RS66708B9 - Antitela koja se vezuju za egfr i cmet - Google Patents

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na oblast antitela. Konkretno, odnosi se na oblast terapeutskih antitela, uključujući humana antitela, za upotrebu u lečenju bolesti koje uključuju aberantne ćelije. Dalje, odnosi se na antitela koja se vezuju za EGFR i cMET, uključujući multispecifična antitela, i njihovu upotrebu u vezivanju za EGFR i cMET pozitivne ćelije, naročito tumorske ćelije.

[0002] Receptor za epidermalni faktor rasta (EGF) (EGFR) je receptor na površini ćelije, za članove ekstracelularnih proteinskih liganada iz familije epidermalnog faktora rasta (EGF-familije). EGFR je takođe poznat kao ErbB-1 receptor. Receptor je u prošlosti dobijao različita imena (EGFR; ERBB; ERBB1; HER1; PIG61; mENA). U predmetnom pronalasku će se ravnopravno i sinonimno koristiti imena ErbB-1, EGFR ili HER1 kod čoveka. EGFR je član familije ErbB receptora, podfamilije od četiri vrlo bliske receptorske tirozin kinaze: ErbB-1 (EGFR), ErbB-2 (HER2/c-neu; Her2), ErbB-3 (Her 3) i ErbB-4 (Her 4).

[0003] EGFR se nalazi na površini ćelije i može da se aktivira vezivanjem svojih specifičnih liganada, uključujući epidermalni faktor rasta i transformišući faktor rasta α (TGFα). Nakon aktivacije svojim ligandima, faktorima rasta, receptor može da pređe iz neaktivnog, uglavnom monomernog oblika, EGFR u aktivni homodimer. Osim toga što formira homodimere po vezivanju liganda, EGFR može da se spari sa drugim članom ErbB familije receptora, kao što je ErbB2, kako bi se formirao aktivni heterodimer. Dimeri mogu da se formiraju i u odsustvu vezivanja liganda, a po vezivanju liganda mogu da se formiraju klasteri aktiviranih EGFR receptora.

[0004] EGFR dimerizacija stimuliše intrinzičku aktivnost intracelularne protein-tirozin kinaze (PTK). Ova aktivnost indukuje nekoliko kaskada transdukcije signala koje dovode do proliferacije i diferencijacije ćelija. Kinazni domen EGFR može unakrsno da fosforiliše tirozinske ostatke drugih receptora sa kojima je u kompleksu, i može na taj način i sam da se aktivira.

[0005] Mutacije koje uključuju EGFR su identifikovane u nekoliko tipova kancera. One su ciljna kategorija jedne klase terapija protiv kancera ciji se broj povećava. Ove terapije uključuju inhibitore EGFR tirozin kinaze (EGFR-TKI inhibitore) kao što su gefitinib i erlotinib za kancer pluća, i antitela kao što su cetuksimab i panitumumab za kancer debelog creva i kancer glave i vrata.

[0006] Cetuksimab i panitumumab su monoklonska antitela koja inhibiraju receptor. Druge monoklonske vrste u kliničkom razvoju su zalutumumab, nimotuzumab i matuzumab.

Monoklonska antitela imaju za cilj da blokiraju aktivaciju receptora indukovanu ekstracelularnim ligandom, uglavnom tako što blokiraju vezivanje liganda za receptor. Sa blokiranim mestom vezivanja, molekuli koji indukuju signal mogu da se ne vezuju efikasno, i da zbog toga takođe ne aktiviraju nizvodni prenos signala. Aktivacija receptora indukovana ligandom takođe može da se inhibira stabilizacijom neaktivne konformacije receptora (matuzumab).

[0007] Do sada su terapije koje ciljano deluju na EGFR bile povezane sa razvojem rezistencije na tretman tokom vremena. Opisani su različiti mehanizmi rezistencije na EGFR-TKI inhibitore. Kod pacijenata sa uznapredovalim ne-sitnoćelijskim kancerom pluća (NSCLC) mehanizmi rezistencije uključuju pojavu sekundarnih mutacija (npr. T790M, C797S), aktivaciju alternativnih signalnih puteva (npr. Met, HGF, AXL, Hh, IGF-1R), aberantne nizvodne puteve (npr. AKT mutacije, gubitak PTEN), oštećenje EGFR-TKI posredovanog apoptotskog puta (npr. polimorfizam delecije 11/BIM, sličan BCL-2) i histološku transformaciju. Iako su neki mehanizmi rezistencije identifikovani, preostaje da se identifikuju i drugi. Slično tome, pacijenti sa kolorektalnim kancerom koji se leče EGFR antitelima takođe razvijaju rezistenciju tokom vremena. Ovo može da se desi usled pojave KRAS mutacija. Kod onih koji nemaju KRAS mutacije, amplifikacija MET protoonkogena može da bude povezana sa stečenom rezistencijom tokom anti-EGFR terapije (Bardelli et al., 2013; Cancer Discov. Jun;3(6):658‑73. doi: 10.1158/2159‑8290.CD‑12‑0558). Tumor može da bude rezistentan ab initio ili da razvije rezistenciju tokom lečenja. Rezistencija na EGFR-usmerenu terapiju je uočena kod mnogih EGFR-pozitivnih kancera i pokazala je da u stanju tehnike postoji potreba za efikasnijim EGFR tretmanima karcinoma koji poboljšavaju standard nege i superiorniji su u smislu sposobnosti da se reši problem rezistencije na EGFR-usmerenu terapiju.

[0008] Poremećena regulacija MET protoonkogena, receptorske tirozin kinaze (cMET) i faktora rasta hepatocita (HGF) je zabeležena kod niza različitih tumora. Aktivacija cMET-a vođena ligandom je primećena kod nekoliko karcinoma. Povišeni serumski i intratumorski HGF uočeni su kod kancera pluća, dojke i multiplog mijeloma (J. M. Siegfried et al., Ann Thorac Surg 66, 1915 (1998); P. C. Ma et al., Anticancer Res 23, 49 (2003); B. E. Elliott et al. Can J Physiol Pharmacol 80, 91 (2002); C. Seidel, et al, Med Oncol 15, 145 (1998)). Prekomerna ekspresija cMET, cMET amplifikacija ili mutacija je zabeležena kod različitih kancera kao što su kancer debelog creva, pluća, želuca i bubrega, i mogu da dovedu do ligand-nezavisne aktivacije receptora (C. Birchmeier et al, Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003); G. Maulik et al., Cytokine Growth Factor Rev 13, 41 (2002)). Ekspresija HGF je takođe povezana sa aktivacijom HGF/cMET signalnog puta i takođe je jedan od mehanizama spašavanja tumora pod dejstvom selekcije EGFR-usmerene terapije.

[0009] Receptor cMET se formira proteolitičkom obradom zajedničkog prekursora u disulfidno povezani α/β heterodimer sa jednim prolazom kroz membranu. Ekstracelularni deo cMET se sastoji od tri tipa domena. Nabor N-terminalnog regiona formira veliki semaforinski (Sema) domen, koji obuhvata celu α-subjedinicu i deo β-subjedinice. Pleksin-semaforinintegrin (PSI) domen sledi iza Sema domena i uključuje četiri disulfidne veze. Ovaj domen je povezan sa transmembranskim heliksom preko četiri imunoglobulin-pleksin transkripciona (IPT) domena, koji su povezani sa imunoglobulinu sličnim domenima. Intracelularno, cMET receptor sadrži katalitički domen tirozin kinaze omeđen karakterističnim jukstamembranskim i karboksi-terminalnim sekvencama (Organ and Tsao. Therapeutic advances in medical oncology 3.1_suppl (2011): S7-S19).

[0010] Ligand cMET, faktor rasta hepatocita (HGF; takođe poznat kao faktor rasipanja) i njegove izoforme dobijene splajsovanjem (NK1, NK2) su poznati ligandi cMET receptora. HGF je identifikovan 1991. godine kao potentan mitogen/morfogen. HGF/cMET signalni put igra važne uloge u razvoju i progresiji različitih kancera. Premećena regulacija i/ili hiperaktivacija HGF ili cMET kod humaih kancera, povezane su sa lošom prognozom. cMET može da se aktivira prekomernom ekspresijom, amplifikacijom ili mutacijom. Aktivacija može da pospeši razvoj, progresiju, invazivni rast i metastaze kancera. cMET može da se aktivira na HGF-povezan i HGF-nezavisan način. HGF-nezavisna aktivacija se javlja u slučajevima prekomerne ekspresije cMET. Veliko prisustvo cMET takođe može da pokrene (hetero)dimerizaciju i intraćelijsko prenošenje signala i u odsustvu liganda. Čini se da dodatni ligand ne utiče na funkcionisanje ovakvih ćelija sa prekomernom ekspresijom cMET. cMET amplifikacija je povezana sa prekomernom ekspresijom cMET i ulazi u upotrebu kao biomarker za podtipove tumora.

[0011] Ekspresija HGF je sveprisutna u celom telu, što pokazuje da je ovaj faktor rasta sistemski dostupan citokin, kao i da dolazi iz strome tumora. Pozitivna parakrina i/ili autokrina petlja cMET aktivacije može da dovede do dalje ekspresije cMET. HGF-specifično antitelo rilotumumab (AMG102) je razvijeno za kancer želuca. Kliničaka ispitivanja Faze I i Faze II su delovala perspektivno, ali je studija faze III sa cisplatinom kapecitabinom kao terapijom prve linije za kancer želuca (RILOMET-2) prekinuta nakon što je komitet za praćenje podataka obavio planiranu analizu bezbednosti studije 20070622.

[0012] Relevantnost cMET/HGF signalnih puteva za rezistenciju na EGFR-usmerene terapije usmerene na EGFR je stimulisala razvoj načina za rešavanje rezistencije. Do danas, pristupi na bazi antitela uključuju anti-HGF antitela; anti cMET ili cMET antitela i cMET/EGFR (pregled dat u publikaciji Lee et al., 2015; Immunotargets and Therapy 4: 35-44) nisu bili klinički efikasni. CMET antitela Onartuzumab (MetMab<™>) i Emibetuzumab (LY-2875358) su procenjena u kliničkim ispitivanjima faze II. Od njih, Onartuzumab se pokazao efikasnim protiv kolorektalnog kancera u kombinovanom tretmanu zajedno sa EGFR-inhibitorom erlotinibom. Ove rezultate, međutim, nije bilo moguće ponoviti u randomizovanom kliničkom ispitivanju faze III. MetMAb je monovalentno monoklonsko antitelo (mAb) protiv cMET, koje blokira vezivanje HGF za cMET i aktivaciju puteva koja sledi (Jin et al., 2008 Cancer Research Vol.68: pp 4360-68).

[0013] Predmetni pronalazak obezbeđuje nova bispecifična antitela koja sadrže prvi varijabilni domen koji može da se veže za ekstracelularni deo receptora za epidermalni faktor rasta (EGFR) i drugi varijabilni domen koji može da se veže za ekstracelularni deo receptorske tirozin kinaze cMET protoonkogena (cMET), čime rešava probleme sa anti-EGFR, cMET i HGF imunoterapijama.

[0014] Do sada su u stanju tehnike opisana neka bispecifična EGFR x cMET antitela. Castoldi R. et al. (2013) opisuju bispecifično EGFR x cMET antitelo označeno kao MetHer1 sa cMET-vezujućim mestom antitela 5D5 (ili MetMab) i EGFR-vezujućim mestom cetuksimaba. Bispecifično antitelo ima fiksnu stehiometriju vezivanja EGFR i cMET od 2:1 (videti dodatne slike)

US20140378664 opisuje, uz različita druga bispecifična antitela, i cMET x EGFR bispecifično antitelo. Kompletno bispecifično antitelo se proizvodi kao jedan protein koji se kasnije proteolitički cepa. Dva VH/VL domena se proizvode kao jednolančani Fv fragmenti. Vezivanje antitela indukuje degradaciju cMET i fosforilaciju Akt u ćelijskoj liniji kancera želuca. Moores et al (2016) opisuju bispecifično cMET x EGFR antitelo označeno kao JNJ-61186372, proizvedeno kontrolisanom razmenom Fab-kraka (cFAE), koje ima mutacije na pozicijama 405 i 409 prema EU numeraciji, koje moguće imaju potencijal za imunogenost. Pokazalo se da je JNJ-61186372 aktivano in vivo kada se koristi model ksenografta sa tumorskom ćelijskom linijom H1975 koja eksprimira cMET ligand HGF. Poznato je da ovaj model tumora zavisi od ADCC aktivnosti antitela (Ahmed et al., 2015). JNJ-61186372 ima zabeleženu neravnotežu afiniteta gde je afinitet za cMET približno 40x veći od afiniteta za EGFR (Moores et al. (2016)), a poznato je da anti-EGFR krak izveden iz zalutumumaba između ostalog izaziva reakciju u vezi sa infuzijom, poremećaje kože.

[0015] LY3164530 je bispecifično cMET x EGFR antitelo, koje sadrži EGFR vezujući domen cetuksimaba kao jednolančani Fv fragment fuzionisan sa varijabilnim domenom teškog lanca cMET-vezujućeg antitela LY2875358 (Emibetuzumab; Kim and Kim 2017). To je takozvano antitelo sa dualnim varijabilnim domenom koje sadrži dva vezujuća mesta za svaki od antigena. Nisu dati podaci o HGF inhibiciji antitela. Po svemu sudeći, antitelo se vezuje i internalizuje cMET i EGFR bez agonističke aktivnosti. Autori razmatraju različite cMET-, EGFR- i cMET x EGFR-usmerene terapije i izvode zaključak da do danas nijedan od ovih inhibitora nije pokazao značajnu efikasnost u kliničkim ispitivanjima.

[0016] Postoji, dakle, potreba za novim bispecifičnim cMET x EGFR antitelima, uključujući i antitela koja mogu da imaju superiorne karakteristike, kao što je ovde opisano.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0017] Predmetni pronalazak je onakav kako je definisan u priloženom setu patentnih zahteva.

[0018] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni domen koji može da se veže za ekstracelularni deo humanog receptora za epidermalni faktor rasta (EGFR) i drugi varijabilni domen koji može da se veže za ekstracelularni deo humanog MET protoonkogena, receptorske tirozin kinaze (cMET), pri čemu prvi varijablini domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNGNTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY; i gde drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYSMN; CDR2 sekvencom WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 sekvencom ETYYYDRGGYPFDP;

ili

pri čemu prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNANTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY i gde drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom TYSMN; CDR2 sekvencu WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 koji sadrži sekvencu ETYFYDRGGYPFDP; i

pri čemu prvi i drugi varijabilni domen dalje sadrže laki lanac koji sadrži CDR1 sekvencu QSISSY, CDR2 sekvencu AAS i CDR3 sekvencu QQSYSTP.

[0019] Bispecifično antitelo može da sadrži zajednički laki lanac. Prvi i drugi varijabilni domen poželjno sadrže isti ili suštinski isti (zajednički) varijabilni region lakog lanca. Navedeni varijabilni region zajedničkog lakog lanca može da bude onaj za koji je poznato da se dobro sparuje sa nizom različitih genskih segmenata humanog varijabilnog regiona kod kojih je došlo do rekombinacije. Poželjnije, navedeni zajednički laki lanac je varijabilni region koga kodira Vk genski segment klicine linije, poželjno genski segment varijabilnog regiona O12/IgVκ1-39*01. Poželjni varijabilni region lakog lanca obuhvata rearanžirani IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ili IgVκ1-39*01/IGJκ5*01. Laki lanac cMET-vezujućeg kraka i laki lanac EGFR-vezujućeg kraka je poželjno isti (zajednički) laki lanac. Zajednički laki lanac je poželjno rearanžirani kapa laki lanac IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ili IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 povezan sa konstantnim regionom humanog lakog lanca. Bispecifično antitelo može da bude humano antitelo. Bispecifično antitelo može da bude antitelo pune dužine. Može da ima jedan varijabilni domen koji može da veže EGFR i jedan varijabilni domen koji može da veže cMET. U jednom aspektu, varijabilni domen koji može da veže humani EGFR takođe može korisno da veže EGFR miša i/ili EGFR cinomolgusa. Varijabilni domen koji može da veže humani EGFR može da se veže za domen III humanog EGFR. Varijabilni domen koji može da veže cMET može da blokira vezivanje antitela 5D5 za cMET. Varijabilni domen koji može da veže cMET može da blokira vezivanje HGF za cMET. Kd antitela za cMET može da bude najmanje 10 puta manja od Kd antitela za EGFR. Aminokiseline na pozicijama 405 i 409 u jednom CH3 domenu mogu da budu iste kao i aminokiseline na odgovarajućim pozicijama u drugom CH3 domenu (EU numeracija).

[0020] Prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa

CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNGNTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY; ili varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNANTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY.

[0021] Drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa varijabilnim regionom teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYSMN; CDR2 sekvencom WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 sekvencom ETYYYDRGGYPFDP; ili varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom TYSMN; CDR2 sekvencom WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 koji sadrži sekvencu ETYFYDRGGYPFDP.

[0022] Opisana su bispecifična antitela kod kojih varijabilni region teškog lanca drugog varijabilnog domena sadrži aminokiselinsku sekvencu jedne od sekvenci SEQ ID NO: 13 ili 23 sa 0-10, poželjno 0-5, aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacije, pri čemu navedene aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihove kombinacije nisu u okviru CDR sekvenci za koje se traži zaštita.

[0023] U primerima izvođenja, prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNGNTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY i drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYSMN; CDR2 sekvencom WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 sekvencom ETYYYDRGGYPFDP.

[0024] U primerima izvođenja, prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNANTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY i drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom TYSMN; CDR2 sekvencom WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 koji sadrži sekvencu ETYFYDRGGYPFDP.

[0025] Pronalazak takođe obezbeđuje bispecifično antitelo za koje se ovde traži zaštita, za upotrebu u lečenju subjekta koji ima bolest koja uključuje aberantne ćelije, kao što je tumor.

[0026] Antitelo prema pronalasku, za koje se ovde traži zaštita, poželjno inhibira migraciju EBC1 ćelija izazvanu HGF u testu zarastanja rana. Poželjno, inhibicija je bolja nego za kombinaciju cetuksimaba i MetMab. Na primer, poželjno je da se postigne inhibicija sprečavanjem zatvaranja rane u prisustvu HGF sa ili bez EGF (HGF je prisutan sa 15 ng/ml, a EGF, kada je prisutan, prisutan je u količini od 12,5 ng/ml).

[0027] Antitelo prema pronalasku za koji se ovde traži zaštita inhibira HGF i EGF/HGF indukovani rast tumorskih ćelijskih linija PC-9 i HCC827 rezistentnih na EGFR TKI kada se koristi u kombinaciji sa inhibitorom tirozin kinaze (TKI). TKI je poželjno gefitinib.

[0028] Antitelo prema pronalasku za koji se ovde traži zaštita inhibira HGF indukovani rast ćelije koja reaguje na HGF, poželjno EGFR TKI rezistentne tumorske ćelijske linije PC-9 ili HCC827.

[0029] Antitelo prema pronalasku za koji se ovde traži zaštita inhibira EGF indukovani rast ćelija koje reaguju na EGF, bez izazivanja toksičnosti kao što su osip i dijareja povezane sa bivalentnim EGFR antitelima visokog afiniteta. Ovo čini antitelo idealno pogodnim za kombinaciju sa TKI koji imaju sopstveni profil toksičnosti.

[0030] Ovde je dalje opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži bispecifično antitelo za koje se traži zaštita.

[0031] Antitelo prema pronalasku može da bude za upotrebu u postupku lečenja tumora koji je rezistentan na lećenje inhibitorom EGFR tirozin kinaze, na primer rezistentan na erlotinib, gefitinib ili afatinib, analog erlotiniba, gefitiniba ili afatiniba ili kombinaviju jednog ili više respektivnih jedinjenja ili njihovih analoga.

[0032] Ovde je dalje opisan, ali ne kao deo priloženih patentnih zahteva, molekul nukleinske kiseline ili grupa molekula nukleinske kiseline koji sami ili zajedno kodiraju teški lanac(e) ili varijabilni region(e) teškog lanca ovde otkrivenog bispecifičnog antitela ili njegove varijante.

Takođe je obezbeđen molekul nukleinske kiseline ili grupa molekula nukleinske kiseline koji kodiraju ovde otkriveno antitelo.

[0033] U poželjnom primeru izvođenja teški lanac antitela za koje se traži zaštita, sadrži konstantni region IgG1 antitela, poželjno humanog IgG1 antitela. CH2 region navedenog IgG1 konstantnog regiona može, ali ne mora, da se izmeni inženjeringom tako da se ADCC i/ili CDC aktivnost antitela promeni. U poželjnom primeru izvođenja, navedena promena dovodi do poboljšane ADCC i/ili CDC aktivnosti. U poželjnom primeru izvođenja, CH3-region antitela je inženjeringom izmenjen tako da olakšava heterodimerizaciju teških lanaca koji sadrže prvi teški lanac koji vezuje EGFR i drugi teški lanac vezuje cMET.

[0034] Ovde je dalje opisana, ali ne kao deo priloženih patentnih zahteva, ćelija koja sadrži jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji sami ili zajedno kodiraju bispecifično antitelo ili njegovu varijantu, kako je ovde otkriveno. Takođe su obezbeđeni postupci za proizvodnju ovde otkrivenog bispecifičnog antitela ili njegove varijante, korišćenjem ćelije kako je opisano, poželjno zajedno sa sakupljanjem bispecifičnog antitela ili njegove varijante iz kulture ćelija.

[0035] Ovde je dalje opisan, ali ne kao deo priloženih patentnih zahteva, ćelijski sistem koji sadrži ovde otkriveno bispecifično antitelo ili njegovu varijantu.

[0036] Ovde je dalje opisana, ali ne kao deo priloženih patentnih zahteva, ćelija koja eksprimira bispecifično antitelo i/ili sadrži molekul(e) nukleinske kiseline koji kodira navedeno bispecifično antitelo.

[0037] Bispecifično antitelo za koje se ovde traži zaštita može dalje da sadrži oznaku, poželjno oznaku za in vivo vizualizaciju.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0038] EGFR je član porodice od četiri receptorske tirozin kinaze (RTK), pod nazivom Herili cErbB-1, -2, -3 i -4. EGFR ima ekstracelularni domen (ECD) koji se sastoji od četiri subdomena, od kojih su dva uključena u vezivanje liganda i od kojih je jedan uključen u homo-dimerizaciju i hetero-dimerizaciju Ferguson (2008). Referentni brojevi koji se koriste u ovom odeljku odnose se na numerisanje referenci na listi pod naslovom „citirano u specifikaciji“. EGFR integriše ekstracelularne signale od različitih liganada kako bi dao različite intracelularne odgovore (Yarden at al. 2001; i Jorrisen et al. 2003). Pretpostavlja se da EGFR ima veze sa nekoliko humanih epitelnih maligniteta, posebno kancere dojke, mokraćne bešike, nesitnoćelijskim kancerom pluća, debelog creva, glave i vrata, jajnika i mozga. Otkrivene su aktivirajuće mutacije u genu, kao i prekomerna ekspresija receptora i njegovih liganada, što dovodi do autokrinih aktivirajućih petlji (za pregled, videti Robertson et al. 2000). Ova RTK se stoga intenzivno koristi kao ciljni molekul za terapiju kancera. Razvijeni su i inhibitori čiji su molekuli mali, a koji ciljano deluju na RTK, i monoklonska antitela (mAbs) usmerena na ekstracelularne ligand-vezujuće domene, i do sada su pokazali nekoliko kliničkih uspeha, mada uglavnom za odabranu grupu pacijenata. Pristupni brojevi baze podataka za humani EGFR protein i gen koji ga kodira su (GenBank NM_005228.3). Druge identifikacione oznake baza podataka za gen i/ili protein su HGNC: 3236; Entrez Gene: 1956; Ensembl: ENSG00000146648; OMIM: 131550 i UniProtKB: P00533. Pristupni brojevi su prvenstveno dati kako bi bio obezbeđen dodatni metod identifikacije EGFR proteina kao ciljnog molekula, stvarna sekvenca EGFR proteina koja se vezuje za antitelo može da varira, na primer zbog mutacije u kodirajućem genu, kao što su mutacije koje se javljaju kod nekih kancera, ili slično tome. Kada se ovde poziva na EGFR, referenca se odnosi na humani EGFR, osim ako nije drugačije navedeno. Antigen-vezujuće mesto koje vezuje EGFR, vezuje EGFR i razne njegove varijante, kao što su varijante eksprimirane na nekim EGFR-pozitivnim tumorima.

[0039] Termin "EGFR ligand" kako se ovde koristi odnosi se na polipeptide koji vezuju i aktiviraju EGFR. Primeri EGFR liganada uključuju, ali nisu ograničeni na EGF, TGF-α, HB-EGF, amfiregulin, betacelulin i epiregulin (za pregled Olayioye MA et al.; EMBO J (2000) Vol 19: pp 3159-3167). Termin uključuje biološki aktivne fragmente i/ili varijante prirodnog polipeptida

[0040] cMET, koji se označava i kao tirozin-protein kinaza MET ili receptor faktora rasta hepatocita (HGFR), je protein koji je kod ljudi kodiran MET genom. Protein poseduje aktivnost tirozin kinaze. Primarni jednolančani prekursorski protein se post-translaciono cepa da bi se proizvele alfa i beta subjedinice, koje su disulfidno povezane da formiraju zreli receptor.

[0041] Aberantno aktivirani cMET može da indukuje rast tumora, formiranje novih krvnih sudova (angiogeneza) koji snabdevaju tumor hranljivim materijama i kancer se širi na druge organe (metastaze). cMET je deregulisan kod mnogih vrsta ljudskih maligniteta, uključujući kancer bubrega, jetre, želuca, dojke i mozga. cMET gen je poznat pod brojnim različitim nazivima kao što su MET protoonkogen, receptorska tirozin kinaza; receptor za faktor rasta hepatocita; tirozinska protein kinaza Met; receptor faktora rasipanja; protoonkogen C-Met; HGF/SF receptor; HGF receptor; SF receptor; EC 2.7.10.1; Met protoonkogen; EC 2.7.10; DFNB97; AUTS9; RCCP2; C-Met; MET; HGFR; eksterne Id oznake za cMET sz HGNC: 7029; Entrez Gene: 4233; Ensembl: ENSG00000105976; OMIM: 164860 and UniProtKB: P08581. Pristupni brojevi su prvenstveno dati da obezbede dodatni postupak za identifikaciju cMET proteina kao ciljnog molekula, stvarna sekvenca cMET proteina koji se vezuje za antitelo može da varira, na primer zbog mutacije u kodirajućem genu kao što su one koje se javljaju kod nekih kancera, ili slično. Kada se ovde cMET pominje u ovom tekstu, referenca se odnosi na humani cMET, osim ako nije drugačije navedeno. Antigen-vezujuće mesto koje vezuje cMET, vezuje cMET i niz njegovih različitih varijanti, kao što su varijante eksprimirane na nekim cMET-pozitivnim tumorima.

[0042] Antitelo tipično prepoznaje samo deo antigena. Antigen je tipično, ali ne nužno, protein. Mesto prepoznavanja ili vezivanja na antigenu, vezano antitelom, naziva se epitop, pri čemu epitop može da bude linearan ili konformacioni. Vezivanje antitela za antigen je tipično specifično. 'Specifičnost' antitela se odnosi na njegovu selektivnost za određeni epitop, dok se 'afinitet' odnosi na jačinu interakcije između antigen-vezujućeg antitela i epitopa koji ono vezuje.

[0043] Primeri antitela prema pronalasku koji su ovde otkriveni vezuju se za EGFR i cMET, poželjno humani EGFR i humani cMET. EGFR/cMET bispecifično antitelo prema pronalasku koje je ovde otkriveno vezuje se za EGFR i, pod inače identičnim uslovima, najmanje 100 puta manje za homologe receptore ErbB-2 i ErbB-4 iste vrste. EGFR/cMET bispecifično antitelo prema pronalasku kako je ovde otkriveno vezuje se za cMET i, pod inače identičnim uslovima, najmanje 100 puta manje za receptore ErbB-2 i ErbB-4 iste vrste. Uzimajući u obzir da su receptori receptori na površini ćelije, vezivanje se može proceniti na ćelijama koje eksprimiraju receptor(e). Bispecifično antitelo prema pronalasku, koje je ovde otkriveno, poželjno se vezuje za humani EGFR, EGFR cinomolgusa i/ili miša.

[0044] Antitelo koje vezuje EGFR i cMET može da veže i druge proteine ako takvi drugi proteini sadrže isti epitop. Dakle, termin "vezivanje" ne isključuje vezivanje antitela za drugi protein ili protein(e) koji sadrže isti epitop. Takvo vezivanje se obično naziva unakrsna reaktivnost. EGFR/cMET bispecifično antitelo se tipično ne vezuje za druge proteine osim EGFR i/ili cMET na membrani ćelija kod postnatalnog, poželjno odraslog čoveka. Antitelo prema pronalasku koje je ovde otkriveno je tipično sposobno da veže EGFR sa afinitetom vezivanja (tj. ravnotežnom konstantom disocijacije Kd) od najmanje 1x10e-6 M, kao što je detaljnije navedeno u nastavku.

[0045] Termin "antitelo", kako se ovde koristi, označava proteinski molekul koji poželjno pripada imunoglobulinskoj klasi proteina. Antitelo tipično sadrži dva varijabilna domena koji vezuju epitop na antigenu. Takvi domeni su izvedeni iz varijabilnog domena antitela ili sa njim dele homologiju sekvence. Bispecifično antitelo prema pronalasku, kako je ovde otkriveno, obuhvata dva varijabilna domena. Antitela za terapeutsku upotrebu su poželjno što je moguće bliža prirodnim antitelima subjekta koji se leči (na primer, humana antitela za humane subjekte). Vezivanje antitela može da se izrazi u smislu specifičnosti i afiniteta. Specifičnost određuje koji antigen ili njegov epitop je specifično vezan za vezujući domen. Tipično, antitela za terapeutske primene mogu imati afinitete do 1x10e-10 M ili više. Antitela, kao što su bispecifična antitela prema pronalasku koja su ovde otkrivena, poželjno sadrže konstantne domene (Fc deo) prirodnog antitela. Antitelo prema pronalasku kako je ovde otkriveno tipično je bispecifično antitelo pune dužine, poželjno humane IgG podklase. Poželjno, antitela prema predmetnom pronalasku su iz potklase humanog IgG1. Ova antitela prema pronalasku, kako su ovde otkrivena, mogu da imaju dobra ADCC svojstva, povoljan polu-život nakon in vivo administracije kod ljudi i postoji tehnologija inženjeringa CH3 koja može da obezbedi modifikovane teške lance koji prvenstveno formiraju heterodimere u odnosu na homodimere, prilikom eksprimiranja u klonalnim ćelijama. ADCC aktivnost antitela takođe može da se poboljša tehnikama koje su poznate stručnjacima u oblasti.

[0046] Antitelo prema pronalasku, kako je ovde otkriveno, je poželjno antitelo "pune dužine". Termin 'puna dužina' prema pronalasku kako je ovde otkriven, definisan je tako da obuhvata suštinski kompletno antitelo, koje, međutim, ne mora da ima sve funkcije intaktnog antitela. Da ne bi bilo sumnje, antitelo pune dužine sadrži dva teška i dva laka lanca. Svaki lanac sadrži konstantne (C) i varijabilne (V) regione, koji mogu da se podele na domene označene kao CH1, CH2, CH3, VH i CL, VL. Tipično, antitelo se vezuje za antigen preko varijabilnih domena sadržanih u Fab delu i nakon vezivanja može da stupi u interakciju sa molekulima i ćelijama imunog sistema preko konstantnih domena, uglavnom preko Fc dela. Antitela pune dužine prema pronalasku koji je ovde otkriven obuhvataju antitela u kojima mogu da budu prisutne mutacije koje obezbeđuju željene karakteristike. Antitela u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka deletirano, bez suštinske promene karakteristika specifičnosti i/ili afiniteta dobijenog antitela, obuhvaćena su terminom "antitelo pune dužine". Na primer, IgG antitelo u konstantnom regionu može da ima 1-20 insercija, delecija ili supstitucija aminokiselinskih ostataka, ili njihovih kombinacija.

[0047] Antitelo prema pronalasku, kako je ovde otkriveno, je poželjno bispecifično IgG antitelo, poželjno bispecifično IgG1 antitelo pune dužine i poželjnije humano IgG1 antitelo. IgG antitela pune dužine su poželjna zbog svog tipično povoljnog polu-života i želje da se ostane što bliže potpuno autologim (humanim) molekulima iz razloga imunogenosti. U nekim primerima izvođenja, antitelo prema pronalasku je IgG1 pune dužine, IgG2 pune dužine, IgG3 pune dužine ili IgG4 antitelo pune dužine.

[0048] Bispecifično antitelo za koje se ovde traži zaštita sadrži prvi varijabilni domen koji može da veže ekstracelularni deo EGFR i drugi varijabilni domen koji može da veže ekstracelularni deo cMET, pri čemu prvi varijabilni domen vezuje EGFR sa afinitetom manjim od cetuksimaba koji ima Kd od 0.39 nM (Kim et al 2008). Prvi varijabilni domen poželjno vezuje EGFR sa Kd koja je između 10e-6 M i 10e-9 M. Kd je poželjno između 10e-7 M i 10e-9 M, poželjno između 10e-8 M i 10e-9 M. Drugi varijabilni domen poželjno vezuje cMET sa Kd koja je 10e-7 M ili manja. Kd je poželjno između 10e-7 M i 10e-11 M. Drugi varijabilni domen poželjno ima veći afinitet za cMET nego što prvi varijabilni domen ima za EGFR. Drugim rečima, u ovom poželjnom primeru izvođenja, Kd antitela za cMET je manja od Kd antitela za EGFR. U poželjnom primeru izvođenja, Kd antitela za cMET je najmanje 5, a poželjno najmanje 10 x manja od Kd antitela za EGFR. U ovom primeru izvođenja, vrednosti za Kd za odgovarajuće antigene su poželjno kao što je naznačeno u ovom paragrafu. Ova pogodna neravnoteža afiniteta omogućava da se bispecifično antitelo prema pronalasku, koje je ovde otkriveno, pričvrsti na ćeliju, poželjno, vezivanjem za EGFR i da blokira vezivanje liganda HGF za cMET.

[0049] Varijabilni domen koji može da veže EGFR je poželjno varijabilni domen koji, u kontekstu bivalentnog monospecifičnog antitela, inhibira EGF indukovanu smrt A431 ćelija. Poželjno je da se inhibicija EGF indukovane ćelijske smrti meri pri koncentraciji od 10nM EGF i 10 µg/ml antitela. Inhibicija EGF indukovane ćelijske smrti može da se detektuje tako što se poredi broj ćelija sa i bez antitela nakon 3-7 dana gajenja A431 pod uslovima koji su permisivni (ali za EGF) za rast A431 ćelija. Bez vezivanja teorijom, veruje se da vezivanje antitela za EGFR blokira vezivanje EGF za EGFR. Varijabilni domen koji može da veže EGFR je poželjno varijabilni domen koji, u kontekstu bivalentnog monospecifičnog antitela, inhibira EGF indukovanu proliferaciju BxPC3 ili BxPC3-luc2 ćelija.

[0050] Antitelo prema pronalasku, kako je ovde otkriveno, poželjno inhibira HGF indukovanu migraciju EBC1 ćelija u testu zarastanja rana. Test zarastanja rana je poželjno test kao što je opisano u primerima. Inhibicija zarastanja rana je bolja od kombinacije cetuksimaba i MetMab. Inhibicija tipično nije 100%. Do zarastanje rana u izvesnoj meri dolazi i u prisustvu inhibitornog antitela.

[0051] Antitelo prema pronalasku, kako je ovde otkriveno, inhibira HGF i EGF/HGF indukovan rast tumorskih ćelijskih linija PC-9 i HCC827, rezistentnih na EGFR TKI, kada se koristi u kombinaciji sa TKI. TKI je poželjno gefitinib.

[0052] Antitelo prema pronalasku, kako je ovde otkriveno, inhibira HGF-indukovan rast HGF-responsivne ćelije, poželjno EGFR TKI-rezistentne tumorske ćelijske linije PC-9 ili HCC827.

[0053] Antitelo prema pronalasku, kako je ovde otkriveno, inhibira EGF-indukovan rast EGF-responsivne ćelije, bez indukovanja značajnih uobičajenih toksičnosti kao što su osip i dijareja, itd, koje su povezane sa bivalentnim EGFR antitelima visokog afiniteta. Ovo čini antitelo idealno pogodnim za kombinovanje sa TKI inhibitorima koji imaju sopstveni profil toksičnosti.

[0054] Indukovani rast se poželjno meri korišćenjem testa kao što je opisano u primerima. Inhibicija tipično nije 100%. Određeni rast se takođe javlja u kontekstu inhibitornog antitela. Varijabilni domen koji može da veže EGFR i koji sadrži aminokiselinsku sekvencu MF3370 ili njegovu varijantu kako je ovde naznačeno, poželjno se vezuje za EGFR domen III (videti tabelu 4 međunarodne patentne prijave PCT/NL2015/050124; WO2015/130172). Cetuksimab može da inhibira vezivanje varijabilnog domena za EGFR. Varijabilni domen vezuje epitop koji se razlikuje od epitopa koga prepoznaju cetuksimab i zalutumumab. Na primer, varijabilni domen se vezuje za mišji EGFR, dok cetuksimab i zalutumumab to ne čine, što ukazuje na to da jedan ili više ostataka koji se razlikuju između mišjeg i humanog EGFR domena III igraju ulogu u vezivanju cetuksimaba i zalutumumaba, ali ne i antitela prema pronalasku. Prednost bispecifičnog antitela prema pronalasku koje ima unakrsnu EGFR-reaktivnost kod ljudi, miša, cinomolgusa je u to što dozvoljava upotrebu studija ksenotransplantata sa modelima kancera kod ljudi, koji mogu da budu prediktivniji u pogledu efikasnosti i toksičnosti pošto se antitelo takođe vezuje za normalne ćelije miša koje imaju receptor, a istovremeno je sposobno za upotrebu u studijama toksičnosti. U jednom aspektu pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni domen koji može da veže ekstracelularni deo receptora humanog epidermalnog faktora rasta (EGFR) i drugi varijabilni domen koji može da veže ekstracelularni deo humanog MET protoonkogena, receptorske tirozin kinaze (cMET), pri čemu navedeni prvi varijabilni domen takođe može da veže EGFR miša, EGFR cinomolgusa, ili oba.

[0055] cMET varijabilni domen poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu MF4356 ili njenu varijantu, kako je ovde naznačeno, i poželjno blokira vezivanje antitela MetMab za cMET. Varijabilni domen poželjno blokira vezivanje liganda HGF za cMET. Varijabilni domen blokira vezivanje MetMab antitela za cMET kada je vezivanje MetMab za cMET pri pola maksimuma uslova vezivanja smanjeno za najmanje 40%, a poželjno najmanje 60% u prisustvu zasićene količine pomenutog varijabilnog domena. Varijabilni domen je poželjno obezbeđen u kontekstu bivalentnog monospecifičnog antitela. cMET varijabilni domen može poželjno da veže sema domen cMET. cMET varijabilni domen antitela prema pronalasku može da bude u kompeticiji sa 5D5 za vezivanje cMET ili da ne bude u kompeticiji sa objavljenim anti-cMET referentnim antitelima, kao što je 5D5. Videti tabelu 2.

[0056] Varijabilni domen antitela za koje se ovde traži zaštita može da veže EGFR (prvi varijabilni domen) i sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNGNTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY; ili CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNANTNYAQKLQG i CDR3 koja sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY.

[0057] Prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom MF3370 ili MF8233, kao što je prikazano na slici 7, koja ima najviše 10, poželjno 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 i poželjno, koja ima 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija, ili njihovih kombinacija, u odnosu na naznačenu sekvencu, pri čemu navedene aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihova kombinacija nisu unutar naznačenih CDR sekvenci. U poželjnom primeru izvođenja, prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom MF3370 ili MF8233 kao, što je prikazano na slici 7.

[0058] Varijabilni domen koji može da veže cMET (drugi varijabilni domen) poželjno sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvenci SEQ ID NO: 13 ili 23 sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacija, pri čemu navedene aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihova kombinacija nisu unutar naznačenih CDR sekvenci. Varijabilni region teškog lanca drugog varijabilnog domena poželjno sadrži aminokiselinsku sekvencu iz sekvenci SEQ ID NO: 13 ili SEQ ID NO: 23 sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacija, pri čemu navedene aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihova kombinacija nisu unutar naznačenih CDR sekvenci.

[0059] Prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNGNTNYAQKLQG i CDR3 koja sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY i gde drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYSMN; CDR2 sekvencom WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 sekvencom ETYYYDRGGYPFDP, pri čemu prvi i drugi varijabilni domen sadrže laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu CDR1 - QSISSY, CDR2 – AAS i CDR3 - QQSYSTP.

[0060] Bispecifično antitelo za koje se traži zaštita sadrži prvi varijabilni domen koji može da veže ekstracelularni deo EGFR i drugi varijabilni domen koji može da veže ekstracelularni deo cMET pri čemu prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNANTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY i gde drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom TYSMN; CDR2 sekvencom WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 koji sadrži sekvencu ETYFYDRGGYPFDP, pri čemu prvi i drugi varijabilni domen dalje sadrže laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu CDR1 - QSISSY, CDR2 - AAS, CDR3 - QQSYSTP, tj. CDR regione IGKV1-39 (prema IMGT).

[0061] CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca prvog i drugog varijabilnog domena, kako je ovde opisano, sadrže aminokiselinsku sekvencu CDR1 - QSISSY, CDR2 - AAS, CDR3 -QQSYSTP, tj. CDR regione IGKV1 39 (prema IMGT). U nekim primerima izvođenja bispecifičnog antitela kako je ovde opisano, prvi i drugi varijabilni domen sadrže zajednički laki lanac, poželjno laki lanac sa slike 9B.

[0062] Termin 'bispecifičan' (bs) u kontekstu predmetnog pronalaska znači da je antitelo sposobno da veže dve različite mete ili dva epitopa na istoj meti, pri čemu se jedan varijabilni domen antitela (kao što je gore definisano) vezuje za epitop na EGFR, a drugi varijabilni domen se vezuje za epitop na cMET. U zavisnosti od nivoa ekspresije, (sub-)ćelijske lokalizacije i stehiometrije dva antigena prepoznata od strane bispecifičnog antitela, oba Fab kraka antitela mogu ili ne moraju istovremeno da vežu svoj epitop. Jedan krak bispecifičnog antitela obično sadrži varijabilni domen jednog antitela, a drugi krak sadrži varijabilni domen drugog antitela (tj. jedan krak bispecifičnog antitela je formiran od jednog teškog lanca sparen sa jednim lakim lancem, dok je drugi krak formiran od drugog teškog lanca sparen sa lakim lancem). Dakle, stehiometrija poželjnog bispecifičnog antitela prema pronalasku koji je ovde otkriven je 1:1, vezivanje EGFR:cMET.

[0063] Varijabilni regioni teškog lanca bispecifičnog antitela prema pronalasku kako je ovde otkriveno se tipično razlikuju jedan od drugog, dok su varijabilni regioni lakog lanca poželjno isti. Bispecifično antitelo u kome su različiti varijabilni regioni teškog lanca povezani sa istim varijabilnim regionom lakog lanca takođe se naziva bispecifično antitelo sa zajedničkim varijabilnim regionom lakog lanca (cLcv). Poželjno je da konstantni region lakog lanca bude takođe isti. Takva bispecifična antitela se nazivaju da imaju zajednički laki lanac (cLc). Dalje je stoga obezbeđeno bispecifično antitelo prema pronalasku kako je ovde otkriveno, pri čemu oba kraka sadrže zajednički laki lanac.

[0064] Termin 'zajednički laki lanac' prema pronalasku koji je ovde otkriven odnosi se na dva ili više lakih lanaca u bispecifičnom antitelu koji mogu da budu identični ili da imaju neke razlike u sekvenci aminokiselina, dok specifičnost vezivanja antitela pune dužine nije pogođena. Na primer, moguće je u okviru definicije zajedničkih lakih lanaca kako se ovde koristi, pripremiti ili pronaći lake lance koji nisu identični, ali još uvek funkcionalno ekvivalentni, na primer, uvođenjem i testiranjem konzervativnih promena amino kiselina, promena aminokiselina u regionima koji ne ili samo delimično doprinose vezivanju sa sličnom specifičnošću kada su teški lanci spojeni. Izrazi 'zajednički laki lanac', 'zajednički LC', 'cLC', 'jednostruki laki lanac' sa ili bez dodatka termina 'rearanžirani' se svi ovde koriste ravnopravno i sinonimno. Izrazi 'zajednički varijabilni region lakog lanca', 'zajednički VL', 'zajednički LCv', 'cLCv', 'pojedinačni VL' sa ili bez dodatka termina 'rearanžirani' se svi ovde ravnopravno i sinonimno. Poželjan aspekt predmetnog pronalaska je da bispecifično antitelo ima zajednički laki lanac (varijabilni region) koji može da se kombinuje sa najmanje dva, a poželjno je sa više teških lanaca (varijabilnih regiona) različite specifičnosti vezivanja, kako bi se formirala antitela sa funkcionalnim domenima za vezivanje antigena (npr. WO2009/157771). Zajednički laki lanac (varijabilni region) je poželjno humani laki lanac (varijabilni region). Zajednički laki lanac (varijabilni region) poželjno ima sekvencu klicine linije. Poželjna sekvenca klicine linije je varijabilni region lakog lanca koji ima dobru termodinamičku stabilnost, prinos i rastvorljivost. Poželjni laki lanac klicine linije je O12. Zajednički laki lanac poželjno sadrži laki lanac kodiran segmentom humanog Vk gena klicine linije, i poželjno je rearanžirani humani kapa laki lanac klicine linije IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (slika 9A). Zajednički varijabilni region lakog lanca je poželjno varijabilni region rearanžiranog humanog kapa lakog lanca klicine linije, IgVk1-39*01/IGJk1*01. Zajednički laki lanac poželjno sadrži varijabilni region lakog lanca kao što je prikazano na slici 9B, ili 9D sa 0-5 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacije. Zajednički laki lanac poželjno dalje obuhvata konstantni region lakog lanca, poželjno konstantni region kapa lakog lanca. Nukleinska kiselina koja kodira zajednički laki lanac može da bude sa optimizovanim kodonima za ćelijski sistem koji se koristi za ekspresiju proteina uobičajenog lakog lanca. Kodirajuća nukleinska kiselina može da odstupa od sekvence nukleinskih kiselina klicine linije.

[0065] U poželjnom primeru izvođenja laki lanac sadrži region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu genskog segmenta O12/IgVκ1-39*01, kao što je prikazano na slici 9A, sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacija. Fraza "O12 laki lanac" će se koristiti u celoj specifikaciji kao skraćenica za "laki lanac koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu genskog segmenta 012/IgVκ1-39*01, kao što je prikazano na slici 9A, sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacija. IgVκ1-39 je skraćenica za imunoglobulinski varijabilni kapa 1-39 gen. Gen je takođe poznat kao imunoglobulinski kapa varijabilni 1-39; IGKV139; IGKV1-39; O12a ili 012. Eksterne identifikacione oznake za gen su HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371. Poželjna aminokiselinska sekvenca za IgVκ1-39 je data na slici 9E. Tu je naveden spisak sekvenci V-regiona. Slika 9B i 9D opisuju dve poželjne sekvence za IgVκ1-39 u kombinaciji sa J regionom. Spojene sekvence su označene kao IGKV1-39/jk1 i IGKV1-39/jk5; alternativna imena su IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ili IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (nomenklatura prema IMGT bazi podataka na internetu, na stranici imgt.org).

[0066] Poželjno je da O12 / IgVκ1-39*01 koji sadrži varijabilni region lakog lanca bude sekvenca klicine linije. Dalje je poželjno da IGJκ1*01 ili /IGJκ5*01 koji sadrži varijabilni region lakog lanca bude sekvenca klicine linije. U poželjnom primeru izvođenja, varijabilni regioni lakog lanca IGKV1-39/jk1 ili IGKV1-39/jk5 su sekvence klicine linije.

[0067] U poželjnom primeru izvođenja, varijabilni region lakog lanca sadrži klicinu liniju O12/ IgVκ1-39*01. U poželjnom primeru izvođenja varijabilni region lakog lanca sadrži kapa laki lanac IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ili IgVκ1-39*01/IGJκ5*01. U poželjnom primeru izvođenja, IgVκ1-39*01/IGJκ1*01. Varijabilni region lakog lanca poželjno sadrži kapa laki lanac klicine linije, IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 ili IgVκ1-39*01/IGJκ5*01, poželjno IgVκ1-39*01/IGJκ1*01.

[0068] Zrele B-ćelije koje proizvode antitelo sa lakim lancem 012 često proizvode laki lanac u kome se javila jedna ili više mutacija u odnosu na sekvencu klicine linije, tj. normalnu sekvencu u nelimfoidnim ćelijama organizma. Proces koji je odgovoran za ove mutacije često se označava kao somatska (hiper)mutacija. Dobijeni laki lanac se označava kao afinitetno sazreli laki lanac. Ovi laki lanci, kada su izvedeni iz sekvence klicine linije 012, su O12-izvedeni laki lanci. U ovoj specifikaciji, fraza „zajednički laki lanac“ će uključivati „lake lance izvedene iz uobičajenog lakog lanca, a fraza „O12 laki lanci“ će uključivati O12-izvedene lake lance. Mutacije koje su uvedene somatskom hipermutacijom takođe se mogu veštački uvesti u laboratoriji. U laboratoriji se mogu uvesti i druge mutacije bez uticaja na svojstva lakog lanca, u smislu vrste, ne nužno i u smislu količine. Laki lanac je najmanje O12 laki lanac ako sadrži sekvencu kao što je prikazano na slici 9A, slici 9B; slici 9D ili slici 9E, sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih insercija, delecija, supctitucija, adicija ili njihovih kombinacija. U poželjnom primeru izvođenja, O12 laki lanac je laki lanac koji sadrži sekvencu kao što je prikazana na slici 9A; 9B; 9D ili 9E, sa 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4 aminokiselinskih insercija, delecija, supctitucija, adicija ili njihovih kombinacija. U poželjnom primeru izvođenja, O12 laki lanac je laki lanac koji sadrži sekvencu kao što je prikazana na slici 9A; slici 9B; slici 9D ili slici 9E, sa 0-5, poželjno 0-4, poželjnije 0-3 aminokiselinske insercije, delecije, supctitucije, adicije ili njihove kombinacije. U poželjnom primeru izvođenja, O12 laki lanac je laki lanac koji sadrži sekvencu kao što je prikazana na slici 9A, slici 9B; slici 9D ili slici 9E, sa 0-2, poželjnije 0-1, najpoželjnije 0 aminokiselinskih insercija, delecija, supctitucija, adicija ili njihovih kombinacija. U poželjnom primeru izvođenja O12 laki lanac je laki lanac koji sadrži sekvencu kao što je prikazano na slici 9A ili slici 9B, sa pomenutim aminokiselinskim insercijama, delecijama, supstitucijama, adicijama ili njihovim kombinacijama. U poželjnom primeru izvođenja laki lanac sadrži sekvencu sa slike 9A. U poželjnom primeru izvođenja, varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu sa slike 9B. Pomenutih 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih supstitucija su poželjno konzervativne aminokiselinske supstitucije, insercije, delecije, supstitucije ili njihove kombinacije nisu u CDR1, CDR2 ili CDR3 regionu, i poželjno ni u FR4 regionu VL lanca.

[0069] Zajednički laki lanac može da ima kapa laki lanac. Konstantni deo uobičajenog lakog lanca prema pronalasku, kako je ovde otkriven, može da bude konstantni region kapa ili lambda lakog lanca. Poželjno je to konstantni region kapa lakog lanca, pri čemu je, poželjno, navedeni zajednički laki lanac laki lanac klicine linije, poželjno rearanžirani humani kapa laki lanac klicine linije koji sadrži genski segment IgVKl-39, najpoželjnije rearanžirani humani kapa laki lanac klicine linije IgVKI-39*01/IGJKI*9 (slika 9). Termini rearanžirani humani kapa laki lanac klicine linije IgVκ1‑39*01/IGJκ1*01, IGKV1-39/IGKJ1, huVκ1-39 laki lanac ili skraćeno huVκ1-39, ili jednostavno 1-39, koriste se ravnopravno i sinonimno u celoj patentnoj prijavi.

[0070] Ćelija koja proizvodi zajednički laki lanac može da proizvede, na primer, rearanžirani humani kapa laki lanac klicine linije IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 i laki lanac koji sadrži varijabilni region pomenutog lakog lanca fuzionisan sa lambda konstantnim regionom.

[0071] U poželjnom primeru izvođenja varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK or DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK sa 0-10, poželjno 0-5 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacija, pri čemu navedene aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihove kombinacije nisu u okviru naznačenih CDR sekvenci. U poželjnom primeru izvođenja varijabilni region lakog lanca sadrži 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4, poželjno 0-3, poželjno 0-2, poželjno 0-1 i poželjno 0 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija u odnosu na naznačenu aminokiselinsku sekvancu, ili njihove kombinacije, pri čemu navedene aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihove kombinacije nisu u okviru naznačenih CDR sekvenci. Kombinacija insercije, delecije, adicije ili supstitucije je kombinacija za koju se traži zaštita, ukoliko se poravnane sekvence ne razlikuju na više od 5 pozicija. U poželjnom primeru izvođenja varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK or DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK. U poželjnom primeru izvođenja varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK. U još jednom poželjnom primeru izvođenja varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK.

[0072] Aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihove kombinacije nisu u CDR3 regionu varijabilnog regiona lakog lanca, i nisu u CDR1 ili CDR2 regionu varijabilnog regiona lakog lanca. U poželjnom primeru izvođenja varijabilni region lakog lanca ne sadrži deleciju, adiciju ili inserciju u odnosu na naznačenu sekvencu. Aminokiselinska supstitucija je poželjno konzervativna aminokiselinska supstitucija. CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca antitela prema pronalasku sadrže redom aminokiselinsku sekvencu CDR1 - QSISSY, CDR2 -AAS, CDR3 - QQSYSTP, tj. CDR regione IGKV1-39 (prema IMGT).

[0073] Bispecifična antitela kao što su ovde opisana imaju jednu kombinaciju varijabilni region teškog lanca/varijabilni region lakog lanca (VH/VL) koja vezuje ekstracelularni deo EGFR i drugu VH/VL kombinaciju koja vezuje ekstracelularni cMET. U poželjnom primeru izvođenja VL u navedenoj prvoj VH/VL kombinaciji je sličan sa VL u navedenoj drugoj kombinaciji VH/VL. U poželjnijem primeru izvođenja, VL regioni u prvoj i drugoj VH/VL kombinaciji su identični. U poželjnom primeru izvođenja, bispecifično antitelo je antitelo pune dužine koje ima jednu kombinaciju teškog/lakog (H/L) lanca koja vezuje ekstracelularni deo EGFR i jednu kombinaciju H/L lanca koja vezuje ekstracelularni deo cMET. U poželjnom primeru izvođenja laki lanac u pomenutoj prvoj kombinaciji H/L lanca je sličan lakom lancu u navedenoj drugoj kombinaciji H/L lanca. U poželjnijem primeru izvođenja, laki lanci u prvoj i drugoj kombinaciji H/L lanca su identični.

[0074] Objavljeno je nekoliko metoda za proizvodnju ćelije-domaćina čija ekspresija favorizuje proizvodnju bispecifičnog antitela ili obrnuto, monospecifičnih antitela. Poželjno je da se ćelijska ekspresija molekula antitela favorizuje u pravcu proizvodnje bispecifičnog antitela u odnosu na proizvodnju odgovarajućih monospecifičnih antitela. To se tipično postiže modifikovanjem konstantnog regiona teških lanaca tako da oni favorizuju heterodimerizaciju (tj. dimerizaciju sa teškim lancem druge kombinacije teškog/lakog lanca) u odnosu na homodimerizaciju. U poželjnom primeru izvođenja bispecifično antitelo prema pronalasku kako je ovde otkriveno obuhvata dva različita imunoglobulinska teška lanca sa kompatibilnim heterodimerizacionim domenima. U stanju tehnike su opisani različiti kompatibilni heterodimerizacioni domeni. Kompatibilni heterodimerizacioni domeni su poželjno kompatibilni CH3 heterodimerizacioni domeni teškog lanca imunoglobulina. Kada se koriste CH3 domeni divljeg tipa, koekspresija dva različita teška lanca (A i B) i zajedničkog lakog lanca rezultiraće sa tri različite vrste antitela, AA, AB i BB. AA i BB su oznake za dva monospecifična, bivalentna antitela, a AB je oznaka za bispecifična antitela. Da bi se povećao procenat željenog bispecifičnog proizvoda (AB), može da se primeni CH3 inženjering, ili drugim rečima, mogu da se koriste teški lanci sa kompatibilnim heterodimerizacionim domenima, kao što je definisano u nastavku teksta. U stanju tehnike su opisani različiti načini na koje može da se postigne ova heterodimerizacija teških lanaca. Jedan od načina je generisanje bispecifičnih antitela ’dugme u rupu’.

[0075] Termin 'kompatibilni heterodimerizacioni domeni' kako se ovde koristi odnosi se na proteinske domene koji su inženjeringom izmenjeni tako da će inženjeringom izmenjeni domen A' preferencijalno da formira heterodimere sa inženjeringom izmenjenim domenom B' i obrnuto, homodimerizacija između A'-A' i B'-B' je umanjena.

[0076] U US13/866,747 (sada izdat kao US 9,248,181), US14/081,848 (sada izdat kao US 9,358,286) i PCT/NL2013/050294 (objavljen kao WO2013/157954) otkriveni su postupci i sredstva za proizvodnju bispecifičnih antitela pomoću kompatibilnih heterodimerizacionih domena. Ova sredstva i postupci se takođe mogu povoljno koristiti u predmetnom pronalasku. Konkretno, bispecifično antitelo prema pronalasku, kao što je ovde otkriveno, poželjno sadrži mutacije za proizvodnju značajne ekspresije bispecifičnih IgG molekula pune dužine u ćelijama-domaćinima. Poželjne mutacije su aminokiselinske supstitucije L351K i T366K u prvom CH3 domenu (teški lanac 'KK-varijante') i aminokiselinske supstitucije L351D i L368E u drugom domenu (teški lanac 'DE-varijante'), ili obrnuto. US 9,248,181 i US 9,358,286 patenti, kao i WO2013/157954 PCT prijava pokazuju da se DE-varijanta i KK-varijanta preferencijalno sparuju kako bi formirale heterodimere (takozvani 'DEKK' bispecifični molekuli). Homodimerizacija teških lanaca DE-varijante (DEDE homodimeri) ne favorizuje se zbog odbijanja između naelektrisanih ostataka na dodirnoj površini CH3-CH3 između identičnih teških lanaca.

[0077] Bispecifična antitela se mogu generisati (privremenom) transfekcijom plazmida koji kodiraju laki lanac i dva različita teška lanca koji imaju inženjeringom izmenjenje CH3 da obezbede efikasnu heterodimerizaciju i formiranje bispecifičnih antitela. Proizvodnja ovih lanaca u jednoj ćeliji dovodi do favorizovanja formiranja bispecifičnih antitela u odnosu na formiranje monospecifičnih antitela. Poželjne mutacije koje proizvode u suštini samo bispecifične IgG1 molekule pune dužine su supstitucije aminokiselina na pozicijama 351 i 366, npr. L351K i T366K (numeracija prema EU numeraciji) u prvom CH3 domenu (teški lanac 'KK-varijante') i supstitucije aminokiselina na pozicijama 351 i 368, npr. L351D i L368E, u drugom CH3 domenu (teški lanac 'DE-varijante'), ili obrnuto (videti, na primer, slike 10E i 10F).

[0078] U jednom primeru izvođenja, kombinacija teški lanac/laki lanac koja sadrži varijabilni domen koji vezuje EGFR, sadrži DE varijantu teškog lanca. U ovom primeru izvođenja, kombinacija teški lanac/laki lanac koja sadrži varijabilni domen koji može da se veže za cMET sadrži KK varijantu teškog lanca. KK varijanta teškog lanca koji vezuje cMET ne proizvodi homodimere, što uočeni efekat HGF-indukovane inhibicije aktivacije cMET pomoću bispecifičnog antitela čini veoma preciznim. Time se izbegava aktivacija cMET koja se ponekad uočava sa bivalentnim cMET antitelima (agonizam).

[0079] Fc region posreduje efektorske funkcije antitela, kao što je citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC), ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) i ćelijska fagocitoza zavisna od antitela (ADCP). U zavisnosti od primene terapeutskog antitela ili Fc fuzionog proteina, može da bude poželjno ili smanjenje ili povećanje efektorske funkcije. Smanjena efektorska funkcija može da bude poželjna kada imuni odgovor treba da se aktivira, pojača ili stimuliše, kao u nekim od primera izvođenja prema pronalasku, kako je ovde otkriveno. Antitela sa smanjenim efektorskim funkcijama mogu da se koriste, između ostalog, za usmereno delovanje na molekule ćelijske površine na imunskim ćelijama.

[0080] Antitela sa smanjenim efektorskim funkcijama su poželjno IgG antitela koja sadrže modifikovani CH2/donji zglobni region, na primer za smanjenje interakcije Fc-receptor ili za smanjenje C1q vezivanja. U nekim primerima izvođenja, antitelo prema pronalasku je IgG antitelo sa mutiranim CH2 i/ili donjim zglobnim domenom tako da je interakcija bispecifičnog IgG antitela sa Fc-gama receptorom smanjena. Antitelo koje sadrži mutirani CH2 region je poželjno IgG1 antitelo. Takav mutirani IgG1 CH2 i/ili donji zglobni domen poželjno sadrži amino supstituciju na poziciji 235 i/ili 236 (EU numeracija), poželjno L235G i/ili G236R supstituciju (slika 10D).

[0081] Antitelo prema pronalasku kako je ovde otkriveno poželjno ima efektorsku funkciju. Bispecifično antitelo prema pronalasku kako je ovde otkriveno poželjno sadrži citotoksičnost posredovanu ćelijama, zavisnu od antitela (ADCC). Antitelo može da bude izmenjeno inženjeringom kako bi se pojačala ADCC aktivnost (za pregled, videti Cancer Sci. 2009 Sep;100(9):1566-72. Engineered therapeutic antibodies with improved effector functions. Kubota T, Niwa R, Satoh M, Akinaga S, Shitara K, Hanai N). Postoji nekoliko in vitro metoda za određivanje efikasnosti antitela ili efektorskih ćelija pri izazivanju ADCC. Među njima su testovi oslobađanja hroma-51 [Cr51], testovi oslobađanja evropijuma [Eu] i testovi oslobađanja sumpora-35 [S35]. Obično se obeležena ciljna ćelijska linija koja eksprimira određeni antigen izložen na površini inkubira sa antitelom specifičnim za taj antigen. Posle ispiranja, efektorske ćelije koje eksprimiraju Fc receptor CD16 se koinkubiraju sa ciljnim ćelijama obeleženim antitelom. Liziranje ciljne ćelije se zatim meri oslobađanjem intracelularne oznake pomoću scintilacionog brojača ili spektrofotometrije. U jednom aspektu, bispecifično antitelo prema pronalasku, kako je ovde otkriveno, pokazuje ADCC aktivnost. U takvom aspektu bispecifično antitelo može da ima poboljšanu ADCC aktivnost. U drugom aspektu, bispecifično antitelo prema pronalasku kako je ovde otkriveno ne pokazuje ADCC aktivnost. U takvom aspektu, antitelo može da ima smanjenu ADCC usled jedne ili više CH2 mutacija kao što je opisano na drugom mestu u ovom tekstu i tehnikama poznatim u stanju tehnike. Jedna tehnika za povećanje ADCC antitela je afukozilacija. (Videti, na primer, Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481‑4489). Dalje je, dakle, obezbeđeno bispecifično antitelo prema pronalasku, kako je ovde otkriveno, koje je afukozilovano. Alternativno, ili dodatno, višestruke druge strategije se mogu koristiti za postizanje poboljšanja ADCC, na primer, uključujući glikoinženjering (Kyowa Hakko/Biowa, GlycArt (Roche) i Eureka Therapeutics) i mutagenezu, od kojih sve nastoje da poboljšaju vezivanje Fc za niskoafinitetni aktivirajući FcyRIIIa i da smanje niskoafinitetni inhibitorni Fcy/RIIb. Bispecifično antitelo prema pronalasku, kako je ovde otkriveno, poželjno je afukozilovano kako bi se poboljšala ADCC aktivnost. Bispecifično antitelo prema pronalasku kako je ovde otkriveno poželjno sadrži smanjenu količinu fukozilacije N-vezane strukture ugljenih hidrata u Fc regionu, kada se poredi sa istim antitelom proizvedenim u normalnoj CHO ćeliji.

[0082] Varijanta antitela ili bispecifičnog antitela kao što je ovde opisano obuhvata funkcionalni deo, derivat i/ili analog antitela ili bispecifičnog antitela. Varijanta održava specifičnost vezivanja (bispecifičnog) antitela. Funkcionalni deo, derivat i/ili analog održava specifičnost vezivanja (bispecifičnog) antitela. Specifičnost vezivanja je definisana kapacitetom da se veže ekstracelularni deo prvog membranskog proteina i drugog membranskog proteina kao što je ovde opisano.

[0083] Bispecifično antitelo prema pronalasku se poželjno koristi kod ljudi. Poželjno antitelo prema pronalasku je humano ili humanizovano antitelo. Konstantni region bispecifičnog antitela prema pronalasku je poželjno ljudski konstantni region. Konstantni region može da sadrži jednu ili više, poželjno ne više od 10, poželjno ne više od 5 razlika aminokiselina sa konstantnim regionom prirodnog humanog antitela. Poželjno je da je konstantni deo u potpunosti izveden iz prirodnog humanog antitela. Različita ovde proizvedena antitela su izvedena iz biblioteke varijabilnih domena humanog antitela. Kao takvi, ovi varijabilni domeni su humani. Jedinstveni CDR regioni mogu da budu dobijeni od ljudi, da budu sintetički ili dobijeni od drugog organizma. Varijabilni region se smatra humanizovanim varijabilnim regionom kada ima aminokiselinsku sekvencu koja je identična amino kiselinskoj sekvenci varijabilnog regiona prirodnog humanog antitela, ali za CDR regione. U takvim primerima izvođenja, VH varijabilnog domena antitela koje vezuje EGFR ili cMET pronalaska može da sadrži jednu ili više, poželjno ne više od 10, poželjno ne više od 5 razlika aminokiselina sa varijabilnim regionom prirodnog humanog antitela, ne računajući moguće razlike u amino kiselinskoj sekvenci CDR regiona. Varijabilni region lakog lanca EGFR-vezujućeg domena i/ili cMET-vezujućeg domena u antitelu prema pronalasku može da sadrži jednu ili više, poželjno ne više od 10, poželjno ne više od 5 razlika aminokiselina sa varijabilnim regionom prirodnog humanog antitela, ne računajući moguće razlike u amino kiselinskoj sekvenci CDR regiona. Laki lanac u antitelu prema pronalasku može da sadrži jednu ili više, poželjno ne više od 10, poželjno ne više od 5 razlika aminokiselina sa varijabilnim regionom prirodnog humanog antitela, ne računajući moguće razlike u amino kiselinskoj sekvenci CDR regiona. Takve mutacije se takođe javljaju u prirodi u kontekstu somatske hipermutacije.

[0084] Antitela mogu da budu izvedena iz različitih životinjskih vrsta, barem u pogledu varijabilnog regiona teškog lanca. Uobičajena je praksa da se humanizuju takvi npr. varijabilni regioni teškog lanca miša. Postoje različiti načini na koje se to može postići, među kojima su CDR-kalemljenje u varijabilni region teškog lanca čoveka sa 3D strukturom koja odgovara 3-D strukturi varijabilnog regiona teškog lanca miša; deimunizacija varijabilnog regiona teškog lanca miša, poželjno urađena uklanjanjem poznatih ili sumnjivih epitopa T- ili B-ćelija iz varijabilnog regiona teškog lanca miša. Uklanjanje se obično vrši zamenom jedne ili više aminokiselina u epitopu drugom (obično konzervativnom) amino kiselinom, tako da se sekvenca epitopa modifikuje tako da više nije epitop T- ili B-ćelija.

[0085] Deimunizovani varijabilni regioni teškog lanca miša su manje imunogeni kod ljudi od originalnog varijabilnog regiona teškog lanca miša. Poželjno, varijabilni region ili domen prema pronalasku, kako je ovde otkriven, se dalje humanizuje, na primer, fasetira. Korišćenjem tehnika fasetiranja, spoljašnji ostaci koje imuni sistem lako susreće, selektivno se zamenjuju humanim ostacima, kako bi se dobio hibridni molekul koji sadrži ili slabo imunogenu ili suštinski neimunogenu fasetiranu površinu. Životinja koja se koristi u pronalasku kako je ovde otkriveno je poželjno sisar, poželjnije primat, najpoželjnije čovek.

[0086] Bispecifično antitelo prema pronalasku, za koje se ovde traži zaštita, poželjno sadrži konstantni region humanog antitela. Prema razlikama u svojim konstantnim domenima teškog lanca, antitela su grupisana u pet klasa, ili izotipova: IgG, IgA, IgM, IgD i IgE. Ove klase ili izotipovi sadrže najmanje jedan od navedenih teških lanaca koji je označen odgovarajućim grčkim slovom. Poželjan primer izvođenja sadrži antitelo u kome je navedeni konstantni region izabran iz grupe IgG, IgA, IgM, IgD i IgE konstantnih regiona, poželjnije da navedeni konstantni region sadrži IgG konstantni region, tj. izabran iz grupe koja se sastoji od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Poželjno, navedeni konstantni region je IgG1 ili IgG4 konstantni region, poželjnije mutirani IgG1 konstantni region. Neke varijacije u konstantnom regionu IgG1 se javljaju u prirodi i/ili su dozvoljene bez promene imunoloških svojstava rezultujućeg antitela. Varijacije takođe mogu veštački da se uvedu, kako bi se na antitelo ili njegove delove postavile određene poželjne karakteristike. Takve karakteristike su, na primer, ovde opisane u kontekstu CH2 i CH3. U konstantnom regionu je tipično dozvoljeno između oko 1-10 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija ili njihovih kombinacija.

[0087] VH lanac sa slike 1, 7 ili 8 poželjno ima najviše 15, poželjno 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija ili njihovih kombinacija, u odnosu na VH lanac prikazan na slikama 1, 7 ili 8, poželjno ima 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 insercija, delecija, supstitucija ili njihovih kombinacija, u odnosu na VH lanac prikazan na slikama 1, 7 ili 8, poželjno 0, 1, 2, 3, 4 insercije, delecije, supstitucije ili njihove kombinacije, poželjno 0, 1, 2 ili 3 insercije, delecije, supstitucije ili njihove kombinacije, poželjnije 0; 1 ili 2 insercije, delecije, supstitucije ili njihove kombinacije, i poželjno 0 ili 1 inserciju, deleciju, supstituciju ili njihovu kombinaciju, u odnosu na VH lanac prikazan na slikama 1, 7 ili 8. Jedna ili više aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija ili njihovih kombinacija nisu u CDR1, CDR2 i CDR3 regionu VH lanca. One takođe poželjno nisu prisutne u Fr4 regionu. Aminokiselinska supstitucija je poželjno konzervativna aminokiselinska supstitucija.

[0088] Racionalne metode su evoluirale ka maksimalnom smanjenju sadržaja ne-humanih ostataka u humanom kontekstu. Dostupne su različite metode za uspešno presađivanje antigen-vezujućeg svojstva jednog antitela na drugo antitelo. Vezujuća svojstva antitela mogu da počivaju predominantno na tačnoj sekvenci CDR3 regiona, često podržanoj sekvencom CDR1 i CDR2 regiona u varijabilnom domenu, u kombinaciji sa odgovarajućom strukturom varijabilnog domena kao celine. Aminokiselinska sekvenca CDR regiona kao što je ovde prikazano određena je Kabat definicijom. Trenutno su dostupne različite metode za presađivanje CDR regiona na pogodan varijabilni domen drugog antitela. Pregled za neke od ovih metoda je dat u publikaciji J.C.Almagro and J. Fransson (2008) Frontiers inBioscience 13, 1619-1633. Pronalazak, dakle, dalje obezbeđuje humano ili humanizovano bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje vezuje EGFR i drugo antigen-vezujuće mesto koje vezuje cMET, pri čemu varijabilni domen koji sadrži EGFR-vezujuće mesto sadrži VH CDR3 sekvencu kao što je prikazano za MF3370 na slici 1, i pri čemu varijabilni domen koji sadrži cMET-vezujuće mesto sadrži VH CDR3 region kao što je prikazano za MF4356 na slici 1. VH varijabilni region koji sadrži EGFR-vezujuće mesto poželjno sadrži sekvencu CDR1 regiona, CDR2 regiona i CDR3 regiona VH lanca kao što je prikazano za MF3370 na slici 1. VH varijabilni region koji sadrži cMET-vezujuće mesto poželjno sadrži sekvencu CDR1 regiona, CDR2 regiona i CDR3 regiona VH lanca kao što je prikazano za MF4356 na slici 1. Presađivanje CDR takođe može da se koristi za proizvodnju VH lanca sa CDR regionima VH sa slike 1, ali koji imaju različit okvir. Različit okvir može da bude iz drugog humanog VH ili drugog sisara. Pronalazak stoga dalje obezbeđuje humano ili humanizovano bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje vezuje EGFR i drugo antigen-vezujuće mesto koje vezuje cMET, pri čemu varijabilni domen koji sadrži EGFR-vezujuće mesto sadrži VH CDR3 sekvencu kao što je prikazano za MF8233 na slici 7, i pri čemu varijabilni domen koji sadrži cMET-vezujuće mesto sadrži VH CDR3 region kao što je prikazano za MF8230 na slici 8. VH varijabilni region koji sadrži EGFR-vezujuće mesto poželjno sadrži sekvencu CDR1 regiona, CDR2 regiona i CDR3 regiona VH lanca kao što je prikazano za MF8233 na slici 7. VH varijabilni region koji sadrži cMET-vezujuće mesto poželjno sadrži sekvencu CDR1 regiona, CDR2 regiona i CDR3 regiona VH lanca kao što je prikazano za MF8230 na slici 8. Presađivanje CDR takođe može da se koristi za proizvodnju VH lanca sa CDR regionima VH sa slike 7 ili slike 8, ali koji imaju različit okvir. Različit okvir može da bude iz drugog humanog VH ili drugog sisara.

[0089] Pronalazak stoga dalje obezbeđuje humano ili humanizovano bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje vezuje EGFR i drugo antigen-vezujuće mesto koje vezuje cMET, pri čemu varijabilni domen koji sadrži EGFR-vezujuće mesto sadrži VH CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu kao što je prikazano za MF3370 na slici 1, i pri čemu varijabilni domen koji sadrži cMET-vezujuće mesto sadrži VH CDR1, CDR2 i CDR3 region kao što je prikazano za MF8230 na slici 8. Presađivanje CDR takođe može da se koristi za proizvodnju VH lanca sa CDR regionima VH sa slike 7 ili slike 8, ali koji imaju različit okvir. Različit okvir može da bude iz drugog humanog VH ili drugog sisara.

[0090] Pronalazak stoga dalje obezbeđuje humano ili humanizovano bispecifično antitelo koje sadrži prvo antigen-vezujuće mesto koje vezuje EGFR i drugo antigen-vezujuće mesto koje vezuje cMET, pri čemu varijabilni domen koji sadrži EGFR-vezujuće mesto sadrži VH CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencu kao što je prikazano za MF8233 na slici 7, i pri čemu varijabilni domen koji sadrži cMET-vezujuće mesto sadrži VH CDR1, CDR2 i CDR3 region kao što je prikazano za MF4356 na slici 8. Presađivanje CDR takođe može da se koristi za proizvodnju VH lanca sa CDR regionima VH sa slike 7 ili slike 8, ali koji imaju različit okvir. Različit okvir može da bude iz drugog humanog VH ili drugog sisara.

[0091] Pronalazak dalje obezbeđuje humano ili humanizovano bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni domen koji vezuje EGFR i drugi varijabilni domen koji vezuje cMET, pri čemu prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom MF3370 kao što je prikazano na slici 7, koja ima najviše 10, poželjno 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 i poželjno ima 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija ili njihovih kombinacija, i pri čemu drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu MF4356 prikazanu na slici 8 (SEQ ID NO: 23) sa 0-10, poželjno 0-5, aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacija, pri čemu navedene aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihove kombinacije nisu unutar naznačenih CDR sekvenci. Pronalazak dalje obezbeđuje humano ili humanizovano bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni domen koji vezuje EGFR i drugi varijabilni domen koji vezuje cMET, pri čemu prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom MF8233 kao što je prikazano na slici 7, koja ima najviše 10, poželjno 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 i poželjno ima 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija ili njihovih kombinacija, i pri čemu drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu MF8230 prikazanu na slici 8 (SEQ ID NO: 13) sa 0-10, poželjno 0-5, aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacija, pri čemu navedene aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihove kombinacije nisu unutar naznačenih CDR sekvenci.

[0092] Pomenutih najviše 15, poželjno 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 i poželjno 0, 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih supstitucija su poželjno konzervativne aminokiselinske supstitucije, insercije, delecije, supstitucije ili njihova kombinacija nisu u CDR1, CDR2 i CDR3 regionu VH lanca i poželjno nisu u FR4 regionu.

[0093] Dostupne su različite metode za proizvodnju bispecifičnih antitela. Jedna metoda uključuje ekspresiju dva različita teška lanca i dva različita laka lanca u ćeliji i sakupljanje antitela koje ćelija proizvodi. Antitelo proizvedeno na ovaj način će obično sadržati kolekciju antitela sa različitim kombinacijama teških i lakih lanaca, od kojih su neka željena bispecifična antitela. Bispecifično antitelo se može zatim da se prečisti iz kolekcije. Odnos bispecifičnih i drugih antitela koje ćelija proizvodi može da se poveća na različite načine. U poželjnom primeru izvođenja, odnos se povećava ekspresijom ne dva različita laka lanca, već zajedničkog lakog lanca u ćeliji. Kada je zajednički laki lanac eksprimiran sa dva različita teška lanca, odnos bispecifičnog antitela prema drugom antitelu koje proizvodi ćelija je značajno poboljšan u odnosu na ekspresiju dva različita laka lanca. Odnos bispecifičnog antitela koje proizvodi ćelija može dalje da se poboljša stimulisanjem međusobnog sparivanja dva različita teška lanca, u odnosu na sparivanje dva identična teška lanca. Opisani su postupci i sredstva za proizvodnju bispecifičnih antitela (iz jedne ćelije), pri čemu su obezbeđena sredstva koja favorizuju formiranje bispecifičnih antitela u odnosu na formiranje monospecifičnih antitela. Ovi postupci takođe mogu povoljno da se koriste za proizvodnju bispecifičnih antitela prema predmetnom pronalasku. Prema tome, u jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela iz jedne ćelije, pri čemu navedeno bispecifično antitelo sadrži dva CH3 domena koji su u stanju da formiraju dodirnu površinu, pri čemu navedeni postupak obuhvata obezbeđivanje u pomenutoj ćeliji a) prvog molekula nukleinske kiseline koji kodira teški lanac koji sadrži prvi CH3 domen, b) drugog molekula nukleinske kiseline koji kodira teški lanac koji sadrži drugi CH3 domen, pri čemu su navedeni molekuli obezbeđeni sa sredstvima za preferencijalno sparivanje navedenih teških lanaca koji sadrže prvi i drugi CH3 domen, pri čemu navedeni postupak dalje obuhvata korak gajenja navedene ćelije-domaćina i omogućavanja ekspresije navedena dva molekula nukleinske kiseline i sakupljanja navedenog bispecifičnog antitela iz kulture. Navedeni prvi i drugi molekul nukleinske kiseline mogu da budu deo istog molekula nukleinske kiseline, vektora ili vehikuluma za isporuku gena i mogu da budu integrisani na istom mestu genoma ćelije-domaćina. Alternativno, navedeni prvi i drugi molekuli nukleinske kiseline se odvojeno obezbeđuju za navedenu ćeliju.

[0094] Ovde je opisan postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela prema pronalasku, kako je ovde otkriveno, iz jedne ćelije, pri čemu navedeno bispecifično antitelo sadrži dva CH3 domena koji su u stanju da formiraju dodirnu površinu, pri čemu navedeni postupak obuhvata obezbeđivanje:

ćelije koja ima a) prvi molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac koji sadrži antigen-vezujuće mesto koje vezuje EGFR i koje sadrži 1. CH3 domen, i b) drugi molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac koji sadrži antigen-vezujuće mesto koje vezuje ErbB-3 i 2. CH3 domen, pri čemu su navedeni molekuli nukleinske kiseline obezbeđeni sa sredstvima za preferencijalno sparivanje navedenog 1. i 2. CH3 domena,

pri čemu navedeni postupak dalje obuhvata korak gajenja navedene ćelije i omogućavanje ekspresije proteina kodiranih od strane dva navedena molekula nukleinske kiseline i sakupljanje navedenog bispecifičnog IgG antitela iz kulture. U posebno poželjnom primeru izvođenja, navedena ćelija takođe ima treći molekul nukleinske kiseline koji kodira zajednički laki lanac. Navedeni prvi, drugi i treći molekul nukleinske kiseline mogu da budu deo istog molekula nukleinske kiseline, vektora ili vehikuluma za isporuku gena i mogu da budu integrisani na istom mestu genoma ćelije-domaćina. Alternativno, navedeni prvi, drugi i treći molekul nukleinske kiseline su odvojeno obezbeđeni za navedenu ćeliju. Poželjni zajedniči laki lanac je zasnovan na 012, poželjno je to rearanžirani humani kapa laki lanac IgVκ1 39*01/IGJκ1*01, kao što je ranije u tekstu opisano. Sredstva za preferencijalno sparivanje navedenog 1. i navedenog 2. CH3 domena su poželjno odgovarajuće mutacije u CH3 domenu kodirajućih regiona teškog lanca. Poželjne mutacije za preferencijalnu proizvodnju bispecifičnih antitela su aminokiselinske supstitucije L351K i T366K (EU numeracija) u prvom CH3 domenu i aminokiselinske supstitucije L351D i L368E u drugom CH3 domenu, ili obrnuto. Dalje je ovde, dakle, obezbeđen postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela za koje se traži zaštita, pri čemu navedeni prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske supstitucije L351K i T366K (EU numeracija) i pri čemu navedeni drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske supstitucije L351D i L368E, pri čemu navedeni postupak dalje obuhvata korak gajenja navedene ćelije i omogućavanje ekspresije proteina kodiranih navedenim molekulima nukleinske kiseline, i sakupljanja navedenog bispecifičnog antitela iz kulture. Takođe je obezbeđen postupak za proizvodnju bispecifičnog antitela, pri čemu navedeni prvi CH3 domen sadrži aminokiselinske supstitucije L351D i L368E (EU numeracija) i pri čemu navedeni drugi CH3 domen sadrži aminokiselinske supstitucije L351K i T366K, pri čemu navedeni postupak dalje obuhvata korak gajenja navedene ćelije i omogućavanje ekspresije navedenih molekula nukleinske kiseline i sakupljanje navedenog bispecifičnog antitela iz kulture. Antitela koja mogu da se proizvedu ovim postupcima su takođe deo predmetnog pronalaska. CH3 heterodimerizacioni domeni su poželjno IgG1 heterodimerizacioni domeni. Konstantni regioni teškog lanca koji sadrže CH3 heterodimerizacione domene su poželjno IgG1 konstantni regioni.

[0095] Dalje je opisan molekul nukleinske kiseline koji kodira varijabilni region teškog lanca antitela. Molekul nukleinske kiseline (tipično in vitro, izolovani ili rekombinantni molekul nukleinske kiseline) poželjno kodira varijabilni region teškog lanca kao što je prikazano na slici 7 ili slici 8, ili varijabilni region teškog lanca, kao što je prikazano na slici 7 ili slici 8, koji ima 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija ili njihovih kombinacija. U poželjnom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline sadrži sekvencu nukleinske kiseline sa optimizovanim kodonima, koja kodira aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano na slici 7 ili slici 8. Optimizacija kodona je izvedena za vrstu i/ili ćelijski tip ćelije koja proizvodi antitelo. Na primer, za proizvodnju u CHO, sekvenca nukleinske kiseline molekula ima kodone optimizovane za ćelije kineskog hrčka. Dalje je opisan molekul nukleinske kiseline koji kodira teški lanac sa slike 7 ili slike 8.

[0096] Molekul nukleinske kiseline, kako je ovde otkriven, je tipično ali ne i isključivo, ribonukleinska kiselina (RNK) ili deozksiribonukleinska kiselina (DNK). Stručnjacima u oblasti su dostupne i alternativne nukleinske kiseline. Nukleinska kiselina kako je ovde otkrivena je na primer sadržana u ćeliji. Kada je navedena nukleinska kiselina eksprimirana u navedenoj ćeliji, navedena ćelija može da proizvede antitelo prema pronalasku. Dakle, otkrivanje uključuje ćeliju koja sadrži antitelo prema pronalasku i/ili nukleinsku kiselinu kao što je ovde otkriveno. Navedena ćelija je poželjno životinjska ćelija, poželjnije sisarska ćelija, poželjnije ćelija primata, najpoželjnije ljudska ćelija. Pogodna ćelija je svaka ćelija sposobna da sadrži i, poželjno, proizvodi antitelo za koje se se ovde traži zaštita i/ili nukleinsku kiselinu kako je ovde otkrivena.

[0097] Dalje je opisana ćelija koja sadrži antitelo za koje se ovde traži zaštita. Poželjno je da navedena ćelija (tipično in vitro, izolovana ili rekombinantna ćelija) proizvodi navedeno antitelo. Navedena ćelija takođe može da bude uskladištena ćelija koja je u stanju da proizvede navedeno antitelo kada se izvadi iz skladišta i gaji. U poželjnom primeru izvođenja, navedena ćelija je hibridoma ćelija, ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO), NS0 ćelija ili PERC6<™>ćelija. U posebno poželjnom primeru izvođenja navedena ćelija je CHO ćelija. Dalje je obezbeđena ćelijska kultura koja sadrži ćeliju kao što je ovde otkrivena. Razne institucije i kompanije razvile su ćelijske linije za proizvodnju antitela u velikim količinama, na primer za kliničku upotrebu. Neograničavajući primeri takvih ćelijskih linija su CHO ćelije, NS0 ćelije ili PER.C6<™>ćelije. Ove ćelije se takođe koriste u druge svrhe kao što je proizvodnja proteina. Ćelijske linije razvijene za industrijsku proizvodnju proteina i antitela se ovde dalje označavaju kao industrijske ćelijske linije. Tako, poželjan primer izvođenja uključuje upotrebu ćelijske linije razvijene za proizvodnju antitela u velikim količinama, za proizvodnju antitela za koje se se ovde traži zaštita, uključujući poželjno ćeliju za proizvodnju antitela koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira VH, VL i/ili teški lanac MF3370 i MF4356, kao što je prikazano slici 7 ili na slici 8.

[0098] Ovde je dalje opisan postupak za proizvodnju antitela koji obuhvata gajenje ćelije kako je ovde otkriveno i sakupljanje pomenutog antitela iz pomenute kulture. Poželjno je da se navedena ćelija uzgaja u medijumu bez seruma. Poželjno je da je navedena ćelija prilagođena za rast suspenzije. Dalje je obezbeđeno antitelo koje se može dobiti postupkom za proizvodnju antitela za koje se ovde traži zaštita. Antitelo je poželjno prečišćeno iz medijuma kulture. Poželjno je pomenuto antitelo prečišćeno afinitetom.

[0099] Ćelija kako je ovde otkrivena je na primer hibridomska ćelijska linija, CHO ćelija, 293F ćelija, NS0 ćelija ili drugi tip ćelije poznat po svojoj podobnosti za proizvodnju antitela u kliničke svrhe. U posebno poželjnom primeru izvođenja navedena ćelija je ljudska ćelija. Poželjno, ćelija koja je transformisana adenovirusom E1 regionom ili njegovim funkcionalnim ekvivalentom. Poželjan primer takve ćelijske linije je ćelijska linija PER.C6TM ili njen ekvivalent. U posebno poželjnom primeru izvođenja, navedena ćelija je CHO ćelija ili njena varijanta. Poželjno, varijanta koja koristi vektorski sistem glutamin sintetaze (GS) za ekspresiju antitela.

[0100] Antitela za koja se ovde traži zaštita mogu se proizvesti na nivoima > 50 mg/L nakon privremene transfekcije ćelija 293F u suspenziji. Bispecifična antitela se mogu prečistiti do čistoće veće od 98% sa prinosima > 70%. Studije analitičke karakterizacije pokazuju profile bispecifičnih IgG1 antitela koji su uporedivi sa bivalentnim monospecifičnim IgG1. U smislu funkcionalne aktivnosti, bispecifično antitelo za koje se ovde traži zaštita može da prikazuje superiornu potenciju u poređenju sa cetuksimabom in vitro i in vivo.

[0101] Ovde je dalje opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku, kako je ovde otkriveno. Farmaceutska kompozicija poželjno sadrži poželjno farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač.

[0102] Antitelo može da sadrži oznaku, poželjno oznaku za in vivo vizualizaciju. Takva oznaka obično nije neophodna za terapeutske primene. Na primer, u okolnostima kada se postavlja dijagnoza, oznaka može da bude od pomoći. Na primer, za vizualizaciju ciljnih ćelija u telu. Pogodne su različite oznake i mnoge su dobro poznate u stanju tehnike. U poželjnom primeru izvođenja, oznaka je radioaktivna oznaka za detekciju. U drugom poželjnom primeru izvođenja, oznaka je infracrvena oznaka. Poželjno, infracrvena oznaka je pogodna za in vivo vizualizaciju. Stručnjaku u oblasti su dostupne različite infracrvene oznake. Poželjne infracrvene oznake su na primer, IRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; IRDye 700 fosforamidit; IRDye 800 fosforamidit (LI-COR USA; 4647 Superior Street; Lincoln, Nebraska).

[0103] Pronalazak dalje obezbeđuje antitelo za koje se ovde traži zaštita, za upotrebu u lečenju subjekta koji ima tumor. Tumor je poželjno EGFR-, cMET- ili EGFR/cMET-pozitivan tumor. Pre početka pomenutog lečenja, postupak poželjno dalje obuhvata određivanje da li navedeni subjekt ima takav EGFR-, cMET- ili EGFR/cMET-pozitivan tumor. Pronalazak dalje obezbeđuje antitelo prema za koje se traži zaštita ili farmaceutsku kompoziciju, kako je ovde otkriveno, za upotrebu u lečenju subjekta koji ima ili je u riziku da dobije EGFR-, cMET- ili EGFR/cMET-pozitivan tumor.

[0104] Da bi ustanovio da li je tumor pozitivan na EGFR, stručnjak može na primer da odredi amplifikaciju EGFR i/ili imunohistohemijsko bojenje. Najmanje 10% tumorskih ćelija u biopsiji treba da bude pozitivno. Biopsija takođe može da sadrži 20%, 30% 40% 50% 60% 70% ili više pozitivnih ćelija. Da bi se utvrdilo da li je tumor pozitivan na cMET, stručnjak može na primer da odredi cMET amplifikacija i/ili bojenje u imunohistohemiji. Najmanje 10% tumorskih ćelija u biopsiji treba da bude pozitivno. Biopsija takođe može da sadrži 20%, 30% 40% 50% 60% 70% ili više pozitivnih ćelija.

[0105] Antitela za koja se ovde traži zaštita, mogu da se primene na širok spektar kancera, kao što je kancer dojke, kancer debelog creva, kancer pankreasa, kancer želuca, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer glave i vrata, kancer pluća, uključujući nesitnoćelijski kancer pluća, kancer bešike i slično. Tumor može da bude EGFR-, cMET- ili EGFR/cMET-pozitivan kancer. Antitela za koja se ovde traži zaštita mogu poželjno da budu za upotrebu u lečenju pozitivnog kancera koji je kancer dojke, kao što je kancer dojke u ranoj fazi. U drugom aspektu, pomenuta antitela mogu da budu poželjno za upotrebu u lečenju EGFR-, cMET- ili EGFR/cMET-pozitivnog kancera koji je kolorektalni kancer. Antitela za koja se ovde traži zaštita mogu se primeniti na širok spektar EGFR-, cMET- ili EGFR/cMET-pozitivnih kancera, kao što su kancer dojke, kancer debelog creva, kancer pankreasa, kancer želuca, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer glave i vrata, kancer pluća uključujući nesitnoćelijski kancer pluća, kancer mokraćne bešike i slično. Subjekt je poželjno humani subjekt. Subjekt je poželjno subjekt koji ispunjava uslove za terapiju antitelima korišćenjem EGFR specifičnog antitela kao što je cetuksimab. U poželjnom primeru izvođenja, antitela mogu poželjno za upotrebu u lečenju subjekta koji sadrži tumor, poželjno EGFR/cMET-pozitivan kancer, poželjno tumor/kancer sa EGFR RTK-rezistentnim fenotipom, fenotipom rezistentnim na EGFR monoklonsko antitelo, ili njihovu kombinaciju.

[0106] Količina antitela koja se primenjuje kod pacijenta je tipično u terapeutskom prozoru, što znači da se koristi dovoljna količina za postizanje terapeutskog efekta, a da pritom količina ne prelazi graničnu vrednost koja dovodi do neprihvatljivog stepena neželjenih efekata. Što je manja količina antitela potrebna za postizanje željenog terapeutskog efekta, to će obično biti veći terapeutski prozor. Prema tome, poželjno je antitelo za koje se ovde traži zaštita, a koje ispoljava dovoljne terapeutske efekte pri niskim dozama. Doza može da bude u opsegu režima doziranja cetuksimaba. Doza takođe može da bude niža.

[0107] Bispecifično antitelo prema pronalasku, za koje se ovde traži zaštita, poželjno indukuje manju toksičnost za kožu u poređenju sa cetuksimabom, pod inače sličnim uslovima. Bispecifično antitelo za koje se ovde traži zaštita poželjno proizvodi manje proinflamatornih hemokina, poželjno CXCL14, u poređenju sa cetuksimabom, pod inače sličnim uslovima. Bispecifično antitelo za koje se ovde traži zaštita poželjno indukuje manje oštećenje antimikrobnih RNAaza, poželjno Rnaze 7, u poređenju sa cetuksimabom, pod inače sličnim uslovima.

[0108] Predmetni pronalazak opisuje, između ostalog, antitela koja ciljano deluju na EGFR i cMET receptore i rezultiraju snažnom inhibicijom proliferacije ćelijskih linija kancera in vitro i inhibicijom rasta tumora in vivo. Bispecifično antitelo za koje se ovde traži zaštita može da kombinuje profile niske toksičnosti sa visokom efikasnošću. Antitelo za koje se ovde traži zaštita može da bude korisno za različite tipove i linije terapija usmerenih na EGFR. Antitelo za koje se ovde traži zaštita može da ima povećan terapeutski prozor u poređenju sa antitelom koje vezuje isti antigen(e) sa oba kraka. Bispecifično antitelo za koje se ovde traži zaštita može da ispolji bolje efekte inhibicije rasta in vitro, in vivo ili u njihovoj kombinaciji, u poređenju sa cetuksimab antitelom.

[0109] Pronalazak takođe obezbeđuje bispecifično antitelo za koje se ovde traži zaštita, za upotrebu u lečenju subjekta koji može da ima jedan ili više od niza različitih vrsta tumora. Tumor može da bude EGFR-pozitivan tumor, cMET-pozitivan tumor ili EGFR- i cMET-pozitivan tumor. Tumor može da bude kancer dojke; kancer debelog creva, kancer pankreasa, kancer želuca, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer glave i vrata, kancer pluća uključujući ne-sitnoćelijski kancer pluća ili kancer mokraćne bešike. Tumor može da bude rezistentan na lečenje inhibitorom EGFR tirozin kinaze. Inhibitor EGFR tirozin kinaze je poželjno erlotinib, gefitinib ili afatinib, analog erlotiniba, gefitiniba ili afatiniba ili kombinacija jednog ili više respektivnih jedinjenja i/ili njihovih analoga. Lečenje poželjno dodatno obuhvata lečenje inhibitorom EGFR tirozin kinaze. Prilikom istovremenog lečenja inhibitorom EGFR tirozin kinaze, tumor može da bude rezistentan na lečenje inhibitorom EGFR tirozin kinaze. Istovremeno lečenje najmanje delimično ponovo uspostavlja senzitivnost tumora na inhibitor tirozin kinaze. Inhibitor EGFR tirozin kinaze može da bude inhibitor prve generacije za EGFR tirozin kinazu. Primeri klinički relevantnih inhibitora prve generacije za EGFR tirozin kinazu su erlotinib i gefitinib. U ovom i drugim primerima izvođenja, tumor može da bude HGF-povezan tumor.

[0110] EGFR-pozitivan tumor je tipično tumor koji ima mutaciju koja aktivira EGFR. Mutacija koja aktivira EGFR je mutacija EGFR koja rezultira aktivacijom EGF/EGFR signalnog puta. Mutacija koja aktivira EGFR može da bude važna za kancerogeno stanje tumora. Jedan od načina na koji takvi tumori mogu da postanu neosetljivi na EGFR-usmerenu terapiju je aktivacija HGF/cMET signalnog puta. Tumor može da bude tumor povezan sa HGF. Aktivacija cMET/HGF signalnog puta je jedan od načina na koji EGFR-pozitivan tumor može da izbegne delovanje tretmana EGFR-usmerenom terapijom. cMET/HGF put može da se aktivira na različite načine. U stanju tehnike su opisani različiti postupci aktivacije, od kojih su neki ovde detaljno opisani. Antitelo za koje se ovde traži zaštita je posebno pogodno za lečenje tumora kod kojih je aktivacija cMET/HGF signalnog puta povezana sa prisustvom ili viškom HGF. Takvi cMET-pozitivni tumori su označeni kao HGF-povezani tumori ili HGF-zavisni tumori. Antitelo za koje se ovde traži zaštita takođe može da se koristi da najmanje delimično inhibira ovaj mehanizam kojim EGFR-pozitivni tumori mogu da izbegnu delovanje terapije. Ovi tumori mogu da izbegnu delovanje EGFR-usmerene terapije selektivnim rastom tumorskih ćelija pri čemu se, pored toga, aktivira cMET/HGF signalni put. Ove ćelije mogu da budu prisutne na početku EGFR-usmerene terapije. Ove ćelije imaju prednost selektivnog rasta u odnosu na tumorske ćelije koje su negativne za HGF/cMET signalne puteve. Tumor može da bude tumor u kome je aktiviran signalni put HGF/cMET. Tumor može da bude tumor koji je povezan sa povišenim nivoima faktora rasta hepatocita (HGF) ili prekomernom ekspresijom HGF receptora c-Met. Tumor može da bude tumor čiji rast pokreću EGF i/ili HGF. Za tumor se kaže da ga pokreće određeni faktor rasta ako se signalni put aktivira u ćelijama tumora kao odgovor na prisustvo faktora rasta i ako uklanjanje faktora rasta dovodi do inhibicije rasta ćelija tumora. Smanjenje može da se meri smanjenom deobom ćelija i/ili indukovanim ubijanjem ćelija kao što je apoptoza. Tumor je HGF-povezani tumor ako pod uslovima koji bi inače bili prihvatljivi za rast tumora, tumor raste ili raste brže u prisustvu HGF.

[0111] Pregled EGFR-usmerenih terapija za različite tumore dali su Vecchione et al., EGFR-targeted therapy." Experimental cell research Vol 317 (2011): 2765‑2771. U principu, EGFR-usmerena terapija je terapija molekulom koji interaguje sa EGFR ili inhibira EGFR-posredovane signalne puteve u ćeliji.

[0112] Antitelo za upotrebu u lečenju kako je ovde naznačeno, poželjno dalje obuhvata korak određivanja da li je tumor HGF-povezani tumor.

[0113] Antitelo za koje se ovde traži zaštita može da inhibira rast HGF-povezanog tumora.

[0114] Kada su u ovom tekstu dati opsezi kao između broja 1 i broja 2, opseg uključuje broj 1 i broj 2. Na primer, opseg između 2-5 uključuje broj 2 i 5.

[0115] Kada se u ovom tekstu govori o afinitetu koji je viši od drugog afiniteta, Kd = niža od druge Kd. Da ne bi bilo sumnje, Kd od 10e-9 M je niža nego Kd od 10e-8 M. Afinitet antitela koje ima Kd od 10e-9 M za ciljnu kategoriju, viši je nego kada je Kd 10e-8 M.

[0116] Pozivanje u ovom tekstu na patentni dokument ili drugu materiju koja se citira ne treba smatrati priznanjem da je taj dokument ili materija bila poznata ili da su informacije koje sadrži bile deo uobičajenog opšteg znanja na datum prioriteta bilo kog od patentnih zahteva.

[0117] U cilju jasnoće i konciznog opisa, karakteristike su ovde opisane kao deo istog ili zasebnih primera izvođenja, međutim, smatraće se da obim pronalaska, kako je ovde otkriven, može da uključuje primere izvođenja koji imaju kombinacije svih ili nekih od opisanih karakteristika.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0118]

Slika 1. Aminokiselinska sekvenca varijabilnih regiona teškog lanca varijabilnih domena navedenih u ovoj prijavi. VH, CDR1, CDR2 i CDR3, kao i FR1, FR2 i FR3 sekvence MF3370 i MF4356 su deo priloženih patentnih zahteva.

Slika 2. Funkcionalnost anti-EGFR cLC bivalentnih antitela u inhibiciji EGF indukovane smrti A431 ćelija. Y osa (broj) prikazuje očitavanje fluorescencije u testu, koje ukazuje na broj metabolički aktivnih ćelija, kao funkciju koncentracije korišćenog antitela (X-osa). PG3370 je u stanju da inhibira EGF-indukovanu ćelijsku smrt i stoga pokazuje pojačan rast ćelija sa povećanjem koncentracije antitela. Molekuli koji imaju aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona cetuksimaba/Erbituksa, koji se ovde pominju kao cetuksimab ili referentno antitelo cetuksimab, korišćeni su u eksperimentima kao interni standard (crne tačke).

Slika 3. Efekat cMET x EGFR bispecifika na zarastanje rana u H385 ćelijama (panel A) i EBC-1 ćelijama (panel B). Ćelije su inkubirane ili bez (mock) ili sa 12.5 ng/ml EGF ili 15 ng/ml HGF ili sa kombinacijom HGF i EGF faktora (15 ng/ml i 12.5 ng/ml) uz dodatak 5 pojedinačnih cMETxEGFR bispecifika. Kao kontrolna je uključen cetuksimab u kombinaciji sa 2994 Fab. Y-osa prikazuje procenat zatvaranja rane izmeren mikroskopijom tokom protoka vremena.

Slika 4. FACS analiza analize ekspresije EGFR i cMET u TKI-rezistentnim NSCLC ćelijama, HCC827 i PC-9 ćelijama.

(A) Obe ćelijske linije su okarakterisane za ekspresiju EGFR (x-osa) i cMET (y-osa) pomoću fluorescentno obeleženih antitela. Sve HCC827 ćelije pokazuju ekspresiju EGFR i mogu dalje da se podele na EGFR<visok>, cMET<poz>populaciju i EGFR<poz>, cMET<neg>populaciju. PC-9 ćelije sadrže malu populaciju EGFR<visok>i cMET<poz>ćelija i minimalnu populaciju EGFR<poz>i cMET<neg>ćelija.

(B) Grafikon koji predstavlja distribuciju različitih ćelijskih populacija u PC-9 i HCC827 ćelijama.

Slika 5. Primer efekta PB8532 i PB8388 na HGF-indukovanu rezistenciju na TKI inhibitore u PC-9 (panel A) i HCC827 (panel B) ćelijama.

Ćelije su pripremno tretirane sa bispecifičnim PB8532, PB8388, ili smešom cetuksimab/5D5 Fab i inkubirane sa HGF i/ili EGF u kombinaciji sa TKI inhibitoron, nakon čega je merena proliferacija. PB8532 inhibira HGF-posredovanu i EGF-posredovanu rezistenciju na gefitinib u PC-9 ćelijama i HCC827 ćelijama.

Slika 6. Efekat tretmana sa naznačenim antitelima na HGF-indukovanu fosforilaciju cMET ili EGF-indukovanu fosforilaciju EGFR na PC-9 i HCC827 ćelije. Antitela (100 nM) su inkubirana 15 minuta na 37°C nakon čega su ćelijski ekstrakti generisani i primenjeni u Western Blot analizi za detekciju (p)EGFR i (p)cMET. Anti-vinkulinsko antitelo je uključeno kao kontrola za prisustvo proteina.

Slika 7. MF3370 i njegove varijante. CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence MF8226 su podvučene, gledano s leva na desno. CDR regioni u drugim sekvencama su na odgovarajućim pozicijama. VH, CDR1, CDR2 i CDR3 kao i FR1, FR2 i FR3 sekvence MF4356 i MF8230 su deo priloženih patentnih zahteva.

Slika 8. MF4356 i njegove varijante. CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence MF4356 su podvučene, gledano s leva na desno. CDR regioni u drugim sekvencama su na odgovarajućim pozicijama. VH, CDR1, CDR2 i CDR3 kao i FR1, FR2 i FR3 sekvence MF4356 i MF8230 su deo priloženih patentnih zahteva.

Slika 9. Zajednički laki lanas koji se koristi u mono- i bispecifičnom IgG.

Slika 9A: Aminokiselinska sekvenca zajedničkog lakog lanca. Slika 9B: DNK sekvenca i translacija varijabilnog domena zajedničkog lakog lanca (IGKV1-39/jk1). Slika 9C: DNK sekvenca i translacija konstantnog regiona zajedničkog lakog lanca. Slika 9D: Translacija varijabilnog domena zajedničkog lakog lanca IGKV1-39/jk5. Slika 9E: V-region IGKV1-39A.

Slika 10. IgG teški lanci za generisanje bispecifičnih molekula. Slika 10A: CH1 region. Slika 10B: zglobni region. Slika C: CH2 region. Slika 10D: CH2 koji sadrži tihe supstitucije L235G i G236R. Slika 10E: CH3 domen koji sadrži supstitucije L351K i T366K (KK). Slika 10F; CH3 domen koji sadrži supstitucije L351D i L368E (DE).

Slika 11. Inhibicija vezivanja EGF za rekombinantni EGFR u ELISA testu.

Omogućeno je vezivanje biotinilisanog EGF za EGFR koji je korišćen za oblaganje, u prisustvu serijskog razblaženja IgG. Cetuksimab je korišćen kao pozitivno kontrolno, a PG2708 kao negativno kontrolno antitelo (Neg ctrl Ab). Vezivanje EGF je detektovano streptavidin-HRP peroksidazom.

Slika 12. Određivanje unakrsne reaktivnosti za EGFR cinomolgus putem FACS analize. CHO-K1 ćelije su transfektovane konstruktima humanog EGFR ili EGFR cinomolgusa. Omogućeno je da se antitela vežu za transfektovane ćelije i CHO-K1 ćelije pri koncentraciji od 5 µg/ml. Cetuksimab je korišćen kao pozitivna kontrola, a PG2708 negativno kontrolno antitelo (Neg ctrl Ab). Vezana antitela su detektovana pomožu PE-konjugovanog antitela.

Slika 13. Određivanje unakrsne reaktivnosti za EGFR i cMET miša ELISA testom. Gornji panel; Fiksirana koncentracija antitela (5 µg/ml) je testirana u serijskoj titraciji u mikrotitarskim pločama koje su obložene sa EGFR miša i humanim EGFR. Omogućeno je vezivanje anti-EGFR antitela i PG2708 (neg Ctrl Ab) i detekcija pomoću HRP-konjugovanog antitela. Donji panel; omogućeno je da se serijska titracija antitela veže za humani i mišji cMET korišćen za oblaganje. Humano/mišje unakrsko reaktivno antitelo BAF527 je uključeno kao antitelo za pozitivnu kotrolu, a PG2708 je dodato kao negativno kontrolno antitelo (Neg Ctrl Ab). Vezana antitela su detektovana pomoću streptavidina i HRP.

Slika 14. Inhibicija ligand-zavisne proliferacije N87. Serijska titracija antitela je inkubirana sa N87 ćelijama u prisustvu HGF(A), EGF (B) ili EGF/HGF (C). Proliferacija ćelija je merena bojom Alamar Blue. Fab 5D5/cetuksimab u ekvimolarnoj koncentraciji je uključen kao pozitivno kontrolno antitelo. Y-osa predstavlja intenzitet fluorescencije kao indikator ćelijske proliferacije. X-osa predstavlja različite koncentracije testiranih antitela.

Slika 15. Primer ADCC aktivnosti cMETxEGFR bispecifičnih antitela u N87 ćelijama (A) i MKN-45 ćelijama (B) pomoću visoko afinitetnog FcyRIIIa ADCC reporterskog testa. X-osa predstavlja koncentraciju dodatog antitela. Y-osa predstavlja luminescenciju (RLU) kao očitavanje ADCC aktivnosti. Anti-EGFR antitelo cetuksimab je uključeno kao pozitivno kontrolno antitelo.

Slika 16. Efekat HGF na efikasnost TKI inhibitora erlotiniba i gefitiniba u PC-9 (A) i HCC827 (B) ćelijama. Ćelije su inkubirane sa rastućim koncentracijama HGF (0 do 120 ng/mL) u kombinaciji sa 300 nM erlotiniba ili gefitiniba, nakon čega je merena ćelijska proliferacija. kod obe ćelijske linije HGF je indukovao dozno-zavisnu rezistenciju na TKI inhibitore.

Slika 17. Testiranje afinitetnog vezivanja ADCC-poboljšanih c-MET x EGFR varijanti. CHO-Kl ćelije koje stabilno eksprimiraju EGFR (A) ili MKN-45 ćelije koje endogeno eksprimiraju c-MET (B) inkubirane su po 2×10<5>ćelija/po bunarčiću, sa rastućim koncentracijama antitela, kao što je označeno. Nakon ispiranja, vezivanje je detektovano pomoću anti-humanog IgG-PE (3 µg/ml). Obojene ćelije su analizirane na iQue sistemu i izračunata je srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI). Kontrolna antitela su bila MF1337xMF1337; TTxTT negativna kontrola; tamni trouglići u dnu) i MF4356xMF3770 (PB8532p04; c-METxEGFR pozitivna kontrola za c-MET; crni trouglići). TT označava tetanus toksoid. ADCC označava antitela sa poboljšanom ADCC funkcijom, putem kontransfekcije sa DNK koja kodira RMD enzim za uklanjanje ostataka fukoze iz Fc regiona IgG1.

Slika 18. Rezultati ADCC reporterskog testa za potvrđivanje poboljšane ADCC efektorska funkcija. BxPC-3 ćelije koje eksprimiraju EGFR (levo) ili MKN-45 ćelije koje eksprimiraju c-MET (desno) pomešane su sa ADCC efektorskim ćelijama pri E:C odnosu od 15:1 i inkubirane u prisustvu titracije testiranog antitela (0.01 do 10 µg/ml). nakon 6 sati je dodat Bio-Glo reagens i luminescencija je merena pomoću čitača mikrotitarskih ploča. Što je viši nivo luminescencije, viši je i stepen interakcije između ciljnih i efektorskih ćelija koji indukuje testirano antitelo. Gornji paneli prikazuju rezultate visokoafinitetnog testa, a donji paneli rezultate niskoafinitetnog testa. Negativno kontrolno antitelo je bilo PG1337p218 (anti-TT, svetli trouglovi na dnu); druga kontrolna antitela su bila 3178x4280 (HER3 x EGFR, ADCC-poboljšano, svetli zatvoreni krugovi (na vrhu levog gornjeg panela); 3178x4280 (HER3 x EGFR, bez ADCC poboljšanja, crni krstići, na dnu); 4356x3370 (c-MET x EGFR, ADCC-poboljšano, otvoreni svetli krugovi); 3370x4356 (EGFR x c-MET, bez ADCC poboljšanja, crni krstići i isprekidane linije); i cetuksimab (anti-EGFR, mali crni krugovi).

Slika 19. Erlotinib indukuje anti-tumorski odgovor kod NGS-hHGFki miševa kojima su presađene HCC827 ćelije, sve dok miševi primaju tretman. Crna strelica označava početak tretmana.

Slika 20. PB8532 samo, ili u kombinaciji sa erlotinibom, indukuje anti-tumorski odgovor kod NGS-hHGFki miševa kojima su presađene HCC827 ćelije. Crna strelica označava početak tretmana; sive strelice na X-osi označavaju nedeljne tretmane antitelima.

Slika 21. Anti-tumorski odgovor indukovan samim PB8532, ili u kombinaciji sa erlotinibom, superioran je u odnosu na tretman erlotinibom, čak i ako se sa tretman zaustavi. Crna strelica označava početak tretmana; sive strelice na X-osi označavaju nedeljne tretmane antitelima.

Slika 22. Anti-tumorski odgovor indukovan samim PB8532, i u kombinaciji sa erlotinibom, superioran je u odnosu na odgovor na erlotinibom. Crna strelica označava početak tretmana; sive strelice na X-osi označavaju nedeljne tretmane antitelima. Tretman cMET antitelom LY2875358, sa i bez tretmana erlotinibom, bio je manje efikasan nego PB8532, čak i bez tretmana erlotinibom.

Slika 23. Anti-tumorski odgovor indukovan cMETxEGFR bispecifičnim antitelom PB19478 je efikasan i kada tumor razvije rezistenciju na erlotinib. Crne strelice označavaju početak tretmana erlotinibom i početak PB19478 tretmana.

PRIMERI

[0119] Kako se ovde koristi, "MFXXXX" gde je X nezavisno broj 0-9, odnosi se na Fab koji sadrži varijabilni domen gde VH ima aminokiselinsku sekvencu identifikovanu sa 4 cifre. Osim ako nije drugačije naznačeno, varijabilni region lakog lanca varijabilnog domena tipično ima sekvencu sa slike 9A, tipično 9B. "MFXXXX VH" se odnosi na aminokiselinsku sekvencu VH identifikovanu sa 4 cifre. MF dalje obuhvata konstantni region lakog lanca i konstantni region teškog lanca koji normalno interaguje sa konstantnim regionom lakog lanca. PG se odnosi na monospecifično antitelo koje sadrži identične teške i lake lance. PB se odnosi na bispecifično antitelo sa dva različita teška lanca. VH varijabilni regioni teških lanaca se razlikuju i tipično takođe CH3 region, pri čemu jedan od teških lanaca ima KK mutaciju svog CH3 domena, a drugi ima komplementarnu DE mutaciju svog CH3 domena (videti za referencu PCT/NL2013/050294 (objavljenu kao WO2013/157954).

Primer 1: Materijali i metode

Ćelijske linije:

[0120] Ćelijske linije EBC-1 [JCRB0820], PC-9 [RCB0446], H358 [ATCC<®>CRL-5807<™>], HCC827 [ATCC<®>CRL-2868<™>], MKN-45 [DSMZ ACC 409] N87 [ATCC<®>CRL-5822<™>] i A431 [ATCC<®>CRL-1555<™>] su kupljene i rutinski održavane u medijumu za gajenje koji je suplementiran sa 10% toplotom inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (FBS). Ćelije HEK293F Freestyle su dobijene od kompanije Invitrogena i rutinski održavane u 293 FreeStyle medijumu.

cDNK konstrukti:

Generisanje cMET i EGFR ekspresionih vektora za generisanje stabilnih ćelijskih linija (cMET i EGFR) i za imunizaciju (cMET)

[0121] cDNK pune dužine svake mete uključujući jedinstvena restrikciona mesta za kloniranje i kozak konsenzus sekvencu za efikasnu translaciju je ili sintetizovana, ili dobijena PCR amplifikacijom na komercijalno dostupnom ekspresionom konstruktu, koji sadrži ciljnu cDNK, sa specifičnim prajmerima koji su uveli jedinstvena restrikciona mesta za kloniranje i kozak konsenzus sekvencu za efikasnu translaciju. cDNK pune dužine svake mete je klonirana u eukariotski ekspresioni konstrukt kao što je pcDNA3.1, dok su ekstracelularni domeni klonirani u pVAX1 i pDisplay. Inserirane sekvence su verifikovane poređenjem sa NCBI referentnim aminokiselinskim sekvencama.

[0122] Aminokiselinska sekvenca pune dužine humanog EGFR inserta za ekspresiju na površini ćelije (identična sa GenBank: NP_00533):

[0123] Od čega:

- MRPSGTAGAALLALLAALCPASR: signalni peptid.

- IATGMVGALLLLLVVALGIGLFM: pretpostavljeni TM region.

[0124] Aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena humanog EGFRvarIII, prirodne EGFR varijante VAR_066493 [Ji H., Zhao X; PNAS 103:7817-7822(2006)] do koje dolazi usled delecije egzona 2-7 unutar okvira. Oznaka _ u nastavku ukazuje na lokaciju na kojoj nedostaju aminokiseline 30 – 297

[0125] Gde je:

- MRPSGTAGAALLALLAALCPASR: signalni peptid.

[0126] Aminokiselinska sekvenca hibrida himernog ekstracelularnog EGFR domena makaka (Macaca mulatta) sa humanim EGFR transmembranskim i intracelularnim domenom za ekspresiju na ćelijskoj površini (identičan sa GenBank: XP_014988922.1. Humana EGFR sekvenca je podvučena u primeru koji sledi.

[0127] Gde je:

- MGPSGTAGAALLALLAALCPASR: signalni peptid.

[0128] Aminokiselinska sekvenca humanoh cMET inserta pune dužine, za ekspresiju na ćelijskoj površini for expression on the cell surface (identična sa GenBank: P08581-2). Sekvenca se razlikuje od referentne sekvence na poziciji sa insercijom na 755-755: S → STWWKEPLNIVSFLFCFAS

[0129] Gde je:

- MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNG: signalni peptid

- GLLAGVVSISTALLLLLGFFLWL: transmembranski region

Referentna antitela

[0130] Anti-cMET antitela su poznata u stanju tehnike (tabela 1). Monospecifična bivalentna cMET antitela su konstruisana prema objavljenim informacijama i eksprimirana u 293F Freestyle ćeliji. Tabela 1 prikazuje povezane otkrivene informacije. Monospecifična bivalentna antitela usmerena protiv cMET konstruisana su prema objavljenim informacijama i eksprimirana u 293F Freestyle ćelijama. Za testove blokiranja HGF liganda, genski segmenti koji kodiraju VH i VL anti-cMET antitela dobijenih prema patentu su ponovo klonirani u vektor za fagni displej za prikaz na filamentoznom bakteriofagu.

[0131] Referentno antitelo cetuksimab (Erbituks) je korišćeno kao referentno antitelo za EGFR Fab panel.

[0132] 2994 Fab protein je generisan iz prečišćenog PG2994 IgG digestijom pomoću papaina. U tom cilju je PG2994 inkubiran sa papainom kuplovanim na zrncima (Pierce #44985), i ostavljen da digerira 5.5 sati na 37°C uz rotaciju. Fab fragmenti su prečišćeni iz digestione smeše filtracijom preko MabSelectSure LX. Propuštene frakcije koje sadrže Fab protein, koncentrovan do 3 ml korišćenjem vivaspin20 10 kDa i dalje prečišćen gel filtracijom korišćenjem superdex75 16/600 kolone u PBS.

Primer 2

Generisanje bivalentnih monoklonskih antitela i karakterizacija antitela

[0133] VH geni jedinstvenih antitela, kako je ocenjeno na osnovu sekvence VH gena i nekih njihovih varijanti sekvence, klonirani su u IgG1 noseći vektor. 293F Freestyle ćelije prilagođene suspenziji su gajene u T125 flaskovima na tacni rotacione mešalice do gustine od 3.0 × 10<6>ćelija/ml. Ćelije su zasejane pri gustini od 0.3-0.5 × 10<6>živih ćelija/ml u svaki bunarčić ploče sa 24 duboka bunara. Ćelije su privremeno transfektovane sa individualnom sterilnom smešom DNK:PEl i dalje gajene. Sedam dana nakon transfekcije, supernatant je sakupljen i filtriran kroz 0-22 µM (Sartorius) i prečišćen na zrncima proteina A korišćenjem serijskog prečišćavanja praćenog zamenom pufera u PBS.

Inhibicija EGF-posredovane apoptoze

[0134] Visoke (10 nM) koncentracije EGF indukuju (apoptotsku) ćelijsku smrt kod A431 ćelija [Gulli et al., 1996)]. Ovaj efekat može, u zavisnosti od doze, da se poništi sko se dodaju anti-EGFR antitela koja blokiraju ligand, kao što je cetuksimab.

[0135] Da bi se testirala potencija bivalentnih anti-EGFR IgG da inhibiraju EGF-indukovanu ćelijsku smrt ćelija A431, antitela su inkubirana u serijskoj titraciji - od 10 µg/ml nadalje - u prisustvu 10 nM EGF. Svaka ploča za analizu je sadržala serijsko razblaženje negativnog (Ctrl Ab; PG2708) i pozitivnog kontrolnog antitela (cetuksimab) koje je služilo kao referentna kontrola. Trećeg dana, dodata je boja Alamar blue (Invitrogen, # DAL1100) (20 µl po bunarčiću) i fluorescencija je izmerena posle 6 sati inkubacije (na 37°C) sa Alamar blue korišćenjem ekscitacije od 560 nm i očitavanja na 590 nm na Biotek Synergy 2 multimoder čitaču ploča. Slika 2 prikazuje aktivnost cLC EGFR antitela u poređenju sa aktivnošću cetuksimaba i kontrolnog antitela. Antitela PG4280, 3755 i 3752 su bila potentnija u poređenju sa cetuksimabom, dok su antitela PG4281 i PG3370 pokazala manju efikasnost.

ELISA test za blokiranje EGF

[0136] Vezivanje EGFR-specifičnih faga za rekombinantni EGFR je testirano u odsustvu i prisustvu molarnog viška liganda (EGF). U tom cilju su MAXISORP<™>ELISA ploče obložene preko noći na 4°C sa 5 µg/ml kozjeg anti-humanog IgG. Bunarčići ELISA ploča su blokirani sa PBS (pH 7.2) koji sadrži 2% ELK tokom 1 h na sobnoj temperaturi uz rotaciono mućkanje (700 rpm). Zatim je 5 µg/ml rekombinantnog humanog EGFR-Fc ostavljeno da se inkubira tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. U međuvremenu, IgG je pomešan u serijskoj titraciji sa humanim biotinilovanim EGF tokom 1H na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja nevezanog humanog EGFR-Fc, dodata je smeša antitelo/EGF i ostavljena da se veže 1 sat na sobnoj temperaturi. Vezani EGF je detektovan pomoću HRP-streptavidina tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Kao kontrola, postupak je izveden istovremeno sa antitelom specifičnim antigene kojima je izvršeno oblaganje (nije prikazano) i negativnim kontrolnim fagom (Neg Ctrl Ab). Vezano sekundarno antitelo je vizualizovano TMB/H2O2bojenjem, a bojenje je kvantifikovano merenjem OD450nm. Slika 11 prikazuje da antitelo PG3370, koje je manje potentno pri inhibiciji apoptoze EGF-posredovane, pokazuje sličnu EGF-blokirajuću aktivnost u poređenju sa cetuksimabom.

Test unakrsne reaktivnosti za EGFR cinomolgusa i miša

[0137] Da bi se testiralo da li su anti-EGFR IgG antitela reaktivna sa EGFR cinomolgusa, konstrukti koji kodiraju humani EGFR pune dužine, kao i ekspresioni konstrukt koji kodira ECD cinomolgusa fuzionisan sa intracelularnim humanim EGFR, su isto transfektovani u (antigen negativne) CHO ćelije i ćelije su zatim obojene anti-EGFR antitelima u koncentraciji od 5µg/ml i na kraju analizirane pomoću FACS. Kao pozitivna kontrola za bojenje, upotrebljeno je antitelo cetuksimab koje je u kliničkoj upotrebi, pošto se za ovo antitelo zna da unakrsno reaguje sa EGFR cinomolgusa. Pokazano je da su PG3370, PG3752, PG4280 i PG4281 reaktivni sa EGFR cinomolgusa, pošto boljenje ćelija koje eksprimiraju humani EGFR praktično nije bilo moguće razlikovati od bojenja ćelija koje eksprimiraju himerni receptor (slika 12).

[0138] Da bi se testirala unakrsna reaktivnost anti-EGFR IgG sa mišjim EGFR, izveden je ELISA test. MAXISORP<™>ELISA ploče su obložene serijski titriranim rekombinantnim mišjim EGFR ECD-Fc, počevši od 5µg/ml i razblaženim do 0.038 µg/ml, preko noći na 4°C. Vezivanje anti-EGFR IgG za ovaj antigen je testirano pri fiksiranoj koncentraciji od 5µg/ml i omogućeno je vezivanje tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Kao pozitivna kontrola za imunoreaktivnost antitela, izvedena je ista ELISA postavka koristeći humani EGFR ECD-Fc fuzioni protein kao antigena (R&D systems). Zatim, kozji anti-mišji IgG HRP konjugat, BD Biosciences) i ostavljen je da se veže 2 sata na sobnoj temperaturi. Vezani IgG je detektovan merenjem OD450nm. Pokazalo se da antitelo PG3370 prepoznaje mišji EGFR, kao i humani EGFR sa sličnim afinitetom (slika 13 - gornji panel). Cetuksimab ne prepoznaje mišji EGFR (125084 Erbitux Pharmacology Review Part 2 - FDA). PG3370 i cetuksimab, dakle, ne prepoznaju isti epitop na humanom EGFR.

Test unakrsne reaktivnosti za cMET miša

[0139] Da bi se testirala unakrsna reaktivnost PG3342 sa mišjim cMET, izveden je ELISA test. Fiksirana koncentracija mišjeg HGF R/c-MET Fc (R&D systems) HGF R/c-MET Fc je razblažena do 2.5µg/ml u PBS i MAXISORP<™>ELISA ploče su obložene preko noći na 4°C. Vezivanje anti-cMET IgG za ovaj antigen je testirano semi-log titracijom počevši od 10 µg/ml. Antitela su ostavljena da se vežu 1 sat na sobnoj temperaturi. Kao pozitivna kontrola za imunoreaktivnost antitela, izvedena je ista ELISA postavka koristeći humani HGF R/c-MET Fc fuzionog proteina kao antigena (R&D systems). Zatim je dodat kozji anti-mišji IgG HRP konjugat (BD Biosciences) i ostavljen da se veže 2 sata na sobnoj temperaturi. Vezani IgG je detektovan merenjem OD450nm. BAF527 poliklonski kozji IgG prečišćen na osnovu afiniteta za antigen, usmeren protiv mišjeg cMET konjugovanog sa biotinom, uključen je kao antitelo pozitivne kontrole. Unakrsna reaktivnost antitela PG3342 sa mišjim cMET nije uočena (slika 13, donji panel).

Test unakrsnog blokiranja sa cMET antitelima

[0140] ELISA testom je testirana kompeticija cMET-specifičnih faga sa cMET referentnim antitelima. U tom cilju su MAXISORPTM ELISA ploče obložene sa 2.5µg/ml cMET-Fc fuzionog proteina, preko noći na 4°C. Bunarčići ploča za ELISA test su blokirani sa PBS (pH 7.2) koji sadrži 2% ELK tokom 1 sata na sobnoj temperaturi uz rotaciono mućkanje (700rpm). Sledeći referentni ili negativni kontrolni IgG je dodat u koncentraciji od 5 µg/ml i ostavljen da se veže 15 minuta na RT na 700 rpm. Zatim je dodato 5 ul PEG-precipitiranog faga i ostavljeno da se veže 1 sata na RT na 700 rpm. Vezani fagi su detektovani sa HRP-obeleženim anti-M13 antitelom tokom 1 sata na sobnoj temperaturi na 700 rpm. Kao kontrola, postupak je izveden istovremeno sa antitelom specifičnim za antigene korišćene za oblaganje i sa negativnim kontrolnim fagom. Vezano sekundarno antitelo je vizuelizovano TMB/H2O2bojenjem i bojenje je kvantifikovano merenjem OD450nm. Tabela 2 pokazuje da MF4040 i MF4356 pokazuju da su kompeticiji sa referentnim antitelom 5D5. MF4297 je u kompeticiji i u manjoj meri sa 13.3.2 i C8H241. Svi pozitivni kontrolni fagi pokazuju potpunoj kompeticiji sa odgovarajućim IgG, dok kontrola bez antitela ne utiče na test kompeticije.

Generisanje bispecifičnih antitela

[0141] Bispecifična antitela su generisana privremenom transfekcijom sa dva plazmida koji kodraju IgG sa različitim VH domenima, koristeći patentniranu tehnologiju CH3 inženjeringa, kako bi se osigurala efikasna heterodimerisation i formiranje bispecifičnih antitela. Zajednički laki lanac je takođe ko-transfektovan u istoj ćeliji, ili na istom plazmidu ili na drugom plazmidu. U našim zajedno podnetim prijavama (npr.

WO2013/157954 i WO2013/157953) smo otkrili postupke i sredstva za proizvodnju bispecifičnih antitela iz jedne ćelije, pri čemu su obezbeđena sredstva koja favorizuju formiranje bispecifičnih antitela u odnosu na formiranje monospecifičnih antitela. Konkretno, poželjne mutacije koje proizvode u suštini samo bispecifične IgG molekule pune dužine su aminokiselinske supstitucije na pozicijama 351 i 366, npr. L351K i T366K (numeracija prema EU numeraciji) u prvom CH3 domenu (teški lanac 'KK-varijante') i supstitucije aminokiselina na pozicijama 351 i 368, npr. L351D i 10 L368E u drugom CH3 domenu (teški lanac 'DE-varijante'), ili obrnuto. Prethodno je pokazano u našim zajedno podnetim prijavama, da se negativno naelektrisani teški lanac DE-varijante i pozitivno naelektrisani teški lanac KK-varijante preferencijalno sparuju kako bi formirali heterodimere (takozvani 'DEKK' bispecifični molekuli). Homodimerizacija teških lanaca DE-varijante (DE-DE homodimeri) ili teških lanaca KK-varijante (KK-KK homodimeri) nisu favorizovana zbog snažnog odbijanja između naelektrisanih ostataka na dodirnoj površini CH3-CH3 između identičnih teških lanaca.

[0142] cMET i EGFR Fab krakovi su klonirani u odgovarajuće KK i DE vektore (tabela 3). Nakon proizvodnje, bispecifični IgG su prečišćeni serijskim prečišćavanjem pomoću proteina-A i pufer je zamenjen sa PBS. Uspešne proizvodnje su rezultirale IgG1 antitelom pune dužine, sa minimalnom koncentracijom od 0.1 mg/ml, kojima je dodeljen jedinstveni kod (PBnnnnn; gde nnnnn predstavlja nasumično generisani broj) za identifikaciju specifične kombinacije 2 različita Fab fragmenta koji vezuju ciljne molekule. Vezivanje uspešno proizvedenih bispecifičnih IgG za svoje respektivne ciljne molekule je testirano u ELISA testu.

Primer 3

Skrining c-MET x EGFR bispecifičnih antitela u testu EGF/HGF i HGF i EGF proliferacije

[0143] Potentnost panela cMET x EGFR bispecifičnih antitela je testirana u N87 ćelijama korišćenjem HGF/EGF, HGF i EGF testova. Ćelijska linija N87, zvaničnog naziva NCI-N87, je ćelijska linija karcinoma želuca izvedena iz metastatskog mesta i ima visoke nivoe ekspresije EGFR i srednje nivoe ekspresije cMET (Zhang et al, 2010). Antitela su testirana u semi-log titraciji od 8 koraka, u opsegu od 10 µg/ml do 3.16 ng/ml. Svako antitelo je testirano u duplikatu. Anti-RSV-G antitelo PG2708 je korišćeno kao negativna kontrola. Fab referentnog antitela 2994 je korišćen kao pozitivna kontrola za HGF test, a referentno antitelo cetuksimab je korišćeno kao pozitivna kontrola za EGF test.

[0144] Ekvimolarni 1:1 cetuksimab/5D5 Fab je korišćen kao pozitivna kontrola za EGF, HGF i EGF/HGF testove.

[0145] Uključeni su bunarčići sa jednim ligandom ili kombinacijom liganada, kao i kontrola medijuma da bi se odredio prozor za analizu. Antitela su razblažena u hemijski definisanom medijumu za izgladnjivanje (CDS: RPMI1640 medijum, koji sadrži 80U penicilina i 80µg streptomicina po ml, 0.05% (tež./zap.) BSA i 10µg/ml holo-transferina) i 50µl razblaženog antitela ke dodato u bunarčiće crne ploče sa 96 bunarčića sa providnim dnom. (Costar). Dodat je ligand (50 µl po bunarčiću osnovnog rastvora koji sadrži 400ng/ml HGF i 4ng/ml EGF, i EGF/HGF koncentracija od 4 ng/ml EGF/400 ng/ml HGF razblaženog u CDS: R&D systems, kat. br.396-HB i 236-EG). N87 ćelije su tripsinizovane, sakupljene i izbrojane i 8000 ćelija u 100 µl CDS je dodato u svaki bunarčić ploče. Da bi se izbegli ivični efekti, ploče su ostavljene sat vremena na sobnoj temperaturi pre nego što su stavljene u kontejner unutar inkubatora za ćelijsku kulturu na 37°C na tri dana. Četvrtog dana je dodata boja Alamar blue (Invitrogen, # DAL1100) (20µl po bunarčiću) i fluorescencija je merena nakon 6 sati inkubacije (na 37°C) sa Alamar blue bojom, upotrebom ekscitacije od 560nm i očitavanja na 590nm na Biotek Synergy 2 Multi-mog čitaču ploča. Vrednosti fluorescencije su normalizovane u odnosu na neinhibirani rast (bez antitela, ali sa dodata oba liganda). Primer testa HGF, EGF i EGF/HGF proliferacije prikazan je na slici 14 (slika 14A, B i C, redom).

[0146] U tabeli 4 su navedeni rezultati različitih eksperimenata. U N87 HGF/EGF testu, identifikovano je četrnaest različitih cMETxEGFR bispecifika sa potencijom uporedivom sa referentnim monospecifičnim antitelima (ekvimolarna smeša cetuksimaba i 5D5 Fab): PB7679, PB7686, PB8218, PB8244, PB8292, PB8316, PB8340, PB8364, PB8388, PB8511, PB8535, PB8583, PB8607 i PB8640.

[0147] U N87 EGF testu, identifikovano je jedanaest različitih cMETkEGFR bispecifika sa potencijom koja je uporediva sa monospecifičnim cetuksimabom: PB7679, PB8244, PB8292, PB8340, PB8364, PB8388, PB8511, PB8535, PB8583, PB8607 i PB8640. Svi sadrže EGFR Fab krak MF3755. U testu HGF N87 identifikovano je devet bispecifika koji su pokazali veću potenciju u poređenju sa monospecifičnim 5D5 Fab referentnim antitelom: PB8218, PB8388, PB8511, PB8532, PB8535, PB8545, PB8583, PB8639 iPB8640. Oni sadrže šest različitih cMET Fab krakova MF4040, MF4297, MF4301, MF4356, MF4491 i MF4506.

ADCC aktivnost

[0148] ADCC aktivnost 24 cMetxEGFR bispecifika je testirana na ćelijskim linijama tumora N87 (EGFR-visok, cMET-nizak) i MKN-45 (EGFR-nizak, cMET-amplifikovan). ADCC test je izveden korišćenjem kompleta Promega ADCC Bioassay kit u formatu ploče sa 384 bunarčića. Antitela su testirana u duplikatu u 9 različitih koncentracija u semi-log serijskim razblaženjima u opsegu od 10 µg/ml do 1 ng/ml.

[0149] Referentno antitelo cetuksimab je uključeno kao pozitivna kontrola za test, a PG2708 je korišćeno kao antitelo za negativnu kontrolu. Antitela ili kontrola za medijuma za test (bez IgG) su inkubirani tokom 6 sati indukcije na 37°C sa ADCC efektorskim ćelijama i ciljnim ćelijama (N87 ili MKN-45). Aktivnost luciferaze je kvantitativno određena korišćenjem reagensa Bio-Glo luciferaze.

[0150] Primer ADCC testa je prikazan na slici 15. Nijedan od cMETxEGFR bispecifika nije pokazao značajnu ADCC aktivnost u obe ćelijske linije. Referentno antitelo za pozitivnu kontrolu, cetuksimab, pokazalo je dozno-zavisnu ADCC aktivnost na obe ćelijske linije.

[0151] Pet bispecifika sastavljenih od EGFR i cMet krakova koji su pokazali visoku efikasnost u N87 HGF/EGF testu i visoku raznolikost sekvenci (tabela 5) odabrano je za dalju analizu. Dva od pet bispecifika sadrže MF4356, koji je u kompeticiji sa 5D5 za vezivanje za cMET (tabela 2). Tabela 5 sumira karakteristike izabranih kandidata.

Test migracije ćelija tokom zarastanja rana

[0152] Dve NSCLC ćelijske linije su testirane u testu zarastanja rana; EBC-1 i H358. Ove ćelijske linije su odabrane jer eksprimiraju visoke nivoe EGFR i c-Met (Zhang et al, 2010; Fong et al., 2013). Test je izveden korišćenjem CytoSelectTM testa za zarastanje rana na ploči sa 24 bunarčića (Cell Biolabs, CBA-120) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, u svaki bunarčić je zasejano 2.5-4 × 10<5>ćelija kancera i inkubirano preko noći na 37°C kao bi se formirao monosloj. Umetci iz bunarčića su zatim uklonjeni kako bi se kreiralo polje rane od 0.9 mm. Posle ispiranja sa PBS puferom da bi se uklonile mrtve ćelije i otpad u oblasti rane, ćelije su inkubirane 15 minuta na 37°C sa kompletnim medijumom (0.5% FBS) koji sadrži bispecifične vrste (100nM) ili cetuksimab:Fab2994 kontrolnu smešu antitela (100nM, molarni odnos 1:1). U svaki bunarčić su zatim dodati faktori rasta: HGF (15ng/ml), EGF (12.5 ng/ml) ili njihovom kombinacijom (15 i 12.5 ng/ml). Praćenje zatvaranja rane tokom protoka vremena je sprovedeno tokom 14 h na 37 °C pomoću konfokalnog mikroskopa (Zeiss LSM780). Stepen (%) zatvaranja rane je prikazan u odnosu na netretirane kontrole.

[0153] H358 ćelije su pokazale povećanje migracije (procenat zatvaranja rane) nakon izlaganja samo HGF ili samo EGF, a najefikasnija je bila kombinacija HGF i EGF (slika 3). Ova povećana migracija je poništena dodavanjem najvećeg broja bispecifika i bila je najizraženija kod PB8532. Ova inhibicija je uporediva sa kombinacijom cetuksimaba i 5D5 Fab, izuzev inhibicije migracije u prisustvu EGF/HGF.

[0154] EBC-1 ćelije su pokazale blago povećanje migracije kada je dodat HGF; i odsustvo povećanja migracije u prisustvu EGF ili kombinacije EGF/HGF. Međutim, zatvaranje rane može da bude inhibirano u svim uslovima analize bispecifičnim vrstama, naročito sa PB8532. PB8532 je bio podjednako efikasan ili efikasniji (EGF/HGF) od kombinacije cetuksimab/5D5 Fab.

Analiza ekspresije EGFR i cMET na PC-9 i HCC827 ćelijama pomoću protočne citometrije

[0155] Stečena rezistencija na erlotinib može da bude rezultat aberantne aktivacije HGF-posredovane c-MET aktivacije. NSCLC ćelijske linije PC-9 i HCC827 su odabrane kako bi se ispitala sposobnost cMET xEGFR bispecifičnih antitela da inhibiraju proliferaciju posredovanu ligandom u okruženju rezistentnom na inhibitor tirozin kinaze (TKI). Obe ćelijske linije ne sadrže EGFR mutacije i rezistentne su u prisustvu HGF na erlotinib i gefitinib ili na kombinaciju gefinitiba i erlotiniba (samo PC-9). Objavljeno je da u PC-9 ćelijama HGF-indukovana rezistencija može da se poništi inhibitorom cMET (Nakade et al., 2014), a rezistencija na gefitinib može da se poništi anti-HGF antitelom (Yano, 2008). PC-9 i HCC827 su okarakterisani za ekspresiju cMET i EGFR FACS analizom, korišćenjem fluorescentno obeleženih antitela. Ćelije su sakupljene pomoću PBS 2mM EDTA. Suspenzije sa jednom vrstom ćelija (10e6 ćelija u 50 µl) su inkubirane sa fluorescentno obeleženim antitelima na ledu 20 minuta u puferu za bojenje (PBS 2% FBS 2mM EDTA). Sledeća antitela su korišćena sama ili u kombinaciji: Met Alexa Fluor 488 konjugat (klon D1C2, Cell Signaling, razblaženje 1:50); EGF receptor Alexa Fluor 647 konjugat (klon D38B1, Cell Signaling, razblaženje 1:50). Posle inkubacije, ćelije su isprane puferom za bojenje i FACS analiza je izvedena na BD FACSVerse protočnom citometru.

[0156] Sve HCC827 ćelije pokazuju ekspresiju EGFR i mogu dodatno da se podele na EGFR<visok>, cMET<poz>populaciju i EGFR<poz>, cMET<neg>populaciju (Slika 4). PC-9 ćelije sadrže malu populaciju EGFR<visok>i cMET<poz>ćelija i minimalnu populaciju EGFR<poz>i cMET<neg>ćelija.

Test proliferacije PC-9 i HCC827

[0157] Inicijalni eksperimenti su izvedeni da bi se odredila koncentracija HGF koje uspostavljaju rezistencija na erlotinib i gefitinib u PC-9 i HCC827 ćelijama. Nakon izgladnjivanja preko noći u medijumu koji sadrži 0.5% FBS, ćelije su inkubirane sa rastućim koncentracijama HGF, u opsegu od 0 do 120 ng/mL sa dodatkom 300 nM erlotiniba ili gefitiniba, u 10% FBS. Posle 72 sata inkubacije, proliferacija ćelija je procenjena korišćenjem WST-1 reagensa prema uputstvima proizvođača. Apsorbanca je merena čitačem mikrotitarskih ploča na talasnoj dužini testa i referentnoj talasnoj dužini od 450 i 630 nm, redom. I kod PC-9 (slika 16A) i kod HCC287 (slika 16B), dodavanje HGF je indukovalo rezistenciju TKI inhibitore na dozno-zavisan način način.

[0158] Testirana je efikasnost PB8532 i PB8388 u prisustvu rezistencije na TKI.4 × 10<3>ćelija kancera je zasejane u ploče sa 96 bunarčića u 100 µL kompletnog RPMI 1640 (10% FBS). Posle izgladnjivanja preko noći, u medijumu koji sadrži 0.5% FBS, ćelije su preinkubirane 15 minuta na 37°C sa Biclonics<®>(100nM) ili smešom kontrolnih monospecifičnih antitela cetuksimab:Fab2994 (100nM, molarni odnos 1:1). Svaki bunarčić je zatim suplementiran kompletnim medijumom (10% FBS) koji sadrži gefitinib ili erlotinib (300 nM) sa ili bez HGF (30ng/ml), EGF (30ng/ml) ili kombinacijom oba (pri 30 ng/ml). Posle 72 sata inkubacije, proliferacija ćelija je procenjena korišćenjem WST-1 metode.

[0159] Slika 5 pokazuje da PB8532 može da inhibira HGF- i EGF-posredovanu rezistenciju na gefitinib u PC-9 ćelijama. U HCC827 ćelijama PB8532 je inhibirao HGF-posredovanu rezistenciju na TKI i bio je potentniji od kombinacije dualne primeen monospecifičnog cetuksimab 5D5 Fab. Uporedivi rezultati su dobijeni sa TKI erlotinibom.

Primer 4 PB8532 inhibicija fosforilacije EGF i cMET

[0160] Posle izgladnjivanja preko noći u medijumu bez FBS, ćelije su inkubirane 15 minuta na 37°C sa medijumom (0.5% FBS) koji sadrži PB8532 (100nM) ili cetuksimab:Fab2994 kontrolnu smešu monospecifičnih antitela (100nM, molarni odnos 1:1). Ćelije su zatim stimulisane faktorima rasta: HGF (30 ng/ml) ili EGF (50 ng/ml) tokom 15 minuta na 37°C.

Posle stimulacije, ćelije su isprane sa PBS u prisustvu 1 mM ortovanadata (Sigma-Aldrich). Ekstrakcija proteina je obavljena korišćenjem RIPA pufera za liziranje (50 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% natrijum deoksiholat, 0.1% SDS) sa dodatkom kompletnog koktela inhibitora proteaza (Roche), inhibitora fosfataza PhosSTOP (1 mM, Sigma-Aldrich). Lizati su inkubirani na ledu 30 minuta pre centrifugiranja 15 minuta na 4°C da bi se uklonili ćelijski ostaci. Nakon centrifugiranja, supernatant je sakupljen i koncentracije proteina su određene korišćenjem reagensa bicinhoninske kiseline (BCA) (Pierce) prema uputstvima proizvođača. Uzorci proteina su denaturisani dodavanjem pufera za nanošenje 6X (β-merkaptoetanol 0.6 M; SDS 8%; Tris-HCl 0.25 M pH 6.8; glicerol 40%; bromofenol plavo 0.2%) i inkubiranjem na 95°C tokom 5 minuta. Posle elektroforeze, proteini su prebačeni na nitroceluloznu membranu korišćenjem Trans-Blot<®>Turbo<™>Blotting sistema (Bio-Rad). Membrane su blokirane, kako bi se spečilo nespecifično vezivanje, u 5% nemasnom mleku u prahu u Tris puferovanom slanom rastvoru-Tween 0.1% (50 mM Tris HCl ph 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween; TBS-T) tokom 1 h na sobnoj temperaturi (RT) i inkubirane sa primarnim antitelom preko noći (ON) na temperaturi od 4°C. Korišćena su sledeća primarna antitela: Phospho-Met (Tyr1234/1235, klon D26, Cell Signaling) 1:500 u TBS-T 5% BSA; Met (klon D1C2, Cell Signaling) 1:1000 u TBS-T 5% BSA; fosfo-EGF receptor (Tyr1068, klon D7A5, Cell Signaling) 1:1000 u TBS-T 5% nemasnog mleka u prahu; EGF receptor (klon D38B1, Cell Signaling) 1:1000 u TBS-T 5% BSA; vinkulin (monoklonski anti-vinkulin, V9131, SIGMA Aldrich) 1:4000 u TBS-T 5% nemasnog mleka u prahu. Posle inkubacije sa naznačenim primarnim antitelima, membrane su isprane 15 minuta u TBS-T i inkubirane sa sekundarnim antitelom (1:5000 u TBS-T 5% nemasnog mleka u prahu) tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Korišćena su sledeća sekundarna antitela: kozji anti-zečji IgG-HRP (sc-2004, Santa Cruz biotechnology); kozji anti-mišji IgG-HRP (sc-2005, Santa Cruz biotechnology). Signal je vizualizovan reagensima Enhanced Chemiluminescent Reagents (ECL; Invitrogen) ili SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)) sa digitalnim instrumentom za vizualizaciju (ImageQuant LAS 4000, GE Health Care Life Science Technologies).

Slika 6 prikazuje Western blot analizu izvedenog eksperimenta.

[0161] U PC-9 ćelijama, PB8532 i 5D5/cetuksimab su bili u stanju da smanje HGF-indukovanu fosforilaciju. Osim toga, oba antitela su blago smanjila fosforilaciju EGF u odsustvu i prisustvu EGF.

[0162] U HCC827 ćelijama PB8532 je smanjio fosforilaciju cMET u prisustvu i odsustvu HGF. Nije uočen efekat sa kombinacijom 5D5/cetuksimab. Osim toga, u ovoj ćelijskoj liniji PB8532 je smanjio EGF-indukovanu fosforilaciju EGFR, za razliku od kombinacije 5D5 sa cetuksimabom.

Primer 5

[0163] Slika 7 prikazuje različite sekvence za alternativne varijabilne regione teškog lanca varijabilnog domena koji se vezuje za EGFR, kako je ovde otkriveno. Slika 8 prikazuje različite sekvence za alternativne varijabilne regione teškog lanca varijabilnog domena koji se vezuje za cMET, kao što je ovde otkriveno. Varijabilni regioni teškog lanca su korišćeni za kreiranje većeg broja različitih cMET x EGFR bispecifičnih antitela. Laki lanac u ovim antitelima ima sekvencu kao što je prikazano na slici 9B. Bispecifična antitela su proizvedena kao što je opisano u primeru 1. Antitela su takođe proizvedena kao ADCC poboljšana verzija. ADCC poboljšane verzije su proizvedene uključivanjem u kotransfekciju konstrukata antitela, DNK koja kodira enzim reduktazu koji uklanja ostatak fukoze iz Fc regiona IgG1.

[0164] Slika 17 prikazuje titraciju različitih proizvedenih bispecifičnih antitela na CHO-K1 EGFR ćelijama opisanim u primeru 2 (panel A) i na MKN-45 ćelijama koje endogeno eksprimiraju c-MET (panel B). Ćelije su inkubirane na 2×10<5>ćelija/bunarčiću sa rastućim koncentracijama antitela, kako je naznačeno. Posle ispiranja vezivanje je detektovano pomoću anti-humanog IgG-PE (3 µg/ml). Obojene ćelije su analizirane na iQue sistemu i izračunati su srednji intenzitet fluorescencije (MFI) i površina ispod krive (AUC). Kontrolna antitela su bila MF1337xMF1337 (PG1337p218; TTxTT negativna kontrola; tamni trouglovi na dnu) i MF4356xMF3770 (PB8532p04; c-METxEGFR pozitivna kontrola; crni trouglovi). TT je skraćenica za tetanus toksoid, Varijabilni domen koji sadrži VH MF1337 (vidi sliku 1) i zajednički laki lanac kako je ovde opisano, vezuje se za tetanus toksoid i stoga se ne očekuje da se vezuje za CHO-K1 EGFR ćelije i MKN-45 ćelije. Napomena (ADCC) ukazuje da se antitela proizvode sa poboljšanom ADCC funkcijom putem kotransfekcije sa DNK koja kodira enzim RMD, kako bi se uklonio ostatak fukoze iz Fc regiona IgG1. Videti tabelu 6 za listu korišćenih bispecifičnih antitela i njihovo PB kodiranje.

ADCC reporterski test

[0165] ADCC reporterski test je izveden da bi se utvrdilo da li je kotransfekcija RMD-kodirajuće DNK uspešno poboljšala ADCC efektorsku funkciju. Svi uzorci su testirani duplo na BxPC3 ćelijama (koje eksprimiraju EGFR) i MKN-45 ćelijama (koje eksprimiraju c-MET) korišćenjem i testa visokog i testa niskog afiniteta. Efektorske ćelije visokog afiniteta eksprimiraju V-varijantu humanog FcyRIIIa, a efektorske ćelije niskog afiniteta eksprimiraju F-varijantu.

[0166] Ukratko, ciljne ćelije BxPC3 i MKN-45 su sakupljene i zasejane u količini od 1000 ćelija/bunariću u 30 µL i inkubirane preko noći na 37°C, 5% C02, 95% relativne vlažnosti. Sledećeg dana, medijum je uklonjen i 10 µL razblaženja antitela je dodato u svaki bunarčić (razblaženje antitela 1.5x; serijska titracija u 9 koraka sa semilogaritamskim koracima razblaživanja koji rezultiraju koncentracijom testa od 1 ng/ml do 10 µg/ml). Istog dana, efektorske ćelije su odmrznute na 37°C, i 630 µL je dodato u 3.6 ml pufera za testiranje u epruveti od 15 ml i pomešano okretanjem naopako; 5 µL ovog rastvora (15000 ćelija) je zatim dodato u bunarčiće test-ploče. Ploča je inkubirana 6 sati na 37°C, 5% C02, 95% relativne vlažnosti, pre nego što je dodato 15 µL Bio-Glo reagensa u bunarčiće koji se testiraju. Luminiscencija je merena korišćenjem EnVision čitača ploča.

[0167] Spisak testiranih uzoraka je dat u tabeli 6, a rezultati testova su dati na slici 18. Kontrolno antitelo na anti-HER3 x EGFR bez ADCC poboljšanja (serija PB4522p25; MF4280xMF3178 opisano u WO2015/130172) bilo je negativno u sva četiri testa (naznačeno crnim krstićima i punim linijama (4. odozgo) na slici 18). Nasuprot tome, ADCC-poboljšana verzija ovog antitela (PB4522p34) bila je pozitivna u sva četiri testa (označena punim narandžastim krugovima). Slično, antic-MET x EGFR kontrolno antitelo bez ADCC poboljšanja (PB8532p04) bilo je negativno u sva četiri testa (naznačeno crnim krstićima i isprekidanim linijama na slici 18), kao i serija PB8532p05 koja je takođe bila bez ADCC poboljšanja (označeno zelenim zvezdicama). Sve tri linije sa zvezdicama nalaze se na dnu četiri panela. Međutim, ADCC-poboljšana varijanta p06 (PB8532p06) bila je pozitivna u svim testovima (označeno otvorenim narandžastim krugovima). Poboljšana efektorska funkcija ADCC slična funkciji kod PB8532p06 takođe je uočena za 5 bispecifika (PB19474 do PB19478). To je značilo da je kotransfekcija RMD-kodirajućom DNK uspešno poboljšala efektorsku funkciju ADCC.

Primer 6

[0168] Varijabilni region teškog lanca (VH) cMET varijabilnog domena PB8532 sadrži aminokiselinu iz MF4356 kao što je prikazano na primer na slici 8. VH cMET varijabilnog domena PB19748 sadrži aminokiselinsku sekvencu MF8230 (videti sliku 8). VH varijabilnog domena EGFR PB8532 sadrži aminokiselinu iz MF3370 kao što je prikazano na primer na slici 7. VH EGFR varijabilnog domena PB19748 sadrži aminokiselinsku sekvencu MF8233 sa slike 7. Laki lanac u PB8532 i PB1748 je isti i prikazan je na slici 9B. Antitelo cMET LY2875358 je između ostalog opisano u publikaciji Kim and Kim 2017. Kapacitet cMETxEGFR bispecifičnog antitela PB8532 ili PB19748 da inhibira rast tumora in vivo testiran je sa samim antitelom i u kombinaciji sa inhibitorom receptorske tirozin kinaze, erlotinibom na mišjem modelu ksenografta. U izabranom modelu, ćelije tumora HCC827 su presađene imunodeficijentnim NOD SCID gama (NSG) knock-in miševima za humani faktor rasta hepatocita (hHGFki), koji eksprimiraju humani HGF (ligand za cMET) umesto endogenog mišjeg HGF. NSG-hHGFki miševi su poznati pod celim imenom NOD.Cg-Hgf<tm1.1(HGF)Aveo>Prk<dcscid Il2rgtm1Wjl/J>(stk#014553) (NOD.Cg-Hgftm1.1(HGF)Aveo Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/J). Nemaju ni T ili B ćelije, nemaju funkcionalne NK ćelije i deficijentni su za signalizaciju citokinima, što omogućava bolje presađivanje tumora. HCC827 je uspostavljena ćelijska linija humanog nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC) koja eksprimira EGFR i cMET i za koju je poznato je da je rezistentna na erlotinib u prisustvu HGF.

[0169] Da bi se utvrdio efekat erlotiniba na rast tumora u ovom modelu, urađen je prvi eksperiment sa dve grupe miševa. Pre presađivanja tumorskih ćelija, ćelijski ciklus HCC827 ćelija je pojačan gajenjem ćelija preko noći u medijumu koji je suplementiran sa 20% fetalnog goveđeg seruma (FBS) pri konfluentnosti koja ne prelazi 80%. Sledećeg dana, NSG-hHGFki miševi (The Jackson Laboratory) su inokulisani subkutano sa 17x10e6 HCC827 tumorskih ćelija suspendovanih u 300 µl PBS plus 30% matrigela koji sadrži visoku koncentraciju matriksa bazalne membrane. Dobijeni tumori su mereni dva puta nedeljno korišćenjem nonijusa. Kada je srednja vrednost zapremine tumora dostigla približno 200 mm<3>, miševi su nasumično podeljeni u dve grupe (4-7 miševa po grupi, u zavisnosti od rasta i zapremine tumora) i započeto je lečenje lekovima.

[0170] Fina suspenzija erlotiniba je pripremana sveža svake nedelje u 0.05% hidroksipropil metilceluloze (HPMC) i 0.2% Tween-80 u vodi, sonifikacijom.

[0171] Od 19. dana, rastvor erlotiniba je korišćen za lečenje 5 miševa jednom dnevno (QD) gavažom u dozi od 6 mg/kg (n=5), a grupi od 4 miša je davana gavaža jednom dnevno sa 200 µl vehikuluma (0.05% HPMC i 0.1% Tween 80 u vodi). zapremina tumora je merena dva puta nedeljno nonijusom, a srednja zapremina tumora (i SEM) izračunata je za svaku grupu. Kada su veličine tumora dostigle 1500 mm<3>, miševi su eutanazirani. Lečenje je zaustavljeno posle 48. dana, a zapremina tumora kod preživelih miševa je merena do 62. dana.

[0172] U drugom eksperimentu u kome je testiran kapacitet bispecifičnog antitela PB8532 da inhibira rast tumora u ovom modelu (samo i u kombinaciji sa erlotinibom), NSG-hHGFki miševi sa tumorima (generisanim kao što je gore opisano) dobili su jedan od šest tretmana ili kombinovanih tretmana, pri čemu je antitelo davano jednom nedeljno intraperitonealnom (i.p.) injekcijom, a erlotinib ili vehikulum su davani jednom dnevno (QD) gavažom. Kao negativna kontrola, miševi su takođe tretirani sa PB17160, bispecifičnim antitelom sačinjenim od istog anti-cMET Fab kraka kao u PB8532, u kombinaciji sa Fab krakom specifičnim za irelevantnu metu. Irelevantna meta je na primer meta koja nije prisutna u mišu i tumoru. Često se koristi varijabilni domen specifičan za tetanus toksoid. Pogodan varijabilni domen koji se vezuje za tetanus toksoid ima VH iz MF1337 (videti sliku 1) i zajednički laki kao što je ovde otkriveno, poželjno sekvencu sa slike 9. Bispecifična antitela sa krakom za usmereno delovanje i krakom bez usmerenog delovanja (TT) su između ostalog opisana u WO2017/069628, videti MF1337. Još jedna irelevantna meta je RSV-G. Pogodan RSV-G varijabilni domen ima VH iz MF2708 sa slike 1 i zajednički laki lanac, poželjno lanac sa slike 9, poželjno 9B.

[0173] 21. dana, kada je srednja zapremina tumora dostigla približno 200 mm<3>, miševi su nasumično podeljeni u šest grupa (5-7 miševa po grupi u zavisnosti od rasta tumora i zapremine) i započet je tretman lekom: dnevna gavaža sa samim vehikulumom (n=5); nedeljno i.p. injekcije od 25 mg/kg PB8532 antitela plus dnevna gavaža sa vehikulumom (n=7); nedeljno i.p. injekcije od 25 mg/kg PB17160 antitela plus dnevna oralna gavaža sa vehikulumom (n=6); dnevna oralna gavaža sa 6 mg/kg erlotiniba (n=7); nedeljno i.p. injekcije od 25 mg/kg PB8532 antitela plus dnevna oralna gavaža sa 6 mg/kg erlotiniba (n=7); ili nedeljno i.p. injekcije od 25 mg/kg PB17160 antitela plus dnevna oralna gavaža sa 6 mg/kg erlotiniba (n=7). Kao i ranije, zapremina tumora je praćena i izračunata je srednja zapremina tumora (i SEM) u svakoj grupi. Svi tretmani su zaustavljeni nakon 60. dana, i zapremina tumora kod preživelih miševa je merena do 82. dana.

[0174] U trećem eksperimentu testiran je kapacitet bispecifičnog antitela PB19478 da inhibira rast tumora u ovom modelu (sam i u kombinaciji sa erlotinibom). NSG-hHGFki miševima sa tumorima (generisanim kao što je gore opisano) dat je jedan od šest tretmana ili kombinovanih tretmana, pri čemu se antitelo davalo nedeljno intraperitonealnom (i.p.) injekcijom, a erlotinib ili vehikulum su davani jednom dnevno (QD) gavažom.

[0175] 23. dana, kada je srednja zapremina tumora dostigla približno 200 mm<3>, miševi su nasumično podeljeni u šest grupa (5-6 miševa po grupi u zavisnosti od rasta i zapremine tumora) i započeto je lečenje lekovima: dnevna gavaža samo sa vehikulom (n=5); nedeljno i.p. injekcije od 25 mg/kg PB19478 antitela plus dnevna gavaža sa vehikulumom (n=5); dnevna oralna gavaža sa 6 mg/kg erlotiniba (n=6); nedeljno i.p. injekcije od 25 mg/kg PB19478 antitela plus dnevna oralna gavaža sa 6 mg/kg erlotiniba (n=4, jedan miš je uginuo tokom eksperimenta); nedeljno i.p. injekcije od 25 mg/kg LY2875358 antitela plus dnevna gavaža sa vehikulumom (n=5); nedeljno i.p. injekcije od 25 mg/kg LY2875358 antitela plus dnevna oralna gavaža sa 6 mg/kg erlotiniba (n=3, dva miša su umrla tokom eksperimenta). Kao i ranije, zapremina tumora je praćena i izračunata je srednja zapremina tumora (i SEM) u svakoj grupi. Svi tretmani su zaustavljeni nakon 93. dana, a zapremina tumora kod preživelih miševa je merena do 93. dana.

[0176] U četvrtom eksperimentu je testiran efekat kasnije primene PB19478. NSG-hHGFki miševima sa tumorima (generisanim kao što je prethodno opisano) dat je jedan od dva tretmana, pri čemu se antitelo davalo jednom nedeljno intraperitonealnom (i.p.) injekcijom, a erlotinib ili vehikulum su davani jednom dnevno (QD) gavažom.

[0177] 21., kada je srednja zapremina tumora dostigla približno 200 mm<3>, svih 14 miševa je počelo sa dnevnim oralnim tretmanom sa 6 mg/kg erlotiniba. 51. dana, kada je srednja zapremina tumora jasno premašila granicu od 500 mm<3>, miševi su nasumično podeljeni u dve grupe. Jedna grupa od šest je lečena dnevnom oralnom gavažom sa 6 mg/kg erlotiniba, a grupa od 8 je primala nedeljno i.p. injekcije od 25 mg/kg PB19478 antitela plus dnevna gavaža sa 6 mg/kg erlotiniba. Kao i ranije, zapremina tumora je praćena i izračunata je srednja zapremina tumora (i SEM) u svakoj grupi. Svi tretmani su prekinuti nakon 72. dana.

[0178] Rezultati prvog eksperimenta pokazuju da je erlotinib bio u stanju da indukuje antitumorski odgovor kod NGS-hHGFki miševa kojima su presađene HCC827 ćelije, ali samo onoliko dugo dok su miševi bili na lečenju (slika 19). U periodu bez lekova koji je počeo nakon oko 4 nedelje lečenja, zapremina tumora se jasno povećala kod miševa koji su lečeni erlotinibom.

[0179] Anti-cMETxEGFR bispecifično antitelo PB8532 je takođe bilo u stanju da indukuje antitumorski odgovor kod NGS-hHGFki miševa kojima su presađene HCC827 ćelije (slika 20). Ovaj efekat je bio veći kada se antitelo davalo u kombinaciji sa dnevnim dozama erlotiniba. U roku od 2.5 nedelje svi tumori su nestali od kombinacije PB8532 sa erlotinibom. Kontrolno antitelo PB17160 koje ciljano deluje na cMet sa jednim Fab krakom nije indukovalo antitumorski odgovor, ni sa ni bez erlotiniba. Dakle, specifično ciljano delovanje na cMet Fab krak kombinovanjem sa Fab krakom koji ciljano deluje na EGFR u bispecifičnom antitelu PB8532 može da prevaziđe HGF-posredovanu rezistenciju na erlotinib. U periodu bez lekova koji je počeo nakon oko 51⁄2 nedelja lečenja, PB8532 je bio očigledno efikasniji od erlotiniba u smanjenju zapremine tumora (slika 21) i nije uočen ponovni rast tumora u kombinovanoj grupi PB8532 erlotinib.

[0180] Anti-cMETxEGFR bispecifično antitelo PB19478 je takođe bilo u stanju da indukuje antitumorski odgovor kod NGS-hHGFki miševa kojima su presađene HCC827 ćelije (slika 22). Ovaj efekat je bio veći kada se antitelo davalo u kombinaciji sa dnevnim dozama erlotiniba. U roku od 2 nedelje svi tumori su nestali od kombinacije PB19478 sa ili bez erlotiniba. Sa erlotinibom, tumor se nije ponovo pojavio u periodu ispitivanja. Bez erlotiniba tumor se ponovo pojavio ubrzo oko 50. dana i ostao na nivou detekcije dok na kraju nije ponovo počeo da raste, od 80. dana nadalje. Humanizovano monoklonsko antitelo emibetuzumab (LY3875358) bilo je manje efikasno, takođe kada se kombinuje sa EGFR inhibitorom erlotinibom. Dakle, specifično ciljano delovanje Fab kraka na cMet u kombinaciji sa ciljanim delovanjem Fab kraka na EGFR u bispecifičnom antitelu PB8532 ili PB19478 može da prevaziđe HGF-posredovanu rezistenciju na erlotinib.

[0181] Slika 23 pokazuje da kada se tumori leče u vremenskoj tački kada počinje da se razvija rezistencija na erlotinib, postoji trenutni efekat bispecifičnog antitela PB19478.

[0182] Uzeti zajedno, podaci iz ovog modela ksenografta tumorskih ćelija HCC827 presađenih u imunodeficijentne miševe NSG-hHGFki, pokazuju da PB8532, PB19478 i antitela koja imaju slične VH sekvence date na slikama 7 i 8 imaju kapacitet da prevaziđu HGF-posredovanu rezistenciju na erlotinib in vivo. Efikasnost kombinovanog lečenja se nastavlja i nakon prekida tretmana.

Citirane publikacije iz stanja tehnike

[0183]

Ahmed, M et al. Lack of in Vivo Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity with Antibody containing gold particles/ Bioconjugate chemistry (2015): 26 812-816. DOI:10.1021/acs.bioconjchem.5b00139.

Buday L, Downward J. Epidermal growth factor regulates p21ras through the formation of a complex of receptor, Grb2 adapter protein, and Sos nucleotide exchange factor. Cell 1993;73: 611-20.

Castoldi, R., et al. "A novel bispecific EGFR/Met antibody blocks tumor-promoting phenotypic effects induced by resistance to EGFR inhibition and has potent antitumor activity." Oncogene 32.50 (2013): 5593-5601.

Chen et al., MET activation mediates resistance to lapatinib inhibition of HER2-amplified gastric cancer cells. Mol Cancer Ther 2012;11(3):650-669

Ferguson KM. Structure-based view of epidermal growth factor receptor regulation. Annu Rev Biophys 2008;37: 353-73.

Fong JT, et al., Alternative signaling pathways as potential therapeutic targets for overcoming EGFR and c-Met inhibitor resistance in non-small cell lung cancer. PLoS One. 2013 Nov 4;8(11):e78398.

Gale NW, Kaplan S, Lowenstein EJ, Schlessinger J, Bar-Sagi D. Grb2 mediates the EGF-dependent activation of guanine nucleotide exchange on Ras. Nature 1993; 363:88-92. Gulli LF1, Palmer KC, Chen YQ, Reddy KB. 1996. Epidermal growth factor-induced apoptosis in A431 cells can be reversed by reducing the tyrosine kinase activity. Cell Growth Differ. Feb;7(2):173-8.

Jorissen RN, Walker F, Pouliot N, Garrett TP, Ward CW, Burgess AW. Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signalling. Exp Cell Res 2003;284:31-53. Kim, George P., and Axel Grothey. "Targeting colorectal cancer with human anti-EGFR monoclonal antibodies: focus on panitumumab." Biologics 2.2 (2008): 223-228.

Kim, Ki-Hyun and Kim, Hyori. Progress of antibody-based inhibitors of the HGF-cMET axis in cancer therapy. Experimental & Molecular medicine (2017), e307; doi:10.1038/emm.2017.17)

Morgillo F, et al. ESMO Open 2016;1:e000060. doi:10.1136/esmoopen-2016-000060 Moores, Sheri L., et al. "A novel bispecific antibody targeting EGFR and cMet is effective against EGFR inhibitor-resistant lung tumors." Cancer research 76.13 (2016): 3942-3953.

Nakade et al. Triple inhibition of EGFR, Met, and VEGF suppresses regrowth of HGF-triggered, erlotinib-resistant lung cancer harboring an EGFR mutation. J Thorac Oncol 2014, 9(6):775-83.

Prigent SA, Gullick WJ. Identification of cErbB-3 binding sites for phosphatidylinositol 30-kinase and SHC using an EGF receptor/c-ErbB-3 chimera. EMBO J 1994;13:2831-41.

Robertson SC, Tynan J, Donoghue DJ. RTK mutations and human syndromes: when good receptors turn bad. Trends Genet 2000; 16:368.

Soltoff SP, Carraway KL, III, Prigent SA, Gullick WG, Cantley LC. ErbB3 is involved in activation of phosphatidylinositol 3-kinase by epidermal growth factor. Mol Cell Biol 1994;14:3550-8.

Yano et al. Hepatocyte growth factor induces gefitinib resistance of lung adenocarcinoma with epidermal growth factor receptor-activating mutations. Cancer Res. 2008, 15;68(22):9479-87.

Yarden Y. The EGFR family and its ligands in human cancer. Signalling mechanisms and therapeutic opportunities. Eur J Cancer 2001;37 (Suppl 4):S3-S8.

Zhang et al., MET kinase inhibitor SGX523 synergizes with epidermal growth factor receptor inhibitor erlotinib in a hepatocyte growth factor-dependent fashion to suppress carcinoma growth. Cancer Res 2010, 70:6880-6890.

US20120107234A1_Symphogen patent "PAN HER antibody composition".

125084 Erbitux Pharmacology Review Part 2 - FDA.

Tabela 1. Referentna antitela sa objavljenim specifičnostima za ekstracelularne domene cMET.

Ime INN ime Epitop MOA

5D5 MetMAb Sema domen HGF blok

13.3.2

224G11

C8-H241 LY-2875358 HGF blok, internalizacija

R13 13-MET

Tabela 2. Kompeticija cMet referentnih antitela sa cMET cLC antitelima. Prikazane su OD450 vrednosti. OD450 vrednosti ukazuju na prisustvo ili odsustvo kompeticije sa navedenim antitelom. MF4506 nije testiran.

Testirani MF Br. IgG 13.3.2 5D5 R13 224G11 C8H241 R28

4040 1.915 1.818 0.066 1.608 1.907 1.979 1.787

4297 1.769 0.072 1.499 1.332 1.955 1.031 1.885

4356 2.380 2.541 0.088 2.231 2.170 1.806 1.825

13.3.2 2.172 0.311 1.934 1.988 2.221 1.893 2.129

5D5 1.868 1.773 0.164 1.660 2.025 2.054 2.035

R13 1.693 1.590 1.549 0.090 1.878 0.078 1.794

Tabela 3. Spisak 24 cMETxEGFR bispecifična antitela izabranih nakon eksperimenata dozno-zavisne titracije u N87 HGF/EGF testu proliferacije. dati su MF broj EGFR i cMET krakova kod svakog pojedinačnog PB kao i njihove HCDR3 sekvence.

Tabela 4. Kratak pregled eksperimenata titracije antitela u kojima se koriste N87 HGF/EGF, HGF i EGF testovi proliferacije sa24 cMETxEGFR bispecifična antitela. Bispecifična antitela su oznalena sa PBXXXX, a različiti Fab kraci sa MGXXXX. Aktivnost bispecifičnih antitela u pojedinačnim testovima je oznalčena sa: - bez efekta; inhibicija proliferacije niža od pozitivne kontrole; + = inhibicija proliferacije uporediva sa pozitivnim kontrolnim antitelom 5D5 Fab; ++ = inhibicija proliferacije viša od pozitivnog kontrolnog antitela 5D5 Fab.

PB PB za MF N87 testovi proliferacije

EGFR cMET HGF/ EGF HGF EGF

PB PB za MF N87 testovi proliferacije

EGFR cMET HGF/ EGF HGF EGF

Tabela 5. Sastav najpotentnijih EGFRxcMET bispecifičnih antitela i njihova kompeticija sa referentnim antitelima.

Bispecifično EGFR EGFR blokiranje u poređenju cMET Blokiranje unakrsnim antitelo krak sa cetuks. (na osnovu IC50) krak referentnim antitelom

Tabela 6. Sastav bispecifičnih antitela. pXX broj označava broj proizvodne serije i može da se koristi kako bi se utvrdilo da li antitelo jeste ili nije proizvedeno u ADCC verziji.

Claims (21)

1. Patentni zahtevi 1. Bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni domen koji može da veže ekstracelularni deo receptora za humani epidermalni faktor rasta (EGFR) i drugi varijabilni domen koji može da veže ekstracelularni deo humanog MET protoonkogena, receptorsku tirozin-kinazu (cMET), pri čemu prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNGNTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY; i pri čemu drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYSMN; CDR2 sekvencom WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 sekvencom ETYYYDRGGYPFDP; ili pri čemu prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNANTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY i pri čemu drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom TYSMN; CDR2 sekvencom WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 koji sadrži sekvencu ETYFYDRGGYPFDP; i pri čemu prvi i drugi varijabilni domen dalje sadrže laki lanac koji sadrži CDR1 sekvencu QSISSY, CDR2 sekvencu AAS, i CDR3 sekvencu QQSYSTP.
2. 2. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje je humano antitelo.
3. 3. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koje je antitelo pune dužine.
4. 4. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, koje je antitelo u IgG1 formatu, koje ima anti-EGFR, anti-cMET stehiometriju od 1:1.
5. 5. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, koje ima jedan varijabilni domen koji može da veže EGFR i jedan varijabilni domen koji može da veže cMET.
6. 6. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačeno time što varijabilni domen koji može da veže humani EGFR takođe može da veže EGFR cinomolgusa i miša.
7. 7. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačeno time što se varijabilni domen koji može da veže humani EGFR vezuje za domen III humanog EGFR.
8. 8. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačeno time što varijabilni domen koji može da veže cMET blokira vezivanje antitela 5D5 za cMET.
9. 9. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačeno time što varijabilni domen koji može da veže cMET blokira vezivanje HGF za cMET.
10. 10. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačeno time što su aminokiseline na pozicijama 405 i 409 u jednom CH3 domenu iste kao i aminokiseline na odgovarajućim pozicijama u drugom CH3 domenu (EU-numeracija).
11. 11. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, naznačeno time što varijabilni region teškog lanca u drugom varijabilnom domenu sadrži aminokiselinsku sekvencu jedne od sekvenci SEQ ID NO: 13 ili 23 sa 0-10, poželjno 0-5, aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacija, pri čemu navedene aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihove kombinacije nisu unutar naznačenih CDR sekvenci.
12. 12. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, u kome prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom jedne od sekvenci

    ili QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGW ISAYNANTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDR HWHWWLDAFDYWGQGTLVTVSS (MF8233), sa 0-10, poželjno 0-5, aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacija, pri čemu navedene aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihove kombinacije nisu unutar naznačenih CDR sekvenci.
13. 13. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačeno time što prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencom WISAYNGNTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY i pri čemu drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYSMN; CDR2 sekvencom WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 sekvencom ETYYYDRGGYPFDP.
14. 14. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačeno time što prvi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom SYGIS; CDR2 sekvencu WISAYNANTNYAQKLQG i CDR3 koji sadrži sekvencu DRHWHWWLDAFDY i pri čemu drugi varijabilni domen sadrži varijabilni region teškog lanca sa CDR1 sekvencom TYSMN; CDR2 sekvencom WINTYTGDPTYAQGFTG i CDR3 koji sadrži sekvencu ETYFYDRGGYPFDP.
15. 15. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14, naznačeno time što prvi i drugi varijabilni domen sadrže varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK ili DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK, sa 0-10, poželjno 0-5, aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija, adicija ili njihovih kombinacija, pri čemu navedene aminokiselinske insercije, delecije, supstitucije, adicije ili njihove kombinacije nisu unutar naznačenih CDR sekvenci.
16. 16. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-15, za upotrebu u lečenju subjakta koji ima tumor.
17. 17. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, naznačeno time što je tumor EGFR-pozitivan tumor, cMET-pozitivan tumor, ili EGFR- i cMET-pozitivan tumor.
18. 18. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 16 ili patentnom zahtevu 17, naznačeno time što je tumor kancer dojke; kancer debelog creva; kancer pankreasa; kancer želuca; kancer jajnika; kolorektalni kancer; kancer glave i vrata, kancer pluća, uključujući nesitnoćelijski kancer pluća, ili kancer mokraćne bešike.
19. 19. Bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 16-18, naznačeno time što je tumor rezistentan na lečenje inhibitorom EGFR tirozin-kinaze.
20. 20. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, naznačeno time što je inhibitor EGFR tirozin-kinaze erlotinib, gefitinib ili afatinib, analog erlotiniba, gefitiniba ili afatiniba, ili kombinacija jednog ili više respektivnih jedinjenja i/ili njihovih analoga.
21. 21. Bispecifično antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, naznačeno time što je inhibitor EGFR tirozin-kinaze erlotinib.