RS66031B1 - Mutant fimh, njegove kompozicije i njegova upotreba - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblasti medicinske mikrobiologije, imunologije i vakcina. Posebno, pronalazak se odnosi na polipeptide koji sadrže FimH lektinski domen koji sadrži aminokiselinsku mutaciju koja dovodi do toga da se lektinski domen FimH nalazi u konformaciji niskog afiniteta za manozu i izaziva visoke nivoe antitelom-posredovane inhibicije adhezije E. coli za ćelije epitela bešike nakon davanja subjektu. Dalje, pronalazak se odnosi na kompozicije koje sadrže takve polipeptide i na postupke stimulacije imunog odgovora kod subjekta kome je potrebno davanjem imunogenog polipeptida.

STANJE TEHNIKE

[0002] Sojevi E. coli odgovorni za ekstra-intestinalne infekcije su generalno različiti od onih koji dovode do bolesti creva i nazvani su ekstra-intestinalni patogeni E. coli (ExPEC). ExPEC su najčešći enterični Gram-negativni organizmi koji uzrokuju ekstra-intestinalnu infekciju u ambulantnim uslovima, dugotrajnoj nezi, i bolničkim uslovima. Obične ekstra-intestinalne infekcije izazvane E. coli obuhvataju infekciju urinarnog trakta (UTI), razne intra-abdominalne infekcije (IAI), pneumoniju, infekciju na hirurškom mestu, meningitis, intravaskularnu infekciju uređajem, osteomijelitis, i infekcije mekih tkiva, od kojih svaka može biti praćena bakteremijom. E. coli je vodeći uzrok ozbiljne sepse i odgovoran je za visoke stope morbiditeta i mortaliteta.

[0003] ExPEC, kao drugi članovi familije Enterobacteriaceae, proizvode tip I fimbrija, koje pomažu vezivanju za mukozne epitelne površine. Ovaj tip I fimbrija su strukture slične dlaci koje potiču sa površina članova familije Enterobacteriaceae. Glavna komponenta Tip I fimbrija su ponavljajuće podjedinice FimA aranžirane u desnogiri heliks da se obrazuje filament približno 1 µm dužine i 7 nm u prečniku sa centralnom aksijalnom rupom (Brinton, 1965). Zajedno sa FimA kao glavnom podjedinicom, fimbrijalni filament takođe sadrži FimF, FimG i FimH kao manje podjedinice proteina. Manja podjedinica proteina FimH je manan-vezujući adhezin koji podstiče prijanjanje bakterija sa Tip I-fimbrijama za glikoproteine koji sadrže manozu na površine eukariotskih ćelija i predstavlja familiju proteina koja se veže za različite mete, uključujući manan i fibronektin. Ispitivanja imuno elektronskom mikroskopijom su otkrila da je FimH strateški postavljen na distalnim krajevima Tip I fimbrija gde izgleda da je u kompleksu sa FimG, pri čemu obrazuje fleksibilnu strukturu fibriluma, i takođe je postavljen longitudilnalno na različitim intervalima duž filamenta.

[0004] Pokazano je da FimH adhezin protein indukuje zaštitu kada se koristi kao vakcina u različitim predkliničkim modelima protiv UTI (Langermann S, et al., 1997, Science, 276: 607-611; Langermann S, et al., 2000, J Infect Dis, 181: 774-778; O’Brien VP et al., 2016, Nat Microbiol, 2:16196). 1999, Medimmune je doveo podjedinicu vakcine koja sadrži FimH do faze II ispitivanja, ali razvoj vakcine je prekinut 2003 zbog nedostatska efikasnosti u prevenciji UTIs (videti, npr., Brumbaugh AR i Mobley HLT, 2012, Expert Rev Vaccines, 11: 663-676). Ipak, izgleda da kompanija Sequoia Sciences trenutno klinički razvija vakcine za rekurentne UTIs, vakcina koja se sastoji iz FimH proteina u kompleksu sa FimC proteinom i kombinuje sa novom formulacijom adjuvansa. Kompanija prijavljuje da je ova vakcina visoko imunogena i dobro se podnosi i može smanjiti učestalnost UTI, iako još uvek moraju da se uspostave bezbednost i stabilnost (https://www.sequoiasciences.com/uti-vaccine-program).

[0005] Pokazano je da tokom infekcije E. coli, lektinski domen adhezina FimH, koji se veže za manozilovane receptore, može da usvoji dve različite konformacije: niskog afiniteta za manozu (napeta) i visokog afiniteta za manozu (produžena/opuštena) (Kalas et al, 2017, Sci Adv 10;3(2)). Konformacija niskog afiniteta podstiče pokretljivost bakterija i kolonizivanje novih tkiva. Konformacija visokog afiniteta obezbeđuje čvrsto bakterijsko prijanjanje pod mehaničkim silama izlučivanja urina (Kalas et al, 2017 supra). Dalje, pokazalo se da antitela protiv niskoafinitetne varijante blokiraju vezivanje bakterija za uroepitelne ćelije i smanjuje broj CFU u bešici (Tchesnokoca, 2011 Infect Immun.

79(10):3895-904; Kisiela, 2013 Proc Natl Acad Sci, 19;110(47):19089-94).

[0006] WO02102974 opisuje broj mutanata FimH pri čemu svaki sadrži aminokiselinsku modifikaciju u kanjonskom regionu molekula. Specifično, WO02102974 opisuje varijante gde su manozni ostaci za interakciju u džepu za vezivanje mutirani. Ova lokacija mutacija je odabrana zbog toga što će održati FimH mutant u otvorenijoj konformaciji i na taj način otkrivaju epitope koji su slabo dostupni u proteinu divljeg tipa. Međutim, do danas, koliko nam je poznato, nijedan od ovih mutanata nisu dalje traženi kao kandidati za vakcinu. U kliničkim ispitivanjima, korišćen je samo divlji tip FimH.

[0007] Prema tome, u tehnici ostaje potreba za vakcinama koje mogu izazvati visoko inhibitorna antitela protiv bakterijskih E. coli.

SUŠTINA PRONALASKA

[0008] U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje polipeptid koji se sastoji iz lektinskog domena FimH koji sadrži, pri čemu lektinski domen FimH sadrži aminokiselinu odabranu iz grupe koja se sastoji iz valina (V), izoleucina (I), leucina (L), glicina (G), metionina (M), i alanina (A) na poziciji koja odgovara poziciji 144 u SEQ ID NO: 1.

[0009] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje za kompleks koji sadrži FimH polipeptid pune dužine prema pronalasku i FimC (FimCH).

[0010] U trećem aspektu, pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira polipeptid prema pronalasku.

[0011] U četvrtom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži polipeptid prema pronalasku, kompleks prema pronalasku ili polinukleotid prema pronalasku.

[0012] U petom aspektu, pronalazak obezbeđuje polipeptid prema pronalasku, kompleks prema pronalasku, polinukleotid prema pronalasku ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za upotrebu kao lek.

[0013] U šestom aspektu, pronalazak obezbeđuje polipeptid prema pronalasku, kompleks prema pronalasku, polunukleotid prema pronalasku ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za upotrebu u izazivanju imunog odgovora protiv bakterije iz familije Enterobacteriaceae. Pronalazak dalje se odnosi na postupak za lečenje ili prevenciju stanja koje je povezano sa enterobacilusom subjektu kome je potrebno postupak obuhvata davanje efikasne količine polipeptida prema pronalasku, polinukleotida prema ponalasku ili farmacetuske kompozicije prema pronalasku.

[0014] U šestom aspektu, pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži polinukleotid prema pronalasku.

[0015] U sedmom aspektu pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju polipeptida koji obuhvata eksprimovanje polipeptida iz rekombinantne ćelije koja sadrži polinukleotid iz pronalaska i/ili vektor iz pronalaska, opciono postupak dalje sadrži oporavak polipeptida što je opciono praćeno formulacijom u farmaceutsku kompoziciju polipeptida.

KRATAK OPIS NACRTA

[0016] Slika 1: Nivoi FimH antitela u serumu (ukupni IgG) indukovani različitim varijantama FimH. Vistar pacovi (n = 2) su primili 4 intramuskularne imunizacije u danu 0, 7, 10 i 18 sa 60 ug/dozi različitih varijanti FimH kombinovano sa ne-Frojndovim adjuvansom (Speedy-rat model, Eurogentec). Nivoi anti-FimH antitela su mereni ELISA pre-imunizacije (dan 0, otvoreni krugovi) i posle-imunizacije (dan 28, zatvoreni krugovi). Podaci predstavljaju srednju vrednost duplikata serumskih uzoraka iz 2 životinje/grupi. Titri antitela (EC50) su izračunati na osnovu logističkog regresionog modela sa 4 parametra uklopljenog na krivi razblaženja u 12 koraka.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0017] Pronalazak obezbeđuje novi polipeptid koji sadrži lektinski domen FimH pri čemu je lektinski domen FimH "zaključan" u konformaciji sa niskim afinitetom za manozu, ovde takođe označena kao ‘konformacija niskog afiniteta’. Predmetni pronalazak je delom zasnovan na zapažanju da FimH antigen u konformaciji niskog afiniteta za manozu je sposoban da indukuje antitela koja mogu inhibirati prijanjanje posredovano manozidom. Ova antitela su visoko inhibitorna i imaju pojačan efekat u prevenciji ili lečenju bakterijskih infekcija. Ovde je utvrđeno da lektinski domen FimH sa F144V mutacijom ima iznenađujuće dobru kombinaciju poželjnih svojstava koje ih čine veoma pogodnim za upotrebu u vakcinama protiv UTI, npr. da se spreči ili smanji rekurentni UTI.

[0018] Shodno tome, u prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje polipeptid, poželjno imunogeni polipeptid, koji sadrži lektinski domen FimH, pri čemu lektinski domen FimH sadrži aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine valin (V), izoleucin (I), leucin (L) glicin (G), metionin (M), i alanin (A), u poziciji koja odgovara poziciji 144 u SEQ ID NO: 1.

[0019] Aminokiselinska pozicija 144 se odnosi na poziciju 144 u referentnoj aminokiselinskoj sekvenci lektinskog domena FimH SEQ ID NO: 1. U aminokiselinskim sekvencama pronalaska koje nisu SEQ ID NO: 1, poželjno, aminokiselinska pozicija 144 je prisutna u aminokiselinskoj poziciji koja odgovara poziciji 144 u SEQ ID NO: 1, poželjno u ClustalW (1.83) poravnanju sekvenci korišćenjem podrazumevanih postavki. Stručnjak iz oblasti tehnike će znati kako da identifikuje odgovarajuće aminokiselinske pozicije u lektinskom domenu FimH aminokiselinskih sekvenci koje nisu SEQ ID NO: 1 korišćenjem algoritama za poravnanje aminokiselinskih sekvenci kao što je ovde gore definisano.

[0020] U jednom izvođenju, polipeptid sadrži lektinski domen FimH prema pronalasku sadrži mutaciju koja dovodi do toga da lektinski domen FimH bude u konformaciji niskog afiniteta za manozu. U jednom izvođenju, polipeptid sadrži lektinski domen FimH prema pronalasku je mutiran na poziciji koja odgovara poziciji 144 u SEQ ID NO: 1. Mutacija može biti bilo koja od delecije, adicije ili supstitucije pojedinačnog aminokiselinskog ostatka. Poželjno, mutacija je supstitucija pojedinačnog aminokiselinskog ostatka. Mutacija je poželjno supstitucija aminokiselinskog ostatka koji odgovara poziciji 144 u SEQ ID NO: 1. Poželjno, mutacija je supstitucija aminokiselinskog ostatka fenilalanina (F) na poziciji koja odgovara poziciji 144 u SEQ ID NO: 1. U polipeptidu koji sadrži lektinski domen FimH iz pronalaska pozicija koja odgovara poziciji 144 u SEQ ID NO: 1 je poželjno supstituisana za aminokiselinu koja je odabrana iz grupe koju čine valin (V), izoleucin (I), leucin (L), glicin (G), metionin (M), i alanin (A). Termini ’mutacija’, ’mutiran’ ili ’supstitucija’, ’supstituisan’ u ovom kontekstu znači da je druga aminokiselina prisutna na naznačenoj poziciji u odnosu na odgovarajući roditeljski molekul, gde je polipeptid koji sadrži lektinski domen FimH sa F na poziciji 144. Takav roditeljski molekul može fizički da postoji kao polipeptid ili u obliku nukleinske kiseline koja kodira takav polipeptid, ali može takođe postojati in silico ili na papiru kao aminokiselinska sekvenca ili odgovarajuća sekvenca nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu. Mutacija ili supstitucija u ovom kontekstu se prema tome takođe smatra prisutnom na primer ukoliko je protein eksprimovan sa nukleinske kiseline koja je sintetisana tako da kodira mutaciju ili supstituciju, iako nukleinska kiselina koja kodira odgovarajući roditeljski molekul nije u početku zapravo bio pripremljen tokom procesa, npr. kada je molekul nukleinske kiseline bio pripremljen u celini hemijskom sintezom.

[0021] U jednom poželjnom izvođenju, polipeptid sadrži lektinski domen FimH iz pronalaska sadrži supstituciju fenilalanina (F) u valin (V) na poziciji 144. U određenim izvođenjima, polipeptid sadrži lektinski domen FimH iz pronalaska je polipeptid koji se ne nalazi u prirodi koji sadrži valin na poziciji 144. U određenim izvođenjima, polipeptid sadrži lektinski domen FimH pronalaska ima valin na poziciji 144 umesto fenilalalnina koji se prirodno nalazi.

[0022] U jednom izvođenju, lektinski domen FimH ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična u sekvenci sa SEQ ID NO: 1. Poželjno, lektinski domen FimH može sadržati sekvencu koja ima SEQ ID NO: 1, izuzev pozicije 144 koja za lektinski domen FimH iz pronalaska je supstituisana valinom (V), izoleucinom (I), leucinom (L), glicinom (G), metioninom (M), ili alaninom (A).

[0023] FimH (FimHFL) pune dužine se sastoji iz dva domena: N-terminalni lektinski domen (FimHLD) koji je povezan kratkim linkerom u obliku petlje sa četiri peptida sa C-terminalnim domenom pilina (FimHPD). U jednom izvođenju pronalaska, polipeptid sadrži lektinski domen FimH prema pronalasku dalje sadrži domen pilina FimH. U jednom poželjnom izvođenju, polipeptid iz pronalaska je pune dužine FimH polipeptid gde lektinski domen FimH sadrži aminokiselinu odabranu iz grupe koja sadrži valin (V), izoleucin (I), leucin (L), glicin (G), metionin (M), i alanin (A) na poziciji koja odgovara poziciji 144 u SEQ ID NO: 1.

[0024] U jednom izvođenju, polipeptid je FimH pune dužine koji je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan u sekvenci sa SEQ ID NO: 2. Poželjno, FimH polipeptid pune dužine može sadržati sekvencu koja je SEQ ID NO: 2, izuzev F144V supstitucije kao što je ovde opisano. U drugom izvođenju, polipeptid je FimH pune dužine koji je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan u sekvenci sa SEQ ID NO: 4 ili poželjno bar sa aminokiselinama 22-300. Poželjno, FimH polipeptid pune dužine može sadržati sekvencu koja je SEQ ID NO: 4 ili poželjnije bar njene aminokiseline 22-300, osim F144V supstitucije kao što je ovde opisano.

[0025] U određenim izvođenjima, polipeptid je FimH pune dužine koji je bar oko 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan u sekvenci sa SEQ ID NO: 23-45 i 55 kao što je opisano US6,737,063.

[0026] FimH polipeptidi nisu samo visoko konzervisani između različitih sojeva E. coli, oni su takođe visoko konzervisani među širokim opsegom gram-negativnih bakterija. Osim toga, aminokiselinske promene koje se pojavljuju između sojeva se generalno pojavljuju na sličnim aminokiselinskim pozicijama. Kao rezultat visoke konzervacije FimH između E. coli sojeva, FimH polipeptidi iz jednog soja su sposobni da indukuju odgovore antitela koja inhibiraju ili sprečavaju druge sojeve E. coli da se vežu za ćelije sa FimH lektinom i/ili obezbeđuju zaštitu i/ili tretman protiv infekcije izazvane drugim sojevima E. coli. Prema tome, u jednom izvođenju FimH pune dužine je najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identičan u sekvenci sa SEQ ID NO: 5, ili poželjno bar njihovim aminokiselinama 22-300. Poželjno, FimH polipeptid pune dužine može sadržati sekvencu koja ima SEQ ID NO: 5 ili više poželjno bar njene aminokiseline 22-300, izuzev F144V supstitucije kao što je ovde opisano. U drugom izvođenju, FimH pune dužine je bar oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan u sekvenci sa SEQ ID NO: 6. Poželjno, FimH polipeptid pune dužine može sadržati sekvencu koja ima SEQ ID NO: 6, sa izuzetkom F144V supstitucije kao što je ovde opisano.

[0027] Kao što se ovde koristi, termin "periplazmatski šaperon" je definisan kao protein lokalizovan u periplazmi bakterija koji je sposoban da obrazuje komplekse sa različitim šaperon vezujućim proteinom preko prepoznavanja zajedničkog vezujućeg epitopa (ili više epitopa). Šaperoni služe kao matrice na osnovu kojih se proteini izvezeni iz bakterijske ćelije u periplazmu sklapaju u njihove prirodne konformacije. Povezivanje šaperon vezujućeg proteina sa šaperonom takođe služi da zaštiti vezujuće proteine od degradacije proteazama lokalizovanim u periplazmi, povećava njihovu rastvorljivost u vodenom rastvoru, i dovodi do njihovog sekvencijalno ispravnog ugrađivanja u sklapanje pilusa. Proteini šaperona su klasa proteina u gram-negativnim bakterijama koji su uključeni u sastavljanje pilija posredovanjem u takvom sklapanju, ali nisu ugrađeni u strukturu. FimC je periplazmatski šaperon protein FimH. FimC ima sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili oko 100% identična u sekvenci sa SEQ ID NO: 3. U određenim izvođenjima, FimC ima sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili oko 100% identična u sekvenci sa SEQ ID NO: 29 kako je opisano u US6,737,063. Nekovalentni kompleks FimC i FimH se zove FimCH.

[0028] Prema tome, u daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje kompleks koji sadrži polipeptid koji sadrži lektinski domen FimH prema pronalasku i dalje sadrži FimH pilin domen ili FimH pune dužine kao što je ovde opisano i FimC.

[0029] U jednom izvođenju pronalaska, polipeptid sadrži lektinski domen FimH prema pronalasku dalje sadrži FimH pilin domen i u kompleksu je sa FimC da se obrazuje kompleks FimCH.

[0030] Pronalazači iz predmetne prijave su napravili nekoliko varijanti lektinskog domena FimH sa različitim promenama aminokiselina i ispitali su njihovu efikasnost u različitim testovima (videti primere). Iznenađujuće, nisu svi testirani proteini FimH sa mutacijama lektinskog domena bili u stanju da se inkorporiraju u kompleks FimCH sa željenim svojstvima, tj. imaju dovoljnu čistoću (koncentracija proteina i stepen čistoće), integritet i funkcionalnost.

[0031] Ovde opisani lektinski domen FimH koji sadrži aminokiselinu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz valina (V), izoleucina (I), leucina (L), glicina (G), metionina (M), i alanina (A), na poziciji koja odgovara poziciji 144 u SEQ ID NO: 1 je sposoban da obrazuje FimCH kompleks koji ima željene osobine.

[0032] U jednom izvođenju, polipeptid sadrži lektinski domen FimH prema pronalasku je FimH pune dužine koji je bar oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan u sekvenci sa SEQ ID NO: 2 i u kompleksu je sa FimC da se obrazuje FimCH kompleks. FimH pune dužine u svom finalnom obliku obično ne obuhvata signalni peptid, koji je na primer prikazan kao aminokiseline 1-21 SEQ ID NOs: 4 i 5, tj. FimH pune dužine SEQ ID NO: 4 ili SEQ ID NO: 5 razume se da uključuje aminokiseline 22-300 ovih sekvenci dok im tipično nedostaju aminokiseline 1-21. Za rekombinantnu proizvodnju FimH pune dužine, korisno je kodirati FimH koji uključuje signalni peptid u rekombinantnoj ćeliji domaćinu, da bi se dobio transport kroz unutrašnju (citoplazmatsku) membranu preko opšteg sekretornog puta koji vodi do periplazmatske lokacije polipeptida (ponekad koji se naziva 'periplazmatska ekspresija'), ali u konačnom FimH polipeptidu kao izolovanom i na primer korišćenom u farmaceutskim kompozicijama, signalni peptid tipično više nije prisutan kao rezultat obrade od strane rekombinantne ćelije koja eksprimuje polipeptid.

[0033] U poželjnijem izvođenju, FimCH kompleks sadrži ili se sastoji iz FimC proteina koji je bar 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili bar 100% identičan u sekvenci sa SEQ ID NO: 3 i FimH protein sadrži lektinski domen koji ima aminokiselinu koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz valina (V), izoleucina (I), leucina (L), glicina (G), metionina (M), i alanina (A), na poziciji koja odgovara poziciji 144 u SEQ ID NO: 1. U još više poželjnom izvođenju, FimCH kompleks sadrži ili se sastoji iz FimC proteina koji je bar 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili bar oko 100% identičan u sekvenci sa SEQ ID NO: 3 i FimH protein koji sadrži F144V supstituciju u lektinskom domenu ili FimH proteinu pune dužine koji sadrži F165V supstituciju (npr. u SEQ ID NOs: 4 ili 5 koji i dalje uključuju signalni peptid). U FimH pune dužine koji bi i dalje uključivao signalni peptid aminokiselinski položaj 165 odgovara položaju aminokiseline 144 u lektinskom domenu FimH. Stručnjak će znati kako da identifikuje odgovarajuće pozicije aminokiselina u sekvencama aminokiselina FimH pune dužine i u aminokiselinskim sekvencama lektinskog domena FimH korišćenjem algoritama za poravnanje sekvenci aminokiselina kao što je gore definisano.

[0034] U jednom izvođenju, kompleksi koji sadrže E. coli šaperon FimC i varijantu lektinskog domena FimH prema pronalasku mogu se formirati ko-ekspresijom polipeptida varijante lektinskog domena FimH prema pronalasku zajedno sa FimC, iz rekombinantne ćelije.

[0035] U jednom izvođenju, kompleks FimCH sadrži FimC koji potiče od jednog bakterijskog soja, dok FimH potiče od drugog bakterijskog soja. U drugom izvođenju, kompleks FimCH sadrži FimC i FimH koji potiču od istog bakterijskog soja. U određenom izvođenju, FimH ili FimC ili i FimH i FimC mogu biti veštačke sekvence koje nisu iz stvarnih bakterijskih izolata koji postoje u prirodi, npr. one takođe mogu biti zasnovane na konsenzusnim sekvencama ili kombinacijama prirodnih izolata.

[0036] U jednom izvođenju, kompleks FimCH sadrži najmanje jedan polipeptid koji sadrži His-oznaku. U jednom izvođenju, FimH pune dužine prema pronalasku sadrži His-oznaku ili FimC kao što je ovde opisano sadrži His-oznaku. Poželjno, u kompleksu FimCH, FimC sadrži His-oznaku. His-oznaka, kako se ovde koristi, je deo histidinskih (His) ostataka, npr. šest His ostataka, koji se mogu dodati interno ili poželjno na N- ili C-kraju proteina. Takva oznaka ima dobro poznatu upotrebu zbog lakšeg prečišćavanja.

[0037] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na polinukleotid koji kodira FimH polipeptid kao što je gore definisano. Polinukleotidu može prethoditi promotor koji je operativno vezan za njega. U određenim izvođenjima, promotor je endogen kodirajućoj sekvenci FimH. U određenim izvođenjima, promotor je endogeni promotor koji pokreće ekspresiju FimH u bakteriji iz porodice Enterobacteriaceae. U drugim izvođenjima, promotor je heterologan kodirajućoj sekvenci FimH, npr. korišćen je jak promotor koji je stručnjaku poznat za upotrebu u rekombinantnim ekspresionim sistemima. Na primer, pET-DUET vektor koji sadrži inducibilni Lac promotor može se koristiti za ekspresiju FimH i/ili FimC. U slučaju inducibilnog promotora, IPTG se može koristiti za izazivanje ekspresije. Poželjno, polinukleotid je izolovan iz svog prirodnog okruženja. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje izolovani polinukleotid prema pronalasku. Polipeptid može biti rekombinantni, sintetički ili veštački polinukleotid. Polinukleotid može biti u bilo kom obliku nukleinske kiseline, npr. DNK ili RNK, poželjno DNK. Polinukleotid može da sadrži jedan ili više nukleotida koji nisu prisutni u polinukleotidu koji kodira FimH u prirodi. Poželjno, polinukleotid ima jedan ili više nukleotida koji nisu prisutni u polinukleotidu koji se prirodno javlja koji kodira FimH na njegovom 5'-kraju i/ili 3'-kraju. Poželjno je da sekvencama kodiranog zrelog FimC i/ili FimH prethodi signalni peptid u polipeptidima kako ih kodiraju odgovarajući polinukleotidi, a signalni peptidi mogu biti endogeni signalni peptidi za polipeptide FimC i/ili FimH (tj. signalni peptidi koji se javljaju u prirodi za ove proteine), odnosno, ili mogu biti heterologni signalni peptidi, tj. signalni peptidi iz drugih proteina ili sintetički signalni peptidi. Signalni peptidi su korisni za periplazmatsku ekspresiju, ali su tipično odcepljeni i nisu prisutni u konačno proizvedenom i prečišćenom redom, FimC i/ili FimH.

[0038] Ako je potrebno i/ili ako se želi, polipeptid koji sadrži lektinski domen FimH prema pronalasku ili polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži lektinski domen FimH prema pronalasku može se ugraditi u farmaceutski aktivnu smešu dodavanjem farmaceutski prihvatljivog nosača.

[0039] Shodno tome, u daljem aspektu, pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju, poželjno farmaceutsku kompoziciju koja sadrži lektinski domen FimH prema pronalasku ili polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži lektinski domen FimH prema pronalasku.

[0040] (Farmaceutske) kompozicije iz pronalaska mogu sadržati bilo koji farmaceutski prihvatljiv ekscipijens uključujući nosač, sredstvo za punjenje, konzervans, solubilizator i/ili razblaživač. Slani rastvori i vodeni rastvori dekstroze i glicerola se takođe mogu koristiti kao tečni nosači, posebno za rastvore za injekcije. Pogodni ekscipijensi su skrob, glukoza, laktoza, saharoza, želatin, slad, pirinač, brašno, kreda, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, i kao. Primeri odgovarajućih farmaceutskih nosača opisani su u "Remington’s pharmaceutical sciences," XIII ed. Editor-in-Chief Eric W. Martin. Mack Publishing Co., Easton, Pa., 2013.

[0041] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska dodatno sadrže jedan ili više pufera, npr., fiziološki rastvor sa tris-puferom, fosfatni pufer i saharoza fosfat glutamatni pufer.

[0042] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska dodatno sadrže jednu ili više soli, npr., trishidrohlorid, natrijum hlorid, kalcijum hlorid, kalijum hlorid, natrijum fosfat, mononatrijum glutamat i soli aluminijuma (npr., aluminijum hidroksid, hidroksid aluminijum fosfat, kalijum aluminijum glutamat, i soli aluminijuma ili smešu takvih aluminijumskih soli).

[0043] Kompozicije pronalaska se mogu koristiti za izazivanje imunološkog odgovora kod domaćina kome se daje kompozicija, tj. imunogene su. Prema tome, kompozicije pronalaska se mogu koristiti kao vakcine protiv infekcije izazvane bakterijom iz porodice Enterobacteriaceae, poželjno protiv infekcije izazvane Klebsiella, poželjnije E.coli i stoga mogu sadržati sve dodatne komponente pogodne za upotrebu kod vakcina. Na primer, dodatna komponenta kompozicije vakcine je adjuvans kao što je ovde opisano.

[0044] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska dodatno sadrže konzervans, kao što je fenol, benzetonijum hlorid, 2-fenoksietanol ili timerosal. U specifičnom izvođenju, (farmaceutske) kompozicije pronalaska sadrže 0.001% do 0.01% konzervansa. U drugim izvođenjima, (farmaceutske) kompozicije pronalaska ne sadrže konzervans.

[0045] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su formulisane tako da budu pogodne za predviđeni način davanja subjektu. Na primer, kompozicije prema pronalasku mogu biti formulisane tako da budu pogodne za subkutanu, parenteralnu, oralnu, intradermalnu, transdermalnu, kolorektalnu, intraperitonealnu, intravaginalnu ili rektalnu primenu. U specifičnom izvođenju, farmaceutska kompozicija se može formulisati za intravensku, oralnu, bukalnu, intraperitonealnu, intranazalnu, intratrahealnu, subkutanu, intramuskularnu, topikalnu, intradermalnu, transdermalnu ili plućnu primenu, poželjno intramuskularnu primenu.

[0046] Kompozicije pronalaska mogu biti uključene u kontejner, pakovanje ili dozator zajedno sa uputstvima za primenu.

[0047] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska se mogu čuvati pre upotrebe, na primer, kompozicije se mogu čuvati zamrznute (npr. na oko -20°C ili na oko -70°C); čuvaju u rashlađenim uslovima (npr. na oko 2-8°C, npr. na oko 4°C); ili čuvaju na sobnoj temperaturi. Alternativno, odvojene kompozicije koje sadrže jednu ili više komponenata (i), (ii) i (iii) mogu se čuvati i mešati sa kompozicijom kombinovane vakcine koja sadrži sva tri od (i), (ii) i (iii) pre upotrebe. U još jednoj alternativi, odvojene kompozicije su obezbeđene u kombinovanom rasporedu davanja.

[0048] U jednom izvođenju pronalaska, farmaceutska kompozicija pronalaska se može primeniti zajedno sa kompozicijom koja sadrži jedan ili više polisaharida kovalentno vezanih za protein nosač. Poželjno, takva kompozicija sadrži jedan ili više biokonjugata polisaharida O-antigena E. coli koji je kovalentno povezan sa proteinom nosačem, kao što je na primer opisan u WO2019/175145

[0049] U izvođenju, ovde navedena farmaceutska kompozicija iz pronalaska dalje sadrži adjuvans. Kao što se ovde koristi, termin "adjuvans" se odnosi na jedinjenje koje kada se daje zajedno sa ili kao deo kompozicije iz pronalaska povećava, pojačava i/ili unapređuje imuni odgovor na FimH, ali kada se adjuvansno jedinjenje primenjuje samo ne generiše imuni odgovor na konjugat i/ili FimH. Adjuvansi mogu poboljšati imuni odgovor pomoću nekoliko mehanizama uključujući, na primer, regrutovanje limfocita, stimulaciju B i/ili T ćelija i stimulaciju antigen prezentujućih ćelija.

[0050] Poželjno, farmaceutske kompozicije iz pronalaska sadrže, ili su davane u kombinaciji sa, adjuvansom. Adjuvans za davanje u kombinaciji sa kompozicijom iz pronalaska može se dati pre, istovremeno sa, ili nakon davanja imunogenih kompozicija. U poželjnim izvođenjima, FimH iz pronalaska i adjuvans se daju u obliku jedne kompozicije.

[0051] Specifični primeri adjuvanasa obuhvataju, ali nisu ograničeni na, soli aluminijuma (alum) (kao što je aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, aluminum sulfat, i aluminijum oksid, uključujući nanočetice koje sadrže alum ili formulacije nanoaluma), kalcijum fosfat (npr. Masson JD et al, 2017, Expert Rev Vaccines 16: 289-299), mono lipid A (MPL) ili 3-de-O-acilovani monofosforil lipid A (3D-MPL) (videti npr., United Kingdom Patent GB2220211, EP0971739, EP1194166, US6491919), AS01, AS02, AS03 i AS04 (sve GlaxoSmithKline; videti npr. EP1126876, US7357936 za AS04, EP0671948, EP0761231, US5750110 za AS02), jedinjenja imidazopiridina (videti WO2007/109812), jedinjenja imidazohinoksalina (videti WO2007/109813), delta-inulin (npr. Petrovsky N i PD Cooper, 2015, Vaccine 33: 5920-5926), STING-aktivirajući sintetički ciklični-di-nukleotidi (npr. US20150056224), kombinacije lecitina i homopolimeri karbomera (npr. US6676958), i saponini, kao što su Quil A i QS21 (videti npr. Zhu D i W Tuo, 2016, Nat Prod Chem Res 3: e113 (doi:10.4172/2329-6836.1000e113), opciono u kombinaciji sa QS7 (videti Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); US 5,057,540). U nekim izvođenjima, adjuvans je Frojndov adjuvans (kompletni ili nekompletni). U određenim izvođenjima, adjuvans sadrži Quil-A, kao što je na primer komercijalno dobijen od Brenntag (sada Croda) ili Invivogen. QuilA sadrži frakciju saponina koja se ekstrahuje vodom iz stabla Quillaja saponaria Molina. Ovi saponini pripadaju grupi triterpenoidnih saponina, koji imaju zajedničku strukturu triterpenoidne okosnice. Poznato je da saponini indukuju jak adjuvansni odgovor na T-zavisne i T-nezavisne antigene, kao i jake citotoksične CD8+ limfocitne odgovore i potenciraju odgovor na mukozne antigene. Takođe se mogu kombinovati sa holesterolom i fosfolipidima, da bi se formirali imunostimulatorni kompleksi (ISCOM), pri čemu QuilA adjuvans može aktivirati imune odgovore posredovane antitelima i ćelije na širok spektar antigena različitog porekla. U određenim izvođenjima, adjuvans je AS01, poželjno AS01B. S01 je sistem adjuvansa koji sadrži MPL (3-O-desacil-4'-monofosforil lipid A), KS21 (Quillaja saponaria Molina, frakcija 21) i lipozome. U određenim izvođenjima, AS01 je komercijalno dostupan (GSK) ili se može dobiti kao što je opisano u WO 96/33739, Određeni adjuvansi sadrže emulzije, koje su smeše dve tečnosti koje se ne mešaju, npr. ulja i vode, od kojih je jedna suspendovana kao male kapi unutar druge i stabilizovana površinski aktivnim agensima. Emulzije ulje u vodi imaju vodu koja formira kontinualnu fazu, koja okružuje kapljice ulja, dok emulzije voda u ulju imaju ulje koje formira kontinuiranu fazu. Određene emulzije sadrže skvalen (ulje koje se može metabolizirati). Određeni adjuvansi sadrže blok kopolimere, koji su kopolimeri koji se obrazuju kada se dva monomera grupišu zajedno i formiraju blokove ponavljajućih jedinica. Primer emulzije vode u ulju koja sadrži blok kopolimer, skvalen i mikročestični stabilizator je TiterMax<®>, koji se komercijalno može dobiti od Sigma-Aldrich. Opciono emulzije se mogu kombinovati sa ili dalje sadržati imunostimulatorne komponente, kao što je agonist TLR4. Određeni adjuvansi su emulzije ulja u vodi (kao što je skvalen ili ulje kikirikija) takođe korišćene u MF59 (vidi npr. EP0399843, US 6299884, US6451325) i AS03, opciono u kombinaciji sa imunim stimulantima, kao što je monofosforil lipid A i/ili QS21 kao što je u AS02 (vidi Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med.336, 86-91). Ostali primeri adjuvanasa su lipozomi koji sadrže imune stimulante kao što su MPL i QS21 kao što je u AS01E i AS01B (npr. US 2011/0206758). Drugi primeri adjuvanasa su CpG (Bioworld Today, Nov.15, 1998) i imidazohinolini (kao što je imihimod and R848). Vidi, npr., Reed G, et al., 2013, Nature Med, 19: 1597-1608.

[0052] U određenim poželjnim izvođenjima, adjuvans sadrži saponine, poželjno ekstrahovanu frakciju saponina u vodi dobijenu iz Quillaja saponaria. U određenim izvođenjima, adjuvans sadrži QS-21.

[0053] U određenim poželjnim izvođenjima, adjuvans sadrži agonist receptora 4 (TLR4) sličan tolu. Agonisti TLR4 su dobro poznati u tehnici, vidi npr. Ireton GC i SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines 12: 793-807. U određenim poželjnim izvođenjima, adjuvans je agonist TLR4 koji sadrži lipid A, ili njegov analog ili derivate.

[0054] Adjuvans, poželjno uključujući agonist TLR4, mogu se formulisati na različite načine, npr. u emulzijama kao što su voda u ulju (v/u) emulzije ili ulje u vodi (u/v) emulzije (primeri su MF59, AS03), stabilne (nano-)emulzije (SE), lipidne suspenzije, lipozomi, (polimerne) nanočestice, virozomi, adsorbovane alum, vodene formulacije (AF) i slično, koje predstavljaju različite sisteme isporuke za imunomodulatorne molekule u adjuvansu i/ili za imunogene (videti npr. Reed et al, 2013, supra; Alving CR et al, 2012, Curr Opin Immunol 24: 310-315).

[0055] Imunostimulatorni agonist TLR4 se može opciono kombinovati sa drugim imunomodulatornim komponentama, kao što su saponini (npr. QuilA, QS7, QS21, Matrix M, Iscoms, Iscomatrix, itd), soli aluminijuma, aktivatorima drugih TLR-a (npr. imidazohinolinima, flagelinom, CpG, analozima dsRNK, itd), i slično (vidi npr. Reed et al, 2013, supra).

[0056] Kao što se ovde koristi, termin"lipid A" se odnosi na hidrofobni lipidni ostatak molekula LPS koji sadrži glukozamin i povezan je sa keto-deoksioktulosonatom u unutrašnjem jezgru molekula LPS preko ketozidne veze, koji usidrava LPS molekul u spoljašnjem listu spoljašnje membrane gram-negativnih bakterija. Za pregled sinteze LPS i struktura lipida A videti, npr., Raetz, 1993, J. Bacteriology 175:5745-5753, Raetz CR i C Whitfield, 2002, Annu Rev Biochem 71: 635-700; US 5,593,969 i US 5,191,072. Lipid A, kako se ovde koristi, uključuje lipid A koji se pojavljuje u prirodi, smeše, analoge, derivate i prekursore. Termin uključuje monosaharide, npr., prekursor lipida A koji se naziva lipid X; disaharid lipid A; hepta-acil lipid A; heksa-acil lipid A; penta-acil lipid A; tetra-acil lipid A, npr., tetra-acil prekursor lipida A, koji se naziva lipid IVA; defosforilovani lipid A; monofosforil lipid A; difosforil lipid A, kao što je lipid A iz Escherichia coli i Rhodobacter sphaeroides. Nekoliko struktura lipida A koje aktiviraju imunitet sadrže 6 acilnih lanaca. Četiri primarna acilna lanca vezana direktno za glukozaminske šećere su 3-hidroksi acilni lanci obično dužine između 10 i 16 ugljenika. Dva dodatna acil lanca su često vezana za 3-hidroksi grupe primarnih acil lanaca. E. coli lipid A, kao primer, tipično ima četiri C143-hidroksi acil lanca vezana za šećere i jedan C12 i jedan C14 koji su vezan za 3-hidroksi grupe primarnih acil lanaca redom na 2' i 3' poziciji.

1

[0057] Kao što se ovde koristi, termin "analog ili derivat lipida A" odnosi se na molekul koji liči na strukturu i imunološku aktivnost lipida A, ali to ne mora nužno da se prirodno javlja u prirodi. Analozi ili derivati lipida A mogu biti modifikovani u npr. biti skraćeni ili kondenzovani, i/ili da se njihovi ostaci glukozamina zamene drugim ostatkom aminskog šećera, npr. ostacima galaktozamina, da sadrže 2-deoksi-2-aminoglukonat umesto glukozamin-1-fosfata na redukcionom kraju, da nose deo galakturonske kiseline umesto fosfata na poziciji 4’. Analozi ili derivati lipida A mogu biti pripremljeni od lipida A izolovanog iz bakterije, npr., hemijskom derivacijom, ili hemijski sintetizovani, npr. prvo određivanjem strukture poželjnog lipida A i sintezom njegovih analoga ili derivata. Analozi ili derivati lipida A su takođe korisni kao adjuvansi TLR4 agonista (videti, npr. Gregg KA et al, 2017, MBio 8, eDD492-17, doi: 10.1128/mBio.00492-17). Na primer, analog ili derivat lipida A može se dobiti deacilacijom molekula lipida A divljeg tipa, npr. tretmanom bazom. Analozi ili derivati lipida A mogu se, na primer, pripremiti iz lipida A izolovanog iz bakterija. Takvi molekuli se takođe mogu hemijski sintetizovati. Drugi primer analoga ili derivata lipida A su molekuli lipida A izolovani iz bakterijskih ćelija koje sadrže mutacije u, ili delecije ili insercije enzima uključenih u biosintezu lipida A i/ili modifikaciju lipida A. MPL i 3D-MPL su analozi ili derivati lipida A koji su modifikovani da ublaže toksičnost lipida A. Lipid A, MPL i 3D-MPL imaju šećernu okosnicu za koju su vezani dugi lanci masnih kiselina, pri čemu okosnica sadrži dva šećera sa 6 ugljenika u glikozidnoj vezi i fosforilni deo na poziciji 4. Obično je pet do osam dugolančanih masnih kiselina (obično 12-14 atoma ugljenika) vezano za okosnicu šećera. Zbog derivacije prirodnih izvora, MPL ili 3D-MPL mogu biti prisutni kao kompozit ili mešavina brojnih obrazaca supstitucije masnih kiselina, npr. hepta-acil, heksa-acil, penta-acil, itd., sa različitim dužinama masnih kiselina. Ovo takođe važi za neke od drugih analoga ili derivata lipida A opisanih ovde, međutim sintetičke varijante lipida A takođe mogu biti definisane i homogene. MPL i njegova proizvodnja su na primer opisani u US 4,436,727.3D-MPL je na primer opisan u US 4,912,094B1, i razlikuje se od MPL po selektivnom uklanjanju 3-hidroksimiristinskog acilnog ostatka koji je estar vezan za redukcioni kraj glukozamina na poziciji 3 (uporedi, na primer, strukturu MPL u koloni 1 u odnosu na 3D-MPL u koloni 6 US 4,912,094B1). U struci se često koristi 3D-MPL, dok se ponekad naziva MPL (npr. prva struktura u tabeli 1 Ireton GC i SG Reed, 2013, supra, ovu strukturu se odnosi na MPL®, ali zapravo prikazuje strukturu 3D-MPL). Primeri lipida A (analozi, derivati) prema pronalasku obuhvataju MPL, 3D-MPL, RC529 (npr. EP1385541), PET-lipid A, GLA (glikopiranozil lipidni adjuvans, sintetički disaharid glikolipid; npr. US20100310602, US8722064), SLA (npr. Carter D et al, 2016, Clin Transl Immunology 5: e108 (doi: 10.1038/cti.2016.63), koji opisuje pristup struktura-funkcija da bi se optimizovali ligandi TLR4 za humane vakcine), PHAD (fosforilovani heksaacil disaharid; struktura koja je ista za GLA), 3D-PHAD, 3D-(6-acil)-PHAD (3D(6A)-PHAD) (PHAD, 3D-PHAD, i 3D(6A)PHAD su sintetičke varijante lipida A, videti npr. avantilipids.com/divisions/adjuvants, koji takođe prikazuje strukture ovih molekula), E6020 (CAS Number 287180-63-6), ONO4007, OM-174, i slično. Za primer hemijskih struktura 3D-MPL, RC529, PET-lipid A, GLA/PHAD, E6020, ONO4007, i OM-174, videti npr. Tabela 1 u Ireton GC i SG Reed, 2013, supra. Za strukturu SLA, videti npr. Sl 1 u Reed SG et al, 2016, Curr Opin Immunol 41: 85-90. U određenim poželjnim izvođenjima, adjuvans TLR4 agonista sadrži analog ili derivate lipida A analog koji je odabran od 3D-MPL, GLA, ili SLA.

[0058] Primeri adjuvanasa koji sadrže analog lipida A ili derivate obuhvataju GLA-LSQ (sintetički MPL [GLA], QS21, lipide formulisane kao lipozome), SLA-LSQ (sintetički MPL [SLA], QS21, lipide, formulisane kao lipozome), GLA-SE (sintetički MPL [GLA], emulzija skvalen ulje/voda), SLA-SE (sintetički MPL [SLA], emulzija skvalen ulje/voda), SLA-Nanoalum (sintetički MPL [SLA], aluminijumova so), GLA-Nanoalum (sintetički MPL [GLA], aluminijumova so), SLA-AF (sintetički MPL [SLA], vodena suspenzija), GLA-AF (sintetički MPL [GLA], vodena suspenzija,), SLA-alum (sintetički MPL [SLA], aluminijumova so), GLA-alum (sintetički MPL [GLA], aluminijumova so), i nekoliko GSK ASxx serija adjuvanasa, uključujući AS01 (MPL, QS21, lipozome), AS02 (MPL, QS21, emulzija ulje/voda), AS25 (MPL, emulzija ulje/voda), AS04 (MPL, aluminijumova so), i AS15 (MPL, QS21, CpG, lipozomi). Videti, npr., WO 2013/119856, WO 2006/116423, US 4,987,237, U.S.4,436,727, US 4,877,611, US 4,866,034, US 4,912,094, US 4,987,237, US5191072, US5593969, US 6,759,241, US 9,017,698, US 9,149,521, US 9,149,522, US 9,415,097, US 9,415,101, US 9,504,743, Reed G, et al., 2013, supra, Johnson et al., 1999, J Med Chem, 42:4640-4649, i Ulrich and Myers, 1995, Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach; Powell i Newman, Eds.; Plenum: New York, 495-524.

[0059] Ne-glikolipidni molekuli se takođe mogu koristiti kao adjuvansi TLR4 agonista, npr. sintetički molekuli kao što su Neoseptin-3 ili prirodni molekuli kao što su LeIF, videti npr. Reed SG et al, 2016, supra.

[0060] U drugom aspektu pronalazak se odnosi na polipeptid koji sadrži lektinski domen FimH pronalaska, polinukleotid pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu kao lek.

[0061] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu polipeptida koji sadrži lektinski domen FimH kako je ovde opisano, polinukleotida kao što je opisano ili farmaceutske kompozicije koja je ovde opisana kao lek za izazivanje imunog odgovora protiv gram negativne bakterije iz porodice Enterobacteriaceae.

[0062] Kao što se ovde koriste izrazi "imunogen" ili "imunogeni " ili "antigen" se koriste naizmenično da opišu molekul koji je sposoban da izazove imunološki odgovor protiv samog sebe na davanje primaocu, bilo zasebno, u kombinaciji sa adjuvansom, ili predstavljen na nosaču za prikaz.

[0063] Kao što se ovde koristi, "imunološki odgovor" ili "imuni odgovor" na antigen ili kompoziciju se odnosi na razvoj humoralnog i/ili ćelijskog imunog odgovora kod subjekta na antigen ili antigen prisutan u kompoziciji.

[0064] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na polipeptid koji sadrži FimH lektinski domen kao što je ovde opisano, polinukleotid kao što je opisano ili farmaceutsku kompoziciju kao što je ovde opisana za upotrebu u indukovanju imunog odgovora protiv bakterijske infekcije koja je uzrokovana gram negativnom bakterijom familije Enterobacteriaceae. U određenim izvođenjima, bakterijska infekcija je uzrokovana Staphylococcus saprophyticus ili Staphylococcus aureus, Proteus spp., Serratia spp., ili Pseudomonas spp. U poželjnim izvođenjima bakterijska infekcija je uzrokovana Klebsiella spp., ili E.coli. U napoželjnijem izvođenju, bakterijska infekcija je uzrokovana E.coli. Prema tome u jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na upotrebu polipeptida koji sadrži lektinski domen FimH kao što je ovde opisano, polinukletid kao što je ovde opisano ili farmaceutsku kompoziciju kao što je ovde opisana kao lek za indukovanje imunog odgovora protiv E.coli ili Klebsiella, poželjno E.coli.

[0065] U poželjnim izvođenjima, bakterijska infekcija, uzrokovana gram negativnom bakterijom familije Enterobacteriaceae je infekcija E.coli, npr. ExPEC, tačnije infekcija urinarnog trakta (UTI). U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na polipeptid koji sadrži FimH lektinski domen kao što je ovde opisano, polinukleotid kao što je opisano ili ovde opisanu farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u lečenju, prevenciji, ili supresiji simptoma i/ili posledica povezanih sa UTI kod subjekta. U određenim izvođenjima, navedeni UTI je rUTI. E.coli je jedan od glavnih uzročnika UTI i rUTI koji su važan zdravstveni problem kod mladih žena i starijih odraslih osoba. Prema tome, u poželjnim izvođenjima, bakterijska infekcija je UTI ili rUTI izazvan E.coli.

[0066] U jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na postupak lečenja, prevencije, ili supresije simptoma i/ili posledice povezane sa oboljenjem povezanim sa enterobacilom kod subjekta kome je to potrebno. Postupak obuhvata davanje subjektu efikasne količine polipeptida koji sadrži FimH lektinski domen kako je ovde opisano, polinukleotida kao što je opisano ili ovde opisane farmaceutske kompozicije. Poželjno, primena indukuje imuni odgovor koji je efikasan u lečenju ili prevenciji stanja povezanog sa enterobacilom. Poželjno, stanje povezano sa enterobacilom je infekcija urogenitalnog trakta, tačnije UTI ili rUTI.

[0067] Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu polipeptida koji sadrži FimH lektinski domen kao što je ovde opisano, polinukleotida kao što je opisano ili farmaceutske kompozicije kao što je opisano za dobijanje leka za lečenje, prevenciju, ili supresiju bakterijske infekcije koja je uzrokovana gram negativnom bakterijom familije Enterobacteriaceae, poželjno bakterijske infekcije uzrokovane E.coli. Poželjnije, bakterijska infekcija je UTI ili rUTI uzrokovana E.coli.

[0068] U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid iz pronalaska. U određenim izvođenjima, vektor je plazmid ili virusni vektor, poželjno plazmid. Vektor je poželjno u obliku DNK, npr. plazmid DNK. U određenim izvođenjima, vektor sadrži polinukleotid iz pronalaska operativno vezan za promotor, što znači da je polinukleotid pod kontrolom promotora. Promotor može biti lociran uzvodno od polinukleotida koji kodira polipeptid pronalaska, npr. u ekspresionoj kaseti u plazmidu.

[0069] Pronalazak se dalje odnosi na postupak za proizvodnju polipeptida iz pronalaska, postupak obuhvata kultivisanje rekombinantne ćelije koja sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži FimH lektinski domen kao što je ovde opisano i/ili vektor kao što je ovde opisano, pri čemu se kultivisanje odvija pod uslovima pogodnim za proizvodnju polipeptida

[0070] U određenim izvođenjima, postupak dalje sadrži oporavak polipeptida, što je po potrebi praćeno formulacijom u farmaceutskoj kompoziciji.

[0071] Poželjno ćelija E. coli, na primer derivat E.coli BL21, ćelija se koristi u postupku za proizvodnju polipeptida koji sadrži lektinski domen FimH prema pronalasku.

[0072] Oporavak polipeptida poželjno sadrži prečišćavanje i/ili korak izolacije koji se mogu izvesti korišćenjem u oblasti tehnike poznatih konvencionalnih postupaka prečišćavanja proteina. Takvi postupci mogu uključiti precipitaciju amonijum sulfatom ili etanolom, ekstrakciju kiselinom, hromatografiju izmene anjona ili katjona, hromatografiju na fosfocelulozi, hromatografiju hidrofobne interakcije, afinitetnu hromatografiju, hromatografiju sa hidroksilapatitom i hromatografiju sa lektinom.

[0073] Obični primeri za takvo prečišćavanje i/ili izolaciju mogu koristiti antitelo na protein ili na His oznaku ili odcepljivu vodeću sekvencu (eng. leader) ili rep koji se eksprimuje kao deo strukture proteina. U određenim izvođenjima, polipeptidi koji su ovde opisani imaju uključenu His-oznaku i prečišćavaju se postupcima kao što je IMAC afinitetno prečišćavanje. U određenim izvođenjima, polipeptidi koji su ovde opisani ne sadrže His-oznaku, u takvim slučajevima prečišćavanje se vrši hromatografijom izmene katjona (cIEX) i hromatografijom sa hidrofobnom interakcijom (HIC).

Definicije

[0074] Različite publikacije, članci i patenti su citirani ili opisani u stanju tehnike i u čitavoj specifikaciji. Diskusija o dokumentima, aktima, materijalima, uređajima, artiklima ili sličnom koji su uključeni u ovu specifikaciju je u svrhu obezbeđivanja konteksta za pronalazak. Takva diskusija ne predstavlja priznanje da bilo koja ili sva ova pitanja čine deo prethodnog stanja tehnike u vezi sa bilo kojim pronalascima koji su otkriveni ili zahtevani.

1

[0075] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje koje uobičajeno razume prosečni stručnjak u oblasti na koju se ovaj pronalazak odnosi. U suprotnom, određeni termini citirani ovde imaju značenja koja su postavljena u specifikaciji. Mora se napomenuti da kako se ovde koristi iu priloženim zahtevima, oblici jednine uključuju referencu u množini osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0076] U ovom opisu i tvrdnjama koje slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „sadrži“ i varijacije kao što su „obuhvata“ i „sastoji se“, razume se da podrazumevaju uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Kada se ovde koristi, termin "sastoji se" može biti zamenjen terminom "sadrži" ili "uključuje" ili ponekad kada se ovde koristi terminom "ima".

[0077] Kada se ovde koristi "koji se sastoji od" isključuje bilo koji element, korak ili sastojak koji nije naveden u elementu zahteva. Kada se ovde koristi, "koji se u suštini sastoji od" ne isključuje materijale ili korake koji ne utiču materijalno na osnovne i nove karakteristike zahteva. Bilo koji od gore pomenutih termina „sastoji se“, „sadrži“, „uključujući“ i „koji ima“, kad god se ovde koristi u kontekstu aspekta ili izvođenja pronalaska, može se zameniti terminom „sastoji se od“ ili „sastoji se od u suštini od" da bi se menjao obim otkrivanja.

[0078] Kako se ovde koristi, konjunktivni izraz "i/ili" između višestruko navedenih elemenata podrazumeva se da obuhvata i pojedinačne i kombinovane opcije. Na primer, kada su dva elementa povezana sa "i/ili", prva opcija se odnosi na primenljivost prvog elementa bez drugog. Druga opcija se odnosi na primenljivost drugog elementa bez prvog. Treća opcija se odnosi na primenljivost prvog i drugog elementa zajedno. Podrazumeva se da bilo koja od ovih opcija spada u značenje, i stoga zadovoljava zahtev termina "i/ili" kako se ovde koristi. Istovremena primenjivost više od jedne od opcija takođe se podrazumeva da spada u značenje, i stoga zadovoljava zahtev termina „i/ili“.

[0079] Kao što se ovde koristi, termin "farmaceutski prihvatljiv nosač" se odnosi na netoksični materijal koji ne interferira sa efikasnošću kompozicije prema pronalasku ili biološkoj aktivnosti kompozicije prema pronalasku. "Farmaceutski prihvatljivi nosač" može obuhvatiti bilo koji ekscipijens, razblaživač, sredstvo za punjenje, so, pufer, stabilizator, rastvarač, ulje, lipid, vezikule koje sadrže lipid, mikrosferu, lipozomsku inkapsulaciju, ili drugi materijal koji je dobro poznat u oblasti tehnike za upotrebu u farmaceutskim formulacijama. Treba razumeti da će karakteristike farmaceutski prihvatljivog nosača zavisiti od načina davanja za određenu primenu. Prema određenim izvođenjima, u pogledu predmetnog prikaza, bilo koji farmaceutski prihvatljiv nosač koji je pogodan za upotrebu u vakcini može se koristiti u pronalasku. Pogodni ekscipijensi uključuju ali nisu ograničeni na sterilnu vodu, slani rastvor, dekstrozu, glicerol, etanol, ili slično i njihove kombinacije, kao i stabilizatori, npr. humani serumski albumin (HSA) ili drugi pogodni proteini i redukujući šećeri.

[0080] Kao što se ovde koristi, termin "efikasna količina" se odnosi na količinu aktivnog sastojka ili komponente koja izaziva željeni biološki ili medicinski odgovor kod subjekta. Efikasna količina može biti određena empirijski i na rutinski način, u odnosu na navedenu namenu. Na primer, in vitro testovi se mogu koristiti po potrebi da se pomogne u identifikaciji optimalnih doznih opsega.

[0081] Kao što se ovde koristi, "subjekt" ili "pacijent" označava bilo koju životinju, poželjno sisara, najpoželjnije čoveka, koji će biti ili je vakcinisan postupkom ili kompozicijom prema izvođenju pronalaska. Termin "sisar" kao što se ovde koristi, obuhvata bilo kog sisara. Primeri sisara sadrže, ali nisu ograničeni na, krave, konje, ovce, svinje, mačke, pse, miševe, pacove, zečeve, zamorce, majmune, ljude, itd., najpoželjnije čoveka. U određenim izvođenjima, subjekt je odrasli čovek. Kao što se ovde koristi, termin "odrasli čovek" se odnosi na čoveka koji ima 18 godina ili je stariji. U određenim izvođenjima, subjekt ima manje od 18 godina, npr.0-18 godina, npr.9-18 godina, ili 12-18 godina. U određenim izvođenjima, subjekt je humani subjekt od oko 18 do oko 50 godina. U određenim izvođenjima, subjekt je čovek od oko 50 do oko 100 godina, npr.50-85 godina, 60-80 godina, 50 godina ili stariji, 55 godina ili stariji, 60 godina ili stariji, 65 godina ili stariji, 70 godina ili stariji, 75 godina ili stariji, 80 godina ili stariji, 85 godina ili stariji. U nekim ovde navedenim izvođenjima subjekt nije stariji od 85 godina, nije stariji od 80 godina, nisu stariji od 75 godina. U određenim izvođenjima, humani subjekt je muškarac. U određenim izvođenjima, humani subjekt je žena.

[0082] Kao što se ovde koristi, "UTI" označava infekciju bubrega, bešike, uretera, ili uretre. Simptomi UTI mogu uključiti jedan ili više od osećaja pečenja tokom mokrenja, čest ili intenzivan nagon za mokrenjem, nepotpuno pražnjenje mokraćne bešike, urin koji ima nenormalan izgled i/ili miris povišenih belih krvnih zrnaca u urinu, umor ili drhtanje, osećaj dezorijentisanosti, groznica ili jeza, malaksalost, bol ili pritisak u leđima, donjem stomaku, karlici ili bešici. Međutim, kod nekih pacijenata simptomi mogu biti odsutni ili nespecifični. Posledice UTI mogu uključivati sistemske komplikacije kao što su invazivna bolest i sepsa. U određenim izvođenjima, UTI je klinički i/ili mikrobiološki dokumentovana, npr., potvrđeno bakterijskom kulturom urina i/ili molekularnim ili drugim metodama. U određenim izvođenjima, subjekt je čovek koji je ranije imao ili trenutno ima UTI. U određenim izvođenjima, subjekt je imao UTI u poslednje dve godine, poslednju godinu ili poslednjih 6 meseci. U određenim izvođenjima, subjekt je imao ili trenutno ima rekurentnu UTI (rUTI). „rUTI“ kako se ovde koristi označava najmanje dve infekcije u šest meseci ili najmanje tri UTI u jednoj godini.

[0083] U određenim izvođenjima, subjekt kome se daje polipeptid koji sadrži lektinski domen FimH iz pronalaska, kompleks FimCH iz pronalaska, ili kompozicija iz pronalaska, je pretrpeo najmanje dva UTIs u poslednje dve godine, u poslednjih godinu dana, ili u poslednjih šest meseci. U određenim izvođenjima, subjekt je patio od UTI sa pratećim komplikacijama. ‘UTI sa komplikacijama’ kao što je ovde korišćen označava UTI povezan sa stanjem, kao što su strukturalni ili funkcionalni abnormaliteti genitourinarnog trakta ili prisustvo osnovne bolesti. U određenim izvođenjima, UTI dovodi do povišenih brojeva belih krvnih ćelija u urinu ili drugih abnormalnosti urina. U određenim izvođenjima, subjekt sa UTI ima veliki broj bakterija u urinu, tj. urin nije sterilan, npr. broj bakterijskih ćelija je bar oko 10 ćelija/mL, bar oko 100 ćelija/mL, bar oko 10<3>ćelija/mL, npr. bar oko 10<4>ćelija/mL, npr. bar oko 10<5>ćelija/mL.

[0084] Kao što se ovde koristi, "imunološki odgovor" ili "imuni odgovor" na antigen ili kompoziciju se odnosi na razvoj kod subjekta humoralnog i/ili ćelijskog imunog odgovora na antigen ili na antigen koji se nalazi u kompoziciji.

[0085] Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, termin "bar" prethodeći nizu elemenata treba shvatiti da se odnosi na svaki element u serijama.

[0086] Reč "oko" ili "približno" kada se koristi zajedno sa brojčanom vrednosti (npr. oko 10) poželjno znači da vrednost može biti data vrednost (od 10) više ili manje 10%, poželjno više ili manje 5% vrednosti.

[0087] Termini "homologija", "identitet u sekvenci" i slično se ovde koriste naizmenično. Identitet sekvence je ovde definisan kao odnos između dve ili više sekvenci aminokiselina (polipeptida ili proteina) ili dve ili više sekvenci nukleinske kiseline (polinukleotida), kao što je određeno poređenjem sekvenci. U tehnici, "identitet" takođe označava stepen povezanosti sekvenci između sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina, u zavisnosti od slučaja, kao što je određeno poklapanjem između nizova takvih sekvenci. "Sličnost" između dve aminokiselinske sekvence se utvrđuje upoređivanjem

1

aminokiselinske sekvence i njenih konzerviranih aminokiselinskih supstituta jednog polipeptida sa sekvencom drugog polipeptida. „Identitet“ i „sličnost“ se mogu lako izračunati poznatim metodama.

[0088] "Identitet u sekvenci" i "sličnost sekvence" može se odrediti poravnanjem dve peptidne ili dve nukleotidne sekvence korišćenjem globalnih ili lokalnih algoritama poravnanja, u zavisnosti od dužine dve sekvence. Sekvence sličnih dužina poželjno je poravnati korišćenjem algoritma globalnog poravnanja (npr. Needleman Wunsch) koji poravnava sekvence optimalno po celoj dužini, dok se sekvence suštinski različitih dužina po mogućstvu poravnavaju korišćenjem algoritma lokalnog poravnanja (npr. Smith Waterman). Sekvence se tada mogu nazvati „u suštini identične“ ili „suštinski slične“ kada (kada su optimalno usklađene, na primer, programima GAP ili BESTFIT koristeći podrazumevane parametre) dele najmanje određeni minimalni procenat identiteta sekvence (kao što je definisano u nastavku). GAP koristi globalni algoritam poravnanja Needle-man i Wunsch da bi poravnao dve sekvence preko cele njihove dužine (puna dužina), maksimizirajući broj podudaranja i minimizirajući broj praznina (eng. gaps). Globalno poravnanje se prikladno koristi za određivanje identiteta sekvence kada dve sekvence imaju slične dužine. Generalno, koriste se GAP podrazumevani parametri, sa kaznom stvaranja praznina = 50 (nukleotidi) / 8 (proteini) i kaznom proširenja praznina = 3 (nukleotidi) / 2 (proteini). Za nukleotide korišćena podrazumevana matrica za bodovanje je nwsgapdna, a za proteine podrazumevana matrica za bodovanje je Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Poravnanja sekvenci i rezultati za procentualni identitet sekvence mogu se odrediti korišćenjem računarskih programa, kao što je GCG Wisconsin Package, verzija 10.3, dostupnog od Accelris Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 SAD, ili korišćenjem softvera otvorenog koda, kao što je program "igla" (koristeći globalni Needleman Wunsch algoritam) ili "voda" (koristeći lokalni Smith Waterman algoritam) u EmbossWIN verziji 2.10.0, koristeći iste parametre kao za GAP iznad, ili koristeći podrazumevana podešavanja (oba za 'iglu' i za 'vodu' i za proteine i za poravnanje DNK, podrazumevana kazna za otvaranje prazninne je 10.0, a podrazumevana kazna za proširenje praznine je 0.5 podrazumevane matrice bodovanja Blosum62 za proteine i DNAFull za DNK). Kada sekvence imaju značajno različite ukupne dužine, poželjna su lokalna poravnanja, kao što su ona koja koriste Smith Waterman algoritam.

[0089] Alternativno, procenat sličnosti ili sličnost može se odrediti pretraživanjem u javnim bazama podataka, korišćenjem algoritama kao što su FASTA, BLAST, itd. Prema tome, sekvence nukleinske kiseline i proteina ovog pronalaska mogu dalje da se koriste kao „sekvenca upita“ za izvođenje pretražujte javne baze podataka da biste, na primer, identifikovali druge članove porodice ili srodne sekvence. Takve pretrage se mogu izvršiti korišćenjem programa BLASTn i BLASTx (verzija 2.0) od Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST pretrage nukleotida se mogu izvršiti pomoću NBLAST programa, rezultat = 100, dužina reči = 12 da bi se dobile nukleotidne sekvence homologne molekulima nukleinske kiseline pronalaska. BLAST pretrage proteina se mogu izvršiti sa BLASTx programom, rezultat = 50, dužina reči = 3 da bi se dobile aminokiselinske sekvence homologne proteinskim molekulima pronalaska. Da bi se dobila “gapped” poravnanja u svrhu poređenja, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Kada se koriste programi BLAST i Gapped BLAST, mogu se koristiti podrazumevani parametri odgovarajućih programa (npr. BLASTx i BLASTn). Pogledajte početnu stranicu Nacionalnog centra za informacije o biotehnologiji na http://vvv.ncbi.nlm.nih.gov/.

1

OPIS SEKVENCI

[0090]

Tabela 1: Sekvenca

[0091] Drugi primeri sekvenci polipeptida FimH su opisani u US6,737,063, na primer bilo koja od SEQ ID NO: 23-45 ili 55 koja je tamo definisana.

1

PRIMERI

[0092] Sledeći primeri pronalaska su da dodatno ilustruju prirodu pronalaska. Trebalo bi razumeti da sledeći primeri ne ograničavaju pronalazak i da obim pronalaska treba da bude određen priloženim zahtevima.

Primer 1: Dizajnirane nove varijante - SPR podaci

[0093] Da bi se razumeo uticaj konformacionih promena FimH na efikasnost vakcine, dizajnirano je nekoliko varijanti FimH koje sadrže različite mutacije koje bi potencijalno mogle da zaključaju protein u statusu niskog afiniteta, sa ciljem da se identifikuje najbolja varijanta FimH koja indukuje funkcionalna antitela sposobna da smanje bakterijske adhezija i kolonizacija bešike.

Materijali i Postupci

Dizajn i ekspresija FimH

[0094] FimC i FimH su eksprimovani u pET-DUET vektoru korišćenjem heterolognih signalnih sekvenci za ekspresiju u periplazmi i C-terminalne His-oznake na FimC za afinitetno prečišćavanje korišćenjem imobilizovane metalne afinitetne hromatografije (IMAC). Ekspresija je indukovana korišćenjem IPTG i protein je ekstrahovan i prečišćen korišćenjem IMAC prečišćavanja (Talon).

SPR

[0095] Da bi se stekao detaljan uvid u afinitet vezivanja i kinetiku interakcije varijanti lektinskog domena FimH sa nheptil-α-D-manopiranozidnim ligandom, izvršena su merenja površinske plazmonske rezonance (SPR). Ukratko, sve varijante FimH su titrirane na površinu manozidnog liganda 5 (Rabbani S et al, J Biol. Chem., 2018, 293(5): 1835-1849) sa najvišim koncentracijama od 3 ili 10 µM u HBS-N (0.01 M HEPES, pH 7.4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% surfaktant P20). Proteini su ubrizgani od 0.12 do 10 µM ili 0.036 do 3.0 µM korišćenjem kinetičke injekcije jednog ciklusa.

Rezultati

[0096] Nekoliko varijanti FimH je dizajnirano sa ciljem pronalaženja varijante lektinskog domena FimH koja bi mogla da izazove funkcionalna inhibitorna antitela, čime se sprečava vezivanje bakterija za ćelije bešike, istovremeno pružajući široku pokrivenost. Da bi se optimizovale šanse za pronalaženje odgovarajuće varijante lektinskog domena FimH, izabrane su varijante sa drugačijim predviđenim načinom delovanja.

[0097] Prethodno opisani mutanti FimH_Q133K i FimH_R60P imaju mutaciju ostataka koji deluju na manozu u džepu za vezivanje. Predviđa se da će ove mutacije direktno uticati na interakciju vezivanja sa manozom. Ovi mutanti su uzeti kao pozitivne kontrole. Dvostruki mutant R60P_Q133K je uključen da bi se proverili potencijalno pojačani efekti. Pored toga, divlji tip (od engl. “wild type” WT) lektinskog domena FimH je uzet zajedno kao negativna kontrola. Nekoliko daljih mutanata FimH (uključujući one koji se ovde pominju kao "Mutant 1" i "Mutant 2") su kreirani i testirani kao kandidati u panelu sa ciljem dobijanja funkcionalnih inhibitornih antitela.

[0098] Prvo je procenjen afinitet varijanti za vezivanje za manozu korišćenjem SPR. Rezultati su predstavljeni u tabeli 2. Kao što se očekivalo, varijante lektinskog domena koje imaju mutacije u džepu za vezivanje manoze FimH (Q133K i R60P_Q133K) se uopšte nisu vezivale za manozid. Mutant R60P pokazao je nizak afinitet za manozid, kao što se očekivalo.

[0099] F142V je i dalje pokazivao određeni afinitet za manozid, što ukazuje da ova mutacija nije u potpunosti ukinula vezivanje za manozid. U varijantama lektinskog domena FimH koje sadrže

1

supstituciju F144V, vezivanje za manozid je potpuno ukinuto. Bilo je iznenađujuće videti da postoji razlika između F142V i F144V u vezivanju za manozid s obzirom na veoma blisku blizinu pozicija u sekvenci aminokiselina u poređenju sa mutacijom F144V.

Tabela 2: Merenja afiniteta varijanti FimH-LD na manozid

Primer 2: Sposobnost indukovanja inhibirajućih antitela

[0100] Pokazalo se da su antitela stvorena protiv FimH u konformaciji niskog afiniteta sposobna da blokiraju bakterijsku ćeliju i smanje formiranje kolonija u bešici. Da bi se procenila funkcionalnost antitela indukovanih različitim varijantama FimH zaključanih u konformaciji niskog afiniteta, korišćen je test inhibicije adhezije (AIA).

Materijali i postupci

Imunizacija

[0101] Vistar pacovi su primili 4 intramuskularne (i.m.) imunizacije u danu 0, 7, 10 i 18 sa gore opisanim varijantama FimH (60 µg svaka varijanta/doza) u kombinaciji sa ne-Frojndovim adjuvansom (Speedy rat 28-dnevni model, Eurogentec). Funkcionalnost serumskih antitela je ispitivana na dan 0 (pre imunizacije) i dan 28 (postimunizacija) pomoću testa inhibicije adhezije (AIA) kao što je opisano u nastavku.

Test inhibicije adhezije (AIA)

[0102] Bakterije (E. coli J96) su obeležene fluorescein izotiocijanatom (FITC). Obeležene bakterije su inkubirane sa urotelnim ćelijama bešike (5637 ćelijska linija) tokom 1 sata na 37°C. Procenat adherentnih bakterija meren je protočnom citometrijom. Za procenu inhibicije seruma, bakterije su prethodno inkubirane sa uzorcima seruma tokom 30 minuta na 37°C, a zatim pomešane sa 5637 ćelija.

ELISA

[0103] Ploče sa 96 bunarića su obložene preko noći sa 1 ug/mL FimH. Posle ispiranja, obloženi bunarići su inkubirani sa puferom za blokiranje [fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS) 2% albumin goveđeg seruma (BSA)] tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja sa PBS 0.05% Tween 20, serum se dodaje u ploče koje se zatim inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja, kozje anti-pacovsko antitelo konjugovano sa peroksidazom rena razblaženom u PBS sa 2% BSA je dodato u svaki bunarić 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle završnog ispiranja, reakcija se razvija sa supstratom

1

tetrametilbenzidina. Reakcija je zaustavljena sa 1M fosfornom kiselinom, a apsorbanca se meri na 450 nm.

Rezultati

[0104] Inhibitorni titri antitela u serumu su izračunati kao polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) na osnovu modela logističke regresije od 4 parametra. Pored toga, nivoi serumskih antitela indukovanih različitim varijantama FimH (ukupni IgG) su procenjeni ELISA testom. EC50 titri, definisani kao polovina maksimalne efektivne koncentracije, izračunati su na osnovu duplikata titracionih kriva od 12 koraka koje su analizirane sa 4PL nelinearnom regresionim modelom. Procena veličine inhibitornih antitela indukovanih svakom od varijanti FimH pokazala je da je FimH-23-10_F144V bio sposoban da indukuje najviše nivoe funkcionalnih antitela (Slika 1), što je bilo iznenađujuće i potpuno nepredvidivo pre ovog pronalaska. Na osnovu ovog rezultata, lektinski domen FimH koji sadrži supstituciju F144V izabran je kao vodeći kandidat.

Primer 3: Funkcionalnost antitela

[0105] Funkcionalnost antitela je procenjena interferometrijskom analizom biosloja (Octet, Pall Fortebio) korišćenjem prečišćenih IgG preparata da bi se procenilo da li su prisutna inhibitorna antitela. Ukratko, 4 različite koncentracije prečišćenog IgG (između 0-125 mikrograma/ml) su pomešane sa varijantom FimH kao što je ovde opisano. Posle mešanja, lektinski domen FimH proteina je procenjen na sposobnost vezivanja za biosenzor koji je prethodno imobilizovan monomanozidom obeleženim biotinom (koristeći hemiju biotin streptavidina). Vezivanje i disocijacija su mereni tokom 600 sekundi i odgovor (u nanometrima (nm)) tokom asocijacije je izračunat i upoređen. Ovo je urađeno sa manozidom u poređenju sa slepim kontrolama da bi se procenila sposobnost varijanti FimH da inhibiraju vezivanje FimH za manozu.

Rezultati

[0106] Promene u konformaciji džepa za vezivanje FimH (koje rezultira vezivanjem FimH sa niskim srednjim ili visokim afinitetom za manozide) igraju važnu ulogu u vezivanju bakterija za uroepitelne ćelije. Pretpostavlja se da bi antitela protiv konformacije koja ima nizak afinitet za manozu imala inhibitorni efekat na bakterijsku adheziju. Da bi se analizirao ovaj predlog i da bi se dalje razumeo uticaj konformacionih promena FimH na efikasnost vakcine, prečišćeni IgG iz seruma pacova imunizovanih varijantama lektinskog domena FimH su testirani na sposobnost da smanje vezivanje FimH za jednostavan manozid (monomanoza-biotin) pomoću bioslojne interferometrija (BLI).

[0107] BLI-skrin za prisustvo inhibirajućih antitela u serumima pacova imunizovanih varijantama lektinskog domena FimH pokazao je da je FimH-23-10_F144V bio sposoban da inhibira vezivanje proteina lektinskog domena FimH i visokog afiniteta za imobilizovani mono-manozid (podaci nisu prikazani).

Primer 4: Sposobnost vezivanja karakterisanih inhibitornih mAt-a 475 i 926

[0108] Mutacije u lektinskom domenu FimH mogu izazvati gubitak epitopa koji su ključni u izazivanju snažnog i funkcionalnog imunološkog odgovora kao što su epitopi koji su prisutni u vezivnom džepu FimH. Da bi se osiguralo da integritet džepa za vezivanje nije ugrožen u ovde opisanim mutacijama, procenjeno je vezivanje monoklonskih antitela (mAt) mAt475 i mAt926 za mutantne lektinske domene FimH. mAt475 i mAt926, prepoznaju preklapajuće, ali različite epitope na lektinskom domenu FimH unutar džepa FimH koji vezuje manozu (Kisiela et al.2013 & 2015).

2

Rezultati

[0109] Mutirani lektinski domeni FimH su prethodno opisani u WO02102974. WO02102974 opisuje opsežnu listu mogućih mutacija uglavnom nespecifikovanih mutacija (predloženo je 65 mogućih mesta mutacije u lektinskom domenu FimH koji je dugačak približno 159 aminokiselina). Međutim, WO02102974 ukazuje da su lektinski domeni FimH koji imaju aminokiselinsku supstituciju na poziciji 54, 133 ili 135 kandidati koji najviše obećavaju, FimH_K133K se eksplicitno pominje kao veoma poželjna opcija. Stoga je bilo prilično iznenađujuće da funkcionalni mAt475 nije prepoznao FimH-23-10_K133K, što ukazuje na probleme integriteta džepa za vezivanje (Tabela 3). Nasuprot tome, FimH-23-10_F144V su prepoznali i mAt475 i mAt926, što ukazuje da je džep za vezivanje ostao potpuno ne taknut (Tabela 3).

[0110] Dakle, u zaključku, od svih varijanti FimH, FimH_F144V je pokazao snažno smanjen afinitet za manozu (što ukazuje da je varijanta imala nizak afinitet za konformaciju manoze) i bila je sposobna da inhibira vezivanje proteina lektinskog domena FimH lektina niskog i visokog afiniteta na imobilisani mono-manozid. Osim toga, FimH_F144V je indukovao najviše nivoe funkcionalnih antitela od svih testiranih mutacija i pokazalo se da ima netaknut džep za vezivanje. Ovaj mutant je takođe bio proizveden u kompleksu FimCH. U zaključku, lektinski domen FimH sa valinom na poziciji 144 ima iznenađujuću kombinaciju karakteristika koje ga čine veoma pogodnim kao komponenta vakcine, tj. boljim od divljeg tipa na kojem su se do sada činili napori da se razvije vakcina zasnovana na FimH fokusirana i bolji od ostalih varijanti koje su ovde testirane.

SEQUENCE LISTING

<110> Janssen Pharmaceuticals, Inc.

Janssen Vaccines & Prevention B.V

<120> FimH mutant, compositions therewith and use thereof.

<130> CRU6033WOPCT1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 159

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FimHLD 23-10

<400> 1

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 20 25 30

Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45

Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60

Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80

Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95

Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110

Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125

Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140

Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly

145 150 155

<210> 2

<211> 279

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FimHt

<400> 2

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala Val Asn Val Gly Gln 20 25 30

Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45

Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60

Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80

Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95

Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110

Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125

Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140

Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Pro 165 170 175

Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 180 185 190

Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 195 200 205

Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 210 215 220

Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn Asn Thr Val Ser Leu 225 230 235 240

Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 245 250 255

Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 260 265 270

Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

275

<210> 3

<211> 205

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FimC

<400> 3

Gly Val Ala Leu Gly Ala Thr Arg Val Ile Tyr Pro Ala Gly Gln Lys 1 5 10 15

Gln Val Gln Leu Ala Val Thr Asn Asn Asp Glu Asn Ser Thr Tyr Leu 20 25 30

Ile Gln Ser Trp Val Glu Asn Ala Asp Gly Val Lys Asp Gly Arg Phe 35 40 45

Ile Val Thr Pro Pro Leu Phe Ala Met Lys Gly Lys Lys Glu Asn Thr 50 55 60

Leu Arg Ile Leu Asp Ala Thr Asn Asn Gln Leu Pro Gln Asp Arg Glu 65 70 75 80

Ser Leu Phe Trp Met Asn Val Lys Ala Ile Pro Ser Met Asp Lys Ser 85 90 95

Lys Leu Thr Glu Asn Thr Leu Gln Leu Ala Ile Ile Ser Arg Ile Lys 100 105 110

Leu Tyr Tyr Arg Pro Ala Lys Leu Ala Leu Pro Pro Asp Gln Ala Ala 115 120 125

Glu Lys Leu Arg Phe Arg Arg Ser Ala Asn Ser Leu Thr Leu Ile Asn 130 135 140

Pro Thr Pro Tyr Tyr Leu Thr Val Thr Glu Leu Asn Ala Gly Ala Arg 145 150 155 160

Val Leu Glu Asn Ala Leu Val Pro Pro Met Gly Glu Ser Thr Val Lys 165 170 175

Leu Pro Ser Asp Ala Gly Ser Asn Ile Thr Tyr Arg Thr Ile Asn Asp 180 185 190

Tyr Gly Ala Leu Thr Pro Lys Met Thr Gly Val Met Glu

195 200 205

<210> 4

<211> 300

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Example of FimH 23-10

<400> 4

Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser 1 5 10 15

Val Asn Ala Trp Ser Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile 20 25 30

Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Ala 35 40 45

Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe 50 55 60

Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln 65 70 75 80

Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val 85 90 95

Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro 100 105 110

Arg Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu 115 120 125

Tyr Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly 130 135 140

Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser 145 150 155 160

Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val 165 170 175

Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr 180 185 190

Leu Pro Asp Tyr Pro Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys 195 200 205

Ala Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr Thr Ala Asp 210 215 220

Ala Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln 225 230 235 240

Gly Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn 245 250 255

Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly 260 265 270

Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn 275 280 285

Val Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

290 295 300

<210> 5

<211> 300

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SEQ ID NO: 2 of US 6,500,434 - FimH

<400> 5

Met Lys Arg Val Ile Thr Leu Phe Ala Val Leu Leu Met Gly Trp Ser 1 5 10 15

Val Asn Ala Trp Ser Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile 20 25 30

Pro Ile Gly Gly Gly Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val 35 40 45

Val Asn Val Gly Gln Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe 50 55 60

Cys His Asn Asp Tyr Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln 65 70 75 80

Arg Gly Ser Ala Tyr Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val 85 90 95

Lys Tyr Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro 100 105 110

Arg Val Val Tyr Asn Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu 115 120 125

Tyr Leu Thr Pro Val Ser Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Lys Ala Gly 130 135 140

Ser Leu Ile Ala Val Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser 145 150 155 160

Asp Asp Phe Gln Phe Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val 165 170 175

Val Pro Thr Gly Gly Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr 180 185 190

Leu Pro Asp Tyr Arg Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys 195 200 205

Ala Lys Ser Gln Asn Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr His Ala Asp 210 215 220

Ala Gly Asn Ser Ile Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln 225 230 235 240

Gly Val Gly Val Gln Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Ala Asn 245 250 255

Asn Thr Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly 260 265 270

Leu Thr Ala Asn Tyr Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn 275 280 285

Val Gln Ser Ile Ile Gly Val Thr Phe Val Thr Gln

290 295 300

<210> 6

<211> 279

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FimH sequence with truncation at N-terminus

<400> 6

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 20 25 30

Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45

Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60

Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80

Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95

Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110

Ser Ser Ala Gly Gly Leu Val Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125

Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140

Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 145 150 155 160

Cys Asp Val Ser Ala Arg Asp Val Thr Val Thr Leu Pro Asp Tyr Arg 165 170 175

Gly Ser Val Pro Ile Pro Leu Thr Val Tyr Cys Ala Lys Ser Gln Asn 180 185 190

Leu Gly Tyr Tyr Leu Ser Gly Thr His Ala Asp Ala Gly Asn Ser Ile 195 200 205

Phe Thr Asn Thr Ala Ser Phe Ser Pro Ala Gln Gly Val Gly Val Gln 210 215 220

Leu Thr Arg Asn Gly Thr Ile Ile Pro Thr Asn Asn Thr Val Ser Leu 225 230 235 240

Gly Ala Val Gly Thr Ser Ala Val Ser Leu Gly Leu Thr Ala Asn Tyr 245 250 255

Ala Arg Thr Gly Gly Gln Val Thr Ala Gly Asn Val Gln Ser Ile Ile 260 265 270

Gly Val Thr Phe Val Tyr Gln

275

<210> 7

<211> 160

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FimHLD

<400> 7

Phe Ala Cys Lys Thr Ala Asn Gly Thr Ala Ile Pro Ile Gly Gly Gly 1 5 10 15

Ser Ala Asn Val Tyr Val Asn Leu Ala Pro Val Val Asn Val Gly Gln 20 25 30

Asn Leu Val Val Asp Leu Ser Thr Gln Ile Phe Cys His Asn Asp Tyr 35 40 45

Pro Glu Thr Ile Thr Asp Tyr Val Thr Leu Gln Arg Gly Ser Ala Tyr 50 55 60

Gly Gly Val Leu Ser Asn Phe Ser Gly Thr Val Lys Tyr Ser Gly Ser 65 70 75 80

Ser Tyr Pro Phe Pro Thr Thr Ser Glu Thr Pro Arg Val Val Tyr Asn 85 90 95

Ser Arg Thr Asp Lys Pro Trp Pro Val Ala Leu Tyr Leu Thr Pro Val 100 105 110

Ser Ser Ala Gly Gly Leu Val Ile Lys Ala Gly Ser Leu Ile Ala Val 115 120 125

Leu Ile Leu Arg Gln Thr Asn Asn Tyr Asn Ser Asp Asp Phe Gln Phe 130 135 140

Val Trp Asn Ile Tyr Ala Asn Asn Asp Val Val Val Pro Thr Gly Gly 145 150 155 160

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid koji sadrži lektinski domen FimH, gde lektinski domen FimH sadrži aminokiselinu odabranu iz grupe koju čine valin (V), izoleucin (I), leucin (L), glicin (G), metionin (M), i alanin (A) na poziciji koja odgovara poziciji 144 u SEQ ID NO: 1.

2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, gde polipeptid sadrži mutaciju i gde je mutacija F144V supstitucija.

3. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde lektinski domen FimH ima aminokiselinsku sekvencu koja je bar 90%, poželjno bar 95%, poželjnije bar 97% identična u sekvenci sa SEQ ID NO: 1, poželjno gde lektinski domen FimH sadrži SEQ ID NO: 1, i gde ostatak fenilalanina na poziciji 144 je supstituisan valinom.

4. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde polipeptid dalje sadrži domen pilina FimH.

5. Polipeptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je polipeptid FimH pune dužine koji je bar 90%, poželjno bar 95%, poželjnije bar 97% identičan u u sekvenci sa SEQ ID NO: 2, poželjno gde FimH sadrži SEQ ID NO: 2, i gde ostatak fenilalanina na poziciji 144 je supstituisan valinom.

6. Kompleks koji sadrži polipeptid prema patentnom zahtevu 4 ili 5 i FimC (FimCH).

7. Polinukleotid koji kodira polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5.

8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, kompleks prema patentnom zahtevu 6, ili polinukleotid prema patentnom zahtevu 7.

9. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8, gde kompozicija dalje sadrži adjuvans.

10. Polipeptid prema patentnim zahtevima 1-5, kompleks prema patentnom zahtevu 6, polinukleotid prema patentnom zahtevu 7 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8 ili 9, za upotrebu kao lek.

11. Polipeptid prema patentnim zahtevima 1-5, kompleks prema patentnom zahtevu 6, polinukleotid prema patentnom zahtevu 7 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8 ili 9, za upotrebu u indukovanju imunog odgovora protiv bakterije iz familije Enterobacteriaceae.

12. Polipeptid, polinukleotid, kompleks ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, gde je bakterija E.coli ili Klebsiella, poželjno E.coli.

13. Polipeptid prema patentnim zahtevima 1-5, kompleks prema patentnom zahtevu 6, polinukleotid prema patentnom zahtevu 7 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8 ili 9, za upotrebu u prevenciji ili tretmanu infekcije urinarnog trakta uzrokovane E. coli kod subjekta.

14. Polipeptid prema patentnim zahtevima 1-5, kompleks prema patentnom zahtevu 6, polinukleotid prema patentnom zahtevu 7 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8 ili 9, za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju stanja povezanog sa enterobacilusom kod subjekta kome je potrebno koji sadrži davanje subjektu efikasne količine polipeptida prema bilo kom od zahteva 1-5,

2

kompleksa prema patentnom zahtevu 6, polinukleotida prema patentnom zahtevu 7 ili farmaceutske kompozicije prema patentnom zahtevu 8 ili 9.

15. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 7.

16. Postupak za proizvodnju polinukleotida koji sadrži lektinski domen FimH, koji sadrži eksprimiranje polipeptida rekombinantne ćelije koja sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 7 i/ili vektor prema patentnom zahtevu 15, opciono postupak dalje obuhvata obnavljanje i prečišćavanje polipeptida opciono nakon čega sledi formulacija u farmaceutsku kompoziciju polipeptida.