RS65760B1 - Prefuzioni rsv f proteini i njihova upotreba - Google Patents

Prefuzioni rsv f proteini i njihova upotreba

Info

Publication number
RS65760B1
RS65760B1 RS20240825A RSP20240825A RS65760B1 RS 65760 B1 RS65760 B1 RS 65760B1 RS 20240825 A RS20240825 A RS 20240825A RS P20240825 A RSP20240825 A RS P20240825A RS 65760 B1 RS65760 B1 RS 65760B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rsv
protein
polypeptide
seq
amino acid
Prior art date
Application number
RS20240825A
Other languages
English (en)
Inventor
Jeffrey Boyington
Ivelin Stefanov Georgiev
Marie Pancera
Cinque Soto
Sanjay Srivatsan
Guillaume Stewart-Jones
Peter D Kwong
Barney S Graham
Jason S Mclellan
Michael Gordon Joyce
Masaru Kanekiyo
Baoshan Zhang
Lei Chen
Man Chen
Gwo-Yu Chuang
Jason Gorman
Yongping Yang
Tongqing Zhou
Mallika Sastry
Gilad Ofek
Original Assignee
The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services filed Critical The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services
Publication of RS65760B1 publication Critical patent/RS65760B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • C07K14/135—Respiratory syncytial virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18523—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Description

SRODNA PRIJAVA
Ova prijava zahteva prioritet od SAD privremene prijave br.61/780,910, podnete 13. marta 2013, br. 61/798,389, podnete 15. marta 2013, br.61/857,613, podnete 23. jula 2013. i br. 61/863,909, podnete 9. avgusta 2013.
OBLAST PRONALASKA
Ovo otkriće se odnosi na polipeptide, polinukleotide, kompozicije i postupke za njihovu upotrebu, za izazivanje i detektovanje imunog odgovora na respiratorni sincicijalni virus (RSV).
OSNOV PRONALASKA
Respiratorni sincicijalni virus (RSV) je virus sa omotačem sa nesegmentisanim negativnim lancem RNK koji pripada familiji Paramyxoviridae, rod Pneumovirus. On je najčešći uzročnik bronhiolitisa i upale pluća kod dece u prvoj godini života. RSV takođe izaziva ponovljene infekcije, uključujući teške bolesti donjeg respiratornog trakta, koje se mogu pojaviti u bilo kom uzrastu, posebno među starijim osobama ili onima sa kompromitovanim srčanim, plućnim ili imunskim sistemom. Pasivna imunizacija trenutno se koristi za sprečavanje teških bolesti uzrokovanih RSV infekcijom, posebno kod odojčadi koja su prevremeno rođena, imaju bronhopulmonalnu displaziju ili urođene srčane bolesti. Savremeno lečenje uključuje davanje antitela za neutralizaciju virusa RSV, Palivizumaba (SYNAGIS®; MedImmune, Inc.), koje se vezuje za linearni konformacioni epitop od 24 aminokiseline na RSV fuzionom (F) proteinu. U prirodi, RSV F protein se inicijalno eksprimira kao jedinstveni polipeptidni prekursor, označen kao F0. F0 trimerizuje u endoplazmatičnom retikulumu i obrađuje se ćelijskom proteazom sličnom furinu na dva konzervativna mesta, generišući polipeptide F1, F2 i Pep27. Polipeptid Pep27 se iseca i ne formira deo zrelog F proteina. Polipeptid F2 potiče iz N-terminalnog dela prekursora F0 i povezuje se sa polipeptidom F1 preko dve disulfidne veze. Polipeptid F1 potiče iz C-terminalnog dela prekursora F0 i učvršćuje zreli F protein u membrani preko transmembranskog domena, koji je povezan sa citoplazmatskim repom od ~24 aminokiseline. Tri protomera heterodimera F2-F1 se sklapaju da bi formirali zreli F protein, koji zadobija metastabilnu prefuzionu konformaciju u kojoj se pokreće konformaciona promena koja omogućava spajanje membrane virusa i ciljne ćelije. Zbog toga što je neophodan za ulazak RSV u ćeliju, RSV F protein je ciljno mesto delovanja neutrališućih antitela i predmet razvoja vakcina; međutim, kao i u slučaju drugih RSV antigena, prethodni napori za razvoj vakcine na bazi RSV F proteina pokazali su se neuspešnim.
Margo et al (2012) PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol 109x, no. 8, p3089-3094 otkriva antitela koja se vezuju za humani RSV protein. McLellan, et al (2013) SCIENCE, Vol, 340, no.6136, p1113-1117 otkriva strukturu prefuzionog RSV F proteina.
SUŠTINA PRONALASKA
Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima. Primeri izvođenja i/ili primeri opisa datog u nastavku koji nisu obuhvaćeni priloženim zahtevima ne smatraju se delom ovog pronalaska. Sva pozivanja u opisu na postupke za lečenje odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog ili životinjskog tela terapijom, ili za dijagnozu.
Kao što je ovde opisano, trodimenzionalna struktura RSV F proteina u njegovoj prefuzionoj konformaciji je razjašnjena. Predmetno otkriće po prvi put otkriva detalje na atomskom nivou prefuzione konformacije RSV F, koja prikazuje jedinstveno antigensko mesto („antigensko mesto Ø“) na svom vrhu distalno u odnosu na membranu. Korišćenjem trodimenzionalne strukture prefuzionog F kao smernice, projektovani su i konstruisani stabilizovani oblici prefuzionog F („PreF“ antigeni), i oni su korišćeni za generisanje RSV-neutrališućih imunskih odgovora koji su mnogostruko veći od onog postignutog sa prethodnim imunogenima na bazi RSV F proteina, i koji pružaju zaštitu pri izlaganju virusu RSV u životinjskim modelima. PreF antigeni mogu da se koriste, na primer, i kao potencijalne vakcine za RSV, i kao dijagnostički molekuli.
Otkriveni su izolovani rekombinantni RSV F proteini koji su stabilizovani u prefuzionoj konformaciji, kao i molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju rekombinantne RSV F proteine. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F proteini su stabilizovani u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L (u poređenju sa nativnim RSV F proteinom kao što je prikazano jednom od SEQ ID NO: 1-184), tako da RSV F proteini mogu specifično da se vežu za antitelo D25 koje je specifično za prefuzionu konformaciju. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein sadrži antigensko mesto Ø koje sadrži ostatke 62-69 i 196-209 sekvence RSV F proteina, kao što je SEQ ID NO: 370. U nekim primerima izvođenja, imunogen može da se veže specifično za antitelo nakon najmanje 24 sata inkubacije imunogena na 20 °C u fosfatno puferisanom fiziološkom rastvoru na fiziološkom pH, u odsustvu antitela. U daljim primerima izvođenja, imunogen može da formira homogenu populaciju kada se rastvori u vodenom rastvoru, pri čemu najmanje 90% imunogena u populaciji može specifično da se veže za antitelo koje je specifično za prefuzionu konformaciju.
U nekim primerima izvođenja, polipeptidi F2 i F1 sadrže pozicije 62-69, odnosno 196-209 RSV F, a polipeptid F2 sadrži ili se sastoji od 8-84 ostatka RSV F na pozicijama 26-109, a polipeptidi F1 sadrže ili se sastoje od 14-393 ostatka RSV F na pozicijama 137-529, pri čemu pozicije u RSV F odgovaraju aminokiselinskoj sekvenci referentnog polipeptida F0 prikazanog kao SEQ ID NO: 124.
U nekoliko primera izvođenja, rekombinantni RSV F protein uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L koje stabilizuju protein u prefuzionoj konformaciji, na primer, koje stabilizuju deo F proteina distalno u odnosu na membranu (uključujući N-terminalni region polipeptida F1) u prefuzionoj konformaciji. Na primer, aminokiselinska supstitucija može da uvede neprirodnu disulfidnu vezu, ili može da bude aminokiselinska supstitucija koja popunjava šupljinu. U nekoliko primera izvođenja, rekombinantni RSV F protein uključuje supstitucije S155C i S290C koje formiraju neprirodnu disulfidnu vezu koja stabilizuje protein u prefuzionoj konformaciji; to jest, u konformaciji koja se specifično vezuje za jedno ili više antitela specifičnih za prefuzionu konformaciju, i/ili predstavlja antigensko mesto, kao što je antigensko mesto Ø, koje je prisutno na prefuzionoj, ali ne i na postfuzionoj konformaciji RSV F proteina. U daljim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein može dodatno da uključuje F, L, W, Y, H ili M supstituciju na poziciji 190, poziciji 207 ili pozicijama 190 i 207. U jednom neograničavajućem primeru, rekombinantni RSV F protein uključuje supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L (ovde označene kao „DSCav1“).
U dodatnim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein može da uključuje jednu ili više modifikacija C-terminusa polipeptida F1 (kao što su skraćenja i aminokiselinske supstitucije) koje, zajedno sa modifikacijama koje stabilizuju region F polipeptida distalno u odnosu na membranu, mogu da povećaju stabilizaciju rekombinantnog F proteina u prefuzionoj konformaciji. Prirodne modifikacije uključuju povezivanje polipeptida F1 sa domenom trimerizacije (kao što je domen foldon) ili uvođenje jednog ili više ostataka cisteina u C-terminalnom području polipeptida F1 (na primer, na pozicijama 512 i 513) koje mogu da formiraju disulfidne veze između protomera. PreF antigen može da se uključi u proteinsku nanočesticu ili virusu-sličnu česticu. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju PreF antigene takođe su otkriveni. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein koji je jednolančani RSV F protein.
Dodatni primeri izvođenja uključuju konstrukt epitop-skafold protein koji uključuje pozicije 62-69 i 196-209 u RSV F, ili njegov kružni permutant, povezan sa heterolognim skafold proteinom, gde se konstrukt epitop-skafold protein specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju.
Obezbeđene su i kompozicije koje uključuju PreF antigene, proteinske nanočestice, molekul nukleinske kiseline ili vektor. Kompozicija može da bude farmaceutska kompozicija pogodna za davanje subjektu, i može takođe da bude sadržana u jediničnom doznom obliku. Kompozicije mogu dodatno da uključuju adjuvans.
Otkrivene su imunogene kompozicije za upotrebu u postupcima za generisanje imunog odgovora kod subjekta kome je to potrebno, kao i imunogene kompozicije za upotrebu u postupcima za lečenje, inhibiranje ili sprečavanje infekcije virusom RSV kod subjekta kome je to potrebno. U nekim primerima izvođenja postupaka, subjektu, kao što je čovek ili govedo, daje se efikasna količina otkrivenog antigena i/ili molekula nukleinske kiseline koji kodira otkriveni antigen. U nekim primerima izvođenja, postupci uključuju davanje subjektu imunogene kompozicije, koja uključuje adjuvans izabran tako, da izazove imunski odgovor pomeren u smeru Th1 tipa odgovora. U dodatnim primerima izvođenja, postupci uključuju primarnu imunizaciju-buster imunizaciju, korišćenjem humanog podtipa A i humanog podtipa B RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji sa modifikacijama koje su ovde otkrivene. Otkriveni su postupci za detektovanje ili izolovanje RSV-vezujućeg antitela kod subjekta zaraženog RSV. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F proteini mogu da se koriste za detekciju i kvantifikaciju ciljnih antitela u odgovoru poliklonskog seruma.
Navedeni i drugi predmeti, karakteristike i prednosti primera izvođenja postaće jasniji iz sledećeg detaljnog opisa, koji je dat uz pozivanje na prateće slike.
KRATAK OPIS SLIKA
SL. 1A-1C su skup grafikona i dijagram koji ilustruje neutralizaciju RSV, prepoznavanje F glikoproteina i kristalnu strukturu humanog antitela D25 u kompleksu sa RSV F trimerom u prefuzionoj konformaciji. Prefuziona konformacija RSV F je metastabilna, a kada se eksprimira u rastvorljivom obliku lako preuzima postfuziono stanje; veliki broj potentnih antitela, uključujući D25, vezuju se za novootkrivena antigenska mesta na vrhu prefuzionog F glikoproteina. (A) Neutralizacija RSV antitelima uključujući palivizumab, profilaktičko antitelo koje je odobrila FDA za sprečavanje teškog oblika RSV bolesti. (B) Enzimski imunosorbentni test (ELISA) koji meri vezivanje antitela za postfuzioni F glikoprotein. (C) Struktura D25-RSV F trimera predstavljena trakastim prikazom i prikazom molekulske površine. Jedan protomer trimera F glikoproteina je predstavljen trakastim prikazom. Molekulske površine su prikazane za druga dva F protomera. Fab D25, vezan za F protomer predstavljen trakastim prikazom, je takođe predstavljen trakastim prikazom, sa teškim lancem osenčenim tamno sivo i lakim lancem osenčenim svetlo sivom. Ostali Fab D25 su osenčeni na isti način, ali su predstavljeni prikazom površine.
SL. 2A i 2B su skup dijagrama i sekvenca poravnata sa sekundarnom strukturom RSV koja ilustruje strukturno preuređenje RSV F. Da bi posredovao u ulasku virusa u ćeliju, RSV F glikoprotein prelazi iz metastabilne prefuzione konformacije u stabilnu postfuzionu konformaciju.
(A) Prefuzione i postfuzione strukture. Spoljašnje slike prikazuju prefuzionu (levo) i postfuzionu (desno) trimernu strukturu, osenčene isto kao na SL. 1C. Kompleksni glikan, prikazan u vidu štapića, je modeliran na svakom od tri N-vezana glikozilaciona mesta nađena u zrelom proteinu. Unutrašnje slike prikazuju jedan protomer RSV F predstavljen trakastim prikazom. (B) Sekvenca i sekundarna struktura RSV F. Mesta N-vezane glikozilacije su istaknuta crnim trouglovima, antigenska mesta su označena, a strelice nadole ukazuju na položaj mesta cepanja furina. Sekundarne strukture su prikazane ispod sekvence (SEQ ID NO: 370), sa cilindrima koji predstavljaju α-zavojnice i strelicama koje predstavljaju β-ploče. Neuređeni ili nedostajući ostaci su označeni sa „X“; ostaci koji se pomeraju preko 5 Å između prefuzione i postfuzione konformacije su osenčeni sivo i uokvireni.
SL. 3A-3C prikazuju skup dijagrama i poravnanje sekvence koje ilustruje dodirnu površinu RSV F sa D25. Antitelo D25 vezuje kvaternarni epitop koji obuhvata dva protomera na vrhu prefuzionog F trimera. (A) Krupni plan dodirne površine između D25 i RSV F. Bočni lanci F ostataka u interakciji sa D25 su označeni i prikazani u vidu štapića. Atomi kiseonika su osenčeni svetlo sivo, a atomi azota su osenčeni tamno sivo. Vodonične veze su prikazane kao isprekidane linije. Dve slike su međusobno povezane rotacijom od 90° oko vertikalne ose. (B) Položaj i konformacija epitopa D25 na F molekulu u prefuzionoj i postfuzionoj konformaciji. Prikazani su RSV F ostaci na dodirnoj površini D25. Polaritet α4 i α5post je naznačen strelicama, sa naznačenim fragmentom N- i C-terminusa. (C) Konzerviranost sekvence F ostataka u regionima koje prepoznaje D25. Aminokiseline u humanom RSV podtipa B (hRSV/B) ili goveđem RSV (bRSV) koje se razlikuju od hRSV/A su podvučene. Ektodomen je definisan kao F ostaci 26-109 i 137-524.
SL. 4A-4D su serije grafikona i digitalnih slika koje se odnose na antigensko mesto Ø. Visoko efikasna RSV-neutrališuća antitela su usmerena na mesto na vrhu distalno u odnosu na membranu prefuzionog F trimera. (A) Sposobnost antitela da blokiraju vezivanje D25 za ćelije inficirane RSV-om merena je u funkciji koncentracije antitela. (B) Analiza kompleksa RSV F/Fab elektronskom mikroskopijom sa negativnim bojenjem: (Levo) Reprojekcija preseka od 12 Å kroz kristalnu strukturu RSV F D25 Fab, filtriranje do rezolucije od 10 Å i pravljenje preseka tako da se uključi šupljina F-trimera. (U sredini) Kombinovani prosek 263 čestice RSV F D25 Fab. (Desno) Kombinovani prosek 550 čestica RSV F AM22 Fab. Oznaka skale u srednjem panelu odgovara 50 Å. (C) Aktivnost inhibicije fuzije i (D) inhibicije vezivanja za antitela usmerena na antigensko mesto Ø i F-specifična antitela usmerena na druga antigenska mesta. Za test inhibicije vezivanja, heparin je korišćen kao pozitivna kontrola.
SL. 5 prikazuje šematski dijagram koji ilustruje postupke korišćene za eksprimiranje kompleksa RSV F i D25. Plazmidi koji eksprimiraju RSV F(+) Fd (F krug), laki lanac D25 (L krug) i teški lanac D25 (sa ili bez stop kodona u regionu zgloba, H krug) su istovremeno transfektovani u ćelije HEK293 u suspenziji. Alternativno, može da bude transfektovan RSV F(+) Fd plazmid, sa prečišćenom D25 Fab ili IgG koji se dodaju u ćelije 3 sata posle transfekcije. Najbolji prinosi su dobijeni istovremenom ekspresijom F i D25 Fab (~1.0 mg prečišćenog kompleksa po litru ćelija).
SL. 6 prikazuje skup dijagrama sa trakastim prikazom koji ilustruju poređenje RSV F vezanog za D25 sa prefuzionim PIV5 F. Trakasti prikaz D25-vezanog RSV F(+) Fd (levo) i PIV5 F-GCNt (desno). Postoji odlična usaglašenost elemenata sekundarne strukture između dva proteina, uprkos tome što imaju samo ~12% identičnosti sekvence. Jedna od najupečatljivijih razlika je lokacija fuzionog peptida (N-terminus podjedinice F1), takođe prikazana na SL. 7. Struktura PIV5 F opisana je kao struktura koja se sastoji od tri domena: I, II i III (Yin et al., Nature, 439, 38 (2006)). Domen III je nazvan režnjem distalno u odnosu na membranu, dok domeni I i II obuhvataju centralnu bačvu i režanj proksimalno u odnosu na membranu. Struktura PIV5 podvrgnuta isecanju koja je ovde prikazana je generisana iz PDB ID: 4GIP (Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.
109, 16672 (2012)).
SL. 7 prikazuje seriju dijagrama koji ilustruju virusne glikoproteine tipa I u prefuzionoj konformaciji. Prefuzione strukture RSV F, PIV5 F (PDB ID: 4GIP (Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.109, 16672 (2012)), HA influence (PDB ID: 2HMG; Wilson et al., Nature, 289, 366 (1981)) i GP ebole (PDB ID: 3CSY; Lee et al., Nature, 454, 177 (2008)) su prikazani kao molekulske površine, sa svakim protomerom obojenim drugačije. U donjem redu, prikazana je sfera za C-terminalni ostatak F2 (RSV i PIV5) ili HA1 (Flu), i sfera je prikazana za N-terminalni ostatak fuzionog peptida. RSV i PIV5 su oba paramiksovirusi i njihovi F proteini dele ~12% identičnosti sekvence. Iako je GP ebole fuzioni protein tipa I, nedostaje mu slobodni N-terminalni fuzioni peptid na GP2, i umesto toga sadrži unutrašnju fuzionu petlju koja se obično viđa kod fuzionih proteina tipa II i tipa III. Stoga je GP ebole izostavljen iz poređenja fuzionih peptida. SL. 8 je skup grafikona koji se odnose na neutralizaciju RSV pomoću IgG i Fab. D25, AM22 i Motavizumab neutralizuju RSV jednako dobro kao IgG ili Fab. Treba napomenuti da je x-osa grafikona za Motavizmab drugačija od ostalih.
SL. 9A i 9B su serija dijagrama i grafikona koji ilustruju svojstva antigenskih mesta na RSV F glikoproteinu. Samo antitela usmerena na antigensko mesto Ø se specifično vezuju za prefuzionu konformaciju i imaju izuzetnu potencu neutralizacije. (A) Za mesto Ø, prikazana je slika vezanja pojedinačnog D25 Fab za prefuzioni RSV F trimer, zajedno sa krivama neutralizacije za AM22 i D25. Za mesto I, strelice pokazuju na Pro389, poznatu mutaciju za izbegavanje imunskog odgovora (Lopez et al., J. Virol., 72, 6922 (1998)). Kriva neutralizacije je prikazana na antitelo 131-2a. Kao antitelo 2F (Magro et al., J. Virol., 84, 7970 (2010)), antitelo 131-2a neutrališe samo ~50% od virusa. (B) Za antigenska mesta II i IV, modeli Motavizumaba (mesto II) i 101F (mesto IV) koji se vezuju za prefuzionu i postfuzionu (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011)) F strukturu su napravljeni korišćenjem koordinata struktura antitelo-peptid (McLellan et al., J. Virol., 84, 12236 (2010); McLellan et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 17, 248 (2010)).
SL. 10 prikazuje sliku poliakrilamidnog gela koji ilustruje ekspresiju rekombinantnog RSV F proteinskog konstrukta sa aminokiselinskim supstitucijama S155C i S290C i domenom Foldon povezanim sa C-terminusom F1, i niz dijagrama koji ilustruju da disulfidna veza između S155C i S290C može da se formira samo u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina.
SL. 11 je skup grafikona koji prikazuju rezultate testova ELISA i gel filtracije korišćenjem konstrukta rekombinantnog RSV F proteina sa aminokiselinskim supstitucijama S155C i S290C i domen Foldon povezan sa C-terminusom F1. Podaci dobijeni ELISA testom ukazuju da se konstrukt S155C/S290C specifično vezuje antitelima specifičnim za prefuzioni RSV F. Profili gel filtracije pokazuju da konstrukt S155C/S290C postoji isključivo kao trimer, dok se agregati i rozete formiraju u rastvoru sa kontrolnim konstruktom RSV F koji nema supstitucije S155C/S290C.
SL. 12 prikazuje slike elektronske mikroskopije sa negativnim bojenjem konstrukta rekombinantnog RSV F proteina sa aminokiselinskim supstitucijama S155C i S290C i domenom Foldon povezanim sa C-terminusom F1. Slike ispod velikog panela su 2D proseci pojedinačnih čestica. Rezultati pokazuju da je konstrukt S155C/S290C stabilizovan u prefuzionoj konformaciji.
SL. 13-14 pokazuju skup grafikona koji ilustruju odgovor neutralizacionog antitela miševa kojima je dat nativni RSV (RSV), formalinom inaktivirani RSV (FI-RSV), konstrukt rekombinantnog RSV F proteina sa aminokiselinskim supstitucijama S155C i S290C i domenom Foldon povezanim sa C-terminusom F1 (prefuzioni F) ili konstrukt RSV F proteina stabilizovn u postfuzionoj konformaciji (postfuzioni RSV). Prikazan je odgovor antitela 5 nedelja (SL.13) i 7 nedelja (SL.
14) posle inicijalne imunizacije.
SL. 15 prikazuje digitalne slike kristala rastvorljivog rekombinantnog RSV F proteina stabilizovanog u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C i S290C. Levo, slike pod standardnim svetlom; Desno, slike pod ultraljubičastim svetlom, indikativne za proteine. Formiranje kristala iz vodenih puferisanih rastvora pokazuje da je ovaj protein suštinski homogen u rastvoru.
SL. 16 prikazuje dizajn antigena na bazi RSV F proteina (RSV_A F(+)FdTHS) stabilizovanog konstruisanim mutacijama disulfidnih veza S155C i S290C („DS“), mutacijama koje ispunjavaju šupljinu za vezivanje S190F i V207L („Cav1“) i dodatim C-terminalnim heterolognim domenom (Fd) za trimerizaciju. RSV F struktura vezana za D25 prikazana je sa dva protomera predstavljena kao molekulska površina obojena ružičastom i bež bojom, a treći protomer je predstavljen trakastim prikazom. Prikazani su N-i C-terminalni ostaci F1 koji se pomeraju više od 5 Å između prefuzione i postfuzione konformacije. Umeci pokazuju konstruisanu disulfidnu vezu između ostanaka S155C i S290C (označenu kao „DS“), kao i mutacije koje ispunjavaju šupljinu za vezivanje S190F i V207L (označene kao „Cav1“). Model domena trimerizacije fibritina T4 faga prikazan je u osnovi prefuzionog trimera. Protein RSV F, koji uključuje supstitucije S155C i S290C, i S190F i V207L u humanom RSV podtipa A, i prikačeni C-terminalni heterologni domen Foldon, označen je kao RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Mutacije kompatibilne sa prepoznavanjem pomoću D25, ali nedovoljno stabilne da bi se omogućilo prečišćavanje u obliku homogenog trimera, označene su i prikazane u vidu crnih štapića.
SL. 17 prikazuje antigensku karakterizaciju RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Stope asocijacije i disocijacije interakcije Fab rastvorljivih D25, AM22, 5C4, 101F, Motavizmaba i Palivizumaba sa imobilisanim RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 izmerene su pomoću OctetRED 384™ instrumenta (ForteBio, Melno Park, CA). Date su ravnotežne konstante disocijacije za svako antitelo.
SL. 18 prikazuje ekskluzionu hromatografiju RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Prečišćeni protein, nakon isecanja trombinom za uklanjanje oznaka, propušten je kroz kolonu 16/70 Superose 6 za ekskluzionu hromatografiju. Eluciona zapremina je u skladu sa glikozilisanim trimerom.
SL. 19 prikazuje tabelu sa antigenskim i fizičkim karakteristikama varijante RSV_A F(+)FdTHS stabilizovane supstitucijama DS, Cav1 ili DSCav1. Kolona sasvim levo definiše varijantu RSV F, a ostale kolone obezbeđuju svojstva varijante, uključujući prinos sa prolazno eksprimiranih plazmida, antigenost protiv različitih antigenskih mesta, i zadržavanje D25-vezivanja (dato kao frakciona količina) nakon 1 sata inkubacije na različitim temperaturama, vrednostima pH i osmolalnosti, ili do 10 ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja. Varijanta DSCav1 zadržava prepoznavanje antigenskog mesta Ø, sa poboljšanom fizičkom stabilnošću, prema dužem zadržavanju D25-reaktivnosti nakon izlaganja ekstremnim temperaturama, pH, osmolalnosti i zamrzavanju-odmrzavanju, zatim slede ili DS ili Cav1 varijante.
SL. 20 daje trakasti prikaz kristalne strukture od 3.1 Å RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Deblje trake odgovaraju povećanju B-faktora. Uprkos stabilizacionim mutacijama, antigensko mesto Ø, na vrhu trimera, zadržava značajnu fleksibilnost.
SL. 21 prikazuje poređenje RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 sa RSV F vezanim za D25. Trakasti prikaz RSV_A F(+)FdTHS DSCav1, superponiran sa trakastim prikazom RSV F vezanog za D25 je obojena belo (PDB ID 4JHW). Slike su međusobno povezane rotacijom od 90° oko vertikalne ose.
SL. 22 prikazuje stabilizujuće mutacije u strukturi RSV_A F(+) FdTHS DSCav1. Prikaz lopte-ištapa kristalne strukture RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 sa elektronskom gustinom 2Fo-Fc konstruisanom na 1σ je prikazan kao mreža. Ove slike pokazuju da je zapažena elektronska gustina koja odgovara disulfidnoj vezi između ostataka cisteina 155 i 290 (levo), kao i ostatku Phe190 koji ispunjava šupljinu za vezivanje (desno).
SL. 23 prikazuje imunogenost RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 kod miša. Deset CB6 miševa po grupi je imunizovano sa 10 μg RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 proteina pomešanog sa 50 μg poli I:C adjuvansa. Imunizacija je urađena na 0 i 3 nedelje, a serumi iz 5 i 7 nedelje su testirani na neutralizaciju RSV podtipa A (RSV_A) i B (RSV_B). Srednje vrednosti su označene horizontalnim linijama.
SL. 24 prikazuje imunogenost RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 kod nehumanog primata (NHP). Četiri RSV-naivna rezus makaka majmuna po grupi imunizovana su sa 50 μg RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 proteina pomešanog sa 500 μg poli I:C adjuvansa. Imunizacija je urađena u 0. i 4. nedelji, a serumi iz 6. nedelje testirani su na neutralizaciju RSV podtipa A (levo) i B (desno). Srednje vrednosti su označene horizontalnim linijama.
SL. 25A-25C pokazuju plazmidne mape ekspresionih vektora. (A) Mapa ekspresionog vektora RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 paH (SEQ ID NO: 384) za eksprimiranje rekombinantnog RSV F proteina iz humanog podtipa A koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, fuzionisanog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis oznakom i StrepTag II. (B) Mapa ekspresionog vektora RSV_B (B1) F(+)FdTHS DSCav1 paH (SEQ ID NO: 386) za eksprimiranje rekombinantnog RSV F proteina iz humanog podtipa B (soj B1) koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, fuzionisanog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis oznakom i StrepTag II. (C) Mapa ekspresionog vektora RSV_B (18537) F(+)FdTHS DSCav1 paH (SEQ ID NO: 388) za eksprimiranje rekombinantnog RSV F proteina iz humanog podtipa B (soj 18537) koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, fuzionisanog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis oznakom i StrepTag II.
SL. 26A-26D ilustruju dizajn vakcine zasnovan na strukturi RSV: paradigma supermesta. (A) Prirodna infekcija RSV-om indukuje niz antitela, sa različitim potencijama neutralizacije virusa. (B) Klaster epitopa za prirodno inducibilna, visoko potentna antitela definiše supemesto virusne ranjivosti. Prikazani su antigen-vezujući fragmenti potentnog neutrališućeg antitela D25 koji prepoznaju epitop na vrhu RSV F trimera. Epitope koji se prostorno preklapaju na vrhu trimera takođe prepoznaju antitela AM22 i 5C4, koja dele željene karakteristike neutralizacije sa D25. Ovi epitopi koji se preklapaju definišu antigensko mesto ∅ kao supermesto ranjivosti RSV. (C) Kada se izabere ciljno supermesto, iterativni postupak dizajniranja, karakterizacije antigenskih i fizičkih svojstava, određivanja strukture na atomskom nivou i procene imunogenosti omogućava strukturnu optimizaciju antigena vakcine koji kodiraju ciljno supermesto. (D) Pošto supermesto virusne ranjivosti prirodno indukuje visokozaštitna antitela, imunizacija „imunogenima supermesta“ lakše izaziva zaštitni odgovor nego imunizacija imunogenima zasnovanim na regionima virusa koje prepoznaju subdominantna antitela ili antitela sa niskom potencijom neutralizacije.
SL. 27 prikazuje dizajn rastvorljivih trimernih RSV F sa stabilizovanim mestom Ø. Preko 100 varijanti RSV F koji sadrži T4 fibritin-trimerizacioni domen (foldon) su dizajnirani da stabilnije zadrže antigensko mesto Ø. Ovde je prikazana struktura RSV F trimera u konformaciji vezanoj za D25 sa modeliranim foldonom. Trimer je prikazan sa dva protomera kao molekulske površine osenčene svetlo sivom bež i ružičastom bojom, a treći promoter je predstavljen trakastim prikazom. Trakasti prikaz je obojen belom bojom u regionima gde je relativno fiksan između prei postfuzione konformacije, dok su N- i C-terminalni ostaci koji se pomeraju više od 5 Å između pre- i postfuzione konformacije osenčeni tamnije sivom. Mutacije kompatibilne sa ekspresijom i početnim prepoznavanjem od strane D25, ali nedovoljno stabilne da bi omogućile prečišćavanje u obliku homogenog trimera, označene su i prikazane u vidu crnog štapića. Umeci pokazuju stabilizacione mutacije u krupnom planu pomoću štapićastog prikaza za varijante DS, Cav1 i TriC, od kojih sve stabilno zadržavaju antigensko mesto Ø (SL.31).
SL. 28A-28C prikazuju strukture RSV F trimera, konstruisanih da očuvaju antigensko mesto Ø. (A-C) Prikazano je šest struktura za varijante RSV F, obeležene stabilizacionom mutacijom (DS, Cav1, DS-Cav1 i DS-Cav1-TriC) i rešetkom (kubnom i tetragonalnom) i pH vrednošću kristalizacije. (A) RSV F trimeri su predstavljeni prikazom obojenim prema faktoru atomske pokretljivosti. Regioni koji nedostaju prikazani su kao isprekidane linije. Oni se javljaju u C-terminalnom regionu proksimalno u odnosu na membranu, gde motiv foldona nije vidljiv, osim u strukturi DS-Cav1-TriC (krajnje desno). U strukturi DS dve petlje u glavnom regionu takođe su poremećene. (B) Antigensko mesto Ø RSV F protomera prikazano je trakastim dijagramom, sa strukturom RSV F vezanog za D25 obojenom sivo i naznačenim različitim varijantama. Stabilizujuće mutacije su označene i predstavljene štapićastim prikazom. (C) Detalji na nivou atoma su predstavljeni štapićastim prikazom, sa regionima RSV F koji menjaju konformaciju između prefuzione i postfuzione konformacije u tamno sivoj boji, i onima koji ostaju konstantni u svetlijoj sivoj boji. Stabilizujući atomi ugljenika za stabilizacione mutacije su naznačeni. U Cav1 (pH5.5) i u DS-Cav1 (pH5.5) primećene su nove karakteristike koje su uključivale interakciju C-terminusa F2 peptida sa sulfatnim jonom i fuzionim peptidom. U strukturi DS-Cav1-TriC, mutacije D486H-E487Q-F488W-D489H stupaju u interakciju sa dva susedna protomera oko ose trimera.
SL. 29A-29B pokazuju rezultate koji se odnose na imunogenost konstruisanih RSV F trimera. RSV F proteini konstruisani da stabilno prikazuju antigensko mesto Ø indukuju neutralizacione titrove znatno više od onih koje izaziva postfuzioni F. (A) Neutralizacioni titrovi seruma miševa imunizovanih sa 10 μg RSV F (levo). Postfuzioni F, kao i RSV F vezan antitelima AM22 ili D25, korišćeni su za imunizaciju u dozi od 20 μg po mišu (desno). Geometrijska sredina je označena horizontalnom linijom. (B) Neutralizacioni titrovi seruma rezus makaka majmuna imunizovanih sa 50 μg varijanti RSV F proteina. Geometrijska sredina je označena horizontalnom linijom. Zaštitni prag je označen tačkastom linijom, a p-vrednost je data za postfuzionu konformaciju naspram DS-Cav1.
SL. 30A-30D pokazuju kako fizička, strukturna i antigena svojstva RSV F sa stabilizovanim antigenskim mestom Ø koreliraju sa imunogenošću. (A) Fizička stabilnost mesta Ø u odnosu na imunogenost. Umetak prikazuje prenos informacija za fizičku stabilnost određenu kada je 7 merenja zadržavanja aktivnosti D25 na SL. 31 uprosečeno (horizontalna osa) i upoređeno sa indukovanim RSV-zaštitnim titrovima sa SL.29 (vertikalna osa). (B) Strukturno mimikrija mesta Ø u odnosu na imunogenost. Umetak prikazuje prenos informacija. Strukturna mimikrija (horizontalna osa) je srednje kvadratno odstupanje (eng. - root-mean-square deviation, rmsd) između različitih struktura (SL. 28) i RSV F vezanog za D25 za sve atome u okviru 10 Å D25. Ovo je upoređeno sa indukovanim RSV-zaštitnim titrovima sa SL. 29 (vertikalna osa). (C) Antigenska analiza seruma imunizovanih makaka majmuna. Vezivanje seruma na imobilizovani DS-Cav1 (levo) ili postfuzioni F (desno) mereno je direktno (blank, crni stubići) ili nakon inkubacije s viškom postfuzionog F (tamno sivi stubići) ili DS-Cav1 (svetlo sivi stubići). Srednji odgovor četiri seruma makaka je grafički prikazan, sa stubićima greške za standardnu devijaciju. (D) Korelacija imunogenosti i antigenosti NHP seruma. Srednji neutralizacioni titrovi četiri seruma makaka u svakoj grupi su prikazani grafički naspram odnosa odgovora vezivanja za DS-Cav1 i postfuzioni F.
SL. 31A-31B su tabela koja prikazuje rezultate antigenske i fizičke karakterizacije imunogena RSV F proteina.<#>Definisana za stanje trimera, a ako stanje trimera nije moglo da bude prečišćeno, onda za oligomerno stanje dominantne oligomerne vrste. Ako je ukupan prinos <0.1 mg/l, onda se ne određuje oligomerno stanje (N.D.). *Prinos je prikazan za specifično oligomerno stanje. >1000 nM = nema vezivanja pri koncentraciji Fab od 1 μM. N/A = nije primenljivo.
SL. 32 prikazuje lokaciju S155 i S290 u pre- i postfuzionim RSV F strukturama. β-ugljenici serinskih ostataka 155 i 290 su udaljeni 4.4 Å u strukturi RSV F vezanoj za D25, a u postfuzionoj strukturi su udaljeni 124.2 Å. Mutacije S155C i S290C (nazvane „DS“) zadržale su strukturu u prefuzionoj konformaciji.
SL. 33A-33C pokazuju negativno bojenje stabilizovanog F-proteina. A) i B) prikazuju reprezentativna polja negativno obojenih uzoraka za DS i DS-Cav1. Proteini su visoko homogeni sa <l% i <0.1% post-F konformacija uočenih u DS, odnosno DSCav1. Primeri post-F konformacija su označeni crnim strelicama. Traka = 50 nm. 2D uprosečenih čestica su prikazani kao umeci u gornjem desnom uglu pri duplom uvećanju. Traka = 5 nm. C) prikazuje poređenje 2D proseka sa prosekom kompleksa F+D25 (McLellan et al.2013). Traka = 5 nm.
SL. 34 prikazuje da je ELISA test na bazi antitela D25 sirovih supernatanata kulture u korelaciji (Spearman R = 0.7752 i P vrednost = 0.0041) sa prinosom prečišćenih oligomernih varijanti RSV F glikoproteina. Proizvodnju RSV F glikoproteina u ćelijama 293 Expi određena je D25 ELISA testom sirovih supernatanata kulture na 4°C nedelju dana nakon žetve i utvrđeno je da korelira sa prinosom čistih oligomernih varijanti RSV F glikoproteina (Tabela 1).
SL. 35 prikazuje ELISA test na bazi antitela motavizumab sirovih supernatanata kulture u odnosu na prinos prečišćenih glikoproteinskih varijanti RSV F. (A) Proizvodnja RSV F glikoproteina u ćelijama 293 Expi određena je motavizumab ELISA testom sirovih supernatanata kulture na 4°C odmah po žetvi i (B) nedelju dana nakon žetve. Podaci dobijeni ELISA testom su prikazani u odnosu na prinos varijanti RSV F glikoproteina nakon afinitetne hromatografije sa streptacinom. Zanimljivo je da su tri proteina, RSV F(+)Fd i dve varijante F137W-F140W i T357C-N371C otkriveni kao visokoekspresivni pomoću testa motavizumab ELISA, ali su dobijeni niski prinosi nakon prečišćavanja u velikom obimu proizvodnje (prikazano duž ordinate).
SL. 36 prikazuje karakterizaciju konstruisanih RSV F glikoproteina primenom ekskluzione hromatografije. RSV F varijante, a: Cav1; b: Cav1-TriC; c: DS-Cav1-TriC; d: F488W; e: DS-Cav1; f: TriC, g: DS-TriC; h: DS; ispoljavaju elucione profile karakteristične za globalni trimerni protein, dok RSV F varijante i: S190F-V296F; j: K87F-V90L; k: V207L-V220L; l: V178N; m: S403C-T420C; n: I506K; o: V185E; p: F137W-F140W-F488W; q: D486H-E487Q-D489H ispoljavaju elucione profile karakteristične za veće oligomerne vrste. Proteinski standardi poznate molekulske težine označeni su na bazi hromatograma.
SL. 37 prikazuje antigensko mesto Ø prikazano odozgo. Regioni DS koji nisu vidljivi predstavljeni su tačkastim linijama.
SL. 38A-38B pokazuju rezultate koji se odnose na antigensku karakterizaciju kompleksa imunogen-adjuvans za imunizaciju nehumanih primata. (A) Reaktivnost uzoraka postfuzionog RSV F, DS i DS-Cav1 je procenjena naspram 1 μM antigen-vezujućeg fragmenta D25 manje od 3 h nakon imunizacije imunogenom formulacije sa Poli I:C i NHP na dan 0 i (B) nakon 4 nedelje.
SL. 39A-39B pokazuju antigensku analizu seruma imunizovanih miševa i rezus makaka. A) U serumima miševa imunizovanih višestruko stabilizovanim RSV F varijantama procenjeno je vezivanje za imobilisani DS-Cav1, mereno direktno, ili za DS-Cav1 nakon inkubacije sa viškom antigen-vezujućih fragmenata D25 ili motavizumaba, da bi se procenili odgovori na mesto Ø ili mesto II. B) U serumima rezus makaka je procenjeno vezivanje za imobilisani DS-Cav1 ili varijante postfuzionog RSV F takođe blokirane sa antigen-vezujućim fragmentima D25 ili motavizumaba. Prikazan je srednji odgovor životinjskih seruma, sa stubićima greške za standardnu devijaciju.
Sl. 40 prikazuje prikupljane kristalografskih podataka i statistiku utačnjavanja.
SL. 41 pokazuje efekat korišćenja konstrukata RSV podtipa B sa DS supstitucijama i da adjuvansi, uključujući agoniste TLR4, mogu da deluju sa stabilizovanim F proteinom. Miševi CB6F1/J su imunizovani sa 10 μg DS S155C/S290C verzije stabilizovanog prefuzionog F formulisanog sa 50 μl Ribi (Ribi sistem adjuvansa, Sigma). Miševi su inokulisani u 0. i 3. nedelji ili konstruktom podtipa A (SEQ ID NO: 185), konstruktom podtipa B (SEQ ID NO: 1479), ili oboje (10 μg svakog). U vremenskoj tački od 5 nedelja (2 nedelje nakon druge injekcije) uzet je serum za testove neutralizacije. Dva glavna nalaza iz ovog eksperimenta su bila da, 1) preFA-DS i preFB-DS indukuju jednake nivoe neutralizacione aktivnosti protiv RSV podtipa A, dok je preFB-DS indukovao viši nivo neutrališuće aktivnosti od preFB-DS protiv RSV podtipa B. Ovo ukazuje da korišćenje konstrukata RSV podtipa B može imati bolji potencijal za unakrsno neutralisanje od konstrukata podtipa A, ili da hibridne verzije RSV F koje uključuju elemente iz oba podtipa mogu da budu poželjne. 2) Adjuvans Ribi je emulzija ulje-u-vodi koja sadrži monofosforil lipid A, koji je agonist TLR4 i predstavnik nekih komercijalnih adjuvanasa. Ovi podaci pokazuju da pored poli I:C (agonist TLR3), adjuvansi koji uključuju agoniste TLR4 funkcionišu kao antigen vakcine sa stabilizovanim prefuzionim F proteinom.
SL. 42 pokazuje da stabilizovani prefuzioni F može da se formuliše u alumu, kao i u poli I:C i da zadrži imunogenost koju daju odgovori antitela na antigensko mesto Ø. Miševi BALB/c su imunizovani sa 20 μg verzije DS S155C/S290C stabilizovanog prefuzionog F izvedenog iz podtipa A i formulisanog sa alumom (aluminijum hidroksid gel 10 mg/ml, Brenntag, Frederikssund, Danska) ili poli I:C. Miševi su inokulisani u 0. i 3. nedelji i u vremenskoj tački od 5 nedelja (2 nedelje nakon druge injekcije) uzet je serum za testove neutralizacije.
SL. 43 je šematski dijagram koji ilustruje ilustrativnu šemu dizajna za antigene prefuziono stabilizovanog jednolančanog RSV F (scF), uključujući i varijable koje su uključene u nekoliko različitih konstrukata RSV scF. Elementi dizajna koji se odnose na RSV scF br. 9 (BZGJ9 DS-Cav1; SEQ ID NO: 669 su oivičeni tamno sivom bojom.
SL. 44A i 44B ilustruju dizajn jednolančanog konstrukta RSV F br.9 (scF br.9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO: 669). Numerisanje označava lokacije ostataka različitih komponenti opisanih u nastavku. (A) Šematski prikazi furinom isečenog RSV F(+) glikoproteina kao što je prikazano na SL. 44B (vrh), i konstrukta RSV scF br.9 (dole), koji prikazuju domen trimerizacije foldon (sivi oval), i veštački linker (sivi kvadrat) koji premošćuje polipeptidni osnovni lanac F2 (levo) i F1 (desno). (B) Strukturna osnova za konstrukt RSV scF br.9 koja koristi prefuziono stabilizovanu strukturu RSV F(+) kao model (PBD ID: 4MMV). RSV F(+) je prikazan u dinamičkom predstavljanju, a domen trimerizacije foldon predstavljen je sfernim prikazom. Na levoj strani je prefuziono stabilizovani trimer RSV F(+), sa tri protomera obojena crno, sivo i belo. Na desnoj strani je prikazan jedan protomer RSV F(+) koji prikazuje F1 (srednje sivo), F2 (tamno sivo), fuzioni peptid (naznačeno) i domen trimerizacije foldon (svetlo sivo, naznačeno). Na umetku je prikazan fuzioni peptid u štapićastom prikazu, a pozicija sekvence fleksibilnog linkera (isprekidana linija) spaja ostatke 104 i 147.
SL. 45 prikazuje tabelu koja se odnosi na dizajn, oligomerno stanje i prinos proizvodnje projektovanih konstrukata jednolančanog RSV F eksprimiranih u ćelijama HEK293-F. RSV F konstrukt br. 9 DSCav1 (scF br. 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO: 669), RSV F konstrukt br.10 DSCav1 (scF br.10; BZGJ10 DSCav1; SEQ ID NO: 670) RSV F konstrukt br.11 DSCav1 (scF br. 11; BZGJ11 DSCav1; SEQ ID NO: 671) su naznačeni. Navedene sekvence linkera uključuju GSGNIGLGG (SEQ ID NO: 364), GSGGNGIGLGG (SEQ ID NO: 359), GSGNVLGG (SEQ ID NO: 361) i GSGNVGLGG (SEQ ID NO: 362). (%) mutacija koje stabilizuju prefuzionu konformaciju uključuju sledeće: S155C i S290C (DS); S190F i V207L (Cav1); bez dodatnih mutacija (a). Sve varijante sadrže tačkastu mutaciju L373R. (==) Domeni trimerizacije uključuju sledeće: L512C i L513C (CC); D486C, E487P i F489C (CPC). (#) U ekskluzionoj hromatografiji često je primećeno da varijante postoje u smeši oligomernih stanja. Ako je primećena merljiva trimerna frakcija, onda je oligomerno stanje navedeno kao „trimer“. Ako nije uočena nikakva trimerna frakcija, onda je predstavljeno oligomerno stanje dominantne vrste. Ako je ukupni prinos pre ekskluzione hromatografije bio <0.1 mg/L, onda je oligomerno stanje navedeno kao neodređeno (N.D.). Ako je oligomerno stanje nemoguće razlikovati pri ekskluzionoj hromatografiji, oligomerno stanje je navedeno kao „agregat“. (*) Prikazani prinos je izračunat nakon prečišćavanja korišćenjem StrepTag i odnosi se na navedeno oligomerno stanje. (Φ) Prinos HEK 293F se procenjuje na osnovu zapaženog odnosa između prinosa ekspresije Expi293F i prinosa ekspresije Freestyle293F uočenog za konstrukte scF (~2:1).
SL. 46A i 46B su skup grafikona koji ilustruju karakterizaciju projektovanih jednolančanih RSV F glikoproteina ekskluzionom hromatografijom. (A) Ekskluzioni profili varijanti RSV scF (scF br.
3, 4, 6, 8 do 11) i RSV F(+) koji sadrže stabilizacione mutacije DS-Cav1. Jednolančani konstrukti su eksprimirani u ćelijama HEK293F, a F(+) DS-Cav1 je eksprimiran u ćelijama Expi 293-F. F(+) DS-Cav1 i scF br.3 DS-Cav1, br.4 DS-Cav1, br.6 DS-Cav1 i br.9 DS-Cav1 ispoljavaju elucione profile karakteristične za globularni trimerni protein, dok scF br. 11 DSCav1 ispoljava elucioni profil karakterističan za globularni monomerni protein. RSV scF br.8 DS-Cav1 i scF br.10 DS-Cav1 ispoljavaju elucione profile koji ukazuju na heterogenu mešavinu monomernih i trimernih vrsta. (B) Ekskluzioni profili RSV F(+) DS-Cav1 i RSV scF br.9 koji sadrže različite stabilizujuće mutacije. F(+) DS-Cav1 i scF br. 9 Cav1 su eksprimirani u ćelijama Expi 293-F, a preostale varijante scF br.9 su eksprimirane u ćelijama HEK293F. Blago odstupanje u elucionim profilima varijanti scF br.9 ukazuje na to da se scF br.9 propušta na većoj molekulskoj težini od trimernog F(+). Zvezdica označava da su oznake za prečišćavanje isečene pre gel filtracije.
SL. 47 je tabela sa sumiranim rezultatima antigenske karakterizacije RSV scF br.9 DS-Cav1. SL. 48 je tabela koja prikazuje kristalografske podatke i statistiku utačnjavanja za trodimenzionalnu strukturu RSV scF br.9 DS-Cav1.
SL. 49A i 49B pokazuju niz dijagrama koji se odnose na kristalnu strukturu trimera RSV scF br.
9 DS-Cav1. Orijentacija protomera prikazanog u dinamičkom predstavljanju (tamno sivo) se održava konstantnom. Debele isprekidane linije odgovaraju motivu C-terminalnog foldona koji se nalazi u regionu proksimalno u odnosu na membranu koji nije vidljiv u kristalnoj strukturi. (A) Trimer RSV scF br. 9 DS-Cav1 čiji su protomeri prikazani u dinamičkim prikazima i trakastom prikazu (tamno sivo) i prikazima molekulske površine (svetlo sivo). Umetak prikazuje uvećani prikaz petlje „GS“ linkera scF br. 9 (naznačeno) i susednog protomera (tamno sivo), oba u štapićastom prikazu. (B) Mutacije koje stabilizuju prefuzionu konformaciju u strukturi RSV scF br. 9 DS-Cav1. Mutacije DS i Cav1 koje stabilizuju prefuzionu konformaciju su naznačene i prikazane u štapićastom prikazu.
SL. 50 je dijagram koji ilustruje strukturno poravnanje RSV scF br.9 DS-Cav1 (srednje sivo) sa strukturom F(+) DS-Cav1 (svetlo sivo; rmsd = 0.839 Å) i sa strukturom F(+) vezanom za D25 (tamno sivo; rmsd = 0.534 Å), sve prikazano u dinamičkom prikazu. Umetak prikazuje krupni plan petlje linkera scF br.9 i fuzione peptide strukture F(+) DS-Cav1 i F(+) strukture vezane za D25.
SL. 51 prikazuje dijagrame koji ilustruju poređenje konstrukta RSV scF br. 3, 4, 6, 8-11 korišćenjem kristalne strukture RSV scF br. 9 DS-Cav1. Debele isprekidane linije predstavljaju motiv C-terminalnog foldona. Protomer RSV scF br.9 DS-Cav1 je prikazan u dinamičkom prikazu (tamno sivo). Umetak pokazuje uvećani štapićasti prikaz petlje linkera „GS“ scF br. 9 koji povezuje ostatke 105 (F2) i 145 (F1). Predviđene pozicije sekvenci fleksibilnog linkera za konstrukte scF br. 3, 4, 6 i 8 (tanka isprekidana linija) koji povezuje ostatke 97 (F2) i 150 (F1) mapirane su na kristalnu strukturu scF br. 9 DS-Cav1. Predviđene pozicije sekvenci linkera za konstrukt scF br. 3, 4, 6 i 8 (tanke isprekidane linije) su mapirane na strukturi trimera scF br. 9 DS-Cav1. Pozicije ostataka krajnjih tačaka linkera su približne.
SL. 52 prikazuje skup digitalnih slika koje se odnose na karakterizaciju konstruisanih jednolančanih RSV F glikoproteina koji su okarakterisani SDS-PAGE gel elektroforezom nakon prečišćavanja StrepTag. Konstrukti RSV scF su eksprimirani u ćelijama HEK293F i prečišćeni pomoću His6-tag i afinitetne hromatografije StrepTag.
SL. 53 je skup grafikona i tabela sa podacima o neutralizaciji za 5. nedelju za navedene konstrukte (10 životinja/grupa). Imunizacije u 0. nedelji i 3. nedelji sa 10 μg proteina 50 μg Poli I:C po životinji.
SL. 54 je trakasti i štapićasti dijagram koji ističe prolinski ostatak na poziciji 101 RSV F u trodimenzionalnoj strukturi RSV scF br.9 (SEQ ID NO: 669). Struktura ukazuje na to da region jednolančanog linkera može da bude poboljšan uklanjanjem prolina 101 ili skraćivanjem/mutiranjem ostataka linkera i susednih ostataka.
SL. 55 je grafikon i poravnanje sekvence koje ilustruje modifikaciju konstrukta scF br.9 (SEQ ID NO: 669) za generisanje konstrukata BZG J9-1 do BZG J9-10. Poravnanje sekvence prikazuje sekvence BZG J9-1 do BZG J9-10 koje odgovaraju RSV F ostacima 97-159 SEQ ID NO: 698-707, respektivno. Ovi konstrukti su eksprimirani u ćelijama Expi i procenjeni gel filtracijom (levo).
SL. 56 je serija grafikona i šematskih dijagrama koji ilustruju nanočestice feritina koje uključuju protein scF br. 9, koji je generisan povezivanjem C-terminusa F1 polipeptida u scF br.9 sa podjedinicom feritina. Ovaj konstrukt je nazvan „BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritin“ i obezbeđen je kao SEQ ID NO: 1429.
SL. 57 je skup grafikona koji ilustruju fizičku stabilnost konstrukta BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritin u poređenju sa RSV F DS-Cav1.
SL. 58A-58C je skup grafikona i tabela koja ilustruje imunogenost različitih prefuzionih stabilizovanih RSV F proteina. Tri konstrukta koja su ispitana su RSV F DSCav1 (SEQ ID NO: 371), BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritin (SEQ ID NO: 1429) i scF br.9 (takođe nazvan BZGJ9 DS-Cav1, SEQ ID NO: 669). Životinjama Macaca mulatta indijskog porekla težine 8.26-11.34 kg intramuskularno su ubrizgani imunogeni u 0. nedelji od 50 μg proteina 500 μg Ribi po životinji, sa buster imunizacijom u 4. nedelji sa 50 μg proteina 500 μg Ribi po životinji; imunogenost je procenjena na 3.5 nedelje.
SL. 59A i 59B su skup dijagrama koji ilustruju trodimenzionalnu strukturu RSV F proteina iz soja B18537 sa mutacijama DSCav1 (SEQ ID NO: 372) (A) Dinamički prikaz protomera RSV F. (B) Trimerni oblik fuzionog glikoproteina sa dodatnim protomerima predstavljenim na prikazima površine i trakastim prikazima.
SL. 60A-60D su skup slika koje ilustruju detalje na atomskom nivou RSV B18537 F glikoproteina sa supstitucijama DSCav1 i pokazuju da supstitucije DSCav1 mogu da se uvedu u RSV F glikoprotein podtipa B da bi se stabilizovao antigensko mesto Ø. (A) Mutacije DS-Cav1 su istaknute. (B) Antigensko mesto Ø smešteno na vrhu trimera je predstavljeno štapićastim prikazom u tamno sivoj boji. (C) Interakcija između fuzionog peptida i β-lanaca 15, 16 i 19 da bi se formirala interprotomerna izdužena ploča. (D) Interakcija između C-terminusa F2 i fuzionog peptida.
SL. 61A i 61B su skup grafikona i digitalnih slika koje ilustruju antigensku karakterizaciju RSV B18537 fuzionog glikoproteina sa supstitucijama DSCav1. (A) Interferometrijska merenja biosloja za prototipska mesto-specifična antitela su izvršena serijskim razblaživanjem svakog Fab molekula i merene su stope asocijacije i disocijacije u odnosu na imobilizovani B18537 F DSCav1 protein. (B) Strukturno poređenje antigenskog mesta Ø iz soja B18537 i A2. Ostaci izloženi na površini koji se razlikuju između dva soja su označeni.
SL. 62A i 62B su grafikoni koji ilustruju prečišćavanje RSV soja B18537 F proteina DSCav1. A. SDS-PAGE elucione frakcije (redukujuća i neredukujuća) i protočne frakcije nakon afinitetnog prečišćavanja StrepTagII. B. Gel filtracija RSV B18537 F glikoproteina u GFB puferu na koloni za ekskluzionu hromatografiju Superdex-200 od 120 ml.
SL. 63-68 ilustruju dizajn i proizvodnju trimernih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji bez C-terminalnog domena trimerizacije kako bi se održala stabilnost režnja RSV F proksimalno u odnosu na membranu. Umesto C-terminalnog domena trimerizacije, u C-terminus F1 polipeptida se uvodi prsten disulfidnih veza supstitucijom cisteinskih ostataka za aminokiseline α10 heliksa.
SL. 69A-69E su skup tabela koje prikazuju podatke dobijene ELISA testom za naznačene rekombinantne RSV F varijante. Ekspresija i antigenska stabilnost varijanti RSV F (SEQ ID NO: 859-1018). DNK koja kodira ove varijante RSV F je transfektovana u ćeliju u formatu sa 96 bunarčića pod uslovima u kojima se rekombinantni RSV F proteini izlučuju iz ćelija u ćelijski medijum. Svaki konstrukt sadrži lidersku sekvencu koja uzrokuje da protein uđe u sekretorni sistem i da se izluči. Medijum je potom centrifugiran i supernatant je upotrebljen za testiranje antigenosti za vezivanje za antitelo D25 specifično za mesto Ø i antitelo Motavizumab specifično za mesto II („Mota“, SL. 69A-69E). Ispitivani uslovi obuhvataju vezivanje D25 i Mota 0. dana (uslovi 1 i 2), vezivanje D25 i Mota 0. dana nakon inkubacije na 70 °C tokom jednog sata (uslovi 3 i 4) i vezivanje D25 i Mota posle 1 nedelje na 4 °C (uslovi 5 i 6). Kontrola je konstrukt DSCav1 sa domenom foldon. Podaci o specifičnoj antigenosti za svaki konstrukt su dati na SL. 69A-69E, sa uslovima testiranja zabeleženim u redovima zaglavlja.
SL. 70A-70E su skup šematskih dijagrama koji ilustruju različite strategije dizajna za generisanje imunogena antigenskog mesta Ø RSV F. Antigensko mesto Ø uključuje mesto prepoznavanja D25 na spoljašnjoj površini prefuzionog RSV F heliksa α4 i petlje neposredno N-terminalno od heliksa α1 svakog protomera. Pet postupaka je korišćeno za predstavljanje izolovanih epitopa mesta Ø na površini imunogena: A) kružne permutacije (tj. menjanje sekundarne strukture linkera za promenu povezanosti segmenata mesta Ø zbog lakoće dizajna i stabilnosti), B) inkorporiranje mesta Ø u mali skafold protein, C) trimerizacija kružnih permutacija ili mesta Ø sa skafoldom tako da odgovara nativnoj trimerizaciji mesta Ø primećenoj u kontekstu prefuzionog RSV F (kao u levom panelu), D) uključivanje celog domena III za dodatnu stabilnost savijanja mesta Ø i E) uključivanje A-D u platformu nanočestica za dodatnu imunogenost.
SL. 71 je rezime imunogena minimalnog mesta Ø koji su dizajnirani, proizvedeni i ispitani na antigenost sa antitelima D25, AN22 i 5C4 specifičnim za mesto Ø pomoću ELISA testa pod navedenim uslovima. Tabela prikazuje broj imunogena mesta Ø koji spadaju u svaku kategoriju dizajna, i koja su dala ELISA rezultat od najmanje 1.5.
SL. 72A-72F su skup tabela koje prikazuju podatke ELISA testa za naznačene konstrukte minimalnog mesta Ø koji se vezuju za antitelo D25, AN22 ili 5C4. Ispitivani uslovi uključuju vezivanje D25 nakon 0 i 1 nedelje na 4 °C (uslov 1) i 2), vezivanje D25 posle 1 sata na 60 °C (uslov 3), 70 °C (uslov 4), 80 °C (uslov 5), 90 °C (uslov 6), ili 100 °C (uslov 7), vezivanje AM22 nakon dve nedelje na 4 °C (uslov 8), vezivanje 5C4 u 0. nedelji (uslov 9). Prosek vezivanja D25, AM22 i D25 nakon 1 sata na 70 °C je takođe prikazan (uslov 10). ELISA ocene ≥1.5 su istaknute tamno sivom bojom; ocene 0.5-1.5 su istaknute svetlo sivom bojom.
SL. 73 je skup grafikona koji ilustruju da imunizacija sa DS verzijom stabilizovanog prefuzionog F podtipa A ili B ili oba indukuje neutrališuću aktivnost protiv oba podtipa
SL. 74 je skup grafikona koji ilustruju da je odgovor antitela DSCav1 dugotrajan kod miševa nakon dve doze sa imunizacijom u nedeljama 0 i 4.
SL. 75 je skup grafikona koji ilustruju da DS imunizacija može da spreči RSV infekciju kod miševa.
SL. 76 je skup grafikona koji ilustruju da DS imunizacija ne izaziva odgovor citokina tipa 2 kod miševa nakon izlaganja patogenu.
SL. 77 je skup grafikona koji ilustruju da je neutrališući imunski odgovor na DSCav1 poboljšan i održiv nakon 3. doze kod nehumanih primata, koji su prethodno imunizovani sa DS-Cav1 ili DS u nedeljama 0 i 4.
SL. 78 je grafikon koji ilustruje da se DS-CAV1 može efikasno da se formuliše u alumu i da pri tom zadrži imunogenost.
SL. 79 je skup grafikona koji ilustruju da je alum efikasan adjuvans za DSCav1 kod nehumanih primata.
SL. 80 je grafikon koji ilustruje da je DS-CAV1 imunogen kada se eksprimira sa vektora na bazi gena, ili sam, ili kao pripremna imunizacija za buster imunizaciju proteinom.
SL. 81 je skup grafikona i tabela koji ilustruje da DS-Cav1 RSV F podtipa A ili B može da poboljša primarnu imunizaciju korišćenjem genetske isporuke divljeg tipa F proteina kod nehumanih primata.
SL. 82 je skup grafikona koji ilustruju da DS-Cav1 RSV F podtipa A ili B može da bude poboljšan primarnom imunizacijom sa rAd-F(A)WT kod nehumanih primata.
SL. 83 je skup grafikona koji ilustruju da imunizacija DS verzijom stabilizovanog prefuzionog F podtipa A ili B ili oba indukuje neutralizacionu aktivnost protiv oba podtipa RSV.
SL. 84 je grafikon koji ilustruje da promena glikozilacije smanjuje imunogenost stabilizovanog F u prefuzionoj konformaciji.
LISTA SEKVENCI
Nukleinske i aminokiselinske sekvence navedene u pratećoj listi sekvenci prikazane su pomoću standardnih
slovnih skraćenica za nukleotidne baze i troslovnog koda za aminokiseline, kao što je definisano u 37 C.F.R. 1.822. Prikazan je samo jedan lanac svake sekvence nukleinske kiseline, ali se podrazumeva da je komplementarni lanac uključen pri svakom pozivanju na prikazani lanac. Lista sekvenci je podneta kao ASCII tekstualna datoteka u obliku datoteke pod imenom „Sequence.txt“ (~3.2 MB), koja je kreirana 12. marta 2014. U pratećoj listi sekvenci:
SEQ ID NO: 1-128 su aminokiselinske sekvence nativnih RSV F proteina iz RSV tipa A.
SEQ ID NO: 129-177 su aminokiselinske sekvence nativnih RSV F proteina iz RSV tipa B. SEQ ID NO: 178-184 su aminokiselinske sekvence nativnih RSV F proteina iz goveđeg RSV.
SEQ ID NO: 185-350 su aminokiselinske sekvence rekombinantnih RSV F proteina.
SEQ ID NO: 351 je aminokiselinska sekvenca domena Foldon fibritina T4.
SEQ ID NO: 352 i 355-365 su aminokiselinske sekvence peptidnih linkera.
SEQ ID NO: 353 je aminokiselinska sekvenca proteina feritina Helicobacter pylori (GENBANK® pristupni br. EJB64322.1, kao što je prikazano u bazi podataka od 28. februara 2013.).
SEQ ID NO: 354 je aminokiselinska sekvenca proteina inkapsulina (GENBANK® pristupni br.
YP_001738186.1, kao što je prisutno u bazi podataka 28. februara, 2013).
SEQ ID NO: 366 i 367 su VH i VL aminokiselinske sekvence AM22 mAb, respektivno.
SEQ ID NO: 368 i 369 su VH i VL aminokiselinske sekvence D25 mAb, respektivno.
SEQ ID NO: 370 je aminokiselinska sekvenca varijante rekombinantnog RSV F0 proteina prototipa A2 soja (GENBANK pristupni br. P03420, kao što je prikazano u bazi podataka od 28. februara 2012.), koja uključuje supstitucije P102A, I379V i M447V u poređenju sa sekvencom P03420.
SEQ ID NO: 371 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz humanog podtipa A, koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis tag i StrepTag II. Četiri mutirana ostatka i C-terminalni dodatak su podvučeni.
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELS NIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLN NAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAV C KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAV VSLSNGVSVLT F KVLDLKNYIDKQLLPI L NKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFS VNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIM C IIKEEVL AYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYКДНКGSVSFFPQAE TCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSC YGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPII NFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGE WVLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (RSV_A F(+)FdTHS DSCav1)
SEQ ID NO: 372 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz humanog podtipa B koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis tag i StrepTag II. Četiri mutirana ostatka i C-terminalni dodatak su podvučeni.
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELS NIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTIN TTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAV C KVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVV SLSNGVSVLT F KVLDLKNYINNQLLPI L NQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSV NAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIM C IIKEEVLAY VVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYКДНКGSVSFFPQADTCK VQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKT KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYD PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLL STFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (RSV_B F(+)FdTHS DSCav1)
SEQ ID NO: 373 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz goveđeg RSV koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis tag i StrepTag II Četiri mutirana ostatka i C-terminalni dodatak su podvučeni.
MAATAMRMIISIIFISTYMTHITLCQNITEEFYQSTCSAVSRGYLSALRTGWYTSVVTIELS KIQKNVCKSTDSKVKLIKQELERYNNAVIELQSLMQNEPASFSRAKRGIPELIHYTRNST KRFYGLMGKKRKRRFLGFLLGIGSAIASGVAV C KVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVS LSNGVSVLT F KVLDLKNYIDKELLPK L NNHDCRISNIETVIEFQQKNNRLLEIAREFSV NAGITTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIM C VVKEEVIA YVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTDNKEGSNICLTRTDRGWYКДНКGSVSFFPQAET CKVQSNRVFCDTMNSLTLPTDVNLCNTDIFNTKYDCKIMTSKTDISSSVITSIGAIVSCYG KTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKALYIKGEPIINY YDPLVFPSDEFDASIAQVNAKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEW VLLSTFLGGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (bRSV F(+)FdTHS DSCav1)
SEQ ID NO: 374 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz humanog podtipa A koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190F, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis tag i StrepTag II. Tri mutirana ostatka i C-terminalni dodatak su podvučeni.
SEQ ID NO: 375 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz humanog podtipa B koji uključuje S155C, S290C i S190F aminokiselinske supstitucije, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis tag i StrepTag II (RSV_B F(+)FdTHS DSS190F)
SEQ ID NO: 376 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz goveđeg RSV koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190F, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis tag i StrepTag II. (bRSV F(+)FdTHS DSS190F)
SEQ ID NO: 377 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz RSV A koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F, V207L, spojenog sa C-terminalnim domenom feritina. _(RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 Ferritin)
SEQ ID NO: 378 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz RSV B koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F, V207L, spojenog sa C-terminalnim domenom feritina. (RSV_B F(+)FdTHS DSCav1 ferritin)
SEQ ID NO: 379 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz bRSV koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F, V207L, spojenog sa C-terminalnim domenom feritina. (bRSV F(+)FdTHS DSCav1 ferritin)
SEQ ID NO: 380 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz RSV A koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F, spojenog sa C-terminalnim domenom feritina. (RSV_A F(+)FdTHS DSS190F Ferritin)
SEQ ID NO: 381 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz RSV B koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F, spojenog sa C-terminalnim domenom feritina. (RSV_B F(+)FdTHS DSS190F ferritin)
SEQ ID NO: 382 je aminokiselinska sekvenca rekombinantnog RSV F proteina iz bRSV koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F, spojenog sa C-terminalnim domenom feritina. (bRSV F(+)FdTHS DSS190F ferritin)
SEQ ID NO: 383 je ilustrativna nukleotidna sekvenca koja kodira rekombinantni RSV F protein iz humanog podtipa A, koji uključuje S155C, S290C, S190F i V207L aminokiselinske supstitucije, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldona, mestom isecanja trombinom, 6xHis tagom i StrepTag II (DNK koja kodira RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 eksprimirana sa VRC3798).
SEQ ID NO: 384 je nukleotidna sekvenca ekspresionog vektora za ekspresiju rekombinantnog RSV F proteina iz humanog podtipa A koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis tag i StrepTag II (RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 paH vektor; VRC3798).
SEQ ID NO: 385 je ilustrativna nukleotidna sekvenca koja kodira rekombinantni RSV F protein iz humanog podtipa B (soj B1) koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis tag i StrepTag II (DNK koja kodira RSV_B (B1) F(+)FdTHS DSCav1; eksprimirana sa VRC3764).
SEQ ID NO: 386 je nukleotidna sekvenca ekspresionog vektora za ekspresiju rekombinantnog RSV F proteina iz humanog podtipa B (soj B1) koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis tag i StrepTag II (RSV_B (B1) F(+)FdTHS DSCav1 paH vektor; VRC3764).
SEQ ID NO: 387 je ilustrativna nukleotidna sekvenca koja kodira rekombinantni RSV F protein iz humanog podtipa B (soj 18537) koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis tag i StrepTag II (DNK koja kodira RSV_B F(+)FdTHS DSCav1; eksprimirana sa VRC3799). SEQ ID NO: 388 je nukleotidna sekvenca ekspresionog vektora za ekspresiju rekombinantnog RSV F proteina iz humanog podtipa B (soj 18537) koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, spojenog sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis tag i StrepTag II (RSV_B F(+)FdTHS DSCav1 paH vektor; VRC3799).
SEQ ID NO: 389-693 su aminokiselinske sekvence rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji.
SEQ ID NO: 694-697 su aminokiselinske sekvence modifikovanih polipeptida domena Foldon.
SEQ ID NO: 698-697 su aminokiselinske sekvence modifikovanih polipeptida domena Foldon.
SEQ ID NO: 698-828, 1429-1442 i 1474-1478 su aminokiselinske sekvence jednolančanih rekombinantnih RSV F proteina.
SEQ ID NO: 829-1025 i 1456-1468 su aminokiselinske sekvence rekombinantnih RSV F proteina povezanih sa domenom foldon koji je podložan isecanju, ili nisu povezani sa domenom foldon.
SEQ ID NO: 1026 je aminokiselinska sekvenca proteina RSV F bez supstitucija za stabilizaciju prefuzione konformacije.
SEQ ID NO: 901-968 su aminokiselinske sekvence rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji.
SEQ ID NO: 1027-1088 i 1099-1428 su aminokiselinske sekvence minimalnih imunogena sa mestom Ø koji su opisani u primeru 14.
STRUKTURNE KOORDINATE
Atomske koordinate kristalne strukture RSV F proteina vezanog za D25 Fab navedene su u tabeli 1 SAD privremene prijave br. 61/780,910, podnete 13. marta 2013. Ove atomske koordinate kristalne strukture RSV F proteina vezanog za D25 Fab su takođe deponovane u Protein Data Bank pod pristupnim br.4JHW, kao što je prikazano u toj bazi podataka 1. maja 2013.
DETALJAN OPIS
Patent je definisan u zahtevima. RSV F glikoprotein je fuzioni protein tipa I koji olakšava fuziju virusnih i ćelijskih membrana (Walsh and Hruska, J. Virol., 47, 171 (1983)). Nakon početne sinteze, RSV F usvaja metastabilnu prefuzionu konformaciju koja skladišti energiju savijanja, koja se oslobađa tokom strukturnog preuređivanja u visoko stabilnu postfuzionu konformaciju nakon kontakta sa membranama ćelija domaćina. Pronađeno je da tri antigenska mesta (I, II i IV) na RSV F proteinu izazivaju neutrališuću aktivnost (Arbiza et al., J. Gen. Virol., 73, 2225 (1992); Lopez et al., J. Virol., 72, 6922 (1998); López et al., J. Virol., 64, 927 (1990)), i svi postoje na postfuzionom obliku RSV F proteina kako je utvrđeno strukturnim i biofizičkim studijama (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011); Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619 (2011)). Apsorpcija humanih seruma sa postfuzionim RSV F, međutim, ne uklanja većinu F-specifične neutrališuće aktivnosti, što ukazuje na to da prefuzioni oblik RSV F sadrži nova neutralizujuća antigenska mesta (Magro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 109, 3089 (2012)).
Pre ovde otkrivenog rada, homogeni preparat rastvorljivog prefuzionog RSV F proteina bio je nedostupan, što je onemogućavalo određivanje strukture prefuzionog F i identifikaciju novih antigenskih mesta specifičnih za prefuzioni F. Kao što je ovde opisano, identifikovana su antitela specifična za RSV F protein, koja neutrališu RSV, ali se ne vezuju specifično za postfuzioni RSV F, i dobijena je trodimenzionalna struktura prefuzionog F, koju ova antitela prepoznaju. Ovde prikazani rezultati po prvi put otkrivaju prefuzionu konformaciju RSV F i mehanizam neutralizacije za kategoriju izuzetno potentnih neutrališućih antitela za prefuzioni RSV F. Upotrebom trodimenzionalne strukture F kao smernice, konstruisani su stabilizovani oblici prefuzionog F („PreF“ antigeni) i upotrebljeni za generisanje RSV-neutrališućih imunskih odgovora mnogostruko jačih od onih dobijenih sa prethodnim imunogenima na bazi RSV F proteina.
I. Termini
Ako nije drugačije naglašeno, tehnički termini se koriste u skladu sa konvencionalnim korišćenjem. Definicije uobičajenih pojmova u molekularnoj biologiji mogu se naći u delu Benjamin Lewin, Genes VII, izdavača Oxford University Press, 1999; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, izdavača Blackwell Science Ltd., 1994; i Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, izdavača VCH Publishers, Inc., 1995; i drugim sličnim referencama.
Kao što se ovde koriste, oblici u jednini odnose se kako na jedninu, tako i na množinu, osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Na primer, termin „antigen“ sadrži jedan ili više antigena i može se smatrati ekvivalentnim izrazu „najmanje jedan antigen“. Kao što se ovde koristi, termin „sadrži“ znači „uključuje“. Tako „koji sadrži antigen“ znači „koji uključuje antigen“ bez isključivanja drugih elemenata. Dalje treba napomenuti da su sve veličine baza ili veličine aminokiselina, kao i sve vrednosti molekulske težine ili molekulske mase, date za nukleinske kiseline ili polipeptide, približne i obezbeđene su u deskriptivne svrhe, osim ako nije drugačije naznačeno. Iako se mogu koristiti mnogi postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde, ovde su opisani posebno odgovarajući postupci i materijali. U slučaju konflikta, presudna je ova specifikacija, uključujući objašnjenja termina. Pored toga, materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni da ograniče pronalazak. Da bi se olakšao pregled različitih primera izvođenja, data su sledeća objašnjenja termina:
5C4: Neutrališuće monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za prefuzionu konformaciju RSV F proteina, ali ne i za postfuzionu konformaciju RSV F proteina. Antitelo 5C4 uključuje varijabilne regione teškog i lakog lanca sa aminokiselinskim sekvencama navedeno kao SEQ ID NO: 1470 i 1471, respektivno. Kao što je opisano u McLellan et al., Science, 340 (6136): 1113-7, 2013, 5C4 se specifično vezuje za kvaternarni epitop koji se nalazi na RSV F proteinu u njegovoj prefuzionoj konformaciji, ali ne i u postfuzionoj konformaciji. U nekim primerima izvođenja, antitelo 5C4 specifično se vezuje za antigene PreF koji su ovde otkriveni.
Varijabilni domen teškog lanca 5C4:
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTFFHWVKQRPEQGLEWIGRIDPADGHTK YDPKFQGKATITADTSSNTAFLQLSSLTSVDTAVYYCATTITAVVPTPYNAMDYWGQGT SVTVSS (SEQ ID NO: 1470)
Varijabilni domen kapa lakog lanca 5C4:
DIVLTQSPASLAVSLGQRTTISCRASESVDSFDNSFIHWYQQKPGQPPKLLIFLASSLESGV PARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 1471)
Adjuvans: Vehikulum koji se koristi za poboljšanje antigenosti. Adjuvansi uključuju suspenziju minerala (alum, aluminijum hidroksid ili fosfat) na kojima se adsorbuje antigen; ili emulziju vode u ulju, na primer, u kojoj se antigenski rastvor emulguje u mineralnom ulju (Frojndov nekompletni adjuvans), ponekad uz uključivanje ubijenih mikobakterija (Frojndov kompletni adjuvans) kako bi se dodatno poboljšala antigenost (inhibira degradaciju antigena i/ili uzrokuje priliv makrofaga). Imunostimulatorni oligonukleotidi (kao što su oni koji uključuju CpG motiv) takođe se mogu koristiti kao adjuvansi. Adjuvansi uključuju biološke molekule („biološki adjuvans“), kao što su kostimulatorni molekuli. Primeri adjuvanasa uključuju IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L, 4-1BBL i agoniste toll-u sličnog receptora (TLR), kao što su TLR-9 agonisti. Stručnjak u ovoj oblasti je upoznat sa adjuvansima (videti, npr. Singh (ed.) Vaccine Adjuvants and Delivery Systems. Wiley-Interscience, 2007). Adjuvansi se mogu koristiti u kombinaciji sa otkrivenim PreF antigenima.
Primena: Uvođenje kompozicije u subjekt izabranim putem. Primena može da bude lokalna ili sistemska. Na primer, ako je izabrani put intravenski, kompozicija (kao što je kompozicija koja uključuje otkriveni imunogen) se daje uvođenjem kompozicije u venu subjekta.
Agens: Bilo koja supstanca ili kombinacija supstanci koja je korisna za postizanje cilja ili rezultata; na primer, supstanca ili kombinacija supstanci korisna za inhibiciju RSV infekcije u subjektu. Agensi uključuju proteine, molekule nukleinske kiseline, jedinjenja, male molekule, organska jedinjenja, neorganska jedinjenja ili druge molekule od interesa, kao što su virusi, kao što su rekombinantni virusi. Agens može da uključuje terapeutski agens (kao što je anti-RSV agens), dijagnostički agens ili farmaceutski agens. U nekim primerima izvođenja, agens je polipeptidni agens (kao što je imunogeni RSV polipeptid) ili antivirusni agens. Stručnjak će shvatiti da pojedini agensi mogu da budu korisni za postizanje više od jednog rezultata.
AM22: Neutrališuće monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za prefuzionu konformaciju RSV F proteina, ali ne i za postfuzionu konformaciju RSV F proteina. Sekvence proteina i nukleinskih kiselina AM22 su poznate, na primer, aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca antitela AM22 su prikazane u SAD obj. pat. prij. br.2012/0070446). Kao što je opisano u primeru 1, AM22 se specifično vezuje za epitop (uključen u antigensko mesto Ø) uključujući pozicije koje se nalaze na RSV F proteinu u njegovoj prefuzionoj konformaciji, ali ne i u postfuzionoj konformaciji. Ovaj epitop je uključen u RSV F pozicije 62-69 i 196-209, a nalazi se na vrhu RSV F proteina distalno u odnosu na membranu u prefuzionoj konformaciji (videti, npr. SL.2B i 9A). Pre ovog otkrića nije bilo poznato da je AM22 specifičan za prefuzionu konformaciju. U nekim primerima izvođenja, antitelo AM22 se specifično vezuje za PreF antigene koji su ovde otkriveni.
Aminokiselinske supstitucije: Zamena jedne aminokiseline u antigenu drugačijom aminokiselinom ili delecija aminokiseline. U nekim primerima, aminokiselina u antigenu je zamenjena aminokiselinom iz homolognog proteina.
Životinja: Živi višećelijski organizam kičmenjaka ili beskičmenjaka, kategorija koja uključuje, na primer, sisare. Termin sisar uključuje i ljude i nehumane sisare. Slično tome, termin „subjekt“ uključuje i ljude i veterinarske subjekte, kao što su nehumani primati. Prema tome, primena kod subjekta može da uključuje i primenu kod humanog subjekta. Neograničeni primeri veterinarskih subjekata su domaće životinje (kao što su mačke i psi), stoka (na primer, goveda, konji, svinje, ovce i koze) i laboratorijske životinje (na primer, miševi, zečevi, pacovi, gerbili, zamorci i nehumani primati).
Antitelo: Polipeptid koji je u prirodi suštinski kodiran imunoglobulinskim genom ili imunoglobulinskim genima, ili njihovim fragmentima, koji specifično vezuje i prepoznaje analit (kao što je antigen ili imunogen), kao što je RSV F protein ili njegov antigeni fragment. Imunoglobulinski geni uključuju gene konstantnih regiona kapa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon i mi, kao i brojne gene varijabilnih regiona imunoglobulina. Termin „antitelo“, kao što se ovde koristi, uključuje fragmente antitela proizvedene, na primer, modifikacijom celih antitela i de novo sintezom korišćenjem rekombinantne DNK metodologije.
Antitela postoje, na primer, kao intaktni imunoglobulini i kao brojni dobro okarakterisani fragmenti antitela. Na primer, Fab, Fv i jednolančani Fv (SCFv) koji se vezuju za RSV F protein bili bi vezujući agensi specifični za RSV F proteine. To uključuje intaktne imunoglobuline i njihove varijante i delove dobro poznate u tehnici, kao što su Fab' fragmenti, F(ab)'2 fragmenti, jednolančani Fv proteini („scFv“) i disulfidno stabilizovani Fv proteini („dsFv“). ScFv protein je fuzioni protein u kome su varijabilni region lakog lanca imunoglobulina i varijabilni region teškog lanca imunoglobulina vezani linkerom, dok su u dsFv lanci mutirani da bi se uvela disulfidna veza kako bi se stabilizovalo povezivanje lanaca. Termin obuhvata i genetski konstruisane oblike kao što su himerna antitela (kao što su humanizovana mišja antitela), heterokonjugovana antitela (kao što su bispecifična antitela). Videti takođe, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3<rd>Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997.
Fragmenti antitela su definisani na sledeći način: (1) Fab, fragment koji sadrži monovalentni antigen-vezujući fragment molekula antitela proizvedenog digestijom celog antitela enzimom papainom da bi se dobio intaktni laki lanac i deo jednog teškog lanca; (2) Fab', fragment molekula antitela dobijen tretiranjem celog antitela pepsinom, praćen redukcijom, kako bi se dobio intaktni laki lanac i deo teškog lanca; po molekulu antitela se dobijaju dva Fab' fragmenta; (3) (Fab')2, fragment antitela dobijen tretiranjem celog antitela enzimom pepsinom bez naknadne redukcije; (4) F(ab')2, dimer dva Fab' fragmenta koja drže zajedno dve disulfidne veze; (5) Fv, genetski konstruisani fragment koji sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca eksprimirane kao dva lanca; i (6) jednolančano antitelo („SCA“), genetski konstruisani molekul koji sadrži varijabilni region lakog lanca, varijabilni region teškog lanca, povezane odgovarajućim polipeptidnim linkerom kao genetski fuzionisani jednolančani molekul.
Tipično, prirodni imunoglobulin ima teški (H) lanac i laki (L) lanac povezane disulfidnim vezama. Postoje dve vrste lakog lanca, lambda (λ) i kapa (κ). Postoji pet glavnih klasa teškog lanca (ili izotipa) koji određuju funkcionalnu aktivnost molekula antitela: IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Otkrivenim antitelima može da se menja klasa.
Svaki teški i laki lanac sadrži konstantni region i varijabilni region (regioni su poznati i kao „domeni“). U nekim primerima izvođenja, varijabilni domeni teškog i lakog lanca se kombinuju za specifično vezivanje antigena. U dodatnim primerima izvođenja potreban je samo varijabilni domen teškog lanca. Na primer, prirodna antitela kamelida koja se sastoje samo od teškog lanca su funkcionalna i stabilna u odsustvu lakog lanca (videti, npr. Hamers-Casterman et al., Nature, 363:446-448, 1993; Sheriff et al., Nat. Struct. Biol., 3:733-736, 1996). Varijabilni domeni lakog i teškog lanca sadrže „okvirni“ region koji prekidaju tri hipervarijbilna regiona, koji se nazivaju i „regioni koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“ (videti, npr. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Sekvence okvirnih regiona različitih lakih ili teških lanaca su relativno očuvane unutar vrste. Okvirni region antitela, to jest kombinovani okvirni regioni sastavnog lakog i teškog lanca, služe za pozicioniranje i poravnanje CDR-ova u trodimenzionalnom prostoru.
CDR su prvenstveno odgovorni za vezivanje za epitop antigena. Granice aminokiselinske sekvence datog CDR-a mogu se lako odrediti korišćenjem bilo koje od brojnih dobro poznatih šema, uključujući one opisane kod Kabat et al. („Sequences of Proteins of Immunological Interest,“ 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; „Kabat“ šema numerisanja), Al-Lazikani et al., (JMB 273,927-948, 1997; „Chothia“ šema numerisanja), i Lefranc, et al. („IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains“, Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003; „IMGT“ šema numerisanja).
CDR regioni svakog lanca su obično označeni kao CDR1, CDR2 i CDR3 (od N-terminusa ka C-terminusu), i obično su identifikovani i lancem u kome se nalazi konkretni CDR. Tako je VH CDR3 smešten u varijabilnom domenu teškog lanca antitela u kome se nalazi, dok VL CDR1 predstavlja CDR1 iz varijabilnog domena lakog lanca antitela u kojem se nalazi. CDR lakog lanca se ponekad naziva CDR L1, CDR L2 i CDR L3. CDR teškog lanca se ponekad naziva CDR H1, CDR H2 i CDR H3.
Antigen: Jedinjenje, kompozicija ili supstanca koja može da stimuliše proizvodnju antitela ili odgovor T ćelija kod životinje, uključujući kompozicije koje se ubrizgavaju ili apsorbuju u životinju. Antigen reaguje sa proizvodima specifičnog humoralnog ili ćelijskog imuniteta, uključujući i one izazvane heterolognim antigenima, kao što su otkriveni rekombinantni RSV F proteini.
Primeri antigena uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide, peptide, lipide, polisaharide, njihove kombinacije (kao što su glikopeptidi) i nukleinske kiseline koje sadrže antigene determinante, kao što su one koje prepoznaje imunska ćelija. U nekim primerima, antigeni uključuju peptide koji potiču iz i patogena od interesa, kao što je RSV. U specifičnim primerima, antigen potiče iz RSV, kao što je antigen koji uključuje modifikovani RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji. „Epitop“ ili „antigena determinanta“ se odnosi na region antigena na koji reaguju B i/ili T ćelije.
Anti-RSV agens: Agens koji specifično inhibira replikaciju RSV ili infekciju ćelija. Neograničavajući primeri anti-RSV agenasa uključuju monoklonsko antitelo palivizumab (SYNAGIS®; Medimmune, Inc.) i niskomolekulski antivirusni lek ribavirin (koji proizvode mnoge kompanije, npr. Warrick Pharmaceuticals, Inc.).
Atomske koordinate ili strukturne koordinate: Matematičke koordinate izvedene iz matematičkih jednačina koje se odnose na obrasce dobijene difrakcijom monohromatskog snopa X-zraka na atomima (centrima rasipanja), kao što su atomi antigena ili antigena u kompleksu sa antitelom. U nekim primerima, antigen može da bude RSV F protein (na primer stabilizovan u prefuzionoj konformaciji vezivanjem za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju, ili uvođenjem stabilizujućih modifikacija) u kristal. Podaci o difrakciji se koriste za izračunavanje mape elektronske gustine ponavljajuće jedinice kristala. Mape elektronske gustine se koriste za određivanje položaja pojedinačnih atoma unutar jedinične ćelije kristala. U jednom primeru, termin „strukturne koordinate“ odnosi se na kartezijanske koordinate izvedene iz matematičkih jednačina koje se odnose na obrasce dobijene difrakcijom monohromatskog snopa X-zraka, kao što su atomi RSV F proteina u kristalnom obliku.
Stručnjaci u ovoj oblasti shvataju da skup strukturnih koordinata određenih rendgenskom kristalografijom ima standardnu grešku. Za potrebe ovog otkrića, svaki skup strukturnih koordinata koji ima srednje kvadratno odstupanje atoma u osnovnom lancu proteina (N, Cα, C i O) manje od oko 1.0 Angstrema pri superponiranju, kao što je oko 0.75, ili oko 0.5, ili oko 0.25 Angstrema, upotrebom atoma osnovnog lanca, smatraće se (u odsustvu eksplicitne izjave suprotne ovome) identičnim.
Aminokiselinska supstitucija koja popunjava šupljinu: Aminokiselinska supstitucija koja popunjava šupljinu unutar proteinskog jezgra proteina RSV F proteina, na primer šupljinu prisutnu u protomeru RSV F proteina ili šupljinu između protomera RSV F proteina. Šupljine su u suštini praznine unutar presavijenog proteina u kojima nema aminokiselina ili aminokiselinskih bočnih lanaca. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska supstitucija koja popunjava šupljinu se uvodi kako bi se popunila šupljina u jezgru proteina RSV F prisutna u prefuzionoj konformaciji proteina RSV F koji se urušava (npr. ima smanjenu zapreminu) nakon prelaska na postfuzionu konformaciju.
Kružna permutacija: Modifikovani rekombinantni protein u kome se modifikuju veze između različitih regiona proteinske tercijarne strukture, tako da se menja relativni redosled različitih regiona u primarnoj sekvenci, ali je očuvan položaj regiona u tercijarnoj strukturi. Na primer, u slučaju 4-struke antiparalelne ploče sa lancem A, B, C i D, koji imaju sledeće N i C terminuse i raspored vezivanja,
N-terminus - lanac A - linker - lanac B - linker - lanac C - linker - lanac D - C-terminus, kružne permutacije 4 lanca A, B, C i D promenom vezivanja linkera između lanaca bi uključivale Permutaciju koja menja N- i C-terminuse:
N-terminus - lanac C - linker - lanac D - linker - lanac A - linker - lanac B - C-terminus Permutaciju sa očuvanjem N-terminusa:
N-terminus - lanac A - linker - lanac D - linker - lanac C - linker - lanac B - C-terminus Permutaciju sa očuvanjem C-terminusa:
N-terminus - lanac C - linker - lanac B - linker - lanac A - linker - lanac D - C-terminus.
Dovođenje u kontakt: Postavljanje u direktnu fizičku vezu; i u čvrstom i tečnom obliku.
Dovođenje u kontakt uključuje kontakt između jednog molekula i drugog molekula, na primer aminokiseline na površini jednog polipeptida, kao što je antigen, koji dolazi u kontakt sa drugim polipeptidom, kao što je antitelo. Dovođenje u kontakt takođe uključuje primenu, kao što je primena otkrivenog antigena kod subjekta odabranim putem.
Kontrola: Referentni standard. U nekim primerima izvođenja, kontrola je negativan kontrolni uzorak dobijen od zdravog pacijenta. U drugim primerima izvođenja, kontrola je pozitivan kontrolni uzorak dobijen od pacijenta sa dijagnozom RSV infekcije. U drugim primerima izvođenja, kontrola je istorijska kontrola ili standardna referentna vrednost ili opseg vrednosti (kao što je prethodno testirani kontrolni uzorak, kao što je grupa RSV pacijenata sa poznatom prognozom ili ishodom, ili grupa uzoraka koji predstavljaju osnovne ili normalne vrednosti). Razlika između uzorka testa i kontrole može da bude povećanje ili, suprotno, smanjenje vrednosti. Razlika može da bude kvalitativna razlika ili kvantitativna razlika, na primer statistički značajna razlika. U nekim primerima, razlika je povećanje ili smanjenje, u odnosu na kontrolu, od najmanje 5%, kao što je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 100%, najmanje oko 150%, najmanje oko 200%, najmanje oko 250%, najmanje oko 300%, oko 350%, najmanje oko 400%, najmanje oko 500% ili više od 500%.
D25: Neutrališuće monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za prefuzionu konformaciju RSV F proteina, ali ne i za postfuzionu konformaciju RSV F proteina. Sekvence proteina i nukleinske kiseline D25 su poznate, na primer, aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca antitela D25 su prikazane u SAD obj. pat. prij. br. 2010/0239593; videti takođe, Kwakkenbos et al., Nat. Med., 16:123-128, 2009). Kao što je opisano u primeru 1, D25 se specifično vezuje za kvaternarni epitop (uključen u antigensko mesto Ø) koji se nalazi na RSV F proteinu u njegovoj prefuzionoj konformaciji, ali ne i u postfuzionoj konformaciji. Ovaj epitop uključuje pozicije 62-69 i 196-209 u RSV F, a nalazi se na vrhu RSV F proteina distalno u odnosu na membranu u prefuzionoj konformaciji (videti, npr. SL. 2B i 9A). Pre ovog otkrića bilo je poznato da je D25 specifično za prefuzionu konformaciju RSV F proteina). U nekim primerima izvođenja, antitelo D25 se specifično vezuje za PreF antigene koji su ovde otkriveni.
Degenerisana varijanta i konzervativna varijanta: Polinukleotid koji kodira polipeptid koji uključuje sekvencu koja je degenerisana kao rezultat genetskog koda. Na primer, polinukleotid koji kodira otkriveni antigen ili antitelo koje specifično vezuje otkriveni antigen, koji uključuje sekvencu koja je degenerisana kao rezultat genetskog koda. Postoji 20 prirodnih aminokiselina, od kojih je većina specifikovana većim brojem od jednog kodona. Prema tome, sve degenerisane nukleotidne sekvence su uključene sve dok je aminokiselinska sekvenca antigena ili antitela koja vezuje antigen kodiran nukleotidnom sekvencom nepromenjena. Zbog degeneracije genetskog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira bilo koji dati polipeptid. Na primer, CGU, CGC, CGA, CGG, AGA i AGG kodiraju aminokiselinu arginin. Tako, na svakoj poziciji gde je arginin naveden unutar proteinske kodirajuće sekvence, kodon se može izmeniti u bilo koji od opisanih odgovarajućih kodona, bez promene kodiranog proteina. Takve varijacije nukleinske kiseline su „tihe varijacije“, koje su jedna vrsta konzervativnih varijacija. Svaka sekvenca nukleinske kiseline ovde koja kodira polipeptid takođe opisuje svaku moguću tihu varijaciju. Stručnjak će prepoznati da svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG, koji je obično jedini kordon za metionin) može da bude modifikovan da bi se dobio funkcionalno identičan molekul standardnim tehnikama. U skladu sa tim, svaka „tiha varijacija“ nukleinske kiseline koja kodira polipeptid je implicirana u svakoj opisanoj sekvenci.
Stručnjak će prepoznati da su pojedinačne supstitucije, delecije ili adicije koje menjaju, dodaju ili brišu jednu aminokiselinu ili mali procenat aminokiselina (na primer manje od 5%, u nekim primerima izvođenja manje od 1%) u kodiranoj sekvenci konzervativne varijacije u kojima promene dovode do supstitucije aminokiseline hemijski sličnom aminokiselinom.
Konzervativne aminokiselinske supstitucije koje daju funkcionalno slične aminokiseline su dobro poznate u umetnosti. Sledećih šest grupa sadrže aminokiseline koje predstavljaju konzervativne supstitucije jedna za drugu:
1) alanin (A), serin (S), treonin (T);
2) asparaginska kiselina (D), glutaminska kiselina (E);
3) asparagin (N), glutamin (Q);
4) arginin (R), lizin (K);
5) izoleucin (I), leucin (L), metionin (M), valin (V); i
6) fenilalanin (F), tirozin (Y), triptofan (W).
Neće sve pozicije ostataka unutar proteina tolerisati inače „konzervativnu“ supstituciju. Na primer, ako je aminokiselinski ostatak neophodan za funkciju proteina, čak i inače konzervativna supstitucija može da poremeti tu aktivnost, na primer specifično vezivanje antitela za ciljni epitop može da bude poremećeno konzervativnom mutacijom u ciljnom epitopu.
Epitop: Antigenska determinanta. To su određene hemijske grupe ili peptidne sekvence na molekulu koje su antigene, tako da izazivaju specifičan imunski odgovor, na primer, epitop je region antigena na koji reaguju B i/ili T ćelije. Antitelo vezuje poseban antigenski epitop, kao što je epitop RSV F proteina, na primer, D25 ili AM22 epitop prisutan na prefuzionoj konformaciji RSV F proteina.
Epitopi se mogu formirati od kontinuiranih aminokiselina ili nekontinuiranih aminokiselina koje se kombinuju tercijarnim savijanjem proteina. Epitopi formirani od kontinuiranih aminokiselina obično ostaju očuvani pri izlaganju denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem obično gube pri izlaganju denaturišućim rastvaračima. Epitop obično uključuje najmanje 3, i obično, najmanje 5, oko 9, ili oko 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Postupci za određivanja prostorne konformacije epitopa uključuju, na primer, kristalografiju x-zraka i nuklearnu magnetnu rezonancu. Epitopi takođe mogu da uključuju post-translacionu modifikaciju aminokiselina, kao što je N-vezana glikozilacija.
U jednom primeru izvođenja, T ćelije reaguju na epitop, kada je epitop predstavljen u kombinaciji sa MHC molekulom. Epitopi se mogu formirati od kontinuiranih aminokiselina ili nekontinuiranih aminokiselina koje se kombinuju tercijarnim savijanjem proteina. Epitopi formirani od kontinuiranih aminokiselina obično ostaju očuvani pri izlaganju denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem obično gube pri izlaganju denaturišućim rastvaračima. Epitop obično uključuje najmanje 3, i obično, najmanje 5, oko 9, ili oko 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Postupci za određivanja prostorne konformacije epitopa uključuju, na primer, kristalografiju x-zraka i nuklearnu magnetnu rezonancu.
„Ciljni epitop“ je konkretan epitop na antigenu koji specifično vezuje antitelo od interesa, kao što je monoklonsko antitelo. U nekim primerima, ciljni epitop uključuje aminokiselinske ostatke koji dolaze u kontakt sa antitelom od interesa, tako da ciljni epitop može da bude odabran na osnovu aminokiselinskih ostataka za koje je utvrđeno da su u kontaktu sa antitelom od interesa.
Efikasna količina: Količina agensa, kao što je PreF antigen ili nukleinska kiselina koja kodira PreF antigena ili drugog agensa koja je dovoljna za generisanje željenog odgovora, kao što je imunski odgovor na RSV F protein, ili za smanjenje ili eliminacija znaka ili simptoma stanja ili bolesti, kao što je RSV infekcija. Na primer, ovo može da bude količina neophodna za inhibiciju virusne replikacije ili za merljivo menjanje spoljašnjih simptoma virusne infekcije. U principu, ova količina će biti dovoljna da merljivo inhibira replikaciju ili infektivnost virusa (na primer, RSV). Kada se primenjuje kod subjekta, generalno će se koristiti doza koja će postići koncentracije u ciljnom tkivu (na primer, u respiratornom tkivu), za koje je pokazano da postižu in vitro inhibiciju virusne replikacije. U nekim primerima, „efikasna količina“ je ona koja leči (uključujući profilaksu) jedan ili više simptoma i/ili osnovne uzroke bilo kog poremećaja ili bolesti, na primer za lečenje RSV infekcije. U jednom primeru, efikasna količina je terapeutski efikasna količina. U jednom primeru, efikasna količina je količina koja sprečava jedan ili više znakova ili simptoma određene bolesti ili stanja da se razvije, kao što je jedan ili više znakova ili simptoma povezanih sa RSV infekcijom.
Ekspresija: Translacija nukleinske kiseline u protein. Proteini mogu da budu eksprimirani i da ostanu intracelularni, da postanu komponenta membrane površine ćelije, ili da se izluče u ekstracelularni matriks ili medijum.
Sekvence za kontrolu ekspresije: Sekvence nukleinske kiseline koje regulišu ekspresiju heterologne sekvence nukleinske kiseline za koju su funkcionalno vezane. Sekvence za kontrolu ekspresije su funkcionalno povezane sa sekvencom nukleinske kiseline kada sekvence za kontrolu ekspresije kontrolišu i regulišu transkripciju i, po potrebi, translaciju sekvence nukleinske kiseline. Tako sekvence za kontrolu ekspresije mogu da uključuju odgovarajuće promotore, pojačivače, transkripcione terminatore, start kodon (ATG) ispred gena za kodiranje proteina, signal za splajsovanje za introne, održavanje ispravnog okvira čitanja tog gena kako bi se omogućila pravilna translacija iRNK i stop kordone. Predviđeno je da termin „sekvence za kontrolu“ uključuje, najmanje, komponente čije prisustvo može da utiče na ekspresiju, a može da sadrži i dodatne komponente čije prisustvo predstavlja prednost, na primer, liderske sekvence i sekvence fuzionog partnera. Sekvence za kontrolu ekspresije mogu da uključuju promotor.
Promotor je minimalna sekvenca dovoljna da pokrene transkripciju. Takođe su uključeni i promotorski elementi koji su dovoljni da obezbede kontrolisanu ekspresiju gena zavisnu od promotora za ekspresiju koja je specifična za ćelijski tip, specifična za tkivo ili inducibilna spoljnim signalima ili agensima; takvi elementi mogu biti locirani u 5' ili 3' regionima gena. Uključeni su i konstitutivni i inducibilni promotori (videti na primer, Bitter et al., Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Na primer, kada se kloniraju u bakterijske sisteme, mogu da se koriste inducibilni promotori kao što su pL bakteriofaga lambda, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac hibridni promotor) i slično. U jednom primeru izvođenja, prilikom kloniranja u ćelijski sistem sisara, mogu da se koriste promotori koji potiču iz genoma ćelija sisara (kao što je promotor metalotioneina) ili iz virusa sisara (kao što je dugi terminalni ponovak retrovirusa; kasni promotor adenovirusa; 7.5K promotor virusa vakcinije). Promotori proizvedeni rekombinantnom DNK ili sintetičkim tehnikama mogu se takođe koristiti za pokretanje transkripcije sekvenci nukleinske kiseline. Polinukleotid može da se umetne u ekspresioni vektor koji sadrži promotorsku sekvencu, što olakšava efikasnu transkripciju umetnute genetske sekvence domaćina. Ekspresioni vektor obično sadrži mesto početka replikacije, promotor, kao i specifične sekvence nukleinske kiseline koje omogućavaju fenotipsku selekciju transformisanih ćelija.
Feritin: Protein koji skladišti gvožđe i oslobađa ga na kontrolisan način. Protein proizvode skoro svi živi organizmi. Feritin se sklapa u globularni proteinski kompleks koji se u nekim slučajevima sastoji od 24 proteinske podjedinice. U nekim primerima, feritin se koristi za formiranje nanočestica koje predstavlja antigene na svojoj površini, na primer RSV antigen, kao što su otkriveni antigeni RSV F proteina stabilizovani u prefuzionoj konformaciji.
Domen Foldon: Aminokiselinska sekvenca koja prirodno formira trimernu strukturu. U nekim primerima, domen Foldon može da bude uključen u aminokiselinsku sekvencu otkrivenog RSV F proteinskog antigena stabiliziranog u prefuzionoj konformaciji tako da antigen formira trimer. U jednom primeru, domen Foldon je T4 domen Foldon prikazan kao SEQ ID NO: 351 (GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF). Nekim primerima izvođenja uključuje domen Foldon koji može da se iseče iz prečišćenog proteina, na primer ugrađivanjem mesta isecanja trombinom u blizini domena Foldon koje može da se koristi za isecanje.
Glikoprotein (gp): Protein koji sadrži lance oligosaharida (glikane) kovalentno vezane za polipeptidne bočne lance. Ugljeni hidrat se vezuje za protein u kotranslacionoj ili posttranslacionoj modifikaciji. Ovaj proces je poznat kao glikozilacija. U proteinima koji imaju segmente koji se pružaju ekstracelularno, ekstracelularni segmenti su često glikozilisani. Glikoproteini su često važni integralni membranski proteini, gde igraju ulogu u međućelijskim interakcijama. U nekim primerima glikoprotein je RSV glikoprotein, kao što je RSV F proteinski antigen stabilizovan u prefuzionoj konformaciji ili njegov imunogeni fragment.
Glikozilaciono mesto: Aminokiselinska sekvenca na površini polipeptida, kao što je protein, koja omogućava vezivanje glikana. N-vezano glikozilaciono mesto je trostruka sekvenca NX(S/T) u kojoj je N asparagin, X je bilo koji ostatak, osim prolina, a (S/T) je ostatak serina ili treonina. Glikan je polisaharid ili oligosaharid. Glikan se takođe može koristiti za označavanje ugljenohidratnog dela glikokonjugata, kao što je glikoprotein, glikolipid ili proteoglikan.
Homologni proteini: Proteini koji imaju sličnu strukturu i funkciju, na primer, proteini iz dve ili više vrsta ili virusnih sojeva koji imaju sličnu strukturu i funkciju u dve ili više vrsta ili virusnih sojeva. Na primer, RSV F protein iz RSV A je homologni protein sa RSV F proteinom iz goveđeg RSV. Homologni proteini dele slične karakteristike savijanja proteina i mogu se smatrati strukturnim homolozima.
Homologni proteini obično dele visok stepen očuvanja sekvenci, kao što je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, ili najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% očuvanja sekvence, i visok stepen identičnosti sekvence, kao što je najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, ili najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičnosti sekvence.
Ćelije-domaćini: Ćelije u kojima može da dođe do umnožavanja vektora i eksprimiranja njegove DNK. Ćelija može da bude prokariotska ili eukariotska. Termin takođe uključuje bilo koje potomstvo predmetne ćelije-domaćina. Podrazumeva se da svi potomci možda nisu identični sa parentalnom ćelijom, jer mogu postojati mutacije koje se javljaju tokom replikacije. Međutim, takvo potomstvo je uključeno kada se koristi termin „ćelija-domaćin“.
Imunogen: Protein ili njegov deo koji je sposoban da izazove imunski odgovor kod sisara, kao što je sisar zaražen ili pod rizikom od infekcije patogenom. Primena imunogena može dovesti do zaštitnog imuniteta i/ili proaktivnog imuniteta protiv patogena od interesa. U nekim primerima, imunogen uključuje otkriveni PreF antigen.
Imunski odgovor: Odgovor ćelije imunog sistema, kao što je B ćelija, T ćelija ili monocit, na stimulus. U jednom primeru izvođenja, odgovor je specifičan za konkretni antigen („antigenspecifični odgovor“). U jednom primeru izvođenja, imunski odgovor je odgovor T ćelija, kao što je CD4+ odgovor ili CD8+ odgovor. U drugom primeru izvođenja, odgovor je B ćelijski odgovor i rezultira proizvodnjom specifičnih antitela.
Imunski odgovor pomeren u smeru „Th1“ tipa odgovora karakteriše prisustvo CD4<+>T pomoćničkih ćelija koje proizvode IL-2 i IFN-γ, a samim tim, sekrecijom ili prisustvom IL-2 i IFN-γ. Nasuprot tome, imunski odgovor pomeren u smeru „Th2“ karakteriše prevaga CD4<+>pomoćničkih ćelija koje proizvode IL-4, IL-5 i IL-13.
Imunogena kompozicija: Kompozicija koja sadrži antigen koji izaziva imunski odgovor, kao što je merljivi CTL odgovor protiv virusa koji eksprimira antigen, ili merljivi odgovor B ćelija (kao što je proizvodnja antitela) protiv antigena. Kao takva, imunogena kompozicija uključuje jedan ili više antigena (na primer, polipeptidnih antigena) ili antigene epitope. Imunogena kompozicija može takođe da sadrži jednu ili više dodatnih komponenti koje mogu da izazovu ili poboljšaju imunski odgovor, kao što su ekscipijens, nosač i/ili adjuvans. U određenim slučajevima, imunogene kompozicije se primenjuju da bi se izazvao imunski odgovor koji štiti subjekta od simptoma ili stanja izazvanih patogenom. U nekim slučajevima, simptomi ili bolest uzrokovana patogenom se sprečavaju (ili smanjuju ili ublažavaju) inhibiranjem replikacije patogena (npr. RSV) nakon izlaganja subjekta patogenu. U jednom primeru, „imunogena kompozicija“ uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, koji izaziva merljiv CTL odgovor protiv virusa koji eksprimira RSV F protein, ili izaziva merljiv odgovor B ćelija (kao što je proizvodnja antitela) protiv RSV F proteina. Dalje se odnosi na izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju antigen, kao što je nukleinska kiselina koja se može koristiti za eksprimiranje antigena (i na taj način se može koristiti za izazivanje imunskog odgovora protiv ovog polipeptida). Za in vitro upotrebu, imunogena kompozicija može da uključuje antigen ili nukleinsku kiselinu koja kodira antigen. Za in vivo upotrebu, imunogena kompozicija će obično uključivati protein, imunogeni peptid ili nukleinsku kiselinu u farmaceutski prihvatljivim nosačima, i/ili drugim agensima. Sposobnost bilo kog peptida, kao što je otkriveni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji ili nukleinske kiseline koja kodira otkriveni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, da indukuje CTL ili B ćelijski odgovor može lako da se ispita pomoću testova poznatih u tehnici. Imunogene kompozicije mogu da uključuju adjuvanse, koji su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti.
Imunološki reaktivni uslovi: Uključuje pozivanje na uslove koji omogućavaju vezivanje antitela koje je indukovano protiv određenog epitopa za taj epitop u znatno većoj meri u odnosu na, i/ili u meri koja suštinski isključuje, vezivanje za sve ostale epitope. Imunski reaktivni uslovi zavise od formata reakcije vezivanja antitela i obično su oni koji se koriste u protokolima imunskih testova ili oni koji se sreću in vivo. Imunski reaktivni uslovi koji se koriste u postupcima su „fiziološki uslovi“ koji uključuju upućivanje na uslove (kao što su temperatura, osmolarnost, pH) koji su tipični unutar živog sisara ili sisarske ćelije. Iako je prepoznato da su neki organi podložni ekstremnim uslovima, sredina u organizmu i ćelijama je normalno oko pH 7 (kao što je od pH 6.0 do pH 8.0, tipično pH 6.5 do 7.5), sadrži vodu kao dominantni rastvarač, i postoji na temperaturi iznad 0 °C i ispod 50 °C. Osmolarnost je unutar opsega koji podržava vitalnost i proliferaciju ćelija.
Imunska proba: Molekul koji može da se koristi za selekciju antitela iz seruma koji su usmereni protiv određenog epitopa ili antigena, uključujući i serume humanih pacijenata. U nekim primerima, otkriveni RSV F proteini stabilizovani u prefuzionoj konformaciji mogu da se koriste kao imunske probe u pozitivnoj i negativnoj selekciji antitela specifičnih za RSV F protein u prefuzionoj konformaciji.
Imunogena površina: Površina molekula, na primer RSV F proteina, sposobna da izazove imunski odgovor. Imunogena površina sadrži karakteristike koje definišu tu površinu, kao što su trodimenzionalni oblik i površinsko naelektrisanje. U nekim primerima, imunogena površina je definisana aminokiselinama na površini proteina ili peptida koji su u kontaktu sa antitelom, kao što je neutrališuće antitelo, kada su protein i antitelo povezani zajedno. Ciljni epitop uključuje imunogenu površinu. Imunogena površina je sinonim za antigenu površinu.
Inhibicija ili lečenje bolesti: Inhibicija punog razvoja bolesti ili stanja, na primer, kod subjekta koji je izložen riziku od bolesti, kao što je RSV infekcija. „Lečenje“ se odnosi na terapijsku intervenciju koja ublažava znak ili simptom bolesti ili patološkog stanja nakon što je počela da se razvija. Termin „ublažavanje“, uz pozivanje na bolest ili patološko stanje, odnosi se na bilo koje primetno blagotvorno dejstvo lečenja. Blagotvorni efekat se može dokazati, na primer, odloženim početkom kliničkih simptoma bolesti kod podložnog subjekta, smanjenjem težine nekih ili svih kliničkih simptoma bolesti, sporijim napredovanjem bolesti, poboljšanjem ukupnog zdravlja ili dobrobiti subjekta, ili drugim parametrima dobro poznatim u struci koji su specifični za konkretnu bolest. „Profilaktički“ tretman je tretman koji se daje subjektu koji ne ispoljava znake bolesti ili ispoljava samo rane znake u svrhu smanjenja rizika od razvoja patologije.
Pojam „smanjuje“ je relativan pojam, takav da agens smanjuje odgovor ili stanje, ako je odgovor ili stanje kvantitativno smanjeno nakon primene agensa ili ako je smanjeno nakon primene agensa, u poređenju sa referentnim agensom. Slično tome, termin „sprečava“ ne mora nužno da znači da agens u potpunosti eliminiše odgovor ili stanje, sve dok se eliminiše bar jedna karakteristika odgovora ili stanja. Dakle, imunogena kompozicija koja smanjuje ili sprečava infekciju ili odgovor, kao što je patološki odgovor, npr. virusno oboljenje pojačano vakcinom, može, ali ne mora nužno u potpunosti da eliminiše takvu infekciju ili odgovor, sve dok se infekcija ili odgovor merljivo smanjuje, na primer, za najmanje oko 50%, kao što je najmanje oko 70%, ili oko 80%, ili čak za oko 90% (što je smanjenje na 10% ili manje) infekcije ili odgovora u odsustvu agensa, ili u poređenju sa referentnim agensom.
Izolovana: „Izolovana“ biološka komponenta (kao što je protein, na primer otkriveni PreF antigen ili nukleinska kiselina koja kodira takav antigen) je suštinski odvojena ili prečišćena od drugih bioloških komponenti, kao što su druge biološke komponente u kojima se komponenta prirodno javlja, kao što su druga hromozomska i ekstrahromozomska DNK, RNK i proteini. Proteini, peptidi i nukleinske kiseline koji su „izolovani“ uključuju proteine pročišćene standardnim postupcima prečišćavanja. Termin obuhvata i proteine ili peptide pripremljene rekombinantnom ekspresijom u ćeliji-domaćinu, kao i hemijski sintetizovane molekule proteina, peptida i nukleinskih kiselina. Izolovano ne zahteva apsolutnu čistoću i može da uključuje molekule proteina, peptida ili nukleinske kiseline koji su najmanje 50% izolovani, kao što je najmanje 75%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ili čak 99.9% izolovani. PreF antigeni otkriveni ovde (na primer, izolovani rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji) izolovani su od RSV F proteina u postfuzionoj konformaciji, na primer, najmanje 80% izolovani, najmanje 90%, 95%, 98%, 99% ili čak 99.9% izolovani od RSV F proteina u postfuzionoj konformaciji. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen je suštinski odvojen od RSV F proteina koji ne uključuju antigensko mesto Ø i/ili nisu specifično vezani monoklonskim antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (kao što su D25 ili AM22), na primer, PreF antigen može da bude najmanje 80% izolovan, najmanje 90%, 95%, 98%, 99%, ili čak 99.9% izolovan od RSV F proteina koji ne uključuju antigensko mesto Ø i/ili nisu posebno vezani monoklonskim antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju, kao što je D25 ili AM22.
Kd: Konstanta disocijacije za datu interakciju, kao što je interakcija polipeptid-ligand ili interakcija antitelo-antigen. Na primer, za biomolekulsku interakciju antitela (kao što je D25) i antigena (kao što je RSV F protein), to je koncentracija pojedinačnih komponenti biomolekulske interakcije podeljena koncentracijom kompleksa. Postupci za određivanje Kd interakcije antitelo: antigen poznati su stručnjaku u ovoj oblasti.
Obeleživač: Detektabilno jedinjenje ili kompozicija koja je direktno ili indirektno konjugovana sa drugim molekulom da olakša detekciju tog molekula. Specifični, neograničavajući primeri obeleživača uključuju fluorescentne oznake, enzimske veze i radioaktivne izotope. U nekim primerima, otkriveni PreF antigen je označen detektabilnim obeleživačem. U nekim primerima, obeleživač je vezan za otkriveni antigen ili nukleinsku kiselinu koja kodira takav antigen.
Linker: Bifunkcionalni molekul koji se može koristiti za povezivanje dva ili više molekula u jedan kontinuirani molekul, na primer, za povezivanje molekula nosača sa imunogenim polipeptidom. Neograničeni primeri peptidnih linkera uključuju peptidni linker (G4S)1, (G4S)2, ili (G4S)3.
Termini „konjugovanje“, „spajanje“, „vezivanje“ ili „povezivanje“ mogu da se odnose na pravljenje jednog kontinuiranog molekula od dva molekula; na primer, povezivanje dva polipeptida u jedan kontinuirani polipeptid, ili kovalentno pričvršćivanje molekula nosača ili drugog molekula sa imunogenim polipeptidom, kao što je rekombinantni RSV F protein koji je ovde otkriven. Veza može da bude ostvarena hemijskim ili rekombinantnim sredstvima. „Hemijska sredstva“ se odnose na reakciju, na primer, između imunogenog polipeptidnog fragmenta i molekula nosača, tako da postoji kovalentna veza formirana između dva molekula da bi se formirao jedan molekul.
MPE8: Neutrališuće monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za prefuzionu konformaciju RSV F proteina, ali ne i za postfuzionu konformaciju RSV F proteina. Kao što je opisano u Corti et al. (Nature, 501(7467)439-443, 2013) MPE8 antitelo se vezuje za epitop koji se nalazi u prefuzionoj konformaciji, ali ne i u postfuzionoj konformaciji RSV F proteina. Epitop MPE8 nije deo antigenskog mesta Ø. Sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca su prikazane kao SEQ ID NO: 1472, odnosno 1473.
Nativni antigen ili nativna sekvenca: Antigen ili sekvenca koja nije modifikovana selektivnom mutacijom, na primer, selektivnom mutacijom za fokusiranje antigenosti antigena na ciljnom epitopu. Nativni antigen ili nativna sekvenca se takođe nazivaju antigenom divljeg tipa ili sekvencom divljeg tipa.
Nukleinska kiselina: Polimer sačinjen od nukleotidnih jedinica (ribonukleotidi, dezoksiribonukleotidi, njihove srodne prirodno prisutne strukturne varijante i sintetički neprirodni analozi) povezanih pomoću fosfodiesterskih veza, njihovih srodnih prirodnih strukturnih varijanti i sintetičkih neprirodnih analoga. Prema tome, termin obuhvata nukleotidne polimere u kojima nukleotidi i veze između njih uključuju neprirodne sintetičke analoge, kao što su, na primer, i bez ograničenja, fosforotioati, fosforamidati, metil fosforati, hiral-metil fosforati, 2-O-metil ribonukleotidi, peptidno-nukleinske kiseline (PNA) i slično. Takvi polinukleotidi se mogu sintetizovati, na primer, pomoću automatizovanog sintetizatora DNK. Termin „oligonukleotid“ se obično odnosi na kratke polinukleotide, generalno ne veće od oko 50 nukleotida. Jasno je da kada je nukleotidna sekvenca predstavljena DNK sekvencom (npr. A, T, G, C), to uključuje i RNK sekvencu (npr. A, U, G, C) u kojoj „U“ zamenjuje „T“.
„Nukleotid“ obuhvata, ali bez ograničenja, monomer koji uključuje bazu povezanu sa šećerom, kao što je pirimidin, purin ili njihov sintetički analog, ili bazu povezanu sa aminokiselinom, kao u peptidnoj nukleinskoj kiselini (PNA). Nukleotid je monomer u polinukleotidu. Nukleotidna sekvenca se odnosi na sekvencu baza u polinukleotidu.
Ovde se koristi konvencionalno obeležavanje za opisivanje nukleotidnih sekvenci: levi kraj jednolančane nukleotidne sekvence je 5'-kraj; smer dvolančane nukleotidne sekvence ulevo se naziva 5'-smer. Pravac dodavanja nukleotida od 5’ ka 3’ nascentnih RNK transkripata se naziva smer transkripcije. DNK lanac koji ima istu sekvencu kao iRNK naziva se „kodirajući lanac“; sekvence na DNK lancu koje imaju istu sekvencu kao iRNK transkribovane sa te DNK i koje se nalaze 5' u odnosu na 5'-kraj RNK transkripta nazivaju se „uzvodne sekvence“; sekvence na DNK lancu koje imaju istu sekvencu kao RNK i koje se nalaze 3' u odnosu na 3'-kraj kodirajućeg RNK transkripta nazivaju se „nizvodne sekvence“.
„cDNA“ se odnosi na DNK koji je komplementarna ili identična sa iRNK, u jednolančanom ili dvolančanom obliku.
„Kodiranje“ se odnosi na svojstvo specifičnih sekvenci nukleotida u polinukleotidu, kao što su gen, cDNA ili iRNK, da služe kao matrica za sintezu drugih polimera i makromolekula u biološkim procesima koji imaju definisanu sekvencu nukleotida (na primer rRNK, tRNK i iRNK) ili definisanu sekvencu aminokiselina i biološka svojstava koja iz toga nastaju. Dakle, gen kodira protein ako transkripcija i translacija iRNK nastale od tog gena proizvodi protein u ćeliji ili drugom biološkom sistemu. I kodirajući lanac, čija je nukleotidna sekvenca identična sekvenci iRNK i obično je data u listama sekvenci, i nekodirajući lanac, koji se koristi kao matrica za transkripciju, gena ili cDNA, mogu da budu označeni kao oni koji kodiraju protein ili drugi proizvod tog gena ili cDNA. Osim ako nije drugačije navedeno, „nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu“ uključuje sve nukleotidne sekvence koje su degenerisane verzije jedna druge i koje kodiraju istu aminokiselinsku sekvencu. Nukleotidne sekvence koje kodiraju proteine i RNK mogu da uključuju introne. U nekim primerima, nukleinska kiselina kodira otkriveni PreF antigen. Funkcionalno povezano: Prva sekvenca nukleinske kiseline je funkcionalno povezana sa drugom sekvencom nukleinske kiseline kada je prva sekvenca nukleinske kiseline u funkcionalnom odnosu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promotor je funkcionalno povezan sa kodirajućom sekvencom ako promotor utiče na transkripciju ili ekspresiju kodirajuće sekvence.
Generalno, funkcionalno povezane DNK sekvence su susedne i, kada je potrebno spojiti dva regiona koji kodiraju protein, u istom okviru čitanja.
Prefuziono-specifično antitelo: Antitelo koje se specifično vezuje za RSV F protein u prefuzionoj konformaciji, ali se ne vezuje specifično za RSV F protein u postfuzionoj konformaciji. Primeri prefuziono-specifičnih antitela uključuju antitela D25, AM22, 5C4 i MPE8
Polipeptid: Bilo koji lanac aminokiselina, bez obzira na dužinu ili post-translacionu modifikaciju (kao što je glikozilacija ili fosforilacija). „Polipeptid“ se odnosi na polimere aminokiseline uključujući prirodne polimere aminokiseline i neprirodne polimere aminokiseline, kao i one u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka neprirodna aminokiselina, na primer veštački hemijski mimetik odgovarajuće prirodne aminokiseline. „Ostatak“ se odnosi na aminokiselinu ili mimetik aminokiseline inkorporiran u polipeptid amidnom vezom ili mimetikom amidne veze. Polipeptid ima amino-završetak (N-terminalni deo) i karboksi-završetak (C-terminalni deo). „Polipeptid“ se koristi kao sinonim sa peptidom ili proteinima, i ti pojmovi se ovde koriste naizmenično da bi označili polimer aminokiselinskih ostataka.
Jedan kontinuirani polipeptidni lanac aminokiselinskih ostataka može da uključuje višestruke polipeptide. Na primer, RSV F0 polipeptid uključuje N-terminalni signalni peptid, F2 polipeptid, pep27 polipeptid i F1 polipeptid, koji uključuje ekstracelularni domen, transmembranski domen i citosolni rep F1. Dalje, u nekim primerima izvođenja rekombinantni RSV F protein je jednolančani RSV F protein, koji uključujući RSV F2 polipeptid povezan sa RSV F1 polipeptidom peptidnim linkerom.
U mnogim slučajevima, polipeptid se savija u specifičnu trodimenzionalnu strukturu i može da uključi površinski izložene aminokiselinske ostatke i aminokiselinske ostatke koji nisu površinski izloženi. U nekim slučajevima protein može da sadrži više polipeptida koji se zajedno savijaju u funkcionalnu jedinicu. Na primer, RSV F protein se sastoji od heterodimera F1/F2 koji trimrizuju u multimerni protein.
„Površinski izloženi aminokiselinski ostaci“ su one aminokiseline koje imaju određeni stepen izloženosti na površini proteina, na primer takav da mogu da dođu u kontakt sa rastvaračem kada je protein u rastvoru. su one aminokiseline koje imaju određeni stepen izloženosti na površini proteina, na primer takav da mogu da dođu u kontakt sa rastvaračem kada je protein u rastvoru. U nekim primerima, aminokiselinski ostaci koji nisu površinski izloženi predstavljaju deo proteinskog jezgra.
„Proteinsko jezgro“ je unutrašnjost savijenog proteina, koja suštinski nije izložena rastvaračima, kao što je rastvarač u vidu molekula vode u rastvoru. Tipično, proteinsko jezgro je pretežno sastavljeno od hidrofobnih ili nepolarnih aminokiselina. U nekim primerima, proteinsko jezgro može da sadrži naelektrisane aminokiseline, na primer asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, arginin i/ili lizin. Uključivanje nekompenzovanih naelektrisanih aminokiselina (kompenzovani naelektrisani amino može da bude u obliku mosta u vidu soli) u proteinsko jezgro može da proizvede destabilizovani protein. To jest, protein sa nižom Tm od sličnog proteina bez nekompenzovane naelektrisane aminokiseline u proteinskom jezgru. U drugim primerima, proteinsko jezgro može da ima šupljinu unutar proteinskog jezgra. Šupljine su u suštini praznine unutar presavijenog proteina u kojima nema aminokiselina ili aminokiselinskih bočnih lanaca. Takve šupljine mogu takođe da destabilizuju protein u odnosu na sličan protein bez šupljine. Stoga, prilikom stvaranja stabilizovanog oblika proteina, može da bude korisno supstituisati aminokiselinske ostatke unutar jezgra kako bi se popunile šupljine prisutne u proteinu divljeg tipa. Aminokiseline u peptidu, polipeptidu ili proteinu uglavnom su hemijski povezane putem amidnih veza (CONH). Pored toga, aminokiseline mogu da budu povezane drugim hemijskim vezama. Na primer, veze za aminokiseline ili analoge aminokiselina mogu uključivati CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-- (cis i trans), -COCH2 --, -CH(OH)CH2- i -CHH2SO- (Ove i druge veze mogu da se nađu u Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol.1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci pp.463-468, 1980; Hudson, et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185, 1979; Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249, 1986; Harm J. Chem. Soc Perkin Trans. 1307-314, 1982; Almquist et al. J. Med. Chem.23:1392-1398, 1980; Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533, 1982; Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404, 1983; i Hruby Life Sci 31:189-199, 1982.
Peptidne modifikacije: Peptidi, kao što su otkriveni RSV F proteini stabilizovani u prefuzionoj konformaciji, mogu da se modifikuju, na primer uključivanjem aminokiselinske supstitucije u odnosu na sekvencu nativnog RSV proteina, ili različitim hemijskim tehnikama za proizvodnju derivata koji u suštini imaju istu aktivnost i konformaciju kao i nemodifikovani peptidi, i opciono imaju druga poželjna svojstva. Na primer, grupe karboksilne kiseline proteina, bilo da su karboksiterminalne ili u bočnom lancu, mogu da budu obezbeđene u obliku soli farmaceutski prihvatljivog katjona ili esterifikovane da bi se formirao C1-C16 estar, ili pretvorene u amid formule NR1R2, pri čemu su R1 i R2 svaki nezavisno H ili C1-C16 alkil, ili kombinovane tako da formiraju hetrociklični prsten, kao što je 5- ili 6-člani prsten. Amino grupe peptida, bilo da su amino-terminalne ili u bočnom lancu, mogu da budu u obliku farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli, kao što su HCl, HBr, sirćetna, benzojeva, toluen sulfonska, maleična, vinska i druge organske soli, ili se mogu modifikovati u C1-C16 alkil ili dialkil amino ili dalje pretvoriti u amid.
Hidroksilne grupe peptidnih bočnih lanaca mogu se pretvoriti u C1-C16 alkoksi ili u C1-C16 estar korišćenjem dobro poznatih tehnika. Fenilni i fenolni prstenovi peptidnih bočnih lanaca mogu se zameniti jednim ili većim brojem atoma halogena, kao što su F, Cl, Br ili I, ili sa C1-C16 alkil, C1-C16 alkoksi, karboksilnim kiselinama i njihovim estrima ili amidima takvih karboksilnih kiselina. Metilenske grupe peptidnih bočnih lanaca mogu se produžiti u homologne C2-C4 alkilene. Tioli se mogu zaštititi bilo kojom od dobro poznatih zaštitnih grupa kao što su acetamidne grupe.
Farmaceutski prihvatljivi nosači: Farmaceutski prihvatljivi nosači za upotrebu su konvencionalni. Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, 1995, opisuje kompozicije i formulacije pogodne za farmaceutsku isporuku obelodanjenih imunogena.
Generalno gledano, priroda nosača će zavisiti od konkretnog načina primene koji će se koristiti. Na primer, parenteralne formulacije obično sadrže injekcione tečnosti koje uključuju farmaceutski i fiziološki prihvatljive tečnosti kao što su voda, fiziološki rastvor, uravnoteženi rastvori soli, vodena dekstroza, glicerol ili slično, kao vehikulum. Za čvrste kompozicije (npr. prah, pilule, tablete ili oblike kapsula), konvencionalni netoksični čvrsti nosači mogu uključivati, na primer, manitol, laktozu, skrob ili magnezijum stearat farmaceutske čistoće. Pored biološki neutralnih nosača, farmaceutske kompozicije koje treba primeniti mogu da sadrže manje količine netoksičnih pomoćnih supstanci, kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje, konzervansi i pH puferski agensi i slično, na primer natrijum acetat ili sorbitan monolaurat. U konkretnim primerima izvođenja, nosač pogodan za primenu kod subjekta može da bude sterilan, i/ili suspendovan ili na drugi način sadržan u jediničnom doznom obliku koji sadrži jednu ili više odmerenih doza kompozicije pogodnih za izazivanje željenog imunog odgovora protiv RSV. Može da bude praćen i lekovima za njegovu upotrebu u svrhe lečenja. Jedinični dozni oblik može da bude, na primer, u zatvorenoj bočici sa sterilnim sadržajem ili u špricu za ubrizgavanje subjektu, ili liofilizovan za naknadnu solubilizaciju i primenu, ili u čvrstom obliku, ili obliku sa kontrolisanim oslobađanjem doze.
Primarna vakcinacija-buster vakcinacija: Imunoterapija koja uključuje davanje prve imunogene kompozicije (primarne vakcine), nakon čega sledi primena druge imunogene kompozicije (buster vakcine) kod subjekta da bi se indukovao imunski odgovor. Primarna vakcina i/ili buster vakcina uključuju vektor (kao što je virusni vektor, RNK ili DNK vektor) koji eksprimira antigen na koji je usmeren imunski odgovor. Buster vakcina se daje subjektu nakon primarne vakcine; stručnjak će znati odgovarajući vremenski interval između primene primarne vakcine i buster vakcine, a primeri takvih vremenskih okvira su ovde dati. U nekim primerima izvođenja, primarna vakcina, buster vakcina, ili i primarna vakcina i buster vakcina dodatno uključuju adjuvans. U jednom neograničavajućem primeru, primarna vakcina je vakcina na bazi DNK (ili druga vakcina zasnovana na isporuci gena), a buster vakcina je proteinska podjedinica ili vakcina na bazi proteinske nanočestice.
Proteinska nanočestica: Struktura sa više podjedinica, na bazi proteina, poliedarskog oblika. Svaka od podjedinica je sačinjena od proteina ili polipeptida (na primer glikozilisani polipeptid), i, opciono jednog ili više od sledećeg: nukleinske kiseline, prostetičke grupe, organskih i neorganskih jedinjenja. Neograničavajući primeri proteinskih nanočestica uključuju nanočestice feritina (videti, npr. Zhang, Y. Int. J. Mol. Sci., 12:5406-5421, 2011,), nanočestice inkapsulina (videti, npr. Sutter et al., Nature Struct, and Mol. Biol., 15:939-947, 2008), nanočestice reduktaze sumpor oksigenaze (SOR) (videti, npr. Urich et al., Science, 311:996-1000, 2006), nanočestice lumazin sintaze (videti, npr. Zhang et al., J. Mol. Biol., 306: 1099-1114, 2001) ili nanočestice piruvat dehidrogenaze (videti, npr. Izard et al., PNAS 96: 1240-1245, 1999). Feritin, inkapsulin, SOR, lumazin sintaza i piruvat dehidrogenaza su monomerni proteini koji se sami sklapaju u globularne proteinske komplekse koji se u nekim slučajevima sastoje od 24, 60, 24, 60 i 60 proteinskih podjedinica, respektivno. U nekim primerima, feritin, inkapsulin, SOR, lumazin sintaza ili monomeri piruvat dehidrogenaze su vezani za opisani antigen (na primer, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji) i podležu samosklapanju u proteinsku nanočesticu koja prikazuje ovde otkrivene antigene na svojoj površini, koja može da se primeni kod subjekta za stimulisanje imunskog odgovora na antigen.
Rekombinant: Rekombinantna nukleinska kiselina je ona koja ima sekvencu koja nije prirodna ili ima sekvencu koja se pravi veštačkim kombinovanjem dva inače odvojena segmenta sekvence. Ova veštačka kombinacija može da se dobije hemijskom sintezom ili, češće, veštačkom manipulacijom izolovanim segmentima nukleinskih kiselina, na primer, tehnikama genetskog inženjeringa. Rekombinantni protein je onaj koji ima sekvencu koja se ne pojavljuje u prirodi ili ima sekvencu koja je napravljena veštačkim kombinovanjem dva inače odvojena segmenta sekvence. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni protein je kodiran heterolognom (na primer, rekombinantnom) nukleinskom kiselinom koja je uvedena u ćeliju-domaćina, kao što je bakterijska ili eukariotska ćelija. Nukleinska kiselina se može uvesti, na primer, na ekspresionom vektoru koji ima signale koji mogu da izraze protein kodiran uvedenom nukleinskom kiselinom ili nukleinska kiselina može da bude integrisana u hromozom ćelije-domaćina.
Aminokiselinska supstitucija za prepakivanje: Aminokiselinska supstitucija koja povećava interakcije susednih ostataka u proteinu, na primer, poboljšavanjem hidrofobnih interakcija ili formiranjem vodonične veze, ili smanjenjem nepovoljnih ili odbojnih interakcija susednih ostataka, na primer, uklanjanjem klastera sličnih naelektrisanih ostataka. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska supstitucija za prepakivanje se uvodi da bi se povećale interakcije ostataka koji su susedni u prefuzionoj konformaciji proteina RSV F, a koji nisu u neposrednoj blizini u postfuzionoj konformaciji RSV F. Tipično, uvođenje aminokiselinske supstitucije za prepakivanje će povećati Tm prefuzione konformacije proteina RSV F i smanjiti Tm postfuzione konformacije proteina RSV F.
Respiratorni sincicijalni virus (RSV): Virus sa omotačem sa nesegmentisanom jednolančanom negativnom RNK koji pripada porodici Paramyxoviridae. To je najčešći uzrok bronhiolitisa i upale pluća kod dece u prvoj godini života i inficira skoro svu decu do 3 godine starosti. RSV takođe izaziva ponovljene infekcije, uključujući teške bolesti donjeg respiratornog trakta, koje se mogu pojaviti u bilo kom uzrastu, posebno među starijim osobama ili onima sa kompromitovanim srčanim, plućnim ili imunskim sistemom. U Sjedinjenim Američkim Državama, RSV bronhiolitis je vodeći uzrok hospitalizacije kod novorođenčadi i glavni uzrok astme i hripanja tokom detinjstva (Shay et al., JAMA, 282, 1440 (1999); Hall et al., N. Engl. J. Med., 360, 588 (2009)). Globalno, RSV je odgovoran za 66 000-199 000 smrtnih slučajeva svake godine kod dece mlađe od pet godina (Nair et al., Lancet, 375, 1545 (2010)) i čini 6.7% smrtnih slučajeva među novorođenčadi uzrasta mesec dana do godinu dana - više od bilo kog drugog pojedinačnog patogena osim malarije (Lozano et al., Lancet, 380, 2095 (2013)).
Genom RSV virusa je dužine ~15 000 nukleotida i uključuje 10 gena koji kodiraju 11 proteina, uključujući glikoproteine SH, G i F. F protein posreduje u fuziji, omogućavajući ulazak virusa u ćelijsku citoplazmu i takođe podstiče formiranje sincicijuma. Opisana su dva podtipa humanih sojeva RSV, podtipovi A i B, na osnovu razlika u antigenosti G glikoproteina. Poznati su i RSV sojevi kod drugih vrsta, uključujući goveđi RSV. Stručnjaku su poznati primeri sekvence soja RSV. Dalje, dostupno je nekoliko modela infekcije humanim RSV, uključujući model-organizme zaražene hRSV, kao i model-organizme zaražene RSV specifičnim za vrstu, kao što su upotreba infekcije bRSV kod goveda (videti, npr. Bern etal., AmJ, Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 301: L148-L156, 2011).
Poznato je nekoliko postupaka za dijagnostikovanje RSV infekcije, uključujući upotrebu direktne detekcije fluorescentnog antitela (DFA), hromatografsku brzu detekciju antigena i detekciju virusne RNK korišćenjem RT PCR. Kvantifikacija virusnog opterećenja može se odrediti, na primer, pomoću metode plaka, enzimskog imunoeseja sa adsorpcijom antigena (EIA) ili PCR metode. Kvantifikacija nivoa antitela može se izvesti testom za neutralizaciju specifičnim za podtip ili ELISA testom. Savremeni postupak lečenja RSV obuhvata pasivnu primenu monoklonskog antitela palivizumaba (SYNAGIS®), koji prepoznaje RSV F protein (Johnson et al., J. Infect. Dis., 176, 1215 (1997); Beeler and van Wyke Coelingh, J. Virol., 63, 2941 (1989)) i smanjuje učestalost teških bolesti (The IMpact-RSV Study Group, Pediatrics, 102, 531 (1998)).
(Takođe videti, npr. Nam and Kun (Eds.). Respiratory Syncytial Virus: Prevention, Diagnosis and Treatment. Nova Biomedical Nova Science Publisher, 2011; i Cane (Ed.) Respiratory Syncytial Virus. Elsevier Science, 2007.)
Postoji nekoliko podtipova RSV virusa, uključujući humani podtip A, humani podtip B i goveđi podtip. Unutar podtipova RSV postoje pojedinačni sojevi svakog podtipa. Na primer, SEQ ID NO: 1-128 koje su ovde date uključuju RSV F proteinske sekvence za mnoge sojeve podtipa A RSV, koji (kao što je prikazano u tabeli 3 ispod) su veoma homologni.
RSV fuzioni (F) protein: Glikoprotein omotača RSV koji olakšava fuziju virusnih i ćelijskih membrana. U prirodi, RSV F protein se inicijalno sintetiše kao jedinstveni polipeptidni prekursor dužine približno 574 aminokiseline, označen kao F0. F0 uključuje N-terminalni signalni peptid koji usmerava lokalizaciju u endoplazmatski retikulum, gde se signalni peptid (približno prvih 25 ostataka F0) proteolitički iseca. Preostali ostaci F0 oligomerizuju da formiraju trimer koji je ponovo proteolitički obrađuje ćelijskom proteazom na dve konzervirane konsenzus sekvence za isecanja furinom (približne F0 pozicije 109 i 136; na primer, RARR109 (SEQ ID NO: 124, ostaci 106-109) i RKRR136 (SEQ ID NO: 124, ostaci 133-136) za generisanje dva disulfidno povezana fragmenta, F1 i F2. Manji od ovih fragmenata, F2, potiče iz N-terminalnog dela prekursora F0 i obuhvata približno ostatke 26-109 u F0. Veći od ovih fragmenata, F1, uključuje C-terminalni deo prekursora F0 (približno ostaci 137-574) uključujući ekstracelularni/luminalni region (~ostaci 137-524), transmembranski domen (~ostaci 525-550) i citoplazmatski domen (~ostaci 551-574) na C-terminusu.
Tri F2-F1 protomera oligomerizuju u zreli F protein, koji usvaja metastabilnu „prefuzionu“ konformacije koja podleže konformacionoj promeni (u „postfuzionu“ konformaciju) pri kontaktu sa ciljnom ćelijskom membranom. Ova konformaciona promena izlaže hidrofobnu sekvencu, poznatu kao fuzioni peptid, koji se nalazi na N-terminusu F1 polipeptida, i koji se povezuje sa membranom ćelije-domaćina i promoviše fuziju membrane virusa, ili zaražene ćelije, sa membranom ciljne ćelije.
Identifikovana su brojna neutrališuća antitela koja se specifično vezuju za antigenska mesta na RSV F proteinu. Tu spadaju monoklonska antitela 131-2a i 2F, koja se vezuju za antigensko mesto I (okružuje ostatak P389); monoklonska antitela, palivizumab i motavizmab, koja se vezuju za antigensko mesto II (okružuje ostatak 254-277); i monoklonska antitela 101F i mAb19, koja se vezuju za antigensko mesto IV (okružuje ostatak 429-437).
Jednolančani RSV F protein: Rekombinantni RSV F protein koji se eksprimira kao jedan polipeptidni lanac koji uključuje RSV F1 polipeptid i RSV F2 polipeptid. Jednolančani RSV F protein trimerizuje da bi formirao ektodomen RSV F proteina. Jednolančani RSV F protein ne uključuje mesta cepanja furinom koja oivičavaju polipeptid pep27 RSV F proteina; stoga, kada se proizvodi u ćelijama, polipeptid F0 se ne cepa u odvojene F1 i F2 polipeptide. U nekim primerima izvođenja, jednolančani RSV F protein uključuje deleciju dva mesta cepanja furinom, polipeptid pep27 i fuzioni peptid. U jednom primeru izvođenja, pozicija 103 ili 105 je povezana sa pozicijom 145 RSV proteina za dobijanje jednolančanog konstrukta. U nekim primerima izvođenja, preostali delovi F1 i F2 polipeptida spojeni su linkerom, kao što je peptidni linker.
F0polipeptid RSV (F0): Prekursor RSV F proteina, koji uključuje aminokiseline N-terminalnog signalnog peptida, F2 polipeptida, pep27 polipeptida, i F1 polipeptida, koji uključuje ekstracelularni domen F1, transmembranski domen i citosolni rep. Nativni F0 polipeptid se proteolitički obrađuje na mestu isecanja signalne sekvence, i na dva mesta isecanja furinom (približno pozicije 109 i 136 u F0; na primer, RARR109 (SEQ ID NO: 124, ostaci 106-109) i RKRR136 (SEQ ID NO: 124, ostaci 133-136), čime nastaju fragmenti F1 i F2. Poznati su primeri F0 polipeptida iz mnogih različitih podgrupa RSV, uključujući podgrupe A, B i goveđeg virusa, čiji su primeri ovde predstavljeni kao SEQ ID NO: 1-128, 129-177 i 178-184.
F1polipeptid RSV (F1): Peptidni lanac RSV F proteina. Kao što se ovde koristi, „F1 polipeptid“ se odnosi i na nativne F1 polipeptide i na F1 polipeptide koji uključuju modifikacije (npr. aminokiselinske supstitucije, insercije ili delecije) nativne sekvence, na primer, modifikacije dizajnirane da stabilizuju rekombinantni F protein (uključujući modifikovani F1 polipeptid) u RSV F proteinu u prefuzionoj konformaciji. Nativni F1 obuhvata približno ostatke 137-574 RSV F0 prekursora i uključuje (od N- ka C-terminusu) ekstracelularni/luminalni region (~ostaci 137-524), transmembranski domen (~ostaci 525-550) i citoplazmatski domen (~ostaci 551-574). Nekim primerima izvođenja uključuje F1 polipeptid modifikovan iz nativne F1 sekvence, na primer F1 polipeptid kome nedostaje transmembranski i citosolni domen, i/ili uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje stabilizuju rekombinantni F protein (koji sadrži F1 polipeptid) u prefuzionoj konformaciji. U jednom primeru, otkriveni RSV F protein uključuje F1 polipeptid sa delecijom transmembranskog i citosolnog domena, i cisteinskim supstitucijama na pozicijama 155 i 290. U drugom primeru, opisani RSV F protein uključuje F1 polipeptid sa delecijom transmembranskog i citosolnog domena, cisteinskim supstitucijama na pozicijama 155 i 290, i fenilalaninsku supstituciju na poziciji 190. U još jednom primeru, opisani RSV F protein uključuje F1 polipeptid sa delecijom transmembranskog i citosolnog domena, cisteinskim supstitucijama na pozicijama 155 i 290, fenilalaninsku supstituciju na poziciji 190, i leucinsku supstituciju na poziciji 207. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid sadrži C-terminalnu vezu sa domenom trimerizacije. Poznati su mnogi primeri sekvenci nativnog F1 koje su ovde date kao približne pozicije 137-524 u SEQ ID NO: 1-184.
F2polipeptid RSV (F2): Polipeptidni lanac RSV F proteina. Kao što se ovde koristi, „F2 polipeptid“ se odnosi i na nativne F2 polipeptide i na F2 polipeptide koji uključuju modifikacije (npr. aminokiselinske supstitucije) nativne sekvence, na primer, modifikacije dizajnirane da stabilizuju rekombinantni F protein (uključujući modifikovani F2 polipeptid) u RSV F proteinu u prefuzionoj konformaciji. Nativni F2 obuhvata približno ostatke 26-109 RSV F0 prekursora. U nativnom RSV F proteinu, F2 polipeptid je povezan sa F1 polipeptidom dvema disulfidnim vezama. Poznati su mnogi primeri sekvenci nativnog F2 koje su ovde date kao približne pozicije 26-109 u SEQ ID NO: 1-184.
Polipeptid pep27 RSV (pep27): Polipeptid sa 27 aminokiselina koji se iseca iz prekursora F0 tokom sazrevanja proteina RSV F. Pep27 je oivičen sa dva mesta isecanja furinom koja se isecaju ćelijskom proteazom tokom sazrevanja F proteina da bi se generisao F1 i F2 polipeptid. Poznati su primeri nativnih pep27 sekvenci koji su ovde dati kao pozicije 110-136 u SEQ ID NO: 1-184.
Prefuziona konformacija RSV F proteina: Strukturna konformacija koju zauzima RSV F protein pre aktiviranja fuzogenog događaja koji dovodi do prelaska RSV F u postfuzionu konformaciju i nakon obrade u zreli RSV F protein u sekretornom sistemu. Trodimenzionalna struktura ilustrativnog RSV F proteina u prefuzionoj konformaciji je ovde otkrivena (vidite primer 1) i strukturne koordinate ilustrativnog RSV F proteina u prefuzionoj konformaciji vezanog za antitelo D25 specifično za prefuzionu konformaciju su date u tabeli 1. Kao što je ovde prikazano, prefuziona konformacija RSV F je slična po opštoj strukturi prefuzionoj konformaciji drugih paramiksovirusa (kao što je PIV, videti SL.7), iako sa nekim značajnim razlikama. U prefuzionom stanju, RSV F protein uključuje antigensko mesto na vrhu distalno u odnosu na membranu („antigensko mesto Ø“, videti primer 1), koji uključuje RSV F ostatke 62-69 i 196-209, a takođe uključuje i epitope antitela D25 i AM22. Kao što se ovde koristi, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji može da bude specifično vezan antitelom koje je specifično za prefuzionu konformaciju RSV F proteina, kao što je antitelo koje se specifično vezuje za epitop unutar antigenskog mesta Ø, na primer, antitela D25 ili AM22. Dodatna prefuziona specifična antitela uključuju antitela 5C4 i MPE8.
Postfuziona konformacija RSV F proteina: Strukturna konformacija koju zauzima RSV F protein koja nije prefuziona konformacija, i u kojoj su N- i C-termini RSV F proteina proksimalni u stabilnoj strukturi upredene zavojnice. Postfuziona konformacija RSV F proteina opisana je na atomskom nivou (videti, npr. McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011; Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619, 2011; i strukturne koordinate su deponovane u PDB pristupni br.
3RRR). Postfuziona konformacija RSV F proteina je slična onoj poznatoj kod drugih paramiksovirusnih glikoproteina, uključujući protein PIV5 F. U postfuzionoj konformaciji, RSV F protein ne uključuje antigensko mesto Ø, te stoga ne uključuje D25 epitop i ne vezuje se specifično za D25 ili AM22. Postfuziona konformacija RSV se javlja, na primer, nakon fuzije F proteina sa ćelijskom membranom. Sekvenca RSV F proteina koji se, kada se eksprimira, može da se savije u postfuzionu konformaciju, data je kao SEQ ID NO: 1469.
Površinski modifikovani antigen ili površinski modifikovani imunogen: Polipeptidni imunogen koji potiče iz antigena divljeg tipa u kojem su aminokiselinski ostaci izvan, ili eksterno u odnosu na ciljni epitop, mutirani na sistematski način da bi se imunogenost antigena fokusirala na izabrani ciljni epitop. U nekim primerima, površinski modifikovani antigen se naziva imunogen skrivenog antigena ili antigen skrivenog antigena.
Srednje kvadratno odstupanje (RMSD): Kvadratni koren aritmetičke sredine kvadrata odstupanja od srednje vrednosti. U nekim primerima izvođenja, RMSD se koristi kao način izražavanja odstupanja ili varijacije od strukturnih koordinata referentne trodimenzionalne strukture. Ovaj broj se obično izračunava nakon optimalne superpozicije dve strukture, kao kvadratni koren srednje kvadratne udaljenosti između ekvivalentnih Cα atoma. U nekim primerima izvođenja, referentna trodimenzionalna struktura uključuje strukturne koordinate RSV F proteina vezanog za monoklonsko antitelo D25, koje je ovde dato u tabeli 1.
Identičnost/sličnost sekvence: Identičnost/sličnost između dve ili više sekvenci nukleinske kiseline, ili dve ili više aminokiselinskih sekvenci, izražava se u smislu identičnosti ili sličnosti između sekvenci. Identičnost sekvenci se može meriti u smislu procentualne identičnosti; što je veći procenat, to su sekvence identičnije. Homolozi ili ortolozi sekvence nukleinske kiseline ili aminokiselinske sekvence poseduju relativno visok stepen identičnosti/sličnosti sekvence kada su poravnati pomoću standardnih metoda.
Metode poravnanja sekvenci u cilju poređenja su dobro poznate u tehnici. Razni programi i algoritmi za poravnanje su opisani u: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; i Pearson et al., Meth. Mol. Bio.24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990, koji daju detaljno razmatranje metoda poravnanja sekvenci i proračuna homologije.
Kada se sekvence poravnaju, broj podudaranja se određuje brojanjem pozicija na kojima je identičan nukleotid ili aminokiselinski ostatak prisutan u obe sekvence. Procenat identičnosti sekvence određuje se tako što se broj podudaranja podeli dužinom sekvence u identifikovanoj sekvenci, ili dobro definisanom dužinom (kao što je 100 uzastopnih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka iz sekvence navedene u identifikovanoj sekvenci), nakon čega se dobijena vrednost množi sa 100. Na primer, peptidna sekvenca koja ima 1166 podudaranja kada je poravnata sa ispitivanom sekvencom koja ima 1554 aminokiseline je 75.0 procenata identična ispitivanoj sekvenci (1166÷1554*100=75.0). Vrednost procenta identičnosti sekvence zaokružuje se na najbližu desetinu. Na primer 75.11, 75.12, 75.13 i 75.14 zaokružuju se na 75.1, dok se 75.15, 75.16, 75.17, 75.18 i 75.19 zaokružuju na 75.2. Vrednost dužine će uvek biti ceo broj.
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol.215:403, 1990) je dostupan iz nekoliko izvora, uključujući i Nacionalni centar za biotehnološke informacije (NCBI, Bethesda, MD) i na internetu, za upotrebu sa programima za analizu sekvenci blastp, blastn, blastx, tblastn i tblastx. Opis načina za određivanje identičnosti sekvence pomoću ovog programa dostupan je na internet stranici NCBI.
Homologe i varijante polipeptida obično karakteriše posedovanje najmanje oko 75%, na primer najmanje oko 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence izračunato iz poravnanja cele dužine sa aminokiselinskom sekvencom od interesa. Proteini sa još većom sličnošću sa referentnim sekvencama pokazaće povećanje procenta identičnosti kada se procene ovom metodom, kao što je najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence. Kada se uporedi manje od cele sekvence da bi se odredila identičnost sekvenci, homolozi i varijante će obično imati najmanje 80% identičnosti sekvence u kratkom prozoru poređenja od 10-20 aminokiselina, i mogu da imaju identičnost sekvence najmanje 85% ili najmanje 90% ili 95% u zavisnosti od njihove sličnosti sa referentnom sekvencom. Metode za određivanje identičnosti sekvenci u ovako kratkim prozorima poređenja dostupne su na internet stranici NCBI. Stručnjak u ovoj oblasti će shvatiti da su ovi rasponi identičnosti sekvence dati samo kao smernice; sasvim je moguće da se mogu dobiti striktno značajni homolozi koji nisu unutar predviđenih opsega.
Da bi se uporedile sekvence nukleinske kiseline, obično jedna sekvenca ima ulogu referentne sekvence sa kojom se upoređuju ispitivane sekvence. Kada se koristi algoritam za poređenje sekvenci, ispitivane i referentne sekvence se unose u računar, po potrebi se naznačuju koordinate podsekvenci i specificiraju se parametri programa algoritma za poređenje sekvenci. Koriste se podrazumevani parametri programa. Metode za poravnanje sekvenci za poređenje su dobro poznate u tehnici. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može se izvesti, npr. korišćenjem algoritma lokalne homologije Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, algoritma homologije poravnanja Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.48:443, 1970, metodom pretraživanja sličnosti Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, korišćenjem kompjuterske implementacije ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u softverskom paketu Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ili korišćenjem ručnog poravnanja i vizuelne inspekcije (videti, npr. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4<th>ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012) i Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, through supplement 104, 2013). Jedan primer odgovarajućeg algoritma je PILEUP. PILEUP koristi pojednostavljenje metode progresivnog poravnanja Feng & Doolittle, J. Mol. Evol.35:351-360, 1987. Metoda koja se koristi je slična metodi opisanoj od strane Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989. Primenom PILEUP, referentna sekvenca se upoređuje sa drugim ispitivanim sekvencama da bi se odredio odnos procenta identičnosti sekvence korišćenjem sledećih parametara: podrazumevana težina za prazninu (3.00), podrazumevana težina za dužinu praznine (0.10) i ponderisane praznine na krajevima. PILEUP može da se dobije iz softverskog paketa za analizu sekvence GCG, npr. verzija 7.0 (Devereaux et al., Nuc. Acids Res.12:387-395, 1984.
Drugi primer algoritama pogodnih za određivanje procenata identičnosti i sličnosti sekvence su BLAST i algoritam BLAST 2.0, koji su opisani u Altschul et al., J. Mol. Biol.215:403-410, 1990 i Altschul et al., Nucleic Acids Res.25:3389-3402, 1977. Softver za izvođenje BLAST analiza je javno dostupan preko Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (ncbi.nlm.nih.gov). Program BLASTN (za nukleotidne sekvence) koristi kao podrazumevane vrednost dužinu reči (W) od 11, poravnanja (B) od 50, očekivanje (E) od 10, M=5, N=-4 i poređenje oba lanca. Program BLASTP (za sekvence aminokiselina) koristi kao podrazumevane vrednosti dužinu reči (W) od 3, i očekivanje (E) od 10 i BLOSUM62 matricu za ocenjivanje (videti Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989). Oligonukleotid je linearna polinukleotidna sekvenca dužine do oko 100 nukleotidnih baza.
Još jedan pokazatelj sličnosti sekvence između dve nukleinske kiseline je sposobnost hibridizacije. Što su dve sekvence nukleinske kiseline sličnije, to su stroži uslovi u kojima će hibridizovati. Strogost uslova hibridizacije zavisi od sekvence i razlikuje se pod različitim parametrima okoline. Tako će uslovi hibridizacije koji rezultuju određenim stepenom strogosti varirati u zavisnosti od prirode izabrane metode hibridizacije i kompozicije i dužine hibridnih sekvenci nukleinske kiseline. Uopšteno, temperatura hibridizacije i jonska jačina (posebno koncentracija Na<+>i/ili Mg<++>) hibridizacionog pufera će odrediti strogost hibridizacije, dok vremena pranja takođe utiču na strogost. Generalno, strogi uslovi se biraju tako da budu oko 5 °C do 20 °C ispod tačke termičkog topljenja (Tm) za specifične sekvence na definisanoj jonskoj jačini i pH. Tm je temperatura (pri definisanoj jonskoj jačini i pH) pri kojoj 50% ciljne sekvence hibridizuje sa savršeno podudarnom probom. Uslovi za hibridizaciju nukleinske kiseline i izračunavanje strogosti mogu se naći, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993; i Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4<th>ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999.
Kao što se ovde koristi, pozivanje na „najmanje 80% identičnosti“ se odnosi na „najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili čak 100% identičnosti“ sa navedenom referentnom sekvencom.
Signalni peptid: Kratka aminokiselinska sekvenca (npr. dužine približno 18-25 aminokiselina) koja usmerava novosintetizovane sekretorne ili membranske proteine do i kroz membrane (na primer, membranu endoplazmatičnog retikuluma). Signalni peptidi se obično nalaze na N-terminusu polipeptida i uklanjaju se signalnim peptidazama nakon što polipeptid prođe kroz membranu. Sekvence signalnih peptida obično sadrže tri zajedničke strukturne karakteristike: N-terminalni polarni bazni region (n-region), hidrofobno jezgro i hidrofilni c-region). Primeri sekvenci signalnih peptida su dati kao ostaci 1-25 u SEQ ID NO: 1-182 (signalni peptidi RSV F proteina iz A, B i goveđeg RSV).
Specifično vezuje: Kada se odnosi na formiranje kompleksa antitelo:antigeni protein, odnosi se na reakciju vezivanja koja određuje prisustvo ciljnog proteina, peptida ili polisaharida (na primer glikoproteina), u prisustvu heterogene populacije proteina i drugih bioloških molekula. Tako, pod određenim uslovima, antitelo se preferencijalno vezuje za određeni ciljni protein, peptid ili polisaharid (kao što je antigen prisutan na površini patogena, na primer RSV F) i ne vezuje se u značajnoj količini za druge proteine ili polisaharide prisutne u uzorku ili subjektu. Antitelo koje se specifično vezuje za prefuzionu konformaciju RSV F proteina (npr. i antitelo koje se specifično vezuje za antigensko mesto Ø) ne vezuje se specifično za postfuzionu konformaciju RSV F proteina. Specifično vezivanje može da se odredi postupcima poznatim u struci. U odnosu na kompleks antitelo:antigen ili Fab:antigen, specifično vezivanje antigena i antitela ima Kd (ili prividnu Kd) manju od oko 10<-6>M, kao što je manje od oko 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>, ili čak manje od oko 10<-10>M.
Rastvorljivi protein: Protein koji može da se rastvori u vodenoj tečnosti na sobnoj temperaturi i ostaje rastvoren Rastvorljivost proteina može da se menja u zavisnosti od koncentracije proteina u tečnosti na bazi vode, puferskog stanja tečnosti, koncentracije drugih rastvorenih supstanci u tečnosti, na primer koncentracije soli i proteina i toplote tečnosti. U nekim primerima izvođenja, rastvorljivi protein je onaj koji se rastvara do koncentracije najmanje 0.5 mg/ml u fosfatno puferisanom fiziološkom rastvoru (pH 7.4) na sobnoj temperaturi i ostaje rastvoren najmanje 48 sati.
Terapeutski agens: Hemijsko jedinjenje, mali molekul, ili druga kompozicija, kao što je molekul nukleinske kiseline, sposoban da indukuje željeni terapeutski ili profilaktički efekat kada se pravilno primenjuje kod subjekta.
Terapeutski efikasna količina efikasne količine: Količina agensa, kao što je otkriveni antigen ili imunogena kompozicija koja sadrži otkriveni antigen, koja je dovoljna za sprečavanje, lečenje (uključujući profilaksu), smanjenje i/ili ublažavanje simptoma i/ili osnovnih uzroka bilo kojeg poremećaja ili bolesti, na primer za sprečavanje, inhibiciju i/ili lečenje RSV infekcije. U nekim primerima izvođenja, terapeutski efikasna količina je dovoljna da smanji ili eliminiše simptom bolesti, kao što je RSV infekcija. Na primer, ovo može da bude količina neophodna za inhibiciju virusne replikacije ili za merljivo menjanje spoljašnjih simptoma virusne infekcije. U principu, ova količina će biti dovoljna da merljivo inhibira replikaciju ili infektivnost virusa (na primer, RSV). Kada se primenjuje kod subjekta, uopšteno će se koristiti doza koja će dostići koncentracije u ciljnom tkivu za koje je pokazano da postižu in vitro inhibiciju replikacije virusa. Podrazumeva se da za dobijanje zaštitnog imunskog odgovora protiv patogena može da bude potreban veći broj primena imunogene kompozicije. Tako, terapeutski efikasna količina obuhvata frakcionu dozu koja, u kombinaciji sa prethodnim ili narednim primenama, doprinosi postizanju zaštitnog imunskog odgovora.
Transmembranski domen: Aminokiselinska sekvenca koja se umeće u lipidni dvosloj, kao što je lipidni sloj ćelije ili virusa ili čestice slične virusu. Transmembranski domen može da se koristi za učvršćivanje antigena u membranu. U nekim primerima transmembranski domen je transmembranski domen RSV F proteina. Primeri transmembranskih domena RSV F su poznati stručnjaku u ovoj oblasti, i ovde su dati. Na primer, aminokiselinske sekvence ilustrativnih transmembranskih domena RSV F date su kao približne pozicije 525-550 u SEQ ID NO: 1-183.
Transformisana: Transformisana ćelija je ćelija u koju je molekul nukleinske kiseline uveden tehnikama molekularne biologije. Kao što se ovde koristi, termin transformacija obuhvata sve tehnike pomoću kojih se molekul nukleinske kiseline može uvesti u takvu ćeliju, uključujući transfekciju virusnim vektorima, transformaciju plazmidnim vektorima i uvođenje DNK elektroporacijom, lipofekcijom i korišćenjem pištolja za čestice.
Vakcina: Farmaceutska kompozicija koja izaziva profilaktički ili terapeutski imunski odgovor kod subjekta. U nekim slučajevima, imunski odgovor je zaštitni imunski odgovor. Tipično, vakcina izaziva imunski odgovor specifičan za antigen patogena, na primer virusni patogen ili ćelijski sastojak povezan sa patološkim stanjem. Vakcina može uključivati polinukleotid (kao što je nukleinska kiselina koja kodira otkriveni antigen), peptid ili polipeptid (kao što je otkriveni antigen), virus, ćeliju ili jedan ili više ćelijskih sastojaka.
Vektor: Molekul nukleinske kiseline kakav je uveden u ćeliju-domaćina, stvarajući time transformisanu ćeliju-domaćina. Rekombinantni DNK vektori imaju rekombinantnu DNK. Vektor može da sadrži sekvence nukleinske kiseline koje mu omogućavaju da se replicira u ćelijidomaćinu, kao što je mesto početka replikacije. Vektor takođe može da uključuje jedan ili više selektabilnih gena markera i drugih genetskih elemenata poznatih u struci. Virusni vektori su rekombinantni DNK vektori koji imaju bar neke sekvence nukleinske kiseline poreklom iz jednog ili više virusa.
Replikativno deficijentni virusni vektori koji zahteva komplementaciju jednog ili više regiona virusnog genoma potrebnog za replikaciju, kao rezultat, na primer, nedostatka najmanje jedne genske funkcije esencijalne za replikaciju. Na primer, tako da se virusni vektor ne replicira u tipičnim ćelijama-domaćinima, posebno onim u humanom pacijentu koje mogu da budu inficirane virusnim vektorom tokom terapeutskog postupka. Primeri replikativno deficijentnih virusnih vektora i sistema za njihovu upotrebu poznati su u struci i uključuju; na primer, replikativno deficijentne LCMV vektore (videti, npr. SAD pat. obj. br. 2010/0297172) i replikativno deficijentne adenovirusne vektore (videti, npr. obj. PCT prij. br. W02000/00628).
Virus: Virus se u suštini sastoji od jezgra od nukleinske kiseline okruženog proteinskim omotačem i ima sposobnost da se replicira samo unutar žive ćelije. „Virusna replikacija“ je proizvodnja dodatnog virusa kroz najmanje jedan životni ciklus virusa. Virus može da poremeti normalne funkcije ćelija domaćina, prisiljavajući ćeliju da se ponaša na način koji određuje virus. Na primer, virusna infekcija može prouzrokovati da ćelija proizvodi citokin ili reaguje na citokin, dok neinficirana ćelija to obično ne čini. U nekim primerima, virus je patogen.
Čestica slična virusu (VLP): Virusni omotač koji se ne replicira i potiče iz bilo kog od nekoliko virusa. VLP se obično sastoje od jednog ili više virusnih proteina, poput, ali bez ograničenja, proteine označene kao proteini kapsida, omotača, ljuske, površinski proteini i/ili proteini ovojnice, ili polipeptida koji formiraju čestice poreklom od ovih proteina. VLP mogu spontano da se formiraju nakon rekombinantne ekspresije proteina u odgovarajućem ekspresionom sistemu. Postupci za proizvodnju određenih VLP su poznati u struci. Prisustvo VLP posle rekombinantne ekspresije virusnih proteina može da se detektuje korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih u struci, kao što je elektronska mikroskopija, biofizička karakterizacija, i slično. Dalje, VLP se mogu izolovati poznatim tehnikama, npr. centrifugiranjem na gradijentu gustine i identifikovati taloženjem u karakterističnom opsegu gustine. Videti, na primer, Baker et al. (1991) Biophys. J.
60:1445-1456; i Hagensee et al. (1994) J. Virol. 68:4503-4505; Vincente, J Invertebr Pathol., 2011; Schneider-Ohrum and Ross, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 354: 53073, 2012).
II. Opis nekih primera izvođenja
Ovde je otkriveno da protein RSV F podleže dramatičnom strukturnom preuređenju na prelazu između svoje pre- i postfuzione konformacije (videti primer 1, ispod). Kao što je prikazano na SL.
2B, N-terminalni region F1 polipeptida u prefuzionoj konformaciji (delimično odgovara režnju distalno u odnosu na membranu prikazanom na SL.2A) uključuje naznačene α2, α3, β3, β4 i α4 helikse i strukture beta naborane ploče, dok odgovarajući region N-terminusa F1 polipeptida u postfuzionoj strukturi uključuje proširenu α5 heliksnu strukturu. Dalje, C-terminalni region F1 polipeptida u prefuzionoj konformaciji (delimično odgovara režnju proksimalno u odnosu na membranu prikazanom na SL. 2A) uključuje naznačene β22, α9 i β23 strukture beta naborane ploče i heliksa, dok odgovarajući C-terminalni region F1 polipeptida u strukturi postfuzione konformacije uključuje proširenu α10 heliksnu strukturu. Tako, režnjevi proteina RSV F distalno u odnosu na membranu i proksimalno u odnosu na membranu u svojoj prefuzionoj konformaciji uključuju nekoliko različitih strukturnih elemenata koji nisu prisutni u odgovarajućim regionima RSV F proteina u njegovoj postfuzionoj konformaciji. Aminokiselinske pozicije (i sekvence) koje odgovaraju ovim regionima istaknute su sivom bojom na SL. 2, uključujući pozicije 137-216 i 461-513 F1 polipeptida.
Dati su antigeni RSV F proteina koji su stabilizovani ili „zaključani“ u prefuzionoj konformaciji, pod nazivom „PreF antigeni“. Korišćenjem dizajna usmerenog strukturom, pozicije RSV F1 i F2 polipeptida su tako određene za modifikaciju (npr. aminokiselinsku supstituciju) da se ometa ili sprečava prelazak RSV F proteina iz pre- u postfuzionu konformaciju. Takvi antigeni su korisni, na primer, kao imunogeni u izazivanju neutrališućeg odgovora na RSV F protein.
A. Nativni RSV F proteini
Poznati su nativni RSV F proteini iz različitih RSV grupa, kao i sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju takve proteine i postupci. Na primer, sekvenca nekoliko prekursora RSV proteina F0 podtipa A, B i goveđeg podtipa, data kao SEQ ID NO: 1-184. Identifikator Geninfo (gi) i odgovarajući pristupni broj za svaku od ovih sekvenci, kao i odgovarajuća RSV grupa, prikazani su u tabeli 3:
Tabela 3. Primer proteinskih sekvenci podtipa A, B i goveđeg podtipa RSV F
Protein RSV F pokazuje izuzetnu očuvanost sekvenci među podtipovima RSV (videti tabelu 3, koja pokazuje prosečnu identičnost sekvence u parovima u podtipovima i F proteinskim segmentima). Na primer, A i B podtip RSV dele 90% identičnosti sekvence, a svaki od A i B podtipa RSV deli 81% identičnosti sekvence sa bRSV F proteinom, u molekulu prekursora F0. Unutar RSV podtipova identičnost sekvence F0 je još veća; na primer, u svakom od A, B i goveđeg podtipa RSV, prekursorski protein RSV F0 ima ~98% identičnosti sekvence. Skoro svi identifikovani prekursorski proteini RSV F0 dugački su približno 574 aminokiseline, sa manjim razlikama u dužini obično zbog dužine C-terminalnog citoplazmatskog repa. Identičnost sekvence u RSV F proteinima ilustrovana je u tabeli 4:
Tabela 4. Identičnost sekvence RSV F proteina
S obzirom na očuvanost sekvenci RSV F, stručnjak u ovoj oblasti može lako da uporedi pozicije aminokiselina između sekvenci različitih nativnih RSV F, da bi identifikovao odgovarajuće pozicije aminokiselina RSV F među različitim sojevima i podtipovima RSV. Na primer, u skoro svim identifikovanim prekursorskim proteinima RSV F0, mesta isecanja furinom nalaze se na istim pozicijama aminokiselina. Stoga, očuvanost sekvenci RSV F proteina kroz sojeve i podtipove omogućava upotrebu referentne sekvence RSV F za poređenje aminokiselina na određenim pozicijama u RSV F proteinu. Za potrebe ovog otkrića (osim ako kontekst ne ukazuje na suprotno), pozicije aminokiselina RSV F proteina date su u odnosu na referentni polipeptid prekursorskog proteina F0 dat kao SEQ ID NO: 124 (odgovara GENBANK® pristupni br. P03420, kako je dato u GENBANK® 28. februara 2013).
B. PreF antigeni
Ovde su otkriveni izolovani antigeni koji uključuju rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji („PreF antigeni“) supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L (u poređenju sa nativnim RSV F proteinom koji je dat kao jedna od SEQ ID NO: 1-184). PreF antigeni sadrže rekombinantni RSV F protein ili njegov fragment koji je modifikovan u odnosu na nativni oblik da bi mu se povećala imunogenost. Na primer, otkriveni rekombinantni RSV F proteini su modifikovani iz nativne RSV sekvence da bi bili stabilizovani u prefuzionoj konformaciji. Stručnjak u ovoj oblasti će znati da su otkriveni PreF antigeni korisni za izazivanje imunogenih odgovora kod kičmenjaka (kao što su sisari, na primer, ljudi i goveda) na RSV (na primer RSV A, RSV B ili goveđi RSV). Tako su u nekim primerima izvođenja otkriveni antigeni imunogeni. Antitelo D25 prepoznaje kvaternarni epitop koji uključuje višestruke protomere RSV F proteina. Ovaj epitop se nalazi u okviru antigenskog mesta („antigensko mesto Ø“) koji se nalazi na vrhu RSV F glikoproteina distalno u odnosu na membranu (videti npr. SL.1C), kada je u prefuzionoj konformaciji. Dok sekundarni strukturni elementi ovog epitopa ostaju uglavnom nepromenjeni između pre- i postfuzione konformacije F, njihova relativna orijentacija se značajno menja, sa α4-helisom koji se rotira ~180° u odnosu na lanac β2 u pre- i postfuzionoj konformaciji (videti, npr. SL. 3B). Konformacione promene u strukturi proteina RSV F između pre- i postfuzione konformacije određuju prisustvo epitopa D25 na RSV F proteinu. Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen, uključujući rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, može se identifikovati određivanjem specifičnog vezivanja monoklonskog antitela D25 za antigen. Stručnjak u ovoj oblasti će znati da druga antitela koja se specifično vezuju za antigensko mesto Ø iz RSV F proteina (kao što je antitelo AM22 ili antitelo 5C4), ili druga antitela koja su specifična za prefuzionu konformaciju, ali ne vezuju antigensko mesto Ø (kao što je MPE8) takođe mogu da se koriste za identifikaciju PreF antigena uključujući RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji.
Dakle, PreF antigeni otkriveni ovde su specifično vezani antitelom koje je specifično za prefuzionu konformaciju RSV F, ali ne i za postfuzionu konformaciju. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen je specifično vezan antitelima D25 i/ili AM22, koja su (kako je ovde otkriveno) antitela specifična za pre- ali ne i za postfuzionu konformaciju RSV F proteina. U nekim primerima, antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (kao što je D25 ili AM22) specifično se vezuje za PreF antigen sa konstantnom disocijacijom manjom od oko 10<-6>M, kao što je manje od oko 10<-7>M, 10<-8>M ili manje od 10<-9>M. Specifično vezivanje može se odrediti metodama poznatim u struci. Određivanje specifičnog vezivanja može se lako izvršiti korišćenjem ili prilagođavanjem rutinskih procedura, kao što su ELISA, imunokompeticija, rezonanca površinskog plazmona ili drugi imunosorbentni testovi (opisani u mnogim standardnim tekstovima, uključujući Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999).
U daljim primerima izvođenja, PreF antigen nije specifično vezan antitelom koje vezuje postfuzionu konformaciju RSV F proteina. Na primer, antitelo specifično po snopu sa šest heliksa nađeno samo u postfuzionoj konformaciji RSV F proteina (npr. kao što je opisano u Magro et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. U.S.A., 109:3089-3094, 2012). U nekim primerima, konstanta disocijacije vezivanja antitela specifičnog za postfuzionu konformaciju RSV F za PreF antigen je veća od 10-
<5>M, kao što je najmanje 10<-5>M, 10<-4>M, ili 10<-3>.
U nekim primerima izvođenja, bilo koji od PreF antigena uključuje prefuzioni epitop RSV F proteina (kao što je epitop D25 ili AM22) u konformaciji vezanoj za antitelo specifično za prefuzioni RSV F protein (kao što je konformacija vezana za D25 ili AM22). Na primer, u nekim primerima izvođenja, bilo koji od PreF antigena uključuje epitop u konformaciji vezanoj za D25 ili AM22 (npr. konformacija definisana strukturnim koordinatama navedenim u tabeli 1) kada PreF antigen nije vezan za D25 ili AM22, to jest, PreF antigen se stabilizuje u konformaciji vezanoj za D25 ili AM22. Postupci za određivanja da li otkriveni antigen PreF uključuje epitop prefuzionog RSV F proteina (kao što je epitop D25 ili AM22) u konformaciji vezanoj za monoklonsko antitelo specifično za prefuzioni RSV F protein (kao što je konformacija vezana za D25 ili AM22) poznati su stručnjaku u ovoj oblasti i dodatno su ovde opisani (videti, na primer, McLellan et al., Nature, 480:336-343, 2011; i SAD objavi prijave patenta br. 2010/0068217). Na primer, otkrivena trodimenzionalna struktura Fab fragmenta D25 u kompleksu sa RSV F proteinom može da se uporedi sa trodimenzionalnom strukturom bilo kog od otkrivenih PreF antigena
Stručnjak u ovoj oblasti će znati da otkriveni PreF antigen može da sadrži epitop u konformaciji vezanoj za monoklonsko antitelo specifično za prefuzionu konformaciju, iako strukturne koordinate antigena nisu strogo identične onima kod prefuzionog proteina kao što je ovde navedeno. Na primer, u nekim primerima izvođenja, bilo koji od otkrivenih PreF antigena uključuje epitop specifičan za prefuzioni RSV F (kao što je epitop D25 ili AM22) koji u odsustvu monoklonskog antitela specifičnog za prefuzioni RSV F može da bude strukturno kompatibilan sa odgovarajućim epitopom u kompleksu sa monoklonskim antitelom specifičnim za prefuzioni RSV F sa srednjim kvadratnom odstupanjem (RMSD) njihovih koordinata manje od 1.0, 0.75, 0.5, 0.45, 0.4, 0.35, 0.3 ili 0.25 Å/ostatku, pri čemu se RMSD meri preko atoma polipeptidnog osnovnog lanca N, Cα, C, O za najmanje tri uzastopne aminokiseline.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen je rastvorljiv u vodenom rastvoru. Na primer, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen je rastvorljiv u rastvoru koji nema deterdžent. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen se rastvara do koncentracije od najmanje 0.5 mg/ml (kao što je najmanje 1.0 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2.0 mg/ml, 3.0 mg/ml, 4.0 mg/ml ili najmanje 5.0 mg/ml) u fosfatno puferisanom fiziološkom rastvoru (pH 7.4) na sobnoj temperaturi (npr. 20-22 stepeni Celzijusa) i ostaje rastvoren najmanje 12 sati (kao što je najmanje 24 sata, najmanje 48 sati, najmanje nedelju dana, najmanje dve nedelje, ili više vremena). U jednom primeru izvođenja, fosfatno puferisani fiziološki rastvor uključuje NaCl (137 mM), KCl (2.7 mM), Na2HPO4 (10 mM), KH2PO4 (1.8 mM) na pH 7.4. U nekim primerima izvođenja, fosfatno puferisani fiziološki rastvor dalje uključuje CaCl2 (1 mM) i MgCl2 (0.5 mM). Stručnjak u ovoj oblasti je upoznat sa postupcima za utvrđivanje da li protein ostaje u rastvoru tokom vremena. Na primer, koncentracija proteina rastvorenog u vodenom rastvoru može da se ispita tokom vremena korišćenjem standardnih metoda.
U nekim primerima izvođenja, bilo koji od otkrivenih PreF antigena može se koristiti za izazivanje imunskog odgovora na RSV u subjektu. U nekoliko takvih primera izvođenja, indukcija imunog odgovora uključuje proizvodnju neutrališućih antitela na RSV. Postupci za ispitivanje neutrališuće aktivnosti poznati su stručnjaku u ovoj oblasti i dodatno ovde opisani, i uključuju, ali nisu ograničeni na testove neutralizacije obrazovanja plaka (PRNT), testove mikroneutralizacije (videti npr. Anderson et al., J. Clin. Microbiol., 22: 1050-1052, 1985), ili testove na bazi protočne citometrije (videti, npr. Chen et al., J. Immunol. Methods., 362:180-184, 2010). Dodatni testovi neutralizacije opisani su ovde, i poznati stručnjaku u ovoj oblasti.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein koji, kada se rastvori u vodenom rastvoru, formira populaciju rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji. Vodeni rastvor može da bude, na primer, fosfatno puferisani slani rastvor na fiziološkom pH, kao što je pH 7.4. U nekim primerima izvođenja, populacija je homogena populacija koja uključuje jedan ili više rekombinantnih RSV F proteina koji su, na primer, svi stabilizovani u prefuzionoj konformaciji. U nekim primerima izvođenja, najmanje oko 90% rekombinantnih RSV F proteina (kao što je najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 99.9% RSV F proteina) u homogenoj populaciji se stabilizuju u prefuzionoj konformaciji. U nekim primerima izvođenja, najmanje oko 90% rekombinantnih RSV F proteina (kao što je najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 99.9% RSV F proteina) u homogenoj populaciji su specifično vezani antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuju specifičnu prefuzionu konformaciju RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Jasno je da homogena populacija RSV F proteina u određenoj konformaciji može uključivati varijacije (kao što su varijacije modifikacije proteina, npr. glikozilaciono stanje), koje ne menjaju konformaciono stanje RSV F proteina. U nekim primerima izvođenja, populacija rekombinantnog RSV F proteina ostaje homogena tokom vremena. Na primer, PreF antigen može da sadrži rekombinantni RSV F protein koji, kada se rastvori u vodenom rastvoru, formira populaciju rekombinantnih RSV F proteina koji se stabilizuju u prefuzionoj konformaciji na najmanje 12 sati, kao što je najmanje 24 sata, najmanje 48 sati, najmanje nedelju dana, najmanje dve nedelje ili više.
U nekim primerima izvođenja, izolovani PreF antigeni su suštinski odvojeni od RSV F proteina u postfuzionoj konformaciji. Tako PreF antigen može da bude, na primer, najmanje 80% izolovan, najmanje 90%, 95%, 98%, 99%, ili čak 99.9% odvojen od RSV F proteina u postfuzionoj konformaciji. U nekim primerima izvođenja, PreF antigeni su takođe odvojeni od RSV F proteina koji ne uključuju antigensko mesto Ø i/ili nisu specifično vezani monoklonskim antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (kao što su D25 ili AM22). Na primer, PreF antigen može da bude najmanje 80% izolovan, najmanje 90%, 95%, 98%, 99%, ili čak 99.9% odvojen od RSV F proteina koji ne uključuju antigensko mesto Ø i/ili nisu specifično vezani monoklonskim antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (kao što su D25 ili AM22).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein koji, kada se inkubira u vodenom rastvoru, formira populaciju rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji, pri čemu je najmanje 70% (kao što je najmanje 80%, ili najmanje 90% ili najmanje 95% ili najmanje 98%) izolovanih antigena u populaciji specifično vezano za antitelo specifično za prefuzioni RSV protein (kao što je D25 ili AM22) nakon
(a) inkubacije jedan sat u 350 mM NaCl pH 7.0, na 50 °C;
(b) inkubacije jedan sat u 350 mM NaCl pH 3.5, na 25 °C;
(c) inkubacije jedan sat u 350 mM NaCl pH 10, na 25 °C;
(d) inkubacije jedan sat u 10 mM osmolarnosti, pH 7.0, na 25 °C;
(e) inkubacije jedan sat u 3000 mM osmolarnosti, pH 7.0, na 25 °C
(g) kombinacije dva ili više (a)-(e); ili
kombinacije (a) i (b); (a) i (c); (a) i (d); (a) i (e); (b) i (d); (b) i (e); (c) i (d); (c) i (e); (a), (b) i (d); (a), (c) i (d); (a), (b) i (e); ili (a), (c) i (e)
U daljim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein koji, kada se inkubira u vodenom rastvoru, formira populaciju rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji, pri čemu je najmanje 60% (kao što je najmanje 70%, najmanje 80%, ili najmanje 90%) izolovanih antigena u populaciji specifično vezano za prefuziono-specifično antitelo nakon deset ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja u 350 mM NaCl pH 7.0.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigeni su obezbeđeni kao homogena populacija koja ne uključuje detektabilni RSV F protein u postfuzionoj konformaciji. RSV F protein se može detektovati elektronskom mikroskopijom sa negativnim bojenjem i/ili specifičnim vezivanjem postfuzionog antitela.
1. Rekombinantni RSV F proteini stabilizovani u prefuzionoj konformaciji
Ovde opisani PreF antigeni uključuju rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L (u poređenju sa nativnim RSV F proteinom koji je prikazan kao jedna od SEQ ID NO: 1-184) i uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid. F1 polipeptid, F2 polipeptid, ili oba, mogu da uključuju najmanje jednu dodatnu modifikaciju (npr. supstitucija aminokiselina) koja dodatno stabilizuje rekombinantni RSV F protein u prefuzionoj konformaciji. U nekim primerima izvođenja, F2 polipeptid i F1 polipeptid su povezani peptidnim linkerom (na primer, u primerima izvođenja koji uključuju jednolančani RSV F protein). Stabilizacija rekombinantnog RSV F proteina u prefuzionoj konformaciji čuva najmanje jedan epitop specifičan za prefuzionu konformaciju (tj. epitop prisutan u pre- (ali ne i u post-) fuzionoj konformaciji RSV F proteina) koji se specifično vezuje za monoklonsko antitelo specifično za prefuzioni RSV F (tj. antitelo koje se specifično vezuje za RSV F protein u prefuzionoj konformaciji, ali ne i u postfuzionoj konformaciji). Prema tome, otkriveni PreF antigeni se specifično vezuju za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuju specifičnu prefuzionu konformaciju RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U nekim primerima, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein koji sadrži F1 i/ili F2 polipeptid iz virusa RSV A, na primer, F1 i/ili F2 polipeptid iz RSV F0 proteina koji je obezbeđen kao jedna od SEQ ID NO: 1-128 ili 370, koji je modifikovan tako da uključuje supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L koje stabilizuju rekombinantni RSV F protein u prefuzionoj konformaciji. U nekim primerima, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein koji sadrži F1 i/ili F2 polipeptid iz virusa RSV B na primer, F1 i/ili F2 polipeptid iz RSV F0 proteina koji je obezbeđen kao jedna od SEQ ID NO: 129-177, koji je modifikovan tako da stabilizuje rekombinantni RSV F protein u prefuzionoj konformaciji. U nekim primerima, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein koji sadrži F1 i/ili F2 polipeptid iz goveđeg virusa RSV, na primer, F1 i/ili F2 polipeptid iz RSV F0 proteina koji je obezbeđen kao jedna od SEQ ID NO: 178-184, koji je modifikovan tako da uključuje supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L koje stabilizuju rekombinantni RSV F protein u prefuzionoj konformaciji. Mogu se koristiti i F1 i/ili F2 polipeptidi iz drugih podtipova RSV. Rekombinantni RSV F protein može dodatno da uključuje modifikacije nativnih RSV sekvenci, kao što su aminokiselinske supstitucije, delecije ili insercije, glikozilacija i/ili kovalentna veza sa nepovezanim proteinima (npr. proteinska oznaka), sve dok PreF antigen zadržava rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L. RSV F proteini iz različitih podgrupa RSV, kao i sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju takve proteine i postupci za manipulaciju i ubacivanje takvih sekvenci nukleinske kiseline u vektore, otkriveni su ovde i poznati u tehnici (videti, npr. Tan et al., PLOS one, 7: e51439, 2011; Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N. Y. (1994)).
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein sadrži ili se sastoji od F2 polipeptida i F1 polipeptida koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 80% identične aminokiselinama 26-103, odnosno 145-310, nativne sekvence RSV F proteina koja je prikazana kao bilo koja od SEQ ID NO: 1-184, kao što je SEQ ID NO: 124.
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein sadrži ili se sastoji od F2 polipeptida i F1 polipeptida koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 80% (kao što je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98%) identične aminokiselinama 26-103, odnosno 145-513 nativne sekvence RSV F proteina koja je prikazana kao bilo koja od SEQ ID NO: 1-184, kao što je SEQ ID NO: 124.
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein sadrži ili se sastoji od F2 polipeptida i F1 polipeptida koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 80% (kao što je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98%) identične aminokiselinama 26-103, odnosno 145-529, nativne sekvence RSV F proteina koja je prikazana kao bilo koja od SEQ ID NO: 1-184, kao što je SEQ ID NO: 124.
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein sadrži ili se sastoji od F2 polipeptida i F1 polipeptida koji sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 80% (kao što je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98%) identične aminokiselinama 26-103, odnosno 145-551 nativne sekvence RSV F proteina koja je prikazana kao bilo koja od SEQ ID NO: 1-184, kao što je SEQ ID NO: 124.
U nekim primerima, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein koji obuhvata F1 i/ili F2 polipeptid, koji sadrže polipeptidne sekvence koje imaju najmanje 75% (na primer najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa F1 i/ili F2 polipeptidom RSV iz RSV A virusa, na primer, F1 i/ili F2 polipeptidom iz RSV F0 proteina obezbeđenog kao jedna od SEQ ID NO: 1-128 ili 370. U sledećim primerima, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein koji obuhvata F1 i/ili F2 polipeptid, koji sadrže polipeptidne sekvence koje imaju najmanje 75% (na primer najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa F1 i/ili F2 polipeptidom RSV iz RSV B virusa, na primer, F1 i/ili F2 polipeptidom iz RSV F0 proteina obezbeđenog kao jedna od SEQ ID NO: 129-177. U sledećim primerima, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein koji obuhvata F1 i/ili F2 polipeptid, koji sadrže polipeptidne sekvence koje imaju najmanje 75% (na primer najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa F1 i/ili F2 polipeptidom RSV iz goveđeg virusa RSV, na primer, F1 i/ili F2 polipeptidom iz RSV F0 proteina obezbeđenog kao jedna od SEQ ID NO: 178-184.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid koji sadrži ili se sastoji od najmanje 300 uzastopnih aminokiselina (kao što je najmanje 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420 ili 430 uzastopnih aminokiselina) iz nativne F1 polipeptidne sekvence, kao što su pozicije 137-513 jedne od SEQ ID NO: 1-184 ili 370, uključujući i sve polipeptidne sekvence koje imaju najmanje 75% (na primer najmanje 80%, 81%, 82%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa nativnom F1 polipeptidnom sekvencom, kao što su pozicije 137-513 bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370. Na primer, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni F protein koji uključuje F1 polipeptid koji sadrži ili se sastoji od pozicija 137-513, 137-481, 137-491, ili pozicije 137 do C-terminusa, ili pozicije 137 do transmembranskog domena, bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370, uključujući bilo koje polipeptidne sekvence koje imaju najmanje 75% (na primer najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa nativnom F1 polipeptidnom sekvencom, kao što su pozicije 137-513, ili pozicija 137 do C-terminusa, ili pozicija 137 do transmembranskog domena, bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370. Stručnjak u ovoj oblasti će znati da PreF antigen koji uključuje rekombinantni RSV F protein, može da sadrži F1 polipeptid sa N- ili C- terminalnim skraćenjima (na primer, delecija 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 ili više aminokiselina) u poređenju sa ekstracelularnim regionom nativnog F1 polipeptida (na primer, pozicije 137-524), sve dok se PreF antigen specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata F1 polipeptid koji uključuje maksimalnu dužinu, na primer dužinu ne veću od 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430 ili ne više od 440 aminokiselina. F1 polipeptid može da uključuje, da se sastoji ili da se suštinski sastoji od otkrivenih sekvenci. Opisane kontinuirane sekvence F1 polipeptida takođe mogu da se spoje na bilo kom kraju sa drugim nesrodnim sekvencama (na primer, sekvencama koje nisu sekvence RSV F1 proteina, sekvence RSV F proteina, RSV sekvence, sekvence virusnog omotača ili sekvence virusnih proteina).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein, koji uključuje F2 polipeptid, koji sadrži ili se sastoji od najmanje 60 uzastopnih aminokiselina (kao što je najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ili 109 uzastopnih aminokiselina) iz nativne polipeptidne sekvence F2, kao što su pozicije 26-109 bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370, uključujući i polipeptidne sekvence koje imaju najmanje 75% (na primer najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa nativnom polipeptidnom sekvencom F1, kao što su pozicije 26-109 bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370. Na primer, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni F protein, koji uključuje F2 polipeptid, koji sadrži ili se sastoji od 70-109 uzastopnih aminokiselina (kao što je 60-100, 75-95, 80-90, 75-85, 80-95, 81-89, 82-88, 83-87, 83-84 ili 84-85 uzastopnih aminokiselina) iz nativne F2 polipeptidne sekvence, kao što su pozicije 26-109 bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370, uključujući i sve polipeptidne sekvence koje imaju najmanje 75% (na primer najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa nativnom F2 polipeptidnom sekvencom, kao što su pozicije 137-513 bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje F2 polipeptid takođe maksimalne dužine, na primer dužine ne veće od 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100 aminokiselina. F2 polipeptid može da uključuje, da se sastoji ili da se suštinski sastoji od otkrivenih sekvenci. Opisane kontinuirane sekvence F2 polipeptida takođe mogu da se spoje na bilo kom kraju sa drugim nesrodnim sekvencama (na primer, sekvencama koje nisu sekvence RSV F2 proteina, sekvence RSV F proteina, RSV sekvence, sekvence virusnog omotača ili sekvence virusnih proteina).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein, koji uključuje F2 polipeptid koji sadrži ili se sastoji od najmanje 60 uzastopnih aminokiselina (kao što je najmanje 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ili 109 uzastopnih aminokiselina) iz nativne F2 polipeptidne sekvence, kao pozicije 26-109 bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370, uključujući i polipeptidne sekvence koje imaju najmanje 75% (na primer najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa nativnom F2 polipeptidnom sekvencom, kao što su aminokiseline 26-109 bilo koji od SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i uključuje F1 polipeptid koji sadrži ili se sastoji od najmanje 300 uzastopnih aminokiselina (kao što je najmanje 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420 ili 430 uzastopnih aminokiselina) iz nativne F1 polipeptidne sekvence, kao što su pozicije 137-513 jedne od SEQ ID NO: 1-184 ili 370, uključujući i sve polipeptidne sekvence koje imaju najmanje 75% (na primer najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence sa nativnom F1 polipeptidnom sekvencom, kao što su pozicije 137-513 bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370.
U jednom neograničavajućem primeru, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid, koji sadrže pozicije 26-109, odnosno 137-513, bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370, uključujući polipeptidne sekvence koje imaju najmanje 75% (na primer najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sekvence na pozicijama 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370.
Kao što je već rečeno, RSV F protein se inicijalno sintetiše kao prekursorski protein F0 i iseca se na više mesta (uključujući dva konzervirana mesta isecanja furinom) tokom sazrevanja u eukariotskim ćelijama. Tako, nativni RSV F protein nema N-terminalni signalni peptid i peptid pep27 (ili njegov deo) prekursorskog proteina F0. U nekim primerima izvođenja, otkriveni rekombinantni RSV F proteini stabilizovani u prefuzionoj konformaciji ne uključuju signalni peptid (ili njegov deo) i/ili ne uključuju peptid pep27 (ili njegov deo). Stručnjak u ovoj oblasti će znati da rekombinantni RSV F proteini koji nemaju RSV F signalni peptid i/ili peptid pep27 mogu da budu generisani eksprimiranjem rekombinantnog F0 polipeptida u ćelijama gde će signalni peptid i pep27 peptid biti isečeni iz F0 prekursora ćelijskim proteazama.
Neki primeri izvođenja uključuju PreF antigen, koji obuhvata multimer bilo kojeg od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina, na primer, multimer koji uključuje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ili više otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina. U nekoliko primera, bilo koji od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina može se povezati (npr. preko peptidnog linkera) sa drugim rekombinantnim RSV F proteinom da bi se formirao multimer.
U tehnici se podrazumeva da se neke varijacije mogu napraviti u aminokiselinskoj sekvenci proteina bez uticaja na aktivnost proteina. Takve varijacije uključuju insercije aminokiselinskih ostataka, delecije aminokiselinskih ostataka i supstitucije aminokiselinskih ostataka. Ove varijacije u sekvenci mogu da budu prirodne varijacije ili mogu da budu konstruisane korišćenjem tehnike genetskog inženjeringa poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Primeri takvih tehnika se nalaze u Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al, in Molecular Cloning- A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp.9.31-9.57), ili u Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Tako, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje F1 polipeptid, F2 polipeptid, ili i F1 i F2 polipeptid, koji uključuju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa odgovarajućom nativnom RSV sekvencom. Na primer, u nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid, F2 polipeptid, ili i F1 polipeptid i F2 polipeptid, uključuju i do 20 (kao što je do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ili 19) aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa nativnom F1 polipeptidnom sekvencom, kao što je nativna RSV sekvenca navedena kao bilo koja od SEQ ID NO: 1-184 ili 370, pri čemu je PreF antigen specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzioni RSV F (npr. antitelom D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U dodatnim primerima izvođenja, F1 polipeptid, F2 polipeptid, ili i F1 polipeptid i F2 polipeptid, uključuju do 20 (kao što je do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ili 19) konzervativnih aminokiselinskih supstitucija u poređenju sa nativnom F1 polipeptidnom sekvencom, kao što je nativna RSV sekvenca prikazana u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-184 ili 370, pri čemu je PreF antigen specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzioni RSV F (npr. antitelom D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Na primer, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein u prefuzionoj konformaciji koja je modifikovana da bi se povećala ekspresija proteina u svrhe proizvodnje proteina, npr. eliminacijom jednog ili više signala za nukleusnu lokalizaciju prisutnih na RSV F proteinu. Manipulacija nukleotidnom sekvencom koja kodira F1 ili F2 polipeptidnu sekvencu (kao što je nukleotidna sekvenca koja kodira F0 polipeptid uključujući F1 i F2 polipeptide) korišćenjem standardnih procedura, uključujući u jednom specifičnom, neograničavajućem primeru izvođenja mesto-specifičnu mutagenezu ili u drugom specifičnom, neograničavajućem primeru izvođenja, PCR, može da se koristi za proizvodnju takvih varijanti. Alternativno, F1 i F2 polipeptidi se mogu sintetizovati pomoću standardnih postupaka. Najjednostavnije modifikacije uključuju supstituciju jedne ili više aminokiselina aminokiselinama koje imaju slične biohemijske osobine. Ove takozvane konzervativne supstitucije verovatno će imati minimalan uticaj na aktivnost rezultujućeg proteina. a. Stabilizujuće modifikacije distalno u odnosu na membranu
Kako je ovde otkriveno, protein RSV F prolazi kroz strukturno preuređenje na prelazu između svoje pre- i postfuzione konformacije. Kao što je prikazano na SL. 2B, N-terminalni region F1 polipeptida u prefuzionoj konformaciji (delimično odgovara režnju distalno u odnosu na membranu prikazanom na SL.2A) uključuje naznačene α2, α3, β3, β4 i α4 helikse i strukture beta naborane ploče, pri čemu odgovarajući region N-terminusa F1 polipeptida u postfuzionoj strukturi uključuje proširenu α5 heliksnu strukturu - α2, α3, β3, β4 i α4 strukture heliksa i beta naborane ploče su odsutne. Dalje, C-terminalni region F1 polipeptida u prefuzionoj konformaciji (delimično odgovara režnju proksimalno u odnosu na membranu prikazanom na SL.2A) uključuje naznačene β22, α9 i β23 strukture beta naborane ploče i heliksa, dok odgovarajući C-terminalni region F1 polipeptida u strukturi postfuzione konformacije uključuje proširenu strukturu heliksa α10 i proširenu zavojnicu - β22, α9 i β23 strukture heliksa i beta naborane ploče su odsutne. Tako, režnjevi proteina RSV F distalno u odnosu na membranu i proksimalno u odnosu na membranu u svojoj prefuzionoj konformaciji uključuju nekoliko različitih strukturnih elemenata koji nisu prisutni u odgovarajućim regionima RSV F proteina u njegovoj postfuzionoj konformaciji.
Na osnovu strukturnih karakteristika identifikovanih u prefuzionim i postfuzionim konformacijama RSV F proteina, dostupno je nekoliko načina stabilizacije RSV F proteina u prefuzionoj konformaciji, uključujući aminokiselinske supstitucije koje uvode jednu ili više neprirodnih disulfidnih veza, popunjavaju šupljine unutar RSV F proteina, menjaju pakovanje ostataka u RSV F proteinu, uvode N-vezana mesta glikozilacije i njihove kombinacije. Stabilizujuće modifikacije koje su ovde navedene su ciljane modifikacije koje stabilizuju rekombinantni RSV F protein u prefuzionoj konformaciji. U nekim primerima izvođenja, RSV F protein nije stabilizovan nespecifičnim umrežavanjem, kao što je umrežavanje glutaraldehidom, umrežavanje RSV F trimera vezanih za membranu.
U nekim neograničavajućim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uvođenjem disulfidne veze, pri čemu rekombinantni RSV F protein uključuje supstitucije S155C i S290C; G151C i I288C; A153C i K461C; A149C i Y458C; G143C i S404S; ili aminokiselinske supstitucije Y33C i V469C. Neograničavajući primeri prekursorskih proteina takvih rekombinantnih RSV F proteina (uključujući domen Foldon povezan sa C-terminusom F1 polipeptida) ovde su dati kao SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209 i SEQ ID NO: 211. U daljim neograničavajućim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uvođenjem disulfidne veze i jedne ili više supstitucija koje popunjavaju šupljine proteina, pri čemu rekombinantni RSV F protein uključuje supstitucije S155C, S290C i veliki hidrofobni ostatak na poziciji 190 i/ili poziciji 207 (npr. supstitucija S190F, S190W ili S190L, i/ili supstitucija V207L, V207F ili V207W). Neograničavajući primeri prekursorskih proteina takvih rekombinantnih RSV F prekursorskih proteina (koji uključuje domen foldon vezan za C-terminus F1 polipeptida) su ovde dati kao SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375 i SEQ ID NO: 376.
Mnoge sekvence rekombinantnih RSV F proteina koje su ovde otkrivene uključuju sekvencu mesta isecanja proteazom (kao što su trombinska mesta), proteinske oznake (kao što je His oznaka, Strep Tag II, Avi tag, itd. koje nisu neophodne za funkciju RSV F proteina, kao što je indukcija imunskog odgovora kod subjekta. Stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati takve sekvence, a kada je to potrebno, razumeti da ove oznake ili mesta isecanja proteazom nisu uključeni u otkriveni rekombinantni RSV F protein.
i. Neprirodne disulfidne veze
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću najmanje jedne neprirodne disulfidne veze, uključujući par umreženih ostataka cisteina. Neprirodna disulfidna veza je ona koja se ne javlja u nativnom RSV F proteinu, a uvodi se proteinskim inženjeringom (npr. uključivanjem jednog ili više supstituisanih ostataka cisteina koji formiraju neprirodnu disulfidnu vezu). Na primer, u nekim primerima izvođenja, bilo koji od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina stabilizuje se u prefuzionoj konformaciji bilo kojom od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 disulfidnih veza, uključujući par umreženih ostataka cisteina. U jednom specifičnom neograničavajućem primeru, rekombinantni RSV F protein se stabilizuje u prefuzionoj konformaciji jednim parom umreženih cisteinskih ostataka. U drugom neograničavajućem primeru, bilo koji od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina stabilizuje se u prefuzionoj konformaciji pomoću dva para umreženih ostataka cisteina.
Ostaci cisteina koji formiraju disulfidnu vezu mogu se uvesti u nativnu sekvencu proteina RSV F pomoću jedne ili više supstitucija aminokiselina. Na primer, u nekim primerima izvođenja, jedna aminokiselinska supstitucija uvodi cistein koji formira disulfidnu vezu sa ostatkom cisteina koji je prisutan u nativnoj sekvenci RSV F proteina. U dodatnim primerima izvođenja, dva cisteinska ostatka se uvode u nativnu RSV sekvencu da bi se formirala disulfidna veza. Lokaciju jednog cisteina (ili više cisteina) disulfidne veze za stabilizaciju RSV F proteina u prefuzionoj konformaciji može lako da odredi stručnjak u ovoj oblasti koristeći otkrivenu strukturu RSV F proteina u njegovoj prefuzionoj konformaciji, i prethodno identifikovanu strukturu RSV F proteina u njegovoj postfuzionoj konformaciji.
Na primer, aminokiselinske pozicije cisteina su obično unutar dovoljno bliske udaljenosti za formiranje disulfidne veze u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina. Postupci korišćenja podataka o trodimenzionalnoj strukturi za utvrđivanje da li su dva ostatka na dovoljno bliskoj međusobnoj udaljenosti za formiranje disulfidne veze su poznati (videti, npr. Peterson et al., Protein engineering, 12:535-548, 1999 i Dombkowski, Bioinformatics, 19:1852-1853, 3002 (koji otkriva DISULFIDE BY DESIGN™). Na primer, ostaci se mogu izabrati ručno, na osnovu trodimenzionalne strukture RSV F proteina u prefuzionoj konformaciji koja se ovde obezbeđuje, ili se može koristiti softver, kao što je DISULFIDEBYDESIGN™. Bez vezanja za određenu teoriju, generalno se smatra da su idealna rastojanja za formiranje disulfidne veze oko ~5.6 Å za rastojanje Cα-Cα, ~2.02 Å za rastojanje Sγ-Sγ i 3.5-4.25 Å za rastojanje Cβ-Cβ (koristeći optimalni rotomer). Stručnjak u ovoj oblasti će znati da su varijacije ovih udaljenosti uključene prilikom odabira ostataka u trodimenzionalnoj strukturi koji mogu da budu supstituisani za cisteine za uvođenje disulfidne veze. Na primer, u nekim primerima izvođenja izabrani ostaci imaju rastojanje Cα-Cα manje od 7.0 Å i/ili rastojanje Cβ-Cβ manje od 4.7 Å. U nekim primerima izvođenja odabrani ostaci imaju rastojanje Cα-Cα od 2.0-8.0 Å i/ili rastojanje Cβ-Cβ od 2.0-5.5 Å. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinske pozicije cisteina su na dovoljno bliskom rastojanju za formiranje disulfidne veze u prefuzionoj, ali ne i postfuzionoj, konformaciji proteina RSV F.
Stručnjak u ovoj oblasti može lako da odredi relativni položaj određene aminokiseline između prei postfuzione konformacije RSV F proteina, na primer poređenjem prefuzionih struktura definisanih ovde strukturnim koordinatama navedenim u tabeli 1, sa prethodno identifikovanom postfuzionom strukturom opisanom u McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, sa strukturnim koordinatama deponovanim kao PDB pristupni br. 3RRR). Poznati su postupci za određivanje relativnog položaja određene aminokiseline između dve proteinske strukture (npr. između trodimenzionalnih struktura pre i postfuzionog RSV F proteina). Na primer, stručnjak u ovoj oblasti može da koristi poznate metode superponiranja u poređenju dve strukture (npr. metode koje koriste program LSQKAB (Kabsch W. Acta. Cryst. A32922-923 (1976)). U jednom primeru, prei postfuzione strukture mogu da se superponiraju pomoću LSQKAB da bi se poravnale pozicije F proteina 26-60, 77-97, 220-322 i 332-459 definisane strukturalnim koordinatama datim u tabeli 1, sa pozicijama F proteina 26-60, 77-97, 220-322 i 332-459 definisanih strukturnim koordinatama deponovanim kao PDB pristupni br.3RRR, i da se, upoređivanjem razdaljine između Cα atoma za svaki ostatak u pre- i postfuzionoj strukturi, identifikuju odstupanja pojedinih ostataka između dve strukture.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji disulfidnom vezom između cisteina uvedenog na aminokiselinsku poziciju koja menja konformaciju, i cisteina uvedenog na aminokiselinsku poziciju koja ne menja konformaciju, između pre- i postfuzionih struktura. Na primer, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje aminokiselinske supstitucije koje uvode par cisteina, pri čemu je prvi cistein na aminokiselinskoj poziciji RSV F proteina koji ima srednje kvadratno odstupanje od najmanje 5 (kao što je najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9 ili najmanje 10) angstrema između trodimenzionalne strukture RSV proteina pre- i postfuzionih konformacija, a drugi cistein je na aminokiselinskoj poziciji RSV F proteina koja ima srednje kvadratno odstupanje od manje 4 (kao što je manje od 3, 2, ili 1) angstrema između trodimenzionalne strukture RSV F proteina pre- i postfuzione konformacije, gde je PreF antigen specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Na osnovu poređenja pre- i postfuzionih RSV F struktura, postoje najmanje dva regiona koji prolaze kroz velike konformacione promene, smeštena na N-i C-terminalnim krajevima F1 podjedinice (ostaci 137-216, odnosno 461- 513). Na primer, kao što je prikazano na SL. 2B, pozicije 137-216 i 461-513 F1 polipeptida podležu strukturnom preuređenju između Pre- i Post-F konformacije proteina, dok pozicije 217-460 F1 polipeptida ostaju relativno nepromenjene. Tako, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji disulfidnom vezom između prvog cisteina na jednoj od pozicija 137-216 ili 461-513 F1 polipeptida, a drugi cistein na jednoj od pozicija 217-460 F1 polipeptida. U daljim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji disulfidnom vezom između prvog cisteina na jednoj od pozicija 137-216 ili 461-513 F1 polipeptida, i drugog cisteina na poziciji F2 polipeptida, kao što je jedna od pozicija 26-109 (na primer, jedna od pozicija 26-61 ili 77-97) F2 polipeptida.
U dodatnim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji disulfidnom vezom između cisteina koji se uvode na aminokiselinske pozicije koje menjaju konformaciju između pre- i post-fuzionih struktura. Na primer, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje aminokiselinske supstitucije koje uvode par cisteina, pri čemu je prvi cistein i drugi cistein na aminokiselinskoj poziciji RSV F proteina koja ima srednje kvadratno odstupanje od najmanje 5 (kao što je najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9 ili najmanje 10) angstrema između trodimenzionalne strukture RSV F proteina pre- i post-fuzionih konformacija, pri čemu PreF antigen uključuje specifičnu aktivnost vezivanja za antitelo specifično za prefuzioni RSV F (npr. antitelo D25 ili AM22), i/ili uključuje epitop specifičan za prefuzioni RSV F (npr. epitop D25 ili AM22). U nekim takvim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji disulfidnom vezom između prvog cisteina i drugog cisteina na pozicijama 137-216 F1 polipeptida. U daljim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji disulfidnom vezom između prvog cisteina i drugog cisteina na pozicijama 461-513 F1 polipeptida. U daljim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji disulfidnom vezom između prvog cisteina i drugog cisteina na pozicijama 137-216, odnosno 461-513 F1 polipeptida.
Stručnjak u ovoj oblasti može lako da odredi lokaciju određene aminokiseline u pre- i postfuzionim konformacijama RSV F proteina (i bilo koju razliku u pozicijama između dve konformacije) koristeći strukturne koordinate trodimenzionalne strukture RSV F proteina u prefuzionoj konformaciji (koje su date u tabeli 1) i strukturne koordinate trodimenzionalne strukture RSV F proteina u postfuzionoj konformaciji (koje su date u Protein Databank pristupni br. 3RRR). Na primer, takvi postupci za poređenje su opisani u primeru 1. Tabela 5 daje primere cisteinskih parova i aminokiselinskih supstitucija koje se mogu koristiti za stabilizaciju RSV F proteina u prefuzionoj konformaciji.
Tabela 5. Primeri cisteinskih parova za stabilizaciju disulfidnom vezom
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje jednu ili više (kao što je 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) disulfidnih veza, uključujući disulfidnu vezu između ostataka cisteina koji se nalaze na RSV F pozicijama navedenim u jednom ili više redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 ili 54 kolone 2 tabele 5, gde je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U sledećim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje jednu ili više (kao što je 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) disulfidnih veza, uključujući disulfidne veze između ostataka cisteina koje su uvedene aminokiselinskim supstitucijama cisteina navedenim u jednom ili više redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, ili 54 kolone 3 tabele 5, gde je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
Brojevi SEQ ID NO navedeni u koloni 4 tabele 5 prikazuju aminokiselinske sekvence koje uključuju navedene supstitucije, kao i signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), polipeptid pep27 (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 SEQ ID NO: 185) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK pozicije 559-568 SEQ ID NO: 185))).
Tako, u dodatnim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO navedenih u koloni 4 tabele 5, kao što je SEQ ID NO navedena u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, ili 54 kolone 4 tabele 5, gde je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Na primer, PreF antigen može da obuhvata RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid, pri čemu F2 i F1 polipeptid uključuju aminokiselinsku sekvencu datu kao pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od SEQ ID NO navedenih u koloni 4 tabele 5, kao što je SEQ ID NO navedena u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, ili 54 kolone 4 tabele 5, gde je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigen site Ø).
U daljim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje jednu ili više (kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) disulfidnih veza unutar protomera, uključujući disulfidnu vezu između ostataka cisteina koji se nalaze na pozicijama F1 polipeptida u RSV F navedenim u jednom ili više redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 1617, 18, 19, 20, ili 21 kolone 2, tabele 5. Na primer, PreF antigen može da obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje jednu ili više (kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) disulfidnih veza unutar protomera, uključujući disulfidne veze između ostataka cisteina koji su uvedeni aminokiselinskim supstitucijama u F1 polipeptidu navedenim u jednom ili više redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 21 kolone 3 tabele 5. U bilo kom od ovih primera izvođenja, PreF antigen je specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U sledećim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje jednu ili više (kao što je 2, 3, 4, 5, 6, ili 7) disulfidnih veza unutar protomera, koje uključuju disulfidnu vezu između cisteinskih ostataka koji se nalaze na pozicijama F2 i F1 polipeptida u RSV F navedenih u jednom ili više redova 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28 kolone 2 tabele 5. Na primer, PreF antigen može da obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje jednu ili više (kao što je 2, 3, 4, 5, 6, ili 7) disulfidnih veza unutar protomera, koje uključuju disulfidnu vezu između cisteinskih ostataka koji su uvedeni aminokiselinskim supstitucijama u F2 i F1 polipeptidu navedenim u jednom ili više redova 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28 kolone 3 tabele 5. U bilo kom od ovih primera izvođenja, PreF antigen je specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U sledećim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje jednu ili više (kao što je 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) disulfidnih veza između protomera, koji uključuje disulfidnu vezu između cisteinskih ostataka koji se nalaze na pozicijama F1 polipeptida u RSV F navedenih u jednom ili više redova 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, ili 39 kolone 2 tabele 5. Na primer, PreF antigen može da obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje jednu ili više (kao što je 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) disulfidnih veza između protomera, koji uključuje disulfidnu vezu između cisteinskih ostataka koji su uvedeni aminokiselinskim supstitucijama u F1 polipeptidu navedenim u jednom ili više redova 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, ili 39 kolone 3 tabele 5. U bilo kom od ovih primera izvođenja, PreF antigen je specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U daljim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje disulfidnu vezu između protomera između ostataka cisteina koji se nalaze na pozicijama F2 i F1 polipeptida u RSV F navedenim u koloni 2 reda 40 tabele 5. U daljim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje disulfidnu vezu između protomera između ostataka cisteina koji su uvedeni supstitucijama aminokiselina u F2 i F1 polipeptidu navedenim u koloni 3 reda 40 tabele 5. U bilo kom od ovih primera izvođenja, PreF antigen je specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U nekim primerima izvođenja, aminokiseline se mogu insertovati (ili deletirati) iz sekvence F proteina da bi se podesilo poravnanje ostataka u strukturi F proteina, tako da su pojedini parovi ostataka na dovoljno bliskom rastojanju da bi se formirala disulfidna veza unutar ili između protomera u prefuzionoj, ali ne i postfuzionoj, konformaciji. U nekoliko takvih primera izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje disulfidnu vezu između ostataka cisteina koji se nalaze na pozicijama F1 polipeptida u RSV F, kao i inserciju aminokiselina, navedenih u jednom ili više redova 41, 42, ili 43 kolone 2 tabele 5. U daljim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje disulfidnu vezu između ostataka cisteina koji su uvedeni supstitucijama aminokiselina u F1 polipeptidu, kao i inserciju aminokiselina, navedenu u jednom ili više redova 41, 42, ili 43 kolone 3 tabele 5.
U jednom primeru, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji koji uključuje disulfidnu vezu između cisteina na pozicijama F1155 i 290, kao što je rekombinantni F1 polipeptidni protein sa supstitucijama S155C i S290C.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje kombinaciju dve ili više disulfidnih veza između ostataka cisteina navedenih u tabeli 5 ili tabeli 5b, pri čemu je PreF antigen specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Podrazumeva se da neke kombinacije neće dovesti do stabilizacije RSV F proteina u prefuzionoj konformaciji; takve kombinacije se mogu identifikovati metodama koje su ovde otkrivene, na primer potvrđivanjem da je antigen koji sadrži takav polipeptid specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø)
U daljim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje neprirodnu disulfidnu vezu koja stabilizuje F protein u prefuzionoj konformaciji, pri čemu F protein uključuje supstitucije navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 kolone 3 tabele 5b, pri čemu su ostaci cisteina umetnuti u F protein za formiranje neprirodne disulfidne veze. U bilo kom od ovih primera izvođenja, PreF antigen se specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22), i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
Brojevi SEQ ID NO navedeni u koloni 4 tabele 5b navode aminokiselinske sekvence koje uključuju naznačene supstitucije, kao i, signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), polipeptid pep27 (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 u SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 u SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 u SEQ ID NO: 185))). Prema tome, u dodatnim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid kao što je dato u bilo kojoj od SEQ ID NO navedenih u koloni 4 tabele 5b, kao što je SEQ ID NO navedena u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ili 16 kolone 4 tabele 5b, pri čemu se PreF antigen specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22), i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Na primer, PreF antigen može da obuhvata RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid, gde F2 i F1 polipeptid uključuju aminokiselinsku sekvencu datu kao pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od SEQ ID NO navedenih u koloni 4 tabele 5b, kao što je SEQ ID NO navedena u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 kolone 4 tabele 5b, pri čemu se PreF antigen specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22), i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
Tabela 5b. Primer stabilizovanih supstitucija i sekvenci F proteina
ii. Aminokiselinske supstitucije koje popunjavaju šupljine proteina
Poređenje strukture prefuzione konformacije RSV F proteina (npr. u kompleksu sa Fab D25 kao što je ovde prikazano) sa strukturom postfuzionog RSV F proteina (opisan, npr. u McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011) identifikuje nekoliko unutrašnjih šupljina ili džepova u prefuzionoj konformaciji koji moraju da kolabiraju da bi F prešao u postfuzionu konformaciju. Ove šupljine uključuju one navedene u tabeli 6.
Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću jedne ili više aminokiselinskih supstitucija koje uvode aminokiselinu koja smanjuje zapreminu unutrašnje šupljine koja kolabira u postfuzionoj konformaciji RSV F proteina. Na primer, šupljine se popunjavaju supstitucijom aminokiselina sa velikim bočnim lancima za one sa malim bočnim lancima. Šupljine mogu da budu šupljine unutar protomera, ili šupljine između protomera. Jedan primer aminokiselinske supstitucije za popunjavanje šupljine RSV F za stabilizaciju proteina RSV u njegovoj prefuzionoj konformaciji je RSV F protein sa supstitucijama S190F i V207L. U drugom primeru izvođenja, kao aminokiselinske supstitucije za popunjavanje šupljine za stabilizaciju RSV proteina u njegovoj prefuzionoj konformaciji, RSV F protein uključuje supstitucije S190F, S190L, S190W, S190H, S190M ili S190Y.
Stručnjak u ovoj oblasti može da koristi postupke koji su ovde dati za poređenje strukture pre- i postfuzionih konformacija proteina RSV F, kako bi se identifikovale odgovarajuće šupljine i aminokiselinske supstitucije za popunjavanje identifikovanih šupljina. Prirodne šupljine i aminokiselinske supstitucije za smanjenje zapremine ovih šupljina date su u tabeli 6.
Tabela 6. Primer supstitucija aminokiselina za popunjavanje šupljina
Navedene šupljine su označene po malom ostatku koji se nalazi u šupljini, koji može da se mutira u veći ostatak za popunjavanje šupljine. Jasno je da bi i drugi ostaci (osim onog po kome je šupljina nazvana) mogli da budu mutirani da popune istu šupljinu.
Stoga, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju zapreminu jedne ili više šupljina navedenih u koloni 2 tabele 6, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U dodatnim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija navedenih u redu 1, 2, 3, 4,5,6, 7, 8, ili 9 kolone 3 tabele 6, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
SEQ ID NO navedene u tabeli 6 predstavljaju aminokiselinske sekvence koje uključuju naznačene supstitucije, kao i, signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), polipeptid pep27 (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))). Prema tome, u dodatnim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid kao što je dato u bilo kojoj od SEQ ID NO navedenih u redu 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 ili 8 kolone 4 tabele 6, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Na primer, PreF antigen može da obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid kao što je navedeno kao pozicije 26-109, odnosno 137-513 kao što je dato u bilo kojoj od SEQ ID NO navedenih u redu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 kolone 4 tabele 6, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U dodatnim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje aminokiselinske supstitucije navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ili 84 kolone 3 tabele 6b, pri čemu je PreF antigen specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
SEQ ID NO navedene u tabeli 6a predstavljaju aminokiselinske sekvence koje uključuju naznačene supstitucije signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), polipeptid pep27 (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))). Prema tome, u dodatnim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid kao što je dato u bilo kojoj od SEQ ID NO navedenih u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, ili 84 kolone 4 tabele 6b, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Na primer, PreF antigen može da obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid kao što je navedeno kao pozicije 26-109, odnosno 137-513, kao što je dato u bilo kojoj od SEQ ID NO navedenih u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, ili 84 kolone 4 tabele 6b, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
Tabela 6b. Primer supstitucije aminokiselina za popunjavanje šupljine
iii. Supstitucije za prepakivanje
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću jedne ili više supstitucija aminokiselina za prepakivanje. Supstitucije za prepakivanje povećavaju atraktivne interakcije (kao što su hidrofobne interakcije ili formiranje vodonične-veze) ili smanjuju odbojne interakcije (kao što su odbojne sile između klastera slično naelektrisanih ostataka), između aminokiselina u proteinu.
Stručnjak u ovoj oblasti može da koristi postupke koji su ovde obezbeđeni za poređenje struktura pre- i post-fuzionih konformacija RSV F proteina, kako bi se identifikovale pogodne lokacije odbojnih i/ili privlačnih interakcija između ostataka RSV F proteina i supstitucija aminokiselina za smanjenje ili povećanje ovih interakcija. Na primer, identifikovanjem odbojnih interakcija u strukturi proteina RSV F u prefuzionoj konformaciji koja je ovde obezbeđena, i uvođenjem supstitucija koje smanjuju ove odbojne interakcije.
Alternativno, protein RSV F može uključivati supstitucije koje povećavaju privlačne interakcije između ostataka RSV F proteina u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina, ali ne i postfuzionoj konformaciji RSV F proteina. Primeri aminokiselinskih supstitucija su dati u tabeli 7.
Tabela 7. Aminokiselinske supstitucije za prepakivanje
V56L, T58I, L158W, V164L, I167V, L171I, V179L, L181F, V187I, I291V,
V296L 236 V56L, T58I, L158Y, V164L, I167V, V187I, T189F, I291V, V296L 237 V56I, T58W, V164I, I167F, L171I, V179L, L181V, V187I, I291V, V296I 238 V56I, T58I, I64L, I79V, Y86W, V164I, V179L, T189F, L193V, L195F, Y198F, 239 I199F, L203F, V207L, I214L, I29IV, V296I, A298I
V56I, T58I, I79V, Y86F, V164I, V179L, T189F, L193V, L195F, Y198F, I199F, 240 L203F, V207L, I214L, I29IV, V296I, A298I
V56I, T58W, I64L, I79V, Y86W, V164I, I167F, L171I, V179L, L181V, V187I, 241 L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L, I214L, I291V, V296I
V56I, T58W, I79V, Y86F, V164I, I167F, L171I, V179L, L181V, V187I, 242 L193V, L195F, Y198F, I199F, L203F, V207L, I214L, I291V, V296I
D486N, E487Q, D489N i S491A 249 D486H, E487Q i D489H 250 T400V, D486L, E487L i D489L 251 T400V, D486I, E487L i D489I, 252 T400V, S485I, D486L, E487L, D489L, Q494L i K498L 253 T400V, S485I, D486I, E487L, D489I, Q494L i K498L 254 K399I, T400V, S485I, D486L, E487L, D489L, Q494L, E497L i K498L 255 K399I, T400V, S485I, D486I, E487L, D489I, Q494L, E497L i K498L 256 L375W, Y391F i K394M 286 L375W, Y391F i K394W 287 L375W, Y391F, K394M, D486N, E487Q, D489N i S491A 288 L375W, Y391F, K394M, D486H, E487Q i D489H 289 L375W, Y391F, K394W, D486N, E487Q, D489N i S491A 290 L375W, Y391F, K394W, D486H, E487Q i D489H 291 L375W, Y391F, K394M, T400V, D486L, E487L, D489L, Q494L i K498M 292 L375W, Y391F, K394M, T400V, D486I, E487L, D489I, Q494L i K498M 293 L375W, Y391F, K394W, T400V, D486L, E487L, D489L, Q494L i K498M 294 L375W, Y391F, K394W, T400V, D486I, E487L, D489I, Q494L i K498M 295 F137W i R339M 326 F137W i F140W 327 F137W, F140W i F488W 328
Tako, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje aminokiselinske supstitucije navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5,6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, ili 47 kolone 2 tabele 7, pri čemu je PreF antigen specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22), i/ili uključuje RSV fuzionu specifičnu konformaciju (kao što je antigensko mesto Ø).
SEQ ID NO navedene u tabeli 7 predstavljaju aminokiselinske sekvence koje uključuju naznačene supstitucije, kao i, signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), polipeptid pep27 (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))). Prema tome, u dodatnim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i a F2 polipeptid kao što je dato u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, ili 47 kolone 3 tabele 7, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Na primer, PreF antigen može da obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i a F2 polipeptid kao što je navedeno kao pozicije 26-109, odnosno 137-513, kao što je dato u bilo kojoj od SEQ ID NO navedenih u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, ili 47 kolone 3 tabele 7, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
Neki primeri izvođenja uključuju kombinacije supstitucija aminokiselina koje su gore navedene. iv. N-vezana glikozilaciona mesta
Poređenje strukture prefuzione konformacije RSV F proteina (npr. u kompleksu sa D25 ili AM22 kako je ovde prikazano) sa strukturom postfuzionog RSV F proteina (otkrivena, npr. u McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011) identifikuje nekoliko regiona RSV F proteina koji su dostupni rastvaraču u ovde opisanoj prefuzionoj konformaciji RSV F, ali su nedostupni rastvaraču u postfuzionoj konformaciji RSV F (kao što je otkriveno u McLellan et al.,J. Virol., 85.7788, 2011). Tako, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje zamenu aminokiselina koja uvodi N-vezano mesto glikozilacije na poziciji koja je dostupna rastvaraču u ovde opisanoj prefuzionoj RSV F konformaciji, ali nije dostupna rastvaraču u postfuzionoj RSV F konformaciji (kao što je objavljeno u McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011). Ove aminokiselinske supstitucijama stabilizuju rekombinantni RSV F protein u prefuzionoj konformaciji povećavajući energiju potrebnu da protein pređe u postfuziono stanje.
Da bi se stvorilo N-vezano glikozilaciono mesto, treba uvesti sekvencu Asn-X-Ser/Thr (gde je X bilo koja aminokiselina osim Pro). To se može postići supstitucijom aminokiseline Ser/Thr dva ostataka C-terminalno do nativnog Asn ostatka, ili supstitucijom aminokiseline Asn dva ostatka N-terminalno do nativnog Ser/Thr ostatka, ili supstitucijom i Asn i Ser/Thr ostatka razdvojenih jednom neprolinskom aminokiselinom. Tako, u nekim primerima izvođenja, bilo koji od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina je glikozilovan. Na primer, protein RSV F uključuje supstituciju aminokiselina koja uvodi N-vezano mesto glikozilacije u proteinu RSV F koje je dostupno rastvaraču u prefuzionoj konformaciji RSV F koja je ovde otkrivena, ali je nedostupna rastvaraču u postfuzionoj konformaciji RSV F kao što je objavljeno u McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011). Primeri modifikacija N-vezanih mesta glikozilacije su dati u tabeli 8.
Tabela 8. Primeri N-vezane glikozilacije
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću N-vezanog mesta glikozilacije na jednoj ili više (kao što je 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9) pozicija 506, 175, 178, 276, 476, 185, 160, 503 ili 157 F1 polipeptida, pri čemu je antigen PreF specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Na primer, F1 polipeptid može uključivati supstituciju aminokiselina koja uvodi N-vezano mesto glikozilacije na jednoj ili više (kao što je 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9) pozicija 506, 175, 178, 276, 476, 185, 160, 503 ili 157 F1 polipeptida.
SEQ ID NO navedene u tabeli 8 predstavljaju aminokiselinske sekvence koje uključuju naznačene supstitucije, kao i signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), polipeptid pep27 (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))). U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata F1 polipeptid koji uključuje I506N i K508T supstitucije za uvođenje N-vezanog mesta glikozilacije na poziciji 506. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata F1 polipeptid koji uključuje supstituciju A177S za uvođenje N-vezanog mesta glikozilacije na poziciji 175. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata F1 polipeptid koji uključuje supstituciju V178N za uvođenje N-vezanog mesta glikozilacije na poziciji 178. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata F1 polipeptid koji uključuje supstituciju V278T za uvođenje N-vezanog mesta glikozilacije na poziciji 276. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata F1 polipeptid koji uključuje supstituciju Y478T za uvođenje N-vezanog mesta glikozilacije na poziciji 476. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata F1 polipeptid koji uključuje supstitucije V185N i V187T za uvođenje N-vezanog mesta glikozilacije na poziciji 185. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata F1 polipeptid koji uključuje supstitucije L160N i G162S za uvođenje N-vezanog mesta glikozilacije na poziciji 160. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata F1 polipeptid koji uključuje supstitucije L503N i F505S za uvođenje N-vezanog mesta glikozilacije na poziciji 503. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata F1 polipeptid koji uključuje supstituciju V157N za uvođenje N-vezanog mesta glikozilacije na poziciji 157. U bilo kom od ovih primera izvođenja, PreF antigen se specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22), i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U dodatnim primerima izvođenja, F1 polipeptid sadrži ostatke 137-513 SEQ ID NO: 198 (N-vezano glikozilaciono mesto na poziciji 506); SEQ ID NO: 199 (N-vezano glikozilaciono mesto na poziciji 175); SEQ ID NO: 200 (N-vezano glikozilaciono mesto na poziciji 178); SEQ ID NO: 203 (N-vezano glikozilaciono mesto na poziciji 276); SEQ NO: 204 (N-vezano glikozilaciono mesto na poziciji 476); SEQ ID NO: 214 (N-vezano glikozilaciono mesto na poziciji 185); SEQ ID NO: 215 (N-vezano glikozilaciono mesto na poziciji 160); SEQ ID NO: 216 (N-vezano glikozilaciono mesto na poziciji 503), SEQ ID NO: 217 (N-vezano glikozilaciono mesto na poziciji 157), gde je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
Postupci za dobijanje glikozilovanih polipeptida su ovde opisani i poznati su stručnjaku u ovoj oblasti. Na primer, takvi postupci su opisani u SAD obj. Patentne prij. br. 2007/0224211, SAD pat. Br.7,029,872; 7,834,159, 7,807,405, Wang and Lomino, ACS Chem. Biol., 7:110-122, 2011, i Nettleship et al., Methods Mol. Biol, 498:245-263, 2009. U nekim primerima izvođenja, glikozilovani PreF antigeni se proizvode eksprimiranjem rekombinantnog RSV F proteina u ćelijama sisara, kao što su HEK293 ćelije ili njihovi derivati, kao što su GnTI<-/->ćelije (ATCC® br. CRL-3022). U nekim primerima izvođenja, antigeni RSV F proteina proizvedeni su ekspresijom antigena RSV F proteina u ćelijama sisara, kao što su HEK293 ćelije ili njihovi derivati, sa svainsoninom koji se dodaje medijumu kako bi se inhibirali određeni aspekti glikozilacione mašinerije, na primer za podsticanje proizvodnje hibridnih glikana.
U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid obuhvata dva ili više N-vezanih mesta glikozilacije navedenih u tabeli 8.
v. Primeri stabilizujućih modifikacija
Stručnjak u ovoj oblasti će znati da PreF antigen može da sadrži rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L (u poređenju sa nativnim RSV F proteinom koji je prikazan kao jedna od SEQ ID NO: 1-184) i kombinacije jedne ili više daljih stabilizujućih supstitucija aminokiselina opisanih ovde, kao što je kombinacija supstitucija aminokiselina koje uvode jednu ili više disulfidnih veza, popunjavaju šupljine unutar RSV F proteina, menjaju način pakovanja ostataka u RSV F proteina, uvode N-vezana mesta glikozilacije. Na primer, u nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein uključuje aminokiselinske supstitucije koje uvode disulfidnu vezu i koje popunjavaju šupljine unutar RSV F proteina.
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje disulfidnu vezu između para cisteina na pozicijama 155 i 290, i supstituciju aminokiselina koja popunjava šupljinu na poziciji 190; ili disulfidnu vezu između para cisteina na pozicijama 155 i 290, supstituciju aminokiselina koja popunjava šupljinu na poziciji 190, i supstituciju aminokiselina koja popunjava šupljinu na poziciji 207. Na primer, supstitucija koja popunjava šupljinu na poziciji 190 i/ili poziciji 207 može da bude supstitucija velike aromatične ili hidrofobne aminokiseline (kao što su tirozin, leucin, fenilalanin, histidin ili triptofan).
U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190F. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190W. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190L
U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207L. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207L. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207F. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207F. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207F. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207W. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207W. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207W.
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid humanog RSV podtipa A, humanog RSV podtipa B, ili goveđeg RSV, gde F1 polipeptid uključuje jednu od gore navedenih kombinacija stabilizujućih supstitucija.
U nekim aspektima otkrića koji ne čine deo pronalaska, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuju pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuju aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190F. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190W. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190L. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26- 109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190H. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109 odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190M. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109 odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, i S190Y.
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207L. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207L. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190H i V207L. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190M i V207L. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190Y i V207L.
U nekim aspektima otkrića koji ne čine deo pronalaska, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207F. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207F. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207F. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190H, i V207F. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190M i V207F. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190Y i V207F.
U nekim aspektima otkrića koji ne čine deo pronalaska, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207W. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207W. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207W. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190H i V207W. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190M i V207W. U nekim aspektima, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190Y i V207W.
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F, V207L i F488W. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuje pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370, i dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i F488W.
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji obuhvata F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuju pozicije 26-109, odnosno 137-513 SEQ ID NO: 371 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 373 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L). Drugi aspekti otkrića koji ne formiraju deo pronalaska uključuju: SEQ ID NO: 374 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C i S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C i S190F); ili SEQ ID NO: 376 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C i S190F).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji koji uključuje aminokiselinske supstitucije navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 3132, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, ili 54 kolone 3 tabele 8b. Aminokiselinske supstitucije navedene u redovima 25-40 ne čine deo pronalaska za koji se traži zaštita Stabilizovani RSV F protein može da bude specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili da uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
Tabela 8b: Primeri supstitucija i sekvenci rekombinantnog RSV F proteina sa i bez C-terminalnog domena Foldon koji je podložan isecanju trombinom
SEQ ID NO navedene u tabeli 8b navode aminokiselinske sekvence uključujući navedene supstitucije, signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), polipeptid pep27 (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), mesto isecanja trombinom (LVPRGS 547-552 SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH) (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 od SEQ ID NO: 185))) ili mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 SEQ ID NO: 185)), trimerizacioni domen (domen Foldon), i oznake za prečišćavanje (his-tag HHHHHH (553-558 sekvence SEQ ID NO: 185) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK položaja 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))). Tako, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid (npr. pribl. pozicije 137-513) i F2 polipeptid (npr. pribl. pozicije 26-109) kao što je navedeno u SEQ ID NO jednog od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53, ili 54 kolone 4 (bez domena Foldon) ili kolone 5 (sa domenom Foldon koji je podložan isecanju) tabele 8b. SEQ ID NO redova 25-40 ne čine deo pronalaska za koji se traži zaštita.
U nekim aspektima otkrića koji ne čine deo pronalaska, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji koji uključuje aminokiselinske supstitucije navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ili 13, kolone 3 tabele 8c. Stabilizovani RSV F protein može da bude specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
SEQ ID NO navedene u tabeli 8c predstavljaju aminokiselinske sekvence koje uključuju naznačene supstitucije, signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), polipeptid pep27 (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)), i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559- 568 sekvence SEQ ID NO: 185))). Tako, u dodatnim aspektima, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid (npr. pribl. pozicije 137-513) i F2 polipeptid (npr. pribl. pozicije 26-109) kao što je navedeno u SEQ ID NO jednog od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili 13 kolone 4 tabele 8c.
Tabela 8c: Primeri supstitucija i sekvenci rekombinantnog RSV F proteina
b. Stabilizujuće modifikacije proksimalno u odnosu na membranu
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje oblik rekombinantnog RSV F proteina (npr. sa transmembranskim domenom) učvršćen u membrani. U drugim primerima izvođenja, PreF antigen uključuje rastvorljivi oblik rekombinantnog RSV F proteina (npr. bez transmembranskog domena ili drugog sidra membrane). Jasno je da postoji nekoliko različitih pristupa za generisanje rastvorljivog ili membranskog rekombinantnog RSV F proteina, uključujući one diskutovane u nastavku. Primeri uključuju uvođenje domena trimerizacije, uvođenje cisteinskih parova koji mogu formirati disulfidnu vezu koja stabilizuje C-terminalni region F1, i uvođenje transmembranskog domena (npr. za primene koje uključuju PreF antigen učvršćen u membrani). Dalje, kako je ovde navedeno, struktura RSV F proteina u kompleksu sa D25 Fab (tj. u prefuzionoj konformaciji) u poređenju sa strukturom postfuzionog RSV F proteina (otkrivenog, npr. u McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, sa koordinatama deponovanim kao PDB pristupni br.
3RRR) pokazuju strukturne reorganizacije između pre- i postfuzionih konformacija i režnjeva proksimalno u odnosu na membranu i distalno u odnosu na membranu. Neki primeri izvođenja uključuju modifikaciju usmerenu na stabilizaciju režnja proksimalno u odnosu na membranu prefuzione konformacije RSV F proteina. Jasno je da ove modifikacije nisu strogo neophodne da bi se stabilizovao rekombinantni RSV F protein u prefuzionoj konformaciji, ali da se, u nekim slučajevima, kombinuju sa drugim modifikacijama koje stabilizuju prefuzionu konformaciju, kao što su one koje su gore opisane.
i. Trimerizacioni domen
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen je povezan sa domenom trimerizacije, na primer PreF antigen može da obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid sa domenom trimerizacije povezanim sa njegovim C-terminusom. U nekim primerima izvođenja, domen trimerizacije podstiče trimerizaciju tri F1/F2 monomera u rekombinantnom RSV F proteinu. Nekoliko egzogenih multimerizacionih domena podstiče stabilne trimere rastvorljivih rekombinantnih proteina: GCN4 leucinski rajsferšlus (Harbury et al. 1993 Science 262:1401-1407), trimerizacioni motiv iz površinskog proteina pluća (Hoppe et al. 1994 FEBS Lett 344:191-195), kolagen (McAlinden et al. 2003 J Biol Chem 278:42200-42207) i Foldon fibritina faga T4 (Miroshnikov et al. 1998 Protein Eng 11:329-414), od kojih svaki može da bude vezan za F1 polipeptid u PreF antigenu za podsticanje trimerizacije rekombinantnog F proteina, sve dok je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U nekim primerima, PreF antigen može da bude povezan sa GCN4 domenom leucinskog rajsferšlusa, na primer PreF antigen može da obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid sa GCN4 domenom leucinskog rajsferšlusa povezanim sa njegovim C-terminusom. U konkretnim primerima, GCN4 domen leucinskog rajsferšlusa je obezbeđen u seriji ovde opisanih konstrukata CSGJ.
U nekim primerima, PreF antigen može da bude vezan za domen Foldon, na primer, PreF antigen može da obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid sa domenom Foldon vezanim za njegov C-terminus. U konkretnim primerima, domen Foldon je domen Foldon fibritina T4, kao što je aminokiselinska sekvenca GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 351), koji zauzima konformaciju β-propelera i može da se savije i trimerizuje autonomno (Tao et al. 1997 Structure 5:789-798).
U nekim specifičnim primerima, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein povezan sa domenom Foldon fibritina T4, uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid povezan sa domenom Foldon kako je navedeno u jednoj od SEQ ID NO: 185, 189-303 ili 371-376. Tipično, heterologni motiv multimerizacije postavljen je C-terminalno u odnosu na F1 domen. Opciono, domen multimerizacije povezan je sa F1 polipeptidom preko linkera, kao što je aminokiselinski linker, na primer sekvenca GG Linker takođe može da bude duži linker (na primer, koji uključuje sekvencu GG, kao što je aminokiselinska sekvenca: GGSGGSGGS; SEQ ID NO: 352). Brojni konformaciono neutralni linkeri su poznati u tehnici i oni mogu da se koriste u ovom kontekstu bez narušavanja konformacije PreF antigena. Neki primeri izvođenja uključuju mesto za isecanje proteazom za uklanjanje domena Foldon iz F1 polipeptida, kao što je, ali ne ograničavajući se na, mesto trombina između F1 polipeptida i domena Foldon.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje bilo koju od gore navedenih modifikacija domena trimerizacije u kombinaciji sa bilo kojom modifikacijom navedenom u odeljku II.B.1.a. Na primer, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje bilo koju modifikaciju domena trimerizacije koja je gore navedena u kombinaciji sa jednom ili više modifikacija disulfidne veze koja je navedena u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ili 51 tabele 5, i/ili jednom ili više modifikacija za popunjavanje šupljine navedenih u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 tabele 6 i/ili jednom ili više modifikacija prepakivanja navedenom u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ili 47 tabele 7 i/ili jednom ili više glikozilacionih modifikacija navedenih u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 tabele 8, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje bilo koju od modifikacija domena trimerizacije koja je gore navedena povezanu sa F1 polipeptidom koji uključuje disulfidnu vezu između para cisteina na pozicijama 155 i 290, supstituciju aminokiselina za popunjavanje šupljine na poziciji 190 i supstituciju aminokiselina za popunjavanje šupljine na poziciji 207.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje bilo koju modifikaciju domena trimerizacije koja je gore navedena, povezanu sa F1 polipeptidom koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L.
Na primer, u nekim aspektima otkrića, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina, pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid povezani sa domenom foldon uključuju sekvencu aminokiselina koja je određena kao pozicije 26-109, odnosno 137-544 bilo koje od SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 285, ili SEQ ID NO: 263; ili pozicije 26-109, odnosno 137-545 bilo koje od SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, ili SEQ ID NO: 299, gde je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina, pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid povezani sa domenom foldon uključuju sekvencu aminokiselina koja je prikazana kao pozicije 26-109, odnosno 137-544 bilo koje od SEQ ID NO: 371 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 373 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L) gde je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje RSV F fuzionu specifične konformacije (kao što je antigensko mesto Ø). Druge SEQ ID NO koje ne formiraju deo pronalaska uključuju: SEQ ID NO: 374 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C i S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C i S190F); ili SEQ ID NO: 376 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C i S190F), gde je PreF antigen je specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid humanog RSV podtipa A, humanog RSV podtipa B ili goveđeg RSV, pri čemu je F1 polipeptid povezan sa bilo kojom modifikacijom domena trimerizacije koja je gore navedena, a F1 polipeptid dalje uključuje ovde opisane stabilizujuće modifikacije S155C, S290C, S190F i V207L.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina i uključuje jednu ili više supstitucija aminokiselina za popunjavanje šupljine i domen Foldon, pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid povezani sa domenom Foldon uključuju sekvencu aminokiselina prikazanu kao pozicije 26-109, odnosno 137-544 bilo koje od SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 195, ili SEQ ID NO: 194; gde je PreF antigen specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina i uključuje jednu ili više supstitucija aminokiselina za prepakivanje i domen foldon, pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid povezani sa domenom foldon uključuju sekvencu aminokiselina prikazanu kao pozicije 26-109, odnosno 137-544 bilo koje od SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336, ili SEQ ID NO: 337; pri čemu je PreF antigen specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji RSV F protein, i uključuje jedno ili više N-vezanih mesta glikozilacije i domen Foldon, pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid vezani za domen Foldon uključuju aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao pozicije 26-109, odnosno 137-544 bilo koje od SEQ ID NO odabranih iz grupe koja se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, ili SEQ ID NO: 217; pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje aminokiselinske supstitucije navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 kolone 3 tabele 5b, pri čemu je F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina povezan sa domenom Foldon. Neki primeri izvođenja uključuju mesto za isecanje proteazom za uklanjanje domena Foldon iz F1 polipeptida, na primer mesto isecanja trombinom.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid povezan sa domenom Foldon, pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid povezani sa domenom Foldon uključuju aminokiselinsku sekvencu predstavljenu kao pozicije 26-109, odnosno 137-544 jedne od SEQ ID NO navedenih u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ili 16 kolone 4 tabele, 5b. U nekim primerima izvođenja, F1 polipeptid povezan sa domenom Foldon dalje uključuje mesto za isecanje proteazom, kao što je, ali ne ograničavajući se na mesto za isecanje trombinom, između F1 polipeptida i domena Foldon.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje aminokiselinske supstitucije navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, ili 84 kolone 3 tabele 6b, gde je F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina povezan sa domenom Foldon.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid povezane sa domenom Foldon, pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid povezani sa domenom Foldon uključuju aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao pozicije 26-109, odnosno 137-544 jedne od SEQ ID NO navedenih u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ili 84 kolone 4 tabele 6b.
U daljim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina, pri čemu rekombinantni RSV F protein uključuje aminokiselinske supstitucije navedene u jednom od redova od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23,24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53, ili 54 kolone 3 tabele 8b, gde je F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina povezan sa domenom Foldon. Aminokiselinske supstitucije prikazane u redovima 25-40 ne čine deo pronalaska. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina, koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid vezan za domen Foldon, pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid vezani za domen Foldon uključuju aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao pozicije 26-109, odnosno 137-544 jedne od SEQ ID NO navedenih u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, ili 54 kolone 5 tabele 8b. SEQ ID NO navedene u redovima 25-40 ne čine deo pronalaska. Ove sekvence uključuju mesto isecanja trombinom između F1 polipeptida i domena Foldon.
U daljim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina, pri čemu rekombinantni RSV F protein uključuje aminokiselinske supstitucije navedene u redu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili 13 kolone 3 tabele 8c, pri čemu je F1 polipeptid rekombinantnog RSV F proteina povezan sa domenom Foldon. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina, koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid vezan za domen Foldon, pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid vezani za domen Foldon uključuju aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao pozicije 26-109, odnosno 137-544 sekvence SEQ ID NO navedene u redu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ili 13 kolone 4 tabele 8c.
Modifikovani domeni Foldon takođe mogu da se koriste, kao što je domen Foldon koji uključuje aminokiselinsku sekvencu predstavljenu kao GYIPEAPRDGQCYVRCDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 694), GYIPECPRDGQAYVCKDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 695), GYIPEAPRDGQCYCRKDGEWVLLSTF (SEQ ID NO: 696), ili GYIPEAPRDGQACVRKDGECVLLSTF (SEQ ID NO: 697). Ovi modifikovani domeni Foldon uključuju aminokiselinske supstitucije koje dodaju dva ostatka cisteina za formiranje stabilizujućih disulfidnih veza. Primeri sekvenci proteina RSV F koje uključuju aminokiselinske supstitucije DSCav1 povezane sa modifikovanim domenima Foldon uključuju one prikazane kao SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 653 i SEQ ID NO: 654. U nekim primerima izvođenja, bilo koji od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina može se povezati sa modifikovanim domenom Foldon kako je ovde opisano.
ii. Disulfidne veze
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid, uključujući jednu ili više disulfidnih veza koje se koriste za stabilizaciju režnja proksimalno u odnosu na membranu rekombinantnog RSV F proteina. Cisteinski ostaci koji formiraju disulfidnu vezu mogu se uvesti u rekombinantni RSV F protein relevantnim supstitucijama aminokiselina S155C, S290C, S190F i V207L.
Položaj cisteinskog ostatka (ili cisteinskih ostataka) disulfidne veze za stabilizaciju režnja proksimalno u odnosu na membranu RSV F proteina u prefuzionoj konformaciji lako može da odredi stručnjak u ovoj oblasti koristeći postupke koji su ovde opisani i poznati stručnjaku. U nekim primerima izvođenja, prsten disulfidnih veza se uvodi na C-terminus F1 polipeptida supstitucijom cisteinskih ostataka za aminokiseline α10 heliksa. Tri α10 heliksa ektodomena RSV F formiraju upredenu zavojnicu koja stabilizuje deo proteina proksimalno u odnosu na membranu. Kada se eksprimiraju u ćelijama, disulfidne veze između protomera se formiraju između cisteina uvedenih u α10 heliks, čime se tri α10 heliksa „fiksiraju“ blizu jedan drugog i sprečavaju da se domen proksimalno u odnosu na membranu pomeri iz pre- u postfuzionu konformaciju. Heliks α10 RSV F proteina uključuje ostatke 492 do transmembranskog domena (ostatak 529).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje disulfidnu vezu između ostataka cisteina koji se nalaze na RSV F pozicijama 486 i 487, ili između ostataka cisteina koji se nalaze na RSV F pozicijama 512 i 513, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U nekim takvim primerima izvođenja, F1 polipeptid uključuje supstitucije D486C i E487C, supstitucije L512C i L513C ili supstitucije D486C, E487C, L512C i L513C, redom.
U nekim primerima izvođenja, aminokiseline mogu da budu insertovane (ili deletirane) iz sekvence F proteina da bi se podesilo poravnanje ostataka u strukturi F proteina, kako bi konkretni parovi ostataka bili dovoljno blizu da formiraju disulfidnu vezu. U nekim takvim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje disulfidnu vezu između cisteinskih ostataka smeštenih na 486 i 487; sa insercijom prolina između pozicija 486 i 487, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U nekim takvim primerima izvođenja, F1 polipeptid sadrži supstitucije D486C i E487C i inserciju prolina između pozicija 486 i 487.
U dodatnim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje disulfidnu vezu između cisteinskih ostataka smeštenih na poziciji 493 i umetnuti cisteinski ostatak između pozicija 329 i 330, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U nekim takvim primerima izvođenja, F1 polipeptid uključuje S493C supstituciju, i ostatke cisteina umetnute između pozicija 329 i 330.
U dodatnim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje disulfidnu vezu između cisteinskih ostataka smeštenih na poziciji 493 i umetnuti cisteinski ostatak između pozicija 329 i 330, i dalje uključuje inserciju glicina između ostataka 492 i 493, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U nekim takvim primerima izvođenja, F1 polipeptid uključuje supstituciju S493C, ostatak cisteina umetnut između pozicija 329 i 330, i inserciju glicina između ostataka 492 i 493.
U dodatnim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein uključuje supstitucije cisteina u α heliksu na pozicijama 525 i 526, 512 i 513 i/ili 519 i 520, koje mogu da formiraju disulfidne veze između protomera kako bi se stabilizovao C-terminalni region F1 polipeptida. Na primer, u nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein uključuje bilo koji od „motiva“ navedenih u tabeli 23. U dodatnim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein uključuje aminokiselinsku sekvencu najmanje 80% (kao što je najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identičnu) aminokiselinskoj sekvenci koja je data kao bilo koja od SEQ ID NO: 829-1025 ili 1456-1468, opciono bez uključivanja oznaka za prečišćavanje ili domena trimerizacije uključenih u ove sekvence.
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein obuhvata, pružajući se C-terminalno od pozicije 512, aminokiselinsku sekvencu navedenu kao jedna od CCHNVNAGKSTTN (ostaci 512-524 sekvence SEQ ID NO: 844) ili CCHNVNACCSTTN (ostaci X-Y sekvence SEQ ID NO: 849); ili CCHNVNACCSTTNICCTT (ostaci 512-529 sekvence SEQ ID NO: 853).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje bilo koju od gore navedenih disulfidnih modifikacija veze za stabilizaciju režnja RSV F proteina proksimalno u odnosu na membranu, u kombinaciji sa bilo kojom od modifikacija stabilizacije navedenih u odeljku II.B.1.a. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje bilo koju modifikaciju disulfidne veze za stabilizaciju režnja RSV F proteina proksimalno u odnosu na membranu koji je gore naveden u kombinaciji sa supstitucijama disulfidne veze koje su navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, ili 51 tabele 5, ili redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 tabele 5b, ili supstitucijama za popunjavanje šupljine navedenim u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 tabele 6, ili jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ili 84 kolone 3 tabele 6b, ili supstitucijama za prepakivanje navedenim u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, ili 47 tabele 7, ili modifikacijama glikozilacije navedenim u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 tabele 8 ili supstitucijama navedenim u redu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53 ili 54 kolone 3 tabele 8b, ili supstitucijama navedenim u redu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ili 13 kolone 3 tabele 8c, pri čemu je antigen PreF specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje bilo koju od modifikacija disulfidne veze za stabilizaciju režnja RSV F proteina proksimalno u odnosu na membranu koji je gore naveden i dalje uključuje F1 polipeptid koji sadrži disulfidnu vezu između para cisteina na pozicijama 155 i 290, i supstituciju aminokiselina za popunjavanje šupljine na poziciji 190; ili disulfidnu vezu između para cisteina na pozicijama 155 i 290, supstituciju aminokiselina za popunjavanje šupljine na poziciji 190, i supstituciju aminokiselina za popunjavanje šupljine na poziciji 207.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje bilo koju od modifikacija disulfidne veze za stabilizaciju režnja RSV F proteina proksimalno u odnosu na membranu koja je gore navedena i dalje uključuje F1 polipeptid koji sadrži aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190W, ili aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190L. U daljim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje bilo koju modifikaciju disulfidne veze za stabilizaciju režnja RSV F proteina proksimalno u odnosu na membranu koja je gore navedena i dalje uključuje F1 polipeptid koji sadrži aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207L, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207L, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C S190L i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207W, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207W ili aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207W.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid koji uključuju aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od SEQ ID NO: 371 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 373 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C i S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C i S190F); ili SEQ ID NO: 376 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C i S190F), gde rekombinantni RSV F protein dalje uključuje bilo koju od modifikacija disulfidnih veza za stabilizaciju režnja RSV F proteina proksimalno u odnosu na membranu navedenih gore, gde je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). SEQ ID NO: 374-376 ne čine deo pronalaska za koji se traži zaštita.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid iz humanog RSV podtipa A, humanog RSV podtipa B, ili goveđeg RSV, gde rekombinantni RSV F protein dalje uključuje bilo koju modifikaciju disulfidne veze za stabilizaciju režnja RSV F proteina proksimalno u odnosu na membranu koja je gore navedena, i gde F1 polipeptid dalje uključuje stabilizujuće modifikacije S155C, S290C, S190F i V207L.
iii. Transmembranski domeni
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein uključuje transmembranski domen povezan sa F1 polipeptidom, na primer, za primenu koja uključuje PreF antigen učvršćen u membrani). Na primer, prisustvo transmembranskih sekvenci je korisno za ekspresiju u vidu transmembranskog proteina za pripremu membranskih vezikula. Transmembranski domen može da bude povezan sa F1 proteinom koji sadrži ovde date stabilizujuće mutacije S155C, S290C, S190F i V207L, na primer one koje su gore opisane, kao što je F1 protein sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L. Pored toga, transmembranski domen može dalje da bude povezan sa citosolnim repom RSV F1. Primeri koji uključuju signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), polipeptid pep27 (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), transmembranski domen RSV su obezbeđeni kao SEQ ID NO: 323 (bez citosolnog domena) i SEQ ID NO: 324 (sa citosolnim domenom).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid povezan sa transmembranskim domenom, u kombinaciji sa bilo kojom od stabilizacionih modifikacija navedenih u odeljku II.B.Ia. Na primer, u nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid vezan za transmembranski domen, i dalje uključuje supstitucije disulfidnih veza navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, ili 51 tabele 5, ili reda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 tabele 5b, ili supstitucije koje popunjavaju šupljine navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 tabele 6, iz jednog od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ili 84 kolone 3 tabele 6b, ili supstitucije za prepakivanje navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, ili 47 tabele 7, glikolizacione modifikacije navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili 9 tabele 8, ili supstitucije navedene u redu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 59, 50, 51, 52, 53, ili 54 kolone 3 tabele 8b, ili supstitucije navedene u redu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ili 13 kolone 3 tabele 8c, pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid vezan za transmembranski domen, pri čemu F1 polipeptid uključuje disulfidnu vezu između para cisteina na pozicijama 155 i 290, i supstituciju za popunjavanje šupljine na poziciji 190; i supstituciju za popunjavanje šupljine na poziciji 207.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid povezan sa transmembranskim domenom, gde F1 polipeptid uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, dodatne aminokiselinske supstitucije mogu uključivati aminokiselinske supstitucije: S155C, S290C i S190W ili aminokiselinske supstitucije S155C, S290C i S190L. U sledećim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid vezan za transmembranski domen, pri čemu F1 polipeptid dalje uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, dodatne aminokiselinske supstitucije mogu uključivati aminokiselinske supstitucije: S155C, S290C, S190W i V207L, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207L, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207W, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207W, ili aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207W.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid vezan za transmembranski domen, pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid vezani za transmembranski domen uključuju aminokiselinsku sekvencu datu kao pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 371 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 373 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C i S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C i S190F); ili SEQ ID NO: 376 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C i S190F), pri čemu je PreF antigen specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). SEQ ID NO 374-376 ne čine deo pronalaska za koji se traži zaštita.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid humanog RSV podtipa A, humanog RSV podtipa B, ili goveđeg RSV, pri čemu je F1 polipeptid vezan za bilo koji od gore navedenih transmembranskih domena, i F1 polipeptid uključuje stabilizujuće modifikacije S155C, S290C, S190F i V207L.
iv. Supstitucije za popunjavanje šupljine
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid koji uključuje jednu ili više supstitucija za popunjavanje šupljine koje se koriste za stabilizovanje režnja proksimalno u odnosu na membranu rekombinantnog RSV F proteina. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid sa supstitucijama V207L i L512F; L513F; L512F i L513F; L512Y i L513Y; L512F i L513Y; L512W i L513W; L5132W i L513Y; S509W; S509F; S509W i L512F; ili S509W, L512F i L513F, pri čemu je PreF antigen specifično vezan antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Primeri sekvence sa takvim supstitucija uključuju SEQ ID NO: 672-682.
c. Antigenska mesta
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji se stabilizuje u prefuzionoj konformaciji i uključuje dalju modifikaciju kako bi se eliminisalo poznato antigensko mesto različito od antigenskog mesta Ø. Na primer, rekombinantni RSV F protein može uključiti modifikaciju koja narušava antigensko mesto I, II ili IV. Takve modifikacije mogu se identifikovati, na primer, vezivanjem antitela specifičnih za ova mesta.
U nekim primerima izvođenja, obezbeđeni su antigeni koji uključuju rekombinantni RSV F protein koji uključuje modifikaciju za eliminisanje antigenskog mesta Ø. Takvi antigeni su korisni, na primer, kao kontrolni reagensi.
Primeri modifikacija za uklanjanje antigenskog mesta Ø i/ili antigenskog mesta II su navedeni u tabeli 8c1.
Tabela 8c1: Primeri supstitucija i sekvenci rekombinantnog RSV F proteina
d. Jednolančani RSV F proteini
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein je jednolančani RSV F protein, koji sadrži jedan polipeptidni lanac koji uključuje RSV F1 polipeptid i RSV F2 polipeptid. Opisani jednolančani RSV F proteini ne uključuju mesta isecanja furinom koja oivičavaju polipeptid pep27 RSV F proteina; stoga se F polipeptid, kada se proizvodi u ćelijama, ne cepa na odvojene F1 i F2 polipeptide. U nekim primerima izvođenja, preostali delovi F1 i F2 polipeptida spojeni su linkerom, kao što je peptidni linker.
U nekim primerima izvođenja se proizvodi pojedinačni polipeptidni lanac koji uključuje sekvence F2, pep27 i F1. Jednolančani RSV F protein može da sadrži sekvencu pep27, ili ova sekvenca može da bude deletirana. Dalje, u primerima gde je sekvenca pep27 deletirana, linker (kao što je peptidni linker) se opciono može postaviti između F2 i F1 polipeptida u rekombinantnom jednolančanom RSV F proteinu. U nekim primerima izvođenja, jednolančani RSV F protein uključuje deleciju pozicija 98-149 ili 106-149 u RSV F što uklanja dva mesta isecanja furinom, polipeptid pep27 i fuzioni peptid. U nekim primerima izvođenja, jednolančani RSV F protein uključuje deleciju pozicija 98-136, 98-144, 98-149, 106-136, 104-144 ili 106-144 u RSV F.
U nekim primerima izvođenja, stabilizujuće mutacije koje su prikazane iznad u tekstu (na primer, u odeljcima (B.1.a) do (B.1.c) uključene su u jednolančani RSV F protein. Na primer, u nekim primerima izvođenja, jednolančani RSV F protein uključuje supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L. U nekim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein u jednolančanom formatu stabilizovan u prefuzionoj konformaciji koja dalje uključuje aminokiselinske supstitucije navedene u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 kolone 3 tabele 8d. Stabilizovani RSV F protein može da bude specifično vezan za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
Primeri sekvence su navedeni u tabeli 8d. SEQ ID NO navedene u tabeli 8d predstavljaju aminokiselinske sekvence koje uključuju naznačene supstitucije, signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), polipeptid pep27 (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))) ili mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)), trimerizacioni domen (domen Foldon) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))). Tako, u dodatnim primerima izvođenja, PreF antigen obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid (npr. pribl. pozicije 137-513) i F2 polipeptid (npr. pribl. pozicije 26-109) kao što je navedeno u SEQ ID NO navedenoj u jednom od redova 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ili 14 kolone 4 (bez domena Foldon) ili kolona 5 (sa domenom Foldon koji je podložan isecanju) tabele 8d. Ovde su opisane dodatni primeri mutacija i sekvenci jednolančanog RSV F proteina, na primer, kao što je navedeno u tabeli 8e (na primer, redovi 34-43) i tabeli 18.
Tabela 8d. Jednolančani rekombinantni RSV F proteini
Sekvence dodatnog jednolančanog RSV F proteina koje su stabilizovane u prefuzionoj konformaciji su date u tabeli 19, uključujući jednolančane RSV F proteine sa domenima Foldon koji nisu podložni isecanju, domenima Foldon koji su podložni isecanju, i povezane sa proteinskim podjedinicama nanočestica.
2. Imunogeni sa minimalnim mestom Ø
Epitop mesta Ø RSV F se nalazi na vrhu šiljka trimera i uključuje region koji prepoznaju tri neutrališuća antitela D25, AM22 i 5C4. Konkretnije, kao što je objašnjeno kristalnom strukturom kompleksa RSV F/D25, ovaj epitop sadrži spoljnu površinu heliksa α4 (ostaci 196-209) i susedne petlje (ostaci 63-68) između β2 i α1. Ovde su obezbeđeni imunogeni koji uključuju ove minimalne aspekte proteina RSV F i koji su korisni, na primer, za indukovanje imunskog odgovora na RSV, kao i za specifično vezivanje za antitela na RSV F protein, na primer kao probe za identifikaciju ili detektovanje takvih antitela.
Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein uključuje minimalni region neophodan za stimulaciju imunskog odgovora na RSV. U nekim primerima izvođenja, RSV F protein uključuje ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80% identična sekvenci datoj u tabeli 20. U dodatnim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein sadrži kružnu permutaciju antigenskog mesta Ø, kao što je navedeno u tabeli 20, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 1027-1052.
Region minimalnog epitopa može da bude povezan sa skafold proteinom za stabilizaciju epitopa u antigenskoj konformaciji. Na primer, bilo koji od ovde navedenih antigena sa minimalnim mestom Ø može da bude povezan sa 2KNO, 2A90, 2W59, 3U2E, 2VJ1, 1CHD, 1PQZ, ili 2MOE skafold proteinom. Ovo su identifikatori referenci za određene sekvence koje se nalaze u bazi podataka PDB, kao što je prikazano u bazi podataka 11. marta 2014. Konkretni primeri antigena sa minimalnim mestom Ø povezanog sa skafold proteinom dati su ovde u tabeli 20.
Bilo koji od antigena sa minimalnim mestom Ø može da bude povezan sa proteinskom podjedinicom nanočestice, na primer feritinskom podjedinicom ili podjedinicom lumazin sintaze, za generisanje proteinske nanočestice. Konkretni primeri antigena sa minimalnim mestom Ø povezanih sa proteinskom podjedinicom nanočestice dati su ovde u tabeli 21.
U nekim primerima izvođenja, PreF antigen sadrži epitop-skafold protein koji uključuje epitop specifičan za prefuzioni RSV F protein u specifičnoj prefuzionoj konformaciji. U nekim primerima, epitop skafold protein obuhvata bilo koji od rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji kao što je ovde prikazano. Epitop specifičan za prefuzionu konformaciju može da se postavi bilo gde u skafold proteinu (na primer, na N-terminusu, C-terminusu ili unutrašnjoj petlji), sve dok se PreF antigen koji uključuje epitop skafold protein specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
Postupci za identifikaciju i selekciju skafolda su ovde otkriveni i poznati stručnjaku u ovoj oblasti. Na primer, postupci za superpoziciju, kalemljenje i de novo dizajn epitopa-skafolda su otkriveni u SAD obj. pat. prij. br.2010/0068217.
„Superponiranje“ konstrukata epitop-skafold se zasniva na skafold proteinima koji imaju izloženi segment sa sličnom konformacijom kao ciljni epitop - atomi osnovnog lanca u ovom „regionu superponiranja“ mogu da budu strukturno kompatibilni sa ciljnim epitopom sa minimalnim srednjim kvadratnim odstupanjem (RMSD) njihovih koordinata. Odgovarajući skafoldi se identifikuju putem kompjuterskog pretraživanja biblioteke kristalnih struktura proteina; konstrukti epitop-skafold se formiraju postavljanjem ostataka epitopa u region superponiranja i uvođenjem dodatnih mutacija u okolnu površinu skafolda, kako bi se sprečile kolizije ili druge interakcije sa antitelom.
Kod „kalemljenja“ konstrukata epitop-skafold koriste se skafold proteini u kojima izloženi segment može da se zameni kristalizovanom konformacijom ciljnog epitopa. Za svaki pogodni skafold identifikovan kompjuterskim pretraživanjem svih kristalnih struktura proteina, izloženi segment se zamenjuje ciljnim epitopom, a okolni bočni lanci se redizajniraju (mutiraju) kako bi se prilagodili i stabilizovali umetnuti epitop. Konačno, kao i kod superponiranja konstrukta epitopskafold, mutacije se uvode na površini skafolda i izvan epitopa, kako bi se sprečile kolizije ili druge interakcije sa antitelom. Kalemljenje skafolda zahteva da zamenjeni segment i umetnuti epitop imaju slične transformacije tokom translacije i rotacije između N- i C-terminusa, i da okolni peptidni osnovni lanac ne bude u koliziji sa umetnutim epitopom. Jedna razlika između kalemljenja i superponiranja je u tome što se kod kalemljenja teži preciznom imitiranju konformacije epitopa, dok su kod superponiranja dozvoljena mala strukturna odstupanja.
„De novo“ konstrukti epitop-skafold su kompjuterski dizajnirani od početka kako bi se optimalno predstavila kristalizovana konformacija epitopa. Ovaj postupak se zasniva na računarskom dizajnu novog savijanja proteina (Kuhlman, B. et al. 2003 Science 302:1364-1368). De novo postupak omogućava projektovanje imunogena koji su minimalnih dimenzija, tako da ne prikazuju neželjene epitope, a takođe su veoma stabilni na termičku ili hemijsku denaturaciju.
Skafold može da bude heterologni skafold. U nekim primerima izvođenja, nativni skafold protein (bez insercije epitopa) nije protein virusnog omotača. U dodatnim izvođenjima, skafold protein nije RSV protein. U narednim primerima izvođenja, skafold protein nije virusni protein.
U dodatnim primerima izvođenja, konstrukt epitop-skafold protein obuhvata aminokiselinsku sekvencu datu kao bilo koja od SEQ ID NO: 341-343, ili polipeptid sa najmanje 80% identičnosti sekvence (kao što je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti sekvence) sa bilo kojom od SEQ ID NO: 341-343, i pri čemu se konstrukt epitop-skafold protein specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U dodatnim primerima izvođenja, RSV F protein je bilo koja od SEQ ID NO: 341-343, gde aminokiselinska sekvenca RSV F proteina ima do 20 aminokiselinskih supstitucija, i gde se konstrukt epitop-skafold protein specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø), u odsustvu vezivanja za odgovarajuće antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22). Alternativno, polipeptid može imati nijednu, ili do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ili 19 aminokiselinskih supstitucija.
Rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji može da se postavi bilo gde u skafoldu, sve dok se dobijeni konstrukt epitop-skafold protein specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø), u odsustvu vezivanja za odgovarajuće antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22). Postupci za određivanje da li se određeni konstrukt epitop-skafold protein specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. D25 ili AM22 antitela) su ovde otkriveni i poznati stručnjaku u ovoj oblasti (videti, na primer, Obj. međunarodnih prij. br. WO 2006/091455 i WO 2005/111621). Pored toga, formiranje kompleksa antitelo-antigena može da bude ispitano pomoću brojnih dobro definisanih dijagnostičkih testova, uključujući konvencionalne formate imunoeseja za otkrivanje i/ili kvantifikaciju antigen-specifičnih antitela. Takvi testovi uključuju, na primer, enzimske imunoeseje, npr. ELISA, testove na bazi ćelija, protočnu citometriju, radioimunoeseje i imunohistohemijsko bojenje. Brojni testovi kompetitivnog i nekompetitivnog vezivanja proteina su poznati u tehnici i mnogi su komercijalno dostupni. Postupci za određivanje da li je određeni konstrukt epitop-skafold protein uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø), u odsustvu vezivanja za odgovarajuće antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. D25 ili AM22 antitela) su takođe ovde opisani i dalje poznati stručnjaku u ovoj oblasti.
3. Čestice slične virusu
U nekim primerima izvođenja obezbeđena je čestica slična virusu (VLP) koja uključuje otkriveni rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji. Česticama VLP nedostaju virusne komponente koje su potrebne za replikaciju virusa i stoga predstavljaju visoko oslabljeni oblik virusa. VLP može da prikaže polipeptid (npr. rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji) koji može izazvati imunski odgovor na RSV kada se daje subjektu. Čestice slične virusu i postupci za njihovu proizvodnje su poznati i bliski stručnjaku u ovoj oblasti, i poznato je da virusni proteini iz nekoliko virusa formiraju VLP, uključujući humani papiloma virus, HIV (Kang et al., Biol. Chem.380: 353-64 (1999)), virus Semliki-šume (Notka et al., Biol. Chem. 380: 341-52 (1999)), humani poliomavirus (Goldmann et al., J. Virol.73: 4465-9 (1999)), rotavirus (Jiang et al., Vaccine 17: 1005-13 (1999)), parvovirus (Casal, Biotechnology and Applied Biochemistry, Vol 29, Part 2, pp 141-150 (1999)), pseći parvovirus (Hurtado et al., J. Virol. 70: 5422-9 (1996)), virus hepatitisa E (Li et al., J. Virol.71: 7207-13 (1997)) i virus bolesti Njukasl. Na primer, himerna VLP koja sadrži RSV antigen i može da bude VLP na bazi virusa bolesti Njukasl. Za VLP na bazi virusa bolesti Njukasl prethodno je pokazano da izazivaju neutrališući imunski odgovor na RSV kod miševa. Formiranje takvih VLP se može detektovati bilo kojom odgovarajućom tehnikom. Primeri pogodnih tehnika poznatih u struci za detekciju VLP u medijumu uključuju, npr. tehnike elektronske mikroskopije, dinamičko rasipanje svetlosti (DLS), selektivno hromatografsko razdvajanje (npr. razdvajanje VLP na bazi jonske izmene, hidrofobne interakcije i/ili ekskluzione hromatografije) i centrifugiranje na gradijentu gustine. U nekim primerima izvođenja, čestica slična virusu obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid (kao što je F1 polipeptid vezan za transmembranski domen), pri čemu F1 polipeptid uključuje disulfidnu vezu između para cisteina na pozicijama 155 i 290, i supstituciju za popunjavanje šupljine na poziciji 190; i supstituciju za popunjavanje šupljine na poziciji 207.
U nekim primerima izvođenja, čestica slična virusu obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid (kao što je F1 polipeptid vezan za transmembranski domen), pri čemu F1 polipeptid uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L i može dalje da uključuje: aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207L, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207L, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207W, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207W, ili aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207W.
U nekim primerima izvođenja, čestica slična virusu sadrži rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid (kao što je F1 polipeptid povezan sa transmembranskim domenom), pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid uključuju aminokiselinsku sekvencu datu kao pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od SEQ ID NO: 371 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 373 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C i S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C i S190F); ili SEQ ID NO: 376 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C i S190F). SEQ ID NO: 374-376 ne čine deo pronalaska za koji se traži zaštita. U nekim primerima izvođenja, čestica slična virusu sadrži rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid (kao što je F1 polipeptid vezan za transmembranski domen) i F2 polipeptid humanog RSV podtipa A, humanog RSV podtipa B, ili goveđeg RSV, pri čemu F1 polipeptid uključuje stabilizujuće modifikacije S155C, S290C, S190F i V207L.
4. Proteinske nanočestice
U nekim primerima izvođenja obezbeđena je proteinska nanočestica koja uključuje jedan ili veći broj bilo kog od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji, pri čemu je proteinska nanočestica specifično vezana antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Neograničavajući primer nanočestica uključuje feritinske nanočestice, nanočestice inkapsulina i nanočestice reduktaze oksigenaze sumpora (SOR), koje su sačinjene od skupa monomernih podjedinica uključujući proteine feritina, proteine inkapsulina, odnosno SOR proteine. Za konstruisanje proteinskih nanočestica koje uključuju otkriveni rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, antigen se vezuje za podjedinicu proteinske nanočestice (kao što je protein feritina, protein inkapsulina ili SOR protein). Fuzioni protein se sam sklapa u nanočesticu pod odgovarajućim uslovima.
Nanočestice feritina i njihova upotreba u svrhe imunizacije (npr. za imunizaciju protiv antigena influence) je otkrivena u tehnici (videti, npr. Kanekiyo et al., Nature, 499: 102-106, 2013).
U nekim primerima izvođenja, bilo koji od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji su povezani sa polipeptidom feritina ili hibridom različitih polipeptida feritina da bi se stvorila proteinska nanočestica feritina, pri čemu se nanočestica feritina specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Feritin je globularni protein koji se nalazi kod svih životinja, bakterija i biljaka, i koji deluje prvenstveno na kontrolu brzine i lokacije formiranja polinuklearnog Fe(III)2O3 kroz transport hidratisanih jona gvožđa i protona do i od mineralizovanog jezgra. Globularni oblik feritina je sačinjen od monomernih podjedinica, koje su polipeptidi sa molekulskom težinom od približno 17-20 kDa. Primer sekvence jedne takve monomerne podjedinice predstavlja SEQ ID NO: 353. Svaka monomerna podjedinica ima topologiju snopa heliksa koji uključuje motiv četiri antiparalelna heliksa, sa petim kraćim heliksom (c-terminalni heliks) postavljenim približno okomito na uzdužnu osu snopa od 4 heliksa. Prema konvenciji, heliksi su označeni kao „A, B, C, D i E“ od N-terminusa respektivno. N-terminalna sekvenca se nalazi pored trostruke ose kapsida i proteže se do površine, dok su E heliksi spakovani zajedno na četvorostrukoj osi sa C-terminusom koji se proteže u jezgro kapsida. Posledica ovog pakovanja su dve pore na površini kapsida. Očekuje se da jedna ili obe ove pore predstavljaju tačku u kojoj hidratizovano gvožđe difunduje u kapsid i iz njega. Nakon proizvodnje, ovi proteini monomerne podjedinice podležu samosklapanju u globularni protein feritina. Dakle, globularni oblik feritina sadrži 24 monomerna subjedinična proteina i ima strukturu sličnu kapsidu sa simetrijom 432. Postupci za konstruisanje nanočestica feritina su poznati stručnjaku u ovoj oblasti i dalje su opisani ovde (videti, npr. Zhang, Int. J. Mol. Sci., 12:5406-5421,2011).
U konkretnim primerima, polipeptid feritina je feritin E. coli, feritin Helicobacter pylori, humani laki lanac feritina, feritin volovske žabe ili njihov hibrid, kao što su hibridni feritin E. coli-čoveka, hibridni feritin E. coli-volovske žabe, ili hibridni feritin čoveka-volovske žabe. Primeri aminokiselinskih sekvenci polipeptida feritina i sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptide feritina za upotrebu u otkrivenim antigenima RSV F proteina stabilizovanim u prefuzionoj konformaciji mogu se naći u GENBANK®, na primer na pristupnim brojevima ZP_03085328, ZP_06990637, EJB64322.1, AAA35832, NP_000137 AAA49532, AAA49525, AAA49524 i AAA49523, dostupno 28. februara 2013. U jednom primeru izvođenja, bilo koji od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji povezan je sa proteinom feritina koji uključuje aminokiselinsku sekvencu najmanje 80% (kao što je najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 97%) identičnu aminokiselinskoj sekvenci datoj kao SEQ ID NO: 353. Specifičan primer otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji povezanoj sa proteinom feritina uključuju aminokiselinsku sekvencu datu kao SEQ ID NO: 350.
U nekim primerima izvođenja, polipeptid feritina je feritin Helicobacter pylori (kao što je polipeptid feritina dat kao SEQ ID NO: 353) i uključuje supstituciju ostatka cisteina na poziciji 31, kao što je supstitucija C31S, C31A ili C31V. Bilo koji od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina (npr. RSV F polipeptid sa supstitucijama S155C, S290C i S190F, ili sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L) može da se poveže sa feritinom Helicobacter pylori (kao što je polipeptid feritina dat kao SEQ ID NO: 353) koji dalje uključuje supstituciju ostatka cisteina na poziciji 31 polipeptida feritina, kao što je supstitucija C31S, C31A ili C31V.
U nekim primerima izvođenja, proteinska nanočestica feritina sadrži rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid, pri čemu je F1 polipeptid vezan za protein feritina, i pri čemu F1 polipeptid uključuje disulfidnu vezu između para cisteina na pozicijama 155 i 290, i supstituciju za popunjavanje šupljine na poziciji 190 i supstituciju za popunjavanje šupljine na poziciji 207.
U nekim primerima izvođenja, proteinska nanočestica feritina sadrži rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid, pri čemu je F1 polipeptid vezan za protein feritina, i pri čemu F1 polipeptid uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L i može dodatno da uključuje: aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207L, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207L, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207W, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207W, ili aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207W.
Protein RSV F koji je uključen u nanočesticu feritina može da bude humani podtip A, humani podtip B ili goveđi RSV F protein koji uključe supstitucije koje su ovde otkrivene za stabilizaciju prefuzione konformacije.
U nekim primerima izvođenja, proteinska nanočestica feritina sadrži rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid, pri čemu je F1 polipeptid vezan za protein feritina, i pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid uključuju aminokiselinsku sekvencu datu kao pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 371 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 373 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C, i S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C, i S190F); ili SEQ ID NO: 376 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C, i S190F). SEQ ID NO: 374-376 ne čine deo pronalaska za koji se traži zaštita. U nekim primerima izvođenja, proteinska nanočestica feritina sadrži rekombinantni RSV F protein koji uključuje F1 polipeptid i F2 polipeptid iz humanog RSV podtipa A, humanog RSV podtipa B ili goveđeg RSV, gde F1 polipeptid uključuje bilo koju od stabilizujućih modifikacija S155C, S290C, S190F i V207L.
U nekim primerima izvođenja proteinska nanočestica feritina sadrži rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid, pri čemu je F1 polipeptid povezan sa proteinom feritina, i pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid povezani sa proteinom feritina uključuju aminokiselinsku sekvencu datu kao pozicije 26-109, odnosno 137-679 sekvence SEQ ID NO: 377 (RSV A koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F, V207L, sa C-terminalnim domenom feritina) ili SEQ ID NO: 378-382.
U nekim primerima izvođenja nanočestica feritina uključuje rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid, pri čemu je F1 polipeptid povezan sa feritinom, i pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid povezani sa feritinom uključuju aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F, V207L i bilo koje dodatne supstitucije navedene u redu 1, 2, 3, 4, 56, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, ili 49 kolone 3 tabele 8e. U nekim primerima izvođenja nanočestica feritina uključuje rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid, pri čemu je F1 polipeptid vezan za protein feritina, i pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid vezani za protein feritina uključuju aminokiselinsku sekvencu F1 i F2 polipeptida datu u SEQ ID NO navedenu u redu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, ili 49 kolone 4 tabele 8e. Biće jasno da SEQ ID NO.602-617 i 620-634 i 645-650 navedene u tabeli 8e uključuju signalnu sekvencu i polipeptidne sekvence pep27, koje se uklanjaju proteolitičkom obradom kada se odgovarajući F protein proizvodi u eukariotskim ćelijama, kao i C-terminalne proteinske oznake.
Tabela 8e: Primeri mutacija i sekvenci proteina RSV F za proizvodnju nanočestica feritina
U dodatnim primerima izvođenja, bilo koji otkriveni antigeni RSV F proteina stabilizovani u prefuzionoj konformaciji su povezani sa polipeptidom inkapsulina da bi se konstruisala nanočestica inkapsulina, pri čemu je nanočestica inkapsulina specifično vezana antitelom specifičnim za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Proteini inkapsulina su konzervirana familija bakterijskih proteina poznatih i kao proteini slični linocinu koji formiraju velike proteinske sklopove koji funkcionišu kao minimalni odeljak za pakovanje enzima. Inkapsulinski sklop čine monomerne podjedinice, koje su polipeptidi sa molekulskom težinom od približno 30 kDa. Primer sekvence jedne takve monomerne podjedinice je SEQ ID NO: 354. Nakon proizvodnje, monomerne podjedinice podležu samosklapanju u globularni sklop inkapsulina koji uključuje 60 monomernih podjedinica. Postupci za konstruisanje nanočestica inkapsulina poznati su stručnjaku u ovoj oblasti i dalje opisani u ovom dokumentu (videti, na primer, Sutter et al., Nature Struct. And Mol. Biol., 15: 939-947, 2008). U specifičnim primerima, polipeptid inkapsulina je bakterijski inkapsulin, kao što je inkapsulin E. coli ili Thermotoga maritime. Primer sekvence inkapsulina za upotrebu sa otkrivenim antigenima RSV F proteina stabilizovanim u prefuzionoj konformaciji naveden je kao SEQ ID NO: 354.
U dodatnim primerima izvođenja, bilo koji od opisanih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji vezan je za polipeptid reduktaze oksigenaze sumpora (SOR) da bi se konstruisala nanočestica SOR, pri čemu se nanočestica SOR specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22), i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). SOR proteini su mikrobni proteini (na primer iz termoacidofilnog arhaeona Acidianus ambivalens koji formiraju 24 podjedinice proteinskih sklopova. Postupci za konstruisanje SOR nanočestica su poznati stručnjaku u ovoj oblasti (videti, npr. Urich, et al., Science, 311:996-1000, 2006). Specifični primeri opisanih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji vezanih za SOR protein uključuju aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 344 i SEQ ID NO: 345.
U dodatnim primerima izvođenja, bilo koji od opisanih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji vezan je za polipeptid Lumazin sintaze da bi se konstruisala nanočestica Lumazin sintaze, pri čemu se nanočestica Lumazin sintaze specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22), i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Specifični primeri opisanih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji vezanih za protein Lumazin sintaze uključuju aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 346-348.
U dodatnim primerima izvođenja, bilo koji od opisanih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji vezan je za polipeptid piruvat dehidrogenaze da bi se konstruisala nanočestica piruvat dehidrogenaze, pri čemu se nanočestica piruvat dehidrogenaze specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22), i/ili uključuje konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Specifični primeri opisanih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji vezanih za protein piruvat dehidrogenaze uključuju aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 349.
U nekim primerima, bilo koji od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji povezan je sa N- ili C-terminusom proteina feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvat dehidrogenaze, na primer linkerom, kao što je linker Ser-Gly. Kada su konstrukti napravljeni u ćelijama HEK 293 Freestyle, fuzioni proteini su izlučivani iz ćelija i podlegali su samosklapanju u nanočestice. Nanočestice se mogu prečistiti korišćenjem poznatih tehnika, na primer, pomoću nekoliko različitih hromatograskih postupaka, npr. Mono Q (anjonska izmena), a zatim ekskluzionom hromatografijom (SUPEROSE® 6) hromatografija.
Neki primeri izvođenja obuhvataju monomernu podjedinicu proteina feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvat dehidrogenaze, ili bilo koji njen deo koji može da usmerava samosklapanje monomernih podjedinica u globularni oblik proteina. Aminokiselinske sekvence iz monomernih podjedinica bilo kog poznatog proteina feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvat dehidrogenaze mogu se koristiti za proizvodnju fuzionih proteina sa otkrivenim rekombinantnim RSV F proteinima stabilizovanim u prefuzionoj konformaciji, sve dok monomerna subjedinica ima sposobnost samo-sklapanja u nanočesticu koja prikazuje rekombinantne RSV F proteine stabilizovane u prefuzionoj konformaciji na svojoj površini. Fuzioni proteini ne moraju da sadrže celu sekvencu monomerne podjedinice polipeptida feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvat dehidrogenaze. Delovi, ili regioni, monomerne podjedinice polipeptida mogu se koristiti sve dok deo sadrži aminokiselinske sekvence koje usmeravaju samo-sklapanje monomernih podjedinica u globularni oblik proteina.
U nekim primerima izvođenja, može da bude korisno konstruisati mutacije u aminokiselinskoj sekvenci monomernih podjedinica feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvat dehidrogenaze. Na primer, može da bude korisno izmeniti mesta, kao što su mesta prepoznavanja enzima ili mesta glikozilacije kako bi se fuzionom proteinu obezbedila korisna svojstva (npr. poluživot).
Stručnjaci u ovoj oblasti će znati da fuzija bilo kog od otkrivenih rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji sa proteinom feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvat dehidrogenaze treba da se izvede tako da opisani delovi rekombinantnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji u fuzionom proteinu ne ometaju samo-sklapanje podjedinica monomernog feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvat dehidrogenaze u globularni protein, i da proteinski deo feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvat dehidrogenaze u fuzionom proteinu ne ometa sposobnost otkrivenog antigena rekombinantnog RSV F proteina stabilizovanog u prefuzionoj konformaciji da izazove imunski odgovor na RSV. U nekim primerima izvođenja, protein feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvat dehidrogenaze i otkriveni rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji mogu se spojiti direktno bez uticaja na aktivnost bilo kog dela. U drugim primerima izvođenja, protein feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvat dehidrogenaze i rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji se spajaju pomoću sekvence linkera (takođe nazvanog spejser). Sekvenca linkera je dizajnirana tako da pozicionira feritinski, inkapsulinski, SOR, lumazin sintazni ili piruvat dehidrogenazni i deo fuzionog proteina koji čini otkriveni rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, jedan u odnosu na drugi, tako da fuzioni protein zadrži sposobnost sklapanja u nanočestice, kao i da izazove imunski odgovor na RSV. U nekim primerima izvođenja, sekvence linkera sadrže aminokiseline. Poželjne aminokiseline za upotrebu su one koje imaju male bočne lance i/ili one koje nisu naelektrisane. Za takve aminokiseline je manje verovatno da će ometati pravilno savijanje i aktivnost fuzionog proteina. Shodno tome, poželjne aminokiseline za korišćenje u sekvencama linkera, bilo same ili u kombinaciji su serin, glicin i alanin. Jedan primer takve sekvence je SGG. Aminokiseline se mogu dodati ili oduzeti po potrebi. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da odrede odgovarajuće sekvence linkera za konstruisanje proteinskih nanočestica.
U određenim izvođenjima, proteinske nanočestice imaju molekulsku težinu od 100 do 5000 kDa, kao što je približno 500 do 4600 kDa. U nekim primerima izvođenja, nanočestica feritina ima približnu molekulsku težinu od 650 kDa, nanočestica incapsulina ima približnu molekulsku težinu od 2100 kDa, SOR nanočestica ima približnu molekulsku težinu od 1000 kDa, nanočestica lumazin sintaze ima približnu molekulsku težinu od 4000 kDa, a nanočestica piruvat dehidrogenaze ima približnu molekulsku težinu od 4600 KDa, kada protein nanočestice uključuju rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji.
Otkriveni rekombinantni RSV F proteini stabilizovani u prefuzionoj konformaciji povezanoj sa proteinima feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvat dehidrogenaze mogu samostalno da se sklope u proteinske nanočestice sa više podjedinica, nazvane nanočestice feritina, nanočestice inkapsulina, SOR nanočestice, nanočestice lumazin sintaze, odnosno nanočestice piruvat dehidrogenaze. Nanočestice koje uključuju otkrivene rekombinantne RSV F proteine stabilizovane u prefuzionoj konformaciji, imaju suštinski iste strukturne karakteristike kao i nanočestice nativnog feritina, inkapsulina, SOR, lumazin sintaze ili piruvate dehidrogenaze koje ne uključuju otkrivene rekombinantne RSV F proteine stabilizovane u prefuzionoj konformaciji. To znači da sadrže 24, 60, 24, 60 ili 60 podjedinica (respektivno) i imaju sličnu odgovarajuću simetriju. U slučaju nanočestica izgrađenih od monomernih podjedinica koje uključuju otkriveni rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, takve nanočestice su specifično vezane za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju (npr. antitelo D25 ili AM22) i/ili uključuju konformaciju specifičnu za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø).
C. Polinukleotidi koji kodiraju antigene
Polinukleotidi koji kodiraju otkrivene PreF antigene (npr. rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, ili konstrukt epitop-skafold protein, ili čestice slične virusu ili nanočestice proteina koje sadrže takve proteine) su takođe obezbeđeni. Ovi polinukleotidi uključuju DNK, cDNA i RNK sekvence koje kodiraju antigen.
U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira prekursorski polipeptid F0 koji se, kada se eksprimira u odgovarajućoj ćeliji, obrađuje u otkriveni PreF antigen. U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira prekursorski polipeptid F0 koji se, kada se eksprimira u odgovarajućoj ćeliji, obrađuje u otkriveni PreF antigen, gde prekursorski polipeptid F0 uključuje, od N- ka C-terminusu, signalni peptid, F2 polipeptid, polipeptid Pep27 i F1 polipeptid. U nekim primerima izvođenja, polipeptid Pep27 sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao pozicije 110-136 bilo koje sekvence SEQ ID NO: 1-184 ili 370, pri čemu aminokiselinske pozicije odgovaraju aminokiselinskoj sekvenci referentnog polipeptida F0 koji je naveden kao SEQ ID NO: 124. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid uključuje aminokiselinsku sekvencu datu kao pozicije 1-25 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 1-184 ili 370 pri čemu aminokiselinske pozicije odgovaraju aminokiselinskoj sekvenci referentnog polipeptida F0 datoj kao SEQ ID NO: 124.
U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira prekursorski polipeptid F0 koji se, kada se eksprimira u odgovarajućoj ćeliji, obrađuje u otkriveni PreF antigen, gde prekursorski polipeptid F0 uključuje aminokiselinsku sekvencu datu kao bilo koja od SEQ ID NO: 185 ili 189-303. U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira prekursorski polipeptid F0 koji se, kada se eksprimira u odgovarajućoj ćeliji, obrađuje u otkriveni PreF antigen, gde prekursorski polipeptid F0 uključuje aminokiselinsku sekvencu datu kao ostaci 1-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 185, ili 189-303.
U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira prekursor F0 polipeptid koji se, kada se eksprimira u odgovarajućoj ćeliji, obrađuje u otkriveni PreF antigen koji obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid, i pri čemu F1 polipeptid uključuje disulfidnu vezu između para cisteina na pozicijama 155 i 290, i aminokiselinsku supstituciju za popunjavanje šupljine na poziciji 190; ili disulfidnu vezu između para cisteina ruda na pozicijama 155 i 290, aminokiselinsku supstituciju za popunjavanje šupljine na poziciji 190, i aminokiselinsku supstituciju za popunjavanje šupljine na poziciji 207.
U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira prekursorski polipeptid F0 koji se, kada se eksprimira u odgovarajućoj ćeliji, obrađuje u otkriveni PreF antigen koji obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid, i gde F1 polipeptid uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L i može da uključuje dodatne supstitucije koje obuhvataju: aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207L, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207L, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207F, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207W, aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190W i V207W, ili aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190L i V207W.
U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira prekursorski polipeptid F0 koji se, kada se eksprimira u odgovarajućoj ćeliji, obrađuje u otkriveni PreF antigen koji obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid, gde F2 polipeptid i F1 polipeptid uključuju aminokiselinsku sekvencu datu kao pozicije 26-109, odnosno 137-513 bilo koje od sekvenci SEQ ID NO: 371 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 372 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 373 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L), SEQ ID NO: 374 (RSV A sa supstitucijama S155C, S290C, i S190F), SEQ ID NO: 375 (RSV B sa supstitucijama S155C, S290C, i S190F); ili SEQ ID NO: 376 (goveđi RSV sa supstitucijama S155C, S290C, i S190F). SEQ ID NO 374-376 ne čine deo pronalaska za koji se traži zaštita.
U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira prekursorski polipeptid F0 koji se, kada se eksprimira u odgovarajućoj ćeliji, obrađuje u otkriveni PreF antigen koji obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid humanog RSV podtipa A, humanog RSV podtipa B ili goveđeg RSV, gde F1 polipeptid uključuje stabilizujuće modifikacije S155C, S290C, S190F i V207L.
U jednom neograničavajućem primeru molekul nukleinske kiseline kodira prekursorski polipeptid F0 koji se, kada se eksprimira u odgovarajućoj ćeliji, obrađuje u otkriveni PreF antigen koji obuhvata rekombinantni RSV F protein koji uključuje F2 polipeptid i F1 polipeptid, pri čemu je F1 polipeptid povezan sa proteinom feritina, i pri čemu F2 polipeptid i F1 polipeptid povezani sa proteinom feritina uključuju aminokiselinsku sekvencu datu kao pozicije 26-109, odnosno 137-679 sekvence SEQ ID NO: 377 (RSV A koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F, V207L, sa C-terminalnim domenom feritina), ili SEQ ID NO: 378-382.
U jednom neograničavajućem primeru, molekul nukleinske kiseline uključuje sekvencu datu kao SEQ ID NO: 383 (RSV F protein humanog podtipa A koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, spojen sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis oznakom i StrepTag II).
U drugom neograničavajućem primeru, molekul nukleinske kiseline je ekspresioni vektor, i uključuje sekvencu datu kao SEQ ID NO: 384 (RSV F protein humanog podtipa A koji uključuje aminokiselinske supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L, spojen sa C-terminalnim domenom Foldon, mestom isecanja trombinom, 6xHis oznakom i StrepTag II).
Postupci za manipulaciju i inserciju nukleinskih kiselina ovog otkrića u vektore su dobro poznati u tehnici (videti, na primer, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1994).
Nukleinska kiselina koja kodira PreF antigene (npr. rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, ili konstrukt epitop-skafold protein, ili čestice slične virusu ili nanočestice proteina koje sadrže takve proteine) mogu se klonirati ili umnožiti in vitro postupcima, kao što su lančana reakcija polimeraze (PCR), lančana reakcija ligaze (LCR), sistem za amplifikaciju na bazi transkripcije (TAS), samoodrživi sistem replikacije sekvenci (3SR) i sistem za amplifikaciju na bazi Qβ replikaze (QB). Na primer, polinukleotid koji kodira protein može da bude izolovan lančanom reakcijom polimeraze cDNA pomoću prajmera na osnovu DNK sekvence molekula. Širok spektar metodologija kloniranja i in vitro amplifikacije je dobro poznat stručnjacima u ovoj oblasti. PCR metode su opisane u, na primer, SAD patentu br. 4,683,195; Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.51:263, 1987; i Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Polinukleotidi se takođe mogu izolovati skriningom genomskih ili cDNA biblioteka sa probama odabranim od sekvenci željenog polinukleotida pod strogim uslovima hibridizacije.
Polinukleotidi koji kodiraju PreF antigene (npr. rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, ili konstrukt epitop-skafold protein, ili čestice slične virusu ili nanočestice proteina koje sadrže takve proteine) uključuju rekombinantnu DNK koja je inkorporisana u vektor, u autonomno replicirajućem plazmidu ili virusu ili u genomsku DNK prokariota ili eukariota, ili koja postoji kao poseban molekul (kao što je cDNA) nezavisno od drugih sekvenci. Nukleotidi mogu da budu ribonukleotidi, dezoksiribonukleotidi ili modifikovani oblici oba nukleotida. Izraz uključuje jednostruke i dvostruke oblike DNK.
DNK sekvence koje kodiraju PreF antigene (npr. rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, ili konstrukt epitop-skafold protein, ili čestice slične virusu ili nanočestice proteina koje sadrže takve proteine) mogu da budu eksprimirane in vitro prenosom DNK u odgovarajuću ćeliju-domaćina. Ćelija može da bude prokariotska ili eukariotska. Termin takođe uključuje bilo koje potomstvo predmetne ćelije-domaćina. Podrazumeva se da svi potomci možda nisu identični sa parentalnom ćelijom, jer mogu da postoje mutacije koje se javljaju tokom replikacije. U struci su poznati postupci za stabilni transfer, koji podrazumeva da se strana DNK kontinuirano održava u domaćinu.
Polinukleotidne sekvence koje kodiraju PreF antigene (npr. rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, ili konstrukt epitop-skafold protein, ili čestice slične virusu ili nanočestice proteina koje sadrže takve proteine) mogu da budu funkcionalno povezane sa sekvencama za kontrolu ekspresije. Sekvenca za kontrolu ekspresije koja je funkcionalno povezana sa kodirajućom sekvencom je ligirana, tako da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima koji su kompatibilni sa sekvencama za kontrolu ekspresije. Sekvence za kontrolu ekspresije uključuju, ali nisu ograničene na odgovarajuće promotore, pojačivače, sekvence za završavanje transkripcije, start kodon (tj. ATG) ispred gena koji kodira protein, signal za splajsovanje introna, održavanje ispravnog okvira čitanja tog gena kako bi se omogućila ispravna translacija iRNK i stop kodone.
Domaćini mogu da obuhvataju organizme mikroba, kvasaca, insekata i sisara. Postupci za eksprimiranje DNK sekvenci koje imaju eukariotske ili virusne sekvence u prokariotima su dobro poznati u struci. Neograničavajući primeri odgovarajućih ćelija-domaćina uključuju bakterije, arheje, insekte, gljivice (na primer, kvasac), biljne i životinjske ćelije (na primer, ćelije sisara, kao što su humane). Primeri ćelija za upotrebu uključuju Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella typhimurium, ćelije SF9, ćelije C129, ćelije 293, Neurospora i imortalizovane sisarske mijeloidne i limfoidne ćelijske linije. Tehnike umnožavanja sisarskih ćelija u kulturi su dobro poznate (videti, Jakoby and Pastan (eds), 1979, Cell Culture. Methods in Enzymology, volume 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, N.Y.). Primeri ćelijskih linija sisara najčešće korišćenih kao ćelije-domaćini su ćelije VERO i HeLa, ćelije CHO i ćelijske linije WI38, BHK i COS, mada se mogu koristiti ćelijske linije, kao što su ćelije dizajnirane da obezbede veću ekspresiju, željene obrasce glikozilacije ili druge karakteristike. U nekim primerima izvođenja, ćelije-domaćini uključuju ćelije HEK293 ili njihove derivate, kao što su GnTI<-/->ćelije (ATCC® br. CRL-3022).
Transformacija ćelije-domaćina rekombinantnom DNK može da se obavi konvencionalnim tehnikama, kao što je dobro poznato stručnjacima u ovoj oblasti. Tamo gde je domaćin prokariot, kao što je, ali bez ograničenja, E. coli, kompetentne ćelije koje su sposobne za preuzimanje DNK mogu se pripremiti iz ćelija sakupljenih nakon eksponencijalne faze rasta i naknadno tretiranih metodom CaCl2 korišćenjem procedura poznatih u struci. Alternativno, može da se koristiti MgCl2 ili RbCl. Transformacija takođe može da se izvede nakon formiranja protoplasta ćelije-domaćina po želji, ili elektroporacijom.
Kada je domaćin eukariot, mogu da se koriste postupci transfekcije DNK kao što su kalcijum fosfatni koprecipitati, konvencionalne mehaničke procedure kao što su mikroinjektovanje, elektroporacija, insercija plazmida ubačenog u lipozome ili virusni vektori. Eukariotske ćelije takođe mogu da se ko-transformišu polinukleotidnim sekvencama koje kodiraju otkriveni antigen, a drugi strani molekul DNK koji kodira odabrani fenotip, kao što je gen timidin kinaze herpes simpleksa. Drugi postupak je upotreba eukariotskog virusnog vektora, kao što je simian virus 40 (SV40) ili goveđi papiloma virus, za prolaznu infekciju ili transformaciju eukariotskih ćelija i eksprimiranje proteina (na primer, Eucariotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982).
D. Virusni vektori
Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji mogu da budu uključeni u virusni vektor, na primer za eksprimiranje antigena u ćeliji-domaćinu, ili za imunizaciju subjekta, kao što je ovde otkriveno. U nekim primerima izvođenja, virusni vektori se primenjuju kod subjekta kao deo primarne vakcinacijebuster vakcinacije. U nekim primerima izvođenja, virusni vektori su uključeni u vakcinu, kao što je primarna vakcina ili buster vakcina za upotrebu u primarnoj vakcinaciji-buster vakcinaciji.
U nekoliko primera, virusni vektor koji kodira rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji može da bude replikativno kompetentan. Na primer, virusni vektor može da ima mutaciju (npr. insercija nukleinske kiseline koja kodira PreF antigen) u virusni genom koji ne inhibira virusnu replikaciju u ćelijama-domaćinima. Virusni vektor takođe može da bude uslovno replikativno kompetentan. U drugim primerima, virusni vektor je replikativno deficijentan u ćelijama-domaćinima.
U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji se eksprimira pomoću virusnog vektora koji se može dostaviti preko respiratornog trakta. Na primer, za eksprimiranje otkrivenog antigena koristi se vektor na bazi paramiksovirusa (PIV), kao što je vektor na bazi virusa goveđe parainfluence (BPIV) (npr. vektor, BPIV-1, BPIV-2 ili BPV-3) ili vektor na bazi humanog PIV, vektor na bazi metapneumovirusa (MPV), vektor na bazi virusa Sendia, ili vektor na bazi virusa morbila. Virusni vektor BPIV3 koji eksprimira proteine RSV F i hPIV F (MEDI-534) je trenutno u kliničkim ispitivanjima kao vakcina protiv RSV. Primeri vektora na bazi paramiksovirusa (PIV) za eksprimiranje antigena poznati su stručnjaku u ovoj oblasti (videti, npr. SAD obj. pat. prij. 2012/0045471, 2011/0212488, 2010/0297730, 2010/0278813, 2010/0167270, 2010/0119547, 2009/0263883, 2009/0017517, 2009/0004722, 2008/0096263, 2006/0216700, 2005/0147623, 2005/0142148, 2005/0019891, 2004/0208895, 2004/0005545, 2003/0232061, 2003/0095987 i 2003/0072773). U drugom primeru, za eksprimiranje otkrivenog antigena koristi se vektor na bazi virusa bolesti Njukasl (videti, npr. McGinnes et al., J. Virol., 85: 366-377, 2011, koji opisuje RSV F i G proteine eksprimirane na česticama sličnim virusu bolesti Njukasl). U drugom primeru, vektor na bazi virusa Sendai se koristi za eksprimiranje otkrivenog antigena (videti, npr. Jones et al., Vaccine, 30: 959-968, 2012, koji otkriva upotrebu vakcine protiv RSV na bazi virusa Sendai za izazivanje imunskog odgovora kod primata).
Dodatni virusni vektori su takođe dostupni za eksprimiranje otkrivenih antigena, uključujući vektore na bazi polioma, tj. SV40 (Madzak et al., 1992, J. Gen. Virol., 73:15331536), adenovirusa (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-6; Berliner et al., 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia et al., 1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584; Rosenfeld et al., 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet et al., 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256), virusa vakcinije (Mackett et al., 1992, Biotechnology, 24:495-499), adeno-asociranog virusa (Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:91-123; On et al., 1990, Gene, 89:279-282), virusa herpesa, uključujući HSV i EBV i CMV (Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90; Johnson et al., 1992, J. Virol., 66:29522965; Fink et al., 1992, Hum. Gene Ther.3:11-19; Breakfield et al., 1987, Mol. Neurobiol., 1:337-371; Fresse et al., 1990, Biochem. Pharmacol., 40:2189-2199), virusa Sindbis (H. Herweijer et al., 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; SAD pat. br.5,091,309 i 5,2217,879), alfavirusa (S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol.11:18-22; I. Frolov et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11371-11377) i retrovirusa ptičjeg (Brandyopadhyay et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:749-754; Petropouplos et al., 1992, J. Virol., 66:3391-3397), mišjeg (Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24; Miller et al., 1985, Mol. Cell Biol., 5:431-437; Sorge et al., 1984, Mol. Cell Biol., 4:1730-1737; Mann et al., 1985, J. Virol., 54:401-407), i humanog porekla (Page et al., 1990, J. Virol., 64:5370-5276; Buchschalcher et al., 1992, J. Virol., 66:2731-2739). Bakulovirusni (virus višejedarne poliedroze Autographa californica; AcMNPV) vektori su takođe poznati u tehnici i mogu se dobiti iz komercijalnih izvora (kao što su PharMingen, San Diego, Kalif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla, Kalif.). Dodatni virusni vektori su poznati stručnjaku u ovoj oblasti. U nekim primerima izvođenja, postupci i kompozicije koje su ovde otkrivene uključuju adenovirusni vektor koji eksprimira rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji. Kao izvor virusnog genoma za adenovirusni vektor mogu da se koriste adenovirusi različitog porekla, podtipovi ili mešavina podtipova. Za generisanje adenovirusnog vektora može da se koristi nehumani adenovirus (npr. adenovirus majmuna, šimpanza, gorila, ptica, pasa, ovaca ili goveda). Na primer, majmunski adenovirus se može koristiti kao izvor virusnog genoma adenovirusnog vektora. Majmunski adenovirus može da bude serotipa 1, 3, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38, 39, 48, 49, 50, ili bilo koji drugi serotip majmunskog adenovirusa. Majmunski adenovirus može da bude označen korišćenjem bilo koje odgovarajuće skraćenice poznate u struci, kao što su, na primer, SV, SAdV, SAV ili sAV. U nekim primerima, majmunsku adenovirusni vektor je majmunski adenovirusni vektor serotipa 3, 7, 11, 16, 18, 19, 20, 27, 33, 38, ili 39. U jednom primeru se koristi vektor šimpanze Ad3 serotipa C (videti, npr. Peruzzi et al., Vaccine, 27:1293-1300, 2009). Adenovirus čoveka može se koristiti kao izvor virusnog genoma za adenovirusni vektor. Adenovirus čoveka može da bude različitih podgrupa ili serotipova. Na primer, adenovirus može da bude podgrupa A (npr. serotipovi 12, 18 i 31), podgrupa B (npr. serotipovi 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35 i 50), podgrupa C (npr. serotipovi 1, 2, 5 i 6), podgrupa D (npr. serotipovi 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36-39 i 42-48), podgrupa E (npr. serotip 4), podgrupa F (npr. serotipovi 40 i 41), neklasifikovana serogrupa (npr. serotipovi 49 i 51), ili bilo koji drugi adenovirusni serotip. Stručnjak u ovoj oblasti upoznat je sa replikativno kompetentnim i deficijentnim adenovirusnim vektorima (uključujući jednostruko i višestruko replikativno deficijentne adenoviruse vektore). Primeri replikativno deficijentnih adenovirusnih vektora, uključujući višestruko replikativno deficijentne adenovirusne vektore, otkriveni su u SAD patentu br.5,837,511; 5,851,806; 5,994,106; 6,127,175; 6,482,616 i 7,195,896, i Međunarodnoj prijavi patenta br. WO 94/28152, WO 95/02697, WO 95/16772, WO 95/34671, WO 96/22378, WO 97/12986, WO 97/21826 i WO 03/022311.
E. Kompozicije
Otkriveni PreF antigeni, virusni vektori i molekuli nukleinske kiseline mogu da budu uključeni u farmaceutsku kompoziciju, uključujući terapeutske i profilaktičke formulacije i mogu se kombinovati zajedno sa jednim ili više adjuvanasa i, opciono, drugim terapeutskim sastojcima, kao što su antivirusni lekovi. U nekim primerima izvođenja, kompozicije koje uključuju jedan ili više otkrivenih PreF antigena, virusnih vektora ili molekula nukleinske kiseline su imunogene kompozicije. Kompozicija može da sadrži bilo koji od PreF antigena, uključujući rekombinantni RSV F protein koji je ovde otkriven, (kao što je proteinska nanočestica koja sadrži bilo koji od rekombinantnih RSV F proteina koji su ovde otkriveni), česticu sličnu virusu koja sadrži bilo koji od rekombinantnih RSV F proteina koji je ovde otkriven, molekul nukleinske kiseline koji kodira bilo koji od rekombinantnih RSV F proteina koji su ovde otkriveni, ili vektor koji kodira ili uključujući bilo koji od rekombinantnih RSV F proteina koji su ovde otkriveni.
U nekim primerima izvođenja, kompozicija uključuje prvi izolovani antigen, uključujući rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L, gde se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa A, i drugi izolovani antigen koji uključuje rekombinantni RSV protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L), pri čemu se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa B.
U nekim primerima izvođenja, kompozicija sadrži prvu proteinsku nanočesticu koja uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L, gde se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa A, i drugu proteinsku nanočesticu koja sadrži rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L), pri čemu se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa B.
U nekim primerima izvođenja, kompozicija sadrži prvi virusni vektor koji uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F, i V207L, gde se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa A, i drugi virusni vektor koji uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L), pri čemu se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa B.
U nekim primerima izvođenja, kompozicija sadrži prvu česticu sličnu virusu koja uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L, gde se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa A, i drugu česticu sličnu virusu koja uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L), pri čemu se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa B.
U nekim primerima izvođenja, kompozicija sadrži prvi molekul nukleinske kiseline (kao što je ekspresioni vektor) koji kodira rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L, gde se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa A, i drugi molekul nukleinske kiseline (kao što je ekspresioni vektor) koji uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L), pri čemu se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa B.
Takve farmaceutske kompozicije mogu se dati subjektima različitim načinima primene koji su poznati stručnjaku u ovoj oblasti, na primer, nazalnim, plućnim, intramuskularnim, supkutanim, intravenskim, intraperitonealnim ili parenteralnim putem.
Da bi se formulisale kompozicije, otkriveni PreF antigeni, virusni vektori ili molekuli nukleinske kiseline mogu se kombinovati sa različitim farmaceutski prihvatljivim aditivima, kao i sa bazom ili vehikulumom za disperziju konjugata. Željeni aditivi uključuju, ali nisu ograničeni na, agense za kontrolu pH, kao što su arginin, natrijum hidroksid, glicin, hlorovodonična kiselina, limunska kiselina i slično. Pored toga, mogu da budu uključeni lokalni anestetici (na primer, benzil alkohol), izotonični agensi (na primer, natrijum hlorid, manitol, sorbitol), inhibitori adsorpcije (na primer, TWEEN® 80), sredstva za poboljšanje rastvorljivosti (na primer, ciklodekstrini i njihovi derivati), stabilizatori (na primer, serumski albumin) i redukcioni agensi (na primer, glutation). Adjuvansi, kao što su aluminijum hidroksid (ALHYDROGEL®, dostupan kod Brenntag Biosector, Kopenhagen, Danska i AMPHOGEL®, Wyeth Laboratories, Madison, NJ), Frojndov adjuvans, MPL™ (3-O-deacilovani monofosforil lipida A; Corixa, Hamilton, IN), IL-12 (Genetics Institute, Kembridž, MA) agonisti TLR (kao što su agonisti TLR-9), među mnogim drugim pogodnim adjuvansima dobro poznatim u struci, mogu da budu uključeni u kompozicije.
Kada je kompozicija tečnost, toničnost formulacije, merena u odnosu na toničnost od 0.9% (tež./zapr.) fiziološkog slanog rastvora uzetu kao jediničnu, obično se podešava na vrednost na kojoj neće doći do značajnog, nepovratnog oštećenja tkiva na mestu primene. Generalno, toničnost rastvora je podešena na vrednost od oko 0.3 do oko 3.0, kao što je oko 0.5 do oko 2.0 ili oko 0.8 do oko 1.7.
Otkriveni PreF antigeni, virusni vektori ili molekuli nukleinske kiseline mogu da se disperguju u bazi ili vehikulumu, što može uključivati hidrofilno jedinjenje koje ima kapacitet da disperguje antigene i bilo koje željene aditive. Baza se može izabrati iz širokog spektra pogodnih jedinjenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na kopolimere polikarboksilnih kiselina ili njihovih soli, anhidride karboksilnih kiselina (na primer, maleični anhidrid) sa drugim monomerima (na primer, metil (met)akrilat, akrilna kiselina i slično), hidrofilne vinilne polimere, kao što su polivinil acetat, polivinil alkohol, polivinilpirolidon, derivati celuloze, kao što su hidroksimetilceluloza, hidroksipropilceluloza i slično, i prirodne polimere, kao što je hitozan, kolagen, natrijum alginat, želatin, hijaluronska kiselina i njihove netoksične soli metala. Često, biorazgradivi polimer se bira kao baza ili vehikulum, na primer, polimlečna kiselina, kopolimer poli (mlečna kiselina-glikolna kiselina), polihidroksibuterna kiselina, kopolimer poli (hidroksibuterna kiselina-glikolna kiselina) i njihove smeše. Alternativno ili dodatno, sintetički esteri masnih kiselina, kao što su estri masnih kiselina i poliglicerina, estri masnih kiselina i saharoze i slično mogu se koristiti kao vehikulumi. Hidrofilni polimeri i drugi vehikulumi mogu da se koriste sami ili u kombinaciji, a poboljšan strukturni integritet može se preneti na vehikulum delimičnom kristalizacijom, jonskim vezivanjem, umrežavanjem i slično. Vehikulum može da se obezbedi u različitim oblicima, uključujući tečne ili viskozne rastvore, gelove, paste, prahove, mikrosfere i filmove, na primer za direktnu primenu na površinu sluzokože.
Otkriveni PreF antigeni, virusni vektori ili molekuli nukleinske kiseline mogu se kombinovati sa bazom ili vehikulumom u skladu sa različitim postupcima, a oslobađanje antigena može da se postigne difuzijom, dezintegracijom vehikuluma ili povezanim formiranjem vodenih kanala. U nekim okolnostima, otkriveni antigeni, ili nukleinska kiselina ili virusni vektor, koji kodira, eksprimira ili uključuje antigen, disperguju se u mikrokapsulama (mikrosferama) ili nanokapsulama (nanosferama) pripremljenim od odgovarajućeg polimera, na primer, izobutil 2-cijanoakrilata (videti, na primer, Michael et al., J. Pharmacy Pharmacol. 43:1-5, 1991), i disperguju u biokompatibilnom disperzionom medijumu, koji obezbeđuje kontinuiranu isporuku i biološku aktivnost tokom dužeg vremena.
Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže, kao farmaceutski prihvatljive vehikulume, supstance potrebne za približavanje fiziološkim uslovima, kao što su agensi za podešavanje pH i puferisanje, agensi za podešavanje toničnosti, agensi za vlaženje i slično, na primer, natrijum acetat, natrijum laktat, natrijum hlorid, kalijum hlorid, kalcijum hlorid, sorbitan monolarat i trietanolamin oleat. Za čvrste kompozicije mogu se koristiti konvencionalna netoksični farmaceutski prihvatljivi vehikulumi koji uključuju, na primer, manitol, laktozu, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, talk, celulozu, glukozu, saharozu, magnezijum karbonat i slično farmaceutske čistoće. Farmaceutske kompozicije za primenu otkrivenih PreF antigena, virusnih vektora ili molekula nukleinske kiseline mogu se takođe formulisati kao rastvor, mikroemulzija ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju aktivnih sastojaka. Vehikulum može da bude rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol, i slično) i njihove odgovarajuće smeše. Pravilna fluidnost rastvora može da se održava, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzibilnih formulacija i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželjno je uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole, kao što su manitol i sorbitol, ili natrijum hlorid u kompoziciju. Produžena apsorpcija otkrivenih antigena može se postići uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatin.
U određenim primerima izvođenja, otkriveni PreF antigeni, virusni vektori ili molekuli nukleinske kiseline mogu se primeniti u formulaciji sa produženim oslobađanjem, na primer u kompoziciji koja uključuje polimer sa sporim oslobađanjem. Ove kompozicije se mogu pripremiti sa vehikulumima koji će ih zaštititi od brzog oslobađanja, na primer vehikulumom za kontrolisano oslobađanje, kao što su polimer, mikroinkapsulirani sistem za isporuku ili bioadhezivni gel. Produžena isporuka u različitim kompozicijama otkrića može se postići uključivanjem u kompoziciju agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, hidrogelova aluminijum monostearata i želatina. Kada su poželjne formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem, veziva za kontrolisano oslobađanje pogodna za upotrebu u skladu sa otkrićem uključuju bilo koji biokompatibilan materijal sa kontrolisanim oslobađanjem koji je inertan za aktivni agens i koji može da inkorporira otkriveni antigen i/ili drugi biološki aktivni agens. Brojni takvi materijali su poznati u struci. Korisna veziva sa kontrolisanim oslobađanjem su materijali koji se polako metabolišu pod fiziološkim uslovima nakon njihove isporuke (na primer, na površini sluznice ili u prisustvu telesnih tečnosti). Odgovarajuća veziva uključuju, ali nisu ograničena na biokompatibilne polimere i kopolimere koji su dobro poznati u struci za upotrebu u formulacijama sa kontinuiranim oslobađanjem. Takva biokompatibilna jedinjenja su netoksična i inertna prema okolnim tkivima i ne izazivaju značajne neželjene efekte, kao što su iritacija nosa, imunski odgovor, zapaljenje ili slično. Oni se metaboliše u produkte metabolizma koji su takođe biokompatibilni i lako se eliminišu iz organizma. Brojni sistemi za kontrolisanu isporuku terapijskih proteina su poznati (npr. SAD patent br.5,055,303; SAD patent br.5,188,837; SAD patent br.4,235,871; SAD patent br. 4,501,728; SAD patent br.4,837,028; SAD patent br.4,957,735; i SAD patent br.5,019,369; SAD patent br.5,055,303; SAD patent br. 5,514,670; SAD patent br.5,413,797; SAD patent br.
5,268,164; SAD patent br.5,004,697; SAD patent br.4,902,505; SAD patent br.5,506,206; SAD patent br.5,271,961; SAD patent br.5,254,342; i SAD patent br.5,534,496).
Primeri polimernih materijala za upotrebu uključuju, ali nisu ograničeni na, polimerne matrice izvedene iz kopolimernih i homopolimernih poliestera koji imaju hidrolizabilne estarske veze. Za neke od njih je poznato u struci da su biorazgradivi i da dovede do degradacije proizvoda koji nemaju nikakvu, ili imaju nisku toksičnost. Primeri polimera obuhvataju poliglikolne kiseline i polimlečne kiseline, poli(DL-mlečna kiselina-ko-glikolna kiselina), poli(D-mlečna kiselina-koglikolna kiselina) i poli(L-mlečna kiselina-ko-glikolna kiselina). Drugi korisni biorazgradivi ili bioerodabilni polimeri uključuju, ali nisu ograničeni na polimere, kao što su poli(epsilonkaprolakton), poli(epsilon-kaprolakton-ko-mlečna kiselina), poli(epsilon-kaprolaktin-ko-glikolna kiselina), poli(beta-hidroksi buterna kiselina), poli(alkil-2-cijanoakrilat), hidrogelovi, kao što su poli(hidroksietil metakrilat), poliamidi, poli(aminokiseline) (na primer, L-leucin, glutaminska kiselina, L-asparaginska kiselina i slično), poli(ester urea), poli(2-hidroksietil DL-aspartamid), poliacetalni polimeri, poliortoestri, polikarbonat, polimaleamidi, polisaharidi i njihovih kopolimera. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti (videti, na primer, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). Druge korisne formulacije uključuju mikrokapsule sa kontrolisanim oslobađanjem (SAD patent br.4,652,441 i 4,917,893), kopolimeri mlečna kiselina-glikolna kiselina korisni u izradi mikrokapsula i drugih formulacija (SAD patent br. 4,677,191 i 4,728,721) i kompozicije sa kontinuiranim oslobađanjem za peptide rastvorljive u vodi (SAD patent br.4,675,189).
Farmaceutske kompozicije su obično sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje, skladištenja i upotrebe. Sterilni rastvori se mogu pripremiti uključivanjem otkrivenih PreF antigena, virusnih vektora ili molekula nukleinske kiseline u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih ovde, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtracijom. Generalno, disperzije se pripremaju uključivanjem otkrivenog antigena i/ili drugog biološki aktivnog agensa u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i druge potrebne sastojke od onih koji su ovde nabrojani. U slučaju sterilnih praškova, postupci za pripremu uključuju sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem, što daje prašak otkrivenog antigena i bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno-filtriranog rastvora. Prevencija delovanja mikroorganizama može se postići raznim antibakterijskim i antifungalnim agensima, na primer parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom i slično.
Aktuelni postupci za pripremu kompozicija za primenu su poznati ili očigledni stručnjacima u ovoj oblasti i detaljnije su opisani u publikacijama kao što su Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19<th>Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1995.
U nekim primerima izvođenja, kompozicije uključuju adjuvans. Stručnjak u ovoj oblasti je upoznat sa adjuvansima, na primer, onima koji se mogu uključiti u imunogenu kompoziciju. U nekim primerima izvođenja, adjuvans je izabran da izazove imunski odgovor pomeren u smeru Th1 tipa odgovora kod subjekta kome se daje imunogena kompozicija koja sadrži adjuvans i otkrivene antigene, ili nukleinsku kiselinu ili virusni vektor koji kodira, eksprimira ili uključuje antigen. Jedan pogodan adjuvans je netoksičan bakterijski derivat lipopolisaharida. Primer pogodnog netoksičnog derivata lipida A je monofosforil lipid A ili konkretnije 3-deacilovani monofosforil lipid A (3D-MPL). Videti, na primer, SAD pat. br.4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 i 4,912,094.
3D-MPL prvenstveno podstiče odgovore CD4+ T ćelija sa fenotipom IFN-y (Th1).3D-MPL može da se proizvede u skladu sa postupcima objavljenim u GB2220211 A. Hemijski je to mešavina 3-deacilovanog monofosforil lipida A sa 3, 4, 5 ili 6 acilovanih lanaca. U kompozicijama mogu da se koriste male 3D-MPL čestice. Male 3D-MPL čestice imaju takvu veličinu čestica, da mogu da se sterilno filtriraju kroz filter od 0.22 µm. Takvi preparati su opisani u WO94/21292.
U drugim primerima izvođenja, lipopolisaharid može da bude β(l-6) glukozamin disaharid, kao što je opisano u SAD pat. br.6,005,099 i EP patentu br.0 729 473 B1. Stručnjak u ovoj oblasti bi lako mogao da proizvede razne lipopolisaharide, kao što je 3D-MPL, na osnovu učenja ovih referenci. Pored gore navedenih imunostimulanata (koji su po strukturi slični LPS ili MPL ili 3D-MPL), derivati acilovanih monosaharida i disaharida koji su deo gore navedene strukture MPL takođe su pogodni adjuvansi.
U nekim primerima izvođenja, agonist Toll-u sličnog receptora (TLR) se koristi kao adjuvans. Na primer otkriveni PreF antigen može da se kombinuje sa TLR agonistom u imunogenoj kompoziciji koja se koristi za izazivanje neutrališućeg imunskog odgovora na RSV. Na primer, agonist TLR može da bude agonist TLR-4, kao što je sintetički derivat lipida A (videti, npr. WO 95/14026 i WO 01/46127) alkil glukozaminid fosfat (AGP; videti, npr. WO 98/50399 ili SAD pat. br.
6,303,347; 6,764,840). Drugi pogodni ligandi TLR-4, sposobni da izazovu odgovor signalizacije putem TLR-4, su, na primer, lipopolisaharid iz gram-negativnih bakterija i njegovi derivati, ili njihovi fragmenti, posebno netoksični derivat LPS (kao što je 3D-MPL). Drugi pogodni TLR agonisti su: protein toplotnog šoka (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ili 90; surfaktant protein A, hijaluronski oligosaharidi, fragmenti heparan sulfata, fragmenti fibronektina, peptidi fibrinogena i β-defensin-2 i muramil dipeptid (MDP). U jednom primeru izvođenja agonist TLR je HSP 60, 70 ili 90. Drugi pogodni ligandi TLR-4 su opisani u WO 2003/011223 i WO 2003/099195.
Dodatni agonisti TLR (kao što je agens koji može da prouzrokuje odgovor signalizacije preko signalnog puta TLR) takođe su korisni kao adjuvansi, kao što su agonisti za TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 i/ili TLR9. Shodno tome, u jednom primeru izvođenja, kompozicija dalje uključuje adjuvans koji se bira iz grupe koja se sastoji od: agonista TLR-1, agonista TLR-2, agonista TLR-3, agonista TLR-4, agonista TLR-5, agonista TLR-6, agonista TLR-7, agonista TLR-8, agonista TLR-9 ili njihove kombinacije.
U jednom primeru izvođenja, koristi se agonist TLR koji može da izazove odgovor u vidu prenosa signala putem TLR-1, na primer jedan ili više od: triacilovanih lipopeptida (LP); modulina rastvorljivog u fenolu; LP Mycobacterium tuberculosis; S-(2,3-bis(palmitoiloksi)-(2-RS)-propil)-N-palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-L-ys(4)-OH, trihidrohlorida (Pam3Cys) LP koji oponaša acetilovani amino terminus bakterijskog lipoproteina i OspA LP iz bakterije Borrelia burgdorferi. U drugom primeru izvođenja, koristi se agonist TLR koji može da izazove odgovor u vidu prenosa signala preko TLR-2, kao što je jedan ili više od lipoproteina, peptidoglikana, bakterijskog lipopeptida iz M tuberculosis, B burgdorferi ili T pallidum; peptidoglikana iz vrsta uključujući Staphilococcus aureus; lipoteihoičnih kiselina, manuronskih kiselina, porina Neisseria, bakterijske fimbrije, faktora virulence Yersina, viriona CMV, hemaglutinina morbila i zimosan kvasca. U nekim primerima izvođenja, koristi se agonist TLR koji može da izazove odgovor u vidu prenosa signala preko TLR-3, kao što je jedna ili više od dvolančane RNK (dsRNA), ili poliinizinskopolicitidilne kiseline (poli IC), što je molekularni obrazac nukleinskih kiselina povezan sa virusnom infekcijom. U daljim primerima izvođenja koristi se agonist TLR koji može da izazove odgovor u vidu prenosa signala preko TLR-5, kao što je bakterijski flagelin. U dodatnim primerima izvođenja koristi se agonist TLR koji može da izazove odgovor u vidu prenosa signala preko TLR-6, kao što je jedan ili više od mikobakterijskih lipoproteina, diacilovanog LP i modulina rastvorljivog u fenolu. Dodatni agonisti TLR6 su opisani u WO 2003/043572. U jednom primeru izvođenja, koristi se agonist TLR koji može da izazove odgovor u vidu prenosa signala preko TLR-7, kao što je jedan ili više od jednolančane RNK (ssRNA), loksoribina, analoga guanozina na pozicijama N7 i C8, ili imidazohinolinskog jedinjenja, ili njegovog derivata. U jednom primeru izvođenja, agonist TLR je imikvimod. Dodatni agonisti TLR7 su opisani u WO 2002/085905. U nekim primerima izvođenja, koristi se agonist TLR koji može da izazove odgovor u vidu prenosa signala preko TLR-8. Pogodno, agonist TLR koji može da izazove odgovor u vidu prenosa signala preko TLR-8 je jednolančana RNK (ssRNA), imidazohinolinski molekul sa antivirusnom aktivnošću, na primer rezikvimod (R848); rezikvimod takođe može da prepozna TLR-7. Među drugim agonistima TLR-8 koji mogu da se koriste su oni opisani u WO 2004/071459.
U daljnjim primerima izvođenja, adjuvans uključuje agonist TLR koji može da izazove odgovor u vidu prenosa signala preko TLR-9. Na primer, adjuvans može da uključuje HSP90, bakterijsku ili virusnu DNK i/ili DNK koja sadrži nemetilovane nukleotide CpG (npr. CpG oligonukleotid). Na primer, oligonukleotidi koji sadrže CpG izazivaju pretežno Th1 odgovor. Takvi oligonukleotidi su dobro poznati i opisani, na primer, u WO 95/26204, WO 96/02555, WO 99/33488 i SAD pat. br.
5,278,302, 5,666,153 i 6,008,200 i 5,856,462. Shodno tome, oligonukleotidi za upotrebu kao adjuvansi u otkrivenim kompozicijama uključuju oligonukleotide koji sadrže CpG, na primer, one koji sadrže dva ili više dinukleotidna CpG motiva. Uključeni su i oligonukleotidi sa mešovitim intenukleotidnim vezama.
Drugi adjuvansi koji se mogu koristiti u imunogenim kompozicijama sa antigenima, ili nukleinskom kiselinom ili virusnim vektorom koji kodira, eksprimira ili uključuje antigen, npr. sami ili u kombinaciji sa 3D-MPL ili drugim adjuvansom opisanim ovde, su saponini, kao što je QS21. U nekim primerima, saponini se koriste kao adjuvans, npr. za sistemsku primenu PreF antigena. Korišćenje saponina (npr. upotreba Quil A, koji potiče iz kore južnoameričkog stabla Quillaja Saponaria Molina) kao adjuvanasa je poznato stručnjaku u ovoj oblasti (videti, npr. US 5,057,540 i EP 0 362 279 B1. EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739). Hemolitički saponini QS21 i QS17 (frakcije Quil A prečišćene HPLC metodom) su opisani kao moćni sistemski adjuvansi, a način njihove proizvodnje je otkriven u SAD pat. br.5,057,540 i EP 0362 279 B1.
Adjuvans može da uključuje i mineralne soli, kao što su aluminijumove ili kalcijumove soli, posebno aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat i kalcijum fosfat.
Druga klasa pogodnih adjuvanasa koji pomeraju imunski odgovor u smeru Th1 tipa odgovora za upotrebu u kompozicijama uključuje imunostimulatorne kompozicije ma bazi proteina spoljne membrane (OMP). Imunostimulatorne kompozicije na bazi OMP su posebno pogodne kao adjuvansi za primenu preko sluzokože, npr. za intranazalnu primenu. Imunostimulatorne kompozicije na bazi OMP su rod preparata OMP (uključujući neke porine) iz Gram-negativnih bakterija, npr. vrste Neisseria, koje su korisne kao nosač ili u kompozicijama za imunogene, kao što su bakterijski ili virusni antigeni (videti, npr. SAD pat. br.5,726,292; SAD pat. br.4,707,543). Dalje, proteozomi imaju mogućnost da se samosklapaju u vezikule ili klastere OMP slične vezikulama od oko 20 nm do oko 800 nm, i da nekovalentno inkorporiraju, koordiniraju, povezuju (npr. elektrostatički ili hidrofobno), ili se na drugi način udružuju sa proteinskim antigenima (Ags), posebno antigenima koji imaju hidrofobni fragment. Proteozomi mogu da se pripreme, na primer, kao što je opisano u tehnici (videti npr. SAD pat. br. 5,726,292 ili SAD pat. br. 5,985,284; 2003/0044425.).
Proteozomi su prvenstveno sačinjeni od hemijski ekstrahovanih proteina spoljne membrane (OMP) iz Neisseria meningitidis (uglavnom porina A i B, kao i OMP klase 4), koji se održavaju u rastvoru pomoću deterdženta (Lowell G H. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine M M, Woodrow G C, Kaper J B, Cobon G S, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206). Proteozomi mogu da budu formulisani sa različitim antigenima, kao što su prečišćeni ili rekombinantni proteini dobijeni iz virusnih izvora, uključujući PreF polipeptide koji su ovde otkriveni. Postepeno uklanjanje deterdženta omogućava formiranje čestica hidrofobnih kompleksa od oko 100-200 nm u prečniku (Lowell G H. Proteosomes for Improved Nasal, Oral, or Injectable Vaccines. In: Levine M M, Woodrow G C, Kaper J B, Cobon G S, eds, New Generation Vaccines. New York: Marcel Dekker, Inc.1997; 193-206).
U kompozicijama sa otkrivenim PreF antigenima, virusnim vektorima ili molekulima nukleinske kiseline u kompoziciji mogu da se koriste i kombinacije različitih adjuvanasa. Na primer, kao što je već rečeno, QS21 se može formulisati zajedno sa 3D-MPL. Odnos QS21:3D-MPL će obično biti reda veličine 1:10 do 10:1; kao što je 1:5 do 5:1, i često suštinski 1:1. Tipično, odnos 3D-MPL:QS21 je u rasponu od 2.5:1 do 1:1 (kao što je AS01 (GlaxoSmithKline). Druga kombinacija formulacije adjuvansa uključuje 3D-MPL i aluminijumsku so, kao što je aluminijum hidroksid (kao što je AS04 (GlaxoSmithKline). Kada je formulisana u kombinaciji, ova kombinacija može da poboljša Th1 imunski odgovor specifičan za antigen.
U nekim slučajevima, formulacija adjuvansa ima mineralnu so, kao što je kalcijum ili aluminijum (alum) so, na primer kalcijum fosfat, aluminijum fosfat ili aluminijum hidroksid U nekim primerima izvođenja, adjuvans uključuje emulziju ulja i vode, npr. emulziju ulja u vodi (kao što je MF59 (Novartis) ili AS03 (GlaxoSmithKline). Jedan primer emulzije ulja u vodi sadrži metabolišuće ulje, kao što je skvalen, tokol kao što je tokoferol, npr. alfa-tokoferol i surfaktant, kao što je sorbitan trioleat (Span 85) ili polioksietilen sorbitan monooleat (Tween 80), u vodenom nosaču.
Farmaceutska kompozicija obično sadrži terapeutski efektivnu količinu otkrivenog PreF antigena, virusnog vektora ili molekula nukleinske kiseline i može se pripremiti konvencionalnim tehnikama. Priprema imunogenih kompozicija, uključujući i one za primenu na humanim subjektima, generalno je opisana u Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Inkapsulacija unutar lipozoma je opisana, na primer, u Fullerton, SAD pat. br.4.235.877. Konjugacija proteina u makromolekule otkrivena je, na primer, u Likhite, SAD pat. br.4,372,945 i kod Armor et al., SAD pat. br.4.474.757. Tipično, količina antigena u svakoj dozi imunogene kompozicije je izabrana kao količina koja izaziva imunski odgovor, bez značajnih neželjenih sporednih efekata.
Količina otkrivenog PreF antigena, virusnog vektora ili molekula nukleinske kiseline može varirati u zavisnosti od korišćenog specifičnog antigena, načina i protokola primene i ciljne populacije, na primer. Tipično, svaka humana doza će sadržati 1-1000 μg proteina, kao što je od oko 1 μg do oko 100 μg, na primer, od oko 1 μg do oko 50 μg, kao što je oko 1 μg, oko 2 μg, oko 5 μg, oko 10 μg, oko 15 μg, oko 20 μg, oko 25 μg, oko 30 μg, oko 40 μg ili oko 50 μg. Količina koja se koristi u imunogenoj kompoziciji se bira na osnovu populacije subjekata (npr. novorođenčad ili starije osobe). Optimalna količina za određenu kompoziciju može da se utvrdi standardnim studijama koje uključuju posmatranje titara antitela i drugih odgovora kod subjekata. Podrazumeva se da terapeutski efikasna količina antigena u imunogenoj kompoziciji može da uključuje količinu koja je neefikasna u izazivanju imunskog odgovora davanjem jedne doze, ali je efikasna nakon primene višestrukih doza, na primer u protokolu primarne primene-buster primene.
U nekoliko primera, farmaceutske kompozicije za izazivanje imunskog odgovora protiv RSV kod ljudi uključuju terapeutski efikasnu količinu otkrivenih PreF antigena, virusnih vektora ili molekula nukleinske kiseline za davanje odojčadi (npr. odojčad između rođenja i 1 godine, kao što je između 0 i 6 meseci, u vreme početne doze) ili stariji pacijenti (kao što je subjekt stariji od 65 godina). Razume se da izbor adjuvansa može da bude različit u ovim različitim primenama, a optimalni adjuvans i koncentraciju za svaku situaciju stručnjak u ovoj oblasti može da odredi empirijski.
U određenim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije su vakcine koje smanjuju ili sprečavaju infekciju virusom RSV. U nekim primerima izvođenja, imunogene kompozicije su vakcine koje smanjuju ili sprečavaju patološki odgovor nakon infekcije virusom RSV. Opciono, farmaceutske kompozicije koje sadrže otkriveni PreF antigen, virusni vektor ili molekul nukleinske kiseline formulisane su sa najmanje jednim dodatnim antigenom patogenog organizma različitim od RSV. Na primer, patogeni organizam može da bude patogen respiratornog trakta (kao što je virus ili bakterija koja uzrokuje respiratornu infekciju). U određenim slučajevima, farmaceutska kompozicija sadrži antigen koji potiče iz patogenog virusa različitog od RSV, kao što je virus koji uzrokuje infekciju respiratornog trakta, kao što je influenca ili parainfluenca. U drugim primerima izvođenja, dodatni antigeni su izabrani da olakšaju primenu ili smanje broj inokulacija potrebnih za zaštitu subjekta od mnoštva infektivnih organizama. Na primer, antigen može da potiče iz bilo kog ili više od virusa influence, hepatitisa B, difterije, tetanusa, velikog kašlja, Hemophilus influenza, poliovirusa, Streptococcus ili Pneumococcus, između ostalih.
F. Kompozicije za upotrebu u postupcima lečenja
Pozivanje na postupke lečenja odnosi se na supstance/kompozicije za upotrebu u navedenim postupcima lečenja.
U nekim primerima izvođenja, otkriveni PreF antigeni, ili nukleinska kiselina ili virusni vektor koji kodira, eksprimira ili uključuje PreF antigen se koriste da izazovu imunski odgovor na RSV u subjektu. Tako, u nekim primerima izvođenja, terapeutski efikasna količina imunogene kompozicije koja uključuje jedan ili više otkrivenih PreF antigena, ili nukleinsku kiselinu ili virusni vektor koji kodira, eksprimira ili uključuje antigen, može da se primeni kod subjekta kako bi se generisao imunski odgovor na RSV.
U skladu sa ovim otkrićem, profilaktički ili terapeutski efikasna količina imunogene kompozicije koja uključuje PreF antigen, ili nukleinsku kiselinu ili virusni vektor koji kodira, eksprimira ili uključuje antigen, daje se subjektu kome je potreban takav tretman tokom vremena i pod uslovima dovoljnim da se spreči, inhibira i/ili ublaži RSV infekcija kod subjekta. Imunogena kompozicija se daje u količini dovoljnoj da izazove imunski odgovor protiv RSV antigena, kao što je RSV F protein, u subjektu.
U nekim primerima izvođenja, kompozicija koja se daje subjektu uključuje (ili kodira) prvi rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, i drugi rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji. U nekim primerima izvođenja, kompozicija koja se daje subjektu uključuje smešu (kao što je smeša od oko 1:1, 1:2, 2:1, 2:3, 3:2, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 3:5, 5:3, 1:5, 5:1, 5:7, 7:5), prvog rekombinantnog RSV F proteina koji je RSV F protein podtipa A stabilizovanog u prefuzionoj konformaciji, i drugog rekombinantnog RSV F proteina koji je RSV F protein podtipa B stabilizovanog u prefuzionoj konformaciji.
U nekim primerima izvođenja kompozicija koja se daje subjektu uključuje prvu proteinsku nanočesticu koja sadrži rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L, gde se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa A, i drugu proteinsku nanočesticu koja sadrži rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L), pri čemu se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa B.
U nekim primerima izvođenja kompozicija koja se daje subjektu uključuje prvi molekul nukleinske kiseline (kao što je ekspresioni vektor) koji kodira rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L, gde se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa A, i drugi molekul nukleinske kiseline (kao što je ekspresioni vektor) koji uključuje rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L), pri čemu se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa B.
U nekim primerima izvođenja, subjektu se daje kompozicija koja uključuje nanočestice feritina koje sadrže rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L. U nekim primerima izvođenja kompozicija koja se daje subjektu uključuje prvu nanočesticu feritina koja sadrži rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L, gde se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa A, i drugu nanočesticu feritina koja sadrži rekombinantni RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L), pri čemu se stabilizovani RSV F protein zasniva na RSV F proteinu podtipa B. Postupci za pravljenje nanočestica feritina koje sadrže virusni antigen i njihova upotreba u svrhu imunizacije (npr. za imunizaciju protiv antigena influence) opisani su u tehnici (videti, npr. Kanekiyo et al., Nature, 499:102-106, 2013).
U nekim primerima izvođenja, subjekt se bira za tretman koji ima ili je izložen riziku od razvoja RSV infekcije, na primer, zbog izloženosti ili mogućnosti izlaganja RSV. Nakon primene terapeutski efikasne količine otkrivenih terapijskih kompozicija, kod subjekta može da se prati RSV infekcija, simptomi povezani sa RSV infekcijom, ili oboje. Pošto se gotovo svi ljudi zaraze virusom RSV do 3 godine, celokupna rođena kohorta je uključena kao relevantna populacija za imunizaciju. To se može uraditi, na primer, započinjanjem režima imunizacije bilo kada od rođenja do 6 meseci starosti, od 6 meseci do 5 godina starosti, kod trudnica (ili žena u reproduktivnoj dobi) kako bi zaštitile svoju odojčad pasivnim prenosom antitela, kod članova porodice novorođenčadi ili onih koji su još u materici, i kod subjekata starijih od 50 godina.
Subjekti sa najvećim rizikom od RSV infekcije sa teškim simptomima (npr. koji zahtevaju hospitalizaciju) uključuju nedonoščad, decu sa bronhopulmonalnom displazijom i urođenim srčanim oboljenjima, koja su najpodložnija teškim bolestima. Atopija ili porodična istorija atopije takođe je povezana sa teškom bolešću u ranom detinjstvu. Tokom detinjstva i odrasle dobi, bolest je blaža, ali može da bude povezana sa bolešću donjih disajnih puteva i obično je komplikovana sinuzitisom. Težina bolesti se povećava kod institucionalizovanih starijih osoba (npr. ljudi preko 65 godina). Teška bolest se javlja i kod osoba sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom ili nakon transplantacije koštane srži ili pluća. (Videti, npr. Shay et al., JAMA,282:1440-6, 1999; Hall et al., N Engl J Med.2009;360:588-598; Glezen et al., Am J Dis Child., 1986;140:543-546; i Graham, Immunol. Rev., 239:149-166, 2011). Tako, ovi subjekti mogu da budu izabrani za primenu otkrivenih PreF antigena, ili nukleinske kiseline ili virusnog vektora koji kodira, eksprimira ili uključuje PreF antigen.
Tipični subjekti predviđeni za lečenje kompozicijama i postupcima predmetnog otkrića uključuju ljude, kao i nehumane primate i druge životinje, kao što je stoka. Da bi se identifikovali subjekti za profilaksu ili lečenje u skladu sa postupcima otkrića, koriste se metode skrininga da bi se odredili faktori rizika povezanih sa datom ili sumnjivom bolešću ili stanjem, ili za određivanje statusa postojeće bolesti ili stanja kod subjekta. Ove metode skrininga obuhvataju, na primer, konvencionalno testiranje za određivanje faktora rizika okoline, porodičnih, profesionalnih i drugih takvih faktora rizika koji mogu da budu povezani sa datom ili sumnjivom bolešću ili stanjem, kao i dijagnostičke metode, kao što su razne ELISA i druge metode imunoeseja, koji su dostupni i dobro poznati u struci za detekciju i/ili karakterizaciju RSV infekciju. Ove i druge rutinske metode omogućavaju kliničaru da odabere pacijente kojima je potrebna terapija korišćenjem postupaka i farmaceutskih kompozicija u skladu sa otkrićem. Imunogena kompozicija može da se primenjuje kao samostalni program profilakse ili lečenja, ili kao naknadni, dopunski ili koordinisani režim lečenja sa drugim tretmanima.
Imunogena kompozicija se može koristiti u koordinisanim protokolima vakcinacije ili kombinovanim formulacijama. U određenim primerima izvođenja, kombinovane imunogene kompozicije i koordinisani protokoli imunizacije koriste odvojene imunogene ili formulacije, od kojih je svaka usmerena na izazivanje imunskog odgovora na RSV antigen, kao što je imunski odgovor na RSV F protein. Odvojene imunogene kompozicije koje izazivaju imunski odgovor na RSV antigen mogu da se kombinuju u polivalentnoj imunogenoj kompoziciji koja se primenjuje na subjekt u jednom koraku imunizacije, ili mogu da se primene odvojeno (u monovalentnim imunogenim kompozicijama) u koordinisanom protokolu imunizacije.
Primena imunogenih kompozicija može da bude za profilaktičku ili terapeutsku svrhu. Kada se daje profilaktički, imunogena kompozicija se daje pre bilo kog simptoma, na primer pre infekcije. Profilaktička primena imunogenih kompozicija služi za sprečavanje ili ublažavanje bilo koje naknadne infekcije. Kada se daje terapeutski, imunogena kompozicija se daje pri ili nakon pojave simptoma bolesti ili infekcije, na primer nakon razvoja simptoma RSV infekcije, ili nakon dijagnoze RSV infekcije. Imunogena kompozicija se tako može dati pre predviđenog izlaganja virusu RSV kako bi se ublažila očekivana težina, trajanje ili stepen infekcije i/ili pridruženih simptoma bolesti, nakon izlaganja ili sumnje na izloženost virusu, ili nakon stvarnog započinjanja infekcije.
Primena izaziva imunski odgovor dovoljan za lečenje ili sprečavanje patogene infekcije, na primer, dovoljan da inhibira infekciju i/ili smanji znakove i/ili simptome infekcije. Količine koje su efikasne za ovu upotrebu zavisiće od težine bolesti, opšteg stanja zdravlja subjekta i robusnosti imunskog sistema subjekta. Terapeutski efikasna količina otkrivenih imunogenih kompozicija je ona koja pruža ili subjektivno olakšanje jednog ili više simptoma, ili objektivno prepoznatljivo poboljšanje, kao što je navedeno od strane kliničara ili drugog kvalifikovanog posmatrača.
Za profilaktičke i terapeutske svrhe, imunogena kompozicija se može primeniti kod subjekta u jednoj bolus isporuci, putem kontinuirane isporuke (na primer, kontinuirana transdermalna, mukozna ili intravenska isporuka) tokom dužeg vremenskog perioda, ili prema protokolu ponovljene primene (na primer, po protokolu ponovljene primene po satima, dnevno ili nedeljno). Terapeutski efikasna doza imunogene kompozicije može se obezbediti kao ponovljene doze u okviru produženog režima profilakse ili lečenja koji će dati klinički značajne rezultate za ublažavanje jednog ili više simptoma ili stanja koja mogu da se detektuju u vezi sa datom bolešću ili stanjem kao što je ovde navedeno. Određivanje efikasnih doza u ovom kontekstu se obično zasniva na studijama životinjskih modela praćenim kliničkim ispitivanjima na ljudima i rukovodi se protokolima primene koji značajno smanjuju pojavu ili ozbiljnost simptoma date bolesti ili stanja kod subjekta. Pogodni modeli u tom pogledu uključuju, na primer, miševe, pacove, svinje, mačke, tvorove, nehumane primate i druge ustanovljene subjekte životinjskih modela poznate u tehnici. Alternativno, efikasne doze se mogu odrediti korišćenjem in vitro modela (na primer, imunološki i histopatološki testovi). Uz korišćenje takvih modela, potrebni su samo rutinski proračuni i prilagođavanja da bi se utvrdila odgovarajuća koncentracija i doza za primenu terapeutski efikasne količine imunogene kompozicije (na primer, količine koje su efikasne za izazivanje željenog imunskog odgovora ili ublažavanje jednog ili više simptoma date bolesti). U alternativnim primerima izvođenja, efikasna količina ili efektivna doza imunogene kompozicije mogu jednostavno da inhibiraju ili poboljšaju jednu ili više odabranih bioloških aktivnosti koje su u korelaciji sa bolešću ili stanjem, kako je ovde navedeno, u terapeutske ili dijagnostičke svrhe.
U jednom primeru izvođenja, pogodan režim imunizacije uključuje najmanje tri odvojene inokulacije jednom ili većim brojem imunogenih kompozicija, pri čemu se druga inokulacija primenjuje više od oko dve, oko tri do osam, ili oko četiri nedelje, nakon prve inokulacije. Generalno, treća inokulacija se primenjuje nekoliko meseci nakon druge inokulacije, a u specifičnim primerima izvođenja više od pet meseci nakon prve inokulacije, više od šest meseci do oko dve godine nakon prve inokulacije, ili oko osam meseci do oko godinu dana nakon prve inokulacije. Periodične inokulacije nakon treće inokulacije takođe su poželjne da bi se poboljšalo „imunološko pamćenje“ subjekta. Adekvatnost odabranih parametara vakcinacije, npr. formulacija, doza, režim i slično, može se odrediti uzimanjem alikvota seruma od subjekta i ispitivanjem titara antitela tokom programa imunizacije. Ako takvo praćenje ukazuje na to da je vakcinacija suboptimalna, subjekt može da primi buster dozu imunogene kompozicije, a parametri vakcinacije mogu se modifikovati na način za koji se očekuje da će pojačati imunski odgovor. Smatra se da može da se obavi višestruka dopunska imunizacija, i da svaka dopunska imunizacija može da uključuje isti ili drugačiji PreF antigen.
Za protokole primarne imunizacije-buster imunizacije, primarna vakcinacija može da se primeni kao jedna doza ili više doza, na primer dve doze, tri doze, četiri doze, pet doza, šest doza ili više, mogu da se daju subjektu tokom dana, nedelja ili meseci. Buster imunizacija može da se primeni kao jedna doza ili više doza, na primer dve do šest doza, ili više, mogu da se primene kod subjekta tokom dana, nedelja ili meseci. Takođe može da se primeni i više buster imunizacija, od jedne do pet, ili više. Različite doze se mogu koristiti u nizu sekvencijalnih inokulacija. Na primer, relativno velika doza primarne inokulacije, a zatim buster inokulacija sa relativno manjim dozama. Imunski odgovor protiv izabrane antigene površine može se generisati jednom ili većim brojem inokulacija subjekta imunogenom kompozicijom koja je ovde otkrivena.
U nekim primerima izvođenja, primarna kompozicija koja se daje subjektu uključuje (ili kodira) rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, a buster kompozicija koja se daje subjektu uključuje (ili kodira) rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji. U nekim primerima izvođenja, primarna kompozicija koja se daje subjektu uključuje (ili kodira) rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, a buster kompozicija koja se daje subjektu uključuje (ili kodira) rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji.
U nekim primerima izvođenja, postupci obuhvataju primenu kompozicije koja uključuje rekombinantni RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji i rekombinantni RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, jednom ili više nego jednom (kao u protokolu za primarnu imunizaciju-buster imunizaciju) kao niz injekcija.
U nekim primerima izvođenja, postupci uključuju primenu kompozicije koja sadrži nanočesticu feritina koja uključuje rekombinantni RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji i nanočesticu feritina koja uključuje rekombinantni RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, jednom ili više nego jednom (kao u protokolu za primarnu imunizaciju-buster imunizaciju) kao niz injekcija.
U nekim primerima izvođenja, postupci uključuju primenu kompozicije koja sadrži vektor koji kodira rekombinantni RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji i vektor koji kodira rekombinantni RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, jednom ili više nego jednom (kao u protokolu za primarnu imunizaciju-buster imunizaciju) kao niz injekcija. U nekim primerima izvođenja, postupak može dodatno da obuhvata davanje kompozicije koja uključuje rekombinantni RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji i rekombinantni RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, i/ili kompozicije koja sadrži nanočesticu feritina koja uključuje rekombinantni RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji i nanočesticu feritina koja uključuje rekombinantni RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji.
U nekim primerima izvođenja, postupci obuhvataju primenu kompozicije koja uključuje molekul nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji i molekul nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji jednom ili više nego jednom (kao u protokolu za primarnu imunizaciju-buster imunizaciju) kao niz injekcija. U nekim primerima izvođenja, postupak može dodatno da obuhvata davanje kompozicije koja uključuje rekombinantni RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji i rekombinantni RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, i/ili kompozicije koja sadrži nanočesticu feritina koja uključuje rekombinantni RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji i nanočesticu feritina koja uključuje rekombinantni RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji.
U nekim primerima izvođenja, svaka od primarne i buster kompozicije date subjektu uključuje (ili kodira) prvi rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, i drugi rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji. U nekim primerima izvođenja, svaka od primarne i buster kompozicije date subjektu uključuje (ili kodira) smešu (kao što je smeša od oko 1:1, 1:2, 2:1, 2:3, 3:2, 1:3, 3:1, 1:4, 4:1, 3:5, 5:3, 1:5, 5:1, 5:7, 7:5), prvog rekombinantnog RSV F proteina koji je RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, i drugog rekombinantnog RSV F proteina koji je RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji.
U nekim primerima izvođenja, primarne i buster kompozicije koje se daju subjektu uključuju rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L i drugi rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od supstitucija koje su ovde otkrivene (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L).
U nekim primerima izvođenja, svaka od primarne i buster kompozicije date subjektu uključuje molekul nukleinske kiseline koji kodira rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L, i molekul nukleinske kiseline koji kodira rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L).
U nekim primerima izvođenja, svaka od primarne i buster kompozicije date subjektu uključuje prvu proteinsku nanočesticu (kao što je nanočestica feritina) koja uključuje rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L, i drugu proteinsku nanočesticu (kao što je nanočestica feritina) koja uključuje rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L).
U nekim primerima izvođenja, svaka od primarne i buster kompozicije date subjektu uključuje vektor koji uključuje ili kodira rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L, i vektor koji uključuje ili kodira rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L).
U nekim primerima izvođenja, primarna kompozicija koja se daje subjektu uključuje prvi molekul nukleinske kiseline (kao što je DNK plazmidni ekspresioni vektor) koji kodira rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću supstitucija S155C, S290C, S190F i V207L supstitucije), i drugi molekul nukleinske kiseline (kao što je DNK plazmidni ekspresioni vektor) koji uključuje rekombinantni RSV F protein koji je RSV protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od supstitucija koje su ovde otkrivene (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L), a buster kompozicija koja se daje subjektu sadrži prvu nanočesticu proteina (kao što je nanočestica feritina) koja uključuje rekombinantni RSV F protein koji je RSV F protein podtipa A stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje od ovde otkrivenih supstitucija (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L) i drugu nanočesticu proteina (kao što je nanočestica feritina) koja uključuje rekombinantni RSV protein koji je RSV F protein podtipa B stabilizovan u prefuzionoj konformaciji pomoću bilo koje ovde otkrivene supstitucije (kao što su supstitucije S155C, S290C i S190F ili supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L).
Imunizacioni protokoli koji koriste primarnu imunizaciju na bazi DNK plazmida i buster imunizaciju na bazi nanočestica feritina su poznati stručnjaku u ovoj oblasti (videti, npr. Wei et al., Science, 329(5995): 1060-4, 2010).
Stvarna doza imunogene kompozicije će varirati u zavisnosti od faktora kao što su indikacija bolesti i specifični status subjekta (na primer, starost subjekta, veličina, fizičko stanje, težina simptoma, faktori osetljivosti i slično), vreme i put primene, drugi lekovi ili tretmani koji se primenjuju istovremeno, kao i specifična farmakologija imunogene kompozicije za izazivanje željene aktivnosti ili biološkog odgovora kod subjekta. Režimi doziranja se mogu prilagoditi kako bi se obezbedio optimalan profilaktički ili terapeutski odgovor. Kao što je opisano u gore navedenom spisku termina, efikasna količina je takođe ona kod koje, sa kliničke tačke gledišta, terapeutski korisnim efektima prevazilaze toksične ili štetne sporedne efekte otkrivenog antigena i/ili drugog biološki aktivnog sredstva.
Neograničavajući opseg za terapeutski efikasnu količinu otkrivenih PreF antigena unutar postupaka i imunogenih kompozicija otkrića je oko 0.0001 mg/kg telesne težine do oko 10 mg/kg telesne težine, kao što je oko 0.01 mg/kg, oko 0.02 mg/kg, oko 0.03 mg/kg, oko 0.04 mg/kg, oko 0.05 mg/kg, oko 0.06 mg/kg, oko 0.07 mg/kg, oko 0.08 mg/kg, oko 0.09 mg/kg, oko 0.1 mg/kg, oko 0.2 mg/kg, oko 0.3 mg/kg, oko 0.4 mg/kg, oko 0.5 mg/kg, oko 0.6 mg/kg, oko 0.7 mg/kg, oko 0.8 mg/kg, oko 0.9 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 1.5 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 2.5 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, ili oko 10 mg/kg, na primer 0.01 mg/kg do oko 1 mg/kg telesne težine, oko 0.05 mg/kg do oko 5 mg/kg telesne težine, oko 0.2 mg/kg do oko 2 mg/kg telesne težine, ili oko 1.0 mg/kg do oko 10 mg/kg telesne težine.
U nekim primerima izvođenja, doza unapred određene količine otkrivenog PreF antigena, ili nukleinske kiseline ili virusnog vektora koji kodira, eksprimira ili uključuje PreF antigen, uključuje dozu za decu, odrasle, starije osobe, itd., na primer, od oko 1-300 μg, doza od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, ili oko 300 μg PreF antigena, ili nukleinske kiseline ili virusnog vektora koji kodira, eksprimira ili uključuje PreF antigena. Doziranje i broj doza zavisiće od situacije, na primer, kod odrasle osobe ili bilo koga ko je prethodno bio izložen RSV infekciji ili imunizaciji, jedna doza može da bude dovoljan buster. Kod odojčadi koja nisu bila izložena virusu RSV, u nekim primerima, biće date najmanje dve doze, na primer, najmanje tri doze. U nekim primerima izvođenja, godišnja buster imunizacija daje se starijim osobama (npr. ljudima starijim od 60 godina) jednom godišnje, na primer, zajedno sa godišnjom vakcinacijom protiv gripa. Postupci za pripremu kompozicija koje se mogu primeniti poznati su ili očigledni stručnjaku u ovoj oblasti i detaljnije opisani u publikacijama kao što je Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19<th>Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1995.
Nadležni lekar može da varira dozu kako bi se održala željena koncentracija na ciljnoj lokaciji (na primer, sistemska cirkulacija). Više ili niže koncentracije mogu da se odaberu na osnovu načina isporuke, na primer, trans-epidermalne, rektalne, oralne, plućne ili intranazalne isporuke u odnosu na intravensku ili supkutanu isporuku. Doziranje se takođe može podesiti na osnovu brzine oslobađanja primenjene formulacije, na primer, intrapulmonalni sprej u odnosu na prašak, oralna formulacija sa kontinuiranim oslobađanjem u odnosu na injektabilnu čestičnu formulaciju ili formulaciju za transdermalnu isporuku, i tako dalje. Da bi se postigao isti nivo koncentracije u serumu, na primer, čestice sa sporim oslobađanjem sa brzinom oslobađanja od 5 nM (u standardnim uslovima) mogu se primenjivati u približno dvostrukoj dozi u odnosu na čestice sa brzinom oslobađanja od 10 nM.
Nakon primene imunogene kompozicije ovog otkrića, imunski sistem subjekta obično reaguje na imunogenu kompoziciju proizvodeći antitela specifična za prefuzionu konformaciju RSV F proteina. Takav odgovor označava da je isporučena efikasna doza imunogene kompozicije.
U nekim primerima izvođenja, može da bude korisno da se ovde opisane imunogene kompozicije primenjuju sa drugim agensima kao što su proteini, peptidi, antitela i drugi antivirusni agensi, kao što su anti-RSV agensi. Neograničavajući primeri anti-RSV agenasa uključuju monoklonsko antitelo palivizumab (SYNAGIS®; Medimmune, Inc.) i niskomolekulski antivirusni lek ribavirin (koji proizvode mnoge kompanije, npr. Warrick Pharmaceuticals, Inc.). U određenim primerima izvođenja, imunogene kompozicije se primenjuju istovremeno sa drugim anti-RSV agensima. U određenim primerima izvođenja, imunogene kompozicije se primenjuju sekvencijalno sa drugim anti-RSV terapeutskim agensima, kao što je pre ili posle drugog agensa. Stručnjak u ovoj oblasti bi znao da sekvencijalna primena može da znači odmah nakon, ili posle odgovarajućeg vremenskog perioda, kao što su sati, dani, nedelje, meseci, ili čak godina kasnije.
U dodatnim primerima izvođenja, terapeutski efikasna količina farmaceutske kompozicije koja uključuje nukleinsku kiselinu koja kodira otkriveni PreF antigen, daje se subjektu kako bi se generisao imunski odgovor. U jednom specifičnom, ne-ograničavajućem primeru, terapeutski efikasna količina nukleinske kiseline koja kodira otkriveni antigen daje se subjektu za lečenje ili sprečavanje ili inhibiranje RSV infekcije.
Jedan pristup primeni nukleinskih kiselina je direktna imunizacija plazmidnom DNK, kao što je ekspresioni plazmid sisara. Kao što je gore opisano, nukleotidna sekvenca koja kodira otkriveni antigen može se postaviti pod kontrolu promotora kako bi se povećala ekspresija molekula. Drugi pristup bi koristio RNK (kao što je nevirusna isporuka samoumnožavajućih RNK vakcina, videti, npr. Geall et al., Proc Natal Acad Sci U S A, 109: 14604-9, 2012.
Imunizacija konstrukata nukleinske kiseline dobro je poznata u struci i opisana je, na primer, u SAD patentu br.5,643,578 (koji opisuje postupke imunizacije kičmenjaka uvođenjem DNK koja kodira željeni antigen za izazivanje ćelijskog ili humoralnog odgovora), i SAD patentu br.
5,593,972 i SAD patentu br. 5,817,637 (koji opisuju funkcionalno povezivanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira antigen sa regulatornim sekvencama koje omogućavaju ekspresiju). SAD patent br.5,880,103 opisuje nekoliko postupaka za isporuku nukleinskih kiselina koje kodiraju imunogene peptide ili druge antigene u organizam. Postupci uključuju lipozomsku isporuku nukleinskih kiselina (ili samih sintetičkih peptida) i imunostimulatornih konstrukata, ili ISCOMS™, negativno naelektrisanih rešetkastih struktura veličine 30-40 nm formirane spontano pri mešanju holesterola i Quil A™ (saponin). Zaštitni imunitet je generisan u različitim eksperimentalnim modelima infekcije, uključujući toksoplazmozu i tumore izazvane virusom Epstein-Barr, korišćenjem ISCOMS™ kao vehikuluma za isporuku antigena (Mowat and Donachie, Immunol. Today 12:383, 1991). Nađeno je da tako niske doze, kao što je 1 μg antigena inkapsuliranog u ISCOMS™ proizvode CTL odgovor posredovan klasom I (Takahashi et al., Nature 344:873, 1990).
U drugom pristupu korišćenju nukleinskih kiselina za imunizaciju, otkriveni antigen može da bude eksprimiran i atenuiranim virusnim domaćinima ili vektorima ili bakterijskim vektorima. Rekombinantni virus vakcinije, adenovirus, adeno-asocirani virus (AAV), herpes virus, retrovirus, citomegalovirus ili drugi virusni vektori mogu da se koriste za eksprimiranje peptida ili proteina, čime se izaziva CTL odgovor. Na primer, vektori vakcinije i postupci korisni u protokolima imunizacije opisani su u SAD patentu br. 4,722,848. BCG (Bacillus Calmette Guerin) daje još jedan vektor za eksprimiranje peptida (videti Stover, Nature 351:456-460, 1991).
U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira otkriveni PreF antigen uvodi se direktno u ćelije. Na primer, nukleinska kiselina može standardnim postupcima da se nanese na zlatne mikrosfere i uvede u kožu uređajem kao što je Bio-Radov genski pištolj HELIOS™. Nukleinska kiselina može da bude „gola“, koja se sastoji od plazmida pod kontrolom jakog promotora. Obično, DNK se ubrizgava u mišić, mada može takođe da se ubrizgava direktno na druga mesta, uključujući tkiva u blizini metastaza. Doze za injekcije su obično oko 0.5 μg/kg do oko 50 mg/kg, i obično su oko 0.005 mg/kg do oko 5 mg/kg (videti, npr. SAD patent br.5,589,466). Pored gore navedenih terapeutskih postupaka, bilo koji od otkrivenih PreF antigena može se koristiti za proizvodnju antigen-specifičnih imunodijagnostičkih reagenasa, na primer, za seronadzor. Imunodijagnostički reagensi se mogu dizajnirati polazeći od bilo kog antigena koji je ovde opisan. Na primer, u slučaju otkrivenih antigena, prisustvo serumskih antitela na RSV prati se korišćenjem izolovanih antigena koji su ovde otkriveni, na primer za detekciju RSV infekcije i/ili prisustva antitela koja se specifično vezuju za prefuzionu konformaciju RSV F proteina. Generalno, postupak uključuje dovođenje u kontakt uzorka uzetog od subjekta, kao što je, ali bez ograničenja, uzorak krvi, seruma, plazme, urina ili sputuma subjekta sa jednim ili više antigena RSV F proteina stabilizovanog u prefuzionoj konformaciji koja je ovde otkriven i detektovanje vezivanja antitela u uzorku za otkrivene imunogene. Vezivanje se može detektovati na bilo koji način poznat stručnjaku u ovoj oblasti, uključujući upotrebu obeleženih sekundarnih antitela koja se specifično vezuju za antitela iz uzorka. Obeleživači uključuju radioobeleživače, enzimske obeleživače i fluorescentne obeleživače.
Pored toga, detekcija antitela koje se vezuje za prefuzioni RSV F takođe omogućava praćenje odgovora subjekta na imunizaciju otkrivenim antigenom. U narednim primerima izvođenja, određen je titar antitela koje se vezuje za prefuzioni RSV F. Vezivanje se može detektovati na bilo koji način poznat stručnjaku u ovoj oblasti, uključujući upotrebu obeleženih sekundarnih antitela koja se specifično vezuju za antitela iz uzorka. Obeleživači uključuju radioobeleživače, enzimske obeleživače i fluorescentne obeleživače. U drugim primerima izvođenja, otkriveni imunogen se koristi za izolaciju antitela prisutnih u subjektu ili biološkom uzorku dobijenom od subjekta.
G. Kompleti
Obezbeđeni su i kompleti. Na primer, kompleti za lečenje ili sprečavanje RSV infekcije kod subjekta, ili za detekciju prisustva antitela specifičnih za prefuzioni RSV F protein u serumu subjekta. Kompleti obično uključuju jedan ili više PreF antigena, ili nukleinsku kiselinu ili virusni vektor koji kodira, eksprimira ili uključuje antigen.
Komplet može da uključuje posudu i etiketu ili obaveštenje o proizvodu u pakovanju na njoj, ili povezan sa posudom. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve itd. Posude mogu da budu napravljene od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Posuda obično sadrži kompoziciju koja uključuje jedan ili više otkrivenih PreF antigena, ili nukleinsku kiselinu ili virusni vektor koji kodira, eksprimira ili uključuje antigen, koja je efikasna za lečenje ili sprečavanje RSV infekcije. U nekim primerima izvođenja posuda može da ima sterilni priključak (na primer posuda može da bude kesa sa intravenskim rastvorom ili bočica sa čepom koji može da se probije iglom za potkožnu injekciju). Nalepnica ili uputstvo u pakovanju označavaju da se kompozicija koristi za lečenje određenog stanja.
Etiketa ili obaveštenje o proizvodu u pakovanju će obično dodatno uključiti uputstva za upotrebu PreF antigena, ili nukleinske kiseline ili virusnog vektora koji kodira, eksprimira ili uključuje antigen, na primer, u postupku lečenja ili sprečavanja RSV infekcije. Obaveštenje o proizvodu u pakovanju obično uključuje uputstva koja se obično nalaze u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda koji sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima vezanim za upotrebu takvih terapeutskih proizvoda. Uputstva mogu da budu pisana, u elektronskom obliku (kao što je kompjuterska disketa ili kompakt disk) ili mogu da budu vizuelni (kao što je video datoteka). Kompleti mogu takođe da uključuju dodatne komponente kako bi olakšali određenu primenu za koju je komplet dizajniran. Kompleti mogu dodatno da uključuju pufere i druge reagense koji se rutinski koriste za izvođenje određenog postupka. Takvi kompleti i odgovarajući sadržaji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
Kako je ovde upotrebljeno, pozivanje na:
„bilo koju od SEQ ID NO: 1-184“ se odnosi na „SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, ili SEQ ID NO: 184“
„SEQ ID NO: 698-828“ se odnosi na „bilo koju od „SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 705, SEQ ID NO: 706, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 710, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 720, SEQ ID NO: 721, SEQ ID NO: 722, SEQ ID NO: 723, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 730, SEQ ID NO: 731, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 736, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO: 752, SEQ ID NO: 753, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 770, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 773, SEQ ID NO: 774, SEQ ID NO: 775, SEQ ID NO: 776, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 779, SEQ ID NO: 780, SEQ ID NO: 781, SEQ ID NO: 782, SEQ ID NO: 783, SEQ ID NO: 784, SEQ ID NO: 785, SEQ ID NO: 786, SEQ ID NO: 787, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 789, SEQ ID NO: 790, SEQ ID NO: 791, SEQ ID NO: 792, SEQ ID NO: 793, SEQ ID NO: 794, SEQ ID NO: 795, SEQ ID NO: 796, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 799, SEQ ID NO: 800, SEQ ID NO: 801, SEQ ID NO: 802, SEQ ID NO: 803, SEQ ID NO: 804, SEQ ID NO: 805, SEQ ID NO: 806, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813, SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 816, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 819, SEQ ID NO: 820, SEQ ID NO: 821, SEQ ID NO: 822, SEQ ID NO: 823, SEQ ID NO: 824, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 826, SEQ ID NO: 827, ili SEQ ID NO: 828“.
„SEQ ID NO: 1474-1478“ se odnosi na „bilo koju od SEQ ID NO: 1474, SEQ ID NO: 1475, SEQ ID NO: 1476, SEQ ID NO: 1477, ili SEQ ID NO: 1478“.
„SEQ ID NO: 829-1025“ se odnosi na „bilo koju od SEQ ID NO: 829, SEQ ID NO: 830, SEQ ID NO: 831, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 833, SEQ ID NO: 834, SEQ ID NO: 835, SEQ ID NO: 836, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 839, SEQ ID NO: 840, SEQ ID NO: 841, SEQ ID NO: 842, SEQ ID NO: 843, SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 845, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 849, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 851, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 853, SEQ ID NO: 854, SEQ ID NO: 855, SEQ ID NO: 856, SEQ ID NO: 857, SEQ ID NO: 858, SEQ ID NO: 859, SEQ ID NO: 860, SEQ ID NO: 861, SEQ ID NO: 862, SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 864, SEQ ID NO: 865, SEQ ID NO: 866, SEQ ID NO: 867, SEQ ID NO: 868, SEQ ID NO: 869, SEQ ID NO: 870, SEQ ID NO: 871, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 873, SEQ ID NO: 874, SEQ ID NO: 875, SEQ ID NO: 876, SEQ ID NO: 877, SEQ ID NO: 878, SEQ ID NO: 879, SEQ ID NO: 880, SEQ ID NO: 881, SEQ ID NO: 882, SEQ ID NO: 883, SEQ ID NO: 884, SEQ ID NO: 885, SEQ ID NO: 886, SEQ ID NO: 887, SEQ ID NO: 888, SEQ ID NO: 889, SEQ ID NO: 890, SEQ ID NO: 891, SEQ ID NO: 892, SEQ ID NO: 893, SEQ ID NO: 894, SEQ ID NO: 895, SEQ ID NO: 896, SEQ ID NO: 897, SEQ ID NO: 898, SEQ ID NO: 899, SEQ ID NO: 900, SEQ ID NO: 901, SEQ ID NO: 902, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 915, SEQ ID NO: 916, SEQ ID NO: 917, SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 919, SEQ ID NO: 920, SEQ ID NO: 921, SEQ ID NO: 922, SEQ ID NO: 923, SEQ ID NO: 924, SEQ ID NO: 925, SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, SEQ ID NO: 946, SEQ ID NO: 947, SEQ ID NO: 948, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 951, SEQ ID NO: 952, SEQ ID NO: 953, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 959, SEQ ID NO: 960, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 964, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 968, SEQ ID NO: 969, SEQ ID NO: 970, SEQ ID NO: 971, SEQ ID NO: 972, SEQ ID NO: 973, SEQ ID NO: 974, SEQ ID NO: 975, SEQ ID NO: 976, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 980, SEQ ID NO: 981, SEQ ID NO: 982, SEQ ID NO: 983, SEQ ID NO: 984, SEQ ID NO: 985, SEQ ID NO: 986, SEQ ID NO: 987, SEQ ID NO: 988, SEQ ID NO: 989, SEQ ID NO: 990, SEQ ID NO: 991, SEQ ID NO: 992, SEQ ID NO: 993, SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 996, SEQ ID NO: 997, SEQ ID NO: 998, SEQ ID NO: 999, SEQ ID NO: 1000, SEQ ID NO: 1001, SEQ ID NO: 1002, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO: 1010, SEQ ID NO: 1011, SEQ ID NO: 1012, SEQ ID NO: 1013, SEQ ID NO: 1014, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1016, SEQ ID NO: 1017, SEQ ID NO: 1018, SEQ ID NO: 1019, SEQ ID NO: 1020, SEQ ID NO: 1021, SEQ ID NO: 1022, SEQ ID NO: 1023, SEQ ID NO: 1024, ili SEQ ID NO: 1025“.
„SEQ ID NO: 969-1025“ se odnosi na „bilo koju od SEQ ID NO: 969, SEQ ID NO: 970, SEQ ID NO: 971, SEQ ID NO: 972, SEQ ID NO: 973, SEQ ID NO: 974, SEQ ID NO: 975, SEQ ID NO: 976, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 980, SEQ ID NO: 981, SEQ ID NO: 982, SEQ ID NO: 983, SEQ ID NO: 984, SEQ ID NO: 985, SEQ ID NO: 986, SEQ ID NO: 987, SEQ ID NO: 988, SEQ ID NO: 989, SEQ ID NO: 990, SEQ ID NO: 991, SEQ ID NO: 992, SEQ ID NO: 993, SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 996, SEQ ID NO: 997, SEQ ID NO: 998, SEQ ID NO: 999, SEQ ID NO: 1000, SEQ ID NO: 1001, SEQ ID NO: 1002, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO: 1010, SEQ ID NO: 1011, SEQ ID NO: 1012, SEQ ID NO: 1013, SEQ ID NO: 1014, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1016, SEQ ID NO: 1017, SEQ ID NO: 1018, SEQ ID NO: 1019, SEQ ID NO: 1020, SEQ ID NO: 1021, SEQ ID NO: 1022, SEQ ID NO: 1023, SEQ ID NO: 1024, ili SEQ ID NO: 1025“.
„SEQ ID NO: 901-968“ se odnosi na „bilo koju od SEQ ID NO: 901, SEQ ID NO: 902, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 915, SEQ ID NO: 916, SEQ ID NO: 917, SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 919, SEQ ID NO: 920, SEQ ID NO: 921, SEQ ID NO: 922, SEQ ID NO: 923, SEQ ID NO: 924, SEQ ID NO: 925, SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, SEQ ID NO: 946, SEQ ID NO: 947, SEQ ID NO: 948, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 951, SEQ ID NO: 952, SEQ ID NO: 953, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 959, SEQ ID NO: 960, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 964, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, ili SEQ ID NO: 968“.
„SEQ ID NO: 1027-1218“ se odnosi na „bilo koju od sekvenci SEQ ID NO: 1027, SEQ ID NO: 1028, SEQ ID NO: 1029, SEQ ID NO: 1030, SEQ ID NO: 1031, SEQ ID NO: 1032, SEQ ID NO: 1033, SEQ ID NO: 1034, SEQ ID NO: 1035, SEQ ID NO: 1036, SEQ ID NO: 1037, SEQ ID NO: 1038, SEQ ID NO: 1039, SEQ ID NO: 1040, SEQ ID NO: 1041, SEQ ID NO: 1042, SEQ ID NO: 1043, SEQ ID NO: 1044, SEQ ID NO: 1045, SEQ ID NO: 1046, SEQ ID NO: 1047, SEQ ID NO: 1048, SEQ ID NO: 1049, SEQ ID NO: 1050, SEQ ID NO: 1051, SEQ ID NO: 1052, SEQ ID NO: 1053, SEQ ID NO: 1054, SEQ ID NO: 1055, SEQ ID NO: 1056, SEQ ID NO: 1057, SEQ ID NO: 1058, SEQ ID NO: 1059, SEQ ID NO: 1060, SEQ ID NO: 1061, SEQ ID NO: 1062, SEQ ID NO: 1063, SEQ ID NO: 1064, SEQ ID NO: 1065, SEQ ID NO: 1066, SEQ ID NO: 1067, SEQ ID NO: 1068, SEQ ID NO: 1069, SEQ ID NO: 1070, SEQ ID NO: 1071, SEQ ID NO: 1072, SEQ ID NO: 1073, SEQ ID NO: 1074, SEQ ID NO: 1075, SEQ ID NO: 1076, SEQ ID NO: 1077, SEQ ID NO: 1078, SEQ ID NO: 1079, SEQ ID NO: 1080, SEQ ID NO: 1081, SEQ ID NO: 1082, SEQ ID NO: 1083, SEQ ID NO: 1084, SEQ ID NO: 1085, SEQ ID NO: 1086, SEQ ID NO: 1087, SEQ ID NO: 1088, SEQ ID NO: 1099, SEQ ID NO: 1100, SEQ ID NO: 1101, SEQ ID NO: 1102, SEQ ID NO: 1103, SEQ ID NO: 1104, SEQ ID NO: 1105, SEQ ID NO: 1106, SEQ ID NO: 1107, SEQ ID NO: 1108, SEQ ID NO: 1109, SEQ ID NO: 1110, SEQ ID NO: 1111, SEQ ID NO: 1112, SEQ ID NO: 1113, SEQ ID NO: 1114, SEQ ID NO: 1115, SEQ ID NO: 1116, SEQ ID NO: 1117, SEQ ID NO: 1118, SEQ ID NO: 1119, SEQ ID NO: 1120, SEQ ID NO: 1121, SEQ ID NO: 1122, SEQ ID NO: 1123, SEQ ID NO: 1124, SEQ ID NO: 1125, SEQ ID NO: 1126, SEQ ID NO: 1127, SEQ ID NO: 1128, SEQ ID NO: 1129, SEQ ID NO: 1130, SEQ ID NO: 1131, SEQ ID NO: 1132, SEQ ID NO: 1133, SEQ ID NO: 1134, SEQ ID NO: 1135, SEQ ID NO: 1136, SEQ ID NO: 1137, SEQ ID NO: 1138, SEQ ID NO: 1139, SEQ ID NO: 1140, SEQ ID NO: 1141, SEQ ID NO: 1142, SEQ ID NO: 1143, SEQ ID NO: 1144, SEQ ID NO: 1145, SEQ ID NO: 1146, SEQ ID NO: 1147, SEQ ID NO: 1148, SEQ ID NO: 1149, SEQ ID NO: 1150, SEQ ID NO: 1151, SEQ ID NO: 1152, SEQ ID NO: 1153, SEQ ID NO: 1154, SEQ ID NO: 1155, SEQ ID NO: 1156, SEQ ID NO: 1157, SEQ ID NO: 1158, SEQ ID NO: 1159, SEQ ID NO: 1160, SEQ ID NO: 1161, SEQ ID NO: 1162, SEQ ID NO: 1163, SEQ ID NO: 1164, SEQ ID NO: 1165, SEQ ID NO: 1166, SEQ ID NO: 1167, SEQ ID NO: 1168, SEQ ID NO: 1169, SEQ ID NO: 1170, SEQ ID NO: 1171, SEQ ID NO: 1172, SEQ ID NO: 1173, SEQ ID NO: 1174, SEQ ID NO: 1175, SEQ ID NO: 1176, SEQ ID NO: 1177, SEQ ID NO: 1178, SEQ ID NO: 1179, SEQ ID NO: 1180, SEQ ID NO: 1181, SEQ ID NO: 1182, SEQ ID NO: 1183, SEQ ID NO: 1184, SEQ ID NO: 1185, SEQ ID NO: 1186, SEQ ID NO: 1187, SEQ ID NO: 1188, SEQ ID NO: 1189, SEQ ID NO: 1190, SEQ ID NO: 1191, SEQ ID NO: 1192, SEQ ID NO: 1193, SEQ ID NO: 1194, SEQ ID NO: 1195, SEQ ID NO: 1196, SEQ ID NO: 1197, SEQ ID NO: 1198, SEQ ID NO: 1199, SEQ ID NO: 1200, SEQ ID NO: 1201, SEQ ID NO: 1202, SEQ ID NO: 1203, SEQ ID NO: 1204, SEQ ID NO: 1205, SEQ ID NO: 1206, SEQ ID NO: 1207, SEQ ID NO: 1208, SEQ ID NO: 1209, SEQ ID NO: 1210, SEQ ID NO: 1211, SEQ ID NO: 1212, SEQ ID NO: 1213, SEQ ID NO: 1214, SEQ ID NO: 1215, SEQ ID NO: 1216, SEQ ID NO: 1217, ili SEQ ID NO: 1218“.
„SEQ ID NO: 1429-1442“ se odnosi na „bilo koju od SEQ ID NO: 1429, SEQ ID NO: 1430, SEQ ID NO: 1431, SEQ ID NO: 1432, SEQ ID NO: 1433, SEQ ID NO: 1434, SEQ ID NO: 1435, SEQ ID NO: 1436, SEQ ID NO: 1437, SEQ ID NO: 1438, SEQ ID NO: 1439, SEQ ID NO: 1440, SEQ ID NO: 1441, ili SEQ ID NO: 1442“.
„SEQ ID NO: 1219-1428“ se odnosi na bilo koju od SEQ ID NO: 1219, SEQ ID NO: 1220, SEQ ID NO: 1221, SEQ ID NO: 1222, SEQ ID NO: 1223, SEQ ID NO: 1224, SEQ ID NO: 1225, SEQ ID NO: 1226, SEQ ID NO: 1227, SEQ ID NO: 1228, SEQ ID NO: 1229, SEQ ID NO: 1230, SEQ ID NO: 1231, SEQ ID NO: 1232, SEQ ID NO: 1233, SEQ ID NO: 1234, SEQ ID NO: 1235, SEQ ID NO: 1236, SEQ ID NO: 1237, SEQ ID NO: 1238, SEQ ID NO: 1239, SEQ ID NO: 1240, SEQ ID NO: 1241, SEQ ID NO: 1242, SEQ ID NO: 1243, SEQ ID NO: 1244, SEQ ID NO: 1245, SEQ ID NO: 1246, SEQ ID NO: 1247, SEQ ID NO: 1248, SEQ ID NO: 1249, SEQ ID NO: 1250, SEQ ID NO: 1251, SEQ ID NO: 1252, SEQ ID NO: 1253, SEQ ID NO: 1254, SEQ ID NO: 1255, SEQ ID NO: 1256, SEQ ID NO: 1257, SEQ ID NO: 1258, SEQ ID NO: 1259, SEQ ID NO: 1260, SEQ ID NO: 1261, SEQ ID NO: 1262, SEQ ID NO: 1263, SEQ ID NO: 1264, SEQ ID NO: 1265, SEQ ID NO: 1266, SEQ ID NO: 1267, SEQ ID NO: 1268, SEQ ID NO: 1269, SEQ ID NO: 1270, SEQ ID NO: 1271, SEQ ID NO: 1272, SEQ ID NO: 1273, SEQ ID NO: 1274, SEQ ID NO: 1275, SEQ ID NO: 1276, SEQ ID NO: 1277, SEQ ID NO: 1278, SEQ ID NO: 1279, SEQ ID NO: 1280, SEQ ID NO: 1281, SEQ ID NO: 1282, SEQ ID NO: 1283, SEQ ID NO: 1284, SEQ ID NO: 1285, SEQ ID NO: 1286, SEQ ID NO: 1287, SEQ ID NO: 1288, SEQ ID NO: 1289, SEQ ID NO: 1290, SEQ ID NO: 1291, SEQ ID NO: 1292, SEQ ID NO: 1293, SEQ ID NO: 1294, SEQ ID NO: 1295, SEQ ID NO: 1296, SEQ ID NO: 1297, SEQ ID NO: 1298, SEQ ID NO: 1299, SEQ ID NO: 1300, SEQ ID NO: 1301, SEQ ID NO: 1302, SEQ ID NO: 1303, SEQ ID NO: 1304, SEQ ID NO: 1305, SEQ ID NO: 1306, SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311, SEQ ID NO: 1312, SEQ ID NO: 1313, SEQ ID NO: 1314, SEQ ID NO: 1315, SEQ ID NO: 1316, SEQ ID NO: 1317, SEQ ID NO: 1318, SEQ ID NO: 1319, SEQ ID NO: 1320, SEQ ID NO: 1321, SEQ ID NO: 1322, SEQ ID NO: 1323, SEQ ID NO: 1324, SEQ ID NO: 1325, SEQ ID NO: 1326, SEQ ID NO: 1327, SEQ ID NO: 1328, SEQ ID NO: 1329, SEQ ID NO: 1330, SEQ ID NO: 1331, SEQ ID NO: 1332, SEQ ID NO: 1333, SEQ ID NO: 1334, SEQ ID NO: 1335, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1337, SEQ ID NO: 1338, SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1340, SEQ ID NO: 1341, SEQ ID NO: 1342, SEQ ID NO: 1343, SEQ ID NO: 1344, SEQ ID NO: 1345, SEQ ID NO: 1346, SEQ ID NO: 1347, SEQ ID NO: 1348, SEQ ID NO: 1349, SEQ ID NO: 1350, SEQ ID NO: 1351, SEQ ID NO: 1352, SEQ ID NO: 1353, SEQ ID NO: 1354, SEQ ID NO: 1355, SEQ ID NO: 1356, SEQ ID NO: 1357, SEQ ID NO: 1358, SEQ ID NO: 1359, SEQ ID NO: 1360, SEQ ID NO: 1361, SEQ ID NO: 1362, SEQ ID NO: 1363, SEQ ID NO: 1364, SEQ ID NO: 1365, SEQ ID NO: 1366, SEQ ID NO: 1367, SEQ ID NO: 1368, SEQ ID NO: 1369, SEQ ID NO: 1370, SEQ ID NO: 1371, SEQ ID NO: 1372, SEQ ID NO: 1373, SEQ ID NO: 1374, SEQ ID NO: 1375, SEQ ID NO: 1376, SEQ ID NO: 1377, SEQ ID NO: 1378, SEQ ID NO: 1379, SEQ ID NO: 1380, SEQ ID NO: 1381, SEQ ID NO: 1382, SEQ ID NO: 1383, SEQ ID NO: 1384, SEQ ID NO: 1385, SEQ ID NO: 1386, SEQ ID NO: 1387, SEQ ID NO: 1388, SEQ ID NO: 1389, SEQ ID NO: 1390, SEQ ID NO: 1391, SEQ ID NO: 1392, SEQ ID NO: 1393, SEQ ID NO: 1394, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1396, SEQ ID NO: 1397, SEQ ID NO: 1398, SEQ ID NO: 1399, SEQ ID NO: 1400, SEQ ID NO: 1401, SEQ ID NO: 1402, SEQ ID NO: 1403, SEQ ID NO: 1404, SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1409, SEQ ID NO: 1410, SEQ ID NO: 1411, SEQ ID NO: 1412, SEQ ID NO: 1413, SEQ ID NO: 1414, SEQ ID NO: 1415, SEQ ID NO: 1416, SEQ ID NO: 1417, SEQ ID NO: 1418, SEQ ID NO: 1419, SEQ ID NO: 1420, SEQ ID NO: 1421, SEQ ID NO: 1422, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1424, SEQ ID NO: 1425, SEQ ID NO: 1426, SEQ ID NO: 1427, ili SEQ ID NO: 1428“.
U nekim aspektima otkrića, otkriveni rekombinantni RSV F protein može da uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% (kao što je najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98%, ili 100%) identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, SEQ ID NO: 273, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 320, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 373, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 391, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 415, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 419, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 423, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 425, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 443, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 452, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 454, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 456, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 458, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 460, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQ ID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498, SEQ ID NO: 499, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO: 506, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: 541, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 544, SEQ ID NO: 545, SEQ ID NO: 546, SEQ ID NO: 547, SEQ ID NO: 548, SEQ ID NO: 549, SEQ ID NO: 550, SEQ ID NO: 551, SEQ ID NO: 552, SEQ ID NO: 553, SEQ ID NO: 554, SEQ ID NO: 555, SEQ ID NO: 556, SEQ ID NO: 557, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 560, SEQ ID NO: 561, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 563, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 571, SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 573, SEQ ID NO: 574, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 579, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 581, SEQ ID NO: 582, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 590, SEQ ID NO: 591, SEQ ID NO: 592, SEQ ID NO: 593, SEQ ID NO: 594, SEQ ID NO: 595, SEQ ID NO: 596, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 601, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 603, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 605, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 610, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 612, SEQ ID NO: 613, SEQ ID NO: 614, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 616, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO: 620, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 622, SEQ ID NO: 623, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 625, SEQ ID NO: 626, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 630, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 634, SEQ ID NO: 635, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 639, SEQ ID NO: 640, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 642, SEQ ID NO: 643, SEQ ID NO: 644, SEQ ID NO: 645, SEQ ID NO: 646, SEQ ID NO: 647, SEQ ID NO: 648, SEQ ID NO: 649, SEQ ID NO: 650, SEQ ID NO: 651, SEQ ID NO: 652, SEQ ID NO: 653, SEQ ID NO: 654, SEQ ID NO: 655, SEQ ID NO: 656, SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 658, SEQ ID NO: 659, SEQ ID NO: 660, SEQ ID NO: 661, SEQ ID NO: 662, SEQ ID NO: 663, SEQ ID NO: 664, SEQ ID NO: 665, SEQ ID NO: 666, SEQ ID NO: 667, SEQ ID NO: 668, SEQ ID NO: 669, SEQ ID NO: 670, SEQ ID NO: 671, SEQ ID NO: 672, SEQ ID NO: 673, SEQ ID NO: 674, SEQ ID NO: 675, SEQ ID NO: 676, SEQ ID NO: 677, SEQ ID NO: 678, SEQ ID NO: 679, SEQ ID NO: 680, SEQ ID NO: 681, SEQ ID NO: 682, SEQ ID NO: 683, SEQ ID NO: 684, SEQ ID NO: 685, SEQ ID NO: 686, SEQ ID NO: 687, SEQ ID NO: 688, SEQ ID NO: 689, SEQ ID NO: 690, SEQ ID NO: 691, SEQ ID NO: 692, SEQ ID NO: 693, SEQ ID NO: 698, SEQ ID NO: 699, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 705, SEQ ID NO: 706, SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 708, SEQ ID NO: 709, SEQ ID NO: 710, SEQ ID NO: 711, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 713, SEQ ID NO: 714, SEQ ID NO: 715, SEQ ID NO: 716, SEQ ID NO: 717, SEQ ID NO: 718, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 720, SEQ ID NO: 721, SEQ ID NO: 722, SEQ ID NO: 723, SEQ ID NO: 724, SEQ ID NO: 725, SEQ ID NO: 726, SEQ ID NO: 727, SEQ ID NO: 728, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 730, SEQ ID NO: 731, SEQ ID NO: 732, SEQ ID NO: 733, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 735, SEQ ID NO: 736, SEQ ID NO: 737, SEQ ID NO: 738, SEQ ID NO: 739, SEQ ID NO: 740, SEQ ID NO: 741, SEQ ID NO: 742, SEQ ID NO: 743, SEQ ID NO: 744, SEQ ID NO: 745, SEQ ID NO: 746, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 748, SEQ ID NO: 749, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 751, SEQ ID NO: 752, SEQ ID NO: 753, SEQ ID NO: 754, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NO: 760, SEQ ID NO: 761, SEQ ID NO: 762, SEQ ID NO: 763, SEQ ID NO: 764, SEQ ID NO: 765, SEQ ID NO: 766, SEQ ID NO: 767, SEQ ID NO: 768, SEQ ID NO: 769, SEQ ID NO: 770, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 772, SEQ ID NO: 773, SEQ ID NO: 774, SEQ ID NO: 775, SEQ ID NO: 776, SEQ ID NO: 777, SEQ ID NO: 778, SEQ ID NO: 779, SEQ ID NO: 780, SEQ ID NO: 781, SEQ ID NO: 782, SEQ ID NO: 783, SEQ ID NO: 784, SEQ ID NO: 785, SEQ ID NO: 786, SEQ ID NO: 787, SEQ ID NO: 788, SEQ ID NO: 789, SEQ ID NO: 790, SEQ ID NO: 791, SEQ ID NO: 792, SEQ ID NO: 793, SEQ ID NO: 794, SEQ ID NO: 795, SEQ ID NO: 796, SEQ ID NO: 797, SEQ ID NO: 798, SEQ ID NO: 799, SEQ ID NO: 800, SEQ ID NO: 801, SEQ ID NO: 802, SEQ ID NO: 803, SEQ ID NO: 804, SEQ ID NO: 805, SEQ ID NO: 806, SEQ ID NO: 807, SEQ ID NO: 808, SEQ ID NO: 809, SEQ ID NO: 810, SEQ ID NO: 811, SEQ ID NO: 812, SEQ ID NO: 813, SEQ ID NO: 814, SEQ ID NO: 815, SEQ ID NO: 816, SEQ ID NO: 817, SEQ ID NO: 818, SEQ ID NO: 819, SEQ ID NO: 820, SEQ ID NO: 821, SEQ ID NO: 822, SEQ ID NO: 823, SEQ ID NO: 824, SEQ ID NO: 825, SEQ ID NO: 826, SEQ ID NO: 827, SEQ ID NO: 828, SEQ ID NO: 829, SEQ ID NO: 830, SEQ ID NO: 831, SEQ ID NO: 832, SEQ ID NO: 833, SEQ ID NO: 834, SEQ ID NO: 835, SEQ ID NO: 836, SEQ ID NO: 837, SEQ ID NO: 838, SEQ ID NO: 839, SEQ ID NO: 840, SEQ ID NO: 841, SEQ ID NO: 842, SEQ ID NO: 843, SEQ ID NO: 844, SEQ ID NO: 845, SEQ ID NO: 846, SEQ ID NO: 847, SEQ ID NO: 848, SEQ ID NO: 849, SEQ ID NO: 850, SEQ ID NO: 851, SEQ ID NO: 852, SEQ ID NO: 853, SEQ ID NO: 854, SEQ ID NO: 855, SEQ ID NO: 856, SEQ ID NO: 857, SEQ ID NO: 858, SEQ ID NO: 859, SEQ ID NO: 860, SEQ ID NO: 861, SEQ ID NO: 862, SEQ ID NO: 863, SEQ ID NO: 864, SEQ ID NO: 865, SEQ ID NO: 866, SEQ ID NO: 867, SEQ ID NO: 868, SEQ ID NO: 869, SEQ ID NO: 870, SEQ ID NO: 871, SEQ ID NO: 872, SEQ ID NO: 873, SEQ ID NO: 874, SEQ ID NO: 875, SEQ ID NO: 876, SEQ ID NO: 877, SEQ ID NO: 878, SEQ ID NO: 879, SEQ ID NO: 880, SEQ ID NO: 881, SEQ ID NO: 882, SEQ ID NO: 883, SEQ ID NO: 884, SEQ ID NO: 885, SEQ ID NO: 886, SEQ ID NO: 887, SEQ ID NO: 888, SEQ ID NO: 889, SEQ ID NO: 890, SEQ ID NO: 891, SEQ ID NO: 892, SEQ ID NO: 893, SEQ ID NO: 894, SEQ ID NO: 895, SEQ ID NO: 896, SEQ ID NO: 897, SEQ ID NO: 898, SEQ ID NO: 899, SEQ ID NO: 900, SEQ ID NO: 901, SEQ ID NO: 902, SEQ ID NO: 903, SEQ ID NO: 904, SEQ ID NO: 905, SEQ ID NO: 906, SEQ ID NO: 907, SEQ ID NO: 908, SEQ ID NO: 909, SEQ ID NO: 910, SEQ ID NO: 911, SEQ ID NO: 912, SEQ ID NO: 913, SEQ ID NO: 914, SEQ ID NO: 915, SEQ ID NO: 916, SEQ ID NO: 917, SEQ ID NO: 918, SEQ ID NO: 919, SEQ ID NO: 920, SEQ ID NO: 921, SEQ ID NO: 922, SEQ ID NO: 923, SEQ ID NO: 924, SEQ ID NO: 925, SEQ ID NO: 926, SEQ ID NO: 927, SEQ ID NO: 928, SEQ ID NO: 929, SEQ ID NO: 930, SEQ ID NO: 931, SEQ ID NO: 932, SEQ ID NO: 933, SEQ ID NO: 934, SEQ ID NO: 935, SEQ ID NO: 936, SEQ ID NO: 937, SEQ ID NO: 938, SEQ ID NO: 939, SEQ ID NO: 940, SEQ ID NO: 941, SEQ ID NO: 942, SEQ ID NO: 943, SEQ ID NO: 944, SEQ ID NO: 945, SEQ ID NO: 946, SEQ ID NO: 947, SEQ ID NO: 948, SEQ ID NO: 949, SEQ ID NO: 950, SEQ ID NO: 951, SEQ ID NO: 952, SEQ ID NO: 953, SEQ ID NO: 954, SEQ ID NO: 955, SEQ ID NO: 956, SEQ ID NO: 957, SEQ ID NO: 958, SEQ ID NO: 959, SEQ ID NO: 960, SEQ ID NO: 961, SEQ ID NO: 962, SEQ ID NO: 963, SEQ ID NO: 964, SEQ ID NO: 965, SEQ ID NO: 966, SEQ ID NO: 967, SEQ ID NO: 968, SEQ ID NO: 969, SEQ ID NO: 970, SEQ ID NO: 971, SEQ ID NO: 972, SEQ ID NO: 973, SEQ ID NO: 974, SEQ ID NO: 975, SEQ ID NO: 976, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 978, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 980, SEQ ID NO: 981, SEQ ID NO: 982, SEQ ID NO: 983, SEQ ID NO: 984, SEQ ID NO: 985, SEQ ID NO: 986, SEQ ID NO: 987, SEQ ID NO: 988, SEQ ID NO: 989, SEQ ID NO: 990, SEQ ID NO: 991, SEQ ID NO: 992, SEQ ID NO: 993, SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 996, SEQ ID NO: 997, SEQ ID NO: 998, SEQ ID NO: 999, SEQ ID NO: 1000, SEQ ID NO: 1001, SEQ ID NO: 1002, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1004, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1006, SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1009, SEQ ID NO: 1010, SEQ ID NO: 1011, SEQ ID NO: 1012, SEQ ID NO: 1013, SEQ ID NO: 1014, SEQ ID NO: 1015, SEQ ID NO: 1016, SEQ ID NO: 1017, SEQ ID NO: 1018, SEQ ID NO: 1019, SEQ ID NO: 1020, SEQ ID NO: 1021, SEQ ID NO: 1022, SEQ ID NO: 1023, SEQ ID NO: 1024, SEQ ID NO: 1025, SEQ ID NO: 1026, SEQ ID NO: 1027, SEQ ID NO: 1028, SEQ ID NO: 1029, SEQ ID NO: 1030, SEQ ID NO: 1031, SEQ ID NO: 1032, SEQ ID NO: 1033, SEQ ID NO: 1034, SEQ ID NO: 1035, SEQ ID NO: 1036, SEQ ID NO: 1037, SEQ ID NO: 1038, SEQ ID NO: 1039, SEQ ID NO: 1040, SEQ ID NO: 1041, SEQ ID NO: 1042, SEQ ID NO: 1043, SEQ ID NO: 1044, SEQ ID NO: 1045, SEQ ID NO: 1046, SEQ ID NO: 1047, SEQ ID NO: 1048, SEQ ID NO: 1049, SEQ ID NO: 1050, SEQ ID NO: 1051, SEQ ID NO: 1052, SEQ ID NO: 1053, SEQ ID NO: 1054, SEQ ID NO: 1055, SEQ ID NO: 1056, SEQ ID NO: 1057, SEQ ID NO: 1058, SEQ ID NO: 1059, SEQ ID NO: 1060, SEQ ID NO: 1061, SEQ ID NO: 1062, SEQ ID NO: 1063, SEQ ID NO: 1064, SEQ ID NO: 1065, SEQ ID NO: 1066, SEQ ID NO: 1067, SEQ ID NO: 1068, SEQ ID NO: 1069, SEQ ID NO: 1070, SEQ ID NO: 1071, SEQ ID NO: 1072, SEQ ID NO: 1073, SEQ ID NO: 1074, SEQ ID NO: 1075, SEQ ID NO: 1076, SEQ ID NO: 1077, SEQ ID NO: 1078, SEQ ID NO: 1079, SEQ ID NO: 1080, SEQ ID NO: 1081, SEQ ID NO: 1082, SEQ ID NO: 1083, SEQ ID NO: 1084, SEQ ID NO: 1085, SEQ ID NO: 1086, SEQ ID NO: 1087, SEQ ID NO: 1088, SEQ ID NO: 1099, SEQ ID NO: 1100, SEQ ID NO: 1101, SEQ ID NO: 1102, SEQ ID NO: 1103, SEQ ID NO: 1104, SEQ ID NO: 1105, SEQ ID NO: 1106, SEQ ID NO: 1107, SEQ ID NO: 1108, SEQ ID NO: 1109, SEQ ID NO: 1110, SEQ ID NO: 1111, SEQ ID NO: 1112, SEQ ID NO: 1113, SEQ ID NO: 1114, SEQ ID NO: 1115, SEQ ID NO: 1116, SEQ ID NO: 1117, SEQ ID NO: 1118, SEQ ID NO: 1119, SEQ ID NO: 1120, SEQ ID NO: 1121, SEQ ID NO: 1122, SEQ ID NO: 1123, SEQ ID NO: 1124, SEQ ID NO: 1125, SEQ ID NO: 1126, SEQ ID NO: 1127, SEQ ID NO: 1128, SEQ ID NO: 1129, SEQ ID NO: 1130, SEQ ID NO: 1131, SEQ ID NO: 1132, SEQ ID NO: 1133, SEQ ID NO: 1134, SEQ ID NO: 1135, SEQ ID NO: 1136, SEQ ID NO: 1137, SEQ ID NO: 1138, SEQ ID NO: 1139, SEQ ID NO: 1140, SEQ ID NO: 1141, SEQ ID NO: 1142, SEQ ID NO: 1143, SEQ ID NO: 1144, SEQ ID NO: 1145, SEQ ID NO: 1146, SEQ ID NO: 1147, SEQ ID NO: 1148, SEQ ID NO: 1149, SEQ ID NO: 1150, SEQ ID NO: 1151, SEQ ID NO: 1152, SEQ ID NO: 1153, SEQ ID NO: 1154, SEQ ID NO: 1155, SEQ ID NO: 1156, SEQ ID NO: 1157, SEQ ID NO: 1158, SEQ ID NO: 1159, SEQ ID NO: 1160, SEQ ID NO: 1161, SEQ ID NO: 1162, SEQ ID NO: 1163, SEQ ID NO: 1164, SEQ ID NO: 1165, SEQ ID NO: 1166, SEQ ID NO: 1167, SEQ ID NO: 1168, SEQ ID NO: 1169, SEQ ID NO: 1170, SEQ ID NO: 1171, SEQ ID NO: 1172, SEQ ID NO: 1173, SEQ ID NO: 1174, SEQ ID NO: 1175, SEQ ID NO: 1176, SEQ ID NO: 1177, SEQ ID NO: 1178, SEQ ID NO: 1179, SEQ ID NO: 1180, SEQ ID NO: 1181, SEQ ID NO: 1182, SEQ ID NO: 1183, SEQ ID NO: 1184, SEQ ID NO: 1185, SEQ ID NO: 1186, SEQ ID NO: 1187, SEQ ID NO: 1188, SEQ ID NO: 1189, SEQ ID NO: 1190, SEQ ID NO: 1191, SEQ ID NO: 1192, SEQ ID NO: 1193, SEQ ID NO: 1194, SEQ ID NO: 1195, SEQ ID NO: 1196, SEQ ID NO: 1197, SEQ ID NO: 1198, SEQ ID NO: 1199, SEQ ID NO: 1200, SEQ ID NO: 1201, SEQ ID NO: 1202, SEQ ID NO: 1203, SEQ ID NO: 1204, SEQ ID NO: 1205, SEQ ID NO: 1206, SEQ ID NO: 1207, SEQ ID NO: 1208, SEQ ID NO: 1209, SEQ ID NO: 1210, SEQ ID NO: 1211, SEQ ID NO: 1212, SEQ ID NO: 1213, SEQ ID NO: 1214, SEQ ID NO: 1215, SEQ ID NO: 1216, SEQ ID NO: 1217, SEQ ID NO: 1218, SEQ ID NO: 1219, SEQ ID NO: 1220, SEQ ID NO: 1221, SEQ ID NO: 1222, SEQ ID NO: 1223, SEQ ID NO: 1224, SEQ ID NO: 1225, SEQ ID NO: 1226, SEQ ID NO: 1227, SEQ ID NO: 1228, SEQ ID NO: 1229, SEQ ID NO: 1230, SEQ ID NO: 1231, SEQ ID NO: 1232, SEQ ID NO: 1233, SEQ ID NO: 1234, SEQ ID NO: 1235, SEQ ID NO: 1236, SEQ ID NO: 1237, SEQ ID NO: 1238, SEQ ID NO: 1239, SEQ ID NO: 1240, SEQ ID NO: 1241, SEQ ID NO: 1242, SEQ ID NO: 1243, SEQ ID NO: 1244, SEQ ID NO: 1245, SEQ ID NO: 1246, SEQ ID NO: 1247, SEQ ID NO: 1248, SEQ ID NO: 1249, SEQ ID NO: 1250, SEQ ID NO: 1251, SEQ ID NO: 1252, SEQ ID NO: 1253, SEQ ID NO: 1254, SEQ ID NO: 1255, SEQ ID NO: 1256, SEQ ID NO: 1257, SEQ ID NO: 1258, SEQ ID NO: 1259, SEQ ID NO: 1260, SEQ ID NO: 1261, SEQ ID NO: 1262, SEQ ID NO: 1263, SEQ ID NO: 1264, SEQ ID NO: 1265, SEQ ID NO: 1266, SEQ ID NO: 1267, SEQ ID NO: 1268, SEQ ID NO: 1269, SEQ ID NO: 1270, SEQ ID NO: 1271, SEQ ID NO: 1272, SEQ ID NO: 1273, SEQ ID NO: 1274, SEQ ID NO: 1275, SEQ ID NO: 1276, SEQ ID NO: 1277, SEQ ID NO: 1278, SEQ ID NO: 1279, SEQ ID NO: 1280, SEQ ID NO: 1281, SEQ ID NO: 1282, SEQ ID NO: 1283, SEQ ID NO: 1284, SEQ ID NO: 1285, SEQ ID NO: 1286, SEQ ID NO: 1287, SEQ ID NO: 1288, SEQ ID NO: 1289, SEQ ID NO: 1290, SEQ ID NO: 1291, SEQ ID NO: 1292, SEQ ID NO: 1293, SEQ ID NO: 1294, SEQ ID NO: 1295, SEQ ID NO: 1296, SEQ ID NO: 1297, SEQ ID NO: 1298, SEQ ID NO: 1299, SEQ ID NO: 1300, SEQ ID NO: 1301, SEQ ID NO: 1302, SEQ ID NO: 1303, SEQ ID NO: 1304, SEQ ID NO: 1305, SEQ ID NO: 1306, SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1308, SEQ ID NO: 1309, SEQ ID NO: 1310, SEQ ID NO: 1311, SEQ ID NO: 1312, SEQ ID NO: 1313, SEQ ID NO: 1314, SEQ ID NO: 1315, SEQ ID NO: 1316, SEQ ID NO: 1317, SEQ ID NO: 1318, SEQ ID NO: 1319, SEQ ID NO: 1320, SEQ ID NO: 1321, SEQ ID NO: 1322, SEQ ID NO: 1323, SEQ ID NO: 1324, SEQ ID NO: 1325, SEQ ID NO: 1326, SEQ ID NO: 1327, SEQ ID NO: 1328, SEQ ID NO: 1329, SEQ ID NO: 1330, SEQ ID NO: 1331, SEQ ID NO: 1332, SEQ ID NO: 1333, SEQ ID NO: 1334, SEQ ID NO: 1335, SEQ ID NO: 1336, SEQ ID NO: 1337, SEQ ID NO: 1338, SEQ ID NO: 1339, SEQ ID NO: 1340, SEQ ID NO: 1341, SEQ ID NO: 1342, SEQ ID NO: 1343, SEQ ID NO: 1344, SEQ ID NO: 1345, SEQ ID NO: 1346, SEQ ID NO: 1347, SEQ ID NO: 1348, SEQ ID NO: 1349, SEQ ID NO: 1350, SEQ ID NO: 1351, SEQ ID NO: 1352, SEQ ID NO: 1353, SEQ ID NO: 1354, SEQ ID NO: 1355, SEQ ID NO: 1356, SEQ ID NO: 1357, SEQ ID NO: 1358, SEQ ID NO: 1359, SEQ ID NO: 1360, SEQ ID NO: 1361, SEQ ID NO: 1362, SEQ ID NO: 1363, SEQ ID NO: 1364, SEQ ID NO: 1365, SEQ ID NO: 1366, SEQ ID NO: 1367, SEQ ID NO: 1368, SEQ ID NO: 1369, SEQ ID NO: 1370, SEQ ID NO: 1371, SEQ ID NO: 1372, SEQ ID NO: 1373, SEQ ID NO: 1374, SEQ ID NO: 1375, SEQ ID NO: 1376, SEQ ID NO: 1377, SEQ ID NO: 1378, SEQ ID NO: 1379, SEQ ID NO: 1380, SEQ ID NO: 1381, SEQ ID NO: 1382, SEQ ID NO: 1383, SEQ ID NO: 1384, SEQ ID NO: 1385, SEQ ID NO: 1386, SEQ ID NO: 1387, SEQ ID NO: 1388, SEQ ID NO: 1389, SEQ ID NO: 1390, SEQ ID NO: 1391, SEQ ID NO: 1392, SEQ ID NO: 1393, SEQ ID NO: 1394, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1396, SEQ ID NO: 1397, SEQ ID NO: 1398, SEQ ID NO: 1399, SEQ ID NO: 1400, SEQ ID NO: 1401, SEQ ID NO: 1402, SEQ ID NO: 1403, SEQ ID NO: 1404, SEQ ID NO: 1405, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1407, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1409, SEQ ID NO: 1410, SEQ ID NO: 1411, SEQ ID NO: 1412, SEQ ID NO: 1413, SEQ ID NO: 1414, SEQ ID NO: 1415, SEQ ID NO: 1416, SEQ ID NO: 1417, SEQ ID NO: 1418, SEQ ID NO: 1419, SEQ ID NO: 1420, SEQ ID NO: 1421, SEQ ID NO: 1422, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1424, SEQ ID NO: 1425, SEQ ID NO: 1426, SEQ ID NO: 1427, SEQ ID NO: 1428, SEQ ID NO: 1429, SEQ ID NO: 1430, SEQ ID NO: 1431, SEQ ID NO: 1432, SEQ ID NO: 1433, SEQ ID NO: 1434, SEQ ID NO: 1435, SEQ ID NO: 1436, SEQ ID NO: 1437, SEQ ID NO: 1438, SEQ ID NO: 1439, SEQ ID NO: 1440, SEQ ID NO: 1441, SEQ ID NO: 1442, SEQ ID NO: 1456, SEQ ID NO: 1457, SEQ ID NO: 1458, SEQ ID NO: 1459, SEQ ID NO: 1460, SEQ ID NO: 1461, SEQ ID NO: 1462, SEQ ID NO: 1463, SEQ ID NO: 1464, SEQ ID NO: 1465, SEQ ID NO: 1466, SEQ ID NO: 1467, SEQ ID NO: 1468, SEQ ID NO: 1474, SEQ ID NO: 1475, SEQ ID NO: 1476, SEQ ID NO: 1477, ili SEQ ID NO: 1478 („Set sekvenci F“), pri čemu se rekombinantni RSV F polipeptid specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzioni RSV F (kao što je D25) i/ili uključuje antigensko mesto specifično za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). U nekim primerima izvođenja, imunogen se specifično vezuje za antitelo ili uključuje antigensko mesto nakon inkubacije u PBS na pH 7.4 na 20 °C tokom 24 sata. U nekim primerima izvođenja, rekombinantni RSV F polipeptid uključuje jednu od sekvenci iz seta sekvenci F, i dalje uključuje i do 20 (kao što je do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ili 19) aminokiselinskih supstitucija (kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije, pri čemu se rekombinantni RSV F polipeptid specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzioni RSV F (kao što je D25) i/ili uključuje antigensko mesto specifično za prefuzioni RSV F (kao što je antigensko mesto Ø). Stručnjak u ovoj oblasti će znati da gore navedene sekvence mogu da uključuju liderske sekvence, oznake za prečišćavanje, mesta isecanja proteazom za uklanjanje oznaka za prečišćavanje trimerizacione domene, domene podjedinica proteinskih nanočestica ili druge sekvence koje nisu u vezi sa rekombinantnim RSV F proteinom. U nekim primerima izvođenja, imunogen koji je ovde obezbeđen uključuje rekombinantni RSV F protein jedne od gore navedenih sekvenci, ali ne uključuje liderske sekvence, oznake za prečišćavanje, mesta isecanja proteazom za uklanjanje oznaka za prečišćavanje, trimerizacione domene, domene podjedinica proteinskih nanočestica ili druge sekvence koje nisu u vezi sa rekombinantnim RSV F proteinom. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju ove proteinske sekvence takođe su obezbeđeni, kao i postupci za korišćenje rekombinantnih RSV F proteina za generisanje imunog odgovora na RSV u subjektu, ili za sprečavanje ili lečenje RSV infekcije kod subjekta.
III. PRIMERI
Dati su sledeći primeri koji ilustruju određene karakteristike pojedinih primera izvođenja, ali obim patentnih zahteva ne treba da bude ograničen na one karakteristike koje su ilustrovane.
Primer 1
Struktura F trimera respiratornog sincicijalnog virusa u prefuzionoj konformaciji vezanog za humano antitelo
Prefuziona konformacija fuzionog (F) glikoproteina respiratornog sincicijalnog virusa (RSV) je ciljno mesto za većinu RSV-neutrališućih antitela u humanim serumima, ali njegova metastabilnost je sprečavala karakterizaciju. Da bi se prevazišla ova prepreka identifikovana su antitela koja ne vezuju postfuzionu konformaciju F i koja su >10 puta potentnija od profilaktičkog antitela palivizumab (Synagis®). Kokristalna struktura jednog od ovih antitela, D25, u kompleksu sa F glikoproteinom otkriva da D25 fiksira F u njegovom prefuzionom stanju. Poređenja prefuzione i postfuzione konformacije F definišu preuređenja potrebna za posredovanje u ulasku RSV u ćeliju. Struktura D25-F glikoproteina pokazuje novo mesto ranjivosti, antigensko mesto Ø, na vrhu F glikoproteina koje je specifično za prefuzionu konformaciju i kvaternarne prirode. Struktura RSV F trimera u prefuzionoj konformaciji, zajedno sa definisanjem antigenskog mesta Ø, treba da omogući dizajniranje poboljšanih antigena vakcine i da dovede do novih pristupa pasivnoj prevenciji bolesti izazvane virusom RSV.
Respiratorni sincicijalni virus (RSV) je sveprisutan, inficira praktično svu decu do 3 godine starosti (Glezen et al., Am. J. Dis. Child., 140, 543 (1986)). U SAD, bronhiolitis izazvan virusom RSV je vodeći uzrok hospitalizacije odojčadi i glavni uzrok astme i šištanja u plućima u detinjstvu (Shay et al., JAMA, 282, 1440 (1999); Hall et al., N. Engl. J. Med., 360, 588 (2009)). Širom sveta, RSV je odgovoran za 66000-199 000 smrti svake godine kod dece mlađe od pet godina (Nair et al., Lancet, 375, 1545 (2010)) i čini 7% smrtnih slučajeva kod odojčadi uzrasta od 1 meseca do 1 godine–više od bilo kog pojedinačnog patogena osim malarije (Lozano et al., Lancet, 380, 2095 (2013)). Jedino dostupno lečenje je pasivna primena licenciranog monoklonskog antitela palivizumaba (Synagis®), koji prepoznaje fuzioni (F) glikoprotein RSV (Johnson et al., J. Infect. Dis., 176, 1215 (1997); Beeler and van Wyke Coelingh, J. Virol., 63, 2941 (1989)) i smanjuje učestalost teških bolesti (The IMpact-RSV Study Group, Pediatrics, 102, 531 (1998)). Klinički dokazi da antitela specifična za RSV F mogu da štite od bolesti su pokrenuli potragu za boljim antitelima (Collarini et al., J. Immunol., 183, 6338 (2009); Wu et al., J. Mol. Biol., 368, 652 (2007); Kwakkenbos et al., Nat. Med., 16, 123 (2010)) i usaglašene napore da se razvije efikasna vakcina (Graham, Immunol. Rev., 239, 149 (2011)).
RSV F glikoprotein olakšava fuziju virusnih i ćelijskih membrana (Walsh and Hruska, J. Virol., 47, 171 (1983)); to je fuzioni protein tipa I, sa metastabilnom prefuzionom konformacijom koja skladišti energiju savijanja, oslobođenu tokom strukturnog preuređenja u visoko stabilnu postfuzionu konformaciju. Nađeno je da tri antigenska mesta (I, II i IV) izaizvaju neutrališuću aktivnost (Arbiza et al., J. Gen. Virol., 73, 2225 (1992); Lopez et al., J. Virol., 72, 6922 (1998); López et al., J. Virol., 64, 927 (1990)), i sva tri postoje u prefuzionom obliku F, kako je utvrđeno strukturnim i biofizičkim ispitivanjima(McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011); Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619 (2011)). Apsorpcija humanih seruma sa prefuzionim F, međutim, ne uspeva da ukloni većinu F-specifične neutrališuće aktivnosti, što sugeriše da prefuzioni oblik može da sadrži nova neutralizujuća antigenska mesta (Magro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109, 3089 (2012)). Uprkos velikim naporima, nije dobijen homogeni preparat rastvorljivog prefuzionog RSV F. Dakle, određivanje prefuzione strukture F i identifikovanje novih specifičnih antigenskih mesta F postali su prioriteti koji se preklapaju za razvoj novih profilaktičkih i terapeutskih antitela i vakcina. U skladu sa ovim ciljevima, identifikovana su F-specifična antitela koja mogu da neutrališu RSV, ali se ne vezuju za postfuzioni F, i utvrđena je struktura RSV F koju ova antitela prepoznaju. Rezultati su otkrili prefuzionu konformaciju RSV F, mehanizam neutralizacije za kategoriju visoko potentnih antitela i detalje na atomskom nivou za antigensko mesto specifično za prefuzionu konformaciju koje treba da posluži kao ciljno mesto delovanja poboljšanih terapija zasnovanih na antitelima i pruži osnovu za razvoj efikasnih antigena vakcine.
Utvrđeno je da su dva humana antitela - D25 i AM22 - ~50 puta potentnija od palivizumaba (SL.
1A) u neutralizaciji RSV F, i ona se takođe ne vezuju za rastvorljivi oblik RSV F stabilizovan u postfuzionoj konformaciji (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011)) (SL.1B). D25 i AM22 su prethodno otkrivena (Kwakkenbos et al., Nat. Med., 16, 123 (2010); SAD pat. obj.2010/0239593; SAD pat. obj. 2012/0070446). Nedostatak vezivanja D25 i AM22 za postfuzioni oblik RSV F sugeriše da bi ova antitela mogla da prepoznaju metastabilnu prefuzionu konformaciju.
Napori strukturnog ispitivanja su bili fokusirani na humana antitela, AM22 i D25. Za skrining vezivanja ovih antitela na panel varijanti RSV F glikoproteina vezanih iz ćelijskih supernatanata na Ni<2+>-NTA ELISA pločama korišćen je format ekspresije na pločama sa 96 bunarčića (Pancera et al., PLoS One. 2013;8(2):e55701, 2013). Ispitano je vezivanje antitela za konstrukt F glikoproteina (RSV F(+) Fd), koji sadrži ostatke 1-513 RSV F spojene sa C-terminalnim domenom trimerizacije fibritina (Frank et al., J. Mol. Biol., 308, 1081 (2001)). Međutim, kompleksi nisu formirani mešanjem prečišćenog RSV F(+) Fd sa prečišćenim antitelom D25 ili AM22. Utvrđeno je da prečišćavanje rastvorljivog F glikoproteina aktivira metastabilno prefuziono stanje (Chaiwatpongsakorn et al., J. Virol., 85, 3968 (2011)); da bi se prevazišla ova nestabilnost, ćelije koje eksprimiraju RSV F(+) Fd su inkubirane sa antigen-vezujućim fragmentima (Fab) ili imunoglobulinima (ovi drugi sa mestom isecanja proteazom HRV3C u regionu zgloba (McLellan et al., Nature 480, 336, (2011)) kako bi se uhvatio F u prefuzionom stanju. Alternativno, ćelije koje eksprimiraju RSV F(+) Fd su bile kotransfektovane sa odvojenim DNK-ekspresionim kasetama koje su kodirale teške i lake lance antitela (SL.5). Optimalna ekspresija kompleksa D25-F glikoprotein je dobijena iz kontransfekcije DNK koja kodira D25 Fab sa DNK koja kodira RSV F(+) Fd; prihvatljivi prinosi kompleksa su takođe primećeni pri dodavanju rastvorljivog Fab. Kristalizacije su podvrgnute skriningu za Fab D25 i AM22, same ili u kompleksu sa RSV F(+) Fd. Podaci dobijeni difrakcijom x-zraka do rezolucije od 1.6 Å su dobijeni na samim heksagonalnim kristalima Fab D25, a struktura je rešena molekularnom zamenom i utačnjena do Rcryst/Rfree od 24.5/25.7 % (Tabela 9). Podaci rezolucije od 3.6 Å su dobijeni na kubnim kristalima Fab D25 u kompleksu sa RSV F(+) Fd, a ova struktura je rešena molekularnom zamenom korišćenjem nevezane strukture D25 i delova prethodno određene postfuzione strukture RSV F (McLellan et al.,J. Virol., 85,7788 (2011); Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619 (2011)) kao modela za pretragu, zajedno sa tragovima iz zlatnog derivata. Struktura kompleksa je utačnjena do Rcryst/Rfree od 21.3/26.7% (SL.1C) (Tabela 9).
Kompleks jednog D25 Fab vezanog za jedan molekul RSV F glikoproteina bio je prisutan u asimetričnoj jedinici kubne rešetke. Trostruka simetrija rešetke je postavila dva druga kompleksa D25-RSV F da bi se formirala ekstenzivna trimerna RSV F kontaktna površina od 2.098 Å<2>. Kontinuirana elektronska gustina je zabeležena za ostatke 26 do 513, osim ostataka 98-136 koji su uključivali fragment od 27 aminokiselina uklonjen proteolitičkim cepanjem F0 prekursora da bi se formirale podjedinice F2 i F1 (odgovara N-, odnosno C-terminalnom fragmentu) zrelog F glikoproteina. Elektronska gustina je otkrila tri mesta N-vezane glikozilacije na ostacima asparagina 27, 70 i 500 (SL.2A).
Uopšteno, konstrukt RSV F vezanog za D25 sastoji se od dva režnja upakovana na oba kraja 7-lančanog antiparalelnog bureta sa otvorenim krajevima, od kojih se dva lanca (β2 i β7) protežu između dva režnja, formirajući vodoničnu vezu preko 70 Å i formirajući integralne delove oba režnja i centralnog bureta. Režanj proksimalno u odnosu na membranu, koji sadrži N-terminus F2 i C-terminus F1, sastoji se od troslojnog β sendviča i tri spirale (α8, α9 i α10). Heliks α10 formira deo heliksa koji izgleda da se proteže u virusnu membranu i za koji je vezan domen trimerizacije fibrina. Režanj distalno u odnosu na membranu, približno 90 Å od virusne membrane, sastoji se od sedam heliksa upakovanih oko trolančane antiparalelne ploče i β-ukosnice (β3+ β4). Čini se da ekstenzivni kontakti između protomera stabilizuju trimernu strukturu, posebno hidrofobni N-terminus F1 podjedinice (poznate i kao fuzioni peptid), koji je podržan trostrukim β-sendvičom iz režnja proksimalno u odnosu na membranu susednog protomera. Fuzioni peptid, koji se nalazi unutar inače prazne šupljine trimera, povezan je sa površinski izloženim heliksima α2 i α3 kroz cilindrični otvor između protomera koji je prečnika oko 10 Å; ovaj otvor se može koristiti kao izlazna putanja za fuzioni peptid tokom aktiviranja.
Struktura F glikoproteina povezanog sa D25 nalikuje prefuzionoj strukturi srodnog virusa parainfluence 5 (PIV5) F glikoproteina (Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109, 16672 (2012); Yin et al., Nature, 439, 38 (2006)) (SL. 6 i 7). Prema tome, izgleda da je oblik RSV F vezan za D25 u prefuzionoj konformaciji (SL. 2). Da bi se definisala strukturna preuređenja između pre- i postfuzionog F, oblik RSV F vezan za D25 je upoređen sa svojom postfuzionom konformacijom, koja je nedavno određena (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011); Swanson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108, 9619 (2011).
Pre- i postfuzione konformacije RSV F otkrile su značajne promene u ukupnom obliku, od relativno kompaktne ovalne strukture visine 110 Å do izduženog konusa koji je približno 50% duži (170 Å) (SL. 2A). Uprkos ovoj značajnoj konformacionoj promeni, većina sekundarne i tercijarne strukture F glikoproteina je očuvana i u pre- i u postfuzionom stanju, a 215 ostataka pokazuju odstupanje Cα manje od 2 Å između dve strukture (SL.2A, B). U dva regiona dolazi do upadljivih konformacionih promena. U režnju distalno u odnosu na membranu, fuzioni peptid i pet elemenata sekundarne strukture (α2, α3, β3, β4 i α4) su povezani sa α5-heliksom da bi formirali jedan izduženi postfuzioni heliks (α5post) dužine preko 100 Å, ograničen na svom N-terminusu fuzionim peptidom (zbog jasnoće, elementi sekundarne strukture postfuzione strukture su označeni indeksom „post“). U režnju proksimalno u odnosu na membranu, jedini paralelni lanac (β22) trostrukog β-sendviča - koji se u prefuzionoj strukturi formira vodoničnu vezu sa β1 – odvija se, omogućavajući prefuzionom α10-heliksu da se veže za heliks α5post. Zajedno, heliksi α5post i α10post približavaju N- i C-terminus F1 da bi se formirala struktura upredene zavojnice karakteristična za fuzione proteine tipa I u njihovoj postfuzionoj konformaciji (Colman and Lawrence, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4, 309 (2003)). Uopšteno, delovi α10 heliksa pomeraju se za više od 170 Å između pre- i postfuzione konformacije.
U poređenju sa prethodno opisanim strukturama tipa I podvrgnutim isecanju proteazom u prefuzionoj konformaciji za hemaglutinin virusa influence (Wilson et al., Nature, 289, 366 (1981)), GP virusa ebole (Lee et al., Nature, 454, 177 (2008)) i PIV5 F (Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109, 16672 (2012)), položaj fuzionog peptida RSV je najsličniji onom kod hemaglutinina (SL. 7), što je iznenađujuće, s obzirom da su i PIV5 i RSV paramiksovirusi. RSV F fuzioni peptid je ugrađen u centar prazne šupljine trimera, i nalazi se na više od 40 Å od poslednjeg vidljivog ostatka F2. Ovo sugeriše da se značajno strukturno preuređenje fuzionog peptida javlja nakon što je cepanja prekursora F0 proteazom domaćina sličnom furinu da bi se proizveo F1/F2. Pored toga, dolazi do značajnih strukturnih preuređenja između pre- i postfuzionih konformacija u režnjevima proksimalno u odnosu na membranu i distalno u odnosu na membranu, što daje uvid u kompleksnost stabilizacije prefuzione konformacije RSV F. Za razliku od PIV5 F i F humanog metapneumovirusa, koji se mogu stabilizovati u prefuzionom stanju samo dodavanjem trimerizacionog motiva GCN4 na C-terminus (Yin et al., Nature, 439, 38 (2006); Wen et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 19, 461 (2012)), prefuziona konformacija RSV F zahteva stabilizaciju i režnja proksimalno u odnosu na membranu (što se postiže dodavanjem domena trimerizacije fibritina (Frank et al., J. Mol. Biol., 308, 1081 (2001)) i režnaj distalno u odnosu na membranu (do čega dolazi vezivanjem antitela D25).
Antitelo D25 prepoznaje vrh RSV F glikoproteina distalno u odnosu na membranu (SL. 1C). Vezuje se za kvaternarni epitop, pri čemu teški lanac D25 interaguje sa jednim protomerom (uključujući 638 Å<2>potopljene interaktivne površine na RSV), a laki lanac D25 se vezuje i za isti protomer (373 Å<2>) i za susedni protomer (112 Å<2>) (SL.3A). Kontakti RSV F se ostvaruju kroz 5 od 6 petlji D25 koje određuju komplementarnost, pri čemu 3. CDR teškog lanca (CDR H3) stupa u interakciju sa heliksom α4 (ostaci 196-210 u F1) i formira međumolekulske vodonične veze sa ostacima 63, 65, 66 i 68 F2 u petlji između lanca β2 i heliksa α1. Dok elementi sekundarne strukture D25 epitopa ostaju uglavnom nepromenjeni, njihova relativna orijentacija se značajno menja, pri čemu se heliks α4 rotira za ~180° u odnosu na lanac β2 u pre- i postfuzionoj konformaciji (SL.
3B). Ovo strukturno preuređenje objašnjava izostanak vezivanja D25 za molekule F u postfuzionoj konformaciji i ukazuje na to da D25 inhibira fuziju membrane stabilizacijom prefuzione konformacije kompleksa trimernog F glikoproteina. Iako su F proteini humanog RSV podtipova A i B veoma slični po sekvenci (447/472 ili 94.7% aminokiselina koje čine zreli F2/F1 ektodomen su identične između poznatih podtipova), šest prirodnih pozicija varijacija sekvence RSV (ostaci 67 i 74 u F2, i ostaci 200, 201, 209 i 213 u F1) se nalaze u regionu koji se vezuje za D25 (SL.3C). Slično tome, od 56 aminokiselina u goveđem RSV F koje nisu identične zrelom ektodomenu humanog RSV F podtipa A, 13 se nalazi u ovom istom regionu (SL.3C). Prema tome, D25 epitop na vrhu strukture prefuzionog RSV F, može da bude pod imunološkim pritiskom i da posluži kao determinanta imuniteta specifičnog za podtip (Chambers et al., J. Gen. Virol., 73, 1717 (1992)). Na primer, na osnovu analize sekvenci, pretpostavlja se da postoji region petlje u F glikoproteinima unutar porodice Paramyxoviridae koji bi mogao da bude pod imunološkim pritiskom (Chambers et al., J. Gen. Virol., 73, 1717 (1992)). Pokazano je da vezivanje monoklonskih antitela specifičnih za podgrupe RSV može da bude pod uticajem mesto-specifičnih mutacija između ostataka 200 i 216 u F1 (Connor et al.,J. Med. Virol., 63, 168 (2001)), i da je peptid koji sadrži ostatke 205-225 u F1 mogao izazvati aktivnost neutralizacije kod zečeva, iako specifičan epitop nije definisan (Corvaisier et al., Arch. Virol., 142, 1073 (1997)).
Da bi se razumeo odnos D25 epitopa u odnosu na epitope koje prepoznaju druga antitela koja neutrališu RSV, testirana je kompeticija za vezivanje D25 sa ćelijama inficiranim virusom RSV (SL. 4A). Pre svega, AM22 je kompetirao sa D25 za vezivanje RSV F, što sugeriše da antitela prepoznaju isto antigensko mesto. Da bi se dodatno definisalo mesto koje prepoznaju ova antitela, urađena je EM sa negativnim bojenjem kompleksa Fab-RSV F. EM slike kompleksa Fab D25-RSV F liče na kristalnu strukturu Fab D25-RSV F, kao i EM slike Fab AM22-RSV F (SL. 4B). Ovi rezultati su zajedno sugerisali da antitela D25 i AM22 prepoznaju isto ili veoma srodno antigensko mesto, koje je dobilo naziv „antigensko mesto Ø“.
Da bi se okarakterisala antitela koja prepoznaju antigensko mesto Ø, ispitana su njihova funkcionalna svojstva. Pored njihove izuzetne potencije i specifičnosti za prefuzionu konformaciju (SL. 1A), sva tri antitela su snažno inhibirala fuziju kada su dodata posle vezivanja (SL. 4C), i nijedno od njih nije bilo u stanju da blokira vezivanje za površinu ćelije (SL.4D), što ukazuje na to da se RSV F receptor vezuje za region na F koji ova tri antitela nisu blokirala. Domen koji se vezuje za receptor na srodnom F proteinu humanog metapneumovirusa je motiv RGD (Cseke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106, 1566 (2009)) koji odgovara ostacima 361-363 u RSV F, koji se nalaze na vrhu petlje centralnog bureta, na strani prefuzionog trimera RSV F koja nije blokirana vezivanjem D25. Iako ova antitela ne sprečavaju vezivanje, poznato je da regioni F2 i F1 koji sadrže antigensko mesto Ø doprinose vezivanju heparina (Feldman et al., J. Virol., 74, 6442 (2000); Crim et al., J. Virol., 81, 261 (2007)), a moguće je da ovaj region može doprineti nespecifičnom vezivanju za fragmente heparin sulfata na glikozaminoglikanima zajedno sa glikoproteinom G i drugim regionima F. Na kraju, antitela AM22 i D25 su pokazala sličnu neutralizaciju i u Fab i u imunoglobulinskom kontekstu (SL.8), što ukazuje na to da aviditet ne igra dominantnu ulogu, kao kod nekih antitela protiv virusa influence (Ekiert et al., Nature, 489, 526 (2012)). Ukupno uzevši, opšta specifičnost vezivanja i fenotipovi neutralizacije D25 i AM22 ukazuju na to da ova svojstva mogu da budu karakteristična za antitela koja prepoznaju antigensko mesto Ø. Nasuprot tome, nijedno od antitela koja prepoznaju druga antigenska mesta na RSV F povezana sa neutralizacionom aktivnošću (mesta I, II i IV) ne deli slična svojstva potencije neutralizacije i specifičnosti za F u prefuzionoj konformaciji (SL.9A-9B).
Iako je antigensko mesto Ø delimično zaštićeno od imunološkog prepoznavanja višestrukim mehanizmima, uključujući konformaciono maskiranje (prisutno je samo u metastabilnom prefuzionom stanju), kvaternarni sklop (mesto je zajedničko za RSV protomere), antigenske varijacije (to je jedan od najvarijabilnijih delova RSV F) i glikanski štit (N-vezani glikan zakačen za Asn70 nalazi se na vrhu prefuzionog F trimera), izgleda da su sva tri antitela specifična za prefuzionu konformaciju usmerena na sličan epitop. Položaj antigenskog mesta Ø na vrhu prefuzionog F trimera treba da bude veoma dostupan čak i na prepunoj površini viriona, što može da objasni zapažanje da je glavna neutralizujuća aktivnost u humanom serumu indukovana prirodnom RSV infekcijom usmerena protiv prefuzionog oblika RSV F (Magro et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109, 3089 (2012), mada se ne mogu isključiti druga prefuziono-specifična antigenska mesta. Visoka potencija antitela protiv antigenskog mesta Ø sugeriše da bi ona mogla da se razviju za pasivnu profilaksu bolesti indukovane virusom RSV kod novorođenčadi. Takođe, indukovanje vakcinom antitela specifičnih za prefuzionu konformaciju može da bude pomognuto stabilizacijom prefuzionog oblika RSV F, što može da bude olakšano povezivanjem pokretnih i nepokretnih delova F strukture kroz dizajn zasnovan na strukturi varijanti RSV F sa disulfidnim vezama. Primećeno je da prefuziono-stabilizovani F sadrži sve prethodno okarakterisane neutralizacione epitope, kao i antigensko mesto Ø. Definisanje strukture D25-RSV F tako obezbeđuje osnovu za više novih pristupa za sprečavanje bolesti indukovanih virusom RSV. Materijali i metode
Virusi i ćelije. Štokovi virusa su pripremljeni i održavana kao što je prethodno opisano (Graham et al., J. Med. Virol., 26, 153 (1988)) RSV koji eksprimira zeleni fluorescentni protein (GFP) RSVGFP je konstruisan kao što je prethodno objavljeno (Hallak et al., Virology. 271, 264 (2000)). Titar štokova RSV-GFP korišćenih za neutralizaciju zasnovanu na protočnoj citometriji i testove fuzije bio je 2.5×10<7>pfu/ml. Titar štoka RSV A2 korišćen za ispitivanje vezivanja bio je 1.02 × 10<8>pfu/ml. Ćelije HEp-2 su održavane u minimalnom esencijalnom medijumu Eagle koji sadrži 10% goveđeg fetalnog seruma (10% EMEM) i obogaćen je glutaminom, penicilinom i streptomicinom.
Kreiranje plazmida za ekspresiju antitela. DNK koja kodira varijabilne regione teškog i lakog lanca antitela je kodon-optimizovana za humanu ekspresiju i sintetizovana. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca AM22 i D25 su subklonirani u pVRC8400 ekspresione plazmide koji sadrže humane konstantne domene (IgG1 za teški lanac i kapa za laki lanac) u istom okviru čitanja. Varijante plazmida za eksprimiranje teških lanaca AM22 i D25 napravljene su umetanjem bilo mesta isecanja proteazom HRV3C (GLEVLFQGP; SEQ ID NO: 355) ili stop kodona u region zgloba.
Ekspresija i prečišćavanje antitela i Fab fragmenata. Antitela su eksprimirana prolaznom kotransfekcijom plazmida teškog i lakog lanca u ćelije HEK293F u suspenziji na 37 °C tokom 4-5 dana. Ćelijski supernatanti su propušteni preko agaroze sa proteinom A i vezana antitela su isprana PBS-om i eluirana elucionim puferom za IgG u 1/10 zapremine 1 M Tris-HCl pH 8.0. Fab AM22 i D25 su pripremljeni digestijom IgG pomoću Lys-C. Digestija je bila inhibirana dodavanjem koktel tableta kompletnog inhibitora proteaze, a smeša Fab i Fc je ponovo propuštena preko agaroze sa proteinom A da bi se uklonili Fc fragmenti. Fab koji je prošao kroz kolonu dalje je prečišćen ekskluzionom hromatografijom.
Testovi neutralizacije RSV. Neutralizacija uz posredovanje antitela je merena testom neutralizacije protočnom citometrijom (Chen et al., J. Immunol. Methods, 362, 180 (2010). Ukratko, ćelije HEp-2 su inficirane sa RSV-GFP i infekcija je praćena kao funkcija ekspresije GFP na 18 sati posle infekcije protočnom citometrijom. Podaci su analizirani prilagođavanjem krive i nelinearnom regresijom (GraphPad Prism, GraphPad Software Inc., San Diego CA).
Test vezivanja prefuzionog RSV F. Prečišćeni, rastvorljivi RSV F protein u postfuzionoj konformaciji pripremljen je kako je opisano u (McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011). Kinetička ELISA je korišćena za testiranje vezivanja monoklonskih antitela na postfuzioni RSV F kako je prethodno opisano (McLellan et al., J. Mol. Biol., 409, 853 (2011). Ukratko, ploče obložene Ni<2+>-NTA sa 96 bunarčića (ThermoFisher Scientific) su obložene sa 100 μl posfuzionog RSV F (1 μg/ml) jedan sat na sobnoj temperaturi. U svaki bunarčić je dodato 100 μl razblaženog antitela i inkubirano jedan sat na sobnoj temperaturi. Vezana antitela su detektovana inkubacijom ploča sa 100 μl HRP-konjugovanog kozjeg anti-mišjeg IgG antitela (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) ili HRP-konjugovanim antihumanim IgG (Santa Cruz Biolotechnology, Inc, Santa Cruz, CA) 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim, 100 μl Super AquaBlue ELISA podloge (eBioscience, San Dijego CA) je dodato u svaki bunarčić i ploče su odmah očitane korišćenjem čitača mikroploča Dynex Technologies na 405nm (Chantilly, VA). Između koraka, ploče su isprane sa PBS-T.
Prikupljanje podataka o kristalizaciji i difrakciji X-zraka za nevezani D25 Fab. Uslovi kristalizacije su provereni korišćenjem robota za kristalizaciju Cartesian Honeybee, a početni kristali su uzgajani postupkom difuzije pare u sedećim kapima na 20 °C mešanjem 0.2 μl D25 Fab sa 0.2 μl rastvora rezervoara (22% (tež./zapr.) PEG 4000, 0.1 M natrijum acetat pH 4.6). Kristali su ručno reprodukovani u visećim kapljicama kombinovanjem proteina i rastvora rezervoara u odnosu 2:1. Kristali su brzo zamrznuti u tečnom azotu u 27.5% (tež./zapr.) PEG 4000, 0.1 M natrijum acetatu pH 4.5, i 15% (zapr./zapr.) 2R,3R-butandiolu. Podaci o difrakciji X-zraka do 1.6 Å dobijeni su na talasnoj dužini od 1.00 Å na liniji snopa SER-CAT ID-22 (Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory).
Određivanje strukture i utačnjavanje strukture nevezanog D25 Fab. Podaci dobijeni difrakcijom X-zraka su integrisani i skalirani pomoću softverskog paketa HKL2000 (Otwinowski and Minor, Methods Enzymol. (Academic Press, vol. 276, pp. 307-326, 1997)), a rastvor za molekularnu zamenu korišćenjem Ig domena iz PDB ID: 3GBM (Ekiert et al., Science, 324, 246 (2009)) i 3IDX (Chen et al., Science, 326, 1123 (2009)) kao modeli pretrage su dobijeni pomoću PHASER (McCoy et al., J. Appl. Crystallogr., 40, 658 (2007)). Ručna izgradnja modela je izvedena korišćenjem COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 486 (2010)), a utačnjavanje pojedinih mesta, TLS parametara i pojedinačnih B-faktora je sprovedeno u PHENIX (Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 213 (2010)). Elektronska gustina za varijabilne domene D25 bila je odlična, ali je elektronska gustina za konstantne domene bila loša, verovatno kao rezultat pokretljivosti ugla savijanja. Konačni prikupljeni podaci i statistika utačnjavanja prikazani su u tabeli 8.
Ekspresija i prečišćavanje RSV F(+) Fd u kompleksu sa D25 Fab. Konstrukt RSV F(+) Fd proteina potiče iz A2 soja (pristupni br. P03420) sa tri prirodne supstitucije (P102A, I379V i M447V) za poboljšanje ekspresije. Kodon-optimizovani gen sisara za kodiranje ostataka 1-513 u RSV F sa C-terminalnim trimerizacionim motivom fibritina T4 (Frank et al., J. Mol. Biol., 308, 1081 (2001)), mestom isecanja trombinom, 6x His-tag i StreptagII je sintetizovan i subkloniran u ekspresioni vektor sisara poreklom iz pLEXm (Aricescu et al., Acta Crystallogr D Biol Cristallogr, 62, 1243 (2006)). Plazmidi koji eksprimiraju RSV F(+) Fd, laki lanac D25 i teški lanac D25 (sa ili bez stop kodona u regionu zgloba) istovremeno su transfektovani u ćelije HEK293 GnTI<-/->(Reeves et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99, 13419 (2002)) u suspenziji. Alternativno, može da se transfektuje samo plazmid RSV F(+) Fd, ali uz dodavanje D25 Fab u ćelije GnTI<-/->3 sata posle transfekcije. Posle 4-5 dana, ćelijski supernatant je sakupljen, centrifugiran, filtriran i koncentrovan. Kompleks je prvobitno prečišćen preko smole Ni<2+>-NTA (Qiagen, Valencia, CA) pomoću elucionog pufera koji se sastoji od 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM NaCl i 250 mM imidazola pH 8.0. Kompleks je zatim koncentrovan i dalje prečišćen preko smole StrepTactin prema uputstvima proizvođača (Novagen, Darmstadt, Nemačka). Nakon inkubacije preko noći sa trombin proteazom (Novagen) za uklanjanje His i Strep oznaka, višak D25 Fab je dodat u kompleks, koji je zatim prečišćen na koloni za gel filtraciju Superose6 (GE Healthcare) sa radnim puferom od 2 mM Tris-HCl pH 7.5, 350 mM NaCl i 0.02% NaN3. Eluirani kompleks je razblažen jednakom količinom vode i koncentrovan do ~5 mg/ml. Slične procedure su korišćene za eksprimiranje i prečišćavanje kompleksa AM22 Fab.
Kristalizacija i prikupljanje podataka difrakcije X-zraka za RSV F(+) Fd u kompleksu sa D25 Fab. Početni kristali su uzgajani postupkom difuzije pare u sedećim kapima na 20 °C mešanjem 0.1 μl RSV F(+) Fd vezanog za D25 Fab sa 0.1 μl rastvora rezervoara (40% (tež./zapr.) PEG 400, 5% (tež./zapr.) PEG 3350 i 0.1 M natrijum acetata pH 5.5) (Majeed et al., Structure, 11, 1061 (2003)). Kristali su ručno reprodukovani u visećim kapima, a kristal koji je difraktovao do 3.6 Å je uzgajan korišćenjem rastvora rezervoara koji sadrži 30% (tež./zapr.) PEG 400, 3.75% (tež./zapr.) PEG 3350, 0.1 M HEPES pH 7.5 i 1% (zapr./zapr.) 1,2-butandiol Kristal je direktno prebačen iz kapi u kriotok, i podaci difrakcije X-zraka su prikupljeni daljinski na talasnoj dužini od 1.00 Å na liniji snopa SER-CAT ID-22.
Određivanje strukture i utačnjavanje RSV F(+)Fd u kompleksu sa D25 Fab. Podaci dobijeni difrakcijom X-zraka su integrisani i skalirani pomoću softverskog paketa HKL2000 (Otwinowski and Minor, in Methods Enzymol. (Academic Press, vol. 276, pp. 307-326, 1997)), a rastvor za molekularnu zamenu je dobijen pomoću PHASER (McCoy et al., J. Appl. Crystallogr., 40, 658 (2007)) korišćenjem nevezane strukture D25 Fab i ostataka 29-42, 49-60, 78-98, 219-306, 313-322, 333-343 i 376-459 iz postfuzione RSV strukture (PDB ID: 3RRR, McLellan et al., J. Virol., 85, 7788 (2011)) kao modela za pretraživanje. Šest mesta iz derivata NaAuCl4 mapirano je na poznatim reaktivnim bočnim lancima (ostaci F Met97/His159, Met264/Met274, His317 i Met396; ostaci teških lanaca D25 Met19/His82 i His 59). Ručna izrada modela je izvedena korišćenjem COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 486 (2010)), pri čemu je prvo izvedena konstrukcija sekundarnih elemenata strukture. Utačnjavanje pojedinih mesta, TLS parametara i pojedinih B faktora je izvedeno u PHENIX (Adams et al., Acta Crystallogllogr D Biol Crystallogr, 66, 213 (2010)), koristeći strukture nevezanog D25 Fab, i delova postfuzione RSV F strukture kao referentnih modela tokom utačnjavanja. Svi RSV F ostaci u zrelom proteina su izgrađeni osim onih ostataka u C-terminalnom F2 za Met97. Konačni prikupljeni podaci i statistika utačnjavanja prikazani su u tabeli 9.
Kompetitivni test vezivanja RSV F. Kompetitivno vezivanje antitela je izvedeno na ćelijama HEp-2 inficiranim virusom RSV. Ćelije HEp-2 su inficirane sa 3 MOI (multiplicitet infekcije) RSV tokom 18-20 sati. Nakon infekcije, ćelije su razdvojene upotrebom rastvora za disocijaciju ćelija (Cellstripper, Mediatech Inc., Herndon, VA), i isprane rastvorom PBS. Zasejano je 5 x 10<4>ćelija/bunarčiću u ploče sa 96 bunarčića sa U-dnom u PBS-u. Monoklonska antitela AM22, D25 i 101F su razblažena počevši od koncentracije 100 μg/ml i dodata u ćelije HEp-2. Nakon 30 minuta dodato je 100ul D25 konjugovanog sa Alexa 488 u koncentraciji od 1 μg/ml i inkubirano na 4 °C jedan sat. Ćelije su jednom oprane PBS-om, a zatim fiksirane 0.5% paraformaldehidom. Vezivanje D25-Alexa 488 za ćelije mereno je protočnom citometrijom (LSR II instrument, Becton Dickinson, San Jose, CA). Podaci su analizirani pomoću softvera FlowJo, verzija 8.5 (Tree Star, San Carlos, CA).
Analiza elektronske mikroskopije sa negativnim bojenjem. Uzorci su apsorbovani na rešetke koje su sveže obložene ugljem posle svetlećeg pražnjenja, isprani kratko vodom i obojeni sveže napravljenim 0.75% uranil formatom. Slike su snimljene mikroskopom FEI T20 sa Eagle CCD kamerom. Analiza slike i 2D usrednjavanje izvedeno je pomoću Bsoft (Heymann and Belnap, J. Struct. Biol., 157, 3 (2007) i EMAN (Ludtke et al., J. Struct. Biol., 128, 82 (1999)).
Test inhibicije fuzije RSV virusa sa ćelijama. Sposobnost antitela da inhibiraju fuziju RSV virusa sa ćelijama je merena kako je prethodno opisano (McLellan et al., J. Virol., 84, 12236 (2010)). Ukratko, ćelije HEp-2 su zasijane u ploče sa 96 bunarčića, gajene 24 sata na 37 °C, a zatim ohlađene na 4 °C jedan sat pre ispitivanja. RSV-GFP je dodat u prethodno ohlađene ćelije na 4°C, a zatim su ćelije isprane u hladnom PBS-u kako bi se uklonio nevezani virus. Serijski razblažena antitela su dodata u ohlađene ćelije i inkubirana 1 sat na 4°C, pre prebacivanja na 37°C na 18 sati. Nakon inkubacije, ćelije su tripsinizovane, fiksirane u 0.5% paraformaldehidu i analizirane protočnom citometrijom da bi se utvrdila učestalost ćelija koje eksprimiraju GFP. Test inhibicije vezivanja RSV. Sposobnost antitela da inhibiraju vezivanje RSV za ćelije je merena kako je prethodno opisano (McLellan et al., J. Virol., 84, 12236 (2010)). Ukratko, ćelije HEp-2 su dispergovane u medijumu, oprane hladnim PBS-om, zasijane u ploče sa v-dnom sa 96 bunarčića i ohlađene 1 sat na 4 °C pre upotrebe. Antitela i heparin, poznati inhibitor vezivanja RSV, su raspoređeni u serijskim razređenjima, a zatim pomešani sa virusom RSV soja A2 na jedan sat na 37 °C. Medijum iz ohlađenih ćelija je uklonjen nakon centrifugiranja i virus ili smeša virusa i reagenasa su dodati u ohlađene ćelije i inkubirani 1 sat na 4 °C. Nakon inkubacije, ćelije su isprane u hladnom PBS-u kako bi se uklonio nevezani virus i fiksirane 0.5% paraformaldehidom. Virusi vezani za ćelije su detektovani sa FITC konjugovanim kozjim anti-RSV antitelom. Ćelije su isprane u hladnom PBS-u i procenjene protočnom citometrijom. Srednji intenziteti fluorescencije vezanog virusa analizirani su softverom FlowJo, verzija 8.5 (Tree Star, San Carlos, CA).
Tabela 9. Prikupljane kristalografskih podataka i statistika utačnjavanja.
D25 Fab D25 Fab RSV F
Prikupljanje podataka
Prostorna grupa P6122 P213
Konstante ćelija
a, b, c (Å) 108.7, 108.7, 139.9 152.3, 152.3, 152.390.0,
α, β, γ (°) 90.0, 90.0, 120.0 90.0, 90.0
Talasna dužina (Å) 1.00 1.00
Rezolucija (Å) 50.0-1.6 (1.63-1.60) 50.0-3.6 (3.73-3.60)
Rmerge 11.2 (68.0) 12.7 (81.4)
I / σI 27.3 (2.1) 16.4 (2.0)
Potpunost (%) 98.3 (86.1) 99.6 (99.3)
Redundancija 11.0 (5.3) 6.5 (5.2)
Utačnjavanje
Rezolucija (Å) 35.4-1.6 (1.62-1.60) 42.2-3.6 (3.88-3.60)
Jedinstvene refleksije 63,360 (2,241) 13,877 (2,742)
Rwork / Rfree (%) 24.1/25.5 21.3/26.7
Br. atoma
Protein 3,305 6,778
Ligand/jon 0 0
Voda 270 0
B-faktori (Å<2>)
Protein 53.0 128,1
Ligand/jon - -Voda 44.1 -R.m.s. odstupanja
Dužine veza (Å) 0.007 0.003
Uglovi veza (°) 1.20 0.91
Ramačandran
Favorizovani (%) 96.5 92.0
Dozvoljeni (%) 3.0 7.3
Rezultati van granica (%) 0.5 0.7
Primer 2
Stabilizacija RSV F proteina
Ovaj primer ilustruje konstruisanje ilustrativnih RSV F proteina stabilizovanih u prefuzionoj konformaciji. Kristalna struktura RSV F proteina u kompleksu sa D25 Fab (tj. u prefuzionoj konformaciji) upoređena sa strukturom postfuzionog RSV F proteina (otkriven, npr. u McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, sa koordinatama deponovanim kao PDB pristupni br. 3RRR) pokazuje značajna strukturna preuređenja između pre- i postfuzionih konformacija u režnju proksimalno u odnosu na membranu, kao i u režnju distalno u odnosu na membranu, pružajući smernice za stabilizaciju prefuzione konformacije RSV F. Na osnovu poređenja pre- i postfuzionih RSV F struktura, postoje dva regiona koja prolaze kroz velike konformacione promene, smeštena na N- i C-terminusima F1 podjedinice. Na primer, kao što je prikazano na SL.2, pozicije 137-216 i 461-513 F1 polipeptida podležu strukturnim preuređenjima između pre- i postfuzione konformacije F proteina, dok pozicije 271-460 F1 polipeptida ostaju relativno nepromenjene. Ovaj primer ilustruje nekoliko strategija stabilizacije RSV F proteina u njegovoj prefuzionoj konformaciji.
Da bi se stabilizovao N-terminalni region F1, koji je komponenta antigenskog mesta Ø i uključen je u vezivanje za antitelo D25, osmišljene su razne strategije, uključujući uvođenje disulfidnih veza unutar protomera, disulfidnih veza između protomera, aminokiselinske supstitucije za popunjavanje šupljine proteina, supstitucije za prepakivanje proteina, uvođenje N-vezanih glikozilacionih mesta i njihove kombinacije.
Disulfidne veze unutar protomera
Uvođenje dva ostatka cisteina koji se nalaze na dovoljno bliskom rastojanju kako bi se formirala disulfidna veza unutar protomera u prefuzionoj, ali ne i postfuzionoj konformaciji može da fiksira F protein u prefuzionoj konformaciji. Intra-molekularna disulfidna veza može da se formira unutar jednog F2/F1 protomera unutar trimera, i time se tri protomera ne bi međusobno unakrsno povezala. Konkretno, disulfidna veza formirana između regiona koji menja konformaciju i regiona koji ne menja konformaciju u pre- i postfuzionim strukturama bi trebalo da fiksira protein u prefuzionoj konformaciji. Jedan od primera je i mutant S155C/S290C, gde se Ser155 nalazi u regionu koji menja konformaciju, dok je Ser290 u regionu koji ne menja konformaciju. Pored toga, formiranje disulfidne veze između dva regiona koji menjaju konformaciju, kao što su dva ostatka koji se nalaze na pozicijama 137-216 u F1, ili dva ostatka koji se nalaze na pozicijama 461-513 u F1, ili jedan ostatak unutar pozicija 137-216 u F1 i drugi unutar pozicija 461-513 u F1, takođe može da bude dovoljno da se protein fiksira u prefuzionoj konformaciji.
Korišćenjem gore opisanih postupaka, utvrđeno je da su nekoliko parova ostataka RSV F proteina na dovoljno bliskom rastojanju u prefuzionoj konformaciji, ali ne i u postfuzionoj konformaciji, da formiraju disulfidnu vezu unutar protomera ako se cisteini uvedu na odgovarajućim pozicijama para ostataka. Ovi parovi ostataka, kao i odgovarajuće aminokiselinske supstitucije u SEQ ID NO: 1 potrebne za uvođenje ostataka cisteina na ovim pozicijama, su označene u tabeli 10. Tabela 10 takođe navodi SEQ ID NO sekvence koja sadrži naznačene supstitucije i odgovara konstruktu prekursora F0 koji uključuje signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), pep27 polipeptid (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))).
Tabela 10. Ilustrativni umreženi parovi cisteina za stabilizaciju disulfidnih veza unutar protomera
Intermolekularne disulfidne veze
Uvođenje dva ostatka cisteina koji se nalaze na dovoljno bliskom rastojanju kako bi se formirala disulfidna veza između protomera u prefuzionoj, ali ne i postfuzionoj konformaciji može da fiksira F protein u prefuzionoj konformaciji. Disulfidna veza između protomera bi se formirala između susednih protomera unutar trimera, i time bi se međusobno unakrsno povezala tri protomera. Konkretno, disulfidna veza formirana između regiona koji menja konformaciju i regiona koji ne menja konformaciju u pre- i postfuzionim strukturama bi trebalo da fiksira protein u prefuzionoj konformaciji. Jedan od primera je mutant A153C/K461C, gde se Ala153 nalazi u regionu koji menja konformaciju, a Lys461 je u regionu koji ne menja konformaciju. Pored toga, formiranje disulfidne veze između dva regiona koji menjaju konformaciju, kao što su dva ostatka koji se nalaze na pozicijama 137-216 u F1, ili dva ostatka koji se nalaze na pozicijama 461-513 u F1, ili jedan ostatak unutar pozicija 137-216 u F1 i drugi unutar pozicija 461-513 u F1, takođe može da bude dovoljno da se protein fiksira u prefuzionoj konformaciji.
Korišćenjem gore opisanih postupaka, utvrđeno je da su nekoliko parova ostataka RSV F proteina na dovoljno bliskom rastojanju u prefuzionoj konformaciji, ali ne i u postfuzionoj konformaciji, da formiraju disulfidnu vezu između protomera ako se cisteini uvedu na odgovarajućim pozicijama para ostataka. Ovi parovi ostataka, kao i odgovarajuće aminokiselinske supstitucije potrebne za uvođenje ostataka cisteina na ovim pozicijama, su označene u tabeli 11. Tabela 11 takođe navodi SEQ ID NO sekvence koja sadrži naznačene supstitucije i odgovara konstruktu prekursora F0 koji uključuje signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), pep27 polipeptid (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))).
Tabela 11. Ilustrativni umreženi parovi cisteina za stabilizaciju disulfidnih veza između protomera
Osim toga, višestruke stabilizacione mutacije opisane ovde mogu se kombinovati da generišu PreF antigen koji sadrži više od jedne stabilizujuće mutacije. Primeri takvih konstrukata koji sadrže prvi i drugi par ostataka koji čine disulfidnu vezu unutar ili između protomera, nalaze se u tabeli 12. Tabela 12 takođe navodi SEQ ID NO sekvence koja sadrži naznačene supstitucije i odgovara konstruktu prekursora F0 koji uključuje signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), pep27 polipeptid (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))).
Tabela 12. Ilustrativni umreženi parovi cisteina za stabilizaciju kombinovanih disulfidnih veza unutar i između protomera.
Dalje, aminokiseline se mogu insertovati (ili deletirati) iz sekvence F proteina da bi se podesilo poravnavanje ostataka u strukturi F proteina, tako da su određeni parovi ostataka na dovoljno bliskom rastojanju da bi se formirala disulfidna veza unutar ili između protomera u prefuzionoj, ali ne i postfuzionoj konformaciji, koja će, kao što je gore navedeno, stabilizovati F protein u prefuzionoj konformaciji. Primeri takve modifikacije su dati u tabeli 13. Tabela 13 takođe navodi SEQ ID NO sekvence koja sadrži naznačene supstitucije i odgovara konstruktu prekursora F0 koji uključuje signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), pep27 polipeptid (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))).
Tabela 13. Upotreba aminokiselinskih insercija za orijentaciju F proteina za prihvatanje disulfidnih veza unutar-između protomera, ili njihovih kombinacija.
Supstitucije za popunjavanje šupljine proteina
Poređenje kristalne strukture RSV F proteina u kompleksu sa D25 Fab (tj. u prefuzionoj konformaciji) u odnosu na postfuzionu strukturu RSV F proteina (otkriveno, npr. u McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011; strukturne koordinate RSV F proteina u njegovoj postfuzionoj konformaciji deponovane su u Banci podataka o proteinima (PDB) kao PDB pristupni br.3RRR) identifikuje nekoliko unutrašnjih šupljina ili džepova u prefuzionoj konformaciji koje moraju da kolabiraju kako bi F prešao u postfuzionu konformaciju. Ove šupljine su navedene u tabeli 14. Shodno tome, popunjavanje ovih unutrašnjih šupljina stabilizuje F u prefuzionom stanju, sprečavajući prelazak u postfuzionu konformaciju. Šupljine se ispunjavaju supstitucijama aminokiselina sa velikim bočnim lancima za one sa malim bočnim lancima. Šupljine mogu da budu šupljine unutar protomera, ili šupljine između protomera. Jedan primer modifikacije za popunjavanja šupljine RSV F proteina za stabilizaciju RSV proteina u njegovoj prefuzionoj konformaciji je mutant S190F/V207L.
Korišćenjem ove strategije, identifikovano je nekoliko modifikacija za popunjavanje šupljine proteina koje stabilizuju RSV F protein u njegovoj prefuzionoj konformaciji. Ove modifikacije su označene u tabeli 14. Tabela 14 takođe navodi SEQ ID NO sekvence koja sadrži naznačene supstitucije i odgovara konstruktu prekursora F0 koji uključuje signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), pep27 polipeptid (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))).
Tabela 14. Primer supstitucije aminokiselina za popunjavanje šupljine
Navedene šupljine su označene po malom ostatku koji se nalazi u šupljini, koji može da se mutira u veći ostatak koji popunjava šupljinu. Jasno je da bi i drugi ostaci (osim onog po kome je šupljina nazvana) mogli da budu mutirani da popune istu šupljinu.
Supstitucije za prepakivanje proteina
Pored toga, prefuziona konformacija RSV F proteina može se stabilizovati povećanjem interakcije susednih ostataka, kao što je povećanje hidrofobnih interakcija ili formiranje vodonične veze. Dalje, prefuziona konformacija RSV F proteina može se stabilizovati smanjenjem nepovoljnih ili odbojnih interakcija susednih ostataka koji dovode do metastabilnosti prefuzione konformacije. To se može postići eliminacijom klastera slično naelektrisanih ostataka. Primeri takvih izmena su naznačeni u tabeli 15. Tabela 15 takođe navodi SEQ ID NO sekvence koja sadrži naznačene supstitucije i odgovara konstruktu prekursora F0 koji uključuje signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), pep27 polipeptid (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))).
Tabela 15. Aminokiselinske supstitucije za prepakivanje proteina
Glikozilacione mutacije
Dodatno, uvođenje N-vezanih glikozilacionih mesta koja bi bila dostupna rastvaraču u prefuzionoj konformaciji RSV F, ali ne bi bila dostupna rastvaraču u postfuzionoj konformaciji RSV F može da stabilizuje RSV F u prefuzionom stanju sprečavanjem usvajanja postfuzionog stanja. Da bi se stvorilo N-vezano glikozilaciono mesto, može da se uvede sekvenca Asn-X-Ser/Thr (gde je X bilo koja aminokiselina izuzev Pro). Ovo može da se postigne supstitucijom aminokiseline Ser/Thr dva ostatka C-terminalno od nativnog ostatka Asn, ili supstitucijom aminokiseline Asn dva ostatka N-terminalno od nativnog ostatka Ser/Thr, ili supstitucijom oba ostatka Asn i Ser/Thr razdvojenih jednom aminokiselinom koja nije prolin.
Korišćenjem ove strategije, identifikovano je nekoliko lokacija za N-vezana mesta glikozilacije koja bi bila dostupna rastvaraču u prefuzionoj konformaciji RSV F, ali nedostupna rastvaraču u postfuzionoj RSV F konformaciji. Ove modifikacije su navedene u tabeli 16. Tabela 16 takođe navodi SEQ ID NO sekvence koja sadrži naznačene supstitucije i odgovara konstruktu prekursora F0 koji uključuje signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), pep27 polipeptid (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), trimerizacioni domen (domen Foldon) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH (pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))).
Tabela 16. Ilustrativna N-vezana glikozilacija
Primer 3
Stabilizacija režnja proksimalno u odnosu na membranu PreF antigena
Kao što je gore razmatrano, kristalna struktura RSV F proteina u kompleksu sa D25 Fab (tj. u prefuzionoj konformaciji) upoređena sa strukturom postfuzionog RSV F proteina ((otkriven, npr. u McLellan et al., J. Virol., 85, 7788, 2011, sa koordinatama deponovanim kao PDB pristupni br.
3RRR)) pokazuje značajna strukturna preuređenja između pre- i postfuzionih konformacija u režnju distalno u odnosu na membranu. Na osnovu poređenja pre- i postfuzionih RSV F struktura, postoje dva regiona koji prolaze kroz velike konformacione promene, smeštena na N- i C-terminusima F1 podjedinice. Na primer, kao što je prikazano na SL.2, pozicije 137-216 i 461-513 F1 polipeptida podležu strukturnim preuređenjima između pre- i postfuzione konformacije F proteina, dok pozicije 271-460 F1 polipeptida ostaju relativno nepromenjene. Ovaj primer ilustruje nekoliko strategija stabilizacije C-terminalnog regiona F1, koji uključuje režanj RSV F proteina proksimalno u odnosu na membranu. Identifikovane su različite strategije, uključujući uvođenje domena trimerizacije (kao što je već rečeno), uvođenje cisteinskih parova koji mogu formirati disulfidnu vezu koja stabilizuje C-terminalni region F1 i uvođenje transmembranskog domena (npr. za primene koje uključuju PreF antigen koji je vezan za membranu).
Disulfidne veze
Jedna strategija za stabilizaciju režnaj F proteina proksimalno u odnosu na membranu je uvođenje jedne ili više supstitucija cisteina koje uvode disulfidnu vezu koja stabilizuje C-terminalni deo F1 (na primer, za primenu koja uključuje rastvorljivi PreF antigen). Takva strategija može se kombinovati sa bilo kojom od stabilizacionih modifikacija koje su ovde navedene, na primer, one opisane u primeru 2, kao što je F1 protein sa supstitucijom cisteina S155C/S290C. Jedna strategija uključuje uvođenje dva ostatka cisteina koji su na dovoljno bliskoj razdaljini kako bi se formirala disulfidna veza između protomera koja povezuje C-terminalni region proteina F1 u prefuzionoj konformaciji. Disulfidna veza između protomera bi se formirala između susednih protomera unutar trimera, i time bi se međusobno unakrsno povezala tri protomera. Korišćenjem gore opisanih postupaka, utvrđeno je da su nekoliko parova ostataka RSV F proteina na dovoljno bliskom rastojanju u prefuzionoj konformaciji, da formiraju disulfidnu vezu između protomera ako se cisteini uvedu na odgovarajućim pozicijama para ostataka.
Primeri cisteinskih supstitucija koje se mogu uvesti da bi se generisala disulfidna veza koja stabilizuje režanj proksimalno u odnosu na membranu uključuju cisteinske supstitucije u ostacima parova:
(a) 486 i 487
(b) 486 i 487; sa insercijom P između pozicija 486/487
(c) 512 i 513
(d) 493; insercija C između 329/330
(e) 493; insercija C između 329/330, i insercija G između 492/493
Dalje, dužina F1 polipeptida može da varira, u zavisnosti od položaja C-terminalnih parova cisteina. Na primer, F1 polipeptid može da sadrži pozicije 137-481, koje eliminišu α10 heliks iz F1 polipeptida.
Primeri konstrukata koje sadrže modifikacije uključujući cisteine u ovim parovima ostataka, kao i dodatni opis navedeni su u tabeli 17. Tabela 17 takođe navodi SEQ ID NO sekvence koja sadrži navedene supstitucije i odgovara konstruktu prekursora F0 koji uključuje i signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), pep27 polipeptid (pozicije 110-136), F1 polipeptid (sa različitim pozicijama).
Tabela 17. Disulfidne veze za stabilizovanje režnja F proteina proksimalno u odnosu na membranu.
Transmembranski domeni
Druga strategija za stabilizaciju režnja F proteina proksimalno u odnosu na membranu je da se transmembranski domen uključi u F1 protein, na primer, za primenu koja uključuje PreF antigen učvršćen u membranu. Na primer, prisustvo transmembranskih sekvenci je korisno za eksprimiranje u obliku transmembranskog proteina za pripremu membranskih vezikula. Transmembranski domen može da bude povezan sa F1 proteinom koji sadrži bilo koju od stabilizujućih mutacija predviđenih ovde, na primer, one opisane u primeru 2, kao što je F1 protein sa supstitucijom cisteina S155C/S290C. Pored toga, transmembranski domen može se dalje povezati sa citosolnim repom RSV F1. Primeri konstrukata prekursora F0 koji uključuju signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), pep27 polipeptid (pozicije 110-136), F1 polipeptid (pozicije 137-513), transmembranski domen RSV dati su kao SEQ ID NO: 323 (bez citosolnog domena) i 324 (sa citosolnim domenom).
Primer 4
Jednolančani PreF antigeni
Ovaj primer ilustruje rekombinantne RSV F proteine koji nemaju nativna mesta isecanja furinom, tako da se protomer F proteina formira kao jedan polipeptidni lanac, umesto heterodimera F2/F1. Tabela 18 navodi nekoliko jednolančanih PreF antigena koji uključuju deleciju pozicija 98-149 u F, koja uklanja dva mesta isecanja furinom, pep27 polipeptid i fuzioni peptid. Preostali delovi F1 i F2 polipeptida su spojeni linkerom. Pored toga, može se koristiti nekoliko strategija za stabilizaciju jednolančanog konstrukta u prefuzionoj konformaciji, uključujući korišćenje strategija opisanih u primerima 2 i 3, gore. Tabela 18 takođe navodi SEQ ID NO sekvence koja sadrži naznačene supstitucije i odgovara konstruktu prekursora F0 koji takođe uključuje signalni peptid, F2 polipeptid (pozicije 26-109), pep27 polipeptid (pozicije 110-136), F1 polipeptid (sa različitim pozicijama).
Tabela 18. Jednolančani PreF antigeni
Primer 5
RSV F protein stabilizovan disulfidnom vezom i domenom trimerizacije Ovaj primer ilustruje proizvodnju RSV F proteina stabilizovanog disulfidnom vezom i domenom trimerizacije. Kao što je prikazano na SL. 10, ostaci serina na pozicijama 155 i 290 (označeni strelicama i crvenim označavanjem na trakastim dijagramima) su jedan pored drugog u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina, ali ne u postfuzionoj konformaciji RSV F proteina. Dalje, bočni lanci ovih ostataka su orijentisani jedan prema drugom. Međutim, bočni lanci ostataka u blizini serine 155, valina 154 i lizina 156, orijentisani su od bočnog lanca serina 290. S obzirom na ove nalaze, rekombinantni RSV F protein konstruisan je pomoću supstitucija S155C i S290C. Očekivalo se da će ostaci cisteina u ovom konstruktu 155/290 formirati disulfidnu vezu koja će fiksirati rekombinantni RSV F protein u prefuzionoj konformaciji, ali to uključivanje cisteina na pozicijama 154 ili 156 (umesto pozicije 155) neće proizvesti stabilizujuću disulfidnu vezu.
Molekul nukleinske kiseline koji kodira nativni RSV F0 polipeptid je mutiran korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije da bi kodirao RSV F protein nazvan RSVF(+)FdTHS S155C, S290C i prikazan je kao SEQ ID NO: 185:
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELS NIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLN NAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAV C KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAV VSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVN AGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIM C IIKEEVLAY VVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETC KVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYG KTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINF YDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL SAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGE WVLLSTFL GGLVPRGSHHHHHHSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 185).
RSVF(+)FdTHS S155C, S290C uključuje signalni peptid (ostaci 1-25), F2 polipeptid (ostaci 26-109), Pep27 polipeptid (ostaci (110-136), F1 polipeptid (ostaci 137-513), domen Foldon (ostaci 514-544) i mesto isecanja trombinom (LVPRGS (pozicije 547-552 sekvence SEQ ID NO: 185)) i oznake za prečišćavanje (his-tag (HHHHHH) pozicije 553-558 sekvence SEQ ID NO: 185)) i Strep Tag II (SAWSHPQFEK (pozicije 559-568 sekvence SEQ ID NO: 185))). Kontrolni konstrukti su takođe generisani pomoću supstitucija V154C ili K156C umesto supstitucije S155C. Kada je eksprimiran u ćelijama, RSVF(+)FdTHS S155C, S290C je obrađen i eksprimiran kao stabilan i rastvorljiv RSV F protein; međutim, kontrolni konstrukti sa supstitucijama 154/290 ili 156/290 se nisu eksprimirali (verovatno zato što nisu uspeli da se saviju u rastvorljivu konformaciju) (videti SL.10).
Konstrukt RSVF(+)FdTHS S155C, S290C je prečišćen i ispitan na vezivanje antitela za antitela specifična za prefuzionu konformaciju AM22 i D25, kao i antitelo 131-2a (koje vezuje antigensko mesto I, prisutno na pre- i postfuzionim konformacijama RSV F), motavizumab i palivizumab (koja vezuju antigensko mesto II, prisutno na pre- i postfuzionim konformacijama RSV F) i antitelo 101F (koje vezuje antigensko mesto IV, prisutno na pre- i postfuzionim konformacijama RSV F). Kao što je prikazano na SL.11 (levi grafikon), sva ova antitela su specifično vezana za prečišćeni konstrukt RSVF(+)FdTHS S155C, S290C, što ukazuje na to da RSVF(+)FdTHS S155C, S290C održava prefuzionu konformaciju. Rezultati dalje pokazuju da ovaj konstrukt sadrži antigenska mesta I, II i IV, zajednička za pre- i postfuzione konformacije RSV F.
Da bi se pokazalo da je prečišćeni RSVF(+)FdTHS S155C, S290C u trimernoj konformaciji, ovaj konstrukt je propušten kroz kolonu za ekskluzionu hromatografiju. Kao što je prikazano na SL.11 (desni grafikoni) priprema prečišćenog RSVF(+)FdTHS S155C, S290C eluira u jednom piku koji odgovara molekulskoj težini trimernog F proteina. Nasuprot tome, preparat kontrolnog konstrukta koji nema supstitucije S155C i S290C, za koji se ne očekuje da bude stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, eluira u više pikova, ukazujući na prisustvo rozeta aktiviranih F proteina i agregata, što pokazuje da ovaj kontrolni konstrukt nije stabilan u homogenoj prefuzionoj konformaciji. Da bi se dalje potvrdilo da je konstrukt RSVF(+)FdTHS S155C, S290C stabilizovan u prefuzionoj konformaciji, izvedene su elektronske mikroskopije (SL.12) i one su pokazale da RSVF(+)FdTHS S155C, S290C formiraju homogenu populaciju struktura sa oblikom sličnim onom kod prefuzione konformacije RSV F, i značajno se razlikuje od one kod postfuzionog F proteina (desna slika, Martin et al., J. Gen. Virol., 2006).
Izvršene su kristalografske studije koje pokazuju da je prečišćeni RSVF(+)FdTHS S155C, S290C homogen u rastvoru. Formiranje kristala u vodenom rastvoru je strog test za homogenost proteina u rastvoru. SL. 15 prikazuje slike kristala formiranih od prečišćenog RSVF(+)FdTHS S155C, S290C u vodenom puferu koji sadrži 0.2 M litijum sulfat, 1.64 M Na/K tartrat i 0.1 M CHES, na pH 9.5. Formiranje kristala RSVF(+)FdTHS S155C, S290C u vodenom puferu pokazuje da je ovaj protein suštinski homogen u rastvoru.
Primer 6
Indukcija neutrališućeg imunog odgovora korišćenjem PreF antigena Ovaj primer ilustruje upotrebu PreF antigena za izazivanje imunskog odgovora kod subjekta koji neutrališe RSV.
Osam nedelja stari miševi CB6F1/J bez patogena (Jackson Labs) podeljeni su u 5 grupa od po 10 miševa i imunizovani u sledećim režimima:
1) živi RSV A2 (RSV) pri 5x10<6>pfu intranazalno;
2) formalinom-inaktivisani RSV(FI-RSV) precipitiran alumom, intramuskularno (IM);
3) stabilizovani prefuzioni RSV F (RSVF(+)FdTHS S155C, S290C; prefuzioni F) 20 μg u poliI:C 50 μg IM;
4) postfuzioni RSV F trimer ((postfuzioni RSV) 20 μg u poliI:C 50 μg IM; i
Grupa 1 (živi RSV) je inficirana jednom u trenutku 0, a sve ostale grupe su imunizovane u 0. i 3. nedelji. Serum je dobijen u 5. nedelji, dve nedelje nakon 2. IM injekcije ili pet nedelja posle infekcije virusom RSV. Neutrališuća aktivnost je određena sledećim postupkom: Serumi su raspoređeni kao četvorostruka razređenja od 1:10 do 1:40960, pomešana sa jednakom zapreminom rekombinantnog mKate-RSV koji eksprimira prototipske F gene iz soja A2 (podtip A) ili 18537 (podtip B) i fluorescentni protein Katushka, i inkubirani na 37 °C jedan sat. Zatim je 50 μl smeše svakog razblaživanja seruma/virusa dodato HEp-2 ćelijama koje su zasejane pri gustini od 1.5x10<4>u 30 μl MEM (minimalni esencijalni medijum) u svaki bunarčić ploče sa crnim optičkim dnom sa 384 bunarčića, i inkubirano 20-22 sata pre spektrofotometrijske analize na Ex 588 nm i Em 635 nm (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, Sunnyvale, CA 94089). IC50 za svaki uzorak je izračunat pomoću prilagođavanja krive i nelinearne regresije korišćenjem GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego CA). P vrednosti su određene Studentovim T-testom. Navedeni postupak za merenje RSV neutralizacije je izvedena suštinski kao što je prethodno opisano (videti, npr. Chen et al. J. Imunol. Methods., 362:180-184, 2010), osim što je očitavanje urađeno pomoću fluorescentnog čitača ploča umesto protočne citometrije.
Kada se koristi ovaj test, odgovor antitela iznad ~100 EC50 bio uopšteno bio smatran zaštitnim. Kao što je prikazano na SL.13 i 14, miševi kojima je dat RSV F protein stabilizovan u prefuzionoj konformaciji (RSV F RSVF(+)FdTHS S155C, S290C) proizveo je neutrališući imunski odgovor na RSV A ~15 puta veći od onog koji su proizveli miševi kojima je dat RSV F protein u postfuzionoj konformaciji, a odgovor na RSV B ~5 puta veći od onog koji su proizveli miševi kojima je dat RSV F protein u postfuzionoj konformaciji. SL. 13 prikazuje rezultate nakon 5 nedelja nakon inicijalne imunizacije, a SL. 14 pokazuje rezultate posle 7 nedelja nakon imunizacije. Srednje indukovane IC50 vrednosti su takođe prikazane na SL. 13 i 14. Razlika u neutralizaciji između RSV podgrupa A i B ne iznenađuje budući da konstrukt RSVF(+)FdTHS S155C, S290C potiče od F proteina iz RSV podgrupe A. Očekuje se da će imunizacija odgovarajućim konstruktom koji potiče iz RSV B soja generisati neutrališuće serume specifičnije za RSV B (videti SL.41).
Dalje, pokazano je da stabilizovani prefuzioni F može da bude formulisan u alumu kao i poliI:C i zadržava imunogenost koja je data odgovorima antitela na antigensko mesto Ø. Miševi BALB/c su imunizovani sa 20 μg verzije DS S155C/S290C stabilizovanog prefuzionog F poreklom iz podtipa A i formulisanog sa alumom (aluminijum hidroksid gel 10 mg/ml, Brenntag, Frederikssund, Danska) ili poliI:C. Miševi su inouklisani u 0. i 3. nedelji, i u vremenskoj tački od 5 nedelja (2 nedelje nakon druge injekcije), dobijen je serum za testove neutralizacije (videti SL.
42). Rezultati pokazuju da imunizacija RSV F proteinom stabilizovanim u prefuzionoj konformaciji stvara zaštitni imunski odgovor na RSV.
Primer 7
Tretman subjekata otkrivenim antigenima
Ovaj primer opisuje postupke koji mogu da se koriste za lečenje subjekta koji ima infekciju, ili je u riziku od infekcije virusom RSV primenom jednog ili više otkrivenih PreF antigena, ili nukleinske kiseline ili virusnog vektora koji kodira, eksprimira ili uključuje PreF antigen. U konkretnim primerima, postupak uključuje skrining subjekta koji ima, misli da ima, ili je u riziku da ima (na primer zbog narušenog imuniteta, fiziološkog statusa, ili izlaganja RSV) infekciju virusom RSV. Subjekti nepoznatog statusa infekcije mogu se ispitati kako bi se utvrdilo da li imaju infekciju, na primer korišćenjem seroloških testova, lekarskog pregleda, enzimski vezanog imunosorbentnog testa (ELISA), radiološkog skrininga ili druge dijagnostičke tehnike poznate stručnjaku u ovoj oblasti. U nekim primerima, izabran je subjekt koji ima RSV infekciju ili je u riziku da dobije RSV infekciju. Subjekti za koje se utvrdi (ili za koje se zna) da imaju RSV infekciju i na taj način se mogu lečiti primenom otkrivenih PreF antigena, ili nukleinske kiseline ili virusnog vektora koji kodira, eksprimira ili uključuje PreF antigen, biraju se da prime PreF antigene, ili nukleinsku kiselinu ili virusni vektor koji kodira, eksprimira ili uključuje PreF antigen. Mogu da se odaberu i subjekti koji su u opasnosti od razvoja RSV infekcije, na primer, starije osobe, imunokompromitovane i veoma mlade osobe, kao što su odojčad.
Kod subjekata izabranih za lečenje može da se primeni terapeutska količina otkrivenih PreF antigena. Imunogena kompozicija koja uključuje PreF antigen može da se primeni u dozama od 0.1 μg/kg telesne težine do oko 1 mg/kg telesne težine po dozi, kao što je 0.1 μg/kg telesne težine do oko 1 μg/kg telesne težine, 0.1 μg/kg telesne težine do oko 10 μg/kg telesne težine po dozi, 1 μg/kg telesne težine - 100 μg/kg telesne težine po dozi, 100 μg/kg telesne težine - 500 μg/kg telesne težine po dozi ili 500 μg/kg telesne težine - 1000 μg/kg telesne težine po dozi ili još većoj. U nekim primerima izvođenja, oko 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili oko 100 μg PreF antigena je uključeno u imunogenu kompoziciju koja se daje subjektu u jednoj dozi. Imunogena kompozicija se može primenjivati u nekoliko doza, na primer kontinuirano, dnevno, nedeljno ili mesečno. Način primene može da bude bilo koji od onih koji se koristite u struci, kao što je nazalna primena. Količinu agensa koja se daje subjektu može da odredi kliničar i ona može da zavisi od konkretnog subjekta koji se leči. Ovde su date specifične ilustrativne količine (ali otkriće nije ograničeno na takve doze).
Primer 8
RSV F protein stabilizovan disulfidnom vezom, supstitucijama za popunjavanje šupljine i domenom trimerizacije
Ovaj primer ilustruje proizvodnju RSV F proteina stabilizovanog disulfidnom vezom i domenom trimerizacije.
Slika 16 pokazuje dizajn rekombinantnog RSV F proteina stabilizovanog konstruisanim mutacijama disulfidnih veza S155C i S290C (nazvane „DS“), mutacijama za popunjavanje šupljine S190F i V207L (nazvane „Cav1“), i heterolognim domenom trimerizacije dodatim na C-terminus F1 polipeptida F proteina. Prikazana trodimenzionalna struktura je struktura RSV F vezanog za D25, i prikazana je sa dva od protomera prikazana kao molekulska površina obojena ružičasti i bež, i trećim protomerom datim u trakastom prikazu. Prikazani su N- i C-terminalni ostaci F1 koji se pomeraju više od 5 Å između pre- i postfuzione konformacije. Umeci pokazuju konstruisane disulfidne veze između ostataka S155C i S290C, kao i mutacije za popunjavanje šupljine S190F i V207L. Model domena trimerizacije fibritina T4 faga prikazan je u osnovi prefuzionog trimera.
RSV F protein koji uključuje supstitucije S155C, S290C, S190F i V207L (Cav1) u humanom RSV podtipa A i dodati C-terminalni heterologni domen foldon, eksprimiran je i prečišćen korišćenjem postupaka opisanih u primeru 1 i 5, a naziva se RSV_A F(+)FdTHS DSCav1.
Antigenska karakterizacija RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 je prikazana na slici 17. Stope asocijacije i disocijacije rastvorljivih Fab D25, AM22, 5C4, 101F, Motavizumaba i Palivizumaba sa imobilisanim RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 izmerene su korišćenjem OctetRED 384™ instrumenta (ForteBio, Melno Park, CA). Date su ravnotežne konstante disocijacije za svako antitelo.
Čistoća RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 je ilustrovana ekskluzionom hromatografijom (SL. 18). Prečišćeni protein, nakon isecanja trombinom za uklanjanje oznaka, propušten je kroz kolonu 16/70 Superose 6 za ekskluzionu hromatografiju. Eluciona zapremina je konzistentna sa glikozilovanim trimerom.
Antigene i fizičke karakteristike, uključujući prinos od prolazno eksprimiranih plazmida, antigenost protiv različitih antigenskih mesta, i postojanost vezivanja za D25 (data kao relativna količina) posle 1 sata inkubacije na različitim temperaturama (350 mM NaCl pH 7.0, na 50 °C, 70 °C, ili 90 °C), pH vrednostima (350 mM NaCl pH 3.5 ili pH 10, na 25 °C) i osmolalnosti (osmolarnost 10 mM ili 3000 mM, pH 7.0, na 25 °C), ili 10 ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja (u 350 mM NaCl pH 7.0), varijanti RSV_A F(+)FdTHS stabilizovanih mutacijama DS, Cav1 ili DSCav1, prikazane su na SL.19. Varijanta DSCav1 zadržava prepoznavanje antigenskog mesta Ø, sa poboljšanom fizičkom stabilnošću zasnovanom na većem zadržavanju reaktivnosti prema D25, nakon izlaganja ekstremnim temperaturama, pH, osmolalnosti i zamrzavanju-odmrzavanju nego bilo koja od varijanti DS ili Cav1.
Da bi se ispitala strukturna svojstva mutanta DSCav1, trodimenzionalna struktura RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 određena je korišćenjem kristalografije X-zraka. SL.20 daje trakasti prikaz kristalne strukture RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 od 3.1 Å. Toplije boje i deblje trake odgovaraju povećanju B-faktora. Uprkos stabilizacionim mutacijama, antigensko mesto Ø, na vrhu trimera, zadržava značajnu fleksibilnost. SL. 21 prikazuje poređenje strukture RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 sa strukturom RSV F vezanom za D25. SL.22 naglašava stabilizujuće mutacije u strukturi RSV_A F(+)FdTHS DSCav1. Posmatrana elektronska gustina koja odgovara disulfidnoj vezi između ostataka cisteina 155 i 290 (levo), kao i ostatku Phe190 (desno) koji popunjava šupljinu, ukazuje da su ove modifikacije prisutne u kristalu.
Da bi se utvrdila imunogenost konstrukta RSV_A F(+)FdTHS DSCav1, miševi i nehumani primati su inokulisani ovim konstruktom, a serumi dobijeni od inokulisanih životinja testirani su na neutralizaciju RSV (SL. 23 i 24). Miševi su imunizovani, a aktivnost neutralizacije rezultirajućih seruma je testirana, kao što je opisano u primeru 6, gore. Ukratko, deset miševa CB6 po grupi je imunizovano sa 10 μg naznačenog RSV F proteina pomešanog sa 50 μg adjuvansa poli I:C. Imunizacije su urađene u 0. i 3. nedelji, i serumi iz 5. nedelje i 7. nedelje su ispitani na neutralizaciju RSV podtipa A (RSV_A) i B (RSV_ B). Srednje vrednosti su označene horizontalnim crvenim linijama. Životinjama indijskog porijekla Macaca mulatta težine 8.76-14.68 kg intramuskularno su ubrizgani imunogeni u 0. nedelji i 4. nedelji. Krv je sakupljana svake druge nedelje do 6 nedelja. Četiri rezus makaki majmuna koja nisu bila izložena virusu RSV po grupi su intramuskularno imunizovana sa 50 μg naznačenog RSV F proteina pomešanog sa 500 μg adjuvansa poli I: C. Imunizacija je urađena u 0. i 4. nedelji, a serumi iz 6. nedelje testirani su na neutralizaciju RSV podtipa A (levo) i B (desno). Srednje vrednosti su označene horizontalnim crvenim linijama. Zajedno uzevši, ovo pokazuje da je konstrukt RSV_A F(+)FdTHS DSCav1 uspešno generisao neutrališući odgovor kod miševa i nehumanih primata.
Primer 9
Dizajn zasnovan na strukturi fuzione glikoproteinske vakcine za respiratorni sincicijalni virus
Apstrakt. Respiratorni sincicijalni virus (RSV) je vodeći uzrok hospitalizacije kod dece mlađe od pet godina. Napori za izazivanje zaštitnog humoralnog odgovora protiv RSV, su bili fokusirani na antigensko mesto Ø, metastabilno mesto specifično za prefuziono stanje fuzionog (F) glikoproteina, jer je ovo mesto je glavno ciljno mesto delovanja visoko potentnih RSV-neutrališućih antitela izazvanih prirodnom infekcijom. Korišćen je dizajn zasnovan na strukturi za konstruisanje stabilizovanih verzija F u kojima je antigensko mesto Ø sačuvano pod ekstremnim vrednostima pH i temperature. Šest kristalnih struktura stabilizovanog F proteina pružilo je detalje na atomskom nivou za uvedene rezidue cisteina i popunjene hidrofobne šupljine i otkrilo suptilno različite „prefuzione“ konformacije F proteina. Imunizacija varijantama RSV F sa stabilizovanim mestom Ø izazvala je - i kod miševa i kod nehumanih primata - RSV-specifičnu neutralizujuću aktivnost 3-15 puta veću od one koju je RSV F izazvao u svom postfuzionom stanju. Stoga dizajn na atomskom nivou za dobijanje supermesta virusne ranjivosti može da ima transformišući efekat na razvoj vakcine.
Uvod. Procenjuje se da je respiratorni sincicijalni virus (RSV) odgovoran za 6.7% smrtnih slučajeva kod dece starosti od 1 meseca do 1 godine i da uzrokuje višak smrtnosti kod starijih osoba na nivoima koji su uporedivi sa onim izazvanim infekcijom virusom influence. Iako RSV infekcija ne izaziva potpuno zaštitni imunitet, antitela protiv RSV fuzionog (F) glikoproteina mogu da spreče teške bolesti kod ljudi kao što je pokazano pasivnom profilaksom sa antitelom usmerenim na F protein, palivizumabom (Synagis<®>).
Dokazani uspeh palivizumaba podstakao je napore u izradi vakcine usmerene na indukovanje zaštitnih antitela usmerenih na RSV F. Ove napore komplikuje strukturna raznolikost RSV F, fuzionog proteina tipa I koji poprima najmanje dve konformacije: metastabilno prefuziono stanje i stabilno postfuziono stanje. Oba stanja dele epitope na koje su usmerena neutralizaciona antitela, uključujući i palivizumab, i postfuzioni RSV F se razvija kao kandidat za vakcinu. Kao što je ovde opisano, nađeno je da se dominantno ciljno mesto RSV-neutrališućih antitela izazvanih prirodnom infekcijom prvenstveno nalazi na prefuzionoj konformaciji RSV F i antitela kao što su AM22 i D25 (videti, npr. U.S. 12/600,950 i U.S. 12/898,325) - znatno potentnija od palivizumaba – usmerena su antigensko mesto Ø, metastabilno mesto specifično za prefuzioni F, koje se nalazi na vrhu prefuzionog RSV F trimera distalno u odnosu na membranu.
Da bi se poboljšala indukcija ovih potentnih antitela, konstruisane rastvorljive varijante RSV F su dizajnirane da stabilno izlože antigensko mesto Ø. Ove varijante su okarakterisane i antigenski i kristalografski, i testirane na imunogenost kod miševa i nehumanih primata. Rezultati pružaju uvid u presek dizajna, antigenosti, strukture i imunogenosti i pokazuju kako inženjering zasnovan na strukturi za očuvanje i prikazivanje odgovarajućeg antigenog cilja može da imati transformišuće dejstvo na indukovanje zaštitnih humoralnih odgovora.
Strategija razvoja vakcine na bazi strukture opisana u ovom dokumentu uključivala je strategiju u četiri koraka: (1) identifikovanje supermesta virusne ranjivosti na koje ciljno deluju antitelima sa potentnom neutrališućom aktivnošću, (2) određivanje strukture supermesta u kompleksu sa reprezentativnim antitelom, (3) konstruisanje stabilno prezentovanog supermesta u odsustvu antitela koje ga prepoznaje i (4) indukovanje zaštitnih odgovora visokog titra imunizacijom konstruisanim antigenima koji prikazuju supermesto (SL.26).
Konstruisanje RSV F antigena
Zbog toga što ga prepoznaju izuzetno potentna antitela koja neutrališu RSV, antigensko mesto Ø je izabrano kao ciljno supermesto; ovde je opisana njegova struktura u kompleksu sa antitelom D25 (SL. 26B). Da bi se konstruisale varijante RSV F koje stabilno prezentuju mesto Ø, analizirana je struktura RSV F vezanog za D25. Mehanički, postoji više načina za stabilizaciju konformacije proteina. Mehanizmi za stabilizaciju mesta Ø bez kompromitovanja njegovog prepoznavanja testirani su u kombinaciji sa domenom trimerizacije fibritina faga T4 („foldon“) (Efimov et al., J Mol Biol 242, 470 (1994); Boudko et al., European journal of biochemistry/FEBS 269, 833 (2002)) dodatim na C-terminus ektodomena RSV F (McLellan et al., J. Virol.85, 7788 (2011)).
Uvođenje cisteinskih parova predviđenih da formiraju disulfidnu vezu u ciljnoj konformaciji, ali široko razdvojenih u alternativnim konformacijama, jedan je od pristupa za stabilizaciju odabrane strukture. β-ugljenici serinskih ostataka 155 i 290 su udaljeni 4.4 Å u RSV F strukturi vezanoj za D25 (videti primer 1) i 124.2 Å u prefuzionoj strukturi (McLellan et al., J. Virol.85, 7788 (2011; opisano iznad, i videti SL. 27 i 32). Dvostruki mutant S155C-S290C, nazvan „DS“, formirao je stabilne RSV F trimere, eksprimirao se na nivou od 1.4 mg/L, imao očuvano antigensko mesto Ø, i bio homogen na osnovu EM sa negativnim bojenjem (opisano iznad; videti i SL. 31, SL. 33). Druge cisteinske modifikacije, kao što su one između regiona RSV F koji su kompatibilni i sa prei sa postfuzionim stanjima (npr. S403C i T420C), nisu stabilizovale antigensko mesto Ø (SL.31). takođe je testiran niz potencijalnih među-subjediničnih dvostrukih modifikacija cisteina; nijedna od testiranih među-subjediničnih dvostrukih supstitucija cisteina, međutim, nije se eksprimirala na nivou višem od 0.1 mg/L.
Hidrofobne supstitucije koje popunjavaju šupljinu pružaju drugo sredstvo za stabilizaciju odabrane konformacije. RSV F struktura vezana za D25 analizirana je za hidrofobne šupljine jedinstvene za konformaciju RSV F vezanu za D25, koje su se pružale na regione koji se razlikuju u pre- i postfuzionim stanjima F proteina. Izvestan broj takvih šupljina identifikovan je u „glavi“ prefuzione strukture distalno u odnosu na membranu, blizu vezujućeg mesta D25, i modelirane su hidrofobne izmene kako bi se popunile ove šupljine. Promene S190F i V207L usvojile su preovlađujuće konformacije bočnih lanaca sa minimalnim interferiranjem, dok su K87F, V90L, V220L i V296F promene pokazale manje sterne kompatibilnosti, Ocenjeno je popunjavanje ovih šupljina parovima izmena. Par S190F-V207L, koji je nazvan „Cav1“ (SL.27), formirao je stabilne RSV F trimere, eksprimirane na nivou od 2.2 mg/L, i zadržao antigensko mesto Ø (SL. 31). Istovremeno, varijante K87F-V90L, S190F-V296F i V207L-V220L su pokazale poboljšano očuvanje prepoznavanja od strane D25, ali manje od 0.1 mg/l prinosa RSV F trimera (SL.31). Ostale šupljine prema centru prefuzionog RSV F bile su blizu fuzionog peptida, ose trimera i kiselom fragmentu koji sadrži ostatke Asp486, Glu487 i Asp489. Modeliran je niz promena za popunjavanja šupljine uključujući F137W, F140W i F488W, i ove izmene su analizirane u kombinaciji sa D486H, E487Q i D489H (SL. 31). Od šest ispitanih kombinacija, samo dve (F488W i D486H-E487Q-F488W-D489H) su eksprimirale nivoe prečišćenog RSV F trimera na nivou većem od 0.1 mg/l i očuvale prepoznavanje od strane D25. Varijanta D486H-E487Q-F488W-D489H, označena kao „TriC“, formirala je stabilne RSV F trimere, eksprimirane na nivou od 0.8 mg/l, i zadržala antigensko mesto Ø (SL.31, SL.27).
Takođe je ispitan uticaj destabilizacije postfuzione konformacije na očuvanje antigenskog mesta Ø. Ispostavilo se da V178N, predviđena za uvođenje N-vezanog glikana kompatibilnog sa prefuzionom, ali ne i postfuzionom konformacijom F, nije stabilizovala antigensko mesto Ø, kao ni V185E ili I506K, koje bi postavile glutaminska kiselina ili lizin u unutrašnjost postfuzionog snopa od šest heliksa (SL. 31). Ove mutacije verovatno rezultuju nekom intermedijarnom konformacijom RSV F koja je „aktivirana“, ali nije u stanju da usvoji postfuzionu konformaciju. Ukupno je konstruisano preko 100 varijanti RSV F, eksprimiranih u formatu transfekcija u pločama sa 96 bunarčića (Pancera et al., PLoS ONE 8, e55701 (2013)) i testirano ELISA metodom za vezivanje za D25 i motavizmab. Petnaest konstrukata je bilo kompatibilno sa vezivanjem za D25, od kojih je šest očuvalo prepoznavanje od strane D25 najmanje 7 dana na 4°C, a tri od njih su mogla da budu prečišćena do homogenih trimera koji su zadržali antigensko mesto Ø (SL.31). Ukupno uzevši, zapažena je jaka korelacija između očuvanja vezivanja za D25 tokom najmanje 7 dana na 4 °C u supernatantima iz ploča sa 96 bunarčića i prinosa prečišćenih trimera iz ekspresije i prečišćavanja industrijskog obima (SL.34).
Kombinatorna optimizacija stabilnosti mesta Ø
Varijante DS, Cav1 i TriC su pokazale niz fizičkih i antigenskih svojstava. Varijanta DS je bila najmanje stabilna na ekstremnim vrednostima pH i temperature, ali trajnije stabilizovana u trimernom stanju, dok je konstantna interkonverzija iz trimera u agregat primećena kod Cav1 i TriC. Da bi se procenilo da li se optimalnija varijanta RSV F može dobiti kombinovanjem DS, Cav1 i TriC, napravljene su sve kombinacije.
Kombinacije su generalno poboljšale zadržavanje reaktivnosti prema D25 pri ekstremnim fizičkim uslovima. Tako su, na primer, sve kombinacije pokazale bolju stabilnost pri inkubaciji na 50°C ili pH 10.0. Međutim, niska tolerancija na zamrzavanje-odmrzavanje koju je ispoljio TriC takođe je primećena i kod Cav1-TriC i DS-Cav1-TriC. Generalno, kombinacija DS-Cav1 pokazala se optimalnom u smislu prinosa trimera i fizičke stabilnosti na ekstremnim vrednostima temperature, pH, osmolalnosti i zamrzavanja-odmrzavanja (SL.31, SL.35), i bila je homogena na osnovu EM sa negativnim bojenjem (SL.33).
Kristalografska analiza
Da bi se obezbedile povratne informacije na nivou atoma, utvrđene su kristalne strukture varijante RSV F sa stabilizovanim mestom Ø (SL.28). Varijante DS, Cav1, DS-Cav1 i DS-Cav1-TriC su kristalizovane u sličnim uslovima 1.5 M tartrata, pH 9.5, i ovi kubni kristali difraktovali su X-zrake do rezolucija od 3.1 Å, 3.1 Å, 3.8 Å, odnosno 2.8 Å (SL.40). Rešenja molekularne zamene dobijena su korišćenjem strukture RSV F vezanog za D25 kao modela za pretragu, i ona su otkrila jedan RSV F protomer u asimetričnoj jedinici, sa osom F trimera poravnatom duž kristalografske trostruke ose. Tetragonalni kristali Cav1 i kubni kristali DS-Cav1 takođe su dobijeni u uslovima 1.7 M amonijum sulfata pH 5.5, i oni su difraktovali do rezolucija od 2.4 Å, odnosno 3.0 Å (SL.
40). Molekularna zamena je otkrila tetragonalnu rešetku koja ima kompletan RSV F trimer u asimetričnom jedinici, i veoma je slična kubnoj tartratnoj rešetki. Sve u svemu, ove strukture otkrile su da su konstruisane varijante RSV F suštinski u konformaciji vezanoj za D25 (Konstruisane varijante RSV F imale su C □-srednja kvadratna odstupanja od konformacije vezane za D25 između 0.68-1.5 Å, a od postfuzione konformacije oko 30 Å).
Iako je struktura varijante DS (SL.28, kolona sasvim levo) bila stabilna kao rastvorljivi trimer, sa cisteinom supstituisanim ostacima 155 i 290 koji zapravo formiraju disulfidnu vezu koja je u velikoj meri sprečila aktivaciju u postfuziono stanje, veliki deo dela RSV F trimera distalno u odnosu na membranu, uključujući antigensko mesto Ø, bio je ili poremećen (ostaci 63-72 i 169-216) ili je bio u drugačijoj konformaciji. Tako, na primer, ostaci 160-168 u DS strukturi se pružaju izvan α2-heliksa umesto da formirju okret i iniciraju α3-heliks kao u F strukturi vezanoj za D25 (SL. 28B, panel sasvim levo). Jedno neograničavajuće objašnjenje za razlike između strukture DS i strukture RSV F vezanog za D25 jeste da je kristalizovani DS u konformaciji koja ne vezuje D25. Generalno, varijanta DS je zadržala mnoge karakteristike prefuzionog stanja RSV F, uključujući fuzioni peptid u unutrašnjosti trimerne šupljine.
U poređenju sa DS, struktura Cav1 (SL.28, 2. i 3. kolona) je uređenija na vrhu distalno u odnosu na membranu, sa jasno definisanim α3-heliksom, β3/β4 ukosnicom i α4-heliksom. Ostaci 137-202, koji sadrže supstituciju S190F, imali su Cα-rmsd od 0.6 Å u odnosu na F strukturu vezanu za D25. Veći stepen strukturnog reda verovatno je nastao usled mutacije S190F koja je ispunila šupljinu uočenu u F strukturi vezanoj za D25, i povećala van der Waalsove kontakte sa ostacima Ile57, Lys176, Val192, Glu256, Ser259 i Leu260. Druga mutacija za popunjavanje šupljine u Cav1, V207L, bila je pomerena za 5.5 Å u poređenju sa F strukturom vezanom za D25, sa C-terminalnim delom α4-heliksa koji formira petlju u blizini Pro205 i usvajala je različite konformacije pod dva različita uslova kristalizacije (SL.28B, 2. i 3. panel sa leve strane).
Upečatljiva karakteristika strukture Cav1 u tetragonalnoj kristalnoj rešetki je C-terminus F2, koji je poremećen u F strukturi vezanoj za D25, ali u Cav1 formira tunel u trimernu šupljinu duž fuzionog peptida. Zanimljivo je da C-terminus završava sa Ala107, a ne Arg109, kao što se očekuje nakon isecanja furinskog mesta (Arg106-Ala107-Arg108-Arg109). U strukturi Cav1 pozitivno naelektrisanje Arg106 se kompenzuje uređenim sulfatnim jonom (SL.28C). Biološki, unutrašnji položaj C-terminusa F2 može da igra ulogu u aktiviranju prefuzione konformacije F proteina. Poređenje struktura DS-Cav1 iz dva tetragonalna kristalna oblika (SL. 28, 2. i 3. kolona s desna) sa strukturom Cav1 otkrilo je samo manje razlike (Cα rmsd od 0.86 Å za ostatke između Cav1 i DS-Cav1 uzgojene u uslovima amonijum sulfata; Cα rmsd od 0.47 Å za 447 ostataka u kubnoj rešetki). Najveće razlike su se javile na vrhu RSV F, uključujući antigensko mesto Ø, a posebno u ostacima 64-73 i 203-216. Značajno, mobilnost atoma (B-faktor) je bila najveća u ovom vršnom regionu za sve varijante sa stabilizovanim mestom Ø, što je možda pokazatelj inherentne fleksibilnosti mesta Ø. Zanimljivo, međutim, mesto Ø ima nisku pokretljivost atoma kada je vezano za D25, otkrivajući sposobnost D25 da stabilizuje i globalne i lokalne konformacije RSV F.
Struktura trostruke kombinacije DS-Cav1-TriC (SL. 28, krajnje desna kolona) je takođe bila veoma slična strukturama drugih varijanti RSV F koje sadrže Cav1. Jedna razlika u elektronskoj gustini, međutim, odgovarala je ekspanziji slabe gustine u regionu proksimalno u odnosu na membranu, što je odgovaralo dimenzijama domena trimerizacije T4-fibritina (Stetefeld et al., Structure 11, 339 (2003)), što nije vidljivo u drugim kristalizovanim strukturama RSV F koje sadrže ovaj domen, uključujući strukturu vezanu za D25. Male strukturne razlike u pakovanju verovatno omogućavaju delimično uređenje ovog domena (a mogu takođe da objasne povećani opseg difrakcije kristala DS-Cav1-TriC u odnosu na druge kubne varijante), pre nego razlike u interakciji između stabilizovanog RSV F sa DS-Cav1-TriC i ovog domena trimerizacije.
U pogledu promena TriC ostataka 486-489, kritična supstitucija F488W bila je upakovana direktno naspram supstitucija F488W u susednim protomerima RSV F trimera. Bočni lanac indola Trp488 bio je usmeren prema vrhu trimera i takođe je formirao steking interakcije prstena sa bočnim lancem 140Phe fuzionog peptida (SL.28C, krajnji desni panel). Ova interakcija fuzionog peptida, koja nije uočena ni u jednoj od struktura koje sadrže Phe488, verovatno inhibira ekstrakciju fuzionog peptida iz šupljine prefuzionog trimera, pružajući strukturno obrazloženje za sposobnost promene F488W da stabilizuje prefuziono stanje RSV F (SL.31).
Imunogenost RSV F sa stabilizovanim antigenskim mestom Ø
Da bi se procenio efekat stabilizacije mesta Ø na indukovanje humoralnih odgovora koji štite od RSV, miševi CB6 su imunizovani sa različitim oblicima RSV F, ubrizgavanjem svakom miša 10 μg RSV F u kombinaciji sa 50 μg adjuvansa poli I:C u 0. i 3. nedelji i merenjem sposobnosti seruma u 5. nedelji da spreči RSV infekciju ćelija HEp-2. DS, Cav1 i TriC su izazvali visoke titre neutrališuće aktivnosti (geometrijska srednja 50% efektivnih koncentracija (EC50) od 1826-2422). Ovaj nivo je bio ~3 puta veći nego nivo izazvan postfuzionim F (504 EC50), i ~20 puta veći od zaštitnog praga. Poređenja radi, DS-Cav1 je izazvao neutralizujuću aktivnost od 3937 EC50, otprilike 7 puta veću od postfuzionog F i 40 puta veću od zaštitnog praga (SL. 29A). (Kada se palivizumab (Synagis®) dozira u koncentraciji od 15 mg/kg, rezidualni serumski nivoi su ~40 μg/ml, što pruža zaštitu kod odojčadi od teških bolesti. U testu neutralizacije, 40 μg/ml palivizumaba u serumu daje EC50 od 100. Ovaj titar je takođe povezan sa potpunom zaštitom od infekcije donjeg respiratornog trakta kod miševa i pamučnih pacova izloženih RSV.)
Da bi se kvantifikovalo indukovanje antitela među različitim mestima na prefuzionom RSV F, korišćeni su oblici RSV F sa skrivenim antigenskim mestom Ø. Miševi CB6 imunizovani sa 20 μg RSV F vezanog za antitela usmerena na antigensko mesto Ø (koji sadrži ~10 μg RSV F i ~10 μg antigen-vezujućeg fragmenta antitela) razvili su u 5. nedelji neutrališuće titre sa geometrijskom sredinom od 911 i 1274 EC50 za kompleks sa AM22, odnosno D25, otprilike dvostruko više od postfuzionog oblika na 10 μg/ml i uporedivo sa onima koje indukuje postfuzioni oblik na 20 μg/ml (SL. 29A). Ovi nalazi ukazuju na to da su veoma visoki titri indukovani imunizacijom sa varijantama RSV F stabilizovanim u prefuzionom stanju - posebno DS-Cav1 - nastali zbog antitela koja su usmerena na antigensko mesto Ø.
Da bi se ispitala univerzalnost indukovanja mesta Ø, majmuni rezus makaki su imunizovani sa DS-Cav1, DS i postfuzionim oblicima RSV F, ubrizgavanjem svakom makaki 50 μg RSV F pomešanog sa 500 μg adjuvansa poli I:C u 0. i 4. nedelji i merenjem sposobnosti seruma u 6. nedelji da inhibiraju RSV infekciju. Formulisani proteini zadržali su očekivane antigene profile mereno vezivanjem D25 (SL.38). DS i DS-Cav1 su indukovali geometrijske srednje titre od 1222, odnosno 2578 EC50, otprilike 5 i 10 puta veće od postfuzionog F (287 EC50) (SL. 29B), čime je pokazana očuvanost relativne imunogenosti kod različitih oblika RSV F imunogena između miševa i primata, i sposobnost DS-Cav1 da generiše visoke zaštitne titre protiv RSV u imunskom sistemu primata.
Optimizacija zaštitnih odgovora na RSV F
Matrica informacija (SL. 26C) dobijena interakcijom dizajna, fizičkih i antigenskih svojstava, strukture na atomskom nivou i imunogenosti pruža osnovu za dalju optimizaciju (Nabel, Science 326, 53 (2009)). Na primer, da bi se razumeo odnos između različitih antigenih i fizičkih svojstava konstruisanog RSV F i indukcije zaštitnih odgovora protiv RSV, mogu se korelirati svojstva (SL.
31) sa imunogenošću (SL. 29). Takve korelacije pokazuju da bi povećana stabilnost mesta Ø na ekstremne fizičke uslove (ali ne i prinos trimera niti afinitet D25) trebalo da poveća zaštitne titre indukovane imunizacijom (SL.30A), čime se obezbeđuje uvid u dalju optimizaciju dizajna. Slično tome, korelacije između različitih konformacionih stanja ili regiona RSV F (SL.28) i imunogenosti (SL. 29) pružaju uvid u dizajn konformacije RSV F koja obezbeđuje odgovore koji najviše štite. U ovom slučaju, rezultati ukazuju na to da bi unapređenje strukturne mimikrije antigenskog mesta Ø u njegovoj konformaciji vezanoj za D25 trebalo da dovede do poboljšanih zaštitnih titara (SL.
30B).
Pored pružanja smernica za poboljšanje, matrica informacija može takođe da obezbedi procenu u kojoj meri može doći do takvog poboljšanja. Odnosno, jednom kada se uspostavi korelacija između fizičke stabilnosti ili strukturne mimikrije i zaštitnih odgovora, može se povećati fizička stabilnost (npr. na 100% očuvanje vezivanja za D25) ili strukturna mimikrija (npr. do precizne mimikrije konformacije vezane za D25) da bi se realizovala ideja o maksimalnom poboljšanju indukovanog zaštitnog odgovora u odnosu na taj određeni parametar. Ovi rezultati (SL.30A, B) ukazuju da dodatna strukturna mimikrija verovatno ne bi imala mnogo uticaja na imunogenost, ali dodatna fizička stabilizacija antigenskog mesta Ø bi mogla značajno da poboljša antigenski kvalitet zaštitnih titara. Nezavisni parametri kao što su adjuvansi, multimerizacija ili režimi imunizacije verovatno će omogućiti poboljšanje indukovanog odgovora, a takvi parametri se mogu nezavisno analizirati i optimizovati. (Fleksibilnost antigenskog mesta može povećati njegovu imunogenost omogućavajući mestu da se prilagodi širokoj raznolikosti antitela. U tom kontekstu autori napominju da su faktori atomske pokretljivosti antigenskog mesta Ø bili među najvišim u ektodomenu RSV F).
Eksperimentalno mešanje parametara takođe može da pruži uvid. Na primer, da bi se odredio fokus seruma indukovanih pomoću RSV F, imunogenost može da se ispita antigenski (SL.30C). Da bi se izmerila antigenost seruma indukovana različitim oblicima RSV F, različiti oblici RSV F su spajani su sa Octet biosenzorskom probom, i izmerena je reaktivnost indukovanih seruma kao i „preapsorbovanih“ seruma, kojima su dodati različiti oblici RSV F (SL.30C). U slučaju DS-Cav1 na senzoru, biosenzorski odgovori za makake imunizovane postfuzionim F, DS i DS-Cav1 pokazali su rastuće odgovore (SL. 30C, levi panel); u slučaju postfuzionog F na senzoru, biosenzorski odgovori na iste serume pokazali su opadajuće odgovore (SL.30C, desni panel); a u slučaju seruma koji su bili preapsorbovani sa postfuzionim F i sa DS-Cav1 na senzoru, odgovori za makake imunizovane postfuzionim F, DS i DS-Cav1 pokazali su tendenciju da indukuju zaštitne titrove (SL. 30C levi panel). Ukupno uzevši, indukovani titrovi EC50 nisu imali tendenciju ka antigenskim odgovorima merenim bilo protiv prefuzionih ili postfuzionih oblika RSV F, već su bili u korelaciji sa nivoom odgovora specifičnih za prefuzionu konformaciju, izmerenim kao razlika ili kao odnos (p=0.005) između odgovora usmerenih prefuzionim i postfuzionim RSV F (SL. 30D) (Za „prefuzioni“ oblik RSV F, korišćena je DS-Cav1 stabilizovana varijanta RSV F). Ovi rezultati ukazuju na to da je kvalitet imunskog odgovora značajno bolji za imunogene RSV F u prefuzionoj u odnosu na postfuzionu konformaciju, što je nalaz koji može da se poveže sa boljom potencijom neutralizacije uočenom kod prefuziono-specifičnih antitela usmerenih na antigensko mesto Ø (trebalo bi da bude moguće eliminisati inducibilni odgovor korišćenjem strukturno definisanih proba, kao što je pokazano za RSV F vezan za D25 i motavizumab na SL.39).
Bez vezivanja za određenu teoriju, antigenska mesta koja sadrže više epitopa, na koja ciljno deluju antitela koja potiču iz većeg broja gena klicine linije, mogu da budu idealna ciljna mesta za vakcinu s obzirom da ova „supermesta“ imaju veliku verovatnoću da indukuju veći broj linija neutrališućih antitela. Antigensko mesto Ø na RSV F je primer antigenog supermesta koje je takođe mesto virusne ranjivosti. Mnoge pouke izvučene iz ovde opisanih napora načinjenih sa RSV, kao što su važnost ispitivanja prirodnog imunskog odgovora čoveka i izbora odgovarajućeg ciljnog mesta, verovatno će biti opšte primenljive. Ukratko, fokusiranjem dizajna zasnovanog na strukturi na supermesta ranjivosti, strukturna vakcinologija može da bude na ivici postizanja promene paradigme u razvoju vakcina protiv virusnih patogena.
Materijali i metode
Virusi i ćelije. Štokovi virusa su pripremljeni i održavani kao što je prethodno opisano (Graham et al., J. Med. Virol.26, 153 (1988)). RSV koji eksprimira zeleni fluorescentni protein (GFP) RSV-GFP je konstruisan i obezbeđen kao što je prethodno opisano (Hallak et al., Virology 271, 264 (2000)). Titar štokova RSV-GFP korišćenih za neutralizaciju zasnovanu na protočnoj citometriji i testove fuzije bio je 2.5×10<7>pfu/ml. Titar štoka RSV A2 koji se koristi za test vezivanja bio je 1.02 × 10<8>pfu/ml. Ćelije HEp-2 su održavane u minimalnom esencijalnom medijumu Eagle koji sadrži 10% goveđeg fetalnog seruma (10% EMEM) i obogaćen je glutaminom, penicilinom i streptomicinom.
Ekspresija i prečišćavanje antitela i Fab fragmenata. Antitela su eksprimirana prolaznom kotransfekcijom plazmida teških i lakih lanaca u ćelijama HEK293F u suspenziji na 37 °C tokom 4-5 dana (videti gore, i takođe McLellan et al., Nat Struct Mol Biol 17, 248 (2010); McLellan et al., J Virol 84, 12236 (2010)). Ćelijski supernatanti su propušteni preko agaroze sa proteinom A i vezana antitela su isprana PBS-om i eluirana elucionim puferom za IgG u 1/10 zapremine 1 M Tris-HCl pH 8.0. Fab su dobijeni digestijom IgG pomoću Lys-C ili HRV3C proteaze (McLellan et al., Nature 480, 336 (2011)), i smeša Fab i Fc je ponovo propuštena preko agaroze sa proteinom A da se uklone Fc fragmenti. Fab koja su protekla kroz kolonu su dalje prečišćena ekskluzionom hromatografijom.
Skrining konstrukata RSV F sa stabilizovanom prefuzionom konformacijom. Prefuzione varijante RSV F potiču iz konstrukta RSV F(+) Fd (videti primer 1), koji se sastoji od ostataka 1-513 RSV F sa C-terminalnim trimerizacionim motivom fibritina T4 (McLellan et al., Nature 480, 336 (2011)), mestom isecanja trombinom, 6x His-tag i StreptagIL Pristup prolazne ekspresije gena u formatu ploče sa 96 bunarčića korišćen je za postizanje efikasne ekspresije različitih RSV F proteina kao što je prethodno opisano (Pancera et al., PLoS ONE 8, e55701 (2013)). Ukratko, 24 sata pre transfekcije, ćelije HEK 293T su zasejane u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića pri gustini od 2.5x10<5>ćelija/ml u medijumu za ekspresiju (visoko glukozni DMEM dopunjen sa 10% goveđeg fetalnog seruma sa veoma niskim sadržajem IgG i 1x neesencijalne aminokiseline), i inkubirane na 37 °C, 5% CO2 tokom 20 h. Plazmidna DNK i TrueFect-Max (United BioSystems, MD) su pomešani i dodati u rastuće ćelije, i ploča sa 96 bunarčića je inkubirana na 37 °C, 5% CO2. Sledećeg dana nakon transfekcije, obogaćeni medijum (visoko glukozni DMEM plus 25% goveđeg fetalnog seruma sa veoma niskim sadržajem IgG, 2x neesencijalne aminokiseline, 1x glutamin) je dodat u svaki bunarčić i ploče su vraćene u inkubator za kontinuiranu kulturu. Petog dana posle transfekcije, eksprimirani RSV F protein u supernatantu je sakupljen i ispitan ELISA testom za vezivanje za antitela D25 i motavizumab korišćenjem Ni<2+>-NTA mikroploča. Nakon inkubacije sakupljenih supernatanata na 4 °C nedelju dana, ELISA testovi su ponovljeni.
Ekspresija i prečišćavanje konstrukata RSV F industrijskog obima. Rastvorljivi postfuzioni RSV F je eksprimiran i prečišćen kao što je prethodno opisano (McLellan, J Virol 85, 7788 (2011)). Prefuzione varijante su eksprimirane prolaznom tranfekcijom u ćelijama Expi293F korišćenjem TrueFect-Max (United BioSystems, MD). Supernatanti kulture su sakupljeni 5 dana posle transfekcije i centrifugirani na 10000 g da bi se uklonili ostaci ćelija. Supernatanti kulture su sterilno filtrirani pre izmene pufera i koncentrisani korišćenjem filtracije sa tangencijalnim protokom (van Reis, J Membrane Sci 159, 133 (1999)). RSV F glikoproteini su prečišćeni afinitetnom hromatografijom na bazi imobilizovanog nikla i streptaktina, a relevantne frakcije koje sadrže varijante RSV F su spojene, koncentrovane i podvrgnute ekskluzionoj hromatografiji (videti primer 1). Afinitetne oznake su uklonjene digestijom trombinom, što je praćeno ekskluzionom hromatografijom. Glikoproteini koji su korišćeni u imunizacijama nehumanih primata testirani su na endotoksine pomoću testa na bazi lizata amebocita limulusa, i ako je potrebno, proteini su propušteni kroz koloni EndoTrap Red (BioVendor) za uklanjanje endotoksina pre imunizacije. Nivo endotoksina je bio < 5 EU/kg telesne težine/čas, mereno pomoću kompleta za test Endpoint Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (Lonza, Bazel, Švajcarska).
Antigenska karakterizacija stabilizovanog RSV F. Instrument fortéBio Octet Red384 je korišćen za merenje kinetike vezivanja RSV F za antitela usmerenih na antigensko mesto Ø (D25, AM22), mesto I (131-2a), mesto II (pavlizumab, motavizmab) i mesto IV (101F). Svi testovi su obavljeni uz mućkanje na 1000 obrtaja u fosfatno puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS) dopunjenom sa 1% goveđeg serumskog albumina (BSA) kako bi se smanjile nespecifične interakcije. Konačna zapremina svih rastvora je bila 100 μl/bunarčiću. Testovi su izvedeni na 30 °C u potpuno crnim pločama sa 96 bunarčića (Geiger Bio-One). Strep MAB-Immo (35 μg/ml) u PBS puferu je korišćen za nanošenje anti-mišjih Fc proba tokom 300 s, koje su zatim korišćene da vezuju relevantne varijante proteina RSV F koje su sadržale C-terminalni Strep-tag. Tipični nivoi vezivanja za svaku fazu opterećenja bili su između 0.7 i 1 nm, a varijabilnost u redu od osam vrhova nije prelazila 0.1 nm za svaki od ovih koraka. Vrhovi biosenzora su zatim bili uravnoteženi tokom 300 s u PBS 1% BSA pre merenja povezivanja sa antigen-vezujućim fragmentima (Fab) u rastvoru (0.002 μM do 1 μM) tokom 300 s; fragmentima Fab je zatim dozvoljeno da disociraju tokom 400 s-1200 s u zavisnosti od zapažene stope disocijacije. Bunarčići za disocijaciju su korišćeni samo jednom da bi se sprečila kontaminacija. Paralelna korekcija za oduzimanje sistematskog pomeranja od početnog nivoa je izvedena oduzimanjem merenja zabeleženih za napunjeni senzor inkubiran u PBS 1% BSA. Da bi se uklonili nespecifični odgovori vezivanja, molekul HIV-1 gp120 sa C-terminalnom oznakom Strep-tag je nanet na probu sa anti-mišjim Fc i inkubiran sa RSV Fab, a nespecifični odgovori su oduzeti od podataka odgovora na varijantu RSV F. Analiza podataka i podešavanje krive su izvedeni korišćenjem softvera Octet, verzija 7.0. Eksperimentalni podaci su prilagođeni jednačinama vezivanja koje opisuju interakciju 1:1. Globalne analize kompletnih skupova podataka koji pretpostavljaju reverzibilno vezivanje (potpuna disocijacija) izvedene su pomoću nelinearne aproksimacije najmanjih kvadrata koja omogućava dobijanje jednog skupa parametara vezivanja istovremeno za sve koncentracije koje se koriste u svakom eksperimentu.
Fizička stabilnost varijanti RSV F. Da bi se procenila fizička stabilnost dizajniranih RSV F proteina pod različitim stresnim uslovima, proteini su tretirani pod različitim farmaceutski relevantnim stresovima, kao što su ekstremni pH, visoka temperatura, niska i visoka osmolalnost, kao i ponovljeni ciklusi zamrzavanja/odmrzavanja. Fizička stabilnost tretiranih RSV F proteina je procenjena njihovim stepenom očuvanja antigenog mesta Ø nakon tretmana, kritičnim parametrom koji se procenjuje vezivanjem antitela D25 specifičnog za mesto Ø.
U pH tretmanu, RSV F protein je razblažen do početne koncentracije od 50 μg/ml, podešen je na pH 3.5 i pH 10 odgovarajućim puferima i inkubiran na sobnoj temperaturi 60 minuta pre nego što se ponovo neutrališe na pH 7.5 i podesi na 40 μg /ml. U temperaturnom tretmanu, RSV protein na 40 μg/ml je inkubiran na 50 °C, 70 °C i 90 °C tokom 60 minuta u uređajima za PCR sa zagrejanim poklopcima kako bi se sprečilo isparavanje. U tretmanu osmolalnosti, 100 μl rastvora RSV F proteina (40 μg/ml) koji je prvobitno sadržavao 350 mM NaCl je ili razblaženo pomoću 2.5 mM Tris pufera (pH 7.5) do osmolalnosti od 10 mM NaCl ili podešeno pomoću 4.5 M MgCl2 do finalne koncentracije od 3.0 M. Rastvori proteina su inkubirani 60 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim vraćeni na 350 m NaCl dodavanjem 5M NaCl ili razblaživanjem pomoću 2.5 mM Tris pufera, redom, pre koncentrovanja do 100 μl. Tretman zamrzavanja/odmrzavanja je sproveden 10 puta ponovljenim zamrzavanjem u tečnom azotu i odmrzavanjem na 37 °C. Vezivanje antitela D25 za tretirane RSV F proteine izmereno je Octet instrumentom prema gore opisanim protokolima.
Stepeni fizičke stabilnosti su prikazani kao odnos nivoa vezivanja D25 u stabilnom stanju pre i posle tretmana pod stresnim uslovima.
Prikupljanje podataka o kristalizaciji i difrakciji X-zraka prefuziono stabilizovanih RSV F proteina. Kristali DS, Cav1, DSCav1 i DSCav1TriC RSV F su uzgajani postupkom difuzije pare u visećim kapljicama na 20 °C mešanjem 1 μl RSV F sa 1 μl rastvora rezervoara (1.4 M K/Na tartrat, 0.1M CHES pH 9.5, 0.2 M LiSO4). Kristali su direktno zamrznuti u tečnom azotu. Kristali Cav1 i DSCav1 RSV F takođe su uzgajani postupkom difuzije pare u visećim kapljicama na 20 °C mešanjem 1 μl RSV F sa 0.5 μl rastvora rezervoara (1.7 M amonijum sulfat, 0.1 M citrat pH 5.5). Kristali su prebačeni u rastvor 3.2 M amonijum sulfata, 0.1 M citrata pH 5.5, i brzo zamrznut u tečnom azotu. Svi podaci difrakcije X-zraka su prikupljeni na talasnoj dužini od 1.00 Å na liniji snopa SER-CAT ID-22.
Određivanje strukture, utačnjavanje i analiza prefuziono stabilizovanog RSV F.
Podaci o difrakciji X-zraka su integrisani i skalirani korišćenjem softverskog paketa HKL2000 (Otwinowski and Minor, Methods Enzymol. (Academic Press, 1997), vol. 276, pp.307-326)), a rastvori za molekularnu zamenu su dobijeni korišćenjem PHASER (McCoy et al., Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658 (2007)) pomoću RSV F strukture vezane za D25 (PDB ID: 4JHW, (videti primer 1)) kao model pretrage. Ručna izgradnja modela izvedena je korišćenjem COOT (Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486 (2010)), a utačnjavanje je izvršeno u PHENIX (Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 213 (2010)). Finalna statistika prikupljanja i utačnjavanja podataka prikazana je na SL.40. Poravnanje RSV F struktura je izvedeno korišćenjem ostataka 225-455 koji su pokazali visok nivo strukturne sličnosti. Proračuni rmsd za antigensko mesto Ø su zasnovani na ostacima 61-71 i 194-219 koji su bili u 10 Å od antitela D25 u strukturi kompleksa RSV F-D25.
Analiza elektronske mikroskopije sa negativnim bojenjem. Uzorci su apsorbovani na rešetke koje su sveže obložene ugljem posle svetlećeg pražnjenja, isprani dva puta puferom i obojeni sveže napravljenim 0.75% uranil formatom. Slike su snimljene mikroskopom FEI T20 sa 2k x 2k Eagle CCD kamerom sa veličinom piksela od 1.5 Å. Analiza slike i 2D usrednjavanje izvedeno je pomoću Bsoft (Heymann, J. Struct. Biol. 157, 3 (2007)) i EMAN (Ludtke et al., J. Struct. Biol.
128, 82 (1999)).
Imunizacije NHP. Svi eksperimenti na životinjama su pregledani i odobreni od strane Odbora za negu i upotrebu životinja Centra za istraživanje vakcina, NIAID, NIH, i sve životinje su smeštene i zbrinute u skladu sa lokalnim, državnim, saveznim i institucionalnim politikama u objektu u NIH akreditovanom od strane Američkog udruženja za akreditaciju nege laboratorijskih životinja (AAALAC). Životinjama Macaca mulatta indijskog porijekla težine 8.76-14.68 kg su intramuskularno ubrizgani imunogeni u 0. nedelji i 4. nedelji. Krv je sakupljana svake druge nedelje do 6 nedelja.
Testovi neutralizacije RSV. Serumi su raspoređeni kao četvorostruka razređenja od 1:10 do 1:40 960, pomešana sa jednakom zapreminom rekombinantnog mKate-RSV koji eksprimira prototipske F gene iz soja A2 i fluorescentni protein Katushka, i inkubirani na 37 °C jedan sat. Zatim je 50 μl smeše svakog razblaživanja seruma/virusa dodato HEp-2 ćelijama koje su zasejane pri gustini od 1.5x10<4>u 30 μl MEM (minimalni esencijalni medijum) u svaki bunarčić ploče sa crnim optičkim dnom sa 384 bunarčića, i inkubirano 20-22 sata pre spektrofotometrijske analize na Ex 588 nm i Em 635 nm (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, Sunnyvale, CA 94089). IC50 za svaki uzorak je izračunat pomoću prilagođavanja krive i nelinearne regresije korišćenjem GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego CA). P vrednosti su određene Studentovim T-testom.
Analiza antigenosti seruma. Instrument fortéBio Octet Red384 je korišćen za merenje reaktivnosti seruma prema varijantama proteina RSV F primenom mućkanja, temperature, ploča sa 96 bunarčića, pufera i zapremina identičnih onima koji se koriste za kinetička merenja. RSV F DSCav1 i postfuzioni F su imobilisani na probama koje vezuju amin putem aktivacije probe u smeši za aktivaciju EDC/NHS tokom 300 s u 10 mM acetatu, pH 5. Reaktivnost probe je ugašena upotrebom 10 mM etanolamina, pH 8.5. Tipični nivoi vezivanja bili su između 0.7 i 1 nm, a varijabilnost unutar reda od osam vrhova nije prelazila 0.1 nm za svaku od ovih faza. Vrhovi biosenzora su potom ekvilibrisani tokom 300 s u PBS 1% BSA puferu pre merenja vezivanja. Serumi su razblaženi do razređenja od 1/50 i 1/100 u PBS 1% BSA i vezivanje je procenjeno tokom 300 s. Deplecija seruma je postignuta korišćenjem 1 μg DSCav1 ili postfuzionog F proteina na 1 μl životinjskih seruma. Paralelna korekcija za oduzimanje nespecifičnog vezivanja seruma je izvedena oduzimanjem nivoa vezivanja neopterećene probe inkubirane sa serumom. Antigenost specifična za mesto je procenjena inkubacijom proba napunjenih varijantom RSV F sa 1 ili 2 μM D25 Fab za procenu mesta Ø i sa motavizmab Fab za procenu mesta II, ili oba antitela za procenu preostale reaktivnosti koja se ne odnosi na mesta Ø/II.
Primer 10
Jednolančani RSV F proteini stabilizovani u prefuzionoj konformaciji Primer ilustruje dodatne rekombinantne RSV F proteine kojima nedostaju nativna mesta isecanja furinom, tako da se protomer F proteina formira kao jedan polipeptidni lanac, umesto heterodimera F2/F1. Šematski dijagrami koji ilustruju dizajn dodatnih prefuziono stabilizovanih jednolančanih RSV F proteina dati su na SL.43 i 44.
SL. 43-45 ilustruju dizajn niza jednolančanih konstrukata, uključujući jednolančani RSV F konstrukt br. 9 (scF br. 9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO: 669). Varijable za jednolančane konstrukte uključuju veličinu linkera, krajnje tačke F1 i F2 i mehanizam koji se koristi za indukovanje trimerizacije jednolančanog konstrukta. Dodatno, može da se koristi nekoliko strategija za stabilizaciju jednolančanih konstrukata u prefuzionoj konformaciji, uključujući upotrebu ovde opisanih strategija. Navedeni jednolančani konstrukti su eksprimirani u ćelijama i okarakterisani ekskluzionom hromatografijom (SL.46) i vezivanjem za antitela specifična za RSV F (SL.47).
Za dalju karakterizaciju RSV F konstrukta br.9 (scF br.9; BZGJ9 DSCav1; SEQ ID NO: 669), trodimenzionalna struktura ovog proteina rešena je kristalografijom X-zraka (videti SL. 48-51). Kubni kristali su gajeni korišćenjem postupka difuzije pare u rastvoru rezervoara od 1.19 M Li2SO4, 3.33% PEG 400, 0.12 M MgSO4, 0.1 M NaOAc pH 5.5. Kristali su porasli do ~120 μm pre nego što su brzo zamrznuti u rastvoru rezervoara koji sadrži 2 M litijum sulfat. Podaci difrakcije prikupljeni su do rezolucije 3.2 Å sa greškom intenziteta od 2.84. Kristalna struktura koja je ilustrovala lokaciju GS-linkera u konstruktu br.9 (SL.49 i 50), korišćena je za predviđanje lokacije drugih veličina linkera (SL.51) i kao osnova dizajna dodatnih jednolančanih konstrukata BZGJ9-1 do 9-10 (videti SL. 55). Jednolančani konstrukt kodon-optimizovanih gena sa C-terminalnim motivom trimerizacije fibritina T4, trombinskim mestom, 6x His-tag i StreptagII je sintetisan i subkloniran u sisarski ekspresioni vektor poreklom iz pLEXm. Plazmidi koji eksprimiraju RSV F(+) Fd su transfektovani u ćelije HEK293 GnTI-/- u suspenziji. Posle 4-5 dana, ćelijski supernatant je sakupljen, centrifugiran, filtriran i koncentrovan. Protein je prvobitno prečišćen preko smole Ni2+-NTA (Qiagen, Valencia, CA) upotrebom elucionog pufera koji se sastoji od 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 200 mM NaCl i 250 mM imidazola, pH 8.0. Kompleks je zatim koncentrovan i dalje prečišćen preko smole StrepTactin prema uputstvima proizvođača (Novagen, Darmstadt, Nemačka). Nakon inkubacije preko noći sa proteazom trombinom (Novagen) za uklanjanje oznaka His i Strep, u kompleks je dodat višak D25 Fab, koji je zatim prečišćen na Superdex-200 koloni za gel filtraciju (GE Healthcare) sa radnim puferom od 2 mM Tris-HCl pH 7.5, 350 mM NaCl i 0.02% NaN3 ili fosfatno puferisanim fiziološkim rastvorom (PBS) pH7.4. Proizvodi jednog gena u vidu jednog lanca sa feritinom su eksprimirani i prečišćeni na sličan način. Za ispitivanje imunogenosti na životinjskim modelima odabrano je nekoliko jednolančanih konstrukata (SL. 53). Imunogenost BZGJ9 DS-Cav1, BZGJ9, BZGJ11 DS-Cav1 (monomer), BZGJ10 (monomer i frakcije trimera), BZGJ8 (monomer), BZGJ4 DS-Cav1 i BZGJ11 DS-Cav1-Lumazin sintaza (60-merni oligomer) je ispitana u grupama od 10 miševa CB6F1/J ubrizgavanjem 10 ug proteina u prisustvu 50 ug poli I C u 0. nedelji i 3. nedelji. Serumi iz 5. nedelje su ispitani na imunogenost. Kontrolne grupe DS-Cav1 i postfuzionog proteina RSV F podtipa A takođe su testirane i upotrebljene za imunizaciju na sličan način.
Da bi se procenila neutralizacija protiv RSV podtipa A i podtipa B, serumi imunizovanih životinja su raspoređeni kao četvorostruka razblaženja od 1:10 do 1:40 960, pomešani sa jednakom količinom rekombinantnog mKate-RSV koji eksprimira prototipove F gena iz podtipa A (soj A2) ili podtipa B (soj 18537) i fluorescentni protein Katushka, i inkubirani na 37 °C tokom 1 h. Zatim je 50 μl smeše svakog razblaživanja seruma/virusa dodato HEp-2 ćelijama koje su zasejane pri gustini od 1.5x104 u 30 μl MEM (minimalni esencijalni medijum) u svaki bunarčić ploče sa crnim optičkim dnom sa 384 bunarčića, i inkubirano 20-22 sata pre spektrofotometrijske analize pri ekscitaciji od 588 nm i emisiji od 635 nm (SpectraMax Paradigm, Molecular Devices, CA). IC50 za svaki uzorak je izračunat pomoću prilagođavanja krive i nelinearne regresije korišćenjem GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., CA). P-vrednosti su određene Studentovim T-testom. Rezultati neutralizacije pokazuju da su svi ispitivani jednolančani konstrukti imunogeni.
Jednolančani konstrukti su bili vezani sa feritinom za proizvodnju nanočestica feritina koje uključuju scF antigene (SL. 56). Ukratko, C-terminus F1 polipeptida uključen u scF protein je povezan sa feritinom, a rekombinantni protein je eksprimiran u ćelijama za proizvodnju nanočestica scF-feritina. Jedan od primera je protein „BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritin“ (SEQ ID NO: 1429), koji uključuje rekombinantni jednolančani RSV F protein koji sadrži GS linker između RSV F pozicija 105 i 145 i podjedinicu feritina vezanu za poziciju 513 RSV F proteina heterolognim peptidnim linkerom generisanim povezivanjem C-terminusa F1 polipeptida u scF br.9 sa podjedinicom feritina. Nanočestice scF-feritina su eksprimirane, prečišćene i okarakterisane prema stabilnosti u odnosu na temperaturu, pH i osmolarnost (SL.57). Pored toga, nanočestice feritina su davane životinjama kako bi se pokazalo da su imunogene (SL. 58). Tri ispitana konstrukta su RSV F DSCav1 (SEQ ID NO: 371), BZGJ9-DS-Cav1-LongLink-Ferritin (SEQ ID NO: 1429) i scF br. 9 (takođe nazvan BZGJ9 DS-Cav1, SEQ ID NO: 669). Oni imaju istu imunogenost/neutralizaciju kao što je gore opisano.
Nekoliko sekvenci pojedinačnih lanaca dato je u SEQ ID NO navedenim u tabeli 19, kao i indikacija za pristup konstruisanju.
Tabela 19. Primeri jednolančanih RSV F proteina
Prinos proteina je izračunat za nekoliko rekombinantnih F proteina, i prikazan je ispod u tabeli 27.
Tabela 27.Prinos ekspresije rekombinantnog RSV F proteina
Primer 11
Struktura RSV F proteina iz soja B18537 sa mutacijama DSCav1
Ovaj primer je ilustrovao sličnost RSV proteina sa stabilizujućim supstitucijama DSCav1 među podtipovima RSV. Supstitucije DSCav1 uvedene su u RSV F protein iz soja B18537. I trodimenzionalna struktura dobijenog rekombinantnog proteina, uključujući C-terminalni domen Foldon, je rešena korišćenjem postupaka sličnih onima opisanim gore. Kao što je prikazano na SL.
59-62, supstitucije DSCav1 bi mogle uspešno da budu uvedene u RSV F glikoprotein podtipa B za stabilizovanje antigenskog mesta Ø kako bi se generisao mutant DSCav1 na osnovi podtipa B koji se specifično vezuje za antitela specifična za prefuzionu konformaciju. Tabela 25, ispod, daje pregled kristalografskih podataka za DSCav1 na RSV F podtipa B.
Tabela 25. Kristalografski podaci o DSCav1 podtipa B
RSV B18537
Pristupni kod PDB
Prikupljanje podataka
Prostorna grupa P4132
Konstante ćelija
a, b, c (Å) 167.9, 167.9, 167.9
a, b, g (°) 90, 90, 90
Talasna dužina (Å) 1.00
Rezolucija (Å) 50.0-1.94 (2.01-1.94)
Rmerge 10 (78.8)
I / sI 11.96 (1.12)
Potpunost (%) 95.9 (79.7)
Redundancija 4.0 (2.4)
Utačnjavanje
Rezolucija (Å) 1.94
Jedinstvene refleksije 57,616
Rwork / Rfree (%) 18.71/21.52
Br. atoma
Protein 3552
Ligand/jon 5
Voda 401
B-faktori (Å<2>)
Protein 46.2
Ligand/jon 78.3
Voda 53.2
R.m.s. odstupanja
Dužine veza (Å) 0.009
Uglovi veza (°) 1.17
Ramačandran
Favorizovani regioni (%) 96.18
Dozvoljeni regioni (%) 3.82
Onemogućeni regioni (%) 0
Primer 12
Konstruisanje i proizvodnja rekombinantnih RSV F proteina bez domena trimerizacije.
Ovaj primer je ilustrovao konstruisanje i proizvodnju rekombinantnih RSV F proteina koji su stabilizovani u prefuzionoj konformaciji, ali koji ne uključuju C-terminalni domen trimerizacije za održavanje stabilnosti režnja RSV F proteina proksimalno u odnosu na membranu.
Ukratko, umesto C-terminalnog domena trimerizacije, u C-terminus F1 polipeptida uveden je prsten disulfidnih veza supstitucijom cisteinskih ostataka za aminokiseline α10 heliksa. Tri α10 heliksa ektodomena RSV F formiraju upredenu zavojnicu koja stabilizuje deo proteina proksimalno u odnosu na membranu. Kada se eksprimiraju u ćelijama, disulfidne veze između protomera se formiraju između cisteina uvedenih u α10 heliks, čime se „fiksiraju“ tri α10 heliksa u neposrednoj blizini i sprečava pomeranje domena proksimalno u odnosu na membranu iz pre- u postfuzionu konformaciju. Heliks α10 RSV F proteina uključuje ostatke 492 do transmembranskog domena (ostatak 529).
U ovom primeru, rekombinantni RSV F protein sa stabilizujućim cisteinskim prstenom se inicijalno eksprimira kao rekombinantni protein koji uključuje domen trimerizacije. Domen trimerizacije može proteolitički da se ukloni nakon početne ekspresije. Isecanje može da se obavi pre, posle ili tokom prečišćavanja RSV F proteina. Trenutno se prečišćavanje RSV F proteina obavlja korišćenjem tendema Ni2 IMAC i koraka imobilizacije na streptactinu preko C-terminalnih oznaka His6 i StrepII, nakon čega sledi digestija trombinom na sobnoj temperaturi tokom 12 sati, zatim odvajanje foldona od RSV F proteina putem ekskluzione hromatografije. Takođe bi bilo moguće prečistiti isečeni RSV F protein jonskom izmenom.
SL. 63-68 prikazuju rezultate gel filtracije i bojenje komazi plavom bojom redukujuće i neredukujuće PAGE analize nekoliko rekombinantnih F proteina bez trimerizacioni domena kako je naznačeno ispod. Tabela 22 daje antigene i fizičke karakteristike navedenih konstrukata, koji uključuju supstitucije DSCav1 i cisteinske supstitucije u α10 heliksu na pozicijama 525 i 526 (CCTail4xFd), 512 i 513 (CCTail5xFd), 519 i 520 (CCTail6xFd), i 512 i 512 (CCLongxFd).
Odgovarajuća SEQ ID NO za svaki konstrukt je prikazana na SL.66.
Tabela 22. Antigenske i fizičke karakteristike konstruisanih varijanti RSV F glikoproteina.
Nekoliko sekvenci RSV F proteina bez trimerizacionih domena ili sa trimerizacionim domenom koji se iseca date su u SEQ ID koje su navedene u tabeli 23, kao i pristup konstruisanju. Naznačeni su naziv, α10 cisteinski prsten, prisustvo ili odsustvo C-terminalnog Foldona ili Foldon koji može da se iseče, sekvenca osnove (npr. „DSCAV1“ označava da konstrukt uključuje supstitucije DSCav1), koncept konstruisanja i odgovarajuća SEQ ID NO. U tabeli 23 koriste se sledeći akronimi: DSCAV1: supstitucije S155C, S290C, S190F, V207L; Op - optimizovana upredena zavojnica; OpCC – optimizovana upredena zavojnica sa disulfidima; InterC - disulfid između protomera na C-terminalnom heliksu; Multi-InterC - višestruke disulfidne stabilizacije između protomera; ECC: poboljšana stabilnost upredene zavojnice; FP-CC: Cys most fuzionog peptida; 190P: 190 alternativna aminokiselina džepa; Fd (neotcepivi foldon), xFd (foldon koji može da se iseca), N (bez Foldona); CFM: mutacija za popunjavanje šupljine; ICFM: mutacije za popunjavanje šupljine na dodirnoj površini.
Rekombinantni RSV F proteini bez ili sa trimerizacionim domenom koji može da se iseče navedeni u tabeli 23 eksprimirani su u ćelijama pod uslovima u kojima su proteini izlučeni iz ćelija u ćelijski medijum, kao što je gore opisano u primeru 9. Svaki konstrukt sadrži lidersku sekvencu koja uzrokuje da protein uđe u sekretorni sistem i da se izluči. Medijum je potom centrifugiran i supernatant je korišćen za testiranje antigenosti za vezivanje za antitelo D25 specifično za mesto Ø i antitelo Motavizumab specifično za mesto II („Mota“, SL. 69A-69E). Ispitivani uslovi obuhvataju vezivanje D25 i Mota 0. dana (uslovi 1 i 2), vezivanje D25 i Mota 0. dana nakon inkubacije na 70 °C tokom jednog sata (uslovi 3 i 4) i vezivanje D25 i Mota posle 1 nedelje na 4 °C (uslovi 5 i 6). Kontrola je konstrukt DSCav1 sa domenom foldon. Podaci o specifičnoj antigenosti za svaki konstrukt dati su na SL.69A-69E (ispitivani uslovi su navedeni u redovima zaglavlja).
Tabela 23. Rekombinantni RSV F proteini koji nemaju trimerizacioni domen ili koji imaju otcepivi trimerizacioni domen.
Prinos proteina je izračunat za nekoliko rekombinantnih F proteina, i prikazan je ispod u tabeli 26.
Tabela 26. Prinos ekspresije rekombinantnog RSV F proteina
Primer 13
Dodatne mutacije za stabilizaciju dela ektodomena RSV F distalno u odnosu na membranu.
Ovaj primer ilustruje dodatne mutacije koje su napravljene u RSV F za stabilizovanje proteina u prefuzionoj konformaciji.
Nekoliko sekvenci RSV F proteina bez trimerizacionih domena je konstruisano i dato u SEQ ID NO navedenim u tabeli 24, kao i indikacija pristupa konstruisanju. Naznačen je naziv, mutacija u odnosu na SEQ ID NO: 1026, prisustvo ili odsustvo C-terminalnog domena Foldon, sekvenca osnove (npr. „WT“ označava divlji tip RSV F), koncept dizajna i odgovarajući SEQ ID NO. Rekombinantni RSV F proteini sa C-terminalnim domenom trimerizacije navedeni u tabeli 24 eksprimirani su u ćelijama pod uslovima u kojima su proteini izlučeni iz ćelija u ćelijski medijum. Svaki konstrukt sadrži lidersku sekvencu koja uzrokuje da protein uđe u sekretorni sistem i da se izluči kao što je gore opisano u primeru 9. Medijum je potom centrifugiran i supernatant je korišćen za testiranje antigenosti za vezivanje za antitelo D25 specifično za mesto Ø i antitelo Motavizumab specifično za mesto II („Mota“, SL.69A-69E). Ispitivani uslovi obuhvataju vezivanje D25 i Mota 0. dana (uslovi 1 i 2), vezivanje D25 i Mota 0. dana nakon inkubacije na 70 °C tokom jednog sata (uslovi 3 i 4) i vezivanje D25 i Mota posle 1 nedelje na 4 °C (uslovi 5 i 6). Kontrola je konstrukt DSCav1 sa domenom foldon. Podaci o specifičnoj antigenosti za svaki konstrukt dati su na SL.
69A-69E (ispitivani uslovi su navedeni u redovima zaglavlja).
Tabela 24. Nova stabilizacija sa domenom Foldon
Primer 14
Imunogeni sa minimalnim mestom Ø
Epitop mesta Ø RSV F se nalazi na vrhu šiljka trimera i uključuje region koji prepoznaju tri neutrališuća antitela D25, AM22 i 5C4. Konkretnije, kao što je objašnjeno kristalnom strukturom kompleksa RSV F/D25, ovaj epitop sadrži spoljnu površinu heliksa α4 (ostaci 196-210) i susedne petlje (ostaci 63-68) između β2 i α1. Ovaj primer ilustruje dizajn i karakterizaciju antigena koji prikazuju samo mesto Ø sa minimalnim brojem susednih ostataka, i koji mogu da se koriste za indukovanje imunskog odgovora na mesto Ø i mogu da budu isplativiji za proizvodnju od RSV F trimera stabilizovanog u prefuzionoj konformaciji cele dužine.
Opšti koncepti za dizajn RSV F imunogena sa minimalnim mestom Ø
Imunogeni sa minimalnim mestom Ø su dizajnirani korišćenjem četiri primarna koncepta dizajna: kružne permutacije, kružne permutacije sa skafoldom, imunogeni sa domenom III i multimerizacija.
Kružne permutacije uključuju menjanje nativnih veza unutar strukture proteina uz zadržavanje prostorne orijentacije/orijentacija komponenti. Komponente epitopa sa minimalnim mestom Ø α4 i petlja β2-α1 su svaka deo dva odvojena segmenta petlje u RSV F1. Da bi se formiralo stabilno savijanje mesta Ø, dva segmenta petlje su povezana (C-terminalni deo na N-terminalni deo) sa kratkim fleksibilnim aminokiselinskim linkerima u dva različita moguća redosleda, čime su stvorena dva odvojena savijena oblika, od kojih je svaki očuvao epitop sa mestom Ø (SL.70A). Da bi se stvorile kružne permutacije sa skafoldom, kratki fleksibilni proteinski linkeri kružno permutovanih mesta Ø zamenjeni su malim krutim segmentima drugih proteina koji potencijalno obezbeđuju veću stabilnost od jednostavnih aminokiselinskih linkera (SL.70B).
Domen III (ostaci 50-306) je veći domen od približno 250 aminokiselina RSV F proteina koji sadrži epitop sa mestom Ø (videti SL.70D). Ostaci domena III koji okružuju mesto Ø obezbeđuju dodatnu strukturnu stabilnost mestu Ø, a ne dodaju značajne dodatne ometajuće površinske epitope na imunogen. Domen III sadrži prirodno mesto isecanja furinom između ostataka 136 i 137 koje izlaže fuzioni peptid. Domen III može da bude dodatno stabilizovan zamenom mesta isecanja aminokiselinskim linkerom ili sprovođenjem kružne permutacije kako bi se povezali originalni N-i C-terminusi ili domen III i kreirali novi N- i C-terminusi na mestu isecanja. Oba ova postupka su korišćena za stabilizaciju različitih imunogena domena III.
Na kraju, imunogeni sa mestom Ø su multimerizovani da bi se poboljšala imunogenost (SL.70D i 70E). Trimerizacija je korišćena da imitira nativni trimer zapažen u virusnom šiljku u prefuzionom RSV F i većim definisanim oligomerima kao što su 24-meri i 60-meri, posebno su korišćeni za specifično poboljšanje imunogenosti. Rezultat je postignut uvođenjem disulfidnih veza između konstrukata, ili kovalentnim povezivanjem konstrukata u vidu dimera ili trimera korišćenjem aminokiselinskih linkera ili vezivanjem konstrukata za multimerizacione domene korišćenjem aminokiselinskih linkera. Kod nekih konstrukata je korišćena kombinacija ovih strategija. Najmanji korišćeni multimerizacioni domeni su bili trimeri (npr. GCN4), a najveći su bili 60-meri (npr. lumazin sintaza). Korišćeni su i pentameri, 12-meri i 24-meri.
Pored gore navedenih glavnih dizajnerskih koncepata, imunogeni su stabilizovani pomoću nekoliko drugih postupaka, uključujući dodavanje disulfidnih veza, mutacija za popunjavanje šupljine, smanjenje površinske hidrofobnosti, dodavanje naelektrisanih površinskih ostataka i dodavanje N-vezanih glikana i skraćivanje potencijalno fleksibilnih regiona. Spisak nekoliko imunogena sa minimalnim mestom Ø je dat u tabeli 20 (nečestični imunogeni sa mestom Ø) i 21 (imunogeni sa mestom Ø na proteinskim nanočesticama), kao i indikacija za pristup dizajnu. Naveden je naziv, koncept, ostaci RSV F proteina, skafold ili drugi dodati proteini i odgovarajuće SEQ ID NO. U tabelama 20 i 21 koriste se sledeći akronimi: SØ: minimalno mesto Ø; CP: kružna permutacija; DS: Disulfid; CAV: popunjavanje šupljine; Naelektrisanje: Dodavanje naelektrisanih ostataka; SC: jedan lanac; TD3: domen tademskog domena III; D3: domen III; RH: Smanjenje hidrofobnosti; Fd: domen trimerizacije Fd T4; CCMPTD: domen trimerizacije proteina matrice kokošije hrskavice; MTQ-CC: motiv trimerizacije upredene zavojnice MTQ; CXVIII: domen trimerizacije kolagena XVIII; 2M0E: skafold Miz-1 cinkani prstić 6 (2M0E); ATCaza: domen trimerizacije (1GQ3) aspartat karbamoiltransferaze (ATCaza); GCN4: domen trimerizacije GCN4; Fer: Feritin; Dps: Dps Microbacterium Arborescens; LS: Lumazin sintaza A. aeolicus; Thr: trombin; EH: izloženi hidrofobni; HCP1: hcp1 P. aeruginosa (1y12).
Imunogeni sa minimalnim mestom Ø su eksprimirni u ćelijama korišćenjem sistema koji dovodi do izlučivanja imunogena sa minimalnim mestom Ø u medijum kulture tkiva kao što je gore opisano u primeru 9. Medijum je zatim centrifugiran i supernatant je korišćen za antigensko testiranje za vezivanje specifičnih antitela D25, AN22 i 5C4 za mesto Ø pomoću ELISA metode (SL. 72A-72F). Ispitivani uslovi uključuju vezivanje D25 nakon 0 i 1 nedelje na 4°C (uslovi 1 i 2), vezivanje D25 nakon 1 sata na 60°C (uslov 3), 70°C (uslov 4), 80°C (uslov 5), 90°C (uslov 6), ili 100°C (uslov 7), vezivanje AM22 nakon dve nedelje na 4°C (uslov 8), vezivanje 5C4 u 0. nedelji na 4°C (uslov 9). Prosek vezivanja D25, AM22 i D25 nakon 1 sata na 70 °C je takođe prikazan (uslov 10). Rezime podataka o antigenosti dat je na SL. 71, koja pokazuje broj imunogena sa mestom Ø koji spadaju u svaku kategoriju dizajna i koji su pri testiranju ELISA metodom dali rezultat od najmanje 1.5. Podaci o specifičnoj antigenosti za svaki konstrukt su dati na SL.72A-72F (ispitivani uslovi su navedeni u redovima zaglavlja). Rezultati ukazuju da se imunogeni sa minimalnim mestom Ø specifično vezuju za antitela specifična za prefuzionu konformaciju; i na taj način su korisni za indukovanje imunskog odgovora na antigensko mesto Ø kod subjekta. Osim toga, rezultati ukazuju na to da konstrukti minimalnog mesta Ø mogu da se koriste kao probe za izolaciju i otkrivanje antitela specifičnih za prefuzionu konformaciju RSV F iz uzorka.
Na osnovu podataka o antigenosti, 14 početnih konstrukata je odabrano kao reprezentativno za evaluaciju u životinjskim modelima za proizvodnju imunskog odgovora i za dodatnu fizičku i strukturnu karakterizaciju. Metrika za izbor ovih 14 konstrukata uključivala je odabir konstrukta koji pokazuju prosečnu vrednost na ELISA testu za D25 (1. nedelja), AM22 (2. nedelja) i D25 nakon 1 sata na 70 stepeni. Da bi se sprečio izbor nekoliko veoma sličnih konstrukta za svaku kategoriju, svaka od kategorija je podeljena na dodatne kategorije (SEQ ID NO u zagradama): Kategorija 1: Monomeri:
kružna permutacija mesta Ø: TZ-13 (354567-108) prosek: 3.18 (SEQ ID NO: 1040)
kružna permutacija mesta Ø sa skafoldom: JG_2KN0 (354567-417) prosek: 3.00 (SEQ ID NO: 1053)
domen III: E-CP_RBD51-307_14mutDS-Cav1_THS (354567-273) prosek: 3.17 (SEQ ID NO: 1156)
dimer domena III: GSJnh4-TWIN (354567-693) prosek: 3.06 (ID SEQ NO: 1194) Kategorija 2: Trimeri:
kružna permutacija mesta Ø: TZ-19 (354567-126) prosek: 3.08 (SEQ ID NO: 1106)
domen III (dva su vezana): RSVF(+)THS_s_to_hp2_foldon (354567-210) prosek: 3.08 (SEQ ID NO: 1170) i MS_08 (354567-447) prosek: 3.08 (SEQ ID NO: 1188)
dimer domena III: GSJnh4Fd-TWIN (354567-705) prosek: 3.01 (SEQ ID NO: 1212) Kategorija 3: multivalentni monomeri:
kružna permutacija mesta Ø na feritinu: 2m0e-resurf1-Ferritin (354567-621) prosek: 2.81 (SEQ ID NO: 1276)
domen III na feritinu: GSJnh2F (354567-471) prosek: 3.10 (SEQ ID NO: 1220)
monomer na neferitinskom oligomeru: LSl-E-CP_RBD51-307_11mutDS-Cav1_THS (354567-315) prosek: 2.72 (SEQ ID NO: 1281)
Dodatno: MP11 (354567-642) prosek: 3.05 (SEQ ID NO: 1263)
Kategorija 4: multivalentni trimeri:
domen III na nanočesticama (2): GSJnh2Fd-F (354567-483) prosek: 2.57 (SEQ ID NO: 1266) i GSJnh4Fd-F (354567-489) prosek: 2.02 (SEQ ID NO: 1268)
Tabela 20. Minimalni imunogeni sa mestom Ø (koji nisu na proteinskoj nanočestici)
Tabela 21. Minimalni imunogeni sa mestom Ø na proteinskoj nanočestici.
Primer 15
Imunogenost prefuziono stabilizovanog F proteina
Izvršen je niz testova (pored gore navedenih) da bi se ilustrovala imunogenost ovde datih rekombinantnih RSV F proteina koji su stabilizovani u prefuzionoj konformaciji. Rezultati pokazuju da se obezbeđeni rekombinantni RSV F proteini stabilizovani u prefuzionoj konformaciji mogu koristiti za indukovanje imunskog odgovora u više životinjskih modela, i dalje da indukcija ovog imunskog odgovora štiti od infekcije kod budućih izlaganja virusu.
Osim ako nije drugačije naznačeno, na SL. 73-84, i u ovom primeru, poziva se na sledeće rekombinantne RSV F proteine:
DS (podtip A) = RSV A2 F(+)FdTHS S155C, S290C (SEQ ID NO: 185)
DS (podtip B) = RSV B18537 F(+)FdTHS S155C, S290C (SEQ ID NO: 1479)
DS-Cav1 (podtip A) = RSV A2 F(+)FdTHS S155C, S290C, S190F, V207L (SEQ ID NO: 371) DS-Cav1 (podtip B) = RSV B18537 F(+)FdTHS S155C, S290C, S190F, V207L (SEQ ID NO: 372)
Postfuzioni F (podtip A) = RSV A2 F(+) dFPTHS
SL. 73 ilustruje da, korišćenjem Ribi kao adjuvansa, jednolančana verzija DS-Cav1 prikazana u kontekstu nanočestice feritina, data IM, indukuje mali, ali detektabilan odgovor antitela nakon 2 nedelje kod rezus makaka nakon jedne doze. Na osnovu ovih malih, ali detektabilnih odgovora nakon jedne doze, očekuje se da će se nakon druge buster doze indukovati značajan neutrališući odgovor antitela. To bi bilo u skladu sa imunogenošću 2 mcg prefuziono stabilizovanog F trimera sa otcepljenim DS prikazanog na nanočestici feritina formulisanog sa Ribi posle 2 doze kod miševa, diskutovano u nastavku.
Kao što je prikazano na SL. 74, imunski odgovor na DS verziju stabilizovane prefuzione konformacije indukovan je kod miševa (CB6F1/J) imunizovanih sa 20 mcg DS F u 50 mcg poli ICLC u 0. i 3. nedelji. Neutrališuća aktivnost je održavana na visokom nivou kod miševa imunizovanih sa DS više od 12 nedelja.
Kao što je prikazano na SL.75, imunizacija sa DS (podtipA) = RSV A2 F(+)FdTHS S155C, S290C (SEQ ID NO: 185) može da spreči RSV infekciju u životinjskom modelu. Miševi su imunizovani IM sa DS verzijom stabilizovanog F proteina (SEQ ID No: 185) u 0. nedelji i 3. nedelji. Miševi su intranazalno izloženi virusu sa 10e7 pfu homolognog virusa RSV A2 u 19. nedelji, četiri meseca nakon poslednje vakcinacije Pluća i nos su uklonjeni 5. dana za merenje virusnog opterećenja u tkivu. Rezultati pokazuju da miševi imunizovani sa DS verzijom prefuzionog F nisu imali detektabilan virus u plućima ili nosu.
Dalje, miševi kojima je dat DS (podtip A) = RSV A2 F(+)FdTHS S155C, S290C (SEQ ID NO: 185) nisu imali odgovor tipa citokina 2 na imunogen (SL. 76). Sadržaj citokina je izmeren u supernanatima pluća i nosa 5. dana nakon inicijalne imunizacije kontrolom (PBS), divljim tipom RSV (RSV), RSV inaktiviranim formalinom (FIRSV), DS (SEQ ID NO: 185; prefuzionim F), ili stabilizovanim postfuzionim konstruktom F (postfuzioni F). Miševi izloženi primarnoj infekciji su imali značajne nivoe IFN-gama i MIP-1alfa kao što se očekivalo. Miševi imunizovani sa FI-RSV imali su značajne nivoe citokina tipa 2 (IL-4, IL-5 i IL-13) i citokina povezanih sa epitelnim oštećenjem (IL-6) tipičnim za odgovore povezane sa bolestima pojačanom vakcinom. Miševi imunizovani prefuzionim F (DS) imali su umeren nivo IFN-gama i IL-10 koji su povezani sa efikasnim i regulisanim odgovorom, bez bolesti ili gubitka težine.
Neutrališuća aktivnost seruma modela nehumanih primata imunizovanih rekombinantnim proteinom RSV F DSCav1 (SEQ ID NO: 371) ispitivana je tokom imunizacije u tri doze (SL.77). Rezus makaki, 4 po grupi, su imunizovani dva puta u 0. i 4. nedelji sa 50 mcg IM ili sa DS-Cav1 prefuzionim F (SEQ ID NO: 371) ili sa postfuzionim F na bazi sekvence podtipa A i formulisanim sa poli ICLC. U 26. nedelji, obe grupe su primile IM buster dozu od 50 mcg DS-Cav1 prefuzionog F formulisanog sa poli ICLC. Posle 2 doze DS-Cav1, indukovana je značajna neutrališuća aktivnost i održavana je iznad zaštitnog praga više od 5 meseci. Postfuzioni F je bio imunogen i indukovao detektabilnu neutrališuću aktivnost posle 2 doze, ali je njen nivo samo prolazno premašio zaštitni prag. Davanje grupi koja je primila postfuzioni F 3. doze DS-Cav1 stabilizovanog prefuzionog F kao buster doze, rezultovalo je porastom neutrališuće aktivnosti iznad nivoa postignutog nakon 2. doze. Nakon 3. doze neutrališuća aktivnost protiv homolognog podtipa A je stabilno održavana više od 10 nedelja, kao što je istaknuto u crvenim okruženim oblastima.
Da bi se pokazalo da konstrukt DSCav1 može da se formuliše sa alumom, prečišćeni DSCav1 (SEQ ID NO: 371) je pomešan sa gelom alum hidroksida ili gelom alum fosfata u različitim proporcijama. Miševi BALB/c su imunizovani IM sa 10 mcg verzije DS-Cav1 stabilizujte prefuzioni F formulisan sa alumom (bilo aluminijum hidroksidni gel ili aluminijum fosfatni gel) u 0. i 3. nedelji. Težinski odnosi protein:alum su bili varirani između 1:1 i 1:10. Sve formulacije su bile imunogene (SL. 78). Pored toga, upotreba aluma kao adjuvansa za imunizaciju DSCav1 demonstrirana je u modelu nehumanih primata (SL. 79). Rezus makaki su imunizovani u 0, 4. i 26. nedelji prečišćenim DS proteinom (SEQ ID NO: 185). Injekcije u 0. i 4. nedelji su bile sačinjene od DS verzije stabilizovanog prefuzionog RSV F (50 mcg) formulisanog u poli ICLC. Buster doza u 26. nedelji je bila 50 mcg F stabilizovanog u prefuzionoj konformaciji pomoću DS formulisanog u aluminijum fosfatnom gelu. Stoga alum je efikasan adjuvans za stabilizovani prefuzioni F kod NHP.
Da bi se pokazalo da je drugi protokol imunizacije efikasan za indukciju efektivnog imunskog odgovora pomoću DSCav1, miševi su imunizovani vektorom zasnovanim na genu koji eksprimira DSCav1 i procenjen je nastali imunski odgovor na RSV F (SL. 80). Miševi CB6F1/J su imunizovani rekombinantnim vektorom na bazi adenovirusa serotipa 5 koji eksprimira divlji tip verzije F u 0. i 3. nedelji ili su imunizovani u 0. nedelji sa rAd5 koji eksprimira verziju DS-Cav1 preF učvršćenu za membranu (koja se ne izlučuje) i data im je buster doza od 10 mcg DS-Cav1 formulisanog u alumu u 3. nedelji. Miševi koji su primili primarnu dozu rAd5-preF i buster dozu DS-Cav1 u alumu proizveli su isti nivo neutrališućih antitela kao miševi kojima su date dve doze proteina, što samo ukazuje da je prefuzioni F isporučen vektorom na bazi gena imunogen i može da predstavlja primarnu imunizaciju za naknadnu buster dozu proteina.
Pored toga, protein DSCav1 je bio efikasan za jačanje imunskog odgovora na divlji tip (WT) RSV F (SL. 81). Nehumanim primatima primarno imunizovanim kombinovanim adenovirusnim vektorima koji eksprimiraju WT verzije RSV F (podtip A) više od 2 godine pre buster imunizacije, data je pojedinačna buster doza od 50 mcg DS-Cav1 podtipa A ili podtipa B formulisanog u alumu. Dve nedelje nakon buster doze neutrališuća aktivnost je značajno povećana pomoću DS-Cav1 proteina oba podtipa, i A i B (SL.81-82).
Da bi se pokazala efikasnost kod unakrsnog podtipa DS (S155C, S290C) verzije stabilizovanog F, miševi CB6F1/J su imunizovani IM sa 10 mcg DS formulisanog u Ribi u 0. nedelji i 3. nedelji (SL. 83). Neutrališuće antitelo je indukovano pomoću oba podtipa, A (SEQ ID NO: 185) i B (SEQ ID NO: 1479) proteina protiv virusa oba podtipa, A i B. Grupa koja je primila i A i B dobila je ukupno 20 mcg proteina.
tretirani glikozidazama ili mutantnim verzijama su napravljene za uklanjanje glikozilacionih mesta na N27 i N70. F protein nije mogao da bude proizveden ako je N500 glikozilacija mutirana, što ukazuje na to da je glikozilacija na tom mestu potrebna za eksprimiranje. Neutrališuća aktivnost je detektovana u 5. nedelji (ispunjeni stubići) i 7. nedelji (šrafirani stubići) kod miševa imunizovanih bilo kojom od glikozilacionih varijanti F. Međutim, pokazalo se da promena glikozilacija smanjuje imunogenost u odnosu na originalnu DS verziju stabilizovanog prefuzionog F. **** = P<0.0001.

Claims (30)

Patentni zahtevi
1. Izolovani imunogen, koji sadrži:
rekombinantni RSV F protein ili njegov fragment koji sadrži aminokiselinske supstitucije, u poređenju sa nativnim RSV F proteinom navedenim kao jedna od SEQ ID NO: 1-184, koje stabilizuju rekombinantni RSV F protein u prefuzionoj konformaciji, koji se specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzioni RSV F, naznačen time, što:
rekombinantni RSV F protein se stabilizuje u prefuzionoj konformaciji RSV F proteina supstitucijama S155C, S290C, S190F i V207L,
prefuziona konformacija rekombinantnog RSV F proteina ili njegovog fragmenta obuhvata antigensko mesto Ø koje sadrži ostatke 62-69 i 196-209 sekvence nativnog RSV F proteina navedene kao jedna od SEQ ID NO: 1-184,
imunogen se specifično vezuje za antitelo specifično za prefuzionu konformaciju nakon inkubacije od najmanje 24 sata na 20 °C, u fosfatno puferisanom slanom rastvoru na fiziološkom pH, u odsustvu antitela specifičnog za prefuzionu konformaciju, i
antitelo specifično za prefuzionu konformaciju RSV F se ne vezuje za RSV F protein u postfuzionoj konformaciji; i
antitelo specifično za prefuzionu konformaciju je antitelo D25 koje sadrži VH i VL domene kako je navedeno u SEQ ID NO 368, odnosno 369.
2. Imunogen prema zahtevu 1, naznačen time što rekombinantni RSV F protein sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti sa ostacima 26-109, odnosno 137-513, ili 26-103, odnosno 145-513, ili 26-105, odnosno 145-513, jedne od SEQ ID NO: 371 (DS-Cav1, podtip A), 372 (DSCav1, podtip B) ili 373 (DSCav1, goveđi podtip).
3. Imunogen prema zahtevu 2, naznačen time što rekombinantni RSV F protein sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti sa ostacima 26-109, odnosno 137-513, ili 26-103, odnosno 145-513, ili 26-105, odnosno 145-513 sekvence SEQ ID NO: 371 (DS-Cav1, podtip A).
4. Imunogen prema zahtevu 2, naznačen time što rekombinantni RSV F protein sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti sa ostacima 26-109, odnosno 137-513, ili 26-103, odnosno 145-513, ili 26-105, odnosno 145-513 sekvence SEQ ID NO: 372 (DS-Cav1, podtip B).
5. Imunogen prema zahtevu 2, naznačen time što rekombinantni RSV F protein sadrži ostatke 26-109, odnosno 137-513, ili 26-103, odnosno 145-513, ili 26-105, odnosno 145-513 sekvence SEQ ID NO: 371 (DS-Cav1, podtip A).
6. Imunogen prema zahtevu 2, naznačen time što rekombinantni RSV F protein sadrži ostatke 26-109, odnosno 137-513, ili 26-103, odnosno 145-513, ili 26-105, odnosno 145-513 sekvence SEQ ID NO: 372 (DSCav1, podtip B).
7. Imunogen prema bilo kom od prethodnih zahteva, koji sadrži multimer rekombinantnog RSV F proteina ili njegovog fragmenta prema zahtevima 1-7.
8. Imunogen prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što je rekombinantni RSV F protein ili njegov fragment prema zahtevima 1-7 povezan sa domenom trimerizacije.
9. Imunogen prema zahtevu 8, naznačen time što je C-terminus F1 polipeptida rekombinantnog RSV F proteina povezan sa domenom trimerizacije.
10. Imunogen prema zahtevu 8 ili zahtevu 9, naznačen time što je domen trimerizacije domen Foldon.
11. Imunogen prema zahtevu 8, naznačen time što rekombinantni RSV F protein povezan sa domenom trimerizacije sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti sa ostacima 26-109 i 137-544 ili 26-103 i 145-544 jedne od SEQ ID NO: 371 (DS-Cav1, podtip A), 372 (DSCav1, podtip B) ili 373 (DSCav1, goveđi podtip).
12. Imunogen prema zahtevu 11, naznačen time što rekombinantni RSV F protein povezan sa domenom trimerizacije sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti sa ostacima 26-109 i 137-544 ili 26-103 i 145-544 sekvence SEQ ID NO: 371 (DS-Cav1, podtip A).
13. Imunogen prema zahtevu 11, naznačen time što rekombinantni RSV F protein povezan sa domenom trimerizacije sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti sa ostacima 26-109 i 137-544 ili 26-103 i 145-544 sekvence SEQ ID NO: 372 (DS-Cav1, podtip B).
14. Imunogen prema zahtevu 11, naznačen time što rekombinantni RSV F protein povezan sa domenom trimerizacije sadrži ostatke 26-109 i 137-544 ili 26-103 i 145-544 sekvence SEQ ID NO: 371 (DS-Cav1, podtip A).
15. Imunogen prema zahtevu 11, naznačen time što rekombinantni RSV F protein povezan sa domenom trimerizacije sadrži ostatke 26-109 i 137-544 ili 26-103 i 145-544 sekvence SEQ ID NO: 372 (DS-Cav1, podtip B).
16. Čestica slična virusu koja sadrži imunogen prema bilo kom od zahteva 1-15.
17. Proteinska nanočestica koja sadrži imunogen prema bilo kom od zahteva 1-15.
18. Molekul nukleinske kiseline koji kodira nanočesticu imunogena ili proteina prema bilo kom od zahteva 1-17.
19. Molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 18, funkcionalno povezan sa promotorom.
20. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 19.
21. Vektor prema zahtevu 20, naznačen time što je vektor virusni vektor.
22. Molekul nukleinske kiseline ili vektor prema bilo kom od zahteva 19-21, koji sadrži nukleotidnu sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385, ili SEQ ID NO: 386.
23. Imunogena kompozicija koja sadrži efikasnu količinu imunogena, čestice slične virusu, proteinske nanočestice, molekula nukleinske kiseline, ili vektora prema bilo kom od zahteva 1-22; i farmaceutski prihvatljiv nosač.
24. Imunogena kompozicija prema zahtevu 23 za upotrebu u postupku za izazivanje imunskog odgovora na RSV F kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata primenu efikasne količine imunogene kompozicije kod subjekta za izazivanje imunskog odgovora.
25. Imunogena kompozicija za upotrebu prema zahtevu 24, naznačena time što postupak obuhvata primenu imunogene kompozicije po principu primarne imunizacije-buster imunizacije.
26. Imunogena kompozicija za upotrebu prema zahtevu 24 ili 25, naznačena time što je subjekt humani ili veterinarski subjekt.
27. Imunogena kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 25-26, naznačena time što je subjekt mlađi od jedne godine, stariji od 65 godina ili je u trudnoći.
28. Komplet koji sadrži imunogen, česticu sličnu virusu, proteinsku nanočesticu, molekul nukleinske kiseline, vektor, ćeliju-domaćina, ili imunogenu kompoziciju prema bilo kom od zahteva 1-27; i uputstva za korišćenje kompleta.
29. Imunogen prema bilo kom od zahteva 1-15, za upotrebu u inhibiranju infekcije virusom RSV kod subjekta.
30. Imunogen prema bilo kom od zahteva 1-15, za upotrebu u postupku za indukovanje imunskog odgovora na RSV F protein kod subjekta kome je to potrebno.
RS20240825A 2013-03-13 2014-03-13 Prefuzioni rsv f proteini i njihova upotreba RS65760B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361780910P 2013-03-13 2013-03-13
US201361798389P 2013-03-15 2013-03-15
US201361857613P 2013-07-23 2013-07-23
US201361863909P 2013-08-09 2013-08-09
EP14775224.0A EP2970398B1 (en) 2013-03-13 2014-03-13 Prefusion rsv f proteins and their use
PCT/US2014/026714 WO2014160463A1 (en) 2013-03-13 2014-03-13 Prefusion rsv f proteins and their use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65760B1 true RS65760B1 (sr) 2024-08-30

Family

ID=51625430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240825A RS65760B1 (sr) 2013-03-13 2014-03-13 Prefuzioni rsv f proteini i njihova upotreba

Country Status (20)

Country Link
US (5) US10017543B2 (sr)
EP (2) EP2970398B1 (sr)
JP (4) JP6703475B2 (sr)
KR (3) KR102450375B1 (sr)
CN (2) CN112851766A (sr)
AU (5) AU2014243756B2 (sr)
DK (1) DK2970398T3 (sr)
ES (1) ES2981623T3 (sr)
FI (1) FI2970398T3 (sr)
HR (1) HRP20240996T1 (sr)
HU (1) HUE067333T2 (sr)
LT (1) LT2970398T (sr)
MX (2) MX385818B (sr)
PL (1) PL2970398T3 (sr)
PT (1) PT2970398T (sr)
RS (1) RS65760B1 (sr)
RU (1) RU2761631C2 (sr)
SI (1) SI2970398T1 (sr)
SM (1) SMT202400297T1 (sr)
WO (1) WO2014160463A1 (sr)

Families Citing this family (155)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080124355A1 (en) 2006-09-22 2008-05-29 David Gordon Bermudes Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment
WO2010062960A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Cedars-Sinai Medical Center METHODS OF DETERMINING RESPONSIVENESS TO ANTI-TNFα THERAPY IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
WO2012116715A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
RS60056B1 (sr) 2013-02-01 2020-04-30 Medimmune Llc Epitopi f proteina respiratornog sincicijalnog virusa
CN112851766A (zh) 2013-03-13 2021-05-28 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 融合前rsv f蛋白和其用途
US9738689B2 (en) * 2013-03-13 2017-08-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion RSV F proteins and their use
AU2014239583B2 (en) 2013-03-14 2020-07-02 Children's Healthcare Of Atlanta, Inc. Recombinant RSV with silent mutations, vaccines, and methods related thereto
EP4285988A3 (en) 2013-03-27 2024-03-06 Cedars-Sinai Medical Center Treating fibrosis by inhibiting tl1a
PE20151867A1 (es) 2013-04-25 2016-01-07 Crucell Holland Bv Polipeptidos f de prefusion del virus sincicial respiratorio (rsv )solubles y estabilizados
CA2914792C (en) 2013-06-17 2024-02-27 Crucell Holland B.V. Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
EP3022295A4 (en) 2013-07-19 2017-03-01 Cedars-Sinai Medical Center Signature of tl1a (tnfsf15) signaling pathway
WO2015013551A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Marshall Christopher Patrick Conformationally stabilized rsv pre-fusion f proteins
BR112016003361A2 (pt) 2013-08-21 2017-11-21 Curevac Ag vacina do vírus sincicial respiratório (rsv)
EP3049107A1 (en) * 2013-09-24 2016-08-03 Massachusetts Institute of Technology Self-assembled nanoparticle vaccines
US9630994B2 (en) 2014-11-03 2017-04-25 University Of Washington Polypeptides for use in self-assembling protein nanostructures
JP7020917B2 (ja) 2015-01-20 2022-02-16 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ キメラｒｓｖ／ｂｐｉｖ３ ｆタンパクを発現する組換えヒト／ウシパラインフルエンザウイルス３（ｂ／ｈｐｉｖ３）およびその使用
WO2016122414A1 (en) * 2015-01-29 2016-08-04 Agency For Science, Technology And Research Nanocapsules carrying chikungunya-associated peptides
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
CA2991002C (en) * 2015-07-07 2023-11-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
CN107847581B (zh) 2015-07-07 2022-03-22 扬森疫苗与预防公司 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽
FR3041962B1 (fr) * 2015-10-01 2018-01-05 Lab Francais Du Fractionnement Procede d'enrichissement d'une preparation d'immunoglobulines en immunoglobulines anti-rsv et preparation ainsi enrichie
AU2016341311B2 (en) * 2015-10-22 2023-11-16 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
HRP20220872T1 (hr) 2015-10-22 2022-12-23 Modernatx, Inc. Cjepiva protiv respiratornih virusa
JP7311872B2 (ja) * 2015-10-29 2023-07-20 エモリー ユニバーシティー キメラｒｓｖ、免疫原性組成物、及び使用方法
IL260203B2 (en) * 2015-12-23 2024-09-01 Pfizer Rsv f protein mutants
JP7082945B2 (ja) 2016-03-17 2022-06-09 シーダーズ―シナイ メディカル センター Ｒｎａｓｅｔ２により炎症性腸疾患を診断する方法
WO2017172890A1 (en) 2016-03-29 2017-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Substitutions-modified prefusion rsv f proteins and their use
PT3439672T (pt) 2016-04-05 2021-02-24 Janssen Vaccines & Prevention Bv Proteína f do rsv pré-fusão solúvel e estabilizada para uso na profilaxia de infeção por rsv
MY193584A (en) 2016-04-05 2022-10-19 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vaccine against rsv
IL245059A0 (en) 2016-04-12 2016-06-30 Technion Res & Dev Foundation Electrospun scaffolds from extracellular matrix
US10953087B2 (en) 2016-05-30 2021-03-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion RSV F proteins
EP3474893A1 (en) 2016-06-27 2019-05-01 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Self-assembling insect ferritin nanoparticles for display of co-assembled trimeric antigens
CN106119287B (zh) * 2016-08-29 2019-10-11 广东华南疫苗股份有限公司 一种表达呼吸道合胞病毒f蛋白的重组载体及方法
US10842862B2 (en) 2016-10-03 2020-11-24 University Of Massachusetts Methods for immunizing pre-immune subjects against respiratory syncytial virus (RSV)
US11078239B2 (en) 2016-10-25 2021-08-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Prefusion PIV F immunogens and their use
CN110121509B (zh) * 2016-10-26 2024-05-07 西达-赛奈医疗中心 中和抗tl1a单克隆抗体
TWI683826B (zh) * 2016-11-22 2020-02-01 國立臺灣大學 重組ｒｓｖ抗原
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
WO2018107088A2 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
CA3043790A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Institute For Research In Biomedicine Novel recombinant prefusion rsv f proteins and uses thereof
GB201621686D0 (en) 2016-12-20 2017-02-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods for inducing an immune response
CN108265079A (zh) * 2017-01-02 2018-07-10 刘昕 一种新型呼吸道合胞体病毒pre-F融合蛋白载体的制备方法
US11464848B2 (en) 2017-03-15 2022-10-11 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
WO2018175518A1 (en) * 2017-03-22 2018-09-27 The Scripps Research Institute Mini-protein immunogens displayng neutralization epitopes for respiratory syncytial virus (rsv)
SG11201908999QA (en) 2017-04-04 2019-10-30 Univ Washington Self-assembling protein nanostructures displaying paramyxovirus and/or pneumovirus f proteins and their use
US11229692B2 (en) 2017-05-17 2022-01-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against RSV infection
CA3063954A1 (en) 2017-05-30 2018-12-06 Glaxosmithline Biologicals S.A. Methods for manufacturing an adjuvant
CA3066026A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 Virometix Ag Cyclic peptides for protection against respiratory syncytial virus
WO2019032480A1 (en) * 2017-08-07 2019-02-14 Avatar Medical, Llc PROTEINS F PRE-FUSION OF RSV STABILIZED IN TERMS OF CONFORMATION
CN111163800A (zh) 2017-09-15 2020-05-15 扬森疫苗与预防公司 用于安全诱导针对rsv的免疫的方法
JP2019092481A (ja) * 2017-11-27 2019-06-20 国立大学法人東京工業大学 ヘテロタンパク質ケージ
JP2021504424A (ja) 2017-12-01 2021-02-15 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム サポニン精製
EP3746090A4 (en) * 2018-01-29 2021-11-17 ModernaTX, Inc. RSV RNA Vaccines
EP3746462A4 (en) * 2018-01-29 2022-01-05 Merck Sharp & Dohme Corp. STABILIZED RSV-F PROTEINS AND THEIR USES
US11771755B2 (en) 2018-02-28 2023-10-03 University Of Washington Self-asssembling nanostructure vaccines
WO2019178521A1 (en) * 2018-03-16 2019-09-19 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Compositions and methods for vaccination against respiratory syncitial virus infection
EP3773703A1 (en) * 2018-04-03 2021-02-17 Sanofi Antigenic influenza-ferritin polypeptides
WO2019195316A1 (en) 2018-04-03 2019-10-10 Sanofi Ferritin proteins
WO2019195314A2 (en) 2018-04-03 2019-10-10 Sanofi Antigenic epstein barr virus polypeptides
MX2020010199A (es) * 2018-04-03 2021-01-08 Sanofi Sa Polipeptidos antigenicos del virus sincitial respiratorio.
EP4227319B1 (en) 2018-04-17 2025-11-26 CureVac SE Novel rsv rna molecules and compositions for vaccination
WO2019209995A2 (en) 2018-04-25 2019-10-31 Precision Ibd, Inc. Optimized anti-tl1a antibodies
SG11202010821TA (en) 2018-05-04 2020-11-27 Spybiotech Ltd Vaccine composition
CN110684747B (zh) * 2018-07-06 2024-05-24 厦门大学 灭活及保存呼吸道合胞病毒的方法
ES3038006T3 (en) 2018-07-31 2025-10-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigen purification method
US11890339B2 (en) 2018-08-03 2024-02-06 The United States of Americam as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Nipah virus immunogens and their use
CN112601545A (zh) 2018-08-07 2021-04-02 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 工艺和疫苗
EP3880243A1 (en) * 2018-11-13 2021-09-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion rsv f proteins
WO2020102603A1 (en) * 2018-11-14 2020-05-22 Rubryc Therapeutics, Inc. Engineered cd25 polypeptides and uses thereof
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
KR102679227B1 (ko) 2019-02-28 2024-06-28 케이엠 바이올로직스 가부시키가이샤 Rsv f/g 키메라 백신
EP3980044A1 (en) 2019-06-05 2022-04-13 GlaxoSmithKline Biologicals SA Saponin purification
US20220306697A1 (en) 2019-09-04 2022-09-29 University Of Washington Self-Assembling Protein Nanostructures Displaying Paramyxovirus and/or Pneumovirus F Proteins and Their Use
CN116063517A (zh) 2019-10-24 2023-05-05 普罗米修斯生物科学公司 Tnf样配体1a(tl1a)的人源化抗体及其用途
US20230053555A1 (en) * 2019-12-11 2023-02-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic Mumps and measles virus immunogens and their use
BR112022012470A2 (pt) * 2019-12-23 2022-09-06 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Proteína rsv f mutante e uso da mesma
US10953089B1 (en) 2020-01-27 2021-03-23 Novavax, Inc. Coronavirus vaccine formulations
BR112022015053A2 (pt) * 2020-01-30 2022-09-20 Modernatx Inc Composições imunizantes contra vírus respiratórios
US12194089B2 (en) 2020-02-04 2025-01-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
EP4142785A2 (en) * 2020-04-29 2023-03-08 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant human metapneumovirus f proteins and their use
CA3180554A1 (en) * 2020-05-29 2021-12-02 Jason MCLELLAN Engineered coronavirus spike (s) protein and methods of use thereof
BR112022024248A2 (pt) 2020-05-29 2023-10-10 CureVac SE Vacinas de combinação à base de ácido nucleico
WO2021249009A1 (en) * 2020-06-10 2021-12-16 Sichuan Clover Biopharmaceuticals, Inc. Rsv vaccine compositions, methods, and uses thereof
JP2022023814A (ja) 2020-07-27 2022-02-08 ファイザー・インク 組換え生産された三量体型のｒｓｖタンパク質の精製方法
JP2022023813A (ja) 2020-07-27 2022-02-08 ファイザー・インク 組換え生産されたｒｓｖタンパク質の精製方法における陰イオン交換クロマトグラフィー用洗浄溶液の改良
CN112226444B (zh) * 2020-08-25 2022-11-04 北京交通大学 呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应用产品
JP7822149B2 (ja) 2020-10-02 2026-03-02 ファイザー・インク Ｒｓｖ ｆタンパク質生産のための細胞培養工程
AU2021357826A1 (en) 2020-10-09 2023-05-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Prefusion-stabilized hmpv f proteins
JP2023547197A (ja) 2020-10-28 2023-11-09 サノフィ・パスツール Ｔｌｒ４アゴニストを含有するリポソーム、その製造および使用
CN112592928B (zh) * 2020-12-31 2021-08-31 北京鼎成肽源生物技术有限公司 冠状病毒的融合基因、融合蛋白、重组载体、通用型dc疫苗及其制备方法
CA3211034A1 (en) * 2021-02-19 2022-08-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion rsv fb antigens
EP4313133A2 (en) 2021-04-02 2024-02-07 Universite De Versailles-Saint Quentin En Yvelines Immunogenic composition containing an antigen and an adjuvant comprising al-mofs
US12304929B2 (en) * 2021-04-12 2025-05-20 Sk Bioscience Co., Ltd. Recombinant RSV live vaccine strain and the preparing method thereof
EP4323383A4 (en) * 2021-04-15 2025-08-13 Merck Sharp & Dohme Llc ROTAVIRUS VECTORS FOR HETEROLOGOUS GENE DELIVERY
EP4384535A4 (en) * 2021-08-10 2025-06-25 Icosavax, Inc. Virus-like particle vaccine for respiratory syncytial virus
WO2023055154A1 (ko) * 2021-09-29 2023-04-06 에스케이바이오사이언스 주식회사 재조합된 약독화 rsv 생백신 및 이를 제조하는 방법
TW202330922A (zh) * 2021-11-19 2023-08-01 美商Ｒｎａ免疫公司 核糖核酸呼吸道融合病毒(rsv)疫苗之組合物及方法
KR102785012B1 (ko) * 2021-12-14 2025-03-20 경희대학교 산학협력단 Rsv 항원 단백질을 포함하는 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 백신
CN117715923A (zh) * 2022-04-29 2024-03-15 北京新合睿恩生物医疗科技有限公司 Rsv f蛋白突变体及其应用
US20230391833A1 (en) * 2022-05-31 2023-12-07 Vlp Therapeutics Japan, Inc. Modified vaccine design developments
US20260014242A1 (en) * 2022-06-10 2026-01-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rsv vaccination with trimeric rsv f fusion protein
WO2024041772A1 (en) * 2022-08-22 2024-02-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Rsv-f proteins
WO2024069420A2 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising an rsv f protein trimer
CN116478296B (zh) * 2022-10-17 2024-02-23 厦门大学 截短的呼吸道合胞病毒f蛋白及其用途
WO2024089633A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Pfizer Inc. Rna molecules encoding rsv-f and vaccines containing them
EP4608441A1 (en) 2022-10-27 2025-09-03 Pfizer Inc. Immunogenic compositions against influenza and rsv
WO2024094881A1 (en) * 2022-11-04 2024-05-10 Sanofi Respiratory syncytial virus rna vaccination
WO2024100196A1 (en) * 2022-11-09 2024-05-16 Nykode Therapeutics ASA Co-expression of constructs and polypeptides
KR102531775B1 (ko) 2022-11-11 2023-05-15 대한민국 Rsv f 항체 또는 이의 항원 결합 단편
CN116284266B (zh) * 2022-11-21 2024-01-19 怡道生物科技(苏州)有限公司 突变型呼吸道合胞病毒融合前f蛋白及其应用
WO2024115561A1 (en) * 2022-12-01 2024-06-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccination against rsv
WO2024127181A1 (en) 2022-12-11 2024-06-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions against influenza and rsv
JP2026503111A (ja) * 2023-01-17 2026-01-27 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 操作されたパラミクソウイルス可溶性融合（ｆ）タンパク質及び関連するワクチン
WO2024154048A1 (en) 2023-01-18 2024-07-25 Pfizer Inc. Vaccines against respiratory diseases
WO2024164020A2 (en) * 2023-02-03 2024-08-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of inhibiting paramyxoviridae fusion to a target cell
EP4658305A1 (en) * 2023-02-03 2025-12-10 Vernagen, LLC Respiratory syncytial virus mrna vaccine
JP2026507630A (ja) * 2023-02-21 2026-03-04 エムエスディー インターナショナル ビジネス ゲーエムベーハー ヘテロ三量体化ドメインのない安定化された三量体ｒｓｖ融合タンパク質
WO2024175040A1 (en) * 2023-02-22 2024-08-29 Everest Medicines (China) Co., Ltd. RSV mRNA VACCINES
CN118078975A (zh) * 2023-03-17 2024-05-28 成都威斯克生物医药有限公司 抗呼吸道合胞病毒感染的疫苗
CN116536357A (zh) * 2023-04-17 2023-08-04 中国医学科学院输血研究所 构建CRISPR/Cas12a中sgRNA剪切活性筛选系统的方法
CN118108812B (zh) * 2023-05-04 2025-04-15 国药中生生物技术研究院有限公司 Rsv f蛋白的突变体
CN118994329A (zh) * 2023-05-18 2024-11-22 北京微星生物科技有限公司 融合前rsv f蛋白及其应用
KR20260015203A (ko) 2023-05-19 2026-02-02 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 호흡기 세포융합 바이러스 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 감염에 대한 면역 반응을 유발하는 방법
CN117050149B (zh) * 2023-05-19 2025-12-12 珠海丽凡达生物技术有限公司 包含人呼吸道合胞病毒抗原的免疫组合物及其制备方法和应用
CN119019514A (zh) * 2023-05-25 2024-11-26 江苏瑞科生物技术股份有限公司 一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（rsv）多肽
KR20260023012A (ko) 2023-06-07 2026-02-20 시추안 클로버 바이오파마슈티컬스, 인크. Rsv 백신 조성물, 방법 및 이의 용도
AR132981A1 (es) * 2023-06-16 2025-08-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Proteínas rsv-f sustituidas con cisteína
CN121463960A (zh) 2023-06-28 2026-02-03 上海瑞宏迪医药有限公司 一种含有阳离子脂质的药物组合物及其用途
US20250135006A1 (en) 2023-07-07 2025-05-01 Pfizer Inc. Amphiphilic tlr7/8 adjuvants and uses thereof
CN119431524A (zh) * 2023-08-07 2025-02-14 北京新合睿恩生物医疗科技有限公司 Rsv融合前构象f蛋白的突变体及其应用
WO2025092933A1 (zh) * 2023-10-31 2025-05-08 上海蓝鹊生物医药有限公司 一种rsv抗原、核酸、重组表达载体、药物组合物及其应用
CN120022355A (zh) * 2023-11-22 2025-05-23 长春百克生物科技股份公司 一种mRNA疫苗及其应用
CN117304278B (zh) * 2023-11-28 2024-04-16 江苏瑞科生物技术股份有限公司 一种重组rsv f蛋白及其应用
WO2025126071A1 (en) 2023-12-14 2025-06-19 Pfizer Inc. Rna molecules
KR20250094574A (ko) * 2023-12-15 2025-06-25 에스케이바이오사이언스(주) 변이 rsv 단백질
KR102816014B1 (ko) 2023-12-20 2025-06-02 에스케이바이오사이언스(주) Rsv 의 가용성 f 단백질을 생성하기 위한 재조합 전구체 폴리펩티드 및 이의 이용
CN117567652B (zh) * 2024-01-19 2024-05-14 北京安百胜生物科技有限公司 一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原
CN117586357B (zh) * 2024-01-19 2024-07-09 北京安百胜生物科技有限公司 一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（rsv）多肽
CN117586425B (zh) * 2024-01-19 2024-06-14 北京安百胜生物科技有限公司 一种重组呼吸道合胞病毒颗粒抗原其制备方法和应用
CN117586359A (zh) * 2024-01-19 2024-02-23 北京安百胜生物科技有限公司 一种具有免疫原性的呼吸道合胞病毒（rsv）多肽
CN117645655B (zh) * 2024-01-26 2024-05-24 普大生物科技(泰州)有限公司 一种肺炎球菌多糖-rsv重组蛋白结合疫苗及其制备方法
WO2025163460A2 (en) 2024-01-30 2025-08-07 Pfizer Inc. Vaccines against respiratory diseases
WO2025186719A1 (en) 2024-03-06 2025-09-12 Pfizer Inc. Immunogenic compositions and uses thereof
CN118440937B (zh) * 2024-04-09 2025-02-25 嘉译生物医药(杭州)有限公司 新型的人合胞病毒RSV B mRNA疫苗
CN118496324B (zh) * 2024-05-22 2025-10-21 苏州聚微生物科技有限公司 RSV pre-F突变体及其生产方法和用途
CN118580323B (zh) * 2024-05-22 2025-06-17 苏州聚微生物科技有限公司 Rsv融合前f蛋白的突变体及其制备和应用
CN118406159B (zh) * 2024-05-22 2025-07-08 苏州聚微生物科技有限公司 RSV pre-F截短体及其生产方法和应用
CN118480560B (zh) * 2024-07-09 2024-11-26 北京悦康科创医药科技股份有限公司 呼吸道合胞病毒mRNA疫苗及其制备方法和应用
WO2026018181A1 (en) 2024-07-17 2026-01-22 Pfizer Inc. Immunogenic compositions and uses thereof
WO2026038177A1 (en) 2024-08-16 2026-02-19 Pfizer Inc. Immunogenic compositions and uses thereof
CN119074910A (zh) * 2024-08-30 2024-12-06 中国医学科学院病原生物学研究所 以麻疹减毒活疫苗为载体的重组呼吸道合胞病毒疫苗及其制备方法
CN118725053B (zh) * 2024-09-03 2024-12-24 北京民海生物科技有限公司 呼吸道合胞病毒融合前f蛋白突变体及其应用
CN119176859B (zh) * 2024-11-26 2025-03-14 北京成大天和生物科技有限公司 呼吸道合胞病毒f蛋白突变体及其应用
CN120248057B (zh) * 2024-12-26 2025-12-02 北京华诺泰生物医药科技有限公司 一种呼吸道合胞病毒f蛋白突变体及其应用

Family Cites Families (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US472209A (en) 1892-04-05 Vacuum-pan
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
US4675189A (en) 1980-11-18 1987-06-23 Syntex (U.S.A.) Inc. Microencapsulation of water soluble active polypeptides
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
JPS60100516A (ja) 1983-11-04 1985-06-04 Takeda Chem Ind Ltd 徐放型マイクロカプセルの製造法
US4957735A (en) 1984-06-12 1990-09-18 The University Of Tennessee Research Corporation Target-sensitive immunoliposomes- preparation and characterization
CA1236641A (en) 1984-07-06 1988-05-10 Motoaki Tanaka Copolymer of lactic acid and glycolic acid and method for producing same
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
JP2551756B2 (ja) 1985-05-07 1996-11-06 武田薬品工業株式会社 ポリオキシカルボン酸エステルおよびその製造法
US4707543A (en) 1985-09-17 1987-11-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Process for the preparation of detoxified polysaccharide-outer membrane protein complexes, and their use as antibacterial vaccines
US5091309A (en) 1986-01-16 1992-02-25 Washington University Sindbis virus vectors
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
CA1331443C (en) 1987-05-29 1994-08-16 Charlotte A. Kensil Saponin adjuvant
US5726292A (en) 1987-06-23 1998-03-10 Lowell; George H. Immuno-potentiating systems for preparation of immunogenic materials
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
CA1336955C (en) * 1988-09-20 1995-09-12 Peter R. Paradiso Respiratory syncytial virus: vaccines and diagnostic assays
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5055303A (en) 1989-01-31 1991-10-08 Kv Pharmaceutical Company Solid controlled release bioadherent emulsions
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5271961A (en) 1989-11-06 1993-12-21 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method for producing protein microspheres
US5188837A (en) 1989-11-13 1993-02-23 Nova Pharmaceutical Corporation Lipsopheres for controlled delivery of substances
US5268164A (en) 1990-04-23 1993-12-07 Alkermes, Inc. Increasing blood-brain barrier permeability with permeabilizer peptides
US5254342A (en) 1991-09-30 1993-10-19 University Of Southern California Compositions and methods for enhanced transepithelial and transendothelial transport or active agents
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
WO1993017668A1 (en) 1992-03-12 1993-09-16 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Controlled release acth containing microspheres
US5534496A (en) 1992-07-07 1996-07-09 University Of Southern California Methods and compositions to enhance epithelial drug transport
CA2142007C (en) 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
JP4028593B2 (ja) 1993-03-23 2007-12-26 グラクソスミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム ３−ｏ脱アシル化モノホスホリルリピドａ含有ワクチン組成物
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
NZ269156A (en) 1993-07-13 1996-03-26 Rhone Poulenc Rorer Sa Defective recombinant adenovirus vector incapable of replicating autonomously in a target cell and its use in gene therapy
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5961970A (en) 1993-10-29 1999-10-05 Pharmos Corporation Submicron emulsions as vaccine adjuvants
KR100355470B1 (ko) 1993-11-17 2003-02-17 도이체 오엠 아르 쯔나이미텔 게엠바하 글루코사민이당류,그의제조방법,이를함유하는제약학적조성물,및그의용도
WO1995016772A1 (en) 1993-12-14 1995-06-22 Cornell Research Foundation, Inc. Adenovirus gene expression system
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5851806A (en) 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
DE69535178T2 (de) 1994-06-10 2006-12-14 Genvec, Inc. Adenoviren-vektor systeme und zelllinien
PT772619E (pt) 1994-07-15 2006-10-31 Univ Iowa Res Found Oligonucleotidos imunomoduladores
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
IL116816A (en) 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US5837511A (en) 1995-10-02 1998-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Non-group C adenoviral vectors
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US6020182A (en) 1996-07-12 2000-02-01 Connaught Laboratories Limited Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2293694A1 (en) * 1998-06-10 1999-12-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. New carboxypeptidase inhibitor
US6113913A (en) 1998-06-26 2000-09-05 Genvec, Inc. Recombinant adenovirus
US6551600B2 (en) 1999-02-01 2003-04-22 Eisai Co., Ltd. Immunological adjuvant compounds compositions and methods of use thereof
US20040006242A1 (en) 1999-02-01 2004-01-08 Hawkins Lynn D. Immunomodulatory compounds and method of use thereof
AU1581400A (en) 1999-12-22 2001-07-03 Om Pharma Acyl pseudopeptides bearing a functionalised auxiliary spacer
US6764685B1 (en) 2000-03-21 2004-07-20 Medimmune Vaccines, Inc. Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines
KR100787073B1 (ko) 2000-06-28 2007-12-21 글리코파이, 인크. 변형된 당단백질의 제조방법
US20040096451A1 (en) 2002-07-25 2004-05-20 Young James F. Methods of treating and preventing RSV, hMPV, and PIV using anti-RSV, anti-hMPV, and anti-PIV antibodies
US20030232061A1 (en) 2001-10-18 2003-12-18 Fouchier Ronaldus Adrianus Maria Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus
EP1372706B1 (en) 2001-03-09 2010-12-01 ID Biomedical Corporation of Quebec Proteosome-liposaccharide vaccine adjuvant
JP4331944B2 (ja) 2001-04-17 2009-09-16 大日本住友製薬株式会社 新規アデニン誘導体
WO2003022311A1 (en) 2001-09-13 2003-03-20 Genvec, Inc. Adenoviral vector and related system and methods of making and use
WO2003029416A2 (en) 2001-10-01 2003-04-10 Uab Research Foundation Recombinant respiratory syncytial viruses with deleted surface glycoprotein genes and uses thereof
DE60230340D1 (de) 2001-11-16 2009-01-22 3M Innovative Properties Co N-Ä4-(4-Amino-2-ethyl-1H-imidazoÄ4,5-cÜchinolin-1-yl)butylÜmethanesulfonamide, diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung und deren Verwendung
TWI356848B (en) 2002-02-21 2012-01-21 Medimmune Vaccines Inc Recombinant parainflulenza virus expression system
ES2333422T3 (es) 2002-10-16 2010-02-22 The Scripps Research Institute Sintesis de glicoproteinas.
JP2006517974A (ja) 2003-02-13 2006-08-03 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー Ｉｒｍ化合物およびトル様受容体８に関する方法および組成物
KR101187955B1 (ko) 2003-04-25 2012-10-08 비로노바티브 비브이 메타뉴모바이러스 유래 이종 항원을 포함하는 재조합파라인플루엔자 바이러스 발현 시스템 및 백신
EP1623006A4 (en) 2003-04-25 2009-10-28 Medimmune Vaccines Inc METAPNEUMOVIRUS STRAINS AND THEIR USE IN VACCINATE IMMULATIONS AND AS VECTORS FOR THE EXPRESSION OF ANTIGENIC SEQUENCES AND PROCESSES FOR VIRUS PROPAGATION
WO2005111621A2 (en) 2004-04-16 2005-11-24 Uab Research Foundation Molecular scaffolds for hiv-1 epitopes
US8647818B2 (en) 2005-02-18 2014-02-11 UAB Research Foundation, University of Alabama—Birmingham Molecular scaffolds for HIV-1 immunogens
KR20070110924A (ko) 2005-03-10 2007-11-20 메드이뮨 백신즈 인코포레이티드 메타뉴모바이러스주 및 항원성 서열의 발현용 벡터 및 백신제제로서의 이의 용도 및 바이러스의 증식 방법
US7728106B2 (en) 2005-07-01 2010-06-01 University Of Maryland Biotechnology Institute HIV-1 glycopeptides and derivatives; preparation and applications thereof
CA2647632C (en) 2006-03-27 2017-06-27 University Of Maryland Biotechnology Institute Glycoprotein synthesis and remodeling by enzymatic transglycosylation
WO2008025015A2 (en) 2006-08-25 2008-02-28 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Epitope-protein scaffolds and their use
EP1997830A1 (en) 2007-06-01 2008-12-03 AIMM Therapeutics B.V. RSV specific binding molecules and means for producing them
EP2069485A4 (en) 2007-07-13 2011-05-25 Medimmune Llc PREPARATION OF NEGATIVE STRAND RNA VIRUSES BY ELECTROPORATION
ES2597439T3 (es) * 2007-12-24 2017-01-18 Id Biomedical Corporation Of Quebec Antígenos recombinantes del VSR
JP5642556B2 (ja) 2007-12-27 2014-12-17 ユニヴァーシテト チューリッヒ 複製欠損アレナウイルスベクター
WO2010075491A2 (en) * 2008-12-24 2010-07-01 University Of Rochester Recombinant expression of self-folding neutralizing epitope-bearing subdomains of the respiratory syncytial virus attachment and fusion proteins
SG176554A1 (en) 2009-05-12 2012-01-30 Transgene Sa Method for orthopoxvirus production and purification
SI2445526T1 (sl) 2009-06-24 2016-08-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Rekombinantni RSV antigeni
JP5796011B2 (ja) * 2009-06-24 2015-10-21 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
PT3178490T (pt) * 2009-07-15 2022-06-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composições de proteína f de rsv e métodos para produção das mesmas
US8568726B2 (en) 2009-10-06 2013-10-29 Medimmune Limited RSV specific binding molecule
MX338063B (es) 2009-10-06 2016-04-01 Medimmune Ltd Molecula de union especifica al rsv.
US20120315270A1 (en) 2009-10-21 2012-12-13 The United States Of America, As Represented By The Rsv immunogens, antibodies and compositions thereof
EP3275892B1 (en) * 2011-05-13 2020-01-08 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Pre-fusion rsv f antigens
CN102210860B (zh) 2011-05-31 2012-11-21 昆明理工大学 一种结核分枝杆菌tb10．4-f1融合蛋白疫苗及制备方法
ES2395677B1 (es) * 2011-07-29 2013-12-26 Instituto De Salud Carlos Iii Proteína F del VRSH en conformación pre-fusión estabilizada y anticuerpos neutralizantes específicos frente a la misma.
AU2013301312A1 (en) * 2012-08-06 2015-03-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Method for eliciting in infants an immune response against RSV and B. pertussis
EA201590683A1 (ru) * 2012-11-20 2015-11-30 Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. Тримеры rsv f, предшествующие слиянию
US9738689B2 (en) 2013-03-13 2017-08-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion RSV F proteins and their use
CN112851766A (zh) * 2013-03-13 2021-05-28 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 融合前rsv f蛋白和其用途
CA2906960C (en) 2013-03-15 2021-07-20 Xiamen University Epitope of rsv fusion protein and antibody recognizing the epitope
PE20151867A1 (es) 2013-04-25 2016-01-07 Crucell Holland Bv Polipeptidos f de prefusion del virus sincicial respiratorio (rsv )solubles y estabilizados

Also Published As

Publication number Publication date
RU2021132097A (ru) 2022-03-03
AU2018282476A1 (en) 2019-01-24
EP2970398B1 (en) 2024-05-08
CN105473604A (zh) 2016-04-06
US20220002351A1 (en) 2022-01-06
AU2021201468A1 (en) 2021-03-25
LT2970398T (lt) 2024-08-12
US20240018193A1 (en) 2024-01-18
JP7503588B2 (ja) 2024-06-20
CN105473604B (zh) 2021-01-22
KR20250023601A (ko) 2025-02-18
AU2021201468B2 (en) 2022-11-24
US11130785B2 (en) 2021-09-28
KR102450375B1 (ko) 2022-10-04
AU2014243756B2 (en) 2018-09-27
EP4421177A3 (en) 2024-12-18
FI2970398T3 (fi) 2024-08-06
JP2016519658A (ja) 2016-07-07
MX2021010519A (es) 2021-10-01
DK2970398T3 (da) 2024-08-05
PL2970398T3 (pl) 2024-09-16
KR20220139415A (ko) 2022-10-14
ES2981623T3 (es) 2024-10-10
US20250368690A1 (en) 2025-12-04
KR102766946B1 (ko) 2025-02-12
SMT202400297T1 (it) 2024-09-16
CN112851766A (zh) 2021-05-28
PT2970398T (pt) 2024-06-07
US10017543B2 (en) 2018-07-10
AU2025203614A1 (en) 2025-06-12
JP2024107243A (ja) 2024-08-08
AU2014243756A1 (en) 2015-09-17
BR112015022375A8 (pt) 2018-01-23
RU2761631C2 (ru) 2021-12-13
MX385818B (es) 2025-03-18
EP4421177A2 (en) 2024-08-28
WO2014160463A8 (en) 2015-10-08
JP2020089384A (ja) 2020-06-11
JP6703475B2 (ja) 2020-06-03
BR112015022375A2 (pt) 2017-10-10
MX2015013065A (es) 2016-06-06
CA2902877A1 (en) 2014-10-02
US20180319846A1 (en) 2018-11-08
EP2970398A4 (en) 2016-08-24
AU2023200712B2 (en) 2025-02-20
US11981707B2 (en) 2024-05-14
EP2970398A1 (en) 2016-01-20
HUE067333T2 (hu) 2024-10-28
WO2014160463A1 (en) 2014-10-02
RU2015142981A (ru) 2017-04-17
AU2018282476B2 (en) 2020-12-10
JP7043530B2 (ja) 2022-03-29
KR20150127102A (ko) 2015-11-16
HRP20240996T1 (hr) 2024-10-25
SI2970398T1 (sl) 2024-09-30
US20160046675A1 (en) 2016-02-18
JP2022089818A (ja) 2022-06-16
RU2015142981A3 (sr) 2018-03-14
AU2023200712A1 (en) 2023-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11981707B2 (en) Prefusion RSV F proteins and their use
US10858400B2 (en) Prefusion RSV F proteins and their use
US12233124B2 (en) Recombinant metapneumovirus f proteins and their use
CA2902877C (en) Prefusion rsv f proteins and their use
BR112015022375B1 (pt) Imunógenos isolados de proteína f de rsv e seu uso, partícula similar a vírus, nanopartícula de proteína, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira isolada bacteriana ou de levedura, composição imunogênica e kit