ES2984352T3 - Anticuerpos anti-C5 y usos de los mismos - Google Patents

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Adrianna Latuszek
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Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína del factor 5 del complemento (C5), y métodos de uso de los mismos. En diversas realizaciones de la invención, los anticuerpos son anticuerpos completamente humanos que se unen a la proteína C5. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son útiles para inhibir o neutralizar la actividad de C5, proporcionando así un medio para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con C5 en seres humanos. En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-C5 que tiene propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas mejoradas, por ejemplo, una vida media de más de 10 días. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-C5 y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos que se unen específicamente al factor del complemento C5, y a métodos terapéuticos y diagnósticos de utilización de dichos anticuerpos.
Antecedentes de la invención
El sistema del complemento es un grupo de proteínas plasmáticas que, cuando se activan, provocan la lisis de la célula diana y facilitan la fagocitosis mediante la opsonización. El complemento se activa a través de una serie de etapas proteolíticas por tres vías principales: la vía clásica, que suele ser activada por inmunocomplejos, la vía alternativa que puede ser inducida por superficies celulares desprotegidas, y la vía de la lectina de unión a manosa. Las tres vías de la cascada del complemento convergen en la escisión proteolítica de la proteína del componente 5 del complemento (C5). La escisión del componente 5 del complemento (C5) da lugar a la producción de los fragmentos C5a y C5b, un proceso crítico durante la activación de la cascada del complemento. C5a puede generar respuestas fisiológicas pleiotrópicas mediante la unión a sus receptores (Monket al.,2007, Br. J. Pharmacol. 152: 429-448). C5a es un potente mediador proinflamatorio que induce la migración quimiotáctica, potencia la adhesión celular, estimula la explosión oxidativa e induce la liberación de diversos mediadores inflamatorios como la histamina o las citocinas. C5b media en la formación del complejo de ataque de membrana (MAC, o C5b-9) que conduce a la lisis celular en las fases tardías de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Además, en las células nucleadas resistentes a la citólisis por C5b-9, cantidades sublíticas de C5b-9 pueden provocar la activación celular que da lugar a la proliferación celular, la generación de mediadores proinflamatorios y la producción de matriz extracelular.
Los anticuerpos monoclonales contra C5 son conocidos en la técnica y se han descrito, por ejemplo, en las publicaciones o patentes de EE. UU. n.° 9206251, 9107861, 9079949, 9051365, 8999340, 8883158, 8241628, 7999081, 7432356, 7361339, 7279158, 6534058, 6355245, 6074642, 20160299305, 20160051673, 20160031975, 20150158936, 20140056888, 20130022615 y 20120308559, y en los documentos WO2015198243, WO2015134894, WO2015120130, EP2563813B1, EP2328616B1 y EP2061810B1.
El documento EP2328616B1 se refiere a anticuerpos dirigidos contra la proteína del complemento C5 y a composiciones y métodos de uso de los mismos. Wonget al.,Transl Res. 2015, 165(2):306-320 se refiere a la terapia contra el complemento C5 con eculizumab para el tratamiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna y el síndrome urémico hemolítico atípico. El documento WO 2014/047500 A1 se refiere a ensayos de cribado de antagonistas del componente del complemento C5.
Los anticuerpos totalmente humanos que se unen específicamente a la proteína C5 con alta afinidad y tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas podrían ser importantes en la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades asociadas a C5 (p. ej., el síndrome urémico hemolítico atípico).
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen específicamente a la proteína del factor 5 del complemento (C5). Los anticuerpos de la invención comprenden una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 98, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 106. La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; un dispositivo de administración de pluma reutilizable que contiene la composición farmacéutica; un dispositivo de administración autoinyector que contiene la composición farmacéutica; una molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una HCVR del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y una secuencia nucleotídica que codifica una LCVR de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo; un vector comprende el polinucleótido; y una célula que expresa el vector. La presente invención también proporciona el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar en un método de prevención, tratamiento o mejora de al menos un síntoma o indicio de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en síndrome urémico hemolítico atípico (SHUa), hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), degeneración macular senil, atrofia geográfica, uveítis, neuromielitis óptica, esclerosis múltiple, accidente cerebrovascular, síndrome de Guillain-Barre, traumatismo craneoencefálico, enfermedad de Parkinson, un trastorno de activación inadecuada o indeseable del complemento, una complicación de la hemodiálisis, rechazo de aloinjerto hiperagudo, rechazo de xenoinjerto, toxicidad inducida por interleucina-2 durante terapia con IL-2, un trastorno inflamatorio, inflamación de una enfermedad autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, lesión térmica, una quemadura, congelación, una afección por reperfusión postisquémica, infarto de miocardio, síndrome de fuga capilar, obesidad, diabetes, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, epilepsia, ateroesclerosis, vasculitis, penfigoide ampolloso, glomerulopatía C3, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatía diabética, síndrome de Alport, insuficiencia renal progresiva, una enfermedad renal proteinúrica, lesión renal por isquemia-reperfusión, nefritis por lupus, angioplastia con balón, síndrome post-bomba en derivación cardiopulmonar o derivación renal, isquemia renal, reperfusión de la arteria mesentérica después de la reconstrucción aórtica, enfermedad infecciosa, sepsis, un trastorno inmunocomplejo, una enfermedad autoinmunitaria, un trastorno renal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis por LES, nefritis proliferativa, anemia hemolítica, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, embolia pulmonar, infarto pulmonar, neumonía y miastenia grave. Los anticuerpos de la presente invención son útiles, entre otras cosas, para inhibir o neutralizar la actividad de la proteína C5. En determinadas realizaciones, los anticuerpos son útiles para prevenir, tratar o mejorar al menos un síntoma o indicio de una enfermedad o trastorno asociado a C5 en un sujeto. En determinadas realizaciones, los anticuerpos pueden administrarse profiláctica o terapéuticamente a un sujeto que padezca o corra el riesgo de padecer una enfermedad o trastorno asociado a C5. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-C5 son anticuerpos totalmente humanos que se unen a C5 con gran afinidad y presentan propiedades farmacocinéticas (FC) y farmacodinámicas (FD) mejoradas. Estos anticuerpos de alta afinidad con FC/f D mejorada pueden utilizarse para proporcionar una eficacia superior, junto con una posología menos frecuente en un sujeto con una enfermedad o trastorno asociado a C5.
Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un Fab, F(ab')<2>o fragmento scFv), y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, p. ej., para aumentar la persistencia en el hospedador o para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddyet al.,2000, J. Immunol. 164:1925-1933). En determinadas realizaciones, los anticuerpos pueden ser biespecíficos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales totalmente humanos.
Sumario de las enseñanzas técnicas
La invención se define en las reivindicaciones independientes. En las reivindicaciones dependientes se definen aspectos y realizaciones preferidas adicionales. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona únicamente con fines ilustrativos. En concreto, los anticuerpos de la invención se definen por medio de las reivindicaciones. Sin embargo, en las Tablas 1 y 2 del presente documento se enumeran otros anticuerpos anti-C5 ilustrativos. La Tabla 1 expone los identificadores de secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada (las HCVR), las regiones variables de cadena ligera (las LCVR), regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3), y regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) de anticuerpos anti-C5 ilustrativos. La Tabla 2 expone los identificadores de secuencia de ácido nucleico de las Hc VR, LCVR, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de los anticuerpos anti-C5 ilustrativos.
Los anticuerpos anti-C5 ilustrativos enumerados en la Tabla 1 tienen un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 98/114, 122/106, 98/130, 138/106, 146/106, 122/130, 146/114, 146/130, 138/130, 154/162, 170/178, 186/194, 202/210, 218/226, 234/242, 250/258, 266/258, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330 y 338/346. En determinados casos, el par de secuencias de aminoácidos HCVR/LCVR se selecciona de uno de SEQ ID NO: 50/58 (p. ej., H4H12161P), 98/106 (el anticuerpo de la invención, p. ej., H4H12166P), 138/106 (p. ej., H4H12166P5) o 202/210 (p. ej., H4H12170P).
La invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 353. La invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 354. La invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 353 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 354.
Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, divulgados en el presente documento pueden comprender un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas en cualquiera de los anticuerpos anti-C5 ilustrativos enumerados en la Tabla 1, tal como el conjunto de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 52-54-56-60-62-64 (p. ej., H4H12161P), 100-102-104-108-110-112 (p. ej., H4H12166P), 140-142-144-108-110-112 (p. ej., H4H12166P5) y 204-206-208-212-214-216 (p. ej., H4H12170P).
Los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, divulgados en el presente documento pueden comprender un conjunto de seis CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contenidas en un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR como las definidas por cualquiera de los anticuerpos anti-C5 ilustrativos enumerados en la Tabla 1. Por ejemplo, se desvelan anticuerpos, o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, que comprenden el conjunto de secuencias de aminoácidos de HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 contenido dentro de un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 50/58 (p. ej., H4H12161P), 98/106 (el anticuerpo de la invención, p. ej., H4H12166P), 138/106 (p. ej., H4H12166P5) o 202/210 (p. ej., H4H12170P). Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la materia y pueden utilizarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas que se divulgan en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden utilizarse para identificar los límites de las CDR incluyen, p. ej., la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de Acm. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de Acm es un término medio entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véase, p. ej., Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikaniet al.,J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martinet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 86:9268-9272 (1989). También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
La presente invención incluye anticuerpos anti-C5 que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas realizaciones, puede ser útil la modificación para eliminar sitios de glucosilación indeseables, o un anticuerpo que carezca de una fracción de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpos (CCDA) (véase, Shieldet al.,(2002) JBC 277:26733). En otras solicitudes, se puede modificar la galactosilación para modificar la Citotoxicidad Dependiente del Complemento (CDC).
En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que presentan una unión dependiente del pH a C5. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen a c 5 con mayor afinidad a pH neutro que a pH ácido (es decir, unión reducida a pH ácido).
En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos que presentan propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas mejoradas, por ejemplo, la presente invención proporciona anticuerpos anti-C5 que tienen una semivida sérica prolongada. En determinados casos, los anticuerpos anti-C5 tienen una concentración sérica superior a 10 |jg/ml hasta el día 40 en ratones humanizados para C5. En determinados casos, los anticuerpos anti-C5 bloquean la hemólisis de VC y VA hasta el día 35 tras su administración a ratones humanizados para C5.
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden competir por la unión específica a C5 con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenda las CDR de una HCVR y las CDR de una LCVR, en donde cada una de la HCVR y la LCVR tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de HCVR y LCVR enumeradas en la Tabla 1.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden competir de forma cruzada por la unión a C5 con un anticuerpo de referencia o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenda las CDR de una HCVR y las CDR de una LCVR, en donde cada una de la HCVR y la LCVR tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de HCVR y LCVR enumeradas en la Tabla 1.
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden unirse al mismo epítopo que un anticuerpo de referencia o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenda las CDR de una HCVR y las CDR de una LCVR, en donde cada una de la HCVR y la LCVR tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de HCVR y LCVR enumeradas en la Tabla 1.
Los anticuerpos anti-C5 y fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden unirse a uno o más restos de aminoácidos comprendidos en la cadena alfa y/o la cadena beta de C5. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden unirse a uno o más aminoácidos de la cadena alfa de C5 y a uno o más aminoácidos de la cadena beta de C5. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden unirse a uno o más aminoácidos de las cadenas alfa y beta de C5, en donde los anticuerpos no se unen al dominio de anafilatoxina C5a. Los anticuerpos anti-C5 descritos en el presente documento pueden interactuar con uno o más aminoácidos contenidos en la C5 humana (SEQ ID NO: 359). Los anticuerpos anti-C5 descritos en el presente documento pueden interactuar con uno o más aminoácidos contenidos en la C5 humana (SEQ ID NO: 359), en donde los anticuerpos no se unen al dominio de anafilatoxina C5a de C5. Los anticuerpos anti-C5 y los fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden interactuar con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) los aminoácidos 591 a 599 de SEQ ID NO: 359; (b) aminoácidos 593 a 599 de SEQ ID NO: 359; (c) aminoácidos 775 a 787 de SEQ ID NO: 359; (d) aminoácidos 775 a 794 de SEQ ID NO: 359; y (e) aminoácidos 779 a 787 de SEQ ID NO: 359. Los anticuerpos anti-C5 y los fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden interactuar con uno o más aminoácidos contenidos en SEQ ID NO: 359, por ejemplo, anticuerpos anti-C5 y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que interactúan con al menos 5 aminoácidos, al menos 10 aminoácidos o al menos 15 aminoácidos contenidos en SEQ ID NO: 361. Los anticuerpos anti-C5 y los fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden interactuar con uno o más aminoácidos contenidos en SEQ ID NO: 359, por ejemplo, anticuerpos anti-C5 y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que interactúan con al menos 5 aminoácidos contenidos en SEQ ID NO: 360. Los anticuerpos anti-C5 y los fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden interactuar con al menos 5 aminoácidos contenidos en SEQ ID NO: 360 y 361. Los anticuerpos anti-C5 y los fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden interactuar con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 360 (correspondiente a los aminoácidos 591 a 599 de SEQ ID NO: 359) y con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 361 (correspondiente a los aminoácidos 775 a 794 de SEQ ID NO: 359).
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede unirse específicamente a C5 de forma agonista, es decir, puede potenciar o estimular la unión y/o actividad de C5; o el anticuerpo puede unirse específicamente a C5 de manera antagonista, es decir, puede bloquear la unión y/o la actividad de C5.
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden bloquear la unión de C5 a la convertasa C5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede bloquear la unión de C5 a la convertasa C5 puede unirse al mismo epítopo en C5 que la convertasa C5 o puede unirse a un epítopo diferente en C5 que la convertasa C5. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden bloquear la unión de C5 a la convertasa C5 de mono.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos descritos en el presente documento pueden ser biespecíficos y comprender una primera especificidad de unión a un primer epítopo de la proteína C5 y una segunda especificidad de unión a un segundo epítopo de la proteína C5, en donde el primer y segundo epítopos son distintos y no se solapan.
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos descritos en el presente documento pueden unirse a C5a con una CI<50>inferior a 0,5 nM.
El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede tener una o más de las siguientes características: (a) es un anticuerpo monoclonal completamente humano; (b) se une a C5 humana con una constante de disociación (Kd) inferior a 0,9 nM a 25 °C, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (c) se une a C5 humana con una Kd inferior a 0,3 nM a 37 °C, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (d) se une a C5 de mono con una Kd inferior a 65 nM, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (e) se une a la variante de C5 humana R885H (SEQ ID NO: 356) con una Kd inferior a 0,5 nM, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (f) se une a la variante de C5 humana R885C (SEQ ID NO: 357) con una Kd inferior a 0,5 nM, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (g) bloquea la hemólisis de la vía clásica (VC) mediada por C5 humana en más del 95 % y con una CI<50>inferior a 6 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VC; (h) bloquea la hemólisis de la vía alternativa (VA) mediada por C5 humana en más del 70 % y con CI<50>inferior a 165 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VA; (i) inhibe la hemólisis de la VC mediada por C5 del mono verde africano con una CI<50>inferior a 185 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VC; (j) inhibe la hemólisis de la VA mediada por C5 del mono verde africano con una CI<50>inferior a 235 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VA; (k) inhibe la hemólisis de la VC mediada por C5 del macaco cangrejero con una CI<50>inferior a 145 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VC; y (l) inhibe la hemólisis de la VA mediada por C5 del macaco cangrejero con CI<50>inferior a 30 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VA.
El anticuerpo monoclonal recombinante anti-C5 aislado o el fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede tener una o más de las siguientes características: (a) comprende un conjunto de seis CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 100-102-104-108-110-112; (b) se une a la C5 humana con una constante de disociación (Kd) inferior a 0,2 nM a 25 °C, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (c) se une a C5 humana con una K<d>inferior a 0,3 nM a 37 °C, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (d) se une a una variante de la C5 humana (R885H) con una Kd inferior a 0,4 nM a 37 °C, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (e) inhibe la hemólisis mediada por la vía clásica (VC) del suero humano con una CI<50>inferior a 3 nM; (f) inhibe la hemólisis mediada por la vía alternativa (VA) del suero humano con una CI<50>inferior a 27 nM; (g) inhibe la hemólisis mediada por la VC del suero de mono con una CI<50>inferior a 21 nM; (g) Inhibe la hemólisis mediada por la VA del suero de mono con un IC<50>inferior a 10 nM; (h) tiene una semivida sérica (t<1/2>) de más de 10 días en ratones humanizados para C5; (i) tiene una concentración sérica de más de 10 |jg/ml hasta el día 40 tras su administración a ratones humanizados para C5; (j) bloquea la hemólisis mediada por la VC hasta el día 50 en ratones humanizados para C5; y (k) se une a uno o más aminoácidos comprendidos en la cadena alfa y/o la cadena beta de SEQ ID NO: 359, en donde el anticuerpo no se une al dominio de anafilatoxina C5a de C5.
En un segundo aspecto, en el presente documento, se describen moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-C5 o partes de los mismos. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden codificar cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden codificar cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1; en determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
Las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden codificar tanto una HCVR como una LCVR, en donde la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1, y en donde la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1. En determinados casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótido seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCVR enumeradas en la Tabla 2 o una secuencia sustancialmente similar a las mismas que tiene al menos el 90 %, al menos un 95 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de identidad de secuencia con la misma, y una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la Tabla 1 o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos el 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma. En determinados casos, la molécula de ácido nucleico codifica una HCVR y LCVR, en donde la HCVR y la LCVR proceden las dos del mismo anticuerpo anti-C5 enumerado en la tabla 1. La invención proporciona una molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una HCVR de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención y una secuencia nucleotídica que codifica una LCVR de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la invención.
En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden la molécula polinucleotídica de la presente invención, como se define en las reivindicaciones. El vector es capaz de expresar un polipéptido que comprende la región variable de cadena pesada o ligera del anticuerpo anti-C5. También se incluyen en el ámbito de la presente invención las células hospedadoras que expresan los vectores de la invención.
En un tercer aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, según se define en las reivindicaciones, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, la composición puede ser una combinación del anticuerpo anti-C5 de la invención y un segundo agente terapéutico. En un caso, el segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que se combine ventajosamente con un anticuerpo anti-C5. Los agentes ilustrativos que pueden combinarse de forma ventajosa con un anticuerpo anti-C5 incluyen, sin limitación, otros agentes que se unen y/o inhiben la actividad de C5 (incluidos otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, etc.) y/o agentes que no se unen directamente a C5 pero que, no obstante, tratan o mejoran al menos un síntoma o indicio de una enfermedad o trastorno asociado a C5. En cualquier parte del presente documento se divulgan terapias de combinación y coformulaciones adicionales que implican los anticuerpos anti-C5 de la presente invención.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usar en un método para el tratamiento del organismo humano (o animal) mediante terapia.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona el anticuerpo anti-C5 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para usar en métodos de prevención, tratamiento o mejora de al menos un síntoma del síndrome urémico hemolítico atípico (SHUa), comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-C5 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el anticuerpo anti-C5 o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para usar en métodos para mejorar o reducir la gravedad de al menos un síntoma o indicio de hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) en un sujeto mediante la administración de un anticuerpo anti-C5 de la invención. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede administrarse profiláctica o terapéuticamente a un sujeto que padezca o corra el riesgo de padecer una enfermedad o trastorno asociado a C5. En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención se administra en combinación con un segundo agente terapéutico al sujeto que lo necesita. El segundo agente terapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en un fármaco antiinflamatorio (tal como los corticosteroides y los antiinflamatorios no esteroideos), un anticuerpo diferente contra la proteína C5, un suplemento dietético tal como antioxidantes y cualquier otro fármaco o terapia conocidos en la técnica. En determinadas realizaciones, el segundo agente terapéutico puede ser un agente que ayude a contrarrestar o reducir cualquier posible efecto o efectos secundarios asociados con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, si ocurriera dicho efecto o efectos secundarios. El anticuerpo o fragmento del mismo se puede administrar por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, oral o intramuscular. El anticuerpo o fragmento del mismo se puede administrar a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del sujeto. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la presente invención puede administrarse a una o más dosis que comprendan entre 50 mg y 600 mg.
Otras realizaciones se pondrán de manifiesto al revisar la descripción detallada que sigue.
Breve descripción de las figuras
Lafigura 1muestra la inhibición de los niveles de C5a por el anticuerpo anti-C5 H4H12166P de forma dependiente de la dosis, según lo determinado por ELISA (descrito en el Ejemplo 9 del presente documento).
Lafigura 2muestra la concentración sérica total frente al tiempo tras una única inyección intravenosa de 15 mg/kg de H4H12166P, H4H12161P o el Comparador 2 a macacos cangrejeros macho (descritos en el Ejemplo 10 del presente documento). Se trazaron los perfiles de concentración-tiempo hasta la primera dosis posterior por debajo del límite inferior de cuantificación (BLQ,Below the Limit of Quantitation),si procede, que se imputó como LLOQ/2. Cada punto de datos representa la media (±DT) (n = 4 animales/grupo); se excluyeron las concentraciones consideradas afectadas por la ADA de 1 animal del grupo H4H12166P y 1 animal del grupo H4H12161P a partir del día 36 y del día 29, respectivamente. LLOQ = Límite inferior de cuantificación(Lower Limit of Quantification)Lafigura 3muestra el porcentaje de hemólisis frente al tiempo en ensayosex vivode eritrocitos(A)de la vía clásica y(B)de la vía alternativa tras una única inyección intravenosa de H4H12166P, H4H12161P o Comparador 2 a macacos cangrejeros macho. El % de hemólisis, calculado como el cociente de la lisis experimental frente a la lisis máxima con el % de lisis de fondo restado de ambos valores, está relacionado con la cantidad de C5 inhibida por el anticuerpo anti-C5 concreto presente en el suero en un punto temporal determinado. Cada punto de datos representa la media (±DT).
LaFigura 4muestra la concentración sérica total frente a los perfiles temporales de anticuerpos anti-C5 seleccionados en ratones humanizados para C5 (descritos en el Ejemplo 11 del presente documento). A los ratones humanizados para C5 se les administró una única dosis subcutánea de 15 mg/kg de H4H12166P, Comparador 1 o Comparador 2. Cada punto de datos representa la media ± ETM (n = 4-5 cada uno). Las concentraciones de anticuerpos en los sueros se monitorizaron 1, 10, 20, 30 y 40 días después de la inyección mediante un ELISA de tipo sándwich.
Lafigura 5muestra el porcentaje de hemólisis frente al tiempo en un ensayo de hemólisis de la vía clásica del complementoex vivode anticuerpos anti-C5 seleccionados en ratones humanizados para C5. A los ratones humanizados para C5 se les administró una única dosis subcutánea de 15 mg/kg de H4H12166P, Comparador 1 o Comparador 2. Cada punto de datos representa la media ± ETM (n = 4-5 cada uno). Se controló el porcentaje de hemólisis en suero antes de la dosis, 10, 20, 30, 40 y 50 días después de la inyección. El % de hemólisis, calculado como el cociente de la lisis experimental frente a la lisis máxima con el % de lisis de fondo restado de ambos valores, está relacionado con la cantidad de C5 inhibida por el anticuerpo anti-C5 concreto presente en el suero en un punto temporal determinado.
LaFigura 6muestra la concentración sérica total frente a los perfiles temporales de anticuerpos anti-C5 seleccionados en ratones humanizados para C5 (descritos en el Ejemplo 11 del presente documento). Se administró a los ratones una dosis única subcutánea de 15 mg/kg de H4H12166P, H4H12161P, el Comparador 1 o el control de isotipo IgG4P. Cada punto de datos representa la media ± ETM (n = 5 cada uno). Los niveles de anticuerpos en el suero se controlaron a las 6 horas, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21, 30, 45 y 59 días después de la inyección utilizando un ELISA de tipo sándwich.
LaFigura 7es un gráfico que muestra las puntuaciones de la tomografía de coherencia óptica (OCT,Optical Coherence Tomography)en ratones tratados con el control del isotipo o con el anticuerpo anti-C5 M1M17628N a 10 mg/kg o 50 mg/kg (descrito en el Ejemplo 14 del presente documento). ****p <0,0001, ANOVA de dos vías tratamiento con anticuerpo anti-C5 a 50 mg/kg frente a ningún tratamiento o tratamiento con control del isotipo. Lafigura 8muestra la inhibición de la hemólisis de la vía clásica por el anticuerpo anti-C5 M1M17628N en ausencia de C3 (A); y en presencia de 80 pg/ml de C3 humano(B) (descrito en el Ejemplo 14 del presente documento). Lafigura 9muestra el recuento de grupos celulares en ratones humanizados para C5 tratados con control de isotipo o con el anticuerpo anti-C5 humana H4H12170P a 10 mg/kg o 50 mg/kg (descrito en el Ejemplo 15 del presente documento). n = 8-12 ojos por cada grupo.
Lafigura 10es un gráfico que muestra las puntuaciones de OCT en ratones humanizados para C5 tratados con control del isotipo o con anticuerpo anti-C5 humana H4H12170P a 10 mg/kg o 50 mg/kg (descrito en el ejemplo 15 del presente documento). n = 8-12 ojos por cada grupo.
Lafigura 11es un gráfico que muestra las puntuaciones de OCT en ratones humanizados para C5 tratados con control del isotipo, anticuerpo anti-C5 humana H4H12166P a 3 mg/kg o 10 mg/kg o Comparador 2 a 10 mg/kg. n = 6-12 ojos por cada grupo (descrito en el Ejemplo 15 del presente documento).
Lafigura 12muestra el recuento de grupos celulares en ratones humanizados para C5 tratados con control del isotipo, anticuerpo anti-C5 humana H4H12166P a 3 mg/kg o 10 mg/kg o Comparador 2 a 10 mg/kg. n = 6-12 ojos por cada grupo (descrito en el Ejemplo 15 del presente documento).
Lafigura 13es una curva de supervivencia de ratones NZBWF1 tratados con control de isotipo o con anticuerpos anti-C5 M1M17628N o M1M17627N (descritos en el Ejemplo 17 del presente documento).
Lafigura 14muestra los niveles de (A) albúmina urinaria y (B) albúmina urinaria normalizada a creatinina urinaria en ratones NZBWF1 tratados con control de isotipo o con anticuerpos anti-C5 M1M17628N o M1M17627N (descritos en el Ejemplo 17 del presente documento).
Lafigura 15muestra los niveles de nitrógeno ureico en sangre en ratones NZBWF1 tratados con control de isotipo o con anticuerpos anti-C5 M1M17628N o M1M17627N (descritos en el Ejemplo 17 del presente documento). Lafigura 16es un gráfico que muestra la inhibición de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos de los astrocitos por los anticuerpos anti-C5 H4H12166P, H4H12170P, Comparador 1 y Comparador 2, como se describe en el Ejemplo 18.
Descripción detallada
Antes de describir los presentes métodos, se ha de entender que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, dado que el alcance de la presente invención estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otra manera, todas las expresiones/términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento, tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden utilizar en la práctica o en el ensayo de la presente invención cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento, a continuación, se describen métodos y materiales preferidos.
Definiciones
El término "C5", también denominado "componente 5 del complemento" o "factor 5 del complemento", se refiere a la proteína sérica de la cascada del complemento. La proteína c 5 es una proteína de 1676 aminoácidos que comprende dos cadenas, alfa y beta. La proteína representa el punto de convergencia de tres vías de activación del complemento: la vía clásica, la vía alternativa y la vía de la lectina de unión a manosa. La secuencia de aminoácidos de la proteína C5 de longitud completa está ejemplificada por la secuencia de aminoácidos proporcionada en GenBank como número de acceso NP_001726.2 (SEQ ID NO: 355). El término "C5" incluye la proteína C5 recombinante o un fragmento de la misma. El término también engloba la proteína C5 o un fragmento de la misma acoplado a, por ejemplo, una etiqueta de histidina, Fc de ratón o humano, o una secuencia de señal tal como ROR1. Por ejemplo, el término incluye secuencias ejemplificadas por la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 356 o 357, que comprende un marcador de histidina en el extremo carboxiterminal, acoplada a los restos de aminoácidos 19-1676 de la proteína C5 de longitud completa. El término también incluye variantes de la proteína que comprenden un marcador de histidina en el extremo carboxiterminal, acoplado a los restos de aminoácidos 19-1676 de la proteína C5 de longitud completa con un cambio R885H o un cambio R885C.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro (es decir, "moléculas de anticuerpo completas"), así como multímeros de las mismas (p. ej., IgM) o fragmentos de unión a antígenos de las mismas. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada ("HCVR" o "Vh") y una región constante de cadena pesada (comprendida por los dominios C<h>1, C<h>2 y C<h>3). Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera ("LCVR o "V<l>") y una región constante de cadena ligera (C<l>). Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, del inglés"complementaríty determining regions"),intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada V<h>y V<l>comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, Cd R3, FR4. Las FR del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse natural o artificialmente. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.
También es posible la sustitución de uno o más restos de CDR o la omisión de una o más CDR. Se han descrito anticuerpos en la bibliografía científica en los que se puede prescindir de una o dos CDR para la unión. Padlanet al.(1995 FASEB J. 9:133-139) analizaron las regiones de contacto entre los anticuerpos y sus antígenos, basándose en estructuras cristalinas publicadas, y concluyeron que solo aproximadamente de un quinto a un tercio de los restos de CDR realmente entran en contacto con el antígeno. Padlan también descubrió muchos anticuerpos en los que una o dos CDR no tenían aminoácidos en contacto con un antígeno (véase también, Vajdoset al.2002 J Mol Biol 320:415-428).
Los restos de CDR que no entran en contacto con el antígeno se pueden identificar basándose en estudios anteriores (por ejemplo, los restos H60-H65 en CDRH2 con frecuencia no son necesarios), de regiones de CDR de Kabat que se encuentran fuera de CDR de Chothia, por modelización molecular y/o empíricamente. Si se omite una CDR o uno o más restos de la misma, generalmente se sustituye con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humano o un consenso de dichas secuencias. Las posiciones para la sustitución dentro de CDR y los aminoácidos a sustituir también pueden seleccionarse empíricamente. Las sustituciones empíricas pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas.
Los anticuerpos monoclonales anti-C5 totalmente humanos divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos desveladas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles, por ejemplo, en bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos, derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que procede el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en conjunto en el presente documento "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera desveladas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En determinadas realizaciones, todos los restos de la región marco y/o CDR dentro de los dominios V<h>y/o V<l>retromutan a los restos encontrados en la secuencia de la estirpe germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otras realizaciones, únicamente determinados restos retromutan a la secuencia de línea germinal original, p. ej., únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otras realizaciones, uno o más del resto o restos marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de una secuencia de línea germinal diferente (es decir, una secuencia de línea germinal que es diferente de la secuencia de línea germinal de la cual se obtuvo originalmente el anticuerpo). Asimismo, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, p. ej., en donde determinados restos individuales se mutan al resto correspondiente de una secuencia de estirpe germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de estirpe germinal original se mantienen o se mutan al resto correspondiente de una secuencia de estirpe germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos que contienen una o más mutaciones de la estirpe germinal pueden probarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc.
Los anticuerpos monoclonales anti-C5 totalmente humanos descritos en el presente documento pueden comprender variantes de cualquiera de las HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-C5 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR con, p. ej., 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento.
La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo por mutación somáticain vivo),por ejemplo, en las CDR y, en particular, CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir Acm en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero (p. ej., ratón), se han injertado en secuencias FR humanas. La expresión incluye anticuerpos producidos de forma recombinante en un mamífero no humano o en células de un mamífero no humano. La expresión no pretende incluir anticuerpos aislados de o generados en un sujeto humano.
El término "recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos de la invención creados, expresados, aislados u obtenidos mediante tecnologías o métodos conocidos en la técnica como tecnología de ADN recombinante que incluye, p. ej., corte y empalme de ADN y expresión transgénica. La expresión se refiere a anticuerpos expresados en un mamífero no humano (incluyendo mamíferos no humanos transgénicos, p. ej., ratones transgénicos) o en un sistema de expresión celular (p. ej., células CHO) o aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes.
La expresión "se une de manera específica", o "se une específicamente a", o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica puede caracterizarse por una constante de disociación en equilibrio de al menos aproximadamente 1*10-8 M o menos (p. ej., una K<d>menor indica una unión más estrecha). Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. Como se describe en el presente documento, los anticuerpos se han identificado mediante resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE™, que se une específicamente a C5. Por otra parte, los anticuerpos multiespecíficos, que se unen a un dominio en C5 y uno o más antígenos adicionales o uno biespecífico que se une a dos regiones diferentes de C5 se consideran, no obstante, anticuerpos que se "unen específicamente", como se usa en el presente documento.
La expresión anticuerpo "de alta afinidad" se refiere a aquellos Acm que tienen una afinidad de unión a C5, expresada como Kd, de al menos 10-8 M; preferentemente de 10-9 M; más preferentemente de 10-10 M, incluso más preferentemente de 10-11 M, incluso más preferentemente de 10-12 M, medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE™ o ELISA de afinidad en solución.
Por la expresión "disociación lenta", "Koff' o "kd" se entiende un anticuerpo que se disocia de C5, con una constante de velocidad de 1 * 10-3 s-1 o menor, preferentemente 1 * 10-4 s-1 o menor, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial, p. ej., BIACORE™.
Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usa en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse a la proteína C5.
En realizaciones específicas, un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden estar conjugados con una fracción tal como un ligando o una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), un segundo anticuerpo anti-C5 o cualquier otra fracción terapéutica útil para tratar una enfermedad o trastorno asociado a C5.
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos (Abs) que tienen diferentes especificidades antigénicas (p. ej., un anticuerpo aislado que se une específicamente a C5 o un fragmento del mismo, está sustancialmente libre de Ab que se unen específicamente a antígenos diferentes a C5.
Un "anticuerpo de bloqueo" o un "anticuerpo neutralizante", como se usa en el presente documento (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad de C5" o "anticuerpo antagonista"), pretende hacer referencia a un anticuerpo cuya unión a C5 da como resultado la inhibición de al menos una actividad biológica de C5. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede prevenir o bloquear la hemólisis mediada por complemento por la vía clásica o vía alternativa.
La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones biomoleculares en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, usando el sistema BIACORE™ system (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.).
El término "K<d>", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Así pues, distintos anticuerpos pueden unirse a distintas áreas de un antígeno y pueden tener distintos efectos biológicos. El término "epítopo" se refiere también a un lugar en un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. También se refiere a una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos también pueden ser conformacionales, es decir, compuestos de aminoácidos no lineales. En determinadas realizaciones, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en determinadas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.
La expresión "competencia cruzada", como se usa en el presente documento, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un antígeno e inhibe o bloquea la unión de otro anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. La expresión también incluye la competencia entre dos anticuerpos en ambas orientaciones, es decir, un primer anticuerpo que se une y bloquea la unión de un segundo anticuerpo y viceversa. En determinadas realizaciones, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo pueden unirse al mismo epítopo. Como alternativa, los anticuerpos primero y segundo pueden unirse a epítopos diferentes, pero solapados, de forma que la unión de uno inhiba o bloquee la unión del segundo anticuerpo, p. ej., a través de impedimento estérico. La competencia cruzada entre anticuerpos puede medirse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante un ensayo de interferometría de biocapa en tiempo real y sin marcadores. La competencia cruzada entre dos anticuerpos puede expresarse como la unión del segundo anticuerpo que es menor que la señal de fondo debida a la autounión (en donde el primer y segundo anticuerpos es el mismo anticuerpo). Puede manifestarse una competencia cruzada entre 2 anticuerpos, por ejemplo, como el % de unión del segundo anticuerpo que es menor que la unión de fondo de referencia propia (en donde el primer y segundo anticuerpos es el mismo anticuerpo).
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de forma óptima con inserciones o supresiones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 90 % y, más preferentemente, en al menos aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como el FASTA, BLAST o GAP, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar que el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.
Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 90 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos, que no son idénticas, difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en donde un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (p. ej., carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Véanse, p. ej., Pearson (1994) Methods Mol. Biol.
24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnetet al.(1992) Science 256: 1443 45. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos se mide normalmente usando un programa informático de análisis de secuencia. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de distintas especies de organismos o entre una proteína de tipo natural y una muteína de la misma. Véanse, p. ej., GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (p. ej., FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000)supra).Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de distintos organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véanse, p. ej., Altschulet al.(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.
Por la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento, y un experto en la materia podrá determinarla usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, que necesita la mejora, la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a C5, como el síndrome urémico hemolítico atípico (SHUa) o la hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). El término incluye a los sujetos humanos que padecen o corren el riesgo de padecer dicha enfermedad o trastorno.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refieren a la reducción o mejora de la gravedad de al menos un síntoma o indicación de una enfermedad o trastorno asociado a C5 debido a la administración de un agente terapéutico como un anticuerpo de la presente invención a un sujeto que lo necesite. Los términos incluyen la inhibición de la progresión de la enfermedad o del empeoramiento de un síntoma/indicación. Los términos también incluyen el pronóstico positivo de la enfermedad, es decir, el sujeto puede estar libre de enfermedad o puede haber reducido la enfermedad tras la administración de un agente terapéutico tal como un anticuerpo de la presente invención. El agente terapéutico puede administrarse a una dosis terapéutica al sujeto.
Los términos "prevenir", "previniendo" o "prevención" se refieren a la inhibición de la manifestación de una enfermedad o trastorno asociado a C5 o cualquier síntoma o indicio de dicha enfermedad o trastorno tras la administración de un anticuerpo de la presente invención.
Fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos
A menos que se indique específicamente otra cosa, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, debe entenderse que abarca moléculas de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina (es decir, "moléculas de anticuerpo completas") así como los fragmentos de unión a antígenos de las mismas. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usa en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a C5. Un fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento Fab, un fragmento F(ab')<2>, un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento que contiene una CDR, o una CDR aislada. En determinadas realizaciones, la expresión "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento de polipéptido de una molécula de unión a antígeno multiespecífica. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígenos de un anticuerpo, p. ej., de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables y (opcionalmente) constantes de anticuerpos. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, p. ej., fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (que incluyen, p. ej., fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.
Algunos ejemplos no limitativos de fragmentos de unión a antígenos incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas de Fv monocatenario (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades mínimas de reconocimiento que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (p. ej., una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada tal como un péptido CDR3) o un péptido restringido FR3-CDR3-FR4. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos con dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (p. ej., nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y en general comprenderá al menos una CDR, que esté adyacente o en marco con una o más secuencias marco conservadas. En fragmentos de unión a antígenos que tienen un dominio Vh asociado con un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh - Vh, Vh - Vl o Vl - Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
En determinadas realizaciones, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido de manera covalente a al menos un dominio constante. Configuraciones no limitantes, ilustrativas, de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) Vh -Ch1; (ii) Vh -Ch2; (iii) Vh -Ch3; (iv) Vh -Ch1-Ch2; (v) Vh -Ch1-C<h>2-C<h>3; (vi) V<h>-C<h>2-C<h>3; (vii) V<h>-C<l>; (viii) V<l>-C<h>1; (ix) V<l>-C<h>2; (x) V<l>-C<h>3; (xi) V<l>-C<h>1-C<h>2; (xii) V<l>-C<h>1-C<h>2-C<h>3; (xiii) Vl -Ch2-Ch3; y (xiv) Vl -Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, que incluye cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (p. ej., 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo que da como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Por otra parte, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominios variables y constantes enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios V<h>o V<l>monoméricos (p. ej., mediante un enlace (o enlaces) disulfuro).
Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión al antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (p. ej., biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo distinto en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos divulgados en el presente documento, puede adaptarse para usar en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención utilizando técnicas rutinarias disponibles en la materia.
Preparación de anticuerpos humanos
Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos se conocen en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a la proteína C5.
Puede usarse un inmunógeno que comprenda uno cualquiera de los siguientes para generar anticuerpos contra la proteína C5. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se obtienen de ratones inmunizados con una proteína C5 nativa de longitud completa (véase, por ejemplo, GenBank número de acceso NP_001726.2) (SEQ ID NO: 355) o con ADN que codifica la proteína o el fragmento de la misma. Como alternativa, la proteína o un fragmento de la misma puede producirse usando técnicas bioquímicas convencionales y modificarse y usarse como inmunógeno. En determinadas realizaciones de la invención, el inmunógeno es un fragmento de proteína C5 que varía de aproximadamente entre los restos de aminoácidos 19-1676 de SEQ ID NO: 355.
En algunas realizaciones, el inmunógeno puede ser una proteína C5 recombinante o un fragmento de la misma expresado enL. colio en cualquier otra célula eucariota o de mamífero tal como células de ovario de hámster chino (CHO).
Utilizando la tecnología VELOCIMMUNE® (véase, por ejemplo, US 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra C5 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE® implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a locus endógenos de región constante de ratón de manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas. A continuación, el ADN se expresa en una célula capaz de expresar el anticuerpo totalmente humano.
En general, un ratón VELOCIMMUNE® se expone al antígeno de interés y se recuperan las células linfáticas (tal como linfocitos B) de los ratones que expresan los anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una estirpe celular de mieloma para preparar estirpes celulares de hibridoma inmortales y dichas estirpes celulares de hibridoma se detectan de manera sistemática y seleccionan para identificar estirpes celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera puede aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicho un anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno.
Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo totalmente humano de la invención, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Si bien la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-C5 y los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unirse a la proteína C5. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero presentan una actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Asimismo, las secuencias de ADN codificantes de anticuerpos descritas en el presente documento abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia divulgada, pero que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en el presente documento.
Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes o alternativas farmacéuticos cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, bien en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su tasa de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes porque tales diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el etiquetado, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, p. ej., el uso crónico, y se consideran médicamente irrelevantes para el fármaco estudiado en concreto.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza, o potencia.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que se conozcan dichos mecanismos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodosin vivoy/oin vitro.Las medidas de bioequivalencia incluyen, p. ej., (a) un ensayoin vivoen seres humanos u otros mamíferos, en donde se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) una pruebain vitroque se ha correlacionado con y es razonablemente predictiva de datos de biodisponibilidadin vivoen seres humanos; (c) una pruebain vivoen seres humanos u otros mamíferos en donde se mide el efecto farmacológico agudo adecuado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden construirse mediante, por ejemplo, diferentes sustituciones de restos o secuencias o eliminando secuencias o restos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden delecionarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse por otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo que comprenden cambios de aminoácidos, los cuales modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, p. ej., mutaciones que eliminan o suprimen la glucosilación.
Anticuerpos anti-C5 que comprenden variantes de Fc
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-C5 que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que potencian o reducen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, p. ej., a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-C5 que comprenden una mutación en la región C<h>2 o C<h>3 del dominio Fc, en donde la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (p. ej., en un endosoma en donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, p. ej., una modificación en la posición 250 (p. ej., E o Q); 250 y 428 (p. ej., L o F); 252 (p. ej., L/Y/F/W o T), 254 (p. ej., S o T) y 256 (p. ej., S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (p. ej., H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (p. ej., A, W, H, F o Y [N434A, N434W, N434H, N434F o N434Y]); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (p. ej., 308F, V308F) y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación en 428L (p. ej., M428L) y 434S (p. ej., N434S); una modificación en 428L, 259I (p. ej., V259I) y 308F (p. ej., V308F); una modificación en 433K (p. ej., H433K) y una modificación en 434 (p. ej., 434Y); una modificación en 252, 254 y 256 (p. ej., 252Y, 254T y 256e ); una modificación en 250Q y una modificación en 428L (p. ej., T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (p. ej., 308F o 308P). En otra realización más, la modificación comprende una modificación 265A (p. ej., D265A) y/o una modificación 297A (p. ej., N297A).
Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-C5 que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (p. ej., T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (p. ej., M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (p. ej., M428L y N434S); 257I y 3111 (p. ej., P257I y Q311I); 257I y 434H (p. ej., P257I y N434H); 376V y 434H (p. ej., D376V y N434H); 307A, 380A y 434A (p. ej., T307A, E380A y N434A); y 433K y 434F (p. ej., H433K y N434F). T odas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anteriores y otras mutaciones dentro de los dominios variables de los anticuerpos divulgados en el presente documento, se contemplan dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-C5 que comprenden una región constante de cadena pesada (C<h>) quimérica, en donde la región C<h>quimérica comprende segmentos procedentes de las regiones C<h>de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden comprender una región Ch quimérica que comprende parte o todo el dominio C<h>2 derivado de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, en combinación con parte o la totalidad de un dominio Ch3 derivado de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. De acuerdo con determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región C<h>quimérica que tiene una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de aminoácidos de "bisagra superior" (restos de aminoácidos de las posiciones 216 a 227 de acuerdo con la numeración EU) derivada de una región bisagra de una IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana, en combinación con una secuencia "bisagra inferior" (restos de aminoácidos de las posiciones 228 a 236 de acuerdo con la numeración EU) derivada de una región bisagra de una IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana. De acuerdo con determinadas realizaciones, la región bisagra quimérica comprende restos de aminoácidos procedentes de una bisagra superior de IgG1 humana o IgG4 humana y restos de aminoácidos procedentes de una bisagra inferior de IgG2 humana. Un anticuerpo que comprende una región Ch quimérica como se describe en el presente documento puede, en determinadas realizaciones, presentar funciones efectoras de Fc modificadas sin afectar negativamente a las propiedades terapéuticas o farmacocinéticas del anticuerpo. (Véanse, p. ej., la publicación de solicitud de patente de EE. UU. 2014/0243504).
Características biológicas de los anticuerpos
En general, los anticuerpos de la presente invención actúan uniéndose a la proteína C5 e impidiendo su división en C5a y C5b. Por ejemplo, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden unirse a la proteína C5 (p. ej., a 25 °C o a 37 °C) con una Kd inferior a 9 nM medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden unirse a C5 con una Kd inferior a aproximadamente 9 nM, inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 2 nM, inferior a aproximadamente 1 nM, inferior a aproximadamente 500 pM, inferior a 250 pM o inferior a 100 pM, medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden unirse a la proteína C5 humana con una semivida disociativa (t1^ ) superior a aproximadamente 2 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C, p. ej., mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 4 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden unirse a la proteína C5 con un t12 superior a aproximadamente 5 minutos, superior a aproximadamente 10 minutos, superior a aproximadamente 30 minutos, superior a aproximadamente 50 minutos, superior a aproximadamente 100 minutos, superior a aproximadamente 150 minutos, superior a aproximadamente 200 minutos o superior a aproximadamente 250 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C, p. ej., mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 3 en el presente documento (p. ej., formato de captura de Acm o captura de antígeno) o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos de los mismos descritos en el presente documento pueden unirse a la proteína C5 humana con una semivida disociativa (t1^ ) superior a aproximadamente 1,5 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial a 37 °C, p. ej., mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 4 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden unirse a la proteína C5 con un t1^ superior a aproximadamente 2 minutos, superior a aproximadamente 5 minutos, superior a aproximadamente 10 minutos, superior a aproximadamente 25 minutos, superior a aproximadamente 50 minutos, superior a aproximadamente 100 minutos, superior a aproximadamente 150 minutos o superior a aproximadamente 200 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial a 37 °C, p. ej., mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 3 en el presente documento (p. ej., formato de captura de Acm o captura de antígeno) o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden unirse a la proteína C5 mono (p. ej., a 25 °C o a 37 °C) con aproximadamente K<d>inferior a 120 nM medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos pueden unirse a C5 de mono con una Kd inferior a aproximadamente 120 nM, inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 50 nM, inferior a aproximadamente 25 nM, inferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 1 nM, inferior a aproximadamente 500 pM o inferior a 250 pM, medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden unirse a la proteína C5 humana modificada con el cambio R885H (ejemplificada por SEQ ID NO: 356) con una Kd inferior a 70 nM medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento. Las variantes de C5 han mostrado una respuesta deficiente a los anticuerpos anti-C5 divulgados previamente en la técnica (p. ej., Nishimura et al., 2014, New Engl. J. Med. 370: 632-639). Los anticuerpos o sus fragmentos de unión a antígenos pueden unirse a la C5 humana modificada con una Kd inferior a aproximadamente 65 nM, inferior a aproximadamente 50 nM, inferior a aproximadamente 20 nM, inferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 3 nM o inferior a 2 nM, medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden unirse a la proteína C5 humana modificada con el cambio R885C (ejemplificada por SEQ ID NO: 357) con una Kd inferior a 160 nM medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento. Las variantes de C5 han mostrado una respuesta deficiente a los anticuerpos anti-C5 divulgados previamente en la técnica (p. ej., Nishimura et al., 2014, New Engl. J. Med. 370: 632-639). Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos pueden unirse a la C5 humana modificada con una K<d>inferior a aproximadamente 150 nM, inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 50 nM, inferior a aproximadamente 20 nM, inferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 5 nM o inferior a 2 nM, medida por resonancia de plasmón superficial, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden inhibir la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) con una CI<50>inferior a 10 nM medida mediante un ensayo de luminiscencia, p. ej., usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 del presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos pueden inhibir la CDC con una CI<50>inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 3,5 nM o inferior a aproximadamente 2 nM, medida mediante un ensayo de luminiscencia de linfocitos B, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos descritos en el presente documento pueden bloquear la hemólisis humana mediada por C5 de la vía clásica (VC) en más del 94 % y con una CI<50>inferior a 6 nM, medida mediante un ensayo de hemólisis de la VC, p. ej., usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 del presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos pueden bloquear la hemólisis de la VC con una CI<50>inferior a aproximadamente 6 nM, inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 4 nM, inferior a aproximadamente 3 nM o inferior a aproximadamente 2 nM, según las mediciones del ensayo de hemólisis de la VC, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden bloquear la hemólisis de la vía alternativa (VA) mediada por C5 humana en más de un 70 % y con una CI<50>inferior a 165 nM, según lo medido por un ensayo de hemólisis de la VA, p. ej., usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 del presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden bloquear la hemólisis de la VA con una CI<50>inferior a aproximadamente 160 nM, inferior a aproximadamente 150 nM, inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 50 nM o inferior a aproximadamente 20 nM, según las mediciones del ensayo de hemólisis de la VA, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos descritos en el presente documento pueden bloquear la hemólisis de la vía clásica (VC) mediada por C5 del mono verde africano en más de un 40 % y con una CI<50>inferior a 185 nM, medida mediante un ensayo de hemólisis de la VC, p. ej., usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 del presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos pueden bloquear la hemólisis de la VC con una CI<50>inferior a aproximadamente 180 nM, inferior a aproximadamente 150 nM, inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 75 nM o inferior a aproximadamente 50 nM, según las mediciones del ensayo de hemólisis de la VC, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos descritos en el presente documento pueden bloquear la hemólisis mediada por la vía alternativa (VA) del C5 del mono verde africano con una CI<50>inferior a 235 nM, según lo medido por un ensayo de hemólisis de la VA, p. ej., usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 del presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos pueden bloquear la hemólisis de la VA con una CI<50>inferior a aproximadamente 200 nM, inferior a aproximadamente 150 nM, inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 50 nM o inferior a aproximadamente 20 nM, según las mediciones del ensayo de hemólisis de la VA, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos descritos en el presente documento pueden bloquear más del 90 % de la hemólisis mediada por C5 de la vía clásica (VC) del macaco cangrejero con una CI<50>inferior a 145 nM, medida mediante un ensayo de hemólisis de la VC, p. ej., usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 del presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos pueden bloquear la hemólisis de la VC con una CI<50>inferior a aproximadamente 140 nM, inferior a aproximadamente 120 nM, inferior a aproximadamente 100 nM, inferior a aproximadamente 75 nM o inferior a aproximadamente 50 nM, según las mediciones del ensayo de hemólisis de la VC, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos descritos en el presente documento pueden bloquear la hemólisis mediada por C5 de la vía alternativa (VA) del macaco cangrejero con una CI<50>inferior a 30 nM, según lo medido por un ensayo de hemólisis de la VA, p. ej., usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 del presente documento. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos de los mismos pueden bloquear la hemólisis de la VA con una CI<50>inferior a aproximadamente 25 nM, inferior a aproximadamente 20 nM, inferior a aproximadamente 10 nM, inferior a aproximadamente 5 nM o inferior a aproximadamente 2 nM, según las mediciones del ensayo de hemólisis de la VA, p. ej., utilizando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 8 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígenos descritos en el presente documento pueden mostrar propiedades farmacocinéticas (FC) y farmacodinámicas (FD) mejoradas en comparación con los anticuerpos anti-C5 de la técnica. Los anticuerpos anti-C5 descritos en el presente documento muestran una menor susceptibilidad a la depuración mediada por la diana tras su administración, como se muestra en los Ejemplos 9 y 10 del presente documento. Los anticuerpos anti-C5 y fragmentos de unión a antígenos de los mismos pueden mostrar concentraciones séricas durante períodos prolongados, p. ej., más de 20 días, más de 25 días, más de 30 días, más de 35 días, más de 40 días, más de 45 días, más de 50 días, más de 55 días o más de 60 días, como se describe en los Ejemplos 9 y 10 del presente documento. Los anticuerpos anti-C5 pueden mostrar una semivida sérica prolongada de más de 10 días, en comparación con los anticuerpos anti-C5 de la técnica.
Los anticuerpos anti-C5 y fragmentos de unión a antígenos de los mismos pueden tener una alta afinidad por la C5 humana (p. ej., K<d>inferior a 0,3 nM) y una depuración menor (p. ej., semivida sérica prolongada, actividad farmacodinámica mejorada durante más días que los anticuerpos anti-C5 conocidos hasta ahora). Dichos anticuerpos pueden utilizarse ventajosamente con una dosificación menos frecuente en un sujeto con una enfermedad o trastorno asociado a C5.
En un caso, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo recombinante aislado o a un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína C5, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (a) es un anticuerpo monoclonal completamente humano; (b) se une a C5 humana con una constante de disociación (Kd) inferior a 0,9 nM a 25 °C, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (c) se une a C5 humana con una K<d>inferior a 0,3 nM a 37 °C, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (d) tiene una concentración sérica superior a 10 pg/ml hasta el día 70 tras su administración al macaco cangrejero; (e) bloquea la hemólisis de la VC y la VA hasta el día 35 tras su administración al macaco cangrejero, medida en un ensayo de hemólisisex vivo;(f) tiene una semivida sérica superior a 10 días en el macaco cangrejero; (g) tiene una concentración sérica superior a 10 pg/ml hasta el día 40 tras su administración a ratones humanizados para C5; (h) bloquea la hemólisis de la VC hasta el día 30 tras su administración a ratones humanizados para C5, medida en un ensayo de hemólisisex vivo;y (i) tiene una semivida sérica de más de 10 días en ratones humanizados para C5.
En un caso, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo recombinante aislado o a un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína C5, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo presenta una o más de las siguientes características: (a) es un anticuerpo monoclonal completamente humano; (b) se une a C5 humana con una constante de disociación (Kd) inferior a 0,9 nM a 25 °C, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (c) se une a C5 humana con una Kd inferior a 0,3 nM a 37 °C, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (d) se une a C5 de mono con una Kd inferior a 65 nM, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (e) se une a la variante de C5 humana R885H (SEQ ID NO: 356) con una K<d>inferior a 0,5 nM, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (f) se une a la variante de C5 humana R885C (SEQ ID NO: 357) con una K<d>inferior a 0,5 nM, medida en un ensayo con resonancia de plasmón superficial; (g) bloquea la hemólisis de la vía clásica (VC) mediada por C5 humana en más del 95 % y con una CI<50>inferior a 6 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VC; (h) bloquea la hemólisis de la vía alternativa (VA) mediada por C5 humana en más del 70 % y con CI<50>inferior a 165 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VA; (i) inhibe la hemólisis de la VC mediada por C5 del mono verde africano con una CI<50>inferior a 185 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VC; (j) inhibe la hemólisis de la VA mediada por C5 del mono verde africano con una CI<50>inferior a 235 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VA; (k) inhibe la hemólisis de la VC mediada por C5 del macaco cangrejero con una CI<50>inferior a 145 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VC; y (l) inhibe la hemólisis de la VA mediada por C5 del macaco cangrejero con CI<50>inferior a 30 nM, medida en un ensayo de hemólisis de la VA.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden poseer una o más de las características biológicas mencionadas, o cualquier combinación de las mismas. Otras características biológicas de los anticuerpos descritos en el presente documento serán evidentes para los expertos habituales en la materia a partir de una revisión de la presente divulgación, incluidos los ejemplos de trabajo expuestos en el presente documento.
Cartografía de epítopos y tecnologías relacionadas
La presente invención se refiere a anticuerpos anti-C5 que interactúan con uno o más aminoácidos que se encuentran dentro de una o más regiones de la molécula de proteína C5, incluyendo, el polipéptido alfa y el polipéptido beta. El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una única secuencia contigua de 3 o más (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos situados dentro de cualquiera de los dominios mencionados de la molécula de proteína C5 (p. ej. un epítopo lineal en un dominio). Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) situados dentro de uno o ambos de los dominios mencionados de la molécula de proteína (p. ej. un epítopo conformacional).
Pueden usarse diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas ilustrativas incluyen, por ejemplo, ensayos de bloqueo cruzado habituales, tales como los descritos en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Otros métodos incluyen análisis mutacionales de barrido de alanina, análisis de hibridación de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), análisis de escisión de péptidos, estudios cristalográficos y análisis por RMN. Adicionalmente, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). Otro método que puede utilizarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. Seguidamente, el complejo proteína/anticuerpo se transfiere al agua y los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que están protegidos por el complejo del anticuerpo experimentan un intercambio inverso de deuterio a hidrógeno a una velocidad más lenta que los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que no forman parte de la interfaz. Como resultado, los aminoácidos que forman parte de la interfaz proteína/anticuerpo pueden conservar deuterio y, por lo tanto, presentan una masa relativamente mayor en comparación con los aminoácidos no incluidos en la interfaz. Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana es sometida a escisión por proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, p. ej., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.
El término "epítopo"se refiere a un lugar sobre un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. Los epítopos de linfocitos B pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como a partir de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se conservan con la exposición con disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario normalmente se pierden al tratarlos con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
El perfilado asistido por modificación (MAP,Modification-Assisted Profiling),también conocido como perfilado de anticuerpos basado en la estructura del antígeno (ASAP,Antigen Structure-based Antibody Profiling)es un método que categoriza grandes números de anticuerpos monoclonales (Acm) dirigidos contra el mismo antígeno según las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies de antígenos modificadas química o enzimáticamente (véase el documento US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítopo exclusivo diferente o parcialmente superpuesto con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización puede centrarse en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica al cribado de hibridomas, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridomas raros que producen Acm que tienen las características deseadas. MAP se puede usar para clasificar los anticuerpos de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.
Los anticuerpos anti-C5 o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento pueden unirse a un epítopo dentro de cualquiera de las regiones ejemplificadas en la proteína C5, ya sea en forma natural, como se ejemplifica en SEQ ID NO: 355, o producida recombinantemente, o a un fragmento de la misma. Los anticuerpos pueden unirse a una región que comprenda uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 19-1676 de la proteína C5 humana.
Los anticuerpos pueden interactuar con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en restos de aminoácidos que van desde aproximadamente la posición 19 hasta aproximadamente la posición 750; o restos de aminoácidos que varían desde aproximadamente la posición 751 hasta aproximadamente la posición 1676 de la SEQ ID NO: 355.
Los anticuerpos anti-C5 y sus fragmentos de unión a antígenos pueden interactuar con uno o más epítopos que se encuentran dentro de la cadena alfa y/o beta de C5 (SEQ ID NO: 359). El epítopo o epítopos pueden consistir en una o más secuencias contiguas de 3 o más (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos ubicados dentro de la cadena alfa y/o beta de C5. Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) ubicados dentro de la C5. Como se muestra en el Ejemplo 11 del presente documento, el epítopo de C5 con el que interactúa el anticuerpo de la invención H4H12166P se define por: (i) la secuencia de aminoácidos NMATGMd Sw (SEQ ID NO: 360) que corresponde a los aminoácidos 591 a 599 comprendidos en la cadena beta de SEQ ID NO: 359; y (ii) la secuencia de aminoácidos WEVHLVPRRKQLQFALPDSL (SEQ ID NO: 361), que corresponde a los aminoácidos 775 a 794 comprendidos en la cadena alfa de SEQ ID NO: 359. Por consiguiente, los anticuerpos anti-C5 pueden interactuar con uno o más aminoácidos contenidos dentro de la región que consiste en (i) la secuencia de aminoácidos NMATGMDSW (SEQ ID NO: 360), que corresponde a los aminoácidos 591 a 599 de SEQ ID NO: 359; y (ii) la secuencia de aminoácidos WEVHLVPRRKQLQFALPDSL (SEQ ID NO: 361), que corresponde a los aminoácidos 775 a 794 de SEQ ID NO: 359.
La presente divulgación incluye anticuerpos anti-C5 que se unen al mismo epítopo, o una porción del epítopo, como cualquiera de los anticuerpos específicos de ejemplo enumerados en la Tabla 1. Asimismo, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-C5 que compiten por la unión a la proteína C5 o a un fragmento de la misma con cualquiera de los anticuerpos de ejemplo específicos enumerados en la Tabla 1. Por ejemplo, anticuerpos anti-C5 que compitan de forma cruzada por la unión a la proteína C5 con uno o más anticuerpos de los enumerados en la Tabla 1.
Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-C5 de referencia usando métodos habituales conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-C5 de referencia, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido C5 en condiciones de saturación. Seguidamente, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de prueba de unirse a la molécula de proteína C5. Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a C5 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-C5 de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-C5 de referencia. Por otra parte, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse a la proteína C5 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-C5 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se une el anticuerpo anti-C5 de referencia.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-C5 de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína C5 en condiciones de saturación seguido por evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de C5. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula C5 en condiciones de saturación seguido por evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de C5. Si, en ambas orientaciones, únicamente el primer anticuerpo (de saturación) puede unirse a la molécula de C5, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a C5. Como apreciará un experto habitual en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede que no se una necesariamente al epítopo idéntico al anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o epítopos solapantes si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro al antígeno. Es decir, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso 99 % medido en un ensayo de unión competitiva (véase, p. ej., Junghanset al.,Cancer Res. 199050:1495-1502). Como alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
A continuación, puede llevarse a cabo experimentación rutinaria adicional (p. ej., mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la falta de unión del anticuerpo de prueba observada se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, resonancia de plasmón superficial, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la materia.
Inmunoconjugados
La invención abarca un anticuerpo monoclonal anti-C5 humana conjugado con una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), para tratar una enfermedad o trastorno asociado a C5 (p. ej., síndrome urémico hemolítico atípico). Como se usa en el presente documento, el término "inmunoconjugado" se refiere a un anticuerpo que está unido química o biológicamente a un agente radiactivo, una citocina, un interferón, un resto diana o indicador, una enzima, un péptido o proteína o un agente terapéutico. El anticuerpo puede estar unido al agente radiactivo, citocina, interferón, resto diana o indicador, enzima, péptido o agente terapéutico en cualquier lugar a lo largo de la molécula siempre que sea capaz de unirse a su diana. Los ejemplos de inmunoconjugados incluyen conjugados anticuerpofármaco y proteínas de fusión anticuerpo-toxina. El agente puede ser un segundo anticuerpo diferente contra la proteína C5. El tipo de resto terapéutico que se puede conjugar con el anticuerpo anti-C5 tendrá en cuenta la afección a tratar y el efecto terapéutico deseado a lograr. En la técnica se conocen ejemplos de agentes adecuados para formar inmunoconjugados; véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081.
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecífico o multiespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véanse, p. ej., Tuttet al.,1991, J. Immunol. 147:60-69; Kuferet al.,2004, Trends Biotechnol. 22:238-244.
Cualquiera de las moléculas de unión a antígeno multiespecíficas de la invención, o variantes de las mismas, pueden construirse utilizando técnicas biológicas moleculares convencionales (p. ej., ADN recombinante y tecnología de expresión de proteínas), como sabrá un experto habitual en la materia.
Los anticuerpos específicos de C5 pueden generarse en un formato biespecífico (un "biespecífico") en el que las regiones variables que se unen a dominios distintos de la proteína C5 se unen entre sí para conferir especificidad de doble dominio dentro de una única molécula de unión. Los biespecíficos diseñados adecuadamente pueden mejorar la eficacia inhibidora global de la proteína C5 al aumentar tanto la especificidad como la avidez de unión. Las regiones variables con especificidad para dominios individuales, (p. ej., segmentos del dominio N-terminal) o que pueden unirse a diferentes regiones dentro de un dominio, se emparejan en un armazón estructural que permite que cada región se una simultáneamente a los epítopos separados, o a diferentes regiones dentro de un dominio. En un ejemplo de un biespecífico, las regiones variables de la cadena pesada (V<h>) de un ligante con especificidad para un dominio se recombinan con regiones variables de la cadena ligera (V<l>) a partir de una serie de ligantes con especificidad para un segundo dominio para identificar parejas V<l>no afines que se pueden emparejar con una V<h>original sin alterar la especificidad original para esa Vh. De este modo, un único segmento Vl (p. ej., Vl1) puede combinarse con dos dominios Vh diferentes (p. ej., Vh1 y Vh2) para generar un biespecífico que comprende dos "brazos" de unión (Vh1-Vl1 and Vh2-Vl1). El uso de un solo segmento de Vl reduce la complejidad del sistema y, por lo tanto, simplifica y aumenta la eficiencia en los procesos de clonación, expresión y purificación utilizados para generar el biespecífico (véase, por ejemplo, USSN13/022759 y US2010/0331527).
Como alternativa, los anticuerpos que se unen a más de un dominio y una segunda diana, tal como, pero sin limitación, por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-C5 diferente, pueden prepararse en un formato biespecífico usando técnicas descritas en el presente documento, u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. Las regiones variables de anticuerpos que se unen a regiones distintas pueden unirse junto con regiones variables que se unen a sitios relevantes en, por ejemplo, el dominio extracelular de C5, para conferir especificidad de antígeno doble dentro de una única molécula de unión. Los biespecíficos adecuadamente diseñados de esta naturaleza cumplen una doble función. Las regiones variables con especificidad para el dominio extracelular se combinan con una región variable con especificidad del exterior del dominio extracelular y se emparejan en un armazón estructural que permite que cada región variable se una a los antígenos separados.
Un formato de anticuerpo biespecífico de ejemplo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio C<h>3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R según la numeración EU). El segundo C<h>3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C<h>3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356<e>, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Dentro del alcance de la presente invención se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Otros formatos biespecíficos ilustrativos que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, p. ej., formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, "botón en ojal", cadena ligera común (p. ej., cadena ligera común con botones en ojales, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, p. ej., Kleinet al.2012, Acm 4:6, 1-11, y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores). Además, pueden construirse anticuerpos biespecíficos utilizando conjugación de péptido/ácido nucleico, p. ej., en donde se usan aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal para generar conjugados de anticuerpo-oligonucleótido específicos de sitio que después se autoensamblan en complejos multiméricos con composición, valencia y geometría definidas. (Véanse, p. ej., Kazaneet al.,J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4 de diciembre de 2012]).
Administración terapéutica y formulaciones
La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-C5 o fragmentos de unión a antígenos de los mismos de la presente invención. Las composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención se administrarán con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares. Se puede encontrar una multitud de formulaciones adecuadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powellet al."Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
La dosis de anticuerpo puede variar dependiendo de la edad y la estatura de un sujeto a recibir la administración, la enfermedad diana, afecciones, la vía de administración y similares. Cuando un anticuerpo de la presente invención se usa para tratar una enfermedad o trastorno en un paciente adulto, o para prevenir dicha enfermedad, es ventajoso administrar el anticuerpo de la presente invención, normalmente en una única dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 80, de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 o de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención puede administrarse como una dosis inicial de al menos aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 800 mg, aproximadamente 1 a aproximadamente 600 mg, aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg o aproximadamente 10 a aproximadamente 400 mg. En determinadas realizaciones, la dosis inicial puede ir seguida de la administración de una segunda o una pluralidad de dosis posteriores del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en una cantidad que puede ser aproximadamente la misma o menor que la de la dosis inicial, en donde las dosis posteriores están separadas por al menos 1 día a 3 días; al menos una semana, al menos 2 semanas; al menos 3 semanas; al menos 4 semanas; al menos 5 semanas; al menos 6 semanas; al menos 7 semanas; al menos 8 semanas; al menos 9 semanas; al menos 10 semanas; al menos 12 semanas; o al menos 14 semanas.
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden utilizarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, p. ej., encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, p. ej., Wuet al.(1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (p. ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. La composición farmacéutica también puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase, por ejemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533).
El uso de nanopartículas para administrar los anticuerpos de la presente invención también se contempla en el presente documento. Las nanopartículas conjugadas con anticuerpo pueden usarse tanto para aplicaciones terapéuticas como de diagnóstico. Las nanopartículas conjugadas con anticuerpo y los métodos de preparación y uso se describen en detalle por Arruebo, M.,et al.2009 ("Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications" in J. Nanomat. volumen 2009, Artículo ID 439389, 24 páginas, doi: 10.1155/2009/439389). Las nanopartículas se pueden desarrollar y conjugar con anticuerpos contenidos en composiciones farmacéuticas dirigidas contra las células diana. También se han descrito nanopartículas para el suministro de fármacos en, por ejemplo, los documentos US 8257740 o US 8246995, cada uno de ellos incorporado en el presente documento en su totalidad.
En determinadas situaciones, la composición farmacéutica se puede administrar en un sistema de liberación controlada. Se puede usar una bomba. Se pueden usar materiales poliméricos. Se puede colocar un sistema de liberación controlada próximo a la diana de la composición, siendo necesaria, por lo tanto, solo una fracción de la dosis sistémica.
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutánea, intracutánea, intracraneal, intraperitoneales e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse mediante métodos conocidos por el público en general. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, p. ej., disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que puede utilizarse junto con un agente de solubilización apropiado, tal como un alcohol (p. ej., etanol), un polialcohol (p. ej., propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [p. ej., polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplea, p. ej., aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que puede usarse junto con un agente solubilizante, tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se carga preferentemente en una ampolla apropiada.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Adicionalmente, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo de administración de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo de administración de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de administración de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y sustituirse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo de administración de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo de administración de pluma desechable, no hay cartucho sustituible. Más bien, el dispositivo de administración de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha todo el dispositivo.
Numerosos dispositivos inyectores de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero ciertamente sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRo NiC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma b D™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTlPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Algunos ejemplos de dispositivos inyectores de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero ciertamente sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (Sanofi-Aventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y el KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK ™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET ™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA ™ (Abbott Labs, Abbott Park, IL), por nombrar solo algunos.
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 300 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 300 mg para las otras formas farmacéuticas.
Usos terapéuticos de los anticuerpos
Los anticuerpos descritos en el presente documento son útiles para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno o afección asociada con C5 y/o para mejorar al menos un síntoma asociado con dicha enfermedad, trastorno o afección. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo descrito en el presente documento puede administrarse a una dosis terapéutica a un paciente con una enfermedad o trastorno o afección asociada a C5.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención son útiles para tratar o prevenir un síntoma o indicación del síndrome urémico hemolítico atípico (SHUa). Los síntomas e indicios del SHUa incluyen, pero no se limitan a, activación plaquetaria, hemólisis, microangiopatía trombótica sistémica (formación de coágulos sanguíneos en pequeños vasos sanguíneos de todo el cuerpo) que provoca un ictus, infarto de miocardio, insuficiencia renal y/o muerte, enfermedad renal terminal, daño renal permanente, dolor abdominal, confusión, edema, cansancio, náuseas/vómitos, diarrea y anemia microangiopática.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención son útiles para tratar o prevenir un síntoma o indicación de hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). Los síntomas e indicios de la HPN incluyen, pero no se limitan a, destrucción de los glóbulos rojos, trombosis (incluyendo trombosis venosa profunda, embolia pulmonar), anemia hemolítica intravascular, decoloración roja de la orina, síntomas de anemia tales como cansancio, dificultad para respirar y palpitaciones, dolor abdominal y dificultad para tragar.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención son útiles para tratar o prevenir al menos un síntoma o indicación de una enfermedad o trastorno asociado a C5 seleccionado del grupo que consiste en trastornos neurológicos, trastornos renales, esclerosis múltiple, accidente cerebrovascular, síndrome de Guillain-Barre, traumatismo craneoencefálico, enfermedad de Parkinson, trastornos de activación inadecuada o indeseable del complemento, complicaciones por hemodiálisis, rechazo de aloinjerto hiperagudo, rechazo de xenoinjerto, toxicidad inducida por interleucina-2 durante terapia con IL-2, trastornos inflamatorios, inflamación de enfermedades autoinmunitarias, enfermedad de Crohn, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, lesiones térmicas incluyendo quemaduras o congelación, afecciones por reperfusión post-isquémica, infarto de miocardio, síndrome de fuga capilar, obesidad, diabetes, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, accidente cerebrovascular, epilepsia, ateroesclerosis, vasculitis, penfigoide ampolloso, glomerulopatía C3, glomerulonefritis membranoproliferativa, angioplastia con balón, síndrome post-bomba en derivación cardiopulmonar o derivación renal, por hemodiálisis, isquemia renal, reperfusión de la arteria mesentérica después de la reconstrucción aórtica, enfermedad infecciosa o sepsis, trastornos del complejo inmunitario y enfermedades autoinmunitarias, nefropatía diabética, síndrome de Alport, insuficiencia renal progresiva, enfermedades renales proteinúricas, lesión renal por isquemia-reperfusión, nefritis por lupus, glomerulopatía, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis por LES, nefritis membranoproliferativa, anemia hemolítica, neuromielitis óptica, trasplante renal, deficiencia hereditaria de CD59, psoriasis y miastenia grave. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser útiles para tratar o prevenir al menos un síntoma o indicación de una enfermedad o trastorno asociado a C5 seleccionado del grupo que consiste en enfermedades y trastornos pulmonares tales como disnea, hemoptisis, SDRA, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, embolias e infartos pulmonares, neumonía, enfermedades por polvo fibrógeno, lesiones debidas a polvos finos y minerales inertes (p. ej., silicio, polvo fino de carbón, berilio y amianto), fibrosis pulmonar, enfermedades por polvo orgánico, lesión química (debido a gases irritantes y productos químicos, por ejemplo, cloro, fosgeno, dióxido de azufre, sulfuro de hidrógeno, dióxido de nitrógeno, amoníaco y ácido clorhídrico), lesión por humo, lesiones térmicas (p. ej., quemadura, congelación), asma, alergia, broncoconstricción, neumonitis por hipersensibilidad, enfermedades parasitarias, síndrome de Goodpasture, vasculitis pulmonar, angioedema hereditario e inflamación asociada a complejos inmunitarios.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser útiles para tratar a sujetos que padecen una enfermedad ocular tal como degeneración macular asociada a la edad (DMAE), edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética, angiogénesis ocular (neovascularización ocular que afecta al tejido coroideo, corneal o retiniano), atrofia geográfica (AG), uveítis y neuromielitis óptica. Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para tratar o mejorar al menos un síntoma o indicación de la DMAE seca o la DMAE húmeda. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser útiles para prevenir o ralentizar la pérdida de visión. En una realización, los anticuerpos de la presente invención son útiles para reducir las drusas en el ojo de un sujeto con DMAE seca. En una realización, los anticuerpos de la presente invención son útiles para prevenir o reducir/retrasar la pérdida de visión en un sujeto con DMAE.
Uno o más anticuerpos descritos en el presente documento pueden administrarse para aliviar o prevenir o disminuir la gravedad de uno o más de los síntomas o afecciones/indicaciones de la enfermedad o trastorno ocular. Los anticuerpos pueden utilizarse para mejorar o reducir la gravedad de al menos un síntoma, incluyendo, pero sin limitarse a la pérdida de visión, distorsión visual, dificultad para adaptarse a niveles bajos de luz, visión central torcida, aumento de la turbidez de la visión central o global, presencia de drusas (pequeñas acumulaciones de material extracelular que se acumulan en la retina), cambios pigmentarios, visión distorsionada en forma de metamorfopsia, en la que una cuadrícula de líneas rectas aparece ondulada y partes de la cuadrícula pueden aparecer en blanco, cambios exudativos (hemorragias en el ojo, exudados duros, líquido subretiniano/sub-EPR/intrarretiniano), lenta recuperación de la función visual tras la exposición a la luz brillante (prueba de fotoestrés), atrofia incipiente y geográfica, agudeza visual que disminuye drásticamente (dos niveles o más), p. ej., de 20/20 a 20/80, cambios de perimetría de hiperagudeza preferenciales (para DMAE húmeda), visión borrosa, pérdida gradual de la visión central (para las personas con degeneración macular no exudativa, rápida aparición de la pérdida de visión (a menudo provocada por fugas y hemorragias de vasos sanguíneos anormales en sujetos con degeneración macular exudativa, escotomas centrales (sombras o áreas faltantes de visión), problemas para discernir los colores, concretamente los oscuros de los oscuros y los claros de los claros, pérdida de sensibilidad al contraste, las líneas rectas aparecen curvadas en una cuadrícula de Amsler.
También se contempla en el presente documento utilizar uno o más anticuerpos de los descritos en el presente documento de forma profiláctica en sujetos con riesgo de desarrollar degeneración macular, tales como sujetos mayores de 50 años, sujetos con antecedentes familiares de degeneración macular, fumadores y sujetos con obesidad, colesterol alto, enfermedades cardiovasculares o una dieta poco saludable.
Los presentes anticuerpos pueden utilizarse para la preparación de una composición farmacéutica o medicamento para el tratamiento de pacientes que padezcan una enfermedad o trastorno asociado a C5. Los presentes anticuerpos pueden usarse como terapia adjunta con cualquier otro agente o cualquier otra terapia conocida por los expertos en la materia útil para tratar o mejorar una enfermedad o trastorno asociado con C5.
Politerapias
Las terapias de combinación pueden incluir un anticuerpo anti-C5 de la invención y cualquier agente terapéutico adicional que pueda combinarse de manera ventajosa con un anticuerpo de la invención, o con un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo de la invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden combinarse sinérgicamente con uno o más fármacos o terapias utilizados para tratar una enfermedad o trastorno asociado con C5. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden combinarse con un segundo agente terapéutico para mejorar uno o más síntomas de dicha enfermedad.
En función de la enfermedad o trastorno asociado al C5, los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales, entre los que se incluyen, pero sin limitación, un anticoagulante (p. ej., warfarina, ácido acetilsalicílico, heparina, fenindiona, fondaparinux, idraparinux, e inhibidores de la trombina como el argatroban, lepirudina, bivalirudina o dabigatrán) un fármaco antiinflamatorio (p. ej., corticoesteroides y fármacos antiinflamatorios no esteroideos), un antihipertensivo (p. ej., un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina, un agente inmunosupresor (p. ej., vincristina, ciclosporina A o metotrexato), un agente fibrinolítico (p. ej., ancrod, ácido £-aminocaproico, antiplasmina-ai, prostaciclina y defibrotida), un agente hipolipemiante, tal como un inhibidor de la hidroximetilglutaril CoA reductasa, un agente anti-CD20 tal como rituximab, un agente anti-TNF tal como infliximab, un agente anticonvulsivo (p. ej., sulfato de magnesio), un inhibidor de C3 o un agente antitrombótico.
En determinadas realizaciones, el segundo agente terapéutico es otro anticuerpo contra la proteína C5. En el presente documento, se contempla el uso de una combinación ("cóctel") de anticuerpos con amplia actividad de neutralización o inhibición frente a C5. En algunas realizaciones, los anticuerpos no competidores pueden combinarse y administrarse a un sujeto que los necesite. En algunas realizaciones, los anticuerpos que componen la combinación se unen a epítopos distintos no solapados de la proteína. Los anticuerpos que comprenden la combinación pueden bloquear la unión de C5 a la convertasa de C5 y/o pueden prevenir/inhibir la escisión de C5 en C5a y C5b. En determinadas realizaciones, el segundo anticuerpo puede poseer una semivida más larga en el suero humano.
Como se usa en el presente documento, la expresión "en combinación con" significa que puede(n) administrarse componente(s) terapéuticamente activo(s) adicional(es) antes de, simultáneamente con o después de la administración del anticuerpo anti-C5 de la presente invención. La expresión "junto con" también incluye la administración secuencial o concomitante de un anticuerpo anti-C5 y un segundo agente terapéutico.
El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales se pueden administrar a un sujeto antes de la administración de un anticuerpo anti-C5 de la presente invención. Por ejemplo, se puede considerar que un primer componente se administra "antes" de un segundo componente si el primer componente se administra 1 semana antes, 72 horas antes, 60 horas antes, 48 horas antes, 36 horas antes, 24 horas antes, 12 horas antes, 6 horas antes, 5 horas antes, 4 horas antes, 3 horas antes, 2 horas antes, 1 hora antes, 30 minutos antes, 15 minutos antes, 10 minutos antes, 5 minutos antes, o menos de 1 minuto antes de la administración del segundo componente. En otras realizaciones, el componente o componentes terapéuticamente activos adicionales se pueden administrar a un sujeto después de la administración de un anticuerpo anti-C5 de la presente invención. Por ejemplo, se puede considerar que un primer componente se administra "después" de un segundo componente si el primer componente se administra 1 minuto después, 5 minutos después, 10 minutos después, 15 minutos después, 30 minutos después, 1 hora después, 2 horas después, 3 horas después, 4 horas después, 5 horas después, 6 horas después, 12 horas después, 24 horas después, 36 horas después, 48 horas después, 60 horas después, 72 horas después de la administración del segundo componente. Aún en otras realizaciones, el componente o componentes terapéuticamente activos adicionales se pueden administrar a un sujeto concurrente con la administración de un anticuerpo anti-C5 de la presente invención. La administración "concurrente", a efectos de la presente invención, incluye, p. ej., la administración de un anticuerpo anti-C5 y un componente terapéuticamente activo adicional a un sujeto en una forma de dosificación única, o en formas de dosificación separadas administradas al sujeto en aproximadamente 30 minutos o menos entre sí. Si se administran en formas de dosificación separadas, cada forma farmacéutica puede administrarse por la misma vía (p. ej., tanto el anticuerpo anti-C5 como el componente terapéuticamente activo adicional pueden administrarse por vía intravenosa, etc.); como alternativa, cada forma de dosificación puede administrarse por una vía diferente (p. ej., el anticuerpo anti-C5 se puede administrar por vía intravenosa, y el componente terapéuticamente activo se puede administrar por vía oral). En cualquier caso, la administración de los componentes en una única forma de dosificación, en formas de dosificación separadas por la misma vía, o en formas de dosificación separadas por vías diferentes, se consideran "administración concurrente", para los fines de la presente divulgación. Para los fines de la presente divulgación, la administración de un anticuerpo anti-C5 "antes de", "concurrente con", o "después" (como se definen esos términos en el presente documento anteriormente) de la administración de un componente terapéuticamente activo adicional se considera la administración de un anticuerpo anti-C5 "en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional.
La presente invención incluye composiciones farmacéuticas en las que un anticuerpo anti-C5 de la presente invención se coformula con uno o más de los componentes terapéuticamente activos adicionales como se describe en otra parte del presente documento.
Pautas posológicas
Puede administrarse una dosis única de un anticuerpo anti-C5 descrito en el presente documento (o una composición farmacéutica que comprenda una combinación de un anticuerpo anti-C5 y cualquiera de los agentes terapéuticamente activos adicionales mencionados en el presente documento) a un sujeto que lo necesite. Pueden administrarse múltiples dosis de un anticuerpo anti-C5 (o una composición farmacéutica que comprende una combinación de un anticuerpo anti-C5 y cualquiera de los agentes terapéuticamente activos adicionales mencionados en el presente documento) a un sujeto durante un transcurso de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto comprenden la administración secuencial a un sujeto de múltiples dosis de un anticuerpo anti-C5 descrito en el presente documento. Como se usa en el presente documento, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis de anticuerpo anti-C5 se administra al sujeto en un diferente punto temporal, p. ej., en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (p. ej., horas, días, semanas o meses). La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una dosis inicial única de un anticuerpo anti-C5, seguida por una o más dosis secundarias del anticuerpo anti-C5 y, opcionalmente, seguidas por una o más dosis terciarias del anticuerpo anti-C5.
Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración del anticuerpo anti-C5 descrito en el presente documento. Así pues, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio de la pauta terapéutica (también denominada "dosis de referencia"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. La dosis inicial, secundaria y terciaria pueden contener todas la misma cantidad de anticuerpo anti-C5, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinados aspectos, sin embargo, la cantidad de anticuerpo anti-C5 contenida en la dosis inicial, secundaria y/o terciaria varían entre sí (p. ej., ajustadas hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el inicio del tratamiento. En determinados aspectos, se administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4 o 5) dosis al inicio de la pauta terapéutica como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (p. ej., las "dosis de mantenimiento").
Cada dosis secundaria y/o terciaria puede administrarse entre 1 y 48 horas (p. ej., 1, 1 / , 2, 2 / , 3, 3 / , 4, 4 / , 5, 5 / , 6, 6 / , 7, 7 / , 8, 8 / , 9, 91/ 2, 10, 10 /, 11, 11 /, 12, 12y2, 13, 13 /, 14, 14y2, 15, 15y2, 16, 161/ 2, 17, 17y2, 18, 18 /, 19, 191/ 2, 20, 20 /, 21, 21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 / o más) después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se usa en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de anticuerpo anti-C5 que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis intermedias.
Los métodos de acuerdo con este aspecto pueden comprender administrar a un paciente cualquier cantidad de dosis secundarias y/o terciarias de un anticuerpo anti-C5. Por ejemplo, en determinados aspectos, solo se administra una dosis secundaria única al paciente. En otros aspectos, se administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias al paciente. Asimismo, en determinados aspectos, solo se administra una dosis terciaria única al paciente. En otros aspectos, se administran dos o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias al paciente.
La frecuencia con la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar durante el transcurso de la pauta terapéutica. La frecuencia de administración también puede ajustarla un médico en el transcurso del tratamiento, dependiendo de las necesidades del paciente individual, después de la exploración clínica.
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-C5 de la presente invención pueden usarse para detectar y/o medir C5 en una muestra, p. ej., con fines diagnósticos. Algunos aspectos contemplan el uso de uno o más anticuerpos de la presente invención en ensayos para detectar una enfermedad o trastorno asociado a C5. Los análisis de diagnóstico ilustrativos para C5 pueden comprender, p. ej., poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-C5 de la invención, en donde el anticuerpo anti-C5 está marcado con un marcador detectable o molécula indicadora o se usa como un ligando de captura para aislar selectivamente C5 de las muestras de pacientes. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo anti-C5 no marcado en aplicaciones de diagnóstico junto con un anticuerpo secundario que está marcado de forma detectable por sí mismo. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tales como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los análisis ilustrativos específicos que pueden usarse para detectar o medir C5 en una muestra incluyen el enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA,Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay),radioInmunoAnálisis (RIA) y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS,Fluorescence-Activated Cell Sorting).
Las muestras que se pueden utilizar en los ensayos de diagnóstico de C5 incluyen cualquier muestra de tejido o líquido que se pueda obtener de un paciente, que contiene cantidades detectables de proteína C5, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. En general, se medirán los niveles de proteína C5 en una muestra concreta obtenida de un paciente sano (p. ej., un paciente no aquejado de una enfermedad asociada a la C5) para establecer inicialmente un nivel de referencia, o estándar, de C5. Este nivel de referencia de C5 puede entonces compararse con los niveles de C5 medidos en muestras obtenidas de individuos sospechosos de padecer una afección asociada a C5, o síntomas asociados a dicha afección.
Los anticuerpos específicos de proteína C5 pueden no contener marcadores o restos adicionales, o pueden contener un marcador o resto aminoterminal o carboxiterminal. En un aspecto, el marcador o resto es biotina. En un ensayo de unión, la ubicación de un marcador (si lo hay) puede determinar la orientación del péptido con respecto a la superficie sobre la que se une el péptido. Por ejemplo, si una superficie está recubierta con avidina, un péptido que contiene una biotina aminoterminal se orientará de manera que la porción carboxiterminal del péptido estará distal a la superficie.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos son ilustrativos pero no limitan el alcance de las reivindicaciones.
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos humanos contra la proteína del factor 5 del complemento (C5)
Los anticuerpos humanos contra la proteína C5 se generaron en un ratón VELOCIMMUNE® que contenía ADN que codificaba las regiones variables de las cadenas pesada y ligera kappa de inmunoglobulina humana. Los ratones fueron inmunizados con proteína C5 humana purificada en suero (Calbiochem n.° de cat. 20-4888).
La respuesta inmunitaria de los anticuerpos se monitorizó mediante un inmunoanálisis específico de C5. Cuando se logró una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar estirpes celulares de hibridoma. Las estirpes celulares de hibridoma se examinaron y seleccionaron para identificar estirpes celulares que produjeran anticuerpos específicos contra el C5. Las estirpes celulares se utilizaron para obtener varios anticuerpos quiméricos anti-C5 (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); los anticuerpos de ejemplo generados de esta manera se designaron como H2M11683N y H2M11686N.
Los anticuerpos anti-C5 también se aislaron directamente de linfocitos B de ratón con expresión de antígeno sin fusión con células de mieloma, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7582298. Con este método, se obtuvieron varios anticuerpos anti-C5 completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos ilustrativos generados de esta manera se denominaron H4H12159P, H4H12161P, H4H12163P, H4H12164P, H4H12166P, H4H12167P, H4H12168P, H4H12169P, H4H12170P, H4H12171P, H4H12175P, H4H12176P2, H4H12177P2yH4H12183P2.
Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos que se exponen a continuación.
Ejemplo 2: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región variable de la cadena pesada y ligera
La Tabla 1 muestra los identificadores de la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera y las CDR de anticuerpos anti-C5 seleccionados como se divulga en el presente documento.
Tabla 1: Identificadores de secuencias de aminoácidos
continuación
En la Tabla 2 se muestran los identificadores de las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes.
Tabla 2: Identificadores de secuencias de ácidos nucleicos
continuación
Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo de Fc (p. ej., "H4H", "H2M", etc.), seguido de un identificador numérico (p. ej., "11686", "12166", "12183", etc., como se muestra en la Tabla 2), seguido de un sufijo "P", "P2", o sufijo "N". Así pues, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, p. ej., "H2M11686N", "H4H12183P2", "H4H12168P", etc. Los prefijos H4H y H2M en las designaciones de anticuerpos utilizadas en el presente documento indican el isotipo particular de la región Fc del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H4H" tiene un Fc de IgG4 humana que comprende una mutación de serina a prolina en la región bisagra (S108P) para promover la estabilización del dímero, y un anticuerpo "H2M" tiene un Fc de IgG2 de ratón (isotipo a o b) (todas las regiones variables son totalmente humanas como denota la primera 'H' en la designación del anticuerpo). Como apreciará un experto habitual en la materia, un anticuerpo que tiene un isotipo de Fc particular se puede convertir en un anticuerpo con un isotipo de Fc diferente (p. ej., un anticuerpo con una Fc de IgG1 de ratón se puede convertir en un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), que se indican mediante los identificadores numéricos que se muestran en la Tabla 2, seguirán siendo los mismos, y se espera que las propiedades de unión sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio Fc.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos seleccionados con un Fc de IgG1 de ratón se convirtieron en anticuerpos con Fc de IgG4 humana. En una realización, el dominio Fc de la IgG4 comprende 2 o más cambios de aminoácidos según se describe en el documento US20100331527.
Para generar anticuerpos mutados, se mutaron varios restos de las regiones determinantes complementarias (CDR) del H4H12166P a histidina para generar 9 anticuerpos mutados, identificados como H4H12166P2 a H4H12166P10. Se ha demostrado que las mutaciones de histidina en las CDR confieren una dependencia del pH en la unión al antígeno diana, lo que mejora la farmacocinética (Igawaet al.2010, Nat. Biotechnol. 28: 1203-1207).
Construcciones de control utilizadas en los siguientes ejemplos
Las siguientes construcciones de control (anticuerpos anti-C5) se incluyeron en los experimentos divulgados en el presente documento, con fines comparativos: "Comparador 1", un anticuerpo monoclonal contra C5 humana con secuencias V<h>/V<l>del anticuerpo "h5G1.1" de acuerdo con la patente de EE. UU. n.° 6.355.245 (Alexion Pharmaceuticals, Inc.); y "Comparador 2", un anticuerpo monoclonal humano contra la C5 humana con secuencias Vh/Vl del anticuerpo "8109" de acuerdo con la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2013/0022615 (Novartis).
Ejemplo 3: Unión de anticuerpos a C5 determinada mediante resonancia de plasmón superficial
Las constantes de disociación de equilibrio (valores de Kd) para la unión de C5 a anticuerpos anti-C5 purificados se determinaron utilizando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real en un instrumento Biacore T200. La superficie del sensor Biacore se derivatizó mediante acoplamiento de aminas con un anticuerpo Fc monoclonal de ratón antihumano (GE Healthcare, n.° BR-1008-39) para capturar anticuerpos anti-C5 expresados con regiones constantes de Fc humanas. Los estudios de unión Biacore se realizaron en tampón de funcionamiento HBST (HEPES 0,01 M a pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v. La proteína C5 humana se obtuvo de una fuente comercial (EMD). Se expresaron otros reactivos de C5 con un marcador carboxiterminal myc-mychexahistidina (posteriormente denominado C5-mmh). También se expresaron reactivos de C5 humana-mmh que contenían mutaciones puntuales de histidina y cisteína en la arginina 885 (posteriormente denominados C5 R885H-mmh y C5 R885C-mmh, respectivamente). Se inyectaron diferentes concentraciones de C5 humana, C5 humana R885H-mmh (SEQ ID NO: 356), C5 humana R885C-mmh (SEQ ID NO: 357) y C5-mmh de mono (SEQ ID NO: 358) (desde 100 nM hasta 1,23 nM, diluciones de 3 veces) preparadas en tampón de funcionamiento HBST sobre la superficie de captura del anticuerpo anti-C5 a un caudal de 30 pl/min. La asociación de todos los reactivos de C5 a cada uno de los anticuerpos monoclonales capturados se controló durante 3 minutos y su disociación en el tampón de funcionamiento HBST se controló durante 8 minutos. Todos los experimentos de cinética de unión se realizaron a 25 °C o 37 °C. Las constantes cinéticas de velocidad de asociación (k<a>) y disociación (k<d>) se determinaron ajustando los sensogramas en tiempo real a un modelo de unión 1:1 mediante elsoftwarede ajuste de curvas Scrubber 2.0c. Las constantes de disociación en equilibrio de unión (Kd) y las semividas disociativas (t1^ ) se calcularon a partir de las constantes cinéticas como:Kd (M) = kd/ka y t% (min) = ln2/(60 x kd)
En las Tablas 3 y 4 se muestran los parámetros cinéticos de unión de la C5 humana a los anticuerpos anti-C5 a 25 °C y 37 °C.
Tabla 3: Parámetros de la cinética de unión de anticuerpos monoclonales anti-C5 que se unen a C5 humana a 25 °C
Tabla 4: Parámetros de la cinética de unión de anticuerpos monoclonales anti-C5 que se unen a C5 humana a 37 °C
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La unión de C5-mmh de mono a anticuerpos anti-C5 a 25 °C y 37 °C se muestra en las Tablas 5 y 6.
Tabla 5: Parámetros cinéticos de unión de anticuerpos monoclonales anti-C5 que se unen al C5-mmh de mono a 25 °C
continuación
Tabla 6: Parámetros cinéticos de unión de anticuerpos monoclonales anti-C5 que se unen al C5-mmh de mono a 37 °C
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La unión de C5 humana R885H-mmh y C5 humana R885C-mmh a anticuerpos anti-C5 a 25 °C se muestra en las Tablas 7 y 8, respectivamente.
Tabla 7: Parámetros de la cinética de unión de anticuerpos monoclonales anti-C5 que se unen a C5 humana R885H-mmh a 25 °C
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Tabla 8: Parámetros de la cinética de unión de anticuerpos monoclonales anti-C5 que se unen a C5 humana R885C-mmh a 25 °C
La unión de C5 humana R885H-mmh y C5 humana R885C-mmh a anticuerpos anti-C5 a 37 °C se muestra en las Tablas 9 y 10, respectivamente.
Tabla 9: Parámetros de la cinética de unión de anticuerpos monoclonales anti-C5 que se unen a C5 humana R885H-mmh a 37 °C
continuación
Tabla 10: Parámetros de la cinética de unión de anticuerpos monoclonales anti-C5 que se unen a C5 humana R885C-mmh a 37 °C
continuación
A 25 °C, la totalidad de los 25 anticuerpos anti-C5 de la invención y los anticuerpos anti-C5 divulgados en el presente documento se unieron a C5 humana con valores deKdque variaban de 73 pM a 8,4 nM, como se muestra en la Tabla 3. A 37 °C, los anticuerpos anti-C5 de la invención y los anticuerpos anti-C5 divulgados en el presente documento se unieron a C5 humana con valores de Kd que variaban de 103 pM a 18,5 nM, como se muestra en la Tabla 4. A 25 °C, 25 de los 25 anticuerpos anti-C5 de la invención y anticuerpos anti-C5 divulgados en el presente documento probados se unieron alC5-mmh de mono con valores de K<d>que variaban de 133 pM a 64 nM como se muestra en la Tabla 5. A 37 °C, 25 de los 25 anticuerpos anti-C5 de la invención y anticuerpos anti-C5 divulgados en el presente documento probados se unieron alC5-mmh de mono con valores de K<d>que variaban de 133 pM a 118 nM como se muestra en la Tabla 6. A 25 °C, 16 de los 16 anticuerpos anti-C5 de la invención y anticuerpos anti-C5 divulgados en el presente documento probados se unieron a C5 humana R885H-mmh con valores de K<d>que variaban de 147 pM a 10,9 nM como se muestra en la Tabla 7. A 25 °C, 16 de los 16 anticuerpos anti-C5 de la invención y anticuerpos anti-C5 divulgados en el presente documento probados se unieron a la C5 humana R885C-mmh con valores de Kd que variaban de 251 pM a 190 nM como se muestra en la Tabla 8. A 37 °C, 16 de los 16 anticuerpos anti-C5 de la invención y anticuerpos anti-C5 divulgados en el presente documento probados se unieron a la C5 humana R885H-mmh con valores de K<d>que variaban de 1,49 nM a 69,4 nM como se muestra en la Tabla 9. A 25 °C, 16 de los 16 anticuerpos anti-C5 de la invención y anticuerpos anti-C5 divulgados en el presente documento probados se unieron a la C5 humana R885C-mmh con valores de K<d>que variaban de 1,74 nM a 159 nM como se muestra en la Tabla 10.
Ejemplo 4: Unión de anticuerpos a C5 a través de diferentes pH
Se determinó el efecto del pH en la velocidad de disociación de la C5 humana recombinante unida a anticuerpos monoclonales anti-C5 purificados mediante un biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real utilizando un instrumento Biacore T200. La superficie del sensor Biacore se derivatizó primero mediante acoplamiento de aminas con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fc humano (GE, n.° BR-1008-39) para capturar anticuerpos monoclonales anti-C5 expresados con Fc de IgG4 humana. Todos los estudios de unión Biacore se llevaron a cabo utilizando dos tampones PBS-T, pH 7,4 (Na2HPO4/NaH2PO40,01 M, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05 % v/v, ajustado a pH 7,4) y PBS-T, pH 6,0 (Na2HPO4/NaH2PO40,01 M, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05 % v/v, ajustado a pH 6,0). Se inyectaron diferentes concentraciones de C5 humana (EMD, n.° de catálogo 204888) o C5 de mono-mmh (preparadas en tampón de funcionamiento PBS-T, pH 7,4 (que variaban de 100 nM a 11,11 nM, diluciones de 3 veces) sobre la superficie capturada del anticuerpo monoclonal anti-C5 durante 3 minutos a un caudal de 50 pl/minuto y su disociación en dos tampones de funcionamiento PBS-T, pH 7,4 y PBS-T, se controló el pH 6,0 durante 6 minutos. Todos los experimentos de cinética de unión se realizaron a 25 °C y 37 °C. La constante cinética de disociación (kd) se determinó ajustando los sensogramas en tiempo real a un modelo de unión 1:1 utilizando elsoftwarede ajuste de curvas Scrubber 2.0c. Las semividas disociativas de la unión ( t / ) se calcularon a partir dekdcomo:
ln(2)
t% (min)
60 * kd
Los coeficientes de semivida para la unión de C5 humana a diferentes anticuerpos monoclonales anti-C5 a 25 °C y 37 °C en dos tampones PBS-T, pH 7,4 y PBS-T, pH 6,0 se muestran en las Tablas 11 y 12.
Tabla 11: Coeficientes de semivida de anticuer os anti-C5 seleccionados^ para la C5 humana a 25 °C
continuación
Tabla 12: Coeficientes de semivida de anticuer os anti-C5 seleccionados sobre C5 humana a 37 °C
continuación
Coeficientes de semivida para la unión de C5 de mono a diferentes anticuerpos monoclonales anti-C5 a 25 °C y 37 °C en dos tampones PBS-T, pH 7,4 y PBS-T, pH 6,0 se muestran en las Tablas 13 y 14.
Tabla 13: Coeficientes de semivida de anticuer os anti-C5 seleccionados^ sobre C5 de mono a 25 °C
Tabla 14: Coeficientes de semivida de anticuer os anti-C5 seleccionados^sobre C5 de mono a 37 °C
Como se muestra en las Tablas 11-14, los anticuerpos anti-C5 seleccionados mostraron una unión dependiente del pH, como se ve en los coeficientes de t i .
Ejemplo 5: Competencia cruzada deternubada mediante Octet entre anticuerpos anti-C5
La competencia de unión entre anticuerpos monoclonales (Acm) anti-C5 se determinó mediante un ensayo de interferometría de biocapa en tiempo real y sin marcadores en un biosensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Todo el experimento se realizó a 25 °C en tampón HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, 0,1mg/ml de BSA (tampón Octet HBS-P) con la placa en agitación a una velocidad de 1000 rpm. Para evaluar si 2 anticuerpos eran capaces de competir entre sí por la unión a sus respectivos epítopos en una C5 humana (hC5 purificada a partir de plasma, EMD), primero se capturaron aproximadamente 1,5 nm de Acm anti-C5 humana en puntas de biosensor Octet recubiertas de anticuerpo anti-HFc (Pall ForteBio Corp., n.° 18-5060) sumergiendo las puntas durante 3 minutos en pocillos que contenían una solución de 50 pg/ml de Acm anti-C5 humana (posteriormente denominado Acm1). A continuación, se saturaron las puntas del biosensor capturadas con anticuerpos con un Acm de control de isotipo H4H de bloqueo (posteriormente denominado Acm de bloqueo) sumergiéndolas durante 4 minutos en pocillos que contenían una solución de 200 pg/ml de Acm de bloqueo. A continuación, se sumergieron las puntas del biosensor en pocillos que contenían una solución complejada simultáneamente de hC5 50 nM y 1 pM de un segundo Acm anti-C5 humana (denominado posteriormente Acm2), que se había preincubado durante 2 horas, y 4 minutos. Las puntas del biosensor se lavaron en tampón Octet HBS-P entre cada etapa del experimento. La respuesta de unión en tiempo real se controló durante todo el transcurso del experimento y se registró la respuesta de unión al final de cada etapa. La respuesta de la unión de Acm2 complejado previamente con C5 humana a Acm1 se corrigió para tener en cuenta la unión de fondo, y se determinó el comportamiento competitivo/no competitivo de diferentes anticuerpos monoclonales anti-C5.
La Tabla 15 define explícitamente las relaciones de los anticuerpos que compiten en ambas direcciones, independientemente del orden de unión.
T l 1 : m n i r z n r r n i r n i- l i n
continuación
Ejemplo 6: Inhibición de la citotoxicidad dependiente del complemento mediada por C5 en un bioensayo de linfocitos B
Este ejemplo describe un bioensayo para comprobar el papel de C5 utilizando un anticuerpo anti-CD20 en la vía clásica del complemento. Los anticuerpos terapéuticos anti-CD20 contra el antígeno de superficie celular CD20 específico de los linfocitos B, ha demostrado conducir a CDC de linfocitos B (Glennieet al.2007, Mol. Immunol. 44: 3823-3837) y el ensayo CDC utilizando estirpes celulares que expresan CD20 se ha descrito anteriormente (Fliegeret al.2000, Cell. Immunol. 204: 55-63). Se utilizaron células Daudi, una estirpe de linfocitos B humanos que expresan CD20, suero preservado del complemento o suero empobrecido en C5 con variantes exógenas de C5 y un anticuerpo anti-CD20 (anticuerpo que comprende VH/VL de "2F2" de la patente de EE. UU. n.° 8.529.902) para evaluar el papel de la actividad de C5 en la CDC.
Para el bioensayo de CDC de C5, se sembraron células Daudi en placas de ensayo de 96 pocillos a razón de 10.000 células/pocillo en RPMI con un 10 % de FBS, penicilina/estreptomicina, L-glutamina, piruvato sódico y aminoácidos no esenciales (medio RPMI completo) o RPMI con BSA al 1 %, penicilina/estreptomicina y L-glutamina (RPMI/BSA). Todos los ensayos con anticuerpos anti-hC5 mutados, junto con las pruebas de los anticuerpos no mutados con suero humano que contenía C5 se probaron en medio RPMI completo, mientras que los ensayos en los que se probaron los anticuerpos no mutados con suero de mono verde africano y las variantes de C5 humanas se realizaron en medios RPMI/BSA. Para medir la CDC con suero humano o de mono, el anticuerpo anti-CD20 se diluyó 1:3 de 100 nM a 2 pM (incluyendo una muestra de control que no contenía anticuerpo) y se incubó con las células durante 10 minutos a 25 °C, seguido de la adición de 1,66 % de suero o 1,66 % de suero empobrecido en C5 y 6,6 nM de proteínas variantes de C5. La cantidad de proteína C5 que debía añadirse al suero empobrecido en C5 se basó en el valor notificado de concentración de C5 en suero humano de 0,37 uM (Rawal et al., 2008, J. Biol. Chem. 283: 7853-7863). Para probar la inhibición de la CDC por el anticuerpo C5, los anticuerpos C5 se diluyeron 1:3 de 100 nM a 2 pM (incluida una muestra de control que no contenía anticuerpos) y se incubaron con 1,66 % de suero o 1,66 % de suero empobrecido en C5 y 6,6 nM de proteínas variantes de C5 durante 30 minutos. Diez minutos antes de la adición de anticuerpos con suero a las células, el anticuerpo anti-CD20 se añadió a las células a 1 nM, 2 nM, 3 nM, 3,5 nM, 7 nM, 10 nM o 30 nM. Al finalizar la incubación con el anticuerpo anti-CD20, la mezcla de anticuerpo/suero se añadió a las células. La citotoxicidad se midió tras 3,5 horas de incubación a 37 °C y en CO<2>al 5 %, seguido de 15 minutos de incubación a 25 °C y la adición del reactivo CytoTox-Glo<™>(Promega, n.° G9292). CytoTox-Glo<™>es un reactivo basado en la luminiscencia que mide la muerte celular tal que se observa un aumento de la luminiscencia con un aumento de la citotoxicidad (medida en unidades relativas de luz, URL). Las células no tratadas en los pocillos de control se lisaron mediante tratamiento con digitonina inmediatamente después de la adición del reactivo CytoTox-Glo<™>para determinar la muerte máxima de células. La luminiscencia de las placas se leyó con un instrumento Victor X (Perkin Elmer) 15 minutos después de la adición de CytoTox-Glo<™>. Cuando se calculó, el porcentaje de citotoxicidad se calculó con los valores de URL mediante la siguiente ecuación:
En esta ecuación, la "lisis celular de fondo" es la luminiscencia de las células tratadas solo con medios y suero sin ningún anticuerpo anti-CD20 y la "lisis celular máxima" es la luminiscencia de las células tratadas con digitonina. Los resultados, expresados como el % de citotoxicidad o URL, se analizaron mediante regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con elsoftwarePrism 5 (GraphPad) para obtenerse los valores CE<50>y CI<50>. La inhibición de los anticuerpos se calculó de modo que del 0 al 100 % de inhibición es el intervalo de inhibición de la concentración de anticuerpo anti-CD20 utilizada en el ensayo sin inhibidor a 0 nM de anticuerpo anti-CD20.
Resultados
Se comprobó la capacidad de 25 anticuerpos anti-C5 humanos, 16 no mutados y 9 mutados, para inhibir la C5 en el ensayo de CDC utilizando células Daudi con un anticuerpo anti-CD20 y sueros humanos (con hC5 normal o variantes de C5) o sueros de mono verde africano. Varios restos de las regiones determinantes complementarias (CDR) del H4H12166P se mutaron a histidinas para generar 9 anticuerpos mutados, H4H12166P2-H4H12166P10. Se ha demostrado que las mutaciones de histidina en las CDR confieren una dependencia del pH en la unión al antígeno diana, lo que mejora la farmacocinética (Igawaet al.2010, Nat. Biotechnol.28: 1203-1207).
Tabla 16: Inhibición de CDC con anticuerpo anti-hC5 no mutado con 1,66%de suero y anticuerpo anti-CD20 en células Daudi
continuación
Como se muestra en las Tablas 16 y 17, los 25 anticuerpos anti-hC5 mostraron una inhibición completa de CDC mediada por C5 presente en el 1,66 % del suero humano. Las CI<50>de los anticuerpos no mutados variaron de 1,2 a 3,4 nM. Las CI<50>de los anticuerpos mutados variaron de 3,0 nM a 12 nM. El anticuerpo parental no mutado H4H12166P proporcionó una inhibición completa con IC<50>de 2,6 nM y 2,9 nM.
Tabla 17: Inhibición de la CDC con anticuerpo anti-hC5 mutado con 1,66%de suero y anticuerpo anti-CD20 en células Daudi
Los dieciséis anticuerpos anti-hC5 no mutados mostraron una inhibición completa de la CDC mediada por la C5 del mono verde africano con CI<50>que variaban de 2,0 nM a 14 nM.
Cuatro de los 9 anticuerpos mutados mostraron una inhibición completa de la CDC mediada por el C5 del mono verde africano con CI<50>que variaban de 7,1 nM a 9,9 nM. Los seis anticuerpos mutados restantes eran bloqueantes con CI<50>superiores a 10 nM, y una inhibición máxima (a 100 nM de anticuerpo) que variaba del 34 % al 85 %. El anticuerpo parental no mutado H4H12166P proporcionó una inhibición completa con IC<50>de 4,5 nM y 5,6 nM.
Para comprobar si los anticuerpos anti-hC5 inhiben las variantes de C5 humanas, R885H y R885C, se ensayó suero humano empobrecido en C5 con 6,6 nM de cada variante de C5. Los 25 anticuerpos anti-hC5 mostraron una inhibición completa de la CDC mediada por la variante de C5 R885H, con CI<50>de los anticuerpos no mutados que variaban de 0,48 nM a 4,2 nM, mientras que las CI<50>de los anticuerpos mutados variaban de 1,3 nM a 7,0 nM. El anticuerpo parental no mutado H4H12166P proporcionó una inhibición completa con IC<50>de 1,3 nM y 1,3 nM.
Quince de los 16 anticuerpos anti-hC5 no mutados mostraron una inhibición completa de la CDC mediada por la variante de C5 R885C con CI<50>que variaban de 0,43 nM a 1,6 nM. Un anticuerpo no mutado mostró una inhibición débil de la CDC con una inhibición máxima del 67 % (a 100 nM de anticuerpo) y una CI<50>>20 nM. Los nueve anticuerpos mutados mostraron una inhibición completa de la CDC mediada por la variante de C5 R885C con CI<50>que variaban de 0,77 nM a 3,5 nM. El anticuerpo parental no mutado H4H12166P proporcionó una inhibición completa con IC<50>de 0,46 nM y 0,76 nM.
El anticuerpo anti-CD20 mostró CDC de células Daudi con 1,66 % de suero con CI<50>de 1,0 nM, 1,4 nM y 1,9 nM para el suero humano, 2,4 nM y 2,6 nM para el suero del mono verde africano, 1,9 nM y 6,3 nM para el suero empobrecido de hC5 con la variante de hC5 R885H, y 2,7 nM y 9,5 nM para el suero empobrecido de hC5 con la variante de hC5 R885C. Ninguno de los anticuerpos de control IgG irrelevantes, Acm1 de control y Acm2 de control, demostraron ninguna inhibición de la CDC.
Ejemplo 7: Inhibición de la actividad de C5a determinada por el ensayo de luciferasa
Este Ejemplo describe un ensayo para probar la activación de C5a a través de uno de sus receptores, C5aR1. C5aR1 es un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) y puede iniciar varias vías de señalización acopladas a GPCR (Monket al.2007, Br. J. Pharmacol. 152: 429-448). Se estableció un bioensayo utilizando células HEK293 transfectadas de forma estable con C5aR1 humano (n.° de acceso NP_001727.1) y Ga16 humano (n.° de acceso NP_002059.3) junto con un indicador de luciferasa [elemento de respuesta NFAT (4X)-luciferasa]. La Ga16 es una proteína G relativamente promiscua que puede acoplarse a diferentes tipos de GPCR dando lugar a la activación de la pLC-p y a la subsiguiente elevación del Ca<++>, que a su vez activa la translocación de NFAT y la transcripción del gen informador (Kosteniset al.
2005, Trends Pharmacol. Sci. 26: 595-602). La estirpe celular resultante, HEK293/ hGa16/hC5aR1/NFAT-luc, se aisló y se mantuvo en DMEM al 10 % que contenía FBS al 10 %, AANE, penicilina/estreptomicina, 500 pg/ml de G418, 100 pg/ml de higromicina B y 7 pg/ml de blasticidina.
Para el bioensayo de luciferasa de C5a, se sembraron células HEK293/hG^16/hC5aR1/NFAT-luc en placas de ensayo de 96 pocillos a 20.000 células/pocillo en OPTIMEM (Invitrogen, n.° 31985-070) suplementado con BSA al 0,5 %, penicilina/estreptomicina y L-glutamina, y después se incubaron a 37 °C y CO<2>al 5 % durante toda la noche. Se utilizó BSA en lugar de FBS, ya que se ha demostrado que el suero escinde e inactiva la hC5a (Kloset al.,2013, Pharmacol. Rev. 65: 500-543). A la mañana siguiente, se valoró el hC5a de 100 nM a 2 pM (incluyendo una muestra de control que no contenía hC5a) y se añadió a las células para determinar la curva de valoración de dosis-respuesta para la estirpe celular. Para probar la inhibición de hC5a del anticuerpo anti-hC5a, se añadieron 500 pM de hC5a a las células. Inmediatamente después, se añadieron a las células anticuerpos diluidos 1:3 de 100 nM a 2 pM (incluida una muestra de control que no contenía ningún anticuerpo). Las células se incubaron durante 5,5 horas a 37 °C en presencia de un CO<2>al 5 %. La actividad de la luciferasa se detectó tras la incubación con el reactivo OneGlo<™>(Promega, n.° E6051). OneGlo<™>es un reactivo basado en la luminiscencia que mide la cantidad de luciferasa presente en las células. En este ensayo, el aumento de la activación de hC5a conlleva un aumento de la producción de luciferasa y de la luminiscencia (medida en unidades relativas de luz, URL). La medición de la luminiscencia se realizó con un instrumento Victor X (Perkin Elmer). Los resultados se analizaron mediante regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con elsoftwarePrism 5 (GraphPad) para obtenerse los valores de CE<50>y CI<50>. La inhibición de los anticuerpos se calculó de forma que del 0 al 100 % de inhibición es el intervalo de inhibición que va de 500 pM de hC5a sin inhibidor hasta 0 nM de hC5a.
Se comprobó la capacidad de cuatro anticuerpos anti-hC5 para inhibir la activación de su receptor por hC5a, hC5aR1, midiendo el grado de inhibición de la activación de 500 pM de hC5a en células HEK293/hGa16/hC5aR1/NFAT-luc.
Tabla 18: Inhibición p r n i r n i-h M h n l l HEK2 ^16/hC5aRl/NFAT-luc
Como se muestra en la Tabla 18, cuatro anticuerpos mostraron una inhibición completa de 500 pM de hC5a con CI<50>que variaban de 0,035 nM a 0,46 nM. Un anticuerpo de control IgG irrelevante, el Acm3 de control, no demostró ninguna inhibición de la hC5a. La hC5a activó las células HEK293/Ga16/hC5aR1/NFAT-luc con una CE<50>de 0,39 nM.
Ejemplo 8: Bioensayo de hemólisis
Se desarrollaron el ensayo de hemólisis de la vía clásica (HC) y el ensayo de hemólisis de la vía alternativa (HA) para comprobar la actividad de los anticuerpos.
HC es un ensayo de detección de la activación de la vía clásica del complemento, que es sensible a la disminución, ausencia y/o inactividad de cualquier componente de la vía. HC prueba la capacidad funcional de los componentes del complemento sérico de la vía clásica para lisar los hematíes de oveja (SRBC,Sheep Red Blood Cells)previamente recubiertos con anticuerpo de conejo contra los hematíes de oveja (hemolisina). Cuando los eritrocitos recubiertos de anticuerpo se incuban con suero de prueba, se activa la vía clásica del complemento y se produce hemólisis. Si falta un componente del complemento, el nivel de HC será cero; si disminuyen uno o más componentes de la vía clásica, HC disminuirá. (Nilsson et al 1984, J. Immunol. Meth. 72: 49-59). Este ensayo se utiliza para la caracterización y el cribado de anticuerpos C5 antihumanos de alta afinidad.
Métodos
(A) Ensayo de hemólisis del complemento por la vía clásica
Se lavó el número deseado de hematíes de oveja (SRBC) en tampón GVB++ y se volvieron a suspender a 1 x<109>células/ml. Para sensibilizar los SRBC, se mezclaron con un volumen igual de hemolisina de conejo antioveja diluida 1:50 (1,5 mg/ml) a 37 °C durante 20 minutos. Los hematíes SRBC sensibilizados se diluyeron a 2 x 10<8>células/ml en GVB++ antes de utilizarlas en el ensayo de hemólisis. El suero humano normal o el suero de macaco cangrejero se diluyó al 2 % o al 10 % en tampón GVB++. Para probar la inhibición de la actividad de hemólisis mediada por<c>5, los anticuerpos de prueba se preincubaron durante 20 minutos a 4 °C, a concentraciones que iban de 0,6 nM a 800 nM en suero humano normal al 2 %-10 % o en suero de macaco cangrejero al 10 % o en suero de mono verde africano. Se utilizaron placas de 96 pocillos de fondo redondo para medir la actividad de hemólisis. Se sembraron 100 ul de glóbulos rojos de oveja sensibilizados (2 x<108>células/ml) en una placa de 96 pocillos, seguidos de la adición de 100 ul de las muestras de suero respectivas que se preincubaron con los anticuerpos de prueba. Las células se mezclaron suavemente y se incubaron a 37 °C durante 60 minutos. Después del tiempo de incubación, las células se centrifugaron a 1250 xg a 4 °C. Se transfirió un total de 100 ul del sobrenadante a una nueva placa de fondo plano de 96 y se leyó a 412 nm en el lector de microplacas Spectramax. La actividad hemolítica se calculó a una concentración final de suero del 1-5 % para los tratamientos.
El porcentaje de hemólisis se calculó de la siguiente manera:
(Lisis celular experimental — Lisis celular de fondo)
% de Hemólisis =100-— ----- —-------— ----------— ----- —— — -— — —
(Lisis celular máxima — Lisis celular de fondo)
En esta ecuación, la "lisis celular de fondo" es la DO a A412 nm de las células incubadas únicamente en tampón GVB++ sin suero. La "lisis celular máxima" es la DO a A412 nm de las células tratadas con agua. Los resultados, expresados como % de hemólisis se analizaron mediante regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con elsoftwarePrism 5 (GraphPad) para obtenerse los valores de CI<50>. Los datos representados como la media ± error típico de la media
(B) Ensayo alternativo del complemento
Se lavó el número deseado de glóbulos rojos de conejo (RbRBC) en tampón GVB-Mg<2+>/EGTA y se volvieron a suspender a 2 * 10<8>células/ml. Se diluyó suero humano normal o de macaco cangrejero al 10 % en tampón GVB-Mg<2+>/EGTA. Para probar la inhibición de la actividad de hemólisis mediada por C5, se preincubaron anticuerpos a concentraciones que variaban de 3 nM a 800 nM durante 20 minutos a 4 °C en 5-10 % de suero humano normal o suero de macaco cangrejero. Se utilizaron placas de 96 pocillos de fondo redondo para medir la actividad de hemólisis. Se sembraron 100 ul de RbRBC (2 × 10<8>células/ml) en una placa de 96 pocillos seguidos de la adición de 100 ul de 10 % de suero humano normal o suero de macaco cangrejero o suero de mono verde africano preincubado con los anticuerpos anti-C5. Las células se mezclaron suavemente y se incubaron a 37 °C durante 60 minutos. Después del tiempo de incubación, las células se centrifugaron a 1250 xg a 4 °C. Se transfirió un total de 100 ul del sobrenadante a una nueva placa de fondo plano de 96 y se leyó a 412 nm en el lector de microplacas Spectramax. La actividad hemolítica se calculó a una concentración final de suero del 5 %.
El porcentaje de hemólisis se calculó de la siguiente manera:
En esta ecuación, la "lisis celular de fondo" es la DO a A412 nm de las células incubadas únicamente en tampón GVB-Mg/EGTA sin suero o sin ningún anticuerpo anti-C5. La "lisis celular máxima" es la DO a A412 nm de las células tratadas con agua. La inhibición por anticuerpos anti-C5, los valores de CI<50>se calcularon mediante regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con elsoftwarePrism 6 (GraphPad).
Resultados
(A) Inhibición de la hemólisis de C5 humana
Se probó un total de 25 anticuerpos anti-C5 humana (hC5), 16 no mutados y 9 mutados, para comprobar su capacidad para inhibir el C5 del suero humano normal (SHN,Normal Human Serum)en el ensayo CH50 con hematíes de oveja sensibilizados (SRBC) y en el ensayo AH50 con hematíes de conejo (RRBC,Rabbit Red Blood Cells).
Tabla 19: Inhibición por anticuerpos anti-hC5 de la actividad en la VC y VA en suero humano normal (NHS) al 1 % o al 5 %
Como se muestra en la Tabla 19, dieciséis anticuerpos anti-hC5 de esta invención y anticuerpos anti-C5 divulgados en el presente documento mostraron una inhibición de más del 94 % de la hemólisis en la vía clásica (VC) mediada por C5 presente en el 1 % del suero humano. Las CI<50>de los anticuerpos variaron de 2,1 a 5,9 nM y el porcentaje de inhibición varió del 95 % al 99 %. Los 16 anticuerpos anti-C5 mostraron una inhibición superior al 60 % (a excepción de H4H12169P) en el ensayo de hemólisis en la vía alternativa (VA) mediada por C5 presente en el 5 % de NHS. Las CI<50>de los anticuerpos variaron de 13 a 160 nM y el porcentaje de actividad inhibidora varió del 44 % al 81 %.
Tabla 20: Inhibición por anticuerpos anti-hC5 de la actividad en la VC y VA en suero humano normal (NHS) al
5 %
Como se muestra en la Tabla 20, los 9 anticuerpos anti-hC5 mutados mostraron inhibición de la actividad de hemólisis en la VC y VA mediada por C5 presente en el 5 % del suero humano. En el ensayo de hemólisis en la VC, el anticuerpo parental no mutado H4H12166P mostró más del 98 % de inhibición con una CI<50>de 10,9 nM. Ocho anticuerpos antihC5 mutados mostraron una inhibición superior al 90 % con una CI<50>que variaba de 10,3 nM a 24,3 nM. El anticuerpo mutante anti-C5 12166P10 mostró una inhibición parcial del 74 %. En el ensayo de hemólisis de la VA, el anticuerpo parental no mutado H4H12166P mostró una inhibición superior al 85 % con CI<50>de 20,9 nM. Los anticuerpos anti-hC5 mutados mostraron un intervalo de inhibición del 72-83 % y las CI<50>de los anticuerpos variaron de 28 nM a 0,15 pM.
(B) Inhibición de la hemólisis de C5 en monos
Se comprobó la capacidad de 25 anticuerpos anti C5 humano (hC5), 16 no mutados y 9 mutados, para inhibir el C5 del macaco cangrejero y del mono verde africano en el ensayo CH50 con hematíes de oveja sensibilizados (SRBC) y en el ensayo AH50 con hematíes de conejo (RRBC).
Tabla 21: Inhibición por anticuerpos anti-hC5 de la actividad en la VC y VA en sueros de mono verde africano A MA r r Ml
continuación
Como se muestra en la Tabla 21, los anticuerpos anti-hC5 mostraron diferentes niveles de inhibición de la actividad de hemólisis en la VC o VA en sueros de mono verde africano al 5 %. En el ensayo de VC, dos de los 16 anticuerpos anti-hC5 no mostraron ninguna inhibición de la actividad de hemólisis. Catorce anticuerpos mostraron una inhibición que varió del 43 al 94 %, con CI<50>que variaban de 25 nM a 180 nM. En el ensayo de hemólisis de la VA, trece de los 17 anticuerpos mostraron una actividad de inhibición que variaba del 17 % al 93 %, con CI<50>de 22,5 nM a 233 nM.
Tabla 22: Inhibición por anticuerpos anti-hC5 de la actividad de la VC y VA en sueros de macaco cangrejero m n rm l l
Como se muestra en la Tabla 22, los anticuerpos anti-hC5 (a excepción de H4H12183P2, que mostró una inhibición de la VC del 64 %) mostraron una inhibición superior al 90 % del ensayo de hemólisis en la VC o VA en el 5 % del suero de macaco cangrejero. En el ensayo de hemólisis en la VC, las CI<50>de los anticuerpos variaron de 7,15 nM a 142 nM. En el ensayo de hemólisis en la VA, las CI<50>de los anticuerpos variaron de 5,4 a 29,6 nM.
(C) Inhibición de la hemólisis de la variante de C5 humana
Se comprobó la capacidad de los anticuerpos anti-C5 seleccionados para inhibir la variante de la C5 humana (véase el Ejemplo 3 del presente documento) a partir de suero humano empobrecido en C5 en el ensayo CH50. En suero humano empobrecido en C5 y suplementado con la variante exógena de C5 R885H, H4H12166P y el Comparador 2 bloquearon la hemólisis en la VC con valores de CI<50>de 6,0 nM a 4,4 nM, respectivamente, y valores de CI<80>de 7,6 nM a 5,5 nM, respectivamente. Para la variante de R885C, H4H12166P y el Comparador 2 bloquearon la hemólisis en la VC en suero humano empobrecido en C5 con variantes exógenas de C5 con una CI<50>de 9,3 nM a 6,8 nM, respectivamente, y valores de CI<80>de 11 nM y 8,2 nM, respectivamente. Como era de esperar, el Comparador 1 no bloqueó la actividad hemolítica de las variantes de C5 humanas.
(D) Inhibición del complejo CSb-6 humano
Se comprobó la capacidad de los anticuerpos anti-C5 seleccionados para inhibir el complejo C5b-6 humano a partir de suero humano empobrecido en C5 en el ensayo CH50. El H4H12166P bloqueó potentemente la hemólisis en la VC en suero humano empobrecido en C5 y suplementado con complejo huC5b-6 exógeno con una CI<50>de 3,8 nM y un valor de CI<80>de 5,8 nM. Por el contrario, el Comparador 1 bloqueó la hemólisis mediada por el complejo C5b-6 con menor potencia, con valores de CI<50>de 5,0 nM y de CI<80>de 46 nM respectivamente. El Comparador 1 solo inhibió el 70 % de la hemólisis total en las concentraciones más altas probadas. El Comparador 2 no bloqueó la actividad hemolítica del complejo C5b-6 humano.
Ejemplo 9: Los anticuerpos anti-C5 bloquean la generación de C5a en el ensayo de hemólisis en la VC
Para evaluar si los anticuerpos anti-C5 inhiben la generación de C5a, se analizaron los sobrenadantes del ensayo de hemólisis de la vía clásica (VC) para determinar los niveles de C5a mediante ELISA.
C5a, generado como resultado de la escisión de C5, es un fragmento de proteína de 74 aminoácidos. El C5a es metabolizado rápidamente por las carboxipeptidasas séricas a una forma más estable, menos activa, forma de 73 aminoácidos, C5a des-Arg, mediante la eliminación de la arginina carboxiterminal. La cuantificación de C5a des-Arg proporciona, por tanto, una medida fiable para controlar la generación de C5ain vivoein vitro.El kit de ELISA de C5a MicroVue utilizado en el presente documento detecta C5a des-Arg de acuerdo con la información proporcionada por el fabricante. Los experimentos preliminares (datos no mostrados) indican que también se detecta la forma primaria de 74 aminoácidos de C5a. A efectos de este ejemplo, ambas formas se denominarán conjuntamente "C5a".
Los niveles de proteína C5a se determinaron en sobrenadantes del ensayo de hemólisis de la VC utilizando suero humano normal (SHN) preservado del complemento preincubado con H4H12166P o anticuerpo de control del isotipo, tal como se describe en el Ejemplo 8. Los niveles de proteína C5a se midieron utilizando el kit de ELISA de C5a MicroVue según las instrucciones del fabricante. Resumiendo, las muestras se diluyeron y se incubaron en placas precubiertas con anticuerpo de captura (anti-C5a de ratón específico para un neoepítopo de la C5a humana). La proteína C5a humana proporcionada por el fabricante se utilizó como patrón para la calibración. La presencia de C5a en los sobrenadantes se detectó mediante un anticuerpo de detección conjugado con HRP (anticuerpo monoclonal de ratón frente a la región C5a de C5). Se añadió el sustrato cromogénico<h>R<p>, 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), para detectar la actividad de HRP. Se utilizó una solución de ácido clorhídrico 1 N para detener la reacción y se midió la densidad óptica a 450 nm (DO450) en un lector de placas SpectraMax. Los datos se analizaron mediante regresión no lineal (logística de 4 parámetros) en GraphPad Prism. La concentración de C5a se expresó en ng/ml de sobrenadante.
En el ensayo con NHS al 5 %, H4H12166P bloqueó potentemente el aumento de los niveles de proteína C5a de forma dependiente de la dosis, con una CI<50>de 8,5 nM, mientras que el anticuerpo de control del isotipo no tuvo ningún efecto sobre los niveles de C5a (Figura 1). El bloqueo máximo a la concentración más alta de H4H12166P probada (267 nM) dio lugar a una disminución de ~10 veces en los niveles de C5a a 3,8 ng/ml (0,3 nM), en comparación con los 34 ng/ml (2,8 nM) observados a la concentración más baja de H4H12166P probada (1 nM) en suero al 5 %. La concentración de C5a observada para el bloqueo máximo se aproximó al nivel basal de C5a de 2,3 ng/ml (0,2 nM) en NHS al 5 % sin tratar.
Ejemplo 10: Caracterización de la farmacocinética y farmacodinámica de los anticuerpos anti-C5 en el macaco cangrejero
Este Ejemplo describe la caracterización de la farmacocinética (FC) y farmacodinámica (FD) de anticuerpos anti-C5 seleccionados realizada en macaco cangrejero macho. Los niveles endógenos de C5 se determinaron antes de la dosificación de los anticuerpos anti-C5 y se utilizaron para estratificar los grupos de dosis de animales.
Los niveles totales de C5 circulante en macaco cangrejero se determinaron utilizando un ELISA de Complemento Humano C5 (Abcam, cat n.° ab125963), que se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se determinó que las concentraciones medias de proteína C5 en los monos eran de 90,85 |jg/ml ± 19,17 |jg/ml.
Para cada anticuerpo anti-C5, se administró a 4 macacos cangrejeros una única inyección intravenosa (iv) a una dosis de 15 mg/kg. Se recogieron muestras de sangre de cada animal desde antes de la dosis hasta las 1680 horas (70 días), se procesaron en suero y se congelaron a -80 °C hasta que se analizaron para FC y FD.
Análisis del nivel de anticuerpos IgG totales mediante inmunoanálisis de ELISA
Las concentraciones totales de anticuerpos en muestras de suero de mono se midieron mediante un ELISA directo no validado. El procedimiento ELISA empleó una placa de microtitulación recubierta con un anticuerpo monoclonal Fc de IgG1/IgG4 antihumano de ratón. Se añadieron diferentes anticuerpos anti-C5 a la placa y los anticuerpos anti-C5 capturados en la placa se detectaron utilizando un anticuerpo monoclonal Fc de IgG4 antihumano de ratón biotinilado, seguido de NeutrAvidina conjugada con peroxidasa de rábano (NeutrAvidina con HRP). A continuación, se añadió un sustrato a base de luminol específico para la peroxidasa con el fin de obtener una intensidad de señal proporcional a la concentración de anticuerpo anti-C5 total capturado. Las mediciones de las unidades relativas de luz (URL) de los patrones de calibración y sus respectivas concentraciones nominales se ajustaron mediante una ecuación logística ponderada de 4 parámetros para generar una ecuación de calibración que describiera la concentración de anticuerpos anti-C5 y la relación de respuesta del ensayo. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) fue de 1,56 ng/ml en el ensayo (2 % de suero de mono) y de 78 ng/ml en suero de mono puro.
Determinación de los parámetros de FC
Los parámetros FC se determinaron mediante análisis no compartimental (NCA) utilizando elsoftwarePhoenix<®>WinNonlin<®>versión 6.4, Certara, L.P.) y un modelo de administración iv en bolo.
Todos los parámetros FC se derivaron de los respectivos valores medios de concentración, incluida la concentración máxima observada en suero (C<máx>), la hora de concentración máxima observada, t<máx>y la semivida estimada observada (T<1 /2>). Para cada anticuerpo, se determinaron el área bajo la curva de concentración frente al tiempo hasta la última concentración medible (ABC<última>) y extrapolada desde el tiempo cero hasta el infinito (ABC<f>utilizando una regla lineal trapezoidal con interpolación lineal y ponderación uniforme.
Análisis FD mediante ensayo de hemolisise x v iv o
La farmacodinámica de los anticuerpos anti-C5 seleccionados se analizó mediante ensayos de hemólisisex vivopor vía clásica y por vía alternativa.
Ensayo de hemólisis en la vía clásica: los hematíes de oveja (SRBC) se lavaron en tampón GVB++ (tampón veronal de gelatina con CaC<b>y MgC<b>) (Boston BioProducts) y se volvieron a suspender a 1 * 10<9>células/ml. Para sensibilizar los SRBC, se mezcló un total de 1 * 10<9>/ml de SRBC con un volumen igual de hemolisina de conejo antioveja diluida 1:50 (1,5 mg/ml) a 37 °C durante 20 minutos. Los SRBC sensibilizados se diluyeron a 2 * 10<8>células/ml en tampón GVB++ antes de utilizarlos en el ensayo de hemólisis. La sangre de los macacos cangrejeros se recogió antes de la dosificación y a los 5 minutos, 4 y<8>horas, y 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63 y 70 días después de la dosis para el análisis FD. Se preparó suero y se congeló hasta su uso posterior. El día del ensayo, se diluyó el suero de macaco cangrejero de los puntos temporales respectivos al 10 % en tampón GVB++. Se utilizaron placas de 96 pocillos de fondo redondo para medir la actividad de hemólisis. Se sembró un total de 100 j l de SRBC sensibilizados (2 * 10<8>células/ml) en una placa de 96 pocillos a 37 °C, seguido de la adición de 100 ul de suero de macaco cangrejero al 10 % de los puntos temporales respectivos. Los SRBC se mezclaron suavemente y se incubaron a 37 °C durante 10 minutos. Después del tiempo de incubación, las células se centrifugaron a 1250 *g a 4 °C. Se transfirió un total de 100 j l del sobrenadante a una nueva placa de fondo plano de 96 y se leyó a 412 nm en un lector de microplacas Spectramax. La actividad hemolítica se calculó a una concentración final de suero del 5 %. El porcentaje de hemólisis se calculó con los valores de absorbancia mediante la siguiente ecuación:
En esta ecuación, "lisis celular de fondo" es la DO a A412 nm de los SRBC incubados únicamente en tampón GVB++ sin suero. La "lisis celular máxima" es la DO a A412 nm de los SRBC tratados con agua. Los resultados, expresados como % de hemólisis se analizaron mediante regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con elsoftwarePrism 5 (GraphPad) para obtenerse los valores de CI<50>. Los datos se representan como media ± error típico de la media.
Ensayo de hemólisis en la vía alternativa: Se lavó el número deseado de hematíes de conejo (RbRBC) en tampón GVB-Mg<2+>/EGTA y se volvieron a suspender a 2 * 10<8>células/ml. La sangre de los macacos cangrejeros se recogió antes de la dosificación y a los 5 minutos, 4 y<8>horas, y 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 28, 35, 42 y 49 días después de la d o s i s p a r a e l a n á l i s i s F D . S e p r e p a r ó s u e r o y s e c o n g e ló h a s t a s u u s o p o s t e r io r . S e u t i l i z a r o n p la c a s d e 96 p o c i l i o s d e f o n d o r e d o n d o p a r a m e d i r la a c t i v i d a d d e h e m ó l is i s . S e s e m b r a r o n l 0 o j l d e R b R B C ( 2 * l 0 8 c é l u la s / m l ) e n u n a p la c a d e 96 p o c i l l o s a 37 ° C , s e g u id o s d e la a d i c ió n d e 100 j l d e s u e r o d e m a c a c o c a n g r e j e r o a l 10 % d e lo s r e s p e c t i v o s p u n t o s t e m p o r a le s in d ic a d o s a n t e r io r m e n t e . L o s R b R B C s e m e z c la r o n s u a v e m e n t e y s e in c u b a r o n a 37 ° C d u r a n t e 60 m in u t o s . D e s p u é s d e l t i e m p o d e in c u b a c ió n , la s c é l u la s s e c e n t r i f u g a r o n a 1250 * g a 4 ° C . S e t r a n s f i r i ó u n t o t a l d e 100 j l d e l s o b r e n a d a n t e a u n a n u e v a p la c a d e f o n d o p la n o d e 96 q u e s e le y ó a 412 n m e n u n l e c t o r d e m ic r o p la c a s S p e c t r a m a x . L a a c t i v i d a d h e m o l í t i c a s e c a l c u ló p a r a u n a c o n c e n t r a c i ó n f in a l d e s u e r o d e l 5 % y s e e x p r e s ó c o m o p o r c e n t a j e d e la h e m ó l i s i s t o t a l d e lo s R B C p o r e l a g u a . E l p o r c e n t a j e d e h e m ó l is i s s e c a l c u ló c o m o s e h a d e s c r i t o a n t e r io r m e n t e .
Resultados
L o s a n t i c u e r p o s a n t i - C S s e l e c c io n a d o s ( e n u m e r a d o s e n la T a b la 1 ) s e p r o b a r o n e n e x p e r i m e n t o s i n ic ia le s p a r a p e r f i l e s f a r m a c o c i n é t i c o s p r o lo n g a d o s e n m a c a c o c a n g r e j e r o y r a t o n e s h u m a n i z a d o s p a r a C 5 ( d e s c r i t o s e n e l E j e m p lo 10 ) . S e s e l e c c io n a r o n H 4 H 12166 P y H 4 H 12161 P p o r t e n e r u n a a l t a a f in i d a d u n id a a u n a F C p r o lo n g a d a y s e u t i l i z a r o n e n lo s e x p e r i m e n t o s s u b s i g u i e n t e s d e l p r e s e n t e d o c u m e n t o c o n e l C o m p a r a d o r 1 y e l C o m p a r a d o r 2.
S e a d m in i s t r ó a m a c a c o c a n g r e j e r o u n a ú n i c a d o s i s iv e n b o lo d e 15 m g / k g d e H 4 H 12166 P , H 4 H 12161 P o C o m p a r a d o r 2. S e d e t e r m i n a r o n la s c o n c e n t r a c i o n e s s é r i c a s d e a n t i c u e r p o s t o t a l e s y e l p o r c e n t a j e d e a c t i v i d a d h e m o l í t i c a e n la v í a c lá s ic a ( V C ) e n 19 p u n t o s t e m p o r a le s d u r a n t e u n p e r í o d o d e v id a d e 70 d í a s . L a h e m ó l is i s e n la v í a a l t e r n a t i v a ( V A ) s e d e t e r m i n ó e n 17 p u n t o s t e m p o r a le s d u r a n t e u n p e r í o d o d e v id a d e 50 d í a s . L a T a b la 23 r e s u m e la s c o n c e n t r a c i o n e s m e d ia s d e a n t i c u e r p o s p a r a lo s 3 a n t i c u e r p o s . E n la f ig u r a 2 s e m u e s t r a n la s c o n c e n t r a c i o n e s m e d ia s t o t a l e s d e a n t i c u e r p o s f r e n t e a lo s p e r f i l e s t e m p o r a le s . L o s p a r á m e t r o s d e m e d io s F C s e d e s c r ib e n e n la T a b la 24.
Tabla 23: Concentraciones medias de IgG total en suero tras una única inyección intravenosa de 15 mg/kg de anticuer os anti-C5 seleccionados en macacos can re eros macho
Tras la administración de un bolo intravenoso, los perfiles de concentración de IgG-tiempo totales de H4H12166P, H4H12161P y el Comparador 2 se caracterizaron por una breve fase inicial de distribución seguida de fases únicas de eliminación a lo largo del período de vida. Las concentraciones máximas de H4H12166P, H4H12161P y Comparador 2 fueron muy equiparables, ya que los valores correspondientes de C<máx>/dosis entre todos los anticuerpos estaban dentro de 1,1 veces (29,7, 30,4 y 30,6 [(ug/ml)/(mg/kg)], respectivamente) (Tabla 24).
Tabla 24: Parámetros farmacocinéticos medios de las concentraciones totales de IgG en suero tras una única inyección intravenosa de 15 mg/kg de anticuerpos anti-C5 seleccionados en macacos cangrejeros macho
La evaluación de los perfiles de concentración-tiempo reveló que H4H12166P demostró la eliminación más lenta con concentraciones terminales de anticuerpos >10 pg/ml hasta el día 71 del estudio. La cinética de H4H12161P y del Comparador 2 fue similar; ambos demostraron una eliminación más rápida que H4H12166P, con concentraciones de Acm >10 pg/ml hasta el día 22 y 29, respectivamente.
En consecuencia, las exposiciones normalizadas por dosis (ABC<última>/dosis) indicaron que H4H12166P tuvo la exposición más alta a 339 día*(pg/ml)/(mg/kg), mientras que H4H12161P y el Comparador 2 tuvieron una exposición aproximadamente 2 veces menor, 157 y 187 día*(pg/ml)/(mg/kg), respectivamente, que la de H4H12166P.
La semivida de los anticuerpos (t<i / 2>) calculada durante la fase de eliminación varió de 5,5 a 15,6 días en todos los grupos de dosis y también se correlacionó con la exposición, ya que H4H12166P tenía un t<1 /2>correspondientemente más alto de 15,6 días, mientras que H4H12161P y Comparador 2 tuvieron valores de t<i /2>de 5,5 y 5,9 días, respectivamente.
Los efectos farmacológicos de los anticuerpos anti-C5 procedentes de muestras de suero de macaco cangrejero se determinaronex vivomediante hemólisis de hematíes de oveja sensibilizados (SRBC) en la vía clásica (VC) del complemento y hemólisis de hematíes de conejo (RbRBC) en la vía alternativa (VA). La inhibición de la actividad hemolítica se calculó para una concentración final de un suero del 5 % y se expresó como porcentaje de la hemólisis total de los RBC por el agua. La Tabla 25 resume la actividadex vivode los 3 anticuerpos determinada por el porcentaje medio de hemólisis.
Tabla 25: Actividad hemolítica porcentuale x v iv oen la vía clásica y alternativa de anticuerpos anti-C5 seleccionados
C o m o s e m u e s t r a e n la T a b la 25 y e n la F ig u r a 2 , lo s e f e c t o s d e la F D s e m id i e r o n m e d ia n t e la V C d e l c o m p le m e n t o ( i n c u b a c ió n d e 10 m in u t o s ) h a s t a e l d í a 70. H 4 H 12166 P b lo q u e ó m á s d e l 95 % d e la a c t i v i d a d h e m o l í t i c a e n la V C h a s t a e l d í a 35. L a a c t i v i d a d v o l v i ó a lo s n i v e le s m á x im o s d e h e m ó l is i s p r e v io s a l e s t u d i o e n e l d í a 70. E l C o m p a r a d o r 2 b l o q u e ó a p r o x i m a d a m e n t e e l 95 % d e la a c t i v i d a d h e m o l í t i c a d e la V C h a s t a e l d í a 10 , y la a c t i v i d a d v o l v i ó r á p id a m e n t e a lo s n i v e le s m á x im o s d e h e m ó l is i s p r e v io s a l e s t u d i o e n e l d í a 18.
L o s e f e c t o s d e la F D t a m b ié n s e m id i e r o n m e d ia n t e e n s a y o s d e h e m ó l is i s d e la v í a V A d e l c o m p le m e n t o ( i n c u b a c ió n d e 60 m in u t o s ) h a s t a e l d í a 49. C o m o s e m u e s t r a e n la T a b la 25 y e n la F ig u r a 3 , H 4 H 12166 P b l o q u e ó e l 80 % d e la a c t i v i d a d h e m o l í t i c a t o t a l e n la V A h a s t a e l d í a 18 y la a c t i v i d a d v o l v i ó a l n iv e l m á x im o d e h e m ó l is i s p r e v io a l e s t u d i o e n e l d í a 50. H 4 H 1216 P y e l C o m p a r a d o r 2 b l o q u e a r o n e l 90 % d e la a c t i v i d a d h e m o l í t i c a d e la V A h a s t a e l d í a 7 , y la a c t i v i d a d v o l v i ó a lo s n i v e le s m á x im o s d e h e m ó l is i s p r e v io s a l e s t u d i o e n e l d í a 21.
Ejemplo 11: Caracterización de la FC/FD de anticuerpos anti-C5 en ratones humanizados para C5
E n e s t e c o n j u n t o d e e x p e r i m e n t o s , s e e v a l u a r o n la f a r m a c o c i n é t i c a y la f a r m a c o d in á m ic a d e a n t i c u e r p o s a n t i - C 5 s e l e c c io n a d o s e n r a t o n e s h u m a n i z a d o s p a r a e x p r e s a r la p r o t e í n a C 5 h u m a n a m e d ia n t e la t e c n o l o g í a V e lo c ig e n e ® t e c h n o l o g y ( V a l e n z u e l a e t a l . , 2003 , N a t . B i o t e c h n o l . 21 : 652 - 659 ) . L o s r a t o n e s h u m a n i z a d o s f u e r o n d i s e ñ a d o s p a r a reemplazar el exón 2 a través del exón 41 del gen C5 murino con los exones 2-42 del gen C5 humano (divulgado en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2015/0313194, incorporado en el presente documento en su totalidad).
Los niveles totales de C5 humana circulante se determinaron mediante un ELISA de complemento humano C5 (Abcam, cat n.° ab125963), que se realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Determinación del nivel total de fármaco en suero mediante ELISA
Las concentraciones circulantes de anticuerpos anti-C5, tanto unido a C5 como sin unir a C5, se determinaron mediante análisis de anticuerpos humanos totales utilizando ELISA. Resumiendo, se inmovilizó un anticuerpo policlonal IgG antihumano de cabra a 1 pg/ml en PBS en placas de 96 pocillos durante toda la noche; se lavaron las placas para eliminar las IgG no unidas y, a continuación, se bloquearon con BSA al 5 %. Se transfirieron diluciones seriadas de anticuerpo anti-C5 que contenían muestras de suero (6 puntos) y los patrones de referencia (12 puntos) de los respectivos anticuerpos a las placas recubiertas de IgG antihumana y se incubaron durante una hora. A continuación, los anticuerpos anti-C5 unidos a la placa se detectaron con un anticuerpo policlonal IgG antihumano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante. Las placas se revelaron con sustrato TMB según el protocolo recomendado por el fabricante y las señales de densidad óptica (DO) a 450 nm se registraron utilizando un lector de placas multimodo Victor X4 de Perkin Elmer. Las concentraciones de anticuerpos anti-C5 en suero se calcularon basándose en la curva de calibración del patrón de referencia generada mediante elsoftwareGraphPad Prism.
Determinación de los parámetros de FC
Los parámetros FC se determinaron mediante análisis no compartimental (NCA) utilizando elsoftwarePhoenix<®>WinNonlin<®>versión 6.3, Certara, L.P.) y un modelo de posología extravascular. Con los respectivos valores de concentración media para cada anticuerpo, todos los parámetros FC, incluida la semivida observada estimada (t<i / 2>), y el área bajo la curva de concentración frente al tiempo hasta la última concentración medible (ABC<última>) se determinaron mediante una regla trapezoidal lineal con interpolación lineal y ponderación uniforme.
Análisis FD mediante ensayo de hemolisis
La farmacodinámica de los anticuerpos anti-C5 seleccionados se determinó mediante un ensayo de hemólisis del complemento en la vía clásica. Los hematíes de oveja (SRBC) (sangre de oveja en solución de Alsevers) se lavaron en tampón GVB++ (tampón veronal de gelatina con CaCb y MgCb) (Boston BioProducts) y se volvieron a suspender a 1 x<109>células/ml. Para la sensibilización, se mezclaron 1 * 10<9>/ml de SRBC con un volumen igual de hemolisina de conejo antioveja diluida a 1:50 (1,5 mg/ml) a 37 °C durante 20 minutos. Los SRBC sensibilizados se diluyeron a 2 * 10<8>células/ml en GVB++ antes de utilizarlos en el ensayo de hemólisis. Las muestras de suero de animales predosificados o de ratones humanizados para C5 dosificados con anticuerpos anti-C5 recogidas los días 10, 20, 30, 40 y 50 después de la dosis se diluyeron al 20 % en tampón GVB++. Un total de 100 pl de SRBC sensibilizados (2 * 10<8>células/ml) se sembraron en placas de 96 pocillos de fondo redondo a 37 °C, seguidas de la adición de 100 pl de suero al 20 % suplementado con 160-180 pg/ml de proteína del complemento humano 3 (huC3). Las células se mezclaron suavemente y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Después de la incubación, las células se centrifugaron a 1250 *g a 4 °C. Se transfirió un total de 100 pl de sobrenadante a una nueva placa de fondo plano de 96 y se leyó a A412 nm en un lector de microplacas Spectramax. El porcentaje de hemólisis se calculó con los valores de absorbancia mediante la siguiente ecuación:
En esta ecuación, "lisis celular de fondo" es la DO a A412 nm de SRBC incubados solo en tampón GVB++ sin suero. La "lisis celular máxima" es la DO a A412 nm de los SRBC tratados con agua. Los resultados, expresados como el % de hemólisis, se analizaron mediante regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con elsoftwarePrism 6 (GraphPad) para obtener los valores de CI<50>. Datos representados como la media ± (error típico de la media).
Experimento 1
En este experimento, se evaluaron la farmacocinética y la farmacodinámica del anticuerpo de ejemplo H4H12166P en comparación con el Comparador 1 y el Comparador 2 en ratones humanizados para C5. Los niveles totales de C5 humana circulante se determinaron mediante un ELISA de complemento humano C5 (Abcam, cat n.° ab125963), que se realizó siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se determinó que las concentraciones medias de C5 humana en los ratones eran de 39,73 pg/ml ± 17,82 pg/ml. Se observó una diferencia entre los ratones macho (55,4 ± 1,7 pg/ml, n = 47) y hembra (24,7 ± 0,6 pg/ml, n = 49).
Antes de la dosificación del anticuerpo, los ratones macho y hembra humanizados para C5 se estratificaron en función de los niveles de C5 humana que alcanzaron una media de 40 pg/ml. Para cada anticuerpo anti-C5, cohortes de veintidós ratones recibieron una dosis única de 15 mg/kg de H4H12166P, Comparador 1 o Comparador 2 mediante inyección subcutánea (sc). Todos los ratones fueron sangrados antes de la dosis y un día después de la inyección para el análisis FC. Adicionalmente, a los 10, 20, 30, 40, 50 días después de la inyección, se practicó la eutanasia a grupos de 4 o 5 ratones de cada cohorte y se recogieron las hemorragias terminales para los análisis FC y FD. Las muestras de suero del día 1 fueron la media de toda la cohorte de 22 ratones. La sangre se procesó en suero y se congeló a -80 °C hasta que se analizó.
Las concentraciones totales de anticuerpos se determinaron en 7 puntos temporales y el porcentaje de actividad hemolítica se determinó en 6 puntos temporales a lo largo de los 50 días de vida útil. Las concentraciones totales de anticuerpos anti-C5 se resumen en la Tabla 26. Las concentraciones medias totales de anticuerpos frente al perfil temporal se muestran en la Figura 4. Los parámetros de medios FC se describen en la Tabla 27.
Tabla 26: Concentraciones medias de IgG total en suero tras una única inyección subcutánea de 15 mg/kg de _______________ ________ anticuerpos anti-C5 en ratones humanizados para C5_________________________Tie N.° Concentración sérica de Ac (pg/ml) Media ± DT
H4H12166P Comparador Comparador 2
1 22 178 ± 22,7 229 ± 40,7 164 ± 24,1
10 4 83,7 ± 22,2 102 ± 22,9 44 ± 24,1
20 5 57,1 ± 26,8 29 ± 31,3 11,4 ± 10,3
30 5 38,1 ± 7,6 30,1 ± 34,2 3,6 ± 3,2
40 4 11,9 ± 5,0 0,4 ± 0,4 0,5 ± 0,4
50 4* 9,3 ± 12,2 0,3 ± 0,3 0,3 ± 0,2
Tiempo = tiempo en horas tras la inyección de la dosis única; Día = Día de estudio; DT = desviación típica; ETM = error típico de la media; ND = no detectado; SM = sin muestra. *Para el Comparador 2, día 50, n= tres debido a la imposibilidad de analizar una muestra por problemas técnicos.______________________________________
Tabla 27: Parámetros FC
Los perfiles de concentración media frente al tiempo en el día 1 muestran que los tres anticuerpos, H4H12166P, Comparador 1 y Comparador 2 tuvieron concentraciones séricas equiparables de 178, 229 y 164 pg/ml, respectivamente. El Comparador 1 tuvo un perfil de eliminación similar a H4H12166P hasta el día 30, pero en los días 40 y 50 mostró un rápido aumento de la depuración frente a H4H12166P. El día 50, H4H12166P tenía una concentración sérica media de anticuerpos de aproximadamente 9 pg/ml, mientras que el Comparador 1 y el Comparador 2 tenían una concentración sérica media de anticuerpos 30 veces inferior, de 0,3 pg/ml. El Comparador 2 mostró la exposición más baja de los tres anticuerpos probados, con una ABC<última>aproximadamente 2 veces inferior (1408 día pg/ml) en comparación con H4H12166P (2801 día pg/ml) y el Comparador 1 (2708 día pg/ml).
Efectos farmacológicos de los anticuerpos anti-C5 H4H12166P, Comparador 1 y Comparador 2 de muestras de suero de ratón humanizado para C5 suplementado con C3 humano se midieron hasta el día 50 y se determinaronex vivomediante hemólisis en la vía clásica (VC) del complemento de SRBC sensibilizados. El porcentaje medio de hemólisis para cada anticuerpo anti-C5 se resume en la Tabla 28 y el perfil del porcentaje medio de hemólisis frente al tiempo se muestra en la Figura 5.
T l 2 : P r n ivi h m lí i n l ví l i l n i r n i h m n
continuación
H4H12166P, El Comparador 1 y Comparador 2 inhibieron la actividad hemolítica terminal del complemento que parecía correlacionarse con las exposiciones a los anticuerpos. H4H12166P bloqueó más del 85 % de la actividad hemolítica hasta el día 30, y la actividad volvió a los niveles basales anteriores a la dosis en el día 50. El Comparador 1 y el Comparador 2 bloquearon aproximadamente el 80 % de la actividad hemolítica hasta el día 20 y el día 10, respectivamente, volviendo la actividad a los niveles iniciales el día 30 en ambos casos.
Experimento 2
En este experimento, se evaluó la farmacocinética y la farmacodinámica de los anticuerpos anti-C5 H4H12166P, H4H12161P, Comparador 1 y un control de isotipo en ratones humanizados para C5 (ratones homocigotos para la expresión humana de C5). Los niveles totales de C5 circulante se determinaron utilizando un ELISA de complemento humano C5 (Abcam, cat n.° ab125963), que se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se determinó que las concentraciones medias de C5 humana en los ratones eran de 48,98|jg/ml ± 15,1 jg/ml.
Antes de la dosificación del anticuerpo, los ratones macho y hembra humanizados para C5 se estratificaron según los niveles de C5 humana que alcanzaron una media de 50 jg/ml. Para cada Acm anti-C5, cohortes de cinco ratones recibieron una única inyección subcutánea (sc) de 15 mg/kg de H4H12166P, H4H12161P, Comparador 1 o un control de isotipo. Todos los ratones fueron sangrados antes de la dosis, 6 horas, 1,2, 3, 4, 7, 10, 13, 21, 30 y 45 después de la inyección para el análisis FC. Adicionalmente, el día 59, se practicó la eutanasia a todos los ratones de cada cohorte y se recogieron las hemorragias terminales para los análisis FC y FD. La sangre se procesó en suero y se congeló a -80 °C hasta que se analizó.
Las concentraciones totales de anticuerpos se determinaron en 12 puntos temporales y el porcentaje de actividad hemolítica se determinó en 1 punto temporal durante un período de vida útil de 59 días. Las concentraciones totales de anticuerpos séricos para cada anticuerpo anti-C5 se resumen en la Tabla 29. En la Figura 6 se muestran los perfiles de concentración media total de anticuerpos frente al tiempo. Los parámetros de medios FC se describen en la Tabla 30.
Tabla 29: Concentraciones medias de IgG total en suero tras una única inyección subcutánea de 15 mg/kg de n i r n i- l i n n r n h m niz r
continuación
Tabla 30: Parámetros FC
Los perfiles de concentración media frente al tiempo muestran que H4H12166P, H4H12161P, el Comparador 1 y el control de isotipo alcanzaron una concentración sérica máxima (C<máx>) entre los días 1 y 3, con valores de C<máx>equiparables en 1,3 veces (178, 225, 183 y 221) pg/ml, respectivamente. H4H12166P y el control del isotipo presentaron perfiles de eliminación similares, con niveles de fármaco restantes de aproximadamente 4 pg/ml en el día 59. El H4H12161P mostró un aclaramiento más rápido que H4H12166P y el control de isotipo, pero se depuró más lentamente que el Comparador 1. El día 59, H4H12161P tuvo un nivel medio de fármaco en suero de 0,6 pg/ml, mientras que el Comparador 1 tuvo un nivel de fármaco casi indetectable de 0,08 pg/ml.
El control de isotipo, H4H12166P y H4H12161P mostraron valores de exposición (ABC<última>) equiparables dentro de 1,3 veces (4080, 3490 y 3040 día pg/ml, respectivamente), mientras que el Comparador 1 mostró una exposición 1,6 veces menor (2240 día pg/ml) en comparación con H4H12166P.
Ejemplo 12: Ensayo basado en LC-MRM-MS para determinar la concentración de C5 humana total
En este ejemplo, se determinaron las concentraciones séricas de C5 humana total mediante un método de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas con monitorización de reacciones múltiples (LC-MRM-MS) en un estudio farmacocinético/farmacodinámico del anticuerpo anti-C5 H4H12166P.
Las concentraciones séricas de C5 humana total se determinaron midiendo la concentración de un péptido de 10 aminoácidos contenido en la secuencia C5 LQGTLPVEAR (aa 1129-1138 de SEQ ID NO: 359) como sustituto de C5. En teoría, este método también podría detectar el producto de la división de C5, C5b. Sin embargo, debido a la inestabilidad del C5b libre, las concentraciones de C5b en el suero son generalmente bajas y la mayor parte del C5b se une a las superficies celulares en forma de complejos MAC (Cooper & Muller-Eberhard 1970, J. Exp. Med. 132: 775-93; Hadderset al.,2012, Cell Rep. 1: 200-7). Por lo tanto, es probable que las muestras de suero procesadas analizadas en el presente documento solo contengan cantidades insignificantes de producto C5b, si las tiene.
Métodos
Para el estudio FC/FD, los ratones recibieron una dosis única de 15 mg/kg de H4H12166P mediante inyección subcutánea (sc). Todos los ratones fueron sangrados antes de la dosis y un día después de la inyección para el análisis FC. Adicionalmente, a los 10, 20, 30, 40, 50 y 60 días después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y se recogieron las hemorragias terminales para el análisis FC y FD.
Se utilizó C5 humana como patrón de referencia para la calibración; y se utilizó como patrón interno un péptido C5 humano producido con un resto carboxiterminal de arginina marcado con isótopos estables (LQGTLPVEAR-<13>C<615>N<4>). El patrón de referencia se utilizó en concentraciones que variaban de 3,9 y 250 pg/ml (diluciones seriadas a 1:2) en suero de ratones con desactivación C5 generados internamente, en donde se eliminó el genC5del ratón(C5-/-).También se utilizó suero de ratonesC5-/-como control negativo (blanco). Los patrones de calibración, los blancos y las muestras de suero del estudio (10 |jl cada uno) se secaron y luego se desnaturalizaron en 100 |jl de tampón 8 M de urea/20 mM de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) a 37 °C durante 1 hora. Seguidamente, se añadieron 1o j l de patrón interno 25 nM a todas las muestras. Las muestras se alquilaron con 10 mM de 2-yodoacetamida a temperatura ambiente durante 30 minutos y se diluyeron con 50 mM de bicarbonato amónico hasta un volumen final de 500 jl. A continuación, las muestras se digirieron con tripsina (1:20 p/p) durante una noche a 37 °C. El péptido tríptico LQGTLPVEAR derivado de C5 se detectó y cuantificó mediante LC-MRM-MS utilizando un TQ-S de Waters Xevo con el sistema de UPLC ACQUITY. Cada muestra procesada (10 j l ) se inyectó en una columna BEH C18 de UPLC ACQUITY preequilibrada. El caudal fue de 0,6 ml/min (Fase móvil A: agua:ácido fórmico/100:0,1 [V:V] y Fase móvil B: acetonitrilo:ácido fórmico/100:0,1 [V:V]). El tiempo de retención y el área de pico se determinaron con elsoftwareMasslynx Analyst Data (Waters). Las concentraciones del analito C5 se calcularon a partir de la curva de calibración que se construyó trazando la relación del área del pico del patrón de referencia C5 (péptido C5 no marcado LQGTLPVEAR-12C614N4 generado por digestión con tripsina de hC5) y el patrón interno (péptido C5 marcado con isótopos estables) frente a la concentración nominal del patrón de referencia C5. Las concentraciones se calcularon mediante regresión lineal. La concentración más baja del patrón de referencia C5 (3,9 jg/m l) estaba dentro del intervalo dinámico del ensayo y se definió como el LLO<q>del ensayo.
Resultados
Se evaluaron las concentraciones de C5 humana total en suero de las muestras recogidas y por sangrado de la cola antes de la dosis (predosis) y por sangrado terminal los días 10, 30 y 35, de los animales correspondientes. Las concentraciones totales de hC5 tras la dosis de H4H12166P fueron similares (entre ~1 y 0,9 veces) a los niveles previos a la dosis en los días 10, 30 y 35 después de la dosis. Las diferencias menores observadas no fueron estadísticamente significativas, según lo evaluado mediante la prueba de Mann-Whitney con elsoftwareGraphPad Prism. El análisis de la relación molar de C5/H4H12166P demostró que H4H12166P se mantuvo en exceso molar respecto a C5 hasta el día 35 después de la dosis (Tabla 31).
Tabla 31: Resumen de las características FD de H4H12166P
Ejemplo 13: Cartografía del epítopo de la unión de H4H12166P a C5 mediante intercambio de hidrógeno/deuterio
Se realizó una cartografía de epítopos de intercambio de H/D con espectrometría de masas para determinar los restos de aminoácidos de hC5 [(aminoácidos M1-C1676 de SEQ ID NO: 359) con el que interactúa H4H12166P. Se expone una descripción general del método de intercambio de H/D en, p. ej., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; y Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.
Los experimentos de HDX-MS se realizaron en una plataforma integrada Waters HDX/MS, que consiste en un sistema Leaptec HDX PAL para el marcaje de deuterio, un Waters Acquity M-Class (administrador auxiliar de disolventes) para la digestión y carga de muestras, un Waters Acquity M-Class (administrador de disolventes jBinary) para el gradiente de columna analítica y un espectrómetro de masas Synapt G2-Si para la medición péctica de masas peptídicas.
La solución de marcaje se preparó en tampón PBS 10 mM en D<2>O a pD 7,0 (equivalente a pH 6,6). Para el marcaje de deuterio, se incubaron 3,8 j l de C5 (6 pmol/jl) o C5 premezclado con el anticuerpo en proporción molar 1:1 con 56,2 |jl de solución de mareaje de D<2>O durante varios puntos temporales (p. ej., control no deuterado = 0 s, marcado durante 1 min y 20 min). La deuteración se inactivó transfiriendo 50 j l de muestra a 50 j l de tampón de inactivación preenfriado (TCEP 0,2 M, cloruro de guanidina 6 M en tampón de fosfato 100 mM, pH 2,5) y la muestra mezclada se incubó a 1,0 °C durante dos minutos. A continuación, la muestra inactivada se inyectó en un administrador Waters HDX para la digestión en estirpe con pepsina/proteasa XIII. Los péptidos digeridos se atraparon en una precolumna VanGuard BEH C18 de UPLC ACQUITY de 1,7 jm y 2,1 * 5 mm a 0 °C y se eluyeron a una columna analítica BEH C18 de UPLC ACQUITY de 1,7 jm , 1,0 * 50 mm para una separación en gradiente de 9 minutos del 5 %-40 % de B (fase móvil A: ácido fórmico al 0,1 % en agua, fase móvil B: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo). El espectrómetro de masas se ajustó a un voltaje de cono de 37 V, tiempo de exploración de 0,5 s e intervalo de masa/carga de 50 1700 Unidades de Thomson (Th).
Para la identificación de los péptidos C5 humanos, Los datos LC- MSE de la muestra no deuterada se procesaron y se buscaron en la base de datos que incluye la C5 humana, pepsina y su secuencia aleatoria mediante elsoftwareWaters ProteinLynx Global Server (PLGS). Los péptidos identificados se importaron al programa informático DynamX y se filtraron por dos criterios: (1) productos mínimos por aminoácido = 0,3 y (2) umbral de veces de replicación = 3. A continuación, el programa informático DynamX determinó automáticamente la captación de deuterio de cada péptido basada en el tiempo de retención y la alta precisión de masa (<10 ppm) en múltiples puntos de tiempo con 3 repeticiones en cada tiempo.
Utilizando la columna en línea de pepsina/proteasa XIII junto con adquisición de datos de MSE, se identificó un total de 189 péptidos de C5 humana en ausencia o presencia del anticuerpo, lo que representa una cobertura de secuencia del 62 %. Cinco péptidos presentaron una captación de deuteración significativamente reducida (valores delta del centroide >0,9 dalton con valores dep<0,05) cuando se unieron a H4H12166P y se ilustran en la Tabla 32.
T l 2: D r i n i h m n l nir l H4H121 P
La masa peptídica registrada corresponde al valor promedio de la masa de MH+ del centroide de tres repeticiones. Estos péptidos, correspondientes a los aminoácidos 591-599 y 775-794, tuvo una tasa de deuteración más lenta al unirse a H4H12166P. Estos restos identificados también corresponden a los restos 591-599 y 775-794 de la C5 humana, tal y como se define en la entrada Uniprot P01031 (CO5_HUMAN; SEQ ID NO: 359).
Ejemplo 14: Efecto de los anticuerpos anti-C5 sobre la inflamación ocular en la uveítis autoinmunitaria experimental en ratones
El presente estudio se llevó a cabo para evaluar el papel de C5 en la uveítis autoinmunitaria experimental (UAE). Se utilizaron enfoques experimentales tanto genéticos [ratones con C5 desactivada (KO), C3/C5 doble KO], como farmacológicos (anticuerpo anti-C5).
Métodos
Se utilizaron ratones adultos C57BL/6J (n = 25, laboratorios Jackson), C5 KO (n=13) y C3/C5 KO (n = 8) (Regeneron Pharmaceuticals Inc.). La EAU se indujo mediante la inyección subcutánea de péptido humano de proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP, New England Peptide) en adyuvante completo de Freund y la inyección intraperitoneal de toxina pertussis. Se administró Acm anti-C5 de ratón o Acm control de isotipo mediante inyecciones subcutáneas cada 3 días desde el día 5 al 28. El anticuerpo anti-C5 de ratón utilizado en este estudio (M1M17628N) comprendía una HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 362/363. Se utilizó SPECTRALIS® HRA+OCT (Heidelberg Engineering, Inc.) para evaluar los niveles de inflamación en los días -1, 7, 14, 21 y 28. Todos los animales fueron sacrificados el día 28 para la extracción de sangre y ojos. Se realizó un ensayo de hemólisis con/sin C3 humana para validar la inhibición del complemento. Los datos se analizaron mediante ANOVA.
Resultados
En comparación con los ratones de tipo natural, la aparición de inflamación (30-50 %) y el número de agrupaciones de células vitreas disminuyeron significativamente en los ratones C5 KO (p <0,01). Las puntuaciones de la tomografía de coherencia óptica (OCT) en ratones C5 KO también se redujeron significativamente en un 50 % en la semana 3 (p <0,0001). Curiosamente, en ratones C3/C5 doble KO, había significativamente más agrupaciones de células vítreas y puntuaciones de enfermedad más altas en el día 28 en comparación con los ratones de tipo natural (p <0,05). En los animales que recibieron Ac anti-mC5 (50 mg/kg), la incidencia de inflamación y las agrupaciones de células vítreas fueron significativamente inferiores en comparación con el grupo sin tratamiento o con el grupo de control de isotipo en el día 21 (p <0,01). En las semanas 3 y 4, las puntuaciones de OCT en el grupo tratado con anticuerpos anti-C5 fueron significativamente inferiores en comparación con la ausencia de tratamiento o el control de isotipo (p <0,0001). (Figura 7) Los ensayos de hemólisis con/sin C3 humana confirmaron el efecto inhibidor del anticuerpo anti-C5 en la semana 4 (Figura 8).
Conclusión
La inflamación ocular debida a la UAE se atenuó mediante la inhibición de la actividad de C5, ya sea por deleción genética o por inhibición farmacológica con un anticuerpo anti-C5 específico. El empobrecimiento de C5 retrasó la aparición de UAE y redujo la puntuación de la enfermedad de OCT. Estos resultados indican que C5 es una posible diana terapéutica para la uveítis autoinmunitaria. El anticuerpo anti-C5 tiene un efecto protector sobre la enfermedad UAE en ratones de tipo natural. Nuestros hallazgos también indican que el C3 podría ser beneficiosa para la enfermedad UAE en ratones.
Ejemplo 15: Efecto de los anticuerpos anti-C5 humana en la uveítis autoinmunitaria experimental
Este ejemplo describe los efectos de anticuerpos anti-C5 contra la C5 humana en un modelo de ratón de uveítis autoinmunitaria experimental (UAE). Los ratones utilizados para este estudio fueron humanizados para expresar la proteína C5 humana mediante la tecnología Velocigene® (Valenzuela et al 2003, Nat. Biotechnol. 21: 652-659). Los ratones humanizados fueron diseñados para reemplazar del exón 2 al exón 41 del gen C5 murino con los exones 2 42 del gen C5 humano (divulgado en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2015/0313194, incorporado en el presente documento en su totalidad).
Métodos
Se inmunizó a ratones macho adultos por vía subcutánea en cada muslo con 150 |jg del péptido humano de la proteína de unión a retinoides interfotorreceptores (IRBP) 1-20 (GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD) (SEQ ID NO: 364) (Avichezeret al.,2000, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41:127-131) en 0,2 ml de emulsión de CFA, suplementada con la cepa H37RA deMycobacterium tuberculosisa 2,5 mg/ml. A continuación, se inoculó a los ratones por vía intraperitoneal 1,0 jg de toxina pertussis (PTX) para facilitar la inducción de la antoinmunidad mediada por células mediante la promoción de una polarización Th1 de la respuesta inmunitaria (Thurauet al.,1997, Clin. Exp. Immunol. 109: 370-376; Silveret al.,1999, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40: 2898-2905). El peso corporal de los animales se controló dos veces por semana.
Se realizaron exámenes oftalmológicos el día -1, antes de la inducción de UAE y en los días 7, 14, 21 y 28. Los ratones fueron anestesiados con ketamina (120 mg/kg, ip) y xilacina (5 mg/kg, ip). Se dilataron las pupilas con una solución oftálmica de Tropicamida al 0,5 % y se examinó el fondo del ojo utilizando una lente de contacto con una cámara de fondo de ojo en una plataforma de angiografía retiniana Spectralis Heidelberg (HRA) sistema OCT (Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA, EE. UU.).
Se obtuvo una serie de 61 secciones ópticas laterales para cada ojo utilizando la función OCT en el sistema Spectralis HRA OCT (Heidelberg Engineering, Carlsbad, CA, EE. UU.)). El área de imagen OCT se centró en el disco óptico, lo que permitió obtener imágenes iguales por encima y por debajo de la cabeza del nervio óptico. Se midió el espesor de la retina como la distancia entre la parte inferior de la capa del EPR y la membrana limitante interna del ojo. Las mediciones se realizaron a 1500 jm del disco óptico, y los valores de 4 cuadrantes retinianos diferentes (p. ej., superior, inferior, temporal y nasal) se promediaron para obtener un espesor medio de la retina del ojo.
La gravedad de la infiltración de células inflamatorias en el vítreo también se calificó en imágenes de OCT, evaluando el promedio de agrupaciones de células inflamatorias en el vítreo, en cuatro exploraciones OCT laterales que seccionaron el nervio óptico, por ojo.
Se elaboró una escala de 4 puntos para evaluar la gravedad de la enfermedad en las imágenes de OCT (puntuaciones de OCT) (Tabla 33).
Tabla 33: Puntuación de la UAEin v iv omediante tomo rafía de coherencia ó tica OCT
continuación
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos de los datos paramétricos (peso corporal, agrupaciones de células inflamatorias en el vitreo y espesor de la retina) se realizaron mediante la prueba ANOVA unidireccional y la prueba de comparación múltiple de Tukey. Para los datos no paramétricos (puntuaciones de OCT y puntuaciones histológicas) se realizaron análisis mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de Dunn con elsoftwareGraphPad Prism versión 5.0d en relación con los grupos de control de isotipo o sin tratamiento. Los datos muestran valores medios ± ETM. Un valor depinferior a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
En un primer estudio (Estudio A), los ratones fueron tratados por vía subcutánea cada 3 días a partir del día 5 con anticuerpo de control del isotipo (50 mg/kg), o 10 mg/kg o 50 mg/kg de H4H12170P. El tratamiento con 10 mg/kg de H4H12170P produjo una reducción de la inflamación y del daño retiniano (Figura 9). Los ratones tratados con 10 mg/kg de H4H12170P también mostraron una reducción estadísticamente significativa de las puntuaciones de OCT el día 21 y el día 28 (Figura 10).
En un segundo estudio (Estudio B), los ratones fueron tratados por vía subcutánea cada 3 días a partir del día 6 con un control de isotipo (10 mg/kg), 3 mg/kg o 10 mg/kg de H4H12166P, o con el Comparador 2 (véase el Ejemplo 2 del presente documento); "construcciones de control utilizadas en los siguientes ejemplos"). El tratamiento con H4H12166P a dosis de 3 mg/kg o 10 mg/kg produjo una reducción relacionada con la dosis en las puntuaciones de OCT que fue estadísticamente significativa en los días 14 a 28 (Figura 11). El tratamiento con 10 mg/kg de H4H12166P en ratones humanizados para C5 comenzando 6 días después de la inducción de UAE dio lugar a una reducción relacionada con la dosis en la inflamación y el daño retiniano según lo determinado por OCT obtenido en el día 14 a 28 (Figura 12).
Para ambos estudios, la evaluación no invasiva en vida mediante OCT mostró un desarrollo progresivo de la inflamación, un aumento del espesor de la retina y anomalías morfológicas en los animales de control tras la inmunización con IRBP.
Conclusión
Estos experimentos proporcionan más pruebas farmacológicas de que C5 desempeña un papel en la patogénesis de la uveítis autoinmunitaria. El empobrecimiento farmacológico de C5 humana mediante anticuerpos anti-C5 humana totalmente humanos pospuso la incidencia de UAE y redujo la gravedad de la enfermedad, estableciendo la eficacia de estos anticuerpos en la uveítis autoinmunitaria.
Ejemplo 16: Efecto de los anticuerpos anti-C5 en la lesión por isquemia-reperfusión renal
El presente estudio se llevó a cabo para evaluar el papel de C5 en la lesión por isquemia-reperfusión renal. Se utilizaron métodos genéticos (ratones con desactivación de C3 y con desactivación de C5) y farmacológicos (anticuerpos anti-C5). El modelo de isquemia-reperfusión se indujo mediante pinzamiento bilateral del pedículo renal durante 45 min seguido de 48 h de reperfusión. La laparotomía simulada sirvió de control. El anticuerpo anti-C5 se administró a 50 mg/kg por vía intravenosa como dosis única inmediatamente después de la isquemia (curativa); o por vía subcutánea en dos dosis, día -1 y día 1 de cirugía (preventiva). El anticuerpo anti-C5 utilizado para este estudio fue M1M17628N, que comprende HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 362/363. Se utilizaron marcadores de nitrógeno ureico en sangre (NUS) y creatinina sérica para evaluar los niveles de enfermedad y protección en los ratones.
Tabla 34: Cambio porcentual en los niveles de nitrógeno ureico en sangre en ratones tratados con n i r n i- M1M17 2 N n m r v n iv r i
Tabla 35: Cambio porcentual en los niveles de creatinina sérica en ratones tratados con anticuerpo anti-C5
M1M17 2 N n m ^ r v n iv r i ^
En comparación con los ratones de tipo natural, Los ratones con desactivación de C3 y C5 mostraron una protección funcional significativa en el modelo de RIRI de lesión renal aguda, como demuestra la reducción de los niveles de nitrógeno ureico en sangre y creatinina sérica. El anticuerpo anti-C5 mostró protección funcional en el modelo de RIRI tanto en modo preventivo como terapéutico (Tablas 34-35).
Ejemplo 17: Efecto de los anticuerpos anti-C5 en la nefritis lúpica
Este ejemplo describe la eficacia de los anticuerpos anti-C5 en el tratamiento de la nefritis lúpica en un modelo de ratón.
El lupus eritematoso sistémico (LES) es un trastorno autoinmunitario provocado por la pérdida de tolerancia a los autoantígenos, la producción de autoanticuerpos y la deposición de complejos inmunitarios fijadores del complemento (CI) en los tejidos lesionados. El LES se caracteriza por una amplia selección de manifestaciones clínicas y órganos diana, siendo la nefritis lúpica una de las complicaciones más graves. La activación del complemento en los riñones de pacientes con nefritis lúpica contribuye a la inflamación y al daño tisular. Se estudió la eficacia de los anticuerpos anti-C5 en el tratamiento de la nefritis lúpica en ratones NZBWF1, un modelo de ratón espontáneo de nefritis lúpica (Yanget al.,1996, PNAS). Los ratones desarrollan una enfermedad autoinmunitaria parecida al LES humano, autoanticuerpos contra antígenos nucleares y proteínas de la membrana celular, hipergammaglobulinemia, albuminuria, proteinuria, inician una glomerulonefritis inmunocompleja y mueren de insuficiencia renal y enfermedad renal terminal entre las 35 y 50 semanas de edad.
Para este estudio, se trataron ratones NZBWF1 de 25 semanas de vida por vía subcutánea con 30 mg/kg de control de isotipo, o anticuerpos anti-C5 dos veces por semana durante 8 semanas seguidas de tres veces por semana durante 10 semanas. Los anticuerpos anti-C5 de ratón utilizados para este estudio fueron M1M17628N y M1M17627N, que comprenden HCVR/LCVR de SEQ ID NO: 362/363 y 365/366, respectivamente.
El tratamiento con anticuerpos anti-C5 mejoró significativamente la tasa de supervivencia de los ratones (Figura 13). Ambos anticuerpos mejoraron la albuminuria a las 8-14 semanas de tratamiento (Figura 14), y los niveles de nitrógeno ureico en sangre a las 12-16 semanas de tratamiento (Figura 15).
Ejemplo 18: Efecto de los anticuerpos anti-C5 contra la muerte celular de los astrocitos
La neuromielitis óptica (NMO) es una enfermedad autoinmunitaria del sistema nervioso central (SNC) que afecta principalmente al nervio óptico y a la médula espinal. En la NMO, los autoanticuerpos antiaquaporina-4 (AQP4-Ab) provoca daños en los astrocitos al activar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Los objetivos de este estudio eran evaluar el papel del sistema del complemento en la progresión de la NMO y el uso de un anticuerpo contra una proteína del complemento como posible tratamiento terapéutico de la NMO.
Los astrocitos corticales primarios de rata se obtuvieron de la corteza cerebral de crías de rata postnatales y se cultivaron con AQP4-Ab (anticuerpo "rAb-53" de la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2014/0170140; Bennettet al.,2009, Ann. Neurol. 66: 617-629) y proteínas del complemento para demostrar la citotoxicidad mediada por células. A continuación, se repitieron los experimentos añadiendo un anticuerpo anti-C5 para demostrar el bloqueo de la destrucción de las células astrocitarias.
Para cuantificar la muerte celular, se realizó un ensayo de citotoxicidad por luminiscencia CytoTox-Glo<™>. En el ensayo se utilizaron varias concentraciones de anticuerpo anti-C5 (0,001 pg/ml, 0,01 pg/ml, 0,1 pg/ml, 1 pg/ml, 10 pg/ml, 100 pg/ml o 1000 pg/ml) o un anticuerpo de control del isotipo.
Para determinar si el anticuerpo anti-C5 podía bloquear la CDC inducida por AQP4-Ab, se sembraron los astrocitos en placas y se repitió el ensayo de citotoxicidad CytoTox-Glo<TM>para encontrar una dosis óptima de AQP4-Ab para esa siembra. Se comprobó que la concentración óptima de AQP4-Ab era de 50 pg/ml, y en un experimento posterior se utilizó una dosis constante de AQP4-Ab (50 pg/ml), mientras se variaba la dosis de anticuerpo anti-C5. Como se muestra en la Figura 16, se observó una disminución de las URL (de una media de 300.000 a una media de 100.000) con cantidades crecientes de anticuerpo anti-C5, lo que demuestra que el anticuerpo anti-C5 bloqueó la muerte celular de los astrocitos. En ambos experimentos, las URL no variaron con el anticuerpo de control del isotipo. Como se muestra en la Figura 16, los anticuerpos anti-C5 inhibieron la citotoxicidad inducida por AQP4-Ab en astrocitos corticales primarios con una CI<50>de 15-17 nM.
En un estudio posterior, el anticuerpo anti-AQP4 y el anticuerpo anti-C5 se inyectarán en cerebros de rata para evaluar la eficacia terapéutica contra la citotoxicidad de los astrocitos mediada por el complemento en el SNC.
Ejemplo 19: Ensayo endotelial
Este ejemplo describe un ensayo endotelial glomerularin vitropara examinar si los anticuerpos anti-C5 bloquean la deposición de C5b-9 y C3.
Los métodos reproducibles para evaluar los efectos inhibidores de los fármacos candidatos sobre la activación del complemento son esenciales para el desarrollo preclínico. Debido a la complejidad de las vías de activación del complemento, un ensayo debe utilizar células y criterios de valoración pertinentes para la indicación terapéutica dada. En el presente documento, utilizando una estirpe inmortalizada de células endoteliales glomerulares humanas (HGEC,Human Glomerular Endothelial Cell),se validó un modelo de deposición de complemento C3 y C5 para usar en la evaluación de la actividad de bloqueo de Acm anti-C3 o C5.
Métodos
Se sembraron células endoteliales glomerulares primarias de riñón humano (HGEC; Cell Biologics) durante la noche en medio completo en placas de 96 pocillos de fondo transparente negro recubiertas de colágeno I. Las células se trataron con PBS (control) o se activaron durante 10 minutos con ADP 10 uM. Después del lavado con PBS, se añadió suero humano al 50 % (preservado del complemento, empobrecido en C3 o empobrecido en C5) durante 4 horas. Se añadieron anticuerpos anti-C5 a 1 mg/ml al suero antes del tratamiento. Las células se lavaron, se fijaron y se sondaron con anticuerpos anti-C3b (Thermofisher) y/o anticuerpos anti-C5b-9 (Abcam), anticuerpos secundarios y sometidos a contratinción con DAPI. Las imágenes se capturaron en ImagExpress y se utilizó el análisis de imágenes de alto contenido para cuantificar la tinción fluorescente de cada imagen y se promedió por condición.
Resultados
Se observó deposición de C3 y C5b-9 en las CEHGG activadas por ADP expuestas a suero humano normal, pero no en las CEHG no activadas (C3: 1,5 * 10<7>± 1,0 * 10<7>; C5: 7,9 * 10<6>± 6,6 * 10<6>,p<0,05 frente a HGEC no activadas por ADP). La deposición de C3 y C5b-9 se redujo significativamente en las HGEC activadas por ADP expuestas a suero empobrecido en C3 o C5 (C3: 3,3 * 10<5>±4,8 * 10<4>; C5: 1,5 * 10<6>± 6,0 * 10<5>, p <0,05). La adición de un Acm anti-C5 bloqueante redujo significativamente la deposición de C5b-9 derivado del suero humano normal sobre las CEHG activadas por ADP, la deposición fue equiparable a la de los sueros empobrecidos en C5 (Acm C5: 1,02 * 10<6>± 6,0 * 10<5>, Acm de control 3,7 * 10<6>± 1,6 * 10<6>,p<0,05 frente a Acm de control).
Conclusión
Estos datos demuestran la utilidad de un ensayo endotelial glomerular humanoin vitropara modelizar la deposición de los complementos C3 y C5. Además del cribadoin vitro,este ensayo ofrece posibilidades como modelo traslacional para evaluar estrategias anticomplemento en la enfermedad renal utilizando muestras de suero obtenidas de pacientes.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la proteína del factor 5 del complemento (C5), en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 98, y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 106.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 353 y/o la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 354.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 353 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 354.
4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es una molécula de anticuerpo completa.
5. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
6. Un dispositivo de administración de pluma reutilizable que comprende la composición farmacéutica de la reivindicación 5.
7. Un dispositivo de administración autoinyector que comprende la composición farmacéutica de la reivindicación 5.
8. Una molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una HCVR de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se establece en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y una secuencia nucleotídica que codifica una LCVR de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se establece en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
9. Un vector de expresión recombinante que comprende la molécula polinucleotídica de la reivindicación 8.
10. Una célula que comprende el vector de expresión recombinante de la reivindicación 9.
11. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para usar en un método de prevención, tratamiento o mejora de al menos un síntoma o indicio de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en síndrome urémico hemolítico atípico (SHUa), hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), degeneración macular senil, atrofia geográfica, uveítis, neuromielitis óptica, esclerosis múltiple, accidente cerebrovascular, síndrome de Guillain-Barre, traumatismo craneoencefálico, enfermedad de Parkinson, un trastorno de activación inadecuada o indeseable del complemento, una complicación de la hemodiálisis, rechazo de aloinjerto hiperagudo, rechazo de xenoinjerto, toxicidad inducida por interleucina-2 durante terapia con IL-2, un trastorno inflamatorio, inflamación de una enfermedad autoinmunitaria, enfermedad de Crohn, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, lesión térmica, una quemadura, congelación, una afección por reperfusión postisquémica, infarto de miocardio, síndrome de fuga capilar, obesidad, diabetes, enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, epilepsia, ateroesclerosis, vasculitis, penfigoide ampolloso, glomerulopatía C3, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatía diabética, síndrome de Alport, insuficiencia renal progresiva, una enfermedad renal proteinúrica, lesión renal por isquemia-reperfusión, nefritis por lupus, angioplastia con balón, síndrome post-bomba en derivación cardiopulmonar o derivación renal, isquemia renal, reperfusión de la arteria mesentérica después de la reconstrucción aórtica, enfermedad infecciosa, sepsis, un trastorno inmunocomplejo, una enfermedad autoinmunitaria, un trastorno renal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis por LES, nefritis proliferativa, anemia hemolítica, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, embolia pulmonar, infarto pulmonar, neumonía y miastenia grave.
12. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para usar de acuerdo con la reivindicación 11, en donde:
(a) el método de tratamiento es profiláctico;
(b) el método comprende administrar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo junto con un segundo agente terapéutico; opcionalmente, en donde el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticoagulante, un fármaco antiinflamatorio, un antihipertensor, un agente inmunosupresor, un agente hipolipemiante, un agente anti-CD20 tal como rituximab, un agente anti-TNF tal como infliximab, un agente anticonvulsivo, un inhibidor de C3, un segundo anticuerpo anti-C5 y un agente antitrombótico; o
(c) el método comprende administrar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal, oral, intramuscular o intracraneal.
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