, T350, L351, E366, D367, D374, V380, S381, Q382, S383, G384, K69, D70, P71, S148, V149, D186, T187, E211, D212, G213, R218, Q219, C223, D224, G227, H229, L253, N254, G259, P288, A290, G291, G316, R319, Y325, V346, G352, T353, G365, I368, I369, S372, S373, C378, F379, T385, S386, ili Q387. U nekim primerima, antigen vezujući molekul vezuje se u okviru 30 angstrema od jednog ili više sledećih ostataka (numerisanje u pozivu na SEQ ID NO: 3): S153, S188, I189, Q190, S191, D192, R194, E197, G198, R199, V200, D224, R237, D238, K243, S373, D374, S376, T377, F379, I154, T187, H193, E195, I196, M201, V202, C223, T228, S235, G236, A239, G244, M247, I369, S372, C375, ili C378.
[0422] U nekim primerima, antigen vezujući molekul se vezuje u okviru 30, 30-25, 25-20, 20-15, 15-8, 8, 8-5, 5, 5-4, 4 ili manje angstrema od jednog ili više od gornjih ostataka. U nekim primerima, antigen vezujući molekul, koji se vezuje za PCSK9, je u okviru najmanje jedne od gornjih distanci, za više od jednog od gore pomenutih ostataka. Na primer, u nekim primerima, antigen vezujući molekul je u okviru jedne od navedenih distanci (npr., 30, 30-25, 25-20, 20-15, 15-8, 8, 8-5, 5, 5-4, 4 ili manje) za najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75 ili više od gornjih ostataka. U nekim primerima, antigen vezujući molekul je u okviru jedne od nabrojanih distanci za najmanje 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, 99-100% od ostataka identifikovanih u svakoj grupi od njihove podgrupe (kao što su samo oni površinski ostaci u grupi). Sem ako se specifično tvrdi drugačije, distanca između antigen vezujućeg molekula i PCSK9 je najkraća distanca između kovalentno vezanog atoma na PCSK9 i kovalentno vezanog atoma od antigen vezujućeg molekula koji su najbliži atomu PCSK9 i antigen vezujućeg molekula. Slično tome, sem ako se specifično tvrdi drugačije, distanca između ostatka (na antigen vezujućem molekulu ili PCSK9) i drugog proteina (bilo PCSK9 ili antigen vezujući molekul respektivno), je distanca od najbliže tačke na identifikovanom ostatku do najbližeg kovalentno vezanog dela drugog proteina. U nekim primerima, distanca se može meriti iz kičme lanaca aminokiseline. U nekim primerima, distanca se može meriti između ivice paratopa i ivice (najbliže jedna drugoj) epitopa. U nekim primerima, distanca se može meriti između centra površine paratopa i centra površine epitopa. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, ovaj opis je primenjiv za svaki od pojedinačnih setova ovde popisanih ostataka. Na primer, gornji rasponi su zamišljeni generalno i specifično za ostatke od 8 angstrema pobrojane u Primerima 28-32 i ostatke 5 angstrema pobrojane u Primerima 28-32.
[0423] U nekim primerima, antigen vezujući molekul se vezuje za površinu PCSK9 koja je vezana sa najmanje jednim od EGFa, 21B12, ili 31H4. U nekim primerima, antigen vezujući molekul vezuje se za PCSK9 na lokacijama koje se preklapaju sa lokacijama interakcije između PCSK9 i EFGa, Ab 31H4, i/ili Ab 21B12 (kao što je opisano gore u primerima i slikama). U nekim primerima, antigen vezujući molekul vezuje se za PCSK9 na poziciji koja je još dalje od jednog od gore nabrojanih ostataka. U nekim primerima, takav antigen vezujući molekul može još uvek biti efektivan u neutralizovanju antigen vezujućeg molekula.
[0424] U nekim primerima, struktura katalitičkog domena PCSK9 može se opisti kao da je bila generalno trouglasta (kao što je prikazano na FIG. 19A). Prva strana trougla je prikazana kao vezana za 31H4. Druga strana trougla je prikazana kao vezana sa 21B12, i treća strana trougla je pozicionirana prema dnu stranice, odmah iznad „FIG. 19A" obeležja. U nekim primerima, antigen vezujući molekuli koji se vezuju za prvu i/ili drugu stranu katalitičkog domena od PCSK9 mogu biti korisni kao neutralizujuća antitela pošto oni mogu bilo direktno ili sterično interferirati sa EGFa koji se vezuje za PCSK9. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, kada su antigen vezujući molekuli dovoljno veliki, kao što je potpuno antitelo, antigen vezujući molekul ne mora direktno da se vezuje za mesto vezivanja EGFa sa ciljem da interferira sa vezivanjem EGFa za PCSK9.
[0425] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, dok je EGFa domen od LDLR bio upotrebljen u mnogo primera, modeli i strukture su još uvek primenjivi na to kako će LDLR protein pune dužine intereagovati sa PCSK9. U stvari, dodatna struktura prisutna na LDLR proteinu pune dužine predstavlja dodatni proteinski prostor koji se može dalje blokirati sa jednim od antigen vezujućih molekula. U tom slučaju, ako antigen vezujući molekul blokira ili inhibira vezivanje EGFa za PCSK9, verovatno će biti najmanje kao, ako ne i više, efektivan sa LDLR proteinom pune dužine. Slično tome, antigen vezujući molekuli koji su u okviru postavljene distance ili blokiraju različite ostatke koji su relevantni za inhibiciju EGFa vezivanja, verovatno će biti isto efektivni, ako ne i više efektivni, za LDLR pune dužine.
[0426] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, bilo koji molekul koji blokira ili se vezuje za gore pomenute PCSK9 ostatke (ili u okviru pobrojanih distanci), ili koji inhibira jednu ili više interakcija zabeleženih u gornjim primerima i slikama, može se upotrebiti da inhibira interakciju EGFa (ili LDLR generalno) i PCSK9. Kao takav, molekul ne mora da bude ograničen na antigen vezujući „protein", pošto bilo koji antigen vezujući molekul može takođe poslužiti za zahtevane namene. Primeri antigen vezujućih molekula uključuju aptamere, koji mogu biti ili oligonukleinska kiselina ili peptidni molekuli. Drugi primeri antigen vezujućih molekula uključuju avimere, peptitela, male molekule i polimere, i modifikovane verzije EGFa koje mogu povećati svoj afinitet za PCSK9 i/ili polu život, kao što su mutacija aminokiselina, glikozilacija, pegilacija, fuzija Fc i fuzija avimera. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, LDLR nije antigen vezujući molekul ili vezujuće podsekcije LDLR nisu antigen vezujući molekuli, npr., EGFa. Slično tome, drugi molekuli preko kojih PCSK9 signalira in vivo nisu antigen vezujući molekuli.
PRIMER 33
Ekspresija i prečišćavanje uzoraka proteina
[0427] Ovaj primer opisuje kako su neki od različitih PCSK9 proteina/varijanti napravljeni i prečišćeni (uključujući LDLR EGFa domen). PCSK9 proteini/varijante (npr., PSCK9 31-692 N533A, PCSK9 449TEV i PCSK9 ProCat 31-454) su eksprimirani u Hi-5 ćelijama insekta inficiranim bakulovirusom sa N-terminalnim signalnim melitin proteinom od pčele praćenim sa His6tagom. PCSK9 proteini su prečišćeni sa nikl afinitetnom hromatografijom, jono izmenjivačkom hromatografijom i hromatografijom izuzimanja veličine. Melittin-His6tag je uklonjen tokom prečišćavanja putem isecanja sa TEV proteazom. Konstrukt PCSK9449TEV je upotrebljen da se generišu PCSK9 ProCat (31-449) i V domen (450-692) uzorci. Ovaj konstrukt je imao TEV mesto isecanja proteaze ubačeno između PCSK9 ostataka 449 i 450. Za kristalografiju varijante N555A pune dužine, PCSK9 31-454 fragment, i PCSK9 449TEV varijanta za kristalografiju, post rTEV protein produkt je takođe uključio inicijalnu GAMG sekvencu. Prema tome, post rTEV isecanje, tih proteina bilo je GAMG-PCSK9. Sem toga, PCSK9 449TEV protein je uključen u sekvencu „ENLYFQ" (SEQ ID NO: 403) ubačenu između pozicija H449 i G450 od SEQ ID NO: 3. Nakon isecanja sa rTEV, PCSK9 ProCat protein generisan iz ovog konstrukta bio je GAMG-PCSK9 (31-449)-ENLYFQ i V domen generisan iz ovog konstrukta bio je PCSK9 (450-692) od SEQ ID NO: 3.
[0428] 21B12 i 31H4 Fab fragmenti su eksprimirani u E. coli. Ovi proteini su prečišćeni sa nikl afinitetnom hromatografijom, hromatografijom izuzimanja veličine i jono izmenjivačkom hromatografijom.
[0429] LDLR EGFa domen (293-334) je eksprimiran kao GST fuzioni protein u E. coli. EGFa domen je prečišćen sa jono izmenjivačkom hromatografijom, glutation sefaroza afinitetnom hromatografijom i hromatografijom izuzimanja veličine. GST protein je uklonjen tokom prečišćavanja sa isecanjem pomoću PreScission proteaze.
PRIMER 34
Formiranje kompleksa i kristalizacija
[0430] Ovaj primer opisuje kako su napravljeni kompleksi i kristali upotrebljeni u Primerima ispitivanjima gornjih strukura.
[0431] PCSK9 31-692 N533A / 31H4 kompleks je napravljen mešanjem 1.5 molarnog viška 31H4 Fab sa PCSK9. Kompleks je prečišćen hromatografijom izuzimanja veličine da se ukloni višak 31H4 Fab. PCSK9 31-692 N533A / 31H4 kompleks kristalizuje u 0.1 M Tris pH 8.3, 0.2 M natrijum acetatu, 15% PEG 4000, 6% soli dekstran sulfat natrijuma (Mr 5000).
[0432] PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B 12 kompleks je napravljen prvo pomoću mešanja 1.5 molarnog viška od 31H4 Fab sa PCSK9 31-449. Kompleks je razdvojen od viška 31H4 kolonskom hromatografijom izuzimanja veličine. 1.5 molarni višak od 21B 12 Fab je zatim dodan u PCSK9 31-449 / 31H4 kompleks. Ternarni kompleks je razdvojen od viška 21B12 pomoću prečišćavanja sa kolonskom hromatografijom izuzimanja veličine. PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B12 kompleks kristalizuje u 0.1 M Tris pH 8.5, 0.2 M jednobaznom amonijum fosfatu, 50% MPD.
[0433] PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa kompleks je napravljen mešanjem 1.2 molarnog viška od EGFa domena sa PCSK931-454. PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa domen kompleks kristalizuje u 0.2 M kalijum formatu, 20% PEG 3350.
PRIMER 35
Sakupljanje podataka i određivanje strukture
[0434] Ovaj primer opisuje kako su sakupljeni setovi podataka i kako su određene strukture za ispitivanje Primera gornjih struktura.
[0435] Početni setovi podataka za PCSK9 31-692 N533A / 31H4 i PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B12 kristale su sakupljeni na Rigaku FR-E X-zrak izvoru. PCSK9 ProCat 31-454 / EGFa set podataka i set podataka više rezolucije za PCSK931-692 N533A / 31H4 i PCSK9 ProCat 31-449 / 31H4 / 21B 12 kristale su sakupljeni na Berkeley Advanced Light Source beamline 5.0.2. Svi setovi podataka su obrađeni sa denzo/scalepack ili HKL2000 (Otwinowski, Z., Borek, D., Majewski, W. & Minor, W. Multiparametarsko skaliranje difrakcionih intenziteta. Acta Crystallogr A 59, 228-34 (2003)).
[0436] PCSK9 / 31H4 kristali rastu u C2 prostornoj grupi sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=264.9, b=137.4, c=69.9 Å, β=102.8° i difrakcijom do 2.3 Å rezolucije. PCSK9 / 31H4 struktura je razrešena sa molekularnom zamenom sa programom MOLREP (CCP4 nastavak: programi za kristalografiju proteina. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-3 (1994) koristeći PCSK9 strukturu (Piper, D.E. i sar. Kristalna struktura PCSK9: regulator plazma LDL-holesterola. Structure 15, 545-52 (2007)) kao polazni istraživački model. Držeći PCSK9 31-692 rastvor fiksiran, varijabilni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Držeći PCSK9 31-692 / rastvor varijabilnog domena antitela fiksiran, konstantni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Kompletna struktura je poboljšana sa višestrukim rundama građenja modela sa Quanta i usavršavanjem sa cnx. (Brunger, A.T. i sar. Kristalografija i NMR sistem: Novi softver pogodan za određivanje makromolekularne strukture. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54, 905-21 (1998)).
[0437] PCSK9 / 31H4 / 21B12 kristali rastu u P21212 prostornoj grupi sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=138.7, b=246.2, c=51.3 Å i difrakcijom do 2.8 Å rezolucije. PCSK9 / 31H4 / 21B12 struktura je razrešena sa molekularnom zamenom sa programom MOLREP koristeći PCSK9 ProCat / 31H4 varijabilni domen kao polazni istraživački model. Držeći PCSK9 ProCat / 31H4 fiksiran varijabilni domen, izvedena je pretraga za konstantni domen antitela. Držeći PCSK9 ProCat / 31H4 / 21B12 fiksiran konstantni domen, varijabilni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Kompletna struktura je poboljšana sa višestrukim rundama građenja modela sa Quanta i usavršavanjem sa cnx.
[0438] PCSK9 / EGFa kristali domena rastu u prostornoj grupi P6s22 sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=b=70.6, c=321.8 Å i difrakcijom do 2.9 Å rezolucije. PCSK9 / EGFa struktura domena je razrešena sa molekularnom zamenom sa programom MOLREP koristeći PCSK9 ProCat kao polazni istraživački model. Analiza mapa elektronske gustine pokazala je jasnu elektronsku gustinu za EGFa domen. LDLR EGFa domen je ručno fitovan i model je poboljšan sa višestrukim rundama građenja modela sa Quanta i usavršavanjem sa cnx.
[0439] Interakcije jezgra međuveze aminokiselina su određene kao da su svi ostaci aminokiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 5 Å od PCSK9 partner proteina.
5 Å je odabrano kao granična distanca regiona jezgra da se omogući atomima u okviru van der Waals-ovog radijus plus moguća vodom-posredovana vodonična veza. Granične interakcije međuveza aminokiselina su određene kao da su svi ostaci aminokiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 8 Å od PCSK9 partner proteina ali koji nisu uključeni u interakcionu listu jezgra. Manje od ili jednako 8 Å je odabrano kao granična distanca graničnog regiona da se omogući proširenje za dužinu aminokiseline arginina. Aminokiseline koje dostižu te kriterijume distance su izračunate sa programom PyMOL. (DeLano, W.L. The PyMOL Molekularni grafički sistem. (Palo Alto, 2002)).
UPOREDNI PRIMER 36
Kristalna struktura PCSK9 i 31A4
[0440] Određena je kristalna struktura 31A4/PCSK9 kompleksa.
Ekspresija i prečišćavanje uzoraka proteina
[0441] PCSK9 449TEV (PCSK9 konstrukt sa TEV mestom isecanja proteaze ubačenim između ostatka 449 i 450, numerisanje u skladu sa SEQ ID NO: 3) je eksprimiran u Hi-5 ćelijama insekta zaraženim bakulovirusom sa N-terminalnim melitin signalnim peptidom pčele praćenim sa His6tagom. PCSK9 protein je prečišćen prvo sa nikl afinitetnom hromatografijom. TEV proteaza je upotrebljena da se ukloni melitin-His6tag i iseče PCSK9 protein između katalitičkog domena i V domena. V domen je dalje prečišćen sa jono izmenjivačkom hromatografijom i hromatografijom isključivanja veličine. 31A4 Fab fragment je eksprimiran u E. coli. Ovaj protein je prečišćen sa nikl afinitetnom hromatografijom, hromatografijom isključivanja veličine i jono izmenjivačkom hromatografijom.
Formiranje kompleksa i kristalizacija
[0442] PCSK9 V domen / 31A4 kompleks je napravljen mešanjem 1.5 molarnog viška od PCSK9 V domena sa 31A4 Fab. Kompleks je odvojen od viška PCSK9 V domena prečišćavanjem kolonskom hromatografijom isključivanja veličine. PCSK9 V domen / 31A4 kompleks kristalizuje u 1.1 M sukcinskoj kiselini pH 7, 2% PEG MME 2000.
Sakupljanje podataka i određivanje strukture
[0443] Set podataka za PCSK9 V domen / 31A4 kristal je sakupljen na Rigaku FR-E x-zrak izvoru i obrađen sa denzo/scalepack (Otwinowski, Z., Borek, D., Majewski, W. & Minor, W. Multiparametarsko skaliranje difrakcionih intenziteta. Acta Crystallogr A 59, 228-34 (2003)).
[0444] PCSK9 V domen / 31A4 kristali rastu u P212121prostornoj grupi sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=74.6, b=131.1, c=197.9 Å sa dva kompleksna molekula po asimetričnoj jedinici, i difrakciji na 2.2 Å rezolucije. PCSK9 V domen / 31A4 struktura je razrešen sa molekulskom zamenom sa programom MOLREP (CCP4. CCP4 nastavak: programi za kristalografiju proteina. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50, 760-3 (1994)) koristeći V domen od PCSK9 strukture (Piper, D.E. i sar. Kristalna struktura PCSK9: regulator plazma LDL-holesterola. Structure 15, 545-52 (2007)) kao polazni model za traženje. Držeći PCSK9 450-692 rastvor fiksiran, varijabilni domen antitela je upotrebljen kao model za traženje. Nakon početnog usavršavanja, konstantni domeni antitela su ručno podešeni. Kompletna struktura je poboljšana sa višestrukim rundama građenja modela sa Quanta i usvršena sa cnx (Brunger, A.T. i sar. Kristalografija i NMR sistem: Novi sovtver nastavak za određivanje makromolekularne strukture. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54, 905-21 (1998)).
[0445] Interakcije jezgra međuveze aminokiselina su određene kao da su svi ostaci aminokiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 5 Å od PCSK9 partner proteina.
5 Å je odabrano kao granična distanca regiona jezgra da se omogući atomima u okviru van der Waals-ovog radijus plus moguća vodom-posredovana vodonična veza. Granične interakcije međuveza aminokiselina su određene kao da su svi ostaci aminokiselina sa najmanje jednim atomom manje od ili jednako 8 Å od PCSK9 partner proteina ali koji nisu uključeni u interakcionu listu jezgra. Manje od ili jednako 8 Å je odabrano kao granična distanca graničnog regiona da se omogući proširenje za dužinu aminokiseline arginina. Aminokiseline koje dostižu te kriterijume distance su izračunate sa programom PyMOL (DeLano, W.L. PyMOL Molekularni grafički sistem. (Palo Alto, 2002)). Distance su izračunate koristeći V domen „A" i 31A4 „L1,H1" kompleks.
[0446] Kristalna struktura PCSK9 V domena vezana za Fab fragment od 31A4 je određena na 2.2 Å rezoluciji. Prikazi kristalne strukture obezbeđeni su na FIG. 21A-21D. FIG. 21A-21C pokazuju da se 31A4 Fab vezuje za PCSK9 V domen u regionu pod domena 1 i 2.
[0447] Napravljen je model pune dužine PCSK9 vezan za 31A4 Fab. Struktura pune dužine PCSK9 je položena na PCSK9 V domen iz kompleksa. Slika ovog modela je prikazana na FIG.
21D. Mesto interakcije između EGFa domena LDLR i PCSK9 je istaknuto.
[0448] Analiza strukture pokazuje gde antitelo intereaguje sa PCSK9 i pokazuje da antitela koja se ne vezuju za LDLR površinu vezivanja od PCSK9 mogu još uvek inhibirati interakciju LDLR koja je posredovana preko PCSK9 (kada se rezultati posmatraju u kombinaciji sa Primerom 40 i 41 dole). U dodatku, analiza kristalne strukture omogućuje identifikaciju specifičnih aminokiselina uključenih u interakciju između PCSK9 i 31A4 antitela. Sem toga, takođe su određeni jezgro i granični regioni međuveze na površini PCSK9. Specifično jezgro PCSK9 ostataka aminokiseline od interakcione međuveze sa 31A4 su definisani kao PCSK9 ostaci koji su u okviru 5 Å od 31A4 proteina. Ostaci jezgra su T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, i E593. Granični PCSK9 ostaci aminokiseline od interakcione međuveze sa 31A4 su definisani kao PCSK9 ostaci koji su 5-8 Å od 31A4 proteina. Granični ostaci su sledeći: S465, G466, P467, A473, 1474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595, i H597. Ostaci aminokiselina koji su blizu ili su potpuno pokriveni u okviru PCSK9 proteina su istaknuti podvlačenjem. Kao što je ovde napomenuto, numerisanje označava pozicije aminokiselina u SEQ ID NO: 3 (doterano kao što je ovde napomenuto).
[0449] Specifični ostaci aminokiseline jezgra 31A4 interakcione međuveze sa PCSK9 su definisani kao 31A4 ostaci koji su u okviru 5 Å od PCSK9 proteina. Ostaci jezgra za 31A4 antitelo su sledeći: teški lanac: G27, S28, F29, S30, A31, Y32, Y33, E50, N52, H53, R56, D58, K76, G98, Q99, L100, i V101; laki lanac: S31, N32, T33, Y50, S51, N52, N53, Q54, W92, i D94. Granični ostaci aminokiseline 31A4 interakcione međuveze sa PCSK9 definisani su kao 31A4 ostaci koji su 5-8 Å od PCSK9 proteina. Granični ostaci za 31A4 su sledeći: teški lanac: V2, G26, W34, N35, W47, 151, S54, T57, Y59, A96, R97, P102, F103, i D104; laki lanac: S26, S27, N28, G30, V34, N35, R55, P56, K67, V91, D93, S95, N97, G98, i W99.
[0450] Kristalna struktura takođe je pokazala prostorne zahteve tog AVP u njegovim interakcijama sa PCSK9. Kao što je pokazano u toj strukturi, na iznenađenje, antitela koja se vezuju na PCSK9 bez direktnog sprečavanja interakcije PCSK9 sa LDLR mogu još uvek inhibirati funkciju PCSK9.
[0451] U nekim primerima, bilo koji antigen vezujući protein koji se vezuje za, pokriva, ili sprečava 31A4 od intereagovanja sa bilo kojim od gornjih ostataka, može se upotrebiti da se veže ili neutralizuje PCSK9. U nekim primerima, AVP se vezuje sa, ili intereaguje sa, najmanje jednim od sledećih PCSK9 (SEQ ID NO: 3) ostataka: T468, R469, M470, A471, T472, R496, R499, E501, A502, Q503, R510, H512, F515, P540, P541, A542, E543, H565, W566, E567, V568, E569, R592, i E593. U nekim primerima, AVP je u okviru 5 angstrema od jednog ili više gornjih ostataka. U nekim primerima, AVP vezuje sa, ili intereaguje sa, najmanje jednim od sledećih PCSK9 (SEQ ID NO: 3) ostataka: S465, G466, P467, A473, 1474, R476, G497, E498, M500, G504, K506, L507, V508, A511, N513, A514, G516, V536, T538, A539, A544, T548, D570, L571, H591, A594, S595, i H597. U nekim primerima, AVP je 5 do 8 angstrema od jednog ili više gornjih ostataka. U nekim primerima, AVP intereaguje, blokira, ili je u okviru 8 angstrema od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 od gornjih ostataka.
[0452] Koordinate kristalnih struktura koje su diskutovane u gornjim Primerima predstavljene su u Tabeli 35.1 (PCSK9 pune dužine i 31H4), Tabela 35.2 (PCSK9 i EGFa), Tabela 35.3 (PCSK9, 31H4, i 21B12), i Tabela 35.4 (PCSK9 i 31A4). Ovde su takođe opisani antigen vezujući proteini i molekuli koji intereaguju sa odgovarajućim područjima ili ostaci od strukture od PCSK9 (uključujući ona područja ili ostatke u okviru 15, 15-8, 8, 8-5, 5, ili manje angstrema odakle EGFa, ili antitela, intereaguju sa PCSK9) prikazani na slikama i/ili njihove odgovarajuće pozicije na strukturama od kordinati.
[0453] Antitela koja su opisana u koordinatama su odgajena u E. coli i, prema tome, poseduju minorne razlike u aminokiselinama od potpuno humanih antitela. Prvi ostatak u varijabilnom regionu bio je glutaminska kiselina umesto glutamina za teške i lake lance 21B12 i za lake lance za 31H4. U dodatku na razlike u sekvenci varijabilnog regiona, postojale su takođe neke razlike u konstantnom regionu antitela opisanog sa kordinatama (ponovo zahvaljući činjenici da je antitelo odgajeno u E. coli). FIG. 22 ističe (preko istaknutog senčenja, ili podebljavanja) razlike između konstantnih regiona 21B12, 31H4, i 31A4 Fabs (odgajenih u E. coli) kada se porede sa SEQ ID NO: 156, i 155. Za 21B12 31H4, i 31A4, laki lanac konstantne sekvence je sličan humanom lambda (SEQ ID NO: 156). Podvučeni glicin ostatak je insercija između mesta gde se 21B 12 i 31H4 varijabilne sekvence zaustavljaju i započinje lambda sekvenca.
[0454] I za 21B 12 i 31H4, konstanta teškog lanca je slična humanom IgG4 (SEQ ID NO: 155). Razlike istaknute na FIG.22 prikazane su u Tabeli 36.1:
Tabela 36.1
Kristal SEQ ID NO: 155
S C
K R
G E
G S
Q K
I T
N D
K R
P S
[0455] Kada se razmatra 31A4, iako on takođe ima iste razlike pobrojane gore, postoje još tri dodatne razlike. Kao što je prikazano na FIG.22, postoje dve dodatne aminokiseline na početku, koje dolaze od nekompletnog procesovanja signalnog peptida u ekspresiji kod E. coli. Sem toga, postoji jedna dodatna supstitucija u teškom lancu konstantnog regiona 31A4 kada se poredi sa SEQ ID NO: 155, koji je u susedstvu od L (u SEQ ID NO: 155) do H. Konačno, 31A4 nema glutamin kao početnu aminokiselinu od Fab, pre nego što će imati ubacivanje glutaminske kiseline pomenuto gore za 21B 12 i 31H4.
[0456] Za sva tri antitela, kraj teškog lanca (zaokružen tamno sivo) razlikuje se takođe, ali aminokiseline nisu poređane u strukturi tako da se pojave u koordinatama. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, his-tagovi nisu potrebni deo AVP i ne treba da se smatraju kao deo sekvence AVP, ako to nije eksplicitno zahtevano na osnovu reference za specifični SEQ ID NO koji uključuje histidin tag i tvrdnju da sekvenca AVP „uključuje histidin tag."
PRIMER 37
Mapiranje--bining epitopa
[0457] Alternativno postavljeni eksperiment bininga izveden je u dodatku na onaj postavljen u Primeru 10. Kao i u Primeru 10, AVP koji su u kompeticiji jedan sa drugim mogu se smatrati kao vezujući na isto mesto na meti i uobičajeno se kaže da se „binuju" zajedno.
[0458] Upotrebljena je modifikacija Multiplexed Binning metoda opisana od strane Jia, i sar. (J. Immunological Methods, 288 (2004) 91-98). Pojedinačni kodovi perlica streptavidin obavijenih Luminex perlica su inkubirani u 100ul 0.5 ug/ml biotiniliranog monovalentnog miš-antihumanog IgG zarobljenog antitela (BD Pharmingen, #555785) tokom 1 časa na sobnoj temperaturi u mraku, zatim isprano 3x sa PBSA, slanim rastvorom fosfatnog pufera (PBS) plus 1% goveđi serum albumin (BSA). Svaka kod perlica je odvojeno inkubirana sa 100 ul 2 ug/ml anti-PCSK9 antitela (obavijajuće antitelo) tokom 1 časa a zatim isprana 3x sa PBSA. Perlice su sakupljene i zatim razdeljene u filter ploču sa 96-bunarčića (Millipore, #MSBVN1250).100ul od 2 ug/ml prečišćenog PCSK9 proteina je dodano u polovinu bunarčića. Drugoj polovini je dodan pufer kao kontrola. Reakcija je inkubirana tokom 1 časa i zatim isprana. 100 ul od 2 ug/ml anti-PCSK9 antitela (Detection Ab) je dodano u sve bunarčiće, inkubirano tokom 1 časa, zatim isprano. Irelevantni humani-IgG (Jackson, #009-000-003) je pušten kao druga kontrola.20ul PE-konjugovanog monovalentnog miš-anti-humanog IgG (BD Pharmingen, #555787) je dodano u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1 časa i zatim isprano. Perlice su resuspendovane u 100ul PBSA i minimum 100 događaja/kod perlice je sakupljeno na BioPlex instrumentu (BioRad).
[0459] Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) para antitela bez PCSK9 je oduzet od signala od odgovarajuće reakcije koja je sadržala PCSK9. Da bi se par antitela smatrao istovremeno vezanim, i prema tome u različitim binovima, oduzeti signal mora biti više od 3 puta signal od antitela koje je u kompeticiji sa samim sobom i 3 puta signal antitela koje je u kompeticiji sa irelevantnim antitelom.
[0460] Gornji podaci su prikazani u FIG. 23A-23D. AVP spadaju u pet binova. Osenčeni kvadrati naznačavaju AVP koji se mogu vezati istovremeno za PCSK9. Neosenčeni kvadrati naznačavaju one AVP koji su u kompeticiji sa svakim drugim za vezivanje. Sažetak rezultata je prikazan u Tabeli 37.1.
Tabela 37.1
[0461] Binovi 1 (u kompeticiji sa AVP 21B12) i 3 (u kompeticiji sa 31H4) su isključeni jedan od drugog; bin 2 je u kompeticiji sa binovima 1 i 3; i bin 4 nije u kompeticiji sa binovima 1 i 3. Bin 5, u ovom primeru, je prisutan kao „uhvati sve" bin da opiše AVP koji se ne uklapaju u druge binove. Prema tome, gore identifikovani AVP u svakom od binova su predstavnici različitih tipova lokacija epitopa na PCSK9, od kojih se neki preklapaju jedan sa drugim.
[0462] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, ako pomenuti AVP sprečava vezivanje probe AVP onda se kaže da su antitela u istom binu. Redosled u kojem su AVP upotrebljeni može biti važan. Ako je AVP A upotrebljen kao pomenuti AVP i blokira vezivanje AVP B suprotno nije uvek tačno: AVP B upotrebljen kao pomenuti AVP neće neophodno blokirati AVP A. Postoji jedan broj faktora koji ovde imaju ulogu: vezivanje AVP može uzrokovati konformacione promene u meti što sprečava vezivanje drugog AVP, ili epitopa koji preklapaju ali ne pokalpaju potpuno jedan drugog što može omogućiti drugom AVP da još uvek ima dovoljno interakcija visokog afiniteta sa ciljem da se omogući vezivanje. AVP sa mnogi višim afinitetom mogu imati mnogo veću sposobnost da uklone blokirajući AVP sa puta. Generalno, ako je zapažena kompeticija u bilo kom redu AVP kaže se da se oni binuju zajedno, a ako AVP mogu blokirati jedan drugog onda je verovatno da će se epitopi poklapati mnogo kompletnije.
PRIMER 38
Mapiranje epitopa-western blot
[0463] Ovaj primer pokazuje da li epitopi jesu ili nisu bili linearni ili konformacioni za ispitane AVP. Denaturišući redukovani i denaturišući neredukovani western blot-ovi su pušteni da se odredi koja antitela imaju konformacioni epitop. Antitela koja se vezuju za denaturišući redukovani western blot imaju linearni epitop i nisu konformaciona. Rezultati su prikazani na FIG. 24A i FIG.24B. Za blot, 0.5 ug/linija prečišćenog humanog PCSK9 pune dužine je puštena na 4-12% NuPAGE Bis-Tris gelu i MES SDS puferu ciklusa. 1 ug/ml anti-PCSK9 antitela, sem 0.5 ug/ml 31G11, je upotrebljeno za probe blota.1:5000 sekundarni magarac-anti-humani-IR700 je upotrebljen i očitan na LiCOR instrumentu. Antitelo 13H1 se vezuje za linearni epitop na prodomen od PCSK9. Sva druga antitela pokazala su rezultate koji su bili konzistentni sa konformacionim epitopima. Ovi gelovi razdvajaju pro-domen od ostatka proteina, i pro domen startuje na oko 15kDa. Sem toga, pokazalo se da se 3C4 i 31A4 vezuju za konformacione epitope koji su bili sačuvani pomoću disulfidnih veza, pošto se ta antitela vezuju za PCSK-9 pod denaturišućim uslovima gde su disulfidne veze bile sačuvane (levo) ali redukujući tako uzorke (desno) eliminišući vezivanje.
PRIMER 39
Mapiranje epitopa--skeniranje arginin / glutaminska kiselina
[0464] Reprezentativni AVP iz svakog bina (na Primer 37) su odabrani iz dalje analize epitopa. Arginin/glutaminska kiselina-skeniranje strategija je izvedena radi mapiranja AVP vezivanja za PCSK9. Pomoću pozadine, ovaj metod determiniše da li je ostatak deo strukturnog epitopa, što znači da ti ostaci u antigenu ili kontaktiraju ili su pokriveni od strane antitela. Arginin i glutaminska kiselina bočni lanci su naelektrisani i zamašni i mogu prekinuti vezivanje antitela čak i kada mutirani ostatak nije direktno uključen u vezivanje antitela.
Selekcija ostataka
[0465] Kristalna struktura PCSK9 je upotrebljena da se odaberu ostaci koji bi trebalo da se mutiraju radi mapiranja epitopa. Metod koji je upotrebljen da se odaberu ostaci koji će se mutirati uključio je oba mehanizma za izračunavanje i interaktivnu analizu strukture. PCSK9 struktura je sadržala gapove i nedostajuće ostatke i nedostajalo joj je 30 aminokiselina u N- (tj., signalna sekvenca) i 10 aminokiselina u C-kraju. Unutrašnji nedostajući ostaci su modelirani na strukturu, ali N- i C-terminalni nedostajući ostaci nisu. Odnos izloženosti rastvarača za svaki ostatak je izračunat: područje površine svakog ostatka u kontekstu proteina (SA1) je podeljeno sa područjem površine ostatka u trimeru sa visećim glicinima (SA2) sa konzerviranom strukturom kičme. Ostaci sa odnosom izloženosti rastvarača više od 10% (R10) su odabrani kao i 40 nedostajućih terminalnih ostataka. Od njih, prolini i glicini sa pozitivnim Φ uglovima su isključeni da se redukuje mogućnost pogrešnog savijanja. Broj ostataka koji bi trebalo da se mutira u V domenu je redukovan koristeći odnos izlaganja rastvarača od 37% duž zajedno sa vizuelnom inspekcijom celog proteina da dovede do ukupnog broja mutacija od 285. Različite orijentacije površine PCSK9 s tim različitim klasama identifikovanja su prikazane na FIG.25A-25F. Na tim slikama, najsvetlije sivo označava područja koja nisu odabrana ili su deselektovana. Tamno sivo označava one ostatke koji su odabrani).
Kloniranje i ekspresija
[0466] Onda kada su ostaci koji bi trebalo da se promene identifikovani, izmenjeni su različiti ostaci. Humani PCSK9 je kloniran u pTT5 vektor sa C-terminal Flag-His tagom. Mutanti su napravljeni iz tog originalnog konstrukta pomoću mutageneze usmerene na mesto koristeći QuikChange II kit od Stratagene. Sens i anti-sens oligonukleotidi koji su upotrebljeni za mutagenezu označeni su koristeći Amgen's MutaGenie softver. Svi PCSK9 konstrukti su eksprimirani u prolazno-transfektovanim 293-6E ćelijama u pločama sa 24-bunarčića i ponovo raspoređeni u tri ploče sa 96-bunarčića sa ne-mutiranim PCSK9 kontrolama (divlji tip, WT) u svakoj ploči. Nivoi ekspresije i integritet rekombinantnih proteina u uslovnom medijumu su provereni sa Western blot-om. Od originalno odabranih 285 mutanata, kod 41 nije uspelo kloniranje ili ekspresija. 244 mutanata je upotrebljeno za mapiranje epitopa. Poklapanje roditeljeske sekvence PCSK9 i reprezentativne sekvence PCSK9 sa 244 mutirana ostatka je prokazano na FIG.26. Napravljeni su odvojeni konstrukti koji su sadržali pojedinačnu mutaciju. Radi namene sekvenci epitopa i epitop zasnovanih primena uključujući promene u vezivanju, sekvence su obezbeđene u vezi sa SEQ ID NO: 1 i/ili SEQ ID NO: 303. Sekvence na FIG.26 su sekvence upotrebljene za ove studije vezivanja epitopa. Stručnjak će prihvatiti da su ovi rezultati primenjivi na druge PCSK9 varijante takođe otkrivene ovde (npr., SEQ ID NO: 1 i 3, kao i druge alelske varijante).
[0467] Pet antitela, reprezentativnih za svaki bin, je odabrano za fino mapiranje epitopa. Oni su bili 21B12, 31H4, 12H11, 31A4, 3C4. Sva konformaciona epitop antitela. Tri, 21B12, 31H4, i 31A4 su takođe kristalizovana sa PCSK9, kao što je gore opisano.
Strukturni i funkcionalni epitopi
[0468] Epitopi se mogu dalje definisati kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podset strukturnih epitopa i imaju takve ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcija (npr. vodonične veze, jonske interakcije). Strukturni epitopi mogu se smatrati delom mete koji je pretvoren od strane antitela.
[0469] Upotrebljena skening mutageneza bila je sken arginina i glutaminske kiseline. Ta dva bočna lanca su odabrana zbog njihove velike sterične mase i njihovog naelektrisanja, koji omogućuju da mutacije koje se dešavaju u strukturnom epitopu imaju veći efekat na vezivanje antitela. Arginin je generalno upotrebljen sem kada je WT bio arginin, i u tim slučajevima ostatak je mutiran u glutaminsku kiselinu da se promeni naelektrisanje.
[0470] Za svrhu mapiranja epitopa, multipleks ogled zasnovan na perlicama je upotrebljen da se meri vezivanje antitela PCSK9 i PCSK9 mutanata istovremeno. Vezivanje antitela za mutante je poređeno za njegovo vezivanje za divlji tip u istom bunarčiću. Varijante su razdvojene u tri grupe: grupa 1: 81 varijanta 2 wt kontrole 1 negativna kontrola 1 drugi PCSK9 supernatant; grupa 2: 81 varianta 2 wt kontrole 2 negativne kontrole; i grupa 3: 82 varujante 2 wt kontrole 1 negativna kontrola.
[0471] Ogled je tekao na sledeći način: 85 setova strepavidin-obavijenih LumAvidin perlica kodiranih bojom (Luminex) je vezano sa biotiniliranim anti-pentaHis antitelom (Qiagen, #1019225) tokom 1 časa na sobnoj temperaturi (ST) zatim isprano tri puta u PBS, 1% BSA, 0.1% Tween 20. Svaki set perlica kodiran bojom je zatim ostavljen da se veže za PCSK9 mutant, divlji tip, ili negativnu kontrolu u 150 ul supernatanta preko noći na 4 °C.
[0472] Bojom kodirani setovi perlica, svaki vezan sa specifičnim proteinom, isprani su i sakupljeni. U toj tački, bila su 3 skupa od po 85 setova perlica, jedan skup za svaku grupu mutanata i kontrole. Perlice iz svakog skupa su alikvotirane u 24 bunarčića (3 kolone) od filter ploča sa 96-bunarčića (Millipore, #MSBVN1250). 100 ul anti-PCSK9 antitela u 4-puta razblaženjima je dodano u devet kolona za utrostručene tačke i inkubirano tokom 1 časa na ST i isprano. 100ul od 1:200 razblaženja fikoeritrin (PE)-konjugovani anti-humani IgG Fc (Jackson Immunoresearch, #109-116-170) je dodano u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1 časa na ST i isprano.
[0473] Perlice su resuspendovane u 1% BSA u PBS, mućkane tokom 10 minuta i očitane na BioPlex instrumentu (Bio-Rad). Instrument identifikuje svaku perlicu prema njenom kodu boje identifikujući tako specifični protein vezan sa kodom boje. U isto vreme, on meri količinu antitela vezanog za perlice preko intenziteta fluorescencije PE boje. Antitelo koje se vezuje za svaki mutant može zatim biti direktno upoređeno prema svom vezivanju za divlji tip u istom skupu. IL-17R himera E je upotrebljena kao negativna kontrola. Sažetak svih ispitanih mutanata je prikazan u Tabeli 39.1 (sa pozivom na numerisanje sekvence upotrebljeno na FIG.1A i 26).
Tabela 39.1
Studija varijabilnosti perlice
[0474] Pre puštanja ogleda mapiranja vezivanja epitopa, izveden je eksperiment potvrđivanja da se proceni varijabilnost „region perlice" prema „regionu perlice" (B-B). U eksperimentu potvrđivanja, sve perlice su bile konjugovane sa istim divljim tipom kontrolnog proteina. Prema tome, razlika između regiona perlica bila je isključivo zbog čiste B-B varijanse i nije bila pomešana sa razlikom između divljeg tipa i mutantnih proteina. Titracija antitela je obavljena u dvanaest ponavljanja u različitim bunarčićima.
[0475] Cilj ove statističke analize bio je da se proceni B-B varijabilnost procenjenih EC50 od vezivanja krivih. Procenjena B-B standardna devijacija (SD) je zatim upotrebljena da se naprave EC50 intervali pouzdanosti divljeg tipa i mutantnih proteina tokom poređenja krivih iz uporednih eksperimenata.
[0476] Četvorostruko-parametarski logistički model je podešen za podatke vezivanja za svaki region perlice. Nastali fajl, koji je sadžao rezultate krive kontrole kvaliteta (QC) i procenjene parametre za vrh (maks), dno (min), Hillslope (nagib), i prirodni log od EC50 (xsred) od krivih, su upotrebljeni kao sirovi podaci za analizu. B-B varijabilnost za svaki parametar je zatim procenjena pomoću podešavanja modela pomešanog efekta koristeći SAS PROC MIXED proceduru. Samo krive sa „dobrim" QC statusom su uključene u analizu. Konačni model mešanog efekta uključio je samo ostatak (tj. pojedinačne regione perlica) kao slučajni efekt. Srednja vrednost najmanjeg kvadrata (LS-srednja vrednost) za svaki parametar je takođe procenjena sa modelom mešanog efekta. B-B SD je izračunata vađenjem kvadratnog korena B-B varijanse. Takođe je izračunata promena umnožaka između LS-srednje vrednosti 2SD i LS-srednje vrednosti - 2SD, koja predstavlja približno gornji i donji 97.5 percentil populacije. Rezultati su prikazani u Tabeli 39.2
Tabela 39.2
Srednja vrednost najmanjeg kvadrata i procena
varijanse perlica-prema-perlici
∗ xsred je prirodni log od EC50. Promena umnoška za xsred je pretvorena ponovo u originalnu skalu.
Identifikovanje ostataka u strukturnom epitopu
[0477] Ostatak je smatran delom strukturnog epitopa („pogotka") kada mutiranje u arginin ili glutaminsku kiselinu izmeni vezivanje antitela. To je viđeno kao pomak u EC50 ili redukcija maksimuma signala u poređenju sa vezivanjem antitela divljeg tipa. Statističke analize krivih vezivanja antitela za divlji i mutant su upotrebljene da se identifikuju statistički značajni EC50 pomaci. Analiza uzima u obzir variranje u ogledu i krivu podešavanja.
Identifikacija pogotka zasnovana na poređenju EC50
[0478] EC50 i Bmax vrednosti su generisane od Weighted 4-Parameter Logistical modela podešenog za podatke vezivanja S-PLUS sa VarPower softverom (Insightful Corporation, Seattle WA). Upoređeni su EC50 od krivih vezivanja mutanta i krivih vezivanja divljeg tipa. Statistički značajne razlike su identifikovane kao pogoci radi daljeg razmatranja. Krive sa „nepodešenim" ili „loše podešenim" obeležjima su isključene iz analize.
Varijacije u procenama EC50
[0479] Razmatrana su dva izvora variranja u poređenju procena EC50, variranje od podešavanja krive i variranje perlica-prema-perlici. Divlji tipovi i mutanti su vezani za razliličite perlice, prema tome, njihove razlike su pomešane sa razlikom perlica-perlica (opisano gore). Variranje podešavanja krive je procenjeno sa standardnom greškom log EC50 procena. Variranje perlicaperlica je eksperimentalno određeno koristeći eksperiment u kojem su kontrole divljeg tipa bile vezane svaka za jednu perlicu (opisano gore). Variranje procena EC50 krive vezivanja divljeg tipa iz ovog eksperimenta je upotrebljeno da se proceni variranje perlica-perlica u aktuelnom eksperimentu mapiranja epitopa.
Testiranje za pomak EC50 između mutanta i divljeg tipa
[0480] Poređenje dva EC50 (u log skali) je izvedeno koristeći Studentov t-test. T-statistika je izračunata kao odnos između delta (apsolutne razlike između EC50 procena) i standardne devijacije delta. Varijansa delta je procenjena sabiranjem tri komponente, procene varijanse od EC50 za krive mutanta i divlji tip u nelinearnoj regresiji i dva puta varijansa perlica-perlica procenjena u odvojenom eksperimentu. Umnožak od dva za varijansu perlica-perlica je upotrebljen zbog pretpostavke da perlice i mutant i divlji tip imaju istu varijansu. Stepen slobode standardne devijacije delta je izračunat koristeći Satterthwaite-ovu (1946) aproksimaciju. Individualne p-vrednosti i intervali poverenja (95% i 99%) izvedeni su na osnovu Studentove t distribucije za svako poređenje. U slučaju višestrukih kontrola divljeg tipa, upotrebljen je konzervativni pristup odabiranjem kontrole divljeg tipa koja je bila najsličnija mutantu, tj., odabiranjem onih sa najvećim p-vrednostima.
[0481] Doterivanja višestrukosti bila su važna da se kontroliše lažno pozitivna(e) dok se obavlja veliki broj testova istovremeno. Dva oblika doterivanja višestrukosti su implementirana za ovu analizu: kontrola porodične pametne greške (FWE) i kontrola lažne stope otkrića (FDR). FWE pristup kontroliše verovatnoću da jedan ili više pogodaka nisu realni; FDR pristup kontroliše verovatnoću očekivane proporcije lažno pozitivnih među odabranim pogocima. Prvi pristup je konzervativniji i manje snažan nego onaj poslednji. Postoji mnogo dostupnih metoda za oba pristupa, za ovu analizu, odabrani su Hochberg-ov (1988) metod za FWE analizu i Benjamini-Hochberg-ov (1995) FDR metod za FDR analizu. Izračunate su doterane p-vrednosti za oba pristupa.
Rezultati
Pomak EC50
[0482] Mutacije čiji je EC50 značajno različit od divljeg tipa, npr., ima False Discovery Rate doteranu p-vrednost za ceo ogled od 0.01 ili manje, smatrane su delom strukturnog epitopa. Svi ovi pogoci takođe imaju porodično mudar tip I stope greške doteranu p-vrednost za svako antitelo manju od 0.01 sem ostatka R185E za antitelo 31H4 koje ima FWE doteranu p-vrednost po antitelu od 0.0109. Ostaci u strukturalnom epitopu različitih antitela određeni sa EC50 pomakom prikazani su u Tabeli 39.3 (tačkaste mutacije su sa pozivom na SEQ ID NO: 1 i 303).
Tabela 39.3
Maksimum redukcije signala
[0483] Procenat maksimuma signala je izračunat koristeći maksimum signala iz podešavanja krive (Bmaks za WT) i tačku sirovog podatka (Sirovi Max za WT). Mutacije koje su redukovale maksimum signala vezivanja antitela za ≥ 70% u poređenju sa signalom divljeg tipa ili koje su redukovale signal antitela u poređenju sa drugim antitelima za >50% kada su sva druga antitela najmanje 40% divljeg tipa smatrane su pogotkom i delom epitopa. Tabela 39.4 pokazuje ostatke koji su u strukturalnom epitopu (kurziv) kao što je određeno redukcijom maksimuma signala.
Tabela 39.4
(tačkaste mutacije su u okviru poziva na SEQ ID NO: 1 i FIG.26).
[0484] Tabela 39.5 prikazuje sažetak svih pogodaka za različita antitela.
[0485] Da bi se dalje ispitalo kako ti ostaci formiraju deo ili cele odgovarajuće epitope, gore pomenute pozicije su mapirane na modele različite kristalne strukture, rezultati su prikazani na FIG. 27A do 27E. FIG. 27A prikazuje 21B12 epitop pogotke, kao što su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 21B12 antitelom. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetlo sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na slici) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax Epitop pogoci su zasnovani na Bmax pomaku. Na ovoj slici, 31H4 je iza 21 B12.
[0486] FIG. 27B prikazuje 31H4 epitop pogotka, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 31H4 i 21B 12 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetlo sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) i tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na slici) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax. Epitop pogotka su zasnovani na EC50 pomaku.
[0487] FIG. 27C prikazuje 31A4 epitop pogotka, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 31H4 i 21B 12 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetlo sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) i tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na slici) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax. Epitop pogoci su zasnovani na EC50 pomaku. Poznato je da se 31A4 antitelo vezuje za V-domen PCSK9, za koji se pokazuje da je konzistentan sa rezultatima predstavljenim na FIG.27C.
[0488] FIG.27D prikazuje 12H11 epitop pogotka, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 31H4 i 21B12 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetlo sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) i tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na slici) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax. 12H11 je u kompeticiji sa 21B 12 i 31H4 u ogledu vezivanja opisanom gore.
[0489] FIG. 27E prikazuje 3C4 epitop pogotke, onako kako su mapirani na kristalnu strukturu PCSK9 sa 31H4 i 21B 12 antitelima. Struktura identifikuje PCSK9 ostatke na sledeći način: svetlo sivo označava one ostatke koji nisu mutirali (sa izuzetkom onih ostataka koji su eksplicitno naznačeni na strukturi) i tamnije sivo označava mutirane ostatke (čiji mali deo nije uspeo da se eksprimira). Ostaci koji su eksplicitno naznačeni su testirani (bez obzira na senčenje označeno na slici) i kao rezultat su dali značajne promene u EC50 i/ili Bmax.
[0490] 3C4 nije u kompeticiji sa 21B12 i 31H4 u ogledu vezivanja.3C4 se vezuje za V-domen u ogledu vezivanja domena (vidi rezultate iz Primera 40, FIG.28A i 28B).
[0491] I dok je bilo približno dvanaest mutanata za koje se očekivalo da mogu imati efekat na vezivanje (zasnovano na kristalnoj strukturi), ovaj eksperiment je pokazao da, na iznenađenje, oni nisu imali efekta. Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, rezultati prikazani gore se dobro slažu sa kristalnim strukturama i vezivanjem PCSK-9 ovih antitela. To pokazuje da obezbeđeni strukturni i odgovarajući funkcionalni podaci adekvatno identifikuju ključne ostatke i područja interakcije neutralizujućih AVP i PCSK9. Prema tome, varijante AVP koje poseduju sposobnost da se vezuju za gore pomenuta područja su adekvatno obezbeđena od strane predmetnog pronalaska.
[0492] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, dok B-maks pad i EC50 pomak pogotka može da se smatra manifestacijom istog fenomena, striktno govoreći, sam B-max pad ne reflektuje gubitak afiniteta sam po sebi već, radije, destrukciju nekih procenata epitopa antitela. I ako nema preklapanja u pogocima određenim sa B-maks i EC50, mutacije sa jakim efektom na vezivanjene moraju omogućiti generisanje korisne krive vezivanja i, prema tome, EC50 se ne može odrediti za takve varijante.
[0493] Kao što će biti prihvaćeno od strane stručnjaka, AVP u istom binu (sa izuzetkom bina 5, koji kao što je gore primećeno, generalno hvata sve binove) se vezuju za preklapajuća mesta na ciljnom proteinu. Kao takvi, gornji epitopi i odgovarajući ostaci mogu se generalno proširiti na sve takve AVP u istom binu.
[0494] Da bi se dalje ispitali gornji rezultati u odnosu na AVP 31H4, poziciju E181R, za koje je, prema gornjoj kristalnoj strukturi, bilo predviđeno da intereaguju sa R185 da formiraju deo od površine koja intereaguje sa AVP, takođe je bio izmenjen (E181R). Rezultati, i ako nisu statistički značajni sami po sebi, bili su, kada su kombinovani sa kristalnom strukturom, dokazni za interakciju 31H4 sa E181R (podaci nisu prikazani). Prema tome, izgleda da pozicija 181 takođe formira deo epitopa za 31H4 AVP.
[0495] Kao što je napomenuto gore, gornji podaci vezivanja i karakterizacije epitopa navode PCSK9 sekvencu (SEQ ID NO: 1) koja ne uključuje prvih 30 aminokiselina od PCSK9. Prema tome, sistem numerisanja ovog fragmenta proteina, i SEQ ID NO: koji navode taj fragment, su pomereni za 30 aminokiselina u poređenju sa podacima i eksperimentima koji koriste sistem numerisanja za PCSK9 pune dužine (kao što su oni podaci koji su upotrebljeni u studiji kristala opisani gore). Prema tome, da bi se uporedili ovi rezultati, mora se dodati 30 ekstra aminokiselina na pozicije u svakom od gornjih rezultata mapiranja epitopa. Na primer, pozicija 207 od SEQ ID NO: 1 (ili SEQ ID NO: 303), je u korelaciji sa pozicijom 237 od SEQ ID NO: 3 (sekvenca pune dužine, i sistem numerisanja koji je upotrebljen kroz ostatak prijave). Tabela 39.6 istiće kako su gore pomenute pozicije, koje pominju SEQ ID NO: 1 (i/ili SEQ ID NO: 303) u korelaciji sa SEQ ID NO: 3 (koji uključuje signalnu sekvencu).
TABELA 39.6
POZICIJE AMINOKISELINE U POZICIJE AMINOKISELINE U
SEQ ID NO: 1 (PODACI O EPITOPU) SEQ ID NO: 3 (PODACI O EPITOPU)
207 237
208 238
185 215
181 211
439 469
513 543
538 568
539 569
132 162
351 381
390 420
413 443
162 192
164 194
167 197
123 153
129 159
311 341
313 343
337 367
519 549
521 551
554 584
[0496] Prema tome, ti primeri opisani ovde u vezi sa SEQ ID NO: 1 mogu se takođe opisati, sa njihovim gore pomenutim odgovarajućim pozicijama u vezi sa SEQ ID NO: 3.
PRIMER 40
Ogled vezivanja domena PCSK9
[0497] Ovaj ogled je ispitao gde se na PCSK9 vezuju različiti AVP.
[0498] Prozirne, ploče maksimalne apsopcije sa 96 bunarčića (Nunc) su obavijene preko noći sa 2 ug/ml različitih anti-PCSK9 antitela razblaženih u PBS. Ploče su snažno isprane sa PBS/.05% Tween-20 i zatim blokirane tokom dva časa sa 3% BSA/PBS. Nakon ispiranja, ploče su inkubirane tokom dva časa ili sa PCSK9 pune dužine (aa 31-692 SEQ ID NO: 3, procat PCSK9 (aa 31-449 SEQ ID NO: 3) ili v-domen PCSK9 (aa 450-692 od SEQ ID NO: 3) razblaženim u razblaživaču za opšti ogled (Immunochemistry Technologies, LLC). Ploče su isprane i zečje poliklonalno biotinilizirano anti-PCSK9 antitelo (D8774), koje prepoznaje procat i v-domen kao i PCSK9 pune dužine, je dodano u 1 ug/ml (u 1 %BSA/PBS). Vezani pune dužine, procat ili vdomen PCSK9 je detektovan pomoću inkubiranja sa neutravidin-HRP (Thermo Scientific) na 200 ng/ml (u 1% BSA/PBS) praćenim sa TMB supstratom (KPL) i merenjem apsorbance na 650 nm. Rezultati, prikazani na FIG.28A i 28B, pokazuju sposobnost različitih ABS da se vezuju za različite delove PCSK9. Kao što je prikazano na FIG.28B, AVP 31A4 se vezuje za V domen od PCSK9.
UPOREDNI PRIMER 41 (nije prema ovom pronalasku)
Neutralizujući, ne-kompetitivni antigen vezujući proteini
[0499] Ovaj primer pokazuje kako da se identifikuje i okarakteriše antigen vezujući protein koji je ne-kompeptitivan sa LDLR za vezivanje sa PCSK9, ali je još uvek neutralizujući u odnosu na aktivnost PCSK9. Drugim rečima, takav antigen vezujući protein neće blokirati PCSK9 da se vezuje za LDLR, ali će sprečiti ili redukovati PCSK9 posredovanu degradaciju LDLR.
[0500] Prozirne, ploče sa 384 bunarčića (Costar) obavijene su sa 2 ug/ml kozjeg anti-LDL receptor antitela (R&D Systems) razblaženog u puferu A (100 mM natrijum kakodilat, pH 7.4). Ploče su snažno isprane sa puferom A i zatim blokirane tokom 2 časa sa puferom B (1% mleko u puferu A). Nakon ispiranja, ploče su inkubirane tokom 1.5 časa sa 0.4 ug/ml od LDL receptora (R&D Systems) razblaženog u puferu C (pufer B snabdeven sa 10 mM CaCl2). Konkurentno sa inkubacijom, 20 ng/ml biotiniliranog D374Y PCSK9 je inkubirano sa 100 ng/ml antitela razblaženog sa puferom A ili samim puferom A (kontrola). Ploče koje su sadržale LDL receptor su isprane i biotinilirane D374Y PCSK9/antitelo mešavina je preneta u njih i inkubirana tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Vezivanje biotiniliranog D374Y za LDL receptor je detektovano pomoću inkubacije sa streptavidin-HRP (Biosource) na 500 ng/ml u puferu C praćeno sa TMB supstratom (KPL). Signal je ugašen sa IN HCl i apsorbanca je očitana na 450 nm. Rezultati su predstavljeni na FIG. 28C, koja pokazuje da dok AVP 31H4 inhibira LDLR vezivanje, AVP 31A4 ne inhibira LDLR vezivanje za PCSK9. U kombinaciji sa rezultatima iz Primera 40 i prikazanim na FIG. 28A i 28B, i jasno je da se 31A4 AVP vezuje za V domen od PCSK9 i ne blokira interakciju PCSK9 sa LDLR.
[0501] Dalje je sposobnost AVP 31A4 da posluži kao neutralizujući AVP bila potvrđena preko ogleda uzimanja LDL od strane ćelija (kao što je opisano u primerima gore). Rezultati tog ogleda uzimanja LDL su predstavljeni na FIG. 28D. Kao što prikazano na FIG. 28D, AVP 31A4 pokazuje značajnu sposobnost neutralizacije PCSK9. Prema tome, u svetlu Primera 40 i ovih rezultata, jasno je da AVP mogu da se vežu za PCSK9 bez blokiranja PCSK9 i LDLR interakcije vezivanja, dok su još uvek korisni kao neutralizatori PCSK9 AVP.
ATOM 68 LYS 69 18.481 -29.195 5.237 1.00 41.46 A C ATOM 69 LYS 69 19.397 -28.113 5.730 1.00 40.68 A N ATOM 70 LYS 69 19.233 -35.212 4.887 1.00 29.96 A C ATOM 71 LYS 69 18.252 -35.845 5.273 1.00 30.13 A O ATOM 72 ASP 70 20.427 -35.764 4.731 1.00 28.75 A N ATOM 73 ASP 70 20.580 -37.202 4.782 1.00 27.72 A C ATOM 74 ASP 70 22.052 -37.571 4.623 1.00 30.38 A C ATOM 75 ASP 70 22.243 -38.864 3.847 1.00 33.51 A C ATOM 76 ASP 70 21.800 -38.932 2.675 1.00 34.66 A O ATOM 77 ASP 70 22.834 -39.813 4.406 1.00 33.99 A O ATOM 78 ASP 70 20.008 -37.850 6.045 1.00 25.79 A C ATOM 79 ASP 70 19.346 -38.878 5.970 1.00 25.05 A O ATOM 80 PRO 71 20.258 -37.265 7.225 1.00 24.83 A N ATOM 81 PRO 71 21.116 -36.107 7.526 1.00 24.43 A C ATOM 82 PRO 71 19.729 -37.890 8.445 1.00 24.69 A C ATOM 83 PRO 71 20.456 -37.157 9.572 1.00 24.48 A C ATOM 84 PRO 71 20.847 -35.854 8.980 1.00 24.31 A C ATOM 85 PRO 71 18.207 -37.806 8.587 1.00 24.67 A C ATOM 86 PRO 71 17.603 -38.557 9.353 1.00 25.53 A O ATOM 87 TRP 72 17.589 -36.892 7.848 1.00 22.88 A N ATOM 88 TRP 72 16.145 -36.742 7.892 1.00 21.03 A C ATOM 89 TRP 72 15.749 -35.337 7.462 1.00 21.00 A C ATOM 90 TRP 72 16.168 -34.308 8.454 1.00 20.77 A C ATOM 91 TRP 72 15.958 -32.894 8.366 1.00 18.78 A C ATOM 92 TRP 72 16.470 -32.326 9.551 1.00 18.39 A C ATOM 93 TRP 72 15.390 -32.056 7.406 1.00 16.68 A C ATOM 94 TRP 72 16.785 -34.531 9.650 1.00 19.91 A C

Claims (11)

  1. Patentni zahtevi 1. Monoklonalno antitelo ili neki njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u lečenju ili prevenciji hiperholesterolemije ili bolesti ateroskleroze povezane sa povišenim nivoima holesterola u serumu; ili za upotrebu u redukovanju rizika od povratka kardiovaskularnog događaja povezanog sa povišenim nivoima holesterola u serumu; pri čemu se monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje za katalitički domen PCSK9 proteina aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, i sprečava ili redukuje vezivanje PCSK9 za LDLR.
  2. 2. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu prema zahtevu 1, u lečenju ili prevenciji hiperholesterolemije.
  3. 3. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu prema zahtevu 1, u lečenju ili prevenciji bolesti ateroskleroze povezane sa povišenim nivoima holesterola u serumu.
  4. 4. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu prema zahtevu 3, pri čemu je bolest ateroskleroze odabrana iz grupe koju čine koronarna srčana bolest, bolest koronarne arterije, bolest periferne arterije, ishemijski ili hemoragični moždani udar, angina pektoris, cerebrovaskularna bolest, akutni koronarni sindrom ili infarkt miokarda.
  5. 5. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu u redukovanju rizika od povratka kardiovaskularnog događaja povezanog sa povišenim nivoima holesterola u serumu.
  6. 6. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu se monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment daje zajedno sa najmanje jednim drugim agensom za snižavanje holesterola.
  7. 7. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu prema zahtevu 6, pri čemu najmanje jedan drugi agens za snižavanje holesterola predstavlja statin, pri čemu je opciono statin izabran iz grupe koju čine atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rozuvastatin i simvastatin.
  8. 8. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu je monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment izabran iz grupe koju čine humano antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, rekombinantno antitelo, antigen vezujući fragment antitela, jednolančano antitelo, dijatelo, Fab fragment, F(ab)2fragment, IgG1 antitelo, IgG2 antitelo, IgG3 antitelo i IgG4 antitelo ili neki njihov antigen vezujući fragment.
  9. 9. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu se monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje za PCSK9 varijantu koja ima D374Y tačkastu mutaciju.
  10. 10. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu se monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje za PCSK9 sa Kdkoja je manja od 1 nM, manja od 100 pM, manja od 10 pM ili manja od 5 pM.
  11. 11. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen vezujući fragment za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je subjekat humani pacijent.
RS20230403A 2007-08-23 2008-08-22 Antigen vezujući proteini za proprotein konvertazu subtilizin keksin tip 9 (pcsk9) RS64295B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95766807P 2007-08-23 2007-08-23
US896507P 2007-12-21 2007-12-21
US1063008P 2008-01-09 2008-01-09
US8613308P 2008-08-04 2008-08-04
EP19207796.4A EP3666797B1 (en) 2007-08-23 2008-08-22 Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64295B1 true RS64295B1 (sr) 2023-07-31

Family

ID=39951467

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230403A RS64295B1 (sr) 2007-08-23 2008-08-22 Antigen vezujući proteini za proprotein konvertazu subtilizin keksin tip 9 (pcsk9)
RS20160312A RS54756B2 (sr) 2007-08-23 2008-08-22 Antigen vezujući proteini za proprotein konvertazu subtilizin keksin tip 9 (pcsk9)

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160312A RS54756B2 (sr) 2007-08-23 2008-08-22 Antigen vezujući proteini za proprotein konvertazu subtilizin keksin tip 9 (pcsk9)

Country Status (42)

Country Link
US (27) US8030457B2 (sr)
EP (3) EP3666797B1 (sr)
JP (7) JP5441905B2 (sr)
KR (10) KR20260006647A (sr)
CN (8) CN104311667A (sr)
AR (1) AR068011A1 (sr)
AU (1) AU2008288791B2 (sr)
BR (2) BRPI0816117B8 (sr)
CA (1) CA2696252C (sr)
CL (1) CL2008002495A1 (sr)
CO (1) CO6230997A2 (sr)
CR (1) CR11328A (sr)
CY (3) CY1117940T1 (sr)
DE (2) DE19207796T9 (sr)
DK (2) DK3666797T5 (sr)
EA (1) EA032106B1 (sr)
ES (3) ES2946083T3 (sr)
FI (2) FI3666797T3 (sr)
FR (1) FR16C0025I2 (sr)
HR (2) HRP20160494T4 (sr)
HU (4) HUE028162T2 (sr)
IL (5) IL304868A (sr)
JO (1) JOP20080381B1 (sr)
LT (3) LT3666797T (sr)
LU (2) LU93096I2 (sr)
MA (1) MA31978B1 (sr)
MX (3) MX2010001921A (sr)
MY (3) MY199053A (sr)
NL (1) NL300818I2 (sr)
NO (3) NO2016010I1 (sr)
NZ (1) NZ584101A (sr)
PE (8) PE20221507A1 (sr)
PH (2) PH12013502285B1 (sr)
PL (2) PL3666797T3 (sr)
PT (1) PT3666797T (sr)
RS (2) RS64295B1 (sr)
SG (2) SG10201710183TA (sr)
SI (2) SI3666797T1 (sr)
TN (1) TN2010000063A1 (sr)
TW (7) TWI675846B (sr)
UA (1) UA127402C2 (sr)
WO (1) WO2009026558A1 (sr)

Families Citing this family (237)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE16192152T1 (de) 2000-05-26 2020-08-06 Immunex Corporation Verwendung von interleukin-4 rezeptor (il-4r) antikörpern und zusammensetzungen davon
EP2194128B1 (en) 2006-05-11 2012-08-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene
EP2083861A4 (en) 2006-11-07 2010-11-24 Merck Sharp & Dohme ANTAGONISTS OF PCSK9
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
EP2615114B1 (en) 2007-08-23 2022-04-06 Amgen Inc. Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9)
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
WO2009134487A2 (en) * 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
AR070316A1 (es) * 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Antagonistas de pcsk9 (proproteina subtilisina-kexina tipo 9)
AR070315A1 (es) * 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9
ES2808660T3 (es) 2008-08-04 2021-03-01 Amgen Inc Proteínas de unión a antígeno para proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9)
TWI516501B (zh) * 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
US20130064834A1 (en) 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
US8357371B2 (en) 2008-12-15 2013-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to PCSK9
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
KR20120050429A (ko) * 2009-06-15 2012-05-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｐｃｓｋ9 유전자를 표적으로 하는 지질 제형된 ｄｓｒｎａ
WO2011028938A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering serum cholestrol in a subject using inhibition of pcsk9
PE20121544A1 (es) * 2009-09-03 2012-12-02 Pfizer Vaccines Llc Vacuna de pcsk9
WO2011037791A1 (en) * 2009-09-25 2011-03-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Antagonists of pcsk9
EP2494355A4 (en) * 2009-10-30 2013-05-01 Merck Sharp & Dohme PCSK9 IMMUNOASSAY
EP2493507A4 (en) 2009-10-30 2013-11-20 Merck Sharp & Dohme AX213 AND AX132 PCSK9 ANTAGONISTS AND VARIANTS THEREOF
WO2011053759A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Ax1 and ax189 pcsk9 antagonists and variants
AR079336A1 (es) * 2009-12-11 2012-01-18 Irm Llc Antagonistas de la pro-proteina convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9)
WO2011087934A2 (en) 2010-01-12 2011-07-21 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Kexin-derived vaccines to prevent or treat fungal infections
US9181538B1 (en) 2010-01-12 2015-11-10 Karen A. Norris Kexin-based vaccines to prevent or treat fungal infections
EP2545079A2 (en) * 2010-03-11 2013-01-16 Rinat Neuroscience Corporation ANTIBODIES WITH pH DEPENDENT ANTIGEN BINDING
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
BR112013018740A2 (pt) * 2011-01-28 2019-01-08 Sanofi Sa anticorpos humanos para pcsk9 para uso em métodos de tratamento de grupos específicos de indivíduos
EP2650016A1 (en) * 2011-01-28 2013-10-16 Sanofi Human antibodies to PSCK9 for use in methods of treatment based on particular dosage regimens (11565)
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US10314865B2 (en) 2011-02-04 2019-06-11 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer and other age-related diseases by extending the healthspan of a human
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US12257272B2 (en) 2015-12-24 2025-03-25 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US12533312B2 (en) 2011-02-04 2026-01-27 Seed Health, Inc. Method and system for preventing sore throat in humans
US12279989B2 (en) 2011-02-04 2025-04-22 Seed Health, Inc. Method and system for increasing beneficial bacteria and decreasing pathogenic bacteria in the oral cavity
US9730967B2 (en) 2011-02-04 2017-08-15 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
CN103562227B (zh) * 2011-02-11 2016-12-21 诺瓦提斯公司 Pcsk9拮抗剂
EP3604330A1 (en) 2011-02-25 2020-02-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fcgammariib-specific fc antibody
EP3421592B1 (en) 2011-04-28 2023-09-13 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Identification of polynucleotides associated with a sample
JP6081714B2 (ja) * 2011-04-28 2017-02-15 株式会社ビー・エム・エル 高コレステロール血症と動脈硬化の検出方法
AR088782A1 (es) * 2011-04-29 2014-07-10 Sanofi Sa Sistemas de ensayo y metodos para identificar y caracterizar farmacos hipolipemiantes
JOP20200043A1 (ar) * 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
US20140004122A1 (en) * 2011-05-10 2014-01-02 Amgen Inc. Methods for treating or preventing cholesterol related disorders
WO2012170607A2 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Use of pcsk9 antagonists
WO2012168491A1 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists
US9890218B2 (en) 2011-06-30 2018-02-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
CA2840482C (en) * 2011-07-14 2018-10-16 Pfizer Inc. Treatment with anti-pcsk9 antibodies
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
CN103930444B (zh) 2011-09-16 2020-08-04 瑞泽恩制药公司 用前蛋白转化酶枯草溶菌素-9(PCSK9)抑制剂降低脂蛋白(a)水平的方法
AR087715A1 (es) 2011-09-16 2014-04-09 Lilly Co Eli Anticuerpos anti pcsk9 y usos de los mismos
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
EP3045188B1 (en) 2011-10-14 2020-12-23 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US20140228539A1 (en) * 2011-10-21 2014-08-14 Tanvex Biologics Corp. Separation of acetylated proteins from unacetylated proteins
BR112014013081A2 (pt) 2011-11-30 2020-10-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha veículo contendo fármaco em célula para formação de um complexo imune
BR112014025037A2 (pt) * 2012-04-09 2018-07-31 Daiichi Sankyo Company, Limited anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo, nucleotídeo, vetor recombinante, célula, métodos para a produção de um anticorpo ou fragmento funcional, para detecção ou ensaio de fgfr2 humano iiib, para a identificação de um indivíduo receptor de uma composição farmacêutica, e, para identificar e para produzir uma substância, forma modificada, composição, e, reagente
US9321681B2 (en) * 2012-04-27 2016-04-26 United States Gypsum Company Dimensionally stable geopolymer compositions and method
EA039663B1 (ru) * 2012-05-03 2022-02-24 Амген Инк. Применение антитела против pcsk9 для снижения сывороточного холестерина лпнп и лечения связанных с холестерином расстройств
US9255154B2 (en) * 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
MX352457B (es) * 2012-05-17 2017-11-24 Cyon Therapeutics Inc Metodos y usos para inhibidores de proproteina convertasa subtilisina kexina 9 (pcsk9).
ES2552371T3 (es) 2012-05-25 2015-11-27 Zora Biosciences Oy Biomarcadores sensibles, eficaces e inocuos, para la inhibición de la Proproteína Convertasa Subtilisina/Kexina de tipo 9 (PCSK9)
JP2013253842A (ja) 2012-06-06 2013-12-19 Univ Of Tokyo ｐＨ依存的に標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法
JP2015530867A (ja) * 2012-06-15 2015-10-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｐｃｓｋ９抗体、製剤、投薬、及び使用方法
TWI596115B (zh) * 2012-08-13 2017-08-21 再生元醫藥公司 具有ｐＨ－依賴性結合特性之抗－ＰＣＳＫ９抗體
TWI855488B (zh) 2012-08-24 2024-09-11 日商中外製藥股份有限公司 FcγRIIb特異性Fc區域變異體
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
PT2929031T (pt) 2012-12-05 2018-01-19 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de pcsk9 e métodos de seu uso
ES2876009T3 (es) 2012-12-27 2021-11-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Polipéptido heterodimerizado
US10287317B2 (en) * 2013-02-15 2019-05-14 Srx Cardio, Llc Proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9) allosteric binding ligands to modulate serum low density lipoprotein (LDL) levels
WO2014149699A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
EP2970501A2 (en) * 2013-03-15 2016-01-20 Amgen, Inc. Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9
EP2976117B1 (en) 2013-03-22 2020-12-30 Amgen Inc. Injector and method of assembly
AU2014250434B2 (en) 2013-04-02 2019-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
US10111953B2 (en) 2013-05-30 2018-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9)
JP6417118B2 (ja) * 2013-05-31 2018-10-31 株式会社ビー・エム・エル Ｐｃｓｋ９測定用標準物質
TW202021614A (zh) 2013-06-07 2020-06-16 法商賽諾菲生物技術公司 藉由投與ｐｃｓｋ９抑制劑抑制動脈粥狀硬化的方法
EP2862877A1 (en) 2013-10-18 2015-04-22 Sanofi Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9
WO2014209384A1 (en) 2013-06-28 2014-12-31 Amgen Inc. Methods for treating homozygous familial hypercholesterolema
US20150004174A1 (en) * 2013-06-28 2015-01-01 Amgen Inc. Methods for treating homozygous familial hypercholesterolemia
WO2015035215A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
CA2920894C (en) 2013-10-24 2023-03-14 Amgen Inc. Injector and method of assembly
US10428157B2 (en) 2013-11-12 2019-10-01 Sanofi Biotechnology Dosing regimens for use with PCSK9 inhibitors
US9034332B1 (en) 2014-07-15 2015-05-19 Kymab Limited Precision medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
DE112014005747T5 (de) * 2013-12-17 2016-10-06 Kymab Limited Antikörper zur Verwendung bei der Behandlung von Zuständen, die mit spezifischen PCSK9 Varianten in spezifischen Patientenpopulationen in Beziehung stehen
US9051378B1 (en) 2014-07-15 2015-06-09 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
FR3014695A1 (sr) * 2013-12-17 2015-06-19 Kymab Ltd
US8992927B1 (en) 2014-07-15 2015-03-31 Kymab Limited Targeting human NAV1.7 variants for treatment of pain
US9067998B1 (en) 2014-07-15 2015-06-30 Kymab Limited Targeting PD-1 variants for treatment of cancer
DE202014010499U1 (de) 2013-12-17 2015-10-20 Kymab Limited Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung
GB2521356B (en) * 2013-12-17 2018-10-10 Kymab Ltd Antibodies for use in treating conditions related to specific PCKS9 variants and associated diagnostic methods
US8883157B1 (en) 2013-12-17 2014-11-11 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9045545B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision medicine by targeting PD-L1 variants for treatment of cancer
US9017678B1 (en) 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US9914769B2 (en) 2014-07-15 2018-03-13 Kymab Limited Precision medicine for cholesterol treatment
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8945560B1 (en) 2014-07-15 2015-02-03 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
EP2975058A1 (en) * 2014-07-15 2016-01-20 Kymab Limited Antibodies for use in treating conditions related to specific PCSK9 variants in specific patient populations
US9045548B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision Medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9023359B1 (en) 2014-07-15 2015-05-05 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
EP2886557A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-24 Kymab Limited Antibodies for use in treating conditions related to specific PCSK9 variants in specific patient populations
WO2015092394A1 (en) * 2013-12-17 2015-06-25 Kymab Limited Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8986694B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Targeting human nav1.7 variants for treatment of pain
US12329783B2 (en) 2013-12-20 2025-06-17 Seed Health, Inc. Method and system to improve the health of a person's skin microbiome
US12246043B2 (en) 2013-12-20 2025-03-11 Seed Health, Inc. Topical application to treat acne vulgaris
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
CN106460033B (zh) 2013-12-30 2021-12-24 阿特雷卡公司 使用核酸条形码分析与单细胞缔合的核酸
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US10156562B2 (en) 2014-05-16 2018-12-18 Amgen Inc. Assay for detecting Th1 and Th2 cell populations
WO2015200438A1 (en) * 2014-06-24 2015-12-30 Eleven Biotherapeutics, Inc. High affinity antibodies against pcsk9
MX2017000527A (es) 2014-07-14 2017-08-10 Amgen Inc Formulaciones de anticuerpos cristalinos.
JP6783223B2 (ja) 2014-07-14 2020-11-11 アムジェン インコーポレイテッド 結晶性抗体製剤
US9150660B1 (en) 2014-07-15 2015-10-06 Kymab Limited Precision Medicine by targeting human NAV1.8 variants for treatment of pain
EP4328245A3 (en) 2014-07-15 2024-06-05 Kymab Ltd. Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
US9139648B1 (en) 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
DE202015009007U1 (de) 2014-07-15 2016-08-19 Kymab Limited Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung
EP2975059A1 (en) * 2014-07-15 2016-01-20 Kymab Limited Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
KR20230074283A (ko) 2014-07-16 2023-05-26 사노피 바이오테크놀로지 이형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증(heFH) 환자의 치료방법
US9982053B2 (en) 2014-08-05 2018-05-29 MabQuest, SA Immunological reagents
US9982052B2 (en) 2014-08-05 2018-05-29 MabQuest, SA Immunological reagents
WO2016020799A1 (en) 2014-08-06 2016-02-11 Rinat Neuroscience Corp. Methods for reducing ldl-cholesterol
EP3193928A1 (en) 2014-08-06 2017-07-26 Rinat Neuroscience Corp. Methods for reducing ldl-cholesterol
WO2016023916A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Kymab Limited Treatment of disease using ligand binding to targets of interest
MX2017003535A (es) 2014-09-16 2017-10-27 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-glucagon y sus usos.
WO2016046684A1 (en) 2014-09-23 2016-03-31 Pfizer Inc. Treatment with anti-pcsk9 antibodies
MX388858B (es) 2014-10-23 2025-03-20 Amgen Inc Reducción de la viscosidad de formulaciones farmacéuticas
WO2016071701A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Kymab Limited Treatment of disease using ligand binding to targets of interest
TWI656133B (zh) 2014-12-19 2019-04-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Ｆｃ區域之多胜肽及使用方法
WO2016125495A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
CN105461809B (zh) * 2015-02-11 2018-10-12 康融东方（广东）医药有限公司 Pcsk9抗体、其药物组合物及其用途
TW201639891A (zh) * 2015-03-10 2016-11-16 索倫多醫療公司 結合ｐｓｍａ之抗體治療劑
MX384944B (es) * 2015-03-20 2025-03-14 Univ Aarhus Inhibidores de pcsk9 para el tratamiento de trastornos del metabolismo de lipoproteínas".
AU2016248997B2 (en) * 2015-04-15 2019-03-07 ConcieValve LLC Devices and methods for inhibiting stenosis, obstruction, or calcification of a native heart valve, stented heart valve or bioprosthesis
CN105037554B (zh) * 2015-06-12 2019-04-12 成都贝爱特生物科技有限公司 抗人pcsk9抗体的制备及其用途
JP2018523684A (ja) 2015-08-18 2018-08-23 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． リポタンパク質アフェレーシスを受けている高脂血症の患者を治療するための抗ｐｃｓｋ９阻害抗体
US10358497B2 (en) 2015-09-29 2019-07-23 Amgen Inc. Methods of treating cardiovascular disease with an ASGR inhibitor
WO2017055966A1 (en) 2015-10-01 2017-04-06 Pfizer Inc. Low viscosity antibody compositions
CN106589127A (zh) * 2015-10-16 2017-04-26 钜川生物医药 一种pcsk9抗体及其制备方法和应用
CN105348390B (zh) * 2015-10-26 2018-08-28 北京智仁美博生物科技有限公司 抗人pcsk9单克隆抗体
US20180363000A1 (en) * 2015-12-14 2018-12-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-anti pcsk9 antibody constructs and uses thereof
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
BR112018013256A2 (pt) * 2015-12-31 2018-12-11 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. anticorpo para pcsk9, fragmento de ligação a antí-geno do mesmo e aplicação médica do mesmo
EP3401336A4 (en) 2016-01-05 2020-01-22 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. ANTI-PCSK9 ANTIBODIES, ASSOCIATED ANTIGEN BINDING FRAGMENT, AND ASSOCIATED MEDICAL APPLICATION
US11214617B2 (en) 2016-01-22 2022-01-04 MabQuest SA Immunological reagents
US10294299B2 (en) 2016-01-22 2019-05-21 MabQuest SA Immunological reagents
GB201604124D0 (en) 2016-03-10 2016-04-27 Ucb Biopharma Sprl Pharmaceutical formulation
WO2017163049A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Kymab Limited Anti-malarial antibodies that bind circumsporozoite protein
US11066464B2 (en) 2016-03-21 2021-07-20 Kymab Limited Anti-malarial antibodies that bind circumsporozoite protein
CN107266575B (zh) * 2016-04-07 2021-12-24 天士力生物医药股份有限公司 前蛋白转化酶枯草溶菌素kexin 9型的结合蛋白及其应用
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
CN107474140B (zh) * 2016-06-08 2022-06-03 常州博嘉生物医药科技有限公司 Pcsk9特异性的结合蛋白mv072及其应用
TWI640536B (zh) 2016-06-20 2018-11-11 克馬伯有限公司 抗體
WO2018029474A2 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Kymab Limited Anti-icos antibodies
CN109689099B (zh) 2016-08-05 2023-02-28 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
US11111313B2 (en) 2016-09-20 2021-09-07 WuXi Biologics Ireland Limited Anti-PCSK9 antibodies
CN107840893B (zh) * 2016-09-20 2022-02-25 信立泰(成都)生物技术有限公司 新型抗-pcsk9抗体
WO2018067987A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Amgen Inc. Reduced viscosity protein pharmaceutical formulations
US20190248888A1 (en) 2016-10-20 2019-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of lowering blood glucose levels
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
CN106822881A (zh) * 2016-12-09 2017-06-13 四川大学 一种针对pcsk9的抗高血脂蛋白疫苗
CN108239150A (zh) * 2016-12-24 2018-07-03 信达生物制药(苏州)有限公司 抗pcsk9抗体及其用途
JP2020503976A (ja) 2017-01-17 2020-02-06 アムジエン・インコーポレーテツド 注入デバイスならびに関連する使用および組立方法
EP4491234A3 (en) 2017-02-08 2025-04-09 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
MX2019009625A (es) 2017-02-17 2019-10-09 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con trayectoria de flujo de fluido esteril y metodo relacionado de ensamblaje.
BR112019017197A2 (pt) 2017-02-20 2020-04-14 Dragonfly Therapeutics, Inc. proteínas que se ligam a her2, nkg2d e cd16
JP7377596B2 (ja) 2017-02-22 2023-11-10 アムジエン・インコーポレーテツド 低粘度、高濃度エボロクマブ製剤及びそれらの製造方法
US10093731B2 (en) 2017-02-24 2018-10-09 Kindred Biosciences, Inc. Anti-IL31 antibodies for veterinary use
JP7672196B2 (ja) 2017-03-14 2025-05-07 アムジエン・インコーポレーテツド 細胞培養において産生される抗体の総非フコシル化グリコフォームの調節
US12023041B2 (en) 2017-03-21 2024-07-02 Teleflex Medical Incorporated Clip applier
CN119385632A (zh) 2017-03-21 2025-02-07 泰利福医疗公司 手术夹和施夹器
US20210148909A1 (en) * 2017-05-31 2021-05-20 North Carolina Central University Optimization of an active pcsk9 assay
CN107029243A (zh) * 2017-06-08 2017-08-11 厦门大学 一种多肽桥连的双酰腙连接键应用于醛衍生药物的递送
GB201709970D0 (en) 2017-06-22 2017-08-09 Kymab Ltd Bispecific antigen-binding molecules
US11672733B2 (en) 2017-07-21 2023-06-13 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
US11484648B2 (en) 2017-07-25 2022-11-01 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
JP2020528296A (ja) 2017-07-25 2020-09-24 アムジエン・インコーポレーテツド ギヤモジュールを有する薬物送達デバイス及び関連する組立方法
WO2019036181A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Amgen Inc. BODY INJECTOR WITH STERILE ADHESIVE PATCH
JP6913566B2 (ja) * 2017-08-23 2021-08-04 協同油脂株式会社 グリース組成物
ES2939292T3 (es) 2017-10-04 2023-04-20 Amgen Inc Adaptador de flujo para dispositivo de administración de fármacos
MA50528A (fr) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc Systèmes et approches pour stériliser un dispositif d'administration de médicament
EP3710589A4 (en) 2017-11-14 2021-11-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-C1S ANTIBODIES AND METHOD OF USING
SG11202003004RA (en) 2017-11-16 2020-04-29 Amgen Inc Door latch mechanism for drug delivery device
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
JP6639463B2 (ja) * 2017-12-21 2020-02-05 アムジエン・インコーポレーテツド ホモ接合性家族性高コレステロール血症の治療方法
WO2019152599A1 (en) * 2018-01-31 2019-08-08 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Nucleic acid monoclonal antibodies targeting pcsk9 and methods of use
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
AU2019218125B2 (en) 2018-02-08 2025-03-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that activate natural killer cells
TW201942134A (zh) 2018-02-20 2019-11-01 美商蜻蜓醫療公司 結合cd33、nkg2d及cd16之多特異性結合蛋白及使用方法
CA3091764A1 (en) * 2018-02-20 2019-08-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting cd33, and use thereof
KR20200135781A (ko) 2018-03-26 2020-12-03 암젠 인크 세포 배양에서 생산된 항체의 총 비푸코실화 당형태
CN119241705A (zh) 2018-03-30 2025-01-03 安姆根有限公司 C末端抗体变体
CA3102032A1 (en) 2018-06-05 2019-12-12 Anji Pharma (Us) Llc Compositions and methods for treating pancreatitis
KR20250112921A (ko) 2018-08-08 2025-07-24 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양 관련 항원에 결합하는 단백질
EA202190468A1 (ru) 2018-08-08 2021-07-06 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Мультиспецифические связывающие белки, которые связывают bcma, nkg2d и cd16, и способы их применения
EA202091888A1 (ru) 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
KR102697702B1 (ko) 2018-08-10 2024-08-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항cd137 항원 결합 분자 및 그의 사용
JP7247330B2 (ja) 2018-09-26 2023-03-28 テレフレックス メディカル インコーポレイテッド 安定化部材を備えたクリップアプライヤ
EP4640698A3 (en) * 2018-11-16 2026-02-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibodies to mucin-16 and methods of use thereof
GB201820687D0 (en) 2018-12-19 2019-01-30 Kymab Ltd Antagonists
CN109776680B (zh) * 2019-01-25 2020-05-12 浙江蓝盾药业有限公司 抗人pcsk9单克隆抗体及其用途
BR112021021689A2 (pt) 2019-05-15 2022-03-22 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de ligação a antígeno, composição farmacêutica, e método
CA3139943A1 (en) 2019-05-17 2020-11-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genome-based methods for reducing cardiovascular risk
WO2021050989A1 (en) * 2019-09-13 2021-03-18 Duke University Zika antibodies and their use
WO2021058597A1 (en) 2019-09-24 2021-04-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of determining whether a subject is at risk of developing arterial plaques
GB201913846D0 (en) 2019-09-25 2019-11-06 King S College London Biomarker
MX2022003461A (es) 2019-09-26 2022-04-19 Amgen Inc Metodos de produccion de composiciones de anticuerpos.
BR112022009587A2 (pt) * 2019-11-18 2022-08-02 Ad Pharmaceuticals Co Ltd Anticorpo anti-pcsk9 e uso do mesmo
PH12022551299A1 (en) 2019-11-29 2023-11-20 Kymab Ltd Treatment for physiological iron overload
CA3164996A1 (en) * 2019-12-20 2021-06-14 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Anti-interleukin-23 p19 antibodies and methods of use thereof
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
EP4146271A4 (en) 2020-05-06 2024-09-04 Dragonfly Therapeutics, Inc. PROTEINS THAT BIND NKG2D, CD16 AND CLEC12A
WO2021247892A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
MX2023004364A (es) 2020-10-15 2023-05-03 Amgen Inc Glucanos no emparejados relativos en metodos de produccion de anticuerpos.
US12377144B2 (en) 2021-03-03 2025-08-05 Dragonfly Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer using multi-specific binding proteins that bind NKG2D, CD16 and a tumor-associated antigen
MX2023011655A (es) 2021-03-31 2023-10-11 Cambridge Entpr Ltd Inhibidores terapeuticos de la se?alizacion de gdf15.
WO2022207785A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Kymab Limited Antibodies to gfral
CA3219336A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
AU2022289365A1 (en) 2021-06-07 2023-12-14 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
CN113480650B (zh) * 2021-06-30 2022-01-28 徐州医科大学 一种全人源靶向cd276的car-t细胞的制备方法及应用
AU2022361382A1 (en) 2021-10-05 2024-03-28 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023076419A2 (en) * 2021-10-27 2023-05-04 Twist Bioscience Corporation Sars-cov-2 antibodies and methods of use
CN119161484A (zh) 2022-04-25 2024-12-20 武汉大学 抗asgr1单克隆抗体及其应用
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
US20250340641A1 (en) 2022-05-18 2025-11-06 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
AU2024256160A1 (en) 2023-04-20 2025-10-02 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
CN121693519A (zh) * 2023-08-14 2026-03-17 信立泰(成都)生物技术有限公司 Pcsk9抑制剂用于治疗或预防胆固醇相关疾病的方法
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Family Cites Families (211)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US896507A (en) 1908-04-06 1908-08-18 Theodore J Asch Sweat-band.
US1063008A (en) 1913-03-15 1913-05-27 William E Budd Vehicle-tire.
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5612114B2 (sr) * 1974-06-07 1981-03-18
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4231938A (en) 1979-06-15 1980-11-04 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4444784A (en) * 1980-08-05 1984-04-24 Merck & Co., Inc. Antihypercholesterolemic compounds
AU548996B2 (en) 1980-02-04 1986-01-09 Merck & Co., Inc. Tetrahydro-2h-pyran-2-one derivatives
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
WO1988001649A1 (en) 1986-09-02 1988-03-10 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FI94339C (fi) 1989-07-21 1995-08-25 Warner Lambert Co Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen /R-(R*,R*)/-2-(4-fluorifenyyli)- , -dihydroksi-5-(1-metyylietyyli)-3-fenyyli-4-/(fenyyliamino)karbonyyli/-1H-pyrroli-1-heptaanihapon ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992003917A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International Homologous recombination in mammalian cells
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JP2648897B2 (ja) 1991-07-01 1997-09-03 塩野義製薬株式会社 ピリミジン誘導体
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
EP1291360A1 (en) 1991-12-13 2003-03-12 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
WO1994000569A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
US6066718A (en) 1992-09-25 2000-05-23 Novartis Corporation Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ATE483733T1 (de) 1995-06-14 2010-10-15 Univ California Hochaffine humane antikörper gegen tumorantigene
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
EP0773288A3 (en) 1995-08-29 1997-07-09 Kirin Brewery Chimera animal and its method of manufacture
GB9610992D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Glaxo Group Ltd Concentrated antibody preparation
AU4326197A (en) 1996-07-09 1998-02-02 Merck & Co., Inc. Pharmaceutical compositions
EP0852951A1 (de) 1996-11-19 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Stabile lyophilisierte pharmazeutische Zubereitungen von mono- oder polyklonalen Antikörpern
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US20050197285A1 (en) * 1997-03-07 2005-09-08 Rosen Craig A. Human secreted proteins
US20070055056A1 (en) * 1997-03-07 2007-03-08 Rosen Craig A 251 human secreted proteins
US7411051B2 (en) * 1997-03-07 2008-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to HDPPA04 polypeptide
US7968689B2 (en) 1997-03-07 2011-06-28 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to HSDEK49 polypeptides
US20070015696A1 (en) * 1997-03-07 2007-01-18 Rosen Craig A 621 human secreted proteins
US20080103090A1 (en) * 1997-03-07 2008-05-01 Human Genome Sciences, Inc. Human Secreted Proteins
US20060223090A1 (en) * 1997-03-07 2006-10-05 Rosen Craig A Polynucleotides encoding human secreted proteins
US20060223088A1 (en) * 1997-03-07 2006-10-05 Rosen Craig A Human secreted proteins
US20070224663A1 (en) * 1997-03-07 2007-09-27 Human Genome Sciences, Inc. Human Secreted Proteins
US20060246483A1 (en) * 1997-03-07 2006-11-02 Rosen Craig A 337 human secreted proteins
US7368531B2 (en) * 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US20070059302A1 (en) 1997-04-07 2007-03-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US6252050B1 (en) 1998-06-12 2001-06-26 Genentech, Inc. Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method
FR2784749B1 (fr) 1998-10-14 2000-12-29 Instruments Sa Appareil de caracterisation optique de materiau en couche mince
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
GB2343233A (en) 1998-10-28 2000-05-03 Whitnash Plc Torsional vibration damper.
NL1011069C2 (nl) 1999-01-19 2000-07-20 Well Engineering Partners B V Werkwijze en installatie voor het inbrengen van een buis in een boorgat in de aardbodem.
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
EP1514933A1 (en) * 1999-07-08 2005-03-16 Research Association for Biotechnology Secretory protein or membrane protein
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US20030119038A1 (en) * 1999-09-09 2003-06-26 Bingham Brendan William NARC1, novel subtilase-like homologs
US7029895B2 (en) * 1999-09-27 2006-04-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 27411, a novel human PGP synthase
US20100291099A1 (en) 1999-09-27 2010-11-18 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 27411, 23413, 22438, 23553, 25278, 26212, narc sc1, narc 10a, narc 1, narc 12, narc 13, narc17, narc 25, narc 3, narc 4, narc 7, narc 8, narc 11, narc 14a, narc 15, narc 16, narc 19, narc 20, narc 26, narc 27, narc 28, narc 30, narc 5, narc 6, narc 9, narc 10c, narc 8b, narc 9, narc2a, narc 16b, narc 1c, narc 1a, narc 25, 86604 and 32222 molecules and uses therefor
JP2003512840A (ja) 1999-10-22 2003-04-08 ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ラット脳に由来する核酸分子およびプログラム細胞死モデル
US20020081679A1 (en) 1999-10-22 2002-06-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. NARC8 programmed cell-death-associated molecules and uses thereof
US20110230392A1 (en) 1999-10-22 2011-09-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel narc sc1, narc 10a, narc 1, narc 12, narc 13, narc17, narc 25, narc 3, narc 4, narc 7, narc 8, narc 11, narc 14a, narc 15, narc 16, narc 19, narc 20, narc 26, narc 27, narc 28, narc 30, narc 5, narc 6, narc 9, narc 10c, narc 8b, narc 9, narc2a, narc 16b, narc 1c, narc 1a, and narc 25 molecules and uses therefor
CA2399727A1 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Narc-1, subtilase-like homologs
JP3753917B2 (ja) 2000-03-17 2006-03-08 茨木精機株式会社 包装体の整列搬出方法及びその装置
JP2003533187A (ja) 2000-05-03 2003-11-11 アムジエン・インコーポレーテツド 治療薬としてのＦｃドメインを含む修飾ペプチド
AU2001269836A1 (en) 2000-06-16 2002-01-02 Incyte Genomics, Inc. Proteases
AU2001280471A1 (en) 2000-08-11 2002-02-25 Eli Lilly And Company Novel secreted proteins and their uses
PT1324776E (pt) * 2000-10-12 2009-12-23 Genentech Inc Formulações de proteína concentradas de viscosidade reduzida
CA2436732A1 (en) 2000-12-08 2002-06-13 Incyte Genomics, Inc. Protein modification and maintenance molecules
EP1414845A4 (en) 2001-03-21 2009-07-08 Human Genome Sciences SEPARATE HUMAN PROTEINS
US20070173473A1 (en) 2001-05-18 2007-07-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of proprotein convertase subtilisin Kexin 9 (PCSK9) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20040023243A1 (en) * 2001-06-13 2004-02-05 Yue Henry Proteases
CA2450793A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
US20040038242A1 (en) * 2001-07-30 2004-02-26 Edmonds Brian Taylor Novel secreted proteins and their uses
EP1572903A2 (en) 2002-02-11 2005-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Immunotherapeutics for biodefense
US6875433B2 (en) 2002-08-23 2005-04-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Monoclonal antibodies and complementarity-determining regions binding to Ebola glycoprotein
ME00204B (me) 2002-09-06 2011-02-10 Medarex Llc Terapijsko, humano, monoklonsko anti-il-1r1antitijelo
AR047392A1 (es) * 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
AU2003293543A1 (en) 2002-12-13 2004-07-09 Abgenix, Inc. System and method for stabilizing antibodies with histidine
US20050158303A1 (en) 2003-04-04 2005-07-21 Genentech, Inc. Methods of treating IgE-mediated disorders comprising the administration of high concentration anti-IgE antibody formulations
EP1471152A1 (en) 2003-04-25 2004-10-27 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Mutations in the human PCSK9 gene associated to hypercholesterolemia
MXPA05012571A (es) * 2003-05-21 2006-02-08 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales humanos contra el antigeno protector de bacillus anthracis.
US20050118625A1 (en) * 2003-10-02 2005-06-02 Mounts William M. Nucleic acid arrays for detecting gene expression associated with human osteoarthritis and human proteases
JP2005130764A (ja) 2003-10-30 2005-05-26 Pharmaceuticals & Medical Devices Agency Ｎａｒｃ−１遺伝子上の多型を利用した脂質代謝異常に起因する疾患の検査方法、および創薬のための用途
PT2409713E (pt) 2004-08-10 2015-10-09 Genzyme Corp Oligonucleótidos para utilização em modulação dos níveis de lipoproteínas e colesterol em humanos
US20060147945A1 (en) * 2005-01-06 2006-07-06 Edmonds Brian T Novel secreted proteins and their uses
CA2589860A1 (en) 2005-01-24 2006-08-03 Amgen Inc. Humanized anti-amyloid antibody
US7682981B2 (en) * 2005-01-27 2010-03-23 Contour Semiconductor, Inc. Topography transfer method with aspect ratio scaling
WO2006124269A2 (en) 2005-05-16 2006-11-23 Amgen Fremont Inc. Human monoclonal antibodies that bind to very late antigen-1 for the treatment of inflammation and other disorders
EP1977763A4 (en) 2005-12-28 2010-06-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTIBODY-CONTAINING STABILIZING PREPARATION
CA2637837A1 (en) 2006-01-26 2007-08-09 Hx Diagnostics, Inc. Monoclonal antibodies binding to avian influenza virus subtype h5 haemagglutinin and uses thereof
CA2900402C (en) 2006-05-08 2018-01-16 Adaerata, Limited Partnership Pcsk9 polypeptide, ligand to said polypeptide, kits and methods using said ligands
EP2194128B1 (en) * 2006-05-11 2012-08-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene
US7572618B2 (en) * 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
WO2008042383A1 (en) 2006-10-02 2008-04-10 Armstrong World Industries, Inc. Process for preparing high molecular weight polyesters
US20100068194A1 (en) * 2006-10-24 2010-03-18 Dong-Ku Kim Composition for in vivo transplantation for treatment of human cervical cancer comprising mononuclear cells derived from umbilical cord blood
CA2667989A1 (en) * 2006-11-07 2008-11-06 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
WO2008057458A2 (en) 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
EP2083861A4 (en) 2006-11-07 2010-11-24 Merck Sharp & Dohme ANTAGONISTS OF PCSK9
WO2008057457A2 (en) * 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
FR2909092B1 (fr) 2006-11-24 2012-10-19 Pf Medicament Nouveaux anticorps anti-proliferation
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
JP5086618B2 (ja) * 2006-11-27 2012-11-28 オリンパス株式会社 カプセル型内視鏡
EP2453016A1 (en) 2006-11-27 2012-05-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
EP2114451A2 (en) 2007-01-09 2009-11-11 Wyeth a Corporation of the State of Delaware Anti-il-13 antibody formulations and uses thereof
WO2008109871A2 (en) 2007-03-08 2008-09-12 Irm Llc Crystal structure of proprotein convertase 9 (pcsk9) and uses thereof
WO2008125623A2 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Novartis Ag Molecules and methods for modulating proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (pcsk9)
US8975377B2 (en) 2007-08-13 2015-03-10 Vasgene Therapeutics, Inc Cancer treatment using humanized antibodies that bind to EphB4
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
EP2615114B1 (en) 2007-08-23 2022-04-06 Amgen Inc. Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9)
US20130072665A1 (en) 2007-08-23 2013-03-21 Simon Mark Jackson Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
SG2013014352A (en) 2007-10-26 2014-09-26 Merck Sharp & Dohme Anti-pcsk9 and methods for treating lipid and cholesterol disorders
WO2009134487A2 (en) 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
AR070316A1 (es) 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Antagonistas de pcsk9 (proproteina subtilisina-kexina tipo 9)
MX2010008688A (es) 2008-02-07 2010-08-30 Schering Corp Anticuerpos anti-receptor de linfopoyetina estromal timica procesados por ingenieria.
AR070315A1 (es) 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9
TWI700293B (zh) 2008-04-11 2020-08-01 日商中外製藥股份有限公司 重複結合複數個抗原的抗體
WO2009131740A2 (en) 2008-04-23 2009-10-29 Amgen Inc. Neutralizing proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9) variants and uses thereof
DK2982695T3 (da) 2008-07-09 2019-05-13 Biogen Ma Inc Sammensætninger, der omfatter antistoffer mod lingo eller fragmenter deraf
DE102008034203B4 (de) * 2008-07-21 2018-04-26 Airbus Helicopters Deutschland GmbH Herstellung von Faserverbundbauteilen mit Formkernen
ES2808660T3 (es) 2008-08-04 2021-03-01 Amgen Inc Proteínas de unión a antígeno para proproteína convertasa subtilisina kexina tipo 9 (PCSK9)
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
WO2010068526A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 immunoassay
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
US20130064834A1 (en) 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
US8357371B2 (en) 2008-12-15 2013-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to PCSK9
AU2010221156A1 (en) 2009-03-06 2011-09-22 Genentech, Inc. Antibody formulation
US8210622B2 (en) 2009-03-13 2012-07-03 Liberty Hardware Mfg. Corp. Adjustable product display assembly
WO2011028938A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for lowering serum cholestrol in a subject using inhibition of pcsk9
WO2011037791A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Antagonists of pcsk9
EP2488544B1 (en) 2009-10-15 2015-03-18 Monash University Affinity ligands and methods for protein purification
WO2011053759A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Ax1 and ax189 pcsk9 antagonists and variants
WO2011053665A1 (en) 2009-10-30 2011-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 immunoassay
EP2493507A4 (en) 2009-10-30 2013-11-20 Merck Sharp & Dohme AX213 AND AX132 PCSK9 ANTAGONISTS AND VARIANTS THEREOF
EP2494355A4 (en) 2009-10-30 2013-05-01 Merck Sharp & Dohme PCSK9 IMMUNOASSAY
PT3721904T (pt) 2009-11-20 2021-11-15 Biocon Ltd Formulações de anticorpo t1h
AR079336A1 (es) 2009-12-11 2012-01-18 Irm Llc Antagonistas de la pro-proteina convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (pcsk9)
EP2545079A2 (en) 2010-03-11 2013-01-16 Rinat Neuroscience Corporation ANTIBODIES WITH pH DEPENDENT ANTIGEN BINDING
KR20130056871A (ko) * 2010-04-13 2013-05-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｐｃｓｋ９에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질
CN201712554U (zh) 2010-07-14 2011-01-19 李辉 电动汽车热管理系统
WO2012054438A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Schering Corporation Anti-pcsk9
CA2817015A1 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Altimab Therapeutics, Inc. Protein complexes for antigen binding and methods of use
US8613308B2 (en) 2010-12-10 2013-12-24 Uop Llc Process for transferring heat or modifying a tube in a heat exchanger
CA2820953A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Genentech, Inc. Anti-pcsk9 antibodies and methods of use
EP2481758A1 (en) 2011-01-28 2012-08-01 Sanofi Human antibodies to PSCK9 for use in methods of treating particular groups of subjects (11566)
EP2650016A1 (en) 2011-01-28 2013-10-16 Sanofi Human antibodies to PSCK9 for use in methods of treatment based on particular dosage regimens (11565)
BR112013018740A2 (pt) 2011-01-28 2019-01-08 Sanofi Sa anticorpos humanos para pcsk9 para uso em métodos de tratamento de grupos específicos de indivíduos
CN103562227B (zh) 2011-02-11 2016-12-21 诺瓦提斯公司 Pcsk9拮抗剂
US20140004122A1 (en) * 2011-05-10 2014-01-02 Amgen Inc. Methods for treating or preventing cholesterol related disorders
JOP20200043A1 (ar) 2011-05-10 2017-06-16 Amgen Inc طرق معالجة أو منع الاضطرابات المختصة بالكوليسترول
WO2012170607A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Use of pcsk9 antagonists
WO2012168491A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists
RU2014101501A (ru) 2011-06-20 2015-07-27 Дженентек, Инк. Связывающие pcsk9 полипептиды и способы применения
CA2840482C (en) 2011-07-14 2018-10-16 Pfizer Inc. Treatment with anti-pcsk9 antibodies
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
CN103930444B (zh) 2011-09-16 2020-08-04 瑞泽恩制药公司 用前蛋白转化酶枯草溶菌素-9(PCSK9)抑制剂降低脂蛋白(a)水平的方法
AR087715A1 (es) 2011-09-16 2014-04-09 Lilly Co Eli Anticuerpos anti pcsk9 y usos de los mismos
US9879093B2 (en) 2011-12-20 2018-01-30 Adaerata, Limited Partnershp Single domain antibodies as inhibitors of PCSK9
WO2013148284A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 Genentech, Inc. Antibodies that bind to a pcsk9 cleavage site and methods of use
EA039663B1 (ru) * 2012-05-03 2022-02-24 Амген Инк. Применение антитела против pcsk9 для снижения сывороточного холестерина лпнп и лечения связанных с холестерином расстройств
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
US9401875B2 (en) 2012-06-01 2016-07-26 Nippon Telegraph And Telephone Corporation Packet transfer processing method and packet transfer processing device
JP2015530867A (ja) 2012-06-15 2015-10-29 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｐｃｓｋ９抗体、製剤、投薬、及び使用方法
EP2703009A1 (en) 2012-08-31 2014-03-05 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
EP2706070A1 (en) 2012-09-06 2014-03-12 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
EP2970501A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Amgen, Inc. Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
US20150004174A1 (en) 2013-06-28 2015-01-01 Amgen Inc. Methods for treating homozygous familial hypercholesterolemia
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
WO2016046684A1 (en) 2014-09-23 2016-03-31 Pfizer Inc. Treatment with anti-pcsk9 antibodies
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly
DE102023206495B3 (de) 2023-07-07 2024-11-21 Volkswagen Aktiengesellschaft Integrierter Schaltkreis, Anordnung sowie Verfahren zum Einkoppeln von optischen Signalen in einen integrierten Schaltkreis

Also Published As

Publication number Publication date
DK3666797T5 (da) 2024-08-26
NO2023012I1 (no) 2023-03-20
US8871914B2 (en) 2014-10-28
BR122018012430B8 (pt) 2021-07-27
KR101494932B1 (ko) 2015-02-26
IL252616A0 (en) 2017-07-31
TW201500374A (zh) 2015-01-01
LT3666797T (lt) 2023-08-10
FR16C0025I1 (fr) 2016-07-08
US20120093818A1 (en) 2012-04-19
ES2946083T3 (es) 2023-07-12
IL273353B1 (en) 2023-09-01
CY2016029I2 (el) 2017-04-26
IL204013A (en) 2017-07-31
US8889834B2 (en) 2014-11-18
TW200916481A (en) 2009-04-16
PE20140231A1 (es) 2014-03-08
EP2215124A1 (en) 2010-08-11
HUE062493T2 (hu) 2023-11-28
US20130052201A1 (en) 2013-02-28
US20130085265A1 (en) 2013-04-04
JP5441905B2 (ja) 2014-03-12
DK2215124T3 (en) 2016-05-30
HUE028162T2 (en) 2016-12-28
HRP20230503T3 (hr) 2023-09-15
CN112415203A (zh) 2021-02-26
RS54756B2 (sr) 2024-07-31
US20090326202A1 (en) 2009-12-31
US20140228547A1 (en) 2014-08-14
TWI633122B (zh) 2018-08-21
FR16C0025I2 (fr) 2018-06-08
US20140357852A1 (en) 2014-12-04
CA2696252A1 (en) 2009-02-26
JP2020058376A (ja) 2020-04-16
CN112390889A (zh) 2021-02-23
SI2215124T1 (sl) 2016-09-30
PH12013502285B1 (en) 2024-04-12
BR122018012430B1 (pt) 2019-10-08
MX2020008898A (es) 2020-10-12
CN104311666A (zh) 2015-01-28
US20130079502A1 (en) 2013-03-28
US20120213797A1 (en) 2012-08-23
EP2215124B2 (en) 2023-07-19
US8981064B2 (en) 2015-03-17
US20140357850A1 (en) 2014-12-04
KR20260006647A (ko) 2026-01-13
US20140235831A1 (en) 2014-08-21
PE20140221A1 (es) 2014-02-21
BRPI0816117A2 (pt) 2015-03-10
PL2215124T3 (pl) 2016-08-31
JP2015166345A (ja) 2015-09-24
US9493576B2 (en) 2016-11-15
PE20180173A1 (es) 2018-01-22
IL204013B2 (en) 2025-07-01
PE20221507A1 (es) 2022-10-04
NO2016015I1 (no) 2016-08-12
HRP20160494T1 (hr) 2016-06-03
DK2215124T4 (da) 2024-01-29
US9045547B2 (en) 2015-06-02
PT3666797T (pt) 2023-06-07
AR068011A1 (es) 2009-10-28
IL252616B (en) 2020-05-31
CN104311667A (zh) 2015-01-28
RS54756B1 (sr) 2016-10-31
FI3666797T3 (fi) 2023-05-25
CL2008002495A1 (es) 2009-09-04
US20120020976A1 (en) 2012-01-26
EP2215124B1 (en) 2016-02-24
US20140357851A1 (en) 2014-12-04
LU93096I2 (fr) 2016-08-01
CO6230997A2 (es) 2010-12-20
CY2016023I1 (el) 2017-04-26
US20090142352A1 (en) 2009-06-04
US8030457B2 (en) 2011-10-04
US9056915B2 (en) 2015-06-16
ES2573258T3 (es) 2016-06-06
CY1117940T1 (el) 2017-04-26
US8859741B2 (en) 2014-10-14
TWI799416B (zh) 2023-04-21
HRP20160494T4 (hr) 2023-10-27
KR20240113594A (ko) 2024-07-22
US9920134B2 (en) 2018-03-20
LTC2215124I2 (lt) 2023-04-25
CN101932607B (zh) 2014-06-25
DE202008018562U1 (de) 2015-11-02
KR101702194B1 (ko) 2017-02-03
TN2010000063A1 (en) 2011-09-26
US20140357853A1 (en) 2014-12-04
MY199051A (en) 2023-10-11
EP3666797B1 (en) 2023-05-17
NZ584101A (en) 2012-09-28
IL273353A (en) 2020-05-31
PE20131400A1 (es) 2013-12-16
US8168762B2 (en) 2012-05-01
TWI441833B (zh) 2014-06-21
KR20230080496A (ko) 2023-06-07
JOP20080381B1 (ar) 2023-03-28
PL3666797T3 (pl) 2023-08-28
CY2016029I1 (el) 2017-04-26
US20120251544A1 (en) 2012-10-04
JP2023071833A (ja) 2023-05-23
KR20220031734A (ko) 2022-03-11
US8883983B2 (en) 2014-11-11
HK1143824A1 (zh) 2011-01-14
PL2215124T5 (pl) 2023-11-20
TW201500375A (zh) 2015-01-01
JP2018118974A (ja) 2018-08-02
PE20140220A1 (es) 2014-02-21
CN101932607A (zh) 2010-12-29
BRPI0816117B8 (pt) 2021-05-25
HUS1600029I1 (hu) 2016-09-28
EA032106B1 (ru) 2019-04-30
US20140357854A1 (en) 2014-12-04
ES2917423T3 (es) 2022-07-08
IL304868A (en) 2023-10-01
US20110027287A1 (en) 2011-02-03
AU2008288791B2 (en) 2014-10-30
WO2009026558A1 (en) 2009-02-26
CA2696252C (en) 2016-06-14
CN104311665A (zh) 2015-01-28
US8829165B2 (en) 2014-09-09
NL300818I2 (sr) 2016-07-14
US20130058944A1 (en) 2013-03-07
MY199053A (en) 2023-10-11
JP5705288B2 (ja) 2015-04-22
KR20180035947A (ko) 2018-04-06
JP2014043446A (ja) 2014-03-13
DK3666797T3 (da) 2023-05-30
PH12013502285A1 (en) 2016-08-08
MX375117B (es) 2025-03-06
AU2008288791A1 (en) 2009-02-26
US20140235830A1 (en) 2014-08-21
TWI675846B (zh) 2019-11-01
US8563698B2 (en) 2013-10-22
MY180102A (en) 2020-11-22
TW201500376A (zh) 2015-01-01
NO2016010I1 (no) 2016-06-03
EA201000356A1 (ru) 2010-08-30
EP3202791A1 (en) 2017-08-09
IL317213A (en) 2025-01-01
MX2010001921A (es) 2010-03-11
LU93180I2 (fr) 2016-10-18
KR20210028741A (ko) 2021-03-12
EP2215124B9 (en) 2023-12-27
US8871913B2 (en) 2014-10-28
JP2010536384A (ja) 2010-12-02
TWI890005B (zh) 2025-07-11
HUS1600036I1 (hu) 2016-10-28
UA127402C2 (uk) 2023-08-16
TW202330625A (zh) 2023-08-01
CN113402611A (zh) 2021-09-17
MA31978B1 (fr) 2011-01-03
BRPI0816117B1 (pt) 2018-12-18
US20130245235A1 (en) 2013-09-19
CR11328A (es) 2010-07-12
LTPA2016025I1 (lt) 2016-09-12
SI2215124T2 (sl) 2023-11-30
JP2016182114A (ja) 2016-10-20
TWI675848B (zh) 2019-11-01
JP5906333B2 (ja) 2016-04-20
TWI675847B (zh) 2019-11-01
TW201906871A (zh) 2019-02-16
US20120020975A1 (en) 2012-01-26
KR20170012592A (ko) 2017-02-02
FI2215124T4 (fi) 2023-10-10
LTPA2016021I1 (lt) 2016-06-27
KR20200074262A (ko) 2020-06-24
DE19207796T9 (de) 2023-02-23
TW201716444A (zh) 2017-05-16
KR20140064962A (ko) 2014-05-28
IL273353B2 (en) 2024-01-01
PE20091006A1 (es) 2009-08-14
JP6638009B2 (ja) 2020-01-29
ES2573258T5 (es) 2024-02-23
CN112409489A (zh) 2021-02-26
US20120027765A1 (en) 2012-02-02
US20150031870A1 (en) 2015-01-29
SG10201710183TA (en) 2018-01-30
US20150087819A1 (en) 2015-03-26
PE20140014A1 (es) 2014-01-31
DE19207796T1 (de) 2022-03-10
CY2016023I2 (el) 2017-04-26
SG184702A1 (en) 2012-10-30
US20140228545A1 (en) 2014-08-14
SI3666797T1 (sl) 2023-10-30
EP3666797A1 (en) 2020-06-17
US20130079501A1 (en) 2013-03-28
US20140228557A1 (en) 2014-08-14
KR20100057070A (ko) 2010-05-28
PH12013502286A1 (en) 2016-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3666797B1 (en) Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
US20130072665A1 (en) Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
EP4248976A2 (en) Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
EP2641917A2 (en) Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9)
AU2018247211A1 (en) Antigen Binding Proteins to Proprotein Convertase Subtilisin Kexin Type 9 (PCSK9)
HK40031907B (en) Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
HK40031907A (en) Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
HK1189605A (en) Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)
HK1143824B (en) Antigen binding proteins to proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (pcsk9)