JP2022106952A - 抗ｃ５抗体及びそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】補体因子５（Ｃ５）タンパク質に結合するモノクローナル抗体、及び、それらの使用方法を提供する。【解決手段】本発明の様々な実施態様において、これらの抗体は、Ｃ５タンパク質に結合する完全ヒト抗体である。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、Ｃ５活性を阻害または中和するために有用であり、従って、ヒトにおいてＣ５関連疾患または障害を処置または予防する手段を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、改善された薬物動態及び薬力学特性、例えば１０日より長い半減期を有する抗Ｃ５抗体を提供する。【選択図】なし

Description

本出願は２０１７年６月１３日にＰＣＴ国際特許出願として出願され、そして米国仮出願第６２／３４９，７０５号（２０１６年６月１４日出願）；同第６２／４０５，５６１号（２０１６年１０月７日）；及び同第６２／４２２，１０７号（２０１６年１１月１５日）（それぞれの開示はそれら全体として参照により本明細書に加入される）に対して優先権の利益を主張する。
発明の分野
本発明は、補体因子Ｃ５に特異的に結合する抗体及び抗体の抗原結合フラグメント、並びにそれらの抗体を使用する治療方法及び診断方法に関する。
発明の背景
補体系は、活性化された場合に標的細胞溶解をもたらし、そしてオプソニン化によりファゴサイトーシスを促進する一群の血漿タンパク質である。補体は３つの主要な経路による一連のタンパク質溶解工程により活性化される：古典的経路、これは典型的には免疫複合体により活性化される、無保護細胞表面により誘導され得る代替経路、及びマンノース結合レクチン経路。補体カスケードの３つの経路全てが補体成分５（Ｃ５）タンパク質のタンパク質分解切断に収束する。補体成分５（Ｃ５）の切断は、補体カスケードの活性化の間の重大なプロセスであるフラグメントＣ５ａ及びＣ５ｂの生成をもたらす。Ｃ５ａはその受容体を通して多面的な生理学的応答を生じ得る（非特許文献１）。Ｃ５ａは走化性移動を誘導する強力な炎症促進性メディエータであり、細胞接着を増強し、酸化的バーストを刺激し、そしてヒスタミン又はサイトカインのような様々な炎症メディエータの放出を誘導する。Ｃ５ｂは膜侵襲複合体（ＭＡＣ、又はＣ５ｂ－９）の形成を媒介し、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の後期に細胞溶解をもたらす。さらに、Ｃ５ｂ－９による細胞溶解に抵抗性である有核細胞において、半溶解的な（ｓｕｂｌｙｔｉｃ）量のＣ５ｂ－９は、細胞活性化を引き起こし得、これが細胞増殖、炎症促進性メディエータの生成及び細胞外マトリクスの産生を生じる。
Ｃ５に対するモノクローナル抗体は当該分野で公知であり、例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、並びに特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６、及び特許文献２７に記載されている。
米国特許第９２０６２５１号 米国特許第９１０７８６１号 米国特許第 ９０７９９４９号 米国特許第９０５１３６５号 米国特許第８９９９３４０号 米国特許第８８８３１５８号 米国特許第８２４１６２８号 米国特許第７９９９０８１号 米国特許第７４３２３５６号 米国特許第７３６１３３９号 米国特許第７２７９１５８号 米国特許第６５３４０５８号 米国特許第６３５５２４５号 米国特許第６０７４６４２号 米国特許公開第２０１６０２９９３０５号 米国特許公開第２０１６００５１６７３号 米国特許公開第２０１６００３１９７５号 米国特許公開第２０１５０１５８９３６号 米国特許公開第２０１４００５６８８８号 米国特許公開第２０１３００２２６１５号 米国特許公開第２０１２０３０８５５９号 ＷＯ２０１５１９８２４３ ＷＯ２０１５１３４８９４ ＷＯ２０１５１２０１３０ ＥＰ２５６３８１３Ｂ１ ＥＰ２３２８６１６Ｂ１ ＥＰ２０６１８１０Ｂ１
Ｍｏｎｋ ｅｔ ａｌ ２００７，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５２：４２９－４４８
高い親和性でＣ５タンパク質に特異的に結合し、かつ改善された薬物動態特性を有する完全ヒト抗体は、様々なＣ５関連疾患（例えば、非典型溶血性尿毒症症候群）の予防及び処置において重要であり得る。
発明の簡単な要旨
本発明は、補体因子５（Ｃ５）タンパク質に特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の抗体は、とりわけ、Ｃ５タンパク質の活性を阻害又は中和するために有用である。特定の実施態様において、抗体は、被験体においてＣ５関連疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は徴候を予防するか、処置するか又は寛解させる際に有用である。特定の実施態様において、抗体は、Ｃ５関連疾患又は障害を有するか又は有する危険性のある被験体に予防的又は治療的に投与され得る。特定の実施態様において、抗Ｃ５抗体は、高い親和性でＣ５に結合し、かつ改善された薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）特性を有する完全ヒト抗体である。このような改善されたＰＫ／ＰＤを有する高親和性抗体は、Ｃ５関連疾患又は障害を有する被験体においてより少ない頻度の投薬ともに、優れた有効性を提供するために使用され得る。
本発明の抗体は全長（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であっても、抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでいてもよく、そして機能に影響を及ぼすため、例えば、宿主における持続性を増加させるため、又は残留エフェクター機能を除外するために改変されてもよい（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５－１９３３）。特定の実施態様において、抗体は二重特異性であってもよい。
第一の局面において、本発明は、Ｃ５タンパク質に特異的に結合する単離された組み換
えモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施態様において、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
本発明の例となる抗Ｃ５抗体は、本明細書の表１及び２に列挙される。表１は、例となる抗Ｃ５抗体の、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、及び軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を示す。表２は、例となる抗Ｃ５抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を示す。
本発明は、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと対になった表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様によれば、本発明は、表１に列挙される例となる抗Ｃ５抗体のいずれか内に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、９８／１１４、１２２／１０６、９８／１３０、１３８／１０６、１４６／１０６、１２２／１３０、１４６／１１４、１４６／１３０、１３８／１３０、１５４／１６２、１７０／１７８、１８６／１９４、２０２／２１０、２１８／２２６、２３４／２４２、２５０／２５８、２６６／２５８、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、及び３３８／３４６からなる群より選択される。特定の実施態様において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号５０／５８（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ）、９８／１０６（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ）、１３８／１０６（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ５）、又は２０２／２１０（例えば、Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ）のうちの１つから選択される。特定の実施態様において、本発明はＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む抗Ｃ５抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、該ＨＣＶＲは５以下のアミノ酸置換を有する表１に列挙されるアミノ酸配列を含み、そして該ＬＣＶＲは２以下のアミノ酸置換を有する表１に列挙されるアミノ酸配列を含む。例えば、本発明は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む抗Ｃ５抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、該ＨＣＶＲは５以下のアミノ酸置換を有する配列番号９８のアミノ酸配列を含み、そして該ＬＣＶＲは２以下のアミノ酸置換を有する配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、本発明は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む抗Ｃ５抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、該ＨＣＶＲは少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号９８のアミノ酸配列を含み、そして該ＬＣＶＲは１つのアミノ酸置換を有する配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれか又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸のいずれか又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対になった表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３アミノ酸対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様によれば、本発明は、表１に列挙される例となる抗Ｃ５抗体のいずれか内に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号５６／６４（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ）、１０４／１１２（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ）、１４４／１１２（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ５）、及び２０８／２１６（例えば、Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ）からなる群より選択される。
本発明はまた、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、該ＨＣＶＲは、表１に列挙されるアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、表１に列挙されるアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び表１に列挙されるアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。特定の実施態様において、本発明は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む抗体又は抗原結合フラグメントを提供し、該ＬＣＶＲは、表１に列挙されるアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、表１に列挙されるアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び表１に列挙されるアミノ酸配列と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。例えば、本発明は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む抗Ｃ５抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、該ＨＣＶＲは、配列番号１００のアミノ酸配列又は配列番号１００と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０２のアミノ酸配列又は配列番号１０２と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号１０４のアミノ酸配列又は配列番号１０４と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。別の例となる実施態様において、本発明
は、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、該ＬＣＶＲは、配列番号１０８のアミノ酸配列又は配列番号１０８と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１０のアミノ酸配列又は配列番号１１０と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１１２のアミノ酸配列又は配列番号１１２と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
本発明は、配列番号３５３のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、配列番号３５４のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
特定の実施態様において、本発明は、配列番号３５３のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む重鎖；及び配列番号３５４のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含む軽鎖を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
本発明はまた、表１に列挙される例となる抗Ｃ５抗体のいずれか内に含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号５２－５４－５６－６０－６２－６４（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ）、１００－１０２－１０４－１０８－１１０－１１２（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ）、１４０－１４２－１４４－１０８－１１０－１１２（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ５）、及び２０４－２０６－２０８－２１２－２１４－２１６（例えば、Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ）からなる群より選択される。
関連する実施態様において、本発明は、表１に列挙される例となる抗Ｃ５抗体のいずれかにより定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、本発明は、配列番号５０／５８（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ）、９８／１０６（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ）、１３８／１０６（例えば、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ５）、又は２０２／２１０（例えば、Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有されるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法及び技術は当該分野で周知であり、そして本明細書に開示される特定のＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用され得る。ＣＤＲの境界を同定するために使用され得る例となる慣例としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、及びＡｂＭ定義が挙げられる。一般的には、Ｋａｂａｔ定義は配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造的ループ領域の位置に基づき、そしてＡｂＭ定義はＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａアプローチの間の折衷である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）；
Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８ （１９９７）；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照のこと。公開データベースも抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
特定の実施態様において、本発明は、Ｃ５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含み、ここでＨＣＶＲは：（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号９８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号９８に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｖ）５以下のアミノ酸置換を有する配列番号９８のアミノ酸配列を含み；そしてＬＣＶＲは：（ｉ）配列番号１０６のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１０６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１０６に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｖ）５以下のアミノ酸置換を有する配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。
本発明は、改変されたグリコシル化パターンを有する抗Ｃ５抗体を含む。いくつかの実施態様において、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増加させるための、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠いた抗体は有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照のこと）。他の適用において、ガラクトシル化の改変が補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を改変するために行われ得る。
特定の実施態様において、本発明は、Ｃ５に対するｐＨ依存性結合を示す抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、本発明は、酸性ｐＨよりも中性ｐＨでより高い親和性でＣ５に結合する（すなわち、酸性ｐＨで減少した結合）抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。
特定の実施態様において、本発明は、改善された薬物動態及び薬力学特性を示す抗体及び抗原結合フラグメントを提供し、例えば、本発明は、延長された血清半減期を有する抗Ｃ５抗体を提供する。特定の実施態様において、本発明の抗Ｃ５抗体は、Ｃ５ヒト化マウスにおいて４０日目まで１０μｇ／ｍＬより高い血清濃度を有する。特定の実施態様において、本発明の抗Ｃ５抗体は、Ｃ５ヒト化マウスへの投与の際に、３５日目までＣＰ溶血及びＡＰ溶血を遮断する。
本発明はまた、ＨＣＶＲのＣＤＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗体又はその抗原結合フラグメントとＣ５に対する特異的結合について競合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供し、ここでＨＣＶＲ及びＬＣＶＲはそれぞれ、表１に列挙されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明はまた、ＨＣＶＲのＣＤＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体又はその抗原結合フラグメントとＣ５に対する結合について交差競合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供し、ここでＨＣＶＲ及びＬＣＶＲはそれぞれ、表１に列挙されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明はまた、ＨＣＶＲのＣＤＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体又はその抗原結合フラグメントと同じエピトープに結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供し、ここでＨＣＶＲ及びＬＣＶＲはそれぞれ、表１に列挙されるＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列
から選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施態様において、本発明は、ＨＣＶＲのＣＤＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体又はその抗原結合フラグメントと同じエピトープに結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供し、ここでＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は配列番号９８／１０６を有する。
本発明はまた、Ｃ５のアルファ鎖及び／又はベータ鎖に含まれる１つ又はそれ以上のアミノ酸残基に結合する抗Ｃ５抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、本発明は、Ｃ５のアルファ鎖中の１つ又はそれ以上のアミノ酸及びＣ５のベータ鎖中の１つ又はそれ以上のアミノ酸に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、本発明は、Ｃ５のアルファ鎖及びベータ鎖中の１つ又はそれ以上のアミノ酸に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを提供し、ここで抗体はＣ５ａアナフィラトキシンドメインに結合しない。特定の実施態様において、本発明は、ヒトＣ５（配列番号３５９）内に含有される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗Ｃ５抗体を提供する。特定の実施態様において、本発明は、ヒトＣ５（配列番号３５９）内に含有される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗Ｃ５抗体を提供し、ここで抗体は、Ｃ５のＣ５ａアナフィラトキシンドメインに結合しない。特定の実施態様において、本発明は、（ａ）配列番号３５９のアミノ酸５９１～５９９；（ｂ）配列番号３５９のアミノ酸５９３～５９９；（ｃ）配列番号３５９のアミノ酸７７５～７８７；（ｄ）配列番号３５９のアミノ酸７７５～７９４；及び（ｅ）配列番号３５９のアミノ酸７７９～７８７からなる群より選択されるアミノ酸配列と相互作用する抗Ｃ５抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、本発明は、配列番号３５９内に含有される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗Ｃ５抗体及びその抗原結合フラグメントを提供し、例えば、本発明は、配列番号３６１内に含有される少なくとも５つのアミノ酸、少なくとも１０のアミノ酸、又は少なくとも１５のアミノ酸と相互作用する抗Ｃ５抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、本発明は、配列番号３５９内に含有される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗Ｃ５抗体及びその抗原結合フラグメントを提供し、例えば、本発明は、配列番号３６０内に含有される少なくとも５つのアミノ酸と相互作用する抗Ｃ５抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、本発明は、配列番号３６０及び３６１内に含有される少なくとも５つのアミノ酸と相互作用する抗Ｃ５抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施態様において、本発明は、配列番号３６０のアミノ酸配列（配列番号３５９のアミノ酸５９１～５９９に対応する）及び配列番号３６１のアミノ酸配列（配列番号３５９のアミノ酸７７５～７９４に対応する）と相互作用する抗Ｃ５抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。
いくつかの実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アゴニスト様式でＣ５に特異的に結合し得、すなわち、Ｃ５結合及び／又は活性を増強又は刺激し得；他の実施態様では、抗体はアンタゴニスト様式でＣ５に特異的に結合し得、すなわち、Ｃ５結合及び／又は活性を遮断し得る。
本発明はまた、Ｃ５転換酵素へのＣ５の結合を遮断する単離された抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施態様において、Ｃ５転換酵素へのＣ５の結合を遮断する抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｃ５転換酵素と同じＣ５上のエピトープに結合し得るか、又はＣ５転換酵素と異なるＣ５上のエピトープに結合し得る。いくつかの実施態様において、本発明は、サルＣ５転換酵素へのＣ５の結合を遮断する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。
特定の実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、Ｃ５タンパク質の第一のエピトープに対する第一の結合特異性及びＣ５タンパク質の第二のエピトープに対する第二の特異性を含む二重特異性であり、ここで第一及び第二のエピトープは異なり
、かつ重ならない。
特定の実施態様において、本発明の抗体及び抗原結合フラグメントは、Ｃ５ａに対して０．５ｎＭ未満のＩＣ５０で結合する。特定の実施態様において、抗体は、配列番号２９０、３０６、３２２、及び３３８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む。特定の実施態様において、抗体は、配列番号２９８、３１４、３３０、及び３４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む。
特定の実施態様において、本発明は、以下の１つ又はそれ以上を有する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である；（ｂ）表面プラズモン共鳴で測定して、２５℃で０．９ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＣ５に結合する；（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、３７℃で０．３ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５に結合する；（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、６５ｎＭ未満のＫＤでサルＣ５に結合する；（ｅ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、０．５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５変異体Ｒ８８５Ｈ（配列番号３５６）に結合する；（ｆ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、０．５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５変異体Ｒ８８５Ｃ（配列番号３５７）に結合する；（ｇ）ＣＰ溶血アッセイで測定して、６ｎＭ未満のＩＣ５０で９５％より多くヒトＣ５媒介古典的経路（ＣＰ）溶血を遮断する；（ｈ）ＡＰ溶血アッセイで測定して、１６５ｎＭ未満のＩＣ５０で７０％より多くヒトＣ５媒介代替経路（ＡＰ）溶血を遮断する；（ｉ）ＣＰ溶血アッセイで測定して、１８５ｎＭ未満のＩＣ５０でアフリカミドリザルＣ５媒介ＣＰ溶血を阻害する；（ｊ）ＡＰ溶血アッセイで測定して、２３５ｎＭ未満のＩＣ５０でアフリカミドリザルＣ５媒介ＡＰ溶血を阻害する；（ｋ）ＣＰ溶血アッセイで測定して、１４５ｎＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＣ５媒介ＣＰ溶血を阻害する；及び（ｌ）ＡＰ溶血アッセイで測定して、３０ｎＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＣ５媒介ＡＰ溶血を阻害する。
特定の実施態様において、本発明は、以下の特徴の１つ又はそれ以上を有する単離された組み換えモノクローナル抗Ｃ５抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：（ａ）配列番号１００－１０２－１０４－１０８－１１０－１１２のアミノ酸配列を含む６つのＣＤＲのセットを含む；（ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、２５℃で０．２ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＣ５に結合する；（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、３７℃で０．３ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５に結合する；（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、３７℃で０．４ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５変異体（Ｒ８８５Ｈ）に結合する；（ｅ）３ｎＭ未満のＩＣ５０でヒト血清の古典経路（ＣＰ）媒介溶血を阻害する；（ｆ）２７ｎＭ未満のＩＣ５０でヒト血清の代替経路（ＡＰ）媒介溶血を阻害する；（ｇ）２１ｎＭ未満のＩＣ５０でサル血清のＣＰ媒介溶血を阻害する；（ｇ）１０ｎＭ未満のＩＣ５０でサル血清のＡＰ媒介溶血を阻害する；（ｈ）Ｃ５ヒト化マウスにおいて１０日より長い血清半減期（ｔ１／２）を有する；（ｉ）Ｃ５ヒト化マウスに投与する際に４０日目まで１０μｇ／ｍＬより高い血清濃度を有する；（ｊ）Ｃ５ヒト化マウスにおいて５０日までＣＰ媒介溶血を遮断する；並びに（ｋ）配列番号３５９のアルファ鎖及び／又はベータ鎖に含まれる１つ又はそれ以上のアミノ酸に結合し、ここで抗体はＣ５のＣ５ａアナフィラトキシンドメインに結合しない。
第二の局面において、本発明は、抗Ｃ５抗体又はその部分をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様において、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれか、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様において、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様において、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ１核酸配列、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様において、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ２核酸配列、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様において、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＤＲ３核酸配列、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様において、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ１核酸配列、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様において、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ２核酸配列、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；特定の実施態様において、核酸分子は、表２に列挙されるＬＣＤＲ３核酸配列、又はそれらに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
本発明はまたＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここでＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）を含み、ここでＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙される例となる抗Ｃ５抗体のいずれかにより定義されるとおりである。
本発明はまたＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ここでＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）をを含み、ここでＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙される例となる抗Ｃ５
抗体のいずれかにより定義されるとおりである。
本発明はまたＨＣＶＲ及びＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子を提供し、ここでＨＣＶＲは、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、そしてここでＬＣＶＲは、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、核酸分子は、表２に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似した配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、及び表１に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列、又はそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実施的に類似した配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。本発明のこの局面に従う特定の実施態様において、核酸分子はＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードし、ここでＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、両方とも表１に列挙される同じ抗Ｃ５抗体から誘導される。
関連する局面において、本発明は、抗Ｃ５抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組み換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子のいずれか、すなわち、表２に示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子を含む組み換え発現ベクターを含む。このようなベクターがその細胞中に導入されている宿主細胞、さらには宿主細胞を抗体又は抗体フラグメントの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、並びにこのようにして産生された抗体及び抗体フラグメントを回収することにより抗体又はその一部を製造する方法もまた本発明の範囲内に包含される。
第三の局面において、本発明は、治療有効量の、Ｃ５に特異的に結合する少なくとも１つの組み換えモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。関連する局面において、本発明は、抗Ｃ５抗体と第二の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施態様において、第二の治療剤は、抗Ｃ５抗体と有利に組み合わせられるいずれかの薬剤である。抗Ｃ５抗体と有利に組み合わせられ得る例となる薬剤としては、限定することなく、Ｃ５活性に結合し、かつ／もしくは阻害する他の薬剤（他の抗体又はその抗原結合フラグメントなどを含む）及び／又はＣ５に直接結合しないが、それにもかかわらずＣ５関連疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状もしくは徴候を処置もしくは寛解する薬剤が挙げられる。本発明の抗Ｃ５抗体を含むさらなる組み合わせ治療及び同時処方（ｃｏ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）は本明細書の他所に開示される。
第四の局面において、本発明は、本発明の抗Ｃ５抗体又は抗体の抗原結合部分を使用して被験体においてＣ５に関連する疾患又は障害を処置するための治療方法を提供し、ここで治療方法は、治療有効量の、本発明の抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを含む医薬組成物をそれを必要とする被験体に投与することを含む。処置される障害は、Ｃ５活性の阻害により改善されるか、寛解されるか、阻害されるか又は予防されるいずれかの疾患又は状態である。特定の実施態様において、本発明は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の少なくとも１つの症状を予防するか、処置するか又は寛解させる方法を提供し、該方法は、治療有効量の本発明の抗Ｃ５抗体又はその抗原結合フラグメントをそれを必要とする被験体に投与することを含む。いくつかの実施態様において、本発明は、本発明の抗Ｃ５抗体を投与することにより、被験体において発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）の少なくとも１つの症状又は徴候を寛解させるか又は重症度を減少させる方法を提供する。いくつかの実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｃ５関連疾患又は障害を有するか又はそれを有する危険性のある被験体に予防的又は治療的に投与され得る。特定の実施態様において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、第二の治
療剤と組み合わせてそれを必要とする被験体に投与される。第二の治療剤は、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド類、及び非ステロイド性抗炎症薬）、Ｃ５に対する異なる抗体、抗酸化剤のような栄養補助食品及び当該分野で公知のいずれかの他の薬物又は治療法からなる群より選択され得る。特定の実施態様において、第二の治療剤は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントに関連するいずれかの可能な副作用を、そのような副作用が発生する場合に、対抗するか又は低減させるために役立つ薬剤でありえる。抗体又はそのフラグメントは、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口又は筋内に投与され得る。抗体又はそのフラグメントは、被験体の約０．１ｍｇ／体重ｋｇから約１００ｍｇ／体重ｋｇの用量で投与され得る。特定の実施態様において、本発明の抗体は、５０ｍｇ～６００ｍｇの間を含む１又はそれ以上の用量で投与され得る。
本発明はまた、Ｃ５の結合及び／又は活性の遮断から利益を得るであろう疾患又は障害の処置のための薬剤の製造における、本発明の抗Ｃ５抗体又はその抗原結合フラグメントの使用を含む。
他の実施態様は、以下の詳細な説明の検討から明らかとなるだろう。
図１は、ＥＬＩＳＡにより決定した、抗Ｃ５抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐの用量依存性様式でのＣ５ａレベルの阻害を示す（本明細書の実施例９に記載される）。 図２は、雄性カニクイザルへのＨ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ、又は対照薬２の単回１５ｍｇ／ｋｇ静脈内注射後の時間に対する総血清濃度を示す（本明細書の実施例１０に記載される）。濃度－時間プロフィールを、該当する場合、定量限界未満（ＢＬＱ）結果後の最初の用量までプロットした（これは、ＬＬＯＱ／２として補完された）。各データ点は平均（±ＳＤ）（ｎ＝４ 動物群）を表し；ＡＤＡにより影響を受けたとみなされる濃度は、それぞれ３６日目及び２９日目に開始したＨ４Ｈ１２１６６Ｐ群における１匹の動物及びＨ４Ｈ１２１６１Ｐ群における１匹の動物から除外された。ＬＬＯＱ＝定量下限。 図３は、雄性カニクイザルへのＨ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ又は対照薬２の単回静脈内注射後の、エクスビボ赤血球（Ａ）古典的経路及び（Ｂ）代替経路アッセイにおける時間に対する溶血パーセントを示す。両方の値からバックグラウンド溶解％を引いた、実験の溶解対最大溶解の比として計算された溶血％は、所定の時点で血清中に存在する特定の抗Ｃ５抗体により阻害されたＣ５の量に関連する。各データ点は平均（±ＳＤ）を表す。 図３は、雄性カニクイザルへのＨ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ又は対照薬２の単回静脈内注射後の、エクスビボ赤血球（Ａ）古典的経路及び（Ｂ）代替経路アッセイにおける時間に対する溶血パーセントを示す。両方の値からバックグラウンド溶解％を引いた、実験の溶解対最大溶解の比として計算された溶血％は、所定の時点で血清中に存在する特定の抗Ｃ５抗体により阻害されたＣ５の量に関連する。各データ点は平均（±ＳＤ）を表す。 図４は、Ｃ５についてヒト化されたマウスにおける選択された抗Ｃ５抗体の総血清濃度対時間プロフィールを示す（本明細書の実施例１１に記載される）。ヒト化Ｃ５マウスに、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、対照薬１又は対照薬２の単回１５ｍｇ／ｋｇ皮下用量を投与した。各データ点は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（それぞれｎ＝４～５）を表す。血清中の抗体濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して注射の１、１０、２０、３０及び４０日後にモニタリングした。 図５は、Ｃ５についてヒト化されたマウスにおける選択された抗Ｃ５抗体のエクスビボ補体古典的経路溶血アッセイにおける溶血パーセント対時間を示す。ヒト化Ｃ５マウスに、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、対照薬１又は対照薬２の単回１５ｍｇ／ｋｇ皮下用量を投与した。各データ点は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（それぞれｎ＝４～５）を表す。血清中の溶血パーセントを、投薬前、注射の１０、２０、３０、４０及び５０日後にモニタリングした。両方の値からバックグラウンド溶解％を引いた、実験の溶解対最大溶解の比として計算された溶血％は、所定の時点で血清中に存在する特定の抗Ｃ５抗体により阻害されたＣ５の量に関連する。 図６は、Ｃ５についてヒト化されたマウスにおける選択された抗Ｃ５抗体の総血清濃度対時間プロフィールを示す（本明細書の実施例１１に記載される）。マウスにＨ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ、対照薬１又はＩｇＧ４Ｐアイソタイプコントロールの単回１５ｍｇ／ｋｇ皮下用量を投与した。各データ点は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（それぞれｎ＝５）を表す。血清中の抗体レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して注射の６時間、１、２、３、４、７、１０、１４、２１、３０、４５及び５９日後にモニタリングした。 図７は、アイソタイプコントロール又は抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎで１０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇで処置されたマウスにおける光干渉断層撮影（ＯＣＴ）スコアを示すグラフである（本明細書の実施例１４に記載される）。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、両側ＡＮＯＶＡ ５０ｍｇ／ｋｇでの抗Ｃ５抗体での処置 対 未処置又はアイソタイプコントロールでの処置。 図８は、Ｃ３の存在しない場合（Ａ）；及び８０μｇ／ｍＬのヒトＣ３の存在下（Ｂ）での抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎによる古典的経路溶血の阻害を示す（本明細書の実施例１４に記載される）。 図９は、アイソタイプコントロール又は抗ヒトＣ５抗体Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ １０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇで処置されたＣ５ヒト化マウスにおける細胞集団数を示す（本明細書の実施例１５に記載される）。各群についてｎ＝８～１２の眼。 図１０は、アイソタイプコントロール又は抗ヒトＣ５抗体 Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ １０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇで処置されたＣ５ヒト化マウスにおけるＯＣＴスコアを示すグラフである（本明細書の実施例１５に記載される）。各群についてｎ＝８～１２の眼。 図１１は、アイソタイプコントロール、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇでの抗ヒトＣ５抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、又は対照薬２ １０ｍｇ／ｋｇで処置されたＣ５ヒト化マウスにおけるＯＣＴスコアを示すグラフである。各群についてｎ＝６～１２の眼（本明細書の実施例１５に記載される）。 図１２は、アイソタイプコントロール、抗ヒトＣ５抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ ３ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇ、又は対照薬２ １０ｍｇ／ｋｇで処置されたＣ５ヒト化マウスにおける細胞集団数を示す。各群についてｎ＝６～１２の眼（本明細書の実施例１５に記載される）。 図１３は、アイソタイプコントロール又は抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８ＮもしくはＭ１Ｍ１７６２７Ｎで処置されたＮＺＢＷＦ１マウスの生存曲線である（本明細書の実施例１７に記載される）。 図１４は、アイソタイプコントロール又は抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８ＮもしくはＭ１Ｍ１７６２７Ｎで処置されたＮＺＢＷＦ１マウスにおける（Ａ）尿中アルブミン及び（Ｂ）尿中クレアチニンに対して正規化された尿中アルブミンのレベルを示す（本明細書の実施例１７に記載される）。 図１４は、アイソタイプコントロール又は抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８ＮもしくはＭ１Ｍ１７６２７Ｎで処置されたＮＺＢＷＦ１マウスにおける（Ａ）尿中アルブミン及び（Ｂ）尿中クレアチニンに対して正規化された尿中アルブミンのレベルを示す（本明細書の実施例１７に記載される）。 図１５は、アイソタイプコントロール又は抗Ｃ５抗体Ｍ１Ｍ１７６２８ＮもしくはＭ１Ｍ１７６２７Ｎ（本明細書の実施例１７に記載される）で処置されたＮＺＢＷＦ１マウスにおける血中尿素窒素のレベルを示す。 図１６は、実施例１８に記載されるように、抗Ｃ５抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ、対照薬１及び対照薬２による星状膠細胞の抗体依存性細胞傷害の阻害を示すグラフである。
詳細な説明
本発明の方法を記載する前に、当然のことながら、記載される方法及び実験条件は変化し得るので、この発明は記載される特定の方法及び実験条件に限定されない。また当然のことながら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的のみのためであり、限定することを意図されない。
他の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似しているか又は等価であるいずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料がここで記載される。本明細書において言及される全ての刊行物は、参照によりそれら全体として本明細書に加入される。
定義
「補体成分５」又は「補体因子５」とも呼ばれる用語「Ｃ５」は、補体カスケードの血清タンパク質を指す。Ｃ５タンパク質は、２つの鎖アルファ及びベータを含む１６７６アミノ酸タンパク質である。タンパク質は、３つの補体活性化経路の収束点を表す：古典的経路、代替経路及びマンノース結合レクチン経路。全長Ｃ５タンパク質のアミノ酸配列は受け入れ番号ＮＰ＿００１７２６．２（配列番号３５５）としてＧｅｎＢａｎｋで提供されるアミノ酸配列により例示される。用語「Ｃ５」は組み換えＣ５タンパク質又はそのフラグメントを含む。この用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトＦｃ、又はＲＯＲ１のようなシグナル配列にカップリングしたＣ５タンパク質又はそのフラグメントも包含する。例えば、この用語は、全長Ｃ５タンパク質のアミノ酸残基１９～１６７６にカップリングされたＣ末端にヒスチジンタグを含む配列番号３５６又は３５７に示される配列により例示される配列を含む。この用語はまた、Ｒ８８５Ｈ変化又はＲ８８５Ｃ変化を有し、全長Ｃ５タンパク質のアミノ酸残基１９～１６７６にカップリングされたＣ末端にヒスチジンタグを含むタンパク質変異体も含む。
本明細書で使用される用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖から構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、さらにはそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）又はそれらの抗原結合フラグメントを指すことを意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」又は「ＶＨ」）及び重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」又は「ＶＬ」）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の特定の実施態様において、抗体（又はその抗原結合フラグメント）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得、又は天然にもしくは人工的に改変され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ又はそれ以上のＣＤＲの対照（ｓｉｄｅ－ｂｙ－ｓｉｄｅ）解析に基づいて定義され得る。
１つもしくはそれ以上のＣＤＲ残基の置換又は１つもしくはそれ以上のＣＤＲの削除も可能である。１つ又は２つのＣＤＲが結合のために省かれ得る抗体が科学文献に記載されている。Ｐａｄｌａｎら（１９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９）は、公開さ
れた結晶構造に基づいて抗体とそれらの抗原との間の接触領域を解析し、そしてＣＤＲ残基のおよそ５分の１から３分の１のみが実際に抗原に接触すると結論づけた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つ又は２つのＣＤＲが抗原と接触するアミノ酸を有していない多くの抗体を発見した（Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５－４２８も参照のこと）。
抗原と接触していないＣＤＲ残基は、分子モデリングにより及び／又は経験的にＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から、以前の研究に基づいて同定することができる（例えば、ＣＤＲＨ２における残基Ｈ６０～Ｈ６５はしばしば必要ない）。ＣＤＲ又はその残基が削除される場合、それは通常、別のヒト抗体配列又はそのような配列のコンセンサスにおける対応する位置を占めるアミノ酸と置き換えられる。ＣＤＲ内の置換の位置及び置換するべきアミノ酸もまた経験的に選択され得る。経験的置換は保存的置換でも非保存的置換でもよい。
本明細書に開示される完全ヒト抗Ｃ５モノクローナル抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域に含み得る。このような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば公開抗体配列データベースから利用可能な生殖系列配列と比較することにより容易に確認され得る。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかから誘導される抗体及びその抗原結合フラグメントを含み、ここで１つ又はそれ以上のフレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域中の１つ又はそれ以上のアミノ酸は、その抗体が誘導された生殖系列配列の対応する残基、又は別のヒト生殖系列配列の対応する残基、又は対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異されている（このような配列変化は、本明細書において集合的に「生殖系列変異」と呼ばれる）。当業者は、本明細書に開示される重鎖及び軽鎖可変領域配列から開始して、１つ又はそれ以上の個々の生殖系列変異又はその組み合わせを含む多数の抗体及び抗原結合フラグメントを容易に製造することができる。特定の実施態様において、ＶＨ及び／又はＶＬドメイン内の全てのフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基は、抗体が誘導された元の生殖系列配列中に見られる残基に変異して戻される。他の実施態様において、特定の残基のみが元の生殖系列配列に変異して戻される、例えば、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８つのアミノ酸内に見られる変異した残基のみ、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内に見られる変異した残基のみ。他の実施態様において、フレームワーク及び／又はＣＤＲ残基の１つ又はそれ以上は、異なる生殖系列配列の対応する残基に変異される（すなわち、抗体が元々誘導された生殖配列と異なる生殖配列）。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の２つ又はそれ以上の生殖系列変異のいずれかの組み合わせを含有し得、例えば、ここで特定の個々の残基が特定の生殖系列配列の対応する残基へと変異され、一方で元の生殖系列配列とは異なる特定の他の残基は維持されるか、又は異なる生殖系列配列の対応する残基へと変異される。１つ又はそれ以上の生殖系列変異を含有する抗体及び抗原結合フラグメントが得られると、それらは改善された結合特異性、増加した結合親和性、改善されたか又は増強されたアンタゴニスト又はアゴニストの生物学的特性（場合によって）、減少した免疫原性などのような１つ又はそれ以上の所望の特性について容易に試験され得る。この一般的な方法で得られる抗体及び抗原結合フラグメントは本発明内に包含される。
本発明はまた、１つ又はそれ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む完全ヒト抗Ｃ５モノクローナル抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比較して例えば、１０又はそれ以下、８又はそれ以下、６又はそれ以下、４又はそれ以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗Ｃ５抗体を含む。
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列から誘導された可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図される。本発明のヒトｍＡｂは、例えばＣＤＲ、及び特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発により又はインビボでの体細胞変異により導入される変異）。しかし、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列から誘導されたＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列上にグラフト化されているｍＡｂを含むことは意図されない。この用語は、非ヒト哺乳動物において、又は非ヒト哺乳動物の細胞において組み換え的に産生された抗体を含む。この用語は、ヒト被験体から単離されたか又はヒト被験体において生成された抗体を含むことを意図されない。
本明細書において使用される用語「組み換え（体）」は、例えば、ＤＮＡスプライシング及びトランスジェニック発現を含む組み換えＤＮＡ技術として当該分野で知られている技術又は方法により生成され、発現され、単離され、又は得られる本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを指す。この用語は、非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えば、トランスジェニックマウスを含む）、もしくは細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系において発現されるか、又は組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体を指す。
用語「特異的に結合する」又は「～に特異的に結合する」、又は同様のものは、抗体又はその抗原結合フラグメントが、生理条件下で比較的安定な抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１ｘ１０－８Ｍ又はそれ以下（例えば、より小さなＫＤはより緊密な結合を示す）の平衡解離定数を特徴とし得る。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。本明細書に記載される抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭにより同定されており、Ｃ５に特異的に結合する。さらに、Ｃ５における１つのドメイン及び１つもしくはそれ以上のさらなる抗原に結合する多選択性（ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、又はＣ５の２つの異なる領域に結合する二重特異性は、それにもかかわらず、本明細書で使用される「特異的に結合する」抗体とみなされる。
用語「高親和性」抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ又は溶液アフィニティＥＬＩＳＡにより測定して、少なくとも１０－８Ｍ；好ましくは１０－９ Ｍ；より好ましくは１０－１０Ｍ、なおより好ましくは１０－１１Ｍ、なおより好ましくは１０－１２ＭのＫＤとして表されるＣ５に対する結合親和性を有するｍＡｂを指す。
用語「遅い解離速度」、「Ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭにより決定して、１ｘ１０－３ｓ－１又はそれ以下、好ましくは１ｘ１０－４ ｓ－１又はそれ以下の速度定数でＣ５から解離する抗体を意味する。
本明細書で使用される用語抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、抗原と特異的に結合して複合体を形成するいずれかの天然に存在するか、酵素的に入手可能か、合成的、又は遺伝子的に操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。本明細書で使用される用語抗体の「抗原結合フラグメント」又は「抗体フラグメント」は、Ｃ５タンパク質に結合する能力を保持した抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを指す。
特定の実施態様において、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、リガンドもしくは治療的部分のような部分（「免疫結合体」）、第二の抗Ｃ５抗体、又はＣ５関連疾患もしく
は障害を処置するために有用ないずれかの他の治療的部分に結合され得る。
本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体を指すことを意図される（例えば、Ｃ５に特異的に結合する単離された抗体又はそのフラグメントは、Ｃ５意以外の抗原に特異的に結合するＡｂを実質的に含まない）。
本明細書で使用される「遮断抗体」又は「中和抗体」（又は「Ｃ５活性を中和する抗体」又は「アンタゴニスト抗体」）は、Ｃ５へのその結合がＣ５の少なくとも１つの生物学的活性の阻害を生じる抗体を指すことを意図される。例えば、本発明の抗体は、古典的経路又は代替経路による補体媒介溶血を防止又は遮断し得る。
本明細書で使用される用語「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度における変化の検出による実時間生体分子相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指すことを意図される。
用語「エピトープ」は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原性決定基を指す。単一の抗原が１つより多くのエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合し得、そして異なる生物学的効果を有し得る。用語「エピトープ」はまた、Ｂ及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。これは抗体により結合される抗原の領域も指す。エピトープは構造的又は機能的として定義され得る。機能的エピトープは、一般的には構造的エピトープのサブセットであり、そして相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた構造的であり得、すなわち、非線状アミノ酸から構成される。特定の実施態様において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基のような分子の化学的に活性な表面集団である決定基を含み得、そして特定の実施態様では、特異的三次元構造特徴、及び／又は特異的電荷特徴を有し得る。
本明細書で使用される用語「交差競合する」は、抗体又はその抗原結合フラグメントが抗原に結合し、そして別の抗体又はその抗原結合フラグメントの結合を阻害又は遮断することを意味する。この用語はまた、両方向での２つの抗体間の競合も含み、すなわち、結合して第二の抗体の結合を遮断する第一の抗体およびその逆。特定の実施態様において、第一の抗体及び第二の抗体は同じエピトープに結合し得る。あるいは、第一及び第二の抗体は、異なるが重なっているエピトープに結合し得、その結果、一方の結合は第二の抗体の結合を、例えば立体障害により阻害又は遮断する。抗体間の交差競合は、当該分野で公知の方法により、例えば実時間無標識バイオレイヤー干渉アッセイにより測定され得る。２つの抗体間の交差競合は、自己－自己結合（ここで第一及び第二の抗体は同じ抗体である）に起因するバックグラウンドシグナルより低い第二の抗体の結合として表され得る。２つの抗体間の交差競合は、例えば、ベースライン自己－自己バックグラウンド結合（ここで第一及び第二の抗体は同じ抗体である）より低い第二の抗体の結合％として表され得る。
核酸又はそのフラグメントに言及する場合の用語「実質的な同一性」又は「実質的に同一」は、別の核酸（又はその相補鎖）と適切なヌクレオチド挿入又は欠失を含んで最適に整列された場合に、以下に考察されるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧＡＰのよう
な配列同一性のいずれかの周知のアルゴリズムにより測定して、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子に対して実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の例において、参照核酸分子によりコードされるポリペプチドと同じかまたは実質的に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
ポリペプチドに適用される用語「実質的な類似性」又は「実質的に類似した」は、デフォルトギャップ重みを使用してＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴのようなプログラムにより最適に整列された場合に、２つのペプチド配列が、少なくとも９０％配列同一性、なおより好ましくは少なくとも９５％、９８％又は９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変更しない。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が互いに保存的置換により異なる場合、類似性パーセント又は類似度は、置換の保存的性質を補正するために上方調整され得る。この調整を行う手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１（これは参照により本明細書に加入される）を参照のこと。類似した化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸及びグルタミン酸、並びに７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニンがあげられる。好ましい保存的アミノ酸置換グループは：バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、及びアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５（参照により本明細書に加入される）において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負ではない値を有する変化である。
ポリペプチドについての配列類似性は、典型的には配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の改変に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似した配列をマッチングする。例えば、ＧＣＧソフトウェアはＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴのようなプログラムを含有し、これらはデフォルトパラメーターを用いて、密に関連するポリペプチド間、例えば異なる種の生物由来の相同ポリペプチド間、又は野生型タンパク質及びそのムテイン間の配列相同性又は配列同一性を決定するために使用され得る。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、ＦＡＳＴＡを使用してデフォルト又は推奨パラメーターを使用して比較することができる；ＧＣＧバージョン６．１中のプログラム。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と検索配列との間の最大オーバーラップの領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）前出）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合に好ましい別のアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用する、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及び（１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（これらはそれぞれ参照により本明細書に加入される）を参照のこと。
句「治療有効量」は、そのために投与される所望の効果を生じる量を意味する。正確な量は処置の目的に依存し、そして当業者により公知の技術を使用して確認可能である（例えば、Ｌｌｏｙｄ （１９９９） Ｔｈｅ Ａｒｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照のこと）。
本明細書で使用される用語「被験体」は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）又は発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）のようなＣ５関連疾患又は障害の寛解、予防及び／又は処置を必要とする動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。この用語は、このような疾患又は障害を有するか又は有する危険性のあるヒト被験体を含む。
本明細書で使用される用語「処置する」、「処置すること」又は「処置」は、本発明の抗体のような治療剤の、それを必要とする被験体への投与に起因する、Ｃ５関連疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は徴候の重症度の低減又は寛解を指す。これらの用語は、疾患の進行又は症状／徴候の悪化の阻害を含む。これらの用語はまた、疾患のポジテイブな予後を含み、すなわち、被験体は、本発明の抗体のような治療剤を投与すると疾患がなくなり得るか又は減少した疾患を有し得る。治療剤は、被験体への治療的用量で投与され得る。
用語「予防する」、「予防すること」又は「予防」は、Ｃ５関連疾患もしくは障害又はこのような疾患もしくは障害の徴候の出現を、本発明の抗体の投与の際に阻害することを指す。
抗体の抗原結合フラグメント
特に具体的に示されていなければ、本明細書で使用される用語「抗体」は、２つの免疫グロブリン重鎖及び２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子、すなわち、「完全抗体分子」）、さらにはその抗原結合フラグメントを包含すると理解されるものとする。本明細書で使用される用語抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在するか、酵素的に得ることができるか、合成又は遺伝子的に操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。本明細書で使用される用語抗体の「抗原結合フラグメント」、又は「抗体フラグメント」は、Ｃ５タンパク質に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを指す。抗体フラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、ＣＤＲを含有するフラグメント、又は単離されたＣＤＲが挙げられる。特定の実施態様において、用語「抗原結合フラグメント」は、多選択性抗原結合分子のポリペプチドフラグメントを指す。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、完全抗体分子から、タンパク質溶解消化又は抗体可変ドメイン及び（場合により）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組み換え遺伝子操作のようないずれかの適切な標準的技術を使用して誘導され得る。このようなＤＮＡは、公知であり、かつ／又は、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、又は合成することができる。ＤＮＡは配列決定され得、そして化学的操作されるか又は分子生物学技術を使用することにより、例えば、１つもしくはそれ以上の可変及び／もしくは定常ドメインを適切な構成に配置し得るか、又はコドンを導入するか、システイン残基を作製するか、アミノ酸を修飾、付加もしくは欠失するなどし得る。
抗原結合フラグメントの非限定的な例としては：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体
の超可変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））、又は拘束性ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドが挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ－グラフト化抗体、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＳＭＩＰ）、及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインのような他の操作された分子もまた、本明細書で使用される表現「抗原結合フラグメント」内に包含される。
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインはいずれのサイズ又はアミノ酸組成のものでもよく、そして一般的には少なくとも１つのＣＤＲを含み、これは１つ又はそれ以上のフレームワーク配列に隣接するかインフレームである。ＶＬドメインと関連するＶＨドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶＨ及びＶＬドメインは、互いに対していずれかの適切な配置に位置し得る。例えば、可変領域は二量体であり得、そしてＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＬ二量体であり得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体ＶＨ又はＶＬドメインを含有し得る。
特定の実施態様において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合で連結された少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内に見られ得る可変及び定常ドメインの非限定的な例となる構成としては：（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２；（ｉｉｉ） ＶＨ－ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３；及び（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。上で列挙された例となる構成のいずれかを含めて可変及び定常ドメインのいずれかの構成において、可変及び定常ドメインは、互いに直接連結されていても、完全又は部分的ヒンジ又はリンカー領域により連結されていてもよい。ヒンジ領域は、少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０又はそれ以上）のアミノ酸からなるものであり得、これは単一のポリペプチド分子中の隣接する可変及び／又は定常ドメイン間の可動性又は半可動性の連結を生じる。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、互いに非共有結合している、及び／又は１つもしくはそれ以上の単量体ＶＨもしくはＶＬドメインとの（例えば、ジスルフィド結合により）、上に列挙された可変及び定常ドメイン構成のいずれかのホモ二量体又はヘテロ二量体（又は他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子のように、抗原結合フラグメントは、単一特異的又は多選択的（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多選択性抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここで各可変ドメインは、別の抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例となる二重特異性抗体形式を含むいずれの多選択性抗体形式も、当該分野で利用可能な通常の技術を使用して本発明の抗体の抗原結合フラグメントの状況における使用のために適合され得る。
ヒト抗体の製造
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は当該分野で公知である。いずれかのこのような公知の方法を本発明の状況で使用して、Ｃ５タンパク質に特異的に結合するヒト抗体を製造することができる。
以下のいずれか１つを含む免疫原を使用してＣ５タンパク質に対する抗体を生成することができる。特定の実施態様において、本発明の抗体は、全長天然Ｃ５タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＮＰ＿００１７２６．２を参照のこと）（配列番号３５５）を用いて、又はそのタンパク質もしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡを用いて免疫されたマウスから得られる。あるいは、タンパク質又はそのフラグメントは、標準的な生化学的技術を使用して製造され得、改変され得、そして免疫原として使用され得る。本発明の特定の実施態様において、免疫原は、配列番号３５５のアミノ酸残基約１９～１６７６の範囲に及ぶＣ５タンパク質のフラグメントである。
いくつかの実施態様において、免疫原は、Ｅ．ｃｏｌｉ又はいずれかの他の真核生物もしくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞において発現される組み換えＣ５タンパク質又はそのフラグメントであり得る。
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（Ｒ）技術（例えば、ＵＳ ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（Ｒ）を参照のこと）又はモノクローナル抗体を生成するためのいずれかの他の公知の方法を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有するＣ５に対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（Ｒ）技術は、マウスが抗原性刺激に応じてヒト可変領域及びマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖及び軽鎖可変領域を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスの生成を含む。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは単離され、そしてヒト重鎖及び軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ついでＤＮＡを、完全ヒト抗体を発現することができる細胞において発現させる。
一般に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（Ｒ）マウスに、目的の抗原を負荷し、そしてリンパ球（例えばＢ細胞）を、抗体を発現するマウスから回収する。リンパ球は、不死ハイブリドーマ細胞株を製造するために骨髄腫細胞株と融合され得、そしてこのようなハイブリドーマ細胞はスクリーニングされ、そして目的の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するために選択される。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは単離され得、そして重鎖及び軽鎖の所望のアイソタイプ定常領域に連結される。このような抗体タンパク質はＣＨＯ細胞のような細胞で産生され得る。あるいは、抗原特異的キメラ抗体又は軽鎖及び重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡが抗原特異的リンパ球から直接単離され得る。
最初に、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体を単離する。以下の実験セクションにおけるように、抗体を特徴づけし、そして親和性、選択性、エピトープなどを含む所望の特徴について選択する。マウス定常領域を所望のヒト定常領域と置き換えて、本発明の完全ヒト抗体、例えば野生型又は改変されたＩｇＧ１又はＩｇＧ４を生成する。選択された定常領域は特定の用途によって変わり得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性特徴は可変領域に存在する。
生物学的同等性
本発明の抗Ｃ５抗体及び抗体フラグメントは、記載された抗体と異なるアミノ酸配列を有するが、Ｃ５タンパク質に結合する能力は保持しているタンパク質を包含する。このような変異体抗体及び抗体フラグメントは、親配列と比較した場合にアミノ酸の１つ又はそれ以上の付加、欠失、又は置換を有するが、記載された抗体と本質的に等価な生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較した場合にヌクレオチドの１つ又はそれ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、本発明の抗体又は抗体フラグメントと本質的に生物学的に同等である抗体又は抗体フラグメントをコー
ドする配列を包含する。
２つの抗原結合タンパク質、又は抗体は、例えば、それらが単回用量又は複数回用量のいずれかで同様の実験条件下で同じモル用量で投与された場合に、その吸収の速度及び程度が有意な差異を示さない薬学的等価物又は薬学的代替物である場合、生物学的に同等とみなされる。いくつかの抗体は、それらがそれらの吸収の程度において等価であるが吸収の速度では等価ではない場合に等価物又は薬学的代替物とみなされ、そしてさらに吸収速度におけるこのような差異は意図的ではなく、そして標識において反映され、例えば、慢性的使用での有効体内薬物濃度の達成には本質的ではなく、そして研究される特定の薬品には医学的に重要でないとみなされるので、生物学的に同等とみなされ得る。
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、又は効力において臨床的に有意な差異がなければ生物学的に同等である。
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、患者が参照製剤と生物学的製剤との間を、切り替えせずに継続した治療と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化を含む有害効果の危険性の予期される増加も、有効性の減少もなしに、１回又はそれ以上切り替えることができる場合に、生物学的に同等である。
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、それらが両方共、使用の条件について共通の作用機序により、そのような機序が知られている程度まで作用する場合に生物学的に同等である。
生物学的同等性はインビボ及び／又はインビトロの方法により実証され得る。生物学的同等性測定としては、例えば、（ａ）抗体又はその代謝物の濃度が、血液、血漿、血清、又は他の生体液において、時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトインビボバイオアベイラビリティデータと相関しており、かつ合理的に予測可能であるインビトロ試験；（ｃ）抗体（又はその標的）の適切な急性薬理効果が時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボ試験；及び（ｄ）抗体の安全性、有効性、又はバイオアベイラビリティ又は生物学的透過性を確立する十分に管理された臨床試験において、が挙げられる。
本発明の抗体の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を作製することにより、又は生物学的活性に必要でない末端もしくは内部残基もしくは配列を除去することにより構築され得る。例えば、生物学的活性に必須でないシステイン残基は、再生の際に不必要又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、除去され得るか、又は他のアミノ酸と置き換えられ得る。他の状況において、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特徴を改変するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を排除又は除去する変異を含む抗体変異体を含み得る。
Ｆｃ変異体を含む抗Ｃ５抗体
本発明の特定の実施態様によれば、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体に対する抗体結合を増強するか又は減少させる１つ又はそれ以上の変異を含むＦｃドメインを含む抗Ｃ５抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２又はＣＨ３領域に変異を含む抗Ｃ５抗体を含み、ここで変異は酸性環境で（例えば、ｐＨが約５．５から約６．０の範囲に及ぶエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増大させる。このような変異は、動物に投与された場合に抗体の血清半減期の増加を生じ得る。このようなＦｃ改変の非限定的な例としては、例えば、位置２５０（例えば、Ｅ又はＱ）；２５０及び４２８（例えば、Ｌ又はＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ又はＴ）、２５４（例えば、Ｓ又はＴ）、並びに２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ
／Ｄ又はＴ）での改変；又は位置４２８及び／若しくは４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑ又はＫ）及び／若しくは４３４（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、Ｆ又はＹ ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ又はＮ４３４Ｙ］）での改変；又は位置２５０及び／若しくは４２８での改変；又は位置３０７若しくは３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４での改変が挙げられる。一実施態様において、改変は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）改変；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）改変；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）改変；２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）改変；２５０Ｑ及び４２８Ｌ改変（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；並びに３０７及び／又は３０８改変（例えば、３０８Ｆ又は３０８Ｐ）を含む。更に別の実施態様において、改変は２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）及び／又は２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）改変を含む。
例えば、本発明は、２５０Ｑ及び２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔ及び２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌ及び４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉ及び３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７Ｉ及びＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉ及び４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７Ｉ及びＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖ及び４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６Ｖ及びＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａ及び４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａ）；並びに４３３Ｋ及び４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆ）からなる群より選択される変異の１つ又はそれ以上の対又は群を含むＦｃドメインを含む抗Ｃ５抗体を含む。本明細書に開示される前述のＦｃドメイン変異及び抗体可変ドメイン内の他の変異すべての可能な組み合わせが、本発明の範囲内に考慮される。
本発明はまた、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗Ｃ５抗体を含み、ここでキメラＣＨ領域は、１つより多くの免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域から誘導されたセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４分子から誘導されたＣＨ３ドメインの一部又は全てと組み合わされた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４分子から誘導されたＣＨ２ドメインの一部又はすべてを含むキメラＣＨ領域を含み得る。特定の実施態様によれば、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域から誘導された「下部ヒンジ（ｌｏｗｅｒ ｈｉｎｇｅ）」配列（ＥＵ番号付けにしたがって位置２２８から２３６のアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２又はヒトＩｇＧ４ヒンジ領域から誘導された「上部ヒンジ（ｕｐｐｅｒ ｈｉｎｇｅ）」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けに従って位置２１６から２２７のアミノ酸残基）を含み得る。特定の実施態様によれば、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４上部ヒンジから誘導されたアミノ酸残基及びヒトＩｇＧ２下部ヒンジから誘導されたアミノ酸残基を含む。本明細書に記載されるキメラＣＨ領域を含む抗体は、特定の実施態様において、抗体の治療的特性又は薬物動態特性に不利な影響を及ぼさずに改変されたＦｃエフェクター機能を示し得る。（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２４３５０４号（その開示は参照によりその全体として本明細書に加入される）を参照のこと）。
抗体の生物学的特徴
一般に、本発明の抗体は、Ｃ５タンパク質に結合し、そしてＣ５ａ及びＣ５ｂへのその切断を防止することにより機能する。例えば、本発明は、Ｃ５タンパク質に（例えば、２５℃又は３７℃で）、例えば本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式を使用して表面プラズモン共鳴により測定して９ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式、又は実質的に同様のア
ッセイを使用して表面プラズモン共鳴により測定して約９ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ｐＭ、２５０ｐＭ未満、又は１００ｐＭ未満のＫＤでＣ５に結合する。
本発明はまた、例えば本明細書の実施例４において規定されるアッセイ形式、又は実質的に同様のアッセイを使用して表面プラズモン共鳴により２５℃で測定して、約２分より長い解離半減期（ｔ１／２）でヒトＣ５タンパク質に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式（例えば、ｍＡｂ捕捉又は抗原捕捉形式）、又は実質的に同様のアッセイを使用して表面プラズモン共鳴により２５℃で測定して、約５分より長い、約１０分より長い、約３０分より長い、約５０分より長い、約１００分より長い、約１５０分より長い、約２００分より長い、又は約２５０分より長いｔ１／２でＣ５タンパク質に結合する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例４において規定されるアッセイ形式、又は実質的に同様のアッセイを使用して表面プラズモン共鳴により３７℃で測定して、約１．５分より長い解離半減期（ヒトＣ５タンパク質に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例において規定されるアッセイ形式（例えば、ｍＡｂ捕捉又は抗原捕捉形式）、又は実質的に同様のアッセイを使用して表面プラズモン共鳴により３７℃で測定して、約２分より長い、約５分より長い、約１０分より長い、約２５分より長い、約５０分より長い、約１００分より長い、約１５０分より長い、又は約２００分より長いｔ１／２でＣ５タンパク質に結合する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式を使用して表面プラズモン共鳴により測定して、１２０ｎＭ未満のＫＤでサルＣ５タンパク質に（例えば、２５℃又は３７℃で）結合する抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式、又は実質的に同様のアッセイを使用して表面プラズモン共鳴により測定して、約１２０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ｐＭ、又は２５０ｐＭ未満のＫＤでサルＣ５に結合する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式を使用して表面プラズモン共鳴により測定して７０ｎＭ未満のＫＤで、Ｒ８８５Ｈ変化（配列番号３５６により例示される）を有する改変されたヒトＣ５タンパク質に結合する抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。Ｃ５変異体は、当該分野で以前に開示された抗Ｃ５抗体に対する不十分な応答を示した（例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ ２０１４、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７０：６３２－６３９）。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式、又は実質的に同様のアッセイを使用して表面プラズモン共鳴により測定して、約６５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、又は２ｎＭ未満のＫＤで改変されたヒトＣ５に結合する。
本発明はまた、Ｒ８８５Ｃ変化を有する改変されたヒトＣ５タンパク質（配列番号３５７により例示される）に、例えば、本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式を使用して表面プラズモン共鳴により測定して１６０ｎＭ未満のＫＤで結合する抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。Ｃ５変異体は、当該分野で以前に開示された抗Ｃ５抗体に対して不十分な応答を示した（例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ ２０１４、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７０：６３２－６３９）。特定の実施態様におい
て、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例３において規定されるアッセイ形式、又は実質的に同様のアッセイを使用して表面プラズモン共鳴により測定して、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、又は２ｎＭ未満のＫＤ で改変されたヒトＣ５に結合する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例６において規定されるアッセイ形式を使用してルミネッセンスアッセイにより測定して、１０ｎＭ未満のＩＣ５０で補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を阻害する抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例６において規定されるアッセイ形式又は実質的に同様のアッセイを使用してＢ細胞ルミネッセンスアッセイにより測定して、約５ｎＭ未満、約３．５ｎＭ未満、又は約２ｎＭ未満のＩＣ５０でＣＤＣを阻害する。
本発明はまた、ヒトＣ５媒介古典的経路（ＣＰ）溶血を、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式を使用してＣＰ溶血アッセイにより測定して６ｎＭ未満のＩＣ５０で９４％より多く遮断する抗体及び抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式又は実質的に同様のアッセイを使用して、ＣＰ溶血アッセイにより測定して、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、又は約２ｎＭ未満のＩＣ５０でＣＰ溶血を遮断する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式を使用して、ＡＰ溶血アッセイにより測定して１６５ｎＭ未満のＩＣ５０で７０％より多くヒトＣ５媒介代替経路（ＡＰ）溶血を遮断する抗体及び抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式又は実質的に同様のアッセイを使用して、ＡＰ溶血アッセイにより測定して約１６０ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、又は約２０ｎＭ未満のＩＣ５０でＡＰ溶血を遮断する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式を使用して、ＣＰ溶血アッセイにより測定して１８５ｎＭ未満のＩＣ５０で、アフリカミドリザルＣ５媒介古典的経路（ＣＰ）溶血を４０％より多く遮断する抗体及び抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式又は実質的に同様のアッセイを使用して、ＣＰ溶血アッセイにより測定して約１８０ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ、又は約５０ｎＭ未満のＩＣ５０でＣＰ溶血を遮断する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式を使用してＡＰ溶血アッセイにより測定して、２３５ｎＭ未満のＩＣ５０でアフリカミドリザルＣ５媒介代替経路（ＡＰ）を遮断する抗体及び抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式又は実質的に同様のアッセイを使用して、ＡＰ溶血アッセイにより測定して、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、又は約２０ｎＭ未満のＩＣ５０でＡＰ溶血を遮断する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式を使用して、ＣＰ溶血アッセイにより測定して、１４５ｎＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＣ５媒介古典的経路（ＣＰ）溶血を９０％より多く遮断する抗体及び抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式又は実質的に同様のアッセイを使用して、Ｃ
Ｐ溶血アッセイにより測定して、約１４０ｎＭ未満、約１２０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、又は約５０ｎＭ未満のＩＣ５０でＣＰ溶血を遮断する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式を使用して、ＡＰ溶血アッセイにより測定して、３０ｎＭ未満のＩＣ５０で果肉老猿Ｃ５媒介代替経路（ＡＰ）溶血を遮断する抗体及び抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書の実施例８において規定されるアッセイ形式又は実質的に同様のアッセイを使用して、ＡＰ溶血アッセイにより測定して、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、又は約２ｎＭ未満のＩＣ５０でＡＰ溶血を遮断する。
本発明はまた、当該分野の抗Ｃ５抗体と比較して改善された薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）特性を示す抗体及び抗原結合フラグメントを含む。本発明の抗Ｃ５抗体は、本明細書の実施例９及び１０に示されるように、投与の際に標的媒介クリアランスのより低い感受性を示す。特定の実施態様において、本発明は、例えば、２０日より長い、２５日より長い、３０日より長い、３５日より長い、４０日より長い、４５日より長い、５０日より長い、５５日より長い、又は６０日より長い、延長された期間の間血清濃度示す抗Ｃ５抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施態様において、本発明の抗Ｃ５抗体は、当該分野における抗Ｃ５抗体と比較して、１０日より長い延長された血清半減期を示す。
特定の実施態様において、本発明は、ヒトＣ５に対して高い親和性（例えば、０．３ｎＭ未満のＫＤ）及びより低いクリアランス（例えば、延長された血清半減期、以前に知られている抗Ｃ５抗体よりも長い日数にわたる改善された薬力学的活性）を有する抗Ｃ５抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。本発明のこのような抗体は、Ｃ５関連疾患又は障害を有する被験体においてより少ない投薬頻度で有利に使用され得る。
一実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質に特異的に結合する単離された組み換え抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、ここで抗体又はそのフラグメントは、以下の特徴の１つ又はそれ以上を示す：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である；（ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、２５℃で０．９ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＣ５に結合する；（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、３７℃で０．３ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５に結合する；（ｄ）カニクイザルへの投与の際に７０日間にわたって１０μｇ／ｍＬより高い血清濃度を有する；（ｅ）エクスビボ溶血アッセイにおいて測定して、カニクイザルへの投与の際に３５日間にわたってＣＰ溶血及びＡＰ溶血を遮断する；（ｆ）カニクイザルにおいて１０日より長い血清半減期を有する；（ｇ）Ｃ５ヒト化マウスへの投与の際に４０日間にわたって１０μｇ／ｍＬより高い血清濃度を有する；（ｈ）エクスビボ溶血アッセイにおいて測定して、Ｃ５ヒト化マウスへの投与の際に３０日間にわたってＣＰ溶血を遮断する；並びに（ｉ）Ｃ５ヒト化マウスにおいて１０日より長い血清半減期を有する。
一実施態様において、本発明は、Ｃ５タンパク質に特異的に結合する単離された組み換え抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、ここで抗体又はそのフラグメントは、以下の特徴の１つ又はそれ以上を示す：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である；（ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、２５℃で０．９ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＣ５に結合する；（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、３７℃で０．３ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５に結合する；（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、６５ｎＭ未満のＫＤでサルＣ５に結合する；（ｅ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、０．５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５変異体Ｒ８８５Ｈ（配列番号３５６）に結合する；（ｆ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、０．５ｎ
Ｍ未満のＫＤでヒトＣ５変異体Ｒ８８５Ｃ（配列番号３５７）に結合する；（ｇ）ＣＰ溶血アッセイにおいて測定して、６ｎＭ未満のＩＣ５０でヒトＣ５媒介古典的経路（ＣＰ）溶血を９５％より多く遮断する；（ｈ）ＡＰ溶血アッセイにおいて測定して、１６５ｎＭ未満のＩＣ５０でヒトＣ５媒介代替経路（ＡＰ）溶血を７０％より多く遮断する；（ｉ）ＣＰ溶血アッセイにおいて測定して、１８５ｎＭ未満のＩＣ５０でアフリカミドリザルＣ５媒介ＣＰ溶血を阻害する；（ｊ）ＡＰ溶血アッセイにおいて測定して、２３５ｎＭ未満のＩＣ５０でアフリカミドリザルＣ５媒介ＡＰ溶血を阻害する；（ｋ）ＣＰ溶血アッセイにおいて測定して、１４５ｎＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＣ５媒介ＣＰ溶血を阻害する；及び（ｌ）ＡＰ溶血アッセイにおいて測定して、３０ｎＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＣ５媒介ＡＰ溶血を阻害する。
本発明の抗体は、前述の生物学的特徴の１つ若しくはそれ以上、又はそれらの組み合わせを有し得る。本発明の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書の実施例を含む本開示を検討することにより当業者に明らかとなる。
エピトープマッピング及び関連技術
本発明は、アルファポリペプチド及びベータポリペプチドを含むＣ５タンパク質分子の１つ又はそれ以上の領域内に見出される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗Ｃ５抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、Ｃ５タンパク質分子の上述のドメインのいずれか（例えば、ドメイン中の線状エピトープ）内に位置する３つ又はそれ以上例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上）のアミノ酸の単一の連続した配列からなるものであり得る。あるいは、エピトープは、タンパク質分子の上述のドメイン（例えば、構造的エピトープ）のいずれか又は両方内に位置する複数の非連続アミノ酸（又はアミノ酸配列）からなるものであり得る。
当業者に公知の様々な技術を、抗体がポリペプチド又はタンパク質内の「１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを決定するために使用することができる。例となる技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に記載されるような、慣用の交差－ブロッキングアッセイが挙げられる。他の方法としては、アラニンスキャニング変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３－６３）、ペプチド切断分析結晶学的研究及びＮＭＲ分析が挙げられる。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出及び抗原の化学修飾のような方法が使用され得る（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することができる別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般的に、水素／重水素法は、目的のタンパク質の重水素標識、続いて抗体の重水素標識タンパク質への結合を含む。次に、タンパク質／抗体複合体は水に移され、そして抗体複合体により保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は重水素を保持し得、したがって界面に含まれていないアミノ酸と比較して比較的高い質量を示す。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断及び質量分析にかけて、それにより抗体が相互作用する特定のアミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２－２５９；Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照のこと。
用語「エピトープ」はＢ及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピ
トープは、タンパク質の三次元折りたたみにより並置された連続的アミノ酸又は非連続的アミノ酸の両方から形成され得る。連続的アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒に露出されて保持されるが、一方三次元折りたたみにより形成されたエピトープは、変性溶媒での処理で典型的に失われる。エピトープは典型的には、少なくとも３、そしてより通常では少なくとも５又は８～１０のアミノ酸を独特の空間配置で含む。
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても知られる修飾援用プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＭＡＰ）は、化学的又は酵素的に修飾された抗原表面への各抗体の結合プロフィールの類似性に従って、同じ抗原に特異的な多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（ＵＳ２００４／０１０１９２０（参照によりその全体として本明細書に具体的に加入される）を参照のこと）。各カテゴリーは、別のカテゴリーにより表されるエピトープと非常に異なるか又は部分的に重なる特有のエピトープを反映し得る。この技術は、遺伝子的に同一の抗体の高速フィルタリングを可能にし、その結果特徴付は、遺伝子的に異なる抗体に集中され得る。ハイブリドーマスクリーニングに適用される場合、ＭＡＰは所望の特徴を有するｍＡｂを生じる希少なハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。ＭＡＰは、本発明の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体のグループに分類するために使用され得る。
特定の実施態様において、抗Ｃ５抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３５５において例示される天然形態、又は組み換え産生されたＣ５タンパク質、又はそのフラグメントにおいて例示される領域のいずれか１つ又はそれ以上内のエピトープに結合する。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、ヒトＣ５タンパク質のアミノ酸残基１９～１６７６からなる群より選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸を含む領域に結合する。
特定の実施態様において、本発明の抗体は、配列番号３５５のおよそ位置１９からおよそ位置７５０までの範囲に及ぶアミノ酸残基；又はおよそ位置７５１からおよそ位置１６７６の範囲に及ぶアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列と相互作用する。
特定の実施態様において、本発明は、Ｃ５（配列番号３５９）のアルファ鎖及び／又はベータ鎖内に見出される１つ又はそれ以上のエピトープと相互作用する抗Ｃ５抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。エピトープは、Ｃ５のアルファ鎖及び／又はベータ鎖内に位置する３つ又はそれ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上）のアミノ酸の１つ又はそれ以上の連続配列からなるものであり得る。あるいは、エピトープは、Ｃ５内に位置する複数の非連続アミノ酸（又はアミノ酸配列）からなるものであり得る。本明細書の実施例１１に示されるように、本発明の例となる抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐが相互作用するＣ５のエピトープは：（ｉ）配列番号３５９のベータ鎖に含まれるアミノ酸５９１～５９９に対応するアミノ酸配列ＮＭＡＴＧＭＤＳＷ（配列番号３６０）；及び（ｉｉ）配列番号３５９のアルファ鎖に含まれるアミノ酸７７５～７９４に対応するアミノ酸配列ＷＥＶＨＬＶＰＲＲＫＱＬＱＦＡＬＰＤＳＬ（配列番号３６１）により定義される。従って、本発明は、（ｉ）配列番号３５９のアミノ酸５９１～５９９に対応するアミノ酸配列ＮＭＡＴＧＭＤＳＷ（配列番号３６０）；及び（ｉｉ）配列番号３５９のアミノ酸７７５～７９４に対応するアミノ酸配列ＷＥＶＨＬＶＰＲＲＫＱＬＱＦＡＬＰＤＳＬ（配列番号３６１）からなる領域内に含有される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する抗Ｃ５抗体を含む。
本発明は、表１に列挙される特定の例となる抗体のいずれかと同じエピトープ又は該エ
ピトープの一部に結合する抗Ｃ５抗体を含む。同様に、本発明はまた、表１に列挙される特定の例となる抗体のいずれかと、Ｃ５タンパク質又はそのフラグメントに対する結合について競合する抗Ｃ５抗体も含む。例えば、本発明は、表１に列挙される１つ又はそれ以上の抗体と、Ｃ５タンパク質に対する結合について交差競合する抗Ｃ５抗体を含む。
当該分野で公知の慣用の方法を使用することにより、抗体が参照抗Ｃ５抗体と同じエピトープに結合するかどうか、又は参照Ｃ５抗体と結合について競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗Ｃ５抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体は、飽和条件下でＣ５タンパク質又はペプチドに結合させられる。次に、Ｃ５分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が、参照抗Ｃ５抗体との飽和結合後にＣ５に結合することができる場合、試験抗体は参照抗Ｃ５抗体と異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方で、試験抗体が参照抗Ｃ５抗体との飽和結合後にＣ５に結合する事ができない場合、試験抗体は本発明の参照抗Ｃ５抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合するかもしれない。
参照抗Ｃ５抗体との結合について抗体が競合するかどうかを決定するために、上記の結合方法論を２つの方向性で行う：第一の方向性では、参照抗体を飽和条件下でＣ５タンパク質に結合させて、続いてＣ５分子への試験抗体の結合を評価する。第二の方向性では、試験抗体を飽和条件下でＣ５分子に結合させて、続いて参照抗体のＣ５分子への結合を評価する。両方の方向性において、第一（飽和）抗体のみがＣ５分子に結合することができる場合、試験抗体及び参照抗体はＣ５結合について競合すると結論付けられる。当業者には当然のことながら、参照抗体との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合していないかもしれないが、重なっているか又は隣接するエピトープに結合することにより参照抗体の結合を立体的にブロックし得る。
２つの抗体は、それぞれが抗原への他方の結合を競合的に阻害する（遮断する）場合、同じか又は重なっているエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍又は１００倍過剰の一方の抗体は、競合結合アッセイ（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ
ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０：１４９５－１５０２を参照のこと）で測定して、他方の結合を少なくとも５０％阻害するが、好ましくは７５％、９０％又は９９％も阻害するあるいは、一方の抗体の結合を減少させるか又は排除する抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の結合を減少させるか又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を減少させるか又は排除するいくつかのアミノ酸変異が他方の結合を減少させるか又は排除する場合、２つの抗体は重なったエピトープを有する。
ついで、さらなる慣用の実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を行って、観察された試験抗体の結合がないことが、実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するか、又は立体ブロッキング（又は別の減少）が観察された結合の無いことの原因であるかどうかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー又は当該分野で利用可能ないずれかの他の定量的若しくは定性的な抗体結合アッセイを使用して行うことができる。
免疫結合体
本発明は、Ｃ５関連疾患又は障害（例えば、非典型溶血性尿毒症症候群）を処置するための、治療的部分に結合されたヒト抗Ｃ５モノクローナル抗体（免疫結合体）を包含する。本明細書で使用される用語「免疫結合体」は、放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、酵素、ペプチド若しくはタンパク質又は治療剤に化学的又は生物学的に連結されている抗体を指す。抗体は、その標的と結合できる限り、分子
に沿ったいずれの位置でも放射性薬剤、サイトカイン、インターフェロン、標的又はレポーター部分、酵素、ペプチド又は治療剤に連結され得る。免疫結合体の例としては、抗体薬物結合体及び抗体－毒素融合タンパク質が挙げられる。一実施態様において、薬剤はＣ５タンパク質に対する第二の異なる抗体であり得る。抗Ｃ５抗体に結合され得る治療的部分の種類は、処置しようとする状態及び達成しようとする所望の治療効果を考慮に入れる。免疫結合体を形成するための適切な薬剤の例は当該分野で公知である；例えば、ＷＯ ０５／１０３０８１を参照のこと。
多選択性抗体
本発明の抗体は単一特異性でも、二重特異性でも、多選択性でもよい。多選択性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であっても、１つより多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有していてもよい、例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９；Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照のこと。
本発明の多選択性抗原結合分子のいずれか又はその変異体は、当業者に公知であるような標準的な分子生物学技術（例えば、組み換えＤＮＡ及びタンパク質発現技術）を使用して構築され得る。
いくつかの実施態様において、Ｃ５特異的抗体は、Ｃ５タンパク質の異なるドメインに結合する可変領域が一緒に連結されて、単一結合分子内に二重ドメイン特異性をもたらす二重特異性形式（「二重特異性（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」）で生成される。適切に設計された二重特異性は、特異性及び結合力の両方を増加させることによりＣ５タンパク質阻害有効性全体を増強し得る。個々のドメイン（例えば、Ｎ末端ドメインのセグメント）に対して特異性を有するか又は１つのドメイン内の異なる領域に結合することができる可変領域は、構造足場上で対になり、各領域が別々のエピトープ又は１つのドメイン内の異なる領域に同時に結合することを可能にする。二重特異性についての一例において、１つのドメインに対して特異性を有する結合剤由来の重鎖可変領域（ＶＨ）は、そのＶＨに対する元の特異性を破壊することなく元のＶＨと対になることができる非同族ＶＬパートナーを同定するために、第二のドメインに対する特異性を有する一連の結合剤由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）と再結合される。このようにして、単一ＶＬセグメント（例えば、ＶＬ１）は、２つの異なるＶＨドメイン（例えば、ＶＨ１及びＶＨ２）と結合されて、２つの結合「アーム」（ＶＨ１－ＶＬ１及びＶＨ２－ＶＬ１）から構成される二重特異性を生じる。単一ＶＬセグメントの使用は、系の複雑さを低減し、そしてそれにより、二重特異性を生成するために使用されるクローニング、発現、及び精製のプロセスを単純化し、それらのおける有効性を増加させる（例えば、ＵＳＳＮ１３／０２２７５９及びＵＳ２０１０／０３３１５２７）。
あるいは、１つより多くのドメイン、及び限定されないが、例えば第二の異なる抗Ｃ５抗体のような第二の標的に結合する抗体は、本明細書に記載される技術、又は当業者に公知の他の技術を使用して二重特異性形式で製造され得る。異なる領域に結合する抗体可変領域は、例えばＣ５の細胞外ドメイン上の関連する部位に結合する可変領域と一緒に連結されて、単一結合分子内に二重抗原特異性をもたらし得る。この性質の適切に設計された二重特異性は二重機能に役立つ。細胞外ドメインに対して特異性を有する可変領域は、細胞外ドメインの外側に対して特異性を有する可変領域と結合され、そして各可変領域が別々の抗原に結合することを可能にする構造足場上で対にされる。
本発明の状況において使用され得る例となる二重特異性抗体形式は、第一の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン及び第二のＩｇ ＣＨ３ドメインの使用を含み、ここで第一
及び第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは、互いに少なくとも１アミノ酸異なり、そしてここで少なくとも１つのアミノ酸差異は、アミノ酸差異の無い二重特異性抗体と比較して、プロテインＡに対する二重特異性抗体の結合を減少させる。一実施態様において、第一のＩｇ
ＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、そして第二のＩｇ ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる；ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）のようなプロテインＡ結合を減少させるか又は消失させる変異を含有する。第二のＣＨ３はＹ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＹ４３６Ｆ）を更に含み得る。第二のＣＨ３内に見られ得るさらなる改変としては：ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＥＵではＩＭＧＴ；Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；並びにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）が挙げられる。上記の二重特異性抗体でのバリエーションは本発明の範囲で検討される。
本発明の状況において使用され得る他の例となる二重特異性形式としては、限定することなく、例えば、ｓｃＦｖベース又は二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）二重特異性形式、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合物、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クアドローマ、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブ・イントゥ・ホールとの共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、及びＭａｂ２二重特異性形式（前述の形式の概説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２、ｍＡｂｓ ４：６、１－１１、及びそこに引用される参考文献を参照のこと）。二重特異性抗体はまた、ペプチド／核酸結合体を使用して構築することもでき、例えば、ここで直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチド結合体を生成し、ついでこれが自己集合して規定された組成、原子価及び配置を有する多量体複合体となる。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４、２０１２］）。
治療的投与及び製剤
本発明は、本発明の抗Ｃ５抗体又はその抗原結合フラグメントを含む治療用組成物を提供する。本発明に従う治療用組成物は、適切な担体、賦形剤、及び改善された輸送、送達、耐性などを提供するために製剤中に組み込まれる他の薬剤とともに投与される。多数の適切な製剤が、全ての薬剤師に知られる処方集において見られ得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ。これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト剤、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油及び油中水乳剤、ｃａｒｂｏｗａｘ乳剤（ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ｃａｒｂｏｗａｘ）（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、及びｃａｒｂｏｗａｘを含有する半固形混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」 ＰＤＡ （１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照のこと。
抗体の用量は、投与しようとする被験体の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに依存して変わり得る。本発明の抗体が成人患者における疾患又は障害を処置するために使用される場合、本発明の抗体を通常、約０．１～約１００ ｍｇ／体重ｋｇの単回用量、より好ましくは約５～約８０、約１０～約７０、又は約２０～約５０ｍｇ／体重ｋ
ｇの単回用量で投与することが有利である。状態の重症度に依存して、処置の頻度及び期間は調整され得る。特定の実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約６００ｍｇ、約５～約５００ｍｇ、又は約１０～約４００ｍｇの初期用量で投与され得る。特定の実施態様において、初期用量に続いて、抗体又はその抗原結合フラグメントの第二又は複数のその後の用量が、初期用量とほぼ同じか又は初期用量より少ない量で投与され得、ここでその後の用量は、少なくとも１日～３日；少なくとも１週、少なくとも２週；少なくとも３週；少なくとも４週；少なくとも５週；少なくとも６週；少なくとも７週；少なくとも８週；少なくとも９週；少なくとも１０週；少なくとも１２週；又は少なくとも１４週だけ離される。
様々な送達系が公知であり、そして本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る、例えば、リポソームでのカプセル化、マイクロパーティクル、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組み換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照のこと）。導入方法としては、限定されないが、皮内、経皮、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、上皮及び経口経路が挙げられる。組成物は、いずれかの都合の良い経路、例えば注入又はボーラス注射により、上皮又は粘膜裏層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通した吸収により投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は全身でも局所でもよい。医薬組成物は小胞、特にリポソームでも送達され得る（例えば、Ｌａｎｇｅｒ （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３）。
本発明の抗体を送達するためのナノ粒子の使用もまた本明細書において検討される。抗体結合ナノ粒子は、治療適用及び診断適用の両方に使用され得る。抗体結合ナノ粒子並びに製造及び使用の方法は、Ａｒｒｕｅｂｏ、Ｍ．らにより２００９年に詳細に記載される（「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」 ｉｎ Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ ２００９、Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４３９３８９、２４ ｐａｇｅｓ、ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）（参照により本明細書に加入される）。ナノ粒子は、細胞を標的化するために開発され、そして医薬組成物中に含有される抗体に結合され得る。薬物送達のためのナノ粒子は、例えばＵＳ ８２５７７４０又はＵＳ ８２４６９９５（それぞれその全体として本明細書に加入される）にも記載されている。
特定の状況において、医薬組成物は制御放出系で送達され得る。一実施態様において、ポンプが使用され得る。別の実施態様において、ポリマー材料が使用され得る。更に別の実施態様において、制御放出系は組成物の標的の近傍に置かれ得、従って全身投薬のほんの一部しか必要としない。
注射可能製剤は、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、腹腔内及び筋内注射、点滴などのための投薬形態を含み得る。これらの注射可能製剤は、公知の方法により製造され得る。例えば、注射可能製剤は、例えば、上記の抗体又はその塩を、従来に注射に使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中に溶解、懸濁化又は乳化させることにより製造され得る。注射のための水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース及び他の補助剤を含有する等張液などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などのような適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが使用され、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどのような可溶化剤と組み合わせて使用され得る。このようにして製造された注射剤は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
本発明の医薬組成物は、標準的な針及びシリンジを用いて皮下又は静脈内に送達され得る。さらに、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは、本発明の医薬組成物の送達において容易に有用性を有する。このようなペン型送達デバイスは、再使用可能か又は使い捨てであり得る。再使用可能ペン型送達デバイスは、一般的に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の医薬組成物が全て投与されてカートリッジが空になると、空のカートリッジは容易に廃棄することができ、そして医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換される。その後ペン型送達デバイスは再使用され得る。使い捨てペン型送達デバイスには交換可能カートリッジはない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のリザーバ中に保持された医薬組成物を予め充填された状態である。リザーバから医薬組成物が空になると、デバイス全体が廃棄される。
多数の再使用可能ペン型及び自動注射器送達デバイスが本発明の医薬組成物の皮下送達において有用性を有する。例としては、確かに限定されないが、少数の例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮＴＭ（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣＴＭペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５ＴＭペン、ＨＵＭＡＬＯＧＴＭペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０ＴＭペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮＴＭＩ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲＴＭ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤＴＭペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮＴＭ、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯＴＭ、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴＴＭ、並びにＯＰＴＩＣＬＩＫＴＭ（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられる。本発明の医薬組成物の皮下送達において有用性を有する使い捨て可能ペン型デバイスの例としては、確かに限定されないが、少数の例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲＴＭペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮＴＭ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮＴＭ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫＴＭ自動注射器（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴＴＭ（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）及びＨＵＭＩＲＡＴＭペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）が挙げられる。
有利には、上記の経口又は非経口用途のための医薬組成物は、活性成分の用量に合うように適合された単位用量で製造されて投薬形態となる。このような単位用量の投薬形態としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される抗体の量は、一般的に単位用量の投薬形態あたり約５～約５００ｍｇであり；特に注射剤の形態では、抗体は約５～約３００ｍｇで含有されることが好ましく、そして他の投薬形態については約１０～約３００ｍｇで含有されることが好ましい。
抗体の治療上の使用
本発明の抗体は、Ｃ５に関連する疾患若しくは障害若しくは状態の処置及び／若しくは予防のため、又はこのような疾患、障害若しくは状態に伴う少なくとも少なくとも１つの症状を寛解させるために有用である。特定の実施態様において、本明細書の抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｃ５に関連する疾患又は障害又は状態を有する患者に治療的用量で投与され得る。
特定の実施態様において、本発明の抗体は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の症状又は徴候を処置又は予防する際に有用である。ａＨＵＳの症状及び徴候としては、限定されないが、血小板活性化、溶血、脳卒中、心臓発作、腎不全及び／又は死亡に至る全
身性血栓性微小血管症（身体中の小血管における血餅の形成）、末期腎疾患、持続性腎損傷、腹痛、錯乱、浮腫、疲労、悪心／嘔吐、下痢、並びに微小血管症性貧血が挙げられる。
特定の実施態様において、本発明の抗体は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）の症状又は徴候を処置又は予防する際に有用である。ＰＮＨの症状及び徴候としては、限定されないが、赤血球の破壊、血栓症（深部静脈血栓症、肺塞栓症を含む）、血管内溶血性貧血、尿の赤変、疲労、息切れ、及び動悸のような貧血の症状、腹痛並びに嚥下困難が挙げられる。
特定の実施態様において、本発明の抗体は、神経学的障害、腎障害、多発性硬化症、脳卒中、ギラン・バレー症候群、外傷性脳傷害、パーキンソン病、不適切又は望ましくない補体活性化の障害、血液透析合併症、超急性同種移植片拒絶、異種移植片拒絶、ＩＬ－２治療の間のインターロイキン－２誘導毒性、炎症性障害、自己免疫疾患の炎症、クローン病、成人呼吸促迫症候群、火傷又は凍傷を含む熱傷、虚血後再灌流状態、心筋梗塞、毛細管漏出症候群、肥満、糖尿病、アルツハイマー病、統合失調症、脳卒中、てんかん、アテローム性動脈硬化、血管炎、水疱性類天疱瘡、Ｃ３腎症（Ｃ３ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｐａｔｈｙ）、膜増殖性糸球体腎炎、バルーン血管形成術、心肺バイパス術又は腎動脈バイパス術におけるポンプ後（ｐｏｓｔ－ｐｕｍｐ）症候群、血液透析、腎虚血、大動脈再建後の腸間膜動脈再灌流、感染性疾患又は敗血症、免疫複合体病及び自己免疫疾患、糖尿病性腎症、アルポート症候群、進行性腎不全、蛋白尿性腎臓病、腎虚血－再灌流傷害、ループス腎炎、糸球体症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＳＬＥ腎炎、膜性増殖性腎炎、溶血性貧血、視神経脊髄炎、腎移植、遺伝性ＣＤ５９欠乏、乾癬、及び重症筋無力症からなる群より選択されるＣ５関連疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は徴候を処置又は予防するために有用である。特定の他の実施態様において、本発明の抗体は、呼吸困難、喀血、ＡＲＤＳ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、肺塞栓症及び梗塞、肺炎、線維形成性粉塵疾患、不活性粉塵及び鉱物に起因する傷害（例えば、ケイ素、炭塵、ベリリウム、及びアスベスト）、肺線維症、有機粉塵疾患、化学的損傷（刺激性ガス及び化学物質、例えば、塩素、ホスゲン、二酸化硫黄、硫化水素、二酸化窒素、アンモニア、及び塩酸に起因する）、煙傷害、熱傷（例えば、火傷、凍傷）、喘息、アレルギー、気管支収縮、過敏性肺炎、寄生虫症、グッドパスチャー症候群、肺血管炎、遺伝性血管性浮腫、及び免疫複合体関連炎症のような肺の疾患及び障害からなる群より選択されるＣ５関連疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は徴候を処置又は予防するために有用である。
特定の実施態様において、本発明の抗体は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、眼内血管新生（脈絡膜、角膜又は網膜組織に影響を及ぼす眼内新血管形成）、地図状萎縮（ＧＡ）、ぶどう膜炎及び視神経脊髄炎のような眼疾患に罹患している被験体を処置するために有用である。本発明の抗体は、萎縮型（ｄｒｙ）ＡＭＤ又は滲出型（ｗｅｔ）ＡＭＤの少なくとも１つの症状又は徴候を処置するか又は寛解させるために使用され得る。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、視力喪失を防止するか又は速度を遅くする際に有用である。一実施態様において、本発明の抗体は、萎縮型ＡＭＤを有する被験体の眼におけるドルーゼンを減少させる際に有用である。一実施態様において、本発明の抗体は、ＡＭＤを有する被験体における視力喪失を防止又は低減／遅延する際に有用である。
本発明の１つ又はそれ以上の抗体は、眼の疾患又は傷害の症状又は状態／徴候の１つ又はそれ以上の重症度を軽減するか又は予防するか又は減少させるために投与され得る。抗体は、視力喪失、視覚の歪み、低光量への適合の困難性、屈曲した中心視野、中心／全体視野のかすみ（ｈａｚｉｎｅｓｓ）の増加、ドルーゼンの存在（網膜上に蓄積する細胞外
物質の小さな蓄積）、色素変化、変視症の形態での歪んだ視野（ここで直線の格子は波状のように見え、そして格子の一部は空白に見える）、滲出性変化（眼の出血、硬性白斑、網膜下／ＲＰＥ下／網膜内液）、明るい光に曝露された後の視覚機能の遅い回復（光ストレス試験）、初発及び地図状萎縮、視力の急激な減少（２レベル又はそれ以上）、例えば、２０／２０から２０／８０、優先的超視野測定変化（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｙｐｅｒａｃｕｉｔｙ ｐｅｒｉｍｅｔｒｙ ｃｈａｎｇｅｓ）（滲出性ＡＭＤについて）、かすみ目、中心視野の緩やかな喪失（非滲出性黄斑変性を有するものについて）、視野喪失の急速な開始（滲出性黄斑変性を有する被験体における異常血管の漏出及び出血によりしばしば引き起こされる）、中心暗点（影又は視野の欠損した領域）、色の区別の困難、特に暗色と暗色の区別及び明色と明色の区別、対比感度の喪失、Ａｍｓｌｅｒ格子において屈曲したように見える直線を含むがこれらに限定されない少なくとも１つの症状を寛解させるか又は重症度を減少させるために使用され得る。
５０歳を超えた被験体、黄斑変性の家族歴がある被験体、喫煙者、及び肥満、高コレステロール、心臓血管疾患、又は不健康な食事を有する被験体のような、黄斑変性を発症する危険性がある被験体に、予防的に本発明の１つ又はそれ以上の抗体を使用することも本明細書において検討される。
本発明のさらなる実施態様において、本抗体は、Ｃ５に関連する疾患又は障害に罹患している患者を処置するための医薬組成物又は薬剤の製造のために使用される。本発明の別の実施態様において、本抗体は、Ｃ５に関連する疾患又は障害を処置するか又は寛解させるために有用である当業者に公知のいずれかの他の薬剤又はいずれかの他の治療とともに補助治療として使用される。
組み合わせ治療
組み合わせ治療は、本発明の抗Ｃ５抗体、及び本発明の抗体と若しくは本発明の抗体の生物学的に活性なフラグメントと有利に組み合わせられ得るいずれかのさらなる治療剤を含み得る。本発明の抗体は、Ｃ５に関連する疾患又は障害を処置するために１つ又はそれ以上の薬物又は治療と相乗的に組み合わせられ得る。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、前記疾患の１つ又はそれ以上の症状を寛解させるために第二の治療剤と組み合わせられ得る。
Ｃ５関連疾患又は障害に依存して、本発明の抗体は１つ又はそれ以上のさらなる治療剤と組み合わせて使用され得、これらとしては、限定されないが、抗凝固薬（例えば、ワルファリン、アスピリン、ヘパリン、フェニンジオン、フォンダパリヌクス、イドラパリナックス、及びトロンビン阻害剤（例えば、アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、又はダビガトラン）、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド類、及び非ステロイド抗炎症薬）、降圧薬（例えば、アンジオテンシン変換酵素阻害剤）、免疫抑制剤（例えば、ビンクリスチン、シクロスポリンＡ、又はメトトレキサート）、線維素溶解剤（例えば、アンクロッド、ε－アミノカプロン酸、抗プラスミン－ａ１、プロスタサイクリン、及びデフィブロチド）、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素の阻害剤のような脂質低下剤、リツキシマブのような抗ＣＤ２０薬、インフリキシマブのような抗ＴＮＦ薬、抗けいれん薬（例えば、硫酸マグネシウム）、Ｃ３阻害剤、又は抗血栓薬が挙げられる。
特定の実施態様において、第二の治療剤はＣ５タンパク質に対する別の抗体である。Ｃ５に対する広い中和又は阻害活性を有する抗体の組み合わせ（「カクテル」）の使用は本明細書において検討される。いくつかの実施態様において、非競合抗体は、それを必要とする被験体に組み合わされて投与され得る。いくつかの実施態様において、その組み合わせを構成する抗体は、タンパク質状の異なる重なっていないエピトープに結合する。組み合わせを構成する抗体は、Ｃ５のＣ５転換酵素への結合を遮断し得、かつ／又はＣ５のＣ
５ａ及びＣ５ｂへの切断を防止／阻害し得る。特定の実施態様において、第二の抗体はヒト血清中でより長い半減期を有し得る。
本明細書に記載される用語「～と組み合わせて」は、さらなる治療活性成分が、本発明の抗Ｃ５抗体の投与の前、抗Ｃ５抗体の投与と同時、又は抗Ｃ５抗体の投与後に投与され得ることを意味する。用語「～と組み合わせて」はまた抗Ｃ５抗体及び第二の治療剤の連続的又は同時の投与も含む。
さらなる治療活性成分は、本発明の抗Ｃ５抗体の投与の前に被験体に投与され得る。例えば、第一の成分は、第一の成分が第二の成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、又は１分未満前に投与される場合に、第二の成分「の前に」投与されるとみなされ得る。他の実施態様において、さらなる治療活性成分は、本発明の抗Ｃ５抗体の投与の後に被験体に投与され得る。例えば、第一の成分は、第一の成分が第二の成分の投与の１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与される場合に、第二の成分「の後に」投与されるとみなされ得る。更に他の実施態様において、さらなる治療活性成分は、本発明の抗Ｃ５抗体の投与と同時に被験体に投与され得る。本発明の目的のための「同時」投与は、例えば、抗Ｃ５抗体及びさらなる治療活性成分は、単一の投薬形態で、又は互いに約３０分若しくはそれ以下以内に被験体に投与される別々の投薬形態での被験体への投与を含む。別々の投薬形態で投与される場合、各投薬形態は、同じ経路を介して投与され得（例えば、抗Ｃ５抗体及びさらなる治療活性成分の両方が静脈内投与などされ得る）；あるいは、各投薬形態は異なる経路で投与され得る（例えば、抗Ｃ５抗体が静脈内投与され得、そしてさらなる治療活性成分は経口投与され得る）。いずれにしても、単一投薬形態、同じ経路による別々の投薬形態、又は異なる経路による別々の投薬形態は、本開示の目的のために全て「同時投与」とみなされる。本開示の目的のために、さらなる治療活性成分の投与の「前」、「同時」又は「後」（本明細書の上で定義される用語と同様）の抗Ｃ５抗体の投与は、さらなる治療活性成分「と組み合わせた」抗Ｃ５抗体の投与とみなされる。
本発明は、本発明の抗Ｃ５抗体が、本明細書の他所に記載されるようにさらなる治療活性成分の１つ又はそれ以上と同時処方される（ｃｏ－ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）医薬組成物を含む。
投与レジメン
特定の実施態様によれば、本発明の抗Ｃ５抗体（又は抗Ｃ５抗体と本明細書において言及されるさらなる治療活性薬剤のいずれかとの組み合わせを含む医薬組成物）の単回用量は、それを必要とする被験体に投与され得る。本発明の特定の実施態様によれば、抗Ｃ５抗体（又は抗Ｃ５抗体と本明細書において言及されるさらなる治療活性薬剤のいずれかとの組み合わせを含む医薬組成物）の複数回用量は、規定された時間経過にわたって被験体に投与され得る。本発明のこの局面に従う方法は、複数回用量の本発明の抗Ｃ５抗体を被験体に連続して投与することを含む。本明細書において使用される「連続的に投与すること」は、各用量の抗Ｃ５抗体が、異なる時点に、例えば所定の間隔（例えば、時間、日、週、又は月）だけ離れた異なる日に被験体に投与されることを意味する。本発明は、単回初期用量の抗Ｃ５抗体、続いて１又はそれ以上の二次用量の抗Ｃ５抗体、そして場合により続いて１又はそれ以上の三次用量の抗Ｃ５抗体を患者に連続的に投与することを含む方法を含む。
用語「初期用量」、「二次用量」、及び「三次用量」は、本発明の抗Ｃ５抗体の投与の
時間的順序を指す。したがって、「初期用量」は処置レジメンの初めに投与される用量であり（「ベースライン用量」とも呼ばれる）；「二次用量」は初期用量の後に投与される用量であり；そして「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初期、二次、及び三次用量は、全て同じ量の抗Ｃ５抗体を含有していてもよいが、一般に投与頻度に関して互いに異なり得る。しかし、特定の実施態様において、初期、二次及び／又は三次用量中に含有される抗Ｃ５抗体の量は、処置の経過の間互いに異なる（例えば、必要に応じて上下に調整される）。特定の実施態様において、２又はそれ以上（例えば、２、３、４、又は５）の用量が、「ローディング用量」として処置レジメンの初めに投与され、続いてその後の用量がより少ない頻度で投与される（例えば、「維持量」）。
本発明の例となる実施態様によれば、各二次及び／又は三次用量は、直前の投薬の１～４８（例えば、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、１５、１５１／２、１６、１６１／２、１７、１７１／２、１８、１８１／２、１９、１９１／２、２０、２０１／２、２１、２１１／２、２２、２２１／２、２３、２３１／２、２４、２４１／２、２５、２５１／２、２６、２６１／２、又はそれ以上）時間後に投与される。本明細書で使用される句「直前の用量」は、複数回投与の順序で、介在する投与がなくその順序ですぐ次の用量の投与の前に患者に投与される抗Ｃ５抗体の用量を意味する。
本発明のこの局面に従う方法は、いずれかの数の二次及び／又は三次用量の抗Ｃ５抗体を患者に投与することを含み得る。例えば、特定の実施態様において、単回のみの二次用量が患者に投与される。他の実施態様において、２又はそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上）の二次用量が患者に投与される。同様に、特定の実施態様において、単回のみの三次用量が患者に投与される。他の実施態様において、２又はそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上）の三次用量が患者に投与される。
本発明の特定の実施態様において、二次及び／又は三次用量が患者に投与される頻度は、処置レジメンの間に変わり得る。投与頻度はまた、臨床検査後に個々の患者の必要によって医師により処置の間に調整され得る。
抗体の診断上の使用
本発明の抗Ｃ５抗体は、例えば診断目的のために、サンプル中のＣ５を検出及び／又は測定するために使用され得る。いくつかの実施態様は、Ｃ５関連疾患又は障害を検出するためのアッセイにおいて本発明の１つ又はそれ以上の抗体の使用を検討する。Ｃ５についての例となる診断アッセイは、例えば、患者から得られたサンプルを本発明の抗Ｃ５抗体と接触させることを含み、ここで抗Ｃ５抗体は、検出可能な標識若しくはレポーター分子で標識されるか、又は患者のサンプルからＣ５を選択的に単離するための捕捉リガンドとして使用される。あるいは、非標識抗Ｃ５抗体は、それ自体検出可能に標識された二次抗体と組み合わせて診断適用において使用され得る。検出可能な標識又はレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、若しくは１２５Ｉのような放射性同位体；フルオレセインイソチオシアネート若しくはローダミンのような蛍光若しくは化学発光部分；又はアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、若しくはルシフェラーゼのような酵素であり得る。サンプル中のＣ５を検出又は測定するために使用することができる具体的な例となるアッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
本発明に従うＣ５診断アッセイにおいて使用され得るサンプルは、患者から得ることが
できるいずれかの組織又は流体サンプルを含み、これは正常又は病的状態下での検出可能な量のＣ５タンパク質又はそのフラグメントのいずれかを含有する。一般に、健常患者（例えば、Ｃ５に関連する疾患をに罹患していない患者）から得られる特定のサンプル中のＣ５タンパク質のレベルは、Ｃ５のベースライン又は標準レベルを最初に確立するために測定される。ついでＣ５のこのベースラインレベルは、Ｃ５に関連する状態又はこのような状態に関連する症状を有することが疑われる個体から得られたサンプルにおいて測定されたＣ５レベルに対して比較され得る。
Ｃ５タンパク質に対して特異的な抗体は、さらなる標識若しくは部分を含有していなくてもよく、又はそれらはＮ末端若しくはＣ末端標識若しくは部分を含有し得る。一実施態様において、標識又は部分はビオチンである。結合アッセイにおいて、標識の位置（もしあれば）は、ペプチドが結合される表面に対してペプチドの方向性を決定し得る。例えば、表面がアビジンで被覆される場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面に対して遠位になるように方向付けられる。
選択された実施態様
本開示の選択された実施態様は以下を含む：
実施態様１において、本発明は補体因子５（Ｃ５）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗体又はその抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換により決定して、Ｃ５（配列番号３５９）内に含有される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する。
実施態様２において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントが、水素／重水素交換により決定して、Ｃ５のアルファ鎖及び／又はベータ鎖内に含有される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する、実施態様１の抗原結合フラグメントの単離された抗体を含む。
実施態様３において、本発明は抗体又はその抗原結合フラグメントが、水素／重水素交換により決定して、Ｃ５のＣ５ａアナフィラトキシン領域のアミノ酸と相互作用しない、実施態様１又は２の抗原結合フラグメントの単離された抗体を含む。
実施態様４において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントが、水素／重水素交換により決定して、配列番号３６０及び／又は配列番号３６１内に含有される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する、実施態様１～３のいずれか１つの抗原結合フラグメントの単離された抗体を含む。
実施態様５において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントが、（ａ）配列番号３５９のアミノ酸５９１～５９９；（ｂ）配列番号３５９のアミノ酸５９３～５９９；（ｃ）配列番号３５９のアミノ酸７７５～７８７；（ｄ）配列番号３５９のアミノ酸７７５～７９４；及び（ｅ）配列番号３５９のアミノ酸７７９～７８７からなる群より選択されるアミノ酸配列と相互作用する、実施態様１～４のいずれか１項の単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様６において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号３６０及び３６１からなる群より選択されるアミノ酸配列内に含有される少なくとも５つのアミノ酸と相互作用する、実施態様１～５のいずれか１つの単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様７において、本発明は、抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号３６０ 及び３６１のアミノ酸配列と相互作用する、実施態様１～５のいずれか１つの単離さ
れた抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様８において、本発明は、補体因子５（Ｃ５）タンパク質に特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、ここで抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下のアミノ酸残基の少なくとも１つと相互作用する：配列番号３５９のＮ５９１、Ｍ５９２、Ａ５９３、Ｔ５９４、Ｇ５９５、Ｍ５９６、Ｄ５９７、Ｓ５９８、Ｗ５９９、Ｗ７７５、Ｅ７７６、Ｖ７７７、Ｈ７７８、Ｌ７７９、Ｖ７８０、Ｐ７８１、Ｒ７８２、Ｒ７８３、Ｋ７８４、Ｑ７８５、Ｌ７８６、Ｑ７８７、Ｆ７８８、Ａ７８９、Ｌ７９０、Ｐ７９１、Ｄ７９２、Ｓ７９３、又はＬ７９４。
実施態様９において、本発明は、抗体が以下の特徴のうちの１つ又はそれ以上を有する、実施態様１～８のいずれか１つの単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含む：（ａ）カニクイザルへの投与の際に７０日目まで１０μｇ／ｍＬより高い血清濃度を有する；（ｂ）エクスビボ溶血アッセイにおいて測定して、カニクイザルへの投与の際に３５日目まで古典的経路（ＣＰ）溶血を遮断する；（ｃ）エクスビボ溶血アッセイにおいて測定して、カニクイザルへの投与の際に３５日目まで代替経路（ＡＰ）溶血を遮断する；（ｄ）カニクイザルにおいて１０日より長い血清半減期を有する；（ｅ）Ｃ５ヒト化マウスへの投与の際に４０日目まで１０μｇ／ｍＬより高い血清濃度を有する；（ｆ）エクスビボ溶血アッセイにおいて測定して、Ｃ５ヒト化マウスへの投与の際に３０日目までＣＰ溶血を遮断する；及び（ｇ）Ｃ５ヒト化マウスにおいて１０日より長い血清半減期を有する。
実施態様１０において、本発明は、抗体が、以下からなる群より選択されるさらなる特徴を有する、実施態様１～９のいずれか１つの単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含む：（ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である；（ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、２５℃で０．９ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＣ５に結合する；（ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、３７℃で０．３ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５に結合する；（ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、６５ｎＭ未満のＫＤでサルＣ５に結合する；（ｅ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、０．５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５変異体Ｒ８８５Ｈ（配列番号３５６）に結合する；（ｆ）表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、０．５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５変異体Ｒ８８５Ｃ（配列番号３５７）に結合する；（ｇ）ＣＰ溶血アッセイにおいて測定して、６ｎＭ未満のＩＣ５０でヒトＣ５媒介古典的経路（ＣＰ）溶血を９５％より多く遮断する；（ｈ）ＡＰ溶血アッセイにおいて測定して、１６５ｎＭ未満のＩＣ５０でヒトＣ５媒介代替経路（ＡＰ）溶血を７０％より多く遮断する；（ｉ）ＣＰ溶血アッセイにおいて測定して、１８５ｎＭ未満のＩＣ５０でアフリカミドリザルＣ５媒介ＣＰ溶血を阻害する；（ｊ）ＡＰ溶血アッセイにおいて測定して、２３５ｎＭ未満のＩＣ５０でアフリカミドリザルＣ５媒介ＡＰ溶血を阻害する；（ｋ）ＣＰ溶血アッセイにおいて測定して、１４５ｎＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＣ５媒介ＣＰ溶血を阻害する；及び（ｌ）ＡＰ溶血アッセイにおいて測定して、３０ｎＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＣ５媒介ＡＰ溶血を阻害する。
実施態様１１において、本発明は、実施態様１～１０のいずれか１つの単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含み、ここで、抗体又は抗原結合フラグメントは、表１に列挙される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つ内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）；及び表１に列挙される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つ内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む。
実施態様１２において、本発明は：（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４
、１００、１２４、１４０、１４８、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２７６、２９２、３０８、３２４、及び３４０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１２６、１４２、１５０、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２７８、２９４、３１０、３２６、及び３４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；（ｃ）ドメイン配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２８、１４４、１５２、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８０、２９６、３１２、３２８、及び３４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１１６、１３２、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２８４、３００、３１６、３３２、及び３４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１１８、１３４、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２８６、３０２、３１８、３３４、及び３５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；並びに（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２０、１３６、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８８、３０４、３２０、３３６、及び３５２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む、実施例１～１１のいずれか１つの単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様１３において、本発明は、表１に列挙されるＨＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、実施態様１～１２のいずれか１つの単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様１４において、本発明は、表１に列挙されるＬＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、実施態様１３の単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様１５において、本発明は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、９８／１１４、１２２／１０６、９８／１３０、１３８／１０６、１４６／１０６、１２２／１３０、１４６／１１４、１４６／１３０、１３８／１３０、１５４／１６２、１７０／１７８、１８６／１９４、２０２／２１０、２１８／２２６、２３４／２４２、２５０／２５８、２６６／２５８、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、３２２／３３０、及び３３８／３４６からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、実施態様１１～１４のいずれか１つの単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含む。
実施態様１６において、本発明は、配列番号５０、９８、１３８、及び２０２からなる群より選択されるＨＣＶＲ内に含有される３つのＣＤＲ；並びに配列番号５８、１０６、及び２１０からなる群より選択されるＬＣＶＲ内に含有される３つのＣＤＲを含む、実施態様１１～１５のいずれか１つの単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様１７において、本発明は：（ａ）配列番号５２、５４、５６、６０、６２、及び６４；（ｂ）配列番号１００、１０２、１０４、１０８、１１０、及び１１２；（ｃ）配列番号１４０、１４２、１４４、１０８、１１０、及び１１２；並びに（ｄ）配列番号２０４、２０６、２０８、２１２、２１４、及び２１６からなる群より選択されるＣＤＲを含む、実施態様１６の単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様１８において、本発明は、配列番号５０／５８、９８／１０６、１３８／１０６、及び２０２／２１０からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ アミノ酸配列対
を含む、実施態様１７の単離された抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様１９において、本発明は、Ｃ５への結合について実施態様１７の抗体又は抗原結合フラグメントと競合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様２０において、本発明は、実施態様１７の抗体又は抗原結合フラグメントと同じエピトープに結合する抗体又は抗原結合フラグメントを含む。
実施態様２１において、本発明は、５以下のアミノ酸置換を有する表１に列挙されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、実施態様９又は１０の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様２２において、本発明は、５以下のアミノ酸置換を有する表１に列挙されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施態様２１の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様２３において、本発明は、配列番号９８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、実施態様９又は１０の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様２４において、本発明は、配列番号１０６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、実施態様２３の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様２５において、本発明は、ＨＣＶＲの３つのＣＤＲ［ここでＨＣＶＲは、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１２２、１３８、１４６、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２７４、２９０、３０６、３２２、及び３３８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する］；及びＬＣＶＲの３つのＣＤＲ、［ここでＬＣＶＲは、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１１４、１３０、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２８２、２９８、３１４、３３０、及び３４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する］を含む、Ｃ５ａ及びＣ５ｂへのＣ５切断を遮断する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。
実施態様２６において、本発明は、実施態様１～２５のいずれか１つに従うＣ５に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む医薬組成物を含む。
実施態様２７において、本発明は、実施態様１～２５のいずれか１つに示される抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含む。
実施態様２８において、本発明は、実施態様１～２５のいずれか１つに示される抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を含む。
実施態様２９において、本発明は実施態様２７又は２８のポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む。
実施態様３０において、本発明は実施態様２９のベクターを発現する細胞を含む。
実施態様３１において、本発明は、Ｃ５に関連する疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は徴候を予防するか、処置するか又はさせる方法を含み、該方法は、実施態様１～２５のいずれか１つの抗体又は抗原結合フラグメントを、それを必要とする被験体に投与することを含む。
実施態様３２において、本発明は、疾患又は障害が、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、加齢性黄斑変性、地図状萎縮、ぶどう膜炎、視神経脊髄炎、多発性硬化症、脳卒中、ギラン・バレー症候群、外傷性脳損傷、パーキンソン病、不適切又は望ましくない補体活性化の障害、血液透析合併症、超急性同種移植片拒絶、異種移植片拒絶、ＩＬ－２治療の間のインターロイキン－２誘導毒性、炎症性障害、自己免疫疾患の炎症、クローン病、成人呼吸促迫症候群、火傷又は凍傷を含む熱傷、虚血後再灌流状態、心筋梗塞、毛細管漏出症候群、肥満、糖尿病、アルツハイマー病、統合失調症、脳卒中、てんかん、アテローム性動脈硬化、血管炎、水疱性類天疱瘡、Ｃ３腎症、膜増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、アルポート症候群、進行性腎不全、蛋白尿性腎臓病、腎虚血－再灌流傷害、ループス腎炎、バルーン血管形成術、心肺バイパス術又は腎動脈バイパス術におけるポンプ後症候群、血液透析、腎虚血、大動脈再建後の腸間膜動脈再灌流、感染性疾患又は敗血症、免疫複合体病及び自己免疫疾患、腎障害、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＳＬＥ腎炎、増殖性腎炎、溶血性貧血、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、肺塞栓症及び梗塞、肺炎、並びに重症筋無力症からなる群より選択される、実施態様３１の方法を含む。
実施態様３３において、本発明は、疾患又は障害がａＨＵＳである実施態様３１の方法を含む。
実施態様３４において、本発明は、疾患又は障害がＰＮＨである実施態様３１の方法を含む。
実施態様３５において、本発明は、医薬組成物がそれを必要とする被験体に予防的又は治療的に投与される、実施態様３１～３４のいずれか１つの方法を含む。
実施態様３６において、本発明は、医薬組成物が第二の治療剤と組み合わせて投与される、実施態様３１～３５のいずれか１つの方法を含む。
実施態様３７、本発明は、抗凝固薬、抗炎症薬、降圧薬、免疫抑制剤、脂質低下剤、リツキシマブのような抗ＣＤ２０薬、インフリキシマブのような抗ＴＮＦ薬、抗てんかん薬、Ｃ３阻害剤、第二の抗Ｃ５抗体、及び抗血栓剤からなる群より選択される、実施態様３６の方法を含む。
実施態様３８において、本発明は、医薬組成物が、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋内、又は頭蓋内に投与される、実施態様３１～３７のいずれか１つの方法を含む。
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を製造し使用する方法の完全な開示及び記載を当業者に提供するように示されるものであり、本発明者らが彼らの発明とみなす範囲を限定することは意図されない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実にするために努力がなされたが、いくらかの実験誤差及び偏差が占めるはずである。特に示されていなければ、部数は質量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、そして圧力は大気圧又は大気圧付近である。
実施例１：補体因子５（Ｃ５）タンパク質に対するヒト抗体の生成
Ｃ５タンパク質に対するヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（Ｒ）マウスにおいて生成した。血清精製ヒトＣ５タンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ カタログ番号２０－４８８８）を用いてマウスを免疫した。
抗体免疫応答をＣ５特異的免疫アッセイによりモニタリングした。所望の免疫応答が達成された場合、脾細胞を採取し、そしてマウス骨髄腫細胞と融合させてそれらの生存能を保存し、そしてハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株を、スクリーニングそして選択して、Ｃ５特異的抗体を産生する細胞株を同定した。これらの細胞株を使用して、いくつかの抗Ｃ５キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを有する抗体）を得た；この方法で生成された例となる抗体をＨ２Ｍ１１６８３Ｎ及びＨ２Ｍ１１６８６Ｎと名付けた。
また抗Ｃ５抗体を、米国特許第７５８２２９８号（参照によりその全体として本明細書に具体的に加入される）に記載されるように、骨髄腫細胞に融合することなく抗原陽性マウスＢ細胞から直接単離した。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗Ｃ５抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインを有する抗体）を得た；この方法で生成された例となる抗体を、Ｈ４Ｈ１２１５９Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６３Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６４Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６７Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６８Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６９Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１７１Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１７５Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１７６Ｐ２、Ｈ４Ｈ１２１７７Ｐ２及びＨ４Ｈ１２１８３Ｐ２と指定した。
この実施例の方法に従って生成された例となる抗体の生物学的特性を、以下に示される実施例において詳細に記載する。
実施例２：重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸及び核酸配列
表１は、本発明の選択された抗Ｃ５抗体の重鎖及び軽鎖可変領域並びにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。
Figure 2022106952000001
対応する核酸配列識別子を表２に示す。
Figure 2022106952000002
抗体は、本明細書において典型的には以下の命名法に従って言及される：Ｆｃ接頭語（例えば、「Ｈ４Ｈ」、「Ｈ２Ｍ」など）、続いて数字識別子（例えば、表２に示されるような「１１６８６」、「１２１６６」、「１２１８３」など）、続いて「Ｐ」、「Ｐ２」、又は「Ｎ」接尾語。従って、この命名法によれば、抗体は、本明細書では例えば、「Ｈ２Ｍ１１６８６Ｎ」、「Ｈ４Ｈ１２１８３Ｐ２」、「Ｈ４Ｈ１２１６８Ｐ」などと呼ばれ得る。本明細書において使用される抗体記号表示でのＨ４Ｈ及びＨ２Ｍ接頭語は、抗体の
特定のＦｃ領域アイソタイプを示す、例えば、「Ｈ４Ｈ」抗体は、二量体安定化を促進するためにヒンジ領域にセリンからプロリンへの変異（Ｓ１０８Ｐ）を含むヒトＩｇＧ４を有し、そして「Ｈ２Ｍ」抗体は、マウスＩｇＧ２ Ｆｃ（ａ又はｂアイソタイプ）を有する（全ての可変領域は抗体記号表示において最初に「Ｈ」と示される完全ヒトである）。当業者には当然のことながら、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプに転換され得る（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体などに転換され得る）が、いずれにしても、可変ドメイン（ＣＤＲを含む）
－ これらは表２に示される数値識別子により示される － は同じままであり、そして抗原に対する結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず同一であるか又は実質的に同様であると期待される。
特定の実施態様において、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する選択された抗体を、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する抗体に転換した。一実施態様において、ＩｇＧ４ ＦｃドメインはＵＳ２０１００３３１５２７に開示される２又はそれ以上のアミノ酸変化を含む。
変異した抗体を生成するために、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐの相補性決定領域（ＣＤＲ）における様々な残基をヒスチジンに変異させ、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ２～Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ１０として同定される９つの変異した抗体を生成した。ＣＤＲにおけるヒスチジン変異は、標的抗原に対する結合のｐＨ依存性を付与することが示されており、改善された薬物動態をもたらす（Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１２０３－１２０７）。
以下の実施例において使用された対照構築物
以下の対照構築物（抗Ｃ５抗体）を、比較の目的のために本明細書に開示される実験に含めた：「対照薬１」、米国特許第６，３５５，２４５号（Ａｌｅｘｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．）に従う抗体「ｈ５Ｇ１．１」のＶＨ／ＶＬ配列を有するヒトＣ５に対するモノクローナル抗体；及び「対照薬２」、米国特許出願公開第２０１３／００２２６１５号（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に従う抗体「８１０９」のＶＨ／ＶＬ配列を有するヒトＣ５に対するヒトモノクローナル抗体。
実施例３：表面プラズモン共鳴により決定したＣ５への抗体の結合
精製された抗Ｃ５抗体へのＣ５結合についての平衡解離定数（ＫＤ値）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器で実時間表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを使用して決定した。ヒトＦｃ定常領域を有する発現された抗Ｃ５抗体を捕捉するために、Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、アミンカップリングによりモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、番号ＢＲ－１００８－３９）で誘導体化した。Ｂｉａｃｏｒｅ結合試験を、ＨＢＳＴランニングバッファ（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％体積／体積 Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）中で行った。ヒトＣ５を商業的供給源（ＥＭＤ）から入手した。Ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ヘキサヒスチジンタグを有する他のＣ５試薬を発現させた（以後Ｃ５－ｍｍｈと呼ぶ）。アルギニン８８５においてヒスチジン及びシステイン点変異を含有するヒトＣ５－ｍｍｈ試薬も発現させた（以後それぞれＣ５ Ｒ８８５Ｈ－ｍｍｈ及びＣ５ Ｒ８８５Ｃ－ｍｍｈと呼ぶ）。ＨＢＳＴランニングバッファ中で調製した様々な濃度のヒトＣ５、ヒトＣ５ Ｒ８８５Ｈ－ｍｍｈ（配列番号３５６）、ヒトＣ５ Ｒ８８５Ｃ－ｍｍｈ（配列番号３５７）及びサルＣ５－ｍｍｈ（配列番号３５８）（１００ｎＭ～１．２３ｎＭの範囲に及ぶ、３倍希釈）を、抗Ｃ５抗体捕捉表面上に３０μＬ／分の流速で注入した。捕捉されたモノクローナル抗体のそれぞれへの全Ｃ５試薬の結合を３分間モニタリングし、そしてＨＢＳＴランニングバッファ中のそれらの解離を８分間モニタリングした。全ての結合動力学実験を２５℃又は３７℃のいずれかで行った。動力学的結合（ｋａ）及び解離（ｋｄ）速度定数を、実時間センサーグラムを１；１結合モデルに対してＳｃｒｕｂ
ｂｅｒ ２．０ｃ曲線フィッティングソフトウェアを使用してフィッティングさせることにより決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）を、動力学的速度定数から：ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ 及びｔ１／２（分）＝ｌｎ２／（６０ｘｋｄ）として計算した。
２５℃及び３７℃での抗Ｃ５抗体へのヒトＣ５結合についての結合動力学的パラメーターを表３及び４に示す。
Figure 2022106952000003
Figure 2022106952000004
２５℃及び３７℃での抗Ｃ５抗体へのサルＣ５－ｍｍｈ結合を表５及び６に示す。
Figure 2022106952000005
Figure 2022106952000006
２５℃での抗Ｃ５抗体へのヒトＣ５ Ｒ８８５Ｈ－ｍｍｈ及びヒトＣ５ Ｒ８８５Ｃ－ｍｍｈの結合をそれぞれ表７及び８に示す。
Figure 2022106952000007
Figure 2022106952000008
３７℃での抗Ｃ５抗体へのヒトＣ５ Ｒ８８５Ｈ－ｍｍｈ及びヒトＣ５ Ｒ８８５Ｃ－ｍｍｈの結合をそれぞれ表９及び１０に示す。
Figure 2022106952000009
Figure 2022106952000010
２５℃で、本発明の全２５の抗Ｃ５抗体は、表３に示されるようにヒトＣ５に７３ｐＭ～８．４ｎＭの範囲に及ぶＫＤ値で結合した。３７℃では、本発明の抗Ｃ５抗体は、表４に示されるように１０３ｐＭ～１８．５ｎＭの範囲に及ぶＫＤ値でヒトＣ５に結合した。２５℃では、試験された２５の本発明の抗Ｃ５抗体のうち２５が、表５に示されるように１３３ｐＭ～６４ｎＭの範囲に及ぶＫＤ値でサルＣ５－ｍｍｈに結合した。３７℃では、試験された２５の本発明の抗Ｃ５抗体のうち２５が、表６に示されるように１３３ｐＭ～１１８ｎＭの範囲に及ぶＫＤ値でサルＣ５－ｍｍｈに結合した。２５℃で試験された本発明の抗Ｃ５抗体のうち１６が、表７に示されるように１４７ｐＭ～１０．９ｎＭの範囲に及ぶＫＤ値でヒトＣ５ Ｒ８８５Ｈ－ｍｍｈに結合した。２５℃で試験された本発明の１６の抗Ｃ５抗体のうち１６が、表８に示されるように２５１ｐＭ～１９０ｎＭの範囲に及ぶＫＤ値でヒトＣ５ Ｒ８８５Ｃ－ｍｍｈに結合した。３７℃で試験された本発明の１６の抗Ｃ５抗体のうち１６が、表９に示されるように１．４９ｎＭ～６９．４ｎＭの範囲に及ぶＫＤ値でヒトＣ５ Ｒ８８５Ｈ－ｍｍｈに結合した。２５℃で試験された本発明の１６の抗Ｃ５抗体のうち１６が、表１０に示されるように１．７４ｎＭ～１５９ｎＭの範囲に及ぶＫＤ値でヒトＣ５ Ｒ８８５Ｃ－ｍｍｈに結合した。
実施例４：異なるｐＨでＣ５に結合する抗体
精製された抗Ｃ５モノクローナル抗体に結合した組み換えヒトＣ５の解離速度に対するｐＨの効果を、実時間表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用して決定した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、最初にアミンカップリングによりモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、番号ＢＲ－１００８－３９）を用いて誘導体化して、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを有する発現された抗Ｃ５モノクローナル抗体を捕捉した。全てのＢｉａｃｏｒｅ結合試験は、２つのランニングバッファＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ７．４（０．０１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，、０．０５％体積／体積 Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４に調整）及びＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ６．０（０．０１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％体積／体積 Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ６．０に調整）を使用して行った。様々な濃度のヒトＣ５（ＥＭＤ、カタログ番号２０４８８８）又はサルＣ５．ｍｍｈ（ＰＢＳ－Ｔ中で調製、１００ｎＭから１１．１１ｎＭまでの範囲に及ぶｐＨ７．４、３倍希釈）を、抗Ｃ５モノクローナル抗体を捕捉した表面上に３分間５０μＬ／分の流速で注入し、そして２つのランニングバッファＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ７．４及びＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ６．０中でのそれらの解離を６分間モニタリングした。全ての結合動力学実験を２５℃及び３７℃で行った。動力学的解離定数（ｋｄ）を、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線フィッティングソフトウェアを使用して実時間センサーグラムを１；１結合モデルにフィッティングすることにより決定した。結合解離半減期（ｔ１／２）をｋｄから：
Figure 2022106952000011
 として計算した。
２つのランニングバッファーＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ７．４及びＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ６．０中における２５℃及び３７℃での様々な抗Ｃ５モノクローナル抗体へのヒトＣ５結合についての半減期の比を表１１及び１２に示す。
Figure 2022106952000012
Figure 2022106952000013
２つのランニングバッファーＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ７．４及びＰＢＳ－Ｔ、ｐＨ６．０での２５℃及び３７℃における様々な抗Ｃ５モノクローナル抗体へのサルＣ５結合についての半減期の比を表１３及び１４に示す。
Figure 2022106952000014
Figure 2022106952000015
表１１～１４に示されるように、選択された抗Ｃ５抗体は、ｔ１／２比によりわかるようにｐＨ依存性結合を示した。
実施例５：抗Ｃ５抗体間のＯｃｔｅｔ交差競合
抗Ｃ５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）間の結合競合を、実時間無標識バイオレイヤー干渉（ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）アッセイを使用してＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４バイオセンサー（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）で決定した。実験全体を２５℃で０．０１ Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％体積／体積Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｔｗｅｅｎ－２０、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｏｃｔｅｔ ＨＢＳ－Ｐ ｂｕｆｆｅｒ）中で１０００ｒｐｍでプレートを振盪しながら行った。２つの抗体がヒトＣ５（血漿から精製されたｈＣ５、ＥＭＤ）上のそれらのそれぞれのエピトープへの結合について互いに競合することができるかどうかを評価するために、チップを３分間抗ヒトＣ５ ｍＡｂ（以後ｍＡｂ１と呼ばれる）の５０μｇ／ｍＬ溶液を含有するウェルに沈めることにより、抗ｈＦｃ抗体被覆Ｏｃｔｅｔバイオセンサーチップ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．、番号１８－５０６０）上に約１．５ｎｍの抗ヒトＣ５ ｍＡｂを最初に捕捉させた。ついで抗体が捕捉されたバイオセンサーチップを、ブロッキングｍＡｂの２００μｇ／ｍＬ溶液を含有するウェル中に４分間浸けることにより、ブロッキングＨ４ＨアイソタイプコントロールｍＡｂ（以後ブロッキングｍＡｂと呼ばれる）を飽和させた。続いて予め２時間インキュベートされていた５０ｎＭ ｈＣ５及び第二の抗ヒトＣ５ ｍＡｂ（以後ｍＡｂ２と呼ばれる）１μＭの共複
合体化（ｃｏ－ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）溶液を含有するウェルにバイオセンサーチップを４分間浸けた。バイオセンサーチップを、実験の各工程間にＯｃｔｅｔ ＨＢＳ－Ｐ緩衝液で洗浄した。実時間結合応答を実験の過程の間モニタリングし、そして各工程の終わりに結合応答を記録した。ヒトＣ５が予め複合体化された（ｐｒｅ－ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）ｍＡｂ２のｍＡｂ１に対する結合をバックグラウンド結合に対して補正し、比較し、そして様々な抗Ｃ５モノクローナル抗体の競合的／非競合的挙動を決定した。
表１５は、結合の順序とは独立して、両方向で競合する抗体の関係を明確に規定する。
Figure 2022106952000016
実施例６：Ｂ細胞バイオアッセイにおけるＣ５媒介補体依存性細胞傷害の阻害
この実施例は、古典的補体経路において抗ＣＤ２０抗体を使用してＣ５の役割を試験するバイオアッセイを記載する。Ｂ細胞特異的細胞表面抗原ＣＤ２０に対する治療的抗ＣＤ２０抗体は、Ｂ細胞のＣＤＣをもたらすことが示されており（Ｇｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：３８２３－３８３７）、そしてＣＤ２０を発現する細胞株を使用したＣＤＣアッセイは以前に記載されている（Ｆｌｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：５５－６３）。ＣＤ２０を発現するヒトＢ細胞株であるＤａｕｄｉ細胞、補体保存血清又は外来Ｃ５変異体ではＣ５欠乏血清、及び抗ＣＤ２０抗体（米国特許第８，５２９，９０２号からの「２Ｆ２」のＶＨ／ＶＬを含む抗体）を、ＣＤＣにおけるＣ５の役割を評価するために使用した。
Ｃ５ ＣＤＣバイオアッセイのために、Ｄａｕｄｉ細胞を９６ウェルアッセイプレート上に１０，０００細胞／ウェルで１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ
－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム及び非必須アミノ酸を含有するＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ完全培地）又は１％ＢＳＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン及び Ｌ－グルタミン（ＲＰＭＩ／ＢＳＡ）を含有するＲＰＭＩのいずれか中で播種した。変異した抗ｈＣ５抗体を試験する全てのアッセイは、Ｃ５含有ヒト血清を用いる非変異抗体の試験とともに、ＲＰＭＩ完全培地で試験したが、非変異抗体を試験するアッセイはアフリカミドリザル血清を用い、そしてヒトＣ５変異体はＲＰＭＩ／ＢＳＡ培地で試験された。ヒト又はサル血清を用いてＣＤＣを測定するために、抗ＣＤ２０抗体を１００ｎＭから２ｐＭに１：３希釈し（抗体を含有しない対照サンプルを含む）、そして細胞とともに１０分間２５℃でインキュベートし、続いて１．６６％血清又は１．６６％のＣ５欠乏血清及び６．６ｎＭ Ｃ５変異体タンパク質を加えた。Ｃ５欠乏血清に加えるべきＣ５タンパク質の量は、ヒト血清中のＣ５濃度の報告された値０．３７ｕＭに基づくものであった（Ｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ ２００８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：７８５３－７８６３）。ＣＤＣのＣ５抗体阻害を試験するために、Ｃ５抗体を１００ｎＭから２ｐＭに１：３希釈し（抗体を含有しない対照サンプルを含む）、そして１．６６％血清又は１．６６％のＣ５欠乏血清及び６．６ｎＭ Ｃ５変異体タンパク質とともに３０分間インキュベートした。血清とともに抗体を細胞に加える１０分前に、抗ＣＤ２０抗体を細胞に１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、３．５ｎＭ、７ｎＭ、１０ｎＭ、又は３０ｎＭで加えた。抗ＣＤ２０抗体とのインキュベートの完了時に、抗体／血清混合物を細胞に加えた。細胞傷害を、３７℃５％ ＣＯ２での３．５時間のインキュベーションの後、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号Ｇ９２９２）を加えた後に測定した。ＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭは、細胞死滅を測定する発光ベースの試薬であり、増加した発光は増加した細胞傷害が増加するにつれて観察される（相対的光単位、ＲＬＵで測定される）。対照ウェル中の未処理の細胞を、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ試薬を加えた直後にジギトニンで処理することによりリンスして、細胞の最大殺傷を決定した。プレートをＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭを加えた１５分後にＶｉｃｔｏｒ Ｘ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により発光について読み取った。計算された場合、細胞傷害のパーセンテージを、以下の等式を使用することによりＲＬＵ値を用いて計算した：
Figure 2022106952000017
この等式において、「バックグラウンド細胞溶解」は、いずれのＣＤ２０抗体も用いずの培地及び血清のみで処理された細胞からの発光であり、そして「最大細胞溶解」は、ジギトニンで処理された細胞からの発光である。細胞傷害％又はＲＬＵとして表される結果を、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて非線形回帰（４パラメーターロジスティクス）を使用して解析し、ＥＣ５０値及びＩＣ５０値を得た。０～１００％阻害が、阻害剤を用いないアッセイにおいて使用された抗ＣＤ２０抗体の濃度から０ｎＭ抗ＣＤ２０抗体までの阻害の範囲であるように抗体の阻害を計算した。
結果
合計で２５の抗ヒトＣ５抗体（１６の非変異及び９の変異したもの）を、Ｄａｕｄｉ細胞を使用して抗ＣＤ２０抗体及びヒト血清（正常ｈＣ５又はＣ５変異体を含む）又はアフリカミドリザル血清を用いたＣＤＣアッセイにおいてＣ５を阻害するそれらの能力について試験した。Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐの相補性決定領域（ＣＤＲ）中の様々な残基をヒスチジンに変異させ、９つの変異した抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ２～Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ１０を生成した。ＣＤＲ中のヒスチジン変異は、標的抗原に結合のｐＨ依存性を付与し、改善された薬物動態をもたらすことを示されている（Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１２０３－１２０７）。
Figure 2022106952000018
表１６及び１７に示されるように、全２５の抗ｈＣ５抗体が、ヒト血清の１．６６％で存在するＣ５により媒介されるＣＤＣの完全阻害を示した。非変異抗体のＩＣ５０は１．２～３．４ｎＭの範囲に及んだ。変異抗体のＩＣ５０は３．０ｎＭ～１２ｎＭの範囲に及んだ。親非変異抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐは、ＩＣ５０ ２．６ｎＭ及び２．９ｎＭで完全阻害を生じた。
Figure 2022106952000019
１６の非変異抗ｈＣ５抗体は、２．０ｎＭ～１４ｎＭの範囲に及ぶＩＣ５０でアフリカミドリザルＣ５により媒介されるＣＤＣの完全阻害を示した。
９つの変異抗体のうち４つは、７．１ｎＭ～９．９ｎＭの範囲に及ぶＩＣ５０でアフリカミドリザルＣ５により媒介されるＣＤＣの完全阻害を示した。残りの６つの変異抗体は、１０ｎＭより大きいＩＣ５０での遮断薬であり、そして最大阻害（１００ｎＭ抗体で）は３４％～８５％の範囲に及んだ。親非変異抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐは４．５ｎＭ及び５．６ｎＭのＩＣ５０で完全阻害を生じた。
抗ｈＣ５抗体がヒトＣ５変異体、Ｒ８８５Ｈ及びＲ８８５Ｃを阻害するかどうかを試験するために、Ｃ５欠乏ヒト血清を各Ｃ５変異体６．６ｎＭを用いて試験した。全２５の抗ｈＣ５抗体は、０．４８ｎＭ～４．２ｎＭの範囲に及ぶ非変異抗体のＩＣ５０でＣ５変異体Ｒ８８５Ｈにより媒介されるＣＤＣの完全阻害を示したが、変異抗体のＩＣ５０は１．３ｎＭ～７．０ｎＭの範囲に及んだ。親非変異抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐは、１．３ｎＭ及
び１．３ｎＭのＩＣ５０で完全阻害を生じた。
１６の非変異抗体ｈＣ５抗体のうち１５は、０．４３ｎＭ～１．６ｎＭの範囲に及ぶＩＣ５０でＣ５変異体Ｒ８８５Ｃにより媒介されるＣＤＣの完全阻害を示した。１つの非変異抗体は、最大阻害６７％（１００ｎＭ抗体にて）及びＩＣ５０＞２０ｎＭでＣＤＣの弱い阻害を示した。全９つの変異抗体は、０．７７ｎＭ～３．５ｎＭの範囲に及ぶＩＣ５０でＣ５変異体Ｒ８８５Ｃにより媒介されるＣＤＣの完全阻害を示した。親非変異抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐは０．４６ｎＭ及び０．７６ｎＭのＩＣ５０で完全阻害を生じた。
抗ＣＤ２０抗体は、１．６６％血清を用いて、ヒト血清について１．０ｎＭ、１．４ｎＭ、及び１．９ｎＭ、アフリカミドリザル血清について２．４ｎＭ及び２．６ｎＭ、ｈＣ５変異体Ｒ８８５Ｈを用いてｈＣ５欠乏血清について１．９ｎＭ及び６．３ｎＭ、そしてｈＣ５変異体Ｒ８８５Ｃを用いてｈＣ５欠乏血清について２．７ｎＭ及び９．５ｎＭのＥＣ５０でＤａｕｄｉ細胞のＣＤＣを示した。関連のないＩｇＧ対照抗体、対照ｍＡｂ１及び対照ｍＡｂ２のいずれもＣＤＣのいずれの阻害も示さなかった。
実施例７：ルシフェラーゼアッセイにより決定されたＣ５ａ活性の阻害
この実施例は、その受容体の１つであるＣ５ａＲ１によるＣ５ａの活性化を試験するためのアッセイを記載する。Ｃ５ａＲ１はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であり、そして様々なＧＰＣＲ共役シグナル伝達経路を開始することができる（Ｍｏｎｋ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５２：４２９－４４８）。ヒトＣ５ａＲ１（受け入れ番号ＮＰ＿００１７２７．１）及びヒトＧα１６（受け入れ番号ＮＰ＿００２０５９．３）を用いてリスフェラーゼ受容体［ＮＦＡＴ応答エレメント（４Ｘ）－ルシフェラーゼ］とともに安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用してバイオアッセイを確立した。Ｇα１６は比較的乱雑な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｇタンパク質であり、これは様々な種類のＧＰＣＲと共役してＰＬＣ－β活性化及びその後のＣａ＋＋上昇をもたらし得、これが今度はＮＦＡＴ転位及びレポーター遺伝子転写を活性化する（Ｋｏｓｔｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．２００５、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２６：５９５－６０２）。結果として得られた細胞株ＨＥＫ２９３／ ｈＧα１６／ｈＣ５ａＲ１／ＮＦＡＴ－ｌｕｃを単離し、そして１０％ ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン、５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８、１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ、及び７μｇ／ｍＬブラストサイジンを含有する１０％ ＤＭＥＭ中で維持した。
Ｃ５ａルシフェラーゼバイオアッセイのために、ＨＥＫ２９３／ｈＧ□１６／ｈＣ５ａＲ１／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞を９６ウェルアッセイプレートに２０，０００細胞／ウェルで０．５％ ＢＳＡ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＬ－グルタミンを追加したＯＰＴＩＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号３１９８５－０７０）中で播種し、ついで３７℃及び５％ ＣＯ２で終夜インキュベートした。血清はｈＣ５ａを切断し活性化することが示されていたのでＢＳＡをＦＢＳの代わりに使用した（Ｋｌｏｓ ｅｔ ａｌ．、２０１３、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．６５：５００－５４３）。翌朝に、ｈＣ５ａを１００ｎＭから２ｐＭに滴定し（ｈＣ５ａを含有しない対照サンプルを含む）、そして細胞に加えて細胞株についての用量応答滴定曲線を決定した。ｈＣ５ａのｈＣ５ａ抗体阻害を調べるために、５００ｐＭのｈＣ５ａを細胞に加えた。その直後に、１００ｎＭから２ｐＭに１：３希釈した抗体を（抗体を含有しない対照サンプルを含む）細胞に加えた。細胞を５．５時間３７℃で５％ＣＯ２の存在下にてインキュベートした。ＯｎｅＧｌｏＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号Ｅ６０５１）とともにインキュベートした後にルシフェラーゼ活性を検出した。ＯｎｅＧｌｏＴＭは、細胞中に存在するルシフェラーゼの量を測定する発光ベースの試薬である。このアッセイにおいて、増加したｈＣ５ａ活性化は増加したルシフェラーゼ産生及び発光をもたらす（相対的光単位ＲＬＵで測定して）。発光の測定をＶｉｃｔｏｒ Ｘ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して行った。Ｐｒｉｓｍ ５
ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）用いて非線形回帰（４パラメーターロジスティクス）を使用して結果を解析してＥＣ５０値及びＩＣ５０値を得た。０～１００％阻害が阻害剤のない５００ｐＭ ｈＣ５ａから０ｎＭ ｈＣ５ａまでの阻害範囲であるように抗体の阻害を計算した。
ＨＥＫ２９３／ｈＧα１６／ｈＣ５ａＲ１／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞の５００ｐＭ ｈＣ５ａ活性化の阻害の程度を測定することにより、その受容体ｈＣ５ａＲ１のｈＣ５ａ活性化を阻害するそれらの能力について４つの抗ｈＣ５抗体を試験した。
Figure 2022106952000020
表１８に示されるように、本発明の４つの抗体は全て、０．０３５ｎＭ～０．４６ｎＭの範囲に及ぶＩＣ５０で５００ｐＭ ｈＣ５ａの完全阻害を示した。関連のないＩｇＧ対照抗体、対照ｍＡｂ３は、ｈＣ５ａのいずれの阻害も示さなかった。ｈＣ５ａはＨＥＫ２９３／Ｇα１６／ｈＣ５ａＲ１／ＮＦＡＴ－ｌｕｃ細胞をＥＣ５０ ０．３９ｎＭで活性化した。
実施例８：溶血バイオアッセイ
古典的経路溶血アッセイ（ＣＨ）及び代替経路溶血アッセイ（ＡＨ）を抗体活性を試験するために開発した。
ＣＨは古典的補体経路の活性化のためのスクリーニングアッセイであり、これは経路のいずれかの成分の減少、不在、及び／又は不活性に対して感受性である。ＣＨは、ウサギ抗ヒツジ赤血球抗体（溶血素）で予め被覆されたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を溶解する古典的経路の血清補体成分の機能的能力を試験する。抗体で被覆されたＳＲＢＣを試験血清とインキュベートした場合、補体の古典的経路は活性化され、そして溶血が生じる。補体成分が存在しない場合、ＣＨレベルはゼロになり；古典的経路の１つ又はそれ以上の成分が減少する場合、ＣＨは減少する。（Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ １９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．７２：４９－５９）。このアッセイは、高親和性抗ヒトＣ５抗体の特徴づけ及びスクリーニングのために使用される。
方法
（Ａ）古典的経路補体溶血アッセイ
所望の数のヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）をＧＶＢ＋＋緩衝液で洗浄し、そして１ｘ１０＾９細胞／ｍＬで再懸濁させた。ＳＲＢＣを感作するために、等体積の１：５０希釈されたウサギ抗ヒツジ溶血素（１．５ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で２０分間混合した。感作されたＳ
ＲＢＣ細胞を、溶血アッセイにおいて使用する前にＧＶＢ＋＋中で２ｘ１０＾８細胞／ｍｌに希釈した。正常ヒト血清又はカニクイザル血清を２％又は１０％にＧＶＢ＋＋緩衝液で希釈した。Ｃ５媒介溶血活性の阻害を調べるために、試験抗体を、２％～１０％正常ヒト又は１０％カニクイザル血清若しくはアフリカミドリザル血清中で０．６ｎＭ～８００ｎＭの範囲に及ぶ濃度で２０分間４℃でプレインキュベートした。丸底９６ウェルプレートを溶血活性を測定するために使用した。合計で１００ｕｌの感作されたヒツジＲＢＣ（２ｘ１０＾８細胞／ｍｌ）を９６ウェルプレートにプレーティングし、続いて試験抗体とプレインキュベートされたそれぞれの血清サンプル１００ｕｌを加えた。細胞を穏やかに混合し、そして３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション時間後に、細胞を４℃で１２５０ｘｇでの遠心分離により沈降させた。合計１００ｕＬの上清を新しい９６平底プレートに移し、そして４１２ｎｍでＳｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダーで読み取った。溶血活性を処理のために１～５％の最終血清濃度で計算した。
溶血パーセントを以下のように計算した：
Figure 2022106952000021
この等式において、「バックグラウンド細胞溶解」は、血清を含有しないＧＶＢ＋＋緩衝液のみでインキュベートされた細胞からのＡ４１２ｎｍでのＯＤである。「最大細胞溶解」は、水で処理された細胞からのＡ４１２ｎｍでのＯＤである。溶血％で表される結果を、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて非線形回帰（４パラメーターロジスティクス）を使用して解析し、ＩＣ５０値を得た。データは平均±平均の標準誤差として表される。
（Ｂ）代替補体アッセイ
所望の数のウサギ赤血球（ＲｂＲＢＣ）をＧＶＢ－Ｍｇ２＋／ＥＧＴＡ緩衝液で洗浄し、そして２ｘ１０＾８細胞／ｍｌで再懸濁させた。正常ヒト又はカニクイザル血清をＧＶＢ－Ｍｇ２＋／ＥＧＴＡ緩衝液中１０％に希釈した。Ｃ５媒介溶血活性の阻害を試験するために、３ｎＭ～８００ｎＭの範囲に及ぶ濃度の抗体を２０分間４℃で５～１０％正常ヒト血清又はカニクイザル血清中でプレインキュベートした。丸底９６ウェルプレートを使用して溶血活性を測定した。合計１００ｕｌのＲｂＲＢＣ（２ｘ１０＾８細胞／ｍｌ）を９６ウェルプレートにプレーティングし、続いて抗Ｃ５抗体とプレインキュベートされた１０％正常ヒト血清又はカニクイザル又はアフリカミドリザル血清１００ｕｌを加えた。細胞を穏やかに混合し、そして３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション時間後に、細胞を１２５０ｘｇで４℃にて遠心分離することにより沈降させた。合計で１００ｕＬの上清を、新しい９６平底プレートに移し、そしてＳｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダーで４１２ｎｍで読み取った。溶血活性を５％血清の最終血清濃度で計算した。
溶血パーセントを以下のように計算した：
Figure 2022106952000022
この等式において、「バックグラウンド細胞溶解」は、血清を含有しないか又はいずれ
の抗Ｃ５抗体も用いないＧＶＢ－Ｍｇ／ＥＧＴＡ緩衝液のみでインキュベートされた細胞からのＡ４１２ｎｍでのＯＤである。「最大細胞溶解」は、水で処理された細胞からのＡ４１２ｎｍでのＯＤである。抗Ｃ５抗体による阻害、ＩＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて非線形回帰（４パラメーターロジスティクス）を使用して計算した。
結果
（Ａ）ヒトＣ５溶血の阻害
合計２５の抗ヒトＣ５（ｈＣ５）抗体（１６の非変異及び９つの変異）を、ＣＨ５０アッセイにおいて感作されたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を使用して、及びウサギ赤血球（ＲＲＢＣ）を使用してＡＨ５０アッセイにおいて正常ヒト血清（ＮＨＳ）からのＣ５を阻害するそれらの能力について試験した。
Figure 2022106952000023
表１９に示されるように、本発明の１６の抗ｈＣ５抗体は、ヒト血清の１％で存在するＣ５により媒介される古典的経路（ＣＰ）において溶血の９４％より多い阻害を示した。抗体のＩＣ５０は２．１～５．９ｎＭの範囲に及び、そして阻害パーセントは９５％～９９％の範囲に及んだ。全１６の抗Ｃ５抗体は、５％ ＮＨＳ中に存在するＣ５により媒介される代替経路（ＡＰ）溶血アッセイにおいて６０％より多い阻害（Ｈ４Ｈ１２１６９Ｐを除く）を示した。抗体のＩＣ５０は１３～１６０ｎＭの範囲に及び、そして阻害活性パーセントは４４％～８１％の範囲に及んだ。
Figure 2022106952000024
表２０に示されるように、９つの変異した抗ｈＣ５抗体は全て、５％ヒト血清中に存在するＣ５により媒介されるＣＰ及びＡＰ溶血活性の阻害を示した。ＣＰ溶血アッセイにおいて、親非変異抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐは、１０．９ｎＭのＩＣ５０で９８％より高い阻害を示した。８つの変異抗ｈＣ５抗体は、１０．３ｎＭ～２４．３ｎＭの範囲に及ぶＩＣ５０で９０％より高い阻害を示した。変異体抗Ｃ５抗体１２１６６Ｐ１０は７４％の部分阻害を示した。ＡＰ溶血アッセイにおいて、親非変異抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐは、２０．９ｎＭのＩＣ５０で８５％より高い阻害を示した。変異抗ｈＣ５抗体は７２～８３％の阻害範囲を示し、ＩＣ５０抗体は２８ｎＭ～０．１５μＭの範囲に及んだ。
（Ｂ）サルＣ５溶血の阻害
合計２５の抗ヒトＣ５（ｈＣ５）抗体（１６の非変異及び９つの変異）を、感作ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を使用するＣＨ５０アッセイ及びウサギ赤血球（ＲＲＢＣ）を使用するＡＨ５０アッセイにおいてカニクイザル及びアフリカミドリザル由来のＣ５を阻害するそれらの能力について試験した。
Figure 2022106952000025
表２１に示されるように、抗ｈＣ５抗体は、５％アフリカミドリザル血清において様々なレベルのＣＰ又はＡＰ溶血活性の阻害を示した。ＣＰアッセイにおいて、１６の抗ｈＣ５抗体のうち２つが溶血活性の阻害を示さなかった。１４の抗体は、２５ｎＭ～１８０ｎＭの範囲に及ぶＩＣ５０で４３～９４％の範囲に及ぶ阻害を示した。ＡＰ溶血アッセイにおいて、１７の抗体のうち１３は、２２．５ｎＭ～２３３ｎＭの範囲に及ぶＩＣ５０で１７％～９３％の範囲に及ぶ阻害活性を示した。
Figure 2022106952000026
表２２に示されるように、抗ｈＣ５抗体（６４％ＣＰ阻害を示したＨ４Ｈ１２１８３Ｐ２を除く）は、５％カニクイザル血清においてＣＰ又はＡＰ溶血アッセイの９０％より高い阻害を示した。ＣＰ溶血アッセイにおいて、抗体のＩＣ５０は７．１５ｎＭ～１４２ｎＭの範囲に及んだ。ＡＰ溶血アッセイにおいて、抗体のＩＣ５０は５．４～２９．６ｎＭの範囲に及んだ。
（Ｃ）変異体ヒトＣ５溶血の阻害
選択された抗Ｃ５抗体を、ＣＨ５０アッセイにおいてＣ５欠乏ヒト血清からの変異体ヒトＣ５（本明細書の実施例３を参照のこと）を阻害するそれらの能力について試験した。外来性Ｃ５変異体Ｒ８８５Ｈを追加したＣ５欠乏ヒト血清において、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、及び対照薬２は、それぞれ６．０ｎＭ及び４．４ｎＭのＩＣ５０値、並びにそれぞれ７．６ｎＭ及び５．５ｎＭのＩＣ８０値でＣＰ溶血を遮断した。変異体Ｒ８８５Ｃについて、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ及び対照薬２は、外来性Ｃ５変異体を含むＣ５欠乏ヒト血清中のＣＰ溶血を、それぞれ９．３ｎＭ及び６．８ｎＭのＩＣ５０値、並びにそれぞれ１１ｎＭ及び８．２ｎＭのＩＣ８０値で遮断した。予測されたように、対照薬１はヒトＣ５変異体の溶血活性を遮断しなかった。
（Ｄ）ヒトＣ５ｂ－６複合体の阻害
選択された抗Ｃ５抗体を、ＣＨ５０アッセイにおいてＣ５欠乏ヒト血清からのヒトＣ５
ｂ－６複合体を阻害するそれらの能力について試験した。Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐは、外来性ｈｕＣ５ｂ－６複合体を追加したＣ５欠乏ヒト血清中でＣＰ溶血を３．８ｎＭのＩＣ５０値及び５．８ｎＭのＩＣ８０値で強く遮断した。対照的に、対照薬１はＣ５ｂ－６複合体媒介溶血をより低い効力で、それぞれ５．０ｎＭのＩＣ５０値及び４６ｎＭのＩＣ８０値で遮断した。対照薬１は、試験された最も高い濃度で総溶血の７０％か阻害しなかった。対照薬２はヒトＣ５ｂ－６複合体溶血活性を遮断しなかった。
実施例９：抗Ｃ５抗体はＣＰ溶血アッセイにおいてＣ５ａの生成を遮断する
抗Ｃ５抗体がＣ５ａの生成を阻害するかどうかを評価するために、古典的経路（ＣＰ）溶血についてのアッセイからの上清をＥＬＩＳＡによりＣ５ａレベルについて分析した。
Ｃ５切断の結果として生成されたＣ５ａは７４アミノ酸のタンパク質フラグメントである。Ｃ５ａは血清カルボキシペプチダーゼにより代謝されて、Ｃ末端アルギニンの除去により、より安定で活性のより低い７３アミノ酸形態、Ｃ５ａ ｄｅｓ－Ａｒｇとなる。従ってＣ５ａ ｄｅｓ－Ａｒｇの定量は、インビボ及びインビトロでのＣ５ａの生成をモニタリングするための信頼できる尺度を提供する。本明細書で使用されるＭｉｃｒｏＶｕｅ
Ｃ５ａ ＥＬＩＳＡキットは、製造者により提供される情報に従ってＣ５ａ ｄｅｓ－Ａｒｇを検出する。予備実験（データは示していない）は、Ｃ５ａの一次７４アミノ酸形態も検出されるということを示す。本実施例の目的のために、両方の形態が集合的に「Ｃ５ａ」と呼ばれる。
Ｃ５ａタンパク質レベルを、ＣＰ溶血アッセイからの上清において、実施例８に記載されるようにＨ４Ｈ１２１６６Ｐ又はアイソタイプコントロール抗体とともにプレインキュベートされた補体が保存された正常ヒト血清（ＮＨＳ）を使用して決定した。Ｃ５ａタンパク質レベルを、ＭｉｃｒｏＶｕｅ Ｃ５ａ ＥＬＩＳＡキットを使用して製造者の指示に従って測定した。手短には、サンプルを希釈し、そして捕捉抗体（ヒトＣ５ａ上の新エピトープ（ｎｅｏ－ｅｐｉｔｏｐｅ）に特異的なマウス抗Ｃ５ａ）で予め被覆されたプレートでインキュベートした。製造者により提供されたヒトＣ５ａタンパク質を、較正のための標準として使用した。上清中のＣ５ａを、ＨＲＰ結合検出抗体（Ｃ５のＣ５ａ領域に対するマウスモノクローナル抗体）により検出した。発色性ＨＲＰ－基質、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、ＨＲＰ活性を検出するために加えた。１Ｎ塩酸溶液を使用して反応を停止させ、そして４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ４５０）をＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーで測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて非線形回帰（４パラメーターロジスティクス）を使用してデータを分析した。Ｃ５ａ濃度はｎｇ／上清ｍＬとして解析した。
５％ ＮＨＳを使用したアッセイにおいて、Ｈ４Ｈ１２１６６ＰはＣ５ａタンパク質レベルの増加を用量依存性の様式で８．５ｎＭのＩＣ５０で強く遮断したが、アイソタイプコントロール抗体はＣ５ａレベルに対して影響を有していなかった（図１）。最も高い試験されたＨ４Ｈ１２１６６Ｐ濃度（２６７ｎＭ）での最大遮断は、５％血清において最も低い試験されたＨ４Ｈ１２１６６Ｐ濃度（１ｎＭ）で観察された３４ｎｇ／ｍＬ（２．８ｎＭ）と比較して、３．８ｎｇ／ｍＬ（０．３ｎＭ）へのＣ５ａへレベルの約１０倍の減少を生じた。最大遮断について観察されたＣ５ａ濃度は、未処理の５％ＮＨＳにおける２．３ｎｇ／ｍＬ（０．２ｎＭ）のベースラインＣ５ａレベルに近かった。
実施例１０：カニクイザルにおける抗Ｃ５抗体の薬物動態及び薬力学の特徴づけ
この実施例は、雄性カニクイザルにおいて実施された選択された抗Ｃ５抗体の薬物動態（ＰＫ）及び薬力学（ＰＤ）の特徴づけを記載する。内因性Ｃ５レベルを、抗Ｃ５抗体投薬の前に決定し、そして動物投薬群を階層化するために使用した。
カニクイザルにおける総循環Ｃ５レベルを、ヒト補体Ｃ５ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２５９６３）を使用して決定し、これは製造者の推奨に従って行った。サルにおけるＣ５タンパク質の平均濃度は０．８５μｇ／ｍＬ±１９．１７μｇ／ｍＬと決定された。
各抗Ｃ５抗体について、４匹のカニクイザルにそれぞれ単回静脈（ＩＶ）注射を１５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。血液サンプルを投薬前から１６８０時間（７０日）まで各動物から集め、処理して血清にし、そして－８０℃でＰＫ及びＰＤについて分析するまで凍結した。
ＥＬＩＳＡイムノアッセイによる総ＩｇＧ抗体レベル分析
サル血清サンプル中の総抗体濃度を、未検証直接ＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＥＬＩＳＡ手順は、マウス抗ヒトＩｇＧ１／ＩｇＧ４ Ｆｃモノクローナル抗体で被覆されたマイクロタイタープレートを使用した。様々な抗Ｃ５抗体をプレートに加え、そしてプレート上に捕捉された抗Ｃ５抗体を、ビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧ４ Ｆｃモノクローナル抗体、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化されたＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ ＨＲＰ）を使用して検出した。次いでペルオキシダーゼに特異的なルミノールベースの基質を加えて、捕捉された抗Ｃ５抗体の合計濃度に比例するシグナル強度を達成した。較正標準及びそれらのそれぞれの名目濃度の相対的光単位（ＲＬＵ）測定値を、重み付けした４パラメーターロジスティック（４ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｌｏｇｉｓｔｉｃ）式を使用してフィッティングし、抗Ｃ５抗体の濃度及びアッセイの応答関係を記載した較正式を生成した。定量下限（ＬＬＯＱ）はこのアッセイ（２％サル血清）において１．５６ｎｇ／ｍＬであり、そしてそのままのサル血清では７８ｎｇ／ｍＬであった。
ＰＫパラメーターの決定
ＰＫパラメーターを、Ｐｈｏｅｎｉｘ（Ｒ）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｒ）ソフトウェア（バージョン６．４、Ｃｅｒｔａｒａ、Ｌ．Ｐ．）及びＩＶボーラス投薬モデルを使用してノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）により決定した。
全てのＰＫパラメーターは、血清中で観察された最大濃度（Ｃｍａｘ）を含むそれぞれの平均濃度値、観察されたピーク濃度の時間、ｔｍａｘ、及び観察された推定半減期（Ｔ１／２）から誘導された。各抗体について、最後の測定可能な濃度までの濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）及び時間ゼロから無限大まで推定したもの（ＡＵＣｉｎｆ）を、線形補間及び均一重み付けを用いて線形台形規則を使用して決定した。
エクスビボ溶血アッセイによるＰＤ解析
選択された抗Ｃ５抗体の薬力学を、エクスビボ古典的経路及び大体経路溶血アッセイを使用して分析した。
古典的経路溶血アッセイ：ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）をＧＶＢ＋＋緩衝液（ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２を含むゼラチン・ベロナール緩衝液）（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）で洗浄し、そして１ｘ１０＾９細胞／ｍＬで再懸濁させた。ＳＲＢＣを感作するために、合計１ｘ１０＾９／ｍＬのＳＲＢＣを等体積の１：５０希釈ウサギ抗ヒツジ溶血素（１．５ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で２０分間混合した。感作したＳＲＢＣを、溶血アッセイにおける使用前に２ｘ１０＾８細胞／ｍＬにＧＶＢ＋＋緩衝液中で希釈した。カニクイザルからの血液を、ＰＤ解析のために投薬前、並びに投薬の５分、４及び８時間、及び１、２、３、５、７、１０、１４、１８、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３及び７０日後に集めた。血清を製造してさらなる使用まで凍結させた。アッセイの日に、それぞれの時点からのカニクイザル血清をＧＶＢ＋＋緩衝液で１０％に希釈した。丸底９６ウ
ェルプレートを溶血活性を測定するために使用した。合計１００μｌの感作ＳＲＢＣ（２ｘ１０＾８細胞／ｍＬ）を９６ウェルプレートに３７℃でプレーティングし、続いてそれぞれの時点からの１０％カニクイザル血清１００ｕｌを加えた。ＳＲＢＣを穏やかに混合し、そして３７℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション時間の後に、細胞を１２５０ｘｇ、４℃で遠心分離した。合計１００μＬの上清を新しい９６平底プレートに移し、そしてＳｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダーにて４１２ｎｍで読み取った。溶血活性を５％の最終血清濃度で計算した。溶血パーセントを、以下の式を使用することにより吸光度値を用いて計算した：
Figure 2022106952000027
この式において、「バックグラウンド細胞溶解」は、血清を含有しないＧＶＢ＋＋緩衝液のみでインキュベートされたＳＲＢＣからのＡ４１２ｎｍでのＯＤである。「最大細胞溶解」は、水で処理されたＳＲＢＣからのＡ４１２ｎｍでのＯＤである。溶血％で表される結果を、Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて非線形回帰（４パラメーターロジスティクス）を使用して解析してＩＣ５０値を得た。データは平均±平均の標準誤差として表される。
代替経路溶血アッセイ：所望の数のウサギ赤血球（ＲｂＲＢＣ）をＧＶＢ－Ｍｇ２＋／ＥＧＴＡ緩衝液で洗浄し、そして２ｘ１０＾８細胞／ｍＬで再懸濁させた。カニクイザルからの血液を、ＰＤ解析のために投薬前、並びに投薬の５分、４及び８時間、及び１、２、３、５、７、１０、１４、１８、２１、２８、３５、４２、及び４９日後に集めた。血清を製造してさらなる使用まで凍結させた。丸底９６ウェルプレートを溶血活性を測定するために使用した。合計１００μｌのＲｂＲＢＣ（２ｘ１０＾８細胞／ｍＬ）を９６ウェルプレートに３７℃でプレーティングし、続いて上に列挙されるそれぞれの時点からの１０％カニクイザル血清１００ｕｌを加えた。ＲｂＲＢＣを穏やかに混合し、そして３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション時間の後に、細胞を１２５０ｘｇ、４℃で遠心分離した。合計１００μＬの上清を新しい９６平底プレートに移し、そしてＳｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダーにて４１２ｎｍで読み取った。溶血活性を、５％の最終血清濃度について計算し、そして水によるＲＢＣの総溶血のパーセンテージとして表した。溶血パーセントを上記のように計算した。
結果
選択された抗Ｃ５抗体（表１に列挙される）を、初期実験においてカニクイザル及びＣ５ヒト化マウスにおける延長された薬物動態プロフィールについて試験した（実施例１０に記載される）。Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ及びＨ４Ｈ１２１６１Ｐを、延長されたＰＫと共役した高親和性を有するとして選択し、そして本明細書以後の実験において対照薬１及び対照薬２とともに使用した。
カニクイザルにＨ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ、又は対照薬２の単回１５ｍｇ／ｋｇ ＩＶボーラス用量を投与した。総抗体血清濃度及び古典的経路（ＣＰ）溶血活性パーセントを、７０日生存期間の間に１９の時点で決定した。代替経路（ＡＰ）溶血を、５０日生存期間の間に１７の時点で決定した。表２３は全３つの抗体についての平均抗体濃度を要約する。平均総抗体濃度対時間プロフィールを図２に示す。平均ＰＫパラメーターを表２４に記載する。
Figure 2022106952000028
ＩＶボーラス投与後に、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ、及び対照薬２の総ＩｇＧ濃度－時間プロフィールを、生存期間にわたって初期短期間分布相、続いて単一排出相により特徴づけした。ピークＨ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ、及び対照薬２濃度は非常に似ており、全抗体間の対応するＣｍａｘ／用量値は１．１倍以内であった（それぞれ２９．７、３０．４、及び３０．６［（ｕｇ／ｍＬ）／（ｍｇ／ｋｇ）］）（表２４）。
Figure 2022106952000029
濃度－時間プロフィールの評価は、研究７１日目まで終末抗体濃度≧１０μｇ／ｍＬで最も遅い排出を示すことを明らかにした。Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ及び対照薬２の動力学は似ていた；両方ともｍＡｂ濃度≧１０μｇ／ｍＬでそれぞれ２２日及び２９日目までＨ４Ｈ１２１６６Ｐより早い排出を示した。
結果として、用量正規化曝露（ＡＵＣｌａｓｔ／用量）は、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐが３３９日＊（μｇ／ｍＬ）／（ｍｇ／ｋｇ）で最も高い曝露を有していたが、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ及び対照薬２はＨ４Ｈ１２１６６Ｐよりも約２倍低い曝露、それぞれ１５７及び１８７日＊（μｇ／ｍＬ）／（ｍｇ／ｋｇ）を有していた。
排出相の間の計算された抗体半減期（ｔ１／２）は、投薬群にわたって５．５～１５．６日の範囲に及び、そしてまたＨ４Ｈ１２１６６Ｐが対応する最も高いｔ１／２ １５．６日を有する一方でＨ４Ｈ１２１６１Ｐ及び対照薬２はそれぞれ５．５日及び５．９日のｔ１／２値を有していたので、曝露と相関していた。
カニクイザル血清サンプルからの抗Ｃ５抗体の薬理効果を、感作ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）の補体古典的経路（ＣＰ）溶血及びウサギ赤血球（ＲｂＲＢＣ）の代替経路（ＡＰ）
溶血によりエクスビボで決定した。溶血活性の阻害を５％の最終血清濃度について計算し、そして水によるＲＢＣの総溶血のパーセンテージとして表した。表２５は、平均溶血パーセントにより決定された３つの抗体のエクスビボ活性を要約する。
Figure 2022106952000030
表２５及び図２に示されるように、ＰＤ効果を、７０日目まで補体ＣＰ（１０分インキュベーション）により測定した。Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐは３５日までＣＰ溶血活性の９５％より多くを遮断した。活性は７０日までに試験前の最大溶血レベルに戻った。対照薬２は１０日目までＣＰ溶血活性の約９５％を遮断し、そして活性は１８日目までに試験前最大溶血レベルまで急速に戻った。
ＰＤ効果も４９日目まで補体ＡＰ経路（６０分インキュベーション）溶血アッセイにより測定した。表２５及び図３に示されるように、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐは１８日まで総ＡＰ溶血活性の８０％を遮断し、そして活性は５９日目までに試験前最大溶血レベルに戻った。Ｈ４Ｈ１２１６Ｐ及び対照薬２は７日目までＡＰ溶血活性の９０％を遮断し、そして活
性は２１日目までに試験前最大溶血レベルに戻った。
実施例１１：Ｃ５ヒト化マウスにおける抗Ｃ５抗体のＰＫ／ＰＤの特徴づけ
この実験セットにおいて、選択された抗Ｃ５抗体の薬物動態及び薬力学を、Ｖｅｌｏｃｉｇｅｎｅ（Ｒ）技術（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ ２００３、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２－６５９）を使用してヒトＣ５タンパク質を発現するようにヒト化されたマウスにおいて評価した。ヒト化マウスを、マウスＣ５遺伝子のエクソン２からエクソン４１をヒトＣ５遺伝子のエクソン２～４２と置き換えるように操作した（米国特許出願公開２０１５／０３１３１９４（本明細書のその全体として加入される）に開示される）。
総循環ヒトＣ５レベルを、製造者の推奨に従って行われたヒト補体Ｃ５ ＥＬＩＳＡ （Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２５９６３）を使用して決定した。
血清中の総薬物レベルのＥＬＩＳＡによる決定
Ｃ５結合及び未結合の両方の循環抗Ｃ５抗体濃度を、総ヒト抗体分析によりＥＬＩＳＡを使用して決定した。手短には、ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体をＰＢＳ中１μｇ／ｍＬで９６ウェルプレートに終夜固定化した；プレートを洗浄して未結合のＩｇＧを除去し、ついで５％ＢＳＡでブロッキングした。抗Ｃ５抗体含有血清サンプルの段階希釈（６点）及びそれぞれの抗体の参照標準（１２点）を、抗ヒトＩｇＧ被覆プレートに移し、そして１時間インキュベートした。ついでプレートに結合した抗Ｃ５抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を使用して検出した。製造者の推薦するプロトコルに従ってプレートをＴＭＢ基質で現像し、そして４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）のシグナルを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４マルチモードプレートリーダーを使用して記録した。血清中の抗Ｃ５抗体濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して生成された参照標準較正曲線に基づいて計算した。
ＰＫパラメーターの決定
ＰＫパラメーターを、Ｐｈｏｅｎｉｘ（Ｒ）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｒ）ソフトウェア（バージョン６．３、Ｃｅｒｔａｒａ、Ｌ．Ｐ．）及び血管外投薬モデルを使用してノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）により決定した。各抗体についてのそれぞれの平均濃度を使用して、観察された推定半減期（ｔ１／２）を含めて全てのＰＫパラメーター、及び最後の測定可能な濃度までの濃度対時間曲線下の面積（ＡＵＣｌａｓｔ）を、線形補間及び均一重み付けを使用して決定した。
溶血アッセイによるＰＤ解析
選択された抗Ｃ５抗体の薬力学を、古典的経路補体溶血アッセイを使用して決定した。ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）（オルシーバー液中のヒツジ血液）をＧＶＢ＋＋緩衝液（ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２を含むゼラチンベロナール緩衝液）（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）で洗浄し、そして１ｘ１０＾９細胞／ｍＬで再懸濁させた。感作するために、１ｘ１０＾９／ｍＬのＳＲＢＣを等体積の１：５０希釈されたウサギ抗ヒツジ溶血素（１．５ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で２０分間混合した。感作したＳＲＢＣを２ｘ１０＾８細胞／ｍＬにＧＶＢ＋＋中で溶血アッセイの前に希釈した。投与前動物又は投薬後１０、２０、３０、４０及び５０日目に集められた抗Ｃ５抗体を投与されたヒト化Ｃ５マウスからの血清サンプルを、ＧＶＢ＋＋緩衝液で２０％に希釈した。感作ＳＲＢＣ合計１００μｌ（２ｘ１０＾８細胞／ｍＬ）を９６ウェル丸底プレート中に３７℃でプレーティングし、続いて１６０～１８０μｇ／ｍＬヒト補体３（ｈｕＣ３）タンパク質を追加された２０％血清１００μｌを加えた。細胞を穏やかに混合し、そして３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞を１２５０ｘｇで４℃にて遠心分離した。上清合計１
００μＬを新しい９６平底プレートに移し、そしてＡ４１２ｎｍでＳｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダーで読み取った。溶血パーセントを吸光度値を用いて以下の式を使用することにより計算した：
Figure 2022106952000031
この式において、「バックグラウンド細胞溶解」は、血清を含有しないＧＶＢ＋＋緩衝液のみでインキュベートされたＳＲＢＣからのＡ４１２ｎｍでのＯＤである。「最大細胞溶解」は、水で処理されたＳＲＢＣからのＡ４１２ｎｍでのＯＤである。溶血％で表される結果を、Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて非線形回帰（４パラメーターロジスティクス）を使用して解析してＩＣ５０値を得た。データは平均±平均の標準誤差として表される。
実験１
この実験において、例となる抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐの薬物動態及び薬力学を、ヒト化Ｃ５マウスにおける対照薬１及び対照薬２と比較して評価した。総循環ヒトＣ５レベルを、製造者の推奨に従って行われたヒト補体Ｃ５ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２５９６３）を使用して決定した。マウスにおけるヒトＣ５の平均濃度を３９．７３μｇ／ｍＬ±１７．８２μｇ／ｍＬと決定した。雄性（５５．４±１．７μｇ／ｍｌ、ｎ＝４７）マウスと雌性（２４．７±０．６μｇ／ｍｌ、ｎ＝４９）マウスとの間に差異があった。
抗体投薬前に、雄性及び雌性ヒト化Ｃ５マウスを、平均４０μｇ／ｍＬのヒトＣ５レベルに従って階層化した。各抗Ｃ５抗体について、２２匹のマウスのコホートに単回１５ｍｇ／ｋｇ用量のＨ４Ｈ１２１６６Ｐ、対照薬１又は対照薬２を皮下（ｓ．ｃ．）注射により投与した。全てのマウスはＰＫ分析のために投薬前及び注射後１日に失血した。さらに、注射の１０、２０、３０、４０及び５０日後に、各コホートからの４又は５匹のマウスのグループを安楽死させ、そして終末血をＰＫ及びＰＤ分析のために集めた。１日目の血清サンプルは、２２匹のマウスのコホート全体の平均であった。血液を処理して血清にし、そして－８０℃で分析されるまで凍結した。
生存期間の５０日にわたって、総抗体濃度を７つの時点で決定し、そして溶血活性パーセントを６つの時点で決定した。総抗Ｃ５抗体濃度を表２６にまとめる。平均総抗体濃度対時間プロフィールを図４に示す。平均ＰＫパラメーターを表２７に記載する。
Figure 2022106952000032
Figure 2022106952000033
１日目の平均濃度対時間プロフィールは、３つの抗体、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、対照薬１及び対照薬２がそれぞれ１７８、２２９及び１６４μｇ／ｍＬの同様の血清濃度を有していたことを示す。対照薬１は、３０日目までＨ４Ｈ１２１６６Ｐと同様の排出プロフィールを有していたが、４０日目及び５０日目に、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐに対してクリアランスの急速な増加を示した。５０日目に、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐは約９μｇ／ｍＬの平均抗体血清濃度を有していたが、対照薬１及び対照薬２は両方とも、０．３μｇ／ｍＬという３０倍低い平均抗体血清濃度を有していた。対照薬２は試験された３つの抗体のうち最も低い曝露を有し、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ（２８０１日μｇ／ｍＬ）及び対照薬１（２７０８日μｇ／ｍＬ）と比較して約２倍低いＡＵＣｌａｓｔ（１４０８日μｇ／ｍＬ）であった。
ヒトＣ３を追加したヒト化Ｃ５マウス血清サンプルからの抗Ｃ５抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、対照薬１及び対照薬２の薬理効果を５０日目まで測定し、そして感作ＳＲＢＣの補体古典的経路（ＣＰ）溶血によりエクスビボで決定した。各抗Ｃ５抗体についての平均溶血パーセントを表２８にまとめ、そして平均溶血パーセント対時間プロフィールを図５に示す。
Figure 2022106952000034
Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、対照薬１及び対照薬２は、終末補体溶血活性を阻害し、これは抗体曝露と相関しているようであった。Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐは３０日目まで溶血活性を８５％より多く遮断し、活性は５０日目までに投薬前ベースラインレベルまで戻った。対照薬１及び対照薬２はそれぞれ２０日目及び１０日目まで約８０％溶血活性を遮断し、活性は両方について３０日目までにベースラインに戻った。
実験２
この実験において、抗Ｃ５抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ、対照薬１、及びアイソタイプコントロールの薬物動態及び薬力学を、ヒト化Ｃ５マウス（ヒトＣ５発現についてホモ接合性のマウス）において評価した。総循環Ｃ５レベルを、製造者の推奨に従って行われたヒト補体Ｃ５ ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２５９６３）を使用して決定した。マウスにおけるヒトＣ５の平均濃度は、４８．９８μｇ／ｍＬ±１５．１μｇ／ｍＬと決定された。
抗体投薬の前に、ヒト化雄性及び雌性Ｃ５マウスを、ヒトＣ５レベルに従って階層化し、これは平均５０μｇ／ｍＬであった。各抗Ｃ５ ｍＡｂについて５匹のマウスのコホートに、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ、対照薬１又はアイソタイプコントロールの単回１５ｍｇ／ｋｇ皮下（ｓ．ｃ．）注射を投与した。全てのマウスは、ＰＫ分析のために、投薬前、注射の６時間、１、２、３、４、７、１０、１３、２１、３０及び４５日後に出血した。さらに、５９日目に、各コホートからの全てのマウスを安楽死させ、そして終末血をＰＫ及びＰＤ分析のために集めた。血液を処理して血清とし、分析されるまで－８０℃で凍結した。
５９日の生存期間の間に総抗体濃度を１２の時点で決定し、そして溶血活性パーセントを１つの時点で決定した。各抗Ｃ５抗体についての総血清抗体濃度を表２９にまとめる。平均総抗体濃度対時間プロフィールを図６に示す。平均ＰＫパラメーターを表３０に記載する。
Figure 2022106952000035
Figure 2022106952000036
平均濃度対時間プロフィールは、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ、対照薬１及びアイソタイプコントロールが、それぞれ１．３倍以内の同様のＣｍａｘ値（１７８、２２５、１８３及び２２１）μｇ／ｍＬで１～３日目に最大血清濃度（Ｃｍａｘ）に達したことを示す。Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ及びアイソタイプコントロールは類似した排出プロフィールを有し、残留薬物レベルは５９日目に約４μｇ／ｍＬであった。Ｈ４Ｈ１２１６１ＰはＨ４Ｈ１２１６６Ｐ及びアイソタイプコントロールよりも速いクリアランスを示したが、対照薬１よりもゆっくりと除去された。５９日目に、Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐは平均血清薬物レベル０．６μｇ／ｍＬを有していたが、対照薬１は０．０８μｇ／ｍＬというほぼ
検出不可能な薬物レベルであった。
アイソタイプコントロール、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ及びＨ４Ｈ１２１６１Ｐは、１．３倍以内の同様の曝露（ＡＵＣｌａｓｔ）値（それぞれ４０８０、３４９０及び３０４０日μｇ／ｍＬ）を示したが、対照薬１は、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐと比較して１．６倍低い曝露（２２４０日μｇ／ｍＬ）を示した。
実施例１２：総ヒトＣ５の濃度を決定するためのＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳベースのアッセイ
この実施例において、総ヒトＣ５の血清濃度を、抗Ｃ５抗体Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐの薬物動態／薬力学試験において多重反応モニタリング質量分析と連結された液体クロマトグラフィー（ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ）法を使用して決定した。
総ヒトＣ５の血清濃度を、Ｃ５の代理としてＣ５配列に含有される１０アミノ酸ペプチドＬＱＧＴＬＰＶＥＡＲ（配列番号３５９のアミノ酸（ａａ）１１２９～１１３８）の濃度を測定することにより決定した。理論的には、この方法はＣ５分裂産物Ｃ５ｂも検出し得る。しかし、遊離Ｃ５ｂの不安定性のために、血清中のＣ５ｂの濃度は一般的に低く、Ｃ５ｂの大部分はＭＡＣ複合体の形態で細胞表面に結合している（Ｃｏｏｐｅｒ ＆ Ｍｕｌｌｅｒ－Ｅｂｅｒｈａｒｄ １９７０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：７７５－９３；Ｈａｄｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ ２０１２、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１：２００－７）。従って、ここで分析される処理された血清サンプルは、もしあれば無視できる量のＣ５ｂ生成物だけ含有する可能性がある。
方法
ＰＫ／ＰＤ研究のために、マウスにＨ４Ｈ１２１６６Ｐの単回１５ｍｇ／ｋｇ用量を皮下（ｓ．ｃ．）注射により投与した。全てのマウスは、ＰＫ分析のために投薬前及び注射後１日目に出血した。さらに、注射の１０、２０、３０、４０、５０及び６０日後に、マウスを安楽死させて、ＰＫ及びＰＤ分析のために終末血を集めた。
ヒトＣ５を較正のための参照標準として使用し；そしてＣ末端安定同位体標識アルギニン残基を有する製造されたヒトＣ５ペプチドを内部標準として使用した（ＬＱＧＴＬＰＶＥＡＲ－１３Ｃ６ １５Ｎ４）。マウスＣ５遺伝子が削除されている（Ｃ５－／－）社内で生成されたＣ５ノックアウトマウスからの血清において参照標準を３．９～２５０μｇ／ｍＬ（１：２段階希釈）の範囲に及ぶ濃度で使用した。Ｃ５－／－マウスからの血清をネガティブコントロール（ブランク）としても使用した。較正標準、ブランク、及び試験血清サンプル（それぞれ１０μＬ）を乾燥させ、ついで８Ｍ尿素／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）緩衝液１００μＬ中３７℃で１時間変性させた。次に、２５ｎＭ内部標準１０μＬを全てのサンプルに加えた。サンプルを、２－ヨードアセトアミド１０ｍＭで室温にて３０分間アルキル化し、そして５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを使用して最終体積５００μＬに希釈した。ついでサンプルをトリプシン（１：２０質量／質量）により終夜３７℃で消化した。Ｃ５由来のトリプシンペプチドＬＱＧＴＬＰＶＥＡＲを検出し、そしてＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ ＴＱ－ＳをＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステムとともに使用するＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳにより定量した。処理された各サンプル（１０μＬ）を予め平衡化されたＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラムに注入した。流量は０．６ｍＬ／分であった（移動相Ａ：水：ギ酸／１００：０．１［体積：体積］及び移動相Ｂ：アセトニトリル：ギ酸／１００：０．１［体積：体積］）。保持時間及びピーク面積をＭａｓｓｌｙｎｘ Ａｎａｌｙｓｔデータソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して決定した。内部標準（安定同位体標識Ｃ５ペプチド）に対するＣ５参照標準（ｈＣ５のトリプシン消化により生成された未標識Ｃ５ペプチドＬＱＧＴＬＰＶＥＡＲ－１２Ｃ６ １４Ｎ４）のピーク面積比を、Ｃ５参照標準の名目濃度に対してプロットすることにより構築された較正曲線からＣ５検体の濃度を計算した。濃度を線形回帰を
使用して計算した。Ｃ５参照標準の最も低い濃度（３．９μｇ／ｍＬ）はアッセイのダイナミックレンジ内であり、そしてアッセイのＬＬＯＱと定義された。
結果
血清中の総ヒトＣ５濃度を、投薬する前に尾出血を介して（投薬前）及び１０、３０及び３５日目に終末血を介して、対応する動物から集めたサンプルについて評価した。投薬の１０、３０、及び３５日後にＨ４Ｈ１２１６６Ｐ投薬後の総ｈＣ５濃度は、投薬前レベルと類似していた（約１～０．９倍以内）。観察された少量の差異は、ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用したＭａｎｎ-Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により評価して統計
的に有意ではなかった。Ｃ５／Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐモル比の分析は、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐが投薬後３５日目までＣ５のモル過剰のままであるということを実証した（表３１）。
Figure 2022106952000037
実施例１３：水素／重水素交換によるＣ５へのＨ４Ｈ１２１６６Ｐ結合のエピトープマッピング
Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐが相互作用するｈＣ５［（配列番号３５９のアミノ酸Ｍ１－Ｃ１６７６）のアミノ酸残基を決定するために、質量分析を用いたＨ／Ｄ交換エピトープマッピングを行った。Ｈ／Ｄ交換法の一般的な説明は、例えば、Ｅｈｒｉｎｇ （１９９９） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９；及びＥｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （２００１） Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａに示される。
重水素標識のためのＬｅａｐｔｅｃ ＨＤＸ ＰＡＬシステム、サンプル消化及びローディングのためのＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－クラス（補助溶媒マネージャー）、分析カラムグラジエントのためのＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｍ－クラス（μＢｉｎａｒｙ溶媒マネージャー）、並びに消化ペプチド質量測定のためのＳｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ質量分光計からなる一体化ＨＤＸ／ＭＳプラットフォームでＨＤＸ－ＭＳ実験を行
った。
標識化溶液をＤ２Ｏ中１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液でｐＤ ７．０（ｐＨ ６．６に等しい）にて製造した重水素標識のために、Ｃ５ ３．８μＬ（６ ｐｍｏｌ／μＬ）又は１：１モル比で抗体と予め混合されたＣ５を、５６．２μＬ Ｄ２Ｏ標識化溶液と様々な時点でインキュベートした（例えば、非重水素化コントロール＝０秒、１分間及び２０分間標識）。重水素化をサンプル５０μＬを、予め冷却したクエンチ緩衝液５０μＬ（０．２Ｍ
ＴＣＥＰ、１００ｍＭリン酸緩衝液中６Ｍ塩化グアニジン、ｐＨ ２．５）を移すことによりクエンチし、そして混合したサンプルを１．０℃で２分間インキュベートした。次いで、クエンチしたサンプルをＷａｔｅｒｓ ＨＤＸマネージャーにオンラインペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化のために注入した。消化されたペプチドをＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７－μｍ、２．１ × ５ ｍｍ ＶａｎＧｕａｒｄプレカラム上に０℃で捕捉し、そして分析カラムＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７－μｍ、１．０×５０ｍｍに５％～４０％ Ｂ （移動相Ａ：水中０．１％ギ酸、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸）へ９分間グラジエント分離のために溶出した。質量分析計を、コーン電圧３７Ｖ、スキャン時間０．５秒、及び質量／電荷範囲５０～１７００ Ｔｈｏｍｓｏｎ単位（Ｔｈ）に設定した。
ヒトＣ５からのペプチドの同定のために、非重水素化サンプルからのＬＣ－ＭＳＥデータを処理し、そしてヒトＣ５、ペプシン、及びそれらの無作為化配列を含むデータベースに対してＷａｔｅｒｓ ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘグローバルサーバー（ＰＬＧＳ）ソフトウェアを介して検索した同定されたペプチドをＤｙｎａｍＸソフトウェアにインポートし、そして２つの基準でフィルタリングした：（１）＝アミノ酸あたりの最小生成物＝０．３及び（２）反復ファイル閾値＝３。次いでＤｙｎａｍＸソフトウェアは、各時点に３つの複製を有する多数の時点にわって保持時間及び高質量精度（＜１０ｐｐｍ）に基づいて各ペプチドの重水素取り込みを自動的に決定した。
ＭＳＥデータ取得と連結されたオンラインペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩカラムを使用して、ヒトＣ５からの合計１８９のペプチドを抗体の存在しない場合又は存在下で同定し、６２％配列範囲を表した。５つのペプチドは、Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐに結合した場合に有意に減少した重水素取り込みを有しており（重心（Ｃｅｎｔｒｏｉｄ）デルタ値＞０．９ダルトン、ｐ値＜０．０５）、これは表３２に示される。
Figure 2022106952000038
記録されたペプチド質量は、３つの複製からの重心ＭＨ＋質量の平均値に対応する。アミノ酸５９１～５９９及び７７５～７９４に対応するこれらのペプチドは、Ｈ４Ｈ１２１
６６Ｐに結合するとより遅い重水素化速度を有していた。これらの同定された残基は、ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０１０３１ （ＣＯ５＿ＨＵＭＡＮ；配列番号３５９）により定義されるヒトＣ５の残基５９１～５９９及び７７５～７９４にも対応する。
実施例１４：マウスにおける実験的自己免疫ぶどう膜炎における眼炎症に対する抗Ｃ５抗体の効果
本試験は、実験的自己免疫ぶどう膜炎（ＥＡＵ）におけるＣ５の役割を評価するために始められた。遺伝的［Ｃ５ノックアウト（ＫＯ）、Ｃ３／Ｃ５二重ＫＯマウス］、及び薬理的（抗Ｃ５抗体）の両方の実験アプローチを使用した。
方法
成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝２５、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ）、Ｃ５ ＫＯ（ｎ＝１３）及びＣ３／Ｃ５ ＫＯ（ｎ＝８）マウス（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）を使用した。完全フロイントアジュバントでのヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質ペプチド（ＩＲＢＰ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ）の皮下注射及び百日咳毒素の腹腔内注射によりＥＡＵを誘導した。抗マウスＣ５ ｍＡｂ又はアイソタイプコントロールｍＡｂを、５日目から２８日目まで３日ごとに皮下注射により投与した。この試験において使用した抗Ｃ５抗体（Ｍ１Ｍ１７６２８Ｎ）は配列番号３６２／３６３のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含んでいた。ＳＰＥＣＴＲＡＬＩＳ（Ｒ） ＨＲＡ＋ＯＣＴ （Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｉｎｃ．）を使用して、－１、７、１４、２１及び２８日目の炎症レベルを評価した。全ての動物を２８日目に眼及び血液収集のために安楽死させた。ヒトＣ３を用いるか又は用いない溶血アッセイを、補体阻害を実証するために行った。データをＡＮＯＶＡにより分析した。
結果
野生型マウスと比較して、炎症発生（３０～５０％）及び硝子体細胞クラスター数はＣ５ ＫＯマウスにおいて有意に減少した（ｐ＜０．０１）。Ｃ５ ＫＯマウスにおける光干渉断層撮影（ＯＣＴ）スコアもまた３週目に５０％有意に減少した（ｐ＜０．０００１）。興味深いことに、Ｃ３／Ｃ５二重ＫＯマウスにおいて、野生型マウスと比較して、２８日目に有意により多くの硝子体細胞クラスター及びより高い疾患スコアがあった（ｐ＜０．０５）。抗ｍＣ５ Ａｂ（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与された動物において、炎症発生率及び硝子体細胞クラスターは、２１日目に未処置又はアイソタイプコントロール群のいずれかと比較して有意に低かった（ｐ＜０．０１）。３週及び４週目に、抗Ｃ５抗体処置群におけるＯＣＴスコアは、未処置又はアイソタイプコントロールと比較して有意に低かった（ｐ＜０．０００１）。（図７） ヒトＣ３を用いるか又は用いない溶血アッセイにより、４週目に抗Ｃ５抗体の阻害効果を確認した（図８）。
結論
ＥＡＵに起因する眼の炎症は、遺伝的欠損又は特異的抗Ｃ５抗体を用いた薬理的阻害のいずれかによりＣ５活性を阻害することにより軽減された。Ｃ５欠乏はＥＡＵの発生を遅らせ、そしてＯＣＴ疾患スコアを減少させた。これらの結果は、Ｃ５が自己免疫ぶどう膜炎についての可能性のある治療標的であることを示す。抗Ｃ５抗体は、野生型マウスにおいてＥＡＵ疾患に対する保護効果を有する。我々の知見もまた、Ｃ３がマウスにおけるＥＡＵ疾患に有益であり得るということを示唆する。
実施例１５：実験的自己免疫ぶどう膜炎に対する抗ヒトＣ５抗体の効果
この実施例は、実験的自己免疫ぶどう膜炎（ＥＡＵ）のマウスモデルにおいてヒトＣ５に対する抗Ｃ５抗体の効果を記載する。この試験に使用されたマウスは、Ｖｅｌｏｃｉｇｅｎｅ（Ｒ）技術（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ ２００３、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２－６５９）を使用してヒトＣ５タンパク質を発現するようにヒ
ト化された。ヒト化マウスを、マウスＣ５遺伝子のエクソン２～エクソン４１をヒトＣ５遺伝子のエクソン２～４２で置き換えるように操作した（米国特許出願公開第２０１５／０３１３１９４号（その全体として本明細書に加入される）に開示される）。
方法
成体雄性マウスを、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）株Ｈ３７ＲＡを２．５ｍｇ／ｍｌまで追加したＣＦＡの０．２ｍｌエマルションでヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）ペプチド１～２０（ＧＰＴＨＬＦＱＰＳＬＶＬＤＭＡＫＶＬＬＤ）（配列番号３６４）（Ａｖｉｃｈｅｚｅｒ ｅｔ ａｌ ２０００、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４１：１２７－１３１）１５０μｇを皮下で免疫した。次いで、免疫応答のＴｈ１極性化を促進することにより細胞媒介自己免疫の誘導を容易にするために、百日咳毒素（ＰＴＸ）１．０μｇをマウスに腹腔内接種した（Ｔｈｕｒａｕ ｅｔ ａｌ １９９７、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９：３７０－３７６；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ
ａｌ １９９９、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０：２８９８－２９０５）。動物の体重を週に２回モニタリングした。
眼の試験を－１日目、ＥＡＵ誘導前、並びに７、１４、２１及び２８日目に行った。マウスをケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）で麻酔した。トロピカミドの０．５％点眼液を使用して瞳孔を散大させ、そして眼底カメラを備えたコンタクトレンズを使用してＳｐｅｃｔｒａｌｉｓ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ網膜血管造影プラットフォーム（ＨＲＡ）＋ＯＣＴシステム（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）において試験した。
Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ＋ＯＣＴシステム（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ））でＯＣＴ機能を使用して各眼について一連の６１の側方光学断面を得た。ＯＣＴ画像化領域を、視神経円板の中心にして視神経乳頭の上下の等しい画像化を可能にした。網膜の厚さをＲＰＥ層の下部から眼の内境界膜まで間の距離として測定した。視神経円板から１５００μｍを測定し、そして４つの異なる網膜の四分円（例えば、上方、下方、側方及び鼻側）からの値を、眼の平均網膜厚のために平均した。
硝子体への炎症性細胞浸潤の重症度も、眼ごとに視神経を横断する４つの側方ＯＣＴスキャンにおいて硝子体における炎症細胞クラスターの平均数を評価することによりＯＣＴ画像において等級付した。
ＯＣＴ画像における疾患重症度の評価のために４点スケールを開発した（ＯＣＴスコア）（表３３）。
Figure 2022106952000039
統計解析
パラメーターデータについての統計解析（体重、硝子体における炎症細胞クラスター、及び網膜厚）を、片側ＡＮＯＶＡ検定及びＴｕｋｅｙの多重比較検定により行った。ノンパラメトリックデータについて（ＯＣＴスコア及び組織学スコア）、クラスカル－ウォリス検定及びダン検定によりＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ｄソフトウェアを用いてアイソタイプコントロール又は未処置群と比較して行った。データは平均値±ＳＥＭを示す。０．０５未満のｐ値を統計的に有意とみなした。
結果
第一の試験において（試験Ａ）、マウスをアイソタイプコントロール抗体（５０ｍｇ／ｋｇ）、又はＨ４Ｈ１２１７０Ｐ １０ｍｇ／ｋｇ若しくは５０ｍｇ／ｋｇで５日目から３日ごとに皮下処置した。１０ｍｇ／ｋｇ Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐを用いた処置は、炎症及び網膜損傷の減少を生じた（図９）。１０ｍｇ／ｋｇ Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐで処置されたマウスはまた、２１日目及び２８日目にＯＣＴスコアの統計的に有意な減少も示した（図１０）。
第二の試験において（試験Ｂ）、アイソタイプコントロール（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｈ４
Ｈ１２１６６Ｐ ３ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇ、又は対照薬２（本明細書の実施例２；「以下の実施例において使用された対照構築物」を参照のこと）のいずれかを用いて６日目から３日ごとにマウスを皮下処置した。３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのいずれかでのＨ４Ｈ１２１６６Ｐを用いた処置は、１４日目から２８日目に統計的に有意であるＯＣＴスコアの用量関連減少を生じた（図１１）。Ｃ５ヒト化マウスにおいてＥＡＵ誘導の６日後に開始した１０ｍｇ／ｋｇ Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐを用いた処置は、１４日目～２８日目に得られたＯＣＴにより決定して炎症及び網膜損傷の用量関連減少を生じた（図１２）。
両方の試験について、非侵襲性のＯＣＴによる生存中評価は、ＩＲＢＰを用いた免疫後の対照マウスにおいて進行性の炎症の発生、増加した網膜厚及び形態異常を示した。
結論
これらの実験は、Ｃ５が自己免疫ぶどう膜炎の病理において役割を果たすというさらなる薬理学的証拠を提供する。完全ヒト抗ヒトＣ５抗体の薬理的欠乏は、ＥＡＵ発生を遅らせ、そして疾患重症度減少し、自己免疫ぶどう膜炎におけるこれらの抗体の有効性を確立する。
実施例１６：腎虚血－再灌流傷害に対する抗Ｃ５抗体の効果
本試験は、腎虚血－再灌流傷害におけるＣ５の役割を評価するために行われた。遺伝的（Ｃ３ノックアウト及びＣ５ノックアウトマウスを使用する）及び薬理的アプローチ（抗Ｃ５抗体を使用する）の両方を使用した。虚血－再灌流モデルを、４５分間両側腎茎をクランプし、続いて４８時間の再灌流により誘導した。偽開腹が対照としての役目を果たした。抗Ｃ５抗体を５０ｍｇ／ｋｇで静脈内に単回用量として虚血直後に（治療的）；又は２回用量として、－１日目及び１日目の手術時に皮下投与した（予防的）。この試験に使用した抗Ｃ５抗体は、配列番号３６２／３６３のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＭ１Ｍ１７６２８Ｎであった。血中尿素窒素（ＢＵＮ）及び血清クレアチニンマーカーを、マウスにおける疾患及び保護のレベルを評価するために使用した。
Figure 2022106952000040
Figure 2022106952000041
野生型マウスと比較して、Ｃ３及びＣ５ノックアウトマウスは、血中尿素窒素及び血清クレアチニンレベルの減少により証明されるように、急性腎臓傷害のＲＩＲＩモデルにおいて有意な機能的保護を示した。抗Ｃ５抗体は、予防的及び治療的の両方の様式でＲＩＲＩモデルにおいて機能的保護を示した（表３４～３５）。
実施例１７：ループス腎炎に対する抗Ｃ５抗体の効果
この実施例は、マウスモデルにおいてループス腎炎を処置する際の抗Ｃ５抗体の有効性を記載する。
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己抗原に対する忍容性の喪失、自己抗体の産生及び損傷組織における補体結合免疫複合体（ＩＣ）の沈着により引き起こされる自己免疫障害である。ＳＬＥは広範囲の臨床症状及び標的器官を特徴とし、ループス腎炎は最も深刻な合併症の１つである。ループス腎炎患者の腎臓における補体活性化は、炎症及び組織損傷に寄与する。ループス腎炎の処置における抗Ｃ５抗体の有効性を、ループス腎炎の自然発症マウスモデルであるＮＺＢＷＦ１マウスにおいて調べた（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ
１９９６、ＰＮＡＳ）。マウスは、ヒトＳＬＥに似た自己免疫疾患、核内抗原に対する自己抗体及び細胞膜タンパク質、高ガンマグロブリン血症、アルブミン尿、タンパク尿を発症し、免疫複合体糸球体腎炎を引き起こし、そして３５～５０週齢で腎不全及び終末期腎疾患で死亡する。
この試験のために、２５週齢ＮＺＢＷＦ１マウスを、３０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプコントロール、又は抗Ｃ５抗体で週に２回８週間、続いて週に３回１０週間皮下処置した。この試験のために使用した抗マウスＣ５抗体は、それぞれ配列番号３６２／３６３及び３６５／３６６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含むＭ１Ｍ１７６２８Ｎ及びＭ１Ｍ１７６２７Ｎであった。
抗Ｃ５抗体での処置はマウスにおいて生存率を有意に改善した（図１３）。両方の抗体が、処置の８～１４週目にアルブミン尿（図１４）、及び処置の１２～１６週目に血中尿素窒素（図１５）を改善した。
実施例１８：星状細胞細胞死に対する抗Ｃ５抗体の効果
視神経脊髄炎（ＮＭＯ）は、主に視神経及び脊髄に影響を及ぼす中枢神経系（ＣＮＳ）の自己免疫疾患である。ＮＭＯにおいて、抗アクアポリン４自己抗体（ＡＱＰ４－Ａｂ）は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を活性化することにより正常細胞への損傷を引き起こす。この試験の目標は、ＮＭＯ進行における補体系の役割、及びＮＭＯのための可能性のある治療的処置としての補体に対する抗体の使用を評価することであった。
初代ラット皮質星状細胞を生後ラット仔の大脳皮質から得て、ＡＱＰ４－Ａｂ（米国特許出願公開２０１４／０１７０１４０号からの抗体「ｒＡｂ－５３」；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ ２００９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６６：６１７－６２９）及び補体タンパク質とともに培養し、細胞媒介細胞傷害を実証した。次いで星状細胞破壊の遮断を実証するために抗Ｃ５抗体を加えて実験を繰り返した。
細胞死を定量するために、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ発光細胞傷害アッセイを行った。このアッセイは様々な濃度の抗Ｃ５抗体（０．００１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、又は１０００μｇ／ｍｌ）又はアイソタイプコントロール抗体を使用した。
抗Ｃ５抗体がＡＱＰ４－Ａｂ誘導ＣＤＣを遮断することができるかどうかを決定するために、星状細胞をプレーティングし、そしてそのプレーティングに最適なＡＱＰ４－Ａｂの用量を発見するためにＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ細胞傷害アッセイを繰り返した。ＡＱＰ４－Ａｂ最適濃度は５０μｇ／ｍＬであることがわかり、そして以下の実験では、一定用量のＡＱＰ４－Ａｂ（５０μｇ／ｍＬ）を使用しながら抗Ｃ５抗体の用量を変化させた。図１６に示されるように、抗Ｃ５抗体の量を増加させるにつれてＲＬＵの減少が見られ（平均３００ｋから平均１００ｋ）、抗Ｃ５抗体が星状細胞細胞死を遮断することを実証した。両方の実験について、ＲＬＵはアイソタイプコントロール抗体では変化しなかった。図１６に示されるように、抗Ｃ５抗体はＡＱＰ４ Ａｂ誘導細胞傷害を初代皮質星状細胞において１５～１７ｎＭのＩＣ５０で阻害した。
その後の試験において、ＣＮＳにおける星状細胞の補体媒介細胞傷害に対する治療有効性を評価するために抗ＡＱＰ４抗体及び抗Ｃ５抗体をラット脳に注入する。
実施例１９：内皮アッセイ
この実施例は、抗Ｃ５抗体がＣ５ｂ－９及びＣ３沈着を遮断するかどうかを調べるためのインビトロ糸球体内皮アッセイを記載する。
補体活性化に対する薬物候補の阻害効果を評価するための再現可能な方法が全臨床開発に必須である。補体活性化経路の複雑性に起因して、アッセイは所定の治療適応症に適切な細胞及び評価項目を使用するべきである。ここでは、不死化ヒト糸球体内皮細胞株（ＨＧＥＣ）を使用して、補体Ｃ３及びＣ５沈着モデルを抗Ｃ３又はＣ５ｍＡｂの遮断活性を評価する使用について実証した。
方法
ヒト初代腎臓糸球体内皮細胞（ＨＧＥＣ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を完全培地中でコラーゲンＩ被覆黒色透明底９６ウェルプレートに終夜プレーティングした。細胞をＰＢＳ（対照）で処理するか又は１０ｕＭ ＡＤＰで１０分間活性化した。ＰＢＳ洗浄後に、５０％ヒト血清（補体保存、Ｃ３欠乏、又はＣ５欠乏）を４時間加えた。抗Ｃ５抗体を処置前に１ｍｇ／ｍＬで血清に加えた。細胞を洗浄し、固定化し、そして抗Ｃ３ｂ抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）及び／又は抗Ｃ５ｂ－９抗体（Ａｂｃａｍ）、二次抗体を用いて調べ、そしてＤＡＰＩを用いて対比染色した。画像をＩｍａｇＥｘｐｒｅｓｓで記録し、そしてハイコンテンツ画像解析を使用して各画像について蛍光染色を定量し、そして条件ごとに平均した。
結果
Ｃ３及びＣ５ｂ－９沈着が正常ヒト血清に曝露されたＡＤＰ活性化ＨＧＥＣで観察されたが、非活性化ＨＧＥＣでは観察されなかった（Ｃ３：１．５ｘ１０７±１．０ｘ１０７
；Ｃ５：７．９ｘ１０６±６．６ｘ１０６、Ｐ＜０．０５対非ＡＤＰ活性化ＨＧＥＣ）。Ｃ３及びＣ５ｂ－９の沈着はＣ３又はＣ５欠乏血清に曝露されたＡＤＰ活性化ＨＧＥＣにおいて有意に減少された（Ｃ３：３．３ｘ１０５±４．８ｘ１０４；Ｃ５：１．５ｘ１０６±６．０ｘ１０５、Ｐ＜０．０５）。遮断抗Ｃ５ ｍＡｂを加えることにより、ＡＤＰ活性化ＨＧＥＣ上への正常ヒト血清由来Ｃ５ｂ－９沈着を有意に減少し、沈着はＣ５欠乏血清と同様であった（Ｃ５ ｍＡｂ：１．０２ｘ１０６±６．０ｘ１０５、対照 ｍＡｂ
３．７ｘ１０６±１．６ｘ１０６、Ｐ＜０．０５対対照ｍＡｂ）。
結論
これらのデータは、補体Ｃ３及びＣ５沈着のモデルを作るためのインビトロヒト糸球体沈着の有用性を実証する。インビトロスクリーニングに加えて、このアッセイは、患者由来の血清サンプルを使用して腎疾患における抗補体ストラテジーを評価するための翻訳モデルとしての可能性を示す。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施態様により範囲を限定されるべきではない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な改変が、前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。このような改変は添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (40)

  1. 補体因子５（Ｃ５）タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで抗体又はその抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換により決定して、配列番号３６０又は配列番号３６１内に含有される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する、上記抗体又は抗原結合フラグメント。
  2. 抗体又はその抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換により決定して、Ｃ５のアルファ鎖及び／又はベータ鎖内に含有される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  3. 抗体又はその抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換により決定して、Ｃ５のＣ５ａアナフィラトキシン領域のアミノ酸と相互作用しない、請求項１又は２に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  4. 抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ａ）配列番号３５９のアミノ酸５９１～５９９；（ｂ）配列番号３５９のアミノ酸５９３～５９９；（ｃ）配列番号３５９のアミノ酸７７５～７８７；（ｄ）配列番号３５９のアミノ酸７７５～７９４；及び（ｅ）配列番号３５９のアミノ酸７７９～７８７からなる群より選択されるアミノ酸配列と相互作用する、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  5. 抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３６０及び３６１からなる群より選択されるアミノ酸配列内に含有される少なくとも５つのアミノ酸と相互作用する、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  6. 抗体又はその抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換により決定して、配列番号３６０及び配列番号３６１内に含有される１つ又はそれ以上のアミノ酸と相互作用する、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  7. 抗体又はその抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換により決定して、配列番号３６０及び３６１のアミノ酸配列と相互作用する、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  8. 抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）並びに軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含み、ここでＨＣＶＲは：
    （ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号９８に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号９８に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
    （ｉｖ）５以下のアミノ酸置換を有する配列番号９８のアミノ酸配列；
    を含み、
    そしてＬＣＶＲは：
    （ｉ）配列番号１０６のアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号１０６に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号１０６に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；又は
    （ｉｖ）５以下のアミノ酸置換を有する配列番号１０６のアミノ酸配列
    を含む、
    請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  9. 抗体は、以下の特徴：
    （ａ）カニクイザルへの投与の際に７０日目まで１０μｇ／ｍＬより高い血清濃度を有する；
    （ｂ）エクスビボ溶血アッセイで測定して、カニクイザルへの投与の際に３５日目まで古典的経路（ＣＰ）溶血を遮断する；
    （ｃ）エクスビボ溶血アッセイで測定して、カニクイザルへの投与の際に３５日目まで代替経路（ＡＰ）溶血を遮断する；
    （ｄ）カニクイザルにおいて１０日より長い血清半減期を有する；
    （ｅ）Ｃ５－ヒト化マウスへの投与の際に４０日目まで１０μｇ／ｍＬより高い血清濃度を有する；
    （ｆ）エクスビボ溶血アッセイで測定して、Ｃ５－ヒト化マウスへの投与の際に３０日目までＣＰ溶血を遮断する；及び
    （ｇ） Ｃ５－ヒト化マウスにおいて１０日より長い血清半減期を有する、
    のうちの１つ又はそれ以上を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  10. 抗体は：
    （ａ）完全ヒトモノクローナル抗体である；
    （ｂ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、２５℃で０．９ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＣ５に結合する；
    （ｃ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、３７℃で０．３ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５に結合する；
    （ｄ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、６５ｎＭ未満のＫＤでサルＣ５に結合する；
    （ｅ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、０．５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５変異体Ｒ８８５Ｈ（配列番号３５６）に結合する；
    （ｆ）表面プラズモン共鳴アッセイで測定して、０．５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣ５変異体Ｒ８８５Ｃ（配列番号３５７）に結合する；
    （ｇ）ＣＰ溶血アッセイで測定して、６ｎＭ未満のＩＣ５０で９５％より多くヒトＣ５媒介古典的経路（ＣＰ）溶血を遮断する；
    （ｈ）ＡＰ溶血アッセイで測定して、１６５ｎＭ未満のＩＣ５０で７０％より多くヒトＣ５媒介代替経路（ＡＰ）溶血を遮断する；
    （ｉ）ＣＰ溶血アッセイで測定して、１８５ｎＭ未満のＩＣ５０でアフリカミドリザルＣ５媒介ＣＰ溶血を阻害する；
    （ｊ）ＡＰ溶血アッセイで測定して、２３５ｎＭ未満のＩＣ５０でアフリカミドリザルＣ５媒介ＡＰ溶血を阻害する；
    （ｋ）ＣＰ溶血アッセイで測定して、１４５ｎＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＣ５媒介ＣＰ溶血を阻害する；及び
    （ｌ）ＡＰ溶血アッセイで測定して、３０ｎＭ未満のＩＣ５０でカニクイザルＣ５媒介ＡＰ溶血を阻害する
    からなる群より選択されるさらなる特徴を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  11. 抗体又はその抗原結合フラグメントは、５以下のアミノ酸置換を有する配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  12. 抗体又はその抗原結合フラグメントは、５以下のアミノ酸置換を有する配列番号１０６
    のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項８～１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  13. 抗体又はその抗原結合フラグメントは、５以下のアミノ酸置換を有する配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ及び５以下のアミノ酸置換を有する配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１１又は１２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  14. 配列番号１００のアミノ酸配列又は配列番号１００と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０２のアミノ酸配列又は配列番号１０２と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１０４のアミノ酸配列又は配列番号１０４と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１０８のアミノ酸配列又は配列番号１０８と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１１０のアミノ酸配列又は配列番号１１０と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１１２のアミノ酸配列又は配列番号１１２と１アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、請求項８～１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  15. 配列番号９８のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項８～１４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  16. 配列番号１０６のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項８～１４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  17. 抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号１００－１０２－１０４－１０８－１１０－１１２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３を含む、請求項１４に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  18. 抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９８／１０６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１７に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  19. 重鎖及び軽鎖を含む請求項１８に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで重鎖は配列番号３５３のアミノ酸配列を含む、上記抗体又はその抗原結合フラグメント。
  20. 重鎖及び軽鎖を含む請求項１８に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで軽鎖は配列番号３５４のアミノ酸配列を含む、上記抗体又はその抗原結合フラグメント。
  21. 配列番号３５３／３５４の重鎖／軽鎖アミノ酸配列対を含む、請求項１８に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
  22. Ｃ５への結合について請求項８に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと競合する、抗体又はその抗原結合フラグメント。
  23. 請求項８に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
  24. 以下のアミノ酸残基：配列番号３５９のＮ５９１、Ｍ５９２、Ａ５９３、Ｔ５９４、Ｇ５９５、Ｍ５９６、Ｄ５９７、Ｓ５９８、Ｗ５９９、Ｗ７７５、Ｅ７７６、Ｖ７７７、Ｈ
    ７７８、Ｌ７７９、Ｖ７８０、Ｐ７８１、Ｒ７８２、Ｒ７８３、Ｋ７８４、Ｑ７８５、Ｌ７８６、Ｑ７８７、Ｆ７８８、Ａ７８９、Ｌ７９０、Ｐ７９１、Ｄ７９２、Ｓ７９３、又はＬ７９４の少なくとも１つと相互作用する、補体因子５（Ｃ５）タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント。
  25. ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む請求項２４に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここでＨＣＶＲは配列番号９８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、上記抗体又は抗原結合フラグメント。
  26. ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲを含む請求項２４又は２５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここでＬＣＶＲは配列番号１０６に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、上記抗体又は抗原結合フラグメント。
  27. 配列番号９８／１０６のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含む、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  28. 請求項１～２７のいずれか１項に記載のＣ５に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む、医薬組成物。
  29. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
  30. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
  31. 請求項２９又は３０に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
  32. 請求項３１に記載のベクターを発現する細胞。
  33. Ｃ５に関連する疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は徴候を予防するか、処置するか又は寛解させる方法であって、治療有効量の請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、上記方法。
  34. 疾患又は障害は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、加齢性黄斑変性、地図状萎縮、ぶどう膜炎、視神経脊髄炎、多発性硬化症、脳卒中、ギラン・バレー症候群、外傷性脳損傷、パーキンソン病、不適切又は望ましくない補体活性化の障害、血液透析合併症、超急性同種移植片拒絶、異種移植片拒絶、ＩＬ－２治療の間のインターロイキン－２誘導毒性、炎症性障害、自己免疫疾患の炎症、クローン病、成人呼吸促迫症候群、火傷又は凍傷を含む熱傷、虚血後再灌流状態、心筋梗塞、毛細管漏出症候群、肥満、糖尿病、アルツハイマー病、統合失調症、脳卒中、てんかん、アテローム性動脈硬化、血管炎、水疱性類天疱瘡、Ｃ３腎症、膜増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、アルポート症候群、進行性腎不全、蛋白尿性腎臓病、腎虚血－再灌流傷害、ループス腎炎、バルーン血管形成術、心肺バイパス術又は腎動脈バイパス術におけるポンプ後症候群、血液透析、腎虚血、大動脈再建後の腸間膜動脈再灌流、感染性疾患又は敗血症、免疫複合体病及び自己免疫疾患、腎障害、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、増殖性腎炎、溶血性貧血、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、肺塞栓症及び梗塞、肺炎、並びに重症筋無力症からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 疾患又は障害がａＨＵＳである、請求項３３に記載の方法。
  36. 疾患又は障害がＰＮＨである、請求項３３に記載の方法。
  37. 医薬組成物は、それを必要とする被験体に予防的又は治療的に投与される、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 医薬組成物は、第二の治療剤と組み合わせて投与される、請求項３３～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 第二の治療剤は、抗凝固薬、抗炎症薬、降圧薬、免疫抑制剤、脂質低下剤、リツキシマブのような抗ＣＤ２０薬、インフリキシマブのような抗ＴＮＦ薬、抗痙攣薬、Ｃ３阻害剤、第二の抗Ｃ５抗体、及び抗血栓薬からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 医薬組成物は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋内又は頭蓋内投与される、請求項３３～３９のいずれか１項に記載の方法。
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