RS65633B1 - Anti-c5 antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Anti-c5 antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS65633B1
RS65633B1 RS20240701A RSP20240701A RS65633B1 RS 65633 B1 RS65633 B1 RS 65633B1 RS 20240701 A RS20240701 A RS 20240701A RS P20240701 A RSP20240701 A RS P20240701A RS 65633 B1 RS65633 B1 RS 65633B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
antibodies
antigen
human
binding
Prior art date
Application number
RS20240701A
Other languages
English (en)
Inventor
Ying Hu
Adrianna Latuszek
Carmelo Romano
William Olson
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS65633B1 publication Critical patent/RS65633B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

Opis pronalaska
OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela i fragmente antitela koji vezuju antigen, koji se specifično vezuju za faktor komplementa C5, i terapijske i dijagnostičke postupke upotrebe tih antitela.
STANJE TEHNIKE
[0002] Sistem komplementa je grupa proteina plazme koji, kada se aktiviraju, dovode do ciljane ćelijske lize i olakšavanja fagocitoze opsonizacijom. Komplement se aktivira serijama proteolitičkih koraka preko tri glavna puta: klasičnog puta koji se obično aktivira imunskim kompleksima, alternativnog puta koji može biti indukovan nezaštićenim površinama ćelija i lektinskog puta vezivanjem manoze. Sva tri puta kaskade komplementa konvergiraju na proteolitičko cepanje proteina komponente 5 sistema komplementa (C5). Cepanje komponente 5 sistema komplementa (C5) rezultuje u proizvodnji fragmenata C5a i C5b, što je kritičan proces tokom aktivacije kaskade komplementa. C5a može generisati plejotropne fiziološke odgovore putem vezivanja za svoje receptore (Monk i saradnici, 2007, Br. J. Pharmacol.152: 429-448). C5a je potentan proinflamatorni medijator koji indukuje hemotaksičku migraciju, pojačava ćelijsku adheziju, stimuliše ekspanziju oksidativnog stresa i indukuje oslobađanje raznih inflamatornih medijatora kao što su histamin ili citokini. C5b posreduje u obrazovanju kompleksa koji napada membranu (MAC ili C5b-9) što dovodi do ćelijske lize u kasnim fazama citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC). Dalјe, u ćelijama sa jedrom koje su rezistentne na citolizu sa C5b-9, sublitičke količine C5b-9 mogu prouzrokovati aktivaciju ćelija čiji su rezultat ćelijska proliferacija, generisanje proinflamatornih medijatora i proizvodnja vanćelijskog matriksa.
[0003] Monoklonska antitela na C5 su poznata u oblasti tehnike i opisana su, na primer, u SAD Patentima/Objavama br. 9206251, 9107861, 9079949, 9051365, 8999340, 8883158, 8241628, 7999081, 7432356, 7361339, 7279158, 6534058, 6355245, 6074642, 20160299305, 20160051673, 20160031975, 20150158936, 20140056888, 20130022615, 20120308559 i u WO2015198243, WO2015134894, WO2015120130, EP2563813B1, EP2328616B1 i EP2061810B1.
[0004] EP2328616B1 se odnosi na antitela koja cilјano deluju na protein komplementa C5 i kompozicije i postupke njihove upotrebe. Wong i saradnici, Transl Res.2015, 165(2):306-320 odnosi se na antikomplementnu terapiju C5 sa ekulizumabom, za lečenje paroksizmalne noćne hemoglobinurije i atipičnog hemolitičko-uremijskog sindroma. WO 2014/047500 A1 se odnosi na testove za skrining antagonista komponente C5 sistema komplementa.
[0005] U potpunosti humana antitela koja se specifično vezuju za C5 protein sa visokim afinitetom i imaju pobolјšane farmakokinetičke osobine, mogu biti važna u prevenciji i lečenju raznih bolesti povezanih sa C5 (npr. atipičnog hemolitičko-uremijskog sindroma).
KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0006] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji specifično vezuju protein faktora 5 sistema komplementa (C5). Antitela pronalaska sadrže varijabilni region teškog lanca (HCVR), koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 98, i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 106. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač; uređaj za isporuku tipa olovke za višekratnu upotrebu, koji sadrži farmaceutsku kompoziciju; uređaj za isporuku tipa autoinjektora koji sadrži farmaceutsku kompoziciju; izolovan polinukleotidni molekul koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira HCVR antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, kao i nukleotidnu sekvencu koja kodira LCVR antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen; vektor koji sadrži polinukleotid; i ćeliju koja eksprimira vektor. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen za upotrebu u postupku prevencije, lečenja ili ublažavanja najmanje jednog simptoma ili indikacije bolesti ili poremećaja izabranog iz grupe koju čine atipičan hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS), paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH), starosna makularna degeneracija, geografska atrofija, uveitis, optički neuromijelitis, multipla skleroza, moždani udar, Giljеn Bаrеоv sindrom, traumatska povreda mozga, Parkinsonova bolest, poremećaj neodgovarajuće ili nepoželјne aktivacije sistema komplementa, komplikacija hemodijalize, hiperakutno odbacivanje alotransplantata, odbacivanje ksenotransplantata, toksičnost indukovana interleukinom-2 tokom terapije sa IL-2, inflamatorni poremećaj, inflamacija u autoimunoj bolesti, Kronova bolest, sindrom respiratornog distresa kod odraslih, termička povreda, opekotina, promrzlina, reperfuziono stanje nakon ishemije, infarkt miokarda, sindrom kapilarnog curenja, gojaznost, dijabetes, Alchajmerova bolest, šizofrenija, epilepsija, ateroskleroza, vaskulitis, bulozni pemfigoid, C3 glomerulopatija, membranski proliferativni glomerulonefritis, dijabetska nefropatija, Alportov sindrom, progresivna bubrežna insuficijencija, proteinurijska bolest bubrega, renalna ishemijsko-reperfuziona povreda, lupusni nefritis, balonska angioplastika, sindrom indukovan ugradnjom pumpe kod kardiopulmonarnog bajpasa ili renalnog bajpasa, renalna ishemija, reperfuzija mezenterične arterije nakon rekonstrukcije aorte, infektivna bolest, sepsa, poremećaj imunskog kompleksa, autoimuna bolest, renalni poremećaj, reumatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus (SLE), SLE nefritis, proliferativni nefritis, hemolitička anemija, astma, hronična opstruktivna bolest pluća (HOPB), emfizem, plućna embolija, infarkt pluća, upala pluća i mijastenija gravis. Antitela predmetnog pronalaska su korisna, između ostalog, za inhibiciju ili neutralizaciju aktivnosti C5 proteina. U određenim primerima izvođenja, antitela su korisna u prevenciji, lečenju ili ublažavanju najmanje jednog simptoma ili indikacije bolesti ili poremećaja povezanog sa C5 kod subjekta. U određenim primerima izvođenja, antitela mogu biti davana profilaktički ili terapijski subjektu koji boluje ili je sa rizikom da oboli od bolesti ili poremećaja povezanog sa C5. U određenim primerima izvođenja, anti-C5 antitela su u potpunosti humana antitela, koja se vezuju za C5 sa visokim afinitetom i imaju pobolјšane farmakokinetičke (PK) i farmakodinamičke (PD) osobine. Takva antitela visokog afiniteta sa pobolјšanim PK/PD mogu biti upotrebljena za obezbeđivanje superiorne efikasnosti, zajedno sa manjom učestalošću doziranja kod subjekta sa bolešću ili poremećajem povezanim sa C5.
[0007] Antitela pronalaska mogu biti pune dužine (na primer, IgG1 ili IgG4 antitela) ili mogu sadržavati samo deo koji vezuje antigen (na primer, biti Fab, F(ab')2ili scFv fragment), a mogu biti i modifikovana tako da se utiče na funkcionalnost, npr. da se poveća postojanosti u domaćinu ili radi eliminisanja rezidualne efektorske funkcije (Reddy i saradnici, 2000, J. Immunol. 164:1925-1933). U određenim primerima izvođenja, antitela mogu biti bispecifična.
[0008] U pojedinim primerima izvođenja, antitela su u potpunosti humana monoklonska antitela.
Kratko izlaganje tehničkih saznanja
[0009] Pronalazak je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima. Dalјi aspekti i poželјni primeri izvođenja su definisani u zavisnim patentnim zahtevima. Bilo koji aspekti, primeri izvođenja i primeri predmetnog opisa koji ne pripadaju obimu priloženih patentnih zahteva, ne čine deo pronalaska i obezbeđeni su samo u ilustrativne svrhe. Preciznije, antitela pronalaska su definisana patentnim zahtevima. Ipak, drugi primeri anti-C5 antitela ovde su navedeni u vidu liste u Tabelama 1 i 2. Tabela 1 navodi identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teških lanaca (HCVR), varijabilnih regiona lakih lanaca (LCVR), regiona koji određuju komplementarnost teških lanaca (HCDR1, HCDR2 i HCDR3) i regiona koji određuju komplementarnost lakih lanaca (LCDR1, LCDR2 i LCDR3) anti-C5 antitela za primer. Tabela 2 navodi identifikatore sekvenci nukleinskih kiselina za HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 anti-C5 antitela za primer.
[0010] Anti-C5 antitela za primer navedena u vidu liste u Tabeli 1 imaju par HCVR/LCVR aminokiselinskih sekvenci izabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 98/114, 122/106, 98/130, 138/106, 146/106, 122/130, 146/114, 146/130, 138/130, 154/162, 170/178, 186/194, 202/210, 218/226, 234/242, 250/258, 266/258, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330 i 338/346. U određenim slučajevima, par HCVR/LCVR aminokiselinskih sekvenci je izabran od jednog od SEQ ID NO: 50/58 (npr. H4H12161P), 98/106 (antitelo pronalaska, npr. H4H12166P), 138/106 (npr. H4H12166P5) ili 202/210 (npr. H4H12170P).
[0011] Pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 353. Pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 354. Pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 353 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 354.
[0012] Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji su ovde opisani, mogu sadržavati set od šest CDR (tj. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) sadržanih u bilo kom od anti-C5 antitela za primer navedenih u Tabeli 1, kao što je set aminokiselinskih sekvenci HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 izabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 52-54-56-60-62-64 (npr. H4H12161P), 100-102-104-108-110-112 (npr. H4H12166P), 140-142-144-108-110-112 (npr. H4H12166P5) i 204-206-208-212-214-216 (npr. H4H12170P).
[0013] Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji su ovde opisani, mogu sadržavati set od šest CDR (tj. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) sadržanih u paru aminokiselinskih sekvenci HCVR/LCVR koji je kao što je definisano bilo kojim od anti-C5 antitela za primer navedenih u Tabeli 1. Na primer, opisana su antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 set aminokiselinskih sekvenci sadržan unutar para HCVR/LCVR aminokiselinskih sekvenci izabranog iz grupe koju čine SEQ ID NO: 50/58 (npr. H4H12161P), 98/106 (antitelo pronalaska, npr. H4H12166P), 138/106 (npr. H4H12166P5) ili 202/210 (npr. H4H12170P). Postupci i tehnike za identifikaciju CDR unutar HCVR i LCVR aminokiselinskih sekvenci dobro su poznati u oblasti tehnike i mogu biti upotrebljeni za identifikaciju CDR unutar specifično navedenih HCVR i/ili LCVR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane. Konvencije za primer koje mogu biti upotrebljene za identifikaciju granica CDR uklјučuju, npr. definiciju po Kabatu, definiciju po Chothia i AbM definiciju. Uopšteno govoreći, definicija po Kabatu se zasniva na varijabilnosti sekvenci, definicija po Chothia se zasniva na lokaciji regiona strukturnih petlji, dok je AbM definicija kompromis između pristupa po Kabatu i po Chothia. Pogledati, npr. Kabat, „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani i saradnici, J. Mol. Biol.
273:927-948 (1997); i Martin i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Javne baze podataka su takođe dostupne za identifikaciju CDR sekvenci unutar antitela.
[0014] Predmetni pronalazak uključuje anti-C5 antitela koja imaju modifikovan obrazac glikozilacije. U pojedinim primerima izvođenja, modifikacija za uklanjanje nepoželјnih mesta glikozilacije može biti korisna, ili antitelo kome nedostaje fukozni ostatak prisutan u oligosaharidnom lancu može biti korisno, na primer, da bi se povećala funkcija ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) (pogledati Shield i saradnici (2002) JBC 277:26733). U drugim primenama, može biti uvedena modifikacija galaktozilacije, da bi se modifikovala citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).
[0015] U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji ispoljavaju vezivanje za C5 zavisno od pH. Na primer, predmetni pronalazak uklјučuje antitela i njihov fragment koji vezuje antigen, koji vezuju C5 sa većim afinitetom na neutralnom pH nego na kiselom pH (tj. vezivanje je smanjeno na kiselom pH).
[0016] U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela i fragmente koji vezuju antigen koji ispoljavaju pobolјšane farmakokinetičke i farmakodinamičke osobine, na primer, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitela koja imaju produžen poluživot u serumu. U određenim slučajevima, anti-C5 antitela imaju koncentraciju u serumu veću od 10 µg/mL do 40. dana kod miševa sa humanizovanim C5. U određenim slučajevima, anti-C5 antitela blokiraju CP i AP hemolizu do 35. dana nakon davanja miševima sa humanizovanim C5.
[0017] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu biti u kompeticiji specifičnog vezivanje za C5 sa antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen koji sadrži CDR iz HCVR i CDR iz LCVR, pri čemu je svaki od HCVR i LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom od HCVR i LCVR sekvenci navedenih u vidu liste u Tabeli 1.
[0018] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu biti međusobno u kompeticiji vezivanja za C5 sa referentnim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, koji sadrže CDR iz HCVR i CDR iz LCVR, pri čemu je svaki od HCVR i LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom od HCVR i LCVR sekvenci navedenih u vidu liste u Tabeli 1.
[0019] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu se vezivati za isti epitop kao referentno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji sadrže CDR iz HCVR i CDR iz LCVR, pri čemu je svaki od HCVR i LCVR sa aminokiselinskom sekvencom izabranom od HCVR i LCVR sekvenci navedenih u vidu liste u Tabeli 1.
[0020] Anti-C5 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu se vezivati za jedan ili više aminokiselinskih ostataka sadržanih u alfa lancu i/ili beta lancu C5. Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu se vezivati za jednu ili više aminokiselina u alfa lancu C5 i jednu ili više aminokiselina u beta lancu C5. Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu se vezivati za jednu ili više aminokiselina u alfa i beta lancima C5, pri čemu se antitela ne vezuju za anafilatoksinski domen C5a. Ovde opisana anti-C5 antitela mogu interagovati sa jednom ili više aminokiselina sadržanih unutar humanog C5 (SEQ ID NO: 359). Ovde opisana anti-C5 antitela mogu interagovati sa jednom ili više aminokiselina sadržanih unutar humanog C5 (SEQ ID NO: 359), pri čemu se antitela ne vezuju za C5a anafilatoksinski domen iz C5. Ovde opisana anti-C5 antitela, i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, mogu interagovati sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine (a) aminokiseline 591 do 599 iz SEQ ID NO: 359; (b) aminokiseline 593 do 599 iz SEQ ID NO: 359; (c) aminokiseline 775 do 787 iz SEQ ID NO: 359; (d) aminokiseline 775 do 794 iz SEQ ID NO: 359; i (e) aminokiseline 779 do 787 iz SEQ ID NO: 359. Anti-C5 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu interagovati sa jednom ili više aminokiselina sadržanih u SEQ ID NO: 359, na primer, anti-C5 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen su oni koji stupaju u interakciju sa najmanje 5 aminokiselina, najmanje 10 aminokiselina ili najmanje 15 aminokiselina sadržanih unutar SEQ ID NO: 361. Anti-C5 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu stupiti u interakciju sa jednom ili više aminokiselina sadržanih unutar SEQ ID NO: 359, na primer, anti-C5 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen su oni koji interaguju sa najmanje 5 aminokiselina sadržanih unutar SEQ ID NO: 360. Anti-C5 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu interagovati sa najmanje 5 aminokiselina sadržanih u SEQ ID NO: 360 i 361. Anti-C5 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu interagovati sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 360 (koja odgovara aminokiselinama 591 do 599 iz SEQ ID NO: 359) i sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO: 361 (koja odgovara aminokiselinama 775 do 794 iz SEQ ID NO: 359).
[0021] Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji su ovde opisani, mogu se specifično vezivati za C5 na agonistički način, tj. mogu pojačavati ili stimulisati vezivanje i/ili aktivnost C5; ili se antitelo može specifično vezivati za C5 na antagonistički način, tj. može blokirati vezivanje i/ili aktivnost C5.
[0022] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu blokirati vezivanje C5 za konvertazu C5. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji su ovde opisani, mogu blokirati vezivanje C5 za C5 konvertazu i mogu se vezivati za isti epitop na C5 kao C5 konvertaza ili se mogu vezivati za drugi epitop na C5 u odnosu na C5 konvertazu. Ovde opisana antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu blokirati vezivanje C5 za C5 konvertazu majmuna.
[0023] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu biti bispecifični i sadržavati prvu specifičnost vezivanja za prvi epitop C5 proteina i drugu specifičnost vezivanja za drugi epitop C5 proteina, pri čemu su prvi i drugi epitopi jasno različiti i ne preklapaju se.
[0024] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu se vezivati za C5a sa IC50manjim od 0,5nM.
[0025] Izolovano antitelo koje je ovde opisano, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može imati jednu ili više od sledećih karakteristika: (a) u potpunosti je humano monoklonsko antitelo; (b) vezuje se za humani C5 sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 0,9nM na 25°C, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (c) vezuje se za humani C5 sa KDmanjom od 0,3nM na 37°C, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (d) vezuje se za C5 majmuna sa KDmanjom od 65nM, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (e) vezuje se za R885H varijantu humanog C5 (SEQ ID NO: 356) sa KDmanjom od 0,5nM, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (f) vezuje se za R885C varijantu humanog C5 (SEQ ID NO: 357) sa KDmanjom od 0,5nM, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (g) blokira hemolizu klasičnim putem (CP) posredovanu humanim C5 za više od 95% i sa IC50manjim od 6nM, što se meri u testu CP hemolize; (h) blokira hemolizu alternativnim putem (AP) posredovanu humanim C5 za više od 70% i sa IC50manjim od 165nM, što se meri u testu AP hemolize; (i) inhibira CP hemolizu posredovanu sa C5 afričkog zelenog majmuna sa IC50manjim od 185nM, što se meri u testu CP hemolize; (j) inhibira AP hemolizu posredovanu sa C5 afričkog zelenog majmuna sa IC50manjim od 235nM, što se meri u testu AP hemolize; (k) inhibira CP hemolizu posredovanu sa C5 cinomolgus majmuna, sa IC50manjim od 145nM, što se meri u testu CP hemolize; i (1) inhibira AP hemolizu posredovanu sa C5 cinomolgus majmuna, sa IC50manjim od 30nM, što se meri u testu AP hemolize.
[0026] Izolovano rekombinantno monoklonsko anti-C5 antitelo koje je ovde opisano, ili njegov fragment koji vezuje antigen, može imati jednu ili više od sledećih karakteristika: (a) sadrži set od šest CDR koji sadrže aminokiselinske sekvence iz SEQ ID NO: 100-102-104-108-110-112; (b) vezuje se za humani C5 sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 0,2nM na 25°C, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (c) vezuje se za humani C5 sa KDmanjom od 0,3nM na 37°C, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (d) vezuje se za varijantu humanog C5 (R885H) sa KDmanjom od 0,4nM na 37°C, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (e) inhibira hemolizu humanog seruma posredovanu klasičnim putem (CP) sa IC50manjim od 3nM; (f) inhibira hemolizu humanog seruma posredovanu alternativnim putem (AP) sa IC50manjim od 27nM; (g) inhibira hemolizu seruma majmuna posredovanu sa CP, sa IC50manjim od 21nM; (g) inhibira hemolizu seruma majmuna posredovanu sa AP, sa IC50manjim od 10nM; (h) ima poluživot u serumu (t1/2) veći od 10 dana kod miševa sa humanizovanim C5; (i) ima koncentraciju u serumu veću od 10 µg/mL do 40. dana nakon davanja miševima sa humanizovanim C5; (j) blokira hemolizu posredovanu sa CP do 50. dana kod miševa sa humanizovanim C5; i (k) vezuje se za jednu ili više aminokiselina sadržanih u alfa lancu i/ili beta lancu SEQ ID NO: 359, pri čemu se antitelo ne vezuje za C5a anafilatoksinski domen C5.
[0027] Prema drugom aspektu, ovde su opisani molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju anti-C5 antitela ili njihove delove. Na primer, ovde opisani molekuli nukleinskih kiselina mogu kodirati bilo koju od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1; u određenim slučajevima, molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu od bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina za HCVR navedenih u Tabeli 2, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja joj je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99 % identična.
[0028] Molekuli nukleinskih kiselina koji su ovde opisani, mogu kodirati bilo koju od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1; u određenim slučajevima, molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu od bilo koje od sekvenci nukleinskih kiselina za LCVR navedenih u Tabeli 2, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja joj je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99 % identična.
[0029] Ovde opisani molekuli nukleinskih kiselina mogu kodirati i HCVR i LCVR, pri čemu HCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od HCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1, i pri čemu LCVR sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od LCVR aminokiselinskih sekvenci navedenih u Tabeli 1. U određenim slučajevima, molekul nukleinske kiseline sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu od bilo koje od HCVR sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 2, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja joj je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99 % identična, i polinukleotidnu sekvencu izabranu od bilo koje od LCVR sekvenci nukleinskih kiselina navedenih u Tabeli 1, ili njenu suštinski sličnu sekvencu koja joj je najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99 % identična. U određenim slučajevima, molekul nukleinske kiseline kodira HCVR i LCVR, pri čemu su oba od HCVR i LCVR izvedeni iz istog anti-C5 antitela navedenog u Tabeli 1. Pronalazak obezbeđuje izolovani polinukleotidni molekul koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira HCVR antitela pronalaska ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, i nukleotidnu sekvencu koja kodira LCVR antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen prema pronalasku.
[0030] Prema srodnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantne ekspresione vektore koji sadrže polinukleotidni molekul predmetnog pronalaska, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Vektor je u stanju da eksprimira polipeptid koji sadrži varijabilni region teškog ili lakog lanca anti-C5 antitela. U obim predmetnog pronalaska su takođe uključene ćelije domaćini koje eksprimiraju vektore pronalaska.
[0031] Prema trećem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo predmetnog pronalaska, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji su kao što je definisano u patentnim zahtevima, i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač. U pojedinim slučajevima, kompozicija može biti kombinacija anti-C5 antitela pronalaska i drugog terapijskog agensa. U jednom slučaju, drugi terapijski agens može biti bilo koji agens čija kombinaciji sa anti-C5 antitelom obezbeđuje prednost. Agensi za primer koji se mogu kombinovati sa anti-C5 antitelom tako da se obezbedi prednost uklјučuju, bez ograničenja, druge agense koji vezuju i/ili inhibiraju aktivnost C5 (uklјučujući druga antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen itd.) i/ili agense koji se ne vezuju direktno za C5, ali ipak leče ili ublažavaju najmanje jedan simptom ili indikaciju bolesti ili poremećaja povezanog sa C5. Dodatne kombinovane terapije i koformulacije koje uklјučuju anti-C5 antitela predmetnog pronalaska su ovde opisane na drugim mestima.
[0032] Sva pozivanja na postupke lečenja odnose se u opisu na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i medikamente predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje humanog (ili životinjskog) tela terapijom.
[0033] U određenim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitelo pronalaska, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u postupcima za prevenciju, lečenje ili ublažavanje najmanje jednog simptoma atipičnog hemolitičko-uremijskog sindroma (aHUS), pri čemu postupak obuhvata davanje terapijski efektivne količine anti-C5 antitela pronalaska, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, subjektu kome je to potrebno. U pojedinim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-C5 antitelo pronalaska, ili njegov fragment koji vezuje antigen, za upotrebu u postupcima ublažavanja ili smanjenja ozbiljnosti najmanje jednog simptoma ili indikacije paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH) kod subjekta, davanjem anti-C5 antitela pronalaska. U pojedinim primerima izvođenja, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen mogu biti davani profilaktički ili terapijski subjektu koji boluje ili je sa rizikom da oboli od bolesti ili poremećaja povezanog sa C5. U određenim primerima izvođenja, antitelo pronalaska, ili njegov fragment koji vezuje antigen, daju se u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom subjektu kome je to potrebno. Drugi terapijski agens može biti izabran iz grupe koju čine anti-inflamatorni lek (kao što su to kortikosteroidi i nesteroidni anti-inflamatorni lekovi), različito antitelo na C5 protein, dodatak ishrani kao što su antioksidansi i bilo koji drugi lek ili terapija koji su poznati u oblasti tehnike. U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens može biti agens koji pomaže u suzbijanju ili smanjenju bilo kog od mogućih sporednih efek(a)ta povezanih sa antitelom pronalaska ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, ukoliko se takav(i) sporedni efekat(i) pojavi(e). Antitelo ili njegov fragment mogu biti dati subkutano, intravenski, intradermalno, intraperitonealno, oralno ili intramuskularno. Antitelo ili njegov fragment mogu biti dati u dozi od oko 0,1 mg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine subjekta. U određenim primerima izvođenja, antitelo predmetnog pronalaska može biti dato u jednoj ili više doza koje sadrže između 50 mg do 600 mg.
[0034] Ostali primeri izvođenja postaće očigledni nakon pregleda detalјnog opisa pronalaska koji sledi.
KRATAK OPIS SLIKA
[0035]
Slika 1 pokazuje inhibiciju nivoa C5a sa anti-C5 antitelom H4H12166P na način koji zavisi od doze, što je utvrđeno ELISA testom (opisano ovde u Primeru 9).
Slika 2 pokazuje ukupnu koncentraciju u serumu u odnosu na vreme, nakon jednokratne intravenske injekcije H4H12166P, H4H12161P ili antitela za poređenje (Komparatora) 2 u dozi od 15 mg/kg, mužjacima cinomolgus majmuna (opisano ovde u Primeru 10). Profili zavisnosti koncentracije i vremena ucrtani su polazeći od prve doze koja je data i koja se nalazi ispod rezultata granice kvantifikacije (BLQ), ukoliko je primenjivo, a koja je uneta kao LLOQ/2. Svaka tačka grafika predstavlјa srednju vrednost (±SD) (n = 4 životinje/grupi); koncentracije za koje se smatra da su pod uticajem ADA, bile su isklјučene za 1 životinju iz H4H12166P grupe i 1 životinju iz H4H12161P grupe počevši od 36. i 29. dana, tim redom. LLOQ = Donja granica kvantifikacije
Slika 3 pokazuje procenat hemolize u odnosu na vreme u testu sa crvenim krvnim ćelijama ex vivo za (A) Klasičan put i (B) Alternativan put, nakon jednokratne intravenske injecije H4H12166P, H4H12161P ili Komparatora 2 mužjacima cinomolgus majmuna. % hemolize, izračunavan kao odnos eksperimentalne naspram maksimalne lize, sa % lize u pozadini oduzetim od obe vrednosti, povezan je sa količinom C5 inhibiranom sa određenim anti-C5 antitelom prisutnim u serumu u datoj vremenskoj tački. Svaka tačka grafika predstavlјa srednju vrednost (±SD).
Slika 4 pokazuje profile ukupne koncentracije u serumu u odnosu na vreme, za odabrana anti-C5 antitela kod miševa sa humanizovanim C5 (opisano ovde u Primeru 11). Miševima sa humanizovanim C5 je data jednokratna subkutana doza H4H12166P, Komparatora 1 ili Komparatora 2 od 15 mg/kg. Svaka tačka grafika predstavlјa srednju vrednost ± s.e.m. (n =4-5 za svaki tretman). Koncentracije antitela u serumima su praćene 1, 10, 20, 30 i 40 dana nakon injeciranja, upotrebom sendvič ELISA testa.
Slika 5 pokazuje procenat hemolize u odnosu na vreme u testu hemolize klasičnim putem aktivacije komplementa ex vivo, za odabrana anti-C5 antitela kod miševa sa humanizovanim C5. Miševima sa humanizovanim C5 je data jednokratna subkutana doza H4H12166P, Komparatora 1 ili Komparatora 2 od 15 mg/kg. Svaka tačka grafika predstavlјa srednju vrednost ± s.e.m. (n =4-5 za svaki tretman). Procenat hemolize u serumu praćen je pre davanja doze, 10, 20, 30, 40 i 50 dana nakon injeciranja. % hemolize, izračunavan kao odnos eksperimentalne naspram maksimalne lize, sa % lize u pozadini oduzetim od obe vrednosti, povezan je sa količinom C5 inhibiranom sa određenim anti-C5 antitelom koje je bilo prisutno u serumu u datoj vremenskoj tački.
Slika 6 prikazuje profile zavisnosti ukupne koncentracije u serumu i vremena za odabrana anti-C5 antitela, kod miševa sa humanizovanim C5 (opisano ovde u Primeru 11). Miševima je data jednokratna subkutana doza H4H12166P, H4H12161P, Komparatora 1 ili IgG4<P>izotipske kontrole od 15 mg/kg. Svaka tačka grafika predstavlјa srednju vrednost ± s.e.m. (n = 5 za svaki tretman). Nivoi antitela u serumima su praćeni 6 sati, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21, 30, 45 i 59 dana nakon injeciranja, upotrebom sendvič ELISA testa.
Slika 7 je grafik koji prikazuje rezultate optičke koherentne tomografije (OCT) kod miševa tretiranih izotipskom kontrolom ili anti-C5 antitelom M1M17628N u dozi od 10 mg/kg ili 50 mg/kg (opisano ovde u Primeru 14). ****p<0,0001, dvofaktorska ANOVA, tretman sa anti-C5 antitelom u dozi od 50 mg/kg u odnosu na grupu bez tretmana ili grupu tretiranu izotipskom kontrolom.
Figura 8 pokazuje inhibiciju hemolize klasičnim putem za anti-C5 antitelo M1M17628N u odsustvu C3 (A); i u prisustvu 80 µg/mL humanog C3 (B) (opisano ovde u Primeru 14).
Slika 9 prikazuje broj ćelijskih klastera kod miševa sa humanizovanim C5 koji su tretirani izotipskom kontrolom ili sa anti-humanim C5 antitelom H4H12170P u dozi od 10 mg/kg ili 50 mg/kg (opisano ovde u Primeru 15). n=8-12 očiju za svaku grupu
Slika 10 je grafik koji prikazuje OCT skorove kod miševa sa humanizovanim C5 koji su tretirani izotipskom kontrolom ili sa anti-humanim C5 antitelom H4H12170P u dozi od 10 mg/kg ili 50 mg/kg (opisano ovde u Primeru 15). n=8-12 očiju za svaku grupu
Slika 11 je grafik koji prikazuje OCT skorove kod miševa sa humanizovanim C5 koji su tretirani izotipskom kontrolom, anti-humanim C5 antitelom H4H12166P u dozi od 3 mg/kg ili 10 mg/kg, ili Komparatorom 2 u dozi od 10 mg/kg. n=6-12 očiju za svaku grupu (opisano ovde u Primeru 15).
Slika 12 prikazuje broj ćelijskih klastera kod miševa sa humanizovanim C5 koji su tretirani izotipskom kontrolom, anti-humanim C5 antitelom H4H12166P u dozi od 3 mg/kg ili 10 mg/kg, ili Komparatorom 2 u dozi od 10 mg/kg. n=6-12 očiju za svaku grupu (opisano ovde u Primeru 15).
Slika 13 je kriva preživlјavanja NZBWF1 miševa tretiranih izotipskom kontrolom ili sa anti-C5 antitelima M1M17628N ili M1M17627N (opisano ovde u Primeru 17).
Slika 14 pokazuje nivoe (A) albumina u urinu i (B) albumina u urinu normalizovanog na kreatinin u urinu, kod NZBWF1 miševa lečenih izotipskom kontrolom ili sa anti-C5 antitelima M1M17628N ili M1M17627N (opisano ovde u Primeru 17).
Slika 15 prikazuje nivoe azota uree u krvi kod NZBWF1 miševa tretiranih sa izotipskom kontrolom ili sa anti-C5 antitelima M1M17628N ili M1M17627N (opisano ovde u Primeru 17).
Slika 16 je grafik koji pokazuje inhibiciju citotoksičnosti astrocita zavisne od antitela, za anti-C5 antitela H4H12166P, H4H12170P, Komparator 1 i Komparator 2, kao što je opisano u Primeru 18.
1
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0036] Pre opisa postupaka predmetnog pronalaska, potrebno je napomenuti da se podrazumeva da ovaj pronalazak nije ograničen na određene postupke i eksperimentalne uslove koji su ovde opisani, pošto takvi postupci i uslovi mogu varirati. Podrazumeva se takođe da je svrha terminologije koja je ovde upotrebljena samo opisivanje određenih primera izvođenja i da nije predviđeno da bude ograničavajuća, pošto će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.
[0037] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde upotrebljeni su sa istim značenjem koje se obično podrazumeva od strane stručnjaka iz oblasti tehnike kojoj pronalazak pripada. Iako u praksi ili prilikom testiranja predmentog pronalaska može biti upotrebljen bilo koji od postupaka ili materijala koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, sledi opis poželjnih postupaka i materijala.
Definicije
[0038] Termin „C5”, koji se takođe naziva „komponenta 5 sistema komplementa” ili „ faktor 5 sistema komplementa” odnosi se na serumski protein kaskade komplementa. C5 protein je protein od 1676 aminokiselina koji sadrži dva lanca, alfa i beta. Protein predstavlјa tačku konvergencije za tri puta aktivacije sistema komplementa: klasičan put, alternativni put i lektinski put vezivanjem manoze. Aminokiselinska sekvenca C5 proteina pune dužine je data u vidu primera kao aminokiselinska sekvenca obezbeđena u GenBank bazi podataka sa pristupnim brojem NP_001726.2 (SEQ ID NO: 355). Termin „C5” uklјučuje rekombinantan C5 protein ili njegov fragment. Termin takođe obuhvata C5 protein ili njegov fragment kuplovan sa, na primer, histidinskim tagom, mišjim ili humanim Fc, ili signalnom sekvencom kao što je ROR1. Na primer, termin uklјučuje sekvence prikazane u vidu primera u sekvenci SEQ ID NO: 356 ili 357, koja sadrži histidinski tag na C-kraju i kuplovana je sa aminokiselinskim ostacima 19 - 1676 iz C5 proteina pune dužine. Termin takođe uklјučuje varijante proteina koje sadrže histidinski tag na C-kraju koje su kuplovane sa aminokiselinskim ostacima 19 -1676 iz C5 proteina pune dužine sa promenom R885H ili promenom R885C.
[0039] Predviđeno je da se termin „antitelo”, kako se ovde upotrebljava, odnosi na imunoglobulinske molekule koji se sastoje od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca koji su međusobno povezani disulfidnim vezama (tj. na „potpune molekule antitela”), kao i na njihove multimere (npr. IgM) ili njihove fragmente koji vezuju antigen. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca („HCVR” ili „VH”) i konstantnog regiona teškog lanca (koga čine domeni CH1, CH2 i CH3). Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca („LCVR ili „VL”) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Regioni VHi VLmogu dalјe biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), koji su ispresecani regionima koji su više evolutivno očuvani i označeni kao uokvirujući regioni (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR i četiri FR raspoređenih od amino-kraja ka karboksi-kraja po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. FR antitela (ili njihovog fragment koji vezuje antigen) mogu biti identični humanim germinativnim sekvencama, ili mogu biti prirodno ili veštački modifikovani. Aminokiselinska konsenzusna sekvenca može biti definisana na osnovu uporedne analize dva ili više CDR-ova.
[0040] Supstitucija jednog ili više ostataka iz CDR ili izostavlјanje jednog ili više CDR je takođe moguće. U naučnoj literaturi su opisana antitela u kojima jedan ili dva CDR može biti izostavljen radi vezivanja. Padlan i saradnici (1995 FASEB J.9:133-139) analizirali su regione kontakta između antitela i njihovih antigena, na osnovu objavlјenih kristalnih struktura, i zaklјučili su da samo oko od jedne petine do jedne trećine CDR ostataka zaista stupa u kontakt sa antigenom. Padlan je takođe pronašao mnoga antitela u kojima jedan ili dva CDR nisu imali aminokiseline u kontaku sa antigenom (pogledati takođe, Vajdos i saradnici 2002 J Mol Biol 320:415-428).
[0041] CDR ostaci koji ne stupaju u kontakt sa antigenom mogu biti identifikovani na osnovu prethodnih studija (na primer, ostaci H60-H65 u CDRH2 često nisu potrebni), iz regiona koji su CDR po Kabatu i leže izvan CDR po Chothia, molekulskim modeliranjem i/ili empirijski. Ukoliko je izostavljen CDR, ili njegov(i) ostatak(ostaci), on je obično supstituisan sa aminokiselinom koja zauzima odgovarajuću poziciju u drugoj sekvenci humanog antitela ili konsenzusu takvih sekvenci. Pozicije za supstituciju unutar CDR-ova i aminokiseline za supstituciju mogu takođe biti izabrane empirijski. Empirijske supstitucije mogu biti konzervativne i nekonzervativne supstitucije.
[0042] U potpunosti humana anti-C5 monoklonska antitela koja su ovde opisana, mogu sadržavati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija i/ili delecija u uokvirujućim i/ili CDR regionima varijabilnih domena teških i lakih lanaca, u poređenju sa odgovarajućim germinativnim sekvencama. Takve mutacije mogu lako biti utvrđene poređenjem aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane sa germinativnim sekvencama koje su dostupne iz, na primer, javnih baza podataka sekvenci antitela. Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, izvedeni su iz bilo koje od aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, pri čemu su jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više uokvirujućih i/ili CDR regiona mutirane u odgovarajući(e) ostatak(e) germinativne sekvence iz koje je antitelo izvedeno, ili u odgovarajući(e) ostatak(e) druge humane germinativne sekvence, ili u konzervativne aminokiselinske supstitucije odgovarajućeg(ih) germinativnog(ih) ostatka(a) (takve promene sekvence se ovde zajedno označavaju kao „germinativne mutacije”). Prosečno iskusan stručnjak iz oblasti tehnike, polazeći od ovde opisanih sekvenci varijabilnih regiona teških i lakih lanaca, lako može proizvesti brojna antitela i fragmente koji vezuju antigen koji sadrže jednu ili više pojedinačnih germinativnih mutacija ili njihove kombinacije. U određenim primerima izvođenja, svi od uokvirujućih i/ili CDR ostataka unutar VHi/ili VLdomena povratno su mutirani u ostatke koji se nalaze u originalnoj germinativnoj sekvenci iz koje je antitelo izvedeno. U drugim primerima izvođenja, samo određeni ostaci su povratno mutirani u originalnu germinativnu sekvencu, npr. samo su mutirani ostaci koji se nalaze unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili su mutirani samo ostaci koji se nalaze unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim primerima izvođenja, jedan ili više od uokvirujućih i/ili CDR ostataka su mutirani u odgovarajući(e) ostatak(ostatke) različite germinativne sekvence (tj. germinativnu sekvencu koja je različita od germinativne sekvence iz koje je antitelo bilo prvobitno izvedeno). Štaviše, antitela koja su ovde opisana mogu sadržavati bilo koju kombinaciju dve ili više germinativnih mutacija unutar uokvirujućih i/ili CDR regiona, npr. pri čemu su određeni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak određene germinativne sekvence, dok su određeni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne germinativne sekvence zadržani ili su mutirani u odgovarajući ostatak različite germinativne sekvence. Jednom dobijeni, antitela i fragmenti koji vezuju antigen i sadrže jednu ili više germinativnih mutacija, lako mogu biti ispitani u pogledu jedne ili više željenih osobina, kao što su pobolјšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, pobolјšane ili pojačane antagonističke ili agonističke biološke osobine (što može biti slučaj), smanjene imunogenosti itd.
[0043] U potpunosti humana anti-C5 monoklonska antitela koja su ovde opisana mogu sadržavati varijante bilo koje od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane, sa jednom ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, anti-C5 antitela mogu imati HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinske sekvence sa, npr.10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje itd. konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na bilo koju od HCVR, LCVR i/ili CDR aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane.
[0044] Predviđeno je da termin „humano antitelo”, kako se ovde upotrebljava, uključuje antitela sa varijabilnim i konstantnim regionima izvedenim iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana mAt pronalaska mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr. mutacije mogu biti uvedene nasumičnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili nastati somatskom mutacijom in vivo), na primer, u CDR-ovima i posebno CDR3. Ipak, nije predviđeno da se termin „humano antitelo”, kako se ovde upotrebljava, uključuje mAt u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije drugih sisarskih vrsta (npr. miša) i koje su uvedene u vidu grafta u humane FR sekvence. Termin uklјučuje antitela koja su rekombinantno proizvedena u sisaru koji je različit od čoveka, ili u ćelijama sisara koji je različit od čoveka. Nije predviđeno da termin uključuje antitela izolovana iz ili generisana u humanom subjektu.
[0045] Termin „rekombinantan”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antitela pronalaska ili njihove fragmente koji vezuju antigen koji su stvoreni, eksprimirani, izolovani ili dobijeni tehnologijama ili postupcima koji su poznati u oblasti tehnike kao tehnologija rekombinantne DNK koja uklјučuje, npr. obradu DNK i transgenu ekspresiju. Termin se odnosi na antitela eksprimirana u sisaru različitom od čoveka (uključujući transgene sisare različite od čoveka, npr. trangene miševe) ili u ćelijskim ekspresionim sistemima (npr. CHO ćelijama) ili ona izolovana iz rekombinantne kombinatorne biblioteke humanih antitela.
[0046] Termin „specifično vezuje” ili „vezuje se specifično za”, ili slično, označava da antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen obrazuju kompleks sa antigenom koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje može biti okarakterisano ravnotežnom konstantom disocijacije od najmanje oko 1×10<-8>M ili manje (npr. manja KDoznačava čvršće vezivanje). Postupci za određivanje da li se dva molekula specifično vezuju su dobro poznati u oblasti tehnike i uklјučuju, na primer, ravnotežnu dijalizu, rezonanciju površinskog plazmonai slično. Kao što je ovde opisano, antitela koja se specifično vezuju za C5 identifikovana su rezonancijom površinskog plazmona, npr. BIACORE<™>sistemom. Štaviše, multispecifična antitela koja se vezuju za jedan domen u C5 i jedan ili više dodatnih antigena, ili bispecifična antitela, koja se vezuju za dva različita regiona C5, smatraju se ipak antitelima koja se „specifično vezuju”, kao što se to ovde upotrebljava.
[0047] Termin antitelo „visokog afiniteta” odnosi se na ona mAt koja imaju afinitet vezivanja za C5, izražen kao KD, od najmanje 10<-8>M; poželјno 10<-9>M; poželјnije 10<-10>M, još poželјnije 10<-11>M, još poželјnije 10<-12>M, što se meri rezonancijom površinskog plazmona, npr. BIACORE<™>sistemom ili ELISA testom sa afinitetom prema rastvoru.
[0048] Pod terminom „spora stopa disocijacije”, „Koff” ili „kd” označava se antitelo koje disocira od C5 sa konstantom brzine od 1 × 10<-3>s<-1>ili manje, poželјno 1 × 10<-4>s<-1>ili manje, što se utvrđuje rezonancijom površinskog plazmona, npr. BIACORE<™>sistemom.
1
[0049] Termini „deo koji vezuje antigen” antitela, „fragment koji vezuje antigen” antitela i slično, kako se ovde upotrebljavaju, uključuju bilo koji peptid ili glikoprotein koji se javlja u prirodi, enzimski je dobijen, sintetički je ili je dobijen genetičkim inženjeringom, a koji specifično vezuje antigen da bi se obrazovao kompleks. Termini „fragment koji vezuje antigen” antitela ili „fragment antitela”, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se vežu za C5 protein.
[0050] U specifičnim primerima izvođenja, antitelo ili fragmenti antitela pronalaska mogu biti konjugovani sa ostatkom kao što je ligand ili terapijski ostatak („imunokonjugat”), drugo anti-C5 antitelo ili bilo koji drugi terapijski ostatak koji je koristan za lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa C5.
[0051] Predviđeno je da se „izolovano antitelo”, kako se ovde upotrebljava, odnosi na antitelo koje je suštinski bez drugih antitela (At) koja imaju različite specifičnosti za antigene (npr. izolovano antitelo koje specifično vezuje C5, ili njegov fragment, suštinski je bez At koja specifično vezuju antigene drugačije od C5.
[0052] Predviđeno je da se „blokirajuće antitelo” ili „neutrališuće antitelo”, kako se ovde upotrebljavaju (ili „antitelo koje neutrališe aktivnost C5” ili „antagonističko antitelo”), odnose na antitelo čije vezivanje za C5 dovodi do inhibicije najmanje jedne biološke aktivnosti C5. Na primer, antitelo pronalaska može sprečiti ili blokirati hemolizu posredovanu komplementom klasičnim ili alternativnim putem.
[0053] Termin „rezonancija površinskog plazmona”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu biomolekulskih interakcija u realnom vremenu, detekcijom izmena u koncentracijama proteina unutar biosenzorskog matriksa, na primer upotrebom BIACORE<™>sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švedska i Piscataway, N.J.).
[0054] Predviđeno je da se termin „KD”, kako se ovde upotrebljava, odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitela i antigena.
[0055] Termin „epitop” se odnosi na antigenu determinantu koja interaguje sa specifičnim mestom vezivanja za antigen u varijabilnom regionu molekula antitela koji je poznat kao paratop. Jedan antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela se mogu vezivati za različite oblasti na antigenu i mogu imati različite biološke efekte. Termin „epitop” takođe se odnosi na mesto na antigenu na koje odgovaraju B i/ili T ćelije. Odnosi se takođe na region antigena koji je vezan antitelom. Epitopi mogu biti definisani kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podskup strukturnih epitopa i imaju one ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcije. Epitopi takođe mogu biti konformacioni, odnosno biti sastavlјeni od nelinearnih aminokiselina. U određenim primerima izvođenja, epitopi mogu uklјučivati determinante koje su hemijski aktivna grupisanja molekula na površini kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil grupe ili sulfonil grupe, a, u određenim primerima izvođenja, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja.
[0056] Termin „unakrsna kompeticija”, kako se ovde upotrebljava, označava da se antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuju za antigen i inhibiraju ili blokiraju vezivanje drugog antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen. Termin takođe uklјučuje kompeticiju između dva antitela u obe orijentacije, tj. kada prvo antitelo vezuje i blokira vezivanje drugog antitela i obrnuto. U određenim primerima izvođenja, prvo antitelo i drugo antitelo se mogu vezivati za isti epitop. Alternativno, prvo i drugo antitelo se mogu vezivati za različite, ali epitope koji se preklapaju, tako da vezivanje jednog inhibira ili blokira vezivanje drugog antitela, npr. putem sternog ometanja. Unakrsna kompeticija između antitela može biti izmerena postupcima poznatim u oblasti tehnike, na primer, testom interferometrije u biološkom sloju bez obeležavanja u realnom vremenu. Unakrsna kompeticija između dva antitela može biti izražena kao vezivanje drugog antitela koje je manje od pozadinskog signala nastalog usled vezivanja za samog sebe (pri čemu su prvo i drugo antitelo isto antitelo). Unakrsna kompeticija između 2 antitela može biti izražena, na primer, kao % vezivanja drugog antitela koje je manje od bazalnog pozadinskog nivoa vezivanja za samog sebe (pri čemu su prvo i drugo antitelo isto antitelo).
[0057] Termin „suštinski identičan” ili „suštinski identični”, kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada je ona optimalno poravnata sa odgovarajućim nukleotidnim insercijama ili delecijama sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost nukleotidnih sekvenci koja iznosi najmanje oko 90%, a poželјnije najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, što se meri bilo kojim dobro poznatim algoritmom za identičnost sekvenci, kao što su FASTA, BLAST ili GAP, kao što je objašnjeno u nastavku teksta. Molekul nukleinske kiseline koji je suštinski identičan referentnom molekulu nukleinske kiseline može, u određenim slučajevima, kodirati polipeptid koji ima istu ili suštinski sličnu aminokiselinsku sekvencu kao polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.
[0058] Kako se primenjuje na polipeptide, termin „značajna sličnost” ili „suštinski sličan” označava da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je sa programima GAP ili BESTFIT upotrebom zadatih težina gapova, dele identičnosti sekvence od najmanje 90%, još poželјnije identičnosti sekvence od najmanje 95%, 98% ili 99%. Poželјno je da se pozicije ostataka koje nisu identične, razlikuju po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. „Konzervativna aminokiselinska supstitucija” je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim osobinama (npr. naelektrisanjem ili hidrofobnošću). U principu, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće bitno promeniti funkcionalne osobine proteina. U slučajevima kada se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge po konzervativnim supstitucijama, procenat ili stepen sličnosti može biti podešen naviše, da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Načini za vršenje ovog podešavanja su dobro poznata stručnjacima iz oblasti tehnike. Pogledati, npr. Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama uklјučuju one koje imaju 1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatično-hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin i histidin; 6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Poželјne grupe konzervativnih aminokiselinskih supstitucija su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 matrici logaritamske verovatnoće koja je opisana u Gonnet i saradnici (1992) Science 256: 144345. „Umereno konzervativna” zamena je bilo koja promena koja ima vrednost koja nije negativna u PAM250 matrici logaritamske verovatnoće.
1
[0059] Sličnost sekvenci za polipeptide se obično meri upotrebom softvera za analizu sekvenci. Softver za analizu proteina preklapa slične sekvence upotrebom mera sličnosti koje su dodelјene za razne supstitucije, delecije i druge modifikacije, uključujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su GAP i BESTFIT, koji mogu biti upotrebljeni sa zadatim parametrima, da bi se utvrdila homologija sekvenci ili identičnost sekvenci između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divlјeg tipa i njegovog muteina. Pogledati, npr. GCG verziju 6.1. Polipeptidne sekvence takođe mogu biti upoređivane upotrebom FASTA sa zadatim ili preporučenim parametrima; program FASTA u GCG verziji 6.1. (npr. FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procent identičnosti sekvenci regiona koji se najbolje preklapaju između datih sekvenci i sekvenci koje se ispituju (Pearson (2000) navedeno iznad). Drugi poželјni algoritam za poređenje sekvence sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, upotrebom zadatih parametara. Pogledati, npr. Altschul i saradnici (1990) J. Mol. Biol.215: 403-410 i (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402.
[0060] Izrazom „terapijski efektivna količina” označava se količina koja proizvodi želјeni efekat zbog koga se i daje. Tačna količina zavisiće od svrhe tretmana, a stručnjak iz oblasti tehnike će moći da je utvrdi upotrebom poznatih tehnika (pogledati, na primer, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
[0061] Kao što se ovde upotrebljava, termin „subjekat” se odnosi na životinju, poželјno sisara, poželјnije čoveka, kome je potrebno ublažavanje, prevencija i/ili lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa C5, kao što su atipičan hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS) ili paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH). Termin uklјučuje humane subjekte koji boluju ili su sa rizikom da obole od takvih bolesti ili poremećaja.
[0062] Kao što se ovde upotrebljava, termini „lečiti”, „lečenje” ili „tretman” odnose se na smanjenje ili ublažavanje ozbiljnosti najmanje jednog simptoma ili indikacije bolesti ili poremećaja povezanog sa C5 usled davanja terapijskog agensa, kao što je antitelo predmetnog pronalaska, subjektu kome je to potrebno. Termini uklјučuju inhibiciju progresije bolesti ili pogoršanja simptoma/indikacije. Termini takođe uklјučuju pozitivnu prognozu bolesti, tj. subjekat može biti bez bolesti ili može imati smanjenu bolest nakon davanja terapijskog agensa kao što je antitelo predmetnog pronalaska. Terapijski agens može biti dat subjektu u terapijskoj dozi.
[0063] Termini „sprečiti”, „prevenirati” ili „prevencija” odnose se na inhibiciju manifestacije bolesti ili poremećaja povezanih sa C5 ili bilo kojih simptoma ili indikacija takvih bolesti ili poremećaja, nakon davanja antitela predmetnog pronalaska.
Fragmenti antitela koji vezuju antigen
[0064] Ukoliko nije drugačije naznačeno, podrazumeva se da termin „antitelo”, kako se ovde upotrebljava, obuhvata molekule antitela koji sadrže dva imunoglobulinska teška lanca i dva imunoglobulinska laka lanca (tj. „potpune molekule antitela”), kao i njihove fragmente koji vezuju antigen. Termini „deo koji vezuje antigen” antitela, „fragment koji vezuje antigen” antitela i slično, kako se ovde upotrebljavaju, uključuju bilo koji peptid ili glikoprotein koji se javlja u prirodi, enzimski je dobijen, sintetički je ili je dobijen genetičkim inženjeringom, koji specifično vezuje antigen da bi se
1
obrazovao kompleks. Termini „fragment koji vezuje antigen” antitela ili „fragment antitela”, kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za C5 protein. Fragment antitela može uklјučivati Fab fragment, F(ab')2fragment, Fv fragment, dAt fragment, fragment koji sadrži CDR ili izolovani CDR. U određenim primerima izvođenja, termin „fragment koji vezuje antigen” odnosi se na polipeptidni fragment multispecifičnog molekula koji vezuje antigen. Fragmenti antitela koji vezuju antigen mogu biti izvedeni, npr. iz potpunih molekula antitela, upotrebom bilo koje pogodne standardne tehnike kao što su proteolitička digestija ili tehnike rekombinantnog genetičkog inženjeringa koje uklјučuju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira varijabilne i (opciono) konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, npr. komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uklјučujući, npr. fagne biblioteke antitela) ili ona može biti sintetisana. DNK može biti sekvencirana i sa njome može biti manipulisano hemijski ili upotrebom tehnika molekularne biologije, na primer, da bi se preuredili jedan ili više varijabilnih i/ili konstantnih domena u odgovarajuću konfiguraciju, ili da bi se uveli kodoni, generisali cisteinski ostaci, modifikovale, dodale ili delecijom uklonile aminokiseline itd.
[0065] Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen uklјučuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab')2 fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAt fragmente; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji imitiraju hipervarijabilni region antitela (npr. izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili kruti FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi molekuli dobijeni genetičkim inženjeringom, kao što su antitela specifična za domene, antitela sa samo jednim domenom, antitela sa delecijom uklonjenim domenom, himerna antitela, antitela sa CDR graftom, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIP) i varijabilni IgNAR domeni ajkule, takođe su obuhvaćeni izrazom „fragment koji vezuje antigen”, kako se ovde upotrebljava.
[0066] Fragment antitela koji vezuje antigen obično će sadržavati najmanje jedan varijabilni domen. Varijabilni domen može biti bilo koje veličine ili aminokiselinskog sastava i generalno će sadržavati najmanje jedan CDR koji je susedan ili u okviru čitanja sa jednom ili sa više uokvirujućih sekvenci. U fragmentima koji vezuju antigen i imaju VHdomen udružen sa VLdomenom, VHi VLdomeni mogu biti postavljeni jedan u odnosu na drugog po bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, varijabilni region može biti dimeran i sadržavati VH- VH, VH- VLili VL- VLdimere. Alternativno, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati monomeran VHili VLdomen.
[0067] U određenim primerima izvođenja, fragment antitela koji vezuje antigen može sadržavati najmanje jedan varijabilni domen kovalentno povezan sa najmanje jednim konstantnim domenom. Neograničavajuće konfiguracije za primer varijabilnih i konstantnih domena koje se mogu naći unutar fragmenta antitela predmetnog pronalaska koji vezuje antigen uklјučuju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji varijabilnih i konstantnih domena, uklјučujući bilo koju od konfiguracija za primer koje su prethodno navedene u vidu liste, varijabilni i konstantni domeni mogu biti bilo direktno povezani jedan sa drugim ili mogu biti povezani potpunim ili delimičnim zglobnim ili linkerskim regionom. Zglobni region se može sastojati od najmanje 2 (npr.5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina, što rezultuje fleksibilnom ili polufleksibilnom vezom između susednih varijabilnih i/ili konstantnih domena u pojedinačnom polipeptidnom molekulu. Štaviše, fragment antitela predmetnog pronalaska koji vezuje antigen može
1
sadržavati homodimer ili heterodimer (ili drugi multimer) bilo koje od konfiguracija varijabilnih i konstantnih domena koje su prethodno navedeni, u vidu nekovalentnog udruživanja sa jednim drugačijim i/ili sa jednim ili više monomernih VHili VLdomena (npr. disulfidnom(im) vezom(ama)).
[0068] Kao i kod kompletnih molekula antitela, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr. bispecifični). Multispecifični fragment koji vezuje antigen antitela obično će sadržavati najmanje dva različita varijabilna domena, pri čemu je svaki varijabilni domen u stanju da se specifično vezuje za poseban antigen ili za različit epitop na istom antigenu. Bilo koji multispecifičan format antitela, uklјučujući formate bispecifičnih antitela za primer koji su ovde opisani, može biti prilagođen za upotrebu u kontekstu fragmenta koji vezuje antigen antitela predmetnog pronalaska, upotrebom rutinskih tehnika koje su dostupne u oblasti tehnike.
Priprema humanih antitela
[0069] Postupci za generisanje humanih antitela u transgenim miševima su poznati u oblasti tehnike. Bilo koji od takvih poznatih postupaka može biti upotrebljen u kontekstu predmetnog pronalaska za pravlјenje humanih antitela koja se specifično vezuju za C5 protein.
[0070] Imunogen, koji sadrži bilo šta od sledeće navedenog, može biti upotrebljen za generisanje antitela na C5 protein. U određenim primerima izvođenja, antitela pronalaska se dobijaju iz miševa imunizovanih nativnim C5 proteinom pune dužine (pogledati, na primer, GenBank pristupni broj NP_001726.2) (SEQ ID NO: 355), ili sa DNK koja kodira protein ili njegov fragment. Alternativno, protein ili njegov fragment mogu biti proizvedeni upotrebom standardnih biohemijskih tehnika i potom modifikovani i upotrebljeni kao imunogen. U određenim primerima izvođenja pronalaska, imunogen je fragment C5 proteina koji je u opsegu aminokiselinskih ostataka od oko 19 - 1676 iz SEQ ID NO: 355.
[0071] U pojedinim primerima izvođenja, imunogen može biti rekombinantan C5 protein ili njegov fragment eksprimiran u L. coli ili u bilo kojoj drugoj eukariotskoj ili sisarskoj ćeliji kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO).
[0072] Upotrebom VELOCIMMUNE<®>tehnologije (pogledati, npr. US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE<®>) ili bilo kog drugog poznatog postupka za generisanje monoklonskih antitela, inicijalno se izoluju himerna antitela na C5 visokog afiniteta, sa humanim varijabilnim regionom i mišjim konstantnim regionom. VELOCIMMUNE<®>tehnologija uklјučuje generisanje transgenog miša sa genomom koji sadrži varijabilne regione humanih teških i lakih lanaca operativno povezanih sa endogenim lokusima mišjeg konstantnog regiona, tako da miš u odgovoru na antigenu stimulaciju proizvodi antitelo koje sadrži humani varijabilni region i mišji konstantan region. DNK koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela izoluje se i operativno povezuje sa DNK koja kodira konstantne regione teških i lakih lanaca čoveka. DNK se zatim eksprimira u ćeliji sposobnoj da eksprimira u potpunosti humano antitelo.
[0073] U principu, VELOCIMMUNE<®>miš se izlaže antigenu od interesa, a limfne ćelije (kao što su B-ćelije) izdvajaju se iz miševa koji eksprimiraju antitela. Limfne ćelije mogu biti fuzionisane sa mijelomskom ćelijskom linijom da bi se pripremile imortalizovane hibridomske ćelijske linije, a takve hibridomske ćelijske linije se podvrgavaju skriningu i selektuju da bi se identifikovale hibridomske
1
ćelijske linije koje proizvode antitela specifična za antigen od interesa. DNK koja kodira varijabilne regione teških lanaca i lakih lanaca može biti izolovana i povezana sa željenim izotipskim konstantnim regionima teških lanaca i lakih lanaca. Takav protein antitela može biti proizveden u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira himerna antitela specifična za antigen ili varijabilne domene lakih i teških lanaca može biti direktno izolovana iz limfocita specifičnih za antigen.
[0074] Na početku, izoluju se himerna antitela visokog afiniteta koja imaju humani varijabilni region i mišji konstantan region. Kao u eksperimentalnom delu koji je opisan u nastavku teksta, antitela se karakterišu i selektuju prema poželјnim karakteristikama, uklјučujući afinitet, selektivnost, epitop itd. Konstantan regioni miša se zamenjuju želјenim humanim konstantnim regionom, da bi se generisalo u potpunosti humano antitelo pronalaska, na primer IgG1 ili IgG4 divlјeg tipa ili onaj koji je modifikovan. Dok selektovan konstantni region može varirati u zavisnosti od specifične upotrebe, karakteristike vezivanja antigena sa visokim afinitetom i specifičnosti ciljanog delovanja potiču od varijabilnog regiona.
Biološki ekvivalenti
[0075] Anti-C5 antitela i fragmenti antitela koji su ovde opisani obuhvataju proteine sa aminokiselinskim sekvencama koje variraju od onih kod opisanih antitela, ali koji zadržavaju sposobnost da vezuju C5 protein. Takva varijantna antitela i fragmenti antitela sadrže jedno ili više od adicija, delecija ili supstitucija aminokiselina u poređenju sa matičnom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je suštinski ekvivalentna onoj za opisana antitela. Slično navedenom, ovde opisane DNK sekvence koje kodiraju antitela, obuhvataju sekvence koje sadrže jedno ili više od adicija, delecija ili supstitucija nukleotida u poređenju sa opisanom sekvencom, a koje kodiraju antitelo ili fragment antitela koji je suštinski biološki ekvivalentan antitelu ili fragmentu antitela koji su ovde opisani.
[0076] Dva proteina koja vezuju antigen, ili antitela, smatraju se biološki ekvivalentnima ukoliko su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija stopa i obim apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se daju u istoj molarnoj dozi, pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo u vidu jednokratne doze ili višestrukih doza. Pojedina antitela će se smatrati ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ukoliko su ekvivalentna po obimu svoje apsorpcije, ali ne i po stopi apsorpcije, a ipak mogu biti smatrana bioekvivalentnima, pošto su takve razlike u stopi apsorpcije namerne i odražavaju se u obeležavanju, a nisu od suštinskog značaja za postizanje efektivne koncentracije leka u telu prilikom, npr. hronične upotrebe, zbog čega se smatraju medicinski beznačajnima za određeni lekoviti proizvod koji se proučava.
[0077] U jednom primeru izvođenja, dva proteina koji vezuju antigen su bioekvivalentni ukoliko ne postoje klinički smislene razlike u njihovoj bezbednosti, čistoći ili potenciji.
[0078] U jednom primeru izvođenja, dva proteina koji vezuju antigen su bioekvivalentni ukoliko pacijent može jednom ili više puta biti prebačen između terapija referentnim proizvodom i biološkim proizvodom bez očekivanog porasta rizika od neželјenih efekata, uklјučujući klinički značajnu promenu imunogenosti, ili smanjenje efektivnosti, u poređenju sa nastavkom terapije bez takvog prebacivanja.
1
[0079] U jednom primeru izvođenja, dva proteina koji vezuju antigen su bioekvivalentni ukoliko oba deluju zajedničkim mehanizmom ili mehanizmima delovanja za stanje ili uslove upotrebe, u meri u kojoj su takvi mehanizmi poznati.
[0080] Biološka ekvivalencija može biti pokazana in vivo i/ili in vitro postupcima. Mere bioekvivalencije uklјučuju, npr. (a) in vivo test kod lјudi ili drugih sisara, u kome se koncentracija antitela ili njegovih metabolita meri u krvi, plazmi, serumu ili drugoj biološkoj tečnosti kao funkcija vremena; (b) in vitro test koji je u korelaciji sa i razumno predviđa in vivo podatke bioraspoloživosti kod ljudi; (c) in vivo test na lјudima ili drugim sisarima, u kome se odgovarajući akutan farmakološki efekat antitela (ili njegovog ciljnog molekula) meri kao funkcija vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje utvrđuje bezbednost, efikasnost ili biološku dostupnost ili biološku ekvivalentnost antitela.
[0081] Bioekvivalentne varijante antitela koja su ovde opisane mogu biti konsturisane, na primer, pravlјenjem raznih supstitucija ostataka ili sekvenci, ili delecijama terminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, cisteinski ostaci koji nisu neophodni za biološku aktivnost mogu biti uklonjeni delecijom ili zamenjeni drugim aminokiselinama, da bi se sprečilo obrazovanje nepotrebnih ili nepravilnih međumolekulskih disulfidnih mostova nakon renaturacije. U drugim kontekstima, bioekvivalentna antitela mogu uklјučivati varijante antitela koje sadrže aminokiselinske promene koje modifikuju karakteristike glikozilacije antitela, npr. mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikozilaciju.
Anti-C5 antitela koja sadrže Fc varijante
[0082] Prema određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, obezbeđena su anti-C5 antitela koja sadrže Fc domen koji sadrži jednu ili više mutacija koje pojačavaju ili značajno smanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr. na kiselom pH, u poređenju sa neutralnim pH. Na primer, predmetni pronalazak uklјučuje anti-C5 antitela koja sadrže mutaciju u CH2 ili CH3 regionu Fc domena, pri čemu mutacija(e) povećava(ju) afinitet Fc domena za FcRn u kiseloj sredini (npr. u endozomu gde je pH opsega od oko 5,5 do oko 6,0). Takve mutacije mogu dovesti do povećanja poluživota antitela u serumu kada se daju životinji. Neograničavajući primeri takvih modifikacija Fc uklјučuju, npr. modifikaciju na poziciji 250 (npr. E ili Q); 250 i 428 (npr. L ili F); 252 (npr. L/Y/F/W ili T), 254 (npr. S ili T) i 256 (npr. S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr. H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr. A, W, H, F ili Y [N434A, N434W, N434H, N434F ili N434Y]); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr. 308F, V308F) i 434. U jednom primeru izvođenja, modifikacija obuhvata modifikaciju 428L (npr. M428L) i 434S (npr. N434S); modifikaciju 428L, 259I (npr. V259I) i 308F (npr. V308F); modifikaciju 433K (npr. H433K) i 434 (npr. 434Y); modifikaciju 252, 254 i 256 (npr.252Y, 254T i 256E); modifikaciju 250Q i 428L (npr. T250Q i M428L); i modifikaciju 307 i/ili 308 (npr.308F ili 308P). U još jednom primeru izvođenja, modifikacija obuhvata modifikaciju 265A (npr. D265A) i/ili 297A (npr. N297A).
[0083] Na primer, predmetni pronalazak uklјučuje anti-C5 antitela koja sadrže Fc domen koji sadrži jedan ili više od parova ili grupa mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od: 250Q i 248L (npr. T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr. M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr. M428L i N434S); 257I i 3111 (npr. P257I i Q311I); 257I i 434H (npr. P257I i N434H); 376V i 434H (npr. D376V i N434H); 307A, 380A i 434A (npr. T307A, E380A i N434A); i 433K i 434F (npr. H433K i N434F). Sve moguće kombinacije
2
prethodno navedenih mutacija Fc domena i drugih mutacija unutar varijabilnih domena antitela koja su ovde opisana, smatraju se onima koje su uključene u obim predmetnog pronalaska.
[0084] Predmetni pronalazak takođe uklјučuje anti-C5 antitela koja sadrže himeran konstantan (CH) region teškog lanca, pri čemu himerni CHregion sadrži segmente izvedene iz CHregiona više od jednog imunoglobulinskog izotipa. Na primer, antitela pronalaska mogu sadržavati himerni CHregion koji sadrži deo ili sve od CH2 domena izvedenog iz molekula humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4, u kombinaciji sa delom ili celokupnim CH3 domenom izvedenim iz molekula humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Prema određenim primerima izvođenja, antitela pronalaska sadrže himerni CHregion koji ima himerni zglobni region. Na primer, himerni zglobni region može sadržavati aminokiselinsku sekvencu „gornjeg dela zglobnog regiona” (aminokiselinske ostatke od pozicija 216 do 227 prema EU numeraciji) izvedenu iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4, u kombinaciji sa sekvencom „donjeg dela zglobnog regiona” (aminokiselinski ostaci od pozicija 228 do 236 prema EU numeraciji) koja je izvedena iz zglobnog regiona humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4. Prema određenim primerima izvođenja, himerni zglobni region sadrži aminokiselinske ostatke izvedene iz gornjeg dela zglobnog regiona humanog IgG1 ili humanog IgG4 i aminokiselinske ostatke izvedene iz donjeg dela zglobnog regiona humanog IgG2. Antitelo koje sadrži himerni CHregion kao što je ovde opisano može, u određenim primerima izvođenja, ispoljavati modifikovane efektorske funkcije Fc bez štetnog uticaja na terapijske ili farmakokinetičke osobine antitela. (Pogledati, npr. U.S. Patent Application Publication 2014/0243504).
Biološke karakteristike antitela
[0085] U principu, antitela predmetnog pronalaska funkcionišu vezivanjem za C5 protein i sprečavanjem njegovog cepanje na C5a i C5b. Na primer, ovde opisana antitela i fragmenti antitela koji vezuju antigen mogu vezivati C5 protein (npr. na 25°C ili na 37°C) sa KDmanjom od 9nM, što se meri rezonancijom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 3. Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu vezivati C5 sa KDmanjom od oko 9nM, manjom od oko 5nM, manjom od oko 2nM, manjom od oko 1nM, manjom od oko 500 pM, manjom od 250 pM ili manjom od 100 pM, što se meri rezonancijom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 3 ili suštinski sličnog testa.
[0086] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu vezivati C5 protein sa disocijativnim poluživotom (t1⁄2) većim od oko 2 minuta, što se meri rezonancijom površinskog plazmona na 25°C, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 4 ili suštinski sličnog testa. Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu vezivati C5 protein sa t1⁄2 većim od oko 5 minuta, većim od oko 10 minuta, većim od oko 30 minuta, većim od oko 50 minuta, većim od oko 100 minuta, većim od oko 150 minuta, većim od oko 200 minuta ili većim od oko 250 minuta, što se meri rezonancijom površinskog plazmona na 25°C, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 3 (npr. formata sa mAt za hvatanje i antigenom za hvatanje) ili suštinski sličnog testa.
[0087] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu vezivati humani C5 protein sa disocijativnim poluživotom (t1⁄2) većim od oko 1,5 minuta, što se meri rezonancijom površinskog plazmona na 37°C, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 4, ili suštinski sličnog testa. Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu vezivati C5 protein sa t1⁄2 većim od oko 2 minuta, većim od oko 5 minuta, većim od oko 10 minuta, većim od oko 25 minuta, većim od oko 50 minuta, većim od oko 100 minuta, većim od oko 150 minuta ili većim od oko 200 minuta, što se meri rezonancijom površinskog plazmona na 37°C, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 3 (npr. formata sa mAt za hvatanje i antigenom za hvatanje) ili suštinski sličnog testa.
[0088] Antitela i fragmenti antitela koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu vezivati C5 protein majmuna (npr. na 25°C ili na 37°C) sa KDmanjom od 120nM, što se meri rezonancijom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 3. Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu vezivati C5 majmuna sa KDmanjom od oko 120nM, manjom od oko 100nM, manjom od oko 50nM, manjom od oko 25nM, manjom od oko 10nM, manjom od oko 5nM, manjom od oko 1nM, manjom od oko 500pM ili manjom od 250pM, što se meri rezonancijom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 3 ili suštinski sličnog testa.
[0089] Antitela i fragmenti antitela koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu vezivati modifikovan humani C5 protein sa R885H promenom (primer je SEQ ID NO: 356) sa KDmanjom od 70nM, što se meri rezonancijom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 3. Varijante C5 su pokazale slab odgovor na anti-C5 antitela koja su prethodno opisana u oblasti tehnike (npr. Nishimura i saradnici, 2014, New Engl. J. Med.370: 632-639). Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu vezivati modifikovan humani C5 sa KDmanjom od oko 65nM, manjom od oko 50nM, manjom od oko 20nM, manjom od oko 10nM, manjom od oko 5nM, manjom od oko 3nM ili manjom od 2nM, što se meri rezonancijom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 3 ili suštinski sličnog testa.
[0090] Antitela i fragmenti antitela koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu vezivati modifikovan humani C5 protein sa R885C promenom (primer je SEQ ID NO: 357) sa KDmanjom od 160nM, što se meri rezonancijom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 3. Varijante C5 su pokazale slab odgovor na anti-C5 antitela koja su prethodno opisana u oblasti tehnike (npr. Nishimura i saradnici, 2014, New Engl. J. Med.370: 632-639). Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu vezivati modifikovan humani C5 sa KDmanjom od oko 150nM, manjom od oko 100nM, manjom od oko 50nM, manjom od oko 20nM, manjom od oko 10nM, manjom od oko 5nM ili manjom od 2nM, što se meri rezonancijom površinskog plazmona, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 3 ili suštinski sličnog testa.
[0091] Antitela i fragmenti antitela koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu inhibirati citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) sa IC50manjim od 10nM, što se meri testom luminiscencije, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 6. Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu inhibirati CDC sa IC50manjim od oko 5nM, manjim od oko 3,5nM ili manjim od oko 2nM, što se meri B-ćelijskim testom luminiscencije, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 6 ili suštinski sličnog testa.
[0092] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu blokirati hemolizu klasičnim putem (CP) posredovanu humanim C5 za više od 94% i sa IC50manjim od 6nM, što se meri testom CP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8. Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu blokirati CP hemolizu sa IC50manjim od oko 6nM, manjim od oko 5nM, manjim od oko 4nM, manjim od oko 3nM ili manjim od oko 2nM, što se meri testom CP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8, ili suštinski sličnog testa.
[0093] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu blokirati hemolizu alternativnim putem (AP) posredovanu humanim C5 za više od 70% i sa IC50manjim od 165nM, što se meri testom AP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8. Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu blokirati AP hemolizu sa IC50manjim od oko 160nM, manjim od oko 150nM, manjim od oko 100nM, manjim od oko 50nM ili manjim od oko 20nM, što se meri testom AP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8, ili suštinski sličnog testa.
[0094] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu blokirati hemolizu klasičnim putem (CP) posredovanu sa C5 afričkog zelenog majmuna, za više od 40% i sa IC50manjim od 185nM, što se meri testom CP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8. Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu blokirati CP hemolizu sa IC50manjim od oko 180nM, manjim od oko 150nM, manjim od oko 100nM, manjim od oko 75nM ili manjim od oko 50nM, što se meri testom CP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8, ili suštinski sličnog testa.
[0095] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu blokirati hemolizu alternativnim putem (AP) posredovanu sa C5 afričkog zelenog majmuna, sa IC50manjim od 235nM, što se meri testom AP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8. Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu blokirati AP hemolizu sa IC50manjim od oko 200nM, manjim od oko 150nM, manjim od oko 100nM, manjim od oko 50nM ili manjim od oko 20nM, što se meri testom AP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8, ili suštinski sličnog testa.
[0096] Atitela i fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu blokirati više od 90% hemolize klasičnim putem (CP) posredovane sa C5 cinomolgus majmuna, sa IC50manjim od 145nM, što se meri testom CP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8. Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu blokirati CP hemolizu sa IC50manjim od oko 140nM, manjim od oko 120nM, manjim od oko 100nM, manjim od oko 75nM ili manjim od oko 50nM, što se meri testom CP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8, ili suštinski sličnog testa.
[0097] Atitela i fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu blokirati hemolizu alternativnim putem (AP) posredovane sa C5 cinomolgus majmuna, sa IC50manjim od 30nM, što se meri testom AP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8. Antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu blokirati AP hemolizu sa IC50manjim od oko 25nM, manjim od oko 20nM, manjim od oko 10nM, manjim od oko 5nM ili manjim od oko 2nM, što se meri testom AP hemolize, npr. upotrebom formata testa koji je kao što je ovde definisano u Primeru 8, ili suštinski sličnog testa.
[0098] Antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu pokazivati pobolјšane farmakokinetičke (PK) i farmakodinamičke (PD) osobine u poređenju sa anti-C5 antitelima iz oblasti tehnike. Ovde opisana anti-C5 antitela pokazuju manju podložnost klirensu posredovanom ciljnim molekulom nakon davanja, kao što je ovde prikazano u Primerima 9 i 10. Anti-C5 antitela i njihovi
2
fragmenti koji vezuju antigen mogu pokazivati koncentracije u serumu tokom produženih perioda od, npr. više od 20 dana, više od 25 dana, više od 30 dana, više od 35 dana, više od 40 dana, više od 45 dana, više od 50 dana, više od 55 dana ili više od 60 dana, kao što je opisano ovde u Primerima 9 i 10. Anti-C5 antitela mogu pokazivati produženi poluživot u serumu veći od 10 dana u poređenju sa anti-C5 antitelima iz oblasti tehnike.
[0099] Anti-C5 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu imati visok afinitet za humani C5 (npr. KDje manja od 0,3nM) i niži klirens (npr. ispoljavati produžen poluživot u serumu, pobolјšanu farmakodinamičku aktivnost tokom većeg broja dana u odnosu na prethodno poznata anti-C5 antitela). Takva antitela mogu imati prednost u upotrebi usled manje učestalog davanja subjektu sa bolešću ili poremećajem povezanim sa C5.
[0100] U jednom slučaju, predmetni opis se odnosi na izolovano rekombinantno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se specifično vezuju za C5 protein, pri čemu antitelo ili njegov fragment ispoljava jednu ili više od sledećih karakteristika: (a) u potpunosti je humano monoklonsko antitelo; (b) vezuje se za humani C5 sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 0,9nM na 25°C, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (c) vezuje se za humani C5 sa KDmanjom od 0,3nM na 37°C, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (d) ima koncentraciju u serumu veću od 10 µg/mL do 70. dana nakon davanja cinomolgus majmunu; (e) blokira CP i AP hemolizu do 35. dana nakon davanja cinomolgus majmunu, što se meri u testu hemolize ex vivo; (f) ima poluživot u serumu veći od 10 dana kod cinomolgus majmuna; (g) ima koncentraciju u serumu veću od 10 µg/mL do 40. dana nakon davanja miševima sa humanizovanim C5; (h) blokira CP hemolizu do 30. dana nakon davanja miševima sa humanizovanim C5, što se meri u testu hemolize ex vivo; i (i) ima poluživot u serumu veći od 10 dana kod miševa sa humanizovanim C5.
[0101] U jednom slučaju, predmetni opis se odnosi na izolovano rekombinantno antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se specifično vezuje za C5 protein, pri čemu antitelo ili njegov fragment ispoljava jednu ili više od sledećih karakteristika: (a) u potpunosti je humano monoklonsko antitelo; (b) vezuje se za humani C5 sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 0,9nM na 25°C, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (c) vezuje se za humani C5 sa KDmanjom od 0,3nM na 37°C, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (d) vezuje se za C5 majmuna sa KDmanjom od 65nM, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (e) vezuje se za varijantu R885H humanog C5 (SEQ ID NO: 356) sa KDmanjom od 0,5nM, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (f) vezuje se za varijantu R885C humanog C5 (SEQ ID NO: 357) sa KDmanjom od 0,5nM, što se meri u testu rezonancije površinskog plazmona; (g) blokira hemolizu klasičnim putem (CP) posredovanu humanim C5 za više od 95% i sa IC50manjim od 6nM, što se meri u testu CP hemolize; (h) blokira hemolizu alternativnim putem (AP) posredovanu sa humanim C5 za više od 70% i sa IC50manjim od 165nM, što se meri u testu AP hemolize; (i) inhibira CP hemolizu posredovanu sa C5 afričkog zelenog majmuna sa IC50manjim od 185nM, što se meri u testu CP hemolize; (j) inhibira AP hemolizu posredovanu sa C5 afričkog zelenog majmuna sa IC50manjim od 235nM, što se meri u testu AP hemolize; (k) inhibira CP hemolizu posredovanu sa C5 cinomolgus majmuna, sa IC50manjim od 145nM, što se meri u testu CP hemolize; i (1) inhibira AP hemolizu posredovanu sa C5 cinomolgus majmuna, sa IC50manjim od 30nM, što se meri u testu AP hemolize.
[0102] Ovde opisana antitela mogu posedovati jednu ili više od prethodno navedenih bioloških karakteristika ili bilo koju od njihovih kombinacija. Druge biološke karakteristike ovde opisanih antitela biće očigledne osobi sa prosečnim iskustvom iz oblasti tehnike nakon pregleda predmetnog opisa, uklјučujući radne Primere koji su ovde prikazani.
Mapiranje epitopa i srodne tehnologije
[0103] Predmetni pronalazak se odnosi na anti-C5 antitela koja interaguju sa jednom ili više aminokiselina koje se nalaze unutar jednog ili više regiona molekula C5 proteina, uklјučujući alfa polipeptid i beta polipeptid. Epitop za koji se antitela vezuju se može sastojati od jedne kontinuirane sekvence od 3 ili više (npr.3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina lociranih unutar bilo kog od prethodno navedenih domena molekula C5 proteina (npr. epitop u domenu je linearan). Alternativno, epitop se može sastojati od mnoštva nesusednih aminokiselina (ili aminokiselinskih sekvenci) lociranih unutar bilo jednog ili oba od prethodno navedenih domena proteinskog molekula (npr. epitop je konformacioni).
[0104] Razne tehnike, poznate osobama sa prosečnim iskustvom u oblasti tehnike, mogu biti upotrebljene da bi se utvrdilo da li antitelo „interaguje sa jednom ili više aminokiselina” unutar polipeptida ili proteina. Tehnike za primer uklјučuju, na primer, rutinske testove unakrsnog blokiranja, kao što je opisano u Antibodies, Harlow i Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Drugi postupci uklјučuju mutacionu analizu skeniranjem alanina, analizu peptidnih blotova (Reineke (2004) Methods Mol. Biol.248: 443-63), kristalografske studije analize cepanja peptida i NMR analizu. Dodatno, mogu biti upotrebljeni postupci kao što su ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer (2000) Prot. Sci.9: 487-496). Drugi postupak koji može biti upotrebljen za identifikaciju aminokiselina unutar polipeptida sa kojima antitelo interaguje je izmena tipa vodonik/deuterijum detektovana masenom spektrometrijom. Uopšteno govoreći, postupak izmene tipa vodonik/deuterijum uklјučuje obeležavanje deuterijumom proteina od interesa, nakon čega sledi vezivanje antitela za protein obeležen deuterijumom. Kompleks protein/antitelo se zatim prenosi u vodu i izmenlјivi protoni unutar aminokiselina koje su zaštićene kompleksom antitela podležu povratnoj izmeni deuterijuma sa vodonikom sa stopom izmene koja je niža nego kod protona koji se izmenjuju unutar aminokiselina koje nisu deo kontaktne površine. Rezultat navedenog je da aminokiseline koje obrazuju deo provršine kontakta protein/antitelo mogu zadržati deuterijum i stoga pokazuju relativno veću masu u poređenju sa aminokiselinama koje nisu uklјučene u površinu kontakta. Nakon disocijacije antitela, cilјni protein se podvrgava cepanju proteazama i analizi masenom spektrometrijom, čime se otkrivaju ostaci obeleženi deuterijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo interaguje. Pogledati, npr. Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen i Smith (2001) Anal. Chem.73: 256A-265A.
[0105] Termin „epitop” se odnosi na mesto na antigenu na koje odgovaraju B i/ili T ćelije. B-ćelijski epitopi mogu biti obrazovani i od susednih aminokiselina ili od nesusednih aminokiselina koje su blisko postavljene tako da su susedne jedna drugoj tercijarnim uvijanjem proteina. Epitopi obrazovani od susednih aminokiselina se obično zadržavaju prilikom izlaganja denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi obrazovani tercijarnim uvijanjem obično gube pri tretmanu sa denaturišućim rastvaračima. Epitop obično uklјučuje najmanje 3, a češće najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
[0106] Profilisanje uz pomoć modifikacija (MAP), takođe poznato kao Profilisanje antitela zasnovano na strukturi antigena (ASAP), postupak je koji kategoriše velike brojeve monoklonskih antitela (mAt)
2
usmerenih na isti antigen prema sličnostima profila vezivanja svakog antitela za hemijski ili enzimski modifikovane površine antigena (pogledati, US 2004/0101920). Svaka kategorija može odražavati jedinstveni epitop, bilo onaj koji je jasno različit od ili se delimično preklapa sa epitopom koji predstavlјa drugu kategoriju. Ova tehnologija omogućava brzo filtriranje genetički identičnih antitela, tako da karakterizacija može biti fokusirana na genetički jasno različita antitela. Kada se primeni na skrining hibridoma, MAP može olakšati identifikaciju retkih hibridomskih klonova koji proizvode mAt sa želјenim karakteristikama. MAP može biti upotrebljen za sortiranje antitela pronalaska u grupe antitela koja vezuju različite epitope.
[0107] Anti-C5 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji su ovde opisani, mogu vezivati epitop unutar bilo kog jednog ili više regiona C5 proteina prikazanih u vidu primera, bilo u prirodnom obliku, kao što je prikazano kroz primer u SEQ ID NO: 355, ili rekombinantno proizvedenih, ili za njihov fragment. Antitela mogu vezivati region koji sadrži jednu ili više aminokiselina izabranih iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci 19 - 1676 iz humanog C5 proteina.
[0108] Antitela mogu interagovati sa najmanje jednom aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka opsega od oko pozicije 19 do oko pozicije 750; ili aminokiselinskih ostataka opsega od oko pozicije 751 do oko pozicije 1676 u SEQ ID NO: 355.
[0109] Anti-C5 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen mogu interagovati sa jednim ili više epitopa koji se nalaze unutar alfa i/ili beta lanca C5 (SEQ ID NO: 359). Epitop(i) se može(gu) sastojati od jedne ili više uzastopnih sekvenci od 3 ili više (npr.3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina lociranih unutar alfa lanca i/ili beta lanca C5. Alternativno, epitop se može sastojati od mnoštva nesusednih aminokiselina (ili aminokiselinskih sekvenci) lociranih unutar C5. Kao što je prikazano u Primeru 11, epitop u C5 sa kojim antitelo pronalaska H4H12166P interaguje definisan je sa: (i) aminokiselinskom sekvencom NMATGMDSW (SEQ ID NO: 360) koja odgovara aminokiselinama 591 do 599 sadržanim u beta lancu SEQ ID NO: 359; i (ii) aminokiselinskom sekvencom WEVHLVPRRKQLQFALPDSL (SEQ ID NO: 361), koja odgovara aminokiselinama 775 do 794 sadržanim u alfa lancu SEQ ID NO: 359. Shodno navedenom, anti-C5 antitela mogu interagovati sa jednom ili više aminokiselina sadržanih u regionu koji se sastoji od (i) aminokiselinske sekvence NMATGMDSW (SEQ ID NO: 360), koja odgovara aminokiselinama 591 do 599 u SEQ ID NO: 359; i (ii) aminokiselinske sekvence WEVHLVPRRKQLQFALPDSL (SEQ ID NO: 361), koja odgovara aminokiselinama 775 do 794 u SEQ ID NO: 359.
[0110] Predmetni opis uklјučuje anti-C5 antitela koja se vezuju za isti epitop, ili deo epitopa, kao što je to slučaj sa bilo kojim od specifičnih antitela za primer navedenih u Tabeli 1. Slično navedenom, predmetni opis takođe uklјučuje anti-C5 antitela ili njihov fragment koja stupaju u kompeticiju vezivanja za C5 protein sa bilo kojim od specifičnih antitela za primer navedenih u vidu liste u Tabeli 1. Na primer, anti-C5 antitela koja su međusobno u kompeticiji vezivanja za C5 protein sa jednim ili više antitela navedena su u Tabeli 1.
[0111] Lako može biti utvrđeno da li se antitelo vezuje za isti epitop kao, ili je u kompeticiji vezivanja sa referentnim anti-C5 antitelom, upotrebom rutinskih postupaka poznatih u oblasti tehnike. Na primer, da bi se utvrdilo da li se ispitivano antitelo vezuje za isti epitop kao referentno anti-C5 antitelo, referentnom antitelu se dozvolјava da se veže za C5 protein ili peptid u uslovima zasićenja. Procenjuje se zatim sposobnost ispitivanog antitela da se veže za molekul C5 proteina. Ukoliko je ispitivano antitelo u stanju da se veže za C5 nakon vezivanja referentnog anti-C5 antitela u uslovima zasićenja,
2
može se zaklјučiti da se ispitivano antitelo vezuje za različit epitop u odnosu na epitop referentnog anti-C5 antitela. S druge strane, ukoliko ispitivano antitelo nije u stanju da se veže za C5 protein nakon vezivanja referentnog anti-C5 antitela u uslovima zasićenja, onda se ispitivano antitelo može vezivati za isti epitop kao epitop za koji je vezano referentno anti-C5 antitelo.
[0112] Da bi se utvrdilo da li je antitelo u kompeticiji vezivanja sa referentnim anti-C5 antitelom, vrši se prethodno opisana metodologija vezivanja u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentnom antitelu se dozvolјava da se veže za C5 protein u uslovima zasićenja, nakon čega sledi procena vezivanja ispitivanog antitela za molekul C5. U drugoj orijentaciji, ispitivanom antitelu se dozvolјava da se veže za C5 molekul u uslovima zasićenja, nakon čega sledi procena vezivanja referentnog antitela za C5 molekul. Ukoliko je, u obe orijentacije, samo prvo (u zasićenju) antitelo sposobno da se veže za molekul C5, onda se zaklјučuje da su ispitivano antitelo i referentno antitelo u kompeticiji vezivanje za C5. Prosečno iskusnom stručnjaku iz oblasti tehnike je ipak potrebno napomenuti da se antitelo koje je u kompeticiji vezivanja sa referentnim antitelom ne mora nužno vezivati za identičan epitop kao referentno antitelo, već da može sterno blokirati vezivanje referentnog antitela svojim vezivanjem za preklapajući ili susedni epitop.
[0113] Dva antitela se vezuju za isti ili preklapajući epitop ukoliko svako kompetitivno inhibira (blokira) vezivanje drugog za antigen. Preciznije, 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-struki višak jednog antitela inhibira vezivanje drugog za najmanje 50%, ali poželјno 75%, 90% ili čak 99%, što se meri u testu kompetitivnog vezivanju (pogledati, npr. Junghans i saradnici, Cancer Res. 199050:1495-1502). Alternativno, dva antitela imaju isti epitop ukoliko suštinski sve mutacije aminokiselina u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela, smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Dva antitela imaju preklapajuće epitope ukoliko pojedine aminokiselinske mutacije, koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela, smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog.
[0114] Dodatno rutinsko eksperimentisanje (npr. mutacija peptida i analize vezivanja) može biti zatim sprovedeno, da bi se potvrdilo da li je uočeni nedostatak vezivanja ispitivanog antitela u stvari posledica vezivanja za isti epitop kao kod referentnog antitela ili je po sredi sterno blokiranje (ili neki drugi fenomen) koje je odgovorno za nedostatak uočenog vezivanja. Eksperimenti ove vrste mogu biti izvedeni upotrebom ELISA, RIA testova, rezonancije površinskog plazmona, protočne citometrije ili bilo kog drugog kvantitativnog ili kvalitativnog testa vezivanja antitela koji je dostupan u oblasti tehnike.
Imunokonj ugati
[0115] Pronalazak obuhvata humano anti-C5 monoklonsko antitelo konjugovano sa terapijskim ostatkom („imunokonjugat”), za lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa C5 (npr. atipičnog hemolitičko-uremijskog sindroma). Kao što se ovde upotrebljava, termin „imunokonjugat” se odnosi na antitelo koje je hemijski ili biološki povezano sa radioaktivnim agensom, citokinom, interferonom, ciljnim ili reporterskim ostatkom, enzimom, peptidom ili proteinom ili terapijskim agensom. Antitelo može biti povezano sa radioaktivnim agensom, citokinom, interferonom, cilјnim ili reporterskim ostatkom, enzimom, peptidom ili terapijskim agensom na bilo kojoj poziciji duž molekula, sve dok je on u stanju da se vezuje za svoj ciljni molekul. Primeri imunokonjugata uklјučuju konjugate antitela sa lekovima i fuzione proteine antitela i toksina. Agens može biti drugo različito antitelo na C5 protein. Vrsta terapijskog ostatka koji može biti konjugovan sa anti-C5 antitelom uzimaće u obzir stanje koje
2
se leči i želјeni terapijski efekat koji je potrebno postići. Primeri pogodnih agenasa za obrazovanje imunokonjugata su poznati u oblasti tehnike; pogledati, na primer, WO 05/103081.
Multispecifična antitela
[0116] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična ili multispecifična. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog cilјnog polipeptida ili mogu sadržavati domene za vezivanje antigena koji su specifični za više od jednog cilјnog polipeptida. Pogledati, npr. Tutt i saradnici, 1991, J. Immunol.147:60-69; Kufer i saradnici, 2004, Trends Biotechnol.
22:238-244.
[0117] Bilo koji od multispecifičnih molekula pronalaska koji vezuju antigen, ili njihove varijante, mogu biti konstruisani upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije (npr. tehnologijom ekspresije rekombinantnih DNK i proteina), što će biti poznato prosečno iskusnom stručnjaku iz oblasti tehnike.
[0118] Antitela specifična za C5 mogu biti generisana u bispecifičnom formatu (biti „bispecifična”), u kome su varijabilni regioni koji se vezuju za različite domene C5 proteina povezani zajedno tako da obezbeđuju specifičnost za dvojne domene unutar jednog vezujućeg molekula. Odgovarajuće dizajnirane bispecifičnosti mogu pojačati ukupnu inhibitornu efikasnost C5 proteina kroz povećanje kako specifičnosti, tako i aviditeta vezivanja. Varijabilni regioni sa specifičnostima za pojedinačne domene (npr. segmenti N-terminalnog domena), ili oni koji se mogu vezati za različite regione unutar jednog domena, upareni su u okviru strukturne mreže koja omogućava da se svaki region istovremeno vezuje za razdvojene epitope ili za različite regione unutar jednog domena. U jednom primeru za bispecifične varijabilne regione teških lanaca (VH), vezujući element sa specifičnošću za jedan domen rekombinuje se sa varijabilnim regionima lakih lanaca (VL) iz serije vezujućih elemenata sa specifičnošću za drugi domen, da bi se identifikovali nesrodni VLpartneri koji mogu biti upareni sa originalnim VHbez narušavanja prvobitne specifičnosti za taj VH. Na ovaj način, jedan VLsegment (npr. VL1) može biti kombinovan sa dva različita VHdomena (npr. VH1 i VH2) da bi se generisala bispecifičnost koja se sastoji od dva vezujuća „kraka” (VH1- VL1 i VH2- VL1). Upotreba jednog VLsegmenta smanjuje složenost sistema i time pojednostavlјuje i povećava efikasnost u procesima kloniranja, ekspresije i prečišćavanja koji se upotrebljavaju za generisanje bispecifičnosti (pogledati, na primer, USSN13/022759 i US2010/0331527).
[0119] Alternativno, antitela koja vezuju više od jednog domena i drugi ciljni molekul, kao što je, ali ne ograničavajući se na, na primer, drugo različito anti-C5 antitelo, mogu biti pripremana u bispecifičnom formatu upotrebom tehnika koje su ovde opisane, ili drugih tehnika poznatih stručnjacima iz oblasti tehnike. Varijabilni regioni antitela koji se vezuju za jasno različite regione mogu biti povezani zajedno sa varijabilnim regionima koji se vezuju za relevantna mesta na, na primer, vanćelijskom domenu C5, da bi se obezbedila dvojna specifičnost za antigen unutar jednog vezujućeg molekula. Odgovarajuće dizajnirane bispecifičnosti ove prirode imaju dvostruku funkciju. Varijabilni regioni sa specifičnošću za vanćelijski domen se kombinuju sa varijabilnim regionom sa specifičnošću izvan vanćelijskog domena i uparuju se u okviru strukturne mreže koja omogućava svakom varijabilnom regionu da se veže za odvojene antigene.
[0120] Format bispecifičnog antitela za primer koji može biti upotrebljen u kontekstu predmetnog pronalaska uklјučuje upotrebu prvog imunoglobulinskog (Ig) CH3 domena i drugog Ig CH3 domena, pri
2
čemu se prvi i drugi Ig CH3 domeni razlikuju jedan od drugog u najmanje jednoj aminokiselini i pri čemu razlika od najmanje jedne aminokiseline smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela za Protein A u poređenju sa bispecifičnim antitelom kome nedostaje aminokiselinska razlika. U jednom primeru izvođenja, prvi Ig CH3 domen vezuje protein A, a drugi Ig CH3 domen sadrži mutaciju koja smanjuje ili ukida vezivanje za Protein A, kao što je modifikacija H95R (prema IMGT numeraciji egzona; H435R prema EU numeraciji). Drugi CH3 može dalјe sadržavati modifikaciju Y96F (prema IMGT; Y436F prema EU). Dodatne modifikacije koje se mogu naći unutar drugog CH3 uklјučuju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M i V82I (prema IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M i V422I prema EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N i V82I (IMGT; N384S, K392N i V422I prema EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q i V82I (prema IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q i V422I prema EU) u slučaju IgG4 antitela. Varijacije formata bispecifičnih antitela koje su prethodno opisane smatraju se onima koje su uključene u obim predmetnog pronalaska.
[0121] Drugi bispecifični formati za primer koji mogu biti upotrebljeni u kontekstu predmetnog pronalaska uklјučuju, bez ograničenja, npr. bispecifične formate zasnovane na scFv ili formate diatela, fuzije IgG-scFv, dualni varijabilni domen (DVD)-Ig, kvadrom, antitela tipa „dugme-u-rupicu”, format tipa uobičajenog lakog lanca (npr. uobičajeni laki lanac tipa „dugme-u-rupicu” itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED)antitela, leucinski rajsfešlus, Duobody, IgG1/IgG2, Fab (DAF)-IgG sa dvostrukim dejstvom i Mab<2>bispecifične formate (za pregled prethodno navedenih formata pogledati, npr. Klein i saradnici, 2012, mAbs 4:6, 1-11, i reference koje su u njemu citirane). Bispecifična antitela mogu takođe biti konstruisana upotrebom konjugacije peptida/nukleinskih kiselina, npr. gde se aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi sa ortogonalnom hemijskom reaktivnošću koriste za generisanje konjugata antitelo-oligonukleotid koji su specifični za mesto, a koji se zatim udružuju sami sa sobom u multimerne komplekse sa definisanim sastavom, valentnošću i geometrijom. (Pogledati, npr. Kazane i saradnici, J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4. decembar, 2012]).
Terapijska davanja i formulacije
[0122] Pronalazak obezbeđuje terapijske kompozicije koje sadrže anti-C5 antitela predmetnog pronalaska ili njihove fragmente koji vezuju antigen. Terapijske kompozicije u skladu sa pronalaskom biće davane sa pogodnim nosačima, ekscipijensima i drugim agensima koji se ugrađuju u formulacije da bi se obezbedili pobolјšani transfer, isporuka, tolerancija i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može biti pronađeno u priručniku poznatom svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uklјučuju, na primer, prahove, paste, masti, želee, voskove, ulјa, lipide, vezikule koje sadrže lipid (katjonski ili anjonski) (kao što je LIPOFECTIN<™>), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije tipa ulјe-u-vodi i voda-u-ulјu, carbowax emulzije (polietilen glikole raznih molekulskih težina), polučvrste gelove i polučvrste smeše koje sadrže carbowax. Pogledati takođe Powell i saradnici, „Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
[0123] Doza antitela može varirati u zavisnosti od starosti i veličine subjekta kome se daje, bolesti, stanja na koje se ciljano deluje, načina davanja i sličnog. Kada se antitelo predmetnog pronalaska upotrebljava za lečenje bolesti ili poremećaja kod odraslog pacijenta, ili za prevenciju takve bolesti, poželјno je da se antitelo predmetnog pronalaska normalno daje u jednoj dozi od oko 0,1 do oko 100 mg/kg telesne težine, poželјnije oko 5 do oko 80, oko 10 do oko 70 ili oko 20 do oko 50 mg/kg telesne
2
težine. U zavisnosti od ozbiljnosti stanja, učestalost i trajanje lečenja mogu biti prilagođeni. U određenim primerima izvođenja, antitelo pronalaska, ili njegov fragment koji vezuje antigen, mogu biti dati u početnoj dozi od najmanje oko 0,1 mg do oko 800 mg, oko 1 do oko 600 mg, oko 5 do oko 500 mg ili oko 10 mg do oko 400 mg. U određenim primerima izvođenja, početna doza može biti praćena davanjem druge ili mnoštva narednih doza antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, u količini koja može biti približno ista ili manja od one koja je početna doza, pri čemu su naredne doze razdvojene periodom od najmanje jednog dana do 3 dana; najmanje nedelјu dana, najmanje 2 nedelјe; najmanje 3 nedelјe; najmanje 4 nedelјe; najmanje 5 nedelјa; najmanje 6 nedelјa; najmanje 7 nedelјa; najmanje 8 nedelјa; najmanje 9 nedelјa; najmanje 10 nedelјa; najmanje 12 nedelјa; ili najmanje 14 nedelјa.
[0124] Poznati su razni sistemi za isporuku koji mogu biti upotrebljeni za davanje farmaceutske kompozicije pronalaska, npr. inkapsulacija u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimiraju mutantne viruse, endocitoza posredovana receptorom (pogledati, npr. Wu i saradnici (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Postupci uvođenja uklјučuju, ali nisu ograničeni na, intradermalne, transdermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, subkutane, intranazalne, epiduralne i oralne puteve davanja. Kompozicija može biti data na bilo koji pogodan način, na primer, infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutane ovojnice (npr. kroz oralnu sluzokožu, rektalnu i crevnu sluzokožu itd.), a mogu biti date i zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Davanje može biti sistemsko ili lokalno. Farmaceutska kompozicija takođe može biti isporučena u vezikuli, posebno u lipozomu (pogledati, npr. Langer (1990) Science 249:1527-1533).
[0125] Ovde se takođe razmatra upotreba nanočestica za isporuku antitela predmetnog pronalaska. Nanočestice konjugovane antitelima mogu biti upotrebljene i za terapijske i za dijagnostičke primene. Nanočestice konjugovane antitelima i postupci njihove pripreme i upotrebe detalјno su opisani u Arruebo M. i saradnici, 2009 („Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" u J. Nanomat. Volume 2009, ID članka 439389, 24 strane, doi: 10.1155/2009/439389). Nanočestice mogu biti razvijene i konjugovane sa antitelima sadržanim u farmaceutskim kompozicijama, da bi se ciljano delovalo na ćelije. Nanočestice za isporuku lekova takođe su opisane u, na primer, US 8257740 ili US 8246995, od kojih je svaki ovde uključen u svojoj celosti.
[0126] U određenim situacijama, farmaceutska kompozicija može biti isporučena putem sistema za kontrolisano oslobađanje. Može biti upotrebljena pumpa. Mogu biti upotrebljeni polimerni materijali. Sistem za kontrolisano oslobađanje može biti postavljen u neposrednu blizinu mesta na koje kompozicija ciljano deluje, što zahteva time samo deo sistemske doze.
[0127] Preparati za injeciranje mogu uklјučivati dozne oblike za intravenska, subkutana, intrakutana, intrakranijalna, intraperitonealna i intramuskularna injeciranja, infuzije u kapima itd. Ovi preparati za injeciranje mogu biti pripremljeni postupcima koje su javno poznati. Na primer, preparati za injeciranja mogu biti pripremljeni, npr. rastvaranjem, resuspendovanjem ili emulgovanjem prethodno opisanog antitela ili njegove soli u sterilnom vodenom medijumu ili ulјanom medijumu koji se uobičajeno i koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije postoje, na primer, fiziološki rastvor, izotoničan rastvor koji sadrži glukozu i drugi pomoćni agensi itd. koji mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa odgovarajućim agensima za rastvaranje kao što su alkohol (npr. etanol), polialkohol (npr. propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr. polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilenski (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulјa)] itd. Kao ulјani medijum koristi se npr. susamovo ulјe, sojino ulјe itd. koji mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa agensom za rastvaranje kao što je benzil benzoat, benzil alkohol itd. Poželjno je da se ovako pripremlјenom injekcijom ispuni odgovarajuća ampula.
[0128] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može biti isporučena subkutano ili intravenski, upotrebom standardne igle i šprica. Dodatno, u pogledu subkutane isporuke, uređaj za isporuku tipa olovke lako nalazi primenu u isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Takav uređaj za isporuku tipa olovke može biti za višekratnu ili jednokratnu upotrebu. Uređaj za isporuku tipa olovke za višekratnu upotrebu generalno koristi zamenlјivi kertridž koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Jednom kada je celokupna farmaceutska kompozicija unutar kertridža data i kertridž je prazan, prazan kertridž lako može biti odbačen i zamenjen sa novim kertridžom koji sadrži farmaceutsku kompoziciju. Uređaj za isporuku tipa olovke se tada može ponovo koristiti. U uređaju za isporuku tipa olovke za jednokratnu upotrebu, ne postoji zamenlјivi kertridž. Umesto toga, uređaj za isporuku tipa olovke za jednokratnu upotrebu dolazi unapred napunjen farmaceutskom kompozicijom koja se nalazi u rezervoaru unutar uređaja. Jednom kada se rezervoar isprazni i nema više farmaceutske kompozicije, celokupan uređaj se odbacuje.
[0129] Brojni uređaji za isporuku tipa olovke i autoinjektori za višekratnu upotrebu imaju primenu u subkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Primeri uklјučuju, ali svakako nisu ograničeni na AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Švajcarska), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Danska), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Danska), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ i OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Nemačka), da spomenemo samo neke. Primeri uređaja za isporuku tipa olovke za jednokratnu upotrebu koji imaju primenu u subkutanoj isporuci farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska uklјučuju, ali svakako nisu ograničeni na SOLOSTAR™ pen (Sanofi-Aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ autoinjektor (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Nemačka), EPIPEN (Dey, L.P.) i HUMIRA ™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park, IL), da spomenemo samo neke.
[0130] Prednost zapravo predstavlja činjenica da se prethodno opisane farmaceutske kompozicije za oralnu ili parenteralnu upotrebu pripremaju kao dozni oblici u jediničnoj dozi podešeni tako da mogu biti uklopljeni sa dozom aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jediničnoj dozi uklјučuju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije itd. Količina sadržanog antitela je generalno oko 5 do oko 500 mg po jediničnom doznom obliku; posebno u obliku za injekcije, poželјno je da se antitelo nalazi u oko 5 do oko 300 mg i u oko 10 do oko 300 mg za druge dozne oblike.
Terapijske upotrebe antitela
[0131] Аntitela koja su ovde opisana korisna su za lečenje i/ili prevenciju bolesti ili poremećaja ili stanja povezanih sa C5 i/ili za ublažavanje najmanje jednog simptoma udruženog sa takvom bolešću, poremećajem ili stanjem. Ovde opisano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen mogu biti davani u terapijskoj dozi pacijentu sa bolešću ili poremećajem ili stanjem povezanim sa C5.
1
[0132] U određenim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska su korisna u lečenju ili prevenciji simptoma ili indikacija atipičnog hemolitičko-uremijskog sindroma (aHUS). Simptomi i indikacije aHUS uklјučuju, ali nisu ograničeni na, aktivaciju trombocita, hemolizu, sistemsku trombotičku mikroangiopatiju (obrazovanje krvnih ugrušaka u malim krvnim sudovima po celom telu) što dovodi do moždanog udara, srčanog udara, otkazivanja bubrega i/ili smrti, renalne bolesti završnog stadijuma, trajnog oštećenja bubrega, bola u stomaku, konfuzije, edema, umora, mučnine/povraćanja, dijareje i mikroangiopatske anemije.
[0133] U određenim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska su korisna u lečenju ili prevenciji simptoma ili indikacija paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH). Simptomi i indikacije PNH uklјučuju, ali nisu ograničeni na, uništavanje crvenih krvnih ćelija, trombozu (uklјučujući duboku vensku trombozu, plućnu emboliju), intravaskularnu hemolitičku anemiju, promenu boje urina u crvenu, simptome anemije kao što su umor, kratak dah i palpitacije, bol u stomaku i otežano gutanje.
[0134] U određenim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska su korisna za lečenje ili prevenciju najmanje jednog simptoma ili indikacije bolesti ili poremećaja povezanog sa C5 koji su izabrani iz grupe koju čine neurološki poremećaji, poremećaji bubrega, multipla skleroza, moždani udar, Giljеn Bаrеоv sindrom, traumatska povreda mozga, Parkinsonova bolest, poremećaj neodgovarajuće ili nepoželјne aktivacije sistema komplementa, komplikacije hemodijalize, hiperakutno odbacivanje alotransplantata, odbacivanje ksenotransplantata, toksičnost indukovana interleukinom-2 tokom terapije sa IL-2, inflamatorni poremećaji, inflamacija u autoimunoj bolesti, Kronova bolest, sindrom respiratornog distresa kod odraslih, termička povreda uključujući opekotine ili promrzline, reperfuziona stanja nakon ishemije, infarkt miokarda, sindrom kapilarnog curenja, gojaznost, dijabetes, Alchajmerova bolest, šizofrenija, moždani udar, epilepsija, ateroskleroza, vaskulitis, bulozni pemfigoid, C3 glomerulopatija, membranski proliferativni glomerulonefritis, balonska angioplastika, sindrom indukovan ugradnjom pumpe kod kardiopulmonarnog bajpasa ili renalnog bajpasa, hemodijaliza, renalna ishemija, reperfuzija mezenterične arterije nakon rekonstrukcije aorte, infektivna bolest ili sepsa, poremećaji imunskog kompleksa i autoimune bolesti, dijabetska nefropatija, Alportov sindrom, progresivna bubrežna insuficijencija, proteinurijska bolest bubrega, renalna ishemijsko-reperfuziona povreda, lupusni nefritis, glomerulopatija, reumatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus (SLE), SLE nefritis, membransko proliferativni nefritis, hemolitička anemija, neuromijelitis optičkog nerva, renalni transplantat, naledna deficijencija CD59, psorijaza i mijastenija gravis. Antitela koja su ovde opisana mogu biti korisna za lečenje ili prevenciju najmanje jednog simptoma ili indikacije bolesti ili poremećaja povezanog sa C5 koji su izabrani iz grupe koju čine bolest i poremećaji pluća kao što su dispnea, hemoptiza, ARDS, astma, hronična opstruktivna bolest pluća (HOBP), emfizem, plućna embolija i infarkti, upala pluća, bolesti fibrogene prašine, povrede usled inertnih prašina i minerala (npr. silicijuma, uglјene prašine, berilijuma i azbesta), plućna fibroza, bolesti organske prašine, hemijske povrede (usled iritirajućih gasova i hemikalija, npr. delovanja hlora, fosgena, sumpor dioksida, vodonik sulfida, azot dioksida, amonijaka i hlorovodonične kiseline), povreda od dima, termička povreda (npr. opekotina, promrzlina), astma, alergija, bronhokonstrikcija, pneumonitis preosetlјivosti, parazitske bolesti, Gudpastureov sindrom, plućni vaskulitis, nasledni angioedem i inflamacija povezana sa imunskim kompleksima.
[0135] Ovde opisana antitela mogu biti korisna za lečenje subjekata koji boluju od očne bolesti kao što je starosna makularna degeneracija (AMD), dijabetski makularni edem (DME), dijabetska retinopatija, očna angiogeneza (očna neovaskularizacija koja utiče na tkivo sudovnjače, rožnjače ili mrežnjače),
2
geografska atrofija (GA), uveitis i optički neuromijelitis. Antitela predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljene za lečenje ili ublažavanje najmanje jednog simptoma ili indikacije suvog ili vlažnog AMD. Ovde opisana antitela mogu biti korisna u prevenciji ili usporavanju stope gubitka vida. U jednom primeru izvođenja, antitela predmetnog pronalaska su korisna u smanjenju drusena u oku subjekta sa suvim AMD. U jednom primeru izvođenja, antitela predmetnog pronalaska su korisna u sprečavanju ili smanjenju/usporavanju gubitka vida kod subjekta sa AMD.
[0136] Jedno ili više od ovde opisanih antitela može biti dato da bi se olakšala ili sprečila ili smanjila ozbiljnost jednog ili više simptoma ili stanja/indikacija očne bolesti ili poremećaja. Antitela mogu biti upotrebljena za ublažavanje ili smanjenje ozbilјnosti najmanje jednog simptoma uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, gubitak vida, izobličenje vida, poteškoću u prilagođavanju niskim nivoima svetlosti, iskrivljenja centralnog vida, povećanje zamućenosti centralnog/ukupnog vida, prisustvo drusena (sićušnih nakupina vanćelijskog materijala koje se stvaraju na mrežnjači), pigmentne promene, izobličen vid tipa metamorfopsije, u kojoj mreža pravih linija deluje talasasto, a delovi mreže mogu izgledati prazni, eksudativne promene (krvarenja u oku, čvrsti eksudati, subretinalna/sub-RPE/intraretinalna tečnost), spor oporavak vizuelne funkcije nakon izlaganja jakom svetlu (fotostresni test), incipijentna i geografska atrofija, drastično opadanje oštrine vida (za dva nivoa ili više), npr.
20/20 do 20/80, preferencijalne promene hiperakuitetne perimetrije (za vlažnu AMD), zamaglјen vid, postepeni gubitak centralnog vida (za one sa makularnom degeneracijom koja nije eksudativna, brz početak gubitka vida (često prouzrokovan curenjem i krvarenjem abnormalnih krvnih sudova kod subjekata sa eksudativnom makularnom degeneracijom, centralni skotomi (senke ili nedostajuća područja vida), problemi u razlikovanju boja, posebno tamnih od tamnih i svetlih od svetlih predmeta, gubitak kontrastne osetlјivosti, prave linije izgledaju zakrivlјene u Amslerovoj mreži.
[0137] Ovde se takođe razmatra upotreba jednog ili više od opisanih antitela u profilaktičke svrhe kod subjekata koji su sa rizikom da razviju makularnu degeneraciju, kao što su subjekti stariji od 50 godina, subjekti sa porodičnom istorijom makularne degeneracije, pušači i subjekti sa gojaznošću, visokim holesterolom, kardiovaskularnom bolešću ili na nezdravoj ishrani.
[0138] Predmetna antitela mogu biti upotrebljena za pripremu farmaceutske kompozicije ili medikamenta za lečenje pacijenata koji boluju od bolesti ili poremećaja povezanog sa C5. Predmetna antitela mogu biti upotrebljena kao pomoćna terapija sa bilo kojim drugim agensom ili bilo kojom drugom terapijom poznatom stručnjacima iz oblasti koja je korisna za lečenje ili ublažavanje bolesti ili poremećaja povezanog sa C5.
Kombinovane terapije
[0139] Kombinovane terapije mogu uklјučivati anti-C5 antitelo pronalaska i bilo koji dodatni terapijski agens koji je poželjno kombinovati sa antitelom pronalaska ili sa biološki aktivnim fragmentom antitela pronalaska. Antitela predmetnog pronalaska se mogu sinergistički kombinovati sa jednim ili više lekova ili terapija koji se upotrebljavaju za lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa C5. U pojedinim primerima izvođenja, antitela pronalaska se mogu kombinovati sa drugim terapijskim agensom da bi se ublažio jedan ili više simptoma navedene bolesti.
[0140] U zavisnosti od bolesti ili poremećaja povezanog sa C5, antitela predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljena u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, antikoagulans (npr. varfarin, aspirin, heparin, fenindion, fondaparinuks, idraparinuks i inhibitore trombina kao što su argatroban, lepirudin, bivalirudin ili dabigatran) antiinflamatorni lek (npr. kortikosteroidi i nesteroidni anti-inflamatorni lekovi), antihipertenziv (npr. inhibitor enzima koji konvertuje angiotenzin), imunosupresivni agens (npr. vinkristin, ciklosporin A ili metotreksat), fibrinolitički agens (npr. ankrod, ε-aminokaproična kiselina, antiplazmini, prostaciklin i defibrotid), agens za snižavanje lipida kao što je inhibitor hidroksimetilglutaril CoA reduktaze, anti-CD20 agens kao što je rituksimab, anti-TNF agens kao što je infliksimab, antiepileptik (npr. magnezijum sulfat), C3 inhibitor ili antitrombotički agens.
[0141] U određenim primerima izvođenja, drugi terapijski agens je drugo antitelo na C5 protein. Ovde se razmatra i upotreba kombinacije („koktela”) antitela sa širokom neutrališućom ili inhibitornom aktivnošću na C5. U pojedinim primerima izvođenja, antitela koja ne stupaju u kompeticiju se mogu kombinovati i davati subjektu kome je to potrebno. U pojedinim primerima izvođenja, antitela koja sadrže kombinaciju vezuju se na proteinu za jasno različite epitope koji se ne preklapaju. Antitela koja sadrže kombinaciju mogu blokirati vezivanje C5 za C5 konvertazu i/ili mogu sprečiti/inhibirati cepanje C5 na C5a i C5b. U određenim primerima izvođenja, drugo antitelo može imati duži poluživot u serumu čoveka.
[0142] Kao što se ovde upotrebljava, izraz „u kombinaciji sa” označava da se dodatna terapijski aktivna komponenta(e) može primeniti pre, istovremeno sa ili nakon davanja anti-C5 antitela predmetnog pronalaska. Termin „u kombinaciji sa” takođe uklјučuje sekvencijalno ili istovremeno davanje anti-C5 antitela i drugog terapijskog agensa.
[0143] Dodatna terapijski aktivna komponenta(e) može biti data subjektu pre davanja anti-C5 antitela predmetnog pronalaska. Na primer, može se smatrati da je prva komponenta data „pre” druge komponente ukoliko je prva komponenta data nedelјu dana pre, 72 sata pre, 60 sati pre, 48 sati pre, 36 sati pre, 24 sata pre, 12 sati pre, 6 sati pre, 5 sati pre, 4 sata pre, 3 sata pre, 2 sata pre, 1 sat pre, 30 minuta pre, 15 minuta pre, 10 minuta pre, 5 minuta pre ili manje od 1 minuta pre davanja druge komponente. U drugim primerima izvođenja, dodatna terapijski aktivna komponenta(e) može biti data subjektu nakon davanja anti-C5 antitela predmetnog pronalaska. Na primer, može se smatrati da je prva komponenta data „nakon” druge komponente ukoliko se prva komponenta daje 1 minut nakon, 5 minuta nakon, 10 minuta nakon, 15 minuta nakon, 30 minuta nakon, 1 sat nakon, 2 sata nakon, 3 sata nakon, 4 sata nakon, 5 sati nakon, 6 sati nakon, 12 sati nakon, 24 sata nakon, 36 sati nakon, 48 sati nakon, 60 sati nakon, 72 sata nakon davanja druge komponente. U još drugim primerima izvođenja, dodatna terapijski aktivna komponenta(e) može biti data subjektu istovremeno sa davanjem anti-C5 antitela predmetnog pronalaska. „Istovremeno” davanje, za potrebe predmetnog pronalaska, uklјučuje, npr. davanje anti-C5 antitela i dodatne terapijski aktivne komponente subjektu u jednom doznom obliku ili u odvojenim doznim oblicima koji se daju subjektu jedan u odnosu na drugog unutar perioda oko 30 minuta ili manje. Ukoliko se daju u odvojenim doznim oblicima, svaki dozni oblik može biti dat istim putem davanja (npr. i anti-C5 antitelo i dodatna terapijski aktivna komponenta mogu biti dati intravenski itd.); alternativno, svaki dozni oblik može biti dat drugačijim putem davanja (npr. anti-C5 antitelo može biti dato intravenski, a dodatna terapijski aktivna komponenta može biti data oralno). U svakom slučaju, za potrebe predmetnog opisa, svaki od tipova davanja komponenti, kao što su u jednom doznom obliku, u odvojenim doznim oblicima istim putem davanja ili u odvojenim doznim oblicima različitim putevima davanja, smatraju se „istovremenim davanjem. Za potrebe ovog opisa, davanje anti-C5 antitela „pre”, „istovremeno sa” ili „nakon” (kako
4
su ti termini ovde prethodno definisani) davanja dodatne terapijski aktivne komponente, smatra se davanjem anti-C5 antitela „u kombinaciji sa” dodatnom terapijski aktivnom komponentom.
[0144] Predmetni pronalazak uklјučuje farmaceutske kompozicije u kojima je anti-C5 antitelo predmetnog pronalaska koformulisano sa jednom ili sa više dodatnih terapijski aktivnih komponenti, kao što je ovde opisano na drugim mestima.
Režimi davanja
[0145] Pojedinačna doza ovde opisanog anti-C5 antitela (ili farmaceutske kompozicije koja sadrži kombinaciju anti-C5 antitela i bilo kog od dodatnih terapijski aktivnih agenasa koji su ovde pomenuti) može biti data subjektu kome je to potrebno. Višestruke doze anti-C5 antitela (ili farmaceutske kompozicije koja sadrži kombinaciju anti-C5 antitela i bilo kog od dodatnih terapijski aktivnih agenasa koji su ovde pomenuti) mogu biti date subjektu tokom definisanog vremenskog perioda. Postupci prema ovom aspektu obuhvataju sekvencijalno davanje subjektu višestrukih doza anti-C5 antitela koje je ovde opisano. Kao što se ovde upotrebljava, „sekvencijalno davanje” označava da se svaka doza anti-C5 antitela daje subjektu u različitoj vremenskoj tački, npr. različitim danima koji su razdvojeni unapred određenim intervalom (npr. satima, danima, nedelјama ili mesecima). Predmetni opis uklјučuje postupke koje obuhvataju sekvencijalno davanje pacijentu jedne inicijalne doze anti-C5 antitela, nakon čega slede jedna ili više sekundarnih doza anti-C5 antitela, a opciono navedeno može biti praćeno i sa jednom ili više tercijarnih doza anti-C5 antitela.
[0146] Termini „početna doza”, „sekundarne doze” i „tercijarne doze” odnose se na vremensku sekvencu davanja anti-C5 antitela koje je ovde opisano. Prema tome, „početna doza” je doza koja se daje na početku režima lečenja (takođe se naziva „osnovna doza”); „sekundarne doze” su doze koje se daju nakon početne doze; a „tercijarne doze” su doze koje se daju nakon sekundarnih doza. Sve od početne, sekundarnih i tercijarnih doza mogu sadržavati istu količinu anti-C5 antitela, ali se generalno mogu i razlikovati jedna od druge u pogledu učestalosti davanja. Prema određenim aspektima, međutim, količina anti-C5 antitela sadržana u početnim, sekundarnim i/ili tercijarnim dozama varira u jednima u odnosu na druge (npr. prilagođava se naviše ili naniže prema potrebi) tokom trajanja tretmana. Prema određenim aspektima, dve ili više (npr.2, 3, 4, ili 5) doza daju se na početku režima lečenja u vidu „udarnih doza”, nakon kojih slede naredne doze koje se daju sa manjom učestalošću (npr. „doze održavanja”).
[0147] Svaka sekundarna i/ili tercijarna doza može biti data 1 do 48 sati (npr. 1, 11⁄2, 2, 21⁄2, 3, 31⁄2, 4, 41⁄2, 5, 51⁄2, 6, 61⁄2, 7, 71⁄2, 8, 81⁄2, 9, 91⁄2, 10, 101⁄2, 11, 111⁄2, 12, 121⁄2 13, 131⁄2, 14, 141⁄2, 15, 151⁄2, 16, 161⁄2, 17, 171⁄2, 18, 181⁄2, 19, 191⁄2, 20, 201⁄2, 21, 211⁄2, 22, 221⁄2, 23, 231⁄2, 24, 241⁄2, 25, 251⁄2, 26, 261⁄2 ili više) nakon doze koja je data neposredno pre. Fraza „neposredno prethodna doza”, kako se ovde upotrebljava, označava, u nizu višestrukih davanja, dozu anti-C5 antitela koja se daje pacijentu pre davanja neposredno sledeće doze u nizu, bez doza između (intervenirajućih doza).
[0148] Postupci prema ovom aspektu mogu obuhvatati davanje pacijentu bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijarnih doza anti-C5 antitela. Na primer, prema određenim aspektima, pacijentu se daje samo jedna sekundarna doza. Prema drugim aspektima, pacijentu se daju dve ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) sekundarnih doza. Slično navedenom, prema određenim aspektima, pacijentu se daje samo jedna tercijarna doza. Prema drugim aspektima, pacijentu se daju dve ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) tercijarnih doza.
[0149] Učestalost kojom se sekundarne i/ili tercijarne doze daju pacijentu može varirati tokom trajanja režima lečenja. Učestalost davanja takođe može biti podešena tokom trajanja lečenja od strane lekara, u zavisnosti od potreba svakog pojedinačnog pacijenta nakon kliničkog pregleda.
Dijagnostičke upotrebe antitela
[0150] Anti-C5 antitela predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljena za detekciju i/ili merenje C5 u uzorku, npr. u dijagnostičke svrhe. Pojedini aspekti razmatraju upotrebu jednog ili više antitela predmetnog pronalaska u testovima za detekciju bolesti ili poremećaja povezanog sa C5. Primeri dijagnostičkih testova za C5 mogu obuhvatati, npr. dovođenje uzorka, dobijenog iz pacijenta, u kontakt sa anti-C5 antitelom pronalaska, pri čemu je anti-C5 antitelo obeleženo obeleživačem ili reporterskim molekulom koji se može detektovati ili se upotrebljava kao ligand za hvatanje, a da bi se selektivno izolovao C5 iz uzoraka pacijenata. Alternativno, neobeleženo anti-C5 antitelo može biti upotrebljeno u dijagnostičkim primenama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo po sebi obeleženo signalom koji se može detektovati. Obeleživač ili reporterski molekul koji se može detektovati može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,<32>P,<35>S ili<125>I; fluorescentni ili hemiluminiscentni ostatak kao što je fluorescein izotiocijanat ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, peroksidaza rena ili luciferaza. Specifični testovi za primer koji mogu biti upotrebljeni za detekciju ili merenje C5 u uzorku uklјučuju imunosorbentni test povezan sa enzimom (ELISA), radioimunoesej (RIA) i sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS).
[0151] Uzorci koji mogu biti upotrebljeni u dijagnostičkim testovima za C5 uklјučuju bilo koji uzorak tkiva ili tečnosti koji može biti dobijen iz pacijenta, a koji sadrži detektabilne količine bilo C5 proteina, ili njegovih fragmenata, u normalnim ili patološkim stanjima. U principu, nivoi C5 proteina u određenom uzorku dobijenom iz zdravog pacijenta (npr. pacijenta koji nije oboleo od bolesti povezane sa C5) biće izmeren da bi se inicijalno utvrdio bazalni ili standardni nivo C5. Ovaj bazalni nivo C5 može zatim biti upoređen sa nivoima C5 izmerenim u uzorcima dobijenim iz osoba za koje se sumnja da imaju stanje povezano sa C5 ili simptome povezane sa takvim stanjem.
[0152] Antitela specifična za C5 protein ne moraju sadržavati dodatne obeleživače ili ostatke, ili mogu sadržavati obeleživače ili ostatke na N-kraju ili C-kraju. Prema jednom aspektu, obeleživač ili ostatak je biotin. U testu vezivanja, lokacija obeleživača (ukoliko je prisutan) može odrediti orijentaciju peptida u odnosu na površinu za koju je peptid vezan. Na primer, ukoliko je površina obložena avidinom, peptid koji sadrži N-terminalni biotin biće orijentisan tako da će C-terminalni deo peptida biti distalno od površine.
PRIMERI
[0153] Primeri koji slede su ilustrativni i ne ograničavaju obim patentnih zahteva.
Primer 1: Generisanje humanih antitela na protein faktora 5 (C5) sistema komplementa
[0154] Humana antitela na C5 protein su generisana u VELOCIMMUNE<®>mišu koji je sadržavao DNK koja kodira varijabilne regione humanih imunoglobulinskih teških i kapa lakih lanaca. Miševi su imunizovani humanim C5 proteinom prečišćenim iz seruma (Calbiochem, kat. br.20-4888).
[0155] Imunski odgovor antitelima bio je praćen imunskim testom specifičnim za C5. Kada je postignut želјeni imunski odgovor, splenociti su prikuplјeni i fuzionisani su sa mišjim mijelomskim ćelijama, da bi se sačuvala njihova vijabilnost i obrazovale hibridomske ćelijske linije. Hibridomske ćelijske linije su podvrgnute skriningu i selektovane su da bi se identifikovale ćelijske linije koje proizvode antitela specifična za C5. Ćelijske linije su bile upotrebljene za dobijanje nekoliko himernih anti-C5 antitela (tj. antitela koja poseduju humane varijabilne domene i mišje konstantne domene); antitela za primer koja su generisana na ovaj način označena su kao H2M11683N i H2M11686N.
[0156] Anti-C5 antitela su takođe izolovana direktno iz mišjih B ćelija pozitivnih na antigen bez fuzije sa ćelijama mijeloma, kao što je opisano u U.S. Patent 7582298. Upotrebom ovog postupka, dobijeno je nekoliko u potpunosti humanih anti-C5 antitela (tj. antitela koja poseduju humane varijabilne domene i humane konstantne domene); antitela za primer koja su generisana na ovaj način označena su kao H4H12159P, H4H12161P, H4H12163P, H4H12164P, H4H12166P, H4H12167P, H4H12168P, H4H12169P, H4H12170P, H4H12171P, H4H12175P, H4H12176P2, H4H12177P2 i H4H12183P2.
[0157] Biološke osobine antitela za primer generisanih u skladu sa postupcima ovog Primera detalјno su opisana u Primerima koji su navedeni u nastavku teksta.
Primer 2: Aminokiselinske i nukleotidne sekvence varijabilnih regiona teških i lakih lanaca
[0158] Tabela 1 prikazuje identifikatore aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona teških i lakih lanaca i CDR odabranih anti-C5 antitela koja su kao što je ovde opisano.
Tabela 1: Identifikatori aminokiselinskih sekvenci
[0159] Odgovarajući identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina su navedeni u Tabeli 2.
Tabela 2: Identifikatori sekvenci nukleinskih kiselina
[0160] Antitela se ovde obično označavaju prema sledećoj nomenklaturi: prefiks je Fc (npr. „H4H”, „H2M” itd.), praćen je numeričkim identifikatorom (npr. „11686”, „12166”, „12183” itd. kao što je prikazano u Tabeli 2), nakon koga sledi sufiks „P”, „P2” ili „N”. Prema tome, u skladu sa ovom nomenklaturom, antitelo ovde može biti označeno kao, npr. „H2M11686N”, „H4H12183P2”, „H4H12168P” itd. U okviru oznaka antitela, prefiksi H4H i H2M koji se ovde upotrebljavaju, ukazuju na određeni Fc region izotipa antitela. Na primer, „H4H” antitelo ima Fc humanog IgG4 koji sadrži mutaciju serina u prolin u zglobnom regionu (S108P) da bi se pospešila stabilizacija dimera, dok „H2M” antitelo ima Fc mišjeg IgG2 (a ili b izotipa) (svi varijabilni regioni su u potpunosti humani, kao što je naznačeno prvim 'H' u oznaci antitela). Kao što će proceniti osoba sa prosečnim iskustvom iz oblasti tehnike, antitelo koje ima određeni Fc izotip može biti konvertovano u antitelo sa različitim Fc izotipom (npr. antitelo sa Fc mišjeg IgG1 može biti konvertovano u antitelo sa humanim IgG4 itd.), ali u svakom slučaju, varijabilni domeni (uklјučujući CDR) - koji su označeni numeričkim identifikatorima prikazanim u Tabeli 2 - ostaće isti, a očekuje se i da će osobine vezivanja za antigen biti identične ili suštinski slične bez obzira na prirodu Fc domena.
[0161] U određenim primerima izvođenja, izabrana antitela sa Fc mišjeg IgG1 su konvertovana u antitela sa Fc humanog IgG4. U jednom primeru izvođenja, Fc domen IgG4 sadrži 2 ili više promena aminokiselina, kao što je opisano u US20100331527.
[0162] Da bi se generisala mutirana antitela, razni ostaci u regionima koji određuju komplementarnost (CDR) u H4H12166P mutirani su u histidin, da bi se generisalo 9 mutiranih antitela, identifikovanih kao H4H12166P2 do H4H12166P10. Pokazano je da mutacije histidina u CDR obezbeđuju vezivanje za cilјni antigen koje zavisi od pH, što dovodi do pobolјšane farmakokinetike (Igawa i saradnici, 2010, Nat. Biotechnol.28: 1203-1207).
Kontrolni konstrukti upotrebljeni u Primerima koji slede
[0163] Kontrolni konstrukti koji slede (anti-C5 antitela) uklјučeni su u eksperimente koji su ovde opisani, u komparativne svrhe: „Komparator 1”, monoklonsko antitelo na humani C5 koje ima VH/VLsekvence antitela „h5G1.1” prema US Patent No. 6,355,245 (Alexion Pharmaceuticals, Inc.); i „Komparator 2”, humano monoklonsko antitelo na humani C5 koje ima VH/VLsekvence antitela „8109” prema US Patent Application Publication No.2013/0022615 (Novartis).
Primer 3: Vezivanje antitela za C5 utvrđeno rezonancijom površinskog plazmona
[0164] Ravnotežne konstante disocijacije (KDvrednosti) vezivanja C5 za prečišćena anti-C5 antitela utvrđivane su upotrebom biosenzorskog testa rezonancije površinskog plazmona u realnom vremenu na Biacore T200 instrumentu. Površina Biacore senzora je derivatizovana aminskim kuplovanjem sa monoklonskim mišjim anti-humanim Fc antitelom (GE Healthcare, kat. br. BR-1008-39), da bi se uhvatila anti-C5 antitela eksprimirana sa humanim Fc konstantnim regionima. Biacore studije vezivanja su rađene u HBST puferu za propuštanje kroz kolonu (0,01M HEPES pH 7,4, 0,15M NaCl, 3mM EDTA, 0,05% v/v Surfaktant P20). Humani C5 je dobijen iz komercijalnog izvora (EMD). Ostali C5 reagensi su eksprimirani sa C-terminalnim myc-myc-heksahistidinskim tagom (označenim potom kao C5-mmh). Humani C5-mmh reagensi su takođe eksprimirani tako da sadrže histidinske i cisteinske tačkaste mutacije na argininu 885 (označenih potom kao C5 R885H-mmh i C5 R885C-mmh, tim redom). Različite koncentracije humanog C5, humanog R885H-mmh C5 (SEQ ID No: 356), humanog R885C-mmh C5 (SEQ ID No: 357) i C5-mmh majmuna (SEQ ID No: 358) (opsega od 100 nM do 1,23 nM, trostruka razblaženja) pripremane su u HBST puferu za protok, nakon čega a su injecirane preko površine na kojoj je bio „uhvaćeno” anti-C5 antitelo, uz brzinu protoka od 30 µL/min. Udruživanje svih C5 reagensa sa svakim od uhvaćenih monoklonskih antitela praćeno je tokom 3 minuta, a njihova disocijacija u HBST puferu za protok je praćena tokom 8 minuta. Svi eksperimenti kinetike vezivanja izvođeni su bilo na 25°C ili 37°C. Konstante stope kinetičke asocijacije (ka) i disocijacije (kd) su određivane uklapanjem senzorgrama u realnom vremenu u model vezivanja tipa 1:1, upotrebom Scrubber 2.0c softvera za uklapanje u krivu. Ravnotežne konstante disocijacije vezivanja (KD) i disocijativni poluživoti (t1⁄2) izračunavani su iz konstanti kinetičkih stopa kao: KD(M) = kd/kai t1⁄2 (min) = ln2/(60×kd)
[0165] Kinetički parametri vezivanja za vezivanje humanog C5 za anti-C5 antitela na 25°C i 37°C, prikazani su u Tabelama 3 i 4.
Tabela 3: Parametri kinetika vezivanja anti-C5 monoklonskih antitela koja se vezuju za humani C5 na 25°C
4
Tabela 4: Parametri kinetika vezivanja anti-C5 monoklonskih antitela koja se vezuju za humani C5 na 37°C
[0166] Vezivanje C5-mmh majmuna za anti-C5 antitela na 25°C i 37°C prikazano je u Tabelama 5 i 6.
Tabela 5: Parametri kinetika vezivanja anti-C5 monoklonskih antitela koja se vezuju za C5-mmh majmuna na 25°C
4
Tabela 6: Parametri kinetika vezivanja anti-C5 monoklonskih antitela koja se vezuju za C5-mmh majmuna na 37°C
[0167] Vezivanja humanog C5 R885H-mmh i humanog C5 R885C-mmh za anti-C5 antitela na 25°C prikazani su u Tabelama 7 i 8, tim redom.
Tabela 7: Parametri kinetika vezivanja anti-C5 monoklonskih antitela koja se vezuju za humani R885H-mmh C5 na 25°C
Tabela 8: Parametri kinetika vezivanja anti-C5 monoklonskih antitela koja se vezuju za humani R885C-mmh C5 na 25°C
4
[0168] Vezivanje humanog C5 R885H-mmh i humanog C5 R885C-mmh za anti-C5 antitela na 37°C prikazani su u Tabelama 9 i 10, tim redom.
Tabela 9: Parametri kinetika vezivanja anti-C5 monoklonskih antitela koja se vezuju za humani R885H-mmh C5 na 37°C
4
Tabela 10: Parametri kinetika vezivanja anti-C5 monoklonskih antitela koja se vezuju za humani R885C-mmh C5 na 37°C
[0169] Na 25°C, svih 25 anti-C5 antitela pronalaska, kao i anti-C5 antitela koja su ovde opisana, vezala su se za humani C5 sa KDvrednostima opsega od 73 pM do 8,4nM, kao što je prikazano u Tabeli 3. Na 37°C, anti-C5 antitela pronalaska i anti-C5 antitela koja su ovde opisana, vezala su se za humani C5 sa KDvrednostima opsega od 103pM do 18,5nM, kao što je prikazano u Tabeli 4. Na 25°C, 25 od 25 ispitivanih anti-C5 antitela pronalaska i anti-C5 antitela koja su ovde opisana, vezalo se za C5-mmh majmuna sa KDvrednostima opsega od 133 pM do 64nM, kao što je prikazano u Tabeli 5. Na 37°C, 25 od 25 ispitivanih anti-C5 antitela pronalaska i anti-C5 antitela koja su ovde opisana, vezalo se za C5-mmh majmuna sa KDvrednostima opsega od 133pM do 118nM, kao što je prikazano u Tabeli 6. Na 25°C, 16 od 16 ispitivanih anti-C5 antitela pronalaska i anti-C5 antitela koja su ovde opisana, vezalo se humani R885H-mmh C5 sa KDvrednostima opsega od 147 pM do 10,9nM, kao što je prikazano u Tabeli 7. Na 25°C, 16 od 16 ispitivanih anti-C5 antitela pronalaska i anti-C5 antitela koja su ovde opisana, vezalo se za humani R885C-mmh C5 sa KDvrednostima opsega od 251 pM do 190nM, kao što je prikazano u Tabeli 8. Na 37°C, 16 od 16 ispitivanih anti-C5 antitela pronalaska i anti-C5 antitela koja su ovde opisana, vezalo se za humani R885H-mmh C5 sa KDvrednostima opsega od 1,49nM do 69,4nM, kao što je prikazano u Tabeli 9. Na 25°C, 16 od 16 ispitivanih anti-C5 antitela pronalaska i anti-C5 antitela koja su ovde opisana, vezalo se za humani R885C-mmh C5 sa KDvrednostima opsega od 1,74nM do 159nM, kao što je prikazano u Tabeli 10.
4
Primer 4: Vezivanje antitela za C5 na različitim pH
[0170] Efekat pH na stopu disocijacije rekombinantnog humanog C5 vezanog za prečišćena anti-C5 monoklonska antitela određivan je upotrebom biosenzorskog testa rezonancije površinskog plazmona u realnom vremenu na Biacore T200 instrumentu. Površina Biacore senzora je najpre derivatizovana aminskim kuplovanjem sa monoklonskim mišjim anti-humanim Fc antitelom (GE, kat. br. BR-1008-39) da bi se uhvatila anti-C5 antitela eksprimirana sa humanim IgG4 Fc. Sve Biacore studije vezivanja su rađene upotrebom dva pufera za protok kroz kolonu, PBS-T, pH7,4 (0,01M Na2HPO4/NaH2PO4, 0,15M NaCl, 0,05% v/v Tween-20, podešenog na pH7,4) i PBS-T, pH6,0 (0,01M Na2HPO4/NaH2PO4, 0,15M NaCl, 0,05% v/v Tween-20, podešenog na pH 6,0). Različite koncentracije humanog C5 (EMD, kat. br.
204888) ili C5.mmh majmuna (pripremlјenog u PBS-T, pH7,4 puferu za protok (opsega od 100nM do 11,11nM, trostruka razblaženja) injecirane su tokom 3 minuta preko anti-C5 monoklonskog antitela uhvaćenog na površinu, uz brzinu protoka od 50μL/min, a njihova disocijacija u dva pufera za protok, PBS-T, pH7,4 i PBS-T, pH6,0 praćena je tokom 6 minuta. Svi ekperimenti kinetika vezivanja su rađeni na 25°C i 37°C. Kinetička konstanta disocijacije (kd) je određivana uklapanjem senzorgrama u realnom vremenu u model vezivanja od 1:1, upotrebom softvera za uklapanje u krive, Scrubber 2.0c. Disocijativni poluživoti vezivanja (t1⁄2) su izračunavani iz kdkao:
[0171] Odnosi poluživota prilikom vezivanja humanog C5 za različita anti-C5 monoklonska antitela na 25°C i 37°C u dva pufera za protok kroz kolonu, PBS-T, pH7,4 i PBS-T, pH6,0, prikazani su u Tabelama 11 i 12.
Tabela 11: Odnosi poluživota za odabrana anti-C5 antitela na humani C5 na 25°C
4
Tabela 12: Odnosi poluživota za odabrana anti-C5 antitela na humani C5 na 37°C
4
[0172] Odnosi poluživota prilikom vezivanja C5 majmuna za različita anti-C5 monoklonska antitela na 25°C i 37°C u dva pufera za protok kroz kolonu, PBS-T, pH7,4 i PBS-T, pH6,0, prikazani su u Tabelama 13 i 14.
Tabela 13: Odnosi poluživota za odabrana anti-C5 antitela na C5 majmuna na 25°C
Tabela 14: Odnosi poluživota za odabrana anti-C5 antitela na C5 majmuna na 37°C
[0173] Kao što je prikazano u Tabelama 11-14, odabrana anti-C5 antitela su pokazala vezivanje zavisno od pH, što se vidi iz odnosa t1⁄2.
Primer 5: Unakrsna kompeticija između anti-C5 antitela izmerena na Octet biosenzoru
[0174] Kompeticija vezivanja između anti-C5 monoklonskih antitela (mAt) utvrđivana je upotrebom interferometrijskog testa u biosloju bez obeleživača u realnom vremenu, na biosenzoru Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Celokupan eksperiment je izvođen na 25°C u 0,01 M HEPES pH7,4, 0,15M NaCl, 0,05% v/v surfaktanta Tween-20, 0,1mg/mL BSA (Octet HBS-P pufer), uz trešenje na ploči pri brzini od 1000 obrt/min. Da bi se procenilo da li su 2 antitela u stanju da budu u kompeticiji jedno sa drugim u pogledu vezivanja za njihove odgovarajuće epitope na humanom C5 (hC5 je prečišćen iz plazme, EMD), oko 1,5 nm anti-humanog C5 mAt je najpre uhvaćeno na vrhove Octet biosenzora obloženog anti-hFc antitelom (Pall ForteBio Corp., kat. br. 18-5060) potapanjem vrhova na 3 minuta u bunariće koji su sadržavali 50 µg/mL rastvora anti-humanog C5 mAt (označenih potom kao mAt1). Vrhovi biosenzora sa uhvaćenim antitelom su dalje podvrgnuti zasićenju sa blokirajućim H4H izotipskim kontrolnim mAt (označenim potom kao blokirajuće mAt), uranjanjem u bunariće koji su sadržavali 200 µg/mL rastvora blokirajućih mAt tokom 4 minuta. Nakon toga, vrhovi biosenzora su uranjani tokom 4 minuta u bunariće koji su sadržavali rastvor sa kokompleksima 50nM hC5 i 1 µM drugog anti-humanog C5 mAt (označenog potom kao mAt2), koji je bio prethodno inkubiran tokom 2 sata. Vrhovi biosenzora su ispirani u Octet HBS-P puferu između svakog koraka eksperimenta. Odgovor vezivanja u realnom vremenu je praćen tokom trajanja eksperimenta, a odgovor vezivanja je beležen na kraju svakog
1
koraka. Odgovor u vidu vezivanja humanog C5 koji je prethodno obrazovao komplekse sa mAt2 za mAt1, korigovan je u odnosu na pozadinsko vezivanje, pa je izvršeno poređenje i utvrđeno je kompetitivno/nekompetitivno ponašanje različitih anti-C5 monoklonskih antitela.
[0175] Tabela 15 eksplicitno definiše odnose antitela koja su u kompeticiji u oba smera, nezavisno od redosleda vezivanja.
Tabela 15: Unakrsna kompeticija između parova odabranih anti-C5 antitela
Primer 6: Inhibicija citotoksičnosti zavisne od komplementa posredovane sa CS u B-ćelijskom biološkom testu
[0176] Ovaj Primer opisuje biološki test za ispitivanje uloge C5, upotrebom anti-CD20 antitela u klasičnom putu aktivacije komplementa. Pokazano je da terapijska anti-CD20 antitela na antigen CD20 sa ćelijske površine koji je specifičan za B-ćelije, dovodi do CDC B-ćelija (Glennie i saradnici, 2007, Mol. Immunol.44: 3823-3837), a CDC test sa upotrebom ćelijskih linija koje eksprimiraju CD20 je prethodno opisan (Flieger i saradnici, 2000, Cell. Immunol.204: 55-63). Daudi ćelije, humana B-ćelijska linija koja eksprimira CD20, dopunjavale su očuvani serum ili serum sa osiromašenim sadržajem C5 sa egzogenim C5 varijantama i anti-CD20 antitelom (antitelo koje sadrži VH/VL „2F2” iz US Patent 8,529,902) i upotrebljene su za procenu uloge aktivnosti C5 u CDC.
[0177] Za CDC biološki test sa C5, Daudi ćelije su zasejavane na ploče za ispitivanje sa 96 bunarića, u gustini od 10.000 ćelija/bunariću, bilo u RPMI koji je sadržavao 10% FBS, penicilin/streptomicin, L-glutamin, natrijum piruvat i ne-esencijalne aminokiseline (kompletan RPMI medijum) ili RPMI koji je sadržavao 1% BSA, penicilin/streptomicin i L-glutamin (RPMI/BSA). Svi testovi za ispitivanje mutiranih anti-hC5 antitela zajedno sa ispitivanjem antitela koja nisu bila mutirana, upotrebom humanog seruma koji je sadržavao C5, ispitivana su u kompletnom RPMI medijumu, dok su testovi za ispitivanje antitela
2
koja nisu bila mutirana koja su ispitivana sa serumom afričkog zelenog majmuna i humanim C5 varijantama, rađeni u RPMI/BSA medijumu. Da bi se izmerio CDC sa humanim ili majmunskim serumom, anti-CD20 antitelo je razblaživano u odnosu 1:3 polazeći od 100nM do 2pM (uklјučujući kontrolni uzorak koji nije sadržavao antitelo), nakon čega je rastvor inkubiran sa ćelijama tokom 10 minuta na 25°C i potom je dodavano 1,66% seruma ili 1,66% seruma sa osiromašenim sadržajem C5 i 6,6nM C5 varijantnih proteina. Količina C5 proteina koja je dodavana serumu sa osiromašenim sadržajem C5 bila je zasnovana na prijavlјenoj vrednosti koncentracije C5 u humanom serumu od 0,37 uM (Rawal i saradnici, 2008, J. Biol. Chem. 283: 7853-7863). Da bi se ispitala inhibicija CDC sa C5 antitelima, C5 antitela su razblaživano u odnosu 1:3, od 100nM do 2pM (uklјučujući kontrolni uzorak koji nije sadržavao antitelo) i inkubirana su zatim sa 1,66% seruma ili 1,66% seruma sa osiromašenim sadržajem C5 i 6,6nM C5 varijantnih proteina, tokom 30 minuta. Deset minuta pre dodavanja antitela sa serumom u ćelije, anti-CD20 antitelo je dodato u ćelije u koncetracijama od 1nM, 2nM, 3nM, 3,5nM, 7nM, 10nM ili 30nM. Po završetku inkubacije sa anti-CD20 antitelom, ćelijama je dodata smeša antitelo/serum. Citotoksičnost je merena nakon 3,5 sata inkubacije na 37 °C i u 5% CO2, pa je usledila inkubacija od 15 minuta na 25°C i dodavanje CytoTox-Glo<™>reagensa (Promega, kat. br. G9292). CytoTox-Glo<™>je reagens zasnovan na luminiscenciji koji meri ubijanje ćelija, tako da se uočava povećana luminiscencija sa povećanom citotoksičnošću (izmerenom u relativnim svetlosnim jedinicama, RLU). Netretirane ćelije u kontrolnim bunarićima bile su lizirane tretmanom sa digitoninom odmah nakon dodavanja CytoTox-Glo<™>reagensa, da bi se utvrdila maksimalna vrednost ubijanja ćelija. Luminescencija ploča je zatim očitavana upotrebom Victor X instrumenta (Perkin Elmer), 15 minuta nakon dodavanja CytoTox-Glo<™>. Kada je računat, procenat citotoksičnosti je izračunavan sa vrednostima RLU, upotrebom sledeće jednačine:
↔ (Ćelijska liza u eksperimentu - Ćelijska liza u pozadini) % Citotoksičnosti = 100
(Maksimalna ćelijska liza - Ćelijska liza u pozadini)
[0178] U ovoj jednačini „ćelijska liza u pozadini” je luminiscencija poreklom od ćelija tretiranih samo medijumom i serumom bez bilo kakvih anti-CD20 antitela, dok je „maksimalna ćelijska liza” luminiscencija poreklom od ćelija tretiranih digitoninom. Rezultati, izraženi kao % citotoksičnosti ili RLU, analizirani su upotrebom nelinearne regresije (4-parametarske log analize) sa softverom Prism 5 (GraphPad), da bi se dobile EC50i IC50vrednosti. Inhibicija antitela je izračunavana tako da inhibicija od 0 - 100% predstavlja opseg inhibicije za koncentracije anti-CD20 antitela upotrebljene u testu bez inhibitora do 0nM anti-CD20 antitela.
Rezultati
[0179] Ukupno 25 anti-humanih C5 antitela, 16 onih koja nisu bila mutirana i 9 mutiranih, ispitivano je u pogledu njihove sposobnosti da inhibiraju C5 u CDC testu, upotrebom Daudi ćelije sa anti-CD20 antitelom i bilo humanih seruma (sa normalnim hC5 ili C5 varijantama) ili seruma afričkog zelenog majmuna. Razni ostaci u regionima koji određuju komplementarnost (CDR) u H4H12166P bili su mutirani u histidine, da bi se generisalo 9 mutiranih antitela, H4H12166P2-H4H12166P10. Pokazano je da mutacije histidina u CDR-ovima obezbeđuju zavisnost vezivanja za cilјni antigen od pH, što dovodi do pobolјšanih farmakokinetika (Igawa et al.2010, Nat. Biotechnol.28: 1203-1207).
Tabela 16: Inhibicija CDC anti-hC5 antitelima koja nisu mutirana sa 1,66% seruma i anti-CD20 antitelom u Daudi ćelijama
4
[0180] Kao što je prikazano u Tabelama 16 i 17, svih 25 anti-hC5 antitela je pokazalo potpunu inhibiciju CDC posredovanu sa C5 koji je bio prisutan u 1,66% humanog seruma. IC50 antitela koja nisu bila mutirana bili su opsega od 1,2 do 3,4nM. IC50 mutiranih antitela bili su opsega od 3,0nM do 12nM. Matično, nemutirano antitelo H4H12166P dalo je potpunu inhibiciju sa IC50 od 2,6nM i 2,9nM.
Tabela 17: Inhibicija CDC mutiranim anti-hC5 antitelom sa 1,66% seruma i anti-CD20 antitelom u Daudi ćelijama
[0181] Šesnaest nemutiranih anti-hC5 antitela je pokazalo potpunu inhibiciju CDC posredovane sa C5 afričkog zelenog majmuna, sa IC50 opsega od 2,0nM do 14nM.
[0182] Četiri od 9 mutiranih antitela pokazala su potpunu inhibiciju CDC posredovane sa C5 afričkog zelenog majmuna, sa IC50 opsega od 7,1nM do 9,9nM. Preostalih šest mutiranih antitela bili su blokatori sa IC50 većim od 10nM i maksimumom inhibicije (sa 100nM antitela) opsega od 34% do 85%. Matično, nemutirano antitelo H4H12166P je dalo potpunu inhibiciju sa IC50 od 4,5nM i 5,6nM.
[0183] Da bi se ispitalo da li anti-hC5 antitela inhibiraju varijante humanog C5, R885H i R885C, humani serum sa osiromašenim sadržajem C5 ispitivan je sa 6,6nM svake varijante C5. Svih 25 anti-hC5 antitela je pokazalo potpunu inhibiciju CDC posredovanu sa R885H varijantom C5, sa IC50 nemutiranih antitela opsega od 0,48nM do 4,2nM, dok je IC50 mutiranih antitela bio opsega od 1,3nM do 7,0nM. Matično, nemutirano antitelo H4H12166P dalo je potpunu inhibiciju sa IC50 od 1,3nM i 1,3nM.
[0184] Petnaest od 16 nemutiranih anti-hC5 antitela pokazalo je potpunu inhibiciju CDC posredovane sa CS varijantom R885C, sa IC50 opsega od 0,43nM do 1,6nM. Jedno nemutirano antitelo pokazalo je slabu inhibiciju CDC sa maksimumom inhibicije od 67% (sa 100nM antitela) i IC50 >20nM. Svih devet mutiranih antitela pokazalo je potpunu inhibiciju CDC posredovane sa CS varijantom R885C, sa IC50 opsega od 0,77nM do 3,5nM. Matično, nemutirano antitelo H4H12166P dalo je potpunu inhibiciju sa IC50 od 0,46nM i 0,76nM.
[0185] Anti-CD20 antitelo je pokazalo CDC Daudi ćelija sa 1,66% seruma, sa EC50 od 1,0nM, 1,4nM i 1,9nM za humani serum, 2,4nM i 2,6nM za serum afričkog zelenog majmuna, 1,9nM i 6,3nM za serum sa osiromašenim sadržajem hC5 i R885H varijantom hC5, a 2,7nM i 9,5nM za serum sa osiromašenim sadržajem hC5 sa R885C varijantom hC5. Nijedno od nerelevantnih IgG kontrolnih antitela, Kontrolnog mAt1 i Kontrolnog mAt2, nije pokazalo bilo kakvu inhibiciju CDC.
Primer 7: Inhibicija aktivnosti C5a utvrđena luciferaznim testom
[0186] Ovaj primer opisuje test za ispitivanje aktivacije C5a putem jednog od njegovih receptora, C5aR1. C5aR1 je receptor kuplovan sa G-proteinom (GPCR) i može inicirati razne signalne puteve kuplovane sa GPCR (Monk i saradnici, 2007, Br. J. Pharmacol. 152: 429-448). Biološki test je uspostavlјen upotrebom HEK293 ćelija stabilno transfektovanih sa humanim C5aR1 (Pristupni broj NP_001727.1) i humanim Gα16 (Pristupni broj NP_002059.3) zajedno sa luciferaznim reporterom [NFAT element odgovora (4X)-luciferaza]. Gα16 je relativno promiskuitetan G protein koji može biti kuplovan sa različitim tipovima GPCR, što dovodi do aktivacije PLC-β i naknadnog povećanja Ca<++>, što zauzvrat aktivira translokaciju NFAT i transkripciju reporterskog gena (Kostenis i saradnici 2005, Trends Pharmacol. Sci.26: 595-602). Dobijena ćelijska linija, HEK293/hGα16/hC5aR1/NFAT-luc, izolovana je i održavana u 10% DMEM koji je sadržavao 10% FBS, NEAA, pencilin/streptomicin, 500 µg/mL G418, 100 µg/mL higromicina B i 7 µg/mL blasticidina.
[0187] Za C5a luciferazni biološki test, HEK293/hG□16/hC5aR1/NFAT-luc ćelije su zasejavane u ploče za ispitivanje sa 96 bunarića u gustini od 20.000 ćelija/bunariću, u OPTIMEM medijumu (Invitrogen, kat. br.31985-070) u koji su bili dodati 0,5% BSA, penicilin/streptomicin i L-glutamin, nakon čega su ćelije inkubirane na 37°C i u 5% CO2preko noći. BSA je upotrebljavan umesto FBS, pošto se pokazalo da serum cepa i inaktivira hC5a (Klos i saradnici, 2013, Pharmacol. Rev.65: 500-543). Sledećeg jutra, hC5a je titriran od 100nM do 2 pM (uklјučujući kontrolni uzorak koji nije sadržavao hC5a) i dodat je ćelijama da bi se utvrdila kriva titracije doze odgovora za ćelijsku liniju. Da bi se ispitala inhibicija hC5a antitelom na hC5a, ćelijama je dodavano 500 pM hC5a. Odmah zatim, ćelijama su dodata antitela razređena u odnosu 1:3 od 100nM do 2 pM (uklјučujući kontrolni uzorak koji nije sadržavao antitela). Ćelije su dalje inkubirane tokom 5,5 sati na 37°C u prisustvu 5% CO2. Aktivnost luciferaze je detektovana nakon inkubacije sa OneGlo<™>reagensom (Promega, kat. br. E6051). OneGlo<™>je reagens zasnovan na luminiscenciji koji meri količinu luciferaze prisutne u ćelijama. U ovom testu, povećana aktivacija hC5a dovodi do povećane proizvodnje luciferaze i luminescencije (što se meri u relativnim svetlosnim jedinicama, RLU). Merenje luminiscencije je vršeno upotrebom Victor X instrumenta (Perkin Elmer). Rezultati su analizirani upotrebom nelinearne regresije (4-parametarska log analiza) sa Prism 5 softverom (GraphPad), da bi se dobile EC50i IC50vrednosti. Inhibicija antitelima je izračunavana tako da je 0 - 100% inhibicije bilo opsega inhibicije od 500 pM hC5a bez inhibitora do 0nM hC5a.
[0188] Četiri anti-hC5 antitela su ispitivana u pogledu njihove sposobnosti da inhibiraju da hC5a aktivira svoj receptor, hC5aR1, merenjem obima inhibicije aktivacije HEK293/hGα16/hC5aR1/NFAT-luc ćelija sa 500 pM hC5a.
Tabela 18: Inhibicija anti-hC5 antitelom od 500 pM hC5a u HEK293/G□16/hC5aRl/ NFAT-luc ćelijama
[0189] Kao što je prikazano u Tabeli 18, četiri antitela su pokazala potpunu inhibiciju 500 pM hC5a sa IC50 opsega od 0,035nM do 0,46nM. Nerelevantno IgG kontrolno antitelo, Kontrolno mAt3, nije pokazalo bilo kakvu inhibiciju hC5a. hC5a je aktivirao HEK293/Gα16/hC5aR1/NFAT-luc ćelije sa EC50 od 0,39nM.
Primer 8: Biološki test hemolize
[0190] Da bi se ispitala aktivnost antitela, razvijeni su test hemolize klasinim putem (CH) i test hemolize alternativnim putem (AH).
[0191] CH je skrining test za aktivaciju klasičnog puta komplementa, koji je osetlјiv na smanjenje, odsustvo i/ili neaktivnost bilo koje od komponente puta. CH ispituje funkcionalnu sposobnost komponenti klasičnog puta aktivacije sistema komplementa iz seruma da liziraju crvene krvne ćelije ovaca (SRBC) koja su prethodno bile obložene zečjim antitelom protiv ovčijih crvenih krvnih ćelija (hemolizinom). Kada se SRBC obložena antitelima inkubiraju sa ispitivanim serumom, aktivira se klasičan put sistema komplementa i rezultat je hemoliza. Ukoliko je komponenta komplementa odsutna, nivo CH će biti nula; ukoliko se smanji jedna ili više komponenti klasičnog puta, CH će biti smanjen. (Nilsson i saradnici, 1984, J. Immunol. Meth. 72: 49-59). Ovaj test se upotrebljava za karakterizaciju i skrining anti-humanih C5 antitela visokog afiniteta.
Postupci
(A) Test za hemolizu klasičnim putem aktivacije sistema komplementa
[0192] Želјeni broj crvenih krvnih ćelija ovaca (SRBC) ispran je u GVB++ puferu, nakon čega je resuspendovan do 1×10^9 ćelija/mL. Da bi se SRBC senzitizovale, pomešane su sa jednakom zapreminom zečjeg hemolizina protiv eritrocita ovaca, razblaženog u odnosu od 1:50 (1,5 mg/mL), nakon čega su ćelije inkubirane na 37oC tokom 20 minuta. Senzitizovane SRBC ćelije su pre upotrebe u testu hemolize razblažene do 2×10^8 ćelija/ml u GVB++. Normalan humani serum ili serum cinomolgus majmuna je zatim razblažen do 2% ili 10% u GVB++ puferu. Da bi se ispitala inhibicija hemolitičke aktivnosti posredovane sa C5, ispitivana antitela su prethodno inkubirana tokom 20 minuta na 4°C, u koncentracijama opsega od 0,6nM do 800nM, u 2% -10% normalnog humanog ili 10% seruma cinomolgus majmuna ili seruma afričkog zelenog majmuna. Za merenje hemolitičke aktivnosti su upotrebljavane ploče sa 96 bunarića okruglog dna. Ukupno 100ul senzitizovanih ovčijih eritrocita (2×10^8 ćelija/ml) zasejavano je u ploču sa 96 bunarića, nakon čega je sledilo dodavanje po 100ul odgovarajućih uzoraka seruma koji su prethodno bili inkubirani sa ispitivanim antitelima. Ćelije su zatim lagano pomešane i inkubirane na 37°C tokom 60 minuta. Nakon vremena inkubacije, ćelije su spuštene centrifugiranjem na 1250xg, na 4°C. Ukupno 100uL supernatanta je prebačeno na svežu ploču sa 96 bunarića ravnog dna i očitana je apsorbancija na 412 nm upotrebom SpectraMax čitača mikroploča. Hemolitička aktivnost je izračunavana za finalnu koncentraciju seruma od 1-5% za tretmane.
[0193] Procenat hemolize je izračunavan na sledeći način:
Ćelijska liza sperimentu - Ćelijska liza u pozadini) % Hemolize = 100↔ ( u ek
(Maksimalna ćelijska liza - Ćelijska liza u pozadini)
[0194] U ovoj jednačini, „ćelijska liza u pozadini” je OD na A412nm poreklom od ćelija inkubiranih u GVB++ puferu koji samo ne sadrži serum. „Maksimalna ćelijska liza” je OD na A412 nm poreklom od ćelija tretiranih vodom. Rezultati, izraženi kao % hemolize, analizirani su upotrebom nelinearne regresije (4-parametarske log analize) sa Prism 5 softverom (GraphPad), da bi se dobile IC50vrednosti. Podaci su predstavlјeni kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti
(B) Test za hemolizu alternativnim putem aktivacije sistema komplementa
[0195] Želјeni broj zečijih crvenih krvnih ćelija (RbRBC) je ispran u GVB-Mg<2+>/EGTA puferu, nakon čega je resuspendovan do 2×10^8 ćelija/ml. Normalan humani ili serum cinomolgus majmuna razblažen je zatim to 10% u GVB-Mg<2+>/EGTA puferu. Da bi se ispitala inhibicija hemolitičke aktivnosti posredovane sa C5, antitela u koncentracijama opsega od 3nM do 800nM su prethodno inkubirana tokom 20 minuta, na 4°C, u 5-10% normalnog humanog seruma ili seruma cinomolgus majmuna. Za merenje hemolitičke aktivnosti su upotrebljavane ploče sa 96 bunarića okruglog dna. Ukupno 100ul RbRBC (2×10^8 ćelija/ml) zasejavano je u ploču sa 96 bunarića, nakon čega je sledilo dodavanje 100ul 10% normalnog humanog seruma ili seruma cinomolgus majmuna ili seruma afričkog zelenog majmuna koji su prethodno bili inkubirani sa anti -C5 antitelima. Ćelije su dalje lagano pomešane i inkubirane na 37°C tokom 60 minuta. Nakon vremena inkubacije, ćelije su spuštene centrifugiranjem na 1250xg, na 4°C. Ukupno 100uL supernatanta je prebačeno na svežu ploču sa 96 bunarića ravnog dna i očitana je apsorbancija na 412 nm, upotrebom SpectraMax čitača mikroploča. Hemolitička aktivnost je izračunavana za finalnu koncentraciju seruma od 5% seruma.
[0196] Procenat hemolize je izračunavan na sledeći način:
(Ćelijska liza u eksperimentu - Ćelijska liza u pozadini) % Hemolize = 100↔ (Maksimalna ćelijska liza - Ćelijska liza u pozadini)
[0197] U ovoj jednačini, „ćelijska liza u pozadini” je OD na A412nm poreklom od ćelija inkubiranih u GVB-Mg/EGTA puferu koje samo nije sadržavao serum ili je bio bez bilo kakvog anti-C5 antitela. „Maksimalna ćelijska liza” je OD na A412 nm poreklom od ćelija tretiranih vodom. Za inhibiciju anti-C5 antitelima, IC50vrednosti su izračunavane upotrebom nelinearne regresije (4-parametarske log analize) sa Prism 6 softverom (GraphPad).
Rezultati
(A) Inhibicija hemolize posredovane sa humanim C5
[0198] Ukupno 25 anti-humanih C5 (hC5) antitela, 16 nemutiranih i 9 mutiranih, ispitivano je u pogledu njihove sposobnost da inhibiraju C5 iz normalnog humanog seruma (NHS) u CH50 testu, upotrebom senzitizovanih crvenih krvnih ćelija ovaca (SRBC), i u AH50 testu, upotrebom zečijih crvenih krvnih ćelija (RRBC).
Tabela 19: Inhibicija CP i AP aktivnosti za anti-hC5 antitelo u 1% ili 5% normalnog humanog seruma
(NHS)
[0199] Kao što je prikazano u Tabeli 19, šesnaest anti-hC5 antitela ovog pronalaska i anti-C5 antitela koja su ovde opisana, pokazalo je više od 94% inhibicije hemolize klasičnim putem (CP) posredovane sa C5 prisutnim u 1% humanog seruma. IC50 antitela su bila opsega od 2,1 do 5,9nM, a procenat inhibicije je bio opsega od 95%-99%. Svih 16 anti-C5 antitela pokazalo je inhibiciju veću od 60% (osim H4H12169P) u testu hemolize alternativnim putem (AP) posredovane C5 prisutnim u 5% NHS. IC50 za antitela su bili opsega od 13 do 160nM, a procenat aktivnosti inhibicije je bio opsega od 44% do 81%.
Tabela 20: Inhibicija CP i AP aktivnosti za anti-hC5 antitelo u 5% normalnog humanog seruma
(NHS)
[0200] Kao što je prikazano u Tabeli 20, svih 9 mutiranih anti-hC5 antitela je pokazalo inhibiciju aktivnosti CP i AP hemolize posredovane sa C5 prisutnim u 5% humanog seruma. U testu CP hemolize, matično, nemutirano antitelo H4H12166P pokazalo je više od 98% inhibicije sa IC50 od 10,9nM. Osam mutiranih anti-hC5 antitela pokazalo je više od 90% inhibicije sa IC50 opsega od 10,3nM do 24,3nM. Mutirano anti-C5 antitelo 12166P10 pokazalo je delimičnu inhibiciju od 74%. U testu AP hemolize, matično, nemutirano antitelo H4H12166P pokazalo je više od 85% inhibicije sa IC50 od 20,9nM. Mutirana anti-hC5 antitela su pokazala opseg inhibicije od 72-83%, a IC50 antitela su bili opsega od 28nM do 0,15 µM.
(B) Inhibicija hemolize sa C5 majmuna
[0201] Ukupno 25 anti-humanih C5 (hC5) antitela, 16 nemutiranih i 9 mutiranih, ispitivano je u pogledu njihove sposobnosti da inhibiraju C5 Cinomolgus majmuna i afričkog zelenog majmuna u CH50 testu, upotrebom senzitizovanih crvenih krvnih ćelija ovaca (SRBC), i u AH50 testu, upotrebom zečijih cvenih krvnih ćelija (RRBC).
Tabela 21: Inhibicija CP i AP aktivnosti za anti-hC5 antitelo u 5% normalnih seruma afričkih zelenih majmuna (AGM)
[0202] Kao što je prikazano u Tabeli 21, anti-hC5 antitela su pokazala različite nivoe inhibicije aktivnosti CP ili AP hemolize u 5% seruma afričkih zelenih majmuna. U CP testu, dva od 16 anti-hC5 antitela nisu pokazala inhibiciju hemolitičke aktivnosti. Četrnaest antitela je pokazalo inhibiciju opsega od 43-94%, sa IC50 opsega od 25nM do 180nM. U testu AP hemolize, trinaest od 17 antitela je pokazalo aktivnost inhibicije opsega od 17%-93% sa IC50 opsega od 22,5nM do 233nM.
Tabela 22: Inhibicija CP i AP aktivnosti za anti-hC5 antitelo u 5% normalnih seruma Cinomolgus (Cino) majmuna
1
[0203] Kao što je prikazano u Tabeli 22, anti-hC5 antitela (osim H4H12183P2, koja je pokazalo CP inhibiciju od 64%) pokazala su više od 90% inhibicije CP ili AP hemolize u 5% seruma Cinomolgus majmuna. U testu CP hemolize, IC50 antitela su bili opsega od 7,15nM do 142nM. U testu AP hemolize, IC50 antitela su bili opsega od 5,4 do 29,6nM.
(C) Inhibicija hemolize za varijantu humanog C5
[0204] Izabrana anti-C5 antitela su ispitivana u pogledu njihove sposobnosti da inhibiraju varijantu humanog C5 (pogledati ovde Primer 3) iz humanog seruma osiromašenog sadržaja C5, u CH50 testu. U humanom serumu osiromašenog sadržaja C5 koji je bio dopunjen egzogenom C5 varijantom R885H, H4H12166P i Komparator 2 su blokirali CP hemolizu sa IC50 vrednostima od 6,0nM i 4,4nM, tim redom, kao i sa IC80 vrednostima od 7,6nM i 5,5nM, tim redom Za varijantu R885C, H4H12166P i Komparator 2 su blokirali CP hemolizu u humanom serumu osiromašenog sadržaja C5 sa egzogenim varijantama C5, sa IC50 od 9,3nM i 6,8nM, tim redom, kao i sa IC80 vrednostima od 11nM i 8,2nM, tim redom. Kao što se očekivalo, Komparator 1 nije blokirao hemolitičku aktivnost varijanti humanog C5.
(D) Inhibicija humanog CSb-6 kompleksa
[0205] Izabrana anti-C5 antitela su ispitivana u pogledu njihove sposobnosti da inhibiraju humani C5b-6 kompleks iz humanog seruma osiromašenog sadražaja C5 u CH50 testu. H4H12166P je snažno blokiralo CP hemolizu u humanom serumu osiromašenog sadražaja C5 koji je bio dopunjen egzogenim huC5b-6 kompleksom, sa IC50 od 3,8nM i sa IC80 vrednošću od 5,8nM. Nasuprot tome, Komparator 1 je blokirao hemolizu posredovanu C5b-6 kompleksom sa nižom potencijom, sa vrednostima IC50 od 5,0nM i sa IC80 vrednostima od 46nM, tim redom. Komparator 1 je inhibirao samo 70% ukupne hemolize pri najvišim ispitivanim koncentracijama. Komparator 2 nije blokirao hemolitičku aktivnost humanog C5b-6 kompleksa.
2
Primer 9: Anti-C5 antitela blokiraju nastanak C5a u testu CP hemolize
[0206] Da bi se procenilo da li anti-C5 antitela inhibiraju generisanje C5a, supernatanti iz testa za hemolizu klasičnim putem (CP) su analizirani u pogledu nivoa CSa upotrebom ELISA testa.
[0207] C5a, nastao kao rezultat cepanja C5, proteinski je fragment od 74 aminokiseline. C5a se brzo metaboliše serumskim karboksipeptidazama u stabilniji, manje aktivni oblik od 73 aminokiseline, C5a des-Arg, uklanjanjem C-terminalnog arginina. Kvantifikacija C5a des-Arg stoga obezbeđuje pouzdanu meru za praćenje generisanja C5a in vivo i in vitro. MicroVue C5a ELISA komplet koji je ovde upotrebljen, detektuje C5a des-Arg u skladu sa informacijama obezbeđenim od strane proizvođača. Preliminarni eksperimenti (podaci nisu prikazani) ukazuju da se takođe detektuje primarni oblik C5a od 74 aminokiseline. Za potrebe ovog Primera, oba oblika će biti zajednički označena kao „C5a”.
[0208] Nivoi C5a proteina su utvrđivani u supernatantima iz testa za CP hemolizu, upotrebom normalnog humanog seruma (NHS) sa očuvanim sadržajem komplementa, koji je prethodno bio inkubiran sa H4H12166P ili izotipskim kontrolnim antitelom, kao što je opisano u Primeru 8. Nivoi C5a proteina su mereni upotrebom MicroVue C5a ELISA kompleta, prema uputstvima proizvođača. Ukratko, uzorci su razblaživani i inkubirani na pločama koje su bile prethodno obložene antitelom za hvatanje (mišjim anti-C5a specifičnim za neoepitop na humanom C5a). Humani C5a protein, koji je obezbeđen od strane proizvođača, upotrebljen je kao standard za kalibraciju. C5a u supernatantima je detektovan antitelom za detekciju konjugovanim sa HRP (mišje monoklonsko antitelo na C5a region iz C5). Da bi se detektovala aktivnost HRP, dodat je zatim hromogeni supstrat za HRP, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB). Za zaustavlјanje reakcije je upotrebljavan rastvor 1N hlorovodonične kiseline, a optička gustina na 450 nm (OD450) je izmerena na SpectraMax čitaču ploča. Podaci su analizirani upotrebom nelinearne regresije (4-parametarske log analize) u GraphPad Prism programu. Koncentracija C5a je izražena kao ng/mL supernatanta.
[0209] U testu u kome je upotrebljen 5% NHS, H4H12166P je snažno blokirao povećanje nivoa C5a proteina na način zavisan od doze, sa IC50 od 8,5nM, dok izotipsko kontrolno antitelo nije imalo uticaja na nivoe C5a (Slika 1). Maksimalna blokada pri najvišoj ispitivanoj koncentraciji H4H12166P (267nM) dovela je do pada u nivoima C5a od ~10 puta do 3,8 ng/mL (0,3nM), u poređenju sa 34 ng/mL (2,8nM) uočenim pri najnižoj ispitivanoj koncentraciji H4H12166P (1nM) u 5% seruma. Koncentracija C5a koja je zableležena u slučaju maksimalne blokade, bila je bliska bazalnom nivou C5a od 2,3 ng/mL (0,2nM) u netretiranom 5% NHS.
Primer 10: Karakterizacija farmakokinetike i farmakodinamike anti-C5 antitela kod cinomolgus majmuna
[0210] Ovaj primer opisuje karakterizaciju farmakokinetike (PK) i farmakodinamike (PD) za izabrana anti-C5 antitela koja je rađena upotrebom mužjaka cinomolgus majmuna. Endogeni nivoi C5 su određivani pre davanja doze anti-C5 antitela i upotrebljeni su za raslojavanje doznih grupa životinja.
[0211] Ukupni nivoi C5 u cirkulaciji kod cinomolgus majmuna su određeni upotrebom ELISA kompleta za humani komplement C5 (Abcam, kat. br. ab125963), koji je rađen u skladu sa preporukama proizvođača. Utvrđeno je da su prosečne koncentracije C5 proteina kod majmuna iznosile 90,85 µg/mL ± 19,17 µg/mL.
[0212] Za svako anti-C5 antitelo, data je po jedna intravenska (IV) injekcija u dozi od 15 mg/kg grupi od po 4 cinomolgus majmuna. Uzorci krvi su prikuplјani iz svake životinje, počevši od perioda pre davanja doze do 1680 sati (70 dana), nakon čega je krv obrađena tako da je izdvojen serum koji je dalje zamrznuti na -80 °C do analize za PK i PD.
Analiza nivoa ukupnog IgG antitela upotrebom ELISA imunoeseja
[0213] Koncentracije ukupnih antitela u uzorcima seruma majmuna merene su upotrebom nevalidiranog direktnog ELISA testa. ELISA procedura je koristila mikrotitarsku ploču obloženu mišjim anti-humanim IgG1/IgG4 Fc monoklonskim antitelom. Različita anti-C5 antitela su dodavana u ploču i anti-C5 antitela uhvaćena na ploči su detektovana upotrebom biotinizovanog mišjeg anti-humanog IgG4 Fc monoklonskog antitela, nakon čega je sledilo dodavanje NeutrAvidin konjugovanog sa peroksidazom rena (NeutrAvidin HRP). Dodavan je zatim supstrat na bazi luminola koji je bio specifičan za peroksidazu, da bi se postigao intenzitet signala koji je proporcionalan koncentraciji ukupnog uhvaćenog anti-C5 antitela. Merenja relativnih svetlosnih jedinica (RLU) za kalibracione standarde i njihove odgovarajuće nominalne koncentracije uneta su u krivu upotrebom ponderisane4-parametrijske log jednačine, da bi se generisala jednačina za kalibraciju koja opisuje koncentraciju anti-C5 antitela i odnos sa odgovorom dobijenim u testu. Donja granica kvantitacije (LLOQ) u testu je iznosila 1,56 ng/mL (2% seruma majmuna) i 78 ng/mL u čistom serumu majmuna.
Određivanje PK parametara
[0214] PK parametri su određivani nekompartmentalnom analizom (NCA) upotrebom Phoenix<®>WinNonlin<®>softvera (verzija 6.4, Certara, L.P.) i modela IV bolusnog davanja doze.
[0215] Svi PK parametri su izvođeni iz odgovarajućih srednjih vrednosti koncentracija, uklјučujući uočenu maksimalnu koncentraciju u serumu (Cmax), vreme uočene maksimalne koncentracije, tmax, kao i procenjen poluživot koji je uočen (T1/2). Za svako antitelo, površina ispod krive koncentracije u odnosu na vreme do poslednje merlјive koncentracije (AUCposlednji), kao i ekstrapolisana vrednost od vremena nula do beskonačnosti (AUCinf) određivane su upotrebom linearnog trapezoidnog pravila sa linearnom interpolacijom i uniformnim ponderisanjem.
PD analiza hemolitičkim testom ex vivo
[0216] Farmakodinamika izabranih anti-C5 antitela je analizirana upotrebom testova hemolize klasičnim putem i alternativnim putem ex vivo.
[0217] Test hemolize klasičnim putem: Crvene krvne ćelije ovaca (SRBC) su ispirane u GVB++ puferu (želatinski Veronal pufer sa CaCl2 i MgCl2) (Boston BioProducts), nakon čega su resuspendovane do 1 × 10^9 ćelija/mL. Da bi se senzitizovale SRBC, ukupno 1×10^9/mL SRBC je pomešano sa jednakom zapreminom zečjeg hemolizina protiv ovaca razblaženog u odnosu 1:50 (1,5 mg/mL), na 37°C tokom 20 minuta. Senzitizovane SRBC su pre upotrebe u testu hemolize razblažene do 2×10^8 ćelija/mL u GVB++ puferu. Krv cinomolgus majmuna prikuplјana je pre davanja doze i nakon 5 minuta, kao i 4 i 8 sati i 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 i 70 dana nakon davanja doza, za analizu PD. Izdvajan je zatim serum, pa je zamrzavan do dalјe upotrebe. Na dan testa, serum cinomolgus majmuna iz odgovarajućih vremenskih tačaka je razblaživan do 10% u GVB++ puferu. Za merenje hemolitičke aktivnosti su upotrebljavane ploče sa 96 bunarića okruglog dna. Ukupno 100µl senzitizovanih SRBC (2×10^8 ćelija/mL) zasejavano je u ploču sa 96 bunarića na 37°C, nakon čega je sledilo dodavanje 100ul
4
10% seruma cinomolgus majmuna iz odgovarajućih vremenskih tačaka. SRBC su zatim lagano promešane i inkubirane na 37°C tokom 10 minuta. Nakon vremena inkubacije, ćelije su centrifugirane na 1250xg, na 4°C. Ukupno 100µL supernatanta je prebačeno na svežu ploču sa 96 bunarića ravnog dna i očitana je apsorbancija na 412 nm upotrebom Spectramax čitača mikroploča. Hemolitička aktivnost je računata za finalnu koncentraciju u serumu od 5%. Procenat hemolize je izračunavan sa vrednostima apsorbancije upotrebom sledeće jednačine:
(Ćelijska liza u eksperimentu - Ćelijska liza u pozadini) % Hemolize = 100↔
(Maksimalna ćelijska liza - Ćelijska liza u pozadini)
[0218] U ovoj jednačini, „ćelijska liza u pozadini” je OD na A412nm poreklom od SRBC inkubiranih u GVB++ puferu puferu koji samo nije sadržavao serum. „Maksimalna ćelijska liza” je OD na A412 nm poreklom od SRBC tretiranih vodom. Rezultati, izraženi kao % hemolize, analizirani su upotrebom nelinearne regresije (4-parametarske log analize) sa Prism 5 softverom (GraphPad), da bi se dobile IC50vrednosti. Podaci su predstavlјeni kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti.
[0219] Test hemolize alternativnim putem: Želјeni broj zečjih crvenih krvnih ćelija (RbRBC) ispiran je u GVB-Mg<2+>/EGTA puferu, nakon čega je resuspendovan do 2×10^8 ćelija/mL. Krv iz cinomolgus majmuna je prikuplјana pre davanja doze i 5 minuta, 4 i 8 sati, kao i 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 28, 35, 42 i 49 dana nakon davanja doza, za PD analizu. Izdvajan je zatim serum, pa je zamrzavan do dalјe upotrebe. Za merenje hemolitičke aktivnosti su upotrebljavane ploče sa 96 bunarića okruglog dna. Ukupno 100µl RbRBC (2×10^8 ćelija/mL) zasejavano je u ploču sa 96 bunarića na 37°C, nakon čega je sledilo dodavanje po 100ul 10% seruma cinomolgus majmuna iz odgovarajućih vremenskih tačaka. RbRBC su zatim lagano promešane i inkubirane na 37°C tokom 60 minuta. Nakon vremena inkubacije, ćelije su centrifugirane na 1250xg, na 4°C. Ukupno 100µL supernatanta je zatim prebacivano na svežu ploču sa 96 bunarića ravnog dna i očitana je apsorbancija na 412 nm upotrebom Spectramax čitača mikroploča. Hemolitička aktivnost je izračunavana za finalnu koncentraciju u serumu od 5% i izražena je kao procenat ukupne hemolize eritrocita vodom. Procenat hemolize je izračunavan kao što je prethodno opisano.
Rezultati
[0220] Izabrana anti-CS antitela (navedena u Tabeli 1) ispitivana su u početnim eksperimentima u pogledu produženih farmakokinetičkih profila kod cinomolgus majmuna i miševa sa humanizovanim C5 (opisano u Primeru 10). H4H12166P i H4H12161P su izabrani kao antitela koja imaju visok afinitet u sprezi sa produženim PK i upotrebljena su ovde u narednim eksperimentima, zajedno sa Komparatorom 1 i Komparatorom 2.
[0221] Cinomolgus majmunima je data jednokratna bolusna doza od 15 mg/kg H4H12166P, H4H12161P ili Komparatora 2. Koncentracije ukupnih antitela u serumu i procenat hemolitičke aktivnosti klasičnim putem (CP) su utvrđivani u 19 vremenskih tačaka tokom 70-dnevnog perioda života. Hemoliza alternativnim putem (AP) određivana je u 17 vremenskih tačaka tokom 50-dnevnog perioda života. Tabela 23 sumira srednje koncentracije antitela za sva 3 antitela. Profili srednjih koncentracija ukupnih antitela u odnosu na vreme prikazani su na Slici 2. Srednje vrednosti PK parametara su opisane u Tabeli 24.
Tabela 23: Srednje koncentracije ukupnih IgG u serumu nakon jednokratne intravenske injekcije odabranih anti-C5 antitela mužjacima Cinomolgus majmuna u dozi od 15 mg/kg
[0222] Nakon davanja IV bolus, profile ukupnih koncentracija IgG i vremena za H4H12166P, H4H12161P i Komparatora 2 je karakterisala početna kratka faza distribucije praćena jednom fazom eliminacije tokom celog perioda života. Maksimum koncentracija za H4H12166P, H4H12161P i Komparator 2 je bio visoko uporediv, pošto su odgovarajuće Cmax/Vrednosti doze između svih antitela bile unutar 1,1 puta (29,7; 30,4 i 30,6 [(ug/mL)/(mg/kg)], tim redom) (Tabela 24).
Tabela 24: Srednji farmakokinetički parametri koncentracija ukupnih IgG u serumu nakon jednokratne intravenske injekcije odabranih anti-C5 antitela mužjacima Cinomolgus majmuna u dozi od 15 mg/kg
[0223] Procena profila zavisnosti koncentracije i vremena ukazala je da je H4H12166P pokazao najsporiju eliminaciju sa terminalnim koncentracijama antitela ≥ 10 µg/mL do 71. dana studije. Kinetike H4H12161P i Komparatora 2 su bile slične; oba su pokazala bržu eliminaciju od H4H12166P, sa koncentracijama mAt ≥ 10 µg/mL do 22. i 29. dana, tim redom.
[0224] Posledično, izloženost normalizovanim dozama (AUCposlednji/dozi) ukazala je da je H4H12166P imao najveću izloženost 339. dana*(µg/mL)/(mg/kg), dok su H4H12161P i Komparator 2 imali približno 2 puta manju izloženost, 157. i 187. dana*(µg/mL)/ (mg/kg), tim redom, u odnosu na istu za H4H12166P.
[0225] Poluživot antitela (t1/2) izračunavan tokom faze eliminacije bio je opsega od 5,5 do 15,6 dana duž doznih grupa i korelisao je takođe sa izloženošću, pošto je H4H12166P imao odgovarajuće najviši t1/2od 15,6 dana, dok su H4H12161P i Komparatora 2 imali t1/2vrednosti od 5,5 i 5,9 dana, tim redom.
[0226] Farmakološki efekti anti-C5 antitela iz uzoraka seruma cinomolgus majmuna određivani su ex vivo hemolizom senzitizovanih crvenih krvnih ćelija ovaca (SRBC) klasičnim putem (CP) aktivacije sistema komplementa i hemolizom zečjih crvenih krvnih ćelija (RbRBC) alternativnim putem (AP).
Inhibicija hemolitičke aktivnosti je izračunavana za finalnu koncentraciju u serumu od 5% i izražena je kao procenat ukupne hemolize eritrocita vodom. Tabela 25 sumira ex vivo aktivnost za 3 antitela koja je utvrđena srednjim procentom hemolize.
Tabela 25: Procenat hemolitičke aktivnosti klasičnim i alternativnim putem ex vivo za odabrana anti-C5 antitela
[0227] Kao što je prikazano u Tabeli 25 i na Slici 2, PD efekti su mereni CP komplementa (inkubacijom od 10 minuta) do 70. dana. H4H12166P je blokirao više od 95% CP hemolitičke aktivnosti do 35. dana. Aktivnost se vratila na maksimalne nivoe hemolize pre studije do 70. Dana. Komparator 2 je blokirao oko 95% CP hemolitičke aktivnosti tokom 10 dana, a aktivnost se brzo vratila na maksimalne nivoe hemolize pre studije do 18. dana.
[0228] PD efekti su takođe mereni testovima hemolize AP putem aktivacije komplementa (inkubacijom od 60 minuta) do 49. dana. Kao što je prikazano u Tabeli 25 i na Slici 3, H4H12166P je blokirao 80% ukupne AP hemolitičke aktivnosti do 18. dana i aktivnost se vratila na maksimalan nivo hemolize pre studije tek 50. dana. H4H1216P i Komparator 2 su blokirali 90% AP hemolitičke aktivnosti tokom 7 dana, a aktivnost se vratila na maksimalne nivoe hemolize pre studije do 21. dana.
Primer 11: Karakterizacija PK/PD za anti-C5 antitela kod miševa sa humanizovanim C5
[0229] U ovom setu eksperimenata, farmakokinetika i farmakodinamika izabranih anti-C5 antitela procenjivane su kod miševa humanizovanih tako da eksprimiraju humani C5 protein, upotrebom Velocigene<®>tehnologije (Valenzuela i saradnici, 2003, Nat. Biotechnol. 21: 652-659). Humanizovani miševi su bili konstruisani zamenom egzona od egzona 2 sve do egzona 41 mišjeg C5 gena sa egzonima 2-42 humanog C5 gena (opisano u US Patent Application Publication 2015/0313194 koja je ovde uključena u svojoj celosti).
[0230] Ukupni nivoi humanog C5 u cirkulaciji su određivani upotrebom ELISA kompleta za humani komplement 5 (Abcam, kat. br. ab125963) prema preporukama proizvođača.
Određivanje ukupnog nivoa leka u serumu ELISA testom
[0231] Koncentracije anti-C5 antitela u cirkulaciji, kako onih vezanih tako i nevezanih za C5, utvrđivane su analizom ukupnog humanog antitela upotrebom ELISA testa. Ukratko, kozje anti-humano IgG poliklonsko antitelo od 1 µg/mL u PBS-u imobilisano je na pločama sa 96 bunarića preko noći; ploče su zatim isprane da bi se uklonio nevezani IgG, pa su blokirane sa 5% BSA. Serijska razblaženja anti-C5 antitela koja su sadržavala uzorke seruma (6 tačaka) i referentni standardi (12 tačaka) odgovarajućih antitela prebacivani su na ploče obložene anti-humanim IgG, pa su inkubirani tokom jednog sata. Anti-C5 antitela vezana za ploču su zatim detektovana upotrebom kozjeg anti-humanog IgG poliklonskog antitela konjugovanog sa peroksidazom rena. Ploče su razvijane sa TMB supstratom prema protokolu koga je preporučio proizvođač, a signali optičke gustine (OD) na 450 nm su snimani upotrebom Perkin Elmer Victor X4 multimodnog čitača ploča. Koncentracije anti-C5 antitela u serumu su izračunavane na osnovu referentne standardne kalibracione krive generisane upotrebom GraphPad Prism softvera.
Određivanje PK parametara
[0232] PK parametri su određivani nekompartmentalnom analizom (NCA) upotrebom Phoenix<®>WinNonlin<®>softvera (verzija 6.3, Certara, L.P.) i modela ekstravaskularnog doziranja. Upotrebom odgovarajućih srednjih vrednosti koncentracija za svako anatitelao, svi od PK parametara, uklјučujući procenjeni poluživot koji je uočen (t1/2) i površinu ispod krive zavisnosti koncentracije od vremena, sve do poslednje merlјive koncentracije (AUCposlednji) određivani su upotrebom linearnog trapezoidnog pravila sa linearnom interpolacijom i uniformnim ponderisanjem.
Analiza PD upotrebom testa hemolize
[0233] Farmakodinamika izabranih anti-C5 antitela je određivanaa upotrebom testova za hemolizu klasičnim putem aktivacije sistema komplementa. Crvena krvna zrnca ovaca (SRBC) (ovčja krv u Alsevers rastvoru) ispirana su u GVB++ puferu (želatinski Veronal pufer sa CaCl2 i MgCl2) (Boston BioProducts), nakon čega su resuspendovane do 1 × 10^9 ćelija/mL. Radi senzitizacije, 1×10^9/mL SRBC je pomešano sa jednakom zapreminom zečjeg hemolizina protiv ovaca razblaženog u odnosu 1:50 (1,5mg/mL), na 37°C tokom 20 minuta. Senzitizovane SRBC su pre upotrebe u testu hemolize razblaživane do 2×10^8 ćelija/mL u GVB++. Uzorci seruma iz životinja pre primanja doze ili iz miševa sa humanizovanim C5 kojima su davana anti-C5 antitela, a koji su prikuplјani 10, 20, 30, 40 i 50 dana nakon davanja doze, razblaženi su do 20% u GVB++ puferu. Ukupno 100µl senzitizovanih SRBC (2 × 10^8 ćelija/mL) je zasejavano u ploče sa 96 bunarića okruglog dna, na 37°C, nakon čega je sledilo dodavanje po 100µl 20% seruma u koji je bilo dodato 160-180 µg/mL proteina humanog komplementa 3 (huC3). Ćelije su zatim nežno pomešane i inkubirane na 37°C tokom 1 sata. Nakon inkubacije, ćelije su centrifugirane na 1250xg, na 4°C. Ukupno 100µL supernatanta je prebacivano na svežu ploču sa 96 bunarića ravnog dna i očitana je apsorbancija A412nm upotrebom Spectramax čitača mikroploča. Procenat hemolize je izračunavan sa vrednostima apsorbancije, upotrebom sledeće jednačine:
(Ćelijska liza u eksperimentu - Ćelijska liza u pozadini) % Hemolize = 100↔
(Maksimalna ćelijska liza - Ćelijska liza u pozadini)
[0234] U ovoj jednačini „ćelijska liza u pozadini” je OD na A412nm koja potiče od SRBC inkubiranih u GVB++ puferu koji nije sadržavao samo serum. „Maksimalna ćelijska liza” je OD na A412 nm koja potiče od SRBC tretiranih vodom. Rezultati, izraženi kao % hemolize, analizirani su upotrebom nelinearne regresije (4-parametarske log analize) sa Prism 6 softverom (GraphPad), da bi se dobile IC50vrednosti. Podaci su predstavlјeni kao srednja vrednost ± (standardna greška srednjih vrednosti).
Eksperiment 1
[0235] U ovom eksperimentu, farmakokinetika i farmakodinamika H4H12166P antitela za primer procenjivani su poređenjem sa Komparatorom 1 i Komparatorom 2 kod miševa sa humanizovanim C5. Ukupni nivoi humanog C5 u cirkulaciji su određivani upotrebom ELISA kompleta za humani komplement C5 (Abcam, kat. br. ab125963), koji je rađen u skladu sa preporukama proizvođača. Utvrđeno je da su prosečne koncentracije humanog C5 kod miševa iznosile 39,73µg/mL ± 17,82µg/mL. Postojala je razlika između mužjaka (55,4 ± 1,7 µg/ml, n=47) i ženki (24,7 ± 0,6 µg/ml, n=49) miševa.
[0236] Pre davanja doze antitela, mužjaci i ženke miševa sa humanizovanim C5 su raslojeni prema nivoima humanog C5 čija je prosečna vrednost iznosila 40 µg/mL. Za svako anti-C5 antitelo, kohorte od po dvadeset dva miša su primile jednu dozu od 15 mg/kg H4H12166P, Komparatora 1 ili Komparatora 2 subkutanom (s.c.) injekcijom. Svim miševima je uzorkovana krv pre davanja doza ili nakon jednog dana od injeciranja doze, radi PK analize. Dodatno, 10, 20, 30, 40 i 50 dana nakon injeciranja, grupe od po 4 ili 5 miševa iz svake kohorte su eutanazirane, a terminalnim krvarenjem su prikupljeni uzorci za PK i PD analizu. Uzorci seruma za prvi dan su predstavljali srednju vrednost za celokupnu kohortu od 22 miša. Krv je obrađena u serum koji je dalje zamrznut na -80 °C do analize.
[0237] Koncentracije ukupnih antitela su određivane u 7 vremenskih tačaka, a procenat hemolitičke aktivnosti je utvrđivan u 6 vremenskih tačaka tokom 50-dnevnog perioda života. Koncentracije ukupnih anti-C5 antitela su sumirane u Tabeli 26. Srednja vrednost koncentracija ukupnih antitela u odnosu na vremenski profil prikazane su na Slici 4. Srednje vrednosti PK parametara su opisane u Tabeli 27.
Tabela 26: Srednje koncentracije ukupnih IgG u serumu nakon jedne subkutane injekcije 15 mg/kg anti-C5 antitela miševima sa humanizovanim C5
Tabela 27: PK parametri
[0238] Profili srednjih koncentracija u odnosu na vreme prvog dana pokazuju da su tri antitela, H4H12166P, Komparator 1 i Komparator 2, imala koncentracije u serumu koje su bile uporedive, od 178, 229 i 164 µg/mL, tim redom. Komparator 1 je imao sličan profil eliminacije kao H4H12166P do 30. dana, ali je 40. i 50. dana ispoljio brzo povećanje klirensa u odnosu na H4H12166P. H4H12166P je 50. dana imao prosečnu koncentraciju antitela u serumu od približno 9µg/mL, dok su i Komparator 1 i Komparator 2 imali 30 puta nižu prosečnu koncentraciju antitela u serumu od 0,3 µg/mL. Komparator 2 je ispoljio najnižu izloženost od tri ispitivana antitela, sa približno 2 puta nižom AUCposlednji(1408 dan·µg/mL) u poređenju sa H4H12166P (2801 dan·µg/mL) i Komparatorom 1 (2708 dan·µg/mL).
[0239] Farmakološki efekti anti-C5 antitela H4H12166P, Komparatora 1 i Komparatora 2 iz uzoraka seruma miševa sa humanizovanim C5 u koji je bio dodat humani C3, mereni su do 50. dana i određivani su ex vivo putem testa hemolize klasičnim putem (CP) aktivacije sistema komplementa sa senzitizovanim SRBC. Srednje vrednosti procenta hemolize za svako anti-C5 antitelo sumirane su u Tabeli 28, a profil srednjeg procenta hemolize u odnosu na vreme je prikazan na Slici 5.
1
Tabela 28: Procenat hemolitičke aktivnosti klasičnim putem ex vivo za anti-humana C5 antitela
[0240] H4H12166P, Komparator 1 i Komparator 2 su inhibirali treminalnu hemolitičku aktivnost komplementa za koju je delovalo da je u korelaciji sa izloženošću antitelima. H4H12166P je blokirao više od 85% hemolitičke aktivnosti do 30. dana, a aktivnost se vraćala na bazalne nivoe pre davanja doze do 50. dana. Komparator 1 i Komparator 2 su blokirali oko 80% hemolitičke aktivnosti do 20. dana i 10. dana, tim redom, pri čemu se aktivnost vraćala na bazalne nivoe do 30. dana za oba tretmana.
Eksperiment 2
[0241] U ovom eksperimentu, farmakokinetika i farmakodinamika anti-C5 antitela H4H12166P, H4H12161P, Komparatora 1 i izotipske kontrole procenjivani su u miševima sa humanizovanim C5 (miševi homozigotni u pogledu ekspresije humanog C5). Ukupni nivoi C5 u cirkulaciji su određivani upotrebom ELISA kompleta za humani komplement C5 (Abcam, kat. br. ab125963), koji je rađen u skladu sa preporukama proizvođača. Utvrđeno je da su prosečne koncentracije humanog C5 kod miševa iznosile 48,98 µg/mL ± 15,1 µg/mL.
[0242] Pre davanja doze antitela, mužjaci i ženke miševa sa humanizovanim C5 su raslojeni prema nivoima humanog C5 čija je prosečna vrednost iznosila 50µg/mL. Za svako anti-C5 antitelo, kohorte od po pet miša su primile jednu subkutanu (s.c.) injekciju H4H12166P, H4H12161P, Komparatora 1 ili izotipske kontrole od 15 mg/kg. Svim miševima je uzorkovana krv pre davanja doze, 6 sati, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 13, 21, 30 i 45 dana nakon injeciranja, radi PK analize. Dodatno, 59. dana, svi miševi iz svake kohorte su eutanazirani i prikuplјeni su uzorci krvi terminalnim krvarenjem, za PK i PD analizu. Krv je obrađena u serum koji je dalje zamrzavan na -80 °C do analize.
[0243] Koncentracije ukupnih antitela su određivane u 12 vremenskih tačaka, a procenat hemolitičke aktivnosti je utvrđivan u 1 vremenskoj tački tokom 59-dnevnog perioda života. Koncentracije ukupnih antitela u serumu za svako od anti-C5 antitela su sumirane u Tabeli 29. Profili srednje vrednosti koncentracija ukupnih antitela u odnosu na vreme su prikazani na Slici 6. Srednje vrednosti PK parametara su opisane u Tabeli 30.
2
Tabela 29: Srednje koncentracije ukupnih IgG u serumu nakon jedne subkutanje injekcije od 15 mg/kg izabranih anti-C5 antitela miševima sa humanizovanim C5
Tabela 30: PK parametri
[0244] Profili srednjih koncentracija u odnosu na vreme pokazuju da su H4H12166P, H4H12161P, Komparator 1 i izotipska kontrola dostigli maksimalnu koncentraciju u serumu (Cmax) između 1. i 3. dana, sa uporedivim Cmaxvrednostima unutar 1,3 puta (178, 225, 183 i 221) µg/mL, tim redom. H4H12166P i izotipska kontrola su imali slične profile eliminacije, sa preostalim nivoima leka od približno 4µg/mL 59. dana. H4H12161P je ispoljio brži klirens od H4H12166P i izotipske kontrole, ali je eliminisan sporije od Komparatora 1. H4H12161P je 59. dana imao srednji nivo leka u serumu od 0,6 µg/mL, dok je Komparator 1 imao skoro nivo leka koji se nije mogao detektovati, od 0,08µg/mL.
[0245] Izotipska kontrola, H4H12166P i H4H12161P su ispoljili uporedive vrednosti izloženosti (AUCposlednji) unutar 1,3 puta (4080, 3490 i 3040 dan·µg/mL, tim redom) dok je Komparator 1 ispoljio 1,6 puta nižu izloženost (2240 dan·µg/mL) u poređenju sa H4H12166P.
Primer 12: Test zasnovan na LC-MRM-MS za određivanje koncentracije ukupnog humanog C5
[0246] U ovom primeru, koncentracije ukupnog humanog C5 u serumu su određivane upotrebom postupka tečne hromatografije kuplovanog sa masenom spektrometrijom za praćenje višestrukih reakcija (LC-MRM-MS) u farmakokinetičkoj/farmakodinamičkoj studiji za anti-C5 antitelo H4H12166P.
[0247] Koncentracije ukupnog humanog C5 u serumu određivane su merenjem koncentracije peptida od 10 aminokiselina sadržanog u LQGTLPVEAR sekvence C5 (ak 1129-1138 iz SEQ ID NO: 359) kao predstavnika za C5. Teorijski, ovaj postupak bi mogao detektovati produkt razdvajanja C5, C5b. Ipak, usled nestabilnosti slobodnog C5b, koncentracije C5b u serumu su u principu niske, sa mnoštvom C5b koji je vezan za ćelijske površine u obliku MAC komplekasa (Cooper i Muller-Eberhard 1970, J. Exp. Med.132: 775-93; Hadders i saradnici, 2012, Cell Rep.1: 200-7). Prema tome, obrađeni uzorci seruma koji su ovde analizirani, verovatno sadrže samo zanemarlјive količine C5b proizvoda, ukoliko ga uopšte sadrže.
Postupci
[0248] Za PK/PD studiju, miševi su primili jednu dozu H4H12166P od 15 mg/kg subkutanom (s.c.) injekcijom. Svim miševima je uzorkovana krv pre davanja doze i jedan dan nakon injeciranja, radi PK analize. Dodatno, 10, 20, 30, 40, 50 i 60 dana nakon injeciranja, miševi su eutanazirani i prikuplјena su uzorci krvi terminalnim krvarenjem za PK i PD analizu.
[0249] Humani C5 je korišćen kao referentni standard za kalibraciju; a humani C5 peptid proizveden sa C-terminalnim argininskim ostatkom obeleženim stabilnim izotopom upotrebljavan je kao interni standard (LQGTLPVEAR-<13>C6<15>N4). Referentni standard je upotrebljavan u koncentracijama opsega od 3,9 do 250 µg/mL (serijska razblaženja od 1:2) u serumu C5 nokaut miševa generisanih u okviru laboratorije, u kojima je mišji C5 gen bio uklonjen delecijom (C5-/-). Serum iz C5-/- miševi takođe je upotrebljavan kao negativna kontrola (blank). Kalibracioni standardi, blankovi i uzorci seruma studije (10 µL svakog) osušeni su i zatim denaturisani u 100 µL pufera 8M urea/20 mM Tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP), na 37°C tokom 1 sata. Svim uzorcima je dalje dodato 10 µL internog standarda od 25nM. Uzorci su alkilovani sa 10 mM 2-jodoacetamidom na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, nakon čega su razblaživani upotrebom 50 mM amonijum bikarbonata do finalne zapremine od 500 µL. Uzorci su potom podvrgavani digestiji tripsinom (1:20 w/w) preko noći na 37°C. Peptid LQGTLPVEAR izveden iz C5 digestijom sa tripsinom, detektovan je i kvantifikovan LC-MRM-MS postupkom upotrebom Xevo TQ-S sa ACQUITY UPLC sistemom kompanije Waters. Svaki obrađeni uzorak (10 µL) je injeciran u prethodno ekvilibrisanu ACQUITY UPLC BEH C18 kolonu. Brzina protoka je iznosila 0,6 mL/min (Mobilna faza A:voda:mravlјa kiselina/100:0,1 [V:V] i Mobilna faza B: acetonitril:mravlјa kiselina/100:0,1 [V:V]). Retenciono vreme i površine pikova su određivani upotrebom Masslinx Analyst Data softvera (Waters). Koncentracije C5 analita su izračunavane iz kalibracione krive koja je bila konstruisana unošenjem odnosa površina pikova referentnog standarda C5 (neobeleženi C5 peptid LQGTLPVEAR-<12>C6<14>N4generisan tripsinskom digestijom hC5) i internog standarda (C5 peptid obeležen stabilnim izotopom) u odnosu na nominalnu koncentraciju referentnog standarda za C5. Koncentracije su izračunavane upotrebom linearne regresije. Najniža koncentracija referentnog standarda za C5 (3,9 µg/mL) bila je unutar dinamičkog opsega testa i definisana je kao LLOQ testa.
Rezultati
[0250] Koncentracije ukupnog humanog C5 u serumu su procenjivane za uzorke prikuplјene iz odgovarajućih životinja, kako iz krvi repa pre davanja doze (pre doziranja), tako i putem terminalnog krvarenja 10. 30. i 35. dana. Ukupne koncentracije hC5 nakon doziranja H4H12166P bile su slične (unutar ~1 do 0,9 puta) nivoima pre davanja doze 10, 30. i 35. dana nakon davanja doze. Uočene manje razlike nisu bile statistički značajne, što je procenjeno Mann-Whitney testom, upotrebom GraphPad
4
Prism softvera. Analiza molarnog odnosa C5/H4H12166P pokazala je da je H4H12166P ostao u molarnom višku C5 do 35. dana nakon doziranja (Tabela 31).
Tabela 31: Rezime PD karakteristika za H4H12166P
Primer 13: Mapiranje epitopa vezivanja H4H12166P za C5 izmenom vodonika/deuterijuma
[0251] Mapiranje epitopa izmenom H/D sa masenom spektrometrijom sprovedeno je da bi se odredili aminokiselinski ostaci hC5 [(aminokiseline M1-C1676 iz SEQ ID No: 359) sa kojima H4H12166P interaguje. Opšti opis postupka H/D izmene je dat u npr. Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; i Engen i Smith (2001) Anal. Chem.73:256A-265A.
[0252] HDX-MS eksperimenti su rađeni na integrisanoj HDX/MS platformi kompanije Waters, koja se sastojala od Leaptec HDX PAL sistema za obeležavanje deuterijumom, Acquity M-Class sistema za digestiju i nanošenje uzoraka kompanije Waters (za raspodelu pomoćnih rastvarača), Acquity M-Class sistema za gradijent analitičke kolone kompanije Waters (za µBinarnu raspodelu rastvarača) i Synapt G2-Si masenog spektrometra za merenje mase peptički peptida.
[0253] Rastvor za obeležavanje je pripremlјan u 10 mM PBS pufera u D2O na pD 7,0 (ekvivalentno pH 6,6). Za obeležavanje deuterijumom, 3,8 µL C5 (6 pmol/µL), ili C5 prethodno pomešanog sa antitelom u molarnom odnosu od 1:1, inkubirano je sa 56,2 µL D2O rastvora za obeležavanje u raznim vremenskim tačkama (npr. kontrola koja nije deuterizovana = 0 sek, obeležavana tokom 1 min i 20 min). Deuterizacija je zaustavljana prenošenjem uzorka od 50 µL u 50 µL prethodno ohlađenog pufera za zaustavljanje reakcije (0,2 M TCEP, 6 M guanidin hlorid u 100 mM fosfatnog pufera, pH 2,5), nakon čega je pomešani uzorak inkubiran na 1,0 °C tokom dva minuta. Uzorak u kome je zaustavljena reacija injeciran je zatim u HDX Manager kompanije Waters za onlajn digestiju pepsinom/proteazom XIII. Digestijom obrađeni peptidi su zatim zaroblјeni na ACQUITY UPLC BEH C18 1,7-µm, 2,1 × 5 mm VanGuard-ovoj pred-koloni na 0°C, nakon čega su eluirani u analitičku kolonu ACQUITY UPLC BEH C18 1,7-µm, 1,0 × 95 mm radi razdvajanja u gradijentu od 9 minuta upotrebom 5%-40% B (mobilna faza A: 0,1% mravlјe kiseline u vodi, mobilna faza B: 0,1% mravlјe kiseline u acetonitrilu). Maseni spektrometar je dalje podešen na napon konusa od 37 V, vreme skeniranja od 0,5 s i opseg mase/naelektrisanja od 50-1700 Tomsonovih jedinica (Th).
[0254] Za identifikaciju peptida iz humanog C5, LC-MS<E>podaci iz uzorka koji nije bio deuterizovan obrađivani su i pretraživani u bazi podataka koja je uklјučivala humani C5, pepsin i njihovu nasumične sekvence, upotrebom ProteinLynx Global Server (PLGS) softvera kompanije Waters. Identifikovani peptidi su uvezeni u DynamX softver, nakon čega su filtrirani prema dva kriterijuma: (1) minimalni proizvodi po aminokiselini = 0,3 i (2) prag datoteke replikacije = 3. DynamX softver je zatim automatski odredio preuzimanje deuterijuma od strane svakog peptida na osnovu retencionog vremena i tačnosti za visoke mase (<10ppm) u više vremenskih tačaka, sa 3 ponavlјanja za svaku vremensku tačku.
[0255] Upotrebom onlajn kolone za pepsin/proteazu XIII u kombinaciji sa MS<E>akvizicijom podataka, identifikovano je ukupno 189 peptida iz humanog C5 u odsustvu ili prisustvu antitela, što predstavlјa pokrivenost sekvence od 62%. Pet peptida je imalo značajno smanjenje u preuzimanja deuterijuma (centroidne delta vrednosti > 0,9 daltona sa p-vrednostima < 0,05) kada su bili vezani za H4H12166P, što je ilustrovano u Tabeli 32.
Tabela 32: Deuterizacija humanih C5 peptida nakon vezivanja za H4H12166P
[0256] Zabeležena masa peptida odgovara prosečnoj vrednosti centroidne MH<+>mase iz tri ponavljanja. Ovi peptidi, koji odgovaraju aminokiselinama 591-599 i 775-794, imali su sporiju stopu deuterizacije nakon vezivanja za H4H12166P. Ovi identifikovani ostaci su takođe odgovarali ostacima 591-599 i 775-794 iz humanog C5, kao što je definisano unosom P01031 u Uniprot bazi podataka (CO5_HUMAN; SEQ ID NO: 359).
Primer 14: Efekat anti-C5 antitela na inflamaciju oka u eksperimentalnom autoimunom uveitisu kod miševa
[0257] Ova studija je preduzeta da bi se procenila uloga C5 u eksperimentalnom autoimunom uveitisu (EAU). Korišćeni su i genetički [C5 nokaut (KO), dvosturki C3/C5 KO miševi] i farmakološki (anti-C5 antitelo) eksperimentalni pristupi.
Postupci
[0258] Upotrebljeni su odrasli C57BL/6J miševi (n=25, Jackson labs), C5 KO (n=13) i C3/C5 KO (n=8) miševi (Regeneron Pharmaceuticals Inc.). EAU je indukovana supkutanom injekcijom humanog interfotoreceptorskog peptida proteina koji vezuje retinoid (IRBP, New England Peptide) u kompletnom Freundovom adjuvansu i intraperitonealnom injekcijom toksina pertusisa. Anti-mišje C5 mAt ili izotipska kontrola mAt davani su putem subkutanih injekcija na svaka 3 dana, od 5. do 28. dana. Anti-mišje C5 antitelo upotrebljeno u ovoj studiji (M1M17628N) sadržavalo je HCVR/LCVR iz SEQ ID NO: 362/363. SPECTRALIS<®>HRA+OCT (Heidelberg Engineering, Inc.) je korišćen za procenu nivoa inflamacije u danima -1, 7, 14, 21 i 28. Sve životinje su eutanazirane 28. dana radi uzorkovanja oka i krvi. Test hemolize sa/bez humanog C3 sprovođen je da bi se potvrdila inhibicija komplementom. Podaci su analizirani upotrebom ANOVA.
Rezultati
[0259] U poređenju sa miševima divljeg tipa, pojava inflamacije (30-50%) i broj ćelijskih klastera u staklastom telu bili su značajno smanjeni kod C5 KO miševa (p<0,01). Rezultati optičke koherentne tomografije (OCT) kod C5 KO miševa takođe su bili značajno smanjeni za 50% u 3. nedelјi (p<0,0001). Zanimlјivo je da je kod C3/C5 dvosturko KO miševa bilo prisutno značajno više ćelijskih klastera u staklastom telu i da su skorovi bolesti bili viši 28. dana u poređenju sa miševima divlјeg tipa (p<0,05). Kod životinja koje su primile anti-mC5 At (50 mg/kg), incidencija inflamacije i ćelijski klasteri u staklastom telu su 21. dana bili značajno niži u poređenju bilo sa grupom bez tretmana ili grupom tretiranom izotipskom kontrolom (p<0,01). U nedeljama 3 i 4, OCT skorovi u grupi tretiranoj sa anti-C5 antitelom bili su značajno niži u poređenju sa grupama bez tretmana ili grupama tretiranim izotipskom kontrolom (p<0,0001). (Slika 7) Testovi hemolize sa/bez humanog C3 potvrdili su efekat inhibicije za anti-C5 antitela u 4. nedelјi (Slika 8).
Zaklјučak
[0260] Inflamacija oka usled EAU je bila ublažena inhibicijom aktivnosti C5, bilo genetičkom delecijom ili farmakološkom inhibicijom sa specifičnim anti-C5 antitelom. Deplecija C5 je odložila pojavu EAU i smanjila OCT skor bolesti. Ovi rezultati ukazuju da je C5 potencijalni terapijski ciljni molekul za autoimuni uveitis. Anti-C5 antitelo ima protektivno delovanje na EAU bolest kod miševa divlјeg tipa. Naši nalazi takođe ukazuju da bi C3 mogao biti od koristi za EAU bolest kod miševa.
Primer 15: Efekat anti-humanih C5 antitela na eksperimentalni autoimuni uveitis
[0261] Ovaj primer opisuje efekte anti-C5 antitela na humani C5 u mišjem modelu eksperimentalnog autoimunog uveitisa (EAU). Miševi upotrebljeni u ovoj studiji su bili humanizovani upotrebom Velocigene<®>tehnologije (Valenzuela i saradnici, 2003, Nat. Biotechnol. 21: 652-659), tako da eksprimiraju humani C5 protein. Humanizovani miševi su bili konstruisani zamenom svih egzona od egzona 2 do egzona 41 mišjeg C5 gena sa egzonima 2-42 humanog C5 gena (opisano u US Patent Application Publication 2015/0313194 koja je ovde uključena u svojoj celosti).
Postupci
[0262] Odrasli mužjaci miševa su subkutano imunizovani u svaku butinu sa 150 µg humanog interfotoreceptorskog peptida proteina koji vezuje retinoid (IRBP) 1-20 (GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD) (SEQ ID NO: 364) (Avichezer i saradnici, 2000, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41:127-131) u 0,2 ml emulzije CFA, sa dodatkom H37RA soja Mycobacterium tuberculosis do 2,5 mg/ml. Miševi su zatim intraperitonealno inokulisani sa 1,0 µg pertusis toksina (PTX) da bi se olakšala indukcija antoimuniteta posredovanog ćelijama, pospešivanjem Th1 polarizacije imunskog odgovora (Thurau i saradnic, 1997, Clin. Exp. Immunol.109: 370-376; Silver i saradnic, 1999, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.40: 2898-2905). Telesne težine životinja su praćene dva puta nedelјno.
[0263] Oftalmološki pregledi su obavlјani dana -1, pre indukcije EAU i 7., 14., 21. i 28. dana. Miševi su anestezirani ketaminom (120 mg/kg, IP) i ksilazinom (5 mg/kg, IP). Zenice su proširivane upotrebom 0,5% oftalmološkog rastvora Tropikamida, a očno dno je pregledano upotrebom kontaktnog sočiva sa kamerom za očno dno u okviru Spectralis Heidelberg platforme za angiografiju retine (HRA) OCT sistem (Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA, SAD).
[0264] Serije od 61 bočnog optičkog preseka dobije su za svako oko upotrebom OCT funkcije na Spectralis HRA OCT sistema (Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA, SAD)). Oblasti OCT snimanja su bile centrirane na optički disk, što je omogućavalo podjednako snimanje iznad i ispod glave optičkog nerva. Deblјina mrežnjače je merena kao rastojanje između dna RPE sloja do unutrašnje ograničavajuće membrane oka. Merenja su vršena na 1500 µm od optičkog diska, a vrednosti iz 4 različita kvadranta mrežnjače (npr. gornjeg, inferiornog, temporalnog i nazalnog) su usrednjavani, da bi se dobila srednja vrednost deblјine mrežnjače oka.
[0265] Ozbilјnost infiltracije inflamatornih ćelija u staklasto telo takođe je ocenjivana na OCT slikama, procenom prosečnog broja klastera inflamatornih ćelija u staklastom telu, u četiri bočna OCT skena po oku koji su presecali optički nerv.
[0266] Razvijena je skala sa 4 stepena gradacije radi procene ozbiljnosti bolesti na OCT slikama (OCT skorovi) (Tabela 33).
Tabela 33: Skorovanje EAU in vivo upotrebom optičke koherentne tomografije (OCT)
Statistička analiza
[0267] Statističke analize parametarskih podataka (telesne težine, klastera inflamatornih ćelija u staklasto telo i deblјina mrežnjače) vršene su jednofaktorskim ANOVA testom i Tukijevim testom za višestruka poređenja. Za neparametarske podatke (OCT skorove i histološke skorove) analize su vršene Kruskal-Wallis-ovim testom i Dann-ovim testom sa GraphPad Prism softverom verzije 5.0d, u odnosu na grupe tretirane izotipskom kontrolom i grupe bez tretmana. Podaci pokazuju srednje vrednosti ±SEM. P-vrednost manja od 0,05 smatrana je statistički značajnom.
Rezultati
[0268] U prvoj studiji (Studiji A), miševi su bili subkutano tretirani na svaka 3 dana počevši od 5. Dana, sa izotipskim kontrolnim antitelom (50 mg/kg), ili sa 10 mg/kg ili 50 mg/kg H4H12170P. Tretman sa 10 mg/kg H4H12170P je rezultirao smanjenjem inflamacije i oštećenja mrežnjače (Slika 9). Miševi tretirani sa 10 mg/kg H4H12170P takođe su pokazali statistički značajno smanjenje OCT skorova 21. i 28. dana (Slika 10).
[0269] U drugoj studiji (studiji B), miševi su subkutano tretirani na svaka 3 dana počevši od 6. Dana, bilo sa izotipskom kontrolom (10 mg/kg), 3 mg/kg ili 10 mg/kg H4H12166P, ili sa Komparatorom 2 (pogledati ovde Primer 2; „Kontrolni konstrukti upotrebljeni u primerima koji slede”); Tretman sa H4H12166P bilo u dozi od 3 mg/kg ili 10 mg/kg doveo je do smanjenja OCT skorova koje je zavisilo od doze i bilo je statistički značajno od 14. do 28. dana (Slika 11). Tretman sa 10 mg/kg H4H12166P kod miševa sa humanizovanim C5 koji je započet 6 dana nakon indukcije EAU, doveo je do smanjenja inflamacije i oštećenja mrežnjače u zavisnosti od doze, što je utvrđeno sa OCT dobijenim 14. do 28. dana (Slika 12).
[0270] Za obe studije, neinvazivna procena tokom života upotrebom OCT, pokazala je progresivan razvoj inflamacije, povećanje deblјine mrežnjače i morfološke abnormalnosti kod kontrolnih životinja nakon imunizacije sa IRBP.
Zaklјučak
[0271] Ovi eksperimenti obezbeđuju dodatne farmakološke dokaze o ulozi C5 u patogenezi autoimunog uveitisa. Farmakološko osiromašenje humanog C5 sa u potpunosti humanim antihumanim C5 antitelima, odložilo je pojavu EAU i smanjilo je ozbilјnost bolesti, čime je ustanovljena efikasnost ovih antitela kod autoimunog uveitisa.
Primer 16: Efekat anti-C5 antitela na renalnu ishemijsko-reperfuzionu povredu
[0272] Ova studija je urađena da bi se procenila uloga C5 u renalnoj ishemijsko-reperfuzionoj povredi. Upotrebljeni su i genetički (upotrebom C3 nokaut i C5 nokaut miševa) i farmakološki pristupi (upotrebom anti-C5 antitela). Model ishemije-reperfuzije indukovan je bilateralnim prekidom protoka krvi kroz bubrežne pedikule tokom 45 minuta, nakon čega je sledija reperfuzija od 48 h. Šam laparotomija je poslužila kao kontrola. Anti-C5 antitelo je davano intravenski u dozi od 50 mg/kg kao jednokratna doza, odmah nakon ishemije (kurativno lečenje); ili subkutano, u dve doze, dana -1 i dana 1 od operacije (preventivno lečenje). Anti-C5 antitelo upotrebljeno za ovu studiju je M1M17628N koje je sadržavalo HCVR/LCVR iz SEQ ID NO: 362/363. Markeri za azot uree u krvi (BUN) i serumski kreatinin upotrebljeni su za procenu nivoa bolesti i protekcije kod miševa.
Tabela 34: Procenat promene nivoa azota uree u krvi kod miševa lečenih anti-C5 antitelom (M1M17628N) u preventivnom i terapijskom režimu
Tabela 35: Procenat promene nivoa serumskog kreatinina kod miševa lečenih anti-C5 antitelom (M1M17628N) u preventivnom i terapijskom režimu
[0273] U poređenju sa miševima divljeg tipa, C3 i C5 nokaut miševi su pokazali značajnu funkcionalnu protekciju u RIRI modelu akutne povrede bubrega, što je dokazano i smanjenjem nivoa azota uree u krvi i serumskog kreatinina. Anti-C5 antitelo je pokazalo funkcionalnu protekciju u RIRI modelu i u preventivnom i u terapijskom režimu (Tabele 34-35).
Primer 17: Efekat anti-C5 antitela na lupusni nefritis
[0274] Ovaj primer opisuje efikasnost anti-C5 antitela u lečenju lupusnog nefritisa u mišjem modelu.
[0275] Sistemski eritematozni lupus (SLE) je autoimuni poremećaj prouzrokovan gubitkom tolerancije na sopstvene antigene, kao i proizvodnjom autoantitela i deponovanjem imunskih kompleksa koji fiksiraju komplement (IC) u povređenim tkivima. SLE karakteriše širok spektar kliničkih manifestacija i cilјanih organa, pri čemu je lupusni nefritis jedna od najozbilјnijih komplikacija. Aktivacija komplementa u bubrezima pacijenata sa lupusni nefritisom doprinosi inflamaciji i oštećenju tkiva. Efikasnost anti-C5 antitela u lečenju lupusnog nefritisa proučavana je kod NZBWF1 miševa, spontanog mišjeg modela lupusnog nefritisa (Yang i saradnici, 1996, PNAS). Miševi razvijaju autoimunu bolest koja podseća na humani SLE, sa autoantitelima na nuklearne antigene i proteine ćelijske membrane, hipergamaglobulinemijom, albuminurijom, proteinurijom, koji iniciraju glomerulonefritisa prouzrokovan imunskim kompleksima i zbog čeka umiru od otkazivanja bubrega i renalne bolesti završnog stadijuma u starosti od 35 do 50 nedelјa.
[0276] Za ovu studiju, NZBWF1 miševi stari 25 nedelja subkutano su tretirani sa 30 mg/kg izotipske kontrole ili anti-C5 antitela, dva puta nedelјno tokom 8 nedelјa, nakon čega je sledio tretman od tri puta nedeljno tokom 10 nedelјa. Anti-mišja C5 antitela upotrebljena za ovu studiju bila su M1M17628N i M1M17627N, koja su sadržavala HCVR/LCVR iz SEQ ID NO: 362/363 i 365/366, tim redom.
[0277] Lečenje anti-C5 antitelima značajno je pobolјšao stopu preživlјavanja kod miševa (Slika 13). Oba antitela su pobolјšala albuminuriju nakon 8-14 nedelјa lečenja (Slika 14), a nivoe azota uree u krvi nakon 12-16 nedelјa lečenja (Slika 15).
Primer 18: Efekat anti-C5 antitela na ćelijsku smrt astrocita
[0278] Optički neuromijelitis (NMO) je autoimuna bolest centralnog nervnog sistema (CNS) koja uglavnom pogađa optički nerv i kičmenu moždinu. U NMO, antikvaporin-4 autoantitela (AQP4-At) prouzrokuju oštećenje astrocita aktiviranjem citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC). Cilјevi ove studije su bili da se proceni uloga sistema komplementa u progresiji NMO, kao i upotreba antitela protiv proteina sistema komplementa kao potencijalan terapijski tretman za NMO.
[0279] Primarni astrociti iz kore velikog mozga pacova dobijeni su iz kore velikog mozga mladunaca pacova odmah nakon rođenja i kultivisani su sa AQP4-At (antitelo „rAt-53” iz US Patent Application Publication 2014/0170140; Bennett i saradnici, 2009, Ann. Neurol. 66: 617-629), kao i proteinima sistema komplementa, da bi se pokazala citotoksičnost posredovana ćelijama. Eksperimenti su zatim ponavljani sa dodatkom anti-C5 antitela da bi se pokazalo blokiranje uništavanja ćelija astrocita.
[0280] Za kvantifikaciju ćelijske smrti, rađen je CytoTox-Glo<™>luminiscentni test citotoksičnosti. Test je koristio različite koncentracije anti-C5 antitela (0,001µg/ml, 0,01µg/ml, 0,1µg/ml, 1µg/ml, 10µg/ml, 100µg/ml ili 1000µg/ml) ili izotipsko kontrolno antitelo.
[0281] Da bi se utvrdilo da li anti-C5 antitelo može blokirati CDC indukovanu sa AQP4-At, astrociti su zasejavani i ponavaljan je CytoTox-GloTM test citotoksičnosti dok nije utvrđena optimalna doza AQP4-At za tu seriju zasejavanja. Nađeno je da je optimalna koncentracija AQP4-At iznosila 50 µg/mL, a u sledećem eksperimentu je upotrebljena konstantna doza AQP4-At (50 µg/mL), dok je doza anti-C5 antitela varirana. Kao što je prikazano na Slici 16, uočeno je smanjenje RLU (u proseku od 300k do prosečnih 100k) sa rastućim količinama anti-C5 antitela što je pokazuje da anti-C5 antitelo blokira ćelijsku smrt astrocita. Za oba eksperimenta, RLU nije varirao sa izotipskim kontrolnim antitelom. Kao što je prikazano na Slici 16, anti-C5 antitela su inhibirala citotoksičnost indukovanu sa AQP4 At u primarnim kortikalnim astrocitima sa IC50 od 15-17nM.
[0282] U narednoj studiji, anti-AQP4 antitelo i anti-C5 antitelo biće injecirani u mozak pacova da bi se procenila terapijska efikasnost u pogledu citotoksičnosti astrocita posredovane komplementom u CNS-u.
Primer 19: Endotelni test
[0283] Ovaj primer opisuje glomerularni endotelni test in vitro, za ispitivanje da li anti-C5 antitela blokiraju deponovanje C5b-9 i C3.
[0284] Reproducibilni postupci za procenu inhibitornih efekata kandidata za lekove na aktivaciju komplementa su od suštinskog značaja za pretklinički razvoj. Usled složenosti puteva aktivacije sistema komplementa, test bi trebao da upotrebljava relevantne ćelije i krajnje tačke za datu terapijsku indikaciju. Ovde, upotrebom imortalizovane humane glomerularne endotelne ćelijske linije (HGEC), model taloženja komplementa C3 i C5 je validiran za upotrebu u proceni blokirajuće aktivnosti za anti-C3 ili C5 mAt.
1
Postupci
[0285] Humane primarne glomerularne endotelne ćelije bubrega (HGEC; Cell Biologics) zasejavane su i inkubirane preko noći u kompletnom medijumu u crnim pločama sa 96 bunarića providnog dna koji su bili obloženi kolagenom I. Ćelije su tretirane bilo sa PBS-om (kontrola) ili su aktivirane tokom 10 minuta sa 10uM ADP. Nakon ispiranja sa PBS-om, dodato je 50% humanog seruma (sa očuvanim sadržajem komplementa, sa osiromašenim sadržajem C3 ili sa osiromašenim sadržajem C5) i ćelije su inkubirane tokom 4 sata. Anti-C5 antitela su dodavana u količini od 1 mg/mL u serum pre tretmana. Ćelije su isprane i fiksirane, pa su testirane dodavanjem anti-C3b antitela (Thermofisher) i/ili anti-C5b-9 antitela (Abcam), kao i sekundarnih antitela, nakon čega su kontrasno obojene sa DAPI bojom. Slike su snimane na ImagExpress insturmentu, a analiza slika visokog sadržaja je upotrebljena za kvantifikaciju fluorescentnog bojenja na svakoj slici, nakon čega su podaci usrednjeni po stanju.
Rezultati
[0286] Deponovanje C3 i C5b-9 je uočeno na HGEC aktiviranim sa ADP koje su bile izložene normalnom humanom serumu, ali ne i na neaktiviranim HGEC (C3: 1,5×10<7>±1,0×10<7>; C5: 7,9×10<6>±6,6×10<6>, P<0,05 u odnosu na HGEC koji nisu bile aktivirane sa ADP). Deponovanje C3 i C5b-9 je bilo značajno smanjeno kod HGEC aktiviranih sa ADP koje su bile izložene serumu sa osiromašenim sadržajem C3 ili C5 (C3: 3,3×10<5>±4,8×10<4>; C5: 1,5×10<6>±6,0×10<5>, P<0,05). Dodavanje blokirajućeg anti-C5 mAt značajno je smanjilo deponovanje C5b-9 poreklom iz normalnog humanog seruma kod HGEC aktiviranih sa ADP, pri čemu je deponovanje bilo uporedivo sa serumima koji su imali smanjem sadržaj C5 (C5 mAt: 1,02×10<6>±6,0×10<5>, Kontrolno mAt 3,7×10<6>±1,6×10<6>, P<0,05 u odnosu na kontrolno mAt).
Zaklјučak
[0287] Ovi podaci pokazuju korisnost in vitro testa sa humanim glomerularnim endotelnim ćelijama kao modelom za deponovanje komplementa C3 i C5. Pored in-vitro skrininga, ovaj test ima potencijal i kao translacioni model za procenu strategija koje deluju na komplement u bubrežnim bolestima, upotrebom uzoraka seruma dobijenih iz pacijenata.
2
SEQUENCE LISTING
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> Anti-C5 Antibodies and Uses Thereof
<130> 10168WO01
<150> 62/349,705
<151> 2016-06-14
<150> 62/405,561
<151> 2016-10-07
<150> 62/422,107
<151> 2016-11-15
<160> 366
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 1
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggaaggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cgtctggatt caccttcagt agttatggca ttcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatgggatg atggaaataa tataaactat 180 tcagactccg tgaagggccg attcatcatc tccagagaca attccaggaa gacagtgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag aggcgaggac acggctgttt attactgtgc gagagatgcc 300 cccatagcac cagtccctga ctattggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Asn Asn Ile Asn Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Val Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Ala Pro Ile Ala Pro Val Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 3
ggattcacct tcagtagtta tggc 24
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 4
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 5
atatgggatg atggaaataa tata 24
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 6
Ile Trp Asp Asp Gly Asn Asn Ile
1 5
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 7
gcgagagatg cccccatagc accagtccct gactat 36
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 8
Ala Arg Asp Ala Pro Ile Ala Pro Val Pro Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 9
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agttggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagacactgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatactt attcgtacac ttttggcctg 300 gggaccaaac tggagatcaa a 321
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Ser Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Leu Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 11
cagagtatta gtagttgg 18
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 12
Gln Ser Ile Ser Ser Trp
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 13
aaggcgtct 9
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 14
Lys Ala Ser
1
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 15
caacagtata atacttattc gtacact 27
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 16
Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Ser Tyr Thr
1 5
<210> 17
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 17
caggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cttctggatt caccttcagt gactactaca tgagctggat ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatat attagcagta gtggtaatac cataaaatat 180 gcagactcta tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa atcactgttt 240 gtggaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaggtataaa 300 agttcgtccg actactttga ccactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 18
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ile Lys Tyr Ala Asp Ser Met 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Phe 65 70 75 80
Val Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Tyr Lys Ser Ser Ser Asp Tyr Phe Asp His Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 19
ggattcacct tcagtgacta ctac 24
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 20
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 21
attagcagta gtggtaatac cata 24
<210> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 22
Ile Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ile
1 5
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 23
gcgaggtata aaagttcgtc cgactacttt gaccac 36
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 24
Ala Arg Tyr Lys Ser Ser Ser Asp Tyr Phe Asp His
1 5 10
<210> 25
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 25
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagg agttacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgc catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagatttag cagtttatta ctgtcagcag tctggcaact ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 26
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Ala Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly Asn Trp Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 27
cagagtgtta ggagttac 18
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 28
Gln Ser Val Arg Ser Tyr
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 29
gatgcatcc 9
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 30
Asp Ala Ser
1
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 31
cagcagtctg gcaactggcc gctcact 27
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 32
Gln Gln Ser Gly Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 33
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 33
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cttgagactc 60 tcctgtggag cgtctggatt caccttcagt acttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atctgggatg atggaaataa taaatattat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attcgaagaa cacgctgtat 240 ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagattca 300 gaggtcgccc cagttgggga ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val Ile Trp Asp Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Ser Glu Val Ala Pro Val Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 35
ggattcacct tcagtactta tggc 24
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 36
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly
1 5
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> synthetic
<400> 37
atctgggatg atggaaataa taaa 24
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 38
Ile Trp Asp Asp Gly Asn Asn Lys
1 5
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 39
gcgagagatt cagaggtcgc cccagttggg gactac 36 <210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 40
Ala Arg Asp Ser Glu Val Ala Pro Val Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 41
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcact 60 atcatttgcc gggccagtca gagtattaac aggtggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaggccc ctaaactcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg cagcttatta ctgccaacag tataatgatt attcgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ile Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Arg Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asp Tyr Ser Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 43
cagagtatta acaggtgg 18
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 44
Gln Ser Ile Asn Arg Trp
1 5
<210> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 45
aaggcgtct 9 <210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 46
Lys Ala Ser
1
<210> 47
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 47
caacagtata atgattattc gtacact 27 <210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 48
Gln Gln Tyr Asn Asp Tyr Ser Tyr Thr
1 5
<210> 49
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gaccactata tggactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggactg gattggccgt attagaaaca aagctaacgc ttataacaca 180 gaatacgccg cgtctgtgag aggcagattc accatctcaa gagatgattc acagaattta 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gatgacacgg ccgtatatta ttgtgttaga 300 gtctggaact acgcctactt cgctatggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Asn Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Asn Leu 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
Tyr Cys Val Arg Val Trp Asn Tyr Ala Tyr Phe Ala Met Asp Val Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 51
ggattcacct tcagtgacca ctat 24
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
Gly Phe Thr Phe Ser Asp His Tyr
1 5
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 53
attagaaaca aagctaacgc ttataacaca 30 <210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 54
Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Asn Thr
1 5 10
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 55
gttagagtct ggaactacgc ctacttcgct atggacgtc 39 <210> 56
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 56
Val Arg Val Trp Asn Tyr Ala Tyr Phe Ala Met Asp Val
1 5 10
<210> 57
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 57
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctatctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc ggtcaagtca gaacattgga atctttttaa actggtatca acaaaaacca 120 ggggaagccc ctaacctcct gatctccgct gcatccagtt tacacagtgg ggtcccttca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcggcag tctgcagcct 240 gaagattttg cgacttacta ctgtcaacag acgtacaata ccatattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa a 321
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Gly Ile Phe 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Asn Leu Leu Ile 35 40 45
Ser Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Asn Thr Ile Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 59
cagaacattg gaatcttt 18
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> synthetic
<400> 60
Gln Asn Ile Gly Ile Phe
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 61
gctgcatcc 9 <210> 62
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 62
Ala Ala Ser
1
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 63
caacagacgt acaataccat attcact 27 <210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 64
Gln Gln Thr Tyr Asn Thr Ile Phe Thr
1 5
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 65
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgaactgggt ccgccagggt 120 ccagggaagg gactggagtg ggtctcagct attagtggtc gtggtgatag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gctcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgt gaaagagggg 300 gagcaactcg tctactggta cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt caccgtctcc 360 tca 363
<210> 66
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Glu Gly Glu Gln Leu Val Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly 100 105 110
Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 67
ggattcacct ttagcagcta tgcc 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 68
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 69
attagtggtc gtggtgatag taca 24 <210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 70
Ile Ser Gly Arg Gly Asp Ser Thr
1 5
<210> 71
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 71
gtgaaagagg gggagcaact cgtctactgg tacttcgatc tc 42 <210> 72
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 72
Val Lys Glu Gly Glu Gln Leu Val Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 73
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 73
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gaccattagc aactttttac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttt caacttactt ctgtcaacag agttacacta ccccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asn Phe 20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ser Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
cagaccatta gcaacttt 18 <210> 76
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 76
Gln Thr Ile Ser Asn Phe
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 77
gctgcatcc 9
<210> 78
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 78
Ala Ala Ser
1
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 79
caacagagtt acactacccc gctcact 27 <210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 80
Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 81
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 81
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgaggt cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttaac agatatgcca tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct ataagtggta gtggtagcag cacatactac 180 acagactccg tgaaaggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa ttcggtggat 240 ctgcaaatgc acagcctgag agtcgaagac acggccatat attattgtgc gagagggact 300 acagtcacta cggggtacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363
<210> 82
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Arg Tyr 20 25 30
Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Val Asp 65 70 75 80
Leu Gln Met His Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Thr Val Thr Thr Gly Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 83
ggattcacct ttaacagata tgcc 24 <210> 84
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 84
Gly Phe Thr Phe Asn Arg Tyr Ala
1 5
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 85
ataagtggta gtggtagcag caca 24 <210> 86
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 86
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr
1 5
<210> 87
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
gcgagaggga ctacagtcac tacggggtac ggtatggacg tc 42
<210> 88
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 88
Ala Arg Gly Thr Thr Val Thr Thr Gly Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 89
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 89
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 ttcacttgcc aggcgagtca ggacattacc aattctttaa attggtatca acagaaacct 120 gggagagccc ctaagctcct gatctacgat gcatcgtatt tgaaggcagg ggtcccatca 180 agattcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtcaacaa tatgatgatc tcccatacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Ser 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Tyr Leu Lys Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Leu Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 91
caggacatta ccaattct 18 <210> 92
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 92
Gln Asp Ile Thr Asn Ser
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 93
gatgcatcg 9 <210> 94
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 94
Asp Ala Ser
1
<210> 95
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> synthetic
<400> 95
caacaatatg atgatctccc atacact 27
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 96
Gln Gln Tyr Asp Asp Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 97
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 97
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtga ctccgtcagt agttcctact ggacctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattggctat atctattaca gtgggagttc caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagc caccatttca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtatatt actgtgcgag agaagggaac 300 gtggatacaa ctatgatatt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 98
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Glu Gly Asn Val Asp Thr Thr Met Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 99
ggtgactccg tcagtagttc ctac 24
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 100
Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 101
atctattaca gtgggagttc c 21
<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 102
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser
1 5
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 103
gcgagagaag ggaacgtgga tacaactatg atatttgact ac 42
<210> 104
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 104
Ala Arg Glu Gly Asn Val Asp Thr Thr Met Ile Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 105
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 105
gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca acagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatcg 180 aggttcgccg gccgtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacaa gatttcaatt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 106
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 106
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ala Gly 50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 107
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 107
cagggcatta gaaatgat 18
<210> 108
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 108
Gln Gly Ile Arg Asn Asp
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 109
gctgcatcc 9
<210> 110
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 110
Ala Ala Ser
1
<210> 111
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 111
ctacaagatt tcaattaccc gtggacg 27
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 112
Leu Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 113
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 113
gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca acagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatcg 180 aggttcgccg gccgtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcatcaa gatttcaatt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 114
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 114
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ala Gly 50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 115
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 115
cagggcatta gaaatgat 18
<210> 116
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 116
Gln Gly Ile Arg Asn Asp
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 117
gctgcatcc 9
<210> 118
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 118
Ala Ala Ser
1
<210> 119
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 119
catcaagatt tcaattaccc gtggacg 27
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 120
His Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 121
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 121
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtga ctccgtcagt agttcctact ggacctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattggctat atctattaca gtgggagttc caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagc caccatttca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtatatt actgtgcgag agaacataac 300 gtggatacaa ctatgatatt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 122
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Glu His Asn Val Asp Thr Thr Met Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 123
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 123
ggtgactccg tcagtagttc ctac 24
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 124
Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 125
atctattaca gtgggagttc c 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 126
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser
1 5
<210> 127
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 127
gcgagagaac ataacgtgga tacaactatg atatttgact ac 42
<210> 128
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 128
Ala Arg Glu His Asn Val Asp Thr Thr Met Ile Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 129
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 129
gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca acagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatcg 180 aggttcgccg gccgtggatc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacaa gatttcaatt acccgtggca cttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 130
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 130
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ala Gly 50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Trp 85 90 95
His Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 131
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 131
cagggcatta gaaatgat 18
<210> 132
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 132
Gln Gly Ile Arg Asn Asp
1 5
<210> 133
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
gctgcatcc 9
<210> 134
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 134
Ala Ala Ser
1
<210> 135
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 135
ctacaagatt tcaattaccc gtggcac 27
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 136
Leu Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Trp His
1 5
<210> 137
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 137
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtga ctccgtcagt agttcctact ggacctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattggctat atctattaca gtgggagttc caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagc caccatttca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtatatt actgtgcgag agaagggaac 300 gtggatacaa ctatgataca tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 138
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Glu Gly Asn Val Asp Thr Thr Met Ile His Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 139
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 139
ggtgactccg tcagtagttc ctac 24
<210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 140
Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 141
atctattaca gtgggagttc c 21
<210> 142
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 142
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser
1 5
<210> 143
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 143
gcgagagaag ggaacgtgga tacaactatg atacatgact ac 42 <210> 144
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 144
Ala Arg Glu Gly Asn Val Asp Thr Thr Met Ile His Asp Tyr
1 5 10
<210> 145
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 145
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtga ctccgtcagt agttcctact ggacctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattggctat atctattaca gtgggagttc caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagc caccatttca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagtt ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtatatt actgtgcgag agaagggaac 300 gtggatcaca ctatgatatt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 146
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 146
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Gly Asn Val Asp His Thr Met Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 147
ggtgactccg tcagtagttc ctac 24
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 148
Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 149
atctattaca gtgggagttc c 21
<210> 150
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 150
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser
1 5
<210> 151
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 151
gcgagagaag ggaacgtgga tcacactatg atatttgact ac 42 <210> 152
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 152
Ala Arg Glu Gly Asn Val Asp His Thr Met Ile Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 153
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 153
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactcctaca tgtcctggat ccgtcaggct 120 ccagggaagg gactagagtg gatttcatac attggtagta gtggtaatac cttttactac 180 gcagactctg tgaagggccg gttcaccatt tccagagaca acgccaacaa tttactgtat 240 ctgcaaatga ccagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagaa 300 ggcgattttt ggagtgccgt tgactcctgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 154
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 154
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Tyr Ile Gly Ser Ser Gly Asn Thr Phe Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Leu Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Gly Asp Phe Trp Ser Ala Val Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 155
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 155
ggattcacct tcagtgactc ctac 24
<210> 156
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 156
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Tyr
1 5
<210> 157
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 157
attggtagta gtggtaatac cttt 24
<210> 158
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 158
Ile Gly Ser Ser Gly Asn Thr Phe
1 5
<210> 159
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 159
gcgagagaag aaggcgattt ttggagtgcc gttgactcc 39
<210> 160
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 160
Ala Arg Glu Glu Gly Asp Phe Trp Ser Ala Val Asp Ser <210> 161
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 161
gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgct gggccagtca gggcattagc agttatttag cctggtatca gcaaaaacca 120 ggtaaagccc ctaaactcct gatccatact gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcaa cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag cttaatagtt acccattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa a 321
<210> 162
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 162
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
His Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 163
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 163
cagggcatta gcagttat 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 164
Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 165
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 165
actgcatcc 9 <210> 166
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 166
Thr Ala Ser
1
<210> 167
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 167
caacagctta atagttaccc attcact 27 <210> 168
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 169
<211> 366
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 169
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcggt ggccatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg gctggcagtt atatcatctg atggcagtaa taaacagtat 180 gcagattctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca atcccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agttggggac acggctattt attactgtgc gaaagaggtg 300 gcacctcgtt attattatta cggtctggac gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366
<210> 170
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 170
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Gly His 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Ala Val Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Lys Gln Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Gly Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Glu Val Ala Pro Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp 100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 171
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> synthetic
<400> 171
ggattcacct tcggtggcca tgcc 24 <210> 172
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 172
Gly Phe Thr Phe Gly Gly His Ala
1 5
<210> 173
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 173
atatcatctg atggcagtaa taaa 24 <210> 174
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 174
Ile Ser Ser Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 175
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 175
gcgaaagagg tggcacctcg ttattattat tacggtctgg acgtc 45 <210> 176
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 176
Ala Lys Glu Val Ala Pro Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val
1 5 10 15
<210> 177
<211> 318
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 177
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcgagtca ggacattagc aattttttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaggttc ctaaactcct gatctatact gcatccactt tacaatcagg ggtcccatct 180 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccgtcagcag cctacagcct 240 gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaag tatgccggcg ccctcacttt cggccctggg 300 accaaagtgg atatcaaa 318
<210> 178
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 178
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Ala Gly Ala Leu Thr 85 90 95
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 179
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 179
caggacatta gcaatttt 18 <210> 180
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 180
Gln Asp Ile Ser Asn Phe
1 5
<210> 181
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 181
actgcatcc 9 <210> 182
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 182
Thr Ala Ser
1
<210> 183
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 183
caaaagtatg ccggcgccct cact 24
<210> 184
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 184
Gln Lys Tyr Ala Gly Ala Leu Thr
1 5
<210> 185
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 185
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggcacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacgtttaga agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggccggagtg ggtctcaggt ataggtggta atggtgttac cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240 ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtat attattgtgt gcaggggggt 300 ttaggtggtt attttacagg ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 186
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 186
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val 35 40 45
Ser Gly Ile Gly Gly Asn Gly Val Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Gln Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Phe Thr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
<210> 187
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 187
ggattcacgt ttagaagcta tgcc 24 <210> 188
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 188
Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala
1 5
<210> 189
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 189
ataggtggta atggtgttac caca 24 <210> 190
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 190
Ile Gly Gly Asn Gly Val Thr Thr
1 5
<210> 191
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> synthetic
<400> 191
gtgcaggggg gtttaggtgg ttattttaca ggctac 36
<210> 192
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 192
Val Gln Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Phe Thr Gly Tyr
1 5 10
<210> 193
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 193
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagtattagt acctatttaa attggtatca gcagaatcca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctttgat gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagagg tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagtg ccccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 194
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 194
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Phe Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 195
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 195
cagagtatta gtacctat 18
<210> 196
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 196
Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
1 5
<210> 197
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 197
gatgcatcc 9
<210> 198
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 198
Asp Ala Ser
1
<210> 199
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 199
caacagagtt acagtgcccc gctcact 27
<210> 200
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 200
Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr
1 5
<210> 201
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 201
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt ggttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatggcttg atggaagtaa tgactactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgttatat 240 ctgcaaatga acagactgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatggc 300 ccggttgctg ctatacccga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 202
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 202
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Trp Leu Asp Gly Ser Asn Asp Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gly Pro Val Ala Ala Ile Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 203
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 203
ggattcacct tcagtggtta tggc 24
<210> 204
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 204
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly
1 5
<210> 205
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 205
atatggcttg atggaagtaa tgac 24
<210> 206
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 206
Ile Trp Leu Asp Gly Ser Asn Asp
1 5
<210> 207
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 207
gcgagagatg gcccggttgc tgctataccc gactac 36
<210> 208
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 208
Ala Arg Asp Gly Pro Val Ala Ala Ile Pro Asp Tyr
1 5 10
<210> 209
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 209
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt aggtggttgg cctggtatca gctgaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcaacct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatactt attcgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 210
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 210
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Ser Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 211
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 211
cagagtatta gtaggtgg 18
<210> 212
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 212
Gln Ser Ile Ser Arg Trp
1 5
<210> 213
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 213
aaggcgtct 9
<210> 214
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 214
Lys Ala Ser
1
<210> 215
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 215
caacagtata atacttattc gtacact 27
<210> 216
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 216
Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Ser Tyr Thr
1 5
<210> 217
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 217
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gaatatggca tgacttgggt ccgccaagtt 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt attacttgga atggtggttt cacagattat 180 acagactctg tgaagggccg attcaccagc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt attactgtgc gagagatgga 300 tatagcagct cgtggggggc ttatgatata tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360 tca 363
<210> 218
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr 20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Gly Ile Thr Trp Asn Gly Gly Phe Thr Asp Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ser Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Ser Ser Trp Gly Ala Tyr Asp Ile Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 219
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 219
ggattcacct ttgatgaata tggc 24
<210> 220
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 220
Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr Gly
1 5
<210> 221
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 221
attacttgga atggtggttt caca 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 222
Ile Thr Trp Asn Gly Gly Phe Thr
1 5
<210> 223
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 223
gcgagagatg gatatagcag ctcgtggggg gcttatgata ta 42 <210> 224
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 224
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Ser Ser Trp Gly Ala Tyr Asp Ile
1 5 10
<210> 225
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 225
gacatccaga tgacccagtc tccatcatcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc acctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatta 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggactgat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caagttattt ctgtcaacag agttacagta ccccgtacac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 226
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 226
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 227
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 227
cagagcatta gcacctat 18
<210> 228
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 228
Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
1 5
<210> 229
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
gctgcatcc 9
<210> 230
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 230
Ala Ala Ser
1
<210> 231
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 231
caacagagtt acagtacccc gtacact 27
<210> 232
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 232
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 233
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 233
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttaat gattatgcca tgcactgggt ccgtcaagct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctctctt attagtggag atggtggtaa cacatactat 180 gcagactctg tgaagggccg actcaccatc tccagagaca acagcaaaaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag aacagaggac accgccttat attactgtgc aaaagataag 300 ggctggaact tcggttactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac tgtctcctca 360 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 234
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Leu Ile Ser Gly Asp Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Lys Gly Trp Asn Phe Gly Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 235
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 235
ggattcacct ttaatgatta tgcc 24
<210> 236
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 236
Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala
1 5
<210> 237
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 237
attagtggag atggtggtaa caca 24 <210> 238
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 238
Ile Ser Gly Asp Gly Gly Asn Thr
1 5
<210> 239
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 239
gcaaaagata agggctggaa cttcggttac ttcgatctc 39 <210> 240
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 240
Ala Lys Asp Lys Gly Trp Asn Phe Gly Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 241
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 241
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctacat ctgtgggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gaacattgac acctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctatgat gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180 cggttcagtg gcagcggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaccag tctgcaacct 240 gaagattttg ccacttacta ctgtcaacag aatgacaata ttcttcaccc tctcactttc 300 ggcggaggga ccaaggtgga gatcaaa 327
<210> 242
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 242
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asp Thr Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asp Asn Ile Leu His 85 90 95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 243
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 243
cagaacattg acacctat 18
<210> 244
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 244
Gln Asn Ile Asp Thr Tyr
1 5
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 245
gatgcatcc 9
<210> 246
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 246
Asp Ala Ser
1
<210> 247
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 247
caacagaatg acaatattct tcaccctctc act 33 <210> 248
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 248
Gln Gln Asn Asp Asn Ile Leu His Pro Leu Thr
1 5 10
<210> 249
<211> 369
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 249
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccaac cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt ccactctaat agatattgga tggactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga ggaaaactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactttat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcga 300 agcacctcgt gggtccctta ctggttcttc gatctctggg gccgtggcac cctggtcact 360 gtctcctca 369
<210> 250
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 250
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe His Ser Asn Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Glu Asn Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Ser Thr Ser Trp Val Pro Tyr Trp Phe Phe Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 251
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 251
ggattccact ctaatagata ttgg 24
<210> 252
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 252
Gly Phe His Ser Asn Arg Tyr Trp
1 5
<210> 253
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 253
ataaagcaag atggaagtga ggaa 24 <210> 254
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 254
Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Glu
1 5
<210> 255
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 255
gcgagagatc gaagcacctc gtgggtccct tactggttct tcgatctc 48 <210> 256
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 256
Ala Arg Asp Arg Ser Thr Ser Trp Val Pro Tyr Trp Phe Phe Asp Leu 1 5 10 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 257
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 258
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 258
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 259
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 259
cagagcatta gcagctat 18
<210> 260
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 260
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 261
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 261
gctgcatcc 9
<210> 262
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 262
Ala Ala Ser
1
<210> 263
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 263
caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30 <210> 264
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 264
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
<210> 265
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 265
gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtacagc ggggggagtc cctgagactc 60 tcctgttcag cctctgactt catctttaaa gattatgcca tgtactgggt ccgtcaaatt 120 ccagggaagg gtctagagtg gatctctctt attagtggtg atggtgacac tacatggtat 180 ggagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acaacgaaaa ctccctcttt 240 ctgcaaatga acgatctgag aactgaggac accgccatgt actactgtgc aagagatatg 300 gggtggaact tctttcagtt gcaatactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 266
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 266
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Arg Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Asp Phe Ile Phe Lys Asp Tyr 20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ile Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Gly Asp Gly Asp Thr Thr Trp Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asn Glu Asn Ser Leu Phe 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Met Gly Trp Asn Phe Phe Gln Leu Gln Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 267
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
gacttcatct ttaaagatta tgcc 24 <210> 268
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 268
Asp Phe Ile Phe Lys Asp Tyr Ala
1 5
<210> 269
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 269
attagtggtg atggtgacac taca 24 <210> 270
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 270
Ile Ser Gly Asp Gly Asp Thr Thr
1 5
<210> 271
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 271
gcaagagata tggggtggaa cttctttcag ttgcaatac 39 <210> 272
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> synthetic
<400> 272
Ala Arg Asp Met Gly Trp Asn Phe Phe Gln Leu Gln Tyr
1 5 10
<210> 273
<211> 361
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 273
dcaggtgcag ctgcaggagt cgggccccgc actggtgaag ccttcacaga ccctgtccct 60 cacctgcact gtctctggtg gctccatcat cagaggtagt acctactgga gttgggtccg 120 ccaattccca gggaagggcc tggagtggat tggatacagt tattacagtg ggaccgccta 180 ctataatccg tccctcgaga gtcgagctac catttctgta gacacgtcta agaaccagtt 240 ctccctgaac ctgaagtctg tgacggccgc ggacacggcc gtgtattatt gtacaagaga 300 aataggagtg gctggtctct ttgacatctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc 360 a 361
<210> 274
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 274
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ile Arg Gly
20 25 30
Ser Thr Tyr Trp Ser Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Ser Leu Asn Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Thr Arg Glu Ile Gly Val Ala Gly Leu Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 275
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 275
ggtggctcca tcatcagagg tagtacctac 30
<210> 276
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 276
Gly Gly Ser Ile Ile Arg Gly Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 277
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 277
agttattaca gtgggaccgc c 21
<210> 278
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 278
Ser Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala
1 5
<210> 279
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 279
acaagagaaa taggagtggc tggtctcttt gacatc 36
<210> 280
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 280
Thr Arg Glu Ile Gly Val Ala Gly Leu Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 281
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 281
gaaatagttt tgacacagag tcccggcaca ctgtcactct ctcccgggga aagagccacc 60 ttgtcatgta gagcaagtca gtcagtctct agctcttatc tcgcctggta ccagcagaag 120 ccgggacagg cccctagact gctgatctac ggggcaagtt ccagggccac cggaatcccc 180 gaccggttca gtggaagcgg aagcggaacc gattttactt tgacgatttc tagactggag 240 ccagaggatt tcgccgttta ctattgtcaa cagtacggaa gcagcccgtg gacgtttggc 300 cagggcacga aggtagaaat caag 324
<210> 282
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 282
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 283
agagcaagtc agtcagtctc tagctcttat ctcgcc 36 <210> 284
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 284
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 285
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 285
ggggcaagtt ccagggccac c 21 <210> 286
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 286
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 287
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 287
caacagtacg gaagcagccc gtggacg 27
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 288
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
<210> 289
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 289
caggagcagt tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgtaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tacattgggt gcgacaggcc 120 cctggactag ggcttgaatg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaaatat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcaa tacagcctac 240 atggagctga aaagactgaa atctgacgac tcggccgtat attactgtgc gagagacgcc 300 cctccccatg atgtttttga tatctggggc caagggacat tggtcaccgt ctcttca 357
<210> 290
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 290
Gln Glu Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Leu Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Lys Arg Leu Lys Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Ala Pro Pro His Asp Val Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 291
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 291
ggatacacct tcaccggcta ctat 24 <210> 292
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 292
Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr
1 5
<210> 293
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 293
atcaacccta acagtggtgg caca 24 <210> 294
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 294
Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr
1 5
<210> 295
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 295
gcgagagacg cccctcccca tgatgttttt gatatc 36
<210> 296
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 296
Ala Arg Asp Ala Pro Pro His Asp Val Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 297
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 297
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaattgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacag cataatagtt acccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 298
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 298
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ile Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 299
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 299
cagggcatta gaaatgat 18
<210> 300
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 300
Gln Gly Ile Arg Asn Asp
1 5
<210> 301
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 301
gctgcatcc 9
<210> 302
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 302
Ala Ala Ser
1
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 303
ctacagcata atagttaccc gctcact 27
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 304
Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 305
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 305
caggtgcagc tgcaagagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agtggtgctt accactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct agagtggatt ggatacatct attacaatgg ggacacctac 180 tataatccgt ccctcaagag tcgcgttacc atttcagtgg acacgtctaa gaaccaattc 240 ttcctgaagg tgacctctgt gactgccgcg gacacggcca tgtattactg tgcgggagaa 300 aagcagctga ctgcttttga tatctggggc caagggacat tggtcaccgt ctcttca 357
<210> 306
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 306
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Ala Tyr His Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Asn Gly Asp Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80
Phe Leu Lys Val Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Gly Glu Lys Gln Leu Thr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 307
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 307
ggtggctcca tcagtagtgg tgcttaccac 30
<210> 308
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 308
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Ala Tyr His
1 5 10
<210> 309
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 309
atctattaca atggggacac c 21
<210> 310
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 310
Ile Tyr Tyr Asn Gly Asp Thr
1 5
<210> 311
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 311
gcgggagaaa agcagctgac tgcttttgat atc 33
<210> 312
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 312
Ala Gly Glu Lys Gln Leu Thr Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 313
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 313
gtcatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 ataacttgcc gggcgagtca ggacattaat aattttttaa attggtatca acagaaatta 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctccgat gcatccaatt tgcagacagg agtcccgtca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatattg ctgcatatta ctgtcaacaa tatgatcatt tcccgtatac ttttggccag 300 gggaccagac tggagaacaa t 321
<210> 314
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
Val Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Phe 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Ser Asp Ala Ser Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Phe Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Asn Asn
100 105
<210> 315
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 315
caggacatta ataatttt 18
<210> 316
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 316
Gln Asp Ile Asn Asn Phe
1 5
<210> 317
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 317
gatgcatcc 9
<210> 318
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 318
Asp Ala Ser
1
<210> 319
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 319
caacaatatg atcatttccc gtatact 27
<210> 320
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 320
Gln Gln Tyr Asp His Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 321
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 321
gaggtgcagt tggtggagtc tgggggaggt gtggttcggc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgacctgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt attaattgga atggcgatag cacagagtat 180 tcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttct atcactgtgc gagagagaat 300 aactggaact tctactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 322
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> synthetic
<400> 322
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Glu Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr His Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Asn Asn Trp Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 323
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 323
ggattcacct ttgatgatta tggc 24
<210> 324
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 324
Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly
1 5
<210> 325
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 325
attaattgga atggcgatag caca 24
<210> 326
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 326
Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr
1 5
<210> 327
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 327
gcgagagaga ataactggaa cttctacttt gactac 36
<210> 328
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 328
Ala Arg Glu Asn Asn Trp Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 329
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 329
gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctcgagggga aagagccacc 60 ctctcctgta gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaactt 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ttgtcagcag tataataact ggccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 330
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Arg Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 331
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 331
cagagtgtta gcagcaac 18
<210> 332
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 332
Gln Ser Val Ser Ser Asn
1 5
<210> 333
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 333
ggtgcatcc 9
<210> 334
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 334
Gly Ala Ser
1
<210> 335
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 335
cagcagtata ataactggcc gtggacg 27
<210> 336
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 336
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp Thr
1 5
<210> 337
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 337
caggtccacc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg tttccggaaa caccctcact gaattatcca tgcactgggt gcgacaggct 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttgatcctg aagatggtga cacaatctac 180 tcacagaagt tccagggcag agtcaccttg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgttc aacagtgggg 300 ggacctacct ctgactgctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351
<210> 338
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 338
Gln Val His Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Asn Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Ile Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser Thr Val Gly Gly Pro Thr Ser Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 339
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 339
ggaaacaccc tcactgaatt atcc 24
<210> 340
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 340
Gly Asn Thr Leu Thr Glu Leu Ser
1 5
<210> 341
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 341
tttgatcctg aagatggtga caca 24 <210> 342
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 342
Phe Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr
1 5
<210> 343
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 343
tcaacagtgg ggggacctac ctctgactgc 30 <210> 344
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 344
Ser Thr Val Gly Gly Pro Thr Ser Asp Cys
1 5 10
<210> 345
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaggtcct gatcttcgat gcatccaatt tagaaccagg ggtcccatca 180 aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcatcag cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtcaacaa tatgataatc tcccgatcac cttcggccag 300 gggacacgac tggacattaa a 321
<210> 346
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 346
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45
Phe Asp Ala Ser Asn Leu Glu Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ile Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 347
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 347
caggacatta gcaactat 18
<210> 348
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 348
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1 5
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 349
gatgcatcc 9 <210> 350
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 350
Asp Ala Ser
1
<210> 351
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 351
caacaatatg ataatctccc gatcacc 27 <210> 352
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 352
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Ile Thr
1 5
<210> 353
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> HC
<400> 353
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Glu Gly Asn Val Asp Thr Thr Met Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445
<210> 354
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LC
<400> 354
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ala Gly 50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 355
<211> 1676
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human C5
<400> 355
Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15
Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg 20 25 30
Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu 35 40 45
Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe 50 55 60
Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80
Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln 85 90 95
Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110
Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125
His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg 130 135 140
Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val 145 150 155 160
Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu 165 170 175
Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser 180 185 190
Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp 195 200 205
Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu 210 215 220
Pro His Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr 225 230 235 240
Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr 245 250 255
Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg 260 265 270
Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln 275 280 285
Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu 290 295 300
Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn 305 310 315 320
Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335
Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr 340 345 350
Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro 355 360 365
Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly 370 375 380
Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu 385 390 395 400
Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly 405 410 415
Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu 420 425 430
Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr 450 455 460
Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu 465 470 475 480
His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile 485 490 495
Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe 500 505 510
Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile 515 520 525
Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr 530 535 540
Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp 545 550 555 560
Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser 565 570 575
Pro Asp Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met 580 585 590
Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala 595 600 605
Val Tyr Gly Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe 610 615 620
Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu 625 630 635 640
Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn 645 650 655
Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile 660 665 670
Leu Arg Pro Arg Arg Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala 675 680 685
Lys Tyr Lys His Ser Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys 690 695 700
Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu 705 710 715 720
Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser 725 730 735
Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu 740 745 750
His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr 755 760 765
Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys 770 775 780
Gln Leu Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln 785 790 795 800
Gly Val Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys 805 810 815
Ala Lys Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser 820 825 830
Val Val Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr 835 840 845
Arg Thr Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly 850 855 860
Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser 865 870 875 880
Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val 885 890 895
Thr Phe Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe 900 905 910
Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg 915 920 925
Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu 930 935 940
Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro 945 950 955 960
Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile 965 970 975
Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu 980 985 990
Ser Gln Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala 995 1000 1005
Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His Tyr 1010 1015 1020
Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro Leu Ile 1025 1030 1035 1040
Glu Lys Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met Leu Ser Ile 1045 1050 1055
Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val Trp Lys Gly Gly 1060 1065 1070
Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu Arg Val Leu Gly Gln 1075 1080 1085
Val Asn Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn Ser Ile Cys Asn Ser Leu 1090 1095 1100
Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu 1105 1110 1115 1120
Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu 1125 1130 1135
Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile 1140 1145 1150
Arg Lys Ala Phe Asp Ile Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu 1155 1160 1165
Ile Lys Ala Asp Asn Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser 1170 1175 1180
Thr Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys 1185 1190 1195 1200
Thr His Pro Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala 1205 1210 1215
Leu Val Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn Leu 1220 1225 1230
Gln His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val 1235 1240 1245
Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp Ile 1250 1255 1260
Asn Tyr Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln Arg Tyr 1265 1270 1275 1280
Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala Ile Glu Gly 1285 1290 1295
Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg Leu Ser Met Asp 1300 1305 1310
Ile Asp Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val Glu Val Leu Leu Asn Asp 1330 1335 1340
Asp Leu Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val His 1345 1350 1355 1360
Val Thr Thr Val Val His Lys Thr Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser 1365 1370 1375
Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg 1380 1385 1390
Gly Tyr Gly Asn Ser Asp Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr 1395 1400 1405
Lys Pro Ser Arg Glu Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met 1410 1415 1420
Asp Ile Ser Leu Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys 1425 1430 1435 1440
Ala Leu Val Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys 1445 1450 1455
Asp Gly His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe 1460 1465 1470
Leu Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu 1475 1480 1485
Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys Gln 1490 1495 1500
Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys Val Cys 1505 1510 1515 1520
Glu Gly Ala Ala Cys Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly Gln Met Gln 1525 1530 1535
Glu Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg Lys Gln Thr Ala 1540 1545 1550
Cys Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val Ser Ile Thr Ser Ile 1555 1560 1565
Thr Val Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys Ala Thr Leu Leu Asp Ile 1570 1575 1580
Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe 1585 1590 1595 1600
Ile Lys Lys Val Thr Cys Thr Asn Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln 1605 1610 1615
Tyr Leu Ile Met Gly Lys Glu Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Ser 1620 1625 1630
Phe Arg Tyr Ile Tyr Pro Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp 1635 1640 1645
Pro Arg Asp Thr Thr Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu 1650 1655 1660
Asp Glu Phe Ala Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys
1665 1670 1675
<210> 356
<211> 1686
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hC5 R885H
aa 1-1658: hC5 (aa 19-1676 of NM_001735.2 with
R885H change)
aa 1659-1686: myc-myc-hexahistidine tag
<400> 356
Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg Val Gly 1 5 10 15
Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu Ala Phe 20 25 30
Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe Ser Tyr 35 40 45
Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln Asn Ser 50 55 60
Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln Asn Pro 65 70 75 80
Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser Lys Ser 85 90 95
Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile His Thr 100 105 110
Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg Val Tyr 115 120 125
Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val Leu Thr 130 135 140
Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu Ile Asp 145 150 155 160
His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser Asn Pro 165 170 175
Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp Phe Ser 180 185 190
Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro His 195 200 205
Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr Lys Asn 210 215 220
Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr Asn Lys 225 230 235 240
Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg Glu Asp 245 250 255
Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln Asn Thr 260 265 270
Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu Thr Ala 275 280 285
Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn Lys Tyr 290 295 300
Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe Ser Glu 305 310 315 320
Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr Lys Leu 325 330 335
Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro Tyr Pro 340 345 350
Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly Gly Val 355 360 365
Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu Thr Ser 370 375 380
Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly Val Ala 385 390 395 400
Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala Arg Glu 420 425 430
Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr Leu Tyr 435 440 445
Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu His Leu 450 455 460
Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile Thr His 465 470 475 480
Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe Gly Thr 485 490 495
Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile Pro Val 500 505 510
Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr Ile Val 515 520 525
Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp Leu Asn 530 535 540
Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser Pro Asp 545 550 555 560
Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met Ala Thr 565 570 575
Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala Val Tyr 580 585 590
Gly Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe Gln Phe 595 600 605
Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu Asn Asn 610 615 620
Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn Ala Asn 625 630 635 640
Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile Leu Arg 645 650 655
Pro Arg Arg Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr 660 665 670
Lys His Ser Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn 675 680 685
Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro 690 695 700
Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu 705 710 715 720
Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu His Met 725 730 735
Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr Phe Pro 740 745 750
Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys Gln Leu 755 760 765
Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln Gly Val 770 775 780
Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys Ala Lys 785 790 795 800
Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser Val Val 805 810 815
Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr Arg Thr 820 825 830
Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly Ile Cys 835 840 845
Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser Ser Lys 850 855 860
Cys Val His Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val Thr Phe 865 870 875 880
Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe Ser Leu 885 890 895
Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg Val Val 900 905 910
Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu Asp Pro 915 920 925
Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro Tyr Arg 930 935 940
Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile Leu Ser 945 950 955 960
Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu Ser Gln 965 970 975
Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala Glu Ala 980 985 990
Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His Tyr Leu Glu 995 1000 1005
Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro Leu Ile Glu Lys 1010 1015 1020
Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met Leu Ser Ile Met Ser 1025 1030 1035 1040
Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val Trp Lys Gly Gly Ser Ala 1045 1050 1055
Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu Arg Val Leu Gly Gln Val Asn 1060 1065 1070
Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp 1075 1080 1085
Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser 1090 1095 1100
Gln Tyr Gln Pro Ile Lys Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg 1105 1110 1115 1120
Glu Asn Ser Leu Tyr Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys 1125 1130 1135
Ala Phe Asp Ile Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu Ile Lys 1140 1145 1150
Ala Asp Asn Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe 1155 1160 1165
Thr Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His 1170 1175 1180
Pro Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val 1185 1190 1195 1200
Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn Leu Gln His 1205 1210 1215
Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val Glu Thr 1220 1225 1230
Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp Ile Asn Tyr 1235 1240 1245
Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln Arg Tyr Gly Gly 1250 1255 1260
Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala Ile Glu Gly Leu Thr 1265 1270 1275 1280
Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg Leu Ser Met Asp Ile Asp Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu His Asn Tyr Lys Met Thr Asp 1300 1305 1310
Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu 1315 1320 1325
Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr 1330 1335 1340
Thr Val Val His Lys Thr Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr 1345 1350 1355 1360
Leu Lys Ile Asp Thr Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr 1365 1370 1375
Gly Asn Ser Asp Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro 1380 1385 1390
Ser Arg Glu Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile 1395 1400 1405
Ser Leu Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu 1410 1415 1420
Val Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly 1425 1430 1435 1440
His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu Cys 1445 1450 1455
Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu Ser Pro 1460 1465 1470
Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys Gln Cys Thr 1475 1480 1485
Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys Val Cys Glu Gly 1490 1495 1500
Ala Ala Cys Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly Gln Met Gln Glu Glu 1505 1510 1515 1520
Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg Lys Gln Thr Ala Cys Lys 1525 1530 1535
Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val Ser Ile Thr Ser Ile Thr Val 1540 1545 1550
Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys 1555 1560 1565
Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe Ile Lys 1570 1575 1580
Lys Val Thr Cys Thr Asn Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln Tyr Leu 1585 1590 1595 1600
Ile Met Gly Lys Glu Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Ser Phe Arg 1605 1610 1615
Tyr Ile Tyr Pro Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Arg 1620 1625 1630
Asp Thr Thr Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu 1635 1640 1645
Phe Ala Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys Glu Gln Lys Leu Ile Ser 1650 1655 1660
Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1665 1670 1675 1680
His His His His His His
1685
<210> 357
<211> 1686
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hC5 R885C
aa 1-1658: hC5 (aa 19-1676 of NM_001735.2 with
R885C change)
aa 1659-1686: myc-myc-hexahistidine tag
<400> 357
Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg Val Gly 1 5 10 15
Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu Ala Phe 20 25 30
Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe Ser Tyr 35 40 45
Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln Asn Ser 50 55 60
Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln Asn Pro 65 70 75 80
Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser Lys Ser 85 90 95
Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile His Thr 100 105 110
Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg Val Tyr 115 120 125
Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val Leu Thr 130 135 140
Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu Ile Asp 145 150 155 160
His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser Asn Pro 165 170 175
Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp Phe Ser 180 185 190
Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro His 195 200 205
Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr Lys Asn 210 215 220
Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr Asn Lys 225 230 235 240
Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg Glu Asp 245 250 255
Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln Asn Thr 260 265 270
Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu Thr Ala 275 280 285
Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn Lys Tyr 290 295 300
Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe Ser Glu 305 310 315 320
Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr Lys Leu 325 330 335
Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro Tyr Pro 340 345 350
Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu Thr Ser 370 375 380
Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly Val Ala 385 390 395 400
Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu Phe Asn 405 410 415
Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala Arg Glu 420 425 430
Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr Leu Tyr 435 440 445
Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu His Leu 450 455 460
Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile Thr His 465 470 475 480
Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe Gly Thr 485 490 495
Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile Pro Val 500 505 510
Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr Ile Val 515 520 525
Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp Leu Asn 530 535 540
Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser Pro Asp 545 550 555 560
Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met Ala Thr 565 570 575
Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala Val Tyr 580 585 590
Gly Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe Gln Phe 595 600 605
Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu Asn Asn 610 615 620
Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn Ala Asn 625 630 635 640
Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile Leu Arg 645 650 655
Pro Arg Arg Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr 660 665 670
Lys His Ser Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn 675 680 685
Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro 690 695 700
Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu 705 710 715 720
Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu His Met 725 730 735
Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr Phe Pro 740 745 750
Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys Gln Leu 755 760 765
Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln Gly Val 770 775 780
Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys Ala Lys 785 790 795 800
Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser Val Val 805 810 815
Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr Arg Thr 820 825 830
Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly Ile Cys 835 840 845
Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser Ser Lys 850 855 860
Cys Val Cys Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val Thr Phe 865 870 875 880
Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe Ser Leu 885 890 895
Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg Val Val 900 905 910
Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu Asp Pro 915 920 925
Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro Tyr Arg 930 935 940
Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile Leu Ser 945 950 955 960
Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu Ser Gln 965 970 975
Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala Glu Ala 980 985 990
Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His Tyr Leu Glu 995 1000 1005
Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro Leu Ile Glu Lys 1010 1015 1020
Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met Leu Ser Ile Met Ser 1025 1030 1035 1040
Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val Trp Lys Gly Gly Ser Ala 1045 1050 1055
Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu Arg Val Leu Gly Gln Val Asn 1060 1065 1070
Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp 1075 1080 1085
Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser 1090 1095 1100
Gln Tyr Gln Pro Ile Lys Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg 1105 1110 1115 1120
Glu Asn Ser Leu Tyr Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys 1125 1130 1135
Ala Phe Asp Ile Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu Ile Lys 1140 1145 1150
Ala Asp Asn Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe 1155 1160 1165
Thr Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His 1170 1175 1180
Pro Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val 1185 1190 1195 1200
Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn Leu Gln His 1205 1210 1215
Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val Glu Thr 1220 1225 1230
Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp Ile Asn Tyr Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln Arg Tyr Gly Gly 1250 1255 1260
Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala Ile Glu Gly Leu Thr 1265 1270 1275 1280
Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg Leu Ser Met Asp Ile Asp 1285 1290 1295
Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu His Asn Tyr Lys Met Thr Asp 1300 1305 1310
Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu 1315 1320 1325
Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr 1330 1335 1340
Thr Val Val His Lys Thr Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr 1345 1350 1355 1360
Leu Lys Ile Asp Thr Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr 1365 1370 1375
Gly Asn Ser Asp Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro 1380 1385 1390
Ser Arg Glu Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile 1395 1400 1405
Ser Leu Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu 1410 1415 1420
Val Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly 1425 1430 1435 1440
His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu Cys 1445 1450 1455
Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu Ser Pro 1460 1465 1470
Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys Gln Cys Thr 1475 1480 1485
Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys Val Cys Glu Gly 1490 1495 1500
Ala Ala Cys Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly Gln Met Gln Glu Glu 1505 1510 1515 1520
Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg Lys Gln Thr Ala Cys Lys 1525 1530 1535
Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val Ser Ile Thr Ser Ile Thr Val 1540 1545 1550
Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys 1555 1560 1565
Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe Ile Lys 1570 1575 1580
Lys Val Thr Cys Thr Asn Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln Tyr Leu 1585 1590 1595 1600
Ile Met Gly Lys Glu Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Ser Phe Arg 1605 1610 1615
Tyr Ile Tyr Pro Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Arg 1620 1625 1630
Asp Thr Thr Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu 1635 1640 1645
Phe Ala Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys Glu Gln Lys Leu Ile Ser 1650 1655 1660
Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1665 1670 1675 1680
His His His His His His
1685
<210> 358
<211> 1686
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M. fascicularis C5 R885H
aa 1-1658: M. fascicularis C5 (determined
in-house; NTBK#12480)
aa 1659-1686: myc-myc-hexahistidine tag
<400> 358
Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg Val Gly 1 5 10 15
Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu Ala Phe 20 25 30
Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe Ser Tyr 35 40 45
Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln Asn Ser 50 55 60
Ala Val Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln Asn Gln 65 70 75 80
Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser Lys Ser 85 90 95
Lys Lys Ile Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile His Thr 100 105 110
Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg Val Tyr 115 120 125
Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val Leu Thr 130 135 140
Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Ile Asp Met Val Glu Glu Ile Asp 145 150 155 160
His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser Asn Pro 165 170 175
Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Gln Ala Lys Tyr Lys Glu Asp Phe Ser 180 185 190
Thr Thr Gly Thr Ala Phe Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro His 195 200 205
Phe Ser Val Ser Val Glu Pro Glu Ser Asn Phe Ile Gly Tyr Lys Asn 210 215 220
Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr Asn Lys 225 230 235 240
Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg Glu Asp 245 250 255
Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln Asn Thr 260 265 270
Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu Thr Ala 275 280 285
Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn Lys Tyr 290 295 300
Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr Lys Leu 325 330 335
Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro Tyr Ser 340 345 350
Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ala Leu Asp Gln Leu Val Gly Gly Val 355 360 365
Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu Thr Ser 370 375 380
Asp Leu Glu Pro Arg Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly Val Ala 385 390 395 400
Ser Phe Val Val Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu Phe Asn 405 410 415
Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Asp Glu Asn Gln Ala Arg Glu 420 425 430
Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr Leu Tyr 435 440 445
Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu Tyr Leu 450 455 460
Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile Thr His 465 470 475 480
Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe Gly Thr 485 490 495
Arg Glu Lys Leu Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile Pro Val 500 505 510
Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr Ile Val 515 520 525
Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp Leu Asn 530 535 540
Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser Pro Asp 545 550 555 560
Ala Asp Thr Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met Val Thr 565 570 575
Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Thr Ala Val Asp Ser Ala Val Tyr 580 585 590
Gly Val Gln Arg Arg Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe Gln Phe 595 600 605
Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu Asn Asn 610 615 620
Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn Ala Asn 625 630 635 640
Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile Ile Arg 645 650 655
Pro Arg Arg Met Leu Gln Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr 660 665 670
Lys His Leu Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Val Arg Ile Asn 675 680 685
His Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Val Gly Pro 690 695 700
Arg Cys Val Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu 705 710 715 720
Arg Ala Asn Asn Ser His Lys Asp Leu Gln Leu Gly Arg Leu His Met 725 730 735
Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr Phe Pro 740 745 750
Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys Gln Leu 755 760 765
Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Val Thr Thr Trp Glu Ile Gln Gly Val 770 775 780
Gly Ile Ser Asn Ser Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Ile Lys Ala Lys 785 790 795 800
Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser Val Val 805 810 815
Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr Arg Thr 820 825 830
Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly Ile Cys 835 840 845
Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser Ser Lys 850 855 860
Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Asn His Leu Val Thr Phe 865 870 875 880
Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu Gln Asn Ile Asn Phe Ser Leu 885 890 895
Glu Thr Ser Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Ser Leu Arg Val Val 900 905 910
Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Leu Asp Pro 915 920 925
Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro Tyr Arg 930 935 940
Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile Leu Ser 945 950 955 960
Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu Ser Arg 965 970 975
Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala Glu Ala 980 985 990
Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His Tyr Leu Glu 995 1000 1005
Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro Leu Ile Glu Lys 1010 1015 1020
Arg Asn Leu Glu Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met Val Ser Ile Met Ser 1025 1030 1035 1040
Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val Trp Lys Gly Gly Ser Ala 1045 1050 1055
Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu Arg Val Leu Gly Gln Val His 1060 1065 1070
Lys His Val Glu Gln Asn Gln Asn Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp 1075 1080 1085
Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser 1090 1095 1100
Gln Tyr Gln Pro Ile Lys Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg 1105 1110 1115 1120
Glu Asn Ser Leu Tyr Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys 1125 1130 1135
Ala Phe Asp Ile Cys Pro Leu Val Lys Ile Asn Thr Ala Leu Ile Lys 1140 1145 1150
Ala Asp Thr Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe 1155 1160 1165
Thr Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His 1170 1175 1180
Pro Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val 1185 1190 1195 1200 Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Ser Leu Gln His 1205 1210 1215
Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val Glu Thr 1220 1225 1230
Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp Ile Asn Tyr 1235 1240 1245
Val Asn Pro Ile Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln Arg Tyr Gly Gly 1250 1255 1260
Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala Ile Glu Gly Leu Thr 1265 1270 1275 1280
Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg Leu Asn Met Asp Ile Asp 1285 1290 1295
Val Ala Tyr Lys His Lys Gly Pro Leu His Asn Tyr Lys Met Thr Asp 1300 1305 1310
Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu 1315 1320 1325
Val Val Ser Thr Gly Phe Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr 1330 1335 1340
Thr Val Val His Lys Thr Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr 1345 1350 1355 1360
Leu Lys Ile Asp Thr Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr 1365 1370 1375
Gly Asn Ser Asp Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro 1380 1385 1390
Ser Arg Glu Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile 1395 1400 1405
Ser Leu Pro Thr Gly Ile Asn Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu 1410 1415 1420
Val Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly 1425 1430 1435 1440
His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu Cys 1445 1450 1455
Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu Ser Pro 1460 1465 1470
Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys Gln Cys Thr 1475 1480 1485
Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys Val Cys Glu Gly 1490 1495 1500
Ala Thr Cys Lys Cys Ile Glu Ala Asp Cys Gly Gln Met Gln Lys Glu 1505 1510 1515 1520
Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg Lys Gln Thr Ala Cys Asn 1525 1530 1535
Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val Ile Ile Thr Ser Ile Thr Thr 1540 1545 1550
Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys 1555 1560 1565
Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe Ile Lys 1570 1575 1580
Lys Val Thr Cys Thr Asn Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln Tyr Leu 1585 1590 1595 1600
Ile Met Gly Lys Glu Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Thr Phe Arg 1605 1610 1615
Tyr Ile Tyr Pro Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Arg 1620 1625 1630
sp r r ys er er ys n a e eu a sn eu sp u 1635 1640 1645
Phe Ala Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys Glu Gln Lys Leu Ile Ser 1650 1655 1660
Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1665 1670 1675 1680
His His His His His His
1685
<210> 359
<211> 1676
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hC5 P01031
<400> 359
Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15
Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg 20 25 30
Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu 35 40 45
Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe 50 55 60
Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80
Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln 85 90 95
Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110
Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125
His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg 130 135 140
Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val 145 150 155 160
Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu 165 170 175
Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser 180 185 190
Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp 195 200 205
Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu 210 215 220
Pro His Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr 225 230 235 240
Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr 245 250 255
Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg 260 265 270
Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln 275 280 285
Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu 290 295 300
Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn 305 310 315 320
Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335
Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr 340 345 350
Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro 355 360 365
Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly 370 375 380
Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu 385 390 395 400
Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly 405 410 415
Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu 420 425 430
Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala 435 440 445
Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr 450 455 460
Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu 465 470 475 480
His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile 485 490 495
Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe 500 505 510
Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile 515 520 525
Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr 530 535 540
Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp 545 550 555 560
Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser 565 570 575
Pro Asp Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met 580 585 590
Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala 595 600 605
Val Tyr Gly Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe 610 615 620
Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu 625 630 635 640
Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn 645 650 655
Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile 660 665 670
Leu Arg Pro Arg Arg Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala 675 680 685
Lys Tyr Lys His Ser Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys 690 695 700
Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu 705 710 715 720
Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu 740 745 750
His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr 755 760 765
Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys 770 775 780
Gln Leu Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln 785 790 795 800
Gly Val Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys 805 810 815
Ala Lys Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser 820 825 830
Val Val Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr 835 840 845
Arg Thr Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly 850 855 860
Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser 865 870 875 880
Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val 885 890 895
Thr Phe Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe 900 905 910
Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg 915 920 925
Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu 930 935 940
Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro 945 950 955 960
Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile 965 970 975
Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu 980 985 990
Ser Gln Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala 995 1000 1005
Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His Tyr 1010 1015 1020
Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro Leu Ile 1025 1030 1035 1040
Glu Lys Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met Leu Ser Ile 1045 1050 1055
Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val Trp Lys Gly Gly 1060 1065 1070
Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu Arg Val Leu Gly Gln 1075 1080 1085
Val Asn Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn Ser Ile Cys Asn Ser Leu 1090 1095 1100
Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu 1105 1110 1115 1120
Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu 1125 1130 1135
Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile 1140 1145 1150
Arg Lys Ala Phe Asp Ile Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu 1155 1160 1165
Ile Lys Ala Asp Asn Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser 1170 1175 1180
Thr Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys 1185 1190 1195 1200
Thr His Pro Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala 1205 1210 1215
Leu Val Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn Leu 1220 1225 1230
Gln His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val 1235 1240 1245
Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp Ile 1250 1255 1260
Asn Tyr Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln Arg Tyr 1265 1270 1275 1280
Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala Ile Glu Gly 1285 1290 1295
Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg Leu Ser Met Asp 1300 1305 1310
Ile Asp Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu His Asn Tyr Lys Met 1315 1320 1325
Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val Glu Val Leu Leu Asn Asp 1330 1335 1340
Asp Leu Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val His 1345 1350 1355 1360
Val Thr Thr Val Val His Lys Thr Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser 1365 1370 1375
Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg 1380 1385 1390
Gly Tyr Gly Asn Ser Asp Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr 1395 1400 1405
Lys Pro Ser Arg Glu Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met 1410 1415 1420
Asp Ile Ser Leu Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys 1425 1430 1435 1440
Ala Leu Val Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys 1445 1450 1455
Asp Gly His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe 1460 1465 1470
Leu Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu 1475 1480 1485
Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys Gln 1490 1495 1500
Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys Val Cys 1505 1510 1515 1520
Glu Gly Ala Ala Cys Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly Gln Met Gln 1525 1530 1535
Glu Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg Lys Gln Thr Ala 1540 1545 1550
Cys Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val Ser Ile Thr Ser Ile 1555 1560 1565
Thr Val Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys Ala Thr Leu Leu Asp Ile 1570 1575 1580
Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe 1585 1590 1595 1600
Ile Lys Lys Val Thr Cys Thr Asn Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln Tyr Leu Ile Met Gly Lys Glu Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Ser 1620 1625 1630
Phe Arg Tyr Ile Tyr Pro Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp 1635 1640 1645
Pro Arg Asp Thr Thr Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu 1650 1655 1660
Asp Glu Phe Ala Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys
1665 1670 1675
<210> 360
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human C5 peptide aa591-599
<400> 360
Asn Met Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp
1 5
<210> 361
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human C5 peptide aa775-794
<400> 361
Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys Gln Leu Gln Phe Ala Leu 1 5 10 15
Pro Asp Ser Leu
20
<210> 362
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HCVR of M1M17628N
<400> 362
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ala Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Arg Asp 20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Asp Tyr Met 35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Tyr Leu 65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Phe Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Val Ser Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 363
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCVR of M1M17628N
<400> 363
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile His Val Trp 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 364
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IRBP peptide
<400> 364
Gly Pro Thr His Leu Phe Gln Pro Ser Leu Val Leu Asp Met Ala Lys 1 5 10 15
Val Leu Leu Asp
20
<210> 365
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> HCVR of M1M17627N
<400> 365
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Ile His Trp Met Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45
Gly Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Ile Leu Pro Pro Pro Pro Tyr Tyr Tyr Ala Asn Tyr Gly Gly Gly 100 105 110
Thr Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
<210> 366
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LCVR of M1M17627N
<400> 366
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Ile Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Ser Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys
100 105

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se specifično vezuje za protein faktora komplementa 5 (C5), pri čemu antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 98 i varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 106.
2. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1, koji sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 353 i/ili laki lanac sadrži set aminokiselinskih sekvenci naveden u SEQ ID NO: 354.
3. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, koji sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 353 i laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 354.
4. Antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, koje je potpun molekul antitela.
5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač.
6. Uređaj za isporuku tipa olovke za višekratnu upotrebu koji sadrži farmaceutsku kompoziciju prema patentnom zahtevu 5.
7. Uređaj za isporuku tipa autoinjektora koji sadrži farmaceutsku kompoziciju prema patentnom zahtevu 5.
8. Izolovani polinukleotidni molekul koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira HCVR antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji su kao što je navedeno u bilo kom od patentnih zahteva 1-4, i nukleotidnu sekvencu koja kodira LCVR antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, koji su kao što je navedeno u bilo kom od patentnih zahteva 1-4.
9. Rekombinantan ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotidni molekul prema patentnom zahtevu 8.
10. Ćelija koja sadrži rekombinantan ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 9.
11. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, za upotrebu u postupku prevencije, lečenja ili ublažavanja najmanje jednog simptoma ili indikacije bolesti ili poremećaja izabranih iz grupe koju čine atipičan hemolitičko-uremijski sindrom (aHUS), paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH), starosna makularna degeneracija, geografska atrofija, uveitis, optički neuromijelitis, multipla skleroza, moždani udar, Giljеn Bаrеоv sindrom, traumatska povreda mozga, Parkinsonova bolest, poremećaj neodgovarajuće ili nepoželјne aktivacije sistema komplementa, komplikacija hemodijalize, hiperakutno odbacivanje
2
alotransplantata, odbacivanje ksenotransplantata, toksičnost indukovana interleukinom-2 tokom terapije sa IL-2, inflamatorni poremećaj, inflamacija u autoimunoj bolesti, Kronova bolest, sindrom respiratornog distresa kod odraslih, termička povreda, opekotina, promrzlina, reperfuziono stanje nakon ishemije, infarkt miokarda, sindrom kapilarnog curenja, gojaznost, dijabetes, Alchajmerova bolest, šizofrenija, epilepsija, ateroskleroza, vaskulitis, bulozni pemfigoid, C3 glomerulopatija, membranski proliferativni glomerulonefritis, dijabetska nefropatija, Alportov sindrom, progresivna bubrežna insuficijencija, proteinurijska bolest bubrega, renalna ishemijsko-reperfuziona povreda, lupusni nefritis, balonska angioplastika, sindrom indukovan ugradnjom pumpe kod kardiopulmonarnog bajpasa ili renalnog bajpasa, renalna ishemija, reperfuzija mezenterične arterije nakon rekonstrukcije aorte, infektivna bolest, sepsa, poremećaj imunskog kompleksa, autoimuna bolest, renalni poremećaj, reumatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus (SLE), SLE nefritis, proliferativni nefritis, hemolitička anemija, astma, hronična opstruktivna bolest pluća (HOPB), emfizem, plućna embolija, infarkt pluća, upala pluća i mijastenija gravis.
12. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu:
(a) postupak lečenja je profilaktički;
(b) postupak obuhvata davanje antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom; opciono, pri čemu je drugi terapijski agens izabran iz grupe koju čine antikoagulans, anti-inflamatorni lek, antihipertenziv, imunosupresivni agens, agens za snižavanje lipida, anti-CD20 agens kao što je rituksimab, anti-TNF agens kao što je infliksimab, antiepileptik, inhibitor C3, drugo anti-C5 antitelo i antitrombotički agens; ili
(c) postupak obuhvata davanje antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen subkutano, intravenski, intradermalno, intraperitonealno, oralno, intramuskularno ili intrakranijalno.
RS20240701A 2016-06-14 2017-06-13 Anti-c5 antitela i njihove upotrebe RS65633B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662349705P 2016-06-14 2016-06-14
US201662405561P 2016-10-07 2016-10-07
US201662422107P 2016-11-15 2016-11-15
PCT/US2017/037226 WO2017218515A1 (en) 2016-06-14 2017-06-13 Anti-c5 antibodies and uses thereof
EP17731785.6A EP3468990B1 (en) 2016-06-14 2017-06-13 Anti-c5 antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65633B1 true RS65633B1 (sr) 2024-07-31

Family

ID=59091673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240701A RS65633B1 (sr) 2016-06-14 2017-06-13 Anti-c5 antitela i njihove upotrebe

Country Status (29)

Country Link
US (4) US10633434B2 (sr)
EP (3) EP4374922B1 (sr)
JP (4) JP7102353B2 (sr)
KR (3) KR102667023B1 (sr)
CN (3) CN116751293A (sr)
AU (2) AU2017283470B2 (sr)
CA (1) CA3027487A1 (sr)
CL (1) CL2018003563A1 (sr)
CO (1) CO2018014413A2 (sr)
DK (1) DK3468990T3 (sr)
ES (1) ES2984352T3 (sr)
FI (1) FI3468990T3 (sr)
HR (1) HRP20240815T1 (sr)
HU (1) HUE067224T2 (sr)
IL (3) IL309975B1 (sr)
LT (1) LT3468990T (sr)
MA (1) MA45235B1 (sr)
MD (1) MD3468990T2 (sr)
MX (3) MX2018015149A (sr)
MY (3) MY191668A (sr)
PH (2) PH12018502560B1 (sr)
PL (1) PL3468990T3 (sr)
PT (1) PT3468990T (sr)
RS (1) RS65633B1 (sr)
SG (2) SG11201810933QA (sr)
SI (1) SI3468990T1 (sr)
SM (1) SMT202400269T1 (sr)
UA (1) UA124734C2 (sr)
WO (1) WO2017218515A1 (sr)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN2014DN10515A (sr) 2006-03-31 2015-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd
MX336725B (es) 2007-09-26 2016-01-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos medinate la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr).
TWI700293B (zh) 2008-04-11 2020-08-01 日商中外製藥股份有限公司 重複結合複數個抗原的抗體
PY09026846A (es) * 2008-08-05 2015-09-01 Novartis Ag Composiciones y métodos para anticuerpos que se dirigen a la proteína de complemento c5
KR102568454B1 (ko) 2010-11-30 2023-08-18 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복해서 결합하는 항원 결합 분자
NZ631007A (en) * 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
TWI656133B (zh) 2014-12-19 2019-04-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Ｆｃ區域之多胜肽及使用方法
KR101838645B1 (ko) 2014-12-19 2018-03-14 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-c5 항체 및 그의 사용 방법
EP3463461A4 (en) 2016-05-27 2020-05-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis
KR102667023B1 (ko) 2016-06-14 2024-05-21 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항-c5 항체 및 이의 용도
CN109689099B (zh) 2016-08-05 2023-02-28 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
JP7364221B2 (ja) * 2017-03-06 2023-10-18 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 抗ｃ５抗体およびその使用
KR20230066126A (ko) 2017-07-27 2023-05-12 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 고농도 항-c5 항체 제형
US11525002B2 (en) 2017-10-11 2022-12-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Human PD-L1 antibodies and methods of use therefor
MX2020004284A (es) 2017-10-26 2020-10-28 Alexion Pharma Inc Dosis y administracion de anticuerpos anti-c5 para el tratamiento de la hemoglobinuria paroxistica nocturna (hpn) y el sindrome hemolitico uremico atipico (shua).
CN120571008A (zh) 2017-12-13 2025-09-02 瑞泽恩制药公司 抗c5抗体组合及其用途
US20190247560A1 (en) * 2018-02-13 2019-08-15 Gambro Lundia Ab Extracorporeal devices and methods of treating complement factor related diseases
JP7514765B2 (ja) * 2018-03-23 2024-07-11 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム ヒトｐｄ－ｌ１およびｐｄ－ｌ２に対する二重特異性抗体およびその使用方法
JP7390301B2 (ja) 2018-03-23 2023-12-01 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム ヒトｐｄ－ｌ２抗体およびその使用方法
EP3768726B1 (en) 2018-03-23 2024-10-30 Board of Regents, The University of Texas System Dual specificity antibodies to pd-l1 and pd-l2 and methods of use therefor
CA3135166A1 (en) 2018-04-26 2019-10-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for retrieving tumor-related antibodies and antigens
ES2996257T3 (en) * 2018-05-31 2025-02-12 Alexion Pharma Inc Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) in pediatric patients
US12460012B2 (en) 2018-06-04 2025-11-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-C5 antibodies for treatment of atypical hemolytic uremic syndrome (aHUS) in pediatric patients
WO2020006266A1 (en) 2018-06-28 2020-01-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of producing anti-c5 antibodies
EP3846850A4 (en) * 2018-09-06 2022-06-15 The Trustees of the University of Pennsylvania HUMANIZED ANTI-C5 ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2020058759A1 (en) * 2018-09-17 2020-03-26 Kyoto University Administration of an anti-c5 agent for treatment of hepatic injury or failure
JP2022501378A (ja) 2018-09-21 2022-01-06 アレクシオン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドAlexion Pharmaceuticals, Inc. 視神経脊髄炎の処置のためのエクリズマブ
US20210388070A1 (en) 2018-10-30 2021-12-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Co-administration of a hyaluronidase and anti-c5 antibody for treatment of complement-associated conditions
AU2019370295A1 (en) 2018-10-30 2021-06-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Subcutaneous dosage and administration of anti-C5 antibodies for treatment of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH)
PT3914617T (pt) 2019-01-25 2024-05-31 Alexion Pharma Inc Dosagem e administração de anticorpos anti-c5 para tratamento da síndrome hemolítica urémica atípica (ahus)
KR20210126045A (ko) 2019-02-14 2021-10-19 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 전신 중증 근무력증을 치료하기 위한 항-c5 항체의 투여량 및 투여
US20220227851A1 (en) * 2019-05-24 2022-07-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating vitiligo using an anti-c5 antibody
WO2021026160A1 (en) 2019-08-05 2021-02-11 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis with eculizumab
PH12022550167A1 (en) * 2019-08-16 2023-05-08 Regeneron Pharma High concentration anti-c5 formulations
US20220356234A1 (en) 2019-10-02 2022-11-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Complement inhibitors for treating drug-induced complement-mediated response
JP7798763B2 (ja) * 2019-10-25 2026-01-14 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃ５関連疾患の治療または予防のための投与レジメン
EP4061400A4 (en) * 2019-11-20 2024-01-10 Cornell University GENERATION OF GLOMERULAR-SPECIFIC KIDNEY ENDOTHELIAL CELLS AND METHOD OF USE
US20230043034A1 (en) 2019-12-09 2023-02-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anti-c5 antibody for the treatment of neuromyelitis optica spectrum disorder
EP4081805A1 (en) 2019-12-23 2022-11-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating pregnancy-associated atypical hemolytic uremic syndrome using an anti-c5 antibody
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
CN111234016B (zh) * 2020-02-23 2021-09-07 北京康普美特创新医药科技有限责任公司 一种抗补体c5分子的全人源单克隆抗体及应用
BR112022021136A2 (pt) 2020-04-30 2022-11-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de fator b de complemento (cfb) e métodos de uso das mesmas
CN115666578A (zh) 2020-05-12 2023-01-31 阿雷克森制药公司 补体因子d抑制剂单独或结合抗c5抗体治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿的用途
WO2021231720A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of using extracellular vesicles to detect complement activation, and uses thereof to assess and/or monitor treatment of a complement-mediated disease
CN113754763B (zh) * 2020-06-05 2024-03-08 天辰生物医药(苏州)有限公司 分离的抗原结合蛋白及其用途
JP2023533682A (ja) 2020-06-24 2023-08-04 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体関連病態の処置用抗ｃ５抗体の皮下（ｓｃ）投与
EP4295905A1 (en) * 2020-07-09 2023-12-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) in pediatric patients
US20240209071A1 (en) 2020-08-13 2024-06-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating hematopoietic stem cell transplant-associated thrombotic microangiopathy (hsct-tma)
EP4213940A1 (en) 2020-09-21 2023-07-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating c5-mediated glomerular nephritis (gn), including lupus nephritis (ln) and/or iga nephropathy (igan)
CA3196434A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Krista K. JOHNSON Methods of treating patients having complement disorders using anti-c5 antibodies
CA3173016A1 (en) 2021-01-22 2022-07-28 Gin-Fu CHEN Methods of treating complement mediated thrombotic microangiopathy using an anti-c5 antibody
CA3220629A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Tobin J. CAMMETT Methods for detecting cm-tma biomarkers
WO2022265915A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating dermatomyositis (dm)
WO2023287991A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment of myasthenia gravis
WO2023023220A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating sickle cell disease or beta thalassemia using a complement alternative pathway inhibitor
WO2023050233A1 (en) * 2021-09-29 2023-04-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Humanized anti-c5a antibodies and uses thereof
EP4423271A2 (en) 2021-10-28 2024-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
CA3234636A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement factor b (cfb) irna compositions and methods of use thereof
EP4582445A1 (en) * 2022-08-30 2025-07-09 Longbio Pharma (Suzhou) Co., Ltd. Anti-human complement c5 antibody and fusion protein thereof
CN120035450A (zh) 2022-09-06 2025-05-23 阿雷克森制药公司 造血干细胞移植物相关血栓性微血管病（hsct-tma）患者的诊断和预后生物标志物谱
TW202426048A (zh) 2022-09-06 2024-07-01 美商阿雷希昂製藥公司 用於治療造血幹細胞移植相關血栓性（ｈｓｃｔ－ｔｍａ）的抗ｃ５抗體的補充劑量和投與
TW202423479A (zh) 2022-09-28 2024-06-16 美商阿雷希昂製藥公司 用於預防或最小化患有慢性腎病的患者中的心臟手術相關急性腎損傷（csa-aki）和/或隨後的主要不良腎事件（make）的抗c5抗體之劑量及投與
WO2024238421A1 (en) 2023-05-12 2024-11-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of biomarkers for the identification and treatment of complement-mediated disorders
WO2024238422A1 (en) 2023-05-12 2024-11-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of a panel of lectins for detection of complement biomarkers in urine extracellular vesicles
US12180274B2 (en) 2023-05-26 2024-12-31 Inflarx Gmbh Treatment of pneumonia and ARDS with inhibitors of C5a and IL-6 activity
WO2025166118A1 (en) 2024-02-02 2025-08-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treating iga nephropathy (igan)
WO2025221479A1 (en) 2024-04-16 2025-10-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Biomarkers for monitoring effective treatment of neuromyelitis optica spectrum disorder (nmosd) with complement component c5 inhibitors
CN119409815B (zh) * 2025-01-07 2025-04-08 天辰生物医药(苏州)有限公司 抗人补体c5 vhh抗体及其应用

Family Cites Families (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4686100A (en) 1985-04-02 1987-08-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for the treatment of adult respiratory distress syndrome
CA2113089C (en) 1991-07-15 2007-11-06 Peter J. Sims Universal donor cells
AU4657993A (en) 1992-06-29 1994-01-24 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Matrix for universal donor microvascular endothelial cells
DE69533921T2 (de) 1994-03-23 2005-12-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc., New Haven Verfahren zur reduktion von fehlfunktionen des immunsystems und der hämostase während des extrakorporalen kreislaufs
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5562904A (en) 1994-07-21 1996-10-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Retroviral transduction of cells using soluble complement inhibitors
EP0777474B1 (en) 1994-09-23 2005-12-21 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of inflammatory joint disease
US6673346B1 (en) 1999-08-31 2004-01-06 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for the treatment of sepsis
US6534058B2 (en) 2000-10-10 2003-03-18 Tanox, Inc. Anti-C5 monoclonal antibodies
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1878441B1 (en) 2001-08-17 2018-01-24 Genentech, Inc. Complement pathway inhibitors binding to C5 and C5a without preventing the formation of C5b
ES2283594T5 (es) 2001-08-17 2016-03-15 Genentech, Inc. Inhibidores de la ruta del complemento que se unen a C5 y C5a sin impedir la formación de C5b
ITMI20021527A1 (it) 2002-07-11 2004-01-12 Consiglio Nazionale Ricerche Anticorpi anti componente c5 del complemento e loro uso
US20050271660A1 (en) 2002-09-06 2005-12-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Nebulization of monoclonal antibodies for treating pulmonary diseases
AU2003270330B2 (en) 2002-09-06 2009-07-30 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of treatment of asthma using antibodies to complement component C5
US9415102B2 (en) 2002-09-06 2016-08-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. High concentration formulations of anti-C5 antibodies
PL216630B1 (pl) 2002-10-17 2014-04-30 Genmab As Izolowane ludzkie przeciwciało monoklonalne wiążące ludzki CD20, związane z tym przeciwciałem transfektoma, komórka gospodarza, transgeniczne zwierzę lub roślina, kompozycja, immunokoniugat, cząsteczka bispecyficzna, wektor ekspresyjny, kompozycja farmaceutyczna, zastosowanie medyczne, zestaw oraz przeciwciało antyidiotypowe i jego zastosowanie
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
US7361339B2 (en) 2003-01-09 2008-04-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing morality associated with acute myocardial infarction
EP2669377A3 (en) 2003-04-17 2015-10-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
ATE427356T1 (de) 2003-06-02 2009-04-15 Varleigh Ltd Komplementinhibitoren aus zecken
KR101076516B1 (ko) 2003-09-08 2011-10-24 파나소닉 주식회사 플라즈마 처리방법 및 장치
US20050169921A1 (en) 2004-02-03 2005-08-04 Leonard Bell Method of treating hemolytic disease
US20070116710A1 (en) 2004-02-03 2007-05-24 Leonard Bell Methods of treating hemolytic anemia
US7850962B2 (en) 2004-04-20 2010-12-14 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
DK1755674T3 (en) 2004-05-14 2015-02-09 Alexion Pharma Inc PROLONGED SURVIVAL OF A allograft by inhibiting complement activity
US7763708B2 (en) 2004-08-12 2010-07-27 Institute For Protein Science Co., Ltd. Methods and compositions for modulating C5-a-mediated inflammatory responses
US8257740B1 (en) 2011-08-15 2012-09-04 Gp Medical, Inc. Pharmaceutical composition of nanoparticles
US8246995B2 (en) 2005-05-10 2012-08-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Hydrophobic nanotubes and nanoparticles as transporters for the delivery of drugs into cells
GB0518443D0 (en) 2005-09-09 2005-10-19 Evolutec Ltd Method of treating myasthenia gravis
HUE026423T2 (en) 2005-11-04 2016-05-30 Genentech Inc Use of complement biosynthetic pathway inhibitors for treating eye diseases
AU2013200223B2 (en) 2005-11-04 2015-08-20 Genentech, Inc. Use of Complement Pathway Inhibitors to Treat Ocular Diseases
CA2644020C (en) 2006-03-02 2016-05-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Prolongation of survival of an allograft by inhibiting complement activity
SI2359834T1 (sl) 2006-03-15 2017-02-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Zdravljenje pacientov,ki imajo paroksizmalno nočno hemoglobinurijo, z zaviralcem komplementa
RS52176B (sr) 2006-06-02 2012-08-31 Regeneron Pharmaceuticals Inc. Antitela visokog afiniteta prema humanom il-6 receptoru
US9388235B2 (en) 2006-09-05 2016-07-12 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of antibody mediated neuropathies
GB0617734D0 (en) 2006-09-08 2006-10-18 Evolutec Ltd Method of treating peripheral nerve disorders
PL2061501T3 (pl) 2006-09-08 2016-01-29 Volution Immuno Pharmaceuticals Sa Sposób leczenia zaburzeń oddechowych
NZ576195A (en) 2006-10-10 2012-04-27 Az Univ Amsterdam Complement inhibition for improved nerve regeneration
WO2008097525A2 (en) 2007-02-05 2008-08-14 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Local complement inhibition for treatment of complement-mediated disorders
CL2008003241A1 (es) 2007-11-02 2009-07-31 Novartis Ag Molecula de enlace que comprende una porcion de enlace de antigeno que se enlaza con un neoepitopo de c3b; composicion farmaceutica que la comprende; y su uso para tratar trastornos oculares
TWI700293B (zh) 2008-04-11 2020-08-01 日商中外製藥股份有限公司 重複結合複數個抗原的抗體
US8675507B2 (en) 2009-01-28 2014-03-18 Headwater Partners I Llc Service profile management with user preference, adaptive policy, network neutrality and user privacy for intermediate networking devices
AU2014201433B2 (en) 2008-08-05 2016-05-26 Novartis Ag Compositions and methods for antibodies targeting complement protein C5
PY09026846A (es) * 2008-08-05 2015-09-01 Novartis Ag Composiciones y métodos para anticuerpos que se dirigen a la proteína de complemento c5
WO2010039690A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of inhibiting biomaterial-induced procoagulant activity using complement inhibitors
US9891219B2 (en) 2008-10-10 2018-02-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for treating neuromyelitis optica (NMO) by administration of eculizumab to an individual that is aquaporin-4 (AQP4)-IgG autoantibody positive
HUE061548T2 (hu) 2008-11-10 2023-07-28 Alexion Pharma Inc Komplementtel összefüggõ rendellenességek kezelésére szolgáló eljárások és készítmények
US20110002931A1 (en) 2009-06-23 2011-01-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that bind to complement proteins
KR101747103B1 (ko) 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
CN102483501A (zh) 2009-07-17 2012-05-30 康宁光缆系统有限责任公司 光纤带和具有低含量齐聚物的带基质材料
EP2327725A1 (en) 2009-11-26 2011-06-01 InflaRx GmbH Anti-C5a binding moieties with high blocking activity
JP5840623B2 (ja) 2010-01-08 2016-01-06 ヴォリューション イミュノ ファーマシューティカルズ エスエイ 気道のウイルス感染症の治療に用いるｅｖ５７６
US10143186B2 (en) 2010-02-08 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common light chain mouse
NZ602219A (en) 2010-03-01 2014-10-31 Alexion Pharma Inc Methods and compositions for treating degos’ disease
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
EA028899B1 (ru) 2010-04-30 2018-01-31 Алексион Фармасьютикалз, Инк. АНТИ-C5a-АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ
AU2015201676B2 (en) 2010-04-30 2016-10-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anti-C5a antibodies and methods for using the antibodies
CN103249432A (zh) * 2010-06-22 2013-08-14 科罗拉多大学董事会,法人团体 补体成分3的C3d片段的抗体
US10654916B2 (en) 2011-04-21 2020-05-19 The Regents Of The University Of California, A California Corporation Compositions and methods for the treatment of neuromyelitis optica
PE20150159A1 (es) 2011-12-21 2015-02-08 Novartis Ag Composiciones y metodos para anticuerpos que actuan sobre el factor p
CN104220047B (zh) 2012-05-25 2019-11-15 诺华股份有限公司 含有生物治疗剂和胍或胍衍生物的水性药物组合物以及包含所述组合物的注射剂
US9133269B2 (en) 2012-08-24 2015-09-15 Anaptysbio, Inc. Humanized antibodies directed against complement protein C5
TW201418707A (zh) 2012-09-21 2014-05-16 Alexion Pharma Inc 補體組分ｃ５拮抗劑之篩選分析
EP2975055A4 (en) 2013-01-31 2016-11-02 Univ Seoul Nat R & Db Found C5 ANTIBODIES AND METHOD FOR PREVENTING AND TREATING COMPLEMENT-MEDIATED ILLNESSES
TWI635098B (zh) 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
US20160051673A1 (en) 2013-03-29 2016-02-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing the serum half-life of a therapeutic agent targeting complement c5
KR101834469B1 (ko) 2013-08-07 2018-03-06 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 비정형적 용혈성 요독증후군 (ahus) 바이오마커 단백질
JP6654137B2 (ja) 2013-09-16 2020-02-26 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター Ｈｓｃｔ関連血栓性微小血管症の治療のための組成物及び方法
CA2926812A1 (en) 2013-10-07 2015-04-16 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods of preventing or reducing photoreceptor cell death
WO2015103438A2 (en) 2014-01-02 2015-07-09 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
WO2015120130A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Novartis Ag Impact of genetic factors on disease progression and response to anti-c5 antibody in geographic atrophy
EP3107935B1 (en) 2014-02-20 2020-06-24 Allergan, Inc. Complement component c5 antibodies
US10077319B2 (en) 2014-02-21 2018-09-18 Medimmune, Llc Anti-PCSK9-GLP-1 fusions and methods for use
NZ631007A (en) 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
KR20160127042A (ko) 2014-03-20 2016-11-02 인플라알엑스 게엠베하 바이러스성 폐렴의 치료를 위한 c5a의 억제제
JP6598798B2 (ja) 2014-05-05 2019-10-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｃ５およびｃ３動物
EP3160990A2 (en) 2014-06-25 2017-05-03 Novartis AG Compositions and methods for long acting proteins
JP6564776B2 (ja) 2014-07-12 2019-08-21 株式会社カネカ 複合太陽電池、太陽電池モジュール、および集光太陽電池
WO2016094834A2 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method for treating a complement mediated disorder caused by an infectious agent in a patient
KR101838645B1 (ko) 2014-12-19 2018-03-14 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-c5 항체 및 그의 사용 방법
JP2018511557A (ja) 2015-01-22 2018-04-26 中外製薬株式会社 ２種以上の抗ｃ５抗体の組み合わせおよび使用方法
JP6944375B2 (ja) 2015-03-31 2021-10-06 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 発作性夜間血色素尿症（ｐｎｈ）患者の亜集団の同定および処置
WO2016178980A1 (en) 2015-05-01 2016-11-10 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Efficacy of an anti-c5 antibody in the prevention of antibody mediated rejection in sensitized recipients of kindney thansplant
US11840564B2 (en) 2015-06-09 2023-12-12 Children's Hospital Medical Center Dosing algorithm for complement inhibitor
US20160362482A1 (en) 2015-06-10 2016-12-15 Case Western Reserve University Compositions and methods of modulating b cell response
WO2016201301A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
WO2017035362A1 (en) 2015-08-26 2017-03-02 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Use of complement pathway inhibitor compounds to mitigate adoptive t-cell therapy associated adverse immune responses
WO2017044811A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 Bruce Andrien Recombinant glycosylated eculizumab and eculizumab variants
WO2017055908A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Noris Marina Methods of treating adamts13 deficiencies and congenital thrombotic thrombocytopenia in pediatric patients
JP2018530574A (ja) 2015-10-07 2018-10-18 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 患者の加齢黄斑変性を治療する方法
TW201718014A (zh) 2015-10-12 2017-06-01 諾華公司 C5抑制劑於移植相關微血管病之用途
US20180311345A1 (en) 2015-10-30 2018-11-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. A method of inhibiting exacerbations of t cell-mediated allograft vasculopathy
KR102467124B1 (ko) 2015-12-18 2022-11-15 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-c5 항체 및 사용 방법
WO2017123636A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment
EP3408291A1 (en) 2016-01-25 2018-12-05 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Anti-c5 antibodies with enhanced ph switch
GB201602802D0 (en) 2016-02-17 2016-03-30 Volution Immuno Pharmaceuticals Sa Method of treatment
EP3463461A4 (en) 2016-05-27 2020-05-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of refractory generalized myasthenia gravis
JP2019521105A (ja) 2016-06-07 2019-07-25 ノバルティス アーゲー 補体ｃ５多型を有する患者を治療するための抗ｃ５抗体
CN109310760A (zh) 2016-06-07 2019-02-05 诺华股份有限公司 抗c5抗体给药方案
EP3469083A1 (en) 2016-06-10 2019-04-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLEMENT COMPONENT C5 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING PAROXYSMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA (PNH)
KR102667023B1 (ko) 2016-06-14 2024-05-21 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항-c5 항체 및 이의 용도
PE20240825A1 (es) 2016-06-17 2024-04-18 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos anti-c5 y metodos de uso
WO2018009588A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Macho Daisy Llc Wearable device and system for personal audio messaging
WO2018053039A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Methods of diagnosing and treating cd55 deficiency, hyperactivation of complement, angiopathic thrombosis and protein losing enteropathy (chaple), a newly identified orphan disease
JP7256741B2 (ja) 2016-10-12 2023-04-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 感作レシピエントの腎移植における抗体関連型拒絶反応の予防における抗ｃ５抗体の有効性
US10802945B2 (en) 2016-12-07 2020-10-13 Ab Initio Technology Llc Differencing of executable dataflow graphs
BR112019011769A2 (pt) 2016-12-16 2019-11-12 Samsung Bioepis Co Ltd composição de anticorpo anti-c5 aquosa estável
PL3577135T3 (pl) 2017-01-31 2023-12-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Kompozycja farmaceutyczna do stosowania do leczenia lub zapobiegania chorobom związanym z c5
JP7364221B2 (ja) 2017-03-06 2023-10-18 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 抗ｃ５抗体およびその使用
EP3600421A4 (en) 2017-03-23 2021-01-06 The Trustees of The University of Pennsylvania ANTI-C5A ANTIBODIES AND USES OF THEM
WO2018195034A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Efficacy of an anti-c5 antibody in the prevention of antibody mediated rejection in sensitized recipients of a kidney transplant
SG11201912882QA (en) 2017-06-23 2020-01-30 Inflarx Gmbh Treatment of inflammatory diseases with inhibitors of c5a activity
CN120571008A (zh) 2017-12-13 2025-09-02 瑞泽恩制药公司 抗c5抗体组合及其用途
PH12022550167A1 (en) 2019-08-16 2023-05-08 Regeneron Pharma High concentration anti-c5 formulations

Also Published As

Publication number Publication date
CN109563159A (zh) 2019-04-02
JP7102353B2 (ja) 2022-07-19
NZ749153A (en) 2025-03-28
IL263481B2 (en) 2024-06-01
US20200262901A1 (en) 2020-08-20
US20200262900A1 (en) 2020-08-20
CO2018014413A2 (es) 2019-03-08
CA3027487A1 (en) 2017-12-21
HRP20240815T1 (hr) 2024-09-27
EP4374922A2 (en) 2024-05-29
MA45235A (fr) 2019-04-17
SG11201810933QA (en) 2019-01-30
US11492392B2 (en) 2022-11-08
NZ789069A (en) 2025-06-27
JP2019528039A (ja) 2019-10-10
MY196006A (en) 2023-03-06
AU2024204175A1 (en) 2024-07-11
PH12023500007A1 (en) 2024-03-11
UA124734C2 (uk) 2021-11-10
MX2023001727A (es) 2023-02-22
IL263481A (en) 2019-01-31
SI3468990T1 (sl) 2024-07-31
CN116751293A (zh) 2023-09-15
AU2017283470A1 (en) 2019-01-03
DK3468990T3 (da) 2024-06-24
BR112018075875A2 (pt) 2019-03-19
CN116769024A (zh) 2023-09-19
KR102667023B1 (ko) 2024-05-21
MD3468990T2 (ro) 2024-11-30
MX2018015149A (es) 2019-08-21
FI3468990T3 (fi) 2024-06-26
KR20230074831A (ko) 2023-05-31
MA45235B1 (fr) 2024-07-31
EP4706763A2 (en) 2026-03-11
HUE067224T2 (hu) 2024-10-28
KR102534895B1 (ko) 2023-05-24
US11479602B2 (en) 2022-10-25
WO2017218515A1 (en) 2017-12-21
EP4374922B1 (en) 2026-02-25
ES2984352T3 (es) 2024-10-29
IL309975A (en) 2024-03-01
SMT202400269T1 (it) 2024-07-09
JP7682964B2 (ja) 2025-05-26
MX2023001726A (es) 2023-02-22
PT3468990T (pt) 2024-06-25
IL324531A (en) 2026-01-01
CN109563159B (zh) 2023-06-23
MY196220A (en) 2023-03-23
PL3468990T3 (pl) 2024-08-05
PH12018502560A1 (en) 2019-10-14
US10633434B2 (en) 2020-04-28
IL309975B1 (en) 2025-12-01
EP4374922A3 (en) 2024-08-28
KR20240070728A (ko) 2024-05-21
CL2018003563A1 (es) 2019-02-22
US20170355757A1 (en) 2017-12-14
JP2023175765A (ja) 2023-12-12
JP2022106952A (ja) 2022-07-20
EP3468990B1 (en) 2024-03-27
IL263481B1 (en) 2024-02-01
MY191668A (en) 2022-07-06
SG10202012243VA (en) 2021-01-28
LT3468990T (lt) 2024-06-25
EP3468990A1 (en) 2019-04-17
JP2025134088A (ja) 2025-09-16
JP7368543B2 (ja) 2023-10-24
KR20190018166A (ko) 2019-02-21
US20230174631A1 (en) 2023-06-08
PH12018502560B1 (en) 2023-11-15
AU2017283470B2 (en) 2024-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7682964B2 (ja) 抗ｃ５抗体及びそれらの使用
AU2017245479C1 (en) Anti-PDGFR-beta antibodies and uses thereof
KR102337042B1 (ko) Pd-1에 대한 사람 항체
KR101781786B1 (ko) 사람 안지오포이에틴-2에 대한 고 친화성 사람 항체
US11066474B2 (en) Anti-TrkB monoclonal antibodies and methods of use
HK40110954A (en) Anti-c5 antibodies and uses thereof
HK40001079B (en) Anti-c5 antibodies and uses thereof
HK40001079A (en) Anti-c5 antibodies and uses thereof
EA039858B1 (ru) Антитела против c5 и их применение
EA048201B1 (ru) Полинуклеотиды, кодирующие антитела против с5, и способ получения антител против с5